特表 2024-546189 点眼製剤

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-12-17

(54)【発明の名称】点眼製剤

(51)【国際特許分類】

   A61K 31/375 20060101AFI20241210BHJP

   A61K 47/40 20060101ALI20241210BHJP

   A61K 31/14 20060101ALI20241210BHJP

   A61P 27/02 20060101ALI20241210BHJP

   A61K 47/02 20060101ALI20241210BHJP

   A61K 9/19 20060101ALI20241210BHJP

   A61P 17/02 20060101ALI20241210BHJP

   A61K 47/18 20170101ALI20241210BHJP

【ＦＩ】

A61K31/375

A61K47/40

A61K31/14

A61P27/02

A61K47/02

A61K9/19

A61P17/02

A61K47/18

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024539491

(86)(22)【出願日】2022-12-21

(85)【翻訳文提出日】2024-07-31

(86)【国際出願番号】 HU2022050090

(87)【国際公開番号】W WO2023126636

(87)【国際公開日】2023-07-06

(31)【優先権主張番号】P2100456

(32)【優先日】2021-12-28

(33)【優先権主張国・地域又は機関】HU

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．テフロン

(71)【出願人】

【識別番号】523041632

【氏名又は名称】センメルベイス エジェテム

(71)【出願人】

【識別番号】524243930

【氏名又は名称】セゲディ トゥドマーニャエジェテム

(74)【代理人】

【識別番号】100099759

【弁理士】

【氏名又は名称】青木 篤

(74)【代理人】

【識別番号】100123582

【弁理士】

【氏名又は名称】三橋 真二

(74)【代理人】

【識別番号】100108903

【弁理士】

【氏名又は名称】中村 和広

(74)【代理人】

【識別番号】100123593

【弁理士】

【氏名又は名称】関根 宣夫

(74)【代理人】

【識別番号】100208225

【弁理士】

【氏名又は名称】青木 修二郎

(74)【代理人】

【識別番号】100217179

【弁理士】

【氏名又は名称】村上 智史

(72)【発明者】

【氏名】ジョルジャ ティボー バログ

(72)【発明者】

【氏名】ガーボー カトナ

(72)【発明者】

【氏名】イルディコ チョカ

(72)【発明者】

【氏名】イストバーン ズプコ

(72)【発明者】

【氏名】ゾルターン ジョルト ナジ

(72)【発明者】

【氏名】フーバ キス

(72)【発明者】

【氏名】アーグネス タカークス

(72)【発明者】

【氏名】アニタ チョルバ

【テーマコード（参考）】

4C076

4C086

4C206

【Ｆターム（参考）】

4C076AA12

4C076AA30

4C076BB24

4C076CC10

4C076DD23Z

4C076DD49R

4C076EE39

4C076FF70

4C086AA01

4C086AA10

4C086BA18

4C086MA02

4C086MA03

4C086MA05

4C086MA17

4C086MA44

4C086MA58

4C086NA14

4C086NA20

4C086ZA33

4C206AA01

4C206AA10

4C206FA41

4C206MA02

4C206MA03

4C206MA05

4C206MA37

4C206MA64

4C206MA78

4C206NA14

4C206NA20

4C206ZA33

(57)【要約】

Ｌ－アスコルビン酸６－パルミテート（ＡＳＰ）を含む眼用製剤が提供される。製剤は、角膜透明性の維持が危険にさらされている状況、例えば角膜手術の間又は後において有用である。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

Ｌ－アスコルビン酸６－パルミテート（ＡＳＰ）と、ランダムメチル化β－シクロデキストリン（ＲＡＭＥＢ）、（２－ヒドロキシプロピル）－β－シクロデキストリン（ＨＰＢＣＤ）及びそれらの混合物からなる群から選択されるβ－シクロデキストリンと、等張生理食塩水と、場合によって塩化ベンザルコニウム（ＢＣ）とを含む、医薬組成物。

【請求項2】

前記医薬組成物が、ＡＳＰと、ＲＡＭＥＢ及びＨＰＢＣＤからなる群から選択されるβ－シクロデキストリンと、等張生理食塩水と、ＢＣとからなる、請求項１に記載の医薬組成物。

【請求項3】

－約８００～１２００μＭのＡＳＰ、好ましくは約８５０～１１５０μＭ、好ましくは約９００～１１００μＭ、好ましくは約９５０～１０５０μＭ、非常に好ましくは約１０００μＭのＡＳＰ、及び
－約５～３０ｍＭのＲＡＭＥＢ、好ましくは約８～２５ｍＭ、より好ましくは約９～２２ｍＭのＲＡＭＥＢ、又は
－約８～１２ｍＭのＲＡＭＥＢ、好ましくは約８．５～１１．５ｍＭ、好ましくは約９～１１ｍＭ、好ましくは約９．５～１０．５ｍＭ、非常に好ましくは約１０ｍＭのＲＡＭＥＢ、又は
－約１５～２５ｍＭのＲＡＭＥＢ、好ましくは約１６～２４ｍＭ、好ましくは約１７～２３ｍＭ、好ましくは約１８～２２ｍＭ、好ましくは約１９～２１ｍＭ、非常に好ましくは約２０ｍＭのＲＡＭＥＢ、又は
－約５～３０ｍＭの（２－ヒドロキシプロピル）－β－シクロデキストリン（ＨＰＢＣＤ）、好ましくは約８～２５ｍＭ、より好ましくは約９～２２ｍＭのＨＰＢＣＤ、又は
－約８～１２ｍＭのＨＰＢＣＤ、好ましくは約８．５～１１．５ｍＭ、好ましくは約９～１１ｍＭ、好ましくは約９．５～１０．５ｍＭ、非常に好ましくは約１０ｍＭのＨＰＢＣＤ、又は
－約１５～２５ｍＭのＨＰＢＣＤ、好ましくは約１６～２４ｍＭ、好ましくは約１７～２３ｍＭ、好ましくは約１８～２２ｍＭ、好ましくは約１９～２１ｍＭ、非常に好ましくは約２０ｍＭのＨＰＢＣＤ、及び
－等張生理食塩水、及び
－場合によって、約０．００１～１ｍ／Ｖ％（質量／体積）のＢＣ、好ましくは約０．００２～０．００９ｍ／Ｖ％、好ましくは約０．００３～０．００９ｍ／Ｖ％のＢＣ、又は
－場合によって、約０．００２～０．００６ｍ／Ｖ％のＢＣ、好ましくは約０．００３～０．００５ｍ／Ｖ％、非常に好ましくは約０．００４ｍ／Ｖ％のＢＣ、
を含む、請求項１又は２に記載の医薬組成物。

