特表 2024-546706 花粉稔性を高める方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-12-26

(54)【発明の名称】花粉稔性を高める方法

(51)【国際特許分類】

   A01H 3/04 20060101AFI20241219BHJP

【ＦＩ】

A01H3/04

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024534145

(86)(22)【出願日】2022-12-09

(85)【翻訳文提出日】2024-07-18

(86)【国際出願番号】 EP2022085101

(87)【国際公開番号】W WO2023105017

(87)【国際公開日】2023-06-15

(31)【優先権主張番号】21213796.2

(32)【優先日】2021-12-10

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】508186875

【氏名又は名称】キージーン ナムローゼ フェンノートシャップ

(74)【代理人】

【識別番号】100092783

【弁理士】

【氏名又は名称】小林 浩

(74)【代理人】

【識別番号】100120134

【弁理士】

【氏名又は名称】大森 規雄

(74)【代理人】

【識別番号】100196966

【弁理士】

【氏名又は名称】植田 渉

(72)【発明者】

【氏名】カレーノ―キンテーロ，ナタリア

(72)【発明者】

【氏名】ラドエヴァ，タチアナ ミトコヴァ

(72)【発明者】

【氏名】ホフステード，レネ ヨハネス マリア

(57)【要約】

本発明は、ＭＲＮ－ＡＴＭ経路阻害剤を使用して植物花粉の生存能力を向上させるための方法に関する。向上した花粉生存能力は、好ましくは向上した植物生存能力をもたらす。本発明はさらに、植物花粉の生存能力を向上するためのＭＲＮ－ＡＴＭ経路阻害剤に関する。本発明で使用するための好ましいＭＲＮ－ＡＴＭ経路阻害剤は２－アミノ－５－［（４－ヒドロキシフェニル）メチレン］－４（５Ｈ）－チアゾロンである。本発明はまた、未熟な花芽を含む単離された植物の一部を（危険または有毒な）化合物と接触させるステップを含む、成熟した稔性のある植物の接ぎ木を発育させるための方法にも関する。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ａ）植物花粉を生じさせる組織を含む第１の種子植物またはその植物の一部を用意するステップと；
ｂ）用意した植物または植物の一部の少なくとも一部分においてＭＲＮ－ＡＴＭ経路を阻害するステップと；
ｃ）前記植物または植物の一部に改良された生存能力を示す花粉を生成させるステップと
を含む、植物花粉の生存能力を改良するための方法。

【請求項2】

ステップｂ）において、前記植物または植物の一部を２－アミノ－５－［（４－ヒドロキシフェニル）メチレン］－４（５Ｈ）－チアゾロンに接触させることにより、前記ＭＲＮ－ＡＴＭ経路を阻害する、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

植物花粉の前記改良された生存能力が、植物稔性を高める、請求項１または２に記載の方法。

【請求項4】

ステップａ）の前記植物またはその植物の一部が種間雑種またはその一部である、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項5】

ステップａ）で用意する植物の一部が挿し木であり、前記挿し木の切断端をステップｂ）でＭＲＮ－ＡＴＭ経路を阻害する化合物と接触させる、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項6】

前記挿し木が被子植物の種子植物の挿し木であり、花序を含み、前記花序が少なくとも１つの未熟花芽を含み、かつ、好ましくは成熟花芽を含まない、請求項５に記載の方法。

【請求項7】

ステップａ）～ｃ）が、穂木である植物の一部を用いて行われ、前記方法が：
ｄ）前記穂木を台木に接ぎ木するステップ
をさらに含む、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項8】

前記花粉を成熟させるステップをさらに含む、請求項１～７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項9】

成熟花粉を単離するステップをさらに含む、請求項８に記載の方法。

【請求項10】

第１の植物を自家受粉させるステップまたは第２の植物に受粉させるステップをさらに含む、請求項１～９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項11】

ＭＲＮ－ＡＴＭ経路を阻害する化合物を含む植物生育培地。

【請求項12】

請求項１～１０のいずれか１項に記載の方法により得られる、植物または植物の一部の生存可能な花粉。

【請求項13】

ａ）植物花粉を生じさせる組織を含む第１の種子植物またはその植物の一部を用意するステップと；
ｂ）用意した植物または植物の一部の少なくとも一部分においてＭＲＮ－ＡＴＭ経路を阻害するステップと；
ｃ）前記植物または植物の一部に改良された生存能力を示す花粉を生成させるステップと
を含む、改良された花粉生存能力を有する第１の種子植物を生産するための方法。

【請求項14】

請求項１３に記載の方法により得られ得る、改良された生存能力を有する花粉を含む種子植物、好ましくは種間雑種。

【請求項15】

花粉生存能力を改良するための、場合により植物生育培地に含まれる、ＭＲＮ－ＡＴＭ経路を阻害する化合物の使用。

【請求項16】

第２の植物の受粉のため、好ましくは後代植物の生産のための、請求項１２に記載の生存可能な花粉または請求項１４に記載の種子植物の使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は植物育種の分野、より具体的には種間交配植物育種の分野に関する。花粉生存能力の向上をもたらす花粉処理および花粉稔性を高める化合物の使用を介して植物の稔性を改良する新しい方法が開示される。上記花粉は、種間雑種などの低稔性または不稔性植物に由来し得る。

【背景技術】

【0002】

植物育種の過程は、遺伝的バリエーションの利用可能性に大きく依存する。このバリエーションは、逆育種技術およびＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ならびに対象作物の近縁野生種に見られる自然変異を利用することで生み出される。栽培品種の害虫抵抗性を高めるため、および／または新しい品種を作出するためなどの様々な理由から、野生の近縁種から新しい形質を遺伝子移入することが望まれている。さらに、交配種はヘテロシスまたは雑種強勢を示すことが多く、これにより一般に生物学的品質が高まる。したがって、交配種は非常に興味深いものであり、種間交配は今後数十年間、育種のための強力なツールであり続けると予想される。

【0003】

交配させる種に応じて、種間雑種の作出および繁殖にはいくつかの生殖障壁が存在する。これら、異なる植物種の交配を防いでいる接合後および接合前障壁は、花粉と柱頭の相互作用、Ｆ_１雑種における減数分裂中の相同染色体間の対合および組換えならびに胚への花粉管誘導または内乳の発生の問題にまで及ぶ。これらの問題を回避する現在の方法には、つぼみ受粉、胚珠培養および胚救出が含まれるが、まだ最適からは程遠い。これまでのところ、種間雑種の作出は試行錯誤に大きく依存しており、これには多大な時間、労力および費用がかかる大規模な育種作業が伴う。さらに困難なのは、これらの得られた種間雑種のその後の繁殖である可能性がある。実際、種間雑種の大多数は生存可能な花粉を持たない。

【0004】

したがって、当技術分野では、特に種間雑種などの低稔性の植物のために、植物の稔性を改良する方法が強く求められている。より具体的には、例えば種間雑種育種および／または生産において、花粉生存能力を高めることが強く求められている。

【発明の概要】

【0005】

本発明は、以下の実施形態に要約することができる：
実施形態１．ａ）植物花粉を生じさせる組織を含む第１の種子植物またはその植物の一部を用意するステップと；
ｂ）用意した植物または植物の一部の少なくとも一部分においてＭＲＮ－ＡＴＭ経路を阻害するステップと；
ｃ）上記植物または植物の一部に改良された生存能力を示す花粉を生成させるステップと
を含む、植物花粉の生存能力を改良するための方法。
実施形態２．ステップｂ）において、上記植物または植物の一部を２－アミノ－５－［（４－ヒドロキシフェニル）メチレン］－４（５Ｈ）－チアゾロンに接触させることにより、上記ＭＲＮ－ＡＴＭ経路を阻害する、実施形態１に記載の方法。
実施形態３．植物花粉の上記改良された生存能力が、植物稔性を高める、実施形態１または２に記載の方法。
実施形態４．ステップａ）に記載の第１の植物またはその植物の一部が種間雑種またはその一部である、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法。
実施形態５．ステップａ）で用意する植物の一部が挿し木であり、上記挿し木の切断端をステップｂ）でＭＲＮ－ＡＴＭ経路を阻害する化合物と接触させる、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法。
実施形態６．上記挿し木が被子植物の種子植物の挿し木であり、花序を含み、上記花序が少なくとも１つの未熟花芽を含み、かつ、好ましくは成熟花芽を含まない、実施形態５に記載の方法。
実施形態７．ステップａ）～ｃ）が、穂木である植物の一部を用いて行われ、上記方法が：
ｄ）上記穂木を台木に接ぎ木するステップ
をさらに含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法。
実施形態８．上記花粉を成熟させるステップをさらに含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法。
実施形態９．成熟花粉を単離するステップをさらに含む、実施形態８に記載の方法。
実施形態１０．上記第１の植物を自家受粉させるステップまたは第２の植物に受粉させるステップをさらに含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１１．ＭＲＮ－ＡＴＭ経路を阻害する化合物を含む植物生育培地。
実施形態１２．実施形態１～１０のいずれか１つに記載の方法により得られる、植物または植物の一部の生存可能な花粉。
実施形態１３．ａ）植物花粉を生じさせる組織を含む第１の種子植物またはその植物の一部を用意するステップと；
ｂ）用意した植物または植物の一部の少なくとも一部分においてＭＲＮ－ＡＴＭ経路を阻害するステップと；
ｃ）上記植物または植物の一部に改良された生存能力を示す花粉を生成させるステップと
を含む、改良された花粉生存能力を有する第１の種子植物を生産するための方法。
実施形態１４．実施形態１３に記載の方法により得られる改良された生存能力を有する花粉を含む種子植物、好ましくは種間雑種。
実施形態１５．花粉生存能力を改良するための、場合により植物生育培地に含まれるＭＲＮ－ＡＴＭ経路を阻害する化合物の使用。
実施形態１６．第２の植物の受粉のため、好ましくは後代植物の生産のための、実施形態１２に記載の生存可能な花粉または実施形態１４に記載の種子植物の使用。

