特表 2024-546382 皮膚由来幹細胞の培養方法及びその用途

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-12-20

(54)【発明の名称】皮膚由来幹細胞の培養方法及びその用途

(51)【国際特許分類】

   C12N 5/074 20100101AFI20241213BHJP

   A61K 35/36 20150101ALI20241213BHJP

   A61P 17/02 20060101ALI20241213BHJP

   A61K 8/02 20060101ALI20241213BHJP

   A61K 8/98 20060101ALI20241213BHJP

   A61Q 90/00 20090101ALI20241213BHJP

【ＦＩ】

C12N5/074

A61K35/36

A61P17/02

A61K8/02

A61K8/98

A61Q90/00

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024538424

(86)(22)【出願日】2022-12-23

(85)【翻訳文提出日】2024-07-19

(86)【国際出願番号】 KR2022021212

(87)【国際公開番号】W WO2023121399

(87)【国際公開日】2023-06-29

(31)【優先権主張番号】10-2021-0187681

(32)【優先日】2021-12-24

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＷＥＥＮ

２．ＳＰＡＮ

(71)【出願人】

【識別番号】518357128

【氏名又は名称】イファ ユニバーシティ－インダストリー コラボレーション ファウンデーション

【氏名又は名称原語表記】ＥＷＨＡ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ － ＩＮＤＵＳＴＲＹ ＣＯＬＬＡＢＯＲＡＴＩＯＮ ＦＯＵＮＤＡＴＩＯＮ

【住所又は居所原語表記】５２， Ｅｗｈａｙｅｏｄａｅ－ｇｉｌ Ｓｅｏｄａｅｍｕｎ－ｇｕ Ｓｅｏｕｌ ０３７６０， Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｋｏｒｅａ

(71)【出願人】

【識別番号】521129141

【氏名又は名称】ヒエラバイオ インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】110000176

【氏名又は名称】弁理士法人一色国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】リ，ソン チン

(72)【発明者】

【氏名】シン，チ－ヨン

(72)【発明者】

【氏名】チョン，チョン ファ

(72)【発明者】

【氏名】キム，ヒチョン

【テーマコード（参考）】

4B065

4C083

4C087

【Ｆターム（参考）】

4B065AA90X

4B065BC46

4B065BD50

4B065CA44

4C083AA071

4C083AA072

4C083CC02

4C083DD39

4C083EE13

4C083FF01

4C087AA01

4C087AA02

4C087BB48

4C087BB64

4C087CA04

4C087MA23

4C087MA66

4C087NA14

4C087ZA89

(57)【要約】

本発明は、皮膚由来幹細胞の培養方法及びその用途に関し、皮膚由来幹細胞の培養方法；前記方法で製造された皮膚由来幹細胞；前記製造された皮膚由来幹細胞、その培養物または前記皮膚由来幹細胞から分化した細胞を有効成分として含む、皮膚再生または創傷治療用薬学組成物；医薬部外品組成物；及び化粧料組成物に関する。
本発明の培養方法によると、皮膚組織から効果的に幹細胞を分離及び得ることができ、前記得られた皮膚由来幹細胞は、多分化能と自己複製能に優れ、皮膚再生効果及び創傷治療効果に優れるため、皮膚再生及び創傷治療または改善用途として有用に活用できるものである。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

（ａ）皮膚組織をハイドロゲル内に取り込んで培養して培養物を得る段階；及び
（ｂ）前記で得られた培養物においてハイドロゲルを分解して前記皮膚組織からハイドロゲル内に移動及び増殖した幹細胞を回収する段階を含む、皮膚由来幹細胞の培養方法。

【請求項2】

前記（ａ）段階で皮膚組織の培養は、皮膚切片をハイドロゲル内に３日～２０日間取り込み培養するものである、請求項１に記載の皮膚由来幹細胞の培養方法。

【請求項3】

前記（ａ）段階の以前に皮膚組織の前処理段階として、皮膚組織の試料を５０～７０℃の温度で３０秒～９０秒間皮膚組織を処理する段階；アルコール（ａｌｃｏｈｏｌ）または界面活性剤に１分～１０分間浸漬する段階；及び洗浄段階を含む皮膚組織の前処理段階を含むものである、請求項１に記載の皮膚由来幹細胞の培養方法。

【請求項4】

前記皮膚由来幹細胞は、ＧＡＳ１、ＯＳＲ２、ＤＭＫＮ及びＳＢＳＮから選択されるいずれか一つ以上の遺伝子発現が増加したものである、請求項１に記載の皮膚由来幹細胞の培養方法。

【請求項5】

前記皮膚由来幹細胞は、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０及びＣＤ１０５は発現し、
ＣＤ１４、ＣＤ３４及びＣＤ４５は発現しない免疫学的特性を有するものである、請求項１に記載の皮膚由来幹細胞の培養方法。

【請求項6】

前記皮膚由来幹細胞は、組織培養及び細胞分離後、継代培養９回目まで細胞の形態及び大きさが維持されるものである、請求項１に記載の皮膚由来幹細胞の培養方法。

【請求項7】

請求項１に記載の方法で製造された皮膚由来幹細胞。

【請求項8】

前記皮膚由来幹細胞は、ＧＡＳ１、ＯＳＲ２、ＤＭＫＮ及びＳＢＳＮから選択されるいずれか一つ以上の遺伝子発現が増加したものである、請求項７に記載の皮膚由来幹細胞。

【請求項9】

前記皮膚由来幹細胞は、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０及びＣＤ１０５は発現し、
ＣＤ１４、ＣＤ３４及びＣＤ４５は発現しない免疫学的特性を有するものである、請求項７に記載の皮膚由来幹細胞。

【請求項10】

請求項１に記載の方法で製造された皮膚由来幹細胞、その培養物または前記皮膚由来幹細胞から分化した細胞を有効成分として含む、皮膚再生または創傷治療用薬学組成物。

【請求項11】

請求項１に記載の方法で製造された皮膚由来幹細胞、その培養物または前記皮膚由来幹細胞から分化した細胞を有効成分として含む、皮膚再生または創傷改善用医薬部外品組成物。

【請求項12】

請求項１に記載の方法で製造された皮膚由来幹細胞、その培養物または前記皮膚由来幹細胞から分化した細胞を有効成分として含む、皮膚再生または創傷改善用化粧料組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、皮膚由来幹細胞の培養方法及びその用途に関し、皮膚由来幹細胞の培養方法；前記方法で製造された皮膚由来幹細胞；前記製造された皮膚由来幹細胞、その培養物または前記皮膚由来幹細胞から分化した細胞を有効成分として含む、皮膚再生または創傷治療用薬学組成物；医薬部外品組成物；及び化粧料組成物に関する。

