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▶ ザ・トラスティーズ・オブ・インディアナ・ユニバーシティーの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-12-17
(54)【発明の名称】ヒト蝸牛有毛細胞を生成する方法
(51)【国際特許分類】
C12N 5/071 20100101AFI20241210BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20241210BHJP
C12N 5/0735 20100101ALI20241210BHJP
C12M 1/00 20060101ALI20241210BHJP
C12N 15/09 20060101ALN20241210BHJP
【ＦＩ】
C12N5/071
C12N5/10
C12N5/0735
C12M1/00 A
C12N15/09 Z
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024534272
(86)(22)【出願日】2022-12-09
(85)【翻訳文提出日】2024-08-05
(86)【国際出願番号】 US2022081292
(87)【国際公開番号】W WO2023108136
(87)【国際公開日】2023-06-15
(31)【優先権主張番号】63/287,761
(32)【優先日】2021-12-09
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＲＩＴＯＮ
(71)【出願人】
【識別番号】520477485
【氏名又は名称】ザ・トラスティーズ・オブ・インディアナ・ユニバーシティー
(74)【代理人】
【識別番号】110001173
【氏名又は名称】弁理士法人川口國際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】橋野 惠里
(72)【発明者】
【氏名】ムーア，スティーブン・ティー
【テーマコード（参考）】
4B029
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B029AA01
4B029BB11
4B029CC02
4B065AA93X
4B065AA93Y
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA01
4B065BB04
4B065BB13
4B065BB19
4B065BB34
4B065CA44
4B065CA46
(57)【要約】
多能性幹細胞からヒト蝸牛有毛細胞の生成のための方法が、本明細書に提供される。より具体的には、ヒト多能性幹細胞から、内耳有毛細胞、感覚ニューロン及び支持細胞を含む三次元細胞オルガノイドを生成するための方法が、本明細書に提供される。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ヒト蝸牛有毛細胞を生成する方法であって、（ａ）約５日間にわたってソニックヘッジホッグの活性化因子を含む培地中でヒト多能性幹細胞に由来するＰＡＸ２ｂ＋内耳前駆細胞を培養するステップ；並びに
（ｂ）続いて、ステップ（ａ）の後、約４日間にわたって、ソニックヘッジホッグの活性化因子及びＷｎｔ阻害剤を含む培地中でステップ（ａ）の細胞を培養するステップ；
（ｃ）ＰＲＥＳＴＩＮ、ＮＲ２Ｆ１、ＧＡＴＡ３、ＩＮＳＭ１、ＨＥＳ６、ＴＭＰＲＳＳ３又はＧＮＧ８の内耳マーカーのうちの１種以上を発現するヒト蝸牛有毛細胞に細胞を分化させるのに十分な時間量にわたってステップ（ｂ）の細胞をさらに培養するステップ
を含む、方法。
【請求項2】
ステップ（ａ）及びステップ（ｂ）におけるソニックヘッジホッグの活性化因子は、パルモルファミンである、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
パルモルファミンの濃度が約１ｎＭ～約１ｍＭである、請求項２に記載の方法。
【請求項4】
Ｗｎｔ阻害剤がＩＷＰ－２である、請求項１に記載の方法。
【請求項5】
ＩＷＰ－２の濃度が約１ｎＭ～約１ｍＭである、請求項４に記載の方法。
【請求項6】
内耳前駆細胞が、ステップ（ａ）の開始の約３９日後に開始して、約５０日間にわたってチロキシンと共に培養される、請求項１に記載の方法。
【請求項7】
培地中のチロキシンの濃度が約２５０ｎｇ／ｍｌである、請求項６に記載の方法。
【請求項8】
十分な時間量が、ステップ（ａ）の開始後、約８９日であり、培地が、ステップ（ａ）の開始の約１１日後にさらなるアゴニスト又は阻害剤を含有しない、請求項１に記載の方法。
【請求項9】
十分な時間量が、ステップ（ａ）の開始後、約１３９日であり、培地が、ステップ（ａ）の開始の約１１日後にさらなるアゴニスト又は阻害剤を含有しない、請求項１に記載の方法。
【請求項10】
蝸牛有毛細胞が、ステップ（ａ）の開始の約９８日後にＰＲＥＳＴＩＮ、ＮＲ２Ｆ１、ＧＡＴＡ３、及びＩＮＳＭ１から選択される２種以上のマーカーを発現する、請求項１に記載の方法。
【請求項11】
細胞が、ステップ（ａ）の開始の約９８日後にＰＲＥＳＴＩＮ、ＮＲ２Ｆ１、ＧＡＴＡ３、及びＩＮＳＭ１を発現する、請求項１０に記載の方法。
【請求項12】
細胞が、ステップ（ａ）の開始の約９８日後にＨＥＳ６、ＴＭＰＲＳＳ３及びＧＮＧ８から選択される１種以上のさらなるマーカーをさらに発現する、請求項１０又は１１に記載の方法。
【請求項13】
ステップ（ａ）の開始の約９８日後にＰＲＥＳＴＩＮ、ＧＡＴＡ３、ＩＮＳＭ１、ＨＥＳ６、ＴＭＰＲＳＳ３及びＧＮＧ８から選択される２種以上のマーカーを発現する細胞をもたらす、請求項１に記載の方法。
【請求項14】
ステップ（ａ）の開始の約９８日後にＰＲＥＳＴＩＮ、ＧＡＴＡ３、ＩＮＳＭ１、ＨＥＳ６、ＴＭＰＲＳＳ３及びＧＮＧ８から選択される３種以上のマーカーを発現する細胞をもたらす、請求項１に記載の方法。
【請求項15】
内耳前駆細胞が、（ａ）コーティングされたプレート上で約３日間にわたってＦＧＦ－２、ＢＭＰ－４、及びＴＧＦ－ベータ阻害剤を含む培地中で多能性幹細胞を培養するステップ；
（ｂ）約４日間にわたって、ＦＧＦ－２、ＴＧＦ－ベータ阻害剤及びＢＭＰ－４阻害剤を含む培地中でステップ（ａ）の細胞をさらに培養するステップ；
（ｃ）約４日間にわたってＧＳＫ－３阻害剤、ＢＭＰ－４阻害剤及びＦＧＦ－２を含む培地中でステップ（ｂ）の細胞をさらに培養するステップ；並びに
（ｄ）約２日間にわたってコーティングされたプレート上でＧＳＫ－３阻害剤を含む培地中でステップ（ｃ）の細胞をさらに培養して、ＰＡＸ２ｂ＋内耳前駆細胞を産生するステップ
の方法によって多能性幹細胞から誘導される、請求項１に記載の方法。
【請求項16】
多能性幹細胞が、人工多能性幹細胞又は胚性幹細胞である、請求項１７に記載の方法。
【請求項17】
ＢＭＰ－４の濃度が約１００ｐｇ／ｍｌより高い、請求項１５に記載の方法。
【請求項18】
ＢＭＰ－４の濃度が約５００ｐｇ／ｍｌより高い、請求項１５に記載の方法。
【請求項19】
ＢＭＰ－４の濃度が約１００ｐｇ／ｍｌ～約１０００ｐｇ／ｍｌである、請求項１８に記載の方法。
【請求項20】
ＢＭＰ－４の濃度が約５００ｐｇ／ｍｌ～約１０００ｐｇ／ｍｌである、請求項１８に記載の方法。
【請求項21】
（ａ）コーティングされたプレート上で約３日間にわたってＦＧＦ－２、ＢＭＰ－４、及びＳＢ４３１５４２を含む培地中で多能性幹細胞を培養するステップ；（ｂ）約４日間にわたって、ＦＧＦ－２、ＳＢ４３１５４２及びＬＤＮ１９３１８９を含む培地中でステップ（ａ）の細胞をさらに培養するステップ；
（ｃ）約４日間にわたってＣＨＩＲ９９０２１、ＬＤＮ１９３１８９、及びＦＧＦ－２を含む培地中でステップ（ｂ）の細胞をさらに培養するステップ；
（ｄ）約２日間にわたってコーティングされたプレート上でＣＨＩＲ９９０２１を含む培地中でステップ（ｃ）の細胞をさらに培養して、ＰＡＸ２ｂ＋前駆細胞を生成するステップ
を含む、方法。
【請求項22】
（ｅ）約５日間にわたってＣＨＩＲ９９０２１及びパルモルファミンを含む培地中でステップ（ｄ）の細胞を培養するステップ；（ｆ）約４日間にわたってＣＨＩＲ９９０２１、パルモルファミン、及びＩＷＰ－２を含む培地中でステップ（ｅ）の細胞をさらに培養するステップ；
（ｇ）少なくとも約７８日間にわたって培地中でステップ（ｆ）の細胞をさらに培養して、ヒト蝸牛有毛細胞を生成するステップ
をさらに含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項23】
ステップ（ｇ）における培地が、ＣＨＩＲ９９０２１、パルモルファミン、又はＩＷＰ－２を含まない、請求項２２に記載の方法。
【請求項24】
（ａ）コーティングされたプレート上で約３日間にわたってＦＧＦ－２、ＢＭＰ－４、及びＳＢ４３１５４２を含む培地中で多能性幹細胞を培養するステップ；（ｂ）約４日間にわたって、ＦＧＦ－２、ＳＢ４３１５４２及びＬＤＮ１９３１８９を含む培地中でステップ（ａ）の細胞をさらに培養するステップ；
（ｃ）約４日間にわたってＣＨＩＲ９９０２１、ＬＤＮ１９３１８９、及びＦＧＦ－２を含む培地中でステップ（ｂ）の細胞をさらに培養するステップ；
（ｄ）約２日間にわたってコーティングされたプレート上でＣＨＩＲ９９０２１を含む培地中でステップ（ｃ）の細胞をさらに培養するステップ；
（ｅ）約５日間にわたってＣＨＩＲ９９０２１及びパルモルファミンを含む培地中でステップ（ｄ）の細胞をさらに培養するステップ；
（ｆ）約４日間にわたってＣＨＩＲ９９０２１、パルモルファミン、及びＩＷＰ－２を含む培地中でステップ（ｅ）の細胞をさらに培養するステップ；
（ｇ）少なくとも約７８日間にわたって培地中でステップ（ｆ）の細胞をさらに培養して、ヒト蝸牛有毛細胞を生成するステップ
を含む、方法。
【請求項25】
ステップ（ｇ）における培地が、ＣＨＩＲ９９０２１、パルモルファミン、又はＩＷＰ－２を含まない、請求項２４に記載の方法。
【請求項26】
（ａ）コーティングされたプレート上で約３日間にわたってＦＧＦ－２、ＢＭＰ－４、及びＳＢ４３１５４２を含む培地中で多能性幹細胞を培養するステップ；（ｂ）約４日間にわたって、ＦＧＦ－２、ＳＢ４３１５４２及びＬＤＮ１９３１８９を含む培地中でステップ（ａ）の細胞をさらに培養するステップ；
（ｃ）約４日間にわたってＣＨＩＲ９９０２１、ＬＤＮ１９３１８９、及びＦＧＦ－２を含む培地中でステップ（ｂ）の細胞をさらに培養するステップ；
（ｄ）約２日間にわたってコーティングされたプレート上でＣＨＩＲ９９０２１を含む培地中でステップ（ｃ）の細胞をさらに培養するステップ；
（ｅ）約５日間にわたってＣＨＩＲ９９０２１及びパルモルファミンを含む培地中でステップ（ｄ）の細胞をさらに培養するステップ；
（ｆ）約４日間にわたってＣＨＩＲ９９０２１、パルモルファミン、及びＩＷＰ－２を含む培地中でステップ（ｅ）の細胞をさらに培養するステップ；
（ｇ）約２８日間にわたって培地中でステップ（ｆ）の細胞をさらに培養するステップ；
（ｈ）約５０日間にわたってチロキシンを含む培地中でステップ（ｇ）の細胞をさらに培養して、ヒト蝸牛有毛細胞を生成するステップ
を含む、方法。
【請求項27】
ステップ（ｇ）における培地が、ＣＨＩＲ９９０２１、パルモルファミン、又はＩＷＰ－２を含まない、請求項２６に記載の方法。
【請求項28】
請求項１～１９又は２２～２７のいずれか一項に記載の方法によって生成されるヒト蝸牛有毛細胞。
【請求項29】
請求項２８に記載の蝸牛有毛細胞を含むオルガノイド。
【請求項30】
（ａ）ソニックヘッジホッグの活性化因子；及び（ｂ）Ｗｎｔ阻害剤
を含む、キット、プラットフォーム、又はシステム。
【請求項31】
（ｃ）ＦＧＦ－２；（ｄ）ＴＧＦ－ベータ阻害剤；
（ｅ）ＢＭＰ－４阻害剤；及び
（ｆ）ＧＳＫ－３阻害剤
をさらに含む、請求項３０に記載のキット、システム、又はプラットフォーム。
【請求項32】
（ｇ）チロキシンをさらに含む、請求項３０又は３１に記載のキット、システム、又はプラットフォーム。
【請求項33】
（ｈ）人工多能性幹細胞又は胚性幹細胞をさらに含む、請求項３０～３２のいずれか一項に記載のキット、システム、又はプラットフォーム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本出願は、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、２０２１年１２月９日に出願された米国仮特許出願第６３／２８７，７６１号の優先権を主張する。
【0002】
連邦政府に支援された研究に関する陳述
本発明は、米国防高等研究計画局（Ｄｅｆｅｎｓｅ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ Ａｇｅｎｃｙ）によって授与されたＷ８１ＸＷＨ－１８－１－００６２、並びに米国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）によって授与されたＤＣ０１５７８８及びＤＣ０１３２０４の下での政府支援と共に為された。米国連邦政府は、本発明において、一定の権利を有する。
本発明は、米国防高等研究計画局（Ｄｅｆｅｎｓｅ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ Ａｇｅｎｃｙ）によって授与されたＷ８１ＸＷＨ－１８－１－００６２、並びに米国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）によって授与されたＤＣ０１５７８８及びＤＣ０１３２０４の下での政府支援と共に為された。米国連邦政府は、本発明において、一定の権利を有する。
【0003】
配列表
配列表は、本出願に添付され、２７，８２２バイトのサイズであり、２０２２年１２月９日に作成された、配列表名「１４４５７８＿００３５３．ｘｍｌ」のｘｍｌファイルとして提出される。配列表は、Ｐａｔｅｎｔ Ｃｅｎｔｅｒを介して電子的に提出され、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
配列表は、本出願に添付され、２７，８２２バイトのサイズであり、２０２２年１２月９日に作成された、配列表名「１４４５７８＿００３５３．ｘｍｌ」のｘｍｌファイルとして提出される。配列表は、Ｐａｔｅｎｔ Ｃｅｎｔｅｒを介して電子的に提出され、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【0004】
開示される技術は一般に、ヒト多能性幹細胞の蝸牛有毛細胞への分化を指示するための方法を対象とする。
【背景技術】
【0005】
ヒトの内耳は、蝸牛器官及び前庭器官で構成され、それぞれ、２種類の構造的に異なる機械感受性有毛細胞を含有する。胚形成の間に、蝸牛器官は、耳胞の最腹側の領域に由来するが、前庭器官は、隣接するより背側の領域に由来する。胚形成中のモルフォゲン勾配のバランスは、内耳末端器官の同一性を決定付けると考えられている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
マウス又はヒト多能性幹細胞の凝集体から内耳感覚上皮を生成する以前の方法は、誘導される有毛細胞が天然の前庭有毛細胞の構造的及び機能的特性を単に担持するため、蝸牛細胞型を産生しない。
【課題を解決するための手段】
【0007】
（発明の要旨）
本開示の態様において、ヒト蝸牛有毛細胞を生成する方法が提供される。一部の実施形態において、方法は、（ａ）約５日間にわたってソニックヘッジホッグの活性化因子を含む培地中でヒト多能性幹細胞に由来するＰＡＸ２ｂ＋内耳前駆細胞を培養するステップ；並びに（ｂ）続いて、ステップ（ａ）の後、約４日間にわたって、ソニックヘッジホッグの活性化因子及びＷｎｔ阻害剤を含む培地中でステップ（ａ）の細胞を培養するステップ；（ｃ）ＰＲＥＳＴＩＮ、ＮＲ２Ｆ１、ＧＡＴＡ３、ＩＮＳＭ１、ＨＥＳ６、ＴＭＰＲＳＳ３又はＧＮＧ８の内耳マーカーのうちの１種以上を発現するヒト蝸牛有毛細胞に細胞を分化させるのに十分な時間量にわたってステップ（ｂ）の細胞をさらに培養するステップを含む。一部の実施形態において、ステップ（ａ）及びステップ（ｂ）におけるソニックヘッジホッグの活性化因子は、パルモルファミンである。一部の実施形態において、パルモルファミンの濃度は、約１ｎＭ～約１ｍＭである。一部の実施形態において、Ｗｎｔ阻害剤は、ＩＷＰ－２である。一部の実施形態において、ＩＷＰ－２の濃度は、約１ｎＭ～約１ｍＭである。一部の実施形態において、内耳前駆細胞は、ステップ（ａ）の開始の約３９日後に開始して、約５０日間にわたってチロキシンと共に培養される。一部の実施形態において、培地中のチロキシンの濃度は、約２５０ｎｇ／ｍｌである。一部の実施形態において、十分な時間量は、ステップ（ａ）の開始後、約８９日であり、培地は、ステップ（ａ）の開始の約１１日後にさらなるアゴニスト又は阻害剤を含有しない。一部の実施形態において、十分な時間量は、ステップ（ａ）の開始後、約１３９日であり、培地は、ステップ（ａ）の開始の約１１日後にさらなるアゴニスト又は阻害剤を含有しない。一部の実施形態において、蝸牛有毛細胞は、ステップ（ａ）の開始の約９８日後にＰＲＥＳＴＩＮ、ＮＲ２Ｆ１、ＧＡＴＡ３、及びＩＮＳＭ１から選択される２種以上のマーカーを発現する。一部の実施形態において、細胞は、ステップ（ａ）の開始の約９８日後にＰＲＥＳＴＩＮ、ＮＲ２Ｆ１、ＧＡＴＡ３、及びＩＮＳＭ１を発現する。一部の実施形態において、細胞は、ステップ（ａ）の開始の約９８日後にＨＥＳ６、ＴＭＰＲＳＳ３及びＧＮＧ８から選択される１種以上のさらなるマーカーをさらに発現する。一部の実施形態において、方法は、ステップ（ａ）の開始の約９８日後にＰＲＥＳＴＩＮ、ＧＡＴＡ３、ＩＮＳＭ１、ＨＥＳ６、ＴＭＰＲＳＳ３及びＧＮＧ８から選択される２種以上のマーカーを発現する細胞をもたらす。一部の実施形態において、方法は、ステップ（ａ）の開始の約９８日後にＰＲＥＳＴＩＮ、ＧＡＴＡ３、ＩＮＳＭ１、ＨＥＳ６、ＴＭＰＲＳＳ３及びＧＮＧ８から選択される３種以上のマーカーを発現する細胞をもたらす。一部の実施形態において、内耳前駆細胞は、（ａ）コーティングされたプレート上で約３日間にわたってＦＧＦ－２、ＢＭＰ－４、及びＴＧＦ－ベータ阻害剤を含む培地中で多能性幹細胞を培養するステップ；（ｂ）約４日間にわたって、ＦＧＦ－２、ＴＧＦ－ベータ阻害剤及びＢＭＰ－４阻害剤を含む培地中でステップ（ａ）の細胞をさらに培養するステップ；（ｃ）約４日間にわたってＧＳＫ－３阻害剤、ＢＭＰ－４阻害剤及びＦＧＦ－２を含む培地中でステップ（ｂ）の細胞をさらに培養するステップ；並びに（ｄ）約２日間にわたってコーティングされたプレート上でＧＳＫ－３阻害剤を含む培地中でステップ（ｃ）の細胞をさらに培養して、ＰＡＸ２ｂ＋内耳前駆細胞を産生するステップの方法によって多能性幹細胞から誘導される。一部の実施形態において、多能性幹細胞は、人工多能性幹細胞又は胚性幹細胞である。一部の実施形態において、ＢＭＰ－４の濃度は、約１００ｐｇ／ｍｌより高い。一部の実施形態において、ＢＭＰ－４の濃度は、約５００ｐｇ／ｍｌより高い。一部の実施形態において、ＢＭＰ－４の濃度は、約１００ｐｇ／ｍｌ～約１０００ｐｇ／ｍｌである。一部の実施形態において、ＢＭＰ－４の濃度は、約５００ｐｇ／ｍｌ～約１０００ｐｇ／ｍｌである。
本開示の態様において、ヒト蝸牛有毛細胞を生成する方法が提供される。一部の実施形態において、方法は、（ａ）約５日間にわたってソニックヘッジホッグの活性化因子を含む培地中でヒト多能性幹細胞に由来するＰＡＸ２ｂ＋内耳前駆細胞を培養するステップ；並びに（ｂ）続いて、ステップ（ａ）の後、約４日間にわたって、ソニックヘッジホッグの活性化因子及びＷｎｔ阻害剤を含む培地中でステップ（ａ）の細胞を培養するステップ；（ｃ）ＰＲＥＳＴＩＮ、ＮＲ２Ｆ１、ＧＡＴＡ３、ＩＮＳＭ１、ＨＥＳ６、ＴＭＰＲＳＳ３又はＧＮＧ８の内耳マーカーのうちの１種以上を発現するヒト蝸牛有毛細胞に細胞を分化させるのに十分な時間量にわたってステップ（ｂ）の細胞をさらに培養するステップを含む。一部の実施形態において、ステップ（ａ）及びステップ（ｂ）におけるソニックヘッジホッグの活性化因子は、パルモルファミンである。一部の実施形態において、パルモルファミンの濃度は、約１ｎＭ～約１ｍＭである。一部の実施形態において、Ｗｎｔ阻害剤は、ＩＷＰ－２である。一部の実施形態において、ＩＷＰ－２の濃度は、約１ｎＭ～約１ｍＭである。一部の実施形態において、内耳前駆細胞は、ステップ（ａ）の開始の約３９日後に開始して、約５０日間にわたってチロキシンと共に培養される。一部の実施形態において、培地中のチロキシンの濃度は、約２５０ｎｇ／ｍｌである。一部の実施形態において、十分な時間量は、ステップ（ａ）の開始後、約８９日であり、培地は、ステップ（ａ）の開始の約１１日後にさらなるアゴニスト又は阻害剤を含有しない。一部の実施形態において、十分な時間量は、ステップ（ａ）の開始後、約１３９日であり、培地は、ステップ（ａ）の開始の約１１日後にさらなるアゴニスト又は阻害剤を含有しない。一部の実施形態において、蝸牛有毛細胞は、ステップ（ａ）の開始の約９８日後にＰＲＥＳＴＩＮ、ＮＲ２Ｆ１、ＧＡＴＡ３、及びＩＮＳＭ１から選択される２種以上のマーカーを発現する。一部の実施形態において、細胞は、ステップ（ａ）の開始の約９８日後にＰＲＥＳＴＩＮ、ＮＲ２Ｆ１、ＧＡＴＡ３、及びＩＮＳＭ１を発現する。一部の実施形態において、細胞は、ステップ（ａ）の開始の約９８日後にＨＥＳ６、ＴＭＰＲＳＳ３及びＧＮＧ８から選択される１種以上のさらなるマーカーをさらに発現する。一部の実施形態において、方法は、ステップ（ａ）の開始の約９８日後にＰＲＥＳＴＩＮ、ＧＡＴＡ３、ＩＮＳＭ１、ＨＥＳ６、ＴＭＰＲＳＳ３及びＧＮＧ８から選択される２種以上のマーカーを発現する細胞をもたらす。一部の実施形態において、方法は、ステップ（ａ）の開始の約９８日後にＰＲＥＳＴＩＮ、ＧＡＴＡ３、ＩＮＳＭ１、ＨＥＳ６、ＴＭＰＲＳＳ３及びＧＮＧ８から選択される３種以上のマーカーを発現する細胞をもたらす。一部の実施形態において、内耳前駆細胞は、（ａ）コーティングされたプレート上で約３日間にわたってＦＧＦ－２、ＢＭＰ－４、及びＴＧＦ－ベータ阻害剤を含む培地中で多能性幹細胞を培養するステップ；（ｂ）約４日間にわたって、ＦＧＦ－２、ＴＧＦ－ベータ阻害剤及びＢＭＰ－４阻害剤を含む培地中でステップ（ａ）の細胞をさらに培養するステップ；（ｃ）約４日間にわたってＧＳＫ－３阻害剤、ＢＭＰ－４阻害剤及びＦＧＦ－２を含む培地中でステップ（ｂ）の細胞をさらに培養するステップ；並びに（ｄ）約２日間にわたってコーティングされたプレート上でＧＳＫ－３阻害剤を含む培地中でステップ（ｃ）の細胞をさらに培養して、ＰＡＸ２ｂ＋内耳前駆細胞を産生するステップの方法によって多能性幹細胞から誘導される。一部の実施形態において、多能性幹細胞は、人工多能性幹細胞又は胚性幹細胞である。一部の実施形態において、ＢＭＰ－４の濃度は、約１００ｐｇ／ｍｌより高い。一部の実施形態において、ＢＭＰ－４の濃度は、約５００ｐｇ／ｍｌより高い。一部の実施形態において、ＢＭＰ－４の濃度は、約１００ｐｇ／ｍｌ～約１０００ｐｇ／ｍｌである。一部の実施形態において、ＢＭＰ－４の濃度は、約５００ｐｇ／ｍｌ～約１０００ｐｇ／ｍｌである。
【0008】
