特表 2024-546497 Ｃｌａｕｄｉｎ１８．２を標的とする抗体―薬物複合体

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-12-24

(54)【発明の名称】Ｃｌａｕｄｉｎ１８．２を標的とする抗体―薬物複合体

(51)【国際特許分類】

   A61K 47/68 20170101AFI20241217BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20241217BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20241217BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20241217BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20241217BHJP

   A61K 38/19 20060101ALI20241217BHJP

   C07K 16/28 20060101ALI20241217BHJP

   A61K 31/537 20060101ALI20241217BHJP

   A61K 31/4745 20060101ALN20241217BHJP

【ＦＩ】

A61K47/68 ZNA

A61K39/395 T

A61K39/395 L

A61P35/00

A61P43/00 121

A61K45/00

A61K38/19

C07K16/28

A61K31/537

A61K31/4745

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024535848

(86)(22)【出願日】2022-12-16

(85)【翻訳文提出日】2024-07-10

(86)【国際出願番号】 CN2022139637

(87)【国際公開番号】W WO2023109953

(87)【国際公開日】2023-06-22

(31)【優先権主張番号】202111551337.8

(32)【優先日】2021-12-17

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＲＩＴＯＮ

(71)【出願人】

【識別番号】523353465

【氏名又は名称】フォートビタ バイオロジクス（シンガポール）プライベート リミティド

(74)【代理人】

【識別番号】100099759

【弁理士】

【氏名又は名称】青木 篤

(74)【代理人】

【識別番号】100123582

【弁理士】

【氏名又は名称】三橋 真二

(74)【代理人】

【識別番号】100117019

【弁理士】

【氏名又は名称】渡辺 陽一

(74)【代理人】

【識別番号】100141977

【弁理士】

【氏名又は名称】中島 勝

(74)【代理人】

【識別番号】100138210

【弁理士】

【氏名又は名称】池田 達則

(72)【発明者】

【氏名】フー カイチエ

(72)【発明者】

【氏名】チョウ ショアイシアン

(72)【発明者】

【氏名】リウ シャオダン

(72)【発明者】

【氏名】ルー ジャア

【テーマコード（参考）】

4C076

4C084

4C085

4C086

4H045

【Ｆターム（参考）】

4C076AA95

4C076BB13

4C076CC27

4C076CC41

4C076EE59

4C084AA19

4C084BA14

4C084BA41

4C084DA01

4C084MA02

4C084NA05

4C084ZB072

4C084ZB261

4C084ZB262

4C084ZC412

4C084ZC751

4C085AA14

4C085AA26

4C085BB01

4C085BB11

4C085BB41

4C085BB43

4C085EE01

4C085GG02

4C085GG06

4C086AA01

4C086AA02

4C086CB22

4C086NA14

4C086ZB26

4H045AA11

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA10

4H045BA72

4H045CA40

4H045DA76

4H045EA28

4H045FA74

4H045GA26

(57)【要約】

本発明は、Ｃｌａｕｄｉｎ１８．２を標的とする抗体－薬物複合体（ＡＤＣ）および上記分子を含む組成物に関する。本発明は、これらの抗体もしくは抗体断片の治療および診断の使用にさらに関する。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

式Ｉ：
Ａｂ－（Ｌ－（Ｄ）_ｒ）_ｐ（Ｉ）
を有する抗体－薬物複合体またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物であって、
式中、
Ａｂは、ＣＬＤＮ１８．２（例えばヒトＣＬＤＮ１８．２）に結合する抗体もしくはその断片であり、
Ｌはリンカーであり、
Ｄは薬物、例えば抗腫瘍化合物であり、かつ
ｐは１～１０、例えば１～９、２～８、３～７、４～６、もしくは２～６であり、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０であり、
ｒは１～５、好ましくは１または２であり、
ここで
前記式（Ｉ）中のＡｂは、それぞれ配列番号１、２および３に示されるアミノ酸配列のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３、ならびにそれぞれ配列番号６、７および８に示されるアミノ酸配列のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含む、
前記抗体－薬物複合体またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物。

【請求項2】

請求項１に記載の抗体－薬物複合体またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物であって、
前記式（Ｉ）中のＡｂは、重鎖可変領域および／または軽鎖可変領域を含み、
前記重鎖可変領域は、
（ｉ）配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、もしくはそれらからなる、もしくは
（ｉｉ）配列番号４のアミノ酸配列を含む、もしくはそれからなる、もしくは
（ｉｉｉ）配列番号４のアミノ酸配列と比較して、１つもしくは複数（好ましくは１０個以下、より好ましくは５個、４個、３個、２個、１個以下）のアミノ酸変化（好ましくはアミノ酸置換、より好ましくは保存的アミノ酸置換）を有するアミノ酸配列を含む、もしくはそれらからなり、好ましくは、前記アミノ酸変化はＣＤＲ領域に生じない、および／または
前記軽鎖可変領域は、
（ｉ）配列番号９のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、もしくはそれらからなる、もしくは
（ｉｉ）配列番号９のアミノ酸配列を含む、もしくはそれからなる、もしくは（ｉｉｉ）配列番号９のアミノ酸配列と比較して、１つもしくは複数（好ましくは１０個以下、より好ましくは５個、４個、３個、２個、１個以下）のアミノ酸変化（好ましくはアミノ酸置換、より好ましくは保存的アミノ酸置換）を有するアミノ酸配列を含む、もしくはそれらからなり、好ましくは、前記アミノ酸変化はＣＤＲ領域に生じない、
前記抗体－薬物複合体またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物。

【請求項3】

前記式（Ｉ）中のＡｂは、重鎖定常領域および／または軽鎖定常領域をさらに含む、
請求項１または２に記載の抗体－薬物複合体またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物。

【請求項4】

前記式（Ｉ）中のＡｂは、ＩｇＧ抗体である、
請求項１～３のいずれか一項に記載の抗体－薬物複合体またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物。

【請求項5】

前記式（Ｉ）中のＡｂの重鎖定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３もしくはＩｇＧ４から選択され、好ましくはＩｇＧ１である、
請求項１～４のいずれか一項に記載の抗体－薬物複合体またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物。

【請求項6】

請求項１～５のいずれか一項に記載の抗体－薬物複合体またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物であって、
前記式（Ｉ）中のＡｂは、重鎖および軽鎖を含み、前記重鎖は、
（ｉ）配列番号１１のアミノ酸配列と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、もしくはそれらからなり、
（ｉｉ）配列番号１１のアミノ酸配列を含む、もしくはそれからなり、または
（ｉｉｉ）配列番号１１のアミノ酸配列と比較して、１つもしくは複数（好ましくは２０個もしくは１０個以下、より好ましくは５個、４個、３個、２個、１個以下）のアミノ酸変化（好ましくはアミノ酸置換、より好ましくは保存的アミノ酸置換）を有するアミノ酸配列を含む、もしくはそれらからなり、および
前記軽鎖は、
（ｉ）配列番号１２のアミノ酸配列と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、もしくはそれらからなり、
（ｉｉ）配列番号１２のアミノ酸配列を含む、もしくはそれからなり、または
（ｉｉｉ）配列番号１２のアミノ酸配列と比較して、１つもしくは複数（好ましくは２０個もしくは１０個以下、より好ましくは５個、４個、３個、２個、１個以下）のアミノ酸変化（好ましくはアミノ酸置換、より好ましくは保存的アミノ酸置換）を有するアミノ酸配列を含む、もしくはそれらからなる、
前記抗体－薬物複合体またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物。

【請求項7】

前記式（Ｉ）中のＡｂはヒト抗体である、
請求項１～６のいずれか一項に記載の抗体－薬物複合体またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物。

【請求項8】

前記式（Ｉ）中のＡｂは抗原結合断片、例えばＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）_２、ｄＡｂ（ｄｏｍａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ）、線状抗体、単鎖抗体（例えば、ｓｃＦｖ）、単一ドメイン抗体（例えば、ＶＨＨ）、二価抗体もしくはその断片、またはラクダ科抗体である、
請求項１～７のいずれか一項に記載の抗体－薬物複合体またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物。

【請求項9】

前記リンカーは、ＭＣ－ＶＣ－ＰＡＢ、ｖｃ－ＰＡＢ、ＳＭＣＣまたはＭＣ－ＧＧＦＧである、
請求項１～８のいずれか一項に記載の抗体－薬物複合体またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物。

【請求項10】

前記抗体は、改変されたグリコシル化を有する抗体、例えばインビトロでの糖鎖の酵素的修飾（例えば、グリコシダーゼ（エンドグリコシダーゼまたはグリコシルトランスフェラーゼなど）による糖鎖の修飾）後に得られた抗体であり、好ましくは、前記改変されたグリコシル化を有する抗体は、抗体のグリコシル化部位の糖鎖が不均一な構造のＮ糖鎖から、反応性基（例えば、アジド基、ケトン基およびアルキニル基などの、リンカー部分と反応できる任意の反応性基）を持つ単一構造のＮ糖鎖に改変された抗体であり、より好ましくは、前記Ｎ－グリコシル化部位は、前記抗体のＦｃドメインの保存的なＮ－グリコシル化部位、例えばＡｓｎ２９７である、
請求項１～８のいずれか一項に記載の抗体－薬物複合体またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物。

【請求項11】

前記リンカーは、部位特異的カップリングを実現することができるリンカーであり、好ましくは抗体オリゴ糖に連結するリンカーであり、好ましくは、前記オリゴ糖リンカーは、アルキニル基を含むリンカーであり、最も好ましくは、前記オリゴ糖リンカーは、前記抗体のＦｃドメインの保存的なＮ－グリコシル化部位（Ａｓｎ２９７など）にあるＮ－糖鎖上の反応性基（アジド基など）との特異的部位カップリングを実現することができるリンカーである、
請求項１～８のいずれか一項に記載の抗体－薬物複合体またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物。

【請求項12】

前記抗腫瘍化合物は、細胞傷害剤もしくは化学療法剤であり、例えばエキサテカン（Ｅｘａｔｅｃａｎ）、Ｄｘｄ、ＭＭＡＥもしくはＤＭ１である、
請求項１～１１のいずれか一項に記載の抗体－薬物複合体またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物。

【請求項13】

式ＩＩを有する抗体－薬物複合体またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物であって、

【化1】

式中
Ａｂは、請求項１～８のいずれか一項に定義されるとおりであり、
Ｌ_１はリンカーであり、
Ｅは糖または糖誘導体であり、好ましくは、ガラクトース（Ｇａｌ）、マンノース（Ｍａｎ）、Ｎ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、グルコース（Ｇｌｃ）、Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、グルクロン酸（Ｇｃｕ）、フコース（Ｆｕｃ）およびＮ－アセチルノイラミン酸（シアル酸）から選択され、
ＧｌｃＮＡｃはＮ－アセチルグルコサミン、Ｆｕｃはフコースであり、
Ｄおよびｒは、請求項１～８のいずれか一項の式Ｉに定義されるとおりであり、
ｂは、０もしくは１であり、
ｘは、１、２、３もしくは４であり、
ｙは、１～２０である、
前記抗体－薬物複合体またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物。

【請求項14】

ｘは、１もしくは２であり、および
ｙは、１～１０であり、
好ましくは、ｘは１、およびｙは２である、
請求項１３に記載の抗体－薬物複合体またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物。

【請求項15】

ＥはＧａｌＮＡｃである、
請求項１３に記載の抗体－薬物複合体またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物。

【請求項16】

Ｅは６－デオキシ－２－アセトアミドガラクトースであり、および６位のＣ原子を介してＬ_１に連結する、
請求項１５に記載の抗体－薬物複合体またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物。

【請求項17】

Ａｂに連結するＧｌｃＮＡｃは、前記抗体の前記２つの重鎖のＡｓｎ２９７－グリコシル化部位に存在する、
請求項１３～１５のいずれか一項に記載の抗体－薬物複合体またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物。

【請求項18】

請求項１１～１７のいずれか一項に記載の抗体－薬物複合体またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物であって、
Ｌ_１は、下記構造を有する：

【化2】

Ｑは、－Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）ＣＨ_２－または－ＣＨ_２－であり、
Ｒ_１は、独立的に水素、ハロゲン、－ＯＲ_２、－ＮＯ_２、－ＣＮ、－Ｓ（Ｏ）_２Ｒ_２、Ｃ_１－Ｃ_１２アルキル基、アリール基、ヘテロアリール基、Ｃ_１－Ｃ_１２アルキルアリール基、Ｃ_１－Ｃ_１２アルキルヘテロアリール基、アリールＣ_１－Ｃ_１２アルキル基およびヘテロアリールＣ_１－Ｃ_１２アルキル基から選択され、および、前記アルキル基、アリール基、ヘテロアリール基、アルキルアリール基、アルキルヘテロアリール基、アリールアルキル基およびヘテロアリールアルキル基は、任意選択で置換されており、２つの置換基Ｒ_１は、縮合、架橋もしくはスピロ結合されたシクロアルキル基または縮合もしくはスピロ結合された芳香族炭化水素もしくはヘテロ芳香族炭化水素置換基を形成するために共に連結され得、および、Ｒ_２は、独立的に水素、ハロゲン、Ｃ_１－Ｃ_２４アルキル基、アリール基、ヘテロアリール基、Ｃ_１－Ｃ_１２アルキルアリール基、Ｃ_１－Ｃ_１２アルキルヘテロアリール基、アリールＣ_１－Ｃ_１２アルキル基およびヘテロアリールＣ_１－Ｃ_１２アルキル基から選択され、
Ｒ_３およびＲ_４はそれぞれ、独立的に水素、ハロゲン、Ｃ_１－Ｃ_２４アルキル基、アリール基、ヘテロアリール基、Ｃ_１－Ｃ_１２アルキルアリール基、Ｃ_１－Ｃ_１２アルキルヘテロアリール基、アリールＣ_１－Ｃ_１２アルキル基およびヘテロアリールＣ_１－Ｃ_１２アルキル基から選択され、
ｃは、０、１、２、３もしくは４であり、
ｍは、０もしくは１であり、
ｎは、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０であり、
Ｙは、Ｏ、ＳもしくはＮＲ_１であり、
Ｌ_２およびＬ_３はそれぞれ、独立的にＣ_１－Ｃ_１２アルキル基であり、当該アルキル基における１つまたは複数の炭素原子は、Ｏ、Ｎおよび／またはＳが互いに直接連結しないことを条件として、Ｏ、ＮおよびＳから選択されるヘテロ原子で任意選択で置換され、
Ｌ_４はそれぞれ、独立的に切断可能なリンカーである、
前記抗体－薬物複合体またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物。

【請求項19】

Ｌ_４はそれぞれ、独立的に

【化3】

であり、
Ｒ_５およびＲ_６はそれぞれ、独立的に水素およびＣ_１－Ｃ_１２アルキル基から選択され、および
Ａｒは、アリール基から選択される、
請求項１８に記載の抗体－薬物複合体またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物。

【請求項20】

Ｌ_４はそれぞれ、独立的に

【化4】

である、
請求項１９に記載の抗体－薬物複合体またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物。

【請求項21】

－Ｌ_１－は、下記構造

【化5】

を有する、
請求項１３～１７のいずれか一項に記載の抗体－薬物複合体またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物。

【請求項22】

前記抗体－薬物複合体は１～１５、例えば２～１０、２～８もしくは３～５のＤＡＲ平均値を有する、
請求項１～２１のいずれか一項に記載の抗体－薬物複合体またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物。

【請求項23】

前記抗体－薬物複合体は、

【化6-1】

【化6-2】

から選択され、
式中、ＡｂはＨＢ３７Ａ６であり、
式中、ｑはＤＡＲ平均値を表し、
ＩＥＸ０１９－０２、ＩＥＸ０１９－０４、ＩＥＸ０１９－０５において、ｑは２～５、例えば３～５もしくは３．５～４．５であり、
ＩＥＸ０１９－０３において、ｑは５～１１、例えば７～９もしくは７．５～８．５である、
請求項１～１３のいずれか一項に記載の抗体－薬物複合体またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物。

【請求項24】

医薬組成物であって、
請求項１～２３のいずれか一項に記載の抗体－薬物複合体またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物、および任意選択で、１つまたは複数の他の治療剤、例えば化学療法剤、血管新生抑制剤、サイトカイン、細胞傷害剤、他の抗体、小分子薬物もしくは免疫調節剤、並びに任意選択で、薬用補助材料、を含む、
前記医薬組成物。

【請求項25】

医薬組合せであって、
請求項１～２３のいずれか一項に記載の抗体－薬物複合体またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物、および任意選択で、１つまたは複数の他の治療剤、例えば化学療法剤、血管新生抑制剤、サイトカイン、細胞傷害剤、他の抗体、小分子薬物もしくは免疫調節剤、を含む、
前記医薬組合せ。

【請求項26】

対象における腫瘍を予防または治療する方法であって、
有効量の請求項１～２３のいずれか一項に記載の抗体－薬物複合体またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物、または請求項２４に記載の医薬組成物、もしくは請求項２５に記載の医薬組合せを前記対象に投与することを含む、
前記方法。

【請求項27】

前記腫瘍は癌であり、好ましくは、前記癌は上昇したレベル（例えば、核酸またはタンパク質レベルでの）のＣＬＤＮ１８．２を有し、好ましくは、前記対象の腫瘍細胞は中程度または高程度にＣＬＤＮ１８．２を発現し、前記癌は、例えば上皮癌または消化管癌であり、例えば、胃癌、胃食道接合部癌、膵臓癌、結腸直腸癌または結腸癌である、
請求項２６に記載の方法。

【請求項28】

前記方法は、治療方式および／または他の治療剤などの１つまたは複数の療法を患者に投与することをさらに含み、好ましくは、前記治療方式は放射線治療もしくは手術を含み、または、前記治療剤は化学療法剤、血管新生抑製剤、サイトカイン、細胞傷害剤、他の抗体、小分子薬物もしくは免疫調節剤を含む、
請求項２６または２７に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、Ｃｌａｕｄｉｎ１８．２（ＣＬＤＮ１８．２）を標的とする抗体－薬物複合体（ＡＤＣ）および上記分子を含む組成物に関する。本発明は、これらの抗体もしくは抗体断片の治療および診断の使用にさらに関する。

【背景技術】

【0002】

Ｃｌａｕｄｉｎｓは、タンパク質ファミリーの一つであり、細胞のタイトジャンクションを構成する重要な組成部分である。それらは、細胞間の分子運動を制御する細胞間バリアを確立し、細胞間の分子の運動を制御することができる。Ｃｌａｕｄｉｎｓファミリータンパク質は、４回膜貫通ドメインを有し、そのＮ末端とＣ末端は、いずれも細胞質に含まれる。異なるＣｌａｕｄｉｎｓタンパク質は異なる組織で発現され、その機能の変化は各組織の癌形成に関連している。例えば、Ｃｌａｕｄｉｎ－１は結腸癌で発現されているとともに、予後価値が示され、Ｃｌａｕｄｉｎ－１８は胃癌、膵臓癌で高発現され、Ｃｌａｕｄｉｎ－１０の発現は肝細胞癌で高発現されている。Ｃｌａｕｄｉｎｓは、細胞膜表面タンパク質として、各種の治療戦略の有用な標的である。

【0003】

Ｃｌａｕｄｉｎー１８のアイソタイプ２（Ｃｌａｕｄｉｎ １８．２またはＣＬＤＮ１８．２）は、高選択的細胞系マーカーであり、その正常組織での発現は、胃粘膜が分化した上皮細胞に厳密に限られるが、胃幹細胞領域に発現されない。ＣＬＤＮ１８．２は、かなり多くの原発性胃癌に発現されているとともに、胃転移の癌組織にその発現レベルを保っている。胃癌以外、膵臓癌にもＣＬＤＮ１８．２の発現が見られ、これらの癌を治療する理想的な標的分子である（Ｓｉｎｇｈ， Ｐ．， Ｔｏｏｍ， Ｓ． ＆ Ｈｕａｎｇ， Ｙ． Ａｎｔｉ－ＣＬＤＮ１８．２ ａｎｔｉｂｏｄｙ ａｓ ｎｅｗ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ ａｄｖａｎｃｅｄ ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ． Ｊ Ｈｅｍａｔｏｌ Ｏｎｃｏｌ １０， １０５ （２０１７）． ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１８６／ｓ１３０４５－０１７－０４７３－４）。

【0004】

胃癌に関しては、２０１４年には全国で胃癌の新発症例が約４１万例、死亡例が約２９万例であり、世界の発症人数、死亡人数のほぼ半分を占めており、かつ依然として増加の傾向にある。しかし、満足されない臨床腫瘍治療の要求が大量存在しているため、Ｃｌａｕｄｉｎ１８．２を標的とする薬物の開発が非常に必要である。

【0005】

治療用抗体の臨床的成功にもかかわらず、細胞表面腫瘍抗原を標的とする裸のＭＡｂが単独で十分な効果を提供することはほとんどなかった。ＭＡｂの低い活性を増加させるために、新たな戦略は、毒性分子への結合に焦点を当てる。植物および細菌毒素ならびに小さな化学療法分子は、極少量で非常に効果的で、活性を有するため、良好な候補物となる可能性がある。

【0006】

過去数年間の技術的進歩により、癌の治療のための抗体－薬物複合体（ＡＤＣ）の分野では最近、免疫原性、親和性、特異性、望ましくない毒性、生産性、半減期などに関して最初に呈する問題を解決することを目的として、製薬会社によってますます開発活動が増加している。

【0007】

いくつかの進歩が達成されているが、腫瘍を治療するための他の治療戦略、ならびにそのような治療戦略において使用される成分、特に親和性が高く、特異性が高く、および／または免疫原性リスクが低い抗Ｃｌａｕｄｉｎ１８．２に対する抗体、ならびに活性が比較的高く、毒性が低く、半減期が長く、特異性が高く、または親和性が高く、および／または半減期もしくはファーマコフォア特性が良好であるＡＤＣ分子の必要性が存在する。

【発明の概要】

【0008】

本発明は、Ｃｌａｕｄｉｎ１８．２を標的とする抗体－薬物複合体（ＡＤＣ）を提供し、上記複合体は、以下の利点を有する。

【0009】

（１）ヒトＣＬＤＮ１８．２を発現する標的細胞に結合し、それと高い親和性を有する。
（２）エンドサイトーシスにより細胞に入り、標的細胞を殺傷することができ、いくつかの実施形態において、本発明のＡＤＣは、高いエンドサイトーシス効率を有する。
（３）顕著なバイスタンダー殺傷効果を有する。
（４）高い抗腫瘍薬効を有する。
（５）低い毒性を有する。
（６）良好な安定性を有する。
（７）良好な創薬可能性を有する。