【背景技術】

【0002】

幹細胞（ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）とは、組織を構成する各細胞に分化する前段階の細胞であり、未分化状態で無限増殖が可能であり、特定分化刺激により多様な組織の細胞に分化し得る潜在的可能性を有する細胞をいう。

【0003】

幹細胞は、分化の可能性に応じて大きく胚性幹細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ：ＥＳ ｃｅｌｌ）と成体幹細胞（ａｄｕｌｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ（組織特異的幹細胞（ｔｉｓｓｕｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ））に分けられる。胚性幹細胞は、受精卵が形成された後、子宮内膜に着床する前の初期段階である胚盤胞（ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔ）胚中の胎児になる細胞塊（ｉｎｎｅｒ ｃｅｌｌ ｍａｓｓ：ＩＣＭ）から分離した幹細胞であり、全ての組織の細胞に分化し得る潜在力を有している細胞である。

【0004】

一方、組織特異的幹細胞は、胚発生過程が進行されて胚の各臓器が形成される段階で現れる各臓器に特異的な幹細胞であり、その分化能が一般にその組織を構成する細胞のみに限定（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ）される。代表的な組織特異的幹細胞は、骨髄（ｂｏｎｅ－ｍａｒｒｏｗ）に存在する造血幹細胞（ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）と血球細胞以外の結合組織（ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅ ｔｉｓｓｕｅ）細胞に分化する間葉系幹細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）がある。造血幹細胞は赤血球、白血球などの各種血球細胞に分化され、間葉系幹細胞は骨芽細胞（ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ）、軟骨芽細胞（ｃｈｏｎｄｒｏｂｌａｓｔ）、脂肪細胞（ａｄｉｐｏｃｙｔｅ）及び筋芽細胞（ｍｙｏｂｌａｓｔ）などに分化する。

【0005】

近来、ヒトから胚性幹細胞の分離が成功した後、その臨床的適用に関心が高まっている。幹細胞の適用分野として最も注目されているのは細胞代替療法のための細胞供給源としての利用である。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0006】

【特許文献1】韓国公開特許公報１０－２０１４－００７５４６９ Ａ

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

既存の皮膚幹細胞の分離方法は、コラゲナーゼ（ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ）などを利用した酵素的分離方法（韓国公開特許公報１０－２０１４－００７５４６９ Ａ）であり、細胞表面のタンパク質損傷が避けられないため、細胞性能に影響を及ぼす短所があり、皮膚幹細胞の分離及び培養方法に関する研究が必要なのが現状である。

【0008】

このような背景下で、本発明者らは、新たな幹細胞を開発するために多様な研究を行った結果、本発明の培養方法により製造された皮膚由来幹細胞が体外増殖力、細胞性能、分化能に優れ、皮膚再生及び創傷治療用途として使用できることを確認し、本発明を完成した。

【課題を解決するための手段】

【0009】

本発明の一つの目的は、皮膚組織及びハイドロゲルを用いて皮膚由来幹細胞を培養する方法を提供することにある。

【0010】

本発明のもう一つの目的は、前記方法で製造された皮膚由来幹細胞を提供することにある。

【0011】

本発明の他の一つの目的は、前記皮膚由来幹細胞、その培養物または前記皮膚由来幹細胞から分化した細胞を有効成分として含む、皮膚再生または創傷治療用薬学組成物を提供することにある。

【0012】

本発明の他の一つの目的は、前記皮膚由来幹細胞、その培養物または前記皮膚由来幹細胞から分化した細胞を有効成分として含む、皮膚再生または創傷改善用医薬部外品組成物を提供することにある。

【0013】

本発明の他の一つの目的は、前記皮膚由来幹細胞、その培養物または前記皮膚由来幹細胞から分化した細胞を有効成分として含む、皮膚再生または創傷改善用化粧料組成物を提供することにある。

【0014】

本発明の他の一つの目的は、皮膚組織及びハイドロゲルを含む皮膚由来幹細胞培養用組成物を提供することにある。

【0015】

本発明の他の一つの目的は、前記幹細胞培養用組成物を含む皮膚由来幹細胞培養用キットを提供することにある。

【発明の効果】

【0016】

本発明の培養方法によると、皮膚組織から効果的に幹細胞を分離及び得ることができ、前記得られた皮膚由来幹細胞は、多分化能と自己複製能に優れ、皮膚再生効果及び創傷治療効果に優れるため、皮膚再生及び創傷治療または改善用途として有用に活用できる。

【図面の簡単な説明】

【0017】

【図1】本発明のＨＢ－皮膚由来幹細胞の組織培養結果（図１ａ）、細胞分離及び培養した結果（図１ｂ）である。

【図2】本発明のＨＢ－皮膚由来幹細胞の免疫表現型を確認した結果である。

【図3】本発明のＨＢ－皮膚由来幹細胞の継代培養による増殖能を確認した結果である。

【図4】本発明のＨＢ－皮膚由来幹細胞（ＨＢ－ＳＳＣ）のコロニー形成能を確認した結果である。

【図5a】本発明のＨＢ－皮膚由来幹細胞の脂肪細胞への分化能を確認した結果である。

【図5b】本発明のＨＢ－皮膚由来幹細胞の骨細胞への分化能を確認した結果である。

【図6a】ＤＢ基盤皮膚再生機能に関連する遺伝子Ｓｔｒｉｎｇ Ｎｅｔｗｏｒｋ分析結果及びＨＢ－皮膚由来幹細胞（ＨＢ－ＳＳＣ）の特異皮膚再生機能性遺伝子を確認した結果である。

【図6b】本発明のＨＢ－皮膚由来幹細胞（ＨＢ－ＳＳＣ）の特異的発現皮膚再生機能性遺伝子を脂肪由来幹細胞（ＡＳＣ）に比べた発現量を比較分析した結果である。

【図6c】本発明の皮膚由来幹細胞（ＨＢ－ＳＳＣ）の特異的発現皮膚再生機能性遺伝子を脂肪由来幹細胞（ＡＳＣ）に比べた発現量を比較分析した結果である。

【図7a】マウスモデルにおいて本発明のＨＢ－皮膚由来幹細胞（ＨＢ－ＳＳＣ）の創傷治癒効果を確認した結果である。

【図7b】マウスモデルにおいて本発明のＨＢ－皮膚由来幹細胞（ＨＢ－ＳＳＣ）の創傷治癒効果を確認した結果である。

【図8】マウス創傷モデルにおいて本発明のＨＢ－皮膚由来幹細胞（ＨＢ－ＳＳＣ）の皮膚及び皮膚構造物の再生能を確認した結果である。

【発明を実施するための形態】

【0018】

これを具体的に説明すると、次の通りである。一方、本発明で開示されたそれぞれの説明及び実施形態は、それぞれの異なる説明及び実施形態にも適用することができる。即ち、本発明で開示された多様な要素の全ての組合せが本発明の範疇に属する。また、下記の具体的な記述により本発明の範疇が制限されるとは見られない。

