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特表2024-546681多重遺伝子特異的ＰＣＲを使用する遺伝性変異を検出するための方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-12-26
(54)【発明の名称】多重遺伝子特異的ＰＣＲを使用する遺伝性変異を検出するための方法
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/6869 20180101AFI20241219BHJP
C12Q 1/6883 20180101ALI20241219BHJP
G01N 33/53 20060101ALI20241219BHJP
C12Q 1/686 20180101ALN20241219BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/6869 Z ZNA
C12Q1/6883 Z
G01N33/53 M
C12Q1/686 Z
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024533983
(86)(22)【出願日】2022-12-06
(85)【翻訳文提出日】2024-07-25
(86)【国際出願番号】 US2022052044
(87)【国際公開番号】W WO2023107512
(87)【国際公開日】2023-06-15
(31)【優先権主張番号】63/286,906
(32)【優先日】2021-12-07
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】519059753
【氏名又は名称】クエスト ダイアグノスティクス インベストメンツ エルエルシー
(74)【代理人】
【識別番号】110002572
【氏名又は名称】弁理士法人平木国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】ローゼンタール，スン ヒー
【テーマコード（参考）】
4B063
【Ｆターム（参考）】
4B063QA13
4B063QA17
4B063QA19
4B063QQ03
4B063QQ42
4B063QR08
4B063QR32
4B063QR62
4B063QS24
(57)【要約】
本開示は、多重遺伝子特異的ＰＣＲを使用して、遺伝性変異（例えば、アシュケナージ系ユダヤ人キャリア変異、ベータサラセミア変異、又はアルファサラセミア変異）を検出するための方法を提供する。本方法を実践する際に使用するためのキットも提供される。
【選択図】なし
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
少なくとも１つの遺伝性遺伝的変異についてのキャリアであることが疑われる対象における遺伝的障害のための１つ以上のバリアントを検出するための方法であって、前記対象から得られた生体試料からＤＮＡを抽出することと、
前記生体試料を第１の複数のプライマー対と接触させることによって、第１の複数のアンプリコンを生成することであって、少なくとも１つのアンプリコンが、複数の遺伝子の各々に対応し、前記複数の遺伝子が、ＨＥＸＡ、ＳＭＰＤ１、ＭＣＯＬＮ１、ＧＢＡ、ＦＡＮＣＣ、ＩＫＢＫＡＰ、ＡＳＰＡ、ＢＬＭ、ＢＣＫＤＨＢ、Ｇ６ＰＣ、ＡＢＣＣ８、ＤＬＤ、ＮＥＢ、ＰＣＤＨ１５、ＣＬＲＮ１、ＴＭＥＭ２１６、及びＦＫＴＮを含む、生成することと、
前記生体試料を第２の複数のプライマー対と接触させることによって、第２の複数のアンプリコンを生成することであって、少なくとも１つのアンプリコンが、ＧＢＡ及びＨＢＢの各々に対応し、前記第２の複数のプライマー対が、配列番号８１及び８２、並びに配列番号８３及び８４を含む、生成することと、
前記生体試料を、第３の複数のプライマー対、ホットスタートＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、及びＴａｑエクステンダーＰＣＲ添加剤と接触させることによって、第３の複数のアンプリコンを生成することであって、少なくとも１つのアンプリコンが、ＨＢＡ１及びＨＢＡ２の各々に対応する、生成することと、
ポリメラーゼ連鎖反応を介して、前記第１、第２、及び第３の複数のアンプリコンの末端にバーコード配列を組み込むことと、
高スループット大規模並列シーケンシングを使用して、前記第１、第２、及び第３の複数のアンプリコンのうちの少なくとも１つにおける１つ以上のバリアントを検出することと、を含む、方法。
【請求項2】
前記第１の複数のプライマー対が、欠失が存在する場合にのみ、標的領域を増幅するように設計された少なくとも１つのギャッププライマー対を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記第２の複数のプライマー対のＧＢＡプライマーが、ＧＢＡ遺伝子を特異的に増幅し、任意のＧＢＡ疑似遺伝子を増幅しない、請求項１に記載の方法。
【請求項4】
前記第３の複数のプライマー対が、欠失が存在する場合にのみ、標的領域を増幅するように設計された少なくとも１つのギャッププライマー対を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項5】
前記ＨＥＸＡ遺伝子の変動が、テイ－サックス病を引き起こし、前記ＳＭＰＤ１遺伝子の変動が、ニーマンピック病を引き起こし、
前記ＭＣＯＬＮ１遺伝子の変動が、ＩＶ型ムコリピドーシスを引き起こし、
前記ＧＢＡ遺伝子の変動が、ゴーシェ病を引き起こし、
前記ＰＡＮＣＣ遺伝子の変動が、ファンコーニ貧血を引き起こし、
前記ＩＫＢＫＡＰ遺伝子の変動が、家族性自律神経障害を引き起こし、
前記ＡＳＰＡ遺伝子の変動が、カナバン病を引き起こし、
前記ＢＬＭ遺伝子の変動が、ブルーム症候群を引き起こし、
前記ＢＣＫＤＨＢ遺伝子の変動が、メープル血清尿症を引き起こし、
前記Ｇ６ＰＣ遺伝子の変動が、グリコーゲン貯蔵疾患Ｉを引き起こし、
前記ＡＢＣＣ８遺伝子の変動が、家族性高インスリン症を引き起こし、
前記ＤＬＤ遺伝子の変動が、ジヒドロリポアミドデヒドロゲナーゼ欠損症（ＤＬＤ）又はリポアミドデヒドロゲナーゼ欠損症（Ｅ３）を引き起こし、
前記ＮＥＢ遺伝子の変動が、ネマリンミオパシーを引き起こし、
前記ＰＣＤＨ１５遺伝子の変動が、アッシャー症候群、ＩＦ型を引き起こし、
前記ＣＬＲＮ１遺伝子の変動が、アッシャー症候群、ＩＩＩＡ型を引き起こし、
前記ＴＭＥＭ２１６遺伝子の変動が、ジュベール症候群２を引き起こし、
前記ＦＫＴＮ遺伝子の変動が、ウォーカー－ワールブルク症候群を引き起こす、請求項１に記載の方法。
【請求項6】
前記ＨＥＸＡ遺伝子の変動が、Ｒ１７８Ｈ（Ｂ１バリアント）、Ｒ２４７Ｗ、Ｒ２４９Ｗ、Ｇ２６９Ｓ、ＩＶＳ９＋１Ｇ＞Ａ、１２７８＿ＴＡＴＣ、ＩＶＳ１２＋１Ｇ＞Ｃ、又は７．６－ｋｂ Ｄｅｌ、Ｅｘ１を含み、前記ＳＭＰＤ１遺伝子の変動が、Ｌ３０２Ｐ、ｆｓＰ３３０、Ｒ４９６Ｌ（Ｒ４９８Ｌ）、又はｄｅｌｔａＲ６０８を含み、
前記ＭＣＯＬＮ１遺伝子の変動が、ＩＶＳ３－２Ａ＞Ｇ又は６．４ｋｂ＿ｄｅｌを含み、
前記ＧＢＡ遺伝子の変動が、ＩＶＳ２＋１Ｇ＞Ａ、８４Ｇ＞ＧＧ、Ｎ３７０Ｓ、ｄｅｌ＿５５ｂｐ、Ｖ３９４Ｌ、Ｄ４０９Ｈ、Ｌ４４４Ｐ、又はＲ４９６Ｈを含み、
前記ＰＡＮＣＣ遺伝子の変動が、ＩＶＳ４＋４Ａ＞Ｔ又は３２２ｄｅｌＧを含み、
前記ＩＫＢＫＡＰ遺伝子の変動が、Ｒ６９６Ｐ又はＩＶＳ２０＋６Ｔ＞Ｃを含み、
前記ＡＳＰＡ遺伝子の変動が、ＩＶＳ２－２Ａ＞Ｇ、Ｙ２３１Ｘ、Ｅ２８５Ａ、又はＡ３０５Ｅを含み、
前記ＢＬＭ遺伝子の変動が、２２８１ｄｅｌ６／ｉｎｓ７を含み、
前記ＢＣＫＤＨＢ遺伝子の変動が、Ｒ１８３Ｐ、Ｇ２７８Ｓ、又はＥ３７２Ｘを含み、
前記Ｇ６ＰＣ遺伝子の変動が、Ｒ８３Ｃ又はＱ３４７Ｘを含み、
前記ＡＢＣＣ８遺伝子の変動が、ＩＶＳ３２－９Ｇ＞Ａ又はＦ１３８７ｄｅｌを含み、
前記ＤＬＤ遺伝子の変動が、Ｙ３５＊又はＧ２２９Ｃを含み、
前記ＮＥＢ遺伝子の変動が、Ｒ２４７８＿Ｄ２５１２ｄｅｌ３５を含み、
前記ＰＣＤＨ１５遺伝子の変動が、Ｒ２４５を含み、
前記ＣＬＲＮ１遺伝子の変動が、Ｎ４８Ｋを含み、
前記ＴＭＥＭ２１６遺伝子の変動が、Ｒ７３Ｌを含み、
前記ＦＫＴＮ遺伝子の変動が、Ｆ３９０ｆｓを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項7】
前記ＨＢＢ遺伝子におけるベータサラセミア遺伝子の変動が、ｃ．＊１１１Ａ＞Ｇ、ｃ．＊１１０Ｔ＞Ｃ、ｃ．＊９６Ｔ＞Ｃ、Ｈｂ Ｄ－Ｌｏｓ Ａｎｇｅｌｅｓ（ｃ．３６４Ｇ＞Ｃ）、Ｈｂ Ｏ－Ａｒａｂ（ｃ．３６４Ｇ＞Ａ）、ｃ．３２１＿３２２ｉｎｓＧ、ｃ．３１６－２Ａ＞Ｃ、ｃ．３１６－２Ａ＞Ｇ、ｃ．３１６－３Ｃ＞Ａ、ｃ．３１６－１０６Ｃ＞Ｇ、ｃ．３１６－１２５Ａ＞Ｇ、ｃ．３１６－１４６Ｔ＞Ｇ、ｃ．３１６－１９７Ｃ＞Ｔ、ｃ．３１５＋１Ｇ＞Ａ、ｃ．２８７＿２８８ｉｎｓＡ、ｃ．２５１ｄｅｌＧ、ｃ．２３０ｄｅｌＣ、ｃ．２１６＿２１７ｉｎｓＡ、ｃ．２０３＿２０４ｄｅｌＴＧ、ｃ．１４３＿１４４ｉｎｓＡ、ｃ．１４６＿１４７ｉｎｓＡＴＣＴ、ｃ．１３５ｄｅｌＣ、ｃ．１３０Ｇ＞Ｔ、ｃ．１２６＿１２９ｄｅｌＣＴＴＴ、ｃ．１２４＿１２７ｄｅｌＴＴＣＴ、ｃ．１１８Ｃ＞Ｔ、ｃ．１１４Ｇ＞Ａ、ｃ．１１２ｄｅｌＴ、ｃ．９３－１Ｇ＞Ｃ、ｃ．９３－１Ｇ＞Ａ、ｃ．９３－２１Ｇ＞Ａ、ｃ．９２＋６Ｔ＞Ｃ、ｃ．９２＋５Ｇ＞Ａ、ｃ．９２＋５Ｇ＞Ｃ、ｃ．９２＋５Ｇ＞Ｔ、ｃ．９２＋２Ｔ＞Ａ、ｃ．９２＋２Ｔ＞Ｃ、ｃ．９２＋１Ｇ＞Ａ、ｃ．９２＋１Ｇ＞Ｔ、Ｈｂ Ｍｏｎｒｏｅ（ｃ．９２Ｇ＞Ｃ）、ｃ．９２Ｇ＞Ａ、ｃ．８４＿８５ｉｎｓＣ、ｃ．７９Ｇ＞Ｔ、ＨＢ Ｅ（ｃ．７９Ｇ＞Ａ）、ｃ．７５Ｔ＞Ａ、ｃ．５９Ａ＞Ｇ、ｃ．５２Ａ＞Ｔ（ＬＹＳ１７＊）、ｃ．５１ｄｅｌＣ、ｃ．４８Ｇ＞Ａ、ｃ．４７Ｇ＞Ａ（Ｔｒｐ１５）、ｃ．４６ｄｅｌＴ、ｃ．３６ｄｅｌＴ、ｃ．３３Ｃ＞Ａ、ｃ．２７＿２８ｉｎｓＧ、ｃ．２５＿２６ｄｅｌＡＡ、ｃ．２０ｄｅｌＡ、ＨＢ Ｓ（ｃ．２０Ａ＞Ｔ）、ＨＢ Ｃ（ｃ．１９Ｇ＞Ａ）、ｃ．１７＿１８ｄｅｌＣＴ、ｃ．２Ｔ＞Ｃ、ｃ．２Ｔ＞Ｇ、ｃ．１Ａ＞Ｇ、ｃ．－７８Ａ＞Ｃ、ｃ．－７８Ａ＞Ｇ、ｃ．－７９Ａ＞Ｇ、ｃ．－８０Ｔ＞Ａ、ｃ．－８１Ａ＞Ｇ、ｃ．－１３６Ｃ＞Ｇ、ｃ．－１３７Ｃ＞Ａ、ｃ．－１３７Ｃ＞Ｇ、ｃ．－１３７Ｃ＞Ｔ、ｃ．－１３８Ｃ＞Ｔ、ｃ．－１３８Ｃ＞Ａ、ｃ．－１４０Ｃ＞Ｔ、又はｃ．－１５１Ｃ＞Ｔを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項8】
前記ＨＢＡ１及びＨＢＡ２遺伝子におけるアルファサラセミア変動が、バリアント３．７、バリアント４．２、バリアントＳＥＡ、バリアントＴＨＡＩ、バリアント２０．５、バリアントＭＥＤ、若しくはバリアントＦＩＬ、又は前記ＨＢＡ２遺伝子ＨＢＡ２ ｃ．４２７Ｔ＞Ｃにおける単一ヌクレオチドバリアントから選択される大きな欠失を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項9】
前記第１の複数のプライマー対が、表４から選択される少なくとも２つのプライマー対に対して、少なくとも８５％の同一性を有する少なくとも２つのプライマー対を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項10】
前記第１の複数のプライマー対が、表４に示される全てのプライマー対を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項11】
前記第２の複数のプライマー対が、配列番号７３及び７４、配列番号７５及び７６、配列番号７７及び７８、配列番号７９及び８０、配列番号８５及び８６、配列番号８７及び８８、又は配列番号８９及び９０から選択される少なくとも２つのプライマー対に対して、少なくとも８５％の同一性を有する少なくとも２つのプライマー対を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項12】
前記第２の複数のプライマー対が、表５に示される全てのプライマー対を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項13】
前記第３の複数のプライマー対が、表６から選択される少なくとも２つのプライマー対に対して、少なくとも８５％の同一性を有する少なくとも２つのプライマー対を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項14】
前記第１の複数のプライマー対が、表６に示される全てのプライマー対を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項15】
次世代シーケンシングが、合成によるシーケンシング又はライゲーションによるシーケンシングを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項16】
前記対象が、アシュケナージ系ユダヤ人の子孫の者であるか、又はベータサラセミア若しくはアルファサラセミアの家族歴を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項17】
前記生体試料が、全血、血清、血漿、羊水、又は絨毛膜絨毛である、請求項１に記載の方法。
【請求項18】
前記障害が、常染色体障害又はＸ連鎖劣性障害である、請求項１に記載の方法。
【請求項19】
前記対象が、テイ－サックス病、ニーマンピック病、ＩＶ型ムコリピドーシス、ゴーシェ病、ファンコーニ貧血、家族性自律神経障害、カナバン病、ブルーム症候群、メープル血清尿症、グリコーゲン貯蔵疾患Ｉ、家族性高インスリン症、ジヒドロリポアミドデヒドロゲナーゼ欠損症（ＤＬＤ）、リポアミドデヒドロゲナーゼ欠損症（Ｅ３）、ネマリンミオパシー、アッシャー症候群ＩＦ型、アッシャー症候群、ＩＩＩＡ型、ジュベール症候群２、ウォーカー－ワールブルク症候群、ベータサラセミア、又はアルファサラセミアから選択される少なくとも１つの疾患についてのキャリアであることが疑われる、請求項１～１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項20】
キットであって、（ｉ）複数の遺伝子の各々の増幅領域に指向された第１の複数のプライマー対であって、前記複数の遺伝子が、ＨＥＸＡ、ＳＭＰＤ１、ＭＣＯＬＮ１、ＧＢＡ、ＦＡＮＣＣ、ＩＫＢＫＡＰ、ＡＳＰＡ、ＢＬＭ、ＢＣＫＤＨＢ、Ｇ６ＰＣ、ＡＢＣＣ８、ＤＬＤ、ＮＥＢ、ＰＣＤＨ１５、ＣＬＲＮ１、ＴＭＥＭ２１６、及びＦＫＴＮを含む、第１の複数のプライマー対と、
（ｉｉ）ＧＢＡ及びＨＢＢ遺伝子の増幅領域に指向された第２の複数のプライマー対であって、配列番号８１及び８２、並びに配列番号８３及び８４を含む、第２の複数のプライマー対と、
（ｉｉｉ）ＨＢＡ１及びＨＢＡ２遺伝子の各々におけるアルファサラセミア遺伝子の変動の増幅領域に指向された第３の複数のプライマー対と、
使用説明書と、を含む、キット。
【請求項21】
前記第１の複数のプライマー対が、欠失が存在する場合にのみ、標的領域を増幅するように設計された少なくとも１つのギャッププライマー対を含む、請求項２０に記載のキット。
【請求項22】
前記第２の複数のプライマー対のＧＢＡプライマーが、ＧＢＡ遺伝子を特異的に増幅し、任意のＧＢＡ疑似遺伝子を増幅しない、請求項２０に記載のキット。
【請求項23】
前記第３の複数のプライマー対が、欠失が存在する場合にのみ、標的領域を増幅するように設計された少なくとも１つのギャッププライマー対を含む、請求項２０に記載のキット。
【請求項24】
前記ＨＥＸＡ遺伝子の変動が、テイ－サックス病を引き起こし、前記ＳＭＰＤ１遺伝子の変動が、ニーマンピック病を引き起こし、
前記ＭＣＯＬＮ１遺伝子の変動が、ＩＶ型ムコリピドーシスを引き起こし、
前記ＧＢＡ遺伝子の変動が、ゴーシェ病を引き起こし、
前記ＰＡＮＣＣ遺伝子の変動が、ファンコーニ貧血を引き起こし、
前記ＩＫＢＫＡＰ遺伝子の変動が、家族性自律神経障害を引き起こし、
前記ＡＳＰＡ遺伝子の変動が、カナバン病を引き起こし、
前記ＢＬＭ遺伝子の変動が、ブルーム症候群を引き起こし、
前記ＢＣＫＤＨＢ遺伝子の変動が、メープル血清尿症を引き起こし、
前記Ｇ６ＰＣ遺伝子の変動が、グリコーゲン貯蔵疾患Ｉを引き起こし、
前記ＡＢＣＣ８遺伝子の変動が、家族性高インスリン症を引き起こし、
前記ＤＬＤ遺伝子の変動が、ジヒドロリポアミドデヒドロゲナーゼ欠損症（ＤＬＤ）又はリポアミドデヒドロゲナーゼ欠損症（Ｅ３）を引き起こし、
前記ＮＥＢ遺伝子の変動が、ネマリンミオパシーを引き起こし、
前記ＰＣＤＨ１５遺伝子の変動が、アッシャー症候群、ＩＦ型を引き起こし、
前記ＣＬＲＮ１遺伝子の変動が、アッシャー症候群、ＩＩＩＡ型を引き起こし、
前記ＴＭＥＭ２１６遺伝子の変動が、ジュベール症候群２を引き起こし、
前記ＦＫＴＮ遺伝子の変動が、ウォーカー－ワールブルク症候群を引き起こす、請求項２０に記載のキット。
【請求項25】
前記ＨＥＸＡ遺伝子の変動が、Ｒ１７８Ｈ（Ｂ１バリアント）、Ｒ２４７Ｗ、Ｒ２４９Ｗ、Ｇ２６９Ｓ、ＩＶＳ９＋１Ｇ＞Ａ、１２７８＿ＴＡＴＣ、ＩＶＳ１２＋１Ｇ＞Ｃ、又は７．６－ｋｂ Ｄｅｌ、Ｅｘ１を含み、前記ＳＭＰＤ１遺伝子の変動が、Ｌ３０２Ｐ、ｆｓＰ３３０、Ｒ４９６Ｌ（Ｒ４９８Ｌ）、又はｄｅｌｔａＲ６０８を含み、
前記ＭＣＯＬＮ１遺伝子の変動が、ＩＶＳ３－２Ａ＞Ｇ又は６．４ｋｂ＿ｄｅｌを含み、
前記ＧＢＡ遺伝子の変動が、ＩＶＳ２＋１Ｇ＞Ａ、８４Ｇ＞ＧＧ、Ｎ３７０Ｓ、ｄｅｌ＿５５ｂｐ、Ｖ３９４Ｌ、Ｄ４０９Ｈ、Ｌ４４４Ｐ、又はＲ４９６Ｈを含み、
前記ＰＡＮＣＣ遺伝子の変動が、ＩＶＳ４＋４Ａ＞Ｔ又は３２２ｄｅｌＧを含み、
前記ＩＫＢＫＡＰ遺伝子の変動が、Ｒ６９６Ｐ又はＩＶＳ２０＋６Ｔ＞Ｃを含み、
前記ＡＳＰＡ遺伝子の変動が、ＩＶＳ２－２Ａ＞Ｇ、Ｙ２３１Ｘ、Ｅ２８５Ａ、又はＡ３０５Ｅを含み、
前記ＢＬＭ遺伝子の変動が、２２８１ｄｅｌ６／ｉｎｓ７を含み、
前記ＢＣＫＤＨＢ遺伝子の変動が、Ｒ１８３Ｐ、Ｇ２７８Ｓ、又はＥ３７２Ｘを含み、
前記Ｇ６ＰＣ遺伝子の変動が、Ｒ８３Ｃ又はＱ３４７Ｘを含み、
前記ＡＢＣＣ８遺伝子の変動が、ＩＶＳ３２－９Ｇ＞Ａ又はＦ１３８７ｄｅｌを含み、
前記ＤＬＤ遺伝子の変動が、Ｙ３５＊又はＧ２２９Ｃを含み、
前記ＮＥＢ遺伝子の変動が、Ｒ２４７８＿Ｄ２５１２ｄｅｌ３５を含み、
