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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-12-17
(54)【発明の名称】タンパク質測定のための次世代シーケンシング
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/06 20060101AFI20241210BHJP
C12Q 1/68 20180101ALI20241210BHJP
C12Q 1/6816 20180101ALI20241210BHJP
C12Q 1/6844 20180101ALI20241210BHJP
C12Q 1/6869 20180101ALI20241210BHJP
C12Q 1/6855 20180101ALI20241210BHJP
C12Q 1/686 20180101ALI20241210BHJP
C12Q 1/6865 20180101ALI20241210BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/06
C12Q1/68 100Z
C12Q1/6816 Z
C12Q1/6844 Z
C12Q1/6869 Z
C12Q1/6855 Z
C12Q1/686 Z
C12Q1/6865 Z
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024539484
(86)(22)【出願日】2022-12-29
(85)【翻訳文提出日】2024-08-23
(86)【国際出願番号】 US2022082594
(87)【国際公開番号】W WO2023130049
(87)【国際公開日】2023-07-06
(31)【優先権主張番号】63/294,964
(32)【優先日】2021-12-30
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＰＹＴＨＯＮ
(71)【出願人】
【識別番号】505373306
【氏名又は名称】ソマロジック オペレーティング カンパニー インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100114775
【弁理士】
【氏名又は名称】高岡 亮一
(74)【代理人】
【識別番号】100121511
【弁理士】
【氏名又は名称】小田 直
(74)【代理人】
【識別番号】100202751
【弁理士】
【氏名又は名称】岩堀 明代
(74)【代理人】
【識別番号】100208580
【弁理士】
【氏名又は名称】三好 玲奈
(74)【代理人】
【識別番号】100191086
【弁理士】
【氏名又は名称】高橋 香元
(72)【発明者】
【氏名】ジチ，ドム
(72)【発明者】
【氏名】ワイス，アリソン
(72)【発明者】
【氏名】セゲッティ，デイヴィッド
(72)【発明者】
【氏名】ジェンコ，キャスリン
【テーマコード（参考）】
4B063
【Ｆターム（参考）】
4B063QA01
4B063QQ79
4B063QR32
4B063QR55
4B063QR62
4B063QS25
4B063QS34
4B063QX02
(57)【要約】
生物学的サンプル中のタンパク質などの標的分子を検出および定量化する方法を提供する。開示された方法は、アプタマーで標的分子を捕捉することと、アプタマーをアプタマー同定配列に置き換えることと、次世代シーケンシング技術を使用して、アプタマー同定配列を配列決定することと、を含む。
【選択図】図３Ａ
【選択図】図３Ａ
【特許請求の範囲】
【請求項1】
生物学的サンプル中の標的タンパク質の存在量を定量化するための方法であって、前記生物学的サンプルを、それぞれが特定のタンパク質に結合するように構成された複数のアプタマーに曝露することによって、前記標的タンパク質を捕捉することと；
アプタマー含有溶出液中の前記標的タンパク質のうちの１つを捕捉した前記アプタマーを単離することと；
前記溶出液中の前記アプタマーを、それぞれが特定のアプタマーにハイブリダイズするように構成された複数の捕捉プローブに曝露することにより、複数の三分子複合体を形成することであって、各三分子複合体が、
前記溶出液からの前記アプタマーのうちの１つと、
前記アプタマーの第１の部分にハイブリダイズした部分を含む第１の捕捉プローブと、
前記アプタマーの第２の部分にハイブリダイズした部分、ＤＮＡプライマー領域、前記アプタマーに対応するアプタマーＩＤ配列を含む第２の捕捉プローブと、を含む、形成することと；
前記三分子複合体をアプタマーに結合していない捕捉プローブから分離することと；
前記三分子複合体中の前記捕捉プローブを前記対応するアプタマーから解離させることと；
前記解離させた捕捉プローブ中の前記アプタマーＩＤ配列を増幅させることと；
次世代シーケンシングにより前記アプタマーＩＤ配列を配列決定することと：
前記アプタマーＩＤ配列の配列決定により得られたデータに基づいて、前記生物学的サンプル中の前記標的タンパク質の存在量を決定することと、を含む方法。
【請求項2】
前記アプタマーが、ＳＯＭＡｍｅｒである、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記三分子複合体を形成する前に、前記アプタマー含有溶出液を２つ以上のグループに分割することをさらに含み、前記複数の捕捉プローブが、２つ以上のグループに対応する２つ以上の別個の捕捉プローブのセットを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項4】
前記アプタマーＩＤ配列を増幅させる前に、前記解離した捕捉プローブを複数のアリコートに分割することをさらに含み、前記アプタマーＩＤ配列を増幅させることが、各アリコート中の異なるサブセットのアプタマーＩＤ配列を増幅させることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項5】
前記アプタマーＩＤ配列を増幅させる前に、前記少なくとも１つのアリコートを希釈することをさらに含む、請求項４に記載の方法。
【請求項6】
前記アプタマーＩＤ配列を増幅させる前に、各アリコートに定量的スパイクレポーターを添加することをさらに含む、請求項４に記載の方法。
【請求項7】
前記アプタマーＩＤ配列を配列決定する前に、前記アリコートを再度組み合わせることをさらに含む、請求項６に記載の方法。
【請求項8】
生物学的サンプル中の２種以上の標的タンパク質の存在量を定量化するための方法であって、前記方法が、それぞれが特定のタンパク質を捕捉するように構成された複数のアプタマーに前記生物学的サンプルを曝露することによって、前記標的タンパク質を捕捉することと；
前記生物学的サンプル中の前記標的タンパク質のうちの１つを捕捉した前記アプタマーを単離することによって、アプタマー含有溶出液を形成することと；
複数の三分子複合体を形成することであって、各三分子複合体が：
前記アプタマー含有溶出液中に存在する特定のアプタマーと、
前記特定のアプタマーの対応する第１の部分にハイブリダイズした第１のプローブと、
前記特定のアプタマーの対応する第２の部分にハイブリダイズした部分、少なくとも１つのＤＮＡプライマー領域、および前記特定のアプタマーに対応するアプタマーＩＤ配列を含む、第２のプローブと、を含む、形成することと、
前記アプタマーＩＤ配列を増幅させることと；
前記アプタマーＩＤ配列を配列決定することと；
前記配列決定されたアプタマーＩＤ配列に基づいて、前記標的タンパク質の、前記存在量を定量化することと、を含む、方法。
【請求項9】
前記アプタマーが、ＳＯＭＡｍｅｒである、請求項８に記載の方法。
【請求項10】
前記三分子複合体を形成する前に、前記アプタマー含有溶出液を２つ以上の希釈グループに分割することをさらに含み、前記複数の捕捉プローブが、２つ以上の希釈グループに対応する２つ以上の別個の捕捉プローブのセットを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項11】
前記アプタマーＩＤ配列を増幅させる前に、前記解離した捕捉プローブを複数のアリコートに分割することをさらに含み、ここで、前記アリコートのうちの少なくとも１つを希釈し、前記アプタマーＩＤ配列を増幅させることが、各アリコート中の異なるサブセットのアプタマーＩＤ配列を増幅させることを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項12】
前記アプタマーＩＤ配列を増幅させる前に、各アリコートに定量的スパイクレポーターを添加することをさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項13】
前記アプタマーＩＤ配列を配列決定する前に、前記アリコートを再度組み合わせることをさらに含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項14】
前記アプタマーＩＤ配列を配列決定することが、次世代シーケンシングによって達成される、請求項８に記載の方法。
【請求項15】
生物学的サンプル中の標的タンパク質を検出するための方法であって、前記生物学的サンプルを、それぞれが特定のタンパク質を捕捉するように構成された複数のアプタマーと組み合わせることによって、アプタマーで標的タンパク質を捕捉することと；
三分子複合体を形成することであって、
前記標的タンパク質を捕捉したアプタマーと、
前記標的タンパク質を捕捉した前記アプタマーの対応する第１の部分にハイブリダイズした部分を含む第１のプローブと、
前記標的タンパク質を捕捉した前記アプタマーの対応する第２の部分にハイブリダイズした部分、少なくとも１つのＤＮＡプライマー領域、および前記標的タンパク質を捕捉した前記アプタマーに対応するアプタマーＩＤ配列を含む第２のプローブと、を含む、三分子複合体を形成することと；
前記アプタマーＩＤ配列を増幅させることと；
前記アプタマーＩＤ配列の配列決定を行って、前記アプタマーＩＤ配列を同定し、それによって前記標的タンパク質を捕捉した前記アプタマーおよび前記標的タンパク質を同定することと、を含む、方法。
【請求項16】
前記アプタマー上の標的領域を決定し、次いで前記標的領域の相補体を前記第１のプローブと前記第２のプローブに分割するための境界を決定することによって、前記第１のプローブおよび前記第２のプローブを形成することをさらに含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項17】
前記境界を決定することが、前記第１のプローブおよび前記第２のプローブの前記ハイブリダイズされた部分の所望の融解温度を達成することに基づく、請求項１６に記載の方法。
【請求項18】
前記標的領域の前記相補体の前記融解温度をコンピューターにより決定することと、次いで、前記ハイブリダイズされた部分の所望の融解温度が達成されるまで、前記第１のプローブと前記第２のプローブのハイブリダイズされた部分の間の境界の変更を段階的に行うことと、をさらに含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項19】
前記アプタマーＩＤ配列を配列決定することが、次世代シーケンシングによって達成される、請求項１７に記載の方法。
【請求項20】
前記アプタマーＩＤ配列を増幅させる前に、前記第２のプローブを前記アプタマーから解離させることをさらに含む、請求項１５に記載の方法。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願
【0002】
以下の明細書および資料は、すべての目的のために、その全体が本明細書に組み込まれる：２０２１年１２月３０日出願の米国仮特許出願番号６３／２９４，９６４。
【0003】
技術分野
本開示は、生物学的サンプル中のタンパク質を定量的に測定するためのシステムおよび方法に関する。より具体的には、開示された実施形態は、特別に設計されたアプタマーで標的タンパク質を捕捉すること、標的タンパク質を捕捉したアプタマーの溶出液を作製すること、次いで、溶出液中のアプタマーを、アプタマー自体よりも簡単に配列決定できる「レポーター」ＤＮＡ分子に置き換えることに関する。
本開示は、生物学的サンプル中のタンパク質を定量的に測定するためのシステムおよび方法に関する。より具体的には、開示された実施形態は、特別に設計されたアプタマーで標的タンパク質を捕捉すること、標的タンパク質を捕捉したアプタマーの溶出液を作製すること、次いで、溶出液中のアプタマーを、アプタマー自体よりも簡単に配列決定できる「レポーター」ＤＮＡ分子に置き換えることに関する。
【0004】
概論
従来、遺伝子活性を評価する、および／または疾患プロセスもしくは薬理作用の生物学的プロセスなどの生物学的プロセスを解読するための様々な試みは、ゲノミクスに焦点を当てている。しかし、プロテオミクスは、細胞および生物の生物学的機能に関するさらなる情報を提供することができる。プロテオミクスは、遺伝子レベルよりも、タンパク質レベルでの発現を検出および定量化することにより、遺伝子活性を定性的かつ定量的に測定することを含む。プロテオミクスは、タンパク質の翻訳後修飾およびタンパク質間の相互作用など、遺伝的にコード化されていない事象の研究も含む。
従来、遺伝子活性を評価する、および／または疾患プロセスもしくは薬理作用の生物学的プロセスなどの生物学的プロセスを解読するための様々な試みは、ゲノミクスに焦点を当てている。しかし、プロテオミクスは、細胞および生物の生物学的機能に関するさらなる情報を提供することができる。プロテオミクスは、遺伝子レベルよりも、タンパク質レベルでの発現を検出および定量化することにより、遺伝子活性を定性的かつ定量的に測定することを含む。プロテオミクスは、タンパク質の翻訳後修飾およびタンパク質間の相互作用など、遺伝的にコード化されていない事象の研究も含む。
【0005】
現在では、膨大な量のゲノム情報を得ることが可能である。ＤＮＡチップは、この目的のための分子アレイとして実用化されるようになり、直接的ＤＮＡ配列決定の価格が大幅に下落し続けている。同様に、ハイスループットプロテオミクスに対する需要も高まっている。健康のモニタリングにとって、プロテオミクスは、ゲノミクスよりはるかに優れているが、その理由は、ゲノムが静的であり、医療上の可能性のみを示す一方で、プロテオームは、患者の医学的状態に応じて動的に変化し、患者の医学的状態を定義するとも言える可能性があるためである。しかし、タンパク質の検出および定量化が困難であるのに対し、核酸の検出および定量化は、比較的容易であり、その理由は、少なくとも部分的には、タンパク質は、ＤＮＡよりも生物学的機能が複雑であり、かつより多様であるためである。このため、タンパク質濃度の代理として、ｍＲＮＡ（メッセンジャーＲＮＡ）濃度を測定するための多くの取り組みが進められている。しかし、ｍＲＮＡ濃度は、タンパク質濃度と十分に相関しないことが示されている。プロテオミクスは、タンパク質を直接検出する能力に依存するように思われる。
