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特表2024-546667核酸、当該核酸を含む組成物及び複合体並びに調製方法と使用

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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-12-26

(54)【発明の名称】核酸、当該核酸を含む組成物及び複合体並びに調製方法と使用

(51)【国際特許分類】

C12N 15/113 20100101AFI20241219BHJP

A61K 31/713 20060101ALI20241219BHJP

A61K 48/00 20060101ALI20241219BHJP

A61K 47/54 20170101ALI20241219BHJP

A61P 43/00 20060101ALI20241219BHJP

A61P 25/28 20060101ALI20241219BHJP

A61P 21/02 20060101ALI20241219BHJP

A61P 25/14 20060101ALI20241219BHJP

A61P 25/16 20060101ALI20241219BHJP

A61P 1/16 20060101ALI20241219BHJP

A61P 3/06 20060101ALI20241219BHJP

A61P 25/00 20060101ALI20241219BHJP

【ＦＩ】

C12N15/113 Z ZNA

A61K31/713

A61K48/00

A61K47/54

A61P43/00 105

A61P25/28

A61P21/02

A61P25/14

A61P25/16

A61P1/16

A61P3/06

A61P25/00

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024533904

(86)(22)【出願日】2022-12-19

(85)【翻訳文提出日】2024-06-05

(86)【国際出願番号】 CN2022139942

(87)【国際公開番号】W WO2023116607

(87)【国際公開日】2023-06-29

(31)【優先権主張番号】202111575800.2

(32)【優先日】2021-12-21

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】517452453

【氏名又は名称】スーチョウリボライフサイエンスカンパニー、リミテッド

【氏名又は名称原語表記】ＳＵＺＨＯＵＲＩＢＯＬＩＦＥＳＣＩＥＮＣＥＣＯ．，ＬＴＤ．

(74)【代理人】

【識別番号】110000729

【氏名又は名称】弁理士法人ユニアス国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】リャン、ツーツァイ

(72)【発明者】

【氏名】チャン、ホンイェン

(72)【発明者】

【氏名】カオ、シャン

(72)【発明者】

【氏名】ティン、シュエフォン

【テーマコード（参考）】

4C076

4C084

4C086

【Ｆターム（参考）】

4C076AA95

4C076CC01

4C076CC16

4C076CC21

4C076CC41

4C076DD63

4C076DD66

4C076EE59

4C076FF70

4C084AA13

4C084NA13

4C084ZA02

4C084ZA16

4C084ZA75

4C084ZA94

4C084ZC01

4C084ZC33

4C086AA01

4C086AA02

4C086EA16

4C086MA01

4C086MA04

4C086NA13

4C086ZA02

4C086ZA16

4C086ZA75

4C086ZA94

4C086ZC01

4C086ZC33

(57)【要約】

本開示は、ＲＰＴＯＲ遺伝子発現レベルを抑制し、ｍＴＯＲＣ１活性を調節するｓｉＲＮＡ、当該ｓｉＲＮＡを含む医薬組成物及び複合体を提供する。前記ｓｉＲＮＡは、センス鎖とアンチセンス鎖とを含み、前記ｓｉＲＮＡにおけるヌクレオチドは、それぞれ独立して修飾又は未修飾のヌクレオチドであり、前記センス鎖はヌクレオチド配列Ｉを含み、前記ヌクレオチド配列Ｉと配列番号１に示されるヌクレオチド配列とは、長さが等しく、ヌクレオチド差異が３つ以下であり、前記アンチセンス鎖はヌクレオチド配列ＩＩを含み、前記ヌクレオチド配列ＩＩと配列番号２に示されるヌクレオチド配列とは、長さが等しく、ヌクレオチド差異が３つ以下である。本開示により提供されるｓｉＲＮＡ、医薬組成物及び複合体は、ｍＴＯＲＣ１阻害剤としてｍＴＯＲＣ１の活性化による関連疾患を効果的に治療し、オートファジー誘導剤としてオートファジー関連疾患又は症状を治療することができる。
【選択図】図２

【特許請求の範囲】

【請求項1】

センス鎖と、アンチセンス鎖とを含むｓｉＲＮＡであって、前記ｓｉＲＮＡにおけるヌクレオチドは、それぞれ独立して修飾又は未修飾のヌクレオチドであり、前記センス鎖はヌクレオチド配列Ｉを含み、アンチセンス鎖はヌクレオチド配列ＩＩを含み、前記ヌクレオチド配列Ｉと前記ヌクレオチド配列ＩＩは、少なくとも一部で逆相補的に二本鎖領域を形成し、前記ヌクレオチド配列Ｉと前記ヌクレオチド配列ＩＩとは、ｉ）～ｉｉｉ）に示される配列から選択される１組であり、
ｉ）前記ヌクレオチド配列Ｉと配列番号１に示されるヌクレオチド配列とは、長さが等しく、ヌクレオチド差異が３つ以下であり、前記ヌクレオチド配列ＩＩと配列番号２に示されるヌクレオチド配列とは、長さが等しく、ヌクレオチド差異が３つ以下であり、
５’－ＣＵＧＣＣＡＵＧＧＡＧＵＡＵＣＵＧＡＺ_ａ１－３’（配列番号１）、
５’－Ｚ_ａ２ＵＣＡＧＡＵＡＣＵＣＣＡＵＧＧＣＡＧ－３’（配列番号２）
ただし、Ｚ_ａ１はＡであり、Ｚ_ａ２はＵであり、前記ヌクレオチド配列Ｉに、位置がＺ_ａ１に対応するヌクレオチドＺ_ａ３が含まれ、前記ヌクレオチド配列ＩＩに、位置がＺ_ａ２に対応するヌクレオチドＺ_ａ４が含まれ、前記Ｚ_ａ４は、前記アンチセンス鎖の５’末端の第１位のヌクレオチドであり、或いは、
ｉｉ）前記ヌクレオチド配列Ｉと配列番号１２３に示されるヌクレオチド配列とは、長さが等しく、ヌクレオチド差異が３つ以下であり、前記ヌクレオチド配列ＩＩと配列番号１２４に示されるヌクレオチド配列とは、長さが等しく、ヌクレオチド差異が３つ以下であり、
５’－ＡＣＡＡＣＡＵＣＡＡＧＵＡＣＵＡＣＧＺ_ｂ１－３’（配列番号１２３）、
５’－Ｚ_ｂ２ＣＧＵＡＧＵＡＣＵＵＧＡＵＧＵＵＧＵ－３’（配列番号１２４）
ただし、Ｚ_ｂ１はＡであり、Ｚ_ｂ２はＵであり、前記ヌクレオチド配列Ｉに、位置がＺ_ｂ１に対応するヌクレオチドＺ_ｂ３が含まれ、前記ヌクレオチド配列ＩＩに、位置がＺ_ｂ２に対応するヌクレオチドＺ_ｂ４が含まれ、前記Ｚ_ｂ４は、前記アンチセンス鎖の５’末端の第１位のヌクレオチドであり、或いは、
ｉｉｉ）前記ヌクレオチド配列Ｉと配列番号２４５に示されるヌクレオチド配列とは、長さが等しく、ヌクレオチド差異が３つ以下であり、前記ヌクレオチド配列ＩＩと配列番号２４６に示されるヌクレオチド配列とは、長さが等しく、ヌクレオチド差異が３つ以下であり、
５’－ＣＧＡＣＵＡＣＵＡＣＡＵＣＵＣＣＧＵＺ_ｃ１－３’（配列番号２４５）、
５’－Ｚ_ｃ２ＡＣＧＧＡＧＡＵＧＵＡＧＵＡＧＵＣＧ－３’（配列番号２４６）
ただし、Ｚ_ｃ１はＧであり、Ｚ_ｃ２はＣであり、前記ヌクレオチド配列Ｉに、位置がＺ_ｃ１に対応するヌクレオチドＺ_ｃ３が含まれ、前記ヌクレオチド配列ＩＩに、位置がＺ_ｃ２に対応するヌクレオチドＺ_ｃ４が含まれ、前記Ｚ_ｃ４は、前記アンチセンス鎖の５’末端の第１位のヌクレオチドである、ｓｉＲＮＡ。

【請求項2】

前記ヌクレオチド配列Ｉと配列番号１に示されるヌクレオチド配列とは、ヌクレオチド差異が１つ以下であり、及び／又は前記ヌクレオチド配列ＩＩと配列番号２に示されるヌクレオチド配列とは、ヌクレオチド差異が１つ以下であり、
或いは、前記ヌクレオチド配列Ｉと配列番号１２３に示されるヌクレオチド配列とは、ヌクレオチド差異が１つ以下であり、及び／又は前記ヌクレオチド配列ＩＩと配列番号１２４に示されるヌクレオチド配列とは、ヌクレオチド差異が１つ以下であり、
或いは、前記ヌクレオチド配列Ｉと配列番号２４５に示されるヌクレオチド配列とは、ヌクレオチド差異が１つ以下であり、及び／又は前記ヌクレオチド配列ＩＩと配列番号２４６に示されるヌクレオチド配列とは、ヌクレオチド差異が１つ以下である、請求項１に記載のｓｉＲＮＡ。

【請求項3】

前記ヌクレオチド配列ＩＩと配列番号２に示されるヌクレオチド配列との間のヌクレオチド差異は、Ｚ_ａ４の位置での差異を含み、Ｚ_ａ４がＡ、Ｃ又はＧから選択され、
或いは、前記ヌクレオチド配列ＩＩと配列番号１２４に示されるヌクレオチド配列との間のヌクレオチド差異は、Ｚ_ｂ４の位置での差異を含み、Ｚ_ｂ４がＡ、Ｃ又はＧから選択され、
或いは、前記ヌクレオチド配列ＩＩと配列番号２４６に示されるヌクレオチド配列との間のヌクレオチド差異は、Ｚ_ｃ４の位置での差異を含み、Ｚ_ｃ４がＡ、Ｕ又はＧから選択される、請求項１又は２に記載のｓｉＲＮＡ。

【請求項4】

Ｚ_ａ３は、Ｚ_ａ４と相補的なヌクレオチドであり、或いは、Ｚ_ｂ３は、Ｚ_ｂ４と相補的なヌクレオチドであり、或いは、Ｚ_ｃ３は、Ｚ_ｃ４と相補的なヌクレオチドである、請求項１～３のいずれか一項に記載のｓｉＲＮＡ。

【請求項5】

前記ヌクレオチド配列Ｉと前記ヌクレオチド配列ＩＩとは、基本的に逆相補的、実質的に逆相補的又は完全に逆相補的であり、前記基本的に逆相補的とは、２つのヌクレオチド配列間に３つ以下の塩基ミスマッチが存在することを指し、前記実質的に逆相補的とは、２つのヌクレオチド配列間に１つ以下の塩基ミスマッチが存在することを指し、完全に逆相補的とは、２つのヌクレオチド配列間にミスマッチがないことを指す、請求項１～４のいずれか一項に記載のｓｉＲＮＡ。

【請求項6】

前記センス鎖とアンチセンス鎖とは、長さが同じか又は異なり、前記センス鎖の長さが１９～２３ヌクレオチドであり、アンチセンス鎖の長さが１９～２６ヌクレオチドであり、前記ヌクレオチド配列Ｉは、配列番号３に示されるヌクレオチド配列であり、前記ヌクレオチド配列ＩＩは、配列番号４に示されるヌクレオチド配列であり、
５’－ＣＵＧＣＣＡＵＧＧＡＧＵＡＵＣＵＧＡＺ_ａ３－３’（配列番号３）、
５’－Ｚ_ａ４ＵＣＡＧＡＵＡＣＵＣＣＡＵＧＧＣＡＧ－３’（配列番号４）
ただし、Ｚ_ａ３は、Ａ、Ｕ、Ｇ又はＣから選択され、Ｚ_ａ４は、Ｚ_ａ３と相補的なヌクレオチドであり、
或いは、前記ヌクレオチド配列Ｉは、配列番号１２５に示されるヌクレオチド配列であり、前記ヌクレオチド配列ＩＩは、配列番号１２６に示されるヌクレオチド配列であり、
５’－ＡＣＡＡＣＡＵＣＡＡＧＵＡＣＵＡＣＧＺ_ｂ３－３’（配列番号１２５）、
５’－Ｚ_ｂ４ＣＧＵＡＧＵＡＣＵＵＧＡＵＧＵＵＧＵ－３’（配列番号１２６）
ただし、Ｚ_ｂ３は、Ａ、Ｕ、Ｇ又はＣから選択され、Ｚ_ｂ４は、Ｚ_ｂ３と相補的なヌクレオチドであり、
或いは、前記ヌクレオチド配列Ｉは、配列番号２４７に示されるヌクレオチド配列であり、ヌクレオチド配列ＩＩは、配列番号２４８に示されるヌクレオチド配列であり、
５’－ＣＧＡＣＵＡＣＵＡＣＡＵＣＵＣＣＧＵＺ_ｃ３－３’（配列番号２４７）、
５’－Ｚ_ｃ４ＡＣＧＧＡＧＡＵＧＵＡＧＵＡＧＵＣＧ－３’（配列番号２４８）
ただし、Ｚ_ｃ３は、Ａ、Ｕ、Ｇ又はＣから選択され、Ｚ_ｃ４は、Ｚ_ｃ３と相補的なヌクレオチドである、請求項１～５のいずれか一項に記載のｓｉＲＮＡ。

【請求項7】

Ｚ_ａ３はＡであり、Ｚ_ａ４はＵであり、或いは、Ｚ_ｂ３はＡであり、Ｚ_ｂ４はＵであり、或いは、Ｚ_ｃ３はＧであり、Ｚ_ｃ４はＣである、請求項６に記載のｓｉＲＮＡ。

【請求項8】

前記センス鎖は、ヌクレオチド配列ＩＩＩを更に含み、前記アンチセンス鎖は、ヌクレオチド配列ＩＶを更に含み、ヌクレオチド配列ＩＩＩとヌクレオチド配列ＩＶとは、長さがそれぞれ独立して１～４ヌクレオチドであり、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩがヌクレオチド配列Ｉの５’末端に結合され、ヌクレオチド配列ＩＶがヌクレオチド配列ＩＩの３’末端に結合され、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩと前記ヌクレオチド配列ＩＶとは、長さが等しく、実質的に逆相補的又は完全に逆相補的であり、前記実質的に逆相補的とは、２つのヌクレオチド配列間に１つ以下の塩基ミスマッチが存在することを指し、完全に逆相補的とは、２つのヌクレオチド配列間にミスマッチがないことを指す、請求項１～７のいずれか一項に記載のｓｉＲＮＡ。

【請求項9】

前記ヌクレオチド配列Ｉと配列番号１に示されるヌクレオチド配列とは、長さが等しく、ヌクレオチド差異が３つ以下であり、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩとＩＶとは、長さがいずれも１ヌクレオチドであり、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基がＡであり、又は、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩとＩＶとは、長さがいずれも２ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基配列がＣＡであり、又は、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩとＩＶとは、長さがいずれも３ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基配列がＵＣＡであり、又は、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩとＩＶとは、長さがいずれも４ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基配列がＧＵＣＡであり、
或いは、前記ヌクレオチド配列Ｉと配列番号１２３に示されるヌクレオチド配列とは、長さが等しく、ヌクレオチド差異が３つ以下であり、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩとＩＶとは、長さがいずれも１ヌクレオチドであり、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基がＡであり、又は、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩとＩＶとは、長さがいずれも２ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基配列がＣＡであり、又は、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩとＩＶとは、長さがいずれも３ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基配列がＵＣＡであり、又は、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩとＩＶとは、長さがいずれも４ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基配列がＡＵＣＡであり、
或いは、前記ヌクレオチド配列Ｉと配列番号２４５に示されるヌクレオチド配列とは、長さが等しく、ヌクレオチド差異が３つ以下であり、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩとＩＶとは、長さがいずれも１ヌクレオチドであり、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基がＡであり、又は、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩとＩＶとは、長さがいずれも２ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基配列がＡＡであり、又は、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩとＩＶとは、長さがいずれも３ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基配列がＣＡＡであり、又は、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩとＩＶとは、長さがいずれも４ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基配列がＧＣＡＡである、請求項８に記載のｓｉＲＮＡ。

【請求項10】

前記アンチセンス鎖は、ヌクレオチド配列Ｖを更に含み、ヌクレオチド配列Ｖは、長さが１～３ヌクレオチドであり、前記アンチセンス鎖の３’末端に結合され、アンチセンス鎖の３’突出端を構成し、及び／又は、前記センス鎖は、ヌクレオチド配列ＶＩを更に含み、ヌクレオチド配列ＶＩは、長さが１～３ヌクレオチドであり、前記センス鎖の３’末端に結合され、センス鎖の３’突出端を構成する、請求項１～９のいずれか一項に記載のｓｉＲＮＡ。

【請求項11】

前記ヌクレオチド配列Ｖ及び／又はヌクレオチド配列ＶＩは、長さが２ヌクレオチドである、請求項１０に記載のｓｉＲＮＡ。

【請求項12】

前記ヌクレオチド配列Ｖ及び／又はＶＩは、連続した２つのチミンデオキシリボヌクレオチド又は連続した２つのウラシルリボヌクレオチドであり、或いは、前記ヌクレオチド配列Ｖが標的ｍＲＮＡの対応する位置のヌクレオチドと相補的であり、及び／又は前記ヌクレオチド配列ＶＩが標的ｍＲＮＡの対応する位置のヌクレオチドと同じである、請求項１０又は１１に記載のｓｉＲＮＡ。

【請求項13】

前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、配列番号５に示されるヌクレオチドを含み、前記ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖は、配列番号６に示されるヌクレオチド配列を含み、
５’－ＣＵＧＣＣＡＵＧＧＡＧＵＡＵＣＵＧＡＺ_ａ３－３’（配列番号５）、
５’－Ｚ_ａ４ＵＣＡＧＡＵＡＣＵＣＣＡＵＧＧＣＡＧＵＧ－３’（配列番号６）
ただし、前記Ｚ_ａ４は、アンチセンス鎖の５’末端の第１位のヌクレオチドであり、Ｚ_ａ３は、Ａ、Ｕ、Ｇ又はＣから選択され、Ｚ_ａ４は、Ｚ_ａ３と相補的なヌクレオチドであり、
或いは、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、配列番号７に示されるヌクレオチド配列を含み、前記ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖は、配列番号８に示されるヌクレオチド配列を含み、
５’－ＣＡＣＵＧＣＣＡＵＧＧＡＧＵＡＵＣＵＧＡＺ_ａ３－３’（配列番号７）、
５’－Ｚ_ａ４ＵＣＡＧＡＵＡＣＵＣＣＡＵＧＧＣＡＧＵＧＡＣ－３’（配列番号８）
ただし、前記Ｚ_ａ４は、アンチセンス鎖の５’末端の第１位のヌクレオチドであり、Ｚ_ａ３は、Ａ、Ｕ、Ｇ又はＣから選択され、Ｚ_ａ４は、Ｚ_ａ３と相補的なヌクレオチドであり、
或いは、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、配列番号１２７に示されるヌクレオチド配列を含み、前記ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖は、配列番号１２８に示されるヌクレオチド配列を含み、
５’－ＡＣＡＡＣＡＵＣＡＡＧＵＡＣＵＡＣＧＺ_ｂ３－３’（配列番号１２７）、
５’－Ｚ_ｂ４ＣＧＵＡＧＵＡＣＵＵＧＡＵＧＵＵＧＵＵＧ－３’（配列番号１２８）
或いは、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、配列番号１２９に示されるヌクレオチド配列を含み、前記ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖は、配列番号１３０に示されるヌクレオチド配列を含み、
５’－ＣＡＡＣＡＡＣＡＵＣＡＡＧＵＡＣＵＡＣＧＺ_ｂ３－３’（配列番号１２９）、
５’－Ｚ_ｂ４ＣＧＵＡＧＵＡＣＵＵＧＡＵＧＵＵＧＵＵＧＡＵ－３’（配列番号１３０）
ただし、前記Ｚ_ｂ４は、アンチセンス鎖の５’末端の第１位のヌクレオチドであり、Ｚ_ｂ３は、Ａ、Ｕ、Ｇ又はＣから選択され、Ｚ_ｂ４は、Ｚ_ｂ３と相補的なヌクレオチドであり、
或いは、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、配列番号２４９に示されるヌクレオチド配列を含み、前記ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖は、配列番号２５０に示されるヌクレオチド配列を含み、
５’－ＣＧＡＣＵＡＣＵＡＣＡＵＣＵＣＣＧＵＺ_ｃ３－３’（配列番号２４９）、
５’－Ｚ_ｃ４ＡＣＧＧＡＧＡＵＧＵＡＧＵＡＧＵＣＧＵＵ－３’（配列番号２５０）
或いは、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、配列番号２５１に示されるヌクレオチド配列を含み、前記ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖は、配列番号２５２に示されるヌクレオチド配列を含み、
５’－ＡＡＣＧＡＣＵＡＣＵＡＣＡＵＣＵＣＣＧＵＺ_ｃ３－３’（配列番号２５１）、
５’－Ｚ_ｃ４ＡＣＧＧＡＧＡＵＧＵＡＧＵＡＧＵＣＧＵＵＧＣ－３’（配列番号２５２）
ただし、前記Ｚ_ｃ４は、アンチセンス鎖の５’末端の第１位のヌクレオチドであり、Ｚ_ｃ３は、Ａ、Ｕ、Ｇ又はＣから選択され、Ｚ_ｃ４は、Ｚ_ｃ３と相補的なヌクレオチドである、請求項１～１２のいずれか一項に記載のｓｉＲＮＡ。

【請求項14】

前記ｓｉＲＮＡは、ｓｉＲＰＴＯＲａ１、ｓｉＲＰＴＯＲａ２、ｓｉＲＰＴＯＲａ３、ｓｉＲＰＴＯＲｂ１、ｓｉＲＰＴＯＲｂ２、ｓｉＲＰＴＯＲｂ３、ｓｉＲＰＴＯＲｃ１、ｓｉＲＰＴＯＲｃ２及びｓｉＲＰＴＯＲｃ３のうちの１つである請求項１～１３のいずれか一項に記載のｓｉＲＮＡ。

【請求項15】

前記センス鎖と前記アンチセンス鎖における少なくとも１つのヌクレオチドが修飾ヌクレオチドであり、及び／又は少なくとも１つのリン酸エステル基が修飾基を有するリン酸エステル基である、請求項１～１４のいずれか一項に記載のｓｉＲＮＡ。

【請求項16】

前記センス鎖と前記アンチセンス鎖における各ヌクレオチドは、独立してフルオロ修飾ヌクレオチド又は非フルオロ修飾ヌクレオチドである、請求項１～１５のいずれか一項に記載のｓｉＲＮＡ。

【請求項17】

前記フルオロ修飾ヌクレオチドは、ヌクレオチド配列Ｉとヌクレオチド配列ＩＩに位置し、５’末端から３’末端に向かって、前記ヌクレオチド配列Ｉの少なくとも第７、８、９位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、前記ヌクレオチド配列ＩＩの少なくとも第２、６、１４、１６位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドである、請求項１６に記載のｓｉＲＮＡ。

【請求項18】

前記非フルオロ修飾ヌクレオチドは、２’－Ｏ－メトキシ修飾又は２’－Ｏ－メトキシエチル修飾ヌクレオチドである、請求項１６又は１７に記載のｓｉＲＮＡ。

【請求項19】

５’末端から３’末端に向かって、前記ヌクレオチド配列ＩＩの第３～６位のヌクレオチドのうちの少なくとも１つは、２’－Ｏ－メトキシエチル修飾ヌクレオチドである、請求項１８に記載のｓｉＲＮＡ。

【請求項20】

前記ヌクレオチド配列ＩＩの第３位又は第５位のヌクレオチドは、２’－Ｏ－メトキシエチル修飾ヌクレオチドである、請求項１９に記載のｓｉＲＮＡ。

【請求項21】

５’末端から３’末端に向かって、前記ヌクレオチド配列ＩＩの第３～９位のヌクレオチドのうちの２つ以下のヌクレオチドは、２’－Ｏ－メトキシエチル修飾ヌクレオチドである、請求項１９に記載のｓｉＲＮＡ。