前記ＰＣＤＨ１５遺伝子の変動が、Ｒ２４５を含み、
前記ＣＬＲＮ１遺伝子の変動が、Ｎ４８Ｋを含み、
前記ＴＭＥＭ２１６遺伝子の変動が、Ｒ７３Ｌを含み、
前記ＦＫＴＮ遺伝子の変動が、Ｆ３９０ｆｓを含む、請求項２０に記載のキット。
【請求項26】
前記ＨＢＢ遺伝子におけるベータサラセミア遺伝子の変動が、ｃ．＊１１１Ａ＞Ｇ、ｃ．＊１１０Ｔ＞Ｃ、ｃ．＊９６Ｔ＞Ｃ、Ｈｂ Ｄ－Ｌｏｓ Ａｎｇｅｌｅｓ（ｃ．３６４Ｇ＞Ｃ）、Ｈｂ Ｏ－Ａｒａｂ（ｃ．３６４Ｇ＞Ａ）、ｃ．３２１＿３２２ｉｎｓＧ、ｃ．３１６－２Ａ＞Ｃ、ｃ．３１６－２Ａ＞Ｇ、ｃ．３１６－３Ｃ＞Ａ、ｃ．３１６－１０６Ｃ＞Ｇ、ｃ．３１６－１２５Ａ＞Ｇ、ｃ．３１６－１４６Ｔ＞Ｇ、ｃ．３１６－１９７Ｃ＞Ｔ、ｃ．３１５＋１Ｇ＞Ａ、ｃ．２８７＿２８８ｉｎｓＡ、ｃ．２５１ｄｅｌＧ、ｃ．２３０ｄｅｌＣ、ｃ．２１６＿２１７ｉｎｓＡ、ｃ．２０３＿２０４ｄｅｌＴＧ、ｃ．１４３＿１４４ｉｎｓＡ、ｃ．１４６＿１４７ｉｎｓＡＴＣＴ、ｃ．１３５ｄｅｌＣ、ｃ．１３０Ｇ＞Ｔ、ｃ．１２６＿１２９ｄｅｌＣＴＴＴ、ｃ．１２４＿１２７ｄｅｌＴＴＣＴ、ｃ．１１８Ｃ＞Ｔ、ｃ．１１４Ｇ＞Ａ、ｃ．１１２ｄｅｌＴ、ｃ．９３－１Ｇ＞Ｃ、ｃ．９３－１Ｇ＞Ａ、ｃ．９３－２１Ｇ＞Ａ、ｃ．９２＋６Ｔ＞Ｃ、ｃ．９２＋５Ｇ＞Ａ、ｃ．９２＋５Ｇ＞Ｃ、ｃ．９２＋５Ｇ＞Ｔ、ｃ．９２＋２Ｔ＞Ａ、ｃ．９２＋２Ｔ＞Ｃ、ｃ．９２＋１Ｇ＞Ａ、ｃ．９２＋１Ｇ＞Ｔ、Ｈｂ Ｍｏｎｒｏｅ（ｃ．９２Ｇ＞Ｃ）、ｃ．９２Ｇ＞Ａ、ｃ．８４＿８５ｉｎｓＣ、ｃ．７９Ｇ＞Ｔ、ＨＢ Ｅ（ｃ．７９Ｇ＞Ａ）、ｃ．７５Ｔ＞Ａ、ｃ．５９Ａ＞Ｇ、ｃ．５２Ａ＞Ｔ（ＬＹＳ１７＊）、ｃ．５１ｄｅｌＣ、ｃ．４８Ｇ＞Ａ、ｃ．４７Ｇ＞Ａ（Ｔｒｐ１５）、ｃ．４６ｄｅｌＴ、ｃ．３６ｄｅｌＴ、ｃ．３３Ｃ＞Ａ、ｃ．２７＿２８ｉｎｓＧ、ｃ．２５＿２６ｄｅｌＡＡ、ｃ．２０ｄｅｌＡ、ＨＢ Ｓ（ｃ．２０Ａ＞Ｔ）、ＨＢ Ｃ（ｃ．１９Ｇ＞Ａ）、ｃ．１７＿１８ｄｅｌＣＴ、ｃ．２Ｔ＞Ｃ、ｃ．２Ｔ＞Ｇ、ｃ．１Ａ＞Ｇ、ｃ．－７８Ａ＞Ｃ、ｃ．－７８Ａ＞Ｇ、ｃ．－７９Ａ＞Ｇ、ｃ．－８０Ｔ＞Ａ、ｃ．－８１Ａ＞Ｇ、ｃ．－１３６Ｃ＞Ｇ、ｃ．－１３７Ｃ＞Ａ、ｃ．－１３７Ｃ＞Ｇ、ｃ．－１３７Ｃ＞Ｔ、ｃ．－１３８Ｃ＞Ｔ、ｃ．－１３８Ｃ＞Ａ、ｃ．－１４０Ｃ＞Ｔ、又はｃ．－１５１Ｃ＞Ｔを含む、請求項２０に記載のキット。
【請求項27】
前記ＨＢＡ１及びＨＢＡ２遺伝子における前記アルファサラセミア変動が、バリアント３．７、バリアント４．２、バリアントＳＥＡ、バリアントＴＨＡＩ、バリアント２０．５、バリアントＭＥＤ、若しくはバリアントＦＩＬ、又は前記ＨＢＡ２遺伝子ＨＢＡ２ ｃ．４２７Ｔ＞Ｃにおける単一ヌクレオチドバリアントから選択される大きな欠失を含む、請求項２０に記載のキット。
【請求項28】
前記第１の複数のプライマー対が、表４から選択される少なくとも２つのプライマー対に対して、少なくとも８５％の同一性を有する少なくとも２つのプライマー対を含む、請求項２０に記載のキット。
【請求項29】
前記第１の複数のプライマー対が、表４に示される全てのプライマー対を含む、請求項２８に記載のキット。
【請求項30】
前記第２の複数のプライマー対が、配列番号７３及び７４、配列番号７５及び７６、配列番号７７及び７８、配列番号７９及び８０、配列番号８５及び８６、配列番号８７及び８８、又は配列番号８９及び９０から選択される少なくとも２つのプライマー対に対して、少なくとも８５％の同一性を有する少なくとも２つのプライマー対を含む、請求項２０に記載のキット。
【請求項31】
前記第１の複数のプライマー対が、表５に示される全てのプライマー対を含む、請求項３０に記載のキット。
【請求項32】
前記第３の複数のプライマー対が、表６から選択される少なくとも２つのプライマー対に対して、少なくとも８５％の同一性を有する少なくとも２つのプライマー対を含む、請求項２０に記載のキット。
【請求項33】
前記第１の複数のプライマー対が、表６に示される全てのプライマー対を含む、請求項３２に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、２０２１年１２月７日に出願された米国仮出願第６３／２８６９０６号の米国特許法第１１９条（ｅ）に基づく利益を主張し、その全内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０２１年１２月７日に出願された米国仮出願第６３／２８６９０６号の米国特許法第１１９条（ｅ）に基づく利益を主張し、その全内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
【0002】
本開示は、多重遺伝子特異的ＰＣＲを使用して、遺伝性変異（例えば、アシュケナージ系ユダヤ人キャリア変異、ベータサラセミア変異、又はアルファサラセミア変異）を検出するための方法を提供する。本方法を実践する際に使用するためのキットも提供される。
【背景技術】
【0003】
本開示の背景の以下の説明は、単に読者が本開示を理解するのを助けるために提供され、本開示に対する先行技術を説明又は構成することは認められない。
【0004】
サラセミアは、それぞれ染色体１６及び染色体１１上のα－及びβ－グロビン遺伝子クラスターにおける変異に起因する遺伝性常染色体劣性疾患である。これは、ヘモグロビンのグロビン鎖の非存在又は低減された合成によって特徴付けられ、α－及びβ－サラセミアの２つの主なタイプを含む。サラセミアは、メジャーな先天性欠損の上位５種類のうちの１つであると報告されている。サラセミアメジャーは、社会に多大な負担をかけており、影響を受けた集団の生活の質に深刻な影響を与えている。サラセミアの高い有病率は、中国南部、東南アジア、インド、中東、アフリカ、及び地中海地域で観察されている。
【0005】
主に中央ヨーロッパ及び東ヨーロッパに住んでいたアシュケナージ系ユダヤ人集団は、宗教的及び文化的慣習、並びに血縁関係によってその隣人から切り離された遺伝的隔離を維持していた。アシュケナージ系ユダヤ人集団のこの隔離についての主な証拠は、常染色体劣性疾患の高い有病率、並びに乳がん及び卵巣がん等の一般的な疾患、又は炎症性腸疾患若しくはパーキンソン病に関連するバリアントへのリスクを付与する対立遺伝子の比較的高い頻度を含む、遺伝的特徴の存在である。
【0006】
対象が、単一の生体試料において、遺伝性遺伝的疾患（アシュケナージ系ユダヤ人集団において頻繁に見られる疾患、ベータサラセミア及びアルファサラセミアを含む）についてのキャリアであるかどうかを迅速に検出することができる、より堅牢かつ感度の高い方法が実質的に必要である。
【発明の概要】
【0007】
本開示は、遺伝性遺伝的バリアント（アシュケナージ系ユダヤ人パネル変動、ベータサラセミア変動、及びアルファサラセミア変動等）の同時特定のための方法を提供する。本開示はまた、対象からの生体試料中のアシュケナージ系ユダヤ人パネル変動、ベータサラセミア変動、及びアルファサラセミア変動を特定するための方法を提供する。最後に、本開示は、本明細書に記載される方法を実施するためのキットを提供する。
【0008】
いくつかの実施形態では、本方法は、対象から得られた生体試料からＤＮＡを抽出することと、生体試料を第１の複数のプライマー対と接触させることによって、第１の複数のアンプリコンを生成することであって、少なくとも１つのアンプリコンが、複数の遺伝子の各々に対応し、当該複数の遺伝子が、ＨＥＸＡ、ＳＭＰＤ１、ＭＣＯＬＮ１、ＧＢＡ、ＦＡＮＣＣ、ＩＫＢＫＡＰ、ＡＳＰＡ、ＢＬＭ、ＢＣＫＤＨＢ、Ｇ６ＰＣ、ＡＢＣＣ８、ＤＬＤ、ＮＥＢ、ＰＣＤＨ１５、ＣＬＲＮ１、ＴＭＥＭ２１６、及びＦＫＴＮを含む、生成することと、生体試料を第２の複数のプライマー対と接触させることによって、第２の複数のアンプリコンを生成することであって、少なくとも１つのアンプリコンが、ＧＢＡ及びＨＢＢの各々に対応し、第２の複数のプライマー対が、配列番号８１及び８２、並びに配列番号８３及び８４を含む、生成することと、生体試料を、第３の複数のプライマー対、ホットスタートＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、及びＴａｑエクステンダーＰＣＲ添加剤と接触させることによって、第３の複数のアンプリコンを生成することであって、少なくとも１つのアンプリコンが、ＨＢＡ１及びＨＢＡ２の各々に対応する、生成することと、ポリメラーゼ連鎖反応を介して、第１、第２、及び第３の複数のアンプリコンの末端にバーコード配列を組み込むことと、高スループット大規模並列シーケンシングを使用して、第１、第２、及び第３の複数のアンプリコンのうちの少なくとも１つにおける１つ以上のバリアントを検出することと、を含む。
【0009】
いくつかの実施形態では、アシュケナージ系ユダヤ人パネル変動は、アシュケナージ系ユダヤ人集団において一般的に観察されるが、アシュケナージ系ユダヤ人集団以外でもまた、低頻度ではあるが生じ得る、遺伝子の変動（例えば、単一ヌクレオチド変動（ＳＮＶ）、欠失、挿入、又は反転）を含む。いくつかの実施形態では、アシュケナージ系ユダヤ人パネル変動は、テイ－サックス病、ニーマンピック病、ＩＶ型ムコリピドーシス、ゴーシェ病、ファンコーニ貧血、家族性自律神経障害、カナバン病、ブルーム症候群、メープル血清尿症、グリコーゲン貯蔵疾患Ｉ、家族性高インスリン症、ジヒドロリポアミドデヒドロゲナーゼ欠損症（ＤＬＤ）、リポアミドデヒドロゲナーゼ欠損症（Ｅ３）、ネマリンミオパシー、アッシャー症候群ＩＦ型、アッシャー症候群、ＩＩＩＡ型、ジュベール症候群２、又はウォーカー－ワールブルク症候群を引き起こす可能性がある遺伝的変動を含む。いくつかの実施形態では、アシュケナージ系ユダヤ人パネル変動は、表１に列挙される遺伝的変動を含む。いくつかの実施形態では、ベータサラセミア変動は、表２に列挙される遺伝的変動を含む。いくつかの実施形態では、ベータサラセミア変動は、表３に列挙される遺伝的変動を含む。
【0010】
いくつかの実施形態では、第１の複数のプライマー対は、欠失が存在する場合にのみ、標的領域を増幅するように設計された少なくとも１つのギャッププライマー対を含む。いくつかの実施形態では、第２の複数のプライマー対のＧＢＡプライマーは、ＧＢＡ遺伝子を特異的に増幅し、任意のＧＢＡ疑似遺伝子を増幅しない。いくつかの実施形態では、第３の複数のプライマー対は、欠失が存在する場合にのみ、標的領域を増幅するように設計された少なくとも１つのギャッププライマー対を含む。
【0011】
いくつかの実施形態では、ＨＥＸＡ遺伝子の変動は、テイ－サックス病を引き起こし、ＳＭＰＤ１遺伝子の変動は、ニーマンピック病を引き起こし、ＭＣＯＬＮ１遺伝子の変動は、ＩＶ型ムコリピドーシスを引き起こし、ＧＢＡ遺伝子の変動は、ゴーシェ病を引き起こし、ＰＡＮＣＣ遺伝子の変動は、ファンコーニ貧血を引き起こし、ＩＫＢＫＡＰ遺伝子の変動は、家族性自律神経障害を引き起こし、ＡＳＰＡ遺伝子の変動は、カナバン病を引き起こし、ＢＬＭ遺伝子の変動は、ブルーム症候群を引き起こし、ＢＣＫＤＨＢ遺伝子の変動は、メープル血清尿症を引き起こし、Ｇ６ＰＣ遺伝子の変動は、グリコーゲン貯蔵疾患Ｉを引き起こし、ＡＢＣＣ８遺伝子の変動は、家族性高インスリン症を引き起こし、ＤＬＤ遺伝子の変動は、ジヒドロリポアミドデヒドロゲナーゼ欠損症（ＤＬＤ）又はリポアミドデヒドロゲナーゼ欠損症（Ｅ３）を引き起こし、ＮＥＢ遺伝子の変動は、ネマリンミオパシーを引き起こし、ＰＣＤＨ１５遺伝子の変動は、アッシャー症候群、ＩＦ型を引き起こし、ＣＬＲＮ１遺伝子の変動は、アッシャー症候群、ＩＩＩＡ型を引き起こし、ＴＭＥＭ２１６遺伝子の変動は、ジュベール症候群２を引き起こし、ＦＫＴＮ遺伝子の変動は、ウォーカー－ワールブルク症候群を引き起こす。
【0012】
いくつかの実施形態では、アシュケナージ系ユダヤ人パネル遺伝子の変動は、表１に列挙される１つ以上の遺伝子の変動を含む。いくつかの実施形態では、ＨＥＸＡ遺伝子の変動は、Ｒ１７８Ｈ（Ｂ１バリアント）、Ｒ２４７Ｗ、Ｒ２４９Ｗ、Ｇ２６９Ｓ、ＩＶＳ９＋１Ｇ＞Ａ、１２７８＿ＴＡＴＣ、ＩＶＳ１２＋１Ｇ＞Ｃ、又は７．６－ｋｂ Ｄｅｌ、Ｅｘ１のうちの１つ以上を含み、ＳＭＰＤ１遺伝子の変動は、Ｌ３０２Ｐ、ｆｓＰ３３０、Ｒ４９６Ｌ（Ｒ４９８Ｌ）、又はｄｅｌｔａＲ６０８のうちの１つ以上を含み、ＭＣＯＬＮ１遺伝子の変動は、ＩＶＳ３－２Ａ＞Ｇ又は６．４ｋｂ＿ｄｅｌのうちの１つ以上を含み、ＧＢＡ遺伝子の変動は、ＩＶＳ２＋１Ｇ＞Ａ、８４Ｇ＞ＧＧ、Ｎ３７０Ｓ、ｄｅｌ＿５５ｂｐ、Ｖ３９４Ｌ、Ｄ４０９Ｈ、Ｌ４４４Ｐ、又はＲ４９６Ｈのうちの１つ以上を含み、ＰＡＮＣＣ遺伝子の変動は、ＩＶＳ４＋４Ａ＞Ｔ又は３２２ｄｅｌＧのうちの１つ以上を含み、ＩＫＢＫＡＰ遺伝子の変動は、Ｒ６９６Ｐ又はＩＶＳ２０＋６Ｔ＞Ｃのうちの１つ以上を含み、ＡＳＰＡ遺伝子の変動は、ＩＶＳ２－２Ａ＞Ｇ、Ｙ２３１Ｘ、Ｅ２８５Ａ、又はＡ３０５Ｅのうちの１つ以上を含み、ＢＬＭ遺伝子の変動は、２２８１ｄｅｌ６／ｉｎｓ７のうちの１つ以上を含み、ＢＣＫＤＨＢ遺伝子の変動は、Ｒ１８３Ｐ、Ｇ２７８Ｓ、又はＥ３７２Ｘのうちの１つ以上を含み、Ｇ６ＰＣ遺伝子の変動は、Ｒ８３Ｃ又はＱ３４７Ｘのうちの１つ以上を含み、ＡＢＣＣ８遺伝子の変動は、ＩＶＳ３２－９Ｇ＞Ａ又はＦ１３８７ｄｅｌを含み、ＤＬＤ遺伝子の変動は、Ｙ３５＊又はＧ２２９Ｃのうちの１つ以上を含み、ＮＥＢ遺伝子の変動は、Ｒ２４７８＿Ｄ２５１２ｄｅｌ３５を含み、ＰＣＤＨ１５遺伝子の変動は、Ｒ２４５のうちの１つ以上を含み、ＣＬＲＮ１遺伝子の変動は、Ｎ４８Ｋを含み、ＴＭＥＭ２１６遺伝子の変動は、Ｒ７３Ｌを含み、ＦＫＴＮ遺伝子の変動は、Ｆ３９０ｆｓを含む。
【0013】
いくつかの実施形態では、ＨＢＢ遺伝子におけるベータサラセミア遺伝子の変動は、表２に列挙される１つ以上の遺伝子の変動を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子の変動は、ｃ．＊１１１Ａ＞Ｇ、ｃ．＊１１０Ｔ＞Ｃ、ｃ．＊９６Ｔ＞Ｃ、Ｈｂ Ｄ－Ｌｏｓ Ａｎｇｅｌｅｓ（ｃ．３６４Ｇ＞Ｃ）、Ｈｂ Ｏ－Ａｒａｂ（ｃ．３６４Ｇ＞Ａ）、ｃ．３２１＿３２２ｉｎｓＧ、ｃ．３１６－２Ａ＞Ｃ、ｃ．３１６－２Ａ＞Ｇ、ｃ．３１６－３Ｃ＞Ａ、ｃ．３１６－１０６Ｃ＞Ｇ、ｃ．３１６－１２５Ａ＞Ｇ、ｃ．３１６－１４６Ｔ＞Ｇ、ｃ．３１６－１９７Ｃ＞Ｔ、ｃ．３１５＋１Ｇ＞Ａ、ｃ．２８７＿２８８ｉｎｓＡ、ｃ．２５１ｄｅｌＧ、ｃ．２３０ｄｅｌＣ、ｃ．２１６＿２１７ｉｎｓＡ、ｃ．２０３＿２０４ｄｅｌＴＧ、ｃ．１４３＿１４４ｉｎｓＡ、ｃ．１４６＿１４７ｉｎｓＡＴＣＴ、ｃ．１３５ｄｅｌＣ、ｃ．１３０Ｇ＞Ｔ、ｃ．１２６＿１２９ｄｅｌＣＴＴＴ、ｃ．１２４＿１２７ｄｅｌＴＴＣＴ、ｃ．１１８Ｃ＞Ｔ、ｃ．１１４Ｇ＞Ａ、ｃ．１１２ｄｅｌＴ、ｃ．９３－１Ｇ＞Ｃ、ｃ．９３－１Ｇ＞Ａ、ｃ．９３－２１Ｇ＞Ａ、ｃ．９２＋６Ｔ＞Ｃ、ｃ．９２＋５Ｇ＞Ａ、ｃ．９２＋５Ｇ＞Ｃ、ｃ．９２＋５Ｇ＞Ｔ、ｃ．９２＋２Ｔ＞Ａ、ｃ．９２＋２Ｔ＞Ｃ、ｃ．９２＋１Ｇ＞Ａ、ｃ．９２＋１Ｇ＞Ｔ、Ｈｂ Ｍｏｎｒｏｅ（ｃ．９２Ｇ＞Ｃ）、ｃ．９２Ｇ＞Ａ、ｃ．８４＿８５ｉｎｓＣ、ｃ．７９Ｇ＞Ｔ、ＨＢ Ｅ（ｃ．７９Ｇ＞Ａ）、ｃ．７５Ｔ＞Ａ、ｃ．５９Ａ＞Ｇ、ｃ．５２Ａ＞Ｔ（ＬＹＳ１７＊）、ｃ．５１ｄｅｌＣ、ｃ．４８Ｇ＞Ａ、ｃ．４７Ｇ＞Ａ（Ｔｒｐ１５）、ｃ．４６ｄｅｌＴ、ｃ．３６ｄｅｌＴ、ｃ．３３Ｃ＞Ａ、ｃ．２７＿２８ｉｎｓＧ、ｃ．２５＿２６ｄｅｌＡＡ、ｃ．２０ｄｅｌＡ、ＨＢ Ｓ（ｃ．２０Ａ＞Ｔ）、ＨＢ Ｃ（ｃ．１９Ｇ＞Ａ）、ｃ．１７＿１８ｄｅｌＣＴ、ｃ．２Ｔ＞Ｃ、ｃ．２Ｔ＞Ｇ、ｃ．１Ａ＞Ｇ、ｃ．－７８Ａ＞Ｃ、ｃ．－７８Ａ＞Ｇ、ｃ．－７９Ａ＞Ｇ、ｃ．－８０Ｔ＞Ａ、ｃ．－８１Ａ＞Ｇ、ｃ．－１３６Ｃ＞Ｇ、ｃ．－１３７Ｃ＞Ａ、ｃ．－１３７Ｃ＞Ｇ、ｃ．－１３７Ｃ＞Ｔ、ｃ．－１３８Ｃ＞Ｔ、ｃ．－１３８Ｃ＞Ａ、ｃ．－１４０Ｃ＞Ｔ、又はｃ．－１５１Ｃ＞Ｔを含む。
【0014】
いくつかの実施形態では、ＨＢＡ１及びＨＢＡ２遺伝子におけるアルファサラセミア変動は、表３に列挙される１つ以上の変動を含む。いくつかの実施形態では、ＨＢＡ１及びＨＢＡ２遺伝子におけるアルファサラセミア変動は、バリアント３．７、バリアント４．２、バリアントＳＥＡ、バリアントＴＨＡＩ、バリアント２０．５、バリアントＭＥＤ、若しくはバリアントＦＩＬ、又はＨＢＡ２遺伝子ＨＢＡ２ ｃ．４２７Ｔ＞Ｃにおける単一ヌクレオチドバリアントから選択される大きな欠失を含む。
【0015】
いくつかの実施形態では、第１の複数のプライマー対は、表４から選択される少なくとも２個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも８個、若しくは少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも２５個、少なくとも３０個、少なくとも３５個、又は全てのプライマー対に対して、少なくとも８５％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９３％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、又はそれ以上の同一性を有する少なくとも２個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも８個、又は少なくとも１０個のプライマー対を含む。いくつかの実施形態では、第１の複数のプライマー対は、表４に示される全てのプライマー対を含む。
【0016】
いくつかの実施形態では、第２の複数のプライマー対は、表５から選択される少なくとも２個、少なくとも４個、又は少なくとも５個のプライマー対に対して、少なくとも８５％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９３％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、又はそれ以上の同一性を有する少なくとも２個、少なくとも４個、又は少なくとも５個のプライマー対を含む。
【0017】
いくつかの実施形態では、第３の複数のプライマー対は、表６から選択される少なくとも２個、少なくとも３個、又は少なくとも４個のプライマー対に対して、少なくとも８５％の同一性を有する少なくとも２個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも８個、又は少なくとも１０個のプライマー対を含む。いくつかの実施形態では、第１の複数のプライマー対は、表６に示される全てのプライマー対を含む。