【0006】
生物学的サンプル中の特定のタンパク質の存在を検出し、定量化する１つの方法は、タンパク質捕捉ＳＯＭＡｍｅｒ（登録商標）（Ｓｌｏｗ Ｏｆｆ－ｒａｔｅ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ａｐｔａｍｅｒ）試薬の使用を介して行われる。ＳＯＭＡｍｅｒ試薬は、ＳＯＭＡｍｅｒ試薬が選択される大規模なランダム化核酸ライブラリの物理化学的多様性を大幅に拡大する化学修飾ヌクレオチドで構成される。ＳＯＭＡｍｅｒ試薬を使用するアッセイは、個々のそれぞれのタンパク質濃度を対応するＳＯＭＡｍｅｒ試薬濃度に変換することによって、複雑なマトリックス中の天然のタンパク質を測定し、次いでこれを、マイクロアレイまたはｑＰＣＲなどの標準的なＤＮＡ技術によって定量化する。
【0007】
ＳＯＭＡｍｅｒ試薬は、アミノ酸側鎖を模倣する化学修飾ヌクレオチドを含む一本鎖ＤＮＡベースのタンパク質親和性試薬であり、標準的なアプタマーの化学的多様性を拡大させ、タンパク質と核酸の相互作用の特異性および親和性を増強する。これらの修飾ヌクレオチドは、ＳＥＬＥＸ（Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｌｉｇａｎｄｓ ｂｙ ＥＸｐｏｎｅｎｔｉａｌ ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ）と呼ばれる反復選択および増幅プロセスに使用される核酸ライブラリに組み込まれ、そのライブラリからＳＯＭＡｍｅｒ試薬が選択される。ＳＥＬＥＸタイプのプロセスを使用することにより、非修飾核酸（ＡＣＴＧ従来のアプタマー）による選択に抵抗性であったタンパク質を捕捉するためのＳＯＭＡｍｅｒ試薬を生成することができる。ＳＯＭＡｍｅｒ試薬は、特異性および遅いオフレートの望ましい特性を選択するように、ならびに試薬が使用されるアッセイ条件を模倣するように適合させることもできる。
【0008】
ＳＯＭＡｍｅｒベースのアッセイでは、サンプル中でのタンパク質の存在を、特定のＳＯＭＡｍｅｒベースのＤＮＡシグナルに変換する。ＳＯＭＡｍｅｒ－タンパク質の結合ステップ後、一連の分配ステップおよび洗浄ステップが行われ、ここで、相対的なタンパク質濃度が測定可能な核酸シグナルに変換され、この核酸シグナルを、蛍光標識されたＳＯＭＡｍｅｒとカスタムＤＮＡマイクロアレイのハイブリダイゼーションなどのＤＮＡ検出技術を使用して定量化する。マイクロアレイをレーザースキャンする際に、相対蛍光単位（ＲＦＵ）での読み取り値は、最初のサンプル中の標的タンパク質の量に正比例する。
【0009】
マイクロアレイハイブリダイゼーションを使用するタンパク質検出の定量化は、様々な欠点を有する。これらの欠点としては、スケーラビリティの制限、一定のアッセイコスト、およびマイクロアレイの商業的供給源の制限が挙げられる。したがって、捕捉後の溶出液中のＳＯＭＡｍｅｒ分子を定量化する代替的方法を開発することが望ましい。
【発明の概要】
【0010】
本開示は、次世代シーケンシングまたはＮＧＳとして知られる並列シーケンシング技術を使用するタンパク質の検出および定量化に関するシステム、装置、および方法を提供する。より具体的には、本開示は、タンパク質の捕捉をシグナル伝達するＳＯＭＡｍｅｒ溶出分子を、ＳＯＭＡｍｅｒ特異的同定タグまたは「ＳＯＭＡ ＩＤ」を含む「レポーター」ＤＮＡ分子で置き換えて、次いでこれが、ＮＧＳ技術を使用して配列決定され得るハイブリダイゼーション捕捉（ＨＣ）技術に関する。
【0011】
いくつかの実施形態では、本開示は、生物学的サンプル中の標的タンパク質の存在量を定量化するためのシステムおよび方法であって、生物学的サンプルを、それぞれが特異的タンパク質に結合するように構成された複数のアプタマーに曝露することによって、標的タンパク質を捕捉することと；アプタマー含有溶出液中の標的タンパク質のうちの１つを捕捉するアプタマーを単離することと；溶出液中のアプタマーを、それぞれが特定のアプタマーにハイブリダイズするように構成された複数の捕捉プローブに曝露することによって、複数の三分子複合体を形成することであって、各三分子複合体が、溶出液からのアプタマーのうちの１つと、アプタマーの第１の部分にハイブリダイズした部分を含む第１の捕捉プローブと、アプタマーの第２の部分にハイブリダイズした部分、ＤＮＡプライマー領域、およびアプタマーに対応するアプタマーＩＤ配列を含む第２の捕捉プローブとを含む、形成することと；三分子複合体をアプタマーに結合していない捕捉プローブから分離することと；三分子複合体中の捕捉プローブを対応するアプタマーから解離させることと；解離させた捕捉プローブ中のアプタマーＩＤ配列を増幅させることと；次世代シーケンシングによりアプタマーＩＤ配列を配列決定することと：アプタマーＩＤ配列の配列決定により得られたデータに基づいて、生物学的サンプル中の標的タンパク質の存在量を決定することと、を含むシステムおよび方法に関する。
【0012】
いくつかの実施形態では、本開示は、生物学的サンプル中の２種以上の標的タンパク質の存在量を定量化するためのシステムおよび方法であって、それぞれが特定のタンパク質を捕捉するように構成された複数のアプタマーに生物学的サンプルを曝露することによって、標的タンパク質を捕捉することと；生物学的サンプル中の標的タンパク質のうちの１つを捕捉したアプタマーを単離することによって、アプタマー含有溶出液を形成することと；複数の三分子複合体を形成することであって、それぞれが、アプタマー含有溶出液中に存在する特定のアプタマー、特定のアプタマーの対応する第１の部分にハイブリダイズした第１のプローブ、および特定のアプタマーの対応する第２の部分にハイブリダイズした部分、少なくとも１つのＤＮＡプライマー領域、および特定のアプタマーに対応するアプタマーＩＤ配列を含む第２のプローブを含む、形成することと；アプタマーＩＤ配列を増幅させることと；アプタマーＩＤ配列を配列決定することと；配列決定されたアプタマーＩＤ配列に基づいて、標的タンパク質の存在量を定量化することと、を含むシステムおよび方法に関する。
【0013】
いくつかの実施形態では、本開示は、生物学的サンプル中の標的タンパク質を検出するためのシステムおよび方法であって、生物学的サンプルを、それぞれが特定のタンパク質を捕捉するように構成された複数のアプタマーと組み合わせることによって、アプタマーで標的タンパク質を捕捉することと；標的タンパク質を捕捉したアプタマーと、標的タンパク質を捕捉したアプタマーの対応する第１の部分にハイブリダイズした部分を含む第１のプローブと、標的タンパク質を捕捉したアプタマーの対応する第２の部分にハイブリダイズした部分、少なくとも１つのＤＮＡプライマー領域、および標的タンパク質を捕捉したアプタマーに対応するアプタマーＩＤ配列を含む第２のプローブと、を含む三分子複合体を形成することと；アプタマーＩＤ配列を増幅させることと；アプタマーＩＤ配列を配列決定してアプタマーＩＤ配列を同定し、それによって標的タンパク質を捕捉したアプタマーおよび標的タンパク質を同定することと、を含むシステムおよび方法に関する。
【0014】
本開示の態様によるいくつかの実施形態では、標的タンパク質を捕捉するために使用されるアプタマーは、アプタマーをより単純な配列に変換するために、三分子複合体を使用することなく、例えば次世代シーケンシング技術を使用して、直接配列決定され得る。
【0015】
本開示の態様によるいくつかの実施形態では、標的タンパク質を捕捉するために使用されるアプタマーは、ＳＯＭＡｍｅｒであり得る。
【0016】
本開示の態様によるいくつかの実施形態では、アプタマー含有溶出液は、ハイブリダイズされたプローブ領域への曝露の前および／または曝露後にグループに分割され得る。いくつかの例では、溶出液グループの一部または全部を所望の程度まで希釈してもよい。
【0017】
本開示の態様によるいくつかの実施形態では、分析物のカウント比例性の補完的変化を補正するために、所望のアッセイ段階において、定量的スパイクレポーターを添加してもよい。
【0018】
特徴、機能、および利点を、本開示の様々な実施形態において独立して達成してもよく、またはさらに他の実施形態において組み合わせてもよく、そのさらなる詳細は、以下の説明および図面を参照することで認められ得る。
【図面の簡単な説明】
【0019】
【図1】本開示の態様に従う、アプタマーと、アプタマーにハイブリダイズした２つのプローブとを含む三分子複合体の概略図である。
【図3B】本発明の教示の態様に従う、標的タンパク質を捕捉することと、次いで図１に示される複合体などの三分子複合体を形成することと、を含む次世代シーケンシングアッセイを実行するための例示的な方法のステップを示すフローチャートである。
【図4】本発明の教示の態様に従う、４つのハイブリダイゼーショングループを含む例示的な次世代シーケンシングアッセイのステップおよび副生成物を示すフロー図である。
【図5】本発明の教示の態様に従う、単一のハイブリダイゼーショングループと４つのＰＣＲグループとを含む例示的な次世代シーケンシングアッセイのステップおよび副生成物を示すフロー図である。
【図6】本発明の教示の態様に従う、４つのハイブリダイゼーショングループおよび４つのＰＣＲグループを含む例示的な次世代シーケンシングアッセイのステップおよび副生成物を示すフロー図である。
【図7】２つの個別のサンプルの仮想的な単純化された二分析物アッセイの結果をヒストグラム形式で示すグラフである。
【図9】本発明の教示の態様に従う、４つの異なるｑＳｐｉｋｅレポーターを各サンプルに追加した、異なる分析物濃度での８つの別個のサンプルの、３つの分析物ＳＯＭＡｍｅｒアッセイの生の結果をヒストグラム形式で示すグラフである。
【図11】本発明の教示の態様に従う、４つのＰＣＲグループと各グループに添加したｑＳｐｉｋｅ対照レポーターを含む例示的な次世代シーケンシングアッセイのいくつかのステップおよび副生成物を示すフロー図である。
【図12】本発明の教示の態様に従う、ＳＯＭＡｍｅｒプローブ二重鎖について、実験により得られた単相熱融解データと、二状態理論モデル曲線フィッテイングを重ね合わせた相対蛍光単位（ＲＦＵ）対温度のグラフである。
【図13】本発明の教示の態様に従う、ＳＯＭＡｍｅｒプローブ二重鎖について実験的に得られた二相性熱融解データと、二相性理論モデル曲線フィッテイングを重ね合わせた、相対蛍光単位（ＲＦＵ）対温度のグラフである。
【発明を実施するための形態】
【0020】
タンパク質の検出および定量化のためのハイブリダイゼーション－捕捉、次世代シーケンシングアッセイシステムの様々な態様および例、ならびに関連方法を、以下に記載し、関連する図面に例証する。特に指定がない限り、本発明の教示によるタンパク質アッセイ、および／またはその様々な構成要素は、本明細書に記載し、図示し、かつ／または組み込まれている構造、構成要素、機能、および／または変形のうちの少なくとも１つを含有し得る。さらに、特に除外されない限り、本発明の教示に関連して記載され、図示され、かつ／または組み込まれているプロセスステップ、構造、構成要素、機能、および／または変形形態は、開示された実施形態間で互換可能であることを含む、他の同様のデバイスおよび方法に含まれていてもよい。以下の様々な例の説明は、本質的に単なる説明であり、開示、その適用、または使用を限定することを意図するものではない。さらに、以下に記載する実施例および実施形態によって提供される利点は、本質的に例示的なものであり、すべての例および実施形態が、同じ利点または同じ程度の利点をもたすものではない。
【0021】
「発明を実施するための形態」は、直後の以下の節を含む；（１）定義；（２）概要；（３）実施例、構成要素、および代替物、（４）利点、機能、および利益、ならびに（５）結論。「実施例、構成要素、および代替物」の節はさらに部分節に分かれており、そのそれぞれが適切に表示されている。
【0022】
定義
特に明記しない限り、本書では以下の定義が適用される。
特に明記しない限り、本書では以下の定義が適用される。
【0023】
「含む（Ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、および「有する（ｈａｖｉｎｇ）」（およびそれらの活用形）は、含むが必ずしもこれらに限定されないことを意味するために互換的に使用され、追加の、記載されていない要素または方法のステップを除外することを意図しない制約のない用語である。
【0024】
「第１」、「第２」、および「第３」などの用語は、グループの様々なメンバーなどを区別または同定するために使用され、連続または数値の制限を示すことを意図するものではない。
【0025】
「別名（ＡＫＡ）」は「としても知られる（ａｌｓｏ ｋｎｏｗｎ ａｓ）」ことを意味し、所定の要素または複数の要素の代替用語または対応する用語を示すために使用され得る。
【0026】
「上」、「下」、「垂直」、「水平」などの方向を示す用語は、対象の特定の物体の文脈において理解するものとする。例えば、物体は、定義されたＸ、Ｙ、およびＺ軸の周囲に方向付けられ得る。これらの例では、Ｘ－Ｙ平面は、水平を定義し、上は、正のＺ方向として定義され、下は、負のＺ方向として定義される。
【0027】
方法の文脈における「提供すること（ｐｒｏｖｉｄｉｎｇ）」は、提供される物体または材料が、他のステップを実行するための状態および構成であるように、受け取る、得る、購入する、製造する、生成する、加工処理する、前処理するおよび／または類似のことを含み得る。
【0028】
「ＮＧＳ」は、「次世代シーケンシング」を指す。
【0029】
「ＨＣ」は、「ハイブリダイゼーション－捕捉」を意味する。
【0030】
「ＳＯＭＡｍｅｒ」とは、ＳｏｍａＬｏｇｉｃ Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ Ｃｏ．，Ｉｎｃ．（「ＳｏｍａＬｏｇｉｃ」）（Ｂｏｕｌｄｅｒ，Ｃｏｌｏｒａｄｏ）が開発し、製造した「Ｓｌｏｗ Ｏｆｆ－ｒａｔｅ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ａｐｔａｍｅｒ」試薬を指す。
【0031】
「ＳＯＭＡｍｅｒ ＩＤ配列」または「ＳＯＭＡ ＩＤ」または「レポーター」は、ＮＧＳ技術を使用して配列決定することができるＳＯＭＡｍｅｒ特異的ＤＮＡ鎖を含む三分子複合体の一部を指す。
【0032】