【0019】

前記目的を達成するための本発明の一態様は、皮膚組織及びハイドロゲルを用いた皮膚由来幹細胞の培養方法及び前記方法で培養された皮膚由来幹細胞を提供する。

【0020】

本発明の用語、皮膚由来幹細胞は、皮膚組織に由来する全ての幹細胞を含むことができ、一例として、脂肪幹細胞（ａｄｉｐｏｓｅ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ）、表皮幹細胞（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ）、真皮幹細胞（ｄｅｒｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ）などを含めてもよいが、これに制限されるものではない。

【0021】

具体的には、皮膚組織由来幹細胞の培養方法は、（ａ）皮膚組織をハイドロゲル内に取り込んで培養して培養物を得る段階；及び（ｂ）前記で得られた培養物においてハイドロゲルを分解して前記皮膚組織からハイドロゲル内に移動及び増殖した幹細胞を回収する段階を含む。

【0022】

本発明において、前記ハイドロゲルは、親水性高分子が共有または非共有結合で架橋されて作られた３次元網状構造物を意味するものであり、皮膚組織をハイドロゲル内に３次元的に取り込むことにより、ハイドロゲルは皮膚組織の物理的支持を提供すると共に皮膚組織内に存在する皮膚由来幹細胞をハイドロゲル内に移動し、増殖できる細胞外基質機能を同時に提供することができる。

【0023】

また、本発明のハイドロゲルは、ハイドロゲル支持３次元培養のために溶液状態で存在し、ゾルとゲルに変換できる相転移（ｐｈａｓｅ ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎａｌ）性ハイドロゲルが好ましく、具体的には、コラーゲン（ｃｏｌｌａｇｅｎ）、ゼラチン（ｇｅｌａｔｉｎ）、コンドロイチン（ｃｈｏｎｄｒｏｉｔｉｎ）、ヒアルロン酸（ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ）、アルギニン（ａｌｇｉｎｉｃ ａｃｉｄ）、マトリゲル（ＭａｔｒｉｇｅｌＴＭ）、キトサン（ｃｈｉｔｏｓａｎ）、ペプチド（ｐｅｐｔｉｄｅ）、フィブリン（ｆｉｂｒｉｎ）、ＰＧＡ（ｐｏｌｙｇｌｙｃｏｌｉｃ ａｃｉｄ）、ＰＬＡ（ｐｏｌｙｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄ）及びＰＥＧ（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）、ポリアクリルアミド（ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ）からなる群から選択されたいずれか一つ以上であってもよいが、これに制限されるものではない。また、前記（ａ）段階は、毛包組織をハイドロゲル多重層の間に取り込んで培養することであってもよい。具体的には、ハイドロゲル二重層の間に毛包組織を取り込んで培養することであってもよいが、これに制限されるものではない。

【0024】

前記（ａ）段階において、皮膚組織が取り込んだハイドロゲルの培養は、当業界において幹細胞培養に適することが知られている通常の培地に皮膚組織が取り込んだハイドロゲルを浸漬した後に行われてもよい。

【0025】

また、前記（ａ）段階で皮膚組織の培養は、皮膚切片をハイドロゲル内に３日～２０日、３日～１８日、３日～１６日間取り込み培養することであってもよい。具体的には、３日～１４日間培養してもよいが、これに制限されるものではない。

【0026】

本発明の一具体例では、健康な成人の皮膚を採取して皮膚の切片を形成し、ハイドロゲルに９日間取り込み培養した。

【0027】

また、前記（ａ）段階の以前に皮膚組織の前処理段階として、皮膚組織の試料を５０～７０℃の温度で３０秒～９０秒間皮膚組織を処理する段階；アルコール（ａｌｃｏｈｏｌ）または界面活性剤に１分～１０分間浸漬する段階；及び洗浄段階を含むことができる。

【0028】

その時、前記皮膚組織処理段階の温度は、５０～７０℃、５２～６８℃、５４～６６℃、５６～６４℃、５８～６２℃、または６０℃であってもよいが、これに制限されるものではない。

【0029】

また、前記皮膚組織処理段階は、３０秒～９０秒、４０秒～８０秒、５０秒～７０秒、５５秒～６５秒、５８～６２秒、５９、６０、または６１秒であってもよいが、これに制限されるものではない。

【0030】

また、前記前処理段階中、アルコールまたは界面活性剤に浸漬する段階で使用されるアルコールは、炭素数１～４のアルコールを含んでもよく、具体的には、エタノール、メタノール、プロパノール、イソプロピルアルコールなどであってもよいが、これに制限されるものではない。

【0031】

また、前記界面活性剤は、両性界面活性剤または非イオン性界面活性剤を含むことができる。

【0032】

前記両性界面活性剤は、ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｓｅｒｉｎｅ、ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ、ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅなどを含んでもよいが、これに制限されるものではない。

【0033】

前記非イオン性界面活性剤は、Ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ ｅｓｔｅｒｓ ｏｆ ｇｌｙｃｅｒｏｌ、Ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ ｅｓｔｅｒｓ ｏｆ ｓｏｒｂｉｔｏｌ ＳｐａｎｓまたはＴｗｅｅｎｓなどを含んでもよく、具体的には、Ｇｌｙｃｅｒｏｌ ｍｏｎｏｓｔｅａｒａｔｅ、Ｇｌｙｃｅｒｏｌ ｍｏｎｏｌａｕｒａｔｅ、Ｓｏｒｂｉｔａｎ ｍｏｎｏｌａｕｒａｔｅ、Ｓｏｒｂｉｔａｎ ｍｏｎｏｓｔｅａｒａｔｅ、Ｓｏｒｂｉｔａｎ ｔｒｉｓｔｅａｒａｔｅ、Ｔｗｅｅｎ ２０、Ｔｗｅｅｎ ４０、Ｔｗｅｅｎ ６０、Ｔｗｅｅｎ ８０などであってもよいが、これに制限されるものではない。

【0034】

また、前記アルコールまたは界面活性剤に浸漬する段階は、皮膚組織の脂肪層の除去のためのものであるため、浸漬、噴霧、コーティングなどの本技術分野において使用される方法でアルコールまたは界面活性剤に組織を接触させる方法であれば、全部含まれることであり、特に制限されるものではない。

【0035】

また、前記アルコールまたは界面活性剤に浸漬する段階は、１分～１０分、２分～９分、３分～８分、４分～７分、４分３０秒～６分３０秒、５分～５分３０秒、または５分であってもよいが、これに制限されるものではない。