【0018】
いくつかの実施形態では、次世代シーケンシングは、合成によるシーケンシング（例えば、パイロシーケンシング）を含む。いくつかの実施形態では、次世代シーケンシングは、ライゲーションによるシーケンシングを含む。
【0019】
いくつかの実施形態では、対象は、テイ－サックス病、ニーマンピック病、ＩＶ型ムコリピドーシス、ゴーシェ病、ファンコーニ貧血、家族性自律神経障害、カナバン病、ブルーム症候群、メープル血清尿症、グリコーゲン貯蔵疾患Ｉ、家族性高インスリン症、ジヒドロリポアミドデヒドロゲナーゼ欠損症（ＤＬＤ）、リポアミドデヒドロゲナーゼ欠損症（Ｅ３）、ネマリンミオパシー、アッシャー症候群ＩＦ型、アッシャー症候群、ＩＩＩＡ型、ジュベール症候群２、ウォーカー－ワールブルク症候群、ベータサラセミア、又はアルファサラセミアから選択される少なくとも１つの疾患についてのキャリアであることが疑われる。
【0020】
いくつかの実施形態では、対象は、アシュケナージ系ユダヤ人の子孫の者であるか、又はベータサラセミア若しくはアルファサラセミアの家族歴を有する。
【0021】
いくつかの実施形態では、生体試料は、全血、血清、血漿、羊水、又は絨毛膜絨毛から選択される。
【0022】
いくつかの実施形態では、遺伝的障害は、常染色体障害又はＸ連鎖劣性障害である。
【0023】
別の態様では、本開示は、本明細書に記載の増幅を実施するためのプライマー又はプローブであり得るオリゴヌクレオチドを含むキットを提供する。
【0024】
本開示はまた、対象からの生体試料中のアシュケナージ系ユダヤ人パネル変動、ベータサラセミア変動、又はアルファサラセミア変動の存在を検出するためのキットを提供する。
【0025】
本技術のキットは、少なくとも、（ｉ）複数の遺伝子の各々の増幅領域に指向された第１の複数のプライマー対であって、当該複数の遺伝子が、ＨＥＸＡ、ＳＭＰＤ１、ＭＣＯＬＮ１、ＧＢＡ、ＦＡＮＣＣ、ＩＫＢＫＡＰ、ＡＳＰＡ、ＢＬＭ、ＢＣＫＤＨＢ、Ｇ６ＰＣ、ＡＢＣＣ８、ＤＬＤ、ＮＥＢ、ＰＣＤＨ１５、ＣＬＲＮ１、ＴＭＥＭ２１６、及びＦＫＴＮを含む、第１の複数のプライマー対と、（ｉｉ）ＧＢＡ及びＨＢＢ遺伝子の増幅領域に指向された第２の複数のプライマー対であって、配列番号８１及び８２、並びに配列番号８３及び８４を含む、第２の複数のプライマー対と、（ｉｉｉ）ＨＢＡ１及びＨＢＡ２遺伝子の各々におけるアルファサラセミア遺伝子の変動の増幅領域に指向された第３の複数のプライマー対と、使用説明書と、を含む。
【0026】
いくつかの実施形態では、第１の複数のプライマー対は、欠失が存在する場合にのみ、標的領域を増幅するように設計された少なくとも１つのギャッププライマー対を含む。
【0027】
いくつかの実施形態では、第２の複数のプライマー対のＧＢＡプライマーは、ＧＢＡ遺伝子を特異的に増幅し、任意のＧＢＡ疑似遺伝子を増幅しない。
【0028】
いくつかの実施形態では、第３の複数のプライマー対は、欠失が存在する場合にのみ、標的領域を増幅するように設計された少なくとも１つのギャッププライマー対を含む。
【0029】
いくつかの実施形態では、ＨＥＸＡ遺伝子の変動は、テイ－サックス病を引き起こし、ＳＭＰＤ１遺伝子の変動は、ニーマンピック病を引き起こし、ＭＣＯＬＮ１遺伝子の変動は、ＩＶ型ムコリピドーシスを引き起こし、ＧＢＡ遺伝子の変動は、ゴーシェ病を引き起こし、ＰＡＮＣＣ遺伝子の変動は、ファンコーニ貧血を引き起こし、ＩＫＢＫＡＰ遺伝子の変動は、家族性自律神経障害を引き起こし、ＡＳＰＡ遺伝子の変動は、カナバン病を引き起こし、ＢＬＭ遺伝子の変動は、ブルーム症候群を引き起こし、ＢＣＫＤＨＢ遺伝子の変動は、メープル血清尿症を引き起こし、Ｇ６ＰＣ遺伝子の変動は、グリコーゲン貯蔵疾患Ｉを引き起こし、ＡＢＣＣ８遺伝子の変動は、家族性高インスリン症を引き起こし、ＤＬＤ遺伝子の変動は、ジヒドロリポアミドデヒドロゲナーゼ欠損症（ＤＬＤ）又はリポアミドデヒドロゲナーゼ欠損症（Ｅ３）を引き起こし、ＮＥＢ遺伝子の変動は、ネマリンミオパシーを引き起こし、ＰＣＤＨ１５遺伝子の変動は、アッシャー症候群、ＩＦ型を引き起こし、ＣＬＲＮ１遺伝子の変動は、アッシャー症候群、ＩＩＩＡ型を引き起こし、ＴＭＥＭ２１６遺伝子の変動は、ジュベール症候群２を引き起こし、ＦＫＴＮ遺伝子の変動は、ウォーカー－ワールブルク症候群を引き起こす。
【0030】
いくつかの実施形態では、アシュケナージ系ユダヤ人パネル遺伝子の変動は、表１に列挙される１つ以上の遺伝子の変動を含む。いくつかの実施形態では、ＨＥＸＡ遺伝子の変動は、Ｒ１７８Ｈ（Ｂ１バリアント）、Ｒ２４７Ｗ、Ｒ２４９Ｗ、Ｇ２６９Ｓ、ＩＶＳ９＋１Ｇ＞Ａ、１２７８＿ＴＡＴＣ、ＩＶＳ１２＋１Ｇ＞Ｃ、又は７．６－ｋｂ Ｄｅｌ、Ｅｘ１のうちの１つ以上を含み、ＳＭＰＤ１遺伝子の変動は、Ｌ３０２Ｐ、ｆｓＰ３３０、Ｒ４９６Ｌ（Ｒ４９８Ｌ）、又はｄｅｌｔａＲ６０８のうちの１つ以上を含み、ＭＣＯＬＮ１遺伝子の変動は、ＩＶＳ３－２Ａ＞Ｇ又は６．４ｋｂ＿ｄｅｌのうちの１つ以上を含み、ＧＢＡ遺伝子の変動は、ＩＶＳ２＋１Ｇ＞Ａ、８４Ｇ＞ＧＧ、Ｎ３７０Ｓ、ｄｅｌ＿５５ｂｐ、Ｖ３９４Ｌ、Ｄ４０９Ｈ、Ｌ４４４Ｐ、又はＲ４９６Ｈのうちの１つ以上を含み、ＰＡＮＣＣ遺伝子の変動は、ＩＶＳ４＋４Ａ＞Ｔ又は３２２ｄｅｌＧのうちの１つ以上を含み、ＩＫＢＫＡＰ遺伝子の変動は、Ｒ６９６Ｐ又はＩＶＳ２０＋６Ｔ＞Ｃのうちの１つ以上を含み、ＡＳＰＡ遺伝子の変動は、ＩＶＳ２－２Ａ＞Ｇ、Ｙ２３１Ｘ、Ｅ２８５Ａ、又はＡ３０５Ｅのうちの１つ以上を含み、ＢＬＭ遺伝子の変動は、２２８１ｄｅｌ６／ｉｎｓ７のうちの１つ以上を含み、ＢＣＫＤＨＢ遺伝子の変動は、Ｒ１８３Ｐ、Ｇ２７８Ｓ、又はＥ３７２Ｘのうちの１つ以上を含み、Ｇ６ＰＣ遺伝子の変動は、Ｒ８３Ｃ又はＱ３４７Ｘのうちの１つ以上を含み、ＡＢＣＣ８遺伝子の変動は、ＩＶＳ３２－９Ｇ＞Ａ又はＦ１３８７ｄｅｌを含み、ＤＬＤ遺伝子の変動は、Ｙ３５＊又はＧ２２９Ｃのうちの１つ以上を含み、ＮＥＢ遺伝子の変動は、Ｒ２４７８＿Ｄ２５１２ｄｅｌ３５を含み、ＰＣＤＨ１５遺伝子の変動は、Ｒ２４５のうちの１つ以上を含み、ＣＬＲＮ１遺伝子の変動は、Ｎ４８Ｋを含み、ＴＭＥＭ２１６遺伝子の変動は、Ｒ７３Ｌを含み、ＦＫＴＮ遺伝子の変動は、Ｆ３９０ｆｓを含む。
【0031】
いくつかの実施形態では、ＨＢＢ遺伝子におけるベータサラセミア遺伝子の変動は、表２に列挙される１つ以上の遺伝子の変動を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子の変動は、ｃ．＊１１１Ａ＞Ｇ、ｃ．＊１１０Ｔ＞Ｃ、ｃ．＊９６Ｔ＞Ｃ、Ｈｂ Ｄ－Ｌｏｓ Ａｎｇｅｌｅｓ（ｃ．３６４Ｇ＞Ｃ）、Ｈｂ Ｏ－Ａｒａｂ（ｃ．３６４Ｇ＞Ａ）、ｃ．３２１＿３２２ｉｎｓＧ、ｃ．３１６－２Ａ＞Ｃ、ｃ．３１６－２Ａ＞Ｇ、ｃ．３１６－３Ｃ＞Ａ、ｃ．３１６－１０６Ｃ＞Ｇ、ｃ．３１６－１２５Ａ＞Ｇ、ｃ．３１６－１４６Ｔ＞Ｇ、ｃ．３１６－１９７Ｃ＞Ｔ、ｃ．３１５＋１Ｇ＞Ａ、ｃ．２８７＿２８８ｉｎｓＡ、ｃ．２５１ｄｅｌＧ、ｃ．２３０ｄｅｌＣ、ｃ．２１６＿２１７ｉｎｓＡ、ｃ．２０３＿２０４ｄｅｌＴＧ、ｃ．１４３＿１４４ｉｎｓＡ、ｃ．１４６＿１４７ｉｎｓＡＴＣＴ、ｃ．１３５ｄｅｌＣ、ｃ．１３０Ｇ＞Ｔ、ｃ．１２６＿１２９ｄｅｌＣＴＴＴ、ｃ．１２４＿１２７ｄｅｌＴＴＣＴ、ｃ．１１８Ｃ＞Ｔ、ｃ．１１４Ｇ＞Ａ、ｃ．１１２ｄｅｌＴ、ｃ．９３－１Ｇ＞Ｃ、ｃ．９３－１Ｇ＞Ａ、ｃ．９３－２１Ｇ＞Ａ、ｃ．９２＋６Ｔ＞Ｃ、ｃ．９２＋５Ｇ＞Ａ、ｃ．９２＋５Ｇ＞Ｃ、ｃ．９２＋５Ｇ＞Ｔ、ｃ．９２＋２Ｔ＞Ａ、ｃ．９２＋２Ｔ＞Ｃ、ｃ．９２＋１Ｇ＞Ａ、ｃ．９２＋１Ｇ＞Ｔ、Ｈｂ Ｍｏｎｒｏｅ（ｃ．９２Ｇ＞Ｃ）、ｃ．９２Ｇ＞Ａ、ｃ．８４＿８５ｉｎｓＣ、ｃ．７９Ｇ＞Ｔ、ＨＢ Ｅ（ｃ．７９Ｇ＞Ａ）、ｃ．７５Ｔ＞Ａ、ｃ．５９Ａ＞Ｇ、ｃ．５２Ａ＞Ｔ（ＬＹＳ１７＊）、ｃ．５１ｄｅｌＣ、ｃ．４８Ｇ＞Ａ、ｃ．４７Ｇ＞Ａ（Ｔｒｐ１５）、ｃ．４６ｄｅｌＴ、ｃ．３６ｄｅｌＴ、ｃ．３３Ｃ＞Ａ、ｃ．２７＿２８ｉｎｓＧ、ｃ．２５＿２６ｄｅｌＡＡ、ｃ．２０ｄｅｌＡ、ＨＢ Ｓ（ｃ．２０Ａ＞Ｔ）、ＨＢ Ｃ（ｃ．１９Ｇ＞Ａ）、ｃ．１７＿１８ｄｅｌＣＴ、ｃ．２Ｔ＞Ｃ、ｃ．２Ｔ＞Ｇ、ｃ．１Ａ＞Ｇ、ｃ．－７８Ａ＞Ｃ、ｃ．－７８Ａ＞Ｇ、ｃ．－７９Ａ＞Ｇ、ｃ．－８０Ｔ＞Ａ、ｃ．－８１Ａ＞Ｇ、ｃ．－１３６Ｃ＞Ｇ、ｃ．－１３７Ｃ＞Ａ、ｃ．－１３７Ｃ＞Ｇ、ｃ．－１３７Ｃ＞Ｔ、ｃ．－１３８Ｃ＞Ｔ、ｃ．－１３８Ｃ＞Ａ、ｃ．－１４０Ｃ＞Ｔ、又はｃ．－１５１Ｃ＞Ｔを含む。
【0032】
いくつかの実施形態では、ＨＢＡ１及びＨＢＡ２遺伝子におけるアルファサラセミア変動は、表３に列挙される１つ以上の遺伝子の変動を含む。いくつかの実施形態では、ＨＢＡ１及びＨＢＡ２遺伝子におけるアルファサラセミア変動は、バリアント３．７、バリアント４．２、バリアントＳＥＡ、バリアントＴＨＡＩ、バリアント２０．５、バリアントＭＥＤ、若しくはバリアントＦＩＬ、又はＨＢＡ２遺伝子ＨＢＡ２ ｃ．４２７Ｔ＞Ｃにおける単一ヌクレオチドバリアントから選択される大きな欠失を含む。
【0033】
いくつかの実施形態では、第１の複数のプライマー対は、表４から選択される少なくとも２個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも８個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも２５個、少なくとも３０個、少なくとも３５個、又は全てのプライマー対に対して、少なくとも８５％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９３％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、又はそれ以上の同一性を有する少なくとも２個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも８個、又は少なくとも１０個のプライマー対を含む。いくつかの実施形態では、第１の複数のプライマー対は、表４に示される全てのプライマー対を含む。
【0034】
いくつかの実施形態では、第２の複数のプライマー対は、表５から選択される少なくとも２個、少なくとも４個、又は少なくとも５個のプライマー対に対して、少なくとも８５％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９３％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、又はそれ以上の同一性を有する少なくとも２個、少なくとも４個、又は少なくとも５個のプライマー対を含む。いくつかの実施形態では、第１の複数のプライマー対は、表５に示される全てのプライマー対を含む。
【0035】
いくつかの実施形態では、第３の複数のプライマー対は、表６から選択される少なくとも２個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも８個、又は少なくとも１０個のプライマー対に対して、少なくとも８５％の同一性を有する少なくとも２個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも８個、又は少なくとも１０個のプライマー対を含む。いくつかの実施形態では、第１の複数のプライマー対は、表６に示される全てのプライマー対を含む。
【図面の簡単な説明】
【0036】
【発明を実施するための形態】
【0037】
本開示は、複数の常染色体障害及びＸ連鎖劣性障害についてのバリアントのホットスポット分子検出を同時に提供し、祖先又は地理的起源にかかわらず個体の試験を可能にする方法（「拡張キャリアスクリーニング」）を提供する。本キャリアスクリーニングは、情報に基づいた繁殖の意思決定を容易にするために、影響を受けた子供を持つリスクが高いカップルを容易にかつ素早く特定する。
【0038】
本明細書に開示されるキャリアスクリーニングパネルは、以下を含む１９個の疾患に関連する２０個の遺伝子を含む。アルファサラセミア、ベータサラセミア（鎌状赤血球貧血を含む）、ブルーム症候群、カナバン病、ジヒドロリポアミドデヒドロゲナーゼ欠損症、家族性自律神経障害、家族性高インスリン症、ファンコーニ貧血Ｃ型、ゴーシェ病、グリコーゲン貯蔵疾患ＩＡ型、ジュベール症候群２、メープルシロップ尿疾患、ムコリピドーシスＩＶ、ネマリンミオパシー、ニーマン－ピック病Ａ型、テイ－サックス病、アッシャー症候群ＩＦ型、アッシャー症候群ＩＩＩ型、及びウォーカー－ワールブルク症候群。
【0039】
本キャリアスクリーニングパネルは、１９個の障害の前述のキャリアスクリーニングパネル（２０個の遺伝子）に加えて、３個の追加の疾患、嚢胞性線維症（ＣＦＴＲ）、脆弱Ｘ症候群（ＦＭＲ１）、及び脊髄性筋萎縮症（ＳＭＮ１及びＳＭＮ２）を含むことによって、２４個の遺伝子を含む。
【0040】
開示されるキャリアスクリーニングは、複数の常染色体障害及びＸ連鎖劣性障害についてのバリアントのホットスポット分子検出を同時に提供し、祖先又は地理的起源にかかわらず個体の試験を可能にする。キャリアスクリーニングは、情報に基づいた繁殖の意思決定を容易にするために、影響を受けた子供を持つリスクが高いカップルを特定することを目的としている。
【0041】
定義
別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本技術が属する当業者に一般に理解される意味と同じ意味を有する。
別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本技術が属する当業者に一般に理解される意味と同じ意味を有する。
【0042】
本明細書で使用される場合、別途明記されない限り、単数形の「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、複数の言及を含む。したがって、例えば、「オリゴヌクレオチド」への言及は、複数のオリゴヌクレオチド分子を含み、「核酸」への言及は、１つ以上の核酸への言及である。特許請求の範囲は、あらゆる任意選択的な要素を除外するように起草され得ることに更に留意されたい。したがって、この記述は、特許請求の範囲の要素の記載に関連する「単に」、「のみ」等の排他的な用語の使用、又は「否定的」な限定の使用の先行詞としての役割を果たすことが意図される。
【0043】
本明細書で使用される場合、数値に関して「約」という用語は、別途明記されない限り、又は別途文脈から明らかでない限り、数値のいずれかの方向（それより大きいか又はそれ未満）で１％～１０％の範囲内に入る数値を含むと一般的に解釈される。
【0044】
「アダプタ」という用語は、別の分子への付着を容易にするために、核酸配列の末端にライゲーションするために使用することができる、短い、化学的に合成された核酸配列を指す。アダプタは、一本鎖又は二本鎖であり得る。アダプタは、ＰＣＲ増幅又はシーケンシングに有用な短い（典型的には５０個の塩基対未満）配列を組み込むことができる。
【0045】
本明細書で使用される場合、核酸配列に対して「増幅する」又は「増幅」という用語は、試料中の核酸配列の集団の提示を増加させる方法を指す。増幅反応においてインビトロで生成された特定の標的核酸配列のコピーは、「アンプリコン」又は「増幅産物」と呼ばれる。増幅は、指数関数的又は線形であり得る。標的核酸は、ＤＮＡ（例えば、ゲノムＤＮＡ及びｃＤＮＡ等）又はＲＮＡであり得る。以下に記載される例示的な方法は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用する増幅に関するが、例えば、等温法、ローリングサークル法等の多数の他の方法が、当業者に周知である。当業者であれば、これらの他の方法が、ＰＣＲ方法の代わりに使用され得るか、又はＰＣＲ方法と一緒に使用され得るかのいずれかであることを理解するであろう。例えば、Ｓａｉｋｉ，“Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ”ｉｎ ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｉｎｎｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ １９９０，ｐｐ １３－２０、Ｗｈａｒａｍ，ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２９（１１）：Ｅ５４－Ｅ５４（２００１）を参照されたい。
【0046】
本明細書で使用される「増幅混合物」は、核酸増幅反応で使用される試薬の混合物であるが、プライマー又は試料を含有しない。増幅混合物は、緩衝液、ｄＮＴＰ、及びＤＮＡポリメラーゼを含む。増幅混合物は、ＭｇＣｌ２、ＫＣｌ、非イオン性及びイオン性洗剤（カチオン性洗剤を含む）のうちの少なくとも１つを更に含み得る。
【0047】
「増幅マスターミックス」は、増幅混合物及び１つ以上の標的核酸を増幅するためのプライマーを含むが、増幅される試料を含有しない。
【0048】
本明細書で使用される場合、「選択的に増幅する」という語句は、選択された配列のみが増幅される増幅反応（例えば、ＰＣＲ反応）を指す。「遺伝子特異的増幅」という語句は、選択された遺伝子又は遺伝子の一部のみ（例えば、既知の／事前に選択されたバリアントが生じる場合）が増幅される増幅反応（例えば、ＰＣＲ反応）を指す。
【0049】
ポリヌクレオチド（すなわち、オリゴヌクレオチド又は標的核酸等のヌクレオチドの配列）に関して本明細書で使用される「相補体」、「相補的」、又は「相補性」という用語は、ワトソン／クリック塩基対合ルールを指す。本明細書で使用される核酸配列の相補体は、一方の配列の５’末端が他方の３’末端と対合するように核酸配列とアラインメントした場合に、「逆平行会合」にあるオリゴヌクレオチドを指す。例えば、配列「５’－Ａ－Ｇ－Ｔ－３’」は、配列「３’－Ｔ－Ｃ－Ａ－５’」に相補的である。天然に存在する核酸中に一般的に見出されないある特定の塩基は、本明細書に記載される核酸中に含まれ得る。これらには、例えば、イノシン、７－デアザグアニン、ロックド核酸（ＬＮＡ）、及びペプチド核酸（ＰＮＡ）が含まれる。相補性は完璧である必要はなく、安定した二重鎖は、ミスマッチ塩基対、変性、又はマッチしない塩基を含有し得る。核酸技術の当業者であれば、例えば、オリゴヌクレオチドの長さ、塩基組成物及びオリゴヌクレオチドの配列、イオン強度、並びにミスマッチ塩基対の発生率を含むいくつかの変数を考慮して、経験的に二重鎖安定性を決定することができる。相補体配列は、ＤＮＡ配列又はその相補体配列に相補的なＲＮＡ配列でもあり得、ｃＤＮＡでもあり得る。
