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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-12-26
(54)【発明の名称】アミラーゼを含むホームケア組成物
(51)【国際特許分類】
C12N 9/28 20060101AFI20241219BHJP
C12N 9/56 20060101ALI20241219BHJP
C11D 3/386 20060101ALI20241219BHJP
C12N 15/10 20060101ALN20241219BHJP
C12N 15/57 20060101ALN20241219BHJP
C12N 15/56 20060101ALN20241219BHJP
C12N 1/21 20060101ALN20241219BHJP
C11D 10/02 20060101ALN20241219BHJP
【ＦＩ】
C12N9/28
C12N9/56
C11D3/386
C12N15/10 200Z
C12N15/57 ZNA
C12N15/56
C12N1/21
C11D10/02
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024534179
(86)(22)【出願日】2022-12-14
(85)【翻訳文提出日】2024-06-07
(86)【国際出願番号】 US2022081481
(87)【国際公開番号】W WO2023114792
(87)【国際公開日】2023-06-22
(31)【優先権主張番号】63/290,099
(32)【優先日】2021-12-16
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】590005058
【氏名又は名称】ザ プロクター アンド ギャンブル カンパニー
【氏名又は名称原語表記】ＴＨＥ ＰＲＯＣＴＥＲ ＆ ＧＡＭＢＬＥ ＣＯＭＰＡＮＹ
【住所又は居所原語表記】Ｏｎｅ Ｐｒｏｃｔｅｒ ＆ Ｇａｍｂｌｅ Ｐｌａｚａ， Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉ， ＯＨ ４５２０２，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ
(74)【代理人】
【識別番号】100110423
【弁理士】
【氏名又は名称】曾我 道治
(74)【代理人】
【識別番号】100111648
【弁理士】
【氏名又は名称】梶並 順
(74)【代理人】
【識別番号】100122437
【弁理士】
【氏名又は名称】大宅 一宏
(74)【代理人】
【識別番号】100209495
【弁理士】
【氏名又は名称】佐藤 さおり
(72)【発明者】
【氏名】ベル－ルージーヴィチ、カタルジナ・ドロタ
(72)【発明者】
【氏名】ジャクソン、ミシェル
(72)【発明者】
【氏名】モラレス・ガルシア、アナ・エル
(72)【発明者】
【氏名】ブハティ、マナシ
(72)【発明者】
【氏名】チャン、アマンダ
(72)【発明者】
【氏名】チャン、ホン・キット
(72)【発明者】
【氏名】ラッシラ、ジョナサン
(72)【発明者】
【氏名】リーフラング、クリス
(72)【発明者】
【氏名】レイマー、サンドラ・ダブリュー
(72)【発明者】
【氏名】トラン、パトリシア
【テーマコード（参考）】
4B065
4H003
【Ｆターム（参考）】
4B065AA15X
4B065AA15Y
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA01
4B065CA32
4B065CA57
4H003DA19
4H003EC01
4H003EC02
4H003EC03
4H003EE01
(57)【要約】
本発明は、界面活性剤及びアミラーゼを含むホームケア組成物に関する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
界面活性剤及びアミラーゼを含むホームケア組成物であって、前記アミラーゼは、親α－アミラーゼの組換え非天然変異体であり、前記変異体α－アミラーゼは、配列番号５と少なくとも８０％の同一性を有し、配列番号５に関して５１位及び／又は１２５位にアミノ酸置換を有する、ホームケア組成物。
【請求項2】
前記アミラーゼが、配列番号５に関してアミノ酸置換Ｔ５１Ｖ及びＳ１２５Ｒを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項3】
前記アミラーゼが、配列番号５に関して１７２位、２２７位及び／又は２３１位にアミノ酸置換を含む、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項4】
前記アミラーゼが、配列番号５に関してアミノ酸置換Ｎ１７２Ｑ、Ｎ２２７Ｒ及び／又はＦ２３１Ｌを含む、請求項３に記載の組成物。
【請求項5】
前記アミラーゼが、アミノ酸置換：配列番号５に関して
（ａ）Ｔ５１Ｖ＋Ｓ１２５Ｒ＋Ｆ２３１Ｌ；
（ｂ）Ｔ５１Ｖ＋Ｓ１２５Ｒ＋Ｎ１７２Ｑ＋Ｎ２２７Ｒ；又は
（ｃ）Ｎ２９Ｑ＋Ｔ５１Ｖ＋Ｓ１２５Ｒ＋Ｎ２２７Ｒ＋Ｓ２５３Ｌ＋Ｇ２７２Ｅ＋Ｋ３１９Ｒ＋Ｓ４１８Ａ、
を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項6】
アミノ酸置換Ｘ３９Ｅ、Ｘ９９Ｒ、Ｘ１２６Ａ、Ｘ１２７Ｅ及びＸ１２８Ｇを有するＢａｃｉｌｌｕｓ ｇｉｂｓｏｎｉｉ由来の変異体スブチリシンプロテアーゼを更に含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項7】
前記組成物は自動食器洗浄組成物である、請求項１～６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項8】
前記組成物が漂白系を含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項9】
前記組成物が、１，４，７－トリメチル－１，４，７－トリアザシクロノナン（Ｍｅ－ＴＡＣＮ）、１，２、４，７－テトラメチル－１，４，７－トリアザシクロノナン（Ｍｅ／Ｍｅ－ＴＡＣＮ）及びこれらの混合物から成る群から選択されるマンガン漂白触媒を含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項10】
前記組成物が、アシルトランスフェラーゼ、アミラーゼ、α－アミラーゼ、β－アミラーゼ、α－ガラクトシダーゼ、アラビナーゼ、アラビノシダーゼ、アリールエステラーゼ、β－ガラクトシダーゼ、β－グルカナーゼ、カラギナーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、コンドロイチナーゼ、クチナーゼ、ジスペルシン（dispersin）、エンドグルカナーゼ、エンド－β－マンナナーゼ、エキソ－β－マンナナーゼ、エステラーゼ、エキソ－マンナナーゼ、ガラクタナーゼ、グルコアミラーゼ、ヘミセルラーゼ、ヘキソサミニダーゼ、ヒアルロニダーゼ、ケラチナーゼ、ラッカーゼ、ラクターゼ、リグニナーゼ、リパーゼ、脂肪分解酵素、リポキシゲナーゼ、リゾチーム、マンナナーゼ、メタロプロテアーゼ、ヌクレアーゼ、オキシダーゼ、オキシドレダクターゼ、ペクチン酸リアーゼ、ペクチンアセチルエステラーゼ、ペクチナーゼ、ペントサナーゼ（pentosanases）、ペルヒドロラーゼ、ペルオキシダーゼ、ＰＥＴａｓｅｓ、フェノールオキシダーゼ、ホスファターゼ、ホスホリパーゼ、フィターゼ、ポリエステラーゼ、ポリガラクツロナーゼ、追加のプロテアーゼ、プルラナーゼ、レダクターゼ、ラムノガラクツロナーゼ（rhamnogalacturonases）、タンナーゼ、トランスグルタミナーゼ、キシランアセチルエステラーゼ、キシラナーゼ、及びキシロシダーゼ；並びにそれらの組合せから選択される１以上の他の酵素を含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項11】
前記１以上の酵素がプロテアーゼを含み、前記プロテアーゼが、Ｓ０３９Ｅ、Ｓ０９９Ｒ、Ｓ１２６Ａ、Ｄ１２７Ｅ、及びＦ１２８Ｇから成る群から選択される３個、４個、又は５個のアミノ酸置換を含むスブチリシン変異体であり、Ｎ７４Ｄ、Ｔ１１４Ｌ、Ｍ１２２Ｌ、Ｎ１９８Ａ、Ｎ１９８Ｇ、Ｍ２１１Ｅ、Ｍ２１１Ｑ、Ｎ２１２Ｑ、及びＮ２４２Ｄから成る群から選択される１以上の追加の置換を更に含み、前記変異体が、配列番号６のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有する、請求項１０に記載の組成物。
【請求項12】
前記１以上の酵素がプロテアーゼを含み、前記プロテアーゼが（ｉ）Ｓ０３９Ｅ、Ｎ７４Ｄ、Ｓ０９９Ｒ、Ｍ２１１Ｅ、Ｎ２４２Ｄから成る群から選択される２以上のアミノ酸置換；及び
（ｉｉ）Ｔ１１４Ｌ、Ｍ１２２Ｌ、Ｓ１２６Ａ、Ｆ１２８Ｇ、Ｎ１９８Ａ、Ｎ１９８Ｇ、Ｍ２１１Ｑ、Ｎ２１２Ｑから成る群から選択される１以上の追加の置換を含むスブチリシン変異体であり、
前記変異体は、配列番号６又は７のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有する、請求項１０に記載の組成物。
【請求項13】
前記１以上の酵素がプロテアーゼを含み、前記プロテアーゼが、（ａ）配列番号６の配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有し、Ａ３７Ｔ、Ｓ３９Ｅ、Ｉ４３Ｖ、Ａ４７Ｖ、Ｐ５４Ｔ、Ｔ５６Ｙ、Ｉ８０Ｖ、Ｎ８５Ｓ、Ｅ８７Ｄ、Ｓ９９Ｒ、Ｔ１１４Ｑ、Ｍ１２２Ｌ、Ｓ１２６Ａ、Ｄ１２７Ｅ、Ｆ１２８Ｇ、Ｎ１９８Ａ、Ｍ２１１Ｑ、Ｎ２１２Ｑ及びＮ２４２Ｄから選択される３以上の置換を含むプロテアーゼであって、ナンバリングは配列番号６による、プロテアーゼ；
（ｂ）配列番号８の配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有し、Ｑ１２Ｌ、Ｉ２１Ｖ、Ｉ４３Ｖ、Ｍ１２２Ｌ、Ｄ１２７Ｐ、Ｎ１５４Ｓ、Ｔ１５６Ａ、Ｇ１６０Ｓ、Ｎ１７７Ｖ、Ｍ２１１Ｎ、Ｍ２１１Ｓ、Ｍ２１１Ｌ、Ｐ２１２Ｄ、Ｐ２１２Ｈ、Ａ２２２Ｓ、Ｖ２２８Ｉ及びＴ２４７Ｎから選択される１以上の置換を含むプロテアーゼであって、ナンバリングは配列番号８による、プロテアーゼ；及び
（ｃ）配列番号９の配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有し、Ｓ９Ｒ、Ａ１５Ｔ、Ｇ５９Ｅ、Ｖ６６Ａ、Ｈ１１８Ｎ、Ａ１８８Ｐ、Ｖ１９９Ｉ、Ｑ２００Ｅ、Ｎ２１２Ｄ、Ｑ２３９Ｒ、Ｎ２５５Ｄから選択される３以上の置換を含むプロテアーゼであって、ナンバリングは配列番号９におる、プロテアーゼ、から成る群から選択される、請求項１０に記載の組成物
【請求項14】
洗浄を必要とする表面又は物品を、有効量の請求項１～１３のいずれか一項に記載の組成物と接触させる工程を含み、任意に、前記表面又は物品を前記変異体又は酵素組成物と接触させた後に前記表面又は物品をすすぐ工程を更に含む、洗浄方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ホームケア組成物の分野に属する。特に、本発明は、自動食器洗浄洗剤組成物に関する。
【背景技術】
【0002】
デンプンは、アミロース（１５～３０％ｗ／ｗ）及びアミロペクチン（７０～８５％ｗ／ｗ）の混合物から成る。アミロースは、約６００００～約８０００００の分子量（ＭＷ）を有するα－１，４－結合グルコース単位の直鎖から成る。アミロペクチンは、２４～３０グルコース単位ごとにα－１，６－分枝点を含有する分岐ポリマーであり、そのＭＷは、１億もの高さであってもよい。
【0003】
α－アミラーゼは、内部のα－１，４－グルコシド結合をランダムに切断することによって、デンプン、グリコーゲン、及び関連する多糖類を加水分解する。α－アミラーゼ、特にバチルス（Bacilli）由来のα－アミラーゼは、デンプン液化及び糖化、紙及びパルプ産業におけるデンプンの改質、醸造、ベーキング、食品産業用のシロップの製造、発酵プロセス用の供給原料の製造、並びに消化性を増加させるための動物飼料を含む、様々な異なる目的のために使用されてきた。これらの酵素はまた、食器洗浄中にデンプン質の汚れ（soils）及び汚れ（stains）を除去するために使用することができる。
【0004】
α－アミラーゼによるデンプンの加水分解によって生成される生成物は、隣接するグルコース分子の数に関して変化する。ほとんどの市販のα－アミラーゼは、グルコース（Ｇ１）からマルトヘプタオース（Ｇ７）までの一連の生成物を生成する。完全に明確ではない理由から、かなりの量のマルトペンタオース及びマルトヘキサオースを生成するα－アミラーゼは、洗剤洗浄組成物への組み込みを含む特定の商業的用途に特に有用であると思われる。多くの刊行物には、マルトペンタオース／マルトヘキサオース生成α－アミラーゼなどにおける変異が記載されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
それにも関わらず、より強固でより良好に機能する遺伝子操作されたα－アミラーゼ分子に対する必要性が存在し続けている。
【課題を解決するための手段】
【0006】
本発明は、界面活性剤及びアミラーゼを含むホームケア組成物であって、アミラーゼが親α－アミラーゼの組換え非天然変異体であり、変異α－アミラーゼは配列番号５と少なくとも８０％の同一性、好ましくは少なくとも８５％の同一性、好ましくは少なくとも８６％の同一性、好ましくは少なくとも８７％の同一性、好ましくは少なくとも８８％の同一性、好ましくは少なくとも８９％の同一性、好ましくは少なくとも９０％の同一性、好ましくは少なくとも９５％の同一性、好ましくは少なくとも９６％の同一性、好ましくは少なくとも９７％、好ましくは少なくとも９８％の同一性、好ましくは少なくとも９９％の同一性を有し、配列番号５に関して５１位及び／又は１２５位にアミノ酸置換を有する、ホームケア組成物に関する。
【図面の簡単な説明】
【0007】
【図1-1】４個のα－アミラーゼのアラインメントを示す図である。
【図1-2】４個のα－アミラーゼのアラインメントを示す図である。
【図2】α－アミラーゼＡＡ２５６０におけるアミノ酸５１及び１２５の位置を示す。
【発明を実施するための形態】
【0008】
ホームケア組成物
本発明は、ホームケア組成物を包含する。
本発明は、ホームケア組成物を包含する。
【0009】
ホームケア組成物とは典型的には、消費者用及び施設用組成物を意味し、食器洗浄、及び硬質表面洗浄組成物、他の洗浄剤、及び無生物表面のケア及び洗浄のための洗浄システム全て、並びにエアケア組成物が含まれるがこれらに限定されない。
【0010】
組成物は、ホームケア組成物である。ホームケア組成物とは典型的には、消費者用及び施設用組成物を意味し、食器洗浄、及び硬質表面洗浄組成物、他の洗浄剤、及び無生物表面のケア及び洗浄のための洗浄システム全て、並びに家庭のケア及びメンテナンス用に特に設計された他の組成物が含まれるが、これらに限定されない。
【0011】
特に、組成物は、自動食器洗浄組成物である。組成物は、アミラーゼを含む。
【0012】
組成物は典型的には、洗浄組成物である。洗浄組成物及び洗浄配合物には、任意の物体、物品、及び／又は表面を洗浄、漂白、消毒、及び／又は滅菌するのに適した任意の組成物が含まれる。このような組成物及び配合物としては、例えば、洗浄又は洗剤組成物（例えば、液体、錠剤、ゲル、バー、顆粒、及び／又は固体洗浄又は洗剤組成物；ガラス、木材、セラミック及び金属の調理台及び窓用などの硬質表面洗浄組成物及び配合物；カーペットクリーナー；オーブンクリーナー；手洗い（hand）又は手動（manual）食器洗浄組成物を含む食器洗浄組成物（例えば、「手洗い」又は「手動」食器洗浄洗剤）及び自動食器洗浄組成物（例えば、「自動食器洗浄洗剤」））を含む液体及び／又は固体組成物が挙げられるが、これらに限定されない。単一用量単位形態もまた、本発明での用途が見出され、これには、丸剤、錠剤、ゲルキャップ、又は予め測定された粉末若しくは液体などの他の単一用量単位が挙げられるが、これらに限定されない。
【0013】
洗浄組成物又は洗浄配合物には、本明細書で使用される場合、別段の記載がない限り、顆粒状又は粉末状の汎用洗浄剤又は強力洗浄剤、特に洗浄洗剤；液体、顆粒、ゲル、固体、錠剤、ペースト、又は単位剤形の汎用洗浄剤、特にいわゆる強力液体（ＨＤＬ）洗剤又は強力乾燥（ＨＤＤ）洗剤タイプ；高発泡タイプのものを含む、手洗い用又は手動食器洗浄剤；家庭用及び施設用の様々な錠剤、粉末、固体、顆粒、液体、ゲル、及びすすぎ助剤タイプを含む、手洗い若しくは手動食器洗浄、自動食器洗浄、又は食卓用皿類（dishware）若しくは食卓用食器（tableware）洗浄剤；抗菌手洗いタイプ、クリーニングバー、洗口剤、義歯洗浄剤、カーシャンプー又はカーペットシャンプー、浴室用洗剤を含む、液体の洗浄及び除菌剤；ヒト及び他の動物用のヘアシャンプー及び／又はヘアリンス；シャワージェル及びフォームバス、並びに金属洗浄剤；並びに、漂白用補助剤及び「しみ抜きスティック」又は前処理タイプ等の洗浄補助剤が含まれる。いくつかの実施形態では、顆粒組成物は「コンパクト」形態であり；いくつかの実施形態では、液体組成物は「濃縮」形態である。
【0014】
「洗剤組成物」又は「洗剤配合物」という用語は、汚れた（soiled）又は汚い（dirty）対象を洗浄するために洗浄媒体中で使用することを意図する組成物に関連して使用される。いくつかの実施形態では、本開示の洗剤は、本明細書に記載の１以上のアミラーゼ、加えて、１以上の界面活性剤、トランスフェラーゼ、加水分解酵素、オキシドレダクターゼ、ビルダー（例えば、ビルダー塩）、漂白剤、漂白活性化剤、青味剤、蛍光染料、ケーキング阻害剤、マスキング剤、酵素安定剤、カルシウム、酵素活性化剤、抗酸化剤、及び／又は可溶化剤を含む。いくつかの例では、ビルダー塩は、ケイ酸塩とリン酸塩との混合物であり、好ましくは、リン酸塩（例えば、トリポリリン酸ナトリウム）よりもケイ酸塩（例えば、メタケイ酸ナトリウム）が多い。いくつかの実施形態は、いかなるリン酸塩（例えば、リン酸塩又はリン酸塩ビルダー）も含有しない洗浄組成物又は洗剤組成物に関する。
【0015】
「補助材料」という用語は、本明細書に記載のアミラーゼ、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片以外の、洗浄組成物に含まれる任意の液体、固体、又は気体材料を指す。いくつかの実施形態では、本開示の洗浄組成物は、１以上の洗浄補助材料を含む。各洗浄補助材料は典型的には、洗浄組成物の特定のタイプ及び形態（例えば、液体、顆粒、粉末、バー、ペースト、スプレー、錠剤、ゲル、フォーム、又は他の組成物）に応じて選択される。好ましくは、各洗浄補助材料は、組成物に使用されるアミラーゼ酵素と適合性である。
【0016】
「ホウ素を実質的に含まない組成物」又は「ホウ素を実質的に含まない洗剤」という語句はそれぞれ、おそらく他の組成物又は洗剤成分由来の、微量のホウ素、例えば、約１０００ｐｐｍ未満（１ｍｇ／ｋｇ又はリットル＝１ｐｐｍ）、約１００ｐｐｍ未満、約５０ｐｐｍ未満、約１０ｐｐｍ未満、又は約５ｐｐｍ未満、又は約１ｐｐｍ未満のホウ素を含有する組成物又は洗剤を指す。
【0017】
「漂白」という用語は、材料の増白（すなわち、白化）及び／又は洗浄をもたらすのに十分な長さの時間及び／又は適切なｐＨ及び／又は温度条件下での材料又は表面の処理を指す。漂白に適した化学物質の例としては、例えば、ＣｌＯ２、Ｈ２Ｏ２、過酸、ＮＯ２などが挙げられるが、これらに限定されない。漂白剤には、ペルヒドロラーゼ及びアリールエステラーゼなどの酵素漂白剤も含まれる。別の実施形態は、本明細書に記載の１以上のアミラーゼ及び、例えば国際公開第２００５／０５６７８２号、国際公開第２００７／１０６２９３号、国際公開第２００８／０６３４００号、国際公開第２００８／１０６２１４号及び国際公開第２００８／１０６２１５号に記載されている１以上のペルヒドロラーゼを含む組成物に関する。
【0018】
プロテアーゼ（例えば、本明細書に記載の１以上のアミラーゼ、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片）の「洗浄性能」という用語は、本明細書に記載の１以上のアミラーゼを組成物に添加していない洗剤と比較して、洗剤に追加の洗浄性能を提供する、本明細書に記載の１以上のアミラーゼの洗浄への寄与を指す。洗浄性能を適切な洗浄条件下で比較する。いくつかの試験系では、洗剤組成物、泡濃度、水硬度、洗浄機構、時間、ｐＨ、及び／又は温度などの他の関連因子は、特定の市場セグメント（例えば、手洗い又は手動食器洗浄、自動食器洗浄、食卓用皿類洗浄、食卓用食器洗浄など）における家庭用途に典型的な条件（複数可）を模倣するように制御することができる。
