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特表2024-546152免疫グロブリン分解酵素による切断に対抗するＦｃ変異体
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-12-17
(54)【発明の名称】免疫グロブリン分解酵素による切断に対抗するＦｃ変異体
(51)【国際特許分類】
C07K 16/00 20060101AFI20241210BHJP
C12N 15/13 20060101ALI20241210BHJP
C12N 15/62 20060101ALI20241210BHJP
C07K 19/00 20060101ALI20241210BHJP
C07K 16/46 20060101ALI20241210BHJP
C07K 16/08 20060101ALI20241210BHJP
C07K 16/30 20060101ALI20241210BHJP
C07K 16/28 20060101ALI20241210BHJP
C12N 9/52 20060101ALI20241210BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20241210BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20241210BHJP
A61P 37/06 20060101ALI20241210BHJP
【ＦＩ】
C07K16/00 ZNA
C12N15/13
C12N15/62 Z
C07K19/00
C07K16/46
C07K16/08
C07K16/30
C07K16/28
C12N9/52
A61K39/395 W
A61P35/00
A61P37/06
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024535964
(86)(22)【出願日】2022-12-16
(85)【翻訳文提出日】2024-08-06
(86)【国際出願番号】 CN2022139441
(87)【国際公開番号】W WO2023109928
(87)【国際公開日】2023-06-22
(31)【優先権主張番号】202111547070.5
(32)【優先日】2021-12-16
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＲＩＴＯＮ
(71)【出願人】
【識別番号】521441168
【氏名又は名称】上海宝済薬業股▲ふん▼有限公司
【住所又は居所原語表記】Ｎｏ．２８，Ｌｕｏｘｉｎ Ｒｏａｄ，Ｂａｏｓｈａｎ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ，Ｓｈａｎｇｈａｉ ２０１９０８，Ｃｈｉｎａ
(74)【代理人】
【識別番号】110000729
【氏名又は名称】弁理士法人ユニアス国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】王 征
(72)【発明者】
【氏名】徐 云霞
(72)【発明者】
【氏名】劉 彦君
(72)【発明者】
【氏名】呂 宝杰
【テーマコード（参考）】
4C085
4H045
【Ｆターム（参考）】
4C085AA13
4C085AA34
4C085BA01
4C085BA51
4C085BB01
4C085BB36
4C085CC05
4C085DD62
4C085EE01
4C085GG02
4H045AA11
4H045AA30
4H045BA41
4H045BA72
4H045DA76
4H045EA20
4H045FA74
(57)【要約】
Ｆｃ変異体を含む分子を提供し、前記分子はＩｇＧ野生型Ｆｃを含む分子と比べて、免疫グロブリン分解酵素に対して耐性があり、且つ前記分子は変異を有するヒトＩｇＧ Ｆｃ領域を含み、前記変異は位置Ｇ２３７（ＥＵナンバリング）での１つ又は複数の置換又は欠失であり、前記置換は、Ｇ２３７Ａであることが好ましい。また、前記分子をコードする核酸、前記核酸を含むベクター及び宿主細胞、並びに前記分子の製造方法を提供する。
【選択図】なし
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
Ｆｃ変異体を含む分子であって、前記分子はＩｇＧ野生型Ｆｃを含む分子と比べて、免疫グロブリン分解酵素に対して耐性があり、且つ前記分子は変異を有するヒトＩｇＧ Ｆｃ領域を含み、前記変異は位置Ｇ２３７（ＥＵナンバリング）での１つ又は複数の置換又は欠失であり、前記置換はＧ２３７Ａであることが好ましく、好ましくは、前記ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域が少なくとも、配列番号１９で示される配列を含む、分子。
【請求項2】
前記Ｆｃ分子は、プロテアーゼによる分解に対して耐性があり、前記プロテアーゼは、残基２３６と２３７（ＥＵナンバリング）の間でＩｇＧ野生型Ｆｃを含む分子を切断できる、請求項１に記載の分子。
【請求項3】
前記分子は、野生型ＩｇＧと比べて、ＩｄｅＳ、ＩｄｅＺ、ＩｄｅＥ、ＩｄｅＺ２、ＩｄｅＥ２、ＩｄｅＳＯＲＫ、Ｘｏｒｋ及びそれらの変異体からなる群から選ばれる酵素による分解に対して耐性がある、請求項１又は２に記載の分子。
【請求項4】
前記分子のＩｇＧは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４からなる群から選ばれる、請求項１～３のいずれか一項に記載の分子。
【請求項5】
前記分子のＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、ＣＤＣからなる群から選ばれるエフェクター機能がＩｇＧ野生型Ｆｃを含む分子と比べて促進又は増強されている、請求項１～４のいずれか一項に記載の分子。
【請求項6】
ヒトＩｇＧ野生型Ｆｃ領域配列における１つ又は複数の置換をさらに含み、前記置換は、Ｓ２３９Ｄ、Ｉ３３２Ｅ、Ｇ２３６Ａ、Ｓ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４Ａ、Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅ、Ｇ２３６Ａ／Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｇ２３６Ａ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅ、Ｇ２３６Ａ／Ｓ２３９Ｄ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅ、Ｆ２４３Ｌ／Ｒ２９２Ｐ／Ｙ３００Ｌ、Ｆ２４３Ｌ／Ｒ２９２Ｐ／Ｙ３００Ｌ／Ｖ３０５Ｉ／Ｐ３９６Ｌ、Ｌ２３５Ｖ／Ｆ２４３Ｌ／Ｒ２９２Ｐ／Ｙ３００Ｌ／Ｐ３９６Ｌ、Ｐ２４７Ｉ／Ａ３３９Ｑ、Ｋ３２６Ａ／Ｅ３３３Ａ、Ｋ３２６Ｗ／Ｅ３３３Ｓ、Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４Ａ、Ｈ２６８Ｆ／Ｓ３２４Ｔ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ｈ２６８Ｆ／Ｓ３２４Ｔ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２６７Ｅ／Ｈ２６８Ｆ／Ｓ３２４Ｔ／Ｉ３３２Ｅ、Ｋ３２６Ａ／Ｉ３３２Ｅ／Ｅ３３３Ａ、Ｓ２３９Ｄ／Ｋ３２６Ａ／Ｅ３３３Ａ、Ｓ２６７Ｅ／Ｉ３３２Ｅからなる群から選ばれ、好ましくは、前記置換は、Ｓ２３９Ｄ、Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅからなる群から選ばれる、請求項５に記載の分子。
【請求項7】
Ｎ－グリカン修飾をさらに含み、前記Ｎ－グリカン修飾においてフコースの含有量が５０％未満であり、好ましくは、１０％未満である、請求項１～６のいずれか一項に記載の分子。
【請求項8】
Ｎ－グリカン修飾をさらに含み、前記Ｎ－グリカン修飾において末端ガラクトース修飾の含有量が３０％より高く、好ましくは、５０％より高い、請求項１～７のいずれか一項に記載のＦｃ分子。
【請求項9】
前記分子が、抗体又はＦｃ融合タンパク質である、請求項１～８のいずれか一項に記載の分子。
【請求項10】
前記抗体が、ウイルス、細菌、腫瘍細胞、腫瘍間質、又は腫瘍血管系上の抗原に結合し、好ましくは、前記抗体が、ＣＯＶＩＤ－１９、ＣＤ３８、ＣＤ２０、ＦＲ５、ＢＣＭＡ、ＳＬＡＭ７、ＣＤ７３、ＧＰＲＣＤ５、ＣＤ３からなる群から選ばれる１つ又は２つの抗原に特異的に結合し、最も好ましくは、前記抗体がＣＤ３８に特異的に結合する、請求項９に記載の分子。
【請求項11】
前記抗体が、少なくとも１つの重鎖及び少なくとも１つの軽鎖を含み、前記重鎖は、配列番号１で示されるＨＣＤＲ１、配列番号２で示されるＨＣＤＲ２、配列番号３で示されるＨＣＤＲ３、又は、配列番号４で示されるＨＣＤＲ１、配列番号５で示されるＨＣＤＲ２、配列番号６で示されるＨＣＤＲ３を含み、前記軽鎖は、配列番号７で示されるＬＣＤＲ１、配列番号８で示されるＬＣＤＲ２、配列番号９で示されるＬＣＤＲ３、又は、配列番号１０で示されるＬＣＤＲ１、配列番号１１で示されるＬＣＤＲ２、配列番号１２で示されるＬＣＤＲ３を含む、請求項９又は１０に記載の分子。
【請求項12】
前記抗体が、少なくとも１つの重鎖及び少なくとも１つの軽鎖を含み、前記重鎖は配列番号１３のアミノ酸配列で示される重鎖可変領域を含み、且つ、前記軽鎖は配列番号１４のアミノ酸配列で示される軽鎖可変領域を含み、又は、前記重鎖は配列番号１５のアミノ酸配列で示される重鎖可変領域を含み、且つ、前記軽鎖は配列番号１６のアミノ酸配列で示される軽鎖可変領域を含む、請求項９～１１のいずれか一項に記載の分子。
【請求項13】
前記抗体のエピトープ結合断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ又は二硫化物によって接続されたＦｖ断片である、請求項９～１２のいずれか一項に記載の分子。
【請求項14】
前記分子のＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、ＣＤＣからなる群から選ばれるエフェクター機能が、ＩｇＧ１野生型Ｆｃを含む分子と比べて弱化及び／又は解消されている、請求項１～４のいずれか一項に記載の分子。
【請求項15】
ヒトＩｇＧ１野生型Ｆｃ配列における１つ又は複数の置換をさらに含み、前記置換は、Ｎ２９７Ａ、Ｎ２９７Ｑ、Ｎ２９７Ｇ、Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３５Ａ／Ｅ３１８Ａ、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３６Ｒ／Ｌ３２８Ｒ、Ｓ２９８Ｇ／Ｔ２９９Ａ、Ｌ２３４Ｆ／Ｌ２３５Ｅ／Ｐ３３１Ｓ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｐ３２９Ｇ、Ｌ２３４Ｆ／Ｌ２３５Ｅ／Ｄ２６５Ａからなる群から選ばれ、好ましくは、前記置換は、Ｎ２９７Ａ、Ｎ２９７Ｑ、Ｎ２９７Ｇ、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３４Ｆ／Ｌ２３５Ｅ／Ｐ３３１Ｓからなる群から選ばれる、請求項１４に記載のＦｃ分子。
【請求項16】
ＦｃＲｎに対する前記分子の親和性が、ＩｇＧ１野生型Ｆｃを含む分子と比べて上昇している、請求項１～１５のいずれか一項に記載の分子。
【請求項17】
ＩｇＧ１野生型Ｆｃの配列における１つ又は複数の置換をさらに含み、前記置換は、ＹＴＥＫＦ、ＹＴＥＫＦ＋Ｖ２６４Ａ、ＹＴＥＫＦ＋Ｖ２６４Ｅからなる群から選ばれる、請求項１６に記載の分子。
【請求項18】
（ｉ）細胞又は細胞に結合した標的分子に結合できる結合ドメインと、（ｉｉ）ヒトＩｇＧ１重鎖のＣＨ２及びＣＨ３定常ドメインのアミノ酸配列を有するＦｃドメインとを含み、ただし、ＥＵナンバリングシステムによって定義された残基Ｇ２３７に置換又は欠失が生じた、分離された結合ポリペプチド分子であって、前記結合分子は標的細胞上の標的分子に結合でき、且つ、前記分子は、測定可能なＣＤＣ活性、又は必要なフェクター細胞によって媒介される標的細胞傷害活性を生じ、好ましくは、Ｇ２３７での置換がＧ２３７Ａであることを特徴とする、結合ポリペプチド分子。
【請求項19】
請求項１～１７のいずれか一項に記載の分子又は請求項１８に記載の結合ポリペプチド分子と、細胞毒性薬剤とを含む、免疫複合体。
【請求項20】
請求項１～１７のいずれか一項に記載の分子又は請求項１８に記載の結合ポリペプチド分子をコードする、１種又は複数種の分離された核酸。
【請求項21】
請求項２０に記載の核酸を含む、発現ベクター。
【請求項22】
請求項２０に記載の核酸又は請求項２１に記載の発現ベクターを含む、宿主細胞。
【請求項23】
請求項１～１７のいずれか一項に記載の分子又は請求項１８に記載の結合ポリペプチド分子の方法製造であって、（ａ）前記分子又は前記結合ポリペプチド分子の発現に適する条件で請求項２２に記載の宿主細胞を培養するステップと、
（ｂ）任意に、ステップ（ａ）の培養物から前記分子又は前記結合ポリペプチド分子を回収するステップとを含む、方法。
【請求項24】
請求項２３に記載の方法により産生された、分子又は結合ポリペプチド分子。
【請求項25】