【0050】
本明細書で使用される「実質的に相補的な」という用語は、２つの配列がストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイゼーションすることを意味する。当業者は、実質的に相補的な配列がそれらの全長に沿ってハイブリダイゼーションする必要はないことを理解するであろう。特に、実質的に相補的な配列は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で標的配列にハイブリダイゼーションする塩基の連続配列に３’又は５’で配置された、標的配列にハイブリダイゼーションしない塩基の連続配列を含み得る。
【0051】
本明細書で使用される場合、「検出する」という用語は、試料中の標的核酸の存在を決定することを指す。検出は、１００％の感度及び／又は１００％の特異性を提供する方法を必要としない。
【0052】
本明細書で使用される場合、「直接増幅」という用語は、標的核酸が事前の精製、抽出、又は濃縮なしで試料から増幅される核酸増幅反応を指す。
【0053】
「シーケンシング」という用語は、本明細書で使用される場合、ポリヌクレオチドの少なくとも１０個の連続したヌクレオチドのアイデンティティ（例えば、少なくとも２０個、少なくとも５０個、少なくとも１００個、若しくは少なくとも２００個、又はそれ以上の連続したヌクレオチドのアイデンティティ）が得られる方法を指す。
【0054】
「次世代シーケンシング」という用語は、Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、及びＲｏｃｈｅ等（例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａの可逆的ターミネーター法、Ｒｏｃｈｅのパイロシーケンシング法（４５４）、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのライゲーションによるシーケンシング（ＳＯＬｉＤプラットフォーム）、又はＰａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓの蛍光ベースの切断法）によって現在用いられている、いわゆる、並列化された合成によるシーケンシング又はライゲンシングによるシーケンシングプラットフォームを指す。次世代シーケンシング法はまた、ナノポアシーケンシング法、又はＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによって商業化されたＩｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ技術等の電子検出ベースの方法を含み得る。そのような方法の例は、以下の参考文献：Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ ｅｔ ａｌ（Ｎａｔｕｒｅ ２００５ ４３７：３７６－８０）、Ｒｏｎａｇｈｉ ｅｔ ａｌ（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９９６ ２４２：８４－９）、Ｓｈｅｎｄｕｒｅ（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００５ ３０９：１７２８）、Ｉｍｅｌｆｏｒｔ ｅｔ ａｌ（Ｂｒｉｅｆ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍ．２００９ １０：６０９－１８）、Ｆｏｘ ｅｔ ａｌ（Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２００９；５５３：７９－１０８）、Ａｐｐｌｅｂｙ ｅｔ ａｌ（Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２００９；５１３：１９－３９）Ｅｎｇｌｉｓｈ（ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．２０１２ ７：ｅ４７７６８）、及びＭｏｒｏｚｏｖａ（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．２００８ ９２：２５５－６４）に記載されており、これらは、ステップの各々についての全ての出発産物、試薬、及び最終産物を含む、方法の一般的な説明及び方法の特定のステップのために参照により組み込まれる。次世代シーケンシングは、少なくとも１０，０００、少なくとも５０，０００、少なくとも１００，０００、少なくとも５００，０００、少なくとも１Ｍ 少なくとも１０Ｍ 少なくとも１００Ｍ、又は少なくとも１Ｂの配列リードをもたらし得る。多くの場合、リードは、対合末端リードである。
【0055】
いくつかの実施形態では、本開示の次世代シーケンシングは、以下の次世代シーケンシングシステムを含む。
【0056】
Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ（商標）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）アンプリコンシーケンシングシステムは、ＤＮＡ複製における未修飾ヌクレオチドの組み込み中に水素イオンの放出によって引き起こされるｐＨ変化を検出するフローベースのアプローチを採用する。このシステムとともに使用するために、シーケンシングライブラリは、最初に、シーケンシングアダプタに隣接するＤＮＡ断片を生成することによって産生される。いくつかの実施形態では、これらの断片は、エマルションＰＣＲによって粒子上でクローン的に増幅することができる。次いで、増幅したテンプレートを有する粒子は、シリコン半導体シーケンシングチップ中に入れられる。複製中、チップに次々と１つのヌクレオチドが注がれ、チップの特定のマイクロウェル中でヌクレオチドがＤＮＡ分子を補完すると、それが組み込まれることになる。ポリメラーゼによってヌクレオチドがＤＮＡ分子中に組み込まれる場合に、プロトンが自然に放出され、結果としてｐＨの検出可能な局所的変化が生じる。次いで、溶液のｐＨが、そのウェル中で変化し、イオンセンサによって検出される。テンプレート配列中にホモポリマーの反復が存在する場合、単一のサイクルで複数のヌクレオチドが組み込まれることになる。これが、対応する数の放出された水素及び比例的により高い電子シグナルにつながる。
【0057】
４５４ＴＭ ＧＳ ＦＬＸ（商標）シーケンシングシステム（Ｒｏｃｈｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）は、大規模な並列パイロシーケンシングシステムで光ベースの検出方法論を採用する。
【0058】
パイロシーケンシングは、ＤＮＡ重合を使用し、一度に１つのヌクレオチド種を添加し、付着したピロリン酸の放出によって放出された光を通して所与の位置に付加されたヌクレオチドの数を検出及び定量する。４５４（商標）システムとともに使用するために、アダプタがライゲーションしたＤＮＡ断片を、油中水エマルション中の小さなＤＮＡ捕捉ビーズに固定し、ＰＣＲ（エマルションＰＣＲ）によって増幅する。各々のＤＮＡが結合したビーズをピコタイタープレート上のウェルに入れ、シーケンシング試薬をプレートのウェルにわたり送達する。シーケンシング実行中に、４つのＤＮＡヌクレオチドを、ピコタイタープレートデバイスにわたり固定した順序で逐次的に添加する。ヌクレオチドのフロー中、ビーズの各々に結合したＤＮＡの数百万のコピーが並行してシーケンシングされる。テンプレート鎖に相補的なヌクレオチドがウェルに添加されると、ヌクレオチドは既存のＤＮＡ鎖上に組み込まれ、光シグナルを生成し、これが機器中のＣＣＤカメラによって記録される。
【0059】
可逆的染料ターミネーターに基づくシーケンシング技術：ＤＮＡ分子を最初にスライド上のプライマーに付着させ、局所クローンコロニーが形成されるように増幅する。４つのタイプの可逆的ターミネーター塩基（ＲＴ塩基）を添加し、組み込まれなかったヌクレオチドを洗い流す。パイロシーケンシングとは異なり、ＤＮＡは、一度に１つのヌクレオチドのみ伸長することができる。カメラは、蛍光標識ヌクレオチドの画像を撮り、次いで、末端３’ブロッカーとともに染料がＤＮＡから化学的に除去されて、次のサイクルが可能になる。
【0060】
Ｈｅｌｉｃｏｓの単一分子シーケンシングは、フローセル表面に付着している、ポリＡテールアダプタを添加したＤＮＡ断片を使用する。各サイクルで、ＤＮＡポリメラーゼ及び単一種の蛍光標識ヌクレオチドを添加し、表面に固定化されたプライマー－テンプレート二重鎖のテンプレート依存性の伸長をもたらす。リードは、Ｈｅｌｉｏｓｃｏｐｅシーケンサによって実施される。完全なアレイをタイリングする画像の取得後、蛍光標識の化学的切断及び放出により、その後の伸長及び画像化のサイクルが可能になる。
【0061】
合成によるシーケンシング（ＳＢＳ）は、「オールドスタイルの」染料ターミネーション電気泳動シーケンシングのように、塩基配列を決定するためにＤＮＡポリメラーゼによるヌクレオチドの組み込みに依存する。固定されたアダプタを有するＤＮＡライブラリを一本鎖に変性させ、フローセルにグラフト化し、続いてブリッジ増幅して、ガラスチップ上にスポットの高密度アレイを形成する。可逆的ターミネーター法は、染料ターミネーターの可逆的バージョンを使用し、一度に１つのヌクレオチドを添加し、ブロッキング基の繰り返し除去によって各位置で蛍光を検出して、別のヌクレオチドの重合を可能にする。ヌクレオチド組み込みのシグナルは、全てが使用されている、蛍光標識ヌクレオチド、リン酸により駆動する光反応、及び水素イオン感知とともに変動し得る。ＳＢＳプラットフォームの例には、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＧＡ及びＨｉＳｅｑ ２０００が含まれる。ＭｉＳｅｑ（登録商標）パーソナルシーケンシングシステム（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．）もまた、可逆的ターミネーター化学を用いる合成によるシーケンシングを採用する。
【0062】
合成法によるシーケンシングとは対照的に、ライゲーション法によるシーケンシングは、ＤＮＡリガーゼを使用して標的配列を決定する。このシーケンシング法は、テンプレートＤＮＡ鎖上の局所相補性を介する隣接するオリゴヌクレオチドの酵素ライゲーションに依存する。この技術は、シーケンシングした位置に従って標識された、固定長の全ての可能なオリゴヌクレオチドのパーティションを採用する。オリゴヌクレオチドをアニーリングしてライゲーションし、配列をマッチさせるためのＤＮＡリガーゼによる優先的なライゲーションは、その位置で、ジヌクレオチドによってコードされた色空間シグナルをもたらす（オリゴに沿った既知の位置における既知のヌクレオチドに対応する蛍光標識プローブの放出を通じて）。この方法は、主としてＬｉｆｅ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのＳＯＬｉＤ（商標）シーケンサによって使用される。シーケンシングの前に、ＤＮＡをエマルションＰＣＲによって増幅する。得られたビーズは、各々同じＤＮＡ分子のコピーのみを含有し、固体平面基材上に堆積される。
【0063】
ＳＭＲＴ（商標）シーケンシングは、合成によるシーケンシングアプローチに基づく。ＤＮＡは、ゼロモード導波路（ＺＭＷ）で合成され、ＺＭＷは、ウェルの底部に配置された捕捉ツールを備える、小さいウェル様のコンテナである。シーケンシングは、未修飾ポリメラーゼ（ＺＭＷ底部に付着した）、及び溶液中を自由に流動する蛍光標識ヌクレオチドの使用により実施される。ウェルは、ウェルの底部で発生する蛍光のみが検出されるように構築される。蛍光標識は、ＤＮＡ鎖へのその組み込み時にヌクレオチドから取り外されて、未修飾ＤＮＡ鎖が残る。
【0064】
本明細書で使用される「バーコード配列」又は「分子バーコード」という用語は、（ａ）反応におけるポリヌクレオチドの供給源を特定及び／若しくは追跡するために、並びに／又は（ｂ）初期の分子がシーケンシングされる回数を計数するために（例えば、試料中の実質的に全ての分子が異なる配列でタグ付けされ、次いで試料が増幅される場合）使用されるヌクレオチドの独自の配列を指す。バーコード配列は、オリゴヌクレオチドの５’末端、３’末端、若しくは中央、又は５’末端及び３’末端の両方にあり得る。バーコード配列は、サイズ及び組成物が広範にわたって変動し得る。以下の参考文献は、特定の実施形態に適切なバーコード配列のセットを選択するためのガイダンスを提供する。Ｂｒｅｎｎｅｒ、米国特許第５，６３５，４００号、Ｂｒｅｎｎｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９７：１６６５－１６７０（２０００）、Ｓｈｏｅｍａｋｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１４：４５０－４５６（１９９６）、Ｍｏｒｒｉｓ ｅｔ ａｌ、欧州特許公開第０７９９８９７Ａ１号、Ｗａｌｌａｃｅ、米国特許第５，９８１，１７９号等。いくつかの実施形態では、バーコード配列は、４～３６ヌクレオチド、又は６～３０ヌクレオチド、又は８～２０ヌクレオチドの範囲の長さを有し得る。
【0065】
本明細書で使用される場合、「抽出」という用語は、試料中に存在する他の（非核酸）材料から核酸を除去するために取られる任意のアクションを指す。抽出という用語は、機械的若しくは化学的溶解、洗剤若しくはプロテアーゼの添加、又はタンパク質等の非核酸の沈殿及び除去を含む。
【0066】
本明細書で使用される「ハイブリダイゼーションする」という用語は、２つの実質的に相補的な核酸鎖（少なくとも１４～２５ヌクレオチドの伸長にわたって少なくとも約６５％相補的、少なくとも約７５％、又は少なくとも約９０％相補的）を、適切にストリンジェントな条件下で互いにアニーリングし、相補的な塩基対間の水素結合の形成を通じて二重鎖又はヘテロ二重鎖を形成するプロセスを指す。ハイブリダイゼーションは、典型的かつ好ましくは、プローブ長の核酸分子、好ましくは１５～１００ヌクレオチド長、より好ましくは１８～５０ヌクレオチド長で実行される。核酸ハイブリダイゼーション技術は、当該技術分野で周知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎ．Ｙを参照されたい。ハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーションの強度（すなわち、核酸間の会合の強度）は、核酸間の相補性の程度、関与する条件のストリンジェンシー、及び形成されたハイブリッドの熱融点（Ｔｍ）等の要因に影響される。当業者は、少なくとも所望のレベルの相補性を有する配列が安定してハイブリダイゼーションするであろう一方で、より低い相補性を有する配列がハイブリダイゼーションしないであろうように、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーを推定及び調整する方法を理解している。ハイブリダイゼーション条件及びパラメータの例については、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎ．Ｙ．、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．１９９４，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｓｅｃａｕｃｕｓ，Ｎ．Ｊを参照されたい。いくつかの実施形態では、特異的ハイブリダイゼーションは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で生じる。標的核酸に特異的であるオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチド（例えば、プローブ又はプライマー）は、好適な条件下で標的核酸に「ハイブリダイゼーションする」であろう。
【0067】
核酸増幅反応の文脈における「ホットスタート」は、温度がプライマー又はプライマーの必要なハイブリダイゼーション特異性を提供するのに十分に上昇するまで、少なくとも１つの重要な試薬が反応混合物から留保される（又は、反応混合物中に存在する場合、試薬は不活性のままである）プロトコルを指す。「ホットスタート酵素」は、ホットスタートプロトコルで「留保」又は不活性試薬として作用することができる酵素、典型的には核酸ポリメラーゼである。例えば、いくつかのホットスタート酵素は、酵素を化学的に修飾することによって得ることができる。ホットスタート酵素の例には、ＡＺ０５－Ｇｏｌｄポリメラーゼ、ＫＡＰＡ ＨｉＦｉ、及びＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ（登録商標）が含まれる。
【0068】
本明細書で使用される場合、「Ｔａｑエクステンダー」は、ミスマッチの一時停止を低減させることによって、ＰＣＲの各サイクル中のＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ伸長反応の効率を増加させ、より大きなパーセンテージの完了した伸長反応をもたらすＰＣＲ添加剤である。いくつかの実施形態では、Ｔａｑエクステンダーは、Ａｇｉｌｅｎｔ又はＳｔｒａｔｅｇｅｎｅからのＴａｑ Ｅｘｔｅｎｄｅｒ（商標）を含む。
【0069】
本明細書で使用される場合、「個体」、「患者」、又は「対象」という用語は、個々の生物、脊椎動物、哺乳動物、又はヒトであり得る。好ましい実施形態では、個体、患者、又は対象は、ヒトである。
【0070】
