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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-12-17
(54)【発明の名称】悪性神経膠腫を治療する方法
(51)【国際特許分類】
A61K 38/20 20060101AFI20241210BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20241210BHJP
A61P 25/00 20060101ALI20241210BHJP
C07K 19/00 20060101ALI20241210BHJP
C07K 14/54 20060101ALI20241210BHJP
C07K 14/21 20060101ALI20241210BHJP
C12N 15/24 20060101ALI20241210BHJP
C12N 15/31 20060101ALI20241210BHJP
C12N 15/62 20060101ALI20241210BHJP
G01N 33/68 20060101ALI20241210BHJP
G01N 33/53 20060101ALI20241210BHJP
【ＦＩ】
A61K38/20 ZNA
A61P35/00
A61P25/00
C07K19/00
C07K14/54
C07K14/21
C12N15/24
C12N15/31
C12N15/62 Z
G01N33/68
G01N33/53 D
G01N33/53 M
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024527735
(86)(22)【出願日】2022-11-10
(85)【翻訳文提出日】2024-07-05
(86)【国際出願番号】 US2022079654
(87)【国際公開番号】W WO2023086896
(87)【国際公開日】2023-05-19
(31)【優先権主張番号】63/277,866
(32)【優先日】2021-11-10
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＲＩＴＯＮ
２．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】524176258
【氏名又は名称】ターゲピューティクス，インク
【氏名又は名称原語表記】ＴＡＲＧＥＰＥＵＴＩＣＳ，ＩＮＣ．
【住所又は居所原語表記】１２１４ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｂｌｖｄ．，Ｓｕｉｔｅ １０１１ Ｈｕｍｍｅｌｓｔｏｗｎ，ＰＡ １７０３６ ＵＮＩＴＥＤ ＳＴＡＴＥＳ ＯＦ ＡＭＥＲＩＣＡ
(74)【代理人】
【識別番号】110001461
【氏名又は名称】弁理士法人きさ特許商標事務所
(72)【発明者】
【氏名】シュレーセンゴスト，ランディー
(72)【発明者】
【氏名】ルートケヴィッテ，サード，シルヴァン ビー．
【テーマコード（参考）】
2G045
4C084
4H045
【Ｆターム（参考）】
2G045AA26
2G045CA25
2G045CA26
2G045CB01
2G045CB03
2G045CB07
2G045CB26
2G045CB30
2G045DA13
2G045DA14
2G045DA36
2G045FA40
2G045FB01
2G045FB02
2G045FB03
4C084AA01
4C084AA02
4C084BA01
4C084BA08
4C084BA21
4C084BA26
4C084BA41
4C084CA04
4C084CA59
4C084DA12
4C084MA17
4C084MA66
4C084NA14
4C084ZA021
4C084ZB261
4C084ZC411
4H045AA10
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA10
4H045BA41
4H045BA72
4H045CA11
4H045CA40
4H045DA02
4H045DA83
4H045EA28
4H045FA74
(57)【要約】
悪性神経膠腫を有する対象を治療する方法であって、治療効果のある量の、サイトトキシンにリンクされた変異誘発ＩＬ１３（ｃｍＩＬ１３）を、対流強化薬剤送達法（ＣＥＤ）によって最大９６時間にわたって投与することを含み、悪性神経膠腫はインターロイキン１３受容体α２（ＩＬ１３Ｒα２）を発現する、方法が開示される。ＩＬ１３Ｒα２を発現する悪性神経膠腫を有する対象を治療する方法で使用するための変異誘発ＩＬ１３であって、本方法は、治療効果のある量の、サイトトキシンにリンクされた変異誘発ＩＬ１３（ｃｍＩＬ１３）を、対流強化薬剤送達法（ＣＥＤ）によって最大９６時間にわたって投与することを含む、変異誘発ＩＬ１３も開示される。
【選択図】図６Ｃ
【選択図】図６Ｃ
【特許請求の範囲】
【請求項1】
悪性神経膠腫を有する対象を治療する方法であって、治療効果のある量の、サイトトキシンにリンクされた変異誘発ＩＬ１３（ｍＩＬ１３）（ｃｍＩＬ１３）を、対流強化薬剤送達法（ＣＥＤ）によって最大９６時間にわたって投与すること
を含み、
前記悪性神経膠腫はインターロイキン１３受容体α２（ＩＬ１３Ｒα２）を発現する、方法。
【請求項2】
前記ｃｍＩＬ１３は４時間から９６時間にわたって投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記ｃｍＩＬ１３は０．０３μｇ／ｍＬから１μｇ／ｍＬの用量で投与される、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項4】
前記ｃｍＩＬ１３の投与は最大１ｍＬ／時間の流量で施される、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項5】
前記サイトトキシンは細菌由来毒素を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項6】
前記細菌由来毒素はシュードモナスエクソトクシンＡを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項7】
前記悪性神経膠腫はハイグレード神経膠腫を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項8】
前記悪性神経膠腫は、成人膠芽腫、小児膠芽腫、退形成性星状細胞腫、退形成性乏突起神経膠腫、退形成性乏突起星細胞腫、退形成性上衣腫、および／または退形成性神経節腫を含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項9】
撮像成分の同時注入をさらに含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項10】
試料中のＩＬ１３Ｒα２の発現を検出することをさらに含み、前記ＩＬ１３Ｒα２の発現は、前記悪性神経膠腫がｃｍＩＬ１３による治療に反応することを示す、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項11】
前記試料は、血液、血漿、唾液、尿、および／もしくは脳脊髄液の液体生検、ならびに／または
臓器および／もしくは組織の固体生検
を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項12】
前記組織は腫瘍を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項13】
前記腫瘍は前記悪性神経膠腫を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項14】
前記液体生検は細胞外小胞および／または無細胞遺伝物質を含む、請求項１１から１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項15】
ＩＬ１３Ｒα２の発現の検出は、質量分析法、分析アッセイ、免疫染色法、および／またはシーケンシングによって行われる、請求項１１から１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項16】
（ａ）前記分析アッセイは、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）を含み、（ｂ）前記免疫染色法は、免疫組織化学法（ＩＨＣ）および／もしくは蛍光細胞化学を含み、ならびに／または
（ｃ）前記シーケンシングは、全ゲノムシーケンシング、全エクソームシーケンシング、ＲＮＡシーケンシング、および／もしくはプロテオミクスシーケンシングを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項17】
前記投与によって、治療効果のある量のｃｍＩＬ１３が投与されない悪性神経膠腫を有するコントロール対象に対して、前記対象の生存率が向上する、請求項１～１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項18】
前記生存率の向上は、カプランマイヤー生存曲線分析によって判定される、請求項１７に記載の方法。
【請求項19】
前記方法によって、神経膠腫でない細胞内および／または神経膠腫でない組織内では、臨床的に関係のあるバイオマーカーに検出可能な変化がない、請求項１～１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項20】
前記バイオマーカーは、ＮｅｕＮおよびＣＤ６８＋タンパク質を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項21】
ＩＬ１３Ｒα２を発現する細胞への前記ｃｍＩＬ１３の前記投与によって、（ｉ）前記悪性神経膠腫の体積が減少し、
（ｉｉ）ＩＨＣもしくは蛍光細胞化学によって測定される、検出可能な切断型カスパーゼ３が増加し、および／または
（ｉｉｉ）ＩＨＣもしくは蛍光細胞化学によって測定される、Ｋｉ‐６７陽性細胞のレベルが少なくとも１０％低下する、請求項１～２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項22】
前記悪性神経膠腫の前記体積の減少は、分散分析（ＡＮＯＶＡ）試験によって判定され、統計的有意性はｐ値＜０．０５によって判定される、請求項２１に記載の方法。
【請求項23】
前記悪性神経膠腫の前記体積の減少は、スチューデントの両側ｔ検定によって判定され、統計的有意性はｐ値＜０．０５によって判定される、請求項２１に記載の方法。
【請求項24】
前記ｍＩＬ１３は、天然型ヒトＩＬ１３と比べてＩＬ１３Ｒα２に対する親和性が上昇する、および／または天然型ヒトＩＬ１３と比べてインターロイキン１３受容体α１（ＩＬ１３Ｒα１）に対する親和性が低下するように改変される、請求項１～２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項25】
前記ｍ１３は、配列番号１または配列番号２と比べたときに少なくとも１つのアミノ酸の置換を特徴とする、請求項１～２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項26】
前記ｍＩＬ１３は、位置Ｅ１３、Ｒ６６、Ｓ６９、および／またはＫ１０５において、野生型ＩＬ１３に対するアミノ酸変化を含む、請求項１～２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項27】
前記ｍＩＬ１３は、１つまたは複数のアミノ酸置換基Ｅ１３Ｋ．Ｒ６６Ｄ．Ｓ６９Ｄ．Ｋ１０５Ｒを含む、請求項１～２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項28】
前記ｍＩＬ１３は、配列番号３から２４の１つもしくはその相同物または配列番号１もしくは配列番号２の一方の相同物に記載のアミノ酸配列を含む、請求項１～２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項29】
前記ｍＩＬ１３は、２０以下の残基が配列番号１または配列番号２とは異なる、請求項１～２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項30】
インターロイキン１３受容体α２（ＩＬ１３Ｒα２）を発現する悪性神経膠腫を有する対象を治療する方法で使用するための、サイトトキシンにリンクされた変異誘発ＩＬ１３（ｃｍＩＬ１３）であって、前記方法は、治療効果のある量のｃｍＩＬ１３を、対流強化薬剤送達法（ＣＥＤ）によって最大９６時間にわたって投与することを含み、および／または、前記治療方法はさらに、場合により、請求項１～２９に記載の特徴のうちのいずれかによって特徴づけられている、変異誘発ＩＬ１３（ｃｍＩＬ１３）。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本願は、２０２１年１１月１０日出願の米国特許仮出願第６３／２７７，８６６号の利益を主張するものであり、その文献を本願に引用して援用する。
本願は、２０２１年１１月１０日出願の米国特許仮出願第６３／２７７，８６６号の利益を主張するものであり、その文献を本願に引用して援用する。
【0002】
技術分野
本開示は癌治療に関する。
本開示は癌治療に関する。
【背景技術】
【0003】
効果的な治療処置がないせいで悪性神経膠腫の予後は不良なままである。特定の癌に対する現在の治療様式は効果が限られているため、それらの疾患を患う患者のための効果的かつ新規の治療を開発する必要が顕著である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0004】
悪性神経膠腫を有する対象を治療する方法であって、治療効果のある量の、サイトトキシンにリンクされた変異誘発ＩＬ１３（ｍＩＬ１３：ｍｕｔａｇｅｎｉｚｅｄ ＩＬ１３）（ｃｍＩＬ１３）を、対流強化薬剤送達法（ＣＥＤ：ｃｏｎｖｅｃｔｉｏｎ‐ｅｎｈａｎｃｅｄ ｄｅｌｉｖｅｒｙ）によって最大９６時間にわたって投与することを含み、悪性神経膠腫はインターロイキン１３受容体α２（ＩＬ１３Ｒα２）を発現する、方法が、本明細書で開示される。
【0005】
ＩＬ１３Ｒα２を発現する悪性神経膠腫を有する対象を治療する方法で使用するための、サイトトキシンにリンクされた変異誘発ＩＬ１３（ｃｍＩＬ１３）であって、本方法は、治療効果のある量のｃｍＩＬ１３を対流強化薬剤送達法（ＣＥＤ）によって最大９６時間にわたって投与することを含む、変異誘発ＩＬ１３（ｃｍＩＬ１３）も本明細書で開示される。
【図面の簡単な説明】
【0006】
【図1A】びまん性正中神経膠腫（ＤＭＧ：ｄｉｆｆｕｓｅ ｍｉｄｌｉｎｅ ｇｌｉｏｍａ）および成人膠芽腫（ＧＢＭ：ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ）の細胞モデルのＲＮＡシーケンスを示す。