【請求項4】

－約８００～１２００μＭのＬ－アスコルビン酸６－パルミテート（ＡＳＰ）、好ましくは約８５０～１１５０μＭ、好ましくは約９００～１１００μＭ、好ましくは約９５０～１０５０μＭ、非常に好ましくは約１０００μＭのＡＳＰ、及び
－約８～１２ｍＭのＲＡＭＥＢ、好ましくは約８．５～１１．５ｍＭ、好ましくは約９～１１ｍＭ、好ましくは約９．５～１０．５ｍＭ、非常に好ましくは約１０ｍＭのＲＡＭＥＢ、又は
－約８～１２ｍＭのＨＰＢＣＤ、好ましくは約８．５～１１．５ｍＭ、好ましくは約９～１１ｍＭ、好ましくは約９．５～１０．５ｍＭ、非常に好ましくは約１０ｍＭのＨＰＢＣＤ、及び
－等張生理食塩水、及び
－場合によって、約０．００２～０．００６ｍ／Ｖ％のＢＣ、好ましくは約０．００３～０．００５ｍ／Ｖ％、非常に好ましくは約０．００４ｍ／Ｖ％のＢＣ、
を含む、請求項３に記載の医薬組成物。

【請求項5】

－約９５０～１０５０μＭ、非常に好ましくは約１０００μＭのＡＳＰと、
－約９．５～１０．５ｍＭのＲＡＭＥＢ、好ましくは約１０ｍＭのＲＡＭＥＢ、約９．５～１０．５ｍＭのＨＰＢＣＤ、好ましくは約１０ｍＭのＨＰＢＣＤから選択されるβ－シクロデキストリンと、
－等張生理食塩水と、
－場合によって、約０．００３～０．００５ｍ／Ｖ％、非常に好ましくは約０．００４ｍ／Ｖ％のＢＣと、
を含む、請求項４に記載の医薬組成物。

【請求項6】

－約９５０～１０５０μＭ、非常に好ましくは約１０００μＭのＡＳＰと、
－約１８～２２ｍＭのＲＡＭＥＢ、好ましくは約２０ｍＭのＲＡＭＥＢ、約１８～２２ｍＭのＨＰＢＣＤ、好ましくは約２０ｍＭのＨＰＢＣＤから選択されるβ－シクロデキストリンと、
－等張生理食塩水と、
－場合によって、約０．００３～０．００５ｍ／Ｖ％、非常に好ましくは約０．００４ｍ／Ｖ％のＢＣと、
を含む、請求項３に記載の医薬組成物。

【請求項7】

－約１０００μＭのＡＳＰと、
－約１０ｍＭのＲＡＭＥＢ及び約１０ｍＭのＨＰＢＣＤから選択されるβ－シクロデキストリンと、
－約０．００４ｍ／Ｖ％のＢＣと、
－等張生理食塩水と、
からなる、請求項１～５のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【請求項8】

－約１０００μＭのＡＳＰと、
－約１０ｍＭのＲＡＭＥＢと、
－約０．００４ｍ／Ｖ％のＢＣと、
－等張生理食塩水と、
からなる、請求項７に記載の医薬組成物。

【請求項9】

－約１０００μＭのＡＳＰと、
－約１０ｍＭのＨＰＢＣＤと、
－約０．００４ｍ／Ｖ％のＢＣと、
－等張生理食塩水と、
からなる、請求項７に記載の医薬組成物。

【請求項10】

－約１０００μＭのＡＳＰと、
－約２０ｍＭのＲＡＭＥＢ及び約２０ｍＭのＨＰＢＣＤから選択されるβ－シクロデキストリンと、
－約０．００４ｍ／Ｖ％のＢＣと、
－等張生理食塩水と、
からなる、請求項１～３及び６のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【請求項11】

－約１０００μＭのＡＳＰと、
－約２０ｍＭのＲＡＭＥＢと、
－約０．００４ｍ／Ｖ％のＢＣと、
－等張生理食塩水と、
からなる、請求項１０に記載の医薬組成物。

【請求項12】

－約１０００μＭのＡＳＰと、
－約２０ｍＭのＨＰＢＣＤと、
－約０．００４ｍ／Ｖ％のＢＣと、
－等張生理食塩水と、
からなる、請求項１０に記載の医薬組成物。

【請求項13】

前記医薬組成物が凍結乾燥されている、請求項１～１２のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【請求項14】

眼の障害の予防又は治療に使用するための、請求項１～１３のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【請求項15】

眼の前記障害が、線維症、好ましくは角膜の線維症、角膜薄濁、好ましくは眼科手術に伴う角膜薄濁形成及び／又は急性角膜薄濁、創傷、好ましくは角膜の創傷から選択され、好ましくは前記医薬組成物が、創傷治癒の促進に使用するためのものである、請求項１４に記載の使用のための医薬組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

Ｌ－アスコルビン酸６－パルミテート（ＡＳＰ）を含む眼用製剤が提供される。製剤は、角膜透明性の維持が危険にさらされている状況、例えば角膜手術の間又は後において有用である。

【背景技術】

【0002】

角膜の透明性は、間質内のコラーゲンフィブリルの高度に組織化された組成によって維持される（１）。架橋（ＣＸＬ）又はエキシマレーザー光切除などの一般的な角膜手術は、角膜層の構造を変化させ、角膜薄濁形成のカスケードをもたらし得る。創傷治癒中の角膜組織のリモデリングプロセスには、角膜実質細胞アポトーシス、間質マトリックスの膨潤、及びより組織化されていないコラーゲンフィブリルの産生が含まれる（２）。角膜薄濁は、光散乱の増加及びその結果としての透明性の喪失を誘発し、これは、眩しさ、光輪、又はコントラスト感度低下及び視覚品質低下などの愁訴をもたらし得る（３）。通常、角膜薄濁の量は術後初期に最も高いが、治療１年後にも有意な増加が見られる場合がある（４）。創傷治癒応答の間のリモデリングプロセスはまた、他の角膜病理（例えば、熱的若しくは化学的損傷、又は感染性角膜炎の後）において生じ、永続的な角膜混濁の発生を導き得る。混濁を伴う角膜病変は、関与する患者の視覚関連の生活の質に対して重大な負担を有し得る（５）。一般的に、コルチコステロイド点眼剤及びマイトマイシン－Ｃの適用は、角膜混濁の治療における局所的投薬として使用され、これは、重篤な長期合併症、例えば、白内障、続発性緑内障、強皮症又は穿孔の発症に関連し得る（５）。

【0003】

必須水溶性ビタミンであるＬ－アスコルビン酸（ＡＡ、アスコルビン酸、又はビタミンＣ）は、人体におけるいくつかの生理学的機能及び代謝機能において中心的な役割を有する。ＡＡは、主要な抗酸化特性を有し、ヒドロキシル化において必要な補因子であるため、コラーゲンフィブリルの生合成に必要である。ＡＡの欠如は、構造的に不安定なコラーゲン分子の産生をもたらし得る。したがって、ＡＡ欠如は組織の治癒プロセスに影響を及ぼし得る（６）。静脈内投与されたＡＡは、感染性角膜炎の治療において、上皮欠損のサイズ及び角膜混濁のサイズを安全かつ効果的に減少させることが示されている（１３）。ＡＡの抗酸化効果は、エキシマ光アブレーション後の角膜血管新生及び術後間質混濁化を低減することができる（１４、１５）。Ｓｔｏｊａｎｏｖｉｃ及びＲｉｎｇｖｏｌｄは、ＰＲＫ治療後の角膜薄濁の重症度がＡＡ治療群において有意に減少したことを見出した（１６）。したがって、最近入手可能なデータによれば、ＡＡは角膜薄濁形成に対して有益な効果を有する可能性がある。しかしながら、角膜はＡＡのような親水性物質に対しては主に親油性の拡散バリアに相当するため、角膜組織を通るＡＡの透過性は不十分であり得る。遊離形態のＡＡの水溶液の濃度を増加させると、ある時点まで、透過するＡＡの量が増加することを示す証拠がある（１７）。