疑似遺伝子は、本明細書では、野生型、機能的、タンパク質をコードしない核酸配列として定義される。「疑似遺伝子」という用語は、タンパク質を全くコードしない核酸配列を包含する。追加的に、「疑似遺伝子」という用語は、それらが、同じ種類の野生型タンパク質と比較して著しく機能が損なわれた、又は失われたタンパク質又はタンパク質の一部をコードするように、修飾、例えば、挿入又は欠失を含む遺伝子対立遺伝子を包含する。そのような対立遺伝子は、例えば、少なくとも１つのヌクレオチドの挿入及び／又は欠失によって引き起こされたか、又は未熟停止コドンによって引き起こされたフレームシフトの結果として、切断されたタンパク質をコードする。
【0071】
本明細書で使用される場合、「多重ＰＣＲ」という用語は、同じ反応容器内での２つ以上のＰＣＲ産物又はアンプリコンの同時生成を指す。各ＰＣＲ産物は、異なるプライマー対を使用してプライミングされる。多重反応は、異なる検出可能な部分で標識されている各産物についての特異的プローブを更に含み得る。
【0072】
本明細書で使用される場合、「オリゴヌクレオチド」は、定義された間隔において同一のモノマー単位で主に構成された骨格上の核酸塩基の配列を有する分子を指す。塩基は、オリゴヌクレオチドの塩基に相補的である塩基の配列を有する核酸と結合することができるように、骨格上に配置される。最も一般的なオリゴヌクレオチドは、糖リン酸単位の骨格を有する。区別は、２’位にヒドロキシル基を有しないオリゴデオキシリボヌクレオチドと、２’位にヒドロキシル基を有するオリゴリボヌクレオチドとの間で行われ得る。オリゴヌクレオチドはまた、ヒドロキシル基の水素が有機基、例えば、アリル基で置き換えられている誘導体を含み得る。プライマー又はプローブとして機能するオリゴヌクレオチドは、一般に、少なくとも約１０～１５ヌクレオチド長、又は最大約７０、１００、１１０、１５０、若しくは２００ヌクレオチド長であり、より好ましくは、少なくとも約１５～２５ヌクレオチド長である。特定の標的核酸を特異的に増幅又は特異的に検出するためのプライマー又はプローブとして使用されるオリゴヌクレオチドは、一般に、標的核酸に特異的にハイブリダイゼーションすることができる。
【0073】
本明細書で使用される「陽性対照核酸」又は「内部陽性増幅対照」は、ある特定の量又はレベルで試料中に存在することが既知の核酸である。いくつかの実施形態では、陽性対照核酸は、試料中に天然に存在せず、開示される方法において、反応試料混合物をリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応に供する前に試料に添加される。
【0074】
本明細書で使用される場合、「プライマー」という用語は、標的核酸鎖に相補的であるプライマー伸長産物の合成が誘導される条件下、すなわち、適切な緩衝液（「緩衝液」は、ｐＨ、イオン強度、補因子等を含む）中、及び好適な温度での異なるヌクレオチド三リン酸及びポリメラーゼの存在下で配置された場合、核酸配列合成の開始点として作用することができるオリゴヌクレオチドを指す。プライマーのヌクレオチドのうちの１つ以上は、例えば、メチル基、ビオチン、若しくはジゴキシゲニン部分、蛍光タグの添加によって、又は放射性ヌクレオチドを使用することによって修飾することができる。プライマー配列は、テンプレートの正確な配列を反映する必要はない。例えば、非相補的ヌクレオチド断片は、プライマーの５’末端に付着され得、プライマー配列の残りは、鎖に実質的に相補的である。本明細書で使用されるプライマーという用語は、ペプチド核酸プライマー、ロックド核酸プライマー、ホスホロチオエート修飾プライマー、標識プライマー等を含む、合成され得る全ての形態のプライマーを含む。本明細書で使用される「フォワードプライマー」という用語は、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）のアンチセンス鎖にアニーリングするプライマーを意味する。「リバースプライマー」は、ｄｓＤＮＡのセンス鎖にアニーリングする。
【0075】
プライマーは、典型的には、少なくとも１０、１５、１８、若しくは３０ヌクレオチド長、又は最大約１００、１１０、１２５、若しくは２００ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、プライマーは、好ましくは、約１５～約６０ヌクレオチド長であり、最も好ましくは、約２５～約４０ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、プライマーは、１５～３５ヌクレオチド長である。最適なハイブリダイゼーション又はポリメラーゼ連鎖反応増幅についての標準的な長さはない。特定のプライマー用途に最適な長さは、Ｈ．Ｅｒｌｉｃｈ，ＰＣＲ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｆｏｒ ＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ，（１９８９）に記載されている様式で容易に決定され得る。
【0076】
「プライマー伸長反応」は、オリゴヌクレオチドプライマーが標的核酸にハイブリダイゼーションし、標的核酸の相補的コピーが、個々の相補的ヌクレオチドのポリメラーゼ依存性３’付加によって産生される合成反応を指す。いくつかの実施形態では、プライマー伸長反応は、ＰＣＲである。
【0077】
本明細書で使用される場合、「プライマー対」という語句は、目的の核酸の所定の領域を増幅するために一緒に使用することができるフォワード及びリバースプライマー対（すなわち、左及び右のプライマー対）を指す。
【0078】
本明細書で使用される場合、「ギャッププライマー対」という語句は、欠失が存在する場合にのみ、産物を産生するように設計されたプライマー対を指す。いくつかの実施形態では、ギャッププライマー対を使用して特異的に検出された大きな欠失には、ＨＥＸＡにおける７．６Ｋｂの欠失、ＭＣＯＬＮ１における６．４Ｋｂの欠失、２．５Ｋｂが含まれる。ＮＥＢにおける欠失、並びに以下のアルファサラセミアバリアント：３．７、４．２、ＳＥＡ、ＴＨＡＩ、２０．５、ＭＥＤ、及びＦＩＬ。いくつかの実施形態では、１０個の大きな欠失のうちのいずれかの検出は、ギャップＰＣＲアンプリコンの存在に基づき、呼び出される特定のバリアントに基づいていない
【0079】
本明細書で使用される「プローブ」は、ハイブリダイゼーションを介して標的核酸と相互作用する核酸を指す。プローブは、標的核酸配列に完全に相補的であっても、部分的に相補的であってもよい。相補性のレベルは、一般的に、プローブの機能に基づく多くの要因に依存するであろう。プローブは、当該技術分野で周知のいくつかの方法のうちのいずれかで、標識されるか、標識されないか、又は修飾されることができる。プローブは、標的核酸に特異的にハイブリダイゼーションし得る。プローブは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又はＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドであり得る。プローブは、オリゴヌクレオチド、人工染色体、断片化人工染色体、ゲノム核酸、断片化ゲノム核酸、ＲＮＡ、組換え核酸、断片化組換え核酸、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックド核酸、環状複素環のオリゴマー、又は核酸のコンジュゲートであり得る。プローブは、修飾核酸塩基、修飾糖部分、及び修飾ヌクレオチド間連結を含み得る。プローブは、メチル化標的核酸の存在又は非存在を検出するために使用され得る。プローブは、典型的には、少なくとも約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７５、１００ヌクレオチド、又はそれ以上の長さである。
【0080】
本明細書で使用される「プローブ要素」は、（ａ）プライマー核酸配列に接続されているか、又はプライマー核酸配列に隣接して配置されているという点でプライマーと会合しており、かつ（ｂ）ストリンジェントな条件下で検出される標的核酸配列に特異的にハイブリダイゼーションするヌクレオチドの伸長を指す。
【0081】
本明細書で使用される「反応試料混合物」は、増幅マスターミックス及び試料を含有する混合物を指す。
【0082】
本明細書で使用される場合、「試料」という用語は、患者又は単離された微生物から得られた臨床試料を指す。好ましい実施形態では、試料は、対象から収集された組織、体液、又は微生物等の生体源（すなわち、「生体試料」）から得られる。試料源には、粘液、痰（処理済み又は未処理）、気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬ）、気管支洗浄液（ＢＷ）、血液、体液、脳脊髄液（ＣＳＦ）、尿、血漿、血清、又は組織（例えば、生検材料）が含まれるが、これらに限定されない。好ましい試料源には、鼻咽頭及び／又は喉のスワブ又は鼻洗浄液が含まれる。
【0083】
本技術の方法に関して本明細書で使用される「感度」という用語は、配列の不均一な集団における事前に選択された配列バリアントを検出する方法の能力の尺度である。事前に選択された配列バリアントが試料中の配列の少なくともＦ％として存在する試料を考慮し、方法が、事前に選択されたＣ％の信頼性、時間のＳ％で事前に選択された配列を検出することができる場合、その方法は、Ｆ％のバリアントに対してＳ％の感度を有する。一例として、事前に選択されたバリアント配列が試料中の配列の少なくとも５％として存在する試料を考慮し、方法が、事前に選択された９９％の信頼性、１０回のうち９回（Ｆ＝５％、Ｃ＝９９％、Ｓ＝９０％）で事前に選択された配列を検出することができる場合、その方法は、５％のバリアントに対して９０％の感度を有する。例示的な感度には、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、及び９９％が含まれる。
【0084】
オリゴヌクレオチドプライマーに関して本明細書で使用される「特異的」という用語は、プライマーのヌクレオチド配列が、オリゴヌクレオチド及び核酸がアラインメントされる場合に増幅される核酸の一部と少なくとも１２塩基の配列同一性を有することを意味する。核酸に特異的であるオリゴヌクレオチドプライマーは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション又は洗浄条件下で、目的の標的にハイブリダイゼーションすることができ、目的ではない核酸に実質的にハイブリダイゼーションしないものである。より高いレベルの配列同一性は、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも８５～９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又はそれ以上の配列同一性を含む。配列同一性は、当該技術分野で周知のアルゴリズムを用いるデフォルト設定を有する市販のコンピュータプログラムを使用して決定することができる。本明細書で使用される場合、「高い配列同一性」を有する配列は、アラインメントされたヌクレオチド位置の少なくとも約少なくとも約７５％で、少なくとも約８０％で、少なくとも約８５％で、少なくとも約９０％で、少なくとも約９５％で、少なくとも約９９％で、又はそれ以上で同一のヌクレオチドを有する。
【0085】
本明細書で使用される「特異性」は、真に存在する事前に選択された配列バリアント（遺伝子の変動）をシーケンシングアーチファクト又は他の密接に関連する配列から区別する方法の能力の尺度である。これは、偽陽性検出を回避する能力である。偽陽性検出は、試料調製中に目的の配列に導入されたエラー、シーケンシングエラー、又は疑似遺伝子若しくは遺伝子ファミリーのメンバーのような密接に関連する配列の不注意なシーケンシングから生じ得る。ＸＴｒｕｅ配列が真にバリアントであり、ＸＮｏｔ ｔｒｕｅが真にバリアントではないＮＴｏｔａｌ配列の試料セットに適用されたとき、方法が、真にバリアントではないものの少なくともＸ％をバリアントではないとして選択する場合、その方法は、Ｘ％の特異性を有する。例えば、５００個の配列が真にバリアントであり、５００個が真にバリアントではない１，０００個の配列の試料セットに適用されたとき、方法が、５００個の真にバリアント配列ではないものの９０％をバリアントではないとして選択する場合、その方法は、９０％の特異性を有する。例示的な特異性には、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、及び９９％が含まれる。
【0086】
本明細書で使用される「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」という用語は、以下：５０％のホルムアミド、５×ＳＳＣ、５０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ６．８、０．５％のＳＤＳ、０．１ｍｇ／ｍＬの超音波処理したサケ精子ＤＮＡ、及び５×Ｄｅｎｈａｒｔの溶液中での、４２℃で一晩のハイブリダイゼーション；２×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳを用いる、４５℃での洗浄；並びに０．２×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳを用いる、４５℃での洗浄と少なくとも同程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件を指す。別の例では、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、２０個の連続ヌクレオチドの伸長にわたって３つ以上の塩基が異なる２つの核酸のハイブリダイゼーションを許容しないはずである。
【0087】
本明細書で使用される「標的核酸」又は「標的配列」という用語は、分析される試料中で検出及び／又は定量される目的の核酸配列を指す。標的核酸は、染色体のセグメント、遺伝子間配列を有する若しくは有しない完全な遺伝子、遺伝子間配列を有する若しくは有しない遺伝子のセグメント若しくは部分、又はプローブ若しくはプライマーが設計される核酸の配列から構成され得る。標的核酸は、野生型配列（複数可）、変異、欠失、挿入若しくは重複、タンデム反復エレメント、目的の遺伝子、目的の遺伝子の領域、又はそれらの任意の上流若しくは下流の領域を含み得る。標的核酸は、特定の遺伝子の代替配列又は対立遺伝子を表し得る。標的核酸は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、又はＲＮＡに由来し得る。
【0088】
遺伝子バリアント（変動）を検出するための方法
本開示の態様は、少なくとも１つの遺伝性遺伝的変異についてのキャリアであることが疑われる、対象における遺伝的障害のための１つ以上のバリアントを検出するための方法であって、対象から得られた生体試料からＤＮＡを抽出することと、生体試料を第１の複数のプライマー対と接触させることによって、第１の複数のアンプリコンを生成することであって、少なくとも１つのアンプリコンが、複数の遺伝子の各々に対応し、当該複数の遺伝子が、ＨＥＸＡ、ＳＭＰＤ１、ＭＣＯＬＮ１、ＧＢＡ、ＦＡＮＣＣ、ＩＫＢＫＡＰ、ＡＳＰＡ、ＢＬＭ、ＢＣＫＤＨＢ、Ｇ６ＰＣ、ＡＢＣＣ８、ＤＬＤ、ＮＥＢ、ＰＣＤＨ１５、ＣＬＲＮ１、ＴＭＥＭ２１６、及びＦＫＴＮを含む、生成することと、生体試料を第２の複数のプライマー対と接触させることによって、第２の複数のアンプリコンを生成することであって、少なくとも１つのアンプリコンが、ＧＢＡ及びＨＢＢの各々に対応し、第２の複数のプライマー対が、配列番号８１及び８２、並びに配列番号８３及び８４を含む、生成することと、生体試料を、第３の複数のプライマー対、ホットスタートＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、及びＴａｑエクステンダーＰＣＲ添加剤と接触させることによって、第３の複数のアンプリコンを生成することであって、少なくとも１つのアンプリコンが、ＨＢＡ１及びＨＢＡ２の各々に対応する、生成することと、ポリメラーゼ連鎖反応を介して、第１、第２、及び第３の複数のアンプリコンの末端にバーコード配列を組み込むことと、高スループット大規模並列シーケンシングを使用して、第１、第２、及び第３の複数のアンプリコンのうちの少なくとも１つにおける１つ以上のバリアントを検出することと、を含む、方法を対象とする。
本開示の態様は、少なくとも１つの遺伝性遺伝的変異についてのキャリアであることが疑われる、対象における遺伝的障害のための１つ以上のバリアントを検出するための方法であって、対象から得られた生体試料からＤＮＡを抽出することと、生体試料を第１の複数のプライマー対と接触させることによって、第１の複数のアンプリコンを生成することであって、少なくとも１つのアンプリコンが、複数の遺伝子の各々に対応し、当該複数の遺伝子が、ＨＥＸＡ、ＳＭＰＤ１、ＭＣＯＬＮ１、ＧＢＡ、ＦＡＮＣＣ、ＩＫＢＫＡＰ、ＡＳＰＡ、ＢＬＭ、ＢＣＫＤＨＢ、Ｇ６ＰＣ、ＡＢＣＣ８、ＤＬＤ、ＮＥＢ、ＰＣＤＨ１５、ＣＬＲＮ１、ＴＭＥＭ２１６、及びＦＫＴＮを含む、生成することと、生体試料を第２の複数のプライマー対と接触させることによって、第２の複数のアンプリコンを生成することであって、少なくとも１つのアンプリコンが、ＧＢＡ及びＨＢＢの各々に対応し、第２の複数のプライマー対が、配列番号８１及び８２、並びに配列番号８３及び８４を含む、生成することと、生体試料を、第３の複数のプライマー対、ホットスタートＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、及びＴａｑエクステンダーＰＣＲ添加剤と接触させることによって、第３の複数のアンプリコンを生成することであって、少なくとも１つのアンプリコンが、ＨＢＡ１及びＨＢＡ２の各々に対応する、生成することと、ポリメラーゼ連鎖反応を介して、第１、第２、及び第３の複数のアンプリコンの末端にバーコード配列を組み込むことと、高スループット大規模並列シーケンシングを使用して、第１、第２、及び第３の複数のアンプリコンのうちの少なくとも１つにおける１つ以上のバリアントを検出することと、を含む、方法を対象とする。
【0089】