【請求項22】

前記センス鎖と前記アンチセンス鎖における他のヌクレオチドは、２’－Ｏ－メトキシ修飾ヌクレオチドである、請求項１７～２１のいずれか一項に記載のｓｉＲＮＡ。

【請求項23】

前記ｓｉＲＮＡは、ｓｉＲＰＴＯＲａ１－Ｍ１、ｓｉＲＰＴＯＲａ１－Ｍ２、ｓｉＲＰＴＯＲａ１－Ｍ３、ｓｉＲＰＴＯＲａ２－Ｍ１、ｓｉＲＰＴＯＲａ２－Ｍ２、ｓｉＲＰＴＯＲａ２－Ｍ３、ｓｉＲＰＴＯＲａ３－Ｍ１、ｓｉＲＰＴＯＲａ３－Ｍ２、ｓｉＳＲＰＴＯＲａ３－Ｍ３、ｓｉＲＰＴＯＲｂ１－Ｍ１、ｓｉＲＰＴＯＲｂ１－Ｍ２、ｓｉＲＰＴＯＲｂ１－Ｍ３、ｓｉＲＰＴＯＲｂ２－Ｍ１、ｓｉＲＰＴＯＲｂ２－Ｍ２、ｓｉＲＰＴＯＲｂ２－Ｍ３、ｓｉＲＰＴＯＲｂ３－Ｍ１、ｓｉＲＰＴＯＲｂ３－Ｍ２、ｓｉＳＲＰＴＯＲｂ３－Ｍ３、ｓｉＲＰＴＯＲｃ１－Ｍ１、ｓｉＲＰＴＯＲｃ１－Ｍ２、ｓｉＲＰＴＯＲｃ１－Ｍ３、ｓｉＲＰＴＯＲｃ２－Ｍ１、ｓｉＲＰＴＯＲｃ２－Ｍ２、ｓｉＲＰＴＯＲｃ２－Ｍ３、ｓｉＲＰＴＯＲｃ３－Ｍ１、ｓｉＲＰＴＯＲｃ３－Ｍ２及びｓｉＳＲＰＴＯＲｃ３－Ｍ３のうちの１つである、請求項１～２２のいずれか一項に記載のｓｉＲＮＡ。

【請求項24】

前記修飾基を有するリン酸エステル基は、リン酸エステル基におけるリン酸ジエステル結合の少なくとも１つの酸素原子が硫黄原子で置換されたチオリン酸エステル基である、請求項１５に記載のｓｉＲＮＡ。

【請求項25】

前記ｓｉＲＮＡは、ｓｉＲＰＴＯＲａ１－Ｍ１Ｓ、ｓｉＲＰＴＯＲａ１－Ｍ１Ｘ、ｓｉＲＰＴＯＲａ１－Ｍ２Ｓ、ｓｉＲＰＴＯＲａ１－Ｍ２Ｘ、ｓｉＲＰＴＯＲａ１－Ｍ３Ｓ、ｓｉＲＰＴＯＲａ１－Ｍ３Ｘ、ｓｉＲＰＴＯＲａ２－Ｍ１Ｓ、ｓｉＲＰＴＯＲａ２－Ｍ１Ｘ、ｓｉＲＰＴＯＲａ２－Ｍ２Ｓ、ｓｉＲＰＴＯＲａ２－Ｍ２Ｘ、ｓｉＲＰＴＯＲａ２－Ｍ３Ｓ、ｓｉＲＰＴＯＲａ２－Ｍ３Ｘ、ｓｉＲＰＴＯＲａ３－Ｍ１Ｓ、ｓｉＲＰＴＯＲａ３－Ｍ１Ｘ、ｓｉＲＰＴＯＲａ３－Ｍ２Ｓ、ｓｉＲＰＴＯＲａ３－Ｍ２Ｘ、ｓｉＲＰＴＯＲａ３－Ｍ３Ｓ、ｓｉＲＰＴＯＲａ３－Ｍ３Ｘ、ｓｉＲＰＴＯＲａ１－Ｔ１Ｓ、ｓｉＲＰＴＯＲａ１－Ｔ２Ｓ、ｓｉＲＰＴＯＲｂ１－Ｍ１Ｓ、ｓｉＲＰＴＯＲｂ１－Ｍ１Ｘ、ｓｉＲＰＴＯＲｂ１－Ｍ２Ｓ、ｓｉＲＰＴＯＲｂ１－Ｍ２Ｘ、ｓｉＲＰＴＯＲｂ１－Ｍ３Ｓ、ｓｉＲＰＴＯＲｂ１－Ｍ３Ｘ、ｓｉＲＰＴＯＲｂ２－Ｍ１Ｓ、ｓｉＲＰＴＯＲｂ２－Ｍ１Ｘ、ｓｉＲＰＴＯＲｂ２－Ｍ２Ｓ、ｓｉＲＰＴＯＲｂ２－Ｍ２Ｘ、ｓｉＲＰＴＯＲｂ２－Ｍ３Ｓ、ｓｉＲＰＴＯＲｂ２－Ｍ３Ｘ、ｓｉＲＰＴＯＲｂ３－Ｍ１Ｓ、ｓｉＲＰＴＯＲｂ３－Ｍ１Ｘ、ｓｉＲＰＴＯＲｂ３－Ｍ２Ｓ、ｓｉＲＰＴＯＲｂ３－Ｍ２Ｘ、ｓｉＲＰＴＯＲｂ３－Ｍ３Ｓ、ｓｉＲＰＴＯＲｂ３－Ｍ３Ｘ、ｓｉＲＰＴＯＲｂ１－Ｔ１Ｓ、ｓｉＲＰＴＯＲｂ１－Ｔ２Ｓ、ｓｉＲＰＴＯＲｃ１－Ｍ１Ｓ、ｓｉＲＰＴＯＲｃ１－Ｍ１Ｘ、ｓｉＲＰＴＯＲｃ１－Ｍ２Ｓ、ｓｉＲＰＴＯＲｃ１－Ｍ２Ｘ、ｓｉＲＰＴＯＲｃ１－Ｍ３Ｓ、ｓｉＲＰＴＯＲｃ１－Ｍ３Ｘ、ｓｉＲＰＴＯＲｃ２－Ｍ１Ｓ、ｓｉＲＰＴＯＲｃ２－Ｍ１Ｘ、ｓｉＲＰＴＯＲｃ２－Ｍ２Ｓ、ｓｉＲＰＴＯＲｃ２－Ｍ２Ｘ、ｓｉＲＰＴＯＲｃ２－Ｍ３Ｓ、ｓｉＲＰＴＯＲｃ２－Ｍ３Ｘ、ｓｉＲＰＴＯＲｃ３－Ｍ１Ｓ、ｓｉＲＰＴＯＲｃ３－Ｍ１Ｘ、ｓｉＲＰＴＯＲｃ３－Ｍ２Ｓ、ｓｉＲＰＴＯＲｃ３－Ｍ２Ｘ、ｓｉＲＰＴＯＲｃ３－Ｍ３Ｓ、ｓｉＲＰＴＯＲｃ３－Ｍ３Ｘ、ｓｉＲＰＴＯＲｃ１－Ｔ１Ｓ及びｓｉＲＰＴＯＲｃ１－Ｔ２Ｓのうちの１つである、請求項１～２２のいずれか一項に記載のｓｉＲＮＡ。

【請求項26】

前記アンチセンス鎖の５’末端のヌクレオチドは、５’－リン酸ヌクレオチド又は５’－リン酸アナログ修飾ヌクレオチドである、請求項１５に記載のｓｉＲＮＡ。

【請求項27】

前記ｓｉＲＮＡは、ｓｉＲＰＴＯＲａ１－Ｍ１Ｐ１、ｓｉＲＰＴＯＲａ１－Ｍ２Ｐ１、ｓｉＲＰＴＯＲａ１－Ｍ３Ｐ１、ｓｉＲＰＴＯＲａ２－Ｍ１Ｐ１、ｓｉＲＰＴＯＲａ２－Ｍ２Ｐ１、ｓｉＲＰＴＯＲａ２－Ｍ３Ｐ１、ｓｉＲＰＴＯＲａ３－Ｍ１Ｐ１、ｓｉＲＰＴＯＲａ３－Ｍ２Ｐ１、ｓｉＲＰＴＯＲａ３－Ｍ３Ｐ１、ｓｉＲＰＴＯＲａ１－Ｍ１ＳＰ１、ｓｉＲＰＴＯＲａ１－Ｍ２ＳＰ１、ｓｉＲＰＴＯＲａ１－Ｍ３ＳＰ１、ｓｉＲＰＴＯＲａ２－Ｍ１ＳＰ１、ｓｉＲＰＴＯＲａ２－Ｍ２ＳＰ１、ｓｉＲＰＴＯＲａ２－Ｍ３ＳＰ１、ｓｉＲＰＴＯＲａ３－Ｍ１ＳＰ１、ｓｉＲＰＴＯＲａ３－Ｍ２ＳＰ１、ｓｉＲＰＴＯＲａ３－Ｍ３ＳＰ１、ｓｉＲＰＴＯＲａ１－Ｍ１ＸＰ１、ｓｉＲＰＴＯＲａ１－Ｍ２ＸＰ１、ｓｉＲＰＴＯＲａ１－Ｍ３ＸＰ１、ｓｉＲＰＴＯＲａ２－Ｍ１ＸＰ１、ｓｉＲＰＴＯＲａ２－Ｍ２ＸＰ１、ｓｉＲＰＴＯＲａ２－Ｍ３ＸＰ１、ｓｉＲＰＴＯＲａ３－Ｍ１ＸＰ１、ｓｉＲＰＴＯＲａ３－Ｍ２ＸＰ１、ｓｉＲＰＴＯＲａ３－Ｍ３ＸＰ１、ｓｉＲＰＴＯＲｂ１－Ｍ１Ｐ１、ｓｉＲＰＴＯＲｂ１－Ｍ２Ｐ１、ｓｉＲＰＴＯＲｂ１－Ｍ３Ｐ１、ｓｉＲＰＴＯＲｂ２－Ｍ１Ｐ１、ｓｉＲＰＴＯＲｂ２－Ｍ２Ｐ１、ｓｉＲＰＴＯＲｂ２－Ｍ３Ｐ１、ｓｉＲＰＴＯＲｂ３－Ｍ１Ｐ１、ｓｉＲＰＴＯＲｂ３－Ｍ２Ｐ１、ｓｉＲＰＴＯＲｂ３－Ｍ３Ｐ１、ｓｉＲＰＴＯＲｂ１－Ｍ１ＳＰ１、ｓｉＲＰＴＯＲｂ１－Ｍ２ＳＰ１、ｓｉＲＰＴＯＲｂ１－Ｍ３ＳＰ１、ｓｉＲＰＴＯＲｂ２－Ｍ１ＳＰ１、ｓｉＲＰＴＯＲｂ２－Ｍ２ＳＰ１、ｓｉＲＰＴＯＲｂ２－Ｍ３ＳＰ１、ｓｉＲＰＴＯＲｂ３－Ｍ１ＳＰ１、ｓｉＲＰＴＯＲｂ３－Ｍ２ＳＰ１、ｓｉＲＰＴＯＲｂ３－Ｍ３ＳＰ１、ｓｉＲＰＴＯＲｂ１－Ｍ１ＸＰ１、ｓｉＲＰＴＯＲｂ１－Ｍ２ＸＰ１、ｓｉＲＰＴＯＲｂ１－Ｍ３ＸＰ１、ｓｉＲＰＴＯＲｂ２－Ｍ１ＸＰ１、ｓｉＲＰＴＯＲｂ２－Ｍ２ＸＰ１、ｓｉＲＰＴＯＲｂ２－Ｍ３ＸＰ１、ｓｉＲＰＴＯＲｂ３－Ｍ１ＸＰ１、ｓｉＲＰＴＯＲｂ３－Ｍ２ＸＰ１、ｓｉＲＰＴＯＲｂ３－Ｍ３ＸＰ１、ｓｉＲＰＴＯＲｃ１－Ｍ１Ｐ１、ｓｉＲＰＴＯＲｃ１－Ｍ２Ｐ１、ｓｉＲＰＴＯＲｃ１－Ｍ３Ｐ１、ｓｉＲＰＴＯＲｃ２－Ｍ１Ｐ１、ｓｉＲＰＴＯＲｃ２－Ｍ２Ｐ１、ｓｉＲＰＴＯＲｃ２－Ｍ３Ｐ１、ｓｉＲＰＴＯＲｃ３－Ｍ１Ｐ１、ｓｉＲＰＴＯＲｃ３－Ｍ２Ｐ１、ｓｉＲＰＴＯＲｃ３－Ｍ３Ｐ１、ｓｉＲＰＴＯＲｃ１－Ｍ１ＳＰ１、ｓｉＲＰＴＯＲｃ１－Ｍ２ＳＰ１、ｓｉＲＰＴＯＲｃ１－Ｍ３ＳＰ１、ｓｉＲＰＴＯＲｃ２－Ｍ１ＳＰ１、ｓｉＲＰＴＯＲｃ２－Ｍ２ＳＰ１、ｓｉＲＰＴＯＲｃ２－Ｍ３ＳＰ１、ｓｉＲＰＴＯＲｃ３－Ｍ１ＳＰ１、ｓｉＲＰＴＯＲｃ３－Ｍ２ＳＰ１、ｓｉＲＰＴＯＲｃ３－Ｍ３ＳＰ１、ｓｉＲＰＴＯＲｃ１－Ｍ１ＸＰ１、ｓｉＲＰＴＯＲｃ１－Ｍ２ＸＰ１、ｓｉＲＰＴＯＲｃ１－Ｍ３ＸＰ１、ｓｉＲＰＴＯＲｃ２－Ｍ１ＸＰ１、ｓｉＲＰＴＯＲｃ２－Ｍ２ＸＰ１、ｓｉＲＰＴＯＲｃ２－Ｍ３ＸＰ１、ｓｉＲＰＴＯＲｃ３－Ｍ１ＸＰ１、ｓｉＲＰＴＯＲｃ３－Ｍ２ＸＰ１及びｓｉＲＰＴＯＲｃ３－Ｍ３ＸＰ１のうちの１つである、請求項２６に記載のｓｉＲＮＡ。

【請求項28】

請求項１～２７のいずれか一項に記載のｓｉＲＮＡ及び薬学的に許容可能な担体を含む、医薬組成物。

【請求項29】

前記ｓｉＲＮＡと薬学的に許容可能な担体との重量比は、１：（１～５００）である、請求項２８に記載の医薬組成物。

【請求項30】

前記ｓｉＲＮＡと薬学的に許容可能な担体との重量比は、１：（１～５０）である、請求項２８に記載の医薬組成物。

【請求項31】

ｓｉＲＮＡ複合体であって、請求項１～２７のいずれか一項に記載のｓｉＲＮＡと、当該ｓｉＲＮＡに複合して結合される複合基とを含み、前記複合基は、薬学的に許容可能な少なくとも１つの標的基及び／又は送達補助基を含み、好ましくは、前記複合基は、リンカーを更に含み、前記リンカー及び／又は前記標的基又は前記送達補助基は、順に結合され、好ましくは、各前記標的基は、細胞表面受容体に結合できるリガンドから選択され、及び／又は各送達補助基は、送達目的器官又は組織における前記ｓｉＲＮＡ複合体の生体適合性を向上させることができる基から選択される、ｓｉＲＮＡ複合体。

【請求項32】

前記ｓｉＲＮＡ複合体は、式（３０１）に示される構造を有し、ただし、Ｎｕは、ｓｉＲＰＴＯＲａ２－Ｍ１Ｓ、ｓｉＲＰＴＯＲｂ２－Ｍ１Ｓ、ｓｉＲＰＴＯＲｃ２－Ｍ１Ｓ、ｓｉＲＰＴＯＲｃ１－Ｔ１Ｓ及びｓｉＲＰＴＯＲｃ１－Ｔ２Ｓのうちの１つに対応する配列を有し、前記複合基は、前記ＮｕにおけるｓｉＲＮＡセンス鎖の３’末端のヌクレオチドのリボース基の３’位に結合され、前記ｓｉＲＮＡ複合体は、ナトリウム塩形態である、請求項３１に記載のｓｉＲＮＡ複合体。

【請求項33】

請求項１～２７のいずれか一項に記載のｓｉＲＮＡ、及び／又は、請求項２８～３０のいずれか一項に記載の医薬組成物、及び／又は、請求項３１又は３２に記載のｓｉＲＮＡ複合体の、細胞におけるＲＰＴＯＲ遺伝子発現を抑制する薬物の調製における使用。

【請求項34】

請求項１～２７のいずれか一項に記載のｓｉＲＮＡ、及び／又は、請求項２８～３０のいずれか一項に記載の医薬組成物、及び／又は、請求項３１又は３２に記載のｓｉＲＮＡ複合体の、ＲＰＴＯＲ機能調節に関連する疾患又は症状を治療する薬物の調製における使用。

【請求項35】

前記ＲＰＴＯＲ機能調節に関連する疾患又は症状は、ｍＴＯＲＣ１の活性化による疾患、及び細胞のオートファジー機能異常に関連する疾患である、請求項３４に記載の使用。

【請求項36】

前記ＲＰＴＯＲ機能調節に関連する疾患又は症状は、神経変性疾患又は非アルコール性脂肪性肝炎である、請求項３５に記載の使用。

【請求項37】

前記神経変性疾患は、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、前頭側頭型認知症、レビー小体型認知症、ハンチントン病、トゥレット症候群及びパーキンソン病のうちの１つ以上であり、好ましくは、前記神経変性疾患は、アルツハイマー病である、請求項３６に記載の使用。

【請求項38】

ＲＰＴＯＲ機能調節に関連する疾患又は症状の治療及び／又は予防方法であって、請求項１～２７のいずれか一項に記載のｓｉＲＮＡ、及び／又は、請求項２８～３０のいずれか一項に記載の医薬組成物、及び／又は、請求項３１又は３２に記載のｓｉＲＮＡ複合体を有効量で、それを必要とする被験体に投与することを含む、方法。

【請求項39】

細胞におけるＲＰＴＯＲ遺伝子発現の抑制方法であって、請求項１～２７のいずれか一項に記載のｓｉＲＮＡ、及び／又は、請求項２８～３０のいずれか一項に記載の医薬組成物、及び／又は、請求項３１又は３２に記載のｓｉＲＮＡ複合体を有効量で前記細胞と接触させることを含む、方法。

【請求項40】

請求項１～２７のいずれか一項に記載のｓｉＲＮＡ、及び／又は、請求項２８～３０のいずれか一項に記載の医薬組成物、及び／又は、請求項３１又は３２に記載のｓｉＲＮＡ複合体を含む、キット。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本開示は、ｍＴＯＲＣ１の活性を抑制できる核酸、当該核酸を含む医薬組成物及びｓｉＲＮＡ複合体に関する。本開示は、更に、これらの核酸、医薬組成物及びｓｉＲＮＡ複合体の調製方法と使用に関する。

【背景技術】

【0002】

神経変性疾患は、神経細胞の死亡及びグリア細胞のバランスを含む神経細胞の構造と機能の進行性の喪失であり、認知症などの認知障害を引き起こす。パーキンソン病（Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓｄｉｓｅａｓｅ、ＰＤ）、アルツハイマー病（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓｄｉｓｅａｓｅ、ＡＤ）、前頭側頭型認知症（Ｆｒｏｎｔｏｔｅｍｐｏｒａｌｄｅｍｅｎｔｉａ）、ハンチントン病（Ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎｄｉｓｅａｓｅ、ＨＤ）、筋萎縮性側索硬化症（Ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃｌａｔｅｒａｌｓｃｌｅｒｏｓｉｓ、ＡＬＳ、通称ＡＬＳ）、脊髄性筋萎縮症（Ｓｐｉｎａｌｍｕｓｃｕｌａｒａｔｒｏｐｈｙ、ＳＭＡ）などが含まれる。ＡＤ及びＰＤは、主に中高年に発生し、人口の高齢化に伴い、ＡＤ及びＰＤの発症が益々増加し、ＨＤ、ＡＬＳ、ＳＭＡなどは、各年齢層で発生する可能性がある。

【0003】

現在、神経変性疾患の薬物治療は主に西洋薬に基づいているが、薬物治療には長期間の投薬が必要であり、明らかな副作用があり、中枢神経系、消化器系、呼吸器系などに影響を与えやすく、内分泌かく乱、気分の変化などを引き起こすこともある。

【0004】

哺乳類ラパマイシン標的タンパク質（ｍａｍｍａｌｉａｎｔａｒｇｅｔｏｆｒａｐａｍｙｃｉｎ、ｍＴＯＲ）シグナル伝達経路は、タンパク質合成、細胞成長、増殖などを調節するシグナル伝達経路であり、細胞において、ｍＴＯＲＣ１とｍＴＯＲＣ２の２つの異なる複合体が存在する。ｍＴＯＲＣ１は、ＲＰＴＯＲ、Ｒａｓタンパク質脳組織相同類似体（Ｒａｓｈｏｍｏｌｏｇｅｎｒｉｃｈｅｄｉｎｂｒａｉｎ、ＲＨＥＢ）、ＤＥＰドメイン含有ｍＴＯＲ相互作用タンパク質（ＤＥＰｄｏｍａｉｎ－ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇｍＴＯＲ－ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎ、ＤＥＰＴＯＲ）、哺乳類致死性ＳＥＣ１３タンパク質８（ｍａｍｍａｌｉａｎｌｅｔｈａｌｗｉｔｈＳＥＣ１３ｐｒｏｔｅｉｎ８、ｍＬＳＴ８）、及び４０ｋＤａのプロリンリッチＡｋＴ基質（ＰｒｏｌｉｎｅｒｉｃｈＡＫＴｓｕｂｓｔｒａｔｅｏｆ４０ｋＤａ、ＰＲＡＳ４０）からなる複合体であり、当該複合体は、オートファジー調節の重要な負調節因子である。これまでの研究により、アルツハイマー病（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓＤｉｓｅａｓｅ、ＡＤ）患者及び動物モデルにおいてｍＴＯＲＣ１が活性化され、ミトコンドリアオートファジーが抑制され、これがＡＤ患者の老人斑、神経原線維変化及び認知機能低下の主な原因であることが明らかになっている。文献では、ＲＰＴＯＲを抑制することによりｍＴＯＲＣ１活性を抑制することができ、それにより細胞オートファジー及びミトコンドリアオートファジーを促進し、神経変性疾患患者の脳内のミスフォールドタンパク質を減少させることが報告されている。

【0005】

本分野では、ＲＰＴＯＲ遺伝子発現レベルを調節する新薬を開発することにより、ｍＴＯＲＣ１活性を調節し、更にｍＴＯＲＣ１活性化及び異常なオートファジー機能に関連する疾患又は症状、特に神経変性疾患を調節して治療する必要性が大きくなる。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

本開示の発明者は、本開示により提供される以下のｓｉＲＮＡ及びその修飾配列が細胞におけるＲＰＴＯＲ遺伝子発現を特異的に抑制することができ、本開示のｓｉＲＮＡを含む医薬組成物及びｓｉＲＮＡ複合体が本開示のｓｉＲＮＡを標的組織及び／又は細胞に効果的に送達することができ、それにより神経変性疾患、特にアルツハイマー病の治療又は予防において高い薬物形成の可能性を示すことを意外にも見出した。