【0004】

副作用なしに角膜創傷治癒プロセスを効果的に補助する組成物が、依然として必要とされている。

【発明の概要】

【0005】

アスコルビン酸と脂肪酸とのエステルと、Ｃ１～３アルキル及び／又はＣ１～３ヒドロキシアルキルで置換されたβ－シクロデキストリンと、等張生理食塩水と、場合により保存剤とを含むか又はそれらからなる医薬組成物が提供される。

【0006】

好ましくは、アスコルビン酸と脂肪酸とのエステルは、ラウリン酸アスコルビル、ミリスチン酸アスコルビル、ステアリン酸アスコルビル、パルミチン酸アスコルビル、オレイン酸アスコルビル、リノール酸アスコルビル及びそれらの任意の混合物から選択される。非常に好ましくは、アスコルビン酸と脂肪酸とのエステルは、Ｌ－アスコルビン酸６－パルミテート（ＡＳＰ）である。

【0007】

好ましくは、Ｃ１～３アルキルで置換されたβ－シクロデキストリンは、メチル－β－シクロデキストリン（ランダムメチル化β－シクロデキストリン；ＲＡＭＥＢ）である。

【0008】

好ましくは、β－シクロデキストリン置換Ｃ１～３ヒドロキシアルキルは、（２－ヒドロキシプロピル）－β－シクロデキストリン（ＨＰＢＣＤ）である。

【0009】

好ましくは、保存剤は塩化ベンザルコニウム（ＢＣ）である。

【0010】

ＡＳＰと、ＲＡＭＥＢ、ＨＰＢＣＤ及びそれらの混合物から選択されるβ－シクロデキストリンと、等張生理食塩水と、場合によりＢＣとを含むか又はそれらからなる医薬組成物が提供される。

【0011】

好ましくは、医薬組成物は、ＡＳＰと、ＲＡＭＥＢ、ＨＰＢＣＤ及びそれらの混合物から選択されるβ－シクロデキストリンと、等張生理食塩水と、ＢＣとからなる。

【0012】

好ましくは、医薬組成物は、
－約８００～１２００μＭのＡＳＰ、好ましくは約８５０～１１５０μＭ、好ましくは約９００～１１００μＭ、好ましくは約９５０～１０５０μＭ、非常に好ましくは約１０００μＭのＡＳＰ、及び
－約５～３０ｍＭのＲＡＭＥＢ、好ましくは約８～２５ｍＭ、より好ましくは約９～２２ｍＭのＲＡＭＥＢ、又は
－約８～１２ｍＭのＲＡＭＥＢ、好ましくは約８．５～１１．５ｍＭ、好ましくは約９～１１ｍＭ、好ましくは約９．５～１０．５ｍＭ、非常に好ましくは約１０ｍＭのＲＡＭＥＢ、又は
－約１５～２５ｍＭのＲＡＭＥＢ、好ましくは約１６～２４ｍＭ、好ましくは約１７～２３ｍＭ、好ましくは約１８～２２ｍＭ、好ましくは約１９～２１ｍＭ、非常に好ましくは約２０ｍＭのＲＡＭＥＢ、又は
－約５～３０ｍＭの（２－ヒドロキシプロピル）－β－シクロデキストリン（ＨＰＢＣＤ）、好ましくは約８～２５ｍＭ、より好ましくは約９～２２ｍＭのＨＰＢＣＤ、又は
－約８～１２ｍＭのＨＰＢＣＤ、好ましくは約８．５～１１．５ｍＭ、好ましくは約９～１１ｍＭ、好ましくは約９．５～１０．５ｍＭ、非常に好ましくは約１０ｍＭのＨＰＢＣＤ、又は
－約１５～２５ｍＭのＨＰＢＣＤ、好ましくは約１６～２４ｍＭ、好ましくは約１７～２３ｍＭ、好ましくは約１８～２２ｍＭ、好ましくは約１９～２１ｍＭ、非常に好ましくは約２０ｍＭのＨＰＢＣＤ、又は
－約５～３０ｍＭのＲＡＭＥＢとＨＰＢＣＤとの混合物、好ましくは約８～２５ｍＭ、より好ましくは約９～２２ｍＭのＲＡＭＥＢとＨＰＢＣＤとの混合物、又は
－約８～１２ｍＭのＲＡＭＥＢとＨＰＢＣＤとの混合物、好ましくは約８．５～１１．５ｍＭ、好ましくは約９～１１ｍＭ、好ましくは約９．５～１０．５ｍＭ、非常に好ましくは約１０ｍＭのＲＡＭＥＢとＨＰＢＣＤとの混合物、又は
－約１５～２５ｍＭのＲＡＭＥＢとＨＰＢＣＤとの混合物、好ましくは約１６～２４ｍＭ、好ましくは約１７～２３ｍＭ、好ましくは約１８～２２ｍＭ、好ましくは約１９～２１ｍＭ、非常に好ましくは約２０ｍＭのＲＡＭＥＢとＨＰＢＣＤとの混合物、及び
－等張生理食塩水、及び
－場合によって、約０．００１～１ｍ／Ｖ％（質量／体積）のＢＣ、好ましくは約０．００２～０．００９ｍ／Ｖ％、好ましくは約０．００３～０．００９ｍ／Ｖ％のＢＣ、又は
－場合によって、約０．００２～０．００６ｍ／Ｖ％のＢＣ、好ましくは約０．００３～０．００５ｍ／Ｖ％、非常に好ましくは約０．００４ｍ／Ｖ％のＢＣ、
を含むか又はそれらからなる。

【0013】

好ましくは、医薬組成物は、
－約８００～１２００μＭのＬ－アスコルビン酸６－パルミテート（ＡＳＰ）、好ましくは約８５０～１１５０μＭ、好ましくは約９００～１１００μＭ、好ましくは約９５０～１０５０μＭ、非常に好ましくは約１０００μＭのＡＳＰ、及び
－約８～１２ｍＭのＲＡＭＥＢ、好ましくは約８．５～１１．５ｍＭ、好ましくは約９～１１ｍＭ、好ましくは約９．５～１０．５ｍＭ、非常に好ましくは約１０ｍＭのＲＡＭＥＢ、又は
－約８～１２ｍＭのＨＰＢＣＤ、好ましくは約８．５～１１．５ｍＭ、好ましくは約９～１１ｍＭ、好ましくは約９．５～１０．５ｍＭ、非常に好ましくは約１０ｍＭのＨＰＢＣＤ、又は
－約８～１２ｍＭのＲＡＭＥＢとＨＰＢＣＤとの混合物、好ましくは約８．５～１１．５ｍＭ、好ましくは約９～１１ｍＭ、好ましくは約９．５～１０．５ｍＭ、非常に好ましくは約１０ｍＭのＲＡＭＥＢとＨＰＢＣＤとの混合物、及び
－等張生理食塩水、及び
－場合によって、約０．００２～０．００６ｍ／Ｖ％のＢＣ、好ましくは約０．００３～０．００５ｍ／Ｖ％、非常に好ましくは約０．００４ｍ／Ｖ％のＢＣ、
を含むか又はそれらからなる。

