特表 2024-546578 ムコ多糖症ＩＩＩＡ型の治療のための遺伝子療法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-12-26

(54)【発明の名称】ムコ多糖症ＩＩＩＡ型の治療のための遺伝子療法

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/864 20060101AFI20241219BHJP

   C12N 15/56 20060101ALI20241219BHJP

   C12N 7/01 20060101ALI20241219BHJP

   C12N 15/113 20100101ALI20241219BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20241219BHJP

   C12N 15/867 20060101ALI20241219BHJP

   C12N 15/861 20060101ALI20241219BHJP

   C12N 15/85 20060101ALI20241219BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20241219BHJP

   A61K 35/76 20150101ALI20241219BHJP

   A61P 25/14 20060101ALI20241219BHJP

   A61P 25/08 20060101ALI20241219BHJP

   A61K 9/10 20060101ALI20241219BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20241219BHJP

   A61K 38/46 20060101ALI20241219BHJP

   A61P 3/00 20060101ALI20241219BHJP

【ＦＩ】

C12N15/864 100Z

C12N15/56 ZNA

C12N7/01

C12N15/113 Z

C12N15/63 Z

C12N15/867 Z

C12N15/861 Z

C12N15/85 Z

C12N5/10

A61K35/76

A61P25/14

A61P25/08

A61K9/10

C12N15/864 Z

A61K48/00

A61K38/46

A61P3/00

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024528581

(86)(22)【出願日】2022-11-11

(85)【翻訳文提出日】2024-07-11

(86)【国際出願番号】 US2022079701

(87)【国際公開番号】W WO2023086928

(87)【国際公開日】2023-05-19

(31)【優先権主張番号】63/278,775

(32)【優先日】2021-11-12

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】63/288,293

(32)【優先日】2021-12-10

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＬＡＢＲＡＳＯＬ

２．ＴＷＥＥＮ

(71)【出願人】

【識別番号】502409813

【氏名又は名称】ザ・トラステイーズ・オブ・ザ・ユニバーシテイ・オブ・ペンシルベニア

(74)【代理人】

【識別番号】110000741

【氏名又は名称】弁理士法人小田島特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】オルドー，ジュリエット

(72)【発明者】

【氏名】ウイルソン，ジェームス・エム

(72)【発明者】

【氏名】ラッスーリ－テイラー，レイダ

(72)【発明者】

【氏名】ドー，フン

(72)【発明者】

【氏名】タスケ，スティーブン

【テーマコード（参考）】

4B065

4C076

4C084

4C087

【Ｆターム（参考）】

4B065AA90X

4B065AA90Y

4B065AA95X

4B065AA95Y

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065CA24

4B065CA31

4B065CA44

4C076AA22

4C076BB13

4C076BB21

4C076CC21

4C084AA13

4C084BA01

4C084BA22

4C084BA23

4C084BA44

4C084CA18

4C084DC22

4C084MA21

4C084MA55

4C084MA56

4C084MA66

4C084NA14

4C084ZA02

4C084ZA06

4C084ZC21

4C087AA01

4C087AA02

4C087AA03

4C087BC83

4C087CA09

4C087CA12

4C087MA21

4C087MA55

4C087MA56

4C087MA66

4C087NA14

4C087ZA02

4C087ZA06

4C087ZC21

(57)【要約】

本明細書で提供されるのは、ＡＡＶカプシドと、ＡＡＶカプシド内にパッケージングされたベクターゲノムと、を含む、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）であり、ベクターゲノムが、ＡＡＶ５’逆位末端反復（ＩＴＲ）、任意選択的に安定化アミノ酸変化を含む機能性ｈＳＧＳＨをコードする操作された核酸配列、標的細胞においてｈＳＧＳＨの発現を指示する調節配列、及びＡＡＶ３’ＩＴＲを含む。また提供されるのは、本明細書に記載のｒＡＡＶを製剤緩衝液中に含む薬学的組成物、及びＭＰＳ ＩＩＩＡを有すると診断されたヒト対象を治療する方法である。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシド及びベクターゲノムを含む、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）であって、前記ベクターゲノムが、ＡＡＶ５’逆位末端反復（ＩＴＲ）、発現カセット、及びＡＡＶ３’ＩＴＲを含み、前記発現カセットが、機能性ヒトＮ－スルホグリコサミンスルホヒドロラーゼ（ｈＳＧＳＨ）をコードする操作された核酸配列を含み、前記ｈＳＧＳＨコード配列が、シグナルペプチド配列及び成熟ｈＳＧＳＨコード配列を含み、前記成熟ｈＳＧＳＨコードが、配列番号１６の配列の核酸配列、又は（ａ）配列番号２３をコードする、配列番号１６に対して少なくとも８５％同一であるか、若しくは（ｂ）配列番号２３をコードする、配列番号１６に対して少なくとも９９％同一である、核酸配列を有し、前記ｈＳＧＳＨコード配列が、細胞において前記ｈＳＧＳＨの発現を指示する調節性制御配列と操作可能に連結されている、組換えアデノ随伴ウイルス。

【請求項2】

配列番号１６に対して９９％同一の前記成熟ｈＳＧＳＨコード配列が、配列番号２２であり、配列番号２３をコードする（ｈＳＧＳＨ．Ａ４８２Ｙ－Ｅ４８８Ｖ）、請求項１に記載のｒＡＡＶ。

【請求項3】

前記成熟ｈＳＧＳＨコード配列が、配列番号１６である、請求項１に記載のｒＡＡＶ。

【請求項4】

前記成熟ｈＳＧＳＨコード配列が、配列番号１６の配列の核酸配列、又は配列番号２３をコードする、配列番号１６に対して８５％同一である核酸配列を有する、請求項１に記載のｒＡＡＶ。

【請求項5】

前記シグナルペプチド配列が、配列番号３１の核酸配列を有する天然シグナル配列、又は配列番号３２をコードする、配列番号３１に対して少なくとも約９５％同一の配列である、請求項１に記載のｒＡＡＶ。

【請求項6】

前記ｈＳＧＳＨコード配列が、前記ｈＳＧＳＨのアミノ末端のコード配列に融合された外因性シグナル配列を更に含む、請求項１～４のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ。

【請求項7】

前記外因性シグナル配列が、配列番号２９の核酸配列を有するＢｉＰシグナルペプチド配列、又は配列番号３０をコードする、配列番号２９に対して少なくとも約９５％同一の配列である、請求項６に記載のｒＡＡＶ。

【請求項8】

前記ＢｉＰシグナルペプチドを含む前記ｈＳＧＳＨコード配列が、配列番号１８の核酸配列、又は配列番号１９をコードする、配列番号１８に対して少なくとも約９５％同一の配列を有する、請求項６又は７に記載のｒＡＡＶ。

【請求項9】

前記ＢｉＰシグナルペプチドを含む前記ｈＳＧＳＨが、配列番号２４の核酸配列、又は配列番号２５をコードする、配列番号２４に対して少なくとも約９５％同一の配列を有する、請求項６又は７に記載のｒＡＡＶ。

【請求項10】

前記ｈＳＧＳＨコード配列が、前記ｈＳＧＳＨのカルボキシ末端のコード配列に融合されたｖＩＧＦ２ペプチド配列を更に含む、請求項１～９のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ。

【請求項11】

前記ｈＳＧＳＨコード配列が、５’末端に前記外因性シグナル配列及び３’末端に前記ｖＩＧＦ２を含む、請求項１０に記載のｒＡＡＶ。

【請求項12】

前記ＢｉＰシグナル配列及びｖＩＧＦ２ペプチドを含む前記ｈＳＧＳＨコード配列が、
配列番号２０の核酸配列、又は配列番号２１をコードする、配列番号２０に対して少なくとも約９５％同一の配列を有する、請求項１１に記載のｒＡＡＶ。

【請求項13】

前記ＢｉＰシグナル配列及びｖＩＧＦ２ペプチドを含む前記ｈＳＧＳＨコード配列が、配列番号２６の核酸配列、又は配列番号２７をコードする、配列番号２６に対して少なくとも約９５％同一の配列を有する、請求項１１に記載のｒＡＡＶ。

【請求項14】

前記調節性制御配列が、ＣＭＶ ＩＥエンハンサ及びニワトリ－ベータアクチン（ＣＢ）プロモータを含むＣＢ７プロモータを含む、請求項１～１３のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ。

【請求項15】

前記調節性制御配列が、コザック配列、イントロン、エンハンサ、ＴＡＴＡシグナル、及びポリＡ配列のうちの１つ以上を更に含む、請求項１～１３のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ。

【請求項16】

前記調節性制御配列が、ニワトリベータアクチンイントロン、ウサギグロビンポリアデニル化配列のうちの１つ以上を含む、請求項１５に記載のｒＡＡＶ。

【請求項17】

前記調節性制御配列が、変異型ＷＰＲＥ因子を更に含む、請求項１～１６のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ。

【請求項18】

前記ｒＡＡＶベクターゲノムが、配列番号７の核酸配列（ＣＢ７．ＣＩ．ＢｉＰ．ｈＳＧＳＨｃｏｖ１－Ａ４８２Ｙ＿Ｅ４８８Ｖ．ｖＩＧＦ２．ＷＰＲＥ．ｒＢＧ）を含む、請求項１～１７のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ。

【請求項19】

前記ベクターゲノムが、後根神経節（ｄｒｇ）特異的ｍｉＲＮＡ標的配列の少なくとも１、２、３、４つ以上のタンデム反復を更に含み、前記少なくとも１、２、３、４つ以上のタンデム反復が、少なくとも第１のｍｉＲＮＡ標的配列、少なくとも第２、少なくとも第３、及び／又は少なくとも第４のｍｉＲＮＡ標的配列を含む、請求項１～１７のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ。

【請求項20】

前記ｍｉＲＮＡ標的配列が、ｍｉＲ１８２を標的とする、少なくとも第１のｍｉＲＮＡ標的配列、少なくとも第２、少なくとも第３、及び／又は少なくとも第４のｍｉＲＮＡ標的配列を含む、請求項１９に記載のｒＡＡＶ。

【請求項21】

前記ｍｉＲＮＡ標的配列が、ｍｉＲ１８３を標的とする、少なくとも第１のｍｉＲＮＡ標的配列、少なくとも第２、少なくとも第３、及び／又は少なくとも第４のｍｉＲＮＡ標的配列を含む、請求項１９に記載のｒＡＡＶ。

【請求項22】

前記発現カセットｍＲＮＡ又はＤＮＡプラス鎖の前記少なくとも第１、少なくとも第２、少なくとも第３、及び／又は少なくとも第４のｍｉＲＮＡ標的配列の前記ｍｉＲＮＡが、ＡＧＴＧＴＧＡＧＴＴＣＴＡＣＣＡＴＴＧＣＣＡＡＡ（ｍｉＲ１８２、配列番号４７）である、請求項１９又は２０に記載のｒＡＡＶ。

【請求項23】

前記発現カセットｍＲＮＡ又はＤＮＡプラス鎖の前記少なくとも第１、少なくとも第２、少なくとも第３、及び／又は少なくとも第４のｍｉＲＮＡ標的配列の前記ｍｉＲＮＡが、ＡＧＴＧＡＡＴＴＣＴＡＣＣＡＧＴＧＣＣＡＴＡ（ｍｉＲ１８３、配列番号２８）である、請求項１９又は２１に記載のｒＡＡＶ。

【請求項24】

前記ベクターゲノムが、同じであっても異なっていてもよい、少なくとも第１、少なく
とも第２、少なくとも第３、少なくとも第４、少なくとも第５、少なくとも第６、少なくとも第７、及び少なくとも第８のｍｉＲＮＡ標的配列を含む少なくとも８つのタンデム反復を更に含み、ｍｉＲ１８３又はｍｉＲ１８２を標的とする、請求項１～１７又は１９～２２のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ。

【請求項25】

前記少なくとも８つのタンデム反復が、後根神経節（ｄｒｇ）特異的ｍｉＲＮＡ１８２標的配列の少なくとも４つのタンデム反復、及びｄｒｇ特異的ｍｉＲＮＡ１８３標的配列の少なくとも４つのタンデム反復を含む、請求項２４に記載のｒＡＡＶ。

【請求項26】

前記発現カセットｍＲＮＡ又はＤＮＡプラス鎖の前記少なくとも第１、少なくとも第２、少なくとも第３、少なくとも第４、少なくとも第５、少なくとも第６、少なくとも第７、及び／又は少なくとも第８のｍｉＲＮＡ標的配列の前記ｄｒｇ特異的ｍｉＲＮＡ標的配列が、（ｉ）ＡＧＴＧＡＡＴＴＣＴＡＣＣＡＧＴＧＣＣＡＴＡ（ｍｉＲ１８３、配列番号２８）、及び（ｉｉ）ＡＧＴＧＴＧＡＧＴＴＣＴＡＣＣＡＴＴＧＣＣＡＡＡ（ｍｉＲ１８２、配列番号４７）である、請求項２４又は２５に記載のｒＡＡＶ。

【請求項27】

前記発現カセットｍＲＮＡ又はＤＮＡプラス鎖の前記少なくとも第１、少なくとも第２、少なくとも第３、及び／又は少なくとも第４のｍｉＲＮＡ標的配列の前記ｄｒｇ特異的ｍｉＲＮＡ標的配列が、ＡＧＴＧＴＧＡＧＴＴＣＴＡＣＣＡＴＴＧＣＣＡＡＡ（ｍｉＲ１８２、配列番号４７）であり、前記発現カセットｍＲＮＡ又はＤＮＡプラス鎖の少なくとも第５、少なくとも第６、少なくとも第７、及び／又は少なくとも第８のｍｉＲＮＡ標的配列が、ＡＧＴＧＡＡＴＴＣＴＡＣＣＡＧＴＧＣＣＡＴＡ（ｍｉＲ１８３、配列番号２８）である、請求項２４～２６のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ。

【請求項28】

前記ｍｉＲＮＡ標的配列のうちの２、３、４つ以上、又は前記少なくとも８つが、スペーサによって分離されている、請求項１９～２５のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ。

【請求項29】

前記スペーサが、独立して、（Ａ）ＧＧＡＴ、（Ｂ）ＣＡＣＧＴＧ、（Ｃ）ＧＣＡＴＧＣ、（Ｄ）ｇｃｇｇｃｃｇｃ、（Ｅ）ｃｇａｔ、（Ｆ）ａｔｃｇｇｔ、及び／又は（Ｇ）ｔｃａｃのうちの１つ以上から選択される、請求項２８に記載のｒＡＡＶ。

【請求項30】

前記ｍｉＲＮＡ標的配列間に位置する前記スペーサが、前記第１のｍｉＲＮＡ標的配列の３’及び／又は最後のｍｉＲＮＡ標的配列の５’に位置し得る、請求項２９に記載のｒＡＡＶ。

【請求項31】

後根神経節（ｄｒｇ）特異的ｍｉＲＮＡ標的配列の前記少なくとも１、２、３、４つ以上、又は前記少なくとも８つのタンデム反復が、前記ｈＳＧＳＨの３’非翻訳領域（ＵＴＲ）と操作可能に連結されている、請求項１９～３０のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ。

【請求項32】

後根神経節（ｄｒｇ）特異的ｍｉＲＮＡ標的配列の前記少なくとも１、２、３、４つ以上、又は前記少なくとも８つのタンデム反復が、前記ｈＳＧＳＨの５’非翻訳領域（ＵＴＲ）と操作可能に連結されている、請求項１９～３０のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ。

【請求項33】

前記ｒＡＡＶベクターゲノムが、配列番号１の核酸配列（ＣＢ７．ＣＩ．ＢｉＰ．ｈＳＧＳＨｃｏｖ１（Ａ４８２Ｙ－Ｅ４８８Ｖ）．ｖＩＧＦ２．ＷＰＲＥ．４ｘｍｉＲ１８３．ｒＢＧ）を含む、請求項１～１７、１９～２２のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ。

【請求項34】

前記ｒＡＡＶベクターゲノムが、配列番号４の核酸配列（ＣＢ７．ＣＩ．ＢｉＰ．ｈＳＧＳＨｃｏｖ１－Ａ４８２Ｙ＿Ｅ４８８Ｖ．ｖＩＧＦ２．ｒＢＧ）を含む、請求項１～１６のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ。

【請求項35】

前記ｒＡＡＶベクターゲノムが、配列番号１０の核酸配列（ＡＡＶ．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＳＧＳＨｃｏＶ１．ｒＢＧ）を含む、請求項１～１６のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ。

【請求項36】

前記ｒＡＡＶベクターゲノムが、配列番号１３の核酸配列（ＣＢ７．ＣＩ．ｈＳＧＳＨｃｏＶ１－４ｘｍｉＲ１８３．ｒＢＧ）を含む、請求項１～１７又は１９～２２のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ。

【請求項37】

前記ｒＡＡＶベクターゲノムが、配列番号４０の核酸（ＣＢ７．ＣＩ．ＢｉＰ．ｈＳＧＳＨｃｏｖ１－Ａ４８２Ｙ＿Ｅ４８８Ｖ．ｖＩＧＦ２．ＷＰＲＥ．４ｘｍｉＲ１８２．ｒＢＧ）を含む、請求項１～１７又は１９～２２のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ。

【請求項38】

前記ｒＡＡＶベクターゲノムが、配列番号３７の核酸配列（ＣＢ７．ＣＩ．Ｂｉｐ．ｈＳＧＳＨｃｏｖ１－Ａ４８２Ｙ＿Ｅ４８８Ｖ．ｖＩＧＦ２．ＷＰＲＥ．４ｘｍｉＲ１８２．４ｘｍｉＲ１８３．ｒＢＧ）を含む、請求項１～１７又は１９～３０のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ。

【請求項39】

前記ＡＡＶカプシドが、クレードＦ ＡＡＶである、請求項１～３８のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ。

【請求項40】

前記ＡＡＶカプシドが、ＡＡＶｈｕ６８である、請求項１～３８のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ。

【請求項41】

前記ＡＡＶカプシドが、ＡＡＶｒｈ９１である、請求項１～３８のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ。

【請求項42】

ムコ多糖症ＩＩＩＡ型（ＭＰＳ ＩＩＩＡ又はサンフィリッポ症候群Ａ型）の治療における使用のための、及び／又はムコ多糖症ＩＩＩＡ型の治療を必要とする対象における歩行若しくは可動性の改善、振戦の低減、けいれんの低減、姿勢の改善、若しくは視力喪失の進行の低減における使用のためのものである、請求項１～４１のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ。

【請求項43】

請求項１～４２のいずれか一項に記載のｒＡＡＶのストックと、水性懸濁媒体と、を含む、組成物。

【請求項44】

前記懸濁液が、脳室内（ＩＣＶ）、髄腔内（ＩＴ）、大槽内、又は静脈内（ＩＶ）注射用に製剤化されている、請求項４３に記載の組成物。

【請求項45】

請求項１～４２のいずれか一項に記載のｒＡＡＶを、製剤緩衝液中に含む、薬学的組成物。

【請求項46】

脳室内（ＩＣＶ）、髄腔内（ＩＴ）、大槽内、又は静脈内（ＩＶ）注射を介した送達用に製剤化されている、請求項４５に記載の薬学的組成物。

【請求項47】

脳質量１グラム当たり１×１０^９ＧＣ～脳質量１グラム当たり約１×１０^１３ＧＣの用量で投与可能である、請求項４５又は４６に記載の薬学的組成物。

【請求項48】

約７．２８～約７．３２のｐＨを有するように製剤化されている、請求項４５～４７のいずれか一項に記載の薬学的組成物。

【請求項49】

発現カセットを含むベクターであって、前記発現カセットが、ｈＳＧＳＨコード配列を含み、前記ｈＳＧＳＨコード配列が、前記ｈＳＧＳＨ発現を指示する調節性制御配列の制御下で、機能性ヒトＮ－スルホグリコサミンスルホヒドロラーゼ（ｈＳＧＳＨ）をコードする核酸配列であり、前記ｈＳＧＳＨコード配列が、シグナルペプチド配列及び成熟ｈＳＧＳＨを含み、前記成熟ｈＳＧＳＨコード配列が、配列番号１６、若しくは配列番号１６に対して少なくとも約９５％同一の配列、又は配列番号２２、若しくは配列番号２２に対して少なくとも約９５％同一の配列から選択される、ベクター。

【請求項50】

前記ベクターが、組換えパルボウイルス、組換えレンチウイルス、組換えレトロウイルス、若しくは組換えアデノウイルスから選択されるウイルスベクター、又は裸のＤＮＡ、裸のＲＮＡから選択される非ウイルスベクターである、請求項４９に記載のベクター。

【請求項51】

操作された機能性ヒトＮ－スルホグリコサミンスルホヒドロラーゼ（ｈＳＧＳＨ）遺伝子及び調節性制御配列を含む発現カセットを含む、核酸分子であって、前記発現カセットが、５’逆位末端反復（ＩＴＲ）及び３’ＩＴＲに隣接し、前記操作されたｈＳＧＳＧ遺伝子が、機能性ｈＳＧＳＨをコードし、前記ｈＳＧＳＨコード配列が、シグナルペプチド配列及び成熟ｈＳＧＳＨを含み、前記成熟ｈＳＧＳＨコード配列が、配列番号１６及び２２から選択される、核酸分子。

【請求項52】

前記シグナル配列が、配列番号２９及び３１から選択される、請求項５１に記載の核酸配列。

【請求項53】

前記発現カセットが、配列番号８、２、５、１１、及び１４から選択される、請求項５１に記載の核酸配列。

【請求項54】

請求項５１～５３のいずれか一項に記載の核酸分子を含む、パッケージング宿主細胞。

【請求項55】

前記パッケージング宿主細胞内でｒｅｐタンパク質を発現する配列と操作可能に連結されたＡＡＶ ｒｅｐコード配列と、前記パッケージング宿主細胞内でＡＡＶカプシドタンパク質を発現する配列と操作可能に連結されたＡＡＶカプシドコード配列と、前記発現カセット及びＩＴＲを前記ＡＡＶカプシド内にパッケージングすることを可能にするのに必要なヘルパーウイルス機能と、を更に含む、請求項５４に記載のパッケージング宿主細胞。

【請求項56】

前記ＡＡＶカプシドが、ＡＡＶｈｕ６８及びＡＡＶｒｈ９１から選択される、請求項５４又は５５に記載のパッケージング宿主細胞。

【請求項57】

請求項１～３１のいずれか一項に記載のｒＡＡＶを産生するのに有用なｒＡＡＶ産生系であって、前記産生系が、
（ａ）ＡＡＶカプシドタンパク質をコードする核酸配列と、
（ｂ）ベクターゲノムと、
（ｃ）前記ＡＡＶカプシド内への前記ベクターゲノムのパッケージングを可能にするのに十分なＡＡＶ ｒｅｐ機能及びヘルパー機能と、を含む細胞培養物を含む、ｒＡＡＶ産生系。

【請求項58】

前記ＡＡＶカプシドが、ＡＡＶｈｕ６８及びＡＡＶｒｈ９１から選択される、請求項５７に記載のｒＡＡＶ産生系。

【請求項59】

前記ベクターゲノムが、配列番号７、１、４、１０、及び１３から選択される、請求項５７に記載のｒＡＡＶ産生系。

【請求項60】

ＭＰＳ ＩＩＩＡを有すると診断されたヒト対象を治療する、及び／又はＭＰＳ ＩＩＩＡの治療を必要とする対象における歩行若しくは可動性を改善する、振戦を低減させる、けいれんを低減させる、姿勢を改善する、若しくは視力喪失の進行を低減させる方法であって、前記対象に、製剤緩衝液中、脳質量１グラム当たり１×１０^９ＧＣ～脳質量１グラム当たり約１×１０^１３ＧＣの用量で、請求項１～４２のいずれか一項に記載のｒＡＡＶの懸濁液を投与することを含む、方法。

【発明の詳細な説明】

【背景技術】

【0001】

ムコ多糖症ＩＩＩａ型（ＭＰＳＩＩＩａ、ＭＰＳＩＩＩＡ、又はサンフィリッポ症候群Ａ型）は、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）へパラン硫酸のリソソーム異化に関与する酵素Ｎ－スルホグリコサミン（ｓｕｌｆｏｇｌｙｃｏｓａｍｉｎｅ）スルホヒドロラーゼ（ＳＧＳＨ）の欠乏によって引き起こされる、常染色体劣性遺伝障害である。この欠乏は、中枢神経系における未分解のヘパラン硫酸、並びにガングリオシドＧＭ２及びＧＭ３の細胞内蓄積をもたらし、神経の機能障害及び神経炎症を引き起こす。この疾患は、最初に、３歳頃に認知遅延、続いて異常な多動性及び攻撃的挙動として現れる。次いで、疾患の進行によって、最初の１０年間に運動及び神経機能の喪失に至り、１５歳の中央値での死亡を伴う。

【0002】

症状を緩和し、生活の質を改善するために、（発作用の抗けいれん剤などの）医薬品が使用される。造血幹細胞移植は、神経心理学的悪化を顕著に緩和しないようである。ＭＰＳ ＩＩＩにおける欠乏に対して組換え酵素が利用可能であるが、酵素は、中枢神経系に入ることが可能ではないので、酵素補充療法（ＥＲＴ）での治験は、予後の改善に好ましくなかった。例えば、Ｇｅｒｍａｉｎｅ Ｌ Ｄｅｆｅｎｄｉ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｏｆ
Ｍｕｃｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｏｓｉｓ Ｔｙｐｅ ＩＩＩ．Ｍｅｄｓｃａｐｅ．Ｍａｒｃｈ ２１，２０１４を参照されたい。食事の変更は、疾患進行を防止することはないが、牛乳、糖分、及び乳製品を制限することは、過剰な粘液を有する一部の人々の助けとなっている。

【0003】

様々な遺伝子療法アプローチは、ＭＰＳＩＩＩＡの有効な治療の潜在性を有すると記載されている。しかしながら、現在の構築物は、所望のレベルの治療効果を達成しておらず、サンフィリッポ症候群の治療のための標準的な治療又は治癒は存在しない。当該技術分野には、ＭＰＳ ＩＩＩＡの効果的な治療のための組成物及び方法に対する継続的なニーズが存在する。

【発明の概要】

【0004】

本明細書で提供されるのは、標的細胞において発現を指示する調節配列である、機能性ヒトＮ－スルホグリコサミンスルホヒドロラーゼ（ｈＳＧＳＨ）をコードする操作された核酸配列を含む、治療用組換え複製欠損性アデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）である。一態様では、本明細書で提供されるのは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシド及びベクターゲノムを含む、ｒＡＡＶであって、ベクターゲノムが、ＡＡＶ５’逆位末端反復（ＩＴＲ）、発現カセット、及びＡＡＶ３’ＩＴＲを含み、発現カセットが、機能性ヒトＮ－スルホグリコサミンスルホヒドロラーゼ（ｈＳＧＳＨ）をコードする操作された核酸配列を含み、ｈＳＧＳＨコード配列が、シグナルペプチド配列及び成熟ｈＳＧＳＨコード配列を含み、成熟ｈＳＧＳＨコードが、配列番号１６の配列の核酸配列、又は（ａ）配列番号２３をコードする、配列番号１６に対して少なくとも８５％同一であるか、若しくは（ｂ）配列番号２３をコードする、配列番号１６に対して少なくとも９９％同一である、核酸配列を有し、ｈＳＧＳＨコード配列が、細胞においてｈＳＧＳＨの発現を指示する調節性制御配列と操作可能に連結されている、ｒＡＡＶである。ある特定の実施形態では、ｒＡＡＶは、配列番号２３をコードする配列番号２２の成熟ｈＳＧＳＨコード配列（ｈＳＧＳＨ．Ａ４８２Ｙ－Ｅ４８８Ｖ）を含む。ある特定の実施形態では、シグナルペプチド配列は、配列番号３１の核酸配列を有する天然シグナル配列、又は配列番号３２をコードする、配列番号３１に対して少なくとも約９５％同一の配列である。ある特定の実施形態では、シグナルペプチドは、外因性シグナルペプチドであり、外因性シグナルペプチド配列が、配列番号２９の核酸配列を有するＢｉＰシグナルペプチド配列、又は配列番号３０をコー
ドする、配列番号２９に対して少なくとも約９５％同一の配列である。ある特定の実施形態では、ｈＳＨＳＨは、配列番号１８の核酸配列、又は配列番号１９をコードする、配列番号１８に対して少なくとも約９５％同一の配列を有する。ある特定の実施形態では、ｈＳＨＳＨは、配列番号２４の核酸配列、又は配列番号２５をコードする、配列番号２４に対して少なくとも約９５％同一の配列を有する。ある特定の実施形態では、成熟ｈＳＧＳＨのアミノ末端（成熟ｈＳＧＳＨコード配列の５’末端）にＢｉＰシグナル配列と、成熟ｈＳＧＳＨのカルボキシ末端（成熟ｈＳＧＳＨコード配列の３’末端）にｖＩＧＦ２ペプチドと、を含む、ｈＳＧＳＨコード配列は、及び配列番号２０の核酸配列、又は配列番号２１をコードする、配列番号２０に対して少なくとも約９５％同一の配列を有する。ある特定の実施形態では、ｈＳＧＳＨコード配列は、配列番号２６の核酸配列、又は配列番号２７をコードする、配列番号２６に対して少なくとも約９５％同一の配列を有する。いくつかの実施形態では、調節配列は、ＣＢ７プロモータ、コザック配列、イントロン、エンハンサ、ＴＡＴＡシグナル、及びポリアデニル化（ポリＡ）シグナル配列のうちの１つ以上を更に含み、任意選択的に、調節配列が、及びＷＰＲＥ因子を更に含む。

【0005】

ある特定の実施形態では、ベクターゲノムは、核酸配列（ｉ）ＣＢ７．ＣＩ．ＢＩＰ．ｈＳＧＳＨｃｏｖ１－Ａ４８２Ｙ＿Ｅ４８８Ｖ．ｖＩＧＦ２．ｒＢＧ配列番号３）、（ｉｉ）ＣＢ７．ＣＩ．ＢＩＰ．ｈＳＧＳＨｃｏｖ１－Ａ４８２Ｙ＿Ｅ４８８Ｖ．ｖＩＧＦ２．ＷＰＲＥ．ｒＢＧ配列番号７）、（ｉｉｉ）ＣＢ７．ＣＩ．ｈＳＧＳＨｃｏＶ１．ｒＢＧ配列番号１０）、（ｉｖ）ＣＢ７．ＣＩ．ｈＳＧＳＨｃｏＶ１－４ｘｍｉＲ１８３．ｒＢＧ配列番号１３）、（ｖ）ＣＢ７．ＣＩ．ＢＩＰ．ｈＳＧＳＨｃｏｖ１－Ａ４８２Ｙ＿Ｅ４８８Ｖ．ｖＩＧＦ２．ＷＰＲＥ．４ｘｍｉＲ１８２．ｒＢＧ配列番号４０）、（ｖｉ）ＣＢ７．ＣＩ．ＢＩＰ．ｈＳＧＳＨｃｏｖ１（Ａ４８２Ｙ－Ｅ４８８Ｖ）．ｖＩＧＦ２．ＷＰＲＥ．４ｘｍｉＲ１８３．ｒＢＧ配列番号１）、又は（ｖｉｉ）ＣＢ７．ＣＩ．ＢＩＰ．ｈＳＧＳＨｃｏｖ１－Ａ４８２Ｙ＿Ｅ４８８Ｖ．ｖＩＧＦ２．ＷＰＲＥ．４ｘｍｉＲ１８２．４ｘｍｉＲ１８３．ｒＢＧ（配列番号１４又は配列番号１４に対して少なくとも９５％同一の配列）を有する。ある特定の実施形態では、カプシドは、ＡＡＶｈｕ６８カプシド、ＡＡＶｈｕ９５カプシド、又はＡＡＶｒｈ９１カプシドである。

【0006】

更なる態様では、本明細書で提供されるのは、本明細書に記載のｒＡＡＶ又はベクターと、水性懸濁媒体と、を含む、組成物及び薬学的組成物である。ある特定の実施形態では、ｒＡＡＶ又はその組成物は、ムコ多糖症ＩＩＩ Ａ型（ＭＰＳ ＩＩＩＡ又はサンフィリッポ症候群Ａ型）の治療における使用のための、及び／又はムコ多糖症ＩＩＩ Ａ型の治療を必要とする対象における歩行若しくは可動性の改善、振戦の低減、けいれんの低減、姿勢の改善、若しくは視力喪失の進行の低減における使用のためのものである。

【0007】

別の態様では、ＭＰＳ ＩＩＩＡを有する対象を治療するか、又はＭＰＳ ＩＩＩＡの症状を緩和するか、又はＭＰＳ ＩＩＩＡの進行を遅延させる方法が提供される。方法は、有効量の本明細書に記載のｒＡＡＶ又はベクターを、それを必要とする対象に投与することを含む。ある特定の実施形態では、懸濁液は、静脈内送達、髄腔内投与、大槽内投与、又は脳室内投与用に製剤化されている。ある特定の実施形態では、懸濁液は、脳質量１グラム当たり１×１０^９ＧＣ～脳質量１グラム当たり約１×１０^１３ＧＣの用量での投与用に製剤化されている。

【0008】

ある特定の実施形態では、本明細書で提供されるのは、配列番号２、５、８、１１、及び１４から選択される発現カセットを含む、核酸分子である。ある特定の実施形態では、核酸分子は、プラスミドである。ある特定の実施形態では、発現カセット、ベクターゲノム、又はプラスミドを含む、パッケージング細胞が提供される。

【0009】

本発明のこれらの態様及び他の態様は、以下の本発明の詳細な記載から明らかである。

【図面の簡単な説明】

【0010】

【図1A】野生型（ＷＴ）成熟ＳＧＳＨコード配列を含み、内因性シグナル配列又は結合免疫グロブリンタンパク質（ＢｉＰ）シグナル配列、リンカー、ｖＩＧＦ２ペプチド（すなわち、ＣＩ－ＭＰＲに結合するペプチド）、及び／又はリソソーム切断配列のいずれかを更に含む、様々な設計されたｈＳＧＳＨ構築物を示す。

【図1B】ウェスタンブロットを使用して分析した、トランスフェクション後３日目のＨＥＫ２９３細胞培地中に分泌されたＳＧＳＨの発現レベルを示す。

【図1C】正規化されたＳＧＳＨ分泌レベルとしてプロットした、定量化されたＳＧＳＨ発現レベル（ウェスタンブロット分析から；図１Ｂ）を示す。

【図2A】ウェスタンブロットを使用して分析した、トランスフェクション後４日目のＨＥＫ２９３細胞培地中に分泌されたＳＧＳＨの発現レベルを示す。

【図2B】正規化されたＳＧＳＨ分泌レベルとしてプロットした、定量化されたＳＧＳＨ発現レベル（ウェスタンブロット分析から；図２Ａ）を示す。

【図2C】ＢｉＰシグナル配列及びｖＩＧＦ２ペプチドを含む構築物での使用のための、更に操作された成熟ＳＧＳＨコード配列の概略図を示す。

【図3A】試験の７日目の、ＡＡＶｈｕ６８．ｈＳＧＳＨ（１×１０^１０ＧＣ又は１×１０^１１ＧＣ）を投与したマウスから収集した血清試料からのＳＧＳＨ酵素活性を示す。

【図3B】試験の２８日目の、ＡＡＶｈｕ６８．ｈＳＧＳＨ（１×１０^１１ＧＣ又は１×１０^１１ＧＣ）を投与したマウスから収集した血清試料からのＳＧＳＨ酵素活性を示す。

【図4A】１×１０^１０ＧＣ及び１×１０^１１ＧＣを投与したマウスから収集したホモジネート肝臓組織試料からのＳＧＳＨ酵素活性を示す。

【図4B】１×１０^１０ＧＣ及び１×１０^１１ＧＣを投与したマウスから収集したホモジネート脳組織試料からのＳＧＳＨ酵素活性を示す。

【図5A】１×１０^１０ＧＣ及び１×１０^１１ＧＣの用量でＡＡＶｈｕ６８．ｈＳＧＳＨを投与したマウスからの肝臓組織ホモジネート試料から分析した、ＳＧＳＨの発現レベルを示す。

【図5B】ウェスタンブロット（図５Ａに示される）によって分析した、ＳＧＳＨの定量化された発現レベルを示す。

【図6A】ＷＰＲＥを含むＡＡＶｈｕ６８．ｈＳＧＳＨの投与後の、皮質におけるＳＧＳＨの発現及び定量化を示す。

【図6B】ＷＰＲＥを含むＡＡＶｈｕ６８．ｈＳＧＳＨの投与後の、小脳におけるＳＧＳＨの発現及び定量化を示す。

【図6C】ＷＰＲＥを含むＡＡＶｈｕ６８．ｈＳＧＳＨの投与後の、海馬におけるＳＧＳＨの発現及び定量化を示す。

【図6D】ＷＰＲＥを含むＡＡＶｈｕ６８．ｈＳＧＳＨの投与後の、脳幹におけるＳＧＳＨの発現及び定量化を示す。

【図7A】１×１０^１０ＧＣ～１×１０^１１ＧＣの用量でＡＡＶｈｕ６８．ｈＳＧＳＨを投与したマウスから収集した肝臓組織試料から分析した、ｎｇ／ｇとしてプロットした、ＳＧＳＨタンパク質濃度の結果を示す。

