特表 2024-546129 アルファ－Ｌ－イズロニダーゼ酵素を含む融合タンパク質及びその方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-12-17

(54)【発明の名称】アルファ－Ｌ－イズロニダーゼ酵素を含む融合タンパク質及びその方法

(51)【国際特許分類】

   C07K 19/00 20060101AFI20241210BHJP

   C07K 14/47 20060101ALI20241210BHJP

   C12N 15/12 20060101ALI20241210BHJP

   C12N 15/13 20060101ALI20241210BHJP

   C12N 15/55 20060101ALI20241210BHJP

   C12N 15/62 20060101ALI20241210BHJP

   C12N 9/24 20060101ALI20241210BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20241210BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20241210BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20241210BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20241210BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20241210BHJP

   C12P 21/02 20060101ALI20241210BHJP

   A61K 38/47 20060101ALI20241210BHJP

   A61K 47/68 20170101ALI20241210BHJP

   A61P 3/00 20060101ALI20241210BHJP

   A61P 25/00 20060101ALI20241210BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20241210BHJP

   C07K 16/00 20060101ALN20241210BHJP

【ＦＩ】

C07K19/00 ZNA

C07K14/47

C12N15/12

C12N15/13

C12N15/55

C12N15/62 Z

C12N9/24

C12N15/63 Z

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

C12P21/02 C

A61K38/47

A61K47/68

A61P3/00

A61P25/00

A61K39/395 N

C07K16/00

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024534711

(86)(22)【出願日】2022-12-16

(85)【翻訳文提出日】2024-06-11

(86)【国際出願番号】 US2022053196

(87)【国際公開番号】W WO2023114485

(87)【国際公開日】2023-06-22

(31)【優先権主張番号】63/291,283

(32)【優先日】2021-12-17

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】518086619

【氏名又は名称】デナリ セラピューティクス インコーポレイテッド

【氏名又は名称原語表記】Ｄｅｎａｌｉ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｉｎｃ．

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(74)【代理人】

【識別番号】100181674

【弁理士】

【氏名又は名称】飯田 貴敏

(74)【代理人】

【識別番号】100181641

【弁理士】

【氏名又は名称】石川 大輔

(74)【代理人】

【識別番号】230113332

【弁護士】

【氏名又は名称】山本 健策

(72)【発明者】

【氏名】アドゥスミリ， ゴウリスダ

(72)【発明者】

【氏名】デイビス， オリバー ブレイアー

(72)【発明者】

【氏名】カリオリス， ミハリス エス．

(72)【発明者】

【氏名】マホーン， カタル エス．

(72)【発明者】

【氏名】ティヤギ， シュリシュティ

(72)【発明者】

【氏名】山ノ口 繭輔

【テーマコード（参考）】

4B064

4B065

4C076

4C084

4C085

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B064AG27

4B064CA19

4B064CC24

4B064CE12

4B064DA01

4B065AA91X

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065CA25

4B065CA31

4B065CA44

4B065CA46

4C076AA95

4C076CC21

4C076CC41

4C076EE59

4C084AA02

4C084BA44

4C084DC22

4C084NA14

4C084ZA011

4C084ZC192

4C084ZC211

4C085AA14

4C085BB11

4H045AA10

4H045AA11

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA10

4H045BA41

4H045CA40

4H045DA76

4H045DA89

4H045EA20

4H045FA74

4H045GA26

(57)【要約】

本明細書で提供されるのは、血液脳関門（ＢＢＢ）を通過させて輸送し得、アルファーＬ－イズロニダーゼ（ＩＤＵＡ）酵素－Ｆｃ融合ポリペプチドを含むタンパク質である。特定の実施形態は、ＭＰＳ Ｉを治療するためにそのようなタンパク質を使用する方法も提供する。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

タンパク質であって、
ａ．アルファ－Ｌ－イズロニザーゼ（ＩＤＵＡ）アミノ酸配列、ＩＤＵＡバリアントアミノ酸配列、またはその触媒活性断片に連結された第１のＦｃポリペプチドと、
ｂ．配列番号２８と少なくとも９０％の同一性を有する配列を含み、トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）に特異的に結合し得る第２のＦｃポリペプチドと、を含む前記タンパク質。

【請求項2】

前記第２のＦｃポリペプチドが、ＥＵ付番に従う、位置３８９にＡｌａを有する、請求項１に記載のタンパク質。

【請求項3】

前記第２のＦｃポリペプチドが、ＥＵ付番に従う、位置３８０にＧｌｕ；及び位置３９０にＡｓｎをさらに含む、請求項２に記載のタンパク質。

【請求項4】

前記第２のＦｃポリペプチドが、ＥＵ付番に従う、以下の位置に、すなわち：
ｉ．位置３８４にＴｙｒ；
ｉｉ．位置３８６にＴｈｒ；
ｉｉｉ．位置３８７にＧｌｕ；
ｉｖ．位置３８８にＴｒｐ；
ｖ．位置４１３にＴｈｒ；
ｖｉ．位置４１５にＧｌｕ；
ｖｉｉ．位置４１６にＧｌｕ；及び
ｖｉｉｉ．位置４２１にＰｈｅ、
をさらに含む、請求項３に記載のタンパク質。

【請求項5】

対象の血液脳関門を通過させて輸送され得る、請求項１～４のいずれか１項に記載のタンパク質。

【請求項6】

約１００ｎＭ～約５００ｎＭの親和性でＴｆＲに結合する、請求項１～５のいずれか１項に記載のタンパク質。

【請求項7】

約２００ｎＭ～約４００ｎＭの親和性でＴｆＲに結合する、請求項１～５のいずれか１項に記載のタンパク質。

【請求項8】

前記第２のＦｃポリペプチドが、前記ＴｆＲのアピカルドメインに結合する、請求項１～７のいずれか１項に記載のタンパク質。

【請求項9】

前記タンパク質の前記ＴｆＲへの前記結合が、トランスフェリンの前記ＴｆＲへの結合を実質的に阻害しない、請求項１～８のいずれか１項に記載のタンパク質。

【請求項10】

前記ＩＤＵＡアミノ酸配列が、配列番号３９、４０、４５、７８、及び９９のいずれか１つに対する少なくとも８０％、８５％、９０％、または９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１～９のいずれか１項に記載のタンパク質。

【請求項11】

前記ＩＤＵＡアミノ酸配列が、配列番号３９、４０、４５、７８、及び９９のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、請求項１０に記載のタンパク質。

【請求項12】

前記ＩＤＵＡアミノ酸配列が、配列番号４１～４４のいずれか１つに対する少なくとも８０％、８５％、９０％、または９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１～９のいずれか１項に記載のタンパク質。

【請求項13】

前記ＩＤＵＡアミノ酸配列が、配列番号４１～４４のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、請求項１２に記載のタンパク質。

【請求項14】

前記ＩＤＵＡアミノ酸配列が、配列番号４６～４９のいずれか１つに対する少なくとも８０％、８５％、９０％、または９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１～９のいずれか１項に記載のタンパク質。

【請求項15】

前記ＩＤＵＡアミノ酸配列が、配列番号４６～４９のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、請求項１４に記載のタンパク質。

【請求項16】

前記ＩＤＵＡアミノ酸配列が、配列番号７９～８２のいずれか１つに対する少なくとも８０％、８５％、９０％、または９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１～９のいずれか１項に記載のタンパク質。

【請求項17】

前記ＩＤＵＡアミノ酸配列が、配列番号７９～８２のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、請求項１６に記載のタンパク質。

【請求項18】

前記第１のＦｃポリペプチドが、ペプチド結合によってまたはポリペプチドリンカーによって、前記ＩＤＵＡアミノ酸配列、前記ＩＤＵＡバリアントアミノ酸配列、またはその触媒活性断片に連結される、請求項１～１７のいずれか１項に記載のタンパク質。

【請求項19】

前記ポリペプチドリンカーが可塑性ポリペプチドリンカーである、請求項１８に記載のタンパク質。

【請求項20】

前記可塑性ポリペプチドリンカーがグリシンリッチリンカーである、請求項１８に記載のタンパク質。

【請求項21】

前記ポリペプチドリンカーが、ＧＳ（配列番号７１）、Ｇ_４Ｓ（配列番号７２）または（Ｇ_４Ｓ）_２（配列番号７３）である、請求項１９または２０に記載のタンパク質。

【請求項22】

前記第１のＦｃポリペプチドのＮ末端が、前記ＩＤＵＡアミノ酸配列、前記ＩＤＵＡバリアントアミノ酸配列、またはその触媒活性断片に連結される、請求項１～２１のいずれか１項に記載のタンパク質。

【請求項23】

前記第１のＦｃポリペプチドのＣ末端が、前記ＩＤＵＡアミノ酸配列、前記ＩＤＵＡバリアントアミノ酸配列、またはその触媒活性断片に連結される、請求項１～２１のいずれか１項に記載のタンパク質。

【請求項24】

単一のＩＤＵＡアミノ酸配列、ＩＤＵＡバリアントアミノ酸配列、またはその触媒活性断片を含む請求項１～２３のいずれか１項に記載のタンパク質。

【請求項25】

前記第２のＦｃポリペプチドが前記第１のＦｃポリペプチドとＦｃ二量体を形成する請求項１～２４のいずれか１項に記載のタンパク質。

【請求項26】

前記第１のＦｃポリペプチド及び前記第２のＦｃポリペプチドがそれぞれ、ヘテロ二量体化を促進する改変を含有する、請求項１～２５のいずれか１項に記載のタンパク質。

【請求項27】

ＥＵ付番に従い、前記Ｆｃポリペプチドのうちの一方が、Ｔ３６６Ｗ置換を有し、もう一方のＦｃポリペプチドが、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖ置換を有する、請求項２６に記載のタンパク質。

【請求項28】

前記第１のＦｃポリペプチドが前記Ｔ３６６Ｓ、前記Ｌ３６８Ａ、及び前記Ｙ４０７Ｖ置換を含有し、前記第２のＦｃポリペプチドが前記Ｔ３６６Ｗ置換を含む、請求項２７に記載のタンパク質。

【請求項29】

前記第１のＦｃポリペプチドが、配列番号９～１６及び１９～２２のいずれか１つに対する少なくとも９５％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み；前記第２のＦｃポリペプチドが、配列番号２５～３２及び３５～３８のいずれか１つに対する少なくとも９５％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項２８に記載のタンパク質。

【請求項30】

前記第１のＦｃポリペプチド及び／または前記第２のＦｃポリペプチドが、ネイティブＦｃＲｎ結合部位を含む、請求項１～２９のいずれか１項に記載のタンパク質。

【請求項31】

前記第１のＦｃポリペプチド及び前記第２のＦｃポリペプチドが、エフェクター機能を有しない、請求項１～３０のいずれか１項に記載のタンパク質。

【請求項32】

前記第１のＦｃポリペプチド及び／または前記第２のＦｃポリペプチドが、エフェクター機能を低下させる改変を含む、請求項１～３０のいずれか１項に記載のタンパク質。

【請求項33】

エフェクター機能を低下させる前記改変が、ＥＵ付番に従い、位置２３４でのＡｌａ及び位置２３５でのＡｌａ；位置２３４でのＡｌａ、位置２３５でのＡｌａ及び位置３２９でのＧｌｙ；または位置２３４でのＡｌａ、位置２３５でのＡｌａ及び位置３２９でのＳｅｒという置換である、請求項３２に記載のタンパク質。

【請求項34】

前記第１のＦｃポリペプチドが、配列番号１１～１６及び１９～２２のいずれか１つに対する少なくとも９５％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項３３に記載のタンパク質。

【請求項35】

前記第１のＦｃポリペプチドが、配列番号１１、１２、１９、及び２０のいずれか１つに対する少なくとも９５％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項３４に記載のタンパク質。

【請求項36】

前記第１のＦｃポリペプチドが、配列番号１５、１６、２１、及び２２のいずれか１つに対する少なくとも９５％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項３４に記載のタンパク質。

【請求項37】

前記ＩＤＵＡアミノ酸配列に連結された前記第１のＦｃポリペプチドが、配列番号５０～６９及び８３～９２のいずれか１つに対する少なくとも９５％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項３３に記載のタンパク質。

【請求項38】

前記ＩＤＵＡアミノ酸配列に連結された前記第１のＦｃポリペプチドが、配列番号５０～５３のいずれか１つに対する少なくとも９５％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項３７に記載のタンパク質。

【請求項39】

前記ＩＤＵＡアミノ酸配列に連結された前記第１のＦｃポリペプチドが、配列番号５４～５７のいずれか１つに対する少なくとも９５％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項３７に記載のタンパク質。

【請求項40】

前記ＩＤＵＡアミノ酸配列に連結された前記第１のＦｃポリペプチドが、配列番号８３～８６のいずれか１つに対する少なくとも９５％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項３７に記載のタンパク質。

【請求項41】

前記ＩＤＵＡアミノ酸配列に連結された前記第１のＦｃポリペプチドが、配列番号５８～６１及び９１～９２のいずれか１つに対する少なくとも９５％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項３７に記載のタンパク質。

【請求項42】

前記ＩＤＵＡアミノ酸配列に連結された前記第１のＦｃポリペプチドが、配列番号６２～６５のいずれか１つに対する少なくとも９５％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項３７に記載のタンパク質。

【請求項43】

前記ＩＤＵＡアミノ酸配列に連結された前記第１のＦｃポリペプチドが、配列番号８７～９０のいずれか１つに対する少なくとも９５％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項３７に記載のタンパク質。

【請求項44】

前記ＩＤＵＡアミノ酸配列に連結された前記第１のＦｃポリペプチドが、配列番号６６～６７のいずれか１つに対する少なくとも９５％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項３７に記載のタンパク質。

【請求項45】

前記ＩＤＵＡアミノ酸配列に連結された前記第１のＦｃポリペプチドが、配列番号６８～６９のいずれか１つに対する少なくとも９５％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項３７に記載のタンパク質。

【請求項46】

前記第２のＦｃポリペプチドが、配列番号２７～３２及び３５～３８のいずれか１つに対する少なくとも９５％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項３３～４５のいずれか１項に記載のタンパク質。

【請求項47】

前記第２のＦｃポリペプチドが、配列番号２７、２８、３５及び３６のいずれか１つに対する少なくとも９５％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項４６に記載のタンパク質。

【請求項48】

前記第２のＦｃポリペプチドが、配列番号３１、３２、３７及び３８のいずれか１つに対する少なくとも９５％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項４６に記載のタンパク質。

【請求項49】

前記ＩＤＵＡアミノ酸配列に連結された前記第１のＦｃポリペプチドが、配列番号５０～６５及び８３～９２のいずれか１つのアミノ酸配列を含み；前記第２のＦｃポリペプチドが、配列番号３５～３８のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、請求項２６に記載のタンパク質。

【請求項50】

前記ＩＤＵＡアミノ酸配列に連結された前記第１のＦｃポリペプチドが、配列番号５０～５７及び８３～８６のいずれか１つのアミノ酸配列を含み；前記第２のＦｃポリペプチドが、配列番号３５～３６のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、請求項４９に記載のタンパク質。

【請求項51】

前記ＩＤＵＡアミノ酸配列に連結された前記第１のＦｃポリペプチドが、配列番号５８～６５及び８７～９２のいずれか１つのアミノ酸配列を含み；前記第２のＦｃポリペプチドが、配列番号３７～３８のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、請求項４９に記載のタンパク質。

【請求項52】

前記ＩＤＵＡアミノ酸配列に連結された前記第１のＦｃポリペプチドが、配列番号６６～６９のいずれか１つのアミノ酸配列を含み；前記第２のＦｃポリペプチドが、配列番号３５～３８のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、請求項２６に記載のタンパク質。

【請求項53】

前記ＩＤＵＡアミノ酸配列に連結された前記第１のＦｃポリペプチドが、配列番号６６～６７のいずれか１つのアミノ酸配列を含み；前記第２のＦｃポリペプチドが、配列番号３５～３６のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、請求項５２に記載のタンパク質。

【請求項54】

前記ＩＤＵＡアミノ酸配列に連結された前記第１のＦｃポリペプチドが、配列番号６８～６９のいずれか１つのアミノ酸配列を含み；前記第２のＦｃポリペプチドが、配列番号３７～３８のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、請求項５２に記載のタンパク質。

【請求項55】

前記ＩＤＵＡアミノ酸配列の脳内への取り込みが、前記第１のＦｃポリペプチド及び前記第２のＦｃポリペプチドの非存在下での前記ＩＤＵＡアミノ酸配列の取り込みと比較して、または前記第２のＦｃポリペプチドに対するＴｆＲ結合をもたらす前記改変のない前記ＩＤＵＡ酵素の取り込みと比較して、少なくとも５倍大きい、請求項１～５４のいずれか１項に記載のタンパク質。

【請求項56】

前記第１のＦｃポリペプチドが、血液脳関門（ＢＢＢ）受容体に結合するように改変されておらず、前記第２のＦｃポリペプチドが、ＴｆＲに特異的に結合するように改変されている、請求項１～５５のいずれか１項に記載のタンパク質。

【請求項57】

前記タンパク質が、免疫グロブリン重鎖及び／もしくは軽鎖可変領域配列またはその抗原結合部分を含まない、請求項１～５６のいずれか１項に記載のタンパク質。

【請求項58】

アルファ－Ｌ－イズロニダーゼ（ＩＤＵＡ）アミノ酸配列、ＩＤＵＡバリアントアミノ酸配列、またはその触媒活性断片に連結されたＦｃポリペプチドを含むポリペプチドであって、前記Ｆｃポリペプチドが、配列番号１２に対する少なくとも９０％の同一性を有する配列を含み、かつ別のＦｃポリペプチドとのヘテロ二量体化を促進する１つ以上の改変を含む、前記ポリペプチド。

【請求項59】

前記Ｆｃポリペプチドが、ペプチド結合によってまたはポリペプチドリンカーによって、前記ＩＤＵＡ酵素、前記ＩＤＵＡバリアントアミノ酸配列、またはその触媒活性断片に連結される、請求項５８に記載のポリペプチド。

【請求項60】

Ｎ末端からＣ末端まで：前記ＩＤＵＡ酵素、前記ＩＤＵＡバリアントアミノ酸配列、またはその触媒活性断片；ポリペプチドリンカー；及び前記Ｆｃポリペプチド、を含む、請求項５９に記載のポリペプチド。

【請求項61】

Ｎ末端からＣ末端まで：前記Ｆｃポリペプチド；ポリペプチドリンカー；及び前記ＩＤＵＡ酵素、前記ＩＤＵＡバリアントアミノ酸配列、またはその触媒活性断片、を含む、請求項５９に記載のポリペプチド。

【請求項62】

前記Ｆｃポリペプチドが、ＥＵ付番に従うＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖ置換を含む、請求項５８～６１のいずれか１項に記載のポリペプチド。

【請求項63】

前記Ｆｃポリペプチドが、ＥＵ付番に従い、位置２３４でのＡｌａ及び位置２３５でのＡｌａ；位置２３４でのＡｌａ、位置２３５でのＡｌａ及び位置３２９でのＧｌｙ；または位置２３４でのＡｌａ、位置２３５でのＡｌａ及び位置３２９でのＳｅｒという置換を含む、請求項５８～６２のいずれか１項に記載のポリペプチド。

【請求項64】

前記ポリペプチドが、配列番号５０～６９及び８３～９２のいずれか１つに対する少なくとも９５％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項６３に記載のポリペプチド。

【請求項65】

請求項５８～６４のいずれか１項に記載のポリペプチド及び請求項５８に記載の他のＦｃポリペプチドを含むタンパク質。

【請求項66】

請求項１～５７及び６５のいずれか１項に記載のタンパク質、または請求項５８～６４のいずれか１項に記載のポリペプチド及び薬学的に許容される賦形剤を含む、医薬組成物。

【請求項67】

請求項５８～６４のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチド。

【請求項68】

請求項６７に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。

【請求項69】

請求項６７に記載のポリヌクレオチドまたは請求項６８に記載のベクターを含む、宿主細胞。

【請求項70】

請求項５８に記載の前記他のＦｃポリペプチドをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドをさらに含む、請求項６９に記載の宿主細胞。

【請求項71】

ＩＤＵＡアミノ酸配列、ＩＤＵＡバリアントアミノ酸配列、またはその触媒活性断片に連結されたＦｃポリペプチドを含むポリペプチドを生成する方法であって、請求項６７に記載のポリヌクレオチドによってコードされる前記ポリペプチドが発現する条件下で宿主細胞を培養することを含む、前記方法。

【請求項72】

請求項１～５７のいずれか１項に記載の、ＩＤＵＡアミノ酸配列、ＩＤＵＡバリアントアミノ酸配列、またはその触媒活性断片に連結された前記第１のＦｃポリペプチドをコードする第１の核酸配列と；前記第２のＦｃポリペプチドをコードする第２の核酸配列と、を含む、ポリヌクレオチドの対。

【請求項73】

請求項７２に記載のポリヌクレオチドの対を含む、１つ以上のベクター。

【請求項74】

請求項７２に記載のポリヌクレオチドの対、または請求項７３に記載の１つ以上のベクターを含む宿主細胞。

【請求項75】

ＩＤＵＡアミノ酸配列、ＩＤＵＡバリアントアミノ酸配列、またはその触媒活性断片に連結された第１のＦｃポリペプチドと、第２のＦｃポリペプチドとを含むタンパク質を生成する方法であって、請求項７２に記載のポリヌクレオチドの対が発現する条件下で宿主細胞を培養することを含む、前記方法。

【請求項76】

ＭＰＳ Ｉを治療する方法であって、請求項１～５７及び６５のいずれか１項に記載のタンパク質または請求項５８～６４のいずれか１項に記載のポリペプチドを、それを必要とする患者に投与することを含む、前記方法。

【請求項77】

ＭＰＳ Ｉの治療を必要とする患者におけるその治療に使用するための、請求項１～５７及び６５のいずれか１項に記載のタンパク質または請求項５８～６４のいずれか１項に記載のポリペプチド。

【請求項78】

ＭＰＳ Ｉの治療を必要とする患者におけるそれを治療するための医薬の調製における、請求項１～５７及び６５のいずれか１項に記載のタンパク質または請求項５８～６４のいずれか１項に記載のポリペプチドの使用。

【請求項79】

ＭＰＳ Ｉを有する患者において毒性代謝産物の蓄積を減少させる方法であって、請求項１～５７及び６５のいずれか１項に記載のタンパク質または請求項５８～６４のいずれか１項に記載のポリペプチドを、前記患者に投与することを含む、前記方法。

【請求項80】

ＭＰＳ Ｉを有する患者における毒性代謝産物の蓄積を減少させるのに使用するための、請求項１～５７及び６５のいずれか１項に記載のタンパク質または請求項５８～６４のいずれか１項に記載のポリペプチド。

【請求項81】

ＭＰＳ Ｉを有する患者における毒性代謝産物の蓄積を減少させるための医薬の調製における、請求項１～５７及び６５のいずれか１項に記載のタンパク質または請求項５８～６４のいずれか１項に記載のポリペプチドの使用。

【請求項82】

前記毒性代謝産物が、ヘパラン硫酸由来オリゴ糖またはデルマタン硫酸由来オリゴ糖を含む、請求項７９～８１のいずれか１項に記載の方法、タンパク質または使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０２１年１２月１７日出願の米国仮出願第６３／２９１，２８３号に対する優先権を主張する。上に参照された出願の全内容は、参照により本明細書に組み込まれる。

【背景技術】

【0002】

ムコ多糖症Ｉ型（ＭＰＳ Ｉ）（またはハーラー症候群）は、ＩＤＵＡ遺伝子の遺伝子変異によって引き起こされるリソソーム蓄積障害である。これらの変異により、アルファ－Ｌ－イズロニダーゼ（ＩＤＵＡ）タンパク質の機能が低下または消失し、グリコサミノグリカンであるデルマタン硫酸及びヘパラン硫酸が蓄積し、骨格、心臓、呼吸器系、及び脳などの複数の臓器及び組織に変化が生じる。ＭＰＳ Ｉの治療は依然として大部分が保存的である；欠乏している酵素は静脈内投与してもよいが、血液脳関門（ＢＢＢ）を通過させて組換え酵素を送達することが困難であるせいで、脳にはほとんど効果がない。したがって、ＭＰＳ Ｉの症状及びＩＤＵＡ欠損を、ＣＮＳ（中枢神経系）及び末梢神経の両方で治療する、より効果的な治療法が必要である。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0003】

したがって、本明細書では、ＢＢＢを通過し、ＭＰＳ Ｉの末梢及びＣＮＳ症状の両方を治療する能力を有する特定の酵素補充療法が提供される。特に、特定の実施形態は、（ａ）アルファ－Ｌ－イズロニダーゼ（ＩＤＵＡ）アミノ酸配列、ＩＤＵＡバリアントアミノ酸配列、またはその触媒活性断片に連結された第１のＦｃポリペプチド；及び（ｂ）第２のＦｃポリペプチドを含むタンパク質を提供し；この第１及び／または第２のＦｃポリペプチドは、血液脳関門（ＢＢＢ）受容体、例えばトランスフェリン受容体（ＴｆＲ）に結合し得る（例えば、特異的に結合し得る）改変Ｆｃである。特定の実施形態では、この第２のＦｃポリペプチドは、第１のＦｃポリペプチドとＦｃ二量体を形成する。

【0004】

特定の実施形態では、この第１のＦｃポリペプチドは、ＴｆＲに結合し得る（例えば、特異的に結合する）改変されたＦｃである。特定の実施形態では、この第１のＦｃポリペプチドは、配列番号２８または９８（例えば、配列番号２８）と少なくとも９０％の同一性を有する配列を含む改変Ｆｃであり、ＴｆＲに特異的に結合し得る。

【0005】

特定の実施形態では、この第１のＦｃポリペプチドは、１）配列番号２８または９８（例えば、配列番号２８）と少なくとも９０％の同一性を有する配列を含み；２）ＴｆＲに特異的に結合し得；かつ３）ＥＵ付番に従い位置３８９にＡｌａを有する。特定の実施形態では、この第１のＦｃポリペプチドは、ＥＵ付番に従い、位置３８０にＧｌｕ；及び位置３９０にＡｓｎをさらに含む。いくつかの実施形態では、この第１のＦｃポリペプチドは、ＥＵ付番に従い、以下の位置に：すなわち位置３８４にＴｙｒ；位置３８６にＴｈｒ；位置３８７にＧｌｕ；位置３８８にＴｒｐ；位置４１３にＴｈｒ；位置４１５にＧｌｕ；位置４１６にＧｌｕ；及び位置４２１にＰｈｅをさらに含む。

【0006】

特定の実施形態では、この第２のＦｃポリペプチドは、ＴｆＲに結合し得る（例えば、特異的に結合し得る）改変Ｆｃである。特定の実施形態では、この第２のＦｃポリペプチドは、配列番号２８または９８（例えば、配列番号２８）と少なくとも９０％の同一性を有する配列を含む改変Ｆｃであり、ＴｆＲに特異的に結合し得る。

【0007】

特定の実施形態では、この第２のＦｃポリペプチドは、１）配列番号２８または９８（例えば、配列番号２８）と少なくとも９０％の同一性を有する配列を含み；２）ＴｆＲに特異的に結合し得；かつ３）ＥＵ付番に従い位置３８９にＡｌａを有する。特定の実施形態では、この第２のＦｃポリペプチドは、ＥＵ付番に従い、位置３８０にＧｌｕ；及び位置３９０にＡｓｎをさらに含む。特定の実施形態では、第２のＦｃポリペプチドは、ＥＵ付番に従い、以下の位置に、すなわち位置３８４にＴｙｒ；位置３８６にＴｈｒ；位置３８７にＧｌｕ；位置３８８にＴｒｐ；位置４１３にＴｈｒ；位置４１５にＧｌｕ；位置４１６にＧｌｕ；及び位置４２１にＰｈｅをさらに含む。

【0008】

特定の実施形態は、以下を含むタンパク質を提供する：
ａ．アルファ－Ｌ－イズロニダーゼ（ＩＤＵＡ）アミノ酸配列、ＩＤＵＡバリアントアミノ酸配列、またはその触媒活性断片に連結された第１のＦｃポリペプチド；及び
ｂ．配列番号２８と少なくとも９０％の同一性を有する配列を含み、トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）に特異的に結合し得る第２のＦｃポリペプチド。

【0009】

特定の実施形態では、第２のＦｃポリペプチドは、ＥＵ付番に従い、位置３８９にＡｌａを有する。

【0010】

特定の実施形態では、前記第２のＦｃポリペプチドが、ＥＵ付番に従い、位置３８０にＧｌｕ；及び位置３９０にＡｓｎをさらに含む。

【0011】

特定の実施形態では、第２のＦｃポリペプチドは、ＥＵ付番に従い、以下の位置に、すなわち：位置３８４にＴｙｒ；位置３８６にＴｈｒ；位置３８７にＧｌｕ；位置３８８にＴｒｐ；位置４１３にＴｈｒ；位置４１５にＧｌｕ；位置４１６にＧｌｕ；及び位置４２１にＰｈｅをさらに含む。

【0012】

特定の実施形態では、タンパク質は、対象の血液脳関門を横切って輸送され得る。

【0013】

特定の実施形態では、タンパク質は、約１００ｎＭ～約５００ｎＭの親和性でＴｆＲに結合する。

【0014】

特定の実施形態では、タンパク質は、約２００～約４００ｎＭの親和性でＴｆＲに結合する。

【0015】

特定の実施形態では、第２のＦｃポリペプチドは、ＴｆＲのアピカルドメインに結合する。

【0016】

特定の実施形態では、タンパク質のＴｆＲへの結合は、トランスフェリンのＴｆＲへの結合を実質的に阻害しない。

【0017】

特定の実施形態では、ＩＤＵＡアミノ酸配列は、配列番号３９、４０、４５、７８、及び９９のいずれか１つに対する少なくとも８０％、８５％、９０％、または９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0018】

特定の実施形態では、ＩＤＵＡアミノ酸配列は、配列番号３９、４０、４５、７８、及び９９のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。

【0019】

特定の実施形態では、ＩＤＵＡアミノ酸配列は、配列番号４１～４４のいずれか１つに対する少なくとも８０％、８５％、９０％、または９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0020】

特定の実施形態では、ＩＤＵＡアミノ酸配列は、配列番号４１～４４のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。

【0021】

特定の実施形態では、ＩＤＵＡアミノ酸配列は、配列番号４６～４９のいずれか１つに対する少なくとも８０％、８５％、９０％、または９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0022】

特定の実施形態では、ＩＤＵＡアミノ酸配列は、配列番号４６～４９のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。

【0023】

特定の実施形態では、ＩＤＵＡアミノ酸配列は、配列番号７９～８２のいずれか１つに対する少なくとも８０％、８５％、９０％、または９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0024】