【発明を実施するための形態】

【0006】

定義
本発明の方法、組成物、使用およびその他の態様に関する様々な用語が本明細書および特許請求の範囲全体にわたって使用される。このような用語には、別段の指示がない限り、本発明が関連する技術分野における通常の意味が与えられる。他の特別に定義された用語は、本明細書で提供する定義と一致する様態で解釈されるべきである。本明細書で説明されるものと類似または同等の任意の方法および材料を本発明の試験の実施に使用することができるが、好ましい材料および方法を本明細書で説明する。

【0007】

本発明の方法で使用される従来の技術を実行する方法は、当業者には明らかであろう。分子生物学、生化学、計算化学、細胞培養、組換えＤＮＡ、バイオインフォマティクス、ゲノミクス、配列決定および関連分野における従来技術の実践は当業者には周知であり、例えば以下の参考文献で論じられている：Sambrook et al.. Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y., 1989; Ausubel et al.. Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, 1987およびperiodic updates; and the series Methods in Enzymology, Academic Press, San Diego.

【0008】

「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」：これら単数形の用語には、内容が別途明確に示さない限り、複数の指示対象物が含まれる。したがって、例えば、「細胞（ａ ｃｅｌｌ）」への言及には、２つ以上の細胞の組み合わせなどが含まれる。

【0009】

本明細書で使用される時、「約」という用語は、小さな変動を記載しそれを説明するために使用される。例えば、この用語は、±５％以下、±４％以下、±３％以下、±２％以下、±１％以下、±０．５％以下、±０．１％以下、または±０．０５％以下などの±１０％以下を指すことができる。加えて、量、比率およびその他の数値は、本明細書では範囲形式で表示される場合がある。このような範囲形式は利便性および簡潔さのために使用されており、範囲の限界として明示的に指定された数値を含むように柔軟に理解されるべきであるが、その範囲内に含まれる全ての個々の数値または部分的な範囲も、あたかも各数値および部分的な範囲が明示的に特定されているがごとく含まれるものと理解されたい。例えば、約１から約２００の範囲の比率は、明示的に記載された約１および約２００の限界値を含むが、約２、約３および約４などの個々の比率ならびに約１０～約５０、約２０～約１００などの部分的な範囲も含むものと理解されるべきである。

【0010】

「および／または」：「および／または」という用語は、記載された事例のうちの１つ以上が、単独で、または記載された事例のうちの少なくとも１つと組み合わされて、最大で記載された事例の全てが発生する可能性がある状況を指す。

【0011】

「植物」：本明細書では、少なくとも根系の一部およびシュート系の一部を含む植物として理解されるべきである。植物は、好ましくは、本明細書において以下に定義される植物の一部を含む。好ましくは、少なくとも、植物は植物花粉を生じさせる組織を含む。好ましくは、植物は、（成熟または未熟）花芽および花序のうち、少なくとも１つを含む。植物の非限定的な例には、大麦、キャッサバ、綿、落花生またはピーナッツ、トウモロコシ、キビ、アブラヤシ果実、ジャガイモ、豆類、菜種またはキャノーラ、米、ライ麦、ソルガム、大豆、サトウキビ、テンサイ、ヒマワリ、小麦、オクラ、アリウム、セロリ、アスパラガス、トウガン、ビート、アブラナ科野菜を含むアブラナ属、ピーマン、唐辛子、アンディーブ、チコリ、スイカを含むメロン、キュウリ、ガーキン、ズッキーニ、カボチャ、アーティチョーク、ニンジン、ロケット、フェンネル、レタス、ユウガオ、トカドヘチマ、ヘチマ、ゴーヤ、パースニップ、パセリ、インゲン、ホオズキ、トマティーロ、大根、ナス、トマト台木を含むトマト、ペピーノ、ほうれん草、ヘビウリ、ノヂシャ、ひよこ豆を含むエンドウ豆、大豆、そら豆、スイートコーン、麻、ホップ、ベリー、タンポポおよび観賞植物などの作物および栽培植物が含まれる。

【0012】

「植物の一部」：これには、植物細胞、植物プロトプラスト、植物を再生できる植物細胞組織培養物、植物カルス、植物塊、（成熟または未熟）花芽、花序および胚、花粉、胚珠、種子、葉、花、枝、果実、穀粒、穂、穂軸、殻、茎、根、根端、葯、穀物などの植物または植物の一部における無傷の植物細胞のうちの少なくとも１つが含まれる。好ましくは、植物の一部は、少なくとも、植物花粉を生じさせる組織を含む。好ましくは、植物の一部は、（成熟または未熟）花芽および花序のうちの少なくとも１つである。

【0013】

本明細書で説明される「種子植物（seed plant）」は、胞子形成植物とは対照的に、有性生殖の主な形態として種子を実らせる植物または植物群のことである。この群は別名種子植物（spermatophyte）としても知られ、裸子植物および被子植物で構成され、これには農業に関連する全ての作物が包含される。非限定的な例を、本明細書で「植物」の定義の下で提供する。

【0014】

「花序」とは植物の生殖単位のことである。これは、好ましくは、主枝または枝の配列から構成される茎上に配置された花の群または集団である。これは花が形成される、種子植物のシュートの一部分であり得る。有限花序および無限花序という、２つの特定のタイプの花序が決定できる。有限（集散）花序は頂芽から頂生（中央）花を成長させ、中心軸の伸長を停止する。無限（総状）花序では、頂芽が成長を続け、側芽から側花を形成する。頂花が形成されることはない。花序は上記植物の有性生殖の手段となる。したがって、これには、心皮、葯、柱頭、花柱、雄しべ、花弁およびがく片の、１つ以上、好ましくは全ての発育段階が含まれるが、これらに限定されない。

【0015】

「種間雑種」は、２つの種、好ましくは同じ属内の２つの個体の交配からの直接の子孫（「Ｆ１」子孫）である。子孫は、好ましくは両親の形質および特性を示すが、多くの場合は不稔であり、種間の遺伝子流動を妨げている（Keeton, William T. 1980. Biological science. New York: Norton. ISBN 0-393-95021-2, p. 800）。不稔性は、多くの場合、２種間の染色体の数の違いに起因する。不稔性は、少なくとも部分的には、生存可能な花粉が存在しないことが原因である可能性がある。

【0016】

「ＭＲＮ－ＡＴＭ経路」は、ＤＮＡ損傷の制御、より具体的には二本鎖（ＤＳＢ）切断修復に関与する経路である。ＭＲＮ－ＡＴＭ経路は植物種間で高度に保存されている（Yoshiyama et al., Biology (Basel). 2013 2(4): 1338-1356; Amiard et al. The Plant Cell, 2010, 22 (9): 3020-3033）。植物のＭＲＮ複合体は、減数分裂組換え１１（Ｍｒｅ１１：Meiotic recombination 11）、ＤＮＡ修復タンパク質Ｒａｄ５０（DNA repair protein Rad 50）およびナイミーヘン染色体不安定症候群１（Nijmegen breakage syndrome 1（Ｎｂｓ１））の３つのタンパク質を含むヘテロ三量体である。これは、ＤＳＢの調整および感知ならびにＤＮＡ損傷応答経路の開始における主要な触媒性タンパク質複合体として知られている。ＭＲＮ複合体はＤＳＢを感知し、不活性二量体ＡＴＭ（ataxia telangiectasia mutated（毛細血管拡張性運動失調症変異））を動員し、そこで細胞周期制御およびＤＮＡ修復に関与する他の様々なタンパク質に加えて、不活性二量体ＡＴＭはＭＲＮ複合体のメンバーをリン酸化するために活性化される（Kanaar and Wyman Cell 2008, 135, 14-16.）。ＭＲＮ－ＡＴＭ経路の活性化により、ＤＮＡ損傷修復が活性化され、細胞周期が継続する。植物における減数分裂中、ＭＲＮ－ＡＴＭ経路のサブユニットは減数分裂の制御および花粉形成に関与する（Culligan et al., Plant J. 2008 Aug; 55(4): 629-38.; Kurzbauer et al., The Plant Cell 2021; 33(5): 1-24）。