【図7B】高用量のＡＡＶｈｕ６８．ｈＳＧＳＨ（図７Ａ、１×１０^１１ＧＣ）を投与したマウスから収集した肝臓試料に対して実施した、ＳＧＳＨ酵素活性（蛍光アッセイを使用して測定される）とシグナルペプチドアッセイとの間の相関を示す。

【図8A】低用量（１×１０^１０）のＡＡＶｈｕ６８．ｈＳＧＳＨを投与したＭＰＳ ＩＩＩＡ ＳＧＳＨ ＫＯマウスにおける免疫蛍光及び組織化学分析を使用したＬＡＭＰ１定量を介して調べた、リソソーム区画低減のエンドポイント分析を示す。群１（Ｇ１）＝ＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ｈＳＧＳＨｃｏＶ１、Ｇ２＝ＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＢＩＰ－ｈＳＧＳＨｃｏＶ１、Ｇ３＝ＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＢＩＰ－ｈＳＧＳＨｃｏＶ１－ｖＩＧＦ２、Ｇ４＝ＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＢＩＰ－ｈＳＧＳＨ（Ａ４８２Ｙ Ｅ４８８Ｖ）ｃｏＶ１、Ｇ５＝ＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＢＩＰ－ｈＳＧＳＨ（Ａ４８２Ｙ Ｅ４８８Ｖ）ｃｏＶ１－ｖＩＧＦ２、Ｇ６＝ＫＯマウスＰＢＳ対照、Ｇ７＝ＷＴマウスＰＢＳ対照。小脳におけるＬＡＭＰ１陽性細胞の平均サイズ（μｍ^２）を示す。

【図8B】低用量（１×１０^１０）のＡＡＶｈｕ６８．ｈＳＧＳＨを投与したＭＰＳ ＩＩＩＡ ＳＧＳＨ ＫＯマウスにおける免疫蛍光及び組織化学分析を使用したＬＡＭＰ１定量を介して調べた、リソソーム区画低減のエンドポイント分析を示す。群１（Ｇ１）＝ＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ｈＳＧＳＨｃｏＶ１、Ｇ２＝ＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＢＩＰ－ｈＳＧＳＨｃｏＶ１、Ｇ３＝ＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＢＩＰ－ｈＳＧＳＨｃｏＶ１－ｖＩＧＦ２、Ｇ４＝ＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＢＩＰ－ｈＳＧＳＨ（Ａ４８２Ｙ Ｅ４８８Ｖ）ｃｏＶ１、Ｇ５＝ＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＢＩＰ－ｈＳＧＳＨ（Ａ４８２Ｙ Ｅ４８８Ｖ）ｃｏＶ１－ｖＩＧＦ２、Ｇ６＝ＫＯマウスＰＢＳ対照、Ｇ７＝ＷＴマウスＰＢＳ対照。小脳におけるＬＡＭＰ１面積パーセントを示す。

【図8C】低用量（１×１０^１０）のＡＡＶｈｕ６８．ｈＳＧＳＨを投与したＭＰＳ ＩＩＩＡ ＳＧＳＨ ＫＯマウスにおける免疫蛍光及び組織化学分析を使用したＬＡＭＰ１定量を介して調べた、リソソーム区画低減のエンドポイント分析を示す。群１（Ｇ１）＝ＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ｈＳＧＳＨｃｏＶ１、Ｇ２＝ＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＢＩＰ－ｈＳＧＳＨｃｏＶ１、Ｇ３＝ＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＢＩＰ－ｈＳＧＳＨｃｏＶ１－ｖＩＧＦ２、Ｇ４＝ＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＢＩＰ－ｈＳＧＳＨ（Ａ４８２Ｙ Ｅ４８８Ｖ）ｃｏＶ１、Ｇ５＝ＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＢＩＰ－ｈＳＧＳＨ（Ａ４８２Ｙ Ｅ４８８Ｖ）ｃｏＶ１－ｖＩＧＦ２、Ｇ６＝ＫＯマウスＰＢＳ対照、Ｇ７＝ＷＴマウスＰＢＳ対照。脳幹におけるＬＡＭＰ１陽性細胞の平均サイズ（μｍ^２）を示す。

【図8D】低用量（１×１０^１０）のＡＡＶｈｕ６８．ｈＳＧＳＨを投与したＭＰＳ ＩＩＩＡ ＳＧＳＨ ＫＯマウスにおける免疫蛍光及び組織化学分析を使用したＬＡＭＰ１定量を介して調べた、リソソーム区画低減のエンドポイント分析を示す。群１（Ｇ１）＝ＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ｈＳＧＳＨｃｏＶ１、Ｇ２＝ＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＢＩＰ－ｈＳＧＳＨｃｏＶ１、Ｇ３＝ＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＢＩＰ－ｈＳＧＳＨｃｏＶ１－ｖＩＧＦ２、Ｇ４＝ＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＢＩＰ－ｈＳＧＳＨ（Ａ４８２Ｙ Ｅ４８８Ｖ）ｃｏＶ１、Ｇ５＝ＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＢＩＰ－ｈＳＧＳＨ（Ａ４８２Ｙ Ｅ４８８Ｖ）ｃｏＶ１－ｖＩＧＦ２、Ｇ６＝ＫＯマウスＰＢＳ対照、Ｇ７＝ＷＴマウスＰＢＳ対照。脳幹におけるＬＡＭＰ１面積パーセントを示す。

【図8E】低用量（１×１０^１０）のＡＡＶｈｕ６８．ｈＳＧＳＨを投与したＭＰＳ ＩＩＩＡ ＳＧＳＨ ＫＯマウスにおける免疫蛍光及び組織化学分析を使用したＬＡＭＰ１定量を介して調べた、リソソーム区画低減のエンドポイント分析を示す。群１（Ｇ１）＝ＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ｈＳＧＳＨｃｏＶ１、Ｇ２＝ＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＢＩＰ－ｈＳＧＳＨｃｏＶ１、Ｇ３＝ＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＢＩＰ－ｈＳＧＳＨｃｏＶ１－ｖＩＧＦ２、Ｇ４＝ＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＢＩＰ－ｈＳＧＳＨ（Ａ４８２Ｙ Ｅ４８８Ｖ）ｃｏＶ１、Ｇ５＝ＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＢＩＰ－ｈＳＧＳＨ（Ａ４８２Ｙ Ｅ４８８Ｖ）ｃｏＶ１－ｖＩＧＦ２、Ｇ６＝ＫＯマウスＰＢＳ対照、Ｇ７＝ＷＴマウスＰＢＳ対照。皮質におけるＬＡＭＰ１陽性細胞の平均サイズ（μｍ^２）を示す。

【図8F】低用量（１×１０^１０）のＡＡＶｈｕ６８．ｈＳＧＳＨを投与したＭＰＳ ＩＩＩＡ ＳＧＳＨ ＫＯマウスにおける免疫蛍光及び組織化学分析を使用したＬＡＭＰ１定量を介して調べた、リソソーム区画低減のエンドポイント分析を示す。群１（Ｇ１）＝ＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ｈＳＧＳＨｃｏＶ１、Ｇ２＝ＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＢＩＰ－ｈＳＧＳＨｃｏＶ１、Ｇ３＝ＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＢＩＰ－ｈＳＧＳＨｃｏＶ１－ｖＩＧＦ２、Ｇ４＝ＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＢＩＰ－ｈＳＧＳＨ（Ａ４８２Ｙ Ｅ４８８Ｖ）ｃｏＶ１、Ｇ５＝ＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＢＩＰ－ｈＳＧＳＨ（Ａ４８２Ｙ Ｅ４８８Ｖ）ｃｏＶ１－ｖＩＧＦ２、Ｇ６＝ＫＯマウスＰＢＳ対照、Ｇ７＝ＷＴマウスＰＢＳ対照。皮質におけるＬＡＭＰ１面積パーセントを示す。

【図9A】高用量（１×１０^１１）のＡＡＶｈｕ６８．ｈＳＧＳＨを投与したＭＰＳ ＩＩＩＡ ＳＧＳＨ ＫＯマウスにおける免疫蛍光及び組織化学分析を使用したＬＡＭＰ１定量を介して調べた、リソソーム区画低減のエンドポイント分析を示す。図８と同様のＧ６及びＧ７（ＫＯ及びＷＴ ＰＢＳ対照）、Ｇ８＝ＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ｈＳＧＳＨｃｏＶ１、Ｇ１１＝ＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＢＩＰ－ｈＳＧＳＨ（Ａ４８２Ｙ Ｅ４８８Ｖ）、Ｇ１２＝ＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＢＩＰ－ｈＳＧＳＨ（Ａ４８２Ｙ Ｅ４８８Ｖ）ｃｏＶ１－ｖＩＧＦ２。小脳におけるＬＡＭＰ１陽性細胞の平均サイズ（μｍ^２）を示す。

【図9B】高用量（１×１０^１１）のＡＡＶｈｕ６８．ｈＳＧＳＨを投与したＭＰＳ ＩＩＩＡ ＳＧＳＨ ＫＯマウスにおける免疫蛍光及び組織化学分析を使用したＬＡＭＰ１定量を介して調べた、リソソーム区画低減のエンドポイント分析を示す。図８と同様のＧ６及びＧ７（ＫＯ及びＷＴ ＰＢＳ対照）、Ｇ８＝ＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ｈＳＧＳＨｃｏＶ１、Ｇ１１＝ＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＢＩＰ－ｈＳＧＳＨ（Ａ４８２Ｙ Ｅ４８８Ｖ）、Ｇ１２＝ＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＢＩＰ－ｈＳＧＳＨ（Ａ４８２Ｙ Ｅ４８８Ｖ）ｃｏＶ１－ｖＩＧＦ２。小脳におけるＬＡＭＰ１面積パーセントを示す。

【図9C】高用量（１×１０^１１）のＡＡＶｈｕ６８．ｈＳＧＳＨを投与したＭＰＳ ＩＩＩＡ ＳＧＳＨ ＫＯマウスにおける免疫蛍光及び組織化学分析を使用したＬＡＭＰ１定量を介して調べた、リソソーム区画低減のエンドポイント分析を示す。図８と同様のＧ６及びＧ７（ＫＯ及びＷＴ ＰＢＳ対照）、Ｇ８＝ＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ｈＳＧＳＨｃｏＶ１、Ｇ１１＝ＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＢＩＰ－ｈＳＧＳＨ（Ａ４８２Ｙ Ｅ４８８Ｖ）、Ｇ１２＝ＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＢＩＰ－ｈＳＧＳＨ（Ａ４８２Ｙ Ｅ４８８Ｖ）ｃｏＶ１－ｖＩＧＦ２。脳幹におけるＬＡＭＰ１陽性細胞の平均サイズ（μｍ^２）を示す。

【図9D】高用量（１×１０^１１）のＡＡＶｈｕ６８．ｈＳＧＳＨを投与したＭＰＳ ＩＩＩＡ ＳＧＳＨ ＫＯマウスにおける免疫蛍光及び組織化学分析を使用したＬＡＭＰ１定量を介して調べた、リソソーム区画低減のエンドポイント分析を示す。図８と同様のＧ６及びＧ７（ＫＯ及びＷＴ ＰＢＳ対照）、Ｇ８＝ＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ｈＳＧＳＨｃｏＶ１、Ｇ１１＝ＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＢＩＰ－ｈＳＧＳＨ（Ａ４８２Ｙ Ｅ４８８Ｖ）、Ｇ１２＝ＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＢＩＰ－ｈＳＧＳＨ（Ａ４８２Ｙ Ｅ４８８Ｖ）ｃｏＶ１－ｖＩＧＦ２。脳幹におけるＬＡＭＰ１面積パーセントを示す。

【図9E】高用量（１×１０^１１）のＡＡＶｈｕ６８．ｈＳＧＳＨを投与したＭＰＳ ＩＩＩＡ ＳＧＳＨ ＫＯマウスにおける免疫蛍光及び組織化学分析を使用したＬＡＭＰ１定量を介して調べた、リソソーム区画低減のエンドポイント分析を示す。図８と同様のＧ６及びＧ７（ＫＯ及びＷＴ ＰＢＳ対照）、Ｇ８＝ＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ｈＳＧＳＨｃｏＶ１、Ｇ１１＝ＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＢＩＰ－ｈＳＧＳＨ（Ａ４８２Ｙ Ｅ４８８Ｖ）、Ｇ１２＝ＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＢＩＰ－ｈＳＧＳＨ（Ａ４８２Ｙ Ｅ４８８Ｖ）ｃｏＶ１－ｖＩＧＦ２。皮質におけるＬＡＭＰ１陽性細胞の平均サイズ（μｍ^２）を示す。

【図9F】高用量（１×１０^１１）のＡＡＶｈｕ６８．ｈＳＧＳＨを投与したＭＰＳ ＩＩＩＡ ＳＧＳＨ ＫＯマウスにおける免疫蛍光及び組織化学分析を使用したＬＡＭＰ１定量を介して調べた、リソソーム区画低減のエンドポイント分析を示す。図８と同様のＧ６及びＧ７（ＫＯ及びＷＴ ＰＢＳ対照）、Ｇ８＝ＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ｈＳＧＳＨｃｏＶ１、Ｇ１１＝ＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＢＩＰ－ｈＳＧＳＨ（Ａ４８２Ｙ Ｅ４８８Ｖ）、Ｇ１２＝ＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＢＩＰ－ｈＳＧＳＨ（Ａ４８２Ｙ Ｅ４８８Ｖ）ｃｏＶ１－ｖＩＧＦ２。皮質におけるＬＡＭＰ１面積パーセントを示す。

【図9H】マン－ホイットニー試験を使用して１か月目に測定した、２～３か月齢のマウスにおける２×１０^１０ＧＣの用量での、図８Ａ～図８Ｆに定義されるＧ１、Ｇ２、及びＧ３の皮質におけるＬＡＭＰ１面積パーセントを示す。

【図9I】マン－ホイットニー試験を使用して１か月目に測定した、２～３か月齢のマウスにおける２×１０^１０ＧＣの用量でのＧ１、Ｇ２、及びＧ３の小脳におけるＬＡＭＰ－１面積パーセントを示す。

【図9J】マン－ホイットニー試験を使用して１か月目に測定した、２～３か月齢のマウスにおける２×１０^１０ＧＣの用量でのＧ１、Ｇ２、及びＧ３の海馬におけるＬＡＭＰ－１面積パーセントを示す。

【図10A】雄及び雌のマウスの脳におけるＳＧＳＨ活性及びＧＡＧ低減を示す。活性としてプロットした、脳におけるＳＧＳＨ活性（ｎｍｏｌ／ｍＬ／時間）を示す。

【図10B】雄及び雌のマウスの脳におけるＳＧＳＨ活性及びＧＡＧ低減を示す。対数活性としてプロットした、脳におけるＳＧＳＨ活性を示す。

【図10C】雄及び雌のマウスの脳におけるＳＧＳＨ活性及びＧＡＧ低減を示す。タンパク質１ｍｇ当たりのＧＡＧ（ＨＳ）ｎｇとしてプロットした、脳におけるＧＡＧレベルを示す。

【図11A】雄及び雌のマウスの脊髄におけるＧＡＧ低減におけるＳＧＳＨ活性を示す。活性としてプロットした、脊髄におけるＳＧＳＨ活性（ｎｍｏｌ／ｍＬ／時間）を示す。

【図11B】雄及び雌のマウスの脊髄におけるＧＡＧ低減におけるＳＧＳＨ活性を示す。対数活性としてプロットした、脊髄におけるＳＧＳＨ活性を示す。

【図11C】雄及び雌のマウスの脊髄におけるＧＡＧ低減におけるＳＧＳＨ活性を示す。タンパク質１ｍｇ当たりのＧＡＧ（ＨＳ）ｎｇとしてプロットした、脊髄におけるＧＡＧレベルを示す。

【図12A】雄及び雌のマウスの肝臓におけるＧＡＧ低減におけるＳＧＳＨ活性を示す。活性としてプロットした、肝臓おけるＳＧＳＨ活性（ｎｍｏｌ／ｍＬ／時間）を示す。

【図12B】雄及び雌のマウスの肝臓におけるＧＡＧ低減におけるＳＧＳＨ活性を示す。対数活性としてプロットした、肝臓におけるＳＧＳＨ活性を示す。

【図12C】雄及び雌のマウスの肝臓におけるＧＡＧ低減におけるＳＧＳＨ活性を示す。タンパク質１ｍｇ当たりのＧＡＧ（ＨＳ）ｎｇとしてプロットした、肝臓におけるＧＡＧレベルを示す。

【図13A】ＩＣＶ注射後７日目に測定した、活性としてプロットした、血清におけるＳＧＳＨ活性（ｎｍｏｌ／ｍＬ／時間）を示す。

【図13B】ＩＣＶ注射後７日目の対数活性としてプロットした、血清におけるＳＧＳＨ活性（ｎｍｏｌ／ｍＬ／時間）を示す。

【図13C】ＩＣＶ注射後１か月目に測定した活性としてプロットした、血漿におけるＳＧＳＨレベル活性（ｎｍｏｌ／ｍＬ／時間）を示す。

【図13D】ＩＣＶ注射後１か月目に測定した対数活性としてプロットした、血漿におけるＳＧＳＨレベル活性（ｎｍｏｌ／ｍＬ／時間）を示す。

【図14A】タンパク質１ｍｇ当たりのｐｍｏｌ ＧＭ３としてプロットした、マウス脳における総ＧＭ３のレベルを示す。

【図14B】タンパク質１ｍｇ当たりの対数スケールのｐｍｏｌ ＧＭ３としてポットした、マウス脳における総ＧＭ３のレベルを示す。

【図15A】髄質、小脳、視床、前頭皮質で測定したｎｍｏｌ／ｍｇ／時間としてプロットした、未治療ＮＨＰ脳切片におけるＳＧＳＨベースライン活性のレベルを示す。

【図15B】脊髄頸部、胸部、腰部、及び後根神経節（ＤＲＧ）頸部、腰部、及び胸部切片で測定したｎｍｏｌ／ｍｇ／時間としてプロットした、未治療ＮＨＰ脊髄切片におけるＳＧＳＨベースライン活性のレベルを示す。

【図15C】操作されたペプチドを含む、ＡＡＶｈｕ６８．ｈＳＧＳＨ、ＡＡＶｒｈ９１．ｈＳＧＳＨ、又はＡＡＶｈｕ６８ｈＳＧＳＨの送達後の軸索変性を示す。後根神経節（ＤＲＧ）壊死平均を示す。

【図15D】操作されたペプチドを含む、ＡＡＶｈｕ６８．ｈＳＧＳＨ、ＡＡＶｒｈ９１．ｈＳＧＳＨ、又はＡＡＶｈｕ６８ｈＳＧＳＨの送達後の軸索変性を示す。脊髄軸索変性平均を示す。

【図15E】操作されたペプチドを含む、ＡＡＶｈｕ６８．ｈＳＧＳＨ、ＡＡＶｒｈ９１．ｈＳＧＳＨ、又はＡＡＶｈｕ６８ｈＳＧＳＨの送達後の軸索変性を示す。正中神経軸索変性平均を示す。

【図16】ＡＡＶベクターゲノム内にＷＴ ＳＧＳＨ構築物、操作されたＳＧＳＨ構築物、又はＷＰＲＥ因子を更に含む操作されたＳＧＳＨ構築物を含む、ＡＡＶ．ｈＳＧＳＨで治療した神経球におけるＡＦＵ（８００／７００ｎｍ）としてプロットした、様々なＭＯＩでのＳＧＳＨ導入遺伝子発現レベルを示す。

【図17A】治療したマウス脳におけるＳＧＳＨ活性を示す。

【図17B】脳におけるＧＡＧ（ＨＳ）レベルを示す。

【図17C】マウス脳における総ＧＭ３を示す。これらの結果は、操作された候補へのＷＰＲＥの添加が、ＷＴ構築物と同様のレベルまで発現を救済し、同等又はより良好な保管クリアランスを可能にすることを示す。

【図18A】Ｇ１（ＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ｈＳＧＳＨｃｏＶ１）、Ｇ２（ＡＡＶｒｈ９１．ＣＢ７．ｈＳＧＳＨｃｏＶ１）、及びＧ４（ＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＢＩＰ－ｈＳＧＳＨ（Ａ４８２Ｙ Ｅ４８８Ｖ）ｃｏＶ１－ｖＩＧＦ２．ＷＰＲＥ）のバックグラウンドに対して比較した、治療したＮＨＰ小脳脳組織におけるＳＧＳＨ活性を示す。

【図18B】Ｇ１（ＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ｈＳＧＳＨｃｏＶ１）、Ｇ２（ＡＡＶｒｈ９１．ＣＢ７．ｈＳＧＳＨｃｏＶ１）、及びＧ４（ＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＢＩＰ－ｈＳＧＳＨ（Ａ４８２Ｙ Ｅ４８８Ｖ）ｃｏＶ１－ｖＩＧＦ２．ＷＰＲＥ）のバックグラウンドに対して比較した、治療したＮＨＰ髄質脳組織におけるＳＧＳＨ活性を示す。

【図18C】Ｇ１（ＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ｈＳＧＳＨｃｏＶ１）、Ｇ２（ＡＡＶｒｈ９１．ＣＢ７．ｈＳＧＳＨｃｏＶ１）、及びＧ４（ＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＢＩＰ－ｈＳＧＳＨ（Ａ４８２Ｙ Ｅ４８８Ｖ）ｃｏＶ１－ｖＩＧＦ２．ＷＰＲＥ）のバックグラウンドに対して比較した、治療したＮＨＰ前頭皮質脳組織におけるＳＧＳＨ活性を示す。

【図18D】Ｇ１（ＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ｈＳＧＳＨｃｏＶ１）、Ｇ２（ＡＡＶｒｈ９１．ＣＢ７．ｈＳＧＳＨｃｏＶ１）、及びＧ４（ＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＢＩＰ－ｈＳＧＳＨ（Ａ４８２Ｙ Ｅ４８８Ｖ）ｃｏＶ１－ｖＩＧＦ２．ＷＰＲＥ）のバックグラウンドに対して比較した、治療したＮＨＰ視床脳組織におけるＳＧＳＨ活性を示す。

【図19A】Ｇ１（ＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ｈＳＧＳＨｃｏＶ１）、Ｇ２（ＡＡＶｒｈ９１．ＣＢ７．ｈＳＧＳＨｃｏＶ１）、及びＧ４（ＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＢＩＰ－ｈＳＧＳＨ（Ａ４８２Ｙ Ｅ４８８Ｖ）ｃｏＶ１－ｖＩＧＦ２．ＷＰＲＥ）のバックグラウンドに対して比較した、治療したＮＨＰ脊髄切片（ＳＣ頸部）におけるＳＧＳＨ活性を示す。

【図19B】Ｇ１（ＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ｈＳＧＳＨｃｏＶ１）、Ｇ２（ＡＡＶｒｈ９１．ＣＢ７．ｈＳＧＳＨｃｏＶ１）、及びＧ４（ＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＢＩＰ－ｈＳＧＳＨ（Ａ４８２Ｙ Ｅ４８８Ｖ）ｃｏＶ１－ｖＩＧＦ２．ＷＰＲＥ）のバックグラウンドに対して比較した、治療したＮＨＰ脊髄切片（ＳＣ胸部）におけるＳＧＳＨ活性を示す。

【図19C】Ｇ１（ＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ｈＳＧＳＨｃｏＶ１）、Ｇ２（ＡＡＶｒｈ９１．ＣＢ７．ｈＳＧＳＨｃｏＶ１）、及びＧ４（ＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＢＩＰ－ｈＳＧＳＨ（Ａ４８２Ｙ Ｅ４８８Ｖ）ｃｏＶ１－ｖＩＧＦ２．ＷＰＲＥ）のバックグラウンドに対して比較した、治療したＮＨＰ脊髄切片（ＳＣ腰部）におけるＳＧＳＨ活性を示す。

【図20A】治療したＮＨＰ血漿におけるＳＧＳＨ活性を示す。

【図20B】治療したＣＳＦにおけるＳＧＳＨ活性を示す。

【図21A】ＮＨＰ血漿中の総抗ｈＳＧＳＨ ＩｇＧ力価を示す。

【図21B】ＣＳＦにおける総ａｎｔｏ－ｈＳＧＳＨ力価を示す。

【図22A】左正中神経におけるＮＰ（Ａｍｐでの神経極性）としてプロットした、神経伝導速度（ＮＣＶ）の結果を示す。

【図22B】右正中神経におけるＮＰ（Ａｍｐでの神経極性）としてプロットした、神経伝導速度（ＮＣＶ）の結果を示す。

【図22C】左正中神経における速度としてプロットした、神経伝導速度（ＮＣＶ）の結果を示す。

【図22D】右正中神経における速度としてプロットした、神経伝導速度（ＮＣＶ）の結果を示す。

【図23】治療したＮＨＰ中の血清Ｎｆｌを示し、血清ＮｆＬが、組織病理学的軸索変性の重症度と一致することを示す。

【発明を実施するための形態】

【0011】

本明細書で提供されるのは、ムコ多糖症ＩＩＩａ型（ＭＰＳ ＩＩＩＡ）の治療に、及び／又はＭＰＳ ＩＩＩＡの症状を緩和するのに有用な、組成物及び組成物の方法である。これらの組成物は、機能性ヒトＮ－スルホグリコサミンスルホヒドロラーゼ（ｈＳＧＳＨ）をコードする核酸配列と、標的細胞において核酸配列の発現を指示する調節配列と、を含み、ｈＳＧＳＨコード配列が、シグナルペプチド配列及び成熟ｈＳＧＳＨコード配列を含み、成熟ｈＳＧＳＨコードが、配列番号１６の配列の核酸配列、又は（ａ）配列番号２３をコードする、配列番号１６に対して少なくとも８５％同一であるか、若しくは（ｂ）配列番号２３をコードする、配列番号１６に対して少なくとも９９％同一である、核酸配列を有する。

【0012】

一実施形態では、本明細書に記載の組成物及び方法は、機能性ｈＳＧＳＨの発現のための、核酸配列、発現カセット、ベクター、組換えウイルス、他の組成物、及び方法を含む。別の実施形態では、本明細書に記載の組成物及び方法は、機能性ヒトＳＧＳＨをコードする核酸配列を含む組成物を生成するための、核酸配列、発現カセット、ベクター、組換えウイルス、宿主細胞、他の組成物、及び方法を含む。更に別の実施形態では、本明細書に記載の組成物及び方法は、ＭＰＳ ＩＩＩＡの治療のために、対象に機能性ｈＳＧＳＨをコードする核酸配列を送達するための、核酸配列、発現カセット、ベクター、組換えウイルス、他の組成物、及び方法を含む。一実施形態では、本明細書に記載の組成物及び方法は、中枢神経系（ＣＮＳ）に治療レベルのＳＧＳＨを提供するのに有用である。追加的に又は代替的に、本明細書に記載の組成物及び方法は、例えば、血液、肝臓、腎臓、又は末梢神経系などの末梢に治療レベルのＳＧＳＨを提供するのに有用である。ある特定の実施形態では、本明細書に記載のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターに基づく方法は、ＳＧＳＨタンパク質の発現を必要とする対象にそれを提供することによって、ＳＧＳＨの所望の機能を回復するか、ＭＰＳ ＩＩＩＡに関連付けられる症状を緩和するか、ＭＰＳ
ＩＩＩＡに関連するバイオマーカを改善するか、又はＭＰＳ ＩＩＩＡに対する他の治療（複数可）を促進するのを助ける、新たな治療選択肢を提供する。

【0013】

本明細書で使用される場合、「治療レベル」という用語は、健康な対照の少なくとも約５％、約１０％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約１００％、１００％超、約２倍、約３倍、又は約５倍の酵素活性を意味する。ＳＧＳＨ酵素活性を測定するための好適なアッセイは、本明細書に記載されている。いくつかの実施形態では、かかる治療レベルのＳＧＳＨは、ＭＰＳ ＩＩＩ－Ａに関連する症状の緩和、ＭＰＳ ＩＩＩＡに関連する疾患バイオマーカの改善、又はＭＰＳ ＩＩＩＡ、例えば、脳脊髄液（ＣＳＦ）、血清、尿、及び／若しくは他の生物学的試料中のＧＡＧレベルに対する他の治療（複数可）の促進、神経認知低下の予防、ある特定のＭＰＳ ＩＩＩＡに関連する症状の逆転、並びに／又はＭＰＳ ＩＩＩＡに関連するある特定の症状の進行の予防、又はそれらの任意の組み合わせを生じ得る。

【0014】

本明細書で使用される場合、「健康な対照」は、対象又は対象からの生物学的試料を指し、対象が、ＭＰＳ ＩＩＩＡ障害を有さない。健康な対照は、１つの対象からのもので
あり得る。一実施形態では、健康な対照は、複数の対象のプールである。

【0015】

本明細書で使用される場合、「生物学的試料」という用語は、任意の細胞、生物学的流体、又は組織を指す。本発明での使用に好適な試料としては、限定されないが、全血、白血球、線維芽細胞、血清、尿、血漿、唾液、骨髄、脳脊髄液、羊水、及び皮膚細胞が挙げられ得る。かかる試料は、生理食塩水、緩衝液、又は生理学的に許容される希釈剤で更に希釈され得る。代替的に、かかる試料は、従来の手段によって濃縮される。

【0016】

本発明の記載に関して、本明細書に記載の組成物の各々は、別の実施形態では、本発明の方法で有用であることが意図される。加えて、方法で有用な本明細書に記載の組成物の各々は、別の実施形態では、それ自体が本発明の実施形態であることも意図される。

【0017】

本明細書で別途定義されない限り、本明細書で使用される技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって、及び本出願で使用されている多くの用語に対して当業者に一般的な手引きを提供する公開された文書を参照することによって、一般的に理解されているものと同じ意味を有する。

【0018】

本明細書で使用される場合、「疾患」、「障害」、及び「状態」は、ムコ多糖症ＩＩＩＡ型（サンフィリッポ症候群Ａ型又はサンフィリッポＡ型疾患としても知られている、ＭＰＳＩＩＩＡ、ＭＰＳ ＩＩＩＡ、ＭＰＳ ＩＩＩａ）である。

【0019】

本明細書で使用される場合、「ＭＰＳ ＩＩＩＡに関連する症状（複数可）」又は「症状（複数可）」という用語は、ＭＰＳ ＩＩＩＡ患者並びにＭＰＳ ＩＩＩＡ動物モデルで見出される症状（複数可）を指す。かかる症状としては、限定されないが、言葉の遅延；社会的相互作用及びコミュニケーションの困難性；睡眠障害；進行性の知的障害及び以前に獲得したスキルの喪失（発達退行）；発作及び運動障害；大きな頭部；わずかに肥大した肝臓（軽度の肝腫大）；臍（臍ヘルニア）又は下腹部（鼠径ヘルニア）の周りの柔らかい突出；低身長、硬い関節、軽度の多発性異骨症、複数の骨格異常；慢性下痢；再発性上気道感染；再発性中耳炎；聴覚不全；視力障害；非対的性中隔肥大；粗な顔貌；剛毛；頭蓋冠閉鎖（Ｄｅｎｓｅ ｃａｌｖａｒｉａ）；多発性異骨症；成長異常；尿中へのヘパラン硫酸排泄；脳脊髄液（ＣＳＦ）、血清、尿、及び／又は任意の他の生物学的試料におけるＧＡＧ蓄積；Ｎ－アセチル－アルファ－Ｄ－グルコサミニダーゼ（ＮＡＧＬＵ）又はＮ－スルホグリコサミンスルホヒドロラーゼ（ＩＤＵＡ）の異常な発現及び／又は酵素活性；ＧＭ２及びＧＭ３の蓄積；リソソーム酵素における活性変化；ＣＮＳにおける遊離非エステル化コレステロールの蓄積；ＣＮＳ及び骨格組織における炎症応答；過剰な発毛（多毛症）；多動症；卵形の胸腰部脊椎（Ｏｖｏｉｄ ｔｈｏｒａｃｏｌｕｍｂａｒ ｖｅｒｔｅｂｒａｅ）；脾臓肥大；眉毛癒合；肋骨の腫大；ヘルニア；並びに不安定な歩行が挙げられる。

【0020】

本明細書で使用される「患者」又は「対象」は、臨床研究に使用される男性又は女性のヒト、イヌ、及び動物モデルを意味する。一実施形態では、これらの方法及び組成物の対象は、ＭＰＳ ＩＩＩＡを有すると診断されたヒトである。ある特定の実施形態では、これらの方法及び組成物のヒト対象は、出生前児、新生児、乳児、幼児、未就学児、小学生、十代、若年成人、又は成人である。更なる実施形態では、これらの方法及び組成物の対象は、小児ＭＰＳ ＩＩＩＡ患者である。

【0021】

臨床検査及び尿試験（過剰なムコ多糖が尿中に排泄される）は、ＭＰＳ疾患の診断における最初のステップである。また、ＭＰＳ ＩＩＩＡの決定的な診断を提供するために、血液、皮膚細胞、又は多様な細胞における酵素活性のレベルを測定する酵素アッセイが使用される。ＭＰＳ ＩＩＩＡに関連付けられるＳＧＳＨの変異を検出する様々な遺伝子試
験が利用可能である。例えば、ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｔｒ／ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ／－Ｃ００８６６４７／、ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｔｒ／ａｌｌ／ｔｅｓｔｓ／？ｔｅｒｍ＝Ｃ００８６６４７［ＤＩＳＣＵＩ］を参照されたい。羊水穿刺及び絨毛試料採取を使用する出生前診断は、胎児が障害に罹患しているかどうかを検証することができる。遺伝カウンセリングは、ムコ多糖症の家族歴を有する親が、障害を引き起こす変異遺伝子を担持しているかどうかを決定するのを助けることができる。例えば、Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ ＭＰＳ ＩＩＩ，Ｎａｔｉｏｎａｌ ＭＰＳ Ｓｏｃｉｅｔｙ，２００８，ｍｐｓｓｏｃｉｅｔｙ．ｏｒｇ／ｌｅａｒｎ／ｄｉｓｅａｓｅｓ／ｍｐｓ－ｉｉｉ／を参照されたい。

【0022】

Ｎ－スルホグリコサミンスルホヒドロラーゼ（ＳＧＳＨ）
本明細書で使用される場合、「Ｎ－スルホグリコサミンスルホヒドロラーゼ」及び「ＳＧＳＨ」という用語は、ヘパラン－Ｎ－スルファターゼ、ＨＮＳと互換的に使用される。本発明は、組成物中で又は本明細書で提供される方法によって送達されると、所望の機能を回復するか、症状を緩和するか、ＭＰＳ ＩＩＩＡに関連するバイオマーカと関連付けられる症状を改善するか、又はＭＰＳ ＩＩＩＡに対する他の治療（複数可）を促進する、本明細書で提供される核酸配列から発現されるＳＧＳＨタンパク質の任意のバリアント、又はその機能的断片を含む。ＭＰＳＩＩＩに対する好適なバイオマーカの例としては、参照により本明細書に援用される、ＷＯ２０１７／１３６５３３に記載されているバイオマーカが挙げられる。

【0023】

本明細書で使用される場合、「機能性ＳＧＳＨ」という用語は、完全長野生型（天然）ヒトＳＧＳＨのアミノ酸配列（配列番号３６及びＵｎｉＰｒｏｔＫＢ受託番号：Ｐ５１６８８に示される）を有する酵素、それらのバリアント、保存的アミノ酸置き換えを有するそれらの変異体、それらの断片、保存的アミノ酸置き換えを有するバリアントと変異体との任意の組み合わせの完全長又は断片を指し、正常なヒトＳＧＳＨの生物学的活性レベルの少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、又はほぼ同じか、又は１００％超を提供する。完全長野生型（天然）ヒトＳＧＳＨ（配列番号３６）は、天然シグナル（又はリーダー）ペプチド及び成熟ｈＳＧＳＨ（配列番号１７）を含む。いくつかの実施形態では、機能性ＳＧＳＨは、配列番号３６の配列を有する野生型タンパク質を指す。ある特定の実施形態では、機能性ｈＳＧＳＨは、天然リーダー配列を含む。ある特定の実施形態では、機能性ｈＳＧＳＨは、外因性リーダー配列を含む。ある特定の実施形態では、機能性ｈＳＧＳＨは、外因性ヒト免疫グロブリン重鎖結合タンパク質ＢＩＰリーダー配列（ＢｉＰ又はＢｉｐ）である外因性リーダー配列を含む。参照により本明細書に援用される、ＷＯ２０１２／０７１４２２ Ａ２及び米国特許第９，２７９，００７号も参照されたい。ある特定の実施形態では、機能性ｈＳＧＳＨは、エンドサイトーシスを可能にするペプチドを更に含み、ペプチドが、ＣＩ－ＭＰＲに結合する。ある特定の実施形態では、ＣＩ－ＭＰＲに結合するペプチドは、ｖＩＧＦ２ペプチドである。ある特定の実施形態では、機能性ｈＳＧＳＨは、ＢＩＰリーダー配列である外因性リーダーペプチド配列、成熟ｈＳＧＳＨ、及びリンカーを介して接続されたｖＩＧＦ２ペプチドを含む、融合タンパク質である。ある特定の実施形態では、機能性ｈＳＧＳＨは、細胞においてｈＳＧＳＨの安定性及び／又は発現を増強する（すなわち、アミノ残基の変化を安定させる）少なくとも１つ以上の変異を有する、成熟ｈＳＧＳＨを含む。ある特定の実施形態では、機能性ｈＳＧＳＨは、ＢＩＰリーダー配列である外因性リーダーペプチド配列、安定化アミノ酸残基変化Ａ４８２Ｙ及びＥ４８８Ｖを含む成熟ｈＳＧＳＨ、並びにリンカーを介して接続されたｖＩＧＦ２ペプチドを含む、融合タンパク質である。