本開示の別の態様において、方法が提供される。一部の実施形態において、方法は、（ａ）コーティングされたプレート上で約３日間にわたってＦＧＦ－２、ＢＭＰ－４、及びＳＢ４３１５４２を含む培地中で多能性幹細胞を培養するステップ；（ｂ）約４日間にわたって、ＦＧＦ－２、ＳＢ４３１５４２及びＬＤＮ１９３１８９を含む培地中でステップ（ａ）の細胞をさらに培養するステップ；（ｃ）約４日間にわたってＣＨＩＲ９９０２１、ＬＤＮ１９３１８９、及びＦＧＦ－２を含む培地中でステップ（ｂ）の細胞をさらに培養するステップ；（ｄ）約２日間にわたってコーティングされたプレート上でＣＨＩＲ９９０２１を含む培地中でステップ（ｃ）の細胞をさらに培養して、ＰＡＸ２ｂ＋前駆細胞を生成するステップを含む。一部の実施形態において、方法は、（ｅ）約５日間にわたってＣＨＩＲ９９０２１及びパルモルファミンを含む培地中でステップ（ｄ）の細胞を培養するステップ；（ｆ）約４日間にわたってＣＨＩＲ９９０２１、パルモルファミン、及びＩＷＰ－２を含む培地中でステップ（ｅ）の細胞をさらに培養するステップ；（ｇ）少なくとも約７８日間にわたって培地中でステップ（ｆ）の細胞をさらに培養して、ヒト蝸牛有毛細胞を生成するステップをさらに含む。一部の実施形態において、ステップ（ｇ）における培地は、ＣＨＩＲ９９０２１、パルモルファミン、又はＩＷＰ－２を含まない。
【0009】
本開示の別の態様において、さらなる方法が提供される。一部の実施形態において、方法は、（ａ）コーティングされたプレート上で約３日間にわたってＦＧＦ－２、ＢＭＰ－４、及びＳＢ４３１５４２を含む培地中で多能性幹細胞を培養するステップ；（ｂ）約４日間にわたってＦＧＦ－２、ＳＢ４３１５４２及びＬＤＮ１９３１８９を含む培地中でステップ（ａ）の細胞をさらに培養するステップ；（ｃ）約４日間にわたってＣＨＩＲ９９０２１、ＬＤＮ１９３１８９、及びＦＧＦ－２を含む培地中でステップ（ｂ）の細胞をさらに培養するステップ；（ｄ）約２日間にわたってコーティングされたプレート上でＣＨＩＲ９９０２１を含む培地中でステップ（ｃ）の細胞をさらに培養するステップ；（ｅ）約５日間にわたってＣＨＩＲ９９０２１及びパルモルファミンを含む培地中でステップ（ｄ）の細胞をさらに培養するステップ；（ｆ）約４日間にわたってＣＨＩＲ９９０２１、パルモルファミン、及びＩＷＰ－２を含む培地中でステップ（ｅ）の細胞をさらに培養するステップ；（ｇ）少なくとも約７８日間にわたって培地中でステップ（ｆ）の細胞をさらに培養して、ヒト蝸牛有毛細胞を生成するステップを含む。一部の実施形態において、ステップ（ｇ）における培地は、ＣＨＩＲ９９０２１、パルモルファミン、又はＩＷＰ－２を含まない。
【0010】
本開示の別の態様において、さらなる方法が提供される。一部の実施形態において、方法は、（ａ）コーティングされたプレート上で約３日間にわたってＦＧＦ－２、ＢＭＰ－４、及びＳＢ４３１５４２を含む培地中で多能性幹細胞を培養するステップ；（ｂ）約４日間にわたってＦＧＦ－２、ＳＢ４３１５４２及びＬＤＮ１９３１８９を含む培地中でステップ（ａ）の細胞をさらに培養するステップ；（ｃ）約４日間にわたってＣＨＩＲ９９０２１、ＬＤＮ１９３１８９、及びＦＧＦ－２を含む培地中でステップ（ｂ）の細胞をさらに培養するステップ；（ｄ）約２日間にわたってコーティングされたプレート上でＣＨＩＲ９９０２１を含む培地中でステップ（ｃ）の細胞をさらに培養するステップ；（ｅ）約５日間にわたってＣＨＩＲ９９０２１及びパルモルファミンを含む培地中でステップ（ｄ）の細胞をさらに培養するステップ；（ｆ）約４日間にわたってＣＨＩＲ９９０２１、パルモルファミン、及びＩＷＰ－２を含む培地中でステップ（ｅ）の細胞をさらに培養するステップ；（ｇ）約２８日間にわたって培地中でステップ（ｆ）の細胞をさらに培養するステップ；（ｈ）約５０日間にわたってチロキシンを含む培地中でステップ（ｇ）の細胞をさらに培養して、ヒト蝸牛有毛細胞を生成するステップを含む。一部の実施形態において、ステップ（ｇ）における培地は、ＣＨＩＲ９９０２１、パルモルファミン、又はＩＷＰ－２を含まない。
【0011】
本開示の別の態様において、ヒト蝸牛有毛細胞が提供される。一部の実施形態において、ヒト蝸牛有毛細胞は、（ａ）約５日間にわたってソニックヘッジホッグの活性化因子を含む培地中でヒト多能性幹細胞に由来するＰＡＸ２ｂ＋内耳前駆細胞を培養するステップ；並びに（ｂ）続いて、ステップ（ａ）の後、約４日間にわたって、ソニックヘッジホッグの活性化因子及びＷｎｔ阻害剤を含む培地中でステップ（ａ）の細胞を培養するステップ；（ｃ）ＰＲＥＳＴＩＮ、ＮＲ２Ｆ１、ＧＡＴＡ３、ＩＮＳＭ１、ＨＥＳ６、ＴＭＰＲＳＳ３又はＧＮＧ８の内耳マーカーのうちの１種以上を発現するヒト蝸牛有毛細胞に細胞を分化させるのに十分な時間量にわたってステップ（ｂ）の細胞をさらに培養するステップによって生成される。一部の実施形態において、パルモルファミンの濃度は、約１ｎＭ～約１ｍＭである。一部の実施形態において、Ｗｎｔ阻害剤は、ＩＷＰ－２である。一部の実施形態において、ＩＷＰ－２の濃度は、約１ｎＭ～約１ｍＭである。一部の実施形態において、内耳前駆細胞は、ステップ（ａ）の開始の約３９日後に開始して、約５０日間にわたってチロキシンと共に培養される。一部の実施形態において、培地中のチロキシンの濃度は、約２５０ｎｇ／ｍｌである。一部の実施形態において、十分な時間量は、ステップ（ａ）の開始後、約８９日であり、培地は、ステップ（ａ）の開始の約１１日後にさらなるアゴニスト又は阻害剤を含有しない。一部の実施形態において、十分な時間量は、ステップ（ａ）の開始後、約１３９日であり、培地は、ステップ（ａ）の開始の約１１日後にさらなるアゴニスト又は阻害剤を含有しない。一部の実施形態において、蝸牛有毛細胞は、ステップ（ａ）の開始の約９８日後にＰＲＥＳＴＩＮ、ＮＲ２Ｆ１、ＧＡＴＡ３、及びＩＮＳＭ１から選択される２種以上のマーカーを発現する。一部の実施形態において、細胞は、ステップ（ａ）の開始の約９８日後にＰＲＥＳＴＩＮ、ＮＲ２Ｆ１、ＧＡＴＡ３、及びＩＮＳＭ１を発現する。一部の実施形態において、細胞は、ステップ（ａ）の開始の約９８日後にＨＥＳ６、ＴＭＰＲＳＳ３及びＧＮＧ８から選択される１種以上のさらなるマーカーをさらに発現する。一部の実施形態において、方法は、ステップ（ａ）の開始の約９８日後にＰＲＥＳＴＩＮ、ＧＡＴＡ３、ＩＮＳＭ１、ＨＥＳ６、ＴＭＰＲＳＳ３及びＧＮＧ８から選択される２種以上のマーカーを発現する細胞をもたらす。一部の実施形態において、方法は、ステップ（ａ）の開始の約９８日後にＰＲＥＳＴＩＮ、ＧＡＴＡ３、ＩＮＳＭ１、ＨＥＳ６、ＴＭＰＲＳＳ３及びＧＮＧ８から選択される３種以上のマーカーを発現する細胞をもたらす。一部の実施形態において、内耳前駆細胞は、（ａ）コーティングされたプレート上で約３日間にわたってＦＧＦ－２、ＢＭＰ－４、及びＴＧＦ－ベータ阻害剤を含む培地中で多能性幹細胞を培養するステップ；（ｂ）約４日間にわたって、ＦＧＦ－２、ＴＧＦ－ベータ阻害剤及びＢＭＰ－４阻害剤を含む培地中でステップ（ａ）の細胞をさらに培養するステップ；（ｃ）約４日間にわたってＧＳＫ－３阻害剤、ＢＭＰ－４阻害剤及びＦＧＦ－２を含む培地中でステップ（ｂ）の細胞をさらに培養するステップ；並びに（ｄ）約２日間にわたってコーティングされたプレート上でＧＳＫ－３阻害剤を含む培地中でステップ（ｃ）の細胞をさらに培養して、ＰＡＸ２ｂ＋内耳前駆細胞を産生するステップの方法によって多能性幹細胞から誘導される。一部の実施形態において、多能性幹細胞は、人工多能性幹細胞又は胚性幹細胞である。一部の実施形態において、ＢＭＰ－４の濃度は、約１００ｐｇ／ｍｌより高い。一部の実施形態において、ＢＭＰ－４の濃度は、約５００ｐｇ／ｍｌより高い。一部の実施形態において、ＢＭＰ－４の濃度は、約１００ｐｇ／ｍｌ～約１０００ｐｇ／ｍｌである。一部の実施形態において、ＢＭＰ－４の濃度は、約５００ｐｇ／ｍｌ～約１０００ｐｇ／ｍｌである。
【0012】
一部の実施形態において、ヒト蝸牛有毛細胞は、（ａ）コーティングされたプレート上で約３日間にわたってＦＧＦ－２、ＢＭＰ－４、及びＳＢ４３１５４２を含む培地中で多能性幹細胞を培養するステップ；（ｂ）約４日間にわたってＦＧＦ－２、ＳＢ４３１５４２及びＬＤＮ１９３１８９を含む培地中でステップ（ａ）の細胞をさらに培養するステップ；（ｃ）約４日間にわたってＣＨＩＲ９９０２１、ＬＤＮ１９３１８９、及びＦＧＦ－２を含む培地中でステップ（ｂ）の細胞をさらに培養するステップ；（ｄ）約２日間にわたってコーティングされたプレート上でＣＨＩＲ９９０２１を含む培地中でステップ（ｃ）の細胞をさらに培養して、ＰＡＸ２ｂ＋前駆細胞を生成するステップによって生成される。一部の実施形態において、方法は、（ｅ）約５日間にわたってＣＨＩＲ９９０２１及びパルモルファミンを含む培地中でステップ（ｄ）の細胞を培養するステップ；（ｆ）約４日間にわたってＣＨＩＲ９９０２１、パルモルファミン、及びＩＷＰ－２を含む培地中でステップ（ｅ）の細胞をさらに培養するステップ；（ｇ）少なくとも約７８日間にわたって培地中でステップ（ｆ）の細胞をさらに培養して、ヒト蝸牛有毛細胞を生成するステップをさらに含む。一部の実施形態において、ステップ（ｇ）における培地は、ＣＨＩＲ９９０２１、パルモルファミン、又はＩＷＰ－２を含まない。
【0013】
一部の実施形態において、ヒト蝸牛有毛細胞は、（ａ）コーティングされたプレート上で約３日間にわたってＦＧＦ－２、ＢＭＰ－４、及びＳＢ４３１５４２を含む培地中で多能性幹細胞を培養するステップ；（ｂ）約４日間にわたってＦＧＦ－２、ＳＢ４３１５４２及びＬＤＮ１９３１８９を含む培地中でステップ（ａ）の細胞をさらに培養するステップ；（ｃ）約４日間にわたってＣＨＩＲ９９０２１、ＬＤＮ１９３１８９、及びＦＧＦ－２を含む培地中でステップ（ｂ）の細胞をさらに培養するステップ；（ｄ）約２日間にわたってコーティングされたプレート上でＣＨＩＲ９９０２１を含む培地中でステップ（ｃ）の細胞をさらに培養するステップ；（ｅ）約５日間にわたってＣＨＩＲ９９０２１及びパルモルファミンを含む培地中でステップ（ｄ）の細胞をさらに培養するステップ；（ｆ）約４日間にわたってＣＨＩＲ９９０２１、パルモルファミン、及びＩＷＰ－２を含む培地中でステップ（ｅ）の細胞をさらに培養するステップ；（ｇ）少なくとも約７９日間にわたって培地中でステップ（ｆ）の細胞をさらに培養して、ヒト蝸牛有毛細胞を生成するステップによって生成される。一部の実施形態において、ステップ（ｇ）における培地は、ＣＨＩＲ９９０２１、パルモルファミン、又はＩＷＰ－２を含まない。
【0014】
一部の実施形態において、ヒト蝸牛有毛細胞は、（ａ）約５日間にわたってソニックヘッジホッグの活性化因子を含む培地中でヒト多能性幹細胞に由来するＰＡＸ２ｂ＋内耳前駆細胞を培養するステップ；並びに（ｂ）続いて、ステップ（ａ）の後、約４日間にわたって、ソニックヘッジホッグの活性化因子及びＷｎｔ阻害剤を含む培地中でステップ（ａ）の細胞を培養するステップ；（ｃ）ＰＲＥＳＴＩＮ、ＮＲ２Ｆ１、ＧＡＴＡ３、ＩＮＳＭ１、ＨＥＳ６、ＴＭＰＲＳＳ３又はＧＮＧ８の内耳マーカーのうちの１種以上を発現するヒト蝸牛有毛細胞に細胞を分化させるのに十分な時間量にわたってステップ（ｂ）の細胞をさらに培養するステップによって生成される。一部の実施形態において、パルモルファミンの濃度は、約１ｎＭ～約１ｍＭである。一部の実施形態において、Ｗｎｔ阻害剤は、ＩＷＰ－２である。一部の実施形態において、ＩＷＰ－２の濃度は、約１ｎＭ～約１ｍＭである。一部の実施形態において、内耳前駆細胞は、ステップ（ａ）の開始の約３９日後に開始して、約５０日間にわたってチロキシンと共に培養される。一部の実施形態において、培地中のチロキシンの濃度は、約２５０ｎｇ／ｍｌである。一部の実施形態において、十分な時間量は、ステップ（ａ）の開始後、約８９日であり、培地は、ステップ（ａ）の開始の約１１日後にさらなるアゴニスト又は阻害剤を含有しない。一部の実施形態において、十分な時間量は、ステップ（ａ）の開始後、約１３９日であり、培地は、ステップ（ａ）の開始の約１１日後にさらなるアゴニスト又は阻害剤を含有しない。一部の実施形態において、蝸牛有毛細胞は、ステップ（ａ）の開始の約９８日後にＰＲＥＳＴＩＮ、ＮＲ２Ｆ１、ＧＡＴＡ３、及びＩＮＳＭ１から選択される２種以上のマーカーを発現する。一部の実施形態において、細胞は、ステップ（ａ）の開始の約９８日後にＰＲＥＳＴＩＮ、ＮＲ２Ｆ１、ＧＡＴＡ３、及びＩＮＳＭ１を発現する。一部の実施形態において、細胞は、ステップ（ａ）の開始の約９８日後にＨＥＳ６、ＴＭＰＲＳＳ３及びＧＮＧ８から選択される１種以上のさらなるマーカーをさらに発現する。一部の実施形態において、方法は、ステップ（ａ）の開始の約９８日後にＰＲＥＳＴＩＮ、ＧＡＴＡ３、ＩＮＳＭ１、ＨＥＳ６、ＴＭＰＲＳＳ３及びＧＮＧ８から選択される２種以上のマーカーを発現する細胞をもたらす。一部の実施形態において、方法は、ステップ（ａ）の開始の約９８日後にＰＲＥＳＴＩＮ、ＧＡＴＡ３、ＩＮＳＭ１、ＨＥＳ６、ＴＭＰＲＳＳ３及びＧＮＧ８から選択される３種以上のマーカーを発現する細胞をもたらす。一部の実施形態において、内耳前駆細胞は、（ａ）コーティングされたプレート上で約３日間にわたってＦＧＦ－２、ＢＭＰ－４、及びＴＧＦ－ベータ阻害剤を含む培地中で多能性幹細胞を培養するステップ；（ｂ）約４日間にわたって、ＦＧＦ－２、ＴＧＦ－ベータ阻害剤及びＢＭＰ－４阻害剤を含む培地中でステップ（ａ）の細胞をさらに培養するステップ；（ｃ）約４日間にわたってＧＳＫ－３阻害剤、ＢＭＰ－４阻害剤及びＦＧＦ－２を含む培地中でステップ（ｂ）の細胞をさらに培養するステップ；並びに（ｄ）約２日間にわたってコーティングされたプレート上でＧＳＫ－３阻害剤を含む培地中でステップ（ｃ）の細胞をさらに培養して、ＰＡＸ２ｂ＋内耳前駆細胞を産生するステップの方法によって多能性幹細胞から誘導される。一部の実施形態において、多能性幹細胞は、人工多能性幹細胞又は胚性幹細胞である。一部の実施形態において、ＢＭＰ－４の濃度は、約１００ｐｇ／ｍｌより高い。一部の実施形態において、ＢＭＰ－４の濃度は、約５００ｐｇ／ｍｌより高い。一部の実施形態において、ＢＭＰ－４の濃度は、約１００ｐｇ／ｍｌ～約１０００ｐｇ／ｍｌである。一部の実施形態において、ＢＭＰ－４の濃度は、約５００ｐｇ／ｍｌ～約１０００ｐｇ／ｍｌである。
【0015】
本開示の別の態様において、オルガノイドが提供される。一部の実施形態において、オルガノイドは、（ａ）約５日間にわたってソニックヘッジホッグの活性化因子を含む培地中でヒト多能性幹細胞に由来するＰＡＸ２ｂ＋内耳前駆細胞を培養するステップ；並びに（ｂ）続いて、ステップ（ａ）の後、約４日間にわたって、ソニックヘッジホッグの活性化因子及びＷｎｔ阻害剤を含む培地中でステップ（ａ）の細胞を培養するステップ；（ｃ）ＰＲＥＳＴＩＮ、ＮＲ２Ｆ１、ＧＡＴＡ３、ＩＮＳＭ１、ＨＥＳ６、ＴＭＰＲＳＳ３又はＧＮＧ８の内耳マーカーのうちの１種以上を発現するヒト蝸牛有毛細胞に細胞を分化させるのに十分な時間量にわたってステップ（ｂ）の細胞をさらに培養するステップ、蝸牛有毛細胞を含む。一部の実施形態において、パルモルファミンの濃度は、約１ｎＭ～約１ｍＭである。一部の実施形態において、Ｗｎｔ阻害剤は、ＩＷＰ－２である。一部の実施形態において、ＩＷＰ－２の濃度は、約１ｎＭ～約１ｍＭである。一部の実施形態において、内耳前駆細胞は、ステップ（ａ）の開始の約３９日後に開始して、約５０日間にわたってチロキシンと共に培養される。一部の実施形態において、培地中のチロキシンの濃度は、約２５０ｎｇ／ｍｌである。一部の実施形態において、十分な時間量は、ステップ（ａ）の開始後、約８９日であり、培地は、ステップ（ａ）の開始の約１１日後にさらなるアゴニスト又は阻害剤を含有しない。一部の実施形態において、十分な時間量は、ステップ（ａ）の開始後、約１３９日であり、培地は、ステップ（ａ）の開始の約１１日後にさらなるアゴニスト又は阻害剤を含有しない。一部の実施形態において、蝸牛有毛細胞は、ステップ（ａ）の開始の約９８日後にＰＲＥＳＴＩＮ、ＮＲ２Ｆ１、ＧＡＴＡ３、及びＩＮＳＭ１から選択される２種以上のマーカーを発現する。一部の実施形態において、細胞は、ステップ（ａ）の開始の約９８日後にＰＲＥＳＴＩＮ、ＮＲ２Ｆ１、ＧＡＴＡ３、及びＩＮＳＭ１を発現する。一部の実施形態において、細胞は、ステップ（ａ）の開始の約９８日後にＨＥＳ６、ＴＭＰＲＳＳ３及びＧＮＧ８から選択される１種以上のさらなるマーカーをさらに発現する。一部の実施形態において、方法は、ステップ（ａ）の開始の約９８日後にＰＲＥＳＴＩＮ、ＧＡＴＡ３、ＩＮＳＭ１、ＨＥＳ６、ＴＭＰＲＳＳ３及びＧＮＧ８から選択される２種以上のマーカーを発現する細胞をもたらす。一部の実施形態において、方法は、ステップ（ａ）の開始の約９８日後にＰＲＥＳＴＩＮ、ＧＡＴＡ３、ＩＮＳＭ１、ＨＥＳ６、ＴＭＰＲＳＳ３及びＧＮＧ８から選択される３種以上のマーカーを発現する細胞をもたらす。一部の実施形態において、内耳前駆細胞は、（ａ）コーティングされたプレート上で約３日間にわたってＦＧＦ－２、ＢＭＰ－４、及びＴＧＦ－ベータ阻害剤を含む培地中で多能性幹細胞を培養するステップ；（ｂ）約４日間にわたって、ＦＧＦ－２、ＴＧＦ－ベータ阻害剤及びＢＭＰ－４阻害剤を含む培地中でステップ（ａ）の細胞をさらに培養するステップ；（ｃ）約４日間にわたってＧＳＫ－３阻害剤、ＢＭＰ－４阻害剤及びＦＧＦ－２を含む培地中でステップ（ｂ）の細胞をさらに培養するステップ；並びに（ｄ）約２日間にわたってコーティングされたプレート上でＧＳＫ－３阻害剤を含む培地中でステップ（ｃ）の細胞をさらに培養して、ＰＡＸ２ｂ＋内耳前駆細胞を産生するステップの方法によって多能性幹細胞から誘導される。一部の実施形態において、多能性幹細胞は、人工多能性幹細胞又は胚性幹細胞である。一部の実施形態において、ＢＭＰ－４の濃度は、約１００ｐｇ／ｍｌより高い。一部の実施形態において、ＢＭＰ－４の濃度は、約５００ｐｇ／ｍｌより高い。一部の実施形態において、ＢＭＰ－４の濃度は、約１００ｐｇ／ｍｌ～約１０００ｐｇ／ｍｌである。一部の実施形態において、ＢＭＰ－４の濃度は、約５００ｐｇ／ｍｌ～約１０００ｐｇ／ｍｌである。
【0016】
一部の実施形態において、オルガノイドは、（ａ）コーティングされたプレート上で約３日間にわたってＦＧＦ－２、ＢＭＰ－４、及びＳＢ４３１５４２を含む培地中で多能性幹細胞を培養するステップ；（ｂ）約４日間にわたって、ＦＧＦ－２、ＳＢ４３１５４２及びＬＤＮ１９３１８９を含む培地中でステップ（ａ）の細胞をさらに培養するステップ；（ｃ）約４日間にわたってＣＨＩＲ９９０２１、ＬＤＮ１９３１８９、及びＦＧＦ－２を含む培地中でステップ（ｂ）の細胞をさらに培養するステップ；（ｄ）約２日間にわたってコーティングされたプレート上でＣＨＩＲ９９０２１を含む培地中でステップ（ｃ）の細胞をさらに培養して、ＰＡＸ２ｂ＋前駆細胞を生成するステップによって生成される蝸牛有毛細胞を含む。一部の実施形態において、方法は、（ｅ）約５日間にわたってＣＨＩＲ９９０２１及びパルモルファミンを含む培地中でステップ（ｄ）の細胞を培養するステップ；（ｆ）約４日間にわたってＣＨＩＲ９９０２１、パルモルファミン、及びＩＷＰ－２を含む培地中でステップ（ｅ）の細胞をさらに培養するステップ；（ｇ）少なくとも約７８日間にわたって培地中でステップ（ｆ）の細胞をさらに培養して、ヒト蝸牛有毛細胞を生成するステップをさらに含む。一部の実施形態において、ステップ（ｇ）における培地は、ＣＨＩＲ９９０２１、パルモルファミン、又はＩＷＰ－２を含まない。
【0017】
一部の実施形態において、オルガノイドは、（ａ）コーティングされたプレート上で約３日間にわたってＦＧＦ－２、ＢＭＰ－４、及びＳＢ４３１５４２を含む培地中で多能性幹細胞を培養するステップ；（ｂ）約４日間にわたってＦＧＦ－２、ＳＢ４３１５４２及びＬＤＮ１９３１８９を含む培地中でステップ（ａ）の細胞をさらに培養するステップ；（ｃ）約４日間にわたってＣＨＩＲ９９０２１、ＬＤＮ１９３１８９、及びＦＧＦ－２を含む培地中でステップ（ｂ）の細胞をさらに培養するステップ；（ｄ）約２日間にわたってコーティングされたプレート上でＣＨＩＲ９９０２１を含む培地中でステップ（ｃ）の細胞をさらに培養するステップ；（ｅ）約５日間にわたってＣＨＩＲ９９０２１及びパルモルファミンを含む培地中でステップ（ｄ）の細胞をさらに培養するステップ；（ｆ）約４日間にわたってＣＨＩＲ９９０２１、パルモルファミン、及びＩＷＰ－２を含む培地中でステップ（ｅ）の細胞をさらに培養するステップ；（ｇ）少なくとも約７８日間にわたって培地中でステップ（ｆ）の細胞をさらに培養して、ヒト蝸牛有毛細胞を生成するステップによって生成された蝸牛有毛細胞を含む。一部の実施形態において、ステップ（ｇ）における培地は、ＣＨＩＲ９９０２１、パルモルファミン、又はＩＷＰ－２を含まない。
【0018】
一部の実施形態において、オルガノイドは、（ａ）約５日間にわたってソニックヘッジホッグの活性化因子を含む培地中でヒト多能性幹細胞に由来するＰＡＸ２ｂ＋内耳前駆細胞を培養するステップ；並びに（ｂ）続いて、ステップ（ａ）の後、約４日間にわたって、ソニックヘッジホッグの活性化因子及びＷｎｔ阻害剤を含む培地中でステップ（ａ）の細胞を培養するステップ；（ｃ）ＰＲＥＳＴＩＮ、ＮＲ２Ｆ１、ＧＡＴＡ３、ＩＮＳＭ１、ＨＥＳ６、ＴＭＰＲＳＳ３又はＧＮＧ８の内耳マーカーのうちの１種以上を発現するヒト蝸牛有毛細胞に細胞を分化させるのに十分な時間量にわたってステップ（ｂ）の細胞をさらに培養するステップによって生成された蝸牛有毛細胞を含む。一部の実施形態において、パルモルファミンの濃度は、約１ｎＭ～約１ｍＭである。一部の実施形態において、Ｗｎｔ阻害剤は、ＩＷＰ－２である。一部の実施形態において、ＩＷＰ－２の濃度は、約１ｎＭ～約１ｍＭである。一部の実施形態において、内耳前駆細胞は、ステップ（ａ）の開始の約３９日後に開始して、約５０日間にわたってチロキシンと共に培養される。一部の実施形態において、培地中のチロキシンの濃度は、約２５０ｎｇ／ｍｌである。一部の実施形態において、十分な時間量は、ステップ（ａ）の開始後、約８９日であり、培地は、ステップ（ａ）の開始の約１１日後にさらなるアゴニスト又は阻害剤を含有しない。一部の実施形態において、十分な時間量は、ステップ（ａ）の開始後、約１３９日であり、培地は、ステップ（ａ）の開始の約１１日後にさらなるアゴニスト又は阻害剤を含有しない。一部の実施形態において、蝸牛有毛細胞は、ステップ（ａ）の開始の約９８日後にＰＲＥＳＴＩＮ、ＮＲ２Ｆ１、ＧＡＴＡ３、及びＩＮＳＭ１から選択される２種以上のマーカーを発現する。一部の実施形態において、細胞は、ステップ（ａ）の開始の約９８日後にＰＲＥＳＴＩＮ、ＮＲ２Ｆ１、ＧＡＴＡ３、及びＩＮＳＭ１を発現する。一部の実施形態において、細胞は、ステップ（ａ）の開始の約９８日後にＨＥＳ６、ＴＭＰＲＳＳ３及びＧＮＧ８から選択される１種以上のさらなるマーカーをさらに発現する。一部の実施形態において、方法は、ステップ（ａ）の開始の約９８日後にＰＲＥＳＴＩＮ、ＧＡＴＡ３、ＩＮＳＭ１、ＨＥＳ６、ＴＭＰＲＳＳ３及びＧＮＧ８から選択される２種以上のマーカーを発現する細胞をもたらす。一部の実施形態において、方法は、ステップ（ａ）の開始の約９８日後にＰＲＥＳＴＩＮ、ＧＡＴＡ３、ＩＮＳＭ１、ＨＥＳ６、ＴＭＰＲＳＳ３及びＧＮＧ８から選択される３種以上のマーカーを発現する細胞をもたらす。一部の実施形態において、内耳前駆細胞は、（ａ）コーティングされたプレート上で約３日間にわたってＦＧＦ－２、ＢＭＰ－４、及びＴＧＦ－ベータ阻害剤を含む培地中で多能性幹細胞を培養するステップ；（ｂ）約４日間にわたって、ＦＧＦ－２、ＴＧＦ－ベータ阻害剤及びＢＭＰ－４阻害剤を含む培地中でステップ（ａ）の細胞をさらに培養するステップ；（ｃ）約４日間にわたってＧＳＫ－３阻害剤、ＢＭＰ－４阻害剤及びＦＧＦ－２を含む培地中でステップ（ｂ）の細胞をさらに培養するステップ；並びに（ｄ）約２日間にわたってコーティングされたプレート上でＧＳＫ－３阻害剤を含む培地中でステップ（ｃ）の細胞をさらに培養して、ＰＡＸ２ｂ＋内耳前駆細胞を産生するステップの方法によって多能性幹細胞から誘導される。一部の実施形態において、多能性幹細胞は、人工多能性幹細胞又は胚性幹細胞である。一部の実施形態において、ＢＭＰ－４の濃度は、約１００ｐｇ／ｍｌより高い。一部の実施形態において、ＢＭＰ－４の濃度は、約５００ｐｇ／ｍｌより高い。一部の実施形態において、ＢＭＰ－４の濃度は、約１００ｐｇ／ｍｌ～約１０００ｐｇ／ｍｌである。一部の実施形態において、ＢＭＰ－４の濃度は、約５００ｐｇ／ｍｌ～約１０００ｐｇ／ｍｌである。
