特表 2024-546168 レポータースクリーニングアッセイ用の品質管理

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-12-17

(54)【発明の名称】レポータースクリーニングアッセイ用の品質管理

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/02 20060101AFI20241210BHJP

   C12Q 1/6806 20180101ALI20241210BHJP

   C12Q 1/6844 20180101ALI20241210BHJP

   C12Q 1/6869 20180101ALI20241210BHJP

   C12N 15/09 20060101ALN20241210BHJP

【ＦＩ】

C12Q1/02

C12Q1/6806 Z

C12Q1/6844 Z

C12Q1/6869 Z

C12N15/09 Z

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024537422

(86)(22)【出願日】2022-12-20

(85)【翻訳文提出日】2024-08-19

(86)【国際出願番号】 US2022053472

(87)【国際公開番号】W WO2023122068

(87)【国際公開日】2023-06-29

(31)【優先権主張番号】63/292,841

(32)【優先日】2021-12-22

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＵＮＩＸ

(71)【出願人】

【識別番号】521229005

【氏名又は名称】オクタント，インク．

(74)【代理人】

【識別番号】110003797

【氏名又は名称】弁理士法人清原国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】バーガー，カーター

(72)【発明者】

【氏名】コスリ，スリラム

(72)【発明者】

【氏名】シンプキンス，スコット

(72)【発明者】

【氏名】タン，ジェフリー

【テーマコード（参考）】

4B063

【Ｆターム（参考）】

4B063QA01

4B063QA18

4B063QQ01

4B063QQ42

4B063QQ52

4B063QR32

4B063QR56

4B063QR62

4B063QS25

4B063QS36

(57)【要約】

【解決手段】本明細書では、対照核酸を用いて試料損失、混入、および最適ではないプロセス工程を検出して診断する、ハイスループットスクリーニングシステム用の品質保証の方法が記載される。
【選択図】図６

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ハイスループットスクリーニングシステム用の品質保証の方法であって、
（ａ）複数の細胞を含む第１の組成物を提供する工程と、
（ｂ）前記複数の細胞を溶解して溶解細胞組成物を得る工程であって、前記溶解細胞組成物は、第１の複数の対照核酸、第２の複数の対照核酸、または第１の複数の対照核酸および第２の複数の対照核酸を含む、工程と、
（ｃ）前記溶解細胞組成物の少なくとも一部、ならびに、第３の複数の対照核酸、第４の複数の対照核酸、または第３の複数の対照核酸および第４の複数の対照核酸を含む逆転写反応物を調製する工程と、
（ｄ）前記逆転写反応物を逆転写して逆転写核酸を得、任意選択で、前記逆転写核酸を増幅する工程と、
（ｅ）前記逆転写核酸を含むシーケンシングライブラリーを調製する工程と、
（ｆ）前記シーケンシングライブラリーに対して配列決定反応を行い、（ｉ）複数のレポーター、および（ｉｉ）前記第１の複数の対照核酸、前記第２の複数の対照核酸、前記第３の複数の対照核酸、または前記第４の複数の対照核酸のうちの１つ以上に関する配列情報を得る工程と
を含む、方法。

【請求項2】

前記溶解細胞組成物をＤＮＡ分解剤に接触させる工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記溶解細胞組成物を前記ＤＮＡ分解剤に接触させる前に、前記溶解細胞組成物を第５の複数の対照核酸に接触させる工程をさらに含む、請求項２に記載の方法。

【請求項4】

前記複数の細胞を検査薬に接触させる工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。

【請求項5】

前記複数の細胞を前記検査薬に接触させる工程は、工程（ｂ）の前である、請求項４に記載の方法。

【請求項6】

前記複数のレポーターに関する前記配列情報は、前記複数のレポーターのうちの少なくとも１つのレポーターに関するｍＲＮＡ発現レベルの情報を提供する、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項7】

前記少なくとも１つのレポーターは、バーコード配列を含む、請求項６に記載の方法。

【請求項8】

前記バーコード配列は、プロモーターエレメントおよび／またはエンハンサーエレメントに作動可能に連結される、請求項７に記載の方法。

【請求項9】

前記シーケンシングライブラリーに対して配列決定反応を行い、（ｉ）複数のレポーター、ならびに（ｉｉ）前記第１の複数の対照核酸、前記第２の複数の対照核酸、および前記第４の複数の対照核酸に関する配列情報を得る工程を含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項10】

前記第１の複数の対照核酸は、ＲＮＡ核酸を含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項11】

前記第１の複数の対照核酸は、前記複数の細胞を溶解する前に前記複数の細胞に添加される、請求項１０に記載の方法。

【請求項12】

前記第１の複数の対照核酸は、互いに区別可能な第１のヌクレオチド配列、第２のヌクレオチド配列、第３のヌクレオチド配列、および／または第４のヌクレオチド配列を含む、請求項１０または１１に記載の方法。

【請求項13】

前記複数のレポーターのうちの少なくとも１つのレポーターに関する配列情報を、前記第１の複数の対照核酸に基づいて正規化する工程をさらに含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項14】

前記第２の複数の対照核酸は、二本鎖ＤＮＡ核酸を含む、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項15】

前記第３の複数の対照核酸は、ＲＮＡ核酸を含む、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項16】

前記逆転写核酸内における前記第２の複数の対照核酸の相対的存在量を判定する工程をさらに含む、請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項17】

前記第４の複数の対照核酸は、一本鎖ＤＮＡ核酸を含む、請求項１～１６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項18】

前記複数のレポーター、前記第１の複数の対照核酸、前記第２の複数の対照核酸、および前記第４の複数の対照核酸の配列ではない対照配列を判定する工程をさらに含む、請求項１～１７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項19】

前記複数のレポーターは、少なくとも１０個のレポーター、少なくとも１００個のレポーター、少なくとも１，０００個のレポーター、少なくとも５，０００個のレポーター、少なくとも１０，０００個のレポーターを含む、請求項１～１８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項20】

前記少なくとも１０個のレポーター、前記少なくとも１００個のレポーター、前記少なくとも１，０００個のレポーター、前記少なくとも５，０００個のレポーター、前記少なくとも１０，０００個のレポーターはそれぞれ、固有のバーコード配列を含む、請求項１９に記載の方法。

【請求項21】

前記少なくとも１０個のレポーター、前記少なくとも１００個のレポーター、前記少なくとも１，０００個のレポーター、前記少なくとも５，０００個のレポーター、前記少なくとも１０，０００個のレポーターはそれぞれ、標的分子を固有に特定する、請求項１９または２０に記載の方法。

【請求項22】

前記標的分子は、前記複数の細胞によって核酸から発現されるポリペプチドである、請求項２１に記載の方法。

【請求項23】

前記第１の複数の対照核酸、前記第２の複数の対照核酸、前記第３の複数の対照核酸、前記第４の複数の対照核酸、または第５の複数の対照核酸のうちのいずれかの核酸のヌクレオチド配列を、後続の実験実行のために変更する工程を含む、請求項１～２２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項24】

前記配列決定反応は、ハイスループットシーケンシング反応である、請求項１～２３のいずれか一項に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

相互参照
本出願は、２０２１年１２月２２日出願の米国仮特許出願第６３／２９２，８４１号の利益を主張し、当該文献の全体は、引用によって本明細書に組み込まれる。

【背景技術】

【0002】

ハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）には、ある特定の条件下で最適に機能しない可能性がある複数の工程が含まれている場合がある。液体処理時の不備、最適ではない溶解工程、最適ではない酵素反応（ＤＮａｓｅ消化、逆転写、増幅、および配列決定を含む）、および混入により非効率がもたらされる場合がある。本明細書では、ハイスループットスクリーニングプロセス全体での非効率を管理するための方法およびプロセス工程が記載される。

【発明の概要】

【0003】

ハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）は、細胞の生物学について多くを明らかにし、新たな治療分子の開発を加速させる可能性を有している。しかしながら、エンドツーエンドプロセスとしてのＨＴＳには不確かさが伴い、その理由としては、最も有用なアッセイ（例えば、複数の直交読み出し（ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｒｅａｄｏｕｔ）を展開するもの）に、試料処理やデータ獲得中に変動やデータ損失がもたらされるからである。本明細書に記載される方法は、研究者が、より信頼性が高いデータを生成して信頼性に疑問のあるデータを除外することができるようにする。

【0004】

本明細書では、ハイスループットスクリーニングアッセイのデータ出力を改善する方法が記載される。本方法は、読み出しとして次世代シーケンシングを用いるアッセイに最も有用であるが、これは、そのようなアッセイが、変動、混入、および／またはデータ損失の複数の原因をもたらす可能性がある複数の工程を有しているからである。本明細書に記載される方法は、様々な工程においてエンドツーエンドプロセスに添加される対照核酸を使用する工程を含み、研究者が、信頼性のないデータを特定して除外することができるようにする。

【0005】

本明細書には、ハイスループットスクリーニングシステム用の品質保証の方法が記載され、該方法は、（ａ）複数の細胞を含む第１の組成物を提供する工程と、（ｂ）複数の細胞を溶解して溶解細胞組成物を得る工程であって、溶解細胞組成物は、第１の複数の対照核酸、および第２の複数の対照核酸、または第１の複数の対照核酸および第２の複数の対照核酸を含む、工程と、（ｃ）溶解細胞組成物の少なくとも一部、ならびに、第３の複数の対照核酸、第４の複数の対照核酸、または第３の複数の対照核酸および第４の複数の対照核酸を含む逆転写反応物を調製する工程と、（ｄ）逆転写反応物を逆転写して逆転写核酸を得る工程と、（ｅ）逆転写核酸を含むシーケンシングライブラリーを調製する工程と、（ｆ）シーケンシングライブラリーに対して配列決定反応を行い、（ｉ）複数のレポーター、および（ｉｉ）第１の複数の対照核酸、第２の複数の対照核酸、第３の複数の対照核酸、または第４の複数の対照核酸のうちの１つ以上に関する配列情報を得る工程とを含む。ある特定の実施形態では、本方法は、溶解細胞組成物をＤＮＡ分解剤に接触させる工程をさらに含む。ある特定の実施形態では、本方法は、溶解細胞組成物をＤＮＡ分解剤に接触させる前に、溶解細胞組成物を第５の複数の対照核酸に接触させる工程をさらに含む。ある特定の実施形態では、本方法は、複数の細胞を検査薬に接触させる工程をさらに含む。ある特定の実施形態では、複数の細胞を検査薬に接触させる工程は、工程（ｂ）の前である。ある特定の実施形態では、複数のレポーターに関する配列決定情報は、複数のレポーターのうちの少なくとも１つのレポーターに関するｍＲＮＡ発現レベルの情報を提供する。ある特定の実施形態では、少なくとも１つのレポーターは、バーコード配列を含む。ある特定の実施形態では、バーコード配列は、プロモーターエレメントおよび／またはエンハンサーエレメントに作動可能に連結される。ある特定の実施形態では、本方法は、シーケンシングライブラリーに対して配列決定反応を行い、（ｉ）複数のレポーター、ならびに（ｉｉ）第１の複数の対照核酸、第２の複数の対照核酸、および第４の複数の対照核酸に関する配列決定情報を得る工程をさらに含む。ある特定の実施形態では、第１の複数の対照核酸は、ＲＮＡ核酸を含む。ある特定の実施形態では、第１の複数の対照核酸は、溶解前に複数の細胞に添加される。ある特定の実施形態では、第１の複数の対照核酸は、互いに区別可能な第１のヌクレオチド配列、第２のヌクレオチド配列、第３のヌクレオチド配列、および／または第４のヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、本方法は、複数のレポーターのうちの少なくとも１つのレポーターに関する配列情報を、第１の複数の対照核酸に対して正規化する工程をさらに含む。ある特定の実施形態では、第２の複数の対照核酸は、二本鎖ＤＮＡ核酸を含む。ある特定の実施形態では、第３の複数の対照核酸は、ＲＮＡ核酸を含む。ある特定の実施形態では、本方法は、逆転写核酸内における第２の複数の対照核酸の相対的存在量を判定する工程をさらに含む。ある特定の実施形態では、第４の複数の対照核酸は、一本鎖ＤＮＡ核酸を含む。ある特定の実施形態では、本方法は、複数のレポーター、第１の複数の対照核酸、第２の複数の対照核酸、および第４の複数の対照核酸の配列ではない対照配列を判定する工程をさらに含む。ある特定の実施形態では、複数のレポーターは、少なくとも１０個のレポーター、少なくとも１００個のレポーター、少なくとも１，０００個のレポーター、少なくとも５，０００個のレポーター、少なくとも１０，０００個のレポーターを含む。ある特定の実施形態では、少なくとも１０個のレポーター、少なくとも１００個のレポーター、少なくとも１，０００個のレポーター、少なくとも５，０００個のレポーター、少なくとも１０，０００個のレポーターはそれぞれ、固有のバーコード配列を含む。ある特定の実施形態では、少なくとも１０個のレポーター、少なくとも１００個のレポーター、少なくとも１，０００個のレポーター、少なくとも５，０００個のレポーター、少なくとも１０，０００個のレポーターはそれぞれ、標的分子を固有に特定する。ある特定の実施形態では、標的分子は、複数の細胞によって発現されるポリペプチドである。ある特定の実施形態では、配列決定反応は、ハイスループットシーケンシング反応である。

【図面の簡単な説明】

【0006】

本明細書で説明される新規な特徴は、添付の特許請求の範囲に具体的に示されている。本明細書で説明される特徴の原理が用いられている例示的な例が示されている以下の詳細な説明と添付の図面を参照することによって、本明細書で説明される特徴とその特徴の利点についてのよりよい理解が得られるであろう。

【0007】

【図1】ＨＴＳアッセイからの例示的な次世代シーケンシング読み取り出力を示す。点線より下のリード数を有するウェルは棄却した。

【図2】棄却したウェルのプレートマップを、本明細書に記載される品質管理基準を使用して生成して示す。

【図3】ＤＮＡｓｅで処理する前後の試料の二本鎖ＤＮＡ対照スパイクインのリードカウントを示す。

【図4】逆転写で処理する前後の試料の一本鎖ＤＮＡ対照スパイクインのリードカウントを示す。

【図5】１つ以上の工程を行った後の様々な複数の対照核酸のリードカウントを示す。

【図6】様々な複数の核酸スパイクを添加した例示的なプロセスを示す。

【図7】様々な複数の核酸のリードカウントを示す。

【図8】様々なアッセイおよびアッセイ内の工程に関して工程性能および信頼性のあるデータを分析するための関連比率を示す。

【発明を実施するための形態】

【0008】

以下の説明では、様々な実施形態を完全に理解できるように、ある特定の詳細が示されている。しかし、当業者であれば、これらの詳細なしに、提供される実施形態が実践されてもよいことを理解するであろう。文脈上特に必要としない限り、本明細書と後述する特許請求の範囲全体にわたり、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という語およびその変形（「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」および「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」など）は、開放的で包括的な意味、つまり、「含むが、限定されない（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ，ｂｕｔ ｎｏｔ ｌｉｍｉｔｅｄ）」として解釈されるものとする。明細書と添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、その内容が他に明確に指示していない限り、複数の指示対象を含む。「または」という用語は概して、その内容が他に明確に指示していない限り、「および／または」を含む意味で用いられていることにも留意されたい。さらに、本明細書に提供される見出しは、便宜上のものであり、請求される実施形態の範囲や意味の解釈を行うものではない。

【0009】

本明細書で使用される場合、「約」という用語は、示される量の１０％以下付近の量を指す。

【0010】

「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語は、アミノ酸残基のポリマーを指すように互換可能に使用され、最小長に限定されるものではない。提供される標的ポリペプチド、例えば、リンカーおよび結合ペプチドを含むポリペプチドは、天然アミノ酸残基および／または非天然アミノ酸残基を含むアミノ酸残基を含んでもよい。この用語はまた、例えば、グリコシル化、シアリル化、アセチル化、リン酸化など、ポリペプチドの発現後修飾を含む。いくつかの態様では、ポリペプチドは、タンパク質が所望の活性を維持する限り、生来または天然の配列に対する修飾を含んでもよい。これらの修飾は、部位特異的突然変異導入によるもののように意図的であってよく、あるいはタンパク質を産生する宿主の突然変異またはＰＣＲ増幅による不備によるもののように偶発的であってもよい。