「定量的スパイク」または「レポータースパイク」または「ｑＳｐｉｋｅ」は、サンプル間の補完的リードカウントを正規化するために使用され、真のシグナルの変化を認識できるようにする増幅可能レポーターを指す。
【0033】
本開示では、１つ以上の刊行物、特許、および／または特許出願が参照により組み込まれ得る。しかし、こうした資料は、組み込まれた資料と本書に記載された記述および図面との間にいかなる矛盾も存在しない程度に限り組み込まれる。用語における任意の矛盾を含む、そのような任意の矛盾がある場合には、本開示が優先する。
【0034】
概要
一般に、本開示は、生物学的サンプル中のタンパク質などの標的分子を検出し、定量化する方法に関する。開示される方法は、アプタマーで標的分子を捕捉することと、アプタマーをアプタマー同定配列に置き換えることと、次に次世代シーケンシング技術を使用して、アプタマー同定配列を配列決定することと、を含み得る。あるいは、開示される方法は、アプタマーで標的分子を捕捉した後に、アプタマーを直接配列決定することを含み得る。
一般に、本開示は、生物学的サンプル中のタンパク質などの標的分子を検出し、定量化する方法に関する。開示される方法は、アプタマーで標的分子を捕捉することと、アプタマーをアプタマー同定配列に置き換えることと、次に次世代シーケンシング技術を使用して、アプタマー同定配列を配列決定することと、を含み得る。あるいは、開示される方法は、アプタマーで標的分子を捕捉した後に、アプタマーを直接配列決定することを含み得る。
【0035】
実施例、構成要素、および代替物
以下の節では、ＳＯＭＡｍｅｒ試薬などのアプタマーを使用するタンパク質の検出および定量化に関して選択された態様、ならびに関連するシステム、および／または方法について記載しており、ここで、ＳＯＭＡｍｅｒは、次世代シーケンシング技術を使用して配列決定され得るＳＯＭＡｍｅｒ特異的セグメントを含有するレポーターＤＮＡ分子によるハイブリダイゼーション捕捉を介して置き換えられる。これらの節の実施例は、説明することを目的としており、本開示の範囲を限定するものとして解釈してはならない。各節は、１つ以上の別個の実施形態もしくは実施例、および／または文脈情報（ｃｏｎｔｅｘｔｕａｌ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）もしくは関連情報、機能、および／もしくは構造を含み得る。
以下の節では、ＳＯＭＡｍｅｒ試薬などのアプタマーを使用するタンパク質の検出および定量化に関して選択された態様、ならびに関連するシステム、および／または方法について記載しており、ここで、ＳＯＭＡｍｅｒは、次世代シーケンシング技術を使用して配列決定され得るＳＯＭＡｍｅｒ特異的セグメントを含有するレポーターＤＮＡ分子によるハイブリダイゼーション捕捉を介して置き換えられる。これらの節の実施例は、説明することを目的としており、本開示の範囲を限定するものとして解釈してはならない。各節は、１つ以上の別個の実施形態もしくは実施例、および／または文脈情報（ｃｏｎｔｅｘｔｕａｌ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）もしくは関連情報、機能、および／もしくは構造を含み得る。
【0036】
Ａ．例示的アプタマー
本節では、ＳＯＭＡｍｅｒ（Ｓｌｏｗ Ｏｆｆ－ｒａｔｅ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ａｐｔａｍｅｒｓ）について記載し、これは、本明細書に記載されるシステムおよび方法の実施例と併せて好適に使用されるアプタマーの例示的な実施例である。
本節では、ＳＯＭＡｍｅｒ（Ｓｌｏｗ Ｏｆｆ－ｒａｔｅ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ａｐｔａｍｅｒｓ）について記載し、これは、本明細書に記載されるシステムおよび方法の実施例と併せて好適に使用されるアプタマーの例示的な実施例である。
【0037】
「指数関数的濃縮によるリガンドの系統的進化（Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｌｉｇａｎｄｓ ｂｙ ＥＸｐｏｎｅｎｔｉａｌ ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）」として知られる方法は、時にＳＥＬＥＸプロセスと呼ばれ、これを介して、核酸が、タンパク質とよく似た三次元的構造多様性を有することが明らかになった。ＳＥＬＥＸプロセスは、特定の望ましい活性に関して核酸分子をｉｎ ｖｉｔｒｏで進化させる方法である。ここでは、標的分子に対して高度に特異的に結合する核酸分子を生成するためのＳＥＬＥＸについて記載する。ＳＥＬＥＸプロセスは、それぞれが一意的配列を有し、所望の標的化合物または分子に特異的に結合する特性を有する、核酸リガンドまたはアプタマーと称される任意のクラスの生成物を提供する。ＳＥＬＥＸで同定される各核酸捕捉試薬は、所定の標的化合物または分子の特定のリガンドである。ＳＥＬＥＸプロセスは、核酸が、様々な二次元構造および三次元構造を形成するのに十分な能力を有し、そのモノマー内で利用可能である十分な化学的汎用性を有しており、これによりモノマーであってもポリマーであっても、実質的にあらゆる化学化合物と、リガンドとして作用する（特定の結合対を形成する）という独自の見識に基づくものである。任意のサイズまたは組成の分子が、標的として作用することができる。
【0038】
高親和性結合の用途に適用されるＳＥＬＥＸ法は、候補オリゴヌクレオチドの混合物から選択すること、ならびに同じ一般的な選択スキームを使用して、結合、分配、および増幅を段階的に反復させて、結合親和性および選択性に関する実質的に任意の望ましい基準を達成することを伴う。ＳＥＬＥＸ法は、好ましくは、ランダム化配列の任意のセグメントを含む核酸の混合物から開始し、結合に有利な条件下で混合物を標的と接触させるステップと、標的分子に特異的に結合した核酸から非結合核酸を分配するステップと、核酸－標的複合体を解離させるステップと、核酸－標的複合体から解離した核酸を増幅して、核酸のリガンドが豊富な混合物を生成するステップと、次に結合ステップ、分配ステップ、解離ステップおよび増幅ステップを望ましいサイクル数反復して、標的分子に対して高度に特異的な高親和性核酸リガンドを生成するステップと、を含む。このようにして、実質的に任意の標的タンパク質に結合するのに好適であるアプタマーを発見することができる。
【0039】
より具体的には、ＳＯＭＡｍｅｒは、ＳＥＬＥＸプロセスの改良によって発見されたタンパク質結合アプタマーであり、概して、３０～２４０分の解離速度（ｔ１／２）を有し、これは、タンパク質－アプタマー複合体の半分が解離するのに要する平均時間である。さらに、ＳＯＭＡｍｅｒは、異なる組込み官能性を提供する修飾ヌクレオシドを含有する。これらの官能性は、固定化用のタグ、検出用の標識、分離を促進するかまたは制御する手段、タンパク質とのよりよい親和性を提供するためのアミノ酸様側鎖、および／または類似のものを含み得る。タンパク質との親和性を改善するための修飾は、通常は、ピリミジン塩基の５位に結合する化学基である。５位をタンパク質様部分（例えば、ベンジル、２－ナフチル）で官能基化することにより、ＳＯＭＡｍｅｒの化学的多様性が拡大し、これにより、さらにより広範囲の標的分子との高親和性結合が可能になる。さらに、一部のポリメラーゼは、これらの位置に修飾を有するＤＮＡをなおも転写することができるため、ＳＥＬＥＸプロセスに必要な増幅を可能にする。
【0040】
ＳＯＭＡｍｅｒを含む結合アプタマーは、一般に、ＳＥＬＥＸプロセスによって発見されるが、それらを選択するための他の手段が存在し得ることに留意すべきである。例えば、分子相互作用のコンピュータモデリングが改善されるにつれて、アプタマーにとって理想的な核酸配列およびＳＯＭＡｍｅｒにとって関連する化学修飾を直接計算して、所定の標的分子に特異的である捕捉試薬を生成することが可能になり得る。ＳＥＬＥＸ以外の、アプタマーおよびＳＯＭＡｍｅｒをスクリーニングするための他の化学技術も可能である。
【0041】
生物学的サンプルおよび他のサンプル中の生理的に重要な分子の検出および定量化を目的としたアッセイは、科学研究およびヘルスケア分野において重要なツールである。ＳＯＭＡｍｅｒは、それぞれが、非常に特異的に、かつ非常に高い親和性でサンプル中の標的分子に結合することができる。適切な洗浄ステップおよび分配ステップ後に、最初に非結合タンパク質を除去し、次に非結合ＳＯＭＡｍｅｒを除去した後、結果として得られたＳＯＭＡｍｅｒ－タンパク質複合体からＳＯＭＡｍｅｒを溶出する。次に、ＳＯＭＡｍｅｒ溶出液をＳＯＭＡｍｅｒの相補体を含有するマイクロアレイと接触させて、サンプル中の標的分子の存在、非存在、量、および／または濃度の決定を可能にする。
【0042】
Ｂ．ハイブリダイゼーション捕捉アッセイの例示的アプローチ
この節は、標的ハイブリダイゼーション－捕捉（ＨＣ）アッセイについて記載し、このアッセイでは、アッセイ溶出液からのＳＯＭＡｍｅｒシグナルを、配列決定用のＳＯＭＡｍｅｒ特異的同定配列または「ＳＯＭＡ ＩＤ」を含有する「レポーター」ＤＮＡ分子に置き換える。
この節は、標的ハイブリダイゼーション－捕捉（ＨＣ）アッセイについて記載し、このアッセイでは、アッセイ溶出液からのＳＯＭＡｍｅｒシグナルを、配列決定用のＳＯＭＡｍｅｒ特異的同定配列または「ＳＯＭＡ ＩＤ」を含有する「レポーター」ＤＮＡ分子に置き換える。
【0043】
この節に記載するＨＣアッセイの前に、ＳＯＭＡｍｅｒ結合ステップがすでに実施されており、サンプル中に対応する標的タンパク質が存在することを示すＳＯＭＡｍｅｒ試薬を含有する溶出液が得られる。例えば、限定されないが、ＳＯＭＡｍｅｒ含有溶出液を得るために、以下のステップが実施されていてもよい。
（１）５’蛍光色素、光分解可能リンカー、およびビオチンで標識されたタンパク質特異的ＳＯＭＡｍｅｒ試薬を、ストレプトアビジン（ＳＡ）コーティングされているビーズ上に固定し、タンパク質の複雑な混合物を含有する１つ以上のサンプルと共にインキュベートする；
（２）ビーズ上にＳＯＭＡｍｅｒ－標的タンパク質複合体が形成される；
（３）ビーズを洗浄して、非結合タンパク質を除去し、結合タンパク質にビオチンのタグを付ける。
（４）ＳＯＭＡｍｅｒ－タンパク質複合体は、紫外光によるリンカーの光分解によってビーズから放出される；
（５）ポリアニオン競合物質を含有する緩衝液中でインキュベートすることにより、解離したタンパク質の再結合を防止し、それによって、標的タンパク質の対応するＳＯＭＡｍｅｒへの結合を表す速いオフレートの相互作用と比較して、遅いオフレートで結合する標的タンパク質に特異的な複合体を速度論的に濃縮させる；
（６）ＳＯＭＡｍｅｒ－タンパク質複合体は、ビオチンタグ付きタンパク質を介して、第２のセットのストレプトアビジンコーティングビーズに再度捕捉され、その後、非特異的に結合したＳＯＭＡｍｅｒ試薬のさらなる除去を容易にする追加の洗浄ステップを行う；および
（７）ＳＯＭＡｍｅｒ試薬は、変性緩衝液中でビーズから放出され、定量分析にとって好適であるＳＯＭＡｍｅｒ含有溶出液を形成する。
（１）５’蛍光色素、光分解可能リンカー、およびビオチンで標識されたタンパク質特異的ＳＯＭＡｍｅｒ試薬を、ストレプトアビジン（ＳＡ）コーティングされているビーズ上に固定し、タンパク質の複雑な混合物を含有する１つ以上のサンプルと共にインキュベートする；
（２）ビーズ上にＳＯＭＡｍｅｒ－標的タンパク質複合体が形成される；
（３）ビーズを洗浄して、非結合タンパク質を除去し、結合タンパク質にビオチンのタグを付ける。
（４）ＳＯＭＡｍｅｒ－タンパク質複合体は、紫外光によるリンカーの光分解によってビーズから放出される；
（５）ポリアニオン競合物質を含有する緩衝液中でインキュベートすることにより、解離したタンパク質の再結合を防止し、それによって、標的タンパク質の対応するＳＯＭＡｍｅｒへの結合を表す速いオフレートの相互作用と比較して、遅いオフレートで結合する標的タンパク質に特異的な複合体を速度論的に濃縮させる；
（６）ＳＯＭＡｍｅｒ－タンパク質複合体は、ビオチンタグ付きタンパク質を介して、第２のセットのストレプトアビジンコーティングビーズに再度捕捉され、その後、非特異的に結合したＳＯＭＡｍｅｒ試薬のさらなる除去を容易にする追加の洗浄ステップを行う；および
（７）ＳＯＭＡｍｅｒ試薬は、変性緩衝液中でビーズから放出され、定量分析にとって好適であるＳＯＭＡｍｅｒ含有溶出液を形成する。
【0044】
ここで、この節の主な焦点であるハイブリダイゼーション－捕捉アプローチに目を向けると、図１は、標的タンパク質を同定するために次世代シーケンシングアッセイで使用することができる、通常、１００で示される三分子複合体を概略的に示す。複合体１００は、アッセイ後のＳＯＭＡｍｅｒ、すなわち、生物学的サンプルへの曝露および（例えば）上記の他のステップの後に、ＳＯＭＡｍｅｒ含有溶出液中に残留しているＳＯＭＡｍｅｒのうちの１つであるＳＯＭＡｍｅｒ１０２を含む。換言すれば、アッセイ後の溶出液中にＳＯＭＡｍｅｒ１０２が存在するということは、サンプル中に対応する標的タンパク質（または他の標的分子）が存在することを示す。
【0045】
複合体１００は、第１のプローブ１０４および第２のプローブ１０６をさらに含む。第１のプローブ１０４は、図１のＳＯＭＡｍｅｒ１０２の左側部分と相補的であるハイブリダイゼーション領域Ｈ１を含む。第２のプローブ１０６は、図１のＳＯＭＡｍｅｒ１０２の右側部分と相補的であるハイブリダイゼーション領域Ｈ２を含み、共通のプライマー領域Ｐ１およびＰ２、ならびに以下でより詳細に説明するようにＳＯＭＡｍｅｒ１０２に対応する一意的ＳＯＭＡｍｅｒ同定配列Ｉｓまたは「ＳＯＭＡ ＩＤ」も含む。Ｈ１とＨ２の位置を逆にしてもよく、共通プライマー領域Ｐ１およびＰ２、ならびにＨ２中の一意的ＳＯＭＡｍｅｒ同定配列ＩＳを適切に反転させて、Ｈ１は、ＳＯＭＡｍｅｒ１０２の右側部分にハイブリダイズし、Ｈ２は、ＳＯＭＡｍｅｒ１０２の左側部分にハイブリダイズする。
【0046】
ハイブリダイゼーション領域Ｈ１およびＨ２は、対応するＳＯＭＡｍｅｒのそれぞれの相補部分に特異的に結合するように構成され、所定のセットのアッセイ条件下で、均一なハイブリダイゼーションを達成するために類似の融解温度（Ｔｍ）を有するように設計され得る。複合体１００のハイブリダイゼーション領域は、例えば以下のステップに従って設計および作製され得る。
【0047】
最初に、プローブの標的領域をＳＯＭＡｍｅｒ上で決定する。切断型ＳＯＭＡｍｅｒの場合、ランダム領域の各末端からＳＥＬＥＸで増幅するために使用される固定領域の５つの塩基を含む完全なＳＯＭＡｍｅｒ配列を標的領域として使用してもよい。全長ＳＯＭＡｍｅｒの場合、ＳＯＭＡｍｅｒを、例えば５０ｍｅｒなど、任意の望ましい長さにｉｎ ｓｉｌｉｃｏ（すなわち、計算上）で切断してもよく、その後、ハイブリダイゼーション補完を決定する。