【課題を解決するための手段】

【0007】

一態様において、本開示は、ＲＰＴＯＲ遺伝子発現を抑制できるｓｉＲＮＡを提供し、当該ｓｉＲＮＡは、センス鎖とアンチセンス鎖とを含み、前記ｓｉＲＮＡにおけるヌクレオチドは、それぞれ独立して修飾又は未修飾のヌクレオチドであり、前記センス鎖はヌクレオチド配列Ｉを含み、前記アンチセンス鎖はヌクレオチド配列ＩＩを含み、前記ヌクレオチド配列Ｉと前記ヌクレオチド配列ＩＩとは、少なくとも一部で逆相補的に二本鎖領域を形成し、前記ヌクレオチド配列Ｉと前記ヌクレオチド配列ＩＩとは、ｉ）～ｉｉｉ）に示される配列から選択される１組であり、
ｉ）前記ヌクレオチド配列Ｉと配列番号１に示されるヌクレオチド配列とは、長さが等しく、ヌクレオチド差異が３つ以下であり、前記ヌクレオチド配列ＩＩと配列番号２に示されるヌクレオチド配列とは、長さが等しく、ヌクレオチド差異が３つ以下であり、
５’－ＣＵＧＣＣＡＵＧＧＡＧＵＡＵＣＵＧＡＺ_ａ１－３’（配列番号１）、
５’－Ｚ_ａ２ＵＣＡＧＡＵＡＣＵＣＣＡＵＧＧＣＡＧ－３’（配列番号２）
ただし、Ｚ_ａ１はＡであり、Ｚ_ａ２はＵであり、前記ヌクレオチド配列Ｉに、位置がＺ_ａ１に対応するヌクレオチドＺ_ａ３が含まれ、前記ヌクレオチド配列ＩＩに、位置がＺ_ａ２に対応するヌクレオチドＺ_ａ４が含まれ、前記Ｚ_ａ４は、前記アンチセンス鎖の５’末端の第１位のヌクレオチドであり、或いは、
ｉｉ）前記ヌクレオチド配列Ｉと配列番号１２３に示されるヌクレオチド配列とは、長さが等しく、ヌクレオチド差異が３つ以下であり、前記ヌクレオチド配列ＩＩと配列番号１２４に示されるヌクレオチド配列とは、長さが等しく、ヌクレオチド差異が３つ以下であり、
５’－ＡＣＡＡＣＡＵＣＡＡＧＵＡＣＵＡＣＧＺ_ｂ１－３’（配列番号１２３）、
５’－Ｚ_ｂ２ＣＧＵＡＧＵＡＣＵＵＧＡＵＧＵＵＧＵ－３’（配列番号１２４）
ただし、Ｚ_ｂ１はＡであり、Ｚ_ｂ２はＵであり、前記ヌクレオチド配列Ｉに、位置がＺ_ｂ１に対応するヌクレオチドＺ_ｂ３が含まれ、前記ヌクレオチド配列ＩＩに、位置がＺ_ｂ２に対応するヌクレオチドＺ_ｂ４が含まれ、前記Ｚ_ｂ４は、前記アンチセンス鎖の５’末端の第１位のヌクレオチドであり、或いは、
ｉｉｉ）前記ヌクレオチド配列Ｉと配列番号２４５に示されるヌクレオチド配列とは、長さが等しく、ヌクレオチド差異が３つ以下であり、前記ヌクレオチド配列ＩＩと配列番号２４６に示されるヌクレオチド配列とは、長さが等しく、ヌクレオチド差異が３つ以下であり、
５’－ＣＧＡＣＵＡＣＵＡＣＡＵＣＵＣＣＧＵＺ_ｃ１－３’（配列番号２４５）、
５’－Ｚ_ｃ２ＡＣＧＧＡＧＡＵＧＵＡＧＵＡＧＵＣＧ－３’（配列番号２４６）
ただし、Ｚ_ｃ１はＧであり、Ｚ_ｃ２はＣであり、前記ヌクレオチド配列Ｉに、位置がＺ_ｃ１に対応するヌクレオチドＺ_ｃ３が含まれ、前記ヌクレオチド配列ＩＩに、位置がＺ_ｃ２に対応するヌクレオチドＺ_ｃ４が含まれ、前記Ｚ_ｃ４は、前記アンチセンス鎖の５’末端の第１位のヌクレオチドである。

【0008】

別の態様において、本開示は、医薬組成物を提供し、前記医薬組成物は、本開示のｓｉＲＮＡ及び薬学的に許容可能な担体を含む。

【0009】

更に別の態様において、本開示は、ｓｉＲＮＡ複合体を提供し、前記ｓｉＲＮＡ複合体は、本開示により提供されるｓｉＲＮＡと、当該ｓｉＲＮＡに複合して結合される複合基とを含む。

【0010】

更に別の態様において、本開示は、本開示のｓｉＲＮＡ、及び／又は医薬組成物、及び／又はｓｉＲＮＡ複合体の、ＲＰＴＯＲ機能調節に関連する疾患を治療及び／又は予防する薬物の調製における使用を提供する。

【0011】

更に別の態様において、本開示は、ＲＰＴＯＲ機能調節に関連する疾患又は症状、例えば、神経変性疾患又は非アルコール性脂肪性肝炎に関連する疾患又は症状、特にアルツハイマー病の治療方法を提供し、前記方法は、本開示のｓｉＲＮＡ、及び／又は医薬組成物、及び／又はｓｉＲＮＡ複合体を有効量で、それを必要とする被験体に投与することを含む。

【0012】

更に別の態様において、本開示は、細胞におけるＲＰＴＯＲ遺伝子発現の抑制方法を提供し、当該方法は、本開示のｓｉＲＮＡ、及び／又は医薬組成物、及び／又はｓｉＲＮＡ複合体を有効量で前記細胞と接触させることを含む。

【0013】

また、本開示は、キットを更に提供し、前記キットは、本開示のｓｉＲＮＡ、及び／又は医薬組成物、及び／又はｓｉＲＮＡ複合体を含む。

【0014】

［引用による組み込み］
本明細書で言及される全ての出版物、特許及び特許出願は、各々の出版物、特許又は特許出願が特別にかつ個別に引用により本明細書に組み込まれるのと同じ程度に、引用により本明細書に組み込まれる。

【発明の効果】

【0015】

本開示により提供されるｓｉＲＮＡ、医薬組成物及びｓｉＲＮＡ複合体は、安定性に優れ、ＲＰＴＯＲｍＲＮＡ抑制活性が高く、オフターゲット効果が低減され、及び／又はＲＰＴＯＲ機能調節に関連する疾患又は症状を顕著に治療及び軽減することができる。

【0016】

例えば、本開示により提供されるｓｉＲＮＡ、医薬組成物又はｓｉＲＮＡ複合体は、体外細胞実験において優れた標的遺伝子発現抑制活性を示す。例えば、本開示のｓｉＲＮＡは、体外ＨｅｐＧ２ヒト肝癌細胞において、０．５ｎＭの低濃度で、少なくとも４０．５％のＲＰＴＯＲｍＲＮＡ抑制率を示し、５ｎＭの濃度で、少なくとも６８．３％のＲＰＴＯＲｍＲＮＡ抑制率を示し、５０ｎＭの濃度で、少なくとも７１．１％、ひいては８６．８％のＲＰＴＯＲｍＲＮＡ抑制率を示し、優れたＲＰＴＯＲ遺伝子発現抑制効果を示す。また、異なる長さ及び修飾スキームを有する本開示のｓｉＲＮＡは、いずれも高い抑制率を有する。

【0017】

また、例えば、本開示により提供されるｓｉＲＮＡ、医薬組成物又はｓｉＲＮＡ複合体は、体内における安定性及び標的ｍＲＮＡ抑制活性がより高い。例えば、３ｍｇ／ｋｇの濃度で、本開示の異なる修飾スキームのｓｉＲＮＡ複合体は、Ｃ５７ＢＬ／６ｊマウスの体内において５１．３％又は５２．９％のＲＰＴＯＲｍＲＮＡ発現抑制率を示し、優れたＲＰＴＯＲｍＲＮＡ抑制活性を示す。

【0018】

このように、本開示により提供されるｓｉＲＮＡ、医薬組成物及びｓｉＲＮＡ複合体は、ＲＰＴＯＲ遺伝子の発現を抑制し、ｍＴＯＲＣ１の活性化による疾患及び細胞のオートファジー機能異常に関連する疾患を効果的に治療することができ、応用において明るい見通しを有している。

【0019】

本開示の他の特徴と利点については、後述する発明を実施するための形態部分において詳しく説明する。

【図面の簡単な説明】

【0020】

【図1】５０ｎＭ濃度の本開示のｓｉＲＮＡ及び参照ｓｉＲＮＡをトランスフェクションした後の、体外ＨｅｐＧ２ヒト肝癌細胞におけるＲＰＴＯＲｍＲＮＡの相対的発現レベルを示すヒストグラムである。

【図2】異なる濃度の本開示のｓｉＲＮＡをトランスフェクションした後の、体外ＨｅｐＧ２ヒト肝癌細胞におけるＲＰＴＯＲｍＲＮＡの相対的発現レベルを示すヒストグラムである。

【発明を実施するための形態】

【0021】

以下、本開示の発明を実施するための形態を詳細に説明する。ここで説明される発明を実施するための形態は、本開示を説明し解釈するためのものに過ぎず、本開示を限定するためのものではないことを理解されたい。

【0022】

＜定義＞
本開示において、ＲＰＴＯＲｍＲＮＡとは、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＭ＿０２０７６１．３に示される配列を指す。更に、特に説明がない限り、本開示において用いられる用語「標的遺伝子」とは、上記ＲＰＴＯＲｍＲＮＡをコードする遺伝子を指し、用語「標的ｍＲＮＡ」とは、上記ＲＰＴＯＲｍＲＮＡを指す。

【0023】

文脈において、特に説明がない限り、大文字Ｃ、Ｇ、Ｕ、Ａは、ヌクレオチドの塩基配列を表し、小文字ｍは、当該文字ｍの左側に隣接する１つのヌクレオチドがメトキシ修飾ヌクレオチドであることを表し、小文字ｆは、当該文字ｆの左側に隣接する１つのヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであることを表し、小文字ｓは、当該文字ｓの左右に隣接する２つのヌクレオチド間がチオリン酸エステル基により結合されていることを表し、Ｐ１は、当該Ｐ１の右側に隣接する１つのヌクレオチドが５’－リン酸ヌクレオチド又は５’－リン酸アナログ修飾ヌクレオチドであることを表す。いくつかの実施形態において、Ｐ１は、修飾が特定されたＶＰ、Ｐｓ又はＰを表し、組合せ文字ＶＰは、当該組合せ文字ＶＰの右側に隣接する１つのヌクレオチドがビニルリン酸エステル（５’－（Ｅ）－ｖｉｎｙｌｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅ、Ｅ－ＶＰ）修飾ヌクレオチドであることを表し、組合せ文字Ｐｓは、当該組合せ文字Ｐｓの右側に隣接する１つのヌクレオチドがチオリン酸エステル修飾ヌクレオチドであることを表し、大文字Ｐは、当該文字Ｐの右側に隣接する１つのヌクレオチドが５’－リン酸ヌクレオチドであることを表す。

【0024】

文脈において、前記「フルオロ修飾ヌクレオチド」とは、ヌクレオチドのリボース基の２’位のヒドロキシがフッ素で置換されたヌクレオチドを指し、「非フルオロ修飾ヌクレオチド」とは、ヌクレオチドのリボース基の２’位のヒドロキシが非フッ素基で置換されたヌクレオチド又はヌクレオチドアナログを指す。「ヌクレオチドアナログ」とは、核酸においてヌクレオチドの代わりとなることができるが、アデニンリボヌクレオチド、グアニンリボヌクレオチド、シトシンリボヌクレオチド、ウラシルリボヌクレオチド又はチミンデオキシリボヌクレオチドと構造が異なる基を指し、例えば、イソヌクレオチド、架橋ヌクレオチド（ｂｒｉｄｇｅｄｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄ、ＢＮＡと略称される）又は非環式ヌクレオチドがある。前記「メトキシ修飾ヌクレオチド」とは、リボース基の２’－ヒドロキシがメトキシで置換されたヌクレオチドを指す。

【0025】

本明細書の文脈において、用語「相補的」又は「逆相補的」は、互換的に使用されてもよく、当業者に周知の意味、即ち、二本鎖核酸分子において、一方の鎖の塩基と他方の鎖上の塩基とが相補的に対合するという意味を有する。ＤＮＡにおいて、プリン塩基であるアデニン（Ａ）は、常にピリミジン塩基であるチミン（Ｔ）（又は、ＲＮＡにおいてウラシル（Ｕ）である）と対合し、プリン塩基であるグアニン（Ｃ）は、常にピリミジン塩基であるシトシン（Ｇ）と対合する。各塩基対は、いずれも１つのプリンと１つのピリミジンを含む。一方の鎖上のアデニンが常に他方の鎖上のチミン（又はウラシル）と対合するとともに、グアニンが常にシトシンと対合する場合、両方の鎖同士が相補的である、またその相補的な鎖の配列から当該鎖の配列を推知できると考えられる。これに応じて、「ミスマッチ」は、本分野において、二本鎖核酸において、対応する位置の塩基が相補的に対合して存在しないことを意味する。

【0026】

文脈において、特に説明がない限り、「基本的に逆相補的」とは、関連する２つのヌクレオチド配列間に３つ以下の塩基ミスマッチが存在することを指し、「実質的に逆相補的」とは、２つのヌクレオチド配列間に１つ以下の塩基ミスマッチが存在することを指し、「完全に逆相補的」とは、２つのヌクレオチド配列間に塩基ミスマッチが存在しないことを指す。

【0027】

文脈において、一方のヌクレオチド配列と他方のヌクレオチド配列に「ヌクレオチド差異」が存在するとは、前者が後者に比べて、同じ位置のヌクレオチドの塩基種類が変化したことを指し、例えば、後者において１つのヌクレオチド塩基がＡであるとき、前者の同じ位置での、対応するヌクレオチド塩基がＵ、Ｃ、Ｇ又はＴである場合に、当該位置で２つのヌクレオチド配列間にヌクレオチド差異が存在すると認められている。いくつかの実施形態において、元の位置のヌクレオチドの代わりに無塩基ヌクレオチド又はその等価物を用いる場合、当該位置でヌクレオチド差異が生じたとも考えられる。無塩基ヌクレオチドとは、ヌクレオチドの核酸塩基が他の基又は水素原子で置換されたモノマー化合物であり、当該他の基は、置換又は非置換の芳香族基又はヘテロアリール基を含むが、これらに限定されない。

【0028】

文脈において、特に本開示のｓｉＲＮＡ、医薬組成物又はｓｉＲＮＡ複合体の調製方法を説明する際に、特に説明がない限り、前記ヌクレオシドモノマー（ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｍｏｎｏｍｅｒ）とは、調製対象のｓｉＲＮＡ又はｓｉＲＮＡ複合体におけるヌクレオチドの種類と順序に応じてホスホルアミダイト固相合成に用いられる修飾又は未修飾のヌクレオシドホスホルアミダイトモノマー（ｕｎｍｏｄｉｆｉｅｄｏｒｍｏｄｉｆｉｅｄＲＮＡｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅｓ。ＲＮＡｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅｓをＮｕｃｌｅｏｓｉｄｅｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅｓということもある）を指す。ホスホルアミダイト固相合成は、当業者に公知のＲＮＡ合成に用いられる方法である。本開示に用いられるヌクレオシドモノマーは、いずれも市販品として購入可能である。

【0029】

本開示の文脈において、特に説明がない限り、「複合」とは、それぞれ特定の機能を有する２つ以上の化学部分間が共有結合的に互いに結合されることを指し、これに応じて、「複合体」とは、当該各化学部分間が共有結合的に結合されることにより形成された化合物を指す。更に、「ｓｉＲＮＡ複合体」は、特定の機能を有する１つ又は複数の化学部分がｓｉＲＮＡに共有結合的に結合されて形成された化合物を表す。ｓｉＲＮＡ複合体は、文脈により、複数のｓｉＲＮＡ複合体の総称、又はある化学式に示されるｓｉＲＮＡ複合体であると理解されるべきである。本開示の文脈において、「複合分子」は、反応することによりｓｉＲＮＡに複合され、最終的に本開示のｓｉＲＮＡ複合体を形成することができる特定の化合物であると理解されるべきである。

【0030】

１つ又は複数の置換基を含む任意の基に関して、これらの基が、立体的に非現実的な、合成上実行不可能な及び／又は本質的に不安定な、いかなる置換又は置換パターンも導入することは意図されないと、当業者に理解される。

【0031】

本明細書で用いられる場合、「アルキル」とは、特定の数の炭素原子を有する直鎖と分岐鎖を指し、前記数は、通常１～２０個の炭素原子、例えば、１～８個又は１～６個などの１～１０個の炭素原子である。例えば、Ｃ_１－Ｃ_６アルキルは、１～６個の炭素原子を含む直鎖と分岐鎖アルキルである。特定の数の炭素を有するアルキル残基に言及する場合、当該数の炭素を有する全ての分岐鎖及び直鎖形態を含むことを意図する。したがって、例えば、「ブチル」は、ｎ－ブチル、ｓｅｃ－ブチル、イソブチル及びｔｅｒｔ－ブチルを含むことを意味し、「プロピル」は、ｎ－プロピル及びイソプロピルを含む。アルキレンは、アルキルのサブセットであり、アルキルと同じであるが２つの結合点を有する二価原子団を指す。

【0032】

本明細書で用いられる場合、「アルケニル」とは、少なくとも１つの炭素－炭素二重結合を有する不飽和分岐鎖又は直鎖アルキルを指し、前記炭素－炭素二重結合は、親アルキルの隣接する炭素原子から１つの水素分子を除去することにより得られる。当該基は、二重結合のシス又はトランス配置にあってもよい。典型的なアルケニル基としては、ビニルと、プロパ－１－エン－１－イル、プロパ－１－エン－２－イル、プロパ－２－エン－１－イル（アリル）、プロパ－２－エン－２－イルなどのプロペニルと、ブタ－１－エン－１－イル、ブタ－１－エン－２－イル、２－メチルプロパ－１－エン－１－イル、ブタ－２－エン－１－イル、ブタ－２－エン－２－イル、ブタ－１，３－ジエン－１－イル、ブタ－１，３－ジエン－２－イルなどのブテニルとを含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、アルケニル基は、２～２０個の炭素原子を有するが、他の実施形態において、２～１０個、２～８個又は２～６個の炭素原子を有する。アルケニレンは、アルケニルのサブセットであり、アルケニルと同じであるが２つの結合点を有する残基を指す。

【0033】

本明細書で用いられる場合、「アルコキシ」とは、酸素橋により結合された特定の数の炭素原子を有するアルキルを指し、例えば、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソプロポキシ、ｎ－ブトキシ、ｓｅｃ－ブトキシ、ｔｅｒｔ－ブトキシ、ペンチルオキシ、２－ペンチルオキシ、イソペンチルオキシ、ネオペンチルオキシ、ヘキシルオキシ、２－ヘキシルオキシ、３－ヘキシルオキシ、３－メチルペンチルオキシなどがある。アルコキシは、通常１～１０個、１～８個、１～６個又は１～４個の、酸素橋により結合された炭素原子を有する。

【0034】

本開示において各種のヒドロキシ保護基を用いることができる。一般的には、保護基は、化学官能基を特定の反応条件に不敏感にすることができ、かつ分子の残りの部分を実質的に損傷することなく分子中の当該官能基に付加する、及びそれから除去することができる。代表的なヒドロキシ保護基は、Ｂｅａｕｃａｇｅら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ１９９２，４８，２２２３－２３１１、及びＧｒｅｅｎｅａｎｄＷｕｔｓ，ＰｒｏｔｅｃｔｉｖｅＧｒｏｕｐｓｉｎＯｒｇａｎｉｃＳｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｃｈａｐｔｅｒ２，２ｄｅｄ，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ，１９９１に開示されており、引用により、上記文献は、それぞれ全体として本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態において、保護基は、塩基性条件で安定しているが、酸性条件で除去することができる。いくつかの実施形態において、本明細書で使用できるヒドロキシ保護基の非排他的な実例としては、ジメトキシトリチル（ＤＭＴ）、モノメトキシトリチル、９－フェニルキサンテン－９－イル（Ｐｉｘｙｌ）及び９－（ｐ－メトキシフェニル）キサンテン－９－イル（Ｍｏｘ）を含む。いくつかの実施形態において、本明細書で使用できるヒドロキシ保護基の非排他的な実例としては、Ｔｒ（トリチル）、ＭＭＴｒ（４－メトキシトリチル）、ＤＭＴｒ（４，４’－ジメトキシトリチル）及びＴＭＴｒ（４，４’，４’’－トリメトキシトリチル）を含む。

【0035】

用語「被験体」は、本明細書で用いられる場合、任意の動物、例えば、哺乳動物又は有袋動物を指す。本開示の被験体としては、ヒト、非ヒト霊長類（例えば、アカゲザル又は他の種類のマカク属のサル）、マウス、ブタ、ウマ、ロバ、ウシ、ヒツジ、ラット及び任意の種類の家禽を含むが、これらに限定されない。

【0036】

本明細書で用いられる場合、「治療」とは、有益な又は所望の結果を得る方法を指し、治療効果を含むが、これに限定されない。「治療効果」は、治療される潜在的障害を根絶又は改善することを意味する。また、治療効果は、被験体が依然として潜在的障害の苦痛を受ける可能性があるにもかかわらず、潜在的障害に関連する１つ又は複数の生理的症状を根絶又は改善することにより、被験体に改善が観察されて得られる。

【0037】

本明細書で用いられる場合、「予防」とは、有益な又は所望の結果を得る方法を指し、予防効果を含むが、これに限定されない。「予防効果」を得るために、特定の疾患に対する診断が行われていないかもしれないが、ｓｉＲＮＡ、医薬組成物又はｓｉＲＮＡ複合体を、当該疾患に罹患するリスクのある被験体に投与するか、又は当該疾患の１つ又は複数の生理的症状が報告された被験体に投与することができる。

【0038】

本開示のｓｉＲＮＡ
一態様において、本開示は、ＲＰＴＯＲ遺伝子発現を抑制することができるｓｉＲＮＡを提供する。

【0039】

本開示のｓｉＲＮＡは、基本的な構造単位としてヌクレオチド基を含み、前記ヌクレオチド基がリン酸基、リボース基及び塩基を含むことは、当業者に公知であるので、ここでは説明を省略する。

【0040】

本開示のｓｉＲＮＡは、センス鎖とアンチセンス鎖とを含み、前記センス鎖とアンチセンス鎖とは、長さが同じか又は異なり、前記センス鎖の長さが１９～２３ヌクレオチドであり、アンチセンス鎖の長さが１９～２６ヌクレオチドである。このように、本開示により提供されるｓｉＲＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖の長さ比は、１９／１９、１９／２０、１９／２１、１９／２２、１９／２３、１９／２４、１９／２５、１９／２６、２０／２０、２０／２１、２０／２２、２０／２３、２０／２４、２０／２５、２０／２６、２１／２０、２１／２１、２１／２２、２１／２３、２１／２４、２１／２５、２１／２６、２２／２０、２２／２１、２２／２２、２２／２３、２２／２４、２２／２５、２２／２６、２３／２０、２３／２１、２３／２２、２３／２３、２３／２４、２３／２５又は２３／２６であってもよい。いくつかの実施形態において、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖の長さ比は、１９／２１、２１／２１、２１／２３又は２３／２５である。

【0041】

本開示によれば、前記ｓｉＲＮＡは、センス鎖とアンチセンス鎖とを含み、前記ｓｉＲＮＡにおけるヌクレオチドは、それぞれ独立して修飾又は未修飾のヌクレオチドであり、前記センス鎖はヌクレオチド配列Ｉを含み、アンチセンス鎖はヌクレオチド配列ＩＩを含み、前記ヌクレオチド配列Ｉと前記ヌクレオチド配列ＩＩとは、少なくとも一部で逆相補的に二本鎖領域を形成する。

【0042】

いくつかの実施形態において、本開示のｓｉＲＮＡは、以下の第１種、第２種又は第３種のｓｉＲＮＡであってもよく、以下、各種のｓｉＲＮＡをそれぞれ説明する。

【0043】

第１種のｓｉＲＮＡ
いくつかの実施形態において、本開示のｓｉＲＮＡは、第１種のｓｉＲＮＡである。前記ヌクレオチド配列Ｉと配列番号１に示されるヌクレオチド配列とは、長さが等しく、ヌクレオチド差異が３つ以下であり、前記ヌクレオチド配列ＩＩと配列番号２に示されるヌクレオチド配列とは、長さが等しく、ヌクレオチド差異が３つ以下であり、
５’－ＣＵＧＣＣＡＵＧＧＡＧＵＡＵＣＵＧＡＺ_ａ１－３’（配列番号１）、
５’－Ｚ_ａ２ＵＣＡＧＡＵＡＣＵＣＣＡＵＧＧＣＡＧ－３’（配列番号２）
ただし、Ｚ_ａ１はＡであり、Ｚ_ａ２はＵであり、前記ヌクレオチド配列Ｉに、位置がＺ_ａ１に対応するヌクレオチドＺ_ａ３が含まれ、前記ヌクレオチド配列ＩＩに、位置がＺ_ａ２に対応するヌクレオチドＺ_ａ４が含まれ、前記Ｚ_ａ４は、前記アンチセンス鎖の５’末端の第１位のヌクレオチドである。