【0011】

基準ポリペプチド配列に関する配列同一性パーセント（％）は、配列をアライメントし、最大の配列同一性パーセントが得られるように必要に応じてギャップを導入した後に、基準ポリペプチド配列中のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基の割合であり、いかなる保存的置換も配列同一性の一部と見なさない。アミノ酸配列同一性パーセントを判定する目的のアライメントは、公知の様々な手段、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮ、またはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアといった公的に入手可能なコンピュータソフトウェアを使用して、達成することができる。比較される配列の全長にわたって最大のアライメントを達成するのに必要なアルゴリズムを含む、配列をアライメントするのに適切なパラメータを判定することができる。しかしながら、本明細書における目的のためには、％アミノ酸配列同一性の値は、配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ－２を使用して生成される。ＡＬＩＧＮ－２配列比較コンピュータプログラムは、ジェネンテック社によって著作され、ソースコードは米国著作権庁、ワシントンＤ．Ｃ．，２０５５９に使用者用書類とともに提出され、米国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７で登録されている。ＡＬＩＧＮ－２プログラムは、ジェネンテック社（カリフォルニア州、南サンフランシスコ）から公的に入手可能であり、あるいはそのソースコードからコンパイルしてもよい。ＡＬＩＧＮ－２プログラムは、デジタルＵＮＩＸのＶ４．０Ｄを含むＵＮＩＸオペレーティングシステムでの使用のためにコンパイルされる。すべての配列比較パラメータは、ＡＬＩＧＮ－２プログラムによって設定され、変動しない。

【0012】

アミノ酸配列比較にＡＬＩＧＮ－２が用いられる状況では、所与のアミノ酸配列Ａの、所与のアミノ酸配列Ｂへの、それとの、またはそれに対する％アミノ酸配列同一性（代わりに、所与のアミノ酸配列Ｂへの、それとの、またはそれに対するある特定の％アミノ酸配列同一性を有するか、これを含む所与のアミノ酸配列Ａと言うこともできる）は次のように計算される。ＸがＡおよびＢのそのプログラムのアライメントにて配列アライメントプログラムＡＬＩＧＮ－２によって同一の一致としてスコア化されたアミノ酸残基の数であり、ＹがＢにおけるアミノ酸残基の総数である分数Ｘ／Ｙを１００倍する。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと同等ではない場合、Ｂに対するＡの％アミノ酸配列同一性はＡに対するＢの％アミノ酸配列同一性と同等ではないことが理解されるであろう。具体的に言及されない限り、本明細書で使用される％アミノ酸配列同一性の値はすべて、ＡＬＩＧＮ－２コンピュータプログラムを使用して直前の段落に記載されているように得られる。

【0013】

本明細書に記載されるポリペプチドは、核酸によってコードできる。核酸は、２つ以上のヌクレオチド塩基を含むポリヌクレオチドの一種である。ある特定の実施形態において、核酸は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを細胞に転写するために使用できるベクターの成分である。本明細書で使用される場合、「ベクター」という用語は、それが連結している別の核酸を輸送可能な核酸分子を指す。ベクターの一種は、宿主細胞の染色体ＤＮＡに組み込まれることができるゲノム組み込み型ベクターまたは「組み込み型ベクター」である。ベクターの別の一種は、「エピソーマル」ベクター、例えば、染色体外で複製可能な核酸である。作動可能に連結している遺伝子の発現を指向することが可能なベクターは、本明細書において「発現ベクター」と呼ばれる。好適なベクターは、プラスミド、細菌人工染色体、酵母人工染色体、ウイルスベクターなどを含む。発現ベクターにおいて、転写を制御するために使用される、プロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化シグナルなどの調節エレメントは、哺乳動物、細菌、ウイルス、または昆虫遺伝子由来であってもよい。通常、複製起点によって付与される宿主中での複製能や、形質転換体の認識を容易にするための選択遺伝子をさらに取り込むことができる。ウイルス、例えば、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルスなどに由来するベクターを用いてもよい。プラスミドベクターは、染色体位置への組み込みのために線形化することができる。ベクターは、ゲノム内の規定された位置または制限された部位のセットに部位特異的な組み込み（例えば、ＡｔｔＰ－ＡｔｔＢ組み換え）を導く配列を含んでもよい。さらに、ベクターは、転移可能エレメント由来の配列を含んでもよい。

【0014】

本明細書で使用される場合、基準配列に対して、アミノ酸配列または核酸配列に対して記載するために本明細書に使用される場合、「相同性である」、「相同性」、または「相同性パーセント」という用語は、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８７巻：２２６４～２２６８頁、１９９０年、ｍｏｄｉｆｉｅｄ ａｓ ｉｎ Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０巻：５８７３～５８７７頁、１９９３年）によって記載される式を使用して判定され得る。係る式は、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ． （Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２１５巻：４０３～４１０頁、１９９０年）のｂａｓｉｃ ｌｏｃａｌ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｓｅａｒｃｈ ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）プログラムに組み入れられる。配列の相同性パーセントは、本出願の出願日の時点での、ＢＬＡＳＴの最も最近のバージョンを使用して判定されてもよい。

【0015】

アッセイ
本明細書では、ハイスループットスクリーニングアッセイ用の品質管理の方法が記載される。このようなアッセイは、細胞ベースであり、異なる潜在的な標的ポリペプチドを発現する複数の細胞を含む。標的ポリペプチドに対する、例えば小分子またはポリペプチドのスクリーニングライブラリーの活性は、標的ポリペプチドによって活性化され得る様々なレポーターアッセイ、または下流の媒介物質による標的ポリペプチドの活性を使用して判定できる。ある特定の実施形態では、レポーターは、標的ポリペプチドに固有にマッピングされ、ポリペプチドにおける活性を配列決定アッセイによって判定できるようにするバーコード（例えば、インデックス配列。本明細書では「固有の分子識別子」とも呼ばれる）を含む。概して、異なる標的ポリペプチドを含む細胞のライブラリーは、バーコードによって固有に標識された少なくとも１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、または１０００個以上の異なるポリペプチドを含んでもよい。本開示のアッセイは、９６ウェルプレート、３８４ウェルプレート、または１，５３６ウェルプレートで実施できる。レポーターはまた、概して、レポーターの活性化を標識することができる視覚的に追跡可能な遺伝子（例えば、蛍光または発光レポーター遺伝子）を含んでもよい。本明細書に記載されるアッセイでは、異なる標的ポリペプチド（およびバーコード）を含む異なる細胞が、同じウェルに存在してもよい。ある特定の実施形態では、複数の細胞のうちのいくつかまたはすべてが、特定の標的を発現しない場合があり、ＵＭＩを含む生物学的レポーターを含んでもよい。このような生物学的レポーターは、ＵＭＩに作動可能に連結されたプロモーター、リプレッサー、またはエンハンサーエレメント、および任意選択でルシフェラーゼ酵素または蛍光タンパク質などの追加のレポーター遺伝子を含んでもよい。

【0016】

本明細書に記載される方法によるアッセイ設計の非限定的な例は、１）ウェルプレートのウェルに細胞を播種する工程と、２）細胞を検査薬に接触させて、検査薬がレポーターの活性化（例えば、バーコードの発現）に影響を及ぼす時間を与える工程と、３）細胞を溶解して細胞から核酸を放出させる工程と、４）溶解物をＤＮＡｓｅ処理し、混入ゲノムＤＮＡを除去する工程と、５）逆転写されたｍＲＮＡを逆転写および／または増幅し、ｃＤＮＡまたは増幅されたｃＤＮＡ（例えば、ＲＴ－ＰＣＲ）を作製する工程と、６）次世代配列決定反応のためにｃＤＮＡを調製する工程と、７）調製したｃＤＮＡを配列決定する工程とを含んでもよい。上記の工程は、アッセイのウェルごとに実施され得る。工程３）～７）に関して、細胞をウェルに播種して検査薬で処理した後に様々な核酸が放出および／または処理される。溶解工程に関して、核酸は細胞から放出される。これらの核酸は、二本鎖ＤＮＡを切断して除去するＤＮＡｓｅで処理されてもよい。その後、ＲＮＡは、逆転写によって一本鎖ＤＮＡに逆転写され、その後、ＰＣＲによってさらに増幅され、二本鎖ＤＮＡが生じる。ゆえに、アッセイの工程を通して、複数の核酸が導入および／または生成され、核酸のそれぞれが配列決定され特定されてもよい。様々な工程中に添加される対照核酸の他、各工程中、または、ある特定の実施形態では最後の配列決定段階に対照核酸配列（プロセス工程中にアッセイのウェルに添加される場合、本明細書では様々な核酸「スパイクイン」とも呼ばれる）を使用して検出されるリードカウント、量、または対照核酸の比率を使用して、各工程の効果が評価されてもよい。

【0017】

上記の非限定的な例の各工程について、ある特定の条件が各工程の効果（例えば、どのくらいの細胞が溶解工程中に溶解されるか、ＤＮａｓｅ工程の効率、どのくらいのｃＤＮＡまたは増幅されたｃＤＮＡが逆転写工程中に作製されるかなど）に影響を及ぼす場合があり、これが、ｃＤＮＡのどれくらいのリードがその工程に関連または変換されるかに影響を及ぼす場合があり、これが、異なる条件を有するアッセイを使用する場合にどのような条件がより良好な性能または移動につながるかを示す。以下に記載されるように、本方法全体にわたって特定できる対照核酸の使用により、各工程がどのくらい効率的であるかの指標を可能にし、結果として、当該工程が可能な限り効率的であるように条件を変更することによって工程の最適化につなげることができる。また、これらのプロセス対照は、アッセイまたはプレートにわたってデータを正規化して比較する能力を増加させることができる。また、これらのプロセス対照は、分析から除外されるべきアッセイの区画またはウェルを特定することができる。

【0018】

さらに、様々な工程中の様々な対照核酸のリードカウントは、当該プロセスの各工程が効率的に行われたか否かを示すことができる。例えば、溶解工程中に１０，０００個の核酸（例えば、ＤＮＡスパイクイン）がウェルに添加され、核酸が切断されることが意図されるＤＮａｓｅ工程後にこれらの１０，０００個の核酸が残り、これらの核酸のリードカウントが１０，０００である場合は、その特定のウェルにおいてＤＮａｓｅ工程が効率的ではなく、ゆえに、当該データは除外されるべきであると判定できる。逆に、ＲＮＡスパイクインが最終的にＤＮＡに変換されることが予想されるＲＴ－ＰＣＲ中に１０，０００個のＲＮＡスパイクインが添加され、予想されるリードカウントが５，０００リードであるにもかかわらず、ＲＴ－ＰＣＲ工程の終了時に算出されるＤＮＡのリードカウントが１０，０００リードである場合、実際のリードカウントが予想されるリードカウントよりもはるかに大きいので、アッセイの少なくとも１つの工程またはアッセイの測定が誤りであるか、非効率的であるかのいずれかであり、ゆえに、そのウェルからのデータは除外されるべきであると判定できる。

【0019】

対照核酸
溶解工程、ＤＮａｓｅ工程、逆転写反応、ＲＴ－ＰＣＲ反応、または次世代シーケンシングライブラリー調製反応のうちの１つ以上の間に対照核酸が添加されてもよい。対照核酸は、異なる種類の対照核酸内で異なる既知の配列を含み、異なるプロセス工程における変動性を特定することができる。

【0020】

図６は、上述のように、溶解工程、ＤＮａｓｅ工程、およびＲＴ－ＰＣＲ工程などの様々な工程の間に対照核酸が添加される例示的なプロセスを示す。アッセイの工程中にウェルに添加される場合、対照核酸は、種々の核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）の「スパイクイン」と称されてもよい。対照核酸の既知の量と、後に配列決定される核酸のリード量とを比較することで、各工程の効果について洞察がもたらされる。各工程で添加される対照核酸の量は変化してもよい。さらに、対照核酸の量は、各工程の効果を妨害しないように、ある範囲（例えば、複数の核酸中、１，０００～１０，０００個の対照核酸）内に制限されてもよい。例えば、ある工程中に添加される対照核酸の量が少なすぎる場合、工程を較正（例えば、工程の１つ以上の条件を変更）したり、好ましいリードカウント（例えば、ウェルあたり１，０００リード）を得たりするのに十分な対照核酸が添加されていない。逆に、添加される対照核酸の量が多すぎると、当該工程の観測可能な性能を妨害し（例えば、核酸スパイクインが多すぎる場合があり、これが、レポーターによって生成されたＵＭＩから読み取りを得るために利用可能な試薬を過剰に使用する）、ゆえに、リードカウントにも影響を及ぼす。

【0021】

対照核酸は、絶対数（または絶対数と同等の濃度）に基づいて、種々のプロセス工程において試料に添加されてもよい。いくつかの実施形態では、特定のプロセス工程で添加される対照核酸（例えば、ＲＮＡまたはＤＮＡスパイクイン）の量は、約１，０００個の核酸から約５０，０００個の核酸を含む。いくつかの実施形態では、核酸（例えば、ＲＮＡまたはＤＮＡスパイクイン）の量は、約１，０００個の核酸から約２，０００個の核酸、約１，０００個の核酸から約３，０００個の核酸、約１，０００個の核酸から約４，０００個の核酸、約１，０００個の核酸から約５，０００個の核酸、約１，０００個の核酸から約７，５００個の核酸、約１，０００個の核酸から約１０，０００個の核酸、約１，０００個の核酸から約１２，５００個の核酸、約１，０００個の核酸から約１５，０００個の核酸、約１，０００個の核酸から約２０，０００個の核酸、約１，０００個の核酸から約３０，０００個の核酸、約１，０００個の核酸から約５０，０００個の核酸、約２，０００個の核酸から約３，０００個の核酸、約２，０００個の核酸から約４，０００個の核酸、約２，０００個の核酸から約５，０００個の核酸、約２，０００個の核酸から約７，５００個の核酸、約２，０００個の核酸から約１０，０００個の核酸、約２，０００個の核酸から約１２，５００個の核酸、約２，０００個の核酸から約１５，０００個の核酸、約２，０００個の核酸から約２０，０００個の核酸、約２，０００個の核酸から約３０，０００個の核酸、約２，０００個の核酸から約５０，０００個の核酸、約３，０００個の核酸から約４，０００個の核酸、約３，０００個の核酸から約５，０００個の核酸、約３，０００個の核酸から約７，５００個の核酸、約３，０００個の核酸から約１０，０００個の核酸、約３，０００個の核酸から約１２，５００個の核酸、約３，０００個の核酸から約１５，０００個の核酸、約３，０００個の核酸から約２０，０００個の核酸、約３，０００個の核酸から約３０，０００個の核酸、約３，０００個の核酸から約５０，０００個の核酸、約４，０００個の核酸から約５，０００個の核酸、約４，０００個の核酸から約７，５００個の核酸、約４，０００個の核酸から約１０，０００個の核酸、約４，０００個の核酸から約１２，５００個の核酸、約４，０００個の核酸から約１５，０００個の核酸、約４，０００個の核酸から約２０，０００個の核酸、約４，０００個の核酸から約３０，０００個の核酸、約４，０００個の核酸から約５０，０００個の核酸、約５，０００個の核酸から約７，５００個の核酸、約５，０００個の核酸から約１０，０００個の核酸、約５，０００個の核酸から約１２，５００個の核酸、約５，０００個の核酸から約１５，０００個の核酸、約５，０００個の核酸から約２０，０００個の核酸、約５，０００個の核酸から約３０，０００個の核酸、約５，０００個の核酸から約５０，０００個の核酸、約７，５００個の核酸から約１０，０００個の核酸、約７，５００個の核酸から約１２，５００個の核酸、約７，５００個の核酸から約１５，０００個の核酸、約７，５００個の核酸から約２０，０００個の核酸、約７，５００個の核酸から約３０，０００個の核酸、約７，５００個の核酸から約５０，０００個の核酸、約１０，０００個の核酸から約１２，５００個の核酸、約１０，０００個の核酸から約１５，０００個の核酸、約１０，０００個の核酸から約２０，０００個の核酸、約１０，０００個の核酸から約３０，０００個の核酸、約１０，０００個の核酸から約５０，０００個の核酸、約１２，５００個の核酸から約１５，０００個の核酸、約１２，５００個の核酸から約２０，０００個の核酸、約１２，５００個の核酸から約３０，０００個の核酸、約１２，５００個の核酸から約５０，０００個の核酸、約１５，０００個の核酸から約２０，０００個の核酸、約１５，０００個の核酸から約３０，０００個の核酸、約１５，０００個の核酸から約５０，０００個の核酸、約２０，０００個の核酸から約３０，０００個の核酸、約２０，０００個の核酸から約５０，０００個の核酸、または約３０，０００個の核酸から約５０，０００個の核酸を含む。いくつかの実施形態では、核酸（例えば、ＲＮＡまたはＤＮＡスパイクイン）の量は、約１，０００個の核酸、約２，０００個の核酸、約３，０００個の核酸、約４，０００個の核酸、約５，０００個の核酸、約７，５００個の核酸、約１０，０００個の核酸、約１２，５００個の核酸、約１５，０００個の核酸、約２０，０００個の核酸、約３０，０００個の核酸、または約５０，０００個の核酸を含む。いくつかの実施形態では、核酸（例えば、ＲＮＡまたはＤＮＡスパイクイン）の量は、少なくとも約１，０００個の核酸、約２，０００個の核酸、約３，０００個の核酸、約４，０００個の核酸、約５，０００個の核酸、約７，５００個の核酸、約１０，０００個の核酸、約１２，５００個の核酸、約１５，０００個の核酸、約２０，０００個の核酸、または約３０，０００個の核酸を含む。いくつかの実施形態では、核酸（例えば、ＲＮＡまたはＤＮＡスパイクイン）の量は、最大で約２，０００個の核酸、約３，０００個の核酸、約４，０００個の核酸、約５，０００個の核酸、約７，５００個の核酸、約１０，０００個の核酸、約１２，５００個の核酸、約１５，０００個の核酸、約２０，０００個の核酸、約３０，０００個の核酸、または約５０，０００個の核酸を含む。これらのスパイクインは、ｄｓＤＮＡ、ｓｓＤＮＡ、ｓｓＲＮＡ、またはこれらの組み合わせを含んでもよい。ウェル中の核酸の濃度を判定するために核酸の量（例えば、リードカウント／絶対数）が使用されてもよく、ウェル中の核酸の量を判定するためにウェル中の核酸の濃度が使用されてもよい。いくつかの実施形態では、既知量の核酸が、方法または工程の開始時にウェルに添加されてもよく、核酸の濃度は、方法または工程が実施された後に判定されてもよい。