【0019】
本開示の別の態様において、キット、プラットフォーム、及びシステムが提供される。一部の実施形態において、キット、システム又はプラットフォームは、（ａ）ソニックヘッジホッグの活性化因子；及び（ｂ）Ｗｎｔ阻害剤を含む。一部の実施形態において、キット、システム、又はプラットフォームは、（ｃ）ＦＧＦ－２；（ｄ）ＴＧＦ－ベータ阻害剤；（ｅ）ＢＭＰ－４阻害剤；及び（ｆ）ＧＳＫ－３阻害剤をさらに含む。一部の実施形態において、キット、システム、又はプラットフォームは、（ｇ）チロキシンをさらに含む。一部の実施形態において、キット、システム、又はプラットフォームは、（ｈ）人工多能性幹細胞又は胚性幹細胞をさらに含む。
【図面の簡単な説明】
【0020】
【図1a-1】ａ～ｌ、ＰＡＸ２－２Ａ－ｎＧＦＰ／ＰＯＵ４Ｆ３－２Ａ－ｎｔＴｏｍａｔｏ（ＰＡＸ２ｎＧ／ＰＯＵ４Ｆ３ｎＴ）多重リポーターｈＥＳＣは、内耳オルガノイドへの内耳前駆細胞及び有毛細胞の分化を正確に再現する。ａ、ＰＡＸ２－２Ａ－ｎＧＦＰ及びＰＯＵ４Ｆ３－２Ａ－ｎｔｄＴｏｍａｔｏ ＣＲＩＳＰＲ設計の概略図。２対の１ｋｂホモロジーアームを、内耳主要ＰＡＸ２ｂスプライスバリアント及びＰＯＵ４Ｆ３の唯一のスプライスバリアントの終止コドンを挟むようにＰＣＲによって生成した。ＰＡＸ２構築物は、正確に標的化されたクローンの陽性選択のために含まれるｆｌｏｘｅｄ ＰＧＫ－ピューロマイシンカセットを含有し、その後、ＣＲＥリコンビナーゼ発現ベクターのトランスフェクション後にＣＲＥ組換えによって除去された。ＰＯＵ４Ｆ３構築物は、ＦＬＰｏに挟まれたＰＧＫ－ピューロマイシンカセットを含有し、その後、ＦＬＰｏリコンビナーゼ発現ベクターのトランスフェクション後に除去された。ウイルスｐ２Ａ配列を、多シストロン性ｍＲＮＡ転写物に由来する別々の遺伝子産物を生成するように含有させた。核局在化配列を、適切に局在化された可視化のために含有させた。単一ガイドＲＮＡを使用して、挿入効率を最大化し、オフターゲット活性を最小化した。
【図1a-2】ａ、ＰＡＸ２－２Ａ－ｎＧＦＰ及びＰＯＵ４Ｆ３－２Ａ－ｎｔｄＴｏｍａｔｏ ＣＲＩＳＰＲ設計の概略図。２対の１ｋｂホモロジーアームを、内耳主要ＰＡＸ２ｂスプライスバリアント及びＰＯＵ４Ｆ３の唯一のスプライスバリアントの終止コドンを挟むようにＰＣＲによって生成した。ＰＡＸ２構築物は、正確に標的化されたクローンの陽性選択のために含まれるｆｌｏｘｅｄ ＰＧＫ－ピューロマイシンカセットを含有し、その後、ＣＲＥリコンビナーゼ発現ベクターのトランスフェクション後にＣＲＥ組換えによって除去された。ＰＯＵ４Ｆ３構築物は、ＦＬＰｏに挟まれたＰＧＫ－ピューロマイシンカセットを含有し、その後、ＦＬＰｏリコンビナーゼ発現ベクターのトランスフェクション後に除去された。ウイルスｐ２Ａ配列を、多シストロン性ｍＲＮＡ転写物に由来する別々の遺伝子産物を生成するように含有させた。核局在化配列を、適切に局在化された可視化のために含有させた。単一ガイドＲＮＡを使用して、挿入効率を最大化し、オフターゲット活性を最小化した。
【図1b-1l】ｂ、内耳オルガノイド発生中のＰＡＸ２ｎＧ及びＰＯＵ４Ｆ３ｎＴリポーター発現の略図。ｃ～ｆ、複数の発生中の内耳オルガノイドを含有する全凝集体のライブ画像は、ＰＡＸ２ｎＧリポーター発現の時空間進行及びＰＡＸ２＋上皮の初期形態形成を示す。ｇ～ｈ、内耳特異的マーカーＦＢＸＯ２を同時発現するが、ＰＯＵ４Ｆ３ｎＴ発現を含まない小胞に組織化されたＰＡＸ２ｎＧ＋上皮を示すｈＥＳＣ由来凝集体の代表的な画像。ｉ～ｉ’、上皮小胞に局在化した強力なＰＯＵ４Ｆ３ｎＴ＋点を示す後期段階（Ｄ９６）の凝集体のライブ画像。ｊ～ｌ、内耳オルガノイド中のＰＯＵ４Ｆ３ｎＴ＋細胞はまた、有毛細胞マーカーＭＹＯ７Ａ、ＡＴＯＨ１及びＳＯＸ２を発現し、ＳＯＸ２＋支持上皮の内腔表面に位置する。スケールバー、２００μｍ（ｃ～ｇ、ｈ、ｉ、ｉ’）、５０μｍ（ｇ’、ｈ’）、１０μｍ（ｊ～ｌ）。
【図2a-2c】内耳オルガノイド誘導プロトコールの最適化。ａ、本発明者らの元のプロトコール対最適化されたプロトコールの比較の略図。ｂ、元のプロトコール対最適化されたプロトコールの下で培養された本発明者らのＰＡＸ２ｎＧ／ＰＯＵ４Ｆ３ｎＴ多重リポーターｈＥＳＣ系に由来する内耳オルガノイドを含有する全細胞凝集体のライブ画像。ｃ、最適化された培養プロトコール対元の培養プロトコールにおける培養結果の定量的比較。ｎ＝２０（緑色のヒストグラム）、１３（赤色のヒストグラム）の１群あたり別々の実験に由来する生体試料。Ｗｅｌｃｈの両側ｔ検定＊＊＊Ｐ＝０．０００１３２、＊＊＊＊Ｐ＝０．００００１３（嚢胞数）、Ｐ＜０．０００００１（直径）、スケールバー、２００μｍ。
【図3a】a～ｆ、ＰＵＲ＋ＩＷＰ２処置はヒト内耳オルガノイドにおける内耳前駆細胞の腹側化を促進する。ａ、マウス内耳発生中の既知の腹側化及び背側化シグナル並びにヒト内耳オルガノイド系へのこの原理の適用の略図。
【図3b】ｂ～ｄ、ヒト内耳オルガノイドにおけるＦＡＣＳ選別されたＰＡＸ２ｎＧ＋内耳前駆細胞のＤ２０ ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑ分析。ＰＵＲ＋ＩＷＰ２、ＰＵＲ及びＣＴＲＬ試料に由来する内耳前駆細胞のＵＭＡＰ投影図（ｂ）。フィーチャープロット（Ｆｅａｔｕｒｅ Ｐｌｏｔ）は、背側内耳マーカーは主にＰＵＲ及びＣＴＲＬ内耳前駆細胞中で発現されるが、腹側内耳マーカー及びＳＨＨシグナル伝達成分は主にＰＵＲ＋ＩＷＰ２細胞に限定されることを示す。
【図3c】これと一致して、ボルケーノプロット（Ｖｏｌｃａｎｏ ｐｌｏｔ）（ｃ）は、ＰＵＲ＋ＩＷＰ２とＣＴＲＬ内耳前駆細胞との間で示差的に発現される背側及び腹側内耳マーカー遺伝子を示す。ＰＵＲ＋ＩＷＰ２及びＣＴＲＬ内耳前駆細胞において上方調節される遺伝子の遺伝子セットエンリッチメント分析（それぞれ、バブルプロットにおいて０より上及び下）
【図3d】遺伝子発現の転写後調節、クロマチン改変及びヘッジホッグシグナル伝達と関連する遺伝子が、内耳オルガノイド中の腹側化された内耳前駆細胞において富化されていることを示す。
【図3e】ＰＵＲ＋ＩＷＰ２オルガノイド対ＣＴＲＬオルガノイドにおいてＮＲ２Ｆ１及びＳＵｌＦ１の顕著により高い発現を示すＤ２５試料の代表的な画像。
【図3f】ＰＵＲ＋ＩＷＰ２対ＣＴＲＬオルガノイドにおいてＰＡＸ２及びＮＲ２Ｆ１（又はＳＵＬＦ１）を同時発現する小胞の定量的分析；ｎ＝８の１群あたり別々の実験に由来する生体試料；Ｗｅｌｃｈの両側ｔ検定＊Ｐ＝０．００１３（ＮＲ２Ｆ１）、＊Ｐ＝０．００８９（ＳＵＬＦ１）；値は平均±ＳＥＭである。スケールバー、２００μｍ。
【図4a】a～ｇ、腹側化された内耳オルガノイド中のＰＯＵ４Ｆ３ｎＴ＋細胞は蝸牛有毛細胞マーカーを発現する。ａ～ｄ、Ｄ１０９ ＰＵＲ＋ＩＷＰ２及びＣＴＲＬ内耳オルガノイドから単離されたＰＯＵ４Ｆ３ｎＴ＋細胞のＵＭＡＰ投影図（ａ）。
【図4b】フィーチャープロットは、注釈された有毛細胞集団中での公知の蝸牛及び前庭マーカー遺伝子の示差的発現を示す（ｂ）。
【図4c】ボルケーノプロット（ｃ）は、ＰＵＲ＋ＩＷＰ２有毛細胞とＣＴＲＬ有毛細胞との間で示差的に発現される蝸牛及び前庭有毛細胞マーカー遺伝子を確認する。さらに、ＮＲ２Ｆ１、ＴＭＰＲＳＳ３、ＣＤ１６４Ｌ２、ＺＢＢＸ及びＳＫＯＲ１などの以前は認識されていなかった遺伝子は、ＰＵＲ＋ＩＷＰ２有毛細胞とＣＴＲＬ有毛細胞との間で示差的に発現される。
【図4d】クラスターにわたる遺伝子発現を示すヒートマップ（ｄ）。
【図4e】ＰＵＲ＋ＩＷＰ２内耳オルガノイドとＣＴＲＬ内耳オルガノイドとの間のＮＲ２Ｆ１及びＧＡＴＡ３の示差的発現を検証する代表的な免疫組織化学。
【図4f】ＰＵＲ＋ＩＷＰ２対ＣＴＲＬ内耳オルガノイドにおけるＮＲ２Ｆ１陽性有毛細胞又はＧＡＴＡ３陽性有毛細胞及び支持細胞のパーセンテージの比較；ｎ＝９の別々の実験に由来する生体試料；Ｗｅｌｃｈの両側ｔ検定＊＊＊＊Ｐ＜０．０００００１；値は平均±ＳＥＭである。
【図4g】ＮＲ２Ｆ１及びＧＡＴＡ３は、ＧＷ１８でヒト蝸牛における外及び内有毛細胞の両方において発現される。スケールバー、２０μｍ (ｅ、ｇ)。
【図5a-5o】ａ～ｑ、腹側化されたオルガノイドに由来する有毛細胞は蝸牛有毛細胞の構造特性を示す。ａ～ｈ’、ＰＵＲ＋ＩＷＰ２毛束の走査電子顕微鏡写真（ａ～ｂ、ｆ～ｇ）は、蝸牛有毛細胞表現型に特徴的な増大する高さ及び直径の凹型の行に編成された比較的短い不動毛を示す。対照的に、ＣＴＲＬ毛束の走査電子顕微鏡写真（ｃ～ｅ、ｈ～ｈ’）は、天然の前庭有毛細胞に特徴的な同等の直径のものである凸型の行に編成された伸長した不動毛を示す。ｉ～ｋ’、ＰＵＲ＋ＩＷＰ２処置された有毛細胞の共焦点顕微鏡画像（ｉ～ｉ’）は、短いＦ－アクチン＋毛束及び基底部に位置する核を有する長方形の体細胞を示すが、ＣＴＲＬ有毛細胞のもの（ｊ～ｋ’）は、伸長したＦ－アクチン＋毛束及び球根状であることが多い又はフラスコ型の体細胞を示す。ＣＴＲＬ有毛細胞は、Ｄ２００でも前庭形態を保持する（ｊ）。ｐ～ｑ、ＰＵＲ＋ＩＷＰ２有毛細胞（ｌ～ｍ）対ＣＴＲＬ有毛細胞（ｊ～ｋ’）における個々の不動毛の高さ及び直径の不動毛の定量的分析；ｎ＝５０の別々の実験に由来する生体試料；Ｗｅｌｃｈの両側ｔ検定＊＊＊＊Ｐ＜０．００００１；値は平均±ＳＥＭである。スケールバー、１０μｍ（ｃ、ｉ、ｊ、ｋ）、１μｍ（ａ、ｂ、ｄ～ｈ、ｋ’）。
【図5p】腹側化されたオルガノイドに由来する有毛細胞は蝸牛有毛細胞の構造特性を示す。
【図5q】腹側化されたオルガノイドに由来する有毛細胞は蝸牛有毛細胞の構造特性を示す。
【図6a】a～ｈ、腹側化されたオルガノイドに由来する有毛細胞のサブ集団はＰＲＥＳＴＩＮを発現し、蝸牛外有毛細胞に特徴的な電位依存性電流を示す。ａ～ｂ、ＰＲＥＳＴＩＮ＋有毛細胞は、ＰＵＲ＋ＩＷＰ２内耳オルガノイドにおいて時間と共に増加する。異なる年齢群間でＰＲＥＳＴＩＮを発現する有毛細胞のパーセンテージの比較と共に、Ｄ１０２、－１５０、及び－２００でのＰＵＲ＋ＩＷＰ２試料中のＰＲＥＳＴＩＮに関する代表的な免疫組織化学は、培養物中で時間と共に膜性ＰＲＥＳＴＩＮを発現する有毛細胞の数の増加を示す。対照的に、ＰＲＥＳＴＩＮは、Ｄ１１０又は－２００でＣＴＲＬ有毛細胞中で検出不能である。
【図6b】ＰＲＥＳＴＩＮ＋有毛細胞は、ＰＵＲ＋ＩＷＰ２内耳オルガノイドにおいて時間と共に増加する。異なる年齢群間でＰＲＥＳＴＩＮを発現する有毛細胞のパーセンテージの比較と共に、Ｄ１０２、－１５０、及び－２００でのＰＵＲ＋ＩＷＰ２試料中のＰＲＥＳＴＩＮに関する代表的な免疫組織化学は、培養物中で時間と共に膜性ＰＲＥＳＴＩＮを発現する有毛細胞の数の増加を示す。対照的に、ＰＲＥＳＴＩＮは、Ｄ１１０又は－２００でＣＴＲＬ有毛細胞中で検出不能である。
【図6c】ダイアモンドナイフによって切断したｔｄＴｏｍａｔｏ陽性試料のライブ画像。
【図6d】ｄ～ｈ、ｈＥＳＣ由来有毛細胞における電位依存性電流。Ａ型（ｄ）及びＢ型（ｅ）細胞における電圧ステッププロトコール（下のトレース）に対する典型的な全細胞電流応答（上のトレース）。
【図6e】ｈＥＳＣ由来有毛細胞における電位依存性電流。Ａ型（ｄ）及びＢ型（ｅ）細胞における電圧ステッププロトコール（下のトレース）に対する典型的な全細胞電流応答（上のトレース）。
【図6f】ｈＥＳＣ由来有毛細胞における電位依存性電流。Ａ型（ｆ）及びＢ型（ｈ）細胞における電圧ステップの終わりでの平均定常状態電流振幅。負の内向き電流のピーク振幅（ｇ）。
【図6g】ｈＥＳＣ由来有毛細胞における電位依存性電流。Ａ型（ｆ）及びＢ型（ｈ）細胞における電圧ステップの終わりでの平均定常状態電流振幅。負の内向き電流のピーク振幅（ｇ）。
【図6h】ｈＥＳＣ由来有毛細胞における電位依存性電流。Ａ型（ｆ）及びＢ型（ｈ）細胞における電圧ステップの終わりでの平均定常状態電流振幅。負の内向き電流のピーク振幅（ｇ）。全データは、平均±標準誤差として示される。細胞の日齢：ｄ１３８～ｄ１６４。スケールバー、１０μｍ（ａ）、２００μｍ（ｃ）。
【図7a-7c】チロキシン処置は蝸牛オルガノイド中のＰＲＥＳＴＩＮ＋ＨＣの数を増加させる。（ａ）プレスチン陽性ＨＣの数は、オルガノイドが２５０ｎｇ／ｍＬのチロキシンで処置された場合に増加する。（ｂ）チロキシン処置されたオルガノイド及び処置されていないオルガノイドにおける経時的なプレスチン＋ＨＣの定量化。（ｃ）チロキシン処置されたＨＣは、未熟ＨＣマーカーＳＯＸ２を下方調節するが、ＳＯＸ２発現はＳＣ中で維持され、蝸牛成熟化の事象を要約する。
【図8a】a～ｇ、ＰＡＸ２－２Ａ－ｎＧＦＰ（ＰＡＸ２ｎＧ）リポーターｈＥＳＣ系の生成及び検証。ａ～ｂ、ＰＡＸ２アイソフォームの略図（ａ）及びＰＡＸ２ｂが幹細胞由来内耳オルガノイド中で発現される最も豊富なアイソフォームであることを示すＲＴ－ＰＣＲデータ（ｂ）。
【図8b】ＰＡＸ２アイソフォームの略図（ａ）及びＰＡＸ２ｂが幹細胞由来内耳オルガノイド中で発現される最も豊富なアイソフォームであることを示すＲＴ－ＰＣＲデータ（ｂ）。
【図8e】未分化のＰＡＸ２ｎＧｈＥＳＣの免疫蛍光は、複数の多能性マーカーの発現及び構成的ＰＡＸ２ｎＧリポーター発現の非存在を示す。
【図8f】切片化されたＰＡＸ２ｎＧｈＥＳＣ由来内耳オルガノイドの代表的な免疫組織化学は、Ｄ２０までに内耳マーカーＰＡＸ８、並びにＤ２５までにＳＯＸ１０及びＦＢＸＯ２を同時発現する上皮小胞に局在化したＰＡＸ２ｎＧの発現を示す。ＰＡＸ２ｎＧの発現は持続的であり、Ｄ７０でのライブイメージングによって検出することができる。ＳＯＸ２／ＭＹＯ７Ａ＋有毛細胞は、Ｄ７０でＰＡＸ２ｎＧ＋小胞の内腔表面上で検出することができる。
【図8g】上から１０個の予測されたオフターゲットＣＲＩＳＰＲ部位に関する配列決定の結果は、周囲の遺伝子座での挿入も欠失もないことを示す。スケールバー、５０μｍ（ｅ）、２００μｍ（ｆ）。
【図9a】a～ｈ、ＰＡＸ２－２Ａ－ｎＧＦＰ／ＰＯＵ４Ｆ３－２Ａ－ｎｔｄＴｏｍａｔｏ（ＰＡＸ２ｎＧ／ＰＯＵ４Ｆ３ｎＴ）リポーターｈＥＳＣ系の生成及び検証。ａ～ｂ、ＰＯＵ４Ｆ３遺伝子座のＰＣＲ増幅は、２Ａ－ｎｔｄＴｏｍａｔｏリポーターカセットの両アレルの挿入を示す（ａ）。
【図9b】サンガー配列決定は、ＰＯＵ４Ｆ３終止コドンのすぐ下流へのリポーターカセットの正確な挿入及び配向性を示す（ｂ）。
【図9c-9f】ｃ～ｄ、ＰＯＵ４Ｆ３ｎＴリポーター発現は、Ｄ６０及びＤ１００での小胞の内腔表面上の細胞に限定される。ｅ、Ｄ８０の内耳オルガノイドから単離された、解離したＰＯＵ４Ｆ３ｎＴ＋細胞の固定細胞懸濁液は、ｔｄＴｏｍａｔｏ＋核並びにＦ－アクチン＋膜及び不動毛を示す。ｆ～ｆ”、ＰＯＵ４Ｆ３ｎＴｈＥＳＣに由来するＤ１１０の内耳オルガノイドの免疫組織化学は、ｔｄＴｏｍａｔｏ＋点がＰＣＰ４＋有毛細胞の核を標識し、抗体標識されたＰＯＵ４Ｆ３と完全に共局在化することを示す。
【図9g】上から１０個の予測されたオフターゲットＣＲＩＳＰＲ部位に関する配列決定の結果は、周囲の遺伝子座に挿入も欠失もないことを示す。
【図9h】ＰＡＸ２ｎＧ／ＰＯＵ４Ｆ３ｎＴｈＥＳＣ系は正常な核型分析結果を示す。スケールバー、２００μｍ（ｃ、ｄ）、１０μｍ（ｅ）、１００μｍ（ｆ）。
【図10a】a～ｃ、非神経外胚葉の誘導及び下流の蝸牛オルガノイド形成のためのＢＭＰ４濃度の最適化。ａ、０日目に適用された種々の濃度の組換えＢＭＰ４の下での経時的な細胞凝集体の代表的なライブ画像。別途、培養物は、内耳及び蝸牛分化プロトコールについて記載された条件で維持された。
【図10b】２０日目でのライブ画像におけるＧＦＰ＋領域画分の定量化；ｎ＝４の条件あたりの凝集体；一元配置分散分析、Ｄｕｎｎｅｔの多重比較検定、＊Ｐ＜０．０１。
【図10c】５５日目でのＴｄＴｏｍａｔｏ発現細胞凝集体の母比率。スケールバー、２００μｍ（ａ）。
【図11a-11g】Ｄ２０のＣＴＲＬ、ＰＵＲ、及びＰＵＲ＋ＩＷＰ２内耳オルガノイドにおけるＰＡＸ２ｎＧ細胞のｓｃＲＮＡ－ｓｅｑ分析。ａ、全凝集体からＰＡＸ２ｎＧ＋細胞を単離するために使用されるＦＡＣＳゲーティング戦略。ｂ、細胞クラスターはＳｅｕｒａｔによって生成され、ＵＭＡＰを使用して可視化された。ｃ、注釈したクラスター内のマーカー遺伝子の相対発現を示すドットプロット。ｄ、内耳前駆細胞、神経芽細胞及びサイクリング細胞の標準マーカーを示すフィーチャープロット。ｅ、色付きの細胞は、各クラスター内の条件の分布を示す。スタックされたヒストグラムは、条件による各クラスターの組成を示す。ｆ、Ｄ２５のオルガノイド切片の代表的な免疫組織化学は、条件間のＯＴＸ２及びＤＬＸ３の示差的発現を示す。ｇ、免疫組織化学によるＰＵＲ＋ＩＷＰ２条件とＣＴＲＬ条件との間のＯＴＸ２及びＤＬＸ３発現の定量的比較；ｎ＝５の１群あたりの別々の実験に由来する生体試料；Ｗｅｌｃｈの両側ｔ検定＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．０００１；値は平均±ＳＥＭである。スケールバー、２００μｍ。
【図12a】a～ｊ、タンパク質キナーゼＡ阻害は有毛細胞分化を促進することができない。ａ、１０μＭのＨ８９のみ、又はＰＵＲ若しくはＰＵＲ＋ＩＷＰ２と組み合わせた１０μＭのＨ８９で処置された又は処置されていないＤ２５の内耳オルガノイドに関する局所的に発現される内耳マーカーＯＴＸ２、ＧＡＴＡ３、及びＤＬＸ３の代表的な免疫組織化学。
【図12b】ＳＨＨ経路におけるＨ８９の提唱される役割の略図。
【図12c-12h】ｃ、単一のＰＯＵ４Ｆ３ｎＴ＋内耳オルガノイドを示す、Ｈ８９及びＰＵＲで処置されたＤ１０２の細胞凝集体のライブ画像。ｄ、少数のＰＯＵ４Ｆ３ｎＴ＋点を示す、Ｄ１０２のＰＵＲ＋Ｈ８９処置された凝集体の代表的な画像。ｅ、ＳＯＸ２＋上皮の内腔表面上でＰＯＵ４Ｆ３ｎＴ＋核を有するＭＹＯ７Ａ＋有毛細胞を示す、Ｈ８９＋ＰＵＲで処置されたＤ１０２の内耳オルガノイドの免疫組織化学。ｆ、蝸牛外有毛細胞マーカーＬＭＯＤ３の検出可能な発現を示す、Ｈ８９＋ＰＵＲで処置されたオルガノイドにおける有毛細胞の共焦点画像。ｇ～ｈ、ファロイジンで染色されたＤ１０２のＨ８９＋ＰＵＲ処置された内耳オルガノイドの免疫組織化学は、前庭のような長さ及び形態を有する毛束を示す。
【図12i】異なる処置群間でのＯＴＸ２、ＧＡＴＡ３及びＤＬＸ３発現の定量的比較；ｎ＝５の１群あたり別々の実験に由来する生体試料；＊Ｐ＜０．０１；値は平均±ＳＥＭである。
【図12j】異なる処置群間での、ｔｄＴｏｍａｔｏ発現凝集体のパーセンテージ（左のｙ軸）、及び凝集体あたりの総ｔｄＴｏｍａｔｏ陽性領域（右のｙ軸）の定量的比較；ｎ＝１２の１群あたり別々の実験に由来する生体試料；Ｗｅｌｃｈの両側ｔ検定＊Ｐ＜０．０１；ｎｓ、有意でない；値は平均±ＳＥＭである。スケールバー、２００μｍ（ａ～ｄ）、２０μｍ（ｅ～ｇ）、５μｍ（ｈ）。
【図13a】a～ｇ、Ｄ８０のＣＴＲＬ及びＰＵＲ＋ＩＷＰ２内耳オルガノイドにおけるＦＡＣＳ選別されたＰＯＵ４Ｆ３ｎＴ＋細胞のｓｃＲＮＡ－ｓｅｑ分析。ａ、ＰＯＵ４Ｆ３ｎｔ＋細胞の注釈したクラスターを示すＵＭＡＰ投影図。
【図13b】内耳及び神経マーカー遺伝子の分布を示すフィーチャープロット。
【図13c】注釈したクラスター内のマーカー遺伝子の相対発現を示すドットプロット。
【図13d】それぞれ、マゼンタ及びブルーで示されたＰＵＲ＋ＩＷＰ２有毛細胞とＣＴＲＬ有毛細胞との間で示差的に発現された遺伝子を描写するボルケーノプロット。
【図13g】それぞれ、マゼンタ及びブルーで示された、クラスターマップにわたる、及びＰＵＲ＋ＩＷＰ２有毛細胞とＣＴＲＬ有毛細胞との間の蝸牛及び前庭遺伝子発現の分布を示すバイオリンプロットを伴うフィーチャープロット。
【図14a】a～ｈ、Ｄ１０９のＣＴＲＬ及びＰＵＲ＋ＩＷＰ２内耳オルガノイドにおけるＦＡＣＳ選別されたＰＯＵ４Ｆ３ｎＴ＋細胞のｓｃＲＮＡ－ｓｅｑ分析。ａ、ＰＵＲ＋ＩＷＰ２及びＣＴＲＬ条件における解離された１０９日目の内耳オルガノイドからＰＯＵ４Ｆ３ｎＴ＋細胞を単離するために使用されるＦＡＣＳゲーティング戦略。
【図14b】クラスターマップにわたるマーカー遺伝子の分布を示すフィーチャープロット。
【図14c】ＧＡＴＡ３及びＭＥＩＳ２の発現パターンを示す二重フィーチャープロット。
【図14d】ＰＵＲ＋ＩＷＰ２条件におけるＰＯＵ４Ｆ３ｎＴ＋細胞の擬似時間分析は、有毛細胞様又は支持細胞様運命のいずれかを採用するＬＧＲ５＋細胞に関する分岐した軌道を示す。
【図14e】それぞれ、マゼンタ及びブルーで示された、ＰＵＲ＋ＩＷＰ２条件とＣＴＲＬ条件との間の蝸牛及び前庭マーカー遺伝子の分布を描写するバイオリンプロット。
【図14f】ＰＵＲ＋ＩＷＰ２及びＣＴＲＬ条件において上方調節される遺伝子の遺伝子セットエンリッチメント分析（それぞれ、バブルプロットにおいて０より上及び下。）は、電位依存性カチオンチャネル活性と関連する遺伝子セットが、ＣＴＲＬオルガノイドと比較した場合、ＰＵＲ＋ＩＷＰ２内耳オルガノイドの有毛細胞において上方調節されることを示す。
【図14g】ＰＵＲ＋ＩＷＰ２内耳オルガノイドとＣＴＲＬ内耳オルガノイドとの間のＩＮＳＭ１及びＮＤＧＲ１の示差的発現を示す代表的な免疫組織化学。
【図14h】ＰＵＲ＋ＩＷＰ２及びＣＴＲＬ内耳オルガノイドにおけるＩＮＳＭ１及びＮＤＧＲ１の発現レベルの定量的比較；ｎ＝５の１群あたりの別々の実験に由来する生体試料；Ｗｅｌｃｈの両側ｔ検定＊Ｐ＝０．００１４６８、＊＊＊Ｐ＜０．００００１２；値は平均±ＳＥＭである。スケールバー、２０μｍ。
【図15a-15g】a～ｍ、ＰＵＲ＋ＩＷＰ２及びＣＴＲＬ内耳オルガノイド中の有毛細胞は異なる毛束形態を示す。ａ～ｃ’’’、チップリンク（ｔｉｐ ｌｉｎｋ）のアセンブリーを含む毛束組織の発生進行を示す、ＰＵＲ＋ＩＷＰ２処置細胞に由来する毛束の走査電子顕微鏡写真。ｄ～ｄ’、ＰＵＲ＋ＩＷＰ２有毛細胞の先端面上の不動毛の直径の増大を示す走査電子顕微鏡写真。ｅ～ｆ、Ｄ１１０及び－２００でのＰＵＲ＋ＩＷＰ２処置有毛細胞の先端面上の短いＦ－アクチン＋不動毛を示す共焦点顕微鏡画像。ｇ、Ｄ２００でＰＵＲ＋ＩＷＰ２有毛細胞と接触するＴＵＪ１＋神経突起プロセス。
【図15h-15m】ｈ～ｋ、各毛束内で一貫した直径の不動毛を有する長い点の形態を示す、ＣＴＲＬ毛束の走査電子顕微鏡写真。ｌ～ｌ’、ＣＴＲＬ有毛細胞の表面上の長い点のＦ－アクチン＋不動毛を示す共焦点顕微鏡画像。ｍ～ｍ’、－２００日目でＣＴＲＬ有毛細胞と接触するＴＵＪ１＋神経突起プロセス。スケールバー、１μｍ（ａ、ｂ、ｃ、ｄ）、５００ｎｍ（ａ’、ｃ’、ｄ’、ｊ、ｋ）、１００ｎｍ（ｃ”、ｃ’’’）、１０μｍ（ｅ’、ｈ、ｉ、ｌ’、ｍ’）、２０μｍ（ｅ、ｆ、ｇ、ｌ、ｍ）。
【図16a-16e】ヒト内耳オルガノイド発生の時系列は、ヒト胎児内耳発生のものを密接に反映する。天然のヒト蝸牛発生中の発生事象及び本研究において観察されたヒト蝸牛オルガノイド発生中の発生事象のタイミングを描写する略図。ａ～ｃ”、ヒトＧＷ１３蝸牛の低倍率蝸牛軸切片（ａ）並びに内有毛細胞及び外有毛細胞の存在（ｂ～ｂ’）並びにこの段階での蝸牛有毛細胞におけるＰＲＥＳＴＩＮ発現の欠如（ｃ～ｃ”）を示す免疫蛍光画像。ｄ～ｅ”、ヒトＧＷ１８蝸牛の低倍率蝸牛軸切片（ｄ）及び外有毛細胞中での膜性ＰＲＥＳＴＩＮ発現を示す免疫蛍光画像（ｅ～ｅ”）。スケールバー、１０００μｍ（ａ、ｄ）、５０μｍ（ｂ、ｃ、ｅ）、２０μｍ（ｂ’、ｃ’、ｅ’）。
【発明を実施するための形態】
【0021】