請求項１～１７のいずれか一項に記載の分子、請求項１８に記載の結合ポリペプチド分子又は請求項１９に記載の免疫複合体と、免疫グロブリン分解酵素とを含む医薬組成物であって、前記免疫グロブリン分解酵素は残基２３６と２３７（ＥＵナンバリング）の間でＩｇＧ分子を切断でき、前記免疫グロブリン分解酵素は、ＩｄｅＳ、ＩｄｅＺ、ＩｄｅＥ、ＩｄｅＳＯＲＫ、Ｘｏｒｋ及びそれらの酵素の変異体であることが好ましい、医薬組成物。
【請求項26】
請求項１～１７のいずれか一項に記載の分子、請求項１８に記載の結合ポリペプチド分子又は請求項１９に記載の免疫複合体と、医薬担体とを含む、医薬組成物。
【請求項27】
薬物としての、請求項１～１７のいずれか一項に記載の分子、請求項１８に記載の結合ポリペプチド分子、請求項１９に記載の免疫複合体又は請求項２５若しくは２６に記載の医薬組成物であって、好ましくは、前記薬物は疾患を治療するために用いられ、より好ましくは、前記疾患は、がん又は自己免疫疾患であり、最も好ましくは、前記がんは、多発性骨髄腫である、薬物。
【請求項28】
薬物の製造における、請求項１～１７のいずれか一項に記載の分子、請求項１８に記載の結合ポリペプチド分子、請求項１９に記載の免疫複合体又は請求項２５若しくは２６に記載の医薬組成物の用途であって、前記薬物は、疾患、特にがん又は自己免疫疾患を治療するために用いられる、用途。
【請求項29】
薬物の製造における、請求項１～１７のいずれか一項に記載の分子、請求項１８に記載の結合ポリペプチド分子、請求項１９に記載の免疫複合体又は請求項２５若しくは２６に記載の医薬組成物の用途であって、前記薬物は、ＣＤ３８陽性細胞に対するＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、アポトーシスによって媒介される枯渇を誘導するために用いられる、用途。
【請求項30】
がん又は自己免疫疾患を持っている個体の治療方法であって、前記個体に有効量の請求項１～１７のいずれか一項に記載の分子、請求項１８に記載の結合ポリペプチド分子、請求項１９に記載の免疫複合体又は請求項２５若しくは２６に記載の医薬組成物を投与することを含む、方法。
【請求項31】
個体においてＣＤ３８陽性細胞に対するＡＤＣＣ、ＡＤＣＰによって媒介される枯渇を誘導する方法であって、前記個体に有効量の請求項１～１７のいずれか一項に記載の分子、請求項１８に記載の結合ポリペプチド分子、請求項１９に記載の免疫複合体又は請求項２５若しくは２６に記載の医薬組成物を投与して、ＣＤ３８陽性細胞に対するＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、アポトーシスによって媒介される枯渇を誘導することを含む、方法。
【請求項32】
本明細書に記載の本発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、生物医学の分野に関し、具体的には、ヒトＩｇＧ Ｆｃ変異体及び前記変異体を含む分子に関する。
【背景技術】
【0002】
免疫グロブリンＧ（Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｇ、ＩｇＧ）は、血清の主要な抗体成分で、血清免疫グロブリンの約７５％を占めており、体内の免疫で主に保護的な役割を果たし、感染症を効果的に予防できる。保護的な役割を有するほかに、ＩｇＧは疾患にも関係している。関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、重症筋無力症、免疫性（あるいは自発性）血小板減少症などの疾患では、ＩｇＧ抗体が人体自身の分子と反応し、臓器移植ではＩｇＧが急性移植拒絶反応を引き起こす。多発性骨髄腫などの一部の疾患では、５０％の患者に血中ＩｇＧが非常に高く、治療用抗体の代謝と効果への影響が認められる。
【0003】
ＩｄｅＳ型免疫グロブリン分解酵素で血中ＩｇＧを分解して、人体自身のＩｇＧの治療用抗体に対するマイナスの影響を解消できることが研究で明らかになった。また、血中ＩｇＧレベルを低下させることにより、治療用抗体の半減期を延長できる（Ａｂｄａｌｌａｈ，Ｈ．Ｍ．＆Ａ．Ｚ．Ｘ．Ｚｈｕ．２０２０．Ｃｌｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｔｈｅｒ １０７（２）：４２３－４３４）。ＩｄｅＳは投与２時間後に、人体の血中ＩｇＧを完全に切断する効果が得られる（Ｗｉｎｓｔｅｄｔ，Ｌ． ｅｔ ａｌ．，２０１５．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ １０（７）：ｅ０１３２０１１）ため、ＩｇＧの干渉を効果的に解消する方法である。しかし、ＩｄｅＳなどの免疫グロブリン分解酵素を投与した後、少なくとも４日間以内は、他の治療用抗体を一切使用できない。そこで、ＩｄｅＳを使用して血中ＩｇＧの干渉を低下させると同時に、抗体を使用して治療できるよう、つまり、ＩｄｅＳと治療用抗体の同時投与を可能にするために、ＩｄｅＳによる切断に抵抗できる治療用抗体が必要になる。
【発明の概要】
【0004】
本発明の１つ又は複数の実施形態の詳細な内容は以下に示すとおりである。本発明の他の特徴、目的及び利点が明細書及び特許請求の範囲から明らかなものになるだろう。
【0005】
事項１．Ｆｃ変異体を含む分子であって、
前記分子はＩｇＧ野生型Ｆｃを含む分子と比べて、免疫グロブリン分解酵素に対して耐性があり、且つ前記分子は変異を有するヒトＩｇＧ Ｆｃ領域を含み、前記変異は位置Ｇ２３７（ＥＵナンバリング）での１つ又は複数の置換又は欠失であり、前記置換はＧ２３７Ａであることが好ましく、好ましくは、前記ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域が少なくとも、配列番号１９で示される配列を含む、分子。
前記分子はＩｇＧ野生型Ｆｃを含む分子と比べて、免疫グロブリン分解酵素に対して耐性があり、且つ前記分子は変異を有するヒトＩｇＧ Ｆｃ領域を含み、前記変異は位置Ｇ２３７（ＥＵナンバリング）での１つ又は複数の置換又は欠失であり、前記置換はＧ２３７Ａであることが好ましく、好ましくは、前記ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域が少なくとも、配列番号１９で示される配列を含む、分子。
【0006】
事項２．前記Ｆｃ分子は、プロテアーゼによる分解に対して耐性があり、前記プロテアーゼは、残基２３６と２３７（ＥＵナンバリング）の間でＩｇＧ野生型Ｆｃを含む分子を切断できる、事項１に記載の分子。
【0007】
事項３．前記分子は、野生型ＩｇＧと比べて、ＩｄｅＳ、ＩｄｅＺ、ＩｄｅＥ、ＩｄｅＺ２、ＩｄｅＥ２、ＩｄｅＳＯＲＫ、Ｘｏｒｋ及びそれらの変異体からなる群から選ばれる酵素による分解に対して耐性がある、事項１又は２に記載の分子。
【0008】
事項４．前記分子のＩｇＧは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４からなる群から選ばれる、事項１～３のいずれか一項に記載の分子。
【0009】
事項５．前記分子のＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、ＣＤＣからなる群から選ばれるエフェクター機能がＩｇＧ野生型Ｆｃを含む分子と比べて促進又は増強されている、事項１～４のいずれか一項に記載の分子。
【0010】
事項６．ヒトＩｇＧ野生型Ｆｃ領域配列における１つ又は複数の置換をさらに含み、前記置換は、Ｓ２３９Ｄ、Ｉ３３２Ｅ、Ｇ２３６Ａ、Ｓ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４Ａ、Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅ、Ｇ２３６Ａ／Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｇ２３６Ａ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅ、Ｇ２３６Ａ／Ｓ２３９Ｄ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅ、Ｆ２４３Ｌ／Ｒ２９２Ｐ／Ｙ３００Ｌ、Ｆ２４３Ｌ／Ｒ２９２Ｐ／Ｙ３００Ｌ／Ｖ３０５Ｉ／Ｐ３９６Ｌ、Ｌ２３５Ｖ／Ｆ２４３Ｌ／Ｒ２９２Ｐ／Ｙ３００Ｌ／Ｐ３９６Ｌ、Ｐ２４７Ｉ／Ａ３３９Ｑ、Ｋ３２６Ａ／Ｅ３３３Ａ、Ｋ３２６Ｗ／Ｅ３３３Ｓ、Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４Ａ、Ｈ２６８Ｆ／Ｓ３２４Ｔ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ｈ２６８Ｆ／Ｓ３２４Ｔ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２６７Ｅ／Ｈ２６８Ｆ／Ｓ３２４Ｔ／Ｉ３３２Ｅ、Ｋ３２６Ａ／Ｉ３３２Ｅ／Ｅ３３３Ａ、Ｓ２３９Ｄ／Ｋ３２６Ａ／Ｅ３３３Ａ、Ｓ２６７Ｅ／Ｉ３３２Ｅからなる群から選ばれ、好ましくは、前記置換は、Ｓ２３９Ｄ、Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅからなる群から選ばれる、事項５に記載の分子。
【0011】
事項７．Ｎ－グリカン修飾をさらに含み、前記Ｎ－グリカン修飾においてフコースの含有量が５０％未満であり、好ましくは、１０％未満である、事項１～６のいずれか一項に記載の分子。
【0012】
事項８．Ｎ－グリカン修飾をさらに含み、前記Ｎ－グリカン修飾において末端ガラクトース修飾の含有量が３０％より高く、好ましくは、５０％より高い、事項１～７のいずれか一項に記載のＦｃ分子。
【0013】
事項９．前記分子が、抗体又はＦｃ融合タンパク質である、事項１～８のいずれか一項に記載の分子。
【0014】
事項１０．前記抗体が、ウイルス、細菌、腫瘍細胞、腫瘍間質、又は腫瘍血管系上の抗原に結合し、好ましくは、前記抗体が、ＣＯＶＩＤ－１９、ＣＤ３８、ＣＤ２０、ＦＲ５、ＢＣＭＡ、ＳＬＡＭ７、ＣＤ７３、ＧＰＲＣＤ５、ＣＤ３からなる群から選ばれる１つ又は２つの抗原に特異的に結合し、最も好ましくは、前記抗体がＣＤ３８に特異的に結合する、事項９に記載の分子。
【0015】
事項１１．前記抗体が、少なくとも１つの重鎖及び少なくとも１つの軽鎖を含み、前記重鎖は、配列番号１で示されるＨＣＤＲ１、配列番号２で示されるＨＣＤＲ２、配列番号３で示されるＨＣＤＲ３、又は、配列番号４で示されるＨＣＤＲ１、配列番号５で示されるＨＣＤＲ２、配列番号６で示されるＨＣＤＲ３を含み、前記軽鎖は、配列番号７で示されるＬＣＤＲ１、配列番号８で示されるＬＣＤＲ２、配列番号９で示されるＬＣＤＲ３、又は、配列番号１０で示されるＬＣＤＲ１、配列番号１１で示されるＬＣＤＲ２、配列番号１２で示されるＬＣＤＲ３を含む、事項９又は１０に記載の分子。
【0016】
事項１２．前記抗体が、少なくとも１つの重鎖及び少なくとも１つの軽鎖を含み、前記重鎖は配列番号１３のアミノ酸配列で示される重鎖可変領域を含み、且つ、前記軽鎖は配列番号１４のアミノ酸配列で示される軽鎖可変領域を含み、又は、前記重鎖は配列番号１５のアミノ酸配列で示される重鎖可変領域を含み、且つ、前記軽鎖は配列番号１６のアミノ酸配列で示される軽鎖可変領域を含む、事項９～１１のいずれか一項に記載の分子。
【0017】
事項１３．前記抗体のエピトープ結合断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ又は二硫化物によって接続されたＦｖ断片である、事項９～１２のいずれか一項に記載の分子。
【0018】
事項１４．前記分子のＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、ＣＤＣからなる群から選ばれるエフェクター機能が、ＩｇＧ１野生型Ｆｃを含む分子と比べて弱化及び／又は解消されている、事項１～４のいずれか一項に記載の分子。
【0019】
事項１５．ヒトＩｇＧ１野生型Ｆｃ配列における１つ又は複数の置換をさらに含み、前記置換は、Ｎ２９７Ａ、Ｎ２９７Ｑ、Ｎ２９７Ｇ、Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３５Ａ／Ｅ３１８Ａ、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３６Ｒ／Ｌ３２８Ｒ、Ｓ２９８Ｇ／Ｔ２９９Ａ、Ｌ２３４Ｆ／Ｌ２３５Ｅ／Ｐ３３１Ｓ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｐ３２９Ｇ、Ｌ２３４Ｆ／Ｌ２３５Ｅ／Ｄ２６５Ａからなる群から選ばれ、好ましくは、前記置換は、Ｎ２９７Ａ、Ｎ２９７Ｑ、Ｎ２９７Ｇ、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３４Ｆ／Ｌ２３５Ｅ／Ｐ３３１Ｓからなる群から選ばれる、事項１４に記載のＦｃ分子。
【0020】
事項１６．ＦｃＲｎに対する前記分子の親和性が、ＩｇＧ１野生型Ｆｃを含む分子と比べて上昇している、事項１～１５のいずれか一項に記載の分子。
【0021】
事項１７．ＩｇＧ１野生型Ｆｃの配列における１つ又は複数の置換をさらに含み、前記置換は、ＹＴＥＫＦ、ＹＴＥＫＦ＋Ｖ２６４Ａ、ＹＴＥＫＦ＋Ｖ２６４Ｅからなる群から選ばれる、事項１６に記載の分子。
【0022】
