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特表2024-546196ＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡを標的とするｓｎＲＮＡ、及びその使用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-12-17
(54)【発明の名称】ＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡを標的とするｓｎＲＮＡ、及びその使用
(51)【国際特許分類】
C12N 15/113 20100101AFI20241210BHJP
C12N 15/86 20060101ALI20241210BHJP
C12N 7/01 20060101ALI20241210BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20241210BHJP
C12P 21/02 20060101ALI20241210BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20241210BHJP
A61P 27/02 20060101ALI20241210BHJP
A61P 27/16 20060101ALI20241210BHJP
A61K 35/76 20150101ALI20241210BHJP
A61K 35/12 20150101ALI20241210BHJP
A61K 31/7105 20060101ALI20241210BHJP
【ＦＩ】
C12N15/113 Z ZNA
C12N15/86 Z
C12N7/01
C12N5/10
C12P21/02 C
A61K48/00
A61P27/02
A61P27/16
A61K35/76
A61K35/12
A61K31/7105
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024540776
(86)(22)【出願日】2022-12-21
(85)【翻訳文提出日】2024-07-30
(86)【国際出願番号】 CN2022140599
(87)【国際公開番号】W WO2023130959
(87)【国際公開日】2023-07-13
(31)【優先権主張番号】202210003448.3
(32)【優先日】2022-01-04
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】522039717
【氏名又は名称】広州瑞風生物科技有限公司
【氏名又は名称原語表記】ＧＵＡＮＧＺＨＯＵ ＲＥＦＯＲＧＥＮＥ ＭＥＤＩＣＩＮＥ ＣＯ．，ＬＴＤ．
(74)【代理人】
【識別番号】110001519
【氏名又は名称】弁理士法人太陽国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】リャン、チュンピン
(72)【発明者】
【氏名】オウ、チアユイ
(72)【発明者】
【氏名】シュイ、ホイ
(72)【発明者】
【氏名】リン、スーミャオ
【テーマコード（参考）】
4B064
4B065
4C084
4C086
4C087
【Ｆターム（参考）】
4B064AG01
4B064CA19
4B064CC24
4B064DA01
4B065AA93X
4B065AB01
4B065AC14
4B065AC20
4B065BA02
4B065BA05
4B065CA24
4B065CA46
4C084AA13
4C084NA14
4C084ZA331
4C084ZA332
4C084ZA341
4C084ZA342
4C086AA01
4C086AA02
4C086EA16
4C086MA01
4C086MA04
4C086NA14
4C086ZA33
4C086ZA34
4C087AA01
4C087AA02
4C087BB63
4C087BC83
4C087CA04
4C087CA12
4C087NA14
4C087ZA33
4C087ZA34
(57)【要約】
認識ドメインは、ＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡ配列に逆相補的であり、ＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡに結合することによってエクソン１３をスプライシングスキッピングするＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡを標的とするｓｎＲＮＡを提供する。当該ｓｎＲＮＡは、ＡＯＮよりも効率的にエクソン１３のスキッピングを促進する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡ配列に逆相補的な認識ドメインを含み、ＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡに結合することによってエクソン１３をスプライシングスキッピングすることを特徴とする、ＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡを標的とするｓｎＲＮＡ。
【請求項2】
前記ＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡ配列は、ＵＳＨ２Ａエクソン１３、イントロン１２又はイントロン１３の領域から選択されることを特徴とする、請求項１に記載のｓｎＲＮＡ。
【請求項3】
前記ＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡ配列に対応するゲノム位置領域は、Ｃｈｒ１：２１６２４７１４２－２１６２４７１８５、Ｃｈｒ１：２１６２４７１３０－２１６２４７１６１、Ｃｈｒ１：２１６２４６６１６－２１６２４６６４９、Ｃｈｒ１：２１６２４７２１３－２１６２４７２４６、Ｃｈｒ１：２１６２４７２０４－２１６２４７２３２、Ｃｈｒ１：２１６２４７１８７－２１６２４７２２０及びＣｈｒ１：２１６２４７１６９－２１６２４７２０２から選択されることを特徴とする、請求項２に記載のｓｎＲＮＡ。
【請求項4】
前記ＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡ配列は、配列番号１～７に示される配列から選択されることを特徴とする、請求項３に記載のｓｎＲＮＡ。
【請求項5】
前記ｓｎＲＮＡの認識ドメインは、前記ＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡ配列中の少なくとも１６ｂｐの連続配列に逆相補的であり、好ましくは、少なくとも２０ｂｐの連続配列に逆相補的であり、より好ましくは、２０ｂｐ～２７ｂｐの連続配列に逆相補的であることを特徴とする、請求項１～４のいずれか１項に記載のｓｎＲＮＡ。
【請求項6】
前記ＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡ配列に対応するゲノム位置領域は、Ｃｈｒ１：２１６２４７２２３－２１６２４７２４６、Ｃｈｒ１：２１６２４７２１８－２１６２４７２４１、Ｃｈｒ１：２１６２４７２１３－２１６２４７２３６、Ｃｈｒ１：２１６２４７２０９－２１６２４７２３２、Ｃｈｒ１：２１６２４７２０４－２１６２４７２２７、Ｃｈｒ１：２１６２４７１９７－２１６２４７２２０、Ｃｈｒ１：２１６２４７１９１－２１６２４７２１４、Ｃｈｒ１：２１６２４７１８７－２１６２４７２１０、Ｃｈｒ１：２１６２４７１７９－２１６２４７２０２、Ｃｈｒ１：２１６２４７１７４－２１６２４７１９７、Ｃｈｒ１：２１６２４７１６９－２１６２４７１９２、Ｃｈｒ１：２１６２４７１６２－２１６２４７１８５、Ｃｈｒ１：２１６２４７１５５－２１６２４７１７８、Ｃｈｒ１：２１６２４７１４７－２１６２４７１６８、Ｃｈｒ１：２１６２４７１４７－２１６２４７１７３、Ｃｈｒ１：２１６２４７１４２－２１６２４７１６５、Ｃｈｒ１：２１６２４７１３８－２１６２４７１６１、Ｃｈｒ１：２１６２４７１３０－２１６２４７１５３、Ｃｈｒ１：２１６２４６６２６－２１６２４６６４９、Ｃｈｒ１：２１６２４６６２２－２１６２４６６４５、及びＣｈｒ１：２１６２４６６１６－２１６２４６６３９から選択され；好ましくは、Ｃｈｒ１：２１６２４７２１３－２１６２４７２３６、Ｃｈｒ１：２１６２４７２０９－２１６２４７２３２、Ｃｈｒ１：２１６２４７２０４－２１６２４７２２７、Ｃｈｒ１：２１６２４７１９７－２１６２４７２２０、Ｃｈｒ１：２１６２４７１９１－２１６２４７２１４、Ｃｈｒ１：２１６２４７１８７－２１６２４７２１０、Ｃｈｒ１：２１６２４７１７９－２１６２４７２０２、Ｃｈｒ１：２１６２４７１７４－２１６２４７１９７、及びＣｈｒ１：２１６２４７１６９－２１６２４７１９２であり；或いは
好ましくは、Ｃｈｒ１：２１６２４７１６２－２１６２４７１８５、Ｃｈｒ１：２１６２４７１５５－２１６２４７１７８、Ｃｈｒ１：２１６２４７１４７－２１６２４７１６８、Ｃｈｒ１：２１６２４７１４７－２１６２４７１７３、Ｃｈｒ１：２１６２４７１４２－２１６２４７１６５、Ｃｈｒ１：２１６２４７１３８－２１６２４７１６１、Ｃｈｒ１：２１６２４７１３０－２１６２４７１５３、Ｃｈｒ１：２１６２４６６２６－２１６２４６６４９、Ｃｈｒ１：２１６２４６６２２－２１６２４６６４５、及びＣｈｒ１：２１６２４６６１６－２１６２４６６３９であり；
より好ましくは、Ｃｈｒ１：２１６２４７２１３－２１６２４７２３６、Ｃｈｒ１：２１６２４７２０９－２１６２４７２３２、Ｃｈｒ１：２１６２４７２０４－２１６２４７２２７、Ｃｈｒ１：２１６２４７１９７－２１６２４７２２０、Ｃｈｒ１：２１６２４７１９１－２１６２４７２１４、Ｃｈｒ１：２１６２４７１８７－２１６２４７２１０、Ｃｈｒ１：２１６２４７１７９－２１６２４７２０２、Ｃｈｒ１：２１６２４７１７４－２１６２４７１９７、Ｃｈｒ１：２１６２４７１６９－２１６２４７１９２、Ｃｈｒ１：２１６２４７１６２－２１６２４７１８５、Ｃｈｒ１：２１６２４７１５５－２１６２４７１７８、Ｃｈｒ１：２１６２４７１４７－２１６２４７１６８、Ｃｈｒ１：２１６２４７１４７－２１６２４７１７３、Ｃｈｒ１：２１６２４７１４２－２１６２４７１６５、及びＣｈｒ１：２１６２４７１３０－２１６２４７１５３であり；
更に好ましくは、Ｃｈｒ１：２１６２４７２１３－２１６２４７２３６、Ｃｈｒ１：２１６２４７２０９－２１６２４７２３２、Ｃｈｒ１：２１６２４７２０４－２１６２４７２２７、Ｃｈｒ１：２１６２４７１９７－２１６２４７２２０、Ｃｈｒ１：２１６２４７１９１－２１６２４７２１４、Ｃｈｒ１：２１６２４７１８７－２１６２４７２１０、Ｃｈｒ１：２１６２４７１７９－２１６２４７２０２、Ｃｈｒ１：２１６２４７１７４－２１６２４７１９７、Ｃｈｒ１：２１６２４７１６９－２１６２４７１９２、Ｃｈｒ１：２１６２４７１６２－２１６２４７１８５、Ｃｈｒ１：２１６２４７１４７－２１６２４７１６８、Ｃｈｒ１：２１６２４７１４７－２１６２４７１７３、Ｃｈｒ１：２１６２４７１４２－２１６２４７１６５、及びＣｈｒ１：２１６２４７１３０－２１６２４７１５３であり；
或いは、
前記ＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡ配列に対応するゲノム位置領域は、Ｃｈｒ１：２１６２４７２１８－２１６２４７２４１、Ｃｈｒ１：２１６２４７１８７－２１６２４７２１０、Ｃｈｒ１：２１６２４７１４７－２１６２４７１６８、Ｃｈｒ１：２１６２４７１４７－２１６２４７１７３、Ｃｈｒ１：２１６２４７１４２－２１６２４７１６５、及びＣｈｒ１：２１６２４７１３０－２１６２４７１５３から選択されることを特徴とする、請求項１に記載のｓｎＲＮＡ。
【請求項7】
前記ｓｎＲＮＡの認識ドメインは、配列番号８～２８に示される配列から選択され、好ましくは、配列番号１０～１８又は配列番号１９～２８に示される配列であり、より好ましくは、配列番号１０～２３、又は配列番号２５に示される配列であり、更に好ましくは、配列番号１０～１９、配列番号２１～２３又は配列番号２５に示される配列であり；或いは、
前記ｓｎＲＮＡの認識ドメインは、配列番号９、配列番号１５、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３又は配列番号２５に示される配列から選択され；好ましくは、配列番号１５、配列番号２１、配列番号２２又は配列番号２３に示される配列であることを特徴とする、請求項１に記載のｓｎＲＮＡ。
【請求項8】
前記ｓｎＲＮＡは、Ｕ１－ｓｎＲＮＡ又はＵ７－ｓｎＲＮＡであることを特徴とする、請求項１～７のいずれか１項に記載のｓｎＲＮＡ。
【請求項9】
前記ｓｎＲＮＡは、ｓｍ配列を含み、前記ｓｍ配列は、好ましくは、ｓｍＯＰＴ配列であり、前記ｓｍＯＰＴ配列は、より好ましくは、配列番号３１に示されることを特徴とする、請求項８に記載のｓｎＲＮＡ。
【請求項10】
前記ｓｎＲＮＡは、認識ドメイン、ｓｍＯＰＴ配列、及びＵ１－ｓｎＲＮＡ ｓｃａｆｆｏｌｄ又はＵ７－ｓｎＲＮＡ ｓｃａｆｆｏｌｄ配列を含み；好ましくは、前記Ｕ７－ｓｎＲＮＡ ｓｃａｆｆｏｌｄ配列は配列番号４９に示される通りであることを特徴とする、請求項９に記載のｓｎＲＮＡ。
【請求項11】
前記ｓｎＲＮＡは、更にスプライシング調節タンパク質を動員するモチーフを含み、前記スプライシング調節タンパク質は、好ましくは、ｈｎＲＮＰＡ１、ＳＲＳＦ１、ＲＢＭ４、ＤＡＺＡＰ１又はＳＲのうちの少なくとも１つを含むことを特徴とする、請求項１０に記載のｓｎＲＮＡ。
【請求項12】
請求項１～１１のいずれか一項に記載のｓｎＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含むことを特徴とする、ヌクレオチド。
【請求項13】
請求項１～１０のいずれか一項に記載のｓｎＲＮＡ及び／又は請求項１１に記載のヌクレオチドを含むことを特徴とする、ベクター。
【請求項14】
請求項１～１１のいずれか一項に記載のｓｎＲＮＡ、請求項１２に記載のヌクレオチド、及び／又は請求項１３に記載のベクターを含むことを特徴とする、ウイルス粒子。
【請求項15】
請求項１～１１のいずれか一項に記載のｓｎＲＮＡ、請求項１２に記載のヌクレオチド、請求項１３に記載のベクター、及び／又は請求項１４に記載のウイルス粒子を含むことを特徴とする、細胞。
【請求項16】
請求項１～１１のいずれか一項に記載のｓｎＲＮＡ、請求項１２に記載のヌクレオチド、請求項１３に記載のベクター、請求項１４に記載のウイルス粒子、及び／又請求項１５に記載の細胞を含むことを特徴とする、医薬組成物。
【請求項17】
ＵＳＨ２Ａ遺伝子のｐｒｅ－ｍＲＮＡと、請求項１～１１のいずれか１項に記載のｓｎＲＮＡ、請求項１２に記載のヌクレオチド、請求項１３に記載のベクター、請求項１４に記載のウイルス粒子、請求項１５に記載の細胞、及び／又は請求項１６に記載の医薬組成物とを接触させることを含む、エクソン１３発現産物を欠失させたＵｓｈｅｒｉｎタンパク質の取得方法。
【請求項18】
眼疾患及び／又は耳疾患を予防及び／又は治療する医薬の調製における請求項１～１１のいずれか１項に記載のｓｎＲＮＡ、請求項１２に記載のヌクレオチド、請求項１３に記載のベクター、請求項１４に記載のウイルス粒子、請求項１５に記載の細胞、請求項１６に記載の医薬組成物、及び／又は請求項１７に記載の方法の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、遺伝子工学技術の分野に関し、特にＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡを標的とするｓｎＲＮＡ、及びその使用に関する。
【背景技術】
【0002】
Ｕｓｈｅｒ症候群（Ｕｓｈｅｒ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ）は、難聴－網膜色素変性症症候群としても知られる遺伝性疾患の一種であり、程度の異なる先天性感音性難聴と、網膜色素変性症（ＲＰ）による進行性の視力喪失を特徴とする。臨床的に、Ｕｓｈｅｒ症候群は下記の３つのタイプに分類できる：１、Ｉ型Ｕｓｈｅｒ症候群、患者は聴覚に関しては先天性重度感音性難聴、前庭反応に関しては前庭反応の消失、視覚に関しては思春期前の網膜色素変性症を患い、その後、徐々に失明し、このタイプに関連する遺伝子には、ＭＹＯ７Ａ、ＣＤＨ２３、ＵＳＨ１Ｃ、ＰＣＨＤ１５などが含まれ；２、ＩＩ型Ｕｓｈｅｒ症候群、患者は聴覚に関しては先天性中等度から重度の感音性難聴、前庭反応に関しては正常、視覚に関しては思春期前の網膜色素変性症を患い、徐々に失明し、このタイプに関連する遺伝子には、ＳＨ２Ａ、ＧＰＲ９８、ＷＨＲＮなどが含まれ；３、ＩＩＩ型Ｕｓｈｅｒ症候群、患者は聴覚に関しては進行性の感音性難聴、前庭反応に関しては正常、視覚に関しては、思春期の終わりに網膜色素変性症が発症し、徐々に失明し、このタイプに関連する遺伝子には、ＣＬＲＮ１などが含まれる。その中で、ＩＩ型Ｕｓｈｅｒ症候群はＵｓｈｅｒ症候群の５０％以上を占め、ＵＳＨ２Ａ遺伝子変異はＩＩ型Ｕｓｈｅｒ症候群の最も一般的な原因であり、Ｕｓｈｅｒ症候群患者の５０％以上を占めている。同時に、ＵＳＨ２Ａ遺伝子の突然変異も非症候性網膜色素変性症（ＮＳＲＰ）の重要な原因の１つである。
【0003】
ＵＳＨ２Ａは１ｑ４１に位置し、ゲノム内で８００ｋｂ以上に広がり、大型の膜貫通タンパク質Ｕｓｈｅｒｉｎをコードし、Ｕｓｈｅｒｉｎは、網膜光受容細胞と内耳有毛細胞の原形質膜に固定されており、繊毛の発達と維持に不可欠な構成要素である。網膜でＵｓｈｅｒｉｎはＵＳＨ２複合体の重要な部分であり、光受容体の外節の安定化に役割を果たしていると考えられている。ＵＳＨ２Ａには２つのサブタイプがあり、網膜細胞の主なサブタイプには７２個のエクソンが含まれ、コード領域の長さは約１５．６ｋｂである。Ｕｓｈｅｒｉｎタンパク質の細胞外部分には、１０個のＬａｍｉｎｉｎ ＥＧＦ－ｌｉｋｅ（ＬＥ）ドメインと３５個のＦｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ ｔｙｐｅ ３（ＦＮ３）ドメインを含む、多くの反復ドメインが含まれる。ヒトＵＳＨ２Ａエクソン１３は長さが６４２ｂｐであり、Ｕｓｈｅｒｉｎタンパク質の１０個のＬＥドメインのうちの４個であるアミノ酸７２３～９３６をコードする。
【0004】
ＵＳＨ２Ａ遺伝子のエクソン１３、エクソン５０、及びイントロン４０の突然変異は、Ｕｓｈｅｒ症候群を引き起こす可能性がある。現在までに、ＵＳＨ２Ａ遺伝子全体に分布する１，０００個以上の病原性変異が同定されており、そのうちエクソン１３はＵＳＨ２Ａ遺伝子で最も頻繁に突然変異するエクソンであり、約３５％を占めている。ＵＳＨ２Ａ遺伝子のエクソン１３の突然変異には、ｃ．２８０２Ｔ＞Ｇ（ｐ．Ｃｙｓ９３４Ｔｒｐ、中国の患者で頻度が最も高い突然変異）、ｃ．２２９９ｄｅｌＧ（ｐ．Ｇｌｕ７６７Ｓｅｒｆｓ＊２１、ヨーロッパとアメリカの患者で頻度が最も高い突然変異）、ｃ．２２７６Ｇ＞Ｔ（ｐ．ｃｙｓ７５９ｐｈｅ、非症候性ＲＰを引き起こす頻度が最も高い突然変異部位）、ｃ．２５２２Ｃ＞Ａ（ｐ．Ｓ８４１Ｙ）、ｃ．２２４２Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ７４８Ｘ）、ｃ．２５４１Ｃ＞Ａ（Ｃ８４７Ｘ）、ｃ．２７６１ｄｅｌＣ（Ｌｅｕ９２１ｆｓ）及びｃ．２７７６Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｒ９２６Ｃ）、ｃ．２２０９Ｃ＞Ｔ、ｃ．２３１０ｄｅｌＡ、ｃ．２３９１＿２３９２ｄｅＩＴＧ、ｃ．２４３１Ａ＞Ｔ、ｃ．２４３１＿２４３２ｄｅｌＡＡ、ｃ．２４４０Ｃ＞Ｔ、ｃ．２５２５ｄｕｐ、ｃ．２６１０Ｃ＞Ａ、ｃ．２７５５Ｃ＞Ｔ、ｃ．２１７６Ｔ＞Ｃ、ｃ．２２３６Ｃ＞Ｇ、ｃ．２２９６Ｔ＞Ｃ、ｃ．２３３２Ｇ＞Ｔ、ｃ．２３３９Ｇ＞Ｔ（ＰＭＩＤ：３１９０４０９１）が含まれる。
【0005】
ＵＳＨ２Ａ遺伝子のエクソン１３については、既存の技術では一般に３つの一般的な方法があり、１つ目は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを通じてゲノムＤＮＡを編集して、エクソン１３を直接削除するか、ＲＮＡスプライシング関連部位を破壊することである。ただし、セグメント欠失の使用には、染色体の再配列、ウイルスの組込み、逆再組込みなどのリスクが伴い、並びに、ＣＡＳシステムが長時間発現する場合、又は２つのｇＲＮＡによって誘導される二重切断が比較的大きなゲノムバックグラウンドに基づいて実行される場合、オフターゲットの確率が高くなる。２つ目は、単一の塩基エディターを使用して、上記のスプライシング関連部位の主要な塩基を変更する方法であり、これにより、エクソンスキッピングも促進される可能性がある。ただし、既存の単一塩基エディターは単一のＡＡＶベクターを介してロードすることができず、ＰＡＭ、編集ウィンドウ、及び塩基変換タイプによって制限され、スプライシング関連部位の近くに適切なｇＲＮＡがない可能性がある。３つ目は、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮｓ、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ）を使用して、ｐｒｅ－ｍＲＮＡスプライシングを標的にし、より高い効率でエクソンスキッピングを促進することである。ただし、ＡＯＮはエクソン１３のスキッピングを促進すると同時に、エクソン１２とエクソン１３の同時スキッピングも促進し、一部のＡＯＮ処理では、ダブルスキッピングが発生し、シングルスキッピングが発生しない場合もある。エクソン１２の全長は１９６ｂｐであり、これは３の整数倍ではなく、欠失はフレームシフト突然変異を引き起こし、スプライシングの二重ジャンプ後のＵＳＨ２Ａタンパク質が不活化され、ＡＯＮ効果は長く続かず、薬剤の投与量が高く；スプライシングスキッピングを誘発する効率が高くない。
【発明の概要】
【0006】
上記の課題を解決するために、本発明は、ＡＯＮよりも効率的にエクソン１３のスキッピングを促進することができる、ＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡを標的とするｓｎＲＮＡを提供する。
【0007】
上記の目的を達成するために、本発明は、認識ドメインがＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡ配列に逆相補的であり、ＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡに結合することにより、エクソン１３のスプライシングスキッピングを誘導するＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡを標的とするｓｎＲＮＡを提供する。
【0008】
ＵＳＨ２Ａを調査及び研究した後、発明者は、ＵＳＨ２Ａコード領域の長さが約１５．６ｋｂであるため、従来の遺伝子治療送達方法（組換えレンチウイルス、組換えアデノ随伴ウイルスなど）ではこれほど大きな配列パッケージングすることが困難であるため、ＵＳＨ２Ａを直接送達することで治療することは困難であることを発見した。マウスＵＳＨ２Ａのエクソン１２はヒトＵＳＨ２Ａのエクソン１３と相同であり、両方とも長さは６４２ｂｐであり、このエクソンの除去はその後のフレームシフト突然変異を引き起こさなかった。同時に、本発明者らは、マウスＵＳＨ２Ａのエキソン１２をノックアウトした後でも、Ｕｓｈｅｒｉｎは依然として正しく配置され、通常の機能を実行できることを発見した。従って、病原性突然変異を含むヒトＵＳＨ２Ａエクソン１３については、一連の手段を使用してジャンプを誘導して治療を実行することができる。
【0009】
同時に、細胞内には核内低分子ＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｎｕｃｌｅａｒＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ）が存在し、これは真核生物の転写後プロセシング中のＲＮＡスプライセオソーム（ｓｐｌｉｃｅｏｓｏｍｅ）の主成分であり、ｓｎＲＮＰタンパク質に結合することによってｍＲＮＡ前駆体のプロセシングに関与する。その長さは哺乳類では約１００～２１５ヌクレオチドであり、７つのカテゴリーに分類され、豊富なＵを含むためＵ１～Ｕ７と番号が付けられる。ただし、Ｕ７－ｓｎＲＮＰはスプライシングには関与しないが、複製依存性ヒストン（ＲＤＨ）ｐｒｅ－ｍＲＮＡの独特な３’末端プロセシングにおける重要な因子である。
【0010】
従って、本発明者らは、Ｕ７－ｓｎＲＮＡの非標準的なＳｍ結合部位を主なスプライソソームＵ－ｓｎＲＮＰに由来するコンセンサス配列で置き換え、Ｕ７－ｓｎＲＮＡの５’領域のヒストン結合配列を改変対象遺伝子の相補配列に変更してエクソンを標的とすることによりエクソンのスプライシングスキッピングを誘導することができる。
【0011】
