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特表2024-546019ＭＩＲＮＡ抑制剤を利用した血管平滑筋細胞増殖性疾患の診断、予防または治療用組成物
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-12-17
(54)【発明の名称】ＭＩＲＮＡ抑制剤を利用した血管平滑筋細胞増殖性疾患の診断、予防または治療用組成物
(51)【国際特許分類】
A61K 45/00 20060101AFI20241210BHJP
A61K 31/713 20060101ALI20241210BHJP
A61K 31/7105 20060101ALI20241210BHJP
A61K 31/7088 20060101ALI20241210BHJP
A61K 31/711 20060101ALI20241210BHJP
A61P 9/10 20060101ALI20241210BHJP
A61P 9/12 20060101ALI20241210BHJP
A61P 9/00 20060101ALI20241210BHJP
A61P 9/04 20060101ALI20241210BHJP
A61P 9/06 20060101ALI20241210BHJP
A61P 9/08 20060101ALI20241210BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20241210BHJP
G01N 33/50 20060101ALI20241210BHJP
G01N 33/53 20060101ALI20241210BHJP
【ＦＩ】
A61K45/00
A61K31/713
A61K31/7105
A61K31/7088
A61K31/711
A61P9/10 101
A61P9/12
A61P9/00
A61P9/04
A61P9/06
A61P9/08
A61P9/10
A61P9/10 103
A61K48/00
G01N33/50 P
G01N33/53 M
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024527420
(86)(22)【出願日】2022-11-09
(85)【翻訳文提出日】2024-05-30
(86)【国際出願番号】 KR2022017553
(87)【国際公開番号】W WO2023085772
(87)【国際公開日】2023-05-19
(31)【優先権主張番号】10-2021-0153320
(32)【優先日】2021-11-09
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＲＩＴＯＮ
(71)【出願人】
【識別番号】519463570
【氏名又は名称】バステラ カンパニー リミテッド
【氏名又は名称原語表記】ＶＡＳＴＨＥＲＡ ＣＯ．ＬＴＤ．
(74)【代理人】
【識別番号】100105957
【弁理士】
【氏名又は名称】恩田 誠
(74)【代理人】
【識別番号】100068755
【弁理士】
【氏名又は名称】恩田 博宣
(74)【代理人】
【識別番号】100142907
【弁理士】
【氏名又は名称】本田 淳
(74)【代理人】
【識別番号】100152489
【弁理士】
【氏名又は名称】中村 美樹
(72)【発明者】
【氏名】カン、サン ウォン
(72)【発明者】
【氏名】イ、サン－ヒョク
(72)【発明者】
【氏名】キム、イェリン
【テーマコード（参考）】
2G045
4C084
4C086
【Ｆターム（参考）】
2G045CB01
2G045DA14
2G045FB01
2G045FB02
2G045FB03
4C084AA17
4C084MA02
4C084NA14
4C084ZA361
4C084ZA421
4C084ZA451
4C084ZC411
4C086AA01
4C086AA02
4C086EA16
4C086MA01
4C086MA04
4C086NA14
4C086ZA36
4C086ZA42
4C086ZA45
4C086ZC41
(57)【要約】
本発明は、ｍｉＲＮＡ（ｍｉｃｒｏＲＮＡ）抑制剤を有効成分として含む血管平滑筋細胞増殖性疾患の予防または治療用薬学組成物；ｍｉＲＮＡを検出できる製剤を含む血管平滑筋細胞増殖性疾患診断用キット；前記疾患診断の情報提供方法；及び治療方法に関する。本発明は、平滑筋細胞の増殖性疾患に関与するｍｉＲＮＡのｓｕｂｓｅｔ、ｍｉＲ－１３２－３ｐ、ｍｉＲ－３７０－３ｐ、ｍｉＲ－１３０ｂ－５ｐ及びｍｉＲ－４１０－３ｐを発掘し、これらｍｉＲＮＡは、対照群に比べて損傷動脈で５倍以上に顕著に発現が増加し、特に、ｍｉＲ－３７０－３ｐは動脈硬化患者の管状組織で高発現を確認することにより、これと関連した疾患の診断に有用であり、さらにそれを用いた血管平滑筋細胞増殖性疾患の治療用途としても活用することができる。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ｍｉＲＮＡ（ｍｉｃｒｏＲＮＡ）抑制剤を有効成分として含む血管平滑筋細胞増殖性疾患の予防または治療用薬学組成物。
【請求項2】
前記ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ－１３２－３ｐ、ｍｉＲ－３７０－３ｐ、ｍｉＲ－１３０ｂ－５ｐまたはｍｉＲ－４１０－３ｐからなる群から選択された一つ以上である、請求項１に記載の薬学組成物。
【請求項3】
前記ｍｉＲＮＡ抑制剤は、損傷動脈で上方発現したｍｉＲＮＡを抑制することにより試験管内血管平滑筋細胞機能及び生体内新生内膜増殖を調節するものである、請求項１に記載の薬学組成物。
【請求項4】
前記ｍｉＲＮＡ抑制剤は、ｍｉＲＮＡに特異的なｓｉＲＮＡ、アプタマー（ａｐｔａｍｅｒ）、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム及び化合物で構成された群から選択されたいずれか一つ以上である、請求項１に記載の薬学組成物。
【請求項5】
前記血管平滑筋細胞増殖性疾患は、血管狭窄症、血管再狭窄症、粥状動脈硬化症、アテローム性動脈硬化症、心不全症、心筋梗塞症、狭心症、不整脈症、高血圧性心疾患症、先天性心疾患症、脳卒中及び末梢血管狭窄症からなる群から選択された疾患である、請求項１に記載の薬学組成物。
【請求項6】
ｍｉＲＮＡを検出できる製剤を含む血管平滑筋細胞増殖性疾患診断用キット。
【請求項7】
前記ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ－１３２－３ｐ、ｍｉＲ－３７０－３ｐ、ｍｉＲ－１３０ｂ－５ｐまたはｍｉＲ－４１０－３ｐからなる群から選択されたものである、請求項６に記載のキット。
【請求項8】
前記キットは、マイクロアレイ、アプタマー・チップ・キット、エライザ（ＥＬＩＳＡ，ｅｎｚｙｍｅ ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ）キット、ＳＡＧＥ（Ｓｅｒｉａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）キット、ｑＲＴ－ＰＣＲ（ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＰＣＲ）キットまたはそれらの組み合わせからなる群から選択されたものである、請求項６に記載のキット。
【請求項9】
分離した生物学的試料でｍｉＲＮＡの発現水準を測定する段階；及び対照群で前記ｍｉＲＮＡの発現水準が増加すると、血管平滑筋細胞増殖性疾患にかかる危険があると判定する段階を含む血管平滑筋細胞増殖性疾患診断の情報提供方法。
【請求項10】
前記ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ－１３２－３ｐ、ｍｉＲ－３７０－３ｐ、ｍｉＲ－１３０ｂ－５ｐまたはｍｉＲ－４１０－３ｐからなる群から選択されたものである、請求項９に記載の情報提供方法。
【請求項11】
前記生物学的試料でｍｉＲＮＡ標的遺伝子の発現水準が対照群に比べて減少するかどうかを判定する段階をさらに含む、請求項９に記載の情報提供方法。
【請求項12】
前記分離した生物学的試料は、動脈硬化症患者の血液または管状組織切片である、請求項８に記載の情報提供方法。
【請求項13】
ｍｉＲＮＡ発現抑制剤及び薬学的に許容可能な担体を含む血管平滑筋細胞増殖性疾患の予防または治療用薬学組成物をこれを必要とするヒトを除いた個体に投与することを含む、血管平滑筋細胞増殖性疾患の治療方法。
【請求項14】
前記ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ－１３２－３ｐ、ｍｉＲ－３７０－３ｐ、ｍｉＲ－１３０ｂ－５ｐまたはｍｉＲ－４１０－３ｐからなる群から選択されたものである、請求項１３に記載の治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ｍｉＲＮＡ（ｍｉｃｒｏＲＮＡ）抑制剤を有効成分として含む血管平滑筋細胞増殖性疾患の予防または治療用薬学組成物；ｍｉＲＮＡを検出できる製剤を含む血管平滑筋細胞増殖性疾患診断用キット；前記疾患診断の情報提供方法；及び治療方法に関する。
【背景技術】
【0002】
正常の動脈血管は、健康な内皮細胞（ＥＣ）の単層と収縮性平滑筋細胞（平滑筋細胞）の二つの主な細胞類型で構成される。しかし、血流障害と結合された低密度リポタンパク質の内部蓄積はＥＣに炎症を起こすことがあり、単球／マクロファージは炎症があるＥＣ病変に付着してＥＣ単層に浸透し、脂質粒子を吸収して泡沫細胞となる。生成されたマクロファージ駆動泡沫細胞と動脈硬化病変の免疫細胞は、逆分化及び繊維性キャップ形成のために平滑筋細胞を刺激する多くの成長因子とサイトカインを分泌する。初期炎症反応を含む全粥状形成過程は、結局、動脈内腔の閉塞をもたらすようになる。現在、動脈硬化症の患者で閉鎖された動脈を復旧できる唯一の方法は、血管成形術とステント手術を併行することであるが、手術後には内皮損傷により主な合併症である血栓症が生じ、これは、ステント内再狭窄という追加の新生内膜の増殖を誘発する。このような再狭窄合併症の過程は、再び動脈硬化の後期段階で逆分化された平滑筋細胞の増殖及び移動と類似し、したがって、これは、如何なる標的接近法も動脈硬化を予防するための正しい解決策になり得ないことを示唆する。
【0003】
ｍｉｃｒｏＲＮＡ（略称ｍｉＲＮＡ）は、１９９３年に線虫でｌｉｎ－４遺伝子を研究していた中に発見された後、ｍｉＲＮＡの翻訳調節因子としての機能が過去数十年間に多くの関心を集めてきた。ｍｉＲＮＡのユニークな特徴は、３’ＵＴＲにおいて種々の遺伝子の発現を同時に調節することであり、実際に、種々の研究で血管平滑筋細胞の成長を調節する血管ｍｉＲＮＡを見出して特性化することを試みた（Ｆａｒｉｎａ、２０２０ ＃２６１９；Ｔｏｒｅｌｌａ、２０１８ ＃２６１８；Ｊｉ、２００７ ＃２６１７）。それにもかかわらず、げっ歯類とヒトの共通の血管ｍｉＲＮＡのゲノム全体に対するスクリーニングはなかった。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0004】
このような背景下に、本発明者らは、動脈平滑筋細胞の過増殖及び移動に関連した血管ｍｉＲＮＡをスクリーニングすべく鋭意努力研究した結果、平滑筋細胞の増殖を示す標準動物モデルを用いて動脈平滑筋細胞の増殖及び移動を調節する重要な４つのｍｉＲＮＡを確認し、特に、ｍｉＲ－３７０－３ｐが粥状動脈硬化症において非常に重要な平滑筋細胞の増殖性疾患に関連した新たなｍｉＲＮＡであることを確認することにより、本発明を完成した。
【課題を解決するための手段】
【0005】
本発明の一つの目的は、ｍｉＲＮＡ（ｍｉｃｒｏＲＮＡ）抑制剤を有効成分として含む血管平滑筋細胞増殖性疾患の予防または治療用薬学組成物を提供することにある。
本発明のもう一つの目的は、ｍｉＲＮＡを検出できる製剤を含む血管平滑筋細胞増殖性疾患診断用キットを提供することにある。
本発明のもう一つの目的は、ｍｉＲＮＡを検出できる製剤を含む血管平滑筋細胞増殖性疾患診断用キットを提供することにある。
【0006】
本発明の他の一つの目的は、血管平滑筋細胞増殖性疾患診断の情報提供方法を提供することにある。
本発明の他の一つの目的は、ｍｉＲＮＡ発現抑制剤を含む前記薬学組成物をこれを必要とするヒトを除いた個体に投与することを含む血管平滑筋細胞増殖性疾患の治療方法を提供することにある。
本発明の他の一つの目的は、ｍｉＲＮＡ発現抑制剤を含む前記薬学組成物をこれを必要とするヒトを除いた個体に投与することを含む血管平滑筋細胞増殖性疾患の治療方法を提供することにある。
【発明の効果】
【0007】