事項１８．（ｉ）細胞又は細胞に結合した標的分子に結合できる結合ドメインと、（ｉｉ）ヒトＩｇＧ１重鎖のＣＨ２及びＣＨ３定常ドメインのアミノ酸配列を有するＦｃドメインとを含み、ただし、ＥＵナンバリングシステムによって定義された残基Ｇ２３７に置換又は欠失が生じた、分離された結合ポリペプチド分子であって、前記結合分子は標的細胞上の標的分子に結合でき、且つ、前記分子は、測定可能なＣＤＣ活性、又は必要なフェクター細胞によって媒介される標的細胞傷害活性を生じ、好ましくは、Ｇ２３７での置換がＧ２３７Ａであることを特徴とする、結合ポリペプチド分子。
【0023】
事項１９．事項１～１７のいずれか一項に記載の分子又は事項１８に記載の結合ポリペプチド分子をコードする、核酸。
【0024】
事項２０．事項１９に記載の核酸を含む、発現ベクター。
【0025】
事項２１．事項１９に記載の核酸又は事項２０に記載の発現ベクターを含む、宿主細胞。
【0026】
事項２２．事項１～１７のいずれか一項に記載の分子又は事項１８に記載の結合ポリペプチド分子の製造方法であって、
（ａ）事項２１に記載の宿主細胞を提供するステップと、
（ｂ）前記分子又は前記結合ポリペプチド分子の発現に適する条件で前記宿主細胞を培養するステップと、
（ｃ）任意に、ステップ（ｂ）の培養物から前記分子又は前記結合ポリペプチド分子を回収するステップとを含む、方法。
（ａ）事項２１に記載の宿主細胞を提供するステップと、
（ｂ）前記分子又は前記結合ポリペプチド分子の発現に適する条件で前記宿主細胞を培養するステップと、
（ｃ）任意に、ステップ（ｂ）の培養物から前記分子又は前記結合ポリペプチド分子を回収するステップとを含む、方法。
【図面の簡単な説明】
【0027】
【発明を実施するための形態】
【0028】
本発明の目的は、従来技術の欠点に対して、ＩｄｅＳ型免疫グロブリン分解酵素による切断に抵抗できるＦｃ変異体を提供することである。当該変異体を含むＩｇＧ、Ｆｃ融合タンパク質、Ｆｃ断片は、いずれもＩｄｅＳ型免疫グロブリン分解酵素による切断に抵抗でき、単一の点変異だけで酵素切断に対抗する効果が得られる。
【0029】
本発明の目的は、以下の技術的解決手段によって達成される。
１．定義
「Ｆｃ」「Ｆｃ含有タンパク質」とは、少なくとも１つの免疫グロブリンＣＨ２及びＣＨ３ドメインを有する単量体、二量体又はヘテロ二量体タンパク質を指す。ＣＨ２及びＣＨ３ドメインが、タンパク質（例えば、抗体）の二量体ドメインの少なくとも一部を形成できる。他のＩｇＧサブクラスの類似するドメインは、ＩｇＧサブクラスの重鎖又は重鎖断片のアミノ酸配列とヒトＩｇＧ１のアミノ酸配列との比較により決定でき、詳しくは、以下のウェブサイトの掲載を参照できる（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ／ＩＭＧＴＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＣｈａｒｔ／Ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ／Ｈｕ＿ＩＧＨＧｎｂｅｒ．ｈｔｍｌ）。本明細書で「ＥＵナンバリング」とは、ヒトＩｇＧ１抗体残基の番号を指す。本明細書でアミノ酸位置は全て「ＥＵナンバリング」を用いる。
１．定義
「Ｆｃ」「Ｆｃ含有タンパク質」とは、少なくとも１つの免疫グロブリンＣＨ２及びＣＨ３ドメインを有する単量体、二量体又はヘテロ二量体タンパク質を指す。ＣＨ２及びＣＨ３ドメインが、タンパク質（例えば、抗体）の二量体ドメインの少なくとも一部を形成できる。他のＩｇＧサブクラスの類似するドメインは、ＩｇＧサブクラスの重鎖又は重鎖断片のアミノ酸配列とヒトＩｇＧ１のアミノ酸配列との比較により決定でき、詳しくは、以下のウェブサイトの掲載を参照できる（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ／ＩＭＧＴＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＣｈａｒｔ／Ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ／Ｈｕ＿ＩＧＨＧｎｂｅｒ．ｈｔｍｌ）。本明細書で「ＥＵナンバリング」とは、ヒトＩｇＧ１抗体残基の番号を指す。本明細書でアミノ酸位置は全て「ＥＵナンバリング」を用いる。
【0030】
用語「野生型Ｆｃ」とは、野生型Ｆｃ領域における参照ポリペプチド又は検討されるもの以外の変異を任意に含有する変異体を指す。用語「野生型」又は「ＷＴ」は、本明細書では、自然界で見つかるアミノ酸配列又はヌクレオチド配列であって、天然由来のもの（対立遺伝子変異を含む）で、しかも分子生物学技術によって意図的に修飾、例えば変異誘発されていないものを指す（Ｖｉｄａｒｓｓｏｎ，Ｇ． ｅｔ ａｌ．（２０１４）．Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ ５：５２０）。例えば、「野生型Ｆｃ領域」とは、特に配列番号１７のＩｇＧ１ Ｆｃ領域（Ｇ１ｍ１、１７アロタイプ）、配列番号１８（Ｇ１ｍ３アロタイプ）のＩｇＧ１ Ｆｃ領域を有するものを指す。
【0031】
用語「半減期」とは、Ｆｃ断片が投与対象患者の血清に出現したから、循環又は他の組織から半分除去されるまでの期間を指す。
【0032】
用語「Ｆｃγ受容体」又は「ＦｃγＲ」とは、ＣＤ６４（ＦｃγＲＩ）、ＣＤ３２（ＦｃγＲＩＩ）、ＣＤ１６（ＦｃγＲＩＩＩ）と呼ばれるＩｇＧ型免疫グロブリン受容体を指し、特に、発現された５種の受容体（ＦｃγＲＩａ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩＩＩｂ）である。ヒトＦｃγＲＩＩｂ（免疫細胞の活性化を抑制する受容体）の外に、いずれもフェクター細胞活性化受容体である（Ｍｕｔａ Ｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，１９９４，３６８：７０－７３）。
【0033】
用語「フェクター細胞」とは、Ｆｃ受容体を備えるあらゆる細胞を指し、例えば、リンパ球、単球、好中球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好酸球、好塩基球、肥満細胞、樹状細胞、ランゲルハンス細胞、血小板である。
【0034】
用語「ＡＤＣＣ」とは、抗体依存性細胞傷害を指し、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）を発現するフェクター細胞が標的細胞上の結合抗体を認識し、続いて標的細胞の溶解を引き起こす抗体媒介性細胞免疫応答である。主にＡＤＣＣを媒介する細胞であるＮＫ細胞はＦｃγＲＩＩＩだけを発現するが、単球はＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩを発現できる。ＡＤＣＣの検出方法は、ＰＢＭＣを用いる方法、ＮＫ細胞を用いる方法、ＮＫ９２レポーター遺伝子を用いる方法、Ｊｕｒｋａｔレポーター遺伝子を用いる方法などである。ＡＤＣＣは、血中単球の存在下で測定される。ＡＤＣＣの検出方法は、ＰＢＭＣを用いる方法、ＮＫ細胞を用いる方法、ＮＫ９２レポーター遺伝子を用いる方法、Ｊｕｒｋａｔレポーター遺伝子を用いる方法などである。ＡＤＣＣは、血中単球の存在下で測定される。
【0035】
用語「ＡＤＣＰ」とは、抗体依存性細胞食作用を指し、ＩｇのＦｃエフェクタードメインに結合された細胞食作用性免疫細胞（例えば、マクロファージ、好中球、樹状細胞）によって、抗体によって包み込まれた細胞が（完全に又は部分的に）取り込まれていくプロセスである。ＡＤＣＰの検出方法は、ＰＢＭＣを用いる方法、ＮＫ９２レポーター遺伝子を用いる方法、Ｊｕｒｋａｔレポーター遺伝子を用いる方法などである。ＡＤＣＰは、ＣＤ１４ ｐｏｓ及び／又はＣＤ１１ｂ ｐｏｓ血中単球の存在下で測定されてもよい。
【0036】
用語「Ｃ１ｑ」とは、補体の古典的経路の活性化経路における最初のタンパク質を指し、補体タンパク質Ｃ１ｑが細胞表面又は細胞表面に結合した抗体に直接結合することにより活性化され、また、アポトーシス細胞の貪食の制御、内皮細胞の活性化、Ｔ細胞及びＢ細胞の制御などの作用も有する。
【0037】
用語「補体依存性細胞傷害」又はＣＤＣとは、標的が抗体のＦｃエフェクタードメインに結合して一連の酵素反応を活性化させて、標的細胞膜において細孔を形成させる細胞死誘導メカニズムを指す。一般的に、抗原－抗体複合体、例えば抗体によって包み込まれた標的細胞上の複合体が補体成分Ｃｌｑに結合してそれを活性化させた上で、補体カスケード反応を活性化させて標的細胞を死なせる。補体の活性化は、標的細胞の表面への補体成分の沈着をも引き起こし、白血球上の補体受容体（例えば、ＣＲ３）に結合することによりＡＤＣＣに役立つ。ＣＤＣの検出方法として、例えば、ヒト血液に由来する補体と標的細胞を共インキュベートして、標的細胞に対する殺傷を検出することである。
【0038】
用語「免疫グロブリン分解酵素」「ＩｄｅＳ型免疫グロブリン分解酵素」とは、免疫グロブリンを切断できる酵素を指す。本発明で免疫グロブリン分解酵素は、特に酵素切断部位がＩｇＧの位置Ｇ２３６とＧ２３７（ＥＵナンバリング）の間であるＩｇＧ特異的分解プロテアーゼを指し、現在知られているのは、ストレプトコッカス・ズーエピデミカスに由来するＩｄｅＺ、ＩｄｅＺ２、ＩｄｅＥ、ＩｄｅＥ２（Ｌａｎｎｅｒｇａｒｄ，Ｊ．＆Ｂ．Ｇｕｓｓ．２００６．ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ ２６２（２）：２３０－２３５、Ｈｕｌｔｉｎｇ，Ｇ． ｅｔ ａｌ．（２００９）．ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ ２９８（１）：４４－５０）、化膿レンサ球菌に由来するＩｄｅＳ（Ｗｅｎｉｇ，Ｋ． ｅｔ ａｌ．（２００４）．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０１（５０）：１７３７１－１７３７６）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｋｒｏｓｕｓに由来するＩｄｅＳＯＲＫなどである。それらが免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）１～４を特異的に切断する。他の免疫グロブリンクラス、例えば、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭを切断しない。それらの免疫グロブリン分解酵素はＣＨ２ドメインのＧ２３６とＧ２３７の間で切断し、ヒトＩｇＧをＦ（ａｂ’）２断片及びＦｃ断片に切断する。それらの既知の酵素の変異体も、ＣＮ１０７５３２１５８Ａ、ＣＮ１０７５３２１５６Ａ、ＷＯ２０２２２２３８１８Ａ１、ＷＯ２０２１２５４４７９Ａ１、ＣＮ１１５４４３２８８Ａに記載のように、同じ作用を発揮できる。
【0039】
用語「Ｎ－グリカン」「Ｎ－結合型グリカン」「糖タンパク質」「グリコシル化」及び「グリコフォーム」とは、Ｎ－結合型オリゴ糖、例えば、アスパラギン－Ｎ－アセチルグルコサミン結合によってポリペプチドのアスパラギン残基に結合されているオリゴ糖を指す。糖タンパク質に見出される主要な糖は、グルコース、ガラクトース、マンノース、フコース、Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、Ｎ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）及びシアル酸（ＮＡＮＡ、ＮＧＮＡを含むＳＡ、並びにアセチル化ＮＡＮＡ又はアセチル化ＮＧＮＡを含むその誘導体及び類似体）である。糖鎖工学的に操作されたピキア・パストリスにおいてシアル酸は、もっぱらＮ－アセチルノイラミン酸（ＮＡＮＡ）である（Ｈａｍｉｌｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１３（５７９２），１４４１－１４４３，２００６）。Ｎ－グリカンは共通のコア５糖Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２を有し、ここで「Ｍａｎ」とはマンノースを指し、「Ｇｌｃ」とはグルコースを指し、「ＮＡｃ」とはＮ－アセチルを指し、ＧｌｃＮＡｃとはＮ－アセチルグルコサミンを指す。Ｎグリカンは、「トリマンノシルコア」「コア５糖」又は「オリゴマンノースコア」とも呼ばれるコア構造Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２（「Ｍａｎ３」）に付加される周辺糖（例えば、ＧｌｃＮＡｃ、ガラクトース、フコース、シアル酸）の含む分岐（アンテナ）の本数に関して異なる。Ｎ－グリカンはその分岐成分によって分類される（例えば、高マンノース型、複合型又は混成型）。１つのＮ－グリカン末端は、最大４つのシアル酸をつけて修飾される。
【0040】
用語「Ｇ０」とは、ガラクトースもフコースも有しない複合二分岐オリゴ糖（ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２）を指し、「Ｇ１」とは、フコースを有せず１つのガラクトシル残基を含む複合二分岐オリゴ糖（ＧａｌＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２）を指し、「Ｇ２」とは、フコースを有せず２つのガラクトシル残基を含む複合二分岐オリゴ糖（Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２）を指し、「Ｇ０Ｆ」とは、１つのコアフコースを含みガラクトースを有しない複合二分岐オリゴ糖（ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２Ｆ）を指し、「Ｇ１Ｆ」とは、１つのコアフコース及び１つのガラクトシル残基を含む複合二分岐オリゴ糖（ＧａｌＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２Ｆ）を指し、「Ｇ２Ｆ」とは、１つのコアフコース及び２つのガラクトシル残基を含む複合二分岐オリゴ糖（Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２Ｆ）を指す。