【0014】

好ましくは、医薬組成物は、
－約８００～１２００μＭのＬ－アスコルビン酸６－パルミテート（ＡＳＰ）、好ましくは約８５０～１１５０μＭ、好ましくは約９００～１１００μＭ、好ましくは約９５０～１０５０μＭ、非常に好ましくは約１０００μＭのＡＳＰ、及び
－約１５～２５ｍＭのＲＡＭＥＢ、好ましくは約１６～２４ｍＭ、好ましくは約１７～２３ｍＭ、好ましくは約１８～２２ｍＭ、好ましくは約１９～２１ｍＭ、非常に好ましくは約２０ｍＭのＲＡＭＥＢ、又は
－約１５～２５ｍＭのＨＰＢＣＤ、好ましくは約１６～２４ｍＭ、好ましくは約１７～２３ｍＭ、好ましくは約１８～２２ｍＭ、好ましくは約１９～２１ｍＭ、非常に好ましくは約２０ｍＭのＨＰＢＣＤ、又は
－約１５～２５ｍＭのＲＡＭＥＢとＨＰＢＣＤとの混合物、好ましくは約１６～２４ｍＭ、好ましくは約１７～２３ｍＭ、好ましくは約１８～２２ｍＭ、好ましくは約１９～２１ｍＭ、非常に好ましくは約２０ｍＭのＲＡＭＥＢとＨＰＢＣＤとの混合物、及び
－等張生理食塩水、及び
－場合によって、約０．００２～０．００６ｍ／Ｖ％のＢＣ、好ましくは約０．００３～０．００５ｍ／Ｖ％、非常に好ましくは約０．００４ｍ／Ｖ％のＢＣ、
を含むか又はそれらからなる。

【0015】

好ましくは、医薬組成物は、
－約９５０～１０５０μＭ、非常に好ましくは約１０００μＭのＡＳＰと、
－約９．５～１０．５ｍＭ、非常に好ましくは約１０ｍＭのＲＡＭＥＢと、
－等張生理食塩水と、
－場合によって、約０．００３～０．００５ｍ／Ｖ％、非常に好ましくは約０．００４ｍ／Ｖ％のＢＣと、
を含むか又はそれらからなる。

【0016】

好ましくは、医薬組成物は、
－約９５０～１０５０μＭ、非常に好ましくは約１０００μＭのＡＳＰと、
－約１８～２２ｍＭ、非常に好ましくは約２０ｍＭのＲＡＭＥＢと、
－等張生理食塩水と、
－場合によって、約０．００３～０．００５ｍ／Ｖ％、非常に好ましくは約０．００４ｍ／Ｖ％のＢＣと、
を含むか又はそれらからなる。

【0017】

好ましくは、医薬組成物は、
－約９５０～１０５０μＭ、非常に好ましくは約１０００μＭのＡＳＰと、
－約９．５～１０．５ｍＭ、非常に好ましくは約１０ｍＭのＨＰＢＣＤと、
－等張生理食塩水と、
－場合によって、約０．００３～０．００５ｍ／Ｖ％、非常に好ましくは約０．００４ｍ／Ｖ％のＢＣと、
を含むか又はそれらからなる。

【0018】

好ましくは、医薬組成物は、
－約９５０～１０５０μＭ、非常に好ましくは約１０００μＭのＡＳＰと、
－約１８～２２ｍＭ、非常に好ましくは約２０ｍＭのＨＰＢＣＤと、
－等張生理食塩水と、
－場合によって、約０．００３～０．００５ｍ／Ｖ％、非常に好ましくは約０．００４ｍ／Ｖ％のＢＣと、
を含むか又はそれらからなる。

【0019】

非常に好ましくは、医薬組成物は、
－１０００μＭのＡＳＰと、
－１０ｍＭのＲＡＭＥＢと、
０．００４ｍ／Ｖ％のＢＣと、
等張生理食塩水と、
からなる。

【0020】

好ましくは、医薬組成物は、
－１０００μＭのＡＳＰと、
－１０ｍＭのＨＰＢＣＤと、
０．００４ｍ／Ｖ％のＢＣと、
等張生理食塩水と、
からなる。

【0021】

好ましくは、医薬組成物は、
－１０００μＭのＡＳＰと、
－２０ｍＭのＲＡＭＥＢと、
０．００４ｍ／Ｖ％のＢＣと、
等張生理食塩水と、
からなる。

【0022】

好ましくは、医薬組成物は、
－１０００μＭのＡＳＰと、
－２０ｍＭのＨＰＢＣＤと、
０．００４ｍ／Ｖ％のＢＣと、
等張生理食塩水と、
からなる。

【0023】

好ましくは、等張生理食塩水は、医薬使用のためのものであり、例えば、点眼剤における使用に適している。

【0024】

好ましくは、医薬組成物は凍結乾燥される。好ましくは、医薬組成物は眼科（例えば、眼内）使用のためのものである。好ましくは、医薬組成物は、角膜薄濁の予防又は治療、好ましくは眼の手術に伴う角膜薄濁形成の予防又は治療に使用するためのものである。好ましくは、角膜薄濁は急性角膜薄濁である。

【0025】

好ましくは、医薬組成物は、眼、好ましくは角膜における線維症の予防又は治療に使用するためのものである。

【0026】

好ましくは、医薬組成物は、眼、好ましくは角膜における創傷治癒の促進に使用するためのものである。

【0027】

好ましくは、凍結乾燥医薬組成物は、投与前に、好ましくは等張生理食塩水に溶解される。好ましくは、凍結乾燥された医薬組成物は、例えば１０ｍＬの等張生理食塩水に溶解される。好ましくは、医薬組成物は、眼の手術の直後及び手術後１日１～２０回、好ましくは１日１～１０回、好ましくは３～８回、非常に好ましくは５回投与されるべきである。医薬組成物は、手術後３０日間、又は２５日間、２０日間、１５日間、１０日間若しくは５日間使用することができる。好ましくは、１回に１滴が片眼に投与される（例えば、１滴が片眼に１～１０回、１日に投与される）。

【0028】

好ましくは、平均置換度（メチル基）は、ＲＡＭＥＢ中のグルコース単位当たり１．６～２．０である。好ましくは、平均置換度（ヒドロキシプロピル基）は、ＨＰＢＣＤ中のグルコース単位当たり２．５～７．０である。

【図面の簡単な説明】

【0029】

【図1】（２－ヒドロキシプロピル）－γ－シクロデキストリン（ＨＰＧＣＤ）、γ－シクロデキストリン（ＧＣＤ）、スルホブチル化β－シクロデキストリンナトリウム塩（ＳＢＥＣＤ）（Ａ）；（２－ヒドロキシプロピル）－β－シクロデキストリン（ＨＰＢＣＤ）、β－シクロデキストリン（ＢＣＤ）（Ｂ）及びランダム置換メチル－β－シクロデキストリン（ＲＡＭＥＢ）（Ｃ）の場合のＡＳＰ－ＣＤ（Ｌ－アスコルビン酸６－パルミテート－シクロデキストリン）複合体の溶解度プロファイル