【0044】

文脈において、「位置が対応する」とは、ヌクレオチド配列の同一端から、ヌクレオチド配列において同じ位置にあることを指す。例えば、ヌクレオチド配列Ｉの３’末端の第１位のヌクレオチドは、位置が配列番号１の３’末端の第１位のヌクレオチドに対応するヌクレオチドである。

【0045】

いくつかの実施形態において、前記センス鎖は、ヌクレオチド配列Ｉのみを含み、前記アンチセンス鎖は、ヌクレオチド配列ＩＩのみを含む。いくつかの実施形態において、前記ヌクレオチド配列Ｉと配列番号１に示されるヌクレオチド配列とは、ヌクレオチド差異が１つ以下であり、及び／又は前記ヌクレオチド配列ＩＩと配列番号２に示されるヌクレオチド配列とは、ヌクレオチド配列差異が１つ以下である。

【0046】

いくつかの実施形態において、前記ヌクレオチド配列ＩＩと配列番号２に示されるヌクレオチド配列との間のヌクレオチド差異は、Ｚ_ａ４の位置での差異を含み、Ｚ_ａ４がＡ、Ｃ又はＧから選択される。いくつかの実施形態において、Ｚ_ａ３は、Ｚ_ａ４と相補的なヌクレオチドである。上記ヌクレオチド差異を有するｓｉＲＮＡは、標的ｍＲＮＡ抑制能力が高く、これらのヌクレオチド差異を含むｓｉＲＮＡも、本開示の保護範囲内にある。

【0047】

いくつかの実施形態において、前記ヌクレオチド配列Ｉと前記ヌクレオチド配列ＩＩとは、基本的に逆相補的、実質的に逆相補的又は完全に逆相補的であり、前記基本的に逆相補的とは、２つのヌクレオチド配列間に３つ以下の塩基ミスマッチが存在することを指し、前記実質的に逆相補的とは、２つのヌクレオチド配列間に１つ以下の塩基ミスマッチが存在することを指し、完全に逆相補的とは、２つのヌクレオチド配列間に塩基ミスマッチがないことを指す。

【0048】

いくつかの実施形態において、前記センス鎖とアンチセンス鎖とは、長さが同じか又は異なり、前記センス鎖の長さが１９～２３ヌクレオチドであり、アンチセンス鎖の長さが１９～２６ヌクレオチドであり、前記ヌクレオチド配列Ｉは、配列番号３に示されるヌクレオチド配列であり、前記ヌクレオチド配列ＩＩは、配列番号４に示されるヌクレオチド配列であり、
５’－ＣＵＧＣＣＡＵＧＧＡＧＵＡＵＣＵＧＡＺ_ａ３－３’（配列番号３）、
５’－Ｚ_ａ４ＵＣＡＧＡＵＡＣＵＣＣＡＵＧＧＣＡＧ－３’（配列番号４）
ただし、Ｚ_ａ３は、Ａ、Ｕ、Ｇ又はＣから選択され、Ｚ_ａ４は、Ｚ_ａ３と相補的なヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、Ｚ_ａ３はＡであり、Ｚ_ａ４はＵである。

【0049】

いくつかの実施形態において、前記センス鎖は、ヌクレオチド配列ＩＩＩを更に含み、前記アンチセンス鎖は、ヌクレオチド配列ＩＶを更に含み、ヌクレオチド配列ＩＩＩとヌクレオチド配列ＩＶとは、長さがそれぞれ１～４ヌクレオチドであり、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩと前記ヌクレオチド配列ＩＶとは、長さが等しく、実質的に逆相補的又は完全に逆相補的であり、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩは、前記ヌクレオチド配列Ｉの５’末端に結合され、前記ヌクレオチド配列ＩＶは、前記ヌクレオチド配列ＩＩの３’末端に結合される。

【0050】

いくつかの実施形態において、前記ヌクレオチド配列ＩＶと第２のヌクレオチド配列は、実質的に逆相補的又は完全に逆相補的であり、当該第２のヌクレオチド配列とは、標的ｍＲＮＡにおける、配列番号１に示されるヌクレオチド配列の５’末端に隣接し、かつ長さが前記ヌクレオチド配列ＩＶと同じであるヌクレオチド配列を指す。いくつかの実施形態において、５’から３’に向かって、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩとヌクレオチド配列ＩＶとは、長さがいずれも１ヌクレオチドであり、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基がＡであり、ヌクレオチド配列ＩＶの塩基がＵであり、このとき、センス鎖とアンチセンス鎖の長さ比が２０／２０であり、或いは、ヌクレオチド配列ＩＩＩとＩＶとは、長さがいずれも２ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基配列がＣＡであり、ヌクレオチド配列ＩＶの塩基配列がＵＧであり、このとき、センス鎖とアンチセンス鎖の長さ比が２１／２１であり、或いは、ヌクレオチド配列ＩＩＩとＩＶとは、長さがいずれも３ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基配列がＵＣＡであり、ヌクレオチド配列ＩＶの塩基配列がＵＧＡであり、このとき、センス鎖とアンチセンス鎖の長さ比が２２／２２であり、或いは、ヌクレオチド配列ＩＩＩとＩＶとは、長さがいずれも４ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基配列がＧＵＣＡであり、ヌクレオチド配列ＩＶの塩基配列がＵＧＡＣであり、このとき、センス鎖とアンチセンス鎖の長さ比が２３／２３である。

【0051】

いくつかの実施形態において、ヌクレオチド配列ＩＩＩとヌクレオチド配列ＩＶとは、完全に逆相補的であるため、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基が与えられると、ヌクレオチド配列ＩＶの塩基も決定される。

【0052】

第２種のｓｉＲＮＡ
いくつかの実施形態において、本開示のｓｉＲＮＡは、第２種のｓｉＲＮＡである。前記ヌクレオチド配列Ｉと配列番号１２３に示されるヌクレオチド配列とは、長さが等しく、ヌクレオチド差異が３つ以下であり、前記ヌクレオチド配列ＩＩと配列番号１２４に示されるヌクレオチド配列とは、長さが等しく、ヌクレオチド差異が３つ以下であり、
５’－ＡＣＡＡＣＡＵＣＡＡＧＵＡＣＵＡＣＧＺ_ｂ１－３’（配列番号１２３）、
５’－Ｚ_ｂ２ＣＧＵＡＧＵＡＣＵＵＧＡＵＧＵＵＧＵ－３’（配列番号１２４）
ただし、Ｚ_ｂ１はＡであり、Ｚ_ｂ２はＵであり、前記ヌクレオチド配列Ｉに、位置がＺ_ｂ１に対応するヌクレオチドＺ_ｂ３が含まれ、前記ヌクレオチド配列ＩＩに、位置がＺ_ｂ２に対応するヌクレオチドＺ_ｂ４が含まれ、前記Ｚ_ｂ４は、前記アンチセンス鎖の５’末端の第１位のヌクレオチドである。

【0053】

いくつかの実施形態において、前記センス鎖は、ヌクレオチド配列Ｉのみを含み、前記アンチセンス鎖は、ヌクレオチド配列ＩＩのみを含む。いくつかの実施形態において、前記ヌクレオチド配列Ｉと配列番号１２３に示されるヌクレオチド配列とは、ヌクレオチド差異が１つ以下であり、及び／又は前記ヌクレオチド配列ＩＩと配列番号１２４に示されるヌクレオチド配列とは、ヌクレオチド差異が１つ以下である。

【0054】

いくつかの実施形態において、前記ヌクレオチド配列ＩＩと配列番号１２４に示されるヌクレオチド配列との間のヌクレオチド差異は、Ｚ_ｂ４の位置での差異を含み、Ｚ_ｂ４がＡ、Ｃ又はＧから選択される。いくつかの実施形態において、Ｚ_ｂ３は、Ｚ_ｂ４と相補的なヌクレオチドである。上記ヌクレオチド差異を有するｓｉＲＮＡは、標的ｍＲＮＡ抑制能力が高く、これらのヌクレオチド差異を含むｓｉＲＮＡも、本開示の保護範囲内にある。

【0055】

【0056】

いくつかの実施形態において、前記ヌクレオチド配列Ｉは、配列番号１２５に示されるヌクレオチド配列であり、前記ヌクレオチド配列ＩＩは、配列番号１２６に示されるヌクレオチド配列であり、
５’－ＡＣＡＡＣＡＵＣＡＡＧＵＡＣＵＡＣＧＺ_ｂ３－３’（配列番号１２５）、
５’－Ｚ_ｂ４ＣＧＵＡＧＵＡＣＵＵＧＡＵＧＵＵＧＵ－３’（配列番号１２６）
ただし、Ｚ_ｂ３は、Ａ、Ｕ、Ｇ又はＣから選択され、Ｚ_ｂ４は、Ｚ_ｂ３と相補的なヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、Ｚ_ｂ３はＡであり、Ｚ_ｂ４はＵである。

【0057】

【0058】

いくつかの実施形態において、前記ヌクレオチド配列ＩＶと第２のヌクレオチド配列は、実質的に逆相補的又は完全に逆相補的であり、当該第２のヌクレオチド配列とは、標的ｍＲＮＡにおける、配列番号１２３に示されるヌクレオチド配列の５’末端に隣接し、かつ長さが前記ヌクレオチド配列ＩＶと同じであるヌクレオチド配列を指す。いくつかの実施形態において、５’から３’に向かって、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩとヌクレオチド配列ＩＶとは、長さがいずれも１ヌクレオチドであり、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基がＡであり、ヌクレオチド配列ＩＶの塩基がＵであり、このとき、センス鎖とアンチセンス鎖の長さ比が２０／２０であり、或いは、ヌクレオチド配列ＩＩＩとＩＶとは、長さがいずれも２ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基配列がＣＡであり、ヌクレオチド配列ＩＶの塩基配列がＵＧであり、このとき、センス鎖とアンチセンス鎖の長さ比が２１／２１であり、或いは、ヌクレオチド配列ＩＩＩとＩＶとは、長さがいずれも３ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基配列がＵＣＡであり、ヌクレオチド配列ＩＶの塩基配列がＵＧＡであり、このとき、センス鎖とアンチセンス鎖の長さ比が２２／２２であり、或いは、ヌクレオチド配列ＩＩＩとＩＶとは、長さがいずれも４ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基配列がＡＵＣＡであり、ヌクレオチド配列ＩＶの塩基配列がＵＧＡＵであり、このとき、センス鎖とアンチセンス鎖の長さ比が２３／２３である。

【0059】

【0060】

第３種のｓｉＲＮＡ
いくつかの実施形態において、本開示のｓｉＲＮＡは、第３種のｓｉＲＮＡである。前記ヌクレオチド配列Ｉと配列番号２４５に示されるヌクレオチド配列とは、長さが等しく、ヌクレオチド差異が３つ以下であり、前記ヌクレオチド配列ＩＩと配列番号２４６に示されるヌクレオチド配列とは、長さが等しく、ヌクレオチド差異が３つ以下であり、
５’－ＣＧＡＣＵＡＣＵＡＣＡＵＣＵＣＣＧＵＺ_ｃ１－３’（配列番号２４５）、
５’－Ｚ_ｃ２ＡＣＧＧＡＧＡＵＧＵＡＧＵＡＧＵＣＧ－３’（配列番号２４６）
ただし、Ｚ_ｃ１はＧであり、Ｚ_ｃ２はＣであり、前記ヌクレオチド配列Ｉに、位置がＺ_ｃ１に対応するヌクレオチドＺ_ｃ３が含まれ、前記ヌクレオチド配列ＩＩに、位置がＺ_ｃ２に対応するヌクレオチドＺ_ｃ４が含まれ、前記Ｚ_ｃ４は、前記アンチセンス鎖の５’末端の第１位のヌクレオチドである。

【0061】

いくつかの実施形態において、前記センス鎖は、ヌクレオチド配列Ｉのみを含み、前記アンチセンス鎖は、ヌクレオチド配列ＩＩのみを含む。いくつかの実施形態において、前記ヌクレオチド配列Ｉと配列番号２４５に示されるヌクレオチド配列とは、ヌクレオチド差異が１つ以下であり、及び／又は前記ヌクレオチド配列ＩＩと配列番号２４６に示されるヌクレオチド配列とは、ヌクレオチド差異が１つ以下である。

【0062】

いくつかの実施形態において、前記ヌクレオチド配列ＩＩと配列番号２４６に示されるヌクレオチド配列との間のヌクレオチド差異は、Ｚ_ｃ４の位置での差異を含み、Ｚ_ｃ４がＡ、Ｕ又はＧから選択される。いくつかの実施形態において、Ｚ_ｃ３は、Ｚ_ｃ４と相補的なヌクレオチドである。上記ヌクレオチド差異を有するｓｉＲＮＡは、標的ｍＲＮＡ抑制能力が高く、これらのヌクレオチド差異を含むｓｉＲＮＡも、本開示の保護範囲内にある。

【0063】

【0064】

いくつかの実施形態において、前記ヌクレオチド配列Ｉは、配列番号２４７に示されるヌクレオチド配列であり、ヌクレオチド配列ＩＩは、配列番号２４８に示されるヌクレオチド配列であり、
５’－ＣＧＡＣＵＡＣＵＡＣＡＵＣＵＣＣＧＵＺ_ｃ３－３’（配列番号２４７）、
５’－Ｚ_ｃ４ＡＣＧＧＡＧＡＵＧＵＡＧＵＡＧＵＣＧ－３’（配列番号２４８）
ただし、Ｚ_ｃ３は、Ａ、Ｕ、Ｇ又はＣから選択され、Ｚ_ｃ４は、Ｚ_ｃ３と相補的なヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、Ｚ_ｃ３はＧであり、Ｚ_ｃ４はＣである。

【0065】

【0066】

いくつかの実施形態において、前記ヌクレオチド配列ＩＶと第２のヌクレオチド配列は、実質的に逆相補的又は完全に逆相補的であり、当該第２のヌクレオチド配列とは、標的ｍＲＮＡにおける、配列番号２４５に示されるヌクレオチド配列の５’末端に隣接し、かつ長さが前記ヌクレオチド配列ＩＶと同じであるヌクレオチド配列を指す。いくつかの実施形態において、５’から３’に向かって、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩとヌクレオチド配列ＩＶとは、長さがいずれも１ヌクレオチドであり、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基がＡであり、ヌクレオチド配列ＩＶの塩基がＵであり、このとき、センス鎖とアンチセンス鎖の長さ比が２０／２０であり、或いは、ヌクレオチド配列ＩＩＩとＩＶとは、長さがいずれも２ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基配列がＡＡであり、ヌクレオチド配列ＩＶの塩基配列がＵＵであり、このとき、センス鎖とアンチセンス鎖の長さ比が２１／２１であり、或いは、ヌクレオチド配列ＩＩＩとＩＶとは、長さがいずれも３ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基配列がＣＡＡであり、ヌクレオチド配列ＩＶの塩基配列がＵＵＧであり、このとき、センス鎖とアンチセンス鎖の長さ比が２２／２２であり、或いは、ヌクレオチド配列ＩＩＩとＩＶとは、長さがいずれも４ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基配列がＧＣＡＡであり、ヌクレオチド配列ＩＶの塩基配列がＵＵＧＣであり、このとき、センス鎖とアンチセンス鎖の長さ比が２３／２３である。

【0067】

【0068】

以下、ヌクレオチド配列Ｖ、ヌクレオチド配列ＶＩ、核酸配列、ｓｉＲＮＡ中のヌクレオチド修飾及び修飾配列の説明は、上記第１種のｓｉＲＮＡ、第２種のｓｉＲＮＡ又は第３種のｓｉＲＮＡに適用される。即ち、特に明記されていない場合、以下、ｓｉＲＮＡの説明は、第１種のｓｉＲＮＡ、第２種のｓｉＲＮＡ及び第３種のｓｉＲＮＡを１つずつ説明したものとみなされるべきである。例えば、特定のｓｉＲＮＡが指定されていない場合、「前記ｓｉＲＮＡがヌクレオチド配列Ｖを更に含む」とは、「第１種のｓｉＲＮＡ、第２種のｓｉＲＮＡ又は第３種のｓｉＲＮＡがヌクレオチド配列Ｖを更に含む」ことを意味する。

【0069】

いくつかの実施形態において、前記センス鎖とアンチセンス鎖とは、長さが異なり、前記アンチセンス鎖は、ヌクレオチド配列Ｖを更に含み、ヌクレオチド配列Ｖは、長さが１～３ヌクレオチドであり、前記アンチセンス鎖の３’末端に結合され、アンチセンス鎖の３’突出端を構成する。

【0070】

いくつかの実施形態において、前記センス鎖は、ヌクレオチド配列ＶＩを更に含み、ヌクレオチド配列ＶＩは、長さが１～３ヌクレオチドであり、前記センス鎖の３’末端に結合され、センス鎖の３’突出端を構成する。

【0071】

いくつかの実施形態において、本開示により提供されるｓｉＲＮＡは、ヌクレオチド配列Ｖを含むが、ヌクレオチド配列ＶＩを含まない。これにより、本開示により提供されるｓｉＲＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖の長さ比は、１９／２０、１９／２１、１９／２２、２０／２１、２０／２２、２０／２３、２１／２２、２１／２３、２１／２４、２２／２３、２２／２４、２２／２５、２３／２４、２３／２５又は２３／２６であってもよい。いくつかの実施形態において、本開示により提供されるｓｉＲＮＡは、ヌクレオチド配列Ｖ及びＶＩを含む。いくつかの実施形態において、ヌクレオチド配列Ｖとヌクレオチド配列ＶＩとは、長さが同じか又は異なる。これにより、本開示により提供されるｓｉＲＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖の長さ比は、（１９～２６）：（１９～２６）であってもよい。いくつかの実施形態において、前記ヌクレオチド配列Ｖ及び／又はＶＩは、長さが２ヌクレオチドであり、これにより、本開示により提供されるｓｉＲＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖の長さ比は、１９／２１、２１／２１、２１／２３、２３／２３、２３／２５又は２５／２５であってもよい。

【0072】

前記ヌクレオチド配列Ｖにおける各ヌクレオチドは、任意のヌクレオチドであってもよく、合成しやすく合成コストを節約するために、いくつかの実施形態において、前記ヌクレオチド配列Ｖは、連続した２つのチミンデオキシリボヌクレオチド（ｄＴｄＴ）又は連続した２つのウラシルリボヌクレオチド（ＵＵ）であり、或いは、ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖と標的ｍＲＮＡとの親和力を向上させるために、ヌクレオチド配列Ｖは、標的ｍＲＮＡの対応する位置のヌクレオチドと相補的である。したがって、いくつかの実施形態において、本開示のｓｉＲＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖の長さ比は、１９／２１又は２１／２３であり、このとき、本開示のｓｉＲＮＡは、より高いｍＲＮＡサイレンシング活性を有する。

【0073】

前記ヌクレオチド配列ＶＩにおける各ヌクレオチドは、任意のヌクレオチドであってもよく、合成しやすく合成コストを節約するために、いくつかの実施形態において、前記ヌクレオチド配列ＶＩは、連続した２つのチミンデオキシリボヌクレオチド（ｄＴｄＴ）又は連続した２つのウラシルリボヌクレオチド（ＵＵ）であり、或いは、ｓｉＲＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖との親和力を向上させるために、ヌクレオチド配列ＶＩは、標的ｍＲＮＡの対応する位置のヌクレオチドと同じである。したがって、いくつかの実施形態において、本開示のｓｉＲＮＡは、ヌクレオチド配列Ｖ及びＶＩを含み、ｓｉＲＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖の長さ比は、２１／２１又は２３／２３であり、このとき、本開示のｓｉＲＮＡは、より高いｍＲＮＡサイレンシング活性を有する。

【0074】

標的ｍＲＮＡの対応する位置のヌクレオチドとは、５’末端で標的ｍＲＮＡのヌクレオチド配列に隣接するヌクレオチド又はヌクレオチド配列を指し、当該標的ｍＲＮＡのヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列ＩＩと実質的に逆相補的又は完全に逆相補的であるヌクレオチド配列であるか、又はヌクレオチド配列ＩＩ及びヌクレオチド配列ＩＶから構成されるヌクレオチド配列と実質的に逆相補的又は完全に逆相補的であるヌクレオチド配列である。

【0075】

いくつかの実施形態において、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、配列番号５に示されるヌクレオチドを含み、前記ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖は、配列番号６に示されるヌクレオチド配列を含み、
５’－ＣＵＧＣＣＡＵＧＧＡＧＵＡＵＣＵＧＡＺ_ａ３－３’（配列番号５）、
５’－Ｚ_ａ４ＵＣＡＧＡＵＡＣＵＣＣＡＵＧＧＣＡＧＵＧ－３’（配列番号６）
ただし、前記Ｚ_ａ４は、アンチセンス鎖の５’末端の第１位のヌクレオチドであり、Ｚ_ａ３は、Ａ、Ｕ、Ｇ又はＣから選択され、Ｚ_ａ４は、Ｚ_ａ３と相補的なヌクレオチドであり、
或いは、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、配列番号７に示されるヌクレオチド配列を含み、前記ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖は、配列番号８に示されるヌクレオチド配列を含み、
５’－ＣＡＣＵＧＣＣＡＵＧＧＡＧＵＡＵＣＵＧＡＺ_ａ３－３’（配列番号７）、
５’－Ｚ_ａ４ＵＣＡＧＡＵＡＣＵＣＣＡＵＧＧＣＡＧＵＧＡＣ－３’（配列番号８）
ただし、前記Ｚ_ａ４は、アンチセンス鎖の５’末端の第１位のヌクレオチドであり、Ｚ_ａ３は、Ａ、Ｕ、Ｇ又はＣから選択され、Ｚ_ａ４は、Ｚ_ａ３と相補的なヌクレオチドである。

【0076】

いくつかの実施形態において、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、配列番号１２７に示されるヌクレオチド配列を含み、前記ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖は、配列番号１２８に示されるヌクレオチド配列を含み、
５’－ＡＣＡＡＣＡＵＣＡＡＧＵＡＣＵＡＣＧＺ_ｂ３－３’（配列番号１２７）、
５’－Ｚ_ｂ４ＣＧＵＡＧＵＡＣＵＵＧＡＵＧＵＵＧＵＵＧ－３’（配列番号１２８）
或いは、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、配列番号１２９に示されるヌクレオチド配列を含み、前記ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖は、配列番号１３０に示されるヌクレオチド配列を含み、
５’－ＣＡＡＣＡＡＣＡＵＣＡＡＧＵＡＣＵＡＣＧＺ_ｂ３－３’（配列番号１２９）、
５’－Ｚ_ｂ４ＣＧＵＡＧＵＡＣＵＵＧＡＵＧＵＵＧＵＵＧＡＵ－３’（配列番号１３０）
ただし、前記Ｚ_ｂ４は、アンチセンス鎖の５’末端の第１位のヌクレオチドであり、Ｚ_ｂ３は、Ａ、Ｕ、Ｇ又はＣから選択され、Ｚ_ｂ４は、Ｚ_ｂ３と相補的なヌクレオチドである。

【0077】

いくつかの実施形態において、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、配列番号２４９に示されるヌクレオチド配列を含み、前記ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖は、配列番号２５０に示されるヌクレオチド配列を含み、
５’－ＣＧＡＣＵＡＣＵＡＣＡＵＣＵＣＣＧＵＺ_ｃ３－３’（配列番号２４９）、
５’－Ｚ_ｃ４ＡＣＧＧＡＧＡＵＧＵＡＧＵＡＧＵＣＧＵＵ－３’（配列番号２５０）
或いは、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、配列番号２５１に示されるヌクレオチド配列を含み、前記ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖は、配列番号２５２に示されるヌクレオチド配列を含み、
５’－ＡＡＣＧＡＣＵＡＣＵＡＣＡＵＣＵＣＣＧＵＺ_ｃ３－３’（配列番号２５１）、
５’－Ｚ_ｃ４ＡＣＧＧＡＧＡＵＧＵＡＧＵＡＧＵＣＧＵＵＧＣ－３’（配列番号２５２）
ただし、前記Ｚ_ｃ４は、アンチセンス鎖の５’末端の第１位のヌクレオチドであり、Ｚ_ｃ３は、Ａ、Ｕ、Ｇ又はＣから選択され、Ｚ_ｃ４は、Ｚ_ｃ３と相補的なヌクレオチドである。