【0024】

本明細書で使用される場合、「保存的アミノ酸置き換え」又は「保存的アミノ酸置換」
は、当業者によって知られている、同様の生化学的特性（例えば、電荷、疎水性、及びサイズ）を有する異なるアミノ酸へのアミノ酸の変更、置き換え、又は置換を指す。例えば、それらの各々全体が参照により本明細書に援用される、ＦＲＥＮＣＨ ｅｔ ａｌ．Ｗｈａｔ ｉｓ ａ ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ？ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ，Ｍａｒｃｈ １９８３，Ｖｏｌｕｍｅ １９，Ｉｓｓｕｅ ２，ｐｐ １７１－１７５及びＹＡＭＰＯＬＳＫＹ ｅｔ
ａｌ．Ｔｈｅ Ｅｘｃｈａｎｇｅａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ．２００５ Ａｕｇ；１７０（４）：１４５９－１４７２も参照されたい。

【0025】

ある特定の実施形態では、機能性ＳＧＳＨは、野生型におけるアラニン（Ａｌａ、Ａ）の代わりに４８８番目のアミノ酸にチロシン（Ｔｙｒ、Ｙ）を含む配列番号３６のアミノ酸配列からなるＡ４８２Ｙ、及び野生型におけるグルタミン酸（Ｇｌｕ、Ｅ）の代わりに４８８番目のアミノ酸にバリン（Ｖａｌ、Ｖ）を含む配列番号３６のアミノ酸配列からなるＥ４８８Ｖを含む、ＳＧＳＨバリアントである。ＳＧＳＨバリアントの追加の例としては、当業者に利用可能なバイオインフォマティクスツールによって予測されるものが挙げられ得る。例えば、その全体が参照により本明細書に援用される、Ｕｇｒｉｎｏｖ ＫＧ
ｅｔ ａｌ．Ａ ｍｕｌｔｉｐａｒａｍｅｔｒｉｃ ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ ａｌｇｏｒｉｔｈｍ ｆｏｒ ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ
ｇｅｎｅｔｉｃ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｍｕｃｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｏｓｉｓ ｔｙｐｅ ＩＩＩＡ（Ｓａｎｆｉｌｉｐｐｏ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．２０１５ Ｍａｒ ２５；１０（３）：ｅ０１２１５１１．ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．０１２１５１１．ｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ２０１５を参照されたい。

【0026】

ある特定の実施形態では、機能性ｈＳＧＳＨは、配列番号１９のアミノ酸配列を指し、アミノ酸配列が、外因性リーダーペプチド及び成熟ｈＳＧＳＨコード配列を含む。ある特定の実施形態では、成熟ｈＳＧＳＨは、Ａ４８２Ｙ及びＥ４８８Ｖ、例えば、配列番号２３での安定化アミノ酸残基の変化及び／又は置換を更に含む。ある特定の実施形態では、機能性ｈＳＧＳＨは、配列番号２５のアミノ酸配列を指し、機能性ｈＳＧＳＨが、外因性リーダーペプチド、並びに安定化アミノ酸変化Ａ４８２Ｙ及びＥ４８８Ｖを含む成熟ｈＳＧＳＨを含む。

【0027】

ある特定の実施形態では、機能性ｈＳＧＳＨは、配列番号２１のアミノ酸配列を指し、アミノ酸配列が、外因性リーダーペプチド、成熟ｈＳＧＳＨ、及びｖＩＧＦ２ペプチドを含む。ある特定の実施形態では、機能性ｈＳＧＳＨは、配列番号２７のアミノ酸配列を指し、アミノ酸配列が、外因性リーダーペプチド、安定化アミノ酸変化Ａ４８２Ｙ及びＥ４８８Ｖを含む成熟ｈＳＧＳＨ、並びにｖＩＧＦ２ペプチドを含む。

【0028】

従来の方法による、ＳＧＳＨの発現及び活性レベルを測定するための多様なアッセイが存在する。例えば、それらの各々全体が参照により本明細書に援用される、ｎｃｂｉ＿ｎｌｍ＿ｎｉｈ＿ｇｏｖ／ｇｔｒ／ａｌｌ／ｔｅｓｔｓ／？ｔｅｒｍ＝Ｃ００８６６４７［ＤＩＳＣＵＩ］＆ｆｉｌｔｅｒ＝ｍｅｔｈｏｄ：１２；ｔｅｓｔｔｙｐｅ：ｃｌｉｎｉｃａｌ，Ｋａｒｐｏｖａ ＥＡ ｅｔ ａｌ，Ａ ｆｌｕｏｒｉｍｅｔｒｉｃ ｅｎｚｙｍｅ ａｓｓａｙ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ Ｓａｎｆｉｌｉｐｐｏ ｄｉｓｅａｓｅ ｔｙｐｅ Ａ （ＭＰＳ ＩＩＩＡ）．Ｊ Ｉｎｈｅｒｉｔ Ｍｅｔａｂ Ｄｉｓ．１９９６；１９（３）：２７８－８５、Ｔａｒｄｉｅｕ Ｍ ｅｔ ａｌ，Ｉｎｔｒａｃｅｒｅｂｒａｌ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒ ｓｅｒｏｔｙｐｅ ｒｈ．１０ ｃａｒｒｙｉｎｇ ｈｕｍａｎ ＳＧＳＨ ａｎｄ ＳＵＭＦ１ ｃＤＮＡｓ ｉｎ ｃｈｉｌ
ｄｒｅｎ ｗｉｔｈ ｍｕｃｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｏｓｉｓ ｔｙｐｅ ＩＩＩＡ ｄｉｓｅａｓｅ：ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ａ ｐｈａｓｅ Ｉ／ＩＩ ｔｒｉａｌ．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２０１４ Ｊｕｎ；２５（６）：５０６－１６．ｄｏｉ：１０．１０８９／ｈｕｍ．２０１３．２３８．Ｅｐｕｂ ２０１４ Ｍａｙ ５、Ｗｈｙｔｅ ＬＳ ｅｔ ａｌ，Ｖａｒｉａｂｌｅｓ ｉｎｆｌｕｅｎｃｉｎｇ ｆｌｕｏｒｉｍｅｔｒｉｃ Ｎ－ｓｕｌｆｏｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ ｓｕｌｆｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ（ＳＧＳＨ）ａｃｔｉｖｉｔｙ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｉｎ ｂｒａｉｎ ｈｏｍｏｇｅｎａｔｅｓ．Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ Ｍｅｔａｂ Ｒｅｐ．２０１５ Ｏｃｔ ２２；５：６０－６２．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｙｍｇｍｒ．２０１５．１０．００５．ｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ２０１５ Ｄｅｃ、Ｈｏｐｗｏｏｄ ＪＪ ｅｔ ａｌ．Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ Ｓａｎｆｉｌｉｐｐｏ ｔｙｐｅ Ａ ｓｙｎｄｒｏｍｅ ｂｙ
ｅｓｔｉｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｕｌｆａｍｉｄａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｕｓｉｎｇ ａ ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｌｅｄ ｔｅｔｒａｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ．Ｃｌｉｎ Ｃｈｉｍ Ａｃｔａ．１９８２ Ａｕｇ １８；１２３（３）：２４１－５０を参照されたい。

【0029】

核酸
一態様では、機能性ＳＧＳＨタンパク質をコードする核酸配列が提供される。一実施形態では、核酸配列は、操作されたコード配列であり、機能性ｈＳＧＳＨコード配列が、シグナルペプチド配列及び成熟ｈＳＧＳＨコード配列を含み、成熟ｈＳＧＳＨコード配列が、配列番号１６の配列の核酸配列、又は（ａ）配列番号２３をコードする、配列番号１６に対して少なくとも８５％同一であるか、若しくは（ｂ）配列番号２３をコードする、配列番号１６に対して少なくとも９９％同一である、核酸配列を有する。ある特定の実施形態では、配列番号１６に対して９９％同一の成熟ｈＳＧＳＨコード配列は、配列番号２２であり、配列番号２３をコードする（ｈＳＧＳＨ．Ａ４８２Ｙ．Ｅ４８８Ｖ）。ある特定の実施形態では、成熟ｈＳＧＳＨコード配列は、配列番号１６である。ある特定の実施形態では、成熟ｈＳＧＳＨコード配列は、配列番号１６に対して少なくとも約８５％同一であり、配列番号２３をコードする。

【0030】

一態様では、ＳＧＳＨコード配列は、操作された配列である。一実施形態では、操作された配列は、対象における産生、転写、発現、又は安全性を改善するのに有用である。別の実施形態では、操作された配列は、生じる治療用組成物又は治療の有効性を増加させるのに有用である。更なる実施形態では、操作された配列は、発現される機能性ＳＧＳＨタンパク質の有効性を増加させるのに有用であるが、また、機能性タンパク質を送達する治療試薬の用量を下げることを可能にして、安全性を増加させ得る。ある特定の実施形態では、ｈＳＧＳＨコード配列は、安定化アミノ酸変化Ａ４８２Ｙ及びＥ４８８Ｖを含む機能性ＳＧＳＨタンパク質を操作し、それらをコードする。

【0031】

ある特定の実施形態では、機能性ｈＳＧＳＨコード配列は、成熟ｈＳＧＳＨコード配列の５’に位置するシグナルペプチド配列を含む。ある特定の実施形態では、シグナルペプチドは、成熟ｈＳＧＳＨのアミノ末端（Ｎ末端）にある。ある特定の実施形態では、機能性ｈＳＧＳＨコード配列は、天然シグナルペプチド配列であるシグナルペプチド配列を含む。ある特定の実施形態では、天然シグナルペプチドは、配列番号３１の核酸配列、又は配列番号３２のアミノ酸配列をコードする、配列番号３１に対して少なくとも約９５％同一の配列を含む。

【0032】

ある特定の実施形態では、機能性ｈＳＧＳＨコード配列は、外因性シグナルペプチド配列であるシグナルペプチド配列を含む。ある特定の実施形態では、外因性シグナルペプチドは、ＢＩＰシグナルペプチドである。ある特定の実施形態では、ＢＩＰペプチドである外因性シグナルペプチドは、配列番号２９の核酸配列、又は配列番号３０のアミノ酸配列
をコードする、配列番号２９に対して少なくとも約９５％同一の配列を含む。

【0033】

ある特定の実施形態では、機能性ｈＳＧＳＨコード配列は、リンカーを介して接続されたｖＩＧＦ２ペプチドを更に含む。ある特定の実施形態では、ｖＩＧＦ２ペプチドは、配列番号３３の核酸配列、又は配列番号３４をコードする、配列番号３３に対して少なくとも約９５％同一の配列を含む。ある特定の実施形態では、ｖＩＧＦ２ペプチドは、成熟ｈＳＧＳＨのカルボキシ末端（Ｃ末端）でリンカーを介して接続される。ある特定の実施形態では、リンカーを含むｖＩＧＦ２ペプチドコード配列は、成熟ｈＳＧＳＨコード配列の３’に位置する。

【0034】

一態様では、機能性ｈＳＧＳＨコード配列は、５’から３’へ、シグナルペプチドコード配列及び成熟ｈＳＧＳＨコード配列を含む、操作された配列である。いくつかの実施形態では、機能性ｈＳＧＳＨコード配列は、５’から３’へ、シグナルペプチドコード配列、並びに安定化アミノ酸変化Ａ４８Ｙ及びＥ４８８Ｖを含む成熟ｈＳＧＳＨコード配列を含む、操作された配列である。別の態様では、機能性ｈＳＧＳＨコード配列は、５’から３’へ、シグナルペプチドコード配列、成熟ｈＳＧＳＨコード配列、及びリンカーを含むｖＩＧＦ２コード配列を含む、操作された配列である。いくつかの実施形態では、機能性ｈＳＧＳＨコード配列は、５’から３’へ、シグナルペプチドコード配列、安定化アミノ酸変化Ａ４８Ｙ及びＥ４８８Ｖを含む成熟ｈＳＧＳＨコード配列、並びにリンカーを含むｖＩＧＦ２コード配列を含む、操作された配列である。

【0035】

一実施形態では、提供されるのは、配列番号３５の配列を含む操作された核酸配列であり、配列が、天然シグナル配列を含み、機能性ｈＳＧＳＨをコードする（ｈＳＧＳＨ；配列番号３６）。一実施形態では、本明細書で提供されるのは、配列番号３５の操作された核酸配列、又は機能性ｈＳＧＳＨをコードする、配列番号３５に対して少なくとも約９９％同一の核酸配列である。別の実施形態では、ｈＳＧＳＨコード配列は、配列番号３５に対して少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％の同一性であり、配列が、機能性ｈＳＧＳＨをコードする。

【0036】

一実施形態では、提供されるのは、配列番号１８の配列を含む操作された核酸配列であり、配列が、ＢＩＰシグナル配列を含み、機能性ｈＳＧＳＨをコードする（ＢＩＰ．ｈＳＧＳＨ；配列番号１９）。一実施形態では、本明細書で提供されるのは、配列番号１８の操作された核酸配列、又は機能性ｈＳＧＳＨをコードする、配列番号１８に対して少なくとも約９９％同一の核酸配列である。別の実施形態では、ＳＧＳＨコード配列は、配列番号１８に対して少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％の同一性であり、配列が、機能性ｈＳＧＳＨをコードする。

【0037】

一実施形態では、提供されるのは、配列番号２０の配列を含む操作された核酸配列であり、配列が、ＢＩＰシグナル配列を含み、融合ｈＳＧＳＨである機能性ｈＳＧＳＨをコードする（ＢＩＰ．ｈＳＧＳＨ．ｖＩＧＦ２；配列番号２１）。一実施形態では、本明細書で提供されるのは、配列番号２０の操作された核酸配列、又は機能性ｈＳＧＳＨをコードする、配列番号２０に対して少なくとも約９９％同一の核酸配列である。別の実施形態では、ＳＧＳＨコード配列は、配列番号２０に対して少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％の同一性であり、配列が、機能性ｈＳＧＳＨをコードする。

【0038】

一実施形態では、提供されるのは、配列番号２４の配列を含む操作された核酸配列であり、配列が、ＢＩＰシグナル配列を含み、安定化アミノ酸変化Ａ４８２Ｙ及びＥ４８８Ｖを含む機能性ｈＳＧＳＨをコードする（ＢＩＰ．ｈＳＧＳＨ．Ａ４８８Ｙ．Ｅ４８８Ｖ；
配列番号２５）。一実施形態では、本明細書で提供されるのは、配列番号２４の操作された核酸配列、又は機能性ｈＳＧＳＨをコードする、配列番号２４に対して少なくとも約９９％同一の核酸配列である。別の実施形態では、ＳＧＳＨコード配列は、配列番号２４に対して少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％の同一性であり、配列が、機能性ｈＳＧＳＨをコードする。

【0039】

一実施形態では、提供されるのは、配列番号２６の配列を含む操作された核酸配列であり、配列が、ＢＩＰシグナル配列を含み、安定化アミノ酸変化Ａ４８２Ｙ及びＥ４８８Ｖを含み、融合ｈＳＧＳＨである機能性ｈＳＧＳＨをコードする（ＢＩＰ．ｈＳＧＳＨ．Ａ４８８Ｙ．Ｅ４８８Ｖ．ｖＩＧＦ２；配列番号２７）。一実施形態では、本明細書で提供されるのは、配列番号２６の操作された核酸配列、又は機能性ｈＳＧＳＨをコードする、配列番号２６に対して少なくとも約９９％同一の核酸配列である。別の実施形態では、ＳＧＳＨコード配列は、配列番号２６に対して少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％の同一性であり、配列が、機能性ｈＳＧＳＨをコードする。

【0040】

本明細書に記載される場合、「核酸」は、ＲＮＡ、ＤＮＡ、又はその修飾物であり得、一本鎖又は二本鎖であり得、例えば、目的のタンパク質をコードする核酸、オリゴヌクレオチド、核酸類似体、例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、偽相補性ＰＮＡ（ｐｃ－ＰＮＡ）、ロック核酸（ＬＮＡ）などを含む群から選択され得る。ヌクレオチドは、リボヌクレオチド、デオキシヌクレオチド、又はいずれかの種類のヌクレオチドの修飾形態（例えば、ペプチド核酸オリゴマー）を指す。当業者は、これらの核酸分子の機能性バリアントも、本発明の一部であることが意図されることを理解するであろう。機能性バリアントは、標準的な遺伝子コードを使用して直接的に翻訳されて、親核酸分子から翻訳されたものと同一のアミノ酸配列を提供することができる、核酸配列である。かかる核酸配列としては、例えば、限定されないが、例えば、転写リプレッサーとして作用するタンパク質をコードする核酸配列、アンチセンス分子、リボザイム、小さな阻害性核酸配列、例えば、限定されないが、ＲＮＡｉ、ｓｈＲＮＡｉ、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡｉ（ｍＲＮＡｉ）、アンチセンスオリゴヌクレオチドなどが挙げられる。

【0041】

ある特定の実施形態では、本発明によって包含され、発現カセット及びベクターゲノムを生成するのに有用である、機能性ヒトＳＧＳＨ（ｈＳＧＳＨ）をコードする核酸分子、及び他の構築物は、酵母細胞、昆虫細胞、又はヒト細胞などの哺乳類細胞における発現のために操作され得る。方法は既知であり、以前に記載されている（例えば、ＷＯ９６／０９３７８）。野生型配列と比較して少なくとも１つの好ましくないコドンが、より好ましいコドンによって置き換えられる場合、配列は、操作されたものとみなされる。本明細書において、好ましくないコドンは、同じアミノ酸をコードする別のコドンよりも生物において使用される頻度が低いコドンであり、より好ましいコドンは、好ましくないコドンよりも生物において使用される頻度が高いコドンである。特定の生物のコドン使用頻度は、ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｊｐ／ｃｏｄｏｎなどのコドン頻度表に見出すことができる。好ましくは、１つより多い好ましくないコドン、好ましくは、大部分又は全ての好ましくないコドンは、より好ましいコドンによって置き換えられる。好ましくは、生物において最も頻繁に使用されるコドンは、操作された配列で使用される。好ましいコドンによる置き換えは、一般に、より高い発現をもたらす。また、遺伝子コードの縮重の結果として、多数の異なる核酸分子が同じポリペプチドをコードすることができることも当業者によって理解されるであろう。また、当業者は、日常的な技術を使用して、ポリペプチドが発現される任意の特定の宿主生物のコドン使用を反映するために、核酸分子によってコードされるアミノ酸配列に影響を及ぼさないヌクレオチド置換を行ってもよいことも理解される。したがって、別途指定されない限り、「アミノ酸配列をコードする核酸配列」は、互いに縮重態様であり、同じアミノ酸配列をコードする、全てのヌクレオチド配列を含む。核酸
配列は、日常的な分子生物学技術を使用してクローニングされ得るか、又はＤＮＡ合成によってデノボで生成され得、これらは、ＤＮＡ合成及び／又は分子クローニングの分野で事業を有するサービス企業（例えば、ＧｅｎｅＡｒｔ、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｅｕｒｏｆｉｎｓ）によって日常的な手順を使用して実施され得る。

【0042】

「操作された」とは、本明細書に記載の機能性ＳＧＳＨタンパク質をコードする核酸配列が、組み立てられ、任意の好適な遺伝子因子、例えば、裸のＤＮＡ、ファージ、トランスポゾン、コスミド、エピソームなどに配置され、それらは、例えば、非ウイルス送達系（例えば、ＲＮＡに基づく系、裸のＤＮＡなど）を生成するために、又はパッケージング宿主細胞内でウイルスベクターを生成するために、及び／又は対象の宿主細胞への送達のために、その上に担持されるＳＧＳＨ配列を宿主細胞へと導入することを意味する。一実施形態では、遺伝子因子は、ベクターである。一実施形態では、遺伝子因子は、プラスミドである。かかる操作された構築物を作製するために使用される方法は、核酸操作における当業者に既知であり、遺伝子工学、組換え工学、及び合成技術を含む。例えば、Ｇｒｅｅｎ ａｎｄ Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（２０１２）を参照されたい。

【0043】

核酸配列の文脈における「同一性パーセント（％）」、「配列同一性」、「配列同一性パーセント」、又は「同一のパーセント」という用語は、対応するように整列させると同じである２つの配列中の残基を指す。配列同一性の長さの比較は、ゲノムの完全長、遺伝子コード配列の完全長、又は少なくとも約５００～５０００個のヌクレオチドの断片にわたる場合があり、これが望ましい。しかしながら、例えば、少なくとも約９つのヌクレオチド、通常は少なくとも約２０～２４個のヌクレオチド、少なくとも約２８～３２個のヌクレオチド、少なくとも約３６個以上のヌクレオチドのより小さい断片間の同一性も望ましい場合がある。

【0044】

同一性パーセントは、タンパク質の完全長ポリペプチド、約３２個のアミノ酸、約３３０個のアミノ酸、若しくはそのペプチド断片にわたるアミノ酸配列、又は配列をコードする対応する核酸配列に対して容易に決定され得る。好適なアミノ酸断片は、少なくとも約８アミノ酸長であり得、最大で約７００個であり得る。一般に、２つの異なる配列間の「同一性」、「相同性」、又は「類似性」について言及する場合、「同一性」、「相同性」、又は「類似性」は、「整列させた」配列を参照して決定される。「整列させた」配列又は「整列」とは、複数の核酸配列又はタンパク質（アミノ酸）配列を指し、参照配列と比較して、多くの場合、欠損又は追加の塩基又はアミノ酸についての補正を含有する。

【0045】

整列は、公的又は商業的に利用可能な多様な多重配列整列プログラムのうちのいずれかを使用して実施される。配列整列プログラムは、アミノ酸配列に対して利用可能であり、例えば、「Ｃｌｕｓｔａｌ Ｘ」、「Ｃｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａ」、「ＭＡＰ」、「ＰＩＭＡ」、「ＭＳＡ」、「ＢＬＯＣＫＭＡＫＥＲ」、「ＭＥＭＥ」、及び「Ｍａｔｃｈ－Ｂｏｘ」プログラムが挙げられる。一般に、これらのプログラムのうちのいずれかがデフォルト設定で使用されるが、当業者は、これらの設定を必要に応じて変更することができる。代替的に、当業者は、参照されるアルゴリズム及びプログラムによって提供されるように、少なくとも同一性又は整列のレベルを提供する、別のアルゴリズム又はコンピュータプログラムを利用することができる。例えば、Ｊ．Ｄ．Ｔｈｏｍｓｏｎ ｅｔ ａｌ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．，「Ａ ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ」，２７（１３）：２６８２－２６９０（１９９９）を参照されたい。

【0046】

多重配列整列プログラムはまた、核酸配列についても利用可能である。かかるプログラムの例としては、「Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ」、「Ｃｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａ」、「ＣＡＰ
Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｓｓｅｍｂｌｙ」、「ＢＬＡＳＴ」、「ＭＡＰ」、及び「ＭＥＭＥ」が挙げられ、これらは、インターネット上のウェブサーバを通じてアクセス可能である。かかるプログラムの他の供給源は、当業者に既知である。代替的に、Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩユーティリティも使用される。また、上に記載のプログラムに含有されるものを含む、当該技術分野で既知の多くのアルゴリズムが存在し、ヌクレオチド配列同一性を測定するために使用することができる。別の例として、ポリヌクレオチド配列は、ＧＣＧバージョン６．１のプログラムであるＦａｓｔａ（商標）を使用して比較され得る。Ｆａｓｔａ（商標）は、照会及び検索配列の間の最良の重複領域の整列及び配列同一性パーセントを提供する。例えば、核酸配列間の配列同一性パーセントは、参照により本明細書に援用される、ＧＣＧバージョン６．１に提供されるような、そのデフォルトパラメータ（ワードサイズ６及びスコアリングマトリックスのＮＯＰＡＭ因子）を用いるＦａｓｔａ（商標）を使用して決定することができる。

【0047】

本明細書で使用される場合、「所望される機能」は、健康な対照の少なくとも約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、又は約１００％のＳＧＳＨ酵素活性を指す。

【0048】

本明細書で使用される場合、「症状を緩和する」、「症状を改善する」という語句、又はそれらの文法的変形物は、ＭＰＳ ＩＩＩＡに関連する症状の逆転、ＭＰＳ ＩＩＩＡに関連する症状の進行の決着又は予防を指す。一実施形態では、緩和又は改善は、投与前又は使用前と比較して、約５％、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％低減される、記載の組成物（複数可）の投与又は記載の方法の使用後の患者における症状の総数を指す。別の実施形態では、緩和又は改善は、投与前又は使用前と比較して、約５％、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％低減される、記載された組成物（複数可）の投与又は記載された方法の使用後の症状の重症度又は進行を指す。

【0049】

本明細書に記載のＳＧＳＨ機能性タンパク質及びＳＧＳＨコード配列における組成物は、本明細書にわたって記載される他の組成物、レジメン、態様、実施形態、及び方法に適用されることが意図されることが理解されるべきである。

【0050】

発現カセット及びベクターゲノム
本明細書では、操作された核酸の発現を指示する調節配列と操作可能に連結されたｈＳＧＳＨのコード配列を含む操作された核酸配列を含む発現カセットを含む、遺伝子治療ベクターが提供される。ある特定の実施形態では、発現カセットは、含む。

【0051】

本明細書で使用される場合、「発現カセット」とは、生物学的に有用な核酸配列と、核酸配列（例えば、タンパク質、酵素、又は他の有用な遺伝子産物、ｍＲＮＡなどをコードする遺伝子ｃＤＮＡ）及びその遺伝子産物の転写、翻訳、並びに／若しくは発現を指示又は調節する、それと操作可能に連結された調節配列と、を含む、核酸分子を指す。本明細書で使用される場合、「操作可能に連結された」配列は、核酸配列と連続又は非連続である調節配列、及びシス又はトランスで核酸配列とともに作用する調節配列の両方を含む。かかる調節配列は、典型的には、例えば、プロモータ、エンハンサ、イントロン、コザック配列、ポリアデニル化配列、及びＴＡＴＡシグナルのうちの１つ以上を含む。発現カセットは、他の因子の中で、遺伝子配列の上流（５’～）の調節配列、例えば、プロモータ、エンハンサ、イントロンなどのうちの１つ以上、及びエンハンサ、又は遺伝子配列の下
流（３’～）の調節配列、例えば、ポリアデニル化部位を含む３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）のうちの１つ以上を含有し得る。ある特定の実施形態では、調節配列は、遺伝子産物の核酸配列と操作可能に連結され、調節配列が、介在する核酸配列、すなわち、５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）によって、遺伝子産物の核酸配列から分離されている。ある特定の実施形態では、発現カセットは、１つ以上の遺伝子産物の核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、発現カセットは、モノシストロン性又はバイシストロン性発現カセットであり得る。他の実施形態では、「導入遺伝子」という用語は、標的細胞に挿入される外因性供給源からの１つ以上のＤＮＡ配列を指す。典型的には、ウイルスベクターを生成するためのかかる発現カセットは、ウイルスゲノムのパッケージングシグナルに隣接する本明細書に記載の遺伝子産物のためのコード配列、及び本明細書に記載されるものなどの他の発現制御配列を含有する。ある特定の実施形態では、ベクターゲノムは、２つ以上の発現カセットを含有し得る。

【0052】

核酸配列又はタンパク質を説明するために使用される「外因性」という用語は、核酸又はタンパク質が、染色体又は宿主細胞に存在する位置では、天然に発生しないことを意味する。外因性核酸配列はまた、同じ宿主細胞又は対象に由来し、挿入される配列を指すが、非天然状態、例えば、異なるコピー数、又は異なる調節因子の制御下で存在する。

【0053】

核酸配列又はタンパク質を説明するために使用される「異種」という用語は、核酸又はタンパク質が、それが発現される宿主細胞又は対象とは異なる生物又は同じ生物の異なる種に由来することを意味する。タンパク質、又はプラスミド、発現カセット、若しくはベクターの核酸を参照して使用される場合、「異種」という用語は、タンパク質又は核酸が、問題のタンパク質又は核酸が天然には互いに同じ関係で見出されないタンパク質又は核酸とは別の配列若しくはサブ配列とともに存在することを示す。

【0054】

一実施形態では、調節配列は、プロモータを含む。一実施形態では、プロモータは、ニワトリβ－アクチンプロモータ（ＣＢ）である。更なる実施形態では、プロモータは、サイトメガロウイルス最初期（ＣＭＶ ＩＥ）エンハンサとニワトリβ－アクチンプロモータとのハイブリッドである、ＣＢ７（ＣＢ７プロモータ）である。ある特定の実施形態では、ＣＢ７プロモータは、配列番号４４の核酸配列を含む。別の実施形態では、好適なプロモータとしては、限定されないが、伸長因子１アルファ（ＥＦ１アルファ）プロモータ（例えば、Ｋｉｍ ＤＷ ｅｔ ａｌ，Ｕｓｅ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ １ ａｌｐｈａ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ａｓ ａ ｖｅｒｓａｔｉｌｅ ａｎｄ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ．Ｇｅｎｅ．１９９０ Ｊｕｌ １６；９１（２）：２１７－２３を参照されたい）、シナプシン１プロモータ（例えば、Ｋｕｅｇｌｅｒ Ｓ ｅｔ ａｌ，Ｈｕｍａｎ ｓｙｎａｐｓｉｎ １ ｇｅｎｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｃｏｎｆｅｒｓ ｈｉｇｈｌｙ ｎｅｕｒｏｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｌｏｎｇ－ｔｅｒｍ ｔｒａｎｓｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｆｒｏｍ ａｎ ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒ ｉｎ ｔｈｅ ａｄｕｌｔ ｒａｔ ｂｒａｉｎ ｄｅｐｅｎｄｉｎｇ ｏｎ ｔｈｅ ｔｒａｎｓｄｕｃｅｄ ａｒｅａ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２００３ Ｆｅｂ；１０（４）：３３７－４７を参照されたい）、神経特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）プロモータ（例えば、Ｋｉｍ Ｊ ｅｔ ａｌ，Ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ ｏｆ ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ－ｒｉｃｈ ｌｉｐｉｄ ｒａｆｔｓ ｉｎ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－６－ｉｎｄｕｃｅｄ ｎｅｕｒｏｅｎｄｏｃｒｉｎｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ＬＮＣａＰ ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ．２００４ Ｆｅｂ；１４５（２）：６１３－９．Ｅｐｕｂ ２００３ Ｏｃｔ １６を参照されたい）、又はＣＢ６プロモータ（例えば、Ｌａｒｇｅ－Ｓｃａｌｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒ Ｓｅｒｏｔｙｐｅ－９ Ｃａｒｒｙｉｎｇ ｔｈｅ Ｈｕｍａｎ Ｓｕｒｖｉｖａｌ Ｍｏｔｏｒ Ｎｅｕｒｏｎ Ｇｅｎｅ，Ｍ
ｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１６ Ｊａｎ；５８（１）：３０－６．ｄｏｉ：１０．１００７／ｓ１２０３３－０１５－９８９９－５を参照されたい）が挙げられ得る。

【0055】

ある特定の実施形態では、発現制御配列（調節配列）の一部として、例えば、選択される５’ＩＴＲ配列とコード配列との間に位置する追加的な又は代替的なプロモータ配列が含まれ得る。構成的プロモータ、調節可能なプロモータ［例えば、ＷＯ２０１１／１２６８０８及びＷＯ２０１３／０４９４３を参照されたい］、組織特異的プロモータ、又は生理学的ヒントに応答するプロモータが、本明細書に記載されるベクターに利用され得る。プロモータ（複数可）は、異なる供給源、例えば、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期エンハンサ／プロモータ、ＳＶ４０初期エンハンサ／プロモータ、ＪＣポリモウイルスプロモータ、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）又は神経膠原線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）プロモータ、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ－１）潜伏関連プロモータ（ＬＡＰ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）長末端反復（ＬＴＲ）プロモータ、ニューロン特異的プロモータ（ＮＳＥ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）プロモータ、ｈＳＹＮ、メラニン凝集ホルモン（ＭＣＨ）プロモータ、ＣＢＡ、マトリックス金属タンパク質プロモータ（ＭＰＰ）、及びニワトリベータ－アクチンプロモータから選択され得る。

【0056】

一実施形態では、発現カセットは、ヒト対象における発現及び分泌のために設計される。一実施形態では、発現カセットは、脳脊髄液及び脳を含む中枢神経系（ＣＮＳ）における発現のために設計される。更なる実施形態では、発現カセットは、ＣＮＳ及び肝臓の両方での発現に有用である。好適なプロモータとしては、限定されないが、構成的プロモータ、組織特異的プロモータ、又は誘導性／調節性プロモータが選択され得る。構成的プロモータの例は、ニワトリベータ－アクチンプロモータである。単独の、又は様々なエンハンサ因子と組み合わせた様々なニワトリベータ－アクチンプロモータが報告されている（例えば、ＣＢ７は、サイトメガロウイルスエンハンサ因子を有するニワトリベータ－アクチンプロモータであり；プロモータと、ニワトリベータアクチンの第１のエキソン及び第１のイントロンと、ウサギベータ－グロビン遺伝子のスプライスアクセプタとを含むＣＡＧプロモータ；ＣＢｈプロモータ、ＳＪ Ｇｒａｙ ｅｔ ａｌ，Ｈｕ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ，２０１１ Ｓｅｐ；２２（９）：１１４３－１１５３）。肝臓（アルブミン、Ｍｉｙａｔａｋｅ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７１：５１２４ ３２；Ｂ型肝炎ウイルスコアプロモータ、Ｓａｎｄｉｇ ｅｔ ａｌ．，（１９９６）Ｇｅｎｅ
Ｔｈｅｒ．，３：１００２ ９；アルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）、Ａｒｂｕｔｈｎｏｔ ｅｔ ａｌ．，（１９９６）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，７：１５０３ １４）、ニューロン（ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）プロモータ、Ａｎｄｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．，１３：５０３ １５；ニューロフィラメント軽鎖遺伝子、Ｐｉｃｃｉｏｌｉ ｅｔ ａｌ．，（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８：５６１１ ５；及びニューロン特異的ｖｇｆ遺伝子、Ｐｉｃｃｉｏｌｉ ｅｔ ａｌ．，（１９９５）Ｎｅｕｒｏｎ，１５：３７３ ８４）、並びに他の組織に組織特異的であるプロモータの例が周知である。代替的に、調節可能なプロモータが選択され得る。例えば、ＷＯ２０１１／１２６８０８Ｂ２を参照されたい（参照により本明細書に援用される）。

【0057】

プロモータに加えて、ベクターは、１つ以上の他の適切な転写開始配列、転写終結配列、エンハンサ配列、スプライシング及びポリアデニル化（ポリＡ）シグナルなどの効率的なＲＮＡプロセシングシグナル、細胞質ｍＲＮＡを安定化させる配列（例えば、ＷＰＲＥ）、翻訳効率を増強する配列（すなわち、コザックコンセンサス配列）、タンパク質の安定性を増強する配列、及び必要に応じて、コードされた産物の分泌を増強する配列を含有し得る。

【0058】

一実施形態では、調節配列は、エンハンサを更に含む。一実施形態では、調節配列は、
１つのエンハンサを含む。別の実施形態では、調節配列は、２つ以上の発現エンハンサを含有する。これらのエンハンサは、同じであり得るか、又は異なり得る。例えば、エンハンサとしては、アルファｍｉｃ／ｂｉｋエンハンサ、又はＣＭＶエンハンサが挙げられ得る。このエンハンサは、互いに隣接して位置する２つのコピー中に存在し得る。代替的に、エンハンサの二重コピーは、１つ以上の配列によって分離され得る。