【0030】

【図2】３５℃での生理食塩水溶液中でのＡＳＰ－ＨＰＢＣＤ（Ａ）複合体及びＡＳＰ－ＲＡＭＥＢ（Ｂ）複合体の溶解度プロファイルに対する塩化ベンザルコニウム（ＢＣ）の影響

【0031】

【図3】３５℃での生理食塩水溶液中のＡＳＰ－ＣＤ複合体の溶解度（ドナー側での）及び角膜透過性プロファイル

【0032】

【図4】３５℃でのＡＳＰ－ＣＤ複合体のｉｎ ｖｉｔｒｏ角膜透過性値

【0033】

【図5】３５℃でのＡＳＰ－ＣＤ複合体の角膜フラックス（corneal flux）プロファイル

【0034】

【図6】４℃（Ａ）及び２５℃（Ｂ）で貯蔵されたＡＳＰ－ＣＤ複合体の貯蔵安定性プロファイル。

【0035】

【図7】ＡＳＰ溶液と比較した、１５分間の処理の間の濃縮製剤のラマンマップにおいて得られたＡＳＰの相対強度値

【0036】

【図8】ＡＳＰ溶液と比較した、６０分間の処理の間の濃縮製剤のラマンマップにおいて得られたＡＳＰの相対強度値

【0037】

【図9】１０倍希釈製剤での処置後のドナー部位（Ａ）、角膜（Ｂ）及び眼房水（Ｃ）におけるＡＳＰ濃度

【0038】

【図10】ＡＳＰの角膜透過性（Ａ）及び房水透過性（Ｂ）のフラックス

【発明を実施するための形態】

【0039】

副作用を伴わず、角膜創傷治癒プロセスを効果的に補助するアスコルビン酸を含む組成物が開発された。有用な製剤を作製するためには、ＡＡの透過度を増加させなければならなかった。

【0040】

角膜透過度がより高ければ、より深い眼内構造でＡＡレベルが達成され得る。これは、酸化ストレスが病態生理に影響を及ぼすいくつかの眼病態、例えば、加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）、糖尿病性網膜症若しくは黄斑症、又は緑内障において重要な役割を有し得る。硝子体におけるＡＡの枯渇は、増殖性糖尿病性網膜症を有する患者における黄斑虚血に関連し得る（１８）。ＡＡは、毛細血管周皮細胞のアポトーシスによる損失及び内皮機能不全を予防し得るため、糖尿病性黄斑浮腫の予防において潜在的な役割を有する（１９）。酸化ストレスは、小柱網の損傷をもたらし、眼内圧のレベルの上昇及び網膜神経節細胞の喪失をもたらす可能性があり、したがって、ビタミンＣが緑内障の病因形成にも影響を及ぼし得ることが報告されている（２３、２４）。眼房水又は硝子体におけるＡＡレベルの増加は、前述の疾患の潜在的な治療様式を有し得る。

【0041】

遊離形態ＡＡは、親水性プロファイル及び酸性特性を有する。したがって、相対的に負に荷電した親油性脂質バリアを提供する、角膜の上皮を通る透過性は、不十分であり得る。親油性を有するＡＡの構造類似体として使用されるＬ－アスコルビン酸６－パルミテート（ＡＳＰ又は６－Ｏ－パルミトイル－Ｌ－アスコルビン酸）は、そのより高い角膜透過性のため、角膜瘢痕の治療においてより有効であり得るが、この薬物単独の使用は、水溶性が乏しいことから局所濃度が低いため、制限される。シクロデキストリン（ＣＤ）複合体化は、主に親油性組成物の水性点眼剤溶液としての製剤化を可能にする（２５、２６）。

【0042】

試験したＣＤの中で、ＢＣＤ、ＨＰＢＣＤ及びＲＡＭＥＢは、有望な水溶性を示した。しかし、ＢＣＤは、細胞膜からコレステロール及び他の脂質成分を抽出し、細胞破壊及び角膜上皮膜を通る薬物透過の増強をもたらすことが報告された。一方、ＨＰＢＣＤは、眼組織においてより良好に許容され、角膜上皮バリアの破壊を引き起こす可能性が低い。本発明者らはまた、５％及び１２．５％の濃度でのＲＡＭＥＢの眼投与がウサギ眼の結膜及び角膜表面に対して刺激性であるのに対して、ＨＰＢＣＤは１２．５％の濃度であっても十分に許容されることを見出した。

【0043】

ＣＤの量を増加させることは、ＡＳＰの溶解度に対して、比例した効果を有し、したがって、いかなる毒性学的問題も回避するために、適用されるＣＤの量は、１～２０ｍＭの範囲（２．８％（ｍ／Ｖ％）未満）に最小限にしなければならなかった。

【0044】

角膜特異的平行人工膜透過性アッセイからの結果は、ＨＰＢＣＤ及びＲＡＭＥＢの両方の場合において、０．００４％のＢＣに加えて、１０及び２０ｍＭ濃度のＣＤが、ＡＳＰのドナー側濃度の顕著な増加をもたらしたことを示した。

【0045】

ＣＤ濃度を増加させると、ｉｎ ｖｉｔｒｏ角膜透過性において逆の変化が観察され得、これは、異なるドナーＡＳＰ濃度及び適用されたＣＤの増加した量で部分的に説明され得る。シクロデキストリンは、薬物の溶解度を増加させることによって透過を増強し得るが、過剰量のシクロデキストリンが角膜を通じた吸収の減少をもたらし得ることも報告されている。ＡＳＰの角膜透過性は、ＡＳＰの最大溶解度がドナー側で達成されるまで増加する。

【0046】

Ｅｘ ｖｉｖｏブタ角膜透過研究
驚くべきことに、ＲＡＭＥＢを含む製剤がＡＳＰの優れた透過値を提供することが見出された。

【0047】

置換の度合いは、特定のＣＤが透過性を増加させる能力に影響を与えないようである。

【0048】

保存剤
ＢＣは、点眼剤において頻繁に使用される保存剤であるが、本発明者らの溶解性結果は、ＢＣが溶解性に対して負の効果を有することを示した。したがって、その濃度は最終製剤において０．００４％に最小限にされた。この濃度は、眼用製品の必要とされる微生物学的安定性を確保するのに十分高い。

【0049】

保存条件
安定性試験は、冷所での貯蔵がＡＳＰ－ＣＤ複合体に悪影響を及ぼすことを示し、濃度－時間曲線は、溶質相中のＡＳＰ含量がより高い傾向で減少することを示すが、ＡＳＰの分解速度は温度を上昇させることによって加速される。この結果に基づいて、最終製剤を室温で保存することが好ましい。

【0050】

本明細書で使用される用語「約」は、濃度を指す場合、この分野で通常の意味、すなわち測定方法が許す限り正確な意味を有する。「約」という用語はまた、所与の特定の値の±２５％の範囲内、好ましくは±２０％の範囲内、又は好ましくは±２０％の範囲内にある濃度を指し得る。

