特表 2024-546130 癌の免疫療法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-12-17

(54)【発明の名称】癌の免疫療法

(51)【国際特許分類】

   C07K 19/00 20060101AFI20241210BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20241210BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20241210BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20241210BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20241210BHJP

   C12N 15/09 20060101ALI20241210BHJP

   C12N 15/62 20060101ALI20241210BHJP

   C12N 15/13 20060101ALI20241210BHJP

   C07K 16/28 20060101ALI20241210BHJP

   C12N 15/12 20060101ALI20241210BHJP

   C12N 15/85 20060101ALI20241210BHJP

   A61K 47/68 20170101ALI20241210BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20241210BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20241210BHJP

   A61P 35/02 20060101ALI20241210BHJP

【ＦＩ】

C07K19/00

C12N1/15 ZNA

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

C12N15/09 Z

C12N15/62 Z

C12N15/13

C07K16/28

C12N15/12

C12N15/85 Z

A61K47/68

A61K39/395 N

A61P35/00

A61P35/02

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024534730

(86)(22)【出願日】2022-12-12

(85)【翻訳文提出日】2024-08-09

(86)【国際出願番号】 GB2022053174

(87)【国際公開番号】W WO2023105248

(87)【国際公開日】2023-06-15

(31)【優先権主張番号】2117928.8

(32)【優先日】2021-12-11

(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＷＥＥＮ

(71)【出願人】

【識別番号】598176569

【氏名又は名称】キャンサー・リサーチ・テクノロジー・リミテッド

【氏名又は名称原語表記】ＣＡＮＣＥＲ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ ＬＩＭＩＴＥＤ

(71)【出願人】

【識別番号】506042265

【氏名又は名称】メディミューン リミテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100079108

【弁理士】

【氏名又は名称】稲葉 良幸

(74)【代理人】

【識別番号】100109346

【弁理士】

【氏名又は名称】大貫 敏史

(74)【代理人】

【識別番号】100117189

【弁理士】

【氏名又は名称】江口 昭彦

(74)【代理人】

【識別番号】100134120

【弁理士】

【氏名又は名称】内藤 和彦

(72)【発明者】

【氏名】アディマン，アレクサンドラ

(72)【発明者】

【氏名】アンダーソン，ジョージナ

(72)【発明者】

【氏名】オースティン，マーク

(72)【発明者】

【氏名】バーナード，ミシェル

(72)【発明者】

【氏名】チャン，デニス ツ ヤウ

(72)【発明者】

【氏名】チャップマン，マイケル

(72)【発明者】

【氏名】ディアマンダキス，アガタ

(72)【発明者】

【氏名】グローブス，マリア

(72)【発明者】

【氏名】ホーソーン，ウィリアム

(72)【発明者】

【氏名】ヘインズ，ステュアート

(72)【発明者】

【氏名】ジェンキンソン，レスリー

(72)【発明者】

【氏名】ラポイント，ジーン－マーティン

(72)【発明者】

【氏名】マーティン，カースティー－ジェーン

(72)【発明者】

【氏名】スラター，ルイーズ

(72)【発明者】

【氏名】ヴォーン，トリスタン

【テーマコード（参考）】

4B065

4C076

4C085

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B065AA01X

4B065AA57X

4B065AA72X

4B065AA90X

4B065AA90Y

4B065AB01

4B065BA02

4B065CA43

4B065CA44

4C076AA95

4C076CC27

4C076CC41

4C076EE59

4C085AA14

4C085AA27

4C085BB01

4C085BB11

4C085EE01

4C085GG02

4C085GG04

4H045AA11

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA09

4H045BA10

4H045BA41

4H045BA72

4H045CA40

4H045DA76

4H045EA28

4H045FA74

4H045GA21

4H045GA26

(57)【要約】

抗ヒトＳＥＭＡ４Ａヒト化抗体又はヒト抗体と、リンカーと、細胞毒素と、を含む抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

抗ヒト－ＳＥＭＡ４Ａヒト抗体若しくはヒト化抗体又はその抗原結合断片と、リンカーと、細胞毒素と、を含む抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）。

【請求項2】

前記抗体が、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含むＶ_Ｈ並びにＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含むＶ_Ｌを含み、前記ＣＤＲが、
（ａ）５Ｅ３（配列番号：３、４、５、１２、１３、１４）；
（ｂ）５Ｈｇ１－５Ｌｇ１（配列番号：２１、２２、２３、３０、３１、３２）；
（ｃ）５Ｈｇ１－５Ｌｇ２（配列番号：３９、４０、４１、４８、４９、５０）；
（ｄ）５Ｈｇ２－５Ｌｇ１（配列番号：５７、５８、５９、６６、６７、６８）；
（ｅ）５Ｈｇ２－５Ｌｇ２（配列番号：７５、７６、７７、８４、８５、８６）；
（ｆ）５Ｈｇ２－５Ｌｇ３（配列番号：９３、９４、９５、１０２、１０３、１０４）；
（ｇ）５Ｈｇ２－５Ｌｇ５（配列番号：１１１、１１２、１１３、１２０、１２１、１２２）；
（ｈ）５Ｈｇ２－５Ｌｇ６（配列番号：１２９、１３０、１３１、１３８、１３９、１４０）；
（ｉ）５Ｈｇ４－５Ｌｇ１（配列番号：１４７、１４８、１４９、１５６、１５７、１５８）；
（ｊ）５Ｈｇ４－５Ｌｇ２（配列番号：１６５、１６６、１６７、１７４、１７５、１７６）；
（ｋ）５Ｈｇ４－５Ｌｇ４（配列番号：１８３、１８４、１８５、１９２、１９３、１９４）；
（ｌ）５Ｈｇ４－５Ｌｇ５（配列番号：２０１、２０２、２０３、２１０、２１１、２１２）；
（ｍ）５Ｈｇ５－５Ｌｇ２（配列番号：２１９、２２０、２２１、２２８、２２９、２３０）；
（ｎ）Ｃ０１２０９０３（配列番号：２３７、２３８、２３９、２４６、２４７、２４８）；
（ｏ）Ｃ０１２０９０４（配列番号：２５５、２５６、２５７、２６４、２６５、２６６）；
（ｐ）Ｃ０１２０９０５（配列番号：２７３、２７４、２７５、２８２、２８３、２８４）；
（ｑ）Ｃ０１２０９０６（配列番号：２９１、２９２、２９３、３００、３０１、３０２）；
（ｒ）Ｃ０１２０９１０（配列番号：３０９、３１０、３１１、３１８、３１９、３２０）；
（ｓ）Ｃ０１２０９１３（配列番号：３２７、３２８、３２９、３３６、３３７、３３８）；
（ｔ）Ｃ０１２０９１４（配列番号：３４５、３４６、３４７、３５４、３５５、３５６）；
（ｕ）Ｃ０１２０９１７（配列番号：３６３、３６４、３６５、３７２、３７３、３７４）；
（ｖ）Ｃ０１２０９１８（配列番号：３８１、３８２、３８３、３９０、３９１、３９２）；
（ｗ）Ｃ０１２０９１９（配列番号：３９９、４００、４０１、４０８、４０９、４１０）；
（ｘ）Ｃ０１２０９２０（配列番号：４１７、４１８、４１９、４２６、４２７、４２８）；
（ｙ）Ｃ０１２０９２１（配列番号：４３５、４３６、４３７、４４４、４４５、４４６）；
（ｚ）Ｃ０１２０９２２（配列番号：４５３、４５３、４５５、４６２、４６３、４６４）；
（ａａ）Ｃ０１２０９２３（配列番号：４７１、４７２、４７３、４８０、４８１、４８２）；
（ｂｂ）Ｃ０１２０９２４（配列番号：４８９、４９０、４９１、４９８、４９９、５００）；
（ｃｃ）Ｃ０１２０９２５（配列番号：５０７、５０８、５０９、５１６、５１７、５１８）；
（ｄｄ）Ｃ０１２０９２６（配列番号：５２５、５２６、５２７、５３４、５３５、５３６）；
（ｅｅ）Ｃ０１２０９２７（配列番号：５４３、５４４、５４５、５５２、５５３、５５４）；
（ｆｆ）Ｃ０１２０９２８（配列番号：５６１、５６２、５６３、５７０、５７１、５７２）；
（ｇｇ）Ｃ０１２０９２９（配列番号：５７９、５８０、５８１、５８８、５８９、５９０）及び
（ｈｈ）Ｃ０１２０９３０（配列番号：５９７、５９８、５９９、６０６、６０７、６０８）
のＣＤＲから選択され、
前記ＣＤＲはKabat命名法に従って定義される、請求項１に記載のＡＤＣ。

【請求項3】

前記抗体が、
ａ．５Ｈｇ１－５Ｌｇ１（配列番号：２０及び２９）；
ｂ．５Ｈｇ１－５Ｌｇ２（配列番号：３８及び４７）；
ｃ．５Ｈｇ２－５Ｌｇ１（配列番号：５６及び６５）；
ｄ．５Ｈｇ２－５Ｌｇ２（配列番号：７４及び８３）；
ｅ．５Ｈｇ２－５Ｌｇ３（配列番号：９２及び１０１）；
ｆ．５Ｈｇ２－５Ｌｇ５（配列番号：１１０及び１１９）；
ｇ．５Ｈｇ２－５Ｌｇ６（配列番号：１２８及び１３７）；
ｈ．５Ｈｇ４－５Ｌｇ１（配列番号：１４６及び１５５）；
ｉ．５Ｈｇ４－５Ｌｇ２（配列番号：１６４及び１７３）；
ｊ．５Ｈｇ４－５Ｌｇ４（配列番号：１８２及び１９１）；
ｋ．５Ｈｇ４－５Ｌｇ５（配列番号：２００及び２０９）；
ｌ．５Ｈｇ５－５Ｌｇ２（配列番号：２１８及び２２７）；
ｍ．Ｃ０１２０９０３（配列番号：２３６及び２４５）；
ｎ．Ｃ０１２０９０４（配列番号：２５４及び２６３）；
ｏ．Ｃ０１２０９０５（配列番号：２７２及び２８１）；
ｐ．Ｃ０１２０９０６（配列番号：２９０及び２９９）；
ｑ．Ｃ０１２０９１０（配列番号：３０８及び３１７）；
ｒ．Ｃ０１２０９１３（配列番号：３２６及び３３５）；
ｓ．Ｃ０１２０９１４（配列番号：３４４及び３５３）；
ｔ．Ｃ０１２０９１７（配列番号：３６２及び３７１）；
ｕ．Ｃ０１２０９１８（配列番号：３８０及び３８９）；
ｖ．Ｃ０１２０９１９（配列番号：３９８及び４０７）；
ｗ．Ｃ０１２０９２０（配列番号：４１６及び４２５）；
ｘ．Ｃ０１２０９２１（配列番号：４３４及び４４３）；
ｙ．Ｃ０１２０９２２（配列番号：４５２及び４６１）；
ｚ．Ｃ０１２０９２３（配列番号：４７０及び４７９）；
ａａ．Ｃ０１２０９２４（配列番号：４８８及び４９７）；
ｂｂ．Ｃ０１２０９２５（配列番号：５０６及び５１５）；
ｃｃ．Ｃ０１２０９２６（配列番号：５２４及び５３３）；
ｄｄ．Ｃ０１２０９２７（配列番号：５４２及び５５１）；
ｅｅ．Ｃ０１２０９２８（配列番号：５６０及び５６９）；
ｆｆ．Ｃ０１２０９２９（配列番号：５７８及び５８７）；及び
ｇｇ．Ｃ０１２０９３０（配列番号：５９６及び６０５）；
のＶ_Ｈ及びＶ_Ｌから選択されるＶ_Ｈ及びＶ_Ｌを含み、
前記配列が、Kabat命名法によって定義される、請求項１又は請求項２に記載のＡＤＣ。

【請求項4】

前記細胞毒素が微小管阻害剤（例えば、メイタンシノイド又はアウリスタチン）である、請求項１～３のいずれか一項に記載のＡＤＣ。

【請求項5】

前記細胞毒素が、モノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ、ベドチン）及びメルタンシン（ＤＭ１又はＳＭＣＣリンカーを有するエムタンシンとして）から選択される、請求項１～４のいずれか一項に記載のＡＤＣ。

【請求項6】

前記リンカーが、切断不可能なリンカーであるか、又は切断可能なリンカーである、請求項１～５のいずれか一項に記載のＡＤＣ。

【請求項7】

前記細胞毒素がモノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）であり、前記リンカーがｍｃ－ｖｃＰＡＢリンカー（マレイミド系リンカー、システイン連結）であるか、又は前記細胞毒素がメルタンシン（ＤＭ１）であり、前記リンカーがＳＭＣＣリンカー（ＮＨＳエステル系、リジン）である、請求項１～６のいずれか一項に記載のＡＤＣ。

【請求項8】

前記ＳＥＭＡ４Ａに結合したＡＤＣが、その表面上にヒトＳＥＭＡ４Ａを発現する細胞に内在化することができる、請求項１～７のいずれか一項に記載のＡＤＣ。

【請求項9】

前記ＳＥＭＡ４Ａに結合したＡＤＣが、その表面上にヒトＳＥＭＡ４Ａを発現する細胞に内在化することができ、前記細胞への前記ＡＤＣの内在化が、細胞死をもたらす、請求項１～８のいずれか一項に記載のＡＤＣ。

【請求項10】

ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含むＶ_Ｈ並びにＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含むＶ_Ｌを含むヒト又はヒト化抗ヒトＳＥＭＡ４Ａ抗体であって、前記ＣＤＲが、
（ａ）５Ｅ３（配列番号：３、４、５、１２、１３、１４）；
（ｂ）５Ｈｇ１－５Ｌｇ１（配列番号：２１、２２、２３、３０、３１、３２）；
（ｃ）５Ｈｇ１－５Ｌｇ２（配列番号：３９、４０、４１、４８、４９、５０）；
（ｄ）５Ｈｇ２－５Ｌｇ１（配列番号：５７、５８、５９、６６、６７、６８）；
（ｅ）５Ｈｇ２－５Ｌｇ２（配列番号：７５、７６、７７、８４、８５、８６）；
（ｆ）５Ｈｇ２－５Ｌｇ３（配列番号：９３、９４、９５、１０２、１０３、１０４）；
（ｇ）５Ｈｇ２－５Ｌｇ５（配列番号：１１１、１１２、１１３、１２０、１２１、１２２）；
（ｈ）５Ｈｇ２－５Ｌｇ６（配列番号：１２９、１３０、１３１、１３８、１３９、１４０）；
（ｉ）５Ｈｇ４－５Ｌｇ１（配列番号：１４７、１４８、１４９、１５６、１５７、１５８）；
（ｊ）５Ｈｇ４－５Ｌｇ２（配列番号：１６５、１６６、１６７、１７４、１７５、１７６）；
（ｋ）５Ｈｇ４－５Ｌｇ４（配列番号：１８３、１８４、１８５、１９２、１９３、１９４）；
（ｌ）５Ｈｇ４－５Ｌｇ５（配列番号：２０１、２０２、２０３、２１０、２１１、２１２）；
（ｍ）５Ｈｇ５－５Ｌｇ２（配列番号：２１９、２２０、２２１、２２８、２２９、２３０）；
（ｎ）Ｃ０１２０９０３（配列番号：２３７、２３８、２３９、２４６、２４７、２４８）；
（ｏ）Ｃ０１２０９０４（配列番号：２５５、２５６、２５７、２６４、２６５、２６６）；
（ｐ）Ｃ０１２０９０５（配列番号：２７３、２７４、２７５、２８２、２８３、２８４）；
（ｑ）Ｃ０１２０９０６（配列番号：２９１、２９２、２９３、３００、３０１、３０２）；
（ｒ）Ｃ０１２０９１０（配列番号：３０９、３１０、３１１、３１８、３１９、３２０）；
（ｓ）Ｃ０１２０９１３（配列番号：３２７、３２８、３２９、３３６、３３７、３３８）；
（ｔ）Ｃ０１２０９１４（配列番号：３４５、３４６、３４７、３５４、３５５、３５６）；
（ｕ）Ｃ０１２０９１７（配列番号：３６３、３６４、３６５、３７２、３７３、３７４）；
（ｖ）Ｃ０１２０９１８（配列番号：３８１、３８２、３８３、３９０、３９１、３９２）；
（ｗ）Ｃ０１２０９１９（配列番号：３９９、４００、４０１、４０８、４０９、４１０）；
（ｘ）Ｃ０１２０９２０（配列番号：４１７、４１８、４１９、４２６、４２７、４２８）；
（ｙ）Ｃ０１２０９２１（配列番号：４３５、４３６、４３７、４４４、４４５、４４６）；
（ｚ）Ｃ０１２０９２２（配列番号：４５３、４５４、４５５、４６２、４６３、４６４）；
（ａａ）Ｃ０１２０９２３（配列番号：４７１、４７２、４７３、４８０、４８１、４８２）；
（ｂｂ）Ｃ０１２０９２４（配列番号：４８９、４９０、４９１、４９８、４９９、５００）；
（ｃｃ）Ｃ０１２０９２５（配列番号：５０７、５０８、５０９、５１６、５１７、５１８）；
（ｄｄ）Ｃ０１２０９２６（配列番号：５２５、５２６、５２７、５３４、５３５、５３６）；
（ｅｅ）Ｃ０１２０９２７（配列番号：５４３、５４４、５４５、５５２、５５３、５５４）；
（ｆｆ）Ｃ０１２０９２８（配列番号：５６１、５６２、５６３、５７０、５７１、５７２）；
（ｇｇ）Ｃ０１２０９２９（配列番号：５７９、５８０、５８１、５８８、５８９、５９０）及び
（ｈｈ）Ｃ０１２０９３０（配列番号：５９７、５９８、５９９、６０６、６０７、６０８）
のＣＤＲから選択され、
前記ＣＤＲの配列が、Kabat命名法によって定義される、ヒト又はヒト化抗ヒトＳＥＭＡ４Ａ抗体。

【請求項11】

前記抗体が、
（ａ）５Ｈｇ１－５Ｌｇ１（配列番号：２０及び２９）；
（ｂ）５Ｈｇ１－５Ｌｇ２（配列番号：３８及び４７）；
（ｃ）５Ｈｇ２－５Ｌｇ１（配列番号：５６及び６５）；
（ｄ）５Ｈｇ２－５Ｌｇ２（配列番号：７４及び８３）；
（ｅ）５Ｈｇ２－５Ｌｇ３（配列番号：９２及び１０１）；
（ｆ）５Ｈｇ２－５Ｌｇ５（配列番号：１１０及び１１９）；
（ｇ）５Ｈｇ２－５Ｌｇ６（配列番号：１２８及び１３７）；
（ｈ）５Ｈｇ４－５Ｌｇ１（配列番号：１４６及び１５５）；
（ｉ）５Ｈｇ４－５Ｌｇ２（配列番号：１６４及び１７３）；
（ｊ）５Ｈｇ４－５Ｌｇ４（配列番号：１８２及び１９１）；
（ｋ）５Ｈｇ４－５Ｌｇ５（配列番号：２００及び２０９）；
（ｌ）５Ｈｇ５－５Ｌｇ２（配列番号：２１８及び２２７）；
（ｍ）Ｃ０１２０９０３（配列番号：２３６及び２４５）；
（ｎ）Ｃ０１２０９０４（配列番号：２５４及び２６３）；
（ｏ）Ｃ０１２０９０５（配列番号：２７２及び２８１）；
（ｐ）Ｃ０１２０９０６（配列番号：２９０及び２９９）；
（ｑ）Ｃ０１２０９１０（配列番号：３０８及び３１７）；
（ｒ）Ｃ０１２０９１３（配列番号：３２６及び３３５）；
（ｓ）Ｃ０１２０９１４（配列番号：３４４及び３５３）；
（ｔ）Ｃ０１２０９１７（配列番号：３６２及び３７１）；
（ｕ）Ｃ０１２０９１８（配列番号：３８０及び３８９）；
（ｖ）Ｃ０１２０９１９（配列番号：３９８及び４０７）；
（ｗ）Ｃ０１２０９２０（配列番号：４１６及び４２５）；
（ｘ）Ｃ０１２０９２１（配列番号：４３４及び４４３）；
（ｙ）Ｃ０１２０９２２（配列番号：４５２及び４６１）；
（ｚ）Ｃ０１２０９２３（配列番号：４７０及び４７９）；
（ａａ）Ｃ０１２０９２４（配列番号：４８８及び４９７）；
（ｂｂ）Ｃ０１２０９２５（配列番号：５０６及び５１５）；
（ｃｃ）Ｃ０１２０９２６（配列番号：５２４及び５３３）；
（ｄｄ）Ｃ０１２０９２７（配列番号：５４２及び５５１）；
（ｅｅ）Ｃ０１２０９２８（配列番号：５６０及び５６９）；
（ｆｆ）Ｃ０１２０９２９（配列番号：５７８及び５８７）及び
（ｇｇ）Ｃ０１２０９３０（配列番号：５９６及び６０５）
のＶ_Ｈ及びＶ_Ｌから選択されるＶ_Ｈ及びＶ_Ｌを含み、
前記Ｖ_Ｈ配列及びＶ_Ｌ配列は、Kabat命名法によって定義される、請求項１０に記載の抗体。

【請求項12】

Ｔ細胞活性化部分に連結された請求項１０又は１１のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体の抗原結合ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）。

【請求項13】

前記抗原結合ドメインが、請求項１０又は１１のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体の単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片を含む、請求項１２に記載のＣＡＲ。

【請求項14】

請求項１～９のいずれか一項に記載のＡＤＣ、又は請求項１０若しくは１１のいずれか一項に記載の抗ヒトＳＥＭＡ４Ａ抗体、又は請求項１２及び１３のいずれか一項に記載のＣＡＲと、希釈剤と、を含む組成物。

【請求項15】

ａ．医薬品として使用するための、
ｂ．癌を治療するための医薬品として使用するための、
ｃ．血液癌の治療に使用するための、
ｄ．多発性骨髄腫（ＭＭ）、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）及び濾胞性リンパ腫（ＦＬ）から選択される血液癌の治療に使用するための、
ｅ．癌の治療的処置のための医薬品の製造に使用するための、
ｆ．血液癌の治療的処置のための医薬品の製造に使用するための、
ｇ．ＭＭ、ＮＨＬ、ＡＭＬ、ＤＬＢＣＬ及びＦＬから選択される血液癌の治療的処置のための医薬品の製造に使用するための、又は
ｈ．細胞表面にＳＥＭＡ４Ａを発現する細胞において細胞死を誘導するための、請求項１～９のいずれか一項に記載のＡＤＣ、請求項１０若しくは１１のいずれか一項に記載の抗体、請求項１２若しくは１３のいずれか一項に記載のＣＡＲ、又は請求項１４に記載の組成物。

【請求項16】

請求項１～９のいずれか一項に記載のＡＤＣ、請求項１０若しくは１１のいずれか一項に記載の抗体、請求項１２若しくは１３のいずれか一項に記載のＣＡＲ、又は請求項１４に記載の組成物を対象に投与することを含む、血液癌、例えばＭＭ、ＮＨＬ、ＡＭＬ、ＤＬＢＣＬ及びＦＬから選択される血液癌等の癌の治療方法。

【請求項17】

請求項１０又は請求項１１に記載の抗体を、リンカーを介して細胞毒素にコンジュゲーションすることを含む、請求項１～９のいずれか一項に記載のＡＤＣの製造方法。

【請求項18】

請求項１０又は１１のいずれか一項に記載の単離された抗体又はその抗原結合断片をコードする配列を含む、単離された組換えＤＮＡ又はＲＮＡ配列。

【請求項19】

ベクターである、請求項１８に記載の単離された組換えＤＮＡ配列。

【請求項20】

発現ベクターである、請求項１８又は請求項１９に記載の単離された組換えＤＮＡ配列。

【請求項21】

プロモータの制御下で、請求項１０又は１１のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片をコードする、請求項１８～２０のいずれか一項に記載の単離された組換えＤＮＡ配列。

【請求項22】

請求項１８～２１のいずれか一項に記載のＤＮＡ又はＲＮＡ配列を含む宿主細胞。

【請求項23】

請求項１０又は１１のいずれか一項に記載の単離された抗体又はその抗原結合断片を発現することができる、請求項２２に記載の宿主細胞。

【請求項24】

請求項１０又は１１に記載の単離された抗体又はその抗原結合断片を作製する方法であって、請求項２２又は２３に記載の宿主細胞を、前記単離された抗体又はその抗原結合断片の発現に適した条件下で培養することを含む、方法。

【発明の詳細な説明】

【背景技術】

【0001】

発明の背景
腫瘍細胞を攻撃する免疫系の誘導である癌免疫療法は、長い歴史を有し、関心の最近の復活が見られている。これは、免疫チェックポイント遮断及び癌指向性免疫療法の成功の両方によって推進されてきた。癌細胞上の細胞表面タンパク質の標的化を利用する後者は、２０世紀の終わりに導入されたモノクローナル抗体療法（例えば、リツキシマブ、トラスツズマブ）、及び２１世紀の初めに導入されたキメラ抗原受容体－Ｔ（ＣＡＲ－Ｔ）細胞によって例示される。しかしながら、単剤免疫療法に対する耐性は頻繁であり、一般に抗原回避、すなわち癌細胞による抗原性標的の下方制御によって促進される。抗原回避は、腫瘍内不均一性によって推進され得、低レベルの標的タンパク質を発現するサブクローン又は標的タンパク質を発現しないサブクローンは、免疫療法中に競合的増殖利点を得る。この耐性を克服するために、新規免疫療法は、癌細胞の生存に不可欠な抗原に対して標的化されるべきであり、併用治療が使用され得る。複数のモノクローナル抗体を組み合わせる戦略は、部分的には低毒性のために、また部分的には癌細胞の免疫表現型決定が感受性及び耐性の亜集団を明らかにし得、合理的な治療決定をもたらし得るために、特に魅力的である。したがって、癌細胞の表面上の新規標的タンパク質を同定する緊急の必要性がある。

【0002】

癌細胞の表面プロテオームの完全な理解は、治療を進めるために特に有益であろう。しかしながら、この知識は、利用可能な技術では分かりにくいことが判明している。ＲＮＡ発現とタンパク質発現との間の相関は適度であり、トランスクリプトームアプローチを非効率的にする。全細胞プロテオミクスアプローチによる細胞表面タンパク質の包括的な同定は、それらの低存在量、疎水性、及びプロテアーゼ切断部位の欠如、並びに不正確な定量によって制限される。これらの制限を克服するために、癌細胞表面タンパク質を単離及び同定するための様々な技術が用いられてきた。しかしながら、これらのアプローチは、主に初代細胞ではなく癌細胞株に焦点を当てており、細胞表面タンパク質全体を捕捉することができず、及び／又は定量的ではない。結果として、これらのタイプのプロテオーム研究は、関連する癌免疫療法標的をもたらすことができなかった。