【0041】
用語「混成型」Ｎ－グリカンとは、トリマンノシルコアの１，３マンノースアームの末端に少なくとも１つのＧｌｃＮＡｃを有し、且つトリマンノシルコアの１，６マンノースアームにゼロ又は２つ以上のマンノースを有するＮ－グリカンを指す。
【0042】
ＩｇＧは、血液中の主要な血清免疫グロブリンで、健常者の血中ＩｇＧレベルが約１０ｇ／Ｌである。それは２つの同じ重鎖及び２つの軽鎖からなる糖タンパク質であり、重鎖及び軽鎖が可変領域及び定常領域からなる。ＩｇＧは、その２つの重鎖の各Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインの位置Ａｓｎ２９７に単一のＮ－結合型グリカンを含有している。当該共有結合された複合炭水化物は、Ｎ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）及びマンノース（Ｍａｎｎｏｓｅ）を含有している１コア二分岐のペンタ多糖（ｐｅｎｔａ－ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）からなる。Ｆｃのグリコシル化修飾が抗体機能の発揮に関与する。フコースをノックアウトすると抗体のＩｇＧ修飾を大幅に高めることができる。末端のガラクトース修飾がＣＤＣ機能を向上させることができる。
【0043】
用語「免疫複合体」とは、１種又は複数種の治療剤を本発明に記載の変異体に複合させて得た分子を指し、前記治療剤は、例えば、細胞毒性薬剤、化学療法剤、薬物、成長抑制剤、毒素（例えば、タンパク質毒素、細菌、真菌、植物若しくは動物に由来し酵素活性を有する毒素若しくはその断片）又は放射性同位体である。
【0044】
用語「酵素切断に対抗する」、プロテアーゼに対して「耐性」があるとは、免疫グロブリンＩｇＧ、又はＦｃを備える免疫グロブリン抗体断片構造が、上記の免疫グロブリン分解酵素によって切断されない特性を有することを指す。
【0045】
用語「ベクター」又は「発現ベクター」は、本明細書で用いる場合、所望の遺伝子を細胞に導入し、細胞の中で当該所望の遺伝子を発現させるための媒体（ｖｅｈｉｃｌｅ）として使用するベクターを意味する。そのようなベクターは、プラスミド、ファージ、ウイルス、レトロウイルスから選ばれてもよいということが当業者に知られている。一般的には、本発明に好適なベクターは、選択マーカー、所望の遺伝子のクローニングに役立つ適切な制限部位、真核生物又は原核生物細胞に入り及び／又はその中で複製する能力を含む。
【0046】
本明細書で使用される用語「形質転換」は、ＤＮＡをレシピエントの宿主細胞に導入することによって、遺伝子型を改変してレシピエントの細胞の改変を引き起こすと、広い意味で使用される。
【0047】
同様に、「宿主細胞」とは、形質転換によりベクターが導入されている細胞を指し、前記ベクターは組換えＤＮＡ技術により構築され且つ少なくとも１種の異種遺伝子をコードする。他に明確な説明がない限り、組換え宿主からポリペプチドを分離するための方法を記述する場合、用語「細胞」と「細胞培養物」は、Ｆｃ変異体の由来を指して入れ替えて使用される。言い換えれば、「細胞」からＦｃ変異体を回収することは、ペレット化された細胞全体から、又は培地と浮遊細胞を同時に含有している細胞培養物から回収することを意味してもよい。
【0048】
２．酵素切断に対抗する変異
本発明のＧ２３７変異（ＥＵナンバリング）を含むＦｃ変異体は、上記の免疫グロブリン分解酵素と共存しても、酵素切断により分解されない。免疫グロブリン分解酵素による切断は、少なくともＣＨ２ドメインを含むものに対する構造特異的な酵素切断である（Ｗｅｎｉｇ，Ｋ． ｅｔ ａｌ．，２００４．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０１（５０）：１７３７１－１７３７６）。ただし、ＣＨ２ドメインは、少なくともＬ２３５から始まる配列、例えば配列番号１９を含む（Ｎｏｖａｒｒａ，Ｓ． ｅｔ ａｌ．，２０１６．ＭＡｂｓ ８（６）：１１１８－１１２５）。したがって、本発明のＦｃ変異体は、少なくともＧ２３７変異を有するＣＨ２ドメインを含む。Ｇ２３７変異は当該部位での１つ又は複数の置換又は欠失であってもよく、前記置換は、Ｇ２３７Ａであることが好ましい。
本発明のＧ２３７変異（ＥＵナンバリング）を含むＦｃ変異体は、上記の免疫グロブリン分解酵素と共存しても、酵素切断により分解されない。免疫グロブリン分解酵素による切断は、少なくともＣＨ２ドメインを含むものに対する構造特異的な酵素切断である（Ｗｅｎｉｇ，Ｋ． ｅｔ ａｌ．，２００４．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０１（５０）：１７３７１－１７３７６）。ただし、ＣＨ２ドメインは、少なくともＬ２３５から始まる配列、例えば配列番号１９を含む（Ｎｏｖａｒｒａ，Ｓ． ｅｔ ａｌ．，２０１６．ＭＡｂｓ ８（６）：１１１８－１１２５）。したがって、本発明のＦｃ変異体は、少なくともＧ２３７変異を有するＣＨ２ドメインを含む。Ｇ２３７変異は当該部位での１つ又は複数の置換又は欠失であってもよく、前記置換は、Ｇ２３７Ａであることが好ましい。
【0049】
本発明は、Ｇ２３７一点の変異だけで、免疫グロブリン分解酵素による切断に対抗する効果を実現できることを最初に見出した。当該効果を得られること関する報告がＣＮ１０３２６０６４０Ｂに記載の複雑な組み合わせ変異しかなく、抗体ＩｇＧ１ ＣＨ２ドメインのＥ２３３－Ｌ２３４－Ｌ２３５－Ｇ２３６でＩｇＧ２のＰ２３３－Ｖ２３４－Ａ２３５を置換し、さらにＳ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ又はＧ２３７Ａ／Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅと組み合わせることである。
【0050】
ＩｇＧ１以外の他のＩｇＧアイソタイプ、例えば、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４などは、いずれも免疫グロブリン分解酵素が分解できる（Ｗｅｎｉｇ，Ｋ． ｅｔ ａｌ．，２００４．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０１（５０）：１７３７１－１７３７６）。本明細書に記載のいくつかの実施例では、本発明のＦｃ断片で異なるＩｇＧサブタイプに由来するＦｃ断片、例えば、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４を使用してもよい。異なるアロタイプＩｇＧ２～４の野生型Ｆｃ配列（Ｖｉｄａｒｓｓｏｎ，Ｇ．， ｅｔ ａｌ．（２０１４）．Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ ５：５２０）は、位置Ｇ２３７で置換又は欠失が生じた後、いずれも酵素切断に対抗できる。
【0051】
本明細書に記載のいくつかの実施例では、抗体の定常領域に対してアミノ酸を置換してもよい。例えば、本発明のＦｃ断片において異なるＩｇＧ１アロタイプ、熟知されるＧ１ｍ１７アロタイプ、Ｇ１ｍ３アロタイプ若しくはＧ１ｍ１アロタイプ、又はそれらの組み合わせが使用されてもよいし、又は異なるＩｇＧ２～４アロタイプ（Ｖｉｄａｒｓｓｏｎ，Ｇ． ｅｔ ａｌ．（２０１４）．Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ ５：５２０）若しくはそれらの組み合わせが使用されてもよい。
【0052】
３．エフェクター機能の促進又は増強
ＡＤＣＣなどは抗体が機能を発揮するための重要な作用の１つである。Ｇ２３７変異がそのようなエフェクター機能の弱化又は喪失を引き起こす恐れがある（Ｈｅｚａｒｅｈ，Ｍ． ｅｔ ａｌ．，２００１．Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７５（２４）：１２１６１－１２１６８．）。本明細書に記載のいくつかの実施例では、分子のＦｃ領域に対してアミノ酸の置換及び／又はグリコシル化修飾である改変を行って、Ｇ２３７変異によるエフェクター機能の弱化を向上させることができる。前記分子のＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、ＣＤＣからなる群から選ばれるエフェクター機能が、ＩｇＧ１野生型Ｆｃを含む分子と比べて促進又は増強されている。
ＡＤＣＣなどは抗体が機能を発揮するための重要な作用の１つである。Ｇ２３７変異がそのようなエフェクター機能の弱化又は喪失を引き起こす恐れがある（Ｈｅｚａｒｅｈ，Ｍ． ｅｔ ａｌ．，２００１．Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７５（２４）：１２１６１－１２１６８．）。本明細書に記載のいくつかの実施例では、分子のＦｃ領域に対してアミノ酸の置換及び／又はグリコシル化修飾である改変を行って、Ｇ２３７変異によるエフェクター機能の弱化を向上させることができる。前記分子のＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、ＣＤＣからなる群から選ばれるエフェクター機能が、ＩｇＧ１野生型Ｆｃを含む分子と比べて促進又は増強されている。
【0053】
いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域に対するアミノ酸の置換は、野生型ヒトＩｇＧ１配列における１つ又は複数の置換を含み、前記置換は、Ｓ２３９Ｄ、Ｉ３３２Ｅ、Ｇ２３６Ａ、Ｓ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４Ａ、Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅ、Ｇ２３６Ａ／Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｇ２３６Ａ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅ、Ｇ２３６Ａ／Ｓ２３９Ｄ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅ、Ｆ２４３Ｌ／Ｒ２９２Ｐ／Ｙ３００Ｌ、Ｆ２４３Ｌ／Ｒ２９２Ｐ／Ｙ３００Ｌ／Ｖ３０５Ｉ／Ｐ３９６Ｌ、Ｌ２３５Ｖ／Ｆ２４３Ｌ／Ｒ２９２Ｐ／Ｙ３００Ｌ／Ｐ３９６Ｌ、Ｐ２４７Ｉ／Ａ３３９Ｑ、Ｋ３２６Ａ／Ｅ３３３Ａ、Ｋ３２６Ｗ／Ｅ３３３Ｓ、Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４Ａ、Ｈ２６８Ｆ／Ｓ３２４Ｔ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ｈ２６８Ｆ／Ｓ３２４Ｔ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２６７Ｅ／Ｈ２６８Ｆ／Ｓ３２４Ｔ／Ｉ３３２Ｅ、Ｋ３２６Ａ／Ｉ３３２Ｅ／Ｅ３３３Ａ、Ｓ２３９Ｄ／Ｋ３２６Ａ／Ｅ３３３Ａ、Ｓ２６７Ｅ／Ｉ３３２Ｅからなる群から選ばれ、好ましくは、前記置換はＩ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅである。
【0054】
いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域のグリコシル化修飾の特徴は、Ｎ－グリカン修飾を含み、且つ低下しているフコース修飾を有することであり、前記Ｎ－グリカン修飾においてフコースの含有量が５０％未満であり、好ましくは、１０％未満である。低下しているフコース修飾が抗体のＡＤＣＣ活性を向上できる。
【0055】
いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域のグリコシル化修飾の特徴は、Ｎ－グリカン修飾を含み、且つ増加している末端ガラクトース修飾を有することであり、前記Ｎ－グリカン修飾において末端ガラクトース修飾の含有量が３０％より高く、好ましくは、５０％より高い。増加している末端ガラクトース修飾が抗体のＣＤＣ活性を向上できる。
【0056】
４．エフェクター機能の弱化又は解消
いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域に対してアミノ酸を置換することにより、前記分子のＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、ＣＤＣからなる群から選ばれるエフェクター機能が、ＩｇＧ１野生型Ｆｃを含む分子と比べて弱化及び／又は解消されている。前記置換は、Ｎ２９７Ａ、Ｎ２９７Ｑ、Ｎ２９７Ｇ、Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３５Ａ／Ｅ３１８Ａ、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３６Ｒ／Ｌ３２８Ｒ、Ｓ２９８Ｇ／Ｔ２９９Ａ、Ｌ２３４Ｆ／Ｌ２３５Ｅ／Ｐ３３１Ｓ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｐ３２９Ｇ、Ｌ２３４Ｆ／Ｌ２３５Ｅ／Ｄ２６５Ａからなる群から選ばれ、好ましくは、前記置換はＮ２９７Ａ、Ｎ２９７Ｑ、Ｎ２９７Ｇ、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３４Ｆ／Ｌ２３５Ｅ／Ｐ３３１Ｓから選ばれる。
いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域に対してアミノ酸を置換することにより、前記分子のＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、ＣＤＣからなる群から選ばれるエフェクター機能が、ＩｇＧ１野生型Ｆｃを含む分子と比べて弱化及び／又は解消されている。前記置換は、Ｎ２９７Ａ、Ｎ２９７Ｑ、Ｎ２９７Ｇ、Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３５Ａ／Ｅ３１８Ａ、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３６Ｒ／Ｌ３２８Ｒ、Ｓ２９８Ｇ／Ｔ２９９Ａ、Ｌ２３４Ｆ／Ｌ２３５Ｅ／Ｐ３３１Ｓ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｐ３２９Ｇ、Ｌ２３４Ｆ／Ｌ２３５Ｅ／Ｄ２６５Ａからなる群から選ばれ、好ましくは、前記置換はＮ２９７Ａ、Ｎ２９７Ｑ、Ｎ２９７Ｇ、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３４Ｆ／Ｌ２３５Ｅ／Ｐ３３１Ｓから選ばれる。
【0057】
５．ＦｃＲｎとの結合向上
ＦｃＲｎに対するＦｃの親和性は、人体における抗体の代謝を制御する。いくつかの実施形態では、前記Ｆｃ変異体はＦｃＲｎに対するＦｃの親和性を向上できる変異を含み、ＦｃＲｎに対する前記分子の親和性が、ＩｇＧ１野生型Ｆｃを含む分子と比べて上昇している。前記変異は、Ｎ４３４Ａ、Ｎ４３４Ｗ、Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ、Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ、Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ／Ｈ４３３Ｋ／Ｎ４３４Ｆ、Ｔ２５０Ｑ／Ｍ４２８Ｌ、Ｔ３０７Ｑ／Ｎ４３４Ａ、Ｍ２５２Ｙ／Ｖ３０８Ｐ／Ｎ４３４Ｙ、Ｔ３０７Ｐ／Ｌ３０９Ｑ／Ｑ３１１Ｒ、Ｈ２８５Ｄ／Ｔ３０７Ｑ／Ａ３７８Ｖ、Ｌ３０９Ｄ／Ｑ３１１Ｈ／Ｎ４３４Ｓ、Ｍ２５２Ｙ／Ｔ２５６Ｄ、Ｔ２５６Ｄ／Ｔ３０７Ｑ、Ｔ２５６Ｄ／Ｔ３０７Ｗであることが好ましい。
ＦｃＲｎに対するＦｃの親和性は、人体における抗体の代謝を制御する。いくつかの実施形態では、前記Ｆｃ変異体はＦｃＲｎに対するＦｃの親和性を向上できる変異を含み、ＦｃＲｎに対する前記分子の親和性が、ＩｇＧ１野生型Ｆｃを含む分子と比べて上昇している。前記変異は、Ｎ４３４Ａ、Ｎ４３４Ｗ、Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ、Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ、Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ／Ｈ４３３Ｋ／Ｎ４３４Ｆ、Ｔ２５０Ｑ／Ｍ４２８Ｌ、Ｔ３０７Ｑ／Ｎ４３４Ａ、Ｍ２５２Ｙ／Ｖ３０８Ｐ／Ｎ４３４Ｙ、Ｔ３０７Ｐ／Ｌ３０９Ｑ／Ｑ３１１Ｒ、Ｈ２８５Ｄ／Ｔ３０７Ｑ／Ａ３７８Ｖ、Ｌ３０９Ｄ／Ｑ３１１Ｈ／Ｎ４３４Ｓ、Ｍ２５２Ｙ／Ｔ２５６Ｄ、Ｔ２５６Ｄ／Ｔ３０７Ｑ、Ｔ２５６Ｄ／Ｔ３０７Ｗであることが好ましい。
【0058】
本発明で利用可能なＦｃ変異体が他にもあり、前記変異体は、Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａらによって記述された変異（ＷＦ，Ｄ．Ａ． ｅｔ ａｌ．，２００２．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．１６９（９）：５１７１－５１８０）、Ｓｈａｎらによって記述された変異（Ｓｈａｎ，Ｌ． ｅｔ ａｌ．，２０１６．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ １１（８）：ｅ０１６０３４５）、Ｌｅｅらによって記述された変異（Ｌｅｅ，Ｃ．Ｈ． ｅｔ ａｌ．，２０１９．Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ １０（１）：５０３１）、Ｍａｃｋｎｅｓｓらによって記述された変異（Ｍａｃｋｎｅｓｓ，Ｂ．Ｃ． ｅｔ ａｌ．，２０１９．ＭＡｂｓ １１（７）：１２７６－１２８８）、Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅらによって記述された変異
などであり、ただしそれらに限定されない。
【0059】
いくつかの実施形態では、Ｆｃ分子は、野生型ヒトＩｇＧ１配列における１つ又は複数の置換をさらに含み、前記置換は、ＹＴＥＫＦ、ＹＴＥＫＦ＋Ｖ２６４Ａ、ＹＴＥＫＦ＋Ｖ２６４Ｅからなる群から選ばれる。
【0060】
いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域のグリコシル化修飾の特徴は、Ｎ－グリカン修飾を含み、且つ増加している末端シアル酸修飾を有することであり、前記シアル酸の含有量が２０％より高く、好ましくは３０％より高い。Ｆｃ領域のいくつかのアミノ酸置換はシアル酸修飾のレベルを上昇させることができ、前記アミノ酸置換は、Ｆ２４１Ａ、Ｆ２４３Ａ、Ｖ２６２Ｅ、Ｖ２６４Ａ、Ｖ２６４Ｅ、Ｅ２９３ＤＥＬ、Ｅ２９４ＤＥＬ、Ｙ３００Ａであることが好ましい。
【0061】
６．抗原結合ドメイン
本発明の分子は、免疫グロブリン分解酵素に対して耐性があり、当該分解酵素は、少なくともＣＨ２ドメインを含むものに対する構造特異的な酵素切断である（Ｗｅｎｉｇ，Ｋ． ｅｔ ａｌ．，２００４．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０１（５０）：１７３７１－１７３７６）。ただし、ＣＨ２ドメインは、少なくともＬ２３５から始まる配列、例えば配列番号１９を含む（Ｎｏｖａｒｒａ，Ｓ． ｅｔ ａｌ．，２０１６．ＭＡｂｓ ８（６）：１１１８－１１２５）。したがって、本発明は、ヒトＦｃ ＣＨ２ドメインを含むあらゆる抗体又は融合タンパク質を含む。抗体は、改変しているエフェクター機能、例えば、向上しているＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ及び／又はＣＤＣをさらに有してもよい。いくつかの実施形態では、低下しているエフェクター機能であってもよい。
本発明の分子は、免疫グロブリン分解酵素に対して耐性があり、当該分解酵素は、少なくともＣＨ２ドメインを含むものに対する構造特異的な酵素切断である（Ｗｅｎｉｇ，Ｋ． ｅｔ ａｌ．，２００４．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０１（５０）：１７３７１－１７３７６）。ただし、ＣＨ２ドメインは、少なくともＬ２３５から始まる配列、例えば配列番号１９を含む（Ｎｏｖａｒｒａ，Ｓ． ｅｔ ａｌ．，２０１６．ＭＡｂｓ ８（６）：１１１８－１１２５）。したがって、本発明は、ヒトＦｃ ＣＨ２ドメインを含むあらゆる抗体又は融合タンパク質を含む。抗体は、改変しているエフェクター機能、例えば、向上しているＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ及び／又はＣＤＣをさらに有してもよい。いくつかの実施形態では、低下しているエフェクター機能であってもよい。
【0062】
抗体結合ドメインは、当業者に知られる方法で産生してもよい。抗体結合ドメインの構造は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、ＶＨＨ、重鎖可変領域、軽鎖可変領域、ＣＤＲなどであり、ただしそれらに限定されない。
【0063】
本発明の分子は標的化部分を含む。標的化部分は、腫瘍細胞表面抗原、酵素、ホルモン、受容体、サイトカイン、免疫細胞表面抗原、接着分子などから選ばれる。標的化部分は、非タンパク質性のもの、例えば、炭水化物、脂質、リポ多糖、有機分子、金属又は金属錯体をさらに有してもよい。一般的に、標的化分子が存在する場合、リンカーによってＦｃに結合され、前記リンカーは、ポリペプチドであってもよいし又はポリペプチドでなくてもよい。
【0064】
本発明の分子は標的化部分を含み、標的化部分がウイルス、細菌、腫瘍細胞、腫瘍間質、又は腫瘍血管系上の抗原に結合し、好ましくは、前記標的化部分が、ＣＯＶＩＤ－１９、ＣＤ３８、ＣＤ２０、ＦＲ５、ＢＣＭＡ、ＳＬＡＭ７、ＣＤ７３、ＧＰＲＣＤ５、ＣＤ３からなる群から選ばれる１つ又は２つの抗原に特異的に結合し、最も好ましくは、前記抗体がＣＤ３８に特異的に結合する。
【0065】
一実施形態では、本発明の標的化部分は少なくとも１つの重鎖及び少なくとも１つの軽鎖を含み、前記重鎖は配列番号１、配列番号２及び配列番号３のアミノ酸配列で示される３つの相補性決定領域を含み、前記軽鎖は配列番号７、配列番号８及び配列番号９のアミノ酸配列で示される３つの相補性決定領域を含む。
【0066】
一実施形態では、前記重鎖は配列番号１３で示される可変領域を含み、前記軽鎖は配列番号１５で示される可変領域を含む。好ましくは、配列番号２８で示される軽鎖、配列番号２９、３０で示される重鎖を含む。
【0067】
一実施形態では、本発明の標的化部分は少なくとも１つの重鎖及び少なくとも１つの軽鎖を含み、前記重鎖は配列番号４、配列番号５及び配列番号６のアミノ酸配列で示される３つの相補性決定領域を含み、前記軽鎖は配列番号１０、配列番号１１及び配列番号１２のアミノ酸配列で示される３つの相補性決定領域を含む。
【0068】
一実施形態では、前記重鎖は配列番号１４で示される可変領域を含み、前記軽鎖は配列番号１６で示される可変領域を含む。好ましくは、配列番号２７で示される軽鎖、配列番号２３、配列番号２５で示される重鎖を含む。
【0069】
７．製造方法
一実施形態では、本発明は、本発明のＦｃ変異体をコードする分離された核酸、前記核酸を含むベクター、並びに前記核酸及び／又はベクターを含む宿主細胞を提供する。一般的に、宿主細胞に導入するために、本明細書に開示されているＦｃ変異体をコードするポリヌクレオチドを発現ベクターに挿入し、前記宿主細胞は、所望の量の保護しようとするＦｃ変異体、即ち、本発明のＦｃ変異体を産生するために用いられてもよい。したがって、いくつかの態様では、本発明は、本明細書に開示されているポリヌクレオチドを含む発現ベクター、並びにそれらの発現ベクター及びポリヌクレオチドを含む宿主細胞を提供する。
一実施形態では、本発明は、本発明のＦｃ変異体をコードする分離された核酸、前記核酸を含むベクター、並びに前記核酸及び／又はベクターを含む宿主細胞を提供する。一般的に、宿主細胞に導入するために、本明細書に開示されているＦｃ変異体をコードするポリヌクレオチドを発現ベクターに挿入し、前記宿主細胞は、所望の量の保護しようとするＦｃ変異体、即ち、本発明のＦｃ変異体を産生するために用いられてもよい。したがって、いくつかの態様では、本発明は、本明細書に開示されているポリヌクレオチドを含む発現ベクター、並びにそれらの発現ベクター及びポリヌクレオチドを含む宿主細胞を提供する。
【0070】
本発明は、また、Ｇ２３６Ａ抗体の製造方法を提供する。方法は、上記のポリペプチド配列をコードする分離された核酸、核酸を含む発現ベクター、及び、核酸を含む宿主細胞を提供する。本発明のポリペプチドの生産方法も特徴的である。方法は、核酸によってコードされるポリペプチドの発現が可能な条件で、培地において宿主細胞を培養し、培養された細胞又は細胞の培地からポリペプチドを精製することを含む。
【0071】
様々な発現ベクター系が本発明の目的で利用可能である。例えば、１種のベクターは動物ウイルスに由来するＤＮＡ要素を利用し、前記動物ウイルスは、例えば、ウシパピローマウイルス、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルス、レトロウイルス（ＲＳＶ、ＭＭＴＶ若しくはＭＯＭＬＶ）又はＳＶ４０ウイルスである。またいくつかは、内部リボソーム結合部位を有するポリシストロン性系の使用に関わる。また、染色体にＤＮＡが組み込まれた細胞は、トランスフェクトされた宿主細胞の選択を可能にする１種又は複数種のマーカーを導入することによって選択されてもよい。前記マーカーは栄養要求性宿主に原栄養性を持たせ、殺生物剤（例えば、抗生物質）耐性又は重金属（例えば、銅）に対する耐性を持たせることができる。選択マーカー遺伝子と発現しようとするＤＮＡ配列を直接接続させてもよいし、又は共形質転換によりそれを１つの細胞に導入してもよい。ｍＲＮＡの最適な合成には他の要素が必要な場合もある。それらの要素として、シグナル配列、スプライシングシグナル、転写プロモーター、エンハンサー、終結シグナルが挙げられる。
【0072】