【0048】
次に、標的領域を２つの部分に分割するための境界を決定する。いくつかの実施例では、２つのハイブリダイゼーション領域で同様の融解温度を達成するために、ＳＯＭＡｍｅｒとＨ１およびＨ２の両方との間の２５ｍｅｒ（例えば）二重鎖の融解温度をコンピューターにより決定し、次に、融解温度がＨ１－ＳＯＭＡｍｅｒ二重鎖とＨ２－ＳＯＭＡｍｅｒ二重鎖との間で最大限にバランスが取れるまで、２つの領域間の境界変更を段階的に行う。他の例では、異なる融解温度、例えば、Ｈ１のプローブに対して第１の融解温度（４５℃など）、Ｈ２のプローブに対して第２の融解温度（３５℃など）を意図的に選択してもよい。
【0049】
ハイブリダイゼーション領域には、長さの制約も課され得る。例えば、Ｈ１およびＨ２の両方に、最小長１８ｍｅｒ設定してもよい。同様に、例えば、Ｈ２に最大長３０ｍｅｒを設定してもよく、Ｈ２と第２のプローブの残りのレポーター部分との合計が、その後の合成のために所望の最大長が、例えば、１００塩基長未満に留まることを確実にすることができる。これらの制約の下では、ハイブリダイゼーション領域Ｈ１およびＨ２は、コンピューターによって生成され得る。
【0050】
共通プライマー領域Ｐ１およびＰ２、ならびに第２のプローブ１０６のＳＯＭＡｍｅｒＩＤ配列ＩＳを生成する際には、様々な要因が考慮され得る。例えば、カウントアプリケーション用の配列決定アンプリコン設計では、短くて安価なリードに対する要望と、カウントに使用されるＳＯＭＡｍｅｒ ＩＤなどの同定子配列および多重化に使用されるバーコード配列として役立つために十分な長さおよび情報コンテンツを有する配列の必要性との間で適切なバランスを見い出す必要がある。これらの理由により、コンテンツをスケーリングする場合、最終的に配列決定鋳型の最大の部分となるレポーター領域の不動産の長さが制限され得る。例えば、プライマー領域Ｐ１およびＰ２の長さを２４ｍｅｒに制限してもよく、ＳＯＭＡｍｅｒ ＩＤ配列ＩＳの長さを１５ｍｅｒに制限してもよく、編集距離は少なくとも５の長さであり、いずれのホモポリマーも長さが、２ｍｅｒを超えない。プライマー領域およびＳＯＭＡｍｅｒ ＩＤ配列の両方に対して、他の長さの制約および選択が可能である。
【0051】
図２Ａは、図１の三分子複合体を形成するために用いられるハイブリダイゼーションプローブＨ１（１０４）およびＨ２（１０６）を作製するための例示的な方法２００のステップを例証するフローチャートである。ステップ２０２では、アッセイで使用されるＳＯＭＡｍｅｒ配列のセットが提供される。
【0052】
ステップ２０４では、ハイブリダイゼーションプローブ領域Ｈ１およびＨ２が作製される。これらのハイブリダイゼーションプローブ領域は、例えば、上述のように、様々な長さおよび／または他の制約の下でコンピューターにより決定され得る。また、前述のとおり、いくつかの例では、各領域の融解温度のバランスなどの要因に基づいて、ハイブリダイゼーション領域を、単一のＳＯＭＡｍｅｒ相補的構造から分配してもよい。
【0053】
ステップ２０６では、各ＳＯＭＡｍｅｒに独自に対応するＳＯＭＡｍｅｒ ＩＤ（ＩＳ）領域が作製される。ＳＯＭＡｍｅｒ ＩＤ領域は、様々な方法で設計され得る。例えば、ＩＳ領域は、（例えば、最大編集距離を有するように）「肉眼」で設計され得るか、またはハイブリダイゼーション領域Ｈ１およびＨ２のコンピューターによる生成と組み合わせて、コンピューターにより生成され得る。ＳＯＭＡｍｅｒ ＩＤ領域のライブラリが生成された後、ＳＯＭＡｍｅｒＩＤは、ランダムに、または任意の他の好適な方法でＳＯＭＡｍｅｒに割り当てられ、各ＳＯＭＡｍｅｒに対応する一意的レポーターを作製する。
【0054】
ステップ２０８では、ユニバーサルプライマー領域Ｐ１およびＰ２が作製される。ユニバーサルプライマーは、安定性のため、および下流バイアスのリスクを軽減するために設計され得る。例えば、いくつかの例では、プライマーは、推定融解温度が約７０℃で、長さが２４ｍｅｒまたは２５ｍｅｒであってもよい。いくつかの例では、プライマーは、安定性のために３’末端で、グアニン（Ｇ）で終了してもよい。いくつかの例では、二量体形成の潜在的なリスクを軽減するために、プライマーをオリゴヌクレオチド（オリゴ）アナライザーで評価してもよい。いくつかの例では、既知のシーケンシング技術で使用される機能性オリゴとの非特異的相互作用を回避するために、プライマーは、さらに調整してもよい。
【0055】
ステップ２１０では、第１および第２のＳＯＭＡｍｅｒ特異的プローブ（「捕捉プローブ」と呼ばれることもある）が作製される。第１のプローブはそれぞれ、アッセイビーズに結合するのに好適である１つ以上のエレメント、例えば、ストレプトアビジンコーティングビーズに結合するためのビオチンと共にハイブリダイゼーション領域Ｈ１を含む。第１のプローブには、光分解可能リンカーなどの追加のエレメントも含み得る。第２のプローブはそれぞれ、ハイブリダイゼーション領域Ｈ２、ユニバーサルプライマー領域Ｐ１およびＰ２、ならびにＳＯＭＡｍｅｒ ＩＤ配列ＩＳを含む。第２のプローブを作製する一部として、ＳＯＭＡｍｅｒ ＩＤ領域をユニバーサルプライマーに追加して、増幅可能レポーターを作製してもよい。
【0056】
図２Ｂは、図１の三分子複合体などの三分子複合体を作製するための例示的な方法２５０のステップを例証するフローチャートである。ステップ２５２では、ＳＯＭＡｍｅｒ含有溶出液が提供され、溶出液中のＳＯＭＡｍｅｒは、前述のとおり、ＳＯＭＡｍｅｒライブラリに曝露された１つ以上の生物学的サンプル中に、１つ以上の標的タンパク質または他の標的分子が存在することを示す。
【0057】
ステップ２５４では、方法２００によって作製されたＳＯＭＡｍｅｒ特異的捕捉プローブのセットまたはライブラリを、アッセイ後のＳＯＭＡｍｅｒ含有溶出液と組み合わせる。一例では、２５μｌのＳＯＭＡｍｅｒ含有溶出液を、２５μｌのプローブ含有溶液と組み合わせて、５０μｌのハイブリダイゼーション容量をもたらす。ハイブリダイゼーションを促進するために、捕捉プローブは、溶出液中のＳＯＭＡｍｅｒの濃度と同等であるかまたはそれより高い濃度を有し得る。例えば、プローブの好適な濃度は、０．５ｎＭ（ｎＭ＝１リットルあたりのナノモル）などの０．０５ｎＭ～５．０ｎＭの範囲に入り得る。
【0058】
いくつかの例では、方法２５０の任意選択のステップ２５３において、ＳＯＭＡｍｅｒ含有溶出液をハイブリダイゼーション前に分割して選択的に希釈し、その後、配列決定前に再度組み合わせてもよい。より具体的には、アッセイ後の溶出液を、各グループ内のＳＯＭＡｍｅｒの予想される相対的存在量に基づいて、２つ以上の希釈グループ（例えば、４つの希釈グループ）に分割してもよい。最も濃度が低い（最も希釈された）サンプルは、溶出液中に最も存在量の多いＳＯＭＡｍｅｒを含有し得る。逆に、最も濃度が高い（最も希釈されていない）サンプルでは、溶出液中に最も少ない存在量のＳＯＭＡｍｅｒを含有し得る。このようにして、ＳＯＭＡｍｅｒカウントを「平準化」して、より少ない存在量のＳＯＭＡｍｅｒの検出における正確性および精度を改善させてもよい。各希釈グループを、対応するプローブのサブセットに曝露することによって、個別にハイブリダイズさせてもよい。希釈グループの使用に関するさらなる詳細を、本開示のその後の節に示す。
【0059】
さらに、溶出液中の特定の高存在量のＳＯＭＡｍｅｒに対して、捕捉タグ付きおよび捕捉タグなしＨ１プローブを固定比率で導入することによって、平準化を達成してもよい。捕捉タグのないＨ１プローブと三分子複合体を形成するＳＯＭＡｍｅｒは、方法３００で以下に詳述されているように、洗浄ステップ中に除去される。
【0060】
ステップ２５６では、第１のプローブと第２のプローブがＳＯＭＡｍｅｒにハイブリダイズし、それぞれが、（ｉ）ＳＯＭＡｍｅｒ、（ｉｉ）ハイブリダイゼーション領域Ｈ１を介してＳＯＭＡｍｅｒに結合した第１のプローブ、および（ｉｉｉ）ハイブリダイゼーション領域Ｈ２を介してＳＯＭＡｍｅｒに結合した第２のプローブを含む三分子複合体を形成する。第２のプローブはそれぞれが、ＳＯＭＡｍｅｒ ＩＤ配列ＩＳを含み、これを配列決定して、溶出液中に、対応するＳＯＭＡｍｅｒが存在することを示すことができ、したがって、元の生物学的サンプル中において、そのＳＯＭＡｍｅｒによって捕捉された対応するタンパク質の存在を示すことができる。捕捉プローブとＳＯＭＡｍｅｒとのハイブリダイゼーションは、適切な熱サイクリングなど、任意の好適な技術を使用して実行することができ、ハイブリダイゼーション速度を増強するために添加剤を含んでもよい。
【0061】
図３Ａは、図１に描かれている複合体などの、および図２Ｂの方法などの方法によって作製される三分子複合体を用いて次世代シーケンシングアッセイを行うための例示的な方法３００のステップを例証するフローチャートである。ステップ３０２では、アッセイ後のＳＯＭＡｍｅｒの所望のライブラリに対応するハイブリダイズされた三分子複合体（例えば、それぞれが、複合体１００の構造などの構造を有し、方法２５０などの方法に従って作製される）が、シーケンシングアッセイのために提供される。
【0062】
ステップ３０４では、三分子複合体が磁気ビーズ上に捕捉される。例えば、複合体は、第１のプローブのハイブリダイゼーション領域Ｈ１に結合したビオチンと、ビーズ上のストレプトアビジンとの結合を介して捕捉され得る。捕捉は、任意の好適な技術を使用して達成され得る。例えば、一例では、ハイブリダイゼーション容量を、２０ｍｇ／ｍｌの濃度のビーズを含有する３０μｌの溶液と組み合わせて、次いでサーモミキサーで、温度４５℃、１２００ｒｐｍで３０分間混合してもよい。
【0063】
ステップ３０６では、ビーズ捕捉プローブを含有する溶液を１回以上洗浄して、非結合Ｈ２プローブレポーター、すなわち対応するＳＯＭＡｍｅｒにハイブリダイズしていないプローブを除去する。例えば、洗浄することは、１ｍＭ ＥＤＴＡおよび０．０５％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）を含む２０ｍＭリン酸緩衝液などの好適な緩衝液で行ってもよい。洗浄段階は、静的に実施してもよく、サーモミキサーを使用して動的に実施してもよく、または両方のタイプを順番に組み合わせて実施してもよい。一例では、２つの静的５分間洗浄フェーズと２つの１２００ｒｐｍでの１０分間の動的洗浄フェーズが存在してもよい。いずれの場合も、洗浄後、得られた溶液は、ビーズに結合した三分子複合体を含有しなければならず、非結合Ｈ２プローブ／レポーターの残存量は、せいぜい少量である。
【0064】
ＳＯＭＡｍｅｒ溶出液の平準化、またはダイナミックレンジの圧縮の特定の実施形態では、Ｈ１上のビーズ捕捉タグを有しない三分子複合体は、ステップ３０６において、非結合Ｈ２プローブレポーターと同様に除去される。これらの複合体は、最終的なＮＧＳシーケンシングにおいて、これらのＳＯＭＡｍｅｒのコピーを減少させ、それによってこれらの存在量の多いＳＯＭＡｍｅｒ上でのカウントを低下させる。
【0065】
ステップ３０８では、結合した三分子複合体は、例えば溶媒への曝露、熱、または任意の他の好適な溶出方法によって、結合しているビーズから溶出される。このステップの一部として複合体の構成要素が解離して、分離されたＳＯＭＡｍｅｒおよびプローブをもたらしてもよい。一例では、結合した複合体を含む溶出液に濃度２０ｍＭのＮａＯＨ ８５μｌを添加し、次いでサーモミキサーで、１２００ｒｐｍで３分間混合し、複合体を分配するために５分間混合することによって複合体を溶出させる。溶出された複合体を含む溶液を、その後２０μｌのＨＣＬと組み合わせてもよい。
【0066】
いくつかの例では、ステップ３０８から得られる溶出溶液（すなわち、溶出液）を、方法３００の任意選択のステップ３０９において、４つの希釈グループまたはプライマー増幅グループなどの２つ以上のグループに分割および／または希釈してもよい。方法２５０の文脈で前述したように、異なる予想される存在量を有するＳＯＭＡｍｅｒのサブセットに対応する複数の希釈グループまたはプライマー増幅グループ（いくつかの例では希釈されない場合もある）を使用することは、ＳＯＭＡｍｅｒの全体的なセットの相対的な存在量を平準化するか、または広範囲の分布を圧縮して、比較的希少な標的分子の検出における精度および正確性を高めるために役立つ。このようなグループに分割することは、ハイブリダイゼーションの前（方法２０のステップ２５３のように）、ハイブリダイゼーションの後（ここに記載されているステップ３０９のように）、またはその両方で行うことができる。可能な希釈および組換え技術のさらなる詳細については、本開示の後の節に記載する。
【0067】
ステップ３１０では、ステップ３０８および任意選択のステップ３０９から得られた溶液（複数可）を、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）のために調製する。これは、関連するＳＯＭＡｍｅｒ ＩＤ配列ＩＳと共に共通のプライマー（図１のＰ１およびＰ２）を含有するレポーター領域のＰＣＲ増幅を含み得る。ＮＧＳの調製はまた、複数のサンプルからの溶出液を配列決定前に組み合わせる場合、逆多重化のためのアダプター配列および／またはバーコード配列を結合させることも含み得る。アダプター配列およびバーコード配列の作製およびレポーター領域への結合は、次世代シーケンシング用のサンプルを調製する際に一般的になっているように、当技術分野で公知の任意の好適な方法で達成され得る。いくつかの例では、バーコード配列を、第１の調製ステップの一部として追加してもよく、ＮＧＳアダプターうぃ、第２の調製ステップの一部として追加してもよい。
【0068】
任意選択のステップ３１１では、ステップ３１０後に分離されたままである任意のグループを、配列決定の準備のために再度組み合わせてもよい。
【0069】
ステップ３１２では、次世代シーケンシング技術を使用して、調製されたサンプル（複数可）を配列決定する。いくつかの例では、調製されたサンプルを、Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．（ＳａｎＤｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）によって開発された次世代シーケンシングプラットフォームを使用して、配列決定してもよい。しかしながら、本発明で開示されている方法は、他のＮＧＳシーケンシングプラットフォームで使用するのにも好適である。
【0070】