【0003】

国際公開第２０２１１９５５３６号は、多発性骨髄腫（ＭＭ）における細胞表面候補標的の発現の分析を記載している。７つの異なるＭＭ細胞株の表面タンパク質をビオチン化し、分光分析に供し、それによって４７６１のタンパク質を同定し、統合データベースを使用して細胞表面分子アノテーションを生成し、これを発現レベルに基づく排除と組み合わせて、ＳＴＲＩＮＧによる更なる分析のために３２６の表面タンパク質を同定した。ヒートマップにより、全身のいくつかの正常組織及び器官における９４個の選択された標的のタンパク質アノテーションが明らかにされた。造血組織を除く任意の正常組織における高発現の分子及び３つのプロテオミクスデータベースのうち２つ未満のアノテーションを有する分子を除外した。潜在的な生物学的関連性及び治療的関連性を有する標的のベンン・ダイアグラム重複により、６７個の共通の標的が明らかにされ、そのうち２４個が原発患者における発現プロファイルに基づいて選択され、ＣＣＲ１、ＣＤ２８、ＣＤ３２０、ＦＣＲＬ３、ＩＦＮＧＲ１、ＩＬ１２ＲＢ１、ＩＬ２７ＲＡ、ＩＬ２ＲＧ、ＩＬ６Ｒ、ＩＴＧＡ４、ＫＣＮＮ４、ＬＡＸ１、ＬＩＬＲＢ１、ＬＩＬＲＢ４、ＬＲＲＣ８Ａ、ＬＲＲＣ８Ｄ、ＰＬＸＮＡ３、ＰＬＸＮＣ１、Ｓ１ＰＲ４、ＳＥＬＰＬＧ、ＳＥＭＡ４Ａ、ＳＬＡＭＦ６、ＴＬＲ１及びＢＣＭＡを含む患者試料における検証に使用された。

【0004】

Anderson et al.(2022)は、原発性癌の細胞表面タンパク質を同定するための初代ヒト骨髄腫細胞の原形質膜プロファイリングを記載している。免疫療法標的を優先順位付けするための新規アプローチを使用して、以前には骨髄腫に関与していることが示唆されていなかった細胞表面タンパク質であるセマフォリン－４Ａ（ＳＥＭＡ４Ａ）を同定した。ＳＥＭＡ４Ａの発現はインビトロでの正常な骨髄腫細胞増殖に必須であることが示され、これは、骨髄腫細胞が検出を回避するためにタンパク質を下方制御することができないことを示し、また、エクソンスキッピングのために、ＳＥＭＡ４Ａが標準的なCRISPR/Cas9ノックアウトスクリーニングによって骨髄腫治療標的として同定されないことも示された。マウス抗体－薬物コンジュゲートを使用したＳＥＭＡ４Ａの標的化は、インビトロ及びインビボで実証された。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

ＭＭは、形質細胞の癌であり、疲労、骨痛、病理学的骨折、免疫抑制、及び腎不全を引き起こす。モノクローナル抗体療法及びＣＡＲ－Ｔ細胞療法を含む近年の新規治療の導入にもかかわらず、治療に対する耐性は不可避である。したがって、ＭＭは常に致命的なままであり、新規治療法が緊急に必要とされている。

【課題を解決するための手段】

【0006】

発明の陳述
本発明は、以下を提供する。
１．抗ヒト－ＳＥＭＡ４Ａヒト抗体若しくはヒト化抗体又はその抗原結合断片と、リンカーと、細胞毒素と、を含む抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）。

【0007】

２．抗体が、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含むＶ_Ｈ並びにＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含むＶ_Ｌを含み、ＣＤＲが、
（ａ）５Ｅ３（配列番号：３、４、５、１２、１３、１４）；
（ｂ）５Ｈｇ１－５Ｌｇ１（配列番号：２１、２２、２３、３０、３１、３２）；
（ｃ）５Ｈｇ１－５Ｌｇ２（配列番号：３９、４０、４１、４８、４９、５０）；
（ｄ）５Ｈｇ２－５Ｌｇ１（配列番号：５７、５８、５９、６６、６７、６８）；
（ｅ）５Ｈｇ２－５Ｌｇ２（配列番号：７５、７６、７７、８４、８５、８６）；
（ｆ）５Ｈｇ２－５Ｌｇ３（配列番号：９３、９４、９５、１０２、１０３、１０４）；
（ｇ）５Ｈｇ２－５Ｌｇ５（配列番号：１１１、１１２、１１３、１２０、１２１、１２２）；
（ｈ）５Ｈｇ２－５Ｌｇ６（配列番号：１２９、１３０、１３１、１３８、１３９、１４０）；
（ｉ）５Ｈｇ４－５Ｌｇ１（配列番号：１４７、１４８、１４９、１５６、１５７、１５８）；
（ｊ）５Ｈｇ４－５Ｌｇ２（配列番号：１６５、１６６、１６７、１７４、１７５、１７６）；
（ｋ）５Ｈｇ４－５Ｌｇ４（配列番号：１８３、１８４、１８５、１９２、１９３、１９４）；
（ｌ）５Ｈｇ４－５Ｌｇ５（配列番号：２０１、２０２、２０３、２１０、２１１、２１２）；
（ｍ）５Ｈｇ５－５Ｌｇ２（配列番号：２１９、２２０、２２１、２２８、２２９、２３０）；
（ｎ）Ｃ０１２０９０３（配列番号：２３７、２３８、２３９、２４６、２４７、２４８）；
（ｏ）Ｃ０１２０９０４（配列番号：２５５、２５６、２５７、２６４、２６５、２６６）；
（ｐ）Ｃ０１２０９０５（配列番号：２７３、２７４、２７５、２８２、２８３、２８４）；
（ｑ）Ｃ０１２０９０６（配列番号：２９１、２９２、２９３、３００、３０１、３０２）；
（ｒ）Ｃ０１２０９１０（配列番号：３０９、３１０、３１１、３１８、３１９、３２０）；
（ｓ）Ｃ０１２０９１３（配列番号：３２７、３２８、３２９、３３６、３３７、３３８）；
（ｔ）Ｃ０１２０９１４（配列番号：３４５、３４６、３４７、３５４、３５５、３５６）；
（ｕ）Ｃ０１２０９１７（配列番号：３６３、３６４、３６５、３７２、３７３、３７４）；
（ｖ）Ｃ０１２０９１８（配列番号：３８１、３８２、３８３、３９０、３９１、３９２）；
（ｗ）Ｃ０１２０９１９（配列番号：３９９、４００、４０１、４０８、４０９、４１０）；
（ｘ）Ｃ０１２０９２０（配列番号：４１７、４１８、４１９、４２６、４２７、４２８）；
（ｙ）Ｃ０１２０９２１（配列番号：４３５、４３６、４３７、４４４、４４５、４４６）；
（ｚ）Ｃ０１２０９２２（配列番号：４５３、４５３、４５５、４６２、４６３、４６４）；
（ａａ）Ｃ０１２０９２３（配列番号：４７１、４７２、４７３、４８０、４８１、４８２）；
（ｂｂ）Ｃ０１２０９２４（配列番号：４８９、４９０、４９１、４９８、４９９、５００）；
（ｃｃ）Ｃ０１２０９２５（配列番号：５０７、５０８、５０９、５１６、５１７、５１８）；
（ｄｄ）Ｃ０１２０９２６（配列番号：５２５、５２６、５２７、５３４、５３５、５３６）；
（ｅｅ）Ｃ０１２０９２７（配列番号：５４３、５４４、５４５、５５２、５５３、５５４）；
（ｆｆ）Ｃ０１２０９２８（配列番号：５６１、５６２、５６３、５７０、５７１、５７２）；
（ｇｇ）Ｃ０１２０９２９（配列番号：５７９、５８０、５８１、５８８、５８９、５９０）及び
（ｈｈ）Ｃ０１２０９３０（配列番号：５９７、５９８、５９９、６０６、６０７、６０８）
のＣＤＲから選択され、
ＣＤＲはKabat命名法に従って定義される、
条項１に記載のＡＤＣ。

【0008】

３．抗体が、
ａ．５Ｈｇ１－５Ｌｇ１（配列番号：２０及び２９）；
ｂ．５Ｈｇ１－５Ｌｇ２（配列番号：３８及び４７）；
ｃ．５Ｈｇ２－５Ｌｇ１（配列番号：５６及び６５）；
ｄ．５Ｈｇ２－５Ｌｇ２（配列番号：７４及び８３）；
ｅ．５Ｈｇ２－５Ｌｇ３（配列番号：９２及び１０１）；
ｆ．５Ｈｇ２－５Ｌｇ５（配列番号：１１０及び１１９）；
ｇ．５Ｈｇ２－５Ｌｇ６（配列番号：１２８及び１３７）；
ｈ．５Ｈｇ４－５Ｌｇ１（配列番号：１４６及び１５５）；
ｉ．５Ｈｇ４－５Ｌｇ２（配列番号：１６４及び１７３）；
ｊ．５Ｈｇ４－５Ｌｇ４（配列番号：１８２及び１９１）；
ｋ．５Ｈｇ４－５Ｌｇ５（配列番号：２００及び２０９）；
ｌ．５Ｈｇ５－５Ｌｇ２（配列番号：２１８及び２２７）；
ｍ．Ｃ０１２０９０３（配列番号：２３６及び２４５）；
ｎ．Ｃ０１２０９０４（配列番号：２５４及び２６３）；
ｏ．Ｃ０１２０９０５（配列番号：２７２及び２８１）；
ｐ．Ｃ０１２０９０６（配列番号：２９０及び２９９）；
ｑ．Ｃ０１２０９１０（配列番号：３０８及び３１７）；
ｒ．Ｃ０１２０９１３（配列番号：３２６及び３３５）；
ｓ．Ｃ０１２０９１４（配列番号：３４４及び３５３）；
ｔ．Ｃ０１２０９１７（配列番号：３６２及び３７１）；
ｕ．Ｃ０１２０９１８（配列番号：３８０及び３８９）；
ｖ．Ｃ０１２０９１９（配列番号：３９８及び４０７）；
ｗ．Ｃ０１２０９２０（配列番号：４１６及び４２５）；
ｘ．Ｃ０１２０９２１（配列番号：４３４及び４４３）；
ｙ．Ｃ０１２０９２２（配列番号：４５２及び４６１）；
ｚ．Ｃ０１２０９２３（配列番号：４７０及び４７９）；
ａａ．Ｃ０１２０９２４（配列番号：４８８及び４９７）；
ｂｂ．Ｃ０１２０９２５（配列番号：５０６及び５１５）；
ｃｃ．Ｃ０１２０９２６（配列番号：５２４及び５３３）；
ｄｄ．Ｃ０１２０９２７（配列番号：５４２及び５５１）；
ｅｅ．Ｃ０１２０９２８（配列番号：５６０及び５６９）；
ｆｆ．Ｃ０１２０９２９（配列番号：５７８及び５８７）；及び
ｇｇ．Ｃ０１２０９３０（配列番号：５９６及び６０５）；
のＶ_Ｈ及びＶ_Ｌから選択されるＶ_Ｈ及びＶ_Ｌを含み、配列はKabat命名法によって定義される、条項１又は条項２に記載のＡＤＣ。

【0009】

４．細胞毒素が微小管阻害剤（例えば、メイタンシノイド又はアウリスタチン）である、条項１～３のいずれか一項に記載のＡＤＣ。

【0010】

５．細胞毒素がモノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ、ベドチン）及びメルタンシン（ＤＭ１、例えば、ＳＭＣＣリンカーを有するエムタンシンとして）から選択される、条項１～４のいずれか一項に記載のＡＤＣ。

【0011】

６．リンカーが、切断不可能なリンカーであるか、又は切断可能なリンカーである、条項１～５のいずれか一項に記載のＡＤＣ。

【0012】

７．細胞毒素がモノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）であり、リンカーがｍｃ－ｖｃＰＡＢリンカー（マレイミド系リンカー、システイン連結）であるか、又は細胞毒素がメルタンシン（ＤＭ１）であり、リンカーがＳＭＣＣリンカー（ＮＨＳエステル系、リジン）である、条項１～６のいずれか一項に記載のＡＤＣ。

【0013】

８．ＳＥＭＡ４Ａに結合したＡＤＣが、その表面上にヒトＳＥＭＡ４Ａを発現する細胞に内在化され得る、条項１～７のいずれか一項に記載のＡＤＣ。

【0014】

９．ＳＥＭＡ４Ａに結合したＡＤＣが、ヒトＳＥＭＡ４Ａをその表面上に発現する細胞に内在化することができ、細胞へのＡＤＣの内在化が、細胞死をもたらす、条項１～８のいずれか一項に記載のＡＤＣ。

【0015】

１０．ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含むＶ_Ｈ並びにＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含むＶ_Ｌを含むヒト又はヒト化抗ヒトＳＥＭＡ４Ａ抗体であって、ＣＤＲが、
（ａ）５Ｅ３（配列番号：３、４、５、１２、１３、１４）；
（ｂ）５Ｈｇ１－５Ｌｇ１（配列番号：２１、２２、２３、３０、３１、３２）；
（ｃ）５Ｈｇ１－５Ｌｇ２（配列番号：３９、４０、４１、４８、４９、５０）；
（ｄ）５Ｈｇ２－５Ｌｇ１（配列番号：５７、５８、５９、６６、６７、６８）；
（ｅ）５Ｈｇ２－５Ｌｇ２（配列番号：７５、７６、７７、８４、８５、８６）；
（ｆ）５Ｈｇ２－５Ｌｇ３（配列番号：９３、９４、９５、１０２、１０３、１０４）；
（ｇ）５Ｈｇ２－５Ｌｇ５（配列番号：１１１、１１２、１１３、１２０、１２１、１２２）；
（ｈ）５Ｈｇ２－５Ｌｇ６（配列番号：１２９、１３０、１３１、１３８、１３９、１４０）；
（ｉ）５Ｈｇ４－５Ｌｇ１（配列番号：１４７、１４８、１４９、１５６、１５７、１５８）；
（ｊ）５Ｈｇ４－５Ｌｇ２（配列番号：１６５、１６６、１６７、１７４、１７５、１７６）；
（ｋ）５Ｈｇ４－５Ｌｇ４（配列番号：１８３、１８４、１８５、１９２、１９３、１９４）；
（ｌ）５Ｈｇ４－５Ｌｇ５（配列番号：２０１、２０２、２０３、２１０、２１１、２１２）；
（ｍ）５Ｈｇ５－５Ｌｇ２（配列番号：２１９、２２０、２２１、２２８、２２９、２３０）；
（ｎ）Ｃ０１２０９０３（配列番号：２３７、２３８、２３９、２４６、２４７、２４８）；
（ｏ）Ｃ０１２０９０４（配列番号：２５５、２５６、２５７、２６４、２６５、２６６）；
（ｐ）Ｃ０１２０９０５（配列番号：２７３、２７４、２７５、２８２、２８３、２８４）；
（ｑ）Ｃ０１２０９０６（配列番号：２９１、２９２、２９３、３００、３０１、３０２）；
（ｒ）Ｃ０１２０９１０（配列番号：３０９、３１０、３１１、３１８、３１９、３２０）；
（ｓ）Ｃ０１２０９１３（配列番号：３２７、３２８、３２９、３３６、３３７、３３８）；
（ｔ）Ｃ０１２０９１４（配列番号：３４５、３４６、３４７、３５４、３５５、３５６）；
（ｕ）Ｃ０１２０９１７（配列番号：３６３、３６４、３６５、３７２、３７３、３７４）；
（ｖ）Ｃ０１２０９１８（配列番号：３８１、３８２、３８３、３９０、３９１、３９２）；
（ｗ）Ｃ０１２０９１９（配列番号：３９９、４００、４０１、４０８、４０９、４１０）；
（ｘ）Ｃ０１２０９２０（配列番号：４１７、４１８、４１９、４２６、４２７、４２８）；
（ｙ）Ｃ０１２０９２１（配列番号：４３５、４３６、４３７、４４４、４４５、４４６）；
（ｚ）Ｃ０１２０９２２（配列番号：４５３、４５４、４５５、４６２、４６３、４６４）；
（ａａ）Ｃ０１２０９２３（配列番号：４７１、４７２、４７３、４８０、４８１、４８２）；
（ｂｂ）Ｃ０１２０９２４（配列番号：４８９、４９０、４９１、４９８、４９９、５００）；
（ｃｃ）Ｃ０１２０９２５（配列番号：５０７、５０８、５０９、５１６、５１７、５１８）；
（ｄｄ）Ｃ０１２０９２６（配列番号：５２５、５２６、５２７、５３４、５３５、５３６）；
（ｅｅ）Ｃ０１２０９２７（配列番号：５４３、５４４、５４５、５５２、５５３、５５４）；
（ｆｆ）Ｃ０１２０９２８（配列番号：５６１、５６２、５６３、５７０、５７１、５７２）；
（ｇｇ）Ｃ０１２０９２９（配列番号：５７９、５８０、５８１、５８８、５８９、５９０）及び
（ｈｈ）Ｃ０１２０９３０（配列番号：５９７、５９８、５９９、６０６、６０７、６０８）
のＣＤＲから選択され、ＣＤＲの配列はKabat命名法によって定義される、ヒト又はヒト化抗ヒトＳＥＭＡ４Ａ抗体。

【0016】

１１．抗体が、
（ａ）５Ｈｇ１－５Ｌｇ１（配列番号：２０及び２９）；
（ｂ）５Ｈｇ１－５Ｌｇ２（配列番号：３８及び４７）；
（ｃ）５Ｈｇ２－５Ｌｇ１（配列番号：５６及び６５）；
（ｄ）５Ｈｇ２－５Ｌｇ２（配列番号：７４及び８３）；
（ｅ）５Ｈｇ２－５Ｌｇ３（配列番号：９２及び１０１）；
（ｆ）５Ｈｇ２－５Ｌｇ５（配列番号：１１０及び１１９）；
（ｇ）５Ｈｇ２－５Ｌｇ６（配列番号：１２８及び１３７）；
（ｈ）５Ｈｇ４－５Ｌｇ１（配列番号：１４６及び１５５）；
（ｉ）５Ｈｇ４－５Ｌｇ２（配列番号：１６４及び１７３）；
（ｊ）５Ｈｇ４－５Ｌｇ４（配列番号：１８２及び１９１）；
（ｋ）５Ｈｇ４－５Ｌｇ５（配列番号：２００及び２０９）；
（ｌ）５Ｈｇ５－５Ｌｇ２（配列番号：２１８及び２２７）；
（ｍ）Ｃ０１２０９０３（配列番号：２３６及び２４５）；
（ｎ）Ｃ０１２０９０４（配列番号：２５４及び２６３）；
（ｏ）Ｃ０１２０９０５（配列番号：２７２及び２８１）；
（ｐ）Ｃ０１２０９０６（配列番号：２９０及び２９９）；
（ｑ）Ｃ０１２０９１０（配列番号：３０８及び３１７）；
（ｒ）Ｃ０１２０９１３（配列番号：３２６及び３３５）；
（ｓ）Ｃ０１２０９１４（配列番号：３４４及び３５３）；
（ｔ）Ｃ０１２０９１７（配列番号：３６２及び３７１）；
（ｕ）Ｃ０１２０９１８（配列番号：３８０及び３８９）；
（ｖ）Ｃ０１２０９１９（配列番号：３９８及び４０７）；
（ｗ）Ｃ０１２０９２０（配列番号：４１６及び４２５）；
（ｘ）Ｃ０１２０９２１（配列番号：４３４及び４４３）；
（ｙ）Ｃ０１２０９２２（配列番号：４５２及び４６１）；
（ｚ）Ｃ０１２０９２３（配列番号：４７０及び４７９）；
（ａａ）Ｃ０１２０９２４（配列番号：４８８及び４９７）；
（ｂｂ）Ｃ０１２０９２５（配列番号：５０６及び５１５）；
（ｃｃ）Ｃ０１２０９２６（配列番号：５２４及び５３３）；
（ｄｄ）Ｃ０１２０９２７（配列番号：５４２及び５５１）；
（ｅｅ）Ｃ０１２０９２８（配列番号：５６０及び５６９）；
（ｆｆ）Ｃ０１２０９２９（配列番号：５７８及び５８７）及び
（ｇｇ）Ｃ０１２０９３０（配列番号：５９６及び６０５）
のＶ_Ｈ及びＶ_Ｌから選択されるＶ_Ｈ及びＶ_Ｌを含み、Ｖ_Ｈ配列及びＶ_Ｌ配列は、Kabat命名法によって定義される、条項１０に記載の抗体。

【0017】

１２．Ｔ細胞活性化部分に連結された条項１０又は１１のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体の抗原結合ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）。

【0018】

１３．抗原結合ドメインが、条項１０又は１１のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体の単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片を含む、条項１２記載のＣＡＲ。

【0019】

１４．条項１～９のいずれか一項に記載のＡＤＣ、又は条項１０若しくは１１のいずれか一項に記載の抗ヒトＳＥＭＡ４Ａ抗体、又は条項１２及び１３のいずれか一項に記載のＣＡＲと、希釈剤と、を含む組成物。

【0020】

１５．
ａ．医薬品として使用するための、
ｂ．癌を治療するための医薬品として使用するための、
ｃ．血液癌の治療に使用するための、
ｄ．多発性骨髄腫（ＭＭ）、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）及び濾胞性リンパ腫（ＦＬ）から選択される血液癌の治療に使用するための、
ｅ．癌の治療的処置のための医薬品の製造に使用するための、
ｆ．血液癌の治療的処置のための医薬品の製造に使用するための、
ｇ．ＭＭ、ＮＨＬ、ＡＭＬ、ＤＬＢＣＬ及びＦＬから選択される血液癌の治療的処置のための医薬品の製造に使用するための、又は
ｈ．細胞表面にＳＥＭＡ４Ａを発現する細胞において細胞死を誘導するための、
条項１～９のいずれか一項に記載のＡＤＣ、条項１０又は１１のいずれか一項に記載の抗体、条項１２又は１３のいずれか一項に記載のＣＡＲ、又は条項１４に記載の組成物。

【0021】

１６．条項１～９のいずれか一項に記載のＡＤＣ、条項１０又は１１のいずれか一項に記載の抗体、条項１２又は１３のいずれか一項に記載のＣＡＲ、又は条項１４に記載の組成物を対象に投与することを含む、血液癌、例えばＭＭ、ＮＨＬ、ＡＭＬ、ＤＬＢＣＬ及びＦＬから選択される血液癌等の癌の治療方法。

【0022】

１７．条項１０又は条項１１のいずれか一項に記載の抗体を、リンカーを介して細胞毒素にコンジュゲーションすることを含む、条項１～９のいずれか一項に記載のＡＤＣの製造方法。

【0023】

１８．条項１０又は１１のいずれか一項に記載の単離された抗体又はその抗原結合断片をコードする配列を含む単離された組換えＤＮＡ又はＲＮＡ配列。

【0024】

１９．ベクターである、条項１８に記載の単離された組換えＤＮＡ配列。

【0025】

２０．発現ベクターである、条項１８又は条項１９に記載の単離された組換えＤＮＡ配列。

【0026】

２１．プロモータの制御下で、条項１０又は１１のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片をコードする、条項１８～２０のいずれか一項に記載の単離された組換えＤＮＡ配列。

【0027】

２２．条項１８～２１のいずれか一項に記載のＤＮＡ又はＲＮＡ配列を含む宿主細胞。

【0028】

２３．条項１０又は１１のいずれか一項に記載の単離された抗体又はその抗原結合断片を発現することができる、条項２２に記載の宿主細胞。

【0029】

２４．条項１０又は１１に記載の単離された抗体又はその抗原結合断片を作製する方法であって、条項２２又は２３のいずれか一項に記載の宿主細胞を、単離された抗体又はその抗原結合断片の発現に適した条件下で培養することを含む方法。

【0030】

本発明は、細胞毒素にコンジュゲートしたヒトセマフォリン４Ａ（ＳＥＭＡ４Ａ）に対するヒト若しくはヒト化抗体又はその抗原結合断片を含む抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）を提供する。本明細書で使用される「抗体－薬物コンジュゲート」という用語は、化学リンカーを介して細胞毒性薬（一般に、高い全身毒性を有する小分子薬物）に結合したヒト化若しくはヒトモノクローナル抗体（ｍＡｂ）又はその抗原結合断片等の抗体を含む化合物を指す。いくつかの実施形態では、ＡＤＣは、リンカーを含有するように化学修飾された小分子細胞毒素を含み得る。次いで、リンカーを使用して、細胞毒素を抗体又はその抗原結合断片にコンジュゲートさせる。いくつかの実施形態では、細胞の表面上の標的抗原に結合すると、リンカーの切断又はタンパク質分解によって細胞毒素を放出することができ、次いで細胞毒素はその標的に結合し、細胞死を誘導することができる。

【0031】

本明細書に記載のＡＤＣは、全抗体又は抗体断片を含み得る。全抗体は、典型的には、４つのポリペプチド：２つの同一のコピーの重（Ｈ）鎖ポリペプチド及び２つの同一のコピーの軽（Ｌ）鎖ポリペプチドからなる。各重鎖は１つのＮ末端可変（Ｖ_Ｈ）領域及び３つのＣ末端定常（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３）領域を含み、各軽鎖は１つのＮ末端可変（Ｖ_Ｌ）領域及び１つのＣ末端定常（ＣＬ）領域を含む。軽鎖及び重鎖の各対の可変領域は、抗体の抗原結合部位を形成する。Ｖ_Ｈ及びＶ_Ｌ領域は同じ一般構造を有し、各領域は４つのフレームワーク領域を含み、その配列は比較的保存されている。フレームワーク領域は、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）によって連結されている。ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３として知られる３つのＣＤＲは、抗原結合に関与する各可変ドメインの「超可変領域」を形成する。

【0032】

ＡＤＣは、ヒト化抗体又はヒト抗体の抗原結合断片を含み得る。「抗体断片」、「抗原結合断片」、「抗体の機能的断片」及び「抗原結合部」という用語は、本明細書では互換的に使用され、抗原に特異的に結合する能力を保持する抗体の１つ以上の断片又は部分を指す。抗体断片は、例えば、１つ以上のＣＤＲ、可変領域（又はその一部）、又はそれらの組合せを、場合により定常領域（又はその一部）と更に組み合わせて含み得る。抗体断片の例としては、限定されないが、（ｉ）Ｖ_Ｌ、Ｖ_Ｈ、ＣＬ、及びＣＨ１ドメインからなる一価断片であるＦａｂ断片；（ｉｉ）ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂ断片を含む二価断片であるＦ（ａｂ’）２断片；（ｉｉｉ）抗体の単一アームのＶ_Ｌドメイン及びＶ_ＨドメインからなるＦｖ断片；（ｉｖ）２つのドメインが単一のポリペプチド鎖として合成されることを可能にする合成リンカーによって連結されたＦｖ断片の２つのドメイン（すなわち、Ｖ_Ｌ及びＶ_Ｈ）からなる一価分子である単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、並びに（ｖ）ポリペプチド鎖の二量体であるダイアボディが挙げられ、各ポリペプチド鎖は、同じポリペプチド鎖上のＶ_ＨとＶ_Ｌとの間の対形成を可能にするには短すぎるペプチドリンカーによってＶ_Ｌに連結されたＶ_Ｈを含み、それにより、異なるＶ_Ｈ－Ｖ_Ｌポリペプチド鎖上の相補的ドメイン間の対形成を駆動して、２つの機能的抗原結合部位を有する二量体分子を生成する。抗体断片は当技術分野で公知であり、例えば、米国特許出願公開第２００９／００９３０２４Ａ１号に更に詳細に記載されている。