本発明者らは、標的スクリーニングを通じて、エクソン１３のスプライシングスキッピング効果を誘導することができる、スプライシングスキッピングを誘導するＵ７－ｓｎＲＮＰの７つの標的領域及び２１の標的部位を発見し、同時に、Ｕ７－ｓｍＯＰＴ－ｓｎＲＮＡの認識ドメインとＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡエクソン１３のスプライシングスキッピング関連部位が逆相補的になるように設計し、それにより、Ｕ７－ｓｍＯＰＴ－ｓｎＲＮＡがＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡエクソン１３のスプライシングスキッピング関連部位に結合するように誘導し、更に、ＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡエクソン１３のスプライシングスキッピングを誘導し、エクソン１２は保持するため、エクソン１２と１３の二重ジャンプなどの予期しないスプライシングスキッピングの可能性が大幅に減少し、効率を大幅に向上させながら、安全性も確保した。
【0012】
その中の一つの実施形態において、前記ＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡ配列は、ＵＳＨ２Ａエクソン１３、イントロン１２又はイントロン１３の領域から選択される。
【0013】
その中の一つの実施形態において、前記ＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡ配列は、ＵＳＨ２Ａエクソン１３及びその両側に向かって５０ｂｐ延長される領域から選択される。
【0014】
その中の一つの実施形態において、前記ＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡ配列は、ＵＳＨ２Ａエクソン１３及び両側に向かって２０ｂｐ延長される領域から選択される。
【0015】
その中の一つの実施形態において、前記エクソン１３は、野生型のエクソン１３又は突然変異含有エクソン１３を含む。
【0016】
その中の一つの実施形態において、前記突然変異は、ｃ．２２４２Ｃ＞Ｔ、ｃ．２２７６Ｇ＞Ｔ、ｃ．２２９９ｄｅｌＧ、ｃ．２５２２Ｃ＞Ａ、ｃ．２５４１Ｃ＞Ａ、ｃ．２７６１ｄｅｌＣ、ｃ．２７７６Ｃ＞Ｔ、ｃ．２８０２Ｔ＞Ｇ、ｃ．２２０９Ｃ＞Ｔ、ｃ．２３１０ｄｅｌＡ、ｃ．２３９１＿２３９２ｄｅＩＴＧ、ｃ．２４３１Ａ＞Ｔ、ｃ．２４３１＿２４３２ｄｅｌＡＡ、ｃ．２４４０Ｃ＞Ｔ、ｃ．２５２５ｄｕｐ、ｃ．２６１０Ｃ＞Ａ、ｃ．２７５５Ｃ＞Ｔ、ｃ．２１７６Ｔ＞Ｃ、ｃ．２２３６Ｃ＞Ｇ、ｃ．２２９６Ｔ＞Ｃ、及びｃ．２３３２Ｇ＞Ｔの突然変異部位のうちの少なくとも１つを含む。
【0017】
その中の一つの実施形態において、前記ＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡ配列に対応するゲノム位置（ＮＣＢＩデータベースＧＲｃｈ３８バージョンに対応）領域は、Ｃｈｒ１：２１６２４７１４２－２１６２４７１８５、Ｃｈｒ１：２１６２４７１３０－２１６２４７１６１、Ｃｈｒ１：２１６２４６６１６－２１６２４６６４９、Ｃｈｒ１：２１６２４７２１３－２１６２４７２４６、Ｃｈｒ１：２１６２４７２０４－２１６２４７２３２、Ｃｈｒ１：２１６２４７１８７－２１６２４７２２０、及びＣｈｒ１：２１６２４７１６９－２１６２４７２０２から選択される。
【0018】
その中の一つの実施形態において、前記ＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡ配列は、配列番号１～７に示される配列から選択される。
【0019】
その中の一つの実施形態において、前記ＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡ配列に対応するゲノム位置は、Ｃｈｒ１：２１６２４７２２３－２１６２４７２４６、Ｃｈｒ１：２１６２４７２１８－２１６２４７２４１、Ｃｈｒ１：２１６２４７２１３－２１６２４７２３６、Ｃｈｒ１：２１６２４７２０９－２１６２４７２３２、Ｃｈｒ１：２１６２４７２０４－２１６２４７２２７、Ｃｈｒ１：２１６２４７１９７－２１６２４７２２０、Ｃｈｒ１：２１６２４７１９１－２１６２４７２１４、Ｃｈｒ１：２１６２４７１８７－２１６２４７２１０、Ｃｈｒ１：２１６２４７１７９－２１６２４７２０２、Ｃｈｒ１：２１６２４７１７４－２１６２４７１９７、Ｃｈｒ１：２１６２４７１６９－２１６２４７１９２、Ｃｈｒ１：２１６２４７１６２－２１６２４７１８５、Ｃｈｒ１：２１６２４７１５５－２１６２４７１７８、Ｃｈｒ１：２１６２４７１４７－２１６２４７１６８、Ｃｈｒ１：２１６２４７１４７－２１６２４７１７３、Ｃｈｒ１：２１６２４７１４２－２１６２４７１６５、Ｃｈｒ１：２１６２４７１３８－２１６２４７１６１、Ｃｈｒ１：２１６２４７１３０－２１６２４７１５３、Ｃｈｒ１：２１６２４６６２６－２１６２４６６４９、Ｃｈｒ１：２１６２４６６２２－２１６２４６６４５、及びＣｈｒ１：２１６２４６６１６－２１６２４６６３９から選択される。
【0020】
その中の一つの実施形態において、前記ｓｎＲＮＡの認識ドメインは、前記ＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡ配列の少なくとも１６ｂｐの連続配列に対して逆相補的である。
【0021】
その中の一つの実施形態において、前記ｓｎＲＮＡの認識ドメインは、前記ＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡ配列の少なくとも１７ｂｐの連続配列に対して逆相補的である。
【0022】
その中の一つの実施形態において、前記ｓｎＲＮＡの認識ドメインは、前記ＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡ配列の少なくとも１８ｂｐの連続配列に対して逆相補的である。
【0023】
その中の一つの実施形態において、前記ｓｎＲＮＡの認識ドメインは、前記ＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡ配列の少なくとも１９ｂｐの連続配列に対して逆相補的である。
【0024】
その中の一つの実施形態において、前記ｓｎＲＮＡの認識ドメインは、前記ＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡ配列の少なくとも２０ｂｐの連続配列に対して逆相補的である。
【0025】
その中の一つの実施形態において、前記ｓｎＲＮＡの認識ドメインは、前記ＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡ配列の少なくとも２１ｂｐの連続配列に対して逆相補的である。
【0026】
その中の一つの実施形態において、前記ｓｎＲＮＡの認識ドメインは、前記ＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡ配列の少なくとも２２ｂｐの連続配列に対して逆相補的である。
【0027】
その中の一つの実施形態において、前記ｓｎＲＮＡの認識ドメインは、前記ＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡ配列の少なくとも２３ｂｐの連続配列に対して逆相補的である。
【0028】
その中の一つの実施形態において、前記ｓｎＲＮＡの認識ドメインは、前記ＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡ配列の少なくとも２４ｂｐの連続配列に対して逆相補的である。
【0029】
その中の一つの実施形態において、前記ｓｎＲＮＡの認識ドメインは、前記ＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡ配列の１８ｂｐ～４０ｂｐの連続配列に対して逆相補的である。
【0030】
その中の一つの実施形態において、前記ｓｎＲＮＡの認識ドメインは、前記ＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡ配列の２０ｂｐ～２７ｂｐの連続配列に対して逆相補的である。
【0031】
その中の一つの実施形態において、前記ｓｎＲＮＡの認識ドメインは、配列番号８～２８に示される配列から選択される。
【0032】
その中の一つの実施形態において、前記ＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡ配列に対応するゲノム位置は、Ｃｈｒ１：２１６２４７２１３－２１６２４７２３６、Ｃｈｒ１：２１６２４７２０９－２１６２４７２３２、Ｃｈｒ１：２１６２４７２０４－２１６２４７２２７、Ｃｈｒ１：２１６２４７１９７－２１６２４７２２０、Ｃｈｒ１：２１６２４７１９１－２１６２４７２１４、Ｃｈｒ１：２１６２４７１８７－２１６２４７２１０、Ｃｈｒ１：２１６２４７１７９－２１６２４７２０２、Ｃｈｒ１：２１６２４７１７４－２１６２４７１９７、及びＣｈｒ１：２１６２４７１６９－２１６２４７１９２から選択される。
【0033】
その中の一つの実施形態において、前記ｓｎＲＮＡの認識ドメインは、配列番号１０～２８に示される配列から選択される。
【0034】
その中の一つの実施形態において、前記ＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡ配列に対応するゲノム位置は、Ｃｈｒ１：２１６２４７１６２－２１６２４７１８５、Ｃｈｒ１：２１６２４７１５５－２１６２４７１７８、Ｃｈｒ１：２１６２４７１４７－２１６２４７１６８、Ｃｈｒ１：２１６２４７１４７－２１６２４７１７３、Ｃｈｒ１：２１６２４７１４２－２１６２４７１６５、Ｃｈｒ１：２１６２４７１３８－２１６２４７１６１、Ｃｈｒ１：２１６２４７１３０－２１６２４７１５３、Ｃｈｒ１：２１６２４６６２６－２１６２４６６４９、Ｃｈｒ１：２１６２４６６２２－２１６２４６６４５、及びＣｈｒ１：２１６２４６６１６－２１６２４６６３９から選択される。
【0035】
その中の一つの実施形態において、前記ｓｎＲＮＡの認識ドメインは、配列番号１９～２８に示される配列から選択される。
【0036】
その中の一つの実施形態において、前記ＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡ配列に対応するゲノム位置は、Ｃｈｒ１：２１６２４７２１３－２１６２４７２３６、Ｃｈｒ１：２１６２４７２０９－２１６２４７２３２、Ｃｈｒ１：２１６２４７２０４－２１６２４７２２７、Ｃｈｒ１：２１６２４７１９７－２１６２４７２２０、Ｃｈｒ１：２１６２４７１９１－２１６２４７２１４、Ｃｈｒ１：２１６２４７１８７－２１６２４７２１０、Ｃｈｒ１：２１６２４７１７９－２１６２４７２０２、Ｃｈｒ１：２１６２４７１７４－２１６２４７１９７、Ｃｈｒ１：２１６２４７１６９－２１６２４７１９２、Ｃｈｒ１：２１６２４７１６２－２１６２４７１８５、Ｃｈｒ１：２１６２４７１５５－２１６２４７１７８、Ｃｈｒ１：２１６２４７１４７－２１６２４７１６８、Ｃｈｒ１：２１６２４７１４７－２１６２４７１７３、Ｃｈｒ１：２１６２４７１４２－２１６２４７１６５、及びＣｈｒ１：２１６２４７１３０－２１６２４７１５３から選択される。
【0037】
その中の一つの実施形態において、前記ｓｎＲＮＡの認識ドメインは、配列番号１０～２３に示される配列、配列番号２５に示される配列から選択される。
【0038】
その中の一つの実施形態において、前記ＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡ配列に対応するゲノム位置は、Ｃｈｒ１：２１６２４７２１３－２１６２４７２３６、Ｃｈｒ１：２１６２４７２０９－２１６２４７２３２、Ｃｈｒ１：２１６２４７２０４－２１６２４７２２７、Ｃｈｒ１：２１６２４７１９７－２１６２４７２２０、Ｃｈｒ１：２１６２４７１９１－２１６２４７２１４、Ｃｈｒ１：２１６２４７１８７－２１６２４７２１０、Ｃｈｒ１：２１６２４７１７９－２１６２４７２０２、Ｃｈｒ１：２１６２４７１７４－２１６２４７１９７、Ｃｈｒ１：２１６２４７１６９－２１６２４７１９２、Ｃｈｒ１：２１６２４７１６２－２１６２４７１８５、Ｃｈｒ１：２１６２４７１４７－２１６２４７１６８、Ｃｈｒ１：２１６２４７１４７－２１６２４７１７３、Ｃｈｒ１：２１６２４７１４２－２１６２４７１６５、及びＣｈｒ１：２１６２４７１３０－２１６２４７１５３から選択される。
【0039】
その中の一つの実施形態において、前記ｓｎＲＮＡの認識ドメインは、配列番号１０～１９に示される配列、配列番号２１～２３に示される配列、配列番号２５に示される配列から選択される。
【0040】
その中の一つの実施形態において、前記ＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡ配列に対応するゲノム位置は、Ｃｈｒ１：２１６２４７２１８－２１６２４７２４１、Ｃｈｒ１：２１６２４７１８７－２１６２４７２１０、Ｃｈｒ１：２１６２４７１４７－２１６２４７１６８、Ｃｈｒ１：２１６２４７１４７－２１６２４７１７３、Ｃｈｒ１：２１６２４７１４２－２１６２４７１６５、及びＣｈｒ１：２１６２４７１３０－２１６２４７１５３から選択される。
【0041】
その中の一つの実施形態において、前記ｓｎＲＮＡの認識ドメインは、配列番号９に示される配列、配列番号１５に示される配列、配列番号２１に示される配列、配列番号２２に示される配列、配列番号２３に示される配列、配列番号２５に示される配列から選択される。
【0042】
その中の一つの実施形態において、前記ｓｎＲＮＡの認識ドメインは、配列番号１５に示される配列、配列番号２１に示される配列、配列番号２２に示される配列、配列番号２３に示される配列から選択される。
【0043】
その中の一つの実施形態において、前記ｓｎＲＮＡはＵ１－ｓｎＲＮＡ又はＵ７－ｓｎＲＮＡである。
【0044】
その中の一つの実施形態において、前記Ｕ７－ｓｎＲＮＡは化学合成である。
【0045】
その中の一つの実施形態において、前記化学合成されたＵ７－ｓｎＲＮＡのうちの少なくとも１つのヌクレオチドは化学修飾されている。
【0046】
その中の一つの実施形態において、前記化学修飾は２’－Ｏ－アルキル修飾、２’－Ｏ－メトキシ修飾又は２’－Ｏ－メトキシエチル修飾のうちの少なくとも１つを含む。
【0047】
その中の一つの実施形態において、前記２’－Ｏ－アルキル修飾は２’－Ｏ－メチル修飾である。
【0048】
その中の一つの実施形態において、前記化学合成されたＵ７－ｓｎＲＮＡの少なくとも１つのヌクレオチドはリン酸エステル結合を介して連結され、前記リン酸エステル結合は、ホスホロチオエート結合、ホスホロジチオエート結合、アルキルリン酸エステル結合、アミドリン酸エステル結合、ボラノリン酸エステル結合、又はキラルリン結合のうちの少なくとも１つを含む。
【0049】
その中の一つの実施形態において、前記化学合成されたＵ７－ｓｎＲＮＡの両側の６～８０個のヌクレオチドはいずれも前記化学的に修飾され、前記リン酸エステル結合によって連結される。
【0050】
その中の一つの実施形態において、前記化学合成されたＵ７－ｓｎＲＮＡの両側の１～１０個のヌクレオチドはいずれも前記化学的に修飾され、前記リン酸エステル結合によって連結される。
【0051】
その中の一つの実施形態において、前記化学合成されたＵ７－ｓｎＲＮＡの両側の３～４０個の塩基はいずれも前記化学的に修飾され、前記リン酸エステル結合によって連結される。
【0052】
その中の一つの実施形態において、前記化学合成されたＵ７－ｓｎＲＮＡのすべてのヌクレオチドはホスホロチオエート結合を介して連結され、すべて２’－Ｏ－メトキシで修飾される。
【0053】
その中の一つの実施形態において、前記化学合成されたＵ７－ｓｎＲＮＡの両側の３つのヌクレオチドはホスホロチオエート結合を介して連結され、２’－Ｏ－メトキシで修飾される。
【0054】
その中の一つの実施形態において、前記化学合成されたＵ７－ｓｎＲＮＡの５’末端の最初のヌクレオチドはアデニル酸である。
【0055】
その中の一つの実施形態において、前記化学合成されたＵ７－ｓｎＲＮＡの認識ドメインの５’末端の最初のヌクレオチドはアデニル酸である。
【0056】
その中の一つの実施形態において、前記化学合成されたＵ７－ｓｎＲＮＡの認識ドメインと標的部位との間の逆相補対には、０～５個のミスマッチヌクレオチドが存在する。
【0057】
その中の一つの実施形態において、前記化学合成されたＵ７－ｓｎＲＮＡの認識ドメインと標的部位との間の逆相補対には、０～１個のミスマッチヌクレオチドが存在する。
【0058】
その中の一つの実施形態において、前記化学合成されたＵ７－ｓｎＲＮＡの認識ドメインの配列長さは≧１６ｂｐである。
【0059】
その中の一つの実施形態において、前記化学合成されたＵ７－ｓｎＲＮＡの認識ドメインの配列長さは１８ｂｐ～４０ｂｐである。
【0060】
その中の一つの実施形態において、前記化学合成されたＵ７－ｓｎＲＮＡの認識ドメインの配列長さは２０ｂｐ～２７ｂｐである。
【0061】
その中の一つの実施形態において、前記化学合成されたＵ７－ｓｎＲＮＡは、標的配列の５’末端又は／及び３’末端に沿った逆相補対形成を通じて認識ドメイン配列の長さを延長し続ける。
【0062】
その中の一つの実施形態において、前記延長された認識ドメイン配列の長さは≦４０ｂｐである。
【0063】
その中の一つの実施形態において、前記ｓｎＲＮＡはｓｍ配列を含む。
【0064】
その中の一つの実施形態において、前記ｓｍ配列は、ｓｍＯＰＴ配列であり、前記ｓｍＯＰＴ配列は配列番号３１に示された通りである。
【0065】
その中の一つの実施形態において、前記ｓｎＲＮＡは、認識ドメイン、ｓｍＯＰＴ配列、及びＵ１－ｓｎＲＮＡ ｓｃａｆｆｏｌｄ又はＵ７－ｓｎＲＮＡ ｓｃａｆｆｏｌｄ配列を含み；好ましくは、前記Ｕ７－ｓｎＲＮＡ ｓｃａｆｆｏｌｄ配列は配列番号４９に示された通りである。
【0066】
その中の一つの実施形態において、前記ｓｎＲＮＡは、更にスプライシング制御タンパク質をリクルートするモチーフを含む。
【0067】
その中の一つの実施形態において、前記Ｕ７－ｓｎＲＮＡの５’末端は遊離テールが導入されており、遊離テールの配列はスプライシング制御タンパク質をリクルートするモチーフを含む。
【0068】
その中の一つの実施形態において、前記スプライシング調節タンパク質は、ｈｎＲＮＰＡ１、ＳＲＳＦ１、ＲＢＭ４、ＤＡＺＡＰ１、又はＳＲのうちの少なくとも１つを含む。
【0069】
その中の一つの実施形態において、前記遊離テール配列は、少なくとも１つのｈｎＲＮＰＡ１結合モチーフを含む。
【0070】
その中の一つの実施形態において、前記遊離テール配列は、２つのｈｎＲＮＰＡ１結合モチーフを含む。
【0071】
本発明はまた、前記ｓｎＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含むヌクレオチドを提供する。
【0072】
本発明はまた、前記ｓｎＲＮＡを含み、及び／又は前記ヌクレオチドを含む遺伝子発現カセットを提供する。
【0073】
本発明はまた、前記ｓｎＲＮＡを含み、前記ヌクレオチドを含み、及び／又は遺伝子発現カセットを含むベクターを提供する。
【0074】
その中の一つの実施形態において、前記ベクターは、ベクター骨格と前記ｓｎＲＮＡを含み、前記ベクター骨格は、プロモーター、ｓｍＯＰＴ配列、及びｓｎＲＮＡ遺伝子特異的３’カセットを含み、前記プロモーターは、Ｔｙｐｅ ＩＩｓ型制限エンドヌクレアーゼ認識部位を介してｓｍＯＰＴ配列に接続される。
【0075】
その中の一つの実施形態において、前記ベクターは、ｐＵＣ５７、ｐＡＡＶ－ＣＭＶ、レンチウイルス又はトランスポゾンから選択される。
【0076】
その中の一つの実施形態において、前記ｓｎＲＮＡ遺伝子特異的３’カセットは、ｓｎＲＮＡ遺伝子の３’末端から２８～１３１ｂｐ伸びる遺伝子断片である。
【0077】
その中の一つの実施形態において、前記ｓｎＲＮＡ遺伝子特異的３’カセットは、ｓｎＲＮＡ遺伝子の３’末端から１０６ｂｐ伸びる遺伝子断片である。
【0078】
本発明はまた、前記ｓｎＲＮＡを含み、前記ヌクレオチドを含み、及び／又は前記ベクターを含むウイルス粒子を提供する。
【0079】
その中の一つの実施形態において、前記ウイルス粒子はＡＡＶウイルスである。
【0080】
その中の一つの実施形態において、前記ＡＡＶウイルスのキャプシドタンパク質は天然有来、天然有来のキャプシドタンパク質に基づく変異体である。
【0081】
その中の一つの実施形態において、前記ＡＡＶウイルスのキャプシドタンパク質は動物又は植物に由来する。
【0082】
その中の一つの実施形態において、前記ＡＡＶウイルスのキャプシドタンパク質は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ１０又はＡＡＶｒｈ４３から選択される。
【0083】
その中の一つの実施形態において、前記天然由来のキャプシドタンパク質に基づく変異体ＡＡＶウイルスは、天然キャプシドタンパク質の指向性進化又はアミノ酸／ペプチドセクメトの合理的修飾に基づくＡＡＶウイルスである。
【0084】
その中の一つの実施形態において、前記変異体ＡＡＶウイルスは、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｉ８、ＡＡＶ－ＴＴ、ＡＡＶ９．ＨＲ又はＣＡＭ１３０から選択される。
【0085】
その中の一つの実施形態において、前記ＡＡＶウイルスがＡＡＶ ＩＴＲである場合、血清型はＲｅｐ遺伝子の血清型と一致する。
【0086】
本発明はまた、前記ｓｎＲＮＡを含み、前記ヌクレオチドを含み、前記ベクターを含み、及び／又は前記ウイルス粒子を含む細胞を提供する。
【0087】
本発明はまた、前記ｓｎＲＮＡを含み、前記ヌクレオチドを含み、前記ベクターを含み、及び／又は前記ウイルス粒子を含む医薬組成物を提供する。
【0088】
本発明はまた、ＵＳＨ２Ａ遺伝子のｐｒｅ－ｍＲＮＡと前記ｓｎＲＮＡ、前記ヌクレオチド、前記ベクター、前記遺伝子発現カセット、前記ウイルス粒子、前記細胞、及び／又は前記医薬組成物を接触させる、エクソン１３の発現産物が欠失したＵｓｈｅｒｉｎタンパク質を取得する方法を提供する。
【0089】
その中の一つの実施形態において、前記方法は科学研究に使用される。
【0090】
本発明はまた、ＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡのエキソン１３のスプライシングスキッピングによる、エキソン１３が欠失した成熟ＵＳＨ２Ａ ｍＲＮＡの調製、エキソン１３が欠失したＵｓｈｅｒｉｎタンパク質の取得、及び／又はＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡエキソン１３の発現及び機能の阻害における前記方法の使用を提供する。
【0091】
本発明はまた、眼疾患及び／又は耳疾患を予防及び／又は治療する医薬の調製における、前記ｓｎＲＮＡ、前記ヌクレオチド、前記ベクター、前記遺伝子発現カセット、前記ウイルス粒子又は前記細胞の使用を提供する。
【0092】
一つの実施形態において、前記眼疾患は難聴－網膜色素変性症症候群又は非症候群性網膜色素変性症である。
【0093】
従来技術と比較して、本発明は下記の有益な効果を有する。
【0094】
本発明のＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡを標的とするｓｎＲＮＡは、標的領域としてＵＳＨ２Ａエクソン１３を選択し、エクソン１３のスプライシングスキッピングを誘導することにより、ＵＳＨ２Ａエクソン１３のミスセンス、フレームシフト、終止コドン、ナンセンス、同義変異などのＵＳＨ２Ａタンパク質の機能不全によって引き起こされる目や耳の疾患を治療する。同時に、本発明のＵＳＨ２Ａを標的とするＵ７－ｓｎＲＮＡは、Ｕ７－ｓｎＲＮＰを使用してスプライシングには関与しないが、複製依存性ヒストン（ＲＤＨ）ｐｒｅ－ｍＲＮＡの特異的３’末端プロセシングにおける重要な因子であり、修飾されたＵ７－ｓｎＲＮＡは、Ｕ７－ｓｎＲＮＡの非標準的なＳｍ結合部位を主なスプライセオソームＵ－ｓｎＲＮＰに由来するコンセンサス配列で置き換え、Ｕ７－ｓｎＲＮＡの５’領域のヒストン結合配列を、修飾対象の遺伝子の相補配列に変更する独自の作用機構により、ＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡを標的とするｓｎＲＮＡと組み合わせて、ＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡエクソン１３のスプライシングスキッピングを誘導し、エクソン１２を保持して、エクソン１２と１３のダブルスキッピングなどの予期しないスプライシングスキッピングの確率を大幅に減少させ、安全性を確保しながらエクソン１３のシングルスキッピングの効率を大幅に向上させる。