【0078】

いくつかの実施形態において、本開示に記載されたｓｉＲＮＡは、表１に列挙されたｓｉＲＰＴＯＲａ１、ｓｉＲＰＴＯＲａ２、ｓｉＲＰＴＯＲａ３、ｓｉＲＰＴＯＲｂ１、ｓｉＲＰＴＯＲｂ２、ｓｉＲＰＴＯＲｂ３、ｓｉＲＰＴＯＲｃ１、ｓｉＲＰＴＯＲｃ２及びｓｉＲＰＴＯＲｃ３である。

【0079】

前述したように、本開示のｓｉＲＮＡにおけるヌクレオチドは、それぞれ独立して修飾又は未修飾のヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、本開示のｓｉＲＮＡにおけるヌクレオチドは、未修飾ヌクレオチドであり、いくつかの実施形態において、本開示のｓｉＲＮＡにおけるヌクレオチドの一部又は全部は、修飾ヌクレオチドであり、ヌクレオチド基上のこれらの修飾により、本開示のｓｉＲＮＡがＲＰＴＯＲ遺伝子発現を抑制する機能を明らかに弱めるか又は喪失させることがない。

【0080】

いくつかの実施形態において、本開示のｓｉＲＮＡは、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む。本開示の文脈において、用いられる用語「修飾ヌクレオチド」とは、ヌクレオチドのリボース基の２’位のヒドロキシ基が他の基で置換されたヌクレオチド又はヌクレオチドアナログ、或いは、ヌクレオチド上の塩基が修飾された塩基であるヌクレオチドを指す。前記修飾ヌクレオチドにより、ｓｉＲＮＡが遺伝子発現を抑制する機能を明らかに弱めるか又は喪失させることがない。例えば、Ｊ．Ｋ．Ｗａｔｔｓ，Ｇ．Ｆ．Ｄｅｌｅａｖｅｙ，ａｎｄＭ．Ｊ．Ｄａｍｈａ，ＣｈｅｍｉｃａｌｌｙｍｏｄｉｆｉｅｄｓｉＲＮＡ：ｔｏｏｌｓａｎｄａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．ＤｒｕｇＤｉｓｃｏｖＴｏｄａｙ，２００８，１３（１９－２０）：８４２－５５に開示された修飾ヌクレオチドを選択してもよい。

【0081】

いくつかの実施形態において、本開示により提供されるｓｉＲＮＡのセンス鎖又は前記アンチセンス鎖は、少なくとも１つのヌクレオチドが修飾ヌクレオチドであり、及び／又は少なくとも１つのリン酸エステル基が修飾基を有するリン酸エステル基である。言い換えれば、前記センス鎖と前記アンチセンス鎖において、少なくとも１本の一本鎖のリン酸－糖骨格中のリン酸エステル基及び／又はリボース基の少なくとも一部は、修飾基を有するリン酸エステル基及び／又は修飾基を有するリボース基である。

【0082】

いくつかの実施形態において、前記センス鎖及び／又は前記アンチセンス鎖におけるヌクレオチドは、全て修飾ヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、本開示により提供されるｓｉＲＮＡのセンス鎖と前記アンチセンス鎖における各ヌクレオチドは、独立してフルオロ修飾ヌクレオチド又は非フルオロ修飾ヌクレオチドである。

【0083】

本開示の発明者は、驚くべきことに、本開示により提供されるｓｉＲＮＡにより、動物実験において血漿中安定性と遺伝子サイレンシング効率の高度なバランスが取られていることを見出した。

【0084】

いくつかの実施形態において、前記フルオロ修飾ヌクレオチドは、ヌクレオチド配列Ｉとヌクレオチド配列ＩＩに位置し、前記ヌクレオチド配列Ｉにおけるフルオロ修飾ヌクレオチドが５つ以下であり、５’末端から３’末端に向かって、前記ヌクレオチド配列Ｉの第７、８、９位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであり、前記ヌクレオチド配列ＩＩにおけるフルオロ修飾ヌクレオチドが７つ以下であり、前記ヌクレオチド配列ＩＩの第２、６、１４、１６位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドである。

【0085】

いくつかの実施形態において、５’末端から３’末端に向かって、前記センス鎖において、前記ヌクレオチド配列Ｉの第７、８、９位又は５、７、８、９位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであり、残りの位置のヌクレオチドが非フルオロ修飾ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、前記アンチセンス鎖において、前記ヌクレオチド配列ＩＩの第２、６、１４、１６位又は第２、６、８、９、１４、１６位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであり、残りの位置のヌクレオチドが非フルオロ修飾ヌクレオチドである。

【0086】

本開示の文脈において、「フルオロ修飾ヌクレオチド」とは、ヌクレオチドのリボース基の２’位のヒドロキシがフッ素で置換された、以下の式（７）に示される構造を有するヌクレオチドを指す。「非フルオロ修飾ヌクレオチド」とは、ヌクレオチドのリボース基の２’位のヒドロキシが非フッ素基で置換されたヌクレオチド又はヌクレオチドアナログを指す。いくつかの実施形態において、各非フルオロ修飾ヌクレオチドは、ヌクレオチドのリボース基の２’位のヒドロキシが非フッ素基で置換されたヌクレオチド又はヌクレオチドアナログから独立して選択される１つである。

【0087】

これらのリボース基の２’位のヒドロキシが非フッ素基で置換されたヌクレオチドは、当業者に公知であり、これらのヌクレオチドは、２’－アルコキシ修飾ヌクレオチド、２’－置換アルコキシ修飾ヌクレオチド、２’－アルキル修飾ヌクレオチド、２’－置換アルキル修飾ヌクレオチド、２’－アミノ修飾ヌクレオチド、２’－置換アミノ修飾ヌクレオチド、２’－デオキシヌクレオチドから選択される１つであってもよい。

【0088】

いくつかの実施形態において、２’－アルコキシ修飾ヌクレオチドは、式（８）に示されるメトキシ修飾ヌクレオチド（２’－ＯＭｅ）である。いくつかの実施形態において、２’－置換アルコキシ修飾ヌクレオチドは、例えば、式（９）に示される２’－Ｏ－メトキシエチル修飾ヌクレオチド（２’－ＭＯＥ）であってもよい。いくつかの実施形態において、２’－アミノ修飾ヌクレオチド（２’－ＮＨ_２）は、式（１０）に示される。いくつかの実施形態において、２’－デオキシヌクレオチド（ＤＮＡ）は、式（１１）に示される。

【0089】

【化1】

【0090】

ヌクレオチドアナログとは、核酸においてヌクレオチドの代わりとなることができるが、アデニンリボヌクレオチド、グアニンリボヌクレオチド、シトシンリボヌクレオチド、ウラシルリボヌクレオチド又はチミンデオキシリボヌクレオチドと構造が異なる基を指す。いくつかの実施形態において、ヌクレオチドアナログは、イソヌクレオチド、架橋ヌクレオチド（ｂｒｉｄｇｅｄｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄ、ＢＮＡと略称される）又は非環式ヌクレオチドであってもよい。

【0091】

ＢＮＡとは、拘束された又は近づけないヌクレオチドを指す。ＢＮＡは、五員環、六員環又は七員環の、「固定された」Ｃ３’－エンド糖パッカリングを有する架橋構造を含んでもよい。通常、当該橋を当該リボースの２’－、４’－位に導入して２’，４’－ＢＮＡヌクレオチドを提供する。いくつかの実施形態において、ＢＮＡは、式（１２）に示されるＬＮＡ、式（１３）に示されるＥＮＡ、式（１４）に示されるｃＥＴＢＮＡなどであってもよい。

【0092】

【化2】

【0093】

非環式ヌクレオチドは、ヌクレオチドの糖環が開環されたヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、非環式ヌクレオチドは、式（１５）に示されるアンロック核酸（ＵＮＡ）、又は式（１６）に示されるグリセロール核酸（ＧＮＡ）であってもよい。

【0094】

【化3】

【0095】

上記式（１５）及び式（１６）において、Ｒは、Ｈ、ＯＨ又はアルコキシ（Ｏ－アルキル）から選択される。

【0096】

イソヌクレオチドとは、ヌクレオチドにおいて塩基のリボース環における位置が変化した化合物を指す。いくつかの実施形態において、イソヌクレオチドは、式（１７）又は（１８）に示される、塩基がリボース環の１’－位から２’－位又は３’－位に移行した化合物であってもよい。

【0097】

【化4】

【0098】

上記式（１７）及び式（１８）の化合物において、Ｂａｓｅは、Ａ、Ｕ、Ｇ、Ｃ又はＴなどの核酸塩基を表し、Ｒは、Ｈ、ＯＨ、Ｆ又は上述した非フッ素基から選択される。
いくつかの実施形態において、ヌクレオチドアナログは、イソヌクレオチド、ＬＮＡ、ＥＮＡ、ｃＥＴ、ＵＮＡ及びＧＮＡから選択される１つである。いくつかの実施形態において、各非フルオロ修飾ヌクレオチドは、いずれもメトキシ修飾ヌクレオチドである。文脈において、前記メトキシ修飾ヌクレオチドとは、リボース基の２’－ヒドロキシがメトキシで置換されたヌクレオチドを指す。いくつかの実施形態において、前記非フルオロ修飾ヌクレオチドは、独立して２’－Ｏ－メトキシ修飾又は２’－Ｏ－メトキシエチル修飾ヌクレオチドである。

【0099】

文脈において、「フルオロ修飾ヌクレオチド」とは、ヌクレオチドの２’－ヒドロキシがフッ素で置換されて形成された、式（７）に示される構造を有する化合物を指し、「メトキシ修飾ヌクレオチド」とは、ヌクレオチドのリボース基の２’－ヒドロキシがメトキシで置換されて形成された、式（８）に示される構造を有する化合物を指し、「２’－Ｏ－メトキシエチル修飾ヌクレオチド」とは、ヌクレオチドのリボース基の２’－ヒドロキシ基がメトキシエチルで置換されて形成された、式（９）に示される構造を有する化合物を指す。

【0100】

いくつかの実施形態において、本開示のｓｉＲＮＡは、以下の修飾を有するｓｉＲＮＡである。すなわち、５’末端から３’末端に向かって、前記センス鎖において、前記ヌクレオチド配列Ｉの第７、８、９位又は第５、７、８、９位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであり、残りの位置のヌクレオチドがメトキシ修飾ヌクレオチドであり、前記アンチセンス鎖において、前記ヌクレオチド配列ＩＩの第２、６、１４、１６位又は第２、６、８、９、１４、１６位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであり、残りの位置のヌクレオチドがメトキシ修飾ヌクレオチドである。

【0101】

いくつかの実施形態において、本開示のｓｉＲＮＡは、以下の修飾を有するｓｉＲＮＡである。すなわち、５’末端から３’末端に向かって、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖におけるヌクレオチド配列Ｉの第５、７、８及び９位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであり、ｓｉＲＮＡのセンス鎖における残りの位置のヌクレオチドがメトキシ修飾ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、前記ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖におけるヌクレオチド配列ＩＩの第２、６、１４、１６位又は第２、６、８、９、１４、１６位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであり、ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖における残りの位置のヌクレオチドがメトキシ修飾ヌクレオチドであり、
或いは、５’末端から３’末端に向かって、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖におけるヌクレオチド配列Ｉの第５、７、８及び９位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであり、ｓｉＲＮＡのセンス鎖における残りの位置のヌクレオチドがメトキシ修飾ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、前記ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖におけるヌクレオチド配列ＩＩの第２、６、１４及び１６位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであり、ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖における残りの位置のヌクレオチドがメトキシ修飾ヌクレオチドであり、
或いは、５’末端から３’末端に向かって、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖におけるヌクレオチド配列Ｉの第７、８及び９位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであり、ｓｉＲＮＡのセンス鎖における残りの位置のヌクレオチドがメトキシ修飾ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、前記ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖におけるヌクレオチド配列ＩＩの第２、６、１４及び１６位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであり、ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖における残りの位置のヌクレオチドがメトキシ修飾ヌクレオチドである。

【0102】

いくつかの実施形態において、本開示のｓｉＲＮＡは、以下の修飾を有するｓｉＲＮＡである。すなわち、５’末端から３’末端に向かって、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖におけるヌクレオチド配列Ｉの第７、８及び９位又は第５、７、８及び９位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであり、ｓｉＲＮＡのセンス鎖における残りの位置のヌクレオチドがメトキシ修飾ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、前記ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖におけるヌクレオチド配列ＩＩの第２、６、１４、１６位又は第２、６、８、９、１４、１６位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、前記ヌクレオチド配列ＩＩの第３～６位のヌクレオチドのうちの少なくとも１つが２’－Ｏ－メトキシエチル修飾ヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、前記アンチセンス鎖において、第３位又は第５位のヌクレオチドが２’－Ｏ－メトキシエチル修飾ヌクレオチドであり、残りの位置のヌクレオチドがメトキシ修飾ヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、５’末端から３’末端に向かって、前記ヌクレオチド配列ＩＩの第３～９位のヌクレオチドのうちの２つ以下のヌクレオチドは、２’－Ｏ－メトキシエチル修飾ヌクレオチドである。

【0103】

いくつかの実施形態において、本開示により提供されるｓｉＲＮＡは、任意に、
ｓｉＲＰＴＯＲａ１－Ｍ１、ｓｉＲＰＴＯＲａ１－Ｍ２、ｓｉＲＰＴＯＲａ１－Ｍ３、ｓｉＲＰＴＯＲａ２－Ｍ１、ｓｉＲＰＴＯＲａ２－Ｍ２、ｓｉＲＰＴＯＲａ２－Ｍ３、ｓｉＲＰＴＯＲａ３－Ｍ１、ｓｉＲＰＴＯＲａ３－Ｍ２、ｓｉＳＲＰＴＯＲａ３－Ｍ３、ｓｉＲＰＴＯＲｂ１－Ｍ１、ｓｉＲＰＴＯＲｂ１－Ｍ２、ｓｉＲＰＴＯＲｂ１－Ｍ３、ｓｉＲＰＴＯＲｂ２－Ｍ１、ｓｉＲＰＴＯＲｂ２－Ｍ２、ｓｉＲＰＴＯＲｂ２－Ｍ３、ｓｉＲＰＴＯＲｂ３－Ｍ１、ｓｉＲＰＴＯＲｂ３－Ｍ２、ｓｉＳＲＰＴＯＲｂ３－Ｍ３、ｓｉＲＰＴＯＲｃ１－Ｍ１、ｓｉＲＰＴＯＲｃ１－Ｍ２、ｓｉＲＰＴＯＲｃ１－Ｍ３、ｓｉＲＰＴＯＲｃ２－Ｍ１、ｓｉＲＰＴＯＲｃ２－Ｍ２、ｓｉＲＰＴＯＲｃ２－Ｍ３、ｓｉＲＰＴＯＲｃ３－Ｍ１、ｓｉＲＰＴＯＲｃ３－Ｍ２及びｓｉＳＲＰＴＯＲｃ３－Ｍ３から選択される１つである。

【0104】

上記修飾を有するｓｉＲＮＡは、コストが低いだけでなく、血液中のリボヌクレアーゼで核酸を切断しにくくすることができ、これにより、核酸の安定性を向上させ、核酸のヌクレアーゼ加水分解耐性という特性をより高めている。また、上記修飾ｓｉＲＮＡは、標的ｍＲＮＡ抑制活性が高い。

【0105】

いくつかの実施形態において、本開示により提供されるｓｉＲＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖において、少なくとも１本の一本鎖のリン酸－糖骨格中のリン酸エステル基の少なくとも一部は、修飾基を有するリン酸エステル基である。いくつかの実施形態において、修飾基を有するリン酸エステル基は、リン酸エステル基におけるリン酸ジエステル結合中の少なくとも１つの酸素原子が硫黄原子で置換されたチオリン酸エステル基である。いくつかの実施形態において、前記修飾基を有するリン酸エステル基は、式（１）に示される構造を有するチオリン酸エステル基である。

【0106】

【化5】

【0107】

このような修飾により、ｓｉＲＮＡの二本鎖構造を安定化させ、塩基対合の高い特異性と高い親和力を維持することができる。

【0108】

いくつかの実施形態において、本開示により提供されるｓｉＲＮＡにおいて、チオリン酸エステル基は、センス鎖又はアンチセンス鎖の任意の一端の第１位のヌクレオチドと第２位のヌクレオチドとの間、センス鎖又はアンチセンス鎖の任意の一端の第２位のヌクレオチドと第３位のヌクレオチドとの間、及びそれらの任意の組合せからなる群から選択される少なくとも一箇所に結合されて存在する。いくつかの実施形態において、チオリン酸エステル基は、センス鎖の５’末端を除く全ての上記位置に結合されて存在する。いくつかの実施形態において、チオリン酸エステル基は、センス鎖の３’末端を除く全ての上記位置に結合されて存在する。いくつかの実施形態において、チオリン酸エステル基は、
前記センス鎖の５’末端から第１位のヌクレオチドと第２位のヌクレオチドとの間、
前記センス鎖の５’末端から第２位のヌクレオチドと第３位のヌクレオチドとの間、
前記センス鎖の３’末端から第１位のヌクレオチドと第２位のヌクレオチドとの間、
前記センス鎖の３’末端から第２位のヌクレオチドと第３位のヌクレオチドとの間、
前記アンチセンス鎖の５’末端から第１位のヌクレオチドと第２位のヌクレオチドとの間、
前記アンチセンス鎖の５’末端から第２位のヌクレオチドと第３位のヌクレオチドとの間、
前記アンチセンス鎖の３’末端から第１位のヌクレオチドと第２位のヌクレオチドとの間、及び
前記アンチセンス鎖の３’末端から第２位のヌクレオチドと第３位のヌクレオチドとの間の少なくとも一箇所に結合されて存在する。

【0109】

いくつかの実施形態において、本開示により提供されるｓｉＲＮＡは、任意に、ｓｉＲＰＴＯＲａ１－Ｍ１Ｓ、ｓｉＲＰＴＯＲａ１－Ｍ１Ｘ、ｓｉＲＰＴＯＲａ１－Ｍ２Ｓ、ｓｉＲＰＴＯＲａ１－Ｍ２Ｘ、ｓｉＲＰＴＯＲａ１－Ｍ３Ｓ、ｓｉＲＰＴＯＲａ１－Ｍ３Ｘ、ｓｉＲＰＴＯＲａ２－Ｍ１Ｓ、ｓｉＲＰＴＯＲａ２－Ｍ１Ｘ、ｓｉＲＰＴＯＲａ２－Ｍ２Ｓ、ｓｉＲＰＴＯＲａ２－Ｍ２Ｘ、ｓｉＲＰＴＯＲａ２－Ｍ３Ｓ、ｓｉＲＰＴＯＲａ２－Ｍ３Ｘ、ｓｉＲＰＴＯＲａ３－Ｍ１Ｓ、ｓｉＲＰＴＯＲａ３－Ｍ１Ｘ、ｓｉＲＰＴＯＲａ３－Ｍ２Ｓ、ｓｉＲＰＴＯＲａ３－Ｍ２Ｘ、ｓｉＲＰＴＯＲａ３－Ｍ３Ｓ、ｓｉＲＰＴＯＲａ３－Ｍ３Ｘ、ｓｉＲＰＴＯＲａ１－Ｔ１Ｓ、ｓｉＲＰＴＯＲａ１－Ｔ２Ｓ、ｓｉＲＰＴＯＲｂ１－Ｍ１Ｓ、ｓｉＲＰＴＯＲｂ１－Ｍ１Ｘ、ｓｉＲＰＴＯＲｂ１－Ｍ２Ｓ、ｓｉＲＰＴＯＲｂ１－Ｍ２Ｘ、ｓｉＲＰＴＯＲｂ１－Ｍ３Ｓ、ｓｉＲＰＴＯＲｂ１－Ｍ３Ｘ、ｓｉＲＰＴＯＲｂ２－Ｍ１Ｓ、ｓｉＲＰＴＯＲｂ２－Ｍ１Ｘ、ｓｉＲＰＴＯＲｂ２－Ｍ２Ｓ、ｓｉＲＰＴＯＲｂ２－Ｍ２Ｘ、ｓｉＲＰＴＯＲｂ２－Ｍ３Ｓ、ｓｉＲＰＴＯＲｂ２－Ｍ３Ｘ、ｓｉＲＰＴＯＲｂ３－Ｍ１Ｓ、ｓｉＲＰＴＯＲｂ３－Ｍ１Ｘ、ｓｉＲＰＴＯＲｂ３－Ｍ２Ｓ、ｓｉＲＰＴＯＲｂ３－Ｍ２Ｘ、ｓｉＲＰＴＯＲｂ３－Ｍ３Ｓ、ｓｉＲＰＴＯＲｂ３－Ｍ３Ｘ、ｓｉＲＰＴＯＲｂ１－Ｔ１Ｓ、ｓｉＲＰＴＯＲｂ１－Ｔ２Ｓ、ｓｉＲＰＴＯＲｃ１－Ｍ１Ｓ、ｓｉＲＰＴＯＲｃ１－Ｍ１Ｘ、ｓｉＲＰＴＯＲｃ１－Ｍ２Ｓ、ｓｉＲＰＴＯＲｃ１－Ｍ２Ｘ、ｓｉＲＰＴＯＲｃ１－Ｍ３Ｓ、ｓｉＲＰＴＯＲｃ１－Ｍ３Ｘ、ｓｉＲＰＴＯＲｃ２－Ｍ１Ｓ、ｓｉＲＰＴＯＲｃ２－Ｍ１Ｘ、ｓｉＲＰＴＯＲｃ２－Ｍ２Ｓ、ｓｉＲＰＴＯＲｃ２－Ｍ２Ｘ、ｓｉＲＰＴＯＲｃ２－Ｍ３Ｓ、ｓｉＲＰＴＯＲｃ２－Ｍ３Ｘ、ｓｉＲＰＴＯＲｃ３－Ｍ１Ｓ、ｓｉＲＰＴＯＲｃ３－Ｍ１Ｘ、ｓｉＲＰＴＯＲｃ３－Ｍ２Ｓ、ｓｉＲＰＴＯＲｃ３－Ｍ２Ｘ、ｓｉＲＰＴＯＲｃ３－Ｍ３Ｓ、ｓｉＲＰＴＯＲｃ３－Ｍ３Ｘ、ｓｉＲＰＴＯＲｃ１－Ｔ１Ｓ及びｓｉＲＰＴＯＲｃ１－Ｔ２Ｓから選択される１つである。

【0110】

いくつかの実施形態において、前記ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖の５’末端のヌクレオチドは、５’－リン酸ヌクレオチド又は５’－リン酸アナログ修飾ヌクレオチドである。

【0111】

通常用いられる前記５’－リン酸ヌクレオチド又は５’－リン酸アナログ修飾ヌクレオチドは、当業者に公知であり、例えば、５’－リン酸ヌクレオチドは、以下の構造を有してもよい。

【0112】

【化6】

【0113】

また、例えば、ＡｎａｓｔａｓｉａＫｈｖｏｒｏｖａａｎｄＪｏｎａｔｈａｎＫ．Ｗａｔｔｓ，Ｔｈｅｃｈｅｍｉｃａｌｅｖｏｌｕｔｉｏｎｏｆｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｔｈｅｒａｐｉｅｓｏｆｃｌｉｎｉｃａｌｕｔｉｌｉｔｙ．ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１７，３５（３）：２３８－４８には、以下の４種類の５’－リン酸アナログ修飾ヌクレオチドが開示されている。

【0114】

【化7】

【0115】

ただし、Ｒは、Ｈ、ＯＨ、メトキシ、フッ素から選択され、Ｂａｓｅは、Ａ、Ｕ、Ｃ、Ｇ又はＴから選択される核酸塩基を表す。

【0116】

いくつかの実施形態において、５’－リン酸ヌクレオチドは、式（２）に示される、５’－リン酸修飾を含むヌクレオチドであり、５’－リン酸アナログ修飾ヌクレオチドは、式（３）に示される、ビニルリン酸エステル（５’－（Ｅ）－ｖｉｎｙｌｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅ、Ｅ－ＶＰ）修飾を含むヌクレオチドであり、又は、式（５）に示されるチオリン酸エステル修飾ヌクレオチドである。