特定の実施形態では、ＩＤＵＡアミノ酸配列は、配列番号７９～８２のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。

【0025】

特定の実施形態では、第１のＦｃポリペプチドは、ペプチド結合によってまたはポリペプチドリンカーによって、ＩＤＵＡアミノ酸配列、ＩＤＵＡバリアントアミノ酸配列、またはその触媒活性断片に連結される。特定の実施形態では、第１のＦｃポリペプチドは、ペプチド結合によって、ＩＤＵＡアミノ酸配列、ＩＤＵＡバリアントアミノ酸配列、またはその触媒活性断片に連結される。特定の実施形態では、第１のＦｃポリペプチドは、ペプチドリンカーによって、ＩＤＵＡアミノ酸配列、ＩＤＵＡバリアントアミノ酸配列、またはその触媒活性断片に連結される。

【0026】

特定の実施形態では、ポリペプチドリンカーは、可塑性ポリペプチドリンカーである。

【0027】

特定の実施形態では、可塑性ポリペプチドリンカーは、グリシンリッチリンカーである。

【0028】

特定の実施形態では、ポリペプチドリンカーは、ＧＳ（配列番号７１）、Ｇ_４Ｓ（配列番号７２）または（Ｇ_４Ｓ）_２（配列番号７３）である。

【0029】

特定の実施形態では、第１のＦｃポリペプチドのＮ末端は、ＩＤＵＡアミノ酸配列、ＩＤＵＡバリアントアミノ酸配列、またはその触媒活性断片に連結される。

【0030】

特定の実施形態では、第１のＦｃポリペプチドのＣ末端は、ＩＤＵＡアミノ酸配列、ＩＤＵＡバリアントアミノ酸配列、またはその触媒活性断片に連結される。

【0031】

特定の実施形態では、本明細書に記載の融合タンパク質は、単一のＩＤＵＡアミノ酸配列、ＩＤＵＡバリアントアミノ酸配列、またはその触媒活性断片を含む。

【0032】

特定の実施形態では、この第２のＦｃポリペプチドは、第１のＦｃポリペプチドとＦｃ二量体を形成する。

【0033】

特定の実施形態では、第１のＦｃポリペプチド及び第２のＦｃポリペプチドはそれぞれ、ヘテロ二量体化を促進する改変を含む。

【0034】

特定の実施形態では、ＥＵ付番に従い、Ｆｃポリペプチドのうちの一方は、Ｔ３６６Ｗ置換を有し、他方のＦｃポリペプチドは、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖ置換を有する。

【0035】

特定の実施形態では、第１のＦｃポリペプチドは、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖ置換を含有し、第２のＦｃポリペプチドは、Ｔ３６６Ｗ置換を含む。

【0036】

特定の実施形態では、第１のＦｃポリペプチドは、配列番号９～１６及び１９～２２のいずれか１つに対する少なくとも９５％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み；第２のＦｃポリペプチドは、配列番号２５～３２及び３５～３８のいずれか１つに対する少なくとも９５％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0037】

特定の実施形態では、第１のＦｃポリペプチドは、Ｔ３６６Ｗ置換を含み、第２のＦｃポリペプチドは、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖ置換を含む。

【0038】

特定の実施形態では、第１のＦｃポリペプチドは、配列番号１７～１８及び７４～７５のいずれか１つに対する少なくとも９５％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み；第２のＦｃポリペプチドは、配列番号３３～３４及び９７～９８のいずれか１つに対する少なくとも９５％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0039】

特定の実施形態では、第１のＦｃポリペプチド及び／または第２のＦｃポリペプチドは、ネイティブＦｃＲｎ結合部位を含む。

【0040】

特定の実施形態では、第１のＦｃポリペプチド及び第２のＦｃポリペプチドは、エフェクター機能を有さない。

【0041】

特定の実施形態では、第１のＦｃポリペプチド及び／または第２のＦｃポリペプチドは、エフェクター機能を低下させる改変を含む。

【0042】

特定の実施形態では、エフェクター機能を低下させる改変は、ＥＵ付番に従い、位置２３４でのＡｌａ及び位置２３５でのＡｌａ；位置２３４でのＡｌａ、位置２３５でのＡｌａ及び位置３２９でのＧｌｙ；または位置２３４でのＡｌａ、位置２３５でのＡｌａ及び位置３２９でのＳｅｒという置換である。

【0043】

特定の実施形態では、第１のＦｃポリペプチドは、配列番号１１～１６、及び１９～２２のいずれか１つに対する少なくとも９５％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0044】

特定の実施形態では、第１のＦｃポリペプチドは、配列番号１１、１２、１９、及び２０のいずれか１つに対する少なくとも９５％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0045】

特定の実施形態では、第１のＦｃポリペプチドは、配列番号１５、１６、２１、及び２２のいずれか１つに対する少なくとも９５％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0046】

特定の実施形態では、ＩＤＵＡアミノ酸配列に連結された第１のＦｃポリペプチドは、配列番号５０～６９及び８３～９２のいずれか１つに対する少なくとも９５％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0047】

特定の実施形態では、ＩＤＵＡアミノ酸配列に連結された第１のＦｃポリペプチドは、配列番号５０～５３のいずれか１つに対する少なくとも９５％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0048】

特定の実施形態では、ＩＤＵＡアミノ酸配列に連結された第１のＦｃポリペプチドは、配列番号５４～５７のいずれか１つに対する少なくとも９５％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0049】

特定の実施形態では、ＩＤＵＡアミノ酸配列に連結された第１のＦｃポリペプチドは、配列番号８３～８６のいずれか１つに対する少なくとも９５％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0050】

特定の実施形態では、ＩＤＵＡアミノ酸配列に連結された第１のＦｃポリペプチドは、配列番号５８～６１及び９１～９２のいずれか１つに対する少なくとも９５％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0051】

特定の実施形態では、ＩＤＵＡアミノ酸配列に連結された第１のＦｃポリペプチドは、配列番号６２～６５のいずれか１つに対する少なくとも９５％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0052】

特定の実施形態では、ＩＤＵＡアミノ酸配列に連結された第１のＦｃポリペプチドは、配列番号８７～９０のいずれか１つに対する少なくとも９５％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0053】

特定の実施形態では、ＩＤＵＡアミノ酸配列に連結された第１のＦｃポリペプチドは、配列番号６６～６７のいずれか１つに対する少なくとも９５％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0054】

特定の実施形態では、ＩＤＵＡアミノ酸配列に連結された第１のＦｃポリペプチドは、配列番号６８～６９のいずれか１つに対する少なくとも９５％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0055】

特定の実施形態では、第２のＦｃポリペプチドは、配列番号２７～３２及び３５～３８のいずれか１つに対する少なくとも９５％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0056】

特定の実施形態では、第２のＦｃポリペプチドは、配列番号２７、２８、３５及び３６のいずれか１つに対する少なくとも９５％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0057】

特定の実施形態では、第２のＦｃポリペプチドは、配列番号３１、３２、３７及び３８のいずれか１つに対する少なくとも９５％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0058】

特定の実施形態では、ＩＤＵＡアミノ酸配列に連結された第１のＦｃポリペプチドは、配列番号５０～６５及び８３～９２のいずれか１つのアミノ酸配列を含み；第２のＦｃポリペプチドは、配列番号３５～３８のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。

【0059】

特定の実施形態では、ＩＤＵＡアミノ酸配列に連結された第１のＦｃポリペプチドは、配列番号５０～５７及び８３～８６のいずれか１つのアミノ酸配列を含み；第２のＦｃポリペプチドは、配列番号３５～３６のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。

【0060】

特定の実施形態では、ＩＤＵＡアミノ酸配列に連結された第１のＦｃポリペプチドは、配列番号５８～６５及び８７～９２のいずれか１つのアミノ酸配列を含み；第２のＦｃポリペプチドは、配列番号３７～３８のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。

【0061】

特定の実施形態では、ＩＤＵＡアミノ酸配列に連結された第１のＦｃポリペプチドは、配列番号６６～６９のいずれか１つのアミノ酸配列を含み；第２のＦｃポリペプチドは、配列番号３５～３８のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。

【0062】

特定の実施形態では、ＩＤＵＡアミノ酸配列に連結された第１のＦｃポリペプチドは、配列番号６６～６７のいずれか１つのアミノ酸配列を含み；第２のＦｃポリペプチドは、配列番号３５～３６のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。

【0063】

特定の実施形態では、ＩＤＵＡアミノ酸配列に連結された第１のＦｃポリペプチドは、配列番号６８～６９のいずれか１つのアミノ酸配列を含み；第２のＦｃポリペプチドは、配列番号３７～３８のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。

【0064】

特定の実施形態では、ＩＤＵＡアミノ酸配列の脳内への取り込みは、第１のＦｃポリペプチド及び第２のＦｃポリペプチドの非存在下でのＩＤＵＡアミノ酸配列の取り込みと比較して、またはＴｆＲ結合をもたらす、第２のＦｃポリペプチドに対する、改変のないＩＤＵＡ酵素の取り込みと比較して、少なくとも５倍大きい。

【0065】

特定の実施形態では、第１のＦｃポリペプチドは、血液脳関門（ＢＢＢ）受容体に結合するように改変されておらず、第２のＦｃポリペプチドはＴｆＲに特異的に結合するように改変されている。

【0066】

特定の実施形態では、タンパク質は、免疫グロブリン重鎖及び／または軽鎖可変領域配列またはその抗原結合部分を含まない。

【0067】

特定の実施形態では、アルファ－Ｌ－イズロニダーゼ（ＩＤＵＡ）アミノ酸配列、ＩＤＵＡバリアントアミノ酸配列、またはその触媒活性断片に連結されたＦｃポリペプチドを含むポリペプチドを提供し、このＦｃポリペプチドは、配列番号１２に対する少なくとも９０％の同一性を有する配列を含み、別のＦｃポリペプチドとのヘテロ二量体化を促進する１つ以上の改変を含む。

【0068】

特定の実施形態では、Ｆｃポリペプチドは、ペプチド結合によってまたはポリペプチドリンカーによって、ＩＤＵＡ酵素、ＩＤＵＡバリアントアミノ酸配列、またはその触媒活性断片に連結される。

【0069】

特定の実施形態では、ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端まで：ＩＤＵＡ酵素、ＩＤＵＡバリアントアミノ酸配列、またはその触媒活性断片；ポリペプチドリンカー；及びＦｃポリペプチドを含む。

【0070】

特定の実施形態では、ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端まで：Ｆｃポリペプチド；ポリペプチドリンカー；及びＩＤＵＡ酵素、ＩＤＵＡバリアントアミノ酸配列、またはその触媒活性断片を含む。

【0071】

特定の実施形態では、Ｆｃポリペプチドは、ＥＵ付番に従う、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖ置換を含む。

【0072】

特定の実施形態では、Ｆｃポリペプチドは、ＥＵ付番に従う、位置２３４でのＡｌａ及び位置２３５でのＡｌａ；位置２３４でのＡｌａ、位置２３５でのＡｌａ及び位置３２９でのＧｌｙ；または位置２３４でのＡｌａ、位置２３５でのＡｌａ及び位置３２９でのＳｅｒという置換を含む。

【0073】

特定の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号５０～６９及び８３～９２のいずれか１つに対する少なくとも９５％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0074】

特定の実施形態では、１）アルファ－Ｌ－イズロニダーゼ（ＩＤＵＡ）アミノ酸配列、ＩＤＵＡバリアントアミノ酸配列、またはその触媒活性断片に連結されたＦｃポリペプチドを含むポリペプチドであって、このＦｃポリペプチドは、配列番号１２に対する少なくとも９０％の同一性を有する配列を含み、別のＦｃポリペプチドとのヘテロ二量体化を促進する１つ以上の改変を含む、ポリペプチドと、２）他のＦｃポリペプチドと、を含むタンパク質を提供する。

【0075】

特定の実施形態は、本明細書に記載の融合タンパク質または本明細書に記載のポリペプチドと、薬学的に許容される担体及び／または賦形剤とを含む医薬組成物を提供する。

【0076】

特定の実施形態は、本明細書に記載のポリペプチド（例えば、本明細書に記載のＩＤＵＡ－Ｆｃ融合ポリペプチド）をコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドを提供する。

【0077】

特定の実施形態は、本明細書に記載のポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。

【0078】

特定の実施形態は、本明細書に記載のポリヌクレオチドまたは本明細書に記載のベクターを含む宿主細胞を提供する。特定の実施形態では、その宿主細胞は、本明細書に記載の別のポリペプチド（例えば、ＴｆＲ結合改変Ｆｃポリペプチドなどの他のＦｃポリペプチド）をコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドをさらに含む。

【0079】

特定の実施形態は、ＩＤＵＡアミノ酸配列、ＩＤＵＡバリアントアミノ酸配列、またはその触媒活性断片に連結されたＦｃポリペプチドを含むポリペプチドを生成する方法であって、本明細書に記載のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドが発現する条件下で宿主細胞を培養することを含む、方法を提供する。

【0080】

特定の実施形態は、ＩＤＵＡアミノ酸配列、ＩＤＵＡバリアントアミノ酸配列、またはその触媒活性断片に連結された第１のＦｃポリペプチドをコードする第１の核酸配列；及び本明細書に記載される、第２のＦｃポリペプチドをコードする第２の核酸配列、を含むポリヌクレオチドの対を提供する。

【0081】

特定の実施形態はまた、本明細書に記載のポリヌクレオチドの対を含む１つ以上のベクターを提供する。例えば、特定の実施形態は、ポリヌクレオチドの対を含む単一のベクターを提供する。他の実施形態は、２つのベクターを提供し、この第１のベクターは、この対からの第１のポリヌクレオチドを含み、第２のベクターは、この対からの第２のポリヌクレオチドを含む。

【0082】

特定の実施形態は、本明細書に記載のポリヌクレオチドの対、または本明細書に記載の１つ以上のベクターを含む宿主細胞を提供する。
特定の実施形態は、ＩＤＵＡアミノ酸配列、ＩＤＵＡバリアントアミノ酸配列、またはその触媒活性断片に連結された第１のＦｃポリペプチド、及び第２のＦｃポリペプチドを含むタンパク質を生成する方法であって、本明細書に記載のポリヌクレオチドの対が発現する条件下で宿主細胞を培養することを含む、方法を提供する。

【0083】

特定の実施形態は、ＭＰＳ Ｉを治療する方法であって、本明細書に記載のタンパク質または本明細書に記載のポリペプチドを、それを必要とする患者に投与することを含む、方法を提供する。特定の実施形態では、治療有効量のタンパク質またはポリペプチドが投与される。

【0084】

特定の実施形態は、ＭＰＳ Ｉの治療を必要とする患者におけるその治療に使用するための、本明細書に記載のタンパク質または本明細書に記載のポリペプチドを提供する。

【0085】

特定の実施形態は、ＭＰＳ Ｉの治療を必要とする患者におけるそれを治療するための医薬の調製における、本明細書に記載のタンパク質または本明細書に記載のポリペプチドの使用を提供する。

【0086】

特定の実施形態は、ＭＰＳ Ｉを有する患者における毒性代謝産物の蓄積を減少させる方法であって、本明細書に記載のタンパク質または本明細書に記載のポリペプチドをこの患者に投与することを含む、方法を提供する。特定の実施形態では、治療有効量（例えば、治療上有効な量）のタンパク質またはポリペプチドが投与される。

【0087】

特定の実施形態は、ＭＰＳ Ｉを有する患者における毒性代謝産物の蓄積を減少させるのに使用するための、本明細書に記載のタンパク質または本明細書に記載のポリペプチドを提供する。

【0088】

特定の実施形態は、ＭＰＳ Ｉを有する患者における毒性代謝産物の蓄積を減少させるための医薬の調製における、本明細書に記載のタンパク質または本明細書に記載のポリペプチドの使用を提供する。

【0089】

特定の実施形態では、毒性代謝産物は、ヘパラン硫酸由来のオリゴ糖またはデルマタン硫酸由来のオリゴ糖を含む。

【図面の簡単な説明】

【0090】

【図1】例示的なＥＴＶ：ＩＤＵＡ融合タンパク質の図解であり、ＩＤＵＡ酵素は、ＦｃポリペプチドのＮ末端（Ａ）またはＦｃポリペプチドのＣ末端（Ｂ）に融合されている。

【図2】ＩＤＵＡ－Ｆｃ融合タンパク質及びＡｌｄｕｒａｚｙｍｅ（アウドラザイム）（ラロニダーゼ）の酵素活性のインビトロ評価。

【図3】ヘパラン硫酸及びデルマタン硫酸のＬＣＭＳ定量を使用して、ハーラー（ＭＰＳ Ｉ）患者と健常対照群の線維芽細胞におけるラロニダーゼと比較したＥＴＶ：ＩＤＵＡ Ｆｕｓｉｏｎ １の細胞活性の評価。

【図4A】ＴｆＲノックインマウス（「ＴｆＲ^{ｍｕ／ｈｕ}ＫＩ」）における、ＥＴＶ：ＩＤＵＡ Ｆｕｓｉｏｎ ３血清ＰＫの評価。

【図4B】ＴｆＲノックインマウス（「ＴｆＲ^{ｍｕ／ｈｕ}ＫＩ」）における、ＥＴＶ：ＩＤＵＡ Ｆｕｓｉｏｎ ４血清ＰＫの評価。

【図4C】ＴｆＲノックインマウス（「ＴｆＲ^{ｍｕ／ｈｕ}ＫＩ」）における、ＥＴＶ：ＩＤＵＡ Ｆｕｓｉｏｎ ６血清ＰＫの評価。

【図5A】ＴｆＲノックインマウス（「ＴｆＲ^{ｍｕ／ｈｕ}ＫＩ」）におけるＥＴＶ：ＩＤＵＡ Ｆｕｓｉｏｎ ３脳ＰＫの評価。

【図5B】ＴｆＲノックインマウス（「ＴｆＲ^{ｍｕ／ｈｕ}ＫＩ」）における、ＥＴＶ：ＩＤＵＡ Ｆｕｓｉｏｎ ４脳ＰＫの評価。

【図5C】ＴｆＲノックインマウス（「ＴｆＲ^{ｍｕ／ｈｕ}ＫＩ」）における、ＥＴＶ：ＩＤＵＡ Ｆｕｓｉｏｎ ６脳ＰＫの評価。

【図6A】ＭＰＳ Ｉの健康なマウスモデルと疾患マウスモデルで実施した比較研究における、ＣＳＦにおける薬力学的反応（総ＧＡＧレベル）の評価。健康なマウスモデルは、ＴｆＲノックインマウス（“ＴｆＲ^{ｍｕ／ｈｕ}”）で表され、疾患マウスモデルは、ＩＤＵＡ遺伝子がノックアウトされたＴｆＲノックインマウス（「ＩＤＵＡ ＫＯ；ＴｆＲ^{ｍｕ／ｈｕ}」）で表される。グラフには平均±ＳＥＭ及びｐ値が示される：一元配置分散分析、ダネットの多重比較検定；＊＊ ｐ≦０．０１、＊＊＊ｐ≦０．００１、及び＊＊＊＊ｐ≦０．０００１。

【図6B】ＭＰＳ Ｉの健康なマウスモデルと疾患マウスモデルで実施した比較研究における、脳における薬力学的反応（総ＧＡＧレベル）の評価。健康なマウスモデルは、ＴｆＲノックインマウス（“ＴｆＲ^{ｍｕ／ｈｕ}”）で表され、疾患マウスモデルは、ＩＤＵＡ遺伝子がノックアウトされたＴｆＲノックインマウス（「ＩＤＵＡ ＫＯ；ＴｆＲ^{ｍｕ／ｈｕ}」）で表される。グラフには平均±ＳＥＭ及びｐ値が示される：一元配置分散分析、ダネットの多重比較検定；＊＊ ｐ≦０．０１、＊＊＊ｐ≦０．００１、及び＊＊＊＊ｐ≦０．０００１。

【図6C】ＭＰＳ Ｉの健康なマウスモデルと疾患マウスモデルで実施した比較研究における、肝臓における薬力学的反応（総ＧＡＧレベル）の評価。健康なマウスモデルは、ＴｆＲノックインマウス（“ＴｆＲ^{ｍｕ／ｈｕ}”）で表され、疾患マウスモデルは、ＩＤＵＡ遺伝子がノックアウトされたＴｆＲノックインマウス（「ＩＤＵＡ ＫＯ；ＴｆＲ^{ｍｕ／ｈｕ}」）で表される。グラフには平均±ＳＥＭ及びｐ値が示される：一元配置分散分析、ダネットの多重比較検定；＊＊ ｐ≦０．０１、＊＊＊ｐ≦０．００１、及び＊＊＊＊ｐ≦０．０００１。

【図6D】ＭＰＳ Ｉの健康なマウスモデルと疾患マウスモデルで実施した比較研究における、尿における薬力学的反応（総ＧＡＧレベル）の評価。健康なマウスモデルは、ＴｆＲノックインマウス（“ＴｆＲ^{ｍｕ／ｈｕ}”）で表され、疾患マウスモデルは、ＩＤＵＡ遺伝子がノックアウトされたＴｆＲノックインマウス（「ＩＤＵＡ ＫＯ；ＴｆＲ^{ｍｕ／ｈｕ}」）で表される。グラフには平均±ＳＥＭ及びｐ値が示される：一元配置分散分析、ダネットの多重比較検定；＊＊ ｐ≦０．０１、＊＊＊ｐ≦０．００１、及び＊＊＊＊ｐ≦０．０００１。

【発明を実施するための形態】

【0091】

現在、ＭＰＳ Ｉの治療のための新しい治療薬、特に神経認知表現型を有する重篤なＭＰＳ Ｉを治療する治療薬が必要とされている。本明細書に記載されているのは、ＥＴＶ：ＩＤＵＡと呼ばれる特定の酵素補充療法であり、これには、ＢＢＢを通過し、ＭＰＳ Ｉの末梢及びＣＮＳ症状の両方を治療する能力がある。本明細書で使用される場合、「ＥＴＶ：ＩＤＵＡ」という用語は、ＢＢＢを通過させて輸送し得、ＩＤＵＡ酵素、ＩＤＵＡ酵素バリアント、またはその触媒活性断片に結合（例えば、融合）している第１のＦｃポリペプチド；及び第２のＦｃポリペプチドを含む、タンパク質（例えば、二量体タンパク質）を指す。

【0092】

ＩＤＵＡ酵素－Ｆｃ融合ポリペプチドを含むタンパク質分子
本明細書に記載されるように、特定の実施形態は、ＩＤＵＡ酵素－Ｆｃ融合ポリペプチドを含むタンパク質分子を提供する。タンパク質に組み込まれたＩＤＵＡ酵素は、触媒的に活性である、すなわち、酵素活性を保持する。いくつかの態様では、本明細書に記載のタンパク質は、以下を含む：（ａ）改変（例えば、ヘテロ二量体化を促進する１つ以上の改変）を含んでもよいし、または野生型Ｆｃポリペプチドであってもよい第１のＦｃポリペプチド；及びＩＤＵＡ酵素；ならびに（ｂ）第２のＦｃポリペプチドであって、改変（例えば、ヘテロ二量体化を促進する１つ以上の改変）を含んでもよいし、または野生型Ｆｃポリペプチドであってもよい、第２のＦｃポリペプチド；及び任意選択でＩＤＵＡ酵素を含み、ここでこの第１及び／または第２のＦｃポリペプチドは、血液脳関門（ＢＢＢ）受容体、例えば、トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）への結合をもたらす改変を含む。

【0093】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載のタンパク質は、全長ＩＤＵＡ野生型配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のタンパク質は、成熟ＩＤＵＡ野性型配列を含む。本明細書に記載されているように、野生型ＩＤＵＡタンパク質配列にはいくつかの多型が報告されている。例えば、ＩＤＵＡ酵素は、ＥＵ付番に従い、位置３３にＨもしくはＱを含み、及び／または位置６２２にＡもしくはＴを含んでもよい。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のタンパク質は、触媒活性断片または野生型ＩＤＵＡ配列のバリアントを含む。例えば、ＩＤＵＡ酵素は、ＥＵ付番に従い位置２７にＥを含んでもよいし、または、アミノ酸が存在しなくてもよい。他のＩＤＵＡ酵素短縮についても本明細書で説明する。したがって、いくつかの実施形態では、ＩＤＵＡアミノ酸配列は、配列番号３９～４９、７８～８２及び９９のいずれか１つのアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、あるいは配列番号３９～４９、７８～８２及び９９のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＩＤＵＡアミノ酸配列は、配列番号３９、４０、４５、７８、及び９９のいずれか１つのアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、あるいは配列番号３９、４０、４５、７８、及び９９のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、このような配列内でＸ_１はＨである。特定の実施形態では、このような配列内でＸ_１はＱである。特定の実施形態では、このような配列内でＸ_２はＡである。特定の実施形態では、このような配列内でＸ_２はＴである。特定の実施形態では、このような配列内でＸ_３はＥである。特定の実施形態では、このような配列内でＸ_３は存在しない。いくつかの実施形態では、ＩＤＵＡアミノ酸配列は、配列番号４１～４４のいずれか１つのアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、あるいは配列番号４１～４４のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＩＤＵＡアミノ酸配列は、配列番号４６～４９のいずれか１つのアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、あるいは配列番号４６～４９のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＩＤＵＡアミノ酸配列は、配列番号７９～８２のいずれか１つのアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、あるいは配列番号７９～８２のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。

【0094】

上で考察するとおり、いくつかの実施形態では、ＩＤＵＡ酵素は、ＩＤＵＡタンパク質のバリアントまたは触媒活性断片である（例えば、本明細書に記載されたＩＤＵＡアミノ酸配列を含む）。いくつかの実施形態では、ＩＤＵＡ酵素の触媒活性バリアントまたは断片は、野生型ＩＤＵＡ酵素の活性の少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、またはそれ以上を有する。

【0095】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載のタンパク質に存在するＩＤＵＡ酵素、またはその触媒活性バリアントもしくは断片は、ＦｃポリペプチドまたはＴｆＲ結合Ｆｃポリペプチドに接合されていない場合のその活性と比較して、その活性の少なくとも２５％を保持する。いくつかの実施形態では、ＩＤＵＡ酵素、またはその触媒活性バリアントもしくは断片は、ＦｃポリペプチドまたはＴｆＲ結合Ｆｃポリペプチドに接合されていない場合のその活性と比較して、その活性の少なくとも１０％、または少なくとも１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％もしくは９５％を保持する。いくつかの実施形態では、ＩＤＵＡ酵素、またはその触媒活性バリアントもしくは断片は、ＦｃポリペプチドまたはＴｆＲ結合Ｆｃポリペプチドに接合されていない場合のその活性と比較して、その活性の少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％を保持する。いくつかの実施形態では、Ｆｃポリペプチドへの融合は、ＩＤＵＡ酵素、またはその触媒活性バリアントもしくは断片の活性を低下させない。いくつかの実施形態では、ＴｆＲ結合Ｆｃポリペプチドへの融合は、ＩＤＵＡ酵素の活性を低下させない。

【0096】

Ｆｃポリペプチド改変
本明細書に記載の融合タンパク質に組み込まれたＦｃポリペプチドは、ある特定の改変を含み得る。例えば、Ｆｃポリペプチドは、血液脳関門（ＢＢＢ）受容体、例えば、トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）への結合をもたらす改変を含み得る。さらに、Ｆｃポリペプチドは、ヘテロ二量体化を促進する改変、血清安定性または血清半減期を増大させる改変、エフェクター機能を調節する改変、グリコシル化に影響を与える改変、及び／またはヒトにおける免疫原性を低下させる改変など、他の改変を含んでもよい。したがって、特定の実施形態では、本明細書に記載の融合タンパク質は、２つのＦｃポリペプチドを含み、一方のＦｃは野生型Ｆｃポリペプチド、例えば、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃポリペプチドであり；他方のＦｃは、血液脳関門（ＢＢＢ）受容体、例えば、トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）に結合するように改変されており、任意選択で、１つ以上の追加の改変をさらに含む。特定の他の実施形態では、両方のＦｃポリペプチドはそれぞれ、独立して選択された改変（例えば、本明細書に記載の改変）を含む。例えば、特定の実施形態では、本明細書に記載の融合タンパク質は、２つのＦｃポリペプチドを含み、ここで一方のＦｃは、ＢＢＢ受容体に結合するように改変されていないが、本明細書に記載される１つ以上の他の改変を含み；もう一方のＦｃは、血液脳関門（ＢＢＢ）受容体、例えば、トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）に結合するように改変されており、任意選択で、１つ以上の追加の改変をさらに含む。特定の他の実施形態では、本明細書に記載の融合タンパク質は、２つのＦｃポリペプチドを含み、両方のＦｃポリペプチドとも、血液脳関門（ＢＢＢ）受容体、例えば、トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）に結合するように改変されており、任意選択で、１つ以上の追加の改変をさらに含む。

【0097】

種々のＦｃ改変において指定されるアミノ酸残基は、ＢＢＢ受容体、例えば、ＴｆＲに結合する改変Ｆｃポリペプチド中に導入されるものを含め、本明細書において、ＥＵインデックス付番を使用して付番される。任意のＦｃポリペプチド、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４のＦｃポリペプチドは、本明細書に記載の１つ以上の位置に、改変、例えば、アミノ酸置換を有し得る。

【0098】

本明細書に記載の融合タンパク質に存在する改変（例えば、ヘテロ二量体化及び／またはＢＢＢ受容体結合を増強させる）Ｆｃポリペプチドは、ネイティブＦｃ領域配列またはその断片、例えば、少なくとも５０アミノ酸長もしくは少なくとも１００アミノ酸長、もしくはそれ以上の断片に対して、少なくとも７０％の同一性、少なくとも７５％の同一性、少なくとも８０％の同一性、少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、または少なくとも９９％の同一性を有し得る。いくつかの実施形態では、ネイティブＦｃのアミノ酸配列は、配列番号１のＦｃ領域配列である。いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸１～１１０もしくは配列番号１のアミノ酸１１１～２１７、またはそれらの断片、例えば、少なくとも５０アミノ酸長もしくは少なくとも１００アミノ酸長もしくはそれ以上の断片に対して、少なくとも７０％の同一性、少なくとも７５％の同一性、少なくとも８０％の同一性、少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、または少なくとも９９％の同一性を有する。

【0099】

いくつかの実施形態では、改変（例えば、ヘテロ二量体化及び／またはＢＢＢ受容体結合を増強させる）Ｆｃポリペプチドは、ネイティブＦｃ領域のアミノ酸配列に対応する、少なくとも５０個のアミノ酸、または少なくとも６０個、６５個、７０個、７５個、８０個、８５個、９０個もしくは９５個以上、または少なくとも１００個以上のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチドは、配列番号１のようなネイティブＦｃ領域のアミノ酸配列に対応する、少なくとも２５個の連続するアミノ酸、または少なくとも３０個、３５個、４０個もしくは４５個の連続するアミノ酸、または５０個の連続するアミノ酸、または少なくとも６０個、６５個、７０個、７５個、８０個、８５個、９０個もしくは９５個以上の連続するアミノ酸、または１００個のもしくはそれ以上の連続するアミノ酸を含む。