本発明は、血管平滑筋細胞の増殖性疾患に関与するｍｉＲＮＡのｓｕｂｓｅｔ、ｍｉＲ－１３２－３ｐ、ｍｉＲ－３７０－３ｐ、ｍｉＲ－１３０ｂ－５ｐ及びｍｉＲ－４１０－３ｐを発掘し、これらｍｉＲＮＡは、対照群に比べて損傷動脈において５倍以上に顕著に発現が増加し、特に、ｍｉＲ－３７０－３ｐは、動脈硬化患者の管状組織で高発現を確認することにより、前記疾患の診断に有用に使用され、さらに、それを用いた血管平滑筋細胞増殖性疾患の予防または治療用途としても活用され得る。
【図面の簡単な説明】
【0008】
【図1a】バルーン損傷動脈動物モデルからシャム対照群（ｓｈａｍ ｃｏｎｔｒｏｌ）と比較して動脈損傷３日及び５日に差異発現したｍｉＲＮＡに対するヒートマップ分析である。
【図1b】差異発現したｍｉＲＮＡ中の発現量が５倍以上変化を示した８個の上方制御されたｍｉＲＮＡと２個の下方制御されたｍｉＲＮＡを示したグラフである。
【図2a】上方制御されたｍｉＲＮＡの役割を確認するために、ｍｉＲＮＡ抑制剤でトランスフェクションされたヒト血管平滑筋細胞を用いて確認した結果、ｍｉＲ－１３２－３ｐ及びｍｉＲ－３７０－３ｐが平滑筋細胞の増殖に有意な抑制効果を示し、ｍｉＲ－１３０ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－１３２－３ｐ及びｍｉＲ－４１０－３ｐが単球の付着を顕著に抑制することを確認したグラフである。
【図2b】ｍｉＲ－１３２－３ｐ及びｍｉＲ－３７０－３ｐ抑制剤が細胞周期Ｇ１段階で細胞周期停止を誘導し、ヒト血管平滑筋細胞の時間依存的増殖を抑制することを示したグラフである。
【図2c】ｍｉＲ－１３２－３ｐ及びｍｉＲ－３７０－３ｐ抑制剤が細胞周期Ｇ１段階で細胞周期停止を誘導し、ヒト血管平滑筋細胞の時間依存的増殖を抑制することを示したグラフである。
【図2d】ｍｉＲ－１３２－３ｐ及びｍｉＲ－３７０－３ｐ抑制剤がサイクリン依存性キナーゼ抑制剤であるｐ２１及びｐ２７の水準を顕著に増加させることを示したグラフである。
【図2e】ｍｉＲ－１３２－３ｐ抑制剤がＳＭＡ水準を回復させることにより、平滑筋細胞が収縮表現型に転換されたことを通じて、ｍｉＲ－１３２－３ｐが平滑筋細胞表現型転移に関与することを確認したグラフである。
【図2f】Ｆ－アクチンフィラメントを通じてヒト血管平滑筋細胞の合成表現型がｍｉＲ－１３２－３ｐ抑制剤により収縮表現型に変形されたことを再度確認したグラフである。
【図3a】選択された４個のｍｉＲＮＡのＩｎ ｓｉｔｕ ハイブリダイゼーション（ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）を通じた動脈発現水準を確認した結果、ｍｉＲ－１３２－３ｐ及びｍｉＲ－３７０－３ｐはバルーン損傷動脈で顕著に増加し、ｍｉＲ－１３０ｂ－５ｐ及びｍｉＲ－４１０－３ｐはバルーン損傷により誘導されることを確認したものである。
【図3b】選択された４個のｍｉＲＮＡ抑制剤のカテーテル媒介局所的壁内伝達が対照群に比べてバルーン損傷病変で新生内膜増殖を顕著に退行させることを確認した写真及びグラフである。
【図3c】ｍｉＲＮＡ中でもｍｉＲ－１３０ｂ－５ｐ抑制剤が再内皮化（ｒｅ－ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｉｚａｔｉｏｎ）を通じてＥＣ単層の回復を促進することにより、ＥＣにおける抗増殖効能を示すものである。
【図4a】損傷動脈において差異的に発現した遺伝子（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ－ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｇｅｎｅｓ，ＤＥＧｓ）をプロファイリングしたものである。
【図4b】ヒートマップ分析を通じて上方制御及び下方制御されたＤＥＧを確認したものである。
【図4c】ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＰＣＲを通じて、選択された４個のｍｉＲＮＡの予想標的遺伝子のシャム対照群に比べてバルーン損傷頸動脈で下方制御されたことを確認したグラフである。
【図4d】ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＰＣＲを通じて、ｍｉＲ－１３２－３ｐ、ｍｉＲ－３７０－３ｐ、ｍｉＲ－１３０ｂ－５ｐ及びｍｉＲ－４１０－３ｐ ｍｉＲＮＡそれぞれの標的遺伝子がＳＯＣＳ２、ＢＭＰ７、ＴＳＰＡＮ２及びＳＭＡＤ６であることを確認したグラフである。
【図5a】動脈硬化症ＩＩ型及びＩＶ型病変があるヒト患者の管状組織切片においてｍｉＲ－３７０－３ｐの高発現を確認したものである。
【図5b】血清刺激を通じてｍｉＲ－３７０－３ｐとＢＭＰ７との関係を調査したものであり、血清刺激はｍｉＲ－３７０－３ｐ発現を誘導したが、ＢＭＰ７発現は減少させた。
【図5c】ｍｉＲ－３７０－３ｐ抑制を通じて血管平滑筋細胞においてＢＭＰ７タンパク質水準が増加することを確認したものである。
【図5d】ｍｉＲ－３７０－３ｐ模倣体がヒトＢＭＰ７－３’ＵＴＲのｍｉＲ－３７０－３ｐ標的領域内の２個の連続ヌクレオチドを突然変異させた陰性対照群ではない野生型ＵＴＲを含有するルシフェラーゼ発現を減少させることを確認したものである。
【図5e】ＢＭＰ７処理による血管平滑筋細胞においてＳＭＡＤ１／５／９リン酸化誘導を確認したものである。
【図5f】ｓｉＲＮＡトランスフェクションによりＢＭＰ７が減少することによりｍｉＲ－３７０－３ｐ抑制剤により抑制された平滑筋細胞増殖が回復することを立証したものである。
【発明を実施するための形態】
【0009】
これを具体的に説明すると、次の通りである。ただし、下記の具体的な記述により本発明の範疇が制限されるとは見られない。即ち、本発明で開示されたそれぞれの説明及び実施形態はそれぞれの異なる説明及び実施形態にも適用されることができ、本発明で開示された多様な要素のすべての組合せが本発明の範疇に属する。
【0010】
本発明の一態様として、前述した目的を達成するために、本発明は、ｍｉＲＮＡ（ｍｉｃｒｏＲＮＡ）抑制剤を有効成分として含む血管平滑筋細胞増殖性疾患の予防または治療用薬学組成物を提供する。
【0011】
また、本発明は、ｍｉＲＮＡ（ｍｉｃｒｏＲＮＡ）抑制剤の血管平滑筋細胞増殖性疾患の予防または治療用途を提供する。
本出願において、用語「ｍｉＲＮＡ」は、ｍｉｃｒｏＲＮＡ、マイクロＲＮＡなどと記載することができ、生物の遺伝子発現を制御する役割をするｓｍａｌｌ ＲＮＡであり、具体的には、ターゲットｍＲＮＡ ３’ＵＴＲ（ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｅｄ ｒｅｇｉｏｎ）との相補的な塩基対配列によるターゲットｍＲＮＡ翻訳の抑制を通じて、遺伝子発現過程で重要な調節の役割をする２０～２５個のヌクレオチドを含むｓｍａｌｌ ＲＮＡである。前記ｍｉＲＮＡは、増殖、分化、アポトーシスなどを含む細胞機能において重要な役割をし、あらゆる動物に存在する進化的に保存された調節物質であり、一部のｍｉＲＮＡは、そのプロモーター部位と関連したエピジェネティックな調節機構（ヒストン修飾、ＤＮＡメチル化など）を通じて遺伝子発現調節を起こすことができる。
本出願において、用語「ｍｉＲＮＡ」は、ｍｉｃｒｏＲＮＡ、マイクロＲＮＡなどと記載することができ、生物の遺伝子発現を制御する役割をするｓｍａｌｌ ＲＮＡであり、具体的には、ターゲットｍＲＮＡ ３’ＵＴＲ（ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｅｄ ｒｅｇｉｏｎ）との相補的な塩基対配列によるターゲットｍＲＮＡ翻訳の抑制を通じて、遺伝子発現過程で重要な調節の役割をする２０～２５個のヌクレオチドを含むｓｍａｌｌ ＲＮＡである。前記ｍｉＲＮＡは、増殖、分化、アポトーシスなどを含む細胞機能において重要な役割をし、あらゆる動物に存在する進化的に保存された調節物質であり、一部のｍｉＲＮＡは、そのプロモーター部位と関連したエピジェネティックな調節機構（ヒストン修飾、ＤＮＡメチル化など）を通じて遺伝子発現調節を起こすことができる。
【0012】
本発明で用いるｍｉＲＮＡは、平滑筋細胞の過増殖、表現型の転移、移動などを調節するものであり、バルーン損傷動脈モデルを通じて具体的には、ｍｉＲ－１３２－３ｐ、ｍｉＲ－３７０－３ｐ、ｍｉＲ－１３０ｂ－５ｐ及びｍｉＲ－４１０－３ｐを決定した。また、これらの核心標的遺伝子をさらに確認し、特に、ｍｉＲ－３７０－３ｐは、粥状動脈硬化症に関連した新たなｍｉＲＮＡであることを発見したものであり、本発明者らにより最初に糾明された。
【0013】
本発明の用語、「ｍｉＲＮＡ抑制剤」とは、細胞内における各ｍｉＲＮＡの発現または活性を減少させる製剤を意味するものであり、前記各ｍｉＲＮＡに直接的に作用するか、または上位調節因子に間接的に作用して標的遺伝子の発現を調節するｍｉＲＮＡを遮断することを意味する。本発明において、前記ｍｉＲＮＡ抑制剤は、損傷動脈において上方発現したｍｉＲＮＡを抑制することにより、血管平滑筋細胞機能及び生体内新生内膜増殖を調節することを意味し、具体的には、ｍｉＲ－１３２－３ｐ、ｍｉＲ－３７０－３ｐ、ｍｉＲ－１３０ｂ－５ｐまたはｍｉＲ－４１０－３ｐに対するそれぞれの抑制剤を意味するが、これに制限されるものではない。
【0014】
本発明において、前記ｍｉＲＮＡ抑制は、ｍｉＲ－１３２－３ｐ、ｍｉＲ－３７０－３ｐ、ｍｉＲ－１３０ｂ－５ｐまたはｍｉＲ－４１０－３ｐのそれぞれに特異的な抑制剤を使用することができ、具体的には、各ｍｉＲＮＡに特異的なｓｉＲＮＡアプタマー、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイムまたは化合物であってもよいが、これに制限されるものではない。本発明の目的上、前記化合物は、生体内新生内膜増殖と関連したｍｉＲＮＡを抑制させる化合物であれば、いずれも使用することができる。
【0015】
前記損傷動脈は、本発明の目的上、発現が動脈平滑筋細胞の過増殖に関連した血管ｍｉＲＮＡをスクリーニングするために、人為的に動脈を損傷させたものであり、具体的には、ラット頸動脈をバルーンを通じて損傷させるモデルを製作して実験に用いた。
【0016】
本発明の一実施例では、損傷動脈において差異発現するｍｉＲＮＡを確認した結果、対照群に比べて損傷３日目及び５日目に差異的に発現した６２個のｍｉＲＮＡ中、ヒト大動脈平滑筋細胞におけるこれらの発現を確認し、最終６個の上方制御されたｍｉＲＮＡを確認した（図１）。
【0017】
前記用語、「上方制御された」とは、特定ｍｉＲＮＡの転写とプロセッシングが増加することにより成熟したｍｉＲＮＡ（ｍａｔｕｒｅ ｍｉＲＮＡ）が増加することを意味し、本発明では、対照群と比較して損傷動脈モデルで生合成が増加したことを意味する。本発明の目的上、発現が増加したことは、具体的には、対照群に比べて５倍以上に顕著に増加したことを意味するが、これに制限されるものではない。
【0018】
本出願において、用語「血管平滑筋細胞」とは、血管内壁を構成する細胞であり、収縮と弛緩を通じて血圧を一定に維持する機能をする細胞を意味する。正常血管では、平滑筋細胞が分化しながら収縮及び弛緩に必要なタンパク質を作って細胞増殖を止めるが、機能に問題が生じて逆分化する場合、血管が狭くなって動脈硬化及び血管再狭窄などの疾患を起こすようになる。このような血管疾患は、血管平滑筋細胞の機能と密接な関連があり、したがって、血管平滑筋細胞モデルは血管疾患研究において主な細胞モデルである。
【0019】
本出願において、用語「増殖」とは、生物や組織細胞などが細胞分裂をしてその数を増やすことで、通常、多細胞生物の体内で細胞が増加することを意味する。本発明において、前記細胞増殖は、血管平滑筋細胞の増殖を意味し、このような血管平滑筋細胞の過多な増殖は、動脈硬化症病変の進行に重要な要素である。
【0020】
本出願において、用語「血管平滑筋細胞増殖性疾患」とは、血管平滑筋細胞の過度な増殖により発生する疾患を意味する。前記血管平滑筋細胞増殖性疾患は、血管平滑筋細胞の増殖により直接的に発生する血管狭窄症（ｓｔｅｎｏｓｉｓ）、血管再狭窄症（ｒｅｓｔｅｎｏｓｉｓ）、粥状動脈硬化症、アテローム性動脈硬化症だけでなく、これら疾患により２次的に誘発するか、症状が深刻化する心血管系疾患である心不全症、心筋梗塞症、狭心症、不整脈症、高血圧性心疾患症、先天性心疾患症、脳卒中または末梢血管狭窄症などを含むことができる。
【0021】
本発明において、前記血管平滑筋細胞増殖性疾患は、具体的には、血管狭窄症、血管再狭窄症、粥状動脈硬化症、アテローム性動脈硬化症であってもよい。