本発明者らは、ヒト多能性幹細胞から蝸牛有毛細胞を生成するための次世代オルガノイド系を開発した。このインビトロモデル系を使用して、聴覚障害並びに、難聴を含む、蝸牛有毛細胞の機能障害又は喪失を伴う疾患及び障害を処置するための療法をより適切に研究することができる。本発明者らは、ヒト多能性幹細胞の、聴覚を伝達することができる蝸牛有毛細胞への分化を指令するための方法を開発した。本発明者らは、マウス又はヒト多能性幹細胞の凝集体から内耳感覚上皮を生成するための方法を以前に開発したが、この系の大きな限界は、誘導される有毛細胞が天然の前庭有毛細胞の構造的及び機能的特性を単に担持するため、蝸牛細胞型の非存在であった。ここで、聴覚障害及び治療モダリティをより適切に研究するための両方のインビトロモデル系のために使用することができる、ヒト多能性幹細胞から蝸牛有毛細胞を生成するための次世代オルガノイド系が提供される。
【0022】
多能性幹細胞からインビトロで蝸牛有毛細胞を誘導する方法
本開示の一態様において、ヒト蝸牛有毛細胞を生成する方法が提供される。一部の実施形態において、ヒト蝸牛有毛細胞を生成する方法は、（ａ）少なくとも３～５日間にわたってソニックヘッジホッグの活性化因子を含む培地中でヒト多能性幹細胞に由来するＰＡＸ２＋内耳前駆細胞を培養するステップ；並びに（ｂ）続いて、ステップ（ａ）の細胞を、ＧＡＴＡ３、ＮＲ２Ｆ１、ＩＮＳＭ１又はＰＲＥＳＴＩＮの蝸牛有毛細胞マーカーのうちの１種以上を発現するヒト蝸牛有毛細胞に細胞を分化させるのに十分な時間量にわたって、ソニックヘッジホッグの活性化因子及びＷｎｔ阻害剤を含む培地中でステップ（ａ）の細胞を培養するステップを含む。好ましくは、ヒト蝸牛有毛細胞は、聴覚を伝達することができる。図６ｄ～６ｆを参照されたい。
本開示の一態様において、ヒト蝸牛有毛細胞を生成する方法が提供される。一部の実施形態において、ヒト蝸牛有毛細胞を生成する方法は、（ａ）少なくとも３～５日間にわたってソニックヘッジホッグの活性化因子を含む培地中でヒト多能性幹細胞に由来するＰＡＸ２＋内耳前駆細胞を培養するステップ；並びに（ｂ）続いて、ステップ（ａ）の細胞を、ＧＡＴＡ３、ＮＲ２Ｆ１、ＩＮＳＭ１又はＰＲＥＳＴＩＮの蝸牛有毛細胞マーカーのうちの１種以上を発現するヒト蝸牛有毛細胞に細胞を分化させるのに十分な時間量にわたって、ソニックヘッジホッグの活性化因子及びＷｎｔ阻害剤を含む培地中でステップ（ａ）の細胞を培養するステップを含む。好ましくは、ヒト蝸牛有毛細胞は、聴覚を伝達することができる。図６ｄ～６ｆを参照されたい。
【0023】
ＰＡＸ２ｂ＋内耳前駆細胞は、多能性幹細胞に由来してもよい。好適には、ＰＡＸ２ｂ＋細胞は、１０～１３日目までにヒト多能性幹細胞から誘導される（０日目は分化培地の開始である、例えば、図２ａ及び３ａを参照されたい。）。そのような場合、ＰＡＸ２ｂ＋内耳前駆細胞は、約１８日目から約２２日目までソニックヘッジホッグのアゴニストと共に培養される。次いで、細胞は、約１８日目から約２２日目までＷｎｔ阻害剤と共に培養される。ＳＨＨのアゴニストへのＷｎｔ阻害剤のその後の添加により、本方法は、驚くべきことに、細胞を、ＧＡＴＡ３、ＮＲ２Ｆ１又はＩＮＳＭ１を発現する蝸牛有毛細胞に分化させることができる。所与のマーカー、例えば、ＧＡＴＡ３、ＮＲ２Ｆ１又はＩＮＳＭ１の発現を、任意の公知の技術、例えば、ＲＮＡ配列決定、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）などによって測定することができる。ＰＡＸ２ｂ＋内耳前駆細胞は、（ａ）コーティングされたプレート上で約３日間にわたってＦＧＦ－２、ＢＭＰ－４、及びＳＢ４３１５４２を含む培地中で多能性幹細胞を培養するステップ；（ｂ）約４日間にわたって、ＦＧＦ－２、ＳＢ４３１５４２及びＬＤＮ１９３１８９を含む培地中でステップ（ａ）の細胞をさらに培養するステップ；（ｃ）約４日間にわたってＣＨＩＲ９９０２１、ＬＤＮ１９３１８９、及びＦＧＦ－２を含む培地中でステップ（ｂ）の細胞をさらに培養するステップ；約２日間にわたってコーティングされたプレート上でＣＨＩＲ９９０２１を含む培地中でステップ（ｃ）の細胞をさらに培養して、ＰＡＸ２ｂ＋内耳前駆細胞を生成するステップによって分化させることができる。
【0024】
本明細書で使用される場合、「蝸牛有毛細胞」とは、聴覚を伝達する蝸牛の細胞を指す。正常なヒト蝸牛には、２種類の蝸牛有毛細胞、内有毛細胞及び外有毛細胞が存在する。外有毛細胞は、電気運動性の特性を有する－細胞の長さを入ってくる音声信号に同期させることによって、音声信号の機械的増幅を提供する。この効果は、「蝸牛増幅器」と呼ばれ、哺乳動物の耳の周波数選択性を改善すると考えられる。外有毛細胞は、ＳＬＣ２６Ａ５遺伝子によってコードされる運動タンパク質ＰＲＥＳＴＩＮの発現を特徴とする。内有毛細胞は、蝸牛の液体中の音響振動を検出し、それらを、聴覚神経を介して脳へ中継される電気信号に変換する。本明細書で誘導される蝸牛有毛細胞は、ＧＡＴＡ３、ＩＮＳＭ１、ＮＲ２Ｆ１、ＨＥＳ６、ＴＭＰＲＳＳ３、ＧＮＧ８、又はＰＲＥＳＴＩＮから選択される１種以上のマーカーを使用して検出され得る。一部の実施形態において、蝸牛有毛細胞は、ＧＡＴＡ３、ＩＮＳＭ１、ＮＲ２Ｆ１、ＨＥＳ６、ＴＭＰＲＳＳ３、ＧＮＧ８、又はＰＲＥＳＴＩＮから選択される２種以上のマーカーを発現し、一部の代替的な実施形態において、該細胞は、ＧＡＴＡ３、ＩＮＳＭ１、ＮＲ２Ｆ１、ＨＥＳ６、ＴＭＰＲＳＳ３、ＧＮＧ８、又はＰＲＥＳＴＩＮから選択される３種以上のマーカー又は４種以上のマーカーを発現する。一実施形態において、蝸牛有毛細胞は、ＧＡＴＡ３、ＮＲ２Ｆ１、ＩＮＳＭ１及びＰＲＥＳＴＩＮの４種のマーカーを発現し、一部の実施形態において、ＨＥＳ６、ＴＭＰＲＳＳ３及びＧＮＧ８から選択される１種以上のマーカーをさらに発現する。
【0025】
対照的に、「前庭有毛細胞」は、平衡及び重力の感覚を伝達する有毛細胞である。前庭器官は、三半規管並びに卵形嚢及び球形嚢を含む。発生中に、蝸牛は、耳胞の最も腹側の領域から誘導されるが、前庭構造は、より背側の耳領域を起源とする（したがって、背側内耳マーカーを発現する。）。
【0026】
したがって、蝸牛の内耳細胞は、前庭器官の内耳細胞と比較して「腹側化された」と称される。したがって、一部の実施形態において、本明細書に開示される発明は、背側／前庭有毛細胞を生成した以前の方法とは反対に、腹側化された有毛細胞を生成する新規方法を提示する。
【0027】
本発明の方法は、ヒト多能性幹細胞の凝集体に適用され、ソニックヘッジホッグ及びＷｎｔシグナル伝達のモジュレーションが、幹細胞由来内耳前駆細胞が腹側内耳マーカーを発現するのを促進することを見出した。驚くべきことに、これらの腹側化された内耳前駆細胞の一部は、蝸牛有毛細胞とよく似た形状に整列された不動毛で構成される短い毛束を有する有毛細胞を生じる。さらに、これらの腹側化された有毛細胞は、蝸牛において外有毛細胞又は内有毛細胞を規定する複数のマーカーを発現する。これらの結果は、初期の形態形成シグナルが、蝸牛遺伝子発現の確立だけでなく、蝸牛感覚上皮に関連する構造特性を規定するのに十分なものであることを示す。
【0028】
次に、本発明者らは、ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）経路の時限的活性化と共に、タンパク質キナーゼＡ（ＰＫＡ）、骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）及び／又はウィングレス（ＷＮＴ、又はＷｎｔ）シグナル伝達の同時抑制が、腹側内耳遺伝子の上方調節を促進し、長期培養物中で蝸牛有毛細胞の生成をもたらし得ることを発見した。簡単に述べると、内耳前駆細胞は、少なくとも３～５日間にわたってソニックヘッジホッグシグナル伝達の活性化因子（ＳＨＨの活性化因子）を含む培地中で培養される。次に、細胞は、細胞を、ＧＡＴＡ３、ＩＮＳＭ１、ＮＲ２Ｆ１又はＰＲＥＳＴＩＮの蝸牛有毛細胞マーカーのうちの１種以上を発現するヒト蝸牛有毛細胞に分化させるのに十分な時間量にわたって、ＳＨＨの活性化因子及びＷｎｔ阻害剤を含む培地中で培養される。一部の実施形態において、蝸牛有毛細胞は、ＰＲＥＳＴＩＮを発現する。一部の実施形態において、内耳前駆細胞は、約１３日目から約２２日目まで、例えば、約１０、９、８、７、６、５、４、３、又は２日間にわたって、ＳＨＨの活性化因子と共に培養される。一部の実施形態において、内耳前駆細胞は、約１８日目から約２２日目まで、例えば、約６、５、４、３、２、又は１日間にわたって、Ｗｎｔ阻害剤と共に培養され、０日目は、ＴＧＦ－ベータ阻害剤、ＦＧＦ２、任意選択的に、ＢＭＰ－４を含む培地中で凝集した幹細胞の培養の開始である（図２ａを参照されたい。）。本開示では、培養Ｄ０は、多能性幹細胞からの内耳前駆細胞の生成の開始時に始まることが理解されるべきである（図２Ａを参照されたい。）。
【0029】
本発明者らは、開示される方法を実施する場合に、長期培養物（例えば、５０日を超える。）が、成熟蝸牛有毛細胞のマーカー、例えば、ＰＲＥＳＴＩＮを発現する細胞を産生することを発見した。したがって、一部の実施形態において、ＳＨＨの活性化因子及びＷｎｔ阻害剤を含む培地中での細胞の培養に続いて、細胞は、オルガノイド成熟化培地（ＯＭＭ）中でさらに培養される。ＯＭＭは、０．５ｘＮ２ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、１７５０２０４８）、０．５ｘＢ２７マイナスビタミンＡ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、１２５８７０１０）、１ｘＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、３５０５００６１）、０．１ｍＭ β－メルカプトエタノール（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、２１９８５０２３）、及びノルモシンを補った、Ａｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ：Ｆ１２（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、１２６３４０２８）及びＮｅｕｒｏｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、２１１０３０４９）の５０：５０混合物を含む。一部の実施形態において、細胞は、例えば、約５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０日以上にわたって、ＯＭＭ中でさらに培養される。一部の実施形態において、細胞は、約１００日を超えて、又は約１５０日を超えて培養される。一部の実施形態において、長期培養は、例えば、ｍＲＮＡ又はタンパク質の発現によって測定された場合、ＰＲＥＳＴＩＮ、ＧＡＴＡ３、ＩＮＳＭ１、ＨＥＳ６、ＴＭＰＲＳＳ３及びＧＮＧ８から選択される１種以上のマーカーを発現する細胞をもたらす。マーカーの検出は、標的分子の発現を検出するための当業界で公知の任意のアッセイ、例えば、免疫蛍光（ＩＦ）、免疫組織化学（ＩＨＣ）、蛍光又は発光リポーター、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）、ＲＮＡ配列決定（ＲＮＡ－ｓｅｑ）、単一細胞ＲＮＡｓｅｑ（ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑ）などを使用して実施され得る。
【0030】
ＳＨＨの例示的な活性化因子としては、限定されるものではないが、化合物ＳＡＧ（３－クロロ－Ｎ－［ｔｒａｎｓ－４－（メチルアミノ）シクロヘキシル］－Ｎ－［［３－（４－ピリジニル）フェニル］メチル］－ベンゾ［ｂ］チオフェン－２－カルボキサミドジヒドロクロリド）及びパルモルファミン、タンパク質スムーズンドのアゴニスト、（９Ｈ－プリン－６－アミン、９－シクロヘキシル－Ｎ－［４－（４－モルホリニル）フェニル］－２－（１－ナフタレニルオキシ）－が挙げられる。一部の実施形態において、ＳＨＨの活性化因子は、パルモルファミンである。好適な濃度は、当業界で公知である。一部の実施形態において、ＳＨＨの活性化因子は、培養培地中で約１ｎＭ～約１ｍＭの濃度を有し、好適には、パルモルファミンである。
【0031】
例示的なＷｎｔ阻害剤としては、限定されるものではないが、ＩＷＰ－２（Ｎ－（６－メチル－２－ベンゾチオアゾリル）－２－［（３，４，６，７－テトラヒドロ－４－オキソ－３－フェニルチエノ［３，２－ｄ］ピリミジン－２－イル）チオ］－アセトアミド）、Ｗｎｔ－Ｃ４９（２－（４－（２－メチルピリジン－４－イル）フェニル）－Ｎ－（４－（ピリジン－３－イル）フェニル）アセトアミド）、ＩＷＰ Ｌ６（２－［（４－オキソ－３－フェニル－６，７－ジヒドロチエノ［３，２－ｄ］ピリミジン－２－イル）スルファニル］－Ｎ－（５－フェニルピリジン－２－イル）アセトアミド）、及びＩＷＰ １２（２－［（３，６－ジメチル－４－オキソ－６，７－ジヒドロチエノ［３，２－ｄ］ピリミジン－２－イル）スルファニル］－Ｎ－（６－メチル－１，３－ベンゾチアゾール－２－イル）アセトアミド）が挙げられる。一部の実施形態において、Ｗｎｔ阻害剤は、ＩＷＰ－２である。当業者であれば、好適な濃度を決定することができる。例えば、一部の実施形態において、Ｗｎｔ阻害剤は、培養培地中で約１ｎＭ～約１ｍＭの濃度である。Ｗｎｔ阻害剤は、ＩＷＰ－２であってよく、約１ｎＭ～１ｍＭの濃度で使用される。
【0032】
例示的なＴＧＦ－ベータ阻害剤としては、ＳＢ－４３１５４２、ガルニセルチブ（ＬＹ２１５７２９９）、ＬＹ２１０９７６１、ＳＢ５２５３３４、ＳＢ５０５１２４、ＧＷ７８８３８８、ＬＹ３６４９４７、ＲｅｐＳｏｘ（Ｅ－６１６４５２）、ＴＧＦβＲＩ－ＩＮ－３、Ｒ－２６８７１２、ＢＩＢＦ－０７７５、ＴＰ０４２７７３６ＨＣｌ、Ａ－８３－０１、ＳＤ－２０８、及びバクトセルチブ（ＴＥＷ－７１９７）が挙げられる。ＴＧＦ－ベータ阻害剤は、好ましくは、ＳＢ－４３１５４２であってもよい。
【0033】
上記のように、ＳＨＨの活性化因子とＷｎｔ阻害剤との両方と共に培養された細胞を、最初の２２日を超えてさらに培養してもよく、例えば、細胞を、少なくとも５０日間にわたって、あるいは、約１００日間を超えてさらに培養してもよく、約２２～２５日目後の培地は、約２２～２５日後にさらなるアゴニスト又は阻害剤を含まない。一部の実施形態において、細胞は、さらなるアゴニスト又は阻害剤を含まない培地に移動させる前に洗浄される。一部の実施形態において、細胞は、さらなるアゴニスト又は阻害剤を含まない培地中で約１５０日を超えて培養される。
【0034】
本発明者らは、チロキシン、例えば、２５０ｎｇ／ｍｌのチロキシンの存在下での約５０日目から約１００日目までの細胞の培養は、細胞中でのＰＲＥＳＴＩＮ発現の増加をもたらすことを発見した。したがって、細胞を、チロキシンの存在を除いて、約２２～２５日後にさらなるアゴニスト又は阻害剤の非存在下で培養することができる。そのような長期的培養後の細胞は、蝸牛有毛細胞マーカー、例えば、ＰＲＥＳＴＩＮを発現する。さらに、細胞は、蝸牛有毛細胞と関連する、ＰＲＥＳＴＩＮ、ＧＡＴＡ３、ＩＮＳＭ１、ＨＥＳ６、ＴＭＰＲＳＳ３及びＧＮＧ８から選択されるマーカーのうちの２種以上、あるいは、３種以上のマーカー、あるいは、４種以上のマーカー、あるいは、５種以上のマーカー、あるいは、６種全部のマーカーを発現する。
【0035】
一部の場合、細胞外マトリックスタンパク質の半固体組成物は、Ｇｅｌｔｒｅｘ（登録商標）基底膜マトリックスなどの市販の生成物である。Ｇｅｌｔｒｅｘ（登録商標）基底膜マトリックスは、ＳｔｅｍＰｒｏ（登録商標）ｈＥＳＣ ＳＦＭ又はＥｓｓｅｎｔｉａｌ ８（商標）培地系を使用するヒト多能性幹細胞適用と共に使用するのに好適である。他の場合、半固体組成物は、例えば、ラミニン、エンタクチン、ビトロネクチン、フィブロネクチン、コラーゲン、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）、又はそれらの組合せなどの２種以上の細胞外マトリックスタンパク質を含む。
【0036】
一部の実施形態において、本開示の方法は、「内耳前駆細胞」を生成するための方法から始まる。内耳前駆細胞は、ＰＡＸ２（例えば、ＰＡＸ２＋内耳前駆細胞。）、より具体的には、ヒト内耳の発生において、ＰＡＸ２ｂの発現を特徴とする（図８）。細胞が内耳前駆細胞になるように誘導される前に、細胞は、一部の実施形態において、凝集される。凝集体を形成させるために、多能性幹細胞の集密培養物を、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）などの表面から、クランプ、凝集体、又は単一細胞に化学的、酵素的又は機械的に解離させることができる。一部の実施形態において、本開示の細胞を凝集させるために使用される培地は、好適なマトリックス、例えば、組換えヒトビトロネクチン－Ｎ、コラーゲン、マトリゲルなどの上に、１００μｇ／ｍｌノルモシンを補ったＥｓｓｅｎｔｉａｌ ８ Ｆｌｅｘ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、Ａ２８５８５０１）（Ｅ８ｆｎ）を含む。一部の実施形態において、解離した細胞（クランプ、凝集体、又は単一細胞として。）は、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）／Ｆ１２、ｍＴｅＳＲ（商標）（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ、Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｃｏｌｕｍｂｉａ、カナダ）、及びＴｅＳＲ（商標）などのタンパク質非含有基本培地中、表面上にプレーティングされる。ＴｅＳＲ（商標）の全構成成分及び使用方法は、Ｌｕｄｗｉｇらに記載されている。例えば、Ｌｕｄｗｉｇ Ｔら、「Ｆｅｅｄｅｒ－ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ」、Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ３：６３７～６４６頁（２００６）；及びＬｕｄｗｉｇ Ｔら、「Ｄｅｒｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｄｅｆｉｎｅｄ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ」、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２４：１８５～１８７頁（２００６）（それぞれ、あたかもその全体が記載されたかのように参照により本明細書に組み込まれる。）を参照されたい。本明細書における使用にとって好適な他のＤＭＥＭ製剤としては、例えば、Ｘ－Ｖｉｖｏ（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ、Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、Ｍｄ．）及びＳｔｅｍＰｒｏ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆ．）が挙げられる。
【0037】
本明細書で使用される場合、用語「多能性細胞」は、３種全部の胚葉、すなわち、外胚葉、中胚葉、及び内胚葉の細胞に分化することができる細胞を意味する。多能性細胞の例としては、胚性幹細胞及び人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞が挙げられる。本明細書で使用される場合、「ｉＰＳ細胞」とは、そのそれぞれの分化した元の体細胞と実質的に遺伝的に同一であり、本明細書に記載されるように、ＥＳ細胞などのより高い効力の細胞と類似する特徴を示す細胞を指す。これらの細胞は、非多能性（例えば、多分化能又は体。）細胞を再プログラミングすることによって取得され得る。本明細書に開示される分化方法にとって好適な多能性幹細胞（ＰＳＣ）としては、限定されるものではないが、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）、ヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）、非ヒト霊長類胚性幹細胞（ｎｈｐＥＳＣ）、非ヒト霊長類人工多能性幹細胞（ｎｈｐｉＰＳＣ）が挙げられる。
【0038】
ｉＰＳ細胞に再プログラミングするための対象特異的体細胞は、生検又は他の組織試料採取法によって目的の標的組織から取得又は単離され得る。一部の場合、対象特異的細胞は、使用前にインビトロで操作される。例えば、対象特異的細胞を拡大し、分化させ、遺伝的に改変し、ポリペプチド、核酸、若しくは他の因子と接触させ、凍結保存する、又はそうでなければ改変することができる。
【0039】
本明細書に記載される方法において使用される多能性幹細胞を培養するための規定の培地及び基質条件は、当業界で周知である。一部の例示的な実施形態において、本明細書に開示される方法に従って分化させようとする多能性幹細胞は、製造業者のプロトコールに従って、Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標）Ｓｙｎｔｈｅｍａｘ（登録商標）表面、又は一部の場合、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）基質（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＮＪ）上、ｍＴＥＳＲ（登録商標）－１培地（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ、Ｃａｌｉｆ．）、又はＥｓｓｅｎｔｉａｌ ８（登録商標）培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）中で培養される。
【0040】
一部の実施形態において、多能性幹細胞の凝集体は、任意選択的に、Ｒｈｏキナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤の存在下で培養される。ＲＯＣＫ阻害剤などのキナーゼ阻害剤は、単一細胞及び細胞の小さい凝集体を保護することが公知である。例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２００８／０１７１３８５号明細書；及び参照により本明細書に組み込まれる、Ｗａｔａｎａｂｅ Ｋら、「Ａ ＲＯＣＫ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｐｅｒｍｉｔｓ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｏｆ ｄｉｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｈｕｍａｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ」、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２５：６８１～６８６頁（２００７）を参照されたい。ＲＯＣＫ阻害剤は、化学的に規定された表面上で多能性細胞の生存を有意に増加させることが以下に示される。本明細書の使用にとって好適なＲＯＣＫ阻害剤としては、限定されるものではないが、（Ｓ）－（＋）－２－メチル－１－［（４－メチル－５－イソキノリニル）スルホニル］ホモピペラジンジヒドロクロリド（非公式名：Ｈ－１１５２）、１－（５－イソキノリンスルホニル）ピペラジンヒドロクロリド（非公式名：ＨＡ－１００）、１－（５－イソキノリンスルホニル）－２－メチルピペラジン（非公式名：Ｈ－７）、１－（５－イソキノリンスルホニル）－３－メチルピペラジン (非公式名：イソＨ－７)、Ｎ－２－（メチルアミノ）エチル－５－イソキノリン－スルホンアミドジヒドロクロリド（非公式名：Ｈ－８）、Ｎ－（２－アミノエチル）－５－イソキノリンスルホンアミドジヒドロクロリド（非公式名：Ｈ－９）、Ｎ－［２－ｐ－ブロモ－シンナミルアミノ）エチル］－５－イソキノリンスルホンアミドジヒドロクロリド（非公式名：Ｈ－８９）、Ｎ－（２－グアニジノエチル）－５－イソキノリンスルホンアミドヒドロクロリド（非公式名：ＨＡ－１００４）、１－（５－イソキノリンスルホニル）ホモピペラジンジヒドロクロリド（非公式名：ＨＡ－１０７７）、（Ｓ）－（＋）－２－メチル－４－グリシル－１－（４－メチルイソキノリニル－５－スルホニル）ホモピペラジンジヒドロクロリド（非公式名：グリシルＨ－１１５２）及び（＋）－（Ｒ）－ｔｒａｎｓ－４－（１－アミノエチル）－Ｎ－（４－ピリジル）シクロヘキサンカルボキサミドジヒドロクロリド（非公式名：Ｙ－２７６３２）が挙げられる。キナーゼ阻害剤を、細胞が生存し、表面に付着したままになる十分に高い濃度で提供することができる。約３μＭ～約１０μＭの阻害剤濃度が、開示される方法にとって好適であり得る。より低濃度において、又はＲＯＣＫ阻害剤が提供されない場合、未分化の細胞は典型的には、剥離するが、分化した細胞は規定の表面に付着したままになる。