【0017】

「ＭＲＮ－ＡＴＭ経路阻害剤」とは、ＭＲＮ－ＡＴＭ経路の活性化を下方制御または妨げる化合物である。上記化合物は、好ましくは化学化合物である。

【0018】

本明細書で使用する「受粉」または「受粉する」という用語は、花粉が植物の葯（雄性部分）から柱頭（雌性部分）に移され、それによって受精および生殖が可能となる過程を指す。それぞれの花粉粒は雄性半数体配偶体であり、雌性配偶体に輸送されるのに適合されており、そこで、重複受精の過程で１つの雄性配偶子（または複数の配偶子）を生成することで受精を引き起こすことができる。

【0019】

雄性配偶子を含む被子植物の成功する花粉粒（配偶体）は柱頭に輸送され、そこで発芽し、花粉管が花柱に沿って子房まで成長する。花粉粒の２つの配偶子は管を通って下がっていき、雌性配偶子を含む配偶体が心皮内に保持されている場所まで移動する。１個の核は極体と融合して胚乳組織を生成し、もう一方の核は胚珠と融合して胚を生成する。裸子植物には果実および花がない。しかし、被子植物と同様に、裸子植物は受精を促進するために花粉を用いている。

【0020】

詳細な説明
本発明者らは、植物内のＭＲＮ－ＡＴＭ経路を阻害すると、不稔性種間雑種が完全に成熟した葯および生存可能な花粉を発達させることができることを発見した。

【0021】

したがって、本発明の第１の側面では、
ａ）植物花粉を生じさせる組織を含む第１の種子植物またはその植物の一部を用意するステップと；
ｂ）用意した植物または植物の一部の少なくとも一部分においてＭＲＮ－ＡＴＭ経路を阻害するステップと；
ｃ）上記植物または植物の一部に改良された生存能力を示す花粉を生成させるステップと
を含む、植物花粉の生存能力を改良するための方法を提供する。

【0022】

本発明の方法は、改良された生存能力を有する植物花粉を生産するための方法とも考えられ得る。

【0023】

ステップａ）第１の種子植物または植物の一部を用意する
本発明の方法のステップａ）において、第１の種子植物または植物の一部を用意する。好ましくは、用意する種子植物は植物花粉を生じさせる組織を含む。同じく、好ましくは、用意する植物の一部は植物花粉を生じさせる組織を含む。用意する種子植物は、好ましくは農業関連作物植物である。本明細書では、植物の一部とは第１の種子植物の一部であると理解される。

【0024】

「植物花粉を生じさせる組織」という用語は、当業者にはよく知られている。このような組織は、好ましくは胞子形成組織であり、好ましくは胞子形成細胞、小胞子母細胞（「花粉母細胞」または「減数母細胞」としても知られる）および小胞子のうちの少なくとも１つを含む。この組織は、未熟な芽の一部であり得るか、未熟な芽内に含まれ得る。

【0025】

好ましくは、ステップａ）で用意する第１の種子植物またはその植物の一部は、未熟な芽を含む。好ましくは、植物の一部は挿し木である。したがって、好ましくは、上記挿し木は未熟な芽を含む。

【0026】

好ましくは、植物花粉を生じさせる組織は、花序の一部であり得るか、花序内に含まれ得る。好ましくは、ステップａ）で用意する植物の一部は、花序であるか、花序を含む。好ましくは、挿し木は花序であるか、花序を含む。花序は、好ましくは、少なくとも１つの未熟な花芽を含む。花序は、少なくとも１、２、３、４、５、５、６、７、８、９、１０個以上の未熟な花芽を含み得る。好ましくは、花序は、１０、９、８、７、６、５、４、３、２未満または１個未満の成熟した花芽を含む。好ましくは、本発明の方法で使用するための植物の一部は、少なくとも１つの未熟な花芽を含み、いかなる成熟した花芽も含まない花序である。場合により、本発明の方法のステップａ）の前に、あらゆる成熟した花芽は植物または植物の一部から除去されている。

【0027】

好ましくは、用意する第１の種子植物またはその一部は被子植物の種子植物である。好ましくは、挿し木は、被子植物の種子植物の挿し木である。

【0028】

好ましくは、第１の種子植物は、生存可能な花粉を生成する能力が低下している。好ましくは、第１の種子植物が生成する花粉の少なくとも約２％、４％、６％、８％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％が生存不能である。好ましくは、第１の種子植物が生成する花粉の約９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、８％、６％、４％、２％未満または約１％未満が生存可能である。好ましくは、第１の種子植物は生存可能な花粉を生成できず、第１の種子植物はいかなる生存可能な花粉をも生成できない可能性がある。第１の種子植物の生存可能な花粉を生成する能力の低下により、好ましくは、上記植物は能力が制限された植物となるか、受粉によって子孫を生み出すことができない植物となる。

【0029】

植物花粉の生存能力は、当業者に知られている任意の従来の方法を用いて簡単に決定することができる。非限定的な例として、生存能力は、従来のＭＴＳ（３－（４，５－ジメチルチアゾール－２－イル）－５－（３－カルボキシメトキシフェニル）－２－（４－スルホフェニル）－２Ｈ－テトラゾリウムまたはＭＴＴ（３－（４，５－ジメチルチアゾール－２－イル）－２，５－ジフェニルテトラゾリウムブロミド）アッセイを使用して、例えば、本明細書の以下の実施例１に記載される方法ステップを使用して決定することができる。

【0030】

あるいは、またはそれに加えて、好ましくは、用意する第１の種子植物において、葯の少なくとも約２％、４％、６％、８％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％は花粉の成熟の際に閉じたままである。好ましくは、葯の約９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、８％、６％、４％、２％未満または約１％未満は花粉の成熟の際に開く。葯の開きは目視検査によって、場合により画像を拡大するために顕微鏡を使用して評価できる。

【0031】

本発明の方法で使用される第１の種子植物は、花粉生存能力が低い、または生存不能な花粉を有する植物および／または閉じた葯を有する植物および／または稔性が低い植物であり得る。場合により、植物は不稔であるか、部分的に不稔である。第１の種子植物は種間雑種であり得る。第１の種子植物は、本明細書では、有性生殖の主な形態として種子を生成する植物であり、種子植物の分類の一員であり、全ての主要作物を含むが、これらに限定されないと理解される。ステップａ）で用意する第１の種子植物は、被子植物または裸子植物であり得、好ましくは被子植物である。好ましくは、ステップａ）において、被子植物の植物の一部、好ましくは被子植物からの花序を用意する。植物はナス科（Solanaceae）、ウリ科（Cucurbitaceae）、アブラナ科（Brassicaceae）、キク科（Asteraceae）、アオイ科（Malvaceae）、マメ科（Fabaceae）、イネ科（Poaceae）、ヒユ科（Amaranthaceae）、マメ科（Leguminosae）、バショウ科（Musaceae）、イネ科（Gramineae）、バラ科（Rosaceae）、トウダイグサ科（Euphorbiaceae）、セリ科（Apiaceae）およびアカネ科（Rubiaceae）の植物に属し得るが、これらに限定されない。植物は、ナス属（Solanum）（トマト（Lycopersicum）を含む）、ネギ属（Allium）、フダンソウ属（Beta）、アブラナ属（Brassica）、ニコチアナ属（Nicotiana）、トウガラシ属（Capsicum）、ペチュニア属（Petunia）コムギ属（Triticum）、イネ属（Oryza）、ダイズ属（Glycine）、キュウリ属（Cucumis）、キクニガナ属（Cichorium）、キク属（Chrysanthemum）、チカラシバ属（Pennisetum）、ライムギ属（Secale）、アキノノゲシ属（Lactuca）、オオムギ属（Hordeum）、ヒマワリ属（Helianthus）、アサ属（Cannabis）、カラスムギ属（Avena）、モロコシ属（Sorghum）、ワタ属（Gossypium）、ウマゴヤシ属（Medicago）、インゲンマメ属（Phaseolus）、モロコシ属（Sorghum）、サトウキビ属（Saccharum）、オオムギ属（Hordeum）、タンポポ属（Taraxacum）、エンドウ属（Pisum）、トウモロコシ属（Zea）、ウマゴヤシ属（Medicago）、インゲンマメ属（Phaseolus）、バラ属（Rosa）、ユリ属（Lilium）、コーヒーノキ属（Coffea）、アマ属（Linum）、イモノキ属（Mannihot）、ニンジン属（Daucus）、カボチャ属（Cucurbita）、スイカ属（Citrullus）およびバショウ属（Musa）の植物に属し得るが、これらに限定されない。好ましくは、植物はアブラナ科の植物、好ましくはアブラナ属の植物である。