【0033】

本発明のヒト化抗体を含む、又は本発明のヒト抗体を含む本発明のＡＤＣは、組換えヒトＳＥＭＡ４Ａ（UniProt ID Q9H3S1）に特異的に結合することができ、組換えカニクイザルＳＥＭＡ４Ａ（UniProt ID G7NV79）及び／又は組換えマウスＳＥＭＡ４Ａ（UniProt ID Q62178）にも結合し得る。

【0034】

一実施形態では、ＡＤＣは、ヒト化又は完全ヒト抗ヒトＳＥＭＡ４Ａ抗体の可変領域を含む。この点において、ＡＤＣは、抗ヒトＳＥＭＡ４Ａモノクローナル抗体の軽鎖可変領域、重鎖可変領域、又は軽鎖可変領域と重鎖可変領域の両方を含み得る。好ましくは、ＡＤＣは、抗ヒトＳＥＭＡ４Ａ抗体の軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含む。「細胞毒素」及び「細胞毒性薬」という用語は、細胞の機能を阻害若しくは防止し、及び／又は細胞の破壊（細胞死）を引き起こし、及び／又は抗増殖効果を発揮する任意の分子を指す。ＡＤＣの細胞毒素又は細胞毒性薬は、当技術分野ではＡＤＣの「ペイロード」又は「弾頭（warhead）」とも呼ばれることが理解されよう。多数のクラスの細胞毒性薬は、ＡＤＣ分子に潜在的な有用性を有することが当技術分野で知られており、本明細書に記載のＡＤＣに使用することができる。例示的なクラスの細胞毒性薬には、チューブリシン、メイタンシノイド、アウリスタチン、又はそれらの誘導体等の抗微小管剤が含まれる。より具体的には、細胞毒性薬は、例えば、ＭＭＡＦ、ＭＭＡＥ又はＤＭ１、ＤＭ４であり得る。

【0035】

一実施形態では、細胞毒性薬は抗微小管剤であり得る。「抗微小管剤」及び「微小管標的化剤」という用語は同義であり、微小管を妨害することによって細胞分裂を阻害する薬剤を指す。チューブリシンは、チューブリン重合を阻害し、細胞周期停止及びアポトーシスをもたらす有糸分裂毒として作用する粘液細菌種（Sasse et al.,2000）から単離された天然産物のクラスのメンバーである（Steinmetz et al.,2004;Khalil et al.,2006;Kaur et al.,2006）。チューブリシンの例は、例えば、国際公開第２０１５／１５７５９４号、国際公開第２００４／００５３２６号、国際公開第２０１２／０１９１２３号、国際公開第２００９／１３４２７９号、国際公開第２００９／０５５５６２号、国際公開第２００４／００５３２７号；米国特許第７，７７６，８４１号、同第７，７５４，８８５号、及び同第７，８１６，３７７号；及び米国特許出願公開第２０１０／０２４０７０１号、同第２０１１／００２１５６８号、及び同第２０１１／０２６３６５０号に開示されている。

【0036】

メイタンシノイドは、微小管タンパク質チューブリンの重合を阻害し、それによって微小管の形成を妨げる（例えば、米国特許第６，４４１，１６３号及びRemillard et al.,1975を参照されたい）。メイタンシノイドは、細胞培養モデルを使用してインビトロで、実験動物系を使用してインビボで腫瘍細胞増殖を阻害することが示されている。更に、メイタンシノイドの細胞傷害性は、例えば、メトトレキサート、ダウノルビシン、及びビンクリスチン等の従来の化学療法剤よりも１，０００倍大きい（例えば、米国特許第５，２０８，０２０号を参照されたい）。メイタンシノイドには、メイタンシン、メイタンシノール、メイタンシノールのＣ－３エステル、並びに他のメイタンシノール類似体及び誘導体が含まれる（例えば、米国特許第５，２０８，０２０号及び同第６，４４１，１６３号を参照されたい）。メイタンシノールのＣ－３エステルは、天然に存在し得るか、又は合成的に誘導され得る。更に、天然に存在するＣ－３メイタンシノールエステルと合成Ｃ－３メイタンシノールエステルの両方は、単純なカルボン酸を有するＣ－３エステル、又はＮ－メチル－Ｌ－アラニンの誘導体を有するＣ－３エステルとして分類することができ、後者は前者よりも細胞毒性が高い。合成メイタンシノイド類似体も当技術分野で公知であり、例えば、Kupchan et al.,1978に記載されている。メイタンシノール並びにその類似体及び誘導体を生成する方法は、例えば、米国特許第４，１５１，０４２号に記載されている。本明細書に記載のＡＤＣに関連して使用され得るメイタンシノイドの例としては、Ｎ２’－デアセチル－Ｎ２’－（３－メルカプト－１－オキソプロピル）－メイタンシン（ＤＭ１）及びＮ２’－デアセチル－Ｎ２’－（４－メルカプト－４－メチル－１－オキソペンチル）－メイタンシン（ＤＭ４）が挙げられるが、これらに限定されない。

【0037】

オーリスタチンは、忍容性の高い用量で実質的な前臨床活性を示した非常に強力な抗有糸分裂剤のクラスを表す（Law et al.,2006;Ma et al.,2006;Tse et al.,2006;Oflazoglu et al.,2008,Oflazoglu et al.,2008）。オーリスタチンＡＤＣは、現在、前臨床試験及び臨床試験において評価されている。本明細書に記載のＡＤＣに関連して使用され得るアウリスタチンの例としては、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）及び関連分子モノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）が挙げられるが、これらに限定されない（例えば、Doronina et al.,2003;Doronina et al.,2006を参照されたい）。

【0038】

ＳＥＭＡ４Ａヒト化抗体若しくはヒトモノクローナル抗体、又はその抗原結合断片は、部位特異的又は非部位特異的コンジュゲーション方法を含む、当技術分野で公知の任意の適切な方法を使用して細胞毒素にコンジュゲートされ得る。抗体のための従来のコンジュゲーション戦略は、典型的には、ペイロードを抗体、その抗原結合断片に、リジン又はシステインを介してランダムに（すなわち、非特異的に）コンジュゲーションする確率論的に依拠する。したがって、いくつかの態様では、抗体又はその抗原結合断片は、例えば、抗体又は抗体断片の部分的還元、続いてリンカー部分が結合した又は結合していない所望の薬剤との反応によって、細胞毒性薬にランダムにコンジュゲートされる。例えば、抗体又はその抗原結合断片は、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）又は類似の還元剤を使用して還元され得る。次いで、細胞毒性薬を、それに結合したリンカー部分の有無にかかわらず、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）の存在下で、還元された抗体又は抗体断片にモル過剰で付加することができる。コンジュゲーション後、過剰の遊離システインを添加して未反応薬剤をクエンチすることができる。次いで、反応混合物を精製し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に緩衝液交換することができる。

【0039】

他の実施形態では、細胞毒性薬は、特異的反応性アミノ酸残基での部位特異的コンジュゲーション法を使用してＳＥＭＡ４Ａモノクローナル抗体にコンジュゲートされ、均一な化学量論を有する均一なＡＤＣ調製物をもたらし得る。部位特異的コンジュゲーションは、システイン残基又は非天然アミノ酸を介するものであり得る。一実施形態では、細胞毒性薬は、少なくとも１つのシステイン残基を介して抗体又はその抗原結合断片にコンジュゲートされ得る。特に、例えば、細胞毒性薬は、ＳＥＭＡ４Ａモノクローナル抗体のＦｃ領域中の特定のKabat位置（Kabat et al.,1991）のアミノ酸の側鎖に化学的にコンジュゲートされ得る。これに関して、細胞毒性薬は、抗体のＦｃ領域の任意の適切な位置のシステイン残基を介してＳＥＭＡ４Ａモノクローナル抗体にコンジュゲートされ得る。或いは、細胞毒性薬は、チオール－マレイミド結合を介して、例えばヒンジ及び重軽鎖におけるスルフヒドリル反応性基を介して等、ＳＥＭＡ４Ａモノクローナル抗体又はその抗原結合断片にコンジュゲートされ得る。

【0040】

本明細書に記載されるＳＥＭＡ４Ａヒト化又はヒトモノクローナルＡＤＣは、それにコンジュゲートされた少なくとも１つの細胞毒素分子を含むが、ＳＥＭＡ４Ａヒト化又はヒトモノクローナル抗体は、所望の治療効果を達成するために、それにコンジュゲートされた任意の適切な数の細胞毒素分子（例えば、１、２、３、４又はそれを超える細胞毒素分子）を含み得る。したがって、本発明のＡＤＣは、例えば、１、２、３、４、５、６、７、又は８の薬物－抗体比（ＤＡＲ）を有し得る。ＤＡＲは、ＡＤＣの所与の調製物の平均薬物（細胞毒素）対抗体比である。ＤＡＲは、ＡＤＣの薬物負荷の尺度である。

【0041】

いくつかの実施形態では、本発明は、ＡＤＣとは無関係の上記のヒトＳＥＭＡ４Ａに対して向けられた、ヒト化若しくはヒトモノクローナル抗体、又はその抗原結合断片を提供する。

【0042】

本発明のヒト化及びヒト抗体、並びにそのような抗体を含むＡＤＣ又はＣＡＲは、組換えヒトＳＥＭＡ４Ａ（UniProt ID Q9H3S1、配列番号６１３）に特異的に結合することができ、組換えカニクイザルＳＥＭＡ４Ａ（UniProt ID G7NV79、配列番号６１４）及び／又は組換えマウスＳＥＭＡ４Ａ（UniProt ID Q62178、配列番号６１５）にも結合し得る。

【0043】

ヒトＳＥＭＡ４Ａに対するヒト化抗体若しくはヒト抗体、又はその抗原結合断片は、ヒトＳＥＭＡ４Ａ又はそのエピトープに対する任意の適切な結合親和性を含み得る。「親和性」という用語は、２つの薬剤の可逆的結合の平衡定数を指し、解離定数（Ｋ_Ｄ）として表される。目的の抗原又はエピトープに対する抗体又はその抗原結合断片の親和性は、当技術分野で公知の任意の方法を使用して測定することができる。そのような方法としては、例えば、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）、表面プラズモン共鳴（例えば、Biacore、ProteOn）、バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ、例えばOctet）、速度論的排除アッセイ（例えば、KinExA）、分離可能ビーズ（例えば、磁気ビーズ）、抗原パニング、及び／又は酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）（Janeway et al.,2001）が挙げられる。特定の抗体の結合親和性は、結合親和性を分析するために使用される方法に応じて変化することが当技術分野で公知である。

【0044】

リガンドに対する結合剤の親和性、例えば、エピトープに対する抗体の親和性は、例えば、約１ｎＭ～約１００ｎＭであり得る。一実施形態では、モノクローナル抗体又はその抗原結合断片は、５００、４００、３００、２００又は１００ナノモル（例えば、１００ｎＭ、約９０ｎＭ、約８０ｎＭ、約７０ｎＭ、約６０ｎＭ、約５０ｎＭ、約４０ｎＭ、約３０ｎＭ、約２０ｎＭ、若しくは約１０ｎＭ、又は前述の値のいずれか２つによって定義される範囲）以下のＫ_ＤでヒトＳＥＭＡ４Ａに結合し得る。別の実施形態では、モノクローナル抗体は、１０ナノモル（例えば、約９ｎＭ、約８．５ｎＭ、約８ｎＭ、約７．５ｎＭ、約７ｎＭ、約６．５ｎＭ、約６ｎＭ、約５．５ｎＭ、約５ｎＭ、約４．５ｎＭ、約４ｎＭ、約３．５ｎＭ、約３ｎＭ、約２．５ｎＭ、約２ｎＭ、約１．５ｎＭ、約１ｎＭ、又は前述の値のいずれか２つによって定義される範囲）以下のＫ_ＤでヒトＳＥＭＡ４Ａに結合し得る。

【0045】

本発明のヒト化抗体又はヒト抗体の抗原結合部分又は断片は、その部分がヒトＳＥＭＡ４Ａに結合する限り、任意のサイズであり得る。

【0046】

本発明の抗体又はその抗原結合断片は、組換え手段によって産生され得る。「組換え抗体」は、組換え操作された宿主細胞によって産生された抗体である。本発明による抗体又はその抗原結合断片は、場合により単離又は精製される。「抗体」又は「抗体分子」という用語は、天然又は部分的若しくは完全に合成的に産生された免疫グロブリンを表す。本発明の抗原結合タンパク質は、抗体、好ましくはモノクローナル抗体であり得、ヒト又は非ヒト、キメラ又はヒト化であり得る。

【0047】

抗体分子は、好ましくはモノクローナル抗体分子である。抗体の例は、免疫グロブリンＧ等の免疫グロブリンアイソタイプ、並びにＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４等のそれらのアイソタイプサブクラス、並びにそれらの断片である。４つのヒトサブクラス（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４）はそれぞれ異なる重鎖を含むが、それらは高度に相同的であり、主にヒンジ領域及びそれらが宿主免疫系を活性化する程度が異なる。ＩｇＧ１及びＩｇＧ４はヒンジ領域に２つの鎖間ジスルフィド結合を含み、ＩｇＧ２は４個の鎖間ジスルフィド結合を有し、ＩｇＧ３は１１個の鎖間ジスルフィド結合を有する。

【0048】

「抗体」及び「抗体分子」という用語は、本明細書で使用される場合、Ｆａｂ及びｓｃＦｖ断片等の抗体断片を含み、ただし、当該断片はヒトＳＥＭＡ４Ａのエピトープに対するＣＤＲベースの抗原結合部位を含む。抗体断片の例としては、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２；ダイアボディ；線状抗体；一本鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）及びドメイン抗体（ｓｄＡｂ）が挙げられるが、これらに限定されない。したがって、文脈上別段の要求がない限り、本明細書で使用される「抗原結合タンパク質」、「抗体」又は「抗体分子」という用語は、「抗体又はその抗原結合断片」と同等である。

【0049】

抗体は免疫グロブリンであり、２つのＦａｂアームを形成する２つの重鎖及び２つの軽鎖からなる同じ基本構造を有し、２つの重鎖及び２つの軽鎖は、柔軟なヒンジ領域によって抗体のステムに結合された同一のドメイン、Ｆｃドメインを含み、古典的な「Ｙ」形状を与える。Ｆａｂドメインは、２つの可変ドメイン及び２つの定常ドメインからなり、重鎖に可変重鎖（Ｖ_Ｈ）ドメイン及び定常重鎖１（ＣＨ１）ドメインがあり、軽鎖に可変軽鎖（Ｖ_Ｌ）ドメイン及び定常軽鎖（ＣＬ）ドメインがある。２つの可変ドメイン（Ｖ_Ｈ及びＶ_Ｌ）は、抗体のＣＤＲベースの抗原特異性を提供する可変断片（Ｆｖ）を形成し、定常ドメイン（ＣＨ１及びＶ_Ｌ）は構造フレームワークとして作用する。各可変ドメインは、相補性決定領域（ＣＤＲ）として知られる３つの超可変ループを含む。Ｖ_Ｈ及びＶ_Ｌドメインの各々において、３つのＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）は、４つの可変性の低いフレームワーク（ＦＷ）領域（ＦＷ１、ＦＷ２、ＦＷ３、及びＦＷ４）に隣接して、構造ＦＷ１－ＣＤＲ１－ＦＷ２－ＣＤＲ２－ＦＷ３－ＣＤＲ３－ＦＷ４を与える。ＣＤＲは、抗体の表面上に特異的抗原認識部位を提供する。

【0050】

Kabat及びImMunoGeneTics（IMGT）ナンバリング命名法の両方を本明細書で使用することができる。一般に、別段示されない限り、アミノ酸残基は、本明細書ではKabatナンバリングスキームに従ってナンバリングされる（Kabat et al.,1991）。IMGTナンバリングスキームが使用される場合、アミノ酸残基は、Lefranc et al.,2005に記載のImMunoGeneTics（IMGT）ナンバリングスキームに従って本明細書でナンバリングされる。

【0051】

モノクローナル抗体及び他の抗体を使用し、組換えＤＮＡテクノロジーの技術を使用して、一般に元の抗体の特異性を保持する他の抗体又はキメラ分子を産生することが可能である。そのような技術は、ＣＤＲを異なる免疫グロブリンフレームワークに導入すること、又は可変領域を異なる免疫グロブリン定常領域にグラフトすることを含み得る。ある免疫グロブリンのＣＤＲの別の免疫グロブリンへの導入は、例えば欧州特許出願公開第Ａ－１８４１８７号、英国特許出願公開第２１８８６３８Ａ号又は欧州特許出願公開第Ａ－２３９４００号に記載されている。或いは、抗体分子を産生するハイブリドーマ又は他の細胞は、遺伝子変異又は他の変化を受けてもよく、産生された抗体の結合特異性を変化させてもさせなくてもよい。

【0052】

抗体ヒト化は、ヒト抗体フレームワークへの重要な非ヒトアミノ酸の移入又は「グラフト化」を含む。主に、これには、相補性決定領域（ＣＤＲ）におけるアミノ酸のグラフト化が含まれるが、Ｖ_Ｈ－Ｖ_Ｌ界面及びＣＤＲの配向にとって重要な他のフレームワークアミノ酸も含まれる可能性がある。ヒト化は、非ヒト親抗体の元の結合活性を保持しながら、免疫原性のリスクを低減するためにヒト含有量を導入しようとする。「ヒト化抗体」という用語は、別の哺乳動物種の生殖系列に由来するＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列にグラフトされている抗体を指すことを意図し、場合により、ヒトフレームワーク配列内で更なるフレームワーク領域修飾を行うことができる。「ヒト化抗体」という用語は、別の哺乳動物種の生殖系列に由来するＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列にグラフトされ、例えばＣＤＲの１つ以上及び／又は１つ以上のフレームワーク配列中の１つ以上のアミノ酸残基の改変によって（例えば親和性成熟によって）最適化されて、ヒト化抗体の生物学的特性を調節又は改善する、例えば親和性を増加させる、又は抗体のその標的エピトープへの結合のオン速度及び／又はオフ速度を調節する抗体を含む。

【0053】

本発明で使用される可変ドメインは、任意の生殖系列又は再編成されたヒト可変ドメインから得られるか若しくは誘導され得るか、又は既知のヒト可変ドメインのコンセンサス配列又は実際の配列に基づく合成可変ドメインであり得る。可変ドメインのレパートリは、適切な結合メンバーが選択され得るように、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる国際公開第９２／０１０４７号のファージディスプレイシステム、又はKay,Winter&McCafferty [Kay,B.K.,Winter,J.,and McCafferty,J.(1996)Phage Display of Peptides and Proteins:A Laboratory Manual,San Diego:Academic Press]を含むその後の大規模な文献のいずれか等の適切な宿主システムで表示され得る。他の適切な宿主系には、酵母ディスプレイ、細菌ディスプレイ、Ｔ７ディスプレイ、ウイルスディスプレイ、細胞ディスプレイ、リボソームディスプレイ及び共有結合ディスプレイが含まれるが、これらに限定されない。

【0054】

抗体は多数の方法で修飾することができるので、「抗原結合タンパク質」又は「抗体」という用語は、天然又は全体的若しくは部分的に合成されているかどうかにかかわらず、免疫グロブリン結合ドメイン、アプタマー、アフィマー又は二環式ペプチドを含む任意のポリペプチドを含む、抗体の抗体断片、誘導体、機能的等価物及びホモログを包含すると解釈されるべきである。

【0055】

したがって、別のポリペプチドに融合された免疫グロブリン結合ドメイン又は等価物を含むキメラ分子が含まれる。キメラ抗体のクローニング及び発現は、欧州特許出願公開第Ａ－０１２０６９４号及び欧州特許出願公開第Ａ－０１２５０２３号に記載されている。

【0056】

ＣＤＲ配列及びＣＨ３ドメインの両方を含む抗体断片の例は、ＣＨ３ドメインに連結されたｓｃＦｖを含むミニボディである（Hu et al.,1996）。

【0057】

ドメイン（単一ドメイン）抗体は、重鎖抗体又はＩｇＧの一方の可変ドメイン（Ｖ_Ｈ）を含む、通常約１１０アミノ酸長のペプチドである。単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）（例えば、ナノボディ）は、単一の単量体可変抗体ドメインからなる抗体断片である。全抗体（２つの重鎖及び２つの軽鎖を含む）と同様に、それは特定の抗原に選択的に結合することができる抗原結合タンパク質である。ドメイン抗体は、わずか１２～１５ｋＤａの分子量を有し、したがって、二本のタンパク質重鎖及び二本の軽鎖で構成される抗体（１５０～１６０ｋＤａ）よりもはるかに小さく、ドメイン抗体は、Ｆａｂ断片（約５０ｋＤａ、１つの軽鎖及び半分の重鎖）並びに一本鎖可変断片（約２５ｋＤａ、２つの可変ドメイン、一方は軽鎖由来、他方は重鎖由来）よりも更に小さい。単一ドメイン抗体は、ラクダ科動物に見られる重鎖抗体から操作されており、これらはＶ_ＨＨ断片と呼ばれる。軟骨魚類はまた、重鎖抗体（ＩｇＮＡＲ、「免疫グロブリン新規抗原受容体」）を有し、そこからＶＮＡＲ断片と呼ばれる単一ドメイン抗体を得ることができる。ドメイン（単一ドメイン）抗体は、Ｖ_Ｈ又はＶ_Ｌであり得る。ドメイン抗体は、ヒト又はマウス起源のＶ_Ｈ又はＶ_Ｌであり得る。ほとんどの単一ドメイン抗体は重鎖可変ドメインであるが、軽鎖単一ドメイン抗体（Ｖ_Ｌ）も標的エピトープに特異的に結合することが示されている。

【0058】

タンパク質足場は、比較的定義された三次元構造を有し、典型的には、抗原に結合することができる足場内の抗原結合領域を生成するために、特異的又はランダムなアミノ酸配列バリエーションに適した１つ以上の領域を含む。

【0059】

本発明のヒト化若しくはヒト抗体又は抗原結合断片は、ヒトＳＥＭＡ４Ａに特異的に結合する。「特異的」という用語は、抗体分子がその特異的結合パートナー、ここではヒトＳＥＭＡ４Ａのエピトープ以外の分子に有意な結合を示さない状況を指し得る。「特異的」という用語は、抗体が、多数の抗原によって担持されるヒトＳＥＭＡ４Ａのエピトープ等の特定のエピトープに特異的である場合にも適用可能であり、その場合、抗体分子は、エピトープを担持する様々な抗原に結合することができる。エピトープは、細胞表面上に発現されたヒトＳＥＭＡ４Ａ又は細胞表面から脱落した若しくは組換え発現された可溶性ＳＥＭＡ４Ａ（ｓＳＥＭＡ４Ａ）中に存在し得る。いくつかの実施形態では、本発明のヒト化若しくはヒト抗体又は抗原結合断片は、ヒトＳＥＭＡ４Ａに特異的に結合し、カニクイザル及び／又はマウスＳＥＭＡ４Ａに結合し、したがって、本発明のヒト化若しくはヒト抗体又は抗原結合断片は、ヒトＳＥＭＡ４Ａに特異的に結合し得、カニクイザル及び／又はマウスＳＥＭＡ４Ａと交差反応性であり得る。

【0060】

本発明のいくつかの実施形態では、ヒト化抗体及びその抗原結合断片は、マウス５Ｅ３（配列番号３、４、５、１２、１３及び１４）の６つのＣＤＲのセット及びヒトフレームワーク配列を含む、マウス５Ｅ３ ｍＡｂ（カタログ番号：１４８４０２、BioLegend,Inc.、USA）のヒト化バージョンである。

【0061】

本発明のいくつかの態様では、本発明のヒト化抗体及びヒト抗体並びにそれらの抗原結合断片は、マウス５Ｅ３ ｍＡｂ（カタログ番号：１４８４０２、BioLegend,Inc.、USA）によって結合されたエピトープに結合するか、又はＳＥＭＡ４Ａ、好ましくはヒトＳＥＭＡ４Ａ上のエピトープへの結合についてマウスｍＡｂ ５Ｅ３と競合する。

【0062】

アミノ酸は、それらの１文字若しくは３文字コードによって、又はそれらの完全名によって参照され得る。２０個の標準アミノ酸のそれぞれの１及び３文字コード並びに完全名を以下の表１に示す。

【0063】

【表1】

【0064】

好ましい実施形態では、本発明は、
ａ）５Ｅ３（配列番号：３、４、５、１２、１３、１４）；
ｂ）５Ｈｇ１－５Ｌｇ１（配列番号：２１、２２、２３、３０、３１、３２）；
ｃ）５Ｈｇ１－５Ｌｇ２（配列番号：３９、４０、４１、４８、４９、５０）；
ｄ）５Ｈｇ２－５Ｌｇ１（配列番号：５７、５８、５９、６６、６７、６８）；
ｅ）５Ｈｇ２－５Ｌｇ２（配列番号：７５、７６、７７、８４、８５、８６）；
ｆ）５Ｈｇ２－５Ｌｇ３（配列番号：９３、９４、９５、１０２、１０３、１０４）；
ｇ）５Ｈｇ２－５Ｌｇ５（配列番号：１１１、１１２、１１３、１２０、１２１、１２２）；
ｈ）５Ｈｇ２－５Ｌｇ６（配列番号：１２９、１３０、１３１、１３８、１３９、１４０）；
ｉ）５Ｈｇ４－５Ｌｇ１（配列番号：１４７、１４８、１４９、１５６、１５７、１５８）；
ｊ）５Ｈｇ４－５Ｌｇ２（配列番号：１６５、１６６、１６７、１７４、１７５、１７６）；
ｋ）５Ｈｇ４－５Ｌｇ４（配列番号：１８３、１８４、１８５、１９２、１９３、１９４）；
ｌ）５Ｈｇ４－５Ｌｇ５（配列番号：２０１、２０２、２０３、２１０、２１１、２１２）；
ｍ）５Ｈｇ５－５Ｌｇ２（配列番号：２１９、２２０、２２１、２２８、２２９、２３０）；
ｎ）Ｃ０１２０９０３（配列番号：２３７、２３８、２３９、２４６、２４７、２４８）；
ｏ）Ｃ０１２０９０４（配列番号：２５５、２５６、２５７、２６４、２６５、２６６）；
ｐ）Ｃ０１２０９０５（配列番号：２７３、２７４、２７５、２８２、２８３、２８４）；
ｑ）Ｃ０１２０９０６（配列番号：２９１、２９２、２９３、３００、３０１、３０２）；
ｒ）Ｃ０１２０９１０（配列番号：３０９、３１０、３１１、３１８、３１９、３２０）；
ｓ）Ｃ０１２０９１３（配列番号：３２７、３２８、３２９、３３６、３３７、３３８）；
ｔ）Ｃ０１２０９１４（配列番号：３４５、３４６、３４７、３５４、３５５、３５６）；
ｕ）Ｃ０１２０９１７（配列番号：３６３、３６４、３６５、３７２、３７３、３７４）；
ｖ）Ｃ０１２０９１８（配列番号：３８１、３８２、３８３、３９０、３９１、３９２）；
ｗ）Ｃ０１２０９１９（配列番号：３９９、４００、４０１、４０８、４０９、４１０）；
ｘ）Ｃ０１２０９２０（配列番号：４１７、４１８、４１９、４２６、４２７、４２８）；
ｙ）Ｃ０１２０９２１（配列番号：４３５、４３６、４３７、４４４、４４５、４４６）；
ｚ）Ｃ０１２０９２２（配列番号：４５３、４５３、４５５、４６２、４６３、４６４）；
ａａ）Ｃ０１２０９２３（配列番号：４７１、４７２、４７３、４８０、４８１、４８２）；
ｂｂ）Ｃ０１２０９２４（配列番号：４８９、４９０、４９１、４９８、４９９、５００）；
ｃｃ）Ｃ０１２０９２５（配列番号：５０７、５０８、５０９、５１６、５１７、５１８）；
ｄｄ）Ｃ０１２０９２６（配列番号：５２５、５２６、５２７、５３４、５３５、５３６）；
ｅｅ）Ｃ０１２０９２７（配列番号：５４３、５４４、５４５、５５２、５５３、５５４）；
ｆｆ）Ｃ０１２０９２８（配列番号：５６１、５６２、５６３、５７０、５７１、５７２）；
ｇｇ）Ｃ０１２０９２９（配列番号：５７９、５８０、５８１、５８８、５８９、５９０）及び
ｈｈ）Ｃ０１２０９３０（配列番号：５９７、５９８、５９９、６０６、６０７、６０８）
から選択されるクローンの６つのＣＤＲ ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３のセットを含むヒト化抗体若しくはヒト抗体又はその抗原結合断片を提供し、
ここで、ＣＤＲはKabatに従って定義される。