【図1B】ＤＭＧおよびＧＢＭの細胞モデルの免疫ブロットを示す。
【図2A】ＤＭＧ細胞株の細胞増殖および用量反応曲線をｃｍＩＬ１３投与量の関数の反応パーセントとして示す。
【図2B】ＤＭＧ細胞株の細胞生存能力および用量反応曲線をｃｍＩＬ１３投与量の関数の反応パーセントとして示す。
【図2C】ＤＭＧ細胞のＩＬ１３Ｒα２発現と、ｃｍＩＬ１３に対する感度との間の反比例関係のグラフを示す。
【図2D】野生型ＩＬ１３（１０ｎｇ／ｍＬ）曝露の８、２４、４８、および７２時間後の、ＳＵ‐ＤＩＰＧ ＸＩＩＩ‐Ｐ、ＳＦ８６２８、およびＰＥＤ１７細胞株の免疫ブロットを示す。
【図2E】ｃｍＩＬ１３（細胞株特異的ＩＣ５０）曝露の８、２４、４８、および７２時間後の、ＳＵ‐ＤＩＰＧ ＸＩＩＩ‐Ｐ、ＳＦ８６２８、およびＰＥＤ１７細胞株の免疫ブロットを示す。
【図2F】ＩＣ５０のｃｍＩＬ１３による処理の７２時間後の、ＳＦ８６２８細胞の免疫蛍光検査染色を示す。
【図3】成人ＧＢＭ細胞株の細胞生存能力および用量反応曲線をｃｍＩＬ１３投与量の関数の反応パーセントとして示す。
【図4】ＤＭＧおよびＧＢＭ細胞株に関するｃｍＩＬ１３のＩＣ５０値をＩＬ‐１３Ｒα２発現の関数として示す。
【図5A】腫瘍細胞注射およびＣＥＤのワークフローの概略図である。
【図5B】ＧＢＭ６担持動物にｃｍＩＬ１３を１μｇ注射した後の日数の関数として、生物発光（ＢＬＩ：Ｂｉｏｌｕｍｉｓｃｅｎｃｅ）信号を示す。
【図5C】ＧＢＭ６担持動物の生存期間が延びたことを、ｃｍＩＬ１３を１μｇ注射した後の日数の関数として生存パーセントによって示す。
【図5D】ＰＥＤ１７異種移植片にｃｍＩＬ１３を１μｇ注射した後の日数の関数としてＢＬＩ信号を示す。
【図5E】ＰＥＤ１７異種移植片の生存期間が延びたことを、ｃｍＩＬ１３を１μｇ注射した後の日数の関数として生存パーセントによって示す。
【図5F】ＳＵ‐ＤＩＰＧ‐ＸＩＩＩ‐Ｐ動物にｃｍＩＬ１３を１μｇ注射した後の日数の関数としてＢＬＩ信号を示す。
【図5G】ＳＵ‐ＤＩＰＧ‐ＸＩＩＩ‐Ｐ動物の生存期間が延びたことを、ｃｍＩＬ１３を１μｇ注射した後の日数の関数として生存パーセントによって示す。
【図6A】ビヒクル溶液または１μｇのｃｍＩＬ１３それぞれのＣＥＤの後、５５日目（コントロール）および８６日目（実験）に採取した、ＨＧＧを担持するマウス脳の免疫組織化学法を示す。
【図6B】コントロールと比べたときの、ｃｍＩＬ１３で治療したマウスにおける、ＩＬ‐１３Ｒα２レベル、アポトーシス誘導、および細胞増殖のＩＨＣ分析を示す。
【図6C】コントロールおよび１μｇのｃｍＩＬ１３で治療したマウスに関する、Ｋｉ‐６７、切断型カスパーゼ３、およびＮｅｕＮを含有する細胞の密度を示す。
【図7A】ＩＣ５０のｃｍＩＬ１３で曝露した８、２４、４８、および７２時間後の、ＳＦ８６２８細胞の免疫蛍光検査（ＩＦ）を示す。ｃｍＩＬ１３は赤色で、ＩＬ‐１３Ｒα２は緑色で、ＤＡＰＩは青色で示されている。
【図7B】ＩＣ５０のｃｍＩＬ１３で曝露した８、２４、４８、および７２時間後のＳＦ８６２８細胞のＩＦを示す。切断型カスパーゼ３は緑色で、Ｋｉ‐６７は赤色で、ＤＡＰＩは青色で示されている。
【発明を実施するための形態】
【0007】
別段の定義がない限り、本明細書で用いる技術用語および化学用語はすべて、本開示が属する分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。本開示の試験を実施する際に本明細書に記載するものと同様または等価の任意の方法および材料を使用できるが、好ましい材料および方法は本明細書に記載されている。
【0008】
以下の詳細な説明のために、別段の明確な指示がある場合を除き、本開示が様々な代替的な変形例および工程の連続を想定できることを理解するべきである。さらに、操作例を除き、または別段の指示がある場合を除き、値、量、百分率、範囲、下位範囲、および分数を表す数字など、すべての数字は、明確に表れていなくても「約」という単語が接頭されているかのように読むことができる。したがって、別段の指示がない限り、以下で明細書および添付の特許請求の範囲に記載されている数値パラメーターは概数であり、本開示によって得ようとしている所望の結果に応じて変わることがある。少なくとも、さらに特許請求の範囲に対する均等論の適用を制限しようとするものではなく、各数値パラメーターは、有効数字の数に照らしておよび通常の端数処理を適用することによって、少なくとも解釈されるべきである。クローズドエンドまたはオープンエンドの数値範囲が本明細書に記載されている場合、その数値範囲内にあるかまたはその数値範囲によって包含されるすべての数字、値、量、百分率、下位範囲、および分数は、それらの数字、値、量、百分率、下位範囲、および分数の全体が明示的に記載されているかのように、本願の元来の開示に具体的に含まれており属しているものと見なすべきである。
【0009】
本開示の広い範囲を記載する数値範囲およびパラメーターは概数であるが、特定の例に記載されている数値は可能な限り正確に報告している。ただし、いずれの数値も、それぞれの試験測定値に見られる標準偏差から必然的に生じる一定の誤差を本質的に含む。
【0010】
本明細書で用いるように、別段の指示がない限り、複数形の用語は、対応するその単数形の用語を含むことができ、その逆も同様である。例えば、本明細書では「１つの（ａ）」変異誘発ＩＬ１３、または「１つの（ａ）」サイトトキシンについて言及しているが、それらの成分の組み合わせ（すなわち、複数）を使用できる。さらに、本願において、ある特定の場合に「および／または」を明示的に使用できる場合でも、「または」の使用は別段の具体的な記述がない限り「および／または」を意味する。
【0011】
本明細書で用いるように、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、および同様の用語は、本願の文脈において、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」と同義であると理解され、したがってオープンエンドであり、記載されていないおよび／または列挙されていない付加的な要素、材料、成分、および／または方法の工程の存在を除外しない。
【0012】
本明細書で用いるように、「～からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」は、本願の文脈において、明記されていない要素、成分、および／または方法の工程の存在はいずれも除外すると理解される。
【0013】
本明細書で用いるように、「本質的に～からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」は、本願の文脈において、明記されている要素、材料、成分、および／または方法の工程、ならびに記載されているものの「基本的特徴および新規特徴に実質的に影響を及ぼさないもの」を含むと理解される。
【0014】
本明細書で用いるように、「患者（ｐａｔｉｅｎｔ）」、「対象（ｓｕｂｊｅｃｔ）」、「個人（ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ）」などは、区別なく用いられており、インビトロであれインサイチュであれ、ヒト、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタ、霊長類、および／またはげっ歯類を含む哺乳類を含む、任意の動物またはその細胞を指す。
【0015】
本明細書で用いるように、用語「インターロイキン‐１３」または「ＩＬ１３」は、別段の指示がない限り、霊長類およびげっ歯類などの哺乳類を含む任意の脊椎動物供給源由来の任意の天然型または野生型のＩＬ１３を意味し、プロセシングを受けていないＩＬ１３および細胞中でのプロセシングによって生じる任意の形態のＩＬ１３、ならびにスプライスバリアントまたは対立遺伝子バリアントなど、ＩＬ１３の天然に存在する任意のバリアントを含む。例示的なヒトＩＬ１３のアミノ酸配列は、配列番号１に示されている。第２の例示的なヒトＩＬ１３のアミノ酸配列は、配列番号２に示されている。
【0016】
ポリペプチドにおける「変異（ｍｕｔａｔｉｏｎ）」とは、グリコシル化、リン酸化、アセチル化、ミリストイル化、プレニル化、パルミトイル化、アミド化などによる、任意のアミノ酸の置換、欠失（例えば、ペプチドなど、短縮版のタンパク質）、挿入、および／または修飾を有するタンパク質を包含することが意図されている。一例では、「変異型ＩＬ１３（ｍｕｔａｔｅｄ ＩＬ１３）」または「変異誘発ＩＬ１３（ｍｕｔａｇｅｎｉｚｅｄ ＩＬ１３）」は、アミノ酸の１つまたは複数が天然型のＩＬ１３における対応するアミノ酸とは異なるＩＬ１３を指す。変異型ＩＬ１３および／または変異誘発ＩＬ１３は、ヒト、ヒト以外の霊長類、ラット、ネズミ、ブタ、ウシ、イヌなどに見られる天然型のＩＬ１３由来でよい。変異型ＩＬ１３および／または変異誘発ＩＬ１３は、本明細書では「ｍＩＬ１３」と称される場合がある。
【0017】
本明細書で用いるように、用語「ＩＬ‐１３受容体」または「ＩＬ１３Ｒ」は、ＩＬ‐１３に結合する受容体を指す。
【0018】
本明細書で用いるように、用語「ＩＬ‐１３受容体α２」または「ＩＬ１３Ｒα２」は、特定の細胞サブセットの表面で発現され、ＩＬ１３に結合する、単量体のＩＬ１３受容体を指す。
【0019】
本明細書で用いるように、用語「ｃｍＩＬ１３」または「ｃｍＩＬ‐１３」は、サイトトキシンにリンクされた変異誘発ＩＬ１３を指す。
【0020】
本明細書で用いるように、「治療する（ｔｒｅａｔ）」、「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」、または「治療する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」は、発症を予防するか、または疾患によって生じるものなどの患者もしくは対象が経験する病理もしくは症状を変えるつもりで患者または対象に提供される治療手段を意味する。患者または対象に施される「治療」は、患者または対象が治療を受けている状態の任意の臨床的または定量的に測定可能な減少を実現でき、その現象には完全な除去が含まれる。
【0021】
本明細書で用いるように、「治療効果のある量」は、疾患（例えば、癌）を治療するために患者に投与されるときにその疾患を治療するために十分な量と定義される。例えば、癌治療のための化合物の治療効果のある量は、例えば、悪性腫瘍の体積を減らすかまたは患者の生存期間を延ばすのに十分な量とすることができる。
【0022】
本明細書で用いるように、「サイトトキシン（ｃｙｔｏｔｏｘｉｎ）」は、細胞の機能を妨害するか、細胞の破壊を引き起こすか、またはその両方を行う、毒素または抗体などの物質と定義される。
【0023】
本明細書で用いるように、用語「親和性（ａｆｆｉｎｉｔｙ）」は、受容体の単一の結合部位とリガンドとの間の非共有相互作用全体の強度と定義される。リガンドに対する受容体の親和性は、それぞれ解離速度定数Ｋｏｆｆと会合速度定数Ｋｏｎの比である解離定数（ＫＤ）によって表すことができる。親和性は、当業者に知られた方法によって測定できる。
【0024】
「強化された結合（ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｂｉｎｄｉｎｇ）」は、ｍＩＬ１３の結合レベルが、野生型ＩＬ１３よりも少なくとも１０％以上、例えば２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％以上高いか、または１倍、２倍、５倍、１０倍、２０倍、１００倍、１０００倍以上高く、ならびにそれらの間の任意のおよび全体的もしくは部分的な増分であることを指す。
【0025】
「減弱された結合（ｄｅｃｒｅａｓｅｄ ｂｉｎｄｉｎｇ）」は、ｍＩＬ１３の結合レベルが、野生型ＩＬ１３よりも少なくとも１０％以上、例えば２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％以上低いか、または１倍、２倍、５倍、１０倍、２０倍、１００倍、１０００倍以上低く、ならびにそれらの間の任意のおよび全体的もしくは部分的な増分であることを指す。
【0026】
本明細書で用いるように、用語「リンク（ｌｉｎｋ）」は、例えば接合または融合による、第２の遺伝子に対するある遺伝子の化学的付着（共有または非共有）と定義される。本明細書で用いるように、用語「リンクさせること（ｌｉｎｋｉｎｇ）」は、ある遺伝子を第２の遺伝子に（共有または非共有で）化学的に付着させることと定義される。本明細書で用いるように、用語「接合（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）」は、翻訳後にある遺伝子を第２の遺伝子にリンクさせることと定義される。本明細書で用いるように、用語「融合（ｆｕｓｉｏｎ）」は、翻訳前にある遺伝子を第２の遺伝子にリンクさせることと定義される。
【0027】
本明細書で用いるように、用語「コントロール（ｃｏｎｔｒｏｌ）」または「参照（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）」または「比較コントロール（ｃｏｍｐａｒａｔｏｒ ｃｏｎｔｒｏｌ）」は、対流強化薬剤送達法によるｃｍＩＬ１３の投与が行われない対象と定義され、そのため、コントロールまたは参照標準は、実験試料を比較できるコンパレーターとして働くことができる。
【0028】
本明細書で用いるように、用語「マーカー（またはバイオマーカー）の発現レベルを判定すること」は、「ＩＬ１３Ｒα２のレベルを判定する」など、任意のマーカー発現産物の十分な部分を検出するために当業者が利用可能な技術を用いて、試料中のマーカーの発現または存在の程度を核酸またはタンパク質のレベルで評価することが意図されている。
【0029】
本明細書で用いるように、１つまたは複数のマーカー（またはバイオマーカー）の「レベル（ｌｅｖｅｌ）」は、試料中のマーカー（またはバイオマーカー）の絶対的または相対的な量または濃度を意味する。
【0030】
「測定する（ｍｅａｓｕｒｉｎｇ）」もしくは「測定（ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ）」、または代替的に「検出する（ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ）」もしくは「検出（ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ）」は、臨床試料または対象由来の試料に含まれるいずれかの所与の物質の定性的もしくは定量的な濃度レベルの導出を含む、このような物質の存在、不在、質、もしくは量（効果的な量とすることができる）を評価すること、またはそうでなければ対象の臨床パラメーターの値もしくはカテゴリー分類を査定することを意味する。
【0031】