【0041】
内耳前駆細胞の形成を誘導するために、凝集した多能性幹細胞は、トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ－β）シグナル伝達の阻害剤、例えば、ＳＢ－４３１５４２、骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ－４）及び低濃度の線維芽細胞増殖因子２（ＦＧＦ－２）を含む培地中で約３日間培養される。本発明者らは、分化プロトコールのこの段階で凝集した幹細胞をＢＭＰ－４と共に培養することは、凝集体の培養開始後Ｄ５５でＰＯＵ４Ｆ３＋細胞の割合を増加させることを発見した（図１０ａ）。さらに、ＢＭＰ－４の濃度は、ＰＯＵ４Ｆ３＋細胞の割合に影響し（図１０ｂ、１０ｃ）、約１００ｐｇ／ｍｌより高い、約２００ｐｇ／ｍｌより高い、約３００ｐｇ／ｍｌより高い、約４００ｐｇ／ｍｌより高い、約５００ｐｇ／ｍｌより高い、約６００ｐｇ／ｍｌより高い、約７００ｐｇ／ｍｌより高い、約８００ｐｇ／ｍｌより高い、約９００ｐｇ／ｍｌより高くてもよい。ＢＭＰ－４の濃度は、約１００ｐｇ／ｍｌ～約５００ｐｇ／ｍｌ、例えば、約２００、３００、４００、若しくは５００ｐｇ／ｍｌ、又は約５００ｐｇ／ｍｌ～約１０００ｐｇ／ｍｌ、例えば、約５００、６００、７００、８００、９００若しくは１０００ｐｇ／ｍｌであってもよい。次いで、細胞は、骨形成タンパク質４（ＢＭＰ－４）シグナル伝達の阻害剤、例えば、ＬＤＮ１９３１８９、及び高濃度のＦＧＦ－２を含む培地中で約４日間培養された後、細胞は、高濃度のＦＧＦ－２、ＢＭＰ－４シグナル伝達阻害剤、及びグリコーゲンシンターゼキナーゼ３（ＧＳＫ－３）の阻害剤、例えば、ＣＨＩＲ９９０２１を含む培地中で約４日間培養される。図２ａを参照されたい。
【0042】
一部の実施形態において、内耳前駆細胞は、（ｉ）コーティングされたプレート上で約０日目から３日目まで、ＦＧＦ－２及びＴＧＦ－ベータ阻害剤、例えば、ＳＢ－４３１５４２を含む培地中で多能性幹細胞を培養するステップ；（ｉｉ）３日目～７日目にわたって、ＦＧＦ－２、ＴＧＦ－ベータ阻害剤及びＢＭＰ－４阻害剤、例えば、ＬＤＮ１９３１８９を含む培地中でステップ（ｉ）の細胞を培養するステップ；（ｉｉｉ）７日目～１１日目にわたってＧＳＫ－３阻害剤、例えば、ＣＨＩＲ９９０２１、ＢＭＰ－４阻害剤を含む培地中でステップ（ｉｉ）の細胞を培養するステップ；並びに（ｉｖ）１１～１８日目にわたってコーティングされたプレート上でＧＳＫ３阻害剤を含む培地中でステップ（ｉｉｉ）の細胞を培養して、ＰＡＸ＋内耳前駆細胞を産生するステップの方法によって多能性幹細胞から誘導される。
【0043】
細胞組成物
本開示の別の態様において、細胞組成物が提供される。一部の実施形態において、組成物は、本明細書に記載の方法によって生成されたヒト蝸牛有毛細胞又はヒト蝸牛有毛細胞を含むオルガノイドを含む。例えば、ヒト蝸牛有毛細胞は、（ａ）少なくとも３～５日間にわたってソニックヘッジホッグの活性化因子を含む培地中でヒト多能性幹細胞に由来するＰＡＸ２＋内耳前駆細胞を培養するステップ；並びに（ｂ）続いて、ＧＡＴＡ３又はＮＲ２Ｆ１の内耳マーカーのうちの１種以上を発現するヒト蝸牛有毛細胞に細胞を分化させるのに十分な時間量にわたって、ソニックヘッジホッグの活性化因子及びＷｎｔ阻害剤を含む培地中でステップ（ａ）の細胞を培養するステップによって生成される。蝸牛有毛細胞は、ＰＲＥＳＴＩＮを発現してもよい。ステップ（ｂ）の細胞は、少なくとも５０日間、あるいは、少なくとも１００日間、あるいは、少なくとも１５０日間にわたってＳＳＨの活性化因子又はＷＮＴ阻害剤を含まない培地中でさらに培養されてもよく、蝸牛有毛細胞は、ＰＲＥＳＴＩＮ、ＮＲ２Ｆ１、ＧＡＴＡ３、ＩＮＳＭ１、ＨＥＳ６、ＴＭＰＲＳＳ３及びＧＮＧ８から選択される２種以上のマーカーを発現する。蝸牛有毛細胞は、ＰＲＥＳＴＩＮ、ＮＲ２Ｆ１、ＧＡＴＡ３及びＩＮＳＭ１を発現してもよい。細胞は、ＨＥＳ６、ＴＭＰＲＳＳ３又はＧＮＧ８のうちの１種以上をさらに発現してもよい。これらの蝸牛有効細胞は、聴覚を伝達することができる。例えば、図６ｄ～６ｈを参照されたい。
本開示の別の態様において、細胞組成物が提供される。一部の実施形態において、組成物は、本明細書に記載の方法によって生成されたヒト蝸牛有毛細胞又はヒト蝸牛有毛細胞を含むオルガノイドを含む。例えば、ヒト蝸牛有毛細胞は、（ａ）少なくとも３～５日間にわたってソニックヘッジホッグの活性化因子を含む培地中でヒト多能性幹細胞に由来するＰＡＸ２＋内耳前駆細胞を培養するステップ；並びに（ｂ）続いて、ＧＡＴＡ３又はＮＲ２Ｆ１の内耳マーカーのうちの１種以上を発現するヒト蝸牛有毛細胞に細胞を分化させるのに十分な時間量にわたって、ソニックヘッジホッグの活性化因子及びＷｎｔ阻害剤を含む培地中でステップ（ａ）の細胞を培養するステップによって生成される。蝸牛有毛細胞は、ＰＲＥＳＴＩＮを発現してもよい。ステップ（ｂ）の細胞は、少なくとも５０日間、あるいは、少なくとも１００日間、あるいは、少なくとも１５０日間にわたってＳＳＨの活性化因子又はＷＮＴ阻害剤を含まない培地中でさらに培養されてもよく、蝸牛有毛細胞は、ＰＲＥＳＴＩＮ、ＮＲ２Ｆ１、ＧＡＴＡ３、ＩＮＳＭ１、ＨＥＳ６、ＴＭＰＲＳＳ３及びＧＮＧ８から選択される２種以上のマーカーを発現する。蝸牛有毛細胞は、ＰＲＥＳＴＩＮ、ＮＲ２Ｆ１、ＧＡＴＡ３及びＩＮＳＭ１を発現してもよい。細胞は、ＨＥＳ６、ＴＭＰＲＳＳ３又はＧＮＧ８のうちの１種以上をさらに発現してもよい。これらの蝸牛有効細胞は、聴覚を伝達することができる。例えば、図６ｄ～６ｈを参照されたい。
【0044】
内耳前駆細胞は、（ｉ）コーティングされたプレート上で０日目から３日目まで、ＦＧＦ－２及びＴＧＦ－ベータ阻害剤、例えば、ＳＢ－４３１５４２を含む培地中で多能性幹細胞を培養するステップ；（ｉｉ）３日目～７日目にわたって、ＦＧＦ－２、ＴＧＦ－ベータ阻害剤及びＢＭＰ－４阻害剤、例えば、ＬＤＮ １９３１８９を含む培地中でステップ（ｉ）の細胞を培養するステップ；（ｉｉｉ）７日目から１１日目までＧＳＫ－３阻害剤、例えば、ＣＨＩＲ９９０２１、ＢＭＰ－４阻害剤を含む培地中でステップ（ｉｉ）の細胞を培養するステップ；並びに（ｉｖ）１１日目から１８日目までコーティングされたプレート上でＧＳＫ－３阻害剤を含む培地中でステップ（ｉｉｉ）の細胞を培養して、ＰＡＸ＋内耳前駆細胞を産生するステップの方法によって多能性幹細胞から誘導することができる。
【0045】
キット、プラットフォーム、及びシステム
本開示の態様において、キット、システム、及びプラットフォームが提供される。キット、システム、又はプラットフォームは、ソニックヘッジホッグの活性化因子、Ｗｎｔ阻害剤、ＦＧＦ－２、ＴＧＦ－ベータ阻害剤、ＢＭＰ－４阻害剤、ＧＳＫ－３阻害剤、チロキシン、及び人工多能性幹細胞又は胚性幹細胞のうちの１種以上を含んでもよい。キット、システム、又はプラットフォームはまた、固相支持体、ラミニン、エンタクチン、ビトロネクチン、フィブロネクチン、コラーゲン、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）、又はそれらの組合せを含んでもよい。
本開示の態様において、キット、システム、及びプラットフォームが提供される。キット、システム、又はプラットフォームは、ソニックヘッジホッグの活性化因子、Ｗｎｔ阻害剤、ＦＧＦ－２、ＴＧＦ－ベータ阻害剤、ＢＭＰ－４阻害剤、ＧＳＫ－３阻害剤、チロキシン、及び人工多能性幹細胞又は胚性幹細胞のうちの１種以上を含んでもよい。キット、システム、又はプラットフォームはまた、固相支持体、ラミニン、エンタクチン、ビトロネクチン、フィブロネクチン、コラーゲン、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）、又はそれらの組合せを含んでもよい。
【0046】
その他
文脈によって別途特定又は指摘されない限り、用語「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」及び「ｔｈｅ」は、「１つ以上（ｏｎｅ ｏｒ ｍｏｒｅ）」を意味する。例えば、「分子（ａ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）」は、「１つ以上の分子（ｏｎｅ ｏｒ ｍｏｒｅ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）」を意味すると解釈されるべきである。
文脈によって別途特定又は指摘されない限り、用語「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」及び「ｔｈｅ」は、「１つ以上（ｏｎｅ ｏｒ ｍｏｒｅ）」を意味する。例えば、「分子（ａ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）」は、「１つ以上の分子（ｏｎｅ ｏｒ ｍｏｒｅ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）」を意味すると解釈されるべきである。
【0047】
本明細書で使用される場合、「約」、「およそ」、「実質的に」及び「有意に」は、当業者により理解され、また、それらが使用される文脈に応じてある程度まで変化する。それが使用される文脈を考慮しても当業者に明確でないこの用語が使用される場合には、「約」及び「およそ」とは、特定の用語のプラス又はマイナス１０％以下を意味し、「実質的に」及び「有意に」は特定の用語のプラス又はマイナス１０％を超えることを意味する。
【0048】
本明細書で使用される場合、用語「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」及び「含むこと（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」は、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」及び「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」と同じ意味を有する。用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」及び「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、特許請求の範囲に記載される構成要素への追加の構成要素のさらなる含有を許容する「オープン」な暫定的な用語であると解釈されるべきである。用語「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔ）」及び「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」は、特許請求の範囲に記載される構成要素以外の追加の構成要素の含有を許容しない「クローズド」な暫定的な用語であると解釈されるべきである。用語「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」は、部分的にクローズドであり、特許請求される主題の性質を根本的に変更させない追加の構成要素のみの含有を許容すると解釈されるべきである。
【0049】
本明細書に記載の全ての方法は、本明細書で別途指摘しない限り、又は文脈によって別途明確に否定されない限り、任意の好適な順序で実施することができる。本明細書で提供される任意及び全ての例、又は例示的言語（例えば、「など」）の使用は、単に本発明の説明をより容易にすることを意図するものであり、別途特許請求されない限り、本発明の範囲に対して制限を課すものではない。本明細書における言語は、本発明の実施にとって必須であるものとしてあらゆる特許請求されていない要素を示すと解釈されるべきではない。
【0050】
本明細書で引用された刊行物、特許出願、及び特許を含む全ての参考文献は、あたかもそれぞれの参考文献が参照により組み込まれたかのように個別に、かつ具体的に示され、その全体が本明細書に記載されたのと同程度に、参照により本明細書に組み込まれる。
【0051】
本発明を実行するために本発明者らに公知の最良の様式を含む、本発明の好ましい態様は、本明細書に記載される。これらの好ましい態様の変形は、前述の説明を読む際に当業者に明らかになってもよい。本発明者らは、必要に応じて、そのような変形を用いることを当業者に期待し、本発明者らは、本明細書に具体的に記載されるもの以外に本発明が実施されることを意図する。したがって、本発明は、適用可能な法律によって許容されるような本明細書に添付される特許請求の範囲に記載される主題の全ての改変物及び等価物を含む。さらに、別途本明細書で指摘されない限り、又は別途文脈によって明確に否定されない限り、そのあらゆる可能な変形中の上記の要素の任意の組合せが本発明によって包含される。
【実施例】
【0052】
［実施例１］ ヒト多能性幹細胞からの高忠実度蝸牛オルガノイドの操作
ヒト内耳は、身体の中で最も複雑な器官の１つであり、カタツムリ状の蝸牛及び前庭末端器官を含む３つの直交する半規管を有する。前者には、整然と列を成して配置された２つの異なる種類の機械感受性有毛細胞（ＨＣ）が存在する。内耳の形態形成は、胎児発生中の編み込まれたシグナル伝達事象によって調整される１～３。胚形成の間の内耳発生は、時間に関して９９％を超える誤差なく成功する。実際、ほぼ１０％の成人が中等度から深刻な難聴を有するが、誕生時の発生率は０．２％未満であり、これは、大多数の感音性難聴が、発生初期の内耳の中での細胞の出産後死滅又は機能障害の結果生じることを意味する４。
ヒト内耳は、身体の中で最も複雑な器官の１つであり、カタツムリ状の蝸牛及び前庭末端器官を含む３つの直交する半規管を有する。前者には、整然と列を成して配置された２つの異なる種類の機械感受性有毛細胞（ＨＣ）が存在する。内耳の形態形成は、胎児発生中の編み込まれたシグナル伝達事象によって調整される１～３。胚形成の間の内耳発生は、時間に関して９９％を超える誤差なく成功する。実際、ほぼ１０％の成人が中等度から深刻な難聴を有するが、誕生時の発生率は０．２％未満であり、これは、大多数の感音性難聴が、発生初期の内耳の中での細胞の出産後死滅又は機能障害の結果生じることを意味する４。
【0053】
インビトロでのヒト内耳発生の複雑なプロセスを要約するために、本発明者らは、マウス又はヒト多能性幹細胞の凝集体から内耳感覚上皮を生成するための規定の３Ｄ培養系を以前に確立した５～８。これらのいわゆる「内耳オルガノイド」は、感覚様ニューロンによって刺激される支持細胞層及び機能的有毛細胞を担持する。しかしながら、これらのオルガノイドは、天然の前庭有毛細胞のものと同等の構造的、生化学的及び機能的特性を有するが、任意の蝸牛細胞型を産生することができない有毛細胞を一貫して生成する。ヒト内耳発生をより適切にモデリングするために、本発明者らは、聴覚刺激の適切な検出にとって必須である蝸牛における２つの機械感受性有毛細胞である、外有毛細胞及び内有毛細胞を含有する新しいオルガノイド系を確立することを目標とした。
【0054】
結果
多重リポーターｈＥＳＣ系は培養最適化の増強を提供する
培養物中の内耳前駆細胞及び有毛細胞の誘導をモニタリングし、本発明者らの以前に公開されたプロトコール５、８の効率を改善するために、本発明者らは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ゲノム操作技術を使用して、ＰＡＸ２－２Ａ－ｎＧＦＰ／ＰＯＵ４Ｆ３－２Ａ－ｎｔｄＴｏｍａｔｏリポーターヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）系を生成した。ＰＡＸ２は、インビボでの内耳前駆細胞の初期マーカーであるが、ＰＯＵ４Ｆ３発現は有毛細胞に非常に特異的であり、培養効率の後期読み出しを提供する。本発明者らは、ＰＡＸ２ｂがヒト内耳オルガノイド組織において最も豊富に発現されるＰＡＸ２アイソフォームであることを初めて確認した（図８ａ～ｂ）。高忠実度Ｃａｓ９９及びこのアイソフォームの終止コドンを標的とするｓｇＲＮＡを使用して、本発明者らは、内因性ＰＡＸ２コード配列のすぐ下流に２Ａ－ｎＧＦＰカセットにノックインした。２Ａ－ｎｔｄＴｏｍａｔｏカセットを、親細胞系として確立されたＰＡＸ２－２Ａ－ｎＧＦＰ ｈＥＳＣを使用してＰＯＵ４Ｆ３終止コドンの下流のＰＯＵ４Ｆ３遺伝子座に同様にノックインした（図１ａ～ｂ）。得られた多重リポーター細胞系は、オルガノイド培養１２日目（Ｄ１２）あたりから開始して核ＧＦＰを用いてＰＡＸ２＋内耳前駆細胞を標識し、Ｄ３５あたりから開始して核ｔｄＴｏｍａｔｏを用いてＰＯＵ４Ｆ３＋有毛細胞を標識する（図１ｃ～ｍ；図８～９）。ｈＥＳＣリポーター系を使用して、本発明者らは、内耳誘導を最適化するための基本培地、低分子処置のタイミング及び持続期間を確立し、体系的に変化させた（図２）。さらに、全ての内耳系列の分化は、非神経内胚葉を確立するためにＢＭＰシグナル伝達を必要とするが、本発明者らは、本発明者らの蝸牛オルガノイド培養物が効率的な内耳誘導及びその後の有毛細胞生成のためのこのパラメーターに特に感受性であることを見出した（図１０）。最適化の後、有毛細胞を産生する凝集体の数は、本発明者らの以前のプロトコール８、１０に対して倍化し、凝集体あたりの有毛細胞の数は２０倍増加した。
多重リポーターｈＥＳＣ系は培養最適化の増強を提供する
培養物中の内耳前駆細胞及び有毛細胞の誘導をモニタリングし、本発明者らの以前に公開されたプロトコール５、８の効率を改善するために、本発明者らは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ゲノム操作技術を使用して、ＰＡＸ２－２Ａ－ｎＧＦＰ／ＰＯＵ４Ｆ３－２Ａ－ｎｔｄＴｏｍａｔｏリポーターヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）系を生成した。ＰＡＸ２は、インビボでの内耳前駆細胞の初期マーカーであるが、ＰＯＵ４Ｆ３発現は有毛細胞に非常に特異的であり、培養効率の後期読み出しを提供する。本発明者らは、ＰＡＸ２ｂがヒト内耳オルガノイド組織において最も豊富に発現されるＰＡＸ２アイソフォームであることを初めて確認した（図８ａ～ｂ）。高忠実度Ｃａｓ９９及びこのアイソフォームの終止コドンを標的とするｓｇＲＮＡを使用して、本発明者らは、内因性ＰＡＸ２コード配列のすぐ下流に２Ａ－ｎＧＦＰカセットにノックインした。２Ａ－ｎｔｄＴｏｍａｔｏカセットを、親細胞系として確立されたＰＡＸ２－２Ａ－ｎＧＦＰ ｈＥＳＣを使用してＰＯＵ４Ｆ３終止コドンの下流のＰＯＵ４Ｆ３遺伝子座に同様にノックインした（図１ａ～ｂ）。得られた多重リポーター細胞系は、オルガノイド培養１２日目（Ｄ１２）あたりから開始して核ＧＦＰを用いてＰＡＸ２＋内耳前駆細胞を標識し、Ｄ３５あたりから開始して核ｔｄＴｏｍａｔｏを用いてＰＯＵ４Ｆ３＋有毛細胞を標識する（図１ｃ～ｍ；図８～９）。ｈＥＳＣリポーター系を使用して、本発明者らは、内耳誘導を最適化するための基本培地、低分子処置のタイミング及び持続期間を確立し、体系的に変化させた（図２）。さらに、全ての内耳系列の分化は、非神経内胚葉を確立するためにＢＭＰシグナル伝達を必要とするが、本発明者らは、本発明者らの蝸牛オルガノイド培養物が効率的な内耳誘導及びその後の有毛細胞生成のためのこのパラメーターに特に感受性であることを見出した（図１０）。最適化の後、有毛細胞を産生する凝集体の数は、本発明者らの以前のプロトコール８、１０に対して倍化し、凝集体あたりの有毛細胞の数は２０倍増加した。
【0055】
ＳＨＨ及びＷＮＴ経路の逐次的モジュレーションによる内耳オルガノイドの腹側化
内耳発生中に、蝸牛構造は、耳胞の最も腹側の領域から誘導されるが、前庭構造は、より背側の耳領域を起源とする１。本発明者らの培養プラットフォームは、自己誘導性分化及びパターン形成に一部依拠し、以前に報告された内耳オルガノイドプロトコールと同様、本発明者らの最適化された基本制御（ＣＴＲＬ）培養系は、前庭表現型の有毛細胞を一貫して生成する。本発明者らは、胚発生においてと同様に、耳胞に対して外因性のシグナルが、蝸牛誘導にとって必要であり得るとの仮説を立てた。神経管の底板及び下部の脊索から分泌されるシグナル伝達分子であるソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）は、腹側耳胞のパターン形成にとって必須である。ＳＨＨは、マウス及びニワトリにおいて耳胞を腹側化し、蝸牛構造を誘導するのに必要かつ十分である１１、１２。より最近の研究により、これらの以前の報告が裏付けられ、ＳＨＨ経路の活性化がｃＡＭＰ依存性タンパク質キナーゼＡ（ＰＫＡ）の阻害をもたらし、それにより、標的ＧＬＩ３の下流でＳＨＨのタンパク質分解的プロセシングを減少させ、腹側関連遺伝子の発現を調節することが示された１２。対照的に、ＷＮＴ及びＢＭＰシグナル伝達経路は、内耳発生中の背側遺伝子発現の誘導において役割を果たすことが示された１３、１４。
内耳発生中に、蝸牛構造は、耳胞の最も腹側の領域から誘導されるが、前庭構造は、より背側の耳領域を起源とする１。本発明者らの培養プラットフォームは、自己誘導性分化及びパターン形成に一部依拠し、以前に報告された内耳オルガノイドプロトコールと同様、本発明者らの最適化された基本制御（ＣＴＲＬ）培養系は、前庭表現型の有毛細胞を一貫して生成する。本発明者らは、胚発生においてと同様に、耳胞に対して外因性のシグナルが、蝸牛誘導にとって必要であり得るとの仮説を立てた。神経管の底板及び下部の脊索から分泌されるシグナル伝達分子であるソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）は、腹側耳胞のパターン形成にとって必須である。ＳＨＨは、マウス及びニワトリにおいて耳胞を腹側化し、蝸牛構造を誘導するのに必要かつ十分である１１、１２。より最近の研究により、これらの以前の報告が裏付けられ、ＳＨＨ経路の活性化がｃＡＭＰ依存性タンパク質キナーゼＡ（ＰＫＡ）の阻害をもたらし、それにより、標的ＧＬＩ３の下流でＳＨＨのタンパク質分解的プロセシングを減少させ、腹側関連遺伝子の発現を調節することが示された１２。対照的に、ＷＮＴ及びＢＭＰシグナル伝達経路は、内耳発生中の背側遺伝子発現の誘導において役割を果たすことが示された１３、１４。
