特表 2024-546360 遺伝的に再プログラミングされた細胞外マトリックス

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-12-19

(54)【発明の名称】遺伝的に再プログラミングされた細胞外マトリックス

(51)【国際特許分類】

   C12N 5/10 20060101AFI20241212BHJP

   C12N 15/09 20060101ALI20241212BHJP

   C07K 14/78 20060101ALI20241212BHJP

   C12N 15/11 20060101ALN20241212BHJP

   C12N 15/63 20060101ALN20241212BHJP

   C12N 15/12 20060101ALN20241212BHJP

【ＦＩ】

C12N5/10 ZNA

C12N15/09 Z

C07K14/78

C12N15/11 Z

C12N15/63 Z

C12N15/12

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024561735

(86)(22)【出願日】2023-01-04

(85)【翻訳文提出日】2024-08-05

(86)【国際出願番号】 US2023010089

(87)【国際公開番号】W WO2023133123

(87)【国際公開日】2023-07-13

(31)【優先権主張番号】63/296,272

(32)【優先日】2022-01-04

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】524252105

【氏名又は名称】ロナウク， インク．

【氏名又は名称原語表記】ＲＯＮＡＷＫ， ＩＮＣ．

(74)【代理人】

【識別番号】100107364

【弁理士】

【氏名又は名称】斉藤 達也

(72)【発明者】

【氏名】メロット，アダム ジェイ．

【テーマコード（参考）】

4B065

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B065AA90X

4B065AA90Y

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065BC01

4B065CA24

4H045AA10

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA10

4H045CA40

4H045DA86

4H045EA60

4H045FA74

(57)【要約】

細胞自体を識別する目的の為の細胞にトランスフェクションされ得る人工配列の使用、並びに人工配列によって生成されたユニークな人工ペプチドによってタグ付けされた任意の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）材料が提供される。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

配列番号１、配列番号２、又は其の両方を含む、トランスフェクションされた細胞。

【請求項2】

前記トランスフェクションされた細胞は、ヒトホウォートンゼリー細胞（ＭＳＣ）、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、ヒト脂肪由来間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、ヒト皮膚由来人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、ヒト血液細胞由来人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、ヒトＣＤ４＋ Ｔ細胞、又はヒトＣＤ８＋ Ｔ細胞等のヒト幹細胞を含む、請求項１に記載のトランスフェクションされた細胞。

【請求項3】

前記トランスフェクションされた細胞は、ＨｅｐＧ２細胞（肝臓癌細胞）、ヒト成人皮膚線維芽細胞（初代細胞）、ヒト新生児皮膚線維芽細胞（初代細胞）、ヒト成人ケラチノサイト（初代細胞）、マウス背根神経節（初代神経細胞）、ウシ心筋細胞（初代細胞系統）、初代ブタ肝細胞、ブタ軟骨細胞、ブタ骨細胞、ウマ筋肉由来幹細胞（初代ＭＳＣ）、初代スネイル細胞、ヒトマクロファージ等の初代哺乳動物細胞、又はヒト、動物、若しくは植物から採取された組織から分離する事が出来る任意の初代細胞を含む、請求項１に記載のトランスフェクションされた細胞。

【請求項4】

前記トランスフェクションされた細胞は、ＵＢ－ＯＣ２細胞（マウス蝸牛上皮）、ヒト筋芽細胞腫（筋肉腫瘍）、ＰＣ３（前立腺癌）、ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣細胞）、ＨＥＫ２９３（ヒト胎児腎臓細胞）、ＳＨＳＹ５Ｙ（神経腫瘍）、ＰＡＮＣ－１（ヒト膵臓癌）、ＨｅＬａ（子宮頸癌）、Ａ５４９（肺癌）、Ａ６７３（筋肉癌）等の不死化哺乳動物細胞系統、及び（４）実質細胞、厚角細胞、厚壁細胞、木部細胞、師管細胞、分裂組織細胞、表皮細胞等の初代植物細胞を含む、請求項１に記載のトランスフェクションされた細胞。

【請求項5】

対象細胞系統をタグ付けする方法であって、前記対象細胞系統を準備する事と、前記対象細胞系統の細胞に配列番号１、配列番号２、又は其の両方を含むベクターをトランスフェクションする事とを含む、方法。