【実施例】

【0051】

材料及び方法
材料
Ｌ－アスコルビン酸６－パルミテート（ＡＳＰ）（ＣＡＳ番号：１３７－６６－６）、塩化ベンザルコニウム（ＢＣ）（ＣＡＳ番号：６３４４９－４１－２）、Ｌ－α－ホスファチジルコリン（ＣＡＳ番号：９７２８１－４７－５）、並びに塩化カルシウム及び塩化マグネシウムを含まず、液体であり、滅菌濾過され細胞培養に適した改変ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）は、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ．Ｌｔｄ．（Ｂｕｄａｐｅｓｔ，Ｈｕｎｇａｒｙ）から購入した。分析等級の溶媒であるメタノール、ヘキサン、ドデカン及びクロロホルムは、Ｍｅｒｃｋ ＫＧａＡ（Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入した。β－シクロデキストリン（ＢＣＤ）（ＣＡＳ番号：７５８５－３９－９）、２－ヒドロキシプロピル）－β－シクロデキストリン（ＨＰＢＣＤ）（ＣＡＳ番号：１２８４４６－３５－５）、γ－シクロデキストリン（ＧＣＤ）（ＣＡＳ番号：１７４６５－８６－０）、（２－ヒドロキシプロピル）－γ－シクロデキストリン（ＨＰＧＣＤ）（ＣＡＳ番号：１２８４４６－３４－４）、スルホブチル化β－シクロデキストリンナトリウム塩（ＳＢＥＣＤ）（ＣＡＳ番号：１８２４１０－００－０）及びランダム置換メチル－β－シクロデキストリン（ＲＡＭＥＢ）（ＣＡＳ番号：１２８４４６－３６－６）は、Ｃｙｃｌｏｌａｂ Ｌｔｄ．（Ｂｕｄａｐｅｓｔ，Ｈｕｎｇａｒｙ）から快く供与された。

【0052】

相溶解度試験
過剰量のＡＳＰを、密封ガラスバイアル中の１～５０ｍＭ範囲の漸増濃度のＣＤを含有する５ｍＬのリン酸緩衝液（ＰＢＳ、ｐＨ＝７．４）に添加した。得られた懸濁液を、平衡になるまで（２４時間）、一定温度（３５±０．５℃）で電磁気的に撹拌した（５００ｒｐｍ）。次いで、アリコートを取り出し、Ｈｅｒｍｌｅ Ｚ３２３Ｋ高性能冷却遠心機（Ｈｅｒｍｌｅ ＡＧ，Ｇｏｓｓ－ｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して１６０００ｒｐｍで３０分間遠心分離して、固体ＡＳＰ結晶をＡＳＰ－ＣＤ溶液から分離し、ＡＳＰ濃度をＨＰＬＣ－ＤＡＤでアッセイした。

【0053】

眼用製剤の開発
過剰量のＡＳＰを、密封ガラスバイアル中の１～２０ｍＭ範囲の漸増濃度のＣＤを含有する５ｍＬの生理食塩水溶液に添加した。保存剤としての異なる濃度の塩化ベンザルコニウム（ＢＣ）（０．００４％及び０．００８％）を製剤に添加した。得られた懸濁液を、平衡になるまで（２４時間）、一定温度（３５±０．５℃）で電磁的に撹拌した（５００ｒｐｍ）。次いで、アリコートを取り出し、Ｈｅｒｍｌｅ Ｚ３２３Ｋ高性能冷却遠心機（Ｈｅｒｍｌｅ ＡＧ，Ｇｏｓｓ－ｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して１６０００ｒｐｍで３０分間遠心分離して、固体ＡＳＰ結晶をＡＳＰ－ＣＤ溶液から分離し、ＡＳＰ濃度をＨＰＬＣ－ＤＡＤでアッセイした。

【0054】

高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）
ＡＳＰ濃度の決定は、Ａｇｉｌｅｎｔ １２６０（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＵＳＡ）を使用してＨＰＬＣで行った。固定相として、Ｚｏｒｂａｘ Ｅｃｌｉｐｓｅ（登録商標）Ｃ１８カラム１００×４．６ｍｍ、５μｍ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ，Ｔｏｒｒａｎｃｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）を適用した。精製水及びメタノール１０：９０（ｖ／ｖ）による定組成溶離を、２５℃で１．０ｍＬ／分の流速で６分間適用した。１０μＬのサンプルを注入して、ＡＳＰ濃度を決定した。クロマトグラムは、ＵＶ－ＶＩＳダイオードアレイ検出器を用いて２５５ｎｍで検出した。ＣｈｅｍＳｔａｔｉｏｎ Ｂ．０４．０３ソフトウェア（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＵＳＡ）を用いてデータを評価した。検量線の線形回帰は０．９９９８であり、検出限界（ＬＯＤ）及び定量化限界（ＬＯＱ）はそれぞれ１．１１μｇ／ｍＬ及び３．３３μｇ／ｍＬであった。

【0055】

Ｉｎ ｖｉｔｒｏ角膜透過性測定
角膜特異的平行人工膜透過性アッセイ（角膜－ＰＡＭＰＡ）を使用して、ＡＳＰ－ＣＤ製剤の経角膜透過性を決定した。フィルタードナープレート（Ｍｕｌｔｉｓｃｒｅｅｎ（商標）－ＩＰ、ＭＡＩＰＮ４５１０、孔径０．４５μｍ；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｍｅｒｃｋ Ｌｔｄ．，Ｂｕｄａｐｅｓｔ，Ｈｕｎｇａｒｙ）を、７０％（ｖ／ｖ）ヘキサン、２５％（ｖ／ｖ）ドデカン及び５％（ｖ／ｖ）クロロホルムの６００μＬ溶媒混合物に溶解した５μＬのホスファチジルコリン（１６ｍｇ）でコーティングした。アクセプタープレート（ＭＳＳＡＣＣＥＰＴＯＲ；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｍｅｒｃｋ Ｌｔｄ．，Ｂｕｄａｐｅｓｔ，Ｈｕｎｇａｒｙ）をｐＨ７．４のＰＢＳ溶液３００μＬで満たした。１５０－１５０μＬの製剤及び参照溶液をドナープレートの膜上に適用した。次いで、溶媒の蒸発の可能性を減少させるために、これをプレート蓋で覆った。このサンドイッチ系を３５℃で４時間インキュベートした（Ｈｅｉｄｏｌｐｈ Ｔｉｔｒａｍａｘ １０００，Ｈｅｉｄｏｌｐｈ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｓｃｈｗａｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）。アクセプタープレートに透過したＡＳＰの濃度を、ＨＰＬＣを用いて決定した。ＡＳＰの有効透過率は、以下の式を用いて計算した（２９）。

【数1】

式中、Ｐ_ｅは、有効透過係数（ｃｍ／ｓ）であり、Ａは、フィルター面積（０．３ｃｍ^２）であり、ｔはインキュベーション時間（ｓ）であり、τ_ｓｓは、定常状態に達する時間（ｓ）であり、ｒ_ｖは、水性区画の体積比（Ｖ_Ｄ／Ｖ_Ａ）であり、Ｖ_Ｄ及びＶ_Ａは、ドナー相の体積（０．１５ｃｍ^３）及びアクセプター相の体積（０．３ｃｍ^３）であり、Ｃ_Ｄ（ｔ）は、時点ｔでのドナー相中の化合物の濃度（ｍｏｌ／ｃｍ^３）であり、Ｃ_Ｄ（０）は、時点０でのドナー相中の化合物の濃度（ｍｏｌ／ｃｍ^３）であり、ＭＲは、（２９）のように定義される膜保持係数である。