前記血管狭窄症は、血管壁が損傷した後、炎症、血疔、平滑筋細胞の過度な増殖などにより血管の内部が異常に狭くなり、血流量が減少する疾患である。血管再狭窄症は、血管狭窄症が再発することであり、主に、血管の狭窄を解決するために、血管内腔（ｌｕｍｅｎ）を拡張したり、詰まった血管を再開通させるなどの血管手術後に発生する場合が多い。ステント（ｓｔｅｎｔ）／バルーン血管形成術（ｂａｌｌｏｏｎ ａｎｇｉｏｐｌａｓｔｙ）のような血管形成術、冠動脈バイパス術（ｃｏｒｏｎａｒｙ ａｒｔｅｒｙ ｂｙｐａｓｓ ｓｕｒｇｅｒｙ）のような血管迂回術（ｖａｓｃｕｌａｒ ｂｙｐａｓｓまたはｖａｓｃｕｌａｒ ｇｒａｆｔ）などの血管手術は、手術自体で血管に損傷を加えたり、炎症を起こしながら血管狭窄を起こす。粥状動脈硬化症は、動脈の内層に脂肪が沈着したり繊維化している疾患であり、動脈硬化の進行と血管拡張のために、ステント挿入後に発生する血管再狭窄症は、全て血管平滑筋細胞の増殖、移動、細胞外基質分泌によることが知られている。
前記血管狭窄症は、血管壁が損傷した後、炎症、血疔、平滑筋細胞の過度な増殖などにより血管の内部が異常に狭くなり、血流量が減少する疾患である。血管再狭窄症は、血管狭窄症が再発することであり、主に、血管の狭窄を解決するために、血管内腔（ｌｕｍｅｎ）を拡張したり、詰まった血管を再開通させるなどの血管手術後に発生する場合が多い。ステント（ｓｔｅｎｔ）／バルーン血管形成術（ｂａｌｌｏｏｎ ａｎｇｉｏｐｌａｓｔｙ）のような血管形成術、冠動脈バイパス術（ｃｏｒｏｎａｒｙ ａｒｔｅｒｙ ｂｙｐａｓｓ ｓｕｒｇｅｒｙ）のような血管迂回術（ｖａｓｃｕｌａｒ ｂｙｐａｓｓまたはｖａｓｃｕｌａｒ ｇｒａｆｔ）などの血管手術は、手術自体で血管に損傷を加えたり、炎症を起こしながら血管狭窄を起こす。粥状動脈硬化症は、動脈の内層に脂肪が沈着したり繊維化している疾患であり、動脈硬化の進行と血管拡張のために、ステント挿入後に発生する血管再狭窄症は、全て血管平滑筋細胞の増殖、移動、細胞外基質分泌によることが知られている。
【0022】
本発明の用語、「予防」とは、本発明による薬学組成物の投与により血管平滑筋細胞増殖性疾患の発病を抑制させるか、または遅延させるあらゆる行為を意味し、「治療」とは、前記薬学組成物の投与により血管平滑筋細胞増殖性疾患の疑いのある、及び発病個体の症状が好転したり有益に変更されるあらゆる行為を意味する。
【0023】
本発明の薬学組成物は、ｍｉＲ－１３２－３ｐ、ｍｉＲ－３７０－３ｐ、ｍｉＲ－１３０ｂ－５ｐまたはｍｉＲ－４１０－３ｐの活性及び／又は発現を阻害することにより、これと関連した疾患を予防または治療することができる。
【0024】
本発明による薬学組成物は、有効成分としてｍｉＲ－１３２－３ｐ、ｍｉＲ－３７０－３ｐ、ｍｉＲ－１３０ｂ－５ｐまたはｍｉＲ－４１０－３ｐ抑制剤を組成物の総重量を基準として０．１～７５重量％、より好ましくは１～５０重量％で含有することができる。
【0025】
また、前記薬学組成物は、ｍｉＲＮＡ抑制剤の生体内伝達効率を上げるために、当業界に知られている多様な核酸伝達体（ウイルス性または非ウイルス性伝達体）と複合体の形態をさらに含むことができる。前記ウイルス性伝達体としては、具体的には、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルスがｍｉＲＮＡをコードするベクターを細胞内核に伝達し、ｍｉＲＮＡ抑制剤を発現するのに使用される。また、非ウイルス性伝達体としては、金、炭素、シリカのような無機物質を用いてサイズと形態を調節できる無機ナノ粒子基盤の伝達体、特定の細胞特異的に効果的伝達のために、特に変形が多くなったＰＬＧＡとＰＥＩのようなポリマー基盤伝達体、脂質二重層で形成されており、内相が水となっていて核酸などを封入して伝達できるリポソームなどを利用した脂質輸送体は、ｍｉＲＮＡ抑制剤を保護して血液循環時に安定性を向上させることができる。
【0026】
前記薬学組成物は、個別治療剤として投与したり、他の治療剤と併用して投与することができ、従来の治療剤とは順次または同時に投与することができる。そして、単一または多重投与することができる。前記の要素をすべて考慮して副作用なしに最小限の量で最大効果を得る量を投与することが重要であり、当業者により容易に決定することができる。
【0027】
また、前記薬学組成物は、目的とする方法により非経口投与（例えば、静脈内、皮下、腹腔内または局所に適用）することができ、投与量は、患者の状態及び体重、疾病の程度、薬物形態、投与経路及び時間によって異なるが、当業者により適切に選択することができる。
【0028】
本発明の一実施例では、試験管内における血管平滑筋細胞機能を調節する上方制御されたｍｉＲＮＡを確認した結果、ｍｉＲ－１３２－３ｐ及びｍｉＲ－３７０－３ｐが血管平滑筋細胞増殖において有意な抑制効果を示し、ｍｉＲ－１３０ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－１３２－３ｐ及びｍｉＲ－４１０－３ｐにより血管平滑筋細胞に対する単球付着が顕著に抑制されることを確認し、増殖関連のｍｉＲ－１３２－３ｐ及びｍｉＲ－３７０－３ｐに対する深層調査を通じて、それぞれ表現型転移と増殖信号を調節する可能性があることを確認した（図２）。
【0029】
また、本発明の一実施例では、生体内における新生内膜増殖を調節する上方制御されたｍｉＲＮＡを確認するために、ｍｉＲ－１３２－３ｐ、ｍｉＲ－３７０－３ｐ、ｍｉＲ－１３０ｂ－５ｐ及びｍｉＲ－４１０－３ｐの動脈発現水準を調査した結果、ｍｉＲ－１３２－３ｐ及びｍｉＲ－３７０－３ｐの発現がシャム対照群に比べてバルーン損傷頸動脈で顕著に増加し、ｍｉＲ－１３０ｂ－５ｐ及びｍｉＲ－４１０－３ｐもバルーン損傷により実質的に誘導され、前記ｍｉＲＮＡの抑制剤は、対照群に比べてバルーン損傷病変で新生内膜増殖を顕著に退行させ、ｍｉＲ－１３０ｂ－５ｐ抑制剤は、再内皮化と呼ばれる単層の回復を促進することを示すことにより、これら４個のｍｉＲＮＡが血管内炎症及び増殖のような動脈恒常性で明確な役割をすることを確認した（図３）。
【0030】
また、本発明の一実施例では、ｍｉＲ－１３２－３ｐ、ｍｉＲ－３７０－３ｐ、ｍｉＲ－１３０ｂ－５ｐ及びｍｉＲ－４１０－３ｐの核心標的遺伝子を確認するために、損傷動脈で二つの時点に差異的に発現した遺伝子（ＤＥＧｓ）を用いて標的予測データベースを通じてラットとヒトで共通して予測したＤＥＧを各ｍｉＲＮＡの標的遺伝子として選択し、これら標的遺伝子が損傷動脈で下方制御されたことを確認することにより、前記ｍｉＲ－１３２－３ｐ、ｍｉＲ－３７０－３ｐ、ｍｉＲ－１３０ｂ－５ｐ及びｍｉＲ－４１０－３ｐの各核心標的遺伝子がＳＯＣＳ２（Ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ ｏｆ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ ２）、ＢＭＰ７（Ｂｏｎｅ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ ７）、ＴＳＰＡＮ２（Ｔｅｔｒａｓｐａｎｉｎ－２）及びＳＭＡＤ６（ＳＭＡＤ ｆａｍｉｌｙ ｍｅｍｂｅｒ ６）であることを明らかにした（図４）。
【0031】
また、本発明の一実施例では、不安定型狭心症、第２型糖尿病及び高脂血症患者の血液からｍｉＲ－３７０が検出されたため、平滑筋細胞増殖においてｍｉＲ－３７０／ＢＭＰ（ｂｏｎｅ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ）－７軸の生物学的重要性を調査した結果、動脈硬化症ＩＩ型及びＩＶ型病変があるヒト患者の管状組織切片でｍｉＲ－３７０－３ｐの高発現を確認した。したがって、ｍｉＲ－３７０が粥状動脈硬化症に関連した新たなｍｉＲＮＡであることを確認し、ヒト血管平滑筋細胞ではｍｉＲ－３７０抑制を通じてＢＭＰ７タンパク質の水準を増加させ、ＢＭＰ７処理は、ヒト平滑筋細胞でＳＭＡＤ１／５／９リン酸化を顕著に誘導し、ＢＭＰ７の枯渇がｍｉＲ－３７０抑制剤による平滑筋細胞増殖抑制を妨害することにより、ｍｉＲ－３７０依存的ＢＭＰ７の発現は、平滑筋細胞成長と損傷した動脈で発生する新生内膜増殖の前提条件であることを確認した（図５）。
【0032】
したがって、本発明のｍｉＲ－１３２－３ｐ、ｍｉＲ－３７０－３ｐ、ｍｉＲ－１３０ｂ－５ｐ及びｍｉＲ－４１０－３ｐの細胞増殖抑制効果に基づいて血管平滑筋細胞で前記ｍｉＲＮＡ抑制剤を含ませることにより、血管平滑筋細胞増殖性疾患を予防または治療するのに用いられることを予想することができる。
【0033】
本発明の他の一態様として、前述した目的を達成するために、本発明は、ｍｉＲＮＡを検出できる製剤を含む血管平滑筋細胞増殖性疾患診断用キットを提供する。
前記「ｍｉＲＮＡ」及び「血管平滑筋細胞増殖性疾患」は、上述した通りである。
前記「ｍｉＲＮＡ」及び「血管平滑筋細胞増殖性疾患」は、上述した通りである。
【0034】
本出願において、用語「診断」とは、病理状態の存在または特徴を確認したことを意味する。本発明の目的上、前記診断は、血管平滑筋細胞増殖性疾患に関し、目的とする患者から血管平滑筋細胞の過増殖または移動があったかどうかを客観的に判別する行為を意味すると解釈することができる。
【0035】
本発明の診断キットは、検体内のｍｉＲ－１３２－３ｐ、ｍｉＲ－３７０－３ｐ、ｍｉＲ－１３０ｂ－５ｐ及びｍｉＲ－４１０－３ｐまたはこれらの標的遺伝子を定性的及び／又は定量的に検出するために用いられる。
【0036】
前記キットは、具体的には、マイクロアレイ、アプタマー・チップ・キット、エライザ（ＥＬＩＳＡ，ｅｎｚｙｍｅ ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ）キット、ブロット（ｂｌｏｔｔｉｎｇ）キット、免疫沈降キット、免疫蛍光検査キット、タンパク質チップキット、ＲＴ－ＰＣＲキット及びそれらの組み合わせからなる群から選択することができ、より具体的には、ＲＴ－ＰＣＴキットであってもよいが、ｍｉＲＮＡまたはその標的遺伝子発現水準を測定できる限り、これに制限されるものではない。
【0037】
本発明のもう一つの態様として、前述した目的を達成するために、本発明は、ａ）分離した生物学的試料でｍｉＲＮＡの発現水準を測定する段階；及びｂ）対照群で前記ｍｉＲＮＡの発現水準が増加すると、血管平滑筋細胞増殖性疾患にかかる危険があると判定する段階を含む血管平滑筋細胞増殖性疾患診断の情報提供方法を提供する。
【0038】
前記「血管平滑筋細胞増殖性疾患」及び「診断」は、上述した通りである。
前記分離した生物学的試料でｍｉＲＮＡの発現水準を測定する段階は、具体的には、ｍｉＲ－１３２－３ｐ、ｍｉＲ－３７０－３ｐ、ｍｉＲ－１３０ｂ－５ｐまたはｍｉＲ－４１０－３ｐの発現水準を意味し、さらに具体的には、ｍｉＲ－３７０－３ｐの発現水準を測定したことを意味する。
前記分離した生物学的試料でｍｉＲＮＡの発現水準を測定する段階は、具体的には、ｍｉＲ－１３２－３ｐ、ｍｉＲ－３７０－３ｐ、ｍｉＲ－１３０ｂ－５ｐまたはｍｉＲ－４１０－３ｐの発現水準を意味し、さらに具体的には、ｍｉＲ－３７０－３ｐの発現水準を測定したことを意味する。
【0039】
前記情報提供方法は、前記分離した生物学的試料でｍｉＲＮＡの標的遺伝子の発現水準が対照群に比べて減少するかどうかを判定する段階をさらに含むことができ、具体的には、前記標的遺伝子は、ＢＭＰ７を意味する。
【0040】
また、前記ｍｉＲＮＡまたはその標的遺伝子の発現水準を測定する製剤を含むことができる。前記発現水準を測定する製剤は、ｍｉＲＮＡまたはその標的遺伝子に特異的に結合して認識できるようにするか、または増幅させる製剤を意味する。具体的な例として、前記ｍｉＲＮＡまたはその標的遺伝子に特異的に結合する抗体、プライマーまたはプローブであってもよいが、これらに限定されるものではなく、当業者であれば、発明の目的に合うように適切な製剤を選択できるはずである。
【0041】
前記製剤は、前記ｍｉＲＮＡまたはその標的遺伝子の発現水準の測定のために、直接または間接的に標識することができる。具体的には、前記標識には、リガンド、ビード（ｂｅａｄ）、放射性核種、酵素、基質、補因子、抑制剤、蛍光物質（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｒ）、化学発光物質、磁性粒子、ハプテン及び染料などが用いられるが、これに制限されない。具体的な例として、前記リガンドには、ビオチン、アビジン及びストレプトアビジンなどが含まれ、前記酵素には、ルシフェラーゼ、ペルオキシダーゼ及びベータガラクトシダーゼなどが含まれ、前記蛍光物質には、フルオレセイン、クマリン、ローダミン、フィコエリトリン及びスルホローダミン酸クロリド（テキサスレッド：Ｔｅｘａｓ ｒｅｄ）などが含まれるが、これに制限されない。このような検出可能な標識物として公知の標識物の大部分を使用することができ、当業者であれば、発明の目的に合うように適切な標識物を選択することができるはずである。
【0042】