【0022】

いくつかの実施形態では、アッセイの様々な工程に添加される対照核酸によって、異なる複数の対照核酸のすべてについてある特定の総リード数がもたらされ、アッセイにおけるウェルあたりの予想されるリードカウントは、対照核酸の約１，０００リードである。いくつかの実施形態では、アッセイにおけるウェルあたりのリードカウントは、約０個の対照核酸から約１５０個の対照核酸である。いくつかの実施形態では、アッセイにおけるウェルあたりのリードカウントは、約０個の対照核酸から約５個の対照核酸、約０個の対照核酸から約１０個の対照核酸、約０個の対照核酸から約１５個の対照核酸、約０個の対照核酸から約２０個の対照核酸、約０個の対照核酸から約２５個の対照核酸、約０個の対照核酸から約３０個の対照核酸、約０個の対照核酸から約４０個の対照核酸、約０個の対照核酸から約５０個の対照核酸、約０個の対照核酸から約７５個の対照核酸、約０個の対照核酸から約１００個の対照核酸、約０個の対照核酸から約１５０個の対照核酸、約５個の対照核酸から約１０個の対照核酸、約５個の対照核酸から約１５個の対照核酸、約５個の対照核酸から約２０個の対照核酸、約５個の対照核酸から約２５個の対照核酸、約５個の対照核酸から約３０個の対照核酸、約５個の対照核酸から約４０個の対照核酸、約５個の対照核酸から約５０個の対照核酸、約５個の対照核酸から約７５個の対照核酸、約５個の対照核酸から約１００個の対照核酸、約５個の対照核酸から約１５０個の対照核酸、約１０個の対照核酸から約１５個の対照核酸、約１０個の対照核酸から約２０個の対照核酸、約１０個の対照核酸から約２５個の対照核酸、約１０個の対照核酸から約３０個の対照核酸、約１０個の対照核酸から約４０個の対照核酸、約１０個の対照核酸から約５０個の対照核酸、約１０個の対照核酸から約７５個の対照核酸、約１０個の対照核酸から約１００個の対照核酸、約１０個の対照核酸から約１５０個の対照核酸、約１５個の対照核酸から約２０個の対照核酸、約１５個の対照核酸から約２５個の対照核酸、約１５個の対照核酸から約３０個の対照核酸、約１５個の対照核酸から約４０個の対照核酸、約１５個の対照核酸から約５０個の対照核酸、約１５個の対照核酸から約７５個の対照核酸、約１５個の対照核酸から約１００個の対照核酸、約１５個の対照核酸から約１５０個の対照核酸、約２０個の対照核酸から約２５個の対照核酸、約２０個の対照核酸から約３０個の対照核酸、約２０個の対照核酸から約４０個の対照核酸、約２０個の対照核酸から約５０個の対照核酸、約２０個の対照核酸から約７５個の対照核酸、約２０個の対照核酸から約１００個の対照核酸、約２０個の対照核酸から約１５０個の対照核酸、約２５個の対照核酸から約３０個の対照核酸、約２５個の対照核酸から約４０個の対照核酸、約２５個の対照核酸から約５０個の対照核酸、約２５個の対照核酸から約７５個の対照核酸、約２５個の対照核酸から約１００個の対照核酸、約２５個の対照核酸から約１５０個の対照核酸、約３０個の対照核酸から約４０個の対照核酸、約３０個の対照核酸から約５０個の対照核酸、約３０個の対照核酸から約７５個の対照核酸、約３０個の対照核酸から約１００個の対照核酸、約３０個の対照核酸から約１５０個の対照核酸、約４０個の対照核酸から約５０個の対照核酸、約４０個の対照核酸から約７５個の対照核酸、約４０個の対照核酸から約１００個の対照核酸、約４０個の対照核酸から約１５０個の対照核酸、約５０個の対照核酸から約７５個の対照核酸、約５０個の対照核酸から約１００個の対照核酸、約５０個の対照核酸から約１５０個の対照核酸、約７５個の対照核酸から約１００個の対照核酸、約７５個の対照核酸から約１５０個の対照核酸、または約１００個の対照核酸から約１５０個の対照核酸である。いくつかの実施形態では、アッセイにおけるウェルあたりのリードカウントは、約０個の対照核酸、約５個の対照核酸、約１０個の対照核酸、約１５個の対照核酸、約２０個の対照核酸、約２５個の対照核酸、約３０個の対照核酸、約４０個の対照核酸、約５０個の対照核酸、約７５個の対照核酸、約１００個の対照核酸、または約１５０個の対照核酸である。いくつかの実施形態では、アッセイにおけるウェルあたりのリードカウントは、少なくとも約０個の対照核酸、約５個の対照核酸、約１０個の対照核酸、約１５個の対照核酸、約２０個の対照核酸、約２５個の対照核酸、約３０個の対照核酸、約４０個の対照核酸、約５０個の対照核酸、約７５個の対照核酸、または約１００個の対照核酸である。いくつかの実施形態では、アッセイにおけるウェルあたりのリードカウントは、最大で約５個の対照核酸、約１０個の対照核酸、約１５個の対照核酸、約２０個の対照核酸、約２５個の対照核酸、約３０個の対照核酸、約４０個の対照核酸、約５０個の対照核酸、約７５個の対照核酸、約１００個の対照核酸、または約１５０個の対照核酸である。いくつかの実施形態では、アッセイにおけるウェルあたりのリードカウントは、約１００個の対照核酸から約１，５００個の対照核酸である。いくつかの実施形態では、アッセイにおけるウェルあたりのリードカウントは、約１００個の対照核酸から約２００個の対照核酸、約１００個の対照核酸から約３００個の対照核酸、約１００個の対照核酸から約４００個の対照核酸、約１００個の対照核酸から約５００個の対照核酸、約１００個の対照核酸から約６００個の対照核酸、約１００個の対照核酸から約７００個の対照核酸、約１００個の対照核酸から約８００個の対照核酸、約１００個の対照核酸から約９００個の対照核酸、約１００個の対照核酸から約１，０００個の対照核酸、約１００個の対照核酸から約１，２５０個の対照核酸、約１００個の対照核酸から約１，５００個の対照核酸、約２００個の対照核酸から約３００個の対照核酸、約２００個の対照核酸から約４００個の対照核酸、約２００個の対照核酸から約５００個の対照核酸、約２００個の対照核酸から約６００個の対照核酸、約２００個の対照核酸から約７００個の対照核酸、約２００個の対照核酸から約８００個の対照核酸、約２００個の対照核酸から約９００個の対照核酸、約２００個の対照核酸から約１，０００個の対照核酸、約２００個の対照核酸から約１，２５０個の対照核酸、約２００個の対照核酸から約１，５００個の対照核酸、約３００個の対照核酸から約４００個の対照核酸、約３００個の対照核酸から約５００個の対照核酸、約３００個の対照核酸から約６００個の対照核酸、約３００個の対照核酸から約７００個の対照核酸、約３００個の対照核酸から約８００個の対照核酸、約３００個の対照核酸から約９００個の対照核酸、約３００個の対照核酸から約１，０００個の対照核酸、約３００個の対照核酸から約１，２５０個の対照核酸、約３００個の対照核酸から約１，５００個の対照核酸、約４００個の対照核酸から約５００個の対照核酸、約４００個の対照核酸から約６００個の対照核酸、約４００個の対照核酸から約７００個の対照核酸、約４００個の対照核酸から約８００個の対照核酸、約４００個の対照核酸から約９００個の対照核酸、約４００個の対照核酸から約１，０００個の対照核酸、約４００個の対照核酸から約１，２５０個の対照核酸、約４００個の対照核酸から約１，５００個の対照核酸、約５００個の対照核酸から約６００個の対照核酸、約５００個の対照核酸から約７００個の対照核酸、約５００個の対照核酸から約８００個の対照核酸、約５００個の対照核酸から約９００個の対照核酸、約５００個の対照核酸から約１，０００個の対照核酸、約５００個の対照核酸から約１，２５０個の対照核酸、約５００個の対照核酸から約１，５００個の対照核酸、約６００個の対照核酸から約７００個の対照核酸、約６００個の対照核酸から約８００個の対照核酸、約６００個の対照核酸から約９００個の対照核酸、約６００個の対照核酸から約１，０００個の対照核酸、約６００個の対照核酸から約１，２５０個の対照核酸、約６００個の対照核酸から約１，５００個の対照核酸、約７００個の対照核酸から約８００個の対照核酸、約７００個の対照核酸から約９００個の対照核酸、約７００個の対照核酸から約１，０００個の対照核酸、約７００個の対照核酸から約１，２５０個の対照核酸、約７００個の対照核酸から約１，５００個の対照核酸、約８００個の対照核酸から約９００個の対照核酸、約８００個の対照核酸から約１，０００個の対照核酸、約８００個の対照核酸から約１，２５０個の対照核酸、約８００個の対照核酸から約１，５００個の対照核酸、約９００個の対照核酸から約１，０００個の対照核酸、約９００個の対照核酸から約１，２５０個の対照核酸、約９００個の対照核酸から約１，５００個の対照核酸、約１，０００個の対照核酸から約１，２５０個の対照核酸、約１，０００個の対照核酸から約１，５００個の対照核酸、または約１，２５０個の対照核酸から約１，５００個の対照核酸である。いくつかの実施形態では、アッセイにおけるウェルあたりのリードカウントは、約１００個の対照核酸、約２００個の対照核酸、約３００個の対照核酸、約４００個の対照核酸、約５００個の対照核酸、約６００個の対照核酸、約７００個の対照核酸、約８００個の対照核酸、約９００個の対照核酸、約１，０００個の対照核酸、約１，２５０個の対照核酸、または約１，５００個の対照核酸である。いくつかの実施形態では、アッセイにおけるウェルあたりのリードカウントは、少なくとも約１００個の対照核酸、約２００個の対照核酸、約３００個の対照核酸、約４００個の対照核酸、約５００個の対照核酸、約６００個の対照核酸、約７００個の対照核酸、約８００個の対照核酸、約９００個の対照核酸、約１，０００個の対照核酸、または約１，２５０個の対照核酸である。いくつかの実施形態では、アッセイにおけるウェルあたりのリードカウントは、最大で約２００個の対照核酸、約３００個の対照核酸、約４００個の対照核酸、約５００個の対照核酸、約６００個の対照核酸、約７００個の対照核酸、約８００個の対照核酸、約９００個の対照核酸、約１，０００個の対照核酸、約１，２５０個の対照核酸、または約１，５００個の対照核酸である。いくつかの実施形態では、アッセイにおけるウェルあたりのリードカウントは、約５００個の対照核酸から約１５，０００個の対照核酸である。いくつかの実施形態では、アッセイにおけるウェルあたりのリードカウントは、約５００個の対照核酸から約７５０個の対照核酸、約５００個の対照核酸から約１，０００個の対照核酸、約５００個の対照核酸から約１，２５０個の対照核酸、約５００個の対照核酸から約１，５００個の対照核酸、約５００個の対照核酸から約２，０００個の対照核酸、約５００個の対照核酸から約３，０００個の対照核酸、約５００個の対照核酸から約４，０００個の対照核酸、約５００個の対照核酸から約５，０００個の対照核酸、約５００個の対照核酸から約７，５００個の対照核酸、約５００個の対照核酸から約１０，０００個の対照核酸、約５００個の対照核酸から約１５，０００個の対照核酸、約７５０個の対照核酸から約１，０００個の対照核酸、約７５０個の対照核酸から約１，２５０個の対照核酸、約７５０個の対照核酸から約１，５００個の対照核酸、約７５０個の対照核酸から約２，０００個の対照核酸、約７５０個の対照核酸から約３，０００個の対照核酸、約７５０個の対照核酸から約４，０００個の対照核酸、約７５０個の対照核酸から約５，０００個の対照核酸、約７５０個の対照核酸から約７，５００個の対照核酸、約７５０個の対照核酸から約１０，０００個の対照核酸、約７５０個の対照核酸から約１５，０００個の対照核酸、約１，０００個の対照核酸から約１，２５０個の対照核酸、約１，０００個の対照核酸から約１，５００個の対照核酸、約１，０００個の対照核酸から約２，０００個の対照核酸、約１，０００個の対照核酸から約３，０００個の対照核酸、約１，０００個の対照核酸から約４，０００個の対照核酸、約１，０００個の対照核酸から約５，０００個の対照核酸、約１，０００個の対照核酸から約７，５００個の対照核酸、約１，０００個の
対照核酸から約１０，０００個の対照核酸、約１，０００個の対照核酸から約１５，０００個の対照核酸、約１，２５０個の対照核酸から約１，５００個の対照核酸、約１，２５０個の対照核酸から約２，０００個の対照核酸、約１，２５０個の対照核酸から約３，０００個の対照核酸、約１，２５０個の対照核酸から約４，０００個の対照核酸、約１，２５０個の対照核酸から約５，０００個の対照核酸、約１，２５０個の対照核酸から約７，５００個の対照核酸、約１，２５０個の対照核酸から約１０，０００個の対照核酸、約１，２５０個の対照核酸から約１５，０００個の対照核酸、約１，５００個の対照核酸から約２，０００個の対照核酸、約１，５００個の対照核酸から約３，０００個の対照核酸、約１，５００個の対照核酸から約４，０００個の対照核酸、約１，５００個の対照核酸から約５，０００個の対照核酸、約１，５００個の対照核酸から約７，５００個の対照核酸、約１，５００個の対照核酸から約１０，０００個の対照核酸、約１，５００個の対照核酸から約１５，０００個の対照核酸、約２，０００個の対照核酸から約３，０００個の対照核酸、約２，０００個の対照核酸から約４，０００個の対照核酸、約２，０００個の対照核酸から約５，０００個の対照核酸、約２，０００個の対照核酸から約７，５００個の対照核酸、約２，０００個の対照核酸から約１０，０００個の対照核酸、約２，０００個の対照核酸から約１５，０００個の対照核酸、約３，０００個の対照核酸から約４，０００個の対照核酸、約３，０００個の対照核酸から約５，０００個の対照核酸、約３，０００個の対照核酸から約７，５００個の対照核酸、約３，０００個の対照核酸から約１０，０００個の対照核酸、約３，０００個の対照核酸から約１５，０００個の対照核酸、約４，０００個の対照核酸から約５，０００個の対照核酸、約４，０００個の対照核酸から約７，５００個の対照核酸、約４，０００個の対照核酸から約１０，０００個の対照核酸、約４，０００個の対照核酸から約１５，０００個の対照核酸、約５，０００個の対照核酸から約７，５００個の対照核酸、約５，０００個の対照核酸から約１０，０００個の対照核酸、約５，０００個の対照核酸から約１５，０００個の対照核酸、約７，５００個の対照核酸から約１０，０００個の対照核酸、約７，５００個の対照核酸から約１５，０００個の対照核酸、または約１０，０００個の対照核酸から約１５，０００個の対照核酸である。いくつかの実施形態では、アッセイにおけるウェルあたりのリードカウントは、約５００個の対照核酸、約７５０個の対照核酸、約１，０００個の対照核酸、約１，２５０個の対照核酸、約１，５００個の対照核酸、約２，０００個の対照核酸、約３，０００個の対照核酸、約４，０００個の対照核酸、約５，０００個の対照核酸、約７，５００個の対照核酸、約１０，０００個の対照核酸、または約１５，０００個の対照核酸である。いくつかの実施形態では、アッセイにおけるウェルあたりのリードカウントは、少なくとも約５００個の対照核酸、約７５０個の対照核酸、約１，０００個の対照核酸、約１，２５０個の対照核酸、約１，５００個の対照核酸、約２，０００個の対照核酸、約３，０００個の対照核酸、約４，０００個の対照核酸、約５，０００個の対照核酸、約７，５００個の対照核酸、または約１０，０００個の対照核酸である。いくつかの実施形態では、アッセイにおけるウェルあたりのリードカウントは、最大で約７５０個の対照核酸、約１，０００個の対照核酸、約１，２５０個の対照核酸、約１，５００個の対照核酸、約２，０００個の対照核酸、約３，０００個の対照核酸、約４，０００個の対照核酸、約５，０００個の対照核酸、約７，５００個の対照核酸、約１０，０００個の対照核酸、または約１５，０００個の対照核酸である。以上に特定のリードカウントが記載されているが、当該リードカウントは例示的なものであり、他のリードカウントに判定されてもよい。さらに、様々な対照核酸について、ウェルで異なるリードカウントが判定されてもよい。さらに、すべての核酸について、ウェル間で同じリードカウントが判定される必要はない。