ＮＧＳの後、配列決定によって得られたデータを、任意のステップ３１４で分析または他の方法で処理して、元の生物学的サンプル中の標的タンパク質などの分析物の濃度を決定してもよい。一般的に、この分析は、各元のサンプルに対応するバーコードを使用して（複数のサンプルが多重化されている場合）配列決定データを逆多重化すること、レポーター配列をカウントすること、およびデータをスケーリングおよび／または正規化して、正確な結果を抽出することを伴う。分析目的の場合、配列決定データを、ＳｏｍａＬｏｇｉｃによって開発されたＡＤＡＴフォーマットなどの標準形式でデータファイルに書き込んでもよい。可能な定量分析方法については、以下で詳細に論じる。
【0071】
図３Ｂは、アプタマーで標的タンパク質を捕捉すること、アプタマーから三分子複合体を形成すること、捕捉された標的タンパク質を同定するための基礎として、三分子複合体を使用することと、を含む、次世代シーケンシングアッセイを実施するための例示的な方法３５０のステップを例証するフローチャートである。方法３５０のステップはいずれも、前述の方法（すなわち、方法２００および３００）の対応するステップと類似であり得るため、同じ詳細を再度記載しない場合があることに留意されたい。
【0072】
方法３５０のステップ３５２では、標的タンパク質は、それぞれが特異的タンパク質に結合するように構成された複数のアプタマー、例えば、ＳＯＭＡｍｅｒに生物学的サンプルを曝露することによって捕捉される。サンプルを多数のこうしたＳＯＭＡｍｅｒのライブラリに曝露することによって、１回のアッセイで多数の標的タンパク質種が検出され得る。
【0073】
ステップ３５４では、標的タンパク質のうちの１つを捕捉したアプタマーが、アプタマー含有溶出液中で単離される。アプタマー含有溶出液を形成することは、例えば、ＳｏｍａＬｏｇｉｃによって実施されるいわゆるＳｏｍａＳｃａｎアッセイプロセスにおいて達成されてもよく、このプロセスは、アプタマーをアッセイビーズに結合することと、アプタマーでタンパク質を捕捉することと、非結合タンパク質を洗い流すことと、結合したタンパク質にビオチンでタグ付けすることと、ビーズからアプタマーを放出することと、タグ付けされたタンパク質を新しいビーズに捕捉することと、非結合アプタマーを除去することと、捕捉されたタンパク質からアプタマーを変性させることと、その後、アプタマーを溶出液に分離することと、を含む。
【0074】
【0075】
ステップ３５８では、溶出液（または各溶出液希釈グループ）中のアプタマーを、それぞれが特定のアプタマーにハイブリダイズするように構成された複数の捕捉プローブに曝露することによって、複数の三分子複合体が形成される。例えば、各複合体は、図１に示す複合体１００の構造に類似した構造を有し得る。したがって、各三分子複合体は、（ｉ）溶出液からのアプタマーのうちの特定の１つと、（ｉｉ）アプタマーの第１の部分にハイブリダイズした部分を含む第１の捕捉プローブと、（ｉｉｉ）アプタマーの第２の部分にハイブリダイズした部分を含み、１つ以上のＤＮＡプライマー領域および特定のアプタマーに対応するアプタマーＩＤ配列をさらに含む第２の捕捉プローブと、を含む。個別の希釈グループが形成された場合、各希釈グループは、アプタマーの異なるサブセットに対応する捕捉プローブの異なるセットに曝露される。任意選択により、Ｈ１プローブの一部は、ＳＯＭＡｍｅｒカウントをさらに平準化するためのビーズ捕捉タグを欠如してもよい。
【0076】
ステップ３６０では、ステップ３５６で形成されたグループ（存在する場合）を、再度組み合わせてもよい。
【0077】
ステップ３６２では、三分子複合体を、アプタマーに結合していない捕捉プローブから分離する。例えば、ハイブリダイズした複合体を磁気ビーズに捕捉し、その後洗浄して、非結合プローブを除去してもよい。
【0078】
ステップ３６４では、三分子複合体中の捕捉プローブは、対応するアプタマーから解離される。これは、ビーズから複合体を溶出することを含み得るが、いずれにしても、ステップ３６２の結果は、捕捉プローブがもはやアプタマーに結合しないことである。
【0079】
ステップ３６６では、非結合捕捉プローブを含む溶出液は、任意選択により分割および／または希釈して（図６に関して以下で論じるように、おそらく２回目）、複数のＰＣＲグループを痙性してもよい。
【0080】
ステップ３６８では、溶出液の解離した捕捉プローブ中のアプタマーＩＤ配列が、例えばＤＮＡプライマー領域（複数可）および関連するＩＤ配列のＰＣＲ増幅を介して増幅される。この段階では、例えばアダプター配列の結合および／またはバーコード配列の逆多重化などのＮＧＳのためのさらなる調製を実施してもよい。
【0081】
ステップ３７０では、分離されたＰＣＲグループ（存在する場合）を、再度組み合わせてもよい。
【0082】
ステップ３７２では、次世代シーケンシング技術を使用して、アプタマーＩＤ配列を配列決定する。いくつかの例では、Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．（ＳａｎＤｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）によって開発された次世代シーケンシングプラットフォームを使用してこれが達成され得る。
【0083】
ステップ３７４では、アプタマーＩＤ配列の配列決定によって得られたデータを使用して、元の生物学的サンプル中の標的タンパク質の存在量を決定してもよい。
【0084】
Ｃ．次世代シーケンシングのための例示的な希釈グループまたはダイナミックレンジ圧縮
この節では、本発明の教示の態様に従って、次世代シーケンシングシステムにおいてより高いアッセイ効率、再現性、性能、および／または産生実現可能性を得るために、アッセイ溶出液を希釈する考えられる方法について記載する；図４～６を参照されたい。
この節では、本発明の教示の態様に従って、次世代シーケンシングシステムにおいてより高いアッセイ効率、再現性、性能、および／または産生実現可能性を得るために、アッセイ溶出液を希釈する考えられる方法について記載する；図４～６を参照されたい。
【0085】
まず、溶出液を希釈グループに分割することなく、すなわち決して分割されていない、希釈されていない、または再度組み合わせられていない単一の溶出溶液中でＳＯＭＡｍｅｒ含有溶出液についてＮＧＳを実施することが可能であることを理解する必要がある。このようなアッセイは、本発明の教示の範囲内であり、必要とされる溶出液が少なく、９６個のサンプルごとに、１つのハイブリダイゼーションプレートのみを必要とするという利点を有する。しかし、このようなアッセイでは、例えば、元の溶出液中におけるＳＯＭＡｍｅｒの存在量が極端な範囲の可能性がある、おそらく数桁に及ぶことから、感度および精度の課題を有する。例えば、サンプル中の標的タンパク質は、ｆＭ～μＭの範囲（すなわち、約９桁の範囲）の濃度を有する可能性があり、５桁以上に及ぶ溶出液のＳＯＭＡｍｅｒの濃度をもたらす。このような溶出液に対してアッセイを実施することにより、より存在量の多いＳＯＭＡｍｅｒの過剰カウント、およびより存在量の少ないＳＯＭＡｍｅｒの対応する過少カウントをもたらし得る。したがって、配列決定およびカウントを行う前に、ＳＯＭＡｍｅｒの存在量の範囲を平準化するかまたは圧縮することが望ましくなり得る。
【0086】
本開示のシステムおよび方法は、カウント前にＳＯＭＡｍｅｒを部分集団に細分化することによって、この問題に対処し、これは希釈と組み合わせることで、配列決定およびカウントを行うために部分集団を再び組み合わせたときに、部分集団でのカウントの平準化、またはダイナミックレンジの圧縮をもたらす。いくつかの例では、ＳＯＭＡｍｅｒプローブのセットを、ＳＯＭＡｍｅｒ溶出液の存在量に基づいて、部分集団に細分化する（第１のグループには、希少なＳＯＭＡｍｅｒ、第２のグループには、やや希少なＳＯＭＡｍｅｒ、第３のグループには、存在量の多いＳＯＭＡｍｅｒなど）。各部分集団のダイナミックレンジは、元の（分割されていない）溶出液のダイナミックレンジよりも小さく、いくつかの例ではかなり小さい。以下に記載するとおり、希釈グループは、ＳＯＭＡｍｅｒとプローブのハイブリダイゼーションの前および／または後、すなわち、ＮＧＳに好適である三分子複合体の形成の前および／または後に形成され得る。
【0087】
希釈による平準化に加えて、ビーズ捕捉タグを含まないＨ１プローブを、タグを含有するプローブと共に導入することによって、高存在量のＳＯＭＡｍｅｒを「平準化」してもよい。ビーズ捕捉タグ付きＨ１プローブとタグなしＨ１プローブとの比率は、方法３００のステップ３０４および方法３５０のステップ３５８で捕捉された三分子複合体を、その比率に対応する量の分、減少させる。例えば、タグなしプローブ対タグ付きプローブの比率が１０：１の場合、三分子複合体の１０パーセントのみが捕捉され、タグなしプローブのないアッセイと比較して、ＮＧＳ出力のカウントを任意の桁の分、減少させる。タグなしプローブとタグ付きプローブの比率は、各ＳＯＭＡｍｅｒの予想カウントに応じて、ＳＯＭＡｍｅｒごとに異なり得る。
【0088】
１．４つのハイブリダイゼーショングループ
図４は、４つのハイブリダイゼーショングループを伴う、一般に４００で示される例示的なＮＧＳアッセイのステップおよび副生成物を示す。ステップ４０２では、ＳＯＭＡｍｅｒ含有溶出液４０４が提供される。溶出液４０４は、既に記載されているように、生物学的サンプルへの事前の曝露と標的分子からの分離によって生じたＳＯＭＡｍｅｒを含有する。
図４は、４つのハイブリダイゼーショングループを伴う、一般に４００で示される例示的なＮＧＳアッセイのステップおよび副生成物を示す。ステップ４０２では、ＳＯＭＡｍｅｒ含有溶出液４０４が提供される。溶出液４０４は、既に記載されているように、生物学的サンプルへの事前の曝露と標的分子からの分離によって生じたＳＯＭＡｍｅｒを含有する。
【0089】
ステップ４０６では、溶出液４０４を、４つの等しい部分またはアリコート４０８、４１０、４１２、および４１４に分割する。図４のアッセイでは、アリコート４０８は、１：１６の比率、すなわち１部の溶出液に対して１６部の緩衝液で希釈され；アリコート４１０は、１：４の比率で希釈され；アリコート４１２および４１４は、それぞれ１：２の比率で希釈される。いくつかの例では、アリコートを、希釈しなくてもよい。
【0090】
ステップ４１６では、４つのアリコートがそれぞれ「グループ１」、「グループ２」、「グループ３」、および「グループ４」と表示されるハイブリダイゼーション捕捉プローブ４１８、４２０、４２２、および４２４のグループと組み合わせる。この例では、捕捉プローブグループ４１８を、最も希釈された溶出液と組み合わせ、したがって、溶出液中の最も一般的なＳＯＭＡｍｅｒと結合するように構成された捕捉プローブを含有する。同様に、捕捉プローブグループ４２０は、その次に一般的なＳＯＭＡｍｅｒと結合するように構成されたプローブを含有し、捕捉プローブグループ４２２および４２４は、それぞれ、相対的に少ない存在量のＳＯＭＡｍｅｒの異なるサブセットと組み合わせるように構成されたプローブを含有する。したがって、ステップ４１６の結果は、それぞれが、ハイブリダイゼーション時に、ＳＯＭＡｍｅｒと、ＳＯＭＡｍｅｒにハイブリダイズされた対応するプローブとを含む三分子化合物のセットをもたらすように構成された４つの個別の溶液である。各化合物は、図１の化合物１００と一般的に類似であり得る。
【0091】
ハイブリダイゼーション捕捉プローブの４つのグループのいずれも、カウントをさらに平準化するために、各グループ中の一部のＳＯＭＡｍｅｒのサブセットに対して、固定比率の、ビーズ捕捉タグがあるＨ１プローブとタグのないＨ１プローブを含有し得る。
【0092】
ステップ４２６では、ステップ４１６で生成された４つの溶液をそれぞれハイブリダイズし、ビーズに捕捉し、洗浄し、および溶出される。これは、例えば、図３Ａに示す方法３００のステップ３０４、３０６、および３０８に関して以前に記載したように達成され得る。
【0093】
ステップ４２８では、ステップ４２６から得られた個別の溶出溶液を、単一の溶出液４３０に再度組み合わせる。いくつかの例では、個別の溶液を異なる容量で再度組み合わせ、比較的存在量の多い捕捉グループ（すなわち、元の生物学的サンプル中の存在量の多いＳＯＭＡｍｅｒおよび存在量の多い標的分子種に対応）のさらなる希釈をもたらし得る。その結果、異なる三分子化合物の濃度の全体的な変動の少ない正規化された組み合わせた溶液が得られ、比較的少ないシーケンシング「リード」で分析され得る。例えば、希釈と正規化の組み合わせは、サンプルあたりの必要なリードの数を、約２億から５００万未満まで減少させ、これにより、配列決定の実行あたりの多数のサンプルの多重化を可能にし、結果の変動係数（ＣＶ）によって測定される許容可能な精度を達成しながら、サンプルあたりのコストを削減する。
【0094】
方法３００の前述のステップ３１０、３１２、および３１４を組み合わせたものとして考えられ得るステップ４３２では、ステップ４２８から得た溶液４３０を、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）のために調製し、配列決定し、結果をデータファイルに書き込み、所望により分析する。調製は、関連するＳＯＭＡｍｅｒ ＩＤ配列ＩＳと共に共通プライマー（図１のＰ１およびＰ２）を含有するレポーター領域のＰＣＲ増幅を含み得る。前述のとおり、調製は、三分子化合物へと逆多重化するためのアダプター配列および／またはバーコード配列を結合させることも含み得る。次に、調製された溶液を、Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）によって開発された次世代シーケンシングプラットフォームまたは他のＮＧＳシーケンシングプラットフォームなどのＮＧＳ技術を使用して、配列決定する。ＮＧＳの後、配列決定によって得られたデータを、分析するまたは他の方法で処理して、元の生物学的サンプル中の標的タンパク質などの分析物の濃度を決定してもよい。これは、元の各サンプルに対応するバーコードを使用して、配列決定データを逆多重化することと（複数のサンプルを組み合わせた場合）、レポーター配列をカウントすることと、正確な結果を抽出するためにデータをスケーリングおよび／または正規化することを含み得る。配列決定データを、ＳｏｍａＬｏｇｉｃによって開発されたＡＤＡＴフォーマットなどの標準形式でデータファイルに書き込んでもよい。
【0095】
２．４つのＰＣＲグループを有する単一のハイブリダイゼーショングループ
図５は、１つのハイブリダイゼーショングループと４つのＰＣＲグループを伴う、一般的に５００で示される例示的なＮＧＳアッセイのステップおよび副生成物を示す。ステップ５０２では、ＳＯＭＡｍｅｒ含有溶出液５０４が提供される。溶出液５０４は、前述のように、生物学的サンプルへの事前の曝露と標的分子からの分離によって生じたＳＯＭＡｍｅｒを含有する。