前記用語「プライマー」とは、短い遊離３’末端ヒドロキシル基（ｆｒｅｅ ３’ ｈｙｄｒｏｘｙｌ ｇｒｏｕｐ）を有する塩基配列であり、相補的なテンプレート（ｔｅｍｐｌａｔｅ）と塩基対（ｂａｓｅ ｐａｉｒ）を形成でき、鋳型鎖のコピーのための開始地点として機能をする短い配列を意味する。本発明において、前記ｍｉＲＮＡ増幅に使用されるプライマーは、適切なバッファー中の適切な条件（例えば、４個の他のヌクレオシドトリホスフェート及びＤＮＡ、ＲＮＡポリメラーゼまたは逆転写酵素のような重合剤）及び適当な温度下に鋳型指示ＤＮＡ合成の開始点として作用できる一本鎖オリゴヌクレオチドであってもよいが、前記プライマーの適切な長さは、使用目的に応じて変わり得る。前記プライマー配列は、前記遺伝子のｍｉＲＮＡのポリヌクレオチドまたはその相補的なポリヌクレオチドと完全に相補的である必要はなく、ハイブリダイズする程度に十分に相補的であれば、使用可能である。
【0043】
前記用語「プローブ」とは、ｍｉＲＮＡと特異的結合を成し得る、ラベリング（ｌａｂｅｌｉｎｇ）された核酸断片またはペプチドを意味する。具体的な例として、オリゴヌクレオチド（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）プローブ、一本鎖ＤＮＡ（ｓｉｎｇｌｅ ｓｔｒａｎｄｅｄ ＤＮＡ）プローブ、二本鎖ＤＮＡ（ｄｏｕｂｌｅ ｓｔｒａｎｄｅｄ ＤＮＡ）プローブ、ＲＮＡプローブ、オリゴペプチド（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｅｐｔｉｄｅ）プローブ、ポリペプチドプローブ（ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）などの形態で製作することができる。
【0044】
本発明において前記分離した生物学的試料は、具体的には、動脈硬化症ＩＩ型及びＩＶ型病変がある患者の血液または管状組織切片であることを意味し、前記管状組織は、さらに具体的には、詰まった動脈血管から掻き取られた組織を意味するが、これに制限されるものではない。
【0045】
ｍｉＲ－３７０－３ｐは、不安定型狭心症、第２型糖尿病及び高脂血症患者の血液から検出されており、前記動脈硬化症患者の管状組織切片で高発現を確認することにより、粥状動脈硬化症に関連した新たなｍｉＲＮＡであることを確認した。
【0046】
本発明の前記疾患の発病の有無判別に必要な情報を提供する方法は、血管平滑筋細胞増殖性疾患、具体的には、粥状動脈硬化症の発病が疑わしい個体の血液または管状組織からｍｉＲＮＡまたはその標的遺伝子の発現水準を定量分析する段階を含むことができる。
【0047】
前記用語、「個体」は、例えば、血管平滑筋細胞増殖性疾患が発病する可能性があるか、または発病したラット、家畜、ヒトなどを含む哺乳動物を制限なく含むことができる。
本発明のもう一つの態様として、前述した目的を達成するために、本発明は、血管平滑筋細胞増殖性疾患診断用製剤を製造するためのｍｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡ標的遺伝子の発現水準を測定する製剤の用途を提供することができる。
本発明のもう一つの態様として、前述した目的を達成するために、本発明は、血管平滑筋細胞増殖性疾患診断用製剤を製造するためのｍｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡ標的遺伝子の発現水準を測定する製剤の用途を提供することができる。
【0048】
前記「血管平滑筋細胞増殖性疾患」、「診断」及び「ｍｉＲＮＡ」は、上述した通りである。
本発明のもう一つの態様として、前述した目的を達成するために、本発明は、前記ｍｉＲＮＡ発現抑制剤及び薬学的に許容可能な担体を含む血管平滑筋細胞増殖性疾患の予防または治療用薬学組成物をこれを必要とする個体に投与することを含む、血管平滑筋細胞増殖性疾患の治療方法を提供することができる。
本発明のもう一つの態様として、前述した目的を達成するために、本発明は、前記ｍｉＲＮＡ発現抑制剤及び薬学的に許容可能な担体を含む血管平滑筋細胞増殖性疾患の予防または治療用薬学組成物をこれを必要とする個体に投与することを含む、血管平滑筋細胞増殖性疾患の治療方法を提供することができる。
【0049】
前記「血管平滑筋細胞増殖性疾患」、「予防」、「治療」及び「ｍｉＲＮＡ」は、上述した通りである。
本発明において、前記発現抑制剤は、各ｍｉＲＮＡに相補的に結合するｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ）、アプタマーまたはアンチセンスＲＮＡであることを意味するが、これに制限されるものではない。
本発明において、前記発現抑制剤は、各ｍｉＲＮＡに相補的に結合するｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ）、アプタマーまたはアンチセンスＲＮＡであることを意味するが、これに制限されるものではない。
【0050】
本出願において、用語「個体」とは、本発明の血管平滑筋細胞増殖性疾患を保有するか、または発病した、ヒトを含むあらゆる動物を意味する。本発明の薬学組成物を個体に投与することにより前記疾患の予防及び治療効果を得ることができる。
【0051】
前記本発明の薬学組成物は、薬学的に有効な量で投与する。
本出願において、用語「投与」とは、如何なる適切な方法で対象に本発明の薬学組成物を導入することを言い、投与経路は、目的組織に到達できる限り、非経口の多様な経路を通じて投与することができる。
本出願において、用語「投与」とは、如何なる適切な方法で対象に本発明の薬学組成物を導入することを言い、投与経路は、目的組織に到達できる限り、非経口の多様な経路を通じて投与することができる。
【0052】
前記薬学組成物は、目的または必要に応じて当業界において使用される通常の方法、投与経路、投与量に応じて適切に個体に投与することができる。投与経路の例としては、非経口、皮下、腹腔内、肺内、及び鼻腔内に投与することができ、非経口の注入には、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内または皮下投与が含まれる。また、当業界に公知となった方法により適切な投与量及び投与回数を選択することができ、実際に投与される本発明の薬学組成物の量及び投与回数は、治療しようとする症状の種類、投与経路、性別、健康状態、食事、個体の年齢及び体重、及び疾患の重症度のような多様な因子により適切に決定することができる。
【0053】
本発明における用語、「薬学的に有効な量」とは、医学的用途に適用可能な合理的な受恵／リスクの比率で血管透過性の増加を抑制または緩和するのに十分な量を意味し、有効用量の水準は、個体の種類及び重症度、年齢、性別、薬物の活性、薬物に対する敏感度、投与時間、投与経路及び排出比率、治療期間、同時に使用される薬物を含む要素及びその他の医学分野によく知られている要素により決定することができる。例えば、前記投与は、１日に０．０１～５００ｍｇ／ｋｇで、具体的には、１０～１００ｍｇ／ｋｇの用量で投与することができ、前記投与は、１日に１回または数回に分けて投与することもできる。
【0054】
本発明の組成物は、個別治療剤として投与するか、または他の治療剤と併用して投与することができ、従来の治療剤とは順次または同時に投与することができる。そして単一または多重投与することができる。前記要素をすべて考慮し、副作用なしに最小限の量で最大効果を得ることができる量を投与することが重要であり、当業者により容易に決定することができる。
【0055】
本発明の組成物は、血管平滑筋細胞増殖性疾患の予防または治療のために単独で使用することができ、手術、ホルモン治療、薬物治療及び生物学的反応調節剤を使用する方法と併用することができる。
【0056】
本発明のもう一つの態様として、前述した目的を達成するために、本発明は、損傷動脈において損傷後３日及び５日に差異的に発現した遺伝子（Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ Ｇｅｎｅｓ，ＤＥＧｓ）をプロファイリングする段階を含む血管平滑筋細胞増殖または移動を抑制するｍｉＲＮＡの標的遺伝子スクリーニング方法を提供する。
【0057】
前記「損傷動脈」、「血管平滑筋細胞」、「増殖」及び「ｍｉＲＮＡ」は、上述した通りである。
前記スクリーニング方法は、具体的には、１）損傷動脈において損傷後３日及び５日に差異的に発現した遺伝子（Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ Ｇｅｎｅｓ，ＤＥＧｓ）をプロファイリングする段階；２）前記ＤＥＧｓを用いて標的予測データベースを通じてｍｉＲ－１３２－３ｐ、ｍｉＲ－３７０－３ｐ、ｍｉＲ－１３０ｂ－５ｐ及びｍｉＲ－４１０－３ｐに対するｉｎ ｓｉｌｉｃｏ標的プロファイリングする段階；３）二個以上のデータベースにおいてラットとヒトで共通して予測したＤＥＧを各ｍｉＲＮＡの標的遺伝子として選択する段階；及び４）前記選択された標的遺伝子が損傷動脈において下方制御されたことを確認する段階を含む。
前記スクリーニング方法は、具体的には、１）損傷動脈において損傷後３日及び５日に差異的に発現した遺伝子（Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ Ｇｅｎｅｓ，ＤＥＧｓ）をプロファイリングする段階；２）前記ＤＥＧｓを用いて標的予測データベースを通じてｍｉＲ－１３２－３ｐ、ｍｉＲ－３７０－３ｐ、ｍｉＲ－１３０ｂ－５ｐ及びｍｉＲ－４１０－３ｐに対するｉｎ ｓｉｌｉｃｏ標的プロファイリングする段階；３）二個以上のデータベースにおいてラットとヒトで共通して予測したＤＥＧを各ｍｉＲＮＡの標的遺伝子として選択する段階；及び４）前記選択された標的遺伝子が損傷動脈において下方制御されたことを確認する段階を含む。
【0058】
前記１）段階のプロファイリングは、遺伝子発現プロファイリングを意味し、二個以上のサンプル間の種々の遺伝子の発現水準を同時に比較することができる。遺伝子発現を分析するにおいて、ノーザン・ブロッティング（ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ）、マイクロアレイ（ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ）分析、ＲＮＡシーケンシングなどを利用することができ、本発明では、ＲＮＡシーケンシングを通じて全体遺伝子発現変化を確認したが、これに制限されるものではない。
【0059】
前記２）段階の標的予測データベースは、ｍｉＲＮＡの標的遺伝子を予測するためのものであり、ｍｉＲＮＡの機能は、大概ｍｉＲＮＡが調節する遺伝子を通じて分かり、ｍｉＲＮＡは、２０１８年１０月を基準にｈｕｍａｎ ｍｉＲＮＡ ３８，５８９個（ｍａｔｕｒｅ ｍｉＲＮＡ）がデータベース化している（ｍｉＲＢａｓｅ ｄａｔａｂａｓｅ，ｖｅｒｓｉｏｎ ２２．１）。標的遺伝子の３’ＵＴＲとｍｉＲＮＡのｓｅｅｄをａｌｉｇｎｍｅｎｔして予測することができ、構造的な特徴を付け加えたり、進化的に保存された結合部位などを追加することにより予測正確度を高めている。このような予測結果を提供するプログラムとしては、ＤＩＡＮＡ－ｍｉｃｒｏＴ、ＭｉｃｒｏＩｎｓｐｅｃｔｏｒ、ＭｉＲａｎｄａ、ＰｉｃＴａｒ、ＲＮＡ２２、ＲＮＡｈｙｂｒｉｄ、ＴａｒｇｅｔＢｏｏｓｔ、ＴａｒｇｅｔＳｃａｎ、ｍｉＲＤＢ、ｍｉＲｍａｐなどがある。本発明では、ＴａｒｇｅｔＳｃａｎ、ｍｉＲＤＢ及びｍｉＲｍａｐを使用したが、これに制限されるものではない。
【0060】
前記３）段階の標的遺伝子は、具体的には、ｍｉＲＮＡがｍＲＮＡと相補的な結合を通じて細胞内発現を調節できる遺伝子を意味し、一つのｍｉＲＮＡの標的遺伝子は、数多く存在する。
【0061】
前記４）段階のスクリーニングは、遺伝子スクリーニングを意味し、ライブラリー内に存在する標的遺伝子を選び出すことを意味する。スクリーニング方法には、ハイブリダイゼーションを利用したスクリーニング、抗体を利用したスクリーニング、遺伝子発現の差異を利用したスクリーニング、特定のタンパク質との結合を利用したスクリーニングなどが存在し、本発明では、遺伝子発現の差異を利用したスクリーニングを利用したが、これに制限されるものではない。
【実施例】
【0062】
以下、実施例を通じて本発明をより詳細に説明する。これら実施例は、本発明をより具体的に説明するためのものであり、本発明の範囲がこれら実施例により限定されるものではない。
【0063】
実験例１．頸動脈バルーン損傷モデルの製作
基礎飼育後、１週間環境に適応させた生後１０週齢の雄性アルビノラット（Ｓｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙ ｒａｔｓ）を用いて頸動脈バルーン損傷モデルを製作した。
基礎飼育後、１週間環境に適応させた生後１０週齢の雄性アルビノラット（Ｓｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙ ｒａｔｓ）を用いて頸動脈バルーン損傷モデルを製作した。
【0064】