【0036】

また、前記前処理段階の洗浄段階は、本技術分野において洗浄剤として用いられることであれば十分であり、特別な制限があるものではない。

【0037】

一具体例においてＰＢＳであってもよく、洗浄回数は１回～１０回、２回～８回、３回、４回、５回、６回、または７回であってもよく、これに制限されるものではない。

【0038】

また、前記皮膚組織の試料は、動物から摘出またはヒトから供与された皮膚組織を試料とすることができるが、これに制限されるものではない。

【0039】

本発明の一実施例では、皮膚組織を試料として約６０℃、約１分間皮膚組織を処理して角質層を分離し、イソプロピルアルコールに５分間浸漬して皮膚の脂肪層を除去した後、洗浄段階の前処理段階を経た。

【0040】

前記（ｂ）段階は、（ａ）段階のハイドロゲル－支持３次元培養段階後、ハイドロゲル内に移動／増殖した皮膚由来幹細胞を回収するために、ハイドロゲルのみを選択的に分解させることができる。

【0041】

前記ハイドロゲルの分解は、コラゲナーゼ、ゼラチナーゼ、ウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、ＴＰＡ（ｔｉｓｓｕｅ ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ）、プラスミン（ｐｌａｓｍｉｎ）及びヒアルロニダーゼからなる群から選択された一つ以上の酵素を通じて分解することができる。

【0042】

本発明の皮膚幹細胞の分離／培養技術は、ハイドロゲル基盤のニッチ保存自己複製誘導分離技術として幹細胞を分離する技術であり、皮膚組織が体外生存／培養され、酵素処理なしに組織から直接純度の高い細胞を分離できる新技術に該当する。

【0043】

既存の方法とは異なり、本分離方法は、現存する方式と差別化された方式で体外増殖力及び細胞性能の側面で優れるという長所がある。

【0044】

既存の方法で分離した細胞は、２－３継代（最大５継代）までのみ体外増幅が可能であるが、本発明の方法で分離した細胞は、８継代以上継代培養しても細胞老化が起きないなど性能に優れ、長期間継代培養が可能であるため、大量生産が可能である。

【0045】

また、前記方法により製造された皮膚由来幹細胞は、組織培養及び細胞分離後の継代培養９回目まで細胞の形態及び大きさが維持されることを確認した。

【0046】

一方、本発明で提供する皮膚由来幹細胞を製造する方法により製造された皮膚由来幹細胞は、その細胞表面にＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０またはＣＤ１０５が発現し、ＣＤ１４、ＣＤ３４またはＣＤ４５は発現しない免疫学的特性を示し、脂肪細胞または骨細胞などに分化し得る多分化特性を示すが、これに制限されるものではない。

【0047】

前記皮膚由来幹細胞は、本発明で提供する皮膚由来幹細胞を製造する方法により製造された皮膚由来幹細胞、本発明の皮膚由来幹細胞、皮膚由来幹細胞、ＨＢ－皮膚由来幹細胞、本発明のＨＢ－皮膚由来幹細胞、ＨＢ－ＳＳＣと混用され得る。

【0048】

本発明の一実施例では、本発明の皮膚由来幹細胞製造方法により製造した皮膚由来幹細胞の増殖能、分化能、コロニー形成能を確認することができた。

【0049】

本発明のまた他の実施例では、本発明の皮膚由来幹細胞製造方法により製造した皮膚由来幹細胞の皮膚創傷治療効果を確認することができた。

【0050】

本発明のまた他の実施例では、さらに、継代培養による細胞成長能／細胞老化（体外増殖力）及び初代細胞の純度評価の遂行を通じて体外で生存期間が長く、生存能が優れていることを確認することができた。

【0051】

本発明で提供する皮膚由来幹細胞を製造する方法により製造された皮膚由来幹細胞は、特異的皮膚再生機能性遺伝子を発現することができる。

【0052】

その時、前記皮膚再生機能性遺伝子は、具体的には、ＯＳＲ２（ｏｄｄ－ｓｋｉｐｐｅｄ－ｒｅｌａｔｅｄ ２）、ＤＭＫＮ（Ｄｅｒｍｏｋｉｎｅ）、ＳＢＳＮ（Ｓｕｐｒａｂａｓｉｎ）及びＧＡＳ１（Ｇｒｏｗｔｈ Ａｒｒｅｓｔ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ １）から選択されるいずれか一つ以上の遺伝子であってもよいが、これに制限されるものではなく、皮膚再生機能性遺伝子として知られた遺伝子であれば、これに含まれ得る。

【0053】

本発明の一実施例では、前記皮膚由来幹細胞製造方法により製造された皮膚由来幹細胞において脂肪由来幹細胞に比べて前記４個の皮膚再生機能性遺伝子が１０倍以上の顕著な発現量を示すことを確認し、本願方法により製造された皮膚由来幹細胞が特異的皮膚再生機能性遺伝子を発揮することを確認することができた。

【0054】

本発明の他の一態様は、前記皮膚由来幹細胞、その培養物または前記皮膚由来幹細胞から分化した細胞を有効成分として含む、皮膚再生または創傷治療用薬学組成物を提供する。

【0055】

本発明の用語、「皮膚再生」とは、皮膚の外部及び内部の原因による損傷に対し、皮膚組織の回復過程を意味し、外部の原因による損傷は、紫外線、汚染物質、創傷、外傷などであり、内部の原因としては、遺伝的、心理的原因などを全部含むことができるが、これに制限されるものではない。

【0056】

また、前記皮膚再生は、毛包再生または毛包細胞の増殖を含むことができる概念であり、前記毛包細胞の増殖は、毛包細胞が休止期から増殖期への変換が促進されることを含めてもよいが、これに制限されるものではない。

【0057】

本発明の用語、「培養物」または「培養液」は、皮膚由来幹細胞を培地で培養する過程中または培養した後に得られた培養物またはその上澄液、その濃縮物またはその凍結乾燥物であってもよい。

【0058】

本発明の用語、「薬学組成物」とは、疾病の予防または治療を目的として製造されたものを意味し、実際の臨床投与時に経口及び非経口の種々の剤形で投与されてもよいが、製剤化する場合には、通常使用する充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、界面活性剤などの希釈剤または賦形剤を用いて調剤することができる。

【0059】

また、それぞれの剤形により薬学的に許容可能な添加剤をさらに含むことができ、その時、薬学的に許容可能な添加剤としては、デンプン、ゼラチン化デンプン、微結晶セルロース、乳糖、ポビドン、コロイダルシリコーンジオキシド、リン酸水素カルシウム、ラクトース、マンニトール、飴、アラビアゴム、前糊化デンプン、コーンスターチ、粉末セルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、オパドライ、デンプングリコール酸ナトリウム、カルナウバロウ、合成ケイ酸アルミニウム、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸アルミニウム、ステアリン酸カルシウム、白糖、デキストロース、ソルビトール及びタルクなどが用いられる。本発明による薬学的に許容可能な添加剤は、前記組成物に対して０．１～９０重量部が含まれ得る。