【0100】

血液脳関門（ＢＢＢ）受容体結合のための改変
いくつかの態様では、本明細書で提供されるのは、血液脳関門（ＢＢＢ）を通過させて輸送し得る融合タンパク質である。このようなタンパク質は、ＢＢＢ受容体に結合する、改変Ｆｃポリペプチドを含む。ＢＢＢ受容体は、ＢＢＢ内皮、ならびに他の細胞型及び組織型で発現する。いくつかの実施形態では、ＢＢＢ受容体は、トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）である。

【0101】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の融合タンパク質は、ＴｆＲに特異的に結合する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の融合タンパク質は、約５０ｎＭ～約５００ｎＭの親和性でＴｆＲに特異的に結合する。いくつかの実施形態では、タンパク質は、約５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０または５００ｎＭの親和性でＴｆＲに結合する（例えば、特異的に結合する）。いくつかの実施形態では、タンパク質は、約１００～約５００ｎＭの親和性でＴｆＲに結合する。いくつかの実施形態では、タンパク質は、約１００ｎＭ～約３００ｎＭ、または約２００ｎＭ～約４５０ｎＭの親和性でＴｆＲに結合する。いくつかの実施形態では、タンパク質は、約２５０ｎＭの親和性でＴｆＲに結合する。特定の実施形態では、タンパク質は、約１５０～約４００ｎＭ、または約２００～約４００ｎＭ、または約２５０ｎＭ～約３５０ｎＭ、または約３００～約３５０ｎＭの親和性でＴｆＲに結合する。

【0102】

いくつかの実施形態では、ＴｆＲに特異的に結合する改変Ｆｃポリペプチドは、ＣＨ３ドメインに置換を含む。いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチドは、ＴｆＲ結合活性のために改変されるＩｇＧ ＣＨ３ドメインなどのヒトＩｇ ＣＨ３ドメインを含む。ＣＨ３ドメインは、任意のＩｇＧサブタイプ、すなわちＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４からのものであり得る。ＩｇＧ抗体の文脈では、ＣＨ３ドメインとは、ＥＵ付番スキームに従って付番されたほぼ位置３４１～ほぼ位置４４７のアミノ酸のセグメントを指す。

【0103】

いくつかの実施形態では、ＴｆＲに特異的に結合する改変Ｆｃポリペプチドは、ＴｆＲのアピカルドメインに結合し、かつトランスフェリンのＴｆＲへの結合を遮断することもその他で阻害することもなく、ＴｆＲに結合し得る。いくつかの実施形態では、トランスフェリンのＴｆＲへの結合は、実質的に阻害されない。いくつかの実施形態では、トランスフェリンのＴｆＲへの結合は、約５０％未満（例えば、約４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、または５％未満）阻害される。いくつかの実施形態では、トランスフェリンのＴｆＲへの結合は、約２０％未満（例えば、約１５％未満、１０％未満、９％未満、８％未満、７％未満、６％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満または１％未満）阻害される。

【0104】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の融合タンパク質に存在する改変（例えば、ＢＢＢ受容体結合）Ｆｃポリペプチドは、ＥＵ付番スキームに従う、アミノ酸位置３８４、３８６、３８７、３８８、３８９、４１３、４１５、４１６及び４２１に置換を含む。

【0105】

いくつかの実施形態では、ＴｆＲに特異的に結合する改変Ｆｃポリペプチドは、ＥＵ付番に従う、位置３８９にＡｌａを含む。いくつかの実施形態では、ＴｆＲに特異的に結合する改変Ｆｃポリペプチドは、ＥＵ付番に従う、以下の位置に、すなわち、位置３８０にＧｌｕ；位置３８９にＡｌａ；及び位置３９０にＡｓｎを含む。いくつかの実施形態では、ＴｆＲに特異的に結合する改変Ｆｃポリペプチドは、ＥＵ付番に従う、以下の位置に、すなわち位置３８０にＧｌｕ；位置３８４にＴｙｒ；位置３８６にＴｈｒ；位置３８７にＧｌｕ；位置３８８にＴｒｐ；位置３８９にＡｌａ；位置３９０にＡｓｎ；位置４１３にＴｈｒ；位置４１５にＧｌｕ；位置４１６にＧｌｕ；及び位置４２１にＰｈｅを含む。

【0106】

追加の実施形態では、改変Ｆｃポリペプチドは、ＥＵ付番スキームに従う４１４、４２４及び４２６を含む位置に１つ、２つまたは３つの置換をさらに含む。いくつかの実施形態では、位置４１４はＬｙｓ、Ａｒｇ、ＧｌｙもしくはＰｒｏであり、位置４２４はＳｅｒ、Ｔｈｒ、ＧｌｕもしくはＬｙｓであり、及び／または位置４２６はＳｅｒ、ＴｒｐもしくはＧｌｙである。

【0107】

いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチドは、配列番号２３のアミノ酸１１１～２１７に対する少なくとも７０％の同一性、少なくとも７５％の同一性、少なくとも８０％の同一性、少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、または少なくとも９９％の同一性を有し；配列番号２３のＥＵインデックス位置３８０、３８４～３９０及び／または４１３～４２１のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチドは、配列番号２４のアミノ酸１１１～２１６に対する少なくとも７０％の同一性、少なくとも７５％の同一性、少なくとも８０％の同一性、少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、または少なくとも９９％の同一性を有し；配列番号２３または２４のＥＵインデックス位置３８０、３８４～３９０及び／または４１３～４２１のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチドは、配列番号２３または２４に対する少なくとも７０％の同一性、少なくとも７５％の同一性、少なくとも８０％の同一性、少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、または少なくとも９９％の同一性を有し；配列番号２３または２４のＥＵインデックス位置３８０、３８４～３９０及び／または４１３～４２１のアミノ酸を含む。

【0108】

いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチドは、配列番号２３または２４に対する少なくとも７５％の同一性、少なくとも８０％の同一性、少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、または少なくとも９９％の同一性を有し、かつＥＵ付番に従う、位置３８９にＡｌａを有する。いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチドは、配列番号２３または２４に対する少なくとも７５％の同一性、少なくとも８０％の同一性、少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、または少なくとも９９％の同一性を有し、かつＥＵ付番に従う、以下の位置に、すなわち、位置３８０にＧｌｕ；位置３８９にＡｌａ；及び位置３９０にＡｓｎを含む。いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチドは、配列番号２３または２４に対する少なくとも７５％の同一性、少なくとも８０％の同一性、少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、または少なくとも９９％の同一性を有し、かつＥＵ付番に従い、以下の位置に、すなわち位置３８０にＧｌｕ；位置３８４にＴｙｒ；位置３８６にＴｈｒ；位置３８７にＧｌｕ；位置３８８にＴｒｐ；位置３８９にＡｌａ；位置３９０にＡｓｎ；位置４１３にＴｈｒ；位置４１５にＧｌｕ；位置４１６にＧｌｕ；及び位置４２１にＰｈｅを含む。

【0109】

いくつかの実施形態では、改変されたＦｃポリペプチドは、配列番号２３または２４のアミノ酸配列を含む。

【0110】

追加のＦｃポリペプチド変異
いくつかの態様では、本明細書に記載の融合タンパク質は、２つのＦｃポリペプチドを含み、一方または両方のＦｃポリペプチドはそれぞれ、独立して選択された改変（例えば、本明細書に記載の改変）を含む。一方または両方のＦｃポリペプチドに導入され得る他の変異の非限定的な例としては、例えば、Ｆｃポリペプチドの血清安定性もしくは血清半減期を増加させる変異、Ｆｃポリペプチドのエフェクター機能を調節する変異、Ｆｃポリペプチドのグリコシル化に影響を与える変異、Ｆｃポリペプチドのヒトにおける免疫原性を低下させる変異、ならびに／またはＦｃポリペプチドのノブ及びホールによるヘテロ二量体化をもたらす変異が挙げられる。Ｆｃポリペプチドに含まれ得るさまざまな修飾の例は、ＷＯ２０１９／０７０５７７に記載されており、その全体があらゆる目的で本明細書に参照により組み込まれている。
いくつかの実施形態では、融合タンパク質に存在するＦｃポリペプチドはそれぞれ独立して、対応する野生型Ｆｃポリペプチド（例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４のＦｃポリペプチド）に対する少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のアミノ酸配列同一性を有する。

【0111】

いくつかの実施形態では、融合タンパク質に存在するＦｃポリペプチドは、ヘテロ二量体形成を促進し、ホモ二量体形成を妨げるノブ変異及びホール変異を有する。一般に、改変は、突起が空洞内に配置されてヘテロ二量体形成を促進し、それによってホモ二量体形成を妨げることができるように、一方のポリペプチドの界面で突起（「ノブ」）を導入し、別のポリペプチドの界面で対応する空洞（「ホール」）を導入する。突起は、第一のポリペプチドの界面の小さいアミノ酸側鎖をより大きな側鎖（例えば、チロシンまたはトリプトファン）で置き換えることによって構築される。突起と同一または類似のサイズの埋め合わせとなる空洞は、第二のポリペプチドの界面で、大きなアミノ酸側鎖をより小さいもの（例えば、アラニンまたはトレオニン）と置き換えることによって作成される。いくつかの実施形態では、このような追加の変異は、ＢＢＢ受容体、例えば、ＴｆＲへのポリペプチドの結合に悪影響を与えないＦｃポリペプチドの位置にある。

【0112】

二量体化のためのノブ及びホールアプローチの一つの例示的な実施形態では、融合タンパク質に存在するＦｃポリペプチドのうちの一方の位置３６６（ＥＵ付番スキームに従って付番された）は、ネイティブトレオニンの代わりにトリプトファンを含む。二量体の他方のＦｃポリペプチドは、位置４０７（ＥＵ付番スキームに従って付番された）にネイティブチロシンの代わりにバリンを有する。他方のＦｃポリペプチドはさらに置換を含んでもよく、この場合、位置３６６（ＥＵ付番スキームに従って付番された）のネイティブトレオニンがセリンで置換され、位置３６８（ＥＵ付番スキームに従って付番された）のネイティブロイシンがアラニンで置換される。したがって、本明細書に記載の融合タンパク質のＦｃポリペプチドのうちの一方は、Ｔ３６６Ｗノブ変異を有し、他方のＦｃポリペプチドはＹ４０７Ｖ変異を有しており、これは通常、Ｔ３６６Ｓ及びＬ３６８Ａホール変異を伴う。特定の実施形態では、第１のＦｃポリペプチドは、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖ置換を含有し、第２のＦｃポリペプチドは、Ｔ３６６Ｗ置換を含む。特定の他の実施形態では、第１のＦｃポリペプチドは、Ｔ３６６Ｗ置換を含有し、第２のＦｃポリペプチドは、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖ置換を含む。

【0113】

いくつかの実施形態では、血清半減期を増強するための改変を、導入してもよい。例えば、いくつかの実施形態では、本明細書に記載の融合タンパク質に存在する一方または両方のＦｃポリペプチドは、ＥＵ付番スキームに従って付番した、位置２５２にチロシン、位置２５４にトレオニン及び位置２５６にグルタミン酸を含んでもよい。したがって、一方または両方のＦｃポリペプチドは、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、及びＴ２５６Ｅ置換を有し得る。代替的に、一方または両方のＦｃポリペプチドは、ＥＵ付番スキームに従って付番した、Ｍ４２８Ｌ及びＮ４３４Ｓ置換を有し得る。代替的に、一方または両方のＦｃポリペプチドは、Ｎ４３４ＳまたはＮ４３４Ａ置換を有し得る。

【0114】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の融合タンパク質に存在する一方または両方のＦｃポリペプチドは、エフェクター機能を低下させる改変、すなわち、エフェクター機能を媒介するエフェクター細胞上に発現したＦｃ受容体に結合した際に、特定の生物学的機能を誘導する能力が低下している改変を含み得る。抗体のエフェクター機能の例としては、限定するものではないが、Ｃ１ｑ結合及び補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、Ｆｃ受容体結合、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞媒介性食作用（ＡＤＣＰ）、細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体）の下方制御、及びＢ細胞活性化が挙げられる。エフェクター機能は、抗体のクラスによって異なる場合がある。例えば、ネイティブヒトＩｇＧ１及びＩｇＧ３抗体は、免疫系細胞に存在する適切なＦｃ受容体に結合するとＡＤＣＣ及びＣＤＣ活性を誘発し得；ネイティブヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４は、免疫細胞に存在する適切なＦｃ受容体に結合すると、ＡＤＣＰ機能を誘発し得る。

【0115】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の融合タンパク質に存在する一方または両方のＦｃポリペプチドを、ヘテロ二量体化のための他の改変、例えば、天然に荷電したＣＨ３－ＣＨ３界面内の接触残基の静電的な操作または疎水性パッチ改変を含むように操作してもよい。

【0116】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の融合タンパク質に存在する一方または両方のＦｃポリペプチドは、エフェクター機能を調節する追加の改変を含んでもよい。

【0117】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の融合タンパク質に存在する一方または両方のＦｃポリペプチドは、エフェクター機能を低下させるか、または除去する改変を含んでもよい。エフェクター機能を低下させる例示的なＦｃポリペプチド変異としては、ＣＨ２ドメインにおける、例えば、ＥＵ付番スキームに従う位置２３４及び位置２３５での置換が挙げられるがこれらに限定されない。例えば、いくつかの実施形態では、一方または両方のＦｃポリペプチドは、位置２３４及び位置２３５にアラニン残基を含んでもよい。したがって、一方または両方のＦｃポリペプチドは、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ（ＬＡＬＡ）置換を有してもよい。
エフェクター機能を調節する追加のＦｃポリペプチド変異としては、以下のもの、すなわち、位置３２９に、プロリンが、グリシン、セリンもしくはアルギニンで、またはＦｃのプロリン３２９とＦｃγＲＩＩＩのトリプトファン残基Ｔｒｐ８７及びＴｒｐ１１０との間に形成されたＦｃ／Ｆｃγ受容体界面を破壊するのに十分な大きさのアミノ酸残基で置換されている変異を有し得ることが挙げられるが、これらに限定されない。さらなる例示的な置換としては、ＥＵ付番スキームに従うＳ２２８Ｐ、Ｅ２３３Ｐ、Ｌ２３５Ｅ、Ｎ２９７Ａ、Ｎ２９７Ｄ、及びＰ３３１Ｓが挙げられる。複数の置換もまた存在する場合がある、例えば、ＥＵ付番スキームに従う、ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域のＬ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ；ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域のＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＰ３２９Ｇ；ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域のＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＰ３２９Ｓ；ヒトＩｇＧ４のＦｃ領域のＳ２２８Ｐ及びＬ２３５Ｅ；ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域のＬ２３４Ａ及びＧ２３７Ａ；ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域のＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＧ２３７Ａ；ヒトＩｇＧ２のＦｃ領域のＶ２３４Ａ及びＧ２３７Ａ；ヒトＩｇＧ４のＦｃ領域のＬ２３５Ａ、Ｇ２３７Ａ、及びＥ３１８Ａ；ならびにヒトＩｇＧ４のＦｃ領域のＳ２２８Ｐ及びＬ２３６Ｅ。いくつかの実施形態では、一方または両方のＦｃポリペプチドは、ＡＤＣＣを調節する１つ以上のアミノ酸置換、例えば、ＥＵ付番スキームに従う位置２９８、３３３、及び／または３３４での置換を有し得る。

【0118】

いくつかの実施形態では、Ｃ末端Ｌｙｓ残基は、本明細書に記載のＦｃポリペプチドにおいて除去される（すなわち、ＥＵ付番スキームに従う、位置４４７のＬｙｓ残基）。

【0119】

追加の変異を含む例示的なＦｃポリペプチド
本明細書に記載の非限定的な例として、本明細書に記載の融合タンパク質に存在する一方または両方のＦｃポリペプチドは、ノブ変異（例えば、ＥＵ付番スキームに従って付番したＴ３６６Ｗ）、ホール変異（例えば、ＥＵ付番スキームに従って付番したＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖ）、エフェクター機能を調節する変異（例えば、ＥＵ付番スキームに従って付番したＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及び／またはＰ３２９ＧまたはＰ３２９Ｓ（例えば、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ；Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＰ３２９Ｇ；またはＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＰ３２９Ｓ））、及び／または血清安定性もしくは血清半減期を増加させる変異（例えば、（ｉ）ＥＵ付番を参照して付番されたＭ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、及びＴ２５６Ｅ、または（ｉｉ）ＥＵ付番スキームに従って付番されたＭ４２８Ｌを伴うかまたは伴わないＮ４３４Ｓ）、を含む追加の変異を含んでもよい。例として、配列番号９～２２、２５～３８、７４～７７、及び９７～９８は、これらの追加の変異の１つ以上を含む改変Ｆｃポリペプチドの非限定的な例を提供する。

【0120】

いくつかの実施形態では、Ｆｃポリペプチドまたは改変Ｆｃポリペプチドは、ノブ変異（例えば、ＥＵ付番スキームに従って付番したＴ３６６Ｗ）、ならびに配列番号１、２、２３及び２４のいずれか１つの配列に対する少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、または少なくとも９９％の同一性を有し得る。いくつかの実施形態では、配列番号１、２、２３、及び２４のいずれか１つの配列を有するＦｃポリペプチドまたは改変Ｆｖポリペプチドは、ノブ変異を有するように改変してもよい。

【0121】

いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチドは、ノブ変異（例えば、ＥＵ付番を参照して付番したＴ３６６Ｗ）を含み、かつ配列番号１７及び１８のいずれか１つの配列に対する少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、または少なくとも９９％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチドは、配列番号１７及び１８のいずれか１つの配列を含む。

【0122】

いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチドは、ノブ変異（例えば、ＥＵ付番を参照して付番したＴ３６６Ｗ）を含み、かつ配列番号２５及び２６のいずれか１つの配列に対する少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、または少なくとも９９％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチドは、ノブ変異（例えば、ＥＵ付番を参照して付番したＴ３６６Ｗ）を含み、配列番号２５及び２６のいずれか１つの配列に対する少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、または少なくとも９９％の同一性を有し、かつＥＵ付番に従う、位置３８９にＡｌａを含む。いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチドは、ノブ変異（例えば、ＥＵ付番を参照して付番したＴ３６６Ｗ）を含み、配列番号２５または２６に対する少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、または少なくとも９９％の同一性を有し、かつＥＵ付番に従う、以下の位置に、すなわち、位置３８０にＧｌｕ；位置３８９にＡｌａ；及び位置３９０にＡｓｎを含む。いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチドは、ノブ変異（例えば、ＥＵ付番を参照して付番したＴ３６６Ｗ）を含み、配列番号２５または２６に対する少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、または少なくとも９９％の同一性を有し、かつＥＵ付番に従う、以下の位置に、すなわち位置３８０にＧｌｕ；位置３８４にＴｙｒ；位置３８６にＴｈｒ；位置３８７にＧｌｕ；位置３８８にＴｒｐ；位置３８９にＡｌａ；位置３９０にＡｓｎ；位置４１３にＴｈｒ；位置４１５にＧｌｕ；位置４１６にＧｌｕ；及び位置４２１にＰｈｅを含む。いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチドは、配列番号２５及び２６のいずれか１つの配列を含む。

【0123】

いくつかの実施形態では、Ｆｃポリペプチドまたは改変Ｆｃポリペプチドは、ノブ変異（例えば、ＥＵ付番スキームに従って付番したＴ３６６Ｗ）、エフェクター機能を調節する変異（例えば、ＥＵ付番スキームに従って付番したＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及び／またはＰ３２９ＧまたはＰ３２９Ｓ（例えば、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ；Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＰ３２９Ｇ；またはＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＰ３２９Ｓ））、ならびに配列番号１、２、２３、及び２４のいずれか１つの配列に対する少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、または少なくとも９９％の同一性を有し得る。いくつかの実施形態では、配列番号１、２、２３、及び２４のうちのいずれか１つの配列を有するＦｃポリペプチドまたは改変されたＦｃポリペプチドは、ノブ変異、及びエフェクター機能を調節する変異を有するように改変してもよい。

【0124】

いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチドは、ノブ変異（例えば、ＥＵ付番を参照して付番したＴ３６６Ｗ）、ならびにエフェクター機能を調節する変異（例えば、ＥＵ付番を参照して付番したＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及び／またはＰ３２９ＧまたはＰ３２９Ｓ（例えば、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ；Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＰ３２９Ｇ；またはＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＰ３２９Ｓ））を含み、かつ配列番号７４～７５及び７６～７７のいずれか１つの配列に対する少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、または少なくとも９９％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチドは、配列番号７４～７５及び７６～７７のいずれか１つの配列を含む。

【0125】

いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチドは、ノブ変異（例えば、ＥＵ付番を参照して付番したＴ３６６Ｗ）、ならびにエフェクター機能を調節する変異（例えば、ＥＵ付番を参照して付番したＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及び／またはＰ３２９ＧまたはＰ３２９Ｓ（例えば、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ；Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＰ３２９Ｇ；またはＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＰ３２９Ｓ））を含み、配列番号２７～３２及び３５～３８のいずれか１つの配列に対する少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、または少なくとも９９％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチドは、ノブ変異（例えば、ＥＵ付番を参照して付番したＴ３６６Ｗ）、ならびにエフェクター機能を調節する変異（例えば、ＥＵ付番を参照して付番したＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及び／またはＰ３２９ＧまたはＰ３２９Ｓ（例えば、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ；Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＰ３２９Ｇ；またはＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＰ３２９Ｓ））を含み、配列番号２７～３２及び３５～３８のいずれか１つの配列に対する少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、または少なくとも９９％の同一性を有し、かつＥＵ付番に従う、位置３８９にＡｌａを含む。いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチドは、ノブ変異（例えば、ＥＵ付番を参照して付番したＴ３６６Ｗ）、ならびにエフェクター機能を調節する変異（例えば、ＥＵ付番を参照して付番したＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及び／またはＰ３２９ＧまたはＰ３２９Ｓ（例えば、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ；Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＰ３２９Ｇ；またはＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＰ３２９Ｓ））を含み、配列番号２７～３２及び３５～３８のいずれか１つの配列に対する少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、または少なくとも９９％の同一性を有し、かつＥＵ付番に従い、以下の位置に、すなわち位置３８０にＧｌｕ；位置３８９にＡｌａ；及び位置３９０にＡｓｎを含む。いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチドは、ノブ変異（例えば、ＥＵ付番を参照して付番したＴ３６６Ｗ）、ならびにエフェクター機能を調節する変異（例えば、ＥＵ付番を参照して付番したＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及び／またはＰ３２９ＧまたはＰ３２９Ｓ（例えば、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ；Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＰ３２９Ｇ；またはＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＰ３２９Ｓ））を含み、配列番号２７～３２及び３５～３８のいずれか１つの配列に対する少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、または少なくとも９９％の同一性を有し、かつＥＵ付番に従う、以下の位置に、すなわち位置３８０にＧｌｕ；位置３８４にＴｙｒ；位置３８６にＴｈｒ；位置３８７にＧｌｕ；位置３８８にＴｒｐ；位置３８９にＡｌａ；位置３９０にＡｓｎ；位置４１３にＴｈｒ；位置４１５にＧｌｕ；位置４１６にＧｌｕ；及び位置４２１にＰｈｅを含む。いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチドは、配列番号２７～３２及び３５～３８のいずれか１つの配列を含む。

【0126】

いくつかの実施形態では、Ｆｃポリペプチドまたは改変Ｆｃポリペプチドは、ホール変異（例えば、ＥＵ付番スキームに従って付番したＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖ）、ならびに配列番号１、２、２３、及び２４のいずれか１つの配列に対する少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、または少なくとも９９％の同一性を有し得る。いくつかの実施形態では、配列番号１、２、２３、及び２４のいずれか１つの配列を有するＦｃポリペプチドまたは改変Ｆｃポリペプチドは、ホール変異を有するように改変してもよい。

【0127】

いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチドは、ホール変異（例えば、ＥＵ付番を参照して付番したＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖ）を含み、かつ配列番号９及び１０のいずれか１つの配列に対する少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、または少なくとも９９％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチドは、配列番号９及び１０のいずれか１つの配列を含む。

【0128】

いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチドは、ホール変異（例えば、ＥＵ付番を参照して付番したＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖ）を含み、かつ配列番号３３及び３４のいずれか１つの配列に対する少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、または少なくとも９９％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチドは、ホール変異（例えば、ＥＵ付番を参照して付番したＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖ）を含み、配列番号３３及び３４のいずれか１つの配列に対する少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、または少なくとも９９％の同一性を有し、かつＥＵ付番に従う、位置３８９にＡｌａを含む。いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチドは、ホール変異（例えば、ＥＵ付番を参照して付番したＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖ）を含み、配列番号３３及び３４のいずれか１つの配列に対する少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、または少なくとも９９％の同一性を有し、かつＥＵ付番に従う、以下の位置にすなわち、位置３８０にＧｌｕ；位置３８９にＡｌａ；及び位置３９０にＡｓｎを含む。いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチドは、ホール変異（例えば、ＥＵ付番を参照して付番したＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖ）を含み、配列番号３３及び３４のいずれか１つの配列に対する少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、または少なくとも９９％の同一性を有し、かつＥＵ付番に従う、以下の位置に、すなわち位置３８０にＧｌｕ；位置３８４にＴｙｒ；位置３８６にＴｈｒ；位置３８７にＧｌｕ；位置３８８にＴｒｐ；位置３８９にＡｌａ；位置３９０にＡｓｎ；位置４１３にＴｈｒ；位置４１５にＧｌｕ；位置４１６にＧｌｕ；及び位置４２１にＰｈｅを含む。いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチドは、配列番号３３及び３４のいずれか１つの配列を含む。

【0129】

いくつかの実施形態では、Ｆｃポリペプチドまたは改変Ｆｃポリペプチドは、ホール変異（例えば、ＥＵ付番スキームに従って付番したＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖ）、エフェクター機能を調節する変異（例えば、ＥＵ付番スキームに従って付番したＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及び／またはＰ３２９ＧまたはＰ３２９Ｓ（例えば、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ；Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＰ３２９Ｇ；またはＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＰ３２９Ｓ））、ならびに配列番号１、２、２３、及び２４のいずれか１つの配列に対する少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、または少なくとも９９％の同一性を有し得る。いくつかの実施形態では、配列番号１、２、２３、及び２４のうちのいずれか１つの配列を有するＦｃポリペプチドまたは改変Ｆｃポリペプチドは、ホール変異、及びエフェクター機能を調節する変異を有するように改変され得る。

【0130】

いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチドは、ホール変異（例えば、ＥＵ付番を参照して付番したＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖ）、ならびにエフェクター機能を調節する変異（例えば、ＥＵ付番を参照して付番したＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及び／またはＰ３２９ＧまたはＰ３２９Ｓ（例えば、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ；Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＰ３２９Ｇ；またはＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＰ３２９Ｓ））を含み、かつ配列番号１１～１６及び１９～２２のいずれか１つの配列に対する少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、または少なくとも９９％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチドは、配列番号１１～１６及び１９～２２のいずれか１つの配列を含む。

【0131】

いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチドは、ホール変異（例えば、ＥＵ付番を参照して付番したＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖ）、ならびにエフェクター機能を調節する変異（例えば、ＥＵ付番を参照して付番したＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及び／またはＰ３２９ＧまたはＰ３２９Ｓ（例えば、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ；Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＰ３２９Ｇ；またはＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＰ３２９Ｓ））を含み、かつ配列番号９７～９８のいずれか１つの配列に対する少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、または少なくとも９９％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチドは、ホール変異（例えば、ＥＵ付番を参照して付番したＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖ）、ならびにエフェクター機能を調節する変異（例えば、ＥＵ付番を参照して付番したＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及び／またはＰ３２９ＧまたはＰ３２９Ｓ（例えば、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ；Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＰ３２９Ｇ；またはＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＰ３２９Ｓ））を含み、配列番号９７～９８のいずれか１つの配列に対する少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、または少なくとも９９％の同一性を有し、かつＥＵ付番に従う、位置３８９にＡｌａを含む。いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチドは、ホール変異（例えば、ＥＵ付番を参照して付番したＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖ）、ならびにエフェクター機能を調節する変異（例えば、ＥＵ付番を参照して付番したＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及び／またはＰ３２９ＧまたはＰ３２９Ｓ（例えば、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ；Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＰ３２９Ｇ；またはＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＰ３２９Ｓ））を含み、配列番号９７～９８のいずれか１つの配列に対する少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、または少なくとも９９％の同一性を有し、かつＥＵ付番に従う、以下の位置に、すなわち位置３８０にＧｌｕ；位置３８９にＡｌａ；及び位置３９０にＡｓｎを含む。いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチドは、ホール変異（例えば、ＥＵ付番を参照して付番したＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖ）、ならびにエフェクター機能を調節する変異（例えば、ＥＵ付番を参照して付番したＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及び／またはＰ３２９ＧまたはＰ３２９Ｓ（例えば、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ；Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＰ３２９Ｇ；またはＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＰ３２９Ｓ））を含み、配列番号９７～９８のいずれか１つの配列に対する少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、または少なくとも９９％の同一性を有し、かつＥＵ付番に従う、以下の位置に、すなわち位置３８０にＧｌｕ；位置３８４にＴｙｒ；位置３８６にＴｈｒ；位置３８７にＧｌｕ；位置３８８にＴｒｐ；位置３８９にＡｌａ；位置３９０にＡｓｎ；位置４１３にＴｈｒ；位置４１５にＧｌｕ；位置４１６にＧｌｕ；及び位置４２１にＰｈｅを含む。いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチドは、配列番号９７～９８のいずれか１つの配列を含む。

【0132】

ＦｃＲｎ結合部位
特定の態様では、改変（例えば、ＢＢＢ受容体結合）Ｆｃポリペプチド、またはＢＢＢ受容体に特異的に結合しない本明細書に記載の融合タンパク質に存在するＦｃポリペプチドは、ＦｃＲｎ結合部位を含み得る。いくつかの実施形態では、ＦｃＲｎ結合部位は、Ｆｃポリペプチドまたはその断片中に存在する。

【0133】

いくつかの実施形態では、ＦｃＲｎ結合部位は、ネイティブＦｃＲｎ結合部位を含む。いくつかの実施形態では、ＦｃＲｎ結合部位は、ネイティブＦｃＲｎ結合部位のアミノ酸配列に対するアミノ酸変化を含まない。いくつかの実施形態では、ネイティブＦｃＲｎ結合部位は、ＩｇＧ結合部位、例えば、ヒトＩｇＧ結合部位である。いくつかの実施形態では、ＦｃＲｎ結合部位は、ＦｃＲｎ結合を変化させる改変を含む。