【請求項6】

前記ベクターは、リポフェクション、リン酸カルシウム、カチオン性脂質、デキストラン、マグネトフェクションエレクトロポレーション、マイクロインジェクション、遺伝子銃導入、光学的／レーザートランスフェクション、及び超音波処理等の非ウイルス性ベクターを含む、請求項５に記載の方法。

【請求項7】

前記ベクターは、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、及びレンチウイルス、ＨＩＶ－１等のレトロウイルス等のウイルスベクターを含む、請求項５に記載の方法。

【請求項8】

配列番号３を含む、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）材料。

【請求項9】

前記ＥＣＭは、配列番号３でタグ付けされた１種以上の組織成分を含む、請求項５に記載のＥＣＭ材料。

【請求項10】

前記１種以上の組織成分は、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）、プロテオグリカン、ヒアルロン酸（ＨＡ）、ヘパリン硫酸（ＨＳ）、コンドロイチン硫酸（ＣＳ）、ケラタン硫酸（ＫＳ）、コラーゲンの種類（例えば、線維型（Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、Ｖ、ＸＩ）、Ｆａｃｉｔ型（ＩＸ、ＸＩＩ、ＸＩＶ）、短鎖（ＶＩＩＩ、Ｘ）、基底膜（ＩＶ）、及び其の他（ＶＩ、ＶＩＩ、ＸＩＩＩ）、エラスチン、ＤＮＡ、ＲＮＡ、フィブロネクチン及び糖タンパク質、ラミニン－１１１（ラミニン－１）、ラミニン－２１１（ラミニン－２）、ラミニン－１２１（ラミニン－３）、ラミニン－２２１（ラミニン－４）、ラミニン－３３２／ラミニン－３Ａ３２（ラミニン－５／ラミニン－５Ａ）、ラミニン－３Ｂ３２（ラミニン－５Ｂ）、ラミニン－３１１／ラミニン－３Ａ１１（ラミニン－６／ラミニン－６Ａ）、ラミニン－３２１／ラミニン－３Ａ２１（ラミニン－７／ラミニン－７Ａ）、ラミニン－４１１（ラミニン－８）、ラミニン－４２１（ラミニン－９）、ラミニン－５１１（ラミニン－１０）、ラミニン－５２１（ラミニン－１１）、ラミニン－２１３（ラミニン－１２）、ラミニン－４２３（ラミニン－１４）、ラミニン－５２２、ラミニン－５２３（ラミニン－１５）、ペプチド、脂質及びリン脂質、炭水化物、ホスフェート（Phosphates）、飽和脂肪、不飽和脂肪、トランス脂肪、コレステロール、細胞小器官（例えば、ミトコンドリア、滑面小胞体、粗面小胞体、ゴルジ体／装置、リソソーム、エンドソーム、小胞、ペルオキシソーム、核小体、核、及びリボソーム）、並びに細胞骨格成分（例えば、アクチン）を含む、請求項９に記載のＥＣＭ。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

（関連出願の相互参照）
本出願は、２０２２年１月４日に出願された米国仮特許出願第６３／２９６，２７２号に対する優先権を主張するものであり、此れは参照により其の全体が本明細書に明示的に援用される。

【0002】

本開示の発明の実施形態は一般に、細胞自体を識別する目的の為の細胞にトランスフェクションされ得る人工配列の使用、並びに人工配列によって生成されたユニークな人工ペプチドによってタグ付けされた任意の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）材料に関する。

【背景技術】

【0003】

細胞に於けるＤＮＡ配列への改変を行って、細胞に何らかの有利な特徴を与え、又はペプチド若しくはタンパク質を生産する事が出来る。例えば、プラスミドベクター又はｍＲＮＡを使用する事によって細胞をトランスフェクションさせて、培養細胞（又は動物モデル）に於いて対象タンパク質を発現させる事が出来る。真核細胞に於いてタンパク質を発現させる事により、其の機能に必要とされる適切な折り畳み及び翻訳後修飾を備えた組換えタンパク質を生産する事が可能と成る。概して、トランスフェクションは、ウイルス感染以外の手段を利用して、例えば、核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）を細胞に人工的に導入するプロセスである。様々な化学的、生物学的、又は物理的な方法を使用した此の様な外来核酸の導入により、細胞の特性の変化がもたらされ得る事から、細胞の文脈に於ける遺伝子機能及びタンパク質発現の研究が可能と成る。トランスフェクションに於いては、導入された核酸は細胞内に一過的に存在し得る事で、限られた期間に亘って発現されるだけで複製されないか、又は安定してレシピエントのゲノム内に組み込まれて、宿主ゲノムの複製の際に複製され得る。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0004】