【0060】

前記薬学組成物には、前記皮膚由来間葉系幹細胞以外にも一つまたはそれ以上の薬学的に許容可能な通常の不活性担体、例えば、注射剤の場合には、保存剤、無痛化剤、可溶化剤または安定化剤などを、局所投与用製剤の場合には、基剤（ｂａｓｅ）、賦形剤、潤滑剤または保存剤などをさらに含むことができる。

【0061】

本発明の薬学組成物は、個別治療剤で投与しても、他の治療剤と併用して投与してもよく、従来の治療剤とは順次または同時に投与することができる。そして、単一または多重投与することができる。前記要素を全て考慮し、副作用を誘発せず最小限の量で最大の効果を得る量を投与することが重要であり、当業者により容易に決定することができる。

【0062】

それだけでなく、本発明で提供する薬学組成物は、前記皮膚由来幹細胞以外にも皮膚再生または創傷の治療を補助したり、前記皮膚由来幹細胞の活性を維持したり、前記皮膚由来幹細胞の分化を促進する多様な成分をさらに含むことができるが、一例として、抗炎症製剤、幹細胞動員因子、成長誘導因子などをさらに含むことができる。

【0063】

本発明で使用される用語、「改善」とは、本発明による組成物を個体に投与して皮膚損傷の進行を遅延させたり症状を軽減させるあらゆる行為を意味する。

【0064】

本発明で使用される用語、「予防」とは、本発明による組成物を個体に投与して皮膚損傷の発生を抑制したり遅延させるあらゆる行為を意味する。

【0065】

本発明で使用される用語、「治療」とは、本発明の前記組成物を皮膚損傷発生の疑いのある個体に投与して皮膚損傷症状が好転又は有益にするあらゆる行為を意味する。

【0066】

本発明の他の一つの目的は、前記皮膚由来幹細胞、その培養物または前記皮膚由来幹細胞から分化した細胞を有効成分として含む組成物を個体に投与する段階を含む、皮膚再生または創傷改善または治療方法を提供する。

【0067】

前記皮膚由来幹細胞、その培養物または前記皮膚由来幹細胞から分化した細胞、皮膚再生、創傷改善、治療は、前述した通りである。

【0068】

本発明で使用される用語、「投与」とは、適切な方法で個体に前記組成物を導入することを意味する。具体的には、本発明の前記皮膚由来幹細胞、その培養物または前記皮膚由来幹細胞から分化した細胞を有効成分として含む組成物、またはそれを含む前記薬学的組成物を局所部位、例えば、皮膚損傷または創傷部位に塗布または注射剤として投与することができるが、これに制限されるものではない。

【0069】

また、前記組成物は、皮膚損傷または創傷治療に用いられる他の薬学的組成物と併用されてもよい。

【0070】

本発明の用語、「個体」とは、皮膚損傷または創傷が発症又は発症し得るヒトを含むマウス、ラット、家畜などのあらゆる動物を意味する。前記動物は、ヒトだけでなくこれと類似の症状の予防または治療を必要とするウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ラクダ、カモシカ、イヌ、ネコなどの哺乳動物であってもよいが、これに制限されない。

【0071】

本発明の組成物は、薬学的に有効な量で投与することができる。

【0072】

前記用語、「薬学的に有効な量」とは、医学的治療に適用可能な合理的な受恵／リスクの比率で疾患を治療するのに十分な量を意味し、有効用量の水準は、個体の種類及び重症度、年齢、性別、薬物の活性、薬物に対する敏感度、投与時間、投与経路及び排出比率、治療期間、同時に使用される薬物を含む要素及びその他の医学分野によく知られている要素により決定することができる。

【0073】

前記組成物は、個別治療剤として投与したり他の治療剤と併用して投与することができ、従来の治療剤とは順次または同時に投与することができる。また、単一または多重投与することができる。前記要素を全て考慮して副作用なしに最小限の量で最大効果を得ることができる量を投与することが重要であり、これは、当業者により容易に決定することができる。

【0074】

また、前記組成物は、目的とする方法により経口投与しても非経口投与（例えば、静脈内、皮下、腹腔内または局所に適用）してもよく、投与量は、患者の状態及び体重、疾病の程度、薬物形態、投与経路及び時間に応じて異なるが、当業者により適切に選択されることができる。具体的な例として、前記組成物は、一般に、１日１回～数回に分けて投与することができるが、好ましい投与量は、個体の状態及び体重、疾病の程度、薬物形態、投与経路及び期間に応じて当業者により適切に選択することができる。

【0075】

本発明の他の一つの目的は、前記皮膚由来幹細胞、その培養物または前記皮膚由来幹細胞から分化した細胞を有効成分として含む、皮膚再生または創傷改善用医薬部外品組成物を提供することにある。

【0076】

本発明の用語、「医薬部外品組成物」とは、ヒトや動物の疾病を治療、軽減、処置または予防する目的として使用される繊維、ゴム製品またはそれと類似したもの、人体に対する作用が弱かったり人体に直接作用せず、器具または機械ではないものとそれと類似したもの、感染予防のために、殺菌、殺虫及びそれと類似した用途で使用される製剤の一つに該当する物品であり、ヒトや動物の疾病を診断、治療、軽減、処置または予防する目的で使用する物品中、器具、機械または装置ではないもの及びヒトや動物の構造と機能に薬理学的影響を与える目的として使用する物品中、器具、機械または装置ではないものを除いた物品を意味し、具体的には、皮膚外用剤または個人衛生用品であってもよい。

【0077】

本発明の他の一つの目的は、前記皮膚由来幹細胞、その培養物または前記皮膚由来幹細胞から分化した細胞を有効成分として含む、皮膚再生または創傷改善用化粧料組成物を提供することにある。

【0078】

本発明の用語、「化粧料組成物」は、通常製造される如何なる剤形にも製造することができ、例えば、溶液、乳濁液、懸濁液、ペースト、クリーム、ローション、ゲル、パウダー、スプレー、界面活性剤含有クレンジング、オイル、石鹸、液体洗浄料、入浴剤、ファンデーション、メイクアップベース、エッセンス、化粧水、フォーム、パック、柔軟水、サンスクリーンクリームまたはサンオイルなどに剤形化することができる。

【0079】

本発明の他の一つの目的は、皮膚組織及びハイドロゲルを含む皮膚由来幹細胞培養用組成物及び前記組成物を含む皮膚由来幹細胞培養用キットを提供することにある。

【0080】

併せて、皮膚由来幹細胞培養用キットは、前記幹細胞培養用組成物と前記幹細胞の培養に必要な溶液、装置などの多様な構成要素を含むことができる。

【0081】

本発明の他の一つの目的は、前記皮膚由来幹細胞、その培養物または前記皮膚由来幹細胞から分化した細胞を有効成分として含む組成物の皮膚再生または創傷改善用途を提供する。