【0019】
「関連する洗浄条件」という語句は、手洗い食器洗浄、自動食器洗浄洗剤市場セグメントにおいて家庭で実際に使用される条件、特に、洗浄温度、時間、洗浄機、泡濃度、洗剤の種類、及び水硬度を示すために本明細書で使用される。
【0020】
「食器洗浄」という用語は、家庭用及び工業用食器洗浄の両方を指し、自動食器洗浄（例えば、食器洗浄機における）及び手動食器洗浄（例えば、手洗い）の両方に関する。
【0021】
「消毒する」という用語は、表面からの汚染物質の除去、並びに物品の表面上の微生物の阻害又は死滅を指す。
【0022】
本明細書の洗浄組成物の「コンパクト」形態という用語は、密度によって、及び組成に関しては、無機充填剤塩の量によって最もよく反映される。無機充填剤塩は、粉末形態の洗剤組成物の従来の成分である。従来の洗剤組成物において、充填剤塩は、かなりの量で、典型的には全組成物の約１７～約３５重量％で存在する。対照的に、コンパクト組成物では、充填剤塩は、全組成物の約１５％を超えない量で存在する。いくつかの実施形態では、充填剤塩は、組成物の約１０重量％、又はより好ましくは約５重量％を超えない量で存在する。いくつかの実施形態では、無機充填剤塩は、硫酸塩及び塩化物のアルカリ及びアルカリ土類金属塩から選択される。いくつかの実施形態では、充填剤塩は硫酸ナトリウムである。
【0023】
アミラーゼ
典型的には、本発明の組成物及び方法は、変異体マルトペンタオース／マルトヘキサオース形成アミラーゼポリペプチド、及びその使用方法に関する。本発明の組成物及び方法の態様及び実施形態を、以下の別々に番号付けされた段落に要約する。
典型的には、本発明の組成物及び方法は、変異体マルトペンタオース／マルトヘキサオース形成アミラーゼポリペプチド、及びその使用方法に関する。本発明の組成物及び方法の態様及び実施形態を、以下の別々に番号付けされた段落に要約する。
【0024】
親α－アミラーゼの組換え非天然変異体であって、変異体α－アミラーゼが、配列番号５と少なくとも８０％の同一性、好ましくは少なくとも８５％の同一性、好ましくは少なくとも８６％の同一性、好ましくは少なくとも８７％の同一性、好ましくは少なくとも８８％の同一性、好ましくは少なくとも８９％の同一性、好ましくは少なくとも９０％の同一性、好ましくは少なくとも９５％の同一性、好ましくは少なくとも９６％の同一性、好ましくは少なくとも９７％の同一性、好ましくは少なくとも９８％の同一性、又は好ましくは少なくとも９９％の同一性を有し、配列番号５に関して５１位及び／又は１２５位にアミノ酸置換を有する、変異体が提供される。
【0025】
変異体α－アミラーゼは、配列番号５に関して５１位及び１２５位にアミノ酸置換を有してもよい。
【0026】
変異体α－アミラーゼは、配列番号５に関してアミノ酸置換Ｔ５１Ｖ及び／又はＳ１２５Ｒを有してもよい。
【0027】
変異体α－アミラーゼは、配列番号５に関してアミノ酸置換Ｔ５１Ｖ及びＳ１２５Ｒを有してもよい。
【0028】
変異体α－アミラーゼは、配列番号５に関して１７２、２２７及び／又は２３１位に１以上、又は２以上のアミノ酸置換を更に含んでもよい。
【0029】
変異体α－アミラーゼは、配列番号５に関して１７２、２２７及び２３１位にアミノ酸置換を更に含んでもよい。
【0030】
変異体α－アミラーゼは、配列番号５に関して、アミノ酸置換Ｎ１７２Ｑ、Ｎ２２７Ｒ及び／又はＦ２３１Ｌのうちの１以上、又は２以上を更に含んでもよい。
【0031】
変異体α－アミラーゼは、配列番号５に関してアミノ酸置換Ｎ１７２Ｑ、Ｎ２２７Ｒ及びＦ２３１Ｌを更に含んでもよい。
【0032】
変異体α－アミラーゼは、配列番号５に関して、アミノ酸置換
（ａ）Ｔ５１Ｖ＋Ｓ１２５Ｒ＋Ｆ２３１Ｌ；
（ｂ）Ｔ５１Ｖ＋Ｓ１２５Ｒ＋Ｎ１７２Ｑ＋Ｎ２２７Ｒ；又は
（ｃ）Ｎ２９Ｑ＋Ｔ５１Ｖ＋Ｓ１２５Ｒ＋Ｎ２２７Ｒ＋Ｓ２５３Ｌ＋Ｇ２７２Ｅ＋Ｋ３１９Ｒ＋Ｓ４１８Ａ、
を有してもよい。
（ａ）Ｔ５１Ｖ＋Ｓ１２５Ｒ＋Ｆ２３１Ｌ；
（ｂ）Ｔ５１Ｖ＋Ｓ１２５Ｒ＋Ｎ１７２Ｑ＋Ｎ２２７Ｒ；又は
（ｃ）Ｎ２９Ｑ＋Ｔ５１Ｖ＋Ｓ１２５Ｒ＋Ｎ２２７Ｒ＋Ｓ２５３Ｌ＋Ｇ２７２Ｅ＋Ｋ３１９Ｒ＋Ｓ４１８Ａ、
を有してもよい。
【0033】
変異体マルトペンタオース／マルトヘキサオース形成アミラーゼ酵素に関する組成物及び方法を記載する。変異体は、添付の実施例に詳述される様々な実験アプローチによって発見された。変異体アミラーゼ酵素の例示的な用途は、食器洗浄及び他の用途におけるデンプン質の汚れの洗浄、デンプンの液化及び糖化、動物飼料における消化性の改善、並びにベーキング及び醸造のためである。組成物及び方法のこれら及び他の態様を、以下に詳述する。
【0034】
「α－アミラーゼ」又は「デンプン分解酵素」又は一般にアミラーゼという用語は、とりわけ、デンプンの分解を触媒することができる酵素を指す。α－アミラーゼは、デンプン中のα－Ｄ－（１→４）０－グリコシド結合を切断するヒドロラーゼである。一般に、α－アミラーゼ（ＥＣ ３．２．１．１；α－Ｄ－（１→４）－グルカングルカノヒドロラーゼ）は、デンプン分子内のα－Ｄ－（１→４）Ｏ－グリコシド結合をランダムに切断して、３以上の（１－４）－α－結合Ｄ－グルコース単位を含有する多糖を生成するエンド作用酵素として定義される。対照的に、エキソ作用デンプン分解酵素、例えばβ－アミラーゼ（ＥＣ ３．２．１．２；α－Ｄ－（１→４）－グルカンマルトヒドロラーゼ）及びマルトース産生α－アミラーゼ（ＥＣ ３．２．１．１３３）のようないくつかの生成物特異的α－アミラーゼは、基質の非還元末端から多糖分子を切断する。β－アミラーゼ、α－グルコシダーゼ（ＥＣ ３．２．１．２０；α－Ｄ－グルコシドグルコヒドロラーゼ）、グルコアミラーゼ（ＥＣ ３．２．１．３；α－Ｄ－（１→４）－グルカングルコヒドロラーゼ）、並びにマルトテトラオシダーゼ（ＥＣ ３．２．１．６０）及びマルトヘキサオシダーゼ（ＥＣ ３．２．１．９８）などの生成物特異的アミラーゼは、特定長のマルトオリゴ糖又は特定のマルトオリゴ糖の濃縮シロップを生成することができる。いくつかの細菌性α－アミラーゼは主に、デンプン及び関連するα－１，４－グルカンからマルトテトラオース（Ｇ４）、マルトペンタオース（Ｇ５）又はマルトヘキサオース（Ｇ６）を生成し、一方大部分のα－アミラーゼは更に、それらを最終生成物としてグルコース及び／又はマルトースに変換する。バチルス種ＤＳＭ１２６４９（すなわち、ＳＴＡＩＮＺＹＭＥ（商標）の親）由来のＡＡ５６０アミラーゼ及びバチルス属７０７アミラーゼ（マルトヘキサオース形成α－アミラーゼ（ＥＣ ３．２．１．９８）とも呼ばれる）などのＧ６アミラーゼは、技術的にはエキソ作用するが、α－アミラーゼと比較して類似の構造を有し、場合によっては同じ有益な変異のいくつかに応答するようである。
【0035】
本明細書における「酵素単位」とは、アッセイの特定条件下で時間当たりに形成される生成物の量を指す。例えば、「グルコアミラーゼ活性単位」（ＧＡＵ）は、６０℃、ｐＨ４．２で可溶性デンプン基質（４％ＤＳ）から１時間あたり１ｇのグルコースを生成する酵素の量として定義される。「可溶性デンプン単位」（ＳＳＵ）は、ｐＨ４．５、５０℃で可溶性デンプン基質（４％ＤＳ）から１分当たり１ｍｇのグルコースを生成する酵素の量である。ＤＳとは「乾燥固体」を指す。
【0036】
用語「デンプン」とは、式（Ｃ６Ｈ１０Ｏ５）ｘを有し、式中Ｘは任意の整数であることができる、アミロース及びアミロペクチンから構成される、植物の複合多糖炭水化物から構成される任意の材料を指す。この用語は、穀物（grains）、穀類（cereal）、草、塊茎及び根などの植物性材料、より具体的には、コムギ、オオムギ、トウモロコシ、ライムギ、イネ、モロコシ、ぬか、キャッサバ、キビ、ミロ、ジャガイモ、サツマイモ、及びタピオカから得られる材料を含む。「デンプン」という用語には、顆粒デンプンが含まれる。「顆粒デンプン」という用語は、生のすなわち未調理のデンプン、例えばゼラチン化されていないデンプンを指す。
【0037】
本明細書で使用される場合、「液化」又は「液化する」という用語は、デンプンをより粘性が低く、より短鎖のデキストリンに変換するプロセスを意味する。
【0038】
ポリペプチドに関する「野生型」、「親」、又は「参照」という用語は、１以上のアミノ酸位置に人工的な置換、挿入、又は欠失を含まない天然に存在するポリペプチドを指す。同様に、ポリヌクレオチドに関する「野生型」、「親」、又は「参照」という用語は、人工ヌクレオシド変化を含まない天然に存在するポリヌクレオチドを指す。しかしながら、野生型、親、又は参照ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、天然に存在するポリヌクレオチドに限定されず、野生型、親、又は参照ポリペプチドをコードする任意のポリヌクレオチドを包含することに留意されたい。
【0039】
野生型ポリペプチドへの言及は、ポリペプチドの成熟形態を含むと理解される。「成熟」ポリペプチド又はその変異体は、シグナル配列が存在しないもの、例えば、ポリペプチドの発現中又は発現後にポリペプチドの未成熟形態から切断されるものである。
【0040】
ポリペプチドに関する「変異体」という用語は、アミノ酸の１以上の天然又は人工の置換、挿入、又は欠失を含むという点で、特定の野生型、親、又は参照ポリペプチドとは異なるポリペプチドを指す。同様に、ポリヌクレオチドに関する「変異体」という用語は、特定の野生型、親、又は参照ポリヌクレオチドとヌクレオチド配列が異なるポリヌクレオチドを指す。野生型、親又は参照ポリペプチド又はポリヌクレオチドの同一性は、文脈から明らかだろう。
【0041】
本発明のα－アミラーゼの場合、「活性」とは、本明細書に記載されるように測定することができるα－アミラーゼ活性を指す。
【0042】
「性能上の利益」という用語は、分子の望ましい特性の改善を指す。例示的な機能上の利点としては、デンプン基質の加水分解の増加、穀物、穀類又は他のデンプン基質の液化性能の増加、洗浄機能の増加、熱安定性の増加、洗剤安定性の増加、貯蔵安定性の増加、溶解性の増加、ｐＨプロファイルの変化、カルシウム依存性の減少、比活性度の増加、基質特異性の変更、基質結合の変更、ｐＨ依存性活性の変更、ｐＨ依存性安定性の変更、酸化安定性の増加、及び発現の増加が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの場合では、性能上の利点は比較的低い温度で実現される。いくつかの場合では、性能上の利点は比較的高い温度で実現される。
【0043】
「プロテアーゼ」及び「プロテイナーゼ」という用語は、タンパク質を形成するペプチド又はポリペプチド鎖中のアミノ酸を互いに連結するペプチド結合の加水分解を指す「タンパク質分解」又は「タンパク質切断」を行う能力を有する酵素タンパク質を指す。タンパク質消化酵素としてのプロテアーゼのこの活性は、「タンパク質分解活性」と呼ばれる。
【0044】
「セリンプロテアーゼ」という用語は、タンパク質中のペプチド結合を切断する酵素を指し、この酵素ではセリンは酵素活性部位で求核性アミノ酸として働く。セリンプロテアーゼは、その構造に基づいて：キモトリプシン様（トリプシン様）又はスブチリシン様の２つの広いカテゴリーに分類される。食器洗浄用洗剤に最も一般的に使用されているのは、セリンプロテアーゼ、特にスブチリシンである。
【0045】
「コンビナトリアル変異体」は、２以上の突然変異、例えば２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又はそれ以上の置換、欠失、及び／又は挿入を含む変異体である。
【0046】
「組換え」という用語は、対象の細胞、核酸、タンパク質又はベクターに関して使用される場合、対象が天然の状態から改変されていることを示す。したがって、例えば、組換え細胞は、ネイティブ（非組換え）形態の細胞内に見られない遺伝子を発現するか、又は天然に見られるのとは異なるレベルで、又は異なる条件下でネイティブ遺伝子を発現する。組換え核酸は、１つ以上のヌクレオチドによってネイティブ配列とは異なり、及び／又は異種配列に、例えば、発現ベクター中の異種プロモータに操作可能に連結されている。組換えタンパク質は、１以上のアミノ酸によって天然配列とは異なり得、及び／又は異種配列と融合し得る。アミラーゼをコードする核酸を含むベクターは、組換えベクターである。
【0047】
「回収された」、「単離された」、及び「分離された」という用語は、天然に見られるように本来関連している少なくとも１つの他の材料又は成分から除去された化合物、タンパク質（ポリペプチド）、細胞、核酸、アミノ酸、又は他の特定の材料若しくは成分を指す。その「単離された」ポリペプチドとしては、異種宿主細胞において発現された分泌ポリペプチドを含む培養液が挙げられるが、これに限定されない。
【0048】
「精製された」という用語は、比較的純粋な状態、例えば少なくとも約９０％純粋、少なくとも約９５％純粋、少なくとも約９８％純粋、又は更に少なくとも約９９％純粋である物質（例えば、単離されたポリペプチド又はポリヌクレオチド）を指す。
【0049】
「濃縮された」という用語は、約５０％純粋、少なくとも約６０％純粋、少なくとも約７０％純粋、又は更に少なくとも約７０％純粋である材料（例えば、単離されたポリペプチド又はポリヌクレオチド）を指す。
【0050】
酵素に関する「熱安定性の（thermostable）」及び「熱安定性（thermostability）」という用語は、酵素が高温に曝露した後に活性を保持する能力を指す。アミラーゼ酵素などの酵素の熱安定性は、その間に規定の条件下で酵素活性の半分が失われる分数、時間数、又は日数で与えられる半減期（ｔ１／２）によって測定される。半減期は、高温に曝露（exposure）（すなわち、それによる曝露）した後の残留α－アミラーゼ活性を測定することによって計算してもよい。
【0051】
酵素に関して「ｐＨ範囲」とは、酵素が触媒活性を示すｐＨ値の範囲を指す。
【0052】
酵素に関する「ｐＨ安定性の」及び「ｐＨ安定性」という用語は、酵素が、所定の期間（例えば、１５分、３０分、１時間）広範囲のｐＨ値にわたって活性を保持する能力に関する。
【0053】
「アミノ酸配列」という用語は、「ポリペプチド」、「タンパク質」、及び「ペプチド」という用語と同義であり、互換的に使用される。そのようなアミノ酸配列が活性を示す場合、アミノ酸配列は「酵素」と呼ばれてもよい。アミノ酸残基の従来の１文字又は３文字コードを使用し、アミノ酸配列は、標準的なアミノ－カルボキシ末端配向で示される（すなわち、Ｎ→Ｃ）。
【0054】
「核酸」という用語は、ポリペプチドをコードすることができるＤＮＡ、ＲＮＡ、ヘテロ二本鎖、及び合成分子を包含する。核酸は、一本鎖又は二本鎖であってもよく、化学修飾を含んでもよい。「核酸」及び「ポリヌクレオチド」という用語は互換的に使用される。遺伝暗号は縮重しているので、特定のアミノ酸をコードするために２以上のコドンを使用してもよく、本発明の組成物及び方法は、特定のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を包含する。別段の定めがない限り、核酸配列は、５’から３’への配向で示される。
【0055】
「合成」分子は、生物によってではなく、インビトロ化学合成又は酵素合成によって生成される。
【0056】
核酸配列を細胞に挿入する文脈における「導入された」という用語は、当技術分野で知られるように、「トランスフェクション」、「形質転換」又は「形質導入」を意味する。
【0057】
「宿主株」又は「宿主細胞」は、目的のポリペプチド（例えば、アミラーゼ）をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクター、ファージ、ウイルス、又は他のＤＮＡ構築物が導入された生物である。例示的な宿主株は、目的のポリペプチドを発現することができ、及び／又は糖類を発酵させることができる微生物細胞（例えば、細菌、糸状菌、及び酵母）である。「宿主細胞」という用語は、細胞から作製されたプロトプラストを含む。
【0058】
ポリヌクレオチド又はタンパク質に関する「異種」という用語は、宿主細胞に天然には存在しないポリヌクレオチド又はタンパク質を指す。
【0059】
ポリヌクレオチド又はタンパク質に関する「内因性」という用語は、宿主細胞に天然に存在するポリヌクレオチド又はタンパク質を指す。
【0060】
「発現」という用語は、核酸配列に基づいてポリペプチドを生成するプロセスを指す。このプロセスには、転写及び翻訳の両方が含まれる。
【0061】
「シグナル配列」は、細胞外へのタンパク質の分泌を促進する、タンパク質のＮ末端部分に結合したアミノ酸の配列である。細胞外タンパク質の成熟形態は、分泌プロセス中に切断されるシグナル配列を欠く。
【0062】
「生物学的に活性な」とは、特定の生物学的活性、例えば酵素活性を有する配列を指す。
【0063】
「比活性」という用語は、特定の条件下で単位時間当たりに酵素又は酵素調製物によって生成物に変換されることができる基質のモル数を指す。比活性は一般に、単位（Ｕ）／ｍｇタンパク質として表される。
【0064】
本明細書で使用される場合、「水硬度」は、水中に存在する鉱物（例えば、カルシウム及びマグネシウム）の尺度である。
【0065】
「アミラーゼを含む培養細胞材料」又は類似の用語は、成分としてアミラーゼを含む細胞溶解物又は上清（培地を含む）を指す。細胞材料は、アミラーゼを産生するために培養物中で増殖させた異種宿主由来であってもよい。
【0066】
「パーセント配列同一性」とは、デフォルトパラメータを有するＣＬＵＳＴＡＬ Ｗアルゴリズムなどのソフトウェアプログラムを使用して整列させた場合に、特定の配列が、指定された参照配列中のアミノ酸残基と同一のものを少なくとも特定の割合で有することを意味する。Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２：４６７３－４６８０を参照する。ＣＬＵＳＴＡＬ Ｗアルゴリズムのデフォルトパラメータは以下の通りである。
【0067】
【表1】
【0068】
欠失は、参照配列と比較して同一でない残基としてカウントされる。
【0069】
「乾燥固形分」（ｄｓ）という用語は、乾燥重量パーセント基準でのスラリーの全固形分を指す。「スラリー」という用語は、不溶性固体を含有する水性混合物を指す。
【0070】
「同時糖化発酵（ＳＳＦ）」という語句は、エタノール産生微生物などの微生物、及びアミラーゼなどの少なくとも１つの酵素が同じプロセス工程中に存在する、生化学物質の製造プロセスを指す。ＳＳＦは、デンプン基質（顆粒状、液化、又は可溶化）のグルコースを含む糖類への同時加水分解、及び同じ反応容器内での糖類のアルコール又は他の生化学物質若しくは生体材料への発酵を含む。
【0071】
「エタノール産生微生物」は、糖又はオリゴ糖をエタノールに変換する能力を有する微生物を指す。
【0072】
「発酵飲料」という用語は、微生物発酵、例えば細菌及び／又は真菌発酵などの発酵プロセスを含む方法によって製造される任意の飲料を指す。
【0073】
「麦芽」という用語は、大麦麦芽又は小麦麦芽などの任意の麦芽穀物を指す。
【0074】
「マッシュ」という用語は、例えば破砕大麦麦芽、破砕大麦、及び／又は他の補助剤又はそれらの組合せを含み、後に水と混合されて麦汁及び使用済み穀物に分離される、製粉用の穀物などの任意のデンプン及び／又は糖含有植物性材料の水性スラリーを指す。
【0075】
「麦汁」という用語は、マッシュ中に製粉用の穀物を抽出した後に流出する未発酵液体を指す。
【0076】
「約」という用語は、参照値の±１５％を指す。
【0077】
２．マルトペンタオース／マルトヘキサオース形成α－アミラーゼ変異体
自動食器洗浄（ＡＤＷ）用途において高度の性能を示すマルトペンタオース／マルトヘキサオース形成α－アミラーゼのコンビナトリアル変異体を記載する。変異体は、本明細書ではＡＡ２５６０と呼ばれ、国際公開第２０１８／１８４００４号でＢｓｐＡｍｙ２４（配列番号１）と以前に同定されているバチルス種由来のα－アミラーゼに最も密接に関連している。ＡＡ２５６０α－アミラーゼの成熟アミノ酸配列を、配列番号１として以下に示す。
ＨＨＮＧＴＮＧＴＭＭ ＱＹＦＥＷＨＬＰＮＤ ＧＱＨＷＮＲＬＲＮＤ ＡＡＮＬＫＮＬＧＩＴ ＡＶＷＩＰＰＡＷＫＧ ＴＳＱＮＤＶＧＹＧＡ ＹＤＬＹＤＬＧＥＦＮ ＱＫＧＴＩＲＴＫＹＧ ＴＲＳＱＬＱＳＡＩＡ ＳＬＱＮＮＧＩＱＶＹ ＧＤＶＶＭＮＨＫＧＧ ＡＤＧＴＥＷＶＱＡＶ ＥＶＮＰＳＮＲＮＱＥ ＶＴＧＥＹＴＩＥＡＷ ＴＫＦＤＦＰＧＲＧＮ ＴＨＳＳＦＫＷＲＷＹ ＨＦＤＧＴＤＷＤＱＳ ＲＱＬＮＮＲＩＹＫＦ ＲＧＴＧＫＡＷＤＷＥ ＶＤＴＥＮＧＮＹＤＹ ＬＭＹＡＤＶＤＭＤＨ ＰＥＶＩＮＥＬＲＲＷ ＧＶＷＹＴＮＴＬＮＬ ＤＧＦＲＩＤＡＶＫＨ ＩＫＹＳＦＴＲＤＷＬ ＮＨＶＲＳＴＴＧＫＮ ＮＭＦＡＶＡＥＦＷＫ ＮＤＬＧＡＩＥＮＹＬ ＨＫＴＮＷＮＨＳＶＦ ＤＶＰＬＨＹＮＬＹＮ ＡＳＫＳＧＧＮＹＤＭ ＲＱＩＬＮＧＴＶＶＳ ＫＨＰＩＨＡＶＴＦＶ ＤＮＨＤＳＱＰＡＥＡ ＬＥＳＦＶＥＡＷＦＫ ＰＬＡＹＡＬＩＬＴＲ ＥＱＧＹＰＳＶＦＹＧ ＤＹＹＧＩＰＴＨＧＶ ＡＡＭＫＧＫＩＤＰＩ ＬＥＡＲＱＫＹＡＹＧ ＴＱＨＤＹＬＤＨＨＮ ＩＩＧＷＴＲＥＧＮＳ ＡＨＰＮＳＧＬＡＴＩ ＭＳＤＧＰＧＧＳＫＷ ＭＹＶＧＲＨＫＡＧＱ ＶＷＲＤＩＴＧＮＲＴ ＧＴＶＴＩＮＡＤＧＷ ＧＮＦＳＶＮＧＧＳＶ ＳＩＷＶＮＫ