【0010】

いくつかの実施形態において、ＣＬＤＮ１８．２は細胞表面で発現または過剰発現され、いくつかの実施形態において、標的細胞はＣＬＤＮ１８．２を発現するＣＨＯ細胞または２９３細胞、例えばＣＨＯ－Ｓ細胞またはＨＥＫ２９３細胞であり、いくつかの実施形態において、標的細胞はＣＬＤＮ１８．２を発現する癌細胞、例えばＣＬＤＮ１８．２を天然に発現する細胞、ＣＬＤＮ１８．２を人工的トランスフェクションによって発現する細胞、または人工的トランスフェクションによって発現レベルが増加したＣＬＤＮ１８．２を有する細胞であり、例えばＣＬＤＮ１８．２を発現する胃癌細胞、膵臓癌細胞株または結腸癌もしくは結腸直腸癌細胞株である。いくつかの実施形態において、標的細胞は、中程度のｈＣＬＤＮ１８．２の発現レベルを有する細胞株、例えばＮＵＧＣ－４、ＳＮＵ６２０である。いくつかの実施形態において、標的細胞は、高発現レベルの細胞株、例えばｈＣＬＤＮ１８．２を過剰発現するＤＡＮ－Ｇ細胞である。

【図面の簡単な説明】

【0011】

【図1】ＨＢ３７Ａ６抗体が細胞表面のＣＬＤＮ１８．２と特異的に結合することを示す。

【図2】ＨＢ３７Ａ６抗体が細胞表面のＣＬＤＮ１８．１と結合していないことを示す。

【図3】ＨＢ３７Ａ６抗体と、胃癌細胞株ＮＵＧＣ－４、胃癌細胞株ＫＡＴＯ ＩＩＩ－ｈＣＬＤＮ１８．２および膵臓癌細胞株ＤＡＮ－Ｇ－ｈＣＬＤＮ１８．２との結合を示す。

【図4】ＨＢ３７Ａ６抗体の膵臓癌マウスモデルにおける抗腫瘍効果を示す。

【図5】ＨＢ３７Ａ６抗体の胃癌マウスモデルにおける抗腫瘍効果を示す。

【図6】ＩＥＸ０１９分子の細胞結合作用を示す。

【図7】ＩＥＸ０１９分子のＤＡＮＧ－ｈＣＬＤＮ１８．２細胞でのエンドサイトーシスを示す。

【図8A】ＩＥＸ０１９分子のｈＣＬＤＮ１８．２を低発現する細胞株での殺傷效果（図８Ａ）、ＩＥＸ０１９分子のｈＣＬＤＮＡ８．２の中程度発現レベルの細胞株での殺傷效果（図８Ｂ）およびＩＥＸ０１９分子のｈＣＬＤＮ１８．２細胞株を高発現する殺傷效果（図８Ｃ）を示す。

【図8B】ＩＥＸ０１９分子のｈＣＬＤＮ１８．２を低発現する細胞株での殺傷效果（図８Ａ）、ＩＥＸ０１９分子のｈＣＬＤＮＡ８．２の中程度発現レベルの細胞株での殺傷效果（図８Ｂ）およびＩＥＸ０１９分子のｈＣＬＤＮ１８．２細胞株を高発現する殺傷效果（図８Ｃ）を示す。

【図8C】ＩＥＸ０１９分子のｈＣＬＤＮ１８．２を低発現する細胞株での殺傷效果（図８Ａ）、ＩＥＸ０１９分子のｈＣＬＤＮＡ８．２の中程度発現レベルの細胞株での殺傷效果（図８Ｂ）およびＩＥＸ０１９分子のｈＣＬＤＮ１８．２細胞株を高発現する殺傷效果（図８Ｃ）を示す。

【図9】ＩＥＸ０１９分子のバイスタンダー殺傷効果を示す。

【図10A】ＩＥＸ０１９分子のマウスにおける腫瘍抑制効果（図１０Ａ）および体重変化（図１０Ｂ）を示す。

【図10B】ＩＥＸ０１９分子のマウスにおける腫瘍抑制効果（図１０Ａ）および体重変化（図１０Ｂ）を示す。

【図11A】ＩＥＸ０１９分子のマウスにおける腫瘍抑制効果（図１１Ａ）および体重変化（図１１Ｂ）を示す。

【図11B】ＩＥＸ０１９分子のマウスにおける腫瘍抑制効果（図１１Ａ）および体重変化（図１１Ｂ）を示す。

【図12A】ＩＥＸ０１９分子のマウスにおける腫瘍抑制効果（図１２Ａ）および体重変化（図１２Ｂ）を示す。

【図12B】ＩＥＸ０１９分子のマウスにおける腫瘍抑制効果（図１２Ａ）および体重変化（図１２Ｂ）を示す。

【発明を実施するための形態】

【0012】

Ｉ．定義

【0013】

以下、本発明を詳細に説明するに先立ち、本明細書に記載される特定の方法学、形態または試薬が変更され得るため、本発明はそれらに限定されるものではないことが理解すべきである。また、本明細書に使用される用語は、具体的な実施形態を説明するためのものに過ぎず、本発明の範囲を限定しようとは意図せず、本発明の範囲は、特許請求の範囲のみによって限定されると理解すべきである。特に定義のない限り、本明細書に使用される技術・科学用語は、当業者による通常の理解と同じ意味を有する。

【0014】

本明細書を解釈するために次の定義が使用され、また、適切であるならば、単数形で使用される用語には複数形が含まれてもよく、その逆も同様である。本明細書で使用される用語は、具体的な実施形態を説明するためのものに過ぎず、限定するためのものではないと理解しなければならない。

【0015】

「約」という用語は、数字または数値とともに使用される場合、下限として指定された数字または数値より５％小さく、上限として指定された数字または数値より５％大きい範囲内の数字または数値をカバーすることを意味する。

【0016】

本明細書で使用されるように、用語「および／または」は、選択可能なオプションのうちのいずれか１つ、または選択可能なオプションの２つもしくは複数を指す。

【0017】

本明細書で使用されるように、用語「含有する」または「含む」とは、上記要素、整数またはステップを含むが、任意の他の要素、整数またはステップを排除しないことを意味する。本明細書において、用語「含有する」または「含む」が使用される場合、特に断りのない限り、上記他の要素、整数またはステップの組合せの場合も包含する。例えば、ある具体的な配列を「含む」抗体可変領域が言及される場合、この具体的な配列からなる抗体可変領域を包含することも意図する。

【0018】

本明細書に使用される用語「ＣＬＡＵＤＩＮ」または「ＣＬＤＮ」は、細胞間のタイトジャンクション構造を決定する最も重要な骨格タンパク質であり、接着接合に関与するとともに、腫瘍細胞の転移と侵襲に重要な役割を果たす。Ｃｌａｕｄｉｎタンパク質は、哺乳動物上皮と内皮細胞に広く存在しており、主に上皮細胞側面および基底細胞質膜上に分布している。異なるＣｌａｕｄｉｎタンパク質は、異なる組織においてそれぞれ特異的発現を有し、そのうち、Ｃｌａｕｄｉｎ１８（ＣＬＤＮ１８）遺伝子は、３ｑ２２．３に位置づけられ、分子量が２４ｋＤａであり、２６１個のアミノ酸残基を有し、Ｃｌａｕｄｉｎｓスーパーファミリーメンバーに属し、そのタンパク質構成が、２つの細胞外ループと４つの膜透過領域を有する。ヒトＣＬＤＮ１８またはＣｌａｕｄｉｎ１８タンパク質の２つのサブタイプは、それぞれＣｌａｕｄｉｎ１８．１またはＣＬＤＮ１８．１（ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ：Ｐ５６８５６－１）およびＣｌａｕｄｉｎ１８．２またはＣＬＤＮ１８．２（ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ：Ｐ５６８５６－２）であり、両方のタンパク質の一次構造配列において、Ｎ末端シグナルペプチドから細胞外ループ１（Ｌｏｏｐ１）構造までのある位置でのアミノ酸残基のみが異なり、特に細胞外ループ１上に、ＣＬＤＮ１８．１とＣＬＤＮ１８．２は、８つのアミノ酸のみが異なる。ＣＬＤＮ１８の２種類のサブタイプタンパク質の種間配列相同性も非常に高い。そのうち、ＣＬＤＮ１８．２の細胞外ループ１は、ヒト、マウス、アカゲザルなどの異なる生物に配列が完全に一致し、ヒトとマウスのＣＬＤＮ１８．２タンパク質の相同性が８４％に達することで、ＣＬＤＮ１８．２タンパク質配列は極めて保存性の高いことが明らかになった（Ｏ．Ｔｕｒｅｃｉ．ら．，Ｇｅｎｅ ４８１：８３－９２，２０１１）。ＣＬＤＮ１８．２またはその任意の変異体とアイソタイプは、それらを天然的に発現する細胞または組織から単離し、或いは、この分野でよく知られている技術および／または本明細書に記載の技術により組換えて産生することができる。一実施形態において、本明細書に記載のＣＬＤＮ１８．２は、ヒトＣＬＤＮ１８．２である。

【0019】

本明細書に使用される用語「抗ＣＬＤＮ１８．２抗体」、「抗ＣＬＤＮ１８．２」、「ＣＬＤＮ１８．２抗体」、「ＣＬＤＮ１８．２と結合する抗体」または「ＣＬＤＮ１８．２と特異的に結合する抗体」とは、十分な親和性で（ヒト）ＣＬＤＮ１８．２と結合することにより、（ヒト）ＣＬＤＮ１８．２を標的とする治療剤として用いることができる抗体である。一実施形態において、上記（ヒト）ＣＬＤＮ１８．２抗体は、インビトロまたはインビボで高い親和性で（ヒト）ＣＬＤＮ１８．２と結合する。一実施形態において、上記（ヒト）ＣＬＤＮ１８．２抗体は、ＣＬＤＮ１８．１と結合しない。一実施形態において、上記（ヒト）ＣＬＤＮ１８．２抗体は、ＣＬＤＮ１８．２を発現する細胞と結合するが、ＣＬＤＮ１８．１を発現する細胞と結合しない。いくつかの実施形態において、上記結合は、例えば、放射免疫測定（ＲＩＡ）、バイオレイヤー干渉測定法（ＢＬＩ）、ＭＳＤ測定法または表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ）またはフローサイトメトリーで測定される。

【0020】

様々な手段、例えば抗ＣＬＤＮ１８．２抗体によって、細胞におけるＣＬＤＮ１８．２の発現を決定することができる。例えば、「ＣＬＤＮ１８．２を高発現する」細胞と抗ＣＬＤＮ１８．２抗体との結合強度（例えば、ＦＡＣＳによって測定される）は、抗ＣＬＤＮ１８．２抗体とＣＬＤＮ１８．２を発現しない細胞との結合強度の５００倍、６００倍、７００倍、８００倍、９００倍もしくは好ましくは１０００倍以上であってもよく、例えば１１００倍、１２００倍、１３００倍、１４００倍以上もしくはそれより高い。例えば、「ＣＬＤＮ１８．２を中程度に発現する」細胞と抗ＣＬＤＮ１８．２抗体との結合強度（例えば、ＦＡＣＳによって測定される）は、抗ＣＬＤＮ１８．２抗体とＣＬＤＮ１８．２を発現しない細胞との結合強度の５倍～５００倍であってもよく、例えば６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍またはそれより高いが、５００倍を超えないものである。

【0021】

用語「完全抗体」、「全抗体」または「全長抗体」は、本明細書において互換的に使用可能であり、天然の免疫グロブリン分子構造を有する抗体分子を指す。一般的な４鎖ＩｇＧ抗体である場合、全長抗体は、ジスルフィド結合によって相互連結された２本の重鎖（Ｈ）および２本の軽鎖（Ｌ）を含む。重鎖のみを有して軽鎖を欠いた重鎖抗体である場合、全長抗体は、ジスルフィド結合によって相互連結された２本の重鎖（Ｈ）を含む。

【0022】

一般的な４鎖ＩｇＧ抗体では、全長抗体重鎖は、一般的に重鎖可変領域（本明細書においてＶＨと略す）と重鎖定常領域とからなり、ここで、重鎖定常領域は、少なくとも３つのドメインＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３を含む。全長抗体軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書においてＶＬと略す）と軽鎖定常領域とからなり、ここで、軽鎖定常領域は１つのドメインＣＬからなる。それぞれの重鎖可変領域ＶＨおよびそれぞれの軽鎖可変領域は、３つのＣＤＲと４つのＦＲとからなり、アミノ末端からカルボキシ末端へＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４という順に配列される。

【0023】

用語「抗体断片」は、完全な抗体の一部を含む。好ましい実施形態において、抗体断片は抗原結合断片である。

【0024】

「抗原結合断片」とは、完全な抗体の一部を含むとともに、完全な抗体の結合する抗原と結合する、完全な抗体とは異なる分子を指す。抗体断片の例は、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）_２、ｄＡｂ（ｄｏｍａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ）、線状抗体、単鎖抗体（例えば、ｓｃＦｖ）、単一ドメイン抗体（例えば、ＶＨＨ）、二価抗体もしくはその断片、あるいはラクダ科抗体を含むが、これらに限定されない。

【0025】

用語「抗原」とは、免疫応答を引き起こす分子を指す。このような免疫応答は、抗体の産生または特異性免疫細胞の活性化に関係し、あるいは両方に関係する可能性がある。当業者であれば、ほぼすべてのタンパク質またはペプチドを含む高分子は、いずれも抗原として利用できると理解される。なお、抗原は、組換えＤＮＡまたはゲノムＤＮＡから誘導されてもよい。本明細書に使用されるように、用語「エピトープ」とは、抗原（例えば、ＣＬＤＮ１８．２）における抗体分子と特異的に相互作用する部分を指す。

【0026】

「相補性決定領域」、「ＣＤＲ領域」または「ＣＤＲ」は、抗体可変ドメインにおいて、配列において超可変であるとともに構造上に形成されて決定されたループ（「超可変ループ」）であり、および／または抗原接触残基（「抗原接触点」）を含む領域である。ＣＤＲは、主に抗原エピトープに結合する役割を果たす。重鎖および軽鎖のＣＤＲは通常、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３と呼ばれ、Ｎ－末端から順に番号付けられる。抗体の重鎖可変ドメインにあるＣＤＲはＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３と呼ばれ、抗体の軽鎖可変ドメインにあるＣＤＲはＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３と呼ばれる。１つの所定の軽鎖可変領域または重鎖可変領域のアミノ酸配列において、各ＣＤＲの精確なアミノ酸配列の境界は、多くの公知の抗体ＣＤＲ割り当てシステムのいずれか１種またはその組合せにより決定されることができ、上記割り当てシステムは、例えば、抗体の３次元構造とＣＤＲループのトポロジーに基づくＣｈｏｔｈｉａ（Ｃｈｏｔｈｉａら．（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４２：８７７～８８３、Ａｌ－Ｌａｚｉｋａｎｉら、「Ｓｔａｎｄａｒｄ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｃａｎｏｎｉｃａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ」、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、２７３、９２７～９４８（１９９７））、抗体配列の可変性に基づくＫａｂａｔ（Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、４ｔｈ Ｅｄ．、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ（１９８７））、ＡｂＭ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｂａｔｈ）、Ｃｏｎｔａｃｔ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｃｏｌｌｅｇｅ Ｌｏｎｄｏｎ）、国際ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ ｄａｔａｂａｓｅ（ＩＭＧＴ）（ワールドワイドウェブのｉｍｇｔ．ｃｉｎｅｓ．ｆｒ／にて利用可能）、および大量の結晶構造が利用されるアフィニティ伝播クラスタリング（ａｆｆｉｎｉｔｙ ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ）に基づくＮｏｒｔｈ ＣＤＲ定義（Ｎｏｒｔｈら、「Ａ Ｎｅｗ Ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｙ ＣＤＲ Ｌｏｏｐ Ｃｏｎフォーマットｉｏｎｓ」、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、４０６、２２８～２５６（２０１１））を含む。

【0027】

以下は、ｋａｂａｔ、ＡｂＭ、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＣｏｎｔａｃｔおよびＩＭＧＴ方案で定義されたＣＤＲの領域範囲である。

【0028】

【表1】

【0029】

ＣＤＲは、参照ＣＤＲの配列（例えば、本発明の例示的なＣＤＲのいずれか１つ）と同じＫａｂａｔ番号付け位置を有することで決定されてもよい。

【0030】

特に断りのない限り、本発明において、「ＣＤＲ」または「ＣＤＲ配列」という用語は、上記いずれか１つの方法で決定されるＣＤＲ配列をカバーする。

【0031】

特記しない限り、本発明において、抗体可変領域における残基位置（重鎖可変領域残基と軽鎖可変領域残基を含む）に言及する場合、Ｋａｂａｔ番号付けシステム（Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ．（１９９１））に基づく番号付け位置を指す。

【0032】

一実施形態において、本発明に係る抗体の重鎖可変領域ＣＤＲは、以下のルールで決定される。

【0033】

ＶＨ ＣＤＲ１は、ＡｂＭルールで決定され、また、ＶＨ ＣＤＲ２とＶＨ ＣＤＲ３は、いずれもＫａｂａｔルールで決定される。

【0034】

一実施形態において、本発明に係る抗体の軽鎖可変領域ＣＤＲは、Ｋａｂａｔルールで決定される。

【0035】

一実施形態において、本発明に係る抗体の重鎖可変領域ＣＤＲは、以下のルールで決定される。ＶＨ ＣＤＲ１は、ＡｂＭルールで決定され、また、ＶＨ ＣＤＲ２とＶＨ ＣＤＲ３は、いずれもＫａｂａｔルールで決定され、かつ軽鎖可変領域ＣＤＲは、Ｋａｂａｔルールで決定される。

【0036】

異なる割り当てシステムによって得られた同一抗体の可変領域のＣＤＲの境界は、差異があり得ると注意すべきである。即ち、異なる割り当てシステムで定義された同一抗体の可変領域のＣＤＲ配列には、違いがある。従って、本発明で定義された具体的なＣＤＲ配列により抗体が限定される場合、上記抗体の範囲には、可変領域配列が上記具体的なＣＤＲ配列を含むが、異なる方案（例えば、異なる割り当てシステムのルールまたは組合せ）が使用されるので、かかるＣＤＲ境界が本発明に定義された具体的なＣＤＲ境界と異なるような抗体も含まれる。

【0037】

異なる特異性を有する（即ち、異なる抗原の異なる結合部位を対象とする）抗体は、（同一の割り当てシステムにおいて）異なるＣＤＲを有する。しかし、ＣＤＲが抗体間で異なるにもかかわらず、ＣＤＲにおいては、抗原との結合に直接関与するアミノ酸位置の数が限られている。Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＡｂＭ、ＣｏｎｔａｃｔおよびＮｏｒｔｈ方法のうちの少なくとも２つにより、最小重複領域を決定して抗原結合用の「最小結合単位」を提供することができる。最小結合単位は、ＣＤＲの１つのサブ部分であってもよい。当業者に知られているように、抗体の構造とタンパク質の折り畳みによって、ＣＤＲ配列の残り部分の残基を決定することができる。従って、本発明は、本明細書で提供されるいずれのＣＤＲの変異体についても考慮する。例えば、１つのＣＤＲの変異体において、最小結合単位のアミノ酸残基は変わらないように保持するが、ＫａｂａｔまたはＣｈｏｔｈｉａに基づいて定義された残りのＣＤＲ残基は、保存的なアミノ酸残基で置換されてもよい。

【0038】

用語「Ｆｃ領域」は、本明細書において、少なくとも一部の定常領域を含む免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。当該用語は、天然配列Ｆｃ領域および変異体Ｆｃ領域を含む。天然の免疫グロブリン「Ｆｃドメイン」は、２つまたは３つの定常ドメイン、すなわち、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメインおよび選択的なＣＨ４ドメインを含む。例えば、天然抗体において、免疫グロブリンＦｃドメインは、ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＤ類抗体の２本の重鎖に由来する第２および第３の定常ドメイン（ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメイン）を含み、またはＩｇＭおよびＩｇＥ類抗体の２本の重鎖に由来する第２、第３および第４の定常ドメイン（ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメインおよびＣＨ４ドメイン）を含む。本明細書において特に断りのない限り、Ｆｃ領域または重鎖定常領域におけるアミノ酸残基の番号は、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓ，５ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，１９９１に記載のＥＵ番号付けシステム（ＥＵインデックスとも呼ばれる）に基づいて番号が付けられる。本明細書において、用語「Ｆｃ領域」は、免疫グロブリンの重鎖可変領域ＶＨと軽鎖可変領域ＶＬ、および重鎖定常領域ＣＨ１と軽鎖定常領域ＣＬを含まないが、場合によっては、重鎖定常領域のＮ末端にあるヒンジ領域を含める。

【0039】

「ＩｇＧ形態の抗体」は、抗体の重鎖定常領域の属するＩｇＧ形態を指す。すべての同じタイプの抗体は、その重鎖定常領域がいずれも同じであり、異なるタイプの抗体は、その重鎖定常領域が異なる。例えば、ＩｇＧ４形態の抗体は、その重鎖定常領域がＩｇＧ４由来のものであることを指し、またはＩｇＧ１形態の抗体は、その重鎖定常領域がＩｇＧ１由来のものであることを指す。

【0040】

本明細書に用いられるように、「結合」または「特異的に結合」という用語は、結合作用が抗原に対して選択的であり、かつ不要または非特異的な相互作用と区別できることを意味する。抗原結合部位の特定の抗原との結合能力は、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）またはこの分野における既知の通常の結合測定法、例えば、放射免疫測定（ＲＩＡ）やバイオレイヤー干渉測定法やＭＳＤ測定法や表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ）で測定することができる。

【0041】

本明細書に用いられるように、「抗体－薬物複合体（ＡＤＣ）」は、抗体と薬物とを連結することによって得られる構造を指す。

【0042】

本明細書に使用される一般的な用語「糖」は、グルコース（Ｇｌｃ）、ガラクトース（Ｇａｌ）、マンノース（Ｍａｎ）およびフコース（Ｆｕｃ）などの単糖類を示す。本明細書に使用される用語「糖誘導体」は、単糖類の誘導体、すなわち置換基および／または官能基を含む単糖類を表す。糖誘導体の実例は、グルコサミン（ＧｌｃＮ）、ガラクトサミン（ＧａｌＮ）、Ｎ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、Ｎ－アセチルノイラミン酸（ＮｅｕＮＡｃ）、Ｎ－アセチルムラミン酸（ＭｕｒＮＡｃ）、グルクロン酸（ＧｌｃＡ）およびイズロン酸（ＩｄｏＡ）などのアミノ糖および糖酸を含む。糖誘導体の実例は、本明細書でＥ（Ａ）ｘとして表される化合物をさらに含み、式中、Ｅは糖または糖誘導体であり、および、Ｅはｘ個の官能基Ａを含む。