「試料（ｓａｍｐｌｅ）」または「生物学的試料（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｓａｍｐｌｅ）」は、本明細書で用いるように、生検（すなわち、「液体生検（ｌｉｑｕｉｄ ｂｉｏｐｓｙ）」または「固体生検（ｓｏｌｉｄ ｂｉｏｐｓｙ）」）によって採取された液体または固体の生物学的試料など、個人から切り離された生物学的材料を意味する。液体生検は、例えば、血液、血漿、唾液、尿、脳脊髄液、および／または他の体液を含むことができる。液体生検は、細胞外小胞および／または無細胞遺伝物質を含有できる。固体生検は、例えば、臓器、および／または腫瘍などの組織を含むことができる。生物学的試料は、所望のバイオマーカーを検出するのに適切な任意の生物学的材料を含有でき、個人から取得される細胞性物質および／または非細胞性物質を含むことができる。
【0032】
用語「癌（ｃａｎｃｅｒ）」は、本明細書で用いるように、異常な細胞の異常な増殖を特徴とする疾患と定義される。癌細胞は、血流およびリンパ系で局所的にまたはそれらを通って身体の他の部分に広がることがある。様々な癌の例には、神経膠腫などを含むがそれに限定されない、組織細胞がＩＬ１３Ｒα２を発現する脳腫瘍が含まれる。
【0033】
用語「神経膠腫（ｇｌｉｏｍａ）」は、脳または脊髄のグリア細胞に生じる腫瘍と定義される。
【0034】
本開示は、悪性神経膠腫を有する対象を治療する方法であって、治療効果のある量の、サイトトキシンにリンクされた変異誘発ＩＬ１３（ｃｍＩＬ１３）を、対流強化薬剤送達法（ＣＥＤ）によって最大９６時間にわたって投与することを含むか、本質的にその投与からなるか、またはその投与からなり、悪性神経膠腫は、インターロイキン１３受容体α２（ＩＬ１３Ｒα２）を発現する、方法を対象とする。
【0035】
本開示は、ＩＬ１３Ｒα２を発現する悪性神経膠腫を有する対象を治療する方法で使用するための、サイトトキシンにリンクされた変異誘発ＩＬ１３（ｃｍＩＬ１３）であって、本方法は、治療効果のある量のｃｍＩＬ１３を対流強化薬剤送達法（ＣＥＤ）によって最大９６時間にわたって投与することを含む、変異誘発ＩＬ１３（ｃｍＩＬ１３）も対象とする。
【0036】
本方法は、変異誘発ＩＬ１３（ｍＩＬ１３）の投与を含むか、本質的にその投与からなるか、またはその投与からなる。ｍＩＬ１３は、サイトトキシンにリンクされ得る（ｃｍＩＬ１３）。
【0037】
ｍＩＬ１３は、天然型ヒトＩＬ１３と比べてＩＬ１３Ｒα２に対する親和性が上昇する、および／または天然型ヒトＩＬ１３と比べてインターロイキン１３受容体α１（ＩＬ１３Ｒα１）に対する親和性が低下するように改変され得る。例えば、ｍＩＬ１３は、ＩＬ１３Ｒα２の結合または活性を少なくとも維持しながら、野生型ポリペプチドと比べてＩＬ１３Ｒα１に対して低下した、例えば、運動学的ＫＤの２倍低下、３倍低下、５倍低下、１０倍低下、１００倍以上低下した、親和性を有し得る。一部の例では、ＩＬ１３Ｒα１に対するｍＩＬ１３の親和性は、ＩＬ１３Ｒα２の結合または活性を維持しながら、ＫＤによって検出可能な結合がなくなるように、完全に弱められる。一部の例では、ＩＬ１３Ｒα２に対するｍＩＬ１３の親和性は、少なくとも維持されるか、または一部の例では野生型ＩＬ１３と比べて、例えば、運動学的ＫＤの２倍上昇、３倍上昇、５倍上昇、１０倍上昇、１００倍上昇、１０００倍以上上昇され得る。
【0038】
いくつかの例では、ｍＩＬ１３は、ｃＤＮＡ変異誘発、ＤＮＡ合成、ペプチド／タンパク質合成、または当業者に知られた任意の方法によって生成され得る。
【0039】
ｍＩＬ１３は、ヒト全長型ＩＬ１３分子など、全長型ＩＬ１３分子でよい。いくつかの例では、ｍＩＬ１３は、ヒトＩＬ１３（配列番号１）の残基１３に対応する位置に、配列番号１の残基６６に対応する位置に、配列番号１の残基６９に対応する位置に、および／または配列番号１の残基１０５に対応する位置に、野生型ＩＬ１３に対するアミノ酸変化を含み得る。ｍＩＬ１３は、ヒトＩＬ１３（配列番号１）の位置１３においてグルタミン酸に対する置換を含み得る。例えば、位置１３においてグルタミン酸をリシンで置換し得る。ｍＩＬ１３は、ヒトＩＬ１３（配列番号１）の位置６６においてアルギニンに対する置換を含み得る。例えば、位置６６においてアルギニンをアスパラギン酸で置換し得る。ｍＩＬ１３は、ヒトＩＬ１３（配列番号１）の位置６９においてセリンに対する置換を含み得る。位置６９においてセリンをアスパラギン酸で置換し得る。ｍＩＬ１３は、ヒトＩＬ１３（配列番号１）の位置１０５においてリシンの置換を含み得る。位置１０５においてリシンをアルギニンで置換し得る。ｍＩＬ１３は、位置Ｅ１３、Ｒ６６、Ｓ６９、および／またはＫ１０５における変化を含み得る。ｍＩＬ１３は、ＩＬ１３．Ｅ１３Ｋ．Ｒ６６Ｄ．Ｓ６９Ｄ．Ｋ１０５Ｒと呼ばれ得る。一例では、ｍＩＬ１３は、配列番号３に記載のアミノ酸配列を含み得る。他の例では、ｍＩＬ１３は、配列番号４から２２のいずれかを含み得るか、または配列番号１から２４のいずれかと少なくとも５０、６０、７０、８０、８５、９０、９５、もしくは９９％の相同性を共有するシーケンスを含み得るか、または配列番号１から２４のいずれかとは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、もしくは２０以上の残基が異なるシーケンスを含み得る。いくつかの例では、本願に引用して援用する２０１７年５月１７日出願の米国特許出願第１５／５９７，８２３号「Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ＩＬ１３ Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ」のｃｏｌ．２，ｌ．１６～４７、ｃｏｌ．２，ｌ．５６～ｃｏｌ．３，ｌ．３には、野生型ＩＬ１３（本明細書では配列番号２として開示されている）、および本明細書では配列番号３から２４として提供されているＩＬ１３Ｒα２に特異的な変異が開示されている。用語「相同性（ｈｏｍｏｌｏｇｙ）」および「相同（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）」は、２つのタンパク質またはペプチド分子など２つの分子間の、サブユニットのシーケンスの同一性を指す。両方の分子サブユニットの位置が同じサブユニットで占有されているときは、それらの分子はその位置で相同である。２つのシーケンスの間の相同性は、一致するかまたは相同な位置の数の一次関数である。例えば、２つのシーケンスの位置の半分が相同である場合、それら２つのシーケンスは５０％相同であり、それらの位置の７０％（すなわち、１０のうちの７）が一致するかまたは相同である場合、それら２つのシーケンスは７０％相同である。本開示の相同物は、自然変異を含む自然対立遺伝子変異の結果であり得る。本開示の相同物は、自然変異を含む自然対立遺伝子変異の結果であり得る。本開示の相同物は、タンパク質への直接的な修飾を含む当技術分野で公知の技術を用いて、例えば、ランダム変異誘発または標的変異誘発を行う組換えＤＮＡ技術を用いて生成することもできる。
【0040】
ｍＩＬ１３は、細胞外小胞（ＥＶ）と複合化して細胞外小胞複合体（ＥＶ複合体）を形成し得る。細胞外小胞は、特定のタイプの生物学的試料（尿、血清、血漿、脳脊髄液、臓器、組織など）から取得され得る、および／または神経膠腫幹細胞など、特定のタイプの細胞から採取され得る。いくつかの例では、神経膠腫幹細胞は、間葉性神経膠腫幹細胞または前神経性神経膠腫幹細胞でよい。細胞外小胞は、腫瘍関連エクソソームなどのエクソソームを含み得る。細胞外小胞は、分画遠心分離、超遠心分離、および／または当業者に知られた他の方法を用いて生物学的試料から精製または濃縮され得る。
【0041】
細胞外小胞の亜集団は、生物学的マーカーを用いることによって切り離され得る。生物学的マーカーは、腫瘍関連の受容体などの受容体でよい。腫瘍関連の受容体はＩＬ１３Ｒα２でよい。各エクソソームは、例えば、１、２、５、１０、１５、２０、２５、５０、１００、２５０、５００、１０００以上の生物学的マーカーを発現し得る。
【0042】
サイトトキシンは、本明細書で開示するｍＩＬ１３の１つにリンクされてｃｍＩＬ１３を形成し得る。例えば、リンクは、ＥＤＣ化学作用または精製ゲルろ過によって起こり得る。
【0043】
サイトトキシンは、細菌由来毒素を含み得るか、本質的に細菌由来毒素からなるか、または細菌由来毒素からなる。細菌由来毒素は、例えば、シュードモナスエクソトクシンＡを含み得る。
【0044】
治療効果のある量のｃｍＩＬ１３は、対流強化薬剤送達法（ＣＥＤ）によって投与され得る。ＣＥＤは、少なくとも１つのカテーテルを、例えば脳の間質空間に、脳の切除空所に、または手つかずの脳腫瘍に直接的に挿入することを含む。当業者は、ＣＥＤによるｃｍＩＬ１３の送達のために適切なカテーテルを選択することができる。本明細書で用いるように、「対流強化薬剤送達法」すなわち「ＣＥＤ」は、治療を受ける構造、例えば、悪性神経膠腫腫瘍または切除空所に治療薬を直接的に投与する低流量陽圧注入法と定義される。ｃｍＩＬ１３は、外部のシリンジポンプによって制御される規定の流量での対流注入によって投与され得る。本方法は、治療を受ける領域内にカテーテルの先端を位置決めすることを含む。外部のポンプは、カテーテルに連結され得、そうすることで、陽圧勾配を維持しながら、治療効果のある用量の治療薬、例えば、ｃｍＩＬ１３を含む組成を供給する。ｃｍＩＬ１３の投与は、薬物送達のための代用マーカー、例えば、ガドリニウムまたはガドリニウム‐ＤＴＰＡとして働く撮像成分の同時注入を伴って行われる場合もあり行われない場合もある。
【0045】
ｃｍＩＬ１３の投与は、少なくとも４時間にわたって行うことができる。いくつかの例では、ｃｍＩＬ１３の投与は、４時間から９６時間にわたって行うことができる。
【0046】
ｃｍＩＬ１３は、少なくとも０．０３μｇ／ｍＬから１μｇ／ｍＬ以下の用量で投与され得る。ｃｍＩＬ１３の投与は、最大１ｍＬ／時間の流量で施され得る。
【0047】
本明細書で開示する方法による治療を受ける悪性神経膠腫は、ハイグレード神経膠腫を含み得るか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。本明細書で開示する方法を用いて治療できる悪性神経膠腫の例には、限定されるものではないが、成人膠芽腫、小児膠芽腫、びまん性正中神経膠腫などの退形成性星状細胞腫、退形成性乏突起神経膠腫、退形成性乏突起星細胞腫、退形成性上衣腫、および／または退形成性神経節腫が含まれる。
【0048】
開示されている方法による治療を受ける悪性神経膠腫は、ＩＬ１３特異的受容体を発現し得る。ＩＬ１３特異的受容体は、インターロイキン１３受容体α２（ＩＬ１３Ｒα２）を含み得る。ＩＬ１３Ｒα２の発現は、ｃｍＩＬ１３の投与の前に悪性神経膠腫の試料中で検出され得る。いくつかの例では、悪性神経膠腫の試料は、ＩＬ１３Ｒα２の発現の検出前に精製され得る。ＩＬ１３Ｒα２の発現の検出は、質量分析法、分析アッセイ、免疫染色法、および／またはシーケンシングによって検出され得る。いくつかの例では、分析アッセイは、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ：ｅｎｚｙｍｅ‐ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ）を含み得る。他の例では、免疫染色法は、免疫組織化学法（ＩＨＣ）および／または蛍光細胞化学を含み得る。他の例では、シーケンシングは、全ゲノムシーケンシング、エクソームシーケンシング、プロテオミクスシーケンシング、および／またはＲＮＡシーケンシングを含む。悪性神経膠腫によるＩＬ１３Ｒα２の発現は、悪性神経膠腫がｃｍＩＬ１３による治療に反応することを示す。
【0049】
驚くべきことに、本明細書に記載する悪性神経膠腫を治療する方法が、本明細書に記載する方法による治療を受けない悪性神経膠腫を有するコントロール対象に対して、悪性神経膠腫を有する対象の生存率を向上させることが見出された。生存率の向上は、例えば、カプランマイヤー生存曲線分析によって判定され得る。生存曲線分析は、限定されるものではないが、治療を受ける対象のｃｍＩＬ１３とコントロールとの間の生存確率の比較を含み、ここで、生存確率（Ｓｔ）は、［開始時に生存していた対象数－死亡した対象数］／開始時に生存していた対象数、と定義される。得られたデータはグラフにプロットされており、グラフでは、生存確率がｙ軸に、本研究に参加してからの時間がｘ軸にある。少なくとも異なる２つのグラフ化されたデータセット間の統計的な差は、各群の各事象時間についてカイ二乗を計算して結果を合計するログランク検定、または各事象時間についてカイ二乗を計算して結果を合計し曲線全体の最終的な観測結果および予測結果を与えるハザード比の少なくともいずれかによって判定され得る。統計的有意性はｐが０．０５以下であると定義される。
【0050】
驚くべきことに、本明細書に記載する悪性神経膠腫を治療する方法によって、健康な細胞および／または健康な組織（例えば、神経膠腫でない細胞および神経膠腫でない組織）内での臨床的に関係のあるバイオマーカーには検出可能な変化がないことも見出された。臨床的に関係のあるバイオマーカーの例には、限定されるものではないが、ＮｅｕＮおよびＣＤ６８＋タンパク質が含まれる。
【0051】
最後に、驚くべきことに、本明細書に開示する悪性神経膠腫を治療する方法が、悪性神経膠腫の体積を減少させることが見出された。神経膠腫の体積の減少は、当業者に知られた統計分析によって、例えば、１元配置分散分析もしくは２元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）試験またはスチューデントの両側ｔ検定によって判定され得、統計的有意性は、ｐ＜０．０５によって判定され得る。したがって、本明細書に記載する悪性神経膠腫を治療する方法は、健康な細胞および組織を害することなく悪性神経膠腫を事実上治療することができる。
【0052】
態様
以下に、本開示のいくつかの非限定的な態様を要約する。
以下に、本開示のいくつかの非限定的な態様を要約する。
【0053】
態様１
悪性神経膠腫を有する対象を治療する方法であって、
治療効果のある量の、サイトトキシンにリンクされた変異誘発ＩＬ１３（ｍＩＬ１３）（ｃｍＩＬ１３）を、対流強化薬剤送達法（ＣＥＤ）によって最大９６時間にわたって投与すること
を含み、
悪性神経膠腫はインターロイキン１３受容体α２（ＩＬ１３Ｒα２）を発現する、方法。
悪性神経膠腫を有する対象を治療する方法であって、
治療効果のある量の、サイトトキシンにリンクされた変異誘発ＩＬ１３（ｍＩＬ１３）（ｃｍＩＬ１３）を、対流強化薬剤送達法（ＣＥＤ）によって最大９６時間にわたって投与すること
を含み、
悪性神経膠腫はインターロイキン１３受容体α２（ＩＬ１３Ｒα２）を発現する、方法。
【0054】
態様２
ｃｍＩＬ１３は４時間から９６時間にわたって投与される、態様１に記載の方法。