より一般的に、Ｆｃ変異体をコードするベクター又はＤＮＡ配列が作製されたら、発現ベクターを適切な宿主細胞に導入してよい。つまり、宿主細胞の形質転換が可能になる。宿主細胞へのプラスミドの導入は当業者に周知される様々な技術で行ってもよい。それらの技術は、トランスフェクション（電気泳動、電気穿孔を含む）、プロトプラスト融合、リン酸カルシウム共沈殿、エンベロープのあるＤＮＡある細胞との融合、マイクロインジェクション、完全なウイルスによる感染などであり、ただしそれらに限定されない。より好ましくは、電気穿孔によりプラスミドを宿主に導入する。形質転換を経た細胞をＦｃ変異体の産生に適する条件で培養し、Ｆｃ変異体の発現を測定する。例示的な測定技術は、酵素結合免疫吸着測定（ＥＬＩＳＡ）、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）又は蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）、免疫組織化学などである。
【0073】
一実施形態では、本発明は、本発明のＦｃ変異体の製造方法を提供し、前記方法は、野生型ＩｇＧ１の野生型Ｆｃ断片を変異させて対応するＦｃ変異体を得ることを含み、前記野生型Ｆｃ断片の配列は配列番号１７又は１８で示されるとおりである。
【0074】
一実施形態では、前記変異は、Ｇ２３７Ａ、Ｇ２３７Ａ／Ｉ３３２Ｅ、Ｇ２３７Ａ／Ｉ３３２Ｅ／Ｓ２３９Ｄ、Ｇ２３７Ａ／Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ、Ｇ２３７Ａ／Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ、Ｇ２３７Ａ／Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ／Ｈ４３３Ｋ／Ｎ４３４Ｆからなる群から選ばれる。
【0075】
一実施形態では、Ｆｃ変異体は、以下の手順により得る。
（ｉ）本発明のＦｃ変異体をコードする核酸を宿主細胞に導入する。
（ｉｉ）本発明のＦｃ変異体の発現が可能な条件で培地において宿主細胞を培養する。
（ｉｉｉ）培養された細胞又は細胞の培地から本発明のＦｃ変異体を精製する。
（ｉ）本発明のＦｃ変異体をコードする核酸を宿主細胞に導入する。
（ｉｉ）本発明のＦｃ変異体の発現が可能な条件で培地において宿主細胞を培養する。
（ｉｉｉ）培養された細胞又は細胞の培地から本発明のＦｃ変異体を精製する。
【0076】
一実施形態では、前記宿主細胞は、免疫原性を有するＮＧＮＡ又はα－ガラクトースを産生しない。
【0077】
一実施形態では、本発明のＦｃ変異体を発現させるための宿主細胞株は哺乳動物に由来し、当業者は所望の遺伝子産物の発現に最も適する特定の宿主細胞を決定できる。例示的な宿主細胞株は、ＤＧ４４及びＤＵＸＢ１１（チャイニーズハムスター卵巣細胞株、ＤＨＦＲ－）、ＳＰ２／０（マウス骨髄腫）、２９３（ヒト腎臓）などであり、ただしそれらに限定されない。一実施形態では、前記細胞株は、それによって発現されたＦｃ変異体のグリコシル化を改変させており、例えば、アフコシル化である（例えば、ＰＥＲ．Ｃ６又はＦＵＴ８ノックアウトＣＨＯ細胞株）。一実施形態では、ＮＳ０細胞を使用してもよい。ＣＨＯ細胞が特に好ましい。宿主細胞株は、一般的に、生物資源プロバイダーであるＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから提供されてもよいし、又は開示している文献を通じて得てもよい。
【0078】
インビトロ生産ではスケールアップできるため大量の所望のＦｃ変異体を得る。哺乳動物細胞培養技術は当分野で知られており、例えば、バイオリアクターでの均一な浮遊培養、又は、例えば、中空糸、マイクロカプセルの中で若しくはアガロースビーズ上での固定化若しくは捕捉式細胞培養が挙げられる。必要及び／又は所望により、通常の精製方法（例えば、ゲル濾過、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィーなど）によりＦｃ変異体の溶液を精製してもよい。
【0079】
非哺乳動物細胞（例えば、酵母又は植物細胞）において本発明のＦｃ変異体をコードする遺伝子を発現させてもよい。真核微生物のうち最もよく利用されるのはサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、あるいはパン酵母（ｂａｋｅｒ’ｓ ｙｅａｓｔ）であり、他の様々な菌株も一般には利用可能である。
【0080】
細胞ベースの発現系のほかに、無細胞合成法又は化学合成方法でＦｃ変異体を産生してもよい。いくつかの実施形態では、インビトロ化学合成でＦｃ変異体を産生する。
【0081】
８．医薬組成物
本発明は、上記のポリペプチド又は核酸を含む医薬組成物を提供する。
本発明は、上記のポリペプチド又は核酸を含む医薬組成物を提供する。
【0082】
本発明は、また、（ｉ）上記のポリペプチド若しくは核酸及び／又は上記の医薬組成物と、（ｉｉ）免疫グロブリン分解酵素とを含む、医薬製剤を提供する。前記免疫グロブリン分解酵素は、ＩｄｅＳ、ＩｄｅＺ、ＩｄｅＺ２、ＩｄｅＥ、ＩｄｅＥ２、ＩｄｅＳＯＲＫ、Ｘｏｒｋ及びそれらの変異体からなる群から選ばれる。
【0083】
前記医薬組成物は、非経口ボーラス投与（例えば、静脈内又は筋肉内）用に製剤化されてもよい。前記組成物として、例えば、油性又は水性担体における懸濁液、溶液又は乳剤の形態が用いられてもよく、しかも添加剤、例えば、懸濁剤、安定剤及び／又は分散剤が含まれる。又は、活性成分は、適切な担体（例えば、パイロジェンフリー水）と組み合わせるための粉末の形態であってもよい。
【0084】
本発明は、また、本明細書に開示されている変異体を含む免疫複合体を提供し、当該変異体が、１種又は複数種の治療剤、例えば、細胞毒性薬剤、化学療法剤、薬物、成長抑制剤、毒素（例えば、タンパク質毒素、細菌、真菌、植物若しくは動物に由来し酵素活性を有する毒素若しくはその断片）又は放射性同位体に複合（化学的に結合）する。
【0085】
９．Ｆｃ変異体及び医薬組成物の使用
本発明は、本発明の分子及び／又は医薬組成物を用いて疾患を治療する方法を提供し、前記疾患は、がん又は自己免疫疾患であり、前記がんは、多発性骨髄腫である。
本発明は、本発明の分子及び／又は医薬組成物を用いて疾患を治療する方法を提供し、前記疾患は、がん又は自己免疫疾患であり、前記がんは、多発性骨髄腫である。
【0086】
本発明は、薬物の製造における本発明の分子及び／又は医薬組成物の用途を提供し、前記薬物は、疾患、特にがん又は自己免疫疾患を治療するために用いられる。前記薬物は、また、ＣＤ３８陽性細胞に対するＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、アポトーシスによって媒介される枯渇を誘導するために用いられてもよい。
【0087】
本発明は、がん又は自己免疫疾患を持っている個体の治療方法を提供し、当該方法は、前記個体に有効量の本発明の分子及び／又は医薬組成物を投与することを含み、さらに、必要とする被験者に治療有効量の上記のポリペプチド又はポリペプチドをコードする核酸を投与することを含む。また、自己免疫疾患及び／又は腫瘍を治療する薬物の製造におけるポリペプチド又は核酸の用途を提供し、疾患は、ＣＤ３８関連がん又は自己免疫疾患であることが好ましい。本発明の分離されたポリペプチド、核酸、発現ベクター、宿主細胞、医薬組成物又は実質的には本発明で示され記載されている自己免疫疾患及び／若しくは腫瘍を治療するための方法も特徴的であり、疾患は、ＣＤ３８関連がん又は自己免疫疾患であることが好ましい。前記ＣＤ３８関連がんは、固形腫瘍、Ｂ細胞リンパ腫又は多発性骨髄腫である。
【0088】
本発明は、個体においてＣＤ３８陽性細胞に対するＡＤＣＣ、ＡＤＣＰによって媒介される枯渇を誘導する方法を提供し、当該方法は、前記個体に有効量の本発明の分子及び／又は医薬組成物を投与して、ＣＤ３８陽性細胞に対するＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、アポトーシスによって媒介される枯渇を誘導することを含む。
【0089】
本発明のＦｃ変異体は、以下の利点を有する。１）免疫グロブリン分解酵素による切断に対抗すること、２）免疫グロブリン分解酵素と同時に使用できること、３）免疫グロブリン分解酵素と同時に使用される場合、生物学的利用能が向上していること。
【0090】
当分野の常識に沿っている限り、上記の各好ましい条件を自由に組み合わせれば、本発明の好ましい例のそれぞれを得ることができる。
【0091】
本発明で使用される試薬及び原料は、いずれも市販品であってもよい。
【0092】
以下、実施例で本発明をさらに説明し、ただし本発明を実施例の範囲に限定するわけではない。以下の実施例で具体的な条件が明記されていない試験方法は、通常の方法及び条件で行うか、商品の説明書に従って選択する。
【0093】
実施例１：タンパク質の製造
配列の合成であった。表１でＩｄｅＳ以外のアミノ酸配列をコードする塩基配列を合成し、哺乳動物細胞発現ベクターであるｐｃＤＮＡ３．１ベクターにおいて構築した。
配列の合成であった。表１でＩｄｅＳ以外のアミノ酸配列をコードする塩基配列を合成し、哺乳動物細胞発現ベクターであるｐｃＤＮＡ３．１ベクターにおいて構築した。
【0094】
発現と精製であった。重鎖と軽鎖を１：２の比率で混合して一過性形質転換によりそれぞれＥｘｐｉＣＨＯ－Ｓ細胞、フコース非修飾ＣＨＯ細胞に導入した。トランスフェクション後６～８日目に液体を回収し、発現上清を９５００ｒｐｍで２０分間遠心分離して上清を収集した。Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａで精製し、エンドトキシンを１ＥＵ／ｍｇ未満に制限した。異なる番号の重鎖及びその変異体と軽鎖を共発現して野生型抗体、抗体１～６を得て、重鎖がそれぞれ配列番号２０～２６に対応し、使用する軽鎖配列が配列番号２７であった。抗体７が配列番号２８の軽鎖、配列番号２９の重鎖に対応した。
【0095】
ＩｄｅＳ酵素の発現であった。コドン最適化を経てＩｄｅＳ（配列番号３１）をコードするポリヌクレオチド配列を合成し、Ｎ末端シグナルペプチド配列ＭＲＫＲＣＹＳＴＳＡＡＶＬＡＡＶＴＬＦＶＬＳＶＤＲＧＶＩＡ（配列番号３２）を加えた。配列合成後にｐＥＴ３２ａ発現ベクターに挿入し、正しい配列と確認した後、発現用の組換えプラスミドを得た。電気形質転換により変異体組換えプラスミドを大腸菌ＢＬ２１ Ｓｔａｒ（ＤＥ３）に導入し、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢアガロースプレートに接種した。コロニーが出るまで３７℃で一晩培養した。単一のコロニーをピッキングして、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ培地２００μＬに接種し、３７℃、２５０ｒｐｍで一晩培養した。１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ培地１ｍＬに一晩の培養物を接種し、３７℃で４時間培養した後、０．１ｍＭのＩＰＴＧを加えて、３０℃で引き続き一晩培養した。一晩の培養物を遠心分離して上清を収集した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥを利用して変異体発現上清中の変異体タンパク質の濃度を評価した。
【0096】
イオン交換クロマトグラフィー、次に疎水性クロマトグラフィーを利用して上清を精製し、エンドトキシンを１ＥＵ／ｍｇ未満に制限し、最終的に純粋なタンパク質を得た。
【表1】
【0097】
実施例２：変異体の酵素切断への対抗に関する検出
ＳＤＳ－ＰＡＧＥにより異なる変異体のＩｄｅＳによって切断される効果を評価した。１：５０の比率で、ＩｄｅＳを２ｍｇ／ｍＬの異なる変異体を含有している５０μＬの反応系に加えて切断反応を開始させ、３７℃で３０分間反応させた。サンプルと等量の非還元２×ＳＤＳローディング緩衝液を混合した後、７５℃のウォーターバスで５分間保持して、ＳＤＳ－ＰＡＧＥで切断産物を検出した。
ＳＤＳ－ＰＡＧＥにより異なる変異体のＩｄｅＳによって切断される効果を評価した。１：５０の比率で、ＩｄｅＳを２ｍｇ／ｍＬの異なる変異体を含有している５０μＬの反応系に加えて切断反応を開始させ、３７℃で３０分間反応させた。サンプルと等量の非還元２×ＳＤＳローディング緩衝液を混合した後、７５℃のウォーターバスで５分間保持して、ＳＤＳ－ＰＡＧＥで切断産物を検出した。
【0098】
切断の結果（図１）に示すように、抗体１～３、５、７がいずれも切断に対抗でき、抗体６が部分的に切断に対抗し、野生型は切断に対抗しなかった。
【0099】
実施例３：ＡＤＣＣ活性の検出
それぞれレポーター遺伝子、ＰＢＭＣを用いて各変異体のＡＤＣＣ活性を検出した。レポーター遺伝子を用いる方法ではＤａｕｄｉ細胞を用い、密度を１×１０６細胞／ｍＬに調整し、２５μＬ／ウェルで９６ウェルプレートにプレーティングした。１６４０培地で被験抗体を２０μｇ／ｍＬに希釈し、さらに６倍勾配で７回希釈して、８つの濃度勾配の薬物を得た。２５μＬの希釈済みの薬物を９６ウェルプレートに加えた。１６４０培地をネガティブコントロール（ＮＣ）とした。９６ウェルプレートを３７℃の二酸化炭素インキュベーターに入れて４５分間インキュベートした。レポーター遺伝子の入った細胞を加えて、二酸化炭素インキュベーターで６時間インキュベートした。インキュベーション終了後、各ウェルに７５μＬのホタルルシフェラーゼ基質溶液（Ｒｈｉｎｏｇｅｎ（登録商標））を加え、マイクロプレートシェーカーにおいて振盪して均一に混合し、室温で５分間静置し、マイクロプレートリーダーで発光量（ｒｅｌａｔｉｖｅ ｌｉｇｈｔ ｕｎｉｔ、ＲＬＵ）の値を読み取り、ソフトウェアＧｒａｐｈｐａｄの４パラメータロジスティック回帰モデルを適用してデータを解析した。