【0134】

いくつかの実施形態では、ＦｃＲｎ結合部位は、１つ以上の変異した、例えば置換されたアミノ酸残基を有し、この変異（複数可）は、血清半減期を増加させるか、または血清半減期を実質的に減少させない（すなわち、変異した位置に野生型残基を有する同等物の改変Ｆｃポリペプチドと比較して、同一条件下でアッセイした場合に血清半減期を２５％以下減少させる）。いくつかの実施形態では、ＦｃＲｎ結合部位は、ＥＵ付番スキームに従う位置２５０～２５６、３０７、３８０、４２８及び４３３～４３６で置換された１つ以上のアミノ酸残基を有する。

【0135】

いくつかの実施形態では、ＦｃＲｎ結合部位のまたはその近傍の１つ以上の残基は、改変ポリペプチドの血清半減期を延長させるために、ネイティブヒトＩｇＧ配列に対して変異している。いくつかの実施形態では、変異は、位置２５２、２５４及び２５６のうちの１つ、２つまたは３つに導入されている。いくつかの実施形態では、変異はＭ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ及びＴ２５６Ｅである。いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチドは、変異Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ及びＴ２５６Ｅをさらに含む。いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチドは、ＥＵ付番スキームに従う、位置Ｔ３０７、Ｅ３８０及びＮ４３４のうちの１つ、２つまたは３つすべてに置換を含む。いくつかの実施形態では、変異はＴ３０７Ｑ及びＮ４３４Ａである。いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチドは、変異Ｔ３０７Ａ、Ｅ３８０Ａ及びＮ４３４Ａを含む。いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチドは、ＥＵ付番スキームに従う、位置Ｔ２５０及びＭ４２８に置換を含む。いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチドは、変異Ｔ２５０Ｑ及び／またはＭ４２８Ｌを含む。いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチドは、ＥＵ付番スキームに従う、位置Ｍ４２８及びＮ４３４に置換を含む。いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチドは、変異Ｍ４２８Ｌ及びＮ４３４Ｓを含む。いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチドは、Ｎ４３４ＳまたはＮ４３４Ａ変異を含む。

【0136】

Ｆｃポリペプチドに連結されたＩＤＵＡ酵素
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の融合タンパク質は、本明細書に記載されている２つのＦｃポリペプチドを含み、Ｆｃポリペプチドの一方または両方は、部分的または完全なヒンジ領域をさらに含み得る。ヒンジ領域は、任意の免疫グロブリンサブクラスまたはアイソタイプ由来のものであり得る。例示的な免疫グロブリンヒンジは、ＩｇＧ１ヒンジ領域などのＩｇＧヒンジ領域、例えば、ヒトＩｇＧ１ヒンジのアミノ酸配列ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ（配列番号５）またはその一部（例えば、ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ、配列番号６）である。いくつかの実施形態では、ヒンジ領域は、ＦｃポリペプチドのＮ末端領域に存在する。

【0137】

特定の実施形態では、第１のＦｃポリペプチドのＮ末端は、ＩＤＵＡアミノ酸配列、ＩＤＵＡバリアントアミノ酸配列、またはその触媒活性断片に連結される。特定の実施形態では、第１のＦｃポリペプチドのＣ末端は、ＩＤＵＡアミノ酸配列、ＩＤＵＡバリアントアミノ酸配列、またはその触媒活性断片に連結される。

【0138】

特定の実施形態では、本明細書に記載の融合タンパク質は、単一のＩＤＵＡアミノ酸配列、ＩＤＵＡバリアントアミノ酸配列、またはその触媒活性断片を含む。

【0139】

特定の他の実施形態では、本明細書に記載の融合タンパク質は、第２のＩＤＵＡアミノ酸配列、ＩＤＵＡバリアントアミノ酸配列、またはその触媒活性断片を含む。例えば、特定の実施形態では、第２のＦｃポリペプチドは、ＩＤＵＡアミノ酸配列、ＩＤＵＡバリアントアミノ酸配列、またはその触媒活性断片に連結される。特定の実施形態では、第２のＦｃポリペプチドのＮ末端は、第２のＩＤＵＡアミノ酸配列、ＩＤＵＡバリアントアミノ酸配列、またはその触媒活性断片に連結される。特定の実施形態では、第２のＦｃポリペプチドのＣ末端は、第２のＩＤＵＡアミノ酸配列、ＩＤＵＡバリアントアミノ酸配列、またはその触媒活性断片に連結される。

【0140】

特定の実施形態では、第１のＦｃポリペプチドのＮ末端は、第１のＩＤＵＡアミノ酸配列、ＩＤＵＡバリアントアミノ酸配列、またはその触媒活性断片に連結され；第２のＦｃポリペプチドのＮ末端は、第２のＩＤＵＡアミノ酸配列、ＩＤＵＡバリアントアミノ酸配列、またはその触媒活性断片に連結される。

【0141】

特定の実施形態では、第１のＦｃポリペプチドのＣ末端は、第１のＩＤＵＡアミノ酸配列、ＩＤＵＡバリアントアミノ酸配列、またはその触媒活性断片に連結され；第２のＦｃポリペプチドのＣ末端は、第２のＩＤＵＡアミノ酸配列、ＩＤＵＡバリアントアミノ酸配列、またはその触媒活性断片に連結される。

【0142】

特定の実施形態では、第１のＦｃポリペプチドのＮ末端は、第１のＩＤＵＡアミノ酸配列、ＩＤＵＡバリアントアミノ酸配列、またはその触媒活性断片に連結され；第２のＦｃポリペプチドのＣ末端は、第２のＩＤＵＡアミノ酸配列、ＩＤＵＡバリアントアミノ酸配列、またはその触媒活性断片に連結される。

【0143】

特定の実施形態では、第１のＦｃポリペプチドのＣ末端は、第１のＩＤＵＡアミノ酸配列、ＩＤＵＡバリアントアミノ酸配列、またはその触媒活性断片に連結され；第２のＦｃポリペプチドのＮ末端は、第２のＩＤＵＡアミノ酸配列、ＩＤＵＡバリアントアミノ酸配列、またはその触媒活性断片に連結される。

【0144】

いくつかの実施形態では、Ｆｃポリペプチドは、リンカー、例えば、ペプチドリンカーによってＩＤＵＡ酵素に接合されている。いくつかの実施形態では、Ｆｃポリペプチドは、ペプチド結合によって、または、ペプチドリンカーによってＩＤＵＡ酵素に接合されており、例えば、Ｆｃポリペプチドは融合ポリペプチドである。ペプチドリンカーは、接合しているＦｃポリペプチドに対してＩＤＵＡ酵素の回転が可能となるように、及び／またはプロテアーゼによる消化に対して耐性であるように構成されてもよい。ペプチドリンカーは、天然アミノ酸、非天然アミノ酸またはそれらの組み合わせを含んでもよい。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、例えば、Ｇｌｙ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｌａなどのようなアミノ酸を含有する可塑性リンカー（例えば、グリシンリッチリンカー）であってもよい。そのようなリンカーは、公知のパラメータを使用して設計され、任意の長さのものであってもよく、かつ任意の長さの任意の反復単位（例えば、Ｇｌｙ残基及びＳｅｒ残基の反復単位）を任意の数含んでもよい。例えば、リンカーは、２つ、３つ、４つ、５つもしくはそれ以上のＧｌｙ_４－Ｓｅｒ（配列番号７２）反復などの反復、または単一のＧｌｙ_４－Ｓｅｒ（配列番号７２）を有してもよい。他の態様では、リンカーは、Ｇｌｙ－Ｓｅｒ（配列番号７１）であってもよい。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、プロテアーゼ切断部位、例えば、中枢神経系に存在する酵素によって切断可能なプロテアーゼ切断部位を含んでもよい。

【0145】

いくつかの実施形態では、ＩＤＵＡ酵素は、例えば、Ｇｌｙ－Ｓｅｒリンカー（配列番号７１）、Ｇｌｙ_４－Ｓｅｒリンカー（配列番号７２）または（Ｇｌｙ_４－Ｓｅｒ）_２リンカー（配列番号７３）によって、ＦｃポリペプチドのＮ末端に接合されている。いくつかの実施形態では、Ｆｃポリペプチドは、リンカーに接合されているかまたはＩＤＵＡ酵素に直接接合されているヒンジ配列または部分的ヒンジ配列をＮ末端に含み得る。

【0146】

いくつかの実施形態では、ＩＤＵＡ酵素は、例えば、Ｇｌｙ－Ｓｅｒリンカー（配列番号７１）、Ｇｌｙ_４－Ｓｅｒリンカー（配列番号７２）または（Ｇｌｙ_４－Ｓｅｒ）_２リンカー（配列番号７３）によって、ＦｃポリペプチドのＣ末端に接合されている。いくつかの実施形態では、ＦｃポリペプチドのＣ末端は、ＩＤＵＡ酵素に直接接合されている。

【0147】

いくつかの実施形態では、ＩＤＵＡ酵素は、化学的架橋剤によってＦｃポリペプチドに接合されている。そのようなコンジュゲートは、周知の化学的架橋試薬及びプロトコルを使用して生成され得る。例えば、当業者に公知であり、ポリペプチドを目的の作用物質と架橋させるのに有用である、多数の化学的架橋剤がある。例えば、この架橋剤は、段階的に分子を連結させるために使用し得るヘテロ二官能性架橋剤である。ヘテロ二官能性架橋剤によって、タンパク質をコンジュゲートさせるためのより特異的なカップリング方法が設計できるようになり、これにより、ホモタンパク質ポリマーなどの望ましくない副反応の発生を低減させる。多種多様なヘテロ二官能性架橋剤が当技術分野において公知であり、それらとしては、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）またはその水溶性類似体であるＮ－ヒドロキシスルホスクシンイミド（スルホ－ＮＨＳ）、スクシンイミジル４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、ｍ－マレイミドベンゾイル－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）；Ｎ－スクシンイミジル（４－ヨードアセチル）アミノベンゾエート（ＳＩＡＢ）、スクシンイミジル４－（ｐ－マレイミドフェニル）ブチレート（ＳＭＰＢ）、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドヒドロクロリド（ＥＤＣ）；４－スクシンイミジルオキシカルボニル－ａ－メチル－ａ－（２－ピリジルジチオ）－トルエン（ＳＭＰＴ）、Ｎ－スクシンイミジル３－（２－ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、及びスクシンイミジル６－［３－（２－ピリジルジチオ）プロピオネート］ヘキサノエート（ＬＣ－ＳＰＤＰ）が挙げられる。Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド部分を有するこれらの架橋剤を、一般により高い水溶性を有するＮ－ヒドロキシスルホスクシンイミド類似体として得ることができる。さらに、連結鎖内にジスルフィド架橋を有する架橋剤は、インビボでのリンカー切断の量を低減させるために、代わりにアルキル誘導体として合成され得る。ヘテロ二官能性架橋剤に加えて、ホモ二官能性架橋剤及び光反応性架橋剤を含む多数の他の架橋剤が存在する。ジスクシンイミジルスベレート（ｄｉｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ｓｕｂｃｒａｔｅ）（ＤＳＳ）、ビスマレイミドヘキサン（ＢＭＨ）及びジメチルピメルイミデート・ ２ＨＣｌ（ＤＭＰ）は、有用なホモ二官能性架橋剤の例であり、ならびにビス－［Ｂ－（４－アジドサリチルアミド）エチル］ジスルフィド（ＢＡＳＥＤ）及びＮ－スクシンイミジル－６（４’－アジド－２’－ニトロフェニルアミノ）ヘキサノエート（ＳＡＮＰＡＨ）は、有用な光反応性架橋剤の例である。

【0148】

ＩＤＵＡ酵素－Ｆｃ融合ポリペプチドを含む例示的なタンパク質分子
いくつかの態様において、本明細書に記載の融合タンパク質は、ＩＤＵＡ酵素、ＩＤＵＡ酵素バリアント、またはその触媒活性断片に連結された第１のＦｃポリペプチド、及び第２のＦｃポリペプチドを含み、この第１及び／または第２のＦｃポリペプチドは、血液脳関門（ＢＢＢ）受容体、例えば、トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）に結合（例えば、特異的に結合）し得る改変Ｆｃである。特定の実施形態では、この第２のＦｃポリペプチドは、第１のＦｃポリペプチドとＦｃ二量体を形成する。いくつかの実施形態では、この第１のＦｃポリペプチド及び／または第２のＦｃポリペプチドは、免疫グロブリン重鎖及び／もしくは軽鎖可変領域配列またはその抗原結合部分を含まない。いくつかの態様では、融合タンパク質は、第２のＩＤＵＡ酵素、ＩＤＵＡ酵素バリアント、またはその触媒活性断片（例えば、第２のＦｃポリペプチドに結合していてもよい）をさらに含む。

【0149】

いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチドは改変Ｆｃポリペプチドであり、及び／または第２のＦｃポリペプチドは改変Ｆｃポリペプチドである（例えば、本明細書に記載の１つ以上の改変を含む）。例えば、いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチドは、他方のＦｃポリペプチドとのヘテロ二量体化を促進する１つ以上の改変を含む。いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチドは、エフェクター機能を低下させる１つ以上の改変を含む。いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチドは、血清半減期を延長する１つ以上の改変を含む。いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチドは、ＢＢＢ）受容体、例えば、トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）への結合を付与する１つ以上の改変を含む。例えば、特定の実施形態では、ＴｆＲに結合可能なＦｃポリペプチドは、ＥＵ付番に従い、位置３８９にＡｌａを含む。いくつかの実施形態では、ＴｆＲ受容体に結合し得るＦｃポリペプチドは、ＥＵ付番に従う、以下の位置に、すなわち、位置３８０にＧｌｕ；位置３８９にＡｌａ；及び位置３９０にＡｓｎを含む。いくつかの実施形態では、ＴｆＲ受容体に結合し得るＦｃポリペプチドは、ＥＵ付番に従う、以下の位置に、すなわち位置３８０にＧｌｕ；位置３８４にＴｙｒ；位置３８６にＴｈｒ；位置３８７にＧｌｕ；位置３８８にＴｒｐ；位置３８９にＡｌａ；位置３９０にＡｓｎ；位置４１３にＴｈｒ；位置４１５にＧｌｕ；位置４１６にＧｌｕ；及び位置４２１にＰｈｅを含む。いくつかの実施形態では、このようなＦｃポリペプチドは、ＴｆＲに特異的に結合する。

【0150】

いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチドは、改変Ｆｃポリペプチドである。いくつかの実施形態では、第２のＦｃポリペプチドは、改変Ｆｃポリペプチドである。いくつかの実施形態では、第１及び第２のＦｃポリペプチドはそれぞれ改変Ｆｃポリペプチドである。いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチドは改変ポリペプチドであるが、ＴｆＲに特異的に結合しない；そして第２のＦｃポリペプチドは、ＴｆＲに特異的に結合し得る改変ポリペプチドであり、任意選択で、本明細書に記載される１つ以上のさらなる改変をさらに含む。他の実施形態では、第１のＦｃポリペプチドは改変ポリペプチドであり、これは、ＴｆＲに特異的に結合し得、かつ任意選択で、本明細書に記載の１つ以上のさらなる改変をさらに含み；この第２のＦｃポリペプチドは、ＴｆＲに特異的に結合しない改変ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチドは、ＴｆＲに特異的に結合し得る改変ポリペプチドであり、任意選択で、本明細書に記載の１つ以上のさらなる改変をさらに含み；この第２のＦｃポリペプチドは、ＴｆＲに特異的に結合し得る改変ポリペプチドであり、かつ任意選択で、本明細書に記載の１つ以上のさらなる改変をさらに含む。

【0151】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の融合タンパク質は、ＩＤＵＡ酵素、ＩＤＵＡ酵素バリアント、またはその触媒的に活性な断片に連結されたＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖ（ホール）置換を含む第１のＦｃポリペプチドを含む第１のポリペプチド鎖と；Ｔ３６６Ｗ（ノブ）置換を含む第２のＦｃポリペプチドを含む第２のポリペプチド鎖とを含み、ここでこの第１及び／または第２のＦｃポリペプチドは、ＴｆＲに結合し得る、改変ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチド及び／または第２のＦｃポリペプチドは、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ（ＬＡＬＡ）置換をさらに含む。いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチド及び／または第２のＦｃポリペプチドは、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＰ３２９Ｇ（ＬＡＬＡＰＧ）置換をさらに含むか、またはＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＰ３２９Ｓ（ＬＡＬＡＰＳ）置換をさらに含む。いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチド及び／または第２のＦｃポリペプチドは、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、及びＴ２５６Ｅ（ＹＴＥ）置換をさらに含む。いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチド及び／または第２のＦｃポリペプチドは、１）Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ（ＬＡＬＡ）置換；Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＰ３２９Ｇ（ＬＡＬＡＰＧ）置換；またはＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＰ３２９Ｓ（ＬＡＬＡＰＳ）置換；ならびに２）Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、及びＴ２５６Ｅ（ＹＴＥ）置換をさらに含む。いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチド及び／または第２のＦｃポリペプチドは、位置２３４、２３５、２５２、２５４、２５６及び３６６にヒトＩｇＧ１野生型残基を含む。

【0152】

いくつかの実施形態では、第２のＦｃポリペプチドは、ＴｆＲに結合し得る改変ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、ＩＤＵＡ酵素、ＩＤＵＡ酵素バリアント、またはその触媒活性断片に連結された第１のＦｃポリペプチドは、ＴｆＲに結合するように改変されてはいない。いくつかの実施形態では、第２のＦｃポリペプチドは、ノブ変異、ＬＡＬＡ／ＬＡＬＡＰＧ／ＬＡＬＡＰＳ変異、及び／またはＹＴＥ変異を含み、配列番号２５～３２のいずれか１つに対する少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、または少なくとも９９％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、第２のＦｃポリペプチドは、ノブ変異、ＬＡＬＡ／ＬＡＬＡＰＧ／ＬＡＬＡＰＳ変異、及び／またはＹＴＥ変異を含み、配列番号２５～３２のいずれか１つに対する少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、または少なくとも９９％の同一性を有し、かつＥＵ付番に従う、位置３８９にＡｌａを含む。いくつかの実施形態では、第２のＦｃポリペプチドは、配列番号２５～３２のいずれか１つの配列に対する少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、または少なくとも９９％の同一性を有し、かつＥＵ付番に従う、以下の位置に、すなわち、位置３８０にＧｌｕ；位置３８９にＡｌａ；及び位置３９０にＡｓｎを含む。いくつかの実施形態では、第２のＦｃポリペプチドは、配列番号２５～３２のいずれか１つの配列に対する少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、または少なくとも９９％の同一性を有し、かつＥＵ付番に従う、以下の位置に、すなわち位置３８０にＧｌｕ；位置３８４にＴｙｒ；位置３８６にＴｈｒ；位置３８７にＧｌｕ；位置３８８にＴｒｐ；位置３８９にＡｌａ；位置３９０にＡｓｎ；位置４１３にＴｈｒ；位置４１５にＧｌｕ；位置４１６にＧｌｕ；及び位置４２１にＰｈｅを含むか、あるいは配列番号２５～３２のいずれか１つの配列を含む。いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチドは、ホール変異、ＬＡＬＡ／ＬＡＬＡＰＧ／ＬＡＬＡＰＳ変異、及び／またはＹＴＥ変異を含み、かつ配列番号９～１６のいずれか１つに対する少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、または少なくとも９９％の同一性を有するか、あるいは配列番号９～１６のいずれか１つの配列を含む。いくつかの実施形態では、第２のＦｃポリペプチドは、配列番号２５～３２のいずれか１つを含み、第１のＦｃポリペプチドは、配列番号９～１６のいずれか１つを含む。いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチド及び／または第２のＦｃポリペプチドのＮ末端は、ＩｇＧ１ヒンジ領域の一部（例えば、ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ、配列番号６）を含む。いくつかの実施形態では、第２のＦｃポリペプチドは、配列番号３５～３８のいずれか１つに対する少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、または少なくとも９９％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、第２のＦｃポリペプチドは、配列番号３５～３８のいずれか１つに対する少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、または少なくとも９９％の同一性を有し、かつＥＵ付番に従う、位置３８９にＡｌａを含む。いくつかの実施形態では、第２のＦｃポリペプチドは、配列番号３５～３８のいずれか１つの配列に対する少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、または少なくとも９９％の同一性を有し、かつＥＵ付番に従う、以下の位置に、すなわち、位置３８０にＧｌｕ；位置３８９にＡｌａ；及び位置３９０にＡｓｎを含む。いくつかの実施形態では、第２のＦｃポリペプチドは、配列番号３５～３８のいずれか１つの配列に対する少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、または少なくとも９９％の同一性を有し、かつＥＵ付番に従う、以下の位置に、すなわち位置３８０にＧｌｕ；位置３８４にＴｙｒ；位置３８６にＴｈｒ；位置３８７にＧｌｕ；位置３８８にＴｒｐ；位置３８９にＡｌａ；位置３９０にＡｓｎ；位置４１３にＴｈｒ；位置４１５にＧｌｕ；位置４１６にＧｌｕ；及び位置４２１にＰｈｅを含むか、あるいは配列番号３５～３８のいずれか１つの配列を含む。いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチドは、配列番号１９～２２のいずれか１つに対する少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、または少なくとも９９％の同一性を有するか、あるいは配列番号１９～２２のいずれか１つの配列を含む。

【0153】

いくつかの実施形態では、第２のＦｃポリペプチドはＴｆＲに結合するように改変されてはいない。いくつかの実施形態では、ＩＤＵＡ酵素、ＩＤＵＡ酵素バリアント、またはその触媒活性断片に連結された第１のＦｃポリペプチドは、ＴｆＲに結合し得る改変ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、第２のＦｃポリペプチドは、ノブ変異、ＬＡＬＡ／ＬＡＬＡＰＧ／ＬＡＬＡＰＳ変異、及び／またはＹＴＥ変異を含み、かつ配列番号１７～１８及び７４～７５のいずれか１つの配列に対する少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、または少なくとも９９％の同一性を有するか、あるいは配列番号１７～１８及び７４～７５のいずれか１つの配列を含む。いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチドは、ホール変異、ＬＡＬＡ／ＬＡＬＡＰＧ／ＬＡＬＡＰＳ変異、及び／またはＹＴＥ変異を含み、かつ配列番号３３～３４、及び９７～９８のいずれか１つに対する少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、または少なくとも９９％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチドは、ホール変異、ＬＡＬＡ／ＬＡＬＡＰＧ／ＬＡＬＡＰＳ変異、及び／またはＹＴＥ変異を含み、配列番号３３～３４、及び９７～９８のいずれか１つに対する少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、または少なくとも９９％の同一性を有し、かつＥＵ付番に従う、位置３８９にＡｌａを含む。いくつかの実施形態では、第１のポリペプチドは、ホール変異、ＬＡＬＡ／ＬＡＬＡＰＧ／ＬＡＬＡＰＳ変異、及び／またはＹＴＥ変異を含み、配列番号３３～３４、及び９７～９８のいずれか１つの配列に対する少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、または少なくとも９９％の同一性を有し、かつＥＵ付番に従う、以下の位置に、すなわち、位置３８０にＧｌｕ；位置３８９にＡｌａ；及び位置３９０にＡｓｎを含む。いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチドは、ホール変異、ＬＡＬＡ／ＬＡＬＡＰＧ／ＬＡＬＡＰＳ変異、及び／またはＹＴＥ変異を含み、配列番号３３～３４、及び９７～９８のいずれか１つに対する少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、または少なくとも９９％の同一性を有し、かつＥＵ付番に従う、以下の位置に、すなわち位置３８０にＧｌｕ；位置３８４にＴｙｒ；位置３８６にＴｈｒ；位置３８７にＧｌｕ；位置３８８にＴｒｐ；位置３８９にＡｌａ；位置３９０にＡｓｎ；位置４１３にＴｈｒ；位置４１５にＧｌｕ；位置４１６にＧｌｕ；及び位置４２１にＰｈｅを含むか、あるいは配列番号３３～３４、及び９７～９８のいずれか１つの配列を含む。いくつかの実施形態では、第２のＦｃポリペプチドは、配列番号１７～１８及び７４～７５のいずれか１つを含み、この第１のＦｃポリペプチドは、配列番号３３～３４、及び９７～９８のいずれか１つを含む。いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチド及び／または第２のＦｃポリペプチドのＮ末端は、ＩｇＧ１ヒンジ領域の一部（例えば、ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ、配列番号６）を含む。いくつかの実施形態では、第２のＦｃポリペプチドは、配列番号７６～７７のいずれか１つに対する少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、または少なくとも９９％の同一性を有するか、あるいは配列番号７６～７７のいずれか１つの配列を含む。

【0154】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の融合タンパク質は、ＩＤＵＡ酵素、ＩＤＵＡ酵素バリアント、またはその触媒活性断片に連結されたＴ３６６Ｗ（ノブ）置換を含む第１のＦｃポリペプチドを含む第１のポリペプチド鎖と；Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖ（ホール）置換を含む第２のＦｃポリペプチドを含む第２のポリペプチド鎖とを含み、ここでこの第１及び／または第２のＦｃポリペプチドは、ＴｆＲに結合し得る、改変ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチド及び／または第２のＦｃポリペプチドは、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ（ＬＡＬＡ）置換をさらに含む。いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチド及び／または第２のＦｃポリペプチドは、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＰ３２９Ｇ（ＬＡＬＡＰＧ）置換をさらに含むか、またはＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＰ３２９Ｓ（ＬＡＬＡＰＳ）置換をさらに含む。いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチド及び／または第２のＦｃポリペプチドは、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ及びＴ２５６Ｅ（ＹＴＥ）置換をさらに含む。いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチド及び／または第２のＦｃポリペプチドは、１）Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ（ＬＡＬＡ）置換；Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＰ３２９Ｇ（ＬＡＬＡＰＧ）置換；またはＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＰ３２９Ｓ（ＬＡＬＡＰＳ）置換；ならびに２）Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、及びＴ２５６Ｅ（ＹＴＥ）置換をさらに含む。いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチド及び／または第２のＦｃポリペプチドは、位置２３４、２３５、２５２、２５４、２５６及び３６６にヒトＩｇＧ１野生型残基を含む。

【0155】

いくつかの実施形態では、第２のＦｃポリペプチドは、ＴｆＲに結合し得る改変ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、ＩＤＵＡ酵素、ＩＤＵＡ酵素バリアント、またはその触媒活性断片に連結された第１のＦｃポリペプチドは、ＴｆＲに結合するように改変されてはいない。いくつかの実施形態では、第２のＦｃポリペプチドは、ホール変異、ＬＡＬＡ／ＬＡＬＡＰＧ／ＬＡＬＡＰＳ変異、及び／またはＹＴＥ変異を含み、配列番号３３～３４、及び９７～９８のいずれか１つに対する少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、または少なくとも９９％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、第２のＦｃポリペプチドは、ホール変異、ＬＡＬＡ／ＬＡＬＡＰＧ／ＬＡＬＡＰＳ変異、及び／またはＹＴＥ変異を含み、配列番号３３～３４、及び９７～９８のいずれか１つに対する少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、または少なくとも９９％の同一性を有し、かつＥＵ付番に従う、位置３８９にＡｌａを含む。前述の実施形態のいくつかでは、第２のＦｃポリペプチドは、ＥＵ付番に従う、以下の位置に、すなわち、位置３８０にＧｌｕ及び位置３９０にＡｓｎをさらに含む。前述の実施形態のいくつかでは、第２のＦｃポリペプチドは、ＥＵ付番に従う、以下の位置に、すなわち位置３８０にＧｌｕ；位置３８４にＴｙｒ；位置３８６にＴｈｒ；位置３８７にＧｌｕ；位置３８８にＴｒｐ；位置３８９にＡｌａ；位置３９０にＡｓｎ；位置４１３にＴｈｒ；位置４１５にＧｌｕ；位置４１６にＧｌｕ；及び位置４２１にＰｈｅを含む。いくつかの実施形態では、第２のＦｃポリペプチドは、配列番号３３～３４、及び９７～９８のうちのいずれか１つの配列を含む。いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチドは、ノブ変異、ＬＡＬＡ／ＬＡＬＡＰＧ／ＬＡＬＡＰＳ変異、及び／またはＹＴＥ変異を含み、かつ配列番号１７～１８及び７４～７５のいずれか１つの配列に対する少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、または少なくとも９９％の同一性を有するか、あるいは配列番号１７～１８及び７４～７５のいずれか１つの配列を含む。いくつかの実施形態では、第２のＦｃポリペプチドは、配列番号３３～３４及び９７～９８のいずれか１つを含み、第１のＦｃポリペプチドは、配列番号１７～１８及び７４～７５のいずれか１つを含む。いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチド及び／または第２のＦｃポリペプチドのＮ末端は、ＩｇＧ１ヒンジ領域の一部（例えば、ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ、配列番号６）を含む。いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチドは、配列番号７６～７７のいずれか１つに対する少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、または少なくとも９９％の同一性を有するか、あるいは配列番号７６～７７のいずれか１つの配列を含む。

【0156】

いくつかの実施形態では、第２のＦｃポリペプチドはＴｆＲに結合するように改変されてはいない。いくつかの実施形態では、ＩＤＵＡ酵素、ＩＤＵＡ酵素バリアント、またはその触媒活性断片に連結された第１のＦｃポリペプチドは、ＴｆＲに結合し得る改変ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、第２のＦｃポリペプチドは、ホール変異、ＬＡＬＡ／ＬＡＬＡＰＧ／ＬＡＬＡＰＳ変異、及び／またはＹＴＥ変異を含み、かつ配列番号９～１６のいずれか１つに対する少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、または少なくとも９９％の同一性を有するか、あるいは配列番号９～１６のいずれか１つの配列を含む。いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチドは、ノブ変異、ＬＡＬＡ／ＬＡＬＡＰＧ／ＬＡＬＡＰＳ変異、及び／またはＹＴＥ変異を含み、かつ配列番号２５～３２のいずれか１つに対する少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、または少なくとも９９％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチドは、ノブ変異、ＬＡＬＡ／ＬＡＬＡＰＧ／ＬＡＬＡＰＳ変異、及び／またはＹＴＥ変異を含み、配列番号２５～３２のいずれか１つに対する少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、または少なくとも９９％の同一性を有し、かつＥＵ付番に従う、位置３８９にＡｌａを含む。前述の実施形態のいくつかでは、Ｆｃポリペプチドは、ＥＵ付番に従う、以下の位置に、すなわち、位置３８０にＧｌｕ及び位置３９０にＡｓｎをさらに含む。前述の実施形態のいくつかでは、第１のＦｃポリペプチドは、ＥＵ付番に従う、以下の位置に、すなわち位置３８０にＧｌｕ；位置３８４にＴｙｒ；位置３８６にＴｈｒ；位置３８７にＧｌｕ；位置３８８にＴｒｐ；位置３８９にＡｌａ；位置３９０にＡｓｎ；位置４１３にＴｈｒ；位置４１５にＧｌｕ；位置４１６にＧｌｕ；及び位置４２１にＰｈｅを含む。いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチドは、配列番号２５～３２のいずれか１つの配列を含む。いくつかの実施形態では、第２のＦｃポリペプチドは、配列番号９～１６のいずれか１つを含み、第１のＦｃポリペプチドは、配列番号２５～３２のいずれか１つを含む。いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチド及び／または第２のＦｃポリペプチドのＮ末端は、ＩｇＧ１ヒンジ領域の一部（例えば、ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ、配列番号６）を含む。いくつかの実施形態では、第２のＦｃポリペプチドは、配列番号１９～２２のいずれか１つに対する少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、または少なくとも９９％の同一性を有するか、あるいは配列番号１９～２２のいずれか１つの配列を含む。いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチドは、配列番号３５～３８のいずれか１つに対する少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、または少なくとも９９％の同一性を有するか、あるいは配列番号３５～３８のいずれか１つの配列を含む。