自動食器洗浄（ＡＤＷ）用途において高度の性能を示すマルトペンタオース／マルトヘキサオース形成α－アミラーゼのコンビナトリアル変異体を記載する。変異体は、本明細書ではＡＡ２５６０と呼ばれ、国際公開第２０１８／１８４００４号でＢｓｐＡｍｙ２４（配列番号１）と以前に同定されているバチルス種由来のα－アミラーゼに最も密接に関連している。ＡＡ２５６０α－アミラーゼの成熟アミノ酸配列を、配列番号１として以下に示す。
ＨＨＮＧＴＮＧＴＭＭ ＱＹＦＥＷＨＬＰＮＤ ＧＱＨＷＮＲＬＲＮＤ ＡＡＮＬＫＮＬＧＩＴ ＡＶＷＩＰＰＡＷＫＧ ＴＳＱＮＤＶＧＹＧＡ ＹＤＬＹＤＬＧＥＦＮ ＱＫＧＴＩＲＴＫＹＧ ＴＲＳＱＬＱＳＡＩＡ ＳＬＱＮＮＧＩＱＶＹ ＧＤＶＶＭＮＨＫＧＧ ＡＤＧＴＥＷＶＱＡＶ ＥＶＮＰＳＮＲＮＱＥ ＶＴＧＥＹＴＩＥＡＷ ＴＫＦＤＦＰＧＲＧＮ ＴＨＳＳＦＫＷＲＷＹ ＨＦＤＧＴＤＷＤＱＳ ＲＱＬＮＮＲＩＹＫＦ ＲＧＴＧＫＡＷＤＷＥ ＶＤＴＥＮＧＮＹＤＹ ＬＭＹＡＤＶＤＭＤＨ ＰＥＶＩＮＥＬＲＲＷ ＧＶＷＹＴＮＴＬＮＬ ＤＧＦＲＩＤＡＶＫＨ ＩＫＹＳＦＴＲＤＷＬ ＮＨＶＲＳＴＴＧＫＮ ＮＭＦＡＶＡＥＦＷＫ ＮＤＬＧＡＩＥＮＹＬ ＨＫＴＮＷＮＨＳＶＦ ＤＶＰＬＨＹＮＬＹＮ ＡＳＫＳＧＧＮＹＤＭ ＲＱＩＬＮＧＴＶＶＳ ＫＨＰＩＨＡＶＴＦＶ ＤＮＨＤＳＱＰＡＥＡ ＬＥＳＦＶＥＡＷＦＫ ＰＬＡＹＡＬＩＬＴＲ ＥＱＧＹＰＳＶＦＹＧ ＤＹＹＧＩＰＴＨＧＶ ＡＡＭＫＧＫＩＤＰＩ ＬＥＡＲＱＫＹＡＹＧ ＴＱＨＤＹＬＤＨＨＮ ＩＩＧＷＴＲＥＧＮＳ ＡＨＰＮＳＧＬＡＴＩ ＭＳＤＧＰＧＧＳＫＷ ＭＹＶＧＲＨＫＡＧＱ ＶＷＲＤＩＴＧＮＲＴ ＧＴＶＴＩＮＡＤＧＷ ＧＮＦＳＶＮＧＧＳＶ ＳＩＷＶＮＫ
【0078】
密接に関連するマルトペンタオース／マルトヘキサオース形成α－アミラーゼは、本明細書で「ＡＡ７０７」と呼ばれるＢａｃｉｌｌｕｓ種７０７由来のものである。ＡＡ７０７α－の成熟アミノ酸配列を、配列番号２として以下に示す。
ＨＨＮＧＴＮＧＴＭＭ ＱＹＦＥＷＹＬＰＮＤ ＧＮＨＷＮＲＬＮＳＤ ＡＳＮＬＫＳＫＧＩＴ ＡＶＷＩＰＰＡＷＫＧ ＡＳＱＮＤＶＧＹＧＡ ＹＤＬＹＤＬＧＥＦＮ ＱＫＧＴＶＲＴＫＹＧ ＴＲＳＱＬＱＡＡＶＴ ＳＬＫＮＮＧＩＱＶＹ ＧＤＶＶＭＮＨＫＧＧ ＡＤＡＴＥＭＶＲＡＶ ＥＶＮＰＮＮＲＮＱＥ ＶＴＧＥＹＴＩＥＡＷ ＴＲＦＤＦＰＧＲＧＮ ＴＨＳＳＦＫＷＲＷＹ ＨＦＤＧＶＤＷＤＱＳ ＲＲＬＮＮＲＩＹＫＦ ＲＧＨＧＫＡＷＤＷＥ ＶＤＴＥＮＧＮＹＤＹ ＬＭＹＡＤＩＤＭＤＨ ＰＥＶＶＮＥＬＲＮＷ ＧＶＷＹＴＮＴＬＧＬ ＤＧＦＲＩＤＡＶＫＨ ＩＫＹＳＦＴＲＤＷＩ ＮＨＶＲＳＡＴＧＫＮ ＭＦＡＶＡＥＦＷＫＮ ＤＬＧＡＩＥＮＹＬＱ ＫＴＮＷＮＨＳＶＦＤ ＶＰＬＨＹＮＬＹＮＡ ＳＫＳＧＧＮＹＤＭＲ ＮＩＦＮＧＴＶＶＱＲ ＨＰＳＨＡＶＴＦＶＤ ＮＨＤＳＱＰＥＥＡＬ ＥＳＦＶＥＥＷＦＫＰ ＬＡＹＡＬＴＬＴＲＥ ＱＧＹＰＳＶＦＹＧＤ ＹＹＧＩＰＴＨＧＶＰ ＡＭＲＳＫＩＤＰＩＬ ＥＡＲＱＫＹＡＹＧＫ ＱＮＤＹＬＤＨＨＮＩ ＩＧＷＴＲＥＧＮＴＡ ＨＰＮＳＧＬＡＴＩＭ ＳＤＧＡＧＧＳＫＷＭ ＦＶＧＲＮＫＡＧＱＶ ＷＳＤＩＴＧＮＲＴＧ ＴＶＴＩＮＡＤＧＷＧ ＮＦＳＶＮＧＧＳＶＳ ＩＷＶＮＫ
ＨＨＮＧＴＮＧＴＭＭ ＱＹＦＥＷＹＬＰＮＤ ＧＮＨＷＮＲＬＮＳＤ ＡＳＮＬＫＳＫＧＩＴ ＡＶＷＩＰＰＡＷＫＧ ＡＳＱＮＤＶＧＹＧＡ ＹＤＬＹＤＬＧＥＦＮ ＱＫＧＴＶＲＴＫＹＧ ＴＲＳＱＬＱＡＡＶＴ ＳＬＫＮＮＧＩＱＶＹ ＧＤＶＶＭＮＨＫＧＧ ＡＤＡＴＥＭＶＲＡＶ ＥＶＮＰＮＮＲＮＱＥ ＶＴＧＥＹＴＩＥＡＷ ＴＲＦＤＦＰＧＲＧＮ ＴＨＳＳＦＫＷＲＷＹ ＨＦＤＧＶＤＷＤＱＳ ＲＲＬＮＮＲＩＹＫＦ ＲＧＨＧＫＡＷＤＷＥ ＶＤＴＥＮＧＮＹＤＹ ＬＭＹＡＤＩＤＭＤＨ ＰＥＶＶＮＥＬＲＮＷ ＧＶＷＹＴＮＴＬＧＬ ＤＧＦＲＩＤＡＶＫＨ ＩＫＹＳＦＴＲＤＷＩ ＮＨＶＲＳＡＴＧＫＮ ＭＦＡＶＡＥＦＷＫＮ ＤＬＧＡＩＥＮＹＬＱ ＫＴＮＷＮＨＳＶＦＤ ＶＰＬＨＹＮＬＹＮＡ ＳＫＳＧＧＮＹＤＭＲ ＮＩＦＮＧＴＶＶＱＲ ＨＰＳＨＡＶＴＦＶＤ ＮＨＤＳＱＰＥＥＡＬ ＥＳＦＶＥＥＷＦＫＰ ＬＡＹＡＬＴＬＴＲＥ ＱＧＹＰＳＶＦＹＧＤ ＹＹＧＩＰＴＨＧＶＰ ＡＭＲＳＫＩＤＰＩＬ ＥＡＲＱＫＹＡＹＧＫ ＱＮＤＹＬＤＨＨＮＩ ＩＧＷＴＲＥＧＮＴＡ ＨＰＮＳＧＬＡＴＩＭ ＳＤＧＡＧＧＳＫＷＭ ＦＶＧＲＮＫＡＧＱＶ ＷＳＤＩＴＧＮＲＴＧ ＴＶＴＩＮＡＤＧＷＧ ＮＦＳＶＮＧＧＳＶＳ ＩＷＶＮＫ
【0079】
別の密接に関連するマルトペンタオース／マルトヘキサオース形成α－アミラーゼは、Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．由来のものであり、ＡＡ５６０と称される。ＡＡ５６０の成熟アミノ酸配列を、配列番号３として以下に示す。
ＨＨＮＧＴＮＧＴＭＭ ＱＹＦＥＷＹＬＰＮＤ ＧＮＨＷＮＲＬＲＳＤ ＡＳＮＬＫＤＫＧＩＳ ＡＶＷＩＰＰＡＷＫＧ ＡＳＱＮＤＶＧＹＧＡ ＹＤＬＹＤＬＧＥＦＮ ＱＫＧＴＩＲＴＫＹＧ ＴＲＮＱＬＱＡＡＶＮ ＡＬＫＳＮＧＩＱＶＹ ＧＤＶＶＭＮＨＫＧＧ ＡＤＡＴＥＭＶＲＡＶ ＥＶＮＰＮＮＲＮＱＥ ＶＳＧＥＹＴＩＥＡＷ ＴＫＦＤＦＰＧＲＧＮ ＴＨＳＮＦＫＷＲＷＹ ＨＦＤＧＶＤＷＤＱＳ ＲＫＬＮＮＲＩＹＫＦ ＲＧＤＧＫＧＷＤＷＥ ＶＤＴＥＮＧＮＹＤＹ ＬＭＹＡＤＩＤＭＤＨ ＰＥＶＶＮＥＬＲＮＷ ＧＶＷＹＴＮＴＬＧＬ ＤＧＦＲＩＤＡＶＫＨ ＩＫＹＳＦＴＲＤＷＩ ＮＨＶＲＳＡＴＧＫＮ ＭＦＡＶＡＥＦＷＫＮ ＤＬＧＡＩＥＮＹＬＮ ＫＴＮＷＮＨＳＶＦＤ ＶＰＬＨＹＮＬＹＮＡ ＳＫＳＧＧＮＹＤＭＲ ＱＩＦＮＧＴＶＶＱＲ ＨＰＭＨＡＶＴＦＶＤ ＮＨＤＳＱＰＥＥＡＬ ＥＳＦＶＥＥＷＦＫＰ ＬＡＹＡＬＴＬＴＲＥ ＱＧＹＰＳＶＦＹＧＤ ＹＹＧＩＰＴＨＧＶＰ ＡＭＫＳＫＩＤＰＩＬ ＥＡＲＱＫＹＡＹＧＲ ＱＮＤＹＬＤＨＨＮＩ ＩＧＷＴＲＥＧＮＴＡ ＨＰＮＳＧＬＡＴＩＭ ＳＤＧＡＧＧＮＫＷＭ ＦＶＧＲＮＫＡＧＱＶ ＷＴＤＩＴＧＮＲＡＧ ＴＶＴＩＮＡＤＧＷＧ ＮＦＳＶＮＧＧＳＶＳ ＩＷＶＮＫ
ＨＨＮＧＴＮＧＴＭＭ ＱＹＦＥＷＹＬＰＮＤ ＧＮＨＷＮＲＬＲＳＤ ＡＳＮＬＫＤＫＧＩＳ ＡＶＷＩＰＰＡＷＫＧ ＡＳＱＮＤＶＧＹＧＡ ＹＤＬＹＤＬＧＥＦＮ ＱＫＧＴＩＲＴＫＹＧ ＴＲＮＱＬＱＡＡＶＮ ＡＬＫＳＮＧＩＱＶＹ ＧＤＶＶＭＮＨＫＧＧ ＡＤＡＴＥＭＶＲＡＶ ＥＶＮＰＮＮＲＮＱＥ ＶＳＧＥＹＴＩＥＡＷ ＴＫＦＤＦＰＧＲＧＮ ＴＨＳＮＦＫＷＲＷＹ ＨＦＤＧＶＤＷＤＱＳ ＲＫＬＮＮＲＩＹＫＦ ＲＧＤＧＫＧＷＤＷＥ ＶＤＴＥＮＧＮＹＤＹ ＬＭＹＡＤＩＤＭＤＨ ＰＥＶＶＮＥＬＲＮＷ ＧＶＷＹＴＮＴＬＧＬ ＤＧＦＲＩＤＡＶＫＨ ＩＫＹＳＦＴＲＤＷＩ ＮＨＶＲＳＡＴＧＫＮ ＭＦＡＶＡＥＦＷＫＮ ＤＬＧＡＩＥＮＹＬＮ ＫＴＮＷＮＨＳＶＦＤ ＶＰＬＨＹＮＬＹＮＡ ＳＫＳＧＧＮＹＤＭＲ ＱＩＦＮＧＴＶＶＱＲ ＨＰＭＨＡＶＴＦＶＤ ＮＨＤＳＱＰＥＥＡＬ ＥＳＦＶＥＥＷＦＫＰ ＬＡＹＡＬＴＬＴＲＥ ＱＧＹＰＳＶＦＹＧＤ ＹＹＧＩＰＴＨＧＶＰ ＡＭＫＳＫＩＤＰＩＬ ＥＡＲＱＫＹＡＹＧＲ ＱＮＤＹＬＤＨＨＮＩ ＩＧＷＴＲＥＧＮＴＡ ＨＰＮＳＧＬＡＴＩＭ ＳＤＧＡＧＧＮＫＷＭ ＦＶＧＲＮＫＡＧＱＶ ＷＴＤＩＴＧＮＲＡＧ ＴＶＴＩＮＡＤＧＷＧ ＮＦＳＶＮＧＧＳＶＳ ＩＷＶＮＫ
【0080】
アミノ酸配列同一性に基づいて、別の想定されるマルトペンタオース／マルトヘキサオース形成α－アミラーゼは、別のＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．由来のものであり、本明細書においてＡＡＩ１０と称される。ＡＡＩ１０α－アミラーゼの成熟アミノ酸配列を、配列番号４として以下に示す。
ＨＨＤＧＴＮＧＴＩＭ ＱＹＦＥＷＮＶＰＮＤ ＧＱＨＷＮＲＬＨＮＮ ＡＱＮＬＫＮＡＧＩＴ ＡＩＷＩＰＰＡＷＫＧ ＴＳＱＮＤＶＧＹＧＡ ＹＤＬＹＤＬＧＥＦＮ ＱＫＧＴＶＲＴＫＹＧ ＴＫＡＥＬＥＲＡＩＲ ＳＬＫＡＮＧＩＱＶＹ ＧＤＶＶＭＮＨＫＧＧ ＡＤＦＴＥＲＶＱＡＶ ＥＶＮＰＱＮＲＮＱＥ ＶＳＧＴＹＱＩＥＡＷ ＴＧＦＮＦＰＧＲＧＮ ＱＨＳＳＦＫＷＲＷＹ ＨＦＤＧＴＤＷＤＱＳ ＲＱＬＡＮＲＩＹＫＦ ＲＧＤＧＫＡＷＤＷＥ ＶＤＴＥＮＧＮＹＤＹ ＬＭＹＡＤＶＤＭＤＨ ＰＥＶＩＮＥＬＮＲＷ ＧＶＷＹＡＮＴＬＮＬ ＤＧＦＲＬＤＡＶＫＨ ＩＫＦＳＦＭＲＤＷＬ ＧＨＶＲＧＱＴＧＫＮ ＬＦＡＶＡＥＹＷＫＮ ＤＬＧＡＬＥＮＹＬＳ ＫＴＮＷＴＭＳＡＦＤ ＶＰＬＨＹＮＬＹＱＡ ＳＮＳＳＧＮＹＤＭＲ ＮＬＬＮＧＴＬＶＱＲ ＨＰＳＨＡＶＴＦＶＤ ＮＨＤＴＱＰＧＥＡＬ ＥＳＦＶＱＧＷＦＫＰ ＬＡＹＡＴＩＬＴＲＥ ＱＧＹＰＱＶＦＹＧＤ ＹＹＧＩＰＳＤＧＶＰ ＳＹＲＱＱＩＤＰＬＬ ＫＡＲＱＱＹＡＹＧＲ ＱＨＤＹＦＤＨＷＤＶ ＩＧＷＴＲＥＧＮＡＳ ＨＰＮＳＧＬＡＴＩＭ ＳＤＧＰＧＧＳＫＷＭ ＹＶＧＲＱＫＡＧＥＶ ＷＨＤＭＴＧＮＲＳＧ ＴＶＴＩＮＱＤＧＷＧ ＨＦＦＶＮＧＧＳＶＳ ＶＷＶＫＲ
ＨＨＤＧＴＮＧＴＩＭ ＱＹＦＥＷＮＶＰＮＤ ＧＱＨＷＮＲＬＨＮＮ ＡＱＮＬＫＮＡＧＩＴ ＡＩＷＩＰＰＡＷＫＧ ＴＳＱＮＤＶＧＹＧＡ ＹＤＬＹＤＬＧＥＦＮ ＱＫＧＴＶＲＴＫＹＧ ＴＫＡＥＬＥＲＡＩＲ ＳＬＫＡＮＧＩＱＶＹ ＧＤＶＶＭＮＨＫＧＧ ＡＤＦＴＥＲＶＱＡＶ ＥＶＮＰＱＮＲＮＱＥ ＶＳＧＴＹＱＩＥＡＷ ＴＧＦＮＦＰＧＲＧＮ ＱＨＳＳＦＫＷＲＷＹ ＨＦＤＧＴＤＷＤＱＳ ＲＱＬＡＮＲＩＹＫＦ ＲＧＤＧＫＡＷＤＷＥ ＶＤＴＥＮＧＮＹＤＹ ＬＭＹＡＤＶＤＭＤＨ ＰＥＶＩＮＥＬＮＲＷ ＧＶＷＹＡＮＴＬＮＬ ＤＧＦＲＬＤＡＶＫＨ ＩＫＦＳＦＭＲＤＷＬ ＧＨＶＲＧＱＴＧＫＮ ＬＦＡＶＡＥＹＷＫＮ ＤＬＧＡＬＥＮＹＬＳ ＫＴＮＷＴＭＳＡＦＤ ＶＰＬＨＹＮＬＹＱＡ ＳＮＳＳＧＮＹＤＭＲ ＮＬＬＮＧＴＬＶＱＲ ＨＰＳＨＡＶＴＦＶＤ ＮＨＤＴＱＰＧＥＡＬ ＥＳＦＶＱＧＷＦＫＰ ＬＡＹＡＴＩＬＴＲＥ ＱＧＹＰＱＶＦＹＧＤ ＹＹＧＩＰＳＤＧＶＰ ＳＹＲＱＱＩＤＰＬＬ ＫＡＲＱＱＹＡＹＧＲ ＱＨＤＹＦＤＨＷＤＶ ＩＧＷＴＲＥＧＮＡＳ ＨＰＮＳＧＬＡＴＩＭ ＳＤＧＰＧＧＳＫＷＭ ＹＶＧＲＱＫＡＧＥＶ ＷＨＤＭＴＧＮＲＳＧ ＴＶＴＩＮＱＤＧＷＧ ＨＦＦＶＮＧＧＳＶＳ ＶＷＶＫＲ
【0081】
これら４種のα－アミラーゼのアラインメントを図１に示す。アミノ酸配列同一性を表１に要約する。ＡＡ７０７、ＡＡ５６０、及びＡＡＩ１０は全て、ＡＡ２５６０に対して８０％超のアミノ酸を有する。
【0082】
【表2】
【0083】
優れた洗浄性能を示した国際公開第２０２１／０８０９４８号に記載されているＡＡ２５６０α－アミラーゼの変異体を、配列番号５として以下に示す。
ＨＨＮＧＴＮＧＴＭＭ ＱＹＦＥＷＨＬＰＮＤ ＧＱＨＷＮＲＬＲＮＤ ＡＡＮＬＫＮＬＧＩＮ ＡＶＷＩＰＰＡＷＫＧ ＴＳＱＮＤＶＧＹＧＡ ＹＤＬＹＤＬＧＥＦＮ ＱＫＧＴＩＲＴＫＹＧ ＴＲＳＱＬＱＳＡＩＡ ＲＬＱＮＮＧＩＱＶＦ ＧＤＶＶＭＮＨＫＧＧ ＡＤＧＴＥＲＶＱＡＶ ＥＶＮＰＳＮＲＮＱＥ ＶＴＧＥＹＴＩＥＡＷ ＴＫＦＤＦＰＧＲＧＮ ＴＨＳＳＦＫＷＲＷＹ ＨＦＤＧＴＤＷＤＱＳ ＲＮＬＮＮＲＩＹＫＦ ＴＧＫＡＷＤＷＥＶＤ ＴＥＮＧＮＹＤＹＬＭ ＹＡＤＶＤＭＤＨＰＥ ＶＩＮＥＬＲＲＷＧＶ ＷＹＴＮＴＬＮＬＤＧ ＦＲＩＤＡＶＫＨＩＫ ＹＱＦＴＲＤＷＬＮＨ ＶＲＳＴＴＧＫＮＮＭ ＦＡＶＡＥＦＷＫＮＤ ＬＧＡＩＥＮＹＬＳＫ ＴＮＷＮＨＳＶＦＤＶ ＰＬＨＹＮＬＹＮＡＳ ＫＳＧＧＮＹＤＭＲＱ ＩＬＮＧＴＶＶＳＫＨ ＰＩＨＡＶＴＦＶＤＮ ＨＤＳＱＰＡＥＡＬＥ ＳＦＶＥＡＷＦＫＰＬ ＡＹＡＬＩＬＴＲＥＱ ＧＹＰＳＶＦＹＧＤＹ ＹＧＩＰＴＨＧＶＡＡ ＭＫＧＫＩＤＰＩＬＥ ＡＲＱＫＹＡＹＧＴＱ ＨＤＹＬＤＨＨＮＩＩ ＧＷＴＲＥＧＮＳＡＨ ＰＮＳＧＬＡＴＩＭＳ ＤＧＰＧＧＳＫＷＭＹ ＶＧＲＨＫＡＧＱＶＷ ＲＤＩＴＧＮＲＴＧＴ ＶＴＩＮＡＤＧＷＧＮ ＦＳＶＮＧＧＳＶＳＩ ＷＶＮＫ
ＨＨＮＧＴＮＧＴＭＭ ＱＹＦＥＷＨＬＰＮＤ ＧＱＨＷＮＲＬＲＮＤ ＡＡＮＬＫＮＬＧＩＮ ＡＶＷＩＰＰＡＷＫＧ ＴＳＱＮＤＶＧＹＧＡ ＹＤＬＹＤＬＧＥＦＮ ＱＫＧＴＩＲＴＫＹＧ ＴＲＳＱＬＱＳＡＩＡ ＲＬＱＮＮＧＩＱＶＦ ＧＤＶＶＭＮＨＫＧＧ ＡＤＧＴＥＲＶＱＡＶ ＥＶＮＰＳＮＲＮＱＥ ＶＴＧＥＹＴＩＥＡＷ ＴＫＦＤＦＰＧＲＧＮ ＴＨＳＳＦＫＷＲＷＹ ＨＦＤＧＴＤＷＤＱＳ ＲＮＬＮＮＲＩＹＫＦ ＴＧＫＡＷＤＷＥＶＤ ＴＥＮＧＮＹＤＹＬＭ ＹＡＤＶＤＭＤＨＰＥ ＶＩＮＥＬＲＲＷＧＶ ＷＹＴＮＴＬＮＬＤＧ ＦＲＩＤＡＶＫＨＩＫ ＹＱＦＴＲＤＷＬＮＨ ＶＲＳＴＴＧＫＮＮＭ ＦＡＶＡＥＦＷＫＮＤ ＬＧＡＩＥＮＹＬＳＫ ＴＮＷＮＨＳＶＦＤＶ ＰＬＨＹＮＬＹＮＡＳ ＫＳＧＧＮＹＤＭＲＱ ＩＬＮＧＴＶＶＳＫＨ ＰＩＨＡＶＴＦＶＤＮ ＨＤＳＱＰＡＥＡＬＥ ＳＦＶＥＡＷＦＫＰＬ ＡＹＡＬＩＬＴＲＥＱ ＧＹＰＳＶＦＹＧＤＹ ＹＧＩＰＴＨＧＶＡＡ ＭＫＧＫＩＤＰＩＬＥ ＡＲＱＫＹＡＹＧＴＱ ＨＤＹＬＤＨＨＮＩＩ ＧＷＴＲＥＧＮＳＡＨ ＰＮＳＧＬＡＴＩＭＳ ＤＧＰＧＧＳＫＷＭＹ ＶＧＲＨＫＡＧＱＶＷ ＲＤＩＴＧＮＲＴＧＴ ＶＴＩＮＡＤＧＷＧＮ ＦＳＶＮＧＧＳＶＳＩ ＷＶＮＫ
【0084】
変異体は、番号付け用に野生型ＡＡ２５６０α－アミラーゼ（配列番号１）を使用して、ＡＡ２５６０α－アミラーゼに関して変異Ｔ４０Ｎ、Ｓ９１Ｒ、Ｙ１００Ｆ、Ｗ１１６Ｒ、Ｑ１７２Ｎ、ΔＲ１８１、ΔＧ１８２、Ｓ２４４Ｑ及びＨ２８１Ｓを有する。
【0085】
前述の変異体ＡＡ２５６０α－アミラーゼを出発点として使用して、更に改善された洗浄性能を示す更なる変異体ＡＡ２５６０α－アミラーゼを設計した。新しい変異体のほとんどは、２つの変異、Ｔ５１Ｖ及びＳ１２５Ｒを含む。これらの位置に変異があると、分子のデンプン結合溝内のヒドロキシル基が喪失する。酵素の構造モデルでは、Ｔ５１及びＳ１２５のヒドロキシル基は、溶媒に露出され、デンプン結合溝内の水素結合に利用可能である（図１）。
【0086】
理論に限定されるものではないが、本発明者らは、Ｔ５１Ｖ及びＳ１２５Ｒ変異の組合せが一緒になって、もしあればデンプン結合溝内の水素結合のために露出されるだろうヒドロキシル基を除去することによって、活性部位におけるデンプンの非生産的結合様式を低減するのに役立ってもよいと提案する。これらのヒドロキシル基が喪失すると、触媒作用のための求核剤及び一般的な酸／塩基側鎖に関して分子の最適な配置と適合しない立体配座でのデンプンの結合を防止してもよい。この理論に基づいて、これらの位置のヒドロキシル基を除去する他の置換は、同様の洗浄上の利点を提供する可能性があり、したがって、置換はより一般的に、Ｔ５１Ｘ及びＳ１２５Ｘとして記載することができ、ＸはＳ又はＴではない。
【0087】
本発明の変異体の別の特徴は、９１位の変異及び／又はα－アミラーゼＴＩＭバレル構造の底部（底）における少なくとも１つの変異に続く。バレル底部残基は、ゼロより大きい溶媒アクセス可能表面積を有し、活性部位とは反対側のバレルの側面で、及び各鎖のＮ末端を含有する側面で、コアβバレル構造内にあるか、又はそれに隣接している。関連残基は、配列番号１の番号を参照して、６、７、４０、９６、９８、１００、２２９、２３０、２３１、２６２、２６３、２８５、２８６、２８７、２８８、３２２、３２３、３２４、３２５、３６２、３６３、及び３６４位にある。全ての場合では、残基は、ＴＩＭバレル構造の底に沿って並び、この残基は、α－アミラーゼ及び他の多くの酵素の主要な構造的特徴を表す。残基９１における例示的な変異は、極性残基から電荷残基、具体的にはアルギニンなどの正電荷残基への置換であり（すなわち、Ｘ９１Ｒ）、ＡＡ２５６０の場合は特定の置換Ｓ９１Ｒである。
【0088】
変異体は、配列番号１の番号を参照して、表面露出残基１６７、１６９、１７１、１７２、及び１７６を含むループ内の変異を更に特徴とし得る。変異体は、１１６位及び２８１位における変異を更に特徴とし得、これは溶解性に影響を与えると考えられる。
【0089】
変異体は、配列番号１の番号を参照して、１９０位及び／又は２４４位における安定化変異を更に特徴とし得る。そのような変異は、十分に分類されており、洗浄に使用される現在市販のα－アミラーゼに含まれる。これらの残基における例示的な変異は、置換Ｘ１９０Ｐ及びＸ２４４Ａ、Ｅ、又はＱ、具体的にはＥ１９０Ｐ、Ｓ２４４Ａ、Ｓ２４４Ｅ、及びＳ２４４Ｑである。２７５位及び２７９位の変異もまた、１９０位の変異と組み合わせて対象となる。
【0090】
変異体は、配列番号１の番号を参照して、１位、７位、１１８位、１９５位、２０２位、２０６位、３２１位、２４５位、及び４５９位の変異を更に特徴とし得、これらは、現在の市販のα－アミラーゼに含まれるか、又はそのような用途に提案されている。
【0091】
変異体は、番号付けに配列番号１を使用して、Ｒ１８１、Ｇ１８２、Ｔ１８３、及びＧ１８４に対応するカルシウム結合ループに隣接するＸ１Ｇ／Ｓ１Ｘ２Ｇ２モチーフにおいて欠失を更に含む。いくつかの実施形態では、変異α－アミラーゼは、Ｒ１８１及びＧ１８２、又はＴ１８３及びＧ１８４に対応するアミノ酸残基の隣接するペアワイズ欠失を含む。Ｒ１８１及びＧ１８２に対応するアミノ酸残基における欠失は、「ΔＲＧ」と称され得、１８３位の残基に対応するアミノ酸残基（通常はＴ、Ｄ、又はＨ）及びＧ１８４の欠失は、必要に応じて「ΔＴＧ」、「ΔＤＧ」、「ΔＨＧ」などと称され得る。両方のペアワイズ欠失は、α－アミラーゼにおいて同じ効果を生じさせるように思われる。
【0092】
変異体は、（ｉ）例えば、Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｍｉｓ（すなわち、ＢＬＡ及びＬＡＴ）、Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（すなわち、ＢＳＧ）、及びＢ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｉｆａｃｉｅｎｓ（すなわち、Ｐ００６９２、ＢＡＣＡＭ、及びＢＡＡ）由来の周知であるＢａｃｉｌｌｕｓ α－アミラーゼのうちのいずれか、若しくはそのハイブリッド、（ｉｉ）炭水化物活性酵素データベース（ＣＡＺｙ）ファミリー１３α－アミラーゼとして分類される任意のα－アミラーゼ、又は（ｉｉｉ）記述用語、「Ｔｅｒｍａｍｙｌ様」と従来から呼ばれている任意のアミラーゼと同様の折り畳み及び／又は６０％以上のアミノ酸配列同一性を有する他のα－アミラーゼに使用するための、前述の変異を更に含んでもよい。例示的なα－アミラーゼには、Ｂａｃｉｌｌｕｓ種ＳＧ－１、Ｂａｃｉｌｌｕｓ種７０７由来のもの、並びにＡ７－７、ＳＰ７２２、ＤＳＭ９０１４、及びＫＳＭ ＡＰ１３７８と呼ばれるα－アミラーゼが挙げられるが、これらに限定されない。同様に、マルトペンタオース／マルトヘキサオース生成α－アミラーゼとして記載されているか否かに関わらず、本明細書に記載の変異の組合せのいずれも、これらのα－アミラーゼにおいて性能上の利点をもたらしてもよい。
【0093】
具体的に企図されるコンビナトリアル変異体を、配列番号５に関して、番号付けのために配列番号５を使用して以下に列挙する。配列番号５の変異体は既に欠失ΔＲ１８１及びΔＧ１８２を有しており、したがって、１８３の後の各位置の数は２つ減少していることに留意されたい。
【0094】
α－アミラーゼが上記に列挙された変異を自然に有する場合（すなわち、野生型α－アミラーゼが、変異として特定された残基を既に含んでいる場合）、その特定の変異が、その分子には適用されないことが理解されるであろう。しかしながら、他に記載された変異は、その位置での天然に存在する残基と組み合わせて作用してもよい。
【0095】
本変異体α－アミラーゼはまた、アミノ酸配列における１又は複数のアミノ酸の置換、欠失、又は付加、例えば、１０未満、９未満、８未満、７未満、６未満、５未満、４未満、３未満、又は更には２未満の置換、欠失、又は付加を含み得る。そのような変異体は、それらが由来したα－アミラーゼと同様の活性を有すると予想される。本変異体α－アミラーゼはまた、それらのＮ又はＣ末端に１つ又はいくつかの残基の小さな欠失及び／又は伸長を含み得る。そのようなわずかな変化は、本明細書に記載の発明概念を損なう可能性が低い。
【0096】
本アミラーゼは、「前駆体」、「未成熟」、又は「完全長」（その場合、それらは、シグナル配列を含む）、又は「成熟」（その場合、それらはシグナル配列を欠いている）であり得る。ポリペプチドの成熟形態は、一般に最も有用である。特に明記しない限り、本明細書で使用されるアミノ酸残基の番号付けは、それぞれのアミラーゼポリペプチドの成熟形態を指す。
【0097】