【0043】

コア－Ｎ－アセチルグルコサミン置換基（コア－ＧｌｃＮＡｃ置換基）は、本明細書では、Ｃ１を介して、好ましくは抗体のアスパラギンアミノ酸の側鎖上のアミド窒素原子のＮ－グリコシド結合を介して、抗体に結合するＧｌｃＮＡｃとして定義される。上記コア－ＧｌｃＮＡｃ置換基は、抗体の天然グリコシル化部位に存在することができるが、抗体の異なる部位に導入することもできる。本明細書では、コア－Ｎ－アセチルグルコサミン置換基は単糖類置換基、または（上記コア－ＧｌｃＮＡｃ置換基がフコシル化される場合）二糖コア－（Ｆｕｃα１－６）ＧｌｃＮＡｃ置換基であり、ＧｌｃＮＡｃ（Ｆｕｃ）とも呼ばれる。

【0044】

「グリコシル化改変」は、グリコシル化プロセスを通じて抗体の糖鎖を改変するプロセスを指す。抗体のグリコシル化は、様々な目的のためにさらに改変され、新たにグリコシル化された抗体を得ることができる。例えば、ＦｃγＲ親和性および補体結合／エフェクター機能を除去するためにグリコシル化を除去し、Ｆｃ媒介性ＡＤＣＣおよびＣＤＣ効果を強化するためにフコースおよびシアル酸基を減少させ、二分化Ｎ－アセチルグルコサミン、ガラクトースおよびマンノースを増加させる。当該分野で既知のグリコシル化改変方法は、例えば、抗体のグリコシル化部位を変更することで抗体表面の糖鎖を増加または減少させること、あるいはインビトロで糖鎖を化学的もしくは酵素的修飾すること、あるいは発現システムのグリコシル化経路（例えば、グリコシダーゼおよびグリコシルトランスフェラーゼなどの酵素で構成される）を変更することで抗体のグリコシル化を触媒すること、ならびに、細胞培養条件に影響を与えることで抗体のグリコシル化を変更することである。いくつかの実施形態において、本発明の「グリコシル化改変」は、インビトロでの糖鎖の酵素的修飾によって行われる。好ましくは、本発明のグリコシル化改変は、グリコシダーゼ（エンドグリコシダーゼまたはグリコシルトランスフェラーゼなど）による糖鎖の修飾によって行われる。

【0045】

本発明の改変されたグリコシル化を有する抗体は、天然グリコシル化モードを有する抗体と比較して、グリコシル化モードが改変された抗体を指す。好ましくは、上記の改変されたグリコシル化を有する抗体は、発現システム（例えば、哺乳動物細胞）での発現後の抗体が、インビトロでの糖鎖の酵素的修飾（例えば、グリコシダーゼ（エンドグリコシダーゼまたはグリコシルトランスフェラーゼなど）による糖鎖の修飾）後に得られた抗体を指す。より好ましくは、本発明の改変されたグリコシル化を有する抗体は、コア－ＧｌｃＮＡｃおよびそれと連結する糖誘導体Ｅ（Ａ）ｘを含む抗体を指し、ここで、ＧｌｃＮＡｃは、Ｃ１を介して、好ましくは抗体のアスパラギンアミノ酸の側鎖上のアミド窒素原子のＮ－グリコシド結合を介して、抗体に結合する。ＧｌｃＮＡｃ－Ｅ（Ａ）ｘ置換基における－ＧｌｃＮＡｃ置換基がフコシル化されている場合、一般に、フコースは、α－１，６を介して－ＧｌｃＮＡｃ置換基のＣ６に連結する。フコシル化された－ＧｌｃＮＡｃ置換基はコア－ＧｌｃＮＡｃ（Ｆｕｃ）を指し、フコシル化されたＧｌｃＮＡｃ－Ｅ（Ａ）ｘ置換基はＧｌｃＮＡｃ（Ｆｕｃ）－Ｅ（Ａ）ｘを指す。

【0046】

本明細書に記載の用語「部位特異的カップリング」は、リンカーを介して薬物／活性物質を抗体の特定部位に特異的に連結するカップリングを指す。

【0047】

本明細書に記載の用語「アルキル基」は、完全に飽和の分岐鎖または非分岐鎖の炭化水素基を指す。アルキル基は、好ましくは、１個～２４個の炭素原子、より好ましくは１個～１６個の炭素原子、１個～１２個の炭素原子、１個～６個の炭素原子または１個～４個の炭素原子を含む。アルキル基の代表的な例は、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、イソプロピル基、ｎ－ブチル基、ｓｅｃ－ブチル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ－ブチル基、ｎ－ペンチル基、イソペンチル基、ネオペンチル基、ｎ－ヘキシル基、３－メチルヘキシル基、２，２－ジメチルペンチル基、２，３－ジメチルペンチル基、ｎ－ヘプチル基、ｎ－オクチル基、ｎ－ノニル基、ｎ－デシル基などを含むが、これらに限定されない。

【0048】

用語「アリール基」は、環部分に６個～２０個、例えば６個～１２個の炭素原子を有する単環式または二環式芳香族炭化水素基を指す。好ましくは、アリール基は（Ｃ_６－Ｃ_１０）アリール基である。非限定的な例は、フェニル基、ビフェニル基、ナフチル基またはテトラヒドロナフチル基を含み、これらのそれぞれは任意選択で、１個～４個の置換基で置換されてもよく、上記置換基は、例えばアルキル基、トリフルオロメチル基、シクロアルキル基、ハロゲン、ヒドロキシ基、アルコキシ基、アシル基、アルキル－Ｃ（Ｏ）－Ｏ－、アリール－Ｏ－、ヘテロアリール－Ｏ－、アミノ基、メルカプト基、アルキル－Ｓ－、アリール－Ｓ－、ニトロ基、シアノ基、カルボキシ基、アルキル－Ｏ－Ｃ（Ｏ）－、カルバモイル基、アルキル－Ｓ（Ｏ）－、スルホニル基、スルホンアミド基、ヘテロシクリル基などであり、式中、Ｒは、独立的に水素、アルキル基、アリール基、ヘテロアリール基、アリール－アルキル－、ヘテロアリール－アルキル－などである。

【0049】

用語「シクロアルキル基」は、環状アルキル基、すなわち、環状構造を有する一価の飽和もしくは不飽和炭化水素基である。シクロアルキル基は、環状構造を有する飽和もしくは部分飽和（１個もしくは２個の二重結合を含む）の炭化水素基の全てを含む。シクロアルキル基は、３個またはそれより多くの、例えば３個～１８個、３個～１０個、もしくは３個～８個の炭素原子を環内に含んでもよく、一般に、本発明によれば、３個～６個の原子を含む。シクロアルキル基の実例は、シクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基を含むが、これらに限定されない。

【0050】

本明細書に用いられるように、用語「ヘテロアリール基」は、Ｎ、ＯもしくはＳから選択される１個～８個のヘテロ原子を含む５員～２０員（例えば、５員～１４員、５員～８員、５員～６員）の単環式、二環式または縮合多環式環系を指す。好ましくは、ヘテロアリール基は５員～１０員環系である。代表的なヘテロアリール基は、２－チエニル基もしくは３－チエニル基、２－フリル基もしくは３－フリル基、２－ピロリル基もしくは３－ピロリル基、２－イミダゾリル基、４－イミダゾリル基もしくは５－イミダゾリル基、３－ピラゾリル基、４－ピラゾリル基もしくは５－ピラゾリル基、２－チアゾリル基、４－チアゾリル基もしくは５－チアゾリル基、３－イソチアゾリル基、４－イソチアゾリル基もしくは５－イソチアゾリル基、２－オキサゾリル基、４－オキサゾリル基もしくは５－オキサゾリル基、３－イソオキサゾリル基、４－イソオキサゾリル基もしくは５－イソオキサゾリル基、３－トリアゾリル基もしくは５－１，２，４－トリアゾリル基、４－トリアゾリル基もしくは５－１，２，３－トリアゾリル基、テトラゾリル基、２－ピリジル基、３－ピリジル基もしくは４－ピリジル基、３－ピリダジニル基もしくは４－ピリダジニル基、３－ピラジニル基、４－ピラジニル基もしくは５－ピラジニル基、２－ピラジニル基、２－ピリミジニル基、４－ピリミジニル基もしくは５－ピリミジニル基を含む。

【0051】

用語「薬学的に許容される塩」は、本発明のＡＤＣ複合体の生物学的効果および性能を保持する塩を指し、また、当該塩は生物学的にまたは他の点で望ましくない。本発明のＡＤＣ複合体は、酸付加塩および塩基付加塩を含む、それらの薬学的に許容される塩の形態で存在することができる。本発明において、薬学的に許容される非毒性の酸付加塩は、本発明におけるＡＤＣ複合体と、有機酸または無機酸とが形成される塩を意味し、有機酸または無機酸は、塩酸、硫酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、リン酸、硝酸、過塩素酸、酢酸、シュウ酸、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、ベンゼンスルホン酸、メタンスルホン酸、サリチル酸、コハク酸、クエン酸、乳酸、プロピオン酸、安息香酸、ｐ－トルエンスルホン酸、リンゴ酸などを含むが、これらに限定されない。薬学的に許容される非毒性の塩基付加塩は、本発明のＡＤＣ複合体と、有機塩基または無機塩基とが形成される塩を意味し、リチウム塩、ナトリウム塩またはカリウム塩などのアルカリ金属塩、カルシウム塩またはマグネシウム塩などのアルカリ土類金属塩、Ｎ基含有の有機塩基と形成されるアンモニウム塩などの有機塩基塩を含むが、これらに限定されない。

【0052】

用語「溶媒和物」は、１つまたは複数の溶媒分子と、本発明のＡＤＣ複合体とが形成される結合物を表す。溶媒和物を形成する溶媒は、水、メタノール、エタノール、イソプロパノール、酢酸エチル、テトラヒドロフラン、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシドなどを含むが、これらに限定されない。

【0053】

文脈による矛盾がない限り、本明細書では、「薬学的に許容される」および「薬用」は、互換的に使用される。

【0054】

用語「薬物：抗体比」または「ＤＡＲ」は、本明細書に記載のＡｂ部分にカップリングされる小分子薬物部分（Ｄ）とＡｂ部分との比を指す。本明細書に記載のいくつかの実施形態において、ＤＡＲは、式Ｉにおけるｐおよびｒによって決定することができ、例えばＤＡＲは１～２０、例えば２～１８、４～１６、５～１２、６～１０、２～８、３～８、２～６、４～６、６～１０であってよく、例えば２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４もしくは１５である。ＤＡＲは、生成物中の分子集団のＤＡＲ平均値、すなわち検出方法によって（例えば、質量分析、ＥＬＩＳＡ測定、電気泳動および／またはＨＰＬＣなどの従来の方法によって）測定された生成物中の本明細書に記載のＡｂ部分にカップリングされる小分子薬物部分（Ｄ）とＡｂ部分との全体的な比率として計算することもでき、このＤＡＲは、本明細書ではＤＡＲ平均値と呼ばれる。いくつかの実施形態において、本発明にかかる複合体のＤＡＲ平均値は１～２０、例えば２～１８、４～１６、５～１２、６～１０、２～８、３～８、２～６、４～６、６～１０、例えば１．０～８．０、２．０～６．０であり、例えば０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５．０、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８．０、７．９、８、８．１、８．２、８．３、８．４、８．５、８．６、８．７、８．８、８．９、９．０、９．１、９．２、９．３、９．４、９．５、９．６、９．７、９．８、９．９もしくは１０．０という値のうちの２つを端点とする範囲である。

【0055】

本明細書に記載の用語「治療剤」は、癌などの腫瘍の治療または予防に有効ないずれの物質も含み、化学療法剤、サイトカイン、血管新生抑制剤、細胞傷害剤、他の抗体、小分子薬物、または免疫調節剤（例えば、免疫抑制剤）を含む。

【0056】

用語「細胞傷害剤」は、本発明において細胞機能を抑制または阻止し、および／または細胞死または破壊を引き起こす物質を指す。

【0057】

「化学療法剤」は、癌または免疫系疾患の治療に有用な化学化合物を含む。

【0058】

用語「小分子薬物」とは、生物学的プロセスを調節できる低分子量の有機化合物を指す。「小分子」は、１０ｋＤ未満、一般的に２ｋＤ未満、好ましくは１ｋＤ未満の分子量を有する分子として定義される。小分子は、無機分子、有機分子、無機成分含有有機分子、放射性原子含有分子、合成分子、ペプチド模倣体、および抗体模倣体を含むが、これらに限定されない。治療剤として、小分子は、大分子よりも細胞透過性が高く、分解に対して感受性が高く、免疫応答を誘発しにくい。

【0059】

本明細書に使用される用語「免疫調節剤」は、免疫応答を抑制または調節する天然または合成の活性薬剤または薬剤を指す。免疫応答は、体液応答または細胞応答であってもよい。免疫調節剤は、免疫抑制剤を含む。いくつかの実施形態において、本発明の免疫調節剤は、免疫チェックポイント抑制剤または免疫チェックポイントアゴニストを含む。

【0060】

用語「有効量」とは、本発明の抗体もしくは断片または組成物または組合せの１回分または複数回分の量を患者に投与した後、治療または予防が必要な患者に所望の効果が得られるという量または投与量を指す。

【0061】

「治療有効量」とは、必要な期間にわたって必要な用量で所望の治療結果を効果的に実現するための量を指す。治療有効量は、抗体もしくは抗体断片または組成物または組合せのいずれの毒性または有害作用も治療による有益な作用に及ばないという量でもある。未治療の対象と比較して、「治療有効量」は、好ましくは、測定可能なパラメータ（例えば腫瘍体積）を少なくとも約３０％、さらに、より好ましくは少なくとも約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％ひいては１００％抑制する。

【0062】

「予防有効量」とは、必要な期間にわたって必要な用量で所望の予防結果を効果的に実現するための量を指す。一般的に、予防目的の用量が対象における疾患の初期段階より前にまたは疾患の初期段階に適用されるため、予防有効量は治療有効量を下回る。

【0063】

用語「宿主細胞」、「宿主細胞株」および「宿主細胞培養物」は、交換して使用されてもよく、外因性核酸が導入された細胞を指し、この細胞の子孫を含む。宿主細胞は、「形質転換体」と「形質転換細胞」を含み、初代形質転換細胞および継代数に関係なくそれに由来する子孫を含む。子孫は、核酸の内容において親細胞とは全く同じではない可能性があり、変異を含んでもよい。本明細書では、初代形質転換細胞からスクリーニングまたは選択された同じ機能または生物学的活性を有する変異体子孫を含む。

【0064】

本明細書で使用される用語「標識」とは、試薬（例えば、ポリヌクレオチドプローブもしくは抗体）に直接的または間接的に結合または融合され、かつ、その結合または融合の対象試薬による検出を促進する化合物または組成物を指す。標識は、それ自体が検出可能（例えば、放射性同位体標識または蛍光標識）であるか、または、酵素触媒によって標識される場合に、検出可能な基質化合物または組成物の化学的改変に触媒作用を及ぼすことができる。当該用語は、検出可能な物質をプローブまたは抗体にカップリング（すなわち、物理的連結）することによってプローブもしくは抗体を直接標識すること、および、直接標識されている別の試薬との反応によりプローブもしくは抗体を間接的に標識することを含もうとする。

【0065】

「個体」または「対象」は、哺乳動物を含む。哺乳動物は、家畜（例えば、ウシ、ヤギ、ネコ、イヌおよびウマ）、霊長類動物（例えば、ヒト、サルなどの非ヒト霊長類動物）、ウサギ、およびげっ歯類動物（例えば、マウスとラット）を含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、個体または対象はヒトである。

【0066】

「単離された」抗体または他の分子（例えば、ＡＤＣ分子）は、その天然環境またはその発現環境の成分から分離された抗体または分子である。いくつかの実施形態において、抗体またはＡＤＣ分子は、純度が９５％または９９％を超えるように精製され、例えば、電気泳動（例えば、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、等電点電気泳動（ＩＥＦ）、キャピラリー電気泳動）またはクロマトグラフィー（例えば、イオン交換もしくは逆相ＨＰＬＣ）によって決定される。

【0067】

用語「抗腫瘍作用」とは、さまざまな手段により表示できる生物学的効果であり、例えば、腫瘍体積の減少、腫瘍細胞数の減少、腫瘍細胞増殖の低減または腫瘍細胞の生存率の減少を含むが、これらに限定されない。

【0068】

用語「腫瘍」および「癌」は、本明細書において交換して使用され、固形腫瘍および血液腫瘍を含む。

【0069】

用語「癌」および「癌性」は、一般的に細胞の成長が調節されないことを特徴とする哺乳動物の生理障害を指し、または説明する。一部の実施形態において、本発明の抗体による治療に適する癌は、胃癌、膵臓癌または胃食道接合部癌を含み、これらの癌の転移性形態を含む。

【0070】

用語「腫瘍」とは、悪性か良性かを問わず、すべての腫瘍性（ｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ）の細胞の成長と増殖、およびすべての前癌性（ｐｒｅ－ｃａｎｃｅｒｏｕｓ）と癌性の細胞や組織を指す。用語「癌」、「癌性」および「腫瘍」は、本明細書で言及される場合、互いに排他的ではない。

【0071】

用語「薬用補助材料」は、活性物質とともに投与される希釈剤、アジュバント（例えば、フロイントアジュバント（完全もしくは不完全））、賦形剤、ベクターや安定化剤などを指す。

【0072】

用語「医薬組成物」とは、それに含まれる活性成分の生物学的活性を有効にする形態で存在するとともに、上記組成物が投与された対象に許容されない毒性がある別の成分を含まない組成物を指す。

【0073】

用語「医薬組合せ」は、非固定組合せの製品または固定組合せの製品であり、薬物キット、医薬組成物を含むが、これらに限定されない。用語「非固定組合せ」とは、活性成分（例えば、（ｉ）本発明のＡＤＣ分子、および（ｉｉ）他の治療剤）が、別個の実体で同時に、特定の時間制限なしに、または同じもしくは異なる時間間隔で、患者に順に投与されるものを指し、ここで、このような投与は、患者のインビボにおいて予防的または治療的に有効なレベルの２つ以上の活性剤を提供する。いくつかの実施形態において、医薬組合せで使用される本発明のＡＤＣ分子および他の治療剤は、それらが単独で使用されるレベルを超えないレベルで投与される。用語「固定組合せ」とは、２つ以上の活性剤が単一実体の形態で同時に患者に投与されるものを指す。好ましくは、２つ以上の活性剤の用量かつ／または時間間隔を選択することにより、各成分の併用が疾患または病症の治療において、いずれか１つの成分を単独で使用する場合よりもよい効果を達成することができる。各成分はそれぞれ、単独の製剤形態であってもよく、その製剤形態は同じであってもよく、異なってもよい。

【0074】

用語「組合せ療法」とは、２つ以上の治療剤または治療形態（例えば、放射線治療や手術）を投与することにより、本明細書に記載の疾患を治療するものを指す。そのような投与は、ほぼ同時に、例えば、一定の割合の活性成分を有する単一のカプセルで、これらの治療剤を共投与することを含む。または、このような投与は、複数または別個の容器（例えば、錠剤、カプセル、粉末および液体）での各有効成分の共投与を含む。粉末および／または液体は、投与前に所望の用量に再構成または希釈することができる。なお、このような投与は、各タイプの治療剤を実質的に同じ時間、または異なる時間で順番によって使用することを含む。いずれの場合においても、治療プログラムは、本明細書に記載の病症または病状の治療における医薬組合せの有益な効果を提供する。

【0075】

本明細書で使用される場合、「治療」とは、存在している症状、病症、病状または疾患の進行もしくは重症度を軽減、中断、遅延、寛解、停止、低減、または逆転することを指す。

【0076】

本明細書で使用される場合、「予防」は、疾患、病症、または特定の疾患もしくは病症に係る症状の発生または進行に対する阻害を含む。いくつかの実施形態において、癌の家族歴がある対象は、予防プログラムの候補である。一般的に、癌の背景では、用語「予防」とは、癌にかかる病徴または症状が生じる前に、特に、癌に罹患するリスクのある対象に癌が生じる前の医薬投与を指す。

【0077】

用語「ベクター」は、本明細書で使用される場合、それに連結された別の核酸を増殖可能な核酸分子を指す。当該用語は、自己複製の核酸構造であるベクター、およびそれが導入された宿主細胞のゲノムに結合されたベクターを含む。一部のベクターは、それに操作可能に連結された核酸の発現をガイドすることができる。かかるベクターは本明細書において、「発現ベクター」と呼ばれる。

【0078】

「対象／患者／個体試料」とは、患者または対象から得た細胞または流体の集まりを指す。組織または細胞試料の由来としては、新鮮な、冷凍されたおよび／または保存された器官や組織試料や生検試料や穿刺試料などの固形組織、血液もしくは任意の血液成分、脳脊髄液、羊膜液（羊水）、腹膜液（腹水）や間質液などの体液、対象における妊娠もしくは発育の任意段階に由来する細胞であってもよい。組織試料は、自然界において天然に組織と混ぜ合わせない化合物、例えば、防腐剤、抗凝固剤、緩衝剤、固定剤、栄養素、抗生物質などを含んでもよい。

【0079】

ＩＩ．抗体－薬物複合体

【0080】

本発明は、式（Ｉ）：
Ａｂ－（Ｌ－（Ｄ）_ｒ）_ｐ （Ｉ）
を有する抗体－薬物複合体またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物であって、
式中、
Ａｂは、ＣＬＤＮ１８．２（例えばヒトＣＬＤＮ１８．２）に結合する抗体もしくはその断片であり、
Ｌはリンカーであり、
Ｄは、プロドラッグ、好ましくは抗腫瘍化合物を含む薬物であり、かつ
ｐは１～１０、例えば１～９、２～８、３～７、４～６、もしくは２～６であり、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０であり、
ｒは１～５、例えば１、２、３、４もしくは５であり、好ましくは１または２である、抗体－薬物複合体またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物を提供する。