【0023】

対照核酸（または複数の対照核酸）を添加することで、１つ以上の工程の効果を判定する方法が提供される。例えば、ある工程中に対照核酸が既知の量で導入されてもよく、これらの対照核酸の読み取りは、対照核酸が導入される工程中に後で算出されてもよく、または後の工程中に算出されてもよい。ゆえに、対照核酸の導入量と比較した、ある特定の工程中の対照核酸のリードカウントにより、工程がどのくらい適切に機能しているか（例えば、逆転写反応がどのくらい効率的であるか）について洞察がもたらされ得る。工程が効率的に機能していると判定される場合（例えば、対照核酸のリードが、リードの予想量付近である場合）、工程の条件が変更されなくてもよく、あるいは工程の効果をさらに高めるために工程の条件が変更されてもよいが、工程が適切に機能していないと判定される場合（例えば、対照核酸のリードが、リードの予想量付近でない場合）は、効果を高めるために工程の条件が変更されてもよい。

【0024】

溶解工程は、細胞内部から核酸が放出されるように細胞膜を破壊することを含んでもよい。核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、または他の核酸を含んでもよい。

【0025】

第１の複数の対照核酸（例えば、ＲＮＡスパイク６０２）は、溶解工程中またはその前に添加されてもよい。ある特定の実施形態では、第１の複数の対照核酸は、細胞溶解中に細胞に添加される溶解剤または緩衝液に含まれてもよい。いくつかの実施形態では、第１の複数の核酸は、ウェルに播種された複数の細胞内に存在し、その後、細胞が溶解されると、細胞の内部内容物が放出される。ある特定の実施形態では、これらの核酸はＲＮＡを含む。ある特定の実施形態では、これらの核酸はＤＮＡを含む。ある特定の実施形態では、第１の複数の対照核酸のうちの一方がＤＮＡであり、第１の複数の対照核酸のうちの他方はＲＮＡである。この第１の複数の核酸は、（１）既知の参照標準に対してエンドリードカウントを正規化するか、および／または（２）関心対象の試料のリードカウント対他の対照核酸スパイクインの比率を判定するために使用されてもよく、スパイクインは、細胞溶解反応の効果の定量的測定として使用されてもよい。第１の複数の核酸は、１つ以上の後の工程（例えば、配列決定工程）中の第１の複数の核酸のリードカウントと、最初に含まれていた第１の複数の核酸の量とを比較することによって既知の参照標準に対してエンドリードカウントを正規化するために使用されてもよい。また、第１の複数の核酸は、配列決定工程中に算出された第１の複数の核酸のリード数と、溶解工程に添加された第１の複数の核酸の数とを比較することによってリードカウントの細胞溶解反応比率を判定するために使用されてもよい。細胞溶解反応が非効率的である場合、細胞溶解反応比率が低くなり、細胞溶解反応が効率的である場合、細胞溶解反応は高くなる。例えば、細胞溶解反応比率が０．１の場合、第１の複数の核酸の１０％しか溶解されなかったので細胞溶解反応は非効率的であったことを示す。対照的に、細胞溶解反応比率が０．９５の場合、第１の複数の核酸の９５％が溶解されているので細胞溶解反応が効率的であったことを示す。細胞溶解反応比率を改善するために、溶解工程の条件、例えばアッセイのｐＨ、アッセイの持続時間、添加される細胞の量、または他の条件などが変更されてもよい。

【0026】

溶解ＲＮＡ安定性比率（例えば、「溶解ＲＮＡ安定性」６１８）などの他の比率は、溶解工程中に添加された別の複数の核酸に基づいて判定されてもよい。例えば、溶解ＲＮＡ安定性比率は、溶解工程からＤＮａｓｅ工程への移動の効果を測定することができ、および／または、ＲＮａｓｅの存在がＲＴ工程を含むＲＴ工程以前の後続工程のいずれかに影響を与えるか否かを判定することができる。さらに、溶解ＲＮＡ安定性比率は、ウェル中のＤＮａｓｅの存在が強すぎるか否かを示すことができる。例えば、ＤＮａｓｅ工程中に多すぎるＤＮａｓｅが存在する場合、ＤＮａｓｅがＤＮＡを切断するだけではなく、ＲＮＡも切断し得、これによってＲＮＡの濃度が低くなり、結果として、溶解ＲＮＡ安定性比率が低くなる。ゆえに、溶解ＲＮＡ安定性比率は、ＤＮａｓｅ工程中に過剰なＤＮａｓｅが使用されることを示すことができる。例えば、溶解工程の終了時に別の複数の核酸（例えば、別のＲＮＡスパイク）のリードカウントが行われ、その後、ＤＮａｓｅ工程の開始時に別の複数の核酸の別のリードカウントが行われる場合、移動の効果は、溶解ＲＮＡ安定性比率を使用して評価されてもよい。ゆえに、溶解ＲＮＡ安定性比率が０．９４の場合、移動が効率的であったことを示す。対照的に、溶解ＲＮＡ安定性比率が０．２５の場合、移動が非効率非的であったことと、移動の特定の条件（例えば、速度、持続時間、温度、および／またはｐＨ）を変更する必要があり得ることとを示す。

【0027】

第２の複数の対照核酸（例えば、ＤＮＡスパイク６０４）は、溶解工程中またはその前に添加されてもよい。いくつかの実施形態では、第２の複数の核酸は、溶解工程中に添加される複数の細胞のうちにあり、当該細胞は、その後、溶解される。ある特定の実施形態では、第２の複数の対照核酸は、細胞溶解中に細胞に添加される溶解剤または緩衝液に含まれてもよい。ある特定の実施形態では、これらの核酸は二本鎖ＤＮＡを含む。これらの二本鎖ＤＮＡは、ＤＮａｓｅ工程の効果を判定するために使用でき、したがって、不完全にＤＮａｓｅ処理された試料から潜在的な混入源を特定する。例えば、第２の複数の核酸のリードカウントは、ＤＮａｓｅの非効率（例えば、「ＤＮａｓｅ非効率」６１６）を示すことができる。ＤＮａｓｅ非効率は、ＤＮａｓｅ工程中に測定される第２の複数の核酸に関連するＲＮＡのリードカウントと、逆転写工程中に測定される第２の複数の核酸に関連するＲＮＡのリードカウントとを比較することによって判定されてもよい。特に、溶解工程中に添加される第２の複数の核酸のすべてまたは一部は、ＤＮａｓｅ工程中に切断されてもよく、結果として生じるＲＮＡは、ＤＮａｓｅ工程中に算出される。ゆえに、溶解工程中に添加される第２の複数の核酸の既知量とＤＮａｓｅ工程中のＲＮＡのリードカウントとを比較することによって、ＤＮａｓｅ非効率を判定することができる。例えば、ＤＮａｓｅ非効率が１，０００：１０，０００の場合、第２の複数の核酸の９０％がＤＮａｓｅ工程中に切断されたことを示す。対照的に、ＤＮａｓｅ非効率が５，０００：１０，０００の場合、第２の複数の核酸の５０％のみがＤＮａｓｅ工程中に切断されたことを示す。ＤＮａｓｅ非効率を改善するために、溶解工程の条件、例えば、アッセイのｐＨ、アッセイの持続時間、添加される細胞の量、または他の条件などが変更されてもよい。

【0028】

第３の複数の核酸（例えば、ＲＮＡスパイク６０８）は、ＲＴ－ＰＣＲ工程中に添加されてもよい。ある特定の実施形態では、これらの核酸はＲＮＡを含む。この複数の核酸は、ＲＴ－ＰＣＲ工程から配列決定工程への核酸移動の不備または準最適性、ＲＴ－ＰＣＲ工程中の何らかの非特異的なＲＮＡの消化、またはＲＴ反応中の混入ＲＮａｓｅの存在を特定するために使用できる。ＲＴ－ＰＣＲ ＲＮＡ安定性比率は、どれくらいのＲＮＡが移動されるかに基づいて判定されてもよい。例えば、第３の複数の核酸（例えば、ＲＮＡスパイク）は、ＲＴ－ＰＣＲ工程中に第１の位置に既知量で添加され、その後、配列決定工程が行われるように第２の位置に移動されてもよい。移動が効率的であった場合、ＲＴ－ＰＣＲ ＲＮＡ安定性比率は高くなるが、移動が非効率的であった場合、ＲＴ－ＰＣＲ ＲＮＡ安定性比率は低くなる。例えば、ＲＴ－ＰＣＲ ＲＮＡ安定性比率が０．３の場合、ＲＮＡスパイクの３０％しか移動しなかったので、ＲＴ－ＰＣＲ工程から配列決定工程への移動が非効率的であることを示す。対照的に、ＲＴ－ＰＣＲ ＲＮＡ安定性比率が０．９９の場合、ＲＮＡスパイクの９９％が移動を行ったので、ＲＴ－ＰＣＲ工程から配列決定工程への移動が有効であることを示す。ＲＴ－ＰＣＲ ＲＮＡ安定性比率が低い場合、工程に関連する特定の条件、例えば、移動の速度またはＲＮＡスパイクの量が変更されてもよい。

【0029】

第４の複数の核酸（例えば、ＤＮＡスパイク６１０）は、ＲＴ－ＰＣＲ工程中に添加されてもよい。ある特定の実施形態では、これらの核酸は一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）を含む。このスパイクインは、ＲＴ－ＰＣＲ工程の逆転写部分の効果を判定するために使用できる。第４の複数の核酸は、逆転写工程で添加される一本鎖ＤＮＡスパイクを含んでもよく、様々な工程における第４の複数の核酸のリードカウントにより、どれくらいの相補的ＤＮＡが生成されるかについて洞察がもたらされることによって、ＲＴ－ＰＣＲ性能の効率およびＲＴ効率（例えば、「ＲＴ効率」６１２）を示し得る。例えば、ＲＴ－ＰＣＲ工程中に既知量の第４の複数の核酸（例えば、ｓｓＤＮＡスパイク）が添加されてもよく、当該既知量は、ＲＴ－ＰＣＲ工程中またはその後の第４の複数の核酸のリードカウントと比較されてもよい。例えば、ＲＴ効率が０．８の場合、ＲＴ－ＰＣＲ工程によりｓｓＤＮＡの８０％が変換されることを示す。対照的に、ＲＴ効率が０．１の場合、ＲＴ－ＰＣＲ工程によりｓｓＤＮＡの１０％のみが変換されることを示す。ＲＴ効率が低いことは、ＲＴ－ＰＣＲ工程の条件、例えば、ＲＴ－ＰＣＲ工程の温度、ＲＴ－ＰＣＲ工程のｐＨ、および／またはＲＴ－ＰＣＲ工程の持続時間の変更につながり得る。

【0030】

第５の複数の核酸（例えば、ＲＮＡスパイク６０６）は、ＤＮａｓｅ工程中に添加されてもよい。ある特定の実施形態では、これらの核酸は、ＤＮａｓｅ工程で添加されるＲＮＡスパイクを含む。このスパイクインは、ＤＮａｓｅプレートからＲＴ－ＰＣＲプレートへの送液の効果を判定するために使用できる。ＤＮａｓｅ ＲＮＡ安定性（例えば、「ＤＮａｓｅ ＲＮＡ安定性」６１４）は、どれくらいのＲＮＡが移動されるかに基づいて判定されてもよい。例えば、第５の複数の核酸（例えば、ＲＮＡスパイク）は、ＤＮａｓｅ工程中に第１の位置（例えば、ＤＮａｓｅプレート）に既知量で添加され、その後、逆転写工程が行われるように第２の位置（例えば、ＲＴ－ＰＣＲプレート）に移動されてもよい。移動が効率的であった場合、ＤＮａｓｅ ＲＮＡ安定性比率は高くなるが、移動が非効率的であった場合、ＤＮａｓｅ ＲＮＡ安定性比率は低くなる。例えば、ＤＮａｓｅ ＲＮＡ安定性比率が０．３の場合、ＲＮＡスパイクの３０％しか移動しなかったので、ＤＮａｓｅ工程から逆転写工程への移動が非効率的であることを示す。対照的に、ＤＮａｓｅ ＲＮＡ安定性比率が０．９９の場合、ＲＮＡスパイクの９９％が移動したので、ＤＮａｓｅ工程から逆転写工程への移動が有効ではないことを示す。ＤＮａｓｅ ＲＮＡ安定性比率が低い場合、工程に関連する特定の条件、例えば、移動の速度またはＲＮＡスパイクの量が変更されてもよい。

【0031】

さらなる情報により、プロセスに関連するさらなる態様、例えば、複数の核酸に基づいて判定されるさらなる比率が示され得る。例えば、ｇＤＮＡ混入比率（例えば、「ｇＤＮＡ混入」６２０）を判定すると、第１の複数の核酸を添加した後に生じるｇＤＮＡ混入が示される。例えば、第１の複数の核酸（例えば、二本鎖ＤＮＡスパイク）は、溶解工程中に既知量で添加されてもよく、これは、ＤＮＡの何割がｇＤＮＡであるかを判定するために、ＲＴ－ＰＣＲ工程中の第１の複数の核酸のリードカウントと比較されてもよい。ゆえに、ｇＤＮＡ混入比率が０．７５の場合、ＤＮａｓｅ工程により、溶解工程中に添加されたＤＮＡスパイクインの大部分がＲＮＡに変換されたことを示す。対照的に、ｇＤＮＡ混入比率が０．２５の場合、ＤＮａｓｅ工程により、溶解工程中に添加されたＤＮＡスパイクインの大部分がＲＮＡに変換されたことを示す。

【0032】

本明細書に記載される対照核酸のヌクレオチド配列（例えば、バーコード）は、以前の実験実行による交叉汚染を検出するために、後続実験実行のために変更できる。このような交叉汚染は、以前の実験実行で使用された機器または試薬に起因し得る。いくつかの実施形態において、複数の複数の核酸は、ヌクレオチドが共通に配列決定されていてもよい。他の実施形態では、複数の核酸はそれぞれ、それ自体のヌクレオチド配列を有する。

【0033】

さらに、上述のように、様々な複数の核酸が、１つ以上の工程中に添加されてもよい。いくつかの実施形態では、単一の複数の核酸が添加され、各工程を通して評価されてもよい。例えば、単一の複数の核酸（例えば、ＲＮＡスパイク）は、溶解工程中に添加され、溶解工程の終了時に算出され、ＤＮａｓｅ工程の開始時に算出され、ＤＮａｓｅ工程の終了時に算出され、ＲＴ－ＰＣＲ工程の開始時に算出され、ＲＴ－ＰＣＲ工程の終了時に算出され、その後、配列決定工程中に再度算出され、単一の複数の核酸の複数のリードカウントが効率的にでき、以上に特定される比率、例えば、溶解ＲＮＡ安定性比率、ＤＮａｓｅ ＲＮＡ安定性比率、およびＲＴ－ＰＣＲ ＲＮＡ安定性比率のうちのいくつかを判定することができる。