いくつかの実施形態では、変異体α－アミラーゼは、配列番号１、２、３、４又は５、好ましくは配列番号５と、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は更に少なくとも９９％であるが、１００％未満のアミノ酸配列同一性を有する。
【0098】
２．５．変異体アミラーゼポリペプチドをコードするヌクレオチド
別の態様では、変異体α－アミラーゼポリペプチドをコードする核酸を提供する。核酸は、特定のアミラーゼポリペプチド、又は特定のα－アミラーゼと特定の程度のアミノ酸配列同一性を有するα－アミラーゼをコードしてもよい。
別の態様では、変異体α－アミラーゼポリペプチドをコードする核酸を提供する。核酸は、特定のアミラーゼポリペプチド、又は特定のα－アミラーゼと特定の程度のアミノ酸配列同一性を有するα－アミラーゼをコードしてもよい。
【0099】
いくつかの実施形態では、核酸は、配列番号１、２、３、又は４又は５と、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は更に少なくとも９９％であるが、１００％未満のアミノ酸配列同一性を有するα－アミラーゼをコードする。遺伝暗号の縮重のために、複数の核酸が同じポリペプチドをコードしてもよいことが理解される。
【0100】
いくつかの実施形態では、核酸は、配列番号１、２、３、４、又は５と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は更に少なくとも９９％であるが、１００％未満のアミノ酸配列同一性を有するα－アミラーゼをコードする（又はコードする核酸に相補的な）核酸に、ストリンジェントな又は非常にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする。
【0101】
３．変異体α－アミラーゼの製造
本発明の変異体α－アミラーゼは、当該技術分野で周知の方法を使用して、例えば分泌又は細胞内発現によって宿主細胞中で生成されることができる。発酵、分離、及び濃縮技術は当技術分野において周知であり、従来の方法を使用して、濃縮された変異体－α－アミラーゼ－ポリペプチド含有溶液を調製することができる。
本発明の変異体α－アミラーゼは、当該技術分野で周知の方法を使用して、例えば分泌又は細胞内発現によって宿主細胞中で生成されることができる。発酵、分離、及び濃縮技術は当技術分野において周知であり、従来の方法を使用して、濃縮された変異体－α－アミラーゼ－ポリペプチド含有溶液を調製することができる。
【0102】
生産規模の回収のために、変異体α－アミラーゼポリペプチドは、ポリマーによる凝集を介して細胞を除去することによって、一般的に上述されたように濃縮又は部分的に精製することができる。あるいは、酵素は、精密濾過によって濃縮又は精製し、その後利用可能な膜及び装置を使用する限外濾過によって濃縮することができる。しかしながら、いくつかの用途では、酵素を濃縮又は精製する必要はなく、ブロス培養物全体を溶解し、更に処理することなく使用することができる。次いで、酵素を例えば顆粒に加工することができる。
【0103】
自動食器洗浄組成物
自動食器洗浄組成物は、任意の物理的形態とすることができる。当該組成物は、ルース粉末であっても、ゲルであっても、単位用量形態で提示されてもよい。好ましくは、当該組成物は単位用量形態であり、単位用量形態としては、圧縮錠剤及び水溶性パックが挙げられる。本発明の自動食器洗浄組成物は好ましくは、単位用量形態で提示され、固体、液体及びゲル形態を含む任意の物理的形態とすることができる。本発明の組成物は、多区画型パックの形態、より具体的には、異なる物理的形態の組成物を有する区画、例えば固体形態の組成物を含む区画と液体形態の組成物を含む別の区画とを含む多区画型パックでの提供に非常によく適している。組成物は、好ましくは、ポリビニルアルコールなどの水溶性フィルムに封入される。厚さ１００μｍ未満、好ましくは２０～９０μｍのポリビニルアルコールフィルムに包まれた単位用量形態の組成物がとりわけ好ましい。本発明の洗剤組成物は、約８～約２５グラム、好ましくは約１０～約２０グラムの重量を有する。この重量範囲は、食器洗浄機のディスペンサに余裕をもって収まる。この範囲は洗剤としては少ない量に相当するものであるが、洗剤は本明細書で上記に述べたような効果の全てを提供するように配合されている。
自動食器洗浄組成物は、任意の物理的形態とすることができる。当該組成物は、ルース粉末であっても、ゲルであっても、単位用量形態で提示されてもよい。好ましくは、当該組成物は単位用量形態であり、単位用量形態としては、圧縮錠剤及び水溶性パックが挙げられる。本発明の自動食器洗浄組成物は好ましくは、単位用量形態で提示され、固体、液体及びゲル形態を含む任意の物理的形態とすることができる。本発明の組成物は、多区画型パックの形態、より具体的には、異なる物理的形態の組成物を有する区画、例えば固体形態の組成物を含む区画と液体形態の組成物を含む別の区画とを含む多区画型パックでの提供に非常によく適している。組成物は、好ましくは、ポリビニルアルコールなどの水溶性フィルムに封入される。厚さ１００μｍ未満、好ましくは２０～９０μｍのポリビニルアルコールフィルムに包まれた単位用量形態の組成物がとりわけ好ましい。本発明の洗剤組成物は、約８～約２５グラム、好ましくは約１０～約２０グラムの重量を有する。この重量範囲は、食器洗浄機のディスペンサに余裕をもって収まる。この範囲は洗剤としては少ない量に相当するものであるが、洗剤は本明細書で上記に述べたような効果の全てを提供するように配合されている。
【0104】
組成物は、好ましくは、無リン酸塩である。本明細書において「無リン酸塩」とは、組成物が、組成物の１重量％未満、好ましくは０．１重量％未満のリン酸塩を含むものとして理解される。
【0105】
錯化剤系
本発明の目的のために、「錯化剤」とは、カルシウム、マグネシウム、鉛、銅、亜鉛、カドミウム、水銀、マンガン、鉄、アルミニウム、及び他のカチオン性多価イオンのような多価イオンと結合して水溶性の錯体を形成することが可能な化合物のことである。錯化剤は、Ｃａ２＋に対する対数安定性定数（［ｌｏｇＫ］）が少なくとも３である。安定性定数、ｌｏｇＫは、温度２５℃でイオン強度０．１の溶液中で測定される。
本発明の目的のために、「錯化剤」とは、カルシウム、マグネシウム、鉛、銅、亜鉛、カドミウム、水銀、マンガン、鉄、アルミニウム、及び他のカチオン性多価イオンのような多価イオンと結合して水溶性の錯体を形成することが可能な化合物のことである。錯化剤は、Ｃａ２＋に対する対数安定性定数（［ｌｏｇＫ］）が少なくとも３である。安定性定数、ｌｏｇＫは、温度２５℃でイオン強度０．１の溶液中で測定される。
【0106】
本発明の組成物は、好ましくは、錯化剤系の組成物の１０重量％～５０重量％を含む。錯化剤系は、メチルグリシン二酢酸（ＭＧＤＡ）、クエン酸、グルタミン酸－Ｎ，Ｎ－二酢酸（ＧＬＤＡ）、イミノジコハク酸（ＩＤＳ）、カルボキシメチルイヌリン、Ｌ－アスパラギン酸Ｎ，Ｎ－二酢酸四ナトリウム塩（ＡＳＤＡ）及びこれらの混合物からなる群から選択される１つ以上の錯化剤を含む。好ましくは、錯化剤系は、少なくとも１０重量％のＭＧＤＡの組成物を含む。錯化系は、クエン酸、（ＧＬＤＡ）、（ＩＤＳ）、カルボキシメチルイヌリン、Ｌ－アスパラギン酸Ｎ，Ｎ－二酢酸四ナトリウム塩（ＡＳＤＡ）及びこれらの混合物からなる群から選択される錯化剤を更に含み得る。好ましくは、錯化剤系は、組成物の少なくとも１０重量％のＭＧＤＡ及び少なくとも１０重量％のクエン酸の組成物を含む。本発明の目的のために、用語「酸」は、錯化剤を指すとき、酸及びその塩を含む。
【0107】
好ましい実施形態では、組成物は、ＭＧＤＡの組成物、より好ましくはＭＧＤＡの三ナトリウム塩の少なくとも１５重量％、より好ましくは２０重量％～４０重量％を含む。この高レベルのＭＧＤＡを含む組成物は、硬水でも、長時間及び／又は高温サイクルでも良好に機能する。
【0108】
本発明の錯化剤系は、クエン酸を更に含むことができる。
【0109】
分散剤ポリマー
分散剤ポリマーは、組成物の約０．１～約２０重量％、好ましくは０．２～約１５重量％、より好ましくは０．３～重量％の任意の好適な量で使用され得る。
分散剤ポリマーは、組成物の約０．１～約２０重量％、好ましくは０．２～約１５重量％、より好ましくは０．３～重量％の任意の好適な量で使用され得る。
【0110】
分散剤ポリマーは、自動食器洗浄プロセスにおいてカルシウム又は炭酸カルシウムを懸濁させることができる。
【0111】
分散剤ポリマーは、２５℃で、３０～２５０ｍｇのＣａ／ｇの分散剤ポリマー、好ましくは３５～２００ｍｇのＣａ／ｇの分散剤ポリマー、より好ましくは４０～１５０ｍｇのＣａ／ｇの分散剤ポリマーの範囲内で、カルシウム結合能を有する。ポリマーが本発明の意味において分散剤ポリマーであるかどうかを判定するために、以下の指示に従い、以下のカルシウム結合能の判定を行う。
【0112】
カルシウム結合能試験方法
本明細書で言及されるカルシウム結合能は、Ｍｅｅｔｔｌｅｒ Ｔｏｌｅｄｏ ＳｅｖｅｎＭｕｌｔｉ（商標）ベンチトップメータ及びＰｅｒｆｅｃｔＩＯＮ（商標）櫛形Ｃａ組み合わせ電極などのｐＨ／イオンメータを用いて、滴定によって決定される。結合能を測定するために、ビーカー又はターゴトメータポットに適した加熱撹拌装置を２５℃に設定し、メータ付イオン電極を製造元の指示に従って較正する。電極較正の標準濃度は試験濃度をブラケティングし、２５℃で測定しなければならない。脱イオン水１Ｌに３．６７ｇのＣａＣｌ２－２Ｈ２Ｏを添加することにより、１０００ｍｇ／ｇのＣａの原液を調製し、次いで希釈を行ってそれぞれ１００ｍｇ／ｇ、１０ｍｇ／ｇ、及び１ｍｇ／ｇ濃度のカルシウムを含む、それぞれ１００ｍＬの３つの作用液を調製する。１００ｍｇ Ｃａ／ｇの作用液を、２５℃で実施される滴定中の初期濃度として使用する。各作用液のイオン強度は、２．５ｇ／ＬのＮａＣｌをそれぞれ添加することによって調節する。１００ｍｇ Ｃａ／ｇの作用液１００ｍＬを加熱し、２５℃に達するまで撹拌する。カルシウムイオン濃度の初期測定は、イオン電極を使用して溶液が２５℃に達したときに行う。次いで、試験ポリマーをカルシウム作用液に徐々に加え（０．０１ｇ／Ｌ間隔で）、各増分の添加後に５分間攪拌した後に測定する。滴定は、溶液が１ｍｇ／ｇのカルシウムに達したら停止する。残りの２つのカルシウム濃度の作用液を用いて、滴定手順を繰り返す。試験ポリマーの結合能は、添加された試験ポリマーのグラム／Ｌに対する、測定されたカルシウム濃度の直線勾配として計算される。
本明細書で言及されるカルシウム結合能は、Ｍｅｅｔｔｌｅｒ Ｔｏｌｅｄｏ ＳｅｖｅｎＭｕｌｔｉ（商標）ベンチトップメータ及びＰｅｒｆｅｃｔＩＯＮ（商標）櫛形Ｃａ組み合わせ電極などのｐＨ／イオンメータを用いて、滴定によって決定される。結合能を測定するために、ビーカー又はターゴトメータポットに適した加熱撹拌装置を２５℃に設定し、メータ付イオン電極を製造元の指示に従って較正する。電極較正の標準濃度は試験濃度をブラケティングし、２５℃で測定しなければならない。脱イオン水１Ｌに３．６７ｇのＣａＣｌ２－２Ｈ２Ｏを添加することにより、１０００ｍｇ／ｇのＣａの原液を調製し、次いで希釈を行ってそれぞれ１００ｍｇ／ｇ、１０ｍｇ／ｇ、及び１ｍｇ／ｇ濃度のカルシウムを含む、それぞれ１００ｍＬの３つの作用液を調製する。１００ｍｇ Ｃａ／ｇの作用液を、２５℃で実施される滴定中の初期濃度として使用する。各作用液のイオン強度は、２．５ｇ／ＬのＮａＣｌをそれぞれ添加することによって調節する。１００ｍｇ Ｃａ／ｇの作用液１００ｍＬを加熱し、２５℃に達するまで撹拌する。カルシウムイオン濃度の初期測定は、イオン電極を使用して溶液が２５℃に達したときに行う。次いで、試験ポリマーをカルシウム作用液に徐々に加え（０．０１ｇ／Ｌ間隔で）、各増分の添加後に５分間攪拌した後に測定する。滴定は、溶液が１ｍｇ／ｇのカルシウムに達したら停止する。残りの２つのカルシウム濃度の作用液を用いて、滴定手順を繰り返す。試験ポリマーの結合能は、添加された試験ポリマーのグラム／Ｌに対する、測定されたカルシウム濃度の直線勾配として計算される。
【0113】
分散剤ポリマーは、好ましくは、６を超えるｐＨを有する水溶液中に溶解した場合に、負の正味電荷を有する。
【0114】
分散剤ポリマーは、より低いｐＨで負電荷を増加させ、硬水中でのその分散特性を改善するために、スルホン化カルボン酸エステル又はアミドもまた有し得る。好ましい分散剤ポリマーは、スルホン化／カルボキシル化ポリマー、すなわち、スルホン化モノマー及びカルボキシル化モノマーの両方を含むポリマーである。
【0115】
好ましくは、分散剤ポリマーは、ポリカルボン酸のスルホン化誘導体であり、２、３、４又はそれ以上の異なるモノマー単位を含むことができる。好ましいコポリマーは、次のものを含む。
【0116】
カルボン酸モノマーに由来する少なくとも１つの構造単位は一般式（ＩＩＩ）を有し：
【0117】
【化1】
好ましいカルボン酸モノマーは、アクリル酸、マレイン酸、無水マレイン酸、イタコン酸、シトラコン酸、２－フェニルアクリル酸、桂皮酸、クロトン酸、フマル酸、メタクリル酸、２－エチルアクリル酸、メチレンマロン酸、又はソルビン酸のうちの１つ以上を含む。アクリル及びメタクリル酸がより好ましい。
【0118】
任意に、少なくとも１つの非イオン性モノマーに由来する１つ以上の構造単位は一般式（ＩＶ）を有し：
【0119】
【化2】
【0120】
好ましい非イオン性モノマーは、ブテン、イソブテン、ペンテン、２－メチルペント－１－エン、３－メチルペント－１－エン、２，４，４－トリメチルペント－１－エン、２，４，４－トリメチルペント－２－エン、シクロペンテン、メチルシクロペンテン、２－メチル－３－メチル－シクロペンテン、ヘキセン、２，３－ジメチルヘキサ－１－エン、２，４－ジメチルヘキサ－１－エン、２，５－ジメチルヘキサ－１－エン、３，５－ジメチルヘキサ－１－エン、４，４－ジメチルヘキサ－１－エン、シクロヘキセン、メチルシクロヘキセン、シクロヘプテン、１０個以上の炭素原子を有する、デカ－１－エン、ドデカ－１－エン、ヘキサデカ－１－エン、オクタデカ－１－エン及びドコサ－１－エンなどのα－オレフィンのうちの１つ以上を含み、好ましい芳香族モノマーは、スチレン、α－メチルスチレン、３－メチルスチレン、４－ドデシルスチレン、２－エチル－４－ベジルスチレン（bezylstyrene）、４－シクロヘキシルスチレン、４－プロピルスチロール、１－ビニルナフタレン、２－ビニルナフタレンであり、好ましいカルボン酸エステルモノマーは、メチル（メタ）アクリレート、エチル（メタ）アクリレート、プロピル（メタ）アクリレート、ｔ－ブチル（メタ）アクリレート、ペンチル（メタ）アクリレート、ヘキシル（メタ）アクリレート、２－エチルヘキシル（メタ）アクリレート、オクチル（メタ）アクリレート、ラウリル（メタ）アクリレート、ステアリル（メタ）アクリレート及びベヘニル（メタ）アクリレートであり、好ましいアミドは、Ｎ－メチルアクリルアミド、Ｎ－エチルアクリルアミド、Ｎ－ｔ－ブチルアクリルアミド、Ｎ－２－エチルヘキシルアクリルアミド、Ｎ－オクチルアクリルアミド、Ｎ－ラウリルアクリルアミド、Ｎ－ステアリルアクリルアミド、Ｎ－ベヘニルアクリルアミドである。
【0121】
並びに少なくとも１つのスルホン酸モノマーから誘導される少なくとも１つの構造単位は一般式（Ｖ）及び（ＶＩ）を有し：
【0122】
【化3】
【0123】
好ましいスルホン化モノマーは、１－アクリルアミド－１－プロパンスルホン酸、２－アクリルアミド－２－プロパンスルホン酸、２－アクリルアミド－２－メチル－１－プロパンスルホン酸、２－メタクリルアミド－２－メチル－１－プロパンスルホン酸、３－メタクリルアミド－２－ヒドロキシ－プロパンスルホン酸、アリルスルホン酸、メタリルスルホン酸、アリルオキシベンゼンスルホン酸、メタリルオキシベンゼンスルホン酸、２－ヒドロキシ－３－（２－プロペニルオキシ）プロパンスルホン酸、２－メチル－２－プロペン－１－スルホン酸、スチレンスルホン酸、ビニルスルホン酸、３－スルホプロピル、３－スルホ－プロピルメタクリレート、スルホメタクリルアミド、スルホメチルメタクリルアミド、及び上述の酸又はこれらの水溶性塩の混合物のうちの１つ以上を含む。
【0124】
好ましくは、ポリマーは、以下の濃度のモノマー、すなわち、ポリマーの約４０～約９０重量％、好ましくは約６０～約９０重量％の１種以上のカルボン酸モノマー、ポリマーの約５～約５０重量％、好ましくは約１０～約４０重量％の１種以上のスルホン酸モノマー、及び任意にポリマーの約１重量％～約３０重量％、好ましくは約２～約２０重量％の１種以上の非イオン性モノマーを含む。とりわけ好ましいポリマーは、ポリマーの約７０重量％～約８０重量％の少なくとも１種のカルボン酸モノマー及びポリマーの約２０重量％～約３０重量％の少なくとも１種のスルホン酸モノマーを含む。
【0125】
ポリマー中、カルボン酸基又はスルホン酸基の全て又はいくつかが中和形態で存在していてよく、すなわちいくつか又は全ての酸性基中のカルボン酸基及び／又はスルホン酸基の酸性水素原子が、金属イオン、好ましくはアルカリ金属イオン、具体的にはナトリウムイオンと置き換えられ得る。
【0126】
カルボン酸は、好ましくは（メタ）アクリル酸である。スルホン酸モノマーは、好ましくは２－アクリルアミド－２－プロパンスルホン酸（ＡＭＰＳ）である。
【0127】
好ましい市販のポリマーとしては、Ａｌｃｏ Ｃｈｅｍｉｃａｌによって供給されるＡｌｃｏｓｐｅｒｓｅ ２４０、Ａｑｕａｔｒｅａｔ ＡＲ５４０、及びＡｑｕａｔｒｅａｔ ＭＰＳ、Ｒｏｈｍ ＆ Ｈａａｓによって供給されるＡｃｕｍｅｒ ３１００、Ａｃｕｍｅｒ ２０００、Ａｃｕｓｏｌ ５８７Ｇ及びＡｃｕｓｏｌ ５８８Ｇ、ＢＦ Ｇｏｏｄｒｉｃｈによって供給されるＧｏｏｄｒｉｃｈ Ｋ－７９８、Ｋ－７７５及びＫ－７９７、並びにＩＳＰ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．によって供給されるＡＣＰ１０４２が挙げられる。特に好ましいポリマーは、Ｒｏｈｍ ＆ Ｈａａｓによって供給されるＡｃｕｓｏｌ ５８７Ｇ及びＡｃｕｓｏｌ ５８８Ｇである。
【0128】
適切な分散剤ポリマーには、低分子量のアニオン性カルボン酸ポリマーが含まれる。それらは、約２００，０００ｇ／モル以下、又は約７５，０００ｇ／モル以下、又は約５０，０００ｇ／モル以下、又は約３，０００～約５０，０００ｇ／モル、好ましくは約５，０００～約４５，０００ｇ／モルの重量平均分子量を有するホモポリマー又はコポリマーであり得る。分散剤ポリマーは、１，０００～２０，０００、特に２，０００～１０，０００、及び特に好ましくは３，０００～５，０００の平均分子量を有するポリアクリレートの低分子量ホモポリマーであってもよい。
【0129】
分散剤ポリマーは、７０，０００未満の分子量を有する、アクリル酸とメタクリル酸のコポリマー、アクリル酸及び／又はメタクリル酸とマレイン酸のコポリマー並びにアクリル酸及び／又はメタクリル酸とフマル酸のコポリマーであってもよい。それらの分子量は、２，０００～８０，０００、より好ましくは２０，０００～５０，０００、具体的には３０，０００～４０，０００ｇ／モルの範囲であり、（メタ）アクリレートとマレエート又はフマレートセグメントとの比は３０：１～１：２である。
【0130】
分散剤ポリマーは、３，０００～１００，０００、あるいは４，０００～２０，０００の分子量を有するアクリルアミドとアクリレートとのコポリマーであってもよく、分散剤ポリマーの５０重量％未満、あるいは２０重量％未満のアクリルアミド含有量も使用され得る。あるいは、そのような分散剤ポリマーは、４，０００～２０，０００の分子量、及びポリマーの０重量％～１５％のアクリルアミド含有量を有してもよい。
【0131】
本明細書で好適な分散剤ポリマーには、イタコン酸ホモポリマー及びコポリマーも含まれる。
【0132】
あるいは、分散剤ポリマーは、アルコキシル化ポリアルキレンイミン、アルコキシル化ポリカルボキシレート、ポリエチレングリコール、スチレンコポリマー、セルロースサルフェートエステル、カルボキシル化多糖、両親媒性グラフトコポリマー及びこれらの混合物からなる群から選択され得る。
【0133】
漂白剤系
本発明の組成物は、好ましくは、高濃度の漂白剤、好ましくは過炭酸塩を、漂白活性化剤又は漂白触媒又はその両方と組み合わせて含む、漂白系を含む。好ましくは、漂白活性化剤はＴＡＥＤであり、漂白触媒はマンガン漂白触媒である。
本発明の組成物は、好ましくは、高濃度の漂白剤、好ましくは過炭酸塩を、漂白活性化剤又は漂白触媒又はその両方と組み合わせて含む、漂白系を含む。好ましくは、漂白活性化剤はＴＡＥＤであり、漂白触媒はマンガン漂白触媒である。
【0134】
漂白剤
本発明の組成物は、好ましくは、組成物の約１０～約２０重量％、より好ましくは約１２～約１８重量％の漂白剤、好ましくは過炭酸塩を含む。