【図面の簡単な説明】
【0095】
【図1】Ｕ７－ｓｎＲＮＡの構造と機能の模式図である。
【図2】ｐＵＣ５７－Ｕ７ ｓｎＲＮＡ骨格ベクターのマップである。
【図3】レポーターベクターｐＣＭＶ－ＥＧＦＰｌｅｆｔ－Ｅｘｏｎ１３ｃ．２８０２Ｔ＞Ｇ－ＥＧＦＰｒｉｇｈｔのプラスミドマップである。
【図4】レポーターベクターｐＣＭＶ－ＥＧＦＰｌｅｆｔ－Ｅｘｏｎ１３ｃ．２２９９ｄｅｌＧ－ＥＧＦＰｒｉｇｈｔのプラスミドマップである。
【図5】ゲノム上の標的領域１を標的とするＵ７－ｓｎＲＮＡの位置の模式図である。
【図6】レポーターベクター細胞における標的領域１を標的とするＵ７－ｓｎＲＮＡによりＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡエキソン１３のスプライシングスキッピングが誘導された細胞比率の結果を示すグラフである。
【図7】標的領域１を標的とするＵ７－ｓｎＲＮＡによって誘導される（ＵＳＨ２Ａプレ－ｍＲＮＡエクソン１３スのスプライシングスキッピング）ＧＦＰ陽性細胞の平均ＦＩＴＣ強度のヒストグラムである。
【図8】ゲノム上の標的領域２を標的とするＵ７－ｓｎＲＮＡの位置の概略図である。
【図9】レポーターベクター細胞における標的領域２を標的とするＵ７－ｓｎＲＮＡによりＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡエキソン１３のスプライシングスキッピングが誘導された細胞比率の結果を示すグラフである。
【図10】標的領域２を標的とするＵ７－ｓｎＲＮＡによって誘導される（ＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡエキソン１３のスプライシングスキッピング）ＧＦＰ陽性細胞の平均ＦＩＴＣ強度のヒストグラムである。
【図11】ゲノム上の標的領域３を標的とするＵ７－ｓｎＲＮＡの位置の概略図である。
【図12】レポーターベクター細胞における標的領域３を標的とするＵ７－ｓｎＲＮＡによりＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡエキソン１３のスプライシングスキッピングが誘導された細胞比率の結果を示すグラフである。
【図13】標的領域３を標的とするＵ７－ｓｎＲＮＡによって誘導される（ＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡエキソン１３のスプライシングスキッピング）ＧＦＰ陽性細胞の平均ＦＩＴＣ強度のヒストグラムである。
【図14】ゲノム上の標的領域４を標的とするＵ７－ｓｎＲＮＡの位置の概略図である。
【図15】レポーターベクター細胞における標的領域４を標的とするＵ７－ｓｎＲＮＡによりＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡエキソン１３のスプライシングスキッピングが誘導された細胞比率の結果を示すグラフである。
【図16】ゲノム上の標的領域５を標的とするＵ７－ｓｎＲＮＡの位置の概略図である。
【図17】レポーターベクター細胞における標的領域５を標的とするＵ７－ｓｎＲＮＡによりＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡエキソン１３のスプライシングスキッピングが誘導された細胞比率の結果を示すグラフである。
【図18】ゲノム上の標的領域６を標的とするＵ７－ｓｎＲＮＡの位置の概略図である。
【図19】レポーターベクター細胞における標的領域６を標的とするＵ７－ｓｎＲＮＡによりＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡエキソン１３のスプライシングスキッピングが誘導された細胞比率の結果を示すグラフである。
【図20】ゲノム上の標的領域７を標的とするＵ７－ｓｎＲＮＡの位置の概略図である。
【図21】レポーターベクター細胞における標的領域７を標的とするＵ７－ｓｎＲＮＡによりＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡエキソン１３のスプライシングスキッピングが誘導された細胞比率の結果を示すグラフである。
【図22】レポーター遺伝子細胞において異なる領域を標的とするＵ７ ｓｎＲＮＡによりＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡエキソン１３スプライシングスキッピングが誘導された細胞の平均ＦＩＴＣ強度の結果を示すグラフである。
【図23】Ｕ７－ｓｎＲＮＡにより誘導されたＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡエキソン１３スプライシングスキッピング効率が、ＡＯＮ１よりも有意に優れたことを示す実験結果を示すグラフである。
【図24】ＷＥＲＩ細胞において化学合成されたＵ７ ｓｎＲＮＡにより誘導されたＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡエキソン１３のスプライシングスキッピング効率を検出した結果を示すグラフである。
【図25】Ｕ７－ｈｎＲＮＰ Ａ１－ｓｎＲＮＡの概略構造図である。
【図26】Ｕ７－ｈｎＲＮＰ Ａ１－ｓｎＲＮＡにより誘導されたＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡエキソン１３のスプライシングスキッピング効率の結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【0096】
本発明の理解を容易にするために、以下、関連する図面を参照しながら本発明をより詳細に説明する。本発明の好ましい実施形態が図面に示されている。しかしながら、本発明は多くの異なる形態で具体化することができ、本明細書で説明する実施形態に限定されない。むしろ、これらの実施形態は、本開示の完全な理解を提供するために提供される。
【0097】
別段の定義がない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。本発明の説明において本発明の明細書で使用される用語は、特定の実施例を説明することのみを目的としており、本発明を限定することを意図したものではない。本明細書で使用される場合、「及び／又は」という用語は、関連する列挙された項目の１つ又は複数の任意の及びすべての組み合わせを含む。配列が別の配列から「選択される」と言われる場合、それは直接に別の配列又は別の配列の配列断片であり得；ゲノムマッピング領域が別のゲノムマッピング領域から「選択」される場合、その対応する配列は、直接に別のゲノムマッピング領域に対応する配列、又は別のゲノムマッピング領域に対応する配列中の配列断片であり得；前記配列はＤＮＡ又はＲＮＡを含む。
【0098】
定義：
本発明に記載のｓｎＲＮＡは、真核生物の転写後プロセシングにおけるＲＮＡスプライセオソーム（ｓｐｌｉｃｅｏｓｏｍｅ）の主成分であり、ｓｎＲＮＰタンパク質に結合することによってｍＲＮＡ前駆体のプロセシングに関与する。
本発明に記載のｓｎＲＮＡは、真核生物の転写後プロセシングにおけるＲＮＡスプライセオソーム（ｓｐｌｉｃｅｏｓｏｍｅ）の主成分であり、ｓｎＲＮＰタンパク質に結合することによってｍＲＮＡ前駆体のプロセシングに関与する。
【0099】
材料のサプライヤー：
ＡＡＶｐｒｏ（登録商標） Ｈｅｌｐｅｒ Ｆｒｅｅ Ｓｙｓｔｅｍ（ＡＡＶ５）キット（ＴＡＫＡＲＡ社、Ｃｏｄｅ Ｎｏ．：６６５０）
ＡＡＶｐｒｏ（登録商標） Ｈｅｌｐｅｒ Ｆｒｅｅ Ｓｙｓｔｅｍ（ＡＡＶ５）キット（ＴＡＫＡＲＡ社、Ｃｏｄｅ Ｎｏ．：６６５０）
【0100】
本実施例で使用される試薬、材料、及び装置は別段の定義がない限り、すべて市販品であり；実験方法は別段の定義がない限り、本技術分野の従来の実験方法である。
【0101】
実施例１
Ｕ７－ｓｎＲＮＡシステムの設計とベクター構築。
Ｕ７－ｓｎＲＮＡシステムの設計とベクター構築。
【0102】
１、Ｕ７－ｓｎＲＮＡ発現ベクター骨格の合成。
野生型Ｕ７－ｓｎＲＮＡは、ステムループ構造（ｓｃａｆｆｏｌｄ）、Ｕ７特異的Ｓｍ配列（ＡＡＵＵＵＧＵＣＵＡＧ）、及び認識ドメイン（ヒストンｐｒｅ－ｍＲＮＡに相補的）を含む。
野生型Ｕ７－ｓｎＲＮＡは、ステムループ構造（ｓｃａｆｆｏｌｄ）、Ｕ７特異的Ｓｍ配列（ＡＡＵＵＵＧＵＣＵＡＧ）、及び認識ドメイン（ヒストンｐｒｅ－ｍＲＮＡに相補的）を含む。
【0103】
本実施例のＵ７－ｓｎＲＮＡは、ＮＣＢＩのマウス野生型Ｕ７－ｓｎＲＮＡの遺伝子配列（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＲ＿０２４２０１．３）の上で、Ｕ７特異的ｓｍ配列ＡＡＴＴＴＧＴＣＴＡＧ（配列番号：３０）を最適化されたコンセンサスｓｍ配列に置き換え、即ち、ｓｍＯＰＴ：ＡＡＴＴＴＴＴＧＧＡＧ（配列番号３１）であり、図１に示されるように、ｓｍＯＰＴ配列の５’末端にある元の認識ドメインをＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡ特異的標的部位に逆相補的な認識ドメインに置き換え、ｓｍＯＰＴ配列の３’末端にＵ７元のステムループ構造配列を保持した。ＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡエクソン１３を標的として誘導するＵ７－ｓｎＲＮＡ認識ドメイン配列は、ＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡのイントロン１２－エクソン１３－イントロン１３から選択される標的配列と逆相補的に対になっている。
【0104】
具体的な操作過程：まず、全遺伝子合成により、遺伝子配列、即ち、Ｕ７－ｓｎＲＮＡ遺伝子発現カセット骨格（５’－マウスＵ７プロモーター－ｓｍＯＰＴ配列－Ｕ７ ｓｎＲＮＡ ｓｃａｆｆｏｌｄ－ｓｎＲＮＡ遺伝子特異的３’カセット－３’）を含むｐＵＣ５７ベクターを合成した（図２に示される通りである）。ここで、２つのＴｙｐｅ ＩＩｓ型制限エンドヌクレアーゼ認識部位がＵ７プロモーターとｓｍＯＰＴの間に追加されて、その後の切断、他の認識ドメイン配列の置換及び挿入を容易にする。ｓｎＲＮＡ遺伝子特異的３’カセットは、マウスゲノム（ＧｅｎＢａｎｋ：Ｘ５４７４８．１）のＵ７－ｓｎＲＮＡ遺伝子の３’末端の後に、ｇｔｃｔａｃａａｔｇａａａ（配列番号３２）配列を含み、ｐｒｅ－ｓｎＲＮＡのプロセシングに関与し、好ましくは、Ｕ７ｓｎＲＮＡ遺伝子の３’末端に接続された配列であり、好ましくは、配列長は２８～１３１ｂｐの遺伝子断片であり、更に好ましきは、配列長は１０６ｂｐであった。
【0105】
２、ＵＳＨ２Ａエクソン１３及びその近くの異なる部位を標的とするＵ７－ｓｎＲＮＡベクターを構築。
【0106】
本実例では、ＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡの７つの標的領域に対してそれぞれ２１個の標的部位を設定し、ＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡの７個の標的領域は下記に示された通りである。
【0107】
エクソン１３領域１（配列番号１）（Ｃｈｒ１：２１６２４７１４２－２１６２４７１８５）：ＣＧＡＡＧＣＵＵＵＡＡＵＧＡＵＧＵＵＧＧＡＵＧＵＧＡＧＣＣＣＵＧＣＣＡＧＵＧＵＡＡＣＣＵ；
エクソン１３領域２（配列番号２）（Ｃｈｒ１：２１６２４７１３０－２１６２４７１６１）：ＧＡＧＣＣＣＵＧＣＣＡＧＵＧＵＡＡＣＣＵＣＣＡＵＧＧＣＵＣＡＧＵ；
エクソン１３領域３（配列番号３）（Ｃｈｒ１：２１６２４６６１６－２１６２４６６４９）：ＡＡＵＣＡＧＵＧＧＣＣＡＧＵＧＣＣＵＧＵＧＵＧＵＧＣＣＵＡＡＵＣＧＵ；
エクソン１３領域４（配列番号４）（Ｃｈｒ１：２１６２４７２１３－２１６２４７２４６）：ＵＡＡＡＵＡＵＡＵＵＵＵＡＵＣＵＵＵＡＧＧＧＣＵＵＡＧＧＵＧＵＧＡＵ；
エクソン１３領域５（配列番号５）（Ｃｈｒ１：２１６２４７２０４－２１６２４７２３２）： ＣＵＵＵＡＧＧＧＣＵＵＡＧＧＵＧＵＧＡＵＣＡＵＵＧＣＡＡＵ；
エクソン１３領域６（配列番号６）（Ｃｈｒ１：２１６２４７１８７－２１６２４７２２０）： ＧＧＵＧＵＧＡＵＣＡＵＵＧＣＡＡＵＵＵＵＧＧＡＵＵＵＡＡＡＵＵＵＣＵ；
エクソン１３領域７（配列番号７）（Ｃｈｒ１：２１６２４７１６９－２１６２４７２０２）：ＵＵＧＧＡＵＵＵＡＡＡＵＵＵＣＵＣＣＧＡＡＧＣＵＵＵＡＡＵＧＡＵＧＵ。
エクソン１３領域２（配列番号２）（Ｃｈｒ１：２１６２４７１３０－２１６２４７１６１）：ＧＡＧＣＣＣＵＧＣＣＡＧＵＧＵＡＡＣＣＵＣＣＡＵＧＧＣＵＣＡＧＵ；
エクソン１３領域３（配列番号３）（Ｃｈｒ１：２１６２４６６１６－２１６２４６６４９）：ＡＡＵＣＡＧＵＧＧＣＣＡＧＵＧＣＣＵＧＵＧＵＧＵＧＣＣＵＡＡＵＣＧＵ；
エクソン１３領域４（配列番号４）（Ｃｈｒ１：２１６２４７２１３－２１６２４７２４６）：ＵＡＡＡＵＡＵＡＵＵＵＵＡＵＣＵＵＵＡＧＧＧＣＵＵＡＧＧＵＧＵＧＡＵ；
エクソン１３領域５（配列番号５）（Ｃｈｒ１：２１６２４７２０４－２１６２４７２３２）： ＣＵＵＵＡＧＧＧＣＵＵＡＧＧＵＧＵＧＡＵＣＡＵＵＧＣＡＡＵ；
エクソン１３領域６（配列番号６）（Ｃｈｒ１：２１６２４７１８７－２１６２４７２２０）： ＧＧＵＧＵＧＡＵＣＡＵＵＧＣＡＡＵＵＵＵＧＧＡＵＵＵＡＡＡＵＵＵＣＵ；
エクソン１３領域７（配列番号７）（Ｃｈｒ１：２１６２４７１６９－２１６２４７２０２）：ＵＵＧＧＡＵＵＵＡＡＡＵＵＵＣＵＣＣＧＡＡＧＣＵＵＵＡＡＵＧＡＵＧＵ。
【0108】
前記２１個の標的位置は下記の表に示された通りである。
【0109】
【表1】
【0110】
実施例２
Ｕ７－ｓｎＲＮＡの化学合成と修飾。
オリゴヌクレオチドと同様に、Ｕ７－ｓｎＲＮＡも直接化学合成によって、認識ドメイン、ｓｍＯＰＴ及びＵ７－ｓｎＲＮＡ ｓｃａｆｆｏｌｄを含むＲＮＡを生成することができる。インビトロで合成されたＵ７－ｓｎＲＮＡは、特定の修飾によってヌクレアーゼ分解に耐えるようにすることも、標的配列への親和性を高めることもできる。
Ｕ７－ｓｎＲＮＡの化学合成と修飾。
オリゴヌクレオチドと同様に、Ｕ７－ｓｎＲＮＡも直接化学合成によって、認識ドメイン、ｓｍＯＰＴ及びＵ７－ｓｎＲＮＡ ｓｃａｆｆｏｌｄを含むＲＮＡを生成することができる。インビトロで合成されたＵ７－ｓｎＲＮＡは、特定の修飾によってヌクレアーゼ分解に耐えるようにすることも、標的配列への親和性を高めることもできる。
【0111】
本実施例では、Ｕ７－ｓｎＲＮＡを化学合成し、その５’末端と３’末端の３つの塩基にそれぞれ２’メトキシ（２’－ＯＭＥ）修飾とスルホ修飾を施して、ヌクレアーゼ耐性を高めた。ｓｎＲＮＡ＃１６とｓｎＲＮＡ＃１５を例とし、化学合成されたｓｎＲＮＡの配列と修飾は下記の通りである（＊はホスホロチオエート骨格を表し、ｍは２’－メトキシ修飾を表し、下線部分は標的配列に逆相補的な認識ドメインを表し、斜体はｓｍＯＰＴ配列を表す）。
【0112】
化学合成及び修飾されたＵ７－ｓｎＲＮＡ＃１６：
【化1】
【0113】
上記修飾配列は、配列番号３３に示される配列の上で、５’末端及び３’末端の最初の３個の塩基にホスホロチオエート骨格修飾とメトキシ修飾を加えたものである。
【0114】
化学合成及び修飾されたＵ７－ｓｎＲＮＡ＃１５：
【化2】
【0115】
上記修飾配列は、配列番号３４に示される配列の上で、５’末端及び３’末端の最初の３個の塩基にホスホロチオエート骨格修飾とメトキシ修飾を加えたものである。
【0116】
実施例３
ＵＳＨ２Ａエクソン１３のスプライシングスキッピング効率を定量的に評価するためのレポーターベクターを構築した。
ＵＳＨ２Ａエクソン１３のスプライシングスキッピング効率を定量的に評価するためのレポーターベクターを構築した。
【0117】
ＲＧｌｅｆｔ－ＵＳＨ２Ａ ＥＸＯＮ１３ｍｕｔ－ＲＧｒｉｇｈｔ配列（それぞれ５’及び３’末端にＡｇｅＩ及びＥｃｏＲＩ酵素切断部位が追加された）は、全遺伝子合成によって得られ、合成配列、ｐＸ６０１プラスミド（Ａｄｄｇｅｎｅ、６１５９１）に対して制限エンドヌクレアーゼＡｇｅＩ及びＥｃｏＲＩ消化、電気泳動、ゲル回収及びライゲーションを実行することにより、合成配列をｐＸ６０１ベクターのＡｇｅＩ制限部位とＥｃｏＲＩ制限部位との間に挿入し、元のベクターのＳａＣａｓ９遺伝子配列を置き換えてレポーターベクターを得た。さらに、大腸菌コンピテントセルの形質転換、シングルクローニング、ＰＣＲ、及び配列検証を通じて、精製されたレポーターベクタープラスミドを得、後で使用するために－２０℃で保存した。
【0118】
レポーターベクターの構造は：ｐＣＭＶ－ＲＧｌｅｆｔ－ＵＳＨ２Ａ ＥＸＯＮ１３ｍｕｔ－ＲＧｒｉｇｈｔであり、ＲＧはレポーター遺伝子（ｒｅｐｏｒｔｅｒ ｇｅｎｅ）を表し、ＲＧｌｅｆｔはレポーティング機能を持たないレポーター遺伝子の５’末端の前半を表し、ＲＧｒｉｇｈｔレポーティング機能を持たないレポーター遺伝子の３’末端の後半を表し、ＲＧｌｅｆｔとＲＧｒｉｇｈｔのタンデム発現は、レポーター遺伝子の完全な機能が正常に実施されるようにする。実施例でレポーター遺伝子は緑色蛍光遺伝子ＥＧＦＰであり、ベクター構造はｐＣＭＶ－ＥＧＦＰｌｅｆｔ－Ｅｘｏｎ１３ｍｕｔ－ＥＧＦＰｒｉｇｈｔであった。ＥＸＯＮ１３ｍｕｔは、病原性突然変異を含むＵＳＨ２Ａエクソン１３、及びその上流と下流のイントロン配列（上流のイントロン配列は、ヒトＵＳＨ２Ａ遺伝子イントロン１２の５’末端２０４ｂｐと３’末端４９０ｂｐを直列連結した遺伝子配列であり；下流のイントロン配列は、ヒトＵＳＨ２Ａのイントロン１３の５’末端の７０３ｂｐと３’末端の２１６ｂｐを直列連結した遺伝子配列である）を含むものを表す。前記ＵＳＨ２Ａエクソン１３の病原性突然変異は、ｃ．２８０２Ｔ＞Ｇ、ｃ．２２９９ｄｅｌＧ、ｃ．２２７６Ｇ＞Ｔ、ｃ．２５２２Ｃ＞Ａ、ｃ．２２４２Ｃ＞Ｔ、ｃ．２５４１Ｃ＞Ａ、ｃ．２７６１ｄｅｌＣ又はｃ．２７７６Ｃ＞Ｔを含んでもよく、本発明の実施例に記載されたＵＳＨ２Ａエクソン１３における病原性突然変異は、ｃ．２８０２Ｔ＞Ｇ、ｃ．２２９９ｄｅｌＧであり、即ち、得られたベクター構造はそれぞれｐＣＭＶ－ＥＧＦＰｌｅｆｔ－Ｅｘｏｎ１３ｃ．２８０２Ｔ＞Ｇ－ＥＧＦＰｒｉｇｈｔ（レポートベクターマップは図３に示される）、ｐＣＭＶ－ＥＧＦＰｌｅｆｔ－Ｅｘｏｎ１３ｃ．２２９９ｄｅｌＧ－ＥＧＦＰｒｉｇｈｔ（レポートベクターマップは図４に示される）であり、ＥＧＦＰｌｅｆｔ配列は配列番号３５に示された通りであり、ＥＧＦＰｒｉｇｈｔ配列は配列番号３６に示された通りである。
【0119】
実施例４
標的領域１を標的とするＵ７－ｓｎＲＮＡによって媒介されるＵＳＨ２Ａエクソン１３のスプライシングスキッピング効果の検出。
標的領域１を標的とするＵ７－ｓｎＲＮＡによって媒介されるＵＳＨ２Ａエクソン１３のスプライシングスキッピング効果の検出。
【0120】
検出方法：２９３Ｔ細胞を２４時間後に細胞コンフルエンスが約８０％に達するように２４ウェルプレートに所定の量で播種した。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００を使用して、ｐＣＭＶ－ＥＧＦＰｌｅｆｔ－Ｅｘｏｎ１３ｃ．２８０２Ｔ＞Ｇ－ＥＧＦＰｒｉｇｈｔ及びＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡを標的とするｐＵＣ５７－Ｕ７－ｓｎＲＮＡプラスミドを２９３Ｔ細胞（ベクター質量比は１００ｎｇ：４００ｎｇである）に同時トランスフェクトし、レポータープラスミド単独でトランスフェクトされた、レポータープラスミド及びｐＵＣ５７－Ｕ７－ｃｏｎで同時にトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞を、それぞれ２つの陰性対照として使用し、いかなるプラスミドもトランスフェクトしない２９３Ｔ細胞をブランク対照として使用した。トランスフェクション後、細胞は続いて４～７２時間培養され、トリプシンを使用して単一細胞に消化し、次に、フローサイトメトリーを使用して、異なるＵ７－ｓｎＲＮＡ群のＧＦＰ陽性率（即ち、ＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡエクソン１３のスプライスジャンプが誘導された細胞比率）とＧＦＰ陽性細胞の平均ＦＩＴＣ強度（即ち、ＧＦＰ細胞におけるＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡエクソン１３のスプライシングスキッピング平均レベル）を検出し、標的領域１を標的とするＵ７－ｓｎＲＮＡのゲノム上の位置（図で左から右でゲノムの５’末端から３’末端に相当）は図５に示された通りである。
【0121】
実験結果：図６及び下記の表に示されるように、標的領域１を標的とするすべてのＵ７－ｓｎＲＮＡは、レポーター遺伝子細胞においてＵＳＨ２Ａエクソン１３のスプライシングスキッピングを誘導することができる。当該領域１を標的とする既存のＡＯＮはエクソン１３のスプライシングスキッピングを誘導できないが、当該領域１を標的とするｓｎＲＮＡはエクソン１３のスプライシングスキッピングを効果的に誘導でる。
【0122】
【表2】
【0123】
実施例５
標的領域２を標的とするＵ７－ｓｎＲＮＡによって媒介されるＵＳＨ２Ａエクソン１３のスプライシングスキッピング効果の検出。
標的領域２を標的とするＵ７－ｓｎＲＮＡによって媒介されるＵＳＨ２Ａエクソン１３のスプライシングスキッピング効果の検出。
【0124】
検出方法：実施例４と同じであり、ゲノム上の標的領域２を標的とするＵ７－ｓｎＲＮＡの位置（図で左から右でゲノムの５’末端から３’末端に相当する）は図８に示された通りである。
【0125】
実験結果：図９及び下記の表に示されるように、標的領域２を標的とするすべてのＵ７－ｓｎＲＮＡは、レポーター遺伝子細胞においてＵＳＨ２Ａエクソン１３のスプライシングスキッピングを誘導することができる。当該領域２を標的とする既存のＡＯＮはエクソン１３のスプライシングスキッピングを誘導する効果が低いが、当該領域２を標的とするｓｎＲＮＡはエクソン１３のスプライシングスキッピングを効果的に誘導することができる。
【0126】
【表3】
【0127】
実施例６
標的領域３を標的とするＵ７－ｓｎＲＮＡによって媒介されるＵＳＨ２Ａエクソン１３のスプライシングスキッピング効果の検出。
標的領域３を標的とするＵ７－ｓｎＲＮＡによって媒介されるＵＳＨ２Ａエクソン１３のスプライシングスキッピング効果の検出。
【0128】
検出方法：実施例４と同じであり、ゲノム上の標的領域３を標的とするＵ７－ｓｎＲＮＡの位置（図で左から右でゲノムの５’末端から３’末端に相当する）は図１１に示された通りである。
【0129】
実験結果：図１２及び下記の表に示されるように、標的領域３を標的とするすべてのＵ７－ｓｎＲＮＡは、レポーター遺伝子細胞においてＵＳＨ２Ａエクソン１３のスプライシングスキッピングを誘導することができる。当該領域３を標的とする既存のＡＯＮはエクソン１３のスプライシングスキッピングを誘導する効果が低いが、当該領域３を標的とするｓｎＲＮＡはエクソン１３のスプライシングスキッピングを効果的に誘導することができる。
【0130】
【表4】
【0131】
実施例４、５、６の分析を結合して見ると、先行技術において標的領域１、２、３は、ＡＯＮの非感受性領域を標的であって、即ち、当該領域を標的とすることは、エクソン１３のスプライシングスキッピングを誘導できないか、又はほとんど誘導しないが、当該領域を標的とするｓｎＲＮＡはエクソン１３のスプライシングスキッピングを有意に誘導することができることを見つけた。従って、ｓｎＲＮＡとＡＯＮは両方ともスプライシングスキッピングを誘導することができるが、それらの作用機序は異なり、標的部位感受性（標的領域内の適用可能な標的部位）も異なる。
【0132】
同時に、図７、１０、１３及び下記の表に示されるように、同じ領域を標的とするスプライシングスキッピングを誘導した細胞比率（ＧＦＰ％）は近いが、同じ領域内の異なる標的を標的とするｓｎＲＮＡが、同じ細胞内でスプライシングスキッピングして得られたｍＲＮＡとそのタンパク質レベル（平均ＦＩＴＣ強度）には違いがある。さらに、標的領域１と標的領域２は、同じ細胞内でスプライシングスキッピングを誘導して得られたｍＲＮＡとタンパク質のレベルは、標的領域３よりも優れている。
【0133】
【表5】
【0134】
実施例７
標的領域４を標的とするＵ７－ｓｎＲＮＡ及びｓｎＲＮＡ＃２４によって媒介されるＵＳＨ２Ａエクソン１３のスプライシングスキッピング効果を検出。
標的領域４を標的とするＵ７－ｓｎＲＮＡ及びｓｎＲＮＡ＃２４によって媒介されるＵＳＨ２Ａエクソン１３のスプライシングスキッピング効果を検出。
【0135】
検出方法：実施例４と同じであり、ゲノム上の領域４を標的とするＵ７－ｓｎＲＮＡ位置（図で左から右でゲノムの５’末端から３’末端に相当する）は図１４に示された通りである。
【0136】
実験結果：図１５及び下記の表に示されるように、標的領域４を標的とするすべてのＵ７－ｓｎＲＮＡは、レポーター遺伝子細胞においてＵＳＨ２Ａエクソン１３のスプライシングスキッピングを誘導することができる。
