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特表2024-546191テトラヒドロシクロヘプタインダゾール化合物の塩形、結晶
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-12-17
(54)【発明の名称】テトラヒドロシクロヘプタインダゾール化合物の塩形、結晶
(51)【国際特許分類】
C07D 403/14 20060101AFI20241210BHJP
A61K 31/497 20060101ALI20241210BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20241210BHJP
【ＦＩ】
C07D403/14 CSP
A61K31/497
A61P35/00
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024539514
(86)(22)【出願日】2022-12-28
(85)【翻訳文提出日】2024-08-26
(86)【国際出願番号】 CN2022142948
(87)【国際公開番号】W WO2023125700
(87)【国際公開日】2023-07-06
(31)【優先権主張番号】202111631128.4
(32)【優先日】2021-12-28
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
２．ＴＲＩＴＯＮ
(71)【出願人】
【識別番号】524244317
【氏名又は名称】深▲セン▼揚歴医薬技術有限公司
(74)【代理人】
【識別番号】110000338
【氏名又は名称】弁理士法人 ＨＡＲＡＫＥＮＺＯ ＷＯＲＬＤ ＰＡＴＥＮＴ ＆ ＴＲＡＤＥＭＡＲＫ
(72)【発明者】
【氏名】アン，ケ
(72)【発明者】
【氏名】チン，スフィ
【テーマコード（参考）】
4C086
【Ｆターム（参考）】
4C086AA02
4C086AA03
4C086BC48
4C086GA07
4C086GA14
4C086GA15
4C086GA16
4C086MA01
4C086MA04
4C086NA03
4C086NA11
4C086ZB26
(57)【要約】
一連のテトラヒドロシクロヘプタインダゾール化合物の塩形、結晶及びその製造方法を開示し、具体的には、関連疾患を治療する医薬の製造における式（Ｉ）で表される化合物の塩形及び結晶の使用を開示する。
【化１】
【化１】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
式（ＩＩＩ）で表される化合物。【化1】
【請求項2】
粉末Ｘ線回折スペクトルが以下の２θ角：２０．９２±０．２０°、２２．０８±０．２０°、２４．７０±０．２０°において特徴的な回折ピークを有することを特徴とする、式（ＩＩＩ）で表される化合物のＡ型結晶。【化2】
【請求項3】
粉末Ｘ線回折スペクトルが以下の２θ角：１２．３０±０．２０°、１５．６４±０．２０°、１７．００±０．２０°、１８．２６±０．２０°、２０．９２±０．２０°、２２．０８±０．２０°、２２．６２±０．２０°、２４．７０±０．２０°において回折ピークを有することを特徴とする、請求項２に記載の式（ＩＩＩ）で表される化合物のＡ型結晶。
【請求項4】
粉末Ｘ線回折スペクトルが以下の２θ角：５．１８±０．２０°、５．９２±０．２０°、８．１２±０．２０°、１２．３０±０．２０°、１５．６４±０．２０°、１７．００±０．２０°、１８．２６±０．２０°、２０．９２±０．２０°、２２．０８±０．２０°、２４．７０±０．２０°において回折ピークを有することを特徴とする、請求項２に記載の式（ＩＩＩ）で表される化合物のＡ型結晶。
【請求項5】
粉末Ｘ線回折スペクトルが以下の２θ角：５．１８±０．２０°、５．９２±０．２０°、８．１２±０．２０°、１２．３０±０．２０°、１５．６４±０．２０°、１７．００±０．２０°、１８．２６±０．２０°、１９．５４±０．２０°、２０．９２±０．２０°、２２．０８±０．２０°、２２．６２±０．２０°、２４．７０±０．２０°において回折ピークを有することを特徴とする、請求項４に記載の式（ＩＩＩ）で表される化合物のＡ型結晶。
【請求項6】
粉末Ｘ線回折スペクトルが以下の２θ角：５．１８±０．２０°、５．９２±０．２０°、８．１２±０．２０°、１２．３０±０．２０°、１５．６４±０．２０°、１７．００±０．２０°、１８．２６±０．２０°、１９．５４±０．２０°、２０．９２±０．２０°、２２．０８±０．２０°、２４．７０±０．２０°、２５．４８±０．２０°において回折ピークを有することを特徴とする、請求項４に記載の式（ＩＩＩ）で表される化合物のＡ型結晶。
【請求項7】
粉末Ｘ線回折スペクトルが以下の２θ角：５．１８±０．２０°、５．９２±０．２０°、８．１２±０．２０°、１２．３０±０．２０°、１５．６４±０．２０°、１７．００±０．２０°、１８．２６±０．２０°、１９．５４±０．２０°、２０．９２±０．２０°、２２．０８±０．２０°、２２．６２±０．２０°、２４．７０±０．２０°、２５．４８±０．２０°において回折ピークを有することを特徴とする、請求項４に記載の式（ＩＩＩ）で表される化合物のＡ型結晶。
【請求項8】
粉末Ｘ線回折スペクトルが以下の２θ角：５．１８±０．２０°、５．９２±０．２０°、８．１２±０．２０°、１２．３０±０．２０°、１５．６４±０．２０°、１６．４２±０．２０°、１７．００±０．２０°、１７．６６±０．２０°、１８．２６±０．２０°、１９．５４±０．２０°、２０．０６±０．２０°、２０．９２±０．２０°、２２．０８±０．２０°、２２．６２±０．２０°、２３．３２±０．２０°、２３．８６±０．２０°、２４．７０±０．２０°、２５．４８±０．２０°、２６．６８±０．２０°、２８．５０±０．２０°、２９．５４±０．２０°、３１．５８±０．２０°、３３．２０±０．２０°において回折ピークを有することを特徴とする、請求項２～７のいずれか一項に記載の式（ＩＩＩ）で表される化合物のＡ型結晶。
【請求項9】
粉末Ｘ線回折スペクトルが以下の２θ角：５．１８１°、５．９２０°、８．１１９°、１２．２９９°、１５．６３８°、１６．４１８°、１７．００２°、１７．６６０°、１８．２６１°、１９．５３９°、２０．０６１°、２０．９１９°、２２．０８０°、２２．６２１°、２３．３２０°、２３．８６１°、２４．７００°、２５．４８３°、２６．６８１°、２８．４９８°、２９．５４２°、３１．５７８°、３３．１９８°において回折ピークを有することを特徴とする、請求項２～８のいずれか一項に記載の式（ＩＩＩ）で表される化合物のＡ型結晶。
【請求項10】
粉末Ｘ線回折スペクトルが基本的に図１に示される通りであることを特徴とする、請求項２～８のいずれか一項に記載の式（ＩＩＩ）で表される化合物のＡ型結晶。
【請求項11】
熱重量分析曲線は１５０．０００±３℃において重量が０．１９８％減少し、２４０．０００±３℃において重量が１０．８８０％減少することを特徴とする、請求項２～９のいずれか一項に記載の式（ＩＩＩ）で表される化合物のＡ型結晶。
【請求項12】
熱重量分析曲線スペクトルが図２で示される通りであることを特徴とする、請求項１１に記載の式（ＩＩＩ）で表される化合物のＡ型結晶。
【請求項13】
示差走査熱量曲線が１７５．８７±５℃、２１４．６８±５℃及び２９２．１１±５℃において吸熱ピークの開始点を有することを特徴とする、請求項２～９のいずれか一項に記載の式（ＩＩＩ）で表される化合物のＡ型結晶。
【請求項14】
示差走査熱量曲線が図３で示される通りであることを特徴とする、請求項１３に記載の式（ＩＩＩ）で表される化合物のＡ型結晶。
【請求項15】
粉末Ｘ線回折スペクトルが以下の２θ角：１４．２４±０．２０°、２２．１８±０．２０°、２３．７８±０．２０°において特徴的な回折ピークを有することを特徴とする、式（ＩＩ）で表される化合物のＢ型結晶。【化3】
【請求項16】
粉末Ｘ線回折スペクトルが以下の２θ角：６．５０±０．２０°、１４．２４±０．２０°、１５．８０±０．２０°、１８．１８±０．２０°、２２．１８±０．２０°、２３．７８±０．２０°、２５．３０±０．２０°において回折ピークを有することを特徴とする、請求項１５に記載の式（ＩＩ）で表される化合物のＢ型結晶。
【請求項17】
粉末Ｘ線回折スペクトルが以下の２θ角：６．５０±０．２０°、７．８６±０．２０°、１４．２４±０．２０°、１５．８０±０．２０°、１６．９２±０．２０°、１８．１８±０．２０°、１９．６６±０．２０°、２０．７６±０．２０°、２２．１８±０．２０°、２３．７８±０．２０°、２５．３０±０．２０°、２６．１２±０．２０°において回折ピークを有することを特徴とする、請求項１６に記載の式（ＩＩ）で表される化合物のＢ型結晶。
【請求項18】
粉末Ｘ線回折スペクトルが以下の２θ角：６．４９９°、７．８６０°、９．７３９°、１０．２５７°、１１．８６２°、１２．２５５°、１３．０２１°、１４．２４０°、１５．４１７°、１５．７９７°、１６．５４１°、１６．９２０°、１７．５５８°、１８．１８２°、１８．４３９°、１８．７０２°、１９．６６０°、２０．３８１°、２０．７６１°、２１．４９４°、２１．６４７°、２２．１８０°、２３．７８１°、２４．０９９°、２４．４９８°、２５．３０４°、２６．１１８°、２６．８２１°、２７．２３９°、２８．５７９°、２８．９２４°、２９．３０２°、２９．８８１°、３０．２７８°、３０．６８１°、３０．９３８°、３１．７６４°、３２．９７８°、３４．２６０°、３５．１０１°、３５．４１９°、３５．７６１°、３６．５９７°、３７．０８３°、３７．５４０°、３８．４２３°において回折ピークを有することを特徴とする、請求項１７に記載の式（ＩＩ）で表される化合物のＢ型結晶。
【請求項19】
粉末Ｘ線回折スペクトルが基本的に図４に示される通りであることを特徴とする、請求項１５～１８のいずれか一項に記載の式（ＩＩ）で表される化合物のＢ型結晶。
【請求項20】
熱重量分析曲線スペクトルは２００．０００±３℃において重量が０．０８５％減少することを特徴とする、請求項１８～１９のいずれか一項に記載の式（ＩＩ）で表される化合物のＢ型結晶。
【請求項21】
熱重量分析曲線スペクトルが図５に示される通りであることを特徴とする、請求項２０に記載の式（ＩＩ）で表される化合物のＢ型結晶。
【請求項22】
粉末Ｘ線回折スペクトルが以下の２θ角：４．９０±０．２０°、１５．８２±０．２０°、２２．２６±０．２０°において特徴的な回折ピークを有することを特徴とする、式（Ｉ）で表される化合物のＣ型結晶。【化4】
【請求項23】
粉末Ｘ線回折スペクトルが以下の２θ角：４．９０±０．２０°、９．８２±０．２０°、１５．８２±０．２０°、１７．４８±０．２０°、１８．６４±０．２０°、２２．２６±０．２０°、２３．７４±０．２０°、２９．３６±０．２０°において回折ピークを有することを特徴とする、請求項２２に記載の式（Ｉ）で表される化合物のＣ型結晶。
【請求項24】
粉末Ｘ線回折スペクトルが以下の２θ角：３０±０．２０°、４．９０±０．２０°、９．８２±０．２０°、１１．０６±０．２０°、１４．２０±０．２０°、１５．８２±０．２０°、１７．４８±０．２０°、１８．６４±０．２０°、２２．２６±０．２０°、２３．７４±０．２０°、２４．４６±０．２０°、２９．３６±０．２０°において回折ピークを有することを特徴とする、請求項２３に記載の式（Ｉ）で表される化合物のＣ型結晶。
【請求項25】
粉末Ｘ線回折スペクトルが以下の２θ角：３．３０１°、４．９０１°、７．８９８°、９．３１９°、９．８１９°、１１．０６１°、１４．２００°、１４．７２１°、１５．１９７°、１５．８２１°、１６．４５７°、１７．４８１°、１８．１０１°、１８．６４２°、１９．７６２°、２０．９６１°、２１．３８２°、２２．２５９°、２３．７４０°、２４．４６１°、２５．７６１°、２６．２９５°、２６．９４３°、２７．５１８°、２９．３５８°、３０．０７５°、３１．３１７°、３１．９１６°、３４．５９８°、３７．６６１°において回折ピークを有することを特徴とする、請求項２４に記載の式（Ｉ）で表される化合物のＣ型結晶。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【0001】
本出願は下記の優先権を主張する：
ＣＮ２０２１１１６３１１２８．４、出願日は２０２１年１２月２８日である。
ＣＮ２０２１１１６３１１２８．４、出願日は２０２１年１２月２８日である。
【0002】
〔技術分野〕
本発明は、テトラヒドロシクロヘプタインダゾール化合物の塩形、結晶及びその製造方法に関し、具体的には、関連疾患を治療する医薬の製造における式（Ｉ）で表される化合物の塩形及び結晶の使用に関する。
本発明は、テトラヒドロシクロヘプタインダゾール化合物の塩形、結晶及びその製造方法に関し、具体的には、関連疾患を治療する医薬の製造における式（Ｉ）で表される化合物の塩形及び結晶の使用に関する。
【0003】
〔背景技術〕
ＷＨＯの統計によると、乳癌は世界で２番目に多い癌になり、女性の間で最も罹患率の高い癌である。長年の研究の結果、乳癌の発症におけるエストロゲン－エストロゲン受容体シグナル伝達経路の役割が特定され、エストロゲン受容体（ＥＲ）は乳癌の最も重要なバイオマーカーに発展した。エストロゲン受容体発現を判別指標として使用すると、乳癌はエストロゲン受容体陽性乳癌とエストロゲン受容体陰性乳癌に分類でき、その中で、エストロゲン受容体陽性乳癌は乳癌患者全体の７０％以上を占める。
ＷＨＯの統計によると、乳癌は世界で２番目に多い癌になり、女性の間で最も罹患率の高い癌である。長年の研究の結果、乳癌の発症におけるエストロゲン－エストロゲン受容体シグナル伝達経路の役割が特定され、エストロゲン受容体（ＥＲ）は乳癌の最も重要なバイオマーカーに発展した。エストロゲン受容体発現を判別指標として使用すると、乳癌はエストロゲン受容体陽性乳癌とエストロゲン受容体陰性乳癌に分類でき、その中で、エストロゲン受容体陽性乳癌は乳癌患者全体の７０％以上を占める。
【0004】
乳癌細胞のエストロゲン－エストロゲン受容体シグナル伝達経路を標的とする内分泌療法（Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ、ＥＴ）は、有害作用が最小限で有効性が高いため、エストロゲン受容体陽性乳癌の治療の第一選択となっている。内分泌療法の第一選択療法は主にアロマターゼ阻害剤（Ａｒｏｍａｔａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ、ＡＩ）である。アロマターゼ阻害剤レトロゾールはエストロゲン受容体陽性乳癌の治療に良好な効果を示しているが、２種類の医薬の使用によりアロマターゼ阻害剤に対するエストロゲン受容体陽性乳癌の耐性の問題がますます有意になってきている。数多くの研究から、アロマターゼ阻害剤に対しては、それに応じてエストロゲン受容体が変異することが示されており、主にＹ５３７Ｘ変異では、変異したエストロゲン受容体がエストロゲン非存在下でも作動性立体構造を維持し、乳癌細胞の増殖を促進する受容体として機能し続けることができる。フルベストラント（Ｆｕｌｖｅｓｔｒａｎｔ）は市販されている唯一の選択的エストロゲン受容体ダウンモジュレーターであり、ホルモン療法に抵抗性のある乳癌の治療において良好な効果を示している。しかし、フルベストラントはＡＩ耐性ＥＲ変異乳癌の治療において多くの問題を抱えている。まず、その薬物動態学的特性が乏しいため、フルベストラントは経口バイオアベイラビリティーがほぼゼロであると同時に、フルベストラントは高い血液クリアランスを有する。上記の２つの理由により、前記医薬は筋肉注射によってのみ投与できる。しかし、その強力な親油性構造により、筋肉内投与されてもフルベストラントは組織分布に重大な問題があり、その臨床症状としては、フルベストラントで治療を受けた乳癌患者の約５０％のみが臨床反応を示した。また、薬物動態学的特性が不十分なため、現在承認されている用量のフルベストラントでは、組織濃度ではＥＲ、特に変異ＥＲの完全な分解が達成されず、この治療スキームは、ＡＩ耐性ＥＲ変異乳癌には最適ではない。従って、より優れた薬物動態特性を備えたＥＲ変異乳癌に対する医薬の開発は、依然として満たされていない医療ニーズである。
【0005】
【化1】
【0006】
ＲａｄｉｕｓとＭｅｎａｒｉｎｉ社によって開発された選択的エストロゲン受容体分解剤であるＥｌａｃｅｓｔｒａｎｔ（ＲＡＤ１９０１，Ｇａｒｎｅｒ， Ｆ． ｅｔ ａｌ．， Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇｓ， ２０１５， ２６， ９４８－９５６．）は、第ＩＩＩ相臨床試験において、特にＥＳＲ１突然変異患者において、標準治療よりも優れた無増悪生存率を示し、現在ＦＤＡにＮＤＡ申請が提出されている。ＷＯ２０１８／０７７６３０Ａ１は、ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａが現在開発中のＥＲ陽性乳癌の治療に使用される新世代の非共有結合性エストロゲン受容体分解剤であるＣａｍｉｚｅｓｔｒａｎｔ（ＡＺＤ９８３３）を報告し、ＥＲ陽性ＨＥＲ２陰性乳癌を治療するための当該分子の第ＩＩＩ相臨床試験が進行中である。ＷＯ２０１９／２４５９７４Ａ１及びＷＯ２０２０／０４９１５０Ａ１は、それぞれＧｅｎｅｔｅｃｈ及びＳａｎｏｆｉが現在開発中の新世代の非共有結合性エストロゲン受容体分解剤であるＧｉｒｅｄｅｓｔｒａｎｔ（ＧＤＣ－９５４５）及びＡｍｃｅｎｅｓｔｒａｎｔ（ＳＡＲ４３９８５９）を報告し、ここで、Ｇｉｒｅｄｅｓｔｒａｎｔは、臨床第ＩＩＩ相試験段階にあり、その単剤の臨床第ＩＩ相では既存の治療法と比較して利点を示さなく、Ａｍｃｅｎｅｓｔｒａｎｔも臨床第ＩＩ相では利点を示さず、現在研究を中止すると発表した。
【0007】
〔発明の概要〕
本発明は、式（ＩＩＩ）で表される化合物を提供する。
本発明は、式（ＩＩＩ）で表される化合物を提供する。
【0008】
【化2】
【0009】
本発明は更に、その粉末Ｘ線回折スペクトルが以下の２θ角：２０．９２±０．２０°、２２．０８±０．２０°、２４．７０±０．２０°において特徴的な回折ピークを有することを特徴とする、式（ＩＩＩ）で表される化合物のＡ型結晶を提供する。
【0010】
【化3】
【0011】
本発明のいくつかの実施形態において、前記式（ＩＩＩ）で表される化合物のＡ型結晶は、その粉末Ｘ線回折スペクトルが以下の２θ角：１２．３０±０．２０°、１５．６４±０．２０°、１７．００±０．２０°、１８．２６±０．２０°、２０．９２±０．２０°、２２．０８±０．２０°、２２．６２±０．２０°、２４．７０±０．２０°において特徴的な回折ピークを有することを特徴とする。
【0012】
本発明のいくつかの実施形態において、前記式（ＩＩＩ）で表される化合物のＡ型結晶は、その粉末Ｘ線回折スペクトルが以下の２θ角：５．１８±０．２０°、５．９２±０．２０°、８．１２±０．２０°、１２．３０±０．２０°、１５．６４±０．２０°、１７．００±０．２０°、１８．２６±０．２０°、２０．９２±０．２０°、２２．０８±０．２０°、２４．７０±０．２０°において特徴的な回折ピークを有することを特徴とする。
【0013】
本発明のいくつかの実施形態において、前記式（ＩＩＩ）で表される化合物のＡ型結晶は、その粉末Ｘ線回折スペクトルが以下の２θ角：５．１８±０．２０°、５．９２±０．２０°、８．１２±０．２０°、１２．３０±０．２０°、１５．６４±０．２０°、１７．００±０．２０°、１８．２６±０．２０°、１９．５４±０．２０°、２０．９２±０．２０°、２２．０８±０．２０°、２２．６２±０．２０°、２４．７０±０．２０°において特徴的な回折ピークを有することを特徴とする。
【0014】
本発明のいくつかの実施形態において、前記式（ＩＩＩ）で表される化合物のＡ型結晶は、その粉末Ｘ線回折スペクトルが以下の２θ角：５．１８±０．２０°、５．９２±０．２０°、８．１２±０．２０°、１２．３０±０．２０°、１５．６４±０．２０°、１７．００±０．２０°、１８．２６±０．２０°、１９．５４±０．２０°、２０．９２±０．２０°、２２．０８±０．２０°、２４．７０±０．２０°、２５．４８±０．２０°において特徴的な回折ピークを有することを特徴とする。
【0015】
本発明のいくつかの実施形態において、前記式（ＩＩＩ）で表される化合物のＡ型結晶は、その粉末Ｘ線回折スペクトルが以下の２θ角：５．１８±０．２０°、５．９２±０．２０°、８．１２±０．２０°、１２．３０±０．２０°、１５．６４±０．２０°、１７．００±０．２０°、１８．２６±０．２０°、１９．５４±０．２０°、２０．９２±０．２０°、２２．０８±０．２０°、２２．６２±０．２０°、２４．７０±０．２０°、２５．４８±０．２０°において特徴的な回折ピークを有することを特徴とする。
【0016】