【0034】

いくつかの実施形態では、溶液中に複数の核酸がある濃度で存在してもよい。いくつかの実施形態では、溶媒が添加されて溶液中の濃度が達成されてもよい。いくつかの実施形態において、濃度は、約０ｐＭから約０．０５ｐＭであり得る。いくつかの実施形態において、濃度は、約０ｐＭから約０．０１ｐＭ、約０ｐＭから約０．０１５ｐＭ、約０ｐＭから約０．０２ｐＭ、約０ｐＭから約０．０２５ｐＭ、約０ｐＭから約０．０３ｐＭ、約０ｐＭから約０．０３５ｐＭ、約０ｐＭから約０．０４ｐＭ、約０ｐＭから約０．０４５ｐＭ、約０ｐＭから約０．０５ｐＭ、約０．０１ｐＭから約０．０１５ｐＭ、約０．０１ｐＭから約０．０２ｐＭ、約０．０１ｐＭから約０．０２５ｐＭ、約０．０１ｐＭから約０．０３ｐＭ、約０．０１ｐＭから約０．０３５ｐＭ、約０．０１ｐＭから約０．０４ｐＭ、約０．０１ｐＭから約０．０４５ｐＭ、約０．０１ｐＭから約０．０５ｐＭ、約０．０１５ｐＭから約０．０２ｐＭ、約０．０１５ｐＭから約０．０２５ｐＭ、約０．０１５ｐＭから約０．０３ｐＭ、約０．０１５ｐＭから約０．０３５ｐＭ、約０．０１５ｐＭから約０．０４ｐＭ、約０．０１５ｐＭから約０．０４５ｐＭ、約０．０１５ｐＭから約０．０５ｐＭ、約０．０２ｐＭから約０．０２５ｐＭ、約０．０２ｐＭから約０．０３ｐＭ、約０．０２ｐＭから約０．０３５ｐＭ、約０．０２ｐＭから約０．０４ｐＭ、約０．０２ｐＭから約０．０４５ｐＭ、約０．０２ｐＭから約０．０５ｐＭ、約０．０２５ｐＭから約０．０３ｐＭ、約０．０２５ｐＭから約０．０３５ｐＭ、約０．０２５ｐＭから約０．０４ｐＭ、約０．０２５ｐＭから約０．０４５ｐＭ、約０．０２５ｐＭから約０．０５ｐＭ、約０．０３ｐＭから約０．０３５ｐＭ、約０．０３ｐＭから約０．０４ｐＭ、約０．０３ｐＭから約０．０４５ｐＭ、約０．０３ｐＭから約０．０５ｐＭ、約０．０３５ｐＭから約０．０４ｐＭ、約０．０３５ｐＭから約０．０４５ｐＭ、約０．０３５ｐＭから約０．０５ｐＭ、約０．０４ｐＭから約０．０４５ｐＭ、約０．０４ｐＭから約０．０５ｐＭ、または約０．０４５ｐＭから約０．０５ｐＭであってもよい。いくつかの実施形態において、濃度は、約０ｐＭ、約０．０１ｐＭ、約０．０１５ｐＭ、約０．０２ｐＭ、約０．０２５ｐＭ、約０．０３ｐＭ、約０．０３５ｐＭ、約０．０４ｐＭ、約０．０４５ｐＭ、または約０．０５ｐＭであり得る。いくつかの実施形態において、濃度は、少なくとも約０ｐＭ、約０．０１ｐＭ、約０．０１５ｐＭ、約０．０２ｐＭ、約０．０２５ｐＭ、約０．０３ｐＭ、約０．０３５ｐＭ、約０．０４ｐＭ、または約０．０４５ｐＭであり得る。いくつかの実施形態において、濃度は、最大で約０．０１ｐＭ、約０．０１５ｐＭ、約０．０２ｐＭ、約０．０２５ｐＭ、約０．０３ｐＭ、約０．０３５ｐＭ、約０．０４ｐＭ、約０．０４５ｐＭ、または約０．０５ｐＭであり得る。いくつかの実施形態において、濃度は、約０．０５ｐＭから約０．５ｐＭであり得る。いくつかの実施形態において、濃度は、約０．０５ｐＭから約０．１ｐＭ、約０．０５ｐＭから約０．１５ｐＭ、約０．０５ｐＭから約０．２ｐＭ、約０．０５ｐＭから約０．２５ｐＭ、約０．０５ｐＭから約０．３ｐＭ、約０．０５ｐＭから約０．３５ｐＭ、約０．０５ｐＭから約０．４ｐＭ、約０．０５ｐＭから約０．４５ｐＭ、約０．０５ｐＭから約０．５ｐＭ、約０．１ｐＭから約０．１５ｐＭ、約０．１ｐＭから約０．２ｐＭ、約０．１ｐＭから約０．２５ｐＭ、約０．１ｐＭから約０．３ｐＭ、約０．１ｐＭから約０．３５ｐＭ、約０．１ｐＭから約０．４ｐＭ、約０．１ｐＭから約０．４５ｐＭ、約０．１ｐＭから約０．５ｐＭ、約０．１５ｐＭから約０．２ｐＭ、約０．１５ｐＭから約０．２５ｐＭ、約０．１５ｐＭから約０．３ｐＭ、約０．１５ｐＭから約０．３５ｐＭ、約０．１５ｐＭから約０．４ｐＭ、約０．１５ｐＭから約０．４５ｐＭ、約０．１５ｐＭから約０．５ｐＭ、約０．２ｐＭから約０．２５ｐＭ、約０．２ｐＭから約０．３ｐＭ、約０．２ｐＭから約０．３５ｐＭ、約０．２ｐＭから約０．４ｐＭ、約０．２ｐＭから約０．４５ｐＭ、約０．２ｐＭから約０．５ｐＭ、約０．２５ｐＭから約０．３ｐＭ、約０．２５ｐＭから約０．３５ｐＭ、約０．２５ｐＭから約０．４ｐＭ、約０．２５ｐＭから約０．４５ｐＭ、約０．２５ｐＭから約０．５ｐＭ、約０．３ｐＭから約０．３５ｐＭ、約０．３ｐＭから約０．４ｐＭ、約０．３ｐＭから約０．４５ｐＭ、約０．３ｐＭから約０．５ｐＭ、約０．３５ｐＭから約０．４ｐＭ、約０．３５ｐＭから約０．４５ｐＭ、約０．３５ｐＭから約０．５ｐＭ、約０．４ｐＭから約０．４５ｐＭ、約０．４ｐＭから約０．５ｐＭ、または約０．４５ｐＭから約０．５ｐＭであり得る。いくつかの実施形態において、濃度は、約０．０５ｐＭ、約０．１ｐＭ、約０．１５ｐＭ、約０．２ｐＭ、約０．２５ｐＭ、約０．３ｐＭ、約０．３５ｐＭ、約０．４ｐＭ、約０．４５ｐＭ、または約０．５ｐＭであり得る。いくつかの実施形態において、濃度は、少なくとも約０．０５ｐＭ、約０．１ｐＭ、約０．１５ｐＭ、約０．２ｐＭ、約０．２５ｐＭ、約０．３ｐＭ、約０．３５ｐＭ、約０．４ｐＭ、または約０．４５ｐＭであり得る。いくつかの実施形態において、濃度は、最大で約０．１ｐＭ、約０．１５ｐＭ、約０．２ｐＭ、約０．２５ｐＭ、約０．３ｐＭ、約０．３５ｐＭ、約０．４ｐＭ、約０．４５ｐＭ、または約０．５ｐＭであり得る。いくつかの実施形態において、濃度は、約０．５ｐＭから約２ｐＭであり得る。いくつかの実施形態において、濃度は、約０．５ｐＭから約０．６ｐＭ、約０．５ｐＭから約０．７ｐＭ、約０．５ｐＭから約０．８ｐＭ、約０．５ｐＭから約０．９ｐＭ、約０．５ｐＭから約１ｐＭ、約０．５ｐＭから約１．２５ｐＭ、約０．５ｐＭから約１．５ｐＭ、約０．５ｐＭから約１．７５ｐＭ、約０．５ｐＭから約２ｐＭ、約０．６ｐＭから約０．７ｐＭ、約０．６ｐＭから約０．８ｐＭ、約０．６ｐＭから約０．９ｐＭ、約０．６ｐＭから約１ｐＭ、約０．６ｐＭから約１．２５ｐＭ、約０．６ｐＭから約１．５ｐＭ、約０．６ｐＭから約１．７５ｐＭ、約０．６ｐＭから約２ｐＭ、約０．７ｐＭから約０．８ｐＭ、約０．７ｐＭから約０．９ｐＭ、約０．７ｐＭから約１ｐＭ、約０．７ｐＭから約１．２５ｐＭ、約０．７ｐＭから約１．５ｐＭ、約０．７ｐＭから約１．７５ｐＭ、約０．７ｐＭから約２ｐＭ、約０．８ｐＭから約０．９ｐＭ、約０．８ｐＭから約１ｐＭ、約０．８ｐＭから約１．２５ｐＭ、約０．８ｐＭから約１．５ｐＭ、約０．８ｐＭから約１．７５ｐＭ、約０．８ｐＭから約２ｐＭ、約０．９ｐＭから約１ｐＭ、約０．９ｐＭから約１．２５ｐＭ、約０．９ｐＭから約１．５ｐＭ、約０．９ｐＭから約１．７５ｐＭ、約０．９ｐＭから約２ｐＭ、約１ｐＭから約１．２５ｐＭ、約１ｐＭから約１．５ｐＭ、約１ｐＭから約１．７５ｐＭ、約１ｐＭから約２ｐＭ、約１．２５ｐＭから約１．５ｐＭ、約１．２５ｐＭから約１．７５ｐＭ、約１．２５ｐＭから約２ｐＭ、約１．５ｐＭから約１．７５ｐＭ、約１．５ｐＭから約２ｐＭ、または約１．７５ｐＭから約２ｐＭであり得る。いくつかの実施形態において、濃度は、約０．５ｐＭ、約０．６ｐＭ、約０．７ｐＭ、約０．８ｐＭ、約０．９ｐＭ、約１ｐＭ、約１．２５ｐＭ、約１．５ｐＭ、約１．７５ｐＭ、または約２ｐＭであり得る。いくつかの実施形態において、濃度は、少なくとも約０．５ｐＭ、約０．６ｐＭ、約０．７ｐＭ、約０．８ｐＭ、約０．９ｐＭ、約１ｐＭ、約１．２５ｐＭ、約１．５ｐＭ、または約１．７５ｐＭであり得る。いくつかの実施形態において、濃度は、最大で約０．６ｐＭ、約０．７ｐＭ、約０．８ｐＭ、約０．９ｐＭ、約１ｐＭ、約１．２５ｐＭ、約１．５ｐＭ、約１．７５ｐＭ、または約２ｐＭであり得る。いくつかの実施形態において、濃度は、約１ｐＭから約５０ｐＭであり得る。いくつかの実施形態において、濃度は、約１ｐＭから約２ｐＭ、約１ｐＭから約３ｐＭ、約１ｐＭから約４ｐＭ、約１ｐＭから約５ｐＭ、約１ｐＭから約７．５ｐＭ、約１ｐＭから約１０ｐＭ、約１ｐＭから約１２．５ｐＭ、約１ｐＭから約１５ｐＭ、約１ｐＭから約２０ｐＭ、約１ｐＭから約２５ｐＭ、約１ｐＭから約５０ｐＭ、約２ｐＭから約３ｐＭ、約２ｐＭから約４ｐＭ、約２ｐＭから約５ｐＭ、約２ｐＭから約７．５ｐＭ、約２ｐＭから約１０ｐＭ、約２ｐＭから約１２．５ｐＭ、約２ｐＭから約１５ｐＭ、約２ｐＭから約２０ｐＭ、約２ｐＭから約２５ｐＭ、約２ｐＭから約５０ｐＭ、約３ｐＭから約４ｐＭ、約３ｐＭから約５ｐＭ、約３ｐＭから約７．５ｐＭ、約３ｐＭから約１０ｐＭ、約３ｐＭから約１２．５ｐＭ、約３ｐＭから約１５ｐＭ、約３ｐＭから約２０ｐＭ、約３ｐＭから約２５ｐＭ、約３ｐＭから約５０ｐＭ、約４ｐＭから約５ｐＭ、約４ｐＭから約７．５ｐＭ、約４ｐＭから約１０ｐＭ、約４ｐＭから約１２．５ｐＭ、約４ｐＭから約１５ｐＭ、約４ｐＭから約２０ｐＭ、約４ｐＭから約２５ｐＭ、約４ｐＭから約５０ｐＭ、約５ｐＭから約７．５ｐＭ、約５ｐＭから約１０ｐＭ、約５ｐＭから約１２．５ｐＭ、約５ｐＭから約１５ｐＭ、約５ｐＭから約２０ｐＭ、約５ｐＭから約２５ｐＭ、約５ｐＭから約５０ｐＭ、約７．５ｐＭから約１０ｐＭ、約７．５ｐＭから約１２．５ｐＭ、約７．５ｐＭから約１５ｐＭ、約７．５ｐＭから約２０ｐＭ、約７．５ｐＭから約２５ｐＭ、約７．５ｐＭから約５０ｐＭ、約１０ｐＭから約１２．５ｐＭ、約１０ｐＭから約１５ｐＭ、約１０ｐＭから約２０ｐＭ、約１０ｐＭから約２５ｐＭ、約１０ｐＭから約５０ｐＭ、約１２．５ｐＭから約１５ｐＭ、約１２．５ｐＭから約２０ｐＭ、約１２．５ｐＭから約２５ｐＭ、約１２．５ｐＭから約５０ｐＭ、約１５ｐＭから約２０ｐＭ、約１５ｐＭから約２５ｐＭ、約１５ｐＭから約５０ｐＭ、約２０ｐＭから約２５ｐＭ、約２０ｐＭから約５０ｐＭ、または約２５ｐＭから約５０ｐＭであり得る。いくつかの実施形態において、濃度は、約１ｐＭ、約２ｐＭ、約３ｐＭ、約４ｐＭ、約５ｐＭ、約７．５ｐＭ、約１０ｐＭ、約１２．５ｐＭ、約１５ｐＭ、約２０ｐＭ、約２５ｐＭ、または約５０ｐＭであり得る。いくつかの実施形態において、濃度は、少なくとも約１ｐＭ、約２ｐＭ、約３ｐＭ、約４ｐＭ、約５ｐＭ、約７．５ｐＭ、約１０ｐＭ、約１２．５ｐＭ、約１５ｐＭ、約２０ｐＭ、または約２５ｐＭであり得る。いくつかの実施形態において、濃度は、最大で約２ｐＭ、約３ｐＭ、約４ｐＭ、約５ｐＭ、約７．５ｐＭ、約１０ｐＭ、約１２．５ｐＭ、約１５ｐＭ、約２０ｐＭ、約２５ｐＭ、または約５０ｐＭであり得る。以上に特定の濃度が記載されているが、当該濃度は例示的なものであり、他の濃度が使用されてもよい。様々な核酸が、ウェルで様々な濃度で存在し得る。さらに、すべての核酸が、ウェル間で同じ濃度で存在する必要はない。

【0035】

図８は、複数のアッセイの様々なウェルにおける１モル当たりのリードカウントの比率を示す。

【0036】

区分８０２では、予想されるＲＴ効率は０．５０であるが、様々なウェルにおいてＲＴ効率が０．０から１．０であることが示されている。特に、ＲＴ効率が０．３９を下回る場合、データが信頼性のないものであり、除外できることを示す。ＲＴ効率は、ＲＴ－ＰＣＲ工程の逆転写部分の効果を示す（例えば、複数の核酸（例えば、ｓｓＤＮＡスパイクイン）のどの部分が逆転写によって変換されるか）。高いＲＴ効率は、信頼性が高いデータであることを示し、逆に、低いＲＴ効率は、データを除外する必要があり得ることを示す。いくつかの実施形態では、ＲＴ効率は、約０から約１であり得る。いくつかの実施形態では、ＲＴ効率は、約０から約０．１、約０から約０．２、約０から約０．３、約０から約０．４、約０から約０．５、約０から約０．６、約０から約０．７、約０から約０．８、約０から約０．９、約０から約０．９５、約０から約１、約０．１から約０．２、約０．１から約０．３、約０．１から約０．４、約０．１から約０．５、約０．１から約０．６、約０．１から約０．７、約０．１から約０．８、約０．１から約０．９、約０．１から約０．９５、約０．１から約１、約０．２から約０．３、約０．２から約０．４、約０．２から約０．５、約０．２から約０．６、約０．２から約０．７、約０．２から約０．８、約０．２から約０．９、約０．２から約０．９５、約０．２から約１、約０．３から約０．４、約０．３から約０．５、約０．３から約０．６、約０．３から約０．７、約０．３から約０．８、約０．３から約０．９、約０．３から約０．９５、約０．３から約１、約０．４から約０．５、約０．４から約０．６、約０．４から約０．７、約０．４から約０．８、約０．４から約０．９、約０．４から約０．９５、約０．４から約１、約０．５から約０．６、約０．５から約０．７、約０．５から約０．８、約０．５から約０．９、約０．５から約０．９５、約０．５から約１、約０．６から約０．７、約０．６から約０．８、約０．６から約０．９、約０．６から約０．９５、約０．６から約１、約０．７から約０．８、約０．７から約０．９、約０．７から約０．９５、約０．７から約１、約０．８から約０．９、約０．８から約０．９５、約０．８から約１、約０．９から約０．９５、約０．９から約１、または約０．９５から約１であり得る。いくつかの実施形態では、ＲＴ効率は、約０、約０．１、約０．２、約０．３、約０．４、約０．５、約０．６、約０．７、約０．８、約０．９、約０．９５、または約１であり得る。いくつかの実施形態では、ＲＴ効率は、少なくとも約０、約０．１、約０．２、約０．３、約０．４、約０．５、約０．６、約０．７、約０．８、約０．９、または約０．９５であり得る。いくつかの実施形態では、ＲＴ効率は、最大で約０．１、約０．２、約０．３、約０．４、約０．５、約０．６、約０．７、約０．８、約０．９、約０．９５、または約１であり得る。