いくつかの実施形態では、アシュケナージ系ユダヤ人パネル変動は、アシュケナージ系ユダヤ人集団において一般的に観察されるが、アシュケナージ系ユダヤ人集団以外でもまた、低頻度ではあるが生じ得る、遺伝子の変動（例えば、単一ヌクレオチド変動（ＳＮＶ）、欠失、挿入、又は反転）を含む。いくつかの実施形態では、アシュケナージ系ユダヤ人パネル変動は、テイ－サックス病、ニーマンピック病、ＩＶ型ムコリピドーシス、ゴーシェ病、ファンコーニ貧血、家族性自律神経障害、カナバン病、ブルーム症候群、メープル血清尿症、グリコーゲン貯蔵疾患Ｉ、家族性高インスリン症、ジヒドロリポアミドデヒドロゲナーゼ欠損症（ＤＬＤ）、リポアミドデヒドロゲナーゼ欠損症（Ｅ３）、ネマリンミオパシー、アッシャー症候群ＩＦ型、アッシャー症候群、ＩＩＩＡ型、ジュベール症候群２、又はウォーカー－ワールブルク症候群を引き起こす可能性がある遺伝的変動を含む。いくつかの実施形態では、アシュケナージ系ユダヤ人パネル変動は、表１に列挙される遺伝的変動を含む。いくつかの実施形態では、ベータサラセミア変動は、表２に列挙される遺伝的変動を含む。いくつかの実施形態では、アルファサラセミア変動は、表３に列挙される遺伝的変動を含む。
【0090】
いくつかの実施形態では、第１の複数のプライマー対は、欠失が存在する場合にのみ、標的領域を増幅するように設計された少なくとも１つのギャッププライマー対を含む。いくつかの実施形態では、第２の複数のプライマー対のＧＢＡプライマーは、ＧＢＡ遺伝子を特異的に増幅し、任意のＧＢＡ疑似遺伝子を増幅しない。いくつかの実施形態では、第３の複数のプライマー対は、欠失が存在する場合にのみ、標的領域を増幅するように設計された少なくとも１つのギャッププライマー対を含む。
【0091】
いくつかの実施形態では、ＨＥＸＡ遺伝子の変動は、テイ－サックス病を引き起こし、ＳＭＰＤ１遺伝子の変動は、ニーマンピック病を引き起こし、ＭＣＯＬＮ１遺伝子の変動は、ＩＶ型ムコリピドーシスを引き起こし、ＧＢＡ遺伝子の変動は、ゴーシェ病を引き起こし、ＰＡＮＣＣ遺伝子の変動は、ファンコーニ貧血を引き起こし、ＩＫＢＫＡＰ遺伝子の変動は、家族性自律神経障害を引き起こし、ＡＳＰＡ遺伝子の変動は、カナバン病を引き起こし、ＢＬＭ遺伝子の変動は、ブルーム症候群を引き起こし、ＢＣＫＤＨＢ遺伝子の変動は、メープル血清尿症を引き起こし、Ｇ６ＰＣ遺伝子の変動は、グリコーゲン貯蔵疾患Ｉを引き起こし、ＡＢＣＣ８遺伝子の変動は、家族性高インスリン症を引き起こし、ＤＬＤ遺伝子の変動は、ジヒドロリポアミドデヒドロゲナーゼ欠損症（ＤＬＤ）又はリポアミドデヒドロゲナーゼ欠損症（Ｅ３）を引き起こし、ＮＥＢ遺伝子の変動は、ネマリンミオパシーを引き起こし、ＰＣＤＨ１５遺伝子の変動は、アッシャー症候群、ＩＦ型を引き起こし、ＣＬＲＮ１遺伝子の変動は、アッシャー症候群、ＩＩＩＡ型を引き起こし、ＴＭＥＭ２１６遺伝子の変動は、ジュベール症候群２を引き起こし、ＦＫＴＮ遺伝子の変動は、ウォーカー－ワールブルク症候群を引き起こす。
【0092】
いくつかの実施形態では、アシュケナージ系ユダヤ人パネル遺伝子の変動は、表１に列挙される１つ以上の遺伝子の変動を含む。いくつかの実施形態では、ＨＥＸＡ遺伝子の変動は、Ｒ１７８Ｈ（Ｂ１バリアント）、Ｒ２４７Ｗ、Ｒ２４９Ｗ、Ｇ２６９Ｓ、ＩＶＳ９＋１Ｇ＞Ａ、１２７８＿ＴＡＴＣ、ＩＶＳ１２＋１Ｇ＞Ｃ、又は７．６－ｋｂ Ｄｅｌ、Ｅｘ１のうちの１つ以上を含み、ＳＭＰＤ１遺伝子の変動は、Ｌ３０２Ｐ、ｆｓＰ３３０、Ｒ４９６Ｌ（Ｒ４９８Ｌ）、又はｄｅｌｔａＲ６０８のうちの１つ以上を含み、ＭＣＯＬＮ１遺伝子の変動は、ＩＶＳ３－２Ａ＞Ｇ又は６．４ｋｂ＿ｄｅｌのうちの１つ以上を含み、ＧＢＡ遺伝子の変動は、ＩＶＳ２＋１Ｇ＞Ａ、８４Ｇ＞ＧＧ、Ｎ３７０Ｓ、ｄｅｌ＿５５ｂｐ、Ｖ３９４Ｌ、Ｄ４０９Ｈ、Ｌ４４４Ｐ、又はＲ４９６Ｈのうちの１つ以上を含み、ＰＡＮＣＣ遺伝子の変動は、ＩＶＳ４＋４Ａ＞Ｔ又は３２２ｄｅｌＧのうちの１つ以上を含み、ＩＫＢＫＡＰ遺伝子の変動は、Ｒ６９６Ｐ又はＩＶＳ２０＋６Ｔ＞Ｃのうちの１つ以上を含み、ＡＳＰＡ遺伝子の変動は、ＩＶＳ２－２Ａ＞Ｇ、Ｙ２３１Ｘ、Ｅ２８５Ａ、又はＡ３０５Ｅのうちの１つ以上を含み、ＢＬＭ遺伝子の変動は、２２８１ｄｅｌ６／ｉｎｓ７のうちの１つ以上を含み、ＢＣＫＤＨＢ遺伝子の変動は、Ｒ１８３Ｐ、Ｇ２７８Ｓ、又はＥ３７２Ｘのうちの１つ以上を含み、Ｇ６ＰＣ遺伝子の変動は、Ｒ８３Ｃ又はＱ３４７Ｘのうちの１つ以上を含み、ＡＢＣＣ８遺伝子の変動は、ＩＶＳ３２－９Ｇ＞Ａ又はＦ１３８７ｄｅｌを含み、ＤＬＤ遺伝子の変動は、Ｙ３５＊又はＧ２２９Ｃのうちの１つ以上を含み、ＮＥＢ遺伝子の変動は、Ｒ２４７８＿Ｄ２５１２ｄｅｌ３５を含み、ＰＣＤＨ１５遺伝子の変動は、Ｒ２４５のうちの１つ以上を含み、ＣＬＲＮ１遺伝子の変動は、Ｎ４８Ｋを含み、ＴＭＥＭ２１６遺伝子の変動は、Ｒ７３Ｌを含み、ＦＫＴＮ遺伝子の変動は、Ｆ３９０ｆｓを含む。
【0093】
いくつかの実施形態では、ＨＢＢ遺伝子におけるベータサラセミア遺伝子の変動は、表２に列挙される１つ以上の遺伝子の変動を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子の変動は、ｃ．＊１１１Ａ＞Ｇ、ｃ．＊１１０Ｔ＞Ｃ、ｃ．＊９６Ｔ＞Ｃ、Ｈｂ Ｄ－Ｌｏｓ Ａｎｇｅｌｅｓ（ｃ．３６４Ｇ＞Ｃ）、Ｈｂ Ｏ－Ａｒａｂ（ｃ．３６４Ｇ＞Ａ）、ｃ．３２１＿３２２ｉｎｓＧ、ｃ．３１６－２Ａ＞Ｃ、ｃ．３１６－２Ａ＞Ｇ、ｃ．３１６－３Ｃ＞Ａ、ｃ．３１６－１０６Ｃ＞Ｇ、ｃ．３１６－１２５Ａ＞Ｇ、ｃ．３１６－１４６Ｔ＞Ｇ、ｃ．３１６－１９７Ｃ＞Ｔ、ｃ．３１５＋１Ｇ＞Ａ、ｃ．２８７＿２８８ｉｎｓＡ、ｃ．２５１ｄｅｌＧ、ｃ．２３０ｄｅｌＣ、ｃ．２１６＿２１７ｉｎｓＡ、ｃ．２０３＿２０４ｄｅｌＴＧ、ｃ．１４３＿１４４ｉｎｓＡ、ｃ．１４６＿１４７ｉｎｓＡＴＣＴ、ｃ．１３５ｄｅｌＣ、ｃ．１３０Ｇ＞Ｔ、ｃ．１２６＿１２９ｄｅｌＣＴＴＴ、ｃ．１２４＿１２７ｄｅｌＴＴＣＴ、ｃ．１１８Ｃ＞Ｔ、ｃ．１１４Ｇ＞Ａ、ｃ．１１２ｄｅｌＴ、ｃ．９３－１Ｇ＞Ｃ、ｃ．９３－１Ｇ＞Ａ、ｃ．９３－２１Ｇ＞Ａ、ｃ．９２＋６Ｔ＞Ｃ、ｃ．９２＋５Ｇ＞Ａ、ｃ．９２＋５Ｇ＞Ｃ、ｃ．９２＋５Ｇ＞Ｔ、ｃ．９２＋２Ｔ＞Ａ、ｃ．９２＋２Ｔ＞Ｃ、ｃ．９２＋１Ｇ＞Ａ、ｃ．９２＋１Ｇ＞Ｔ、Ｈｂ Ｍｏｎｒｏｅ（ｃ．９２Ｇ＞Ｃ）、ｃ．９２Ｇ＞Ａ、ｃ．８４＿８５ｉｎｓＣ、ｃ．７９Ｇ＞Ｔ、ＨＢ Ｅ（ｃ．７９Ｇ＞Ａ）、ｃ．７５Ｔ＞Ａ、ｃ．５９Ａ＞Ｇ、ｃ．５２Ａ＞Ｔ（ＬＹＳ１７＊）、ｃ．５１ｄｅｌＣ、ｃ．４８Ｇ＞Ａ、ｃ．４７Ｇ＞Ａ（Ｔｒｐ１５）、ｃ．４６ｄｅｌＴ、ｃ．３６ｄｅｌＴ、ｃ．３３Ｃ＞Ａ、ｃ．２７＿２８ｉｎｓＧ、ｃ．２５＿２６ｄｅｌＡＡ、ｃ．２０ｄｅｌＡ、ＨＢ Ｓ（ｃ．２０Ａ＞Ｔ）、ＨＢ Ｃ（ｃ．１９Ｇ＞Ａ）、ｃ．１７＿１８ｄｅｌＣＴ、ｃ．２Ｔ＞Ｃ、ｃ．２Ｔ＞Ｇ、ｃ．１Ａ＞Ｇ、ｃ．－７８Ａ＞Ｃ、ｃ．－７８Ａ＞Ｇ、ｃ．－７９Ａ＞Ｇ、ｃ．－８０Ｔ＞Ａ、ｃ．－８１Ａ＞Ｇ、ｃ．－１３６Ｃ＞Ｇ、ｃ．－１３７Ｃ＞Ａ、ｃ．－１３７Ｃ＞Ｇ、ｃ．－１３７Ｃ＞Ｔ、ｃ．－１３８Ｃ＞Ｔ、ｃ．－１３８Ｃ＞Ａ、ｃ．－１４０Ｃ＞Ｔ、又はｃ．－１５１Ｃ＞Ｔを含む。
【0094】
いくつかの実施形態では、ＨＢＡ１及びＨＢＡ２遺伝子におけるアルファサラセミア変動は、表３に列挙される１つ以上の変動を含む。いくつかの実施形態では、ＨＢＡ１及びＨＢＡ２遺伝子におけるアルファサラセミア変動は、バリアント３．７、バリアント４．２、バリアントＳＥＡ、バリアントＴＨＡＩ、バリアント２０．５、バリアントＭＥＤ、若しくはバリアントＦＩＬ、又はＨＢＡ２遺伝子ＨＢＡ２ ｃ．４２７Ｔ＞Ｃにおける単一ヌクレオチドバリアントから選択される大きな欠失を含む。
【0095】
いくつかの実施形態では、第１の複数のプライマー対は、表４から選択される少なくとも２個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも８個、若しくは少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも２５個、少なくとも３０個、少なくとも３５個、又は全てのプライマー対に対して、少なくとも８５％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９３％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、又はそれ以上の同一性を有する少なくとも２個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも８個、又は少なくとも１０個のプライマー対を含む。いくつかの実施形態では、第１の複数のプライマー対は、表４に示される全てのプライマー対を含む。
【0096】
いくつかの実施形態では、第１の複数のプライマー対は、表４の対１（配列番号１～２）、対２（配列番号３～４）、対３（配列番号５～６）、対４（配列番号７～８）、対５（配列番号９～１０）、対６（配列番号１１～１２）、対７（配列番号１３～１４）、対８（配列番号１５～１６）、対９（配列番号１７～１８）、対１０（配列番号１９～２０）、対１１（配列番号２１～２２）、対１２（配列番号２３～２４）、対１３（配列番号２５～２６）、対１４（配列番号２７～２８）、対１５（配列番号２９～３０）、対１６（配列番号３１～３２）、対１７（配列番号３３～３４）、対１８（配列番号３５～３６）、対１９（配列番号３７～３８）、対２０（配列番号３９～４０）、対２１（配列番号４１～４２）、対２２（配列番号４３～４４）、対２３（配列番号４５～４６）、対２４（配列番号４７～４８）、対２５（配列番号４９～５０）、対２６（配列番号５１～５２）、対２７（配列番号５３～５４）、対２８（配列番号５５～５６）、対２９（配列番号５７～５８）、対３０（配列番号５９～６０）、対３１（配列番号６１～６２）、対３２（配列番号６３～６４）、対３３（配列番号６５～６６）、対３４（配列番号６７～６８）、対３５（配列番号６９～７０）、対３６（配列番号７１～７２）、対３７（配列番号７３～７４）、対３７（配列番号７５～７６）、対３８（配列番号７７～７８）、及び対４０（配列番号７９～８０）からなる群から選択される少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも２５個、少なくとも３０個、又は全ての対に対して、少なくとも８５％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９３％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、又はそれ以上の同一性を有する少なくとも２個のプライマー対を含む。
【0097】
いくつかの実施形態では、第２の複数のプライマー対は、表５から選択される少なくとも２個、少なくとも４個、又は少なくとも５個のプライマー対に対して、少なくとも８５％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９３％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、又はそれ以上の同一性を有する少なくとも２個、少なくとも４個、又は少なくとも５個のプライマー対を含む。いくつかの実施形態では、第１の複数のプライマー対は、表５に示される全てのプライマー対を含む。
【0098】
いくつかの実施形態では、第２の複数のプライマー対は、配列番号７３及び７４、配列番号７５及び７６、配列番号７７及び７８、配列番号７９及び８０、配列番号８５及び８６、配列番号８７及び８８、又は配列番号８９及び９０から選択される少なくとも２個、少なくとも４個、又は少なくとも５個のプライマーのプライマー対に対して、少なくとも８５％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９３％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、又はそれ以上の同一性を有する少なくとも２個のプライマー対を含む。
【0099】
いくつかの実施形態では、第２の複数のプライマー対は、表６の対１（配列番号８１～８２）、対２（配列番号８３～８４）、対３（配列番号８５～８６）、対４（配列番号８７～８８）、及び対５（配列番号８９～９０）からなる群から選択される少なくとも２個の対に対して、少なくとも８５％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９３％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、又はそれ以上の同一性を有する少なくとも２個のプライマー対を含む。
【0100】
いくつかの実施形態では、第３の複数のプライマー対は、表６から選択される少なくとも２個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも８個、又は少なくとも１０個のプライマー対に対して、少なくとも８５％の同一性を有する少なくとも２個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも８個、又は少なくとも１０個のプライマー対を含む。いくつかの実施形態では、第１の複数のプライマー対は、表６に示される全てのプライマー対を含む。
【0101】
いくつかの実施形態では、第３の複数のプライマー対は、表６の対１（配列番号９１～９２）、対２（配列番号９３～９４）、対３（配列番号９５～９６）、対４（配列番号９７～９８）、対５（配列番号９９～１００）、対６（配列番号１０１～１０２）、対７（配列番号１０３～１０４）、及び対８（配列番号１０５～１０６）からなる群から選択される少なくとも２個の対に対して、少なくとも８５％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９３％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、又はそれ以上の同一性を有する少なくとも２個のプライマー対を含む。
【0102】
いくつかの実施形態では、次世代シーケンシングは、合成によるシーケンシング（例えば、パイロシーケンシング）を含む。いくつかの実施形態では、次世代シーケンシングは、ライゲーションによるシーケンシングを含む。
【0103】
いくつかの実施形態では、次世代シーケンシング（別名「高スループット、大規模並列シーケンシング」）は、可逆的染料ターミネーターを用いる、合成によるシーケンシングを採用する。他の実施形態では、シーケンシングは、ライゲーションによるシーケンシングを介して実施される。更に他の実施形態では、シーケンシングは、単一分子シーケンシングである。次世代シーケンシング技術の例には、パイロシーケンシング、可逆的染料ターミネーターシーケンシング、ＳＯＬｉＤシーケンシング、イオン半導体シーケンシング、及びＨｅｌｉｏｓｃｏｐｅ単一分子シーケンシングが含まれるが、これらに限定されない。
【0104】
いくつかの実施形態では、本技術で特徴とされる方法は、多重、多遺伝子アッセイフォーマット、例えば、多数の遺伝子における多数の多様な遺伝子変化からの複数のシグナルを組み込むアッセイにおいて使用される。
【0105】
いくつかの実施形態では、対象は、アシュケナージ系ユダヤ人の子孫の者であるか、又はベータサラセミア若しくはアルファサラセミアの家族歴を有する。
【0106】
いくつかの実施形態では、生体試料は、全血、血清、血漿、羊水、又は絨毛膜絨毛から選択される。
【0107】
いくつかの実施形態では、遺伝的障害は、常染色体障害又はＸ連鎖劣性障害である。
【0108】
単一アッセイにおける遺伝性変異（例えば、アシュケナージ系ユダヤ人パネル変動、ベータサラセミア変動、又はアルファサラセミア変動）を検出するための方法
上記のような生体試料及び次世代シーケンシングを調製する際に、本開示は、生体試料から増幅された標的核酸配列中に存在する遺伝性変異（例えば、アシュケナージ系ユダヤ人パネル変動、ベータサラセミア変動、又はアルファサラセミア変動）の存在を検出するための方法を更に提供する。
上記のような生体試料及び次世代シーケンシングを調製する際に、本開示は、生体試料から増幅された標的核酸配列中に存在する遺伝性変異（例えば、アシュケナージ系ユダヤ人パネル変動、ベータサラセミア変動、又はアルファサラセミア変動）の存在を検出するための方法を更に提供する。
【0109】
いくつかの実施形態では、本方法は、対象が、次世代シーケンシング結果に基づいて、アシュケナージ系ユダヤ人パネル変動、ベータサラセミア変動、又はアルファサラセミア変動のうちの少なくとも１つについてのキャリアであるかどうかを決定することを更に含む。いくつかの実施形態では、決定することは、シーケンシングリードを逆多重化することと、シーケンシングリードをカスタムヒト参照ゲノムにマッピングすることであって、参照コンソーシアムヒトゲノムビルド３７（ＧＲＣｈ３７）ｃｈｒ１：１５５１８４０３１－１５５１８５３２７、ｃｈｒ１：１５５１８８０３１－１５５１８８９６４、ｃｈｒ１６：２２３７０５－２２４２４０、及びｃｈｒ１６：２２７２５７－２２７４１３内の疑似遺伝子配列が、ヌクレオチドＴで置き換えられている、マッピングすることと、３０を超えるリードマッピングを必要とするＰｈｒｅｄ Ｑｕａｌｉｔｙスコアを使用して、マッピングされたリードをフィルタリングすることと、フィルタリングされたリード内のバリアントを検出することと、対象が、アシュケナージ系ユダヤ人パネル変動、ベータサラセミア変動、又はアルファサラセミア変動についてのキャリアであるかどうかを決定することと、によって達成される。
【0110】
いくつかの実施形態では、対象は、テイ－サックス病、ニーマンピック病、ＩＶ型ムコリピドーシス、ゴーシェ病、ファンコーニ貧血、家族性自律神経障害、カナバン病、ブルーム症候群、メープル血清尿症、グリコーゲン貯蔵疾患Ｉ、家族性高インスリン症、ジヒドロリポアミドデヒドロゲナーゼ欠損症（ＤＬＤ）、リポアミドデヒドロゲナーゼ欠損症（Ｅ３）、ネマリンミオパシー、アッシャー症候群ＩＦ型、アッシャー症候群、ＩＩＩＡ型、ジュベール症候群２、ウォーカー－ワールブルク症候群、ベータサラセミア、又はアルファサラセミアから選択される少なくとも１つの疾患についてのキャリアであることが疑われる。
【0111】
キット
本開示はまた、対象からの生体試料中のアシュケナージ系ユダヤ人パネル変動、ベータサラセミア変動、又はアルファサラセミア変動の存在を検出するためのキットを提供する。