本発明のいくつかの実施形態において、前記式（ＩＩＩ）で表される化合物のＡ型結晶は、その粉末Ｘ線回折スペクトルが以下の２θ角：５．１８±０．２０°、５．９２±０．２０°、８．１２±０．２０°、１２．３０±０．２０°、１５．６４±０．２０°、１６．４２±０．２０°、１７．００±０．２０°、１７．６６±０．２０°、１８．２６±０．２０°、１９．５４±０．２０°、２０．０６±０．２０°、２０．９２±０．２０°、２２．０８±０．２０°、２２．６２±０．２０°、２３．３２±０．２０°、２３．８６±０．２０°、２４．７０±０．２０°、２５．４８±０．２０°、２６．６８±０．２０°、２８．５０±０．２０°、２９．５４±０．２０°、３１．５８±０．２０°、３３．２０±０．２０°において特徴的な回折ピークを有することを特徴とする。
【0017】
本発明のいくつかの実施形態において、前記式（ＩＩＩ）で表される化合物のＡ型結晶は、その粉末Ｘ線回折スペクトルが以下の２θ角：５．１８１°、５．９２０°、８．１１９°、１２．２９９°、１５．６３８°、１６．４１８°、１７．００２°、１７．６６０°、１８．２６１°、１９．５３９°、２０．０６１°、２０．９１９°、２２．０８０°、２２．６２１°、２３．３２０°、２３．８６１°、２４．７００°、２５．４８３°、２６．６８１°、２８．４９８°、２９．５４２°、３１．５７８°、３３．１９８°において特徴的な回折ピークを有することを特徴とする。
【0018】
本発明のいくつかの実施形態において、前記式（ＩＩＩ）で表される化合物のＡ型結晶は、その粉末Ｘ線回折スペクトルが基本的に図１に示される通りであることを特徴とする。
【0019】
本発明のいくつかの実施形態において、前記Ａ型結晶のＸＲＰＤスペクトル解析データは表１に示される通りである。
【0020】
【表1】
【0021】
本発明のいくつかの実施形態において、前記式（ＩＩＩ）で表される化合物のＡ型結晶は、その粉末Ｘ線回折スペクトルが以下の２θ角：及び／又は５．１８±０．２０°、及び／又は５．９２±０．２０°、及び／又は８．１２±０．２０°、及び／又は１２．３０±０．２０°、及び／又は１５．６４±０．２０°、及び／又は１６．４２±０．２０°、及び／又は１７．００±０．２０°、及び／又は１７．６６±０．２０°、及び／又は１８．２６±０．２０°、及び／又は１９．５４±０．２０°、及び／又は２０．０６±０．２０°、及び／又は２０．９２±０．２０°、及び／又は２２．０８±０．２０°、及び／又は２２．６２±０．２０°、及び／又は２３．３２±０．２０°、及び／又は２３．８６±０．２０°、及び／又は２４．７０±０．２０°、及び／又は２５．４８±０．２０°、及び／又は２６．６８±０．２０°、及び／又は２８．５０±０．２０°、及び／又は２９．５４±０．２０°、及び／又は３１．５８±０．２０°、及び／又は３３．２０±０．２０°において特徴的な回折ピークを有することを特徴とする。
【0022】
本発明のいくつかの実施形態において、前記式（ＩＩＩ）で表される化合物のＡ型結晶は、その熱重量分析曲線が１５０．０００±３℃において重量が０．１９８％減少し、２４０．０００±３℃において重量が１０．８８０％減少することを特徴とする。
【0023】
本発明のいくつかの実施形態において、前記式（ＩＩＩ）で表される化合物のＡ型結晶は、その熱重量分析曲線が図２に示される通りであることを特徴とする。
【0024】
本発明のいくつかの実施形態において、前記式（ＩＩＩ）で表される化合物のＡ型結晶は、その差走査熱量曲線が１７５．８７±５℃、２１４．６８±５℃及び２９２．１１±５℃において吸熱ピークの開始点を有することを特徴とする。
【0025】
本発明のいくつかの実施形態において、前記式（ＩＩＩ）で表される化合物のＡ型結晶は、その差走査熱量曲線が図３に示される通りであることを特徴とする。
【0026】
本発明は更に、その粉末Ｘ線回折スペクトルが以下の２θ角：１４．２４±０．２０°、２２．１８±０．２０°、２３．７８±０．２０°において特徴的な回折ピークを有することを特徴とする、式（ＩＩ）で表される化合物のＢ型結晶を提供する。
【0027】
【化4】
【0028】
本発明のいくつかの実施形態において、前記式（ＩＩ）で表される化合物のＢ型結晶は、その粉末Ｘ線回折スペクトルが以下の２θ角：６．５０±０．２０°、１４．２４±０．２０°、１５．８０±０．２０°、１８．１８±０．２０°、２２．１８±０．２０°、２３．７８±０．２０°、２５．３０±０．２０°において特徴的な回折ピークを有することを特徴とする。
【0029】
本発明のいくつかの実施形態において、前記式（ＩＩ）で表される化合物のＢ型結晶は、その粉末Ｘ線回折スペクトルが以下の２θ角：６．５０±０．２０°、７．８６±０．２０°、１４．２４±０．２０°、１５．８０±０．２０°、１６．９２±０．２０°、１８．１８±０．２０°、１９．６６±０．２０°、２０．７６±０．２０°、２２．１８±０．２０°、２３．７８±０．２０°、２５．３０±０．２０°、２６．１２±０．２０°において特徴的な回折ピークを有することを特徴とする。
【0030】
本発明のいくつかの実施形態において、前記式（ＩＩ）で表される化合物のＢ型結晶は、その粉末Ｘ線回折スペクトルが以下の２θ角：６．４９９°、７．８６０°、９．７３９°、１０．２５７°、１１．８６２°、１２．２５５°、１３．０２１°、１４．２４０°、１５．４１７°、１５．７９７°、１６．５４１°、１６．９２０°、１７．５５８°、１８．１８２°、１８．４３９°、１８．７０２°、１９．６６０°、２０．３８１°、２０．７６１°、２１．４９４°、２１．６４７°、２２．１８０°、２３．７８１°、２４．０９９°、２４．４９８°、２５．３０４°、２６．１１８°、２６．８２１°、２７．２３９°、２８．５７９°、２８．９２４°、２９．３０２°、２９．８８１°、３０．２７８°、３０．６８１°、３０．９３８°、３１．７６４°、３２．９７８°、３４．２６０°、３５．１０１°、３５．４１９°、３５．７６１°、３６．５９７°、３７．０８３°、３７．５４０°、３８．４２３°において特徴的な回折ピークを有することを特徴とする。
【0031】
本発明のいくつかの実施形態において、前記Ｂ型結晶のＸＲＰＤスペクトル分析データは表２に示される通りである。
【0032】
【表2】
【0033】
本発明のいくつかの実施形態において、前記式（ＩＩ）で表される化合物のＢ型結晶は、その粉末Ｘ線回折スペクトルが以下の２θ角：及び／又は６．５０±０．２０°、及び／又は７．８６±０．２０°、及び／又は９．７４±０．２０°、及び／又は１０．２６±０．２０°、及び／又は１１．８６±０．２０°、及び／又は１２．２６±０．２０°、及び／又は１３．０２±０．２０°、及び／又は１４．２４±０．２０°、及び／又は１５．４２±０．２０°、及び／又は１５．８０±０．２０°、及び／又は１６．５４±０．２０°、及び／又は１６．９２±０．２０°、及び／又は１７．５６±０．２０°、及び／又は１８．１８±０．２０°、及び／又は１８．４４±０．２０°、及び／又は１８．７０±０．２０°、及び／又は１９．６６±０．２０°、及び／又は２０．３８±０．２０°、及び／又は２０．７６±０．２０°、及び／又は２１．４９±０．２０°、及び／又は２１．６５±０．２０°、及び／又は２２．１８±０．２０°、及び／又は２３．７８±０．２０°、及び／又は２４．１０±０．２０°、及び／又は２４．５０±０．２０°、及び／又は２５．３０±０．２０°、及び／又は２６．１２±０．２０°、及び／又は２６．８２±０．２０°、及び／又は２７．２４±０．２０°、及び／又は２８．５８±０．２０°、及び／又は２８．９２±０．２０°、及び／又は２９．３０±０．２０°、及び／又は２９．８８±０．２０°、及び／又は３０．２８±０．２０°、及び／又は３０．６８±０．２０°、及び／又は３０．９４±０．２０°、及び／又は３１．７６±０．２０°、及び／又は３２．９８±０．２０°、及び／又は３４．２６±０．２０°、及び／又は３５．１０±０．２０°、及び／又は３５．４２±０．２０°、及び／又は３５．７６±０．２０°、及び／又は３６．６０±０．２０°、及び／又は３７．０８±０．２０°、及び／又は３７．５４±０．２０°、及び／又は３８．４２±０．２０°において特徴的な回折ピークを有することを特徴とする。
【0034】
本発明のいくつかの実施形態において、前記式（ＩＩ）で表される化合物のＢ型結晶は、その粉末Ｘ線回折スペクトルが基本的に図４に示される通りであることを特徴とする。
【0035】
本発明のいくつかの実施形態において、前記式（ＩＩ）で表される化合物のＢ型結晶は、その熱重量分析曲線が２００．０００±３℃において重量が０．０８５％減少することを特徴とする。
【0036】
本発明のいくつかの実施形態において、前記式（ＩＩ）で表される化合物のＢ型結晶は、その熱重量分析曲線が図５に示される通りであることを特徴とする。
【0037】
本発明のいくつかの実施形態において、前記式（ＩＩ）で表される化合物のＢ型結晶は、その差走査熱量曲線が２１５．６０±３℃において吸熱ピークを有することを特徴とする。
【0038】
本発明のいくつかの実施形態において、前記式（ＩＩ）で表される化合物のＢ型結晶は、その差走査熱量曲線が図６に示される通りであることを特徴とする。
【0039】
本発明は更に、その粉末Ｘ線回折スペクトルが以下の２θ角：４．９０±０．２０°、１５．８２±０．２０°、２２．２６±０．２０°において特徴的な回折ピークを有することを特徴とする、式（Ｉ）で表される化合物のＣ型結晶を提供する。
【0040】
【化5】
【0041】
本発明のいくつかの実施形態において、前記式（Ｉ）で表される化合物のＣ型結晶は、その粉末Ｘ線回折スペクトルが以下の２θ角：４．９０±０．２０°、９．８２±０．２０°、１５．８２±０．２０°、１７．４８±０．２０°、１８．６４±０．２０°、２２．２６±０．２０°、２３．７４±０．２０°、２９．３６±０．２０°において特徴的な回折ピークを有することを特徴とする。
【0042】
本発明のいくつかの実施形態において、前記式（Ｉ）で表される化合物のＣ型結晶は、その粉末Ｘ線回折スペクトルが以下の２θ角：３０±０．２０°、４．９０±０．２０°、９．８２±０．２０°、１１．０６±０．２０°、１４．２０±０．２０°、１５．８２±０．２０°、１７．４８±０．２０°、１８．６４±０．２０°、２２．２６±０．２０°、２３．７４±０．２０°、２４．４６±０．２０°、２９．３６±０．２０°において特徴的な回折ピークを有することを特徴とする。
【0043】
本発明のいくつかの実施形態において、前記式（Ｉ）で表される化合物のＣ型結晶は、その粉末Ｘ線回折スペクトルが以下の２θ角：３．３０１°、４．９０１°、７．８９８°、９．３１９°、９．８１９°、１１．０６１°、１４．２００°、１４．７２１°、１５．１９７°、１５．８２１°、１６．４５７°、１７．４８１°、１８．１０１°、１８．６４２°、１９．７６２°、２０．９６１°、２１．３８２°、２２．２５９°、２３．７４０°、２４．４６１°、２５．７６１°、２６．２９５°、２６．９４３°、２７．５１８°、２９．３５８°、３０．０７５°、３１．３１７°、３１．９１６°、３４．５９８°、３７．６６１°において特徴的な回折ピークを有することを特徴とする。
【0044】
本発明のいくつかの実施形態において、前記Ｃ型結晶のＸＲＰＤスペクトル分析データは表３に示される通りである。
【0045】
【表3】
【0046】
本発明のいくつかの実施形態において、前記式（Ｉ）で表される化合物のＣ型結晶は、その粉末Ｘ線回折スペクトルが以下の２θ角：及び／又は３．３０±０．２０°、及び／又は４．９０±０．２０°、及び／又は７．９０±０．２０°、及び／又は９．３２±０．２０°、及び／又は９．８２±０．２０°、及び／又は１１．０６±０．２０°、及び／又は１４．２０±０．２０°、及び／又は１４．７２±０．２０°、及び／又は１５．２０±０．２０°、及び／又は１５．８２±０．２０°、及び／又は１６．４６±０．２０°、及び／又は１７．４８±０．２０°、及び／又は１８．１０±０．２０°、及び／又は１８．６４±０．２０°、及び／又は１９．７６±０．２０°、及び／又は２０．９６±０．２０°、及び／又は２１．３８±０．２０°、及び／又は２２．２６±０．２０°、及び／又は２３．７４±０．２０°、及び／又は２４．４６±０．２０°、及び／又は２５．７６±０．２０°、及び／又は２６．３０±０．２０°、及び／又は２６．９４±０．２０°、及び／又は２７．５２±０．２０°、及び／又は２９．３６±０．２０°、及び／又は３０．０８±０．２０°、及び／又は３１．３２±０．２０°、及び／又は３１．９２±０．２０°、及び／又は３４．６０±０．２０°、及び／又は３７．６６±０．２０°において特徴的な回折ピークを有することを特徴とする。
【0047】
本発明のいくつかの実施形態において、前記式（Ｉ）で表される化合物のＣ型結晶は、その粉末Ｘ線回折スペクトルが基本的に図７に示される通りであることを特徴とする。
【0048】
本発明のいくつかの実施形態において、前記式（Ｉ）で表される化合物のＣ型結晶は、その差走査熱量曲線が１２４．１４±５℃において吸熱ピークの開始点を有し、１９９．３４±５℃において発熱ピークの開始点を有し、２７８．７０±５℃において発熱ピークの開始点を有することを特徴とする。
【0049】
本発明のいくつかの実施形態において、前記式（Ｉ）で表される化合物のＣ型結晶は、その差走査熱量曲線が図８に示される通りであることを特徴とする。
【0050】
本発明は更に、その結晶構造が図９に示される通りであることを特徴とする、前記式（ＩＩ）で表される化合物の結晶を提供する。
【0051】
本発明は更に、ＥＳＲ１陽性腫瘍を治療するための医薬の製造における、上記化合物及びその結晶の使用を提供する。
【0052】
〔技術効果〕
本発明は、化合物に対して良好なＰＫ特性及び経口吸收率を有し、その結晶も安定である。
本発明は、化合物に対して良好なＰＫ特性及び経口吸收率を有し、その結晶も安定である。
【0053】
本発明の化合物は、野生型及び突然変異型ＥＳＲ１陽性腫瘍モデルに対して優れた活性を示し、様々な種類のＥＳＲ１陽性細胞に対して優れた有効性を示す。これらは、ＥＲ＋／ＨＥＲ２－の局所進行性又は転移性乳癌患者に対して、より効果的な治療を提供する可能性がある。
【0054】
〔定義及び説明〕
本発明は下記の略語を使用する。ＤＭＳＯはジメチルスルホキシドを表し、ＴｓＯＨはｐ－トルエンスルホン酸を表し、ＰＢＳは０．９％の塩化ナトリウムリン酸緩衝液を表し、ＴＨＰはテトラヒドロピラニルを表し、Ｎｆはペルフルオロ－１－ｎ－ブチルを表す。
本発明は下記の略語を使用する。ＤＭＳＯはジメチルスルホキシドを表し、ＴｓＯＨはｐ－トルエンスルホン酸を表し、ＰＢＳは０．９％の塩化ナトリウムリン酸緩衝液を表し、ＴＨＰはテトラヒドロピラニルを表し、Ｎｆはペルフルオロ－１－ｎ－ブチルを表す。
【0055】
Ｗｅｉｇｈｔ ｌｏｓｓは重量減少を表し、Ｗｅｉｇｈｔ ｐｅｒｃｅｎｔ ｌｏｓｓは重量減少百分率を表し、Ｒｅｓｉｄｕｅは残留物を表し、Ｒｅｓｉｄｕｅ ｐｅｒｃｅｎｔは残存率を表し、Ｉｎｔｅｇｒａｌは発熱（吸熱）総量を表し、Ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄは標準発熱（吸熱）量を表し、Ｐｅａｋはピーク値を表し、Ｏｎｓｅｔは初期融解温度を表し、Ｅｎｄｓｅｔは最終融解温度を表し、Ｌｅｆｔ ｌｉｍｉｔは左境界の温度を表し、Ｒｉｇｈｔ ｌｉｍｉｔは右境界の温度を表す。
【0056】
化合物は、当分野の通常の命名原則に従って、又はＣｈｅｍＤｒａｗ（登録商標）ソフトウェアを使用して命名され、市販の化合物はサプライヤーのカタログで命名される。
【0057】
本発明の粉末Ｘ線回折（Ｘ－ｒａｙ ｐｏｗｄｅｒ ｄｉｆｆｒａｃｔｏｍｅｔｅｒ、ＸＲＰＤ）方法
計器モデル：ブルカーＤ８ ａｄｖａｎｃｅ Ｘ－線回折計
測定方法：約１０～２０ｍｇの試料をＸＲＰＤの検出に用いる。
計器モデル：ブルカーＤ８ ａｄｖａｎｃｅ Ｘ－線回折計
測定方法：約１０～２０ｍｇの試料をＸＲＰＤの検出に用いる。
【0058】
詳細なＸＲＰＤパラメータは以下通りである：
Ｘ線管：Ｃｕ、ｋα、（λ＝１．５４０５６Å）。
Ｘ線管：Ｃｕ、ｋα、（λ＝１．５４０５６Å）。
【0059】
管電圧：４０ｋＶ、管電流：４０ｍＡ
発散スリット：０．６０ｍｍ
検出器スリット：１０．５０ｍｍ
散乱防止スリット：７．１０ｍｍ
走査範囲：４～４０ｄｅｇ
ステップ角：０．０２ｄｅｇ
ステップ幅：０．１２秒
試料パン回転数：１５ｒｐｍ
本発明の示差走査熱分析（Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ Ｓｃａｎｎｉｎｇ Ｃａｌｏｒｉｍｅｔｅｒ、ＤＳＣ）方法
計器モデル：ＴＡ Ｑ２０００示差走査熱量計
測定方法：試料（～１ｍｇ）をＤＳＣアルミニウム製坩堝に取って測定を実行し、５０ｍＬ／ｍｉｎ Ｎ２の条件で、１０℃／ｍｉｎの昇温速度で、試料を３０℃（室温）から３００℃（又は３５０℃）まで加熱する。
発散スリット：０．６０ｍｍ
検出器スリット：１０．５０ｍｍ
散乱防止スリット：７．１０ｍｍ
走査範囲：４～４０ｄｅｇ
ステップ角：０．０２ｄｅｇ
ステップ幅：０．１２秒
試料パン回転数：１５ｒｐｍ
本発明の示差走査熱分析（Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ Ｓｃａｎｎｉｎｇ Ｃａｌｏｒｉｍｅｔｅｒ、ＤＳＣ）方法
計器モデル：ＴＡ Ｑ２０００示差走査熱量計
測定方法：試料（～１ｍｇ）をＤＳＣアルミニウム製坩堝に取って測定を実行し、５０ｍＬ／ｍｉｎ Ｎ２の条件で、１０℃／ｍｉｎの昇温速度で、試料を３０℃（室温）から３００℃（又は３５０℃）まで加熱する。
【0060】
本発明の熱重量分析（Ｔｈｅｒｍａｌ Ｇｒａｖｉｍｅｔｒｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ、ＴＧＡ）方法
計器モデル：ＴＡ Ｑ５０００ＩＲ熱重量分析計
測定方法：試料（２～５ｍｇ）をＴＧＡ白金坩堝に取って測定を実行し、２５ｍＬ／ｍｉｎ Ｎ２の条件で、１０℃／ｍｉｎの昇温速度で、試料を室温から３５０℃まで、又は重量が２０％減少するまで加熱する。
計器モデル：ＴＡ Ｑ５０００ＩＲ熱重量分析計
測定方法：試料（２～５ｍｇ）をＴＧＡ白金坩堝に取って測定を実行し、２５ｍＬ／ｍｉｎ Ｎ２の条件で、１０℃／ｍｉｎの昇温速度で、試料を室温から３５０℃まで、又は重量が２０％減少するまで加熱する。
【0061】
本発明の単結晶回折方法
試料培養：２ｍｇの式（ＩＩ）で表される化合物を室温の条件下で、４００μＬのメタノール／酢酸エチル（１：１）に溶解させ、試料溶液を１ｍＬの半密閉試料バイアルに入れ、室温の条件下でゆっくりと揮発させ、翌日に結晶を得、結晶図は図９に示される通りである。
試料培養：２ｍｇの式（ＩＩ）で表される化合物を室温の条件下で、４００μＬのメタノール／酢酸エチル（１：１）に溶解させ、試料溶液を１ｍＬの半密閉試料バイアルに入れ、室温の条件下でゆっくりと揮発させ、翌日に結晶を得、結晶図は図９に示される通りである。
【0062】
計器モデル：Ｒｉｇａｋｕ Ｏｘｆｏｒｄ Ｄｉｆｆｒａｃｔｉｏｎ ＸｔａＬＡＢ Ｓｙｎｅｒｇｙ－Ｓ ｆｏｕｒ－ｃｉｒｃｌｅ ｄｉｆｆｒａｃｔｏｍｅｔｅｒ ｅｑｕｉｐｐｅｄ ｗｉｔｈ ａ ＨｙＰｉｘ－６０００ＨＥ ａｒｅａ ｄｅｔｅｃｔｏｒ。
【0063】
〔図面の簡単な説明〕
〔図１〕式（ＩＩＩ）で表される化合物のＡ型結晶のＸＲＰＤパターンである。
〔図１〕式（ＩＩＩ）で表される化合物のＡ型結晶のＸＲＰＤパターンである。
【0064】
〔図２〕式（ＩＩＩ）で表される化合物のＡ型結晶のＴＧＡパターンである。
【0065】
〔図３〕式（ＩＩＩ）で表される化合物のＡ型結晶のＤＳＣパターンである。
【0066】
〔図４〕式（ＩＩ）で表される化合物のＢ型結晶のＸＲＰＤパターンである。
【0067】
〔図５〕式（ＩＩ）で表される化合物のＢ型結晶のＴＧＡパターンである。
【0068】
〔図６〕式（ＩＩ）で表される化合物のＢ型結晶のＤＳＣパターンである。
【0069】
〔図７〕式（Ｉ）で表される化合物のＣ型結晶のＸＲＰＤパターンである。
【0070】
〔図８〕式（Ｉ）で表される化合物のＣ型結晶のＤＳＣパターンである。
【0071】
〔図９〕式（ＩＩ）で表される化合物の単結晶構造の模式図である。
【0072】
〔図１０〕試験化合物を投与した後のヒト乳癌ＭＣＦ７細胞皮下異種移植腫瘍モデル担癌マウスにおける式（Ｉ）で表される化合物のＣ型結晶の腫瘍増殖曲線である。
【0073】
〔図１１〕試験化合物を投与した後のヒト乳癌ＭＣＦ７細胞皮下異種移植腫瘍モデル担癌マウスにおけるフルベストラント及びパルボシクリブと比較した式（Ｉ）で表される化合物Ｃ型結晶の腫瘍増殖曲線である。
【0074】
〔図１２〕試験化合物の投与後のヒト乳癌ＭＣＦ７細胞皮下異種移植腫瘍モデル担癌マウスにおけるパルボシクリブと組み合わせた式（Ｉ）で表される化合物のＣ型結晶の腫瘍増殖曲線である。