【0137】
【表6】
【0138】
実施例８
標的領域５を標的とするＵ７－ｓｎＲＮＡによって媒介されるＵＳＨ２Ａエクソン１３のスプライシングスキッピング効果の検出。
標的領域５を標的とするＵ７－ｓｎＲＮＡによって媒介されるＵＳＨ２Ａエクソン１３のスプライシングスキッピング効果の検出。
【0139】
検出方法：実施例４と同じであり、ゲノム上のＵ７－ｓｎＲＮＡ標的領域５の位置（図で左から右でゲノムの５’末端から３’末端に相当する）は図１６に示された通りである。
【0140】
実験結果：図１７及び下記の表に示されるように、標的領域５を標的とするすべてのＵ７－ｓｎＲＮＡは、レポーター遺伝子細胞においてＵＳＨ２Ａエクソン１３のスプライシングスキッピングを誘導することができる。
【0141】
【表7】
【0142】
実施例９
標的領域６を標的とするＵ７－ｓｎＲＮＡによって媒介されるＵＳＨ２Ａエクソン１３のスプライシングスキッピング効果の検出。
標的領域６を標的とするＵ７－ｓｎＲＮＡによって媒介されるＵＳＨ２Ａエクソン１３のスプライシングスキッピング効果の検出。
【0143】
検出方法：実施例４と同じであり、ゲノム上のＵ７－ｓｎＲＮＡ標的領域６の位置（図で左から右でゲノムの５’末端から３’末端に相当する）は図１８に示された通りである。
【0144】
実験結果：図１９及び下記の表に示されるように、標的領域６を標的とするすべてのＵ７－ｓｎＲＮＡは、レポーター遺伝子細胞においてＵＳＨ２Ａエクソン１３のスプライシングスキッピングを誘導することができる。
【0145】
【表8】
【0146】
実施例１０
標的領域７を標的とするＵ７－ｓｎＲＮＡによって媒介されるＵＳＨ２Ａエクソン１３のスプライシングスキッピング効果の検出。
標的領域７を標的とするＵ７－ｓｎＲＮＡによって媒介されるＵＳＨ２Ａエクソン１３のスプライシングスキッピング効果の検出。
【0147】
検出方法：実施例４と同じであり、ゲノム上の標的領域７を標的とするＵ７－ｓｎＲＮＡの位置（図で左から右でゲノムの５’末端から３’末端に相当する）は図２０に示された通りである。
【0148】
実験結果：図２１及び下記の表に示されるように、標的領域７を標的とするすべてのＵ７－ｓｎＲＮＡは、レポーター遺伝子細胞においてＵＳＨ２Ａエクソン１３のスプライシングスキッピングを誘導することができる。
【0149】
【表9】
【0150】
実施例１１
Ｕ７－ｓｎＲＮＡによって媒介されるＵＳＨ２Ａエクソン１３のスプライシングスキッピング効果の検出。
Ｕ７－ｓｎＲＮＡによって媒介されるＵＳＨ２Ａエクソン１３のスプライシングスキッピング効果の検出。
【0151】
検証方法：実施例４と同じである。
【0152】
実験結果：異なる領域におけるＵ７－ｓｎＲＮＡによって誘導されるＧＦＰ陽性細胞の平均ＦＩＴＣ強度は図２２及び下記の表に示された通りである。
【0153】
【表10】
【0154】
同じ領域を標的とするＧＦＰ％（スプライシングスキッピングが誘導された細胞比率）は近いが、同じ領域内の異なる標的を標的とするｓｎＲＮＡは、同じ細胞内でスプライシングスキッピングして得られたｍＲＮＡとそのタンパク質レベル（平均ＦＩＴＣ強度）が異なる。
【0155】
領域２を標的すると、より高いスプライシングスキッピングが誘導された細胞比率（ＧＦＰ％）が得られるだけではなく、同じ細胞内でスプライシングスキッピングを誘導して得られるｍＲＮＡ及びタンパク質のレベル（平均ＦＩＴＣ強度）もより高い。
【0156】
しかしながら、従来技術においてＡＯＮによるスプライシングスキッピングの誘導効率が高い標的部位＃２とその隣接部位＃１及び＃３は、ｓｎＲＮＡシステムでは、同じ細胞内でスプライシングスキッピングを誘発して得られるｍＲＮＡとタンパク質のレベルが低かった。領域３を標的とする既存技術のＡＯＮ効率は領域２より高いが、ｓｎＲＮＡシステムでは領域２を標的とする効率が領域３より高かった。従って、ｓｎＲＮＡとＡＯＮはどちらもスプライシングスキッピングを誘導できるが、両者の作用機序は異なり、標的部位の感受性も異なる。実施例１２の結果分析に結合すると、ｓｎＲＮＡ＃２４の効率がｓｎＲＮＡ＃２、ＡＯＮ１の効率と近いため、ｓｎＲＮＡ＃３～＃１１の効果はすべてｓｎＲＮＡ＃２、ｓｎＲＮＡ＃２４より優れ、ＡＯＮ１よりも優れていると推測できる。
【0157】
実施例１２
Ｕ７－ｓｎＲＮＡによって媒介されるＵＳＨ２Ａエクソン１３のスプライシングスキッピング効率はＡＯＮよりも有意に優れていることの確認。
Ｕ７－ｓｎＲＮＡによって媒介されるＵＳＨ２Ａエクソン１３のスプライシングスキッピング効率はＡＯＮよりも有意に優れていることの確認。
【0158】
検出方法：２９３Ｔを２４時間後に細胞コンフルエンスが約８０％に達するように２４ウェルプレートに所定の量で播種した。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００を使用して、ｐＣＭＶ－ＥＧＦＰｌｅｆｔ－Ｅｘｏｎ１３ｃ．２８０２Ｔ＞Ｇ－ＥＧＦＰｒｉｇｈｔ及び異なる標的のｐＵＣ５７－Ｕ７－ｓｎＲＮＡプラスミドを２９３Ｔ細胞に同時トランスフェクト（ベクター質量比は１００ｎｇ：４００ｎｇである）し、レポータープラスミド単独でトランスフェクトされた、レポータープラスミド及びｐＵＣ５７－Ｕ７ Ｓｃｒａｍｂｌｅで同時にトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞を、それぞれ２つの陰性対照として使用し、レポータープラスミド及び１０ｐｍｏｌのアンチセンスオリゴヌクレオチドＡＯＮ１（５′－ＭＡ＊ＭＧ＊ＭＣ＊ＭＵ＊ＭＵ＊ＭＣ＊ＭＧ＊ＭＧ＊ＭＡ＊ＭＧ＊ＭＡ＊ＭＡ＊ＭＡ＊ＭＵ＊ＭＵ＊ＭＵ＊ＭＡ＊ＭＡ＊ＭＡ＊ＭＵ＊ＭＣ＊－３′、「Ｍ」は２’－Ｏ－メトキシ修飾を示し、「＊」はホスホロチオエートを示す）で同時にトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞を陽性対照として使用し、いかなるプラスミドもトランスフェクトしていない２９３Ｔ細胞をブランク対照として使用した。トランスフェクトされた細胞を４８～７２時間培養し、トリプシンを使用して単一細胞に消化した後、フローサイトメーターを使用して、さまざまなｓｎＲＮＡのＧＦＰ陽性率と平均ＦＩＴＣ強度を検出した。
【0159】
実験結果：図２３及び下記の表に示されるように、本発明によってスクリーニングされたｓｎＲＮＡ＃８及びｓｎＲＮＡ＃１８はいずれもＡＯＮ１より優れており、ｓｎＲＮＡ＃２はＡＯＮ１と似ていた効率を有する。
【0160】
【表11】
【0161】
実施例１３
化学合成されたＵ７－ｓｎＲＮＡによる、ＷＥＲＩ細胞におけるＵＳＨ２Ａエクソン１３のスプライシングスキッピングの誘導。
化学合成されたＵ７－ｓｎＲＮＡによる、ＷＥＲＩ細胞におけるＵＳＨ２Ａエクソン１３のスプライシングスキッピングの誘導。
【0162】
ヒト由来宿主細胞を２４ウェルプレートに６×１０５／ウェルで播種し、本実施例で選択したヒト網膜神経細胞はＷＥＲＩ－Ｒｂ－１細胞（網膜神経細胞株）であった。
【0163】
Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００を使用して、インビトロで合成した１００ｐｍｏｌのＵ７－ｓｎＲＮＡ＃１、ｓｎＲＮＡ＃４、ｓｎＲＮＡ＃８、ｓｎＲＮＡ＃１０、ｓｎＲＮＡ＃１４をＷＥＲＩ細胞にそれぞれトランスフェクトし、同じ量（１００ｐｍｏｌ）のアンチセンスオリゴヌクレオチドＡＯＮ１（５′－ＭＡ＊ＭＧ＊ＭＣ＊ＭＵ＊ＭＵ＊ＭＣ＊ＭＧ＊ＭＧ＊ＭＡ＊ＭＧ＊ＭＡ＊ＭＡ＊ＭＡ＊ＭＵ＊ＭＵ＊ＭＵ＊ＭＡ＊ＭＡ＊ＭＡ＊ＭＵ＊ＭＣ＊－３′、「Ｍ」は２’－Ｏ－メトキシ修飾を示し、「＊」はホスホロチオエートを示す）及びＡＯＮ２（５′－ＭＵ＊ＭＧ＊ＭＡ＊ＭＵ＊ＭＣ＊ＭＡ＊ＭＣ＊ＭＡ＊ＭＣ＊ＭＣ＊ＭＵ＊ＭＡ＊ＭＡ＊ＭＧ＊ＭＣ＊ＭＣ＊ＭＣ＊ＭＵ＊ＭＡ＊ＭＡ＊ＭＡ＊－３′、「Ｍ」は２’－Ｏ－メトキシ修飾を示し、「＊」はホスホロチオエートを示す）をトランスフェクトして対照群とし、１μｇのＥＧＦＰプラスミドをトランスフェクトして陰性対照とし、いかなるプラスミドもトランスフェクトしないＷＥＲＩ細胞をブランク対照として使用した。トランスフェクトされた細胞を続いて７２時間培養し、その後、各実験群細胞のＲＮＡを抽出し、逆転写してｃＤＮＡを得、プライマーＡＧＣＣＴＴＴＣＣＧＣＣＡＡＧＧＴＧＡＴＣ（配列番号３７）及びＣＡＣＡＡＣＧＴＴＧＣＣＣＡＧＣＡＡＴＧＧ（配列番号３８）を使用してＲＴ－ＰＣＲ実験を実行し、成熟ＵＳＨ２Ａ ｍＲＮＡにおけるエクソン１３の存在を検出し、電気泳動の結果は図２４に示された通りである。
【0164】
実験結果：Ｕｓｈｅｒｉｎタンパク質を内因的に発現するＷＥＲＩ細胞において、ＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡエクソ１３スプライシングスキッピングに対する化学合成Ｕ７－ｓｎＲＮＡの誘導効果をＡＯＮ技術スキームと比較し、ＲＴ－ＰＣＲテストデータと分析結果は、ＡＯＮシングルホップバンドがｓｎＲＮＡよりも弱く、ＡＯＮシングルホップバンドの下にさらに有意なダブルホップバンドがあることを示し、これにより、化学合成されたＵ７－ｓｎＲＮＡ実験群１及びＵ７－ｓｎＲＮＡ実験群２は、エクソン１３のシングルスプライシングスキッピングの誘導において、ＡＯＮ１及びＡＯＮ２技術スキームより有意に優れていることを示している。更に、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して、ｒｔ－ＰＣＲ電気泳動バンドのさらなる定量分析を実行し、ジャンプされたＵＳＨ２Ａ ｍＲＮＡの合計（エクソン１３のシングルスキッピング、エクソン１２及びエクソン１３のダブルスキッピングのＵＳＨ２Ａ ｍＲＮＡ合計）に対する、エクソン１２及びエクソン１３のダブルスキッピングＵＳＨ２Ａ ｍＲＮＡの比率を分析し、結果は、エクソン１２及びエクソン１３におけるＵ７－ｓｎＲＮＡによって誘導されるダブルスプライシングスキッピングの比率が非常に低く、ＡＯＮ１及びＡＯＮ２のダブルスキッピングの比率よりも低いことを示している。従って、Ｕ７－ｓｎＲＮＡがエキソン１３のシングルスプライシングスキッピングの効率を有意に向上させ、同時より低いＵＳＨ２Ａ ｍＲＮＡのダブルホップ副産物を確保していることが分かる。
【0165】
さらに、Ｕ７－ｓｎＲＮＡ＃１４の標的部位は、従来技術ではエクソン１２及びエクソン１３におけるダブルスプライシングスキッピングの可能性が極めて高いＡＯＮ部位に近いが、Ｕ７－ｓｎＲＮＡ＃１４処理後のダブルスプライシングスキッピングの発生可能性は非常に低い。さらに、Ｕ７－ｓｎＲＮＡは、エクソン１３のスプライシングスキッピングを誘導しながら、エクソン１２とエクソン１３のダブルジャンプ確率を大幅に減少させることができることが分かる。
【0166】
実施例１４
ｈｎＲＮＰ Ａ１結合モチーフに連結されたＵ７－ｓｎＲＮＡのスプライシングスキッピング効果の検出。
ｈｎＲＮＰ Ａ１結合モチーフに連結されたＵ７－ｓｎＲＮＡのスプライシングスキッピング効果の検出。
【0167】
１、ｈｎＲＮＰ Ａ１結合モチーフに連結されたＵ７－ｓｎＲＮＡの構築。
表のｇＲＮＡ配列に対応する転写前ＤＮＡ配列に従って、対応するＯｌｉｇｏ ＤＮＡをそれぞれ合成した。Ｏｌｉｇｏ ＤＮＡのセンス鎖は、標的配列の逆相補配列（認識ドメイン配列に相当するＤＮＡ配列）であり、５’にＣＣＧＣＡＡＴＡＴＧＡＴＡＧＧＧＡＣＴＴＡＧＧＧＴＧ（配列番号３９）を加え、アンチセンス鎖は標的配列は５’にＡＡＴＴを加え、３’にＣＡＣＣＣＴＡＡＧＴＣＣＣＴＡＴＣＡＴＡＴＴ（配列番号４０）を加えた。例えば、ｓｎＲＮＡ＃１４の認識ドメイン配列はＡＣＡＣＵＧＧＣＡＧＧＧＣＵＣＡＣＡＵＣＣＡ（配列番号４１）であり、合成されたＯｌｉｇｏ ＤＮＡセンス鎖は
（配列番号４２）であり、アンチセンス鎖は
（配列番号４３）であり、下線は認識ドメイン配列に対応するＤＮＡ二本鎖配列を示し、太字斜体は、ｈｎＲＮＰ Ａ１タンパク質の結合モチーフ「ＵＡＧＧＧＵ」に対応するＤＮＡ二本鎖配列を示す。
表のｇＲＮＡ配列に対応する転写前ＤＮＡ配列に従って、対応するＯｌｉｇｏ ＤＮＡをそれぞれ合成した。Ｏｌｉｇｏ ＤＮＡのセンス鎖は、標的配列の逆相補配列（認識ドメイン配列に相当するＤＮＡ配列）であり、５’にＣＣＧＣＡＡＴＡＴＧＡＴＡＧＧＧＡＣＴＴＡＧＧＧＴＧ（配列番号３９）を加え、アンチセンス鎖は標的配列は５’にＡＡＴＴを加え、３’にＣＡＣＣＣＴＡＡＧＴＣＣＣＴＡＴＣＡＴＡＴＴ（配列番号４０）を加えた。例えば、ｓｎＲＮＡ＃１４の認識ドメイン配列はＡＣＡＣＵＧＧＣＡＧＧＧＣＵＣＡＣＡＵＣＣＡ（配列番号４１）であり、合成されたＯｌｉｇｏ ＤＮＡセンス鎖は
【化3】
（配列番号４２）であり、アンチセンス鎖は
【化4】
（配列番号４３）であり、下線は認識ドメイン配列に対応するＤＮＡ二本鎖配列を示し、太字斜体は、ｈｎＲＮＰ Ａ１タンパク質の結合モチーフ「ＵＡＧＧＧＵ」に対応するＤＮＡ二本鎖配列を示す。
【0168】
合成したＯｌｉｇｏ ＤＮＡセンス鎖とアンチセンス鎖をアニーリング反応系（総反応量２０μｌ：Ｏｌｉｇｏ－Ｆ（１００μＭ）２μｌ＋Ｏｌｉｇｏ－Ｒ（１００μＭ）２μｌ＋１０×ＮＥＢ Ｃｕｔｔｅｒ ｓｍａｒｔ ｂｕｆｆｅｒ ２μｌ＋脱イオン水１６μｌ）を混合し、９５℃で５分間培養した後、氷上に置いて冷却させ、アニーリングして粘着末端を持つ二本鎖ＤＮＡを形成した。１００倍に希釈した後、１μｌを取り、１０ｎｇのＢｓａＩで消化し、回収した線状化ｐＵＣ５７－Ｕ７－ｓｎＲＮＡ骨格プラスミドを連結させた。さらに、大腸菌コンピテントセルの形質転換、シングルクローニング、ＰＣＲ及び配列確認により、ＵＳＨ２Ａエクソン１３のスプライシングスキッピングを誘導するためのｈｎＲＮＰ Ａ１結合モチーフを含むＵ７－ｓｎＲＮＡベクターを得、ベクターをｐＵＣ５７－Ｕ７－ｈｎＲＮＰ Ａ１－ｓｎＲＮＡ＃と名付けた。プラスミドを精製し、後で使用するために－２０℃で保存した。
【0169】
Ｕ７－ｈｎＲＮＰ Ａ１－ｓｎＲＮＡは、実施例２、実施例４に記載の方法に従って化学合成及び修飾することもできる。ｓｎＲＮＡ＃１４を例に挙げると、化学合成されたＵ７－ｈｎＲＮＰ Ａ１－ｓｎＲＮＡの配列と修飾は下記の通りである（＊はホスホロチオエート骨格を示し、ｍは２’－メトキシ修飾を示し、下線は標的配列に逆相補的な認識ドメインを示し、斜体はｓｍＯＰＴ配列を示し、太字はｈｎＲＮＰ Ａ１タンパク質結合モチーフを示す）：
Ｕ７－ｈｎＲＮＰ Ａ１－ｓｎＲＮＡの概略構造図は図２５に示された通りである。
【化5】
Ｕ７－ｈｎＲＮＰ Ａ１－ｓｎＲＮＡの概略構造図は図２５に示された通りである。
【0170】
上記改変配列は、配列番号４４に示される配列の上で、５’末端及び３’末端の最初の３個の塩基にホスホロチオエート骨格修飾とメトキシ修飾を加えたものである。
【0171】
２、レポーター遺伝子細胞におけるＵＳＨ２Ａエクソン１３のスプライシングスキッピングを誘導するｈｎＲＮＰ Ａ１結合モチーフに連結されたＵ７－ｓｎＲＮＡの効率を試験した。
【0172】
検出方法：２９３Ｔを２４時間後に細胞コンフルエンスが約８０％に達するように２４ウェルプレートに所定の量で播種した。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００を使用して、ｐＣＭＶ－ＥＧＦＰｌｅｆｔ－Ｅｘｏｎ１３ｃ．２８０２Ｔ＞Ｇ－ＥＧＦＰｒｉｇｈｔを、それぞれｐＵＣ５７－Ｕ７－ｈｎＲＮＰ Ａ１－ｓｎＲＮＡプラスミド、ｐＵＣ５７－Ｕ７－ｓｎＲＮＡプラスミドと、２９３Ｔ細胞に同時にトランスフェクト（ベクター質量比は１００ｎｇ：４００ｎｇである）し、レポータープラスミド単独でトランスフェクトされた、レポータープラスミド及びｐＵＣ５７－Ｕ７ Ｓｃｒａｍｂｌｅで同時にトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞を、それぞれ２つの陰性対照として使用し、いかなるプラスミドもトランスフェクトしていない２９３Ｔ細胞をブランク対照として使用した。トランスフェクトされた細胞を続いて４８～７２時間培養し、トリプシンを使用して単一細胞に消化した後、フローサイトメーターを使用して、さまざまなｓｎＲＮＡ群によって誘導されるスプライシングスキッピング効率を検出した。
【0173】
実験結果：図２６及び下記の表に示されるように、Ｕ７－ｓｎＲＮＡの５’末端へのｈｎＲＮＰ Ａ１結合モチーフの導入は、ＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡエキソン１３のスプライシングスキッピングを誘導する効果を有意に改善することができ、エキソン１３のスプライシングスキッピングを持つ細胞（ＧＦＰ＋）の比率を増加させるだけではなく、各細胞内のスプライシングスキッピングされたエクソンを持つｍＲＮＡのレベル（平均ＦＩＴＣ強度）も増加させた。
【0174】
【表12】
【0175】
本実施例はＵ７－ｓｎＲＮＡの５’末端に遊離テールを導入し、前記遊離テール配列はｈｎＲＮＰ Ａ１タンパク質の結合モチーフ「ＵＡＧＧＧＵ」を含み、遊離テール配列は好ましくは、「ＵＡＵＧＡＵＡＧＧＧＡＣＵＵＡＧＧＧＵＧ」（配列番号４５）であり、ｈｎＲＮＰ Ａ１タンパク質を動員してＵＳＨ２Ａエクソン１３のスプライシングスキッピングを促進でき、エクソン１２とエクソン１３のダブルスキッピングは増加せず、その他の標的特異性に影響を与えず、標的離脱効果を誘発又は増加させなかった。
【0176】
実施例１５
ＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡエクソン１３のスプライシングスキッピングの誘導を標的としたＡＡＶ－Ｕ７－ｓｎＲＮＡ関連プラスミドベクターの構築とウイルスパッケージング。
ＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡエクソン１３のスプライシングスキッピングの誘導を標的としたＡＡＶ－Ｕ７－ｓｎＲＮＡ関連プラスミドベクターの構築とウイルスパッケージング。
【0177】
本実施例はＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡのエキソン１３のスプライシングスキッピングを標的にして誘導するＵ７－ｓｎＲＮＡ遺伝子を挿入し、ｐＡＡＶ－ＣＭＶベクターの２つのＩＴＲドメインの中央の遺伝子配列を置き換え、ｐＡＡＶ－Ｕ７－ｓｎＲＮＡベクター、ＡＡＶパッケージングプラスミドを構築した。血清型ｐＲＣプラスミド（ＡＡＶ２のＲｅｐ遺伝子と各血清型のそれぞれのＣａｐ遺伝子を含む）、ｐＨｅｌｐｅｒプラスミド（アデノウイルスのＥ２Ａ、Ｅ４、及びＶＡ遺伝子を含むベクタープラスミド）を宿主細胞に同時トランスフェクトし、パッケージしてＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡエキソン１３のスプライシングスキッピングを標的とするＡＡＶ－Ｕ７－ｓｎＲＮＡウイルスを得た。具体的な操作プロセスは下記の通りである：
【0178】
まず、全遺伝子合成により遺伝子配列－－Ｕ７－ｓｎＲＮＡ遺伝子発現カセット骨格（認識ドメインを含まない）：５’－マウスＵ７プロモーター－ｓｍＯＰＴ配列－Ｕ７－ｓｎＲＮＡ ｓｃａｆｆｏｌｄ－ｓｎＲＮＡ遺伝子特異的３’カセット－３’を合成した。ここで、Ｕ７プロモーターとｓｍＯＰＴの間に２つのＴｙｐｅ ＩＩｓ型制限エンドヌクレアーゼ認識部位を加えて、その後の切断、他の認識ドメイン配列の置換及び挿入を容易にした。全遺伝子合成配列を、ｐＡＡＶ－ＣＭＶプラスミドの２つのＡＡＶ２－ＩＴＲドメイン間に挿入及び置換して、ｐＡＡＶ－Ｕ７－ｓｎＲＮＡ骨格ベクターを得た。
【0179】
Ｕ７－ｓｎＲＮＡ遺伝子発現カセット骨格（認識ドメインは含まない）（配列番号４６）：
ＡＡＧＣＴＴＡＡＣＡＡＣＡＴＡＧＧＡＧＣＴＧＴＧＡＴＴＧＧＣＴＧＴＴＴＴＣＡＧＣＣＡＡＴＣＡＧＣＡＣＴＧＡＣＴＣＡＴＴＴＧＣＡＴＡＧＣＣＴＴＴＡＣＡＡＧＣＧＧＴＣＡＣＡＡＡＣＴＣＡＡＧＡＡＡＣＧＡＧＣＧＧＴＴＴＴＡＡＴＡＧＴＣＴＴＴＴＡＧＡＡＴＡＴＴＧＴＴＴＡＴＣＧＡＡＣＣＧＡＡＴＡＡＧＧＡＡＣＴＧＴＧＣＴＴＴＧＴＧＡＴＴＣＡＣＡＴＡＴＣＡＧＴＧＧＡＧＧＧＧＴＧＴＧＧＡＡＡＴＧＧＣＡＣＣＴＴＧＡＴＣＴＣＡＣＣＣＴＣＡＴＣＧＡＡＡＧＴＧＧＡＧＴＴＧＡＴＧＴＣＣＴＴＣＣＣＴＧＧＣＴＣＧＣＴＡＣＡＧＡＣＧＣＡＣＴＴＣＣＧＣＡＧＡＧＡＣＣＡＡＴＧＴＧＧＧＴＣＴＣＧＡＡＴＴＴＴＴＧＧＡＧＣＡＧＧＴＴＴＴＣＴＧＡＣＴＴＣＧＧＴＣＧＧＡＡＡＡＣＣＣＣＴＣＣＣＡＡＴＴＴＣＡＣＴＧＧＴＣＴＡＣＡＡＴＧＡＡＡＧＣＡＡＡＡＣＡＧＴＴＣＴＣＴＴＣＣＣＣＧＣＴＣＣＣＣＧＧＴＧＴＧＴＧＡＧＡＧＧＧＧＣＴＴＴＧＡＴＣＣＴＴＣＴＣＴＧＧＴＴＴＣＣＴＡＧＧＡＡＡＣＧＣＧＴＡＴＧＴＧＣＧＧＣＣＧＣ。
ＡＡＧＣＴＴＡＡＣＡＡＣＡＴＡＧＧＡＧＣＴＧＴＧＡＴＴＧＧＣＴＧＴＴＴＴＣＡＧＣＣＡＡＴＣＡＧＣＡＣＴＧＡＣＴＣＡＴＴＴＧＣＡＴＡＧＣＣＴＴＴＡＣＡＡＧＣＧＧＴＣＡＣＡＡＡＣＴＣＡＡＧＡＡＡＣＧＡＧＣＧＧＴＴＴＴＡＡＴＡＧＴＣＴＴＴＴＡＧＡＡＴＡＴＴＧＴＴＴＡＴＣＧＡＡＣＣＧＡＡＴＡＡＧＧＡＡＣＴＧＴＧＣＴＴＴＧＴＧＡＴＴＣＡＣＡＴＡＴＣＡＧＴＧＧＡＧＧＧＧＴＧＴＧＧＡＡＡＴＧＧＣＡＣＣＴＴＧＡＴＣＴＣＡＣＣＣＴＣＡＴＣＧＡＡＡＧＴＧＧＡＧＴＴＧＡＴＧＴＣＣＴＴＣＣＣＴＧＧＣＴＣＧＣＴＡＣＡＧＡＣＧＣＡＣＴＴＣＣＧＣＡＧＡＧＡＣＣＡＡＴＧＴＧＧＧＴＣＴＣＧＡＡＴＴＴＴＴＧＧＡＧＣＡＧＧＴＴＴＴＣＴＧＡＣＴＴＣＧＧＴＣＧＧＡＡＡＡＣＣＣＣＴＣＣＣＡＡＴＴＴＣＡＣＴＧＧＴＣＴＡＣＡＡＴＧＡＡＡＧＣＡＡＡＡＣＡＧＴＴＣＴＣＴＴＣＣＣＣＧＣＴＣＣＣＣＧＧＴＧＴＧＴＧＡＧＡＧＧＧＧＣＴＴＴＧＡＴＣＣＴＴＣＴＣＴＧＧＴＴＴＣＣＴＡＧＧＡＡＡＣＧＣＧＴＡＴＧＴＧＣＧＧＣＣＧＣ。
【0180】
実施例１及び実施例６に記載の方法に従い、表１のｓｎＲＮＡ認識ドメイン配列に対応する転写前ＤＮＡ配列に従って、対応するＯｌｉｇｏ ＤＮＡセンス鎖及びアンチセンス鎖をそれぞれ合成し、Ｔｙｐｅ ＩＩｓ型制限エンドヌクレアーゼ認識部位によって切断されるものと同様の粘着末端を両端に加えた。アニーリングして粘着末端を持つ認識ドメイン二本鎖ＤＮＡを形成し、Ｔ４リガーゼを対応するＴｙｐｅ ＩＩｓ型制限エンドヌクレアーゼで消化した線状化ｐＡＡＶ－Ｕ７－ｓｎＲＮＡ骨格プラスミドでに連結させて、ＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡエクソン１３の特定の部位を標的としてスプライシングスキッピングを誘導するｐＡＡＶ－Ｕ７－ｓｎＲＮＡプラスミドの形成し、ｐＡＡＶ－Ｕ７－ｓｎＲＮＡ＃３、ｐＡＡＶ－Ｕ７－ｓｎＲＮＡ＃１４、ｐＡＡＶ－Ｕ７－ｓｎＲＮＡ＃１６など、認識ドメイン配列に対応するｓｎＲＮＡ番号に従って名前を付けた。
【0181】
標的遺伝子（ＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡエクソン１３のスプライシングスキッピングの誘導を標的とするＵ７－ｓｎＲＮＡ遺伝子発現カセット）を挿入し、ｐＡＡＶ－ＣＭＶプラスミドのＡＡＶ２－ＩＴＲドメイン間の遺伝子配列を置き換えた後、ｐＡＡＶ－Ｕ７－ｓｎＲＮＡプラスミドベクターを得た。説明書及び標準的な細胞操作手順に従って、ＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡエクソン１３のスプライシングスキッピングを標的とするＡＡＶ－Ｕ７－ｓｎＲＮＡウイルスをパッケージして得た。
【0182】
トランスフェクションの２４時間前に、ＨＥＫ２９３／２９３Ｔ細胞を１００ｍｍ細胞培養皿に播種し、培地は１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地であり、コンフルエンスが８０％～９０％に達したときにトランスフェクションを実行した。トランスフェクションの３時間前に、古い培地を廃棄し、新しい培地に交換した。トランスフェクションの際に、同時に下記の表の系に従ってｐＡＡＶ－Ｕ７－ｓｎＲＮＡプラスミド、ｐＲＣプラスミド、ｐＨｅｌｐｅｒプラスミド、及びＰＥＩ（ポリエチレンイミン）トランスフェクション試薬を調製し、培養皿に滴加した。ＰＥＩトランスフェクション混合物を加えた後、培養皿を軽く振ってトランスフェクション試薬を均一に分散させ、培地を３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで培養した。
【0183】
【表13】
【0184】
トランスフェクションの２４時間後、新鮮な２％ＦＢＳのＤＭＥＭ培地に交換した。トランスフェクションの４８～７２時間後、ＡＡＶウイルスを含む細胞を収集し、洗浄し、遠心分離し、細胞ペレットを収集し、ボルテックスして細胞ペレットをほぐした。続いて、キットの説明書に従って、細胞ペレットに０．５ｍＬのＡＡＶ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ａを加え、１５秒間ボルテックスして細胞ペレットを完全に懸濁させた。室温で５分間放置した後、１５秒間ボルテックスした。４℃、２０００～１４０００ｇで１０分間遠心分離し、細胞破片を除去した。上清を新しい滅菌遠心チューブに収集し、５０μＬのＡＡＶ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｂを加え、ピペットを使用して均一に混合し、異なる認識ドメインを持つＡＡＶ－Ｕ７－ｓｎＲＮＡウイルス溶液を得、一部を取ってｑＰＣＲを使用してウイルス力価を検出し、後で使用するために８０℃で保管した。