【0059】

一実施形態では、調節配列は、イントロンを更に含む。更なる実施形態では、イントロンは、ニワトリベータ－アクチンイントロンである。ある特定の実施形態では、ニワトリベータ－アクチンイントロンは、配列番号４５の核酸配列を含む。ある特定の実施形態では、イントロンは、ヒトベータ－グロビンスプライスドナー及び免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）スプライスアクセプタ因子からなるハイブリッドイントロンである、キメライントロン（ＣＩ）である。他の好適なイントロンとしては、例えば、ＷＯ２０１１／１２６８０８に記載されるものなどの、当該技術分野で既知のものが挙げられる。他の好適なイントロンとしては、当該技術分野で既知のものが挙げられ、ヒトβ－グロブリンイントロン、及び／又は市販のＰｒｏｍｅｇａ（登録商標）イントロン、及びＷＯ２０１１／１２６８０８に記載のものであり得る。

【0060】

一実施形態では、調節配列は、ポリアデニル化シグナル（ポリＡ）を更に含む。好適なポリＡ配列の例には、例えば、ウサギグロビンポリＡ、ＳＶ４０、ＳＶ５０、ウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）、ヒト成長ホルモン、及び合成ポリＡが含まれる。任意選択的に、１つ以上の配列を選択して、ｍＲＮＡを安定させてもよい。ある特定の実施形態では、ポリＡは、ウサギベータグロビンポリＡ（ウサギグロビンポリａ又はｒＢＧ）である。例えば、ＷＯ２０１４／１５１３４１を参照されたい。ある特定の実施形態では、ウサギベータグロビンポリＡは、配列番号４６の核酸配列を含む。ある特定の実施形態では、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）ポリアデニル化配列、ＳＶ４０ポリＡ、又は合成ポリＡが、発現カセット内に含まれ得る。

【0061】

ある特定の実施形態では、提供される発現カセットは、ウッドチャック（ＷＰＲＥ）、ヒト（ＨＰＲＥ）、ジリス（ＧＰＲＥ）、若しくはホッキョクジリス（ＡＧＳＰＲＥ）の肝炎ウイルスからの転写後調節因子などの１つ以上の発現エンハンサ、又は合成転写後調節因子を含み得る。これらの発現増強因子は、３’ＵＴＲに配置されると特に有利であり、ｍＲＮＡ安定性及び／又はタンパク質収率を著しく増加させることができる。ある特定の実施形態では、提供される発現カセットは、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節因子（ＷＰＲＥ）又はそのバリアントである調節配列を含む。好適なＷＰＲＥ配列は、本明細書に記載のベクターゲノム内に提供され、当該技術分野で既知である（例えば、参照により援用される、米国特許第６，１３６，５９７号、同第６，２８７，８１４号、及び同第７，４１９，８２９号に記載されるものなど）。ある特定の実施形態では、ＷＰＲＥは、例えば、ＷＨＸ遺伝子の開始コドンに変異を含む、ウッドチャックＢ型肝炎ウイルスＸ（ＷＨＸ）タンパク質の発現を排除するために変異させたバリアントである。また、それらの両方全体が参照により本明細書に援用される、Ｋｉｎｇｓｍａｎ Ｓ．Ｍ．，Ｍｉｔｒｏｐｈａｎｏｕｓ Ｋ．，＆Ｏｌｓｅｎ Ｊ．Ｃ．（２００５），Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ
Ｏｎｃｏｇｅｎｅ Ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｗｏｏｄｃｈｕｃｋ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｐｏｓｔ－Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｅｌｅｍｅｎｔ （Ｗｐｒｅ）．」Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１２（１）：３－４及びＺａｎｔａ－Ｂｏｕｓｓｉｆ Ｍ．Ａ．，Ｃｈａｒｒｉｅｒ Ｓ．，Ｂｒｉｃｅ－Ｏｕｚｅｔ Ａ．，Ｍａｒｔｉｎ Ｓ．，Ｏｐｏｌｏｎ Ｐ．，Ｔｈｒａｓｈｅｒ Ａ．Ｊ．，Ｈｏｐｅ Ｔ．Ｊ．，＆Ｇａｌｙ Ａ．（２００９），Ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｍｕｔａｔｅｄ Ｐｒｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｌｌｏｗｉｎｇ Ｈｉｇｈ ａｎｄ Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ Ｔｒａｎｓｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｗｈｉｌｅ Ａｂｒｏｇａｔｉｎｇ Ｗｈｖ－Ｘ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｔ
ｏ ｔｈｅ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ｗａｓ，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１６（５）：６０５－１９も参照されたい。他の実施形態では、エンハンサは、非ウイルス供給源から選択される。ある特定の実施形態では、ＷＰＲＥ配列は、存在しない。ある特定の実施形態では、ＷＰＲＥは、配列番号４３の核酸配列を含む。

【0062】

ある特定の実施形態では、発現カセットは、ｈＳＧＳＨコード配列を含み、そのための他の調節配列を含み得る。必要な調節配列は、標的細胞内でその転写、翻訳、及び／又は発現を可能にする様式でｈＳＧＳＨコード配列と操作可能に連結されている。

【0063】

ある特定の実施形態では、標的細胞は、中枢神経系細胞であり得る。ある特定の実施形態では、標的細胞は、興奮性ニューロン、抑制性ニューロン、グリア細胞、皮質細胞、前頭皮質細胞、大脳皮質細胞、脊髄細胞のうちの１つ以上である。ある特定の実施形態では、標的細胞は、末梢神経系（ＰＮＳ）細胞、例えば、網膜細胞である。単球、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、ＮＫ細胞、リンパ節細胞、扁桃細胞、骨髄間葉細胞、幹細胞、骨髄幹細胞、心臓細胞、上皮細胞、食道細胞、胃細胞、胎児切断細胞、結腸細胞、直腸細胞、肝臓細胞、腎細胞、肺細胞、唾液腺細胞、甲状腺細胞、副腎細胞、乳房細胞、膵臓細胞、ランゲルハンス島細胞、胆嚢細胞、前立腺細胞、膀胱細胞、皮膚細胞、子宮細胞、子宮頸部細胞、精巣細胞、又はＭＰＳＩＩＩＡを有さない対象における機能性ＳＧＳＨ酵素を発現する任意の他の細胞などの、神経系からの細胞以外の他の細胞も、標的細胞として選択され得る。

【0064】

ある特定の実施形態では、発現カセットは、ＣＢ７プロモータ－任意選択的にニワトリベータアクチンイントロン配列－ｈＳＧＳＨコード配列－ウサギベータ－グロビンポリＡを含む。ある特定の実施形態では、発現カセットは、ＣＢ７プロモータ－任意選択的にニワトリベータアクチンイントロン配列－ＢＩＰ外因性リーダーペプチドを含むｈＳＧＳＨコード配列－ウサギベータ－グロビンポリＡを含む。ある特定の実施形態では、発現カセットは、ＣＢ７プロモータ－任意選択的にニワトリベータアクチンイントロン配列－ｈＳＧＳＨコード配列に対して５’にＢＩＰ外因性リーダーペプチド及びｈＳＧＳＨコード配列に対して３’にｖＩＧＦ２ペプチドを含むｈＳＧＳＨコード配列－ウサギベータ－グロビンポリＡを含む。ある特定の実施形態では、発現カセットは、ＣＢ７プロモータ－任意選択的にニワトリベータアクチンイントロン配列－ｈＳＧＳＨコード配列に対して５’にＢＩＰ外因性リーダーペプチド及びｈＳＧＳＨコード配列に対して３’にｖＩＧＦ２ペプチドを含むｈＳＧＳＨコード配列－任意選択的にＷＰＲＥ－ウサギベータ－グロビンポリＡを含む。ある特定の実施形態では、発現カセットは、ＣＢ７プロモータ－任意選択的にニワトリベータアクチンイントロン配列－ｈＳＧＳＨコード配列に対して５’にＢＩＰ外因性リーダーペプチド及びｈＳＧＳＨコード配列に対して３’にｖＩＧＦ２ペプチドを含むｈＳＧＳＨコード配列を含み、任意選択的に、ｈＳＧＳＨが、安定化アミノ酸変化Ａ４８２Ｙ及びＥ４８８Ｖ（ｈＳＧＳＨ．Ａ４８２Ｙ－Ｅ４８８Ｖ）－任意選択的にＷＰＲＥ－ウサギベータ－グロビンポリＡを含む。

【0065】

ある特定の実施形態では、発現カセットは、ＣＢ７プロモータ（配列番号４４）－任意選択的にニワトリベータアクチンイントロン配列（配列番号４５）－ｈＳＧＳＨコード配列に対して５’にＢＩＰ外因性リーダーペプチド及びｈＳＧＳＨコード配列に対して３’にｖＩＧＦ２ペプチドを含むｈＳＧＳＨコード配列－任意選択的にＷＰＲＥ（配列番号４３）－ウサギベータ－グロビンポリＡ（配列番号４６）を含む。ある特定の実施形態では、発現カセットは、ＣＢ７プロモータ（配列番号４４）－任意選択的にニワトリベータアクチンイントロン配列（配列番号４５）－ｈＳＧＳＨコード配列に対して５’にＢＩＰ外因性リーダーペプチド及びｈＳＧＳＨコード配列に対して３’にｖＩＧＦ２ペプチドを含むｈＳＧＳＨ（任意選択的にｈＳＧＳＨ．Ａ４８２Ｙ－Ｅ４８８Ｖ）コード配列－任意選択的にＷＰＲＥ（配列番号４３）－ウサギベータ－グロビンポリＡ（配列番号４６）を含
む。ある特定の実施形態では、発現カセットは、配列番号８の核酸配列を含む。

【0066】

ある特定の実施形態では、発現カセットは、配列番号４の核酸配列（ＣＢ７．ＣＩ．ＢＩＰ．ｈＳＧＳＨｃｏｖ１－Ａ４８２Ｙ＿Ｅ４８８Ｖ．ｖＩＧＦ２．ｒＢＧ）、又は配列番号４に対して少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％～少なくとも１００％同一の配列を含む。ある特定の実施形態では、発現カセットは、配列番号１１の核酸配列（ＣＢ７．ＣＩ．ｈＳＧＳＨｃｏＶ１．ｒＢＧ）、又は配列番号１１に対して少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％～少なくとも１００％同一の配列を含む。ある特定の実施形態では、発現カセットは、配列番号８の核酸配列（ＣＢ７．ＣＩ．ＢＩＰ．ｈＳＧＳＨｃｏｖ１－Ａ４８２Ｙ＿Ｅ４８８Ｖ．ｖＩＧＦ２．ＷＰＲＥ．ｒＢＧ）、又は配列番号８に対して少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％～少なくとも１００％同一の配列を含む。

【0067】

本明細書に記載の発現カセットにおける組成物が、本明細書にわたって記載される他の組成物、レジメン、態様、実施形態及び方法に適用されるように意図されることを理解されたい。

【0068】

ｍｉＲＮＡ
ある特定の実施形態では、ｈＳＧＳＨコード配列に加えて、別の非ＡＡＶコード配列、例えば、目的のペプチド、ポリペプチド、タンパク質、機能性ＲＮＡ分子（例えば、ｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ阻害剤）、又は他の遺伝子産物が含まれ得る。有用な遺伝子産物としては、ｍｉＲＮＡが挙げられ得る。ｍｉＲＮＡ及び他の小さい干渉核酸は、標的ＲＮＡ転写産物の切断／分解、又は標的メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の翻訳抑制を介して遺伝子発現を調節する。ｍｉＲＮＡは、典型的には、最終的な１９～２５の非翻訳ＲＮＡ産物として天然に発現される。ｍｉＲＮＡは、標的ｍＲＮＡの３’非翻訳領域（ＵＴＲ）との配列特異的相互作用を通じてそれらの活性を呈する。これらの内因的に発現されるｍｉＲＮＡは、ヘアピン前駆体を形成し、これがその後、ｍｉＲＮＡ二本鎖へと処理され、更に「成熟」一本鎖ｍｉＲＮＡ分子へと処理される。この成熟ｍｉＲＮＡは、多タンパク質複合体ｍｉＲＩＳＣを導き、これが、成熟ｍｉＲＮＡに対する相補性に基づいて、標的ｍＲＮＡの、例えば、３’ＵＴＲ領域内の標的部位を同定する。

【0069】

本明細書で使用される場合、「ｍｉＲＮＡ標的配列」は、ＤＮＡプラス鎖上に位置する配列（５’から３’へ）であり、ｍｉＲＮＡシード配列を含むｍｉＲＮＡ配列に対して少なくとも部分的に相補的である。ｍｉＲＮＡ標的配列は、コードされた導入遺伝子産物の非翻訳領域に対して外因性であり、導入遺伝子発現の抑制が所望される細胞で、ｍｉＲＮＡによって特異的に標的化されるように設計される。「ｍｉＲ１８３クラスター標的配列」という用語は、ｍｉＲ－１８３を含むｍｉＲ１８３クラスター（代替的に、ファミリーと称される）及び－１８２（参照により本明細書に援用される、Ｄａｍｂａｌ，Ｓ．ｅｔ
ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ４３：７１７３－７１８８，２０１５によって記載されている）のうちの１つ以上のメンバーに応答する、標的配列を指す。理論に束縛されることを望むものではないが、（遺伝子産物をコードする）導入遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）は、ｍｉＲＮＡを含有する発現カセットが送達される細胞型に存在するので、３’ＵＴＲ ｍｉＲＮＡ標的配列へのｍｉＲＮＡの特異的結合が、ｍＲＮＡのサイレンシング及び切断を生じ、それによって、ｍｉＲＮＡを発現する細胞においてのみ、導入遺伝子の発現が低減又は排除される。

【0070】

典型的には、ｍｉＲＮＡ標的配列は、少なくとも７ヌクレオチド～約２８ヌクレオチド長、少なくとも８ヌクレオチド～約２８ヌクレオチド長、７ヌクレオチド～２８ヌクレオチド、８ヌクレオチド～１８ヌクレオチド長、約１２～約２８ヌクレオチド長、約２０～
約２６ヌクレオチド、約２２ヌクレオチド、約２４ヌクレオチド、又は約２６ヌクレオチドであり、ｍｉＲＮＡシード配列に相補的である少なくとも１つの連続領域（例えば、７又は８ヌクレオチド）を含有する。ある特定の実施形態では、標的配列は、ｍｉＲＮＡシード配列と正確な相補性（１００％）を有する配列、又はｍｉＲＮＡシード配列といくつかのミスマッチを含む部分的な相補性を有する配列を含む。ある特定の実施形態では、標的配列は、ｍｉＲＮＡシード配列と１００％相補的である少なくとも７～８個のヌクレオチドを含む。ある特定の実施形態では、標的配列は、ｍｉＲＮＡシード配列と１００％相補的である配列からなる。ある特定の実施形態では、標的配列は、シード配列に１００％相補的である配列の複数のコピー（例えば、２、３、４つ以上のコピー）を含有する。ある特定の実施形態では、１００％相補性の領域は、標的配列の長さの少なくとも３０％を含む。ある特定の実施形態では、標的配列の残部は、ｍｉＲＮＡに対して少なくとも約８０％～約９９％の相補性を有する。ある特定の実施形態では、ＤＮＡプラス鎖を含有する発現カセットでは、ｍｉＲＮＡ標的配列は、ｍｉＲＮＡの逆相補体である。

【0071】

ある特定の実施形態では、発現カセットｍＲＮＡ又はＤＮＡプラス鎖の少なくとも第１及び／又は少なくとも第２のｍｉＲＮＡ標的配列のｍｉＲＮＡ標的配列は、（ｉ）ＡＧＴＧＡＡＴＴＣＴＡＣＣＡＧＴＧＣＣＡＴＡ（ｍｉＲ１８３、配列番号２８）、（ｉｉ）ＡＧＴＧＴＧＡＧＴＴＣＴＡＣＣＡＴＴＧＣＣＡＡＡ（ｍｉＲ１８２、配列番号４７）から選択される。

【0072】

ある特定の実施形態では、ベクターゲノム又は発現カセットは、ｍｉＲ－１８３標的配列である少なくとも１つのｍｉＲＮＡ標的配列を含有するある特定の実施形態では、ベクターゲノム又は発現カセットは、ＡＧＴＧＡＡＴＴＣＴＡＣＣＡＧＴＧＣＣＡＴＡ（配列番号２８）を含むｍｉＲ－１８３標的配列を含有する（ｍｉＲ－１８３シード配列に相補的な配列には、下線が引かれている）。ある特定の実施形態では、ベクターゲノム又は発現カセットは、ｍｉＲ－１８３シード配列に１００％相補的である配列の２つ以上のコピー（例えば、２又は３つのコピー）を含有する。ある特定の実施形態では、ベクターゲノム又は発現カセットは、ｍｉＲ－１８３シード配列に１００％相補的である配列の４つのコピーを含有する。ある特定の実施形態では、ｍｉＲ－１８３標的配列は、約７ヌクレオチド～約２８ヌクレオチド長であり、ｍｉＲ－１８３シード配列に少なくとも１００％相補的である少なくとも１つの領域を含む。ある特定の実施形態では、ｍｉＲ－１８３標的配列は、配列番号２８に部分的な相補性を有する配列を含有し、したがって、配列番号２８と整列させると、１つ以上のミスマッチが存在する。ある特定の実施形態では、ｍｉＲ－１８３標的配列は、配列番号２８に整列させた場合、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個のミスマッチを有する配列を含み、ミスマッチは非連続的であり得る。ある特定の実施形態では、ｍｉＲ－１８３標的配列は、１００％相補的な領域を含み、その領域はまた、ｍｉＲ－１８３標的配列の長さの少なくとも３０％を構成する。ある特定の実施形態では、１００％相補的な領域は、ｍｉＲ－１８３シード配列に対して１００％の相補性を有する配列を含む。ある特定の実施形態では、ｍｉＲ－１８３標的配列の残りは、ｍｉＲ－１８３に対して少なくとも約８０％～約９９％の相補性を有する。ある特定の実施形態では、発現カセット又はベクターゲノムは、切断された配列番号２８、すなわち、配列番号２８の５’又は３’末端のいずれか又は両方で、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０ヌクレオチドを欠く配列を含む、ｍｉＲ－１８３標的配列を含む。ある特定の実施形態では、発現カセット又はベクターゲノムは、導入遺伝子及び１つのｍｉＲ－１８３標的配列を含む。更に他の実施形態では、発現カセット又はベクターゲノムは、少なくとも２、３、又は４つのｍｉＲ－１８３標的配列を含む。

【0073】

ある特定の実施形態では、ベクターゲノム又は発現カセットは、ｍｉＲ－１８２標的配列である少なくとも１つのｍｉＲＮＡ標的配列を含有する。ある特定の実施形態では、ベ
クターゲノム又は発現カセットは、ＡＧＴＧＴＧＡＧＴＴＣＴＡＣＣＡＴＴＧＣＣＡＡＡ（配列番号４７）を含むｍｉＲ－１８２標的配列を含有する。ある特定の実施形態では、ベクターゲノム又は発現カセットは、ｍｉＲ－１８２シード配列に対して１００％相補的である配列の２つ以上のコピー（例えば、２又は３つのコピー）を含有する。ある特定の実施形態では、ｍｉＲ－１８２標的配列は、約７ヌクレオチド～約２８ヌクレオチド長であり、ｍｉＲ－１８２シード配列に対して少なくとも１００％相補的である少なくとも１つの領域を含む。ある特定の実施形態では、ｍｉＲ－１８２標的配列は、配列番号４７に部分的な相補性を有する配列を含有し、したがって、配列番号４７と整列させると、１つ以上のミスマッチが存在する。ある特定の実施形態では、ｍｉＲ－１８３標的配列は、配列番号４７に整列させた場合、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個のミスマッチを有する配列を含み、ミスマッチは非連続的であり得る。ある特定の実施形態では、ｍｉＲ－１８２標的配列は、１００％相補的な領域を含み、その領域はまた、ｍｉＲ－１８２標的配列の長さの少なくとも３０％を構成する。ある特定の実施形態では、１００％相補的な領域は、ｍｉＲ－１８２シード配列に対して１００％の相補性を有する配列を含む。ある特定の実施形態では、ｍｉＲ－１８２標的配列の残りは、ｍｉＲ－１８２に対して少なくとも約８０％～約９９％の相補性を有する。ある特定の実施形態では、発現カセット又はベクターゲノムは、切断された配列番号４７、すなわち、配列番号４７の５’又は３’末端のいずれか又は両方で、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０ヌクレオチドを欠く配列を含む、ｍｉＲ－１８２標的配列を含む。ある特定の実施形態では、発現カセット又はベクターゲノムは、導入遺伝子及び１つのｍｉＲ－１８２標的配列を含む。更に他の実施形態では、発現カセット又はベクターゲノムは、少なくとも２、３、又は４つのｍｉＲ－１８２標的配列を含む。

【0074】

「タンデム反復」という用語は、２つ以上の連続するｍｉＲＮＡ標的配列の存在を指すために本明細書で使用される。これらのｍｉＲＮＡ標的配列は、連続的であり得、すなわち、一方の３’末端が、介在配列なしで、次の配列の５’末端のすぐ上流にあるように、又はその逆で、互いの後に直接的に位置し得る。別の実施形態では、ｍｉＲＮＡ標的配列のうちの２つ以上が、短いスペーサ配列によって分離されている。

【0075】

本明細書で使用される場合、「スペーサ」は、２つ以上の連続するｍｉＲＮＡ標的配列の間に位置する、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０ヌクレオチド長の任意の選択された核酸配列である。ある特定の実施形態では、スペーサは、１～８ヌクレオチド長、２～７ヌクレオチド長、３～６ヌクレオチド長、４ヌクレオチド長、４～９ヌクレオチド、３～７ヌクレオチド、又はより長い数値である。好適には、スペーサは、非コード配列である。ある特定の実施形態では、スペーサは、４つの（４）ヌクレオチドであり得る。ある特定の実施形態では、スペーサは、ＧＧＡＴである。ある特定の実施形態では、スペーサは、６つの（６）ヌクレオチドである。ある特定の実施形態では、スペーサは、ＣＡＣＧＴＧ又はＧＣＡＴＧＣである。ある特定の実施形態では、スペーサは、独立して、（Ａ）ＧＧＡＴ、（Ｂ）ＣＡＣＧＴＧ、（Ｃ）ＧＣＡＴＧＣ、（Ｄ）ＧＣＧＧＣＣＧＣ、（Ｅ）ＣＧＡＴ、（Ｆ）ＡＴＣＧＧＴ、及び／又は（Ｇ）ＴＣＡＣのうちの１つ以上から選択される。

【0076】

ある特定の実施形態では、タンデム反復は、２、３、４つ以上の同じｍｉＲＮＡ標的配列を含有する。ある特定の実施形態では、タンデム反復は、少なくとも２つの異なるｍｉＲＮＡ標的配列、少なくとも３つの異なるｍｉＲＮＡ標的配列、又は少なくとも４つの異なるｍｉＲＮＡ標的配列などを含有する。ある特定の実施形態では、タンデム反復は、２又は３つの同じｍｉＲＮＡ標的配列、及び異なる第４のｍｉＲＮＡ標的配列を含有し得る。

【0077】

ある特定の実施形態では、発現カセットには、少なくとも２つの異なるタンデム反復の
セットが存在し得る。例えば、３’ＵＴＲは、導入遺伝子のすぐ下流にタンデム反復、ＵＴＲ配列、ＵＴＲの３’末端のより近くに２つ以上のタンデム反復を含有し得る。別の例では、５’ＵＴＲは、１つ、２つ以上のｍｉＲＮＡ標的配列を含有し得る。別の例では、３’は、タンデム反復を含有し得、５’ＵＴＲは、少なくとも１つのｍｉＲＮＡ標的配列を含有し得る。

【0078】

ある特定の実施形態では、発現カセットは、導入遺伝子の終止コドンの約０～２０ヌクレオチド以内で開始する、２、３、４つ以上のタンデム反復を含有する。ある特定の実施形態では、発現カセットは、導入遺伝子の終止コドンの約０～２０ヌクレオチド以内で開始する、２、３、４、５、６、７、８以上のタンデム反復を含有する。他の実施形態では、発現カセットは、導入遺伝子の終止コドンから少なくとも１００～約４０００ヌクレオチドでｍｉＲＮＡタンデム反復を含有する。標的ｍｉＲＮＡ配列は、配列番号２８及び／又は配列番号４７から選択され得る。

【0079】

ある特定の実施形態では、ベクターゲノムは、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、又は好ましくは少なくとも４つの後根神経節（ｄｒｇ）特異的ｍｉＲＮＡ標的配列のタンデム反復を更に含む。ある特定の実施形態では、ベクターゲノムは、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、又は好ましくは少なくとも８つの後根神経節（ｄｒｇ）特異的ｍｉＲＮＡ標的配列のタンデム反復を更に含む。例えば、２０１９年１２月２０日に出願され、現在ＷＯ２０２０／１３２４５５として公表されている、ＰＣＴ／ＵＳ１９／６７８７２を参照されたい。また、参照により本明細書に援用される、２０２０年５月１２日に出願された米国仮特許出願第６３／０２３，５９３号、２０２０年６月１２日に出願された米国仮特許出願第６３／０３８，４８８号、２０２０年６月２４日に出願された米国仮特許出願第６３／０４３，５６２号、及び２０２０年６月２４日に出願された米国仮特許出願第６３／０７９，２９９号、２０２０年９月１６日に出願された米国仮特許出願第６３／０７９，２９９号、及び２０２１年２月２２日に出願された米国仮特許出願第６３／１５２，０４２号、並びに国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２１／３２００３を参照されたい。

【0080】

ある特定の実施形態では、発現カセットは、少なくとも８つのｍｉＲＮＡ ｄｒｇ標的解除（ｄｅ－ｔａｒｇｅｔｉｎｇ）配列を含む。ある特定の実施形態では、発現カセットは、少なくとも８つのｍｉＲＮＡ ｄｒｇ標的解除配列を含み、ｍｉＲ１８２及びｍｉＲ１８３を含む。ある特定の実施形態では、発現カセットは、少なくとも８つのｍｉＲＮＡ
ｄｒｇ標的解除配列を含み、少なくとも第１、少なくとも第２、少なくとも第３、及び少なくとも第４のｍｉＲＮＡが、ｍｉＲ１８２配列であり、少なくとも第５、少なくとも第６、少なくとも第７、及び少なくとも第８のｍｉＲＮＡが、ｍｉＲ１８３配列である。ある特定の実施形態では、発現カセット又はベクターゲノムは、少なくとも８つのｍｉＲＮＡ ｄｒｇ標的解除配列を含み、少なくとも第１、少なくとも第２、少なくとも第３、及び少なくとも第４のｍｉＲＮＡが、ｍｉＲ１８３配列であり、少なくとも第５、少なくとも第６、少なくとも第７、及び少なくとも第８のｍｉＲＮＡが、ｍｉＲ１８２配列である。

【0081】

ある特定の実施形態では、本発明は、本明細書に定義されるｈＳＧＳＨコード配列、４つのｍｉＲ１８２配列、４つのｍｉＲ１８３配列、及びＳＧＳＨコード配列と操作可能に連結された他の好適な調節配列を含む、核酸分子を有する発現カセットを提供する。ある特定の実施形態では、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）配列（例えば、調節性制御配列と操作可能に連結されたｈＳＧＳＨコード配列を含む、ＯＲＦ）、及びＤＲＧ標的解除配列を含む、発現カセット。ある特定の実施形態では、ＤＲＧ標的解除配列は、コード配列に対して５’に位置する。ある特定の実施形態では、ＤＲＧ標的解除配列は、コード配列に対して３’に位置する。

【0082】

ある特定の実施形態では、調節配列は、ＣＢ７プロモータを含む。ある特定の実施形態では、調節配列は、１つ以上のイントロン（複数可）、１つ以上のエンハンサ（複数可）、及びポリＡを含む。ある特定の実施形態では、発現カセットは、ＣＢ７プロモータ－任意選択的にニワトリベータアクチンイントロン配列－ｈＳＧＳＨコード配列－ｍｉＲＮＡ１８２の少なくとも４つのコピー－ｍｉＲ１８３の少なくとも４つのコピー－ウサギベータ－グロビンポリＡを含む。ある特定の実施形態では、発現カセットは、ＣＢ７プロモータ－任意選択的にニワトリベータアクチンイントロン配列－ＢＩＰ外因性リーダーペプチドを含むｈＳＧＳＨコード配列－ｍｉＲＮＡ１８２の少なくとも４つのコピー－ｍｉＲ１８３の少なくとも４つのコピー－ウサギベータ－グロビンポリＡを含む。ある特定の実施形態では、発現カセットは、ＣＢ７プロモータ－任意選択的にニワトリベータアクチンイントロン配列－ｈＳＧＳＨコード配列に対して５’にＢＩＰ外因性リーダーペプチド及びｈＳＧＳＨコード配列に対して３’にｖＩＧＦ２ペプチドを含むｈＳＧＳＨコード配列－ｍｉＲ１８２の少なくとも４つのコピー－ｍｉＲ１８３の少なくとも４つのコピー－ウサギベータ－グロビンポリＡを含む。ある特定の実施形態では、発現カセットは、配列番号３７の核酸配列を含む。

【0083】

ある特定の実施形態では、発現カセットは、ＣＢ７プロモータ－任意選択的にニワトリベータアクチンイントロン配列－野生型コード配列であるｈＳＧＳＨコード配列－ｍｉＲＮＡ１８２の少なくとも４つのコピー－ウサギベータ－グロビンポリＡを含む。ある特定の実施形態では、発現カセットは、ＣＢ７プロモータ－任意選択的にニワトリベータアクチンイントロン配列－野生型コード配列であるｈＳＧＳＨコード配列－ｍｉＲ１８３の少なくとも４つのコピー－ウサギベータ－グロビンポリＡを含む。ある特定の実施形態では、発現カセットは、ＣＢ７プロモータ－任意選択的にニワトリベータアクチンイントロン配列－野生型コード配列であるｈＳＧＳＨコード配列－ｍｉＲＮＡ１８２の少なくとも４つのコピー－ｍｉＲ１８３の少なくとも４つのコピー－ウサギベータ－グロビンポリＡを含む。ある特定の実施形態では、天然シグナルペプチド及び成熟ｈＳＧＳＨを含む野生型ｈＳＧＳＨコード配列は、配列番号６０を含む。

【0084】

ある特定の実施形態では、発現カセットは、配列番号２、３８、４１の核酸分子を指す。ある特定の実施形態では、発現カセットは、ｈＳＧＳＨをコードし、ｍｉＲＮＡ１８３の４つのタンデム反復（ｍｉＲ１８３、配列番号２８）を含む、配列番号２の核酸分子を指す。ある特定の実施形態では、発現カセットは、ｈＳＧＳＨをコードし、ｍｉＲＮＡ１８２の４つのタンデム反復（ｍｉＲ１８２、配列番号４８）を含む、配列番号４１の核酸分子を指す。ある特定の実施形態では、発現カセットは、ｈＳＧＳＨをコードし、ｍｉＲＮＡ１８２の４つのタンデム反復（ｍｉＲ１８２、配列番号４８）及びｍｉＲＮＡ１８３の４つのタンデム反復（ｍｉＲ１８３、配列番号２８）を含む、配列番号３８の核酸分子を指す。

【0085】

ある特定の実施形態では、発現カセットは、配列番号１４の核酸配列（ＣＢ７．ＣＩ．ｈＳＧＳＨｃｏＶ１－４ｘｍｉＲ１８３．ｒＢＧ）、又は配列番号１４に対して少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９～少なくとも１００％、及び／又はそれらの間の値で同一の配列を含む。ある特定の実施形態では、発現カセットは、配列番号４１の核酸配列（ＣＢ７．ＣＩ．ＢＩＰ．ｈＳＧＳＨｃｏｖ１－Ａ４８２Ｙ＿Ｅ４８８Ｖ．ｖＩＧＦ２．ＷＰＲＥ．４ｘｍｉＲ１８２．ｒＢＧ）、又は配列番号４１に対して少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％～少なくとも１００％、及び／又はそれらの間の値で同一の配列を含む。ある特定の実施形態では、発現カセットは、配列番号２の核酸配列（ＣＢ７．ＣＩ．ＢＩＰ．ｈＳＧＳＨｃｏｖ１（Ａ４８２Ｙ－Ｅ４８８Ｖ）．ｖＩＧＦ２．ＷＰＲＥ．４ｘｍｉＲ１８３．ｒＢＧ）、又は配列番号２に対して少なくとも９５％
、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％～少なくとも１００％、及び／又はそれらの間の値で同一の配列を含む。ある特定の実施形態では、発現カセットは、配列番号３８の核酸配列（ＣＢ７．ＣＩ．ＢＩＰ．ｈＳＧＳＨｃｏｖ１－Ａ４８２Ｙ＿Ｅ４８８Ｖ．ｖＩＧＦ２．ＷＰＲＥ．４ｘｍｉＲ１８２．４ｘｍｉＲ１８３．ｒＢＧ）、又は配列番号３８に対して少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９～少なくとも１００％、及び／又はそれらの間の値で同一の配列を含む。

【0086】

ベクター
一態様では、本明細書で提供されるのは、機能性ヒトＮ－スルホグリコサミンスルホヒドロラーゼ（ｈＳＧＳＨ）をコードする操作された核酸配列と、標的細胞において発現を指示する調節配列と、を含む、ベクターであり、ｈＳＧＳＨコード配列が、シグナルペプチド配列及び成熟ｈＳＧＳＨコード配列を含む。一実施形態では、成熟ｈＳＧＳＨコード配列は、配列番号１６であり、アミノ酸配列配列番号１７をコードする。ある特定の実施形態では、成熟ｈＳＧＳＨコード配列は、配列番号１６に対して少なくとも約８５％同一の、配列番号１７のアミノ酸配列をコードする、配列である。ある特定の実施形態では、成熟ｈＳＧＳＨコード配列は、配列番号１６に対して少なくとも約８５％同一の、配列番号２３のアミノ酸配列をコードする、配列である。更なる実施形態では、成熟ｈＳＧＳＨコード配列は、配列番号１６に対して少なくとも９９％同一であり、配列番号２３のアミノ酸配列をコードする。更に更なる実施形態では、成熟ｈＳＧＳＨコード配列は、配列番号２２であるか、又は配列番号２３のアミノ酸配列をコードする、配列番号２２に対して少なくとも約９９％同一の配列である。

【0087】

ある特定の実施形態では、ベクターは、天然リーダーペプチド配列及び成熟ｈＳＧＳＨコード配列を含む、ｈＳＧＳＨコード配列を含み、ｈＳＧＳＨ成熟コード配列が、配列番号１６、若しくは配列番号１６に対して少なくとも９５％同一の配列、又は配列番号２２、若しくは配列番号２２に対して少なくとも約９５％同一の配列から選択される。ある特定の実施形態では、ベクターは、外因性リーダーペプチド配列及び成熟ｈＳＧＳＨコード配列を含む、ｈＳＧＳＨコード配列を含み、ｈＳＧＳＨ成熟コード配列が、配列番号１６、若しくは配列番号１６に対して少なくとも９５％同一の配列、又は配列番号２２、若しくは配列番号２２に対して少なくとも約９５％同一の配列から選択される。

【0088】

ある特定の実施形態では、ベクターは、天然リーダーペプチド配列及び成熟ｈＳＧＳＨコード配列を含む、ｈＳＧＳＨコード配列を含み、ｈＳＧＳＨコード配列が、配列番号３５、又は配列番号３５に対して少なくとも９５％同一の配列である。ある特定の実施形態では、ベクターは、外因性リーダーペプチド配列及び成熟ｈＳＧＳＨコード配列を含む、ｈＳＧＳＨコード配列を含み、ｈＳＧＳＨコード配列が、配列番号１８、又は配列番号１８に対して少なくとも９５％同一の配列である。ある特定の実施形態では、ベクターは、外因性リーダーペプチド配列、並びに安定化アミノ酸残基変化Ａ４８２Ｙ及びＥ４８８Ｖを含む成熟ｈＳＧＳＨコード配列を含む、ｈＳＧＳＨコード配列を含み、ｈＳＧＳＨコード配列が、配列番号２４、又は配列番号２４に対して少なくとも９５％同一の配列である。

【0089】

更なる実施形態では、ベクターは、外因性リーダーペプチド配列、成熟ｈＳＧＳＨコード配列、リンカー配列、及びｖＩＧＦ２ペプチド配列を含む、ｈＳＧＳＨコード配列を含み、ｈＳＧＳＨコード配列が、配列番号２０、又は配列番号２０に対して少なくとも９５％同一の配列である。更なる実施形態では、ベクターは、外因性リーダーペプチド配列、安定化アミノ酸残基変化Ａ４８２Ｙ及びＥ４８８Ｖを含む成熟ｈＳＧＳＨコード配列、リンカー配列、並びにｖＩＧＦ２ペプチド配列を含む、ｈＳＧＳＨコード配列を含み、ｈＳＧＳＨコード配列が、配列番号２６、又は配列番号２６に対して少なくとも９５％同一の
配列である。