【0032】

用意する第１の種子植物は雌雄同株植物または雌雄異株植物であり得る。好ましくは、用意する第１の種子植物は、稔性が低下した、もしくは低い植物または不稔性の植物である。好ましくは、第１の種子植物は、花粉生存能力が低下した、もしくは低い植物または生存不能な花粉を有する植物である。好ましくは、第１の種子植物は、受粉を通じて子孫を生み出すことについて限られた能力を有するか、それができない。

【0033】

第１の種子植物は種間雑種であり得る。種間雑種は、生存可能な子孫をもたらすことができる、種の任意の組み合わせ間の交配から生じ得る。言い換えれば、種間雑種は、生存可能な植物をもたらす異なる種の任意の２つの親植物の雑種であり得る。好ましくは、種間雑種は、同じ属の２つの種間の雑種である。この種間雑種は、親植物に対する雑種強勢および／または各親からの染色体の混合を有することを特徴とする可能性がある。

【0034】

好ましくは、種間雑種は、染色体の数および／または倍数性が異なる２つの親植物間の雑種である。本発明は、いかなる特定の種間雑種にも限定されず、一般に適用可能であることが理解される。本発明の方法は、任意の種間雑種、すなわち、好ましくは同じ属の２つの種間の任意の交配から得られ、結果として部分的または完全に不稔の種間雑種であり、かつ／または花粉生存能力を高める方法、葯を開く方法および／もしくは稔性を高める方法から利益を得ることができる植物に適用することができる。

【0035】

場合により、種間雑種は、アブラナ属（Brassica）の２つの種間の種間雑種であり、好ましくは、親同士の染色体数が異なる。種間雑種は、アブラナ（B.rapa）（ＡＡ ２ｎ＝２０）、クロガラシ（B.nigra）（ＢＢ ２ｎ＝１６）およびヤセイカンラン（B.oleracea）（ＣＣ ２ｎ＝１８）からなる群から選択される種の１つの親植物と上記群の別の種の別の親植物の雑種であり得る。種間雑種はヤセイカンラン（Brassica oleraceae）とアブラナ（Brassica rapa）との交配の種間雑種であり得る。場合により、種間雑種は、アキノノゲシ属（Lactuca）の２つの種間の雑種である。種間雑種は、レタス（Lactuca sativa）とワイルドレタス（Lactuca virosa）との交配の種間雑種であり得る。

【0036】

場合により、第１の種子植物は種間雑種の子孫、好ましくは低下した花粉生存能力を有する子孫である。上記子孫は、種間雑種の戻し交配、自家受粉またはそれらの組み合わせから生じる子孫であり得る。場合により、種間雑種が「第１世代植物」と考えられる場合、上記子孫は第２世代、第３世代、第４世代、第５世代、第６世代、第７世代、第８世代、第９世代または第１０世代のものである。

【0037】

ステップｂ）用意した植物または植物の一部においてＭＲＮ－ＡＴＭ経路を阻害する
本発明の方法のステップｂ）において、植物の少なくとも一部分においてＭＲＮ－ＡＴＭ経路が阻害され得る。好ましくは、ＭＲＮ－ＡＴＭ経路は、少なくとも、植物花粉を生じさせる組織内で阻害される。ＭＲＮ－ＡＴＭ経路の阻害は、上記経路の一員であるタンパク質の活性を阻害することを包含し得、ここで、好ましくは、タンパク質は、Ｍｒｅ１１、Ｒａｄ５０、Ｎｂｓ１（一緒になってＭＲＮ複合体）およびＡＴＭタンパク質からなる群から選択される。好ましくは、ＭＲＮ－ＡＴＭ経路の阻害は、ＭＲＮ複合体の阻害、好ましくは、上記複合体の一員であるタンパク質の活性の阻害、例えば、Ｍｒｅ１１、Ｒａｄ５０およびＮｂｓ１のうちの少なくとも１つの活性の阻害を包含し得る。

【0038】

Ｍｒｅ１１の活性の低下は、好ましくは、活性の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％の低下または１００％の低下である。Ｒａｄ５０の活性の低下は、好ましくは、活性の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％の低下または１００％の低下である。Ｎｂｓ１の活性の低下は、好ましくは、活性の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％の低下または１００％の低下である。ＡＴＭの活性の低下は、好ましくは、活性の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％の低下または１００％の低下である。活性の１００％の低下とは、本明細書では活性の完全な欠如と理解される。

【0039】

ＭＲＮ－ＡＴＭ経路の阻害は、部分的または完全な阻害であり得る。ＭＲＮ－ＡＴＭ経路の阻害は、好ましくは化合物に曝露させることによって行う。ステップｂ）の第１の種子植物またはその一部の植物花粉を生じさせる組織内のＭＲＮ－ＡＴＭ経路を阻害することは、ひいては第１の種子植物、またはその一部の、植物花粉を生じさせる組織をＭＲＮ－ＡＴＭ阻害剤で処理することであるとも考えられる。植物花粉を生じさせる組織は、好ましくは花序の一部であるか、花序内に含まれている。ステップｂ）の第１の種子植物またはその一部の花序内のＭＲＮ－ＡＴＭ経路を阻害することは、ひいては上記第１の種子植物またはその一部の花序をＭＲＮ－ＡＴＭ阻害剤で処理することであるとも考えられる。

【0040】

加えて、またはあるいは、ＭＲＮ－ＡＴＭ経路は、上記経路の１つ以上のタンパク質の発現を下方制御する、または消失させることによって、例えば上記１つ以上のタンパク質の発現を、例えばＲＮＡｉを用いて抑制する、かつ／または上記１つ以上のタンパク質をコードする遺伝子の変異によって妨害することによって阻害または遮断され得る。上記１つ以上のタンパク質をコードする遺伝子の変異は、機能的タンパク質の発現の減少または消失をもたらす可能性がある。上記変異はプロモーター配列内にあり得、これは発現の減少および／または消失をもたらす可能性があり、ならびに／あるいは上記変異は、コード配列内にあり得、機能不全および／もしくは切断されたタンパク質および／または機能の低下したタンパク質をもたらす可能性がある。場合により、ＭＲＮ－ＡＴＭ経路の阻害はＲＮＡｉによって行われ、ここで、発現したｓｉＲＮＡ／ｍｉＲＮＡはプロモーター、好ましくは組織特異的プロモーターの制御下にある。組織特異的プロモーターは、好ましくは植物花粉を生じさせる組織内で、場合により植物花粉を生じさせる組織内でのみ、活性である。

【0041】

好ましくは、ＭＲＮ－ＡＴＭ経路は化合物への曝露によって阻害される。したがって、本発明の方法のステップｂ）は、用意した植物または植物の一部の少なくとも一部分をＭＲＮ－ＡＴＭ経路を阻害する化合物に接触させるステップでもあり得る。好ましくは、少なくとも、植物花粉を生じさせる組織を上記化合物と接触させる。好ましくは、上記化合物は化学化合物であり、上記化合物は、好ましくはＭｒｅ１１に関連する３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を阻害する。上記化合物は、分子式Ｃ_１０Ｈ_８Ｎ_２Ｏ_２Ｓを有し、ミリンの名でも知られる２－アミノ－５－［（４－ヒドロキシフェニル）メチレン］－４（５Ｈ）－チアゾロンであり得る（ＰｕｂＣｈｅｍ ＩＤ １２０６２４３、ＣＡＳ番号 ２９９９５３－００－７）。場合により、本発明の方法で使用するための化合物は、ミリンの誘導体または類似体である。ミリンの好ましい誘導体は、参照により本明細書に組み込まれるShibata et al., Mol Cell (2014) 53:7-18に記載の誘導体である。

【0042】

他の潜在的に有用な阻害性化合物は、例えば以下のいずれか１つのＡＴＭキナーゼ活性阻害剤であり得るが、これらに限定されない：
－ 分子式Ｃ_３０Ｈ_３３Ｎ_３Ｏ_５Ｓを有し、ＫＵ－６００１９という名でも知られている２－（（２Ｓ，６Ｒ）－２，６－ジメチルモルホリノ）－Ｎ－（５－（６－モルホリノ－４－オキソ－４Ｈ－ピラン－２－イル）－９Ｈ－チオキサンテン－２－イル）アセトアミド（ＰｕｂＣｈｅｍ ＩＤ １５９５３８７０、ＣＡＳ番号９２５７０１－４９－１）；
－ 分子式Ｃ_２１Ｈ_１７ＮＯ_３Ｓ_２を有し、ＫＵ－５５９３３という名でも知られている２－（４－モルホリニル）－６－（１－チアントレニル）－４Ｈ－ピラン－４－オン（ＰｕｂＣｈｅｍ ＩＤ ５２７８３９６、ＣＡＳ番号、５８７８７１－２６－９）；および
－ 分子式Ｃ_１７Ｈ_１５Ｎ_７Ｏ_２を有し、ＣＰ－４６６７２２という名でも知られている１－（６，７－ジメトキシキナゾリン－４－イル）－３－（ピリジン－２－イル）－１Ｈ－１，２，４－トリアゾール－５－アミン（ＰｕｂＣｈｅｍ ＩＤ ４４５５１６６０、ＣＡＳ番号１０８０６２２－８６－１）。