ｃｍＩＬ１３は４時間から９６時間にわたって投与される、態様１に記載の方法。
【0055】
態様３
ｃｍＩＬ１３は０．０３μｇ／ｍＬから１μｇ／ｍＬの用量で投与される、態様１または態様２に記載の方法。
ｃｍＩＬ１３は０．０３μｇ／ｍＬから１μｇ／ｍＬの用量で投与される、態様１または態様２に記載の方法。
【0056】
態様４
ｃｍＩＬ１３の投与は最大１ｍＬ／時間の流量で施される、先行する態様のいずれかに記載の方法。
ｃｍＩＬ１３の投与は最大１ｍＬ／時間の流量で施される、先行する態様のいずれかに記載の方法。
【0057】
態様５
ｃｍＩＬ１３は、天然型ヒトＩＬ１３と比べてＩＬ１３Ｒα２に対する親和性が上昇する、および／または天然型ヒトＩＬ１３と比べてインターロイキン１３受容体α１（ＩＬ１３Ｒα１）に対する親和性が低下するように改変される、先行する態様のいずれかに記載の方法。
ｃｍＩＬ１３は、天然型ヒトＩＬ１３と比べてＩＬ１３Ｒα２に対する親和性が上昇する、および／または天然型ヒトＩＬ１３と比べてインターロイキン１３受容体α１（ＩＬ１３Ｒα１）に対する親和性が低下するように改変される、先行する態様のいずれかに記載の方法。
【0058】
態様６
ｃｍＩＬ１３は、位置Ｅ１３、Ｒ６６、Ｓ６９、および／またはＫ１０５において、野生型ＩＬ１３に対するアミノ酸変化を含む、先行する態様のいずれかに記載の方法。
ｃｍＩＬ１３は、位置Ｅ１３、Ｒ６６、Ｓ６９、および／またはＫ１０５において、野生型ＩＬ１３に対するアミノ酸変化を含む、先行する態様のいずれかに記載の方法。
【0059】
態様７
ｃｍＩＬ１３は、１つまたは複数のアミノ酸置換基Ｅ１３Ｋ．Ｒ６６Ｄ．Ｓ６９Ｄ．Ｋ１０５Ｒを含む、先行する態様のいずれかに記載の方法。
ｃｍＩＬ１３は、１つまたは複数のアミノ酸置換基Ｅ１３Ｋ．Ｒ６６Ｄ．Ｓ６９Ｄ．Ｋ１０５Ｒを含む、先行する態様のいずれかに記載の方法。
【0060】
態様８
ｃｍＩＬ１３は、配列番号３から２４の１つもしくはその相同物または配列番号１もしくは配列番号２の一方の相同物に記載のアミノ酸配列を含む、先行する態様のいずれかに記載の方法。
ｃｍＩＬ１３は、配列番号３から２４の１つもしくはその相同物または配列番号１もしくは配列番号２の一方の相同物に記載のアミノ酸配列を含む、先行する態様のいずれかに記載の方法。
【0061】
態様９
ｃｍＩＬ１３は、２０以下の残基が配列番号１または配列番号２とは異なる、先行する態様のいずれかに記載の方法。
ｃｍＩＬ１３は、２０以下の残基が配列番号１または配列番号２とは異なる、先行する態様のいずれかに記載の方法。
【0062】
態様１０
サイトトキシンは細菌由来毒素を含む、先行する態様のいずれかに記載の方法。
サイトトキシンは細菌由来毒素を含む、先行する態様のいずれかに記載の方法。
【0063】
態様１１
細菌由来毒素はシュードモナスエクソトクシンＡを含む、態様１０に記載の方法。
細菌由来毒素はシュードモナスエクソトクシンＡを含む、態様１０に記載の方法。
【0064】
態様１２
悪性神経膠腫はハイグレード神経膠腫を含む、先行する態様のいずれかに記載の方法。
悪性神経膠腫はハイグレード神経膠腫を含む、先行する態様のいずれかに記載の方法。
【0065】
態様１３
悪性神経膠腫は、成人膠芽腫、小児膠芽腫、退形成性星状細胞腫、退形成性乏突起神経膠腫、退形成性乏突起星細胞腫、退形成性上衣腫、および／または退形成性神経節腫を含む、先行する態様のいずれかに記載の方法。
悪性神経膠腫は、成人膠芽腫、小児膠芽腫、退形成性星状細胞腫、退形成性乏突起神経膠腫、退形成性乏突起星細胞腫、退形成性上衣腫、および／または退形成性神経節腫を含む、先行する態様のいずれかに記載の方法。
【0066】
態様１４
退形成性星状細胞腫は、びまん性正中神経膠腫を含む、態様１３に記載の方法。
退形成性星状細胞腫は、びまん性正中神経膠腫を含む、態様１３に記載の方法。
【0067】
態様１５
撮像成分の同時注入をさらに含む、先行する態様のいずれかに記載の方法。
撮像成分の同時注入をさらに含む、先行する態様のいずれかに記載の方法。
【0068】
態様１６
撮像成分は、ガドリニウム、ガドリニウム‐ＤＴＰＡ、またはそれらの組み合わせを含む、態様１５に記載の方法。
撮像成分は、ガドリニウム、ガドリニウム‐ＤＴＰＡ、またはそれらの組み合わせを含む、態様１５に記載の方法。
【0069】
態様１７
試料中のＩＬ１３Ｒα２の発現を検出することをさらに含み、ＩＬ１３Ｒα２の発現は、悪性神経膠腫がｃｍＩＬ１３による治療に反応することを示す、先行する態様のいずれかに記載の方法。
試料中のＩＬ１３Ｒα２の発現を検出することをさらに含み、ＩＬ１３Ｒα２の発現は、悪性神経膠腫がｃｍＩＬ１３による治療に反応することを示す、先行する態様のいずれかに記載の方法。
【0070】
態様１８
試料は、
血液、血漿、唾液、尿、および／もしくは脳脊髄液の液体生検、ならびに／または
臓器および／もしくは組織の固体生検
を含む、態様１７に記載の方法。
試料は、
血液、血漿、唾液、尿、および／もしくは脳脊髄液の液体生検、ならびに／または
臓器および／もしくは組織の固体生検
を含む、態様１７に記載の方法。
【0071】
態様１９
組織は腫瘍を含む、態様１８に記載の方法。
組織は腫瘍を含む、態様１８に記載の方法。
【0072】
態様２０
腫瘍は悪性神経膠腫を含む、態様１９に記載の方法。
腫瘍は悪性神経膠腫を含む、態様１９に記載の方法。
【0073】
態様２１
液体生検は、細胞外小胞および／または無細胞遺伝物質を含む、態様１８から２０の何れかに記載の方法。
液体生検は、細胞外小胞および／または無細胞遺伝物質を含む、態様１８から２０の何れかに記載の方法。
【0074】
態様２２
試料を精製することをさらに含む、態様１８から２１の何れかに記載の方法。
試料を精製することをさらに含む、態様１８から２１の何れかに記載の方法。
【0075】
態様２３
ＩＬ１３Ｒα２の発現の検出は、質量分析法、分析アッセイ、免疫染色法、および／またはシーケンシングによって行われる、態様１８から２２のいずれかに記載の方法。
ＩＬ１３Ｒα２の発現の検出は、質量分析法、分析アッセイ、免疫染色法、および／またはシーケンシングによって行われる、態様１８から２２のいずれかに記載の方法。
【0076】
態様２４
（ａ）分析アッセイは、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）を含み、
（ｂ）免疫染色法は、免疫組織化学法（ＩＨＣ）および／もしくは蛍光細胞化学を含み、ならびに／または
（ｃ）シーケンシングは、全ゲノムシーケンシング、全エクソームシーケンシング、ＲＮＡシーケンシング、および／もしくはプロテオミクスを含む、態様２３に記載の方法。
（ａ）分析アッセイは、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）を含み、
（ｂ）免疫染色法は、免疫組織化学法（ＩＨＣ）および／もしくは蛍光細胞化学を含み、ならびに／または
（ｃ）シーケンシングは、全ゲノムシーケンシング、全エクソームシーケンシング、ＲＮＡシーケンシング、および／もしくはプロテオミクスを含む、態様２３に記載の方法。
【0077】
態様２５
投与によって、治療効果のある量のｃｍＩＬ１３が投与されない悪性神経膠腫を有するコントロール対象に対して、対象の生存率が向上する、先行する態様のいずれかに記載の方法。
投与によって、治療効果のある量のｃｍＩＬ１３が投与されない悪性神経膠腫を有するコントロール対象に対して、対象の生存率が向上する、先行する態様のいずれかに記載の方法。
【0078】
態様２６
生存率の向上は、カプランマイヤー生存曲線分析によって判定される、態様２５に記載の方法。
生存率の向上は、カプランマイヤー生存曲線分析によって判定される、態様２５に記載の方法。
【0079】
態様２７
本方法によって、神経膠腫でない細胞内および／または神経膠腫でない組織内では、臨床的に関係のあるバイオマーカーに検出可能な変化がない、先の態様のいずれかに記載の方法。
本方法によって、神経膠腫でない細胞内および／または神経膠腫でない組織内では、臨床的に関係のあるバイオマーカーに検出可能な変化がない、先の態様のいずれかに記載の方法。
【0080】
態様２８
バイオマーカーは、ＮｅｕＮおよびＣＤ６８＋タンパク質を含む、態様２７に記載の方法。
バイオマーカーは、ＮｅｕＮおよびＣＤ６８＋タンパク質を含む、態様２７に記載の方法。
【0081】
態様２９
ＩＬ１３Ｒα２を発現する細胞へのｃｍＩＬ１３の投与によって、
（ｉ）悪性神経膠腫の体積が減少し、
（ｉｉ）ＩＨＣもしくは蛍光細胞化学によって測定される、検出可能な切断型カスパーゼ３が増加し、および／または
（ｉｉｉ）ＩＨＣもしくは蛍光細胞化学によって測定される、Ｋｉ‐６７陽性細胞のレベルが少なくとも１０％低下する、先行する態様のいずれかに記載の方法。
ＩＬ１３Ｒα２を発現する細胞へのｃｍＩＬ１３の投与によって、
（ｉ）悪性神経膠腫の体積が減少し、
（ｉｉ）ＩＨＣもしくは蛍光細胞化学によって測定される、検出可能な切断型カスパーゼ３が増加し、および／または
（ｉｉｉ）ＩＨＣもしくは蛍光細胞化学によって測定される、Ｋｉ‐６７陽性細胞のレベルが少なくとも１０％低下する、先行する態様のいずれかに記載の方法。
【0082】
態様３０
悪性神経膠腫の体積の減少は、分散分析（ＡＮＯＶＡ）試験によって判定され、統計的有意性はｐ値＜０．０５によって判定される、態様２９に記載の方法。
悪性神経膠腫の体積の減少は、分散分析（ＡＮＯＶＡ）試験によって判定され、統計的有意性はｐ値＜０．０５によって判定される、態様２９に記載の方法。
【0083】
態様３１
悪性神経膠腫の体積の減少は、スチューデントの両側ｔ検定によって判定され、統計的有意性はｐ値＜０．０５によって判定される、態様２９に記載の方法。
悪性神経膠腫の体積の減少は、スチューデントの両側ｔ検定によって判定され、統計的有意性はｐ値＜０．０５によって判定される、態様２９に記載の方法。
【0084】
態様３２
変異誘発ＩＬ‐１３は、配列番号１または配列番号２と比べたときに少なくとも１つのアミノ酸置換を特徴とする、先行する態様のいずれかに記載の方法。
変異誘発ＩＬ‐１３は、配列番号１または配列番号２と比べたときに少なくとも１つのアミノ酸置換を特徴とする、先行する態様のいずれかに記載の方法。
【0085】
態様３３
インターロイキン１３受容体α２（ＩＬ１３Ｒα２）を発現する悪性神経膠腫を有する対象を治療する方法で使用するための、サイトトキシンにリンクされた変異誘発ＩＬ１３（ｃｍＩＬ１３）であって、本方法は、治療効果のある量のｃｍＩＬ１３を対流強化薬剤送達法（ＣＥＤ）によって最大９６時間にわたって投与することを含む、および／または、前記治療方法はさらに、場合により、先行する態様に記載の特性のうちのいずれかを特徴とする、変異誘発ＩＬ１３（ｃｍＩＬ１３）。
インターロイキン１３受容体α２（ＩＬ１３Ｒα２）を発現する悪性神経膠腫を有する対象を治療する方法で使用するための、サイトトキシンにリンクされた変異誘発ＩＬ１３（ｃｍＩＬ１３）であって、本方法は、治療効果のある量のｃｍＩＬ１３を対流強化薬剤送達法（ＣＥＤ）によって最大９６時間にわたって投与することを含む、および／または、前記治療方法はさらに、場合により、先行する態様に記載の特性のうちのいずれかを特徴とする、変異誘発ＩＬ１３（ｃｍＩＬ１３）。
【0086】
以下の実施例は本開示を示しているが、本開示をそれらの実施例の詳細に限定することを意図するものではない。別段の指定がない限り、以下の実施例および本明細書全体にわたってすべての部分および百分率は重量によるものである。
【実施例】
【0087】
研究１
材料および方法
材料
ｃｍＩＬ１３（ＩＬ１３．Ｅ１３Ｋ‐ＰＥ４Ｅ）をＴａｒｇｅｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．（Ｈｅｒｓｈｅｙ、ＰＡ）から入手した。ｃｍＩＬ１３をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ：Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ－Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ）に溶解し、２．６ｍｇ／ｍＬストックとして－８０℃で保管した。ヒトＩＬ１３組換えタンパク質（カタログ番号：Ａ２５２５）をＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）から入手した。製造者のプロトコルに準拠して、ＩＬ１３を２回蒸留水（ｄｄＨ２Ｏ）に溶解し、５μｇ／ｍＬストックとして－８０℃で保存した。
材料および方法
材料
ｃｍＩＬ１３（ＩＬ１３．Ｅ１３Ｋ‐ＰＥ４Ｅ）をＴａｒｇｅｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．（Ｈｅｒｓｈｅｙ、ＰＡ）から入手した。ｃｍＩＬ１３をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ：Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ－Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ）に溶解し、２．６ｍｇ／ｍＬストックとして－８０℃で保管した。ヒトＩＬ１３組換えタンパク質（カタログ番号：Ａ２５２５）をＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）から入手した。製造者のプロトコルに準拠して、ＩＬ１３を２回蒸留水（ｄｄＨ２Ｏ）に溶解し、５μｇ／ｍＬストックとして－８０℃で保存した。
【0088】
細胞株および培養
すべての患者由来細胞株について、インフォームドコンセントおよび治験審査委員会の承認を得た。細胞株に関する詳細を表１に示す。
すべての患者由来細胞株について、インフォームドコンセントおよび治験審査委員会の承認を得た。細胞株に関する詳細を表１に示す。
【0089】
【表1】
【0090】
初期継代のＨＧＧ株を使用し、すべての細胞株を、ショートタンデムリピートＤＮＡフィンガープリント法によって年１回検証し、マイコプラズマ汚染については３か月ごとに試験した。Ｈ３Ｋ２７Ｍ変異を有する細胞株を、Ｋ２７Ｍ変異のヒストン発現について、ウエスタンブロットおよびサンガーシーケンシングを用いて３か月ごとに検証した。すべての患者由来腫瘍細胞株を細胞株に適切な培地で維持した。その詳細を表２に示す。
【0091】
【表2】
【0092】
ニューロスフェアとして培養した細胞を１～２週間ごとに継代した。接着性単分子層として培養した細胞を１週間に１～２回継代した。
【0093】
ＲＮＡシーケンシングおよびデータ分析