具体的には、ラット左総頸動脈にフォガティバルーン塞栓除去カテーテル（Ｆｏｇａｒｔｙ ｂａｌｌｏｏｎ ｅｍｂｏｌｅｃｔｏｍｙ ｃａｔｈｅｔｅｒ）を用いてバルーン損傷を生成した。左外頸動脈を露出させて周辺動脈枝は電気凝固した後、外頸動脈の横切開を通じてカテーテルを挿入し、切断部位から１ｃｍ内側に位置させて膨張させた後、総頸動脈に沿って前後に動かして頸動脈を損傷させた。ｍｉＲＮＡ抑制剤のカテーテル媒介動脈内伝達のために、トランスフェクション複合体（２００ｎＭ ｍｉＲＮＡ／１０μｌ Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ ＲＮＡｉｍａｘ ｉｎ ２００μｌ Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ）を損傷した頸動脈内腔に注入して１５分間培養した。カテーテルを除去する前に内腔を食塩水で一回洗浄し、カテーテルを除去した後には穿孔された部位を封印し、総頸動脈のｃｌａｐを解いて血流を再確立した。特に明示が無い限り、ラットはその後最大１４日間ケージで回復した。
【0065】
実験例２．組織病理学的分析
バルーン損傷ラットを麻酔させ、３．７％ホルムアルデヒドを含有したヘパリン化食塩水で経心潅流（ｔｒａｎｓｃａｒｄｉａｃ ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ－ｆｉｘａｔｉｏｎ）固定後、総頸動脈を切除した。血管をパラフィン包埋し、回転式ミクロトーム（Ｌｅｉｃａ ＲＭ２２５５）で切断した。総頸動脈の中間部位から２個の連続組織切片（厚さ４μｍ）を得、ｈａｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ ＆ ｅｏｓｉｎで染色した。内腔、内部弾性層及び外部弾性層領域は、ＮＩＨ Ｉｍａｇｅ ｖ １．６２を用いて測定した。内膜及び内側領域はそれぞれ内部弾性領域から内腔領域を除き、外部弾性領域から内部弾性領域を除くことにより決定した。分析のために、ラット当たり２個の連続切片から得た値の平均を求めた。
バルーン損傷ラットを麻酔させ、３．７％ホルムアルデヒドを含有したヘパリン化食塩水で経心潅流（ｔｒａｎｓｃａｒｄｉａｃ ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ－ｆｉｘａｔｉｏｎ）固定後、総頸動脈を切除した。血管をパラフィン包埋し、回転式ミクロトーム（Ｌｅｉｃａ ＲＭ２２５５）で切断した。総頸動脈の中間部位から２個の連続組織切片（厚さ４μｍ）を得、ｈａｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ ＆ ｅｏｓｉｎで染色した。内腔、内部弾性層及び外部弾性層領域は、ＮＩＨ Ｉｍａｇｅ ｖ １．６２を用いて測定した。内膜及び内側領域はそれぞれ内部弾性領域から内腔領域を除き、外部弾性領域から内部弾性領域を除くことにより決定した。分析のために、ラット当たり２個の連続切片から得た値の平均を求めた。
【0066】
実験例３．ＲＮＡシーケンシング
ｓｍａｌｌ ＲＮＡ及びｍＲＮＡシーケンシングを行うために、メーカーのプロトコルによりＱＩＡｚｏｌ Ｌｙｓｉｓ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてラットの頸動脈組織から全体ＲＮＡを分離した。シャム対照群（ｓｈａｍ ｃｏｎｔｒｏｌ）の場合、全ＲＮＡの量を増加させるために、３個の頸動脈組織をプールした。全ＲＮＡ抽出物の純度と完全性は、それぞれＮａｎｏＤｒｏｐ ８０００分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）及びＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で測定し、ＲＩＮ値が８より大きいサンプルをシーケンスプロセスに用いた。
ｓｍａｌｌ ＲＮＡ及びｍＲＮＡシーケンシングを行うために、メーカーのプロトコルによりＱＩＡｚｏｌ Ｌｙｓｉｓ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてラットの頸動脈組織から全体ＲＮＡを分離した。シャム対照群（ｓｈａｍ ｃｏｎｔｒｏｌ）の場合、全ＲＮＡの量を増加させるために、３個の頸動脈組織をプールした。全ＲＮＡ抽出物の純度と完全性は、それぞれＮａｎｏＤｒｏｐ ８０００分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）及びＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で測定し、ＲＩＮ値が８より大きいサンプルをシーケンスプロセスに用いた。
【0067】
まず、ｓｍａｌｌ ＲＮＡシーケンシングのために、ＴｒｕＳｅｑ Ｓｍａｌｌ ＲＮＡ Ｐｒｅｐキット（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社）を用いてｓｍａｌｌ ＲＮＡライブラリーを準備した。簡単には、１μｇの全ＲＮＡは３’及び５’ ＲＮＡアダプターでライゲーションした。逆転写ＰＣＲはｃＤＮＡコンストラクトを生成し、強化（ｅｎｒｉｃｈｉｎｇ）するために３’及び５’アダプターにアニーリングするプライマーを用いて行った。ｃＤＮＡライブラリーは、Ｐｉｐｐｉｎ ｐｒｅｐ電気泳動プラットフォーム（Ｓａｇｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ）で精製し、ライブラリーの品質は、２１００ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で検証した。ｓｍａｌｌ ＲＮＡシーケンシングは、１Ｘ５１の設定でＨｉｓｅｑ ２５００システム（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を用いて行った。
【0068】
次に、ｍＲＮＡシーケンシングのために、ＴｒｕＳｅｑ ＲＮＡ Ｐｒｅｐキットｖ２（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社）を用いてｍＲＮＡシーケンシングライブラリーを準備した。簡単には、ｍＲＮＡサンプルはｐｏｌｙ－Ｔ ｏｌｉｇｏ－ａｔｔａｃｈｅｄ ｍａｇｎｅｔｉｃ ｂｅａｄを用いて１μｇの全ＲＮＡから精製し、断片化したｍＲＮＡはランダムヘキサマーでプライミングし、逆転写した。ｍＲＮＡ鋳型を除去し、第二鎖ｃＤＮＡを合成した。３’ Ａ－テーリング及び５’末端リペアリングの後、ＤＮＡシーケンシングアダプターをｃＤＮＡテンプレートにライゲーションした。その後、テンプレートを増幅するためにＰＣＲを行った。ライブラリーの品質は、２１００ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で検証し、ｍＲＮＡシーケンシングは、２Ｘ１０１設定でＨｉｓｅｑ ２５００システム（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を用いて行った。
【0069】
実験例４．細胞培養
一次ヒト血管平滑筋細胞（ｈｕｍａｎ ａｏｒｔｉｃ ＳＭＣ，ＨＡＳＭＣ）は、Ｌｏｎｚａ社から購入し、成長因子及び抗生剤（ｃａｔ．Ｎｏ．ｃｃ－４１４９，Ｌｏｎｚａ）が含まれた５％ウシ胎児血清を含む平滑筋細胞成長培地（ＳｍＧＭ）で継代培養して増殖させた。ヒト血管平滑筋細胞は、主に、継代数５～７の実験に用いた。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、１０％ウシ胎児血清及び１％ペニシリン／ストレプトマイシンを含有するＤＭＥＭで培養し、すべての培養は３７℃で５％ＣＯ２を含む加湿インキュベーターで維持させた。
一次ヒト血管平滑筋細胞（ｈｕｍａｎ ａｏｒｔｉｃ ＳＭＣ，ＨＡＳＭＣ）は、Ｌｏｎｚａ社から購入し、成長因子及び抗生剤（ｃａｔ．Ｎｏ．ｃｃ－４１４９，Ｌｏｎｚａ）が含まれた５％ウシ胎児血清を含む平滑筋細胞成長培地（ＳｍＧＭ）で継代培養して増殖させた。ヒト血管平滑筋細胞は、主に、継代数５～７の実験に用いた。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、１０％ウシ胎児血清及び１％ペニシリン／ストレプトマイシンを含有するＤＭＥＭで培養し、すべての培養は３７℃で５％ＣＯ２を含む加湿インキュベーターで維持させた。
【0070】
ｍｉｒＶａｎａ ｍｉＲＮＡ模倣体または抑制剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＵＳＡ）及びｓｉＲＮＡ（Ｂｉｏｎｅｅｒ，Ｋｏｒｅａ）は、リポフェクタミンＲＮＡｉｍａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を使用してトランスフェクションさせた。
【0071】
細胞を６ウェルプレートに１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの密度で分注した。２４時間後、ｍｉＲＮＡ模倣体（それぞれ０．１ ｎＭ）、ｍｉＲＮＡ抑制剤（それぞれ１０～１５０ｎＭ）またはｓｉＲＮＡ（それぞれ１００ｎＭ）を含むトランスフェクション複合体を培養プレートに添加した後、トランスフェクション２４時間後に新たな培養培地で交換した。
【0072】
実験例５：リアルタイム定量ＰＣＲ（Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ）
全ＲＮＡは、メーカーのプロトコルによりＱＩＡｚｏｌ Ｌｙｓｉｓ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して培養されたヒト血管平滑筋細胞及びラットの頸動脈組織から分離した。ＭｉＲＮＡの検証のために、ＴａｑＭａｎ ＭｉｃｒｏＲＮＡ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ＫｉｔとＴａｑＭａｎ ＭｉｃｒｏＲＮＡ Ａｓｓａｙｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）の特定のＲＴプライマーを使用して分離した全ＲＮＡ４０ｎｇで個別ｃＤＮＡｓを合成した。成熟したｍｉＲＮＡの発現水準は、メーカーのプロトコルによりＴａｑＭａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ ＩＩとＴａｑＭａｎ ＭｉｃｒｏＲＮＡ Ａｓｓａｙｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）の特定のＦＡＭ基盤のプローブ及びプライマーを使用して定量的リアルタイムＰＣＲを通じて定量化した。
全ＲＮＡは、メーカーのプロトコルによりＱＩＡｚｏｌ Ｌｙｓｉｓ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して培養されたヒト血管平滑筋細胞及びラットの頸動脈組織から分離した。ＭｉＲＮＡの検証のために、ＴａｑＭａｎ ＭｉｃｒｏＲＮＡ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ＫｉｔとＴａｑＭａｎ ＭｉｃｒｏＲＮＡ Ａｓｓａｙｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）の特定のＲＴプライマーを使用して分離した全ＲＮＡ４０ｎｇで個別ｃＤＮＡｓを合成した。成熟したｍｉＲＮＡの発現水準は、メーカーのプロトコルによりＴａｑＭａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ ＩＩとＴａｑＭａｎ ＭｉｃｒｏＲＮＡ Ａｓｓａｙｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）の特定のＦＡＭ基盤のプローブ及びプライマーを使用して定量的リアルタイムＰＣＲを通じて定量化した。
【0073】
ｍｉＲＮＡの熱サイクリング条件は、次の通りである。９５℃で１０分間初期酵素活性化させた後、９５℃で１５秒変性、６０℃で６０秒アニーリング及び伸長を４０回繰り返して増幅させた。
【0074】
Ｕ８７、ｓｎｏＲＮＡ及びＵ６は、ラットの頸動脈に対する内部対照群として使用し、Ｕ６はヒト血管平滑筋細胞に対する内部対照群として使用した。
ｍＲＮＡの検証のために、ＩｍＰｒｏｍ－ＩＩ ＲＴ ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を使用して分離した全ＲＮＡ１μｇで逆転写を行った。定量的リアルタイムＰＣＲは、遺伝子特異的プライマー（全部Ｑｉａｇｅｎ社）及びＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ（Ｒｏｃｈｅ社）を使用して行った。