【0082】

以下、本発明を実施例を通じてより詳細に説明する。しかし、これら実施例は、本発明を例示的に説明するためのものであり、本発明の範囲がこれら実施例に限定されるものではない。

【0083】

実施例１．フィブリンハイドロゲル－支持皮膚組織の３次元培養
動物から摘出またはヒトから供与された皮膚組織を試料にして６０℃、１分間皮膚組織を処理して角質層を分離し、ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ ａｌｃｏｈｏｌに５分間浸漬して皮膚の脂肪層を除去した後、ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）で三回洗浄して皮膚組織を前処理した。Ｆｏｒｃｅｐを用いて処理された組織を固定した後、ｒａｚｏｒ ｂｌａｄｅを用いて１－３ｍｍ２の大きさで切断し、ＰＢＳで三回洗浄した。ＤＭＥＭ（ｌｏｗ ｇｌｕｃｏｓｅ，Ｇｉｂｃｏ）で１回洗浄した後、上澄液を除去し、ｆｉｂｒｉｎｏｇｅｎ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（０．２５％ ｗ／ｖ ｆｉｂｒｉｎｏｇｅｎ （緑十字）、２００μｇ／ｍＬ ｔｒａｎｅｘａｍｉｃ ａｃｉｄ（シンプン製薬）ｉｎ ＤＭＥＭ）５ｍＬを入れた。Ｔｈｒｏｍｂｉｎ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（０．５ ＩＵ／ｍＬ ｔｈｒｏｍｂｉｎ（緑十字）ｉｎ ＤＭＥＭ）を同量添加し、直ちに１００ｍｍの培養容器に移して穏やかに転がして組織切片及びハイドロゲルが均一に広がるようにした。必要に応じてｆｏｒｃｅｐを用いて組織切片の間隔を確保した。常温で５分間、３７℃で２時間培養して十分にゲル化させた。Ｔｒａｎｅｘａｍｉｃ ａｃｉｄ １００μｇ／ｍＬが添加された成長培地１０ｍＬ（９０％ ｌｏｗ ＤＭＥＭ：Ｆ１２＝１：１，１０％ Ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ、２０ｎｇ／ｍＬ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ、５ｎｇ／ｍＬ ｂａｓｉｃ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ、１０ｎｇ／ｍＬ ｉｎｓｕｌｉｎ－ｌｉｋｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ，ａｎｄ １０ｍｇ／ｍＬ ｇｅｎｔａｍｉｃｉｎ）を入れて３時間の間、１時間ごとに培養液を交換した。その後、２～３日に一回ずつ成長培地を交換した。

【0084】

実施例２．フィブリンハイドロゲル内に移動成長したＨＢ－皮膚由来幹細胞の回収及び増幅培養
実施例１で記述した方法で約１０日間毛包組織を培養した。ハイドロゲルをｗａｒｍ ＰＢＳで３分間三回洗浄した後、３０％ ＦＢＳ／ＤＭＥＭを入れてｏｒｂｉｔａｌ ｓｈａｋｅｒで撹拌した（３０ｒｐｍ）。１時間後に上澄液を除去した後、３，０００ｕｎｉｔ ｕｒｏｋｉｎａｓｅ（緑十字）が添加された１０ｍＬ ３０％ ＦＢＳ／ｌｏｗ ＤＭＥＭを入れてｇｅｌを分解させた。Ｇｅｌが十分に分解されると、ｓｔａｔｉｃ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎでｏｖｅｒｎｉｇｈｔ培養した後、上澄液を除去し、成長培地を添加して常法で培養した。２～３日ごとに成長培地を交換し、４～６日ごとに継代培養した。

【0085】

前記方法により培養した組織培養結果及び細胞分離及び培養結果は、図１に示した。
具体的には、組織培養後、細胞を分離して継代培養した時、継代培養の９回目まで細胞の形態及び大きさが維持されることを確認することができた。

【0086】

実施例３．分離及び培養されたＨＢ－皮膚由来幹細胞の免疫表現型の確認
実施例２の方法により分離及び培養されたＨＢ－皮膚由来幹細胞の免疫表現型を確認するために、Ｔ７５フラスコで培養中であった細胞をＰＢＳで１回洗浄した後、ＴｒｙｐｌｅＥｘｐｒｅｓｓ（Ｇｉｂｃｏ）３ｍＬを３分間処理して細胞を剥離した。剥離した細胞は１０％ ｃａｌｆ ｓｅｒｕｍ／ＰＢＳ ６ｍＬを入れてタンパク質分解反応を抑制させた。遠心分離（３００ｇ、５ｍｉｎ）した後、上澄液を除去し、３％ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ（ｓｉｇｍａ）／ＰＢＳに懸濁した。

【0087】

細胞懸濁液は９等分して次の抗体と４℃で１時間反応させた：ＦＩＴＣ－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ＣＤ２９（Ｂｉｏ－ｒａｄ、１：１０）、ＣＤ４４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１：１００）、ＣＤ９０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１：２０）、ＣＤ１４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１：２０） ａｎｔｉｂｏｄｙ，ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ＣＤ１０５（ａｂｃａｍ、１：２５）、ＰＥ－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ＣＤ７３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１：２０） ａｎｔｉｂｏｄｙ，ＰｅｒＣＰ－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ＣＤ３４（Ｓａｎｔａｃｒｕｚ、１：５）抗体、またはＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５９４－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ＣＤ４５（Ｎｏｖｕｓ、１：２０） ａｎｔｉｂｏｄｙ．反応後３００ｇ、５ｍｉｎで遠心分離して洗浄後、３％ ＢＳＡ／ＰＢＳに懸濁した後、フローサイトメトリー（ＢＤ）で測定した（図２）。

【0088】

その結果、図２で見られるように、分離及び培養されたＨＢ－皮膚由来幹細胞の表面にはＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０及びＣＤ１０５が発現し、ＣＤ１４、ＣＤ３４及びＣＤ４５は発現しないことを確認することができた。

【0089】

具体的には、間葉系幹細胞のマーカーであるＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ９０、ＣＤ７３及びＣＤ１０５を陽性発現（９５％以上）しており、造血系細胞のマーカーであるＣＤ３４、ＣＤ４５及びＨＬＡ－ＤＲは陰性発現（５％未満）を示すことを確認した。

【0090】

実施例４．分離及び培養されたＨＢ－皮膚由来幹細胞の増殖能及びコロニー形成能の確認
実施例２で得られた分離及び培養されたＨＢ－皮膚由来幹細胞の増殖能を確認するために、最初培養時に４０００個／ｃｍ２の密度で細胞を播種し、４日ごとに継代し、得られた細胞数を通じて継代培養回数による群集の倍加時間を測定した。