【0037】

区分８０４では、予想されるＤＮａｓｅ－ＲＮＡ安定性比率は１．００から２．００であるが、様々なウェルにおいてＤＮａｓｅ－ＲＮＡ安定性比率が０．００から４．００であることが示されている。特に、ＤＮａｓｅ安定性比率が２．７５を上回るか、１．７５を下回る場合、データが信頼性のないものであり、除外できることを示す。ＤＮａｓｅ－ＲＮＡ安定性比率は、ＤＮａｓｅ工程中に添加された複数の核酸のうちのどのくらいが別のウェルへの移動後に残存しているかを（例えば、当該工程中に添加された核酸の量と、ＤＮａｓｅ工程後に残存している核酸の量とを比較することによって）示す。予想より高いＤＮａｓｅ－ＲＮＡ安定性比率は、データの破損が生じた可能性があることを示し（例えば、後の工程が核酸の添加によって影響を受けたことを示すデータ）、逆に、予想より低いＤＮａｓｅ－ＲＮＡ安定性比率は、移動が失敗に終わったことを示す。いくつかの実施形態では、ＤＮａｓｅ ＲＮＡ安定性比率は、約０から約２．５であり得る。いくつかの実施形態では、ＤＮａｓｅ ＲＮＡ安定性比率は、約０から約０．２５、約０から約０．５、約０から約０．７５、約０から約１、約０から約１．２５、約０から約１．５、約０から約１．７５、約０から約２、約０から約２．２５、約０から約２．５、約０．２５から約０．５、約０．２５から約０．７５、約０．２５から約１、約０．２５から約１．２５、約０．２５から約１．５、約０．２５から約１．７５、約０．２５から約２、約０．２５から約２．２５、約０．２５から約２．５、約０．５から約０．７５、約０．５から約１、約０．５から約１．２５、約０．５から約１．５、約０．５から約１．７５、約０．５から約２、約０．５から約２．２５、約０．５から約２．５、約０．７５から約１、約０．７５から約１．２５、約０．７５から約１．５、約０．７５から約１．７５、約０．７５から約２、約０．７５から約２．２５、約０．７５から約２．５、約１から約１．２５、約１から約１．５、約１から約１．７５、約１から約２、約１から約２．２５、約１から約２．５、約１．２５から約１．５、約１．２５から約１．７５、約１．２５から約２、約１．２５から約２．２５、約１．２５から約２．５、約１．５から約１．７５、約１．５から約２、約１．５から約２．２５、約１．５から約２．５、約１．７５から約２、約１．７５から約２．２５、約１．７５から約２．５、約２から約２．２５、約２から約２．５、または約２．２５から約２．５であり得る。いくつかの実施形態では、ＤＮａｓｅ ＲＮＡ安定性比率は、約０、約０．２５、約０．５、約０．７５、約１、約１．２５、約１．５、約１．７５、約２、約２．２５、または約２．５であり得る。いくつかの実施形態では、ＤＮａｓｅ ＲＮＡ安定性比率は、少なくとも約０、約０．２５、約０．５、約０．７５、約１、約１．２５、約１．５、約１．７５、約２、または約２．２５であり得る。いくつかの実施形態では、ＤＮａｓｅ ＲＮＡ安定性比率は、最大で約０．２５、約０．５、約０．７５、約１、約１．２５、約１．５、約１．７５、約２、約２．２５、または約２．５であり得る。いくつかの実施形態では、ＤＮａｓｅ ＲＮＡ安定性比率は、約１．７５から約２．７５であり得る。いくつかの実施形態では、ＤＮａｓｅ ＲＮＡ安定性比率は、約１．７５から約２、約１．７５から約２．２５、約１．７５から約２．５、約１．７５から約２．７５、約２から約２．２５、約２から約２．５、約２から約２．７５、約２．２５から約２．５、約２．２５から約２．７５、または約２．５から約２．７５であり得る。いくつかの実施形態では、ＤＮａｓｅ ＲＮＡ安定性比率は、約１．７５、約２、約２．２５、約２．５、または約２．７５であり得る。いくつかの実施形態では、ＤＮａｓｅ ＲＮＡ安定性比率は、少なくとも約１．７５、約２、約２．２５、または約２．５であり得る。いくつかの実施形態では、ＤＮａｓｅ ＲＮＡ安定性比率は、最大で約２、約２．２５、約２．５、または約２．７５であり得る。いくつかの実施形態では、ＤＮａｓｅ ＲＮＡ安定性比率は、約２．７５から約４であり得る。いくつかの実施形態では、ＤＮａｓｅ ＲＮＡ安定性比率は、約２．７５から約３、約２．７５から約３．２５、約２．７５から約３．５、約２．７５から約３．７５、約２．７５から約４、約３から約３．２５、約３から約３．５、約３から約３．７５、約３から約４、約３．２５から約３．５、約３．２５から約３．７５、約３．２５から約４、約３．５から約３．７５、約３．５から約４、または約３．７５から約４であり得る。いくつかの実施形態では、ＤＮａｓｅ ＲＮＡ安定性比率は、約２．７５、約３、約３．２５、約３．５、約３．７５、または約４であり得る。いくつかの実施形態では、ＤＮａｓｅ ＲＮＡ安定性比率は、約２．７５、約３、約３．２５、約３．５、または約３．７５であり得る。いくつかの実施形態では、ＤＮａｓｅ ＲＮＡ安定性比率は、最大で約３、約３．２５、約３．５、約３．７５、または約４であり得る。いくつかの実施形態では、ＤＮａｓｅ ＲＮＡ安定性比率は、約２から約２０であり得る。いくつかの実施形態では、ＤＮａｓｅ ＲＮＡ安定性比率は、約２から約４、約２から約６、約２から約８、約２から約１０、約２から約１２、約２から約１４、約２から約１６、約２から約１８、約２から約２０、約４から約６、約４から約８、約４から約１０、約４から約１２、約４から約１４、約４から約１６、約４から約１８、約４から約２０、約６から約８、約６から約１０、約６から約１２、約６から約１４、約６から約１６、約６から約１８、約６から約２０、約８から約１０、約８から約１２、約８から約１４、約８から約１６、約８から約１８、約８から約２０、約１０から約１２、約１０から約１４、約１０から約１６、約１０から約１８、約１０から約２０、約１２から約１４、約１２から約１６、約１２から約１８、約１２から約２０、約１４から約１６、約１４から約１８、約１４から約２０、約１６から約１８、約１６から約２０、または約１８から約２０であり得る。いくつかの実施形態では、ＤＮａｓｅ ＲＮＡ安定性比率は、約２、約４、約６、約８、約１０、約１２、約１４、約１６、約１８、または約２０であり得る。いくつかの実施形態では、ＤＮａｓｅ ＲＮＡ安定性比率は、少なくとも約２、約４、約６、約８、約１０、約１２、約１４、約１６、または約１８であり得る。いくつかの実施形態では、ＤＮａｓｅ ＲＮＡ安定性比率は、最大で約４、約６、約８、約１０、約１２、約１４、約１６、約１８、または約２０であり得る。

【0038】

区分８０６では、予想されるＤＮａｓｅ非効率は約０．０５であるが、様々なウェルにおいてＤＮａｓｅ非効率が０．００から０．７５であることが示されている。特に、ＤＮａｓｅ非効率が０．１５より高い場合、データが信頼性のないものであり、除外できることを示す。ＤＮａｓｅ非効率は、溶解工程中に添加される核酸（例えば、ＤＮＡスパイクイン）の残量とＤＮａｓｅ工程中に添加される核酸（例えば、ＲＮＡスパイクイン）の量とを比較することによってＤＮａｓｅ工程の効果を示す。より高いＤＮａｓｅ非効率は、ＤＮａｓｅ工程が成功せず、関連データを除外する必要があることを示す。いくつかの実施形態では、ＤＮａｓｅ非効率は、約０から約０．１であり得る。いくつかの実施形態では、ＤＮａｓｅ非効率は、約０から約０．０１、約０から約０．０２、約０から約０．０３、約０から約０．０４、約０から約０．０５、約０から約０．０６、約０から約０．０７、約０から約０．０８、約０から約０．０９、約０から約０．１、約０．０１から約０．０２、約０．０１から約０．０３、約０．０１から約０．０４、約０．０１から約０．０５、約０．０１から約０．０６、約０．０１から約０．０７、約０．０１から約０．０８、約０．０１から約０．０９、約０．０１から約０．１、約０．０２から約０．０３、約０．０２から約０．０４、約０．０２から約０．０５、約０．０２から約０．０６、約０．０２から約０．０７、約０．０２から約０．０８、約０．０２から約０．０９、約０．０２から約０．１、約０．０３から約０．０４、約０．０３から約０．０５、約０．０３から約０．０６、約０．０３から約０．０７、約０．０３から約０．０８、約０．０３から約０．０９、約０．０３から約０．１、約０．０４から約０．０５、約０．０４から約０．０６、約０．０４から約０．０７、約０．０４から約０．０８、約０．０４から約０．０９、約０．０４から約０．１、約０．０５から約０．０６、約０．０５から約０．０７、約０．０５から約０．０８、約０．０５から約０．０９、約０．０５から約０．１、約０．０６から約０．０７、約０．０６から約０．０８、約０．０６から約０．０９、約０．０６から約０．１、約０．０７から約０．０８、約０．０７から約０．０９、約０．０７から約０．１、約０．０８から約０．０９、約０．０８から約０．１、または約０．０９から約０．１であり得る。いくつかの実施形態では、ＤＮａｓｅ非効率は、約０、約０．０１、約０．０２、約０．０３、約０．０４、約０．０５、約０．０６、約０．０７、約０．０８、約０．０９、または約０．１であり得る。いくつかの実施形態では、ＤＮａｓｅ非効率は、少なくとも約０、約０．０１、約０．０２、約０．０３、約０．０４、約０．０５、約０．０６、約０．０７、約０．０８、または約０．０９であり得る。いくつかの実施形態では、ＤＮａｓｅ非効率は、最大で約０．０１、約０．０２、約０．０３、約０．０４、約０．０５、約０．０６、約０．０７、約０．０８、約０．０９、または約０．１であり得る。いくつかの実施形態では、ＤＮａｓｅ非効率は、約０から約１であり得る。いくつかの実施形態では、ＤＮａｓｅ非効率は、約０から約０．１、約０から約０．２、約０から約０．３、約０から約０．４、約０から約０．５、約０から約０．６、約０から約０．７、約０から約０．８、約０から約０．９、約０から約１、約０．１から約０．２、約０．１から約０．３、約０．１から約０．４、約０．１から約０．５、約０．１から約０．６、約０．１から約０．７、約０．１から約０．８、約０．１から約０．９、約０．１から約１、約０．２から約０．３、約０．２から約０．４、約０．２から約０．５、約０．２から約０．６、約０．２から約０．７、約０．２から約０．８、約０．２から約０．９、約０．２から約１、約０．３から約０．４、約０．３から約０．５、約０．３から約０．６、約０．３から約０．７、約０．３から約０．８、約０．３から約０．９、約０．３から約１、約０．４から約０．５、約０．４から約０．６、約０．４から約０．７、約０．４から約０．８、約０．４から約０．９、約０．４から約１、約０．５から約０．６、約０．５から約０．７、約０．５から約０．８、約０．５から約０．９、約０．５から約１、約０．６から約０．７、約０．６から約０．８、約０．６から約０．９、約０．６から約１、約０．７から約０．８、約０．７から約０．９、約０．７から約１、約０．８から約０．９、約０．８から約１、または約０．９から約１であり得る。いくつかの実施形態では、ＤＮａｓｅ非効率は、約０、約０．１、約０．２、約０．３、約０．４、約０．５、約０．６、約０．７、約０．８、約０．９、または約１であり得る。いくつかの実施形態では、ＤＮａｓｅ非効率は、少なくとも約０、約０．１、約０．２、約０．３、約０．４、約０．５、約０．６、約０．７、約０．８、または約０．９であり得る。いくつかの実施形態では、ＤＮａｓｅ非効率は、最大で約０．１、約０．２、約０．３、約０．４、約０．５、約０．６、約０．７、約０．８、約０．９、または約１であり得る。

【0039】

区分（８０８）では、予想される溶解ＲＮＡ安定性比率は０．２０から０．５０であるが、様々なウェルにおいて溶解ＲＮＡ安定性比率が０．００から１．００であることが示されている。特に、溶解ＲＮＡ安定性比率が０．１５より低い場合、データが信頼性のないものであり、除外できることを示す。溶解ＲＮＡ安定性比率は、溶解工程中に添加される核酸（例えば、ＲＮＡスパイクイン）の量とＤＮａｓｅ工程中に添加される核酸（例えば、他のＲＮＡスパイクイン）の量とを比較することによって、工程間の移動の効果を示すか、またはＲＮａｓｅの存在が後の工程に影響を及ぼすか否かを判定する。予想より高い溶解ＲＮＡ安定性比率は、データの破損が生じた可能性があることを示し（例えば、後の工程が核酸の添加によって影響を受けたことを示すデータ）、逆に、予想より低い溶解ＲＮＡ安定性比率は、移動が失敗に終わったことを示す。いくつかの実施形態では、溶解ＲＮＡ安定性比率は、約０から約１であり得る。いくつかの実施形態では、溶解ＲＮＡ安定性比率は、約０から約０．１、約０から約０．２、約０から約０．３、約０から約０．４、約０から約０．５、約０から約０．６、約０から約０．７、約０から約０．８、約０から約０．９、約０から約１、約０．１から約０．２、約０．１から約０．３、約０．１から約０．４、約０．１から約０．５、約０．１から約０．６、約０．１から約０．７、約０．１から約０．８、約０．１から約０．９、約０．１から約１、約０．２から約０．３、約０．２から約０．４、約０．２から約０．５、約０．２から約０．６、約０．２から約０．７、約０．２から約０．８、約０．２から約０．９、約０．２から約１、約０．３から約０．４、約０．３から約０．５、約０．３から約０．６、約０．３から約０．７、約０．３から約０．８、約０．３から約０．９、約０．３から約１、約０．４から約０．５、約０．４から約０．６、約０．４から約０．７、約０．４から約０．８、約０．４から約０．９、約０．４から約１、約０．５から約０．６、約０．５から約０．７、約０．５から約０．８、約０．５から約０．９、約０．５から約１、約０．６から約０．７、約０．６から約０．８、約０．６から約０．９、約０．６から約１、約０．７から約０．８、約０．７から約０．９、約０．７から約１、約０．８から約０．９、約０．８から約１、または約０．９から約１であり得る。いくつかの実施形態では、溶解ＲＮＡ安定性比率は、約０、約０．１、約０．２、約０．３、約０．４、約０．５、約０．６、約０．７、約０．８、約０．９、または約１であり得る。いくつかの実施形態では、溶解ＲＮＡ安定性比率は、少なくとも約０、約０．１、約０．２、約０．３、約０．４、約０．５、約０．６、約０．７、約０．８、または約０．９であり得る。いくつかの実施形態では、溶解ＲＮＡ安定性比率は、最大で約０．１、約０．２、約０．３、約０．４、約０．５、約０．６、約０．７、約０．８、約０．９、または約１であり得る。

【0040】

区分（８１０）では、予想されるｇＤＮＡ混入比率は０．０から０．０９であるが、様々なウェルにおいてｇＤＮＡ混入比率が０．００から０．１０であることが示されている。特に、ｇＤＮＡ混入比率が０．１０より高い場合、データが信頼性のないものであり、除外できることを示す。ｇＤＮＡ混入比率は、溶解工程中に添加される複数の核酸（例えば、ＤＮＡスパイクイン）と配列決定前にＲＴ－ＰＣＲ工程中に添加される複数の核酸（例えば、別の複数のＤＮＡスパイクイン）とを比較することによって、アッセイの過程にわたってどれくらいのＤＮＡが変換されなかったかを示す。より高いｇＤＮＡ混入比率は、以前の核酸の添加によって後の工程に影響が及び、ゆえに、関連データを除外する必要があり得ることを示す。いくつかの実施形態では、ｇＤＮＡ混入比率は、約０から約０．５であり得る。いくつかの実施形態では、ｇＤＮＡ混入比率は、約０から約０．０５、約０から約０．１、約０から約０．１５、約０から約０．２、約０から約０．２５、約０から約０．３、約０から約０．３５、約０から約０．４、約０から約０．４５、約０から約０．５、約０．０５から約０．１、約０．０５から約０．１５、約０．０５から約０．２、約０．０５から約０．２５、約０．０５から約０．３、約０．０５から約０．３５、約０．０５から約０．４、約０．０５から約０．４５、約０．０５から約０．５、約０．１から約０．１５、約０．１から約０．２、約０．１から約０．２５、約０．１から約０．３、約０．１から約０．３５、約０．１から約０．４、約０．１から約０．４５、約０．１から約０．５、約０．１５から約０．２、約０．１５から約０．２５、約０．１５から約０．３、約０．１５から約０．３５、約０．１５から約０．４、約０．１５から約０．４５、約０．１５から約０．５、約０．２から約０．２５、約０．２から約０．３、約０．２から約０．３５、約０．２から約０．４、約０．２から約０．４５、約０．２から約０．５、約０．２５から約０．３、約０．２５から約０．３５、約０．２５から約０．４、約０．２５から約０．４５、約０．２５から約０．５、約０．３から約０．３５、約０．３から約０．４、約０．３から約０．４５、約０．３から約０．５、約０．３５から約０．４、約０．３５から約０．４５、約０．３５から約０．５、約０．４から約０．４５、約０．４から約０．５、または約０．４５から約０．５であり得る。いくつかの実施形態では、ｇＤＮＡ混入比率は、約０、約０．０５、約０．１、約０．１５、約０．２、約０．２５、約０．３、約０．３５、約０．４、約０．４５、または約０．５であり得る。いくつかの実施形態では、ｇＤＮＡ混入比率は、少なくとも約０、約０．０５、約０．１、約０．１５、約０．２、約０．２５、約０．３、約０．３５、約０．４、または約０．４５であり得る。いくつかの実施形態では、ｇＤＮＡ混入比率は、最大で約０．０５、約０．１、約０．１５、約０．２、約０．２５、約０．３、約０．３５、約０．４、約０．４５、または約０．５であり得る。