【0056】
これらの以前のマウス遺伝学研究に基づいて、本発明者らは、ＳＨＨ経路の時限的活性化が、ＰＫＡ、ＢＭＰ及び／又はＷＮＴシグナル伝達の同時的抑制と共に、腹側内耳遺伝子の上方調節を促進し、長期培養物中での蝸牛有毛細胞の生成をもたらし得るとの仮説を立てた（図３ａ）。この仮説を検査するために、本発明者らは、低分子ＳＨＨアゴニストであるパルモルファミン（ＰＵＲ）のみの存在下で、又はＢＭＰ（ＬＤＮ）、ＷＮＴ（ＩＷＰ２）、及びＰＫＡ（Ｈ８９）の阻害剤と組み合わせたパルモルファミンの存在下で、ｈＥＳＣ由来凝集体を培養した（図３ａ）。簡潔にするために、ここで提示される順列は包括的なものではなく、ＳＨＨ活性化のみ（ＰＵＲ）、又はＷＮＴ阻害と組み合わせたＳＨＨ活性化（ＰＵＲ＋ＩＷＰ２）からの結果を含む。
【0057】
本発明者らは、ＣＴＲＬ、ＰＵＲ又はＰＵＲ＋ＩＷＰ２条件下で生成された凝集体に由来するＤ２０のＰＡＸ２－ｎＧＦＰ＋選別された細胞に対して高効率単一細胞ＲＮＡ配列決定（ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑ）分析を実施した。それぞれの条件は、条件あたり１つのバッチで、別々に分析された。合計３７，０７３個の細胞を収集し、各バッチに由来する細胞を混合し、一緒にクラスター化した。Ｓｅｕｒａｔ ｖ３．２に実装されたような偏りのないクラスタリングは、ＰＵＲ＋ＩＷＰ２条件に由来するＥＰＣＡＭ／ＦＢＸＯ２＋内耳前駆細胞が異なるクラスターを形成するが、ＰＵＲ及びＣＴＲＬ内耳前駆細胞は一緒にクラスター化することを示した（図３ｂ；図１１）。全部で３種の条件に由来する内耳前駆細胞が単離され、その後の条件間の示差的発現分析は、ＤＬＸ５、ＭＳＸ１、ＧＰＲ１６６、及びＡＣＳＬ４などの背側内耳マーカーはＰＵＲ及びＣＴＲＬ処置細胞に大まかに限定されるが、ＯＴＸ１／２、ＮＲ２Ｆ１／２、ＥＤＮ３、及びＲＳＰＯ３を含む腹側内耳マーカーはＰＵＲ＋ＩＷＰ２条件に集中していることを示した。さらに、ＳＵＬＦ１、ＬＲＰ２、ＧＡＳ１、及びＰＴＣＨ１などのＳＨＨ経路に関与する遺伝子はＰＵＲ＋ＩＷＰ２処置細胞において高度に発現されたが、その発現はＣＴＲＬ及びＰＵＲ処置された前駆細胞において減弱された（図３ｃ）。これと一致して、遺伝子セットエンリッチメント分析（ＧＳＥＡ）１５は、未処置のＣＴＲＬ内耳前駆細胞と比較した場合、ＰＵＲ＋ＩＷＰ２処置された内耳前駆細胞において、ヘッジホッグ経路と関連する遺伝子セットの富化及び標準ＷＮＴ経路と関連する遺伝子セットの下方調節を示した。さらに、ＰＵＲ＋ＩＷＰ２処置された内耳前駆細胞の分析は、遺伝子発現の転写後調節のための複数の富化された遺伝子セット、クロマチン改変、並びにＺＮＦ７１１、ＭＯＲＣ２、ＧＣＭ２及びＢＡＲＨＬ１などの転写因子をコードする公知の遺伝性難聴遺伝子の標的から構成される遺伝子セットを示した（図３ｄ）。
【0058】
本発明者らは、Ｄ２５オルガノイドを使用してＮＲ２Ｆ１、ＳＵＬＦ１、及びＯＴＸ２に関する免疫蛍光と共にｓｃＲＮＡ－ｓｅｑデータを実証した（図３ｅ；図１１）。本発明者らは、ＰＵＲ及びＩＷＰ２を用いた逐次処置後のｈＥＳＣ由来内耳前駆細胞のより効率的な腹側化が、少なくとも部分的には、ＳＨＨの下流の遺伝子標的のモジュレーションに起因すると結論付けた。本発明者らは、単独の、又はＰＵＲ及びＩＷＰ２と組み合わせた、細胞透過性ＰＫＡ阻害剤である低分子Ｈ８９の効果を検査したが、これらの処置はいずれも、有毛細胞の誘導において有効ではなかった（図１２）。
【0059】
腹側化された内耳オルガノイドにおける内耳前駆細胞は蝸牛有毛細胞を生じる
ＰＵＲ＋ＩＷＰ２処置された凝集体及びＣＴＲＬ凝集体を、Ｄ２２から前方へ外因性シグナル伝達分子又は増殖因子を含まない規定の培養培地中で増殖させた。ＰＵＲ＋ＩＷＰ２処置されたＨＣとＣＴＲＬ ＨＣとの間で転写プロファイルを比較するために、Ｄ８０及び－１０９のＰＯＵ４Ｆ３－ｎｔｄＴ＋選別細胞をｓｃＲＮＡ－ｓｅｑによって分析した。本発明者らは、高及び低ＰＯＵ４Ｆ３発現細胞を収集するために非ストリンジェントなＦＡＣＳゲーティング戦略を用いて、それぞれ、Ｄ８０及び－１０９の試料について、３，３３２個（合計１７，６６８個の細胞のうちの１８．９％。）及び４，５８２個の有毛細胞（合計１６，０４４個の細胞のうちの２８．６％。）からの配列データの回収を得た。Ｄ２０のｓｃＲＮＡ－ｓｅｑデータと同様、細胞を偏りのないクラスタリングにかけた場合、ＣＴＲＬ有毛細胞からＰＵＲ＋ＩＷＰ２有毛細胞が分離した（図４ａ～ｂ；図１３～１４）。２つの条件間で発現された遺伝子の差異を示すボルケーノプロットは、ＧＡＴＡ３、ＩＮＳＭ１、ＨＥＳ６、ＴＭＰＲＳＳ３及びＧＮＧ８を含む、いくつかの公知の蝸牛有毛細胞マーカー１６～１９を同定し、その発現はＤ１０９でＣＴＲＬ有毛細胞に対してＰＵＲ＋ＩＷＰ２処置された有毛細胞において有意により高かった（図４ｃ；図１４）。ＰＵＲ＋ＩＷＰ２及びＣＴＲＬ有毛細胞のＧＳＥＡは、電位依存性カチオンチャネル活性と関連する遺伝子セットはＰＵＲ＋ＩＷＰ２有毛細胞において上方調節されるが、繊毛及び微小管関連遺伝子はＣＴＲＬ有毛細胞において上方調節されることを示した（図１４）。
ＰＵＲ＋ＩＷＰ２処置された凝集体及びＣＴＲＬ凝集体を、Ｄ２２から前方へ外因性シグナル伝達分子又は増殖因子を含まない規定の培養培地中で増殖させた。ＰＵＲ＋ＩＷＰ２処置されたＨＣとＣＴＲＬ ＨＣとの間で転写プロファイルを比較するために、Ｄ８０及び－１０９のＰＯＵ４Ｆ３－ｎｔｄＴ＋選別細胞をｓｃＲＮＡ－ｓｅｑによって分析した。本発明者らは、高及び低ＰＯＵ４Ｆ３発現細胞を収集するために非ストリンジェントなＦＡＣＳゲーティング戦略を用いて、それぞれ、Ｄ８０及び－１０９の試料について、３，３３２個（合計１７，６６８個の細胞のうちの１８．９％。）及び４，５８２個の有毛細胞（合計１６，０４４個の細胞のうちの２８．６％。）からの配列データの回収を得た。Ｄ２０のｓｃＲＮＡ－ｓｅｑデータと同様、細胞を偏りのないクラスタリングにかけた場合、ＣＴＲＬ有毛細胞からＰＵＲ＋ＩＷＰ２有毛細胞が分離した（図４ａ～ｂ；図１３～１４）。２つの条件間で発現された遺伝子の差異を示すボルケーノプロットは、ＧＡＴＡ３、ＩＮＳＭ１、ＨＥＳ６、ＴＭＰＲＳＳ３及びＧＮＧ８を含む、いくつかの公知の蝸牛有毛細胞マーカー１６～１９を同定し、その発現はＤ１０９でＣＴＲＬ有毛細胞に対してＰＵＲ＋ＩＷＰ２処置された有毛細胞において有意により高かった（図４ｃ；図１４）。ＰＵＲ＋ＩＷＰ２及びＣＴＲＬ有毛細胞のＧＳＥＡは、電位依存性カチオンチャネル活性と関連する遺伝子セットはＰＵＲ＋ＩＷＰ２有毛細胞において上方調節されるが、繊毛及び微小管関連遺伝子はＣＴＲＬ有毛細胞において上方調節されることを示した（図１４）。
【0060】
本発明者らのｓｃＲＮＡ－ｓｅｑデータと一致して、ＰＵＲ＋ＩＷＰ２処置されたオルガノイドの免疫蛍光は、ＰＯＵ４Ｆ３＋細胞が、ＮＲ２Ｆ１及びＧＡＴＡ３などの、有意により高いレベルの蝸牛有毛細胞マーカータンパク質を発現し（図４ｅ～ｆ）、これが妊娠週数（ＧＷ）１８でヒト胎児蝸牛の有毛細胞にて確認されたことを示した（図４ｇ）。
【0061】
ＰＵＲ＋ＩＷＰ２オルガノイドとＣＴＲＬオルガノイドとの間の誘導される有毛細胞の先端面での毛束の構造特性を比較するために、走査電子顕微鏡観察を実施した（図５ａ～ｈ）。表皮板の中央の運動毛の出現から、典型的には、マウス内耳において見られる、不動毛の階段パターンの発達までの、毛束の構造的発達２０が、オルガノイド有毛細胞において観察された（図１５）。本発明者らはまた、個々の不動毛間でチップリンク様構造も検出した（図１５）。これらの暫定的な特性は、マウス蝸牛における毛束の発達を要約する。Ｄ１１０～２００のＣＴＲＬオルガノイドにおいて、本発明者らは、前庭有毛細胞に特徴的な、毛束の長い点の配置を一貫して観察した。極めて対照的に、毛束の長さは、ＰＵＲ＋ＩＷＰ２処置された試料において有意に短く、不動毛は線状又は凹形状に配置されることが多く、マウス蝸牛における内有毛細胞の先端面での不動毛とよく似ていた（図５ａ～ｈ；図１５）。高解像度共焦点顕微鏡観察は、ＰＵＲ＋ＩＷＰ２処置された有毛細胞と、未処置のＣＴＲＬ有毛細胞との間で不動毛の配置及び全体の長さの差異を示すことによってこれらの結果を実証した（図５ｉ～ｌ）。さらに、個々の不動毛の直径及び長さは、ＰＵＲ＋ＩＷＰ２処置された毛束において正に相関していた。対照的に、個々のＣＴＲＬ不動毛の直径は、その変化する長さに沿って均一であった（図５ｍ；図１５）。ＰＵＲ＋ＩＷＰ２有毛細胞と対照有毛細胞との間の毛束のこれらの構造的差異は、哺乳動物内耳における蝸牛有毛細胞と前庭有毛細胞との間で観察された構造的差異と一致している。
【0062】
ＰＵＲ＋ＩＷＰ２処置された有毛細胞の同一性を評価するために、本発明者らは、蝸牛外有毛細胞のホールマークであるＰＲＥＳＴＩＮ２１の発現を試験した。膜局在化ＰＲＥＳＴＩＮは、早くもＤ１０２で一部の試料中で検出可能であり（ＨＣの０．３３％）、発現は培養物が加齢するにつれてより広くなる。Ｄ１５０及びＤ２００には、それぞれ、全てのＰＵＲ＋ＩＷＰ２処置された有毛細胞の１２．６％及び１６．８％が、膜局在化ＰＲＥＳＴＩＮを発現する（図６ａ～ｂ）。対照的に、ＰＲＥＳＴＩＮは、Ｄ２００まで、いかなるＣＴＲＬ有毛細胞中でも検出不能であった（図６ａ）。ｈＥＳＣ由来有毛細胞の機能的発生を評価するために、本発明者らは、強力なｔｄＴｏｍａｔｏリポーターを示す細胞中で電位依存性イオン伝導率の従来の全細胞パッチクランプ記録を実施した（図６ｃ）。２つの機能的に異なる種類の細胞が、Ｋ＋に基づく細胞内溶液を用いて同定された。第１群（Ａ型）の細胞がより頻繁に観察され（７８％）、成熟蝸牛外有毛細胞と同様２２、内向き電流の実質的な不在及び速い外向き電流を特徴としていた（図６ｄ、ｆ）。あまり頻繁ではない（２２％）細胞（Ｂ型）は、遅い外向きの電流（図６ｅ、ｈ）及び顕著な速い内向きの電流（図６ｇ）を示し、未熟な内有毛細胞におけるＫ＋及びＮａ＋電流とよく似ていた２２。両方の種類の細胞が、類似する逆転電位を有し（平均＝－３４．７ｍＶ、－１７．５～－５５．５ｍＶの範囲。）、静止電位で活性化されたＫＣＮＱ型の速いＫ＋電流の証拠を示さなかった２２。
【0063】
以前の研究は、甲状腺ホルモンが有毛細胞成熟化にとって必須であること、及びチロキシンによる出生後置換がＰＡＸ８欠損マウスにおいて内耳表現型をレスキューすることを示した３１。さらに、甲状腺ホルモンは、ｓｌｃ２６ａ５プロモーター領域中のチロキシン応答エレメントによって直接的にＰＲＥＳＴＩＮ発現を調節することが示された３２。本発明者らは、本発明者らの蝸牛オルガノイド培養物中でのＰＲＥＳＴＩＮ発現の開始の遅延及び不完全なＨＣ成熟化が、少なくとも部分的には、甲状腺低下性培養条件に起因し得ると推論した。培養５０日目（蝸牛培養物中でのＨＣの最初の出現のあたり。）からＤ１００まで２５０ｎｇ／ｍＬのＴ４で処置した培養物は、Ｄ１００で、又はＤ１５０でも、補給しなかった培養物よりもはるかに多くのＰＲＥＳＴＩＮ＋ＨＣを有していた（約８０％対約１％対約１３％）（図６ａ、図７ａ、ｂ）。さらに、ＳＯＸ２発現もＴ４で処置したＨＣにおいて下方調節されたが（図７ｃ）、支持細胞又は非補給ＨＣにおいては下方調節されず、これは、甲状腺ホルモンシグナル伝達が蝸牛オルガノイド培養物の成熟化にとっても必要とされることを示唆している。
【0064】
考察
内耳オルガノイドのための既存のプロトコールは、天然の前庭有毛細胞のものと類似する構造的、分子的、及び生理学的特性を有する有毛細胞のみを得るものである。この実験例は、他方で、オルガノイドにおいて蝸牛有毛細胞型を誘導するための手段の開発を証明する。耳胞の背腹軸をわたる勾配ＳＨＨ濃度は内耳発生の間の主な腹側化の合図と考えられるため、本発明者らは、Ｄ２０のオルガノイドにおける遺伝子発現の変化に対する、強力なスムーズンドアゴニストＰＵＲの効果を最初に検査した。ＳＨＨ経路のみの増大では、腹側内耳マーカー発現の促進にとって十分ではなかった。以前の報告はＰＫＡ活性がＳＨＨ経路のメディエーターであることを示唆しているため、腹側化条件をさらに強化するために、本発明者らは、ＰＫＡ阻害剤Ｈ８９を適用した。ＰＵＲ及びＨ８９による併用処置は腹側内耳マーカー、ＯＴＸ２及びＧＡＴＡ３の発現を促進したが、この処置はＰＯＵ４Ｆ３＋有毛細胞を誘導する効率を大きく低下させ、本発明者らにこの手法を断念させた。同時に、本発明者らは、ｈＥＳＣ由来凝集体を、最初の５日間はＷＮＴ阻害剤ＩＷＰ２で同時処置し、ＰＵＲによる処置を行った。この処置は、背側内耳マーカーを抑制しながら、腹側内耳マーカーの有意な上方調節をもたらした。本発明者らはまた、ＣＴＬＲ又はＰＵＲ処置された試料中ではなく、ＰＵＲ＋ＩＷＰ２処置された試料において、ＳＵＬＦ１、ＬＲＰ２、ＧＡＳ１及びＰＴＣＨ１などのＳＨＨの下流のエフェクターの有意な上方調節も観察したが、内耳前駆細胞の腹側化が、ＷＮＴシグナル伝達によって拮抗されるリガンド受容体及び下流のエフェクターの上方調節を含む、ＳＨＨ経路活性化の閾値を必要とすることを示唆している。
内耳オルガノイドのための既存のプロトコールは、天然の前庭有毛細胞のものと類似する構造的、分子的、及び生理学的特性を有する有毛細胞のみを得るものである。この実験例は、他方で、オルガノイドにおいて蝸牛有毛細胞型を誘導するための手段の開発を証明する。耳胞の背腹軸をわたる勾配ＳＨＨ濃度は内耳発生の間の主な腹側化の合図と考えられるため、本発明者らは、Ｄ２０のオルガノイドにおける遺伝子発現の変化に対する、強力なスムーズンドアゴニストＰＵＲの効果を最初に検査した。ＳＨＨ経路のみの増大では、腹側内耳マーカー発現の促進にとって十分ではなかった。以前の報告はＰＫＡ活性がＳＨＨ経路のメディエーターであることを示唆しているため、腹側化条件をさらに強化するために、本発明者らは、ＰＫＡ阻害剤Ｈ８９を適用した。ＰＵＲ及びＨ８９による併用処置は腹側内耳マーカー、ＯＴＸ２及びＧＡＴＡ３の発現を促進したが、この処置はＰＯＵ４Ｆ３＋有毛細胞を誘導する効率を大きく低下させ、本発明者らにこの手法を断念させた。同時に、本発明者らは、ｈＥＳＣ由来凝集体を、最初の５日間はＷＮＴ阻害剤ＩＷＰ２で同時処置し、ＰＵＲによる処置を行った。この処置は、背側内耳マーカーを抑制しながら、腹側内耳マーカーの有意な上方調節をもたらした。本発明者らはまた、ＣＴＬＲ又はＰＵＲ処置された試料中ではなく、ＰＵＲ＋ＩＷＰ２処置された試料において、ＳＵＬＦ１、ＬＲＰ２、ＧＡＳ１及びＰＴＣＨ１などのＳＨＨの下流のエフェクターの有意な上方調節も観察したが、内耳前駆細胞の腹側化が、ＷＮＴシグナル伝達によって拮抗されるリガンド受容体及び下流のエフェクターの上方調節を含む、ＳＨＨ経路活性化の閾値を必要とすることを示唆している。
【0065】
Ｄ８０及び－１０９の試料の本発明者らのｓｃＲＮＡ－ｓｅｑ分析は、ＰＵＲ＋ＩＷＰ２処置された有毛細胞及び未処置の対照有毛細胞が異なる転写プロファイルを示すことを示した。これらの２つの細胞集団間で示差的に発現される遺伝子のうち、ＮＲ２Ｆ１及びＧＡＴＡ３が、Ｄ８０と－１０９との両方においてＰＵＲ＋ＩＷＰ２処置された有毛細胞中で最も高く発現されたが、転写経路におけるコアエレメントのための潜在的な候補としてのこれらの２つの遺伝子が蝸牛分化をもたらすことを示唆している。ＧＡＴＡ３は、前庭組織に対して蝸牛において主に発現されることが示されたが２３、２４、蝸牛の特定化におけるオーファン核受容体ＮＲ２Ｆ１／２の役割に関してはほとんど知られていない。ＮＲ２Ｆ１の標的化された不活化は、発生中のマウス蝸牛において過剰の有毛細胞及び支持細胞をもたらし、これはＮｏｔｃｈシグナル伝達成分の調節異常と関連している２５。ＮＲ２Ｆ１／２はリガンド依存性転写因子として機能すると考えられ、そのため、蝸牛細胞型に分化する能力を有する多能性内耳前駆細胞を提供するためのマスタードライバー（ｍａｓｔｅｒ ｄｒｉｖｅｒ）として作用することができる。しかしながら、ＮＲ２Ｆ１／２がＯＴＸ２発現の直接的調節によって耳胞の背腹パターン形成において必須の役割を果たすことが示されたことは注目に値する２６。
【0066】
本発明者らは、外又は内蝸牛有毛細胞として腹側化された内耳オルガノイド中で誘導された有毛細胞をさらに分類することを求めた。構造的には、これらの有毛細胞は、典型的には、哺乳動物蝸牛の内有毛細胞において見られる、変化する直径を担持する短い不動毛を有するＵ型の毛束を示す２７、２８。しかしながら、マウスにおける外有毛細胞分化にとって必須のジンクフィンガー転写因子２９であるＩＮＳＭ１は、ＰＵＲ＋ＩＷＰ２処置されたオルガノイドの有毛細胞において主に発現されるが、内有毛分化のためのパイオニア因子３０であるＴＢＸ２の発現はＰＵＲ＋ＩＷＰ２と対照有毛細胞との間で有意に異ならない。さらに、本発明者らの電気生理学的記録は、Ｄ１３８～１６４のＰＵＲ＋ＩＷＰ２オルガノイドにおける２つの異なる有毛細胞集団を同定した。これらの有毛細胞の約７８％が、内向き電流の実質的な不在及び速い外向き電流を特徴としたが、これは、マウス蝸牛において内有毛細胞ではなく天然の外有毛細胞と類似している。これは、外有毛細胞マーカーＰＲＥＳＴＩＮを発現する有毛細胞の集団がより少なく観察されることと矛盾しているように見える。Ｄ１０９でのｓｃＲＮＡ－ｓｅｑは、わずか１．６％のＰＵＲ＋ＩＷＰ２有毛細胞が、ＰＲＥＳＴＩＮをコードするＳＬＣ２６Ａ５を発現し、わずか６．４％のこれらの有毛細胞が、内有毛細胞マーカーであるＶＧＬＵＴ３をコードするＳＬＣ１７Ａ８を発現することを示した３１。ＰＲＥＳＴＩＮ＋有毛細胞の割合はＤ１０２から２００までＰＵＲ＋ＩＷＰ２オルガノイドにおいて時間と共に増加するため（０．３３％～１６．８％まで）、本発明者らの結果は、多くの誘導された有毛細胞が、ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑ実験を実施した場合に完全な表現型成熟化に達しなかったことを集合的に示唆する。
【0067】
本発明者らの転写及び構造分析に基づくと、ｈＥＳＣ由来蝸牛オルガノイド発生の時間経過は、ヒト蝸牛発生のものとかなり類似し、Ｄ１１０の蝸牛オルガノイドはＧＷ１８でのヒト胎児蝸牛とほぼ一致している（図１６）。さらに、マーカー発現の順序も、ＭＹＯ７Ａ発現に先行するＡＴＯＨ１発現を示す蝸牛オルガノイドにおいて正確に要約される。ＰＲＥＳＴＩＮは、ＧＷ１８ではヒト胎児蝸牛の外有毛細胞において検出されるが、ＧＷ１３では存在しない。同様に、ＰＲＥＳＴＩＮは、Ｄ２００ではＰＵＲ＋ＩＷＰ２処置されたオルガノイド中の有毛細胞の約１６％において検出されるが、Ｄ１０２ではほとんど検出不能である。これらの結果は、本研究において本発明者らが確立した蝸牛オルガノイドが、妊娠第３期でのヒト蝸牛と同等の発生段階に到達することができることを示唆する。
【0068】
本発明者らは、ＳＨＨ及びＷＮＴ経路のモジュレーションが、腹側内耳表現型を示す多能性内耳前駆細胞を提供し、その後、その一部は、２種類の蝸牛有毛細胞、内及び外有毛細胞の構造的、転写的及び機能的特性を示す有毛細胞を生じ、インビトロでヒト胎児発生の妊娠第３期に対応する段階に成熟することを実証している。さらに、ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑ分析は、蝸牛及び前庭多様化にとって必須の重要な転写経路のための以前には認識されていなかった候補としてＮＲ２Ｆ１を同定する。転写経路と構造的発達との間のクロストークの基礎となる機構を解明し、内有毛細胞対外有毛細胞の生成を制御するための手段を確立するためには、さらなる調査が必要である。本発明者らが本研究において確立した蝸牛オルガノイドは、ヒト蝸牛発生の生物学を調査し、遺伝性難聴の病因を解明し、重度の難聴を処置するための治療標的を同定するための強力なヒトモデルとして役立つと期待される。
【0069】
材料及び方法
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を用いたＰＡＸ２／ＰＯＵ４Ｆ３リポーターｈＥＳＣ系の確立
３Ｄ培養物中での内耳前駆細胞の誘導をモニタリングするために、本発明者らは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ゲノム操作技術を使用して、内因性ＰＡＸ２遺伝子座に２Ａ－ｅＧＦＰ－ｎｌｓ（２Ａ－ｎＧＦＰ）蛍光リポーターを組み込むことによって、ＰＡＸ２リポーターｈＥＳＣ系を生成した。終止コドンの位置に基づいて、ＰＡＸ２スプライスバリアントを、ＰＡＸ２ｂ、ＰＡＸ２ｃ、及びＰＡＸ２ｄ型として分類することができる３２～３４。ＰＣＲ増幅を、Ｄ４０のヒト内耳オルガノイドに由来するｃＤＮＡライブラリー上で、並びにサイズ参照のためのＰＡＸ２ｂ、ＰＡＸ２ｃ、及びＰＡＸ２ｄ合成ｃＤＮＡ ｇＢｌｏｃｋ（ＩＤＴ）上で実施した。ＰＣＲアンプリコンのアガロースゲル電気泳動、次いで、抽出された最も明るいバンドのサンガー配列決定検証は、ＰＡＸ２ｂがヒト内耳オルガノイド中の最も豊富な型のＰＡＸ２アイソフォームであることを示した。したがって、ｇＲＮＡ及びホモロジーアームは、ＰＡＸ２ｂ終止コドン遺伝子座を標的とするように設計された。ＰＡＸ２－２Ａ－ｅＧＦＰ－ｎｌｓ－ｐＡ－ｌｏｘＰ－ＰＧＫ－Ｐｕｒｏ－ｐＡ－ｌｏｘＰドナーベクターを構築するために、ＰＡＸ２ｂ終止コドンを挟む２つの１ｋｂのホモロジーアームを、ＷＡ２５ ｈＥＳＣ（ＷｉＣｅｌｌ）ゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅した。Ｇｉｂｓｏｎアセンブリー３５を使用して、２つのホモロジーアームを、２Ａ－ｅＧＦＰ８、３６、ｎｌｓ－ｓｔｏｐ－ｂＧＨポリＡ（ｇＢｌｏｃｋ、ＩＤＴ）、及びｌｏｘＰ－ＰＧＫ－Ｐｕｒｏ－ｐＡ－ｌｏｘＰ ＤＮＡ断片８、３６、並びに線状化されたｐＵＣ１９プラスミド骨格と、最終ドナーベクター中で接続した。ＰＡＸ２ｂ終止コドンを標的とするｇＲＮＡ（５’－ＡＴＧＡＣＣＧＣＣＡＣＴＡＧＴＴＡＣＣＧ－３’（配列番号２９））を、Ｕ６プロモーター（Ａｄｄｇｅｎｅ ＃７１８１４）の制御下で発現プラスミド中にクローニングした３７。ＰＡＸ２－２Ａ－ｎＧＦＰドナーベクター、ＰＡＸ２ｂ ｇＲＮＡプラスミド、並びに高忠実度Ｃａｓ９発現プラスミド（ＳｐＣａｓ９－ＨＦ１、Ａｄｄｇｅｎｅ ＃７２２４７）９を、Ｐ３ Ｐｒｉｍａｒｙ Ｃｅｌｌ ４Ｄ－Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ Ｘキット及びＰｒｏｇｒａｍ ＣＢ－１５０を使用して、４Ｄ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（Ｌｏｎｚａ）と共にＷＡ２５ ｈＥＳＣ中にトランスフェクトした。ヌクレオフェクション後、細胞生存率の改善のための１ｘＲｅｖｉｔａＣｅｌｌ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）、及びより高いＨＤＲ効率のための１μＭのＳｃｒ７（Ｘｃｅｓｓｂｉｏ）を含有するＥ８ｆｎ培地中に細胞をプレーティングした３８。０．５μｇ／ｍＬのピューロマイシン選択を、ヌクレオフェクションの４８時間後から開始して１４日間にわたって実施した。２つのｌｏｘＰ部位によって挟まれたＰＧＫ－Ｐｕｒｏサブカセットを、Ｃｒｅリコンビナーゼ発現ベクター（Ａｄｄｇｅｎｅ ＃１３７７５）のヌクレオフェクションによるピューロマイシン選択後にゲノムから除去した。クローン細胞系を、解離した単一のｈＥＳＣの低密度播種（１～３個の細胞／ｃｍ２）、次いで、５～７ｄの拡大後のｈＥＳＣコロニーの単離によって確立した。クローン細胞系の遺伝子型を、ＰＣＲ増幅、次いで、ゲル電気泳動、及びＴＯＰＯベクター（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）中にクローニングされた全ＰＣＲアンプリコン又は個々のＰＣＲアンプリコンのサンガー配列決定によって分析した。両アレルの２Ａ－ｎＧＦＰを組み込んだ細胞系を、その後の実験のために使用した。ｇＲＮＡの上から１０個の予測されたオフターゲット部位を、確立された細胞系のゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅し（約１ｋｂ）、サンガー配列決定を行って、オフターゲット突然変異について試験した。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を用いたＰＡＸ２／ＰＯＵ４Ｆ３リポーターｈＥＳＣ系の確立