【0091】

また、細胞数はｔｒｙｐａｎ ｂｌｕｅ染色法で染色されていない細胞の個数をカウントし、群集の倍加時間（ＰＤＴｓ，ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｄｏｕｂｌｉｎｇ ｔｉｍｅ）は、次の式から計算して図３に示した：ＰＤＴ＝［ｄａｙｓ／（ｌｏｇＮ２－ｌｏｇＮ１）］／ｌｏｇ２，（Ｎ１＝４，０００ｃｅｌｌｓ，Ｎ２＝４日後の細胞数）。

【0092】

また、実施例２で得られた分離及び培養されたＨＢ－皮膚由来幹細胞のコロニー形成能を確認するために、ヒト皮膚由来幹細胞（４ ｐａｓｓａｇｅｓ）を６－ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに２０個／ｗｅｌｌで播種した。３日ごとに成長培地で交換しながら１４日間培養した。ＰＢＳで洗浄した後、４％ ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ（４％ ＰＦＡ，ｓｉｇｍａ）で１５分間常温で放置して固定した。固定された細胞はＰＢＳで三回洗浄した後、０．５％ ｃｒｙｓｔａｌ ｖｉｏｌｅｔ／Ｍｅｔｈａｎｏｌで１５分間常温で放置して染色させた。残余溶液を全部除去した後、蒸溜水で三回洗浄し、染色されたコロニーを観察した結果を図４に示した。

【0093】

前記図３及び４の結果のように、本実施例２の方法により得られたＨＢ－皮膚由来幹細胞はＨＢ－皮膚由来幹細胞を継代培養７回目まで培養してｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｄｏｕｂｌｉｎｇ ｔｉｍｅ（ＰＤＴ）を求めた結果、ＰＤＴは平均３５時間±６時間で観察され、継代培養による増殖能が維持されることが認められ、コロニー形成能も、一定レベル以上であることを確認することができた。

【0094】

実施例５．ＨＢ－皮膚由来幹細胞の分化能の確認
得られたＨＢ－皮膚由来幹細胞の脂肪細胞への分化能力を評価するために、細胞を１×１０４個／ｃｍ２の濃度で播種し、８０％ ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｙに到達するまで成長培地で培養した後、ＳｔｅｍＰｒｏＴＭ Ａｄｉｐｏｇｅｎｅｓｉｓ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｇｉｂｃｏ，ｃａｔ．Ａ１００７００１）で培地を交換し、３日ごとに培地を交換しながら１４日間培養した。４％ ＰＦＡで１５分間固定し、６０％ ｉｓｏｐｒｏｐａｎｏｌで１５分間反応させた後、全ての溶液を除去して十分に乾燥させた。６０％ Ｏｉｌ Ｒｅｄ Ｏ（ｓｉｇｍａ）／ｅｔｈａｎｏｌを常温で１５分間染色して細胞質内における脂肪蓄積の有無を確認した（図５ａ）。

【0095】

また、前記ＨＢ－皮膚由来幹細胞の骨細胞への分化能力を評価するために、細胞を１×１０４個／ｃｍ２の濃度で播種して８０％ ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｙに到達するまで成長培地で培養した後、ＳｔｅｍＰｒｏＴＭ Ｏｓｔｅｏｇｅｎｅｓｉｓ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｇｉｂｃｏ，ｃａｔ．Ａ１００７２０１）で培地を交換し、３日ごとに培地を交換しながら１４日間培養した。４％ ＰＦＡで６０秒間固定し、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｓｉｇｍａ）処理した後、遮光条件で１０分間染色して塩基性リン酸分解酵素（Ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ，ＡＬＰ）の活性を確認した（図５ｂ）。

【0096】

即ち、前記のような結果として本願培養方法により得られたＨＢ－皮膚由来幹細胞は、多分化能を有していることを確認することができた。

【0097】

実施例６．ＨＢ－皮膚由来幹細胞の差異発現遺伝子の確認
脂肪幹細胞（ＡＳＣ－１．ＡＳＣ－２．ＡＳＣ－３）、ＨＢ－皮膚由来幹細胞（ＨＢ－ＳＳＣ－１，ＨＢ－ＳＳＣ－２，ＨＢ－ＳＳＣ－３）サンプルのために、ＴｒｕＳｅｑ Ｓｔｒａｎｄｅｄ ｍＲＮＡ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔを用いてメーカーのプロトコルによりペアエンドＲＮＡライブラリーを構築し、マクロジェン社（ソウル、大韓民国）でシーケンシングを行った。前処理過程後、ＨＩＳＡＴ２プログラム（バージョン２．１．０，ｈｔｔｐｓ：／／ｃｃｂ．ｊｈｕ．ｅｄｕ／ｓｏｆｔｗａｒｅ／ｈｉｓａｔ２／ｉｎｄｅｘ．ｓｈｔｍｌ）でリファレンスゲノム（バージョンＧＲＣｈ３８）にマッピングし、ＳｔｒｉｎｇＴｉｅプログラム（バージョン２．１．３ｂ、ｈｔｔｐｓ：／／ｃｃｂ．ｊｈｕ．ｅｄｕ／ｓｏｆｔｗａｒｅ／ｓｔｒｉｎｇｔｉｅ／）で転写体別の発現量プロファイルを得た。遺伝子発現量は、ＴＰＭ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ Ｐｅｒ Ｋｉｏｂａｓｅ Ｍｉｌｌｉｏｎ）値にログを取って扱った。対照群と比較群間の差異発現遺伝子は、Ｒプログラム（バージョン４．０）のｅｄｇｅＲパッケージ［１］を用いて得た（１．ＲＯＢＩＮＳＯＮ，Ｍａｒｋ Ｄ．；ＭＣＣＡＲＴＨＹ，Ｄａｖｉｓ Ｊ．；ＳＭＹＴＨ，Ｇｏｒｄｏｎ Ｋ．ｅｄｇｅＲ：ａ Ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ ｐａｃｋａｇｅ ｆｏｒ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｄｉｇｉｔａｌ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｄａｔａ．ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ、２０１０，２６．１：１３９－１４０．）（図６ｂ及び６ｃ）。マーカー遺伝子が参加する生物学的ネットワーク構築は、Ｓｔｒｉｎｇ Ｄａｔａｂａｓｅ（バージョン１１．５）［２］を用いてタンパク質－タンパク質相互作用（ＰＰＩ）ネットワークを構築した（２．ＳＺＫＬＡＲＣＺＹＫ，Ｄａｍｉａｎ，ｅｔ ａｌ．ＳＴＲＩＮＧ ｖ１１：ｐｒｏｔｅｉｎ－ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｎｅｔｗｏｒｋｓ ｗｉｔｈ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｃｏｖｅｒａｇｅ，ｓｕｐｐｏｒｔｉｎｇ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｉｎ ｇｅｎｏｍｅ－ｗｉｄｅ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｄａｔａｓｅｔｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ ｒｅｓｅａｒｃｈ、２０１９，４７．Ｄ１：Ｄ６０７－Ｄ６１３）。ＰＰＩネットワーク構築に使用した有機体レファレンスはＨｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓとした。ネットワーク構築のための設定でタンパク質を示すノード（ｎｏｄｅ）を互いに連結するエッジ（ｅｄｇｅ）は、実験の結果、生物学的データベース及び文献、遺伝子フュージョンなどの根拠基盤で連結するようにし、エッジ点数は０．４以上であることを有意なこととした。ネットワーク構築後、他のノード間の連結性がない孤児ノードは除去した。ノードグループが属する生物学的機能は、ＫＥＧＧデータベース［３］を基準として統計的に有意なことだけ抽出した（３．ＫＡＮＥＨＩＳＡ，Ｍｉｎｏｒｕ；ＧＯＴＯ，Ｓｕｓｕｍｕ．ＫＥＧＧ：ｋｙｏｔｏ ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ ｇｅｎｅｓ ａｎｄ ｇｅｎｏｍｅｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ ｒｅｓｅａｒｃｈ、２０００，２８．１：２７－３０）（Ｆａｌｓｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｒａｔｅ ＜ ０．０５）（図６ａ）。両グループ間の有意な差の検定はＴ－Ｔｅｓｔを行って得、Ｐ ｖａｌｕｅ＜０．０５未満を有意なことと見なした。分析プログラムにより自主的に提供する統計的検定結果はそのまま使用し、有意の水準は０．０５未満を有意なことと見なした。Ｐ ｖａｌｕｅが０．０５を超過した結果を表記する場合、Ｐ ｖａｌｕｅを別途に表記した。