【0075】
〔図１３〕式（Ｉ）で表される化合物のＣ型結晶の投与過程におけるヒト乳癌ＭＣＦ７細胞皮下異種移植腫瘍モデル担癌マウスの体重変化百分率（％）である。
【0076】
〔図１４〕フルベストラント及びパルボシクリブと比較した式（Ｉ）で表される化合物のＣ型結晶の投与過程におけるヒト乳癌ＭＣＦ７細胞皮下異種移植腫瘍モデル担癌マウスの体重変化百分率（％）である。
【0077】
〔図１５〕パルボシクリブと組み合わせた式（Ｉ）で表される化合物のＣ型結晶の投与過程におけるヒト乳癌ＭＣＦ７細胞皮下異種移植腫瘍モデル担癌マウスの体重変化百分率（％）である。
【0078】
〔図１６〕ＥＳＲ１ Ｄ５３８Ｇ突然変異を有するＭＣＦ７細胞皮下異種移植腫瘍モデル担癌マウスにおける式（ＩＩ）で表される化合物のＢ型結晶の腫瘍増殖曲線である。
【0079】
〔図１７〕ＥＳＲ１ Ｄ５３８Ｇ突然変異を有するＭＣＦ７細胞皮下異種移植腫瘍モデル担癌マウスにおけるパルボシクリブと組み合わせた式（ＩＩ）で表される化合物のＢ型結晶の腫瘍増殖曲線である。
【0080】
〔図１８〕式（ＩＩ）で表される化合物のＢ型結晶の投与過程におけるＥＳＲ１ Ｄ５３８Ｇ突然変異を有するＭＣＦ７細胞皮下異種移植腫瘍モデル担癌マウスの体重変化百分率（％）である。
【0081】
〔図１９〕パルボシクリブと組み合わせた式（ＩＩ）で表される化合物のＢ型結晶の投与過程におけるＥＳＲ１ Ｄ５３８Ｇ突然変異を有するＭＣＦ７細胞皮下異種移植腫瘍モデル担癌マウスの体重変化百分率（％）である。
【0082】
〔発明を実施するための形態〕
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、本発明の不利な制限を意味するものではない。本発明の化合物は当業者に熟知の様々な合成方法によって製造することができ、以下に挙げられた具体的な実施形態、他の化学合成方法と合わせた実施形態及び当業者に熟知の同等の代替方法を含み、好適な実施形態は本発明の実施例を含むが、これらに限定されない。当業者にとって、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、本発明の特定の実施形態において様々な変更及び修正を行うことができることは明らかである。
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、本発明の不利な制限を意味するものではない。本発明の化合物は当業者に熟知の様々な合成方法によって製造することができ、以下に挙げられた具体的な実施形態、他の化学合成方法と合わせた実施形態及び当業者に熟知の同等の代替方法を含み、好適な実施形態は本発明の実施例を含むが、これらに限定されない。当業者にとって、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、本発明の特定の実施形態において様々な変更及び修正を行うことができることは明らかである。
【0083】
実施例１：式（Ｉ）で表される化合物の製造
中間体化合物１－１１の製造：
中間体化合物１－１１の製造：
【0084】
【化6】
【0085】
ステップＡ：２５℃で、撹拌中の１－１３（１００．０ｇ、４２０．３８ｍｍｏｌ）のＮ－メチルピロリドン（１０００ｍｌ）溶液に順次にトリエチルアミン（８７．７７ｍｌ、６３０．５７ｍｍｏｌ）及び１－１４（７８．３０ｇ、４２０．３８ｍｍｏｌ）を加え、混合溶液を窒素ガスの保護下で１３０℃（内部温度）で１２時間撹拌した。２５℃に冷却した後、反応溶液を撹拌し、水（１０００ｍｌ）を加え、２５℃で１時間撹拌を続けた。得られた懸濁液をブフナー漏斗で減圧濾過し、ケーキに水（２００ｍｌ×２）を加えて洗浄した。ケーキを収集し、真空乾燥させて化合物１－１５を得た。
【0086】
ステップＢ：２５℃で、撹拌中の１－１５（１００ｇ、２９１．３６ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン（７００ｍｌ）の混合溶液にｐ－トルエンスルホン酸一水合物（１６６．２６ｇ、８７４．０８ｍｍｏｌ）を加え、混合溶液を３５℃で１２時間撹拌した。反応溶液を液体が蒸発しなくなるまで減圧濃縮した。濃縮した粗生成物を２５℃でアセトニトリル（３００ｍｌ）を加えて溶解させた後メトキシシクロペンチルエーテル（１５００ｍｌ）を加え、２５℃で１２時間撹拌した。得られた懸濁液をブフナー漏斗で減圧濾過した。ケーキをメトキシシクロペンチルエーテル（５０ｍｌ×２）で洗浄し、ケーキを收集し、真空乾燥させて化合物１－１６を得た。
【0087】
ステップＣ：２５℃で、撹拌中の１－１６（１００ｇ、１７０．２１ｍｍｏｌ）のアセトニトリル（１Ｌ）懸濁液に無水リン酸カリウム（１１２．００ｇ、５２７．６５ｍｍｏｌ）及び１－１７（３２．６４ｇ、１７３．６２ｍｍｏｌ）を加え、窒素ガスの保護下で４０℃で１２時間撹拌した。反応溶液を液体が蒸発しなくなるまで減圧濃縮し、残留物に２－メチルテトラヒドロフラン（５００ｍｌ×３）及び飽和炭酸ナトリウム水溶液（４００ｍｌ）を加えた。分離した有機相に飽和食塩水（３００ｍｌ×２）を加え、分離した有機相を無水硫酸ナトリウム乾燥させ、濾過し、濾液を減圧濃縮し、乾燥させて化合物１－１１を得た。ＬＣＭＳ （ＥＳＩ） ｍ／ｚ： ３０３／３０５ ［Ｍ＋Ｈ］＋。
【0088】
式（Ｉ）で表される化合物の製造：
【0089】
【化7】
【0090】
ステップＡ：０℃で、窒素ガスの保護下で、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルアミン（７．７３ｇ、７６．４１ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン（１００ｍｌ）溶液にｎ－ブチルリチウムのｎ－ヘキサン溶液（２．５ｍｏｌ／Ｌ、２８．２１ｍｌ３）をゆっくりと滴加し、反応溶液を０℃で０．５時間撹拌した後、－７０℃に冷却させ、１－１（１０ｇ、５８．７８ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン（１００ｍｌ）溶液をゆっくりと滴加し、滴加完了後、反応溶液を－７０℃で０．５時間撹拌し、次に、反応溶液に１－２（８．５３ｇ、７０．５３ｍｍｏｌ）のトルエン（１０ｍｌ）溶液をゆっくりと滴加し、滴加完了後、反応溶液を－７０℃で３時間撹拌して反応させた。反応溶液に飽和塩化アンモニウム水溶液（２００ｍｌ）を加え、酢酸エチル（１００ｍｌ×２）で抽出し、有機相を合わせ、順次に飽和塩化アンモニウム水溶液（２００ｍｌ×２）及び飽和食塩水（２００ｍｌ×２）を加えて洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過した後減圧濃縮して粗生成物を得た。シリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶離液：石油エーテル）により精製して化合物１－３を得た。
【0091】
化合物１－３：１ＨＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ ＝ ５．８２ - ５．５９ （ｍ， １Ｈ）， ５．１５ （ｄ， Ｊ ＝ １．０ Ｈｚ， １Ｈ）， ５．１３ - ５．０９ （ｍ， １Ｈ）， ４．１９ （ｑ， Ｊ ＝ ７．１ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．８２ - ２．７４ （ｍ， １Ｈ）， ２．６９ - ２．５３ （ｍ， １Ｈ）， ２．５０ - ２．４０ （ｍ， １Ｈ）， ２．３９ - ２．３０ （ｍ， １Ｈ）， ２．３０ - ２．１７ （ｍ， １Ｈ）， １．３２ - １．２７ （ｍ， ３Ｈ）。
【0092】
ステップＢ：２０℃で窒素ガスの保護下で、１－３（３．１ｇ、１４．７５ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン（１８ｍｌ）溶液に９－ボラビシクロ［３．３．１］ノナン（０．５ｍｏｌ／Ｌ、３２．４５ｍｌ）を加え、反応溶液を６０℃で３時間撹拌した後室温に冷却させた。反応溶液に順次に水（１０ｍｌ）、１－４（３．５３ｇ、１１．８０ｍｍｏｌ）、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）（１．７ｇ、１．４７ｍｍｏｌ）及びリン酸カリウム（４．７ｇ、２２．１２ｍｍｏｌ）を加えた。混合溶液を窒素ガスの保護下で、７０℃で１６時間撹拌した。得られた反応溶液に酢酸エチル（１００ｍｌ）を加えた後希釈し、飽和食塩水（２００ｍｌ×２）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過した後減圧濃縮して粗生成物を得た。シリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶離液：石油エーテル／酢酸エチル＝１００／１～０／１）により精製して化合物１－５を得た。ＬＣＭＳ （ＥＳＩ） ｍ／ｚ： ４３１．１ ［Ｍ ＋ Ｈ］ ＋。
【0093】
ステップＣ：１－５（６．７ｇ、１３．４６ｍｍｏｌ）のメタノール（７５ｍｌ）及び水（２５ｍｌ）の混合溶液に水酸化ナトリウム（２．１５ｇ、５３．８３ｍｍｏｌ）を加え、混合溶液を２５℃で１６時間撹拌した。得られた反応溶液を減圧濃縮して溶媒メタノールを除去し、残留物に水（１５０ｍｌ）を加えて希釈した後、ジクロロメタン（１００ｍｌ×２）で抽出し、水相に塩酸（２ｍｏｌ／Ｌ）を加えてｐＨ＝２に調節し、酢酸エチル（８０ｍｌ×４）で抽出し、合わせた有機相を飽和食塩水（２００ｍｌ×２）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、減圧濃縮して化合物１－６を得た。
【0094】
化合物１－６：１ＨＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ ＝ ７．３４ （ｄ， Ｊ ＝ ４．３ Ｈｚ， ２Ｈ）， ６．９９ - ６．９０ （ｍ， １Ｈ）， ５．５９ （ｔｄ， Ｊ ＝ ２．４， ９．３ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．０４ （ｂｒ ｄ， Ｊ ＝ １１．０ Ｈｚ， １Ｈ）， ３．７３ （ｄｔ， Ｊ ＝ ２．９， １０．９ Ｈｚ， １Ｈ）， ２．９７ （ｂｒ ｔ， Ｊ ＝ ７．１ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．８２ - ２．７２ （ｍ， １Ｈ）， ２．７２ - ２．５６ （ｍ， １Ｈ）， ２．５６ - ２．４２ （ｍ， １Ｈ）， ２．２８ - ２．１３ （ｍ， ２Ｈ）， ２．０６ - １．９９ （ｍ， １Ｈ）， １．７９ - １．５８ （ｍ， ７Ｈ）。ＬＣＭＳ （ＥＳＩ） ｍ／ｚ： ４０３．１ ［Ｍ ＋ Ｈ］ ＋。
【0095】
ステップＤ：１－６（２．７ｇ、６．５４ｍｍｏｌ）をポリリン酸（３０ｍｌ）に溶解させ、混合溶液を１１０℃で１６時間撹拌した。得られた反応溶液に水（３００ｍｌ）を加えて希釈し、酢酸エチル（１００ｍｌ×３）で抽出した。合わせた有機相を飽和炭酸ナトリウム水溶液（２００ｍｌ×２）及び飽和食塩水（２００ｍｌ）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過した後、減圧濃縮して化合物１－７を得た。ＬＣＭＳ （ＥＳＩ） ｍ／ｚ： ３０１．１ ［Ｍ ＋ Ｈ］ ＋。
【0096】
ステップＥ：１－７（２．７ｇ、８．９９ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（５０ｍｌ）に溶解させ、ｐ－トルエンスルホン酸一水和物（８５５．２６ｍｇ、４．５ｍｍｏｌ）及び３，４－ジヒドロ－２Ｈ－ピラン（１．１３ｇ、１３．４９ｍｍｏｌ）を加えた。混合溶液を２５℃で１６時間撹拌した。反応溶液を減圧濃縮して粗生成物を得た。シリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶離液：石油エーテル／酢酸エチル＝４０／１～２０／１）により精製して化合物１－８を得た。
【0097】
化合物１－８：１ＨＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ ＝ ７．８１ （ｄｄ， Ｊ ＝ ５．４， ８．９ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．３８ （ｔｄ， Ｊ ＝ ２．０， ８．８ Ｈｚ， １Ｈ）， ５．５９ （ｔｄ， Ｊ ＝ ２．４， ９．２ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．０６ - ３．９５ （ｍ， １Ｈ）， ３．８１ - ３．６４ （ｍ， ２Ｈ）， ３．３６ - ３．２３ （ｍ， １Ｈ）， ３．２２ - ２．９５ （ｍ， ２Ｈ）， ２．５３ - ２．３８ （ｍ， １Ｈ）， ２．３５ - ２．２０ （ｍ， ２Ｈ）， ２．１９ - ２．０８ （ｍ， ２Ｈ）， ２．０６ - ２．００ （ｍ， １Ｈ）， １．８０ - １．６５ （ｍ， ５Ｈ））。ＬＣＭＳ （ＥＳＩ） ｍ／ｚ： ３８５．１ ［Ｍ ＋ Ｈ］ ＋。
【0098】
ステップＦ：－４０℃で、窒素ガスの保護下で、カリウムビス（トリメチルシリル）アミドのテトラヒドロフラン溶液（１ｍｏｌ／Ｌ、１１４．４７ｍｌ、１１４．４７ｍｍｏｌ）に１－８（４０ｇ、１０４．０７ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン（２６６ｍｌ）溶液を滴加し、滴加完了後、混合溶液を－４０℃で１時間撹拌した。－４０℃で反応溶液にペルフルオロブタンスルホニルフルオリド（２０．１１ｍｌ、１１４．４７ｍｍｏｌ）を滴加し、２５℃にゆっくりと昇温させ、１２時間撹拌した。２５℃で、得られた反応溶液に飽和塩化アンモニウム水溶液（１３００ｍｌ）を加えてクエンチングさせ、混合溶液を５００ｍｌの水で希釈した後酢酸エチル（６００ｍｌ×３）を加えて抽出した。合わせた有機相を飽和食塩水（２００ｍｌ×２）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過した後減圧濃縮して粗生成物（７９．１３ｇ）を得た。粗生成物をエタノール（１６０ｍｌ）で２５℃で１２時間撹拌し、濾過し、洗浄して化合物１－９を得た。
【0099】
ステップＧ：２５℃で、１－９（２５ｇ、３７．５１ｍｍｏｌ）及びビス（ピナコラート）ジボロン（１４．２９ｇ、５６．２７ｍｍｏｌ）の１，４－ジオキサン（２００ｍｌ）溶液に炭酸カリウム（７．７８ｇ、５６．２７ｍｍｏｌ）、トリフェニルホスフィン（１．４８ｇ、５．６３ｍｏｌ）及びジクロロビス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）（１．８４ｇ、２．６３ｍｍｏｌ）を加えた。混合溶液を窒素ガスの保護下で９０℃で１２時間撹拌した。得られた反応溶液を珪藻土で濾過し、水（４０ｍｌ）で希釈し、酢酸エチル（５０ｍｌ×３）で抽出した。合わせた有機相を飽和食塩水（４０ｍｌ×１）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過した後減圧濃縮して３０．４３ｇの粗生成物を得た。アセトニトリル（１５０ｍｌ）及び水（３７．５ｍｌ）を加え、５０℃に加熱させて溶解させ、２５℃に冷却させ、１２時間撹拌した。得られた懸濁液を減圧濾過し、ケーキを収集して化合物１－１０を得た。ＬＣＭＳ （ＥＳＩ） ｍ／ｚ： ４９５．２ ［Ｍ＋Ｈ］＋。
【0100】
ステップＨ：２５℃で、１－１１（１．９１ｇ、６．３１ｍｍｏｌ）及び１－１０（３．１２ｇ、６．３１ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン（３０ｍｌ）及び水（６ｍｌ）の混合溶液に水酸化カリウム（１．９５ｇ、３４．７１ｍｍｏｌ）及びテトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）（３６４．６７ｍｇ、３１５．５８μｍｏｌ）を加えた。混合溶液を窒素ガスの保護下で、６０℃で１２時間撹拌した。得られた反応溶液を水（２０ｍｌ）で希釈し、ジクロロメタン（２０ｍｌ×３）で抽出した。合わせた有機相を飽和食塩水（２０ｍｌ×１）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過した後減圧濃縮して粗生成物を得た。逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．１％のアンモニア水溶液／アセトニトリルで勾配溶出）により精製して化合物１－１２を得た。ＬＣＭＳ （ＥＳＩ） ｍ／ｚ： ５９１．２ ［Ｍ ＋ Ｈ］ ＋。
【0101】
ステップＩ：２０℃で、１－１２（１８ｇ、７．８７ｍｍｏｌ）のアセトニトリル（１８０ｍｌ）溶液にトリフルオロ酢酸（６０ｍｌ）を加えた。混合溶液を８０℃で１６時間撹拌した。得られた反応溶液を液体が蒸発しなくなるまで減圧濃縮し、炭酸ナトリウム水溶液を加えてｐＨを８～１０に調節し、ジクロロメタンで抽出した。合わせた有機相を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過した後減圧濃縮して粗生成物を得た。シリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶離液：ジクロロメタン／メタノール＝１０／１）により精製して式（Ｉ）で表される化合物を得た。ＬＣＭＳ （ＥＳＩ） ｍ／ｚ： ５０７．３ ［Ｍ＋Ｈ］＋。
【0102】
実施例２：式（ＩＩＩ）で表される化合物のＡ型結晶の製造
５ｇの式（Ｉ）で表される化合物を取り、３０ｍｌのアセトニトリルを加えて溶解させた。９０℃に加熱させ、フマル酸（１．２６ｇ）を加えて１時間撹拌し、２０℃にゆっくりと冷却させ、１２時間撹拌を続けた。得られた懸濁液で濾過し、ケーキを乾燥させて式（ＩＩＩ）で表される化合物のＡ型結晶を得た。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６） δ ＝ １２．６０ （ｓ， １Ｈ）， ８．０１ （ｄ， Ｊ ＝ １．２ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．７１ （ｄ， Ｊ ＝ ０．８ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．６１ （ｂｒ ｄ， Ｊ ＝ ６．４ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．２８ （ｄｄ， Ｊ ＝ ２．４， ８．８ Ｈｚ， １Ｈ）， ６．８７ （ｄ， Ｊ ＝ ８．８ Ｈｚ， １Ｈ）， ６．６４ （ｓ， ２Ｈ）， ４．６１ （ｔ， Ｊ ＝ ６．０ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．５０ （ｔ， Ｊ ＝ ６．０ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．４６ － ４．３５ （ｍ， １Ｈ）， ３．５４ （ｑ， Ｊ ＝ １１．６ Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．１３ － ２．９４ （ｍ， ４Ｈ）， ２．８５ － ２．７０ （ｍ， ４Ｈ）， ２．４５ － ２．２４ （ｍ， ３Ｈ）， ２．１０ （ｂｒ ｔ， Ｊ ＝ ６．８ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．０３ － １．８７ （ｍ， ２Ｈ）， １．８６ － １．７４ （ｍ， １Ｈ）。
５ｇの式（Ｉ）で表される化合物を取り、３０ｍｌのアセトニトリルを加えて溶解させた。９０℃に加熱させ、フマル酸（１．２６ｇ）を加えて１時間撹拌し、２０℃にゆっくりと冷却させ、１２時間撹拌を続けた。得られた懸濁液で濾過し、ケーキを乾燥させて式（ＩＩＩ）で表される化合物のＡ型結晶を得た。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６） δ ＝ １２．６０ （ｓ， １Ｈ）， ８．０１ （ｄ， Ｊ ＝ １．２ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．７１ （ｄ， Ｊ ＝ ０．８ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．６１ （ｂｒ ｄ， Ｊ ＝ ６．４ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．２８ （ｄｄ， Ｊ ＝ ２．４， ８．８ Ｈｚ， １Ｈ）， ６．８７ （ｄ， Ｊ ＝ ８．８ Ｈｚ， １Ｈ）， ６．６４ （ｓ， ２Ｈ）， ４．６１ （ｔ， Ｊ ＝ ６．０ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．５０ （ｔ， Ｊ ＝ ６．０ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．４６ － ４．３５ （ｍ， １Ｈ）， ３．５４ （ｑ， Ｊ ＝ １１．６ Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．１３ － ２．９４ （ｍ， ４Ｈ）， ２．８５ － ２．７０ （ｍ， ４Ｈ）， ２．４５ － ２．２４ （ｍ， ３Ｈ）， ２．１０ （ｂｒ ｔ， Ｊ ＝ ６．８ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．０３ － １．８７ （ｍ， ２Ｈ）， １．８６ － １．７４ （ｍ， １Ｈ）。