【0185】
ｐＡＡＶ－Ｕ７－ｓｎＲＮＡプラスミドのＡＡＶ２－ＩＴＲドメインと挿入される標的遺伝子断片は４．７ｋｂ未満ではなければならないため、複数のＵ７－ｓｎＲＮＡ遺伝子発現カセット（５’－マウスＵ７プロモーター認識ドメイン－ｓｍＯＰＴ配列、ｓｎＲＮＡ遺伝子特異的３’カセット－３’）を挿入することにより、同じ数のＡＡＶウイルス粒子を確保しながらＵ７－ｓｎＲＮＡの発現レベルを増加させ、遺伝子配列の長さは約４５０ｂｐであり、好ましくは、ｐＡＡＶ－Ｕ７－ｓｎＲＮＡプラスミドは１～１０個のＵ７－ｓｎＲＮＡ遺伝子発現カセットを保持し、前記ｐＡＡＶ－Ｕ７－ｓｎＲＮＡ プラスミド内の複数の Ｕ７－ｓｎＲＮＡ遺伝子発現カセットは、同じ認識ドメインを有してもよい。
【0186】
上述の実施例の技術的特徴は、任意の方法で組み合わせることができ、説明を簡略化するために、上記の実施例の技術的特徴のすべての可能な組み合わせについて説明することはしないが、これらの技術的特徴の組み合わせに矛盾がない限り、本明細書の範囲内にあるとみなすべきである。
【0187】
上述の実施例は、本発明のいくつかの実施形態を表現するのみであり、その説明は比較的具体的かつ詳細であるが、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。当業者であれば、本発明の概念から逸脱することなく、いくつかの修正及び改良を行うことができ、これらはすべて本発明の保護範囲に属することに留意されたい。したがって、本発明の特許の保護範囲は、添付の特許請求の範囲によって決定されるべきである。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2024-07-30
【手続補正1】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、遺伝子工学技術の分野に関し、特にＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡを標的とするｓｎＲＮＡ、及びその使用に関する。
【背景技術】
【0002】
Ｕｓｈｅｒ症候群（Ｕｓｈｅｒ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ）は、難聴－網膜色素変性症症候群としても知られる遺伝性疾患の一種であり、程度の異なる先天性感音性難聴と、網膜色素変性症（ＲＰ）による進行性の視力喪失を特徴とする。臨床的に、Ｕｓｈｅｒ症候群は下記の３つのタイプに分類できる：１、Ｉ型Ｕｓｈｅｒ症候群、患者は聴覚に関しては先天性重度感音性難聴、前庭反応に関しては前庭反応の消失、視覚に関しては思春期前の網膜色素変性症を患い、その後、徐々に失明し、このタイプに関連する遺伝子には、ＭＹＯ７Ａ、ＣＤＨ２３、ＵＳＨ１Ｃ、ＰＣＨＤ１５などが含まれ；２、ＩＩ型Ｕｓｈｅｒ症候群、患者は聴覚に関しては先天性中等度から重度の感音性難聴、前庭反応に関しては正常、視覚に関しては思春期前の網膜色素変性症を患い、徐々に失明し、このタイプに関連する遺伝子には、ＳＨ２Ａ、ＧＰＲ９８、ＷＨＲＮなどが含まれ；３、ＩＩＩ型Ｕｓｈｅｒ症候群、患者は聴覚に関しては進行性の感音性難聴、前庭反応に関しては正常、視覚に関しては、思春期の終わりに網膜色素変性症が発症し、徐々に失明し、このタイプに関連する遺伝子には、ＣＬＲＮ１などが含まれる。その中で、ＩＩ型Ｕｓｈｅｒ症候群はＵｓｈｅｒ症候群の５０％以上を占め、ＵＳＨ２Ａ遺伝子変異はＩＩ型Ｕｓｈｅｒ症候群の最も一般的な原因であり、Ｕｓｈｅｒ症候群患者の５０％以上を占めている。同時に、ＵＳＨ２Ａ遺伝子の突然変異も非症候性網膜色素変性症（ＮＳＲＰ）の重要な原因の１つである。
【0003】
ＵＳＨ２Ａは１ｑ４１に位置し、ゲノム内で８００ｋｂ以上に広がり、大型の膜貫通タンパク質Ｕｓｈｅｒｉｎをコードし、Ｕｓｈｅｒｉｎは、網膜光受容細胞と内耳有毛細胞の原形質膜に固定されており、繊毛の発達と維持に不可欠な構成要素である。網膜でＵｓｈｅｒｉｎはＵＳＨ２複合体の重要な部分であり、光受容体の外節の安定化に役割を果たしていると考えられている。ＵＳＨ２Ａには２つのサブタイプがあり、網膜細胞の主なサブタイプには７２個のエクソンが含まれ、コード領域の長さは約１５．６ｋｂである。Ｕｓｈｅｒｉｎタンパク質の細胞外部分には、１０個のＬａｍｉｎｉｎ ＥＧＦ－ｌｉｋｅ（ＬＥ）ドメインと３５個のＦｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ ｔｙｐｅ ３（ＦＮ３）ドメインを含む、多くの反復ドメインが含まれる。ヒトＵＳＨ２Ａエクソン１３は長さが６４２ｂｐであり、Ｕｓｈｅｒｉｎタンパク質の１０個のＬＥドメインのうちの４個であるアミノ酸７２３～９３６をコードする。
【0004】
ＵＳＨ２Ａ遺伝子のエクソン１３、エクソン５０、及びイントロン４０の突然変異は、Ｕｓｈｅｒ症候群を引き起こす可能性がある。現在までに、ＵＳＨ２Ａ遺伝子全体に分布する１，０００個以上の病原性変異が同定されており、そのうちエクソン１３はＵＳＨ２Ａ遺伝子で最も頻繁に突然変異するエクソンであり、約３５％を占めている。ＵＳＨ２Ａ遺伝子のエクソン１３の突然変異には、ｃ．２８０２Ｔ＞Ｇ（ｐ．Ｃｙｓ９３４Ｔｒｐ、中国の患者で頻度が最も高い突然変異）、ｃ．２２９９ｄｅｌＧ（ｐ．Ｇｌｕ７６７Ｓｅｒｆｓ＊２１、ヨーロッパとアメリカの患者で頻度が最も高い突然変異）、ｃ．２２７６Ｇ＞Ｔ（ｐ．ｃｙｓ７５９ｐｈｅ、非症候性ＲＰを引き起こす頻度が最も高い突然変異部位）、ｃ．２５２２Ｃ＞Ａ（ｐ．Ｓ８４１Ｙ）、ｃ．２２４２Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ７４８Ｘ）、ｃ．２５４１Ｃ＞Ａ（Ｃ８４７Ｘ）、ｃ．２７６１ｄｅｌＣ（Ｌｅｕ９２１ｆｓ）及びｃ．２７７６Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｒ９２６Ｃ）、ｃ．２２０９Ｃ＞Ｔ、ｃ．２３１０ｄｅｌＡ、ｃ．２３９１＿２３９２ｄｅＩＴＧ、ｃ．２４３１Ａ＞Ｔ、ｃ．２４３１＿２４３２ｄｅｌＡＡ、ｃ．２４４０Ｃ＞Ｔ、ｃ．２５２５ｄｕｐ、ｃ．２６１０Ｃ＞Ａ、ｃ．２７５５Ｃ＞Ｔ、ｃ．２１７６Ｔ＞Ｃ、ｃ．２２３６Ｃ＞Ｇ、ｃ．２２９６Ｔ＞Ｃ、ｃ．２３３２Ｇ＞Ｔ、ｃ．２３３９Ｇ＞Ｔ（ＰＭＩＤ：３１９０４０９１）が含まれる。
【0005】
ＵＳＨ２Ａ遺伝子のエクソン１３については、既存の技術では一般に３つの一般的な方法があり、１つ目は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを通じてゲノムＤＮＡを編集して、エクソン１３を直接削除するか、ＲＮＡスプライシング関連部位を破壊することである。ただし、セグメント欠失の使用には、染色体の再配列、ウイルスの組込み、逆再組込みなどのリスクが伴い、並びに、ＣＡＳシステムが長時間発現する場合、又は２つのｇＲＮＡによって誘導される二重切断が比較的大きなゲノムバックグラウンドに基づいて実行される場合、オフターゲットの確率が高くなる。２つ目は、単一の塩基エディターを使用して、上記のスプライシング関連部位の主要な塩基を変更する方法であり、これにより、エクソンスキッピングも促進される可能性がある。ただし、既存の単一塩基エディターは単一のＡＡＶベクターを介してロードすることができず、ＰＡＭ、編集ウィンドウ、及び塩基変換タイプによって制限され、スプライシング関連部位の近くに適切なｇＲＮＡがない可能性がある。３つ目は、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮｓ、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ）を使用して、ｐｒｅ－ｍＲＮＡスプライシングを標的にし、より高い効率でエクソンスキッピングを促進することである。ただし、ＡＯＮはエクソン１３のスキッピングを促進すると同時に、エクソン１２とエクソン１３の同時スキッピングも促進し、一部のＡＯＮ処理では、ダブルスキッピングが発生し、シングルスキッピングが発生しない場合もある。エクソン１２の全長は１９６ｂｐであり、これは３の整数倍ではなく、欠失はフレームシフト突然変異を引き起こし、スプライシングの二重ジャンプ後のＵＳＨ２Ａタンパク質が不活化され、ＡＯＮ効果は長く続かず、薬剤の投与量が高く；スプライシングスキッピングを誘発する効率が高くない。
【発明の概要】
【0006】
上記の課題を解決するために、本発明は、ＡＯＮよりも効率的にエクソン１３のスキッピングを促進することができる、ＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡを標的とするｓｎＲＮＡを提供する。
【0007】
上記の目的を達成するために、本発明は、認識ドメインがＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡ配列に逆相補的であり、ＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡに結合することにより、エクソン１３のスプライシングスキッピングを誘導するＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡを標的とするｓｎＲＮＡを提供する。
【0008】
ＵＳＨ２Ａを調査及び研究した後、発明者は、ＵＳＨ２Ａコード領域の長さが約１５．６ｋｂであるため、従来の遺伝子治療送達方法（組換えレンチウイルス、組換えアデノ随伴ウイルスなど）ではこれほど大きな配列パッケージングすることが困難であるため、ＵＳＨ２Ａを直接送達することで治療することは困難であることを発見した。マウスＵＳＨ２Ａのエクソン１２はヒトＵＳＨ２Ａのエクソン１３と相同であり、両方とも長さは６４２ｂｐであり、このエクソンの除去はその後のフレームシフト突然変異を引き起こさなかった。同時に、本発明者らは、マウスＵＳＨ２Ａのエキソン１２をノックアウトした後でも、Ｕｓｈｅｒｉｎは依然として正しく配置され、通常の機能を実行できることを発見した。従って、病原性突然変異を含むヒトＵＳＨ２Ａエクソン１３については、一連の手段を使用してジャンプを誘導して治療を実行することができる。
【0009】
同時に、細胞内には核内低分子ＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｎｕｃｌｅａｒＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ）が存在し、これは真核生物の転写後プロセシング中のＲＮＡスプライセオソーム（ｓｐｌｉｃｅｏｓｏｍｅ）の主成分であり、ｓｎＲＮＰタンパク質に結合することによってｍＲＮＡ前駆体のプロセシングに関与する。その長さは哺乳類では約１００～２１５ヌクレオチドであり、７つのカテゴリーに分類され、豊富なＵを含むためＵ１～Ｕ７と番号が付けられる。ただし、Ｕ７－ｓｎＲＮＰはスプライシングには関与しないが、複製依存性ヒストン（ＲＤＨ）ｐｒｅ－ｍＲＮＡの独特な３’末端プロセシングにおける重要な因子である。
【0010】
従って、本発明者らは、Ｕ７－ｓｎＲＮＡの非標準的なＳｍ結合部位を主なスプライソソームＵ－ｓｎＲＮＰに由来するコンセンサス配列で置き換え、Ｕ７－ｓｎＲＮＡの５’領域のヒストン結合配列を改変対象遺伝子の相補配列に変更してエクソンを標的とすることによりエクソンのスプライシングスキッピングを誘導することができる。
【0011】
本発明者らは、標的スクリーニングを通じて、エクソン１３のスプライシングスキッピング効果を誘導することができる、スプライシングスキッピングを誘導するＵ７－ｓｎＲＮＰの７つの標的領域及び２１の標的部位を発見し、同時に、Ｕ７－ｓｍＯＰＴ－ｓｎＲＮＡの認識ドメインとＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡエクソン１３のスプライシングスキッピング関連部位が逆相補的になるように設計し、それにより、Ｕ７－ｓｍＯＰＴ－ｓｎＲＮＡがＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡエクソン１３のスプライシングスキッピング関連部位に結合するように誘導し、更に、ＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡエクソン１３のスプライシングスキッピングを誘導し、エクソン１２は保持するため、エクソン１２と１３の二重ジャンプなどの予期しないスプライシングスキッピングの可能性が大幅に減少し、効率を大幅に向上させながら、安全性も確保した。
【0012】
その中の一つの実施形態において、前記ＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡ配列は、ＵＳＨ２Ａエクソン１３、イントロン１２又はイントロン１３の領域から選択される。
【0013】
その中の一つの実施形態において、前記ＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡ配列は、ＵＳＨ２Ａエクソン１３及びその両側に向かって５０ｂｐ延長される領域から選択される。
【0014】
その中の一つの実施形態において、前記ＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡ配列は、ＵＳＨ２Ａエクソン１３及び両側に向かって２０ｂｐ延長される領域から選択される。
【0015】
その中の一つの実施形態において、前記エクソン１３は、野生型のエクソン１３又は突然変異含有エクソン１３を含む。
【0016】
その中の一つの実施形態において、前記突然変異は、ｃ．２２４２Ｃ＞Ｔ、ｃ．２２７６Ｇ＞Ｔ、ｃ．２２９９ｄｅｌＧ、ｃ．２５２２Ｃ＞Ａ、ｃ．２５４１Ｃ＞Ａ、ｃ．２７６１ｄｅｌＣ、ｃ．２７７６Ｃ＞Ｔ、ｃ．２８０２Ｔ＞Ｇ、ｃ．２２０９Ｃ＞Ｔ、ｃ．２３１０ｄｅｌＡ、ｃ．２３９１＿２３９２ｄｅＩＴＧ、ｃ．２４３１Ａ＞Ｔ、ｃ．２４３１＿２４３２ｄｅｌＡＡ、ｃ．２４４０Ｃ＞Ｔ、ｃ．２５２５ｄｕｐ、ｃ．２６１０Ｃ＞Ａ、ｃ．２７５５Ｃ＞Ｔ、ｃ．２１７６Ｔ＞Ｃ、ｃ．２２３６Ｃ＞Ｇ、ｃ．２２９６Ｔ＞Ｃ、及びｃ．２３３２Ｇ＞Ｔの突然変異部位のうちの少なくとも１つを含む。
【0017】
その中の一つの実施形態において、前記ＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡ配列に対応するゲノム位置（ＮＣＢＩデータベースＧＲｃｈ３８バージョンに対応）領域は、Ｃｈｒ１：２１６２４７１４２－２１６２４７１８５、Ｃｈｒ１：２１６２４７１３０－２１６２４７１６１、Ｃｈｒ１：２１６２４６６１６－２１６２４６６４９、Ｃｈｒ１：２１６２４７２１３－２１６２４７２４６、Ｃｈｒ１：２１６２４７２０４－２１６２４７２３２、Ｃｈｒ１：２１６２４７１８７－２１６２４７２２０、及びＣｈｒ１：２１６２４７１６９－２１６２４７２０２から選択される。
【0018】
その中の一つの実施形態において、前記ＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡ配列は、配列番号１～７に示される配列から選択される。
【0019】
その中の一つの実施形態において、前記ＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡ配列に対応するゲノム位置は、Ｃｈｒ１：２１６２４７２２３－２１６２４７２４６、Ｃｈｒ１：２１６２４７２１８－２１６２４７２４１、Ｃｈｒ１：２１６２４７２１３－２１６２４７２３６、Ｃｈｒ１：２１６２４７２０９－２１６２４７２３２、Ｃｈｒ１：２１６２４７２０４－２１６２４７２２７、Ｃｈｒ１：２１６２４７１９７－２１６２４７２２０、Ｃｈｒ１：２１６２４７１９１－２１６２４７２１４、Ｃｈｒ１：２１６２４７１８７－２１６２４７２１０、Ｃｈｒ１：２１６２４７１７９－２１６２４７２０２、Ｃｈｒ１：２１６２４７１７４－２１６２４７１９７、Ｃｈｒ１：２１６２４７１６９－２１６２４７１９２、Ｃｈｒ１：２１６２４７１６２－２１６２４７１８５、Ｃｈｒ１：２１６２４７１５５－２１６２４７１７８、Ｃｈｒ１：２１６２４７１４７－２１６２４７１６８、Ｃｈｒ１：２１６２４７１４７－２１６２４７１７３、Ｃｈｒ１：２１６２４７１４２－２１６２４７１６５、Ｃｈｒ１：２１６２４７１３８－２１６２４７１６１、Ｃｈｒ１：２１６２４７１３０－２１６２４７１５３、Ｃｈｒ１：２１６２４６６２６－２１６２４６６４９、Ｃｈｒ１：２１６２４６６２２－２１６２４６６４５、及びＣｈｒ１：２１６２４６６１６－２１６２４６６３９から選択される。
【0020】
その中の一つの実施形態において、前記ｓｎＲＮＡの認識ドメインは、前記ＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡ配列の少なくとも１６ｂｐの連続配列に対して逆相補的である。
【0021】
その中の一つの実施形態において、前記ｓｎＲＮＡの認識ドメインは、前記ＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡ配列の少なくとも１７ｂｐの連続配列に対して逆相補的である。
【0022】
その中の一つの実施形態において、前記ｓｎＲＮＡの認識ドメインは、前記ＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡ配列の少なくとも１８ｂｐの連続配列に対して逆相補的である。
【0023】
その中の一つの実施形態において、前記ｓｎＲＮＡの認識ドメインは、前記ＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡ配列の少なくとも１９ｂｐの連続配列に対して逆相補的である。
【0024】
その中の一つの実施形態において、前記ｓｎＲＮＡの認識ドメインは、前記ＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡ配列の少なくとも２０ｂｐの連続配列に対して逆相補的である。
【0025】
その中の一つの実施形態において、前記ｓｎＲＮＡの認識ドメインは、前記ＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡ配列の少なくとも２１ｂｐの連続配列に対して逆相補的である。
【0026】
その中の一つの実施形態において、前記ｓｎＲＮＡの認識ドメインは、前記ＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡ配列の少なくとも２２ｂｐの連続配列に対して逆相補的である。
【0027】
その中の一つの実施形態において、前記ｓｎＲＮＡの認識ドメインは、前記ＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡ配列の少なくとも２３ｂｐの連続配列に対して逆相補的である。
【0028】
その中の一つの実施形態において、前記ｓｎＲＮＡの認識ドメインは、前記ＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡ配列の少なくとも２４ｂｐの連続配列に対して逆相補的である。
【0029】
その中の一つの実施形態において、前記ｓｎＲＮＡの認識ドメインは、前記ＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡ配列の１８ｂｐ～４０ｂｐの連続配列に対して逆相補的である。
【0030】
その中の一つの実施形態において、前記ｓｎＲＮＡの認識ドメインは、前記ＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡ配列の２０ｂｐ～２７ｂｐの連続配列に対して逆相補的である。
【0031】
その中の一つの実施形態において、前記ｓｎＲＮＡの認識ドメインは、配列番号８～２８に示される配列から選択される。
【0032】
その中の一つの実施形態において、前記ＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡ配列に対応するゲノム位置は、Ｃｈｒ１：２１６２４７２１３－２１６２４７２３６、Ｃｈｒ１：２１６２４７２０９－２１６２４７２３２、Ｃｈｒ１：２１６２４７２０４－２１６２４７２２７、Ｃｈｒ１：２１６２４７１９７－２１６２４７２２０、Ｃｈｒ１：２１６２４７１９１－２１６２４７２１４、Ｃｈｒ１：２１６２４７１８７－２１６２４７２１０、Ｃｈｒ１：２１６２４７１７９－２１６２４７２０２、Ｃｈｒ１：２１６２４７１７４－２１６２４７１９７、及びＣｈｒ１：２１６２４７１６９－２１６２４７１９２から選択される。
【0033】
その中の一つの実施形態において、前記ｓｎＲＮＡの認識ドメインは、配列番号１０～２８に示される配列から選択される。
【0034】
その中の一つの実施形態において、前記ＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡ配列に対応するゲノム位置は、Ｃｈｒ１：２１６２４７１６２－２１６２４７１８５、Ｃｈｒ１：２１６２４７１５５－２１６２４７１７８、Ｃｈｒ１：２１６２４７１４７－２１６２４７１６８、Ｃｈｒ１：２１６２４７１４７－２１６２４７１７３、Ｃｈｒ１：２１６２４７１４２－２１６２４７１６５、Ｃｈｒ１：２１６２４７１３８－２１６２４７１６１、Ｃｈｒ１：２１６２４７１３０－２１６２４７１５３、Ｃｈｒ１：２１６２４６６２６－２１６２４６６４９、Ｃｈｒ１：２１６２４６６２２－２１６２４６６４５、及びＣｈｒ１：２１６２４６６１６－２１６２４６６３９から選択される。
【0035】
その中の一つの実施形態において、前記ｓｎＲＮＡの認識ドメインは、配列番号１９～２８に示される配列から選択される。
【0036】
その中の一つの実施形態において、前記ＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡ配列に対応するゲノム位置は、Ｃｈｒ１：２１６２４７２１３－２１６２４７２３６、Ｃｈｒ１：２１６２４７２０９－２１６２４７２３２、Ｃｈｒ１：２１６２４７２０４－２１６２４７２２７、Ｃｈｒ１：２１６２４７１９７－２１６２４７２２０、Ｃｈｒ１：２１６２４７１９１－２１６２４７２１４、Ｃｈｒ１：２１６２４７１８７－２１６２４７２１０、Ｃｈｒ１：２１６２４７１７９－２１６２４７２０２、Ｃｈｒ１：２１６２４７１７４－２１６２４７１９７、Ｃｈｒ１：２１６２４７１６９－２１６２４７１９２、Ｃｈｒ１：２１６２４７１６２－２１６２４７１８５、Ｃｈｒ１：２１６２４７１５５－２１６２４７１７８、Ｃｈｒ１：２１６２４７１４７－２１６２４７１６８、Ｃｈｒ１：２１６２４７１４７－２１６２４７１７３、Ｃｈｒ１：２１６２４７１４２－２１６２４７１６５、及びＣｈｒ１：２１６２４７１３０－２１６２４７１５３から選択される。
【0037】
その中の一つの実施形態において、前記ｓｎＲＮＡの認識ドメインは、配列番号１０～２３に示される配列、配列番号２５に示される配列から選択される。
【0038】
その中の一つの実施形態において、前記ＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡ配列に対応するゲノム位置は、Ｃｈｒ１：２１６２４７２１３－２１６２４７２３６、Ｃｈｒ１：２１６２４７２０９－２１６２４７２３２、Ｃｈｒ１：２１６２４７２０４－２１６２４７２２７、Ｃｈｒ１：２１６２４７１９７－２１６２４７２２０、Ｃｈｒ１：２１６２４７１９１－２１６２４７２１４、Ｃｈｒ１：２１６２４７１８７－２１６２４７２１０、Ｃｈｒ１：２１６２４７１７９－２１６２４７２０２、Ｃｈｒ１：２１６２４７１７４－２１６２４７１９７、Ｃｈｒ１：２１６２４７１６９－２１６２４７１９２、Ｃｈｒ１：２１６２４７１６２－２１６２４７１８５、Ｃｈｒ１：２１６２４７１４７－２１６２４７１６８、Ｃｈｒ１：２１６２４７１４７－２１６２４７１７３、Ｃｈｒ１：２１６２４７１４２－２１６２４７１６５、及びＣｈｒ１：２１６２４７１３０－２１６２４７１５３から選択される。
【0039】
その中の一つの実施形態において、前記ｓｎＲＮＡの認識ドメインは、配列番号１０～１９に示される配列、配列番号２１～２３に示される配列、配列番号２５に示される配列から選択される。
【0040】
その中の一つの実施形態において、前記ＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡ配列に対応するゲノム位置は、Ｃｈｒ１：２１６２４７２１８－２１６２４７２４１、Ｃｈｒ１：２１６２４７１８７－２１６２４７２１０、Ｃｈｒ１：２１６２４７１４７－２１６２４７１６８、Ｃｈｒ１：２１６２４７１４７－２１６２４７１７３、Ｃｈｒ１：２１６２４７１４２－２１６２４７１６５、及びＣｈｒ１：２１６２４７１３０－２１６２４７１５３から選択される。