ｍＲＮＡの検証のために、ＩｍＰｒｏｍ－ＩＩ ＲＴ ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を使用して分離した全ＲＮＡ１μｇで逆転写を行った。定量的リアルタイムＰＣＲは、遺伝子特異的プライマー（全部Ｑｉａｇｅｎ社）及びＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ（Ｒｏｃｈｅ社）を使用して行った。
【0075】
ｍＲＮＡの熱サイクリング条件は、次の通りである。９５℃で１５分間初期変性の後、９４℃で１５秒変性、５５℃で３０秒アニーリング及び７２℃で３０秒伸長を４０回繰り返して増幅させた。
【0076】
溶融曲線分析は、ＰＣＲ終了時に行い、β－アクチンまたは１８Ｓ ＲＮＡをハウスキーピング遺伝子として使用した。ＣＦＸ ＣｏｎｎｅｃｔリアルタイムＰＣＲ検出システム（Ｂｉｏ－Ｒａｄ社）を使用して成熟したｍｉＲＮＡ及び転写体の水準を検出した。相対的遺伝子発現は、ΔΔＣｔ値で決定した。
【0077】
実験例６：免疫ブロット分析
ヒト血管平滑筋細胞を冷たいリン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄し、液体窒素で速かに凍結させた。前記細胞は、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ ７．０）、１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００，１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０％グリセロール、１ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ ８．０）、２ｍＭ ＥＧＴＡ（ｐＨ ８．０）、１ｍＭ ＤＴＴ、５ｍＭ Ｎａ３ＶＯ４、５ｍＭ ＮａＦ、１ｍＭ ＡＥＢＳＦ、５μｇ／ｍｌ ａｐｒｏｔｉｎｉｎ、及び５μｇ／ｍｌ ｌｅｕｐｅｐｔｉｎを含む溶解緩衝液で溶解させた。１２，０００×ｇで１０分間遠心分離した後、精製された溶解物を変性ポリアクリルアミドゲルで３０μｇずつ分離し、ニトロセルロースメンブレンに移した。前記メンブレンは、４℃で０．０５％ Ｔｗｅｅｎ（登録商標）－２０及び５％ ＢＳＡを含むＴｒｉｓ緩衝食塩水（ＴＢＳ）溶液で１次抗体と共に一晩中インキュベーションした。次に、前記メンブレンを０．０５％ Ｔｗｅｅｎ（登録商標）－２０及び５％脱脂乳を含有するＴＢＳ溶液で１：３０００で希釈したＨＲＰ接合二次抗体と共に１時間インキュベーションした。免疫反応性バンドは、ＷＥＳＴＳＡＶＥ ｕｐ ＥＣＬソリューション（ｃａｔ．Ｎｏ．ＬＦ－ＱＣ０１０１，Ａｂｆｒｏｎｔｉｅｒ，Ｋｏｒｅａ）を使用して視角化した。
ヒト血管平滑筋細胞を冷たいリン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄し、液体窒素で速かに凍結させた。前記細胞は、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ ７．０）、１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００，１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０％グリセロール、１ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ ８．０）、２ｍＭ ＥＧＴＡ（ｐＨ ８．０）、１ｍＭ ＤＴＴ、５ｍＭ Ｎａ３ＶＯ４、５ｍＭ ＮａＦ、１ｍＭ ＡＥＢＳＦ、５μｇ／ｍｌ ａｐｒｏｔｉｎｉｎ、及び５μｇ／ｍｌ ｌｅｕｐｅｐｔｉｎを含む溶解緩衝液で溶解させた。１２，０００×ｇで１０分間遠心分離した後、精製された溶解物を変性ポリアクリルアミドゲルで３０μｇずつ分離し、ニトロセルロースメンブレンに移した。前記メンブレンは、４℃で０．０５％ Ｔｗｅｅｎ（登録商標）－２０及び５％ ＢＳＡを含むＴｒｉｓ緩衝食塩水（ＴＢＳ）溶液で１次抗体と共に一晩中インキュベーションした。次に、前記メンブレンを０．０５％ Ｔｗｅｅｎ（登録商標）－２０及び５％脱脂乳を含有するＴＢＳ溶液で１：３０００で希釈したＨＲＰ接合二次抗体と共に１時間インキュベーションした。免疫反応性バンドは、ＷＥＳＴＳＡＶＥ ｕｐ ＥＣＬソリューション（ｃａｔ．Ｎｏ．ＬＦ－ＱＣ０１０１，Ａｂｆｒｏｎｔｉｅｒ，Ｋｏｒｅａ）を使用して視角化した。
【0078】
実験例７：細胞増殖及び細胞周期の分析
細胞増殖の分析のために、ｍｉＲＮＡ抑制剤－トランスフェクションされたヒト血管平滑筋細胞（ｍｉＲＮＡ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ－ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ ＨＡＳＭＣ）を９６ｗｅｌｌプレートに２，０００ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの密度で播種し、表示された時間成長させた後、ＷＳＴ－１試薬（１０μｌ／ｗｅｌｌ）と共に３７℃で１時間培養した。生存細胞数は、４５０ｎｍで吸光度を測定して推定した。
細胞増殖の分析のために、ｍｉＲＮＡ抑制剤－トランスフェクションされたヒト血管平滑筋細胞（ｍｉＲＮＡ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ－ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ ＨＡＳＭＣ）を９６ｗｅｌｌプレートに２，０００ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの密度で播種し、表示された時間成長させた後、ＷＳＴ－１試薬（１０μｌ／ｗｅｌｌ）と共に３７℃で１時間培養した。生存細胞数は、４５０ｎｍで吸光度を測定して推定した。
【0079】
細胞周期の分析のために、ヒト血管平滑筋細胞（１×１０５細胞）を４８時間トランスフェクション後に回収した。前記細胞を固定させ、－２０℃で一晩中７０％エタノール透過処理し、３７℃で１時間１００μｇ／ｍｌ ＲＮａｓｅ Ａで処理した後、１０μｇ／ｍｌ ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ ｉｏｄｉｄｅで染色した。細胞内ＤＮＡ含量は、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒシステム（ＢＤ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）で測定し、Ｇ０／Ｇ１二倍体細胞の百分率はＭｏｄｆｉｔ ＬＴソフトウェア（Ｖｅｒｉｔｙ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｈｏｕｓｅ社）を使用して分析した。
【0080】
実験例８：免疫蛍光染色
組織染色は、バルーン損傷頸動脈のパラフィン切片をキシレンを用いて脱パラフィン化し、エタノールで再水和した。前記再水和された組織切片は、抗原復旧（ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｔｒｉｅｖａｌ）のために、クエン酸基盤抗原ｕｎｍａｓｋｉｎｇソリューション（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で２０分間ボイリングした。二重免疫蛍光法の場合、前記組織切片を５％正常ロバ血清が含まれたＰＢＳ－Ｔ（０．３％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００ ｉｎ ＰＢＳ）で１時間ブロッキングした。その後、前記サンプルを４℃で一晩中ＦＩＴＣ－接合された抗ｖＷＦ抗体（１：５０希釈、Ａｂｃａｍ）と共にインキュベーションした。ＰＢＳ－Ｔで三回洗浄した後、サンプルをＣｙ３接合された抗ＳＭＡ抗体（１：２００希釈、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）と共に暗い室温で２時間インキュベーションした。
組織染色は、バルーン損傷頸動脈のパラフィン切片をキシレンを用いて脱パラフィン化し、エタノールで再水和した。前記再水和された組織切片は、抗原復旧（ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｔｒｉｅｖａｌ）のために、クエン酸基盤抗原ｕｎｍａｓｋｉｎｇソリューション（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で２０分間ボイリングした。二重免疫蛍光法の場合、前記組織切片を５％正常ロバ血清が含まれたＰＢＳ－Ｔ（０．３％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００ ｉｎ ＰＢＳ）で１時間ブロッキングした。その後、前記サンプルを４℃で一晩中ＦＩＴＣ－接合された抗ｖＷＦ抗体（１：５０希釈、Ａｂｃａｍ）と共にインキュベーションした。ＰＢＳ－Ｔで三回洗浄した後、サンプルをＣｙ３接合された抗ＳＭＡ抗体（１：２００希釈、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）と共に暗い室温で２時間インキュベーションした。
【0081】
Ｆ－アクチン染色は、ヒト血管平滑筋細胞を１５分間３．７％ホルムアルデヒドで固定し、室温で１５分間ＰＢＳ－Ｔで透過させた。前記細胞は、室温で６０分間Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８接合ｐｈａｌｌｏｉｄｉｎ（ｃａｔ． ｎｏ Ａ１２３７９，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でラベリングした。
【0082】
ＴＵＮＥＬ分析は、前記固定された細胞を４℃で２分間透過性溶液（０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００，０．１％クエン酸ナトリウム）と共にインキュベーションし、Ｉｎ Ｓｉｔｕ Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）のＴＵＮＥＬ反応混合物と共に３７℃で６０分間インキュベーションした。
【0083】
Ｎｕｃｌｅａｒ ＤＮＡはＤＡＰＩでラベリングし、蛍光イメージはＬＳＭ８８０ Ａｉｒｙｓｃａｎ共焦点顕微鏡（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ）を使用して得た。
実験例９：トランズウェル移動分析（Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ ｍｉｇｒａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ）
化学走性細胞移動（ｃｈｅｍｏｔａｃｔｉｃ ｃｅｌｌ ｍｉｇｒａｔｉｏｎ）は、２４ｗｅｌｌトランズウェル培養チャンバー（Ｃｏｓｔａｒ；８ｍＭ気孔サイズ）を使用して測定した。上部チャンバーは、ゼラチンＢ（１ｍｇ／ｍｌ）でコーティングし、１時間エアドライした。ヒト血管平滑筋細胞を２４時間ｍｉＲＮＡ抑制剤でトランスフェクションさせ、１８時間血清欠乏させた後、基底培地を用いて６，０００ｃｅｌｌ／チャンバーの密度で上部チャンバーに再びプレーティングした。完全培地を下部チャンバーに添加し、トランズウェルチャンバーを３７℃で２４時間インキュベーションした。メンブレン上側から移動していない細胞を除去し、通過して膜の下方に付着した細胞を固定し、０．６％ ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎと０．５％ ｅｏｓｉｎで染色した。４個の部分で染色された細胞の数を数えて平均を出した。
実験例９：トランズウェル移動分析（Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ ｍｉｇｒａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ）
化学走性細胞移動（ｃｈｅｍｏｔａｃｔｉｃ ｃｅｌｌ ｍｉｇｒａｔｉｏｎ）は、２４ｗｅｌｌトランズウェル培養チャンバー（Ｃｏｓｔａｒ；８ｍＭ気孔サイズ）を使用して測定した。上部チャンバーは、ゼラチンＢ（１ｍｇ／ｍｌ）でコーティングし、１時間エアドライした。ヒト血管平滑筋細胞を２４時間ｍｉＲＮＡ抑制剤でトランスフェクションさせ、１８時間血清欠乏させた後、基底培地を用いて６，０００ｃｅｌｌ／チャンバーの密度で上部チャンバーに再びプレーティングした。完全培地を下部チャンバーに添加し、トランズウェルチャンバーを３７℃で２４時間インキュベーションした。メンブレン上側から移動していない細胞を除去し、通過して膜の下方に付着した細胞を固定し、０．６％ ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎと０．５％ ｅｏｓｉｎで染色した。４個の部分で染色された細胞の数を数えて平均を出した。