【0103】
実施例３：式（ＩＩ）で表される化合物のＢ型結晶の製造
１ｇの式（Ｉ）で表される化合物を秤量して５０ｍｌの一口フラスコに加え、アセトニトリル（９ｍｌ）を加えて溶解させた。磁石を加えた後、上記溶液を磁気加熱式攪拌機（９０℃）に置いて撹拌し、９０℃でメタンスルホン酸（１５５μｌ）のアセトニトリル溶液（１ｍｌ）を加えて撹拌した。２０℃にゆっくりと冷却させて１２時間撹拌を続け、得られた懸濁液を濾過し、ケーキを乾燥させて式（ＩＩ）で表される化合物のＢ型結晶を得た。
１ｇの式（Ｉ）で表される化合物を秤量して５０ｍｌの一口フラスコに加え、アセトニトリル（９ｍｌ）を加えて溶解させた。磁石を加えた後、上記溶液を磁気加熱式攪拌機（９０℃）に置いて撹拌し、９０℃でメタンスルホン酸（１５５μｌ）のアセトニトリル溶液（１ｍｌ）を加えて撹拌した。２０℃にゆっくりと冷却させて１２時間撹拌を続け、得られた懸濁液を濾過し、ケーキを乾燥させて式（ＩＩ）で表される化合物のＢ型結晶を得た。
【0104】
１ｇの式（Ｉ）で表される化合物を秤量して５０ｍｌの一口フラスコに加え、酢酸エチル（１０ｍｌ）を加えて溶解させた。磁石を加えた後、上記溶液を磁気加熱式攪拌機（９０℃）に置いて撹拌し、９０℃でメタンスルホン酸（１５５μｌ）の酢酸エチル溶液（１ｍｌ）を加えて１時間撹拌した。２０℃にゆっくりと冷却させて１２時間撹拌を続け、得られた懸濁液を濾過し、ケーキを乾燥させて式（ＩＩ）で表される化合物のＢ型結晶を得た。
【0105】
１ｇの式（Ｉ）で表される化合物を秤量して５０ｍｌの一口フラスコに加え、酢酸イソプロピル（９ｍｌ）を加えて溶解させた。磁石を加えた後、上記溶液を磁気加熱式攪拌機（２０℃）に置いて撹拌し、２０℃でメタンスルホン酸（１５５μｌ）の酢酸イソプロピル溶液（１ｍｌ）を加えて撹拌した。４℃にゆっくりと冷却させて１７時間撹拌を続け、得られた懸濁液を濾過し、ケーキを乾燥させて式（ＩＩ）で表される化合物のＢ型結晶を得た。
【0106】
３５０ｇの前記製造方法で得られた式（ＩＩ）で表される化合物のＢ型結晶を秤量し、５Ｌの一口フラスコに加え、ジメチルスルホキシド（４５５ｍｌ）を加え、完全に溶解するまで６０～７０℃に加熱させた。６０～７０℃で酢酸イソプロピル（３Ｌ）を１時間にかけて滴加し、当該温度で１時間撹拌した。混合溶液を撹拌しながら４～６時間にかけて２５～３０℃にゆっくりと冷却させ、当該温度で１２時間撹拌して乳白色の懸濁液を得た。反応溶液を濾過した後淡黄色ケーキを得、ケーキを酢酸イソプロピルでよく撹拌し、２回（５００ｍｌ×２）洗浄し、恒温吸引濾過して得られたケーキを真空乾燥させて粗生成物を得た。アセトン（４．６Ｌ）を加え、５５～６０℃で１６時間撹拌し、濾過した。得られたケーキに更にアセトン（３．９Ｌ）を加え、５５～６０℃で１６時間撹拌し、濾過し、ケーキを乾燥させて式（ＩＩ）で表される化合物のＢ型結晶を得た。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６） δ ＝ １２．５５ （ｓ， １Ｈ）， ９．８４ － ９．６６ （ｍ， １Ｈ）， ８．０３ （ｂｒ ｄ， Ｊ ＝ ６．８ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．７２ （ｓ， １Ｈ）， ７．７０ － ７．５３ （ｍ， １Ｈ）， ７．２４ （ｄｄ， Ｊ ＝ ２．０， ８．７ Ｈｚ， １Ｈ）， ６．８１ （ｄ， Ｊ ＝ ８．８ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．６０ （ｑ， Ｊ ＝ ５．６ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．５２ － ４．４３ （ｍ， ２Ｈ）， ４．０５ － ３．６２ （ｍ， ２Ｈ）， ３．６１ － ３．３７ （ｍ， ４Ｈ）， ３．２９ （ｂｒ ｓ， ２Ｈ）， ３．２３ － ２．９９ （ｍ， １Ｈ）， ２．９６ （ｂｒ ｔ， Ｊ ＝ ６．８ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．４０ － ２．３１ （ｍ， ５Ｈ）， ２．１４ － １．９４ （ｍ， ６Ｈ）。
【0107】
実施例４：式（Ｉ）で表される化合物のＣ型結晶の製造
４ｇの式（Ｉ）で表される化合物に１２ｍｌの酢酸イソプロピルを加えて溶解させ、次に、撹拌しながら３０ｍｌのｎ－ヘプタンをゆっくりと加えた。２５℃で１２時間撹拌し、得られた懸濁液を濾過し、ケーキを乾燥させて式（Ｉ）で表される化合物のＣ型結晶を得た。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤ３ＯＤ） δ ＝ ７．９２ （ｄ， Ｊ ＝ １．３ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．７２ （ｄ， Ｊ ＝ １．３ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．１８ （ｄｄ， Ｊ ＝ ２．４， ８．８ Ｈｚ， １Ｈ）， ６．８５ （ｄ， Ｊ ＝ ８．８ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．５５ （ｔ， Ｊ ＝ ５．９ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．４７ － ４．３７ （ｍ， ２Ｈ）， ３．４１ － ３．３３ （ｍ， ２Ｈ）， ３．０８ （ｂｒ ｔ， Ｊ ＝ ７．０ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．９８ （ｄｄ， Ｊ ＝ ７．１， ９．９ Ｈｚ， １Ｈ）， ２．７９ （ｄｔ， Ｊ ＝ ６．３， ８．６ Ｈｚ， １Ｈ）， ２．６８ － ２．５８ （ｍ， ３Ｈ）， ２．５４ （ｄｄ， Ｊ ＝ ４．９， １０．０ Ｈｚ， １Ｈ）， ２．４６ － ２．３０ （ｍ， ３Ｈ）， ２．１９ － ２．１１ （ｍ， ２Ｈ）， ２．００ － １．８４ （ｍ， ２Ｈ）， １．８２ － １．７１ （ｍ， １Ｈ）。ＬＣＭＳ （ＥＳＩ） ｍ／ｚ： ５０７．２ ［Ｍ＋Ｈ］＋。
４ｇの式（Ｉ）で表される化合物に１２ｍｌの酢酸イソプロピルを加えて溶解させ、次に、撹拌しながら３０ｍｌのｎ－ヘプタンをゆっくりと加えた。２５℃で１２時間撹拌し、得られた懸濁液を濾過し、ケーキを乾燥させて式（Ｉ）で表される化合物のＣ型結晶を得た。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤ３ＯＤ） δ ＝ ７．９２ （ｄ， Ｊ ＝ １．３ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．７２ （ｄ， Ｊ ＝ １．３ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．１８ （ｄｄ， Ｊ ＝ ２．４， ８．８ Ｈｚ， １Ｈ）， ６．８５ （ｄ， Ｊ ＝ ８．８ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．５５ （ｔ， Ｊ ＝ ５．９ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．４７ － ４．３７ （ｍ， ２Ｈ）， ３．４１ － ３．３３ （ｍ， ２Ｈ）， ３．０８ （ｂｒ ｔ， Ｊ ＝ ７．０ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．９８ （ｄｄ， Ｊ ＝ ７．１， ９．９ Ｈｚ， １Ｈ）， ２．７９ （ｄｔ， Ｊ ＝ ６．３， ８．６ Ｈｚ， １Ｈ）， ２．６８ － ２．５８ （ｍ， ３Ｈ）， ２．５４ （ｄｄ， Ｊ ＝ ４．９， １０．０ Ｈｚ， １Ｈ）， ２．４６ － ２．３０ （ｍ， ３Ｈ）， ２．１９ － ２．１１ （ｍ， ２Ｈ）， ２．００ － １．８４ （ｍ， ２Ｈ）， １．８２ － １．７１ （ｍ， １Ｈ）。ＬＣＭＳ （ＥＳＩ） ｍ／ｚ： ５０７．２ ［Ｍ＋Ｈ］＋。
【0108】
実験例１：生物試験
（１）ＥＲα結合試験：放射性リガンド結合試験における式（Ｉ）で表される化合物の活性評価
実験材料：エストロゲンＥＲα
由来：ヒト組換え昆虫Ｓｆ９細胞
リガンド：０．５ｎＭ［３Ｈ］エストラジオール
溶媒：１．０％のＤＭＳＯ
非特異的リガンド：１．０μＭのジエチルスチルベストロール
培養時間／温度：２時間＠２５℃
特異的結合：８５％
培養緩衝液：１０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．４、０．１％のＢＳＡ、１０％のグリセリン、１ｍＭのＤＴＴ
定量的方法：放射性リガンド結合
Ｋｄ：０．２ｎＭ
有意性の基準：≧５０％の最大活性化又は阻害
Ｂｍａｘ：１４００ｐｍｏｌ／ｍｇタンパク質
実験方法：
本研究で使用された方法は科学文献（Ｏｂｏｕｒｎ， Ｊ． Ｄ． ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， １９９３， ３２， ６２２９－６２３６）から引用された。
（１）ＥＲα結合試験：放射性リガンド結合試験における式（Ｉ）で表される化合物の活性評価
実験材料：エストロゲンＥＲα
由来：ヒト組換え昆虫Ｓｆ９細胞
リガンド：０．５ｎＭ［３Ｈ］エストラジオール
溶媒：１．０％のＤＭＳＯ
非特異的リガンド：１．０μＭのジエチルスチルベストロール
培養時間／温度：２時間＠２５℃
特異的結合：８５％
培養緩衝液：１０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．４、０．１％のＢＳＡ、１０％のグリセリン、１ｍＭのＤＴＴ
定量的方法：放射性リガンド結合
Ｋｄ：０．２ｎＭ
有意性の基準：≧５０％の最大活性化又は阻害
Ｂｍａｘ：１４００ｐｍｏｌ／ｍｇタンパク質
実験方法：
本研究で使用された方法は科学文献（Ｏｂｏｕｒｎ， Ｊ． Ｄ． ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， １９９３， ３２， ６２２９－６２３６）から引用された。
【0109】
データ分析：
ＭａｔｈＩＱＴＭ（ＩＤ Ｂｕｓｉｎｅｓｓ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ Ｌｔｄ．， ＵＫ）ソフトウェアを使用し、非線形、最小二乗回帰法を使用してＩＣ５０値を得た。表された阻害定数（Ｋｉ）は、実験で測定して得られた試験化合物ＩＣ５０、試験で使用された放射性リガンド濃度及びリガンドＫＤの履歴値（Ｅｕｒｏｆｉｎｓ Ｐａｎｌａｂｓ， Ｉｎｃ．で実験的に決定）は、Ｃｈｅｎｇ及びＰｒｕｓｏｆｆ式（Ｃｈｅｎｇ，Ｙ．， Ｐｒｕｓｏｆｆ， Ｗ． Ｈ．， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． ２２：３０９９－３１０８，１９７３）で計算して得られた。示されるように、競合結合曲線の傾きを定義するヒル係数（ｎＨ）は、ＭａｔｈＩＱＴＭを使用して計算した。ヒル係数が値１から大きく逸脱している場合、当該結合置換が単一の結合部位での質量作用の法則に準拠していないことを示している可能性がある。ＩＣ５０、Ｋｉ及び／又はｎＨデータに平均値の標準誤差（ＳＥＭ）が含まれていない場合、データは十分に定量的ではないため、データ（Ｋｉ、ＩＣ５０、ｎＨ）は注意して解釈する必要がある。
ＭａｔｈＩＱＴＭ（ＩＤ Ｂｕｓｉｎｅｓｓ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ Ｌｔｄ．， ＵＫ）ソフトウェアを使用し、非線形、最小二乗回帰法を使用してＩＣ５０値を得た。表された阻害定数（Ｋｉ）は、実験で測定して得られた試験化合物ＩＣ５０、試験で使用された放射性リガンド濃度及びリガンドＫＤの履歴値（Ｅｕｒｏｆｉｎｓ Ｐａｎｌａｂｓ， Ｉｎｃ．で実験的に決定）は、Ｃｈｅｎｇ及びＰｒｕｓｏｆｆ式（Ｃｈｅｎｇ，Ｙ．， Ｐｒｕｓｏｆｆ， Ｗ． Ｈ．， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． ２２：３０９９－３１０８，１９７３）で計算して得られた。示されるように、競合結合曲線の傾きを定義するヒル係数（ｎＨ）は、ＭａｔｈＩＱＴＭを使用して計算した。ヒル係数が値１から大きく逸脱している場合、当該結合置換が単一の結合部位での質量作用の法則に準拠していないことを示している可能性がある。ＩＣ５０、Ｋｉ及び／又はｎＨデータに平均値の標準誤差（ＳＥＭ）が含まれていない場合、データは十分に定量的ではないため、データ（Ｋｉ、ＩＣ５０、ｎＨ）は注意して解釈する必要がある。
【0110】
【表4】
【0111】
結論：本発明の化合物は、体外でＥＲαに対して強い結合作用を有する。
【0112】
（２）ＨＥＫ２９３／ＧＡＬ４／ＥＲα拮抗実験
実験材料：
実験材料：
【0113】
【表5】
【0114】
細胞情報と培養条件：
【0115】
【表6】
【0116】
実験培地：
ＤＭＥＭ（フェノールレッドを含まない）、１０％の炭素吸着血清を含む、即ち、５００ｍＬの細胞培地に４５０ｍＬのＤＭＥＭ、５０ｍＬの炭素吸着血清を含む
Ｂｒｉｇｈｔ Ｇｌｏ検出試薬：
Ｂｒｉｇｈｔ－ＧｌｏTM Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙキットには下記の２つの試薬が含まれる：
Ｂｒｉｇｈｔ－ＧｌｏTM Ｂｕｆｆｅｒ
Ｂｒｉｇｈｔ－ＧｌｏTM Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ
使用前に２つの試薬を室温（２５℃）に平衡化してから２つの試薬を混合し、試薬が完全に溶解した後使用し、未使用のＢｒｉｇｈｔ Ｇｌｏは－２０℃に保存して使用を続けた。
ＤＭＥＭ（フェノールレッドを含まない）、１０％の炭素吸着血清を含む、即ち、５００ｍＬの細胞培地に４５０ｍＬのＤＭＥＭ、５０ｍＬの炭素吸着血清を含む
Ｂｒｉｇｈｔ Ｇｌｏ検出試薬：
Ｂｒｉｇｈｔ－ＧｌｏTM Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙキットには下記の２つの試薬が含まれる：
Ｂｒｉｇｈｔ－ＧｌｏTM Ｂｕｆｆｅｒ
Ｂｒｉｇｈｔ－ＧｌｏTM Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ
使用前に２つの試薬を室温（２５℃）に平衡化してから２つの試薬を混合し、試薬が完全に溶解した後使用し、未使用のＢｒｉｇｈｔ Ｇｌｏは－２０℃に保存して使用を続けた。
【0117】
実験計画：
ＥＲαに対する式（Ｉ）で表される化合物の拮抗作用を分析するために、三重ウェルを設定し、化合物の濃度範囲は２００ｎＭ～０．００２５６ｎＭであった。
ＥＲαに対する式（Ｉ）で表される化合物の拮抗作用を分析するために、三重ウェルを設定し、化合物の濃度範囲は２００ｎＭ～０．００２５６ｎＭであった。
【0118】
実験ステップ：
１）ＨＥＫ２９３／ＧＡＬ４／ＥＲα細胞懸濁液を収集し、１０００ｒｐｍ／分で５分間遠心分離し、上清を除去し、予熱した実験培地に再懸濁し、カウントした後細胞懸濁液を実験培地で希釈した。９６ウェル細胞培養プレートにウェルあたり４００００細胞を接種し、各ウェルに８０μＬの細胞懸濁液を接種し、３７℃、５％のＣＯ２インキュベーターで一晩培養した。
１）ＨＥＫ２９３／ＧＡＬ４／ＥＲα細胞懸濁液を収集し、１０００ｒｐｍ／分で５分間遠心分離し、上清を除去し、予熱した実験培地に再懸濁し、カウントした後細胞懸濁液を実験培地で希釈した。９６ウェル細胞培養プレートにウェルあたり４００００細胞を接種し、各ウェルに８０μＬの細胞懸濁液を接種し、３７℃、５％のＣＯ２インキュベーターで一晩培養した。
【0119】
２）実験当日、化合物配置マップに従い、細胞プレートの各ウェルに１０μＬの化合物作業溶液を加え、３７℃、５％ ＣＯ２のインキュベーターで１時間培養を続けた後、更に各ウェルに１ｎＭのＥｓｔｒａｄｉｏｌを含むＡｓｓａｙ培地１０μＬを加え、ブランク対照には１０μＬのＡｓｓａｙ培地を加え、Ｅｓｔｒａｄｉｏｌの最終濃度は１ｎＭであった。細胞プレートを３７℃、５％ ＣＯ２のインキュベーターで２４時間培養を続けた。
【0120】
３）培養完了後、細胞上清を除去し、細胞プレートの各ウェルに５０μＬのＢｒｉｇｈｔ Ｇｌｏ検出試薬を加え、２５℃で２分間培養した。培養完了後、ＥｎＶｉｓｉｏｎを使用して発光シグナルを検出した。
【0121】
データ分析：
データは次の式に従って化合物処理後のＥＲａ阻害率を算出した：％阻害率＝１００－（ＲＦＵ化合物－ＲＦＵブランク対照）／（ＲＦＵ陰性対照－ＲＦＵブランク対照）×１００％。陰性対照：１ｎＭのＥｓｔｒａｄｉｏｌで処理した細胞；ブランク対照：Ｅｓｔｒａｄｉｏｌで処理していない細胞、Ｐｒｉｓｍでプロットして化合物のＩＣ５０値を計算した。
データは次の式に従って化合物処理後のＥＲａ阻害率を算出した：％阻害率＝１００－（ＲＦＵ化合物－ＲＦＵブランク対照）／（ＲＦＵ陰性対照－ＲＦＵブランク対照）×１００％。陰性対照：１ｎＭのＥｓｔｒａｄｉｏｌで処理した細胞；ブランク対照：Ｅｓｔｒａｄｉｏｌで処理していない細胞、Ｐｒｉｓｍでプロットして化合物のＩＣ５０値を計算した。
【0122】
実験結果
ＨＥＫ２９３／ＧＡＬ４／ＥＲαに対する式（Ｉ）で表される化合物の拮抗作用のＩＣ５０は下記の表７に示される通りである。
ＨＥＫ２９３／ＧＡＬ４／ＥＲαに対する式（Ｉ）で表される化合物の拮抗作用のＩＣ５０は下記の表７に示される通りである。
【0123】
【表7】
【0124】
実験結論：
式（Ｉ）の化合物は、ＨＥＫ２９３／ＧＡＬ４／ＥＲαの転写機能に対して有意な拮抗作用を有する。
式（Ｉ）の化合物は、ＨＥＫ２９３／ＧＡＬ４／ＥＲαの転写機能に対して有意な拮抗作用を有する。
【0125】
（３）ＭＣＦ－７、Ｔ－４７Ｄ、ＣＡＭＡ－１細胞におけるＥＲα分解実験
実験材料：
実験材料：
【0126】
【表8】
【0127】
細胞情報と培養条件：
【0128】
【表9】
【0129】
試験試薬の製造：
ＴｒｉｔｏｎＸ－１００の製造：ＴｒｉｔｏｎＸ－１００をＤＰＢＳで１００倍に希釈して１．００％のＴｒｉｔｏｎＸ－１００を得た。
ＴｒｉｔｏｎＸ－１００の製造：ＴｒｉｔｏｎＸ－１００をＤＰＢＳで１００倍に希釈して１．００％のＴｒｉｔｏｎＸ－１００を得た。
【0130】
０．１００％のＴｗｅｅｎ２０を含むブロッキング緩衝液の製造：Ｔｗｅｅｎ２０をブロッキング緩衝液で１０００倍に希釈して０．１００％のＴｗｅｅｎ２０のブロッキング緩衝液を得た。
【0131】
一次抗体希釈液の製造：一次抗体（Ｅｓｔｒｏｇｅｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｌｐｈａ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（ＳＰ１））ストック溶液を０．１００％のＴｗｅｅｎ－２０を含むブロッキング緩衝液で１０００倍に希釈して一次抗体希釈液を得た。
【0132】
二次抗体とＤＲＡＱ５混合溶液の製造：０．１００％のＴｗｅｅｎ－２０を含むブロッキング緩衝液で二次抗体（ＬＩ－ＣＯＲ－９２６－３２２１１、１：１０００で希釈）及びＤＲＡＱ５（ＤＲ５１０００、１：２０００で希釈）を希釈し、均一混合した。
【0133】
実験ステップ：
１）培養フラスコから完全培地を吸引し、適量のトリプシンを加えてすすいだ後、吸引して残留血清を除去した。
１）培養フラスコから完全培地を吸引し、適量のトリプシンを加えてすすいだ後、吸引して残留血清を除去した。
【0134】
２）培養フラスコに適量のトリプシンを加え、２回すすいだ後吸引し、培養フラスコをインキュベーターに２～３分間入れて取り出し、培養フラスコを振って細胞を剥離させた。
【0135】
３）細胞を新鮮な完全培地に再懸濁し、セルカウンターでカウントした。
【0136】
４）プレーティング密度に応じて細胞懸濁液を配置した。
【0137】
５）３０．０μＬの細胞懸濁液を３８４ウェルプレートの各ウェルに加えた。
【0138】
６）実験ウェルプレートを遠心分離機に置き、１０００ｒｐｍで１分間遠心分離した。
【0139】
７）実験ウェルプレートを細胞培養インキュベーターで一晩培養した。
【0140】