【0041】

ある特定の比率が示され、ある特定の予想される比率が記載されているが、当業者であれば、核酸のリードカウントから比率を判定する他、予想されるリードカウントに基づいて予想される比率を判定することができるであろう。さらに、信頼性のないデータについてある特定のパラメータが記載されているが、これらは例示的なものであり、どのような工程が実行されるか、どのような条件でそれらの工程が実行されるか、また、当業者の最終的な実験目標に基づいて変化し得る。

【0042】

バーコード
指標として機能する可変ヌクレオチド配列（バーコード）は、本明細書に記載されるレポーター遺伝子のいずれに含まれていてもよい。さらに、バーコードは、別個のライブラリー調製反応において添加されてもよい。本明細書に記載される可変ヌクレオチド配列は、本明細書で使用される配列決定反応から得られた結果をデコンボリューションするために、試料インデックスとして使用することができる。

【0043】

いったん細胞の内容物が溶解剤によってそれぞれの区画に放出されると、そこに含まれる高分子成分（例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡ、またはタンパク質などの試料の高分子成分）は、区画内でさらに処理され得る。本明細書に記載される方法およびシステムに従って、個々の試料の高分子成分の内容物は、それらの高分子成分の特徴付けの際に、それらが同じ試料または粒子に由来するものとして帰属され得るように、固有の識別子を提供され得る。個々の試料または試料の群に特徴を帰する能力は、特に個々の試料または試料の群に固有の識別子を割り当てることによって提供される。試料の高分子成分（および、結果としてのその特徴）に固有の識別子をタグ付けまたは標識するために、例えば、核酸バーコードの形態の固有の識別子は、個々の試料または試料の集団に割り当てられ得るか、または関連付けられ得る。その後、これらの固有の識別子を使用して、試料の成分や特徴を個々の試料または試料の群に帰属させることができる。

【0044】

いくつかの態様では、これは、個々の試料または試料の群を、固有の分子識別子配列（ＵＭＩ）を含む固有の識別子またはバーコードと共に区画に分けることによって実行される。いくつかの態様では、固有の識別子は、個々の試料の核酸内容物、または試料の他の成分、特にそれらの核酸の断片に結合するか、またはそれ以外の方法で関連付けることができる核酸バーコード配列を含む核酸分子（例えば、オリゴヌクレオチド）の形態で提供される。核酸分子は、所定の区画における核酸分子間として、そこに含まれる核酸バーコード配列が同じであるが、異なる区画間として、核酸分子が異なるバーコード配列を有することができ、かつ、有し、あるいは、所定の分析における区画のすべてで多くの異なるバーコード配列を少なくとも表すように、区画に分けられる。いくつかの態様では、１つの核酸バーコード配列のみが所定の区画に関連付けられ得るが、いくつかの実施形態では、２つ以上の異なるバーコード配列が存在してもよい。

【0045】

核酸バーコード配列は、核酸分子（例えば、オリゴヌクレオチド）の配列内に約６個から約２０個以上のヌクレオチドを含み得る。核酸バーコード配列は、約６個から約２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００個以上のヌクレオチドを含み得る。いくつかの実施形態では、バーコード配列の長さは、約６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０ヌクレオチドまたはそれ以上であってもよい。いくつかの実施形態では、バーコード配列の長さは、少なくとも約６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０ヌクレオチドまたはそれ以上であってもよい。いくつかの実施形態では、バーコード配列の長さは、最大で約６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０ヌクレオチドまたはそれ以下であってもよい。これらのヌクレオチドは、完全に連続していてもよく、すなわち、隣接するヌクレオチドの単一のストレッチであってもよく、または１個以上のヌクレオチドによって分離された２個以上の別々の部分配列（ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）に分離されていてもよい。いくつかの実施形態では、分離したバーコード部分配列は、長さが約４から約１６ヌクレオチドであってもよい。いくつかの実施形態では、バーコード部分配列は、約４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６ヌクレオチドまたはそれより長くてもよい。いくつかの実施形態では、バーコード部分配列は、少なくとも約４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６ヌクレオチドまたはそれより長くてもよい。いくつかの実施形態では、バーコード部分配列は、最大で約４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６ヌクレオチドまたはそれより短くてもよい。

【0046】

共に区画に分けられた核酸分子は、共に区画に分けられた試料からの核酸の処理に有用な他の機能的配列も含むことができる。これらの配列としては、例えば、関連するバーコード配列を結合させながら区画内の個々の試料からゲノムＤＮＡを増幅するための標的化またはランダム／ユニバーサル増幅プライマー配列、配列決定プライマーまたはプライマー認識部位、例えば、配列の存在の識別のための、またはバーコード核酸をプルダウンするためのハイブリダイゼーションまたはプローブ配列、あるいは多くの他の潜在的な機能的配列のいずれかが挙げられる。例えば、１つの区画がオリゴヌクレオチドを含有している２つ以上の区画の合体、または区画、例えば、マイクロ流体系内の区画へのオリゴヌクレオチドの微分散を含む、オリゴヌクレオチドを共に区画に分ける他の機構も採用されてもよい。いくつかの実施形態では、プライマーは、バーコードオリゴヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、プライマー配列は、鋳型核酸分子内の配列に相補的な標的化プライマー配列である。いくつかの実施形態では、第１の核酸分子は、１つ以上の機能的配列をさらに含み、第２の核酸分子は、１つ以上の機能的配列を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の機能的配列は、アダプター配列、追加のプライマー配列、プライマーアニーリング配列、配列決定プライマー配列、シーケンサーのフローセルに結合するように構成された配列、および固有の分子識別子配列からなる群から選択される。

【0047】

例えば、上記のバーコード化核酸分子（例えば、バーコード化オリゴヌクレオチド）を試料に添加する。いくつかの実施形態では、区画は、同じバーコード配列を有するバーコード化オリゴヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、複数の区分のうちの１つの区分は、同一のバーコード配列を有するバーコード化オリゴヌクレオチドを含み、複数の区分内の各区分は、固有のバーコード配列を含む。いくつかの実施形態では、バーコード化オリゴヌクレオチドの集団は、少なくとも約１，０００個の異なるバーコード配列、少なくとも約５，０００個の異なるバーコード配列、少なくとも約１０，０００個の異なるバーコード配列、少なくとも約５０，０００個の異なるバーコード配列、少なくとも約１００，０００個の異なるバーコード配列、少なくとも約１，０００，０００個の異なるバーコード配列、少なくとも約５，０００，０００個の異なるバーコード配列、または少なくとも約１０，０００，０００個以上の異なるバーコード配列を含む多様なバーコード配列ライブラリーを提供する。さらに、各バーコード化オリゴヌクレオチドは、多数の核酸（例えば、オリゴヌクレオチド）分子が結合した状態で提供され得る。特に、個々のバーコード化オリゴヌクレオチド上にバーコード配列を含む核酸分子の分子の数は、少なくとも約１，０００個の核酸分子、少なくとも約５，０００個の核酸分子、少なくとも約１０，０００個の核酸分子、少なくとも約５０，０００個の核酸分子、少なくとも約１００，０００個の核酸分子、少なくとも約５００，０００個の核酸分子、少なくとも約１，０００，０００個の核酸分子、少なくとも約５，０００，０００個の核酸分子、少なくとも約１０，０００，０００個の核酸分子、少なくとも約５０，０００，０００個の核酸分子、少なくとも約１００，０００，０００個の核酸分子、少なくとも約２５０，０００，０００個の核酸分子、および、実施形態によっては、少なくとも約１０億個以上の核酸分子であり得る。所与のバーコード化オリゴヌクレオチドの核酸分子は、同一（または共通）のバーコード配列、異なるバーコード配列、またはその両方の組み合わせを含んでもよい。所与のバーコード化オリゴヌクレオチドの核酸分子は、複数のセットの核酸分子を含んでもよい。所与のセットの核酸分子は、同一のバーコード配列を含んでもよい。同一のバーコード配列は、別のセットの核酸分子のバーコード配列と異なり得る。

【0048】

さらに、バーコード化オリゴヌクレオチドの集団が区画に分けられる際、結果として生じる区画の集団はさらに、少なくとも約１，０００個の異なるバーコード配列、少なくとも約５，０００個の異なるバーコード配列、少なくとも約１０，０００個の異なるバーコード配列、少なくとも約５０，０００個の異なるバーコード配列、少なくとも約１００，０００個の異なるバーコード配列、少なくとも約１，０００，０００個の異なるバーコード配列、少なくとも約５，０００，０００個の異なるバーコード配列、または少なくとも約１０，０００，０００個の異なるバーコード配列を含む多様なバーコードライブラリーを含んでもよい。さらに、集団の各区画は、少なくとも約１，０００個の核酸分子、少なくとも約５，０００個の核酸分子、少なくとも約１０，０００個の核酸分子、少なくとも約５０，０００個の核酸分子、少なくとも約１００，０００個の核酸分子、少なくとも約５００，０００個の核酸分子、少なくとも約１，０００，０００個の核酸分子、少なくとも約５，０００，０００個の核酸分子、少なくとも約１０，０００，０００個の核酸分子、少なくとも約５０，０００，０００個の核酸分子、少なくとも約１００，０００，０００個の核酸分子、少なくとも約２５０，０００，０００個の核酸分子、および、実施形態によっては、少なくとも約１０億個の核酸分子を含んでもよい。

【0049】

いくつかの実施形態では、所定の区画内に複数の異なるバーコードを組み込むことが望ましい場合がある。例えば、いくつかの実施形態では、区画内のバーコード化オリゴヌクレオチドは、（１）区画内のすべてのバーコード化オリゴヌクレオチドによって共有される共通のバーコード配列、および（２）各バーコード化オリゴヌクレオチド間で異なる固有の分子識別子または追加のバーコード配列を含むことができる。共通のバーコード配列は、例えば、所定の区画からの出力の二重の確認または独立した確認として、所定の区画へのバーコードのより強いアドレスまたは属性を提供することによって、その後の処理における識別をより確実なものとする場合がある。

【0050】

いくつかの実施形態では、バーコード化オリゴヌクレオチドはビーズに結合し、ここで、特定のビーズに結合する核酸分子のすべては同じ核酸バーコード配列を含むが、多くの多様なバーコード配列は、使用されるビーズの集団にわたって表される。いくつかの実施形態では、例えば、ポリアクリルアミドポリマーマトリックスを含むヒドロゲルビーズは、多くの核酸分子を運ぶことができるため、核酸分子の固体支持体および区画への送達ビヒクルとして用いられ、本明細書の他の箇所に記載されるように、特定の刺激への曝露時にそれらの核酸分子を放出するように構成されてもよい。

【0051】

核酸分子（例えば、オリゴヌクレオチド）は、ビーズへの特定の刺激の適用時にビーズから放出可能であってもよい。いくつかの実施形態では、刺激は、例えば、核酸分子を放出する感光性の連結の切断による、光刺激であってもよい。他の実施形態では、熱刺激が使用されてもよく、ビーズ環境の温度の上昇は、連結の切断を引き起こすか、核酸分子の他の放出はビーズを形成する。さらに他の実施形態では、ビーズへの核酸分子の連結を切断するか、さもなければビーズからの核酸分子の放出をもたらす化学的刺激が使用されてもよい。一実施形態では、このような組成物は、試料のカプセル化のために上記のポリアクリルアミドマトリックスを含み、ＤＴＴなどの還元剤への曝露を介して結合した核酸分子の放出のために分解されてもよい。

【0052】

本開示の方法において使用するために企図され得る支持体は、例えば、ウェル、マトリックス、ロッド、容器、またはビーズであってもよい。支持体は、任意の有用なサイズ、表面化学、流動性、固体性、密度、多孔性、および組成などの任意の有用な特性および特徴を有していてもよい。いくつかの実施形態では、支持体は、プレート上のウェルの表面である。いくつかの実施形態では、支持体は、ゲルビーズなどのビーズであってもよい。ビーズは、固体または半固体であってもよい。ビーズのさらなる詳細は、本明細書の他の箇所で提供されている。

【0053】

支持体（例えば、ビーズ）は、それに官能化されたアンカー配列（例えば、本明細書に記載されている）を含んでもよい。アンカー配列は、例えば、ジスルフィド結合を介して支持体に結合されてもよい。アンカー配列は、部分的なリード配列および／またはフローセル機能的配列を含んでもよい。このような配列は、シーケンサー（例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａシーケンサー）によって配列に結合した核酸分子の配列決定を可能にし得る。様々なアンカー配列は様々な配列決定用途に役立つことがある。アンカー配列は、例えば、ＴｒｕＳｅｑまたはＮｅｘｔｅｒａの配列を含んでもよい。アンカー配列は任意の有用な長さおよびヌクレオチド組成などの任意の有用な特徴を有していてもよい。例えば、アンカー配列は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個以上のヌクレオチドを含んでもよい。いくつかの実施形態では、アンカー配列は、１５個のヌクレオチドを含んでもよい。アンカー配列のヌクレオチドは、自然発生のものであってもよく、または、非自然発生のものであってもよい（例えば、本明細書に記載されるように）。ビーズは、それに結合した複数のアンカー配列を含んでもよい。例えば、ビーズは、それに結合した複数の第１のアンカー配列を含んでもよい。いくつかの実施形態では、ビーズは、それに結合した２つ以上の異なるアンカー配列を含んでもよい。例えば、ビーズは、それに結合した複数の第１のアンカー配列（例えば、Ｎｅｘｔｅｒａ配列）および複数の第２のアンカー配列（例えば、ＴｒｕＳｅｑ配列）の両方を含んでもよい。それに結合した２つ以上の異なるアンカー配列を含むビーズについて、各異なるアンカー配列の配列は、ビーズから遠位の端部において、他のアンカー配列のそれぞれの配列から区別可能であってもよい。例えば、異なるアンカー配列は、ビーズから最も遠い２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個以上のヌクレオチドにおいて１個以上のヌクレオチドの違いを含んでもよい。

【0054】

いくつかの実施形態では、複数の異なるバーコード分子（例えば、核酸バーコード分子）が、同じ支持体（例えば、ビーズ）上に生成されてもよい。例えば、２つの異なるバーコード分子が同じ支持体上に生成されてもよい。代替的に、３つ以上の異なるバーコード分子が、同じ支持体上に生成されてもよい。同じ支持体に結合した異なるバーコード分子は、１つ以上の異なる配列を含んでもよい。例えば、異なるバーコード分子は、１つ以上の異なるバーコード配列および／または他の配列（例えば、スターター配列）を含んでもよい。いくつかの実施形態では、同じ支持体に結合した異なるバーコード分子は、同じバーコード配列を含んでもよい。同じ支持体に結合した異なるバーコード分子は、同じまたは異なるバーコード配列を含んでもよい。同様に、異なるバーコード分子は、同じまたは異なる固有の分子識別子（ＵＭＩ）を含んでもよい。

【0055】

次世代シーケンシング
本明細書に開示される方法に記載されるように、細胞ベースのアッセイを含む細胞に対する検査薬による生物学的効果を検出するのに核酸分子の配列決定が使用され、これが有用である。概して、配列決定は、１つ以上のポリヌクレオチドにおけるヌクレオチド塩基の配列を判定するための方法および技術を指す。ポリヌクレオチドは、例えば、その変異体または誘導体（例えば、一本鎖ＤＮＡ）を含む、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）であり得る。配列決定は、現在入手可能な様々なシステム、例えば、限定されないが、Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｏｘｆｏｒｄ Ｎａｎｏｐｏｒｅ、またはＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ）による配列決定システムによって実施することができる。このような装置は、対象によって提供された試料から装置によって生成された、対象（例えば、ヒト）の遺伝情報に対応する複数の生の遺伝データを提供することができる。いくつかの状況では、本明細書で提供されるシステムおよび方法は、プロテオミクス情報と共に使用されてもよい。代替的にまたは追加的に、配列決定は、核酸増幅、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（例えば、デジタルＰＣＲ、定量的ＰＣＲ、またはリアルタイムＰＣＲ）、または等温増幅を使用して実施されてもよい。そのようなシステムは、対象によって提供された試料からシステムによって生成された、対象（例えば、ヒト）の遺伝情報に対応する複数の生の遺伝データを提供してもよい。いくつかの例では、そのようなシステムは、配列決定リード（本明細書では「リード」ともいう）を提供する。リードは、配列決定された核酸分子の配列に対応する核酸塩基の文字列を含み得る。いくつかの状況では、本明細書で提供されるシステムおよび方法は、プロテオミクス情報と共に使用されてもよい。