然しながら、当該技術分野に於いて、識別の目的の為の１つ以上の配列が安定的にトランスフェクションされ、遺伝子改変細胞から形成されたＥＣＭ材料を識別する為のユニークなタグとして使用する事が出来るユニークな人工ペプチドを生成する遺伝子改変細胞が依然として求められている。

【課題を解決するための手段】

【0005】

本発明の１つ以上の実施形態は、上述の問題の１つ以上に対処する事が出来る。本発明による或る特定の実施形態は、配列番号１、配列番号２、又は其の両方を含むトランスフェクションされた細胞を提供する。本発明は又、対象細胞系統をタグ付けする方法であって、対象細胞系統を準備する事と、対象細胞系統の細胞に配列番号１、配列番号２、又は其の両方を含むベクターをトランスフェクションする事とを含む、方法を提供する。別の態様に於いて、本発明は、配列番号３を含む細胞外マトリックス（ＥＣＭ）材料を提供する。

【0006】

次に以下で、添付図面を参照して本発明を更に詳しく説明する。添付図面には、本発明の実施形態の一部が示されているが、其の全てが示されている訳ではない。実際、本発明は多くの様々な形態で実施する事が出来、本明細書に示される実施形態に限定されると解釈されるべきではなく、寧ろ、此れらの実施形態は、本開示が当該法的要件を満たす様に提供されるものである。全体を通じて同じ番号は同じ要素を指す。

【図面の簡単な説明】

【0007】

【図1】配列番号１を示す図である。

【図2】配列番号２を示す図である。

【図3】配列番号３を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0008】

次に以下で、添付図面を参照して本発明を更に詳しく説明する。添付図面には、本発明の実施形態の一部が示されているが、其の全てが示されている訳ではない。実際、本発明は多くの様々な形態で実施する事が出来、本明細書に示される実施形態に限定されると解釈されるべきではなく、寧ろ、此れらの実施形態は、本開示が当該法的要件を満たす様に提供されるものである。本明細書及び添付の特許請求の範囲に於いて使用される場合、単数形「１つの（a）」、「１つの（an）」、「其の（the）」は、文脈上特段の明確な規定が無い限り、複数の指示対象を含む。

【0009】

本開示の発明は一般に、識別の目的の為の配列番号１（図１）及び／又は配列番号２（図２）の使用に関する。例えば、実験室環境に於いて新規の細胞系統が作製され、又は新規のタンパク質が作製される場合、其の細胞系統又はタンパク質が由来する起源を識別することができることが有益と成る場合がある。本発明の或る特定の実施形態によれば、本発明は、人工遺伝子配列を利用して本発明者等の対象細胞に安定的にトランスフェクションさせて、生産された安定的にトランスフェクションされた細胞又は所与の出所若しくは場所（例えば、特定の実験室）と関連付けられた安定的にトランスフェクションされた細胞を品質管理及び参照の目的で識別又は商標化（brand）する。

【0010】

特に、配列番号１（即ち、５’ＧＣＡＧＴＴＴＴＡＣＧＡＡＣＣＴＴＴ３’）及び其の相補配列である配列番号２（即ち、５’ＡＡＡＧＧＴＴＣＧＴＡＡＡＡＣＴＧＣ３’）を、識別の目的の為に細胞に安定的にトランスフェクションする事が出来る。本発明の或る特定の実施形態に依れば、何れかの配列が起源細胞によって上手く翻訳されると、配列番号３（即ち、ＲＱＮＡＷＫ）の人工ペプチド配列が細胞又は起源によって分泌された細胞外マトリックス上に存在する。此処で、「Ｒ」＝Ａｒｇ＝アルギニン、「Ｑ」＝Ｇｌｎ＝グルタミン、「Ｎ」＝Ａｓｎ＝アスパラギン、「Ａ」＝Ａｌａ＝アラニン、「Ｗ」＝Ｔｒｐ＝トリプトファン、及び「Ｋ」＝Ｌｙｓ＝リジンである。本発明の或る特定の実施形態によれば、配列番号１及び／又は配列番号２を、識別の目的で、例えばコラーゲン１型の配列内に埋め込む事が出来る。此の配列を細胞にトランスフェクションする目的は、生産される任意の無細胞材料内のコラーゲン線維上にユニークな識別タグを生成する遺伝子改変細胞を全て識別する事を可能にする為である。此れにより、利用者は関連製品に関する材料を識別し、相互参照する事が可能と成る。例えば、此の識別方法により、利用者は、自身の実験室（又は別の出所）に於いて生産された細胞及び無細胞材料の両方の経過を追って、遺伝子改変された新しい製品を生産する際の参照及び相互参照を行う事が可能と成る。