【0090】

本明細書で使用される「ベクター」は、核酸配列を含む生物学的部分又は化学的部分であり、当該核酸配列の複製又は発現のために、適切な標的細胞に導入され得る。ベクターの例としては、限定されないが、組換えウイルス、プラスミド、リポプレックス、ポリマーソーム、ポリプレックス、デンドリマー、細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）コンジュゲート、磁性粒子、又はナノ粒子が挙げられる。一実施形態では、ベクターは、機能性ＳＧＳＨをコードする、外因性若しくは異種核酸、又は操作された核酸を挿入され得、次いで、適切な標的細胞に導入され得る、核酸分子である。かかるベクターは、好ましくは、１つ以上の複製起点と、組換えＤＮＡが挿入され得る１つ以上の部位とを有する。例えば、薬剤耐性遺伝子をコードするベクターは、多くの場合、ベクターを含む細胞を、含まない細胞から選択することができる手段を有する。一般的なベクターとしては、プラスミド、ウイルスゲノム、及び「人工染色体」が挙げられる。ベクターの生成、産生、特徴付け、又は定量化の従来の方法は、当業者に利用可能である。

【0091】

一実施形態では、ベクターは、非ウイルスプラスミドであり、例えば、ミセル、リポソーム、カチオン性脂質－核酸組成物、ポリグリカン組成物、並びに他のポリマー、脂質、及び／又はコレステロール系－核酸コンジュゲート、並びに本明細書に記載のものなどの他の構築物を含む、様々な組成物及びナノ粒子と結合される、その記載の発現カセット、例えば、「裸のＤＮＡ」、「裸のプラスミドＤＮＡ」、裸のＲＮＡ、及びｍＲＮＡを含む。例えば、それらの全てが参照により本明細書に援用される、Ｘ．Ｓｕ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ，２０１１，８（３），ｐｐ ７７４－７８７、ウェブ公開：２０１１年３月２１日、ＷＯ２０１３／１８２６８３、ＷＯ２０１０／０５３５７２、及びＷＯ２０１２／１７０９３０を参照されたい。

【0092】

ある特定の実施形態では、本明細書に記載のベクターは、合成又は人工ウイルス粒子を指す、「複製欠陥ウイルス」又は「ウイルスベクター」であり、それらの中で、ＳＧＳＨをコードする核酸配列を含有する発現カセットが、ウイルスカプシド又はエンベロープ内にパッケージングされ、ウイルスカプシド又はエンベロープ内にパッケージングされた任意のウイルスゲノム配列も、複製欠損である、すなわち、後代ビリオンを生成することはできないが、標的細胞に感染する能力を保持している。一実施形態では、ウイルスベクターのゲノムは、複製に必要とされる酵素をコードする遺伝子を含まない（ゲノムは、人工ゲノムの増幅及びパッケージングに必要とされるシグナルに隣接するＳＧＳＨをコードする核酸配列のみを含有する「ガットレス（ｇｕｔｌｅｓｓ）」であるように操作されることができる）が、これらの遺伝子は、産生中に供給され得る。したがって、後代ビリオンによる複製及び感染は、複製に必要とされるウイルス酵素の存在下以外で生じ得ないので、遺伝子療法における使用に安全であると考えられる。

【0093】

本明細書で使用される場合、組換えウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、アデノウイルス、ボカウイルス、ハイブリッドＡＡＶ／ボカウイルス、単純ヘルペスウイルス、又はレンチウイルスである。

【0094】

本明細書で使用される場合、「宿主細胞」という用語は、ベクター（例えば、組換えＡＡＶ）が産生されるパッケージング細胞株を指し得る。宿主細胞は、任意の手段、例えば、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、マイクロインジェクション、形質転換、ウイルス感染、トランスフェクション、リポソーム送達、膜融合技術、高速ＤＮＡコーティングペレット、ウイルス感染、及びプロトプラスト融合によって細胞に導入される外因性又は異種ＤＮＡを含有する、原核細胞又は真核細胞（例えば、ヒト、昆虫、又は酵母）であり得る。宿主細胞の例としては、限定されないが、単離された細胞、細胞培養物、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ細胞、酵母細胞、ヒト細胞、非ヒト細胞、哺乳類細
胞、非哺乳類細胞、昆虫細胞、ＨＥＫ－２９３細胞、肝臓細胞、腎臓細胞、中枢神経系の細胞、ニューロン、グリア細胞、又は幹細胞が挙げられ得る。

【0095】

本明細書で使用される場合、「標的細胞」という用語は、機能性ＳＧＳＨの発現が所望される、任意の標的細胞を指す。ある特定の実施形態では、「標的細胞」という用語は、ＭＰＳ ＩＩＩＡを治療されている対象の細胞を指すことが意図される。標的細胞の例としては、限定されないが、肝臓細胞、腎臓細胞、中枢神経系の細胞、ニューロン、グリア細胞、及び幹細胞が挙げられ得る。ある特定の実施形態では、ベクターは、エクスビボで標的細胞に送達される。ある特定の実施形態では、ベクターは、インビボで標的細胞に送達される。

【0096】

本明細書に記載のベクターの組成物は、本明細書にわたって記載される他の組成物、レジメン、態様、実施形態、及び方法に適用されるように意図されることを理解されたい。

【0097】

組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）
本明細書で提供されるのは、ムコ多糖症ＩＩＩ Ａ型（ＭＰＳ ＩＩＩＡ）を治療するのに有用な組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）である。ｒＡＡＶは、（ａ）ＡＡＶカプシド、及び（ｂ）（ａ）のＡＡＶカプシド内にパッケージングされたベクターゲノムを含む。好適には、選択されたＡＡＶカプシドは、治療される細胞を標的とする。ある特定の実施形態では、カプシドは、クレードＦからのものである。しかしながら、ある特定の実施形態では、別のＡＡＶカプシド供給源、すなわち、クレードＡが選択され得る。ある特定の実施形態では、ＡＡＶカプシドは、ＡＡＶｈｕ６８カプシドである。ある特定の実施形態では、ＡＡＶカプシドは、ＡＡＶｒｈ９１カプシドである。ある特定の実施形態では、ＡＡＶカプシドは、ＡＡＶｈｕ９５カプシドである。ある特定の実施形態では、ＡＡＶカプシドは、ＡＡＶｈｕ９６カプシドである。ベクターゲノムは、ＡＡＶ５’逆位末端反復（ＩＴＲ）と、本明細書に記載の機能性ｈＳＧＳＨをコードする操作された核酸配列と、標的細胞内で機能性ｈＳＧＳＨの発現を指示する調節配列と、ＡＡＶ３’ＩＴＲと、を含む。

【0098】

本明細書で使用される場合、「ベクターゲノム」という用語は、ウイルスカプシド、例えば、ＡＡＶカプシド内にパッケージングされ、宿主細胞又は患者の細胞に送達することが可能である、核酸分子を指す。ある特定の実施形態では、ベクターゲノムは、５’及び３’最末端に、ベクターゲノムをカプシド内にパッケージングするのに必要な末端反復配列（ＡＡＶ逆位末端反復配列（ＩＴＲ）を含み、それらの間に、ベクターゲノムの発現を指示する配列と操作可能に連結された本明細書に記載のＭＥＣＰ２遺伝子を含む発現カセットを含有する。

【0099】

ベクターのＡＡＶ配列は、典型的には、シス作用性５’及び３’逆位末端反復（ＩＴＲ）配列を含む（例えば、Ｂ．Ｊ．Ｃａｒｔｅｒ，ｉｎ「Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ」，ｅｄ．，Ｐ．Ｔｉｊｓｓｅｒ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，ｐｐ．１５５ １６８（１９９０）を参照されたい）。ＩＴＲ配列は、約１４５塩基対（ｂｐ）の長さである。好ましくは、ＩＴＲをコードする実質的に完全な配列が分子内で使用されるが、これらの配列のある程度の微小な修飾は許容される。これらのＩＴＲ配列を修飾する能力は、当該技術分野の範囲内である。（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ，「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」，２ｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８９）及びＫ．Ｆｉｓｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７０：５２０ ５３２（１９９６）を参照されたい）。本発明で用いられるかかる分子の一例は、導入遺伝子を含有する「シス作用性」プラスミドであり、選択された導入遺伝子配列及び関連する調節因子は、５’及び３’ＡＡＶ ＩＴＲ配列に隣接している。一実施形態では、
ＩＴＲは、カプシドを供給するものとは異なるＡＡＶからのものである。一実施形態では、ＩＴＲ配列は、ＡＡＶ２由来である。Ｄ配列及び末端解離部位（ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｓｉｔｅ）（ｔｒｓ）が欠失している、ΔＩＴＲと称される５’ＩＴＲの短縮されたバージョンが記載されている。ある特定の実施形態では、（例えば、プラスミドの）ベクターゲノムは、外部Ａ因子が欠失している、１３０塩基対の短縮されたＡＡＶ２ ＩＴＲを含む。短縮されたＩＴＲは、内部Ａ因子をテンプレートとして使用して、ベクターＤＮＡ増幅中に１４５塩基対の野生型の長さまで戻され得、カプシド内にパッケージングされてウイルス粒子が形成される。他の実施形態では、完全長ＡＡＶ５’及び３’ＩＴＲが使用される。しかしながら、他のＡＡＶ供給源からのＩＴＲが選択され得る。ＩＴＲの供給源がＡＡＶ２由来であり、ＡＡＶカプシドが別のＡＡＶ供給源由来である場合、得られるベクターは、擬似型と称され得る。しかしながら、これらの因子の他の構成が好適な場合がある。

【0100】

一態様では、ｒＡＡＶは、ムコ多糖症ＩＩＩ Ａ型（ＭＰＳ ＩＩＩＡ）の治療における使用のためのものである。一実施形態では、ｒＡＡＶは、５’ＡＡＶ ＩＴＲ、発現カセット、及び３’ＡＡＶ ＩＴＲを含むベクターゲノムを含み、発現カセットが、機能性ｈＳＧＳＨをコードする操作された核酸配列を含み、機能性ｈＳＧＳＨコード配列が、シグナルペプチド配列及び成熟ｈＳＧＳＨコード配列を含み、成熟ｈＳＧＳＨコード配列が、配列番号１６の配列の核酸配列、又は（ａ）配列番号２３をコードする、配列番号１６に対して少なくとも８５％同一であるか、若しくは（ｂ）配列番号２３をコードする、配列番号１６に対して少なくとも９９％同一である、核酸配列を有し、ｈＳＧＳＨコード配列が、細胞においてｈＳＧＳＨの発現を指示する調節性制御配列と操作可能に連結されている。ある特定の実施形態では、ｒＡＡＶは、配列番号２２であり、配列番号２３をコードする、配列番号１６に対して９９％同一の成熟ｈＳＧＳＨコード配列を含む発現カセット（ｈＳＧＳＨ．Ａ４８２Ｙ．Ｅ４８８Ｖ）を含む。ある特定の実施形態では、成熟ｈＳＧＳＨコード配列は、配列番号１６である。ある特定の実施形態では、成熟ｈＳＧＳＨコード配列は、配列番号１６に対して少なくとも約８５％同一であり、配列番号２３をコードする。

【0101】

ある特定の実施形態では、調節配列は、ＣＮＳ特異的プロモータ、例えば、ヒトシナスピンプロモータ（ｈＳｙｎ）、又は構成的プロモータ、例えば、ＣＢ７、ＣＢｈ、又は調節性プロモータを含む。ある特定の実施形態では、調節因子は、コザック配列、ＴＡＴＡシグナル、イントロン、エンハンサ、及びポリアデニル化配列のうちの１つ以上を含む。

【0102】

ある特定の実施形態では、ベクターゲノムは、配列番号３の核酸配列（ＣＢ７．ＣＩ．ＢＩＰ．ｈＳＧＳＨｃｏｖ１－Ａ４８２Ｙ＿Ｅ４８８Ｖ．ｖＩＧＦ２．ｒＢＧ）、又は配列番号３に対して少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％～少なくとも１００％同一の配列を含む。ある特定の実施形態では、ベクターゲノムは、配列番号７の核酸配列（ＣＢ７．ＣＩ．ＢＩＰ．ｈＳＧＳＨｃｏｖ１－Ａ４８２Ｙ＿Ｅ４８８Ｖ．ｖＩＧＦ２．ＷＰＲＥ．ｒＢＧ）、又は配列番号７に対して少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％～少なくとも１００％同一の配列を含む。ある特定の実施形態では、ベクターゲノムは、配列番号１０の核酸配列（ＣＢ７．ＣＩ．ｈＳＧＳＨｃｏＶ１．ｒＢＧ）、又は配列番号１０に対して少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％～少なくとも１００％同一の配列を含む。ある特定の実施形態では、ベクターゲノムは、配列番号１３の核酸配列（ＣＢ７．ＣＩ．ｈＳＧＳＨｃｏＶ１－４ｘｍｉＲ１８３．ｒＢＧ）、又は配列番号１３に対して少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％～少なくとも１００％同一の配列を含む。ある特定の実施形態では、ベクターゲノムは、配列番号４０の核酸配列（ＣＢ７．ＣＩ．ＢＩＰ．ｈＳＧＳＨｃｏｖ１－Ａ４８２Ｙ＿Ｅ４８８Ｖ
．ｖＩＧＦ２．ＷＰＲＥ．４ｘｍｉＲ１８２．ｒＢＧ）、又は配列番号４０に対して少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％～少なくとも１００％同一の配列を含む。ある特定の実施形態では、ベクターゲノムは、配列番号１の核酸配列（ＣＢ７．ＣＩ．ＢＩＰ．ｈＳＧＳＨｃｏｖ１（Ａ４８２Ｙ－Ｅ４８８Ｖ）．ｖＩＧＦ２．ＷＰＲＥ．４ｘｍｉＲ１８３．ｒＢＧ）、又は配列番号１に対して少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％～少なくとも１００％同一の配列を含む。ある特定の実施形態では、ベクターゲノムは、配列番号３７の核酸配列（ＣＢ７．ＣＩ．ＢＩＰ．ｈＳＧＳＨｃｏｖ１－Ａ４８２Ｙ＿Ｅ４８８Ｖ．ｖＩＧＦ２．ＷＰＲＥ．４ｘｍｉＲ１８２．４ｘｍｉＲ１８３．ｒＢＧ）、又は配列番号３７に対して少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％～少なくとも１００％同一の配列を含む。

【0103】

ある特定の実施形態では、クレードＦ ＡＡＶカプシドは、ＡＡＶｈｕ６８カプシド［例えば、ＵＳ２０２０／００５６１５９、ＰＣＴ／ＵＳ２１／５５４３６、核酸配列については配列番号４８及び４９、アミノ酸配列については配列番号５０を参照されたい］、ＡＡＶｈｕ９５カプシド［例えば、２０２１年１０月２日に出願された米国仮出願第６３／２５１，５９９号及び２０２２年９月３０日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ２０２２／０７７３１５、配列番号５４及び５５（ｈｕ９５核酸配列）、並びに配列番号５６（ｈｕ９５アミノ酸配列）を参照されたい、又はＡＡＶｈｕ９６カプシド［例えば、２０２１年１０月２日に出願された米国仮出願第６３／２５１，５９９号及び２０２２年９月３０日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ２０２２／０７７３１５、配列番号５７及び５８（ｈｕ９６核酸配列）、並びに配列番号５９（ｈｕ９６アミノ酸配列）を参照されたい、から選択される。ある特定の実施形態では、ＡＡＶカプシドは、ＡＡＶｒｈ９１カプシド（配列番号５１及び５２の核酸配列；配列番号５３のアミノ酸配列）などのクレードＡカプシドである。参照により本明細書に援用される、２０２０年４月２９日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ２０／０３０２６６、現在公表されているＷＯ２０２０／２２３２３１、及び参照により本明細書に援用される、２０２１年８月１３日に出願された国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２１／４５９４５号を参照されたい。

【0104】

ある特定の実施形態では、本明細書に記載の組成物及び方法のためのＡＡＶカプシドは、標的細胞に基づいて選択される。ある特定の実施形態では、ＡＡＶカプシドは、ＣＮＳ細胞及び／又はＰＮＳ細胞を形質導入する。ある特定の実施形態では、他のＡＡＶカプシドが選択され得る。ＡＡＶカプシドは、ｃｙ０２カプシド、ｒｈ４３カプシド、ＡＡＶ８カプシド、ｒｈ０１カプシド、ＡＡＶ９カプシド、ｒｈ８カプシド、ｒｈ１０カプシド、ｂｂ０１カプシド、ｈｕ３７カプシド、ｒｈ０２カプシド、ｒｈ２０カプシド、ｒｈ３９カプシド、ｒｈ６４カプシド、ＡＡＶ６カプシド、ＡＡＶ１カプシド、ｈｕ４４カプシド、ｈｕ４８カプシド、ｃｙ０５カプシド、ｈｕ１１カプシド、ｈｕ３２カプシド、ｐｉ２カプシド、又はそれらのバリエーションから選択される。ある特定の実施形態では、ＡＡＶカプシドは、ＡＡＶ９カプシド、ＡＡＶｈｕ６８カプシド、ｈｕ３１カプシド、ｈｕ３２カプシド、又はそれらのバリエーションなどのクレードＦカプシドである。例えば、２０１５年４月１４日に公開されたＷＯ２００５／０３３３２１、ＷＯ２０１８／１６０５８２、及びＵＳ２０１５／００７９０３８を参照されたい（これらの各々は、参照によりその全体が本明細書に援用される）。ある特定の実施形態では、ＡＡＶカプシドは、非クレードＦカプシド、例えば、クレードＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、又はＥカプシドである。ある特定の実施形態では、非クレードＦカプシドは、ＡＡＶ１又はそのバリエーションである。ある特定の実施形態では、ＡＡＶカプシドは、神経系細胞以外の標的細胞を形質導入する。ある特定の実施形態では、ＡＡＶカプシドは、クレードＡカプシド（例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ６、ＡＡＶｒｈ９１）、クレードＢカプシド（例えば、ＡＡＶ２）、クレードＣカプシド（例えば、ｈｕ５３）、クレードＤカプシド（例えば、ＡＡＶ７）、又はクレード
Ｅカプシド（例えば、ｒｈ１０）である。

【0105】

ｒＡＡＶは、ＡＡＶカプシド及びベクターゲノムからなる。ＡＡＶカプシドは、ｖｐ１タンパク質の異種集団、ｖｐ２タンパク質の異種集団、及びｖｐ３タンパク質の異種集団の集合体である。本明細書で使用される場合、ｖｐカプシドタンパク質について言及するために使用される場合、「異種」という用語又はその任意の文法的バリエーションは、例えば、異なる修飾アミノ酸配列を有するｖｐ１、ｖｐ２、又はｖｐ３モノマー（タンパク質）を有する、同じではない因子からなる集団を指す。

【0106】

本明細書で使用される場合、ｖｐカプシドタンパク質について言及するために使用される場合、「異種」という用語又はその任意の文法的バリエーションは、例えば、異なる修飾アミノ酸配列を有するｖｐ１、ｖｐ２、又はｖｐ３モノマー（タンパク質）を有する、同じではない因子からなる集団を指す。ｖｐ１、ｖｐ２、及びｖｐ３タンパク質（代替的にアイソフォームと称される）に関連して使用される「異種集団」という用語は、カプシド内のｖｐ１、ｖｐ２、及びｖｐ３タンパク質のアミノ酸配列の違いを指す。ＡＡＶカプシドは、予測されたアミノ酸残基からの修飾を有する、ｖｐ１タンパク質内、ｖｐ２タンパク質内、及びｖｐ３タンパク質内の亜集団を含有する。これらの亜集団は、最低限でも、ある特定の脱アミド化アスパラギン（Ｎ又はＡｓｎ）残基を含む。例えば、ある特定の亜集団は、アスパラギン－グリシン対に少なくとも１、２、３、又は４つの高度に脱アミド化されたアスパラギン（Ｎ）位置を含み、任意選択的に、他の脱アミド化アミノ酸を更に含み、脱アミド化が、アミノ酸変化及び他の任意選択的な修飾を生じる。

【0107】

ある特定の実施形態では、複数の高度脱アミド化「ＮＧ」位置を含有するＡＡＶカプシドアイソフォーム（すなわち、ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３）の異種集団を有するＡＡＶカプシドが提供される。ある特定の実施形態では、高度脱アミド化位置は、予測される完全長ＶＰ１アミノ酸配列を参照して、以下に示す位置にある。他の実施形態では、カプシド遺伝子は、参照される「ＮＧ」が除去されるように修飾され、変異「ＮＧ」は、別の位置に操作される。

【0108】

ある特定の実施形態では、ＡＡＶカプシドは、ＡＡＶｈｕ６８カプシド又はＡＡＶｒｈ９１カプシドである。ある特定の実施形態では、ＡＡＶｈｕ６８カプシドは、配列番号５０のアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、ＡＡＶｈｕ６８カプシドは、（ｉ）配列番号５０をコードする核酸配列から産生されるＡＡＶｈｕ６８ ｖｐ１タンパク質、ＡＡＶｈｕ６８ ｖｐ２タンパク質、及びＡＡＶｈｕ６８ ｖｐ３タンパク質、又は（ｉｉ）ＡＡＶｈｕ６８ ｖｐ１、ＡＡＶｈｕ６８ ｖｐ２、及びＡＡＶｈｕ６８ ｖｐ３タンパク質の異種集団を含み、ＡＡＶｈｕ６８ ｖｐ１、ＡＡＶｈｕ６８ ｖｐ２、及びＡＡＶ ｈｕ６８ ｖｐ３タンパク質の亜集団が、配列番号５０のアミノ酸と比較して、５７、３２９、４５２、５１２位の各々のアスパラギン－グリシン対に少なくとも５０％～１００％の脱アミド化アスパラギン（Ｎ）を含み、質量分析法を使用して決定して、脱アミド化アスパラギンが、アスパラギン酸、イソアスパラギン酸、相互変換アスパラギン酸／イソアスパラギン酸、又はそれらの組み合わせへと脱アミド化される。ある特定の実施形態では、ＡＡＶｈｕ６８ ｖｐ１タンパク質をコードする核酸配列は、配列番号４８、又は配列番号５０のアミノ酸配列をコードする、配列番号４８に対して少なくとも８０％～少なくとも９９％同一の配列であり、任意選択的に、核酸配列が、配列番号４８に対して少なくとも８０％～９７％同一である。ある特定の実施形態では、ＡＡＶｈｕ６８ ｖｐ１タンパク質をコードする核酸配列は、配列番号４９、又は配列番号５０のアミノ酸配列をコードする、配列番号４９に対して少なくとも８０％～少なくとも９９％同一の配列であり、任意選択的に、核酸配列が、配列番号４９に対して少なくとも８０％～９７％同一である。

【0109】

本明細書で使用される場合、「標的細胞」及び「標的組織」という用語は、対象となるＡＡＶベクターによって形質導入されることが意図される任意の細胞又は組織を指し得る。この用語は、筋肉、肝臓、肺、気道上皮、中枢神経系、ニューロン、眼（視覚細胞）、又は心臓のうちのいずれか１つ以上を指し得る。

【0110】

追加的に、本明細書では、本明細書に記載されるｒＡＡＶを産生するために有用なｒＡＡＶ産生系が提供される。産生系は、（ａ）ＡＡＶカプシドタンパク質をコードする核酸配列と、（ｂ）ベクターゲノムと、（ｃ）ベクターゲノムをＡＡＶカプシドにパッケージングするのを可能にする十分なＡＡＶ ｒｅｐ機能及びヘルパー機能とを含む、細胞培養を含む。ある特定の実施形態では、ベクターゲノムは、配列番号３、７、１０、１３、４０、１、又は３７である。ある特定の実施形態では、細胞培養は、ヒト胎児由来腎臓２９３細胞培養である。ある特定の実施形態では、ＡＡＶ ｒｅｐは、異なるＡＡＶ由来である。ある特定の実施形態では、ＡＡＶ ｒｅｐは、ＡＡＶ２由来である。ある特定の実施形態では、ＡＡＶ ｒｅｐコード配列及びｃａｐ遺伝子は、同じ核酸分子上にあり、任意選択的に、ｒｅｐ配列とｃａｐ遺伝子との間にスペーサが存在する。

【0111】

ＡＡＶウイルスベクター（例えば、組換え（ｒ）ＡＡＶ）の産生での使用のために、ベクターゲノムは、パッケージング宿主細胞に送達される任意の好適なベクター、例えば、プラスミド上に担持され得る。本発明に有用なプラスミドは、とりわけ、インビトロで原核細胞、昆虫細胞、哺乳類細胞に複製及びパッケージングするのに好適であるように操作され得る。好適なトランスフェクション技術及びパッケージング宿主細胞は、既知であり、かつ／又は当業者によって容易に設計することができる。

【0112】

ある特定の実施形態では、ｒＡＡＶ産生に有用な核酸（例えば、プラスミド）は、５’ＩＴＲ、ＣＢ７プロモータ配列、ニワトリベータアクチンイントロン、コザック配列、ＢＩＰ．ｈＳＧＳＨ．ｖＩＧＦ２コード配列、ｒＢＧポリＡ配列、及び３’ＩＴＲを含む、ベクターゲノムを含む。ある特定の実施形態では、ｒＡＡＶ産生に有用な核酸（例えば、プラスミド）は、５’ＩＴＲ、ＣＢ７プロモータ配列、ニワトリベータアクチンイントロン、コザック配列、ＢＩＰ．ｈＳＧＳＨ．Ａ４８２Ｙ．Ｅ４８８Ｖ．ｖＩＧＦ２コード配列、ｒＢＧポリＡ配列、及び３’ＩＴＲを含む、ベクターゲノムを含む。ある特定の実施形態では、ｒＡＡＶ産生に有用な核酸（例えば、プラスミド）は、５’ＩＴＲ、ＣＢ７プロモータ配列、ニワトリベータアクチンイントロン、コザック配列、ＢＩＰ．ｈＳＧＳＨ．Ａ４８２Ｙ．Ｅ４８８Ｖ．ｖＩＧＦ２コード配列、少なくとも４つのタンデム反復ｍｉＲ１８２、ｒＢＧポリＡ配列、及び３’ＩＴＲを含む、ベクターゲノムを含む。ある特定の実施形態では、ｒＡＡＶ産生に有用な核酸（例えば、プラスミド）は、５’ＩＴＲ、ＣＢ７プロモータ配列、ニワトリベータアクチンイントロン、コザック配列、ＢＩＰ．ｈＳＧＳＨ．Ａ４８２Ｙ．Ｅ４８８Ｖ．ｖＩＧＦ２コード配列、少なくとも４つのタンデム反復ｍｉＲ１８３、ｒＢＧポリＡ配列、及び３’ＩＴＲを含む、ベクターゲノムを含む。ある特定の実施形態では、ｒＡＡＶ産生に有用な核酸（例えば、プラスミド）は、５’ＩＴＲ、ＣＢ７プロモータ配列、ニワトリベータアクチンイントロン、コザック配列、ＢＩＰ．ｈＳＧＳＨ．Ａ４８２Ｙ．Ｅ４８８Ｖ．ｖＩＧＦ２コード配列、少なくとも４つのタンデム反復ｍｉＲ１８２、少なくとも４つのタンデム反復ｍｉＲ１８３、ｒＢＧポリＡ配列、及び３’ＩＴＲを含む、ベクターゲノムを含む。

【0113】

ベクターとしての使用に好適なＡＡＶを生成し、単離するための方法は、当該技術分野で既知である。一般に、例えば、それらの各々全体が参照により本明細書に援用される、Ｇｒｉｅｇｅｒ＆Ｓａｍｕｌｓｋｉ，２００５，Ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ａｓ ａ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｖｅｃｔｏｒ：Ｖｅｃｔｏｒ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａｄｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｅｎｇｉｎ／Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．９９：１１
９－１４５、Ｂｕｎｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００８，Ｒｅｃｅｎｔ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ ｉｎ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｊ．Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ．１０：７１７－７３３、及び以下に引用される参考文献を参照されたい。本明細書で使用される場合、遺伝子療法ベクターは、本明細書に記載のｒＡＡＶを指し、患者を治療する際の使用に好適である。遺伝子をビリオンにパッケージングするために、ＩＴＲは、遺伝子を含有する核酸分子と同じ構築物において、シスで必要とされる唯一のＡＡＶ構成要素である。ｃａｐ及びｒｅｐ遺伝子は、トランスで供給され得る。

【0114】

ある特定の実施形態では、ｒＡＡＶの製造プロセスは、それらの全体が参照により本明細書に援用される、２０２２年８月１６日に出願された米国仮特許出願第６３／３７１，５９７号及び２０２２年８月１６日に出願された米国仮特許出願第６３／３７１，５９２号に記載されている方法を含む。

【0115】

一実施形態では、選択される遺伝子因子は、トランスフェクション、エレクトロポレーション、リポソーム送達、膜融合技術、高速ＤＮＡコーティングペレット、ウイルス感染、及びプロトプラスト融合を含む任意の好適な方法によって、ＡＡＶパッケージング細胞に送達され得る。好適なＡＡＶパッケージング細胞も作製され得る。かかる構築物を作製するために使用される方法は、核酸操作における当業者に既知であり、遺伝子工学、組換え工学、及び合成技術が挙げられる。例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，ｅｄ．Ｇｒｅｅｎ ａｎｄ Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（２０１２）を参照されたい。

【0116】

用語「ＡＡＶ中間体」又は「ＡＡＶベクター中間体」は、それにパッケージングされた所望のゲノム配列を欠失している組み立てられたｒＡＡＶカプシドを指す。これらはまた、「空の」カプシドと称され得る。かかるカプシドは、発現カセットの検出可能なゲノム配列を全く含有しないか、又は部分的にパッケージングされたのみのゲノム配列を含有する場合があり、これらは、遺伝子産物の発現を達成するには不十分である。これらの空のカプシドは、宿主細胞に目的の遺伝子を導入するには機能的ではない。

【0117】

本明細書に記載の組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、既知である技術を使用して生成することができる。例えば、ＷＯ２００３／０４２３９７、ＷＯ２００５／０３３３２１、ＷＯ２００６／１１０６８９、ＵＳ７５８８７７２ Ｂ２を参照されたい。かかる方法は、ＡＡＶカプシドタンパク質をコードする核酸配列、機能性ｒｅｐ遺伝子、最低限、ＡＡＶ逆位末端反復（ＩＴＲ）及び導入遺伝子で構成される発現カセット、並びに発現カセットをＡＡＶカプシドタンパク質にパッケージングするのを可能にするのに十分なヘルパー機能を含有する宿主細胞を培養することを含む。カプシドを生成する方法、そのためのコード配列、及びｒＡＡＶウイルスベクターの産生方法が記載されている。例えば、Ｇａｏ，ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１００（１０），６０８１－６０８６（２００３）及びＵＳ２０１３／００４５１８６Ａ１を参照されたい。

【0118】

一実施形態では、ＡＡＶｈｕ６８、ＡＡＶｒｈ９１、ＡＡＶｈｕ９５、又はＡＡＶｈｕ９６から選択されるカプシドを有する組換えＡＡＶを産生するのに有用な、産生細胞培養物が提供される。かかる細胞培養物は、宿主細胞内でＡＡＶカプシドタンパク質を発現する核酸（例えば、配列番号４８又は配列番号４９；ＡＡＶｈｕ６８カプシド内にパッケージングするのに好適な核酸分子、例えば、ＡＡＶ ＩＴＲ、並びに宿主細胞において遺伝子の発現を指示する調節配列と操作可能に連結された遺伝子をコードする非ＡＡＶ核酸配列；組換えＡＡＶｈｕ６８カプシド、又はＡＡＶｒｈ９１カプシド（例えば、配列番号５
１又は配列番号５２）、ＡＡＶｈｕ９５カプシド（例えば、配列番号５４又は配列番号５５）、ＡＡＶｈｕ９６カプシド（例えば、配列番号５７又は配列番号５８）へのベクターゲノムのパッケージングを可能にするのに十分なＡＡＶ ｒｅｐ機能及びアデノウイルスヘルパー機能を含有する、ベクターゲノムを含有する。一実施形態では、細胞培養物は、哺乳類細胞（例えば、特に、ヒト胚性腎臓２９３細胞）又は昆虫細胞（例えば、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（Ｓｆ９）細胞）で構成される。ある特定の実施形態では、バキュロウイルスは、組換えＡＡＶｈｕ６８、ＡＡＶｒｈ９１、ＡＡＶｈｕ９５、又はＡＡＶｈｕ９６カプシド内にベクターゲノムをパッケージングするのに必要なヘルパー機能を提供する。

【0119】

任意選択的に、ｒｅｐ機能は、ＩＴＲの供給源を補完するように選択されたＡＡＶ２以外のＡＡＶによって提供される。

【0120】

一実施形態では、細胞は、好適な細胞培養物（例えば、ＨＥＫ２９３又はＳｆ９）又は懸濁液中で製造される。本明細書に記載の遺伝子療法ベクターを製造するための方法としては、遺伝子療法ベクターの産生に使用されるプラスミドＤＮＡの生成、ベクターの生成、及びベクターの精製などの、当該技術分野で周知の方法が挙げられる。いくつかの実施形態では、遺伝子療法ベクターは、ＡＡＶベクターであり、産生されたプラスミドは、ＡＡＶベクターゲノム及び目的の遺伝子をコードするＡＡＶシス－プラスミド、ＡＡＶのｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子を含有するＡＡＶトランス－プラスミド、及びアデノウイルスヘルパープラスミドである。ベクター生成プロセスは、細胞培養の開始、細胞の継代、細胞の播種、プラスミドＤＮＡによる細胞のトランスフェクション、トランスフェクション後の無血清培地への培地交換、並びにベクター含有細胞及び培養培地の収集などの方法ステップを含み得る。収集されたベクター含有細胞及び培養培地は、本明細書では、粗細胞採取物と称される。更に別の系では、遺伝子療法ベクターは、バキュロウイルスに基づくベクターによる感染によって、昆虫細胞に導入される。これらの産生系に関する考察については、一般に、例えば、その各々の内容全体が参照により本明細書に援用される、Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００９，Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ－ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｈｙｂｒｉｄ ｆｏｒ ｌａｒｇｅ－ｓｃａｌｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２０：９２２－９２９を参照されたい。これらの及び他のＡＡＶ産生系を作製及び使用する方法は、以下の米国特許にも記載されており、各々の内容は、参照によりその全体が本明細書に援用される：米国特許第５，１３９，９４１号、同第５，７４１，６８３号、同第６，０５７，１５２号、同第６，２０４，０５９号、同第６，２６８，２１３号、同第６，４９１，９０７号、同第６，６６０，５１４号、同第６，９５１，７５３号、同第７，０９４，６０４号、同第７，１７２，８９３号、同第７，２０１，８９８号、同第７，２２９，８２３号、及び同第７，４３９，０６５号。

【0121】

粗細胞採取物は、その後、ベクター収集物の濃縮、ベクター収集物の透析濾過、ベクター収集物の顕微溶液化、ベクター収集物のヌクレアーゼ消化、顕微溶液化された中間体の濾過、クロマトグラフィーによる粗精製、超遠心分離による粗精製、タンジェンシャルフロー濾過による緩衝液交換、並びに／又はバルクベクターを調製するための製剤化及び濾過を含む、更なる処理を施され得る。ベクター薬物産生物を精製し、空のカプシドを除去するために、親和性クロマトグラフィー精製、続いてアニオン交換樹脂クロマトグラフィーが使用される。これらの方法は、参照により本明細書に援用される、「Ｓｃａｌａｂｌｅ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ＡＡＶ９」と題された、２０１６年１２月９に出願されたＷＯ２０１７／１６０３６０により詳細に記載されている。ＡＡＶ８については２０１６年１２月９日に出願されたＷＯ２０１７／１００６７６、及びｒｈ１０については、２０１６年１２月９日に出願され、また２０１５年１２月１１日に出願された「Ｓｃａｌａｂｌｅ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ａ
ＡＶｒｈ１０」と題されたＷＯ２０１７／１００７０４、及びＡＡＶ１については２０１５年１２月１１日に出願された「Ｓｃａｌａｂｌｅ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ＡＡＶ１」に対して２０１６年１２月９日に出願されたＷＯ２０１７／１００６７４の精製方法が全て、参照により本明細書に援用される。他の好適な方法が選択されてもよい。

【0122】

空の粒子及び完全粒子の含有量を算出するために、選択された試料（例えば、本明細書の実施例では、イオジキサノール勾配により精製された調製物、ゲノムコピー（ＧＣ）の数＝粒子の数）についてのＶＰ３バンド体積が、ロードされたＧＣ粒子に対してプロットされる。生じた線形方程式（ｙ＝ｍｘ＋ｃ）を使用して、試験物品ピークのバンド体積中の粒子の数を算出する。次いで、充填した２０μＬ当たりの粒子の数（ｐｔ）に５０を乗算して粒子（ｐｔ）／ｍＬを得る。ｐｔ／ｍＬをＧＣ／ｍＬで除算することによって、ゲノムコピーに対する粒子の比（ｐｔ／ＧＣ）を得る。ｐｔ／ｍＬ－ＧＣ／ｍＬによって、空のｐｔ／ｍＬを得る。空のｐｔ／ｍＬをｐｔ／ｍＬで除算し、１００を乗算することによって、空の粒子のパーセンテージを得る。