本発明の組成物は、好ましくは、組成物の約１０～約２０重量％、より好ましくは約１２～約１８重量％の漂白剤、好ましくは過炭酸塩を含む。
【0135】
無機及び有機漂白剤が、本明細書での使用に好適である。無機漂白剤には、過ホウ酸塩、過炭酸塩、過リン酸塩、過硫酸塩及び過ケイ酸塩などの過水和塩が挙げられる。無機過水和塩は、通常、アルカリ金属塩である。無機過水和塩は、追加の保護なしの結晶性固体として含まれ得る。代替的に、塩はコーティングされていてもよい。好適なコーティングには、硫酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、ケイ酸ナトリウム及びこれらの混合物が挙げられる。当該コーティングは、表面に塗布される混合物として塗布されるか、又は順次積層して塗布され得る。
【0136】
アルカリ金属過炭酸塩、特に過炭酸ナトリウムは、本明細書における使用に好ましい漂白剤である。過炭酸塩は、最も好ましくは、製品内安定性を提供するコーティングされた形態で製品に組み込まれる。
【0137】
過酸化モノ過硫酸カリウムは、本明細書で有用な別の無機過水和塩である。
【0138】
典型的な有機漂白剤は、有機ペルオキシ酸、とりわけドデカンジペルオキシ酸、テトラデカンジペルオキシ酸、及びヘキサデカンジペルオキシ酸である。モノ及びジペルアゼライン酸、モノ及びジペルブラシル酸も、本明細書において好適である。ジアシル及びテトラアシル過酸化物、例えば過酸化ジベンゾイル及び過酸化ジラウロイルは、本発明の関連において使用可能な他の有機過酸化物である。
【0139】
更なる典型的な有機漂白剤としては、ペルオキシ酸が挙げられ、具体例は、アルキルペルオキシ酸及びアリールペルオキシ酸である。好ましい代表例は、（ａ）ペルオキシ安息香酸及びその環置換の誘導体、例えばアルキルペルオキシ安息香酸の他、ペルオキシ－α－ナフトエ酸及びモノペルフタル酸マグネシウム、（ｂ）脂肪族又は置換脂肪族ペルオキシ酸、例えばペルオキシラウリン酸、ペルオキシステアリン酸、ε－フタルイミドペルオキシカプロン酸［フタロイミノペルオキシヘキサン酸（ＰＡＰ）］、ｏ－カルボキシベンズアミドペルオキシカプロン酸、Ｎ－ノネニルアミドペルアジピン酸及びＮ－ノネニルアミドペルスクシネート、並びに（ｃ）脂肪族及び芳香脂肪族ペルオキシジカルボン酸、例えば１，１２－ジペルオキシカルボン酸、１，９－ジペルオキシアゼライン酸、ジペルオキシセバシン酸、ジペルオキシブラシル酸、ジペルオキシフタル酸、２－デシルジペルオキシブタン－１，４－二酸、Ｎ，Ｎ－テレフタロイルジ（６－アミノペルカプロン酸）である。
【0140】
漂白活性化剤
漂白活性化剤は、典型的には、６０℃以下の温度での洗浄の過程で漂白作用を強化する有機過酸前駆体である。本明細書での使用に好適な漂白活性化剤には、過加水分解条件下で、好ましくは１～１２個の炭素原子、特に２～１０個の炭素原子を有する脂肪族ペルオキソカルボン酸（peroxoycarboxylic acid）、及び／又は任意に置換された過安息香酸を与える化合物が含まれる。好適な物質は、炭素原子の数が指定されているＯ－アシル基及び／若しくはＮ－アシル基並びに／又は任意に置換されたベンゾイル基を有する。ポリアシル化アルキレンジアミン、具体的にはテトラアセチルエチレンジアミン（tetraacetylethylenediamine、ＴＡＥＤ）、アシル化トリアジン誘導体、具体的には１，５－ジアセチル－２，４－ジオキソヘキサヒドロ－１，３，５－トリアジン（1,5-diacetyl-2,4-dioxohexahydro-1,3,5-triazine、ＤＡＤＨＴ）、アシル化グリコールウリル、具体的にはテトラアセチルグリコールウリル（tetraacetylglycoluril、ＴＡＧＵ）、Ｎ－アシルイミド、具体的にはＮ－ノナノイルスクシンイミド（N-nonanoylsuccinimide、ＮＯＳＩ）、アシル化フェノールスルホネート、具体的にはｎ－ノナノイル－又はイソノナノイルオキシベンゼンスルホネート（ｎ－又はイソ－ＮＯＢＳ）、デカノイルオキシ安息香酸（decanoyloxybenzoic acid、ＤＯＢＡ）、無水カルボン酸、具体的には無水フタル酸、アシル化多価アルコール、具体的にはトリアセチン、二酢酸エチレングリコール及び２，５－ジアセトキシ－２，５－ジヒドロフラン、並びにクエン酸トリエチルアセチル（triethylacetyl citrate、ＴＥＡＣ）も好まれる。存在する場合、本発明の組成物は、組成物の０．０１～５重量％、好ましくは０．２～２重量％の漂白活性化剤、好ましくはＴＡＥＤを含む。
漂白活性化剤は、典型的には、６０℃以下の温度での洗浄の過程で漂白作用を強化する有機過酸前駆体である。本明細書での使用に好適な漂白活性化剤には、過加水分解条件下で、好ましくは１～１２個の炭素原子、特に２～１０個の炭素原子を有する脂肪族ペルオキソカルボン酸（peroxoycarboxylic acid）、及び／又は任意に置換された過安息香酸を与える化合物が含まれる。好適な物質は、炭素原子の数が指定されているＯ－アシル基及び／若しくはＮ－アシル基並びに／又は任意に置換されたベンゾイル基を有する。ポリアシル化アルキレンジアミン、具体的にはテトラアセチルエチレンジアミン（tetraacetylethylenediamine、ＴＡＥＤ）、アシル化トリアジン誘導体、具体的には１，５－ジアセチル－２，４－ジオキソヘキサヒドロ－１，３，５－トリアジン（1,5-diacetyl-2,4-dioxohexahydro-1,3,5-triazine、ＤＡＤＨＴ）、アシル化グリコールウリル、具体的にはテトラアセチルグリコールウリル（tetraacetylglycoluril、ＴＡＧＵ）、Ｎ－アシルイミド、具体的にはＮ－ノナノイルスクシンイミド（N-nonanoylsuccinimide、ＮＯＳＩ）、アシル化フェノールスルホネート、具体的にはｎ－ノナノイル－又はイソノナノイルオキシベンゼンスルホネート（ｎ－又はイソ－ＮＯＢＳ）、デカノイルオキシ安息香酸（decanoyloxybenzoic acid、ＤＯＢＡ）、無水カルボン酸、具体的には無水フタル酸、アシル化多価アルコール、具体的にはトリアセチン、二酢酸エチレングリコール及び２，５－ジアセトキシ－２，５－ジヒドロフラン、並びにクエン酸トリエチルアセチル（triethylacetyl citrate、ＴＥＡＣ）も好まれる。存在する場合、本発明の組成物は、組成物の０．０１～５重量％、好ましくは０．２～２重量％の漂白活性化剤、好ましくはＴＡＥＤを含む。
【0141】
漂白触媒
本明細書の組成物は、好ましくは、漂白触媒、好ましくは金属含有漂白触媒を含有する。より好ましくは、金属含有漂白触媒は、遷移金属含有漂白触媒、とりわけマンガン又はコバルト含有漂白触媒である。
本明細書の組成物は、好ましくは、漂白触媒、好ましくは金属含有漂白触媒を含有する。より好ましくは、金属含有漂白触媒は、遷移金属含有漂白触媒、とりわけマンガン又はコバルト含有漂白触媒である。
【0142】
本明細書での使用に好ましい漂白触媒としては、マンガントリアザシクロノナン及び関連する錯体；Ｃｏ、Ｃｕ、Ｍｎ及びＦｅビスピリジルアミン並びに関連する錯体；並びにペンタミン酢酸コバルト（ＩＩＩ）及び関連する錯体が挙げられる。本明細書での使用に特に好ましい漂白触媒は、１，４，７－トリメチル－１，４，７－トリアザシクロノナン（Ｍｅ－ＴＡＣＮ）及び１，２，４，７－テトラメチル－１，４，７－トリアザシクロノナン（Ｍｅ／Ｍｅ－ＴＡＣＮ）である。本明細書での使用に特に好ましい組成物は、１，４，７－トリメチル－１，４，７－トリアザシクロノナン（Ｍｅ－ＴＡＣＮ）及び／又は１，２，４，７－テトラメチル－１，４，７－トリアザシクロノナン（Ｍｅ／Ｍｅ－ＴＡＣＮ）である。
【0143】
好ましくは、本発明の組成物は、組成物の０．００１～０．５重量％、より好ましくは０．００２～０．１重量％、より好ましくは０．００５～０．０７５重量％の漂白触媒を含む。好ましくは、漂白触媒は、マンガン漂白触媒である。
【0144】
無機ビルダー
本発明の組成物は、好ましくは、無機ビルダーを含む。好適な無機ビルダーは、炭酸塩、ケイ酸塩及びこれらの混合物からなる群から選択される。炭酸ナトリウムが、本明細書における使用にとりわけ好ましい。好ましくは、本発明の組成物は、組成物の５～６０重量％、より好ましくは１０～５０重量％、特に１５～４５重量％の炭酸ナトリウムを含む。
本発明の組成物は、好ましくは、無機ビルダーを含む。好適な無機ビルダーは、炭酸塩、ケイ酸塩及びこれらの混合物からなる群から選択される。炭酸ナトリウムが、本明細書における使用にとりわけ好ましい。好ましくは、本発明の組成物は、組成物の５～６０重量％、より好ましくは１０～５０重量％、特に１５～４５重量％の炭酸ナトリウムを含む。
【0145】
界面活性剤
本明細書での使用に好適な界面活性剤としては、非イオン性界面活性剤が挙げられ、好ましくは、組成物は、いかなる他の界面活性剤も含まない。従来的には、非イオン性界面活性剤は、表面修飾目的、具体的には膜形成及び斑点形成を回避し、光沢を改善するためのシート化を目的として、自動食器洗浄において使用されてきた。非イオン性界面活性剤は、汚れの再堆積の防止にも寄与することができることが判明している。
本明細書での使用に好適な界面活性剤としては、非イオン性界面活性剤が挙げられ、好ましくは、組成物は、いかなる他の界面活性剤も含まない。従来的には、非イオン性界面活性剤は、表面修飾目的、具体的には膜形成及び斑点形成を回避し、光沢を改善するためのシート化を目的として、自動食器洗浄において使用されてきた。非イオン性界面活性剤は、汚れの再堆積の防止にも寄与することができることが判明している。
【0146】
好ましくは、本発明の組成物は、非イオン性界面活性剤又は非イオン性界面活性剤系を含み、より好ましくは、非イオン性界面活性剤又は非イオン性界面活性剤系は、蒸留水中、濃度１％で測定した場合に４０～７０℃、好ましくは４５～６５℃の転相温度を有する。「非イオン性界面活性剤系」とは、本明細書において、２つ以上の非イオン性界面活性剤の混合物を意味する。非イオン性界面活性剤系が、本明細書での使用に好ましい。これらは、単一の非イオン性界面活性剤よりも、製品中で、改善された洗浄及び仕上がり特性並びに良好な安定性を有すると考えられる。
【0147】
転相温度とは、それよりも低い温度では界面活性剤又はその混合物が油膨張ミセルとして水性相中に優先的に分配され、それよりも高い温度では水膨張逆ミセルとして油性相中に優先的に分配される温度である。転相温度は、混濁が生じる温度を識別することによって視覚的に判断することができる。
【0148】
非イオン性界面活性剤又は系の転相温度は、以下のように判断することができる。蒸留水中、溶液の１重量％の対応する界面活性剤又は混合物を含有する溶液を調製する。溶液を軽く撹拌した後、転相温度を分析して、プロセスが化学平衡で生じることを確実にする。転相温度は、７５ｍｍ密封ガラス試験管中に溶液を浸漬することによって熱安定性の浴槽内で測定する。漏れがないことを確実にするために、転相温度の測定の前後に試験管を秤量しておく。温度が事前予測した転相温度より数度下に達するまで、温度を１℃／分未満の速度で徐々に増加させる。転相温度は、濁りの最初の兆候があった時点で視覚的に判断される。
【0149】
好適な非イオン性界面活性剤としては、ｉ）６～２０個の炭素原子を有するモノヒドロキシアルカノール又はアルキルフェノール（alkyphenol）と、アルコール又はアルキルフェノール１モル当たり、好ましくは少なくとも１２モル、特に好ましくは少なくとも１６モル、更により好ましくは少なくとも２０モルのエチレンオキシドとの反応によって調製される、エトキシル化非イオン性界面活性剤、ｉｉ）６～２０個の炭素原子及び少なくとも１つのエトキシ基及びプロポキシ基を有するアルコールアルコキシル化界面活性剤、が挙げられる。界面活性剤ｉ）とｉｉ）との混合物が、本明細書での使用に好ましい。
【0150】
他の好適な非イオン性界面活性剤は、次式で表されるエポキシキャップ化ポリ（オキシアルキル化）アルコールであり、
Ｒ１Ｏ［ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）Ｏ］ｘ［ＣＨ２ＣＨ２Ｏ］ｙ［ＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）Ｒ２］ （Ｉ）
式中、Ｒ１は、４～１８個の炭素原子を有する直鎖状又は分岐状の脂肪族炭化水素基であり、Ｒ２は、２～２６個の炭素原子を有する直鎖状又は分岐状の脂肪族炭化水素基であり、ｘは、０．５～１．５、より好ましくは約１の平均値を有する整数であり、ｙは、少なくとも１５、より好ましくは少なくとも２０の値を有する整数である。
Ｒ１Ｏ［ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）Ｏ］ｘ［ＣＨ２ＣＨ２Ｏ］ｙ［ＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）Ｒ２］ （Ｉ）
式中、Ｒ１は、４～１８個の炭素原子を有する直鎖状又は分岐状の脂肪族炭化水素基であり、Ｒ２は、２～２６個の炭素原子を有する直鎖状又は分岐状の脂肪族炭化水素基であり、ｘは、０．５～１．５、より好ましくは約１の平均値を有する整数であり、ｙは、少なくとも１５、より好ましくは少なくとも２０の値を有する整数である。
【0151】
好ましくは、式Ｉの界面活性剤は、末端エポキシド単位［ＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）Ｒ２］中に少なくとも約１０個の炭素原子を有する。本発明によれば、式Ｉの好適な界面活性剤は、例えば、Ｏｌｉｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎによる１９９４年１０月１３日に公開された国際公開第９４／２２８００号に記載の、Ｏｌｉｎ ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎのＰＯＬＹ－ＴＥＲＧＥＮＴ（登録商標）ＳＬＦ－１８Ｂ非イオン性界面活性剤である。
【0152】
酵素
プロテアーゼ
本発明の組成物は、本発明のアミラーゼに加えてプロテアーゼを含むことができる。２以上の酵素の混合物は、より広い温度、サイクル持続時間及び／又は基質範囲にわたって洗浄の増強に貢献することができ、特に再付着防止剤及び／又はスルホン化ポリマーとともに使用される場合、優れた光沢効果を提供することができる。
プロテアーゼ
本発明の組成物は、本発明のアミラーゼに加えてプロテアーゼを含むことができる。２以上の酵素の混合物は、より広い温度、サイクル持続時間及び／又は基質範囲にわたって洗浄の増強に貢献することができ、特に再付着防止剤及び／又はスルホン化ポリマーとともに使用される場合、優れた光沢効果を提供することができる。
【0153】
適切なプロテアーゼは、アミノ酸置換Ｘ３９Ｅ、Ｘ９９Ｒ、Ｘ１２６Ａ、Ｘ１２７Ｅ及びＸ１２８Ｇを有するＢａｃｉｌｌｕｓ ｇｉｂｓｏｎｉｉ由来の変異体スブチリシンプロテアーゼである。
【0154】
別の好適なプロテアーゼは、Ｓ０３９Ｅ、Ｓ０９９Ｒ、Ｓ１２６Ａ、Ｄ１２７Ｅ、及びＦ１２８Ｇから成る群から選択される３、４、又は５個のアミノ酸置換を含むスブチリシン変異体であり、Ｎ７４Ｄ、Ｔ１１４Ｌ、Ｍ１２２Ｌ、Ｎ１９８Ａ、Ｎ１９８Ｇ、Ｍ２１１Ｅ、Ｍ２１１Ｑ、Ｎ２１２Ｑ、及びＮ２４２Ｄから成る群から選択される１以上の追加の置換を更に含み、変異体は、配列番号６のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有する。
【0155】
別の適切なプロテアーゼは、
（ｉ）Ｓ０３９Ｅ、Ｎ７４Ｄ、Ｓ０９９Ｒ、Ｍ２１１Ｅ、Ｎ２４２Ｄから成る群から選択される２以上のアミノ酸置換；及び
（ｉｉ）Ｔ１１４Ｌ、Ｍ１２２Ｌ、Ｓ１２６Ａ、Ｆ１２８Ｇ、Ｎ１９８Ａ、Ｎ１９８Ｇ、Ｍ２１１Ｑ、Ｎ２１２Ｑから成る群から選択される１以上の追加の置換を含むスブチリシン変異体であり、
変異体は、配列番号６又は７のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有する。
（ｉ）Ｓ０３９Ｅ、Ｎ７４Ｄ、Ｓ０９９Ｒ、Ｍ２１１Ｅ、Ｎ２４２Ｄから成る群から選択される２以上のアミノ酸置換；及び
（ｉｉ）Ｔ１１４Ｌ、Ｍ１２２Ｌ、Ｓ１２６Ａ、Ｆ１２８Ｇ、Ｎ１９８Ａ、Ｎ１９８Ｇ、Ｍ２１１Ｑ、Ｎ２１２Ｑから成る群から選択される１以上の追加の置換を含むスブチリシン変異体であり、
変異体は、配列番号６又は７のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有する。
【0156】
本発明のアミラーゼと組み合わせて使用するのに適したプロテアーゼとしては、メタロプロテアーゼ、及び中性又はスブチリシン（ＥＣ３．４．２１．６２）などのアルカリ性微生物セリンプロテアーゼを含むセリンプロテアーゼが挙げられる。好適なプロテアーゼとしては、動物、植物又は微生物起源のものが挙げられる。一態様では、このような好適なプロテアーゼは、微生物起源のものであってもよい。好適なプロテアーゼとしては、前述の好適なプロテアーゼの化学的又は遺伝的に修飾された変異体が挙げられる。一態様では、好適なプロテアーゼは、アルカリ性微生物プロテアーゼ又は／及びトリプシン型プロテアーゼなどのセリンプロテアーゼであってよい。好適な中性又はアルカリ性プロテアーゼの例としては、以下が挙げられる。
（ａ）スブチリシン（ＥＣ３．４．２１．６２）、特に国際公開第２００４０６７７３７号、同第２０１５０９１９８９号、同第２０１５０９１９９０号、同第２０１５０２４７３９号、同第２０１５１４３３６０号、米国特許第６，３１２，９３６（Ｂ１）号、同第５，６７９，６３０号、同第４，７６０，０２５号、国際公開第０３／０５５９７４号、同第０３／０５４１８５号、同第０３／０５４１８４号、同第２０１７／２１５９２５号、独国特許公開第１０２００６０２２２１６（Ａ１）号、国際公開第２０１５０８９４４７、同第２０１５０８９４４１号、同第２０１６０６６７５６号、同第２０１６０６６７５７号、同第２０１６０６９５５７号、同第２０１６０６９５６３号、同第２０１６０６９５６９号、同第２０１６１７４２３４号、同第２０１７／０８９０９３号、同第２０２０／１５６４１９号、同第２０１６／１８３５０９号に記載されている、バチルス属（Bacillus）の種、Ｂ．レンタス（B. lentus）、Ｂ．アルカロフィラス（B. alkalophilus）、Ｂ．サブチリス（B. subtilis）、Ｂ．アミロリケファシエンス（B. amyloliquefaciens）、Ｂ．プミルス（B. pumilus）、Ｂ．ギブソニイ（B. gibsonii）、及びＢ．アキバイ（B. akibaii）などのバチルス属由来のもの。具体的には、変異Ｓ９Ｒ、Ａ１５Ｔ、Ｖ６６Ａ、Ａ１８８Ｐ、Ｖ１９９Ｉ、Ｎ２１２Ｄ、Ｑ２３９Ｒ、Ｎ２５５Ｄ、Ｘ９Ｅ、Ｘ２００Ｌ、Ｘ２５６Ｅ、Ｘ９Ｒ、Ｘ１９Ｌ、Ｘ６０Ｄ（サビナーゼ付番システム）；独国特許公開第１０２００６０２２２２４（Ａ１）号、国際公開第２０２０／２２１５７８号、同第２０２０／２２１５７９号、同第２０２０／２２１５８０号に記載されているものなどＢ．プミルス（B. pumilus）に由来する、９、１３０、１３３、１４４、２２４、２５２、２７１から選択される位置のうちの少なくとも１以上にアミノ酸置換を含む変異体（ＢＰＮ’付番システム）を含む、スブチリシン。
（ｂ）国際公開第８９／０６２７０号に記載されているフサリウム属プロテアーゼ、並びに国際公開第０５／０５２１６１号及び国際公開第０５／０５２１４６号に記載されているセルロモナス属に由来するキモトリプシンプロテアーゼを含むトリプシン（例えば、ブタ又はウシ起源）などのトリプシン型又はキモトリプシン型プロテアーゼ。
（ｃ）メタロプロテアーゼ、特に国際公開第０７／０４４９９３（Ａ２）号に記載されているバチルス・アミロリケファシエンス由来のもの、国際公開第２０１４１９４０３２号、同第２０１４１９４０５４号及び同第２０１４１９４１１７号に記載されているバチルス、ブレビバチルス、サーモアクチノミセス、ゲオバチルス、パエニバチルス、リシニバチルス又はストレプトミセス種由来のもの、国際公開第２０１５１９３４８８号に記載されているクリベラ・アルミノサ由来のもの、並びに国際公開第２０１６０７５０７８号に記載されているストレプトミセス及びリソバクター由来のもの。
（ｄ）国際公開第９２／１７５７７号（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ Ａ／Ｓ）に記載されているバチルス種ＴＹ１４５、ＮＣＩＭＢ ４０３３９由来のサブチラーゼに対して少なくとも９０％の同一性を有するプロテアーゼ、国際公開第２０１５０２４７３９号及び同第２０１６０６６７５７号に記載されているこのバチルス種ＴＹ１４５サブチラーゼの変異体を含むプロテアーゼ。