【0065】

各クローンについて、ＣＤＲは、フレームワーク領域ＦＷ１、ＦＷ２、ＦＷ３及びＦＷ４によって離間されて、ＦＷ１－ＣＤＲ１－ＦＷ２－ＣＤＲ２－ＦＷ３－ＣＤＲ３－ＦＷ４の形式の構造を与える。

【0066】

本発明は、
ａ）５Ｈｇ１－５Ｌｇ１（配列番号：２０及び２９）；
ｂ）５Ｈｇ１－５Ｌｇ２（配列番号：３８及び４７）；
ｃ）５Ｈｇ２－５Ｌｇ１（配列番号：５６及び６５）；
ｄ）５Ｈｇ２－５Ｌｇ２（配列番号：７４及び８３）；
ｅ）５Ｈｇ２－５Ｌｇ３（配列番号：９２及び１０１）；
ｆ）５Ｈｇ２－５Ｌｇ５（配列番号：１１０及び１１９）；
ｇ）５Ｈｇ２－５Ｌｇ６（配列番号：１２８及び１３７）；
ｈ）５Ｈｇ４－５Ｌｇ１（配列番号：１４６及び１５５）；
ｉ）５Ｈｇ４－５Ｌｇ２（配列番号：１６４及び１７３）；
ｊ）５Ｈｇ４－５Ｌｇ４（配列番号：１８２及び１９１）；
ｋ）５Ｈｇ４－５Ｌｇ５（配列番号：２００及び２０９）；
ｌ）５Ｈｇ５－５Ｌｇ２（配列番号：２１８及び２２７）；
ｍ）Ｃ０１２０９０３（配列番号：２３６及び２４５）；
ｎ）Ｃ０１２０９０４（配列番号：２５４及び２６３）；
ｏ）Ｃ０１２０９０５（配列番号：２７２及び２８１）；
ｐ）Ｃ０１２０９０６（配列番号：２９０及び２９９）；
ｑ）Ｃ０１２０９１０（配列番号：３０８及び３１７）；
ｒ）Ｃ０１２０９１３（配列番号：３２６及び３３５）；
ｓ）Ｃ０１２０９１４（配列番号：３４４及び３５３）；
ｔ）Ｃ０１２０９１７（配列番号：３６２及び３７１）；
ｕ）Ｃ０１２０９１８（配列番号：３８０及び３８９）；
ｖ）Ｃ０１２０９１９（配列番号：３９８及び４０７）；
ｗ）Ｃ０１２０９２０（配列番号：４１６及び４２５）；
ｘ）Ｃ０１２０９２１（配列番号：４３４及び４４３）；
ｙ）Ｃ０１２０９２２（配列番号：４５２及び４６１）；
ｚ）Ｃ０１２０９２３（配列番号：４７０及び４７９）；
ａａ）Ｃ０１２０９２４（配列番号：４８８及び４９７）；
ｂｂ）Ｃ０１２０９２５（配列番号：５０６及び５１５）；
ｃｃ）Ｃ０１２０９２６（配列番号：５２４及び５３３）；
ｄｄ）Ｃ０１２０９２７（配列番号：５４２及び５５１）；
ｅｅ）Ｃ０１２０９２８（配列番号：５６０及び５６９）；
ｆｆ）Ｃ０１２０９２９（配列番号：５７８及び５８７）；並びに
ｇｇ）Ｃ０１２０９３０（配列番号：５９６及び６０５）；
から選択されるクローンのＶ_Ｈ及び／又はＶ_Ｌ配列を含むヒト抗体若しくはヒト化抗体又はその抗原結合断片を提供し、
ここで、配列はKabatに従って定義される。

【0067】

いくつかの例では、抗体を生殖細胞系のために選択した。抗体のＶ_Ｈ及びＶ_Ｌドメインのアミノ酸配列を、IMGT（ImMunoGeneTics;www.imgt.org）又はImmuneDiscoverデータベースを介してアクセス可能なヒト生殖系列Ｖ、Ｄ及びＪ領域と比較し、最も近い生殖系列を配列類似性によって同定した。生殖系列化プロセスは、Ｖ_Ｈ及びＶ_Ｌドメイン中のフレームワーク残基を最も近い生殖系列配列に戻して、ヒト抗体と同一にマッチさせることからなっていた。

【0068】

本発明の抗体又はその抗原結合断片は、抗体の機能的特性が保持されている限り、Ｖ_Ｈ及び／又はＶ_Ｌ配列中に１つ以上、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個の更なるアミノ酸修飾を含み得る。

【0069】

修飾は、アミノ酸の置換、欠失又は挿入であり得、好ましくは、修飾は置換である。１つ以上のアミノ酸が別のアミノ酸で置換されている好ましい実施形態では、置換は、例えば表２による保存的置換であり得る。いくつかの実施形態では、中央の列の同じカテゴリーのアミノ酸は互いに置換されており、すなわち、例えば、非極性アミノ酸は別の非極性アミノ酸で置換されている。いくつかの実施形態では、右端の列の同じ行のアミノ酸は、互いに置換されている。

【0070】

【表2】

【0071】

いくつかの実施形態では、置換は機能的に保存的であり得る。すなわち、いくつかの実施形態では、置換は、等価な非置換抗体分子と比較して、置換を含む抗体分子の１つ以上の機能的特性（例えば、結合親和性）に影響を及ぼさない（又は実質的に影響を及ぼさない）場合がある。

【0072】

好ましい実施形態では、本発明の抗体又はその抗原結合断片は、本明細書に記載の本発明のＶ_Ｈ及び／又はＶ_Ｌ配列と比較して、１つ以上のアミノ酸配列変化（アミノ酸残基の付加、欠失、置換及び／又は挿入）、好ましくは２０個又はそれ未満の変化、１５個又はそれ未満の変化、１０個又はそれ未満の変化、５個又はそれ未満の変化、４個又はそれ未満の変化、３個又はそれ未満の変化、２個又はそれ未満の変化、又は１個の変化を有するＶ_Ｈ及び／又はＶ_Ｌドメイン配列を含み得る。

【0073】

好ましい実施形態では、本発明は、Kabat命名法によって定義されている場合、
ａ）５Ｅ３（配列番号：２及び１１）；
ｂ）５Ｈｇ１－５Ｌｇ１（配列番号：２０及び２９）；
ｃ）５Ｈｇ１－５Ｌｇ２（配列番号：３８及び４７）；
ｄ）５Ｈｇ２－５Ｌｇ１（配列番号：５６及び６５）；
ｅ）５Ｈｇ２－５Ｌｇ２（配列番号：７４及び８３）；
ｆ）５Ｈｇ２－５Ｌｇ３（配列番号：９２及び１０１）；
ｇ）５Ｈｇ２－５Ｌｇ５（配列番号：１１０及び１１９）；
ｈ）５Ｈｇ２－５Ｌｇ６（配列番号：１２８及び１３７）；
ｉ）５Ｈｇ４－５Ｌｇ１（配列番号：１４６及び１５５）；
ｊ）５Ｈｇ４－５Ｌｇ２（配列番号：１６４及び１７３）；
ｋ）５Ｈｇ４－５Ｌｇ４（配列番号：１８２及び１９１）；
ｌ）５Ｈｇ４－５Ｌｇ５（配列番号：２００及び２０９）；
ｍ）５Ｈｇ５－５Ｌｇ２（配列番号：２１８及び２２７）；
ｎ）Ｃ０１２０９０３（配列番号：２３６及び２４５）；
ｏ）Ｃ０１２０９０４（配列番号：２５４及び２６３）；
ｐ）Ｃ０１２０９０５（配列番号：２７２及び２８１）；
ｑ）Ｃ０１２０９０６（配列番号：２９０及び２９９）；
ｒ）Ｃ０１２０９１０（配列番号：３０８及び３１７）；
ｓ）Ｃ０１２０９１３（配列番号：３２６及び３３５）；
ｔ）Ｃ０１２０９１４（配列番号：３４４及び３５３）；
ｕ）Ｃ０１２０９１７（配列番号：３６２及び３７１）；
ｖ）Ｃ０１２０９１８（配列番号：３８０及び３８９）；
ｗ）Ｃ０１２０９１９（配列番号：３９８及び４０７）；
ｘ）Ｃ０１２０９２０（配列番号：４１６及び４２５）；
ｙ）Ｃ０１２０９２１（配列番号：４３４及び４４３）；
ｚ）Ｃ０１２０９２２（配列番号：４５２及び４６１）；
ａａ）Ｃ０１２０９２３（配列番号：４７０及び４７９）；
ｂｂ）Ｃ０１２０９２４（配列番号：４８８及び４９７）；
ｃｃ）Ｃ０１２０９２５（配列番号：５０６及び５１５）；
ｄｄ）Ｃ０１２０９２６（配列番号：５２４及び５３３）；
ｅｅ）Ｃ０１２０９２７（配列番号：５４２及び５５１）；
ｆｆ）Ｃ０１２０９２８（配列番号：５６０及び５６９）；
ｇｇ）Ｃ０１２０９２９（配列番号：５７８及び５８７）；及び
ｈｈ）Ｃ０１２０９３０（配列番号：５９６及び６０５）；
から選択されるクローンのＶ_Ｈ及び／又はＶ_Ｌアミノ酸配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するＶ_Ｈ及び／又はＶ_Ｌドメインを含むヒト化若しくはヒト抗体又はその抗原結合断片を提供する。

【0074】

本発明の好ましい実施形態では、本発明のヒト化抗体若しくはヒト抗体又はその抗原結合断片は、
（ａ）５Ｅ３（配列番号：３、４、５、１２、１３、１４）；
（ｂ）５Ｈｇ１－５Ｌｇ１（配列番号：２１、２２、２３、３０、３１、３２）；
（ｃ）５Ｈｇ１－５Ｌｇ２（配列番号：３９、４０、４１、４８、４９、５０）；
（ｄ）５Ｈｇ２－５Ｌｇ１（配列番号：５７、５８、５９、６６、６７、６８）；
（ｅ）５Ｈｇ２－５Ｌｇ２（配列番号：７５、７６、７７、８４、８５、８６）；
（ｆ）５Ｈｇ２－５Ｌｇ３（配列番号：９３、９４、９５、１０２、１０３、１０４）；
（ｇ）５Ｈｇ２－５Ｌｇ５（配列番号：１１１、１１２、１１３、１２０、１２１、１２２）；
（ｈ）５Ｈｇ２－５Ｌｇ６（配列番号：１２９、１３０、１３１、１３８、１３９、１４０）；
（ｉ）５Ｈｇ４－５Ｌｇ１（配列番号：１４７、１４８、１４９、１５６、１５７、１５８）；
（ｊ）５Ｈｇ４－５Ｌｇ２（配列番号：１６５、１６６、１６７、１７４、１７５、１７６）；
（ｋ）５Ｈｇ４－５Ｌｇ４（配列番号：１８３、１８４、１８５、１９２、１９３、１９４）；
（ｌ）５Ｈｇ４－５Ｌｇ５（配列番号：２０１、２０２、２０３、２１０、２１１、２１２）；
（ｍ）５Ｈｇ５－５Ｌｇ２（配列番号：２１９、２２０、２２１、２２８、２２９、２３０）；
（ｎ）Ｃ０１２０９０３（配列番号：２３７、２３８、２３９、２４６、２４７、２４８）；
（ｏ）Ｃ０１２０９０４（配列番号：２５５、２５６、２５７、２６４、２６５、２６６）；
（ｐ）Ｃ０１２０９０５（配列番号：２７３、２７４、２７５、２８２、２８３、２８４）；
（ｑ）Ｃ０１２０９０６（配列番号：２９１、２９２、２９３、３００、３０１、３０２）；
（ｒ）Ｃ０１２０９１０（配列番号：３０９、３１０、３１１、３１８、３１９、３２０）；
（ｓ）Ｃ０１２０９１３（配列番号：３２７、３２８、３２９、３３６、３３７、３３８）；
（ｔ）Ｃ０１２０９１４（配列番号：３４５、３４６、３４７、３５４、３５５、３５６）；
（ｕ）Ｃ０１２０９１７（配列番号：３６３、３６４、３６５、３７２、３７３、３７４）；
（ｖ）Ｃ０１２０９１８（配列番号：３８１、３８２、３８３、３９０、３９１、３９２）；
（ｗ）Ｃ０１２０９１９（配列番号：３９９、４００、４０１、４０８、４０９、４１０）；
（ｘ）Ｃ０１２０９２０（配列番号：４１７、４１８、４１９、４２６、４２７、４２８）；
（ｙ）Ｃ０１２０９２１（配列番号：４３５、４３６、４３７、４４４、４４５、４４６）；
（ｚ）Ｃ０１２０９２２（配列番号：４５３、４５３、４５５、４６２、４６３、４６４）；
（ａａ）Ｃ０１２０９２３（配列番号：４７１、４７２、４７３、４８０、４８１、４８２）；
（ｂｂ）Ｃ０１２０９２４（配列番号：４８９、４９０、４９１、４９８、４９９、５００）；
（ｃｃ）Ｃ０１２０９２５（配列番号：５０７、５０８、５０９、５１６、５１７、５１８）；
（ｄｄ）Ｃ０１２０９２６（配列番号：５２５、５２６、５２７、５３４、５３５、５３６）；
（ｅｅ）Ｃ０１２０９２７（配列番号：５４３、５４４、５４５、５５２、５５３、５５４）；
（ｆｆ）Ｃ０１２０９２８（配列番号：５６１、５６２、５６３、５７０、５７１、５７２）；
（ｇｇ）Ｃ０１２０９２９（配列番号：５７９、５８０、５８１、５８８、５８９、５９０）及び
（ｈｈ）Ｃ０１２０９３０（配列番号：５９７、５９８、５９９、６０６、６０７、６０８）
から選択されるクローンのＨＣＤＲのセット：ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含むＶ_Ｈドメインアミノ酸配列、及び／又はクローンのＬＣＤＲのセット：ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含むＶ_Ｌドメインアミノ酸配列を含み、
ここで、ＣＤＲはKabatに従って定義され、Ｖ_Ｈ及び／又はＶ_Ｌドメインは、Kabat命名法によって定義されている場合、
ａ．５Ｅ３（配列番号：２及び１１）；
ｂ．５Ｈｇ１－５Ｌｇ１（配列番号：２０及び２９）；
ｃ．５Ｈｇ１－５Ｌｇ２（配列番号：３８及び４７）；
ｄ．５Ｈｇ２－５Ｌｇ１（配列番号：５６及び６５）；
ｅ．５Ｈｇ２－５Ｌｇ２（配列番号：７４及び８３）；
ｆ．５Ｈｇ２－５Ｌｇ３（配列番号：９２及び１０１）；
ｇ．５Ｈｇ２－５Ｌｇ５（配列番号：１１０及び１１９）；
ｈ．５Ｈｇ２－５Ｌｇ６（配列番号：１２８及び１３７）；
ｉ．５Ｈｇ４－５Ｌｇ１（配列番号：１４６及び１５５）；
ｊ．５Ｈｇ４－５Ｌｇ２（配列番号：１６４及び１７３）；
ｋ．５Ｈｇ４－５Ｌｇ４（配列番号：１８２及び１９１）；
ｌ．５Ｈｇ４－５Ｌｇ５（配列番号：２００及び２０９）；
ｍ．５Ｈｇ５－５Ｌｇ２（配列番号：２１８及び２２７）；
ｎ．Ｃ０１２０９０３（配列番号：２３６及び２４５）；
ｏ．Ｃ０１２０９０４（配列番号：２５４及び２６３）；
ｐ．Ｃ０１２０９０５（配列番号：２７２及び２８１）；
ｑ．Ｃ０１２０９０６（配列番号：２９０及び２９９）；
ｒ．Ｃ０１２０９１０（配列番号：３０８及び３１７）；
ｓ．Ｃ０１２０９１３（配列番号：３２６及び３３５）；
ｔ．Ｃ０１２０９１４（配列番号：３４４及び３５３）；
ｕ．Ｃ０１２０９１７（配列番号：３６２及び３７１）；
ｖ．Ｃ０１２０９１８（配列番号：３８０及び３８９）；
ｗ．Ｃ０１２０９１９（配列番号：３９８及び４０７）；
ｘ．Ｃ０１２０９２０（配列番号：４１６及び４２５）；
ｙ．Ｃ０１２０９２１（配列番号：４３４及び４４３）；
ｚ．Ｃ０１２０９２２（配列番号：４５２及び４６１）；
ａａ．Ｃ０１２０９２３（配列番号：４７０及び４７９）；
ｂｂ．Ｃ０１２０９２４（配列番号：４８８及び４９７）；
ｃｃ．Ｃ０１２０９２５（配列番号：５０６及び５１５）；
ｄｄ．Ｃ０１２０９２６（配列番号：５２４及び５３３）；
ｅｅ．Ｃ０１２０９２７（配列番号：５４２及び５５１）；
ｆｆ．Ｃ０１２０９２８（配列番号：５６０及び５６９）；
ｇｇ．Ｃ０１２０９２９（配列番号：５７８及び５８７）；並びに
ｈｈ．Ｃ０１２０９３０（配列番号：５９６及び６０５）
から選択されるクローンの配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。

【0075】

配列同一性は、アルゴリズムGAP（Wisconsin GCG package、Accelerys Inc、San Diego USA）を参照して一般に定義される。GAPは、Needleman及びWunschアルゴリズムを使用して２つの完全な配列を整列させ、マッチ数を最大化し、ギャップの数を最小化する。一般に、デフォルトパラメータが使用され、ギャップ生成ペナルティは１２であり、ギャップ拡張ペナルティは４と同等である。GAPの使用が好ましいかもしれないが、他のアルゴリズム、例えば、BLAST（Altschul et al.,1990の方法を使用する）、FASTA（Pearson and Lipman 1988の方法を使用する）、又はSmith-Watermanアルゴリズム（Smith and Waterman 1981）、又は一般にデフォルトパラメータを使用する上記のAltschul et al.,(1990)のTBLASTNプログラムを使用することができる。特に、psi-Blastアルゴリズムを使用することができる（Altschul et al.,1997）。配列アラインメントは、CLUSTAL(W)アルゴリズムを使用して行うこともできる。

【0076】

抗体はＣＨ２ドメインを含み得る。ＣＨ２ドメインは、好ましくは、ヒトＩｇＧ分子の場合のように、ＣＨ３ドメインのＮ末端に位置する。抗体のＣＨ２ドメインは、好ましくはヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４のＣＨ２ドメイン、より好ましくはヒトＩｇＧ１のＣＨ２ドメインである。ヒトＩｇＧドメインの配列は、当技術分野で公知である。

【0077】

抗体は、ＣＨ２ドメインのＮ末端に免疫グロブリンヒンジ領域又はその一部を含み得る。免疫グロブリンヒンジ領域は、２つのＣＨ２－ＣＨ３ドメイン配列が会合し、二量体を形成することを可能にする。好ましくは、ヒンジ領域又はその一部は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３若しくはＩｇＧ４ヒンジ領域又はその一部である。より好ましくは、ヒンジ領域、又はその一部は、ＩｇＧ１ヒンジ領域、又はその一部である。

【0078】

ＣＨ３ドメインの配列は特に限定されない。好ましくは、ＣＨ３ドメインは、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４ ＣＨ３ドメイン等のヒト免疫グロブリンＧドメイン、最も好ましくはヒトＩｇＧ１ ＣＨ３ドメインである。

【0079】

本発明の抗体は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４定常領域を含み得る。ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４ ＣＨ３ドメインの配列は、当技術分野で公知である。本発明の抗体は、ヒトＩｇＧ定常領域、例えばヒトＩｇＧ１定常領域を含み得る。本発明の抗体は、リンカー及び細胞毒素とのコンジュゲーションを可能にするように修飾されたヒトＩｇＧ Ｆｃを含み得る。

【0080】

本発明の抗体は、Dimasi et al.,2017;Li et al.,2016及びGallagher et al.,2019（例えば、それぞれＣＨ２及びＣＨ３ Ｆｃドメインに２３９ｉＣｙｓ及びＳ４４２Ｃ（ＥＵナンバリング）を有するヒトＩｇＧ１重鎖）に記載されているような制御された様式でリンカーを介した抗体への細胞毒素のコンジュゲーションを可能にする１つ以上、例えば２つの部位特異的な操作されたシステインを含有するように操作されたヒトＩｇＧ重鎖、例えばヒトＩｇＧ１重鎖を含んで、４の薬物対抗体比を生成し得る（ヒトＩｇＧ１ Ａｌｙａ）。本発明の抗体は、ヒトラムダ軽鎖定常ドメイン又はヒトカッパ軽鎖定常ドメインを含み得る。

【0081】

本発明の抗体は、エフェクター機能を有するヒトＩｇＧ Ｆｃを含み得る。

【0082】

Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）は、細胞エフェクター機能に対する抗体媒介（体液性）免疫応答をつなぐ重要な免疫調節受容体である。ＦｃγＲ（ＩｇＧ）、ＦｃεＲＩ（ＩｇＥ）、ＦｃαＲＩ（ＩｇＡ）、ＦｃμＲ（ＩｇＭ）及びＦｃδＲ（ＩｇＤ）を含む全てのクラスの免疫グロブリンの受容体が同定されている。白血球上に見られるヒトＩｇＧの受容体には、ＣＤ６４（ＦｃγＲＩ）、ＣＤ３２（ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ及びＦｃγＲＩＩｃ）並びにＣＤ１６（ＦｃγＲＩＩＩａ及びＦｃγＲＩＩＩｂ）の３つのクラスがある。ＦｃγＲＩは高親和性受容体（ナノモル範囲の親和性）に分類されるが、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩは低～中程度の親和性（マイクロモル範囲の親和性）である。

【0083】

抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）では、エフェクター細胞（ナチュラルキラー細胞、マクロファージ、単球及び好酸球）の表面上のＦｃγＲは、それ自体が標的細胞に結合しているＩｇＧのＦｃ領域に結合する。結合すると、標的細胞の破壊に介在する溶解酵素、パーフォリン、グランザイム及び腫瘍壊死因子等の様々な物質の分泌をもたらすシグナル伝達経路が引き起こされる。ＡＤＣＣエフェクター機能のレベルは、特定のＩｇＧサブタイプに応じて異なる。バリエーションのレベルはアロタイプ及び特異的ＦｃγＲに依存するが、簡単に言えば、ＡＤＣＣエフェクター機能はヒトＩｇＧ１及びＩｇＧ３では高く、ＩｇＧ２及びＩｇＧ４では低い。効力の低下にランク付けされたエフェクター機能のＩｇＧサブタイプバリエーションについては、以下の表３を参照されたい。

【0084】

【表3】

【0085】

ＦｃγＲは、ヒンジ及び上部ＣＨ２領域を横切って非対称的にＩｇＧに結合する。結合部位の知識は、ＩｇＧエフェクター機能を調節するための工学的努力をもたらした。

【0086】

本発明の抗体は、エフェクター機能、増強されたエフェクター機能又は低減されたエフェクター機能を有するＦｃを有し得る。

【0087】

抗体の効力は、ＡＤＣＣ及び抗体依存性細胞媒介食作用（ＡＤＣＰ）等の細胞傷害機能を媒介する能力の増強によって増加させることができる。Ｆｃドメイン内の多数の突然変異は、Ｆｃ受容体の結合を直接的又は間接的に増強し、細胞傷害性を有意に増強することが同定されている：突然変異Ｓ２３９Ｄ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅ（「３Ｍ」）、Ｆ２４３Ｌ又はＧ２３６Ａ。或いは、エフェクター機能の増強は、Ｆｃドメインのグリコシル化を修飾することによって達成することができ、ＦｃγＲはＣＨ２ドメイン上の炭水化物と相互作用し、グリカン組成物はエフェクター機能活性に実質的な効果を有する。アフコシル化（非フコシル化）抗体は、ＦｃγＲＩＩＩａへの結合の増加を通してＡＤＣＣ活性の大幅な向上を示す。

【0088】

ＡＤＣＣ及びＣＤＣの活性化は、いくつかの治療用抗体にとって望ましい場合があるが、いくつかの実施形態では、エフェクター機能を活性化しない抗体が好ましい。

【0089】

エフェクター機能を欠くため、ＩｇＧ４抗体は、細胞枯渇を伴わない受容体遮断のための好ましいＩｇＧサブクラスである。しかしながら、ＩｇＧ４分子は、Ｆａｂアーム交換と呼ばれる動的プロセスで半分子を交換することができる。この現象は、治療用抗体と内因性ＩｇＧ４との間で起こり得る。Ｓ２２８Ｐ変異は、Ｆａｂアーム交換の傾向が低下したＩｇＧ４抗体の設計を可能にするこの組換えプロセスを妨げることが示されている。

【0090】

Ｆｃ操作アプローチは、ＩｇＧ１ ＦｃドメインとＦｃγ受容体及びＣ１ｑとの重要な相互作用部位を決定し、次いでこれらの位置を変異させて結合を低減又は消失させるために使用されてきた。アラニンスキャニングにより、ヒンジ及びＦｃドメインの上部ＣＨ２を覆う領域へのＣ１ｑの結合部位を同定した。本発明の抗体又は断片のＣＨ２ドメインは、１つ以上のＦｃγＲ、例えばＦｃγＲＩ、ＦｃγＲｌｌａ、ＦｃγＲｌｌｂ、ＦｃγＲＩＩＩ及び／又は補体へのＣＨ２ドメインの結合を減少させるか又は消失させるための１つ以上の変異を含み得る。ヒトＩｇＧドメインのＣＨ２ドメインは、通常、ＦｃγＲ及び補体に結合し、ＦｃγＲへの結合の減少は、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を減少させると予想され、補体への結合の減少は、抗体分子の補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）活性を減少させると予想される。１つ以上のＦｃγＲ及び／又は補体へのＣＨ２ドメインの結合を減少させるか又は消失させる変異は、当技術分野で公知である。本発明の抗体分子は、ＦｃγＲ及びＣ１ｑ結合をほぼ完全に無効にする修飾Ｋ３２２Ａ／Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ又はＬ２３４Ｆ／Ｌ２３５Ｅ／Ｐ３３１Ｓ（「ＴＭ」）を有するＦｃを含み得る。本発明の抗体分子は、ＣＨ２ドメインを含み得、ＣＨ２ドメインは、ＥＵ位置２３４及び２３５（IMGTナンバリングで位置１．３及び１．２）にアラニン残基を含む（「ＬＡＬＡ変異」）。更に、補体活性化及びＡＤＣＣは、Ｐ３２９（ＥＵナンバリングに従う位置）の、例えばＰ３２９Ａ又はＰ３２９Ｇのいずれかへの突然変異によって減少させることができる。本発明の抗体分子は、ＣＨ２ドメインを含み得、ＣＨ２ドメインは、ＥＵ位置２３４及び２３５（IMGTナンバリングで位置１．３及び１．２）にアラニン残基を含み、ＥＵ位置３２９（IMGTナンバリングで位置１１４）にアラニン（ＬＡＬＡ－ＰＡ）又はグリシン（ＬＡＬＡ－ＰＧ）を含む。追加的又は代替的に、本発明の抗体分子は、ＥＵ位置２９７（IMGT番号付けによる位置８４．４）にアラニン、グルタミン又はグリシンを含み得る。