製造者の指示に従ってＲＮｅａｓｙ Ｐｌｕｓ ｍｉｃｒｏ ｋｉｔ（Ｃａｔ＃７４０３４；ＱＩＡＧＥＮ、Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ、ＭＤ、ＵＳＡ）を用いて、全細胞溶解物からトータルＲＮＡを抽出した。細胞株の大規模ライブラリーをスクリーニングするために、単一反復としてＲＮＡシーケンス研究を行った。ＲＮＡライブラリー調製およびシーケンシングをＮｏｖｏｇｅｎｅ（北京、中国）によって行った。Ｉｌｌｕｍｉｎａシーケンサー（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ、ＵＳＡ）のためのＮＥＢＮｅｘｔ ＵｌｔｒａＴＭ ＲＮＡ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔをライブラリー調製のために使用し、その後、ＡＭＰｕｒｅ ＸＰ磁性ビーズ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｐａｓａｄｅｎａ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いてｃＤＮＡライブラリーをサイズ選択した。試料を利用できる時間枠および利用可能なシーケンシング技術に応じてシングルエンドまたはペアエンドシーケンシングを用いて、ＮｏｖａＳｅｑ ６０００シーケンサー（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）で試料を配列した。成人ＧＢＭ細胞株のペアエンドシーケンシングデータをｃＢｉｏＰｏｒｔａｌから取得した。ｃＢｉｏＰｏｒｔａｌとは、Ｍａｙｏ Ｃｌｉｎｉｃの脳腫瘍患者由来異種移植片についてのＲＮＡシーケンスデータを含むウェブベースのフリーツールである。ＦＡＳＴＱＣを用いて、生成したＦＡＳＴＱファイルの品質評価を行った。ＳＴＡＲｖ２．７．３ａを用いて、トリミングしたリードをｈｇ３８にマッピングし、－ｑｕａｎｔＭｏｄｅ ｇｅｎｅＣｏｕｎｔｓ機能を用いて注釈付きの遺伝子計数を取得した。転写数（ＴＰＭ）またはリード値１００万個当たりの１キロベース当たりのリード数（ＲＰＫＭ：ｒｅａｄｓ ｐｅｒ ｋｉｌｏ ｂａｓｅ ｐｅｒ ｍｉｌｌｉｏｎ）を、シングルエンドまたはペアエンドのライブラリーステータスに合わせてＲＳＥＭを用いて計算した。
製造者の指示に従ってＲＮｅａｓｙ Ｐｌｕｓ ｍｉｃｒｏ ｋｉｔ（Ｃａｔ＃７４０３４；ＱＩＡＧＥＮ、Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ、ＭＤ、ＵＳＡ）を用いて、全細胞溶解物からトータルＲＮＡを抽出した。細胞株の大規模ライブラリーをスクリーニングするために、単一反復としてＲＮＡシーケンス研究を行った。ＲＮＡライブラリー調製およびシーケンシングをＮｏｖｏｇｅｎｅ（北京、中国）によって行った。Ｉｌｌｕｍｉｎａシーケンサー（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ、ＵＳＡ）のためのＮＥＢＮｅｘｔ ＵｌｔｒａＴＭ ＲＮＡ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔをライブラリー調製のために使用し、その後、ＡＭＰｕｒｅ ＸＰ磁性ビーズ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｐａｓａｄｅｎａ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いてｃＤＮＡライブラリーをサイズ選択した。試料を利用できる時間枠および利用可能なシーケンシング技術に応じてシングルエンドまたはペアエンドシーケンシングを用いて、ＮｏｖａＳｅｑ ６０００シーケンサー（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）で試料を配列した。成人ＧＢＭ細胞株のペアエンドシーケンシングデータをｃＢｉｏＰｏｒｔａｌから取得した。ｃＢｉｏＰｏｒｔａｌとは、Ｍａｙｏ Ｃｌｉｎｉｃの脳腫瘍患者由来異種移植片についてのＲＮＡシーケンスデータを含むウェブベースのフリーツールである。ＦＡＳＴＱＣを用いて、生成したＦＡＳＴＱファイルの品質評価を行った。ＳＴＡＲｖ２．７．３ａを用いて、トリミングしたリードをｈｇ３８にマッピングし、－ｑｕａｎｔＭｏｄｅ ｇｅｎｅＣｏｕｎｔｓ機能を用いて注釈付きの遺伝子計数を取得した。転写数（ＴＰＭ）またはリード値１００万個当たりの１キロベース当たりのリード数（ＲＰＫＭ：ｒｅａｄｓ ｐｅｒ ｋｉｌｏ ｂａｓｅ ｐｅｒ ｍｉｌｌｉｏｎ）を、シングルエンドまたはペアエンドのライブラリーステータスに合わせてＲＳＥＭを用いて計算した。
【0094】
免疫ブロット
免疫ブロット用の患者由来腫瘍細胞を、プロテアーゼ阻害剤を含有するＴｒｉｔｏｎ Ｘ‐１００溶解バッファーで溶解して、超音波処理した。採取したタンパク質溶解物を－２０℃で保管した。Ｐｉｅｒｃｅ ＢＣＡタンパク質アッセイキット（Ｃａｔ＃２３２２７；Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてタンパク質濃度を判定した。総タンパク量１５μｇを１２．５％ＳＤＳ‐ＰＡＧＥによってサイズ分画した。電気泳動で分離したタンパク質を、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜に電気的に転写し、ＰＢＳＴバッファーで洗浄し、２％無脂肪ミルクで１時間、室温でブロッキングし、次いで、４℃で一晩、一次抗体と共にインキュベートした。一次抗体のブロットの後に、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｐｉｃｏ ＰＬＵＳ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｃａｔ＃３４５８０；Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて種に適したペルオキシダーゼ接合二次抗体（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で特定の信号を検出し、Ａｚｕｒｅ ６００ ウエスタンブロット撮像系（Ａｚｕｒｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｄｕｂｌｉｎ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いてその信号を撮像した。ウエスタンブロットに使用した抗体に関する詳細は表３で確認できる。
免疫ブロット用の患者由来腫瘍細胞を、プロテアーゼ阻害剤を含有するＴｒｉｔｏｎ Ｘ‐１００溶解バッファーで溶解して、超音波処理した。採取したタンパク質溶解物を－２０℃で保管した。Ｐｉｅｒｃｅ ＢＣＡタンパク質アッセイキット（Ｃａｔ＃２３２２７；Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてタンパク質濃度を判定した。総タンパク量１５μｇを１２．５％ＳＤＳ‐ＰＡＧＥによってサイズ分画した。電気泳動で分離したタンパク質を、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜に電気的に転写し、ＰＢＳＴバッファーで洗浄し、２％無脂肪ミルクで１時間、室温でブロッキングし、次いで、４℃で一晩、一次抗体と共にインキュベートした。一次抗体のブロットの後に、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｐｉｃｏ ＰＬＵＳ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｃａｔ＃３４５８０；Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて種に適したペルオキシダーゼ接合二次抗体（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で特定の信号を検出し、Ａｚｕｒｅ ６００ ウエスタンブロット撮像系（Ａｚｕｒｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｄｕｂｌｉｎ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いてその信号を撮像した。ウエスタンブロットに使用した抗体に関する詳細は表３で確認できる。
【0095】
【表3】
【0096】
細胞の増殖および生存能力のアッセイ
９６ウェルのクリアボトム黒色マイクロプレート（Ｃａｔ＃３９１７；Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｃｏｓｔａｒ、Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＮＹ、ＵＳＡ）の培地で、成人ＧＢＭ細胞株（ＧＢＭ６、ＧＢＭ１０、ＧＢＭ１４、ＧＢＭ３９、ＧＢＭ４３、およびＧＢＭ１０８）の場合は１ウェル当たり２，５００個の細胞、またはＤＭＧ細胞株（ＳＵ‐ＤＩＰＧ ＸＩＩＩ‐Ｐ、ＳＵ‐ＤＩＰＧ ＸＶＩＩ、ＳＦ８６２８、ＳＦ８６２８‐Ｂ２３、およびＰＥＤ１７）の場合は１ウェル当たり５，０００個の細胞という濃度で、単一細胞懸濁液中の細胞を播種し、５％ＣＯ２で一晩、３７℃で培養した。翌日、ビヒクル（ｄｄＨ２０またはＰＢＳ）、またはＩＬ１３（最終濃度１００ｎｇ／ｍＬ、５０ｎｇ／ｍＬ、２０ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬ、１ｎｇ／ｍＬ、および０．５ｎｇ／ｍＬまで）もしくはｃｍＩＬ１３（最終濃度３２０ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ、３２ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、３．２ｎｇ／ｍＬ、１ｎｇ／ｍＬ、０．３２ｎｇ／ｍＬ、０．１ｎｇ／ｍＬ、０．０３２ｎｇ／ｍＬ、０．０１ｎｇ／ｍＬ、０．００３２ｎｇ／ｍＬ、および０．００１ｎｇ／ｍＬまで）の連続希釈度で、細胞を３回処理した。細胞を７２時間インキュベートし、次いで、製造者の推奨に従ってＣｅｌｌＴｉｔｅｒ‐Ｇｌｏ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ（Ｃａｔ＃Ｇ７５７０；Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、ＵＳＡ）でアッセイした。Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ２００ ＰＲＯマルチモードマイクロプレートリーダー（Ｔｅｃａｎ Ｇｒｏｕｐ、Ｍａｅｎｎｅｄｏｒｆ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いてルミネセンスを測定し、コントロールウェル（ｄｄＨ２０またはＰＢＳのみ）に対して正規化し、相対ルミネセンス処理を薬物濃度の関数としてプロットした。各処理の有効性（５０％阻害濃度、ＩＣ５０）を、Ｐｒｉｓｍ ９（ＧｒａｐｈＰａｄ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて、非線形最小二乗カーブフィッティング法によって計算した。
９６ウェルのクリアボトム黒色マイクロプレート（Ｃａｔ＃３９１７；Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｃｏｓｔａｒ、Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＮＹ、ＵＳＡ）の培地で、成人ＧＢＭ細胞株（ＧＢＭ６、ＧＢＭ１０、ＧＢＭ１４、ＧＢＭ３９、ＧＢＭ４３、およびＧＢＭ１０８）の場合は１ウェル当たり２，５００個の細胞、またはＤＭＧ細胞株（ＳＵ‐ＤＩＰＧ ＸＩＩＩ‐Ｐ、ＳＵ‐ＤＩＰＧ ＸＶＩＩ、ＳＦ８６２８、ＳＦ８６２８‐Ｂ２３、およびＰＥＤ１７）の場合は１ウェル当たり５，０００個の細胞という濃度で、単一細胞懸濁液中の細胞を播種し、５％ＣＯ２で一晩、３７℃で培養した。翌日、ビヒクル（ｄｄＨ２０またはＰＢＳ）、またはＩＬ１３（最終濃度１００ｎｇ／ｍＬ、５０ｎｇ／ｍＬ、２０ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬ、１ｎｇ／ｍＬ、および０．５ｎｇ／ｍＬまで）もしくはｃｍＩＬ１３（最終濃度３２０ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ、３２ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、３．２ｎｇ／ｍＬ、１ｎｇ／ｍＬ、０．３２ｎｇ／ｍＬ、０．１ｎｇ／ｍＬ、０．０３２ｎｇ／ｍＬ、０．０１ｎｇ／ｍＬ、０．００３２ｎｇ／ｍＬ、および０．００１ｎｇ／ｍＬまで）の連続希釈度で、細胞を３回処理した。細胞を７２時間インキュベートし、次いで、製造者の推奨に従ってＣｅｌｌＴｉｔｅｒ‐Ｇｌｏ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ（Ｃａｔ＃Ｇ７５７０；Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、ＵＳＡ）でアッセイした。Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ２００ ＰＲＯマルチモードマイクロプレートリーダー（Ｔｅｃａｎ Ｇｒｏｕｐ、Ｍａｅｎｎｅｄｏｒｆ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いてルミネセンスを測定し、コントロールウェル（ｄｄＨ２０またはＰＢＳのみ）に対して正規化し、相対ルミネセンス処理を薬物濃度の関数としてプロットした。各処理の有効性（５０％阻害濃度、ＩＣ５０）を、Ｐｒｉｓｍ ９（ＧｒａｐｈＰａｄ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて、非線形最小二乗カーブフィッティング法によって計算した。
【0097】
免疫蛍光検査法