（ａ）スブチリシン（ＥＣ３．４．２１．６２）、特に国際公開第２００４０６７７３７号、同第２０１５０９１９８９号、同第２０１５０９１９９０号、同第２０１５０２４７３９号、同第２０１５１４３３６０号、米国特許第６，３１２，９３６（Ｂ１）号、同第５，６７９，６３０号、同第４，７６０，０２５号、国際公開第０３／０５５９７４号、同第０３／０５４１８５号、同第０３／０５４１８４号、同第２０１７／２１５９２５号、独国特許公開第１０２００６０２２２１６（Ａ１）号、国際公開第２０１５０８９４４７、同第２０１５０８９４４１号、同第２０１６０６６７５６号、同第２０１６０６６７５７号、同第２０１６０６９５５７号、同第２０１６０６９５６３号、同第２０１６０６９５６９号、同第２０１６１７４２３４号、同第２０１７／０８９０９３号、同第２０２０／１５６４１９号、同第２０１６／１８３５０９号に記載されている、バチルス属（Bacillus）の種、Ｂ．レンタス（B. lentus）、Ｂ．アルカロフィラス（B. alkalophilus）、Ｂ．サブチリス（B. subtilis）、Ｂ．アミロリケファシエンス（B. amyloliquefaciens）、Ｂ．プミルス（B. pumilus）、Ｂ．ギブソニイ（B. gibsonii）、及びＢ．アキバイ（B. akibaii）などのバチルス属由来のもの。具体的には、変異Ｓ９Ｒ、Ａ１５Ｔ、Ｖ６６Ａ、Ａ１８８Ｐ、Ｖ１９９Ｉ、Ｎ２１２Ｄ、Ｑ２３９Ｒ、Ｎ２５５Ｄ、Ｘ９Ｅ、Ｘ２００Ｌ、Ｘ２５６Ｅ、Ｘ９Ｒ、Ｘ１９Ｌ、Ｘ６０Ｄ（サビナーゼ付番システム）；独国特許公開第１０２００６０２２２２４（Ａ１）号、国際公開第２０２０／２２１５７８号、同第２０２０／２２１５７９号、同第２０２０／２２１５８０号に記載されているものなどＢ．プミルス（B. pumilus）に由来する、９、１３０、１３３、１４４、２２４、２５２、２７１から選択される位置のうちの少なくとも１以上にアミノ酸置換を含む変異体（ＢＰＮ’付番システム）を含む、スブチリシン。
（ｂ）国際公開第８９／０６２７０号に記載されているフサリウム属プロテアーゼ、並びに国際公開第０５／０５２１６１号及び国際公開第０５／０５２１４６号に記載されているセルロモナス属に由来するキモトリプシンプロテアーゼを含むトリプシン（例えば、ブタ又はウシ起源）などのトリプシン型又はキモトリプシン型プロテアーゼ。
（ｃ）メタロプロテアーゼ、特に国際公開第０７／０４４９９３（Ａ２）号に記載されているバチルス・アミロリケファシエンス由来のもの、国際公開第２０１４１９４０３２号、同第２０１４１９４０５４号及び同第２０１４１９４１１７号に記載されているバチルス、ブレビバチルス、サーモアクチノミセス、ゲオバチルス、パエニバチルス、リシニバチルス又はストレプトミセス種由来のもの、国際公開第２０１５１９３４８８号に記載されているクリベラ・アルミノサ由来のもの、並びに国際公開第２０１６０７５０７８号に記載されているストレプトミセス及びリソバクター由来のもの。
（ｄ）国際公開第９２／１７５７７号（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ Ａ／Ｓ）に記載されているバチルス種ＴＹ１４５、ＮＣＩＭＢ ４０３３９由来のサブチラーゼに対して少なくとも９０％の同一性を有するプロテアーゼ、国際公開第２０１５０２４７３９号及び同第２０１６０６６７５７号に記載されているこのバチルス種ＴＹ１４５サブチラーゼの変異体を含むプロテアーゼ。
【0157】
本発明の組成物に特に好ましい追加のプロテアーゼは、親プロテアーゼの変異体であり、親プロテアーゼは、配列番号７と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９８％、更により好ましくは少なくとも９９％、特に１００％の同一性を示し、変異体は、配列番号７に対する以下の位置のうちの１以上、又は２以上又は３以上の置換を含む。
Ｓ３Ｖ、Ｓ９Ｒ、Ａ１３Ｖ、Ａ１５Ｔ、Ｇ２０＊、Ｌ２１Ｆ、Ｉ３５Ｖ、Ｎ６０Ｄ、Ｖ６６Ａ、Ｎ７４Ｄ、Ｓ８５Ｎ／Ｒ、Ｓ９７ＳＥ、Ｓ９７ＡＤ、Ｓ９７Ｄ／Ｇ、Ｓ９９Ｇ／Ｍ／Ｄ／Ｅ、Ｓ１０１Ａ、Ｖ１０２Ｅ／Ｉ、Ｇ１１６Ｖ／Ｒ、Ｓ１２６Ｆ／Ｌ、Ｐ１２７Ｑ、Ｓ１２８Ａ、Ｓ１５４Ｄ、Ｇ１５７Ｓ、Ｙ１６１Ａ、Ｒ１６４Ｓ、Ａ１８８Ｐ、Ｖ１９９Ｉ、Ｑ２００Ｃ／Ｅ／Ｉ／Ｋ／Ｔ／Ｖ／Ｗ／Ｌ、Ｙ２０３Ｗ、Ｎ２１２Ｄ、Ｍ２１６Ｓ／Ｆ、Ａ２２２Ｖ、Ｑ２３９Ｒ／Ｆ、Ｔ２４９Ｒ、Ｎ２５５Ｄ及びＬ２５６Ｅ／Ｎ／Ｑ／Ｄ
Ｓ３Ｖ、Ｓ９Ｒ、Ａ１３Ｖ、Ａ１５Ｔ、Ｇ２０＊、Ｌ２１Ｆ、Ｉ３５Ｖ、Ｎ６０Ｄ、Ｖ６６Ａ、Ｎ７４Ｄ、Ｓ８５Ｎ／Ｒ、Ｓ９７ＳＥ、Ｓ９７ＡＤ、Ｓ９７Ｄ／Ｇ、Ｓ９９Ｇ／Ｍ／Ｄ／Ｅ、Ｓ１０１Ａ、Ｖ１０２Ｅ／Ｉ、Ｇ１１６Ｖ／Ｒ、Ｓ１２６Ｆ／Ｌ、Ｐ１２７Ｑ、Ｓ１２８Ａ、Ｓ１５４Ｄ、Ｇ１５７Ｓ、Ｙ１６１Ａ、Ｒ１６４Ｓ、Ａ１８８Ｐ、Ｖ１９９Ｉ、Ｑ２００Ｃ／Ｅ／Ｉ／Ｋ／Ｔ／Ｖ／Ｗ／Ｌ、Ｙ２０３Ｗ、Ｎ２１２Ｄ、Ｍ２１６Ｓ／Ｆ、Ａ２２２Ｖ、Ｑ２３９Ｒ／Ｆ、Ｔ２４９Ｒ、Ｎ２５５Ｄ及びＬ２５６Ｅ／Ｎ／Ｑ／Ｄ
【0158】
好ましいプロテアーゼには、以下の変異：
Ｓ９Ｒ＋Ａ１３Ｖ＋Ａ１５Ｔ＋ｌ３５Ｖ＋Ｎ６０Ｄ＋Ｑ２３９Ｆ、又は
Ｓ９Ｒ＋Ａ１５Ｔ＋Ｇ２０＋Ｌ２１Ｆ＋Ｎ６０Ｄ＋Ｑ２３９Ｎ、又は
Ｓ９Ｒ＋Ａ１５Ｔ＋Ｖ６６Ａ＋Ｓ９７Ｇ＋Ａ２２２Ｖ＋Ｑ２３９Ｒ＋Ｎ２５５Ｄ、又は
Ｓ９Ｒ＋Ａ１５Ｔ＋Ｖ６６Ａ＋Ｎ７４Ｄ＋Ｑ２３９Ｒ、又は
Ｓ９Ｒ＋Ａ１５Ｔ＋Ｖ６６Ａ＋Ｎ２１２Ｄ＋Ｑ２３９Ｒ、又は
Ｓ９９ＳＥ、又は
Ｓ９９ＡＤ、又は
Ｎ７４Ｄ＋Ｓ８５Ｒ＋Ｇ１１６Ｒ＋Ｓ１２６Ｌ＋Ｐ１２７Ｑ＋Ｓ１２８Ａ、又は
Ｎ７４Ｄ＋Ｓ８５Ｒ＋Ｇ１１６Ｒ＋Ｓ１２６Ｌ＋Ｐ１２７Ｑ＋Ｓ１２８Ａ＋Ｓ１８２Ｄ＋Ｖ２３８Ｒ又は
Ｇ１１６Ｖ＋Ｓ１２６Ｌ＋Ｐ１２７Ｑ＋Ｓ１２８Ａ又は
Ｓ９９Ｍ＋Ｇ１１６Ｖ＋Ｓ１２６Ｌ＋Ｐ１２７Ｑ＋Ｓ１２８Ａ、を含む、配列番号２に対して少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％の同一性を有するものが含まれる。
Ｓ９Ｒ＋Ａ１３Ｖ＋Ａ１５Ｔ＋ｌ３５Ｖ＋Ｎ６０Ｄ＋Ｑ２３９Ｆ、又は
Ｓ９Ｒ＋Ａ１５Ｔ＋Ｇ２０＋Ｌ２１Ｆ＋Ｎ６０Ｄ＋Ｑ２３９Ｎ、又は
Ｓ９Ｒ＋Ａ１５Ｔ＋Ｖ６６Ａ＋Ｓ９７Ｇ＋Ａ２２２Ｖ＋Ｑ２３９Ｒ＋Ｎ２５５Ｄ、又は
Ｓ９Ｒ＋Ａ１５Ｔ＋Ｖ６６Ａ＋Ｎ７４Ｄ＋Ｑ２３９Ｒ、又は
Ｓ９Ｒ＋Ａ１５Ｔ＋Ｖ６６Ａ＋Ｎ２１２Ｄ＋Ｑ２３９Ｒ、又は
Ｓ９９ＳＥ、又は
Ｓ９９ＡＤ、又は
Ｎ７４Ｄ＋Ｓ８５Ｒ＋Ｇ１１６Ｒ＋Ｓ１２６Ｌ＋Ｐ１２７Ｑ＋Ｓ１２８Ａ、又は
Ｎ７４Ｄ＋Ｓ８５Ｒ＋Ｇ１１６Ｒ＋Ｓ１２６Ｌ＋Ｐ１２７Ｑ＋Ｓ１２８Ａ＋Ｓ１８２Ｄ＋Ｖ２３８Ｒ又は
Ｇ１１６Ｖ＋Ｓ１２６Ｌ＋Ｐ１２７Ｑ＋Ｓ１２８Ａ又は
Ｓ９９Ｍ＋Ｇ１１６Ｖ＋Ｓ１２６Ｌ＋Ｐ１２７Ｑ＋Ｓ１２８Ａ、を含む、配列番号２に対して少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％の同一性を有するものが含まれる。
【0159】
他の適切なプロテアーゼは、
（ａ）配列番号６の配列と少なくとも８０％の配列同一性を有し、Ａ３７Ｔ、Ｓ３９Ｅ、Ｉ４３Ｖ、Ａ４７Ｖ、Ｐ５４Ｔ、Ｔ５６Ｙ、Ｉ８０Ｖ、Ｎ８５Ｓ、Ｅ８７Ｄ、Ｓ９９Ｒ、Ｔ１１４Ｑ、Ｍ１２２Ｌ、Ｓ１２６Ａ、Ｄ１２７Ｅ、Ｆ１２８Ｇ、Ｎ１９８Ａ、Ｍ２１１Ｑ、Ｎ２１２Ｑ及びＮ２４２Ｄから選択される３以上の置換を含むプロテアーゼであって、番号付けは配列番号６による、プロテアーゼ；
（ｂ）配列番号８の配列と少なくとも８０％の配列同一性を有し、Ｑ１２Ｌ、Ｉ２１Ｖ、Ｉ４３Ｖ、Ｍ１２２Ｌ、Ｄ１２７Ｐ、Ｎ１５４Ｓ、Ｔ１５６Ａ、Ｇ１６０Ｓ、Ｎ１７７Ｖ、Ｍ２１１Ｎ、Ｍ２１１Ｓ、Ｍ２１１Ｌ、Ｐ２１２Ｄ、Ｐ２１２Ｈ、Ａ２２２Ｓ、Ｖ２２８Ｉ及びＴ２４７Ｎから選択される１以上の置換を含むプロテアーゼであって、番号付けは配列番号８による、プロテアーゼ；及び
（ｃ）配列番号９の配列と少なくとも８０％の配列同一性を有し、Ｓ９Ｒ、Ａ１５Ｔ、Ｇ５９Ｅ、Ｖ６６Ａ、Ｈ１１８Ｎ、Ａ１８８Ｐ、Ｖ１９９Ｉ、Ｑ２００Ｅ、Ｎ２１２Ｄ、Ｑ２３９Ｒ、Ｎ２５５Ｄから選択される３以上の置換を含むプロテアーゼであって、付番は配列番号９に従う、プロテアーゼから成る群から選択される。
（ａ）配列番号６の配列と少なくとも８０％の配列同一性を有し、Ａ３７Ｔ、Ｓ３９Ｅ、Ｉ４３Ｖ、Ａ４７Ｖ、Ｐ５４Ｔ、Ｔ５６Ｙ、Ｉ８０Ｖ、Ｎ８５Ｓ、Ｅ８７Ｄ、Ｓ９９Ｒ、Ｔ１１４Ｑ、Ｍ１２２Ｌ、Ｓ１２６Ａ、Ｄ１２７Ｅ、Ｆ１２８Ｇ、Ｎ１９８Ａ、Ｍ２１１Ｑ、Ｎ２１２Ｑ及びＮ２４２Ｄから選択される３以上の置換を含むプロテアーゼであって、番号付けは配列番号６による、プロテアーゼ；
（ｂ）配列番号８の配列と少なくとも８０％の配列同一性を有し、Ｑ１２Ｌ、Ｉ２１Ｖ、Ｉ４３Ｖ、Ｍ１２２Ｌ、Ｄ１２７Ｐ、Ｎ１５４Ｓ、Ｔ１５６Ａ、Ｇ１６０Ｓ、Ｎ１７７Ｖ、Ｍ２１１Ｎ、Ｍ２１１Ｓ、Ｍ２１１Ｌ、Ｐ２１２Ｄ、Ｐ２１２Ｈ、Ａ２２２Ｓ、Ｖ２２８Ｉ及びＴ２４７Ｎから選択される１以上の置換を含むプロテアーゼであって、番号付けは配列番号８による、プロテアーゼ；及び
（ｃ）配列番号９の配列と少なくとも８０％の配列同一性を有し、Ｓ９Ｒ、Ａ１５Ｔ、Ｇ５９Ｅ、Ｖ６６Ａ、Ｈ１１８Ｎ、Ａ１８８Ｐ、Ｖ１９９Ｉ、Ｑ２００Ｅ、Ｎ２１２Ｄ、Ｑ２３９Ｒ、Ｎ２５５Ｄから選択される３以上の置換を含むプロテアーゼであって、付番は配列番号９に従う、プロテアーゼから成る群から選択される。
【0160】
好適な市販の追加のプロテアーゼ酵素には、Ａｌｃａｌａｓｅ（登録商標）、Ｓａｖｉｎａｓｅ（登録商標）、Ｐｒｉｍａｓｅ（登録商標）、Ｄｕｒａｚｙｍ（登録商標）、Ｐｏｌａｒｚｙｍｅ（登録商標）、Ｋａｎｎａｓｅ（登録商標）、Ｌｉｑｕａｎａｓｅ（登録商標）、Ｌｉｑｕａｎａｓｅ Ｕｌｔｒａ（登録商標）、Ｓａｖｉｎａｓｅ Ｕｌｔｒａ（登録商標）、Ｌｉｑｕａｎａｓｅ（登録商標）Ｅｖｉｔｙ（登録商標）、Ｓａｖｉｎａｓｅ（登録商標）Ｅｖｉｔｙ（登録商標）、Ｏｖｏｚｙｍｅ（登録商標）、Ｎｅｕｔｒａｓｅ（登録商標）、Ｅｖｅｒｌａｓｅ（登録商標）、Ｃｏｒｏｎａｓｅ（登録商標）、Ｂｌａｚｅ（登録商標）、Ｂｌａｚｅ Ｕｌｔｒａ（登録商標）、Ｂｌａｚｅ（登録商標）Ｅｖｉｔｙ（登録商標）、Ｂｌａｚｅ（登録商標）Ｅｘｃｅｅｄ，Ｂｌａｚｅ（登録商標）Ｐｒｏ、Ｅｓｐｅｒａｓｅ（登録商標）、Ｐｒｏｇｒｅｓｓ（登録商標）Ｕｎｏ、Ｐｒｏｇｒｅｓｓ（登録商標）Ｅｘｃｅｌ、Ｐｒｏｇｒｅｓｓ（登録商標）Ｋｅｙ、Ｒｏｎｏｚｙｍｅ（登録商標）、Ｖｉｎｚｏｎ（登録商標）、及びＨｅｔ Ｕｌｔｒａ（登録商標）の商品名でＮｏｖｏｚｙｍｅｓ Ａ／Ｓ（Ｄｅｎｍａｒｋ）により販売されているもの；
商品名Ｍａｘａｔａｓｅ（登録商標）、Ｍａｘａｃａｌ（登録商標）、Ｍａｘａｐｅｍ（登録商標）、Ｐｒｏｐｅｒａｓｅ（登録商標）、Ｐｕｒａｆｅｃｔ（登録商標）、Ｐｕｒａｆｅｃｔ Ｐｒｉｍｅ（登録商標）、Ｐｕｒａｆｅｃｔ Ｏｘ（登録商標）、ＦＮ３（登録商標）、ＦＮ４（登録商標）、Ｅｘｃｅｌｌａｓｅ（登録商標）、Ｕｌｔｉｍａｓｅ（登録商標）及びＰｕｒａｆｅｃｔ ＯＸＰ（登録商標）としてＤｕｐｏｎｔによって販売されているもの；商品名Ｏｐｔｉｃｌｅａｎ（登録商標）及びＯｐｔｉｍａｓｅ（登録商標）としてＳｏｌｖａｙ Ｅｎｚｙｍｅｓによって販売されているもの；並びにＨｅｎｋｅｌ／Ｋｅｍｉｒａから入手可能なもの、すなわち、ＢＬＡＰ（配列は米国特許第５，３５２，６０４号の図２９に示され、Ｓ９９Ｄ＋Ｓ１０１Ｒ＋Ｓ１０３Ａ＋Ｖ１０４Ｉ＋Ｇ１５９Ｓの変異を有する、本明細書において以降ＢＬＡＰと称する）、ＢＬＡＰ Ｒ（Ｓ３Ｔ＋Ｖ４Ｉ＋Ｖ１９９Ｍ＋Ｖ２０５Ｉ＋Ｌ２１７Ｄを有するＢＬＡＰ）、ＢＬＡＰ Ｘ（Ｓ３Ｔ＋Ｖ４Ｉ＋Ｖ２０５Ｉを有するＢＬＡＰ）及びＢＬＡＰ Ｆ４９（Ｓ３Ｔ＋Ｖ４Ｉ＋Ａ１９４Ｐ＋Ｖ１９９Ｍ＋Ｖ２０５Ｉ＋Ｌ２１７Ｄを有するＢＬＡＰ）；及び任意に、少なくとも１つの更なる変異１０１Ｅ／Ｄ、Ｓ１５６Ｄ、Ｌ２６２を含むことができ；Ｋａｏ製のＫＡＰ（変異Ａ２３０Ｖ＋Ｓ２５６Ｇ＋Ｓ２５９Ｎを有するバチルス・アルカリフィルス（Bacillus alkalophilus）スブチリシン及びＢＡＳＦ製のＬａｖｅｒｇｙ（登録商標）、Ｌａｖｅｒｇｙ（登録商標）Ｐｒｏ、Ｌａｖｅｒｇｙ（登録商標）Ｃ Ｂｒｉｇｈｔが挙げられる。
商品名Ｍａｘａｔａｓｅ（登録商標）、Ｍａｘａｃａｌ（登録商標）、Ｍａｘａｐｅｍ（登録商標）、Ｐｒｏｐｅｒａｓｅ（登録商標）、Ｐｕｒａｆｅｃｔ（登録商標）、Ｐｕｒａｆｅｃｔ Ｐｒｉｍｅ（登録商標）、Ｐｕｒａｆｅｃｔ Ｏｘ（登録商標）、ＦＮ３（登録商標）、ＦＮ４（登録商標）、Ｅｘｃｅｌｌａｓｅ（登録商標）、Ｕｌｔｉｍａｓｅ（登録商標）及びＰｕｒａｆｅｃｔ ＯＸＰ（登録商標）としてＤｕｐｏｎｔによって販売されているもの；商品名Ｏｐｔｉｃｌｅａｎ（登録商標）及びＯｐｔｉｍａｓｅ（登録商標）としてＳｏｌｖａｙ Ｅｎｚｙｍｅｓによって販売されているもの；並びにＨｅｎｋｅｌ／Ｋｅｍｉｒａから入手可能なもの、すなわち、ＢＬＡＰ（配列は米国特許第５，３５２，６０４号の図２９に示され、Ｓ９９Ｄ＋Ｓ１０１Ｒ＋Ｓ１０３Ａ＋Ｖ１０４Ｉ＋Ｇ１５９Ｓの変異を有する、本明細書において以降ＢＬＡＰと称する）、ＢＬＡＰ Ｒ（Ｓ３Ｔ＋Ｖ４Ｉ＋Ｖ１９９Ｍ＋Ｖ２０５Ｉ＋Ｌ２１７Ｄを有するＢＬＡＰ）、ＢＬＡＰ Ｘ（Ｓ３Ｔ＋Ｖ４Ｉ＋Ｖ２０５Ｉを有するＢＬＡＰ）及びＢＬＡＰ Ｆ４９（Ｓ３Ｔ＋Ｖ４Ｉ＋Ａ１９４Ｐ＋Ｖ１９９Ｍ＋Ｖ２０５Ｉ＋Ｌ２１７Ｄを有するＢＬＡＰ）；及び任意に、少なくとも１つの更なる変異１０１Ｅ／Ｄ、Ｓ１５６Ｄ、Ｌ２６２を含むことができ；Ｋａｏ製のＫＡＰ（変異Ａ２３０Ｖ＋Ｓ２５６Ｇ＋Ｓ２５９Ｎを有するバチルス・アルカリフィルス（Bacillus alkalophilus）スブチリシン及びＢＡＳＦ製のＬａｖｅｒｇｙ（登録商標）、Ｌａｖｅｒｇｙ（登録商標）Ｐｒｏ、Ｌａｖｅｒｇｙ（登録商標）Ｃ Ｂｒｉｇｈｔが挙げられる。
【0161】
本発明の変異型プロテアーゼと組み合わせて本明細書での使用に特に好ましいのは、Ｐｒｏｐｅｒａｓｅ（登録商標）、Ｂｌａｚｅ（登録商標）、Ｕｌｔｉｍａｓｅ（登録商標）、Ｅｖｅｒｌａｓｅ、Ｓａｖｉｎａｓｅ（登録商標）、Ｓａｖｉｎａｓｅ Ｅｖｉｔｙ（登録商標）、Ｓａｖｉｎａｓｅ Ｕｌｔｒａ（登録商標）、Ｅｘｃｅｌｌａｓｅ（登録商標）、Ｏｖｏｚｙｍｅ（登録商標）、Ｃｏｒｏｎａｓｅ（登録商標）、Ｂｌａｚｅ Ｕｌｔｒａ（登録商標）、Ｂｌａｚｅ Ｅｖｉｔｙ（登録商標）及びＢｌａｚｅ Ｐｒｏ（登録商標）、ＢＬＡＰ及びＢＬＡＰ変異体から成る群から選択される市販のプロテアーゼである。
【0162】
本発明の製品中のプロテアーゼの好ましい濃度としては、組成物１ｇ当たり約０．０５～約１０、より好ましくは約０．５～約７、特に約１～約６ｍｇの活性プロテアーゼが挙げられる。
【0163】
他のアミラーゼ
好ましくは、本発明の組成物は、アミラーゼを含んでもよい。好適なアルファ－アミラーゼとしては、細菌又は真菌起源のものが挙げられる。化学的又は遺伝的に修飾された変異体（バリアント）が含まれる。好ましいアルカリ性α－アミラーゼは、バチルスの菌種、例えば、バチルス・リケニフォルミス、バチルス・アミロリケファシエンス、バチルス・ステロサーモフィラス、バチルス・ズブチリス又は他のバチルス種、例えば、バチルス種ＮＣＢＩ１２２８９、ＮＣＢＩ１２５１２、ＮＣＢＩ１２５１３、ＤＳＭ９３７５（米国特許第７，１５３，８１８号）、ＤＳＭ１２３６８、ＤＳＭＺ番号１２６４９、ＫＳＭ ＡＰ１３７８（国際公開第９７／００３２４号）、ＫＳＭ Ｋ３６又はＫＳＭ Ｋ３８（欧州特許第１，０２２，３３４号）に由来する。好ましいアミラーゼとしては、以下が挙げられる。
好ましくは、本発明の組成物は、アミラーゼを含んでもよい。好適なアルファ－アミラーゼとしては、細菌又は真菌起源のものが挙げられる。化学的又は遺伝的に修飾された変異体（バリアント）が含まれる。好ましいアルカリ性α－アミラーゼは、バチルスの菌種、例えば、バチルス・リケニフォルミス、バチルス・アミロリケファシエンス、バチルス・ステロサーモフィラス、バチルス・ズブチリス又は他のバチルス種、例えば、バチルス種ＮＣＢＩ１２２８９、ＮＣＢＩ１２５１２、ＮＣＢＩ１２５１３、ＤＳＭ９３７５（米国特許第７，１５３，８１８号）、ＤＳＭ１２３６８、ＤＳＭＺ番号１２６４９、ＫＳＭ ＡＰ１３７８（国際公開第９７／００３２４号）、ＫＳＭ Ｋ３６又はＫＳＭ Ｋ３８（欧州特許第１，０２２，３３４号）に由来する。好ましいアミラーゼとしては、以下が挙げられる。
【0164】
他のアミラーゼとしては、以下が挙げられる：
（ａ）国際公開第９６／２３８７３号、同第００／６００６０号、同第０６／００２６４３号、及び同第２０１７／１９２６５７号に記載の変異体、とりわけ国際公開第０６／００２６４３号において配列番号１２に列挙されているＡＡ５６０酵素に対して以下の位置に１以上の置換を有する変異体：
２６、３０、３３、８２、３７、１０６、１１８、１２８、１３３、１４９、１５０、１６０、１７８、１８２、１８６、１９３、２０２、２１４、２３１、２４６、２５６、２５７、２５８、２６９、２７０、２７２、２８３、２９５、２９６、２９８、２９９、３０３、３０４、３０５、３１１、３１４、３１５、３１８、３１９、３３９、３４５、３６１、３７８、３８３、４１９、４２１、４３７、４４１、４４４、４４５、４４６、４４７、４５０、４６１、４７１、４８２、４８４位に１以上の置換を有し、好ましくは、Ｄ１８３＊及びＧ１８４＊の欠失も含むバリアント。
（ｂ）国際公開第０６／００２６４３号の配列番号４、バチルス属ＳＰ７２２由来の野生型酵素と少なくとも９０％の同一性を示す変異体、特に１８３及び１８４位に欠失を有する変異体並びに参照によって本明細書に組み込まれる国際公開第２０００／６００６０号、同第２０１１／１００４１０号及び同第２０１３／００３６５９号に記載されている変異体。
（ｃ）バチルス種７０７（米国特許第６，０９３，５６２号の配列番号７）由来の野生型酵素と少なくとも９５％の同一性を示す変異体、特に以下の突然変異：Ｍ２０２、Ｍ２０８、Ｓ２５５、Ｒ１７２及び／又はＭ２６１のうちの１つ以上を含むもの。好ましくは、当該アミラーゼは、Ｍ２０２Ｌ、Ｍ２０２Ｖ、Ｍ２０２Ｓ、Ｍ２０２Ｔ、Ｍ２０２Ｉ、Ｍ２０２Ｑ、Ｍ２０２Ｗ、Ｓ２５５Ｎ及び／又はＲ１７２Ｑのうちの１つ以上を含む。Ｍ２０２Ｌ又はＭ２０２Ｔ変異を含むものが、特に好ましい。
（ｄ）国際公開第０９／１４９１３０号に記載されているバリアント、好ましくは同第０９／１４９１３０号の配列番号１又は配列番号２、ゲオバチルス・ステロファーモフィラス（Geobacillus Stearophermophilus）由来の野生型酵素又はその切断版と少なくとも９０％の同一性を示すもの。
（ｅ）国際公開第２０１６０９１６８８号の配列番号１と少なくとも８９％の同一性を示す変異体、特にＨ１８３＋Ｇ１８４位での欠失並びに４０５、４２１、４２２及び／又は４２８位に１つ以上の突然変異を含むもの。
（ｆ）パエニバチルス・カードラノリティカスＹＫ９由来の「ＰｃｕＡｍｙｌ α－アミラーゼ」（国際公開第２０１４０９９５２３号の配列番号３）と少なくとも６０％のアミノ酸配列同一性を示す変異体。
（ｇ）サイトファーガ種由来の「ＣｓｐＡｍｙ２アミラーゼ」（国際公開第２０１４１６４７７７号の配列番号１）と少なくとも６０％のアミノ酸配列同一性を示す変異体。
（ｈ）バチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）由来のＡｍｙＥ（国際公開第２００９１４９２７１号の配列番号１）と少なくとも８５％の同一性を示すバリアント。
（ｉ）受託番号ＡＢ０５１１０２を有するバチルス種ＫＳＭ－Ｋ３８由来の野生型アミラーゼと少なくとも９０％の同一性を示す変異体。
（ｊ）バチルス種由来のＡＡＩ１０の成熟アミノ酸配列（国際公開第２０１６１８０７４８号の配列番号７）と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９８％の同一性を示す変異体。
（ｋ）アリシクロバチルス種アミラーゼの成熟アミノ酸配列（国際公開第２０１６１８０７４８号の配列番号８）と少なくとも８０％の同一性を示す変異体。
（ａ）国際公開第９６／２３８７３号、同第００／６００６０号、同第０６／００２６４３号、及び同第２０１７／１９２６５７号に記載の変異体、とりわけ国際公開第０６／００２６４３号において配列番号１２に列挙されているＡＡ５６０酵素に対して以下の位置に１以上の置換を有する変異体：
２６、３０、３３、８２、３７、１０６、１１８、１２８、１３３、１４９、１５０、１６０、１７８、１８２、１８６、１９３、２０２、２１４、２３１、２４６、２５６、２５７、２５８、２６９、２７０、２７２、２８３、２９５、２９６、２９８、２９９、３０３、３０４、３０５、３１１、３１４、３１５、３１８、３１９、３３９、３４５、３６１、３７８、３８３、４１９、４２１、４３７、４４１、４４４、４４５、４４６、４４７、４５０、４６１、４７１、４８２、４８４位に１以上の置換を有し、好ましくは、Ｄ１８３＊及びＧ１８４＊の欠失も含むバリアント。