８）実験ウェルプレートの試料の添加の概略図（３．５．１を参照）に従って、２０．０μＬの希釈した試験試料を各ウェルに加えた。反応系中のＤＭＳＯの最終濃度は１．００％であった。
【0141】
９）実験ウェルプレートを遠心分離機に置き、１０００ｒｐｍで１分間遠心分離した。
【0142】
１０）ウェルプレートを３７℃、５％ ＣＯ２のインキュベーターで４時間培養した。
【0143】
１１）プレートを取り出し、室温で１０分間平衡化させた後、ウェルプレートから培地を除去した。
【0144】
１２）各ウェルに１００μＬの４．００％ＰＦＡを加え、室温で４０分間固定した。
【0145】
１３）プレート内の液体をたたいて除去し、ｍｕｌｔｉｄｒｏｐを使用して各ウェルに１００μＬの１×ＰＢＳを加え、プレートを２回洗浄した。
【0146】
１４）０．１％のＴｒｉｔｏｎＸ－１００を含む氷冷ＰＢＳ ５０μＬを加えて透過処理し、室温で１５分間放置した。
【0147】
１５）プレート内の液体をたたいて除去し、ｍｕｌｔｉｄｒｏｐを使用して１００μＬのＰＢＳをプレートの各ウェルに加え、たたいて除去し、このようにプレートを５回洗浄した。
【0148】
１６）各ウェルに０．１％のＴｗｅｅｎ－２０を含むブロッキング緩衝液（ＬＩ－ＣＯＲ－９２７－４００００）５０μＬを加え、室温で１時間ブロックした。
【0149】
１７）緩衝液をプレートからたたいて除去した。
【0150】
１８）２５μＬの一次抗体希釈溶液を３８４ウェルプレートの各ウェルに加えた。４℃で一晩培養した。
【0151】
１９）プレート内の一次抗体をたたいて除去し、ｍｕｌｔｉｄｒｏｐにＰＢＳを加えてプレートを５回洗浄した。
【0152】
２０）各ウェルに２５μＬの二次抗体とＤＲＡＱ５混合溶液を加え、室温で１時間培養した。
【0153】
２１）ｍｕｌｔｉｄｒｏｐにＰＢＳを加えて、プレートを５回洗浄した。
【0154】
２２）ｄｄＨ２Ｏを加えてプレートを２回洗浄し、たたいて乾燥させた。
【0155】
２３）Ｏｄｙｓｓｅｙ遠赤外線イメージングシステム装置を使用してプレートを読み取った。
【0156】
データ分析
高対照群平均値：高対照群の平均値を計算；低対照群平均値：低対照群の平均値を計算；高対照群標準偏差（ＳＤ）：高対照群標準偏差を計算；低対照群標準偏差（ＳＤ）：低対照群の標準偏差を計算。
高対照群平均値：高対照群の平均値を計算；低対照群平均値：低対照群の平均値を計算；高対照群標準偏差（ＳＤ）：高対照群標準偏差を計算；低対照群標準偏差（ＳＤ）：低対照群の標準偏差を計算。
【0157】
高対照群変動係数（ＣＶ）＝（高対照群標準偏差÷高対照群平均値）×１００
低対照群変動係数（ＣＶ）＝（低対照群標準偏差÷低対照群平均値）×１００
実験ウィンドウ＝高対照群平均値÷低対照群平均値
Ｚ値＝１－［３×（高対照群標準偏差＋低対照群標準偏差）÷（高対照群平均値－低対照群平均値）］
阻害率（％）＝（１－（実験ウェルのシグナル値－低対照群平均値）／（高対照群平均値－低対照群平均値））×１００
ＩＣ５０値は、データ解析ソフトウェアＧｒａｐｈ Ｐａｄ Ｐｒｉｓｍ ７．０を使用して計算した。
低対照群変動係数（ＣＶ）＝（低対照群標準偏差÷低対照群平均値）×１００
実験ウィンドウ＝高対照群平均値÷低対照群平均値
Ｚ値＝１－［３×（高対照群標準偏差＋低対照群標準偏差）÷（高対照群平均値－低対照群平均値）］
阻害率（％）＝（１－（実験ウェルのシグナル値－低対照群平均値）／（高対照群平均値－低対照群平均値））×１００
ＩＣ５０値は、データ解析ソフトウェアＧｒａｐｈ Ｐａｄ Ｐｒｉｓｍ ７．０を使用して計算した。
【0158】
分析品質管理基準：実験ウィンドウ＞２、Ｚ値＞０．５、参照／陽性化合物データの一貫性。
【0159】
実験結果：
本実験では、ＭＣＦ－７、Ｔ－４７Ｄ、ＣＡＭＡ－１細胞におけるＥＲαタンパク質の発現に対する式（Ｉ）で表される化合物の効果を評価し、４時間の薬物処理後、ＩＣＷ実験によりＥＲαタンパク質の発現レベルを検出した。結果は下記に示される通りである。
本実験では、ＭＣＦ－７、Ｔ－４７Ｄ、ＣＡＭＡ－１細胞におけるＥＲαタンパク質の発現に対する式（Ｉ）で表される化合物の効果を評価し、４時間の薬物処理後、ＩＣＷ実験によりＥＲαタンパク質の発現レベルを検出した。結果は下記に示される通りである。
【0160】
【表10】
【0161】
実験結論：
式（Ｉ）で表される化合物は、様々な乳癌細胞においてＥＲαに対して有意な分解効果を有している。
式（Ｉ）で表される化合物は、様々な乳癌細胞においてＥＲαに対して有意な分解効果を有している。
【0162】
（４）ＭＣＦ－７、Ｔ－４７Ｄ及びＣＡＭＡ－１細胞増殖阻害効果実験
実験材料：
実験材料：
【0163】
【表11】
【0164】
細胞情報と培養条件：
【0165】
【表12】
【0166】
飢餓培地：
１．ＣＡＭＡ－１：ＥＭＥＭ（フェノールレッドを含まない）、１０％の炭素吸着血清を含む、即ち、５００ｍＬの細胞培地に４４０ｍＬのＥＭＥＭ、５０ｍＬの炭素吸着血清、５ｍＬのＮＥＡＡ、５ｍＬの１００ｍＭのピルビン酸ナトリウムを含み、
２．Ｔ－４７Ｄ：ＲＰＭＩ－１６４０（フェノールレッドを含まない）、１０％の炭素吸着血清を含む、即ち、５００ｍＬの細胞培地に４５０ｍＬのＲＰＭＩ－１６４０、５０ｍＬの炭素吸着血清を含む。
１．ＣＡＭＡ－１：ＥＭＥＭ（フェノールレッドを含まない）、１０％の炭素吸着血清を含む、即ち、５００ｍＬの細胞培地に４４０ｍＬのＥＭＥＭ、５０ｍＬの炭素吸着血清、５ｍＬのＮＥＡＡ、５ｍＬの１００ｍＭのピルビン酸ナトリウムを含み、
２．Ｔ－４７Ｄ：ＲＰＭＩ－１６４０（フェノールレッドを含まない）、１０％の炭素吸着血清を含む、即ち、５００ｍＬの細胞培地に４５０ｍＬのＲＰＭＩ－１６４０、５０ｍＬの炭素吸着血清を含む。
【0167】
実験デザイン
ＭＣＦ－７、ＣＡＭＡ－１及びＴ－４７Ｄ細胞の増殖に対する試験である化合物式（Ｉ）で表される化合物の阻害効果を分析した。ＭＣＦ－７は３つの反復を設定して１０個の濃度勾配を試験し、化合物の濃度範囲は１００ｎＭ～０．０００３８１５ｎＭであり、ＣＡＭＡ－１は３つの反復を設定して９個の濃度勾配を試験し、化合物の濃度範囲は１００ｎＭ～０．００１５２６ｎＭであり、Ｔ－４７Ｄは３つの反復を設定して９個の濃度勾配を試験し、化合物の濃度範囲は２μＭ～０．００５１２ｎＭであり、それぞれ２つの独立実験を実行した。
ＭＣＦ－７、ＣＡＭＡ－１及びＴ－４７Ｄ細胞の増殖に対する試験である化合物式（Ｉ）で表される化合物の阻害効果を分析した。ＭＣＦ－７は３つの反復を設定して１０個の濃度勾配を試験し、化合物の濃度範囲は１００ｎＭ～０．０００３８１５ｎＭであり、ＣＡＭＡ－１は３つの反復を設定して９個の濃度勾配を試験し、化合物の濃度範囲は１００ｎＭ～０．００１５２６ｎＭであり、Ｔ－４７Ｄは３つの反復を設定して９個の濃度勾配を試験し、化合物の濃度範囲は２μＭ～０．００５１２ｎＭであり、それぞれ２つの独立実験を実行した。
【0168】
実験ステップ：
ＭＣＦ－７細胞：
細胞コンフルエンスが８０％に達したＭＣＦ－７細胞をトリプシンで消化し、遠心分離し、再懸濁してカウントした。次に、対応する培地を使用して細胞懸濁液を製造し、３８４ウェルプレートの各ウェルに４５μＬの細胞懸濁液を加え、５％のＣＯ２を含む細胞インキュベーターに入れて３７℃で培養した。式（Ｉ）の試験化合物をＤＭＳＯ溶液を使用して２０μＭの開始濃度で、１０個の濃度まで４×連続下向きに希釈した。細胞を一晩培養した後、希釈した化合物を対応する細胞培地で更に希釈し、希釈した混合溶液をそれぞれ対応する細胞プレートに移し、化合物の最終濃度は、１００ｎＭの開始濃度で、１０個の濃度まで４×下向きに希釈し、陽性対照ウェルは２μＭのフルベストラントで、均一に混合して遠心分離し、５％のＣＯ２を含む細胞インキュベーターで３７℃で、上記表の対応する日数を培養した。
ＭＣＦ－７細胞：
細胞コンフルエンスが８０％に達したＭＣＦ－７細胞をトリプシンで消化し、遠心分離し、再懸濁してカウントした。次に、対応する培地を使用して細胞懸濁液を製造し、３８４ウェルプレートの各ウェルに４５μＬの細胞懸濁液を加え、５％のＣＯ２を含む細胞インキュベーターに入れて３７℃で培養した。式（Ｉ）の試験化合物をＤＭＳＯ溶液を使用して２０μＭの開始濃度で、１０個の濃度まで４×連続下向きに希釈した。細胞を一晩培養した後、希釈した化合物を対応する細胞培地で更に希釈し、希釈した混合溶液をそれぞれ対応する細胞プレートに移し、化合物の最終濃度は、１００ｎＭの開始濃度で、１０個の濃度まで４×下向きに希釈し、陽性対照ウェルは２μＭのフルベストラントで、均一に混合して遠心分離し、５％のＣＯ２を含む細胞インキュベーターで３７℃で、上記表の対応する日数を培養した。
【0169】
Ｔ－４７Ｄ細胞：
Ｔ－４７Ｄ細胞を飢餓培地で３日間飢餓処理し、トリプシンで消化させ、遠心分離し、再懸濁してカウントした。対応する培地を使用して細胞懸濁液を製造した後、細胞を３８４ウェルプレートに移し、各ウェルに４０μＬ／ウェルの細胞懸濁液を加え、５％のＣＯ２を含む細胞インキュベーターで３７℃で培養した。試験化合物式（Ｉ）をＤＭＳＯ溶液を使用して４００μＭの開始濃度で、９個の濃度まで５×下向きに希釈した。細胞を一晩培養した後、希釈した化合物を対応する細胞培地で更に希釈し、希釈した混合溶液をそれぞれ対応する細胞プレートに移し、化合物の最終濃度は、２μＭの開始濃度で、９個の濃度まで５×下向きに希釈し、陽性対照ウェルは２μＭのフルベストラントで、プレート全体に１ｎＭのエストラジオールを加え、均一に混合して遠心分離し、５％のＣＯ２を含む細胞インキュベーターで３７℃で、上記表の対応する日数を培養した。
Ｔ－４７Ｄ細胞を飢餓培地で３日間飢餓処理し、トリプシンで消化させ、遠心分離し、再懸濁してカウントした。対応する培地を使用して細胞懸濁液を製造した後、細胞を３８４ウェルプレートに移し、各ウェルに４０μＬ／ウェルの細胞懸濁液を加え、５％のＣＯ２を含む細胞インキュベーターで３７℃で培養した。試験化合物式（Ｉ）をＤＭＳＯ溶液を使用して４００μＭの開始濃度で、９個の濃度まで５×下向きに希釈した。細胞を一晩培養した後、希釈した化合物を対応する細胞培地で更に希釈し、希釈した混合溶液をそれぞれ対応する細胞プレートに移し、化合物の最終濃度は、２μＭの開始濃度で、９個の濃度まで５×下向きに希釈し、陽性対照ウェルは２μＭのフルベストラントで、プレート全体に１ｎＭのエストラジオールを加え、均一に混合して遠心分離し、５％のＣＯ２を含む細胞インキュベーターで３７℃で、上記表の対応する日数を培養した。
【0170】
ＣＡＭＡ－１細胞：
ＣＡＭＡ－１細胞を飢餓培地で３日間飢餓処理し、トリプシンで消化させ、遠心分離し、再懸濁してカウントした。それぞれ対応する培地を使用して細胞懸濁液を製造した後、細胞を９６ウェルプレートに移し、各ウェルに８０μＬ／ウェルの細胞懸濁液を加え、５％のＣＯ２を含む細胞インキュベーターで３７℃で培養した。式（Ｉ）の試験化合物をＤＭＳＯ溶液を使用して２０μＭの開始濃度で、９個の濃度まで４×下向きに希釈した。細胞を一晩培養した後、希釈した化合物を対応する細胞培地で更に希釈し、希釈した混合溶液をそれぞれ対応する細胞プレートに移し、化合物の最終濃度は、１００ｎＭの開始濃度で、９個の濃度まで４×下向きに希釈し、陽性対照ウェルは２μＭのフルベストラントで、プレート全体に１ｎＭのエストラジオールを加え、均一に混合して遠心分離し、５％のＣＯ２を含む細胞インキュベーターで３７℃で、上記表の対応する日数を培養した。
ＣＡＭＡ－１細胞を飢餓培地で３日間飢餓処理し、トリプシンで消化させ、遠心分離し、再懸濁してカウントした。それぞれ対応する培地を使用して細胞懸濁液を製造した後、細胞を９６ウェルプレートに移し、各ウェルに８０μＬ／ウェルの細胞懸濁液を加え、５％のＣＯ２を含む細胞インキュベーターで３７℃で培養した。式（Ｉ）の試験化合物をＤＭＳＯ溶液を使用して２０μＭの開始濃度で、９個の濃度まで４×下向きに希釈した。細胞を一晩培養した後、希釈した化合物を対応する細胞培地で更に希釈し、希釈した混合溶液をそれぞれ対応する細胞プレートに移し、化合物の最終濃度は、１００ｎＭの開始濃度で、９個の濃度まで４×下向きに希釈し、陽性対照ウェルは２μＭのフルベストラントで、プレート全体に１ｎＭのエストラジオールを加え、均一に混合して遠心分離し、５％のＣＯ２を含む細胞インキュベーターで３７℃で、上記表の対応する日数を培養した。
【0171】
化合物を上記の時間まで培養した後、細胞培養プレートを取り出し、ＣＴＧ試薬を加え、均一に混合して遠心分離し、室温で１０分間培養した。Ｅｎｖｉｓｉｏｎマルチラベルアナライザーでデータを読み取った。
【0172】
データ分析：
データは次の式に従って化合物処理後の細胞生存率を計算した：％阻害率＝１００－（ＲＦＵ化合物－ＲＦＵ陽性対照）／（ＲＦＵ陰性対照－ＲＦＵ陽性対照）×１００％。陽性対照：２μＭのフルベストラントで処理した細胞；陰性対照：０．５％のＤＭＳＯで処理した細胞、次に、Ｐｒｉｓｍ５でプロットして化合物のＩＣ５０値を計算した。ＩＣ５０計算式：ｌｏｇ（ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ） ｖｓ． ｒｅｓｐｏｎｓｅ － Ｖａｒｉａｂｌｅ ｓｌｏｐｅ。
データは次の式に従って化合物処理後の細胞生存率を計算した：％阻害率＝１００－（ＲＦＵ化合物－ＲＦＵ陽性対照）／（ＲＦＵ陰性対照－ＲＦＵ陽性対照）×１００％。陽性対照：２μＭのフルベストラントで処理した細胞；陰性対照：０．５％のＤＭＳＯで処理した細胞、次に、Ｐｒｉｓｍ５でプロットして化合物のＩＣ５０値を計算した。ＩＣ５０計算式：ｌｏｇ（ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ） ｖｓ． ｒｅｓｐｏｎｓｅ － Ｖａｒｉａｂｌｅ ｓｌｏｐｅ。
【0173】
実験結果：
本実験は、ＭＣＦ－７、ＣＡＭＡ－１及びＴ－４７Ｄ細胞の増殖に対する試験対象である式（Ｉ）で表される化合物の阻害効果を分析し、３つの反復を設定して２つの独立した実験評価を実行した。
本実験は、ＭＣＦ－７、ＣＡＭＡ－１及びＴ－４７Ｄ細胞の増殖に対する試験対象である式（Ｉ）で表される化合物の阻害効果を分析し、３つの反復を設定して２つの独立した実験評価を実行した。
【0174】
細胞増殖の阻害に対する化合物のＩＣ５０は下記の表に示される通りである。
【0175】
【表13】
【0176】
実験結論
式（Ｉ）で表される化合物は、ＭＣＦ－７、ＣＡＭＡ－１及びＴ－４７Ｄ細胞において有意な体外抗増殖活性を示している。
式（Ｉ）で表される化合物は、ＭＣＦ－７、ＣＡＭＡ－１及びＴ－４７Ｄ細胞において有意な体外抗増殖活性を示している。
【0177】
（５）ＨＣＣ１４２８及びＭＤＡ－ＭＢ－１３４ＶＩ細胞増殖阻害効果実験
実験材料：
実験材料：
【0178】
【表14】
【0179】
実験計画：
式（Ｉ）で表される化合物の検出開始濃度は２００ｎＭであり、１０個濃度勾配に４倍に勾配希釈した。
式（Ｉ）で表される化合物の検出開始濃度は２００ｎＭであり、１０個濃度勾配に４倍に勾配希釈した。
【0180】
実験ステップ
ＭＤＡ－ＭＢ－１３４ＶＩ細胞：
１）２０％のＦＢＳ及び１％のＰｅｎＳｔｒｅｐを含むＤＭＥＭ完全増殖培地でＭＤＡ－ＭＢ－１３４ＶＩ細胞を培養した。
ＭＤＡ－ＭＢ－１３４ＶＩ細胞：
１）２０％のＦＢＳ及び１％のＰｅｎＳｔｒｅｐを含むＤＭＥＭ完全増殖培地でＭＤＡ－ＭＢ－１３４ＶＩ細胞を培養した。
【0181】
２）細胞がＴ７５培養フラスコ内で８０～９０％コンフルエントに達した場合、トリプシンを使用して細胞を消化して収集し、第一次及び第二次の独立した実験の細胞継代はそれぞれ８世代と６世代であった。
【0182】
３）１０００ｒｐｍで細胞を遠心分離し、完全培地で再懸濁してカウントし、測定して得られた第一次及び第二次の独立した実験の細胞密度は、それぞれ１ｍｌあたり３．６０×１０６個細胞及び１ｍｌあたり１．９３×１０６個細胞であり、生存率はいずれも９５％を超えた。
【0183】
４）完全培地で細胞懸濁液を製造し、２回の実験において、細胞懸濁液の密度はいずれも１ｍｌあたり４．００×１０４個細胞であり、９６ウェル丸底ウェルプレートに８０００個細胞／１９５μＬ／ウェルで播種し、３７℃、５％ ＣＯ２のインキュベーターで一晩培養した。
【0184】
５）２日目に５μＬの希釈した化合物を加え、ＤＭＳＯの最終濃度を０．１％にした。ＤＭＳＯウェルをＨｉｇｈ ｃｏｎｔｒｏｌとし、Ｍｅｄｉｕｍ ｏｎｌｙウェルをＬｏｗ Ｃｏｎｔｒｏｌとして使用した。
【0185】
６）ＭＤＡ－ＭＢ－１３４VI細胞を３７℃、５％ ＣＯ２のインキュベーターで１０日間培養した。
【0186】
７）インキュベーターから細胞を取り出して室温に平衡化させ、１０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、各ウェルから１００μＬの細胞培養上清を捨て、１００μＬのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ Ｇｌｏを加えた。室温で３０分間暗所で培養した。
【0187】
８）ＢＭＧを使用してＬｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ値を読み取った。
【0188】
上記のステップに従って、２回の独立した反復実験を実行した。
【0189】
ＨＣＣ１４２８細胞：
１）１０％のＦＢＳ及び１％のＰｅｎＳｔｒｅｐを含むＲＰＭＩ１６４０完全増殖培地でＨＣＣ１４２８細胞を培養した。
１）１０％のＦＢＳ及び１％のＰｅｎＳｔｒｅｐを含むＲＰＭＩ１６４０完全増殖培地でＨＣＣ１４２８細胞を培養した。
【0190】
２）細胞がＴ７５培養フラスコ内で８０～９０％コンフルエントに達した場合、トリプシンを使用して細胞を消化して収集し、第一次及び第二次の独立実験の細胞継代はそれぞれ７世代と１３世代であった。
【0191】
３）１０００ｒｐｍで細胞を遠心分離し、完全培地で再懸濁してカウントし、測定して得られた第一次及び第二次の独立した実験の細胞密度は、それぞれ１ｍｌあたり１．３０×１０６個細胞及び１ｍｌあたり９．５０×１０５個細胞であり、生存率はいずれも９５％を超えた。
【0192】
４）完全培地で細胞懸濁液を製造し、２回の実験において、細胞懸濁液の密度はいずれも１ｍｌあたり１．２５×１０４個細胞であり、９６ウェル丸底ウェルプレートに２５００個細胞／１９５μＬ／ウェルで播種し、３７℃、５％ ＣＯ２のインキュベーターで一晩培養した。
【0193】
５）５μＬの希釈した化合物を加え、ＤＭＳＯの最終濃度を０．１％にした。ＤＭＳＯウェルをＨｉｇｈ ｃｏｎｔｒｏｌとし、Ｍｅｄｉｕｍ ｏｎｌｙウェルをＬｏｗ Ｃｏｎｔｒｏｌとして使用した。
【0194】
６）３７℃、５％ ＣＯ２のインキュベーターで７日間培養した。
【0195】
７）インキュベーターから細胞を取り出して室温に平衡化させ、１０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、各ウェルから１００μＬの細胞培養上清を捨て、１００μＬのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ Ｇｌｏを加えた。室温で３０分間暗所で培養した。
【0196】
８）ＢＭＧを使用してＬｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ値を読み取った。
【0197】
上記のステップに従って、２回の独立した反復実験を実行した。
【0198】
データ分析
陰性対照の読み取り値を阻害率０％、陽性対照の読み取り値を阻害率１００％として設定し、各試験溶液の阻害率を算出した。
陰性対照の読み取り値を阻害率０％、陽性対照の読み取り値を阻害率１００％として設定し、各試験溶液の阻害率を算出した。
【0199】
【数1】
【0200】
下記の非線形フィッティング式を使用して化合物のＩＣ５０（半分の阻害濃度）を得た：
Ｙ＝Ｂｏｔｔｏｍ＋（Ｔｏｐ－Ｂｏｔｔｏｍ）／（１＋１０＾（（ＬｏｇＩＣ５０－Ｘ）＊ＨｉｌｌＳｌｏｐｅ））
Ｘ：化合物濃度ｌｏｇ値
Ｙ：化合物阻害率（％ｉｎｈ）
Ｚ’因子計算式：
Ｚ’＝１－３＊（ＳＤ＿Ｈ＋ＳＤ＿Ｌ）／（Ａｖｅ＿Ｈ－Ａｖｅ＿Ｌ）
ＳＤは標準誤差であり、ＡＶＥは平均値である。
Ｙ＝Ｂｏｔｔｏｍ＋（Ｔｏｐ－Ｂｏｔｔｏｍ）／（１＋１０＾（（ＬｏｇＩＣ５０－Ｘ）＊ＨｉｌｌＳｌｏｐｅ））
Ｘ：化合物濃度ｌｏｇ値
Ｙ：化合物阻害率（％ｉｎｈ）
Ｚ’因子計算式：
Ｚ’＝１－３＊（ＳＤ＿Ｈ＋ＳＤ＿Ｌ）／（Ａｖｅ＿Ｈ－Ａｖｅ＿Ｌ）
ＳＤは標準誤差であり、ＡＶＥは平均値である。
【0201】
実験結果
本実験は、ＭＤＡ－ＭＢ－１３４ＶＩ及びＨＣＣ１４２８細胞の増殖に対する式（Ｉ）で表される化合物の阻害効果を分析し、細胞増殖を阻害する化合物のＩＣ５０は下記の表に示される通りである。
本実験は、ＭＤＡ－ＭＢ－１３４ＶＩ及びＨＣＣ１４２８細胞の増殖に対する式（Ｉ）で表される化合物の阻害効果を分析し、細胞増殖を阻害する化合物のＩＣ５０は下記の表に示される通りである。
【0202】
【表15】
【0203】
実験結論：