４ Ｃｈａｍｂｅｒ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｓｌｉｄｅｓ（Ｃａｔ＃５０‐１１４‐９０５３；ＣＥＬＬＴＲＥＡＴ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｐｅｐｐｅｒｅｌｌ、ＭＡ、ＵＳＡ）上で、１ウェル当たり１０，０００細胞の密度で、単一細胞懸濁液に細胞を播種し、５％ＣＯ２で一晩、３７℃で培養した。２４時間後に、細胞をビヒクル（ＰＢＳ）、またはＣｅｌｌＴｉｔｅｒ‐Ｇｌｏ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）によって判定されるＩＣ５０濃度のｃｍＩＬ１３で処理した。次いで、特定の時点（８時間、２４時間、４８時間、および７２時間）で細胞をＰＢＳで洗浄し、４％パラホルムアルデヒドを用いて２０分間固定した。細胞を３回、それぞれ５分間ＰＢＳで洗浄し、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ‐１００のＰＢＳで５分間インキュベートした。透過処理バッファーのカバースリップを洗浄するために、細胞をＰＢＳで３回、それぞれ５分間インキュベートし、その後、３％ＢＳＡのＰＢＳ‐Ｔで１時間、室温でブロッキングした。次いで、最大２つの異なる一次抗体を１％ＢＳＡのＰＢＳＴに添加し、４℃で一晩置いた。細胞特異的ネガティブコントロールには一次抗体の代わりに希釈バッファーを使用した。翌日、細胞をＰＢＳ‐Ｔで３回、それぞれ５分間洗浄した。次いで、暗所で１時間、室温で、１％ＢＳＡのＰＢＳ‐ＴでＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ結合二次抗体（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と共に細胞をインキュベートした。交差反応を試験するために、他の二次抗体を一次抗体に適用することによって、一次抗体の条件１つにつき１つのコントロールを含めた。さらに３回５分ずつＰＢＳで洗浄した後で、チャンバーを取り外してスライドをｄＨ２０で３回濯いだ。ＤＡＰＩ含有のＰｒｏＬｏｎｇ Ｇｏｌｄ Ａｎｔｉｆａｄｅ試薬（Ｃａｔ＃Ｐ３６９３５；Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてスライドを取り付け、顕微鏡による撮像まで３７℃で保存した。すべてのスライドを検査し、ＬＳＭ７８０共焦点レーザー走査型顕微鏡（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ、Ｗｈｉｔｅ Ｐｌａｉｎｓ、ＮＹ、ＵＳＡ）を用いて画像を取り込んだ。免疫蛍光検査法に使用する抗体に関する詳細情報は上記の表３で確認できる。
４ Ｃｈａｍｂｅｒ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｓｌｉｄｅｓ（Ｃａｔ＃５０‐１１４‐９０５３；ＣＥＬＬＴＲＥＡＴ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｐｅｐｐｅｒｅｌｌ、ＭＡ、ＵＳＡ）上で、１ウェル当たり１０，０００細胞の密度で、単一細胞懸濁液に細胞を播種し、５％ＣＯ２で一晩、３７℃で培養した。２４時間後に、細胞をビヒクル（ＰＢＳ）、またはＣｅｌｌＴｉｔｅｒ‐Ｇｌｏ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）によって判定されるＩＣ５０濃度のｃｍＩＬ１３で処理した。次いで、特定の時点（８時間、２４時間、４８時間、および７２時間）で細胞をＰＢＳで洗浄し、４％パラホルムアルデヒドを用いて２０分間固定した。細胞を３回、それぞれ５分間ＰＢＳで洗浄し、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ‐１００のＰＢＳで５分間インキュベートした。透過処理バッファーのカバースリップを洗浄するために、細胞をＰＢＳで３回、それぞれ５分間インキュベートし、その後、３％ＢＳＡのＰＢＳ‐Ｔで１時間、室温でブロッキングした。次いで、最大２つの異なる一次抗体を１％ＢＳＡのＰＢＳＴに添加し、４℃で一晩置いた。細胞特異的ネガティブコントロールには一次抗体の代わりに希釈バッファーを使用した。翌日、細胞をＰＢＳ‐Ｔで３回、それぞれ５分間洗浄した。次いで、暗所で１時間、室温で、１％ＢＳＡのＰＢＳ‐ＴでＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ結合二次抗体（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と共に細胞をインキュベートした。交差反応を試験するために、他の二次抗体を一次抗体に適用することによって、一次抗体の条件１つにつき１つのコントロールを含めた。さらに３回５分ずつＰＢＳで洗浄した後で、チャンバーを取り外してスライドをｄＨ２０で３回濯いだ。ＤＡＰＩ含有のＰｒｏＬｏｎｇ Ｇｏｌｄ Ａｎｔｉｆａｄｅ試薬（Ｃａｔ＃Ｐ３６９３５；Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてスライドを取り付け、顕微鏡による撮像まで３７℃で保存した。すべてのスライドを検査し、ＬＳＭ７８０共焦点レーザー走査型顕微鏡（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ、Ｗｈｉｔｅ Ｐｌａｉｎｓ、ＮＹ、ＵＳＡ）を用いて画像を取り込んだ。免疫蛍光検査法に使用する抗体に関する詳細情報は上記の表３で確認できる。
【0098】
患者由来異種移植片
いずれの動物実験も、実験動物の使用に関するＮＩＨおよびＩＡＣＵＣのガイドラインに従って実行し、Ｍａｙｏ Ｃｌｉｎｉｃ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｆｏｒ Ａｎｉｍａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈによって承認された。ＨＧＧ細胞株（ＧＢＭ６、ＰＥＤ１７、およびＳＵ‐ＤＩＰＧ ＸＩＩＩ‐Ｐ）に、腫瘍体積の生物発光読出しを可能にするルシフェラーゼレポーター系（ｅＧＦＰ／ｆＬｕｃ２）を形質導入した。Ｗｅｌｂｙ ＪＰ、Ｋａｐｔｚａｎ Ｔ、Ｗｏｈｌ Ａ、Ｐｅｔｅｒｓｏｎ ＴＥ、Ｒａｇｈｕｎａｔｈａｎ Ａ、Ｂｒｏｗｎ ＤＡ、Ｇｕｐｔａ ＳＫ、Ｚｈａｎｇ Ｌ、Ｄａｎｉｅｌｓ ＤＪ（２０１９）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｍｕｒｉｎｅ Ｍｏｄｅｌｓ ａｎｄ Ｎｅｗ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ ｉｎ Ｈ３Ｋ２７Ｍ Ｄｉｆｆｕｓｅ Ｍｉｄｌｉｎｅ Ｇｌｉｏｍａｓ、Ｆｒｏｎｔ Ｏｎｃｏｌ９：９２およびＣａｒｌｓｏｎ ＢＬ、Ｐｏｋｏｒｎｙ ＪＬ、Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ ＭＡ、Ｓａｒｋａｒｉａ ＪＮ（２０１１）Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ， ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｐｒｉｍａｒｙ ｈｕｍａｎ ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ ｍｕｌｔｉｆｏｒｍｅ（ＧＢＭ） ｘｅｎｏｇｒａｆｔ ｍｏｄｅｌｓ ｆｏｒ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｂｉｏｌｏｇｙ ｓｔｕｄｉｅｓ ａｎｄ ｄｒｕｇ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ．Ｃｕｒｒ Ｐｒｏｔｏｃ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｃｈａｐｔｅｒ １４：Ｕｎｉｔ １４．１６で先に説明されているように、培養した細胞を用いて同所性腫瘍接種を行った。それらの文献を本願に引用して援用する。簡潔に言えば、各マウスへの生着のために、単一細胞懸濁液に細胞を置いて、滅菌ＰＢＳ３μｌ中に３００，０００の細胞を用意した。０．５ｍｍの穿頭孔を以下の座標：ブレグマの１ｍｍ後方かつ２ｍｍ右（ＧＢＭ６）またはラムダ縫合の１ｍｍ後方かつ正中矢状面の１ｍｍ側方（ＰＥＤ１７およびＳＵ‐ＤＩＰＧＸＩＩＩ）に作った。Ｅｎｖｉｇｏ（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、ＵＳＡ）から入手した生後６から７週齢の雌性Ｈｓｄ：Ａｔｈｙｍｉｃ Ｎｕｄｅ‐Ｆｏｘｎ１ｎｕ変異マウスの、大脳半球（ＧＢＭ６）または脳橋（ＰＥＤ１７およびＳＵ‐ＤＩＰＧＸＩＩＩ）に、２６ゲージ（５１ｍｍ、ポイントスタイルＡＳ）シリンジ（Ｃａｔ．＃２０３１８５；Ｈａｍｉｌｔｏｎ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｂｏｎａｄｕｚ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて腫瘍細胞を一定流量０．５μｌ／分で定位固定法によって注射した。すべての群で注射の深さは４ｍｍであった。インビボの腫瘍の生着および増悪を生物発光撮像（ＢＬＩ）によってモニタリングした。腹腔内注射でＣｙｃｌｕｃ１０ｍｇ／ｋｇを動物に投薬した。１０分後に、ソフルラン麻酔下で、ＩＶＩＳ‐２００撮像系（Ｘｅｎｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｂｅｒｋｅｌｅｙ、ＣＡ）を用いてマウスを撮像した。ＬｉｖｉｎｇＩｍａｇｅ ４．３（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）を用いて画像解析を行って、対象領域内の総フラックス（１秒当たりの光子数）を定量した。
いずれの動物実験も、実験動物の使用に関するＮＩＨおよびＩＡＣＵＣのガイドラインに従って実行し、Ｍａｙｏ Ｃｌｉｎｉｃ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｆｏｒ Ａｎｉｍａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈによって承認された。ＨＧＧ細胞株（ＧＢＭ６、ＰＥＤ１７、およびＳＵ‐ＤＩＰＧ ＸＩＩＩ‐Ｐ）に、腫瘍体積の生物発光読出しを可能にするルシフェラーゼレポーター系（ｅＧＦＰ／ｆＬｕｃ２）を形質導入した。Ｗｅｌｂｙ ＪＰ、Ｋａｐｔｚａｎ Ｔ、Ｗｏｈｌ Ａ、Ｐｅｔｅｒｓｏｎ ＴＥ、Ｒａｇｈｕｎａｔｈａｎ Ａ、Ｂｒｏｗｎ ＤＡ、Ｇｕｐｔａ ＳＫ、Ｚｈａｎｇ Ｌ、Ｄａｎｉｅｌｓ ＤＪ（２０１９）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｍｕｒｉｎｅ Ｍｏｄｅｌｓ ａｎｄ Ｎｅｗ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ ｉｎ Ｈ３Ｋ２７Ｍ Ｄｉｆｆｕｓｅ Ｍｉｄｌｉｎｅ Ｇｌｉｏｍａｓ、Ｆｒｏｎｔ Ｏｎｃｏｌ９：９２およびＣａｒｌｓｏｎ ＢＬ、Ｐｏｋｏｒｎｙ ＪＬ、Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ ＭＡ、Ｓａｒｋａｒｉａ ＪＮ（２０１１）Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ， ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｐｒｉｍａｒｙ ｈｕｍａｎ ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ ｍｕｌｔｉｆｏｒｍｅ（ＧＢＭ） ｘｅｎｏｇｒａｆｔ ｍｏｄｅｌｓ ｆｏｒ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｂｉｏｌｏｇｙ ｓｔｕｄｉｅｓ ａｎｄ ｄｒｕｇ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ．Ｃｕｒｒ Ｐｒｏｔｏｃ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｃｈａｐｔｅｒ １４：Ｕｎｉｔ １４．１６で先に説明されているように、培養した細胞を用いて同所性腫瘍接種を行った。それらの文献を本願に引用して援用する。簡潔に言えば、各マウスへの生着のために、単一細胞懸濁液に細胞を置いて、滅菌ＰＢＳ３μｌ中に３００，０００の細胞を用意した。０．５ｍｍの穿頭孔を以下の座標：ブレグマの１ｍｍ後方かつ２ｍｍ右（ＧＢＭ６）またはラムダ縫合の１ｍｍ後方かつ正中矢状面の１ｍｍ側方（ＰＥＤ１７およびＳＵ‐ＤＩＰＧＸＩＩＩ）に作った。Ｅｎｖｉｇｏ（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、ＵＳＡ）から入手した生後６から７週齢の雌性Ｈｓｄ：Ａｔｈｙｍｉｃ Ｎｕｄｅ‐Ｆｏｘｎ１ｎｕ変異マウスの、大脳半球（ＧＢＭ６）または脳橋（ＰＥＤ１７およびＳＵ‐ＤＩＰＧＸＩＩＩ）に、２６ゲージ（５１ｍｍ、ポイントスタイルＡＳ）シリンジ（Ｃａｔ．＃２０３１８５；Ｈａｍｉｌｔｏｎ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｂｏｎａｄｕｚ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて腫瘍細胞を一定流量０．５μｌ／分で定位固定法によって注射した。すべての群で注射の深さは４ｍｍであった。インビボの腫瘍の生着および増悪を生物発光撮像（ＢＬＩ）によってモニタリングした。腹腔内注射でＣｙｃｌｕｃ１０ｍｇ／ｋｇを動物に投薬した。１０分後に、ソフルラン麻酔下で、ＩＶＩＳ‐２００撮像系（Ｘｅｎｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｂｅｒｋｅｌｅｙ、ＣＡ）を用いてマウスを撮像した。ＬｉｖｉｎｇＩｍａｇｅ ４．３（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）を用いて画像解析を行って、対象領域内の総フラックス（１秒当たりの光子数）を定量した。
【0099】
脳標的薬物送達のために、研究の開始時（ＢＬＩが約１，０００，０００総対数フラックスに達したとき）に腫瘍サイズが確実に均等に配分されるように、ＢＬＩ信号に基づいてコントロール群（ＰＢＳ）および治療群（ｃｍＩＬ１３）に動物を無作為に分けた。ケタミン１００ｍｇ／ｋｇおよびキシラジン１０ｍｇ／ｋｇを用いた麻酔下にマウスを置いた。眼の後ろから耳の高さまで延びる２ｃｍの中線皮膚切開を行った。先に作った穿頭孔を再度開き、Ｒｏｄｅｎｔ Ｗａｒｍｅｒ Ｘ１（Ｃａｔ＃５３８００Ｍ；Ｓｔｏｅｌｔｉｎｇ、Ｗｏｏｄ Ｄａｌｅ、ＩＬ、ＵＳＡ）を用いた自動熱補助器を有する定位固定台にマウスを固定した。台座の下方に４ｍｍ突出した３３ゲージの内部カニューレ（Ｃａｔ＃８ＩＣ３１５ＩＳ５ＳＰＣ；Ｐ１ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｒｏａｎｏｋｅ、ＶＡ）を、台座の下方に３．５ｍｍ突出した２６ゲージのガイドカニューレ（Ｃａｔ＃８ＩＣ３１５ＧＳ５ＳＰＣ、Ｐ１ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に挿入し、両方ともＰＥチュービングに連結し、シングルコネクターアセンブリー（＃Ｃ３１３Ｃ／ＳＰＣ；Ｐ１ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と固定した。ユニット全体は、カニューレホルダー（Ｃａｔ＃５０５２５４；Ｗｏｒｌｄ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｓａｒａｓｏｔａ、ＦＬ、ＵＳＡ）を用いて垂直に固定し、Ｌｅｇａｔｏ１３０シリンジポンプ（Ｃａｔ＃７８８１３０；ＫＤ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ、ＭＡ、ＵＳＡ）に配置された２２ゲージ（５１ｍｍ、ポイントスタイルＡＳ）シリンジ（Ｃａｔ＃８０４００；Ｈａｍｉｌｔｏｎ Ｃｏｍｐａｎｙ）に連結した。その後、ビヒクル（ＰＢＳ）および薬物（濃度が５０μｇ／ｍｌ（１μｇ用量）、１５μｇ／ｍｌ（０．３μｇ用量）、または５μｇ／ｍｌ（０．１μｇ用量）のｃｍＩＬ１３）溶液を内部カニューレおよび関連するチュービングを通してプライミングした。内部カニューレが取り付けられたカニューレホルダーを、所望の注射の深さの４ｍｍ（ＧＢＭ６）または４．２ｍｍ（ＰＥＤ１７およびＳＵ‐ＤＩＰＧＸＩＩＩ）に達するようにマウス頭蓋骨と面一になるまで下降させた。すべての研究群において、同じ増減のＣＥＤ注入プロトコルを行い、注入した全体積が２０μｌであり、注入速度は以下の通りであった：０．２μｌ／分で３μｌ、０．５μｌ／分で５μｌ、および０．８μｌ／分で１２μｌ。注射管への逆流を避けるために、注入完了後１０分でカニューレを取り外した。動物を毎日モニタリングし、進行性の神経欠損を示す場合または瀕死状態にあることが分かった場合には安楽死させた。