【0091】

最適なＦｃγＲ相互作用に必要であることが知られているＦｃドメインのアスパラギン２９７上のグリコシル化の修飾は、ＦｃγＲへの結合の喪失をもたらし得、Ｎ２９７点変異でＦｃγＲへの結合の喪失が観察された。本発明の抗体分子は、Ｎ２９７Ａ、Ｎ２９７Ｇ又はＮ２９７Ｑ変異を有するＦｃを含み得る。アグリコシルＦｃドメインを有する本発明の抗体分子は、酵素的脱グリコシル化によって、グリコシル化阻害剤の存在下での組換え発現によって、又は細菌におけるＦｃドメインの発現後に得ることができる。

【0092】

ＩｇＧは、ＦｃＲｎが介在する再利用のために血清中で長期間自然に存続し、ＩｇＧに約２１日の典型的な半減期を与える。半減期は、ＦｃドメインとＦｃＲｎとのｐＨ依存性相互作用を操作して、ｐＨ７．４で最小の結合を保持しながらｐＨ６．０で親和性を増加させることによって延長することができる。Ｔ２５０Ｑ／Ｍ４２８Ｌバリアントは、ＩｇＧ半減期の約２倍の増加を与え（アカゲザルで評価）、一方、Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅバリアント（「ＹＴＥ」）は、ＩｇＧ半減期の約４倍の増加を与えた（カニクイザルで評価）。半減期を延長することにより、有効性を維持又は改善しながら、投与頻度を減少させる可能性が可能になり得る。

【0093】

免疫グロブリンは、多数の異なる方法で組み合わせて、多重特異性、例えば二重特異性、三重特異性、又は四重特異性抗体フォーマットを作成することができる、離散ドメインを含むモジュール構造を有することが知られている。例示的な多重特異性抗体フォーマットは、例えば、Spiess et al.,2015;Kontermann 2012に記載される。本発明の抗体は、このような多重特異性フォーマットで使用され得る。

【0094】

本発明は、競合アッセイで評価した場合に、エピトープを含む単離された組換えヒトＳＥＭＡ４Ａ（配列番号６１３）ペプチドへの結合について、本明細書に記載の本発明の抗体（例えば、Kabat命名法によって定義される場合、５Ｅ３（配列番号３、４、５、１２、１３、１４）のＨＣＤＲ及びＬＣＤＲのセットを含む）及び／又はクローン５Ｅ３のＶ_Ｈ及びＶ_Ｌアミノ酸配列のヒト化バリアント（配列番号２及び１１）と競合することができるヒト化若しくはヒト抗体又はその抗原結合断片を提供する。

【0095】

本発明は、
ａ．５Ｅ３（配列番号２及び１１）
ｂ．５Ｈｇ１－５Ｌｇ１（配列番号：２０及び２９）；
ｃ．５Ｈｇ１－５Ｌｇ２（配列番号：３８及び４７）；
ｄ．５Ｈｇ２－５Ｌｇ１（配列番号：５６及び６５）；
ｅ．５Ｈｇ２－５Ｌｇ２（配列番号：７４及び８３）；
ｆ．５Ｈｇ２－５Ｌｇ３（配列番号：９２及び１０１）；
ｇ．５Ｈｇ２－５Ｌｇ５（配列番号：１１０及び１１９）；
ｈ．５Ｈｇ２－５Ｌｇ６（配列番号：１２８及び１３７）；
ｉ．５Ｈｇ４－５Ｌｇ１（配列番号：１４６及び１５５）；
ｊ．５Ｈｇ４－５Ｌｇ２（配列番号：１６４及び１７３）；
ｋ．５Ｈｇ４－５Ｌｇ４（配列番号：１８２及び１９１）；
ｌ．５Ｈｇ４－５Ｌｇ５（配列番号：２００及び２０９）；
ｍ．５Ｈｇ５－５Ｌｇ２（配列番号：２１８及び２２７）；
ｎ．Ｃ０１２０９０３（配列番号：２３６及び２４５）；
ｏ．Ｃ０１２０９０４（配列番号：２５４及び２６３）；
ｐ．Ｃ０１２０９０５（配列番号：２７２及び２８１）；
ｑ．Ｃ０１２０９０６（配列番号：２９０及び２９９）；
ｒ．Ｃ０１２０９１０（配列番号：３０８及び３１７）；
ｓ．Ｃ０１２０９１３（配列番号：３２６及び３３５）；
ｔ．Ｃ０１２０９１４（配列番号：３４４及び３５３）；
ｕ．Ｃ０１２０９１７（配列番号：３６２及び３７１）；
ｖ．Ｃ０１２０９１８（配列番号：３８０及び３８９）；
ｗ．Ｃ０１２０９１９（配列番号：３９８及び４０７）；
ｘ．Ｃ０１２０９２０（配列番号：４１６及び４２５）；
ｙ．Ｃ０１２０９２１（配列番号：４３４及び４４３）；
ｚ．Ｃ０１２０９２２（配列番号：４５２及び４６１）；
ａａ．Ｃ０１２０９２３（配列番号：４７０及び４７９）；
ｂｂ．Ｃ０１２０９２４（配列番号：４８８及び４９７）；
ｃｃ．Ｃ０１２０９２５（配列番号：５０６及び５１５）；
ｄｄ．Ｃ０１２０９２６（配列番号：５２４及び５３３）；
ｅｅ．Ｃ０１２０９２７（配列番号：５４２及び５５１）；
ｆｆ．Ｃ０１２０９２８（配列番号：５６０及び５６９）；
ｇｇ．Ｃ０１２０９２９（配列番号：５７８及び５８７）；並びに
ｈｈ．Ｃ０１２０９３０（配列番号：５９６及び６０５）
から選択されるクローンを有する、エピトープを含む単離された組換えヒトＳＥＭＡ４Ａ（配列番号６１３）ペプチドへの結合について競合することができるヒト化抗体若しくはヒト抗体又はその抗原結合断片を提供し、
ここで、配列はKabat命名法に従って定義され、結合についての競合は競合アッセイで評価される。

【0096】

競合アッセイは、ＥＬＩＳＡ、均一時間分解蛍光（ＨＴＲＦ）、フローサイトメトリ、蛍光マイクロボリュームアッセイ技術（ＦＭＡＴ）アッセイ、Mirrorball、高含有量イメージングベースの蛍光イムノアッセイ、放射性リガンド結合アッセイ、バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）及び熱シフトアッセイ等のイムノアッセイを含む細胞ベース及び無細胞結合アッセイから選択され得る。

【0097】

参照抗体と同じエピトープ又は重複するエピトープに結合する抗体とは、競合アッセイにおいて、その結合パートナー（例えば、抗原又は「標的」）に対する参照抗体の結合を５０％以上遮断する抗体を指し、及び／又は逆に、競合アッセイにおいて、その結合パートナーに対する抗体の結合を５０％以上遮断する抗体を指す。そのような抗体は、目的のエピトープへの結合について競合すると言われる。抗体は、参照抗体のエピトープと同じエピトープ又は重複するエピトープに結合することによって競合し得る。

【0098】

本発明の実施形態では、本明細書に記載の抗ヒト－ＳＥＭＡ４Ａヒト化抗体又はヒト抗体を使用して抗体一本鎖可変断片を生成することができ、次いでこれを使用してキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を調製することができる。抗体一本鎖可変断片は、短いリンカーペプチドによって連結された免疫グロブリンの軽鎖（Ｖ_Ｌ）及び重鎖（Ｖ_Ｈ）から構成されるキメラタンパク質である。いくつかの実施形態では、Ｖ_Ｌ領域とＶ_Ｈ領域との間のリンカーは、柔軟性を付与するグリシン及びセリン、並びに溶解性を付与するグルタマート及びリジンを含む親水性残基からなる。いくつかの態様では、抗体一本鎖可変断片は、典型的には膜貫通ドメインを介して細胞内免疫細胞シグナル伝達ドメインに共有結合してＣＡＲを作製することができる。免疫細胞シグナル伝達ドメインは、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、マクロファージ、及び／又は骨髄細胞ドメインであり得る。

【0099】

抗ヒト－ＳＥＭＡ４Ａヒト化又はヒト抗体一本鎖可変断片は、例えば膜貫通ドメインを介して細胞内Ｔ細胞シグナル伝達又は活性化ドメインに共有結合してＣＡＲを作製し得る。ＣＡＲがＴ細胞において発現される場合、これは、Ｔ細胞に、ＳＥＭＡ４Ａ、特にヒトＳＥＭＡ４Ａを標的化する能力を提供する。したがって、本発明は、血液癌、例えばＭＭ、ＮＨＬ、ＡＭＬ、ＤＬＢＣＬ又はＦＬ患者を治療するために使用するための、ＳＥＭＡ４Ａ、特にヒトＳＥＭＡ４Ａに特異的に結合する、本明細書に記載の抗体の抗ヒトＳＥＭＡ４Ａ抗体一本鎖可変断片を含むＣＡＲを含むＣＡＲ Ｔ細胞を提供し、血液癌、例えば、ＭＭ、ＮＨＬ、ＡＭＬ、ＤＬＢＣＬ又はＦＬを有する患者を治療する方法は、そのようなＣＡＲ Ｔ細胞を、治療を必要とする患者に投与することを含み得る。

【0100】

ＣＡＲの膜貫通ドメインは、ＣＡＲを原形質膜に固定する細胞膜にまたがる疎水性アルファヘリックスを含み得、細胞外抗原認識ドメイン（すなわち、ヒト化又はヒト抗体一本鎖可変断片）を細胞内シグナル伝達領域と架橋する。ＣＡＲは、抗原認識ドメインと膜貫通ドメインとの間にヒンジ領域を更に含み得る。ヒンジは、ｓｃＦｖの柔軟性を高め、ＣＡＲとその標的抗原であるＳＥＭＡ４Ａとの間の空間的制約を低減するのに役立ち得る。ヒンジ配列は、ＩｇＧ、ＣＤ８、及びＣＤ２８等の免疫分子からの膜近位領域に基づき得る。本開示のＣＡＲは、ＣＡＲエンドドメイン成分としてＣＤ３－ゼータ細胞質ドメインを含み得る。Ｔ細胞は、活性化後に持続するためにＣＤ３シグナル伝達に加えて共刺激分子を必要とする。ＣＡＲのエンドドメインは、共刺激タンパク質由来の１つ以上のキメラドメインを含み得る。多種多様な共刺激分子からのシグナル伝達ドメインは首尾よく試験されており、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）及びＣＤ１３７から選択され得る。ＣＡＲ受容体のエンドドメインは、Ｔ細胞活性を増強するための共刺激ドメインを含み得、共刺激ドメインは、ＣＤ２８又は４－１ＢＢ、ＣＤ２８－４－１ＢＢ又はＣＤ２８－ＯＸ４０、及びサイトカイン、例えばＩＬ－２、ＩＬ－５、及びＩＬ－１２のものから選択され得る。

【0101】

本発明はまた、本発明の抗体又は抗原結合断片をコードする核酸又は核酸セット、並びにそのような核酸又は核酸セットを含むベクターを提供する。

【0102】

核酸が本発明の抗体分子のＶ_Ｈ及びＶ_Ｌドメイン又は重鎖及び軽鎖をコードする場合、２つのドメイン又は鎖は、同じ又は別個の核酸分子上にコードされ得る。

【0103】

単離された核酸分子は、本発明の抗体分子を発現するために使用され得る。核酸は、一般に、発現のための組換えベクターの形態で提供される。したがって、本発明の別の態様は、上記の核酸を含むベクターを提供する。プロモータ配列、ターミネータ断片、ポリアデニル化配列、エンハンサ配列、マーカ遺伝子及び必要に応じて他の配列を含む適切な調節配列を含む適切なベクターを選択又は構築することができる。好ましくは、ベクターは、宿主細胞における核酸の発現を駆動するための適切な調節配列を含む。ベクターは、必要に応じて、プラスミド、例えばウイルス、ファージ又はファージミドであり得る。

【0104】

本明細書に記載される核酸分子又はベクターは、宿主細胞に導入され得る。核酸又はベクターを宿主細胞に導入するための技術は、当技術分野で十分に確立されており、任意の適切な技術を使用することができる。組換え抗体分子の産生に適した宿主細胞の範囲は当技術分野で公知であり、細菌、酵母、昆虫又は哺乳動物宿主細胞が含まれる。好ましい宿主細胞は、哺乳動物細胞、例えばＣＨＯ、ＮＳ０、又はＨＥＫ細胞、例えばＨＥＫ２９３細胞である。

【0105】

本発明の核酸又はベクターを含む組換え宿主細胞も提供される。そのような組換え宿主細胞は、本発明の抗原結合タンパク質（例えば、抗体）を産生するために使用され得る。したがって、本発明の抗原結合タンパク質、例えば抗体を産生する方法であって、抗原結合タンパク質、例えば抗体の産生に適した条件下で組換え宿主細胞を培養することを含む方法も提供される。この方法は、抗原結合タンパク質、例えば抗体を単離及び／又は精製する工程を更に含み得る。

【0106】

したがって、本発明は、本発明の抗原結合タンパク質、例えば、抗体を産生する方法であって、抗原結合タンパク質、例えば、抗体をコードする核酸を宿主細胞において発現させること、及び場合により、このようにして産生された抗原結合タンパク質、例えば、抗体を単離及び／又は精製することを含む方法を提供する。宿主細胞を培養するための方法は、当技術分野で周知である。組換え抗原結合タンパク質、例えば、抗体の精製のための技術は当技術分野で周知であり、例えば、高圧液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ）、高速タンパク質液体クロマトグラフ（ＦＰＬＣ）又はアフィニティークロマトグラフィ（例えば、プロテインＡ又はプロテインＬを使用）が挙げられる。いくつかの実施形態では、精製は、抗原結合タンパク質、例えば、抗体上のアフィニティータグを使用して行われ得る。この方法はまた、抗原結合タンパク質、例えば抗体を、場合により薬学的に許容される賦形剤又は以下に記載される他の物質と共に医薬組成物に製剤化することを含み得る。

【0107】

本発明の抗原結合タンパク質、例えば抗体は、治療用途、特にヒトにおける治療用途、例えばＭＭ、ＮＨＬ、ＡＭＬ、ＤＬＢＣＬ又はＦＬ等の血液癌の治療における用途が見出されると予想される。

【0108】

本発明によるＡＤＣ、抗原結合タンパク質、例えば抗体、又はＣＡＲ、及び賦形剤、例えば薬学的に許容される希釈剤を含む組成物、例えば医薬組成物も提供される。

【0109】

本発明は更に、治療方法に使用するための本発明のＡＤＣ、抗原結合タンパク質、例えば抗体、又はＣＡＲを提供する。患者を治療する方法であって、治療有効量の本発明によるＡＤＣ、抗原結合タンパク質、例えば抗体、又はＣＡＲを患者に投与することを含む方法も提供される。医薬品の製造に使用するための本発明によるＡＤＣ、抗原結合タンパク質、例えば抗体、又はＣＡＲの使用が更に提供される。本明細書で言及される患者は、好ましくはヒト患者である。

【0110】

本発明はまた、ＭＭ、ＮＨＬ、ＡＭＬ、ＤＬＢＣＬ又はＦＬ等の血液癌を治療する方法で使用するための、治療有効量の本発明によるＡＤＣ、抗原結合タンパク質、例えば抗体、又はＣＡＲを患者に投与することを含む、本発明のＡＤＣ、抗原結合タンパク質、例えば抗体、又はＣＡＲを提供する。患者における多発性骨髄腫ＭＭ、ＮＨＬ、ＡＭＬ、ＤＬＢＣＬ又はＦＬ等の血液癌を治療するための医薬品の製造に使用するための、本発明によるＡＤＣ、抗原結合タンパク質、例えば抗体、又はＣＡＲの使用が更に提供される。

【0111】

別の態様では、本発明は、ＭＭ、ＮＨＬ、ＡＭＬ、ＤＬＢＣＬ又はＦＬ等の血液癌に罹患している患者において、ａ）治療すること、ｂ）進行を遅延させること、ｃ）生存を延長させること、及び／又は（ｄ）症状の緩和を提供することに使用するための本発明のＡＤＣ、抗原結合タンパク質、例えば抗体、又はＣＡＲに関する。

【0112】

したがって、本明細書に記載のＡＤＣ、抗原結合タンパク質、例えば抗体、又はＣＡＲは、治療用途、特にＭＭ、ＮＨＬ、ＡＭＬ、ＤＬＢＣＬ又はＦＬ等の血液癌の治療に使用するためのものであり得る。

【0113】

本明細書に記載のＡＤＣ、抗原結合タンパク質、例えば抗体、又はＣＡＲは、ヒト又は動物の身体の治療方法において使用され得る。本発明の関連する態様は、
（ｉ）医薬品として使用するための本明細書に記載のＡＤＣ、抗原結合タンパク質、例えば抗体、又はＣＡＲ、
（ｉｉ）疾患又は障害の治療方法に使用するための本明細書に記載のＡＤＣ、抗原結合タンパク質、例えば抗体、又はＣＡＲ、
（ｉｉｉ）疾患又は障害の治療に使用するための医薬品の製造における本明細書に記載のＡＤＣ、抗原結合タンパク質、例えば抗体、又はＣＡＲの使用、及び
（ｉｖ）個体における疾患又は障害を治療する方法であって、治療有効量の本明細書に記載のＡＤＣ、抗原結合タンパク質、例えば抗体、又はＣＡＲを個体に投与することを含む方法、を提供する。

【0114】

個体は、患者、好ましくはヒト患者であり得る。

【0115】

治療は、何らかの所望の治療効果、例えば、状態の進行の阻害又は遅延が達成される任意の治療又は治療であり得、進行速度の低下、進行速度の停止、状態の改善、状態の治癒又は寛解（部分的であれ全体的であれ）、状態の１つ以上の症状及び／又は徴候の予防、改善、遅延、緩和若しくは停止、又は治療の非存在下で予想されるものを超える個体又は患者の生存の延長を含む。

【0116】

予防手段（すなわち、予防）としての治療も含まれる。例えば、ＭＭ、ＮＨＬ、ＡＭＬ、ＤＬＢＣＬ又はＦＬ等の血液癌に罹患しやすい又は再発のリスクがある個体は、本明細書に記載のように治療することができる。そのような治療は、個体における疾患の再発を予防又は遅延させ得る。

【0117】

ＡＤＣ、抗原結合タンパク質、例えば抗体、又はＣＡＲは単独で投与され得るが、ＡＤＣ、抗原結合タンパク質、例えば抗体、又はＣＡＲは通常、ＡＤＣ、抗原結合タンパク質、例えば抗体、又はＣＡＲに加えて少なくとも１つの成分を含み得る医薬組成物の形態で投与される。したがって、本発明の別の態様は、本明細書に記載のＡＤＣ、抗原結合タンパク質、例えば抗体、又はＣＡＲを含む医薬組成物を提供する。ＡＤＣ、抗原結合タンパク質、例えば抗体、又はＣＡＲを医薬組成物に製剤化することを含む方法も提供される。

【0118】

医薬組成物は、ＡＤＣ、抗原結合タンパク質、例えば抗体、又はＣＡＲに加えて、薬学的に許容される賦形剤、担体、緩衝液、安定剤又は当業者に周知の他の材料を含み得る。本明細書で使用される「薬学的に許容される」という用語は、健全な医学的判断の範囲内で、合理的な利益／リスク比に見合った、過度の毒性、刺激、アレルギー反応、又は他の問題若しくは合併症なしに、対象（例えば、ヒト）の組織と接触して使用するのに適した化合物、材料、組成物、及び／又は剤形に関する。各担体、賦形剤等はまた、製剤の他の成分と適合性であるという意味で「許容可能」でなければならない。担体又は他の物質の正確な性質は、投与経路に依存し、投与経路は、以下で論じられるように、注入、注射又は任意の他の適切な経路によるものであり得る。

【0119】

非経口投与、例えば皮下投与又は静脈内投与、例えば注射による投与の場合、ＡＤＣ、抗原結合タンパク質、例えば抗体、又はＣＡＲを含む医薬組成物は、発熱物質を含まず、適切なｐＨ、等張性及び安定性を有する非経口的に許容される水溶液の形態であり得る。いくつかの実施形態では、本発明のＡＤＣ、抗原結合タンパク質、例えば抗体、又はＣＡＲは、投与前の再構成のために凍結乾燥形態で提供され得る。例えば、凍結乾燥抗原結合タンパク質、例えば抗体は、個体への投与前に滅菌水又は生理食塩水で再構成され得る。

【0120】

投与は「治療有効量」であってもよく、これは個体に利益を示すのに十分である。投与される実際の量、並びに投与の速度及び時間経過は、治療されるものの性質及び重症度、治療される特定の個体、個体の臨床状態、障害の原因、組成物の送達部位、ＡＤＣ、抗原結合タンパク質、例えば抗体、又はＣＡＲの種類、投与方法、投与のスケジュール及び他の要因に依存する。治療の処方は、治療される疾患の症状の重症度及び／又は進行に依存し得る。ＡＤＣ、抗原結合タンパク質、例えば抗体、又はＣＡＲの治療有効量又は適切な用量は、インビトロ活性及び動物モデルにおけるインビボ活性を比較することによって決定することができる。マウス及び他の試験動物における有効投与量をヒトに外挿する方法は公知である。正確な用量は、治療される領域のサイズ及び位置、並びにＡＤＣ、抗原結合タンパク質、例えば抗体、又はＣＡＲの正確な性質を含む多くの因子に依存する。

【0121】

血液悪性腫瘍は、血液、骨髄及びリンパ系に影響を及ぼす血液癌の多様な群である。主なカテゴリーは、リンパ腫、白血病、骨髄腫、骨髄異形成症候群及び骨髄増殖性新生物である。好ましい実施形態では、本明細書に記載のＡＤＣ、抗原結合タンパク質、例えば抗体、又はＣＡＲは、ＭＭ、ＮＨＬ、ＡＭＬ、ＤＬＢＣＬ又はＦＬ等の血液癌を治療する方法で使用するためのものであり得る。
図面の一覧

【図面の簡単な説明】

【0122】

【図1】ＮＣＩ－Ｈ９２９細胞のFab-ZAP細胞死滅アッセイにおける７０個の未精製ヒト化ＩｇＧの一次スクリーニングにより、３０％以上の細胞死滅を示した１８個のクローンが同定されたことを示す図である。７０個全ての未精製クローンを１．５６％の最終濃度でスクリーニングした。１８個中１２個のヒットクローン（●）を再発現させ、更なる特徴づけのために精製した。進行のために選択された１２個のクローンのうちの１０個もまた、５Ｅ３エピトープ競合アッセイにおいて阻害を示した（図２を参照のこと）。

【図2】ＭＭ．１Ｓ細胞のエピトープ競合アッセイにおける３２０個の未精製ヒト化ＩｇＧの一次スクリーニングにより、３０％以上の阻害を示した１７個のクローンが同定されたことを示す図である。３２０個全ての未精製クローンを２５％の最終濃度でスクリーニングした。１７個中１０個のヒットクローン（●）を再発現させ、更なる特徴づけのために精製した。３０％未満の阻害を示した２つのクローン：５Ｈｇ２／５Ｌｇ６及び５Ｈｇ４／５Ｌｇ４も再発現させ、更なる特徴づけのために精製した。更なる特徴づけのために選択された１２個全てのクローンもまた、Fab-ZAP細胞死滅アッセイにおいてヒットとして同定された。

【図3】ＮＣＩ－Ｈ９２９細胞のFab-ZAP細胞死滅アッセイにおける未精製の完全ヒトファージディスプレイＩｇＧの一次スクリーニングにより、１５％以上の細胞死滅を示したクローンパネルが同定されたことを示す図である。全ての未精製クローンを３．１３％の最終アッセイ濃度でスクリーニングした。更なる特徴づけのために、１０個のクローン（●）を再発現させ、精製した。

【図4】ＭＭ．１Ｓ細胞における結合アッセイにおいて、未精製の完全ヒトファージディスプレイＩｇＧの一次スクリーニングにより、１００万を超えるＦＬＵの蛍光強度で結合したクローンが同定されたことを示す図である。全ての未精製クローンを１．５６％の最終アッセイ濃度で試験した。結合アッセイデータをFab-ZAPアッセイデータ（図３）と併せて使用して、Fab-ZAPアッセイでヒットし、ＭＭ．１Ｓ細胞への良好な結合（＞１００万ＦＬＵ）を示した１０個のクローン（●）のパネルを選択した。Ｃ０１２０９１０は、２５％の最終アッセイ濃度で試験した場合に結合を示すように進行した（データは示さず）。

【図5A】図５Ａは、ヒトＩｇＧ１ Ａｌｙａベクターで発現されたヒト化リードの結合特異性の測定を示す図である。図５は、ヒトＳＥＭＡ４Ａ（ｉ）、マウスＳＥＭＡ４Ａ（ｉｉ）、カニクイザルＳＥＭＡ４Ａ（ｉｉｉ）、ヒトＳＥＭＡ４Ｂ（ｉｖ）で一過性にトランスフェクトしたexpi293細胞に結合するリードの能力及び擬似トランスフェクトexpi293細胞（ｖ）を、Mirrorballを使用して測定した。リードの結合を、ヒトＩｇＧ１ Ａｌｙａとして発現させたマウス５Ｅ３と比較した。Ｃ００２１１４４ＩｇＧを、擬似トランスフェクトexpi293細胞に結合するための陽性対照として含めた。市販の抗ＳＥＭＡ４Ｂポリクローナル抗体（R&D Systems、AF5485）を、ヒトＳＥＭＡ４Ｂトランスフェクトexpi293細胞への結合の陽性対照として含めた。ヒトＩｇＧ１ Ａｌｙａベクターの説明については、実施例４．１を参照されたい。

【図5B】図５Ｂは、完全ヒトファージディスプレイリードの結合特異性の測定を示す図である。

【図6A】図６Ａは、Fab-ZAP細胞死滅アッセイにおいて、ヒトＩｇＧ１ Ａｌｙａベクターで発現されたヒト化リードがＮＣＩ－Ｈ９２９細胞を死滅させる能力の測定を示す図である。図６は、全てのクローンの細胞死滅能力を、ヒトＩｇＧ１ Ａｌｙａベクターにおけるマウス５Ｅ３と比較した。多くのヒト化クローンは、マウス５Ｅ３抗体に匹敵するＩＣ_５０値を示した（Ｖ_Ｈ及びＶ_Ｌ 配列番号２及び１１）。いくつかのヒト化クローンは完全な細胞死滅を示さなかった。ヒトＡｌｙａ ＩｇＧ１ベクターの説明については、実施例４．１を参照されたい。