【0056】

次世代シーケンシングは、大量の配列情報を生成することができる多くの技術（例えば、ハイスループットシーケンシング）を含み、サンガーシーケンシングまたはマキサム・ギルバートシーケンシングを除くものである。概して、次世代シーケンシングは、単一分子リアルタイムシーケンシング、合成によるシーケンシング、イオン半導体シーケンシングなどを包含する。例示的な次世代シーケンシングマシンは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．のＭｉｎｉＳｅｑ、ｉＳｅｑ１００、ＮｅｘｔＳｅｑ １０００、ＮｅｘｔＳｅｑ ２０００、ＮｏｖａＳｅｑ ６０００、ＮｅｘｔＳｅｑ ５５０シリーズなど、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃからのＩｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔマシン、または、Ｐａｃｉｆｉｃ ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓからのＳｅｑｕｅｌシステムを含んでもよい。

【0057】

本明細書における方法と共に使用される次世代シーケンシングマシンは、１つの機械から２４時間以内に少なくとも１、５、１０、１５、２５、５０、７５、１００、２００、または３００ギガバス以上のデータを生成することができる。

【0058】

本明細書における方法と共に使用される次世代シーケンシングマシンは、１つの機械から２４時間以内に少なくとも１、１、４、１０、１５、２５、５０、７５、１００、２００、３００、５００、または１０億以上の配列リードのデータを生成することができる。

【0059】

シーケンシングデータを受信して解析し、その後、サーバー、解析ポータル、または電子メールを介して電子的に送信またはアクセスすることができる１つ以上のレポートを出力するためのコンピュータプログラム、コンピューティング装置、または解析プラットフォーム／システムも含まれる。コンピューティング装置または解析プラットフォームは、本明細書に記載されるアルゴリズムおよび方法に従って動作することができる。

【0060】

反応混合物
本明細書では、配列決定によって試料中のレポーターの発現レベルを判定するための反応混合物も提供される。いくつかの実施形態では、反応混合物は、本明細書で提供される対照核酸と、上記生体試料の少なくとも一部と、存在する場合には試料中のバーコードを増幅するのに十分な１つ以上の酵素または試薬とを含む。

【0061】

対照核酸は、一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、または二本鎖ＲＮＡのうちのいずれか１つ以上であってもよい。いくつかの実施形態では、上記対照核酸は、反応混合物あたり約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３２０、３４０、３６０、３８０、４００、４２０、４４０、４６０、４８０、または５００コピーの濃度で存在する。

【0062】

いくつかの実施形態では、酵素または試薬は、逆転写酵素、ｄＮＴＰ、バーコードもしくは対照核酸配列に特異的なプライマー対、マグネシウム塩、またはそれらの組み合わせを含む。

【0063】

いくつかの実施形態では、反応混合物は、対照核酸またはバーコード核酸を増幅または複製するために使用することができる１つ以上の酵素を含む。いくつかの実施形態では、酵素は、逆転写酵素である。逆転写酵素の非限定的な例としては、限定されないが、トリ骨髄芽球症ウイルス（ＡＭＶ）逆転写酵素、およびモロニーマウス白血病ウイルス（Ｍ－ＭｕＬＶ、ＭＭＬＶ）、およびその変異体が挙げられる。

【0064】

いくつかの実施形態では、反応はデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）を含む。いくつかの実施形態では、キットは、核酸の他、いずれかの他の所望の核酸（例えば、ｄＡＴＧ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ）の増幅に必要なｄＮＴＰの各々の混合物を含む。

【0065】

いくつかの実施形態では、反応混合物はマグネシウム塩を含む。いくつかの実施形態では、マグネシウム塩は、反応の酵素（例えば、逆転写酵素）が機能し、標的核酸を増幅できるように十分な量で含まれる。いくつかの実施形態では、マグネシウム塩は、塩化マグネシウムである。いくつかの実施形態では、反応混合物は、約０．１ｍＭから約５０ｍＭのマグネシウムイオンの濃度を含む。いくつかの実施形態では、マグネシウムイオンの濃度は、約１ｍＭから約１０ｍＭである。

【0066】

いくつかの実施形態では、上記反応混合物の体積は、約１０マイクロリットルから約１００マイクロリットルである。いくつかの実施形態では、上記反応混合物の体積は、約２０マイクロリットルから約９０マイクロリットル、約３０マイクロリットルから約８０マイクロリットル、または約４０マイクロリットルから約６０マイクロリットルである。いくつかの実施形態では、上記反応混合物の体積は、約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００マイクロリットルである。

【0067】

品質管理方法
上述のように、本明細書に記載される方法によるアッセイ設計の非限定的な例は、１）ウェルプレートのウェルに細胞を播種する工程と、２）細胞を検査薬に接触させて、標的ポリペプチドを介して検査薬がレポーターの活性化（例えば、バーコードの発現）に影響を及ぼす時間を与える工程と、３）細胞を溶解して細胞から核酸を放出させる工程と、４）溶解物をＤＮＡｓｅ処理し、関連ＲＮＡを生成する工程と、５）逆転写されたｍＲＮＡを逆転写および／または増幅し、ｃＤＮＡまたは増幅されたｃＤＮＡ（例えば、ＲＴ－ＰＣＲ）を作製する工程と、６）次世代配列決定反応のためにｃＤＮＡを調製する工程と、７）調製したｃＤＮＡを配列決定する工程とを含んでもよい。

【0068】

図３は、ＤＮａｓｅ工程中に添加される複数の対照核酸のリードカウントを示す。示されているこの実施形態では、複数の核酸は、複数の二本鎖ＤＮＡスパイクである。この例では、溶解工程中に複数の核酸を添加した。ＤＮａｓｅ工程が行われなかったアッセイについては、「スパイク－ＤＮａｓｅなし」と標識されているグラフの左半分にある複数の核酸のリードカウントが得られ、ＤＮａｓｅ工程が行われたアッセイについては、「スパイク－標準－ｐ」と標識されているグラフの右半分のリードカウントが得られた。ゆえに、グラフの左半分のリードカウントは大きく（１ｅ＋０５と１ｅ＋０４との間）、これは、複数の核酸（例えば、二本鎖ＤＮＡスパイク）が切断されておらず、したがって依然として溶液中に存在し、特定することができたためである。対照的に、左側のリードカウントははるかに低く、これは、複数の核酸のうちの多くが切断されており、したがって依然として溶液中に存在しているわけではなく、特定することができなかったためである。ゆえに、バーコードの使用により、ＤＮａｓｅ工程の程度を評価することができ（例えば、二本鎖ＤＮＡの量を約１ｅ＋０５から０リードまで低下させる）、これは、リードカウントに基づくある特定の比率（例えば、ＤＮａｓｅ非効率）を用いても評価することができる。

【0069】

図４は、導入される複数の核酸の元の合計量に対する複数の対照核酸のリード割合を示す。示されているこの実施形態では、複数の核酸は、複数の一本鎖ＤＮＡである。さらに、示されているこの実施形態では、ＲＴ－ＰＣＲ工程の直前に複数の核酸を添加した。この実施形態では、「スパイク－ＲＴなし」と標識されているグラフの左側のリード割合は、逆転写試薬を使用しなかったアッセイのリード割合である。ゆえに、リード割合は高い傾向があり、多数は１．０付近であり、これは、ＲＴ－ＰＣＲ工程において、試料中のＲＮＡがいずれもＤＮＡに変換されず、したがって配列決定反応に至ったリードのみがｓｓＤＮＡスパイクインに関連付けられるものであるからである。「スパイク－標準－ｐ」と標識されているグラフの右側のリード割合は、ＲＴ－ＰＣＲ工程を行ったアッセイのリード割合であり、ＲＴ－ＰＣＲ工程を行った後にリード割合を判定した。ゆえに、リード割合は、試料中に存在するＲＮＡの大部分がｃＤＮＡに転写されたことを示す。

【0070】

図５は、上述の１つ以上の工程中に添加される１０，０００スパイクの量で導入される様々な複数の核酸のリードカウントを示す。例えば、「ｎ１０１８５」と標識されたリードカウントは、ＲＴ－ＰＣＲ工程中に添加されたＲＮＡスパイクの量を表し、「ｎ１０１８６」と標識されたリードカウントは、ＤＮａｓｅ工程中に添加されたＲＮＡの量を表し、「ｎ１０１８７」と標識されたリードカウントは、溶解工程中に添加された二本鎖ＤＮＡスパイクの量を表し、「ｎ１０１８８」と標識されたリードカウントは、ＲＴ－ＰＣＲ工程中の一本鎖ＤＮＡの量を表す。示されているこの実施形態では、リードカウントｎ１０１８５は、ＲＴ－ＰＣＲ工程の開始時にとられ、ゆえに、リードカウントは、逆転写酵素がまだ行われていないため、１０，０００であるか、またはこれをわずかに下回る。示されているこの実施形態では、リードカウントｎ１０１８６は、ＤＮａｓｅ工程中のＲＮＡの保存に関する情報を提供し、ゆえに、リードカウントは、１０，０００であるか、またはこれをわずかに下回るので、ＤＮａｓｅがＲＮＡスパイクを分解しなかったことを示す。示されているこの実施形態では、リードカウントｎ１０１８７は、ＤＮａｓｅ工程におけるＤＮＡ分解の効率に関する情報をもたらし、したがって、多くの二本鎖ＤＮＡがＤＮａｓｅ工程中に切断されるため、リードカウントがより低くなる。さらに、示されているこの実施形態では、リードカウントｎ１０１８８は、ＲＴ－ＰＣＲ工程の効率に関する情報をもたらし、したがって、試料ＲＮＡの多くがＤＮＡに変換されたため、リードカウントがより低くなり、添加されたＤＮＡスパイクの全体のカウントを引き下げている。

【0071】

図７は、ＤＮａｓｅ工程中のＲＮＡスパイク（例えば、リードカウント７０２）、溶解工程中のＤＮＡスパイク（例えば、リードカウント７０４）、溶解工程中のＲＮＡスパイク（例えば、リードカウント７０６）、ＲＴ－ＰＣＲ工程中のＤＮＡスパイク（例えば、リードカウント７０８）、およびＲＴ－ＰＣＲ工程中のＲＮＡスパイク（例えば、リードカウント７１０）の様々なリードカウントを示す。示されているリードカウントは、２つの異なるアッセイ（例えば、実行１１０と実行１１２）に関連付けられ、各アッセイで使用される複数のウェル（例えば、プレート１０５、プレート１０６、プレート１０９、プレート１１０、プレート５、およびプレート６）から得たものである。

【0072】

上述のように、図３～７に示されている上記結果から、溶解ＲＮＡ安定性比率、ＤＮａｓｅ非効率、ＲＴ効率、ＲＴ－ＰＣＲ ＲＮＡ安定性比率、およびＤＮａｓｅ ＲＮＡ安定性比率などの特定の比率が算出されてもよい。

【実施例】

【0073】

以下の例示的な実施例は、本明細書に記載される組成物および方法の実施形態を表し、いずれにしても限定することを意味するものではない。

【0074】

実施例１－対照におけるＲＮＡベースのスパイクにより、液体処理の不備を示すウェルからのデータを棄却することができる
いくつかの重要な工程において本発明者らのワークフローの性能を知らせることができる特殊なプロセス対照を設けた。これらの対照は、様々な中間反応で試料に正確な量で添加された様々な合成ＤＮＡ分子とＲＮＡ分子を含む。その後、これらの「スパイクイン」は、実際の試料と共に同じ下流プロセスを受ける。これらの対照の配列決定による読み出しは、多重化アッセイ終了時に行われ、その結果により、プロセスがどのように行われたか、そして問題があるのであれば、プロセスのどの態様が問題を経験していたかについて重要な洞察がもたらされる。これらの対照のメトリックによって、プロセスの課題の迅速な検出、調査、および解決が可能になった。

【0075】

例えば、図１では、マルチウェルプレートのウェル中の細胞を検査薬に接触させてバーコード化レポーターを発現させる（または発現させない）ＨＴＳアッセイを実施した。ＲＮＡを回収し、逆転写し、次世代シーケンシングアッセイを用いて配列決定した。いくつかの合成ＲＮＡスパイクの性能により、どのように多重化アッセイを行うかについて洞察がもたらされる。図１の例では、これらの分子の存在量が少ないウェルを相当数含んだプレートが４つあり、これらは、本発明者らの液体移動工程のうちの１つにおいてプロセスに課題があることを示している。この図では、ＲＮＡスパイクイン（ｓｉｋｅ ｉｎ）のリードカウントを有するウェルが所定のカットオフを下回っており、棄却となった。

【0076】

個別の品質管理スパイクインを使用することで実現した改善の影響を測定するのに加え、データの品質を測定するための解析ツールを開発した。大部分のハイスループットバイオアッセイは、マルチウェルのマイクロタイタープレートで行う。概して、これらのプレートの各ウェルでは、特定の実験条件、すなわち、化学物質がウェル中の細胞に及ぼす影響を試験する。上述のプロセス対照の他、本発明者らの細胞レポーターの挙動により、複数の特定の品質管理フィルタを適用して、性能の低いウェルと良好なものを区別することができる。品質が高いウェルからくるデータのみを下流バイオインフォマティクスパイプラインに通して解析を行う。どのくらいのウェルがＱＣゲートを通過できないか、そしてなぜ通過できないかについてのメトリックにより、プロセスの監視が可能になり、より重点的に問題をトラブルシューティングすることができる。

【0077】

実施例２－対照におけるＲＮＡベースのスパイクにより、液体処理の不備を示すウェルからのデータを棄却することができる
上述のような溶解工程、ＤＮａｓｅ工程、ＲＴ－ＰＣＲ工程、および配列決定工程を含むプロセスに対する特殊なプロセス対照を判定する。

【0078】

２０μＬの溶解緩衝液と複数の細胞を含む溶液を作製して細胞を溶解し、ＤＮＡスパイク（例えば、第２の複数の核酸）とＲＮＡスパイク（例えば、第１の複数の核酸）を、ＲＮＡスパイク（例えば、第１の複数の対照核酸）の濃度が０．５ｐＭ、ＤＮＡスパイク（例えば、第２の複数の対照核酸）の濃度が０．５ｐＭとなるように添加する。

【0079】

８μＬの溶解溶液を新たなウェルに移し、４μｍの緩衝液を添加するのに加えて（その結果、総体積が１２μＬとなる）、ＲＮＡスパイクイン（例えば、第５の複数の核酸）を添加して０．５ｐＭの濃度を達成し、ＤＮａｓｅ工程を行う。

【0080】

４μＬのＤＮａｓｅ溶液を新たなウェルに移して、ＲＮＡスパイク（例えば、第３の複数の核酸）を、総濃度が０．１３ｐＭとなるように、ＤＮＡスパイク（例えば、第４の複数の核酸）を、総濃度が０．１３ｐＭとなるようにした（その結果、総体積が１２μＬとなる）。ＲＴ－ＰＣＲを行う。その後、ＲＴ ＰＣＲ工程の試料を調製し、次世代シーケンシングマシン上で配列決定する。配列決定後にそれぞれの複数の核酸について総カウントを収集し、データを用いて、アッセイが特定の公差未満で実施され、それに応じて個々のウェルからのデータを認容するか、棄却するかを判定する。あるいは、通過できないウェルが多すぎる場合は、オペレータがトラブルシューティングして、どの工程が非効率的に実行されているかを判定してもよい。

【0081】

本発明の好ましい実施形態が本明細書中で示され、記載されてきたが、このような実施形態はほんの一例として提供されているに過ぎないことが当業者に明らかであろう。当業者であれば、多くの変更、変化、および置換が、本発明から逸脱することなく思いつくだろう。本明細書に記載される本発明の実施形態の様々な代替案が、本発明の実施に際して利用され得ることを理解されたい。

【0082】

本明細書で言及されているすべての刊行物、特許出願、発行特許、およびその他の文書は、個々の刊行物、特許出願、発行特許、またはその他の文書がその全体が参照により組み込まれることが具体的かつ個別に示されているかのように、参照により本明細書に組み込まれる。参照により組み込まれるテキストに含まれる定義は、本開示における定義と矛盾する範囲において除外される。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【国際調査報告】