それぞれレポーター遺伝子、ＰＢＭＣを用いて各変異体のＡＤＣＣ活性を検出した。レポーター遺伝子を用いる方法ではＤａｕｄｉ細胞を用い、密度を１×１０６細胞／ｍＬに調整し、２５μＬ／ウェルで９６ウェルプレートにプレーティングした。１６４０培地で被験抗体を２０μｇ／ｍＬに希釈し、さらに６倍勾配で７回希釈して、８つの濃度勾配の薬物を得た。２５μＬの希釈済みの薬物を９６ウェルプレートに加えた。１６４０培地をネガティブコントロール（ＮＣ）とした。９６ウェルプレートを３７℃の二酸化炭素インキュベーターに入れて４５分間インキュベートした。レポーター遺伝子の入った細胞を加えて、二酸化炭素インキュベーターで６時間インキュベートした。インキュベーション終了後、各ウェルに７５μＬのホタルルシフェラーゼ基質溶液（Ｒｈｉｎｏｇｅｎ（登録商標））を加え、マイクロプレートシェーカーにおいて振盪して均一に混合し、室温で５分間静置し、マイクロプレートリーダーで発光量（ｒｅｌａｔｉｖｅ ｌｉｇｈｔ ｕｎｉｔ、ＲＬＵ）の値を読み取り、ソフトウェアＧｒａｐｈｐａｄの４パラメータロジスティック回帰モデルを適用してデータを解析した。
【0100】
ＰＢＭＣを用いる方法では、カルセインＡＭ（Ｃａｌｃｅｉｎ－ＡＭ）（碧云天、カタログ番号Ｃ２０１２）を用いてＤａｕｄｉ細胞と２０分間共インキュベートして、カルセインＡＭ色素を標的細胞に導入し、カルセインの最終濃度は４μＭであった。インキュベーション後の細胞を９６ウェルプレートに接種し、２×１０４細胞／ウェルであった。１６４０培地で被験抗体を２０００～０．０２ｎｇ／ｍＬの濃度範囲に希釈して、９６ウェルプレートに加えた。各ウェルに５×１０５のＰＢＭＣ細胞を加えて最終的にＰＢＭＣ細胞とＤａｕｄｉ細胞の比率が２５：１であった。１６４０培地をネガティブコントロール（ＮＣ）、トータルコントロールとした。加湿インキュベーターで３７℃、４時間インキュベートした後、遠心分離して、上清を分けて励起波長４９０ｎｍ、発光波長５１５ｎｍで、蛍光値を測定した。トータルコントロールは遠心分離せず、直接０．１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００で細胞を溶解し、遠心分離後に上清を分けて蛍光値を測定した。蛍光値から、標的細胞溶解率を算出した。
【0101】
結果（図２Ａ）に示すように、野生型と比べて、抗体１が弱化しているＡＤＣＣ活性を有している。抗体２にはＡＤＣＣ活性がなく、抗体３、５は増強しているＡＤＣＣ活性を有している。ＥＣ５０値を比較したところ、抗体１、３、５は野生型に対する活性の倍率がそれぞれ０．６、１．３、３．９であった。フコース（Ｆｕｃｏｓｅ）非修飾抗体サンプル（図２Ｂ）については、ＥＣ５０値を比較したところ、抗体３－Ｆｕｃｏｓｅ－、抗体５－Ｆｕｃｏｓｅ－の野生型に対する活性の倍率がそれぞれ１２．７、２３．２で、コントロールよりはるかに高かった。ＰＢＭＣを用いる方法では、野生型抗体、抗体３－Ｆｕｃｏｓｅ－、抗体７のＥＣ５０値がそれぞれ２．０７２ｎｇ／ｍＬ、０．６５７８ｎｇ／ｍＬ、２．０９５ｎｇ／ｍＬで（図２Ｃ）、抗体３－Ｆｕｃｏｓｅ－、抗体７の野生型に対する活性の倍率がそれぞれ３．１、１．０であった。以下、抗体３－Ｆｕｃｏｓｅ－を抗体８として記述した。
【0102】
実施例４：変異体の安定性の検出
変異体タンパク質に対して、Ｕｎｃｈａｉｎｅｄ Ｌａｂｓ社のハイスループットタンパク質安定性分析システムＵｎｃｌｅを用いて抗体の熱安定性を検出した。精製後の変異体サンプルを１．０ｍｇ／ｍＬでローディングして検出した。Ｔｍ＆Ｔａｇｇ ｗｉｔｈ ｏｐｔｉｏｎａｌ ＤＬＳプログラムを用いて、温度範囲を２５～９５℃に設定し、サンプルに１つの並行ウェルを設けた。結果パラメータＴｍ（タンパク質の融解温度）、Ｔａｇｇ２６６（タンパク質の凝集温度）を分析することで、熱安定性を分析した。
変異体タンパク質に対して、Ｕｎｃｈａｉｎｅｄ Ｌａｂｓ社のハイスループットタンパク質安定性分析システムＵｎｃｌｅを用いて抗体の熱安定性を検出した。精製後の変異体サンプルを１．０ｍｇ／ｍＬでローディングして検出した。Ｔｍ＆Ｔａｇｇ ｗｉｔｈ ｏｐｔｉｏｎａｌ ＤＬＳプログラムを用いて、温度範囲を２５～９５℃に設定し、サンプルに１つの並行ウェルを設けた。結果パラメータＴｍ（タンパク質の融解温度）、Ｔａｇｇ２６６（タンパク質の凝集温度）を分析することで、熱安定性を分析した。
【表2】
【0103】
結果（表２）に示すように、各抗体のＴｍ値が５０℃以上であった。抗体１、２、３はＴｍ値が６０℃以上で、安定性がより高い。Ｇ２３７Ａ単独によるＴｍ値の変化は無視できる。
【0104】
実施例５：ＡＤＣＰ活性の検出
抗体８、抗体７及びコントロールを１０μｇ／ｍＬから、５倍希釈して７つの濃度とした。Ｒｏｍａｓ細胞をＣＦＳＥで標識した。単球（Ｍｏｎｏｃｙｔｅ）で刺激してマクロファージ（ＭΦ）を得て、８×１０５細胞／ウェルでプレーティングした（５０μＬ）。マクロファージに５０μＬの希釈後のサンプルを加え、３７℃で、５％のＣＯ２のインキュベーターで１５分間インキュベートした。さらに１：５の比率で（マクロファージを含む細胞の量は８×１０５細胞／ウェル、Ｒｏｍａｓ細胞の量は４×１０６細胞／ウェル）標識後のＲｏｍａｓ細胞を加え、４８ウェル細胞プレートにプレーティングし、３７℃で、５％のＣＯ２インキュベーターで２．５時間インキュベートした。ＣＤ１１ｂ－ＡＰＣで染色した後、フローサイトメトリー検出を行った。
抗体８、抗体７及びコントロールを１０μｇ／ｍＬから、５倍希釈して７つの濃度とした。Ｒｏｍａｓ細胞をＣＦＳＥで標識した。単球（Ｍｏｎｏｃｙｔｅ）で刺激してマクロファージ（ＭΦ）を得て、８×１０５細胞／ウェルでプレーティングした（５０μＬ）。マクロファージに５０μＬの希釈後のサンプルを加え、３７℃で、５％のＣＯ２のインキュベーターで１５分間インキュベートした。さらに１：５の比率で（マクロファージを含む細胞の量は８×１０５細胞／ウェル、Ｒｏｍａｓ細胞の量は４×１０６細胞／ウェル）標識後のＲｏｍａｓ細胞を加え、４８ウェル細胞プレートにプレーティングし、３７℃で、５％のＣＯ２インキュベーターで２．５時間インキュベートした。ＣＤ１１ｂ－ＡＰＣで染色した後、フローサイトメトリー検出を行った。
【0105】
結果（図３）に示すように、抗体８、抗体７に強い食作用効果があった。当該変異は抗体のＡＤＣＰ活性にマイナス的な影響がないことを示した。
【0106】
実施例６：ＣＤＣ活性の検出
０．５％のＢＳＡを含む１６４０培地で抗体３を１００μｇ／ｍＬから５倍希釈し、９回で１０の濃度を得た。希釈済みのサンプルを４０μＬ／ウェルで３０μＬのＤａｕｄｉ細胞がプレーティングされた９６ウェル細胞プレートに加え（５×１０４細胞／ウェル）、細胞プレートを４℃で１時間インキュベートした。健常者の血清を０．５％のＢＳＡを含む１６４０培地で２倍希釈し、４０μＬ／ウェルでサンプルウェルに加えて、３７℃で２時間インキュベートした。残りの細胞生存率をＣｅｌｌｔｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（商標）で検出した。
０．５％のＢＳＡを含む１６４０培地で抗体３を１００μｇ／ｍＬから５倍希釈し、９回で１０の濃度を得た。希釈済みのサンプルを４０μＬ／ウェルで３０μＬのＤａｕｄｉ細胞がプレーティングされた９６ウェル細胞プレートに加え（５×１０４細胞／ウェル）、細胞プレートを４℃で１時間インキュベートした。健常者の血清を０．５％のＢＳＡを含む１６４０培地で２倍希釈し、４０μＬ／ウェルでサンプルウェルに加えて、３７℃で２時間インキュベートした。残りの細胞生存率をＣｅｌｌｔｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（商標）で検出した。
【0107】
結果（図４）に示すように、抗体８は野生型抗体と同じくＣＤＣ活性がなく、変異がＣＤＣ活性特性を変えなかった。一方抗体７にはＣＤＣ活性が保たれていて、野生型抗体に関する報告と一致した（Ｍｉｃｈａｅｌ Ｋａｒｌ Ｂａｕｅｒ，ＣＤ３８：Ａ Ｕｎｉｑｕｅ Ｔａｒｇｅｔ Ｉｎ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｍｙｅｌｏｍａ，２０１４）。
【0108】
実施例７：アポトーシス誘導能の検出
Ｄａｕｄｉ細胞を接種し、細胞密度を調整した後、７５０μＬ／ウェル（２×１０５細胞／ウェル）で２４ウェルプレートにプレーティングした。１６４０培地に１０％の血清（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、２ｍＭ Ｌ－グルタミンを添加して被験抗体を３～４μｇ／ｍＬに希釈し、さらに１０倍希釈し、５回で６つの濃度勾配のサンプルを得た。２５０μＬの希釈済みのサンプルを２４ウェルプレートに加え、１６４０培地をネガティブコントロール（ＮＣ）とした。２４ウェルプレートを３７℃で５％のＣＯ２インキュベーターに入れて２０時間インキュベートし、終了後、１．５ｍＬ ＥＰチューブに移して１０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を捨て、２００μＬのＰＢＳを加えて細胞を再懸濁した後、９６ウェルＶ底ウェルプレートに移して、遠心分離して上清を除去した。Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ－ＦＩＴＣキットを使用して染色し、１０～２０分間インキュベートした後、フローサイトメータ検出を行い、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍでアポトーシス細胞の割合を分析した。
Ｄａｕｄｉ細胞を接種し、細胞密度を調整した後、７５０μＬ／ウェル（２×１０５細胞／ウェル）で２４ウェルプレートにプレーティングした。１６４０培地に１０％の血清（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、２ｍＭ Ｌ－グルタミンを添加して被験抗体を３～４μｇ／ｍＬに希釈し、さらに１０倍希釈し、５回で６つの濃度勾配のサンプルを得た。２５０μＬの希釈済みのサンプルを２４ウェルプレートに加え、１６４０培地をネガティブコントロール（ＮＣ）とした。２４ウェルプレートを３７℃で５％のＣＯ２インキュベーターに入れて２０時間インキュベートし、終了後、１．５ｍＬ ＥＰチューブに移して１０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を捨て、２００μＬのＰＢＳを加えて細胞を再懸濁した後、９６ウェルＶ底ウェルプレートに移して、遠心分離して上清を除去した。Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ－ＦＩＴＣキットを使用して染色し、１０～２０分間インキュベートした後、フローサイトメータ検出を行い、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍでアポトーシス細胞の割合を分析した。
【0109】
結果（図５）に示すように、抗体８の細胞のアポトーシスを誘導する能力が野生型抗体に近かった。変異がアポトーシス誘導能に影響を与えなかった。一方抗体７にはアポトーシス誘導能が保たれている。
【0110】
実施例８：結合活性の検出
ＢＬＩ法を用いて野生型抗体及び抗体３の標的ＣＤ３８に対する、及び酸性条件下でヒトＦｃＲｎに対する親和性を検出した。結果（表３）に示すように、抗体８及び野生型抗体の２種のタンパク質に対する親和性と、ＣＤ３８に対する親和性がいずれも３倍以内で、変異がＦａｂの結合活性に影響を与えないことを示した。
ＢＬＩ法を用いて野生型抗体及び抗体３の標的ＣＤ３８に対する、及び酸性条件下でヒトＦｃＲｎに対する親和性を検出した。結果（表３）に示すように、抗体８及び野生型抗体の２種のタンパク質に対する親和性と、ＣＤ３８に対する親和性がいずれも３倍以内で、変異がＦａｂの結合活性に影響を与えないことを示した。
【表3】
【0111】
実施例９：酵素活性阻害の検出
ｐＨ７．０の２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌでそれぞれ抗体８及び野生型抗体を４０ｎＭに希釈し、ＣＤ３８タンパク質を１０ｎＭに希釈した。希釈後のＣＤ３８と抗体を１：１混合した後、抗体を加えていない希釈液をブランクコントロールとして、室温で遮光下１５分間反応させた。反応終了後、１００μＬの最終濃度８０μＭのＮＧＤ（ニコチンアミドグアニンジヌクレオチド ナトリウム塩）を加えて室温で遮光下インキュベートし、６０分間インキュベートした後、検出した。励起波長３００ｎｍと発光波長４１０ｎｍでの蛍光シグナルを測定して酵素活性の阻害効果を判断した。ＲＦＵ値が低いほど、阻害効果が高い。
ｐＨ７．０の２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌでそれぞれ抗体８及び野生型抗体を４０ｎＭに希釈し、ＣＤ３８タンパク質を１０ｎＭに希釈した。希釈後のＣＤ３８と抗体を１：１混合した後、抗体を加えていない希釈液をブランクコントロールとして、室温で遮光下１５分間反応させた。反応終了後、１００μＬの最終濃度８０μＭのＮＧＤ（ニコチンアミドグアニンジヌクレオチド ナトリウム塩）を加えて室温で遮光下インキュベートし、６０分間インキュベートした後、検出した。励起波長３００ｎｍと発光波長４１０ｎｍでの蛍光シグナルを測定して酵素活性の阻害効果を判断した。ＲＦＵ値が低いほど、阻害効果が高い。