【0098】

Ｓｔｒｉｎｇ ＤＢを用いてＨＢ－皮膚由来幹細胞で発現した遺伝子を皮膚再生関連遺伝子ｎｅｔｗｏｒｋと分析して関連性のある信号伝達経路を確認し、４個の皮膚再生機能性遺伝子（ＧＡＳ１，ＯＳＲ２，ＤＭＫＮ，ＳＢＳＮ）を高い水準で発現することを確認した（図６ａ）。ＨＢ－皮膚由来幹細胞においてＦｏｌｄ ｃｈａｎｇｅ＞１０で脂肪由来幹細胞に比べて発現した遺伝子７３個を確認し、このうち、図６ａで導出した皮膚再生機能性遺伝子４個（ＧＡＳ１，ＯＳＲ２，ＤＭＫＮ，ＳＢＳＮ）が脂肪由来幹細胞に比べて１０倍以上の差異発現を確認した（図６ｂ及び６ｃ）。

【0099】

前記皮膚再生機能性遺伝子４種は、皮膚再生、創傷治癒と関連して免疫調節及び細胞増殖に関連した遺伝子として知られているところ、これに基づいて本発明の皮膚由来幹細胞製造方法により製造された皮膚由来幹細胞の皮膚再生、創傷治癒効果を類推することができる。

【0100】

実施例７．全層皮膚欠損傷（Ｆｕｌｌ－ｔｈｉｃｋｎｅｓｓ ｓｋｉｎ ｗｏｕｎｄ）マウスモデル及び創傷治癒効果の確認
実験動物である１２週齢のＢＡＬＢ／ｃ ｎｕｄｅ ｍｏｕｓｅ（中央実験動物）を３％ Ｉｓｏｆｌｕｒａｎｅ（ハナ製薬）を通じて吸入麻酔させ、手術部位をＡｌｃｏｈｏｌ ｓｗａｂ（メディトップ）で消毒した。目盛り付きステッカーを背中に貼付した後、皮膚を正方形（５ｍｍｘ５ｍｍ、２５ｍｍ２）状に滅菌された手術用はさみで皮下層まで切開した後、皮下組織を分離して全層皮膚欠損傷を誘発した。創傷収縮を防止するために、創傷周辺部位をＳｕｔｕｒｅ（ＰｒｏｌｅｎｅＴＭ，ＥＨＩＣＯＮ，ｃａｔ．Ｗ８５６６）で固定した。創傷周辺部位に５×１０５個の細胞をＮｏｒｍａｌ ｓａｌｉｎｅ（ＮＳ）１００μｌに懸濁して２５μｌ／ｓｉｔｅ（４ｓｉｔｅ）で皮下注射（Ｉｎｓｕｌｉｎ ｓｙｒｉｎｇｅ、３１ｇａｕｇｅ）した。創傷誘発後、感染防止のために、周囲をＡｌｃｏｈｏｌ ｓｗａｂで消毒し、実験群は全部分離して観察した。創傷誘発後、０、１、３、５、７、１２、１４日目に同時間にデジタルカメラを用いて各群の創傷部位を撮影し、Ｉｍａｇｅ Ｊ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＵＳ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ Ｐｒｏｇｒａｍ，ＵＳＡ）で創傷面積を測定した。Ｗｏｕｎｄ ａｒｅａは、創傷誘導直後の創傷面積を基準として測定日別の創傷面積を百分率で計算した（図７ａ及び図７ｂ）。

【0101】

前記結果として本発明の製造方法により製造されたＨＢ－皮膚由来幹細胞の創傷治癒効果を確認することができた。

【0102】

実施例８．全層皮膚欠損傷（Ｆｕｌｌ－ｔｈｉｃｋｎｅｓｓ ｓｋｉｎ ｗｏｕｎｄ）マウスモデルにおける皮膚及び皮膚構造物の再生能の確認
組織学的分析のために、皮膚組織を固定液（４％ ｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ，ｓｉｇｍａ，ＵＳＡ）に２４時間固定した。その後、組織をパラフィン包埋（Ｐａｒａｆｆｉｎ ｅｍｂｅｄｄｉｎｇ）してブロックを６μｍで薄切りした後、Ｈ＆Ｅ（Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ ＆ Ｅｏｓｉｎ）染色を行った。光学顕微鏡を通じて実験群別に組織を観察及び比較した（図８）。

【0103】

前記結果として本発明の製造方法により製造されたＨＢ－皮膚由来幹細胞の皮膚及び皮膚構造物の再生効果を確認することができた。

【0104】

以上の説明から、本発明が属する技術分野の当業者であれば、本発明がその技術的思想や必須の特徴を変更することなく、他の具体的な形態で実施されうることが理解できるだろう。これに関連し、以上で記述した実施例はあくまで例示的なものであり、限定的なものでないことを理解すべきである。本発明の範囲は前記詳細な説明よりは、後述する請求の範囲の意味及び範囲、そしてその等価概念から導かれるあらゆる変更または変形された形態が本発明の範囲に含まれるものと解釈すべきである。

【図1a】

【図1b】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5a】

【図5b】

【図6a】

【図6b】

【図6c】

【図7a】

【図7b】

【図8】

【国際調査報告】