【0011】

配列番号１及び配列番号２は自然界に天然に存在しない。此れらの配列は、同様に天然には存在しないペプチド（即ち、配列番号３）を生成する為に合成された。此の特定のペプチド（即ち、配列番号３）は、申請企業（filing company）のプラットフォーム技術の何れかを用いて成長させた細胞をバーコード化及び／又は商標化する目的で、申請企業の名称に対応するタグである。

【0012】

本発明の或る特定の実施形態によれば、例えばリポフェクション、エレクトロポレーション、超音波処理等の非ウイルス性ベクターを使用して、配列番号１及び／又は配列番号２を様々な細胞に安定的にトランスフェクションするか、又は例えばアデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス等のウイルスベクター、若しくは他の任意のウイルスベクターを使用して、ウイルスにより様々な細胞に形質導入してプラスミドコンストラクトを細胞宿主の核に送達する事が出来る。

【0013】

従って、本発明の或る特定の実施形態は、特定の実験室に於いて生産される細胞及び無細胞材料の両方を追跡及び参照する方法をもたらす事を目的として、細胞によって生成されるカスタム分子タグを提供する。更に、本発明の或る特定の実施形態は、細胞製品の監査生産（audit production）を容易にし、申請企業が使用する為に生産される新規の細胞系統又は分子製品を商標化又はタグ付けする事が出来る。

【0014】

本発明の或る特定の実施形態によれば、例えば、本発明は、配列番号１、配列番号２、又は其の両方を含むトランスフェクションされた細胞を提供する。

【0015】

本発明の或る特定の実施形態によれば、トランスフェクションされた細胞は、ヒトホウォートンゼリー細胞（ＭＳＣ）、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、ヒト脂肪由来間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、ヒト皮膚由来人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、ヒト血液細胞由来人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、ヒトＣＤ４＋ Ｔ細胞、又はヒトＣＤ８＋ Ｔ細胞等のヒト幹細胞を含み得る。追加的に又は代替的に、トランスフェクションされた細胞は、ＨｅｐＧ２細胞（肝臓癌細胞）、ヒト成人皮膚線維芽細胞（初代細胞）、ヒト新生児皮膚線維芽細胞（初代細胞）、ヒト成人ケラチノサイト（初代細胞）、マウス背根神経節（初代神経細胞）、ウシ心筋細胞（初代細胞系統）、初代ブタ肝細胞、ブタ軟骨細胞、ブタ骨細胞、ウマ筋肉由来幹細胞（初代ＭＳＣ）、初代スネイル細胞（Primary Snail Cells）、ヒトマクロファージ等の初代哺乳動物細胞、及びヒト、動物、又は植物から採取された組織から分離する事が出来る任意の初代細胞を含み得る。追加的に又は代替的に、トランスフェクションされた細胞は、ＵＢ－ＯＣ２細胞（マウス蝸牛上皮）、ヒト筋芽細胞腫（筋肉腫瘍）、ＰＣ３（前立腺癌）、ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣細胞）、ＨＥＫ２９３（ヒト胎児腎臓細胞）、ＳＨＳＹ５Ｙ（神経腫瘍）、ＰＡＮＣ－１（ヒト膵臓癌）、ＨｅＬａ（子宮頸癌）、Ａ５４９（肺癌）、Ａ６７３（筋肉癌）等の不死化哺乳動物細胞系統、及び（４）実質細胞、厚角細胞、厚壁細胞、木部細胞、師管細胞（Pholem cells）、分裂組織細胞、表皮細胞等の初代植物細胞を含み得る。