【0157】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の融合タンパク質に存在するＩＤＵＡ酵素は、配列番号９～１６のいずれか１つに対する少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、または少なくとも９９％の同一性を有する第１のＦｃポリペプチドを含む第１のポリペプチド鎖に連結されているか、あるいは配列番号９～１６のいずれか１つの配列を（例えば、融合ポリペプチドとして）含む。いくつかの実施形態では、ＩＤＵＡ酵素は、可塑性リンカーなどのリンカー、及び／またはヒンジ領域もしくはその一部（例えば、ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ、配列番号６）によって第１のＦｃポリペプチドに連結されている。いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチドのＮ末端は、ＩｇＧ１ヒンジ領域の一部（例えば、ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ；配列番号６）を含む。いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチドは、配列番号１９～２２のいずれか１つに対する少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、または少なくとも９９％の同一性を有するか、あるいは配列番号１９～２２のいずれか１つの配列を含む。いくつかの実施形態では、ＩＤＵＡ酵素は、配列番号３９～４９、７８～８２、及び９９のいずれか１つに対する少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、または少なくとも９９％の同一性を有するＩＤＵＡ配列を含むか；あるいは配列番号３９～４９、７８～８２、及び９９のいずれか１つの配列を含む。いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチドに連結されたＩＤＵＡ配列は、配列番号５０～６９、及び８３～９２のいずれか１つに対する少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、または少なくとも９９％の同一性を有するか、あるいは配列番号５０～６９、及び８３～９２のいずれか１つの配列を含む。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、配列番号２５～３２のいずれか１つに対する少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、または少なくとも９９％の同一性を有する第２のＦｃポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、配列番号２５～３２のいずれか１つに対する少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、または少なくとも９９％の同一性を有する第２のＦｃポリペプチドを含み、かつＥＵ付番に従う、位置３８９にＡｌａを含む。いくつかの実施形態では、第２のＦｃポリペプチドは、配列番号２５～３２のいずれか１つの配列に対する少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、または少なくとも９９％の同一性を有し、かつＥＵ付番に従う、以下の位置に、すなわち、位置３８０にＧｌｕ；位置３８９にＡｌａ；及び位置３９０にＡｓｎを含む。いくつかの実施形態では、第２のポリペプチドは、配列番号２５～３２のいずれか１つの配列に対する少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、または少なくとも９９％の同一性を有し、かつＥＵ付番に従う、以下の位置に、すなわち位置３８０にＧｌｕ；位置３８４にＴｙｒ；位置３８６にＴｈｒ；位置３８７にＧｌｕ；位置３８８にＴｒｐ；位置３８９にＡｌａ；位置３９０にＡｓｎ；位置４１３にＴｈｒ；位置４１５にＧｌｕ；位置４１６にＧｌｕ；及び位置４２１にＰｈｅを含むか、あるいは配列番号２５～３２のいずれか１つの配列を含む。いくつかの実施形態では、第２のＦｃポリペプチドのＮ末端は、ＩｇＧ１ヒンジ領域の一部（例えば、ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ；配列番号６）を含む。いくつかの実施形態では、第２のＦｃポリペプチドは、配列番号３５～３８のいずれか１つに対する少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、または少なくとも９９％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、第２のＦｃポリペプチドは、配列番号３５～３８のいずれか１つに対する少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、または少なくとも９９％の同一性を有し、かつＥＵ付番に従う、位置３８９にＡｌａを含む。いくつかの実施形態では、第２のＦｃポリペプチドは、配列番号３５～３８のいずれか１つの配列に対する少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、または少なくとも９９％の同一性を有し、かつＥＵ付番に従う、以下の位置に、すなわち、位置３８０にＧｌｕ；位置３８９にＡｌａ；及び位置３９０にＡｓｎを含む。いくつかの実施形態では、第２のＦｃポリペプチドは、配列番号３５～３８のいずれか１つの配列に対する少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、または少なくとも９９％の同一性を有し、かつＥＵ付番に従う、以下の位置に、すなわち位置３８０にＧｌｕ；位置３８４にＴｙｒ；位置３８６にＴｈｒ；位置３８７にＧｌｕ；位置３８８にＴｒｐ；位置３８９にＡｌａ；位置３９０にＡｓｎ；位置４１３にＴｈｒ；位置４１５にＧｌｕ；位置４１６にＧｌｕ；及び位置４２１にＰｈｅを含むか、あるいは配列番号３５～３８のいずれか１つの配列を含む。いくつかの実施形態では、第２のＩＤＵＡ酵素は、可塑性リンカーなどのリンカー、及び／またはヒンジ領域もしくはその一部（例えば、ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ、配列番号６）によって第２のＦｃポリペプチドに連結されている。いくつかの実施形態では、第２のＩＤＵＡ酵素は、配列番号３９～４９、７８～８２、及び９９のいずれか１つに対する少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、または少なくとも９９％の同一性を有するＩＤＵＡ配列を含むか、あるいは配列番号３９～４９、７８～８２、及び９９のいずれか１つの配列を含む。いくつかの実施形態では、第２のＦｃポリペプチドに連結された第２のＩＤＵＡ配列は、配列番号１０１～１０３のいずれか１つに対する少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、または少なくとも９９％の同一性を有するか、あるいは配列番号１０１～１０３のいずれか１つの配列を含む。

【0158】

いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、配列番号５０～６５及び８３～９２のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＩＤＵＡアミノ酸配列に連結された第１のＦｃポリペプチドと；配列番号３５～３８のいずれか１つのアミノ酸配列を含む第２のＦｃポリペプチドと、を含む。

【0159】

いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、配列番号５０～５７及び８３～８６のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＩＤＵＡアミノ酸配列に連結された第１のＦｃポリペプチドと；配列番号３５～３６のいずれか１つのアミノ酸配列を含む第２のＦｃポリペプチドと、を含む。

【0160】

いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、配列番号５０～５３のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＩＤＵＡアミノ酸配列に連結された第１のＦｃポリペプチドと；配列番号３５～３６のいずれか１つのアミノ酸配列を含む第２のＦｃポリペプチドと、を含む。

【0161】

いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、配列番号５０～５１のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＩＤＵＡアミノ酸配列に連結された第１のＦｃポリペプチドと；配列番号３５～３６のいずれか１つのアミノ酸配列を含む第２のＦｃポリペプチドと、を含む。

【0162】

いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、配列番号５１のアミノ酸配列を含むＩＤＵＡアミノ酸配列に連結された第１のＦｃポリペプチドと；配列番号３６のアミノ酸配列を含む第２のＦｃポリペプチドと、を含む。

【0163】

いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、配列番号５４～５７のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＩＤＵＡアミノ酸配列に連結された第１のＦｃポリペプチドと；配列番号３５～３６のいずれか１つのアミノ酸配列を含む第２のＦｃポリペプチドと、を含む。

【0164】

いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、配列番号８３～８６のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＩＤＵＡアミノ酸配列に連結された第１のＦｃポリペプチドと；配列番号３５～３６のいずれか１つのアミノ酸配列を含む第２のＦｃポリペプチドと、を含む。

【0165】

いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、配列番号８３～８４のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＩＤＵＡアミノ酸配列に連結された第１のＦｃポリペプチドと；配列番号３５～３６のいずれか１つのアミノ酸配列を含む第２のＦｃポリペプチドと、を含む。

【0166】

いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、配列番号８４のアミノ酸配列を含むＩＤＵＡアミノ酸配列に連結された第１のＦｃポリペプチドと；配列番号３６のアミノ酸配列を含む第２のＦｃポリペプチドと、を含む。

【0167】

いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、配列番号５８～６５及び８７～９２のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＩＤＵＡアミノ酸配列に連結された第１のＦｃポリペプチドと；配列番号３７～３８のいずれか１つのアミノ酸配列を含む第２のＦｃポリペプチドと、を含む。

【0168】

いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、配列番号５８～６１のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＩＤＵＡアミノ酸配列に連結された第１のＦｃポリペプチドと；配列番号３７～３８のいずれか１つのアミノ酸配列を含む第２のＦｃポリペプチドと、を含む。

【0169】

いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、配列番号５８～５９のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＩＤＵＡアミノ酸配列に連結された第１のＦｃポリペプチドと；配列番号３７～３８のいずれか１つのアミノ酸配列を含む第２のＦｃポリペプチドと、を含む。

【0170】

いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、配列番号５９のアミノ酸配列を含むＩＤＵＡアミノ酸配列に連結された第１のＦｃポリペプチドと；配列番号３８のアミノ酸配列を含む第２のＦｃポリペプチドと、を含む。

【0171】

いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、配列番号６０～６１のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＩＤＵＡアミノ酸配列に連結された第１のＦｃポリペプチドと；配列番号３７～３８のいずれか１つのアミノ酸配列を含む第２のＦｃポリペプチドと、を含む。

【0172】

いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、配列番号６１のアミノ酸配列を含むＩＤＵＡアミノ酸配列に連結された第１のＦｃポリペプチドと；配列番号３８のアミノ酸配列を含む第２のＦｃポリペプチドと、を含む。

【0173】

いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、配列番号６２～６５のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＩＤＵＡアミノ酸配列に連結された第１のＦｃポリペプチドと；配列番号３７～３８のいずれか１つのアミノ酸配列を含む第２のＦｃポリペプチドと、を含む。

【0174】

いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、配列番号６４～６５のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＩＤＵＡアミノ酸配列に連結された第１のＦｃポリペプチドと；配列番号３７～３８のいずれか１つのアミノ酸配列を含む第２のＦｃポリペプチドと、を含む。

【0175】

いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、配列番号６５のアミノ酸配列を含むＩＤＵＡアミノ酸配列に連結された第１のＦｃポリペプチドと；配列番号３８のアミノ酸配列を含む第２のＦｃポリペプチドと、を含む。

【0176】

いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、配列番号８７～９０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＩＤＵＡアミノ酸配列に連結された第１のＦｃポリペプチドと；配列番号３７～３８のいずれか１つのアミノ酸配列を含む第２のＦｃポリペプチドと、を含む。

【0177】

いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、配列番号８９～９０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＩＤＵＡアミノ酸配列に連結された第１のＦｃポリペプチドと；配列番号３７～３８のいずれか１つのアミノ酸配列を含む第２のＦｃポリペプチドと、を含む。

【0178】

いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、配列番号９０のアミノ酸配列を含むＩＤＵＡアミノ酸配列に連結された第１のＦｃポリペプチドと；配列番号３８のアミノ酸配列を含む第２のＦｃポリペプチドと、を含む。

【0179】

いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、配列番号９１～９２のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＩＤＵＡアミノ酸配列に連結された第１のＦｃポリペプチドと；配列番号３７～３８のいずれか１つのアミノ酸配列を含む第２のＦｃポリペプチドと、を含む。

【0180】

いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、配列番号９２のアミノ酸配列を含むＩＤＵＡアミノ酸配列に連結された第１のＦｃポリペプチドと；配列番号３８のアミノ酸配列を含む第２のＦｃポリペプチドと、を含む。

【0181】

いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、配列番号５０～５１のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＩＤＵＡアミノ酸配列に連結された第１のＦｃポリペプチドと；配列番号１０１または１０２のいずれか１つのアミノ酸配列を含む第２のＩＤＵＡアミノ酸配列に連結された第２のＦｃポリペプチドと、を含む。

【0182】

いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、配列番号５１のアミノ酸配列を含む第１のＩＤＵＡアミノ酸配列に連結された第１のＦｃポリペプチドと；配列番号１０２のいずれか１つのアミノ酸配列を含む第２のＩＤＵＡアミノ酸配列に連結された第２のＦｃポリペプチドと、を含む。

【0183】

いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、配列番号６６～６９のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＩＤＵＡアミノ酸配列に連結された第１のＦｃポリペプチドと；配列番号３５～３８のいずれか１つのアミノ酸配列を含む第２のＦｃポリペプチドと、を含む。

【0184】

いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、配列番号６６～６７のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＩＤＵＡアミノ酸配列に連結された第１のＦｃポリペプチドと；配列番号３５～３６のいずれか１つのアミノ酸配列を含む第２のＦｃポリペプチドと、を含む。

【0185】

いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、配列番号６７のアミノ酸配列を含むＩＤＵＡアミノ酸配列に連結された第１のＦｃポリペプチドと；配列番号３５～３６のアミノ酸配列を含む第２のＦｃポリペプチドと、を含む。

【0186】

いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、配列番号６７のアミノ酸配列を含むＩＤＵＡアミノ酸配列に連結された第１のＦｃポリペプチドと；配列番号３６のアミノ酸配列を含む第２のＦｃポリペプチドと、を含む。

【0187】

いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、配列番号６８～６９のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＩＤＵＡアミノ酸配列に連結された第１のＦｃポリペプチドと；配列番号３７～３８のいずれか１つのアミノ酸配列を含む第２のＦｃポリペプチドと、を含む。

【0188】

いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、配列番号６８のアミノ酸配列を含むＩＤＵＡアミノ酸配列に連結された第１のＦｃポリペプチドと；配列番号３７～３８のアミノ酸配列を含む第２のＦｃポリペプチドと、を含む。

【0189】

いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、配列番号６８のアミノ酸配列を含むＩＤＵＡアミノ酸配列に連結された第１のＦｃポリペプチドと；配列番号３８のアミノ酸配列を含む第２のＦｃポリペプチドと、を含む。

【0190】

いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、配列番号６７のアミノ酸配列を含む第１のＩＤＵＡアミノ酸配列に連結された第１のＦｃポリペプチドと；配列番号１０３のアミノ酸配列を含む第２のＩＤＵＡアミノ酸配列に連結された第２のＦｃポリペプチドと、を含む。

【0191】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の融合タンパク質に存在するＩＤＵＡ酵素は、配列番号１７～１８及び７４～７５のいずれか１つに対する少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、または少なくとも９９％の同一性を有する第１のＦｃポリペプチドを含む第１のポリペプチド鎖に連結されているか、あるいは配列番号１７～１８及び７４～７５のいずれか１つの配列を（例えば、融合ポリペプチドとして）含む。いくつかの実施形態では、第１のＩＤＵＡ酵素は、可塑性リンカーなどのリンカー、及び／またはヒンジ領域もしくはその一部（例えば、ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ、配列番号６）によって第１のＦｃポリペプチドに連結されている。いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチドのＮ末端は、ＩｇＧ１ヒンジ領域の一部（例えば、ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ；配列番号６）を含む。いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチドは、配列番号７６～７７のいずれか１つに対する少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、または少なくとも９９％の同一性を有するか、あるいは配列番号７６～７７のいずれか１つの配列を含む。いくつかの実施形態では、ＩＤＵＡ酵素は、配列番号３９～４９、７８～８２、及び９９のいずれか１つに対する少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、または少なくとも９９％の同一性を有するＩＤＵＡ配列を含むか、あるいは配列番号３９～４９、７８～８２、及び９９のいずれか１つの配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｆｃポリペプチドに連結されたＩＤＵＡ配列は、配列番号１００及び１０４のいずれか１つに対する少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、または少なくとも９９％の同一性を有するか、あるいは配列番号１００及び１０４のいずれか１つの配列を含む。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、配列番号３３～３４及び９７～９８のいずれか１つに対する少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、または少なくとも９９％の同一性を有する第２のＦｃポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、配列番号３３～３４及び９７～９８のいずれか１つに対する少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、または少なくとも９９％の同一性を有する第２のＦｃポリペプチドを含み、かつＥＵ付番に従う、位置３８９にＡｌａを含む。前述の実施形態のいくつかでは、第２のポリペプチドは、ＥＵ付番に従う、以下の位置に、すなわち、位置３８０にＧｌｕ及び位置３９０にＡｓｎをさらに含む。前述の実施形態のいくつかでは、第２のＦｃポリペプチドは、ＥＵ付番に従う、以下の位置に、すなわち位置３８０にＧｌｕ；位置３８４にＴｙｒ；位置３８６にＴｈｒ；位置３８７にＧｌｕ；位置３８８にＴｒｐ；位置３８９にＡｌａ；位置３９０にＡｓｎ；位置４１３にＴｈｒ；位置４１５にＧｌｕ；位置４１６にＧｌｕ；及び位置４２１にＰｈｅを含む。前述の実施形態のいくつかでは、第２のＦｃポリペプチドは、配列番号３３～３４及び９７～９８のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第２のＦｃポリペプチドのＮ末端は、ＩｇＧ１ヒンジ領域の一部（例えば、ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ；配列番号６）を含む。いくつかの実施形態では、第２のＩＤＵＡ酵素は、可塑性リンカーなどのリンカー、及び／またはヒンジ領域もしくはその一部（例えば、ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ、配列番号６）によって第２のＦｃポリペプチドに連結されている。

【0192】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の融合タンパク質に存在するＩＤＵＡ酵素は、配列番号２５～３２のいずれか１つに対する少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、または少なくとも９９％の同一性を有する第１のＦｃポリペプチドを含む第１のポリペプチド鎖に連結されている（例えば、融合ポリペプチドとして）。いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチドは、配列番号２５～３２のいずれか１つに対する少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、または少なくとも９９％の同一性を有し、かつＥＵ付番に従う、位置３８９にＡｌａを含む。前述の実施形態のいくつかでは、第１のポリペプチドは、ＥＵ付番に従う、以下の位置に、すなわち、位置３８０にＧｌｕ及び位置３９０にＡｓｎをさらに含む。前述の実施形態のいくつかでは、第１のＦｃポリペプチドは、ＥＵ付番に従う、以下の位置に、すなわち位置３８０にＧｌｕ；位置３８４にＴｙｒ；位置３８６にＴｈｒ；位置３８７にＧｌｕ；位置３８８にＴｒｐ；位置３８９にＡｌａ；位置３９０にＡｓｎ；位置４１３にＴｈｒ；位置４１５にＧｌｕ；位置４１６にＧｌｕ；及び位置４２１にＰｈｅを含む。前述の実施形態のいくつかでは、第１のＦｃポリペプチドは、配列番号２５～３２のいずれか１つの配列を含む。いくつかの実施形態では、ＩＤＵＡ酵素は、可塑性リンカーなどのリンカー、及び／またはヒンジ領域もしくはその一部（例えば、ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ、配列番号６）によって第１のＦｃポリペプチドに連結されている。いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチドのＮ末端は、ＩｇＧ１ヒンジ領域の一部（例えば、ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ；配列番号６）を含む。いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチドは、配列番号３５～３８のいずれか１つに対する少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、または少なくとも９９％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチドは、配列番号３５～３８のいずれか１つに対する少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、または少なくとも９９％の同一性を有し、かつＥＵ付番に従う、位置３８９にＡｌａを含む。前述の実施形態のいくつかでは、第１のポリペプチドは、ＥＵ付番に従う、以下の位置に、すなわち、位置３８０にＧｌｕ及び位置３９０にＡｓｎをさらに含む。前述の実施形態のいくつかでは、第１のＦｃポリペプチドは、ＥＵ付番に従う、以下の位置に、すなわち位置３８０にＧｌｕ；位置３８４にＴｙｒ；位置３８６にＴｈｒ；位置３８７にＧｌｕ；位置３８８にＴｒｐ；位置３８９にＡｌａ；位置３９０にＡｓｎ；位置４１３にＴｈｒ；位置４１５にＧｌｕ；位置４１６にＧｌｕ；及び位置４２１にＰｈｅを含む。前述の実施形態のいくつかでは、第１のＦｃポリペプチドは、配列番号３５～３８のいずれか１つの配列を含む。いくつかの実施形態では、ＩＤＵＡ酵素は、配列番号３９～４９、７８～８２、及び９９のいずれか１つに対する少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、または少なくとも９９％の同一性を有するＩＤＵＡ配列を含むか、あるいは配列番号３９～４９、７８～８２、及び９９のいずれか１つの配列を含む。いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチドに連結されたＩＤＵＡ配列は、配列番号１０１～１０３のいずれか１つに対する少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、または少なくとも９９％の同一性を有するか、あるいは配列番号１０１～１０３のいずれか１つの配列を含む。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、配列番号９～１６のいずれか１つに対する少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、または少なくとも９９％の同一性を有するか、あるいは配列番号９～１６のいずれか１つの配列を含む。いくつかの実施形態では、第２のＦｃポリペプチドのＮ末端は、ＩｇＧ１ヒンジ領域の一部（例えば、ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ；配列番号６）を含む。いくつかの実施形態では、第２のＦｃポリペプチドは、配列番号１９～２２のいずれか１つに対する少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、または少なくとも９９％の同一性を有するか、あるいは配列番号１９～２２のいずれか１つの配列を含む。いくつかの実施形態では、第２のＩＤＵＡ酵素は、可塑性リンカーなどのリンカー、及び／またはヒンジ領域もしくはその一部（例えば、ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ、配列番号６）によって第２のＦｃポリペプチドに連結されている。いくつかの実施形態では、第２のＩＤＵＡ酵素は、配列番号３９～４９、７８～８２、及び９９のいずれか１つに対する少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、または少なくとも９９％の同一性を有するＩＤＵＡ配列を含むか、あるいは配列番号３９～４９、７８～８２、及び９９のいずれか１つの配列を含む。いくつかの実施形態では、第２のＦｃポリペプチドに連結された第２のＩＤＵＡ配列は、配列番号５０～６９及び８３～９２のいずれか１つに対する少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、または少なくとも９９％の同一性を有するか、あるいは配列番号５０～６９及び８３～９２のいずれか１つの配列を含む。

【0193】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の融合タンパク質に存在するＩＤＵＡ酵素は、配列番号３３～３４及び９７～９８のいずれか１つに対する少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、または少なくとも９９％の同一性を有する第１のＦｃポリペプチドを含む第１のポリペプチド鎖に連結されている（例えば、融合ポリペプチドとして）。いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチドは、配列番号３３～３４及び９７～９８のいずれか１つに対する少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、または少なくとも９９％の同一性を有し、かつＥＵ付番に従う、位置３８９にＡｌａを含む。前述の実施形態のいくつかでは、第１のポリペプチドは、ＥＵ付番に従う、以下の位置に、すなわち、位置３８０にＧｌｕ及び位置３９０にＡｓｎをさらに含む。前述の実施形態のいくつかでは、第１のＦｃポリペプチドは、ＥＵ付番に従う、以下の位置に、すなわち位置３８０にＧｌｕ；位置３８４にＴｙｒ；位置３８６にＴｈｒ；位置３８７にＧｌｕ；位置３８８にＴｒｐ；位置３８９にＡｌａ；位置３９０にＡｓｎ；位置４１３にＴｈｒ；位置４１５にＧｌｕ；位置４１６にＧｌｕ；及び位置４２１にＰｈｅを含む。前述の実施形態のいくつかでは、第１のＦｃポリペプチドは、配列番号３３～３４及び９７～９８のいずれか１つの配列を含む。いくつかの実施形態では、ＩＤＵＡ酵素は、可塑性リンカーなどのリンカー、及び／またはヒンジ領域もしくはその一部（例えば、ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ、配列番号６）によって第１のＦｃポリペプチドに連結されている。いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチドのＮ末端は、ＩｇＧ１ヒンジ領域の一部（例えば、ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ；配列番号６）を含む。いくつかの実施形態では、ＩＤＵＡ酵素は、配列番号３９～４９、７８～８２、及び９９のいずれか１つに対する少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、または少なくとも９９％の同一性を有するＩＤＵＡ配列を含むか、あるいは配列番号３９～４９、７８～８２、及び９９のいずれか１つの配列を含む。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１７～１８及び７４～７５のいずれか１つに対する少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、または少なくとも９９％の同一性を有する第２のＦｃポリペプチドを含むか、あるいは配列番号１７～１８及び７４～７５のいずれか１つの配列を含む。いくつかの実施形態では、第２のＦｃポリペプチドのＮ末端は、ＩｇＧ１ヒンジ領域の一部（例えば、ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ；配列番号６）を含む。いくつかの実施形態では、第２のＦｃポリペプチドは、配列番号７６～７７のいずれか１つに対する少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、または少なくとも９９％の同一性を有するか、あるいは配列番号７６～７７のいずれか１つの配列を含む。いくつかの実施形態では、第２のＩＤＵＡ酵素は、可塑性リンカーなどのリンカー、及び／またはヒンジ領域もしくはその一部（例えば、ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ、配列番号６）によって第２のＦｃポリペプチドに連結されている。いくつかの実施形態では、第２のＩＤＵＡ酵素は、配列番号３９～４９、７８～８２、及び９９のいずれか１つに対する少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、または少なくとも９９％の同一性を有するＩＤＵＡ配列を含むか、あるいは配列番号３９～４９、７８～８２、及び９９のいずれか１つの配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｆｃポリペプチドに連結された第２のＩＤＵＡ配列は、配列番号１００及び１０４のいずれか１つに対する少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、または少なくとも９９％の同一性を有するか、あるいは配列番号１００及び１０４のいずれか１つの配列を含む。

【0194】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の融合タンパク質は、１）ＩＤＵＡアミノ酸配列に結合した第１のＦｃポリペプチド、及び２）第２のＦｃポリペプチドを含み；ここで各ポリペプチドは前述の実施形態で述べたアミノ酸配列からなる。

【0195】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の融合タンパク質は、１）ＩＤＵＡアミノ酸配列に連結された第１のＦｃポリペプチド；及び２）第２のＩＤＵＡアミノ酸配列に連結された第２のＦｃポリペプチドを含み、各ポリペプチドは、前述の実施形態で述べたアミノ酸配列からなる。

【0196】

本明細書に記載の融合タンパク質及び他の組成物は、広範囲にわたる結合親和性を有し得る。例えば、いくつかの実施形態では、タンパク質は、トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）に対する親和性を有し、その範囲は、約５０ｍＭ～約５００ｎＭ、または約１００ｎＭ～約５００ｎＭである。いくつかの実施形態では、ＴｆＲに対する親和性は、約５０ｎＭ～約３００ｎＭの範囲である。いくつかの実施形態では、ＴｆＲに対する親和性は、約１００ｎＭ～約３５０ｎＭの範囲である。いくつかの実施形態では、ＴｆＲに対する親和性は、約１５０ｎＭ～約４００ｎＭの範囲である。いくつかの実施形態では、ＴｆＲに対する親和性は、約２００ｎＭ～約４００ｎＭの範囲である。いくつかの実施形態では、ＴｆＲに対する親和性は、約２００ｎＭ～約４５０ｎＭの範囲である。いくつかの実施形態では、ＴｆＲに対する親和性は、一価の親和性である。

【0197】

タンパク質活性の評価
ＩＤＵＡ酵素を含む本明細書に記載の融合タンパク質の活性は、実施例セクションに記載のものなど、人工基質を使用してインビトロで活性を測定するアッセイを含む、種々のアッセイを使用して評価され得る。

【0198】

いくつかの実施形態では、組織試料を評価する。組織試料は、上記のアッセイを使用して評価し得るが、ただし、微小胞を確実に破裂させるために、超音波処理ステップの前に、複数回の、例えば２回、３回、４回または５回以上の凍結融解サイクルが通常含まれる。

【0199】

本明細書に記載のアッセイによって評価し得る試料としては、脳、肝臓、腎臓、肺、脾臓、血漿、血清、脳脊髄液（ＣＳＦ）及び尿が挙げられる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の酵素－Ｆｃ融合タンパク質（例えば、ＩＤＵＡ－Ｆｃ融合タンパク質）を受けた患者由来のＣＳＦ試料を評価し得る。

【0200】

核酸、ベクター、及び宿主細胞
本明細書に記載の融合タンパク質に含まれるポリペプチド鎖は、通常、組換え法を使用して調製される。したがって、いくつかの態様では、本開示は、本明細書に記載されているＦｃポリペプチドを含むポリペプチド鎖のいずれかをコードする核酸配列を含む単離された核酸、ならびにポリペプチドをコードする核酸を複製するため、及び／またはポリペプチドを発現するために使用される核酸が導入された宿主細胞を提供する。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、真核生物、例えば、ヒト細胞である。

【0201】

別の態様では、本明細書に記載のポリペプチド鎖の１つ以上をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを提供する。いくつかの実施形態では、このポリヌクレオチドは、本明細書に記載のポリペプチド配列のうちの１つをコードする。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、本明細書に記載のポリペプチド配列のうちの２つをコードする。ポリヌクレオチドは、一本鎖であっても、または二本鎖であってもよい。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＤＮＡである。特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ｃＤＮＡである。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＲＮＡである。

【0202】

いくつかの実施形態はまた、各核酸配列が本明細書に記載のポリペプチドをコードする核酸配列の対を提供する。例えば、特定の実施形態は、核酸配列の対を提供し、この対の第１の核酸配列は、第１のＩＤＵＡアミノ酸配列、ＩＤＵＡバリアントアミノ酸配列、またはその触媒活性断片に連結された第１のＦｃポリペプチドをコードし；及びこの対の第２の核酸配列は、第２のＦｃポリペプチドをコードし、ここでこの第１及び／または第２のＦｃポリペプチドは、血液脳関門（ＢＢＢ）受容体、例えば、トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）に結合し得る（例えば、特異的に結合し得る）改変Ｆｃである。

【0203】

いくつかの実施形態では、このポリヌクレオチドが、核酸構築物内に含まれるか、またはポリヌクレオチドの対が１つ以上の核酸構築物内に含まれる。いくつかの実施形態では、構築物は、複製可能なベクターである。いくつかの実施形態では、ベクターは、プラスミド、ウイルスベクター、ファージミド、酵母染色体ベクター、及び非エピソーム哺乳動物ベクターから選択される。