３Ｄ培養物中での内耳前駆細胞の誘導をモニタリングするために、本発明者らは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ゲノム操作技術を使用して、内因性ＰＡＸ２遺伝子座に２Ａ－ｅＧＦＰ－ｎｌｓ（２Ａ－ｎＧＦＰ）蛍光リポーターを組み込むことによって、ＰＡＸ２リポーターｈＥＳＣ系を生成した。終止コドンの位置に基づいて、ＰＡＸ２スプライスバリアントを、ＰＡＸ２ｂ、ＰＡＸ２ｃ、及びＰＡＸ２ｄ型として分類することができる３２～３４。ＰＣＲ増幅を、Ｄ４０のヒト内耳オルガノイドに由来するｃＤＮＡライブラリー上で、並びにサイズ参照のためのＰＡＸ２ｂ、ＰＡＸ２ｃ、及びＰＡＸ２ｄ合成ｃＤＮＡ ｇＢｌｏｃｋ（ＩＤＴ）上で実施した。ＰＣＲアンプリコンのアガロースゲル電気泳動、次いで、抽出された最も明るいバンドのサンガー配列決定検証は、ＰＡＸ２ｂがヒト内耳オルガノイド中の最も豊富な型のＰＡＸ２アイソフォームであることを示した。したがって、ｇＲＮＡ及びホモロジーアームは、ＰＡＸ２ｂ終止コドン遺伝子座を標的とするように設計された。ＰＡＸ２－２Ａ－ｅＧＦＰ－ｎｌｓ－ｐＡ－ｌｏｘＰ－ＰＧＫ－Ｐｕｒｏ－ｐＡ－ｌｏｘＰドナーベクターを構築するために、ＰＡＸ２ｂ終止コドンを挟む２つの１ｋｂのホモロジーアームを、ＷＡ２５ ｈＥＳＣ（ＷｉＣｅｌｌ）ゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅した。Ｇｉｂｓｏｎアセンブリー３５を使用して、２つのホモロジーアームを、２Ａ－ｅＧＦＰ８、３６、ｎｌｓ－ｓｔｏｐ－ｂＧＨポリＡ（ｇＢｌｏｃｋ、ＩＤＴ）、及びｌｏｘＰ－ＰＧＫ－Ｐｕｒｏ－ｐＡ－ｌｏｘＰ ＤＮＡ断片８、３６、並びに線状化されたｐＵＣ１９プラスミド骨格と、最終ドナーベクター中で接続した。ＰＡＸ２ｂ終止コドンを標的とするｇＲＮＡ（５’－ＡＴＧＡＣＣＧＣＣＡＣＴＡＧＴＴＡＣＣＧ－３’（配列番号２９））を、Ｕ６プロモーター（Ａｄｄｇｅｎｅ ＃７１８１４）の制御下で発現プラスミド中にクローニングした３７。ＰＡＸ２－２Ａ－ｎＧＦＰドナーベクター、ＰＡＸ２ｂ ｇＲＮＡプラスミド、並びに高忠実度Ｃａｓ９発現プラスミド（ＳｐＣａｓ９－ＨＦ１、Ａｄｄｇｅｎｅ ＃７２２４７）９を、Ｐ３ Ｐｒｉｍａｒｙ Ｃｅｌｌ ４Ｄ－Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ Ｘキット及びＰｒｏｇｒａｍ ＣＢ－１５０を使用して、４Ｄ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（Ｌｏｎｚａ）と共にＷＡ２５ ｈＥＳＣ中にトランスフェクトした。ヌクレオフェクション後、細胞生存率の改善のための１ｘＲｅｖｉｔａＣｅｌｌ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）、及びより高いＨＤＲ効率のための１μＭのＳｃｒ７（Ｘｃｅｓｓｂｉｏ）を含有するＥ８ｆｎ培地中に細胞をプレーティングした３８。０．５μｇ／ｍＬのピューロマイシン選択を、ヌクレオフェクションの４８時間後から開始して１４日間にわたって実施した。２つのｌｏｘＰ部位によって挟まれたＰＧＫ－Ｐｕｒｏサブカセットを、Ｃｒｅリコンビナーゼ発現ベクター（Ａｄｄｇｅｎｅ ＃１３７７５）のヌクレオフェクションによるピューロマイシン選択後にゲノムから除去した。クローン細胞系を、解離した単一のｈＥＳＣの低密度播種（１～３個の細胞／ｃｍ２）、次いで、５～７ｄの拡大後のｈＥＳＣコロニーの単離によって確立した。クローン細胞系の遺伝子型を、ＰＣＲ増幅、次いで、ゲル電気泳動、及びＴＯＰＯベクター（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）中にクローニングされた全ＰＣＲアンプリコン又は個々のＰＣＲアンプリコンのサンガー配列決定によって分析した。両アレルの２Ａ－ｎＧＦＰを組み込んだ細胞系を、その後の実験のために使用した。ｇＲＮＡの上から１０個の予測されたオフターゲット部位を、確立された細胞系のゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅し（約１ｋｂ）、サンガー配列決定を行って、オフターゲット突然変異について試験した。
【0070】
ＰＡＸ２－２Ａ－ｎＧＦＰ／ＰＯＵ４Ｆ３－２Ａ－ｎｔｄＴｏｍａｔｏ多重リポーター細胞系を構築するために、ＰＯＵ４Ｆ３－２Ａ－ｎｔｄＴｏｍａｔｏノックインＣＲＩＳＰＲを、ＰＡＸ２－２Ａ－ｎＧＦＰ遺伝子バックグラウンド上で実施した。ＰＯＵ４Ｆ３－２Ａ－ｔｄＴｏｍａｔｏ－ｎｌｓ－ｂＧＨポリＡ－ｆｒｔ－ＰＧＫ－Ｐｕｒｏ－ｐＡ－ｆｒｔドナープラスミドを、Ｇｉｂｓｏｎアセンブリーによって以下のＤＮＡ断片を接続することによって構築した：ＷＡ２５ゲノムＤＮＡ、２Ａ－ｔｄＴｏｍａｔｏ ｇＢｌｏｃｋ ＤＮＡ、ｎｌｓ－ｓｔｏｐ－ｂＧＨ ｐＡ ｇＢｌｏｃｋ ＤＮＡ、ｆｒｔ－ＰＧＫ－Ｐｕｒｏ－ｆｒｔ ｇＢｌｏｃｋ ＤＮＡ（ＩＤＴ）、及び線状化されたｐＵＣ１９骨格から増幅したＰＯＵ４Ｆ３終止コドンを挟む２つの１ｋｂホモロジーアーム。完成したドナープラスミドを、ＰＯＵ４Ｆ３終止コドン遺伝子座を標的とする合成ｓｇＲＮＡ（５’－ＡＴＴＣＧＧＣＴＧＴＣＣＡＣＴＧＡＴＴＧ－３’（配列番号３０））（Ｓｙｎｔｈｅｇｏ）、及び高忠実度Ｃａｓ９タンパク質（ＨｉＦｉ Ｃａｓ９ ｖ３、ＩＤＴ）から構成されるリボ核タンパク質複合体と共にＰＡＸ２－２Ａ－ｎＧＦＰ親ｈＥＳ細胞系にトランスフェクトした。また、Ｐ３ Ｐｒｉｍａｒｙ Ｃｅｌｌ ４Ｄ－Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ Ｘキット及びＰｒｏｇｒａｍ ＣＢ－１５０を使用する４Ｄ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（Ｌｏｎｚａ）を用いてトランスフェクションを実施した。ヌクレオフェクション後、１ｘＲｅｖｉｔａＣｅｌｌ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）及び１μＭのＳｃｒ７（Ｘｃｅｓｓｂｉｏ）を含有するＥ８ｆｎ培地中に細胞をプレーティングした。０．５μｇ／ｍＬのピューロマイシン選択を、ヌクレオフェクションの４８時間後から開始して９日間にわたって実施した。ｆｒｔに挟まれたＰＧＫ－Ｐｕｒｏカセットを、ＦＬＰｏトランスフェクション（Ａｄｄｇｅｎｅ ＃１３７９３）によって除去した。クローン細胞系の単離及び遺伝子型決定手順は、ＰＡＸ２－２Ａ－ｎＧＦＰ ＣＲＩＳＰＲのものと同じであった。下流の実験のために選択された最終的な多重細胞系は、ＰＡＸ２遺伝子座に両アレル２Ａ－ｎＧＦＰノックイン及びＰＯＵ４Ｆ３遺伝子座に両アレル２Ａ－ｎｔｄＴｏｍａｔｏノックインを有し、ＫａｒｙｏＬｏｇｉｃ Ｉｎｃ．（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｔｒｉａｎｇｌｅ Ｐａｒｋ、Ｎｏｒｔｈ Ｃａｒｏｌｉｎａ）によって核型決定された。
【0071】
オルガノイド培養
ＰＡＸ２－２Ａ－ｎＧＦＰ／ＰＯＵ４Ｆ３－２Ａ－ｎｔｄＴｏｍａｔｏ ｈＥＳＣ（２２～５０回継代）を、組換えヒトビトロネクチン－Ｎ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、Ａ１４７００）でコーティングした６ウェルプレート上で、１００μｇ／ｍｌノルモシンを補ったＥｓｓｅｎｔｉａｌ ８ Ｆｌｅｘ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、Ａ２８５８５０１）（Ｅ８ｆｎ）中で維持及び継代した。ヒト内耳オルガノイドを、大きな改変を有する本発明者らの以前のプロトコール８、１０に基づいてｈＥＳＣから誘導した。簡単に述べると、ｈＥＳＣを、ＳｔｅｍＰｒｏ Ａｃｃｕｔａｓｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、Ａ１１１０５０１）を用いて解離させ、２０μＭのＹ－２７６３２（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ、０４－００１２－０２）を含有する１００μＬのＥ８ｆｎ中、低接着９６ウェルＵ底プレート上にウェルあたり３５００個の細胞で分配し、１２０ｇで５分間、強制的に凝集させた。４時間を超えるインキュベーションの後、１００μＬのＥ８ｆｎを各ウェルに添加した。非神経上皮の誘導を、以下のように、分化の０日目にマークして、凝集の４８時間後に行った：凝集体を、ＨＥＰＥＳ緩衝剤を含むＤＭＥＭ：Ｆ１２（ＤＦＨ）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、１１３２００３３）中で徹底的に洗浄し、４ｎｇ／ｍＬ-１のＦＧＦ－２（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、７８０００３）、１０μＭのＳＢ－４３１５４２（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ、０４－００１０－０５）、及び２％の増殖因子低減（ＧＦＲ）Ｍａｔｒｉｇｅｌ（Ｃｏｒｎｉｎｇ、３５４２３０）を含有するノルモシンを含む１００μＬのＥ６培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、Ａ１５１６４０１）（Ｅ６ｎ）中、新しい９６ウェルＵ底プレートに移した。分化の３日目に、５０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ－２及び２００ｎＭのＬＤＮ－１９３１８９（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ、０４－００７４－０２）を含有する２５μＬのＥ６ｎを、各ウェルに添加した。培養培地を、７及び９日目に、３μＭのＣＨＩＲ９９０２１（Ｒｅｐｒｏｃｅｌｌ、０４－０００４－１０）、２００ｎＭのＬＤＮ、及び５０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ－２を含有するＥ６ｎと交換した。１１日目に、凝集体を洗浄し、１％のＧＦＲ Ｍａｔｒｉｇｅｌ及び３μＭのＣＨＩＲ９９０２１を含有するオルガノイド成熟化培地（ＯＭＭ）中、Ｎｕｎｃ Ｄｅｌｔａ表面６ウェル培養皿に移した。ＯＭＭは、０．５ｘＮ２ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、１７５０２０４８）、０．５ｘＢ２７マイナスビタミンＡ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、１２５８７０１０）、１ｘＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、３５０５００６１）、０．１ｍＭ β－メルカプトエタノール（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、２１９８５０２３）、及びノルモシンを補った、Ａｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ：Ｆ１２（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、１２６３４０２８）及びＮｅｕｒｏｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、２１１０３０４９）の５０：５０混合物からなる。対照培養物を、１３及び１５日目に培地交換して、１８日目までＯＭＭ＋３μＭ ＣＨＩＲ９９０２１中で維持した後、残りの培養物についてはＯＭＭ中で維持した。処置培養物に、１３～２２日目まで１μＭのパルモルファミン（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ、０４－０００９）、及び１８～２２日目までＩＷＰ－２（Ｔｏｃｒｉｓ、３５３３）を補った、１５、１８、及び２０日目に培地交換した後、残りの培養物についてＯＭＭ中で維持した。
ＰＡＸ２－２Ａ－ｎＧＦＰ／ＰＯＵ４Ｆ３－２Ａ－ｎｔｄＴｏｍａｔｏ ｈＥＳＣ（２２～５０回継代）を、組換えヒトビトロネクチン－Ｎ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、Ａ１４７００）でコーティングした６ウェルプレート上で、１００μｇ／ｍｌノルモシンを補ったＥｓｓｅｎｔｉａｌ ８ Ｆｌｅｘ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、Ａ２８５８５０１）（Ｅ８ｆｎ）中で維持及び継代した。ヒト内耳オルガノイドを、大きな改変を有する本発明者らの以前のプロトコール８、１０に基づいてｈＥＳＣから誘導した。簡単に述べると、ｈＥＳＣを、ＳｔｅｍＰｒｏ Ａｃｃｕｔａｓｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、Ａ１１１０５０１）を用いて解離させ、２０μＭのＹ－２７６３２（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ、０４－００１２－０２）を含有する１００μＬのＥ８ｆｎ中、低接着９６ウェルＵ底プレート上にウェルあたり３５００個の細胞で分配し、１２０ｇで５分間、強制的に凝集させた。４時間を超えるインキュベーションの後、１００μＬのＥ８ｆｎを各ウェルに添加した。非神経上皮の誘導を、以下のように、分化の０日目にマークして、凝集の４８時間後に行った：凝集体を、ＨＥＰＥＳ緩衝剤を含むＤＭＥＭ：Ｆ１２（ＤＦＨ）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、１１３２００３３）中で徹底的に洗浄し、４ｎｇ／ｍＬ-１のＦＧＦ－２（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、７８０００３）、１０μＭのＳＢ－４３１５４２（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ、０４－００１０－０５）、及び２％の増殖因子低減（ＧＦＲ）Ｍａｔｒｉｇｅｌ（Ｃｏｒｎｉｎｇ、３５４２３０）を含有するノルモシンを含む１００μＬのＥ６培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、Ａ１５１６４０１）（Ｅ６ｎ）中、新しい９６ウェルＵ底プレートに移した。分化の３日目に、５０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ－２及び２００ｎＭのＬＤＮ－１９３１８９（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ、０４－００７４－０２）を含有する２５μＬのＥ６ｎを、各ウェルに添加した。培養培地を、７及び９日目に、３μＭのＣＨＩＲ９９０２１（Ｒｅｐｒｏｃｅｌｌ、０４－０００４－１０）、２００ｎＭのＬＤＮ、及び５０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ－２を含有するＥ６ｎと交換した。１１日目に、凝集体を洗浄し、１％のＧＦＲ Ｍａｔｒｉｇｅｌ及び３μＭのＣＨＩＲ９９０２１を含有するオルガノイド成熟化培地（ＯＭＭ）中、Ｎｕｎｃ Ｄｅｌｔａ表面６ウェル培養皿に移した。ＯＭＭは、０．５ｘＮ２ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、１７５０２０４８）、０．５ｘＢ２７マイナスビタミンＡ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、１２５８７０１０）、１ｘＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、３５０５００６１）、０．１ｍＭ β－メルカプトエタノール（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、２１９８５０２３）、及びノルモシンを補った、Ａｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ：Ｆ１２（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、１２６３４０２８）及びＮｅｕｒｏｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、２１１０３０４９）の５０：５０混合物からなる。対照培養物を、１３及び１５日目に培地交換して、１８日目までＯＭＭ＋３μＭ ＣＨＩＲ９９０２１中で維持した後、残りの培養物についてはＯＭＭ中で維持した。処置培養物に、１３～２２日目まで１μＭのパルモルファミン（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ、０４－０００９）、及び１８～２２日目までＩＷＰ－２（Ｔｏｃｒｉｓ、３５３３）を補った、１５、１８、及び２０日目に培地交換した後、残りの培養物についてＯＭＭ中で維持した。
【0072】
免疫組織化学分析
凝集体を、室温で３０分又は４℃で一晩、４％パラホルムアルデヒドで固定した。固定した標本を、段階的な一連のスクロースを用いて凍結保護した後、組織凍結培地中に埋め込んだ。凍結組織ブロックを、Ｌｅｉｃａ ＣＭ－１８６０クリオスタット上で１２μｍの低温切片に切片化した。免疫染色のために、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００ １ｘＰＢＳ溶液中の１０％ヤギ又はウマ血清を、ブロッキングのために使用し、０．１～１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００ １ｘＰＢＳ溶液中の３％ヤギ又はウマ血清を、一次／二次抗体インキュベーションのために使用した。本研究において使用された一次抗体は、表１に列挙される。Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒコンジュゲート化抗マウス、ウサギ、又はヤギＩｇＧ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を、二次抗体として使用した。ＤＡＰＩを含むＰｒｏＬｏｎｇ Ｇｏｌｄ Ａｎｔｉｆａｄｅ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を使用して、試料をマウントし、細胞核を可視化した。
凝集体を、室温で３０分又は４℃で一晩、４％パラホルムアルデヒドで固定した。固定した標本を、段階的な一連のスクロースを用いて凍結保護した後、組織凍結培地中に埋め込んだ。凍結組織ブロックを、Ｌｅｉｃａ ＣＭ－１８６０クリオスタット上で１２μｍの低温切片に切片化した。免疫染色のために、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００ １ｘＰＢＳ溶液中の１０％ヤギ又はウマ血清を、ブロッキングのために使用し、０．１～１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００ １ｘＰＢＳ溶液中の３％ヤギ又はウマ血清を、一次／二次抗体インキュベーションのために使用した。本研究において使用された一次抗体は、表１に列挙される。Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒコンジュゲート化抗マウス、ウサギ、又はヤギＩｇＧ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を、二次抗体として使用した。ＤＡＰＩを含むＰｒｏＬｏｎｇ Ｇｏｌｄ Ａｎｔｉｆａｄｅ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を使用して、試料をマウントし、細胞核を可視化した。
【0073】
ホールマウント免疫蛍光のために、ＡｂＳｃａｌｅ組織洗浄プロトコール３９を、凝集体試料に適用した。インキュベーション及び洗浄ステップを、ローター上で実施し、インキュベーションステップを別途記述しない限りローター上、３７℃で実施した。４％パラホルムアルデヒドを用いて試料を一晩固定した後、試料をＳｃａｌｅ Ｓ０溶液中で６時間インキュベートした後、Ｓｃａｌｅ Ａ２中で１６時間、ＳｃａｌｅＢ４溶液中で２４時間、及びＳｃａｌｅＡ２溶液中で８時間インキュベートした。その後、試料を、室温で４時間、０．１Ｍ ＰＢＳ中でインキュベートし、ＡｂＳｃａｌｅ溶液中で１６時間、１０％正常ウマ血清（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いてブロッキングを実施した。３％正常ウマ血清を含有するＡｂＳｃａｌｅ溶液中での一次抗体とのインキュベーションを４８時間実施した後、ＡｂＳｃａｌｅ溶液で１５、３０、６０、及び１２０分間逐次的洗浄を行い、３％正常ウマ血清を含有するＡｂＳｃａｌｅ溶液中で２４時間、フルオロフォアコンジュゲート化二次抗体と共にインキュベートした。ＲＴで３０分間、ＡｂＳｃａｌｅで３回及び室温で３０分間、ＡｂＳｃａｌｅ Ｒｉｎｓｅ溶液で２回すすいだ後、試料を、室温で１時間、４％パラホルムアルデヒドで再固定し、０．１Ｍ ＰＢＳで２回洗浄し、ＳｃａｌｅＳ４溶液中で１６時間インキュベートした。染色された試料を、シリコーンガスケットを有するポリ－Ｌ－オルニチン被覆カバースリップ（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）上に少量のＳｃａｌｅＳ４溶液と共にマウントした。試料のイメージングを、Ｌｅｉｃａ Ｄｉｖｅ Ｃｏｎｆｏｃａｌ／Ｍｕｌｔｉｐｈｏｔｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ又はＮｉｋｏｎ Ａ１Ｒ ＨＤ２５共焦点顕微鏡上で実行した。三次元再構築を、Ｉｍａｒｉｓ ８ソフトウェアパッケージ（Ｂｉｔｐｌａｎｅ）及びＮＩＳ Ｅｌｅｍｅｎｔｓ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈアプリケーション（Ｎｉｋｏｎ）を使用して実施した。
【0074】
免疫組織化学データの定量化
処置した試料及び対照試料を、それぞれの比較のために同一の試薬及びプロトコールを同時に使用して免疫染色のためにプロセシングした。条件下で同一の画像獲得パラメーターを使用する、Ｎｉｋｏｎ Ａ１Ｒ－ＨＤ２５共焦点顕微鏡、又はＬｅｉｃａ ＤＭＩ８広視野蛍光顕微鏡のいずれかを使用して、画像を獲得した。Ｎｉｋｏｎ ＧＩ３スイートを使用して生画像を分析し、又はＴＩＦＦ形式でエクスポートし、ＩｍａｇｅＪを使用して分析した。標識された組織特異的マーカー及び目的の遺伝子に対応する同時シグナルについて領域を分析することにより、同時発現分析を実施した。平均グレー値及び全共局在化領域を収集した。