式（Ｉ）で表される化合物は、ＭＤＡ－ＭＢ－１３４ＶＩ及びＨＣＣ１４２８細胞に対して有意な体外抗増殖活性を示している。
式（Ｉ）で表される化合物は、ＭＤＡ－ＭＢ－１３４ＶＩ及びＨＣＣ１４２８細胞に対して有意な体外抗増殖活性を示している。
【0204】
（６）ＭＣＦ－７突然変異細胞株ＭＣＦ－７ ＥＳＲ１－Ｙ５３７Ｓ及びＭＣＦ－７ ＥＳＲ１－Ｄ５３８Ｇの増殖阻害効果実験
実験材料：
実験材料：
【0205】
【表16】
【0206】
細胞情報と培養条件：
【0207】
【表17】
【0208】
実験方法及びステップ：
１．細胞の培養
腫瘍細胞を３７℃、５％ ＣＯ２のインキュベーターで培養した。定期的に継代し、対数増殖期の細胞をプレーティングに使用した。
１．細胞の培養
腫瘍細胞を３７℃、５％ ＣＯ２のインキュベーターで培養した。定期的に継代し、対数増殖期の細胞をプレーティングに使用した。
【0209】
２．細胞プレーティング
１）細胞をトリパンブルーで染色し、生細胞をカウントした。
１）細胞をトリパンブルーで染色し、生細胞をカウントした。
【0210】
２）ＰＢＳを使用して細胞を１回洗浄した後、フェノールレッドを含まないＲＰＭＩ１６４０＋１０％のＦＢＳ培地に再懸濁し、濃度を適切な濃度に調節した。
【0211】
３）培養プレートの各ウェルに１３５μＬの細胞懸濁液を加え、ブランク対照ウェルに細胞を含まない培地を加えた。
【0212】
４）培養プレートを３７℃、５％のＣＯ２、及び１００％の相対湿度のインキュベーターで一晩培養した。
【0213】
３．１０Ｘ化合物作業溶液の製造及び細胞の化合物処理
１）１０Ｘ化合物作業溶液の製造：１９９μＬの細胞培地をＶ型底の９６ウェルプレートに加え、２０００Ｘ化合物保存プレートから１μＬの化合物をピペットで吸い取り、９６ウェルプレートの細胞培地に加えた。１μＬのＤＭＳＯを溶媒対照とブランク対照に加えた。化合物又はＤＭＳＯを加え、ピペットで均一に混合した。
１）１０Ｘ化合物作業溶液の製造：１９９μＬの細胞培地をＶ型底の９６ウェルプレートに加え、２０００Ｘ化合物保存プレートから１μＬの化合物をピペットで吸い取り、９６ウェルプレートの細胞培地に加えた。１μＬのＤＭＳＯを溶媒対照とブランク対照に加えた。化合物又はＤＭＳＯを加え、ピペットで均一に混合した。
【0214】
２）投与：１５μＬの１０Ｘ化合物作業溶液を取り、表１に示されるされるように細胞培養プレートに加えた。１５μＬのＤＭＳＯ－細胞培地混合溶液を溶媒対照とブランク対照に加えた。ＤＭＳＯの最終濃度は０．０５％であった。
【0215】
３）９６ウェル細胞プレートを培養用のインキュベーターに戻し、７日間の培養後に細胞を検出した。
【0216】
４．ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ発光細胞生存率検出
下記のステップはＰｒｏｍｅｇａ ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ発光細胞生存率検出キット（Ｐｒｏｍｅｇａ－Ｇ７５７３）の説明書に従って実行した。
下記のステップはＰｒｏｍｅｇａ ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ発光細胞生存率検出キット（Ｐｒｏｍｅｇａ－Ｇ７５７３）の説明書に従って実行した。
【0217】
１）ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ緩衝液を解凍させて室温に放置した。
【0218】
２）ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ基質を室温に放置した。
【0219】
３）ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ基質のボトルにＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ緩衝液を加えて基質を溶解させ、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ作業溶液を製造した。
【0220】
４）ゆっくりとボルテックスして基質を完全に溶解させた。
【0221】
５）細胞培養プレートを取り外し、３０分間室温に平衡化させた。
【0222】
６）各ウェルに７５μＬ（各ウェルの細胞培地の体積の半分に等しい）のＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ作業溶液を加えた。細胞プレートをアルミホイルで包んで光から保護した。
【0223】
７）培養プレートをオービタルシェーカー上で２分間振とうして、細胞溶解を誘導した。
【0224】
８）培養プレートを室温で１０分間放置して、発光シグナルを安定させた。
【0225】
９）発光シグナルは、２１０４ＥｎＶｉｓｉｏｎプレートリーダーで検出した。
【0226】
データ分析：
下記の式で試験化合物の阻害率を計算した（Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｒａｔｅ、ＩＲ）：ＩＲ（％）＝（１－（ＲＬＵ化合物－ＲＬＵブランク対照）／（ＲＬＵ溶媒対照－ＲＬＵブランク対照））×１００％。Ｅｘｃｅｌで異なる濃度の化合物の阻害率を計算し、次に、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（６．０２．３２８）ソフトウェアｌｏｇ（ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）ｖｓ．ｒｅｓｐｏｎｓｅ－－Ｖａｒｉａｂｌｅ ｓｌｏｐｅを使用して阻害曲線をフィッティングし、関連パラメーターを得た。
下記の式で試験化合物の阻害率を計算した（Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｒａｔｅ、ＩＲ）：ＩＲ（％）＝（１－（ＲＬＵ化合物－ＲＬＵブランク対照）／（ＲＬＵ溶媒対照－ＲＬＵブランク対照））×１００％。Ｅｘｃｅｌで異なる濃度の化合物の阻害率を計算し、次に、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（６．０２．３２８）ソフトウェアｌｏｇ（ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）ｖｓ．ｒｅｓｐｏｎｓｅ－－Ｖａｒｉａｂｌｅ ｓｌｏｐｅを使用して阻害曲線をフィッティングし、関連パラメーターを得た。
【0227】
相対ＩＣ５０は、曲線の上端と下端のプラトー間の半分の点まで減少するのに必要な濃度であり、相対ＩＣ９０は、曲線の上端と下端のプラトー間の９０％の点まで減少するのに必要な濃度である。
【0228】
実験結果：
本実験は、２つの突然変異ＭＣＦ－７細胞の増殖に対する試験化合物式（Ｉ）で表される化合物の阻害効果を分析し、細胞増殖の阻害に対する化合物のＩＣ５０は下記の表に示される通りである。
本実験は、２つの突然変異ＭＣＦ－７細胞の増殖に対する試験化合物式（Ｉ）で表される化合物の阻害効果を分析し、細胞増殖の阻害に対する化合物のＩＣ５０は下記の表に示される通りである。
【0229】
【表18】
【0230】
実験結論：
式（Ｉ）で表される化合物は、ＥＳＲ１－Ｙ５３７Ｓ及びＥＳＲ１－Ｄ５３８Ｇ突然変異のＭＣＦ－７細胞に対して有意な体外抗増殖活性を示している。
式（Ｉ）で表される化合物は、ＥＳＲ１－Ｙ５３７Ｓ及びＥＳＲ１－Ｄ５３８Ｇ突然変異のＭＣＦ－７細胞に対して有意な体外抗増殖活性を示している。
【0231】
実験例２：ＤＭＰＫ特性の評価
（１）シトクロムＰ４５０アイソザイムの阻害に関する研究
実験材料：
（１）シトクロムＰ４５０アイソザイムの阻害に関する研究
実験材料：
【0232】
【表19】
【0233】
実験方法及びステップ：
プローブ基質、試験物質、ヒト肝ミクロソーム及び補因子を一緒に培養し、プローブ基質によって生成される代謝産物の濃度をＬＣ－ＭＳ／ＭＳで検出してＩＣ５０値を計算した。溶媒対照試料には試験試料を加えず、同量の溶媒を加え、溶媒対照試料の酵素活性を１００％とした。実験に使用したヒト肝ミクロソームの濃度、各ＣＹＰに対応するプローブ基質濃度、培養時間、陽性対照及び代謝産物等の詳細情報は下記の表に示される通りである。
プローブ基質、試験物質、ヒト肝ミクロソーム及び補因子を一緒に培養し、プローブ基質によって生成される代謝産物の濃度をＬＣ－ＭＳ／ＭＳで検出してＩＣ５０値を計算した。溶媒対照試料には試験試料を加えず、同量の溶媒を加え、溶媒対照試料の酵素活性を１００％とした。実験に使用したヒト肝ミクロソームの濃度、各ＣＹＰに対応するプローブ基質濃度、培養時間、陽性対照及び代謝産物等の詳細情報は下記の表に示される通りである。
【0234】
【表20】
【0235】
試験物質及び陽性対照阻害剤の培養：
すべての試料を３７℃のウォーターバス条件下で培養反応を実行し、試験物質の各濃度は３つの平行度で、陽性対照阻害剤の各濃度は２つの平行度で、培養反応系には対応するアイソザイムのプローブ基質（指定濃度）及びミクロソーム（０．１００ｍｇ ｐｒｏｔｅｉｎ／ｍＬ）の混合作業溶液及び試験物質又は陽性対照阻害剤（一連の最終濃度）の作業溶液が含まれた。すべての試料は３７℃の条件下で１０分間予熱させ、次に、補因子を加えて反応を開始させた。プローブ基質としてミダゾラムを使用するＣＹＰ３Ａ代謝反応の場合、反応時間は３分であり、その他の反応はいずれも１０分であった。
すべての試料を３７℃のウォーターバス条件下で培養反応を実行し、試験物質の各濃度は３つの平行度で、陽性対照阻害剤の各濃度は２つの平行度で、培養反応系には対応するアイソザイムのプローブ基質（指定濃度）及びミクロソーム（０．１００ｍｇ ｐｒｏｔｅｉｎ／ｍＬ）の混合作業溶液及び試験物質又は陽性対照阻害剤（一連の最終濃度）の作業溶液が含まれた。すべての試料は３７℃の条件下で１０分間予熱させ、次に、補因子を加えて反応を開始させた。プローブ基質としてミダゾラムを使用するＣＹＰ３Ａ代謝反応の場合、反応時間は３分であり、その他の反応はいずれも１０分であった。
【0236】
溶媒対照の培養：
溶媒対照データは、培養反応系の各アイソザイムの活性を計算するための基準値として機能した。溶媒対照は、（１）試験物質の溶媒対照、３つの平行度、培養反応系は対応するアイソザイムのプローブ基質（指定濃度）及びミクロソーム（０．１００ｍｇ／ｍＬ）の混合作業溶液及び対応する溶媒ＤＭＳＯ：メタノール（ｖ：ｖ、１：９）を含む；（２）陽性対照阻害剤の溶媒対照、２つの平行度、培養反応系は対応するアイソザイムのプローブ基質（指定濃度）及びミクロソーム（０．１００ｍｇ ｐｒｏｔｅｉｎ／ｍＬ）の混合作業溶液及び対応する溶媒メタノールを含む、の２種類に分けられた。すべての試料は３７℃の条件下で１０分間予熱させ、次に、補因子を加えて反応を開始させた。プローブ基質としてミダゾラムを使用するＣＹＰ３Ａ代謝反応の場合、反応時間は３分であり、その他の反応はいずれも１０分であった。
溶媒対照データは、培養反応系の各アイソザイムの活性を計算するための基準値として機能した。溶媒対照は、（１）試験物質の溶媒対照、３つの平行度、培養反応系は対応するアイソザイムのプローブ基質（指定濃度）及びミクロソーム（０．１００ｍｇ／ｍＬ）の混合作業溶液及び対応する溶媒ＤＭＳＯ：メタノール（ｖ：ｖ、１：９）を含む；（２）陽性対照阻害剤の溶媒対照、２つの平行度、培養反応系は対応するアイソザイムのプローブ基質（指定濃度）及びミクロソーム（０．１００ｍｇ ｐｒｏｔｅｉｎ／ｍＬ）の混合作業溶液及び対応する溶媒メタノールを含む、の２種類に分けられた。すべての試料は３７℃の条件下で１０分間予熱させ、次に、補因子を加えて反応を開始させた。プローブ基質としてミダゾラムを使用するＣＹＰ３Ａ代謝反応の場合、反応時間は３分であり、その他の反応はいずれも１０分であった。
【0237】
試料の処理：
各アイソザイムの培養反応系が対応する反応時間に達した後、２００μＬの対応する内部標準を含む停止溶液を反応プレートに加えて反応を停止させた。十分に振とうした後、遠心分離機に入れ、３２２０×ｇで２０分間遠心分離し、次に、上清を取り出し、適切な希釈液を所定の比率で加えて希釈した。反応プレートをシェーカーに置き、振とうして均一に混合した。次に、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳを使用してプローブ基質の代謝物を分析し、試料をすぐに分析できない場合は、使用するまでに試料を２～８℃で保存した。
各アイソザイムの培養反応系が対応する反応時間に達した後、２００μＬの対応する内部標準を含む停止溶液を反応プレートに加えて反応を停止させた。十分に振とうした後、遠心分離機に入れ、３２２０×ｇで２０分間遠心分離し、次に、上清を取り出し、適切な希釈液を所定の比率で加えて希釈した。反応プレートをシェーカーに置き、振とうして均一に混合した。次に、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳを使用してプローブ基質の代謝物を分析し、試料をすぐに分析できない場合は、使用するまでに試料を２～８℃で保存した。
【0238】
培養した試料をタンパク質沈殿させた後、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳを使用してプローブ基質の代謝産物を定量的に分析した。
【0239】
データ分析：
各ＣＹＰアイソザイムの活性は、各プローブ基質代謝産物の生成速度で反映された。試験物質又は陽性阻害剤を加えない溶媒対照培養反応系における各アイソザイムの活性を１００％として設定し、異なる濃度の試験物質又は陽性阻害剤を含む場合のプローブ基質代謝産物の生成率を溶媒対照代謝産物の生成率と比較し、更に１００％を乗じた値を各アイソザイムの残存活性の百分率とした。残存活性の百分率を縦軸、阻害剤濃度を横軸として、ＳｉｇｍａＰｌｏｔ（Ｖ．１４）ソフトウェアで３又は４パラメーターを使用して非線形回帰分析を実行し、試験製品と各陽性阻害剤のＩＣ５０値を計算した。ＳｉｇｍａＰｌｏｔソフトウェアによりフィッティングして得られたＩＣ５０が最高投与濃度（１００μＭ）を超えた場合、又はフィッティングによってＩＣ５０が得られない場合、ＩＣ５０値は「＞１００μＭ」として標識された。
各ＣＹＰアイソザイムの活性は、各プローブ基質代謝産物の生成速度で反映された。試験物質又は陽性阻害剤を加えない溶媒対照培養反応系における各アイソザイムの活性を１００％として設定し、異なる濃度の試験物質又は陽性阻害剤を含む場合のプローブ基質代謝産物の生成率を溶媒対照代謝産物の生成率と比較し、更に１００％を乗じた値を各アイソザイムの残存活性の百分率とした。残存活性の百分率を縦軸、阻害剤濃度を横軸として、ＳｉｇｍａＰｌｏｔ（Ｖ．１４）ソフトウェアで３又は４パラメーターを使用して非線形回帰分析を実行し、試験製品と各陽性阻害剤のＩＣ５０値を計算した。ＳｉｇｍａＰｌｏｔソフトウェアによりフィッティングして得られたＩＣ５０が最高投与濃度（１００μＭ）を超えた場合、又はフィッティングによってＩＣ５０が得られない場合、ＩＣ５０値は「＞１００μＭ」として標識された。
【0240】
【数2】
【0241】
最小酵素活性が±１０％以内の場合は４パラメータ式を使用し、それ以外の場合は３パラメータ式を使用した。
【0242】
実験結果：
ＣＹＰ１Ａ２に対する式（Ｉ）で表される化合物のＩＣ５０値は９７．２μＭであり、ＣＹＰ３Ａ（基質としてミダゾラムを使用）に対するＩＣ５０値は８．３８μＭであり、ＣＹＰ３Ａ（基質としてテストステロンを使用）に対するＩＣ５０値は１０．９μＭであった。本発明の化合物はＣＹＰ酵素に対して阻害が弱く、薬物相互作用のリスクが低いことを示している。
ＣＹＰ１Ａ２に対する式（Ｉ）で表される化合物のＩＣ５０値は９７．２μＭであり、ＣＹＰ３Ａ（基質としてミダゾラムを使用）に対するＩＣ５０値は８．３８μＭであり、ＣＹＰ３Ａ（基質としてテストステロンを使用）に対するＩＣ５０値は１０．９μＭであった。本発明の化合物はＣＹＰ酵素に対して阻害が弱く、薬物相互作用のリスクが低いことを示している。
【0243】
（２）マウス体内における薬物動態試験
実験目的：メスのＢａｌｂ／ｃマウスを試験動物として使用し、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ法を使用して、マウスに試験化合物を静脈内及び胃内投与した後、異なる時点での血漿中の薬物濃度を測定した。マウス体内における式（Ｉ）で表される化合物のＣ型結晶の薬物動態挙動を研究し、その薬物動態特性を評価した。
実験目的：メスのＢａｌｂ／ｃマウスを試験動物として使用し、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ法を使用して、マウスに試験化合物を静脈内及び胃内投与した後、異なる時点での血漿中の薬物濃度を測定した。マウス体内における式（Ｉ）で表される化合物のＣ型結晶の薬物動態挙動を研究し、その薬物動態特性を評価した。
【0244】
実験スキーム：
試験動物：動物はＳｈａｎｇｈａｉ Ｌｉｎｇｃｈａｎｇ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．から購入した。
試験動物：動物はＳｈａｎｇｈａｉ Ｌｉｎｇｃｈａｎｇ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．から購入した。
【0245】
医薬の製造：
適切な量の試料を秤量し、１ｍｇ／ｍＬの溶液に製造し、透明な状態になるまで撹拌し、超音波処理し、溶媒は１５％のＨＰ－β－ＣＤであった。
適切な量の試料を秤量し、１ｍｇ／ｍＬの溶液に製造し、透明な状態になるまで撹拌し、超音波処理し、溶媒は１５％のＨＰ－β－ＣＤであった。
【0246】
投与：一晩禁食させた後、ＩＶ群には５ｍｇ／ｋｇの投与量で静脈内投与し、ＰＯ群には１０ｍｇ／ｋｇの投与量でそれぞれ胃内投与した。
【0247】
実験の操作：
メスＢａｌｂ／ｃマウスの静脈内投与群に試験化合物を投与した後、０．０８３３、０．２５、０．５、１、２、４、８、及び２４時間後に伏在静脈から３０μＬの血液を採取し、予めＥＤＴＡ－Ｋ２を加えた市販の抗凝固チューブに入れた。胃内投与群に試験化合物を投与した後、それぞれ０．２５、０．５、１、２、４、８、１２及び２４時間後に頸静脈から３０μＬの血液を採取し、予めＥＤＴＡ－Ｋ２を加えた市販の抗凝固チューブに入れ、次に、遠心分離（３，２００ｇ、４℃、１０分）した後血漿を取り出し、血漿を予冷した遠心分離チューブに移し、ドライアイスで急速凍結させ、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析を実行するまで－６０℃又はより低い超低温冷蔵庫で保存した。動物は、投与４時間後に食べさせた。ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ方法を使用して、静脈内及び胃内投与後のマウスの血漿中の試験化合物の含有量を測定した。方法の線形範囲は２．００～２０００ｎＭであった。
メスＢａｌｂ／ｃマウスの静脈内投与群に試験化合物を投与した後、０．０８３３、０．２５、０．５、１、２、４、８、及び２４時間後に伏在静脈から３０μＬの血液を採取し、予めＥＤＴＡ－Ｋ２を加えた市販の抗凝固チューブに入れた。胃内投与群に試験化合物を投与した後、それぞれ０．２５、０．５、１、２、４、８、１２及び２４時間後に頸静脈から３０μＬの血液を採取し、予めＥＤＴＡ－Ｋ２を加えた市販の抗凝固チューブに入れ、次に、遠心分離（３，２００ｇ、４℃、１０分）した後血漿を取り出し、血漿を予冷した遠心分離チューブに移し、ドライアイスで急速凍結させ、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析を実行するまで－６０℃又はより低い超低温冷蔵庫で保存した。動物は、投与４時間後に食べさせた。ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ方法を使用して、静脈内及び胃内投与後のマウスの血漿中の試験化合物の含有量を測定した。方法の線形範囲は２．００～２０００ｎＭであった。
【0248】
実験結果：
【0249】
【表21】
【0250】
式（Ｉ）で表される化合物のＣ型結晶は、マウス体内において代謝的に安定であり、組織分布が大きく、経口吸収及び利用性が高く、生体内で良好な薬物動態特性を有することを示している。
【0251】
（３）ラット体内における薬物動態試験
実験目的：メスのＳｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙラットを試験動物として使用し、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ法を使用して、ラットに試験化合物を静脈内及び胃内投与した後、異なる時点での血漿中の薬物濃度を測定した。ラット体内における式（ＩＩ）で表される化合物のＢ型結晶の薬物動態挙動を研究し、その薬物動態特性を評価した。