本開示はまた、対象からの生体試料中のアシュケナージ系ユダヤ人パネル変動、ベータサラセミア変動、又はアルファサラセミア変動の存在を検出するためのキットを提供する。
【0112】
本技術のキットは、少なくとも、（ｉ）複数の遺伝子の各々の増幅領域に指向された第１の複数のプライマー対であって、当該複数の遺伝子が、ヘキソサミニダーゼサブユニットアルファ（ＨＥＸＡ）、スフィンゴミエリンホスホジエステラーゼ１（ＳＭＰＤ１）、ムコリピンＴＲＰカチオンチャネル１（ＭＣＯＬＮ１）、グルコシルセラミダーゼベータ（ＧＢＡ）、ＦＡ相補群Ｃ（ＦＡＮＣＣ）、Ｂ細胞におけるカッパ軽ポリペプチド遺伝子エンハンサーの阻害剤、キナーゼ複合体関連タンパク質（ＩＫＢＫＡＰ）、アスパルトアシラーゼ（ＡＳＰＡ）、ブルーム症候群ＲｅｃＱ様ヘリカーゼ（ＢＬＭ）、分岐鎖ケト酸デヒドロゲナーゼＥ１サブユニットベータ（ＢＣＫＤＨＢ）、グルコース－６－ホスファターゼ触媒サブユニット（Ｇ６ＰＣ）、ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＣメンバー８（ＡＢＣＣ８）、ジヒドロリポアミドデヒドロゲナーゼ（ＤＬＤ）、ネブリン（ＮＥＢ）、プロトカドヘリン関連１５（ＰＣＤＨ１５）、クラリン１（ＣＬＲＮ１）、膜貫通タンパク質２１６（ＴＭＥＭ２１６）、及びフクチン（ＦＫＴＮ）を含む、第１の複数のプライマー対と、（ｉｉ）グルコシルセラミダーゼベータ（ＧＢＡ）及びヘモグロビンサブユニットベータ（ＨＢＢ）遺伝子の増幅領域に指向された第２の複数のプライマー対であって、配列番号８１及び８２、並びに配列番号８３及び８４を含む、第２の複数のプライマー対と、（ｉｉｉ）ヘモグロビンサブユニットアルファ１（ＨＢＡ１）及びヘモグロビンサブユニットアルファ１（ＨＢＡ２）遺伝子の各々におけるアルファサラセミア遺伝子の変動の増幅領域に指向された第３の複数のプライマー対と、使用説明書と、を含む。
【0113】
いくつかの実施形態では、第１の複数のプライマー対は、欠失が存在する場合にのみ、標的領域を増幅するように設計された少なくとも１つのギャッププライマー対を含む。
【0114】
いくつかの実施形態では、第２の複数のプライマー対のＧＢＡプライマーは、ＧＢＡ遺伝子を特異的に増幅し、任意のＧＢＡ疑似遺伝子を増幅しない。
【0115】
いくつかの実施形態では、第３の複数のプライマー対は、欠失が存在する場合にのみ、標的領域を増幅するように設計された少なくとも１つのギャッププライマー対を含む。
【0116】
いくつかの実施形態では、ＨＥＸＡ遺伝子の変動は、テイ－サックス病を引き起こし、ＳＭＰＤ１遺伝子の変動は、ニーマンピック病を引き起こし、ＭＣＯＬＮ１遺伝子の変動は、ＩＶ型ムコリピドーシスを引き起こし、ＧＢＡ遺伝子の変動は、ゴーシェ病を引き起こし、ＰＡＮＣＣ遺伝子の変動は、ファンコーニ貧血を引き起こし、ＩＫＢＫＡＰ遺伝子の変動は、家族性自律神経障害を引き起こし、ＡＳＰＡ遺伝子の変動は、カナバン病を引き起こし、ＢＬＭ遺伝子の変動は、ブルーム症候群を引き起こし、ＢＣＫＤＨＢ遺伝子の変動は、メープル血清尿症を引き起こし、Ｇ６ＰＣ遺伝子の変動は、グリコーゲン貯蔵疾患Ｉを引き起こし、ＡＢＣＣ８遺伝子の変動は、家族性高インスリン症を引き起こし、ＤＬＤ遺伝子の変動は、ジヒドロリポアミドデヒドロゲナーゼ欠損症（ＤＬＤ）又はリポアミドデヒドロゲナーゼ欠損症（Ｅ３）を引き起こし、ＮＥＢ遺伝子の変動は、ネマリンミオパシーを引き起こし、ＰＣＤＨ１５遺伝子の変動は、アッシャー症候群、ＩＦ型を引き起こし、ＣＬＲＮ１遺伝子の変動は、アッシャー症候群、ＩＩＩＡ型を引き起こし、ＴＭＥＭ２１６遺伝子の変動は、ジュベール症候群２を引き起こし、ＦＫＴＮ遺伝子の変動は、ウォーカー－ワールブルク症候群を引き起こす。
【0117】
いくつかの実施形態では、アシュケナージ系ユダヤ人パネル遺伝子の変動は、表１に列挙される１つ以上の遺伝子の変動を含む。いくつかの実施形態では、ＨＥＸＡ遺伝子の変動は、Ｒ１７８Ｈ（Ｂ１バリアント）、Ｒ２４７Ｗ、Ｒ２４９Ｗ、Ｇ２６９Ｓ、ＩＶＳ９＋１Ｇ＞Ａ、１２７８＿ＴＡＴＣ、ＩＶＳ１２＋１Ｇ＞Ｃ、又は７．６－ｋｂ Ｄｅｌ、Ｅｘ１のうちの１つ以上を含み、ＳＭＰＤ１遺伝子の変動は、Ｌ３０２Ｐ、ｆｓＰ３３０、Ｒ４９６Ｌ（Ｒ４９８Ｌ）、又はｄｅｌｔａＲ６０８のうちの１つ以上を含み、ＭＣＯＬＮ１遺伝子の変動は、ＩＶＳ３－２Ａ＞Ｇ又は６．４ｋｂ＿ｄｅｌのうちの１つ以上を含み、ＧＢＡ遺伝子の変動は、ＩＶＳ２＋１Ｇ＞Ａ、８４Ｇ＞ＧＧ、Ｎ３７０Ｓ、ｄｅｌ＿５５ｂｐ、Ｖ３９４Ｌ、Ｄ４０９Ｈ、Ｌ４４４Ｐ、又はＲ４９６Ｈのうちの１つ以上を含み、ＰＡＮＣＣ遺伝子の変動は、ＩＶＳ４＋４Ａ＞Ｔ又は３２２ｄｅｌＧのうちの１つ以上を含み、ＩＫＢＫＡＰ遺伝子の変動は、Ｒ６９６Ｐ又はＩＶＳ２０＋６Ｔ＞Ｃのうちの１つ以上を含み、ＡＳＰＡ遺伝子の変動は、ＩＶＳ２－２Ａ＞Ｇ、Ｙ２３１Ｘ、Ｅ２８５Ａ、又はＡ３０５Ｅのうちの１つ以上を含み、ＢＬＭ遺伝子の変動は、２２８１ｄｅｌ６／ｉｎｓ７のうちの１つ以上を含み、ＢＣＫＤＨＢ遺伝子の変動は、Ｒ１８３Ｐ、Ｇ２７８Ｓ、又はＥ３７２Ｘのうちの１つ以上を含み、Ｇ６ＰＣ遺伝子の変動は、Ｒ８３Ｃ又はＱ３４７Ｘのうちの１つ以上を含み、ＡＢＣＣ８遺伝子の変動は、ＩＶＳ３２－９Ｇ＞Ａ又はＦ１３８７ｄｅｌを含み、ＤＬＤ遺伝子の変動は、Ｙ３５＊又はＧ２２９Ｃのうちの１つ以上を含み、ＮＥＢ遺伝子の変動は、Ｒ２４７８＿Ｄ２５１２ｄｅｌ３５を含み、ＰＣＤＨ１５遺伝子の変動は、Ｒ２４５のうちの１つ以上を含み、ＣＬＲＮ１遺伝子の変動は、Ｎ４８Ｋを含み、ＴＭＥＭ２１６遺伝子の変動は、Ｒ７３Ｌを含み、ＦＫＴＮ遺伝子の変動は、Ｆ３９０ｆｓを含む。
【0118】
いくつかの実施形態では、ＨＢＢ遺伝子におけるベータサラセミア遺伝子の変動は、表２に列挙される１つ以上の遺伝子の変動を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子の変動は、ｃ．＊１１１Ａ＞Ｇ、ｃ．＊１１０Ｔ＞Ｃ、ｃ．＊９６Ｔ＞Ｃ、Ｈｂ Ｄ－Ｌｏｓ Ａｎｇｅｌｅｓ（ｃ．３６４Ｇ＞Ｃ）、Ｈｂ Ｏ－Ａｒａｂ（ｃ．３６４Ｇ＞Ａ）、ｃ．３２１＿３２２ｉｎｓＧ、ｃ．３１６－２Ａ＞Ｃ、ｃ．３１６－２Ａ＞Ｇ、ｃ．３１６－３Ｃ＞Ａ、ｃ．３１６－１０６Ｃ＞Ｇ、ｃ．３１６－１２５Ａ＞Ｇ、ｃ．３１６－１４６Ｔ＞Ｇ、ｃ．３１６－１９７Ｃ＞Ｔ、ｃ．３１５＋１Ｇ＞Ａ、ｃ．２８７＿２８８ｉｎｓＡ、ｃ．２５１ｄｅｌＧ、ｃ．２３０ｄｅｌＣ、ｃ．２１６＿２１７ｉｎｓＡ、ｃ．２０３＿２０４ｄｅｌＴＧ、ｃ．１４３＿１４４ｉｎｓＡ、ｃ．１４６＿１４７ｉｎｓＡＴＣＴ、ｃ．１３５ｄｅｌＣ、ｃ．１３０Ｇ＞Ｔ、ｃ．１２６＿１２９ｄｅｌＣＴＴＴ、ｃ．１２４＿１２７ｄｅｌＴＴＣＴ、ｃ．１１８Ｃ＞Ｔ、ｃ．１１４Ｇ＞Ａ、ｃ．１１２ｄｅｌＴ、ｃ．９３－１Ｇ＞Ｃ、ｃ．９３－１Ｇ＞Ａ、ｃ．９３－２１Ｇ＞Ａ、ｃ．９２＋６Ｔ＞Ｃ、ｃ．９２＋５Ｇ＞Ａ、ｃ．９２＋５Ｇ＞Ｃ、ｃ．９２＋５Ｇ＞Ｔ、ｃ．９２＋２Ｔ＞Ａ、ｃ．９２＋２Ｔ＞Ｃ、ｃ．９２＋１Ｇ＞Ａ、ｃ．９２＋１Ｇ＞Ｔ、Ｈｂ Ｍｏｎｒｏｅ（ｃ．９２Ｇ＞Ｃ）、ｃ．９２Ｇ＞Ａ、ｃ．８４＿８５ｉｎｓＣ、ｃ．７９Ｇ＞Ｔ、ＨＢ Ｅ（ｃ．７９Ｇ＞Ａ）、ｃ．７５Ｔ＞Ａ、ｃ．５９Ａ＞Ｇ、ｃ．５２Ａ＞Ｔ（ＬＹＳ１７＊）、ｃ．５１ｄｅｌＣ、ｃ．４８Ｇ＞Ａ、ｃ．４７Ｇ＞Ａ（Ｔｒｐ１５）、ｃ．４６ｄｅｌＴ、ｃ．３６ｄｅｌＴ、ｃ．３３Ｃ＞Ａ、ｃ．２７＿２８ｉｎｓＧ、ｃ．２５＿２６ｄｅｌＡＡ、ｃ．２０ｄｅｌＡ、ＨＢ Ｓ（ｃ．２０Ａ＞Ｔ）、ＨＢ Ｃ（ｃ．１９Ｇ＞Ａ）、ｃ．１７＿１８ｄｅｌＣＴ、ｃ．２Ｔ＞Ｃ、ｃ．２Ｔ＞Ｇ、ｃ．１Ａ＞Ｇ、ｃ．－７８Ａ＞Ｃ、ｃ．－７８Ａ＞Ｇ、ｃ．－７９Ａ＞Ｇ、ｃ．－８０Ｔ＞Ａ、ｃ．－８１Ａ＞Ｇ、ｃ．－１３６Ｃ＞Ｇ、ｃ．－１３７Ｃ＞Ａ、ｃ．－１３７Ｃ＞Ｇ、ｃ．－１３７Ｃ＞Ｔ、ｃ．－１３８Ｃ＞Ｔ、ｃ．－１３８Ｃ＞Ａ、ｃ．－１４０Ｃ＞Ｔ、又はｃ．－１５１Ｃ＞Ｔを含む。
【0119】
いくつかの実施形態では、ＨＢＡ１及びＨＢＡ２遺伝子におけるアルファサラセミア変動は、表３に列挙される１つ以上の遺伝子の変動を含む。いくつかの実施形態では、ＨＢＡ１及びＨＢＡ２遺伝子におけるアルファサラセミア変動は、バリアント３．７、バリアント４．２、バリアントＳＥＡ、バリアントＴＨＡＩ、バリアント２０．５、バリアントＭＥＤ、若しくはバリアントＦＩＬ、又はＨＢＡ２遺伝子ＨＢＡ２ ｃ．４２７Ｔ＞Ｃにおける単一ヌクレオチドバリアントから選択される大きな欠失を含む。
【0120】
いくつかの実施形態では、第１の複数のプライマー対は、表４から選択される少なくとも２個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも８個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも２５個、少なくとも３０個、少なくとも３５個、又は全てのプライマー対に対して、少なくとも８５％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９３％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、又はそれ以上の同一性を有する少なくとも２個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも８個、又は少なくとも１０個のプライマー対を含む。いくつかの実施形態では、第１の複数のプライマー対は、表４に示される全てのプライマー対を含む。
【0121】
いくつかの実施形態では、第１の複数のプライマー対は、表４の対１（配列番号１～２）、対２（配列番号３～４）、対３（配列番号５～６）、対４（配列番号７～８）、対５（配列番号９～１０）、対６（配列番号１１～１２）、対７（配列番号１３～１４）、対８（配列番号１５～１６）、対９（配列番号１７～１８）、対１０（配列番号１９～２０）、対１１（配列番号２１～２２）、対１２（配列番号２３～２４）、対１３（配列番号２５～２６）、対１４（配列番号２７～２８）、対１５（配列番号２９～３０）、対１６（配列番号３１～３２）、対１７（配列番号３３～３４）、対１８（配列番号３５～３６）、対１９（配列番号３７～３８）、対２０（配列番号３９～４０）、対２１（配列番号４１～４２）、対２２（配列番号４３～４４）、対２３（配列番号４５～４６）、対２４（配列番号４７～４８）、対２５（配列番号４９～５０）、対２６（配列番号５１～５２）、対２７（配列番号５３～５４）、対２８（配列番号５５～５６）、対２９（配列番号５７～５８）、対３０（配列番号５９～６０）、対３１（配列番号６１～６２）、対３２（配列番号６３～６４）、対３３（配列番号６５～６６）、対３４（配列番号６７～６８）、対３５（配列番号６９～７０）、対３６（配列番号７１～７２）、対３７（配列番号７３～７４）、対３７（配列番号７５～７６）、対３８（配列番号７７～７８）、及び対４０（配列番号７９～８０）からなる群から選択される少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも２５個、少なくとも３０個、又は全ての対に対して、少なくとも８５％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９３％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、又はそれ以上の同一性を有する少なくとも２個のプライマー対を含む。
【0122】
いくつかの実施形態では、第２の複数のプライマー対は、表５から選択される少なくとも２個、少なくとも４個、又は少なくとも５個のプライマー対に対して、少なくとも８５％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９３％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、又はそれ以上の同一性を有する少なくとも２個、少なくとも４個、又は少なくとも５個のプライマー対を含む。いくつかの実施形態では、第１の複数のプライマー対は、表５に示される全てのプライマー対を含む。
【0123】
いくつかの実施形態では、第２の複数のプライマー対は、配列番号７３及び７４、配列番号７５及び７６、配列番号７７及び７８、配列番号７９及び８０、配列番号８５及び８６、配列番号８７及び８８、又は配列番号８９及び９０から選択される少なくとも２個、少なくとも４個、又は少なくとも５個のプライマーのプライマー対に対して、少なくとも８５％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９３％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、又はそれ以上の同一性を有する少なくとも２個のプライマー対を含む。
【0124】
いくつかの実施形態では、第２の複数のプライマー対は、表６の対１（配列番号８１～８２）、対２（配列番号８３～８４）、対３（配列番号８５～８６）、対４（配列番号８７～８８）、及び対５（配列番号８９～９０）からなる群から選択される少なくとも２個の対に対して、少なくとも８５％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９３％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、又はそれ以上の同一性を有する少なくとも２個のプライマー対を含む。
【0125】
いくつかの実施形態では、第３の複数のプライマー対は、表６から選択される少なくとも２個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも８個、又は少なくとも１０個のプライマー対に対して、少なくとも８５％の同一性を有する少なくとも２個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも８個、又は少なくとも１０個のプライマー対を含む。いくつかの実施形態では、第１の複数のプライマー対は、表６に示される全てのプライマー対を含む。
【0126】
いくつかの実施形態では、第３の複数のプライマー対は、表６の対１（配列番号９１～９２）、対２（配列番号９３～９４）、対３（配列番号９５～９６）、対４（配列番号９７～９８）、対５（配列番号９９～１００）、対６（配列番号１０１～１０２）、対７（配列番号１０３～１０４）、及び対８（配列番号１０５～１０６）からなる群から選択される少なくとも２個の対に対して、少なくとも８５％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９３％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、又はそれ以上の同一性を有する少なくとも２個のプライマー対を含む。
【0127】
いくつかの実施形態では、本開示のキットは、本明細書に開示される遺伝性遺伝的変異の特定のセットに対応する標的核酸配列における増幅及び／又は変化の検出等のアッセイ又は反応を実施するのに必要な、緩衝液、ポリメラーゼ活性を有する酵素、ポリメラーゼ活性を有し、５’→３’エクソヌクレアーゼ活性又は５’→３’及び３’―≫５’エクソヌクレアーゼ活性の両方を欠く酵素、酵素補因子、例えば、マグネシウム又はマンガン、塩、鎖伸長ヌクレオチド、例えば、デオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）、修飾ｄＮＴＰ、ヌクレアーゼ耐性ｄＮＴＰ、又は標識ｄＮＴＰを更に含む。
【0128】
いくつかの実施形態では、本開示のキットは、実験実行中にアッセイの完全性を確保するために、陽性対照核酸配列及び陰性対照核酸配列を更に含む。キットはまた、使用説明書、自動分析のためのソフトウェア、コンテナ、パッケージ、例えば、商業販売等を意図したパッケージングを含み得る。
【0129】
本技術のキットはまた、本明細書に開示されるＮＧＳ技術のいずれかを実施するために他の必要な試薬を含むことができる。例えば、キットは、アダプタ配列、バーコード配列、反応チューブ、リガーゼ、リガーゼ緩衝液、洗浄緩衝液及び／又は試薬、ハイブリダイゼーション緩衝液及び／又は試薬、標識化緩衝液及び／又は試薬、並びに検出手段のうちの１つ以上を更に含み得る。緩衝液及び／又は試薬は、通常、キットが意図される特定の増幅／検出技術のために最適化される。手順の異なるステップを実施するためのこれらの緩衝液及び試薬を使用するためのプロトコルもまた、キットに含まれ得る。
【0130】
いくつかの実施形態では、本開示のキットは、表７の対１～４又は表８の対１～９から選択される複数のバーコード化プライマーを更に含む。
【0131】
キットは、洗浄緩衝液及び／又は試薬、ハイブリダイゼーション緩衝液及び／又は試薬、標識化緩衝液及び／又は試薬、並びに検出手段のうちの１つ以上を更に含み得る。緩衝液及び／又は試薬は、通常、キットが意図される特定の増幅／検出技術のために最適化される。手順の異なるステップを実施するためのこれらの緩衝液及び試薬を使用するためのプロトコルもまた、キットに含まれ得る。
【0132】
キットは、追加的に、アッセイにおいてオリゴヌクレオチドを使用するためのアッセイ定義スキャンカード及び／又は印刷された若しくは電子的な説明書等の説明書を含み得る。いくつかの実施形態では、キットは、増幅反応混合物又は増幅マスターミックスを含む。キットに含まれる試薬は、バイアル等の１つ以上のコンテナに含まれ得る。
【0133】
ＤＮＡ内部対照の増幅及び検出に特異的なプライマー、プローブ、及び／又はプライマープローブは、潜在的なＰＣＲ阻害を監視するための標的プライマー対として増幅マスターミックスに含まれ得る。標的及び内部対照の増幅及び検出に必要な試薬は、オールインワン増幅マスターミックスとして製剤化され得、これは、キット内の単一反応アリコートとして提供され得る。
【実施例】
【0134】
実施例１：シーケンシングライブラリの調製及び生のシーケンシングデータの生成