【0081】

いくつかの実施形態において、本発明の式（Ｉ）中のＡｂはヒト抗体もしくはヒト化抗体であり、好ましくはヒト抗体である。いくつかの実施形態において、本発明の式（Ｉ）中のＡｂは抗体断片であり、好ましくは、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）_２などの抗原結合断片、ｄＡｂ（ｄｏｍａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ）、線状抗体、単鎖抗体（例えばｓｃＦｖ）、単一ドメイン抗体（例えば、ＶＨＨ）、二価抗体もしくはその断片、またはラクダ科抗体である。

【0082】

いくつかの実施形態において、本発明の式（Ｉ）中のＡｂは、二重特異性抗体もしくは多重特異性抗体である。

【0083】

本発明の好ましい実施形態において、Ａｂは、重鎖可変領域からの３つの相補性決定領域（ＨＣＤＲ）であるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含む。

【0084】

本発明の好ましい実施形態において、Ａｂは、軽鎖可変領域からの３つの相補性決定領域（ＬＣＤＲ）であるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含む。

【0085】

いくつかの実施形態において、Ａｂは、重鎖可変領域からの３つの相補性決定領域（ＨＣＤＲ）および軽鎖可変領域からの３つの相補性決定領域（ＬＣＤＲ）を含む。

【0086】

いくつかの態様において、Ａｂは、重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。いくつかの態様において、Ａｂは、軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。いくつかの態様において、Ａｂは、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む。いくつかの実施形態において、上記重鎖可変領域は、重鎖可変領域からの３つの相補性決定領域（ＨＣＤＲ）であるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態において、上記軽鎖可変領域は、軽鎖可変領域からの３つの相補性決定領域（ＬＣＤＲ）であるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含む。

【0087】

いくつかの実施形態において、ＶＨは、
（ｉ）配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、もしくはそれらからなる、もしくは
（ｉｉ）配列番号４のアミノ酸配列を含む、もしくはそれからなり、あるいは
（ｉｉｉ）配列番号４のアミノ酸配列と比較して、１つもしくは複数（好ましくは１０個以下、より好ましくは５個、４個、３個、２個、１個以下）のアミノ酸変化（好ましくはアミノ酸置換、より好ましくは保存的アミノ酸置換）を有するアミノ酸配列を含む、もしくはそれらからなり、好ましくは、上記アミノ酸変化はＣＤＲ領域に生じない。

【0088】

いくつかの実施形態において、ＶＬは、
（ｉ）配列番号９のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、もしくはそれらからなる、もしくは
（ｉｉ）配列番号９のアミノ酸配列を含む、もしくはそれからなり、あるいは
（ｉｉｉ）配列番号９のアミノ酸配列と比較して、１つもしくは複数（好ましくは１０個以下、より好ましくは５個、４個、３個、２個、１個以下）のアミノ酸変化（好ましくはアミノ酸置換、より好ましくは保存的アミノ酸置換）を有するアミノ酸配列を含む、もしくはそれらからなり、好ましくは、上記アミノ酸変化はＣＤＲ領域に生じない。

【0089】

いくつかの実施形態において、本発明にかかるＶＨからの３つの相補性決定領域（ＨＣＤＲ）であるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３は、
（ｉ）配列番号４に示されるＶＨに含まれる３つの相補性決定領域であるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３、あるいは
（ｉｉ）（ｉ）の配列に対して、上記３つのＨＣＤＲ領域に合計で少なくとも１個であり、かつ５個、４個、３個、２個もしくは１個以下のアミノ酸変化（好ましくはアミノ酸置換、好ましくは保存的置換）が含まれる配列である。

【0090】

いくつかの実施形態において、本発明にかかるＶＬからの３つの相補性決定領域（ＬＣＤＲ）であるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３は、
（ｉ）配列番号９に示されるＶＬに含まれる３つの相補性決定領域であるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３、あるいは
（ｉｉ）（ｉ）の配列に対して、上記３つのＬＣＤＲ領域に合計で少なくとも１個であり、かつ５個、４個、３個、２個もしくは１個以下のアミノ酸変化（好ましくはアミノ酸置換、好ましくは保存的置換）が含まれる配列である。

【0091】

いくつかの実施形態において、ＨＣＤＲ１は、配列番号１のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなり、あるいは、ＨＣＤＲ１は、配列番号１のアミノ酸配列と比較して１個、２個もしくは３個の変化（好ましくはアミノ酸置換、好ましくは保存的置換）を有するアミノ酸配列を含む。

【0092】

いくつかの実施形態において、ＨＣＤＲ２は、配列番号２のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなり、あるいは、ＨＣＤＲ２は、配列番号２のアミノ酸配列と比較して１個、２個もしくは３個の変化（好ましくはアミノ酸置換、好ましくは保存的置換）を有するアミノ酸配列を含む。

【0093】

いくつかの実施形態において、ＨＣＤＲ３は、配列番号３のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなり、あるいは、ＨＣＤＲ３は、配列番号３のアミノ酸配列と比較して１個、２個もしくは３個の変化（好ましくはアミノ酸置換、好ましくは保存的置換）を有するアミノ酸配列を含む。

【0094】

いくつかの実施形態において、ＬＣＤＲ１は、配列番号６のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなり、あるいは、ＬＣＤＲ１は、配列番号６のアミノ酸配列と比較して１個、２個もしくは３個の変化（好ましくはアミノ酸置換、好ましくは保存的置換）を有するアミノ酸配列を含む。

【0095】

いくつかの実施形態において、ＬＣＤＲ２は、配列番号７のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなり、あるいは、ＬＣＤＲ２は、配列番号７のアミノ酸配列と比較して１個、２個もしくは３個の変化（好ましくはアミノ酸置換、好ましくは保存的置換）を有するアミノ酸配列を含む。

【0096】

いくつかの実施形態において、ＬＣＤＲ３は、配列番号８のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなり、あるいは、ＬＣＤＲ３は、配列番号８のアミノ酸配列と比較して１個、２個もしくは３個の変化（好ましくはアミノ酸置換、好ましくは保存的置換）を有するアミノ酸配列を含む。

【0097】

いくつかの実施形態において、本発明の式（Ｉ）中のＡｂは、重鎖定常領域を含む。いくつかの実施形態において、本発明の式（Ｉ）中のＡｂは、軽鎖定常領域を含む。いくつかの実施形態において、本発明の式（Ｉ）中のＡｂは、重鎖定常領域および軽鎖定常領域をさらに含む。

【0098】

いくつかの実施形態において、本発明の重鎖定常領域ＨＣは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３もしくはＩｇＧ４の重鎖定常領域、好ましくはＩｇＧ１の重鎖定常領域であり、例えば野生型ＩｇＧ１重鎖定常領域である。いくつかの実施形態において、本発明の抗体軽鎖定常領域ＬＣは、ｌａｍｂｄａまたはＫａｐｐａ軽鎖定常領域である。

【0099】

いくつかの好ましい実施形態において、本発明の重鎖定常領域ＨＣは、
（ｉ）配列番号５のアミノ酸配列と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、もしくはそれらからなり、
（ｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含む、もしくはそれからなり、あるいは
（ｉｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列と比較して、１つもしくは複数（好ましくは２０個もしくは１０個以下、より好ましくは５個、４個、３個、２個、１個以下）のアミノ酸変化（好ましくはアミノ酸置換、より好ましくは保存的アミノ酸置換）を有するアミノ酸配列を含むかまたはそれらからなる。

【0100】

いくつかの実施形態において、本発明の抗体軽鎖定常領域ＬＣは、
（ｉ）配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、もしくはそれらからなり、
（ｉｉ）配列番号１０のアミノ酸配列を含む、もしくはそれからなり、あるいは
（ｉｉｉ）配列番号１０のアミノ酸配列と比較して、１つもしくは複数（好ましくは２０個もしくは１０個以下、より好ましくは５個、４個、３個、２個、１個以下）のアミノ酸変化（好ましくはアミノ酸置換、より好ましくは保存的アミノ酸置換）を有するアミノ酸配列を含むかまたはそれらからなる。

【0101】

本発明のいくつかの具体的な実施形態において、本発明の式（Ｉ）中のＡｂは重鎖を含む。本発明のいくつかの具体的な実施形態において、本発明の式（Ｉ）中のＡｂは軽鎖を含む。本発明のいくつかの具体的な実施形態において、本発明の式（Ｉ）中のＡｂは重鎖および軽鎖を含む。

【0102】

本発明のいくつかの具体的な実施形態において、本発明の重鎖は、重鎖可変領域および重鎖定常領域を含むかまたはそれらからなる。本発明のいくつかの具体的な実施形態において、本発明の軽鎖は、軽鎖可変領域および軽鎖定常領域を含むかまたはそれらからなる。

【0103】

いくつかの具体的な実施形態において、本発明の式（Ｉ）中のＡｂは、ＣＬＤＮ１８．２に特異的に結合し、かつ配列番号４に示されるＶＨに含まれる３つの相補性決定領域ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３、かつ／または配列番号９に示されるＶＬに含まれる３つの相補性決定領域ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含む。

【0104】

本発明のいくつかの具体的な実施形態において、本発明の式（Ｉ）中のＡｂは、それぞれ配列番号１、２および３に示されるアミノ酸配列のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３、かつ／または、それぞれ配列番号６、７および８に示されるアミノ酸配列のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含む。

【0105】

本発明のいくつかの具体的な実施形態において、本発明の式（Ｉ）中のＡｂは、
配列番号４に示されるアミノ酸配列またはそれと少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、あるいはそれらからなるＶＨ、かつ／または
配列番号９に示されるアミノ酸配列またはそれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、あるいはそれらからなるＶＬを含む。

【0106】

本発明のいくつかの実施形態において、本発明の式（Ｉ）中のＡｂはＶＨおよびＶＬを含み、ここで、ＶＨのアミノ酸配列は配列番号４に示され、かつＶＬのアミノ酸配列は配列番号９に示される。

【0107】

本発明のいくつかの具体的な実施形態において、本発明の式（Ｉ）中のＡｂはＩｇＧ抗体であり、すなわちＣＬＤＮ１８．２に結合する重鎖および軽鎖を含むものである。いくつかの実施形態において、本発明の式（Ｉ）中のＡｂは完全抗体である。

【0108】

いくつかの実施形態において、式（Ｉ）中のＡｂの重鎖は、
（ｉ）配列番号１１のアミノ酸配列と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、もしくはそれらからなり、
（ｉｉ）配列番号１１のアミノ酸配列を含む、もしくはそれからなり、または
（ｉｉｉ）配列番号１１のアミノ酸配列と比較して、１つもしくは複数（好ましくは２０個もしくは１０個以下、より好ましくは５個、４個、３個、２個、１個以下）のアミノ酸変化（好ましくはアミノ酸置換、より好ましくは保存的アミノ酸置換）を有するアミノ酸配列を含むかまたはそれらからなる。

【0109】

いくつかの実施形態において、式（Ｉ）中のＡｂの軽鎖は、
（ｉ）配列番号１２のアミノ酸配列と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、もしくはそれらからなり、
（ｉｉ）配列番号１２のアミノ酸配列を含む、もしくはそれからなり、または
（ｉｉｉ）配列番号１２のアミノ酸配列と比較して、１つもしくは複数（好ましくは２０個もしくは１０個以下、より好ましくは５個、４個、３個、２個、１個以下）のアミノ酸変化（好ましくはアミノ酸置換、より好ましくは保存的アミノ酸置換）を有するアミノ酸配列を含むかまたはそれらからなる。

【0110】

本発明のいくつかの実施形態において、本発明の式（Ｉ）中のＡｂは重鎖および軽鎖を含み、ここで、重鎖のアミノ酸配列は配列番号１１に示され、かつ軽鎖のアミノ酸配列は配列番号１２に示される。

【0111】

本発明の一実施形態において、本明細書に記載のアミノ酸変化は、アミノ酸の置換、挿入または欠失を含む。好ましくは、本明細書に記載のアミノ酸変化はアミノ酸置換であり、好ましくは保存的置換である。好ましい実施形態において、本発明に記載のアミノ酸変化は、ＣＤＲ外の領域（例えば、ＦＲ）に生じる。より好ましくは、本発明に記載のアミノ酸変化は、重鎖可変領域外かつ／または軽鎖可変領域外の領域に生じる。いくつかの実施形態において、本発明に記載のアミノ酸変化は、抗体重鎖定常領域のＦｃ領域で生じる。

【0112】

いくつかの実施形態において、置換は保存的置換である。保存的置換とは、１つのアミノ酸が同種の別のアミノ酸によって置換され、例えば、１つの酸性アミノ酸が別の酸性アミノ酸によって置換され、１つの塩基性アミノ酸が別の塩基性アミノ酸によって置換され、または１つの中性アミノ酸が別の中性アミノ酸によって置換されたことを指す。ある実施形態において、置換は、抗体のＣＤＲ領域に生じる。一般的に、得られた変異体は、親抗体に対してある生物学的特性（例えば、向上した親和性）において修飾（例えば、改善）を有し、かつ／または親抗体の実質的に保持されたある生物学的特性を有する。例示的な置換変異体は、親和性成熟抗体である。

【0113】

本発明の式（Ｉ）中の抗体Ａｂは、改変されたグリコシル化を有する抗体であってもよい。いくつかの実施形態において、上記抗体は、インビトロでの糖鎖の酵素的修飾（例えば、グリコシダーゼ（エンドグリコシダーゼまたはグリコシルトランスフェラーゼなど）による糖鎖の修飾）後に得られた抗体である。いくつかの実施形態において、上記の改変されたグリコシル化を有する抗体は、抗体のグリコシル化部位の糖鎖が不均一な構造のＮ糖鎖から反応性基（例えば、アジド基、ケトン基およびアルキニル基などの、リンカー部分と反応できる任意の反応性基）を持つ単一構造のＮ糖鎖に改変された抗体を指す。一好ましい実施形態において、抗体のＮ－グリコシル化部位は、抗体Ｆｃドメインの保存的なＮ－グリコシル化部位、例えばＡｓｎ２９７である。

【0114】

本発明に適する抗体グリコシル化の改変方法は、例えば、ＰＣＴ／ＮＬ２０１３／０５０７４４、ＰＣＴ／ＥＰ２０１６／０５９１９４またはＰＣＴ／ＥＰ２０１７／０５２７９２を参照し、上記特許出願は、その全体が本明細書に組み込まれる。

【0115】

一好ましい実施形態において、本発明の改変されたグリコシル化を有する抗体は、ＧｌｃＮＡｃ－Ｅ（Ａ）_ｘ置換基を含む抗体であり、式中、ＧｌｃＮＡｃはＮ－アセチルグルコサミンであり、式中、Ｅ（Ａ）ｘはｘ個の官能基Ａを含む糖誘導体であり、式中、Ａは独立的にアジド基、ケトン基およびアルキニル基から選択され、かつｘは１、２、３もしくは４であり、ここで、上記ＧｌｃＮＡｃ－Ｅ（Ａ）ｘ置換基は、上記ＧｌｃＮＡｃ－Ｅ（Ａ）ｘ置換基のＮ－アセチルグルコサミンのＣ１を介して上記抗体に結合し、ここで、上記Ｎ－アセチルグルコサミンは、任意選択でフコシル化される。Ｎ－アセチルグルコサミンがフコシル化された場合、それはＣ６を介してフコース（Ｆｕｃ）に結合する。

【0116】

一実施形態において、本発明の改変されたグリコシル化を有する抗体は、式（ＩＩＩ）の抗体であり、式中、Ａｂは抗体を表し、ＧｌｃＮＡｃはＮ－アセチルグルコサミン、Ｆｕｃはフコース、ｂは０もしくは１、ｙは１～２０であり、式中、Ｅ（Ａ）ｘはｘ個の官能基Ａを含む糖誘導体であり、式中、Ａはアジド基、ケトン基およびアルキニル基であり、かつｘは１、２、３もしくは４である。一好ましい実施形態において、ｙは１～１０であり、より好ましくは、ｙは１、２、３、４、５、６、７もしくは８であり、さらに好ましくは、ｙは１、２、３もしくは４、最も好ましくは、ｙは１もしくは２である。

【化1】

【0117】

改変されたグリコシル化を有する抗体のＧｌｃＮＡｃ－Ｅ（Ａ）ｘ置換基における糖誘導体Ｅ（Ａ）ｘは、例えば、β（１，４）－グリコシド結合を介して上記ＧｌｃＮＡｃのＣ４に結合するか、あるいはα（１，３）－グリコシド結合を介して上記ＧｌｃＮＡｃのＣ３に結合することができ、好ましくは、β（１，４）－グリコシド結合を介して上記ＧｌｃＮＡｃのＣ４に結合する。上記ＧｌｃＮＡｃ－Ｅ（Ａ）ｘ置換基のＮ－アセチルグルコサミンは、Ｃ１を介して上記抗体に結合し、好ましくは、Ｎ－グリコシド結合を介して上記抗体のアスパラギンの側鎖におけるアミド窒素原子（ＧｌｃＮＡｃβ１－Ａｓｎ）に結合する。上記ＧｌｃＮＡｃ－Ｅ（Ａ）ｘ置換基におけるＧｌｃＮＡｃは、任意選択でフコシル化される。対応的には、抗体－薬物複合体におけるＧｌｃＮＡｃ－Ｅは存在する場合、前述のとおり連結することもできる。

【0118】

一好ましい実施形態において、上記官能基Ａはアジド基である。Ａがアジド基である場合、好ましくは、Ａは、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４もしくはＣ６に結合する。前述のとおり、Ｅ（Ａ）ｘにおける１つまたは複数のアジド置換基は、上記糖または糖誘導体ＥのＣ２、Ｃ３、Ｃ４もしくはＣ６に結合してヒドロキシ基（ＯＨ）を置換することができる。官能基Ａの結合位置は、Ａを含む糖とリンカーとが連結する位置に対応することが理解されるべきである。

【0119】

一好ましい実施形態において、糖誘導体Ｅ（Ａ）ｘは、糖または糖誘導体Ｅに由来する。一好ましい実施形態において、Ｅは糖または糖誘導体であり、ガラクトース（Ｇａｌ）、マンノース（Ｍａｎ）、Ｎ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、グルコース（Ｇｌｃ）、Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、グルクロン酸（Ｇｃｕ）、フコース（Ｆｕｃ）およびＮ－アセチルノイラミン酸（シアル酸）から選択され、好ましくはＧａｌ、ＧｌｃＮＡｃ、グルコースおよびＧａｌＮＡｃであり、最も好ましくはＧａｌＮＡｃである。

【0120】

別の好ましい実施形態において、上記Ｅ（Ａ）ｘはＧａｌＮＡｃ－Ｎ_３であり、好ましくは、Ｅ（Ａ）ｘは６－アジド－６－デオキシ－２－アセトアミドガラクトースである。

【0121】

矛盾しない限り、糖に関する上記の記載および説明（ＧｌｃＮＡｃ－Ｅ（Ａ）ｘのグリコシド結合の連結方式を含むが、これらに限定されない）は、下記の式（ＩＩ）の複合体に対応する糖、例えば糖の連結方式に同様に適用されることが理解されるべきである。いくつかの実施形態において、反応性基（例えば官能基Ａ）が抗体のグリコシル化改変において抗体の糖鎖に連結されるため、「改変されたグリコシル化を有する抗体」は当該反応性基を含む抗体として定義されるが、抗体－薬物複合体が形成される場合、当該反応性基はリンカー部分と反応させて、さらにリンカー部分と新しい基を形成し、それにより抗体薬物複合体において、当該新しい基はリンカーの一部と見なされることが当業者には理解できる。

【0122】

好ましくは、本発明の抗体はモノクローナル抗体、より好ましくはＩｇＧ抗体（例えば四鎖ＩｇＧ抗体）、最も好ましくはＩｇＧ１抗体である。一実施形態において、上記抗体は完全抗体である。

【0123】

上記修飾された抗体が完全抗体である場合、上記抗体は、好ましくは２つまたはそれ以上、より好ましくは２つのＧｌｃＮＡｃ－Ｅ（Ａ）ｘ置換基を含み、上記ＧｌｃＮＡｃ－Ｅ（Ａ）ｘ置換基は、任意選択でフコシル化される。しかし、上記修飾された抗体が抗体断片、例えばＦａｂもしくはＦｃ断片である場合、当該抗体は、１つのＧｌｃＮＡｃ－Ｅ（Ａ）ｘ置換基のみを有する可能性があり、それが任意選択でフコシル化される。上記ＧｌｃＮＡｃ－Ｅ（Ａ）ｘ置換基は、上記置換基が抗原と当該抗体の抗原結合部位との結合を妨げない限り、抗体の任意の位置にすることができる。一実施形態において、上記ＧｌｃＮＡｃ－Ｅ（Ａ）ｘ置換基は、抗体のＦｃドメインに位置し、より好ましくは、ＣＨ２ドメインに位置する。

【0124】

上記のように、本発明の改変されたグリコシル化を有する抗体は、１つ以上のＧｌｃＮＡｃ－Ｅ（Ａ）ｘ置換基、例えば２つのＧｌｃＮＡｃ－Ｅ（Ａ）ｘ置換基を含む。

【0125】

一好ましい実施形態において、ＧｌｃＮＡｃ－Ｅ（Ａ）ｘ置換基は、上記抗体の天然Ｎ－グリコシル化部位（例えば天然保存的Ｎ－グリコシル化部位）、例えばＦｃ領域（より好ましくはＣＨ２ドメイン）のグリコシル化部位に存在する。さらなる好ましい実施形態において、上記抗体はＩｇＧ抗体であり、かつ上記ＧｌｃＮＡｃ－Ｅ（Ａ）ｘ置換基は、ＩｇＧ抗体の天然Ｎ－グリコシル化部位（天然保存的Ｎ－グリコシル化部位）に存在する。さらなる好ましい実施形態において、上記天然部位はＩｇＧ抗体のＡｓｎ２９７－グリコシル化部位である。上記Ａｓｎ２９７－グリコシル化部位は、ＩｇＧ抗体の重鎖のＦｃ領域に存在する。一好ましい実施形態において、上記ＧｌｃＮＡｃ－Ｅ（Ａ）ｘ置換基は、抗体の２つの重鎖のＡｓｎ２９７－グリコシル化部位に存在する。

【0126】

いくつかの実施形態において、本発明の式（Ｉ）中のＬはリンカーである。当該分野で既知の任意のリンカーを用いて本発明の抗ヒトＣＬＤＮ１８．２に連結することができ、好ましくは、リンカーは、ＡＤＣの部位特異的カップリングを実現することができる。