【0016】

別の態様に於いて、本発明は、対象細胞系統をタグ付けする方法を提供する。此の方法は、対象細胞系統を準備する事と、対象細胞系統の細胞に配列番号１、配列番号２、又は其の両方を含むベクターをトランスフェクションする事とを含み得る。本発明の或る特定の実施形態によれば、ベクターは、リポフェクション、リン酸カルシウム、カチオン性脂質、デキストラン、マグネトフェクションエレクトロポレーション、マイクロインジェクション、遺伝子銃導入（ballistic transfer）、光学的／レーザートランスフェクション、及び超音波処理等の非ウイルス性ベクター、又はアデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、及びレトロウイルス等のウイルスベクターを含み得る。

【0017】

別の態様に於いて、本発明は、配列番号３を含む細胞外マトリックス（ＥＣＭ）材料を提供する。本発明の或る特定の実施形態によれば、ＥＣＭ材料は、配列番号１、配列番号２、又は其の両方でトランスフェクションされた細胞から形成される。例えば、ＥＣＭは、配列番号３でタグ付けされた１種以上の組織成分を含み得る。例えば、１種以上の組織成分は、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）、プロテオグリカン、ヒアルロン酸（ＨＡ）、ヘパリン硫酸（ＨＳ）、コンドロイチン硫酸（ＣＳ）、ケラタン硫酸（ＫＳ）、コラーゲンの種類（例えば、線維型（Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、Ｖ、ＸＩ）、Ｆａｃｉｔ型（ＩＸ、ＸＩＩ、ＸＩＶ）、短鎖（ＶＩＩＩ、Ｘ）、基底膜（ＩＶ）、及び其の他（ＶＩ、ＶＩＩ、ＸＩＩＩ）、エラスチン、ＤＮＡ、ＲＮＡ、フィブロネクチン及び糖タンパク質、ラミニン－１１１（ラミニン－１）、ラミニン－２１１（ラミニン－２）、ラミニン－１２１（ラミニン－３）、ラミニン－２２１（ラミニン－４）、ラミニン－３３２／ラミニン－３Ａ３２（ラミニン－５／ラミニン－５Ａ）、ラミニン－３Ｂ３２（ラミニン－５Ｂ）、ラミニン－３１１／ラミニン－３Ａ１１（ラミニン－６／ラミニン－６Ａ）、ラミニン－３２１／ラミニン－３Ａ２１（ラミニン－７／ラミニン－７Ａ）、ラミニン－４１１（ラミニン－８）、ラミニン－４２１（ラミニン－９）、ラミニン－５１１（ラミニン－１０）、ラミニン－５２１（ラミニン－１１）、ラミニン－２１３（ラミニン－１２）、ラミニン－４２３（ラミニン－１４）、ラミニン－５２２、ラミニン－５２３（ラミニン－１５）、ペプチド、脂質及びリン脂質、炭水化物、ホスフェート（Phosphates）、飽和脂肪、不飽和脂肪、トランス脂肪、コレステロール、細胞小器官（例えば、ミトコンドリア、滑面小胞体、粗面小胞体、ゴルジ体／装置、リソソーム、エンドソーム、小胞、ペルオキシソーム、核小体、核、及びリボソーム）、並びに細胞骨格成分（例えば、アクチン、ミオシン）を含むＥＣＭ成分を含み得る。

【0018】

当業者であれば、本発明の趣旨及び範囲から逸脱する事なく、本発明に対する此れらの変更及び変形、並びに其の他の変更及び変形を行う事が出来、本発明は、添付の特許請求の範囲に更に詳細に示される。更に、様々な実施形態の態様を全体的又は部分的に入れ替える事が出来る事が理解されるべきである。更に、当業者であれば、上述の説明は例示のみを目的としており、此の様な添付の特許請求の範囲に於いて更に記載される本発明を制限する事を意図したものではない事を理解するであろう。従って、添付の特許請求の範囲の趣旨及び範囲は、本明細書に含まれる解釈の例示的な説明に限定されるべきではない。

【図1】

【図2】

【図3】

【国際調査報告】