【0043】

ＭＲＮ－ＡＴＭ経路を阻害することは、好ましくはＭｒｅ１１を阻害することによって実行される。好ましくは、Ｍｒｅ１１に関連する３’→５’エキソヌクレアーゼ活性が阻害される。好ましくは上記Ｍｒｅ１１阻害剤はミリンである。

【0044】

用意した植物全体を、本明細書で「阻害性化合物」とも示す、ＭＲＮ－ＡＴＭ経路を阻害する化合物と接触させることができる。場合により、植物の一部のみを阻害性化合物と接触させる。非限定的な例として、根系またはシュート系（の一部）のみを阻害性化合物と接触させる。場合により、植物の一部のみを阻害性化合物と接触させるが、化合物はその後植物組織を通って移動し、花粉を生じさせる組織および／または未熟な花芽の細胞に到達し得る。

【0045】

用意した植物または植物の一部の全ての細胞のＭＲＮ－ＡＴＭ経路が阻害され得る。あるいは、一部の細胞のみでＭＲＮ－ＡＴＭ経路が阻害される。例えば、ＭＲＮ－ＡＴＭ経路は、用意した植物または植物の一部の少なくとも約０．５％、１％、２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または１００％の植物細胞で阻害され得る。ＭＲＮ－ＡＴＭ経路は、根系の細胞またはシュート系の細胞、好ましくはシュート系の細胞で阻害され得る。ＭＲＮ－ＡＴＭ経路は、好ましくは、少なくとも、植物花粉を生じさせる組織で阻害される。ＭＲＮ－ＡＴＭ経路は、少なくとも１つ以上の未熟な花芽で阻害され得る。ＭＲＮ－ＡＴＭ経路は、用意した植物または植物の一部の少なくとも開花（florescense）において阻害され得る。

【0046】

好ましくは、少なくとも植物の一部を阻害性化合物と接触させる。ＭＲＮ－ＡＴＭ経路は、ステップｂ）において、少なくとも、植物花粉を生じさせる組織を阻害性化合物に接触させることによって阻害され得る。好ましくは、化合物を、植物花粉を生じさせる上記組織のみに接触させるか、未熟な花芽のみに接触させるか、花序のみに接触させるか、ステップａ）で用意する植物の一部のみに接触させる。好ましくは、少なくとも、植物花粉を生じさせる組織をＭＲＮ－ＡＴＭ経路を阻害する化合物と接触させる。好ましくは、用意した植物または植物の一部の少なくとも１つ以上の未熟な花芽を阻害性化合物と接触させる。好ましくは、用意した植物または植物の一部の少なくとも花序を阻害性化合物と接触させる。

【0047】

化学化合物は、花芽および／または葉に化学化合物を含む組成物を噴霧すること、花芽を化学化合物を含む培地に浸漬すること、化合物が根を介して花芽に到達するように植物が生育している土壌に化合物を混合することなどの当技術分野で知られている任意の適切な手段によって添加することができるが、これらに限定されない。

【0048】

ＭＲＮ－ＡＴＭ阻害剤は、本発明の方法に必要な濃度においてはヒトに対して有毒である化合物であり得る。したがって、好ましくは、化合物はエアロゾルの形態では使用されず、好ましくは、使用される化学化合物の量は最小限に抑えられる。

【0049】

好ましい実施形態においては、植物花粉を生じさせる組織を含む植物の一部が植物の残りの部分から切り取られてもよい。植物の一部は挿し木であり得る。好ましくは、植物の一部は、その切断端を、上記化学化合物を含む生育培地、好ましくは最小量の生育培地中に置き得る。化合物が環境中に蒸発するのを防ぐために、化合物を含む生育培地を覆うか、例えばパラフィルムを用いて密閉することができる。場合により、図１に示すように化合物を適用することもできる。

【0050】

好ましくは、ＭＲＮ－ＡＴＭ経路阻害剤は植物の特定の一部にのみ使用される。好ましくは、ＭＲＮ－ＡＴＭ経路は、上記植物の一部の植物花粉を生じさせる組織内で阻害される。上記組織は、好ましくは花芽の一部または花芽内に含まれる。したがって、植物の一部は、好ましくは少なくとも１つの花芽を含む。好ましくは、上記花芽は未熟であり、ＭＲＮ－ＡＴＭ経路は、開花するまでの芽の成熟期間を通じて阻害される。好ましくは、上記花芽は未熟であり、植物または植物の一部は、開花するまでの芽の成熟期間を通じてＭＲＮ－ＡＴＭ経路を阻害する化合物に曝露される。好ましくは、上記ＭＲＮ－ＡＴＭ経路は、未熟な花芽の発達の瞬間から、その芽が成熟して開花する瞬間までの間に一時的に阻害される。好ましくは、植物または植物の一部は、ＭＲＮ－ＡＴＭ経路を阻害する化合物に、未熟な花芽の発達の瞬間からその芽が成熟して開花する瞬間までの間に一時的に曝露される。好ましくは、本発明の方法のステップａ）において、少なくとも１つの未熟な花芽を含む花序を用意する。好ましくは、上記花序は成熟した花芽を含まない。好ましくは、上記未熟な花芽はまだ花粉を形成していない。上記花序は、成熟した花芽を除去し、１つ以上の未熟な花芽のみを維持することによって得られる。

【0051】

好ましくは、第１の種子植物またはその植物の一部をＭＲＮ－ＡＴＭ経路阻害剤に接触させる前に、少なくとも１つの未熟な花芽を含む植物の一部を第１の種子植物から切り取る。好ましくは、ステップｂ）において、少なくとも１つの未熟な花芽を含む花序は、植物から切り取られたものである。好ましくは、その後、未熟な花芽を含む植物の一部は、その切断端が、ＭＲＮ－ＡＴＭ経路阻害剤を、ＭＲＮ－ＡＴＭ経路、好ましくは上記経路中のＭＲＮ複合体を阻害するのに有効な濃度で含む培地中に置かれるが、さらに好ましくは、上記濃度は、好ましくは植物花粉を生じさせる組織内および／または細胞内のＭｒｅ１１を阻害するのに有効である。好ましくは、上記培地は、未熟な芽を成熟させる培地である。このような培地は、Murashige T. and Skoog F., Physiol. Plant, 15, 473 (1962)に記載のビタミン含有ムラシゲ・スクーグであり得る。

【0052】

ステップｂ）のＭＲＮ－ＡＴＭ経路阻害剤の濃度は、有効濃度で存在する。有効濃度とは、本明細書においては、所望の効果を引き出すのに十分な、すなわち、花粉生存能力の向上および／または葯の開口をもたらす阻害剤の濃度として理解されるべきである。ＭＲＮ－ＡＴＭ経路阻害剤がミリンである場合、上記濃度は約５μＭ、４μＭ、３μＭ、２μＭ、１μＭ、９００ｎＭ、８００ｎＭ、７００ｎＭ、６００ｎＭ、５００ｎＭ、４００ｎＭ、３００ｎＭ、２００ｎＭ、１００ｎＭ、９０ｎＭ、８０ｍＭ、７０ｎＭ、６０ｎＭ、５０ｎＭ、４０ｎＭまたは３０ｎＭまでの濃度であり得、そして、上記濃度は少なくとも約１ｎＭ、２ｎＭ、３ｎＭ、４ｎＭ、５ｎＭ、６ｎＭ、７ｎＭ、８ｎＭ、９ｎＭ、１０ｎＭ、１１ｎＭ、１２ｎＭ、１３ｎＭ、１４ｎＭ、１５ｎＭ、１６ｎＭ、１７ｎＭ、１８ｎＭ、１９ｎＭまたは２０ｎＭの濃度であり得る。好ましくは、上記濃度は、約１ｎＭ～５μＭの間、約１ｎＭ～１μＭの間、約５ｎＭ～５００ｎＭの間、約５ｎＭ～１００ｎＭの間、約１０ｎＭ～１００ｎＭの間、約５ｎＭ～５０ｎＭの間、約１０ｎＭ～５０ｎＭの間または好ましくは約２０ｎＭ～３０ｎＭの間の範囲である。