図５は、１つのハイブリダイゼーショングループと４つのＰＣＲグループを伴う、一般的に５００で示される例示的なＮＧＳアッセイのステップおよび副生成物を示す。ステップ５０２では、ＳＯＭＡｍｅｒ含有溶出液５０４が提供される。溶出液５０４は、前述のように、生物学的サンプルへの事前の曝露と標的分子からの分離によって生じたＳＯＭＡｍｅｒを含有する。
【0096】
ステップ５０６では、溶出液５０４を、ハイブリダイゼーション捕捉プローブ５０８の完全なセット、すなわち、溶出液中のすべてのＳＯＭＡｍｅｒと組み合わせるように構成されたプローブのセットと組み合わせる。プローブのセットはまた、上記のように、タグ付きＨ１プローブとタグなしＨ１プローブの固定比率も含有してもよい。
【0097】
ステップ５１０では、ステップ５０６で得られた溶液をハイブリダイズさせ、ビーズに捕捉し、洗浄し、溶出する。これは、図３Ａに示す方法３００のステップ３０４、３０６、および３０８に関して記載したように達成され得る。しかし、この例では、１セットのみではなく、４セットのユニバーサルプライマーを使用してもよく、プライマーのそれぞれのセットは、特定の予想される濃度範囲に入るＳＯＭＡｍｅｒのセットに対応する、異なるＳＯＭＡｍｅｒ ＩＤのセットに会合する。換言すれば、ステップ５１０は、ＳＯＭＡｍｅｒの異なる存在量グループに対応し、したがって、元の生物学的サンプルからのＳＯＭＡｍｅｒ溶出液中の標的分子の異なる存在量グループに対応する４つの別個の三分子化合物のグループをもたらし、そのそれぞれが、異なるＰＣＲプライマーを含み、したがって、個別に増幅させることができる。
【0098】
ステップ５１２では、ステップ５１０から得られた溶出液を、４つの等しい部分またはアリコート５１４、５１６、５１８、および５２０に分割する。次のステップで増幅されるＳＯＭＡｍｅｒ ＩＤ配列の予想濃度を正規化するために、各アリコートを、この段階で任意選択により、任意の所望の程度まで希釈してもよい。しかしながら、図５にはステップ５１２における希釈はいずれも示されていない。
【0099】
ステップ５２２では、ステップ５１２から得られた個別の溶出液を、レポーター領域のＰＣＲ増幅を含む次世代シーケンシング（ＮＧＳ）のために調製する。しかし、この場合、プライマーおよび会合するレポーター領域の異なるセットが、それぞれの個別の溶出液中で増幅され、結果として、各溶出液中で、ＳＯＭＡｍｅｒ ＩＤ配列のまさに既知のサブセットの増幅が得られる。
【0100】
ステップ５２４では、各アリコート中の増幅されたＳＯＭＡｍｅｒ ＩＤ配列を含む個別の溶液を、単一の溶出溶液５２６に組み合わせる。いくつかの例では、個別の溶液を異なる容量で再度組み合わせて、比較的存在量の多いＳＯＭＡｍｅｒ ＩＤ配列の所望の程度の希釈、およびＳＯＭＡｍｅｒ ＩＤ濃度の全体的な変動が少ない正規化された組み合わせ溶液を得ることができ、これらは、比較的少ないリードで分析され得る。
【0101】
ステップ５２８では、溶液５２６を、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）のためにさらに調製し、配列決定し、結果をデータファイルに書き込み、所望に応じて分析する。増幅された溶出液の調製は、三分子化合物のレポーター領域に逆多重化するためのアダプター配列および／またはバーコード配列を結合させることを含み得る。次に、調製された溶液を、ＮＧＳ技術を使用して配列決定し、その後、配列決定から得られたデータを分析または他の方法で処理して、前述のように、元の生物学的サンプル中の標的分析物の濃度を決定してもよい。
【0102】
３．４つのハイブリダイゼーショングループおよび４つのＰＣＲグループ
図６は、一般的に６００で示される、４つのハイブリダイゼーショングループおよび４つのＰＣＲグループを伴う、例示的なＮＧＳアッセイのステップおよび副生成物を示しており、したがって、図４～５のアッセイ４００および５００の態様を組み合わせる。ステップ６０２では、生物学的サンプルへの事前の曝露および標的分子からの分離から生じたＳＯＭＡｍｅｒを含有するＳＯＭＡｍｅｒ含有溶出液６０４を提供する。
図６は、一般的に６００で示される、４つのハイブリダイゼーショングループおよび４つのＰＣＲグループを伴う、例示的なＮＧＳアッセイのステップおよび副生成物を示しており、したがって、図４～５のアッセイ４００および５００の態様を組み合わせる。ステップ６０２では、生物学的サンプルへの事前の曝露および標的分子からの分離から生じたＳＯＭＡｍｅｒを含有するＳＯＭＡｍｅｒ含有溶出液６０４を提供する。
【0103】
ステップ６０６では、溶出液６０４を、４つの等しい部分またはアリコート６０８、６１０、６１２、および６１４に分割する。これらのアリコートを、任意選択により様々な程度まで希釈してもよく、また、いくつかの例では、アリコートを希釈しなくてもよい。
【0104】
ステップ６１６では、４つのアリコートを、それぞれ「グループ１」、「グループ２」、「グループ３」、および「グループ４」と表示されるハイブリダイゼーション捕捉プローブ６１８、６２０、６２２、および６２４のグループとそれぞれ組み合わせ、そのプローブのそれぞれは、溶出液中のＳＯＭＡｍｅｒの異なるサブセットと結合するように構成され、次いで、アリコートを個別にハイブリダイズさせる。したがって、ステップ６１６の結果は、各溶液が、ＳＯＭＡｍｅｒと、ＳＯＭＡｍｅｒにハイブリダイズされた対応するプローブを含む三分子化合物のセットを含有する４つの個別の溶液である。各化合物は、図１の化合物１００と一般的に類似であり得る。
【0105】
４つのハイブリダイゼーション捕捉プローブグループのそれぞれは、任意選択で、カウントをさらに平準化するために、タグなしＨ１プローブとタグ付きＨ１プローブとの固定比率を含有し得る。
【0106】
ステップ６２６では、ステップ６１６によって生成された４つのハイブリダイズされた溶液を１つの溶出液６２８に組み合わせ、次いで、ビーズに順次捕捉させ、洗浄し、溶出する。これは、例えば、図３Ａに示す方法３００のステップ３０４、３０６、および３０８に関して前述したように達成され得る。前述のように、各ハイブリダイズ溶液は、再度組み合わせる前に希釈してもしなくてもよく、また、ビーズ捕捉および洗浄前に、各グループの差次的な容量を使用して分析物の変動を圧縮することもできる。
【0107】
ステップ６３０では、ステップ６２６から得られた溶出液を、４つの等しい部分またはアリコート６３２、６３４、６３６、および６３８に分割する。次のステップで増幅されるＳＯＭＡｍｅｒ ＩＤ配列の予想濃度を正規化するために、各アリコートを、この段階で任意選択により任意の所望の程度まで希釈してもよい。しかしながら、図６は、ステップ６３０においていかなる希釈も示していない。
【0108】
ステップ６４０では、ステップ６３０から得られた個別の溶出液を、レポーター領域のＰＣＲ増幅を含む次世代シーケンシング（ＮＧＳ）のために調製する。図５のアッセイ５００と同様に、プライマーおよび会合するレポーター領域の異なるセットが、それぞれの個別の溶出液中で増幅され、結果として、各溶出液中で、ＳＯＭＡｍｅｒ ＩＤ配列のサブセットの増幅が得られる。
【0109】
ステップ６４２では、各アリコート中の増幅されたＳＯＭＡｍｅｒ ＩＤ配列を含む個別の溶液を、単一の溶出溶液６４４に再度組み合わせる。いくつかの例では、個別の溶液を異なる容量で再度組み合わせ、比較的存在量の多いＳＯＭＡｍｅｒ ＩＤ配列を所望の程度の希釈、およびＳＯＭＡｍｅｒ ＩＤ濃度の全体的な変動が少ない正規化された組み合わせ溶液を得ることができ、これらは、比較的少ないリードで分析され得る。
【0110】
ステップ６４６では、溶液６４４を、ＮＧＳのためにさらに調製し、配列決定し、結果をデータファイルに書き込み、所望に応じて分析する。増幅された溶出液の調製は、三分子化合物のレポーター領域に逆多重化するためのアダプター配列および／またはバーコード配列を結合させることを含み得る。次に、調製された溶液を、ＮＧＳ技術を使用して配列決定し、その後、配列決定から得られたデータを分析または他の方法で処理して、元の生物学的サンプル中の標的分析物の濃度を決定してもよい。
【0111】
Ｄ．ＰＣＲグループの定量的スパイクの正規化
ＮＧＳベースのシステムでは、シグナルは、シーケンスリードカウントとして測定され、所定のサンプルのすべての分析物のリードカウントは、固定または有限の総リードセットを有する同じシーケンシングミックス中で測定される。同じ混合物の割合として、所定のサンプル中で測定したすべての分析物のＮＧＳリードカウントは、互いに影響を及ぼし、これにより、分析物あたりに観察されるシグナルカウントは、固定された総リードを有するサンプルあたりの「ゼロサムゲーム」で測定されたすべての分析物の増加および減少の「正味の結果」である。より具体的には、固定された総リード数を有するＮＧＳシステムでは、１つの分析物のカウントの任意の増加は、他の分析物のカウントのそれに対応する減少をもたらし、減少は、各分析物の分画の総リード数に応じて分布する。
ＮＧＳベースのシステムでは、シグナルは、シーケンスリードカウントとして測定され、所定のサンプルのすべての分析物のリードカウントは、固定または有限の総リードセットを有する同じシーケンシングミックス中で測定される。同じ混合物の割合として、所定のサンプル中で測定したすべての分析物のＮＧＳリードカウントは、互いに影響を及ぼし、これにより、分析物あたりに観察されるシグナルカウントは、固定された総リードを有するサンプルあたりの「ゼロサムゲーム」で測定されたすべての分析物の増加および減少の「正味の結果」である。より具体的には、固定された総リード数を有するＮＧＳシステムでは、１つの分析物のカウントの任意の増加は、他の分析物のカウントのそれに対応する減少をもたらし、減少は、各分析物の分画の総リード数に応じて分布する。
【0112】
図７は、２つの個別のサンプルの簡略化された２つの分析物のアッセイをヒストグラム形式で示すことにより、この「ゼロサムゲーム」を図式的に表したものであり、ここで、縦軸は、各分析物のリードカウントの総数を表し、リードカウントの総数は、２００万に固定されている。サンプル１では、分析物Ａおよび分析物Ｂは、等しいカウントを有する。サンプル２では、分析物Ａが５０万カウント増加し、分析物Ｂがそれに比例して５０万カウント減少したように見える。しかし、総リード数が有限であるため、図７から、サンプル２の分析物Ａと分析物Ｂのカウントの差が、分析物Ａの増加によるものか、分析物Ｂの減少によるものか、あるいはその両方を組み合わせたものによるものかを知ることは不可能である。
【0113】
図８は、リファレンスレポーターまたは定量的スパイク対照レポーター（「ｑＳｐｉｋｅ」）の導入を使用して、サンプル全体の補完的リードカウントを正規化することができ、これにより、実際のシグナルの変化の識別を可能にする方法を示す。図８に表すＮＧＳアッセイでは、ｑＳｐｉｋｅレポーターが、すべてのサンプルにおいて同じ既知濃度で、分析物ＡおよびＢを含有する２つの分析物システムに物理的に追加（スパイク）されている。この例では、ｑＳｐｉｋｅレポーターは、サンプル１中の分析物ＡおよびＢと偶然同じ濃度になる。サンプル２では、前と同様に、分析物Ａの増加および分析物Ｂの減少が観察される。しかし、同じ濃度のｑＳｐｉｋｅが追加されたことが既知であるサンプル１と比較して、サンプル２ではｑＳｐｉｋｅの減少が観察することができる。サンプル２中の分析物をすべてスケーリング／調整して、スパイクを予想される濃度に戻すことにより、図８の「サンプル２ｑＳｐｉｋｅ調整」ヒストグラムによって示されるとおり、分析物Ｂと比較して分析物Ａの増加を明確に識別することが可能となる。
【0114】
より実際的なＮＧＳアッセイでは、複数のｑＳｐｉｋｅ参照レポーターの混合物を使用して、分析物のカウント比例性の補完的変化を補正してもよい。例えば、本発明の教示によるアッセイでは、４つの一意的Ｈ２レポーターの混合物、すなわち、例えば、図３Ａに示すアッセイ３００のステップ３０８で三分子複合体の溶出後に導入される第２のプローブの一部を形成する４つの一意的増幅可能レポーターを使用してもよい。あるいは、特定のｑＳｐｉｋｅＳＯＭＡｍｅｒを溶出液に導入してもよく、適切なｑＳｐｉｋｅレポーターがＳＯＭＡｍｅｒ特異的プローブのライブラリに含有される。ｑＳｐｉｋｅレポーターまたはＳＯＭＡｍｅｒは、異なる相対濃度で提供され得る。
【0115】
図９～１０は、こうしたアッセイの生の結果およびｑＳｐｉｋｅ調整後の結果をそれぞれ示すヒストグラムであり、説明文の参照は、以下の意味を有する：
・ＱＳｐｉｋｅ－Ｈ＝高濃度ｑＳｐｉｋｅレポーター
・ＱＳｐｉｋｅ－ＭＨ＝中－高濃度ｑＳｐｉｋｅレポーター
・ＱＳｐｉｋｅ－ＭＬ＝中－低濃度ｑＳｐｉｋｅレポーター
・ＱＳｐｉｋｅ－Ｌ＝低濃度ｑＳｐｉｋｅレポーター
・Ａｐｏ Ｅ２、トランスフェリン、キニノーゲンＨＭＷ＝ＳＯＭＡｍｅｒ分析物
・ＱＳｐｉｋｅ－Ｈ＝高濃度ｑＳｐｉｋｅレポーター
・ＱＳｐｉｋｅ－ＭＨ＝中－高濃度ｑＳｐｉｋｅレポーター
・ＱＳｐｉｋｅ－ＭＬ＝中－低濃度ｑＳｐｉｋｅレポーター
・ＱＳｐｉｋｅ－Ｌ＝低濃度ｑＳｐｉｋｅレポーター
・Ａｐｏ Ｅ２、トランスフェリン、キニノーゲンＨＭＷ＝ＳＯＭＡｍｅｒ分析物
【0116】
図９～１０に表すアッセイでは、３つのＳＯＭＡｍｅｒ ＡｐｏＥ２、トランスフェリン、およびキニノーゲンＨＭＷを５０ｐＭ～５０ａＭの範囲の濃度で、バッファー中で滴定し、ＮＧＳ ＨＣアッセイで測定した。各測定ポイントは、３つのＳＯＭＡｍｅｒ分析物すべてが共に配列決定される個別のサンプルであり、ｑＳｐｉｋｅがすべてのサンプルに同じ濃度で添加される。
【0117】
図９のグラフ（Ａ）では、ｑＳｐｉｋｅは、分析物の用量反応シグナルの変化による補完的な変化を呈する。ＮＧＳアッセイシグナル（リードカウント）を、既知のスパイクと比較し、スケール係数を生成する。図１０のグラフ（Ｂ）では、ＮＧＳカウントがスケーリングされているため、すべてのサンプルに対して、スパイクが均等であり、アッセイで測定された３つのＳＯＭＡｍｅｒに関して実際のＳＯＭＡｍｅｒ用量反応を再構築する。
【0118】
有限のリードカウントを補完するためにｑＳｐｉｋｅレポーターを使用することを、前述の任意の次世代シーケンシングアッセイに組み込むことができる。例えば、図１１は、概して１１００で示される、４つのＰＣＲグループならびに各グループへのｑＳｐｉｋｅレポーターの追加を伴う、例示的なＮＧＳアッセイのステップおよび副生成物のいくつかを示す。したがって、アッセイ１１００のステップは、図５～６に示すアッセイ５００および６００など、複数のＰＣＲグループを使用する任意のＮＧＳアッセイに組み込むことができる。
【0119】