【0117】

いくつかの実施形態において、本開示により提供されるｓｉＲＮＡは、任意に、ｓｉＲＰＴＯＲａ１－Ｍ１Ｐ１、ｓｉＲＰＴＯＲａ１－Ｍ２Ｐ１、ｓｉＲＰＴＯＲａ１－Ｍ３Ｐ１、ｓｉＲＰＴＯＲａ２－Ｍ１Ｐ１、ｓｉＲＰＴＯＲａ２－Ｍ２Ｐ１、ｓｉＲＰＴＯＲａ２－Ｍ３Ｐ１、ｓｉＲＰＴＯＲａ３－Ｍ１Ｐ１、ｓｉＲＰＴＯＲａ３－Ｍ２Ｐ１、ｓｉＲＰＴＯＲａ３－Ｍ３Ｐ１、ｓｉＲＰＴＯＲａ１－Ｍ１ＳＰ１、ｓｉＲＰＴＯＲａ１－Ｍ２ＳＰ１、ｓｉＲＰＴＯＲａ１－Ｍ３ＳＰ１、ｓｉＲＰＴＯＲａ２－Ｍ１ＳＰ１、ｓｉＲＰＴＯＲａ２－Ｍ２ＳＰ１、ｓｉＲＰＴＯＲａ２－Ｍ３ＳＰ１、ｓｉＲＰＴＯＲａ３－Ｍ１ＳＰ１、ｓｉＲＰＴＯＲａ３－Ｍ２ＳＰ１、ｓｉＲＰＴＯＲａ３－Ｍ３ＳＰ１、ｓｉＲＰＴＯＲａ１－Ｍ１ＸＰ１、ｓｉＲＰＴＯＲａ１－Ｍ２ＸＰ１、ｓｉＲＰＴＯＲａ１－Ｍ３ＸＰ１、ｓｉＲＰＴＯＲａ２－Ｍ１ＸＰ１、ｓｉＲＰＴＯＲａ２－Ｍ２ＸＰ１、ｓｉＲＰＴＯＲａ２－Ｍ３ＸＰ１、ｓｉＲＰＴＯＲａ３－Ｍ１ＸＰ１、ｓｉＲＰＴＯＲａ３－Ｍ２ＸＰ１、ｓｉＲＰＴＯＲａ３－Ｍ３ＸＰ１、ｓｉＲＰＴＯＲｂ１－Ｍ１Ｐ１、ｓｉＲＰＴＯＲｂ１－Ｍ２Ｐ１、ｓｉＲＰＴＯＲｂ１－Ｍ３Ｐ１、ｓｉＲＰＴＯＲｂ２－Ｍ１Ｐ１、ｓｉＲＰＴＯＲｂ２－Ｍ２Ｐ１、ｓｉＲＰＴＯＲｂ２－Ｍ３Ｐ１、ｓｉＲＰＴＯＲｂ３－Ｍ１Ｐ１、ｓｉＲＰＴＯＲｂ３－Ｍ２Ｐ１、ｓｉＲＰＴＯＲｂ３－Ｍ３Ｐ１、ｓｉＲＰＴＯＲｂ１－Ｍ１ＳＰ１、ｓｉＲＰＴＯＲｂ１－Ｍ２ＳＰ１、ｓｉＲＰＴＯＲｂ１－Ｍ３ＳＰ１、ｓｉＲＰＴＯＲｂ２－Ｍ１ＳＰ１、ｓｉＲＰＴＯＲｂ２－Ｍ２ＳＰ１、ｓｉＲＰＴＯＲｂ２－Ｍ３ＳＰ１、ｓｉＲＰＴＯＲｂ３－Ｍ１ＳＰ１、ｓｉＲＰＴＯＲｂ３－Ｍ２ＳＰ１、ｓｉＲＰＴＯＲｂ３－Ｍ３ＳＰ１、ｓｉＲＰＴＯＲｂ１－Ｍ１ＸＰ１、ｓｉＲＰＴＯＲｂ１－Ｍ２ＸＰ１、ｓｉＲＰＴＯＲｂ１－Ｍ３ＸＰ１、ｓｉＲＰＴＯＲｂ２－Ｍ１ＸＰ１、ｓｉＲＰＴＯＲｂ２－Ｍ２ＸＰ１、ｓｉＲＰＴＯＲｂ２－Ｍ３ＸＰ１、ｓｉＲＰＴＯＲｂ３－Ｍ１ＸＰ１、ｓｉＲＰＴＯＲｂ３－Ｍ２ＸＰ１、ｓｉＲＰＴＯＲｂ３－Ｍ３ＸＰ１、ｓｉＲＰＴＯＲｃ１－Ｍ１Ｐ１、ｓｉＲＰＴＯＲｃ１－Ｍ２Ｐ１、ｓｉＲＰＴＯＲｃ１－Ｍ３Ｐ１、ｓｉＲＰＴＯＲｃ２－Ｍ１Ｐ１、ｓｉＲＰＴＯＲｃ２－Ｍ２Ｐ１、ｓｉＲＰＴＯＲｃ２－Ｍ３Ｐ１、ｓｉＲＰＴＯＲｃ３－Ｍ１Ｐ１、ｓｉＲＰＴＯＲｃ３－Ｍ２Ｐ１、ｓｉＲＰＴＯＲｃ３－Ｍ３Ｐ１、ｓｉＲＰＴＯＲｃ１－Ｍ１ＳＰ１、ｓｉＲＰＴＯＲｃ１－Ｍ２ＳＰ１、ｓｉＲＰＴＯＲｃ１－Ｍ３ＳＰ１、ｓｉＲＰＴＯＲｃ２－Ｍ１ＳＰ１、ｓｉＲＰＴＯＲｃ２－Ｍ２ＳＰ１、ｓｉＲＰＴＯＲｃ２－Ｍ３ＳＰ１、ｓｉＲＰＴＯＲｃ３－Ｍ１ＳＰ１、ｓｉＲＰＴＯＲｃ３－Ｍ２ＳＰ１、ｓｉＲＰＴＯＲｃ３－Ｍ３ＳＰ１、ｓｉＲＰＴＯＲｃ１－Ｍ１ＸＰ１、ｓｉＲＰＴＯＲｃ１－Ｍ２ＸＰ１、ｓｉＲＰＴＯＲｃ１－Ｍ３ＸＰ１、ｓｉＲＰＴＯＲｃ２－Ｍ１ＸＰ１、ｓｉＲＰＴＯＲｃ２－Ｍ２ＸＰ１、ｓｉＲＰＴＯＲｃ２－Ｍ３ＸＰ１、ｓｉＲＰＴＯＲｃ３－Ｍ１ＸＰ１、ｓｉＲＰＴＯＲｃ３－Ｍ２ＸＰ１及びｓｉＲＰＴＯＲｃ３－Ｍ３ＸＰ１から選択される１つである。

【0118】

本開示の発明者は、本開示により提供されるｓｉＲＮＡが顕著に向上した血漿とリソソーム安定性を有するだけでなく、非常に高い遺伝子抑制活性を維持することを、意外にも見出した。

【0119】

本開示により提供されるｓｉＲＮＡは、本分野における通常のｓｉＲＮＡ調製方法（例えば、固相合成方法及び液相合成方法）によって得ることができる。固相合成は、既に商用カスタマイズサービスが行われている。対応する修飾を有するヌクレオシドモノマーを用いることにより修飾ヌクレオチドを本開示に記載されたｓｉＲＮＡに導入することができ、対応する修飾を有するヌクレオシドモノマーを調製する方法、及び修飾ヌクレオチドをｓｉＲＮＡに導入する方法も、当業者によく知られている。

【0120】

医薬組成物
一態様において、本開示は、医薬組成物を提供し、前記医薬組成物は、活性成分としての上述したｓｉＲＮＡと、薬学的に許容可能な担体とを含む。

【0121】

前記薬学的に許容可能な担体は、ｓｉＲＮＡ投与分野で通常用いられる担体であってもよく、例えば、磁性ナノ粒子（ｍａｇｎｅｔｉｃｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ、例えば、Ｆｅ_３Ｏ_４又はＦｅ_２Ｏ_３に基づくナノ粒子）、カーボンナノチューブ（ｃａｒｂｏｎｎａｎｏｔｕｂｅｓ）、メソポーラスシリコン（ｍｅｓｏｐｏｒｏｕｓｓｉｌｉｃｏｎ）、リン酸カルシウムナノ粒子（ｃａｌｃｉｕｍｐｈｏｓｐｈａｔｅｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ）、ポリエチレンイミン（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ、ＰＥＩ）、ポリアミドアミンデンドリマー（ｐｏｌｙａｍｉｄｏａｍｉｎｅ（ＰＡＭＡＭ）ｄｅｎｄｒｉｍｅｒ）、ポリリジン（ｐｏｌｙ（Ｌ－ｌｙｓｉｎｅ）、ＰＬＬ）、キトサン（ｃｈｉｔｏｓａｎ）、１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウムプロパン（１，２－ｄｉｏｌｅｏｙｌ－３－ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ－ｐｒｏｐａｎｅ、ＤＯＴＡＰ）、ポリＤ－又はＬ－乳酸／グリコール酸共重合体（ｐｏｌｙ（Ｄ＆Ｌ－ｌａｃｔｉｃ／ｇｌｙｃｏｌｉｃａｃｉｄ）ｃｏｐｏｌｙｍｅｒ、ＰＬＧＡ）、ポリ（アミノエチルエチレンリン酸エステル）（ｐｏｌｙ（２－ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌｅｔｈｙｌｅｎｅｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、ＰＰＥＥＡ）及びポリ（Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノエチルメタクリレート）（ｐｏｌｙ（２－ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｅｔｈｙｌｍｅｔｈａｃｒｙｌａｔｅ）、ＰＤＭＡＥＭＡ）並びにこれらの誘導体のうちの１つ又は複数があるが、これらに限定されない。

【0122】

いくつかの実施形態において、前記医薬組成物において、ｓｉＲＮＡと薬学的に許容可能な担体の含有量について特段の要件がなく、いくつかの実施形態において、ｓｉＲＮＡと薬学的に許容可能な担体の重量比は、１：（１～５００）であってもよく、いくつかの実施形態において、上記重量比は、１：（１～５０）である。

【0123】

いくつかの実施形態において、前記医薬組成物には、薬学的に許容可能な他の添加剤が含まれてもよく、当該添加剤は、本分野で通常用いられる各種の製剤又は化合物のうちの１つ又は複数であってもよい。例えば、前記薬学的に許容可能な他の添加剤は、ｐＨ緩衝液、保護剤及び浸透圧調節剤のうちの少なくとも１つを含んでもよい。

【0124】

前記ｐＨ緩衝液は、ｐＨ７．５～８．５のトリスヒドロキシメチルアミノメタン塩酸塩緩衝液及び／又はｐＨ５．５～８．５のリン酸塩緩衝液であってもよく、例えば、ｐＨ５．５～８．５のリン酸塩緩衝液であってもよい。

【0125】

前記保護剤は、イノシトール、ソルビトール、スクロース、トレハロース、マンノース、マルトース、ラクトース及びグルコースのうちの少なくとも１つであってもよい。前記医薬組成物の全重量を基準とし、前記保護剤の含有量は、０．０１～３０重量％であってもよい。

【0126】

前記浸透圧調節剤は、例えば、塩化ナトリウム及び／又は塩化カリウムであってもよい。前記浸透圧調節剤の含有量は、前記医薬組成物の浸透圧が２００～７００ミリオスモル／キログラム（ｍＯｓｍ／ｋｇ）となるように決定される。所望の浸透圧により、当業者は、前記浸透圧調節剤の含有量を容易に決定することができる。いくつかの実施形態において、前記医薬組成物から製造された製剤の投与過程における用量は、投与方式によって調整される。

【0127】

いくつかの実施形態において、前記医薬組成物は、注射液などの液体製剤であってもよく、凍結乾燥粉末注射剤として、投与時に液体添加剤と混合して、液体製剤としてもよい。前記液体製剤は、皮下、筋肉、脳室内又は髄腔内注射投与に用いることができるが、これらに限定されず、鼻腔投与、口腔吸入、噴霧投与などの方式で前記医薬組成物を送達することもできるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、前記医薬組成物は、髄腔内注射により送達される。いくつかの実施形態において、脊髄液への前記医薬組成物の髄腔内注射は、ボーラス注射の方式で又はマイクロポンプを介して行うことができ、これらのマイクロポンプを皮下に埋め込むことにより、ｓｉＲＮＡを脊髄液に規則的かつ定常的に送達することができる。いくつかの実施形態において、髄腔内投与は、手術によって埋め込まれた浸透圧ポンプを介して行われる。いくつかの実施形態において、髄腔内投与を容易にするために、浸透圧ポンプを脊柱管のくも膜下腔に埋め込む。この髄腔内送達系のより多くの詳細については、２０１５年１月２８日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０１３２５３号に記載されており、引用により当該文献の内容が全体として本明細書に組み込まれる。

【0128】

いくつかの実施形態において、前記医薬組成物は、リポソーム製剤の形態であってもよい。いくつかの実施形態において、前記リポソーム製剤に用いられる薬学的に許容可能な担体は、アミン含有トランスフェクション化合物（以下、有機アミンともいう）、補助脂質及び／又はポリエチレングリコール化脂質を含む。前記有機アミン、補助脂質及びポリエチレングリコール化脂質は、それぞれ中国特許出願公開第１０３３８０１１３号明細書（引用によりその全体を本明細書に組み込む）に記載されたアミン含有トランスフェクション化合物又はその薬学的に許容可能な塩若しくは誘導体、補助脂質及びポリエチレングリコール化脂質から選択される１つ又は複数であってもよい。

【0129】

いくつかの実施形態において、前記有機アミンは、中国特許出願公開第１０３３８０１１３号明細書に記載された、式（２０１）に示される化合物又はその薬学的に許容可能な塩であってもよい。

【0130】

【化8】

【0131】

ただし、Ｘ_１０１及びＸ_１０２は、それぞれ独立してＯ、Ｓ、Ｎ－Ａ又はＣ－Ａであり、Ａは、水素又はＣ_１－Ｃ_２０炭化水素鎖であり、
Ｙ_１０１及びＺ_１０１は、それぞれ独立してＣ＝Ｏ、Ｃ＝Ｓ、Ｓ＝Ｏ、ＣＨ－ＯＨ又はＳＯ_２であり、
Ｒ_１０１、Ｒ_１０２、Ｒ_１０３、Ｒ_１０４、Ｒ_１０５、Ｒ_１０６及びＲ_１０７は、それぞれ独立して水素、環式又は非環式の、置換又は無置換の、分岐鎖又は直鎖脂肪族基、環式又は非環式の、置換又は無置換の、分岐鎖又は直鎖ヘテロ脂肪族基、置換又は無置換の、分岐鎖又は直鎖アシル、置換又は無置換の、分岐鎖又は直鎖アリール、置換又は無置換の、分岐鎖又は直鎖ヘテロアリールであり、
ｘは、１～１０の整数であり、
ｎは、１～３の整数であり、ｍは、０～２０の整数であり、ｐは、０又は１であり、ここで、ｍ＝ｐ＝０である場合、Ｒ_１０２は、水素であり、
ｎ及びｍのうちの少なくとも１つが２である場合、Ｒ_１０３と式（２０１）における窒素とは、式（２０２）又は式（２０３）に示される構造を形成する。

【0132】

【化9】

【0133】

ただし、ｇ、ｅ及びｆは、それぞれ独立して１～６の整数であり、「ＨＣＣ」は、炭化水素鎖を表し、各^＊Ｎは、式（２０１）における窒素原子を表す。

【0134】

いくつかの実施形態において、Ｒ_１０３は、ポリアミンである。他の実施形態において、Ｒ_１０３は、ケタールである。いくつかの実施形態において、式（２０１）におけるＲ_１０１及びＲ_１０２のそれぞれは、独立して、任意に置換又は無置換の、分岐鎖又は直鎖アルキル又はアルケニルであり、前記アルキル又はアルケニルは、３～約２０個の炭素原子、例えば、８～約１８個の炭素原子、及び０～４個の二重結合、例えば、０～２個の二重結合を有する。

【0135】

いくつかの実施形態において、ｎとｍのそれぞれは、独立して１又は３である場合、Ｒ_１０３は、下記式（２０４）～式（２１３）のいずれか１つであってもよい。

【0136】

【化10】

【0137】

式（２０４）～式（２１３）中、ｇ、ｅ及びｆは、それぞれ独立して、１～６の整数であり、各「ＨＣＣ」は、炭化水素鎖を表し、各^＊は、Ｒ_１０３と式（２０１）における窒素原子との結合可能点を示し、任意の^＊位置上の各Ｈは、式（２０１）における窒素原子との結合を実現するために置換されてもよい。

【0138】

式（２０１）に示される化合物は、中国特許出願公開第１０３３８０１１３号明細書の記載により調製されてもよい。

【0139】

いくつかの実施形態において、前記有機アミンは、式（２１４）に示される有機アミン及び／又は式（２１５）に示される有機アミンである。

【0140】

【化11】

【0141】

前記補助脂質は、コレステロール、コレステロールのアナログ及び／又はコレステロールの誘導体であり、
前記ポリエチレングリコール化脂質は、１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスファチジルエタノールアミン－Ｎ－［メトキシ（ポリエチレングリコール）］－２０００である。

【0142】

いくつかの実施形態において、前記医薬組成物において、前記有機アミン、前記補助脂質及び前記ポリエチレングリコール化脂質のモル比は、（１９．７～８０）：（１９．７～８０）：（０．３～５０）であり、例えば、（５０～７０）：（２０～４０）：（３～２０）であってもよい。

【0143】

いくつかの実施形態において、本開示のｓｉＲＮＡと上記アミン含有トランスフェクション試薬により形成された医薬組成物の粒子は、約３０ｎｍ～約２００ｎｍの平均径を有し、一般的に約４０ｎｍ～約１３５ｎｍであり、より一般的には、当該リポソーム粒子の平均径は、約５０ｎｍ～約１２０ｎｍ、約５０ｎｍ～約１００ｎｍ、約６０ｎｍ～約９０ｎｍ又は約７０ｎｍ～約９０ｎｍであり、例えば、当該リポソーム粒子の平均径は、約３０、４０、５０、６０、７０、７５、８０、８５、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０又は１６０ｎｍである。

【0144】

いくつかの実施形態において、本開示のｓｉＲＮＡと上記アミン含有トランスフェクション試薬により形成された医薬組成物において、ｓｉＲＮＡと全脂質（例えば有機アミン、補助脂質及び／又はポリエチレングリコール化脂質）の重量比（重量／重量比）は、約１：１～約１：５０、約１：１～約１：３０、約１：３～約１：２０、約１：４～約１：１８、約１：５～約１：１７、約１：５～約１：１５、約１：５～約１：１２、約１：６～約１：１２又は約１：６～約１：１０の範囲内にあり、例えば、本開示のｓｉＲＮＡと全脂質の重量比は、約１：５、１：６、１：７、１：８、１：９、１：１０、１：１１、１：１２、１：１３、１：１４、１：１５、１：１６、１：１７又は１：１８である。

【0145】

いくつかの実施形態において、前記医薬組成物は、市販時に各成分が独立して存在してもよく、使用時に液体製剤として存在してもよい。いくつかの実施形態において、本開示により提供されるｓｉＲＮＡと上記薬学的に許容可能な担体により形成された医薬組成物は、既知の各種の方法に従い調製されてもよく、従来のｓｉＲＮＡの代わりに本開示により提供されるｓｉＲＮＡを用いればよい。いくつかの実施形態において、以下の方法に従い調製されてもよい。

【0146】

有機アミン、補助脂質及びポリエチレングリコール化脂質を上記モル比でアルコールに懸濁させ均一に混合して脂質溶液を得る。アルコールの用量は、得られた脂質溶液の総質量濃度が２～２５ｍｇ／ｍＬ、例えば、８～１８ｍｇ／ｍＬとなるように決定される。前記アルコールは、薬学的に許容可能なアルコール、例えば、エタノール、プロピレングリコール、ベンジルアルコール、グリセリン、ポリエチレングリコール２００、ポリエチレングリコール３００、ポリエチレングリコール４００などの、室温付近で液体であるアルコールから選択される１つ又は複数であり、例えばエタノールであってもよい。

【0147】

本開示により提供されるｓｉＲＮＡを緩衝塩溶液に溶解し、ｓｉＲＮＡ水溶液を得る。緩衝塩溶液の濃度は、０．０５～０．５Ｍであり、例えば、０．１～０．２Ｍであってもよく、緩衝塩溶液のｐＨは、４．０～５．５に調節され、例えば、５．０～５．２であってもよく、緩衝塩溶液の用量は、ｓｉＲＮＡの濃度が０．６ｍｇ／ｍＬ以下、例えば、０．２～０．４ｍｇ／ｍＬとなるように決定される。前記緩衝塩は、可溶性酢酸塩、可溶性クエン酸塩から選択される１つ又は複数であり、例えば、酢酸ナトリウム及び／又は酢酸カリウムであってもよい。

【0148】

脂質溶液とｓｉＲＮＡ水溶液を混合した後、得られた生成物を４０～６０℃で少なくとも２分間、例えば、５～３０分間インキュベートし、インキュベートしたリポソーム製剤を得る。脂質溶液とｓｉＲＮＡ水溶液の体積比は１：（２～５）であり、例えば、１：４であってもよい。

【0149】

インキュベートしたリポソーム製剤を濃縮又は希釈し、不純物を除去して除菌し、本開示により提供される医薬組成物を得る。その物理化学的パラメータとしては、ｐＨが６．５～８、封入効率が８０％以上、粒子径が４０～２００ｎｍ、多分散指数が０．３０以下、浸透圧が２５０～４００ｍＯｓｍ／ｋｇである。例えば、物理化学的パラメータは、ｐＨが７．２～７．６、封入効率が９０％以上、粒子径が６０～１００ｎｍ、多分散指数が０．２０以下、浸透圧が３００～４００ｍＯｓｍ／ｋｇであってもよい。

【0150】

濃縮又は希釈は、不純物を除去する前、不純物を除去した後、又は不純物を除去すると同時に行われてもよい。不純物を除去する方法としては、従来の各種の方法を用いてもよく、例えば、タンジェンシャルフロー系、中空糸カラムを用い、１００ＫＤａの条件で限外濾過し、限外濾過交換溶液をｐＨ７．４のリン酸塩緩衝液（ＰＢＳ）としてもよい。除菌方法としては、従来の各種の方法を用いてもよく、例えば、０．２２μｍのフィルターで濾過して除菌してもよい。

【0151】

ｓｉＲＮＡ複合体
更に別の態様において、本開示は、ｓｉＲＮＡ複合体を提供し、前記ｓｉＲＮＡ複合体は、上記ｓｉＲＮＡと、当該ｓｉＲＮＡに複合して結合される複合基とを含む。

【0152】

一般的には、前記複合基は、薬学的に許容可能な少なくとも１つの標的基及び／又は送達補助基を含む。いくつかの実施形態において、前記複合基は、リンカー（ｌｉｎｋｅｒ）を更に含み、前記リンカー及び／又は前記標的基又は前記送達補助基は、順に結合されている。いくつかの実施形態において、前記標的基は、１～６個である。いくつかの実施形態において、前記標的基は、２～４個である。前記ｓｉＲＮＡ分子は、前記複合基に非共有結合的又は共有結合的に複合されてもよく、例えば、前記複合基に共有結合的に複合されてもよい。ｓｉＲＮＡと複合基との複合部位は、ｓｉＲＮＡのセンス鎖の３’末端又は５’末端にあってもよく、アンチセンス鎖の５’末端にあってもよく、ｓｉＲＮＡの内部配列にあってもよい。いくつかの実施形態において、前記ｓｉＲＮＡと複合基との複合部位は、ｓｉＲＮＡのセンス鎖の３’末端にある。いくつかの実施形態において、前記複合基は、ヌクレオチドのリン酸基、２’－位のヒドロキシ又は塩基に結合されてもよい。いくつかの実施形態において、前記複合基は、３’－位のヒドロキシに結合されてもよく、この場合、ヌクレオチド間が２’－５’リン酸ジエステル結合により結合されている。複合基は、ｓｉＲＮＡ鎖の末端に結合される場合、通常ヌクレオチドのリン酸基に結合され、ｓｉＲＮＡの内部配列に結合される場合、通常リボース糖環又は塩基に結合される。各種の結合方法については、ＭｕｔｈｉａｈＭａｎｏｈａｒａｎｅｔ．ａｌ．ｓｉＲＮＡｃｏｎｊｕｇａｔｅｓｃａｒｒｙｉｎｇｓｅｑｕｅｎｔｉａｌｌｙａｓｓｅｍｂｌｅｄｔｒｉｖａｌｅｎｔＮ－ａｃｅｔｙｌｇａｌａｃｔｏｓａｍｉｎｅｌｉｎｋｅｄｔｈｒｏｕｇｈｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓｅｌｉｃｉｔｒｏｂｕｓｔｇｅｎｅｓｉｌｅｎｃｉｎｇｉｎｖｉｖｏｉｎｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ．ＡＣＳＣｈｅｍｉｃａｌｂｉｏｌｏｇｙ，２０１５，１０（５）：１１８１－７を参照することができる。