【0127】

いくつかの実施形態において、本発明に適用するリンカーは、抗体を薬物にカップリングすることができる任意のリンカーであってもよい。いくつかの実施形態において、リンカーは、部位特異的カップリングを実現できる技術に使用されるリンカーであってもよい。

【0128】

一好ましい実施形態において、本発明のリンカーは、抗体のオリゴ糖に連結するリンカーである。本明細書に定義される「抗体のオリゴ糖に連結するリンカー」は、抗体のグリコシル化部位での糖鎖の反応性基に連結して抗体を薬物にカップリングする任意のリンカーを指す。抗体のグリコシル化部位での糖鎖は一般にＮ－糖鎖であり、かつ、通常、不均一な構造のＮ糖鎖から反応性基を持つ単一構造のＮ糖鎖に改変するように改変され、さらに当該糖鎖が持つ反応性基を用いて「リンカー」に連結し、薬物と抗体との部位特異的カップリングを実現し、抗体－薬物複合体を得る。一好ましい実施形態において、抗体のＮ－グリコシル化部位は抗体Ｆｃドメインであり、好ましくは、ＣＨ２ドメインの保存的Ｎ－グリコシル化部位、例えばＡｓｎ２９７である。従って、一実施形態において、本発明の「抗体のオリゴ糖に連結するリンカー」は、特に抗体Ｆｃドメインの保存的なＮ－グリコシル化部位（例えばＡｓｎ２９７）でのＮ－糖鎖の反応性基と部位特異的カップリングを実現できる任意のリンカー、例えばＰＣＴ／ＮＬ２０１３／０５０７４４に記載のリンカーまたはＰＣＴ／ＥＰ２０２１／０７５４０１のリンカーであり、その全体が本明細書に組み込まれる。一実施形態において、本発明の反応性基は、アジド基、ケトン基またはアルキニル基である。一実施形態において、本発明のリンカーは、アルキニル基を含むリンカーである。一実施形態において、本発明の反応性基は、アジド基、ケトン基またはアルキニル基、好ましくはアジド基であり、かつ本発明のリンカーは、アルキニル基を含むリンカーである。本発明においてこのようなリンカーに言及される場合、反応性基はリンカーの基と反応させて新しい基を形成するため、抗体－薬物複合体における反応性基の反応後に形成される基を「リンカー」の一部として定義することもでき、例えば、本発明の式（ＩＩ）に示されるとおりである。

【0129】

本発明に適用するリンカーは、例えば、Ｖａｌ－Ｃｉｔリンカー（ｖｃ－ＰＡＢなど）、ｃＢｕ－ＣｉｔリンカーおよびＣＸリンカーなどのカテプシン分解リンカー、ＳＭＣＣリンカーまたはＭＤリンカーなどの切断不能なリンカー、酸感受性リンカー、シリコーン構造のリンカー、ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ－ｃａｒｂａｍａｔｅリンカー、ＭＣ－ＧＧＦＧリンカー、ＴＲＸリンカー、ガラクトシド含有リンカー、ピロホスフェートリンカー、近赤外線感受性リンカー、紫外線感受性リンカー例えばＰＣ４ＡＰをさらに含む（Ａｎｔｉｂｏｄｙ-ｄｒｕｇ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ：Ｒｅｃｅｎｔ ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ ｌｉｎｋｅｒｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｓｕ、Ｚ．、Ｘｉａｏ、Ｄ．、Ｘｉｅ、Ｆ．、Ｌｉｕ、Ｌ．、Ｗａｎｇ、Ｙ．、Ｆａｎ、Ｓ．、Ｌｉ、Ｓ．（２０２１）．Ａｎｔｉｂｏｄｙ-ｄｒｕｇ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ：Ｒｅｃｅｎｔ ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ ｌｉｎｋｅｒ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ． Ａｃｔａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａ Ｓｉｎｉｃａ Ｂ．）。本発明に適用されるリンカーは、１つまたは複数のリンカーの組合せであってもよく、例えばカテプシン分解リンカーは、他のタイプのリンカーと組み合せて新しいリンカーを構成することができる。従って、本発明に記載の「リンカー」は、本発明の抗体を薬物にカップリングすることができる限り、単一タイプのリンカーまたは異なるタイプのリンカーの組合せを包含する。従って、一実施形態において、本発明に適用されるリンカーは、ＭＣ－ＶＣ－ＰＡＢ、ｖｃ－ＰＡＢ、ＳＭＣＣまたはＭＣ－ＧＧＦＧである。

【0130】

本発明の式（Ｉ）中のＤは、抗腫瘍効果を有するとともに、リンカー構造に連結可能な置換基、部分構造を有する化合物であれば、任意の抗腫瘍化合物であってもよく、特に制限されない。例えば、抗腫瘍化合物は、腫瘍に作用する薬学的に活性な化合物であってもよい。抗腫瘍性化合物の場合、リンカーの一部もしくは全てが好ましくは、腫瘍細胞内で切断され、抗腫瘍性化合物部分が遊離して抗腫瘍効果を示すことができる。薬物との連結部分でリンカーが切断される場合、未修飾の構造で抗腫瘍性化合物が遊離することで、その本来の抗腫瘍効果を発揮することができる。

【0131】

いくつかの実施形態において、抗腫瘍化合物は、例えば細胞傷害剤または化学療法剤であってもよく、イキシテカン（トポイソメラーゼＩ抑制剤エキサテカン（Ｅｘａｔｅｃａｎ））、Ｄｘｄ（新規トポイソメラーゼＩ抑制剤エキサテカン（Ｅｘａｔｅｃａｎ）誘導体）などのカンプトテシン系化合物、モノメチルオーリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）などのオーリスタチン系化合物、または小分子微小管抑制剤ＤＭ１などのマイタンシン系化合物などである。本発明の実施例における構造は、これらの抗腫瘍性化合物の代表的な化合物の構造を示す。

【0132】

一実施形態において、本発明は、（ＩＩ）に記載の抗体－薬物複合体またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物であって、

【化2】

Ａｂは、明細書に定義される抗体を表し、
Ｌ_１はリンカーであり、
Ｅは、糖または糖誘導体、例えば上記に定義される糖または糖誘導体であり、
ＧｌｃＮＡｃはＮ－アセチルグルコサミン、Ｆｕｃはフコースであり、
Ｄおよびｒは、上記の式Ｉに定義されるとおりであり、
ｂは、０もしくは１、例えば０であり、
ｘは、１、２、３もしくは４、好ましくは１もしくは２であり、
ｙは、１～２０であり、例えば、ｙは１～１０、より好ましくは、ｙは１、２、３、４、５、６、７もしくは８、さらに好ましくは、ｙは１、２、３もしくは４である、抗体－薬物複合体またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物を提供する。

【0133】

一実施形態において、Ｆｕｃはフコースであり、ｂは０もしくは１、例えば０であり、かつ／またはｘは１もしくは２、より好ましくは２であり、かつ／またはｙは１もしくは２、より好ましくは２である。

【0134】

一実施形態において、式（ＩＩ）において、Ｅは、ガラクトース（Ｇａｌ）、マンノース（Ｍａｎ）、Ｎ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、グルコース（Ｇｌｃ）、Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、グルクロン酸（Ｇｃｕ）、フコース（Ｆｕｃ）およびＮ－アセチルノイラミン酸（シアル酸）、好ましくはＧａｌ、ＧｌｃＮＡｃ、グルコースおよびＧａｌＮＡｃ、最も好ましくはＧａｌＮＡｃから選択され、例えば６－デオキシ－２－アセトアミドガラクトースであり、好ましくは、６位のＣ原子を介してＬ_１に連結する。

【0135】

一好ましい実施形態において、Ａｂに連結するＧｌｃＮＡｃは、上記抗体の天然Ｎ－グリコシル化部位（例えば天然保存的Ｎ－グリコシル化部位）、例えばＦｃ領域のグリコシル化部位に存在する。さらなる好ましい実施形態において、上記抗体はＩｇＧであり、かつ上記ＧｌｃＮＡｃは、ＩｇＧの天然Ｎ－グリコシル化部位（例えば天然保存的Ｎ－グリコシル化部位）、例えばＦｃ領域のグリコシル化部位に存在する。さらなる好ましい実施形態において、上記天然部位は、ＩｇＧのＡｓｎ２９７－グリコシル化部位である。上記Ａｓｎ２９７－グリコシル化部位は、ＩｇＧ抗体の重鎖のＦｃ領域に存在する。一好ましい実施形態において、上記ＧｌｃＮＡｃ基は、抗体の２つの重鎖のＡｓｎ２９７－グリコシル化部位に存在する。

【0136】

一実施形態において、式（ＩＩ）において、Ｌ_１は、以下の構造を有し、

【化3】

Ｑは、－Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）ＣＨ_２－または－ＣＨ_２－であり、
Ｒ_１は、独立的に水素、ハロゲン、－ＯＲ_２、－ＮＯ_２、－ＣＮ、－Ｓ（Ｏ）_２Ｒ_２、Ｃ_１－Ｃ_１２アルキル基、アリール基、ヘテロアリール基、Ｃ_１－Ｃ_１２アルキルアリール基、Ｃ_１－Ｃ_１２アルキルヘテロアリール基、アリールＣ_１－Ｃ_１２アルキル基およびヘテロアリールＣ_１－Ｃ_１２アルキル基から選択され、および、上記アルキル基、アリール基、ヘテロアリール基、アルキルアリール基、アルキルヘテロアリール基、アリールアルキル基およびヘテロアリールアルキル基は、任意選択で置換されており、２つの置換基Ｒ_１は、架橋もしくはスピロ結合されたシクロアルキル基あるいは縮合もしくはスピロ結合された芳香族炭化水素もしくはヘテロ芳香族炭化水素置換基を形成するために共に連結され得、および、Ｒ_２は、独立的に水素、ハロゲン、Ｃ_１－Ｃ_２４アルキル基、アリール基、ヘテロアリール基、Ｃ_１－Ｃ_１２アルキルアリール基、Ｃ_１－Ｃ_１２アルキルヘテロアリール基、アリールＣ_１－Ｃ_１２アルキル基およびヘテロアリールＣ_１－Ｃ_１２アルキル基から選択され、
Ｒ_３およびＲ_４はそれぞれ、独立的に水素、ハロゲン、Ｃ_１－Ｃ_２４アルキル基、アリール基、ヘテロアリール基、Ｃ_１－Ｃ_１２アルキルアリール基、Ｃ_１－Ｃ_１２アルキルヘテロアリール基、アリールＣ_１－Ｃ_１２アルキル基およびヘテロアリールＣ_１－Ｃ_１２アルキル基から選択され、
ｃは、０、１、２、３もしくは４であり、
ｍは、０もしくは１であり、
ｎは、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０であり、
Ｙは、Ｏ、ＳもしくはＮＲ_１であり、
Ｌ_２およびＬ_３はそれぞれ、独立的にＣ_１－Ｃ_１２アルキル基であり、当該アルキル基における１つまたは複数（例えば１、２、３もしくは４個）の炭素原子は、Ｏ、Ｎおよび／またはＳが互いに直接連結しないことを条件として、任意選択でＯ、ＮおよびＳから選択されるヘテロ原子で置換され、
Ｌ_４はそれぞれ、独立的に切断可能なリンカーである。

【0137】

ｍが０である場合、Ｑが存在せず、それによりトリアゾールの関連窒素原子が共有単結合によってＥ部分に直接連結することを意味することが理解されるべきである。

【0138】

一実施形態において、Ｌ_４はそれぞれ、独立的に

【化4】

であり、
ここで、Ｒ_５およびＲ_６はそれぞれ、独立的に水素およびＣ_１－Ｃ_１２アルキル基から選択され、
Ａｒはアリール基から選択され、好ましくはフェニル基であり、
一実施形態において、Ｌ_４はそれぞれ、独立的に

【化5】

である。

【0139】

一実施形態において、式中、－Ｌ_１－は以下の構造を有する。

【化6】

【0140】

一実施形態において、上記抗体－薬物複合体は、１～１５、例えば１～１０、２～８、２～６もしくは３～５のＤＡＲ平均値を有する。

【0141】

一実施形態において、本発明的抗体－薬物複合体は、

【化7-1】

【化7-2】

から選択され、
式中、ＡｂはＨＢ３７Ａ６であり、
式中、ｑはＤＡＲ平均値を表し、
ＩＥＸ０１９－０２、ＩＥＸ０１９－０４、ＩＥＸ０１９－０５において、ｑは２～５、例えば３～５、３～４もしくは３．５～４．５であり、

【0142】

ＩＥＸ０１９－０３において、ｑは５～１１、例えば６～１０、７～９もしくは７．５～８．５である。

【0143】

ＩＩＩ．本発明のＡＤＣ分子の製造

【0144】

本発明の一態様は、改変されたグリコシル化を有する抗体を調製する方法であって、

【0145】

（１）グリコシル化抗体の調製：抗体の発現に適する条件で、上記抗体（例えば、いずれか１つのポリペプチド鎖、および／または複数のポリペプチド鎖）をコードする核酸または上記核酸を含む発現ベクターを含む宿主細胞を培養し、上記で提供されるように、および、任意選択で上記宿主細胞（または宿主細胞培地）から上記抗体を回収し、コアＮ－アセチルグルコサミン置換基（コア－ＧｌｃＮＡｃ置換基）を含む抗体を得て、ここで、上記コアＮ－アセチルグルコサミンおよび上記コアＮ－アセチルグルコサミン置換基は、任意選択でフコシル化されることと、

【0146】

（２）トリミングされた抗体の調製：ステップ（１）で調製された抗体を、エンドグリコシダーゼ存在下で脱グリコシル化して、コアＮ－アセチルグルコサミン置換基を含む抗体を得て、ここで、上記コアＮ－アセチルグルコサミンおよび上記コアＮ－アセチルグルコサミン置換基は、任意選択でフコシル化されることと、

【0147】

（３）（２）で得られたトリミングされた抗体を、適切な触媒の存在下で式Ｅ（Ａ）ｘ－Ｐの化合物と接触させ、ＧｌｃＮＡｃ－Ｅ（Ａ）ｘ置換基を含む抗体を得て、上記ＧｌｃＮＡｃ－Ｅ（Ａ）ｘ置換基は、当該ＧｌｃＮＡｃ－Ｅ（Ａ）ｘ置換基のＮ－アセチルグルコサミンのＣ１を介して上記抗体に結合し、ここで、上記触媒は、グリコシルトランスフェラーゼであり、ここで、Ｐは、ウリジン二リン酸（ＵＤＰ）、グアノシン二リン酸（ＧＤＰ）およびシチジン二リン酸（ＣＤＰ）から選択されることと、を含む方法を提供する。

【0148】

ステップ（１）を実施するために、抗体（例えば上記の抗体、例えば、いずれか１つのポリペプチド鎖、および／または複数のポリペプチド鎖）をコードする核酸を単離し、それを１つまたは複数のベクターに挿入し、宿主細胞におけるさらなるクローニングおよび／または発現に用いる。このような核酸は、通常のプロセスにより単離してシークエンシングすることが容易である（例えば、抗体の重鎖と軽鎖をコードする遺伝子と特異的に結合するオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって行われる）。

【0149】

ステップ（２）のエンドグリコシダーゼは、グリコシル化抗体の性質に従って選択することができ、例えばＥｎｄｏ Ｓ、Ｅｎｄｏ Ａ、Ｅｎｄｏ Ｆ、Ｅｎｄｏ Ｍ、Ｅｎｄｏ ＤおよびＥｎｄｏ Ｈ酵素および／またはそれらの組合せから選択され、また、例えばＥｎｄｏ Ｓ、Ｅｎｄｏ Ｓ４９、Ｅｎｄｏ Ｆまたはそれらの組合せである。一好ましい実施形態において、上記エンドグリコシダーゼは、ＰＣＴ／ＥＰ２０１７／０５２７９２に記載のエンドグリコシダーゼであり、最も好ましくはＰＣＴ／ＥＰ２０１７／０５２７９２のＥｎｄｏ ＳＨである。

【0150】

ステップ（３）のグリコシルトランスフェラーゼは、好ましくはβ－（１，４）－Ｎアセチルガラクトサミントランスフェラーゼのグリコシルトランスフェラーゼであるか、またはそれに由来し、より好ましくはＰＣＴ／ＥＰ２０１６／０５９１９４に記載の任意のβ－（１，４）－ＧａｌＮＡｃＴ酵素である。いくつかの実施形態において、上記β－（１，４）－ＧａｌＮＡｃＴ酵素は、無脊椎動物のβ－（１，４）－ＧａｌＮＡｃＴ酵素であるか、またはそれに由来する。β－（１，４）－ＧａｌＮＡｃＴ酵素は、当業者に既知の任意の無脊椎動物のβ－（１，４）－ＧａｌＮＡｃＴ酵素であってもよく、またはそれに由来してもよい。好ましくは、β－（１，４）－ＧａｌＮＡｃＴ酵素は、線形動物門（Ｎｅｍａｔｏｄａ）由来、好ましくはクロマドラ綱（Ｃｈｒｏｍａｄｏｒｅａ）もしくは双腺綱（Ｓｅｃｅｒｎｅｎｔｅａ）由来、あるいは節足動物門（Ａｒｔｈｒｏｐｏｄａ）由来、好ましくは昆虫綱（Ｉｎｓｅｃｔａ）由来のβ－（１，４）－ＧａｌＮＡｃＴ酵素であるか、またはそれに由来する。より好ましくは、β－（１，４）－ＧａｌＮＡｃＴ酵素は、ミレスチネロリ線虫、ブタ回虫、イラクサギンウワパ、ショウジョウバエ、腐生果実線虫、Ｃａｅｎｏ ｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｂｒｉｇｇｓａｅ、呉策線虫、ロバリアムシ、ピセオロギ、ヤマシロアリ、ツバダカメバエ、ビキおよびハムスチョウ由来のβ－（１，４）－ＧａｌＮＡｃＴ酵素であるか、またはそれに由来する。好ましくは、ステップ（３）に適するグリコシルトランスフェラーゼは、ＰＣＴ／ＥＰ２０１６／０５９１９４に開示され、ＴｎＧａｌＮＡｃＴとして命名されるイラクサギンウワパβ－（１，４）－ＧａｌＮＡｃＴ酵素（例えばＨｉｓ－ＴｎＧａｌＮａｃＴ）である。

【0151】

本発明の別の態様は、本発明の抗体を使用してＡＤＣを調製する方法を提供する。本発明における「ＡＤＣ」は、リンカー（Ｌ）を介して生物学的および／薬学活性を有する活性物質（Ｄ）にカップリングされた抗体として定義される。上記方法は、１つまたは複数の本発明に定義されるリンカー（Ｌ）を介して、本発明の抗体を１つ以上の活性物質Ｄにカップリングすることを含む。好ましくは、リンカー－活性物質を抗体に部位特異的にカップリングする。

【0152】

一実施形態において、本発明のＡＤＣを調製する方法であって、（式ＩＩＩ）のグリコシル化抗体を、

【化8】

式中、各変数または記号の意味は上記に定義されるとおりであり、
アルキニル基および１つまたは複数（例えば１、２、３もしくは４個）の薬物分子を含むリンカー－薬物化合物（ｌｉｎｋｅｒ－ｐａｙｌｏａｄ）と反応させ、
（式ＩＩ）の抗体－薬物複合体を生成することを含み、

【化9】

式中、各変数または記号の意味は上記に定義されるとおりである、方法を提供する。

【0153】

一実施形態において、上記リンカー－薬物化合物は、下記式の構造を有し、

【化10】

式中、各変数は上記に定義されるとおりである。

【0154】

ＩＶ．医薬組成物

【0155】

いくつかの実施形態において、本発明は、本明細書に記載の任意のＡＤＣ分子またはその薬学的に許容される塩を含む組成物であって、好ましくは医薬組成物または医薬製剤である、組成物を提供する。一実施形態において、上記組成物は、薬用補助材料をさらに含む。一実施形態において、組成物、例えば医薬組成物は、本発明のＡＤＣ分子、および１つまたは複数の他の治療剤の組合せを含む。

【0156】

本発明は、本発明のＡＤＣ分子またはその薬学的に許容される塩を含む組成物（医薬組成物を含む）をさらに含む。これらの組成物はまた、適切な薬用補助材料、例えば、この分野での既知の薬用ベクター、緩衝剤を含む薬用賦形剤を含んでもよい。

【0157】

本明細書で使用されるように、「薬用ベクター」は、生理学的に適合する溶剤、分散媒体、等張剤、吸収遅延剤などのいずれかまたは全てを含む。

【0158】

薬用補助材料の使用およびその使用については、『Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ』、第八版、Ｒ．Ｃ．Ｒｏｗｅ、Ｐ．Ｊ．ＳｅｓｋｅｙおよびＳ．Ｃ．Ｏｗｅｎ、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｅｓｓ、Ｌｏｎｄｏｎ、Ｃｈｉｃａｇｏも参照される。

【0159】

本発明の組成物は、さまざまな形態であってもよい。これらの形態は、例えば、液体、半固体および固体の剤型、例えば、液体溶液剤（例えば、注射用溶液剤と輸注用溶液剤）、分散剤若しくは懸濁剤、リポソーム剤および坐剤を含む。好ましい形態は、所望の投与モードと治療的使用によって決定される。

【0160】

所望の純度を有する本発明のＡＤＣ分子を１つまたは複数の任意選択の薬用補助材料と混合することにより、本明細書に記載のＡＤＣ分子の薬物を製造することができ、好ましくは、凍結乾燥製剤または水溶液の形態で行われる。

【0161】

本発明の医薬組成物または製剤は、１種以上の活性成分をさらに含んでもよく、上記活性成分は、治療される特定の適応症に必要なものであり、好ましくは、互いに悪影響を与えない相補的な活性を有する活性成分である。例えば、化学療法剤、血管新生抑制剤、サイトカイン、細胞傷害剤、他の抗体、小分子薬物もしくは免疫調節剤（例えば免疫チェックポイント抑制剤またはアゴニスト）などを含む、他の治療剤をさらに提供することも望ましい。上記活性成分は、目的とする使用に有効な量で適切に組合せて存在する。

【0162】

持続放出製剤を製造することができる。持続放出製剤の適切な実例は、抗体を含む疎水性固体ポリマーの半透性マトリックスを含み、上記マトリックスは、例えば、フィルムまたはマイクロカプセル形態のような成形品である。