ステップ１１０２では、すでにプローブにハイブリダイズして、ビーズに捕捉され、洗浄し、溶出したＳＯＭＡｍｅｒを含有する溶出液１１０４を提供する。したがって、溶出液１１０４は、例えば、図５に示すアッセイ５００のステップ５１０から得られる溶出液、または図６に示すアッセイ６００のステップ６２６から得られる溶出液と一般的に類似であると見なされるものとする。
【0120】
ステップ１１０６では、溶出液１１０４を、４つの等しい部分またはアリコート１１０８、１１１０、１１１２、および１１１４に分割する。次のステップで増幅されるＳＯＭＡｍｅｒ ＩＤ配列の予想濃度を正規化するために、各アリコートを、この段階で任意選択により任意の所望の程度まで希釈してもよい。
【0121】
ステップ１１１６では、ステップ１１０６から得られた個別の溶出液を、レポーター領域のＰＣＲ増幅を含む次世代シーケンシング（ＮＧＳ）のために調製する。アッセイ５００および６００と同様に、プライマーおよび会合するレポーター領域の異なるセットを、それぞれの個別の溶出液中で増幅させ、各溶出液中で、ＳＯＭＡｍｅｒ ＩＤ配列のサブセットの増幅が得られる。しかし、この例では、ＰＣＲ増幅前に、異なるｑＳｐｉｋｅレポーターもまた、既知の濃度で各溶出液に添加される。
【0122】
ステップ１１１８では、各アリコート中の増幅されたＳＯＭＡｍｅｒ ＩＤ配列およびｑＳｐｉｋｅレポーターを含有する個別の溶液を、単一の溶出溶液１１２０に再度組み合わせる。いくつかの例では、個別の溶液を異なる容量で再度組み合わせて、比較的存在量の多いＳＯＭＡｍｅｒ ＩＤ配列の所望の程度の希釈、およびＳＯＭＡｍｅｒ ＩＤ濃度の全体的な変動が少ない正規化された組み合わせ溶液を得ることができ、これらは、比較的少ないリードで分析され得る。
【0123】
ステップ１１２２では、溶液１１２０を、ＮＧＳのためにさらに調製し、配列決定し、結果をデータファイルに書き込み、分析する。増幅された溶出液の調製は、三分子化合物の増幅されたレポーター配列に逆多重化するためのアダプター配列および／またはバーコード配列を結合させることを含み得る。次に、調製された溶液を、ＮＧＳ技術を使用して配列決定し、その後、配列決定から得られたデータを分析または他の方法で処理して、元の生物学的サンプル中の標的分析物の濃度を決定してもよい。ｑＳｐｉｋｅレポーターの使用により、分析は、データのスケーリングまたは再正規化を含み、これにより、ｑＳｐｉｋｅ濃度を既知のレベルに戻し、それによって、有限のシーケンシングリードによる、考えられるカウントエラーを補完することができる。
【0124】
Ｅ．ＳＯＭＡｍｅｒプローブの安定性の決定
前述のように、本発明の教示の態様によれば、ハイブリダイゼーション領域Ｈ１およびＨ２は、対応するＳＯＭＡｍｅｒのそれぞれの相補的部分に結合するように構成されており、所定の一連のアッセイ条件下で均一なハイブリダイゼーションを達成するために、類似のまたは意図的に異なる融解温度（Ｔｍ）を有するように設計され得る。本節に記載したとおり、いくつかの例では、ハイブリダイゼーション領域の融解温度は、ＳＯＭＡｍｅｒ－プローブペアの実験的に決定された融解プロファイルを使用して、コンピューターによって推定され得る。
前述のように、本発明の教示の態様によれば、ハイブリダイゼーション領域Ｈ１およびＨ２は、対応するＳＯＭＡｍｅｒのそれぞれの相補的部分に結合するように構成されており、所定の一連のアッセイ条件下で均一なハイブリダイゼーションを達成するために、類似のまたは意図的に異なる融解温度（Ｔｍ）を有するように設計され得る。本節に記載したとおり、いくつかの例では、ハイブリダイゼーション領域の融解温度は、ＳＯＭＡｍｅｒ－プローブペアの実験的に決定された融解プロファイルを使用して、コンピューターによって推定され得る。
【0125】
１．背景技術
核酸二重鎖の安定性を予測するために最も広く使用されている方法は、最近傍モデルとして公知である。最近傍モデルは、らせん形成の熱力学的特性が、主に、二重鎖内の隣接する塩基対の同一性に依存することを仮定する。このモデルは、ＰＣＲおよびオリゴヌクレオチド二重鎖形成が重要である他の用途に必要なプライマー設計における二重鎖形成の安定性の予測での使用に広く適用されている。本発明の教示によるＮＧＳアッセイ（すなわち、ＳＯＭＡｍｅｒを伴う）の場合、１種類の修飾ＤＮＡ塩基を含有する１つの鎖と、天然ＤＮＡ塩基を含む第２の鎖とで構成される二重鎖の安定性を正確に予測するために、この方法を拡張することが望ましい。
核酸二重鎖の安定性を予測するために最も広く使用されている方法は、最近傍モデルとして公知である。最近傍モデルは、らせん形成の熱力学的特性が、主に、二重鎖内の隣接する塩基対の同一性に依存することを仮定する。このモデルは、ＰＣＲおよびオリゴヌクレオチド二重鎖形成が重要である他の用途に必要なプライマー設計における二重鎖形成の安定性の予測での使用に広く適用されている。本発明の教示によるＮＧＳアッセイ（すなわち、ＳＯＭＡｍｅｒを伴う）の場合、１種類の修飾ＤＮＡ塩基を含有する１つの鎖と、天然ＤＮＡ塩基を含む第２の鎖とで構成される二重鎖の安定性を正確に予測するために、この方法を拡張することが望ましい。
【0126】
ＵＶ－ｖｉｓ分光光度計で測定された吸光度対温度プロファイル（融解曲線）は、従来、ＤＮＡ二次構造の安定性を調べるために使用されている。ハイブリダイゼーションは、典型的には、１．０Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭカコジル酸ナトリウム、および０．５ｍＭ Ｎａ２ ＥＤＴＡ緩衝液、ｐＨ７で実施される。オリゴヌクレオチド濃度は、１００倍の範囲にわたって変化し、熱力学的パラメータは、逆融解温度（ＴＭ
－１）と全ＤＮＡ濃度の自然対数のプロットから得られ、以下にあてはめる；
あるいは、
および
を、融解曲線に対する個々のフィットから得て、異なる濃度に対して平均化することができる。いずれの方法も、本質的にはデータのファントホッフ分析である。これら２つの分析方法から得られる熱力学データは、典型的には、１０％以内で一致する。この節では、混合二重鎖の安定性を予測するための熱力学的パラメータを抽出するために、後者の方法（融解曲線プロファイルへの個別のフィット）のみを使用する。さらに、熱融解プロファイルが得られるバッファー組成は、典型的なＳＯＭＡｍｅｒ含有アッセイの読み取り値の組成と一致する。
【数1】
【数2】
【数3】
【0127】
本発明の教示の態様によれば、最も一般的な３つの修飾塩基、Ｎａｐ－ｄＵ、２－Ｎａｐ－ｄＵ、およびＢｅｎｚｙｌ－ｄＵを含有するＳＯＭＡｍｅｒに対して、最近傍モデルの拡張を開発する。以下で論じるように、融解プロファイルは、４００を超えるＳＯＭＡｍｅｒプローブペアの蛍光測定を使用して、実験により得られた。これらのデータを使用して、アッセイ読み取り条件下でのＳＯＭＡｍｅｒプローブの安定性を予測するために必要な最近傍パラメータを定義した。
【0128】
２．ＳＯＭＡｍｅｒ－プローブ結合をモデル化するための二重鎖形成
ＳＯＭＡｍｅｒ－プローブ二重鎖の形成は、以下のプロセスに従う：
式中、
は、ＳＯＭＡｍｅｒであり、
は、ハイブリダイゼーションプローブであり、
は、二重鎖である。初期ＤＮＡの総濃度として
を定義すると：
であり、ＳＯＭＡｍｅｒとプローブの初期濃度が等しいと仮定すると、化学量論から次式が導かれる：
式中、
は、二重鎖のモル分率である。二重鎖形成の平衡定数は、
であり、式中、
および
は、二重鎖形成のエンタルピーおよびエントロピーである。
は、絶対温度（Ｋ）である。
は、気体定数（１．９８７２ｃａｌ／Ｋ×ｍｏｌ）である。濃度の式を代入すると、
となる。定義により、
は、二重鎖および非二重鎖の等しい分画が起こる温度に対応する。すなわち、
により、融解温度の次式が得られる：
ＳＯＭＡｍｅｒ－プローブ二重鎖の形成は、以下のプロセスに従う：
【数4】
【数5】
【数6】
【数7】
【数8】
【数9】
【数10】
【数11】
【数12】
【数13】
【数14】
【数15】
【数16】
【数17】
【数18】
【数19】
【数20】
【数21】
【0129】
３．ＳＯＭＡｍｅｒ融解モデル
内部構造を有するＳＯＭＡｍｅｒは、次のように単純な二状態モデルとしてみなすこともできる：
式中、
および
は、構造化ＳＯＭＡｍｅｒおよび非構造化ＳＯＭＡｍｅｒである。初期ＤＮＡの総濃度として
を定義すると、
であり、化学量論から、次式が導かれる。
式中、
は、構造化されたＳＯＭＡｍｅｒのモル分率である。構造化ＳＯＭＡｍｅｒの平衡定数は、
であり、式中、
および
は、構造形成のエンタルピーおよびエントロピーである。
は、絶対温度（Ｋ）である。
は、気体定数（１．９８７２ｃａｌ／Ｋｘｍｏｌ）である。構造化ＳＯＭＡｍｅｒのモル分率の項で濃度の式を代入すると、
となる。ここでも、定義上、
は、構造化ＳＯＭＡｍｅｒおよび非構造化ＳＯＭＡｍｅｒの等しい分画が起こる温度に対応する。すなわち、
により、以下が得られる：
内部構造を有するＳＯＭＡｍｅｒは、次のように単純な二状態モデルとしてみなすこともできる：
【数22】
【数23】
【数24】
【数25】
【数26】
【数27】
【数28】
【数29】
【数30】
【数31】
【数32】
【数33】
【数34】
【数35】
【数36】
【数37】
【数38】
【0130】
これは単分子反応であり、適度な希釈条件下では、すべての反応が独立しているため、ＳＯＭＡｍｅｒの濃度によるエントロピーの寄与はない。最も単純なモデルは、ＳＯＭＡｍｅｒの融解後にプライマーの融解が起こるか、またはその逆の独立したプロセスを想定することである。独立したＳＯＭＡｍｅｒの融解などの追加実験を行わずに、２つの遷移のいずれがＳＯＭＡｍｅｒ構造の融解によるものであるか、ハイブリダイゼーションプライマーの融解によるものであるか、先験的に知る方法はない。プライマー融解は、１６塩基対融解よりも良好に対応するため、おそらくより高い自由エネルギーデータである。
【0131】
４．融解の熱力学の実験的決定
蛍光強度対温度プロファイル（融解曲線）を、蛍光染料ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉを使用して測定した。ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉの蛍光強度は、一本鎖ＤＮＡと比較して、二重鎖ＤＮＡに結合したときに１００倍増加するため、ＳＯＭＡｍｅｒ－プローブ二重鎖構造が融解するにつれて、蛍光強度は低下する。
蛍光強度対温度プロファイル（融解曲線）を、蛍光染料ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉを使用して測定した。ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉの蛍光強度は、一本鎖ＤＮＡと比較して、二重鎖ＤＮＡに結合したときに１００倍増加するため、ＳＯＭＡｍｅｒ－プローブ二重鎖構造が融解するにつれて、蛍光強度は低下する。
【0132】
熱融解を、ＳＯＭＡｓｃａｎアッセイ溶出液によって定義された成分（この場合は、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０、２００ｍＭ ＮａＣｌ、および０．９Ｍ過塩素酸塩）を含むバッファー中で実施した。過塩素酸塩は、ＤＮＡ二重鎖の安定性を低下させることが公知である。ＳＯＭＡｍｅｒおよびプローブの両方について、すべての熱融解を、１２０μＬ（８．３ｘ１０－７Ｍ）中１００ｐＭの単一濃度で得た。したがって、すべての熱力学的パラメータを、個々の熱融解プロファイルへの単一のフィットから得た。二状態モデルで予想されるものよりも複雑な挙動を呈する融解プロファイルを、分析から除外した。Ｈ１プローブおよびＨ２プローブそれぞれについて、合計４枚のプレートを測定した。これら８００個の融解プロファイルを、二重鎖形成の想定される二状態モデルと一致するデータを生成するために評価した。この８００個のプロファイルのうち、３つの異なる修飾ヌクレオチド（Ｎａｐ－ｄＵ、２－Ｎａｐ－ｄＵ、およびＢｅｎｚｙｌ－ｄＵ）を含有するＳＯＭＡｍｅｒの合計４０８個の融解プロファイルをこの分析に使用した。
【0133】
ａ．単相モデルフィット
図１２は、ＳＯＭＡｍｅｒ－プローブ二重鎖の典型的な熱融解のデータを示す。縦軸はＲＦＵで測定された蛍光、および横軸は温度であり、次の二状態モデルフィットが重ねられている。まず、最初と最後の１５個のデータポイントを使用して、高温ベースラインと低温ベースラインをデータにフィットさせる。低温ベースラインは二本鎖物質に対応し、高温ベースラインは一本鎖物質に対応し、次のように示される。
および
の所定の値について、温度の関数としての二重鎖の分画は、まず
を計算し、次いで
を計算することによって得られる。
式中、
である。
熱融解のプロファイル、
は、以下から計算される
図１２は、ＳＯＭＡｍｅｒ－プローブ二重鎖の典型的な熱融解のデータを示す。縦軸はＲＦＵで測定された蛍光、および横軸は温度であり、次の二状態モデルフィットが重ねられている。まず、最初と最後の１５個のデータポイントを使用して、高温ベースラインと低温ベースラインをデータにフィットさせる。低温ベースラインは二本鎖物質に対応し、高温ベースラインは一本鎖物質に対応し、次のように示される。
【数39】
【数40】
【数41】
【数42】
【数43】
【数44】
【数45】
【数46】
熱融解のプロファイル、
【数47】
【数48】
【0134】
非線形回帰を使用して、６つの自由パラメータ
および
の最適値を求める。一本鎖および二本鎖のベースラインの初期推定値は上記のように得られ、
および
の初期値は、２００ｋｃａｌ／ｍｏｌおよび－０．６ｋｃａｌ／ｍｏｌｘＫである。図１２のデータに関するモデルフィットを、図１２に赤い実線で表示する。下付き文字「ｐ」は、ＳＯＭＡｍｅｒプローブの熱力学を表す。モデルは、データに極めて良好にフィットする。
【数49】
【数50】
【数51】
【数52】
【数53】
【数54】
【数55】
【数56】
【0135】
ｂ．二相性モデルのフィット
多くの場合、データは、より複雑な融解挙動を呈するが、これはおそらく、最初にＳＯＭＡｍｅｒの内部構造が融解し、その後にＳＯＭＡｍｅｒ－プローブ二重鎖が融解するためである。図１３は、典型的な二相性挙動を表すデータを示しており、ここでも、赤い実線によって示された理論モデルフィットが重ねられている。データには、２つの明確な遷移が発生しており、おそらく最初は、内部ＳＯＭＡｍｅｒ構造の融解であり、その後がＳＯＭＡｍｅｒ－プローブの二重鎖融解であると考えられる。２つの遷移は、独立していることが想定される。二相性モデルをフィットさせるためには、３つのベースラインが必要である。最初のものは、内部ＳＯＭＡｍｅｒ構造の温度依存性に対応し、２番目は、二本鎖ＳＯＭＡｍｅｒ－プローブの温度依存性に対応し、３番目は、組み合わせた一本鎖材料の温度依存性に対応する。後者の２つは、上記のベースラインと同じである。前者は、次のように表記される。