（ｂ）国際公開第０６／００２６４３号の配列番号４、バチルス属ＳＰ７２２由来の野生型酵素と少なくとも９０％の同一性を示す変異体、特に１８３及び１８４位に欠失を有する変異体並びに参照によって本明細書に組み込まれる国際公開第２０００／６００６０号、同第２０１１／１００４１０号及び同第２０１３／００３６５９号に記載されている変異体。
（ｃ）バチルス種７０７（米国特許第６，０９３，５６２号の配列番号７）由来の野生型酵素と少なくとも９５％の同一性を示す変異体、特に以下の突然変異：Ｍ２０２、Ｍ２０８、Ｓ２５５、Ｒ１７２及び／又はＭ２６１のうちの１つ以上を含むもの。好ましくは、当該アミラーゼは、Ｍ２０２Ｌ、Ｍ２０２Ｖ、Ｍ２０２Ｓ、Ｍ２０２Ｔ、Ｍ２０２Ｉ、Ｍ２０２Ｑ、Ｍ２０２Ｗ、Ｓ２５５Ｎ及び／又はＲ１７２Ｑのうちの１つ以上を含む。Ｍ２０２Ｌ又はＭ２０２Ｔ変異を含むものが、特に好ましい。
（ｄ）国際公開第０９／１４９１３０号に記載されているバリアント、好ましくは同第０９／１４９１３０号の配列番号１又は配列番号２、ゲオバチルス・ステロファーモフィラス（Geobacillus Stearophermophilus）由来の野生型酵素又はその切断版と少なくとも９０％の同一性を示すもの。
（ｅ）国際公開第２０１６０９１６８８号の配列番号１と少なくとも８９％の同一性を示す変異体、特にＨ１８３＋Ｇ１８４位での欠失並びに４０５、４２１、４２２及び／又は４２８位に１つ以上の突然変異を含むもの。
（ｆ）パエニバチルス・カードラノリティカスＹＫ９由来の「ＰｃｕＡｍｙｌ α－アミラーゼ」（国際公開第２０１４０９９５２３号の配列番号３）と少なくとも６０％のアミノ酸配列同一性を示す変異体。
（ｇ）サイトファーガ種由来の「ＣｓｐＡｍｙ２アミラーゼ」（国際公開第２０１４１６４７７７号の配列番号１）と少なくとも６０％のアミノ酸配列同一性を示す変異体。
（ｈ）バチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）由来のＡｍｙＥ（国際公開第２００９１４９２７１号の配列番号１）と少なくとも８５％の同一性を示すバリアント。
（ｉ）受託番号ＡＢ０５１１０２を有するバチルス種ＫＳＭ－Ｋ３８由来の野生型アミラーゼと少なくとも９０％の同一性を示す変異体。
（ｊ）バチルス種由来のＡＡＩ１０の成熟アミノ酸配列（国際公開第２０１６１８０７４８号の配列番号７）と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９８％の同一性を示す変異体。
（ｋ）アリシクロバチルス種アミラーゼの成熟アミノ酸配列（国際公開第２０１６１８０７４８号の配列番号８）と少なくとも８０％の同一性を示す変異体。
【0165】
好ましくは、アミラーゼは、遺伝子操作を受けた酵素であり、漂白酸化を起こしやすいアミノ酸のうちの１つ以上が、より酸化しにくいアミノ酸で置換されている。具体的には、メチオニン残基は、任意の他のアミノ酸で置換されることが好ましい。具体的には、最も酸化しやすいメチオニンが置換されることが好ましい。好ましくは、国際公開第０６／００２６４３号の配列番号１２として列挙されているＡＡ５６０酵素において２０２に相当する位置のメチオニンが置換される。好ましくは、この位置のメチオニンは、スレオニン又はロイシン、好ましくはロイシンで置換される。
【0166】
好適な市販のα－アミラーゼとしては、ＤＵＲＡＭＹＬ（登録商標）、ＬＩＱＵＥＺＹＭＥ（登録商標）、ＴＥＲＭＡＭＹＬ（登録商標）、ＴＥＲＭＡＭＹＬ ＵＬＴＲＡ（登録商標）、ＮＡＴＡＬＡＳＥ（登録商標）、ＳＵＰＲＡＭＹＬ（登録商標）、ＳＴＡＩＮＺＹＭＥ（登録商標）、ＳＴＡＩＮＺＹＭＥ ＰＬＵＳ（登録商標）、ＦＵＮＧＡＭＹＬ（登録商標）、ＡＴＬＡＮＴＩＣ（登録商標）、ＩＮＴＥＮＳＡ（登録商標）及びＢＡＮ（登録商標）（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ Ａ／Ｓ（Ｂａｇｓｖａｅｒｄ，Ｄｅｎｍａｒｋ））、ＫＥＭＺＹＭ（登録商標）ＡＴ ９０００（Ｂｉｏｚｙｍ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｔｒａｄｉｎｇ ＧｍｂＨ Ｗｅｈｌｉｓｔｒａｓｓｅ ２７ｂ Ａ－１２００ Ｗｉｅｎ Ａｕｓｔｒｉａ）、ＲＡＰＩＤＡＳＥ（登録商標）、ＰＵＲＡＳＴＡＲ（登録商標）、ＥＮＺＹＳＩＺＥ（登録商標）、ＯＰＴＩＳＩＺＥ ＨＴ ＰＬＵＳ（登録商標）、ＰＯＷＥＲＡＳＥ（登録商標）、ＰＲＥＦＥＲＥＮＺ Ｓ（登録商標）シリーズ（ＰＲＥＦＥＲＥＮＺ Ｓ１０００（登録商標）及びＰＲＥＦＥＲＥＮＺ Ｓ２０００（登録商標）を含む）並びにＰＵＲＡＳＴＡＲ ＯＸＡＭ（登録商標）（ＤｕＰｏｎｔ．，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）並びにＫＡＭ（登録商標）（Ｋａｏ，１４－１０ Ｎｉｈｏｎｂａｓｈｉ Ｋａｙａｂａｃｈｏ，１－ｃｈｏｍｅ，Ｃｈｕｏ－ｋｕ Ｔｏｋｙｏ １０３－８２１０，Ｊａｐａｎ）が挙げられる。一態様では、好適なアミラーゼとしては、ＡＴＬＡＮＴＩＣ（登録商標）、ＳＴＡＩＮＺＹＭＥ（登録商標）、ＰＯＷＥＲＡＳＥ（登録商標）、ＩＮＴＥＮＳＡ（登録商標）及びＳＴＡＩＮＺＹＭＥ ＰＬＵＳ（登録商標）並びにこれらの混合物が挙げられる。
【0167】
好ましくは、本発明の組成物は、組成物１ｇ当たり少なくとも０．０１ｍｇ、好ましくは約０．０５～約１０、より好ましくは約０．１～約６、特に約０．２～約５ｍｇの活性アミラーゼを含む。
【0168】
好ましくは、本発明の組成物のプロテアーゼ及び／又はアミラーゼは、粒状体の形態であり、この粒状体は、粒状体の２９重量％超の硫酸ナトリウムを含み、並びに／又は硫酸ナトリウム及び活性酵素（プロテアーゼ及び／若しくはアミラーゼ）は、３：１～１００：１、又は好ましくは４：１～３０：１、又はより好ましくは５：１～２０：１の重量比である。
【0169】
プロテアーゼ安定化剤
ペプチドアルデヒドは、以前に記載されているように（国際公開第１９９８１３４５８号、同第２０１１０３６１５３号、米国特許出願公開第２０１４０２２８２７４号）、洗剤配合物中のプロテアーゼ安定化剤として使用してもよい。ペプチドアルデヒド安定化剤の例は、ペプチドアルデヒド、ケトン、又はハロメチルケトンであり、例えば、ウレイド、カルバメート、若しくはウレア部分で「Ｎ－キャップ」されていてもよく、又は例えば、カルボニル、ウレイド、オキサミド（oxiamide）、チオウレイド、ジチオオキサミド、又はチオオキサミド部分で「二重にＮ－キャップ」されていてもよい（欧州特許第２３５８８５７（Ｂ１）号）。これらの阻害剤対プロテアーゼのモル比は、０．１：１～１００：１、例えば、０．５：１～５０：１、１：１～２５：１又は２：１～１０：１であってもよい。プロテアーゼ安定化剤の他の例は、ベンゾフェノン又は安息香酸アニリド誘導体であり、これらはカルボキシル基を含有してもよい（米国特許第７，９６８，５０８（Ｂ２）号）。これらの安定化剤対プロテアーゼのモル比は好ましくは、１：１～１０００：１、特に１：１～５００：１、特に好ましくは１：１～１００：１、最も特に好ましくは１：１～２０：１の範囲である。
ペプチドアルデヒドは、以前に記載されているように（国際公開第１９９８１３４５８号、同第２０１１０３６１５３号、米国特許出願公開第２０１４０２２８２７４号）、洗剤配合物中のプロテアーゼ安定化剤として使用してもよい。ペプチドアルデヒド安定化剤の例は、ペプチドアルデヒド、ケトン、又はハロメチルケトンであり、例えば、ウレイド、カルバメート、若しくはウレア部分で「Ｎ－キャップ」されていてもよく、又は例えば、カルボニル、ウレイド、オキサミド（oxiamide）、チオウレイド、ジチオオキサミド、又はチオオキサミド部分で「二重にＮ－キャップ」されていてもよい（欧州特許第２３５８８５７（Ｂ１）号）。これらの阻害剤対プロテアーゼのモル比は、０．１：１～１００：１、例えば、０．５：１～５０：１、１：１～２５：１又は２：１～１０：１であってもよい。プロテアーゼ安定化剤の他の例は、ベンゾフェノン又は安息香酸アニリド誘導体であり、これらはカルボキシル基を含有してもよい（米国特許第７，９６８，５０８（Ｂ２）号）。これらの安定化剤対プロテアーゼのモル比は好ましくは、１：１～１０００：１、特に１：１～５００：１、特に好ましくは１：１～１００：１、最も特に好ましくは１：１～２０：１の範囲である。
【0170】
結晶成長阻害剤
結晶成長阻害剤は、炭酸カルシウム結晶に結合して、アラゴナイト及び方解石などの種の更なる成長を防止することができる材料である。
結晶成長阻害剤は、炭酸カルシウム結晶に結合して、アラゴナイト及び方解石などの種の更なる成長を防止することができる材料である。
【0171】
効果的な結晶成長抑制剤の例には、ホスホン酸塩、ポリホスホン酸塩、イヌリン誘導体、ポリイタコン酸ホモポリマー及び環状ポリカルボキシレートが挙げられる。
【0172】
好適な結晶成長抑制剤は、ＨＥＤＰ（１－ヒドロキシエチリデン１，１－ジホスホン酸）、カルボキシメチルイヌリン（ＣＭＩ）、トリカルバリル酸及び環状カルボキシレートを含む群から選択されてもよい。本発明の目的のため、用語カルボキシレートは、アニオン形態及びプロトン化したカルボン酸形態の両方を包含する。
【0173】
環状カルボキシレートは、少なくとも２つ、好ましくは３つ又は好ましくは少なくとも４つのカルボキシレート基を含み、環状構造は、単環若しくは二環アルカン又は複素環のいずれかに基づく。好適な環状構造には、シクロプロパン、シクロブタン、シクロヘキサン若しくはシクロペンタン若しくはシクロヘプタン、ビシクロ－ヘプタン若しくはビシクロ－オクタン、及び／又はテトラヒドロフランが挙げられる。好ましい結晶成長抑制剤の１つは、シクロペンタンテトラカルボキシレートである。
【0174】
少なくとも７５％、好ましくは１００％のカルボキシレート基を素環の三次元構造の同じ側か又は「シス」位に有する環状カルボキシレートは、本明細書での使用に好ましい。
【0175】
素環の同じ側にある２つのカルボキシレート基は、直接隣接しているか、又は「オルト」位にあることが好ましい。
【0176】
好ましい結晶成長抑制剤には、ＨＥＤＰ、トリカルバリル酸、テトラヒドロフランテトラカルボン酸（ＴＨＦＴＣＡ）及びシクロペンタンテトラカルボン酸（ＣＰＴＣＡ）が挙げられる。ＴＨＦＴＣＡは、好ましくは２ｃ，３ｔ，４ｔ，５ｃ配置であり、ＣＰＴＣＡは、シス，シス，シス，シス配置である。本明細書での使用に特に好ましい結晶成長抑制剤は、ＨＥＤＰである。
【0177】
部分的に脱炭酸したポリイタコン酸ホモポリマーもまた、本明細書での使用に好ましく、好ましくは脱炭酸のレベルは５０モル％～９０モル％の範囲である。本明細書での使用に特に好ましいポリマーは、Ｉｔａｃｏｎｉｘにより供給されるＩｔａｃｏｎｉｘ ＴＳＩ（登録商標）である。
【0178】
結晶成長抑制剤は、好ましくは、組成物の約０．０１～約１０重量％、特に約０．０２～約５重量％、特に０．０５～３重量％の量で存在する。
【0179】
金属ケア剤
金属ケア剤は、アルミニウム、ステンレス鋼、並びに銀及び銅などの非鉄金属を含む金属の曇り、腐食又は酸化を防止又は低減することができる。好ましくは、本発明の組成物は、製品の０．１～５重量％、より好ましくは０．２～４重量％、とりわけ０．３～３重量％の金属ケア剤を含み、好ましくは、金属ケア剤はベンゾトリアゾール（ＢＴＡ）である。
金属ケア剤は、アルミニウム、ステンレス鋼、並びに銀及び銅などの非鉄金属を含む金属の曇り、腐食又は酸化を防止又は低減することができる。好ましくは、本発明の組成物は、製品の０．１～５重量％、より好ましくは０．２～４重量％、とりわけ０．３～３重量％の金属ケア剤を含み、好ましくは、金属ケア剤はベンゾトリアゾール（ＢＴＡ）である。
【0180】
ガラスケア剤
ガラスケア剤は、食器洗浄プロセス中にガラス製品の外観を保護する。好ましくは、本発明の組成物は、組成物の０．１～５重量％、より好ましくは０．２～４重量％、特に０．３～３重量％の金属ケア剤を含み、好ましくは、ガラスケア剤は亜鉛含有材料、特に水亜鉛土である。他の好適なガラスケア剤は、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）である。特に好ましいＰＥＩは、ＢＡＳＦにより供給されるＬｕｐａｓｏｌ（登録商標）ＦＧである。
ガラスケア剤は、食器洗浄プロセス中にガラス製品の外観を保護する。好ましくは、本発明の組成物は、組成物の０．１～５重量％、より好ましくは０．２～４重量％、特に０．３～３重量％の金属ケア剤を含み、好ましくは、ガラスケア剤は亜鉛含有材料、特に水亜鉛土である。他の好適なガラスケア剤は、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）である。特に好ましいＰＥＩは、ＢＡＳＦにより供給されるＬｕｐａｓｏｌ（登録商標）ＦＧである。
【0181】
ｐＨ
本発明の自動食器洗浄組成物は、好ましくは、２０℃の蒸留水中１重量／体積％の水溶液中で測定した場合に、約９～約１２、より好ましくは約１０～約１１．５未満、とりわけ約１０．５～約１１．５のｐＨを有する。
本発明の自動食器洗浄組成物は、好ましくは、２０℃の蒸留水中１重量／体積％の水溶液中で測定した場合に、約９～約１２、より好ましくは約１０～約１１．５未満、とりわけ約１０．５～約１１．５のｐＨを有する。
【0182】
予備アルカリ度
本発明の自動食器洗浄組成物は、好ましくは、２０℃において１００グラムの製品を含むＮａＯＨ中で測定した場合に、ｐＨ９．５で、約１０～約２０、より好ましくは約１２～約１８の予備アルカリ度を有する。
本発明の自動食器洗浄組成物は、好ましくは、２０℃において１００グラムの製品を含むＮａＯＨ中で測定した場合に、ｐＨ９．５で、約１０～約２０、より好ましくは約１２～約１８の予備アルカリ度を有する。
【0183】
洗浄条件
本明細書に記載の１以上のアミラーゼが曝露されてもよい様々な洗剤配合物、洗浄水量、洗浄水温、及び洗浄時間の長さを含む様々な洗浄条件が存在する。低濃度洗剤系は、約８００ｐｐｍ未満の洗剤成分を含有する洗浄水を対象とする。中濃度洗剤系は、約８００ｐｐｍ～約２０００ｐｐｍの洗剤成分を含有する洗浄を対象とする。高濃度洗剤系は、約２０００ｐｐｍを超える洗剤成分を含有する洗浄水を対象とする。いくつかの実施形態では、本発明の「冷水洗浄」は、約１０℃～約４０℃、約２０℃～約３０℃、又は約１５℃～約２５℃、並びに約１５℃～約３５℃又は１０℃～４０℃の範囲内の他の全ての組合せの温度での洗浄に適した「冷水洗剤」を利用する。
本明細書に記載の１以上のアミラーゼが曝露されてもよい様々な洗剤配合物、洗浄水量、洗浄水温、及び洗浄時間の長さを含む様々な洗浄条件が存在する。低濃度洗剤系は、約８００ｐｐｍ未満の洗剤成分を含有する洗浄水を対象とする。中濃度洗剤系は、約８００ｐｐｍ～約２０００ｐｐｍの洗剤成分を含有する洗浄を対象とする。高濃度洗剤系は、約２０００ｐｐｍを超える洗剤成分を含有する洗浄水を対象とする。いくつかの実施形態では、本発明の「冷水洗浄」は、約１０℃～約４０℃、約２０℃～約３０℃、又は約１５℃～約２５℃、並びに約１５℃～約３５℃又は１０℃～４０℃の範囲内の他の全ての組合せの温度での洗浄に適した「冷水洗剤」を利用する。
【0184】
地理が異なると、水の硬度も異なる。硬度は、水中のカルシウム（Ｃａ２＋）及びマグネシウム（Ｍｇ２＋）の量の尺度である。水硬度は通常、Ｃａ２＋／Ｍｇ２＋を混合した１ガロン当たりのグレイン（ｇｐｇ）で表される。米国のほとんどの水は硬いが、硬度は様々である。中程度に硬い（６０～１２０ｐｐｍ）から硬い（１２１～１８１ｐｐｍ）水は、６０～１８１ｐｐｍ（ｐｐｍを１７．１で割ることによってｐｐｍを１Ｕ．Ｓ．ガロン当たりのグレインに変換することができる）の硬度鉱物を有する。
【0185】
【表3】
【0186】
本発明の実施形態
以下は本発明の実施形態である：
１．界面活性剤及びアミラーゼを含むホームケア組成物であって、アミラーゼは、親α－アミラーゼの組換え非天然変異体であり、変異体α－アミラーゼは、配列番号５と少なくとも８０％の同一性、好ましくは少なくとも８５％の同一性、好ましくは少なくとも８６％の同一性、好ましくは少なくとも８７％の同一性、好ましくは少なくとも８８％の同一性、好ましくは少なくとも８９％の同一性、好ましくは少なくとも９０％の同一性、好ましくは少なくとも９５％の同一性、好ましくは少なくとも９６％の同一性、好ましくは少なくとも９７％の同一性、好ましくは少なくとも９８％の同一性、又は好ましくは少なくとも９９％の同一性を有し、配列番号５に関して５１位及び／又は１２５位にアミノ酸置換を有する、ホームケア組成物。
２．アミラーゼが、配列番号５に関してアミノ酸置換Ｔ５１Ｖ及び／又はＳ１２５Ｒを含む、実施形態１に記載の組成物。
３．アミラーゼが、配列番号５に関して１７２位、２２７位及び／又は２３１位にアミノ酸置換を含む、実施形態１又は２に記載の組成物。
４．アミラーゼが、配列番号５に関してアミノ酸置換Ｎ１７２Ｑ、Ｎ２２７Ｒ及び／又はＦ２３１Ｌを含む、実施形態３に記載の組成物。
５．アミラーゼが、配列番号５に関してアミノ酸置換：
（ａ）Ｔ５１Ｖ＋Ｓ１２５Ｒ＋Ｆ２３１Ｌ；
（ｂ）Ｔ５１Ｖ＋Ｓ１２５Ｒ＋Ｎ１７２Ｑ＋Ｎ２２７Ｒ；又は
（ｃ）Ｎ２９Ｑ＋Ｔ５１Ｖ＋Ｓ１２５Ｒ＋Ｎ２２７Ｒ＋Ｓ２５３Ｌ＋Ｇ２７２Ｅ＋Ｋ３１９Ｒ＋Ｓ４１８Ａ、
を有してもよい。
６．アミノ酸置換Ｘ３９Ｅ、Ｘ９９Ｒ、Ｘ１２６Ａ、Ｘ１２７Ｅ及びＸ１２８Ｇを有するバチルス・ギブソニイ（Bacillus gibsonii）由来の変異体スブチリシンプロテアーゼを更に含む、実施形態１～５のいずれか一項に記載の組成物。
７．組成物は自動食器洗浄組成物である、請求項１～６のいずれか一項に記載の組成物。
８．組成物が漂白系を含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の組成物。
９．組成物が、１，４，７－トリメチル－１，４，７－トリアザシクロノナン（Ｍｅ－ＴＡＣＮ）、１，２，４，７－テトラメチル－１，４，７－トリアザシクロノナン（Ｍｅ／Ｍｅ－ＴＡＣＮ）及びこれらの混合物から成る群から選択されるマンガン漂白触媒を含む、実施形態１～８のいずれか一項に記載の組成物。
１０．組成物が、アシルトランスフェラーゼ、アミラーゼ、α－アミラーゼ、β－アミラーゼ、α－ガラクトシダーゼ、アラビナーゼ、アラビノシダーゼ、アリールエステラーゼ、β－ガラクトシダーゼ、β－グルカナーゼ、カラギナーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、コンドロイチナーゼ、クチナーゼ、ジスペルシン（dispersin）、エンドグルカナーゼ、エンド－β－マンナナーゼ、エキソ－β－マンナナーゼ、エステラーゼ、エキソ－マンナナーゼ、ガラクタナーゼ、グルコアミラーゼ、ヘミセルラーゼ、ヘキソサミニダーゼ、ヒアルロニダーゼ、ケラチナーゼ、ラッカーゼ、ラクターゼ、リグニナーゼ、リパーゼ、脂肪分解酵素、リポキシゲナーゼ、リゾチーム、マンナナーゼ、メタロプロテアーゼ、ヌクレアーゼ、オキシダーゼ、オキシドレダクターゼ、ペクチン酸リアーゼ、ペクチンアセチルエステラーゼ、ペクチナーゼ、ペントサナーゼ（pentosanases）、ペルヒドロラーゼ、ペルオキシダーゼ、ＰＥＴａｓｅｓ、フェノールオキシダーゼ、ホスファターゼ、ホスホリパーゼ、フィターゼ、ポリエステラーゼ、ポリガラクツロナーゼ、追加のプロテアーゼ、プルラナーゼ、レダクターゼ、ラムノガラクツロナーゼ（rhamnogalacturonases）、タンナーゼ、トランスグルタミナーゼ、キシランアセチルエステラーゼ、キシラナーゼ、及びキシロシダーゼ；並びにそれらの組合せから選択される１以上の他の酵素を含む、実施形態１～９のいずれか一項に記載の組成物。
１１．１以上の酵素がプロテアーゼを含み、プロテアーゼが、Ｓ０３９Ｅ、Ｓ０９９Ｒ、Ｓ１２６Ａ、Ｄ１２７Ｅ、及びＦ１２８Ｇから成る群から選択される３個、４個、又は５個のアミノ酸置換を含むスブチリシン変異体であり、Ｎ７４Ｄ、Ｔ１１４Ｌ、Ｍ１２２Ｌ、Ｎ１９８Ａ、Ｎ１９８Ｇ、Ｍ２１１Ｅ、Ｍ２１１Ｑ、Ｎ２１２Ｑ、及びＮ２４２Ｄから成る群から選択される１以上の追加の置換を更に含み、変異体が配列番号６のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有する、実施形態１０に記載の組成物。
１２．１以上の酵素がプロテアーゼを含み、プロテアーゼが、
（ｉ）Ｓ０３９Ｅ、Ｎ７４Ｄ、Ｓ０９９Ｒ、Ｍ２１１Ｅ、Ｎ２４２Ｄから成る群から選択される２以上のアミノ酸置換；及び
（ｉｉ）Ｔ１１４Ｌ、Ｍ１２２Ｌ、Ｓ１２６Ａ、Ｆ１２８Ｇ、Ｎ１９８Ａ、Ｎ１９８Ｇ、Ｍ２１１Ｑ、Ｎ２１２Ｑから成る群から選択される１以上の追加の置換を含むスブチリシン変異体であり、
変異体は、配列番号６又は７のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有する。
１３．１以上の酵素がプロテアーゼを含み、プロテアーゼが、