【数2】

式中、Ｃ_Ａ（ｔ）は、時点ｔでのアクセプター相中の化合物の濃度（ｍｏｌ／ｃｍ^３）である。フラックス（ｍｏｌ／ｃｍ^２×ｓ）も、以下の式を使用して計算した（３０）。

【数3】

式中、Ｐ_ｅは有効透過係数（ｃｍ／ｓ）であり、Ｓ_ＡＳＰは４時間後のドナー相におけるＡＳＰの溶解度（ｍｏｌ／ｍＬ）である。

【0056】

安定性試験
ＡＳＰ及びＡＳＰ－ＣＤ複合体の生理食塩水中の化学的安定性を、室温条件（２５±０．５℃）及び冷所条件（４±０．５℃）で５日間調べた。製剤の貯蔵寿命を予測するために、所定の時間間隔でＨＰＬＣを用いて実際の薬物含量を定量した。

【0057】

ブタ角膜に対するｅｘ ｖｉｖｏ透過研究
ＡＳＰのｅｘ ｖｉｖｏ透過をＨＰＬＣ及びラマン顕微鏡で調べた。屠殺場から得られた新鮮に提供されたブタの眼を、生理食塩水溶液で湿らせた滅菌脱脂綿床上に置き、輸送中は冷蔵庫内に保管した。ブタの眼をテフロンセルに入れ、ここで角膜の覆いを外し、テフロンリングで囲んで点眼剤の流れを防止した。１０００μＬの生理食塩水溶液を角膜に滴下し、５０μＬのＡＳＰ－ＣＤ製剤を被覆食塩水に添加し、これによって涙液によって引き起こされる生理学的希釈を模倣可能であり、これを３５℃でインキュベートした。１５分、３０分及び６０分の個々の処置後、局所表面からの残留溶液及び房水を、死後２～５時間の角膜穿刺を介して吸引した。角膜を切除し、オービタルシェーカー（ＰＳＵ－１０ｉ Ｏｒｂｉｔａｌ Ｓｈａｋｅｒ，Ｇｒａｎｔ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｌｔｄ，Ｃａｍｂｓ，Ｅｎｇｌａｎｄ）を使用して、４５０ｒｐｍで６０分間、ＡＳＰを２ｍＬのメタノール：水５０：５０（ｖ／ｖ）で抽出した。残留溶液、房水及び角膜中のＡＳＰ含量をＨＰＬＣで測定した。ＡＳの角膜保持を式２に従って計算する一方、以下の式を使用することによって見かけの透過性を計算した。

【数4】

式中、Ｐａｐｐは、処置後の眼房水におけるＡＳの濃度差（Δ［Ｃ］_Ａ）、初期ドナー濃度（［Ｃ］_Ｄ）、前房の体積Ｖ_Ａ（２５０μＬ）から計算され、Ａは、透過性に利用可能な表面積である（１．７７ｃｍ^２）。各測定を三つ組で行い、データを平均±ＳＤとして示す。

【0058】

ラマン分光法による角膜薬物透過の調査
ＨＰＬＣ透過性決定と並行して、角膜を、１５分及び３０分の処置後にラマンマッピングで調査した。処置した角膜を凍結し、Ｌｅｉｃａ ＣＭ１９５０ Ｃｒｙｏｓｔａｔ（Ｌｅｉｃａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＧｍｂＨ，Ｗｅｔｚｌａｒ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて横断切片（１５μｍ厚）に分割した。１５μｍ厚の横断切片の下にアルミニウム被覆スライドを使用した。ラマン分光分析を、ＣＣＤカメラ及び７８０ｎｍで作動するダイオードレーザーを備えたＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ＤＸＲ Ｄｉｓｐｅｒｓｉｖｅ Ｒａｍａｎ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）を用いて行った。倍率５０倍の顕微鏡レンズを使用した。２４ｍＷのレーザー出力及び５０μｍのスリット開口で測定を行った。１５０×１０００μｍの領域の角膜マッピングを、垂直及び水平に５０μｍのステップサイズで捕捉した。ＯＭＮＩＣ ｆｏｒ Ｄｉｓｐｅｒｓｉｖｅ Ｒａｍａｎ ８．２ソフトウェア（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を化学評価に使用した。化学マップをプロファイリングする際に、未配合ＡＳＰの個々のスペクトルを参照として使用した。

【0059】

結果
ＰＢＳ中のＣＤ誘導体の選択（スクリーニング）
異なる濃度のＣＤ誘導体の存在下でのＡＳＰの溶解度試験では、ＣＤの濃度を増加させると、ＰＢＳ（ｐＨ＝７．４）中のＡＳＰの溶解度の増強が示され、したがって薬物の複合体化の成功が示された（図１）。

【0060】

溶解度試験は、ＡＳＰの水溶解度が、ＧＣＤ、ＨＰＧＣＤ又はＳＢＥＣＤと比較して、ＢＣＤ、ＨＰＢＣＤ及びＲＡＭＥＢとの複合体化の場合に最も高かったことを明確に示す。しかし、ＢＣＤは、細胞膜からコレステロール及び他の脂質成分を抽出する能力があることが証明されており（３１）、細胞破壊及び角膜上皮膜を通る薬物透過の増強をもたらす（３２）ため、ＢＣＤの選択を回避した。逆に、ＨＰＢＣＤは、眼組織においてより良好に許容され、角膜上皮バリアの破壊を引き起こす可能性が低い（３３）。したがって、ＨＰＢＣＤ及びＲＡＭＥＢをさらなる調査のための適切な候補として選択した。しかしながら、ＣＤの量を増加させることは、ＡＳＰの溶解度に対して、比例した効果を有し、いかなる毒性学的問題も回避するために、適用されるＣＤの量は、さらなる調査のために１～２０ｍＭ範囲（２．８％未満）に最小限にされた。５％及び１２．５％の濃度でのＲＡＭＥＢの眼への投与は、ウサギ眼の結膜及び角膜表面に対して刺激性であったが、ＨＰＢＣＤは、１２．５％の濃度であっても、十分に許容された。

【0061】

ＡＰＩ溶解度に対する電解質及び保存剤の影響に関する製剤の開発
眼用製剤の要件を満たすために、ＰＢＳを生理食塩水溶液に変更し、保存剤を添加した。その目的のために、ＢＣが最も適切であるように思われたが、ＢＣはまた、ＡＳＰ溶解度に対して望ましくない影響、すなわち、複合体形成に関しての競合を有し得る。ＢＣは、点眼剤において頻繁に使用される保存剤である。典型的な濃度は０．００４～０．０１％の範囲である（３５）。したがって、これを解明するために、生理食塩水溶液及びＢＣ（０．００４及び０．００８％）の存在下で溶解度試験も行った（図２）。

【0062】

結果は、ＢＣが溶解度に対して負の影響を有することを裏付け、さらに、ＢＣに関連する有害反応（例えば、刺激）の可能性を最小限に抑えるために、その濃度を最終製剤中において０．００４％に最小限にした。この濃度は、眼用製品の必要とされる微生物学的安定性を確保するのに十分高い。