【0123】

一般に、空のカプシド及びパッケージングされたゲノムを含むＡＡＶベクター粒子をアッセイするための方法は、当該技術分野で既知である。例えば、Ｇｒｉｍｍ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（１９９９）６：１３２２－１３３０、Ｓｏｍｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃ．Ｔｈｅｒ．（２００３）７：１２２－１２８を参照されたい。変性カプシドについて試験するために、方法は、治療したＡＡＶストックに、３つのカプシドタンパク質を分離することが可能な任意のゲルからなるＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動（例えば、緩衝液中に３～８％のトリス酢酸塩を含有する勾配ゲル）を施すことと、次いで、試料材料が分離されるまでゲルを流すことと、ナイロン又はニトロセルロース膜、好ましくはナイロンの上でゲルをブロッティングすることと、を含む。次いで、抗－ＡＡＶカプシド抗体は、変性したカプシドタンパク質、好ましくは、抗－ＡＡＶカプシドモノクローナル抗体、最も好ましくは、Ｂ１抗－ＡＡＶ－２モノクローナル抗体に結合する主要な抗体として使用される（Ｗｏｂｕｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（２０００）７４：９２８１－９２９３）。次いで、一次抗体に結合し、一次抗体、より好ましくは、抗体に共有結合した検出分子を含有する抗ＩｇＧ抗体、最も好ましくは、西洋ワサビペルオキシダーゼに共有結合したヒツジ抗マウスＩｇＧ抗体との結合を検出するための手段を含有する、二次抗体が使用される。一次抗体と二次抗体との間の結合を半定量的に決定するために、結合を検出するための方法、好ましくは、放射性アイソトープ放射、電磁放射、又は比色変化を検出することができる検出方法、最も好ましくは、化学発光検出キットが使用される。例えば、ＳＤＳ－ＰＡＧＥでは、カラムフラクションから試料を取り、還元剤（例えば、ＤＴＴ）を含有するＳＤＳ－ＰＡＧＥ充填緩衝液中で加熱することができ、カプシドタンパク質を、プレキャスト勾配ポリアクリルアミドゲル（例えば、Ｎｏｖｅｘ）中で分解した。ＳｉｌｖｅｒＸｐｒｅｓｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＣＡ）を製造業者の指示書に従って使用して、又は他の好適な染色方法、すなわち、ＳＹＰＲＯルビー若しくはクマシー染色を使用して、銀染色が実施され得る。一実施形態では、カラムフラクション中のＡＡＶベクターゲノム（ｖｇ）の濃度は、定量的リアルタイムＰＣＲ（Ｑ－ＰＣＲ）によって測定することができる。試料を希釈し、ＤＮａｓｅ Ｉ（又は別の好適なヌクレアーゼ）で消化させて、外因性ＤＮＡを除去する。ヌクレアーゼの不活性化後、試料を更に希釈し、プライマー及びプライマー間のＤＮＡ配列に特異的なＴａｑＭａｎ（商標）蛍光発生プローブを使用して増幅する。規定レベルの蛍光（閾値サイクル、Ｃｔ）に到達するのに必要とされるサイクル数は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｐｒｉｓｍ ７７００配列検出システム上で各試料について測定される。ＡＡＶベクター内に含有されるものと同一の配列を含有するプラスミドＤＮＡを用いて、Ｑ－ＰＣＲ反応における標準曲線を生成する。試料から得たサイクル閾値（Ｃｔ）の値を使用して、プラスミド標準曲線のＣｔ値に対してそれを正規化することによって、ベクターゲノム
力価を決定する。デジタルＰＣＲに基づくエンドポイントアッセイも使用することができる。

【0124】

一態様では、広域スペクトルセリンプロテアーゼ、例えば、プロテアーゼＫ（例えば、Ｑｉａｇｅｎから商業的に入手可能なものなど）を利用する最適化ｑ－ＰＣＲ方法が使用される。より具体的には、最適化ｑＰＣＲゲノム力価アッセイは、ＤＮａｓｅ Ｉ消化の後に、試料をプロテイナーゼＫ緩衝液で希釈し、プロテイナーゼＫで処理し、続いて熱不活性化することを除いて、標準的なアッセイと同様である。好適には、試料サイズと等しい量のプロテイナーゼＫ緩衝液で、試料を希釈する。プロテイナーゼＫ緩衝液は、２倍以上に濃縮されてもよい。典型的に、プロテイナーゼＫ処理は、約０．２ｍｇ／ｍＬであるが、０．１ｍｇ／ｍＬ～約１ｍｇ／ｍＬに変動し得る。処理ステップは、一般に、約５５℃で約１５分間、実施されるが、より低い温度（例えば、約３７℃～約５０℃）でより長時間（例えば、約２０分間～約３０分間）、又はより高い温度（例えば、最高約６０℃）でより短時間（例えば、約５～１０分間）実施され得る。同様に、熱失活は、一般に、約９５℃で約１５分間であるが、温度は低下され得（例えば、約７０～約９０℃）、時間は延長され得る（例えば、約２０分間～約３０分間）。次いで、試料は希釈され（例えば、１０００倍）、標準的なアッセイで記載されるように、ＴａｑＭａｎ分析に供される。

【0125】

追加的に又は代替的に、ドロップレットデジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）を使用してもよい。例えば、ｄｄＰＣＲによる一本鎖及び自己相補性ＡＡＶベクターゲノム力価を決定するための方法が記載されている。例えば、Ｍ．Ｌｏｃｋ ｅｔ ａｌ，Ｈｕ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１４ Ａｐｒ；２５（２）：１１５－２５．ｄｏｉ：１０．１０８９／ｈｇｔｂ．２０１３．１３１．Ｅｐｕｂ ２０１４ Ｆｅｂ １４を参照されたい。

【0126】

簡潔には、パッケージングされたゲノム配列を有するｒＡＡＶｈｕ６８（又はＡＡＶｒｈ９１、ＡＡＶｈｕ９５、又はＡＡＶｈｕ９６）粒子をゲノム欠損ＡＡＶｈｕ６８（又はＡＡＶｒｈ９１、ＡＡＶｈｕ９５、又はＡＡＶｈｕ９６）中間体から分離するための方法は、組換えＡＡＶｈｕ６８（又はＡＡＶｒｈ９１）ウイルス粒子及びＡＡＶｈｕ６８（又はＡＡＶｒｈ９１、又はＡＶｈｕ９５、又はＡＡＶｈｕ９６）カプシド中間体を含む懸濁液に高速液体クロマトグラフィーを施すことを含み、ＡＡＶｈｕ６８（又はＡＡＶｒｈ９１、又はＡＡＶｈｕ９５、又はＡＡＶｈｕ９６）ウイルス粒子及びＡＡＶｈｕ６８中間体を、約１０．２（又はＡＡＶｒｈ９１では約９．８）のｐＨで平衡化された強アニオン交換樹脂に結合させ、約２６０ナノメートル（ｎｍ）及び約２８０ｎｍで紫外線吸光度について溶出液を監視しながら、塩勾配を施す。ｒＡＡＶｈｕ６８及びＡＡＶｒｈ９１にはあまり最適ではないが、ｐＨは、約１０～１０．４の範囲であり得る。この方法では、ＡＡＶ完全カプシドは、Ａ２６０／Ａ２８０の比が感染ポイントに到達すると溶出する画分から収集される。一例では、親和性クロマトグラフィーステップでは、透析濾過した生成物を、ＡＡＶ血清型を効率的に捕捉する親和性樹脂（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に適用してもよい。これらのイオン性条件下では、かなりのパーセンテージの残留細胞ＤＮＡ及びタンパク質が、カラムを通って流れながら、ＡＡＶ粒子が、効率的に捕捉される。

【0127】

ｒＡＡＶ．ｈＳＧＳＨ（例えば、ｒＡＡＶ．ＢＩＰ．ｈＳＧＳＨ又はｒＡＡＶ．ＢＩＰ．ｈＳＧＳＨ．ｖＩＧＦ２、又はｒＡＡＶ．ＢＩＰ．ｈＳＧＳＨ．Ａ４８２Ｙ．Ｅ４８８Ｖ又はｒＡＡＶ．ＢＩＰ．ｈＳＧＳＨ．Ａ４８２Ｙ．Ｅ４８８Ｖ．ｖＩＧＦ２）は、好適な生理学的に適合する組成物（例えば、緩衝生理食塩水）に懸濁される。この組成物は、保管のために凍結され、後に解凍され、任意選択的に、好適な希釈剤で希釈され得る。代替的に、ベクターは、凍結及び解凍ステップを進めることなく患者への送達に好適な組成物として調製され得る。

【0128】

本明細書で使用される場合、ＡＡＶの群に関連する「クレード」という用語は、ＡＡＶ
ｖｐ１アミノ酸配列の整列に基づいて、（少なくとも１０００の複製物のうちの）少なくとも７５％のブートストラップ値及び０．０５以下のポアソン補正距離測定値による隣接結合（Ｎｅｉｇｈｂｏｒ－Ｊｏｉｎｉｎｇ）アルゴリズムを使用して決定して、互いに系統的に関連するＡＡＶの群を指す。隣接結合アルゴリズムは、文献に記載されている。例えば、Ｍ．Ｎｅｉ ａｎｄ Ｓ．Ｋｕｍａｒ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ａｎｄ Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃｓ（Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（２０００）を参照されたい。このアルゴリズムを実装するために使用することができるコンピュータプログラムが利用可能である。例えば、ＭＥＧＡ
ｖ２．１プログラムは、修正されたＮｅｉ－Ｇｏｊｏｂｏｒｉ法を実装している。これらの技術及びコンピュータプログラム、並びにＡＡＶ ｖｐ１カプシドタンパク質の配列を使用して、当業者は、選択されたＡＡＶが、本明細書で同定されるクレードのうちの１つに含有されるか、別のクレードに含有されるか、又はこれらのクレード外にあるかを容易に決定することができる。例えば、Ｇ Ｇａｏ，ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｖｉｒｏｌ，２００４ Ｊｕｎ；７８（１０）：６３８１－６３８８（これは、クレードＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ及びＦを同定し、かつ新規ＡＡＶの核酸配列、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ５３０５５３～ＡＹ５３０６２９を提供する）を参照されたい。また、ＷＯ２００５／０３３３２１も参照されたい。

【0129】

本明細書で使用される場合、「ＮＡｂ力価」という用語は、その標的化されたエピトープ（例えば、ＡＡＶ）の生理学的効果を中和する中和抗体（例えば、抗ＡＡＶ Ｎａｂ）がどれだけ産生されるかの測定値である。抗ＡＡＶ ＮＡｂ力価は、例えば、その全体が参照により本明細書に援用される、Ｃａｌｃｅｄｏ，Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，Ｗｏｒｌｄｗｉｄｅ Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｏ Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓｅｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ，２００９．１９９（３）：ｐ．３８１－３９０に記載されているように、測定され得る。

【0130】

略称「ｓｃ」は、自己相補性（ｓｅｌｆ－ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ）を指す。「自己相補性ＡＡＶ」は、組換えＡＡＶ核酸配列によって担持されるコード領域が、分子内二本鎖ＤＮＡ鋳型を形成するように設計されている構築物を指す。感染の際、第２の鎖の細胞介在性の合成を待つのではなく、ｓｃＡＡＶの２つの相補性の半分が会合して、即時の複製及び転写が可能な１つの二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）ユニットを形成する。例えば、Ｄ Ｍ ＭｃＣａｒｔｙ ｅｔ ａｌ，「Ｓｅｌｆ－ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ（ｓｃＡＡＶ）ｖｅｃｔｏｒｓ ｐｒｏｍｏｔｅ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｌｙ ｏｆ ＤＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，（Ａｕｇｕｓｔ ２００１），Ｖｏｌ ８，Ｎｕｍｂｅｒ １６，Ｐａｇｅｓ １２４８－１２５４．を参照されたい。自己相補的なＡＡＶは、例えば、それらの各々全体が参照により本明細書に援用される、米国特許第６，５９６，５３５号、同第７，１２５，７１７号、及び同第７，４５６，６８３号に記載されている。

【0131】

「複製欠損ウイルス」又は「ウイルスベクター」は、合成又は人工ウイルス粒子を指し、目的の遺伝子を含有する発現カセットは、ウイルスカプシド又はエンベロープ中にパッケージングされ、ウイルスカプシド又はエンベロープ内にパッケージングされた任意のウイルスゲノム配列は、複製欠損である、すなわち、それらは、後代ビリオンを産生することができないが、標的細胞に感染する能力を保持することができる。一実施形態では、ウイルスベクターのゲノムは、複製に必要とされる酵素をコードする遺伝子を含まないが（ゲノムは、人工ゲノムの増幅及びパッケージングに必要とされるシグナルに隣接する目的
の遺伝子のみを含有する「ガットレス（ｇｕｔｌｅｓｓ）」であるように操作されることができる）、これらの遺伝子は、産生中に供給され得る。したがって、後代ビリオンによる複製及び感染は、複製に必要とされるウイルス酵素の存在下以外で生じ得ないので、遺伝子療法における使用に安全であると考えられる。

【0132】

本明細書で使用される場合、「ｒＡＡＶ」及び「人工ＡＡＶ」という用語は互換的に使用され、限定されないが、カプシドタンパク質及びそこにパッケージングされるベクターゲノムを含むＡＡＶを意味し、ベクターゲノムは、ＡＡＶとは異種の核酸を含む。一実施形態では、カプシドタンパク質は、非天然に存在するプシドである。かかる人工カプシドは、選択されたＡＡＶ配列（例えば、ｖｐ１カプシドタンパク質の断片）を、同じＡＡＶの非隣接部分である異なる選択されたＡＡＶからか、非ＡＡＶウイルス供給源からか、又は非ウイルス供給源から得ることができる異種配列と組み合わせて使用して、任意の好適な技術によって生成され得る。人工ＡＡＶは、限定されないが、擬似型ＡＡＶカプシド、キメラＡＡＶカプシド、組換えＡＡＶカプシド、又は「ヒト化」ＡＡＶカプシドであり得る。１つのＡＡＶのカプシドが異種カプシドタンパク質に置き換えられている擬似型ベクターは、本発明に有用である。一実施形態では、ＡＡＶ２／５及びＡＡＶ２／８は、例示的な擬似型ベクターである。選択される遺伝子因子は、トランスフェクション、エレクトロポレーション、リポソーム送達、膜融合技術、高速ＤＮＡコーティングペレット、ウイルス感染、及びプロトプラスト融合を含む任意の好適な方法によって送達され得る。かかる構築物を作製するために使用される方法は、核酸操作における当業者に既知であり、遺伝子工学、組換え工学、及び合成技術が挙げられる。例えば、Ｇｒｅｅｎ ａｎｄ Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（２０１２）を参照されたい。

【0133】

多くの場合、ｒＡＡＶ粒子は、ＤＮａｓｅ耐性として参照される。しかしながら、このエンドヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）に加えて、他のエンド－及びエキソ－ヌクレアーゼが、汚染核酸を除去するために本明細書に記載の精製ステップにおいて使用され得る。かかるヌクレアーゼは、一本鎖ＤＮＡ及び／又は二本鎖ＤＮＡ、及びＲＮＡを分解するために選択され得る。かかるステップは、単一ヌクレアーゼ、又は異なる標的に指向されたヌクレアーゼの混合物を含有し得、エンドヌクレアーゼ又はエキソヌクレアーゼであり得る。

【0134】

「ヌクレアーゼ耐性」という用語は、ＡＡＶカプシドが、宿主細胞に遺伝子を送達するように設計された発現カセットの周りで完全に構築されていることを示し、産生プロセスから存在し得る汚染核酸を除去するように設計されたヌクレアーゼインキュベーションステップの間の分解（消化）から、これらのパッケージングされたゲノム配列を保護する。

【0135】

本明細書で使用される場合、ｖｐカプシドタンパク質について言及するために使用される場合、「異種」という用語又はその任意の文法的バリエーションは、例えば、異なる修飾アミノ酸配列を有するｖｐ１、ｖｐ２、又はｖｐ３モノマー（タンパク質）を有する、同じではない因子からなる集団を指す。

【0136】

ｖｐ１、ｖｐ２、及びｖｐ３タンパク質（代替的にアイソフォームと称される）に関連して使用される「異種」という用語は、カプシド内のｖｐ１、ｖｐ２、及びｖｐ３タンパク質のアミノ酸配列の違いを指す。ＡＡＶカプシドは、予測されたアミノ酸残基の修飾を有する、ｖｐ１タンパク質内、ｖｐ２タンパク質内、及びｖｐ３タンパク質内に亜集団を含有する。これらの亜集団は、最低限でも、ある特定の脱アミド化アスパラギン（Ｎ又はＡｓｎ）残基を含む。例えば、ある特定の亜集団は、アスパラギン－グリシン対に少なくとも１、２、３、又は４つの高度に脱アミド化されたアスパラギン（Ｎ）位置を含み、任意選択的に、他の脱アミド化アミノ酸を更に含み、脱アミド化が、アミノ酸変化及び他の
任意選択的な修飾を生じる。

【0137】

本明細書で使用される場合、ｖｐタンパク質の「亜集団」は、別途指定されない限り、少なくとも１つの定義された共通の特徴を有し、少なくとも１つの群メンバーから、参照群の全てのメンバーよりも少ないメンバーからなるｖｐタンパク質の群を指す。例えば、ｖｐ１タンパク質の「亜集団」は、別途指定されない限り、組み立てられたＡＡＶカプシドにおいて、少なくとも１つのｖｐ１タンパク質であり、全てのｖｐ１タンパク質よりも少ない。ｖｐ３の「亜集団」は、別途指定されない限り、組み立てられたＡＡＶカプシドにおいて、１つのｖｐ３タンパク質から、全てのｖｐ３タンパク質よりも少なくてもよい。例えば、組み立てられたＡＡＶカプシドにおいて、ｖｐ１タンパク質は、ｖｐタンパク質の亜集団であり得、ｖｐ２タンパク質は、ｖｐタンパク質の別の亜集団であり得、ｖｐ３はなお、ｖｐタンパク質の更なる亜集団である。別の例では、ｖｐ１、ｖｐ２、及びｖｐ３タンパク質は、例えば、少なくとも１つ、２つ、３つ、又は４つの高度脱アミド化アスパラギン、例えば、アスパラギン－グリシン対で異なる修飾を有する亜集団を含有し得る。

【0138】

薬学的組成物
一態様では、本明細書で提供されるのは、本明細書に記載のベクターを製剤緩衝液中に含む薬学的組成物である。一実施形態では、提供されるのは、本明細書に記載のｒＡＡＶを製剤緩衝液中に含む薬学的組成物である。一実施形態では、ｒＡＡＶは、約１×１０^９ゲノムコピー（ＧＣ）／ｍＬ～約１×１０^１４ＧＣ／ｍＬで製剤化されている。更なる実施形態では、ｒＡＡＶは、約３×１０^９ＧＣ／ｍＬ～約３×１０^１３ＧＣ／ｍＬで製剤化されている。更に更なる実施形態では、ｒＡＡＶは、約１×１０^９ＧＣ／ｍＬ～約１×１０^１３ＧＣ／ｍＬで製剤化されている。一実施形態では、ｒＡＡＶは、少なくとも約１×１０^１１ＧＣ／ｍＬで製剤化されている。

【0139】

また、本明細書に記載のｒＡＡＶ又はベクターと、水性懸濁媒体とを含む、組成物も本明細書で提供される。ある特定の実施形態では、懸濁液は、静脈内送達、髄腔内投与、又は脳室内投与用に製剤化されている。一態様では、組成物は、少なくとも１つのｒＡＡＶストック、及び任意選択的な担体、賦形剤、及び／又は防腐剤を含有する。本明細書で使用される場合、ｒＡＡＶの「ストック」は、ｒＡＡＶの集団を指す。脱アミド化に起因するカプシドタンパク質の不均一性にもかかわらず、ストック内のｒＡＡＶは、同一のベクターゲノムを共有することが予想される。ストックは、例えば、選択されたＡＡＶカプシドタンパク質及び選択された産生系に特徴的な不均一な脱アミド化パターンを有するカプシドを有するｒＡＡＶを含み得る。ストックは、単一の産生系から産生され得るか、又は産生系の複数の実行からプールされ得る。様々な産生系としては、限定されないが、本明細書に記載されるものが挙げられ、選択され得る。

【0140】

本明細書で使用される場合、「担体」は、任意の及び全ての溶媒、分散媒体、ビヒクル、コーティング、希釈剤、抗細菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤、緩衝剤、担体溶液、懸濁物、コロイドなどを含む。薬学的活性物質のためのかかる媒体及び薬剤の使用は、当該技術分野で周知である。補充的活性成分もまた、組成物中に組み込まれ得る。「薬学的に許容される」という語句は、宿主に投与されると、アレルギー又は同様の有害反応を生じない分子実体及び組成物を指す。本発明の組成物を好適な宿主細胞に導入するために、リポソーム、ナノカプセル、微粒子、ミクロスフェア、脂質粒子、小胞などの送達ビヒクルが使用され得る。特に、ｒＡＡＶベクター送達ベクターゲノムは、脂質粒子、リポソーム、小胞、ナノスフィア、又はナノ粒子などのいずれかに封入された送達ために製剤化され得る。

【0141】

一実施形態では、組成物は、対象への送達に好適な最終製剤を含み、例えば、生理的に
適合するｐＨ及び塩濃度まで緩衝された水性液体懸濁液である。任意選択的に、１つ以上の界面活性剤が製剤中に存在する。別の実施形態では、組成物は、対象への投与のために希釈される濃縮物として輸送され得る。他の実施形態では、組成物は、凍結乾燥され、投与時に再構築されてもよい。

【0142】

好適な界面活性剤、又は界面活性剤の組み合わせは、非毒性である非イオン性界面活性剤の中から選択されてもよい。一実施形態では、例えば、中性ｐＨを有し、平均分子量８４００を有するＰｏｌｏｘａｍｅｒ１８８としても知られているＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ６８［ＢＡＳＦ］などの、一級ヒドロキシル基末端の二官能ブロックコポリマー界面活性剤が選択される。他の界面活性剤及び他のポロキサマー、すなわち、ポリオキシエチレン（ポリ（エチレンオキシド））の２つの親水性鎖に隣接するポリオキシプロピレン（ポリ（プロピレンオキシド））の中心疎水性鎖からなる非イオン性トリブロックコポリマー、ＳＯＬＵＴＯＬ ＨＳ１５（マクロゴール－１５ヒドロキシステアラート）、ＬＡＢＲＡＳＯＬ（ポリオキシカプリン酸グリセリド）、ポリオキシ１０オレイルエーテル、ＴＷＥＥＮ（ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル）、エタノール、及びポリエチレングリコールが選択され得る。一実施形態では、製剤は、ポロキサマーを含有する。これらのコポリマーは、一般的に、文字「Ｐ」（ポロキサマーの場合）の後に３桁の数字で命名され、最初の２桁×１００は、ポリオキシプロピレンコアのおおよその分子質量を与え、最後の１桁×１０は、ポリオキシエチレン含有量のパーセンテージを与える。一実施形態では、ポロキサマー１８８が選択される。一実施形態では、界面活性剤は、懸濁液の最大約０．０００５％～約０．００１％（ｗ／ｗ％、重量比に基づく）の量で存在し得る。別の実施形態では、界面活性剤は、懸濁液の最大約０．０００５％～約０．００１％（ｖ／ｖ％、体積比に基づく）の量で存在し得る。更に別の実施形態では、界面活性剤は、懸濁液の最大約０．０００５％～約０．００１％の量で存在し、ここで、ｎ％は、懸濁液１００ｍＬ当たりのｎグラムを示す。

【0143】

別の実施形態では、組成物は、担体、希釈剤、賦形剤及び／又はアジュバントを含む。好適な担体は、導入ウイルスが指向される適応症の観点で、当業者によって容易に選択され得る。例えば、１つの好適な担体としては、生理食塩水が挙げられ、様々な緩衝溶液（例えば、リン酸緩衝生理食塩水）とともに製剤化され得る。他の例示的な担体としては、滅菌生理食塩水、ラクトース、スクロース、リン酸カルシウム、ゼラチン、デキストラン、寒天、ペクチン、ピーナッツ油、ゴマ油、及び水が挙げられる。緩衝液／担体は、ｒＡＡＶが注入チューブに粘着するのを防ぐが、インビボでのｒＡＡＶ結合活性を妨害しない構成要素を含むべきである。好適な界面活性剤、又は界面活性剤の組み合わせは、非毒性である非イオン性界面活性剤の中から選択されてもよい。一実施形態では、例えば、中性ｐＨを有し、平均分子量８４００を有するポロキサマー１８８（商品名Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ６８［ＢＡＳＦ］、Ｌｕｔｒｏｌ（登録商標）Ｆ６８、Ｓｙｎｐｅｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ６８、Ｋｏｌｌｉｐｈｏｒ（登録商標）Ｐ１８８としても知られている）などの、末端が一級ヒドロキシル基の二機能性ブロックコポリマー界面活性剤が選択される。他の界面活性剤及び他のポロキサマー、すなわち、ポリオキシエチレン（ポリ（エチレンオキシド））の２つの親水性鎖に隣接するポリオキシプロピレン（ポリ（プロピレンオキシド））の中心疎水性鎖からなる非イオン性トリブロックコポリマー、ＳＯＬＵＴＯＬ ＨＳ １５（マクロゴール－１５ヒドロキシステアラート）、ＬＡＢＲＡＳＯＬ（ポリオキシカプリン酸グリセリド）、ポリオキシ－オレイルエーテル、ＴＷＥＥＮ（ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル）、エタノール、及びポリエチレングリコールが選択され得る。一実施形態では、製剤は、ポロキサマーを含有する。これらのコポリマーは、一般的に、文字「Ｐ」（ポロキサマーの場合）の後に３桁の数字で命名され、最初の２桁×１００は、ポリオキシプロピレンコアのおおよその分子質量を与え、最後の１桁×１０は、ポリオキシエチレン含有量のパーセンテージを与える。一実施形態では、ポロキサマー１８８が選択される。界面活性剤は、懸濁液の最大約０．０００５％～約０．
００１％の量で存在し得る。

【0144】

ある特定の実施形態では、ｒＡＡＶ．ｈＳＧＳＨを含有する組成物は、６．８～８、又は７．２～７．８、又は７．５～８の範囲のｐＨで送達される。髄腔内送達の場合、ｐＨが、７．５超、例えば、７．５～８、又は７．８が望ましい可能性がある。

【0145】

ある特定の実施形態では、製剤は、重炭酸ナトリウムを含まない緩衝生理食塩水溶液を含有し得る。かかる製剤は、リン酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウム、及びそれらの組み合わせのうちの１つ以上を水中に含む緩衝生理食塩水溶液、例えば、ハーバード緩衝液を含有し得る。一実施形態では、緩衝液は、ＰＢＳである。別の実施形態では、緩衝液は、人工脳脊髄液（ａＣＳＦ）、例えば、エリオット製剤緩衝液、又はハーバード装置灌流液（最終イオン濃度（ｍＭ単位で）：Ｎａ１５０、Ｋ３．０、Ｃａ１．４、Ｍｇ０．８、Ｐ１．０、Ｃｌ１５５を有する人工ＣＳＦ）である。水溶液は、ポロキサマーであるＫｏｌｌｉｐｈｏｒ（登録商標）Ｐ１８８を更に含有してもよく、これは、ＢＡＳＦから市販され、以前、Ｌｕｔｒｏｌ（登録商標）Ｆ６８という商品名で販売されていた。水溶液は、７．２のｐＨを有し得る。

【0146】

別の実施形態では、製剤は、１ｍＭのリン酸ナトリウム（Ｎａ３ＰＯ４）、１５０ｍＭの塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、３ｍＭの塩化カリウム（ＫＣｌ）、１．４ｍＭの塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）、０．８ｍＭの塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２）、及び０．００１％のポロキサマー（Ｋｏｌｌｉｐｈｏｒ（登録商標））１８８、ｐＨ７．２を含む、緩衝生理食塩水溶液を含有し得る。例えば、ｈａｒｖａｒｄａｐｐａｒａｔｕｓ．ｃｏｍ／ｈａｒｖａｒｄ－ａｐｐａｒａｔｕｓ－ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ－ｆｌｕｉｄ．ｈｔｍｌを参照されたい。ある特定の実施形態では、ハーバード緩衝液でより良好なｐＨ安定性が観察されることに起因して、ハーバード緩衝液が好ましい。

【0147】

ある特定の実施形態では、製剤緩衝液は、ＰｌｕｒｏｎｉｃＦ６８を含む人工ＣＳＦである。他の実施形態では、製剤は、１つ以上の浸透促進剤を含有し得る。好適な浸透促進剤の例としては、例えば、マンニトール、グリココール酸ナトリウム、タウロコール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム、サリチル酸ナトリウム、カプリン酸ナトリウム、カプリン酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレン－９－ラウリルエーテル、又はＥＤＴＡが挙げられ得る。

【0148】

任意選択的に、本発明の組成物は、ｒＡＡＶ及び担体（複数可）に加えて、防腐剤又は化学的安定剤などの他の従来の薬学的成分を含有し得る。好適な例示的な防腐剤としては、クロロブタノール、ソルビン酸カリウム、ソルビン酸、二酸化硫黄、没食子酸プロピル、パラベン、エチルバニリン、グリセリン、フェノール、及びパラクロロフェノールが挙げられる。好適な化学的安定剤としては、ゼラチン及びアルブミンが挙げられる。

【0149】

本発明による組成物は、上に定義されるような薬学的に許容される担体を含み得る。好適には、本明細書に記載の組成物は、薬学的に好適な担体に懸濁され、及び／又は注射、浸透ポンプ、髄腔内カテーテルを介して対象に送達するために、又は別のデバイス若しくは経路による送達のために設計された好適な賦形剤と混合された１つ以上のＡＡＶを有効量含む。ある特定の実施形態では、送達のために、ｏｍｍａｙａリザーバが使用される。一例では、組成物は、髄腔内送達用に製剤化されている。一実施例では、組成物は、髄腔内（ｉｖ）送達用に製剤化されている。

【0150】

一実施形態では、治療有効量の当該ベクターが、薬学的組成物に含まれる。担体の選択は、本発明の制限ではない。防腐剤又は化学的安定剤などの他の従来の薬学的に許容される担体。好適な例示的な防腐剤としては、クロロブタノール、ソルビン酸カリウム、ソル
ビン酸、二酸化硫黄、没食子酸プロピル、パラベン、エチルバニリン、グリセリン、フェノール、及びパラクロロフェノールが挙げられる。好適な化学的安定剤としては、ゼラチン及びアルブミンが挙げられる。

【0151】

「薬学的に許容される」という語句は、宿主に投与されると、アレルギー又は同様の有害反応を生じない分子実体及び組成物を指す。

【0152】

本明細書で使用される場合、「投薬量」又は「量」という用語は、治療の過程で対象に送達される総投薬量若しくは総量、又は単一単位（又は複数単位若しくは分割投薬量）投与で送達される投薬量若しくは量を指し得る。

【0153】

また、複製欠陥ウイルス組成物は、ヒト患者にとって、範囲内の全ての整数又は分数を含む、（体重７０ｋｇの平均対象を治療する）約１．０×１０^９ＧＣ～約１．０×１０^１６ＧＣの範囲、好ましくは１．０×１０^１２ＧＣ～１．０×１０^１４ＧＣの範囲にある量の複製欠陥ウイルスを含有する投薬量単位で製剤化することができる。一実施形態では、組成物は、範囲内の全ての整数又は小数を含む、用量当たり少なくとも１×１０^９、２×１０^９、３×１０^９、４×１０^９、５×１０^９、６×１０^９、７×１０^９、８×１０^９、又は９×１０^９ＧＣを含有するように製剤化されている。別の実施形態では、組成物は、範囲内の全ての整数又は小数を含む、用量当たり少なくとも１×１０^１０、２×１０^１０、３×１０^１０、４×１０^１０、５×１０^１０、６×１０^１０、７×１０^１０、８×１０^１０、又は９×１０^１０ＧＣを含有するように製剤化されている。別の実施形態では、組成物は、範囲内の全ての整数又は小数を含む、用量当たり少なくとも１×１１^１１、２×１１^１１、３×１１^１１、４×１１^１１、５×１１^１１、６×１０^１１、７×１０^１１、８×１０^１１、又は９×１０^１１ＧＣを含有するように製剤化されている。別の実施形態では、組成物は、範囲内の全ての整数又は小数を含む、用量当たり少なくとも１×１０^１２、２×１０^１２、３×１０^１２、４×１０^１２、５×１０^１２、６×１０^１２、７×１０^１２、８×１０^１２、又は９×１０^１２ＧＣを含有するように製剤化されている。別の実施形態では、組成物は、範囲内の全ての整数又は小数を含む、用量当たり少なくとも１×１３^１３、２×１３^１３、３×１３^１３、４×１３^１３、５×１３^１３、６×１０^１３、７×１０^１３、８×１０^１３、又は９×１０^１３ＧＣを含有するように製剤化されている。別の実施形態では、組成物は、範囲内の全ての整数又は小数を含む、用量当たり少なくとも１×１０^１４、２×１０^１４、３×１０^１４、４×１０１４、５×１０^１４、６×１０^１４、７×１０^１４、８×１０^１４、又は９×１０^１４ＧＣを含有するように製剤化されている。別の実施形態では、組成物は、範囲内の全ての整数又は小数を含む、用量当たり少なくとも１×１０^１５、２×１０^１５、３×１０^１５、４×１０^１５、５×１０^１５、６×１０^１５、７×１０^１５、８×１０^１５、又は９×１０^１５ＧＣを含有するように製剤化されている。一実施形態では、ヒトへの適用のために、用量は、範囲内の全ての整数又は少数を含む、用量当たり１×１０^１０～約１×１０^１２ＧＣの範囲であり得る。

【0154】

一実施形態では、本明細書に記載のｒＡＡＶを含む薬学的組成物は、脳質量１グラム当たり約１×１０^９ＧＣ～脳質量１グラム当たり約１×１０^１３ＧＣの用量で投与される。

【0155】

本明細書に記載の薬学的組成物における組成物が、本明細書にわたって記載される他の組成物、レジメン、態様、実施形態、及び方法に適用されるように意図されることが理解されるべきである。

【0156】

使用
一態様では、本明細書で提供される方法は、ＭＰＳ ＩＩＩＡを有すると診断されたヒト対象を治療する方法である。現在、ＭＰＳ ＩＩＩの臨床的疑いが存在する場合、第１のステップは、ジメチルメチレンブルー（ＤＭＢ）を使用する分光光度法を通じて、尿中
のＧＡＧの存在を検出するための定量的試験を要求する。ＤＭＢ試験は、ＧＡＧとジメチルメチレンブルーとの結合、及び分光光度計によるＧＡＧ－ＤＭＢ複合体の定量化に基づく。この試験の感度は１００％であり、特異度は７５～１００％である。疾患の減衰形態を有する一部の患者において、健康な対照とＧＡＧ排泄のレベルが重複し得、ＭＰＳ ＩＩＩにおけるヘパラン硫酸の排泄の増加が無視され得るという事実に起因して、尿中のＧＡＧを検出する場合の陰性結果によって、ＭＰＳ ＩＩＩの存在は排除されない。現在の診断のための黄金律の技術は、培養された皮膚線維芽細胞、白血球、血漿、又は血清中の酵素活性の決定である。ＭＰＳ ＩＩＩＡの特異的診断は、患者の白血球又は線維芽細胞におけるヘパラン硫酸の分解に関与するＳＧＳＨ酵素活性のうちの１つの減少又は不在を示すことによって確認され、健康な個体における活性と比較すると、他のスルファターゼが正常でありながら、低減は１０％未満であるはずである。複数のスルファターゼの欠乏に起因する疾患はまた、ヘパランＮ－スルファターゼ、Ｎ－アセチルグルコサミン６－スルファターゼ、及び他のスルファターゼの活性の低減を示すので、ＭＰＳ ＩＩＩの診断を確認し、したがって、複数のスルファターゼの欠乏を排除するために、少なくとも他のスルファターゼの生化学的分析が必要である。しかしながら、診断方法は、本発明を限定するものではなく、他の好適な方法が選択され得る。

【0157】

方法は、対象に、本明細書に記載のベクターの懸濁液を投与することを含む。一実施形態では、方法は、対象に、脳質量１グラム当たり約１×１０^９ＧＣ～脳質量１グラム当たり約１×１０^１４ＧＣの用量で、製剤緩衝液中の本明細書に記載のｒＡＡＶが投与される。