実験目的：メスのＳｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙラットを試験動物として使用し、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ法を使用して、ラットに試験化合物を静脈内及び胃内投与した後、異なる時点での血漿中の薬物濃度を測定した。ラット体内における式（ＩＩ）で表される化合物のＢ型結晶の薬物動態挙動を研究し、その薬物動態特性を評価した。
【0252】
実験スキーム：
試験動物：動物は、Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｖｉｔａｌ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．から購入した。
試験動物：動物は、Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｖｉｔａｌ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．から購入した。
【0253】
医薬の製造：
適切な量の試料を秤量し、０．２ｍｇ／ｍＬの溶液に製造し、透明な状態になるまで撹拌し、溶媒は２０％のＳＢＥ－β－ＣＤであった。
適切な量の試料を秤量し、０．２ｍｇ／ｍＬの溶液に製造し、透明な状態になるまで撹拌し、溶媒は２０％のＳＢＥ－β－ＣＤであった。
【0254】
投与：一晩禁食させた後、ＩＶ群には１ｍｇ／ｋｇの投与量で静脈内投与し、ＰＯ群には２ｍｇ／ｋｇの投与量でそれぞれ胃内投与した。
【0255】
実験の操作：
メスＳｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙラットの静脈内投与群にそれぞれ試験化合物を投与した後、０．０８３０、０．２５０、０．５００、１．００、２．００、４．００、６．００、８．００、２４．０、３２．０及び４８．０時間後に頸静脈から２００μＬの血液を採取し、予めＥＤＴＡ－Ｋ２を加えた市販の抗凝固チューブに入れた。胃内投与群にそれぞれ試験化合物を投与した後、それぞれ０．２５０、０．５００、１．００、２．００、４．００、６．００、８．００、２４．０、３２．０及び４８．０時間後に頸静脈から２００μＬの血液を採取し、予めＥＤＴＡ－Ｋ２を加えた市販の抗凝固チューブに入れ、次に、遠心分離（３，２００ｇ、４℃、１０分）した後血漿を取り出し、血漿を予冷した遠心分離チューブに移し、ドライアイスで急速凍結させ、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析を実行するまで－６０℃又はより低い超低温冷蔵庫で保存した。動物は、投与４時間後に食べさせた。ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ方法を使用して、静脈内及び胃内投与後のラットの血漿中の試験化合物の含有量を測定した。方法の線形範囲は２．００～２０００ｎＭであった。
メスＳｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙラットの静脈内投与群にそれぞれ試験化合物を投与した後、０．０８３０、０．２５０、０．５００、１．００、２．００、４．００、６．００、８．００、２４．０、３２．０及び４８．０時間後に頸静脈から２００μＬの血液を採取し、予めＥＤＴＡ－Ｋ２を加えた市販の抗凝固チューブに入れた。胃内投与群にそれぞれ試験化合物を投与した後、それぞれ０．２５０、０．５００、１．００、２．００、４．００、６．００、８．００、２４．０、３２．０及び４８．０時間後に頸静脈から２００μＬの血液を採取し、予めＥＤＴＡ－Ｋ２を加えた市販の抗凝固チューブに入れ、次に、遠心分離（３，２００ｇ、４℃、１０分）した後血漿を取り出し、血漿を予冷した遠心分離チューブに移し、ドライアイスで急速凍結させ、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析を実行するまで－６０℃又はより低い超低温冷蔵庫で保存した。動物は、投与４時間後に食べさせた。ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ方法を使用して、静脈内及び胃内投与後のラットの血漿中の試験化合物の含有量を測定した。方法の線形範囲は２．００～２０００ｎＭであった。
【0256】
実験結果：
【0257】
【表22】
【0258】
式（ＩＩ）で表される化合物のＢ型結晶は、ラット体内において代謝的に安定であり、組織分布が大きく、経口吸収及び利用性が高く、生体内で良好な薬物動態特性を有することを示している。
【0259】
（４）イヌ体内における薬物動態試験
実験目的：メス・オスビーグルを試験動物として使用し、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ法を使用して、ビーグルに試験化合物を静脈内及び胃内投与した後、異なる時点での血漿中の薬物濃度を測定した。ビーグル体内における式（ＩＩ）で表される化合物のＢ型結晶の薬物動態挙動を研究し、その薬物動態特性を評価した。
実験目的：メス・オスビーグルを試験動物として使用し、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ法を使用して、ビーグルに試験化合物を静脈内及び胃内投与した後、異なる時点での血漿中の薬物濃度を測定した。ビーグル体内における式（ＩＩ）で表される化合物のＢ型結晶の薬物動態挙動を研究し、その薬物動態特性を評価した。
【0260】
実験スキーム：
試験動物：動物はＢｅｉｊｉｎｇ Ｍａｒｓｈａｌｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．から購入した。
試験動物：動物はＢｅｉｊｉｎｇ Ｍａｒｓｈａｌｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．から購入した。
【0261】
医薬の製造：
適切な量の試料を秤量し、０．２及び０．３ｍｇ／ｍＬの溶液に製造し、透明な状態になるまで撹拌し、溶媒は２０％のＳＢＥ－β－ＣＤであった。
適切な量の試料を秤量し、０．２及び０．３ｍｇ／ｍＬの溶液に製造し、透明な状態になるまで撹拌し、溶媒は２０％のＳＢＥ－β－ＣＤであった。
【0262】
投与：一晩禁食させた後、ＩＶ群には０．３ｍｇ／ｋｇの投与量で静脈内投与し、ＰＯ群には１ｍｇ／ｋｇの投与量でそれぞれ胃内投与した。
【0263】
実験の操作：
ビーグルの静脈内投与群にそれぞれ試験化合物を投与した後、０．２５、０．５、１、２、４、６、８、２４、３２、４８、７２及び９６時間後に末梢静脈から８００μＬの血液を採取し、予めＥＤＴＡ－Ｋ２を加えた市販の抗凝固チューブに入れた。胃内投与群にそれぞれ試験化合物を投与した後、それぞれ０．２５、０．５、１、２、４、６、８、２４、３２、４８、７２及び９６時間後に末梢静脈から８００μＬの血液を採取し、予めＥＤＴＡ－Ｋ２を加えた市販の抗凝固チューブに入れ、次に、遠心分離（３，２００ｇ、２～８℃、１０分）した後血漿を取り出し、血漿を予冷した遠心分離チューブに移し、ドライアイスで急速凍結させ、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析を実行するまで－６０℃又はより低い超低温冷蔵庫で保存した。動物は、投与４時間後に食べさせた。ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ方法を使用して、静脈内及び胃内投与後のビーグルの血漿中の試験化合物の含有量を測定した。方法の線形範囲は２．００～２０００ｎＭであった。
ビーグルの静脈内投与群にそれぞれ試験化合物を投与した後、０．２５、０．５、１、２、４、６、８、２４、３２、４８、７２及び９６時間後に末梢静脈から８００μＬの血液を採取し、予めＥＤＴＡ－Ｋ２を加えた市販の抗凝固チューブに入れた。胃内投与群にそれぞれ試験化合物を投与した後、それぞれ０．２５、０．５、１、２、４、６、８、２４、３２、４８、７２及び９６時間後に末梢静脈から８００μＬの血液を採取し、予めＥＤＴＡ－Ｋ２を加えた市販の抗凝固チューブに入れ、次に、遠心分離（３，２００ｇ、２～８℃、１０分）した後血漿を取り出し、血漿を予冷した遠心分離チューブに移し、ドライアイスで急速凍結させ、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析を実行するまで－６０℃又はより低い超低温冷蔵庫で保存した。動物は、投与４時間後に食べさせた。ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ方法を使用して、静脈内及び胃内投与後のビーグルの血漿中の試験化合物の含有量を測定した。方法の線形範囲は２．００～２０００ｎＭであった。
【0264】
実験結果：
【0265】
【表23】
【0266】
本発明の式（ＩＩ）で表される化合物のＢ型結晶は、ビーグル体内において代謝的に安定であり、組織分布が大きく、経口吸収及び利用性が高く、生体内で良好な薬物動態特性を有することを示している。
【0267】
実験例３：体内での薬効評価
（１）乳癌ＭＣＦ－７細胞皮下異種移植腫瘍ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスモデルにおける体内薬効研究
実験目的：本実験では、ヒト乳癌ＭＣＦ－７細胞皮下異種移植腫瘍ヌードマウスモデルを使用して、式（Ｉ）で表される化合物のＣ型結晶の体内薬効を評価した。
（１）乳癌ＭＣＦ－７細胞皮下異種移植腫瘍ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスモデルにおける体内薬効研究
実験目的：本実験では、ヒト乳癌ＭＣＦ－７細胞皮下異種移植腫瘍ヌードマウスモデルを使用して、式（Ｉ）で表される化合物のＣ型結晶の体内薬効を評価した。
【0268】
実験材料：
【0269】
【表24】
【0270】
実験方法及びステップ：
細胞培養の準備：
ヒト乳癌ＭＣＦ－７細胞は通常の通り体外単層培養し、培養条件はＥＭＥＭ（ＥＢＳＳ；ＡＴＣＣ）培地に１０％のウシ胎児血清（Ｃｅｌｌｍａｘ）、２ｍＭのグルタミン（Ｇｉｂｃｏ）及び１％の非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ；Ｇｉｂｃｏ）を加え、３７℃で５％のＣＯ２インキュベーターで培養した。週に２回、トリプシン－ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ）を使用して通常な消化処理をし、継代培養した。細胞の飽和度が８０％～９０％であり、細胞の数が要求に達する場合、細胞を収集してカウントし接種した。
細胞培養の準備：
ヒト乳癌ＭＣＦ－７細胞は通常の通り体外単層培養し、培養条件はＥＭＥＭ（ＥＢＳＳ；ＡＴＣＣ）培地に１０％のウシ胎児血清（Ｃｅｌｌｍａｘ）、２ｍＭのグルタミン（Ｇｉｂｃｏ）及び１％の非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ；Ｇｉｂｃｏ）を加え、３７℃で５％のＣＯ２インキュベーターで培養した。週に２回、トリプシン－ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ）を使用して通常な消化処理をし、継代培養した。細胞の飽和度が８０％～９０％であり、細胞の数が要求に達する場合、細胞を収集してカウントし接種した。
【0271】
実験動物は、Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｖｉｔａｌ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．（浙江支店）から購入した。
【0272】
腫瘍細胞の接種と群分け
細胞接種：各マウスの左背部にエストロゲン錠（０．３６ｍｇ／錠；ＩＲＡ）を皮下接種し、３日後、０．２ｍＬ（１×１０７細胞）のＭＣＦ－７細胞（マトリゲルを添加；ＣＯＲＮＩＮＧ、体積比１：１）を各マウスの右背部に皮下接種し、平均腫瘍体積が１８８ｍｍ３に達した時点で群を分けて投与した。
細胞接種：各マウスの左背部にエストロゲン錠（０．３６ｍｇ／錠；ＩＲＡ）を皮下接種し、３日後、０．２ｍＬ（１×１０７細胞）のＭＣＦ－７細胞（マトリゲルを添加；ＣＯＲＮＩＮＧ、体積比１：１）を各マウスの右背部に皮下接種し、平均腫瘍体積が１８８ｍｍ３に達した時点で群を分けて投与した。
【0273】
【表25】
【0274】
医薬の製造：
適切な量の式（Ｉ）で表される化合物試料を秤量し、それぞれ０．１、０．３、１及び３ｍｇ／ｍＬの溶液に製造し、しばらくボルテックスし、超音波処理して透明な溶液を形成し、溶媒は１０％のＨＰ－β－ＣＤであった。適切な量のＰａｌｂｏｃｉｃｌｉｂを秤量し、２．５ｍｇ／ｍＬの溶液に製造し、ｐＨを４．０に調節し、しばらくボルテックスし、超音波処理して透明な溶液を形成し、溶媒は５０ｍＭの乳酸ナトリウム緩衝液であった。フルベストラントは市販の注射薬フェソロデックスを使用した。
適切な量の式（Ｉ）で表される化合物試料を秤量し、それぞれ０．１、０．３、１及び３ｍｇ／ｍＬの溶液に製造し、しばらくボルテックスし、超音波処理して透明な溶液を形成し、溶媒は１０％のＨＰ－β－ＣＤであった。適切な量のＰａｌｂｏｃｉｃｌｉｂを秤量し、２．５ｍｇ／ｍＬの溶液に製造し、ｐＨを４．０に調節し、しばらくボルテックスし、超音波処理して透明な溶液を形成し、溶媒は５０ｍＭの乳酸ナトリウム緩衝液であった。フルベストラントは市販の注射薬フェソロデックスを使用した。
【0275】
腫瘍の測定と実験指標：
週に２回ノギスで腫瘍の直径を測定した。腫瘍体積の計算式は：Ｖ＝０．５ａ×ｂ２であり、ａとｂは、それぞれ腫瘍の長径と短径を表す。
週に２回ノギスで腫瘍の直径を測定した。腫瘍体積の計算式は：Ｖ＝０．５ａ×ｂ２であり、ａとｂは、それぞれ腫瘍の長径と短径を表す。
【0276】
化合物の抗腫瘍効果は、ＴＧＩ（％）又は相対腫瘍増殖率Ｔ／Ｃ（％）によって評価された。相対腫瘍増殖率Ｔ／Ｃ（％）＝ＴＲＴＶ／ＣＲＴＶ×１００％（ＴＲＴＶ：治療群のＲＴＶ平均値；ＣＲＴＶ：対照群のＲＴＶ平均値）。腫瘍の測定結果に従って相対腫瘍体積（ｒｅｌａｔｉｖｅ ｔｕｍｏｒ ｖｏｌｕｍｅ、ＲＴＶ）を計算し、計算式はＲＴＶ＝Ｖｔ／Ｖ０であり、ここで、Ｖ０は群を分けて投与する時（即ち、Ｄ０）に測定した腫瘍体積であり、Ｖｔは特定の測定時の腫瘍体積であり、ＴＲＴＶ及びＣＲＴＶは同じ日のデータを取った。
【0277】
ＴＧＩ（％）は、腫瘍増殖阻害率を反映する。ＴＧＩ（％）＝［１－（特定の治療群の投与終了時の平均腫瘍体積－当該治療群の投与開始時の平均腫瘍体積）／（対照群の治療終了時の平均腫瘍体積－対照群の治療開始時の平均腫瘍体積））×１００％。
【0278】
併用投与指数のＱ値はキングの式に従って計算され、判定基準：Ｑ値が０．８５～１．１５の間にある場合は相乗作用（＋）を示し、＞１．１５～２．０は増強作用（＋＋）を示し、＜０．８５～０．５５は拮抗作用（－）を示し、＜０．５５は有意な拮抗作用（－－）を示し；Ｑ＝Ｅａ＋ｂ／（Ｅａ＋Ｅｂ－Ｅａ×Ｅｂ）であり、ここで、Ｅａ＋ｂは併用投与群における腫瘍抑制率であり、Ｅａ及びＥｂはそれぞれ単独投与群における腫瘍抑制率であった。
【0279】
実験終了後腫瘍重量を検出し、Ｔ／Ｃｗｅｉｇｈｔ百分率を計算し、Ｔｗｅｉｇｈｔ及びＣｗｅｉｇｈｔは、それぞれ投与群と溶媒対照群の腫瘍重量を表す。
【0280】
統計分析は、試験終了時のＲＴＶデータに基づいてＳＰＳＳソフトを使用して実行された。群間の比較にはｏｎｅ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡを使用して分析し、分散が均一ではない場合（Ｆ値に有意差がある場合）、Ｇａｍｅｓ－Ｈｏｗｅｌｌ法で試験した。ｐ＜０．０５は、有意差があると見なされた。
【0281】
実験結果：
本実験では、ヒト乳癌異種移植腫瘍モデルにおける式（Ｉ）で表される化合物のＣ型結晶の薬効を評価し、溶媒対照群を参照とした。異なる時点での各群の腫瘍体積及び対応する統計解析結果は表１４及び図１０に示される通りであり、投与期間中のマウスの体重の変化は図１１に示される通りである。
本実験では、ヒト乳癌異種移植腫瘍モデルにおける式（Ｉ）で表される化合物のＣ型結晶の薬効を評価し、溶媒対照群を参照とした。異なる時点での各群の腫瘍体積及び対応する統計解析結果は表１４及び図１０に示される通りであり、投与期間中のマウスの体重の変化は図１１に示される通りである。
【0282】
投与後２１日目、ブランク対照群の平均腫瘍体積は１２２５ｍｍ３であった。式（Ｉ）で表される化合物は、１ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、又は３０ｍｇ／ｋｇの４つの投与量で、その平均腫瘍体積はそれぞれ３４０ｍｍ３、１７９ｍｍ３、１４０ｍｍ３、及び１２１ｍｍ３であり、Ｔ／Ｃ値はそれぞれ２７．２％、１４．８％、１１．３％、及び９．７％であり、ＴＧＩはそれぞれ８５．３％、１００．９％、１０４．６％、及び１０６．５％であり、対照群と比べてＰ値はそれぞれ０．００３、０．００１、０．００１、及び０．００１であり、１０ｍｇ／ｋｇ及び３０ｍｇ／ｋｇの投与量で客観的奏効率（ＯＲＲ）は２５％であり、そのため、式（Ｉ）で表される化合物のＣ型結晶は、上記の投与量でいずれも有意な腫瘍阻害効果を有し、投与量の増加に伴って所定の用量効果関係を示した。
【0283】
【表26】
【0284】
２１日目、フルベストラント（５ｍｇ／マウス）及びパルボシクリブ（２５ｍｇ／ｋｇ）単独投与群の平均腫瘍体積はそれぞれ５９３ｍｍ３及び７８１ｍｍ３であり、Ｔ／Ｃ値はそれぞれ４６．９％及び６４．０％であり、ＴＧＩはそれぞれ６０．９％及び４２．８％であり、対照群と比較してＰ値はそれぞれ０．０１９及び０．２１９であり、そのため、フルベストラントの単独投与では抗腫瘍効果があったが、パルボシクリブの単独投与では抗腫瘍効果を示さなかった。上記２つの参照化合物と比較して、式（Ｉ）で表される化合物のＣ型結晶は３ｍｇ／ｋｇでより強い抗腫瘍効果を示し、その疾患制御率（ＤＣＲ）は１００％に達した。
【0285】
パルボシクリブの単独投与では抗腫瘍効果はないが、式（Ｉ）で表される化合物（３ｍｇ／ｋｇ）をパルボシクリブと併用して投与する場合、平均腫瘍体積は７９ｍｍ３であり、Ｔ／Ｃ値は６．１％であり、ＴＧＩは１１０．５％であり、対照群、パルボシクリブ、及び式（Ｉ）で表される化合物のＣ型結晶（３ｍｇ／ｋｇ）群と比べてＰ値はそれぞれ０．００１、０．００２、及び０．０１２であり、その客観的奏効率（ＯＲＲ）は８７．５％に達し、ジンの式（Ｊｉｎ‘ｓ ｆｏｒｍｕｌａ）により計算されたＱ値は１．１０（＋）であり、そのため、併用投与は式（Ｉ）で表される化合物のＣ型結晶の単独投与より強力な抗腫瘍効果を示し、相乗的な相加効果であった。
【0286】
実験結論：
ブランク対照群と比較して、式（Ｉ）で表される化合物のＣ型結晶は１ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ又は３０ｍｇ／ｋｇの４つの投与量でいずれも有意な腫瘍阻害効果を有し、有効用量は１ｍｇ／ｋｇ（ＴＧＩは８５．３％）であった。式（Ｉ）で表される化合物のＣ型結晶（３ｍｇ／ｋｇ）をパルボシクリブと併用して使用する場合、単独投与より強力な抗腫瘍効果を示した。担癌マウスは式（Ｉ）で表される化合物のＣ型結晶に良好な耐薬性を示した。本発明の化合物は、マウス薬力学的モデルにおいて優れた腫瘍阻害効果を示し、良好な臨床治療の可能性を有していた。
ブランク対照群と比較して、式（Ｉ）で表される化合物のＣ型結晶は１ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ又は３０ｍｇ／ｋｇの４つの投与量でいずれも有意な腫瘍阻害効果を有し、有効用量は１ｍｇ／ｋｇ（ＴＧＩは８５．３％）であった。式（Ｉ）で表される化合物のＣ型結晶（３ｍｇ／ｋｇ）をパルボシクリブと併用して使用する場合、単独投与より強力な抗腫瘍効果を示した。担癌マウスは式（Ｉ）で表される化合物のＣ型結晶に良好な耐薬性を示した。本発明の化合物は、マウス薬力学的モデルにおいて優れた腫瘍阻害効果を示し、良好な臨床治療の可能性を有していた。
【0287】
（２）ＥＳＲ１ Ｄ５３８Ｇ突然変異を有するヒト乳癌ＭＣＦ－７細胞皮下異種移植腫瘍マウスモデルにおける体内薬効研究
実験目的：ＥＳＲ１ Ｄ５３８Ｇ突然変異を有するヒト乳癌ＭＣＦ７細胞を使用して、ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスの体内で皮下異種移植腫瘍モデルを構築し、式（ＩＩ）で表される化合物のＢ型結晶の体内抗腫瘍効果を評価した。