【0112】
結果（図６）に示すように、抗体８のＣＤ３８酵素活性を阻害する能力が野生型抗体とほぼ一致しており、当該変異がＣＤ３８酵素の活性に対するＦａｂの阻害機能に影響を与えないことを示した。抗体７には活性阻害がほぼなかった。
【0113】
実施例１０：動物薬力学
Ｄａｕｄｉマウスモデルを用いて本発明の変異体のインビボ活性を評価した。試験設計では７群を設け、図７に示すように上方から順に群１～群７であった。具体的には、対数増殖期の細胞を採取して、各ｈｕＰＢＭＣ－ＮＯＧ－Ｄｋｏマウスに無菌状態で右腋窩に５×１０６のＤａｕｄｉ細胞を皮下接種し、接種量がいずれも０．１ｍＬ／匹であった。細胞接種後１０日間程度で、腫瘍体積が２００ｍｍ３程度になったとき、腫瘍体積によって５６匹の動物をスクリーニングして１群８匹の動物でランダムに７群に分けた。群分けした当日に群３、群４、群６、群７の動物に単回腹腔内注射でＩＶＩｇを投与し（容量２０ｍＬ／ｋｇ、用量１ｇ／ｋｇ）、２４時間後に群４、群７の動物に単回静脈注射でＩｄｅＳを投与した（容量１０ｍＬ／ｋｇ、用量５ｍｇ／ｋｇ）。ＩｄｅＳ投与２時間後、静脈注射で抗体を投与した（容量１０ｍＬ／ｋｇ、用量２ｍｇ／ｋｇ）。抗体初回投与の日を１日目とし、８日目及び１５日目に群２～群７の動物に抗体を静脈注射し、溶媒コントロール群では静脈注射で対応する容量の生理食塩水を投与した。投与開始後、週２回、腫瘍体積を測定した。
Ｄａｕｄｉマウスモデルを用いて本発明の変異体のインビボ活性を評価した。試験設計では７群を設け、図７に示すように上方から順に群１～群７であった。具体的には、対数増殖期の細胞を採取して、各ｈｕＰＢＭＣ－ＮＯＧ－Ｄｋｏマウスに無菌状態で右腋窩に５×１０６のＤａｕｄｉ細胞を皮下接種し、接種量がいずれも０．１ｍＬ／匹であった。細胞接種後１０日間程度で、腫瘍体積が２００ｍｍ３程度になったとき、腫瘍体積によって５６匹の動物をスクリーニングして１群８匹の動物でランダムに７群に分けた。群分けした当日に群３、群４、群６、群７の動物に単回腹腔内注射でＩＶＩｇを投与し（容量２０ｍＬ／ｋｇ、用量１ｇ／ｋｇ）、２４時間後に群４、群７の動物に単回静脈注射でＩｄｅＳを投与した（容量１０ｍＬ／ｋｇ、用量５ｍｇ／ｋｇ）。ＩｄｅＳ投与２時間後、静脈注射で抗体を投与した（容量１０ｍＬ／ｋｇ、用量２ｍｇ／ｋｇ）。抗体初回投与の日を１日目とし、８日目及び１５日目に群２～群７の動物に抗体を静脈注射し、溶媒コントロール群では静脈注射で対応する容量の生理食塩水を投与した。投与開始後、週２回、腫瘍体積を測定した。
【0114】
試験結果（図７）に示すように、抗体８単独投与と野生型抗体単独投与とで効果が同じであった。ＩｇＧ（ＩＶＩｇ）の存在下、抗体の腫瘍治療効果が抑制された。抗体８と免疫グロブリン分解酵素の併用が抗体の治療効果に対するＩｇＧの抑制を低下させて、治療用抗体の治療効果を顕著に増強させることができる。野生型抗体にこの効果はなかった。
【0115】
出願人は、本発明の上記の実施例で本発明の方法を詳しく説明しているが、本発明は上記の詳細な方法に限定されず、つまり、本発明は必ず上記の詳細な方法により実施されるわけではないと明言する。本発明のいかなる改良、本発明の製品の各原料の同等の置換及び副次的成分の添加、具体的な方式の選択などが、いずれも本発明の保護範囲及び開示の範囲に入るということは当業者に自明なはずである。
【表4】
【図1】
【図2A】
【図2B】
【図2C】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2024-08-06
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
Ｆｃ変異体を含む分子であって、前記分子はＩｇＧ野生型Ｆｃを含む分子と比べて、免疫グロブリン分解酵素に対して耐性があり、且つ前記分子は変異を有するヒトＩｇＧ Ｆｃ領域を含み、前記変異は位置Ｇ２３７（ＥＵナンバリング）での１つ又は複数の置換又は欠失であり、前記置換はＧ２３７Ａであることが好ましく、
前記分子のＩｇＧは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４からなる群から選ばれる、分子。
【請求項2】
前記Ｆｃ分子は、プロテアーゼによる分解に対して耐性があり、前記プロテアーゼは、残基２３６と２３７（ＥＵナンバリング）の間でＩｇＧ野生型Ｆｃを含む分子を切断できる、前記分子は、野生型ＩｇＧと比べて、ＩｄｅＳ、ＩｄｅＺ、ＩｄｅＥ、ＩｄｅＺ２、ＩｄｅＥ２、ＩｄｅＳＯＲＫ、Ｘｏｒｋ及びそれらの変異体からなる群から選ばれる酵素による分解に対して耐性がある、請求項１に記載の分子。
【請求項3】
前記分子のＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、ＣＤＣからなる群から選ばれるエフェクター機能がＩｇＧ野生型Ｆｃを含む分子と比べて促進又は増強されている、または、
前記分子のＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、ＣＤＣからなる群から選ばれるエフェクター機能が、ＩｇＧ１野生型Ｆｃを含む分子と比べて弱化及び／又は解消されている、または、
ＦｃＲｎに対する前記分子の親和性が、ＩｇＧ１野生型Ｆｃを含む分子と比べて上昇している、請求項１に記載の分子。
【請求項4】
ヒトＩｇＧ野生型Ｆｃ領域配列における１つ又は複数の置換をさらに含み、前記置換は、Ｓ２３９Ｄ、Ｉ３３２Ｅ、Ｇ２３６Ａ、Ｓ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４Ａ、Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅ、Ｇ２３６Ａ／Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｇ２３６Ａ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅ、Ｇ２３６Ａ／Ｓ２３９Ｄ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅ、Ｆ２４３Ｌ／Ｒ２９２Ｐ／Ｙ３００Ｌ、Ｆ２４３Ｌ／Ｒ２９２Ｐ／Ｙ３００Ｌ／Ｖ３０５Ｉ／Ｐ３９６Ｌ、Ｌ２３５Ｖ／Ｆ２４３Ｌ／Ｒ２９２Ｐ／Ｙ３００Ｌ／Ｐ３９６Ｌ、Ｐ２４７Ｉ／Ａ３３９Ｑ、Ｋ３２６Ａ／Ｅ３３３Ａ、Ｋ３２６Ｗ／Ｅ３３３Ｓ、Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４Ａ、Ｈ２６８Ｆ／Ｓ３２４Ｔ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ｈ２６８Ｆ／Ｓ３２４Ｔ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２６７Ｅ／Ｈ２６８Ｆ／Ｓ３２４Ｔ／Ｉ３３２Ｅ、Ｋ３２６Ａ／Ｉ３３２Ｅ／Ｅ３３３Ａ、Ｓ２３９Ｄ／Ｋ３２６Ａ／Ｅ３３３Ａ、Ｓ２６７Ｅ／Ｉ３３２Ｅからなる群から選ばれ、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、ＣＤＣからなる群から選ばれるエフェクター機能がＩｇＧ野生型Ｆｃを含む分子と比べて促進又は増強されている、または、
ヒトＩｇＧ１野生型Ｆｃ配列における１つ又は複数の置換をさらに含み、前記置換は、Ｎ２９７Ａ、Ｎ２９７Ｑ、Ｎ２９７Ｇ、Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３５Ａ／Ｅ３１８Ａ、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３６Ｒ／Ｌ３２８Ｒ、Ｓ２９８Ｇ／Ｔ２９９Ａ、Ｌ２３４Ｆ／Ｌ２３５Ｅ／Ｐ３３１Ｓ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｐ３２９Ｇ、Ｌ２３４Ｆ／Ｌ２３５Ｅ／Ｄ２６５Ａからなる群から選ばれ、好ましくは、前記置換は、Ｎ２９７Ａ、Ｎ２９７Ｑ、Ｎ２９７Ｇ、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３４Ｆ／Ｌ２３５Ｅ／Ｐ３３１Ｓからなる群から選ばれる、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、ＣＤＣからなる群から選ばれるエフェクター機能が、ＩｇＧ１野生型Ｆｃを含む分子と比べて弱化及び／又は解消されている、または、
ＩｇＧ１野生型Ｆｃの配列における１つ又は複数の置換をさらに含み、前記置換は、ＹＴＥＫＦ、ＹＴＥＫＦ＋Ｖ２６４Ａ、ＹＴＥＫＦ＋Ｖ２６４Ｅからなる群から選ばれる、ＦｃＲｎに対する前記分子の親和性が、ＩｇＧ１野生型Ｆｃを含む分子と比べて上昇している、請求項１に記載の分子。
【請求項5】
前記置換は、Ｓ２３９Ｄ、Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅからなる群から選ばれる、請求項４に記載の分子。
【請求項6】
前記置換がＧ２３７ＡおよびＩ３３２Ｅである、請求項１に記載の分子。
【請求項7】
Ｎ－グリカン修飾をさらに含み、前記Ｎ－グリカン修飾においてフコースの含有量が５０％未満であり、または、Ｎ－グリカン修飾をさらに含み、前記Ｎ－グリカン修飾において末端ガラクトース修飾の含有量が３０％より高く、請求項１に記載の分子。
【請求項8】
前記分子が、抗体又はＦｃ融合タンパク質である、好ましくは、前記抗体が、ウイルス、細菌、腫瘍細胞、腫瘍間質、又は腫瘍血管系上の抗原に結合し、好ましくは、前記抗体が、ＣＯＶＩＤ－１９、ＣＤ３８、ＣＤ２０、ＦＲ５、ＢＣＭＡ、ＳＬＡＭ７、ＣＤ７３、ＧＰＲＣＤ５、ＣＤ３からなる群から選ばれる１つ又は２つの抗原に特異的に結合し、請求項１に記載の分子。
【請求項9】
前記抗体が、少なくとも１つの重鎖及び少なくとも１つの軽鎖を含み、前記重鎖は、配列番号１で示されるＨＣＤＲ１、配列番号２で示されるＨＣＤＲ２、配列番号３で示されるＨＣＤＲ３、又は、配列番号４で示されるＨＣＤＲ１、配列番号５で示されるＨＣＤＲ２、配列番号６で示されるＨＣＤＲ３を含み、前記軽鎖は、配列番号７で示されるＬＣＤＲ１、配列番号８で示されるＬＣＤＲ２、配列番号９で示されるＬＣＤＲ３、又は、配列番号１０で示されるＬＣＤＲ１、配列番号１１で示されるＬＣＤＲ２、配列番号１２で示されるＬＣＤＲ３を含む、好ましくは、前記抗体が、少なくとも１つの重鎖及び少なくとも１つの軽鎖を含み、前記重鎖は配列番号１３のアミノ酸配列で示される重鎖可変領域を含み、且つ、前記軽鎖は配列番号１４のアミノ酸配列で示される軽鎖可変領域を含み、又は、前記重鎖は配列番号１５のアミノ酸配列で示される重鎖可変領域を含み、且つ、前記軽鎖は配列番号１６のアミノ酸配列で示される軽鎖可変領域を含む、請求項８に記載の分子。
【請求項10】
前記抗体が、少なくとも１つの重鎖及び少なくとも１つの軽鎖を含み、重鎖がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２１～２６、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２９からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる、請求項８に記載の分子。
【請求項11】
前記軽鎖がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２７～２８からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる、
好ましくは、抗体が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２３のアミノ酸配列で示される重鎖、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２７のアミノ酸配列で示される軽鎖からなる；または、抗体が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２９のアミノ酸配列で示される重鎖、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２８のアミノ酸配列で示される軽鎖からなる、請求項１０に記載の分子。
【請求項12】
（ｉ）細胞又は細胞に結合した標的分子に結合できる結合ドメインと、（ｉｉ）ヒトＩｇＧ１重鎖のＣＨ２及びＣＨ３定常ドメインのアミノ酸配列を有するＦｃドメインとを含み、ただし、ＥＵナンバリングシステムによって定義された残基Ｇ２３７に置換又は欠失が生じた、分離された結合ポリペプチド分子であって、前記結合分子は標的細胞上の標的分子に結合でき、且つ、前記分子は、測定可能なＣＤＣ活性、又は必要なフェクター細胞によって媒介される標的細胞傷害活性を生じ、好ましくは、Ｇ２３７での置換がＧ２３７Ａであることを特徴とする、結合ポリペプチド分子。
【請求項13】
請求項１に記載の分子と細胞毒性薬剤とを含む、免疫複合体。
【請求項14】
請求項１に記載の分子をコードする、１種又は複数種の分離された核酸。
【請求項15】
請求項１に記載の分子、請求項１８に記載の結合ポリペプチド分子又は請求項１９に記載の免疫複合体と、免疫グロブリン分解酵素とを含む医薬組成物であって、前記免疫グロブリン分解酵素は残基２３６と２３７（ＥＵナンバリング）の間でＩｇＧ分子を切断でき、前記免疫グロブリン分解酵素は、ＩｄｅＳ、ＩｄｅＺ、ＩｄｅＥ、ＩｄｅＳＯＲＫ、Ｘｏｒｋ及びそれらの酵素の変異体であることが好ましい、医薬組成物。
【国際調査報告】