【0153】

いくつかの実施形態において、前記ｓｉＲＮＡと複合基との間が酸不安定又は還元可能な化学結合により結合されてもよく、細胞エンドソームの酸性環境で、これらの化学結合が分解され、ｓｉＲＮＡが遊離状態になることができる。分解できない複合方法については、複合基は、ｓｉＲＮＡのセンス鎖に結合され、複合によるｓｉＲＮＡ活性への影響をできるだけ低下させることができる。

【0154】

いくつかの実施形態において、前記薬学的に許容可能な標的基は、ｓｉＲＮＡ投与分野で通常用いられるリガンドであってもよい。いくつかの実施形態において、前記各リガンドは、細胞表面受容体と結合できるリガンドから独立して選択される。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの標的リガンドは、中枢神経系（ＣＮＳ）組織への送達を媒介する受容体を標的とする。これらのリガンドの種類は、当業者に公知であり、それらの作用として、一般的に標的細胞表面の特異的受容体と結合し、リガンドに結合されるｓｉＲＮＡの標的細胞への送達を媒介する。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの前記標的基は、ＲＰＴＯＲ遺伝子を発現する細胞表面受容体と結合できるリガンドから選択される。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの標的基は、肝の実質細胞表面の受容体を標的とするリガンドである。いくつかの実施形態において、少なくとも１つ又は各標的基は、肝細胞表面のアシアロ糖タンパク質受容体を標的とするリガンドである。いくつかの実施形態において、少なくとも１つ又は各標的基は、Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）である。いくつかの実施形態において、本開示の複合体は、ＣＮ１１０９５９０１１Ａに開示された各種のｓｉＲＮＡ複合体構造を有し、引用によりその開示内容が全体として本明細書に組み込まれる。

【0155】

いくつかの実施形態において、本開示の複合体は、式（３０１）に示される構造を有する。

【0156】

【化12】

【0157】

ただし、Ｎｕは、本開示のｓｉＲＮＡによって形成されるｓｉＲＮＡ基を表す。いくつかの実施形態において、前記ｓｉＲＮＡ複合体は、式（３０１）に示される構造を有し、ただし、Ｎｕは、ｓｉＲＰＴＯＲａ２－Ｍ１Ｓ、ｓｉＲＰＴＯＲｂ２－Ｍ１Ｓ、ｓｉＲＰＴＯＲｃ２－Ｍ１Ｓ、ｓｉＲＰＴＯＲｃ１－Ｔ１Ｓ及びｓｉＲＰＴＯＲｃ１－Ｔ２Ｓのうちの１つに対応する配列を有し、前記複合基は、前記ＮｕにおけるｓｉＲＮＡセンス鎖の３’末端のヌクレオチドのリボース基の３’位に結合され、前記ｓｉＲＮＡ複合体は、ナトリウム塩形態である。

【0158】

いくつかの実施形態において、各前記標的基は、ＲＰＴＯＲ遺伝子を発現する細胞表面受容体と結合できるリガンドから選択される。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの標的基は、ＣＮＳの標的細胞表面の受容体を標的とするリガンドである。いくつかの実施形態において、各標的基は、ＣＮＳの標的細胞表面の受容体を標的とするリガンドである。いくつかの実施形態において、リガンドは、ｓｉＲＮＡと複合して、特異的なＣＮＳ組織への送達を実現することができ、いくつかの実施形態において、少なくとも１つの標的基は、ペプチドリガンドである。いくつかの実施形態において、各標的基は、ペプチドリガンドである。いくつかの実施形態において、標的リガンドは、アンギオテンシン２、リポタンパク質受容体関連タンパク質（ＬＲＰ）リガンド、ｂＥｎｄ．３細胞結合リガンド、トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）リガンド、マンノース受容体リガンド、グルコーストランスポーター及びＬＤＬ受容体リガンドからなる群から選択される。例えば、中国特許出願公開第１１２４０００１８号明細書に記載された各種の標的基（例えば、段落［０８５６］に記載されたリガンド）があり、引用によりその開示内容が全体として本明細書に組み込まれる。

【0159】

いくつかの実施形態において、前記薬学的に許容可能な送達補助基は、脂肪族化合物又は脂環式化合物を含む親油基であってもよい。いくつかの実施形態において，親油基は、直鎖脂肪族炭化水素、分岐鎖脂肪族炭化水素又はステロイドを含む。いくつかの実施形態において、親油基は、飽和又は不飽和のＣ４－Ｃ３０炭化水素鎖を含む。いくつかの実施例において、親油基は、飽和又は不飽和のＣ_６－Ｃ_１８炭化水素鎖（例えば、直鎖Ｃ_６－Ｃ_１８アルキル又はアルケニル）を含む。いくつかの実施例において、親油基は、飽和又は不飽和のＣ_１６炭化水素鎖（例えば、直鎖Ｃ_１６アルキル又はアルケニル）を含む。いくつかの実施例において、親油基は、Ｃ６－Ｃ３０脂肪族アシルであり、前記Ｃ６－Ｃ３０脂肪族アシルとは、Ｃ６－Ｃ３０脂肪酸からヒドロキシを除去した後の残りの原子団を指す。いくつかの実施形態において、親油基は、ｓｉＲＮＡに非共有結合的又は共有結合的に複合される。いくつかの実施形態において、親油基とｓｉＲＮＡとの複合部位は、ｓｉＲＮＡのセンス鎖の３’末端又は５’末端にある。いくつかの実施形態において、親油基とｓｉＲＮＡとの複合部位は、アンチセンス鎖の５’末端にある。いくつかの実施形態において、親油基とｓｉＲＮＡとの複合部位は、ｓｉＲＮＡの内部配列にあってもよい。いくつかの実施形態において、親油基は、ヌクレオチドのリン酸基、リボース糖環又は塩基に結合される。いくつかの実施形態では、親油基がヌクレオチドの塩基に複合される場合、好ましい位置は、塩基対合に必要な水素結合相互作用を妨げない位置である。いくつかの実施形態において、親油基は、ヌクレオチドのリン酸基、２’－位のヒドロキシ又は塩基に結合される。いくつかの実施形態において、親油基は、２’－位のヒドロキシを介してリボース糖環に複合されてもよい。送達補助基をｓｉＲＮＡに結合する様々な方法は、当業者に周知であり、例えば、中国特許出願公開第１１２４０００１８号明細書に記載された各種の調製方法（例えば、段落［１０５３］～［１０６５］に記載された調製方法）があり、引用によりその開示内容が全体として本明細書に組み込まれる。

【0160】

いくつかの実施形態において、前記標的基は、１つ又は複数のリンカーを介してｓｉＲＮＡに複合される。本開示の発明者は、本開示のｓｉＲＮＡ複合体が、顕著に向上した血漿中安定性を有するとともに、高いＲＰＴＯＲｍＲＮＡサイレンシング活性を更に示すことを意外にも見出した。いくつかの実施形態において、本開示のｓｉＲＮＡは、表１ａ、１ｂ及び１ｃに示されるｓｉＲＮＡのうちの１つであってもよい。これらのｓｉＲＮＡを用いると、本開示のｓｉＲＮＡ複合体は、より高いＲＰＴＯＲｍＲＮＡサイレンシング活性を示す。

【0161】

表１ａ本開示の第１種のｓｉＲＮＡ

【表1】

【0162】

表１ｂ本開示の第２種のｓｉＲＮＡ

【表2】

【0163】

表１ｃ本開示の第３種のｓｉＲＮＡ

【表3】

【0164】

ここで、大文字Ｃ、Ｇ、Ｕ、Ａは、ヌクレオチドの塩基配列を表し、小文字ｍは、当該文字ｍの左側に隣接する１つのヌクレオチドがメトキシ修飾ヌクレオチドであることを表し、小文字ｆは、当該文字ｆの左側に隣接する１つのヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであることを表し、小文字ｓは、当該文字の左右２つのヌクレオチド間がチオリン酸エステル基により結合されていることを表し、Ｐ１は、当該Ｐ１の右側に隣接する１つのヌクレオチドが５’－リン酸ヌクレオチド又は５’－リン酸アナログ修飾ヌクレオチドであることを表す。いくつかの実施形態において、Ｐ１は、修飾が特定されたＶＰ、Ｐｓ又はＰを表し、組合せ文字ＶＰは、当該組合せ文字ＶＰの右側に隣接する１つのヌクレオチドがビニルリン酸エステル（５’－（Ｅ）－ｖｉｎｙｌｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅ、Ｅ－ＶＰ）修飾ヌクレオチドであることを表し、組合せ文字Ｐｓは、当該組合せ文字Ｐｓの右側に隣接する１つのヌクレオチドがチオリン酸エステル修飾ヌクレオチドであることを表し、大文字Ｐは、当該文字Ｐの右側に隣接する１つのヌクレオチドが５’－リン酸ヌクレオチドであることを表す。組合せ文字ｍｏｅは、当該組合せ文字ｍｏｅの左側に隣接する１つのヌクレオチドが２’－Ｏ－メトキシエチル修飾を有するヌクレオチドであることを表す。例えば、組合せ文字Ｇｍｏｅは、当該組合せ文字ｍｏｅの左側に隣接するヌクレオチドが、塩基がグアニンであり、２’－Ｏ－メトキシエチル修飾を有するヌクレオチドであることを表す。また、組合せ文字Ｃｍｏｅは、当該組合せ文字ｍｏｅの左側に隣接するヌクレオチドが、塩基が５－メチルシトシンであり、２’－Ｏ－メトキシエチル修飾を有するヌクレオチドであることを表す。また、上記表に示される配列中の各Ｕは、任意にＴで置換されてもよく、ｓｉＲＮＡの活性又はオフターゲット効果に明らかな影響を与えない。

【0165】

本開示に記載されたｓｉＲＮＡ、医薬組成物又はｓｉＲＮＡ複合体において、各隣接するヌクレオチド間がリン酸ジエステル結合又はチオリン酸ジエステル結合により結合され、リン酸ジエステル結合又はチオリン酸ジエステル結合における非架橋酸素原子又は硫黄原子は、負電荷を帯び、ヒドロキシ又はスルフヒドリルとして存在してもよく、ヒドロキシ又はスルフヒドリルにおける水素イオンは、一部又は全部がカチオンで置換されてもよい。前記カチオンは、任意のカチオン、例えば、金属カチオン、アンモニウムイオンＮＨ_４ ^＋、有機アンモニウムカチオンのうちの１つであってもよい。溶解性の向上を考慮すると、１つの実施形態において、前記カチオンは、アルカリ金属イオン、第３級アミンにより形成されたアンモニウムカチオン及び４級アンモニウムカチオンから選択される１つ又は複数である。アルカリ金属イオンは、Ｋ^＋及び／又はＮａ^＋であってもよく、第３級アミンにより形成されたカチオンは、トリエチルアミンにより形成されたアンモニウムイオン、及び／又はＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミンにより形成されたアンモニウムイオンであってもよい。したがって、本開示に記載されたｓｉＲＮＡ又はｓｉＲＮＡ複合体は、少なくとも一部が塩として存在してもよい。一態様において、リン酸ジエステル結合又はチオリン酸ジエステル結合における非架橋酸素原子又は硫黄原子は、少なくとも一部がナトリウムイオンに結合され、本開示に記載されたｓｉＲＮＡ又はｓｉＲＮＡ複合体は、ナトリウム塩又は部分ナトリウム塩として存在する。

【0166】

当業者であれば明らかに知っているように、対応する修飾を有するヌクレオシドモノマーを用いることにより修飾ヌクレオチド基を本開示に記載されたｓｉＲＮＡに導入することができる。対応する修飾を有するヌクレオシドモノマーを調製する方法、及び修飾ヌクレオチド基をｓｉＲＮＡに導入する方法も、当業者によく知られている。全ての修飾ヌクレオシドモノマーは、いずれも市販品として購入されてもよく、既知の方法により調製されてもよい。

【0167】

任意の合理的な合成経路により本開示のｓｉＲＮＡ複合体を調製してもよい。例えば、標的基と、ホスホルアミダイトと反応して共有結合を形成できる活性な反応性基とを含む複合分子の場合、まず、当該複合分子内の活性基を保護剤で保護した後に固体担体に結合し、次に、ホスホルアミダイト固相合成方法を用いて、ｓｉＲＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖のヌクレオチドの種類と順序により、３’から５’に向かってヌクレオシドモノマーを１つずつ結合し、各ヌクレオシドモノマーの結合が脱保護、カップリング、キャッピング、酸化又は硫化の４つの反応を含み、ｓｉＲＮＡのセンス鎖及びアンチセンス鎖を単離し、アニールを行い、それにより本開示のｓｉＲＮＡ複合体を得る。

【0168】

更に、ｓｉＲＮＡ複合体の調製は、既存の文献の開示内容を参照して行うこともできる。例えば、国際公開第２０１９０１０２７４号には、実施例１に、特定の構造を有する連結基及び標的リガンドを反応させてｓｉＲＮＡに順に結合する方法が記載されている。引用によりその開示内容が全体として本明細書に組み込まれる。

【0169】

本開示のｓｉＲＮＡ、当該ｓｉＲＮＡを含む医薬組成物及びｓｉＲＮＡ複合体の使用
いくつかの実施形態において、本開示は、本開示のｓｉＲＮＡ、及び／又は医薬組成物、及び／又はｓｉＲＮＡ複合体の、ＲＰＴＯＲ機能調節に関連する疾患又は症状を治療及び予防する薬物の調製における使用を提供する。いくつかの実施形態において、前記ＲＰＴＯＲ機能調節に関連する疾患又は症状は、ｍＴＯＲＣ１の活性化による疾患、及び細胞のオートファジー機能異常に関連する疾患である。いくつかの実施形態において、前記神経変性疾患に関連する疾患又は症状はアルツハイマー病及び／又はパーキンソン病であり、好ましくは、前記神経変性疾患は、アルツハイマー病である。いくつかの実施形態において、前記細胞のオートファジー機能異常に関連する疾患は、非アルコール性脂肪性肝炎である。

【0170】

いくつかの実施形態において、本開示は、ＲＰＴＯＲ機能調節に関連する疾患又は症状の予防及び／又は治療方法を提供し、当該方法は、本開示のｓｉＲＮＡ及び／又は医薬組成物及び／又はｓｉＲＮＡ複合体を有効量で、それを必要とする被験体に投与することを含む。本開示のｓｉＲＮＡ活性成分を、それを必要とする被験体に投与することにより、ＲＮＡ干渉機構により疾患を予防及び／又は治療する目的を達成することができる。したがって、本開示のｓｉＲＮＡ及び／又は医薬組成物及び／又はｓｉＲＮＡ複合体は、ＲＰＴＯＲ機能調節に関連する疾患又は症状の予防及び／又は治療に用いられてもよく、ＲＰＴＯＲ機能調節に関連する疾患又は症状を予防及び／又は治療する薬物の調製に用いられてもよい。

【0171】

本明細書で用いられる用語「薬物投与／投与」とは、本開示のｓｉＲＮＡ、医薬組成物及び／又はｓｉＲＮＡ複合体を少なくとも一部で所望の部位に局在化して所望の効果を生じさせる方法又は経路により、本開示のｓｉＲＮＡ、医薬組成物及び／又はｓｉＲＮＡ複合体を被験体の体内に入れることを指す。本開示の方法に適した投与経路は、局所投与と全身投与を含む。一般的には、局所投与により、被験体の体循環よりも多くのｓｉＲＮＡ複合体が特定の部位に送達されるが、全身投与により、本開示のｓｉＲＮＡ、医薬組成物及び／又はｓｉＲＮＡ複合体が被験体の基本体循環に送達される。本開示が神経変性疾患の予防及び／又は治療手段を提供することを意図することを考慮すると、いくつかの実施形態において、薬物を中枢神経系組織に送達することができる投与方法が用いられる。いくつかの実施形態において、薬物を髄腔内に送達することができる投与方法が用いられる。いくつかの実施形態において、薬物を脊髄液に注射することができる投与方法が用いられる。

【0172】

本分野で既知の任意の適切な経路で被験体に投与することができ、前記経路としては、経口投与又は胃腸外経路、例えば、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、経皮投与、気管内投与（エアロゾル）、脳室内投与、髄腔内投与、鼻部投与、直腸投与及び局所投与（口腔内投与と舌下投与を含む）を含むが、これらに限定されない。投与頻度は、１日、１週間、２週間、３週間、１ヶ月又は１年に１回又は複数回であってもよい。本開示に記載されたｓｉＲＮＡ、医薬組成物又はｓｉＲＮＡ複合体の用量は、本分野における通常の用量であってもよく、前記用量は、各種のパラメータ、特に被験体の年齢、体重及び性別により決定されてもよい。細胞培養又は実験動物で標準薬学的手順により毒性と治療効果を測定し、例えば、ＬＤ_５０（５０％の群体を死亡させる致死用量）及びＥＤ_５０（計量的反応において、５０％の最大反応強度を引き起こすことができる用量を指し、計数的反応において、５０％の実験対象に陽性反応が発生する場合の用量を指す）を測定してもよい。細胞培養分析及び動物研究により得られたデータに基づいてヒト用量の範囲を得ることができる。いくつかの実施形態において、前記ｓｉＲＮＡ、医薬組成物又はｓｉＲＮＡ複合体から製造された製剤の投与過程における用量は、投与方式によって調整される。

【0173】

本開示に記載されたｓｉＲＮＡ、医薬組成物、及び／又はｓｉＲＮＡ複合体を投与する場合、例えば、雄性又は雌性、６～１２週齢、体重１８～２５ｇのＣ５７ＢＬ／６Ｊ又は３０～４５ｇのｏｂ／ｏｂマウスに対するｓｉＲＮＡの量は、次のとおりである。（ｉ）ｓｉＲＮＡ複合体について、そのｓｉＲＮＡ用量は０．００１～１００ｍｇ／ｋｇ体重であってもよく、いくつかの実施形態においては０．０１～５０ｍｇ／ｋｇ体重であり、更なる実施形態においては０．０５～２０ｍｇ／ｋｇ体重であり、より更なる実施形態においては０．１～１５ｍｇ／ｋｇ体重であり、また更なる実施形態においては０．１～１０ｍｇ／ｋｇ体重である。（ｉｉ）ｓｉＲＮＡ及び薬学的に許容可能な担体により形成された医薬組成物について、そのｓｉＲＮＡ用量は０．００１～５０ｍｇ／ｋｇ体重であってもよく、いくつかの実施形態においては０．０１～１０ｍｇ／ｋｇ体重であり、更なる実施形態においては０．０５～５ｍｇ／ｋｇ体重であり、より更なる実施形態においては０．１～３ｍｇ／ｋｇ体重である。

【0174】

いくつかの実施形態において、本開示は、細胞におけるＲＰＴＯＲ遺伝子発現の抑制方法を提供し、当該方法は、本開示のｓｉＲＮＡ及び／又は医薬組成物及び／又はｓｉＲＮＡ複合体を有効量で前記細胞と接触させ、本開示のｓｉＲＮＡ及び／又は医薬組成物及び／又はｓｉＲＮＡ複合体を前記細胞に導入し、ＲＮＡ干渉機構により細胞におけるＲＰＴＯＲ遺伝子発現を抑制する目的を達成することを含む。

【0175】

本開示により提供される方法により細胞におけるＲＰＴＯＲ遺伝子発現を抑制し、提供される修飾ｓｉＲＮＡ、医薬組成物及び／又はｓｉＲＮＡ複合体におけるｓｉＲＮＡ用量は、一般的に、標的遺伝子の発現を低減でき、標的細胞表面では１ｐＭ～１μＭ、０．０１ｎＭ～１００ｎＭ、０．０５ｎＭ～５０ｎＭ、又は０．０５ｎＭ～約５ｎＭの細胞外濃度となる量である。当該局所濃度を達成するのに必要な量は、送達方法、送達部位、送達部位と標的細胞又は組織との間の細胞層の数、送達経路（局所か全身か）等を含む各種の因子により変化する。送達部位での濃度は、標的細胞又は組織の表面での濃度よりも顕著に高くてもよい。

【0176】

キット
一態様において、本開示は、キットを提供し、前記キットは、有効量の本開示のｓｉＲＮＡ、医薬組成物及びｓｉＲＮＡ複合体のうちの少なくとも１種を含む。

【0177】

いくつかの実施形態において、本明細書に記載されたキットは、容器でｓｉＲＮＡを提供することができる。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されたキットは、薬学的に許容可能な賦形剤を提供する容器を含んでもよい。いくつかの実施形態において、前記キットには、他の成分、例えば、安定化剤又は防腐剤などが含まれてもよい。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されたキットは、本明細書に記載されたｓｉＲＮＡを提供する容器とは別の容器で少なくとも１種の他の治療剤を含んでもよい。いくつかの実施形態において、前記キットは、ｓｉＲＮＡと薬学的に許容可能な担体及び／又は添加剤又は他の成分（存在する場合）を混合するための説明書を含んでもよい。

【0178】

本開示のキットにおいて、前記ｓｉＲＮＡ及び薬学的に許容可能な担体及び／又は添加剤、並びに、前記修飾ｓｉＲＮＡ、医薬組成物及び／又はｓｉＲＮＡ複合体、及び／又は薬学的に許容可能な担体及び／又は添加剤は、任意の形態、例えば、液体形態、乾燥形態又は凍結乾燥形態で提供されてもよい。いくつかの実施形態において、前記ｓｉＲＮＡ及び薬学的に許容可能な担体及び／又は添加剤、並びに前記医薬組成物及び／又はｓｉＲＮＡ複合体の薬学的に許容可能な担体及び／又は添加剤は、基本的にクリーン及び／又は無菌である。いくつかの実施形態において、本開示のキットで無菌水を提供することができる。

【0179】

以下、実施例により本開示を更に説明するが、本開示は、これによって何ら制限されない。

【実施例】

【0180】

特に説明がない限り、以下の実施例で用いられる試薬、培地は、いずれも市販品であり、用いられる核酸電気泳動、ｒｅａｌ－ｔｉｍｅＰＣＲなどの操作は、いずれもＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬＢｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ（１９８９））に記載された方法を参照して行われる。

【0181】

別に説明がない限り、以下で提供される試薬割合は、いずれも体積比（ｖ／ｖ）として計算される。データ分析では、Ｇｒａｐｈｐａｄｐｒｉｓｍ８．０統計分析ソフトウェアが用いられる。

【0182】

特に説明がない限り、以下の実施例で用いられる試薬、培地は、いずれも市販品であり、用いられる核酸電気泳動、ｒｅａｌ－ｔｉｍｅＰＣＲなどの操作は、いずれもＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ（１９８９））に記載された方法を参照して行われる。

【0183】

調製例１～５：本開示により提供されるｓｉＲＮＡの合成
固相合成方法により、それぞれ表２に列挙されたｓｉＲＮＡ配列を合成し、等モルの表２における相補的なセンス鎖及びアンチセンス鎖をＤＥＰＣ水にそれぞれ溶解し、その後にアニールして、本開示により提供されるｓｉＲＰＴＯＲａ２－Ｍ１Ｘ、ｓｉＲＰＴＯＲｂ２－Ｍ１Ｘ、ｓｉＲＰＴＯＲｃ２－Ｍ１Ｘ、ｓｉＲＰＴＯＲｃ１－Ｔ２Ｓ及びｓｉＲＰＴＯＲｃ１－Ｍ１Ｓを得た。超純水（Ｍｉｌｌｉ－Ｑ超純水装置、抵抗率１８．２ＭΩ^＊ｃｍ（２５℃））を用いてｓｉＲＮＡを濃度０．２ｇ／ｍＬ（ｓｉＲＮＡとして）に希釈した後、液体クロマトグラフィー質量分析計（ＬＣ－ＭＳ、ＬｉｑｕｉｄＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ－ＭａｓｓＳｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ、Ｗａｔｅｒｓ社から購入、型番：ＬＣＴＰｒｅｍｉｅｒ）を用いて、分子量を検出した。実測値が理論値と一致しており、合成されたｓｉＲＮＡが目的設計の二本鎖核酸配列であることが示された。