【0100】
免疫組織化学法
二酸化炭素吸入による動物の安楽死の後に脳を採取し、室温で一晩、４％パラホルムアルデヒドに固定化した。次いで、脳をパラフィン包埋し、ミクロトーム（ＣＭ１８６０ＵＶ；Ｌｅｉｃａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｂｕｆｆａｌｏ Ｇｒｏｖｅ、ＩＬ、ＵＳＡ）を用いて前頭面で薄切した（５μｍ／切片）。標準的な手順に従ってヘマトキシリンおよびエオジン（Ｈ＆Ｅ：ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ ａｎｄ ｅｏｓｉｎ）染色を行った。免疫組織化学法のために、パラフィン包埋した組織切片をキシレンで脱ろうし、エタノールで再水和した。抗原賦活化は、予熱したクエン酸ナトリウムバッファー（１０ｍＭクエン酸三ナトリウム、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ６．０）で３０分間スライドを蒸し焼きすることによって行った。切片を室温まで冷却し、ｄＨ２０で１分間濯いだ。その後に、切片を０．６％過酸化水素のＭｅＯＨで２０分間浸漬した。次いで、１０％正常ヤギ血清（ＮＧＳ）のトリス緩衝食塩水（ＴＢＳ）で、切片を室温で３０分間ブロッキングした。一次抗体を２％ＮＧＳおよび０．５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ‐１００のＴＢＳで希釈し、切片に加えて４℃で一晩置いた。組織特異的ネガティブコントロールには一次抗体の代わりに希釈バッファーを使用した。翌日、切片を３回５分間、２％ＮＧＳおよび０．５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ‐１００のＴＢＳで洗浄した。ビオチン化二次抗体を含有するＶＥＣＴＡＳＴＡＩＮ Ｅｌｉｔｅ ＡＢＣ ｋｉｔ（Ｃａｔ＃ＰＫ‐６１００；ＶＥＣＴＯＲ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ）を、製造者の推奨に従って１．５％ＮＧＳを含むＴＢＳで希釈して切片に加えた。さらに３回５分間ＴＢＳで洗浄した後に、アビジン／ビオチン酵素複合体（ＡＢＣ：Ａｖｉｄｉｎ／Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ Ｅｎｚｙｍｅ Ｃｏｍｐｌｅｘ）溶液（Ｃａｔ＃ＰＫ‐６１００；ＶＥＣＴＯＲ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）を用いて室温で３０分間、切片をインキュベートした。その後、視覚化のために、製造者のプロトコルに準拠して、ＳｉｇｎａｌＳｔａｉｎ ＤＡＢ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｋｉｔ（Ｃａｔ＃８０５９Ｐ；Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、Ｄａｎｖｅｒｓ、ＭＡ、ＵＳＡ）を用いて切片を現像し、ヘマトキシリンで対比染色し、パーマウント（Ｃａｔ＃ＳＰ１５‐１００、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で取り付けた。画像をデジタルスライドスキャナー（Ａｘｉｏ Ｓｃａｎ．Ｚ１；Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）で取得し、倍率４０ｘで表示した。免疫組織化学法（ＩＨＣ）に使用した抗体に関する詳細情報は上記の表３に提供されている。組織切片の染色の一貫性を示すために低拡大率の画像を含めた。
二酸化炭素吸入による動物の安楽死の後に脳を採取し、室温で一晩、４％パラホルムアルデヒドに固定化した。次いで、脳をパラフィン包埋し、ミクロトーム（ＣＭ１８６０ＵＶ；Ｌｅｉｃａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｂｕｆｆａｌｏ Ｇｒｏｖｅ、ＩＬ、ＵＳＡ）を用いて前頭面で薄切した（５μｍ／切片）。標準的な手順に従ってヘマトキシリンおよびエオジン（Ｈ＆Ｅ：ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ ａｎｄ ｅｏｓｉｎ）染色を行った。免疫組織化学法のために、パラフィン包埋した組織切片をキシレンで脱ろうし、エタノールで再水和した。抗原賦活化は、予熱したクエン酸ナトリウムバッファー（１０ｍＭクエン酸三ナトリウム、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ６．０）で３０分間スライドを蒸し焼きすることによって行った。切片を室温まで冷却し、ｄＨ２０で１分間濯いだ。その後に、切片を０．６％過酸化水素のＭｅＯＨで２０分間浸漬した。次いで、１０％正常ヤギ血清（ＮＧＳ）のトリス緩衝食塩水（ＴＢＳ）で、切片を室温で３０分間ブロッキングした。一次抗体を２％ＮＧＳおよび０．５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ‐１００のＴＢＳで希釈し、切片に加えて４℃で一晩置いた。組織特異的ネガティブコントロールには一次抗体の代わりに希釈バッファーを使用した。翌日、切片を３回５分間、２％ＮＧＳおよび０．５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ‐１００のＴＢＳで洗浄した。ビオチン化二次抗体を含有するＶＥＣＴＡＳＴＡＩＮ Ｅｌｉｔｅ ＡＢＣ ｋｉｔ（Ｃａｔ＃ＰＫ‐６１００；ＶＥＣＴＯＲ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ）を、製造者の推奨に従って１．５％ＮＧＳを含むＴＢＳで希釈して切片に加えた。さらに３回５分間ＴＢＳで洗浄した後に、アビジン／ビオチン酵素複合体（ＡＢＣ：Ａｖｉｄｉｎ／Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ Ｅｎｚｙｍｅ Ｃｏｍｐｌｅｘ）溶液（Ｃａｔ＃ＰＫ‐６１００；ＶＥＣＴＯＲ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）を用いて室温で３０分間、切片をインキュベートした。その後、視覚化のために、製造者のプロトコルに準拠して、ＳｉｇｎａｌＳｔａｉｎ ＤＡＢ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｋｉｔ（Ｃａｔ＃８０５９Ｐ；Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、Ｄａｎｖｅｒｓ、ＭＡ、ＵＳＡ）を用いて切片を現像し、ヘマトキシリンで対比染色し、パーマウント（Ｃａｔ＃ＳＰ１５‐１００、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で取り付けた。画像をデジタルスライドスキャナー（Ａｘｉｏ Ｓｃａｎ．Ｚ１；Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）で取得し、倍率４０ｘで表示した。免疫組織化学法（ＩＨＣ）に使用した抗体に関する詳細情報は上記の表３に提供されている。組織切片の染色の一貫性を示すために低拡大率の画像を含めた。
【0101】
統計分析
データを取得し、適切な場合に平均±標準偏差または標準誤差として提示した。２群の間の直接的な統計比較を、スチューデントの両側ｔ検定を用いて実行した。非線形最小二乗カーブフィッティング分析を使用してインビトロｃｍＩＬ１３治療の有効性（ＩＣ５０）を判定した。ログランク検定と共にカプランマイヤー推定を用いて生存率分析を行った。統計試験および分析をＰｒｉｓｍ ９（ＧｒａｐｈＰａｄ）を用いて実行し、統計的有意性をα閾値０．０５に設定し、図にはｐ＜０．０５にアステリスクを付けた。
データを取得し、適切な場合に平均±標準偏差または標準誤差として提示した。２群の間の直接的な統計比較を、スチューデントの両側ｔ検定を用いて実行した。非線形最小二乗カーブフィッティング分析を使用してインビトロｃｍＩＬ１３治療の有効性（ＩＣ５０）を判定した。ログランク検定と共にカプランマイヤー推定を用いて生存率分析を行った。統計試験および分析をＰｒｉｓｍ ９（ＧｒａｐｈＰａｄ）を用いて実行し、統計的有意性をα閾値０．０５に設定し、図にはｐ＜０．０５にアステリスクを付けた。
【0102】
結果
ＨＧＧ腫瘍細胞モデルにおいて異なるレベルでＩＬ‐１３Ｒα２が発現される
ＨＧＧ細胞におけるＩＬ‐１３Ｒα２のベースライン転写レベルおよびタンパク質レベルを特定するために、ＲＮＡシーケンシングおよび免疫ブロットを患者由来ＨＧＧ細胞株１０種類（ＤＭＧが４種類および成人ＧＢＭが６種類）に対して行った（図１Ａ、図１Ｂ）。以前の調査によれば、シーケンシングされたＨＧＧトランスクリプトームのコホートは、ＨＧＧ細胞株間でＩＬ‐１３Ｒα２ ＲＮＡの発現パターンが異なることが確認された（図１Ａ）。ＤＭＧおよび成人ＧＢＭの両方のモデルにおいて、ＩＬ‐１３Ｒα２転写レベルは、低発現（ＳＵ‐ＤＩＰＧ ＸＩＩＩ‐Ｐ、ＧＢＭ３９、ＧＢＭ１０８）から中発現（ＳＵ‐ＤＩＰＧ ＸＶＩＩ、ＳＦ８６２８、ＧＢＭ４３、ＧＢＭ６）および高発現（ＰＥＤ１７、ＧＢＭ１０、ＧＢＭ１４）まであった。次に、入手可能なＨＧＧ細胞株のＩＬ‐１３Ｒα２タンパク質レベルを査定した。それに対応して、ＩＬ‐１３Ｒα２タンパク質レベルは、ＤＭＧおよび成人ＧＢＭ細胞株の両方で遺伝子発現と一致した（図１Ｂ）。ＰＥＤ１７、ＧＢＭ１０、ＧＢＭ１４、ＧＢＭ５９、およびＧＢＭ１１８を含むいくつかの細胞モデルは、高いＩＬ‐１３Ｒα２発現を示したが、ＳＵ‐ＤＩＰＧ ＸＶＩＩ、ＳＦ８６２８、ＳＦ８６２８‐Ｂ２３、ＧＢＭ６、ＧＢＭ１２、およびＧＢＭ４３など他の細胞モデルは（無いわけではないが）著しく低いＩＬ‐１３Ｒα２レベルを示した。ＳＵ‐ＤＩＰＧ ＸＩＩＩ‐Ｐ、ＧＢＭ３９、ＧＢＭ１０８、およびＧＢＭ１２３を含む、ＨＧＧ細胞株の第３のカテゴリーは、ＩＬ‐１３Ｒα２タンパク質レベルがアッセイの検出閾値未満であったことを示した。
ＨＧＧ腫瘍細胞モデルにおいて異なるレベルでＩＬ‐１３Ｒα２が発現される
ＨＧＧ細胞におけるＩＬ‐１３Ｒα２のベースライン転写レベルおよびタンパク質レベルを特定するために、ＲＮＡシーケンシングおよび免疫ブロットを患者由来ＨＧＧ細胞株１０種類（ＤＭＧが４種類および成人ＧＢＭが６種類）に対して行った（図１Ａ、図１Ｂ）。以前の調査によれば、シーケンシングされたＨＧＧトランスクリプトームのコホートは、ＨＧＧ細胞株間でＩＬ‐１３Ｒα２ ＲＮＡの発現パターンが異なることが確認された（図１Ａ）。ＤＭＧおよび成人ＧＢＭの両方のモデルにおいて、ＩＬ‐１３Ｒα２転写レベルは、低発現（ＳＵ‐ＤＩＰＧ ＸＩＩＩ‐Ｐ、ＧＢＭ３９、ＧＢＭ１０８）から中発現（ＳＵ‐ＤＩＰＧ ＸＶＩＩ、ＳＦ８６２８、ＧＢＭ４３、ＧＢＭ６）および高発現（ＰＥＤ１７、ＧＢＭ１０、ＧＢＭ１４）まであった。次に、入手可能なＨＧＧ細胞株のＩＬ‐１３Ｒα２タンパク質レベルを査定した。それに対応して、ＩＬ‐１３Ｒα２タンパク質レベルは、ＤＭＧおよび成人ＧＢＭ細胞株の両方で遺伝子発現と一致した（図１Ｂ）。ＰＥＤ１７、ＧＢＭ１０、ＧＢＭ１４、ＧＢＭ５９、およびＧＢＭ１１８を含むいくつかの細胞モデルは、高いＩＬ‐１３Ｒα２発現を示したが、ＳＵ‐ＤＩＰＧ ＸＶＩＩ、ＳＦ８６２８、ＳＦ８６２８‐Ｂ２３、ＧＢＭ６、ＧＢＭ１２、およびＧＢＭ４３など他の細胞モデルは（無いわけではないが）著しく低いＩＬ‐１３Ｒα２レベルを示した。ＳＵ‐ＤＩＰＧ ＸＩＩＩ‐Ｐ、ＧＢＭ３９、ＧＢＭ１０８、およびＧＢＭ１２３を含む、ＨＧＧ細胞株の第３のカテゴリーは、ＩＬ‐１３Ｒα２タンパク質レベルがアッセイの検出閾値未満であったことを示した。
【0103】
ＨＧＧの増殖および生存に対するＩＬ１３Ｒα２の機能的影響
ＤＭＧおよび成人ＧＢＭの腫瘍細胞モデルにＩＬ‐１３Ｒα２の細胞株依存の過剰発現があると仮定して、ＨＧＧにおけるＩＬ‐１３Ｒα２のシグナル伝達の役割を調査した（図２Ａ～図２Ｆ）。サイトカイン刺激がインビトロで細胞増殖に影響するかどうかを判定するために、様々な濃度のＩＬ‐１３Ｒα２の標準リガンド、ＩＬ１３でＨＧＧ細胞を処理した。ＳＵ‐ＤＩＰＧ ＸＩＩＩ‐Ｐの反応が無いことは、アッセイした細胞モデルにおけるＩＬ‐１３Ｒα２の低発現と矛盾しなかったが、ＩＬ１３で刺激したＩＬ‐１３Ｒα２が中発現の細胞株も、ＩＬ‐１３Ｒα２が高発現の細胞株も、コントロールとしての媒体に対して細胞増殖の有意な増大を示さなかった（図２Ａ）。ＩＬ‐１３Ｒα２が細胞の増殖および浸潤よりも細胞の生存に関係があることを示した以前の報告に基づいて、サイトカイン刺激がその抗アポトーシス効果を強めるＩＬ‐１３Ｒα２発現の増大と関連していると仮定した。これを試験するために、ＨＧＧ細胞をＩＬ‐１３（１０ｎｇ／ｍＬ）で刺激して、様々な時点でタンパク質レベルを調査した（図２Ｃ）。ＩＬ１３による刺激は、ＩＬ‐１３Ｒα２が中発現の細胞株およびＩＬ‐１３Ｒα２が高発現の細胞株において、８時間、２４時間、４８時間、および７２時間後にＩＬ‐１３Ｒα２の強固な上方制御をもたらした。逆に、ＩＬ‐１３Ｒα１のレベルは、アッセイしたいずれのＨＧＧ細胞モデルでもＩＬ１３刺激による影響を受けなかった。