【0158】

本明細書で提供される組成物（複数可）及び方法（複数可）は、ＭＰＳ ＩＩＩＡの治療を必要とする対象の治療において有効性を達成する。対象における方法の有効性は、（ａ）ＳＧＳＨ酵素活性の増加、（ｂ）ＭＰＳ ＩＩＩＡ症状の緩和、（ｃ）ＭＰＳ ＩＩＩＡに関連するバイオマーカ、例えば、脳脊髄液（ＣＳＦ）、血清、尿、及び／若しくは他の生物学的試料中のＧＡＧレベルであるポリアミン（例えば、スペルミン）レベルの改善、又は（ｅ）ＭＰＳ ＩＩＩＡの任意の治療（複数可）の促進を評価することによって示すことができる。ある特定の実施形態では、有効性は、認知的改善及び／又は不安の補正、歩行及び／又は可動性の改善、振戦頻度及び／又は重症度の低減、痙縮／痙攣の低減、姿勢の改善、角膜の不透明度の改善を監視することによって決定することができる。追加的に又は代替的に、方法の有効性は、動物モデルに基づいて予測され得る。別の実施形態では、動物モデルにおいて、本明細書に記載のＭＰＳＩＩＩＡベクター療法に対する疾患補正及び応答を評価するために、マルチパラメータ等級付けスケールを開発した。振戦、姿勢、毛質、痙縮、角膜曇り、及び歩行／可動性の組み合わせの評価に基づいて、動物にスコアを割り当てる。ある特定の実施形態では、これらの因子のうちの１つ以上の任意の組み合わせは、単独で、又は他の因子と組み合わせて、有効性を示すために使用され得る。例えば、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｃｕｒｒ Ｐｒｏｔｏｃ Ｍｏｕｓｅ
Ｂｉｏｌ．Ｊｕｎｅ ２０１２，２：１４５－６５、Ｔｕｍｐｅｙ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ．Ｍａｙ １９９８，３７０５－１０、及びＧｕｙｅｎｅｔ ｅｔ ａｌ．Ｊ
Ｖｉｓ Ｅｘｐ，Ｍａｙ ２０１０，３９；１７８７）を参照されたい。治療した動物の認知改善及び不安補正は、開放的な場所において運動を評価すること（すなわち、例えば、Ｔａｔｅｍ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｖｉｓ Ｅｘｐ，２０１４，（９１）：５１７８５に記載のビーム破断測定）及び（例えば、Ｗａｌｆ ａｎｄ Ｆｒｙｅ，Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ，２００７，２（２）：３２２－３２８に記載の高架式十字迷路アッセイによって評価する。

【0159】

本明細書で使用される場合、「ＭＰＳ ＩＩＩＡのための任意の治療（複数可）の促進」又はその任意の文法的変形は、記載の組成物（複数可）の投与及び記載の方法（複数可）の使用を伴わない標準的な治療のものと比較して、本発明で最初に開示されている組成
物（複数可）又は方法（複数可）以外の、対象におけるＭＰＳ ＩＩＩＡの治療の投薬量の減少又は頻度の低下を指す。本明細書に記載の組成物（複数可）又は方法（複数可）によって促進される好適な治療の例としては、限定されないが、症状（発作及び睡眠障害など）を緩和し、生活の質を改善するために使用される医薬品、骨髄移植又は臍帯血移植などの造血幹細胞移植、静脈内投与又は脳室内注入を介した酵素補充療法（ＥＲＴ）、及びそれらの任意の組み合わせが挙げられ得る。一実施形態では、記載の方法は、対象における、ＭＰＳ ＩＩＩＡに関連するバイオマーカの改善を示すことを生じる。

【0160】

「ＳＧＳＨ酵素活性の増加」は、「所望のＳＧＳＨ機能の増加」という用語と互換的に使用され、健康な患者のＳＧＳＨ酵素範囲の少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、又は約１００％のＳＧＳＨ活性を指す。ＳＧＳＨ酵素活性は、本明細書に記載のアッセイによって測定することができる。一実施形態では、ＳＧＳＨ酵素活性は、血清、血漿、血液、尿、ＣＳＦ、又は別の生物学的試料中で測定され得る。一実施形態では、本明細書に記載の組成物の投与、又は本明細書に記載の方法の使用は、血清、血漿、唾液、尿、又は他の生物学的試料においてＳＧＳＨ酵素活性の増加を生じる。代替的に、治療効果を決定するために、ＣＳＦ ＧＡＧレベル及びスペルミンレベルなどの他のＣＳＦバイオマーカが測定され得る。例えば、ＷＯ２０１７／１３６５３３を参照されたい。

【0161】

神経認知は、従来の方法によって決定することができる、例えば、ＷＯ２０１７／１３６５００ Ａ１を参照されたい。神経認知低下の予防は、ＭＰＳ ＩＩＩＡ患者のものと比較して、本明細書に記載の組成物を投与されたか、又は本明細書に記載の方法を受けた対象の神経認知低下の、少なくとも約５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、又は約１００％の減速を指す。

【0162】

本明細書で使用される場合、「バイオマーカ」又は「ＭＰＳ ＩＩＩＡに関連するバイオマーカ」という用語は、対象の生物学的試料中の生物学的又は化学的分子の存在、濃度、発現レベル、又は活性を指し、陽性又は陰性物質においてＭＰＳ ＩＩＩＡの進行又は発症に相関する。一実施形態では、バイオマーカは、脳脊髄液（ＣＳＦ）、血清、尿、皮膚線維芽細胞、白血球、血漿、又は任意の他の生物学的試料中のＧＡＧレベルである。別の実施形態では、バイオマーカは、臨床化学を使用して評価される。更に別の実施形態では、バイオマーカは、肝臓体積又は脾臓体積である。一実施形態では、バイオマーカは、ヘパランＮ－スルファターゼ、Ｎ－アセチルグルコサミン６－スルファターゼ、及び他のスルファターゼの活性である。別の実施形態では、バイオマーカは、ＣＳＦ、血清、又は別の生物学的試料中のスペルミンレベルである。更に別の実施形態では、バイオマーカは、血清、ＣＳＦ、又は別の生物学的試料中のリソソーム酵素活性である。一実施形態では、バイオマーカは、脳の磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）を介して評価される。別の実施形態では、バイオマーカは、神経認知発達試験によって測定される神経認知スコアである。本明細書で使用される「バイオマーカの改善」という語句は、疾患の進行に正に相関するバイオマーカの低減、又は疾患の進行に負に相関するバイオマーカの増加を意味し、低減又は増加が、本明細書に記載の組成物の投与前又は本明細書に記載の方法の使用前と比較して、少なくとも約５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、又は約１００％である。

【0163】

一実施形態では、方法は、本明細書で提供される療法を用いた療法を開始する前に、対象におけるＭＰＳ ＩＩＩＡに関連するバイオマーカを検出又は監視することを更に含む
。ある特定の実施形態では、方法は、対象からの試料中のポリアミン（スペルミンなど）であるバイオマーカの検出を含む（参照により本明細書に援用される、ＷＯ／２０１７／１３６５３３を参照されたい）。ある特定の実施形態では、本明細書に記載のベクターを使用するＭＰＳＩＩＩに対する治療の有効性を監視するために、患者試料中のスペルミン濃度レベルが検出される。

【0164】

現在、ＭＰＳＩＩＩＡを有する患者は、骨髄移植（ＢＭＴ）、基質合成抑制療法（ＳＲＴ）、又は酵素補充療法（ＥＲＴ）の候補とはみなされていない。しかしながら、ある特定の実施形態では、本明細書に記載のＳＧＳＨを発現するベクターで治療される遺伝子療法患者は、最低でも、任意のほぼ正常範囲の酵素レベルがＥＲＴ又はＳＲＴで治療することができるほど十分な酵素発現レベルを有する。かかるＥＲＴは、併用療法であり得、併用療法において、ＥＲＴの用量が、ベクター投与後数か月又は数年にわたって監視され、調節される。追加的に又は代替的に、ＳＲＴは、併用療法であり得、併用療法において、ＳＲＴの用量が、ベクター投与後数か月又は数年にわたって監視され、調節される。

【0165】

本明細書で使用される場合、酵素補充療法（ＥＲＴ）は、特定の酵素が欠乏又は欠如している患者において、酵素を補充することからなる医学的治療である。酵素は、通常、組換えタンパク質として産生され、患者に投与される。一実施形態では、酵素は、機能性ＳＧＳＨである。別の実施形態では、酵素は、機能性ＳＧＳＨを含む組換えタンパク質である。全身、髄腔内、脳室内、又は大槽内送達は、ＥＲＴを使用して達成することができる。本明細書で使用される場合、基質合成抑制療法（ＳＲＴ）は、ＳＧＳＨの非存在下で蓄積する化合物の生合成を部分的に阻害するために小分子薬物を使用する療法を指す。一実施形態では、ＳＲＴは、ゲニステインを介した療法である。例えば、Ｒｉｔｖａ Ｔｉｋｋａｎｅｎ ｅｔ ａｌ，Ｌｅｓｓ Ｉｓ Ｍｏｒｅ：Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ Ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ Ｌｙｓｏｓｏｍａｌ Ｓｔｏｒａｇｅ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ．Ｉｎｔ Ｊ Ｍｏｌ Ｓｃｉ．２０１６ Ｊｕｌ；１７（７）：１０６５．Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ ２０１６ Ｊｕｌ ４．ｄｏｉ：１０．３３９０／ｉｊｍｓ１７０７１０６５、Ｄｅｌｇａｄｉｌｌｏ Ｖ ｅｔ ａｌ，Ｇｅｎｉｓｔｅｉｎ
ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ａｆｆｅｃｔｅｄ ｂｙ
Ｓａｎｆｉｌｉｐｐｏ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｊ Ｉｎｈｅｒｉｔ Ｍｅｔａｂ Ｄｉｓ．２０１１ Ｏｃｔ；３４（５）：１０３９－４４．ｄｏｉ：１０．１００７／ｓ１０５４５－０１１－９３４２－４．Ｅｐｕｂ ２０１１ Ｍａｙ １０、及びｄｅ Ｒｕｉｊｔｅｒ Ｊ ｅｔ ａｌ，Ｇｅｎｉｓｔｅｉｎ ｉｎ Ｓａｎｆｉｌｉｐｐｏ ｄｉｓｅａｓｅ：ａ ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｃｒｏｓｓｏｖｅｒ ｔｒｉａｌ．Ａｎｎ Ｎｅｕｒｏｌ．２０１２ Ｊａｎ；７１（１）：１１０－２０．ｄｏｉ：１０．１００２／ａｎａ．２２６４３を参照されたい。

【0166】

これらの用量及び濃度の送達のために好適な体積は、当業者によって決定され得る。例えば、約１μＬ～１５０ｍＬの体積が選択され得、成人にはより多くの体積が選択され得る。典型的に、新生児には、好適な体積は、約０．５ｍＬ～約１０ｍＬ、数か月齢の乳児には、約０．５ｍＬ～約１５ｍＬが選択され得る。幼児には、約０．５ｍＬ～約２０ｍＬの体積が選択され得る。小児には、最大約３０ｍＬの体積が選択され得る。１０代前半及び１０代には、最大約５０ｍＬの体積が選択され得る。なお他の実施形態では、患者は、約５ｍＬ～約１５ｍＬの体積での髄腔内投与を受け得るか、又は約７．５ｍＬ～約１０ｍＬが選択される。他の好適な体積及び投薬量が、決定される場合がある。投薬量を調整して、任意の副作用に対する治療的利益のバランスをとり、かかる投薬量は、組換えベクターが利用される治療適用に応じて変化し得る。

【0167】

一実施形態では、本明細書に記載のｒＡＡＶは、脳質量１グラム当たり約１×１０^９ＧＣ～脳質量１グラム当たり約１×１０^１４ＧＣの用量で投与される。ある特定の実施形態
では、ｒＡＡＶは、体重１ｋｇ当たり約１×１０^９ＧＣ～体重１ｋｇ当たり約１×１０^１３ＧＣの用量で全身に同時投与される。

【0168】

一実施形態では、対象は、治療有効量の本明細書に記載のベクターを送達される。本明細書で使用される場合、「治療有効量」は、有効性を達成するのに十分な酵素の量を標的細胞に送達し、標的細胞で発現させる、ｈＳＧＳＨをコードする核酸配列を含む組成物の量を指す。一実施形態では、ベクターの投薬量は、その範囲内及び終点の全ての整数又は小数の量を含む、脳質量１グラム当たり約１×１０^９ＧＣ～脳質量１グラム（ｇ）当たり約１×１０^１３ゲノムコピー（ＧＣ）である。別の実施形態では、投薬量は、脳質量１グラム当たり１×１０^１０ＧＣ～脳質量１グラム当たり約１×１０^１３ＧＣである。特定の実施形態では、患者に投与されるベクターの用量は、少なくとも約１．０×１０^９ＧＣ／ｇ、約１．５×１０^９ＧＣ／ｇ、約２．０×１０^９ＧＣ／ｇ、約２．５×１０^９ＧＣ／ｇ、約３．０×１０^９ＧＣ／ｇ、約３．５×１０^９ＧＣ／ｇ、約４．０×１０^９ＧＣ／ｇ、約４．５×１０^９ＧＣ／ｇ、約５．０×１０^９ＧＣ／ｇ、約５．５×１０^９ＧＣ／ｇ、約６．０×１０^９ＧＣ／ｇ、約６．５×１０^９ＧＣ／ｇ、約７．０×１０^９ＧＣ／ｇ、約７．５×１０^９ＧＣ／ｇ、約８．０×１０^９ＧＣ／ｇ、約８．５×１０^９ＧＣ／ｇ、約９．０×１０^９ＧＣ／ｇ、約９．５×１０^９ＧＣ／ｇ、約１．０×１０^１０ＧＣ／ｇ、約１．５×１０^１０ＧＣ／ｇ、約２．０×１０^１０ＧＣ／ｇ、約２．５×１０^１０ＧＣ／ｇ、約３．０×１０^１０ＧＣ／ｇ、約３．５×１０^１０ＧＣ／ｇ、約４．０×１０^１０ＧＣ／ｇ、約４．５×１０^１０ＧＣ／ｇ、約５．０×１０^１０ＧＣ／ｇ、約５．５×１０^１０ＧＣ／ｇ、約６．０×１０^１０ＧＣ／ｇ、約６．５×１０^１０ＧＣ／ｇ、約７．０×１０^１０ＧＣ／ｇ、約７．５×１０^１０ＧＣ／ｇ、約８．０×１０^１０ＧＣ／ｇ、約８．５×１０^１０ＧＣ／ｇ、約９．０×１０^１０ＧＣ／ｇ、約９．５×１０^１０ＧＣ／ｇ、約１．０×１０^１１ＧＣ／ｇ、約１．５×１０^１１ＧＣ／ｇ、約２．０×１０^１１ＧＣ／ｇ、約２．５×１０^１１ＧＣ／ｇ、約３．０×１０^１１ＧＣ／ｇ、約３．５×１０^１１ＧＣ／ｇ、約４．０×１０^１１ＧＣ／ｇ、約４．５×１０^１１ＧＣ／ｇ、約５．０×１０^１１ＧＣ／ｇ、約５．５×１０^１１ＧＣ／ｇ、約６．０×１０^１１ＧＣ／ｇ、約６．５×１０^１１ＧＣ／ｇ、約７．０×１０^１１ＧＣ／ｇ、約７．５×１０^１１ＧＣ／ｇ、約８．０×１０^１１ＧＣ／ｇ、約８．５×１０^１１ＧＣ／ｇ、約９．０×１０^１１ＧＣ／ｇ、約９．５×１０^１１ＧＣ／ｇ、約１．０×１０^１２ＧＣ／ｇ、約１．５×１０^１２ＧＣ／ｇ、約２．０×１０^１２ＧＣ／ｇ、約２．５×１０^１２ＧＣ／ｇ、約３．０×１０^１２ＧＣ／ｇ、約３．５×１０^１２ＧＣ／ｇ、約４．０×１０^１２ＧＣ／ｇ、約４．５×１０^１２ＧＣ／ｇ、約５．０×１０^１２ＧＣ／ｇ、約５．５×１０^１２ＧＣ／ｇ、約６．０×１０^１２ＧＣ／ｇ、約６．５×１０^１２ＧＣ／ｇ、約７．０×１０^１２ＧＣ／ｇ、約７．５×１０^１２ＧＣ／ｇ、約８．０×１０^１２ＧＣ／ｇ、約８．５×１０^１２ＧＣ／ｇ、約９．０×１０^１２ＧＣ／ｇ、約９．５×１０^１２ＧＣ／ｇ、約１．０×１０^１３ＧＣ／ｇ、約１．５×１０^１３ＧＣ／ｇ、約２．０×１０^１３ＧＣ／ｇ、約２．５×１０^１３ＧＣ／ｇ、約３．０×１０^１３ＧＣ／ｇ、約３．５×１０^１３ＧＣ／ｇ、約４．０×１０^１３ＧＣ／ｇ、約４．５×１０^１３ＧＣ／ｇ、約５．０×１０^１３ＧＣ／ｇ、約５．５×１０^１３ＧＣ／ｇ、約６．０×１０^１３ＧＣ／ｇ、約６．５×１０^１３ＧＣ／ｇ、約７．０×１０^１３ＧＣ／ｇ、約７．５×１０^１３ＧＣ／ｇ、約８．０×１０^１３ＧＣ／ｇ、約８．５×１０^１３ＧＣ／ｇ、約９．０×１０^１３ＧＣ／ｇ、約９．５×１０^１３ＧＣ／ｇ、又は約１．０×１０^１４ＧＣ／脳質量ｇである。

【0169】

投薬量は、任意の副作用に対する治療効果のバランスをとるように調整され、かかる投薬量は、組換えベクターが用いられる治療用途に応じて変動し得る。ウイルスベクター、好ましくは、ミニ遺伝子を含有するＡＡＶベクターを生じる投薬の頻度を決定するために、導入遺伝子産物の発現のレベルが監視され得る。任意選択的に、本発明の組成物を使用する治療目的で記載されているものと同様の投薬レジメンが、免疫化に利用され得る。

【0170】

一実施形態では、方法は、対象が免疫抑制性併用療法を受けることを更に含む。かかる併用療法のための免疫抑制剤としては、限定されないが、グルココルチコイド、ステロイド、抗代謝剤、Ｔ細胞阻害剤、マクロライド（例えば、ラパマイシン又はラパログ）、及び細胞分裂阻害剤（アルキル化剤、抗代謝剤、細胞傷害性抗生物質、抗体、又はイムノフィリンに対して活性な薬剤を含む）が挙げられる。免疫抑制剤には、ナイトロジェンマスタード、ニトロソウレア、白金化合物、メトトレキサート、アザチオプリン、メルカプトプリン、フルオロウラシル、ダクチノマイシン、アントラサイクリン、マイトマイシンＣ、ブレオマイシン、ミトラマイシン、ＩＬ－２受容体（ＣＤ２５）特異的抗体又はＣＤ３特異的抗体、抗ＩＬ－２抗体、シクロスポリン、タクロリムス、シロリムス、ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－γ、オピオイド、又はＴＮＦ－α（腫瘍壊死因子－α）結合剤を含み得る。

【0171】

ある特定の実施形態では、免疫抑制療法は、遺伝子療法投与の０、１、２、７日前、又はそれ以前に開始され得る。かかる療法は、同じ日に２つ以上の薬剤、（例えば、プレドネリゾン、ミコフェノール酸モフェチル（ＭＭＦ）及び／又はシロリムス（すなわち、ラパマイシン）の同時投与を含み得る。これらの薬物のうちの１つ以上は、遺伝子療法投与後に、同じ用量又は調整された用量で継続され得る。かかる療法は、必要に応じて、約１週間（７日間）、約６０日間、又はそれ以上であり得る。ある特定の実施形態では、タクロリムスを含まないレジメンが選択される。

【0172】

ある特定の実施形態では、方法は、血清抗ｈＳＧＳＨ抗体の測定を含む。本明細書に記載の抗ｈＳＧＳＨ抗体を測定する好適なアッセイが、利用可能である。

【0173】

一実施形態では、本明細書に記載のｒＡＡＶは、必要とする対象に１回投与される。別の実施形態では、ｒＡＡＶは、必要とする対象に２回以上投与される。

【0174】

上述の組換えベクターは、公開された方法に従って宿主細胞に送達され得る。好ましくは生理学的に適合性のある担体に懸濁されたｒＡＡＶは、ヒト又は非ヒト哺乳類患者に投与され得る。ある特定の実施形態では、ヒト患者への投与のために、ｒＡＡＶは、好適には、生理食塩水、界面活性剤、及び生理学的に適合性の塩又は塩の混合物を含有する水溶液に懸濁される。好適には、製剤は、生理学的に許容されるｐＨ、例えば、ｐＨ６～９、又はｐＨ６．５～７．５、ｐＨ７．０～７．７、又はｐＨ７．２～７．８の範囲に調整される。脳脊髄液のｐＨは約７．２８～約７．３２であるので、髄腔内送達のためには、この範囲内のｐＨが望ましく、静脈内送達のためには、約６．８～約７．２のｐＨが望ましい可能性がある。しかしながら、他の送達経路では、最も広い範囲内にある他のｐＨ、及びこれらの部分範囲が選択され得る。

【0175】

本明細書で使用される場合、「髄腔内送達」又は「髄腔内投与」という用語は、脊柱管への、より具体的には、脳脊髄液（ＣＳＦ）に到達するようにクモ膜下腔への注射を介する、薬物の投与経路を指す。髄腔内送達は、腰部穿刺、脳室内（側脳室内（ＩＣＶ）を含む）、後頭下／槽内、及び／又はＣ１－２穿刺を含み得る。例えば、クモ膜下腔全体にわたって拡散させるために、腰部穿刺の手段によって、材料が導入され得る。別の例では、大槽内への注射であり得る。ある特定の実施形態では、本明細書に記載されるｒＡＡＶ、ベクター、又は組成物は、髄腔内投与を介して必要な対象に投与される。ある特定の実施形態では、髄腔内投与は、参照によりその全体が本明細書に援用される、２０１９年１１月２９日に公開された米国特許公開第２０１８－０３３９０６５Ａ１号に記載されるように実施される。

【0176】

本明細書で使用される場合、「大槽内送達」又は「大槽内投与」という用語は、小脳延髄大槽の脳脊髄液への直接的な薬物の投与経路、より具体的には、後頭下穿刺による、若しくは大槽内への直接注射による、又は永続的に配置されたチューブによる、薬物の投与
経路を指す。

【0177】

ある特定の実施形態では、本明細書に記載の組成物の治療は、感覚神経毒性及び無症状性感覚ニューロン病変に関して十分に耐容性である、動物及び／又はヒト患者におけるＤＲＧ感覚ニューロンの最小～軽度の無症状変性を有する。

【0178】

本明細書に記載の方法における組成物が、本明細書にわたって記載される他の組成物、レジメン、態様、実施形態、及び方法に適用されるように意図されることを理解されたい。

【0179】

キット
ある特定の実施形態では、（任意選択的に、凍結された）製剤に懸濁された濃縮されたベクター、任意選択的な希釈緩衝液、並びに髄腔内、脳室内、大槽内投与に必要とされるデバイス及び他の構成要素を含む、キットが提供される。別の実施形態では、キットは、追加的な又は代替的に、静脈内送達のための構成要素を含み得る。一実施形態では、注射を可能にするために、キットは、十分な緩衝液を提供する。かかる緩衝液は、濃縮されたベクターの約１：１～１：５希釈、又はそれより以上の希釈を可能にし得る。他の実施形態では、より多量若しくはより少量の緩衝液又は滅菌水が含まれ、治療を行う医師により、用量滴定及び他の調整が可能になる。更に他の実施形態では、キットには、デバイスの１つ以上の構成要素が含まれる。好適な希釈緩衝液、例えば、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）又はグリセロール／ＰＢＳが利用可能である。

【0180】

本明細書に記載のキットにおける組成物が、本明細書にわたって記載される他の組成物、レジメン、態様、実施形態、及び方法に適用されるように意図されることを理解されたい。

【0181】

脳脊髄液への薬学的組成物の送達のための装置及び方法
一態様では、本明細書で提供されるｒＡＡＶ又はその組成物は、このセクションで提供され、かつ参照により本明細書に援用されるＷＯ２０１７／１３６５００及びＷＯ２０１８／１６０５８２に記載の方法及び／又はデバイスを介して、髄腔内投与され得る。代替的に、他のデバイス及び方法が選択され得る。ある特定の実施形態では、方法は、脊髄針を介する、患者の大槽内へのＣＴ誘導による後頭下注射のステップを含む。本明細書で使用される場合、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）という用語は、軸に沿って作成された一連の平面断面画像から、コンピュータによって身体構造の三次元画像が構築される放射線撮影を指す。ある特定の実施形態では、本明細書に記載のベクター及び／又はその組成物は、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）誘導による大槽への（大槽内［ＩＣＭ］）後頭下注射を介して投与される。ある特定の実施形態では、装置は、参照によりその全体が本明細書に援用される、２０１９年１１月２９日に公開された米国特許公開第２０１８－０３３９０６５Ａ１号に記載されている。ある特定の実施形態では、本明細書で提供されるベクター、ｒＡＡＶ、又はそれらの組成物は、Ｏｍｍａｙａリザーバを使用して投与され得る。

【0182】

本明細書に記載のデバイスにおける組成物が、本明細書にわたって記載される他の組成物、レジメン、態様、実施形態、及び方法に適用されるように意図されることを理解されたい。

【0183】

本明細書で使用される場合、「投与」という用語又はその任意の文法的バリエーションは、対象への、本明細書に記載の組成物の送達を指す。

【0184】

「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、及び「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という単語は、排他的ではなく包括的に解釈されるべきであ
る。「構成する（ｃｏｎｓｉｓｔ）」、「構成している（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」という語句、及びその変形は、包括的ではなく排他的に解釈されるべきである。本明細書の様々な実施形態は、「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という言葉を使用して提示されているが、他の状況下では、関連する実施形態は、「からなっている（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」又は「本質的にからなっている（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」という言葉を使用して含めること及び記載することも意図される。本明細書及び特許請求の範囲全体を通して使用される場合、「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含有している（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」という用語、及びその変形は、他の構成要素、因子、整数、ステップなどを含む。逆に、「からなっている（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」という用語及びその変形は、他の構成要素、因子、整数、ステップなどを除外する。

【0185】

「ａ」又は「ａｎ」という用語は、１つ以上を指すことに留意されたい。したがって、「ａ」（又は「ａｎ」）、「１つ以上（ｏｎｅ ｏｒ ｍｏｒｅ）」、及び「少なくとも１つ（ａｔ ｌｅａｓｔ ｏｎｅ）」という用語は、本明細書では互換的に使用される。

【0186】

本明細書で使用される場合、別途指定されない限り、「約」又は「～」という用語は、参照整数から±１０％の変形及び参照整数間の値を指す。例えば、「約」５００μＭは、±５０（すなわち、それらの間の整数を含む４５０～５５０）を含む。他の値では、特に、パーセンテージ（例えば、９０％の意味）について言及する場合、「約」という用語は、整数及び小数の両方を含む範囲内の全ての値を含む。

【0187】

本明細書で使用される場合、「約」という用語は、数値を修飾するために使用される場合、別途指定されない限り、所与の参照から±１０％（±１０％、例えば、±１、±２、±３、±４、±５、±６、±７、±８、±９、±１０、又はそれらの間の値）のバリエーションを意味する。

【0188】

ある特定の場合では、「Ｅ＋＃」という用語、又は「ｅ＋＃」という用語は、冪乗を指すために使用される。例えば、「５Ｅ１０」又は「５ｅ１０」は、５×１０^１０である。これらの用語は、互換的に使用され得る。

【0189】

様々な本明細書の実施形態の記載に関して、別の実施形態では、本明細書に記載の組成物の各々が有用であり、本発明の方法で有用であることが意図される。加えて、方法で有用な本明細書に記載の組成物の各々は、別の実施形態では、それ自体が本発明の実施形態であることも意図される。

【0190】

本明細書で別途定義されない限り、本明細書で使用される技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって、及び本出願で使用されている多くの用語に対して当業者に一般的な手引きを提供する公開された文書を参照することによって、一般的に理解されているものと同じ意味を有する。

【実施例】

【0191】

以下の実施例は、特許請求される本発明のある特定の態様を例示するために提供される。本発明は、これらの実施例に限定されない。

【0192】

これは、ポリＡ配列を含むヒトＮ－スルホグルコサミンスルホヒドロラーゼ（ｈＳＧＳＨｃｏ）の操作されたバージョンを発現するユビキタスプロモータを含む組換えアデノ随伴ウイルス血清型ｈｕ６８（又は他の汎親和性／神経親和性血清型）を使用して、ムコ多糖症ＩＩＩＡ型（ＭＰＳＩＩＩＡ、又はサンフィリッポＡ症候群）を治療する方法である。ｈＳＧＳＨのいくつかの操作された配列コードバージョンが網羅される：参照アミノ酸
配列（Ｎ－スルホグルコサミンスルホヒドロラーゼアイソフォーム１前駆体［ホモサピエンス］ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿０００１９０．１）、ＮＰ＿０００１９０．１：ｐ．Ａｒｇ４５６Ｐｒｏをコードする別の頻繁なミスセンス単一ヌクレオチド多型ｒｓ７５０３０３４、融合タンパク質ｖＩＧＦ２－ｈＳＧＳＨｃｏ、融合タンパク質ｖＩＧＦ２－ｈＳＧＳＨｃｏ（Ｒ４５６Ｐ）。本明細書では、配列に関するより多くの詳細が出願全体を通じて包含される。

【0193】

ベクターは、脳室内（ＩＣＶ）又は髄腔内（ＩＴ）送達を介して投与される。ＩＴ送達は、腰部経路及び後頭下大槽の両方を網羅する。その理論的根拠は、ＭＰＳＩＩＩＡ疾患の神経学的症状を補正するために、ＣＮＳにおける高いｈＳＧＳＨ発現を駆動することである。

【0194】

加えて、徹底的なコード配列操作最適化及びタンパク質の最適化（代替的なＳＮＰの試験、標的化ペプチドの操作など）は、異なるコード配列操作プロセスを使用するＷＴタンパク質又は第一世代アプローチを使用する従来のアプローチと比較して、最小有効用量を低下させることを可能にする効率的な遺伝子治療戦略を提供する。

【0195】

実施例１．インビトロでの、ＷＴマウスにおける操作されたＳＧＳＨと、操作されたＳＧＳＨ構築物との比較。
使用したこの研究では、発現（すなわち、定量化）及び活性について、操作されたｈＳＧＳＨコード配列を比較した。得られた血清試料中のｈＳＧＳＨ活性を、７日目及び２８日目にアッセイした。

【0196】

ＳＧＳＨの活性及び定量化を調べるための様々なＳＧＳＨアッセイが利用可能である。１つのＳＧＳＨアッセイは、純粋な商業用グレードのＳＧＳＨ、条件培地、及びマウス組織ホモジネートを使用する、蛍光に基づくＳＧＳＨ活性アッセイである。別のＳＧＳＨアッセイは、更なる最適化を必要とする、ＨＰＬＣに基づくＳＧＳＨ活性アッセイである。更に別のＳＧＳＨアッセイはまた、更なる最適化を必要とする、質量分析に基づくＳＧＳＨ活性アッセイである。追加的に、質量分析に基づくシグナルペプチドＳＧＳＨタンパク質定量アッセイを使用することができる。

【0197】

まず、インビトロで構築物を調べた。この研究では、ＨＥＫ２９３細胞において、様々なｈＳＧＳＨ構築物の発現について試験した（図１Ａ）。図１Ａは、野生型（ＷＴ）成熟ＳＧＳＨコード配列を含み、内因性シグナル配列又は結合免疫グロブリンタンパク質（ＢＩＰ）シグナル配列、リンカー、ｖＩＧＦ２ペプチド（すなわち、ＣＩ－ＭＰＲに結合するペプチド）、及び／又はリソソーム切断配列のいずれかを更に含む、様々な設計されたｈＳＧＳＨ構築物を示す。図１Ａに記載されるように、構築物をコードする核酸配列を含むプラスミドで、ＨＥＫ２９３細胞をトランスフェクトした。次いで、トランスフェクションの３日及び４日後に、ＳＧＳＨ構築物の発現及び分泌について、ＨＥＫ２９３細胞から収集した培地を分析した。図１Ｂは、ウェスタンブロットを使用して分析した、トランスフェクション後３日目のＨＥＫ２９３細胞培地中に分泌されたＳＧＳＨの発現レベルを示す。図１Ｃは、正規化されたＳＧＳＨ分泌レベルとしてプロットした、定量化されたＳＧＳＨ発現レベル（ウェスタンブロット分析から；図１Ｂ）を示す。図２Ａは、ウェスタンブロットを使用して分析した、トランスフェクション後４日目のＨＥＫ２９３細胞培地中に分泌されたＳＧＳＨの発現レベルを示す。図２Ｂは、正規化されたＳＧＳＨ分泌レベルとしてプロットした、定量化されたＳＧＳＨ発現レベル（ウェスタンブロット分析から；図２Ａ）を示す。更に、ＢｉＰシグナル配列及びｖＩＧＦ２ペプチドを含む構築物での使用のために、成熟ＳＧＳＨコード配列（図２Ｃ）を操作した。

【0198】

更に、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞において、ＷＴ及び操作されたＳＧＳＨ導入遺伝子を含むＡ
ＡＶプラスミドのインビトロ発現を調べた。図１６Ａは、操作されたＳＧＳＨ構築物、ＷＰＲＥ因子を有する操作されたＳＧＳＨ構築物、及びＷＴ ＳＧＳＨ構築物を含む、ＡＡＶプラスミドでトランスフェクションした後のＨＥＫ２９３細胞培地に分泌された、ウェスタンブロットを使用して分析したＳＧＳＨの発現レベルを示す。図１６Ｂは、ＡＡＶプラスミドによるＨＥＫ２９３Ｆ細胞のトランスフェクション後の（ＷＴ ＳＧＳＨに対して正規化した）ＡＡＶ定量化ＳＧＳＨ発現を示す。これらの結果は、操作されたＳＧＳＨ発現が、ＷＰＲＥ因子を含めることによっておよそ４０％増加したことを示す（ｎ＝１）。参照として、図１６Ｃ及び図１６Ｄは、哺乳類発現ベクターを用いて観察された、典型的な発現を示す。図１６Ｃは、ウェスタンブロット分析を用いて調べた、ｖＩＧＦ２ペプチドを含むＳＧＳＨ構築物、及び含まないＳＧＳＨ構築物を含むプラスミドによるトランスフェクション後のＳＧＳＨ発現レベルを示す。図１６Ｄは、ウェスタンブロット分析から定量化し、ＷＴ ＳＧＳＨ発現レベルに対して正規化したものをプロットした、ＳＧＳＨ発現レベルを示す。これらの結果は、ｖＩＧＦ２を含むＳＧＳＨ構築物におけるＳＧＳＨの発現レベルの増加を示す。

【0199】

次に、ＷＴマウスにおいて、操作された構築物をインビボで調べた。この研究では、マウス（１～２か月齢）に、ＡＡＶｈｕ６８カプシドを有し、発現が、ＣＢ７プロモータによって駆動される、様々なｈＳＧＳＨコード配列（すなわち、ＷＴ及び操作されたもの；ＡＡＶｈｕ６８．ｈＳＧＳＨとも称される）を含むベクターゲノムを含むｒＡＡＶを投与した。

【0200】

研究の０日目に、注射を実施した。研究の７日目及び２８日目に、血清試料を収集した。２８日目に剖検を実施し、その間に脳及び肝臓組織を収集した。注射後７日目から血清試料を収集し、－８０℃で保管した。２８日目に剖検を実施し、試料を収集し、－８０℃で保管した。より具体的には、注射後２８日目に、血漿試料の代わりに血清試料を収集した。保管した試料は、脳（右半分）組織及び肝臓組織を含み、これをｈＳＧＳＨ酵素活性及び発現について分析した（すなわち、ウェスタンブロット）。肝臓の他の半分及び脳（左）組織をホルマリン中で固定し、ｈＳＧＳＨ ＩＨＣの病理学的コアに移した。直下の表は、研究レイアウトを要約したものである。