【0184】

比較調製例１：参照ｓｉＲＮＡの合成
固相合成方法により、それぞれ表２における、ｓｉＲＮＡ番号がＮＣのｓｉＲＮＡに対応するセンス鎖及びアンチセンス鎖を合成した。等モルのセンス鎖及びアンチセンス鎖をＤＥＰＣ水に溶解し、その後にアニールして、参照ｓｉＲＮＡを得、番号をＮＣにした。ＮＣは、ＲＰＴＯＲｍＲＮＡと配列相同性を有さない陰性対照ｓｉＲＮＡである。

【0185】

表２ｓｉＲＮＡ配列

【表4】

【0186】

ここで、大文字Ｃ、Ｇ、Ｕ、Ａは、ヌクレオチドの塩基配列を表し、小文字ｍは、当該文字ｍの左側に隣接する１つのヌクレオチドがメトキシ修飾ヌクレオチドであることを表し、小文字ｆは、当該文字ｆの左側に隣接する１つのヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであることを表し、小文字ｓは、当該文字ｓの左右の２つのヌクレオチド間がチオリン酸エステル基により結合されていることを表し、大文字Ｐは、当該文字Ｐの右側に隣接する１つのヌクレオチドが５’－リン酸ヌクレオチドであることを表し、組合せ文字ｍｏｅは、当該組合せ文字ｍｏｅの左側に隣接する１つのヌクレオチドが２’－Ｏ－メトキシエチル修飾を有するヌクレオチドであることを表す。

【0187】

上記本開示のｓｉＲＮＡ又は参照ｓｉＲＮＡの調製が完了した後、固体粉末に凍結乾燥して使用に備えた。

【0188】

調製例６及び７：複合体１及び複合体２の合成
国際公開第２０１９／１０５４３７号の調製例１における「複合体１」の調製方法により本開示の複合体１を得たが、センス鎖及びアンチセンス鎖の一本鎖を調製したとき、表２におけるｓｉＲＰＴＯＲｃ１－Ｔ２Ｓのセンス鎖とアンチセンス鎖の配列に従って、対応する位置のヌクレオシドモノマーをそれぞれ１つずつ結合した点のみが異なっている。液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ－ＭＳ）により分子量を検出した。その結果、センス鎖の理論値が７４６８．３、センス鎖の実測値が７４６７．２であり、アンチセンス鎖の理論値が７１０７．７、アンチセンス鎖の実測値が７１０６．７であった。実測値が理論値と一致しており、合成された複合体１が、式（３０１）に示される基を含む、目的設計の二本鎖核酸配列であることが決定された。複合体１の構造を、以下の式（３０１）により示す。

【0189】

【化13】

【0190】

式（３０１）中のＮｕは、本開示の表１におけるｓｉＲＰＴＯＲｃ１－Ｔ２Ｓであり、複合基は、ｓｉＲＰＴＯＲｃ１－Ｔ２Ｓのセンス鎖の３’末端のリボース基の３’位に結合され、前記複合体は、ナトリウム塩形態である。

【0191】

上記方法により本開示の複合体２を調製したが、センス鎖及びアンチセンス鎖の一本鎖を調製したとき、表２におけるｓｉＲＰＴＯＲｃ１－Ｔ２Ｓのセンス鎖とアンチセンス鎖の配列に従って、対応する位置のヌクレオシドモノマーをそれぞれ１つずつ結合した点のみが異なっている。液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ－ＭＳ）により分子量を検出した。その結果、センス鎖の理論値が７４６８．３、センス鎖の実測値が７４６７．２であり、アンチセンス鎖の理論値が７０６３．７、アンチセンス鎖の実測値が７０６２．７である。実測値が理論値と一致しており、合成された複合体２が、式（３０１）に示される基を含む、目的設計の二本鎖核酸配列であることが決定された。複合体２の構造を、以下の式（３０１）により示す。式（３０１）中のＮｕは、本開示の表１におけるｓｉＲＰＴＯＲｃ１－Ｍ１Ｓであり、複合基は、ｓｉＲＰＴＯＲｃ１－Ｍ１Ｓのセンス鎖の３’末端のリボース基の３’位に結合され、前記複合体は、ナトリウム塩形態である。

【0192】

実験例１：本開示のｓｉＲＮＡの体外（ｉｎｖｉｔｒｏ）における抑制活性
本実験例では、本開示のｓｉＲＰＴＯＲａ２－Ｍ１Ｘ、ｓｉＲＰＴＯＲｂ２－Ｍ１Ｘ及びｓｉＲＰＴＯＲｃ２－Ｍ１Ｘの体外ＨｅｐＧ２ヒト肝癌細胞における抑制活性を考察した。

【0193】

１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ、ＲＭＢＩＯ社）を添加したＤＭＥＭ培地（Ｈｙｃｌｏｎｅ社）でＨｅｐＧ２ヒト肝癌細胞（南京科佰生物技術有限公司から購入）を３７℃で５％ＣＯ_２／９５％空気含有インキュベーターにおいて培養した。

【0194】

ＨｅｐＧ２細胞を２．０ｘ１０^５個の細胞／ウェルで１２ウェルプレートに接種し、１ウェルあたり１ｍＬの細胞液で２４ｈ培養した後、培養ウェル中の培地をすべて吸引し、各ウェルに別途５００μＬのＯｐｔｉ－ＭＥＭ培地（ＧＩＢＣＯ社）を添加した。

【0195】

ＰＢＳ緩衝液を用いて、調製例１～３で調製したｓｉＲＰＴＯＲａ２－Ｍ１Ｘ、ｓｉＲＰＴＯＲｂ２－Ｍ１Ｘ及びｓｉＲＰＴＯＲｃ２－Ｍ１Ｘから、それぞれ濃度２０μＭのｓｉＲＮＡ希釈標準溶液を調製した。

【0196】

各ｓｉＲＮＡに対して、１Ａ１溶液を調製し、１部の１Ａ１溶液は、４８．５μＬのＯｐｔｉ－ＭＥＭ培地及び１．５μＬの２０μＭのｓｉＲＮＡ希釈標準溶液を含む。

【0197】

１Ｂ溶液を調製し、１部の１Ｂ溶液は、４９μＬのＯｐｔｉ－ＭＥＭ培地及び１μＬのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ^ＴＭ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を含む。

【0198】

各ｓｉＲＮＡに対して、それぞれ１部の１Ｂ溶液と１部の１Ａ１溶液を室温で２０ｍｉｎインキュベートして、トランスフェクション複合体１Ｘａ、１Ｘｂ又は１Ｘｃを得た。

【0199】

１部の１Ｂ溶液を５０μＬのＯｐｔｉ－ＭＥＭ培地と混合し、室温で２０ｍｉｎインキュベートして、トランスフェクション複合体１Ｘを得た。

【0200】

２つの培養ウェル（いずれも上記ＨｅｐＧ２細胞及び５００μＬのＯｐｔｉ－ＭＥＭ培地を含む培養ウェルであり、以下同じ）中に、それぞれトランスフェクション複合体１Ｘａを１００μＬ／ウェルの添加量で添加し、均一に混合して、最終濃度が５０ｎＭのトランスフェクション混合物を得、試験群１と記した。

【0201】

２つの培養ウェル（いずれも上記ＨｅｐＧ２細胞及び５００μＬのＯｐｔｉ－ＭＥＭ培地を含む培養ウェルであり、以下同じ）中に、それぞれトランスフェクション複合体１Ｘｂを１００μＬ／ウェルの添加量で添加し、均一に混合して、最終濃度が５０ｎＭのトランスフェクション混合物を得、試験群２と記した。

【0202】

２つの培養ウェル（いずれも上記ＨｅｐＧ２細胞及び５００μＬのＯｐｔｉ－ＭＥＭ培地を含む培養ウェルであり、以下同じ）中に、それぞれトランスフェクション複合体１Ｘｃを１００μＬ／ウェルの添加量で添加し、均一に混合して、最終濃度が５０ｎＭのトランスフェクション混合物を得、試験群３と記した。

【0203】

別の２つの培養ウェルに、それぞれトランスフェクション複合体１Ｘを１００μＬ／ウェルの添加量で添加し、均一に混合して、ｓｉＲＮＡを含まないトランスフェクション混合物を得、ブランク対照群と記した。

【0204】

上記試験群１～３及びブランク対照群を培養ウェルで４ｈ培養した後、各培養ウェル中の上清を吸引し、各ウェルに１ｍＬのＯｐｔｉ－ＭＥＭ培地を添加した。１２ウェルプレートをＣＯ_２インキュベーターに置いて、３７℃で培養を２４ｈ継続した。

【0205】

生工生物社のＵＮＩＱ－１０カラム式全ＲＮＡ抽出キット（生工生物社から購入、番号：ＴＣ１３ＫＡ４１０９）を用いて、説明書に記載された方法に基づいて各ウェルの細胞中の全ＲＮＡを抽出した。

【0206】

各ウェルの細胞につき、それぞれ１μｇの全ＲＮＡを取り、逆転写キットＧｏｌｄｅｎｓｔａｒ^ＴＭＲＴ６ｃＤＮＡＳｙｎｔｈｅｓｉｓＫｉｔ（北京ケイ科新業生物技術有限公司から購入）により提供された試薬を使用し、Ｇｏｌｄｅｎｓｔａｒ^ＴＭＯｌｉｇｏ（ｄＴ）_１７をプライマーとして選択し、キットの説明書における逆転写操作工程に従って逆転写反応系２０μＬを調製し、各ウェルの細胞の全ＲＮＡを逆転写した。逆転写の条件は、以下のとおりである。各逆転写反応系に対して、逆転写反応系を５０℃で５０ｍｉｎインキュベートし、次に８５℃で５ｍｉｎインキュベートし、最後に４℃で３０ｓインキュベートし、反応が終了した後、逆転写反応系にＤＥＰＣ水８０μＬを添加して、ｃＤＮＡを含む溶液を得た。

【0207】

各逆転写反応系に対して、それぞれ上記ｃＤＮＡを含む溶液５μＬをテンプレートとし、ＮｏｖｏＳｔａｒｔ（登録商標）ＳＹＢＲｑＰＣＲＳｕｐｅｒＭｉｘＰｌｕｓキット（近岸蛋白質科技有限公司から購入、番号Ｅ０９６－０１Ｂ）により提供された試薬を使用してｑＰＣＲ反応系２０μＬを調製した。目的遺伝子ＲＰＴＯＲ及び内因性参照遺伝子ＧＡＰＤＨを増幅するためのＰＣＲプライマー配列は、表３に示すとおりであり、各プライマーの最終濃度は、０．２５μＭである。各ｑＰＣＲ反応系をＡＢＩＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓＲｅａｌ－ＴｉｍｅＰＣＲ装置に置き、３段階法を用いて増幅した。増幅プロセスとしては、９５℃で１０ｍｉｎ予め変性し、次に９５℃で３０ｓ変性し、６０℃で３０ｓアニールし、７２℃で３０ｓ伸長し、上記変性、アニール、伸長工程を合計４０回繰り返して、目的遺伝子ＲＰＴＯＲ及び内因性参照遺伝子ＧＡＰＤＨを増幅した生成物Ｗ１を得た。生成物Ｗ１を直ちに９５℃で１５ｓ、６０℃で１ｍｉｎ、９５℃で１５ｓ順にインキュベートし、定量的リアルタイムＰＣＲ装置によりそれぞれ生成物Ｗ１中の目的遺伝子及び内因性参照遺伝子ＧＡＰＤＨの溶解曲線を回収し、目的遺伝子ＲＰＴＯＲ及び内因性参照遺伝子ＧＡＰＤＨのＣｔ値を得た。

【0208】

表３プライマー情報

【表5】

【0209】

比較Ｃｔ（ΔΔＣｔ）法を用い、各試験群における目的遺伝子ＲＰＴＯＲを相対的かつ定量的に算出した。算出方法は以下のとおりである。

【0210】

ΔＣｔ（試験群）＝Ｃｔ（試験群の目的遺伝子）－Ｃｔ（試験群の内因性参照遺伝子）
ΔＣｔ（対照群）＝Ｃｔ（対照群の目的遺伝子）－Ｃｔ（対照群の内因性参照遺伝子）
ΔΔＣｔ（試験群）＝ΔＣｔ（試験群）－ΔＣｔ（対照群の平均値）
ΔΔＣｔ（対照群）＝ΔＣｔ（対照群）－ΔＣｔ（対照群の平均値）
ΔＣｔ（対照群の平均値）は、対照群の２つの培養ウェルのそれぞれのΔＣｔ（対照群）の算術平均値である。それにより、試験群及び対照群の各培養ウェルは、１つのΔΔＣｔ値に対応する。

【0211】

対照群の平均値を基準として、試験群ＲＰＴＯＲｍＲＮＡの発現レベルを正規化し、ブランク対照群ＲＰＴＯＲｍＲＮＡの発現レベルの平均値を１００％と定義する。

【0212】

試験群ＲＰＴＯＲｍＲＮＡの相対的発現レベル＝２^{－ΔΔＣｔ（試験群）}×１００％
試験群ＲＰＴＯＲｍＲＮＡの抑制率＝（１－試験群ＲＰＴＯＲｍＲＮＡの相対的発現レベル）×１００％

【0213】

実験結果を図１に示した。

【0214】

比較実験例１：参照ｓｉＲＮＡＮＣの体外（ｉｎｖｉｔｒｏ）における抑制活性
実験例１の方法により陰性参照ｓｉＲＮＡＮＣの体外ＨｅｐＧ２ヒト肝癌細胞における抑制活性を同時に考察したが、ｓｉＲＰＴＯＲａ２－Ｍ１Ｘ、ｓｉＲＰＴＯＲｂ２－Ｍ１Ｘ又はｓｉＲＰＴＯＲｃ２－Ｍ１Ｘの代わりに比較調製例で調製した参照ｓｉＲＮＡＮＣを用いて、濃度２０μＭのｓｉＲＮＡ希釈標準溶液を調製して試験した点のみが異なっている。結果を図１に示した。

【0215】

図１は、５０ｎＭの本開示のｓｉＲＮＡ及び参照ｓｉＲＮＡＮＣをトランスフェクションした後の、体外ＨｅｐＧ２ヒト肝癌細胞におけるＲＰＴＯＲｍＲＮＡの相対的発現レベルを示すヒストグラムであり、図１において、ＮＣは、参照ｓｉＲＮＡＮＣを表す。図１の結果から分かるように、体外ＨｅｐＧ２ヒト肝癌細胞において、５０ｎＭの濃度で、ｓｉＲＰＴＯＲａ２－Ｍ１ＸのＲＰＴＯＲｍＲＮＡ抑制率が７６．８％であり、５０ｎＭの濃度で、ｓｉＲＰＴＯＲｂ２－Ｍ１ＸのＲＰＴＯＲｍＲＮＡ抑制率が８６．８％であり、５０ｎＭの濃度で、ｓｉＲＰＴＯＲｃ２－Ｍ１ＸのＲＰＴＯＲｍＲＮＡ抑制率が７８．８％であり、優れたＲＰＴＯＲｍＲＮＡ抑制活性を示し、優れたＲＰＴＯＲ遺伝子発現抑制効果を示した。

【0216】

実験例２：本開示のｓｉＲＮＡの体外（ｉｎｖｉｔｒｏ）における標的ｍＲＮＡ抑制活性
本実験例では、異なる濃度の本開示のｓｉＲＰＴＯＲａ２－Ｍ１Ｘ、ｓｉＲＰＴＯＲｂ２－Ｍ１Ｘ及びｓｉＲＰＴＯＲｃ２－Ｍ１Ｘの体外ＨｅｐＧ２ヒト肝癌細胞におけるＲＰＴＯＲｍＲＮＡ抑制活性を考察した。

【0217】

【0218】

【0219】

各ｓｉＲＮＡに対して、ＰＢＳ緩衝液を用いて、調製例１～３で調製したｓｉＲＰＴＯＲａ２－Ｍ１Ｘ、ｓｉＲＰＴＯＲｂ２－Ｍ１Ｘ及びｓｉＲＰＴＯＲｃ２－Ｍ１Ｘから、それぞれ濃度２０μＭ、２μＭ及び０．２μＭのｓｉＲＮＡ希釈標準溶液を調製した。

【0220】

各ｓｉＲＮＡに対して、２Ａ１溶液を調製し、１部の２Ａ１溶液は、４８．５μＬのＯｐｔｉ－ＭＥＭ培地及び１．５μＬの濃度２０μＭのｓｉＲＮＡ希釈標準溶液を含み、それぞれ２Ａ１ａ、２Ａ１ｂ又は２Ａ１ｃのｓｉＲＮＡ希釈標準溶液を得た。

【0221】

各ｓｉＲＮＡに対して、２Ａ２溶液を調製し、１部の２Ａ２溶液は、４８．５μＬのＯｐｔｉ－ＭＥＭ培地及び１．５μＬの濃度２μＭのｓｉＲＮＡ希釈標準溶液を含み、それぞれ２Ａ２ａ、２Ａ２ｂ又は２Ａ２ｃのｓｉＲＮＡ希釈標準溶液を得た。

【0222】

各ｓｉＲＮＡに対して、２Ａ３溶液を調製し、１部の２Ａ３溶液は、４８．５μＬのＯｐｔｉ－ＭＥＭ培地及び１．５μＬの濃度０．２μＭのｓｉＲＮＡ希釈標準溶液を含み、それぞれ２Ａ３ａ、２Ａ３ｂ又は２Ａ３ｃのｓｉＲＮＡ希釈標準溶液を得た。

【0223】

２Ｂ溶液を調製し、１部の２Ｂ溶液は、４９μＬのＯｐｔｉ－ＭＥＭ培地及び１μＬのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ^ＴＭ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を含む。

【0224】

２Ｘ０溶液を調製し、１部の２Ｂ溶液を５０μＬのＯｐｔｉ－ＭＥＭ培地と混合し、室温で２０ｍｉｎインキュベートして、ブランクトランスフェクション複合体２Ｘ０を得た。

【0225】

２Ｘ１溶液を調製し、１部の２Ｂ溶液を１部の２Ａ１ａ溶液、１部の２Ａ２ａ溶液及び１部の２Ａ３ａ溶液とそれぞれ混合し、室温で２０ｍｉｎインキュベートして、それぞれトランスフェクション複合体２Ｘａ１、２Ｘａ２及び２Ｘａ３を得た。

【0226】

２Ｘ２溶液を調製し、１部の２Ｂ溶液を１部の２Ａ１ｂ溶液、１部の２Ａ２ｂ溶液及び１部の２Ａ３ｂ溶液とそれぞれ混合し、室温で２０ｍｉｎインキュベートして、それぞれトランスフェクション複合体２Ｘｂ１、２Ｘｂ２及び２Ｘｂ３を得た。

【0227】

２Ｘ３溶液を調製し、１部の２Ｂ溶液を１部の２Ａ１ｃ溶液、１部の２Ａ２ｃ溶液及び１部の２Ａ３ｃ溶液とそれぞれ混合し、室温で２０ｍｉｎインキュベートして、それぞれトランスフェクション複合体２Ｘｃ１、２Ｘｃ２及び２Ｘｃ３を得た。

【0228】

各ｓｉＲＮＡに対して、２つの培養ウェル（いずれも上記ＨｅｐＧ２細胞及び５００μＬのＯｐｔｉ－ＭＥＭ培地を含む培養ウェルであり、以下同じ）中に、それぞれトランスフェクション複合体２Ｘａ１、２Ｘａ２又は２Ｘａ３を１００μＬ／ウェルの添加量で添加し、均一に混合して、ｓｉＲＰＴＯＲａ２－Ｍ１Ｘを含む、最終濃度が５０ｎＭ、５ｎＭ又は０．５ｎＭのトランスフェクション混合物を得、試験群１と記した。

【0229】

各ｓｉＲＮＡに対して、２つの培養ウェル（いずれも上記ＨｅｐＧ２細胞及び５００μＬのＯｐｔｉ－ＭＥＭ培地を含む培養ウェルであり、以下同じ）中に、それぞれトランスフェクション複合体２Ｘｂ１、２Ｘｂ２又は２Ｘｂ３を１００μＬ／ウェルの添加量で添加し、均一に混合して、ｓｉＲＰＴＯＲｂ２－Ｍ１Ｘを含む、最終濃度が５０ｎＭ、５ｎＭ又は０．５ｎＭのトランスフェクション混合物を得、試験群２と記した。

【0230】

各ｓｉＲＮＡに対して、２つの培養ウェル（いずれも上記ＨｅｐＧ２細胞及び５００μＬのＯｐｔｉ－ＭＥＭ培地を含む培養ウェルであり、以下同じ）中に、それぞれトランスフェクション複合体２Ｘｃ１、２Ｘｃ２又は２Ｘｃ３を１００μＬ／ウェルの添加量で添加し、均一に混合して、ｓｉＲＰＴＯＲｃ２－Ｍ１Ｘを含む、最終濃度が５０ｎＭ、５ｎＭ又は０．５ｎＭのトランスフェクション混合物を得、試験群３と記した。

【0231】

別の２つの培養ウェルに、それぞれブランクトランスフェクション複合体２Ｘ０を１００μＬ／ウェルの添加量で添加し、均一に混合して、ｓｉＲＮＡを含まないトランスフェクション混合物を得、ブランク対照群と記した。

【0232】

【0233】

実験例１と同じ方法を用いて各ウェルの細胞中の全ＲＮＡを抽出し、逆転写して、各試験群における標的遺伝子ＲＰＴＯＲｍＲＮＡを相対的かつ定量的に算出した。結果を図２に示した。

【0234】

図２は、異なる濃度の本開示のｓｉＲＮＡをトランスフェクションした後の、体外ＨｅｐＧ２ヒト肝癌細胞におけるＲＰＴＯＲｍＲＮＡの相対的発現レベルを示すヒストグラムである。図２の結果から分かるように、体外ＨｅｐＧ２ヒト肝癌細胞において、ｓｉＲＰＴＯＲｃ２－Ｍ１Ｘが０．５ｎＭの低濃度で少なくとも４０．５％のＲＰＴＯＲｍＲＮＡ抑制率を示し、ｓｉＲＰＴＯＲａ２－Ｍ１Ｘが５ｎＭの濃度では少なくとも６８．３％、５０ｎＭの濃度では少なくとも７１．１％のＲＰＴＯＲｍＲＮＡ抑制率を示し、ｓｉＲＰＴＯＲｂ２－Ｍ１Ｘが５０ｎＭの濃度で８６．４％に達するＲＰＴＯＲｍＲＮＡ抑制率を示しており、優れたＲＰＴＯＲ遺伝子発現抑制効果を示した。

【0235】

実験例３：ｓｉＲＮＡ複合体のマウス体内における抑制活性
調製例６及び７で調製して得た複合体１及び複合体２を、それぞれＰＢＳに溶解し、３ｍｇ／ｍｌのｓｉＲＮＡ複合体溶液（ｓｉＲＮＡとして）とした。Ｃ５７ＢＬ／６マウス（雌性、体重１６～１８ｇ、６～８週齢、斯貝福公司から購入）をランダムに３群に分け、１群当たりマウス６匹とし、それぞれ番号を付けた。首後部に皮下注射する方式で、第１群の各マウスにそれぞれ上記ｓｉＲＮＡ複合体１溶液を投与し、投与前に体重を測定して記録し、投与体積を５ｍＬ／ｋｇとして体重に応じて投与し、試験群１と記した。第２群の各マウスにそれぞれ上記ｓｉＲＮＡ複合体２溶液を投与し、投与前に体重を測定して記録し、投与体積を５ｍＬ／ｋｇとして体重に応じて投与し、試験群２と記した。残りの群の各マウスに投与体積を５ｍＬ／ｋｇとしてＰＢＳを投与し、ブランク対照群とした。

【0236】

投与時点を１日目として、８日目に試験群及びブランク対照群の各マウスの肝臓組織を取り、ＲＮＡｌａｔｅｒで保存した。

【0237】

実験例１と同じ方法を用いて各ウェルの細胞中の全ＲＮＡを抽出し、逆転写して、各試験群における標的遺伝子ＲＰＴＯＲを相対的かつ定量的に算出し、用いられるプライマー情報を上記表３に示し、ブランク対照群の結果を正規化した。結果を表４に示した。

【0238】

表４ｓｉＲＮＡ複合体のマウス体内における抑制活性

【表6】