ＤＭＧおよび成人ＧＢＭの腫瘍細胞モデルにＩＬ‐１３Ｒα２の細胞株依存の過剰発現があると仮定して、ＨＧＧにおけるＩＬ‐１３Ｒα２のシグナル伝達の役割を調査した（図２Ａ～図２Ｆ）。サイトカイン刺激がインビトロで細胞増殖に影響するかどうかを判定するために、様々な濃度のＩＬ‐１３Ｒα２の標準リガンド、ＩＬ１３でＨＧＧ細胞を処理した。ＳＵ‐ＤＩＰＧ ＸＩＩＩ‐Ｐの反応が無いことは、アッセイした細胞モデルにおけるＩＬ‐１３Ｒα２の低発現と矛盾しなかったが、ＩＬ１３で刺激したＩＬ‐１３Ｒα２が中発現の細胞株も、ＩＬ‐１３Ｒα２が高発現の細胞株も、コントロールとしての媒体に対して細胞増殖の有意な増大を示さなかった（図２Ａ）。ＩＬ‐１３Ｒα２が細胞の増殖および浸潤よりも細胞の生存に関係があることを示した以前の報告に基づいて、サイトカイン刺激がその抗アポトーシス効果を強めるＩＬ‐１３Ｒα２発現の増大と関連していると仮定した。これを試験するために、ＨＧＧ細胞をＩＬ‐１３（１０ｎｇ／ｍＬ）で刺激して、様々な時点でタンパク質レベルを調査した（図２Ｃ）。ＩＬ１３による刺激は、ＩＬ‐１３Ｒα２が中発現の細胞株およびＩＬ‐１３Ｒα２が高発現の細胞株において、８時間、２４時間、４８時間、および７２時間後にＩＬ‐１３Ｒα２の強固な上方制御をもたらした。逆に、ＩＬ‐１３Ｒα１のレベルは、アッセイしたいずれのＨＧＧ細胞モデルでもＩＬ１３刺激による影響を受けなかった。
【0104】
ｃｍＩＬ１３はＨＧＧ細胞モデルにおいて強力な抗腫瘍効果を発揮する
ＩＬ‐１３Ｒα２発現がインビトロでＩＬ‐１３Ｒα２標的療法に対する感度をもたらすかどうかを評価するために、ｃｍＩＬ１３に対するＨＧＧ細胞の薬理学的反応を試験した。ＨＧＧ細胞株１１種類（ＤＭＧが５種類および成人ＧＢＭが６種類）を選択し、０．００１ｎｇ／ｍＬ～３２０ｎｇ／ｍＬの範囲の様々な濃度のｃｍＩＬ１３に曝露した。その結果は、ＩＬ‐１３Ｒα２発現とｃｍＩＬ１３感度との間に直接的な関係を示した（図２Ｂ、図３）。ｃｍＩＬ１３は、ＩＬ‐１３Ｒα２が高い細胞株において強い細胞毒性を示し、そのことは、比較的感度が低くＩＬ‐１３Ｒα２が低い細胞モデルに対して、用量反応曲線上で顕著に左に寄っていることで特徴付けられた。ＩＬ‐１３Ｒα２が高い細胞におけるｃｍＩＬ１３のＩＣ５０値は、ＰＥＤ１７細胞で０．０２ｎｇ／ｍＬ、ＧＢＭ１４で０．０６ｎｇ／ｍＬ、およびＧＢＭ１０で０．５８ｎｇ／ｍＬであった。ＩＬ‐１３Ｒα２が中程度の細胞は、ｃｍＩＬ１３に関して以下のＩＣ５０値を示した：ＳＦ８６２８で０．１０ｎｇ／ｍＬ、ＳＵ‐ＤＩＰＧ ＸＶＩＩで０．７５ｎｇ／ｍＬ、ＳＦ８６２８‐Ｂ２３で０．８１ｎｇ／ｍＬ、ＧＢＭ６で０．１２ｎｇ／ｍＬ、およびＧＢＭ４３で９．０８ｎｇ／ｍＬ。最後に、ＩＬ‐１３Ｒα２が低い細胞におけるｃｍＩＬ１３のＩＣ５０値は、ＳＵ‐ＤＩＰＧ ＸＩＩＩ‐Ｐで１０．６３ｎｇ／ｍＬ、ＧＢＭ１０８で１５．７４ｎｇ／ｍＬ、ＧＢＭ３９で５３．８２ｎｇ／ｍＬであった。ＤＭＧおよび成人ＧＢＭ細胞モデルは両方とも、ＩＬ‐１３Ｒα２の状態に応じてｃｍＩＬ１３に対する同様の感度を示した。
ＩＬ‐１３Ｒα２発現がインビトロでＩＬ‐１３Ｒα２標的療法に対する感度をもたらすかどうかを評価するために、ｃｍＩＬ１３に対するＨＧＧ細胞の薬理学的反応を試験した。ＨＧＧ細胞株１１種類（ＤＭＧが５種類および成人ＧＢＭが６種類）を選択し、０．００１ｎｇ／ｍＬ～３２０ｎｇ／ｍＬの範囲の様々な濃度のｃｍＩＬ１３に曝露した。その結果は、ＩＬ‐１３Ｒα２発現とｃｍＩＬ１３感度との間に直接的な関係を示した（図２Ｂ、図３）。ｃｍＩＬ１３は、ＩＬ‐１３Ｒα２が高い細胞株において強い細胞毒性を示し、そのことは、比較的感度が低くＩＬ‐１３Ｒα２が低い細胞モデルに対して、用量反応曲線上で顕著に左に寄っていることで特徴付けられた。ＩＬ‐１３Ｒα２が高い細胞におけるｃｍＩＬ１３のＩＣ５０値は、ＰＥＤ１７細胞で０．０２ｎｇ／ｍＬ、ＧＢＭ１４で０．０６ｎｇ／ｍＬ、およびＧＢＭ１０で０．５８ｎｇ／ｍＬであった。ＩＬ‐１３Ｒα２が中程度の細胞は、ｃｍＩＬ１３に関して以下のＩＣ５０値を示した：ＳＦ８６２８で０．１０ｎｇ／ｍＬ、ＳＵ‐ＤＩＰＧ ＸＶＩＩで０．７５ｎｇ／ｍＬ、ＳＦ８６２８‐Ｂ２３で０．８１ｎｇ／ｍＬ、ＧＢＭ６で０．１２ｎｇ／ｍＬ、およびＧＢＭ４３で９．０８ｎｇ／ｍＬ。最後に、ＩＬ‐１３Ｒα２が低い細胞におけるｃｍＩＬ１３のＩＣ５０値は、ＳＵ‐ＤＩＰＧ ＸＩＩＩ‐Ｐで１０．６３ｎｇ／ｍＬ、ＧＢＭ１０８で１５．７４ｎｇ／ｍＬ、ＧＢＭ３９で５３．８２ｎｇ／ｍＬであった。ＤＭＧおよび成人ＧＢＭ細胞モデルは両方とも、ＩＬ‐１３Ｒα２の状態に応じてｃｍＩＬ１３に対する同様の感度を示した。
【0105】
次に、ＩＬ‐１３Ｒα２に対するｃｍＩＬ１３の作用を明らかにするために、ＨＧＧ細胞をＩＣ５０濃度の薬物で処理し、８時間、２４時間、４８時間、および７２時間の時点のタンパク質レベルを調査した（図２Ｄ）。ＩＬ１３刺激と同様に、ｃｍＩＬ１３は、ＩＬ‐１３Ｒα２の下方制御を誘発しなかったが、むしろタンパク質レベルは経時的に安定したかまたは上昇した。興味深いことに、ＩＬ‐１３Ｒα１は、ｃｍＩＬ１３に曝露された、いくつかのＩＬ‐１３Ｒα２が中程度の細胞モデルおよびＩＬ‐１３Ｒα２が高い細胞モデルにおいて上方制御された。さらに、アポトーシス誘導は、切断型カスパーゼ３および／または切断型ＰＡＲＰのレベルの上昇によって特徴付けられた。それらの結果は、共焦点顕微鏡検査によって確認され（図２Ｅ、図４）、そこでは、ベースラインにおいて顕著なＩＬ‐１３Ｒα２レベルが見られ、これはｃｍＩＬ１３で処理された細胞において最大７２時間維持された。ｃｍＩＬ１３のＰＥドメインの染色によって、受容体への薬物の共局在化ならびに細胞質および細胞核への内在化を確認した。アポトーシスのレベルの上昇に加えて、ｃｍＩＬ１３の存在下で細胞増殖が低下した。
【0106】
ｃｍＩＬ１３の腫瘍内投与によって、インビボでの腫瘍負荷が軽減され生存期間が延びた
ｃｍＩＬ１３のインビボでの抗腫瘍効果を検証するために、ＩＬ‐１３Ｒα２低発現（ＳＵ‐ＤＩＰＧ ＸＩＩＩ‐Ｐ）、ＩＬ‐１３Ｒα２中発現（ＧＢＭ６）、およびＩＬ‐１３Ｒα２高発現（ＰＥＤ１７）のモデルを含む、ＨＧＧの同所性患者由来ネズミ異種移植モデルを利用した。腫瘍担持動物を４つのコホートに無作為に分け、１治療群当たり４～５匹の動物に、単回の脳標的用量のｃｍＩＬ１３のＣＥＤによって治療した（図５Ａ）。ビヒクル溶液（ＰＢＳ）または様々な用量のｃｍＩＬ１３を大脳半球のＧＢＭ６腫瘍領域に注入することによって、薬物送達システムをまず成体ＧＢＭ動物に確立した。すべてのＣＥＤシステムが合併症なく配置され、許容された。処置関係の死亡は起きず、注入完了後の動物の臨床評価はいずれも異常がなく、急性毒性もしくは遅発毒性または神経欠損の兆候は見られなかった。ＢＬＩで測定した腫瘍体積は、０．３μｇ（ｐ＝０．１４）、０．１μｇ（ｐ＝０．０８）、およびビヒクル治療群と比べて、１μｇのｃｍＩＬ１３で治療した動物（ｐ＝０．０１）において有意に低かった（図５Ｂ）。０．３μｇのｃｍＩＬ１３で６４日間（ｐ＝０．３５）、０．１μｇのｃｍＩＬ１３で６８日間（ｐ＝０．１７）、およびビヒクル群で５７日間であることと比べて、単回用量の１μｇのｃｍＩＬ１３は、生存期間を有意に延ばし、生存期間中央値が８４日間（ｐ＝０．０１）であった（図５Ｃ）。
ｃｍＩＬ１３のインビボでの抗腫瘍効果を検証するために、ＩＬ‐１３Ｒα２低発現（ＳＵ‐ＤＩＰＧ ＸＩＩＩ‐Ｐ）、ＩＬ‐１３Ｒα２中発現（ＧＢＭ６）、およびＩＬ‐１３Ｒα２高発現（ＰＥＤ１７）のモデルを含む、ＨＧＧの同所性患者由来ネズミ異種移植モデルを利用した。腫瘍担持動物を４つのコホートに無作為に分け、１治療群当たり４～５匹の動物に、単回の脳標的用量のｃｍＩＬ１３のＣＥＤによって治療した（図５Ａ）。ビヒクル溶液（ＰＢＳ）または様々な用量のｃｍＩＬ１３を大脳半球のＧＢＭ６腫瘍領域に注入することによって、薬物送達システムをまず成体ＧＢＭ動物に確立した。すべてのＣＥＤシステムが合併症なく配置され、許容された。処置関係の死亡は起きず、注入完了後の動物の臨床評価はいずれも異常がなく、急性毒性もしくは遅発毒性または神経欠損の兆候は見られなかった。ＢＬＩで測定した腫瘍体積は、０．３μｇ（ｐ＝０．１４）、０．１μｇ（ｐ＝０．０８）、およびビヒクル治療群と比べて、１μｇのｃｍＩＬ１３で治療した動物（ｐ＝０．０１）において有意に低かった（図５Ｂ）。０．３μｇのｃｍＩＬ１３で６４日間（ｐ＝０．３５）、０．１μｇのｃｍＩＬ１３で６８日間（ｐ＝０．１７）、およびビヒクル群で５７日間であることと比べて、単回用量の１μｇのｃｍＩＬ１３は、生存期間を有意に延ばし、生存期間中央値が８４日間（ｐ＝０．０１）であった（図５Ｃ）。
【0107】
瀕死状態で安楽死させられたマウスの脳の組織学的査定は、ｃｍＩＬ１３治療後に組織構造が維持されたことおよび腫瘍サイズが小さくなったことを示した（図６Ａ）。コントロールと比べたときの薬物治療したマウスのＩＬ‐１３Ｒα２レベル、アポトーシス誘導、および細胞増殖のＩＨＣ分析によって、腫瘍内の薬物のオンターゲット効果を検証した。インビトロデータと一致して、ＧＢＭ６細胞ではＩＬ‐１３Ｒα２の高い状態が維持された（図６Ｂ）。Ｋｉ‐６７染色で判定した細胞増殖は、ｃｍＩＬ１３への曝露の後に低下した（図６Ｂおよび図６Ｃ）。興味深いことに、アポトーシスマーカーの切断型カスパーゼ３の強い染色は、腫瘍領域全体でおよびすべてのｃｍＩＬ１３群において明らかであったが、ビヒクル治療された動物にはｃｍＩＬ１３投与の後数週間は見られなかった（図６Ｂ）。脳へのイムノトキシンの送達を伴うことがある毒性を考慮するために、成熟神経細胞のマーカーであるＮｅｕＮならびにミクログリアおよび単球によって高いレベルで発現するＣＤ６８に関して付加的なＩＨＣ分析を行った。ｃｍＩＬ１３のＣＥＤは、注入された同側大脳半球においてＮｅｕＮ陽性細胞がビヒクルと比べて減少しなかった（図６Ｂおよび図６Ｃ）。いずれの研究群でも免疫細胞浸潤がなかったことが明らかである（図６Ｂおよび図６Ｃ）。
【0108】
これらの発見を、ＩＬ‐１３Ｒα２が上方制御されたＤＭＧ異種移植モデルにおいて検証した。ＰＥＤ１７細胞を脳橋の同所性に植え込み、腫瘍担持動物をビヒクル溶液、０．１μｇ、０．３μｇ、または１μｇのｃｍＩＬ１３で再び治療した。以前の観察と同じく、すべての動物がＣＥＤ処置に耐えたが、最大用量（１μｇのｃｍＩＬ１３のＣＥＤ注入）のときに、注入後２４時間以内に５／５の動物に毒性の発症の兆候（片側不全麻痺または運動失調などの神経欠損、円背姿勢、皮膚炎）が見られ、４／５の動物を薬物投与後７２時間以内に安楽死させなければならなかった。術後臨床評価は、０．１μｇまたは０．３μｇのｃｍＩＬ１３で治療した動物については異常がなかった。ＢＬＩ信号の比較は、単回の０．１μｇまたは０．３μｇのｃｍＩＬ１３の注入が腫瘍体積を有意に減少させ（ｐ＝０．０００１および０．０００４、図５Ｄ）、ビヒクル群（１２８日間）と比べて生存期間中央値を有意に延ばした（０．１μｇのｃｍＩＬ３で１４７日間（ｐ＝０．００３）および０．３μｇのｃｍＩＬ１３で１５５日間（ｐ＝０．００３））ことを示した（図５Ｅ）。大脳半球ＧＢＭ６腫瘍での発見と同様に、０．１μｇ用量も０．３μｇ用量も、ＮｅｕＮ＋細胞密度およびＣＤ６８＋細胞浸潤に影響しなかった。臨床毒性の観測された差と一致して、１μｇ用量のｃｍＩＬ１３は、より低用量のｃｍＩＬ１３またはビヒクルコントロールと比べて、脳幹のＮｅｕＮ陽性細胞の顕著な減少をもたらした。１μｇのｃｍＩＬ１３への曝露の後に単球細胞の浸潤は認められなかった。検出されたＩＬ‐１３Ｒα２のレベルは、治療群の間で一定のままであった。薬物治療した腫瘍において、ＤＭＧに特徴的なＨ３ Ｋ２７Ｍの減少およびＨ３ Ｋ２７ｍｅ３の増加が明らかであった。付加的なＩＨＣの発見は、第１の研究の結果と同等であった（図７Ａおよび図７Ｂ）。
【0109】
最後に、ＩＬ‐１３Ｒα２タンパク質レベルの低いＨＧＧ異種移植モデルを確立するために、ＤＭＧ細胞株ＳＵ‐ＤＩＰＧ ＸＩＩＩ‐Ｐを使用した。インビトロデータに基づいて、以前に確立した投薬計画を用いてｃｍＩＬ１３が腫瘍体積または生存期間に影響することは予期していなかった。実際に、０．１μｇ、０．３μｇ、または１μｇのｃｍＩＬ１３のＣＥＤは、有意な腫瘍増殖の減少を示すことができず（それぞれｐ＝０．１６、０．１８、および０．２７、図５Ｆ）、コントロール動物（ビヒクルで２４．５日間、０．１μｇのｃｍＩＬ１３で２３日間（ｐ＝０．９２）、０．３μｇのｃｍＩＬ１３で２４日間（ｐ＝０．６８）、および１μｇのｃｍＩＬ１３で２４日間（ｐ＝０．５７））と比べて、大きい生存利益を提供しなかった（図５Ｇ）。ＣＥＤ処置はすべての治療群の間で実行可能であり安全であることを証明し、０．１μｇまたは０．３μｇのｃｍＩＬ１３で治療したマウスでは、ＮｅｕＮ陽性細胞の免疫細胞浸潤または減少が観測されなかったが、１μｇのｃｍＩＬ１３で治療した動物の脳幹におけるＮｅｕＮ＋細胞密度の低下もやはり認められなかった。ＩＨＣは、ｃｍＩＬ１３で薬物治療したＩＬ‐１３Ｒα２の低い異種移植片では切断型カスパーゼ３の染色増加を示さず、ｃｍＩＬ１３の注入後にそれらの腫瘍で高い細胞増殖が維持された。インビトロのタンパク質レベル分析に従って、ＩＬ‐１３Ｒα２のＩＨＣ染色はＳＵ‐ＤＩＰＧ ＸＩＩＩ‐Ｐ異種移植片には存在しなかった。さらに、Ｈ３ Ｋ２７ＭおよびＨ３ Ｋ２７ｍｅ３は、ビヒクル対ｃｍＩＬ１３治療した腫瘍との間でほぼ変わらないままであった。これらの結果は、ＨＧＧ同所性異種移植モデルの治療効果をもたらすためにｃｍＩＬ１３などの標的療法にはＩＬ‐１３Ｒα２の上方制御が必要であることを示している。
【0110】
本開示の特定の態様を詳細に説明してきたが、それらの詳細に対する様々な修正例および改変例を本開示の教示全体に鑑みて考案できることが当業者には理解されよう。したがって、開示されている特定の構成は単なる例示を目的とし、添付の特許請求の範囲および態様ならびにそれらのあらゆる等価物の最大の範囲を与えられるべき本開示の範囲を限定する意図はない。
【図1A】
【図1B】
【図2A】
【図2B】
【図2C】
【図2D】
【図2E】
【図2F】
【図3】
【図4】
【図5A】
【図5B】
【図5C】
【図5D】
【図5E】
【図5F】
【図5G】
【図6A】
【図6B】
【図6C】
【図7A】
【図7B】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2024-07-10
【手続補正1】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0001】
政府契約
本開示は、国立衛生研究所により授与された政府契約番号Ｒ４３ ＣＡ２７５５６０の下で政府の支援によってなされたものである。米国政府は本発明の一定の権利を有する。 関連出願の相互参照
本願は、２０２１年１１月１０日出願の米国特許仮出願第６３／２７７，８６６号の利益を主張するものであり、その文献を本願に引用して援用する。
本開示は、国立衛生研究所により授与された政府契約番号Ｒ４３ ＣＡ２７５５６０の下で政府の支援によってなされたものである。米国政府は本発明の一定の権利を有する。 関連出願の相互参照
本願は、２０２１年１１月１０日出願の米国特許仮出願第６３／２７７，８６６号の利益を主張するものであり、その文献を本願に引用して援用する。
【国際調査報告】