【0053】

好ましくは、本発明の方法のステップａ）で用意する第１の種子植物またはその植物の一部の未熟花芽を、ステップｂ）で、上記花芽の成熟期間中、ＭＲＮ－ＡＴＭ経路阻害剤で、好ましくは本明細書に示された濃度で上記阻害剤を含む培地中で処理する。この処理は花粉形成前の未熟な花芽に効果を発揮し、花粉が形成された時にこの処理を終了してもよい。好ましくは、花芽が開いた場合、その花芽は成熟したと考えられる。好ましくは、花芽を、上記花芽を含む花序をＭＲＮ－ＡＴＭ経路阻害剤を本明細書に示された有効濃度で含む培地中に、上記花芽の成熟中、すなわち、花芽が未熟な時から花芽が開く時まで置くことによって、ＭＲＮ－ＡＴＭ経路阻害剤で処理する。

【0054】

植物花粉を生じさせる組織、好ましくは未熟な花芽を、ＭＲＮ－ＡＴＭ経路阻害剤で、好ましくは、少なくとも約１時間、２時間、４時間、６時間、８時間、１６時間、１日、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間または１０日間処理する。好ましくは、花芽を最長約２０日間、１９日間、１８日間、１７日間、１６日間、１５日間、１４日間、１３日間、１２日間、１１日間、１０日間、９日間、８日間、７日間、６日間、５日間、４日間、３日間、２日間または１日間処理する。植物花粉を生じさせる組織、好ましくは未熟な花芽を、好ましくは約１時間～２０日間、約１日～２０日間、約１日～１０日間、約５日～１５日間または約８日～１２日間の期間処理する。

【0055】

処理期間は花芽の成熟期間の持続時間に依存し得る。成熟期間は当業者によって既知であり得るか、決定され得る。場合により、未熟な花芽は成熟期間の一部の間のみ処理される。花芽の成熟期間は、好ましくは、少なくとも、前減数分裂期、第一減数分裂および場合により第二減数分裂を含む小胞子形成を含む。したがって、本発明の方法の化合物で未熟花芽を処理する期間は、好ましくは、少なくとも前減数分裂期および第一減数分裂を含む小胞子形成中であることが好ましく、場合により第二減数分裂中もである。

【0056】

処理は、花芽の完全な成熟期間中、例えばその期間の１００％の時間、またはその期間の一部、例えば未熟な花芽の成熟に必要な期間の約２０％、４０％、６０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％であり得る。

【0057】

ステップｃ）改良された生存能力を有する花粉の生成
本明細書では、改良された花粉生存能力とは、対照植物またはその植物の一部の花粉との比較において、本発明の方法によって処理された第１の種子植物またはその一部の向上した花粉生存能力として理解されるべきである。

【0058】

好ましくは、改良された花粉生存能力は、本発明の方法によって処理された植物花粉を生じさせる組織の花粉生存能力を、本明細書で対照組織としても表される、本発明の方法によって処理されていない植物花粉を生じさせる組織と比較することによって決定され得る。好ましくは、処理組織および対照組織は同じ種のものであり、好ましくは同じ植物のものである。好ましくは、処理組織および対照組織は類似のまたは同じ遺伝的背景を有する。

【0059】

好ましくは、改良された花粉生存能力は、本発明の方法によって処理された花芽の花粉生存能力を、本明細書で対照花芽としても表される、対照植物またはその植物の一部の花芽と比較することによって決定され得る。

【0060】

対照花芽は、本発明の方法の花芽と同等または同一の花芽であり、本発明の方法を受けていない点においてのみ異なる。本発明の方法が未熟な花芽を含む植物の一部を処理することを含む場合、類似の植物の一部が対照として機能し得る。上記類似の植物の一部は、同じまたは類似の植物のものであり得、好ましくは、上記類似の植物の一部は、本明細書に説明するようにはＭＲＮ－ＡＴＭ経路阻害剤と接触していない点を除いて、本発明の方法で処理された植物の一部と同じ処理を受けている。好ましくは、同じ発育段階の（対照）花芽を含む上記対照植物または植物の一部は、ＭＲＮ－ＡＴＭ経路阻害剤なしで、すなわち、ＭＲＮ－ＡＴＭ経路阻害剤の濃度がゼロではあるが、本発明の方法の植物または植物の一部と同じ培地に、同じ期間置かれる。類似の植物または植物の一部は、同じ種の植物もしくは植物の一部または同じ親植物の子孫であり得る。好ましくは、植物の一部は花序である。ステップａ）の植物の一部が植物の花序である場合、類似の植物または同じ植物の同等の花序を対照として使用することができる。向上した花粉生存能力は、好ましくは、本明細書に例示されるようなＭＴＴアッセイを使用して確立され得る、生存可能な花粉の増加として決定される。

【0061】

好ましくは、生存可能な花粉の増加は、生存可能な花粉の割合の増加であり、すなわち、花芽によって生成される花粉の総量に対する生存可能な花粉の量が増加する。好ましくは、生存可能な花粉の割合の増加とは、本明細書で定義される対照花芽によって生成される生存可能な花粉の割合との比較における増加である。好ましくは、向上した生存能力は、少なくとも約１％、２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％の増加である。

【0062】

加えて、またはあるいは、本発明の方法によって処理された花芽は、好ましくは本明細書に定義される対照花芽と比較して、開いた葯の数が増加している。開いた葯の数の増加とは、開いた葯の割合の増加であり得、すなわち、花芽によって生成された葯の総数に対する開いた葯の数が増加するということである。好ましくは、開いた葯の割合の増加とは、本明細書で定義される対照花芽によって生成される開いた葯の割合との比較における増加である。好ましくは、開いた葯の数の増加は、少なくとも約１％、２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％の増加である。

【0063】

あるいは、または加えて、本明細書で定義するようにＭＲＮ－ＡＴＭ経路阻害剤へ曝露した後、好ましくは、植物花粉を生じさせる組織によって生成された花粉の少なくとも約２％、４％、６％、８％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％が生存可能である。好ましくは、植物花粉を生じさせる組織によって生成された花粉の約９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、８％、６％、４％、２％未満または約１％未満が生存不能である。

【0064】

この向上した花粉生存能力はＭＴＴアッセイによって決定でき、花粉の代謝活性が示される。好ましくは、本発明の方法によって処理されていない、植物花粉を生じさせる組織からの花粉の総量のわずか５％、４％、３％、２％、１％、０．９％、０．８％、０．７％、０．６％、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％、０．１％、０．０１％、０．０１％、０．００１％または０．０００１％とは対照的に、本発明の方法によって処理された、植物花粉を生じさせる組織からの花粉の総量の少なくとも０．００１％、０．０１％、０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、２０％、３０％または４０％は生存可能である。

【0065】

あるいは、または加えて、本明細書で定義されるように植物花粉を生じさせる組織をＭＲＮ－ＡＴＭ経路阻害剤へ曝露した後、好ましくは、形成された葯の少なくとも約２％、４％、６％、８％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％は開いた葯である。好ましくは、形成された葯の約９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、８％、６％、４％、２％未満または約１％未満が閉じたままである。

【0066】

好ましくは、増加した生存可能な花粉の量および／または増加した開いた葯の数は、上記植物の稔性を向上させる。したがって、本発明の方法は、植物の稔性を高める方法であるとも考えられる。

【0067】

本発明の方法のステップａ）の植物または植物の一部、好ましくは植物花粉を生じさせる組織、好ましくは未熟な花芽、好ましくは花序を本発明の方法のＭＲＮ－ＡＴＭ経路阻害剤で処理した後または処理すると同時に、本方法は上記植物または植物の一部に成熟花粉を発育させるステップをさらに含むことができる。このような成熟花粉または熟した花粉は、その後、受粉に効果的に使用することができる。

【0068】

本発明の方法においてＭＲＮ－ＡＴＭ経路阻害剤で処理した植物の一部が植物の残りの部分から切り離されている場合、この処理した植物の一部は、その後、さらに成熟し植物全体に成長するために、別の植物の一部に接ぎ木され得る。好ましくは、本発明の方法によって処理する植物の一部は、その後台木に穂木として接ぎ木される花序である。好ましくは、上記植物の一部は穂木である。

【0069】

好ましい実施形態では、台木およびＭＲＮ－ＡＴＭ阻害剤処理した穂木は、同じまたは類似の植物、好ましくは同じ属、場合により同じ種の植物に由来する。好ましくは、台木および穂木は両方とも同じ親交配の子孫植物に由来する。別の実施形態では、ＭＲＮ－ＡＴＭ阻害剤処理した穂木は、台木を提供する植物とは異なる種に由来するが、穂木および台木は、生存可能な接ぎ木を形成できるようなものである。接ぎ木はその後さらに発育し得、花粉は、収集され得、かつ／またはその後の受粉、好ましくは他家受粉もしくは自家受粉のために使用でき得る段階にまで成熟し得る。