【0041】
その中の一つの実施形態において、前記ｓｎＲＮＡの認識ドメインは、配列番号９に示される配列、配列番号１５に示される配列、配列番号２１に示される配列、配列番号２２に示される配列、配列番号２３に示される配列、配列番号２５に示される配列から選択される。
【0042】
その中の一つの実施形態において、前記ｓｎＲＮＡの認識ドメインは、配列番号１５に示される配列、配列番号２１に示される配列、配列番号２２に示される配列、配列番号２３に示される配列から選択される。
【0043】
その中の一つの実施形態において、前記ｓｎＲＮＡはＵ１－ｓｎＲＮＡ又はＵ７－ｓｎＲＮＡである。
【0044】
その中の一つの実施形態において、前記Ｕ７－ｓｎＲＮＡは化学合成である。
【0045】
その中の一つの実施形態において、前記化学合成されたＵ７－ｓｎＲＮＡのうちの少なくとも１つのヌクレオチドは化学修飾されている。
【0046】
その中の一つの実施形態において、前記化学修飾は２’－Ｏ－アルキル修飾、２’－Ｏ－メトキシ修飾又は２’－Ｏ－メトキシエチル修飾のうちの少なくとも１つを含む。
【0047】
その中の一つの実施形態において、前記２’－Ｏ－アルキル修飾は２’－Ｏ－メチル修飾である。
【0048】
その中の一つの実施形態において、前記化学合成されたＵ７－ｓｎＲＮＡの少なくとも１つのヌクレオチドはリン酸エステル結合を介して連結され、前記リン酸エステル結合は、ホスホロチオエート結合、ホスホロジチオエート結合、アルキルリン酸エステル結合、アミドリン酸エステル結合、ボラノリン酸エステル結合、又はキラルリン結合のうちの少なくとも１つを含む。
【0049】
その中の一つの実施形態において、前記化学合成されたＵ７－ｓｎＲＮＡの両側の６～８０個のヌクレオチドはいずれも前記化学的に修飾され、前記リン酸エステル結合によって連結される。
【0050】
その中の一つの実施形態において、前記化学合成されたＵ７－ｓｎＲＮＡの両側の１～１０個のヌクレオチドはいずれも前記化学的に修飾され、前記リン酸エステル結合によって連結される。
【0051】
その中の一つの実施形態において、前記化学合成されたＵ７－ｓｎＲＮＡの両側の３～４０個の塩基はいずれも前記化学的に修飾され、前記リン酸エステル結合によって連結される。
【0052】
その中の一つの実施形態において、前記化学合成されたＵ７－ｓｎＲＮＡのすべてのヌクレオチドはホスホロチオエート結合を介して連結され、すべて２’－Ｏ－メトキシで修飾される。
【0053】
その中の一つの実施形態において、前記化学合成されたＵ７－ｓｎＲＮＡの両側の３つのヌクレオチドはホスホロチオエート結合を介して連結され、２’－Ｏ－メトキシで修飾される。
【0054】
その中の一つの実施形態において、前記化学合成されたＵ７－ｓｎＲＮＡの５’末端の最初のヌクレオチドはアデニル酸である。
【0055】
その中の一つの実施形態において、前記化学合成されたＵ７－ｓｎＲＮＡの認識ドメインの５’末端の最初のヌクレオチドはアデニル酸である。
【0056】
その中の一つの実施形態において、前記化学合成されたＵ７－ｓｎＲＮＡの認識ドメインと標的部位との間の逆相補対には、０～５個のミスマッチヌクレオチドが存在する。
【0057】
その中の一つの実施形態において、前記化学合成されたＵ７－ｓｎＲＮＡの認識ドメインと標的部位との間の逆相補対には、０～１個のミスマッチヌクレオチドが存在する。
【0058】
その中の一つの実施形態において、前記化学合成されたＵ７－ｓｎＲＮＡの認識ドメインの配列長さは≧１６ｂｐである。
【0059】
その中の一つの実施形態において、前記化学合成されたＵ７－ｓｎＲＮＡの認識ドメインの配列長さは１８ｂｐ～４０ｂｐである。
【0060】
その中の一つの実施形態において、前記化学合成されたＵ７－ｓｎＲＮＡの認識ドメインの配列長さは２０ｂｐ～２７ｂｐである。
【0061】
その中の一つの実施形態において、前記化学合成されたＵ７－ｓｎＲＮＡは、標的配列の５’末端又は／及び３’末端に沿った逆相補対形成を通じて認識ドメイン配列の長さを延長し続ける。
【0062】
その中の一つの実施形態において、前記延長された認識ドメイン配列の長さは≦４０ｂｐである。
【0063】
その中の一つの実施形態において、前記ｓｎＲＮＡはｓｍ配列を含む。
【0064】
その中の一つの実施形態において、前記ｓｍ配列は、ｓｍＯＰＴ配列であり、前記ｓｍＯＰＴ配列は配列番号３１に示された通りである。
【0065】
その中の一つの実施形態において、前記ｓｎＲＮＡは、認識ドメイン、ｓｍＯＰＴ配列、及びＵ１－ｓｎＲＮＡ ｓｃａｆｆｏｌｄ又はＵ７－ｓｎＲＮＡ ｓｃａｆｆｏｌｄ配列を含み；好ましくは、前記Ｕ７－ｓｎＲＮＡ ｓｃａｆｆｏｌｄ配列は配列番号４９に示された通りである。
【0066】
その中の一つの実施形態において、前記ｓｎＲＮＡは、更にスプライシング制御タンパク質をリクルートするモチーフを含む。
【0067】
その中の一つの実施形態において、前記Ｕ７－ｓｎＲＮＡの５’末端は遊離テールが導入されており、遊離テールの配列はスプライシング制御タンパク質をリクルートするモチーフを含む。
【0068】
その中の一つの実施形態において、前記スプライシング調節タンパク質は、ｈｎＲＮＰＡ１、ＳＲＳＦ１、ＲＢＭ４、ＤＡＺＡＰ１、又はＳＲのうちの少なくとも１つを含む。
【0069】
その中の一つの実施形態において、前記遊離テール配列は、少なくとも１つのｈｎＲＮＰＡ１結合モチーフを含む。
【0070】
その中の一つの実施形態において、前記遊離テール配列は、２つのｈｎＲＮＰＡ１結合モチーフを含む。
【0071】
本発明はまた、前記ｓｎＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。
【0072】
本発明はまた、前記ｓｎＲＮＡを含み、及び／又は前記核酸を含む遺伝子発現カセットを提供する。
【0073】
本発明はまた、前記ｓｎＲＮＡを含み、前記核酸を含み、及び／又は遺伝子発現カセットを含むベクターを提供する。
【0074】
その中の一つの実施形態において、前記ベクターは、ベクター骨格と前記ｓｎＲＮＡを含み、前記ベクター骨格は、プロモーター、ｓｍＯＰＴ配列、及びｓｎＲＮＡ遺伝子特異的３’カセットを含み、前記プロモーターは、Ｔｙｐｅ ＩＩｓ型制限エンドヌクレアーゼ認識部位を介してｓｍＯＰＴ配列に接続される。
【0075】
その中の一つの実施形態において、前記ベクターは、ｐＵＣ５７、ｐＡＡＶ－ＣＭＶ、レンチウイルス又はトランスポゾンから選択される。
【0076】
その中の一つの実施形態において、前記ｓｎＲＮＡ遺伝子特異的３’カセットは、ｓｎＲＮＡ遺伝子の３’末端から２８～１３１ｂｐ伸びる遺伝子断片である。
【0077】
その中の一つの実施形態において、前記ｓｎＲＮＡ遺伝子特異的３’カセットは、ｓｎＲＮＡ遺伝子の３’末端から１０６ｂｐ伸びる遺伝子断片である。
【0078】
本発明はまた、前記ｓｎＲＮＡを含み、前記核酸を含み、及び／又は前記ベクターを含むウイルス粒子を提供する。
【0079】
その中の一つの実施形態において、前記ウイルス粒子はＡＡＶウイルスである。
【0080】
その中の一つの実施形態において、前記ＡＡＶウイルスのキャプシドタンパク質は天然有来、天然有来のキャプシドタンパク質に基づく変異体である。
【0081】
その中の一つの実施形態において、前記ＡＡＶウイルスのキャプシドタンパク質は動物又は植物に由来する。
【0082】
その中の一つの実施形態において、前記ＡＡＶウイルスのキャプシドタンパク質は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ１０又はＡＡＶｒｈ４３から選択される。
【0083】
その中の一つの実施形態において、前記天然由来のキャプシドタンパク質に基づく変異体ＡＡＶウイルスは、天然キャプシドタンパク質の指向性進化又はアミノ酸／ペプチドセクメトの合理的修飾に基づくＡＡＶウイルスである。
【0084】
その中の一つの実施形態において、前記変異体ＡＡＶウイルスは、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｉ８、ＡＡＶ－ＴＴ、ＡＡＶ９．ＨＲ又はＣＡＭ１３０から選択される。
【0085】
その中の一つの実施形態において、前記ＡＡＶウイルスがＡＡＶ ＩＴＲである場合、血清型はＲｅｐ遺伝子の血清型と一致する。
【0086】
本発明はまた、前記ｓｎＲＮＡを含み、前記核酸を含み、前記ベクターを含み、及び／又は前記ウイルス粒子を含む細胞を提供する。
【0087】
本発明はまた、前記ｓｎＲＮＡを含み、前記核酸を含み、前記ベクターを含み、及び／又は前記ウイルス粒子を含む医薬組成物を提供する。
【0088】
本発明はまた、ＵＳＨ２Ａ遺伝子のｐｒｅ－ｍＲＮＡと前記ｓｎＲＮＡ、前記核酸、前記ベクター、前記遺伝子発現カセット、前記ウイルス粒子、前記細胞、及び／又は前記医薬組成物を接触させる、エクソン１３の発現産物が欠失したＵｓｈｅｒｉｎタンパク質を取得する方法を提供する。
【0089】
その中の一つの実施形態において、前記方法は科学研究に使用される。
【0090】
本発明はまた、ＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡのエキソン１３のスプライシングスキッピングによる、エキソン１３が欠失した成熟ＵＳＨ２Ａ ｍＲＮＡの調製、エキソン１３が欠失したＵｓｈｅｒｉｎタンパク質の取得、及び／又はＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡエキソン１３の発現及び機能の阻害における前記方法の使用を提供する。
【0091】
本発明はまた、眼疾患及び／又は耳疾患を予防及び／又は治療する医薬の調製における、前記ｓｎＲＮＡ、前記核酸、前記ベクター、前記遺伝子発現カセット、前記ウイルス粒子又は前記細胞の使用を提供する。
【0092】
一つの実施形態において、前記眼疾患は難聴－網膜色素変性症症候群又は非症候群性網膜色素変性症である。
【0093】
従来技術と比較して、本発明は下記の有益な効果を有する。
【0094】
本発明のＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡを標的とするｓｎＲＮＡは、標的領域としてＵＳＨ２Ａエクソン１３を選択し、エクソン１３のスプライシングスキッピングを誘導することにより、ＵＳＨ２Ａエクソン１３のミスセンス、フレームシフト、終止コドン、ナンセンス、同義変異などのＵＳＨ２Ａタンパク質の機能不全によって引き起こされる目や耳の疾患を治療する。同時に、本発明のＵＳＨ２Ａを標的とするＵ７－ｓｎＲＮＡは、Ｕ７－ｓｎＲＮＰを使用してスプライシングには関与しないが、複製依存性ヒストン（ＲＤＨ）ｐｒｅ－ｍＲＮＡの特異的３’末端プロセシングにおける重要な因子であり、修飾されたＵ７－ｓｎＲＮＡは、Ｕ７－ｓｎＲＮＡの非標準的なＳｍ結合部位を主なスプライセオソームＵ－ｓｎＲＮＰに由来するコンセンサス配列で置き換え、Ｕ７－ｓｎＲＮＡの５’領域のヒストン結合配列を、修飾対象の遺伝子の相補配列に変更する独自の作用機構により、ＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡを標的とするｓｎＲＮＡと組み合わせて、ＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡエクソン１３のスプライシングスキッピングを誘導し、エクソン１２を保持して、エクソン１２と１３のダブルスキッピングなどの予期しないスプライシングスキッピングの確率を大幅に減少させ、安全性を確保しながらエクソン１３のシングルスキッピングの効率を大幅に向上させる。
【図面の簡単な説明】
【0095】
【図1】Ｕ７－ｓｎＲＮＡの構造と機能の模式図である。
【図2】ｐＵＣ５７－Ｕ７ ｓｎＲＮＡ骨格ベクターのマップである。
【図3】レポーターベクターｐＣＭＶ－ＥＧＦＰｌｅｆｔ－Ｅｘｏｎ１３ｃ．２８０２Ｔ＞Ｇ－ＥＧＦＰｒｉｇｈｔのプラスミドマップである。
【図4】レポーターベクターｐＣＭＶ－ＥＧＦＰｌｅｆｔ－Ｅｘｏｎ１３ｃ．２２９９ｄｅｌＧ－ＥＧＦＰｒｉｇｈｔのプラスミドマップである。
【図5】ゲノム上の標的領域１を標的とするＵ７－ｓｎＲＮＡの位置の模式図である。
【図6】レポーターベクター細胞における標的領域１を標的とするＵ７－ｓｎＲＮＡによりＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡエキソン１３のスプライシングスキッピングが誘導された細胞比率の結果を示すグラフである。
【図7】標的領域１を標的とするＵ７－ｓｎＲＮＡによって誘導される（ＵＳＨ２Ａプレ－ｍＲＮＡエクソン１３スのスプライシングスキッピング）ＧＦＰ陽性細胞の平均ＦＩＴＣ強度のヒストグラムである。
【図8】ゲノム上の標的領域２を標的とするＵ７－ｓｎＲＮＡの位置の概略図である。
【図9】レポーターベクター細胞における標的領域２を標的とするＵ７－ｓｎＲＮＡによりＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡエキソン１３のスプライシングスキッピングが誘導された細胞比率の結果を示すグラフである。
【図10】標的領域２を標的とするＵ７－ｓｎＲＮＡによって誘導される（ＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡエキソン１３のスプライシングスキッピング）ＧＦＰ陽性細胞の平均ＦＩＴＣ強度のヒストグラムである。
【図11】ゲノム上の標的領域３を標的とするＵ７－ｓｎＲＮＡの位置の概略図である。
【図12】レポーターベクター細胞における標的領域３を標的とするＵ７－ｓｎＲＮＡによりＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡエキソン１３のスプライシングスキッピングが誘導された細胞比率の結果を示すグラフである。
【図13】標的領域３を標的とするＵ７－ｓｎＲＮＡによって誘導される（ＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡエキソン１３のスプライシングスキッピング）ＧＦＰ陽性細胞の平均ＦＩＴＣ強度のヒストグラムである。
【図14】ゲノム上の標的領域４を標的とするＵ７－ｓｎＲＮＡの位置の概略図である。
【図15】レポーターベクター細胞における標的領域４を標的とするＵ７－ｓｎＲＮＡによりＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡエキソン１３のスプライシングスキッピングが誘導された細胞比率の結果を示すグラフである。
【図16】ゲノム上の標的領域５を標的とするＵ７－ｓｎＲＮＡの位置の概略図である。
【図17】レポーターベクター細胞における標的領域５を標的とするＵ７－ｓｎＲＮＡによりＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡエキソン１３のスプライシングスキッピングが誘導された細胞比率の結果を示すグラフである。
【図18】ゲノム上の標的領域６を標的とするＵ７－ｓｎＲＮＡの位置の概略図である。
【図19】レポーターベクター細胞における標的領域６を標的とするＵ７－ｓｎＲＮＡによりＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡエキソン１３のスプライシングスキッピングが誘導された細胞比率の結果を示すグラフである。
【図20】ゲノム上の標的領域７を標的とするＵ７－ｓｎＲＮＡの位置の概略図である。
【図21】レポーターベクター細胞における標的領域７を標的とするＵ７－ｓｎＲＮＡによりＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡエキソン１３のスプライシングスキッピングが誘導された細胞比率の結果を示すグラフである。
【図22】レポーター遺伝子細胞において異なる領域を標的とするＵ７ ｓｎＲＮＡによりＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡエキソン１３スプライシングスキッピングが誘導された細胞の平均ＦＩＴＣ強度の結果を示すグラフである。
【図23】Ｕ７－ｓｎＲＮＡにより誘導されたＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡエキソン１３スプライシングスキッピング効率が、ＡＯＮ１よりも有意に優れたことを示す実験結果を示すグラフである。
【図24】ＷＥＲＩ細胞において化学合成されたＵ７ ｓｎＲＮＡにより誘導されたＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡエキソン１３のスプライシングスキッピング効率を検出した結果を示すグラフである。
【図25】Ｕ７－ｈｎＲＮＰ Ａ１－ｓｎＲＮＡの概略構造図である。
【図26】Ｕ７－ｈｎＲＮＰ Ａ１－ｓｎＲＮＡにより誘導されたＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡエキソン１３のスプライシングスキッピング効率の結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【0096】
本発明の理解を容易にするために、以下、関連する図面を参照しながら本発明をより詳細に説明する。本発明の好ましい実施形態が図面に示されている。しかしながら、本発明は多くの異なる形態で具体化することができ、本明細書で説明する実施形態に限定されない。むしろ、これらの実施形態は、本開示の完全な理解を提供するために提供される。
【0097】
別段の定義がない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。本発明の説明において本発明の明細書で使用される用語は、特定の実施例を説明することのみを目的としており、本発明を限定することを意図したものではない。本明細書で使用される場合、「及び／又は」という用語は、関連する列挙された項目の１つ又は複数の任意の及びすべての組み合わせを含む。配列が別の配列から「選択される」と言われる場合、それは直接に別の配列又は別の配列の配列断片であり得；ゲノムマッピング領域が別のゲノムマッピング領域から「選択」される場合、その対応する配列は、直接に別のゲノムマッピング領域に対応する配列、又は別のゲノムマッピング領域に対応する配列中の配列断片であり得；前記配列はＤＮＡ又はＲＮＡを含む。
【0098】
定義：
本発明に記載のｓｎＲＮＡは、真核生物の転写後プロセシングにおけるＲＮＡスプライセオソーム（ｓｐｌｉｃｅｏｓｏｍｅ）の主成分であり、ｓｎＲＮＰタンパク質に結合することによってｍＲＮＡ前駆体のプロセシングに関与する。
本発明に記載のｓｎＲＮＡは、真核生物の転写後プロセシングにおけるＲＮＡスプライセオソーム（ｓｐｌｉｃｅｏｓｏｍｅ）の主成分であり、ｓｎＲＮＰタンパク質に結合することによってｍＲＮＡ前駆体のプロセシングに関与する。
【0099】
材料のサプライヤー：
ＡＡＶｐｒｏ（登録商標） Ｈｅｌｐｅｒ Ｆｒｅｅ Ｓｙｓｔｅｍ（ＡＡＶ５）キット（ＴＡＫＡＲＡ社、Ｃｏｄｅ Ｎｏ．：６６５０）
ＡＡＶｐｒｏ（登録商標） Ｈｅｌｐｅｒ Ｆｒｅｅ Ｓｙｓｔｅｍ（ＡＡＶ５）キット（ＴＡＫＡＲＡ社、Ｃｏｄｅ Ｎｏ．：６６５０）
【0100】
本実施例で使用される試薬、材料、及び装置は別段の定義がない限り、すべて市販品であり；実験方法は別段の定義がない限り、本技術分野の従来の実験方法である。
【0101】
実施例１
Ｕ７－ｓｎＲＮＡシステムの設計とベクター構築。
Ｕ７－ｓｎＲＮＡシステムの設計とベクター構築。
【0102】
１、Ｕ７－ｓｎＲＮＡ発現ベクター骨格の合成。
野生型Ｕ７－ｓｎＲＮＡは、ステムループ構造（ｓｃａｆｆｏｌｄ）、Ｕ７特異的Ｓｍ配列（ＡＡＵＵＵＧＵＣＵＡＧ：配列番号６１）、及び認識ドメイン（ヒストンｐｒｅ－ｍＲＮＡに相補的）を含む。
野生型Ｕ７－ｓｎＲＮＡは、ステムループ構造（ｓｃａｆｆｏｌｄ）、Ｕ７特異的Ｓｍ配列（ＡＡＵＵＵＧＵＣＵＡＧ：配列番号６１）、及び認識ドメイン（ヒストンｐｒｅ－ｍＲＮＡに相補的）を含む。
【0103】
本実施例のＵ７－ｓｎＲＮＡは、ＮＣＢＩのマウス野生型Ｕ７－ｓｎＲＮＡの遺伝子配列（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＲ＿０２４２０１．３）の上で、Ｕ７特異的ｓｍ配列ＡＡＴＴＴＧＴＣＴＡＧ（配列番号：３０）を最適化されたコンセンサスｓｍ配列に置き換え、即ち、ｓｍＯＰＴ：ＡＡＴＴＴＴＴＧＧＡＧ（配列番号３１）であり、図１に示されるように、ｓｍＯＰＴ配列の５’末端にある元の認識ドメインをＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡ特異的標的部位に逆相補的な認識ドメインに置き換え、ｓｍＯＰＴ配列の３’末端にＵ７元のステムループ構造配列を保持した。ＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡエクソン１３を標的として誘導するＵ７－ｓｎＲＮＡ認識ドメイン配列は、ＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡのイントロン１２－エクソン１３－イントロン１３から選択される標的配列と逆相補的に対になっている。
【0104】
具体的な操作過程：まず、全遺伝子合成により、遺伝子配列、即ち、Ｕ７－ｓｎＲＮＡ遺伝子発現カセット骨格（５’－マウスＵ７プロモーター－ｓｍＯＰＴ配列－Ｕ７ ｓｎＲＮＡ ｓｃａｆｆｏｌｄ－ｓｎＲＮＡ遺伝子特異的３’カセット－３’）を含むｐＵＣ５７ベクターを合成した（図２に示される通りである）。ここで、２つのＴｙｐｅ ＩＩｓ型制限エンドヌクレアーゼ認識部位がＵ７プロモーターとｓｍＯＰＴの間に追加されて、その後の切断、他の認識ドメイン配列の置換及び挿入を容易にする。ｓｎＲＮＡ遺伝子特異的３’カセットは、マウスゲノム（ＧｅｎＢａｎｋ：Ｘ５４７４８．１）のＵ７－ｓｎＲＮＡ遺伝子の３’末端の後に、ｇｔｃｔａｃａａｔｇａａａ（配列番号３２）配列を含み、ｐｒｅ－ｓｎＲＮＡのプロセシングに関与し、好ましくは、Ｕ７ｓｎＲＮＡ遺伝子の３’末端に接続された配列であり、好ましくは、配列長は２８～１３１ｂｐの遺伝子断片であり、更に好ましきは、配列長は１０６ｂｐであった。
【0105】
２、ＵＳＨ２Ａエクソン１３及びその近くの異なる部位を標的とするＵ７－ｓｎＲＮＡベクターを構築。
【0106】
本実例では、ＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡの７つの標的領域に対してそれぞれ２１個の標的部位を設定し、ＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡの７個の標的領域は下記に示された通りである。
【0107】
エクソン１３領域１（配列番号１）（Ｃｈｒ１：２１６２４７１４２－２１６２４７１８５）：ＣＧＡＡＧＣＵＵＵＡＡＵＧＡＵＧＵＵＧＧＡＵＧＵＧＡＧＣＣＣＵＧＣＣＡＧＵＧＵＡＡＣＣＵ；
エクソン１３領域２（配列番号２）（Ｃｈｒ１：２１６２４７１３０－２１６２４７１６１）：ＧＡＧＣＣＣＵＧＣＣＡＧＵＧＵＡＡＣＣＵＣＣＡＵＧＧＣＵＣＡＧＵ；
エクソン１３領域３（配列番号３）（Ｃｈｒ１：２１６２４６６１６－２１６２４６６４９）：ＡＡＵＣＡＧＵＧＧＣＣＡＧＵＧＣＣＵＧＵＧＵＧＵＧＣＣＵＡＡＵＣＧＵ；
エクソン１３領域４（配列番号４）（Ｃｈｒ１：２１６２４７２１３－２１６２４７２４６）：ＵＡＡＡＵＡＵＡＵＵＵＵＡＵＣＵＵＵＡＧＧＧＣＵＵＡＧＧＵＧＵＧＡＵ；
エクソン１３領域５（配列番号５）（Ｃｈｒ１：２１６２４７２０４－２１６２４７２３２）： ＣＵＵＵＡＧＧＧＣＵＵＡＧＧＵＧＵＧＡＵＣＡＵＵＧＣＡＡＵ；
エクソン１３領域６（配列番号６）（Ｃｈｒ１：２１６２４７１８７－２１６２４７２２０）： ＧＧＵＧＵＧＡＵＣＡＵＵＧＣＡＡＵＵＵＵＧＧＡＵＵＵＡＡＡＵＵＵＣＵ；
エクソン１３領域７（配列番号７）（Ｃｈｒ１：２１６２４７１６９－２１６２４７２０２）：ＵＵＧＧＡＵＵＵＡＡＡＵＵＵＣＵＣＣＧＡＡＧＣＵＵＵＡＡＵＧＡＵＧＵ。
エクソン１３領域２（配列番号２）（Ｃｈｒ１：２１６２４７１３０－２１６２４７１６１）：ＧＡＧＣＣＣＵＧＣＣＡＧＵＧＵＡＡＣＣＵＣＣＡＵＧＧＣＵＣＡＧＵ；
エクソン１３領域３（配列番号３）（Ｃｈｒ１：２１６２４６６１６－２１６２４６６４９）：ＡＡＵＣＡＧＵＧＧＣＣＡＧＵＧＣＣＵＧＵＧＵＧＵＧＣＣＵＡＡＵＣＧＵ；
エクソン１３領域４（配列番号４）（Ｃｈｒ１：２１６２４７２１３－２１６２４７２４６）：ＵＡＡＡＵＡＵＡＵＵＵＵＡＵＣＵＵＵＡＧＧＧＣＵＵＡＧＧＵＧＵＧＡＵ；
エクソン１３領域５（配列番号５）（Ｃｈｒ１：２１６２４７２０４－２１６２４７２３２）： ＣＵＵＵＡＧＧＧＣＵＵＡＧＧＵＧＵＧＡＵＣＡＵＵＧＣＡＡＵ；
エクソン１３領域６（配列番号６）（Ｃｈｒ１：２１６２４７１８７－２１６２４７２２０）： ＧＧＵＧＵＧＡＵＣＡＵＵＧＣＡＡＵＵＵＵＧＧＡＵＵＵＡＡＡＵＵＵＣＵ；