実験目的：ＥＳＲ１ Ｄ５３８Ｇ突然変異を有するヒト乳癌ＭＣＦ７細胞を使用して、ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスの体内で皮下異種移植腫瘍モデルを構築し、式（ＩＩ）で表される化合物のＢ型結晶の体内抗腫瘍効果を評価した。
【0288】
実験材料：
【0289】
【表27】
【0290】
実験方法及びステップ：
細胞培養の準備：
ＥＳＲ１ Ｄ５３８Ｇ突然変異を有するヒト乳癌ＭＣＦ７細胞を体外で通常の通り単層培養し、培養条件はＥＭＥＭ培地に１０％のウシ胎児血清、１％のＡｎｔｉｂｉｏｔｉｃ－Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ、２ｍＭのＬ－Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ、１％のＮＥＡＡを加え、３７℃で５％ ＣＯ２のインキュベーターで培養した。週に２回、トリプシン－ＥＤＴＡを使用して通常の消化処理をし、継代培養した。細胞の飽和度が８０％～９０％であり、細胞の数が要求に達する場合、細胞を収集してカウントし接種した。
細胞培養の準備：
ＥＳＲ１ Ｄ５３８Ｇ突然変異を有するヒト乳癌ＭＣＦ７細胞を体外で通常の通り単層培養し、培養条件はＥＭＥＭ培地に１０％のウシ胎児血清、１％のＡｎｔｉｂｉｏｔｉｃ－Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ、２ｍＭのＬ－Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ、１％のＮＥＡＡを加え、３７℃で５％ ＣＯ２のインキュベーターで培養した。週に２回、トリプシン－ＥＤＴＡを使用して通常の消化処理をし、継代培養した。細胞の飽和度が８０％～９０％であり、細胞の数が要求に達する場合、細胞を収集してカウントし接種した。
【0291】
実験動物：動物は、Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｖｉｔａｌ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．から購入した。
【0292】
腫瘍細胞の接種と群分け
細胞の接種：各マウスの右背部に０．２ｍＬ（１０×１０６細胞）のＭＣＦ７ ＥＳＲ１ Ｄ５３８Ｇ細胞（ＰＢＳ＋マトリゲル、体積比１：１）を皮下接種し、平均腫瘍体積が１４７ｍｍ３に達した時点で群を分け投与した。実験の群分け及び投与方法は下記の表にされる通りである。投与初日を０日目とした。
細胞の接種：各マウスの右背部に０．２ｍＬ（１０×１０６細胞）のＭＣＦ７ ＥＳＲ１ Ｄ５３８Ｇ細胞（ＰＢＳ＋マトリゲル、体積比１：１）を皮下接種し、平均腫瘍体積が１４７ｍｍ３に達した時点で群を分け投与した。実験の群分け及び投与方法は下記の表にされる通りである。投与初日を０日目とした。
【0293】
【表28】
【0294】
医薬の製造：
適切な量の式（ＩＩ）で表される化合物のＢ型結晶試料を秤量し、それぞれ０．５、１．５及び５．０ｍｇ／ｍＬの溶液に製造し、しばらくボルテックスし、超音波処理して透明な溶液を形成し、溶媒は１０％のＨＰ－β－ＣＤであった。適切な量のパルボシクリブを秤量し、５ｍｇ／ｍＬの溶液に製造し、ｐＨを４．０に調節し、しばらくボルテックスし、超音波処理して透明な溶液を形成し、溶媒は５０ｍＭの乳酸ナトリウム緩衝液であった。
適切な量の式（ＩＩ）で表される化合物のＢ型結晶試料を秤量し、それぞれ０．５、１．５及び５．０ｍｇ／ｍＬの溶液に製造し、しばらくボルテックスし、超音波処理して透明な溶液を形成し、溶媒は１０％のＨＰ－β－ＣＤであった。適切な量のパルボシクリブを秤量し、５ｍｇ／ｍＬの溶液に製造し、ｐＨを４．０に調節し、しばらくボルテックスし、超音波処理して透明な溶液を形成し、溶媒は５０ｍＭの乳酸ナトリウム緩衝液であった。
【0295】
腫瘍の測定と実験指標：
週に２回ノギスで腫瘍の直径を測定した。腫瘍体積の計算式は：Ｖ＝０．５ａ×ｂ２であり、ａとｂは、それぞれ腫瘍の長径と短径を表す。
週に２回ノギスで腫瘍の直径を測定した。腫瘍体積の計算式は：Ｖ＝０．５ａ×ｂ２であり、ａとｂは、それぞれ腫瘍の長径と短径を表す。
【0296】
化合物の抗腫瘍効果は、ＴＧＩ（％）又は相対腫瘍増殖率Ｔ／Ｃ（％）によって評価される。相対腫瘍増殖率Ｔ／Ｃ（％）＝ＴＲＴＶ／ＣＲＴＶ×１００％（ＴＲＴＶ：治療群のＲＴＶ平均値；ＣＲＴＶ：陰性対照群のＲＴＶ平均値）。腫瘍の測定結果に従って相対腫瘍体積（ｒｅｌａｔｉｖｅ ｔｕｍｏｒ ｖｏｌｕｍｅ、ＲＴＶ）を計算し、計算式はＲＴＶ＝Ｖｔ／Ｖ０であり、ここで、Ｖ０は群を分けて投与する時（即ち、Ｄ０）に測定した腫瘍体積であり、Ｖｔは特定の測定時の腫瘍体積であり、ＴＲＴＶ及びＣＲＴＶは同じ日のデータを取った。
【0297】
ＴＧＩ（％）は、腫瘍増殖阻害率を反映する。ＴＧＩ（％）＝［１－（特定の治療群の投与終了時の平均腫瘍体積－当該治療群の投与開始時の平均腫瘍体積）／（溶媒対照群の治療終了時の平均腫瘍体積－溶媒対照群の治療開始時の平均腫瘍体積）］×１００％。
【0298】
実験終了後腫瘍重量を検出し、Ｔ／Ｃｗｅｉｇｈｔ百分率を計算し、Ｔｗｅｉｇｈｔ及びＣｗｅｉｇｈｔは、それぞれ投与群と溶媒対照群の腫瘍重量を表す。
【0299】
統計分析は、試験終了時のＲＴＶデータに基づいてＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトを使用して実行された。複数の群間の比較は、ｏｎｅ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡを使用して分析し、ｐ＜０．０５は、有意差があると見なされ、ｐ＞０．０５は有意差がないと見なされた。
【0300】
実験結果：
本実験では、ＥＳＲ１ Ｄ５３８Ｇ突然変異を有するヒト乳癌ＭＣＦ７細胞異種移植腫瘍モデルにおける式（ＩＩ）で表される化合物のＢ型結晶の薬効を評価し、ブランク対照群を参照とした。異なる時点での各群の腫瘍体積及び統計処理は表１２及び図２９に示される通りであり、投与期間中のマウスの体重の変化は図１３に示される通りである。
本実験では、ＥＳＲ１ Ｄ５３８Ｇ突然変異を有するヒト乳癌ＭＣＦ７細胞異種移植腫瘍モデルにおける式（ＩＩ）で表される化合物のＢ型結晶の薬効を評価し、ブランク対照群を参照とした。異なる時点での各群の腫瘍体積及び統計処理は表１２及び図２９に示される通りであり、投与期間中のマウスの体重の変化は図１３に示される通りである。
【0301】
【表29】
【0302】
群分け後３１日目、ブランク対照群の平均腫瘍体積は６５４ｍｍ３であった。パルボシクリブ（５０ｍｇ／ｋｇ）単独投与群の平均腫瘍体積は２９５ｍｍ３であり、Ｔ／Ｃ値は４５．４７％であり、ＴＧＩは７０．９１％であり、ブランク対照群と比較してｐ値＜０．０００１であり、パルボシクリブ単独投与は有意な抗腫瘍効果があることが確認された。式（ＩＩ）で表される化合物のＢ型結晶は５ｍｇ／ｋｇ、１５ｍｇ／ｋｇ及び５０ｍｇ／ｋｇの投与量で平均腫瘍体積がそれぞれ１５３ｍｍ３、１２４ｍｍ３及び４３ｍｍ３であり、Ｔ／Ｃはそれぞれ２４．１５％、１８．９３％及び６．３７％であり、ＴＧＩはそれぞれ９８．８６％、１０４．５２％及び１２０．５１％であり、ブランク対照群と比較してｐ値はいずれも＜０．０００１であった。式（ＩＩ）で表される化合物のＢ型結晶は上記の投与量でいずれも有意な抗腫瘍効果を有し、客観的奏効率は良好な用量依存性を示した。式（ＩＩ）で表される化合物のＢ型結晶（５ｍｇ／ｋｇ）とパルボシクリブ（５０ｍｇ／ｋｇ）の併用投与群の平均腫瘍体積は３１ｍｍ３であり、そのＴ／Ｃは４．６７％であり、ＴＧＩは１２２．８３％であり、ブランク対照群ｐ値＜０．０００１であり、式（ＩＩ）で表される化合物のＢ型結晶又はパルボシクリブ単独投与群と比較して統計的有意性があり（ｐ値＜０．０００１、相乗係数は２．２１）、併用投与群の客観的奏効率は１００％に達した。従って、併用投与は単独投与よりも有意な抗腫瘍効果を有していた。
【0303】
上記の結果は、ＥＳＲ１ Ｄ５３８Ｇ突然変異を有するヒト乳癌ＭＣＦ７細胞皮下異種移植腫瘍ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスモデルにおいて、式（ＩＩ）で表される化合物のＢ型結晶は５ｍｇ／ｋｇ、１５ｍｇ／ｋｇ及び５０ｍｇ／ｋｇの投与量でいずれも有意な抗腫瘍効果を有することが示唆された。式（ＩＩ）で表される化合物のＢ型結晶は、５ｍｇ／ｋｇの投与量でパルボシクリブ（５０ｍｇ／ｋｇ）と併用することにより相乗的な抗腫瘍効果を有し、式（ＩＩ）で表される化合物のＢ型結晶の５０ｍｇ／ｋｇの抗腫瘍効果に相当した。
【0304】
実験結論：
式（ＩＩ）で表される化合物のＢ型結晶は、ＥＳＲ１ Ｄ５３８Ｇ突然変異を有するＭＣＦ７マウス皮下移植腫瘍の増殖に対して抗腫瘍効果を有し、所定の用量依存性を示し、パルボシクリブと併用すると単独投与よりも優れた抗腫瘍効果を示した。実験中、各試験群のマウスは、良好な耐薬性を示した。
式（ＩＩ）で表される化合物のＢ型結晶は、ＥＳＲ１ Ｄ５３８Ｇ突然変異を有するＭＣＦ７マウス皮下移植腫瘍の増殖に対して抗腫瘍効果を有し、所定の用量依存性を示し、パルボシクリブと併用すると単独投与よりも優れた抗腫瘍効果を示した。実験中、各試験群のマウスは、良好な耐薬性を示した。
【図面の簡単な説明】
【0305】
【図1】式（ＩＩＩ）で表される化合物のＡ型結晶のＸＲＰＤパターンである。
【図2】式（ＩＩＩ）で表される化合物のＡ型結晶のＴＧＡパターンである。
【図3】式（ＩＩＩ）で表される化合物のＡ型結晶のＤＳＣパターンである。
【図4】式（ＩＩ）で表される化合物のＢ型結晶のＸＲＰＤパターンである。
【図5】式（ＩＩ）で表される化合物のＢ型結晶のＴＧＡパターンである。
【図6】式（ＩＩ）で表される化合物のＢ型結晶のＤＳＣパターンである。
【図7】式（Ｉ）で表される化合物のＣ型結晶のＸＲＰＤパターンである。
【図8】式（Ｉ）で表される化合物のＣ型結晶のＤＳＣパターンである。
【図9】式（ＩＩ）で表される化合物の単結晶構造の模式図である。
【図10】試験化合物を投与した後のヒト乳癌ＭＣＦ７細胞皮下異種移植腫瘍モデル担癌マウスにおける式（Ｉ）で表される化合物のＣ型結晶の腫瘍増殖曲線である。
【図11】試験化合物を投与した後のヒト乳癌ＭＣＦ７細胞皮下異種移植腫瘍モデル担癌マウスにおけるフルベストラント及びパルボシクリブと比較した式（Ｉ）で表される化合物Ｃ型結晶の腫瘍増殖曲線である。
【図12】試験化合物の投与後のヒト乳癌ＭＣＦ７細胞皮下異種移植腫瘍モデル担癌マウスにおけるパルボシクリブと組み合わせた式（Ｉ）で表される化合物のＣ型結晶の腫瘍増殖曲線である。
【図13】式（Ｉ）で表される化合物のＣ型結晶の投与過程におけるヒト乳癌ＭＣＦ７細胞皮下異種移植腫瘍モデル担癌マウスの体重変化百分率（％）である。
【図14】フルベストラント及びパルボシクリブと比較した式（Ｉ）で表される化合物のＣ型結晶の投与過程におけるヒト乳癌ＭＣＦ７細胞皮下異種移植腫瘍モデル担癌マウスの体重変化百分率（％）である。
【図15】パルボシクリブと組み合わせた式（Ｉ）で表される化合物のＣ型結晶の投与過程におけるヒト乳癌ＭＣＦ７細胞皮下異種移植腫瘍モデル担癌マウスの体重変化百分率（％）である。
【図16】ＥＳＲ１ Ｄ５３８Ｇ突然変異を有するＭＣＦ７細胞皮下異種移植腫瘍モデル担癌マウスにおける式（ＩＩ）で表される化合物のＢ型結晶の腫瘍増殖曲線である。
【図17】ＥＳＲ１ Ｄ５３８Ｇ突然変異を有するＭＣＦ７細胞皮下異種移植腫瘍モデル担癌マウスにおけるパルボシクリブと組み合わせた式（ＩＩ）で表される化合物のＢ型結晶の腫瘍増殖曲線である。
【図18】式（ＩＩ）で表される化合物のＢ型結晶の投与過程におけるＥＳＲ１ Ｄ５３８Ｇ突然変異を有するＭＣＦ７細胞皮下異種移植腫瘍モデル担癌マウスの体重変化百分率（％）である。
【図19】パルボシクリブと組み合わせた式（ＩＩ）で表される化合物のＢ型結晶の投与過程におけるＥＳＲ１ Ｄ５３８Ｇ突然変異を有するＭＣＦ７細胞皮下異種移植腫瘍モデル担癌マウスの体重変化百分率（％）である。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【手続補正書】
【提出日】2024-09-05
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
式（ＩＩＩ）で表される化合物。【化1】
【請求項2】
粉末Ｘ線回折スペクトルが以下の２θ角：２０．９２±０．２０°、２２．０８±０．２０°、２４．７０±０．２０°において特徴的な回折ピークを有することを特徴とする、式（ＩＩＩ）で表される化合物のＡ型結晶。【化2】
【請求項3】
粉末Ｘ線回折スペクトルが以下の２θ角：１２．３０±０．２０°、１５．６４±０．２０°、１７．００±０．２０°、１８．２６±０．２０°、２０．９２±０．２０°、２２．０８±０．２０°、２２．６２±０．２０°、２４．７０±０．２０°において回折ピークを有することを特徴とする、請求項２に記載の式（ＩＩＩ）で表される化合物のＡ型結晶。
【請求項4】
粉末Ｘ線回折スペクトルが以下の２θ角：５．１８±０．２０°、５．９２±０．２０°、８．１２±０．２０°、１２．３０±０．２０°、１５．６４±０．２０°、１７．００±０．２０°、１８．２６±０．２０°、２０．９２±０．２０°、２２．０８±０．２０°、２４．７０±０．２０°において回折ピークを有することを特徴とする、請求項２に記載の式（ＩＩＩ）で表される化合物のＡ型結晶。
【請求項5】
粉末Ｘ線回折スペクトルが以下の２θ角：５．１８±０．２０°、５．９２±０．２０°、８．１２±０．２０°、１２．３０±０．２０°、１５．６４±０．２０°、１７．００±０．２０°、１８．２６±０．２０°、１９．５４±０．２０°、２０．９２±０．２０°、２２．０８±０．２０°、２２．６２±０．２０°、２４．７０±０．２０°において回折ピークを有することを特徴とする、請求項４に記載の式（ＩＩＩ）で表される化合物のＡ型結晶。
【請求項6】
粉末Ｘ線回折スペクトルが以下の２θ角：５．１８±０．２０°、５．９２±０．２０°、８．１２±０．２０°、１２．３０±０．２０°、１５．６４±０．２０°、１７．００±０．２０°、１８．２６±０．２０°、１９．５４±０．２０°、２０．９２±０．２０°、２２．０８±０．２０°、２４．７０±０．２０°、２５．４８±０．２０°において回折ピークを有することを特徴とする、請求項４に記載の式（ＩＩＩ）で表される化合物のＡ型結晶。
【請求項7】
粉末Ｘ線回折スペクトルが以下の２θ角：５．１８±０．２０°、５．９２±０．２０°、８．１２±０．２０°、１２．３０±０．２０°、１５．６４±０．２０°、１７．００±０．２０°、１８．２６±０．２０°、１９．５４±０．２０°、２０．９２±０．２０°、２２．０８±０．２０°、２２．６２±０．２０°、２４．７０±０．２０°、２５．４８±０．２０°において回折ピークを有することを特徴とする、請求項４に記載の式（ＩＩＩ）で表される化合物のＡ型結晶。
【請求項8】
粉末Ｘ線回折スペクトルが以下の２θ角：５．１８±０．２０°、５．９２±０．２０°、８．１２±０．２０°、１２．３０±０．２０°、１５．６４±０．２０°、１６．４２±０．２０°、１７．００±０．２０°、１７．６６±０．２０°、１８．２６±０．２０°、１９．５４±０．２０°、２０．０６±０．２０°、２０．９２±０．２０°、２２．０８±０．２０°、２２．６２±０．２０°、２３．３２±０．２０°、２３．８６±０．２０°、２４．７０±０．２０°、２５．４８±０．２０°、２６．６８±０．２０°、２８．５０±０．２０°、２９．５４±０．２０°、３１．５８±０．２０°、３３．２０±０．２０°において回折ピークを有することを特徴とする、請求項２～７のいずれか一項に記載の式（ＩＩＩ）で表される化合物のＡ型結晶。
【請求項9】
粉末Ｘ線回折スペクトルが以下の２θ角：５．１８１°、５．９２０°、８．１１９°、１２．２９９°、１５．６３８°、１６．４１８°、１７．００２°、１７．６６０°、１８．２６１°、１９．５３９°、２０．０６１°、２０．９１９°、２２．０８０°、２２．６２１°、２３．３２０°、２３．８６１°、２４．７００°、２５．４８３°、２６．６８１°、２８．４９８°、２９．５４２°、３１．５７８°、３３．１９８°において回折ピークを有することを特徴とする、請求項２～７のいずれか一項に記載の式（ＩＩＩ）で表される化合物のＡ型結晶。
【請求項10】
熱重量分析曲線は１５０．０００±３℃において重量が０．１９８％減少し、２４０．０００±３℃において重量が１０．８８０％減少することを特徴とする、請求項２～７のいずれか一項に記載の式（ＩＩＩ）で表される化合物のＡ型結晶。
【請求項11】
示差走査熱量曲線が１７５．８７±５℃、２１４．６８±５℃及び２９２．１１±５℃において吸熱ピークの開始点を有することを特徴とする、請求項２～７のいずれか一項に記載の式（ＩＩＩ）で表される化合物のＡ型結晶。
【請求項12】
粉末Ｘ線回折スペクトルが以下の２θ角：１４．２４±０．２０°、２２．１８±０．２０°、２３．７８±０．２０°において特徴的な回折ピークを有することを特徴とする、式（ＩＩ）で表される化合物のＢ型結晶。【化3】
【請求項13】
粉末Ｘ線回折スペクトルが以下の２θ角：６．５０±０．２０°、１４．２４±０．２０°、１５．８０±０．２０°、１８．１８±０．２０°、２２．１８±０．２０°、２３．７８±０．２０°、２５．３０±０．２０°において回折ピークを有することを特徴とする、請求項１２に記載の式（ＩＩ）で表される化合物のＢ型結晶。
【請求項14】
粉末Ｘ線回折スペクトルが以下の２θ角：６．５０±０．２０°、７．８６±０．２０°、１４．２４±０．２０°、１５．８０±０．２０°、１６．９２±０．２０°、１８．１８±０．２０°、１９．６６±０．２０°、２０．７６±０．２０°、２２．１８±０．２０°、２３．７８±０．２０°、２５．３０±０．２０°、２６．１２±０．２０°において回折ピークを有することを特徴とする、請求項１３に記載の式（ＩＩ）で表される化合物のＢ型結晶。
【請求項15】
粉末Ｘ線回折スペクトルが以下の２θ角：６．４９９°、７．８６０°、９．７３９°、１０．２５７°、１１．８６２°、１２．２５５°、１３．０２１°、１４．２４０°、１５．４１７°、１５．７９７°、１６．５４１°、１６．９２０°、１７．５５８°、１８．１８２°、１８．４３９°、１８．７０２°、１９．６６０°、２０．３８１°、２０．７６１°、２１．４９４°、２１．６４７°、２２．１８０°、２３．７８１°、２４．０９９°、２４．４９８°、２５．３０４°、２６．１１８°、２６．８２１°、２７．２３９°、２８．５７９°、２８．９２４°、２９．３０２°、２９．８８１°、３０．２７８°、３０．６８１°、３０．９３８°、３１．７６４°、３２．９７８°、３４．２６０°、３５．１０１°、３５．４１９°、３５．７６１°、３６．５９７°、３７．０８３°、３７．５４０°、３８．４２３°において回折ピークを有することを特徴とする、請求項１４に記載の式（ＩＩ）で表される化合物のＢ型結晶。
【請求項16】
熱重量分析曲線スペクトルは２００．０００±３℃において重量が０．０８５％減少することを特徴とする、請求項１５に記載の式（ＩＩ）で表される化合物のＢ型結晶。
【請求項17】
粉末Ｘ線回折スペクトルが以下の２θ角：４．９０±０．２０°、１５．８２±０．２０°、２２．２６±０．２０°において特徴的な回折ピークを有することを特徴とする、式（Ｉ）で表される化合物のＣ型結晶。【化4】
【請求項18】
粉末Ｘ線回折スペクトルが以下の２θ角：４．９０±０．２０°、９．８２±０．２０°、１５．８２±０．２０°、１７．４８±０．２０°、１８．６４±０．２０°、２２．２６±０．２０°、２３．７４±０．２０°、２９．３６±０．２０°において回折ピークを有することを特徴とする、請求項１７に記載の式（Ｉ）で表される化合物のＣ型結晶。
【請求項19】
粉末Ｘ線回折スペクトルが以下の２θ角：３０±０．２０°、４．９０±０．２０°、９．８２±０．２０°、１１．０６±０．２０°、１４．２０±０．２０°、１５．８２±０．２０°、１７．４８±０．２０°、１８．６４±０．２０°、２２．２６±０．２０°、２３．７４±０．２０°、２４．４６±０．２０°、２９．３６±０．２０°において回折ピークを有することを特徴とする、請求項１８に記載の式（Ｉ）で表される化合物のＣ型結晶。
【請求項20】
粉末Ｘ線回折スペクトルが以下の２θ角：３．３０１°、４．９０１°、７．８９８°、９．３１９°、９．８１９°、１１．０６１°、１４．２００°、１４．７２１°、１５．１９７°、１５．８２１°、１６．４５７°、１７．４８１°、１８．１０１°、１８．６４２°、１９．７６２°、２０．９６１°、２１．３８２°、２２．２５９°、２３．７４０°、２４．４６１°、２５．７６１°、２６．２９５°、２６．９４３°、２７．５１８°、２９．３５８°、３０．０７５°、３１．３１７°、３１．９１６°、３４．５９８°、３７．６６１°において回折ピークを有することを特徴とする、請求項１９に記載の式（Ｉ）で表される化合物のＣ型結晶。【国際調査報告】