【0163】

ＶＩＩ．医薬組合せおよび薬物キット

【0164】

いくつかの実施形態において、本発明は、本発明のＡＤＣ分子、および１つまたは複数の他の治療剤（例えば、化学療法剤、血管新生抑制剤、サイトカイン、細胞傷害剤、他の抗体、小分子薬物もしくは免疫調節剤（例えば免疫チェックポイント抑制剤またはアゴニスト）などを含む治療剤）を含む、医薬組合せまたは医薬組合せ製品をさらに提供する。

【0165】

本発明の別の目的は、本発明の医薬組合せを含む薬物キットを提供することであり、好ましくは、上記薬物キットは、医薬用量単位の形態である。これにより、投与プログラムまたは医薬投与間隔によって用量単位を提供することができる。

【0166】

一実施形態において、本発明の薬物キットは、同一のパッケージにおいて、
－本発明のＡＤＣ分子を含む医薬組成物を含有する第１の容器、
－他の治療剤を含む医薬組成物を含有する第２の容器、を含む。

【0167】

ＶＩＩＩ．使用および方法

【0168】

本発明の一態様は、対象において腫瘍（例えば、癌）を予防または治療する方法であって、有効量の本発明のＡＤＣ分子、医薬組成物、医薬組合せまたは薬物キットを対象に投与することを含む、方法を提供する。

【0169】

いくつかの実施形態において、上記腫瘍（例えば、癌）患者は、（例えば、核酸やタンパク質レベルなどのレベルが上昇した）ＣＬＤＮ１８．２を有する。いくつかの実施形態において、上記患者の腫瘍細胞は、ＣＬＤＮ１８．２を発現し、例えば、ＣＬＤＮ１８．２を中程度に発現し、好ましくはＣＬＤＮ１８．２を高発現する。

【0170】

いくつかの実施形態において、上記腫瘍、例えば癌は、固形腫瘍と血液腫瘍および転移性病巣を含む。一実施形態において、固形腫瘍の例は、悪性腫瘍を含む。癌は、早期、中期または末期にある癌または転移性癌であってもよい。

【0171】

一具体的な実施形態において、本発明のＡＤＣ分子は、腫瘍細胞を殺傷し、かつ／または、例えばＣＬＤＮ１８．２を発現する腫瘍細胞、例えば消化管腫瘍細胞、例えば胃癌細胞、膵臓癌細胞、結腸癌細胞または結腸直腸癌細胞などの腫瘍細胞の増殖を抑制することができる。

【0172】

いくつかの実施形態において、腫瘍は腫瘍の免疫回避である。

【0173】

いくつかの実施形態において、上記腫瘍は癌、例えば上皮腫瘍、例えば消化管腫瘍、例えば上皮癌または消化管癌、例えば胃癌、胃食道接合部癌、膵臓癌、結腸直腸癌または結腸癌である。

【0174】

対象は、霊長類などの哺乳動物であってもよく、好ましくは、高等霊長類、例えば、ヒト（例えば、本明細書に記載の疾患に罹患しているかまたは本明細書に記載の疾患に罹患するリスクのある個体）である。一実施形態において、対象は、本明細書に記載の疾患（例えば、癌）に罹患しているかまたは本明細書に記載の疾患に罹患するリスクがある。一部の実施形態において、対象は、化学療法治療および／または放射線治療などの他の治療を受けるか、または既に受けた。いくつかの実施形態において、対象は、その前に既に免疫療法を受けたか、または受けている。

【0175】

他の態様において、本発明は、薬物の生産または製造における、ＡＤＣ分子、医薬組成物、医薬組合せまたは薬物キットの使用であって、上記薬物は、本明細書に記載の使用に用いられ、例えば本明細書にかかる関連疾患または病状を予防または治療するために用いられる、使用を提供する。

【0176】

いくつかの実施形態において、本発明のＡＤＣ分子、医薬組成物、医薬組合せまたは薬物キットにより、病状および／または病状に関連する症状の発症が遅延される。

【0177】

いくつかの実施形態において、本発明のＡＤＣ分子または医薬組成物は、さらに１つまたは複数の他の療法、例えば治療方式および／または他の治療剤と組み合わせて投与され、本明細書に記載の使用に用いられ、例えば本明細書にかかる関連疾患または病状を予防および／または治療するために用いられることができる。

【0178】

いくつかの実施形態において、治療方式は、外科手術、放射線治療、局所照射または集中的照射などを含む。

【0179】

いくつかの実施形態において、治療剤は、化学療法剤、血管新生抑制剤、サイトカイン、細胞傷害剤、他の抗体、小分子薬物もしくは免疫調節剤（例えば免疫チェックポイント抑制剤またはアゴニスト）から選択される。

【0180】

例示的な他の抗体は、免疫チェックポイントに特異的に結合する抗体を含む。

【0181】

本発明の療法の組合せは、併用投与（例えば、２種または複数種の治療剤が同一の製剤または別個の製剤に含まれる）、個別投与を含み、後者の場合は、本発明のＡＤＣ分子の投与は、別の治療剤および／または薬剤の投与の前に、同時に、および／または後に行われてもよい。

【0182】

医薬組成物の投与経路は、既知の方法、例えば、経口、静脈内注射、腹腔内、脳内（実質内）、脳室内、筋肉内、眼内、動脈内、門脈内、または病巣内経路により、持続放出系により、またはインプラント装置によるものである。ある実施形態において、組成物は、ボーラス注射または連続輸注またはインプラント装置によって投与することができる。

【0183】

組成物は、インプラント膜、スポンジ、または所望の分子を吸収またはカプセル化する別の適切な材料を介して局所的に投与されてもよい。ある実施形態において、インプラント装置が使用される場合、上記装置は、任意の適切な組織または器官にインプラントすることができ、拡散、持続放出ボーラス、または連続投与によって所望の分子を送達することができる。

【0184】

本発明にかかる上記と他の態様および実施形態は、図面（図面の簡単な説明がその後に続く）と以下の発明の詳細な説明において記載され、以下の実施例に例示されている。上記および本願にわたって説明された特徴のいずれかまたはすべては、本発明の各実施形態において組合せることができる。以下の実施例を用いて本発明をさらに説明するが、実施例は、限定ではなく、説明することで記載され、当該業者は、様々な変更を行うことができると理解すべきである。

【実施例】

【0185】

実施例１．１、安定発現細胞株の構築

【0186】

ヒトＣＬＤＮ１８．２の過剰発現細胞株の調製

【0187】

メーカーの取扱説明書によって、Ｆｒｅｅｄｏｍ（登録商標） ＣＨＯ－Ｓ（登録商標）試薬キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ａ１３６９６０１）を使用して、ヒトＣｌａｕｄｉｎ１８．２（ＣＬＤＮ１８．２と略称し、以下同様である）を安定発現する細胞株を構築した。まず、ヒトＣＬＤＮ１８．２（ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ：Ｐ５６８５６－２）の全長遺伝子を、ベクターｐＣＨＯ１．０に構築し、プラスミドを構築し、化学的トランスフェクション法と電気的トランスフェクション法により、構築されたプラスミドをそれぞれＣＨＯ－Ｓ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ａ１３６９６０１）とＨＥＫ２９３細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ａ１４５２７）へ導入し、トランスフェクションした細胞は、２ラウンドのプレススクリーニングを経て、ＣＬＤＮ１８．２をそれぞれ発現した細胞プール（ｐｏｏｌ）を得た。次に、フローサイトメトリー（ＭｏＦｌｏ ＸＤＰ、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）によりＣＬＤＮ１８．２を高発現した細胞をソーティングし、希釈法によりＣＬＤＮ１８．２を安定発現したモノクローナル細胞株ＣＨＯ－ｈＣＬＤＮ１８．２およびＨＥＫ２９３－ｈＣＬＤＮ１８．２を得た。

【0188】

ヒトＣＬＤＮ１８．１の過剰発現細胞株の調製

【0189】

メーカーの取扱説明書によって、Ｆｒｅｅｄｏｍ（登録商標） ＣＨＯ－Ｓ（登録商標）試薬キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ａ１３６９６０１）を使用して、ヒトＣｌａｕｄｉｎ１８．１（ＣＬＤＮ１８．１と称する。以下は、同じである）を安定発現する細胞株を構築した。まず、ヒトＣＬＤＮ１８．１（ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ：Ｐ５６８５６－１）の全長遺伝子を、ベクターｐＣＨＯ１．０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ａ１３６９６０１）に構築し、プラスミドを形成し、化学的トランスフェクション法により構築されたプラスミドをＣＨＯ－Ｓ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ａ１３６９６０１）へ導入し、トランスフェクションした細胞は、２回のプレススクリーニングを経て、ＣＬＤＮ１８．１をそれぞれ発現する細胞プール（ｐｏｏｌ）を得た。次に、フローサイトメトリー（ＭｏＦｌｏ ＸＤＰ、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）によりＣＬＤＮ１８．１を高発現した細胞をソーティングし、希釈法によりＣＬＤＮ１８．１を安定発現したモノクローナル細胞株ＣＨＯ－ｈＣＬＤＮ１８．１を得た。

【0190】

ＣＬＤＮ１８．２を過剰発現する腫瘍細胞株の構築

【0191】

ヒトＣＬＤＮ１８．２（ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ：Ｐ５６８５６－２）の全長遺伝子をベクターｐＷＰＴ－ＧＦＰ（Ａｄｄｇｅｎｅ、１２２５５）に構築し、その中のＧＦＰ配列を置き換え、レンチウイルスのパッケージングベクターｐｓＰＡＸ２（Ａｄｄｇｅｎｅ、１２２６０）とｐＭＤ２．Ｇ（Ａｄｄｇｅｎｅ、１２２５９）と共にＨＥＫ２９３Ｔ（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ－３２１６）細胞にトランスフェクションし、ウイルスのパッケージングを行った。４８時間および７２時間後の培養上清をそれぞれ収集し、ＰＥＧ８０００を用いてレンチウイルスの濃縮を行った。濃縮したウイルスで膵臓癌ＤＡＮ－Ｇ細胞（ＣＬＳ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅｓ Ｓｅｒｖｉｃｅ ＧｍｂＨ、３００１６２）および胃癌ＫＡＴＯ ＩＩＩ細胞（ＡＴＣＣ、ＨＴＢ－１０３）をトランスフェクトし、次にフローサイトメーター（ＭｏＦｌｏ ＸＤＰ、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いてＣＬＤＮ１８．２を発現する細胞をソーティングし、ＣＬＤＮ１８．２を安定的にトランスフェクションした腫瘍細胞株ＤＡＮ－Ｇ－ｈＣＬＤＮ１８．２およびＫＡＴＯ ＩＩＩ－ｈＣＬＤＮ１８．２を得た。

【0192】

実施例１．２、ＣＬＤＮ１８．２モノクローナルの生成

【0193】

本発明はハイブリドーマ技術を用いて、実施例１により得られた細胞（ＣＨＯ－ｈＣＬＤＮ１８．２）によってマウスＨ２Ｌ２完全ヒト抗体遺伝子組換えマウス（Ｈａｒｂｏｕｒ ＢｉｏＭｅｄから購入）を免疫させた。次に、マウスの脾臓細胞を取得し、骨髄種細胞と電気融合した。続いて、上清を収集し、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）により抗ＣＬＤＮ１８．２抗体を特異的に発現したハイブリドーマ細胞をスクリーニングし、かつ分泌された抗体は、ＣＬＤＮ１８．１と結合しなかった。実施例１により得られた検出すべき細胞（ＨＥＫ２９３－ｈＣＬＤＮ１８．２）をカウントし、１×１０^６個細胞／ｍＬに希釈し、Ｕ形底を有する９６ウェルプレートに１００μＬ／ウェルで加入した。５００ｇで５ｍｉｎ遠心分離し、細胞培地を除去した。ハイブリドーマの９６ウェルプレートで培養された上清をＵ形プレートに加入し、細胞を再懸濁し、１ウェル当たり１００μＬ加入し、氷上で３０ｍｉｎ静置した。５００ｇで５ｍｉｎ、上清を除去し、ＰＢＳで細胞を１回洗浄した。１ウェル当たり１００μＬの抗マウスＦａｂのＦＩＴＣで標識された二次抗体（１：５００でＰＢＳに希釈した）を加入し、陽性対照抗体に１００μＬの抗ヒトＦａｂのＦＩＴＣで標識された二次抗体を加入した。氷上で３０ｍｉｎ遮光してインキュベートした。５００ｇで５ｍｉｎ、上清を除去し、ＰＢＳで細胞を１回洗浄した。５０μＬの１×ＰＢＳで細胞を再懸濁し、ＦＡＣＳで機上検出を行った。陽性クローンを上記と同様の方法でＣＨＯ－ｈＣＬＤＮ１８．１の再スクリーニングを行った。２ラウンドのスクリーニングにより、完全ヒト抗体クローンＨＢ３７Ａ６を得た。

【0194】

実施例１．３、組換えＣＬＤＮ１８．２モノクローナル抗体の調製

【0195】

抗ＣＬＤＮ１８．２モノクローナル抗体ＨＢ３７Ａ６（ＣＮ２０２０１０５７０５１７．Ｘを参照）および対照抗体ｚｏｌｂｅｔｕｘｉｍａｂ（Ｚｍａｂと略称され、配列はＩＮＮ１１７から由来）を、全長モノクローナル抗体の形態でＨＥＫ２９３細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ａ１４５２７）に発現させた。

【0196】

まず、発現ベクターを構築し、ＨＢ３７Ａ６および対照抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域（配列表の情報を参照）をヒトＩｇＧ１の重鎖定常領域（配列番号５）および軽鎖ｋａｐｐａ定常領域（配列番号１０）のＮ末端にそれぞれ配置した。その後、Ｎ末端シグナルペプチドを有するｐｃＤＮＡ３．１発現ベクターに構築し、軽重鎖発現ベクターを得た。得られた軽重鎖発現ベクターをＰＥＩ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ、２３９６６）をＨＥＫ２９３細胞に同時トランスフェクションし、７日培養した後、培地上清を収集した。上清をＰｒｏｔｅｉｎ Ａカラム（Ｈｉｔｒａｐ Ｍａｂｓｅｌｅｃｔ Ｓｕｒｅ、ＧＥ １１－００３４－９５）により精製した後、限外濾過してＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ、７００１１－０４４）に液交換し、Ａ２８０法で濃度を検出し、ＳＥＣ－ＨＰＬＣ法で純度を測定し、純度が９５％超の抗体溶液を得て、組換えＣＬＤＮ１８．２モノクローナル抗体ＨＢ３７Ａ６を得た。

【0197】

具体的なトランスフェクションおよび精製手順は以下のとおりである：

【0198】

必要なトランスフェクション体積に応じて、Ｅｘｐｉ２９３細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ａ１４５２７）を継代し、トランスフェクションの前日に細胞密度を１．５×１０^６個の細胞／ｍＬに調整した。トランスフェクションの当日に細胞密度は約３×１０^６ｃｅｌｌ／ｍＬであった。最終体積１／１０のＯｐｔｉ－ＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ、３１９８５－０７０）をトランスフェクション緩衝液として取り、トランスフェクション細胞１．０μｇ／ｍＬとなるように適切なプラスミドを加え、均一に混合した。適切なポリエチレンイミン（ＰＥＩ）（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ、２３９６６）をプラスミドに加え（プラスミドとＰＥＩの割合は２９３Ｆ細胞で１：３である）、均一に混合した後に室温で２０ｍｉｎインキュベートして、ＤＮＡ／ＰＥＩ混合物を得た。ＤＮＡ／ＰＥＩ混合物を細胞に徐々に加えながら、フラスコを軽く振とうした後、３６．５℃、８％のＣＯ_２インキュベーターで培養し、７日間後に細胞液を得て、細胞上清を収集して精製した。

【0199】

精製に使用したＰｒｏｔｅｉｎ Ａカラム（Ｈｉｔｒａｐ Ｍａｂｓｅｌｅｃｔ Ｓｕｒｅ、ＧＥ、１１－００３４－９５）を０．１ＭのＮａＯＨで２ｈ処理し、ガラス瓶などを蒸留水で洗浄した後に１８０℃で４ｈ乾燥させた。精製前に、収集した細胞液を４５００ｒｐｍで３０ｍｉｎ遠心分離し、上清を０．２２μｍのフィルターでろ過した。１０カラム体積の結合緩衝液（リン酸ナトリウム２０ｍＭ、ＮａＣｌ １５０ｍＭ、ＰＨ７．０）を用いてＰｒｏｔｅｉｎ Ａカラムを平衡させた。ろ過した上清を精製カラムに加えた後、１０カラム体積の結合緩衝液を用いて平衡させた。溶離緩衝液５ｍＬ（クエン酸＋クエン酸ナトリウム０．１Ｍ、ｐＨ３．５）を加えて溶離液を収集し、溶離液１ｍＬあたりに２Ｍの濃度であるＴｒｉｓ－ＨＣｌ ８０μＬを加えた。収集した抗体を限外ろ過により濃縮してＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ、７００１１－０４４）に交換し、濃度を検出した。

【0200】

実施例１．４、ＳＰＲ法によるＣＬＤＮ１８．２抗体の親和性の測定

【0201】

表面プラズモン共鳴法（Ｓｕｒｆａｃｅ ｐｌａｓｍｏｎ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ、ＳＰＲ）を用いて、ヒトＣＬＤＮ１８．２に結合するＨＢ３７Ａ６の平衡解離定数（Ｋ_Ｄ）を測定した。メーカーの取扱説明書によって、アミノカップリング試薬キット（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ＢＲ－１００６－３３）を用いて、ヒトＣｌａｕｄｉｎ１８．２（ＧｅｎＳｃｒｉｐ、Ｐ５０２５１８０２）をＣＭ５チップ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、２９－１４９６－０３）の表面にカップリングし、カップリングした後、１Ｍのエタノールアミンを注入し、残りの活性化部位を封止した。メーカーの取扱説明書によって、Ｂｉａｃｏｒｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｔ２００）でチップ表面抗原と移動相での抗体との結合と解離を検出して、親和性および動態定数を取得した。勾配希釈された抗体（０ｎＭ～１００ｎＭ）を、低い濃度から高い濃度の順でチップ表面を流れ、結合時間が１８０ｓ、解離時間が６００ｓであった。最後に、１０ｍＭのＧｌｙｃｉｎｅ ｐＨ １．５（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ＢＲ－１００３－５４）を用いてチップを再生した。データ結果を、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００解析ソフトウェアを用いて１：１の結合モデルで動態解析を行った。表１に示すように、ＨＢ３７Ａ６の親和性は、対照抗体Ｚｍａｂよりも優れた。

【0202】

【表2】

【0203】

実施例１．５、ＣＬＤＮ１８．２抗体のＣＬＤＮ１８細胞との結合特異性

【0204】

フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）により、それぞれ実施例１により得られたヒトＣＬＤＮ１８．２およびヒトＣＬＤＮ１８．１を安定的にトランスフェクションしたＣＨＯ－Ｓ細胞株（すなわち、実施例１に記載したように調製したＣＨＯ－ｈＣＬＤＮ１８．２およびＣＨＯ－ｈＣＬＤＮ１８．１）に対する上記抗ＣＬＤＮ１８．２モノクローナル抗体ＨＢ３７Ａ６および対照抗体Ｚｍａｂの結合を測定した。

【0205】

具体的には、実施例１により得られた検出すべき細胞（ＣＨＯ－ｈＣＬＤＮ１８．２およびＣＨＯ－ｈＣＬＤＮ１８．１）をカウントし、１×１０^６個細胞／ｍＬに希釈し、Ｕ形底を有する９６ウェルプレートに１００μＬ／ウェルで加入した。５００ｇで５ｍｉｎ遠心分離し、細胞培地を除去した。抗ＣＬＤＮ１８．２モノクローナル抗体ＨＢ３７Ａ６および対照抗体Ｚｍａｂを１ウェルあたり１００μＬでＵ形プレートに加えて細胞を再懸濁し、抗体の開始濃度を９００ｎＭとし、次に順に３倍希釈し、合計１０濃度点とした。氷上で３０ｍｉｎ静置した。５００ｇで５ｍｉｎ、上清を除去し、ＰＢＳで細胞を１回洗浄した。１ウェルあたり１００μＬのヤギ抗ヒトＦｃのＰＥで標識された二次抗体（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ、Ｊ２８１５－５Ｈ８７Ｂ）を加入した。氷上で３０ｍｉｎ遮光してインキュベートした。５００ｇで５ｍｉｎ、上清を除去し、ＰＢＳで細胞を１回洗浄した。５０μＬの１×ＰＢＳで細胞を再懸濁し、ＦＡＣＳで機上検出を行った。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いて実験データを分析し、図１および図２を得た。図１および図２に示すように、上記抗体はいずれも、ヒトＣＬＤＮ１８．２に特異的に結合するが（図１）、ヒトＣＬＤＮ１８．１に結合しなかった（図２）。

【0206】

実施例１．６、ＣＬＤＮ１８．２抗体と腫瘍細胞株との結合

【0207】

実施例１．５を参照し、ＦＡＣＳにより、ＨＢ３７Ａ６と胃癌細胞株ＮＵＧＣ－４（ＪＣＲＢ、ＪＣＲＢ０８３４）、胃癌細胞株ＫＡＴＯ ＩＩＩ－ｈＣＬＤＮ１８．２および膵臓癌細胞株ＤＡＮ－Ｇ－ｈＣＬＤＮ１８．２との結合を測定した。図３は、完全ヒト抗体ＨＢ３７Ａ６がいずれも、比較的良い腫瘍細胞への特異的結合を有し、対照抗体Ｚｍａｂよりも優れることを示した。

【0208】

実施例１．７、ＣＬＤＮ１８．２抗体のインビボでの抗腫瘍効果

【0209】

１、ＤＡＮ－Ｇ－ＣＬＤＮ１８．２担腫瘍マウスモデルに対する抗体の活性

【0210】

ＨＢ３７Ａ６抗体を使用して、ヒト膵臓癌に罹患したＮＯＤ－ＳＣＩＤマウス（雌のＮＯＤ－ＳＣＩＤマウス（１５ｇ～１８ｇ）で、北京維通利華実験動物技術有限公司から購入）における抗腫瘍効果を試験した。実施例１で構築されたヒト膵臓癌細胞ＤＡＮ－Ｇ－ｈＣＬＤＮ１８．２に対して通常の継代培養を行い、後続のインビボ実験に用いた。細胞を遠心分離して収集し、ＰＢＳ（１×）でＤＡＮ－Ｇ－ｈＣＬＤＮ１８．２を分散し、１２×１０^５個／ｍＬの細胞密度である懸濁液を得た。細胞懸濁液とｍａｔｒｉｇｅｌゲルを１：１で混合し、６×１０^５個／ｍＬの細胞濃度である細胞懸濁液を調製した。０日目に細胞懸濁液０．２ｍＬを取ってＮＯＤ－ＳＣＩＤマウスの右側腹部領域に皮下接種し、ＤＡＮ－Ｇ－ＣＬＤＮ１８．２担腫瘍マウスモデルを確立した。