【0063】

Ｉｎ ｖｉｔｒｏでの角膜透過性結果
ＨＰＢＣＤ及びＲＡＭＥＢ製剤の両方を含む生理食塩水溶液中で角膜－ＰＡＭＰＡ測定を実施して、透過性に対するＣＤ及びＢＣ濃度の影響を調べた（図３）。

【0064】

角膜－ＰＡＭＰＡ測定は、ＨＰＢＣＤ及びＲＡＭＥＢの場合の両方において、０．００４％のＢＣに加えて、１０及び２０ｍＭ濃度のＣＤが、ＡＳＰのドナー側濃度の顕著な増加を示したことによって、予備製剤研究の結果を裏付ける。どのＣＤ濃度が最も有望であるかを明らかにするために、濃度依存性因子としてのＡＳＰの有効透過性（図４）及び角膜透過フラックス（図５）も計算した。

【0065】

ＣＤ濃度を増加させると、ｉｎ ｖｉｔｒｏ角膜透過性において逆の変化が観察され得、これは、異なるドナーＡＳＰ濃度及び適用されたＣＤの増加した量で部分的に説明され得る。シクロデキストリンは、薬物の溶解度を増加させることによって透過を増強し得るが、過剰量のシクロデキストリンが角膜を通じた吸収の減少をもたらし得ることも報告されている。ＡＳＰの角膜透過性は、ＡＳＰの最大溶解度がドナー側で達成されるまで増加する（３６）。

【0066】

ＡＰＳの角膜－ＰＡＭＰＡ測定のフラックス値は、２０ｍＭとは対照的に、１０ｍＭ ＣＤ濃度で０．００４％ＢＣの場合に最も高い増加を示し、これは、ＡＳＰの異なるドナー側濃度（５倍）で説明され得る。要約すると、角膜－ＰＡＭＰＡの結果に基づいて、２０ｍＭのＣＤ製剤が有望であると思われたため、それらを用いてさらなる特徴付けを行った。

【0067】

安定性試験
安定性試験を実施して、ＡＳＰ－ＣＤ製剤の最適な貯蔵条件及び貯蔵寿命を決定した。４℃及び２５℃で保存した異なるＡＳＰ－ＣＤ複合体のＡＳＰ含量の時間依存的変化を図６に示す。

【0068】

安定性試験は、冷所での貯蔵がＡＳＰ－ＣＤ複合体に対して悪影響を及ぼすことを示し、濃度－時間曲線は、溶質相中のＡＳＰ含量がより高い傾向で減少することを示すが、ＡＳＰの分解速度は温度を上昇させることによって加速される。この現象は、適用されたＣＤによる飽和ＡＳＰ溶液の存在で説明され得る。温度を４℃に低下させることによって、ＡＳＰは、ＣＤ複合体から放出される傾向があり、水性媒体中で沈殿して、液体製剤のＡＳＰ濃度を低下させる。この結果に基づいて、最終製剤を室温で保存することが好ましい。ＡＳＰ－ＣＤ複合体の貯蔵寿命を、表１に示す貯蔵安定性プロフィールに基づいて決定した。

【表1】

ｍ／ｖ％

【0069】

貯蔵寿命データは、ＣＤ複合体がＡＳＰを安定化することができ、分解プロセスが最初のＡＳＰと比較して３～５倍も持続されることを示しており、これは製剤の治療適用性を改善する。ＢＣは、貯蔵寿命に有意な影響を示さない。

【0070】

Ｅｘ ｖｉｖｏブタ角膜透過研究
ブタ角膜上の、選択されたＡＳＰ－ＣＤ製剤及び最初のＡＳＰの分布を調べるために、ラマンマッピングを行った。濃縮製剤（図７）及び１０倍希釈製剤（図８）の両方を試験して、生きている眼の生理学的希釈条件を模倣した。透過した製剤の位置決定のために、ＡＳＰのラマンスペクトルをプロファイルとして設定し、ＩｍａｇｅＪ １．４ソフトウェア（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，ＵＳＡ）を用いてラマンマップにおけるＡＳＰの相対強度を測定することによって、その発生頻度を決定した。

【0071】

５分処置後のラマンマップは、ＨＰＢＣＤ及びＲＡＭＥＢ複合体の両方が、参照ＡＳＰ溶液と比較してＡＳＰの眼透過を改善したことを明確に示した。ＲＡＭＥＢ ０．００４％ＢＣは、他の２つの調査サンプルと比較して、より高い相対強度を示し、これは透過した薬物の濃度がより高いことを示す。

【0072】

１５分の処置後、ＡＳＰの相対強度は、ＡＳＰ参照及びＨＰＢＣＤの場合にも増加し、５分の処置と比較してより高い透過率を示した。生理学的に、最初の１５分は、眼のクリアランスによる排除のため、薬物透過に関連する。

【0073】

３０分の処置後、ＨＰＢＣＤ及びＲＡＭＥＢの両方は、ＡＳＰ溶液と比較してより高い相対強度を示したが、ＲＡＭＥＢの場合、顕著により高いＡＳＰ濃度を観察することができる。

【0074】

涙液による生理学的クリアランスを考慮して、実験をより生物学的に関連性のあるものにするために、１０倍希釈製剤も用いて、先の測定を行った。

【0075】

希釈製剤は、製剤の透過において濃縮製剤と同様の傾向を示したが、１５分後、透過した薬物は依然として間質に到達しなかった。作用部位として角膜が予想されるため、これは治療の観点からは重要ではなく、その飽和は治療目的に相当する。

【0076】

６０分後、ＡＳＰの透過は濃縮製剤と同様であり、ＲＡＭＥＢ複合体は、ブタ角膜の全横断面において顕著に高い相対強度及びＡＳＰ飽和を示す。

【0077】

ｅｘ ｖｉｖｏ透過を、ＨＰＬＣを使用して角膜及び眼房水におけるＡＳＰ濃度を決定することによってもまた定量的に調査した（図９）。

【0078】

ドナー部位濃度は、ＡＳＰ濃度のわずかな減少を示し、これは、角膜への薬物の透過の増加で説明され得る。この知見は、治療時までに同時に増加する角膜濃度によって裏付けられる。基本的に、角膜濃度は治療上重要であり、これらの結果は、両方のＣＤ複合体の改善された治療有効性を予測する。興味深いことに、ＡＳＰ濃度の増加は、眼房水においても検出することができ、これは、ＡＳＰの多量の眼透過を提供する。全ての場合において、ＲＡＭＥＢは有意に増加したＡＳＰ濃度を示し、これは、ＨＰＢＣＤに対して２．５倍高いドナー濃度で説明され得る。角膜透過性及び房水透過性のフラックスも計算した（図１０）。

【0079】

ＲＡＭＥＢは、ＨＰＢＣＤと比較して顕著に増加した角膜フラックス値を示し、両方のＣＤは、最初の薬物に対して有意に高いフラックス値を示し、これは、ＡＳＰの眼送達の改善に対するそれらの有利な効果を証明する。房水フラックス値はそれほど明確な結果を示さず、わずかな差しか観察することができない。

【0080】

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【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【国際調査報告】