【0070】

本明細書でミリンを用いて例示したように、未熟な花芽を含む植物の一部を化合物で処理し、続いてその処理部分を台木、好ましくは同じ属の台木に穂木として接ぎ木し、その後花芽を接ぎ木された植物の一部として首尾よく完全に成熟させることは、花粉生存能力を向上させる本発明の方法を超える方法であると考えることができる。当業者は、このような方法が、花芽の初期発達の間、好ましくは花粉の初期発生の間の過程に影響を与える任意の化合物でそのような植物の一部を処理することへの使用に適しており、例えば危険および／もしくは有害であるから、または高価もしくは希少であるから、好ましくは少量で使用されることを理解する。特に、
（ｉ）未熟な花芽、好ましくは花序を含む植物の一部を単離するステップと；
（ｉｉ）上記植物の一部を、花芽の初期発達中、好ましくは花粉の初期発生中の過程に影響を与える化合物と接触させるステップと；
（ｉｉｉ）上記植物の一部を穂木に接ぎ木して生存可能な接ぎ木を形成するステップと；
（ｉｖ）上記接ぎ木を、好ましくは稔性のある花粉を含む、稔性のある植物に生育させるステップと
を含む、稔性のある植物の接ぎ木を発育させる方法を提供する。

【0071】

化合物は、好ましくは、植物の配偶子の発生、好ましくは花粉の発生における減数分裂の過程に影響を与える化合物である。好ましくは、植物を、花芽の成熟初期中、好ましくは少なくとも前減数分裂期および第一減数分裂を含む小胞子形成中に、そして場合により第二減数分裂中にも上記化合物と接触させる。

【0072】

本発明の方法は、成熟花粉を単離するステップをさらに含み得る。好ましくは、成熟した生存可能な花粉を含んでいる葯は開いている。あるいは、閉じている葯を開いて花粉を露出させることもあり得る。生存可能な花粉を、例えば：ふるい分け、遠心分離または蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）といった様々な方法を通じて選択することができるが、これらに限定されない。好ましくは、生存可能な花粉を収集する方法は、生存不能な花粉の画分を捨てるステップを含む。好ましくは、生存可能な花粉を収集する方法は、生存不能である可能性がある、生存可能な花粉より小さな、およびまたは大きな花粉を捨てつつ、生存可能な花粉と同等または等しいサイズの花粉の画分を選択するステップを含む。

【0073】

さらなる実施形態では、生存可能な成熟花粉は、第１の種子植物および（自家受粉）／または第２の植物（他家受粉）を受粉させるために使用され、場合により、単離された生存可能な成熟花粉が使用される。受粉は好ましくは種子の発生をもたらす。第２の植物は、好ましくは第２の種子植物である。第２の植物は、第１の植物の親の一方と同じ種の植物であり得る。場合により、第２の植物は、第１の種子植物の親植物、すなわち、母植物または父植物である。第２の植物は、第１の植物と同じ種であり得る。受粉は戻し交配である場合がある。場合により、第２の植物は第１の植物と同じ植物である。受粉は自家受粉であり得る。第１の植物が種間雑種である場合、第２の植物は同様の種間雑種であり得る、すなわち、第１の植物の親植物と同じ種の親植物を有し、場合によっては同じ親植物を有し得る。本発明の方法により得られる生存可能な花粉を使用する受粉ステップは、交配、戻し交配および自家受粉であり得るが、これらに限定されない。

【0074】

第２の植物は、好ましくは、本発明の方法によって得られる第１の植物の生存可能な花粉を使用した第１の植物と第２の植物間の交配の発芽のための胚珠を提供する。好ましくは、第２の植物は、本発明の方法の第１の植物と同じ植物またはそのシブリング（sibling）である。

【0075】

この方法は、種子発生のステップおよび場合により後代植物生産のステップをさらに含み得る。

【0076】

場合により、本発明の方法は、植物の生産のための本質的に生物学的なステップを含まない。

【0077】

さらなる側面において、本発明は、花粉生存能力を向上させるための本明細書に定義されるＭＲＮ－ＡＴＭ経路阻害剤の使用を提供する。好ましくは、上記花粉は、本明細書で定義される種間雑種に由来する。好ましくは、上記ＭＲＮ－ＡＴＭ経路阻害剤はＭＲＮ複合体阻害剤、より好ましくはＭｒｅ１１阻害剤、さらに好ましくは２－アミノ－５－［（４－ヒドロキシフェニル）メチレン］－４（５Ｈ）－チアゾロンまたはその誘導体である。

【0078】

さらなる側面では、本発明は、本明細書で提供する本発明の方法によって得られる生存可能な花粉を提供する。好ましくは、花粉は改良された生存能力を有する。好ましくは、花粉は成熟花粉である。場合により、花粉は単離された花粉、好ましくは単離された成熟花粉である。好ましくは、花粉は種間雑種の花粉である。好ましくは、花粉は種間雑種のものであり、（本発明の方法を実施する前に）その植物の花粉の少なくとも１０％は生存不能である。好ましくは、花粉は、さもなければ不稔である種間雑種のものである。言い換えれば、好ましくは、本発明の花粉は、本発明の方法に従って処理されていない植物、好ましくは種間雑種またはその一部の花粉とは対照的に、生存能力がある、または向上した生存能力を有することを特徴とする。

【0079】

場合により、本発明の花粉は、ＭＲＮ－ＡＴＭ経路阻害剤に起因または関連する、好ましくは、ＭＲＮ複合体阻害剤による処理に起因または関連する、より好ましくは、Ｍｒｅ１１阻害剤による処理に起因または関連する、１つ以上のゲノム変化を有する。好ましくは、生存可能な花粉は、２－アミノ－５－［（４－ヒドロキシフェニル）メチレン］－４（５Ｈ）－チアゾロンまたはその誘導体による処理に起因または関連する１つ以上のゲノム変化を有する。場合により、生存可能な花粉は、ＭＲＮ－ＡＴＭ経路が阻害されており、ＭＲＮ複合体が阻害されており、かつ／またはＭｒｅ１１活性が阻害されていることを特徴とし得る。場合により、本発明の生存可能な花粉は、２－アミノ－５－［（４－ヒドロキシフェニル）メチレン］－４（５Ｈ）－チアゾロンまたは微量の２－アミノ－５－［（４－ヒドロキシフェニル）メチレン］－４（５Ｈ）－チアゾロンを含むことを特徴とする。

【0080】

一側面では、本発明は、本明細書で定義する改良された生存能力を有する花粉を含む植物、植物の一部、花芽および花序のうちの少なくとも１つに関する。

【0081】

一側面では、本発明は、本明細書で定義する方法ステップを使用して改良された花粉生存能力を有する第１の種子植物を生産するための方法に関する。好ましくは、この方法は：
ａ）植物花粉を生じさせる組織を含む第１の種子植物または植物の一部を用意するステップと；
ｂ）ステップａ）の植物またはその一部の少なくとも一部分においてＭＲＮ－ＡＴＭ経路を阻害するステップと；
ｃ）接触させた組織に改良された生存能力を示す花粉を生成させるステップと
を含む。

【0082】

ステップａ）で植物の一部を用意する場合、本方法は、本明細書に定義されるように、上記植物の一部を台木に接ぎ木するステップをさらに含み得る。好ましくは、用意する植物の一部は穂木である。好ましくは、植物花粉を生じさせる組織は未熟な花芽の一部である。好ましくは、未熟な花芽は花序の一部である。したがって、好ましくは、ステップａ）の植物の一部は花序である。

【0083】

一側面では、本発明は、改良された生存能力を有する花粉を含む種子植物に関し、ここで、種子植物は本明細書に定義される本発明の方法によって入手可能である。種子植物は種間雑種および／または接ぎ木であり得る。場合により、本発明の種子植物は、花粉が改良された生存能力を有することを除いて、本明細書で定義される第１の種子植物と同一である。

【0084】

好ましくは、改良された生存能力を有する花粉を含む種子植物は、本質的に生物学的な過程によって得られないか、それのみによって得られるわけではない。好ましくは、本発明の種子植物は、技術的なステップを含む方法によって得られる。好ましくは、改良された生存能力を有する花粉を含む種子植物は人工のものである。

【0085】

一側面では、本発明は、改良された生存能力を有する花粉を使用して生産された種子および／または子孫に関し、ここで、花粉は、本明細書に定義される本発明の方法によって入手可能である。上記花粉は父親として使用される。種子生産に使用される母親は、好ましくは、本明細書で定義する第１および第２の植物のうちの少なくとも１つである。

【0086】

さらなる側面では、受粉による子孫の生成における本発明の改良された生存能力を有する花粉の使用を提供する。受粉は、好ましくは、自家受粉および他家受粉の少なくとも一方である。