【図6B】図６Ｂは、Fab-ZAP細胞死滅アッセイにおいて、ヒトＩｇＧ１ Ａｌｙａベクターで発現された完全ヒトリードがＮＣＩｌ－Ｈ９２９細胞を死滅させる能力の測定を示す図である。

【図7】エピトープ競合アッセイにおけるヒトＩｇＧ１ Ａｌｙａベクターで発現されたヒト化リードの試験を示す図である。ヒトＩｇＧ１ Ａｌｙａベクターで発現されるヒト化及び完全ヒトファージディスプレイリードの濃度を増加させて、ＭＭ．１Ｓ細胞上に内因的に発現されるＳＥＭＡ４Ａへの固定濃度のマウス５Ｅ３の結合を阻害する能力を測定した。５Ｅ３の固定濃度はマウスＩｇＧ１アイソタイプであり、この結合は、Alexa Fluor 647で標識された抗マウス抗体を使用して検出された。ヒトアイソタイプ（ヒトＩｇＧ１ Ａｌｙａ）として発現されたマウス５Ｅ３をアッセイに競合させ、試験クローンをこれと比較した。全てのヒト化クローンは、５Ｅ３とのある程度のレベルの競合を示した。

【図8A】図８は、エピトープビニングを示す図である。OctetRED(Pall ForteBio)機器をセクション４．６に記載されているように使用して、エピトープビニングを実施し、リード抗ヒトＳＥＭＡ４Ａクローンを組換えヒトＳＥＭＡ４Ａへの結合に基づいてビンにグループ化した。タンデム形式では、ストレプトアビジンバイオセンサ上に固定化された抗原（ビオチン化組換えヒトＳＥＭＡ４Ａ）を、２つの競合する分析物に連続工程で提示した。第１のＦａｂ断片（マウス５Ｅ３）による飽和が第２の完全ヒトファージディスプレイ由来ＩｇＧの結合を遮断しなかった場合、別個の重複しないエピトープへの結合が示された。全てのヒト化リードは、セクション３．２において５Ｅ３エピトープと競合することが示されていた。図８Ａは、５Ｅ３と重複又は競合するエピトープを有する完全ヒトクローンのデータを表す。

【図8B】図８Ｂは、５Ｅ３との非重複又は非競合エピトープを有する完全ヒトクローンに対応するデータを示す。

【図8C】図８Ｃは、５Ｅ３との非重複又は非競合エピトープを有する完全ヒトクローンに対応するデータを示す。

【図8D】図８Ｄは、互いに非重複又は非競合エピトープを有する完全ヒトクローンに対応するデータを示す。

【図9A】図９Ａは、ヒトＩｇＧ１ Ａｌｙａベクターで発現され、ＭｃＭＭＡＦにコンジュゲートされたヒト化リードの結合特異性を測定する図である。図９は、ヒトＳＥＭＡ４Ａ（ｉ）、ヒトＳＥＭＡ４Ｂ（ｉｉ）及び擬似トランスフェクトexpi293細胞（ｉｉｉ）で一過性にトランスフェクトしたexpi293細胞に結合するリードの能力を、Mirrorballを使用して測定した。結合を、Ａｌｙａベクターで発現されたヒトＩｇＧ１（Ａｌｙａ ＩｇＧ１）及び結合したＭｃＭＭＡＦとしてマウス５Ｅ３と比較した。Ｃ００２１１４４ ＩｇＧを、擬似トランスフェクトexpi293細胞に結合するための陽性対照として含め、Ｃ００２１１４４は、ＭｃＭＭＡＦにコンジュゲート化されなかった。市販の抗ＳＥＭＡ４Ｂポリクローナル抗体（R&D Systems、AF5485）を、ヒトＳＥＭＡ４Ｂトランスフェクトexpi293細胞への結合のための陽性対照として含め、AF5485は、ＭｃＭＭＡＦにコンジュゲート化されなかった。ヒトＩｇＧ１ Ａｌｙａベクターの説明については、実施例４．１を参照されたい。

【図9B】図９Ｂは、ヒトＩｇＧ１ Ａｌｙａベクターで発現され、ＭｃＭＭＡＦにコンジュゲートされた完全ヒトリードの結合特異性を測定する図である。

【図10A】図１０Ａは、ヒトＩｇＧ１ Ａｌｙａベクターで発現したＭｃＭＭＡＦにコンジュゲートしたヒト化リードの、ＮＣＩ－Ｈ９２９細胞を死滅させる能力の細胞死滅アッセイでの測定を示す図である。図１０は、全てのクローンの細胞死滅能力を、ＭｃＭＭＡＦにコンジュゲートしたＡｌｙａ ＩｇＧ１としてマウス５Ｅ３と比較した。ヒト化クローンは、細胞株全体にわたってＩＣ５０値の範囲を示し、ＳＥＭＡ４Ａ発現について陰性対照細胞株であるＫ５６２細胞では細胞死滅は観察されなかった。ヒトＡｌｙａ ＩｇＧ１ベクターの説明については、実施例４．１を参照されたい。Ｊ６Ｍ０抗ＢＣＭＡモノクローナル抗体対照（Tai et al.,2014）。

【図10B】図１０Ｂは、ヒトＩｇＧ１ Ａｌｙａベクターで発現したＭｃＭＭＡＦにコンジュゲートしたヒト化リードのＭＭ１．Ｓ細胞を死滅させる能力の細胞死滅アッセイでの測定を示す図である。

【図10C】図１０Ｃは、ヒトＩｇＧ１ Ａｌｙａベクターで発現したＭｃＭＭＡＦにコンジュゲートしたヒト化リードのKARPAS 25細胞を死滅させる能力の細胞死滅アッセイでの測定を示す図である。

【図10D】図１０Ｄは、ヒトＩｇＧ１ Ａｌｙａベクターで発現したＭｃＭＭＡＦにコンジュゲートしたヒト化リードのＫ５６２細胞を死滅させる能力の細胞死滅アッセイでの測定を示す図である。

【図11A】図１１Ａは、ヒトＡｌｙａ ＩｇＧ１ベクターで発現したＭｃＭＭＡＦにコンジュゲートした完全ヒトリードが、細胞死滅アッセイでＮＣＩ－Ｈ９２９細胞を死滅させる能力の測定を示す図である。図１１は、全てのクローンの細胞死滅能力を、ＭｃＭＭＡＦにコンジュゲートしたＡｌｙａ ＩｇＧ１としてマウス５Ｅ３と比較した。完全ヒトクローンはある範囲のＩＣ_５０値を示し、一部は、ＭｃＭＭＡＦにコンジュゲートしたＡｌｙａ ＩｇＧ１としてマウス５Ｅ３よりもわずかに強力であった。予想されるように、クローンは、Ｋ５６２細胞において、ＳＥＭＡ４Ａ発現のための陰性対照細胞株の細胞死滅を誘発しなかった。ヒトＡｌｙａ ＩｇＧ１ベクターの説明については、実施例４．１を参照されたい。Ｊ６Ｍ０抗ＢＣＭＡモノクローナル抗体対照（Tai et al.,2014）。

【図11B】図１１Ｂは、ヒトＡｌｙａ ＩｇＧ１ベクターで発現したＭｃＭＭＡＦにコンジュゲートした完全ヒトリードが、細胞死滅アッセイでＭＭ１．Ｓ細胞を死滅させる能力の測定を示す図である。

【図11C】図１１Ｃは、ヒトＡｌｙａ ＩｇＧ１ベクターで発現したＭｃＭＭＡＦにコンジュゲートした完全ヒトリードが、細胞死滅アッセイでＫ５６２細胞を死滅させる能力の測定を示す図である。

【図12A】図１２は、ヒトＡｌｙａ ＩｇＧ１ベクターで発現されたＭｃＭＭＡＦコンジュゲート化ヒト化及び完全ヒトリードの細胞内在化を示す図である。各リード抗体及び対照抗体の内在化を、２４時間にわたってある濃度範囲で評価した。ヒトＡｌｙａ ＩｇＧ１ベクターの説明については、実施例４．１を参照されたい。図１２Ａは、Fab-pHastについて陽性としてスコア付けされた細胞のパーセンテージを、マウス５Ｅ３ヒトＡｌｙａ ＩｇＧ１についてここに示されるのと同じ様式で、各抗体の各濃度について経時的にプロットした。

【図12B】図１２Ｂは、２．５ｎＭ ５Ｅ３（マウス５Ｅ３ヒトＡｌｙａ ＩｇＧ１ ＭｃＭＭＡＦ結合）データについて実証されているように、各時間経過を曲線下面積（ＡＵＣ）分析に供した。

【図12C】図１２Ｃは、ヒト化リード及び完全ヒトクローン（全てヒトＡｌｙａ ＩｇＧ１ ＭｃＭＭＡＦコンジュゲートフォーマット）モノクローナルのパネルについてのＡＵＣ分析からプロットされた内在化滴定曲線を示す。

【図12D】図１２Ｄは、各濃度及び時点について平均染色積分強度も抽出し、ベースラインに対するシグナルの変化倍数としてプロットした。

【図13】フローサイトメトリによるＳＥＭＡ４Ａ特異的ヒト抗体（ＭｃＭＭＭＡＦにコンジュゲートさせたＡｌｙａ ＩｇＧ１）の結合親和性（ＫＤ）の測定を示す図である。全てのクローンのＫＤ値を、ヒトＡｌｙａ ＩｇＧ１及びＭｃＭＭＡＦが結合したマウス５Ｅ３と比較した。ヒト化リード、５Ｈｇ１／５Ｌｇ１及び５Ｈｇ２／５Ｌｇ２は、マウス５Ｅ３と同様のＫＤ値を示した。完全ヒトファージディスプレイ由来リードは、マウス５Ｅ３よりも低い親和性を有していた。ヒトＡｌｙａ ＩｇＧ１ベクターの説明については、実施例４．１を参照されたい。

【図14】ヒトＡｌｙａ ＩｇＧ１ベクターで発現された完全ヒト生殖系列リードの結合特異性の測定を示す図である。ヒトＳＥＭＡ４Ａ（ｉ）、マウスＳＥＭＡ４Ａ（ｉｉ）、カニクイザルＳＥＭＡ４Ａ（ｉｉｉ）、ヒトＳＥＭＡ４Ｂ（ｉｖ）で一過性にトランスフェクトしたexpi293細胞、擬似トランスフェクトexpi293細胞（ｖ）に結合する生殖系列リードの能力をMirrorballを使用して測定した。結合をマウス５Ｅ３（ＭｃＭＭＡＦに結合されていないヒトＡｌｙａ ＩｇＧ１）と比較した。Ｃ００２１１４４ＩｇＧを、擬似トランスフェクトexpi293細胞に結合するための陽性対照として含めた。市販の抗ＳＥＭＡ４Ｂポリクローナル抗体（R&D Systems、AF5485）を、ヒトＳＥＭＡ４Ｂトランスフェクトexpi293細胞への結合の陽性対照として含めた。試験した６つ全ての完全ヒト生殖系列クローンは、ヒト、マウス及びカニクイザルＳＥＭＡ４Ａへの強い結合を示し、ヒトＳＥＭＡ４Ｂ及び擬似トランスフェクトexpi293細胞への結合は示さなかった。ヒトＡｌｙａ ＩｇＧ１ベクターの説明については、実施例４．１を参照されたい。

【図15A】図１５は、健康な患者及び骨髄腫患者の両方における血清中の可溶性ＳＥＭＡ４Ａの低発現を示す図である。図１５Ａは、組換えヒトＳＥＭＡ４Ａ（ｒＳＥＭＡ４Ａ）を使用したＥＬＩＳＡの標準曲線を示す。検出下限（ＬＬＯＤ）は、ブランク試料の平均＋ブランクの３つの標準偏差として決定した。検出限界は、ＬＬＯＤを上回る試験した最低濃度（１．５６ｎｇ／ｍＬ）として計算した。

【図15B】図１５Ｂは、健康及び骨髄腫患者の血清中のｓＳＥＭＡ４ＡをＥＬＩＳＡによって検出し、それぞれ３．３ｎｇ／ｍｌ及び８．１ｎｇ／ｍｌであることが見出されたことを示す図である。

【図16】ＮＣＩ－Ｈ９２９細胞を使用した細胞死滅アッセイにおけるマウス５Ｅ３及び完全ヒトリードの効力に対する可溶性ＳＥＭＡ４Ａの影響の評価を示す図である。最大１００ｎｇ／ｍｌのｓＳＥＭＡ４Ａの濃度は、ＩＣ５０値に関して、それぞれＭｃＭＭＡＦとコンジュゲートしたＡｌｙａ ＩｇＧ１としてのマウス５Ｅ３又は完全ヒトクローンのいずれかのＮＣＩ－Ｈ９２９細胞を死滅させる能力に有意な影響を及ぼさなかった。ヒトＡｌｙａ ＩｇＧ１ベクターの説明については、実施例４．１を参照されたい。

【図17】マウス５Ｅ３ＶＨ配列と並んだ、ＳＥＭＡ４ＡリードパネルＶＨドメインの比較配列アラインメントを示す図である。個々のＶＨ ＣＤＲ配列は、太字で、灰色の背景で、黒棒で強調されている。Kabat and Wu(1991)によって定義される配列番号。

【図18】マウス５Ｅ３ Ｖ_Ｌ配列と並んだ、ＳＥＭＡ４ＡリードパネルＶ_Ｌドメインの比較配列アラインメントを示す図である。個々のＶ_Ｌ ＣＤＲ配列は、太字、灰色の背景及び黒色のバーで強調されている。Kabat and Wu(1991)によって定義される配列番号。

【発明を実施するための形態】

【0123】

実施例
実施例１：５Ｅ３ ｍＡｂのヒト化
１．１ ５Ｅ３ヒト化生殖系列バリアントの合理的設計
抗ヒトＳＥＭＡ４ＡモノクローナルマウスＩｇＧ１（λ）５Ｅ３は、BioLegend（登録商標）（カタログ番号：１４８４０２）から購入し、その一次アミノ酸配列を逆操作した。具体的には、５Ｅ３をトリプシン、キモトリプシン、又はトリプシンとＡｓｐＮとの組合せのいずれかで消化した。３つの消化物のそれぞれを、Orbitrap Fusion mass spectrometer(Thermofisher Scientific)を使用してＬＣ／ＭＳ／ＭＳによって分析した。得られたデータの検索を、Peaksソフトウェア及びマウス生殖系列配列のデータベースを使用して行い、続いて手動で解釈した。

【0124】

１０ Ｖ_Ｈ及び７ Ｖ_Ｌヒト生殖系列配列のパネルを、マウス５Ｅ３ヒト化のためのフレームワークとして選択した。ヒト生殖系列の選択は、元の非ヒト化マウス５Ｅ３配列をIMGT（登録商標）データベース（www.IMGT.org）に列挙された全てのヒト生殖系列配列に整列させることによって誘導した。マウス５Ｅ３配列に対して最も高いアミノ酸配列相同性を有するヒト生殖系列を、その後の５Ｅ３ ＣＤＲグラフト化のために優先順位付けした。具体的には、ヒト生殖系列を、「３ｘＶ_Ｈ ＣＤＲグラフト」、「３ｘＶ_Ｌ ＣＤＲグラフト」又は「１ｘＶ_Ｈ ＣＤＲグラフト」のいずれかになるように操作した（表４）。各Ｖ_Ｈ及びＶ_Ｌ遺伝子配列をデノボで合成し、標準的な分子生物学技術を用いて適切なＩｇＧ発現ベクター（Persic,et al.,1997）にクローニングした。

【0125】

【表4】

【0126】

【表5】

【0127】

１．２ 未精製ＩｇＧのハイスループット発現
ヒト化５Ｅ３クローンのパネルを、９６ウェルマイクロタイタープレートについてのLife Technologies Expi293 Expression Systemプロトコル（プロトコル番号CO25793 0912）に従ってExpi293TMF細胞を使用してハイスループット様式（製品フォーマット又はＳｉＰＦでのスクリーニング）でｈｕＩｇＧ１として発現させた。ｐＥＵ１．３にクローニングされた１０個のヒト化５Ｅ３ Ｖ_Ｈ及びｐＥＵ３．４（カッパ）又はｐＥＵ４．４（ラムダ）ベクターのいずれかにクローニングされた７個のヒト化５Ｅ３ Ｖ_Ｌ構築物のそれぞれの精製ＤＮＡを、７０の可能なＶ_ＨｘＶ_Ｌの組合せを生成する９６ウェルプレート中でマトリックスとして組み合わせた。合わせたＤＮＡをOptiMEMで希釈し、トランスフェクション試薬としてExpi293TMFを使用して96 deepwell block（Merck、カタログ番号ＡＸＹＰＤＷ２０ＣＳ）でExpi293TMF細胞をトランスフェクトするために使用した。細胞を、１０００ｒｐｍで振盪しながら３７℃／８％ＣＯ_２／８０％湿度で成長させ、トランスフェクションの１８時間後に（エンハンス１及びエンハンス２を使用して）供給した。ＩｇＧをトランスフェクションの４日後に回収し、その後のアッセイにおいて未精製の未精製ＩｇＧとして使用した。

【0128】

実施例２：ファージディスプレイによるナイーブライブラリからの完全ヒト抗ＳＭＡ４Ａ抗体の単離
２．１ 組換えヒト、カニクイザル及びマウスＳＥＭＡ４Ａの産生
Ｃ末端Ａｖｉタグ及びＨｉｓ１０タグを有する組換えヒトＳＥＭＡ４Ａ（UniProt ID Q9H3S1、アミノ酸３３～６８３）、組換えカニクイザルＳＥＭＡ４Ａ（UniProt ID G7NV79、アミノ酸３２～６７９）及び組換えマウスＳＥＭＡ４Ａ（UniProt ID Q62178、アミノ酸３３～６８２）（それぞれ配列番号６１６、６１８、６１７）をｐｃＤＮＡ３．１ベクターにクローニングし、Expi293発現系で一過性に発現させた。続いて、HisTrap HP Hisタグタンパク質精製カラム（４０ｍＭイミダゾール洗浄、４００ｍＭイミダゾール溶出）を使用してタンパク質を精製した。タンパク質（７５ｋＤａのヒトＳＥＭＡ４Ａ、７９ｋＤａのカニクイザルＳＥＭＡ４Ａ及び７９ｋＤａのマウスＳＥＭＡ４Ａ）を５０ｍＭビシンｐＨ８．３に緩衝液交換し、ＢｉｒＡビオチンリガーゼ（基質タンパク質１０ｎｍｏｌ当たり３ｍｇのビオチンリガーゼ）を使用してビオチン化した。最後に、タンパク質を、５％（ｗ／ｖ）トレハロース（ｐＨ７）を含むダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）に緩衝液交換した。

【0129】

【表6】

【0130】

【表7】

【0131】

２．２ ＳＥＭＡ４Ａ特異的完全ヒトｓｃＦｖを単離するためのファージディスプレイ選択
糸状ファージＭ１３に基づいてファージミドベクターにクローニングした５つのナイーブライブラリ（ｎＦＬ、ＤＰ４７、ＣＳ、ＢＭＶ及びＥＧ３）を使用して、可溶性ファージディスプレイ選択を行った（Vaughan et al.,1996;Lloyd et al.,2008）。抗ＳＥＭＡ４Ａ ｓｃＦｖ抗体を、本質的に以前に記載されたように（Hawkins et al.,1992;Vaughan et al.,1996）、組換えビオチン化ヒト及びマウスＳＥＭＡ４Ａタンパク質（avi-SEMA4A-His10、自社製）に対する一連の選択サイクルを使用してファージディスプレイライブラリから単離した。簡単に記載すると、最初の溶液相選択のために、ＤＰＢＳ ｐＨ７中のビオチン化ヒトＳＥＭＡ４Ａを、ストレプトアビジン結合常磁性ビーズ（Dynabeads（登録商標）M280、Invitrogen Life Sciences、UK）を含有するMarvel-PBS（３％ｗ／ｖ）中で１時間プレインキュベートした精製ファージ粒子に添加した（最終濃度１００ｎＭビオチン化ヒトＳＥＭＡ４Ａ）。ストレプトアビジンビーズを抗原の添加前に除去した。ビオチン化ヒトＳＥＭＡ４Ａに結合したファージ粒子を、新しいストレプトアビジン結合常磁性ビーズを使用して捕捉し、弱く結合したファージを、PBS-Tween（０．１％ｖ／ｖ）を使用した一連の洗浄サイクルによって除去した。結合したファージ粒子を、トリプシン（０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液で希釈した１０μｇ／ｍｌの最終濃度；ｐＨ７）を使用してビーズから溶出し、Ｅ．コリ（E.coli）ＴＧ１細菌に感染させ、次の選択ラウンドのためにレスキューした（Vaughan et al.,1996）。その後の２回の選択を前述のように実施したが、ビオチン化ＳＥＭＡ４Ａ抗原の濃度を低下させ、具体的には、ラウンド２で５０ｎＭのビオチン化ヒト又はマウスＳＥＭＡ４Ａ及びラウンド３で２５ｎＭのビオチン化ヒトＳＥＭＡ４Ａを使用した。マウス抗原をラウンド２に導入して、マウス交差反応性を駆動した。

【0132】

２．３ 細胞に対する直接結合アッセイ（Mirrorball）を使用したＳＥＭＡ４Ａ特異的完全ヒトｓｃＦｖ（未精製）の同定
ペリプラズム調製物からの未精製ｓｃＦｖが細胞表面発現ヒトＳＥＭＡ４Ａに結合することができるかどうかを決定するために、それらをヒトＳＥＭＡ４Ａで一過性にトランスフェクトしたexpi293細胞（Origene、US；カタログ番号ＳＣ３２３７３８）と共にインキュベートした。未精製ｓｃＦｖの結合を、ｓｃＦｖ上に発現されたｍｙｃタグに結合するマウス抗ｃ－ｍｙｃ抗体（Bio-Rad、US；カタログ番号：ＭＣＡ２２００ＧＡ）と、それに続くAlexa Fluor 647にコンジュゲートした抗マウス抗体（Invitrogen、US；カタログ番号：Ａ２１２３５）との２つの抗体を使用して検出した。

【0133】

選択アウトプットを、２００ｍＭトリス緩衝液ｐＨ７．４、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ及び０．５Ｍスクロース中で調製した、ｓｃＦｖを含有する未精製細菌ペリプラズム抽出物として単一濃度でスクリーニングした。１０μｌの未精製ｓｃＦｖ試料をGreiner（登録商標）384 well assay plate(Greiner Bio-one、UK；カタログ番号：７８１９０６）に添加した。これに続いて、Alexa Fluor 647にコンジュゲートした８ｎＭマウス抗ｃ－ｍｙｃ抗体及び８ｎＭ抗マウス抗体を含有する１０μｌの抗体検出混合物及び２０μｌの細胞懸濁液を７５，０００細胞／ｍｌで添加した。

【0134】

非特異的結合ウェル（陰性対照）を、試験ｓｃＦｖ試料の代わりに陰性対照未精製ｓｃＦｖを使用することによって、各プレートについて定義した。非特異的に結合するクローンを、擬似トランスフェクションされたexpi293細胞を用いた同時アッセイを使用して同定した（すなわち、ヒトＳＥＭＡ４Ａ ＤＮＡはトランスフェクション中に省かれた）。

【0135】

全ての希釈は、０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（Sigma、UK；カタログ番号：Ａ９５７６）を含有するハンクス平衡塩類溶液（Sigma、UK；カタログ番号：Ｈ８２６４）（アッセイ緩衝液）中で行った。アッセイプレートを暗所で室温で４時間インキュベートした後、ＦＬ－４チャネル（６５０及び６９０ｎｍ）で励起及び発光を測定するために６４０ｎｍレーザーを使用して、Mirrorball fluorescence cytometer（SPT Labtech、UK）で読み取った。データを、カウントｘ平均強度の中央値（ｘＦＬＵ）として分析した。

【0136】

２２６個の配列のユニークヒットを、セクション２．４に記載されるようにｓｃＦｖからヒトＩｇＧ１に再フォーマットした直接結合アッセイにおいて同定した。

【0137】

２．４ 完全ヒトｓｃＦｖからＩｇＧ１（未精製ＩｇＧ）へのＳＥＭＡ４Ａ結合抗体の再フォーマット
MirrorballアッセイによってヒトＳＥＭＡ４Ａへの特異的結合を示した２２６個の未精製ｓｃＦｖペリプラズム抽出物をＤＮＡ配列決定に供した（Osbourn et al.,1996;Vaughan et al.,1996）。２２６個のユニークなｓｃＦｖを、それらの配列に基づいてラムダプール及びカッパプールにプールした。更に、全アウトプットを以下のクローニング戦略に供した。２段階戦略を使用して、ｓｃＦｖをＩｇＧにバッチ変換し、最初に（Ｇ_４Ｓ）_３ ｓｃＦｖリンカーを、重鎖（ＨＣ）のヒンジ及び定常ドメイン並びに軽鎖（ＬＣ）のプロモータ及びシグナル配列をコードするＤＮＡセグメントで置き換え、次にｓｃＦｖ骨格をＩｇＧベクター中のＬＣ定常ドメイン及びＨＣシグナル配列で置き換えた（Xiao et al.,2017に記載されているように）。最終発現ベクターは、ＣＭＶプロモータの制御下でＨＣ及びＬＣの両方とバイシストロン性である。その後、変換されたＩｇＧを、セクション３．２に記載されるように粗ＩｇＧとして発現させた。

【0138】

実施例３：一次スクリーニングにおける未精製５Ｅ３ヒト化及び完全ヒト、ファージディスプレイ由来、ＩｇＧ１の機能的スクリーニング
実施例３は、５Ｅ３ヒト化アプローチ（実施例１）及びファージディスプレイアプローチ（実施例２）からの未精製ＩｇＧ１（セクション１．２）の一次スクリーニングを記載する。ＩｇＧの両方のセットを、Fab-ZAP細胞死滅アッセイにおいて機能についてスクリーニングした。５Ｅ３ヒト化ＩｇＧも、マウス５Ｅ３エピトープ競合アッセイにおいて５Ｅ３エピトープへの結合について競合する能力についてスクリーニングした。完全ヒトファージディスプレイ由来のクローンも、ヒトＳＥＭＡ４Ａを内因的に発現するＭＭ．１Ｓ多発性骨髄腫細胞に結合する能力についてスクリーニングした。