【0211】

腫瘍細胞を５日間接種した後、各マウスの腫瘍体積を検出し、腫瘍体積が４３．３６ｍｍ^３～８９．４７ｍｍ^３の範囲にあるマウスを、腫瘍体積の大きさによってＳ形群分けた（１群あたり８匹）。

【0212】

各マウスにｈＩｇＧ（Ｅｑｕｉｔｅｃｈ－Ｂｉｏ、ロット番号１６０３０８－０２）、ＨＢ３７Ａ６および対照抗体Ｚｍａｂを投与し、投与量は、１回あたり１０ｍｇ／ｋｇであり、それぞれ接種後の５日目、９日目、１２日目、１６日目に投与し、マウスの腫瘍体積を週に２回～３回監視した。腫瘍体積の測定：ノギスで腫瘍の最大長軸（Ｌ）および最大幅軸（Ｗ）を測定し、腫瘍体積をＶ＝Ｌ×Ｗ^２／２という式により算出した。電子天びんを用いて体重を測定した。

【0213】

２、ＮＵＣＧ－４担腫瘍マウスモデルに対する抗体の活性

【0214】

ＨＢ３７Ａ６抗体を選択して、ヒト胃癌に罹患したＮＯＧマウス（雌のＮＯＧマウス（１５ｇ～１８ｇ）で、北京維通利華実験動物技術有限公司から購入）における抗腫瘍効果を試験した。ＰＢＭＣ細胞（Ａｌｌｃｅｌｌｓ）を蘇生し、細胞を遠心分離して収集し、２．５×１０^６個／ｍＬの細胞密度である細胞懸濁液になるように、ＰＢＳ（１×）でＰＢＭＣ細胞を分散し、０日目に０．２ｍＬの細胞懸濁液を取ってＮＯＧマウスの眼静脈注射に用いて、ＮＯＧヒト化マウスモデルを確立した。

【0215】

ＮＵＧＣ－４細胞に対して通常の蘇生継代培養を行い、後続のインビボ実験に用いた。細胞を遠心分離して収集し、１２×１０^６個／ｍＬの細胞密度になるように、ＰＢＳ（１×）でＮＵＧＣ－４細胞を分散し、ｍａｔｒｉｇｅｌゲルと１：１で混合し、６×１０^６個／ｍＬの細胞濃度である細胞懸濁液を調製した。５日目に細胞懸濁液０．２ｍＬを取ってＮＯＧヒト化マウスの右側腹部領域に皮下接種し、ＮＵＣＧ－４担腫瘍マウスモデルを確立した。

【0216】

腫瘍細胞を接種した後の１日目にランダムに群分け、１群あたり７匹で、各マウスにｈＩｇＧ（Ｅｑｕｉｔｅｃｈ－Ｂｉｏ、ロット番号１６０３０８－０２、対照群）、ＨＢ３７Ａ６および陽性対照抗体Ｚｍａｂ（治療群）を投与し、投与量は、１回あたり１０ｍｇ／ｋｇであり、それぞれ接種後の１日目、５日目、８日目、１２日目に投与し、マウス腫瘍体積と体重を週に２回～３回監視した。腫瘍体積の測定：ノギスで腫瘍の最大長軸（Ｌ）および最大幅軸（Ｗ）を測定し、腫瘍体積をＶ＝Ｌ×Ｗ^２／２という式により算出した。電子天びんを用いて体重を測定した。接種後の２６日目に、相対腫瘍抑制率（ＴＧＩ％）を算出し、計算式は、

【0217】

ＴＧＩ％＝１００％×（対照群腫瘍体積ー治療群腫瘍体積）／（対照群腫瘍体積ー対照群投与前腫瘍体積）であった。

【0218】

３、結果

【0219】

結果は図４に示すように、ＨＢ３７Ａ６および対照抗体Ｚｍａｂがヒト膵臓癌ＤＡＮ－Ｇ－ＣＬＤＮ１８．２マウスモデルでいずれも腫瘍成長を抑制することができ、ＨＢ３７Ａ６のＴＧＩが２８％、ＺｍａｂのＴＧＩが２４％であった。図５に示すように、ＨＢ３７Ａ６は、ヒト胃癌ＮＵＧＣ－４マウスモデルにおいて対照抗体Ｚｍａｂよりも優れた抗腫瘍効果を示し、ＨＢ３７Ａ６のＴＧＩが３１％、ＺｍａｂのＴＧＩが０％であった。

【0220】

実施例２．１ ＩＥＸ０１９ ＡＤＣ分子の合成

【0221】

ＩＥＸ０１９

【0222】

ＨＢ３７Ａ６に基づいて、異なる小分子化合物にカップリングしたＡＤＣの合成をさらに設計した。具体的なプロセスは以下のとおりである。

【0223】

実施例２．１．１ ＩＥＸ０１９－０２の調製

【0224】

１）．化合物６の調製

【化11】

【0225】

Ｎ_２雰囲気で、ＢＣＮ－ＯＨ（５、１．５ｇ、１０ｍｍｏｌ）のＤＣＭ（１５０ｍＬ）溶液にクロロスルホニルイソシアネート（ＣＳＩ）（０．８７ｍＬ、１．４ｇ、１０ｍｍｏｌ）、Ｅｔ_３Ｎ（２．８ｍＬ、２．０ｇ、２０ｍｍｏｌ）および２－（２－アミノエトキシ）エタノール（１．２ｍＬ、１．２６ｇ、１２ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を１０分間撹拌し、ＮＨ_４Ｃｌ水溶液（飽和、１５０ｍＬ）を加えることでクエンチした。分離後、水層をＤＣＭ（１５０ｍＬ）で抽出した。合わせた有機層を乾燥（Ｎａ_２Ｓ_Ｏ４）し、濃縮した。残留物はカラムクロマトグラフィーにより精製された。淡黄色濃厚油状生成物６（２．０６ｇ、５．７２ｍｍｏｌ、５７％）を得た。

【0226】

^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）δ（ｐｐｍ）６．０（ｂｓ、１Ｈ）、４．２８（ｄ、Ｊ＝８．２Ｈｚ、２Ｈ）、３．７８-３．７３（ｍ、２Ｈ）、３．６６-３．６１（ｍ、２Ｈ）、３．６１-３．５５（ｍ、２Ｈ）、３．３４（ｔ、Ｊ＝４．９Ｈｚ、２Ｈ）、２．３７-２．１５（ｍ、６Ｈ）、１．６４-１．４８（ｍ、２Ｈ）、１．４０（ｑｕｉｎｔｅｔ、Ｊ＝８．７Ｈｚ、１Ｈ）、１．０５-０．９２（ｍ、２Ｈ）．

【0227】

２）化合物７の調製

【化12】

【0228】

ＤＣＭ（１０ｍＬ）中の６（４７ｍｇ、０．１３ｍｍｏｌ）の撹拌溶液にＣＳＩ（１１μＬ、１８ｍｇ、０．１３ｍｍｏｌ）を加えた。３０分間後、Ｅｔ_３Ｎ（９１μＬ、６６ｍｇ、０．６５ｍｍｏｌ）およびジエタノールアミン（１６ｍｇ、０．１６ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（０．５ｍＬ）溶液を加えた。３０分間後、クロロギ酸ｐ－ニトロフェニル（５２ｍｇ、０．２６ｍｍｏｌ）およびＥｔ_３Ｎ（５４μＬ、３９ｍｇ、０．３９ｍｍｏｌ）を加えた。さらに４．５時間後、反応混合物を濃縮し、残留物はグラジエントカラムクロマトグラフィー（３３→６６％のＥｔＯＡｃ／ヘプタン（１％のＡｃＯＨ））により精製され、無色油状物７（８８ｍｇ、０．０９８ｍｍｏｌ、７５％）を得た。

【0229】

^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）δ（ｐｐｍ）８．２８-８．２３（ｍ、４Ｈ）、７．４２-７．３５（ｍ、４Ｈ）、４．５２（ｔ、Ｊ＝５．４Ｈｚ、４Ｈ）、４．３０（ｄ、Ｊ＝８．３Ｈｚ、２Ｈ）、４．２７-４．２２（ｍ、２Ｈ）、３．８６（ｔ、Ｊ＝５．３Ｈｚ、４Ｈ）、３．６９-３．６５（ｍ、２Ｈ）、３．６４-３．５９（ｍ、２Ｈ）、３．３０-３．２２（ｍ、２Ｈ）、２．３４-２．１４（ｍ、６Ｈ）、１．６２-１．４６（ｍ、２Ｈ）、１．３８（ｑｕｉｎｔｅｔ、Ｊ＝８．７Ｈｚ、１Ｈ）、１．０４-０．９２（ｍ、２Ｈ）．

【0230】

３）．化合物９の調製

【化13】

【0231】

化合物８（１６３ｍｇ、２４０μｍｏｌ）を、乾燥ＤＭＦ（０．９ｍＬ）中のメシル酸イクサノテカン（１２５ｍｇ、２３５μｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ（６１ｍｇ、８２μＬ、０．４７ｍｍｏｌ）の混合物に添加した。２０時間後、反応混合物を９ｍＬのＤＣＭに希釈し、グラジエントカラムクロマトグラフィー（０→４０％のＭｅＯＨ／ＤＣＭ）により精製され、９（１５５ｍｇ、１５９μｍｏｌ、６８％）を得た。ＬＣＭＳ（ＥＳＩ＋）Ｃ_５５Ｈ_５４ＦＮ_６Ｏ_１０ ^＋（Ｍ＋Ｈ）^＋の計算値：９７７．３９、実測値：９７７．８０。

【0232】

４）．化合物１の調製

【0233】

ＤＭＦ（１．６ｍＬ）中の化合物９（１５５ｍｇ、１５９μｍｏｌ）の溶液にＥｔ_３Ｎ（７３ｍｇ、１０１μＬ、０．７２ｍｍｏｌ）および化合物７（６５ｍｇ、７２μｍｏｌ）のＤＭＦ（１．４ｍＬ）溶液を加えた。反応混合物を２４時間撹拌し、ＤＣＭ（２０ｍＬ）で希釈し、グラジエントカラムクロマトグラフィー（０→４０％のＭｅＯＨ／ＤＣＭ）により精製され、淡黄色固体化合物１（９４ｍｇ、４４μｍｏｌ、２８％）を得た。ＬＣＭＳ（ＥＳＩ＋）Ｃ_１０２Ｈ_１１８Ｆ_２Ｎ_１６Ｏ_２９Ｓ_２ ^２＋（Ｍ／２＋Ｈ）^＋の計算値：１０６６．８８、実測値：１０６７．１２。

【0234】

５）ＨＢ３７Ａ６－（ＧｌｃＮＡｃ（Ｆｕｃ）_１－６－Ｎ_３－ＧａｌＮＡｃ）_２へのＨＢ３７Ａ６の酵素的再構成

【0235】

実施例１．３に従って、ＨＥＫ２９３細胞でＨＢ３７Ａ６を発現させ、精製した。ＰＣＴ／ＥＰ２０１７／０５２７９２に記載されるように、得られたＨＢ３７Ａ６（１６．４ｍｇ／ｍＬ）をＥｎｄｏＳＨ（１％のｗ／ｗ）とともにインキュベートし、Ａｓｎ２９７位置に－ＧｌｃＮＡｃまたはＧｌｃＮＡｃ（Ｆｕｃ）を有するトリミングされたＨＢ３７Ａ６を得た。上記トリミングされたＨＢ３７Ａ６を、ＰＣＴ／ＥＰ２０１６／０５９１９４に開示された酵素Ｈｉｓ－ＴｎＧａｌＮＡｃＴ（４．５％のｗ／ｗ）およびＰＣＴ／ＥＰ２０１６／０５９１９４に開示された６－アジド－ＧａｌＮＡｃ－ＵＤＰ（抗体に対して、２５ｅｑ（当量））（ＭｎＣｌ_２のヒスチジン（２０ｍＭ）＋ＮａＣｌ（１５０ｍＭ）を含む溶液６ｍＭ中）とともに、３０℃で１６時間インキュベートした。

【0236】

続いて、５０ｍＬのｐｒｏｔＡカラム（Ｈｉｔｒａｐ Ｍａｂｓｅｌｅｃｔ Ｓｕｒｅ、ＧＥ、１１－００３４－９５）を使用して上記で得られたインキュベーション混合物を精製した。上記で得られたインキュベーション混合物をカラムにかけ、ＴＢＳ＋０．２％のＴｒｉｔｏｎおよびＴＢＳでカラムを洗浄した。続いて、ｐＨ２．９の０．１Ｍ酢酸塩緩衝液でカラムを溶離し、ｐＨ７．２の２．５ＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌで中和した。ＰＢＳで３回透析した後、Ｖｉｖａｓｐｉｎ Ｔｕｒｂｏ １５限外ろ過装置（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を用いて、得られた（修飾された）グリコシル化抗体を３２．６ｍｇ／ｍＬに濃縮した。

【0237】

得られたグリコシル化抗体を質量分析により分析した。主なステップは以下のとおりである。質量分析前に、Ｆｃ／２断片の分析を可能にするように、ＩｄｅＳでグリコシル化抗体を処理した。２０μｇの（修飾された）グリコシル化抗体溶液およびＩｄｅＳ（Ｆａｂｒｉｃａｔｏｒ^ＴＭ）（１．２５Ｕ／μＬ）を、ｐＨ６．６のＰＢＳ中に１０μＬの総体積で３７℃で１時間インキュベートした。試料を８０μＬに希釈し、次にＪＥＯＬ ＡｃｃｕＴＯＦ（ＥＳＩ－ＴＯＦ）で分析し、Ｍａｇｔｒａｎソフトウェアを使用してデコンボリューションされたスペクトルを取得した。ＩｄｅＳ消化試料の質量分析により、得られたＨＢ３７Ａ６－（ＧｌｃＮＡｃ（Ｆｕｃ）_１－６－Ｎ_３－ＧａｌＮＡｃ）_２に対応する主な生成物が示され、観察された質量は２４３３０．４であった。

【0238】

従って、上記の結果により、２つの重鎖がいずれもＡｓｎ２９７に位置するＧｌｃＮＡｃが６－アジド－ＧａｌＮＡｃで置換された（４位置換）ＨＢ３７Ａ６－（ＧｌｃＮＡｃ（Ｆｕｃ）_１－６－Ｎ_３－ＧａｌＮＡｃ）_２を得たことが実証された。

【0239】

６）ＨＢ３７Ａ６－ＳＹＮｔｅｃａｎ Ｅ複合体（ＩＥＸ０１９－０２）の調製

【0240】

本発明による生物複合体ＩＥＸ０１９－０２は、リンカー－複合体とする化合物１（ｌｉｎｋｅｒ－ｐａｙｌｏａｄ）を、生物分子とするアジド修飾されたＨＢ３７Ａ６－（ＧｌｃＮＡｃ（Ｆｕｃ）_１－６－Ｎ_３－ＧａｌＮＡｃ）_２にカップリングすることで調製された。従って、ＨＢ３７Ａ６－（ＧｌｃＮＡｃ（Ｆｕｃ）_１－６－Ｎ_３－ＧａｌＮＡｃ）_２（１０．８ｍＬ、３５０ｍｇ、３２．６ｍｇ／ｍＬ、ｐＨ７．４のＰＢＳ）溶液に、ｐＨ７．４のＰＢＳ（８０８μＬ）、１，２－プロピレングリコール（１１．３ｍＬ）および化合物１（３５０μＬ、４０ｍＭのＤＭＦ溶液）を加えた。反応を室温で一晩インキュベートし、次にろ過し、ｐＨ７．４のＰＢＳに透析した。木炭（３５０ｍｇ）を加えた後に、室温で一晩回転させることで、残留した遊離ｐａｙｌｏａｄを除去した。遠心分離およびろ過によって木炭を除去し、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ ２６／６００ＳＥＣ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）カラムを備えたＡＫＴＡ Ｐｕｒｉｆｉｅｒ－１０（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）でＡＤＣを精製した。

【0241】

ＩｄｅＳ消化試料の質量分析は、２種類の主な生成物がいずれも得られたＡＤＣ、すなわちＨＢ３７Ａ６－ＳＹＮｔｅｃａｎ Ｅ複合体に対応することを示した。第１のピーク：観察された質量は、カップリングしたＦｃ／２断片（ｐａｙｌｏａｄの２ｘ閉鎖ラクトン型）に対応する、２６４６９ Ｄａ（計算質量は２６４６５ Ｄａ）であった。第２のピーク：観察された質量は、結合したＦｃ／２断片（ｐａｙｌｏａｄの２ｘ開放カルボン酸塩型）に対応する、２６４９９ Ｄａ（計算質量は２６５０１ Ｄａ）であった。

【0242】

調製された構造は以下のとおりであった。ＵＶ、ＳＥＣ、ＲＰ－ＨＰＬＣ、ＬＣ－ＭＳを用いてＡＤＣ生成物の濃度、ＤＡＲ値およびＳＥＣ純度を測定した。ＳＥ－ＨＰＬＣにより検出されたモノマー純度は９９％を超え、６．１２ｍｇ／ｍＬの濃度であった。

【0243】

【化14】

式中、ｑはＤＡＲ平均値を表し、例えば３～５、３．２～４．８もしくは３．５～４．５であり、例えば表２で測定された３．５２であった。

【0244】

式中、ＡｂはＨＢ３７Ａ６であった。

【0245】

実施例２．１．２ ＩＥＸ０１９－０３の調製

【化15】

【0246】

式中、ｑはＤＡＲ平均値を表し、例えば５～１１、６～１０、７～９もしくは７．５～８．５であり、例えば表２で測定された７．９であった。

【0247】

式中、ＡｂはＨＢ３７Ａ６であった。

【0248】

（ａ）還元剤溶液（水に溶解したＴＣＥＰ（Ｓｉｇｍａ、Ｃ４７０６））をＨＢ３７Ａ６溶液（ＰＢＳ緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ、１００１００２３）に溶解した抗体ＨＢ３７Ａ６）に加え、反応混合物を振とう器に２ｈ～４ｈ置き、ここで
（ｉ）ＨＢ３７Ａ６の最適な濃度は５ｍｇ／ｍＬ～１０ｍｇ／ｍＬであった。
（ｉｉ）ＴＣＥＰ／ｍＡｂの最適なモル比は４．５～６．５であった。
（ｉｉｉ）反応の最適な温度は２０℃～３７℃であった。
（ｉｖ）反応の最適なｐＨ値は一般に６．５～８．０の間であった。

【0249】

（ｂ）過剰のリンカー－毒素ＭＣ－ＧＧＦＧ－ＤＸＤ（Ｌｅｖｅｎａ ｂｉｏｐｈａｒｍａから購入し、ＳＥＴ０２１８、構造は下記のとおり）をＤＭＳＯに溶解し、ステップ（ａ）で還元された抗体のチオール基と反応させた。反応混合物を振とう器に１ｈ～２ｈ置き、ここで
（ｉ）ＤＸＤ／ｍＡｂの最適なモル比は１０．０～１２．０であった。
（ｉｉ）反応の最適な温度は２０℃～３７℃であり、
ＡＤＣ粗生成物を得た。

【0250】

（ｃ）得られたＡＤＣ粗生成物は、スピン脱塩、限外ろ過または透析により精製され、最終ＡＤＣ生成物ＩＥＸ０１９－０３を得た。

【0251】

（ｄ）ＨＩＣ、ＬＣ－ＭＳおよびＳＥＣ ＨＰＬＣを用いてＡＤＣ生成物を検出し、ＤＡＲ平均値およびＳＥＣ純度を決定した。

【0252】

【化16】

【0253】

実施例２．１．３ ＩＥＸ０１９－０４の調製

【化17】

式中、ｑはＤＡＲ平均値を表し、例えば３～５、３．２～４．８もしくは３．０～４．０であり、例えば表２で測定された３．５であった。

【0254】

式中、ＡｂはＨＢ３７Ａ６であった。

【0255】

この分子の調製は以下の方法に従って調製された。

【0256】

（ａ）還元剤溶液（水に溶解したＴＣＥＰ（Ｓｉｇｍａ、Ｃ４７０６））を抗体ＨＢ３７Ａ６溶液（ＰＢ緩衝液に溶解した抗体ＨＢ３７Ａ６）に加え、添加完了後に反応混合物を振とう器に２ｈ～４ｈ置き、ここで
（ｉ）抗体ＨＢ３７Ａ６の最適な濃度は５ｍｇ／ｍＬ～１０ｍｇ／ｍＬであった。
（ｉｉ）ＴＣＥＰ／ｍＡｂの最適なモル比は１．９～２．７であった。
（ｉｉｉ）還元反応の最適な温度は２０℃～３７℃であった。
（ｉｖ）反応の最適なｐＨ値は一般に６．５～８．０の間であった。

【0257】

（ｂ）反応基（マレイミド結合薬）を含む過剰のリンカー－ｐａｙｌｏａｄ ＭＣ－ＶＣ－ＰＡＢ－ＭＭＡＥ（Ｌｅｖｅｎａ Ｂｉｏｐｈａｒｍａから購入し、ＳＥＴ０２０１）を有機溶媒ＤＭＳＯに溶解し、ステップ（ａ）で生成された還元チオール基と反応させた。反応混合物を振とう器に１ｈ～２ｈ置いた。
（ｉ）ＭＣ－ＶＣ－ＰＡＢ－ＭＭＡＥ／ｍＡｂの最適なモル比は８．０～１０．０であった。
（ｉｉ）結合反応の最適な温度は２０℃～３７℃であった。