処置した試料及び対照試料を、それぞれの比較のために同一の試薬及びプロトコールを同時に使用して免疫染色のためにプロセシングした。条件下で同一の画像獲得パラメーターを使用する、Ｎｉｋｏｎ Ａ１Ｒ－ＨＤ２５共焦点顕微鏡、又はＬｅｉｃａ ＤＭＩ８広視野蛍光顕微鏡のいずれかを使用して、画像を獲得した。Ｎｉｋｏｎ ＧＩ３スイートを使用して生画像を分析し、又はＴＩＦＦ形式でエクスポートし、ＩｍａｇｅＪを使用して分析した。標識された組織特異的マーカー及び目的の遺伝子に対応する同時シグナルについて領域を分析することにより、同時発現分析を実施した。平均グレー値及び全共局在化領域を収集した。
【0075】
統計分析を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ９中で実施した。全てのデータセットを、両側Ｗｅｌｃｈのｔ検定を使用して分析した。データ収集及び分析を、盲検により実施しなかった。
【0076】
走査電子顕微鏡
分化のＤ８１とＤ１４１との間のＰＯＵ４Ｆ３－ｎｔｄＴｏｍａｔｏ＋点が豊富な凝集体を、４℃で一晩、ナトリウムカコジレート緩衝剤（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）中の２．５％グルタルアルデヒドで固定した。固定された試料を、Ｎｉｋｏｎ ＳＭＺ１８ステレオ蛍光顕微鏡下で切断して、ｎｔｄＴｏｍａｔｏ＋細胞を含有する小胞の内腔表面を露出させ、室温で１時間、１％の四酸化オスミウム（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）で後固定した。次いで、試料を、段階的な一連のエタノールによって脱水し、Ｌｅｉｃａ ＥＭ ＣＰＤ３００臨界点乾燥装置中に移した。臨界点乾燥後、試料を、アルミニウムスタブ上にマウントし、Ｄｅｎｔｏｎ Ｖａｃｕｕｍ Ｄｅｓｋ Ｖ試料調製システムでスパッタコーティングした。試料を、５ｋＶの加速電圧でＪＯＥＬ ＪＳＭ－７８００Ｆ電界放出型走査電子顕微鏡上で見た。
分化のＤ８１とＤ１４１との間のＰＯＵ４Ｆ３－ｎｔｄＴｏｍａｔｏ＋点が豊富な凝集体を、４℃で一晩、ナトリウムカコジレート緩衝剤（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）中の２．５％グルタルアルデヒドで固定した。固定された試料を、Ｎｉｋｏｎ ＳＭＺ１８ステレオ蛍光顕微鏡下で切断して、ｎｔｄＴｏｍａｔｏ＋細胞を含有する小胞の内腔表面を露出させ、室温で１時間、１％の四酸化オスミウム（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）で後固定した。次いで、試料を、段階的な一連のエタノールによって脱水し、Ｌｅｉｃａ ＥＭ ＣＰＤ３００臨界点乾燥装置中に移した。臨界点乾燥後、試料を、アルミニウムスタブ上にマウントし、Ｄｅｎｔｏｎ Ｖａｃｕｕｍ Ｄｅｓｋ Ｖ試料調製システムでスパッタコーティングした。試料を、５ｋＶの加速電圧でＪＯＥＬ ＪＳＭ－７８００Ｆ電界放出型走査電子顕微鏡上で見た。
【0077】
代表データ及び再現性
別途記述しない限り、画像は、少なくとも３つの別々の実験から得られた標本の代表である。凝集体の免疫組織化学分析のために、本発明者らは典型的には、各実験において各条件に由来する６～１５個の凝集体を切片化した。
別途記述しない限り、画像は、少なくとも３つの別々の実験から得られた標本の代表である。凝集体の免疫組織化学分析のために、本発明者らは典型的には、各実験において各条件に由来する６～１５個の凝集体を切片化した。
【0078】
ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑ及び生データのプロセシング
ＰＡＸ２ｎＧ＋（Ｄ２０の試料）又はＰＯＵ４Ｆ３ｎＴ＋（Ｄ８０及び－１０９の試料。）細胞を単離し、ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑ分析のために使用した。条件あたり３０～４５個の凝集体を、ＤＰＢＳ中の０．５ｍＭ ＥＤＴＡ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）で洗浄した後、３７℃で３０分間、オービタルシェーカー上で、次いで、振とうせずに４０～５０分、ＤＰＢＳ中の１Ｘ ＴｒｙｐＬＥ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中の１．１ｍＭ ＥＤＴＡと共にインキュベートした。インキュベーション中に、試料を、振とうし、Ｐ１０００チップを用いて時々穏やかにピペッティングしながら、Ｎｕｎｃｌｏｎ Ｓｐｈｅｒａ ２４ウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）上で機械的に解離させた。ほとんどの細胞、特に、リポーター発現を有するものが完全に解離されたことを確認した後、それらを１００μｍ及び４０μｍの細胞ストレーナー（Ｆａｌｃｏｎ）によって逐次的に濾過した後、２ｍｌのチューブ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）中に移した。１００ｘ ｇで５分間スピンダウンした後、解離した細胞を、１Ｘ ＤＰＢＳ中の２％ウシ胎仔血清（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）からなるＦＡＣＳ緩衝剤中に再懸濁した。細胞を、４０μｍ細胞ストレーナーによって再度濾過し、５ｍｌの丸底ポリプロピレンチューブ（Ｆａｌｃｏｎ）中に収集した。死滅した細胞を、１：５００に希釈したヨウ化プロピジウム（ＰＩ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色した。同時に、ＰＩ染色を行わないサイズ対照細胞を、上記プロトコールを使用して野生型ｈＥＳＣから作製した凝集体を使用して調製した。細胞を氷上で保存し、選別の前に光から保護した。ＰＩ陰性及びＧＦＰ（又はｔｄＴｏｍａｔｏ）陽性集団を収集し、ＳＯＲＰ Ａｒｉａ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して浄化した。
ＰＡＸ２ｎＧ＋（Ｄ２０の試料）又はＰＯＵ４Ｆ３ｎＴ＋（Ｄ８０及び－１０９の試料。）細胞を単離し、ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑ分析のために使用した。条件あたり３０～４５個の凝集体を、ＤＰＢＳ中の０．５ｍＭ ＥＤＴＡ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）で洗浄した後、３７℃で３０分間、オービタルシェーカー上で、次いで、振とうせずに４０～５０分、ＤＰＢＳ中の１Ｘ ＴｒｙｐＬＥ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中の１．１ｍＭ ＥＤＴＡと共にインキュベートした。インキュベーション中に、試料を、振とうし、Ｐ１０００チップを用いて時々穏やかにピペッティングしながら、Ｎｕｎｃｌｏｎ Ｓｐｈｅｒａ ２４ウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）上で機械的に解離させた。ほとんどの細胞、特に、リポーター発現を有するものが完全に解離されたことを確認した後、それらを１００μｍ及び４０μｍの細胞ストレーナー（Ｆａｌｃｏｎ）によって逐次的に濾過した後、２ｍｌのチューブ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）中に移した。１００ｘ ｇで５分間スピンダウンした後、解離した細胞を、１Ｘ ＤＰＢＳ中の２％ウシ胎仔血清（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）からなるＦＡＣＳ緩衝剤中に再懸濁した。細胞を、４０μｍ細胞ストレーナーによって再度濾過し、５ｍｌの丸底ポリプロピレンチューブ（Ｆａｌｃｏｎ）中に収集した。死滅した細胞を、１：５００に希釈したヨウ化プロピジウム（ＰＩ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色した。同時に、ＰＩ染色を行わないサイズ対照細胞を、上記プロトコールを使用して野生型ｈＥＳＣから作製した凝集体を使用して調製した。細胞を氷上で保存し、選別の前に光から保護した。ＰＩ陰性及びＧＦＰ（又はｔｄＴｏｍａｔｏ）陽性集団を収集し、ＳＯＲＰ Ａｒｉａ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して浄化した。
【0079】
全試料に関するｓｃＲＮＡ－ｓｅｑを、ｃＤＮＡライブラリー構築のための１０Ｘ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｃｈｒｏｍｉｕｍ ３’ｖ３プラットフォーム及び配列決定のためのＮｏｖａＳｅｑ ６０００システム（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を使用して実施した。各試料について、Ｃｈｒｏｍｉｕｍ ＮｅｘｔＧＥＭ Ｓｉｎｇｌｅ Ｃｅｌｌ ３’Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔｓ Ｕｓｅｒ Ｇｕｉｄｅに従って、１２，０００～１８，０００個の細胞を単一細胞マスターミックスに添加した。単一細胞マスターミックスを、単一細胞ゲルビーズ及び分配オイルと共に、Ｓｉｎｇｌｅ Ｃｅｌｌ Ｃｈｉｐ Ｇ上に分注し、チップを、バーコード化及びｃＤＮＡ合成のためにＣｈｒｏｍｉｕｍ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｒ中にロードした。得られたｃＤＮＡライブラリーを、２８ｂｐ＋９１ｂｐのペアエンド型配列決定のためのカスタムプログラムを実行するＮｏｖａＳｅｑ ６０００システムを用いて配列決定し、細胞あたり４０，０００を超えるリードのリード深度を得た。
【0080】
ＩｌｌｕｍｎａのＣｅｌｌＲａｎｇｅｒ ｖ４．０．０プログラムを使用して、ＢＣＬファイルを生成し、これを逆多重化し、ｂｃｌ２ｆａｓｔｑ変換ソフトウェア（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）によってＦＡＳＴＱファイルに変換した。次いで、ＦＡＳＴＱファイルをＳＴＡＲ（Ｓｐｌｉｃｅｄ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｔｏ ａ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）アライナーを使用してＧＲＣｈ３８－３．０．０参照ゲノムとアラインメントさせた。マッピングされたリードを細胞バーコードによって分類し、単一細胞遺伝子発現を、ユニーク分子識別子（ＵＭＩ）を使用して定量化し、得られたフィルタリングされた遺伝子バーコード（計数）マトリックスを下流の分析のための入力物として使用した。
【0081】
ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑのデータ分析
フィルタリングされた計数マトリックスを、各データセットについて個別に前処理し、ミトコンドリア遺伝子計数の数が、検出された分子の総数の１２．５パーセントを超えていた細胞を除去した。第２の前処理ステップは、異常なハウスキーピング遺伝子発現を示す細胞を除去した：対数変換されたＲＰＬ２７発現±平均から２標準偏差離れた細胞を除去した。前処理の後、データセットを条件にわたって融合し、各時点に関して１つの組み合わせたデータセットを得た。融合後、生の計数データをＰｅａｒｓｏｎ残差に変換し、異種配列決定深度から得られる技術的変動を効率的に制御する、Ｓｅｕｒａｔ４０中のＳＣＴｒａｎｓｆｏｒｍ関数を使用して、遺伝子発現レベルを正規化した。それぞれ、クラスタリング及び共有最近傍グラフ構築にとって必要とされる分解の値及びｋ．ｐａｒａｍパラメーターを変化させることによって、Ｓｅｕｒａｔの教師なしクラスタリングワークフローを使用して、５０個を超える異なるクラスターパーティションを生成した。次いで、最も高いシルエット指数を有するクラスターパーティションを、さらなる分析のために選択した４１。クラスターの同一性を、標準マーカーの発現に基づいて手動で決定した。
フィルタリングされた計数マトリックスを、各データセットについて個別に前処理し、ミトコンドリア遺伝子計数の数が、検出された分子の総数の１２．５パーセントを超えていた細胞を除去した。第２の前処理ステップは、異常なハウスキーピング遺伝子発現を示す細胞を除去した：対数変換されたＲＰＬ２７発現±平均から２標準偏差離れた細胞を除去した。前処理の後、データセットを条件にわたって融合し、各時点に関して１つの組み合わせたデータセットを得た。融合後、生の計数データをＰｅａｒｓｏｎ残差に変換し、異種配列決定深度から得られる技術的変動を効率的に制御する、Ｓｅｕｒａｔ４０中のＳＣＴｒａｎｓｆｏｒｍ関数を使用して、遺伝子発現レベルを正規化した。それぞれ、クラスタリング及び共有最近傍グラフ構築にとって必要とされる分解の値及びｋ．ｐａｒａｍパラメーターを変化させることによって、Ｓｅｕｒａｔの教師なしクラスタリングワークフローを使用して、５０個を超える異なるクラスターパーティションを生成した。次いで、最も高いシルエット指数を有するクラスターパーティションを、さらなる分析のために選択した４１。クラスターの同一性を、標準マーカーの発現に基づいて手動で決定した。
【0082】
関連集団（例えば、内耳前駆細胞、有毛細胞。）を、クラスターの同一性に基づいて単離し、処置群間の比較を、ＤＥＳｅｑ２及びｚｉｎｇｅＲ４２を使用して実施した。細胞レベルの重み－ｓｃＲＮＡ配列決定に特有のドロップアウト事象について調整するために必要とされる－を、ｚｉｎｇｅＲを用いて算出した。処置群間の示差的発現を、ＤＥＳｅｑ２を使用して決定し、Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ－ＨｏｃｈｂｅｒｇのＰ＜０．０５を示す遺伝子を統計的に有意と考えた。ＤＥＳｅｑ２分析の結果を、遺伝子セットエンリッチメント分析のためのプラットフォームであるｉＤＥＡ１５に渡し、示差的に発現される遺伝子を、ＭＳｉｇＤＢデータベース４３から取得した遺伝子セットと比較した。遺伝子転写調節データベース（ＧＴＲＤ）を使用して、本発明者らのデータが比較される５７３個の転写因子標的遺伝子セットを定義した４４。これらの遺伝子セットは明確に定義されているが、それらはあらゆる可能な転写因子の包括的な一覧を構成するわけではない。
【0083】
電気生理学的分析
Ｄ１３８～１６４のｈＷＳＣ由来オルガノイドを、最初に明視野及び落射蛍光照明（ＴＥ２０００－Ｕ、Ｎｉｋｏｎ）中でイメージングして、ｔｄＴｏｍａｔｏ陽性細胞を有する耳胞の局在化を決定した。次いで、オルガノイドを、ダイアモンドナイフで切片化して、耳胞を露出させた。切片を、特注の記録チャンバーに入れ、そこでそれをデンタルフロスの２本の縒り糸によって保持した。以下の無機塩（ｍＭ）：ＮａＣｌ（１３７）、ＫＣｌ（５．４）、ＣａＣｌ２（１．２６）、ＭｇＣｌ２（１．０）、Ｎａ２ＨＰＯ４（１．０）、ＫＨ２ＰＯ４（０．４４）、ＭｇＳＯ４（０．８１）を含有するＬｅｉｂｏｖｉｔｚ’ｓ Ｌ－１５細胞培養培地（カタログ＃２１０８３０２７、Ｇｉｂｃｏ／ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、米国）中、室温（２０～２５℃）で記録を実施した。高開口数（ＮＡ）対物レンズ（６０ｘ、１．０ＮＡ）及び落射蛍光装置を備えた正立顕微鏡（Ｅ６００ＦＮ、Ｎｉｋｏｎ）を用いて細胞を見た。明るいｔｄＴｏｍａｔｏシグナルを示す細胞のみを、記録のために選択した。記録の間に、オルガノイド切片を、Ｌ－１５培地で連続的に灌流した。全細胞パッチクランプ記録のためのピペットに、ＫＣｌ（１２．６）、ＫＧｌｕ（１３１．４）、ＭｇＣｌ２（２）、ＥＧＴＡ（０．５）、Ｋ２ＨＰＯ４（８）、ＫＨ２ＰＯ４（２）、Ｍｇ２－ＡＴＰ（２）、及びＮａ４－ＧＴＰ（０．２）（括弧内はｍＭ）を含有する細胞内溶液を充填した。溶液を、ＫＯＨを用いてｐＨ７．３～７．４に調整し、Ｄ－グルコースを用いて３２０ｍＯｓｍに調整した。非補償型ピペット抵抗は、典型的には、浴中で測定した場合、５～８ＭＯｈｍであった。全細胞電流応答を、ｐＣｌａｍｐソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、米国）によって制御されたＭｕｌｔｉＣｌａｍｐ ７００Ｂパッチクランプ増幅装置を用いて記録した。
Ｄ１３８～１６４のｈＷＳＣ由来オルガノイドを、最初に明視野及び落射蛍光照明（ＴＥ２０００－Ｕ、Ｎｉｋｏｎ）中でイメージングして、ｔｄＴｏｍａｔｏ陽性細胞を有する耳胞の局在化を決定した。次いで、オルガノイドを、ダイアモンドナイフで切片化して、耳胞を露出させた。切片を、特注の記録チャンバーに入れ、そこでそれをデンタルフロスの２本の縒り糸によって保持した。以下の無機塩（ｍＭ）：ＮａＣｌ（１３７）、ＫＣｌ（５．４）、ＣａＣｌ２（１．２６）、ＭｇＣｌ２（１．０）、Ｎａ２ＨＰＯ４（１．０）、ＫＨ２ＰＯ４（０．４４）、ＭｇＳＯ４（０．８１）を含有するＬｅｉｂｏｖｉｔｚ’ｓ Ｌ－１５細胞培養培地（カタログ＃２１０８３０２７、Ｇｉｂｃｏ／ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、米国）中、室温（２０～２５℃）で記録を実施した。高開口数（ＮＡ）対物レンズ（６０ｘ、１．０ＮＡ）及び落射蛍光装置を備えた正立顕微鏡（Ｅ６００ＦＮ、Ｎｉｋｏｎ）を用いて細胞を見た。明るいｔｄＴｏｍａｔｏシグナルを示す細胞のみを、記録のために選択した。記録の間に、オルガノイド切片を、Ｌ－１５培地で連続的に灌流した。全細胞パッチクランプ記録のためのピペットに、ＫＣｌ（１２．６）、ＫＧｌｕ（１３１．４）、ＭｇＣｌ２（２）、ＥＧＴＡ（０．５）、Ｋ２ＨＰＯ４（８）、ＫＨ２ＰＯ４（２）、Ｍｇ２－ＡＴＰ（２）、及びＮａ４－ＧＴＰ（０．２）（括弧内はｍＭ）を含有する細胞内溶液を充填した。溶液を、ＫＯＨを用いてｐＨ７．３～７．４に調整し、Ｄ－グルコースを用いて３２０ｍＯｓｍに調整した。非補償型ピペット抵抗は、典型的には、浴中で測定した場合、５～８ＭＯｈｍであった。全細胞電流応答を、ｐＣｌａｍｐソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、米国）によって制御されたＭｕｌｔｉＣｌａｍｐ ７００Ｂパッチクランプ増幅装置を用いて記録した。
【0084】
ヒト組織の倫理、収集及び免疫蛍光
真空吸引を使用して人工妊娠中絶から得られた組織から、Ｌｅｉｄｅｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ（オランダ）で、ヒト胎児蝸牛を収集し、プロセシングした。手順の前に、産科的超音波検査を実施して、妊娠週数（ＧＷ）及び妊娠日数を決定した。ＧＷ１３での一方の蝸牛及びＧＷ１８での他方の蝸牛を、本研究において使用した。新鮮な試料をＰＢＳ中に収集し、４℃で一晩、ＰＢＳ中の４％パラホルムアルデヒド中で固定し、脱灰し、以前に記載されたように、パラフィン中に包埋した４５。パラフィンブロックを、Ｌｅｉｃａロータリーミクロトームを使用する矢状面によって５μｍの厚さの切片に切断した。連続切片をキシレン中で脱パラフィン化し、下降系列のエタノール（１００％、９０％、７０％、５０％）中で再水和し、蒸留水中ですすいだ。その後、抗原回収のために沸騰しているポットを使用して９８℃で１２分間、０．０１Ｍクエン酸ナトリウム緩衝剤（ｐＨ６．０）中で切片を処理した後、免疫蛍光のためにプロセシングした。本研究において使用された一次抗体は、表１に列挙される。染色された試料を、Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ９００共焦点顕微鏡上で見て、イメージングした。ヒト胎児組織の使用は、Ｍｅｄｉｃａｌ Ｅｔｈｉｃａｌ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｌｅｉｄｅｎ Ｕｎｉｖｅｓｉｔｙ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ（プロトコール番号０８．０８７）によって認可された。インフォームドコンセント文書は、ＷＭＡヘルシンキ宣言のガイドラインに従って取得された。
真空吸引を使用して人工妊娠中絶から得られた組織から、Ｌｅｉｄｅｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ（オランダ）で、ヒト胎児蝸牛を収集し、プロセシングした。手順の前に、産科的超音波検査を実施して、妊娠週数（ＧＷ）及び妊娠日数を決定した。ＧＷ１３での一方の蝸牛及びＧＷ１８での他方の蝸牛を、本研究において使用した。新鮮な試料をＰＢＳ中に収集し、４℃で一晩、ＰＢＳ中の４％パラホルムアルデヒド中で固定し、脱灰し、以前に記載されたように、パラフィン中に包埋した４５。パラフィンブロックを、Ｌｅｉｃａロータリーミクロトームを使用する矢状面によって５μｍの厚さの切片に切断した。連続切片をキシレン中で脱パラフィン化し、下降系列のエタノール（１００％、９０％、７０％、５０％）中で再水和し、蒸留水中ですすいだ。その後、抗原回収のために沸騰しているポットを使用して９８℃で１２分間、０．０１Ｍクエン酸ナトリウム緩衝剤（ｐＨ６．０）中で切片を処理した後、免疫蛍光のためにプロセシングした。本研究において使用された一次抗体は、表１に列挙される。染色された試料を、Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ９００共焦点顕微鏡上で見て、イメージングした。ヒト胎児組織の使用は、Ｍｅｄｉｃａｌ Ｅｔｈｉｃａｌ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｌｅｉｄｅｎ Ｕｎｉｖｅｓｉｔｙ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ（プロトコール番号０８．０８７）によって認可された。インフォームドコンセント文書は、ＷＭＡヘルシンキ宣言のガイドラインに従って取得された。
【0085】
【表1】
【0086】
【表2】
【図1a-1】
【図1a-2】
【図1b-1l】
【図2a-2c】
【図3a】
【図3b】
【図3c】
【図3d】
【図3e】
【図3f】
【図4a】
【図4b】
【図4c】
【図4d】
【図4e】
【図4f】
【図4g】
【図5a-5o】
【図5p】
【図5q】
【図6a】
【図6b】
【図6c】
【図6d】
【図6e】
【図6f】
【図6g】
【図6h】
【図7a-7c】
【図8a】
【図8b】
【図8c】
【図8d】
【図8e】
【図8f】
【図8g】
【図9a】
【図9b】
【図9c-9f】
【図9g】
【図9h】
【図10a】
【図10b】
【図10c】
【図11a-11g】
【図12a】
【図12b】
【図12c-12h】
【図12i】
【図12j】
【図13a】
【図13b】
【図13c】
【図13d】
【図13g】
【図14a】
【図14b】
【図14c】
【図14d】
【図14e】
【図14f】
【図14g】
【図14h】
【図15a-15g】
【図15h-15m】
【図16a-16e】
【図17】
【配列表】
【国際調査報告】