エクソン１３領域７（配列番号７）（Ｃｈｒ１：２１６２４７１６９－２１６２４７２０２）：ＵＵＧＧＡＵＵＵＡＡＡＵＵＵＣＵＣＣＧＡＡＧＣＵＵＵＡＡＵＧＡＵＧＵ。
【0108】
前記２１個の標的位置は下記の表に示された通りである。
【0109】
【表1】
【0110】
実施例２
Ｕ７－ｓｎＲＮＡの化学合成と修飾。
オリゴヌクレオチドと同様に、Ｕ７－ｓｎＲＮＡも直接化学合成によって、認識ドメイン、ｓｍＯＰＴ及びＵ７－ｓｎＲＮＡ ｓｃａｆｆｏｌｄを含むＲＮＡを生成することができる。インビトロで合成されたＵ７－ｓｎＲＮＡは、特定の修飾によってヌクレアーゼ分解に耐えるようにすることも、標的配列への親和性を高めることもできる。
Ｕ７－ｓｎＲＮＡの化学合成と修飾。
オリゴヌクレオチドと同様に、Ｕ７－ｓｎＲＮＡも直接化学合成によって、認識ドメイン、ｓｍＯＰＴ及びＵ７－ｓｎＲＮＡ ｓｃａｆｆｏｌｄを含むＲＮＡを生成することができる。インビトロで合成されたＵ７－ｓｎＲＮＡは、特定の修飾によってヌクレアーゼ分解に耐えるようにすることも、標的配列への親和性を高めることもできる。
【0111】
本実施例では、Ｕ７－ｓｎＲＮＡを化学合成し、その５’末端と３’末端の３つの塩基にそれぞれ２’メトキシ（２’－ＯＭＥ）修飾とスルホ修飾を施して、ヌクレアーゼ耐性を高めた。ｓｎＲＮＡ＃１６とｓｎＲＮＡ＃１５を例とし、化学合成されたｓｎＲＮＡの配列と修飾は下記の通りである（＊はホスホロチオエート骨格を表し、ｍは２’－メトキシ修飾を表し、下線部分は標的配列に逆相補的な認識ドメインを表し、斜体はｓｍＯＰＴ配列を表す）。
【0112】
化学合成及び修飾されたＵ７－ｓｎＲＮＡ＃１６：
（配列番号６４）
【化1】
（配列番号６４）
【0113】
上記修飾配列は、配列番号３３に示される配列の上で、５’末端及び３’末端の最初の３個の塩基にホスホロチオエート骨格修飾とメトキシ修飾を加えたものである。
【0114】
化学合成及び修飾されたＵ７－ｓｎＲＮＡ＃１５：
（配列番号６５）
【化2】
（配列番号６５）
【0115】
上記修飾配列は、配列番号３４に示される配列の上で、５’末端及び３’末端の最初の３個の塩基にホスホロチオエート骨格修飾とメトキシ修飾を加えたものである。
【0116】
実施例３
ＵＳＨ２Ａエクソン１３のスプライシングスキッピング効率を定量的に評価するためのレポーターベクターを構築した。
ＵＳＨ２Ａエクソン１３のスプライシングスキッピング効率を定量的に評価するためのレポーターベクターを構築した。
【0117】
ＲＧｌｅｆｔ－ＵＳＨ２Ａ ＥＸＯＮ１３ｍｕｔ－ＲＧｒｉｇｈｔ配列（それぞれ５’及び３’末端にＡｇｅＩ及びＥｃｏＲＩ酵素切断部位が追加された）は、全遺伝子合成によって得られ、合成配列、ｐＸ６０１プラスミド（Ａｄｄｇｅｎｅ、６１５９１）に対して制限エンドヌクレアーゼＡｇｅＩ及びＥｃｏＲＩ消化、電気泳動、ゲル回収及びライゲーションを実行することにより、合成配列をｐＸ６０１ベクターのＡｇｅＩ制限部位とＥｃｏＲＩ制限部位との間に挿入し、元のベクターのＳａＣａｓ９遺伝子配列を置き換えてレポーターベクターを得た。さらに、大腸菌コンピテントセルの形質転換、シングルクローニング、ＰＣＲ、及び配列検証を通じて、精製されたレポーターベクタープラスミドを得、後で使用するために－２０℃で保存した。
【0118】
レポーターベクターの構造は：ｐＣＭＶ－ＲＧｌｅｆｔ－ＵＳＨ２Ａ ＥＸＯＮ１３ｍｕｔ－ＲＧｒｉｇｈｔであり、ＲＧはレポーター遺伝子（ｒｅｐｏｒｔｅｒ ｇｅｎｅ）を表し、ＲＧｌｅｆｔはレポーティング機能を持たないレポーター遺伝子の５’末端の前半を表し、ＲＧｒｉｇｈｔレポーティング機能を持たないレポーター遺伝子の３’末端の後半を表し、ＲＧｌｅｆｔとＲＧｒｉｇｈｔのタンデム発現は、レポーター遺伝子の完全な機能が正常に実施されるようにする。実施例でレポーター遺伝子は緑色蛍光遺伝子ＥＧＦＰであり、ベクター構造はｐＣＭＶ－ＥＧＦＰｌｅｆｔ－Ｅｘｏｎ１３ｍｕｔ－ＥＧＦＰｒｉｇｈｔであった。ＥＸＯＮ１３ｍｕｔは、病原性突然変異を含むＵＳＨ２Ａエクソン１３、及びその上流と下流のイントロン配列（上流のイントロン配列は、ヒトＵＳＨ２Ａ遺伝子イントロン１２の５’末端２０４ｂｐと３’末端４９０ｂｐを直列連結した遺伝子配列であり；下流のイントロン配列は、ヒトＵＳＨ２Ａのイントロン１３の５’末端の７０３ｂｐと３’末端の２１６ｂｐを直列連結した遺伝子配列である）を含むものを表す。前記ＵＳＨ２Ａエクソン１３の病原性突然変異は、ｃ．２８０２Ｔ＞Ｇ、ｃ．２２９９ｄｅｌＧ、ｃ．２２７６Ｇ＞Ｔ、ｃ．２５２２Ｃ＞Ａ、ｃ．２２４２Ｃ＞Ｔ、ｃ．２５４１Ｃ＞Ａ、ｃ．２７６１ｄｅｌＣ又はｃ．２７７６Ｃ＞Ｔを含んでもよく、本発明の実施例に記載されたＵＳＨ２Ａエクソン１３における病原性突然変異は、ｃ．２８０２Ｔ＞Ｇ、ｃ．２２９９ｄｅｌＧであり、即ち、得られたベクター構造はそれぞれｐＣＭＶ－ＥＧＦＰｌｅｆｔ－Ｅｘｏｎ１３ｃ．２８０２Ｔ＞Ｇ－ＥＧＦＰｒｉｇｈｔ（レポートベクターマップは図３に示される）、ｐＣＭＶ－ＥＧＦＰｌｅｆｔ－Ｅｘｏｎ１３ｃ．２２９９ｄｅｌＧ－ＥＧＦＰｒｉｇｈｔ（レポートベクターマップは図４に示される）であり、ＥＧＦＰｌｅｆｔ配列は配列番号３５に示された通りであり、ＥＧＦＰｒｉｇｈｔ配列は配列番号３６に示された通りである。
【0119】
実施例４
標的領域１を標的とするＵ７－ｓｎＲＮＡによって媒介されるＵＳＨ２Ａエクソン１３のスプライシングスキッピング効果の検出。
標的領域１を標的とするＵ７－ｓｎＲＮＡによって媒介されるＵＳＨ２Ａエクソン１３のスプライシングスキッピング効果の検出。
【0120】
検出方法：２９３Ｔ細胞を２４時間後に細胞コンフルエンスが約８０％に達するように２４ウェルプレートに所定の量で播種した。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００を使用して、ｐＣＭＶ－ＥＧＦＰｌｅｆｔ－Ｅｘｏｎ１３ｃ．２８０２Ｔ＞Ｇ－ＥＧＦＰｒｉｇｈｔ及びＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡを標的とするｐＵＣ５７－Ｕ７－ｓｎＲＮＡプラスミドを２９３Ｔ細胞（ベクター質量比は１００ｎｇ：４００ｎｇである）に同時トランスフェクトし、レポータープラスミド単独でトランスフェクトされた、レポータープラスミド及びｐＵＣ５７－Ｕ７－ｃｏｎで同時にトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞を、それぞれ２つの陰性対照として使用し、いかなるプラスミドもトランスフェクトしない２９３Ｔ細胞をブランク対照として使用した。トランスフェクション後、細胞は続いて４～７２時間培養され、トリプシンを使用して単一細胞に消化し、次に、フローサイトメトリーを使用して、異なるＵ７－ｓｎＲＮＡ群のＧＦＰ陽性率（即ち、ＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡエクソン１３のスプライスジャンプが誘導された細胞比率）とＧＦＰ陽性細胞の平均ＦＩＴＣ強度（即ち、ＧＦＰ細胞におけるＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡエクソン１３のスプライシングスキッピング平均レベル）を検出し、標的領域１を標的とするＵ７－ｓｎＲＮＡのゲノム上の位置（図で左から右でゲノムの５’末端から３’末端に相当）は図５に示された通りである。
【0121】
実験結果：図６及び下記の表に示されるように、標的領域１を標的とするすべてのＵ７－ｓｎＲＮＡは、レポーター遺伝子細胞においてＵＳＨ２Ａエクソン１３のスプライシングスキッピングを誘導することができる。当該領域１を標的とする既存のＡＯＮはエクソン１３のスプライシングスキッピングを誘導できないが、当該領域１を標的とするｓｎＲＮＡはエクソン１３のスプライシングスキッピングを効果的に誘導でる。
【0122】
【表2】
【0123】
実施例５
標的領域２を標的とするＵ７－ｓｎＲＮＡによって媒介されるＵＳＨ２Ａエクソン１３のスプライシングスキッピング効果の検出。
標的領域２を標的とするＵ７－ｓｎＲＮＡによって媒介されるＵＳＨ２Ａエクソン１３のスプライシングスキッピング効果の検出。
【0124】
検出方法：実施例４と同じであり、ゲノム上の標的領域２を標的とするＵ７－ｓｎＲＮＡの位置（図で左から右でゲノムの５’末端から３’末端に相当する）は図８に示された通りである。
【0125】
実験結果：図９及び下記の表に示されるように、標的領域２を標的とするすべてのＵ７－ｓｎＲＮＡは、レポーター遺伝子細胞においてＵＳＨ２Ａエクソン１３のスプライシングスキッピングを誘導することができる。当該領域２を標的とする既存のＡＯＮはエクソン１３のスプライシングスキッピングを誘導する効果が低いが、当該領域２を標的とするｓｎＲＮＡはエクソン１３のスプライシングスキッピングを効果的に誘導することができる。
【0126】
【表3】
【0127】
実施例６
標的領域３を標的とするＵ７－ｓｎＲＮＡによって媒介されるＵＳＨ２Ａエクソン１３のスプライシングスキッピング効果の検出。
標的領域３を標的とするＵ７－ｓｎＲＮＡによって媒介されるＵＳＨ２Ａエクソン１３のスプライシングスキッピング効果の検出。
【0128】
検出方法：実施例４と同じであり、ゲノム上の標的領域３を標的とするＵ７－ｓｎＲＮＡの位置（図で左から右でゲノムの５’末端から３’末端に相当する）は図１１に示された通りである。
【0129】
実験結果：図１２及び下記の表に示されるように、標的領域３を標的とするすべてのＵ７－ｓｎＲＮＡは、レポーター遺伝子細胞においてＵＳＨ２Ａエクソン１３のスプライシングスキッピングを誘導することができる。当該領域３を標的とする既存のＡＯＮはエクソン１３のスプライシングスキッピングを誘導する効果が低いが、当該領域３を標的とするｓｎＲＮＡはエクソン１３のスプライシングスキッピングを効果的に誘導することができる。
【0130】
【表4】
【0131】
実施例４、５、６の分析を結合して見ると、先行技術において標的領域１、２、３は、ＡＯＮの非感受性領域を標的であって、即ち、当該領域を標的とすることは、エクソン１３のスプライシングスキッピングを誘導できないか、又はほとんど誘導しないが、当該領域を標的とするｓｎＲＮＡはエクソン１３のスプライシングスキッピングを有意に誘導することができることを見つけた。従って、ｓｎＲＮＡとＡＯＮは両方ともスプライシングスキッピングを誘導することができるが、それらの作用機序は異なり、標的部位感受性（標的領域内の適用可能な標的部位）も異なる。
【0132】
同時に、図７、１０、１３及び下記の表に示されるように、同じ領域を標的とするスプライシングスキッピングを誘導した細胞比率（ＧＦＰ％）は近いが、同じ領域内の異なる標的を標的とするｓｎＲＮＡが、同じ細胞内でスプライシングスキッピングして得られたｍＲＮＡとそのタンパク質レベル（平均ＦＩＴＣ強度）には違いがある。さらに、標的領域１と標的領域２は、同じ細胞内でスプライシングスキッピングを誘導して得られたｍＲＮＡとタンパク質のレベルは、標的領域３よりも優れている。
【0133】
【表5】
【0134】
実施例７
標的領域４を標的とするＵ７－ｓｎＲＮＡ及びｓｎＲＮＡ＃２４によって媒介されるＵＳＨ２Ａエクソン１３のスプライシングスキッピング効果を検出。
標的領域４を標的とするＵ７－ｓｎＲＮＡ及びｓｎＲＮＡ＃２４によって媒介されるＵＳＨ２Ａエクソン１３のスプライシングスキッピング効果を検出。
【0135】
検出方法：実施例４と同じであり、ゲノム上の領域４を標的とするＵ７－ｓｎＲＮＡ位置（図で左から右でゲノムの５’末端から３’末端に相当する）は図１４に示された通りである。
【0136】
実験結果：図１５及び下記の表に示されるように、標的領域４を標的とするすべてのＵ７－ｓｎＲＮＡは、レポーター遺伝子細胞においてＵＳＨ２Ａエクソン１３のスプライシングスキッピングを誘導することができる。
【0137】
【表6】
【0138】
実施例８
標的領域５を標的とするＵ７－ｓｎＲＮＡによって媒介されるＵＳＨ２Ａエクソン１３のスプライシングスキッピング効果の検出。
標的領域５を標的とするＵ７－ｓｎＲＮＡによって媒介されるＵＳＨ２Ａエクソン１３のスプライシングスキッピング効果の検出。
【0139】
検出方法：実施例４と同じであり、ゲノム上のＵ７－ｓｎＲＮＡ標的領域５の位置（図で左から右でゲノムの５’末端から３’末端に相当する）は図１６に示された通りである。
【0140】
実験結果：図１７及び下記の表に示されるように、標的領域５を標的とするすべてのＵ７－ｓｎＲＮＡは、レポーター遺伝子細胞においてＵＳＨ２Ａエクソン１３のスプライシングスキッピングを誘導することができる。
【0141】
【表7】
【0142】
実施例９
標的領域６を標的とするＵ７－ｓｎＲＮＡによって媒介されるＵＳＨ２Ａエクソン１３のスプライシングスキッピング効果の検出。
標的領域６を標的とするＵ７－ｓｎＲＮＡによって媒介されるＵＳＨ２Ａエクソン１３のスプライシングスキッピング効果の検出。
【0143】
検出方法：実施例４と同じであり、ゲノム上のＵ７－ｓｎＲＮＡ標的領域６の位置（図で左から右でゲノムの５’末端から３’末端に相当する）は図１８に示された通りである。
【0144】
実験結果：図１９及び下記の表に示されるように、標的領域６を標的とするすべてのＵ７－ｓｎＲＮＡは、レポーター遺伝子細胞においてＵＳＨ２Ａエクソン１３のスプライシングスキッピングを誘導することができる。
【0145】
【表8】
【0146】
実施例１０
標的領域７を標的とするＵ７－ｓｎＲＮＡによって媒介されるＵＳＨ２Ａエクソン１３のスプライシングスキッピング効果の検出。
標的領域７を標的とするＵ７－ｓｎＲＮＡによって媒介されるＵＳＨ２Ａエクソン１３のスプライシングスキッピング効果の検出。
【0147】
検出方法：実施例４と同じであり、ゲノム上の標的領域７を標的とするＵ７－ｓｎＲＮＡの位置（図で左から右でゲノムの５’末端から３’末端に相当する）は図２０に示された通りである。
【0148】
実験結果：図２１及び下記の表に示されるように、標的領域７を標的とするすべてのＵ７－ｓｎＲＮＡは、レポーター遺伝子細胞においてＵＳＨ２Ａエクソン１３のスプライシングスキッピングを誘導することができる。
【0149】
【表9】
【0150】
実施例１１
Ｕ７－ｓｎＲＮＡによって媒介されるＵＳＨ２Ａエクソン１３のスプライシングスキッピング効果の検出。
Ｕ７－ｓｎＲＮＡによって媒介されるＵＳＨ２Ａエクソン１３のスプライシングスキッピング効果の検出。
【0151】
検証方法：実施例４と同じである。
【0152】
実験結果：異なる領域におけるＵ７－ｓｎＲＮＡによって誘導されるＧＦＰ陽性細胞の平均ＦＩＴＣ強度は図２２及び下記の表に示された通りである。
【0153】
【表10】
【0154】
同じ領域を標的とするＧＦＰ％（スプライシングスキッピングが誘導された細胞比率）は近いが、同じ領域内の異なる標的を標的とするｓｎＲＮＡは、同じ細胞内でスプライシングスキッピングして得られたｍＲＮＡとそのタンパク質レベル（平均ＦＩＴＣ強度）が異なる。
【0155】
領域２を標的すると、より高いスプライシングスキッピングが誘導された細胞比率（ＧＦＰ％）が得られるだけではなく、同じ細胞内でスプライシングスキッピングを誘導して得られるｍＲＮＡ及びタンパク質のレベル（平均ＦＩＴＣ強度）もより高い。
【0156】
しかしながら、従来技術においてＡＯＮによるスプライシングスキッピングの誘導効率が高い標的部位＃２とその隣接部位＃１及び＃３は、ｓｎＲＮＡシステムでは、同じ細胞内でスプライシングスキッピングを誘発して得られるｍＲＮＡとタンパク質のレベルが低かった。領域３を標的とする既存技術のＡＯＮ効率は領域２より高いが、ｓｎＲＮＡシステムでは領域２を標的とする効率が領域３より高かった。従って、ｓｎＲＮＡとＡＯＮはどちらもスプライシングスキッピングを誘導できるが、両者の作用機序は異なり、標的部位の感受性も異なる。実施例１２の結果分析に結合すると、ｓｎＲＮＡ＃２４の効率がｓｎＲＮＡ＃２、ＡＯＮ１の効率と近いため、ｓｎＲＮＡ＃３～＃１１の効果はすべてｓｎＲＮＡ＃２、ｓｎＲＮＡ＃２４より優れ、ＡＯＮ１よりも優れていると推測できる。
【0157】
実施例１２
Ｕ７－ｓｎＲＮＡによって媒介されるＵＳＨ２Ａエクソン１３のスプライシングスキッピング効率はＡＯＮよりも有意に優れていることの確認。
Ｕ７－ｓｎＲＮＡによって媒介されるＵＳＨ２Ａエクソン１３のスプライシングスキッピング効率はＡＯＮよりも有意に優れていることの確認。
【0158】
検出方法：２９３Ｔを２４時間後に細胞コンフルエンスが約８０％に達するように２４ウェルプレートに所定の量で播種した。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００を使用して、ｐＣＭＶ－ＥＧＦＰｌｅｆｔ－Ｅｘｏｎ１３ｃ．２８０２Ｔ＞Ｇ－ＥＧＦＰｒｉｇｈｔ及び異なる標的のｐＵＣ５７－Ｕ７－ｓｎＲＮＡプラスミドを２９３Ｔ細胞に同時トランスフェクト（ベクター質量比は１００ｎｇ：４００ｎｇである）し、レポータープラスミド単独でトランスフェクトされた、レポータープラスミド及びｐＵＣ５７－Ｕ７ Ｓｃｒａｍｂｌｅで同時にトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞を、それぞれ２つの陰性対照として使用し、レポータープラスミド及び１０ｐｍｏｌのアンチセンスオリゴヌクレオチドＡＯＮ１（５′－ＭＡ＊ＭＧ＊ＭＣ＊ＭＵ＊ＭＵ＊ＭＣ＊ＭＧ＊ＭＧ＊ＭＡ＊ＭＧ＊ＭＡ＊ＭＡ＊ＭＡ＊ＭＵ＊ＭＵ＊ＭＵ＊ＭＡ＊ＭＡ＊ＭＡ＊ＭＵ＊ＭＣ＊－３′、「Ｍ」は２’－Ｏ－メトキシ修飾を示し、「＊」はホスホロチオエートを示す；配列番号６２）で同時にトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞を陽性対照として使用し、いかなるプラスミドもトランスフェクトしていない２９３Ｔ細胞をブランク対照として使用した。トランスフェクトされた細胞を４８～７２時間培養し、トリプシンを使用して単一細胞に消化した後、フローサイトメーターを使用して、さまざまなｓｎＲＮＡのＧＦＰ陽性率と平均ＦＩＴＣ強度を検出した。
【0159】
実験結果：図２３及び下記の表に示されるように、本発明によってスクリーニングされたｓｎＲＮＡ＃８及びｓｎＲＮＡ＃１８はいずれもＡＯＮ１より優れており、ｓｎＲＮＡ＃２はＡＯＮ１と似ていた効率を有する。
【0160】
【表11】
【0161】
実施例１３
化学合成されたＵ７－ｓｎＲＮＡによる、ＷＥＲＩ細胞におけるＵＳＨ２Ａエクソン１３のスプライシングスキッピングの誘導。
化学合成されたＵ７－ｓｎＲＮＡによる、ＷＥＲＩ細胞におけるＵＳＨ２Ａエクソン１３のスプライシングスキッピングの誘導。
【0162】
ヒト由来宿主細胞を２４ウェルプレートに６×１０５／ウェルで播種し、本実施例で選択したヒト網膜神経細胞はＷＥＲＩ－Ｒｂ－１細胞（網膜神経細胞株）であった。
【0163】
Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００を使用して、インビトロで合成した１００ｐｍｏｌのＵ７－ｓｎＲＮＡ＃１、ｓｎＲＮＡ＃４、ｓｎＲＮＡ＃８、ｓｎＲＮＡ＃１０、ｓｎＲＮＡ＃１４をＷＥＲＩ細胞にそれぞれトランスフェクトし、同じ量（１００ｐｍｏｌ）のアンチセンスオリゴヌクレオチドＡＯＮ１（５′－ＭＡ＊ＭＧ＊ＭＣ＊ＭＵ＊ＭＵ＊ＭＣ＊ＭＧ＊ＭＧ＊ＭＡ＊ＭＧ＊ＭＡ＊ＭＡ＊ＭＡ＊ＭＵ＊ＭＵ＊ＭＵ＊ＭＡ＊ＭＡ＊ＭＡ＊ＭＵ＊ＭＣ＊－３′、「Ｍ」は２’－Ｏ－メトキシ修飾を示し、「＊」はホスホロチオエートを示す；配列番号６２）及びＡＯＮ２（５′－ＭＵ＊ＭＧ＊ＭＡ＊ＭＵ＊ＭＣ＊ＭＡ＊ＭＣ＊ＭＡ＊ＭＣ＊ＭＣ＊ＭＵ＊ＭＡ＊ＭＡ＊ＭＧ＊ＭＣ＊ＭＣ＊ＭＣ＊ＭＵ＊ＭＡ＊ＭＡ＊ＭＡ＊－３′、「Ｍ」は２’－Ｏ－メトキシ修飾を示し、「＊」はホスホロチオエートを示す；配列番号６３）をトランスフェクトして対照群とし、１μｇのＥＧＦＰプラスミドをトランスフェクトして陰性対照とし、いかなるプラスミドもトランスフェクトしないＷＥＲＩ細胞をブランク対照として使用した。トランスフェクトされた細胞を続いて７２時間培養し、その後、各実験群細胞のＲＮＡを抽出し、逆転写してｃＤＮＡを得、プライマーＡＧＣＣＴＴＴＣＣＧＣＣＡＡＧＧＴＧＡＴＣ（配列番号３７）及びＣＡＣＡＡＣＧＴＴＧＣＣＣＡＧＣＡＡＴＧＧ（配列番号３８）を使用してＲＴ－ＰＣＲ実験を実行し、成熟ＵＳＨ２Ａ ｍＲＮＡにおけるエクソン１３の存在を検出し、電気泳動の結果は図２４に示された通りである。
【0164】
実験結果：Ｕｓｈｅｒｉｎタンパク質を内因的に発現するＷＥＲＩ細胞において、ＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡエクソ１３スプライシングスキッピングに対する化学合成Ｕ７－ｓｎＲＮＡの誘導効果をＡＯＮ技術スキームと比較し、ＲＴ－ＰＣＲテストデータと分析結果は、ＡＯＮシングルホップバンドがｓｎＲＮＡよりも弱く、ＡＯＮシングルホップバンドの下にさらに有意なダブルホップバンドがあることを示し、これにより、化学合成されたＵ７－ｓｎＲＮＡ実験群１及びＵ７－ｓｎＲＮＡ実験群２は、エクソン１３のシングルスプライシングスキッピングの誘導において、ＡＯＮ１及びＡＯＮ２技術スキームより有意に優れていることを示している。更に、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して、ｒｔ－ＰＣＲ電気泳動バンドのさらなる定量分析を実行し、ジャンプされたＵＳＨ２Ａ ｍＲＮＡの合計（エクソン１３のシングルスキッピング、エクソン１２及びエクソン１３のダブルスキッピングのＵＳＨ２Ａ ｍＲＮＡ合計）に対する、エクソン１２及びエクソン１３のダブルスキッピングＵＳＨ２Ａ ｍＲＮＡの比率を分析し、結果は、エクソン１２及びエクソン１３におけるＵ７－ｓｎＲＮＡによって誘導されるダブルスプライシングスキッピングの比率が非常に低く、ＡＯＮ１及びＡＯＮ２のダブルスキッピングの比率よりも低いことを示している。従って、Ｕ７－ｓｎＲＮＡがエキソン１３のシングルスプライシングスキッピングの効率を有意に向上させ、同時より低いＵＳＨ２Ａ ｍＲＮＡのダブルホップ副産物を確保していることが分かる。
【0165】
さらに、Ｕ７－ｓｎＲＮＡ＃１４の標的部位は、従来技術ではエクソン１２及びエクソン１３におけるダブルスプライシングスキッピングの可能性が極めて高いＡＯＮ部位に近いが、Ｕ７－ｓｎＲＮＡ＃１４処理後のダブルスプライシングスキッピングの発生可能性は非常に低い。さらに、Ｕ７－ｓｎＲＮＡは、エクソン１３のスプライシングスキッピングを誘導しながら、エクソン１２とエクソン１３のダブルジャンプ確率を大幅に減少させることができることが分かる。
【0166】
実施例１４
ｈｎＲＮＰ Ａ１結合モチーフに連結されたＵ７－ｓｎＲＮＡのスプライシングスキッピング効果の検出。
ｈｎＲＮＰ Ａ１結合モチーフに連結されたＵ７－ｓｎＲＮＡのスプライシングスキッピング効果の検出。
【0167】
１、ｈｎＲＮＰ Ａ１結合モチーフに連結されたＵ７－ｓｎＲＮＡの構築。
表のｇＲＮＡ配列に対応する転写前ＤＮＡ配列に従って、対応するＯｌｉｇｏ ＤＮＡをそれぞれ合成した。Ｏｌｉｇｏ ＤＮＡのセンス鎖は、標的配列の逆相補配列（認識ドメイン配列に相当するＤＮＡ配列）であり、５’にＣＣＧＣＡＡＴＡＴＧＡＴＡＧＧＧＡＣＴＴＡＧＧＧＴＧ（配列番号３９）を加え、アンチセンス鎖は標的配列は５’にＡＡＴＴを加え、３’にＣＡＣＣＣＴＡＡＧＴＣＣＣＴＡＴＣＡＴＡＴＴ（配列番号４０）を加えた。例えば、ｓｎＲＮＡ＃１４の認識ドメイン配列はＡＣＡＣＵＧＧＣＡＧＧＧＣＵＣＡＣＡＵＣＣＡ（配列番号４１）であり、合成されたＯｌｉｇｏ ＤＮＡセンス鎖は
（配列番号４２）であり、アンチセンス鎖は
（配列番号４３）であり、下線は認識ドメイン配列に対応するＤＮＡ二本鎖配列を示し、太字斜体は、ｈｎＲＮＰ Ａ１タンパク質の結合モチーフ「ＵＡＧＧＧＵ」に対応するＤＮＡ二本鎖配列を示す。
表のｇＲＮＡ配列に対応する転写前ＤＮＡ配列に従って、対応するＯｌｉｇｏ ＤＮＡをそれぞれ合成した。Ｏｌｉｇｏ ＤＮＡのセンス鎖は、標的配列の逆相補配列（認識ドメイン配列に相当するＤＮＡ配列）であり、５’にＣＣＧＣＡＡＴＡＴＧＡＴＡＧＧＧＡＣＴＴＡＧＧＧＴＧ（配列番号３９）を加え、アンチセンス鎖は標的配列は５’にＡＡＴＴを加え、３’にＣＡＣＣＣＴＡＡＧＴＣＣＣＴＡＴＣＡＴＡＴＴ（配列番号４０）を加えた。例えば、ｓｎＲＮＡ＃１４の認識ドメイン配列はＡＣＡＣＵＧＧＣＡＧＧＧＣＵＣＡＣＡＵＣＣＡ（配列番号４１）であり、合成されたＯｌｉｇｏ ＤＮＡセンス鎖は
【化3】
（配列番号４２）であり、アンチセンス鎖は
【化4】
（配列番号４３）であり、下線は認識ドメイン配列に対応するＤＮＡ二本鎖配列を示し、太字斜体は、ｈｎＲＮＰ Ａ１タンパク質の結合モチーフ「ＵＡＧＧＧＵ」に対応するＤＮＡ二本鎖配列を示す。
【0168】