【0084】
実験例１０：単球付着分析（Ｍｏｎｏｃｙｔｅ ａｄｈｅｓｉｏｎ ａｓｓａｙ）
ヒト血管平滑筋細胞を２４時間ｍｉＲＮＡ抑制剤でトランスフェクションさせ、９６ｗｅｌｌプレート（４，０００ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌ）に再びプレーティングした。その後、ヒト血管平滑筋細胞を１８時間ＴＮＦ－α（１０ｎｇ／ｍｌ）で刺激した。別途に、単球Ｕ９３７細胞（１×１０６ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌ）を２４時間ＩＦＮ－γ（５０μｇ／ｍｌ）で刺激した。活性化したＵ９３７細胞を４μＭ ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｒｈｏｄａｍｉｎｅ ｅｔｈｙｌ ｅｓｔｅｒ，ｐｅｒｃｈｌｏｒａｔｅ（ｃａｔ．Ｎｏ．Ｔ－６６９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）で３０分間ラベリングし、ラベリングされたＵ９３７細胞（１×１０５ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌ）をｃｏｎｆｌｕｅｎｔヒト血管平滑筋細胞に添加し、３７℃で１時間インキュベーションした。結合されていないＵ９３７細胞をＰＢＳで三回洗浄してスムーズに除去し、付着したＵ９３７細胞はＺＯＥ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｉｍａｇｅｒ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を用いて検出してカウントした。
ヒト血管平滑筋細胞を２４時間ｍｉＲＮＡ抑制剤でトランスフェクションさせ、９６ｗｅｌｌプレート（４，０００ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌ）に再びプレーティングした。その後、ヒト血管平滑筋細胞を１８時間ＴＮＦ－α（１０ｎｇ／ｍｌ）で刺激した。別途に、単球Ｕ９３７細胞（１×１０６ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌ）を２４時間ＩＦＮ－γ（５０μｇ／ｍｌ）で刺激した。活性化したＵ９３７細胞を４μＭ ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｒｈｏｄａｍｉｎｅ ｅｔｈｙｌ ｅｓｔｅｒ，ｐｅｒｃｈｌｏｒａｔｅ（ｃａｔ．Ｎｏ．Ｔ－６６９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）で３０分間ラベリングし、ラベリングされたＵ９３７細胞（１×１０５ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌ）をｃｏｎｆｌｕｅｎｔヒト血管平滑筋細胞に添加し、３７℃で１時間インキュベーションした。結合されていないＵ９３７細胞をＰＢＳで三回洗浄してスムーズに除去し、付着したＵ９３７細胞はＺＯＥ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｉｍａｇｅｒ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を用いて検出してカウントした。
【0085】
実験例１１：ルシフェラーゼレポーター分析
ｍｉＲ－３７０－３ｐの標的遺伝子の予測のために、ヒトＢＭＰ７遺伝子（ｈＢＭＰ７－３’ＵＴＲ）の全長３’ＵＴＲ配列を含むレポータープラスミドｐＭｉｒＴａｒｇｅｔをＯｒｉｇｅｎｅ社（ｃａｔ．Ｎｏ．ＳＣ２１８１１８）から購入した。ｈＢＭＰ７－３’ＵＴＲのｍｉＲ－３７０－３ｐ標的領域＃１（ヌクレオチド２２９－２３５）内の２個の連続ヌクレオチドを突然変異させて陰性対照群とした。レポーターの分析のために、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を２４ｗｅｌｌプレートにプレーティングし、レポータープラスミドで６時間トランスフェクションさせた。その後、前記細胞を４８時間ｍｉＲ－３７０－３ｐ模倣体でトランスフェクションさせ、溶解させてタンパク質分析した。同一の量の細胞溶解物をルシフェラーゼ分析に適用した。発光信号（ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ｓｉｇｎａｌ）はＶＩＣＴＯＲ Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ Ｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）で測定した。
ｍｉＲ－３７０－３ｐの標的遺伝子の予測のために、ヒトＢＭＰ７遺伝子（ｈＢＭＰ７－３’ＵＴＲ）の全長３’ＵＴＲ配列を含むレポータープラスミドｐＭｉｒＴａｒｇｅｔをＯｒｉｇｅｎｅ社（ｃａｔ．Ｎｏ．ＳＣ２１８１１８）から購入した。ｈＢＭＰ７－３’ＵＴＲのｍｉＲ－３７０－３ｐ標的領域＃１（ヌクレオチド２２９－２３５）内の２個の連続ヌクレオチドを突然変異させて陰性対照群とした。レポーターの分析のために、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を２４ｗｅｌｌプレートにプレーティングし、レポータープラスミドで６時間トランスフェクションさせた。その後、前記細胞を４８時間ｍｉＲ－３７０－３ｐ模倣体でトランスフェクションさせ、溶解させてタンパク質分析した。同一の量の細胞溶解物をルシフェラーゼ分析に適用した。発光信号（ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ｓｉｇｎａｌ）はＶＩＣＴＯＲ Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ Ｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）で測定した。
【0086】
実験例１２：Ｉｎ ｓｉｔｕ ハイブリダイゼーション（Ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）
動脈組織内におけるｍｉＲ－３７０－３ｐ発現は、メーカーのプロトコルによりｍｉＲＣＵＲＹ ＬＮＡ ｍｉＲＮＡ ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（ＩＳＨ） Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ Ｋｉｔｓ（Ｑｉａｇｅｎ社）で検出した。５’及び３’ ＤＩＧ－ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｈａｓ－ｍｉＲ－３７０－３ｐ ｍｉＲＣＵＲＹ ＬＮＡ ｍｉＲＮＡ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｐｒｏｂｅはハイブリダイゼーションに使用した。簡単には、固定された動脈組織の４μｍパラフィン切片を脱パラフィン化し、再水和した。ヌクレアーゼは３７℃で１０分間ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋで非活性化し、ハイブリダイゼーションはｍｉＲＮＡ検出プローブ（それぞれ４０ｎＭ）と共にプローブのＲＮＡ Ｔｍ値より３０℃低い温度で１時間インキュベーションして行った。スライドは、各アニーリング温度でｓａｌｉｎｅ－ｓｏｄｉｕｍ ｃｉｔｒａｔｅ（ＳＳＣ）ハイブリダイゼーション緩衝液の連続希釈液で洗浄し、免疫検出は、ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ａｎｔｉ－ＤＩＧ ａｎｔｉｂｏｄｙ（ｃａｔ．Ｎｏ．１１０９３２７４９１０，Ｒｏｃｈｅ）を６０分間室温でインキュベーションして行った。前記スライドを３７℃で２時間０．２ ｎＭ Ｌｅｖａｍｉｓｏｌを含むＮＢＴ／ＢＣＩＰ（ｃａｔ．Ｎｏ．１１６９７４７１００１，Ｒｏｃｈｅ）基質溶液と共にインキュベーションして発色させた。また、ｓｃｒａｍｂｌｅプローブを連続組織切片にアニーリングしたものをコントロールとして用い、細胞核はＮｕｃｌｅａｒ Ｆａｓｔ Ｒｅｄでラベリングした。
動脈組織内におけるｍｉＲ－３７０－３ｐ発現は、メーカーのプロトコルによりｍｉＲＣＵＲＹ ＬＮＡ ｍｉＲＮＡ ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（ＩＳＨ） Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ Ｋｉｔｓ（Ｑｉａｇｅｎ社）で検出した。５’及び３’ ＤＩＧ－ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｈａｓ－ｍｉＲ－３７０－３ｐ ｍｉＲＣＵＲＹ ＬＮＡ ｍｉＲＮＡ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｐｒｏｂｅはハイブリダイゼーションに使用した。簡単には、固定された動脈組織の４μｍパラフィン切片を脱パラフィン化し、再水和した。ヌクレアーゼは３７℃で１０分間ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋで非活性化し、ハイブリダイゼーションはｍｉＲＮＡ検出プローブ（それぞれ４０ｎＭ）と共にプローブのＲＮＡ Ｔｍ値より３０℃低い温度で１時間インキュベーションして行った。スライドは、各アニーリング温度でｓａｌｉｎｅ－ｓｏｄｉｕｍ ｃｉｔｒａｔｅ（ＳＳＣ）ハイブリダイゼーション緩衝液の連続希釈液で洗浄し、免疫検出は、ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ａｎｔｉ－ＤＩＧ ａｎｔｉｂｏｄｙ（ｃａｔ．Ｎｏ．１１０９３２７４９１０，Ｒｏｃｈｅ）を６０分間室温でインキュベーションして行った。前記スライドを３７℃で２時間０．２ ｎＭ Ｌｅｖａｍｉｓｏｌを含むＮＢＴ／ＢＣＩＰ（ｃａｔ．Ｎｏ．１１６９７４７１００１，Ｒｏｃｈｅ）基質溶液と共にインキュベーションして発色させた。また、ｓｃｒａｍｂｌｅプローブを連続組織切片にアニーリングしたものをコントロールとして用い、細胞核はＮｕｃｌｅａｒ Ｆａｓｔ Ｒｅｄでラベリングした。
【0087】
実験例１３：統計分析
特に明示しない限り、データは、二グループ間のＳｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ－ｔｅｓｔ及び種々のグループに対するＴｕｒｋｅｙ’ｓ ｔｅｓｔを用いてｏｎｅ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡで分析した。Ｐ＜０．０５を統計的に有意であると見なした。
特に明示しない限り、データは、二グループ間のＳｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ－ｔｅｓｔ及び種々のグループに対するＴｕｒｋｅｙ’ｓ ｔｅｓｔを用いてｏｎｅ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡで分析した。Ｐ＜０．０５を統計的に有意であると見なした。
【0088】
実施例１：損傷動脈において差異発現するｍｉＲＮＡの確認
以前の研究で調査されたラット頸動脈バルーン損傷モデルから損傷時間による新生内膜肥厚の組織学的分析を基盤に、バルーン損傷後３日目及び５日目の二つの時点を選択し、平滑筋細胞逆分化及び増殖の開始を指示するｍｉＲＮＡを確認した。
以前の研究で調査されたラット頸動脈バルーン損傷モデルから損傷時間による新生内膜肥厚の組織学的分析を基盤に、バルーン損傷後３日目及び５日目の二つの時点を選択し、平滑筋細胞逆分化及び増殖の開始を指示するｍｉＲＮＡを確認した。
【0089】
具体的には、全体ＲＮＡサンプルを準備し、適切な精製手続きを通じてｓｍａｌｌ ＲＮＡｓとメッセンジャーＲＮＡｓに分離して精製した。両ＲＮＡプール（ｐｏｏｌｓ）は、ライブラリー構成及びＨｉＳｅｑ基盤シーケンシングし、ｓｍａｌｌ ＲＮＡシーケンシングデータは、先にＲＳＥＭソフトウェアで分析した。
【0090】