【0204】

いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、発現構築物中の１つ以上の制御性ヌクレオチド配列に作動可能に連結される。ある一連の実施形態では、核酸発現構築物は、表面発現ライブラリーとしての使用に適合する。いくつかの実施形態では、ライブラリーは、酵母における表面発現に適合する。いくつかの実施形態では、ライブラリーは、ファージにおける表面発現に適合する。別の一連の実施形態では、核酸発現構築物は、ミリグラム量またはグラム量でポリペプチドを単離することが可能な系におけるポリペプチドの発現に適合する。いくつかの実施形態では、この系は、哺乳動物細胞発現系である。いくつかの実施形態では、この系は、酵母細胞発現系である。

【0205】

組換えポリペプチド生成のための発現ビヒクルとしては、プラスミド及び他のベクターが挙げられる。例えば、好適なベクターとしては、以下のタイプのプラスミド、すなわち、Ｅ．ｃｏｌｉなどの原核細胞における発現のためのｐＢＲ３２２由来プラスミド、ｐＥＭＢＬ由来プラスミド、ｐＥＸ由来プラスミド、ｐＢＴａｃ由来プラスミド、及びｐＵＣ由来プラスミドが挙げられる。ｐｃＤＮＡＩ／ａｍｐ、ｐｃＤＮＡＩ／ｎｅｏ、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＳＶ２ｇｐｔ、ｐＳＶ２ｎｅｏ、ｐＳＶ２－ｄｈｆｒ、ｐＴｋ２、ｐＲＳＶｎｅｏ、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＴ７、ｐｋｏ－ｎｅｏ、及びｐＨｙｇ由来のベクターは、真核細胞のトランスフェクションに好適な哺乳動物発現ベクターの例である。あるいは、ウシパピローマウイルス（ＢＰＶ－１）またはエプスタイン・バールウイルス（ｐＨＥＢｏ、ｐＲＥＰ由来及びｐ２０５）などのウイルスの誘導体を、真核細胞におけるポリペプチドの一過性発現に使用し得る。いくつかの実施形態では、バキュロウイルス発現系の使用により組換えポリペプチドを発現させることが望ましい場合がある。そのようなバキュロウイルス発現系の例としては、ｐＶＬ由来ベクター（ｐＶＬ１３９２、ｐＶＬ１３９３及びｐＶＬ９４１など）、ｐＡｃＵＷ由来ベクター（ｐＡｃＵＷ１など）、ならびにｐＢｌｕｅＢａｃ由来ベクターが挙げられる。追加の発現系としては、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、及び他のウイルスの発現系が挙げられる。

【0206】

ベクターは、任意の好適な宿主細胞に形質転換し得る。いくつかの実施形態では、宿主細胞、例えば、細菌または酵母細胞は、表面発現ライブラリーとしての使用に適合し得る。ある種の細胞では、ベクターは宿主細胞中で発現し、比較的大量のポリペプチドを発現する。そのような宿主細胞としては、哺乳動物細胞、酵母細胞、昆虫細胞及び原核細胞が挙げられる。いくつかの実施形態では、細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、ＮＳ０細胞、Ｙ０細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＯＳ細胞、Ｖｅｒｏ細胞、またはＨｅＬａ細胞などの哺乳動物細胞である。

【0207】

本明細書に記載の１つ以上のＦｃポリペプチド鎖をコードする発現ベクター（複数可）でトランスフェクトされた宿主細胞を、適切な条件下で培養して、１つ以上のポリペプチドの発現を生じ得る。ポリペプチドは、ポリペプチドを含有する細胞と培地の混合物から分泌して、単離してもよい。あるいは、ポリペプチドを細胞質中にまたは膜画分中に保持して、細胞を回収して溶解し、所望の方法を使用してポリペプチドを単離してもよい。

【0208】

治療方法
本明細書に記載の融合タンパク質は、ＭＰＳ Ｉを治療するために治療上使用し得る。

【0209】

したがって、特定の実施形態は、ＭＰＳ Ｉを有する対象における毒性代謝産物（例えば、ヘパラン硫酸由来のオリゴ糖またはデルマタン硫酸由来のオリゴ糖）の蓄積を減少させる方法であって、本明細書に記載のタンパク質を対象に投与することを含む、方法を提供する。

【0210】

特定の実施形態は、ＭＰＳ Ｉを有する対象における毒性代謝産物（例えば、ヘパラン硫酸由来のオリゴ糖またはデルマタン硫酸由来のオリゴ糖）の蓄積を減少させるのに使用するための、本明細書に記載のタンパク質を提供する。

【0211】

特定の実施形態は、ＭＰＳ Ｉを有する対象における毒性代謝産物（例えば、ヘパラン硫酸由来のオリゴ糖またはデルマタン硫酸由来のオリゴ糖）の蓄積を減少させるための医薬の調製における、本明細書に記載のタンパク質の使用を提供する。

【0212】

特定の実施形態は、ＭＰＳ Ｉを治療する方法であって、本明細書に記載のタンパク質をそれを必要とする対象に投与することを含む、方法も提供する。

【0213】

特定の実施形態は、ＭＰＳ Ｉの治療を必要とする対象におけるその治療に使用するための、本明細書に記載のタンパク質を提供する。

【0214】

特定の実施形態は、ＭＰＳ Ｉの治療を必要とする対象におけるそれを治療するための医薬の調製における、本明細書に記載のタンパク質の使用を提供する。

【0215】

いくつかの実施形態では、タンパク質（例えば、ＩＤＵＡ酵素に連結された）の投与によって、本明細書に記載の融合タンパク質に連結されていない場合のＩＤＵＡの取り込みと比較して、または参照タンパク質（例えば、ＴｆＲ結合をもたらす第２のＦｃポリペプチドに対する改変を有さない、本明細書に記載の融合タンパク質）に連結されたＩＤＵＡの取り込みと比較して、脳内のＩＤＵＡのＣ_ｍａｘが改善される（例えば、増加する）。

【0216】

いくつかの実施形態では、脳内のＩＤＵＡのＣ_ｍａｘは、本明細書に記載の融合タンパク質に連結されていない場合のＩＤＵＡの取り込みと比較して、または参照タンパク質（例えば、ＴｆＲ結合をもたらす第２のＦｃポリペプチドに対する改変を有さない、本明細書に記載の融合タンパク質）に連結されたＩＤＵＡの取り込みと比較して、少なくとも約１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、２倍、２．２倍、２．４倍、２．６倍、２．８倍、３倍、４倍、５倍、６倍、またはそれ以上改善される（例えば、増加される）。

【0217】

本明細書に記載の融合タンパク質は、治療有効量または治療有効用量で対象に投与される。

【0218】

種々の実施形態では、本明細書に記載の融合タンパク質は、非経口的に投与される。いくつかの実施形態では、タンパク質は静脈内投与される。

【0219】

いくつかの非経口的な実施形態では、本明細書に記載の融合タンパク質は、腹腔内投与、皮内投与または筋肉内投与される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の融合タンパク質は、硬膜外投与などによりくも膜下腔内に、または側脳室内に投与される。

【0220】

医薬組成物及びキット
他の態様では、本明細書に記載の融合タンパク質を含む医薬組成物及びキットが提供される。

【0221】

医薬組成物
本開示に使用するための製剤を調製するための指針は、当業者に公知の医薬品及び製剤についての多くのハンドブックに見出すことができる。

【0222】

いくつかの実施形態では、医薬組成物は、本明細書に記載されている融合タンパク質を含み、かつ１つ以上の薬学的に許容される担体及び／または賦形剤をさらに含む。薬学的に許容される担体としては、任意の溶媒、分散媒、またはコーティングが挙げられ、これらは、活性薬剤と生理学的に適合し、活性薬剤の活性を妨害しないか、または別様に阻害しない。

【0223】

本明細書に記載の医薬組成物の用量及び所望の薬物濃度は、想定される特定の使用に応じて変動し得る。

【0224】

キット
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の融合タンパク質を含む、ＭＰＳ Ｉの治療に使用するためのキットを提供する。

【0225】

いくつかの実施形態では、キットは、１つ以上の追加の治療剤をさらに含む。例えば、いくつかの実施形態では、キットは、本明細書に記載の融合タンパク質を含み、ＭＰＳ Ｉの神経学的症状の治療に使用するための１つ以上の追加の治療剤をさらに含む。いくつかの実施形態では、キットは、本明細書に記載の方法を実施するための指示（すなわち、プロトコル）（例えば、血液脳関門を通過させてＩＤＵＡ酵素を含む融合タンパク質を投与するためのキットを使用するための使用説明）を含む説明資料をさらに含む。説明資料は通常、書面または印刷資料を含むが、それらに限定されない。このような使用説明書を保存し、それらをエンドユーザーに伝えることが可能な任意の媒体が、本開示によって企図される。このような媒体としては、電子記憶媒体（例えば、磁気ディスク、テープ、カートリッジ、チップ）、光学媒体（例えば、ＣＤ－ＲＯＭ）等が挙げられるがこれらに限定されない。このような媒体は、このような説明資料を提供するインターネットサイトのアドレスを含んでもよい。

【0226】

特定の定義
本明細書で使用する場合、内容が明らかに別段に示されている場合を除き、「ある、１つの（ａ：不定冠詞）」、「ある、１つの（ａｎ：不定冠詞）」及び「この、その（ｔｈｅ：定冠詞）」という単数形には、複数の言及物が含まれる。したがって、例えば、「ポリペプチド（ａ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）」という言及には、２つ以上のそのような分子などを含み得る。

【0227】

本明細書で使用される場合、「約」及び「およそ」という用語は、数値または範囲で指定された量を修正するために使用される場合、その数値及び当業者に公知の値からの妥当な偏差、例えば、±２０％、±１０％または±５％が、記載された値の意図する意味の範囲内であることを示す。

【0228】

本明細書で互換的に使用される場合、「対象」、「個体」及び「患者」という用語は、限定されないが、ヒト、非ヒト霊長類、げっ歯類（例えば、ラット、マウス、及びモルモット）、ウサギ、雌ウシ、ブタ、ウマ、及び他の哺乳動物種を含む哺乳動物を指す。一実施形態では、患者はヒトである。いくつかの実施形態では、ヒトは、ＭＰＳ Ｉの治療を必要とする患者である。いくつかの実施形態では、患者は、ＭＰＳ Ｉの１つ以上の徴候または症状を有する。

【0229】

「薬学的に許容される賦形剤」という用語は、ヒトまたは動物での使用に対して生物学的に、または薬理学的に適合する非活性医薬成分、例えば、限定されないが、緩衝液、担体、または保存料を指す。

【0230】

「投与する」という用語は、薬剤（例えば、本明細書に記載のＥＴＶ：ＩＤＵＡ療法などのＭＰＳ Ｉ治療剤）、化合物、または組成物（例えば、医薬組成物）を生物学的作用の所望の部位に送達する方法を指す。これらの方法としては、非経口送達、静脈内送達、皮内送達、筋肉内送達、髄腔内送達、または腹腔内送達が挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態では、本明細書に記載のポリペプチドは、静脈内投与される。

【0231】

本明細書で使用される場合、「治療」（及び「治療する」または「治療すること」等のその文法上の変形形態）は、治療されている個体の自然過程を変えるための臨床介入を指し、予防のために、または臨床病理過程の間に行ってもよい。治療の望ましい効果としては、限定するものではないが、疾患の発生または再発の予防、症状の緩和、疾患の任意の直接的または間接的病理学的帰結の縮小、疾患進行速度の減少、病状の回復または緩解、及び寛解または予後の改善が挙げられる。

【0232】

「有効量」という語句は、（ｉ）特定の疾患、状態もしくは障害を治療もしくは予防する、（ｉｉ）特定の疾患、状態もしくは障害のうちの１つ以上の症状を減弱させる、改善する、もしくは排除する、または（ｉｉｉ）本明細書に記載の特定の疾患、状態もしくは障害のうちの１つ以上の症状の発症を予防もしくは遅延させる、本明細書に記載の化合物の量を意味する。

【0233】

本明細書に開示される物質／分子の「治療有効量」は、個体の病状、年齢、性別、及び体重、ならびに個体において所望の応答を誘発する物質／分子の能力などの要因に従って変動し得る。治療有効量は、物質／分子の毒性または有害な効果を、治療上有益な効果が上回る量を包含する。「予防有効量」は、必要な投与量及び投与期間にて、所望の予防的結果を達成するのに有効な量を指す。典型的であって必ずしもそうではないが、疾患の早期段階前または早期段階で予防用量が対象において用いられるため、予防有効量は、治療有効量よりも少ないであろう。

【0234】

本明細書で使用される「アルファ－Ｌ－イズロニダーゼ」、「イズロニダーゼアルファ－Ｌ」、「Ｌ－イズロニダーゼ」、「イズロニダーゼ」、または「ＩＤＵＡ」とは、デルマタン硫酸及びヘパラン硫酸などのグリコサミノグリカンのリソソーム分解に関与する酵素であるアルファ－Ｌ－イズロニダーゼ（ＥＣ３．２．１．７６）を指す。ＩＤＵＡ遺伝子の変異は、ＭＳＰ Ｉと関連しており、ヘパラン硫酸及びデルマタン硫酸の分解障害から生じる。任意選択でＦｃポリペプチドを含むタンパク質の成分として本明細書で使用される「ＩＤＵＡ」または「ＩＤＵＡ酵素」という用語は、触媒活性であり、機能的バリアント、例としては、対立遺伝子バリアント及びスプライスバリアント、ならびにその触媒活性断片を包含する。ヒトＩＤＵＡの配列は、ＵｎｉＰｒｏｔエントリＰ３５４７５で利用可能であり、４ｐ１６．３のヒトＩＤＵＡ遺伝子によってコードされている。全長配列は、配列番号３９として提供され、位置３３にＨもしくはＱ、及び／または位置６２２にＡもしくはＴを有してもよく、この位置はＥＵ付番に従う。本明細書で使用される「成熟」ＩＤＵＡ配列は、天然に存在する完全長ポリペプチド鎖のシグナル配列を欠くポリペプチド鎖の形態を指す。成熟ヒトＩＤＵＡポリペプチドのアミノ酸配列の実施形態は、完全長ヒト配列のアミノ酸２７～６５３に対応する配列番号４０として提供される。本明細書で使用される「短縮された、短縮型、切断された（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）」ＩＤＵＡ配列とは、天然に存在する全長ポリペプチド鎖の触媒活性断片を指す（例えば、配列番号４５～４９、７８～８２、及び９９（ここで、Ｘ_３は存在しない））。ヒトＩＤＵＡの構造は、十分に特徴付けられている。チンパンジー（例えば、Ｐａｎ ｐａｎｉｓｃｕｓ（ピグミーチンパンジー）（ボノボ）のＵｎｉＰｒｏｔエントリＡ０Ａ２Ｒ９ＡＬＺ１）を含む、ヒト以外の霊長類のＩＤＵＡ配列も記載されている。マウスＩＤＵＡ配列は、ＵｎｉｐｒｏｔエントリＰ４８４４１で入手可能である。ＩＤＵＡバリアントは、例えば、同一条件下でアッセイした場合、対応する野生型ＩＤＵＡまたはその断片の活性の少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％を有する。触媒活性ＩＤＵＡ断片は、例えば、同一条件下でアッセイした場合、対応する完全長ＩＤＵＡまたはそのバリアントの活性の少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％を有する。市販されているＩＤＵＡの組換え型は、Ａｌｄｕｒａｚｙｍｅ（アウドラザイム）またはラロニダーゼと呼ばれ、どちらの用語も同じ組換え型を指す。

【0235】

本明細書で使用される「トランスフェリン受容体」または「ＴｆＲ」とは、トランスフェリン受容体タンパク質１を指す。ヒトトランスフェリン受容体１ポリペプチド配列は、配列番号７に示される。他の種に由来するトランスフェリン受容体タンパク質１の配列も公知である（例えば、チンパンジー、アクセッション番号ＸＰ＿００３３１０２３８．１；アカゲザル、ＮＰ＿００１２４４２３２．１；イヌ、ＮＰ＿００１００３１１１．１；畜牛、ＮＰ＿００１１９３５０６．１；マウス、ＮＰ＿０３５７６８．１；ラット、ＮＰ＿０７３２０３．１；及びニワトリ、ＮＰ＿９９０５８７．１）。「トランスフェリン受容体」という用語は、トランスフェリン受容体タンパク質１染色体遺伝子座にある遺伝子によってコードされる、例示的な参照配列、例えば、ヒト配列の対立遺伝子バリアントも包含する。全長のトランスフェリン受容体タンパク質には、短いＮ末端細胞内領域、膜貫通領域、及び大きな細胞外ドメインが含まれる。細胞外ドメインは、３つのドメイン、すなわち、プロテアーゼ様ドメイン、ヘリカルドメイン、及びアピカルドメインを特徴とする。ヒトトランスフェリン受容体１のアピカルドメイン配列は、配列番号８に規定される。

【0236】

本明細書で使用される「融合タンパク質」または「［ＩＤＵＡ酵素］－Ｆｃ融合タンパク質」とは、ＩＤＵＡ酵素、ＩＤＵＡ酵素バリアント、またはその触媒活性断片に連結された（例えば、融合した）第１のＦｃポリペプチド（すなわち、「［ＩＤＵＡ］－Ｆｃ融合ポリペプチド」）と；（例えば、第１のＦｃポリペプチドとＦｃ二量体を形成する）第２のＦｃポリペプチドと、を含む二量体タンパク質を指す。第２のＦｃポリペプチドはまた、ＩＤＵＡ酵素、ＩＤＵＡ酵素バリアント、またはその触媒活性断片に連結（例えば、融合）されてもよい。第１のＦｃポリペプチド及び／または第２のＦｃポリペプチドは、ペプチド結合またはポリペプチドリンカーによって、ＩＤＵＡ酵素、ＩＤＵＡ酵素バリアント、またはそれらの触媒活性断片に連結され得る。第１のＦｃポリペプチド及び／または第２のＦｃポリペプチドは、他のＦｃポリペプチドとのそのヘテロ二量体化を促進する、１つ以上の改変を含有する改変Ｆｃポリペプチドであり得る。第１のＦｃポリペプチド及び／または第２のＦｃポリペプチドは、トランスフェリン受容体への結合を付与する１つ以上の改変を含有する改変Ｆｃポリペプチドであり得る。第１のＦｃポリペプチド及び／または第２のＦｃポリペプチドは、エフェクター機能を低下させる１つ以上の改変を含有する改変Ｆｃポリペプチドであり得る。特定の実施形態では、第１のＦｃポリペプチド及び第２のＦｃポリペプチドは、エフェクター機能を有さない。第１のＦｃポリペプチド及び／または第２のＦｃポリペプチドは、血清半減期を延長する１つ以上の改変を含む改変Ｆｃポリペプチドであり得る。特定の実施形態では、第１のＦｃポリペプチド及び／または第２のＦｃポリペプチドは、免疫グロブリン重鎖及び／もしくは軽鎖可変領域配列またはその抗原結合部分を含まない。特定の実施形態では、第１のＦｃポリペプチド及び第２のＦｃポリペプチドは、免疫グロブリン重鎖及び／もしくは軽鎖可変領域配列またはその抗原結合部分を含まない。

【0237】

本明細書で使用される「融合ポリペプチド」または「［ＩＤＵＡ酵素］－Ｆｃ融合ポリペプチド」とは、ＩＤＵＡ酵素、ＩＤＵＡ酵素バリアント、またはその触媒活性断片に連結（例えば、融合）したＦｃポリペプチドを指す。Ｆｃポリペプチドは、ペプチド結合またはポリペプチドリンカーによって、ＩＤＵＡ酵素、ＩＤＵＡ酵素バリアント、またはそれらの触媒活性断片に連結され得る。Ｆｃポリペプチドは、別のＦｃポリペプチドとのそのヘテロ二量体化を促進する１つ以上の改変を含有する改変Ｆｃポリペプチドであり得る。Ｆｃポリペプチドは、トランスフェリン受容体への結合を付与する１つ以上の改変を含有する改変Ｆｃポリペプチドであり得る。Ｆｃポリペプチドは、エフェクター機能を低下させる１つ以上の改変を含有する改変Ｆｃポリペプチドであり得る。Ｆｃポリペプチドは、血清半減期を延長する１つ以上の改変を含有する改変Ｆｃポリペプチドであり得る。

【0238】

本明細書で使用される場合、「Ｆｃポリペプチド」という用語は、構造ドメインとしてのＩｇフォールドを特徴とする天然に存在する免疫グロブリン重鎖ポリペプチドのＣ末端領域を指す。Ｆｃポリペプチドは、少なくともＣＨ２ドメイン及び／またはＣＨ３ドメインを含む定常領域配列を含有し、少なくともヒンジ領域の一部を含有し得る。一般に、Ｆｃポリペプチドは可変領域を含有しない。

【0239】

「改変Ｆｃポリペプチド」とは、野生型免疫グロブリン重鎖Ｆｃポリペプチド配列と比較して、少なくとも１つの変異、例えば、置換、欠失、または挿入を有するが、ネイティブＦｃポリペプチドの全般的なＩｇフォールドまたは構造を保持するＦｃポリペプチドを指す。

【0240】

「ＦｃＲｎ」という用語は、胎児性Ｆｃ受容体を指す。ＦｃポリペプチドのＦｃＲｎへの結合は、Ｆｃポリペプチドのクリアランスを低下させ、血清半減期を延長する。ヒトＦｃＲｎタンパク質は、主要組織適合性（ＭＨＣ）クラスＩタンパク質に類似した約５０ｋＤａのサイズのタンパク質と、約１５ｋＤａのサイズのβ２－ミクログロブリンから構成されるヘテロ二量体である。

【0241】

本明細書で使用される場合、「ＦｃＲｎ結合部位」とは、ＦｃＲｎに結合するＦｃポリペプチドの領域を指す。ヒトＩｇＧでは、ＥＵインデックスを使用して付番したＦｃＲｎ結合部位には、Ｔ２５０、Ｌ２５１、Ｍ２５２、Ｉ２５３、Ｓ２５４、Ｒ２５５、Ｔ２５６、Ｔ３０７、Ｅ３８０、Ｍ４２８、Ｈ４３３、Ｎ４３４、Ｈ４３５及びＹ４３６が含まれる。これらの位置は、配列番号１の位置２０～２６、７７、１５０、１９８及び２０３～２０６に対応する。

【0242】

本明細書で使用される場合、「ネイティブＦｃＲｎ結合部位」とは、ＦｃＲｎに結合するＦｃポリペプチドの領域であってＦｃＲｎに結合する天然に存在するＦｃポリペプチドの領域と同じアミノ酸配列を有するＦｃポリペプチドの領域を指す。

【0243】

本明細書で使用される場合、「ＣＨ３ドメイン」及び「ＣＨ２ドメイン」という用語は、免疫グロブリン定常領域ドメインポリペプチドを指す。本出願の目的で、ＣＨ３ドメインポリペプチドとは、ＥＵに従って付番した位置ほぼ３４１から位置ほぼ４４７のアミノ酸のセグメントを指し、ＣＨ２ドメインポリペプチドとは、ＥＵ付番スキームに従って付番した位置ほぼ２３１から位置ほぼ３４０のアミノ酸セグメントを指し、ヒンジ領域配列を含まない。ＣＨ２及びＣＨ３ドメインのポリペプチドはまた、ＩＭＧＴ（ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ）付番スキームによっても付番される場合があり、この場合、ＩＭＧＴ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ｃｈａｒｔの付番（ＩＭＧＴウェブサイト）によれば、ＣＨ２ドメインの付番は１～１１０であり、ＣＨ３ドメインの付番は１～１０７である。ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインは、免疫グロブリンのＦｃ領域の一部である。Ｆｃ領域とは、ＥＵ付番スキームに従って付番した位置ほぼ２３１から位置ほぼ４４７のアミノ酸のセグメントを指すが、本明細書で使用される場合、抗体のヒンジ領域の少なくとも一部を含むことができる。例示的なヒンジ領域の配列は、ヒトＩｇＧ１ヒンジ配列ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ（配列番号５）である。

【0244】

「天然に存在する」、「ネイティブ」または「野生型」とは、人工的に生成されたものとは異なるものとして自然界に見出され得る物体を説明するために使用される。例えば、生物（ウイルスを含む）に存在するヌクレオチド配列であって、自然界の供給源から単離し得、実験室で意図的に改変されていないものは、天然に存在する。さらに、「野生型」とは、正常な遺伝子、または既知の変異のない自然界に見出される生物を指す。

【0245】

例えば、ＣＨ３またはＣＨ２ドメインに関する「野生型」、「ネイティブ」及び「天然に存在する」という用語は、天然において存在する配列を有するドメインを指すために本明細書で使用される。

【0246】

本明細書で使用される場合、変異ポリペプチドまたは変異ポリヌクレオチドに関する「変異体」という用語は、「バリアント」と互換的に使用される。所与の野生型ＣＨ３またはＣＨ２ドメインの参照配列に関するバリアントは、天然に存在する対立遺伝子バリアントを含むことができる。「非天然」に生じるＣＨ３またはＣＨ２ドメインとは、細胞に天然には存在せず、ネイティブＣＨ３ドメインもしくはＣＨ２ドメインポリヌクレオチドまたはポリペプチドの、例えば、遺伝子操作技術または変異導入技術を使用した遺伝子改変によって生成されるバリアントまたは変異体ドメインを指す。「バリアント」としては、野生型に対して少なくとも１つのアミノ酸変異を含む任意のドメインが挙げられる。変異には、置換、挿入、及び欠失を含んでもよい。

【0247】

「アミノ酸」という用語は、天然に存在するアミノ酸、及び合成アミノ酸、ならびに天然に存在するアミノ酸に類似した様式で機能するアミノ酸類似体及びアミノ酸模倣体を指す。

【0248】

天然に存在するアミノ酸は、遺伝暗号によってコードされるもの、ならびにそれらのアミノ酸が後で改変されたもの、例えば、ヒドロキシプロリン、γ－カルボキシグルタメート、及びＯ－ホスホセリンである。「アミノ酸類似体」とは、天然に存在するアミノ酸と同じ基本化学構造、すなわち、水素、カルボキシル基、アミノ基、及びＲ基に結合したα炭素を有する化合物、例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムを指す。このような類似体は、改変Ｒ基（例えば、ノルロイシン）または改変ペプチド骨格を有するが、天然に存在するアミノ酸と同じ基本的化学構造を保持する。「アミノ酸模倣体」とは、アミノ酸の一般的な化学構造とは異なる構造を有するが、天然に存在するアミノ酸に類似した様式で機能する化合物を指す。

【0249】

天然に存在するα－アミノ酸としては、アラニン（Ａｌａ）、システイン（Ｃｙｓ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、グリシン（Ｇｌｙ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、アルギニン（Ａｒｇ）、リジン（Ｌｙｓ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、プロリン（Ｐｒｏ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、セリン（Ｓｅｒ）、トレオニン（Ｔｈｒ）、バリン（Ｖａｌ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）、チロシン（Ｔｙｒ）、及びそれらの組み合わせが挙げられるがこれらに限定されない。天然に存在するα－アミノ酸の立体異性体としては、Ｄ－アラニン（Ｄ－Ａｌａ）、Ｄ－システイン（Ｄ－Ｃｙｓ）、Ｄ－アスパラギン酸（Ｄ－Ａｓｐ）、Ｄ－グルタミン酸（Ｄ－Ｇｌｕ）、Ｄ－フェニルアラニン（Ｄ－Ｐｈｅ）、Ｄ－ヒスチジン（Ｄ－Ｈｉｓ）、Ｄ－イソロイシン（Ｄ－Ｉｌｅ）、Ｄ－アルギニン（Ｄ－Ａｒｇ）、Ｄ－リジン（Ｄ－Ｌｙｓ）、Ｄ－ロイシン（Ｄ－Ｌｅｕ）、Ｄ－メチオニン（Ｄ－Ｍｅｔ）、Ｄ－アスパラギン（Ｄ－Ａｓｎ）、Ｄ－プロリン（Ｄ－Ｐｒｏ）、Ｄ－グルタミン（Ｄ－Ｇｌｎ）、Ｄ－セリン（Ｄ－Ｓｅｒ）、Ｄ－トレオニン（Ｄ－Ｔｈｒ）、Ｄ－バリン（Ｄ－Ｖａｌ）、Ｄ－トリプトファン（Ｄ－Ｔｒｐ）、Ｄ－チロシン（Ｄ－Ｔｙｒ）、及びこれらの組み合わせが挙げられるがこれらに限定されない。

【0250】

アミノ酸は、本明細書では、一般に知られている３文字記号またはＩＵＰＡＣ－ＩＵＢ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎが推奨する１文字記号のいずれかで言及され得る。

【0251】

「ポリペプチド」及び「ペプチド」という用語は、本明細書では互換的に使用され、一本鎖におけるアミノ酸残基のポリマーを指す。この用語は、１つ以上のアミノ酸残基が対応する天然に存在するアミノ酸の人工的な化学的模倣体であるアミノ酸ポリマー、ならびに天然に存在するアミノ酸ポリマー及び非天然に生じるアミノ酸ポリマーに適用される。アミノ酸ポリマーは、完全にＬ－アミノ酸、完全にＤ－アミノ酸、またはＬアミノ酸及びＤアミノ酸の混合物を含み得る。

【0252】

本明細書で使用される、「タンパク質」という用語は、ポリペプチドまたは一本鎖ポリペプチドの二量体（すなわち、２つ）もしくは多量体（すなわち、３つ以上）のいずれかを指す。タンパク質の一本鎖ポリペプチドは、共有結合、例えば、ジスルフィド結合によって、または非共有相互作用によって接合され得る。