【0087】

さらなる側面では、本発明は、ＭＲＮ－ＡＴＭ経路を阻害する化合物を含む農業用担体に関し、好ましくは、化合物は２－アミノ－５－［（４－ヒドロキシフェニル）メチレン］－４（５Ｈ）－チアゾロンまたはその誘導体である。好ましくは、農業用担体中の上記化合物の濃度は約５μＭ、４μＭ、３μＭ、２μＭ、１μＭ、９００ｎＭ、８００ｎＭ、７００ｎＭ、６００ｎＭ、５００ｎＭ、４００ｎＭ、３００ｎＭ、２００ｎＭ、１００ｎＭ、９０ｎＭ、８０ｍＭ、７０ｎＭ、６０ｎＭ、５０ｎＭ、４０ｎＭまたは３０ｎＭであり、そして、少なくとも約１ｎＭ、２ｎＭ、３ｎＭ、４ｎＭ、５ｎＭ、６ｎＭ、７ｎＭ、８ｎＭ、９ｎＭ、１０ｎＭ、１１ｎＭ、１２ｎＭ、１３ｎＭ、１４ｎＭ、１５ｎＭ、１６ｎＭ、１７ｎＭ、１８ｎＭ、１９ｎＭまたは２０ｎＭの濃度であり得る。好ましくは、上記濃度は約１ｎＭ～５μＭの間、約１ｎＭ～１μＭの間、約５ｎＭ～５００ｎＭの間、約５ｎＭ～１００ｎＭの間、約１０ｎＭ～１００ｎＭの間、約５ｎＭ～５０ｎＭの間、約１０ｎＭ～５０ｎＭの間の範囲、または好ましくは約２０ｎＭ～３０ｎＭの間である。好ましい農業用担体は、植物生育培地、土壌、肥料、植物ベースの油および保湿剤からなる群から選択される。好ましくは、農業用担体は植物生育培地である。

【0088】

植物生育培地または植物組織培養生育培地は、好ましくは植物の生存能力をサポートし、かつ／または植物の生育を促進する。植物生育培地は、好ましくは植物の生育を促進し、好ましくは植物の根および植物のシュートのうちの少なくとも１つの発育を促進する。植物生育培地は、好ましくは、少なくとも（マクロ）栄養素を含む。植物生育培地は、硝酸塩、寒天、糖、ビタミンおよび成長調節剤のうちの少なくとも１つを含み得る。好ましい成長調節剤は、限定されないがＩＡＡなどのオーキシンおよび限定されないがカイネチンなどのサイトカイニンである。好ましい生育培地はMurashige T. and Skoog F., supraに記載のムラシゲ・スクーグである。

【図面の簡単な説明】

【0089】

【図1】０．５ＭＳ培地および適切な濃度のミリンを含むガラス管内に調製したＡＣ雑種の葯が入れられた実験セットアップの概要を示す図である。

【図2】生存不能な花粉（茶色）と混合されている生存可能な花粉（紫色）の例を示す図である。

【図3】アブラナ（B.rapa）×ヤセイカンラン（B.oleracea）の雑種の未熟な花芽に適用した様々な濃度のミリンの範囲を示す図である。生存可能な花粉粒は、生存可能な花粉を紫色に染色する２，５－ジフェニルモノテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）アッセイを用いて視覚化されている。２０ｎＭという低量のミリンにより、より多くの数の生存可能な花粉粒がもたらされた。濃度が高くなると、より大きいが、生存不能な花粉がもたらされた。

【図4】２０ｎＭミリンを適用した後のアブラナ（B.rapa）×ヤセイカンラン（B.oleracea）交配の開いた葯を示す図である。通常、この交配のＦ_１は開いた葯を形成しない。

【実施例】

【0090】

[実施例１]
ミリンの適用は種間雑種において稔性を向上させる
本発明者らは、ヤセイカンラン（Brassica oleracea）とアブラナ（Brassica rapa）の交配からのＡＣ種間雑種の花序をミリンで処理することにより、生存可能な花粉粒がより高頻度で得られ、そしてより大きな生存可能な花粉粒がもたらされることを発見した。ヤセイカンラン（B.oleracea）とアブラナ（B.rapa）の種間ＡＣ雑種は不稔であることが知られているため、これは驚くべきことである。

【0091】

父としてカイラン（Brassica oleracea var. albograbra）（Ｃゲノム）、母としてアブラナ バー アルボグラブラ（Brassica rapa var. albograbra）（Ａゲノム）の間の種間雑種（ＡＣ）を、つぼみ受粉および胚救出によって調製した。ヤセイカンラン（B.oleracea）およびアブラナ（B.rapa）親系統を２０～２２℃の温室内で１２時間の日長で温室内で生育させた。植物が開花した後、アブラナ（B.rapa）を除雄し、ヤセイカンラン（B.oleracea）から人工受粉で受粉させた。

【0092】

他家受粉の５～９日後、球形またはハート形の胚段階まで発育した長角果を裂開し、胚救出のためのインビトロ条件に置いた。得られた胚を、１ｍｇ・ｍＬ^－１の６－ベンジルアミノプリンおよび０．０１ｍｇ・ｍＬ^－１のオーキシン（インドール－３－酢酸）を含むガンボーグＢ－５培地中に配置した。次いで、胚を、１２時間の光周期および昼１５℃／夜１０℃の温度サイクルの制御された条件に移した。最もよく発育した植物を温室に移し、花序が発達するまでさらなる実験のために生育させた。

【0093】

ミリンの濃度範囲を、３０ｍｌの０．５ムラシゲ・スクーグ（ＭＳ）培地中で最終濃度２０ｎＭから１μＭまで調製した。これを平底ガラス管に加え、パラフィルムで密封した。パラフィルムに小さな穴を開け、そこを通してＡＣ種間雑種の花序を１つ置いた。花序は、長角果、開いた花および成熟した花芽を全て除去し、非常に未熟な芽だけを残すことによって調製した。セットアップの概要は図１で見られる。得られたセットアップを、２３℃／２１℃（昼／夜）、１６Ｈ／８Ｈ（明所／暗所）の制御された条件下に１０日間置いた。開花した花の花粉を収集し、花粉の生存能力に対するミリンの影響を決定するために分析した。

【0094】

花粉生存能力を、標準化された２，５－ジフェニルモノテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）アッセイを用いて測定した。このアッセイはミトコンドリア活性に基づいており、生細胞は濃い紫色に変わるが、非生細胞は染色されないままとなる。手短に言えば、このアッセイでは、沈殿物を除去するためにろ過される、１％ＭＴＴの５％スクロースのミネラル除去Ｈ_２Ｏ（ｄｅｍｉ Ｈ_２Ｏ）溶液を使用する。この溶液は暗所にて４℃で保存する必要がある。ＭＴＴ溶液５０μＬをマイクロスライド上に滴下し、葯を針で開いて採取した少量の花粉をＭＴＴ液滴中に均一に分散させる。ガラス製カバースライドを適用し、室温で５～１０分間インキュベートすると、染色が見えるはずである（図２）。顕微鏡を使用すると、生存可能な花粉をスコア化できる。

【0095】

異なるミリン濃度で花粉を観察すると、低濃度のミリン（約２０ｎＭが最適）により生存可能な花粉の増加がもたらされることが示された（図３）。加えて、この濃度のミリンにより、葯が開くことが分かった（図４）。０．５μＭを超える濃度では、より大きいが、生存不能な花粉がもたらされることが分かった。

【0096】

[実施例２]
化学処理した花序を接ぎ木することにより温室内で完全な植物にまで成熟させる
アブラナ（Brassica rapa）台木の挿し木を、台木の葉および腋芽を全て取り除き、優勢なシュートのみを残すことにより調製した。実施例１で得られた化学処理した若い未熟花序をこれらの台木挿し木に接ぎ木した。接ぎ木のために、穂木先端と同様の厚さの台木を選択した。接ぎ木の前に、メスの刃（スワンモートン＃１０）を使用して台木のシュート先端または花序を切り落とした。接ぎ木前に、メスを切断端まで上方に移動させることによって、台木に垂直の切開を作成した。接ぎ木には台木を保持するのに十分な大きさのシリコンクリップを使用した。端をメスの刃で除去し、穂木の中央領域が無傷に保たれるように、穂木に楔またはＴを作成した。楔形／Ｔ形の穂木を台木の垂直切開部に配置し、シリコンクリップを、接ぎ木接合部を覆うように、優しく、しかししっかりと移動させた。少なくとも最初の数日間は湿度が約１００％になるように、接ぎ木した挿し木／植物をプラスチックのカバーで覆った。１週間後（７～９日後）、接ぎ木は治癒した。シリコンクリップを接ぎ木接合部から取り外した。プラスチックカバーを取り外し、化学処理した花序を通常通りに生育させた。この方法により、花芽を完全に成熟させることができた。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【国際調査報告】