【0139】

３．１ Fab-ZAPアッセイを使用した、ＮＣＩ－Ｈ９２９細胞に内在化し、ＮＣＩ－Ｈ９２９細胞を死滅させることができるｍＡｂの発見
Fab-ZAPアッセイでは、二次サポリンコンジュゲート、Fab-ZAP(Advanced Targeting Systems、San Diego,CA、IT-51）、CellTiter Glo 2.0（Promega、Madison,WI、G9248）及びPherastarプレートリーダ（BMG Labtech、Germany）を使用して、インビトロで未精製ＩｇＧがＮＣＩ－Ｈ９２９多発性骨髄腫細胞に結合し、内在化し、死滅させる能力を評価した。Fab-ZAPは、弾頭サポリンにコンジュゲートさせた抗ヒトＦａｂである。未精製ヒト化５Ｅ３及び完全ヒトファージディスプレイ由来ヒトＩｇＧ１をそれぞれ８倍及び４倍に予備希釈した。未精製ヒトＩｇＧ１をExpi293発現培地（Gibco、UK、A1435101）に含有させた。アッセイへの８倍希釈後、最終アッセイ濃度はそれぞれ１．５６及び３．１３％であった。５μｌの予備希釈した未精製ヒトＩｇＧ１を、３８４ウェルアッセイプレート（Greiner Bio-one、UK、781091）中、室温で３０分間、５μｌの８０ｎＭ Fab-ZAPと共にプレインキュベートした。２，０００個のＮＣＩ－Ｈ９２９細胞を３０μｌの容量でアッセイウェルに添加した。アッセイプレートを３７℃／５％ＣＯ_２／９５％湿度で７２時間インキュベートした。細胞死滅を、Pherastarで発光についてプレートを読み取る前に、２０μｌのCellTiter Glo 2.0を添加し、続いて１０分間インキュベートすることによって評価した。１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Gibco、UK、10500-064）及び５５μＭのβ－メルカプトエタノール（Gibco、UK、21985-023）を補充したRPMI 1640（Gibco、UK、A10491-01）中で全ての希釈を行った。最大アッセイシグナルは、細胞のみを含むウェルによって定義した。バックグラウンドアッセイシグナルは、緩衝液のみを含むウェル、すなわち細胞を含まないウェルによって定義した。GraphPad Prismソフトウェア（GraphPad Software,Inc、La Jolla,CA）を使用してデータを分析し、グラフ化した。この実験の結果を図１及び図３に示す。

【0140】

３．２ ＩｇＧエピトープ競合アッセイを使用して、ｍＡｂがマウス５Ｅ３と重複するエピトープを有することを実証する
５Ｅ３エピトープ競合アッセイは、ヒト多発性骨髄腫細胞株であるＭＭ．１Ｓ細胞によって内因的に発現されるヒトＳＥＭＡ４Ａ上のマウス５Ｅ３エピトープへの結合について競合するヒトＩｇＧ１骨格に発現される未精製ＩｇＧの能力を評価した。アッセイは、二次Alexa Fluor 647コンジュゲート、マウスＩｇＧ１（λ）骨格で発現される５Ｅ３（BioLegend（登録商標）、Diego,CA、148402）及びMirrorball fluorescence cytometer（SPT Labtech、UK）を利用した。ＭＭ．１Ｓ細胞への５Ｅ３マウスＩｇＧ１の結合を、単一濃度の各未精製ヒトＩｇＧ１の存在下で、Alexa Fluor 647(Invitrogen,A21235)で二次標識した抗マウスを介して測定した。未精製ＩｇＧによるＳＥＭＡ４Ａ上の５Ｅ３エピトープの占有は、Mirrorballによって測定されるように、蛍光シグナルの減少をもたらした。Expi293発現培地（Gibco、UK、A1435101）に含有される１０μｌの未希釈未精製ＩｇＧをアッセイプレート（Greiner Bio-one、UK、781906）に添加し、続いて、４ｎＭの抗マウスAlexa Fluor 647でスパイクした１，５００個の細胞を含有する１０μｌの１．２ｎＭの５Ｅ３マウスＩｇＧ１及び２０μｌのＭＭ．１Ｓ細胞懸濁液を添加した。アッセイプレートを室温で４時間、暗所でインキュベートした後、ＦＬ－４チャネル（６５０～６９０ｎｍ）で励起及び発光を測定するために６４０ｎｍレーザーを使用して、Mirrorball fluorescence cytometer（SPT Labtech、UK）で読み取った。データを、カウントｘ平均強度の中央値（ｘＦＬＵ）として分析した。全ての希釈は、０．１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ（Sigma、UK；カタログ番号：Ａ９５７６）を含有するハンクス平衡塩溶液（Sigma、UK；カタログ番号：Ｈ８２６４）中で行った。５Ｅ３マウスＩｇＧ１のＭＭ．１Ｓ細胞への結合を、競合物質未精製ヒトＩｇＧ１の非存在下で分析することによって、最大結合シグナルを決定した。バックグラウンド結合シグナルを、５Ｅ３マウスＩｇＧ１の非存在下で生成された蛍光を分析することによって決定した。GraphPad Prismソフトウェア（GraphPad Software,Inc、La Jolla,CA）を使用してデータを分析し、グラフ化した。この実験の結果を図２に示す。

【0141】

３．３ Mirrorball結合アッセイを使用したＭＭ１．Ｓ細胞株へのｍＡｂの特異的結合の実証
ＭＭ．１Ｓ結合アッセイは、ＭＭ．１Ｓ細胞によって内因的に発現されたヒトＳＥＭＡ４Ａに直接結合する未精製ヒトＩｇＧ１の能力を評価した。単一濃度の未精製ヒトＩｇＧ１のＭＭ．１Ｓ細胞への直接結合を、Alexa Fluor 647（Invitrogen、A21445）で標識した抗ヒト二次抗体を介して測定した。Expi293発現培地（Gibco、UK、A1435101）に含有される１０μｌの未希釈未精製ＩｇＧをアッセイプレート（Greiner Bio-one、UK、781906）に添加し、続いて、１，５００個の細胞を含有する１０μｌの８ｎＭ抗ヒトAlexa Fluor 647及び２０μｌのＭＭ．１Ｓ細胞懸濁液を添加した。アッセイプレートを室温で４時間、暗所でインキュベートした後、ＦＬ－４チャネル（６５０～６９０ｎｍ）で励起及び発光を測定するために６４０ｎｍレーザーを使用して、Mirrorball fluorescence cytometer（SPT Labtech、UK）で読み取った。データを、カウントｘ平均強度の中央値（ｘＦＬＵ）として分析した。全ての希釈は、０．１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ（Sigma、UK；カタログ番号：Ａ９５７６）を含有するハンクス平衡塩溶液（Sigma、UK；カタログ番号：Ｈ８２６４）中で行った。GraphPad Prismソフトウェア（GraphPad Software,Inc、La Jolla,CA）を使用してデータを分析し、グラフ化した。この実験の結果を図４に示す。

【0142】

Fab-ZAPアッセイでは１８個のヒト化クローンがヒットとして同定され（細胞死滅≧３０％）、マウス５Ｅ３エピトープ競合アッセイでは１７個のヒト化クローンがヒットとして同定された（阻害≧３０％）。両方のアッセイでヒットした１２個のクローンと、Fab-ZAPのみのヒットであった２個のクローン（５Ｈｇ２／５Ｌｇ６及び５Ｈｇ４／５Ｌｇ４）を再発現させ、更なる特徴づけのために精製した。

【0143】

４９個の完全ヒトファージディスプレイ由来クローンをFab-ZAPアッセイでヒットとして同定した（細胞死滅≧１５％）。ヒトＳＥＭＡ４Ａを内因的に発現するＭＭ．１Ｓ細胞に結合するかどうかに基づいて、４９個のクローンを更にトリアージした。これにより、Fab-ZAPアッセイでヒットし、ＭＭ．１Ｓ細胞に結合した１０個のクローンのパネルが得られた。これらの１０個のクローンをヒトＩｇＧ１からヒトＡｌｙａ ＩｇＧ１に再フォーマットし、セクション４．１に記載の更なる特徴づけのために発現及び精製した。

【0144】

実施例４：精製ヒトＡｌｙａ ＩｇＧ１の二次スクリーニング
４．１ ヒトＡｌｙａ ＩｇＧ１へのＳＥＭＡ４Ａ結合抗体の再フォーマット
特異的可変断片は、薬物分子が共有結合的にコンジュゲートされ得る各重鎖断片に２つのシステインを導入するための修飾を有するヒトＩｇＧ１定常鎖からなるヒトＩｇＧ１－ＡＤＣアイソタイプ（Ａｌｙａ ＩｇＧ１）を発現して、これにより、４（４ＤＡＲ）の「薬物対抗体」比が得られる。可変重鎖（Ｖ_Ｈ）及び可変軽鎖（Ｖ_Ｌ）ドメインを、それぞれ全ヒト抗体の重鎖及び軽鎖を発現するベクターに導入する。可変重鎖を、ヒト重鎖定常ドメイン及び調節エレメントを含有する哺乳動物発現ベクター（ｐＥＵ１．２２、Ａｌｙａベクター）にクローニングして、哺乳動物細胞においてＩｇＧ１重鎖全体を発現させた。ｐＥＵ１．２２は、制御された薬物コンジュゲーションを可能にする２つの部位特異的システインを含有するように操作されている（それぞれＣＨ２及びＣＨ３ Ｆｃドメイン中の２３９ｉＣｙｓ及びＳ４４２Ｃ（ＥＵナンバリング））。同様に、可変軽鎖ドメインを、ヒトラムダ軽鎖定常ドメイン（ｐＥＵ４．４）又はヒトカッパ軽鎖定常ドメイン（ｐＥＵ３．４）及び調節エレメントを発現させるための哺乳動物発現ベクターにクローニングして、哺乳動物細胞において全ＩｇＧ軽鎖を発現させた。重鎖の発現のためのベクターは、Thompson et al.,2016に最初に記載された。軽鎖の発現のためのベクターは、Persic,et al.,1997に最初に記載された。

【0145】

ＩｇＧとしてクローンを得るために、重鎖及び軽鎖ＩｇＧ発現ベクターをExpiCHO（ThermoScientific UK；カタログ番号：Ａ２９１３３）細胞に一過性にトランスフェクトし、そこで抗体を発現させ、培地に分泌した。回収した培地を精製前に濾過した。ＩｇＧは、プロテインＡクロマトグラフィ（HiTrap Fibro PrismA、Cytiva、UK）を使用して精製した。培養上清を、２５ｍＭのＴｒｉｓ ｐＨ７．４、５０ｍのＭＮａＣｌ中で予め平衡化した適切なプロテインＡカラムにロードした。結合したＩｇＧを、０．１Ｍのクエン酸ナトリウムｐＨ３．０、１００ｍＭのＮａＣｌを使用してカラムから溶出した。ＩｇＧをＰＢＳに緩衝液交換した。精製したＩｇＧを０．２μｍのフィルタに通し、ＩｇＧの濃度を、ＩｇＧのアミノ酸配列に基づく吸光係数を用いて２８０ｎｍでの吸光度によって決定した。ＳＥＣ－ＨＰＬＣ及びＳＤＳ－ＰＡＧＥ技術を使用して、精製ＩｇＧを凝集又は分解について分析した。

【0146】

４．２ 直接結合アッセイ（Mirrorball）を使用したＳＥＭＡ４Ａ特異的ヒトＡｌｙａ ＩｇＧ（精製、非コンジュゲート）の結合プロファイルの確認
一次スクリーニングからのヒットをヒトＡｌｙａ ＩｇＧ１ベクターに再フォーマットし、セクション４．１に記載されているように再発現及び精製した。更に、そのＶ_ＨＣＤＲ２内にアスパラギン脱アミド化モチーフ（Ａｓｎ Ｇｌｙ）を含有する単一クローンが同定された。この潜在的な配列の信頼性は、デノボの２つのクローンバリアントＶ_Ｈ遺伝子（Ａｓｎ Ａｌａ及びＧｌｎ Ｇｌｙ）を合成し、これらの配列をヒトＡｌｙａ ＩｇＧ１発現ベクターにクローニングすることによって、リスクが取り除かれた。各精製ヒトＡｌｙａ ＩｇＧ１の特異性プロファイルを決定するために、希釈系列を、ヒトＳＥＭＡ４Ａ、マウスＳＥＭＡ４Ａ、カニクイザルＳＥＭＡ４Ａ、ヒトＳＥＭＡ４Ｂ及び擬似トランスフェクト細胞（expi 293細胞に設定された一過性トランスフェクション）への結合について試験した。５つのアッセイは、適切な細胞を使用し、未精製ｓｃＦｖペリプラズム調製物を組換えヒトＡｌｙａ ＩｇＧ１希釈系列で置換して、セクション２．３に記載の方法を使用した。データを、カウントｘ平均強度の中央値（ｘＦＬＵ）として分析した。

【0147】

アッセイの更なる改変は、組換えヒトＡｌｙａ ＩｇＧ１がｃ－ｍｙｃタグを有さなかったので、Alexa Fluor 647にコンジュゲートしたマウス抗ｃ－ｍｙｃ抗体及び抗マウス抗体を抗ヒトAlexa Fluor 647検出試薬（ThermoFisher Scientific、UK；カタログ番号：Ａ２１４４５）で置換することであった。

【0148】

必要な結合プロファイルは、ヒトＳＥＭＡ４Ａ、マウスＳＥＭＡ４Ａ、カニクイザルＳＥＭＡ４Ａへの結合であったが、ヒトＳＥＭＡ４Ｂ及び擬似トランスフェクトexpi293細胞への結合ではなかった。この実験の結果を図５に示す。

【0149】

４．３ Fab-ZAP細胞死滅アッセイを使用した、ＳＥＭＡ４Ａ特異的ヒトＡｌｙａ ＩｇＧ１（精製、非コンジュゲート）の細胞死滅能力の確認
ヒトＡｌｙａ ＩｇＧ１ベクターに再フォーマットされ、セクション４．１に記載されるように再発現及び精製された一次スクリーニングからのヒットを、Fab-ZAP細胞死滅アッセイで試験した。Fab-ZAPアッセイ方法は実施例３．１に記載されており、精製されたヒトＡｌｙａ ＩｇＧ１を試験するために使用された。精製したヒトＡｌｙａ ＩｇＧ１を８倍ストックに希釈し、次いで４倍希釈を用いて段階希釈して、１２点濃度応答曲線を作成した。５μｌの濃度応答曲線を、未精製ＩｇＧの代わりに２連でアッセイプレートに移した。ヒトＡｌｙａ ＩｇＧ１ベクターで発現させたヒト化リード及び完全ヒトリードがFab-ZAP細胞死滅アッセイでＮＣＩ－Ｈ９２９細胞を死滅させる能力を、それぞれ図６Ａ及び６Ｂに示す。表６は、ヒトＩｇＧ１ Ａｌｙａベクターにおけるマウス５Ｅ３と比較したヒト化リードクローンの細胞殺傷能力を示す。多数のヒト化クローンは、５Ｅ３に匹敵するＩＣ_５０値を示した。

【0150】

【表8】

【0151】

４．４ ＳＥＭＡ４Ａ特異的Ａｌｙａ ＩｇＧ（精製、非コンジュゲート）のエピトープ結合を評価するためのＩｇＧ競合アッセイ
一次スクリーニングからのヒットをヒトＡｌｙａ ＩｇＧ１ベクターに再フォーマットし、セクション４．１に記載されているように再発現及び精製した。５Ｅ３エピトープ競合アッセイ方法はセクション３．２に記載されており、精製されたヒトＡｌｙａ ＩｇＧ１を試験するために使用した。精製したヒトＡｌｙａ ＩｇＧ１を４倍ストックに希釈し、次いで４倍希釈を用いて段階希釈して、１０点濃度応答曲線を作成した。１０μｌの濃度応答曲線を、未精製ＩｇＧの代わりに２連でアッセイプレートに移した。この実験の結果を図７及び表７に示す。

【0152】

【表9】

【0153】

４．５ 改良されたバリアントの動態プロファイリングを可能にするためのＦａｂ断片の生成
ｓｃＦｖのＩｇＧ１－ＡＤＣ（セクション４．１）への変換と同等に、ｓｃＦｖをＦａｂ断片にも変換し、可変重鎖（Ｖ_Ｈ）及び可変軽鎖（Ｖ_Ｌ）ドメインを、それぞれヒト抗体重鎖及び全軽鎖の一部を発現するベクターにサブクローニングした。可変重鎖を、ＣＨ１ヒト重鎖定常ドメイン、ヒンジ領域の一部、及び哺乳動物細胞においてＦａｂ重鎖断片を発現するのに必要な調節エレメントを含む哺乳動物発現ベクター（ｐＥＵ１．３ Ｆａｂ）にクローニングした。同様に、可変軽鎖ドメインを、ヒトラムダ軽鎖定常ドメイン（ｐＥＵ４．４）又はヒトカッパ軽鎖定常ドメイン（ｐＥＵ３．４）及び調節エレメントを発現させるための哺乳動物発現ベクターにクローニングして、哺乳動物細胞において全ＩｇＧ軽鎖を発現させた。

【0154】

Ｆａｂとしてクローンを得るために、Ｆａｂ重鎖及び軽鎖ＩｇＧ発現ベクターをExpiCHO細胞（ThermoScientific UK；カタログ番号：Ａ２９１３３）に一過性にトランスフェクトし、そこでＦａｂ断片を発現させ、培地に分泌した。回収した培地を精製前に濾過した。Ｆａｂ断片を、ヒトＩｇＧ抗体のＣＨ１ドメインを認識するaffinity matrix（Capture Select CH1-XL Columns、ThermoFisher Scientific、UK）を使用して精製した。培養上清を、ＰＢＳ中で予め平衡化した適切なCapture Selectカラムにロードした。結合したＦａｂ断片を、５０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ４．０～４．５を使用してカラムから溶出した。Ｆａｂ断片をＰＢＳに緩衝液交換した。精製したＦａｂ断片を０．２μｍフィルタに通し、Ｆａｂ断片のアミノ酸配列に基づく吸光係数を用いて２８０ｎｍにおける吸光度を測定することにより、Ｆａｂ断片の濃度を決定した。精製されたＦａｂ断片を、ＳＥＣ－ＨＰＬＣ及びＳＤＳ－ＰＡＧＥ技術を使用して凝集又は分解について分析した。

【0155】

４．６ バイオレイヤー干渉法を用いたヒトＳＥＭＡ４Ａ及びカニクイザルＳＥＭＡ４Ａに対する５Ｅ３ヒト化及び完全ヒトリードパネルの結合親和性の決定
OctetRED（Pall ForteBio）機器を使用して、リード抗ＳＥＭＡ４ＡＩｇＧと組換え産生されたヒトＳＥＭＡ４Ａ及びカニクイザルＳＥＭＡ４Ａとの間の相互作用の動態パラメータを評価した。Octetバイオセンサは、２つの表面：センサ先端上の固定化タンパク質の層及び内部参照層から反射された白色光の干渉パターンを分析する光学分析技術を使用する。バイオセンサ先端での結合の変化は、干渉パターンのシフトをもたらし、これはリアルタイムで測定することができる。バイオセンサ先端のリガンドと会合又はリガンドから解離する分子は、干渉パターンをシフトさせ、取得ソフトウェアによって記録されるOctetシステム上の応答を生成する。

【0156】

典型的には、所定の濃度の分析種をカップリングされたリガンドと接触させ、任意の結合をシグナルの増加として検出する（会合相）。これに続いて、緩衝液ですすぎ、その間に、表面固定化リガンドからの分析種の解離をシグナルの減少として観察することができる（解離相）。一連の分析物濃度でこれを繰り返すことにより、結合速度論の分析のためのデータが得られる。

【0157】

Octet Kinetics緩衝液（０．０１％（ｖ／ｖ）ＢＳＡ及び０．００２％（ｖ／ｖ）Tween20を含有するＰＢＳ）は、典型的には、分析物試料の希釈緩衝液として、及び解離相中のフロー緩衝液として使用される。実験データは、経時的な干渉パターン（ｎｍ）のシフトとして記録され、これはバイオセンサ先端の光学的厚さに正比例し、次に結合した分析物の質量の近似尺度である。その後、独自のOctet Data Analysisソフトウェアパッケージを使用して、データを処理し、結合モデルをデータセットに適合させることができる。戻った会合（ｋａ、Ｍ－１ｓ－１）及び解離（ｋｄ、ｓ－１）速度定数は、解離（Ｋ_Ｄ、Ｍ）親和定数の計算を可能にする。

【0158】

ビオチン化ＳＥＭＡ４Ａ抗原をストレプトアビジンセンサー先端に捕捉したアッセイを使用して、分析物（ヒトＡｌｙａ ＩｇＧ１及びＦａｂとしてヒト化及びファージディスプレイ由来ＩｇＧ）とヒトＳＥＭＡ４Ａ及びカニクイザルＳＥＭＡ４Ａとの間の結合親和性を推定した。新しいセンサーチップを各測定に使用し、再生は使用しなかった。リードＦａｂ及びヒトＡｌｙａ ＩｇＧ１の一連の希釈物（３．２５～２４０ｎＭ）を、信頼性のある適切な結合モデルに適合させることができるセンサーグラムを観察するのに十分な時間（典型的には５分）、続いて適切な解離時間（典型的には１０分）、リガンド表面と個別に接触させた。任意の緩衝アーチファクト又は非特異的結合効果の影響を低減するために、ブランク参照（０ｎＭの分析物）データを各データセットから差し引いた。次いで、Octet Evaluationソフトウェアを使用して、各分析物滴定からのデータに１：１結合モデルを同時に当てはめた（表８）。

【0159】

【表10】

【0160】

４．７ Octetを使用したヒト化抗体パネル及び完全ヒト抗体パネルからの抗体のエピトープビニング
OctetRED（Pall ForteBio）機器をセクション４．６に記載されているように使用して、エピトープビニングを実施し、リード抗ヒトＳＥＭＡ４Ａクローンを組換えヒトＳＥＭＡ４Ａへの結合に基づいてビンにグループ化した。このグループ分けは、交差競合アッセイを使用して行われ、特定の抗原に対する分析物対の競合的結合が特徴づけられる。このインタンデムフォーマットでは、ストレプトアビジンバイオセンサ上に固定化された抗原（ビオチン化組換えヒトＳＥＭＡ４Ａ）は、連続する工程で２つの競合する分析物に提示される。第１のＦａｂ断片（マウス５Ｅ３）による飽和が第２のＩｇＧの結合を遮断しない場合、異なる重複しないエピトープへの結合が示される。

【0161】

所定の濃度の分析種をカップリングされたリガンドと接触させ、任意の結合をシグナルの増加として検出する（会合相）。エピトープビニングは、この第１の会合を飽和させ（親和性測定中に、典型的には５分間測定される）、続いて第２の会合工程で、センサを第１の分析物（マウス５Ｅ３ Ｆａｂ）及び第２の分析物（ナイーブＳＥＭＡ４Ａ ＩｇＧ）の両方を含有するウェルに浸漬する（典型的には５分）ことによって達成される。第１の分析物は、第２の分析物が結合しようとしている間、飽和を維持するために含まれる。これに適切な長さの解離時間（典型的には１０分）が続く。新しいセンサーチップを各測定に使用し、再生は使用しなかった。

【0162】

この実験の結果を図８に示す。図８Ａは、重複又は競合するエピトープを有する２つのクローンから生成されたデータを表す。図８Ｂ～図８Ｄは、非重複エピトープを有するクローンに対応するデータを示す。

【0163】

実施例５：ヒトＡｌｙａ ＩｇＧ１へのリンカー及び弾頭（ＭｃＭＭＡＦ）のコンジュゲーション
５．１ ＭｃＭＭＡＦへのＳＥＭＡ４Ａ特異的ヒトＡｌｙａ ＩｇＧ１のコンジュゲーション
ヒト化及び完全ヒトリードをヒトＡｌｙａ ＩｇＧ１ベクターにクローニングし、発現させ、精製し、ＤＰＢＳ、ｐＨ７中１０ｍｇ／ｍｌに濃縮した。各タンパク質を、４０倍モル過剰のＴＣＥＰ対抗体でＴＣＥＰ（トリス－（２－カルボキシエチル）－ホスフィンヒドロクロリド、Sigmaカタログ番号：７５２５９）を使用して３７℃で３時間穏やかに還元した。ＰＢＳ、ｐＨ７．２、１ｍＭのＥＤＴＡ中に脱塩した後（Zeba（商標）Spin Desalting Columns、ThermoFisher Scientific、カタログ番号：８９８８２）、ｄｈＡＡ（デヒドロアスコルビン酸、Sigmaカタログ番号：２６１５５６）を使用して２０倍モル過剰のｄｈＡＡ対抗体で室温で４時間ＩｇＧを酸化した。ＭＭＡＦコンジュゲーションは、１２倍モル過剰のＭＭＡＦ対抗体でＭｃＭＭＡＦ（MedChemExpress、カタログ番号：ＨＹ－１５５７８）を使用して４℃で一晩行った。室温で１５分間、４倍モル過剰のＮＡＣ（Ｎ－アセチル－Ｌ－システイン、Sigma-Aldrich、カタログ番号：Ａ７２５０）を使用して反応を停止させた。最後に、各コンジュゲート化ＳＥＭＡ４Ａ ＩｇＧ（ヒトＡｌｙａ ＩｇＧ１）をＰＢＳ、ｐＨ７．２、１ｍＭのＥＤＴＡに緩衝液交換し、濃縮し、ＰＢＳ、ｐＨ７．２、１ｍＭのＥＤＴＡを使用してSuperose 6 Increase 10/300 GL（Sigma-Aldrich、カタログ番号：ＧＥ２９－０９１５－９６）を使用して精製した。各非コンジュゲート化ＳＥＭＡ４ＡヒトＡｌｙａ ＩｇＧ１と一緒に、ＩｇＧをＳＤＳ ＰＡＧＥ（NuPAGE 4-12% BisTris gels（１２ウェル）、ThermoFisher Scientific、カタログ番号：ＮＰ０３２２ＰＫ２）上で２００Ｖで６０分間泳動して、コンジュゲーションを確認した。

【0164】

５．２ リードパネル（ＭｃＭＭＡＦにコンジュゲートしたヒトＡｌｙａ ＩｇＧ１）のＳＥＭＡ４Ａ（Mirrorball）に対する結合／特異性の再確認
ヒトＡｌｙａ ＩｇＧ１クローンを、セクション５．１に記載されるようにＭｃＭＭＡＦにコンジュゲートした。コンジュゲーション後、これらのクローンを再試験して、ヒトＳＥＭＡ４Ａ、ヒトＳＥＭＡ４Ｂ及び擬似トランスフェクト細胞（expi 293細胞で設定された一過性トランスフェクション）に対するそれらの結合プロファイルを再確認することが必要であった。

【0165】

ＭｃＭＭＡＦにコンジュゲートした各精製ヒトＡｌｙａ ＩｇＧ１の特異性プロファイルを決定するために、ヒトＳＥＭＡ４Ａ、ヒトＳＥＭＡ４Ｂ及び擬似トランスフェクト細胞（expi 293細胞に設定された一過性トランスフェクション）への結合について希釈系列を試験した。これらの３つのアッセイは、適切な細胞を使用し、未精製ｓｃＦｖペリプラズム調製物をＭｃＭＭＡＦにコンジュゲートしたヒトＡｌｙａ ＩｇＧ１で置換する、セクション２．３に記載の方法を使用した。データを、カウントｘ平均強度の中央値（ｘＦＬＵ）として分析した。

【0166】

アッセイの更なる改変は、組換えＩｇＧがｃ－ｍｙｃタグを有さなかったので、Alexa Fluor 647にコンジュゲートしたマウス抗ｃ－ｍｙｃ抗体及び抗マウス抗体を抗ヒトAlexa Fluor 647検出試薬（ThermoFisher Scientific、UK；カタログ番号：Ａ２１４４５）で置換することであった。