【0253】

「保存的置換」、「保存的変異」、または「保存的に改変されたバリアント」という用語は、類似の特徴を有すると分類され得る別のアミノ酸でのアミノ酸の置換を生じる改変を指す。このようにして定義される保存的アミノ酸群の分類の例としては、Ｇｌｕ（グルタミン酸またはＥ）、Ａｓｐ（アスパラギン酸またはＤ）、Ａｓｎ（アスパラギンまたはＮ）、Ｇｌｎ（グルタミンまたはＱ）、Ｌｙｓ（リジンまたはＫ）、Ａｒｇ（アルギニンまたはＲ）、及びＨｉｓ（ヒスチジンまたはＨ）を含めた「荷電／極性群」、Ｐｈｅ（フェニルアラニンまたはＦ）、Ｔｙｒ（チロシンまたはＹ）、Ｔｒｐ（トリプトファンまたはＷ）、及び（ヒスチジンまたはＨ）を含めた「芳香族群」、ならびにＧｌｙ（グリシンまたはＧ）、Ａｌａ（アラニンまたはＡ）、Ｖａｌ（バリンまたはＶ）、Ｌｅｕ（ロイシンまたはＬ）、Ｉｌｅ（イソロイシンまたはＩ）、Ｍｅｔ（メチオニンまたはＭ）、Ｓｅｒ（セリンまたはＳ）、Ｔｈｒ（トレオニンまたはＴ）、及びＣｙｓ（システインまたはＣ）を含めた「脂肪族群」を挙げることができる。各グループ内で、サブグループを特定することもできる。例えば、荷電または極性アミノ酸のグループは、Ｌｙｓ、Ａｒｇ及びＨｉｓで構成される「正に荷電したサブグループ」、Ｇｌｕ及びＡｓｐで構成される「負に荷電したサブグループ」、ならびにＡｓｎ及びＧｌｎで構成される「極性サブグループ」を含むサブグループに細分し得る。別の例では、芳香族または環状群は、Ｐｒｏ、Ｈｉｓ、及びＴｒｐを含む「窒素環下位群」、ならびにＰｈｅ及びＴｙｒを含む「フェニル下位群」を含めた下位群に分割され得る。別のさらなる例では、脂肪族群は、下位群、例えば、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｇｌｙ、及びＡｌａを含む「脂肪族非極性下位群」ならびにＭｅｔ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、及びＣｙｓを含む「脂肪族微極性下位群」に分割され得る。保存的変異のカテゴリーの例としては、上記サブグループ内のアミノ酸のアミノ酸置換が挙げられ、これには例えば、以下が挙げられる：ＬｙｓをＡｒｇに、またはその逆で正電荷を維持できるようにする；ＧｌｕをＡｓｐに、またはその逆で負電荷を維持できるようにする；ＳｅｒをＴｈｒに、またはその逆で遊離－ＯＨを維持できるようにする；及びＧｌｎをＡｓｎに、またはその逆で遊離－ＮＨ_２を維持できるようにする。いくつかの実施形態では、疎水性アミノ酸は、天然に存在する疎水性アミノ酸と、例えば、活性部位で置換され、疎水性を保存する。

【0254】

２つ以上のポリペプチド配列との関連における「同一の」またはパーセント「同一性」という用語は、配列比較アルゴリズムを使用して、または手動アラインメント及び目視検査により測定した場合に、比較ウィンドウまたは指定された領域にわたり最大限一致するように比較及びアラインメントされるとき、特定の領域にわたって、同じであるかまたは特定のパーセンテージ、例えば、少なくとも６０％の同一性、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％もしくはそれ以上同一であるアミノ酸残基を有する、２つ以上の配列または部分配列を指す。いくつかの実施形態では、参照配列に対して指定されたパーセント同一性を有する配列は、１つ以上の保存的置換によって参照配列とは異なる。

【0255】

ポリペプチドの配列比較の場合、通常は１つのアミノ酸配列が参照配列として機能し、これを候補配列と比較する。アラインメントは、当業者に利用可能な様々な方法、例えば、視覚によるアラインメントを用いて、または既知のアルゴリズムを用いた公開されているソフトウェアを用いて行い、最大のアラインメントを達成し得る。このようなプログラムとしては、ＢＬＡＳＴプログラム、ＡＬＩＧＮ、ＡＬＩＧＮ－２（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｃａｌｉｆ．）、またはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）が挙げられる。最大のアラインメントを達成するためにアラインメントに使用されるパラメータは、当業者によって決定され得る。本出願の目的で、ポリペプチド配列の配列比較に関しては、２種のタンパク質配列をデフォルトのパラメータで整列させるためのＢＬＡＳＴＰアルゴリズム標準タンパク質ＢＬＡＳＴが使用される。

【0256】

ポリペプチド配列における所与のアミノ酸残基の特定との関連で使用される場合の「～に対応する」、「～を参照して決定される」、または「～を参照して付番される」という表現は、所与のアミノ酸配列が最大限にアラインメントされ、参照配列と比較される場合の特定の参照配列の残基の位置を指す。したがって、例えば、改変Ｆｃポリペプチド中のアミノ酸残基は、当該残基を配列番号１に対して最適にアラインメントしたときに配列番号１のアミノ酸と一致する場合、配列番号１のアミノ酸に「対応する」。参照配列に対してアラインメントされるポリペプチドは、参照配列と同じ長さである必要はない。

【0257】

「ポリヌクレオチド」及び「核酸」という用語は、互換的に、任意の長さのヌクレオチド鎖を指し、ＤＮＡ及びＲＮＡを含む。ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、改変ヌクレオチドもしくは塩基、及び／またはそれらの類似体、あるいは、ＤＮＡまたはＲＮＡポリメラーゼによって鎖の中に組み込むことができる任意の基質であり得る。ポリヌクレオチドは、改変ヌクレオチド、例えば、メチル化ヌクレオチド及びそれらの類似体を含み得る。本明細書で企図されるポリヌクレオチドの例としては、一本鎖及び二本鎖ＤＮＡ、一本鎖及び二本鎖ＲＮＡ、ならびに一本鎖ならびに二本鎖ＤＮＡ及びＲＮＡの混合物を有するハイブリッド分子が挙げられる。

【0258】

本明細書で使用する場合、「結合親和性」とは、２つの分子間、例えば、ポリペプチド上の単一の結合部位と、それが結合する標的、例えばトランスフェリン受容体との間の非共有結合相互作用の強さを指す。したがって、例えば、別段示されない限り、または文脈から明らかでない限り、この用語はポリペプチドとその標的との間の１：１の相互作用を指す場合がある。結合親和性は、平衡解離定数（Ｋ_Ｄ）を測定することにより定量化し得、これは、結合速度定数（ｋ_ａ、時間^－１Ｍ^－１）で除した解離速度定数（ｋ_ｄ、時間^－１）を指す。Ｋ_Ｄは、複合体形成及び解離の動態の測定、例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）方法、例えばＢｉａｃｏｒｅ（商標）システム；ＫｉｎＥｘＡ（登録商標）などの結合平衡除外法（ｋｉｎｅｔｉｃ ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ）アッセイ；及びＢｉｏＬａｙｅｒ干渉法（例えば、ＦｏｒｔｅＢｉｏ（登録商標）Ｏｃｔｅｔ（登録商標）プラットフォームを使用する）を使用することによって決定され得る。本明細書で使用される場合、「結合親和性」は、ポリペプチドとその標的との間の１：１の相互作用を反映するものなどの公式の結合親和性のみならず、強力な結合を反映し得るＫ_Ｄが算出される見かけの親和性も含む。

【0259】

本明細書で使用される場合、標的、例えばＴｆＲに「特異的に結合する」または「選択的に結合する」という用語は、本明細書に記載の操作されたＴｆＲ結合ポリペプチド、ＴｆＲ結合ペプチド、またはＴｆＲ結合融合タンパク質を指す場合、それにより、操作されたＴｆＲ結合ポリペプチド、ＴｆＲ結合ペプチド、またはＴｆＲ結合融合タンパク質が、構造的に異なる標的に結合するよりも、より高い親和性、より高いアビディティ、及び／またはより長い持続時間で標的に結合する、結合反応を指す。典型的な実施形態では、操作されたＴｆＲ結合ポリペプチド、ＴｆＲ結合ペプチド、またはＴｆＲ結合融合タンパク質は、同じアフィニティーアッセイ条件下でアッセイした場合、無関係の標的と比較して、特異的標的、例えば、ＴｆＲに対して少なくとも５倍、１０倍、５０倍、１００倍、１，０００倍、１０，０００倍、またはそれ以上大きい親和性を有する。本明細書で使用する場合、特定の標的（例えば、ＴｆＲ）「への特異的な結合」、「に特異的に結合する」または「に特異的である」という用語は、例えば、結合する標的に対して、例えば、１０^－４Ｍ以下（例えば、１０^－５Ｍ、１０^－６Ｍ、１０^－７Ｍ、１０^－８Ｍ、１０^－９Ｍ、１０^－１０Ｍ、１０^－１１Ｍまたは１０^－１２Ｍ）の平衡解離定数Ｋ_Ｄを有する分子によって示され得る。いくつかの実施形態では、操作されたＴｆＲ結合ポリペプチド、ＴｆＲ結合ペプチド、またはＴｆＲ結合融合タンパク質は、種間で保存された（例えば、種間で構造的に保存された）、例えば、非ヒト霊長類とヒト種との間で保存された（例えば、非ヒト霊長類とヒト種との間で構造的に保存された）ＴｆＲ上のエピトープに特異的に結合する。いくつかの実施形態では、操作されたＴｆＲ結合ポリペプチド、ＴｆＲ結合ペプチド、またはＴｆＲ結合融合タンパク質は、ヒトＴｆＲに排他的に結合し得る。

【0260】

「可変領域」または「可変ドメイン」という用語は、生殖系列可変（Ｖ）遺伝子、多様性（Ｄ）遺伝子、または結合（Ｊ）遺伝子に由来し（かつ定常（Ｃμ及びＣδ）遺伝子セグメントには由来しない）、抗体に抗原と結合する特異性を与える、抗体重鎖または軽鎖中のドメインを指す。通常、抗体の可変領域は、３つの超可変「相補性決定領域」が散在する４つの保存された「フレームワーク」領域を含む。

【0261】

「抗原結合部分」及び「抗原結合断片」という用語は、本明細書において互換的に使用され、その可変領域を介して抗原に特異的に結合する能力を保持した１つ以上の抗体の断片を指す。抗原結合断片の例としては、Ｆａｂ断片（ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ１ドメインからなる一価断片）、Ｆ（ａｂ’）_２断片（ヒンジ領域でジスルフィド架橋により連結された２つのＦａｂ断片から構成される二価断片）、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｄｓＦｖ）、相補性決定領域（ＣＤＲ）、ＶＬ（軽鎖可変領域）、ならびにＶＨ（重鎖可変領域）が挙げられるが、これらに限定されない。

【0262】

以下の実施例は非限定的であることを意図している。

【実施例】

【0263】

実施例１：アルファ－Ｌ－イズロニダーゼ（ＩＤＵＡ）を含む融合タンパク質の構築。
設計及びクローニング
（ｉ）ヒトＩＤＵＡ酵素がＦｃ領域を含むヒトＩｇＧ１断片に融合した第１の融合ポリペプチド（「ＩＤＵＡ－Ｆｃ融合ポリペプチド」）と、（ｉｉ）トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）結合を付与するＦｃ領域（「改変Ｆｃポリペプチド」）に変異を含む改変ヒトＩｇＧ１断片と、を含むＩＤＵＡ－Ｆｃ融合タンパク質を設計した。（ｉ）ヒトＩＤＵＡ酵素配列が、Ｆｃ領域を含むヒトＩｇＧ１断片に融合した第１の融合ポリペプチド（「ＩＤＵＡ－Ｆｃ融合ポリペプチド」）と、（ｉｉ）ヒトＩＤＵＡ酵素配列が、ＴｆＲ結合を付与するＦｃ領域に変異を含む改変ヒトＩｇＧ１断片に融合した第２の融合ポリペプチド（「ＴｆＲに結合するＩＤＵＡ－Ｆｃ融合ポリペプチド」）と、を含む融合タンパク質も設計した。ＩＤＵＡ配列がヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域のＮ末端及びＣ末端に融合した、ＩＤＵＡ－Ｆｃ融合ポリペプチドを作成した。すべての構築物において、シグナルペプチドＭＧＷＳＣＩＩＬＦＬＶＡＴＡＴＧＡＹＡ（配列番号７０）を融合の上流に挿入して分泌を促進した。使用したヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域の断片は、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ ＩＤ Ｐ０１８５７の配列のアミノ酸Ｄ１０４－Ｋ３３０（ＥＵ付番、位置２２１～４４７、ヒンジの１０アミノ酸（位置２２１～２３０）を含む）に対応する。（ｉ）ＩＤＵＡ－Ｆｃ融合ポリペプチドと（ｉｉ）改変Ｆｃポリペプチドを別々にコードする発現ベクターを生成し、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞に共トランスフェクトして、ＩＤＵＡ酵素（「モノザイム」）を含むヘテロ二量体融合タンパク質を生成した。（ｉ）ＩＤＵＡ－Ｆｃ融合ポリペプチドと（ｉｉ）ＴｆＲに結合するＩＤＵＡ－Ｆｃ融合ポリペプチドを別々にコードする発現ベクターも生成し、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞に共トランスフェクトして、ＩＤＵＡ酵素（「バイザイム」）を含むヘテロ二量体融合タンパク質を生成した。一部の構築物では、ＩｇＧ１断片には追加の変異が含まれており、これにより２つのＦｃ領域のヘテロ二量体化が容易になる。

【0264】

ホール変異及びＬＡＬＡ変異を有するＩｇＧ１ Ｆｃポリペプチド配列のＮ末端に融合した成熟ヒトＩＤＵＡ配列を含むＩＤＵＡ－Ｆｃ融合ポリペプチドは、配列番号５０または５１の配列を有する。ＩＤＵＡ酵素は、ＧＧＧＧＳリンカー（配列番号７２）によってＦｃポリペプチドに接合し、ＦｃポリペプチドのＮ末端は、ＩｇＧ１ヒンジ領域の一部（ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ；配列番号６）を含んでいた。

【0265】

ホール変異及びＬＡＬＡＰＳ変異を有するＩｇＧ１ Ｆｃポリペプチド配列のＮ末端に融合した成熟ヒトＩＤＵＡ配列を含むＩＤＵＡ－Ｆｃ融合ポリペプチドは、配列番号５８または５９の配列を有する。ＩＤＵＡ酵素は、ＧＧＧＧＳリンカー（配列番号７２）によってＦｃポリペプチドに接合し、ＦｃポリペプチドのＮ末端は、ＩｇＧ１ヒンジ領域の一部（ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ；配列番号６）を含んでいた。

【0266】

ホール変異及びＬＡＬＡＰＳ変異を有するＩｇＧ１ Ｆｃポリペプチド配列のＮ末端に融合した成熟ヒトＩＤＵＡ配列を含むＩＤＵＡ－Ｆｃ融合ポリペプチドは、配列番号６０または６１の配列を有する。ＩＤＵＡ酵素は、ＧＧＧＧＳリンカー（配列番号７２）によってＦｃポリペプチドに接合し、ＦｃポリペプチドのＮ末端は、ＩｇＧ１ヒンジ領域の一部（ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ；配列番号６）を含んでいた。

【0267】

ホール変異及びＬＡＬＡＰＳ変異を有するＩｇＧ１ Ｆｃポリペプチド配列のＮ末端に融合した成熟、短縮型ヒトＩＤＵＡ配列を含むＩＤＵＡ－Ｆｃ融合ポリペプチドは、配列番号６４または６５の配列を有する。ＩＤＵＡ酵素は、ＧＧＧＧＳリンカー（配列番号７２）によってＦｃポリペプチドに接合し、ＦｃポリペプチドのＮ末端は、ＩｇＧ１ヒンジ領域の一部（ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ；配列番号６）を含んでいた。

【0268】

ホール変異及びＬＡＬＡＰＳ変異を有するＩｇＧ１ Ｆｃポリペプチド配列のＮ末端に融合した成熟ヒトＩＤＵＡ配列を含むＩＤＵＡ－Ｆｃ融合ポリペプチドは、配列番号９１または９２の配列を有する。ＩＤＵＡ酵素はＧＧＧＧＳリンカー（配列番号７２）によってＦｃポリペプチドに接合し、ＦｃポリペプチドのＮ末端はＩｇＧ１ヒンジ領域の一部（ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ；配列番号６）を含んでいた。

【0269】

ノブ変異及びＬＡＬＡ変異を有するＩｇＧ１ Ｆｃポリペプチド配列のＮ末端に融合した成熟ヒトＩＤＵＡ配列を含むＩＤＵＡ－Ｆｃ融合ポリペプチドは、配列番号１０４または１００の配列を有する。ＩＤＵＡ酵素はＧＧＧＧＳリンカー（配列番号７２）によってＦｃポリペプチドに接合し、ＦｃポリペプチドのＮ末端は、ＩｇＧ１ヒンジ領域の一部（ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ；配列番号６）を含んでいた。

【0270】

ノブ変異及びＬＡＬＡ変異を有するＴｆＲ結合改変ＩｇＧ１ Ｆｃポリペプチド配列のＮ末端に融合した成熟ヒトＩＤＵＡ配列を含む、ＩＤＵＡ－Ｆｃ融合ポリペプチドは、配列番号１０１または１０２の配列を有する。ＩＤＵＡ酵素はＧＧＧＧＳリンカー（配列番号７２）によってＦｃポリペプチドに接合し、ＦｃポリペプチドのＮ末端は、ＩｇＧ１ヒンジ領域の一部（ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ；配列番号６）を含んでいた。

【0271】

ノブ変異及びＬＡＬＡ変異を有するＴｆＲ結合改変ＩｇＧ１ Ｆｃポリペプチド配列のＣ末端に融合した成熟ヒトＩＤＵＡ配列を含む、Ｆｃ－ＩＤＵＡ融合ポリペプチドは、配列番号１０３の配列を有する。ＩＤＵＡ酵素はＧＧＧＧＳリンカー（配列番号７２）によってＦｃポリペプチドに接合し、ＦｃポリペプチドのＮ末端は、ＩｇＧ１ヒンジ領域の一部（ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ；配列番号６）を含んでいた。

【0272】

ホール変異及びＬＡＬＡＰＳ変異を有するＩｇＧ１ Ｆｃポリペプチド配列のＣ末端に融合した成熟ヒトＩＤＵＡ配列を含むＦｃ－ＩＤＵＡ融合ポリペプチドは、配列番号６８の配列を有する。ＩＤＵＡ酵素は、ＧＧＧＧＳリンカー（配列番号７２）によってＦｃポリペプチドに接合し、ＦｃポリペプチドのＮ末端は、ＩｇＧ１ヒンジ領域の一部（ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ；配列番号６）を含んでいた。

【0273】

ホール変異及びＬＡＬＡＰＳ変異を有するＩｇＧ１ Ｆｃポリペプチド配列のＣ末端に融合した成熟ヒトＩＤＵＡ配列を含むＦｃ－ＩＤＵＡ融合ポリペプチドは、配列番号６９の配列を有する。ＩＤＵＡ酵素は、ＧＧＧＧＳリンカー（配列番号７２）によってＦｃポリペプチドに接合し、ＦｃポリペプチドのＮ末端は、ＩｇＧ１ヒンジ領域の一部（ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ；配列番号６）を含んでいた。

【0274】

ノブ変異及びＬＡＬＡ変異を有するＴｆＲ結合改変Ｆｃポリペプチドは、配列番号３５または３６の配列を有する。改変ＦｃポリペプチドのＮ末端は、ＩｇＧ１ヒンジ領域の一部（ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ；配列番号６）を含んでいた。

【0275】

ノブ変異及びＬＡＬＡＰＳ変異を有するＴｆＲ結合改変Ｆｃポリペプチドは、配列番号３７または３８の配列を有する。改変ＦｃポリペプチドのＮ末端は、ＩｇＧ１ヒンジ領域の一部（ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ；配列番号６）を含んでいた。

【0276】

最初の「Ｎ末端モノザイム」ＩＤＵＡ－Ｆｃ融合タンパク質（「ＥＴＶ：ＩＤＵＡ Ｆｕｓｉｏｎ １」）を生成したが、これは、配列番号３５の配列を有するＴｆＲ結合改変Ｆｃポリペプチドと、配列番号５０の配列を有するＩＤＵＡ－Ｆｃ融合ポリペプチドとを含む。ＩＤＵＡ－Ｆｃ融合タンパク質をまた、細胞培養生成中にさらにプロセシングして、ＴｆＲ結合改変Ｆｃポリペプチドが、配列番号３６の配列を有するか、及び／またはＩＤＵＡ－Ｆｃ融合ポリペプチドが、配列番号５１の配列を有するようにしてもよい。したがって、本明細書で使用される場合、ＥＴＶ：ＩＤＵＡ Ｆｕｓｉｏｎ １という用語は、非プロセシング配列（すなわち、配列番号３５及び５０）を有するタンパク質分子；１つ以上のプロセシング配列（すなわち、配列番号３６及び５１から選択される）を含むタンパク質分子；またはプロセシング及び非プロセシングタンパク質分子を含む混合物を指すために使用し得る。

【0277】

第２の「Ｎ末端モノザイム」ＩＤＵＡ－Ｆｃ融合タンパク質（「ＥＴＶ：ＩＤＵＡ Ｆｕｓｉｏｎ ２」）を生成したが、これは、配列番号３７の配列を有するＴｆＲ結合改変Ｆｃポリペプチドと、配列番号５８の配列を有するＩＤＵＡ－Ｆｃ融合ポリペプチドとを含む。ＩＤＵＡ－Ｆｃ融合タンパク質はまた、細胞培養生成中にさらにプロセシングして、ＴｆＲ結合改変Ｆｃポリペプチドが配列番号３８の配列を有し、及び／またはＩＤＵＡ－Ｆｃ融合ポリペプチドが配列番号５９の配列を有するようにしてもよい。したがって、本明細書で使用される場合、ＥＴＶ：ＩＤＵＡ Ｆｕｓｉｏｎ ２という用語は、非プロセシング配列（すなわち、配列番号３７及び５８）を有するタンパク質分子；１つ以上のプロセシング配列（すなわち、配列番号３８及び５９から選択される）を含むタンパク質分子；またはプロセシング及び非プロセシングタンパク質分子を含む混合物を指すために使用され得る。

【0278】

第３の「Ｎ末端モノザイム」ＩＤＵＡ－Ｆｃ融合タンパク質（「ＥＴＶ：ＩＤＵＡ Ｆｕｓｉｏｎ ３」）を生成したが、これは、配列番号３７の配列を有するＴｆＲ結合改変Ｆｃポリペプチドと、配列番号６０の配列を有するＩＤＵＡ－Ｆｃ融合ポリペプチドとを含む。ＩＤＵＡ－Ｆｃ融合タンパク質をまた、細胞培養生成中にさらにプロセシングして、ＴｆＲ結合改変Ｆｃポリペプチドが配列番号３８の配列を有し、及び／またはＩＤＵＡ－Ｆｃ融合ポリペプチドが配列番号６１の配列を有するようにしてもよい。したがって、本明細書で使用される場合、ＥＴＶ：ＩＤＵＡ Ｆｕｓｉｏｎ ３という用語は、非プロセシング配列（すなわち、配列番号３７及び６０）を有するタンパク質分子；１つ以上のプロセシング配列（すなわち、配列番号３８及び６１から選択される）を含むタンパク質分子；またはプロセシング及び非プロセシングタンパク質分子を含む混合物を指すために使用され得る。

【0279】

第４の「Ｎ末端モノザイム」ＩＤＵＡ－Ｆｃ融合タンパク質（「ＥＴＶ：ＩＤＵＡ Ｆｕｓｉｏｎ ４」）を生成したが、これは、配列番号３７の配列を有するＴｆＲ結合改変Ｆｃポリペプチドと、配列番号６４の配列を有するＩＤＵＡ－Ｆｃ融合ポリペプチドとを含む。ＩＤＵＡ－Ｆｃ融合タンパク質をまた、細胞培養生成中にさらにプロセシングして、ＴｆＲ結合改変Ｆｃポリペプチドが配列番号３８の配列を有し、及び／またはＩＤＵＡ－Ｆｃ融合ポリペプチドが配列番号６５の配列を有するようにしてもよい。したがって、本明細書で使用される場合、ＥＴＶ：ＩＤＵＡ Ｆｕｓｉｏｎ ４という用語は、非プロセシング配列（すなわち、配列番号３７及び６４）を有するタンパク質分子；１つ以上のプロセシング配列（すなわち、配列番号３８及び６５から選択される）を含むタンパク質分子；またはプロセシング及び非プロセシングタンパク質分子を含む混合物を指すために使用され得る。

【0280】

第５の「Ｎ末端モノザイム」ＩＤＵＡ－Ｆｃ融合タンパク質（「ＥＴＶ：ＩＤＵＡ Ｆｕｓｉｏｎ ５」）を生成したが、これは、配列番号３７の配列を有するＴｆＲ結合改変Ｆｃポリペプチドと、配列番号９１の配列を有するＩＤＵＡ－Ｆｃ融合ポリペプチドとを含む。ＩＤＵＡ－Ｆｃ融合タンパク質をまた、細胞培養生成中にさらにプロセシングして、ＴｆＲ結合改変Ｆｃ融合ポリペプチドが配列番号３８の配列を有し、及び／またはＩＤＵＡ－Ｆｃ融合ポリペプチドが配列番号９２の配列を有するようにしてもよい。したがって、本明細書で使用される場合、ＥＴＶ：ＩＤＵＡ Ｆｕｓｉｏｎ ５という用語は、非プロセシング配列（すなわち、配列番号３７及び９１）を有するタンパク質分子；１つ以上のプロセシング配列（すなわち、配列番号３８及び９２から選択される）を含むタンパク質分子；またはプロセシング及び非プロセシングタンパク質分子を含む混合物を指すために使用され得る。

【0281】

「Ｃ末端モノザイム」ＩＤＵＡ－Ｆｃ融合タンパク質（「ＥＴＶ：ＩＤＵＡ Ｆｕｓｉｏｎ ６」）を生成したが、これは、配列番号３７の配列を有するＴｆＲ結合改変Ｆｃポリペプチドと、配列番号６８の配列を有するＩＤＵＡ－Ｆｃ融合ポリペプチドとを含む。ＩＤＵＡ－Ｆｃ融合タンパク質はまた、細胞培養生産中にさらに処理して、ＴｆＲ結合改変Ｆｃポリペプチドが配列番号３８の配列を有するようにしてもよい。したがって、本明細書で使用される場合、ＥＴＶ：ＩＤＵＡ Ｆｕｓｉｏｎ ６という用語は、配列番号３７及び６８を含むタンパク質分子、配列番号３８及び６８を含むタンパク質分子、または配列番号３７及び６８を含むタンパク質分子と、配列番号３８及び６８を含むタンパク質分子との混合物を指すために使用され得る。
表１は、追加の例示的なＩＤＵＡ－Ｆｃ融合タンパク質及び組換えタンパク質の配列を示している。

【表1】

【0282】

ＥＴＶ：ＩＤＵＡ（例えば、上記の任意の融合タンパク質）を含む組成物は、非プロセシング配列を有するタンパク質分子を含む組成物を指すか；１つ以上のプロセシング配列を含むタンパク質分子を含む組成物を指すか；またはプロセシングタンパク質分子と非プロセシングタンパク質分子とを含む混合物を指すために使用され得る。

【0283】

ＴｆＲ結合を付与する変異を欠くＩＤＵＡ－Ｆｃ融合タンパク質を、同様に設計及び構築した。

【0284】

第１の非ＴｆＲ結合「Ｎ末端モノザイム」ＩＤＵＡ－Ｆｃ融合タンパク質（「ＩＤＵＡ－Ｆｃ Ｆｕｓｉｏｎ １２」）を生成したが、これは、配列番号７６の配列を有するＦｃポリペプチドと、配列番号８３の配列を有するＩＤＵＡ－Ｆｃ融合ポリペプチドとを含む。ＩＤＵＡ－Ｆｃ融合タンパク質をまた、細胞培養生成中にさらにプロセシングして、Ｆｃポリペプチドが配列番号７７を有し、及び／またはＩＤＵＡ－Ｆｃ融合ポリペプチドが配列番号８４の配列を有するようにしてもよい。したがって、本明細書で使用される場合、ＩＤＵＡ－Ｆｃ融合タンパク質という用語は、非プロセシング配列（すなわち、配列番号７６及び８３）を有するタンパク質分子；１つ以上のプロセシング配列（すなわち、配列番号７７及び８４から選択される）を含むタンパク質分子を指すか；またはプロセシング及び非プロセシングタンパク質分子を含む混合物を指すために使用され得る。

【0285】

第２の非ＴｆＲ結合「Ｎ末端モノザイム」ＩＤＵＡ－Ｆｃ融合タンパク質（「ＩＤＵＡ－Ｆｃ Ｆｕｓｉｏｎ １３」）を生成したが、これは、配列番号７６の配列を有するＦｃポリペプチドと、配列番号５０の配列を有する第２のＩＤＵＡ－Ｆｃ融合ポリペプチドとを含む。ＩＤＵＡ－Ｆｃ融合タンパク質をまた、細胞培養生成中にさらにプロセシングして、Ｆｃポリペプチドが配列番号７７の配列を有し、及び／またはＩＤＵＡ－Ｆｃ融合ポリペプチドが配列番号５１の配列を有するようにしてもよい。したがって、本明細書で使用される場合、ＩＤＵＡ－Ｆｃ融合タンパク質という用語は、非プロセシング配列（すなわち、配列番号７６及び５０）を有するタンパク質分子を指すか；１つ以上のプロセシング配列（すなわち、配列番号７７及び５１から選択される）を含むタンパク質分子を指すか；またはプロセシング及び非プロセシングタンパク質分子を含む混合物を指すために使用され得る。

【0286】

非ＴｆＲ結合「Ｎ末端バイザイム」ＩＤＵＡ－Ｆｃ融合タンパク質（「ＩＤＵＡ－Ｆｃ Ｆｕｓｉｏｎ １４」）を生成したが、これは、配列番号１０４の配列を有する第１のＩＤＵＡ－Ｆｃポリペプチドと、配列番号５０の配列を有する第２のＩＤＵＡ－Ｆｃ融合ポリペプチドとを含む。ＩＤＵＡ－Ｆｃ融合タンパク質はまた、細胞培養生成中にさらにプロセシングして、第１のＩＤＵＡ－Ｆｃポリペプチドが配列番号１００の配列を有し、及び／または第２のＩＤＵＡ－Ｆｃ融合ポリペプチドが配列番号５１の配列を有するようにしてもよい。したがって、本明細書で使用される場合、ＩＤＵＡ－Ｆｃ Ｆｕｓｉｏｎ １４という用語は、非プロセシング配列（すなわち、配列番号１０４及び５０）を有するタンパク質分子を指すか；１つ以上のプロセシング配列（すなわち、配列番号１００及び５１から選択される）を含むタンパク質分子；またはプロセシング及び非プロセシングタンパク質分子を含む混合物を指すために使用され得る。表２は、ＴｆＲに結合しない例示的なＩＤＵＡ－Ｆｃ融合タンパク質及び組換えタンパク質の配列を示している。

【表2】

【0287】

ＥＴＶ：ＩＤＵＡ（例えば、上記の任意の融合タンパク質）を含む組成物とは、非プロセシング配列を有するタンパク質分子を含む組成物を指すか；１つ以上のプロセシング配列を含むタンパク質分子を含む組成物を指すか；またはプロセシングタンパク質分子と非プロセシングタンパク質分子とを含む混合物を指すために使用され得る。