合成したＯｌｉｇｏ ＤＮＡセンス鎖とアンチセンス鎖をアニーリング反応系（総反応量２０μｌ：Ｏｌｉｇｏ－Ｆ（１００μＭ）２μｌ＋Ｏｌｉｇｏ－Ｒ（１００μＭ）２μｌ＋１０×ＮＥＢ Ｃｕｔｔｅｒ ｓｍａｒｔ ｂｕｆｆｅｒ ２μｌ＋脱イオン水１６μｌ）を混合し、９５℃で５分間培養した後、氷上に置いて冷却させ、アニーリングして粘着末端を持つ二本鎖ＤＮＡを形成した。１００倍に希釈した後、１μｌを取り、１０ｎｇのＢｓａＩで消化し、回収した線状化ｐＵＣ５７－Ｕ７－ｓｎＲＮＡ骨格プラスミドを連結させた。さらに、大腸菌コンピテントセルの形質転換、シングルクローニング、ＰＣＲ及び配列確認により、ＵＳＨ２Ａエクソン１３のスプライシングスキッピングを誘導するためのｈｎＲＮＰ Ａ１結合モチーフを含むＵ７－ｓｎＲＮＡベクターを得、ベクターをｐＵＣ５７－Ｕ７－ｈｎＲＮＰ Ａ１－ｓｎＲＮＡ＃と名付けた。プラスミドを精製し、後で使用するために－２０℃で保存した。
【0169】
Ｕ７－ｈｎＲＮＰ Ａ１－ｓｎＲＮＡは、実施例２、実施例４に記載の方法に従って化学合成及び修飾することもできる。ｓｎＲＮＡ＃１４を例に挙げると、化学合成されたＵ７－ｈｎＲＮＰ Ａ１－ｓｎＲＮＡの配列と修飾は下記の通りである（＊はホスホロチオエート骨格を示し、ｍは２’－メトキシ修飾を示し、下線は標的配列に逆相補的な認識ドメインを示し、斜体はｓｍＯＰＴ配列を示し、太字はｈｎＲＮＰ Ａ１タンパク質結合モチーフを示す）：
（配列番号６６） Ｕ７－ｈｎＲＮＰ Ａ１－ｓｎＲＮＡの概略構造図は図２５に示された通りである。
【化5】
（配列番号６６） Ｕ７－ｈｎＲＮＰ Ａ１－ｓｎＲＮＡの概略構造図は図２５に示された通りである。
【0170】
上記改変配列は、配列番号４４に示される配列の上で、５’末端及び３’末端の最初の３個の塩基にホスホロチオエート骨格修飾とメトキシ修飾を加えたものである。
【0171】
２、レポーター遺伝子細胞におけるＵＳＨ２Ａエクソン１３のスプライシングスキッピングを誘導するｈｎＲＮＰ Ａ１結合モチーフに連結されたＵ７－ｓｎＲＮＡの効率を試験した。
【0172】
検出方法：２９３Ｔを２４時間後に細胞コンフルエンスが約８０％に達するように２４ウェルプレートに所定の量で播種した。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００を使用して、ｐＣＭＶ－ＥＧＦＰｌｅｆｔ－Ｅｘｏｎ１３ｃ．２８０２Ｔ＞Ｇ－ＥＧＦＰｒｉｇｈｔを、それぞれｐＵＣ５７－Ｕ７－ｈｎＲＮＰ Ａ１－ｓｎＲＮＡプラスミド、ｐＵＣ５７－Ｕ７－ｓｎＲＮＡプラスミドと、２９３Ｔ細胞に同時にトランスフェクト（ベクター質量比は１００ｎｇ：４００ｎｇである）し、レポータープラスミド単独でトランスフェクトされた、レポータープラスミド及びｐＵＣ５７－Ｕ７ Ｓｃｒａｍｂｌｅで同時にトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞を、それぞれ２つの陰性対照として使用し、いかなるプラスミドもトランスフェクトしていない２９３Ｔ細胞をブランク対照として使用した。トランスフェクトされた細胞を続いて４８～７２時間培養し、トリプシンを使用して単一細胞に消化した後、フローサイトメーターを使用して、さまざまなｓｎＲＮＡ群によって誘導されるスプライシングスキッピング効率を検出した。
【0173】
実験結果：図２６及び下記の表に示されるように、Ｕ７－ｓｎＲＮＡの５’末端へのｈｎＲＮＰ Ａ１結合モチーフの導入は、ＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡエキソン１３のスプライシングスキッピングを誘導する効果を有意に改善することができ、エキソン１３のスプライシングスキッピングを持つ細胞（ＧＦＰ＋）の比率を増加させるだけではなく、各細胞内のスプライシングスキッピングされたエクソンを持つｍＲＮＡのレベル（平均ＦＩＴＣ強度）も増加させた。
【0174】
【表12】
【0175】
本実施例はＵ７－ｓｎＲＮＡの５’末端に遊離テールを導入し、前記遊離テール配列はｈｎＲＮＰ Ａ１タンパク質の結合モチーフ「ＵＡＧＧＧＵ」を含み、遊離テール配列は好ましくは、「ＵＡＵＧＡＵＡＧＧＧＡＣＵＵＡＧＧＧＵＧ」（配列番号４５）であり、ｈｎＲＮＰ Ａ１タンパク質を動員してＵＳＨ２Ａエクソン１３のスプライシングスキッピングを促進でき、エクソン１２とエクソン１３のダブルスキッピングは増加せず、その他の標的特異性に影響を与えず、標的離脱効果を誘発又は増加させなかった。
【0176】
実施例１５
ＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡエクソン１３のスプライシングスキッピングの誘導を標的としたＡＡＶ－Ｕ７－ｓｎＲＮＡ関連プラスミドベクターの構築とウイルスパッケージング。
ＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡエクソン１３のスプライシングスキッピングの誘導を標的としたＡＡＶ－Ｕ７－ｓｎＲＮＡ関連プラスミドベクターの構築とウイルスパッケージング。
【0177】
本実施例はＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡのエキソン１３のスプライシングスキッピングを標的にして誘導するＵ７－ｓｎＲＮＡ遺伝子を挿入し、ｐＡＡＶ－ＣＭＶベクターの２つのＩＴＲドメインの中央の遺伝子配列を置き換え、ｐＡＡＶ－Ｕ７－ｓｎＲＮＡベクター、ＡＡＶパッケージングプラスミドを構築した。血清型ｐＲＣプラスミド（ＡＡＶ２のＲｅｐ遺伝子と各血清型のそれぞれのＣａｐ遺伝子を含む）、ｐＨｅｌｐｅｒプラスミド（アデノウイルスのＥ２Ａ、Ｅ４、及びＶＡ遺伝子を含むベクタープラスミド）を宿主細胞に同時トランスフェクトし、パッケージしてＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡエキソン１３のスプライシングスキッピングを標的とするＡＡＶ－Ｕ７－ｓｎＲＮＡウイルスを得た。具体的な操作プロセスは下記の通りである：
【0178】
まず、全遺伝子合成により遺伝子配列－－Ｕ７－ｓｎＲＮＡ遺伝子発現カセット骨格（認識ドメインを含まない）：５’－マウスＵ７プロモーター－ｓｍＯＰＴ配列－Ｕ７－ｓｎＲＮＡ ｓｃａｆｆｏｌｄ－ｓｎＲＮＡ遺伝子特異的３’カセット－３’を合成した。ここで、Ｕ７プロモーターとｓｍＯＰＴの間に２つのＴｙｐｅ ＩＩｓ型制限エンドヌクレアーゼ認識部位を加えて、その後の切断、他の認識ドメイン配列の置換及び挿入を容易にした。全遺伝子合成配列を、ｐＡＡＶ－ＣＭＶプラスミドの２つのＡＡＶ２－ＩＴＲドメイン間に挿入及び置換して、ｐＡＡＶ－Ｕ７－ｓｎＲＮＡ骨格ベクターを得た。
【0179】
Ｕ７－ｓｎＲＮＡ遺伝子発現カセット骨格（認識ドメインは含まない）（配列番号４６）：
ＡＡＧＣＴＴＡＡＣＡＡＣＡＴＡＧＧＡＧＣＴＧＴＧＡＴＴＧＧＣＴＧＴＴＴＴＣＡＧＣＣＡＡＴＣＡＧＣＡＣＴＧＡＣＴＣＡＴＴＴＧＣＡＴＡＧＣＣＴＴＴＡＣＡＡＧＣＧＧＴＣＡＣＡＡＡＣＴＣＡＡＧＡＡＡＣＧＡＧＣＧＧＴＴＴＴＡＡＴＡＧＴＣＴＴＴＴＡＧＡＡＴＡＴＴＧＴＴＴＡＴＣＧＡＡＣＣＧＡＡＴＡＡＧＧＡＡＣＴＧＴＧＣＴＴＴＧＴＧＡＴＴＣＡＣＡＴＡＴＣＡＧＴＧＧＡＧＧＧＧＴＧＴＧＧＡＡＡＴＧＧＣＡＣＣＴＴＧＡＴＣＴＣＡＣＣＣＴＣＡＴＣＧＡＡＡＧＴＧＧＡＧＴＴＧＡＴＧＴＣＣＴＴＣＣＣＴＧＧＣＴＣＧＣＴＡＣＡＧＡＣＧＣＡＣＴＴＣＣＧＣＡＧＡＧＡＣＣＡＡＴＧＴＧＧＧＴＣＴＣＧＡＡＴＴＴＴＴＧＧＡＧＣＡＧＧＴＴＴＴＣＴＧＡＣＴＴＣＧＧＴＣＧＧＡＡＡＡＣＣＣＣＴＣＣＣＡＡＴＴＴＣＡＣＴＧＧＴＣＴＡＣＡＡＴＧＡＡＡＧＣＡＡＡＡＣＡＧＴＴＣＴＣＴＴＣＣＣＣＧＣＴＣＣＣＣＧＧＴＧＴＧＴＧＡＧＡＧＧＧＧＣＴＴＴＧＡＴＣＣＴＴＣＴＣＴＧＧＴＴＴＣＣＴＡＧＧＡＡＡＣＧＣＧＴＡＴＧＴＧＣＧＧＣＣＧＣ。
ＡＡＧＣＴＴＡＡＣＡＡＣＡＴＡＧＧＡＧＣＴＧＴＧＡＴＴＧＧＣＴＧＴＴＴＴＣＡＧＣＣＡＡＴＣＡＧＣＡＣＴＧＡＣＴＣＡＴＴＴＧＣＡＴＡＧＣＣＴＴＴＡＣＡＡＧＣＧＧＴＣＡＣＡＡＡＣＴＣＡＡＧＡＡＡＣＧＡＧＣＧＧＴＴＴＴＡＡＴＡＧＴＣＴＴＴＴＡＧＡＡＴＡＴＴＧＴＴＴＡＴＣＧＡＡＣＣＧＡＡＴＡＡＧＧＡＡＣＴＧＴＧＣＴＴＴＧＴＧＡＴＴＣＡＣＡＴＡＴＣＡＧＴＧＧＡＧＧＧＧＴＧＴＧＧＡＡＡＴＧＧＣＡＣＣＴＴＧＡＴＣＴＣＡＣＣＣＴＣＡＴＣＧＡＡＡＧＴＧＧＡＧＴＴＧＡＴＧＴＣＣＴＴＣＣＣＴＧＧＣＴＣＧＣＴＡＣＡＧＡＣＧＣＡＣＴＴＣＣＧＣＡＧＡＧＡＣＣＡＡＴＧＴＧＧＧＴＣＴＣＧＡＡＴＴＴＴＴＧＧＡＧＣＡＧＧＴＴＴＴＣＴＧＡＣＴＴＣＧＧＴＣＧＧＡＡＡＡＣＣＣＣＴＣＣＣＡＡＴＴＴＣＡＣＴＧＧＴＣＴＡＣＡＡＴＧＡＡＡＧＣＡＡＡＡＣＡＧＴＴＣＴＣＴＴＣＣＣＣＧＣＴＣＣＣＣＧＧＴＧＴＧＴＧＡＧＡＧＧＧＧＣＴＴＴＧＡＴＣＣＴＴＣＴＣＴＧＧＴＴＴＣＣＴＡＧＧＡＡＡＣＧＣＧＴＡＴＧＴＧＣＧＧＣＣＧＣ。
【0180】
実施例１及び実施例６に記載の方法に従い、表１のｓｎＲＮＡ認識ドメイン配列に対応する転写前ＤＮＡ配列に従って、対応するＯｌｉｇｏ ＤＮＡセンス鎖及びアンチセンス鎖をそれぞれ合成し、Ｔｙｐｅ ＩＩｓ型制限エンドヌクレアーゼ認識部位によって切断されるものと同様の粘着末端を両端に加えた。アニーリングして粘着末端を持つ認識ドメイン二本鎖ＤＮＡを形成し、Ｔ４リガーゼを対応するＴｙｐｅ ＩＩｓ型制限エンドヌクレアーゼで消化した線状化ｐＡＡＶ－Ｕ７－ｓｎＲＮＡ骨格プラスミドでに連結させて、ＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡエクソン１３の特定の部位を標的としてスプライシングスキッピングを誘導するｐＡＡＶ－Ｕ７－ｓｎＲＮＡプラスミドの形成し、ｐＡＡＶ－Ｕ７－ｓｎＲＮＡ＃３、ｐＡＡＶ－Ｕ７－ｓｎＲＮＡ＃１４、ｐＡＡＶ－Ｕ７－ｓｎＲＮＡ＃１６など、認識ドメイン配列に対応するｓｎＲＮＡ番号に従って名前を付けた。
【0181】
標的遺伝子（ＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡエクソン１３のスプライシングスキッピングの誘導を標的とするＵ７－ｓｎＲＮＡ遺伝子発現カセット）を挿入し、ｐＡＡＶ－ＣＭＶプラスミドのＡＡＶ２－ＩＴＲドメイン間の遺伝子配列を置き換えた後、ｐＡＡＶ－Ｕ７－ｓｎＲＮＡプラスミドベクターを得た。説明書及び標準的な細胞操作手順に従って、ＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡエクソン１３のスプライシングスキッピングを標的とするＡＡＶ－Ｕ７－ｓｎＲＮＡウイルスをパッケージして得た。
【0182】
トランスフェクションの２４時間前に、ＨＥＫ２９３／２９３Ｔ細胞を１００ｍｍ細胞培養皿に播種し、培地は１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地であり、コンフルエンスが８０％～９０％に達したときにトランスフェクションを実行した。トランスフェクションの３時間前に、古い培地を廃棄し、新しい培地に交換した。トランスフェクションの際に、同時に下記の表の系に従ってｐＡＡＶ－Ｕ７－ｓｎＲＮＡプラスミド、ｐＲＣプラスミド、ｐＨｅｌｐｅｒプラスミド、及びＰＥＩ（ポリエチレンイミン）トランスフェクション試薬を調製し、培養皿に滴加した。ＰＥＩトランスフェクション混合物を加えた後、培養皿を軽く振ってトランスフェクション試薬を均一に分散させ、培地を３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで培養した。
【0183】
【表13】
【0184】
トランスフェクションの２４時間後、新鮮な２％ＦＢＳのＤＭＥＭ培地に交換した。トランスフェクションの４８～７２時間後、ＡＡＶウイルスを含む細胞を収集し、洗浄し、遠心分離し、細胞ペレットを収集し、ボルテックスして細胞ペレットをほぐした。続いて、キットの説明書に従って、細胞ペレットに０．５ｍＬのＡＡＶ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ａを加え、１５秒間ボルテックスして細胞ペレットを完全に懸濁させた。室温で５分間放置した後、１５秒間ボルテックスした。４℃、２０００～１４０００ｇで１０分間遠心分離し、細胞破片を除去した。上清を新しい滅菌遠心チューブに収集し、５０μＬのＡＡＶ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｂを加え、ピペットを使用して均一に混合し、異なる認識ドメインを持つＡＡＶ－Ｕ７－ｓｎＲＮＡウイルス溶液を得、一部を取ってｑＰＣＲを使用してウイルス力価を検出し、後で使用するために８０℃で保管した。
【0185】
ｐＡＡＶ－Ｕ７－ｓｎＲＮＡプラスミドのＡＡＶ２－ＩＴＲドメインと挿入される標的遺伝子断片は４．７ｋｂ未満ではなければならないため、複数のＵ７－ｓｎＲＮＡ遺伝子発現カセット（５’－マウスＵ７プロモーター認識ドメイン－ｓｍＯＰＴ配列、ｓｎＲＮＡ遺伝子特異的３’カセット－３’）を挿入することにより、同じ数のＡＡＶウイルス粒子を確保しながらＵ７－ｓｎＲＮＡの発現レベルを増加させ、遺伝子配列の長さは約４５０ｂｐであり、好ましくは、ｐＡＡＶ－Ｕ７－ｓｎＲＮＡプラスミドは１～１０個のＵ７－ｓｎＲＮＡ遺伝子発現カセットを保持し、前記ｐＡＡＶ－Ｕ７－ｓｎＲＮＡ プラスミド内の複数の Ｕ７－ｓｎＲＮＡ遺伝子発現カセットは、同じ認識ドメインを有してもよい。
【0186】
上述の実施例の技術的特徴は、任意の方法で組み合わせることができ、説明を簡略化するために、上記の実施例の技術的特徴のすべての可能な組み合わせについて説明することはしないが、これらの技術的特徴の組み合わせに矛盾がない限り、本明細書の範囲内にあるとみなすべきである。
【0187】
上述の実施例は、本発明のいくつかの実施形態を表現するのみであり、その説明は比較的具体的かつ詳細であるが、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。当業者であれば、本発明の概念から逸脱することなく、いくつかの修正及び改良を行うことができ、これらはすべて本発明の保護範囲に属することに留意されたい。したがって、本発明の特許の保護範囲は、添付の特許請求の範囲によって決定されるべきである。
【手続補正2】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡ配列に逆相補的な認識ドメインを含み、ＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡに結合することによってエクソン１３をスプライシングスキッピングすることを特徴とする、ＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡを標的とするｓｎＲＮＡ。
【請求項2】
前記ＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡ配列は、ＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡ内のエクソン１３、イントロン１２又はイントロン１３の領域から選択され、
好ましくは、前記ＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡ配列に対応するゲノム位置領域は、Ｃｈｒ１：２１６２４７１４２－２１６２４７１８５、Ｃｈｒ１：２１６２４７１３０－２１６２４７１６１、Ｃｈｒ１：２１６２４６６１６－２１６２４６６４９、Ｃｈｒ１：２１６２４７２１３－２１６２４７２４６、Ｃｈｒ１：２１６２４７２０４－２１６２４７２３２、Ｃｈｒ１：２１６２４７１８７－２１６２４７２２０、及びＣｈｒ１：２１６２４７１６９－２１６２４７２０２のうちの１又は複数から選択され、
より好ましくは、前記ＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡ配列は、配列番号１～７から選択されることを特徴とする、請求項１に記載のｓｎＲＮＡ。
【請求項3】
前記ｓｎＲＮＡの認識ドメインは、前記ＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡ配列中の少なくとも１６ｂｐの連続配列に逆相補的であり、好ましくは、前記ＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡ配列中の少なくとも２０ｂｐの連続配列に逆相補的であり、より好ましくは、前記ＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡ配列中の２０ｂｐ～２７ｂｐの連続配列に逆相補的であることを特徴とする、請求項１又は２に記載のｓｎＲＮＡ。
【請求項4】
前記ＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡ配列に対応するゲノム位置領域は、Ｃｈｒ１：２１６２４７２２３－２１６２４７２４６、Ｃｈｒ１：２１６２４７２１８－２１６２４７２４１、Ｃｈｒ１：２１６２４７２１３－２１６２４７２３６、Ｃｈｒ１：２１６２４７２０９－２１６２４７２３２、Ｃｈｒ１：２１６２４７２０４－２１６２４７２２７、Ｃｈｒ１：２１６２４７１９７－２１６２４７２２０、Ｃｈｒ１：２１６２４７１９１－２１６２４７２１４、Ｃｈｒ１：２１６２４７１８７－２１６２４７２１０、Ｃｈｒ１：２１６２４７１７９－２１６２４７２０２、Ｃｈｒ１：２１６２４７１７４－２１６２４７１９７、Ｃｈｒ１：２１６２４７１６９－２１６２４７１９２、Ｃｈｒ１：２１６２４７１６２－２１６２４７１８５、Ｃｈｒ１：２１６２４７１５５－２１６２４７１７８、Ｃｈｒ１：２１６２４７１４７－２１６２４７１６８、Ｃｈｒ１：２１６２４７１４７－２１６２４７１７３、Ｃｈｒ１：２１６２４７１４２－２１６２４７１６５、Ｃｈｒ１：２１６２４７１３８－２１６２４７１６１、Ｃｈｒ１：２１６２４７１３０－２１６２４７１５３、Ｃｈｒ１：２１６２４６６２６－２１６２４６６４９、Ｃｈｒ１：２１６２４６６２２－２１６２４６６４５、及びＣｈｒ１：２１６２４６６１６－２１６２４６６３９のうちの１又は複数から選択され；好ましくは、Ｃｈｒ１：２１６２４７２１３－２１６２４７２３６、Ｃｈｒ１：２１６２４７２０９－２１６２４７２３２、Ｃｈｒ１：２１６２４７２０４－２１６２４７２２７、Ｃｈｒ１：２１６２４７１９７－２１６２４７２２０、Ｃｈｒ１：２１６２４７１９１－２１６２４７２１４、Ｃｈｒ１：２１６２４７１８７－２１６２４７２１０、Ｃｈｒ１：２１６２４７１７９－２１６２４７２０２、Ｃｈｒ１：２１６２４７１７４－２１６２４７１９７、及びＣｈｒ１：２１６２４７１６９－２１６２４７１９２のうちの１又は複数から選択され；或いは
好ましくは、Ｃｈｒ１：２１６２４７１６２－２１６２４７１８５、Ｃｈｒ１：２１６２４７１５５－２１６２４７１７８、Ｃｈｒ１：２１６２４７１４７－２１６２４７１６８、Ｃｈｒ１：２１６２４７１４７－２１６２４７１７３、Ｃｈｒ１：２１６２４７１４２－２１６２４７１６５、Ｃｈｒ１：２１６２４７１３８－２１６２４７１６１、Ｃｈｒ１：２１６２４７１３０－２１６２４７１５３、Ｃｈｒ１：２１６２４６６２６－２１６２４６６４９、Ｃｈｒ１：２１６２４６６２２－２１６２４６６４５、及びＣｈｒ１：２１６２４６６１６－２１６２４６６３９のうちの１又は複数から選択され；
より好ましくは、Ｃｈｒ１：２１６２４７２１３－２１６２４７２３６、Ｃｈｒ１：２１６２４７２０９－２１６２４７２３２、Ｃｈｒ１：２１６２４７２０４－２１６２４７２２７、Ｃｈｒ１：２１６２４７１９７－２１６２４７２２０、Ｃｈｒ１：２１６２４７１９１－２１６２４７２１４、Ｃｈｒ１：２１６２４７１８７－２１６２４７２１０、Ｃｈｒ１：２１６２４７１７９－２１６２４７２０２、Ｃｈｒ１：２１６２４７１７４－２１６２４７１９７、Ｃｈｒ１：２１６２４７１６９－２１６２４７１９２、Ｃｈｒ１：２１６２４７１６２－２１６２４７１８５、Ｃｈｒ１：２１６２４７１５５－２１６２４７１７８、Ｃｈｒ１：２１６２４７１４７－２１６２４７１６８、Ｃｈｒ１：２１６２４７１４７－２１６２４７１７３、Ｃｈｒ１：２１６２４７１４２－２１６２４７１６５、及びＣｈｒ１：２１６２４７１３０－２１６２４７１５３のうちの１又は複数から選択され；
更に好ましくは、Ｃｈｒ１：２１６２４７２１３－２１６２４７２３６、Ｃｈｒ１：２１６２４７２０９－２１６２４７２３２、Ｃｈｒ１：２１６２４７２０４－２１６２４７２２７、Ｃｈｒ１：２１６２４７１９７－２１６２４７２２０、Ｃｈｒ１：２１６２４７１９１－２１６２４７２１４、Ｃｈｒ１：２１６２４７１８７－２１６２４７２１０、Ｃｈｒ１：２１６２４７１７９－２１６２４７２０２、Ｃｈｒ１：２１６２４７１７４－２１６２４７１９７、Ｃｈｒ１：２１６２４７１６９－２１６２４７１９２、Ｃｈｒ１：２１６２４７１６２－２１６２４７１８５、Ｃｈｒ１：２１６２４７１４７－２１６２４７１６８、Ｃｈｒ１：２１６２４７１４７－２１６２４７１７３、Ｃｈｒ１：２１６２４７１４２－２１６２４７１６５、及びＣｈｒ１：２１６２４７１３０－２１６２４７１５３のうちの１又は複数から選択され；
或いは、
前記ＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡ配列に対応するゲノム位置領域は、Ｃｈｒ１：２１６２４７２１８－２１６２４７２４１、Ｃｈｒ１：２１６２４７１８７－２１６２４７２１０、Ｃｈｒ１：２１６２４７１４７－２１６２４７１６８、Ｃｈｒ１：２１６２４７１４７－２１６２４７１７３、Ｃｈｒ１：２１６２４７１４２－２１６２４７１６５、及びＣｈｒ１：２１６２４７１３０－２１６２４７１５３のうちの１又は複数から選択されることを特徴とする、請求項１に記載のｓｎＲＮＡ。
【請求項5】
前記ｓｎＲＮＡの認識ドメインは、配列番号８～２８に示される配列から選択され、好ましくは、配列番号１０～１８又は配列番号１９～２８に示される配列から選択され、より好ましくは、配列番号１０～２３、又は配列番号２５に示される配列から選択され、更に好ましくは、配列番号１０～１９、配列番号２１～２３又は配列番号２５に示される配列から選択され；或いは、
前記ｓｎＲＮＡの認識ドメインは、配列番号９、配列番号１５、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３又は配列番号２５に示される配列から選択され；好ましくは、配列番号１５、配列番号２１、配列番号２２又は配列番号２３に示される配列から選択されることを特徴とする、請求項１に記載のｓｎＲＮＡ。
【請求項6】
前記ｓｎＲＮＡは、Ｕ１－ｓｎＲＮＡ又はＵ７－ｓｎＲＮＡであることを特徴とする、請求項１～５のいずれか１項に記載のｓｎＲＮＡ。
【請求項7】
前記ｓｎＲＮＡは、ｓｍ配列を含み、前記ｓｍ配列は、好ましくは、ｓｍＯＰＴ配列であり、前記ｓｍＯＰＴ配列は、より好ましくは、配列番号３１に示され、
好ましくは、前記ｓｎＲＮＡは、認識ドメイン、ｓｍＯＰＴ配列、及びＵ１－ｓｎＲＮＡ ｓｃａｆｆｏｌｄ配列又はＵ７－ｓｎＲＮＡ ｓｃａｆｆｏｌｄ配列を含み；好ましくは、前記Ｕ７－ｓｎＲＮＡ ｓｃａｆｆｏｌｄ配列は配列番号４９に示される通りであることを特徴とする、請求項６に記載のｓｎＲＮＡ。
【請求項8】
前記ｓｎＲＮＡは、更にスプライシング調節タンパク質を動員するモチーフを含み、前記スプライシング調節タンパク質は、好ましくは、ｈｎＲＮＰＡ１、ＳＲＳＦ１、ＲＢＭ４、ＤＡＺＡＰ１及びＳＲのうちの少なくとも１つを含むことを特徴とする、請求項７に記載のｓｎＲＮＡ。
【請求項9】
請求項１～８のいずれか一項に記載のｓｎＲＮＡをコードする核酸配列を含むことを特徴とする、核酸。
【請求項10】
請求項１～８のいずれか一項に記載のｓｎＲＮＡ及び／又は請求項９に記載の核酸を含むことを特徴とする、ベクター。
【請求項11】
請求項１～８のいずれか一項に記載のｓｎＲＮＡ、請求項９に記載の核酸、及び／又は請求項１０に記載のベクターを含むことを特徴とする、ウイルス粒子。
【請求項12】
請求項１～８のいずれか一項に記載のｓｎＲＮＡ、請求項９に記載の核酸、請求項１０に記載のベクター、及び／又は請求項１１に記載のウイルス粒子を含むことを特徴とする、細胞。
【請求項13】
請求項１～８のいずれか一項に記載のｓｎＲＮＡ、請求項９に記載の核酸、請求項１０に記載のベクター、請求項１１に記載のウイルス粒子、及び／又請求項１２に記載の細胞を含むことを特徴とする、医薬組成物。
【請求項14】
ＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡと、請求項１～８のいずれか１項に記載のｓｎＲＮＡ、請求項９に記載の核酸、請求項１０に記載のベクター、請求項１１に記載のウイルス粒子、請求項１２に記載の細胞、及び／又は請求項１３に記載の医薬組成物とを接触させることを含む、エクソン１３発現産物を欠失させたＵｓｈｅｒｉｎタンパク質の取得方法。
【請求項15】
眼疾患及び／又は耳疾患を予防及び／又は治療するための、請求項１～８のいずれか１項に記載のｓｎＲＮＡ、請求項９に記載の核酸、請求項１０に記載のベクター、請求項１１に記載のウイルス粒子、請求項１２に記載の細胞、請求項１３に記載の医薬組成物。
【手続補正3】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】
【国際調査報告】