【0258】

（ｃ）結合反応が完了した後、アセチルシステイン溶液を加えてステップ（ｂ）の反応を停止した。混合後に、２０℃～２５℃で５分間～１５分間インキュベートした。

【0259】

（ｄ）得られたＡＤＣ粗生成物は、スピン脱塩、限外ろ過または透析により精製され、最終ＡＤＣ生成物ＩＥＸ０１９－０４を得た。

【0260】

（ｅ）ＨＩＣ、ＳＥＣ－ＨＰＬＣを用いてＡＤＣ生成物を検出し、ＤＡＲ平均値およびＳＥＣ純度を決定した。

【0261】

【化18】

【0262】

実施例２．１．４ ＩＥＸ０１９－０５の調製

【化19】

【0263】

式中、ｑはＤＡＲ平均値を表し、例えば３～５、３．２～４．８もしくは３．０～４．５であり、例えば表２で測定された３．３であった。

【0264】

式中、ＡｂはＨＢ３７Ａ６であった。

【0265】

この分子は以下の方法に従って調製された。

【0266】

（ａ）リンカー－ｐａｙｌｏａｄ ＳＭＣＣ－ＤＭ１溶液（Ｌｅｖｅｎａ Ｂｉｏｐｈａｒｍａから購入し、ＳＥＴ０１０１、ＤＭＳＯなどの有機溶媒に溶解したもの）を抗体ＨＢ３７Ａ６溶液（抗体ＨＢ３７Ａ６溶于ＰＢ緩衝液中）に加え、加えた後、反応混合物を振とう器に２ｈ～５ｈ置き、ここで
（ｉ）抗体ＨＢ３７Ａ６の最適な濃度は５ｍｇ／ｍＬ～１０ｍｇ／ｍＬであり、
（ｉｉ）リンカー－ｐａｙｌｏａｄ／ｍＡｂの最適なモル比は５．５～６．５であり、
（ｉｉｉ）反応の最適なｐＨ値は一般に６．５～８．０の間であり、
（ｉｖ）反応の最適な温度は２０℃～３７℃であり、
ＡＤＣ粗生成物を得た。

【0267】

（ｂ）得られたＡＤＣ粗生成物は、スピン脱塩、限外ろ過または透析により精製され、最終ＡＤＣ生成物ＩＥＸ０１９－０５を得た。

【0268】

（ｃ）紫外分光光度法、ＳＥＣ高速液体クロマトグラフィーを用いてＡＤＣ生成物のＤＡＲ平均値およびＳＥＣ純度を測定した。

【0269】

【化20】

【0270】

実施例２．１．５ ＩＥＸ０１９－０６の調製

【0271】

調製プロセスは、対照抗体ＩｇＧでＨＢ３７Ａ６モノクローナル抗体を置換する以外、ＩＥＸ０１９－０２と類似した。

【0272】

実施例２．１．６ ＩＥＸ０１９－０７の調製

【0273】

調製プロセスは、対照抗体ＩｇＧでＨＢ３７Ａ６モノクローナル抗体を置換する以外、ＩＥＸ０１９－０４と類似した。

【0274】

全てのモノクローナル抗体およびＡＤＣの情報を表２にまとめた。

【0275】

【表3】

【0276】

実施例２．２ ＩＥＸ０１９分子の細胞結合実験

【0277】

小分子カップリングにより標的細胞に対するＩＥＸ０１９－０１モノクローナル抗体の結合特性が変化するかどうかを検出するために、発明者らは、ＤＡＮ－Ｇ細胞株（ｈＣＬＤＮ１８．２陰性）および実施例１で調製したＤＡＮ－Ｇ－ｈＣＬＤＮ１８．２細胞株（ｈＣＬＤＮ１８．２を過剰発現）を使用し、フローサイトメトリー技術により標的に対するＩＥＸ０１９－０１およびＩＥＸ０１９－０２の親和性が検出された。実験方法は実施例１．５と同様であった。

【0278】

ＩＥＸ０１９－０１およびＩＥＸ０１９－０２はいずれも、非標的細胞ＤＡＮ－Ｇに結合しないが、ＤＡＮＧ－ｈＣＬＤＮ１８．２に対する親和性が非常に高く、抗体の結合が標的の発現特異性に依存し、かつエキサテカン（Ｅｘａｔｅｃａｎ）のカップリングが抗体の結合に影響を与えないことを示した。同時に、対照分子ＩＥＸ０１９－０６（モノクローナル抗体は、同じ技術によりエキサテカン（Ｅｘａｔｅｃａｎ）毒素にカップリングしたＩｇＧの陰性対照である）は標的細胞に結合しなかった（図６）。

【0279】

実施例２．３ ＩＥＸ０１９分子のエンドサイトーシス実験

【0280】

強いエンドサイトーシスは、ＡＤＣ薬物の重要な特性の１つである。ＡＤＣが細胞膜表面の抗原に結合した後、エンドサイトーシスによりＡＤＣ－抗原複合体が細胞に入り、標的細胞を殺傷した。従って、ＡＤＣのエンドサイトーシス効率は、腫瘍抑制効果を決定する重要な指標の１つである。

【0281】

小分子化合物にカップリングした抗体のエンドサイトーシス効率を検出するために、発明者らは、フローサイトメトリー技術により、ＤＡＮＧ－ｈＣＬＤＮＡ１８．２細胞での異なるＩＥＸ０１９分子のエンドサイトーシスが検出された。ＤＡＮＧ－ｈＣＬＤＮＡ１８．２細胞を消化した後、細胞密度を調整し、１×１０^５個細胞／ウェルで９６ウェルプレートに播種した。５００ｇで３ｍｉｎ遠心分離し、上清を捨てた。１００μＬの検出すべき分子を取って細胞を再懸濁し（５０ｎＭの分子濃度）、各試料に５回の反復を設定した（すなわち、エンドサイトーシス時間：０ｈ、１ｈ、２ｈ、３ｈ、４ｈ）。氷上に置き、１ｈインキュベートした。１ｈ後、５００ｇで３ｍｉｎ遠心分離し、上清を捨てた。各ウェルに２００μＬのＦＡＣＳ ｂｕｆｆｅｒ（１％のＦＢＳ、１×ＰＢＳ）を加え、２回洗浄した。そのうちの１セットの試料を取り、新しい９６ウェルプレートに移し、３７℃で４ｈインキュベートした。残りの試料を氷上で引き続きインキュベートした。先の操作を繰り返し、試料をそれぞれ３７℃で３ｈ、２ｈ、１ｈ、０ｈインキュベートした。特定のインキュベート時間が完了した後、５００ｇで３ｍｉｎ遠心分離し、上清を捨てた。１：４００で希釈した抗ｈＦＣ－ＰＥ抗体１００μＬ（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ）を各ウェルに加え、氷上で遮光して３０分間インキュベートした。二次抗体のインキュベートが完了した後、５００ｇで３ｍｉｎ遠心分離し、上清を捨てた。各ウェルに２００μＬのＦＡＣＳ ｂｕｆｆｅｒを加え、２回洗浄し、最後に１００μＬのＰＢＳで細胞を再懸濁し、機上検出を行った。

【0282】

実験結果は図７に示すように、３７℃での０ｈのインキュベーションをエンドサイトーシスのゼロ点として、２ｈインキュベートした後、全ての分子がエンドサイトーシスの最大限、約６０％に達し、ＩＥＸ０１９－０１に基づいて設計し合成したＡＤＣ分子が腫瘍細胞に結合した後、モノクローナル抗体と一致した強いエンドサイトーシス能力を維持することを示した。

【0283】

実施例２．４：ＩＥＸ０１９分子のインビトロ細胞殺傷効果

【0284】

ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｇ９２４２）検出試薬キットを用いて、異なるレベルのｈＣＬＤＮＡ８．２を発現する様々な細胞株における（表３）、ＡＤＣｓによる細胞生存率の影響を検出した。

【0285】

【表4】

【0286】

使用した細胞をＥＤＴＡ／Ｔｒｙｐｓｉｎで消化した後、密度を調整し、９６ウェルプレートに均一に播種し（表４）、希釈後の特定の濃度である試料ＩＥＸ０１９分子（ＩＥＸ０１９－０２、ＩＥＸ０１９－０３、ＩＥＸ０１９－０４、希釈開始濃度を１００ｎＭとし、希釈倍数は３）を添加し、ＩＥＸ０１９分子を添加していないウェルを対照とした。３７℃のインキュベーターに放置して５日間インキュベートした。５日後、各ウェルに１００μＬのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ検出試薬を加え、室温で３０ｍｉｎインキュベートし、マイクロプレートリーダーを用いて検出した。相対細胞生存率（相対細胞生存率＝試料／対照×１００％）を計算し、Ｇｒａｐｈ Ｐａｄ Ｐｒｉｓｍ８．０で曲線をフィッテイングした。

【0287】

図８に示すように、細胞株に対するＡＤＣ分子の殺傷は、表面ｈＣＬＤＮ１８．２の発現レベルに依存した。ｈＣＬＤＮＡ８．２陰性のＤＡＮＧにおいて、ＩＥＸ０１９分子は細胞生存率に顕著な影響を与えず（図８Ａ）、中程度発現レベルの細胞株（ＮＵＧＣ－４、ＳＮＵ６２０）において、ＩＥＸ０１９分子は細胞に一定の程度の殺傷を示し（図８Ｂ）、高発現細胞株ＤＡＮ－Ｇ－ｈＣＬＤＮ１８．２において、ＩＥＸ０１９分子はいずれも顕著な殺傷効果を示した（図８Ｃ）。ＩＥＸ０１９分子が良好な選択性および有効性を有することを示した。

【0288】

【表5】

【0289】

実施例２．５：バイスタンダー殺傷効果（Ｂｙｓｔａｎｄｅｒ ｋｉｌｌｉｎｇ ｅｆｆｅｃｔ）

【0290】

ＡＤＣ薬物の合成プロセスにおいて、小分子化合物は、切断可能な（ｃｌｅａｖａｂｌｅ）リンカーを介して抗体に連結し、細胞膜にエンドサイトーシスされた後、リンカーは切断され、小分子が放出されて標的細胞を死滅させた。標的細胞が死滅した後、小分子化合物は、標的細胞から細胞隙間に放出され、一定の範囲内の非標的細胞をさらに殺傷し、このような効果はバイスタンダー殺傷効果と呼ばれる。腫瘍内部の細胞は、標的発現レベルで大きく異なる（腫瘍の不均一性）ため、バイスタンダー殺傷効果は、腫瘍細胞に対する効果的な殺傷、腫瘍成長に対する抑制に非常に重要であった。

【0291】

本発明は、非標的細胞ＤＡＮ－Ｇおよび標的細胞ＤＡＮＧ－ｈＣＬＤＮ１８．２を用いて、ＩＥＸ０１９分子のバイスタンダー殺傷効果を検出した。

【0292】

細胞をＥＤＴＡ／Ｔｒｙｐｓｉｎで消化した後、密度を調整し、６ウェルの細胞培養プレートを準備し、ＤＡＮＧ細胞およびＤＡＮＧ－ｈＣＬＤＮ１８．２をそれぞれ７．５×１０^４個加え、２種類の細胞を共培養した。各ウェルに２００μＬの測定すべき試料（ＩｇＧ（配列番号２１、配列番号２２）、ＩＥＸ０１９－０２、ＩＥＸ０１９－０５、ＩＥＸ０１９－０６、エキサテカン（Ｅｘａｔｅｃａｎ）（Ｍａｃｋｌｉｎ、Ｅ８８１５３２）を加え、５０ｎＭの最終濃度であり、各試料に３個の反復を設定した。細胞培養プレートを３７℃のインキュベーターに放置し、５日間培養した。５日後、培養液上清を捨て、ＰＢＳで洗浄した後、Ｔｒｙｐｓｉｎ－ＥＤＴＡを加えて細胞を消化し、消化された全ての細胞を収集し、９６ウェルプレートに移した。フローサイトメトリー技術の抗体インキュベーションプロセスに従って、一次抗体（ＩＥＸ０１９－０１、１００ｎＭ）、二次抗体（抗ｈＦｃ－ＰＥ、ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ）とともに４℃でそれぞれインキュベートし、それぞれ１ｈおよび０．５ｈインキュベートした。ＰＢＳ洗浄後、ｌｉｖｅ／ｄｅａｄ Ｖｉｏｌｅｔ染料（Ｔｈｅｒｍｏ、Ｌ３４９６４）を１：１０００で希釈し、各ウェルに１００μＬを加え、４℃で２０ｍｉｎインキュベートした。ＰＢＳ洗浄後、１００μＬのＰＢＳで細胞を再懸濁し、機上検出を行った。ｌｉｖｅ／ｄｅａｄ染料を用いて各試料を集団に分け、ここで、ＩＥＸ０１９－０１陰性（すなわち、ｈＣＬＤＮ１８．２陰性）の集団はＤＡＮ－Ｇ細胞、ＩＥＸ０１９－０１陽性（すなわち、ｈＣＬＤＮ１８．２陽性）の細胞はＤＡＮ－Ｇ－ｈＣＬＤＮ１８．２であった。各試料中の２種類の細胞数をそれぞれ統計し、下記の方程に従って各種類の細胞の相対細胞生存率を算出し、Ｇｒａｐｈ Ｐａｄ Ｐｒｉｓｍ８．０で曲線をフィッテイングした。

【0293】

ＤＡＮＧ細胞の相対生存率＝試料群のＤＮＡＧ細胞数／ＩｇＧ群のＤＮＡＧ細胞数×１００％

【0294】

ＤＡＮＧ－ｈＣＬＤＮ１８．２細胞の相対生存率＝試料群のＤＮＡＧ－１８．２細胞数／ＩｇＧ群のＤＮＡＧ－１８．２細胞数×１００％

【0295】

ＩｇＧ群の細胞生存率を１００％とした。

【0296】

図９に示すように、陰性対照試料ＩＥＸ０１９－０６は、２種類の細胞に対していずれも殺傷効果がなく、ＩＥＸ０１９－０５分子は、切断不可能なリンカーを介してＤＭ１毒素をＩＥＸ０１９－０１モノクローナル抗体に連結し、周囲の非標的細胞を殺傷する能力がないため、ＤＡＮＧ－ｈＣＬＤＮＡ８．２細胞のみを殺傷することができ、ＤＡＮＧ細胞に影響を与えなかった。ＩＥＸ０１９－０２のみが顕著なバイスタンダー殺傷効果を有し、標的細胞および非標的細胞を同時に死滅することができる。

【0297】

実施例２．６：ＤＡＮ－Ｇ－ｈＣＬＤＮ１８．２マウス移植腫瘍モデルにおけるＩＥＸ０１９分子の抗腫瘍薬効

【0298】

ＩＥＸ０１９分子のインビボ薬効を実証するために、発明者らは、ＤＡＮＧ－ｈＣＬＤＮ１８．２細胞をＣＢ－１７－ＳＣＩＤマウスに接種し、本発明の抗体分子の抗腫瘍薬効を測定した。実験では、ＳＰＦグレードの雌ＣＢ－１７－ＳＣＩＤマウス（１４ｇ～１７ｇ、北京維通利華実験動物技術有限公司から購入）を使用し、合格証明書番号はＮＯ．１１００１１２０１１０８２２５２４６であった。

【0299】

ＤＡＮＧ－ｈＣＬＤＮ１８．２細胞を定期的に継代培養してその後のインビボ実験に使用した。遠心分離により細胞を収集し、ＰＢＳ（１×）でＤＡＮＧ－ｈＣＬＤＮ１８．２細胞を分散させ、３×１０^６個／ｍＬの細胞濃度を有する細胞懸濁液を調製した。０日目に細胞懸濁液０．２ｍＬを取ってＣＢ－１７ ＳＣＩＤマウスの右腹部領域に皮下接種し、ＤＡＮＧ－ｈＣＬＤＮ１８．２担腫瘍マウスモデルを確立した。

【0300】

腫瘍細胞を接種した５日目に、腫瘍体積が５０．１６ｍｍ^３～１３６．６８ｍｍ^３の全てのマウスを蛇形に群分けし（各６匹のマウス）、表５に示した投与量および方式で、接種後の５日目に投与し、図１０ａ、１０ｂに示すように、マウスの腫瘍体積および体重を週に２回監視し、９２日後に監視が終了した。

【0301】

接種後の５０日目に、相対腫瘍抑制率（ＴＧＩ％）を算出し、計算式は、
ＴＧＩ％＝１００％×（対照群腫瘍体積ー治療群腫瘍体積）／（対照群腫瘍体積ー対照群投与前腫瘍体積）であった。

【0302】

腫瘍体積の測定：ノギスで腫瘍の最大長軸（Ｌ）および最大幅軸（Ｗ）を測定し、腫瘍体積は、Ｖ＝Ｌ×Ｗ^２／２という式により算出した。電子天びんを用いて体重を測定した。

【0303】

【表6】

【0304】

腫瘍抑制率の結果は表６および図１０Ａに示すように、接種後の５０日目に、ＩＥＸ０１９－０１モノクローナル抗体と比較し、ＩＥＸ０１９－０２単回投与後の腫瘍抑制率が１０３．６０％に達し、ＩＥＸ０１９－０３およびＩＥＸ０１９－０４よりも明らかに優れ、腫瘍抑制率がそれぞれ９３．７０％および３５．２０％であった。接種の８２日後に、ＩＥＸ０１９－０２群のマウス腫瘍の１００％が完全に退縮した。同時に、発明者らは、マウスの体重を検出し、結果は図１０Ｂに示され、マウスの体重に有意差がなかった。

【0305】

【表7】

【0306】

実施例２．７：ＮＵＧＣ－４マウス移植腫瘍モデルにおけるＩＥＸ０１９分子の抗腫瘍薬効

【0307】

ＩＥＸ０１９分子のインビボ薬効を実証するために、発明者らは、ＮＵＧＣ－４細胞をＣＢ－１７－ＳＣＩＤマウスに接種し、本発明の抗体分子の抗腫瘍薬効を測定した。

【0308】

実験では、ＳＰＦグレードの雌ＣＢ－１７－ＳＣＩＤマウス（１４ｇ～１７ｇ、北京維通利華実験動物技術有限公司から購入）を使用し、合格証明書番号はＮＯ．１１００１１２０１１０９３４８１４１であった。

【0309】

ＮＵＧＣ－４細胞を定期的に継代培養してその後のインビボ実験に使用した。遠心分離により細胞を収集し、ＰＢＳ（１×）でＮＵＧＣ－４細胞を分散させ、３×１０^７個／ｍＬの細胞濃度を有する細胞懸濁液を調製した。０日目に細胞懸濁液０．２ｍＬを取ってＣＢ－１７ ＳＣＩＤマウスの右腹部領域に皮下接種し、ＮＵＧＣ－４担腫瘍マウスモデルを確立した。

【0310】

腫瘍細胞を接種した５日目に、腫瘍体積が７２．２５ｍｍ^３～１４０．５０ｍｍ^３の全てのマウスを蛇形に群分けし（各６匹のマウス）、表７に示した投与量および方式で、接種後の５日目に投与し、図１１Ａ、１１Ｂに示すように、マウスの腫瘍体積および体重を週に２回監視し、４０日後に監視が終了した。

【0311】

接種後の３３日目に、相対腫瘍抑制率（ＴＧＩ％）を算出し、計算式は、
ＴＧＩ％＝１００％×（対照群腫瘍体積ー治療群腫瘍体積）／（対照群腫瘍体積ー対照群投与前腫瘍体積）であった。

【0312】

腫瘍体積の測定：ノギスで腫瘍の最大長軸（Ｌ）および最大幅軸（Ｗ）を測定し、腫瘍体積は、Ｖ＝Ｌ×Ｗ^２／２という式により算出した。電子天びんを用いて体重を測定した。

【0313】

【表8】

【0314】

腫瘍抑制率の結果は表８および１１Ａに示すように、接種後の３３日目に、陰性対照ＩＥＸ０１９－０６、ＩＥＸ０１９－０２およびＩＥＸ０１９－０３の単回投与に対する腫瘍抑制率は、それぞれ８０．０４％および５４．３１％であった。同時にマウスの体重を検出し、結果は図１１Ｂに示すように、マウスの体重に有意差がなかった。

【0315】

【表9】

【0316】

実施例２．８：ＳＮＵ６２０マウス移植腫瘍モデルにおけるＩＥＸ０１９分子の抗腫瘍薬効

【0317】

ＩＥＸ０１９分子のインビボ薬効を実証するために、発明者らは、ＳＮＵ６２０細胞をＣＢ－１７－ＳＣＩＤマウスに接種し、本発明の分子（ＩＥＸ０１９－０２）の抗腫瘍薬効を測定した。実験では、ＳＰＦグレードの雌ＣＢ－１７－ＳＣＩＤマウス（１８ｇ～２０ｇ、北京維通利華実験動物技術有限公司から購入）を使用し、合格証明書番号はＮＯ．１１００１１２１１１０２１７９３６４であった。

【0318】

ＳＮＵ６２０細胞を定期的に継代培養してその後のインビボ実験に使用した。遠心分離により細胞を収集し、ＰＢＳ（１×）でＳＮＵ６２０細胞を分散させ、３×１０^７個／ｍＬの細胞濃度を有する細胞懸濁液を調製した。０日目に細胞懸濁液０．２ｍＬを取ってＣＢ－１７ ＳＣＩＤマウスの右腹部領域に皮下接種し、ＳＮＵ６２０担腫瘍マウスモデルを確立した。

【0319】

腫瘍細胞を接種した７日目に、腫瘍体積が５８．１ｍｍ^３～１１７．３ｍｍ^３の全てのマウスを蛇形に群分けし（各６匹のマウス）、表９に示した投与量および方式で、接種後の７日目に投与し、図１２ａ、１２ｂに示すように、マウスの腫瘍体積および体重を週に２回監視し、３９日後に監視が終了した。

【0320】

接種後の３９日目に、相対腫瘍抑制率（ＴＧＩ％）を算出し、計算式は、
ＴＧＩ％＝１００％×（対照群腫瘍体積ー治療群腫瘍体積）／（対照群腫瘍体積ー対照群投与前腫瘍体積）であった。

【0321】

腫瘍体積の測定：ノギスで腫瘍の最大長軸（Ｌ）および最大幅軸（Ｗ）を測定し、腫瘍体積は、Ｖ＝Ｌ×Ｗ^２／２という式により算出した。電子天びんを用いて体重を測定した。

【0322】

【表10】

【0323】

腫瘍抑制率の結果は表１０および図１２Ａに示すように、接種後の３９日目に、ｈＩｇＧと比較し、ＩＥＸ０１９－０２ １０ｍｇ／ｋｇ単回投与後の腫瘍抑制率が１４３．７７％、マウス腫瘍の１００％が完全に退縮した。マウスの体重は、各投与群においてｈＩｇＧ対照群と比較して、いずれも有意差がなかった（図１２Ｂ）。

【0324】

【表11】

【0325】

配列情報：

【表12-1】

【表12-2】

【表12-3】

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8A】

【図8B】

【図8C】

【図9】

【図10A】

【図10B】

【図11A】

【図11B】

【図12A】

【図12B】

【配列表】

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【国際調査報告】