【0288】

組換えタンパク質の発現及び精製
組換えＩＤＵＡ－Ｆｃ融合タンパク質を発現させるために、ＥｘｐｉＣＨＯ細胞（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に、製造元の使用説明書（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に従ってＥｘｐｉｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＣＨＯトランスフェクションキットを使用して、関連するＤＮＡ構築物をトランスフェクトした。細胞は、オービタルシェーカー（Ｉｎｆｏｒｓ ＨＴ Ｍｕｌｔｉｔｒｏｎ）内で３７℃、５％ＣＯ_２及び１２５ｒｐｍで、製造元のプロトコルに記載されているように、フィードを補充したＥｘｐｉＣＨＯ（商標）発現培地で増殖させた。要するに、対数増殖しているＥｘｐｉＣＨＯ細胞に、培養体積１ｍＬあたり０．８μｇの全ＤＮＡプラスミドを、６×１０^６細胞／ｍｌの密度でトランスフェクトした。トランスフェクション後、細胞を３７℃に戻した。トランスフェクションの１８～２２時間後、トランスフェクトされた培養物に栄養フィードを補充し、生産実行中は細胞培養温度を３２℃に下げた。トランスフェクトされた細胞培養上清を、トランスフェクションの１２０時間後に、４０００ｒｐｍで１５分間遠心分離することにより回収した。清澄化した上清を濾過し（０．２２μＭのメンブレン）、４℃で保存した。

【0289】

ＴｆＲ結合を付与する操作されたＦｃ領域を含む（または含まない）ＩＤＵＡ－Ｆｃ融合タンパク質を、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーを使用して細胞培養上清から精製した。上清を、ＨｉＴｒａｐ ＭａｂＳｅｌｅｃｔ Ｐｒｉｓｍａ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａアフィニティーカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ａｋｔａ Ｐｕｒｅ Ｓｙｓｔｅｍを使用する））にロードした。次に、そのカラムを、１０カラム体積（ＣＶ）のＰＢＳで洗浄した。結合したタンパク質は、５０ｍＭクエン酸緩衝液ｐＨ３．６を使用して溶出した。溶出直後に、１ＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８）（１：８希釈）を使用して画分を中和した。プロテインＡプールは、陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）を使用してさらに精製した。ＨｉＴｒａｐ（登録商標）ＳＰ Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅカラム（Ｃｙｔｉｖａ、ＳＫＵ １７－１１５２－０１）への結合を容易にするために、タンパク質Ａプールを酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）で１０倍に希釈した。カラムは、２０ｍＭの酢酸ナトリウム、０．５ＭのＮａＣｌ、ｐＨ５．５の線形塩勾配を使用して３０ＣＶで溶出した。画分はＨＰＬＣ－ＳＥＣでさらに分析した。純度が９５％を超える画分をプールし、１ＸＰＢＳ、ｐＨ７．４で透析した。ＩＤＵＡ－Ｆｃ融合の最終バルクの均一性は、還元及び非還元キャリパー（マイクロキャピラリー電気泳動－ＳＤＳ）及びＨＰＬＣ－ＳＥＣなどの多数の技術によって評価された。

【0290】

Ｃ末端ヘキサヒスチジンタグ（配列番号９３～９５）を有する組換えＩＤＵＡは、上記のようにＥｘｐｉＣＨＯ細胞で発現された。ヘキサヒスタジンタグ付きＩＤＵＡ酵素を精製するために、トランスフェクトした上清を、１００ｍＭのＮａＣｌを含む２０ｍＭのＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４の１５Ｌに対して一晩透析した。透析された上清を、ＨｉＴｒａｐカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ａｋｔａ Ｐｕｒｅ Ｓｙｓｔｅｍを使用する））に結合した。結合後、そのカラムを２０ＣＶのＰＢＳで洗浄した。結合したタンパク質は、５００ｍＭのイミダゾールを含むＰＢＳを使用して溶出した。ＩＤＵＡ酵素を含むプールされた画分を、５０ｍＭのＴｒｉｓ ｐＨ７．５で１：１０に希釈し、Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用してさらに精製した。結合後、そのカラムを１０ＣＶの５０ｍＭのＴｒｉｓ ｐＨ７．５で洗浄した。結合したタンパク質は、５０ｍＭのＴｒｉｓ ｐＨ７．５及び０．５ＭのＮａＣｌへの直線勾配を使用して溶出して、１ＣＶの画分に収集した。画分の純度は非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって評価された。

【0291】

実施例２：ＩＤＵＡ－Ｆｃ融合タンパク質の特徴付け。
実施例１に記載のとおり構築及び調製したＥＴＶ：ＩＤＵＡ融合タンパク質を、ＴｆＲ結合、酵素活性、及び細胞効力について評価した。

【0292】

操作されたＴｆＲ結合部位を有するＩＤＵＡ－Ｆｃ融合タンパク質は、ヒトＴｆＲに結合する
操作されたＴｆＲ結合を有するＩＤＵＡ－Ｆｃ融合タンパク質が、ヒトＴｆＲと相互作用する改変Ｆｃドメインの能力に影響を与えるか否かを判定するために、ヒトＴｆＲに対するＥＴＶ：ＩＤＵＡ Ｆｕｓｉｏｎ ３、４、及び６（実施例１）の親和性を、Ｂｉａｃｏｒｅ ８Ｋ装置（Ｃｙｔｉｖａ）を用いて表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって測定した。５μｇ／ｍＬのＩＤＵＡ－Ｆｃ融合タンパク質を、プロテインＡコーティングされたＢｉａｃｏｒｅ（商標）シリーズＳ ＣＭ５センサーチップで１分間捕捉し、ヒトアピカルドメインＴｆＲの連続３倍希釈液を３０μＬ／分の流速で注入した。各試料は、ヒトＴｆＲ濃度を増加させながら６０秒間の注入を５回連続して行い、その後、注入サイクルの最後に６０秒間解離させて分析した。各注入後、１０ｍＭグリシン－ＨＣｌ（ｐＨ１．５）を使用して、チップを再生した。結合応答は、同様の密度Ａで無関係なＩｇＧを捕捉するフローセルからＲＵを減算することによって補正された。Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）Ｉｎｓｉｇｈｔ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅを使用した速度論解析には、ｋ_ｏｎとｋ_ｏｆｆを同時にフィッティングする１：１ Ｌａｎｇｕｉｒモデルを使用した。ＥＴＶ：ＩＤＵＡ Ｆｕｓｉｏｎ ３、４、及び６のヒトＴｆＲに対する一価結合親和性は、約２００ｎＭ～４００ｎＭの範囲であった。

【0293】

操作されたＴｆＲ結合部位を有するＩＤＵＡ－Ｆｃ融合タンパク質は、インビトロで活性である
操作されたＴｆＲ結合ＩＤＵＡ－Ｆｃ融合タンパク質のインビトロ活性を評価して、ＩＤＵＡがヒトＩｇＧ断片に融合したとき、その酵素活性を維持することを実証した。組換えＩＤＵＡのインビトロ活性は、人工基質を使用した１ステップの蛍光酵素アッセイを使用して測定した。７０．９６ｍＭの４－メチルウンベリフェリル－α－Ｌ－イズロニド（遊離酸）（Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ ＃１９５４３）のアリコートを、アッセイ緩衝液（５０ｍＭの酢酸ナトリウム、０．５ＭのＮａＣｌ、０．０２５％のＴｒｉｔｏｎ（登録商標） Ｘ－１００、ｐＨ４．５）で希釈し、最終濃度を２．５ｍＭにした。ＩＤＵＡ－Ｆｃ融合タンパク質は、５０ｍＭの濃度から開始して段階的に希釈した。次に、５μＬの基質を、３８４ウェルの黒色平底マイクロプレート（ＮＵＮＣ＃２６２２６０）中で、連続希釈したＩＤＵＡ－Ｆｃ融合タンパク質５μＬと混合した。反応は２２℃で６０分間インキュベートして、１０μＬの停止緩衝液（０．５Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ１０．３）で停止した。次に、反応溶液の蛍光を測定した（励起波長３６５ｎｍ、及び発光波長４５０ｎｍ）。４－メチルウンベリフェロンの標準曲線を非線形回帰によってフィッティングさせて、生成物の量を計算し、全基質切断の１０％未満であることを確認した。比活性（ｐｍｏｌ生成物／分／ｐｍｏｌ ＩＤＵＡ）は、生成物の量を反応時間及びＩＤＵＡのモル量で除すことによって算出した。

【0294】

インビトロ酵素活性アッセイでは、ＩＤＵＡ－Ｆｃ融合タンパク質が活性であり、ＥＴＶ：ＩＤＵＡ Ｆｕｓｉｏｎ ３、４、及び６間で類似していることが実証された（図２）。すべてのＥＴＶ：ＩＤＵＡ融合タンパク質は、Ａｌｄｕｒａｚｙｍｅ（アウドラザイム）（ラロニダーゼ）の活性の約７５％～約９０％の範囲の比活性を示した。

【0295】

改変されたＴｆＲ結合部位を持つＩＤＵＡ－Ｆｃ融合タンパク質は、インビトロでの基質蓄積を修正する
ＩＤＵＡ－Ｆｃ融合タンパク質の細胞活性は、基質補正を評価するためにヘパラン硫酸及びデルマタン硫酸のＬＣＭＳ定量を使用して、ハーラー（ＭＰＳ Ｉ）患者及び健常対照の線維芽細胞でも検査した。簡単に説明すると、ハーラー線維芽細胞と健康な線維芽細胞を、１０％のＦＢＳを補充したＤＭＥＭ培地で２４ウェル培養プレートに、ウェルあたり７５，０００細胞の密度でプレートした。細胞は、コンフルエンスに達するまで、約９６時間この形式で培養した。次に、ＥＴＶ：ＩＤＵＡ Ｆｕｓｉｏｎ １を、開始濃度６２．５ｎＭから１２ポイント、５倍連続希釈用量曲線で各ウェルに添加した。タンパク質を添加してから７２時間後、低張ショックによって細胞を溶解した。溶解物を、９６ウェルアッセイプレートに移し、緩衝液の組成を１１１ｍＭの酢酸アンモニウム及び１１ｍＭの酢酸カルシウムを含むように調整し、超音波処理して溶解を完了した。溶解液のタンパク質濃度をＢＣＡアッセイによって決定し、すべての溶解液を等しいタンパク質濃度に調整した。溶解物に２ｍＭのＤＴＴを補充し、ヘパリナーゼＩ（１．２５ｍＩＵ／反応）、ヘパリナーゼＩＩ（１．２５ｍＩＵ／反応）、ヘパリナーゼＩＩＩ（１．２５ｍＩＵ／反応）、及びコンドロイチナーゼＢ（６．２５ ｍＩＵ／反応）を含む酵素混合物を用いて、ＧＡＧを３０℃で３時間消化した。消化反応は、１０ｍＭのＥＤＴＡでクエンチさせ、各反応に２０ｎｇの４ＵＡ－２Ｓ－ＧｌｃＮＣＯＥｔ－６Ｓ内部標準を添加し、続いて９５℃で１０分間変性させた。遠心濾過により試料から不溶性物質を除去し、清澄化した試料をガラス製ＬＣ－ＭＳバイアル内でアセトニトリルと１：１で混合した。ヘパラン硫酸及びデルマタン硫酸ＧＡＧ由来の二糖類種を、ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ ＢＥＨ Ａｍｉｄｅ １．７ｍｍ、２．１×１５０ｍＭのカラムを備えたＸｅｖｏ ＴＱ－Ｓ Ｍｉｃｒｏ装置でＬＣ－ＭＳ／ＭＳによって定量した。

【0296】

ＭＰＳ Ｉ患者の線維芽細胞は、ＩＤＵＡ活性を欠いており、２つのグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）種であるヘパラン硫酸及びデルマタン硫酸の蓄積につながる。ＥＴＶ：ＩＤＵＡ Ｆｕｓｉｏｎ １は、ＭＰＳ Ｉ患者由来細胞においてラロニダーゼと同様の効力を示し、ヘパラン硫酸の蓄積を減らすための低いピコモル細胞ＥＣ_５０（約７～１０ｐＭ）を示した（図３）。

【0297】

ＴｆＲ結合部位を改変したＩＤＵＡ－Ｆｃ融合タンパク質は、ＴｆＲ ＫＩマウスの脳への取り込み増大を示す
ＴｆＲノックイン（以下「ＴｆＲ^{ｍｕ／ｈｕ}ＫＩ」または「ＴｆＲ^{ｍｕ／ｈｕ}」と表記）マウスにおけるＩＤＵＡ－Ｆｃ融合タンパク質の末梢（血清）及び脳ＰＫを評価した。ＴｆＲ^{ｍｓ／ｈｕ}ＫＩマウスは、国際特許出願番号ＷＯ２０１８／１５２２８５に記載のとおり、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技術を使用して、マウスＴｆｒｃ遺伝子内のヒトＴｆｒｃアピカルドメインを発現するように作製された。得られるキメラＴｆＲは、内因性プロモーターの制御下でインビボで発現させた。簡単に説明すると、６～８週齢の雄性ＴｆＲ^{ｍｕ／ｈｕ}ＫＩマウス（コホートあたりｎ＝１２）にＥＴＶ：ＩＤＵＡ融合タンパク質４０ｍｇ／ｋｇを投与し、血清及び脳組織中のＩＤＵＡ酵素及びＥＴＶ：ＩＤＵＡ完全分子の濃度を測定した。総ＩＤＵＡ酵素レベルは、サンドイッチＥＬＩＳＡベースのアッセイを使用して、血清については投与後ｔ＝０．２５、０．５、１、４、８、１０、２４、及び４８時間で測定され、脳ＰＫについては投与後ｔ＝１、８、２４、４８時間で測定された。分析に使用したＩＤＵＡ－Ｆｃ融合タンパク質は上記の通りであり、実施例１に従って調製した。総ＩＤＵＡ酵素レベルの測定のために、ポリクローナルヒツジ抗ヒトＩＤＵＡ抗体（Ｂｉｏ－Ｔｅｃｈｎｅ ＡＦ４１１９）を、ＭＵＬＴＩ－ＡＲＲＡＹ（登録商標）９６ウェルプレート（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｌ１５ＸＡ－３）に一晩コーティングした。そのプレートをＰＢＳ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ３７５２８）、ＢＳ中のＢｌｏｃｋｅｒ（商標）Ｃａｓｅｉｎでブロックし、その後希釈した血清または脳溶解物とインキュベートした。次に、ルテニウム結合ポリクローナルヒツジ抗ヒトＩＤＵＡ抗体（Ｂｉｏ－Ｔｅｃｈｎｅ ＡＦ４１１９）を、検出用に加えた。界面活性剤を含む１×Ｒｅａｄ緩衝液Ｔ（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｒ９２ＴＣ－１）を各ウェルに加え、プレートして、ＭＳＤリーダーにロードした。標準曲線は個々の構築物に基づいており、４パラメータのロジスティック曲線を使用して適合させた。結果は、図４Ａ～４Ｃ及び図５Ａ～５Ｃならびに表３に示されている。

【0298】

ＥＴＶ：ＩＤＵＡ Ｆｕｓｉｏｎ ３、４、及び６は循環中で良好な安定性を示した。すべての分子で高い脳Ｃｍａｘ値（約１５ｎＭ以上）が観察され、すべての分子の脳への取り込みは末梢曝露と一致していた。

【表3】

【0299】

実施例３：ＥＴＶ：ＩＤＵＡ Ｆｕｓｉｏｎｓの生成物品質属性。
さまざまなＥＴＶ：ＩＤＵＡ融合タンパク質を製品品質の観点から評価した。この研究では、ＥＴＶ：ＩＤＵＡ Ｆｕｓｉｏｎ ３、４、及び６（実施例１）を評価した。すべての構造は、実施例１で説明したように準備された。溶出画分中のＥＴＶ：ＩＤＵＡ融合タンパク質の均一性は、還元及び非還元キャリパー（マイクロキャピラリー電気泳動－ＳＤＳ）及びＨＰＬＣ－ＳＥＣなどのさまざまな技術によって評価した。ヒトＴｆＲに対する親和性を、実施例２に記載されるように測定した。

【0300】

結果
実施例２で説明したように、ＥＴＶ：ＩＤＵＡ Ｆｕｓｉｏｎ ３及び６に対する測定されたヒトＴｆＲ親和性は同等であった（Ｋ_Ｄは、約２００～４００ｎＭの範囲）。
ＥＴＶ：ＩＤＵＡ Ｆｕｓｉｏｎ ３、４、及び６の発現力価は、約１００ｍｇ／Ｌを超えた。

【0301】

ＥＴＶ：ＩＤＵＡ Ｆｕｓｉｏｎ ３、４、及び６のタンパク質Ａクロマトグラフィー精製後の回収率を評価した。全ての構造のプロテインＡ後のプールの分析によって、少なくとも約９０％のインタクトなＥＴＶ構造（ノブ及びホールの対を含む改変Ｆｃ二量体の維持）を伴う、少なくとも８５％の純度が示された（ＨＰＬＣ－ＳＥＣで測定）。すべての構造のプロテインＡ後のプールは、さらに洗練させるために陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）にかけた。全ての構造のＣＥＸ後プールは、＞９５％のインタクトなＥＴＶ構造を伴い、＞９９％の純度レベル（ＨＰＬＣ－ＳＥＣで測定）を達成した。

【0302】

ＥＴＶ：ＩＤＵＡ融合タンパク質の製品品質特性の概要を表４に示す。

【表4】

【0303】

実施例４：ＭＰＳ Ｉの疾患モデルにおけるＥＴＶ：ＩＤＵＡ融合タンパク質とラロニダーゼの比較研究。
代表的なＥＴＶ：ＩＤＵＡ融合タンパク質（ＥＴＶ：ＩＤＵＡ Ｆｕｓｉｏｎ ３）を、ＭＰＳ Ｉのマウスモデルにおける標準治療の酵素補充療法であるラロニダーゼと比較した。

【0304】

結果
ＥＴＶ：ＩＤＵＡ及びラロニダーゼを、単回静脈内（ＩＶ）投与後にＩＤＵＡ ＫＯ；ＴｆＲ^{ｍｕ／ｈｕ}ＫＩマウスの脳、ＣＳＦ、及び肝臓における総ＧＡＧレベルを、そのタンパク質がどの程度低下させるかについて比較した。ＥＴＶ：ＩＤＵＡ Ｆｕｓｉｏｎ ３を、ラロニダーゼと等モル量（０．８５ｍｇ／ｋｇ）、等モル量の約１０倍の量（８．８ｍｇ／ｋｇ）、及び高用量レベル（４０ｍｇ／ｋｇ）でマウスに投与し、ラロニダーゼは治療のための臨床的に関連する用量（０．５８ｍｇ／ｋｇ）と一致する用量で投与した。総ＧＡＧは、主要なヘパラン硫酸（ＨＳ）（Ｄ０Ａ０、Ｄ０Ｓ０）及びデルマタン硫酸（ＤＳ）（Ｄ０ａ４）由来の二糖類の合計として決定した。図６Ａ～６Ｄ及び表５に示すように、単回投与から７日後、ＥＴＶ：ＩＤＵＡタンパク質は、脳脊髄液（ＣＳＦ）と脳組織の両方で総ＧＡＧレベルを低下し得、この低下はラロニダーゼで達成された効果よりも優れていた。総ＧＡＧレベルの減少は、ラロニダーゼの用量と等モルの用量を含め、ＥＴＶ：ＩＤＵＡの３種類の投与量すべてで確認された（ＣＳＦ：７９％減少対３６％減少；脳：３８％減少対Ｎ／Ｓ減少）。肝臓では、投与されたすべての用量において、ラロニダーゼとＥＴＶ：ＩＤＵＡタンパク質のとの間の総ＧＡＧ減少は同様であった。尿中では、ＥＴＶ：ＩＤＵＡは、等モル用量でラロニダーゼ（０．８５ｍｇ／ｋｇ）と同等に総ＧＡＧレベルを低下させた。しかし、ＥＴＶ：ＩＤＵＡの高用量（例えば、８．８ｍｇ／ｋｇ及び４０ｍｇ／ｋｇ）では、尿中の総ＧＡＧレベルの低下はラロニダーゼよりも良好であった。

【表5】

【0305】

図６Ａ～６Ｄのデータは、おおよその平均量＋／－平均の標準誤差を表している。その結果、ＥＴＶ：ＩＤＵＡがＣＳＦ、脳、及び尿中の基質蓄積を確実に減少させ、この減少が標準治療であるＥＲＴ治療に比べて改善を示したことが示されている。

【0306】

実験方法
ＥＴＶ：ＩＤＵＡ Ｆｕｓｉｏｎ ３は、実施例１で説明したように発現及び精製された。ラロニダーゼは、市販品（ＮＤＣ ５８４６８－００７０－１、ロット番号０Ｙ０４３２）から入手した。

【0307】

この研究で使用したＭＰＳ Ｉマウスモデルは、ＩＤＵＡをコードする遺伝子がノックアウトされているが、マウスＴｆＲにノックアウトされたヒトＴｆＲアピカルドメインも有するマウスモデルである（本明細書では「ＩＤＵＡ ＫＯ；ＴｆＲ^{ｍｕ／ｈｕ}ＫＩ」または「ＩＤＵＡ ＫＯ；ＴｆＲ^{ｍｕ／ｈｕ}」マウスと呼ぶ）。ＩＤＵＡ ＫＯマウスは、Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（ＪＡＸ ストック番号００４０６８）から入手した。簡単に説明すると、ＴｆＲ^{ｍｕ／ｈｕ}ＫＩ雄性マウス（実施例２参照；本明細書では「ＴｆＲ^{ｍｕ／ｈｕ}」と称される）を、ＩＤＵＡ変異についてヘテロ接合性である雌性マスと交配させて、ＴｆＲ^{ｍｕ／ｈｕ}ＫＩホモ接合バックグラウンドのホモ接合性のＩＤＵＡ ＫＯマウスを作製した。この研究で使用されたマウスは混合の性別であり、１２時間の明暗サイクルの下で、食物（＃２５５０２、照射；ＬａｂＤｉｅｔ）及び水を自由に摂取させて飼育した。

【0308】

この研究では、ＩＤＵＡ ＫＯ；ＴｆＲ^{ｍｕ／ｈｕ}ＫＩマウスに、ＥＴＶ：ＩＤＵＡ Ｆｕｓｉｏｎ ３またはラロニダーゼを静脈内注射で単回投与し、薬力学的反応を評価した。特に、タンパク質の末梢投与がＩＤＵＡ ＫＯ；ＴｆＲ^{ｍｕ／ｈｕ}ＫＩマウスの脳、ＣＳＦ、肝臓、及び尿中の総ＧＡＧレベルに及ぼす影響を調べた。約２ヶ月齢のＩＤＵＡ ＫＯ；ＴｆＲ^{ｍｕ／ｈｕ}ＫＩに、生理食塩水、ＥＴＶ：ＩＤＵＡ融合タンパク質（０．８５、８．８、または４０ｍｇ／ｋｇ体重）、またはラロニダーゼ（０．５８ｍｇ／ｋｇ体重）を静脈内（ｉ．ｖ．）注射した（ｎ＝４～５／群）。生理食塩水をｉ．ｖ．注射した約２か月齢の同腹子ＴｆＲ^{ｍｕ／ｈｕ}ＫＩマウス（非ＭＰＳ Ｉマウス）を、対照として使用した。尿試料を、単回投与後６日目と７日目に採取して、分析のためにプールした。単回投与後７日目に、すべての動物を屠殺し、脳、ＣＳＦ、及び肝臓組織を採取した。収集されたすべての組織及び体液をドライアイスで急速冷凍し、分析まで－８０℃で保存した。

【0309】

ヘパラン硫酸及びデルマタン硫酸種は、以下に説明するＬＣ－ＭＳ／ＭＳベースの方法を使用して、インビボで測定した。Ｑｉａｇｅｎ ＴｉｓｓｕｅＬｙｚｅｒ ＩＩを３０Ｈｚで３分間、２回使用して、組織アリコート（５０ｍｇ）を水（５００～７５０μＬ）中で均質化した。ホモジネートを、９６ウェルディーププレートに移し、９６チップ超音波処理装置（Ｑ Ｓｏｎｉｃａ）を使用して２０×１秒のパルスで超音波処理した。超音波処理したホモジネートを、１７，０００×ｇで２０分間、４℃で遠心させ、細胞破片をペレット化した。得られた溶解物を清澄な９６ウェルディーププレートに移し、ＢＣＡを実行して総タンパク質を定量した。試料中のヘパラン硫酸（ＨＳ）及びデルマタン硫酸（ＤＳ）は、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析の前に、対応する二糖類に消化された。タンパク質溶解物（脳及び肝臓組織由来）及びＣＳＦ及び尿を、ヘパリナーゼＩ、ＩＩ、ＩＩＩ及び内部標準Ｄ４ＵＡ－２Ｓ－ＧｌｃＮＣＯＥｔ－６Ｓ（ＨＤ００９，Ｉｄｕｒｏｎ Ｌｔｄ，Ｍａｎｃｈｅｓｔｅｒ，ＵＫ）と、酢酸アンモニウム、酢酸カルシウム、及びＤＴＴからなる消化緩衝液中で混合し、ＰＣＲプレート中で３０℃で３時間振とう（７００ｒｐｍ）した。尿については、安定標識クレアチニン（内部標準、Ｎ－メチル－Ｄ３、９８％）も混合物に加えた。３時間のインキュベーション後、各試料に０．００２５ＭのＥＤＴＡを加えて反応を停止し、その混合物を９５℃で１０分間煮沸して酵素を不活性化した。脳、肝臓、ＣＳＦ、及び尿由来の消化試料を遠心分離し、上清をセルロースアセテートフィルタープレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＭＳＵＮ０３０１０）に移して再度遠心分離した。脳、ＣＳＦ及び尿試料のために、得られた溶出液を、９６ウェルのガラスバイアルプレート中で等量のアセトニトリルと混合し、以下のように質量分析によって分析した。肝臓の場合、得られた溶出液を２倍量のアセトニトリルと混合した。

【0310】

体液及び組織中のＨＳ及びＤＳ由来の二糖類の定量は、液体クロマトグラフィー（Ｅｘｉｏｎ ＬＣ，Ｓｃｉｅｘ，Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ；Ａｇｉｌｅｎｔ １２９０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ ＩＩ ＨＰＬＣ，Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．，Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ，ＵＳＡ）とエレクトロスプレー質量分析法（Ｓｃｉｅｘ Ｔｒｉｐｌｅ Ｑｕａｄ ７５００，Ｓｃｉｅｘ，Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ；Ｓｃｉｅｘ Ｔｒｉｐｌｅ Ｑｕａｄ ６５００＋，Ｓｃｉｅｘ，Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）を組み合わせて実施した。両方の液体クロマトグラフィーでの各分析では、ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ ＢＥＨ Ａｍｉｄｅ １．７ｍｍ、２．１×１５０ｍｍカラム（Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ、ＵＳＡ）に、流速０．６ｍＬ／分を、カラム温度５５℃で用いて試料を注入した。移動相Ａは、１０ｍＭギ酸アンモニウム及び０．１％ギ酸を含む水で構成され、移動相Ｂは、０．１％ギ酸を含むアセトニトリルで構成されていた。勾配を、以下のようにプログラムした：８０％Ｂで０．０～６．０分、８０％Ｂ～２０％Ｂで６．０～６．０１分、２０％Ｂ～２０％Ｂで６．０１～８．０分、２０％Ｂ～８０％Ｂで８．０～８．１分、及び８０％Ｂで８．１～１０分保持。Ｓｃｉｅｘ Ｔｒｉｐｌｅ Ｑｕａｄ ７５００のために、エレクトロスプレーイオン化を、以下の設定を適用して負イオン化モードで実行した：カーテンガス４０；イオンスプレー電圧－４５００；温度４５０℃；イオン源ガス１が５０；及びイオン源ガス２が６０。Ｓｃｉｅｘ ＯＳ ２．１．６．５９７８１を、多重反応モニタリングモード（ＭＲＭ）を使用して、以下の設定を用いて、データ取得を実行した：滞留期間１００ｍｓｅｃ；衝突エネルギー－３０；入口電位－１０；衝突セル出口電位－１０。Ｓｃｉｅｘ Ｔｒｉｐｌｅ Ｑｕａｄ ６５００＋の場合、エレクトロスプレーイオン化は、以下の設定を適用して、負イオン化モードで実行した：カーテンガス ２０、イオンスプレー電圧－４５００、温度４５０℃；イオン源ガス１が５０、及びイオン源ガス２が６０。Ａｎａｌｙｓｔ １．７．１を、ＭＲＭを使用して、以下の設定を用いて、データ取得を実行した：滞留期間１００ｍｓｅｃ；衝突エネルギー－３０；デクラスタリング電位－８０；入口電位－１０；衝突セル出口電位－１０。個々の二糖種は、市販の参照標準（Ｉｄｕｒｏｎ Ｌｔｄ）を使用して、保持時間及びＭＲＭトランジションに基づいて同定した。Ｓｃｉｅｘ Ｔｒｉｐｌｅ Ｑｕａｄ ７５００及びＳｃｉｅｘ Ｔｒｉｐｌｅ Ｑｕａｄ ６５００＋では、次の二糖遷移をモニタリングした：Ｄ０Ａ０（ＨＳ）、ｍ／ｚ ３７８＞８７；Ｄ０Ｓ０（ＨＳ）、ｍ／ｚ ４１６＞１３８、及びＤ０ａ４（ｍ／ｚ ４５８＞３００）；Ｄ４ＵＡ－２Ｓ－ＧｌｃＮＣＯＥｔ－６Ｓ（内部標準）ｍ／ｚ ４７２＞９７。二糖類の量は、ＢＣＡアッセイで測定された総タンパク質レベル、または試料あたりに使用された体液の量に対して正規化された。

【表6-1】

【表6-2】

【表6-3】

【表6-4】

【表6-5】

【表6-6】

【表6-7】

【表6-8】

【表6-9】

【表6-10】

【表6-11】

【表6-12】

【表6-13】

【表6-14】

【表6-15】

【表6-16】

【表6-17】

【表6-18】

【表6-19】

【表6-20】

【表6-21】

【表6-22】

【表6-23】

【表6-24】

【表6-25】

【表6-26】

【表6-27】

【表6-28】

【表6-29】

【表6-30】

【表6-31】

【表6-32】

【表6-33】

【表6-34】

【表6-35】

【0311】

すべての刊行物、特許、及び特許文書は、参照により個別に組み込まれるかのように、参照により本明細書に組み込まれる。本開示は、種々の具体的かつ好ましい実施形態及び技術を参照して記載してきた。しかしながら、本発明の主旨及び範囲内に留まりながら、多くの変形及び改変を行うことができることを理解されたい。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4A】

【図4B】

【図4C】

【図5A】

【図5B】

【図5C】

【図6A】

【図6B】

【図6C】

【図6D】

【国際調査報告】