標的領域を増幅するために、各検体に対して３つの多重遺伝子特異的ＰＣＲ反応（ＧＳＰ）を設定した（図１）。各多重ＰＣＲ反応は、このアッセイで検出される変動を含有するゲノムＤＮＡの様々な領域を増幅する、プライマー対のプール（表４～６を参照されたい）からなる（目的の遺伝子の変動については表１～３を参照されたい）。合計で、ＧＳＰ反応から５５個のアンプリコンが生成された。ＰＣＲ後、各患者についてのＧＳＰ産物を水で２５００倍に希釈した。希釈した産物を、バーコード配列（ＢＣ）、並びにＩｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑ上でのシーケンシングに必要なＰ５及びＰ７アダプタ（表７）を添加するプライマーで増幅した。バーコード化試料をプールし、Ａｍｐｕｒｅ ＸＰビーズで精製し、定量した。最終産物を単一のライブラリにプールし、ＭｉＳｅｑ上でのシーケンシングに供した。シーケンシングデータを、自社開発のパイプラインによって分析した。
標的領域を増幅するために、各検体に対して３つの多重遺伝子特異的ＰＣＲ反応（ＧＳＰ）を設定した（図１）。各多重ＰＣＲ反応は、このアッセイで検出される変動を含有するゲノムＤＮＡの様々な領域を増幅する、プライマー対のプール（表４～６を参照されたい）からなる（目的の遺伝子の変動については表１～３を参照されたい）。合計で、ＧＳＰ反応から５５個のアンプリコンが生成された。ＰＣＲ後、各患者についてのＧＳＰ産物を水で２５００倍に希釈した。希釈した産物を、バーコード配列（ＢＣ）、並びにＩｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑ上でのシーケンシングに必要なＰ５及びＰ７アダプタ（表７）を添加するプライマーで増幅した。バーコード化試料をプールし、Ａｍｐｕｒｅ ＸＰビーズで精製し、定量した。最終産物を単一のライブラリにプールし、ＭｉＳｅｑ上でのシーケンシングに供した。シーケンシングデータを、自社開発のパイプラインによって分析した。
【0135】
遺伝子特異的ＰＣＲ（ＧＳＰ）
標的領域を増幅するために、各検体に対して３つの多重遺伝子特異的ＰＣＲ反応（ＧＳＰ－Ａ、－Ｂ、及び－Ｃ）を設定した。反応ＧＳＰ－Ａは、１７個の遺伝子の標的領域を増幅するために、３個のギャップＰＣＲプライマー対を含む４１個のプライマー対を含有する。ギャップＰＣＲプライマー対は、欠失が存在する場合にのみ産物を産生するように設計した。遺伝子特異的プライマー対は、Ｉｌｌｕｍｉｎａシーケンシングプライマー結合部位、フォワードリード用のＲ１ＳＰ、並びにリバース及びバーコードリード用のＲ２ＳＰを含有するように設計した。
標的領域を増幅するために、各検体に対して３つの多重遺伝子特異的ＰＣＲ反応（ＧＳＰ－Ａ、－Ｂ、及び－Ｃ）を設定した。反応ＧＳＰ－Ａは、１７個の遺伝子の標的領域を増幅するために、３個のギャップＰＣＲプライマー対を含む４１個のプライマー対を含有する。ギャップＰＣＲプライマー対は、欠失が存在する場合にのみ産物を産生するように設計した。遺伝子特異的プライマー対は、Ｉｌｌｕｍｉｎａシーケンシングプライマー結合部位、フォワードリード用のＲ１ＳＰ、並びにリバース及びバーコードリード用のＲ２ＳＰを含有するように設計した。
【0136】
反応ＧＳＰ－Ｂは、ＧＢＡ遺伝子のための２個のプライマー対及びＨＢＢ遺伝子のための３個のプライマー対を含有する。ＧＢＡプライマーは、ＧＢＡ疑似遺伝子の共増幅を防止しながら、ＧＢＡ遺伝子標的領域を特異的に増幅するように設計した。反応ＧＳＰ－Ｃは、８つのアルファサラセミア共通変動及び１つの増幅対照の検出のための１６個のプライマーを含有する。ギャップＰＣＲは、７つのアルファサラセミア共通変動に対して用いられたため、産物は、欠失が存在する場合にのみ存在する。合計で、ＧＳＰ反応から５５個のアンプリコンが生成された。
【0137】
バーコード化ＰＣＲ（ＢＣＰ）
全ての検体を同時に単一のライブラリに組み合わせることを容易にするために、各個々の検体には、９６個の独自のバーコード配列のうちの１つが添加された。遺伝子特異的ＰＣＲの後、各患者についての３つのＧＳＰ反応を水で２５００倍に希釈し、３つのバーコード化ＰＣＲ反応（ＢＣＰ－Ａ、－Ｂ、及び－Ｃ）に供した。バーコード化ＰＣＲの間に、Ｒ１ＳＰ及びＲ２ＳＰ配列をプライミング部位として使用して、バーコード配列、並びにＩｌｌｕｍｉｎａ Ｍｉｓｅｑシーケンサ上でのシーケンシングに必要であるＰ５及びＰ７アダプタを添加した。
全ての検体を同時に単一のライブラリに組み合わせることを容易にするために、各個々の検体には、９６個の独自のバーコード配列のうちの１つが添加された。遺伝子特異的ＰＣＲの後、各患者についての３つのＧＳＰ反応を水で２５００倍に希釈し、３つのバーコード化ＰＣＲ反応（ＢＣＰ－Ａ、－Ｂ、及び－Ｃ）に供した。バーコード化ＰＣＲの間に、Ｒ１ＳＰ及びＲ２ＳＰ配列をプライミング部位として使用して、バーコード配列、並びにＩｌｌｕｍｉｎａ Ｍｉｓｅｑシーケンサ上でのシーケンシングに必要であるＰ５及びＰ７アダプタを添加した。
【0138】
バーコード化ＰＣＲ反応Ｂ（ＧＳＰ－Ｂ－表５を参照されたい）は、５個のプライマー対を含有し、反応Ｃ（ＧＳＰ－Ｃ－表６）は、Ｒ１ＳＰ及びＲ２ＳＰ融合ネステッドプライマーのうちの１６個のプライマーを含有して、それぞれ、４つのＧＢＡ特異的ネステッドＰＣＲ産物及び８つのアルファサラセミアネステッドＰＣＲ産物を生成する。
【0139】
合計で、ＢＣＰ反応から５７個のアンプリコンが生成された。
【0140】
検体プール及びＡｍｐｕｒｅクリーンアップ
バーコード化試料を３つの別々のチューブにプールして、プールＡ、プールＢ、及びプールＣを作製し、Ａｍｐｕｒｅ ＸＰビーズで精製し、続いてＱｕｂｉｔ定量した。最終産物を、単一のライブラリに組み合わせ、ＭｉＳｅｑ上でのシーケンシングに供した。
バーコード化試料を３つの別々のチューブにプールして、プールＡ、プールＢ、及びプールＣを作製し、Ａｍｐｕｒｅ ＸＰビーズで精製し、続いてＱｕｂｉｔ定量した。最終産物を、単一のライブラリに組み合わせ、ＭｉＳｅｑ上でのシーケンシングに供した。
【0141】
シーケンシング
組み合わせたライブラリを、０．２ＮのＮａＯＨでシーケンシングする前に変性させた。Ｉｌｌｕｍｉｎａシーケンシング化学は、合成によるシーケンシングに基づく。一本鎖ライブラリをＭｉｓｅｑシーケンシングカートリッジにロードした。要約すると、ＭｉＳｅｑワークフローは以下のとおりである：機器は、フローセルを通してライブラリをフラッシュすることによって開始し、そこでは、ライブラリ上のアダプタに相補的であるアンチセンスＰ５及びＰ７オリゴヌクレオチドにハイブリダイゼーションする。増幅が単一のＤＮＡ分子から同一の産物の十分に分離されたクラスターを生成するように、ライブラリを希釈する（クローン増幅）。これは、等温ブリッジ増幅によって達成される。クラスター生成後、クラスターを一本鎖にし、合成によるシーケンシングを開始する。蛍光体標識ヌクレオチド三リン酸をフローセルに適用する。ヌクレオチドは、単一ヌクレオチドのみが各ラウンドの合成に組み込まれるように、３’ブロックされる。次いで、蛍光体をレーザによって励起し、発光スペクトルをＭｉｓｅｑによって記録する。更なる合成を阻害していたヌクレオチドブロッカーは、次のヌクレオチド三リン酸の添加を可能にするように切断される。このようにして、断片がシーケンシングされる。
組み合わせたライブラリを、０．２ＮのＮａＯＨでシーケンシングする前に変性させた。Ｉｌｌｕｍｉｎａシーケンシング化学は、合成によるシーケンシングに基づく。一本鎖ライブラリをＭｉｓｅｑシーケンシングカートリッジにロードした。要約すると、ＭｉＳｅｑワークフローは以下のとおりである：機器は、フローセルを通してライブラリをフラッシュすることによって開始し、そこでは、ライブラリ上のアダプタに相補的であるアンチセンスＰ５及びＰ７オリゴヌクレオチドにハイブリダイゼーションする。増幅が単一のＤＮＡ分子から同一の産物の十分に分離されたクラスターを生成するように、ライブラリを希釈する（クローン増幅）。これは、等温ブリッジ増幅によって達成される。クラスター生成後、クラスターを一本鎖にし、合成によるシーケンシングを開始する。蛍光体標識ヌクレオチド三リン酸をフローセルに適用する。ヌクレオチドは、単一ヌクレオチドのみが各ラウンドの合成に組み込まれるように、３’ブロックされる。次いで、蛍光体をレーザによって励起し、発光スペクトルをＭｉｓｅｑによって記録する。更なる合成を阻害していたヌクレオチドブロッカーは、次のヌクレオチド三リン酸の添加を可能にするように切断される。このようにして、断片がシーケンシングされる。
【0142】
実施例２：シーケンシングデータ分析
アラインメント、フィルタリング、及びバリアント呼び出し
データ分析パイプラインワークフローを図２に示す。ＭｉＳｅｑ分析ソフトウェアを使用して、多重化されていないＦＡＳＴＱファイルを生成した。次いで、ＦＡＳＴＱファイル中の生の配列リードを、Ｂｕｒｒｏｗｓ－Ｗｈｅｅｌｅｒ Ａｌｉｇｎｅｒ（ＢＷＡ）を使用してカスタム参照ゲノムにアラインメントした。カスタム参照ゲノムは、ｃｈｒ１：１５５１８４０３１－１５５１８５３２７、ｃｈｒ１：１５５１８８０３１－１５５１８８９６４、ｃｈｒ１６：２２３７０５－２２４２４０、及びｃｈｒ１６：２２７２５７－２２７４１３内の高度に相同の疑似遺伝子配列が、ＧＢＡの正確なアラインメント及びアルファサラセミア４．２欠失バリアントの検出のために、ヌクレオチドＴで置き換えられているという点で、ゲノム参照コンソーシアムヒトゲノムビルド３７（ＧＲＣｈ３７）とは異なる。次いで、リードをソートし、ＳＡＭｔｏｏｌｓを使用してインデックスを作成し、続いてＰｉｃａｒｄ Ｔｏｏｌｓを使用してリードグループを配置した。ゲノム分析ツールキット（ＧＡＴＫ）を使用して、標的内で局所再アラインメント及びベース品質スコア再較正を実施した。マッピングされたリードを、下流分析の前に、３０を超えるリードマッピングを必要とするＰｈｒｅｄ Ｑｕａｌｉｔｙスコア（９９．９％超の精度）を使用して更にフィルタリングした。ＲＯＩ（関心領域）毎についての適用範囲の平均及び最小深度を計算し、ＧＡＴＫ Ｕｎｉｆｉｅｄ及びＨａｐｌｏｉｄ Ｇｅｎｏｔｙｐｅｒ呼び出し元を使用してバリアント呼び出しを実施した。単一のバリアントファイル（＊．ｖｃｆ）は、両方のバリアント呼び出し元からのバリアントファイルをマージすることによって作成した。適用範囲及びバリアント深度レポートを作成し、シーケンシングデータベース（ｓｅｑＤＢ）にロードした。Ａｌａｍｕｔバッチは、検出されたバリアントについての高レベル注釈を取得するために使用した。バリアント検出のための品質管理規則には、以下が含まれた。１）標的位置（複数可）で最低４０リードを達成しなければならず、２）バリアントは２０％以上の頻度で検出される。３）大きな欠失の検出は、最低１００リードによるギャップＰＣＲアンプリコンの存在に基づいており、呼び出される特定のバリアントに基づいていなかった。
アラインメント、フィルタリング、及びバリアント呼び出し
データ分析パイプラインワークフローを図２に示す。ＭｉＳｅｑ分析ソフトウェアを使用して、多重化されていないＦＡＳＴＱファイルを生成した。次いで、ＦＡＳＴＱファイル中の生の配列リードを、Ｂｕｒｒｏｗｓ－Ｗｈｅｅｌｅｒ Ａｌｉｇｎｅｒ（ＢＷＡ）を使用してカスタム参照ゲノムにアラインメントした。カスタム参照ゲノムは、ｃｈｒ１：１５５１８４０３１－１５５１８５３２７、ｃｈｒ１：１５５１８８０３１－１５５１８８９６４、ｃｈｒ１６：２２３７０５－２２４２４０、及びｃｈｒ１６：２２７２５７－２２７４１３内の高度に相同の疑似遺伝子配列が、ＧＢＡの正確なアラインメント及びアルファサラセミア４．２欠失バリアントの検出のために、ヌクレオチドＴで置き換えられているという点で、ゲノム参照コンソーシアムヒトゲノムビルド３７（ＧＲＣｈ３７）とは異なる。次いで、リードをソートし、ＳＡＭｔｏｏｌｓを使用してインデックスを作成し、続いてＰｉｃａｒｄ Ｔｏｏｌｓを使用してリードグループを配置した。ゲノム分析ツールキット（ＧＡＴＫ）を使用して、標的内で局所再アラインメント及びベース品質スコア再較正を実施した。マッピングされたリードを、下流分析の前に、３０を超えるリードマッピングを必要とするＰｈｒｅｄ Ｑｕａｌｉｔｙスコア（９９．９％超の精度）を使用して更にフィルタリングした。ＲＯＩ（関心領域）毎についての適用範囲の平均及び最小深度を計算し、ＧＡＴＫ Ｕｎｉｆｉｅｄ及びＨａｐｌｏｉｄ Ｇｅｎｏｔｙｐｅｒ呼び出し元を使用してバリアント呼び出しを実施した。単一のバリアントファイル（＊．ｖｃｆ）は、両方のバリアント呼び出し元からのバリアントファイルをマージすることによって作成した。適用範囲及びバリアント深度レポートを作成し、シーケンシングデータベース（ｓｅｑＤＢ）にロードした。Ａｌａｍｕｔバッチは、検出されたバリアントについての高レベル注釈を取得するために使用した。バリアント検出のための品質管理規則には、以下が含まれた。１）標的位置（複数可）で最低４０リードを達成しなければならず、２）バリアントは２０％以上の頻度で検出される。３）大きな欠失の検出は、最低１００リードによるギャップＰＣＲアンプリコンの存在に基づいており、呼び出される特定のバリアントに基づいていなかった。
【0143】
実施例３：検出されたバリアント
【表1-1】
【表1-2】
【表2-1】
【表2-2】
【表3】
【0144】
実施例４：プライマー及び他の材料
【表4-1】
【表4-2】
【表4-3】
【表4-4】
【表5】
【表6】
【表7】
【表8】
【表9-1】
【表9-2】
【表10】
【表11】
【表12】
【表13】
【表14】
【0145】
分析測定範囲（ＡＭＲ）
陰性（野生型）：試験したバリアントのいずれも検出されない。ヘテロ接合：２０％以上～９６％未満の頻度を有するバリアントが陽性である。複合ヘテロ接合：２０％以上～９６％未満の頻度を有する遺伝子内で、各対立遺伝子上に１つずつの２つの変動が陽性である。ホモ接合：頻度９６％以上を有する両方の対立遺伝子上で同じバリアントが陽性である。
陰性（野生型）：試験したバリアントのいずれも検出されない。ヘテロ接合：２０％以上～９６％未満の頻度を有するバリアントが陽性である。複合ヘテロ接合：２０％以上～９６％未満の頻度を有する遺伝子内で、各対立遺伝子上に１つずつの２つの変動が陽性である。ホモ接合：頻度９６％以上を有する両方の対立遺伝子上で同じバリアントが陽性である。
【表15-1】
【表15-2】
【0146】
実施例５：結果
開示されるアッセイの臨床感度及び特異性を測定し、それぞれ１００％及び１００％であった。アッセイはまた、検証実行中に１００％のアッセイ間及びアッセイ内精度を示した。
開示されるアッセイの臨床感度及び特異性を測定し、それぞれ１００％及び１００％であった。アッセイはまた、検証実行中に１００％のアッセイ間及びアッセイ内精度を示した。
【0147】
等価物
本技術は、本出願に記載される特定の実施形態に関して限定されるものではなく、これは本技術の個々の態様の単一の例示として意図される。当業者に明白であろうように、本技術の多くの修飾及び変形は、その趣旨及び範囲から逸脱することなく行うことができる。本明細書に列挙されるものに加えて、本技術の範囲内の機能的に等価な方法及び装置は、前述の説明から当業者には明白であろう。そのような修飾及び変形は、本技術の範囲内に入ることが意図される。本技術は、特定の方法、試薬、化合物組成物、又は生物学的システムに限定されず、これは、もちろん、変動し得ることが理解されるべきである。本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的とし、限定することが意図されないことも理解されるべきである。
本技術は、本出願に記載される特定の実施形態に関して限定されるものではなく、これは本技術の個々の態様の単一の例示として意図される。当業者に明白であろうように、本技術の多くの修飾及び変形は、その趣旨及び範囲から逸脱することなく行うことができる。本明細書に列挙されるものに加えて、本技術の範囲内の機能的に等価な方法及び装置は、前述の説明から当業者には明白であろう。そのような修飾及び変形は、本技術の範囲内に入ることが意図される。本技術は、特定の方法、試薬、化合物組成物、又は生物学的システムに限定されず、これは、もちろん、変動し得ることが理解されるべきである。本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的とし、限定することが意図されないことも理解されるべきである。
【0148】
「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」等の用語は、広くかつ限定なしに読解されたい。追加的に、本明細書で用いられている用語及び表現は、限定ではなく、説明の用語として使用されており、そのような用語及び表現の使用において、示され、説明された特徴又はその一部のいずれかの等価物を除外する意図はないが、特許請求される開示の範囲内で様々な修正が可能であると認識される。
【0149】
加えて、本開示の特徴又は態様がマーカッシュ群の観点から記載される場合、当業者は、本開示が、それによってマーカッシュ群のいずれかの個々のメンバー又はメンバーのサブグループの観点からも記載されることを認識するであろう。
【0150】
当業者によって理解されるであろうように、いずれか又は全ての目的のために、特に書面による説明を提供するという観点から、本明細書に開示される全ての範囲はまた、いずれか及び全ての可能な部分範囲並びにそれらの部分範囲の組み合わせを包含する。任意の列挙された範囲は、同じ範囲が少なくとも等しい半分、３分の１、４分の１、５分の１、１０分の１等に分解されることを十分に説明し、可能にするものとして容易に認識することができる。非限定的な例として、本明細書で論じられる各範囲は、下位３分の１、中位３分の１、及び上位３分の１等に容易に分解することができる。また、当業者によって理解されるであろうように、例えば、「最大」、「少なくとも」、「より大きい」、「より小さい」等の全ての言語は、列挙された数を含み、上記で論じられるように部分範囲にその後分解することができる範囲を指す。最後に、当業者によって理解されるであろうように、範囲は、各個々のメンバーを含む。よって、例えば、１～３個の細胞を有する群は、１、２、又は３個の細胞を有する群を指す。同様に、１～５個の細胞を有する群は、１、２、３、４、又は５個の細胞を有する群を指し、同じように続く。
【0151】
本明細書で言及又は引用される全ての特許、特許出願、仮出願、及び刊行物は、それらが本明細書の明示的な教示と矛盾しない限り、全ての図及び表を含む、それらの全体が参照により組み込まれる。
【図1】
【図2】
【配列表】