その結果、図１に示されるように、６２個のｍｉＲＮＡがシャム対照群（ｓｈａｍ ｃｏｎｔｒｏｌ）と比較して二つの時点で差異的に発現した（図１Ａ）。血管系との関連性だけでなく、新規性の側面で前記ｍｉＲＮＡを一つずつ検査し、ｍｉＲＮＡ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲによる定量的検証のために、５０個のｍｉＲＮＡを選択した。その結果、１２個の上方制御されたｍｉＲＮＡと６個の下方制御されたｍｉＲＮＡがシャム対照群と比較して損傷した動脈の５倍以上の変化が示され、ｍｉＲＮＡの１／５は損傷後３日に一時的に下方制御され、これは、早期反応（ｅａｒｌｙ－ｒｅｓｐｏｎｓｅ）ｍｉＲＮＡとしての可能性を意味する。ヒトデータベースから確認されていないか、またはラットとヒトとの間に種子配列が一致していない一部のｍｉＲＮＡは除外し、残りのｍｉＲＮＡ候補中、ｍｉＲ－２２１－３ｐ、ｍｉＲ－２１－５ｐ及びｍｉＲ－１４６ａ－５ｐのようなｍｉＲＮＡは平滑筋細胞増殖症（ｈｙｐｅｒｐｌａｓｉａ）として知られており｛Ｓｕｎ、２０１１ ＃２６２７；Ｌｉｕ、２００９ ＃２６２３；Ｊｉ、２００７ ＃２６２５｝、げっ歯類モデルを用いた選別戦略の妥当性を裏付けた。
【0091】
８個の上方制御されたｍｉＲＮＡと２個の下方制御されたｍｉＲＮＡを含む上位１０個のｍｉＲＮＡは損傷した頸動脈で５倍以上の劇的な発現変化を示した（図１Ｂ）。そのヒト関連性を調べてみるために、合成表現型を有する培養された１次ヒト血管平滑筋細胞におけるこれらの発現水準を確認した結果、ｑＰＣＲ分析を通じて８個の上方制御されたｍｉＲＮＡ中の６個がヒト平滑筋細胞で著しく発現したことを確認した（図１Ｃ）。
【0092】
このように、げっ歯類モデルを用いたｍｉＲＮＡスクリーニングを通じて新生内膜増殖に関連した一部知られた候補を含むｍｉＲＮＡの下位集合を発見した。
実施例２．試験管内平滑筋細胞機能を調節する上方制御されたｍｉＲＮＡ
平滑筋細胞生物学において上方制御されたｍｉＲＮＡの役割を決定するために、ｍｉＲＮＡ抑制剤としてトランスフェクションされたヒト血管平滑筋細胞を用いて試験管内において三類型の細胞基盤の分析を行った。
実施例２．試験管内平滑筋細胞機能を調節する上方制御されたｍｉＲＮＡ
平滑筋細胞生物学において上方制御されたｍｉＲＮＡの役割を決定するために、ｍｉＲＮＡ抑制剤としてトランスフェクションされたヒト血管平滑筋細胞を用いて試験管内において三類型の細胞基盤の分析を行った。
【0093】
平滑筋細胞増殖において、ｍｉＲ－１３２－３ｐとｍｉＲ－３７０－３ｐは、有意な抑制効果を示し（図２Ａ）、炎症の兆候としての、ヒト血管平滑筋細胞に対する単球付着は、ｍｉＲ－１３０ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－１３２－３ｐ及びｍｉＲ－４１０－３ｐの３個のｍｉＲＮＡにより顕著に抑制された。このような細胞分析を基盤に、増殖関連のｍｉＲＮＡ、即ち、ｍｉＲ－１３２－３ｐ及びｍｉＲ－３７０－３ｐに対する深層調査を行った。両ｍｉＲＮＡ抑制剤はいずれもＧ１段階で細胞周期停止を誘導してヒト血管平滑筋細胞の時間依存的増殖を持続的に抑制し（図２Ｂ及び２Ｃ）、これと一貫して、サイクリン依存性キナーゼ抑制剤であるｐ２１及びｐ２７の水準は、両ｍｉＲＮＡ抑制剤により顕著に増加した（図２Ｄ）。しかし、このようなｍｉＲＮＡ抑制は、ヒト血管平滑筋細胞で細胞アポトーシスを伴わず、これは、平滑筋細胞増殖の細胞増殖抑制を示唆する。
【0094】
損傷した動脈組織において、逆分化による収縮性状態で合成状態への平滑筋細胞の表現型転移は、増殖依存的新生内膜増殖症（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｎｅｏｉｎｔｉｍａｌ ｈｙｐｅｒｐｌａｓｉａ）に先行しなければならないことにより、ｍｉＲ－１３２－３ｐとｍｉＲ－３７０－３ｐが表現型転移に関与するかどうかを調査した。
【0095】
生体内動脈環境を模倣する最も簡単な方法として、ラミニンでコーティングされたプレートの高い合流点で培養してヒト血管平滑筋細胞の収縮性表現型を誘導した。高い合流点の平滑筋細胞が低い合流点でリプレーティング（ｒｅ－ｐｌａｔｅｄ）された時、細胞は、合成表現型に少しずつ変形された。前記実験例６の免疫ブロット分析を通じて、ｍｉＲ１３２－３ｐ抑制剤のトランスフェクションが低い合流点により消えたＳＭＡ水準を回復させることを確認した（図２Ｅ）。実際に、Ｆ－アクチンフィラメントの免疫蛍光染色は、低い合流点でヒト血管平滑筋細胞の合成表現型がｍｉＲ－１３２－３ｐ抑制剤により収縮性表現型に変形されたことを立証した（図２Ｆ）。
【0096】
したがって、ｍｉＲ－１３２－３ｐとｍｉＲ－３７０－３ｐがそれぞれ表現型転移と増殖信号を調節する可能性があることを確認した。
実施例３．生体内新生内膜増殖を調節する上方制御されたｍｉＲＮＡ
バルーン損傷モデルを通じて生体内ｍｉＲＮＡの効能を評価するために、前記実験例１２のようにＩｎ ｓｉｔｕ ハイブリダイゼーション（ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）を通じて４個の機能性ｍｉＲＮＡの動脈発現水準を調査した。
実施例３．生体内新生内膜増殖を調節する上方制御されたｍｉＲＮＡ
バルーン損傷モデルを通じて生体内ｍｉＲＮＡの効能を評価するために、前記実験例１２のようにＩｎ ｓｉｔｕ ハイブリダイゼーション（ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）を通じて４個の機能性ｍｉＲＮＡの動脈発現水準を調査した。
【0097】
その結果、染色イメージは、２個の増殖関連のｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ－１３２－３ｐ及びｍｉＲ－３７０－３ｐ）の発現がシャム対照群に比べてバルーン損傷頸動脈で顕著に増加したことを示し（図３Ａ）、他の二つの炎症関連のｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ－１３０ｂ－５ｐ及びｍｉＲ－４１０－３ｐ）もバルーン損傷により実質的に誘導された。バルーン損傷を受けたラット動脈で前記４個のｍｉＲＮＡの生体内機能を評価した。
【0098】
ｍｉＲＮＡ抑制剤のカテーテル媒介局所的壁内伝達は、対照群と比較してバルーン損傷病変で新生内膜増殖を顕著に減少させ（図３Ｂ）、ＥＣ及び平滑筋細胞マーカーとしてフォン・ヴィレブランド（ｖＷＦ）及びＳＭＡに対する頸動脈の免疫蛍光染色はｍｉＲ－１３０ｂ－５ｐ抑制剤が、いわゆる再内皮化（ｒｅ－ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｉｚａｔｉｏｎ）と呼ばれるＥＣ単層の回復を促進することを示し（図３Ｃ）、ｍｉＲ－１３０ｂ－５ｐは、平滑筋細胞とは異なり、ＥＣで抗増殖機能を行った。
【0099】
これを通じて、前記４個のｍｉＲＮＡが血管内炎症及び増殖のような動脈恒常性で著しい役割をすることを確認した。
実施例４．機能的ｍｉＲＮＡの標的遺伝子の確認
次に、実施例３で選択されたｍｉＲＮＡの生物学的結果を把握するために、ｍＲＮＡシーケンシングを行い、バルーン損傷したラットの頸動脈で差異的に発現した遺伝子（ＤＥＧｓ）をプロファイリングした。
実施例４．機能的ｍｉＲＮＡの標的遺伝子の確認
次に、実施例３で選択されたｍｉＲＮＡの生物学的結果を把握するために、ｍＲＮＡシーケンシングを行い、バルーン損傷したラットの頸動脈で差異的に発現した遺伝子（ＤＥＧｓ）をプロファイリングした。
【0100】
その結果、図４に示されるように、シャム対照群と比較して損傷後３日及び５日に３，６９９ＤＥＧｓが有意に変更されたことを確認した（図４ａ）。ヒートマップ分析は、上方制御されたＤＥＧｓと下方制御されたＤＥＧｓがそれぞれ半々であることが示された（図４ｂ）。このようなＤＥＧｓを用いて標的予測データベース（ＴａｒｇｅｔＳｃａｎ，ｍｉＲＤＢ及びｍｉＲｍａｐ）を通じて前記選択されたｍｉＲ－１３２－３ｐ／ｍｉＲ－３７０－３ｐ ａｎｄ ｍｉＲ－１３０ｂ－５ｐ／ｍｉＲ－４１０－３ｐに対するｉｎ ｓｉｌｉｃｏ標的プロファイリングを行い、一つ以上のデータベースでラットとヒトの両方に対して共通して高い予測点数（ＴａｒｇｅｔＳｃａｎ＜－０．１，ｍｉＲＤＢ＞７０，ｍｉＲｍａｐ＞７０）を示したＤＥＧｓが各ｍｉＲＮＡの予想標的として選択された。遺伝子オントロジー（ＧＯ）ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ ａｎａｌｙｓｉｓは、同族ｍｉＲＮＡ（ｃｏｇｎａｔｅ ｍｉＲＮＡ）と機能的に関連する標的遺伝子プールをさらに特定し、次いで、リアルタイムＰＣＲを通じて選択された遺伝子中、シャム対照群に比べてバルーン損傷頸動脈で下方制御された遺伝子を確認した（図４ｃ）。ヒト関連性のために、ｍｉＲＮＡ抑制剤でトランスフェクションしたヒト血管平滑筋細胞で前記の表的遺伝子の発現をさらに調査した。
【0101】
その結果、リアルタイムＰＣＲを通じてそれぞれのｍｉＲＮＡに対する核心標的遺伝子を明らかにし、ＳＯＣＳ２、ＢＭＰ７、ＴＳＰＡＮ２及びＳＭＡＤ６がそれぞれｍｉＲ－１３２－３ｐ、ｍｉＲ－３７０－３ｐ、ｍｉＲ－１３０ｂ－５ｐ及びｍｉＲ－４１０－３ｐに対する特異的標的であることを確認した（図４ｄ）。
【0102】
実施例５．平滑筋細胞増殖に必須ＭｉＲ－３７０／ＢＭＰ７軸
特に、不安定型狭心症、第２型糖尿病及び高脂血症患者の血液からｍｉＲ－３７０が検出されたため［Ｈｏｅｋｓｔｒａ、２０１０ ＃２６３５；Ｍｏｔａｗａｅ、２０１５ ＃２６３６；Ｇａｏ、２０１２ ＃２６３７］、平滑筋細胞の増殖においてｍｉＲ－３７０／ＢＭＰ（ｂｏｎｅ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ）－７軸の生物学的重要性を調査するために、ヒト細胞及び動脈組織でｍｉＲ－３７０の検出を試みた。
特に、不安定型狭心症、第２型糖尿病及び高脂血症患者の血液からｍｉＲ－３７０が検出されたため［Ｈｏｅｋｓｔｒａ、２０１０ ＃２６３５；Ｍｏｔａｗａｅ、２０１５ ＃２６３６；Ｇａｏ、２０１２ ＃２６３７］、平滑筋細胞の増殖においてｍｉＲ－３７０／ＢＭＰ（ｂｏｎｅ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ）－７軸の生物学的重要性を調査するために、ヒト細胞及び動脈組織でｍｉＲ－３７０の検出を試みた。
【0103】
Ｉｎ ｓｉｔｕ ハイブリダイゼーションを通じて動脈硬化症ＩＩ型及びＩＶ型病変があるヒト患者の管状組織切片でｍｉＲ－３７０－３ｐの高発現を確認し（図５ａ）、これは、ｍｉＲ－３７０が粥状動脈硬化症に関連した新たなｍｉＲＮＡであることを確認した。その後、培養されたヒト血管平滑筋細胞でｍｉＲ－３７０とＢＭＰ７の関係を調査し、実際に、血清刺激はｍｉＲ－３７０－３ｐの発現を誘導したが、反対にＢＭＰ７の発現を減少させた（図５ｂ）。これと一貫して、ヒトＢＭＰ７遺伝子の３－ＵＴＲ領域を使用したレポーター分析は、突然変異ＵＴＲではない野生型ＵＴＲを含有するルシフェラーゼの発現がｍｉＲ－３７０模倣体により確かに減少したことを示した（図５ｄ）。また、ウェスタンブロット分析は、ｍｉＲ－３７０抑制がヒト平滑筋細胞のＢＭＰ７タンパク質の水準を増加させたことを明確に示した（図５ｄ）。
【0104】
このような結果は、ＢＭＰ７遺伝子がヒト平滑筋細胞で真正なｍｉＲ－３７０標的であることを集合的に確認させたものである。組換えＢＭＰ７の処理は、以前に平滑筋細胞増殖を抑制することが報告されたため［Ｌａｇｎａ、２００７ ＃２６４１；Ｄｏｒａｉ、２０００ ＃２６４０］、平滑筋細胞増殖でｍｉＲ－３７０／ＢＭＰ７軸の関与を調べてみた。直接的な証拠として、ＢＭＰ７処理は、ヒト血管平滑筋細胞でＳＭＡＤ１／５／９リン酸化を顕著に誘導し（図５Ｅ）、これは、平滑筋細胞でＢＭＰ７の抗分裂効果を示唆することである。また、細胞増殖分析は、ＢＭＰ７枯渇がｍｉＲ－３７０抑制剤により抑制された平滑筋細胞増殖を回復させることを立証し（図５Ｆ）、したがって、ｍｉＲ－３７０依存的ＢＭＰ７発現調節は、平滑筋細胞成長と損傷した動脈で発生する新生内膜増殖の前提条件であることを確認した。
【0105】
これを総合すると、本発明のｍｉＲＮＡ抑制剤、具体的には、ｍｉＲ－１３２－３ｐ、ｍｉＲ－３７０－３ｐ、ｍｉＲ－１３０ｂ－５ｐ及びｍｉＲ－４１０－３ｐのそれぞれの抑制剤は、平滑筋細胞に対する増殖抑制効果を有し、これを通じて平滑筋細胞で前記ｍｉＲＮＡ抑制剤を含ませることにより、血管平滑筋細胞増殖性疾患の予防または治療に効果があることを予想することができる。
【0106】
以上の説明から、本発明が属する技術分野の当業者であれば、本発明がその技術的思想や必須の特徴を変更することなく、他の具体的な形態で実施されうることが理解できるだろう。これに関連し、以上で記述した実施例はあくまで例示的なものであり、限定的なものでないことを理解すべきである。本発明の範囲は前記詳細な説明よりは、後述する特許請求の範囲の意味及び範囲、そしてその等価概念から導かれるあらゆる変更または変形された形態が本発明の範囲に含まれるものと解釈すべきである。
【図1a】
【図1b】
【図1c】
【図2a】
【図2b】
【図2c】
【図2d】
【図2e】
【図2f】
【図3a】
【図3b】
【図3c】
【図4a】
【図4b】
【図4c】
【図4d】
【図5a】
【図5b】
【図5c】
【図5d】
【図5e】
【図5f】
【国際調査報告】