ここで、蛍光は、相加的であると想定されるため、二本鎖ＳＯＭＡｍｅｒ－プローブ複合体の蛍光よりも増加することを示す。低温では、ＳＯＭＡｍｅｒ中の内部構造およびＳＯＭＡｍｅｒ－プローブ二重鎖の両方が存在するため、正味の蛍光は、独立した構造の合計であることが想定される。ＳＯＭＡｍｅｒ内部構造のモル分率は、
として示し、ＳＯＭＡｍｅｒ－プローブ二重鎖のモル分率は、
として示し、熱融解プロファイルは、以下によって得られる
低温では、
および
は、１であり、温度依存性は、
によって得られる。ＳＯＭＡｍｅｒの構造が融解すると、蛍光は、完全に、二本鎖二重鎖のベースラインによるものである。単相の場合と同様に、二相モデルは、データに極めて良好にフィットする。
多くの場合、データは、より複雑な融解挙動を呈するが、これはおそらく、最初にＳＯＭＡｍｅｒの内部構造が融解し、その後にＳＯＭＡｍｅｒ－プローブ二重鎖が融解するためである。図１３は、典型的な二相性挙動を表すデータを示しており、ここでも、赤い実線によって示された理論モデルフィットが重ねられている。データには、２つの明確な遷移が発生しており、おそらく最初は、内部ＳＯＭＡｍｅｒ構造の融解であり、その後がＳＯＭＡｍｅｒ－プローブの二重鎖融解であると考えられる。２つの遷移は、独立していることが想定される。二相性モデルをフィットさせるためには、３つのベースラインが必要である。最初のものは、内部ＳＯＭＡｍｅｒ構造の温度依存性に対応し、２番目は、二本鎖ＳＯＭＡｍｅｒ－プローブの温度依存性に対応し、３番目は、組み合わせた一本鎖材料の温度依存性に対応する。後者の２つは、上記のベースラインと同じである。前者は、次のように表記される。
【数57】
【数58】
【数59】
【数60】
【数61】
【数62】
【数63】
【0136】
５．最近傍モデル
実験データが適切なモデル（例えば、上で論じたように単相または二相）にフィットされ、個々の熱力学的パラメータがコンパイルされると、最近傍モデルのパラメータが、データから得られ得る。自由エネルギーの変化は、次のように近似される；
式中、下付き文字
は、ＳＯＭＡｍｅｒ－プローブ二重鎖を表す。
は、最近接スタッキング相互作用の自由エネルギーである。
は、二重鎖
の最近傍
の出現回数である。
は、エントロピーを考慮した開始自由エネルギーである。最近傍相互作用は、１０個の標準的なワトソン－クリック最近傍スタッキング相互作用（例えば、
など）を含む。表記
は、
を有する
ワトソン・クリック塩基対を意味する）。さらに、各修飾塩基は、別の７つの修飾ヌクレオチドスタッキング相互作用を導入する（例えば、
など）。ここで、
は、標準
ヌクレオチドを有する塩基対である修飾
ヌクレオチドを示す。
および
の類似表現を保持する。
二重鎖のセットと
最近傍相互作用の場合、寸法
を有する「スタッキング行列」行列
は、要素
を計算することによって、配列データから構築される。実験的に観察された熱力学値
は、長さ
の列ベクトルとして表される。未知の最近傍スタッキング相互作用
は、長さ
の列ベクトルによって表され、通常の最小二乗回帰法を使用して、次の過剰決定線形方程式を解くことによって得られる：
実験データが適切なモデル（例えば、上で論じたように単相または二相）にフィットされ、個々の熱力学的パラメータがコンパイルされると、最近傍モデルのパラメータが、データから得られ得る。自由エネルギーの変化は、次のように近似される；
【数64】
【数65】
【数66】
【数67】
【数68】
【数69】
【数70】
【数71】
【数72】
【数73】
【数74】
【数75】
【数76】
【数77】
など）。ここで、
【数78】
【数79】
【数80】
【数81】
【数82】
【数83】
【数84】
【数85】
【数86】
【数87】
【数88】
【数89】
【数90】
【数91】
【数92】
【0137】
パラメータ
は、ユークリッド
ノルム
を最小化する。
【数93】
【数94】
【数95】
【0138】
６．例示的結果
上記の教示に従った例示的なプロセスでは、３つの異なる修飾ヌクレオチド、Ｎａｐ－ｄＵ、２－Ｎａｐ－ｄＵ、およびＢｅｎｚｙｌ－ｄＵを含有する二重鎖の熱融解物を使用して、最近傍モデルパラメータを拡張した。これらの拡張された最近傍パラメータに基づいて、熱力学および融解温度を計算するためのＰｙｔｈｏｎコードが開発されている。
上記の教示に従った例示的なプロセスでは、３つの異なる修飾ヌクレオチド、Ｎａｐ－ｄＵ、２－Ｎａｐ－ｄＵ、およびＢｅｎｚｙｌ－ｄＵを含有する二重鎖の熱融解物を使用して、最近傍モデルパラメータを拡張した。これらの拡張された最近傍パラメータに基づいて、熱力学および融解温度を計算するためのＰｙｔｈｏｎコードが開発されている。
【0139】
以下の表は、４つの標準塩基の１０個のパラメータと、各修飾塩基の７個の追加パラメータとを含む、最近傍モデルに必要な３１個のパラメータを要約する。各ＮＮペアの
値および
値、ならびに各最近傍パラメータの発生総数がデータセットに含まれる。データ内での（ＡＴ／ＴＡ）と（ＴＡ／ＡＴ）の出現は比較的少ないが、これは、これらが必然的に固定された領域でのみ発生するためである。
【数96】
【数97】
【表1】
【0140】
上記の表のパラメータを使用して、修飾ヌクレオチド塩基Ｎａｐ－ｄＵ、２－Ｎａｐ－ｄＵ、およびベンジル－ｄＵを含有する二重鎖の推定融解温度Ｔｍをコンピューターにより決定してもよい。同様の手順を使用して、任意の他のＳＯＭＡｍｅｒ含有二重鎖の推定融解温度を計算してもよい。本発明の教示の態様によれば、これらの融解温度は、ＳＯＭＡｍｅｒに対するハイブリダイゼーション相補体をどこで分割するか、すなわち、図１に示す化合物１００などの三分子化合物の第１および第２のハイブリダイゼーション領域Ｈ１とＨ２との間（したがって、第１のプローブ１０４と第２のプローブ１０６との間）の分割点を決定するために使用され得る。
【0141】
Ｆ．例示的な組み合わせおよび追加の例
この節では、本発明の教示の態様に従って生物学的サンプル中の標的分子を検出および定量化するためのシステムおよび方法の追加の態様および特徴について説明し、一連の段落として限定なく提示し、その一部またはすべてを、明確さおよび効率性のために英数字により指定され得る。これらの段落のそれぞれは、１つ以上の他の段落、および／または相互参照において参照により組み込まれた資料を含む本出願の他の場所からの開示と、任意の好適な方法で組み合わせることができる。以下の段落の一部は、他の段落を明示的に参照し、さらに制限し、好適な組み合わせの一部の例を制限なく提供する。
この節では、本発明の教示の態様に従って生物学的サンプル中の標的分子を検出および定量化するためのシステムおよび方法の追加の態様および特徴について説明し、一連の段落として限定なく提示し、その一部またはすべてを、明確さおよび効率性のために英数字により指定され得る。これらの段落のそれぞれは、１つ以上の他の段落、および／または相互参照において参照により組み込まれた資料を含む本出願の他の場所からの開示と、任意の好適な方法で組み合わせることができる。以下の段落の一部は、他の段落を明示的に参照し、さらに制限し、好適な組み合わせの一部の例を制限なく提供する。
【0142】
Ａ．生物学的サンプル中の標的タンパク質の存在量を定量化するためのシステムであって、複数のアプタマーであって、それぞれが、標的タンパク質を含む生物学的サンプルをアプタマーに曝露したときに、特定の標的タンパク質に結合するように構成され、これによって、アプタマー含有溶出液を形成する複数のアプタマーと；複数の捕捉プローブであって、それぞれが特定のアプタマーにハイブリダイズするように構成され、ここで、複数の捕捉プローブは、それぞれのアプタマーの第１の部分にハイブリダイズした部分を有する第１の捕捉プローブ、それぞれのアプタマーの第２の部分にハイブリダイズした部分、ＤＮＡプライマー領域、およびアプタマーに対応するアプタマーＩＤ配列を有する第２の捕捉プローブを含む、複数の捕捉プローブと；溶出液中のアプタマーを捕捉プローブに曝露することによって、複数の三分子複合体を形成するための手段と、アプタマーＩＤ配列を配列決定するための手段であって、それによって、生物学的サンプル中の標的タンパク質の存在量を決定する手段と、を含むシステム。
【0143】
Ｂ．生物学的サンプル中の２種以上の標的タンパク質の存在量を定量化するためのシステムであって、複数のアプタマーであって、それぞれがサンプル中で特定のタンパク質を捕捉するように構成され、それによって、生物学的サンプル中の標的タンパク質のうちの１つを捕捉したアプタマーを単離したときに、アプタマー含有溶出液を形成する複数のアプタマーと；複数の第１のプローブであって、それぞれが特定のアプタマーの対応する第１の部分にハイブリダイズする複数の第１のプローブと；複数の第２のプローブであって、それぞれが特定のアプタマーの対応する第２の部分にハイブリダイズし、それぞれ第２のプローブが、少なくとも１つのＤＮＡプライマー領域、および特定のアプタマーに対応するアプタマーＩＤ配列を含む複数の第２のプローブと、アプタマーＩＤ配列を配列決定するための手段と；配列決定されたアプタマーＩＤ配列に基づいて、標的タンパク質の存在量を定量化するための手段と、を含むシステム。
【0144】
Ｃ．生物学的サンプル中の標的タンパク質を検出するためのシステムであって、それぞれが特定のタンパク質を捕捉するように構成された複数のアプタマーと；複数の第１のプローブであって、それぞれが標的タンパク質を捕捉したアプタマーのうちの１つの対応する第１の部分にハイブリダイズした部分を含む複数の第１のプローブと；複数の第２のプローブであって、それぞれが、標的タンパク質を捕捉したアプタマーのうちの１つの対応する第２の部分にハイブリダイズした部分、少なくとも１つのＤＮＡプライマー領域、および標的タンパク質を捕捉したアプタマーに対応するアプタマーＩＤ配列を含む複数の第２のプローブと；アプタマーＩＤ配列を増幅させるための手段と；アプタマーＩＤ配列の配列決定を行って、アプタマーＩＤ配列を同定し、それによって標的タンパク質を捕捉したアプタマーおよび標的タンパク質を同定するための手段と、を含むシステム。
【0145】
Ｄ．前述の段落のいずれかに記載のシステムであって、全サンプルの補完的リードカウントを正規化するための手段をさらに含む、システム。
【0146】
Ｅ．前述の段落のいずれかに記載のシステムであって、配列決定およびカウントを行う前に、アプタマーおよび／またはアプタマーＩＤ配列の存在量のダイナミックレンジ圧縮を行うための手段をさらに含む、システム。
【0147】
利点、特徴、および利益
本明細書に記載された、生物学的サンプル中の標的分子の存在を検出し定量化するための方法およびシステムの様々な実施形態および例は、従来知られている解決策に対していくつかの利点を提供する。例えば、本明細書に記載の例示的な実施形態および実施例は、配列決定標的をアプタマーからアプタマー同定配列へと単純化することにより、次世代シーケンシングを使用して、アプタマーベースのタンパク質検出を定量化することを可能にする。
本明細書に記載された、生物学的サンプル中の標的分子の存在を検出し定量化するための方法およびシステムの様々な実施形態および例は、従来知られている解決策に対していくつかの利点を提供する。例えば、本明細書に記載の例示的な実施形態および実施例は、配列決定標的をアプタマーからアプタマー同定配列へと単純化することにより、次世代シーケンシングを使用して、アプタマーベースのタンパク質検出を定量化することを可能にする。
【0148】
さらに、他の利益の中でも、本明細書に記載の例示的な実施形態および実施例は、アッセイの１つ以上の段階において、アッセイ溶出液を複数の希釈グループに分割し、次世代シーケンシングの前に再度組み合わせるすることにより、数桁の存在量に及ぶ標的分子の正確な検出を可能にする。
【0149】
さらに、他の利点の中でも、本明細書に記載の例示的な実施形態および実施例は、定量的スパイクレポーターをアッセイ溶出液に追加して、サンプル全体の補完的リードカウントを正規化することにより、有限の配列決定リードから生じるエラーを補正することを可能にする。
【0150】
既知のシステムまたはデバイスはいずれも、これらの機能を実施できない。しかし、本明細書に記載のすべての実施形態および実施例が、同じ利点または同じ程度の利点を提供するものではない。
【0151】
結論
上記の開示は、独立した有用性を備えた複数の別個の実施例を包含し得る。これらのそれぞれは、その好ましい形態（複数可）で開示されているが、本明細書で開示され例示されている特定の実施形態は、多数の変形形態が可能であることから、限定的な意味で考慮されるべきではない。本開示内で節見出しが使用されている場合、そのような見出しは、構成上の目的のためのみである。本開示の主題には、本明細書に開示された様々な要素、特徴、機能、および／または特性のすべての新規かつ自明でない組み合わせおよび部分組み合わせを含む。以下の特許請求の範囲は、特に、新規かつ非自明であると見なされる特定の組み合わせおよび部分組み合わせを指摘する。特徴、機能、要素、および／または特性の他の組み合わせおよび部分組み合わせは、本出願または関連出願からの優先権を主張する出願中で特許請求され得る。このような請求項は、元の特許請求の範囲よりも広義である、狭義である、等しい、または異なるかにかかわらず、本開示の主題内に含まれるものとみなされる。
上記の開示は、独立した有用性を備えた複数の別個の実施例を包含し得る。これらのそれぞれは、その好ましい形態（複数可）で開示されているが、本明細書で開示され例示されている特定の実施形態は、多数の変形形態が可能であることから、限定的な意味で考慮されるべきではない。本開示内で節見出しが使用されている場合、そのような見出しは、構成上の目的のためのみである。本開示の主題には、本明細書に開示された様々な要素、特徴、機能、および／または特性のすべての新規かつ自明でない組み合わせおよび部分組み合わせを含む。以下の特許請求の範囲は、特に、新規かつ非自明であると見なされる特定の組み合わせおよび部分組み合わせを指摘する。特徴、機能、要素、および／または特性の他の組み合わせおよび部分組み合わせは、本出願または関連出願からの優先権を主張する出願中で特許請求され得る。このような請求項は、元の特許請求の範囲よりも広義である、狭義である、等しい、または異なるかにかかわらず、本開示の主題内に含まれるものとみなされる。
【図1】
【図2A】
【図2B】
【図3A】
【図3B】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【国際調査報告】