【0167】

必要な結合プロファイルは、ヒトＳＥＭＡ４Ａへの結合のためのものであったが、ヒトＳＥＭＡ４Ｂ及び擬似トランスフェクトexpi293細胞への結合のためのものではなかった。この実験の結果を図９に示す。

【0168】

５．３ ＭＭ．１Ｓ、ＮＣＩ－Ｈ９２９及びＫａｒｐａｓ－２５細胞株においてＪ６Ｍ０に対してベンチマークした、ＳＥＭＡ４Ａリードパネル（ＭｃＭＭＡＦにコンジュゲートしたヒトＡｌｙａ ＩｇＧ１）を用いた細胞死滅アッセイ
CellTiter Glo 2.0（Promega、Madison,WI、G9248）及びPherastarプレートリーダ（BMG Labtech、Germany）を使用して、インビトロで、ＭＭ．１Ｓ、ＮＣＩ－Ｈ９２９及びＫａｒｐａｓ－２５多発性骨髄腫細胞及びＫ５６２白血病細胞に結合し、内在化し、死滅させる、ＭｃＭＭＡＦにコンジュゲートしたＳＥＭＡ４Ａ特異的ヒトＡｌｙａ ＩｇＧ１の能力を、細胞死滅アッセイにより評価した。コンジュゲートが４つ全ての細胞株を死滅させる能力を試験し、Ｊ６Ｍ０（Tai et al.,2014）として知られるＭｃＭＭＡＦコンジュゲートＢＣＭＡ特異的Ａｌｙａ ＩｇＧ１と比較してベンチマークした。これらのアッセイのために、３つの細胞株を、ヒトＳＥＭＡ４Ａの高発現（ＭＭ．１Ｓ）、中発現（ＮＣＩ－Ｈ９２９）及び低発現（Ｋａｒｐａｓ－２５）として選択した。Ｋ５６２細胞はヒトＳＥＭＡ４Ａを発現しない。

【0169】

ＳＥＭＡ４Ａ発現レベルとＢＣＭＡ発現レベルとの比較において、ＮＣＩ－Ｈ９２９細胞は、同等のレベルの両方の標的を発現することが示された（Quantum（商標）Simply Cellular（登録商標）anti-Mouse IgG beads、カタログ番号：８１５、Bangs Laboratories,Inc、Indiana,USA）を使用して決定された、ＳＥＭＡ４Ａ及びＢＣＭＡの両方についての細胞当たりの３Ｅ５抗体結合部位）。この細胞株は、細胞死滅速度及び内在化速度についてのｍＡｂ対Ｊ６Ｍ０のＳＥＭＡ４Ａパネルの効力を理解するのに適した株であると考えられた。

【0170】

ＭｃＭＭＡＦコンジュゲートを４倍ストックに希釈し、次いで、４倍希釈を用いて段階希釈して、１２点濃度応答曲線を作成した。１０μｌの濃度応答曲線をアッセイプレート（Greiner Bio-one、UK、781091）に加えた後、２，０００個のＭＭ．１Ｓ、ＮＣＩ－Ｈ９２９、Ｋａｒｐａｓ－２５又はＫ５６２細胞を含有する３０μｌの細胞懸濁液を加えた。アッセイプレートを３７℃／５％ＣＯ_２／９５％湿度で９６時間インキュベートした。細胞死滅を、Pherastarで発光についてプレートを読み取る前に、２０μｌのCellTiter Glo 2.0を添加し、続いて１０分間インキュベートすることによって評価した。アッセイ培地に５５μＭβ－メルカプトエタノール（Gibco、UK、21985-023）も補充したＫａｒｐａｓ－２５細胞を試験するアッセイを除いて、全ての希釈を、１０％ＦＢＳ（Gibco、UK、10500-064）を補充したRPMI 1640（Gibco、UK、A10491-01）中で行った。最大アッセイシグナルは、細胞のみを含むウェルによって定義した。バックグラウンドアッセイシグナルは、緩衝液のみを含むウェル、すなわち細胞を含まないウェルによって定義した。GraphPad Prismソフトウェア（GraphPad Software,Inc、La Jolla,CA）を使用してデータを分析し、グラフ化した。この実験の結果を図１０及び表９、並びに図１１及び表１０に示す。

【0171】

【表11】

【0172】

【表12】

【0173】

５．４ ＮＣＩ－Ｈ９２９細胞株においてＪ６Ｍ０に対してベンチマークしたヒト化及び完全ヒトリードパネル（ＭｃＭＭＡＦにコンジュゲートしたヒトＡｌｙａ ＩｇＧ１）の内在化
ヒトＡｌｙａ ＩｇＧ１クローンとしてのヒト化及び完全ヒトリードパネルを、セクション５．１に記載されるようにＭｃＭＭＡＦにコンジュゲートした。これらのコンジュゲート化ＩｇＧがＳＥＭＡ４Ａ発現多発性骨髄腫細胞株に内在化される能力を試験し、Ｊ６Ｍ０として知られるＭｃＭＭＡＦコンジュゲート化ＢＣＭＡ特異的ヒトＡｌｙａ ＩｇＧ１と比較してベンチマークした（Tai et al.,2014）。ＢＣＭＡ（細胞当たり３．３ｘ１０^５個の抗体結合部位）及びＳＥＭＡ４Ａ（細胞当たり３．２ｘ１０^５個の抗体結合部位）の同等の発現を有するＮＣＩ－Ｈ９２９細胞株をこの目的のために選択した。

【0174】

Fab-pHast内在化アッセイを使用して、ＮＣＩ－Ｈ９２９細胞への内在化を可視化した。このアッセイは、既知濃度のＭｃＭＭＡＦコンジュゲートＡｌｙａ ＩｇＧ、Fab-pHast（Advanced Targeting Systems、San Diego,CA、PH-01）、Hoechst 33342（Invitrogen、UK、H3570）及びImageXpress Micro high content imaging system（Molecular Devices、San Jose,CA）を使用して設定した。

【0175】

Fab-pHastは、ｐＨ感受性蛍光標識にコンジュゲートされた抗ヒト二次抗体である。組織培養培地の中性ｐＨはFab-pHast蛍光を消光する。抗体－二次複合体がエンドサイトーシス経路の酸性区画に内在化された場合にのみ、有意なFab-pHast蛍光を検出することができる。

【0176】

ＭｃＭＭＡＦコンジュゲート化ヒトＡｌｙａ ＩｇＧ１としてのヒト化及び完全ヒトリードパネルを、１０ｘFab-pHast溶液中で既知の濃度に希釈することによって標識した。標識反応物を室温で２０分間インキュベートする前に、同じ溶液に段階希釈を設定して滴定曲線を作成した。標識抗体を、ポリ－Ｄ－リジンでコーティングされた９６ウェル組織培養プレート上の無血清RPMI 1640（Gibco、UK、A10491-01）に予め播種したＮＣＩ－Ｈ９２９細胞に１０分の１の比率で添加した。処理した細胞を３７℃／５％ＣＯ_２／９５％湿度でインキュベートし、３、６及び２４時間にImageXpress Microの青色及び黄色チャネルで画像化した。これらの画像をMetaXpress 6ソフトウェアパッケージ（Molecular Devices、San Jose,CA）を使用して処理して、定義された閾値に基づいて青色（全ての核のHoescht染色）及び黄色（内在化されたFab-pHastラベル）チャネル内のオブジェクトを同定した。ソフトウェアは、Fab-pHast陽性細胞のパーセンテージとそれらの平均積分強度（全てのFab-pHast陽性ピクセル強度の合計をHoescht陽性核の総数で割ったものとして定義される）の両方を報告した。これらのデータを、GraphPad Prismソフトウェア（GraphPad Software,Inc、La Jolla,CA）を使用して分析し、グラフ化した。この実験の代表的な結果を図１２に示し、以下の表１１に重複実験の平均結果を示す。

【0177】

【表13】

【0178】

５．５ フローサイトメトリによるリードパネルＳＥＭＡ４Ａ特異的ＩｇＧ（ＭｃＭＭＡＦにコンジュゲートしたヒトＡｌｙａ ＩｇＧ１）の結合親和性の決定
膜結合ＳＥＭＡ４ＡへのＳＥＭＡ４Ａ特異的ＩｇＧの結合を、ヒトＳＥＭＡ４Ａを内因的に発現するＮＣＩ－Ｈ９２９細胞においてフローサイトメトリを使用して評価した。結合アッセイを、抗ＳＥＭＡ４Ａ抗体を２００，０００個の細胞と４℃で３時間インキュベートし、続いてＰＢＳ、１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ（ＦＡＣＳ緩衝液）で２回洗浄することによって行った。１０点、３倍希釈系列を使用して、抗体濃度の範囲を評価した。次いで、細胞を、１：１００に希釈したAlexa Fluor 647 conjugated AffiniPure Fab Fragment Goat Anti-Human IgG(H+L)（Jackson Immunoresearch Europe Limited、Ely,Cambridgeshire）と共に４℃で１時間インキュベートし、続いてＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した。次いで、細胞を４℃で３０分間、LIVE/DEAD（商標）Fixable Violet Dead Cell Stain（Life Technologies、L34955）で染色した後、ＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した。次いで、BD Cell Fix（BD Biosciences、340181）を用いて細胞を固定した。生の単一細胞の蛍光を、Novocyte（商標）３０００フローサイトメーター及びNovoexpressソフトウェア（Acea Biosciences,Inc、San Diego,CA）を使用して測定した。FlowJoソフトウェア（FlowJo、LLC,Ashland,OR）を使用してデータを分析した。Prismソフトウェア（GraphPad Software Inc、La Jolla,CA）を使用して決定した抗体コンジュゲート濃度及びＫ_Ｄ値に対して平均蛍光強度値をプロットした。この実験の結果を図１３及び表１２に示す。

【0179】

【表14】

【0180】

実施例６：完全ヒトファージディスプレイ由来のリードの生殖系列化及び保持された機能の検証
６．１ 完全ヒトファージディスプレイ由来リード生殖系列化
ファージディスプレイ選択から同定された完全ヒトリードは、潜在的な免疫原性リスクを軽減するのを助けるために生殖系列化された。個々の抗体配列を、IMGT（ImMunoGeneTics;www.imgt.org）又はImmuneDiscoverデータベースを介してアクセス可能なヒト生殖系列Ｖ、Ｄ及びＪ領域と比較した。ＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２、ＶＨＣＤＲ３、ＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２、ＶＬＣＤＲ３領域外に存在し、Vernier残基ではない標準的なヒト生殖系列配列とは異なるアミノ酸残基を復帰させた。完全に生殖系列化した各Ｖ_Ｈ及びＶ_Ｌ遺伝子配列をデノボで合成し、標準的な分子生物学技術を使用して適切なＩｇＧ発現ベクター（Persic,et al.,1997）にクローニングした。

【0181】

６．２ 直接結合アッセイ（Mirrorball）を使用した、生殖系列完全ヒトファージディスプレイ由来ヒトＡｌｙａ ＩｇＧ１（精製、非コンジュゲート）の結合特異性の確認
各生殖系列完全ヒトのＳＥＭＡ４Ａ結合特異性を確認するために、ファージディスプレイ由来ヒトＡｌｙａ ＩｇＧ１希釈系列を、ヒトＳＥＭＡ４Ａ、マウスＳＥＭＡ４Ａ、カニクイザルＳＥＭＡ４Ａ、ヒトＳＥＭＡ４Ｂ及び擬似トランスフェクト細胞（expi 293細胞に設定された一過性トランスフェクション）への結合について試験した。５つのアッセイは、適切な細胞を使用し、未精製ｓｃＦｖペリプラズム調製物を組換え生殖系列ヒトＩｇＧ１ Ａｌｙａ希釈系列で置換して、セクション２．３に記載の方法を使用した。データを、カウントｘ平均強度の中央値（ｘＦＬＵ）として分析した。

【0182】

アッセイの更なる改変は、組換えＩｇＧがｃ－ｍｙｃタグを有さなかったので、Alexa Fluor 647にコンジュゲートしたマウス抗ｃ－ｍｙｃ抗体及び抗マウス抗体を抗ヒトAlexa Fluor 647検出試薬（ThermoFisher Scientific、UK；カタログ番号：Ａ２１４４５）で置換することであった。必要な結合プロファイルは、ヒトＳＥＭＡ４Ａ、マウスＳＥＭＡ４Ａ、カニクイザルＳＥＭＡ４Ａへの結合であったが、ヒトＳＥＭＡ４Ｂ及び擬似トランスフェクトexpi293細胞への結合ではなかった。この実験の結果を図１４に示す。

【0183】

実施例７．ＭＭ患者試料中のＳＥＭＡ４Ａの血清レベルを評価し、可溶性ＳＥＭＡ４Ａ（ｓＳＥＭＡ４Ａ）がリードパネル細胞殺傷効力に影響するかどうかを理解する
７．１ 患者試料中のＳＥＭＡ４Ａのレベルの評価
ＳＥＭＡ４Ａが潜在的なＡＤＣ標的であると決定したので、本発明者らは、ＳＥＭＡ４Ａの血清濃度を測定することによって、ヒトＭＭ患者においてＳＥＭＡ４Ａを標的とすることの実現可能性を更に調査した。多くの細胞表面タンパク質が循環中に放出され、この可溶性タンパク質はシンクとして作用し、治療用抗体を「浸す」ことができる。これは、有効性を達成するためには、許容できない血中濃度の抗体が必要であることを意味する。これがＳＥＭＡ４Ａの治療標的化を妨害し得るかどうかを理解するために、本発明者らはｓＳＥＭＡ４Ａを検出するためのサンドイッチＥＬＩＳＡを設計した。

【0184】

White maxisorp plates（ThermoScientific、UK、436110）をＰＢＳ中５μｇ／ｍＬの捕捉抗体（マウス抗ヒトＳＥＭＡ４Ａクローン５Ｅ３、BioLegend（登録商標）、San Diego,CA、148402）５０μｌでコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。未結合抗体を除去し、プレートをＰＢＳで洗浄した。非特異的結合を、カゼイン（ThermoScientific、UK、37528）と室温で１時間インキュベーションし、続いてＰＢＳ洗浄することによってブロックした。５０μｌ／ウェルの未知試料又は希釈標準（組換えヒトＳＥＭＡ４Ａ（Abcam、UK、ab182683））を室温で１～２時間インキュベートした。試料を除去し、プレートをPBS-Tween 20（０．１％ｖ／ｖ）洗浄緩衝液で３回洗浄した。捕捉されたｓＳＥＭＡ４Ａは、室温での１時間のインキュベーションで抗ＳＥＭＡ４Ａポリクローナル抗体（R&D Systems、AF4694、１：２０カゼイン中５μｇ／ｍｌで５０μｌ）によって検出された。プレートを洗浄緩衝液で３回洗浄し、１：２０カゼイン（５０μｌ）中１／５０００で二次検出抗体（ロバ抗ヒツジＩｇＧコンジュゲートＨＲＰ、Abcam、ab97125）を室温で１時間添加した。二次検出抗体を除去し、洗浄緩衝液で５回洗浄した。５０μｌのPico ＥＬＩＳＡ基質（Thermo Scientific、UK、37070）を製造者のガイドラインに従ってプレートに添加し、室温で５分間インキュベートし、EnVisionプレートリーダ（PerkinElmer）を使用して発光を検出した。

【0185】

希釈試験は、アッセイが２ｎｇ／ｍｌ以下の検出限界を有することを実証した（図１５）。本発明者らは、健康な対照及び骨髄腫患者の血清中のｓＳＥＭＡ４Ａをアッセイし、これらがそれぞれ３．３ｎｇ／ｍＬ及び８．１ｎｇ／ｍＬであることを見出した（図１５）。２つの群間の差は有意であったが（ｐ＝０．００２２；ｔ検定）、ｓＳＥＭＡ４Ａの絶対レベルは、骨髄腫におけるＳＥＭＡ４Ａ ＡＤＣの活性を破壊する可能性は非常に低い。例えば、ベランタマブ・マホドチン又はＣＡＲ－Ｔ細胞による骨髄腫におけるＴＮＦＲＳＦ１７（ＢＣＭＡ）の標的化の成功は、１７６ｎｇ／ｍＬの可溶性ＢＣＭＡの血清中発現レベル中央値によって損なわれていないようである。したがって、本発明者らは、シェッドＳＥＭＡ４Ａがこの細胞表面タンパク質を標的化する能力に影響を及ぼす可能性は非常に低いと結論付けた。

【0186】

７．２ ＮＣＩ－Ｈ９２９細胞を死滅させる完全ヒトＳＥＭＡ４Ａ特異的ヒトＡｌｙａ ＩｇＧ１（ＭｃＭＭＡＦコンジュゲート）の能力に対するｓＳＥＭＡ４Ａの影響を測定すること。
セクション５．３に記載される細胞死滅アッセイを使用して、ｓＳＥＭＡ４Ａの存在が、ＮＣＩ－Ｈ９２９細胞を死滅させるためのＭｃＭＭＡＦにコンジュゲートされた完全ヒトＳＥＭＡ４Ａ特異的ヒトＡｌｙａ ＩｇＧの効力に影響を及ぼすかどうかを評価した。ｓＳＥＭＡ４Ａは、１００倍濃縮されたＮＣＩ－Ｈ９２９細胞の細胞培養培地（ＣＣＭ）に由来した。ＣＣＭ中のｓＳＥＭＡ４Ａレベルを、実施例７．１に記載のＥＬＩＳＡを使用して定量した。ｓＳＥＭＡ４Ａを含有しないＣＣＭは、ＮＣＩ－Ｈ９２９ ＳＥＭＡ４Ａノックアウト細胞に由来し、０ｎｇ／ｍｌのＳＥＭＡ４Ａ濃度に使用した。ＭｃＭＭＡＦにコンジュゲートした完全ヒトファージディスプレイ由来ヒトＡｌｙａ ＩｇＧ１の力価を、０、８、２５及び１００ｎｇ／ｍｌでアッセイに添加したｓＳＥＭＡ４Ａの存在下で試験した。

【0187】

この実験の結果（ｎ＝２）を図１６に示す。ＭｃＭＭＡＦにコンジュゲートした完全ヒトファージディスプレイ由来ヒトＡｌｙａ ＩｇＧ１の細胞死滅ＩＣ_５０値は、ｓＳＥＭＡ４Ａの非存在下で測定したＩＣ_５０値と比較して有意な変化を示さなかった。

【0188】

実施例８．正常組織及び血液学的組織におけるＳＥＭＡ４Ａ、ＢＣＭＡ及びＣＤ２２の発現プロファイル
８．１ 免疫組織化学（ＩＨＣ）法
ＳＥＭＡ４Ａ：ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織の切片を４ミクロンの厚さで切断した。Ventana Discovery autostainerを用いて切片を脱パラフィン処理し、細胞コンディショニング溶液又はＣＣ１（低ｐＨ）溶液中、９５℃で６４分間抗原回復を行った。ＳＥＭＡ４Ａに対する抗体（Atlas抗体、ＨＰＡ０６９１３６、ウサギポリクローナル）を０．２μｇ／ｍｌの濃度で６０分間適用した。色素原として３，３’－ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）及び対比染色剤としてヘマトキシリンを用いて、Ventana HQキットを使用して検出を完了した。

【0189】

最も近いファミリーメンバーＳＥＭＡ４Ｂを過剰発現する細胞を含む、既知のＳＥＭＡ４Ａ発現を有する細胞株を含む様々なＦＦＰＥ細胞ペレットを使用して、染色プロトコルを最適化し、その特異性を確認した。予想されるＳＥＭＡ４Ａ発現（扁桃腺、脾臓）を有する正常ヒト組織を使用して、ＦＦＰＥ組織に対するアッセイの適合性を確認した。

【0190】

ＢＣＭＡ：ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織の切片を４ミクロンの厚さで切断した。Ventana Discovery autostainerを用いて切片を脱パラフィン処理し、ＣＣ２（高ｐＨ）溶液中、９５℃で４８分間抗原回復を行った。ＢＣＭＡに対する抗体（Cell Signaling Technology #88183S、ウサギモノクローナル）を１．６μｇ／ｍｌの濃度で６０分間適用した。色素原としてＤＡＢ、対比染色剤としてヘマトキシリンを用いて、Ventana HQキットを使用して検出を完了した。既知のＢＣＭＡ発現を有する細胞株を含む様々なＦＦＰＥ細胞ペレットを使用して、染色プロトコルを最適化し、その特異性を確認した。

【0191】

ＣＤ２２：ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織の切片を４ミクロンの厚さで切断した。Leica Bond autostainerを用いて切片を脱パラフィン処理し、ＥＲ２（高ｐＨ）溶液中、９５℃で２０分間抗原回復を行った。ＣＤ２２に対する抗体（Cell Signaling Technology #98035、ウサギモノクローナル）を０．２μｇ／ｍｌの濃度で３０分間適用した。Leica Bond Refineキットを使用して、ＤＡＢを色素原として、ヘマトキシリンを対比染色剤として検出を完了した。既知のＣＤ２２発現を有する細胞株を含む様々なＦＦＰＥ細胞ペレットを使用して、染色プロトコルを最適化し、その特異性を確認した。

【0192】

８．２ ＳＥＭＡ４Ａ発現評価
ＩＨＣプロトコルを正常組織及び腫瘍組織の集合に適用して、目的の異なる腫瘍タイプにおける発現の有病率及び強度を評価した。切片を、認定された病理学者が調べ、染色結果を、陽性染色腫瘍細胞の割合、並びに大部分の細胞における染色の強度について等級分けした。各試料について、優勢な内在化（膜、細胞質又は核）も認められた。正常組織では、免疫細胞（Ｂ細胞並びに骨髄／樹状細胞系統の特定の細胞と一致する）並びに脳のいくつかの細胞において、ヒトＳＥＭＡ４Ａの陽性染色が観察された。

【0193】

腫瘍組織では、ＭＭ（いくつかの陽性腫瘍染色を有する試料の９２％）、ＤＬＢＣＬ（１００％）、ＦＬ（１００％）及びＡＭＬ（７４％）の試料で陽性染色の高い有病率が観察された。発現強度は、ＭＭ及びＤＬＢＣＬにおいて全体的に最も強かった。これらの腫瘍適応症における発現の高い有病率は、非腫瘍組織（脳以外）における発現レベルの欠如又は低さと相まって、ＳＥＭＡ４Ａが特異的抗体ベースの抗腫瘍治療アプローチの潜在的に価値のある標的であることを示唆した。

【0194】

多発性骨髄腫及びＤＬＢＣＬにおけるＳＥＭＡ４Ａ発現を、これらの腫瘍に対する他の潜在的な治療標的、すなわちＭＭに対するＢＣＭＡ及びＤＬＢＣＬに対するＣＤ２２の発現と比較した。同じスコアリングシステムを使用して、ＳＥＭＡ４Ａについて染色した同じ試料を染色し、ＢＣＭＡ又はＣＤ２２の発現についてスコアリングした。高発現をスコア≧６と定義した。ＭＭについての結果を表１３及び１４に示し、ＤＬＢＣＬについての結果を表１５及び１６に示す。

【0195】

全てのＭＭ試料は、ＳＥＭＡ４Ａ及びＢＣＭＡの両方についていくらかの陽性を有していた。全体的な発現強度は、ＳＥＭＡ４ＡとＢＣＭＡとの間で類似していると考えられたが、発現は、ＳＥＭＡ４Ａについては膜により内在する傾向があり、ＢＣＭＡについては細胞質においてしばしば優勢であった。個々の試料におけるＳＥＭＡ４Ａ発現の強度とＢＣＭＡ発現の強度との間に強い関連は見られなかった（表１３）。

【0196】

【表15】

【0197】

【表16】

【0198】

ＤＬＢＣＬ試料では、全ての症例がＳＥＭＡ４Ａについていくらかの陽性を有したが、ＣＤ２２については１９／２０（９５％）であった。全体的な発現強度は、ＣＤ２２よりもＳＥＭＡ４Ａの方が高い傾向があり、スコアがより高く、高発現症例の割合がより高い（表１５）。ＭＭ症例に関して、ＳＥＭＡ４Ａ発現は主に膜であったが、ＣＤ２２はしばしばより主に細胞質であった。個々の試料におけるＳＥＭＡ４Ａ発現の強度とＣＤ２２発現との間に関連はないようであった（表１６）。

【0199】

【表17】

【0200】

【表18】

【0201】

実施例９．有効性のインビボモデル
ヒトＭＭのＮＣＩ－Ｈ９２９、ＭＭ．１Ｓ、及びＭＭ．１Ｒ異種移植モデル（とりわけ）を、側腹部に５ｘ１０^６個の細胞（例えば）を皮下移植することによって、４週齢～６週齢の雌ＣＢ－１７マウス（又は適切な種）において樹立する（Envigo、Frederick,MD）。ヒトＭＭのＪＪＮ－３異種移植モデルは、雌の無胸腺ヌードマウス（Envigo、Frederick,MD）において、側腹部に１０ｘ１０^６個の細胞（例えば）を皮下移植することによって樹立される。腫瘍成長は、研究の過程にわたって監視することができ、腫瘍体積は、［長さ（ｍｍ）ｘ幅（ｍｍ）ｘ幅（ｍｍ）］／２として計算される。腫瘍が１５０ｍｍ^３～２００ｍｍ^３に達したら、リード抗体又はＩｇＧアイソタイプＡＤＣ対照の単回静脈内注射を投与する前に、（例えば）Study Directorソフトウェアパッケージ（Studylog Systems、South San Francisco,CA）に組み込まれた決定論的ランダム化方法を使用して、マウスを群（とりわけ、ＮＣＩ－Ｈ９２９、ＭＭ．１Ｓ、ＭＭ．１Ｒ、及びＪＪＮ－３モデルについて、それぞれ群当たりｎ＝５、６、８又は１０動物）にランダムに割り当てる。治療情報は腫瘍測定中に盲検化されない。マウスの体重及び腫瘍の測定値を、試験期間中、週に２回決定する。（対照と比較した）腫瘍体積における１００％回帰の試料サイズ推定値を、nQueryバージョン４．０（例えば）を使用して計算する（Statistical Solutions Ltd.、Cork,Ireland、2015）。等しい平均の二群ｔ検定を、０．０５の有意水準で８０％の累乗で使用する（片側検定）。

【0202】

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【0203】

【表19】

【0204】

【表20】

【0205】

【表21】

【0206】

【表22】

【0207】

【表23】

【0208】

【表24】

【0209】

配列番号６１３ 組換えヒトＳＥＭＡ４Ａ（UniProt ID Q9H3S1、アイソフォーム１）

【0210】

【表25】

【0211】

配列番号６１４ 組換えカニクイザルＳＥＭＡ４Ａ（UniProt ID G7NV79）

【0212】

【表26】

【0213】

配列番号６１５ 組換えマウスＳＥＭＡ４Ａ（UniProt ID Q62178）

【0214】

【表27】

【0215】

【表28】

【0216】

【表29】

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5A】

【図5B】

【図6A】

【図6B】

【図7】

【図8A-B】

【図8C-D】

【図9A】

【図9B】

【図10A-D】

【図11A-C】

【図12A-D】

【図13】

【図14】

【図15A-B】

【図16】

【図17A】

【図17B】

【図17C】

【図17D】

【図17E】

【図18A】

【図18B】

【図18C】

【図18D】

【配列表】

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【国際調査報告】