【表1】

【0201】

蛍光活性アッセイを使用して、研究の７日目及び２８日目に、血清中のＳＧＳＨ酵素活性を分析した。収集した血清試料を１：５０に希釈した。図３Ａは、試験の７日目の、ＡＡＶｈｕ６８．ｈＳＧＳＨ（１×１０^１０ＧＣ又は１×１０^１１ＧＣ）を投与したマウスから収集した血清試料からのＳＧＳＨ酵素活性を示す。図３Ｂは、試験の２８日目の、Ａ
ＡＶｈｕ６８．ｈＳＧＳＨ（１×１０^１１ＧＣ又は１×１０^１１ＧＣ）を投与したマウスから収集した血清試料からのＳＧＳＨ酵素活性を示す。これらの結果は、治療した血清におけるＳＧＳＨ濃度と、ＰＢＳ治療した血清（対照群）におけるＳＧＳＨ濃度との間に、約２倍の増加が観察されたことを示す。更に。剖検時にマウスから収集した脳及び肝臓組織からのＳＧＳＨ酵素活性を調べた。図４Ａは、１×１０^１０ＧＣ及び１×１０^１１ＧＣを投与したマウスから収集したホモジネート肝臓組織試料からのＳＧＳＨ酵素活性を示す。図４Ｂは、１×１０^１０ＧＣ及び１×１０^１１ＧＣを投与したマウスから収集したホモジネート脳組織試料からのＳＧＳＨ酵素活性を示す。これらの結果は、肝臓組織ホモジネート試料において著しいＳＧＳＨ活性が観察されたので、肝臓形質導入を裏付けている。脳組織ホモジネートにおけるＳＧＳＨ活性は、ＷＴよりも統計的に高くはなかった。更に、ウェスタンブロットによって、肝臓組織ホモジネート試料におけるＳＧＳＨ発現レベルを調べた。図５Ａは、１×１０^１０ＧＣ及び１×１０^１１ＧＣの用量でＡＡＶｈｕ６８．ｈＳＧＳＨを投与したマウスからの肝臓組織ホモジネート試料から分析した、ＳＧＳＨの発現レベルを示す。図５Ｂは、ウェスタンブロット（図５Ａに示される）によって分析した、ＳＧＳＨの定量化された発現レベルを示す。脳ホモジネートのウェスタンブロット分析は、肝臓と同じ強度で目視可能なバンド形成を示さなかった。バンドは、高コントラストで群間の特徴に見分けがつかなかった（ブロット図示せず）。１×１０^１１ＧＣの用量、１×１０^１０ＧＣの用量の様々な構築物（ＣｏＶ１、ＣｏＶ１－Ｒ４５６Ｐ、ＣｏＶ２、ＣｏＶ３）を含むＡＡＶｈｕ６８．ｈＳＧＳＨを投与したか、又はＰＢＳで治療したマウスから収集した肝臓組織の免疫組織化学顕微鏡分析を実施した（データ示さず）。これらの結果は、ウェスタンブロットによって分析されるように、肝臓組織におけるｈＳＧＳＨの発現を裏付けている。

【0202】

追加的に、肝臓組織試料におけるＳＧＳＨに、シグナルペプチドアッセイを実施した。図７Ａは、１×１０^１０ＧＣ～１×１０^１１ＧＣの用量でＡＡＶｈｕ６８．ｈＳＧＳＨを投与したマウスから収集した肝臓組織試料から分析した、ｎｇ／ｇとしてプロットした、ＳＧＳＨタンパク質濃度の結果を示す。図７Ｂは、高用量のＡＡＶｈｕ６８．ｈＳＧＳＨ（図７Ａ、１×１０^１１ＧＣ）を投与したマウスから収集した肝臓試料に対して実施した、ＳＧＳＨ酵素活性（蛍光アッセイを使用して測定される）とシグナルペプチドアッセイとの間の相関を示す。

【0203】

追加的に、ベクターゲノムにおけるＷＰＲＥ因子の効果を調べた。図６Ａは、ＷＰＲＥを含むＡＡＶｈｕ６８．ｈＳＧＳＨの投与後の、皮質におけるＳＧＳＨの発現及び定量化を示す。図６Ｂは、ＷＰＲＥを含むＡＡＶｈｕ６８．ｈＳＧＳＨの投与後の、小脳におけるＳＧＳＨの発現及び定量化を示す。図６Ｃは、ＷＰＲＥを含むＡＡＶｈｕ６８．ｈＳＧＳＨの投与後の、海馬におけるＳＧＳＨの発現及び定量化を示す。図６Ｄは、ＷＰＲＥを含むＡＡＶｈｕ６８．ｈＳＧＳＨの投与後の、脳幹におけるＳＧＳＨの発現及び定量化を示す。これらの結果は、操作された候補へのＷＰＲＥの添加が、ＷＴ構築物と同様のレベルまで発現を救済することを示す。

【0204】

要約すると、高用量（ＨＤ；１×１０^１１ＧＣ）で、又は緩い用量（ＬＤ；１×１０^１０ ＧＣ）でｒＡＡＶｈｕ６８．ｈＳＧＳＨ構築物を投与した場合、いずれの群も、脳の著しい形質導入を示さない。肝臓組織ホモジネート試料の分析は、全ての治療群で著しい形質導入を示す。

【0205】

構築物「ＳＧＳＨ－ＣｏＶ１」（又はＣｏＶ１）は、他のＣｏｈＳＧＳＨ構築物（例えば、ＣｏＶ１－Ｒ４５６Ｐ、ＣｏＶ２、ＣｏＶ３）よりも肝臓においてわずかに高い活性を示し、血清中の７日目と２８日目の両方で、高用量と低用量との間で統計的に異なるレベルの活性を示した。更に、Ａｒｇ４５６Ｐｒｏが良性のバリアントではないことを確認した。ウェスタンブロット分析は、活性アッセイデータを裏付けている。

【0206】

ｈＳＧＳＨを含むｒＡＡＶの産生
本明細書の研究では、ヒトＳＧＳＨをコードする操作された配列に融合された外因性ＢＩＰリーダー及び／又はｖＩＧＦペプチドを含む融合タンパク質を生成し、外因性ＢＩＰペプチド及びｖＩＧＦ２ペプチド配列を含まない対応する構築物を用いて、比較研究を実施した。（１）ＡＡＶ２ ｒｅｐタンパク質及びＡＡＶｈｕ６８ ＶＰ１ ｃａｐ遺伝子をコードするシスプラスミド、（２）アデノウイルスＥ１ａを発現するパッケージング細胞株によって提供されないアデノウイルスヘルパー遺伝子を含むシスプラスミド、並びに（３）ＡＡＶカプシド内にパッケージングするためのベクターゲノムを含有するトランスプラスミドを利用して、トリプルトランスフェクション技術を使用してｒＡＡＶを生成する。例えば、ＵＳ２０２０／００５６１５９を参照されたい。外因性リーダーペプチド（ＢＩＰ）を含むｈＳＧＳＨ、ｖＩＧＦ２ペプチドを含む天然ｈＳＧＳＨリーダーペプチドを有するｈＳＧＳＨ、ｖＩＧＦ２ペプチドを含まない天然ｈＳＧＳＨリーダーペプチドを有するｈＳＧＳＨを含む、いずれかのベクターゲノムを含有するように、トランスプラスミドを設計する。ベクターゲノムとしては、以下が挙げられる：
（ｉ）ＣＢ７．ＣＩ．ＢＩＰ．ｈＳＧＳＨｃｏｖ１（Ａ４８２Ｙ－Ｅ４８８Ｖ）．ｖＩＧＦ２．ＷＰＲＥ．４ｘｍｉＲ１８３．ｒＢＧ（配列番号１）、
（ｉｉ）ＣＢ７．ＣＩ．ＢＩＰ．ｈＳＧＳＨｃｏｖ１－Ａ４８２Ｙ＿Ｅ４８８Ｖ．ｖＩＧＦ２．ｒＢＧ（配列番号３）、
（ｉｉｉ）ＣＢ７．ＣＩ．ＢＩＰ．ｈＳＧＳＨｃｏｖ１－Ａ４８２Ｙ＿Ｅ４８８Ｖ．ｖＩＧＦ２．ＷＰＲＥ．ｒＢＧ（配列番号７）、
（ｉｖ）ＣＢ７．ＣＩ．ｈＳＧＳＨｃｏＶ１．ｒＢＧ（配列番号１０）、
（ｖ）ＣＢ７．ＣＩ．ｈＳＧＳＨｃｏＶ１－４ｘｍｉＲ１８３．ｒＢＧ（配列番号１３）、
（ｖｉ）ＣＢ７．ＣＩ．ＢＩＰ．ｈＳＧＳＨｃｏｖ１－Ａ４８２Ｙ＿Ｅ４８８Ｖ．ｖＩＧＦ２．ＷＰＲＥ．４ｘｍｉＲ１８２．４ｘｍｉＲ１８３．ｒＢＧ（配列番号３７）、又は
（ｖｉｉ）ＣＢ７．ＣＩ．ＢＩＰ．ｈＳＧＳＨｃｏｖ１－Ａ４８２Ｙ＿Ｅ４８８Ｖ．ｖＩＧＦ２．ＷＰＲＥ．４ｘｍｉＲ１８２．ｒＢＧ（配列番号４０）。

【0207】

ベクターゲノムは、それぞれ、５’及び３’最末端にＡＡＶ５’逆位末端反復（ＩＴＲ）及びＡＡＶ３’ＩＴＲを含有する。ＩＴＲは、ｈＳＧＳＨ、ｈＳＧＳＨ．Ａ４８２Ｙ．Ｅ４８８Ｖ、ＢＩＰ－ｈＳＧＳＨ、又はＢＩＰ－ｈＳＧＳＨ．Ａ４８２Ｙ．Ｅ４８８Ｖをコードする配列を有する、ＡＡＶカプシド内にパッケージングされた発現カセットの配列に隣接し、ＢＩＰが、ａｂ外因性シグナルペプチドを指す。発現カセットは、ＣＢ７プロモータ、ニワトリベータアクチンイントロン、ウサギベータ－グロビンポリＡ、及び任意選択的に、変異したＷＰＲＥ因子であるＷＰＲＥ因子を含む、融合タンパク質コード配列と操作可能に連結された調節配列を更に含む。また、Ｋｉｎｇｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．，２００５及びＺａｎｔａ－Ｂｏｕｓｓｉｆ ｅｔ ａｌ．，２００９も参照されたい。

【0208】

実施例２．ＭＰＳ ＩＩＩＡベクタースクリーニング研究ＭＰＳ ＩＩＩＡマウス
次に、ＭＰＳＩＩＩＡ ＫＯマウスにおけるＳＧＳＨ構築物の有効性を調べた。この研究では、実施例１で観察された結果（ＷＴマウス発現研究）に基づいて、ｈＳＧＳＨ ｃｏＶ１操作構築物を使用した。ＭＰＳＩＩＡ及びＷＴ（対照）マウス（Ｎ－１１０ＫＯマウス、及びＮ＝１０ＷＴマウス）におけるｈＳＧＳＨｃｏＶ１構築物の送達に、ＡＡＶｈｕ６８カプシドを使用した。片側ＩＣＶ（直接脳室内）注射を介して、１×１０^１０（低用量）及び５×１０^１０（高用量）の用量でＡＡＶｈｕ６８．ｈＳＧＳＨを投与した。ＩＣＶ注射時のマウスは、２～３か月齢であった。研究期間は、１か月である。更に、ＢｉＰシグナルペプチド、安定化アミノ酸（ＡＡ）変化、及び／又はｖＩＧＦ２ペプチドを含むものを含む、操作されたｈＳＧＳＨｃｏＶ１構築物の複数のバリエーションを調べた。
使用した研究エンドポイントは、リソソーム区画のサイズ低減（ＬＡＭＰ１免疫蛍光（ＩＦ）分析を介して調べた）、保管低減（ＧＡＧ保管ＨＳ及びＭＳを介して調べた）、及びＳＧＳＨ発現レベル（酵素活性アッセイ及び免疫組織化学分析を介して調べた）であった。

【表2】

【0209】

コホート１の収集した組織試料は、脳、脊髄、及び肝臓を含む。コホート２の収集した組織試料は、心臓及び脾臓を含む。

【0210】

図８Ａ～図８Ｆは、低用量（１×１０^１０）のＡＡＶｈｕ６８．ｈＳＧＳＨを投与したＭＰＳ ＩＩＩＡ ＳＧＳＨ ＫＯマウスにおける免疫蛍光及び組織化学分析を使用した
ＬＡＭＰ１定量を介して調べた、リソソーム区画低減のエンドポイント分析を示す。群１（Ｇ１）＝ＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ｈＳＧＳＨｃｏＶ１、Ｇ２＝ＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＢＩＰ－ｈＳＧＳＨｃｏＶ１、Ｇ３＝ＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＢＩＰ－ｈＳＧＳＨｃｏＶ１－ｖＩＧＦ２、Ｇ４＝ＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＢＩＰ－ｈＳＧＳＨ（Ａ４８２Ｙ Ｅ４８８Ｖ）ｃｏＶ１、Ｇ５＝ＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＢＩＰ－ｈＳＧＳＨ（Ａ４８２Ｙ Ｅ４８８Ｖ）ｃｏＶ１－ｖＩＧＦ２、Ｇ６＝ＫＯマウスＰＢＳ対照、Ｇ７＝ＷＴマウスＰＢＳ対照。図８Ａは、小脳におけるＬＡＭＰ１陽性細胞の平均サイズ（μｍ^２）を示す。図８Ｂは、小脳におけるＬＡＭＰ１面積パーセントを示す。図８Ｃは、脳幹におけるＬＡＭＰ１陽性細胞の平均サイズ（μｍ^２）を示す。図８Ｄは、脳幹におけるＬＡＭＰ１面積パーセントを示す。図８Ｅは、皮質におけるＬＡＭＰ１陽性細胞の平均サイズ（μｍ^２）を示す。図８Ｆは、皮質におけるＬＡＭＰ１面積パーセントを示す。

【0211】

図９Ａ～図９Ｊは、高用量（１×１０^１１）のＡＡＶｈｕ６８．ｈＳＧＳＨを投与したＭＰＳ ＩＩＩＡ ＳＧＳＨ ＫＯマウスにおける免疫蛍光及び組織化学分析を使用したＬＡＭＰ１定量を介して調べた、リソソーム区画低減のエンドポイント分析を示す。図８と同様のＧ６及びＧ７（ＫＯ及びＷＴ ＰＢＳ対照）、Ｇ８＝ＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ｈＳＧＳＨｃｏＶ１、Ｇ１１＝ＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＢＩＰ－ｈＳＧＳＨ（Ａ４８２Ｙ Ｅ４８８Ｖ）、Ｇ１２＝ＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＢＩＰ－ｈＳＧＳＨ（Ａ４８２Ｙ
Ｅ４８８Ｖ）ｃｏＶ１－ｖＩＧＦ２。

【0212】

図９Ａは、小脳におけるＬＡＭＰ１陽性細胞の平均サイズ（μｍ^２）を示す。図９Ｂは、小脳におけるＬＡＭＰ１面積パーセントを示す。図９Ｃは、脳幹におけるＬＡＭＰ１陽性細胞の平均サイズ（μｍ^２）を示す。図９Ｄは、脳幹におけるＬＡＭＰ１面積パーセントを示す。図９Ｅは、皮質におけるＬＡＭＰ１陽性細胞の平均サイズ（μｍ^２）を示す。図９Ｆは、皮質におけるＬＡＭＰ１面積パーセントを示す。図９Ｈは、マン－ホイットニー試験を使用して１か月目に測定した、２～３か月齢のマウスにおける２×１０^１０ＧＣの用量での、図８Ａ～図８Ｆに定義されるＧ１、Ｇ２、及びＧ３の皮質におけるＬＡＭＰ１面積パーセントを示す。図９Ｉは、マン－ホイットニー試験を使用して１か月目に測定した、２～３か月齢のマウスにおける２×１０^１０ＧＣの用量でのＧ１、Ｇ２、及びＧ３の小脳におけるＬＡＭＰ－１面積パーセントを示す。図９Ｊは、マン－ホイットニー試験を使用して１か月で測定した、２～３か月齢のマウスにおける２×１０^１０ＧＣの用量でのＧ１、Ｇ２、及びＧ３の海馬におけるＬＡＭＰ－１面積パーセントを示す。これらの結果は、注射部位の近くでは、ＷＴ（群１）及び操作されたＷＰＲＥ（群３）の候補の同様の性能が観察され、小脳では、群にかかわらずＩＨＣによってＳＧＳＨが検出されず、操作されたＷＰＲＥの候補のみが、ＬＡＭＰ１陽性物質のクリアランスを示したことを示す。

【0213】

次に、以下のアッセイを更に実施した：ＳＧＳＨ酵素活性、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）（ＨＳ）蓄積／低減、及び抗ＳＧＳＨ抗体力価。２－ナフタレン－ＧｌｃＮＳを使用した１段階反応からの産生物形成のタンデム質量分析（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）定量化を伴う液体クロマトグラフィーを使用して、ＳＧＳＨ酵素活性を調べた。組織におけるＨＳのブタノリシスからの二糖分解産生物のＬＣ－ＭＳ／ＭＳ定量を使用して、ＧＡＧ（ＨＳ）の蓄積／低減を調べた。ＥＬＩＳＡを使用して、抗ＳＧＳＨ抗体力価を調べた。

【0214】

図１０Ａ～図１０Ｃは、雄及び雌のマウスの脳におけるＳＧＳＨ活性及びＧＡＧ低減を示す。図１０Ａは、活性としてプロットした、脳におけるＳＧＳＨ活性（ｎｍｏｌ／ｍＬ／時間）を示す。図１０Ｂは、対数活性としてプロットした、脳におけるＳＧＳＨ活性を示す。図１０Ｃは、タンパク質１ｍｇ当たりのＧＡＧ（ＨＳ）ｎｇとしてプロットした、脳におけるＧＡＧレベルを示す。

【0215】

追加的に、投与後１か月後の治療したマウス脳における、ＳＧＳＨ活性及び基質合成抑制を調べた。簡潔には、２ｅ１０（１×１０^１２ｖｇ／ｋｇ）の用量の示されているｒＡＡＶ（ｈＳＧＳＨｃｏＶ１、ｃｏＶ１ＢＩＰ－ｈＳＧＳＨ（Ａ４８２Ｙ Ｅ４８８Ｖ）ｃｏＶ１－ｖＩＧＦ２、及びＷＰＲＥを含むｃｏＶ１ＢＩＰ－ｈＳＧＳＨ（Ａ４８２Ｙ Ｅ４８８Ｖ）ｃｏＶ１－ｖＩＧＦ２）を、マウスに投与した。図１７Ａは、治療したマウス脳におけるＳＧＳＨ活性を示す。図１７Ｂは、脳におけるＧＡＧ（ＨＳ）レベルを示す。図１７Ｃは、マウス脳における総ＧＭ３を示す。これらの結果は、操作された候補へのＷＰＲＥの添加が、ＷＴ構築物と同様のレベルまで発現を救済し、同等又はより良好な保管クリアランスを可能にすることを示す。

【0216】

図１１Ａ～図１１Ｃは、雄及び雌のマウスの脊髄におけるＧＡＧ低減におけるＳＧＳＨ活性を示す。図１１Ａは、活性としてプロットした、脊髄におけるＳＧＳＨ活性（ｎｍｏｌ／ｍＬ／時間）を示す。図１１Ｂは、対数活性としてプロットした、脊髄におけるＳＧＳＨ活性を示す。図１１Ｃは、タンパク質１ｍｇ当たりのＧＡＧ（ＨＳ）ｎｇとしてプロットした、脊髄におけるＧＡＧレベルを示す。

【0217】

図１２Ａ～図１２Ｃは、雄及び雌のマウスの肝臓におけるＧＡＧ低減におけるＳＧＳＨ活性を示す。図１２Ａは、活性としてプロットした、肝臓おけるＳＧＳＨ活性（ｎｍｏｌ／ｍＬ／時間）を示す。図１２Ｂは、対数活性としてプロットした、肝臓におけるＳＧＳＨ活性を示す。図１２Ｃは、タンパク質１ｍｇ当たりのＧＡＧ（ＨＳ）ｎｇとしてプロットした、肝臓におけるＧＡＧレベルを示す。

【0218】

図１３Ａは、ＩＣＶ注射後７日目に測定した、活性としてプロットした、血清におけるＳＧＳＨ活性（ｎｍｏｌ／ｍＬ／時間）を示す。図１３Ｂは、ＩＣＶ注射後７日目の対数活性としてプロットした、血清におけるＳＧＳＨ活性（ｎｍｏｌ／ｍＬ／時間）を示す。図１３Ｃは、ＩＣＶ注射後１か月目に測定した活性としてプロットした、血漿におけるＳＧＳＨレベル活性（ｎｍｏｌ／ｍＬ／時間）を示す。図１３Ｄは、ＩＣＶ注射後１か月目に測定した対数活性としてプロットした、血漿におけるＳＧＳＨレベル活性（ｎｍｏｌ／ｍＬ／時間）を示す。

【0219】

追加的に、マウス脳試料におけるＧＭ３レベルを調べた。図１４Ａは、タンパク質１ｍｇ当たりのｐｍｏｌ ＧＭ３としてプロットした、マウス脳における総ＧＭ３のレベルを示す。図１４Ｂは、タンパク質１ｍｇ当たりの対数スケールのｐｍｏｌ ＧＭ３としてポットした、マウス脳における総ＧＭ３のレベルを示す。これらの結果は、低用量の操作された構築物（ＢＩＰ安定化ＡＡ ＳＧＳＨ－ｖＩＧＦ２）が、他のものよりも優れた性能を有することを示す。

【0220】

要約すると、操作されたｈＳＧＳＨ－ｃｏＶ１構築物を調べ、４つ（４）の他の操作されたＳＧＳＨ候補と比較した。ＳＧＳＨ活性は、ｈＳＧＳＨ－ｃｏＶ１構築物で最も高く観察された。追加的に、ｃｏＶ１ＢＩＰ－ｈＳＧＳＨ（Ａ４８２Ｙ Ｅ４８８Ｖ）ｃｏＶ１及びｃｏＶ１ＢＩＰ－ｈＳＧＳＨ（Ａ４８２Ｙ Ｅ４８８Ｖ）ｃｏＶ１－ｖＩＧＦ２の２つ（２）の操作されたバージョンで、ＧＡＧ低減が等しく低減されたことが観察された。更に、低用量のｃｏＶ１ＢＩＰ－ｈＳＧＳＨ（Ａ４８２Ｙ Ｅ４８８Ｖ）ｃｏＶ１－ｖＩＧＦ２では、ＧＭ３低減が優れていることが観察された。全ての候補は、高用量でのＭＰＳＩＩＩＡ ＫＯマウスと比較して、ＬＡＭＰ１染色を低減させた。低用量では、操作された構築物の発現不良に起因して、結果の変動性が観察された。上記の結果を考慮して、更なる研究は、対照として使用するＢＩＰ－ｈＳＧＳＨ（Ａ４８２Ｙ＿Ｅ４８８Ｙ）ｃｏＶ１－ｖＩＧＦ２及びｈＳＧＳＨｃｏＶ１（操作されていない）に焦点を当てる。

【0221】

実施例３．マウス及び非ヒト霊長類（ＮＨＰ）におけるＭＰＳ ＩＩＩＡベクター研究。
次に、操作されたＳＧＳＨコード配列（ＢＩＰ－ｈＳＧＳＨ（Ａ４８２Ｙ＿Ｅ４８８Ｙ）ｃｏＶ１－ｖＩＧＦ）を含むＡＡＶ．ｈＳＧＳＨの有効性を更に調べる。

【0222】

まず、この研究では、ＡＡＶのベクターゲノムにＷＰＲＥ因子を含む操作された構築物（ＢＩＰ－ｈＳＧＳＨ（Ａ４８２Ｙ＿Ｅ４８８Ｙ）ｃｏＶ１－ｖＩＧＦ）における、ＳＧＳＨ発現及び酵素活性を調べる（実施例１も参照されたい）。追加的に、ｍｉＲ標的解除部位の添加の効果を調べ、有効性に対する影響を評価する。４つ以上のｍｉＲＮＡ標的化配列、すなわち、ｍｉＲ１８２及びｍｉＲ１８３を添加して、ｍｉＲ標的解除を実施する。

【0223】

次に、非ヒト霊長類（ＮＨＰ）にＡＡＶｈｕ６８及びＡＡＶｒｈ９１カプシドを使用して投与した場合のＡＡＶ．ｈＳＧＳＨの生物学的分布及び形質導入レベルを調べ、比較する。更に、ＡＡＶｈｕ６８カプシドの場合のＡＡＶ．ｈＳＧＳＨ．ＷＰＲＥの形質導入レベルを調べ、比較する。追加的に、安全性、有効性を調べ、ＤＲＧ標的解除ｍｉＲＮＡ標的配列を更に含むＡＡＶ．ｈＳＧＳＨの影響を評価する。直下の表は、ＮＨＰ研究の要約したレイアウトを示す。簡潔には、合計１５匹のＮＨＰ（Ｎ－３／群）に、ＩＣＭ（大槽内）を介して、（アカゲザル脳重量（例えば、９０ｇ）に基づいて調整した）３×１０^１３ＧＣの用量でＡＡＶを投与する。研究の主要な読み取り値は、薬理学（ＳＧＳＨ発現レベル）、毒性学、組織病理学である。

【表3】

【0224】

予備研究を実施して、ＡＡＶ．ｈＳＧＳＨベクター投与前に、未治療のアカゲザル（ＮＨＰ）におけるベースラインＳＧＳＨ活性を調べ、測定した。図１５Ａは、髄質、小脳、視床、前頭皮質で測定したｎｍｏｌ／ｍｇ／時間としてプロットした、未治療ＮＨＰ脳切片におけるＳＧＳＨベースライン活性のレベルを示す。図１５Ｂは、脊髄頸部、胸部、腰部、及び後根神経節（ＤＲＧ）頸部、腰部、及び胸部切片で測定したｎｍｏｌ／ｍｇ／時間としてプロットした、未治療ＮＨＰ脊髄切片におけるＳＧＳＨベースライン活性のレベルを示す。これらのデータは、ＤＲＧ切片及び血漿において観察された顕著なＳＧＳＨ活性を示す。図１５Ｂは、脊髄頸部、胸部、腰部、及び後根神経節（ＤＲＧ）頸部、腰部、及び胸部切片で測定したｎｍｏｌ／ｍｇ／時間としてプロットした、未治療ＮＨＰ脊髄切片におけるＳＧＳＨベースライン活性のレベルを示す。図１５Ｃ～図１５Ｅを参照されたい。図２３は、治療したＮＨＰ中の血清Ｎｆｌを示し、血清ＮｆＬが、組織病理学的軸索変性の重症度と一致することを示す。

【0225】

図１８Ａは、Ｇ１（ＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ｈＳＧＳＨｃｏＶ１）、Ｇ２（ＡＡＶｒ
ｈ９１．ＣＢ７．ｈＳＧＳＨｃｏＶ１）、及びＧ４（ＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＢＩＰ－ｈＳＧＳＨ（Ａ４８２Ｙ Ｅ４８８Ｖ）ｃｏＶ１－ｖＩＧＦ２．ＷＰＲＥ）のバックグラウンドに対して比較した、治療したＮＨＰ小脳脳組織におけるＳＧＳＨ活性を示す。図１８Ｂは、Ｇ１（ＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ｈＳＧＳＨｃｏＶ１）、Ｇ２（ＡＡＶｒｈ９１．ＣＢ７．ｈＳＧＳＨｃｏＶ１）、及びＧ４（ＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＢＩＰ－ｈＳＧＳＨ（Ａ４８２Ｙ Ｅ４８８Ｖ）ｃｏＶ１－ｖＩＧＦ２．ＷＰＲＥ）のバックグラウンドに対して比較した、治療したＮＨＰ髄質脳組織におけるＳＧＳＨ活性を示す。図１８Ｃは、Ｇ１（ＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ｈＳＧＳＨｃｏＶ１）、Ｇ２（ＡＡＶｒｈ９１．ＣＢ７．ｈＳＧＳＨｃｏＶ１）、及びＧ４（ＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＢＩＰ－ｈＳＧＳＨ（Ａ４８２Ｙ Ｅ４８８Ｖ）ｃｏＶ１－ｖＩＧＦ２．ＷＰＲＥ）のバックグラウンドに対して比較した、治療したＮＨＰ前頭皮質脳組織におけるＳＧＳＨ活性を示す。図１８Ｄは、Ｇ１（ＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ｈＳＧＳＨｃｏＶ１）、Ｇ２（ＡＡＶｒｈ９１．ＣＢ７．ｈＳＧＳＨｃｏＶ１）、及びＧ４（ＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＢＩＰ－ｈＳＧＳＨ（Ａ４８２Ｙ Ｅ４８８Ｖ）ｃｏＶ１－ｖＩＧＦ２．ＷＰＲＥ）のバックグラウンドに対して比較した、治療したＮＨＰ視床脳組織におけるＳＧＳＨ活性を示す。

【0226】

図１９Ａは、Ｇ１（ＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ｈＳＧＳＨｃｏＶ１）、Ｇ２（ＡＡＶｒｈ９１．ＣＢ７．ｈＳＧＳＨｃｏＶ１）、及びＧ４（ＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＢＩＰ－ｈＳＧＳＨ（Ａ４８２Ｙ Ｅ４８８Ｖ）ｃｏＶ１－ｖＩＧＦ２．ＷＰＲＥ）のバックグラウンドに対して比較した、治療したＮＨＰ脊髄切片（ＳＣ頸部）におけるＳＧＳＨ活性を示す。図１９Ｂは、Ｇ１（ＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ｈＳＧＳＨｃｏＶ１）、Ｇ２（ＡＡＶｒｈ９１．ＣＢ７．ｈＳＧＳＨｃｏＶ１）、及びＧ４（ＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＢＩＰ－ｈＳＧＳＨ（Ａ４８２Ｙ Ｅ４８８Ｖ）ｃｏＶ１－ｖＩＧＦ２．ＷＰＲＥ）のバックグラウンドに対して比較した、治療したＮＨＰ脊髄切片（ＳＣ胸部）におけるＳＧＳＨ活性を示す。図１９Ｃは、Ｇ１（ＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ｈＳＧＳＨｃｏＶ１）、Ｇ２（ＡＡＶｒｈ９１．ＣＢ７．ｈＳＧＳＨｃｏＶ１）、及びＧ４（ＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＢＩＰ－ｈＳＧＳＨ（Ａ４８２Ｙ Ｅ４８８Ｖ）ｃｏＶ１－ｖＩＧＦ２．ＷＰＲＥ）のバックグラウンドに対して比較した、治療したＮＨＰ脊髄切片（ＳＣ腰部）におけるＳＧＳＨ活性を示す。

【0227】

図２０Ａは、治療したＮＨＰ血漿におけるＳＧＳＨ活性を示す。図２０Ｂは、治療したＣＳＦにおけるＳＧＳＨ活性を示す

【0228】

図２１Ａは、ＮＨＰ血漿中の総抗ｈＳＧＳＨ ＩｇＧ力価を示す。図２１Ｂは、ＣＳＦにおける総ａｎｔｏ－ｈＳＧＳＨ力価を示す。これらの結果は、群２（ｒＡＡＶｒｈ９１．ｈＧＳＨ）構築物が、群１（ＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ｈＳＧＳＨｃｏＶ１）又は４（ＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＢＩＰ－ｈＳＧＳＨ（Ａ４８２Ｙ Ｅ４８８Ｖ）ｃｏＶ１－ｖＩＧＦ２．ＷＰＲＥ）構築物よりも、ＣＳＦ及び血漿においてより免疫原性であることを示す。

【0229】

追加的に、Ｇ１（ＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ｈＳＧＳＨｃｏＶ１；表Ａ）及びＧ４（ＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＢｉＰ－ｈＳＧＳＨ（Ａ４８２Ｙ Ｅ４８８Ｖ）ｃｏＶ１－ｖＩＧＦ２．ＷＰＲＥ；表Ｂ）で治療したＮＨＰから得た試料に対して、ＥＬＩＳＰＯＴを実施し、その結果を以下の表に記載する。

【表4】

【表5】

【0230】

図２２Ａは、左正中神経におけるＮＰ（Ａｍｐでの神経極性）としてプロットした、神経伝導速度（ＮＣＶ）の結果を示す。図２２Ｂは、右正中神経におけるＮＰ（Ａｍｐでの神経極性）としてプロットした、神経伝導速度（ＮＣＶ）の結果を示す。図２２Ｃは、左正中神経における速度としてプロットした、神経伝導速度（ＮＣＶ）の結果を示す。図２２Ｄは、右正中神経における速度としてプロットした、神経伝導速度（ＮＣＶ）の結果を示す。これらの結果は、正中神経におけるＮＰ又は速度が、操作されたＷＰＲＥ候補によって著しい低減を示さなかったことを示す。

【0231】

要約すると、マウスの生物学的分析研究は、全ての候補のＳＧＳＨ活性が、脳及び肝臓において未治療ＷＴと同等であり、一般に、互いに区別不可能であり、基質合成抑制は、操作されたＷＰＲＥ候補において最も低減されたことを示した。ＬＡＭＰ－１ ＩＦによる脳リソソーム病理学的補正は、操作されたＷＰＲＥ候補を用いることによって、注射部位から離れて最も低減された。更に、ＮＨＰパイロット安全性／薬理学は、発現がリード操作ＷＰＲＥ候補と同等以上であるように思われることを示した。操作されたｈＳＧＳＨ－ＷＰＲＥは、ＥＬＩＳＰＯＴデータに基づいて、操作されていないものと同様の免疫原性プロファイルを有した。操作されたｈＳＧＳＨ－ＷＰＲＥは、ＤＲＧ毒性バイオマーカ（ＮｆＬ）及び組織病理学に基づいて、最良の安全性プロファイルを示した。

【0232】

実施例４．マウス神経球におけるＡＡＶ．ｈＳＧＳＨ有効性。
この研究では、ＡＡＶベクターゲノム内に、ＷＴ ＳＧＳＨ構築物、操作されたＳＧＳＨ構築物、及びＷＰＲＥ因子を更に含む操作されたＳＧＳＨ構築物を含む、ＡＡＶ．ｈＳＧＳＨのＳＧＳＨ発現レベル及び有効性を調べ、比較する。この研究では、ＷＴ神経球（これらはアストロサイト系統へと分化する）を播種した４８ウェルプレートを使用し、これをＡＡＶ治療後１０日間インキュベートして、最大発現を可能にする。８００チャネル蛍光（緑色）が、二次抗体（抗ＳＧＳＨ）を介したトランス遺伝子発現を示し、７００チャネル蛍光（赤色）が、ＣｅｌｌＴａｇ（商標）ツールを介した細胞質量を示す、細胞ウェスタン分析（すなわち、プレート画像）に使用した。直下の表は、使用したプレートレイアウト及び実験条件／治療の概略図を示す。

【表6】

【0233】

図１６は、ＡＡＶベクターゲノム内にＷＴ ＳＧＳＨ構築物、操作されたＳＧＳＨ構築物、又はＷＰＲＥ因子を更に含む操作されたＳＧＳＨ構築物を含む、ＡＡＶ．ｈＳＧＳＨで治療した神経球におけるＡＦＵ（８００／７００ｎｍ）としてプロットした、様々なＭＯＩでのＳＧＳＨ導入遺伝子発現レベルを示す。変動する細胞質量を考慮するために、データを正規化した。操作されたＳＧＳＨウイルスは、野生型よりも少ない導入遺伝子発現をもたらし、これは、上記のインビボデータと並んでいる一方で、ＨＥＫ細胞におけるプラスミドの一過性トランスフェクションは、操作された発現が野生型よりも高いことを示す。これらの結果は、ＷＰＲＥの添加が、インビボでの操作された構築物の発現を著しく高め得るという点で有望である。

【0234】

本明細書で引用される全ての文書は、参照により本明細書に援用される。本明細書とともに提出された、２０２２年１１月１１日に作成された２５７，６４６バイトのサイズを有する「ＵＰＮ－１９－９０７５ＰＣＴ＿２０２２１１１１．ｘｍｌ」という名称の電子配列表、及び電子配列表の内容（例えば、配列表の配列及びテキスト）の全体は、参照により本明細書に援用される。２０２１年１１月１２日に出願された米国仮特許出願第６３／２７８，７７５号、２０２１年１２月１０日に出願された米国仮特許出願第６３／２８８，２９３号は、参照により援用される。本発明は、特定の実施形態を参照して記載されているが、本発明の趣旨から逸脱することなく修正を行うことができることが理解されるであろう。かかる修正は、添付の特許請求の範囲の範囲内にあることが意図される。

【図1A】

【図1B】

【図1C】

【図2A】

【図2B】

【図2C】

【図3A】

【図3B】

【図4A】

【図4B】

【図5A】

【図5B】

【図6A】

【図6B】

【図6C】

【図6D】

【図7A】

【図7B】

【図8A】

【図8B】

【図8C】

【図8D】

【図8E】

【図8F】

【図9A】

【図9B】

【図9C】

【図9D】

【図9F】

【図9G】

【図9H】

【図9I】

【図9J】

【図10A】

【図10B】

【図10C】

【図11A】

【図11B】

【図11C】

【図12A】

【図12B】

【図12C】

【図13A】

【図13B】

【図13C】

【図13D】

【図14A】

【図14B】

【図15A】

【図15B】

【図15C】

【図15D】

【図15E】

【図16】

【図17A】

【図17B】

【図17C】

【図18A】

【図18B】

【図18C】

【図18D】

【図19A】

【図19B】

【図19C】

【図20A】

【図20B】

【図21A】

【図21B】

【図22A】

【図22B】

【図22C】

【図22D】

【図23】

【配列表】

2024546578000001.xml

【国際調査報告】