（ａ）配列番号６の配列と少なくとも８０％の配列同一性を有し、Ａ３７Ｔ、Ｓ３９Ｅ、Ｉ４３Ｖ、Ａ４７Ｖ、Ｐ５４Ｔ、Ｔ５６Ｙ、Ｉ８０Ｖ、Ｎ８５Ｓ、Ｅ８７Ｄ、Ｓ９９Ｒ、Ｔ１１４Ｑ、Ｍ１２２Ｌ、Ｓ１２６Ａ、Ｄ１２７Ｅ、Ｆ１２８Ｇ、Ｎ１９８Ａ、Ｍ２１１Ｑ、Ｎ２１２Ｑ及びＮ２４２Ｄから選択される３以上の置換を含むプロテアーゼであって、番号付けは配列番号６による、プロテアーゼ；
（ｂ）配列番号８の配列と少なくとも８０％の配列同一性を有し、Ｑ１２Ｌ、Ｉ２１Ｖ、Ｉ４３Ｖ、Ｍ１２２Ｌ、Ｄ１２７Ｐ、Ｎ１５４Ｓ、Ｔ１５６Ａ、Ｇ１６０Ｓ、Ｎ１７７Ｖ、Ｍ２１１Ｎ、Ｍ２１１Ｓ、Ｍ２１１Ｌ、Ｐ２１２Ｄ、Ｐ２１２Ｈ、Ａ２２２Ｓ、Ｖ２２８Ｉ及びＴ２４７Ｎから選択される１以上の置換を含むプロテアーゼであって、番号付けは配列番号８による、プロテアーゼ；及び
（ｃ）配列番号９の配列と少なくとも８０％の配列同一性を有し、Ｓ９Ｒ、Ａ１５Ｔ、Ｇ５９Ｅ、Ｖ６６Ａ、Ｈ１１８Ｎ、Ａ１８８Ｐ、Ｖ１９９Ｉ、Ｑ２００Ｅ、Ｎ２１２Ｄ、Ｑ２３９Ｒ、Ｎ２５５Ｄから選択される３以上の置換を含むプロテアーゼであって、付番は配列番号９に従う、プロテアーゼから成る群から選択される、実施形態１０に記載の組成物。
１４．洗浄を必要とする表面又は物品を、有効量の実施形態１～１３のいずれか一項に記載の組成物と接触させる工程を含み、任意に、表面又は物品を変異体又は酵素組成物と接触させた後に、表面又は物品をすすぐ工程を更に含む、洗浄方法。
以下は本発明の実施形態である：
１．界面活性剤及びアミラーゼを含むホームケア組成物であって、アミラーゼは、親α－アミラーゼの組換え非天然変異体であり、変異体α－アミラーゼは、配列番号５と少なくとも８０％の同一性、好ましくは少なくとも８５％の同一性、好ましくは少なくとも８６％の同一性、好ましくは少なくとも８７％の同一性、好ましくは少なくとも８８％の同一性、好ましくは少なくとも８９％の同一性、好ましくは少なくとも９０％の同一性、好ましくは少なくとも９５％の同一性、好ましくは少なくとも９６％の同一性、好ましくは少なくとも９７％の同一性、好ましくは少なくとも９８％の同一性、又は好ましくは少なくとも９９％の同一性を有し、配列番号５に関して５１位及び／又は１２５位にアミノ酸置換を有する、ホームケア組成物。
２．アミラーゼが、配列番号５に関してアミノ酸置換Ｔ５１Ｖ及び／又はＳ１２５Ｒを含む、実施形態１に記載の組成物。
３．アミラーゼが、配列番号５に関して１７２位、２２７位及び／又は２３１位にアミノ酸置換を含む、実施形態１又は２に記載の組成物。
４．アミラーゼが、配列番号５に関してアミノ酸置換Ｎ１７２Ｑ、Ｎ２２７Ｒ及び／又はＦ２３１Ｌを含む、実施形態３に記載の組成物。
５．アミラーゼが、配列番号５に関してアミノ酸置換：
（ａ）Ｔ５１Ｖ＋Ｓ１２５Ｒ＋Ｆ２３１Ｌ；
（ｂ）Ｔ５１Ｖ＋Ｓ１２５Ｒ＋Ｎ１７２Ｑ＋Ｎ２２７Ｒ；又は
（ｃ）Ｎ２９Ｑ＋Ｔ５１Ｖ＋Ｓ１２５Ｒ＋Ｎ２２７Ｒ＋Ｓ２５３Ｌ＋Ｇ２７２Ｅ＋Ｋ３１９Ｒ＋Ｓ４１８Ａ、
を有してもよい。
６．アミノ酸置換Ｘ３９Ｅ、Ｘ９９Ｒ、Ｘ１２６Ａ、Ｘ１２７Ｅ及びＸ１２８Ｇを有するバチルス・ギブソニイ（Bacillus gibsonii）由来の変異体スブチリシンプロテアーゼを更に含む、実施形態１～５のいずれか一項に記載の組成物。
７．組成物は自動食器洗浄組成物である、請求項１～６のいずれか一項に記載の組成物。
８．組成物が漂白系を含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の組成物。
９．組成物が、１，４，７－トリメチル－１，４，７－トリアザシクロノナン（Ｍｅ－ＴＡＣＮ）、１，２，４，７－テトラメチル－１，４，７－トリアザシクロノナン（Ｍｅ／Ｍｅ－ＴＡＣＮ）及びこれらの混合物から成る群から選択されるマンガン漂白触媒を含む、実施形態１～８のいずれか一項に記載の組成物。
１０．組成物が、アシルトランスフェラーゼ、アミラーゼ、α－アミラーゼ、β－アミラーゼ、α－ガラクトシダーゼ、アラビナーゼ、アラビノシダーゼ、アリールエステラーゼ、β－ガラクトシダーゼ、β－グルカナーゼ、カラギナーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、コンドロイチナーゼ、クチナーゼ、ジスペルシン（dispersin）、エンドグルカナーゼ、エンド－β－マンナナーゼ、エキソ－β－マンナナーゼ、エステラーゼ、エキソ－マンナナーゼ、ガラクタナーゼ、グルコアミラーゼ、ヘミセルラーゼ、ヘキソサミニダーゼ、ヒアルロニダーゼ、ケラチナーゼ、ラッカーゼ、ラクターゼ、リグニナーゼ、リパーゼ、脂肪分解酵素、リポキシゲナーゼ、リゾチーム、マンナナーゼ、メタロプロテアーゼ、ヌクレアーゼ、オキシダーゼ、オキシドレダクターゼ、ペクチン酸リアーゼ、ペクチンアセチルエステラーゼ、ペクチナーゼ、ペントサナーゼ（pentosanases）、ペルヒドロラーゼ、ペルオキシダーゼ、ＰＥＴａｓｅｓ、フェノールオキシダーゼ、ホスファターゼ、ホスホリパーゼ、フィターゼ、ポリエステラーゼ、ポリガラクツロナーゼ、追加のプロテアーゼ、プルラナーゼ、レダクターゼ、ラムノガラクツロナーゼ（rhamnogalacturonases）、タンナーゼ、トランスグルタミナーゼ、キシランアセチルエステラーゼ、キシラナーゼ、及びキシロシダーゼ；並びにそれらの組合せから選択される１以上の他の酵素を含む、実施形態１～９のいずれか一項に記載の組成物。
１１．１以上の酵素がプロテアーゼを含み、プロテアーゼが、Ｓ０３９Ｅ、Ｓ０９９Ｒ、Ｓ１２６Ａ、Ｄ１２７Ｅ、及びＦ１２８Ｇから成る群から選択される３個、４個、又は５個のアミノ酸置換を含むスブチリシン変異体であり、Ｎ７４Ｄ、Ｔ１１４Ｌ、Ｍ１２２Ｌ、Ｎ１９８Ａ、Ｎ１９８Ｇ、Ｍ２１１Ｅ、Ｍ２１１Ｑ、Ｎ２１２Ｑ、及びＮ２４２Ｄから成る群から選択される１以上の追加の置換を更に含み、変異体が配列番号６のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有する、実施形態１０に記載の組成物。
１２．１以上の酵素がプロテアーゼを含み、プロテアーゼが、
（ｉ）Ｓ０３９Ｅ、Ｎ７４Ｄ、Ｓ０９９Ｒ、Ｍ２１１Ｅ、Ｎ２４２Ｄから成る群から選択される２以上のアミノ酸置換；及び
（ｉｉ）Ｔ１１４Ｌ、Ｍ１２２Ｌ、Ｓ１２６Ａ、Ｆ１２８Ｇ、Ｎ１９８Ａ、Ｎ１９８Ｇ、Ｍ２１１Ｑ、Ｎ２１２Ｑから成る群から選択される１以上の追加の置換を含むスブチリシン変異体であり、
変異体は、配列番号６又は７のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有する。
１３．１以上の酵素がプロテアーゼを含み、プロテアーゼが、
（ａ）配列番号６の配列と少なくとも８０％の配列同一性を有し、Ａ３７Ｔ、Ｓ３９Ｅ、Ｉ４３Ｖ、Ａ４７Ｖ、Ｐ５４Ｔ、Ｔ５６Ｙ、Ｉ８０Ｖ、Ｎ８５Ｓ、Ｅ８７Ｄ、Ｓ９９Ｒ、Ｔ１１４Ｑ、Ｍ１２２Ｌ、Ｓ１２６Ａ、Ｄ１２７Ｅ、Ｆ１２８Ｇ、Ｎ１９８Ａ、Ｍ２１１Ｑ、Ｎ２１２Ｑ及びＮ２４２Ｄから選択される３以上の置換を含むプロテアーゼであって、番号付けは配列番号６による、プロテアーゼ；
（ｂ）配列番号８の配列と少なくとも８０％の配列同一性を有し、Ｑ１２Ｌ、Ｉ２１Ｖ、Ｉ４３Ｖ、Ｍ１２２Ｌ、Ｄ１２７Ｐ、Ｎ１５４Ｓ、Ｔ１５６Ａ、Ｇ１６０Ｓ、Ｎ１７７Ｖ、Ｍ２１１Ｎ、Ｍ２１１Ｓ、Ｍ２１１Ｌ、Ｐ２１２Ｄ、Ｐ２１２Ｈ、Ａ２２２Ｓ、Ｖ２２８Ｉ及びＴ２４７Ｎから選択される１以上の置換を含むプロテアーゼであって、番号付けは配列番号８による、プロテアーゼ；及び
（ｃ）配列番号９の配列と少なくとも８０％の配列同一性を有し、Ｓ９Ｒ、Ａ１５Ｔ、Ｇ５９Ｅ、Ｖ６６Ａ、Ｈ１１８Ｎ、Ａ１８８Ｐ、Ｖ１９９Ｉ、Ｑ２００Ｅ、Ｎ２１２Ｄ、Ｑ２３９Ｒ、Ｎ２５５Ｄから選択される３以上の置換を含むプロテアーゼであって、付番は配列番号９に従う、プロテアーゼから成る群から選択される、実施形態１０に記載の組成物。
１４．洗浄を必要とする表面又は物品を、有効量の実施形態１～１３のいずれか一項に記載の組成物と接触させる工程を含み、任意に、表面又は物品を変異体又は酵素組成物と接触させた後に、表面又は物品をすすぐ工程を更に含む、洗浄方法。
【実施例】
【0187】
実施例１．ＡＡ２５６０α－アミラーゼ変異体
タンパク質発現、精製、及び定量：
国際公開第２０２１／０８０９４８号に記載されているＡＡ２５６０α－アミラーゼの変異体（本明細書では配列番号５）に基づくＡＡ２５６０α－アミラーゼコンビナトリアル変異体を合成遺伝子として作製し、標準的な手順を用いて適切なバチルス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）細胞に導入した。全ての変異を、ＤＮＡ配列決定によって確認した。細胞を、Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ宿主におけるタンパク質発現及び分泌に好適な培地中で７２時間増殖させた。分泌タンパク質を遠心分離によって採取した。フェニルセファロース６高速流量樹脂（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いた疎水性相互作用クロマトグラフィーの使用によって、精製を達成した。精製されたタンパク質を、ｐＨ８の緩衝剤、塩化カルシウム、及びプロピレングリコールとしてＨＥＰＥＳを含有する標準的な配合物緩衝液中で安定化させた。タンパク質濃度を、アミノ酸分析、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、及び２８０ｎｍでの吸光度の混合によって決定した。
タンパク質発現、精製、及び定量：
国際公開第２０２１／０８０９４８号に記載されているＡＡ２５６０α－アミラーゼの変異体（本明細書では配列番号５）に基づくＡＡ２５６０α－アミラーゼコンビナトリアル変異体を合成遺伝子として作製し、標準的な手順を用いて適切なバチルス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）細胞に導入した。全ての変異を、ＤＮＡ配列決定によって確認した。細胞を、Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ宿主におけるタンパク質発現及び分泌に好適な培地中で７２時間増殖させた。分泌タンパク質を遠心分離によって採取した。フェニルセファロース６高速流量樹脂（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いた疎水性相互作用クロマトグラフィーの使用によって、精製を達成した。精製されたタンパク質を、ｐＨ８の緩衝剤、塩化カルシウム、及びプロピレングリコールとしてＨＥＰＥＳを含有する標準的な配合物緩衝液中で安定化させた。タンパク質濃度を、アミノ酸分析、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、及び２８０ｎｍでの吸光度の混合によって決定した。
【0188】
酵素性能アッセイ：
α－アミラーゼの活性を、洗剤バックグラウンド中で白色メラミンタイルから染色されたデンプンの染みを除去することによって決定した。Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｔｅｓｔｍａｔｅｒｉａｌｓ（カタログ番号ＤＭ２７７）から購入した、混合コーン／米着色デンプンのタイル及び食品着色剤を含む混合コーン／米デンプンのタイルを使用して、α－アミラーゼの洗浄活性を決定した。タイルを、水性緩衝液中の作用範囲に希釈したアミラーゼ溶液を含有する９６ウェルプレートに固定し、ＷＦＫＢ洗剤の予備作製洗剤溶液（ＷＦＫ Ｔｅｓｔｇｅｗｅｂｅ ＧｍｂＨ，Ｂｒｕｇｇｅｎ，Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ）に添加し、その結果、総体積は３００μＬになった。次いで、着色されたデンプンの染みを有する事前に画像化されたメラミンタイルを９６ウェルプレートの上部に固定し、その結果、アセンブリの撹拌は、デンプンの染みの表面上への酵素含有洗剤の飛散をもたらした。洗浄反応を２５０ｒｐｍで振とうしながら５０℃で１５分間行った。洗浄反応後、メラミンタイルを水で短時間すすぎ、乾燥させ、再び画像化した。α－アミラーゼの活性を、洗浄前及び洗浄後の画像のＲＧＢ（色）値の差として計算する。洗浄後の画像が白ければ白いほど、酵素活性が良好である。性能指数（ＰＩ）を以下のように計算する。
α－アミラーゼの活性を、洗剤バックグラウンド中で白色メラミンタイルから染色されたデンプンの染みを除去することによって決定した。Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｔｅｓｔｍａｔｅｒｉａｌｓ（カタログ番号ＤＭ２７７）から購入した、混合コーン／米着色デンプンのタイル及び食品着色剤を含む混合コーン／米デンプンのタイルを使用して、α－アミラーゼの洗浄活性を決定した。タイルを、水性緩衝液中の作用範囲に希釈したアミラーゼ溶液を含有する９６ウェルプレートに固定し、ＷＦＫＢ洗剤の予備作製洗剤溶液（ＷＦＫ Ｔｅｓｔｇｅｗｅｂｅ ＧｍｂＨ，Ｂｒｕｇｇｅｎ，Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ）に添加し、その結果、総体積は３００μＬになった。次いで、着色されたデンプンの染みを有する事前に画像化されたメラミンタイルを９６ウェルプレートの上部に固定し、その結果、アセンブリの撹拌は、デンプンの染みの表面上への酵素含有洗剤の飛散をもたらした。洗浄反応を２５０ｒｐｍで振とうしながら５０℃で１５分間行った。洗浄反応後、メラミンタイルを水で短時間すすぎ、乾燥させ、再び画像化した。α－アミラーゼの活性を、洗浄前及び洗浄後の画像のＲＧＢ（色）値の差として計算する。洗浄後の画像が白ければ白いほど、酵素活性が良好である。性能指数（ＰＩ）を以下のように計算する。
【0189】
【数1】
【0190】
ΔＲＧ変異体に対するコンビナトリアル変異体の性能指数：
配列番号５の変異体に対する性能指数に関する変異体の洗浄性能を表３に列挙する。
配列番号５の変異体に対する性能指数に関する変異体の洗浄性能を表３に列挙する。
【0191】
【表4】
【0192】
表３の全ての変異体は、配列番号５の変異体よりも良好に機能する。
【0193】
本明細書に開示される寸法及び値は、列挙された正確な数値に厳密に限定されるものとして理解されるべきではない。その代わりに、特に指示がない限り、そのような寸法は各々、列挙された値とその値を囲む機能的に同等な範囲の両方を意味することが意図される。例えば、「４０ｍｍ」と開示された寸法は、「約４０ｍｍ」を意味することが意図される。
【図1-1】
【図1-2】
【図2】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2024-06-07
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
界面活性剤及びアミラーゼを含むホームケア組成物であって、前記アミラーゼは、親α－アミラーゼの組換え非天然変異体であり、前記変異体α－アミラーゼは、配列番号５と少なくとも８０％の同一性を有し、配列番号５に関して５１位及び／又は１２５位にアミノ酸置換を有する、ホームケア組成物。
【請求項2】
前記アミラーゼが、配列番号５に関してアミノ酸置換Ｔ５１Ｖ及びＳ１２５Ｒを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項3】
前記アミラーゼが、配列番号５に関して１７２位、２２７位及び／又は２３１位にアミノ酸置換を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項4】
前記アミラーゼが、配列番号５に関してアミノ酸置換Ｎ１７２Ｑ、Ｎ２２７Ｒ及び／又はＦ２３１Ｌを含む、請求項３に記載の組成物。
【請求項5】
前記アミラーゼが、アミノ酸置換：配列番号５に関して
（ａ）Ｔ５１Ｖ＋Ｓ１２５Ｒ＋Ｆ２３１Ｌ；
（ｂ）Ｔ５１Ｖ＋Ｓ１２５Ｒ＋Ｎ１７２Ｑ＋Ｎ２２７Ｒ；又は
（ｃ）Ｎ２９Ｑ＋Ｔ５１Ｖ＋Ｓ１２５Ｒ＋Ｎ２２７Ｒ＋Ｓ２５３Ｌ＋Ｇ２７２Ｅ＋Ｋ３１９Ｒ＋Ｓ４１８Ａ、
を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項6】
アミノ酸置換Ｘ３９Ｅ、Ｘ９９Ｒ、Ｘ１２６Ａ、Ｘ１２７Ｅ及びＸ１２８Ｇを有するＢａｃｉｌｌｕｓ ｇｉｂｓｏｎｉｉ由来の変異体スブチリシンプロテアーゼを更に含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項7】
前記組成物は自動食器洗浄組成物である、請求項１に記載の組成物。
【請求項8】
前記組成物が漂白系を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項9】
前記組成物が、１，４，７－トリメチル－１，４，７－トリアザシクロノナン（Ｍｅ－ＴＡＣＮ）、１，２、４，７－テトラメチル－１，４，７－トリアザシクロノナン（Ｍｅ／Ｍｅ－ＴＡＣＮ）及びこれらの混合物から成る群から選択されるマンガン漂白触媒を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項10】
前記組成物が、アシルトランスフェラーゼ、アミラーゼ、α－アミラーゼ、β－アミラーゼ、α－ガラクトシダーゼ、アラビナーゼ、アラビノシダーゼ、アリールエステラーゼ、β－ガラクトシダーゼ、β－グルカナーゼ、カラギナーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、コンドロイチナーゼ、クチナーゼ、ジスペルシン（dispersin）、エンドグルカナーゼ、エンド－β－マンナナーゼ、エキソ－β－マンナナーゼ、エステラーゼ、エキソ－マンナナーゼ、ガラクタナーゼ、グルコアミラーゼ、ヘミセルラーゼ、ヘキソサミニダーゼ、ヒアルロニダーゼ、ケラチナーゼ、ラッカーゼ、ラクターゼ、リグニナーゼ、リパーゼ、脂肪分解酵素、リポキシゲナーゼ、リゾチーム、マンナナーゼ、メタロプロテアーゼ、ヌクレアーゼ、オキシダーゼ、オキシドレダクターゼ、ペクチン酸リアーゼ、ペクチンアセチルエステラーゼ、ペクチナーゼ、ペントサナーゼ（pentosanases）、ペルヒドロラーゼ、ペルオキシダーゼ、ＰＥＴａｓｅｓ、フェノールオキシダーゼ、ホスファターゼ、ホスホリパーゼ、フィターゼ、ポリエステラーゼ、ポリガラクツロナーゼ、追加のプロテアーゼ、プルラナーゼ、レダクターゼ、ラムノガラクツロナーゼ（rhamnogalacturonases）、タンナーゼ、トランスグルタミナーゼ、キシランアセチルエステラーゼ、キシラナーゼ、及びキシロシダーゼ；並びにそれらの組合せから選択される１以上の他の酵素を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項11】
前記１以上の酵素がプロテアーゼを含み、前記プロテアーゼが、Ｓ０３９Ｅ、Ｓ０９９Ｒ、Ｓ１２６Ａ、Ｄ１２７Ｅ、及びＦ１２８Ｇから成る群から選択される３個、４個、又は５個のアミノ酸置換を含むスブチリシン変異体であり、Ｎ７４Ｄ、Ｔ１１４Ｌ、Ｍ１２２Ｌ、Ｎ１９８Ａ、Ｎ１９８Ｇ、Ｍ２１１Ｅ、Ｍ２１１Ｑ、Ｎ２１２Ｑ、及びＮ２４２Ｄから成る群から選択される１以上の追加の置換を更に含み、前記変異体が、配列番号６のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有する、請求項１０に記載の組成物。
【請求項12】
前記１以上の酵素がプロテアーゼを含み、前記プロテアーゼが（ｉ）Ｓ０３９Ｅ、Ｎ７４Ｄ、Ｓ０９９Ｒ、Ｍ２１１Ｅ、Ｎ２４２Ｄから成る群から選択される２以上のアミノ酸置換；及び
（ｉｉ）Ｔ１１４Ｌ、Ｍ１２２Ｌ、Ｓ１２６Ａ、Ｆ１２８Ｇ、Ｎ１９８Ａ、Ｎ１９８Ｇ、Ｍ２１１Ｑ、Ｎ２１２Ｑから成る群から選択される１以上の追加の置換を含むスブチリシン変異体であり、
前記変異体は、配列番号６又は７のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有する、請求項１０に記載の組成物。
【請求項13】
前記１以上の酵素がプロテアーゼを含み、前記プロテアーゼが、（ａ）配列番号６の配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有し、Ａ３７Ｔ、Ｓ３９Ｅ、Ｉ４３Ｖ、Ａ４７Ｖ、Ｐ５４Ｔ、Ｔ５６Ｙ、Ｉ８０Ｖ、Ｎ８５Ｓ、Ｅ８７Ｄ、Ｓ９９Ｒ、Ｔ１１４Ｑ、Ｍ１２２Ｌ、Ｓ１２６Ａ、Ｄ１２７Ｅ、Ｆ１２８Ｇ、Ｎ１９８Ａ、Ｍ２１１Ｑ、Ｎ２１２Ｑ及びＮ２４２Ｄから選択される３以上の置換を含むプロテアーゼであって、ナンバリングは配列番号６による、プロテアーゼ；
（ｂ）配列番号８の配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有し、Ｑ１２Ｌ、Ｉ２１Ｖ、Ｉ４３Ｖ、Ｍ１２２Ｌ、Ｄ１２７Ｐ、Ｎ１５４Ｓ、Ｔ１５６Ａ、Ｇ１６０Ｓ、Ｎ１７７Ｖ、Ｍ２１１Ｎ、Ｍ２１１Ｓ、Ｍ２１１Ｌ、Ｐ２１２Ｄ、Ｐ２１２Ｈ、Ａ２２２Ｓ、Ｖ２２８Ｉ及びＴ２４７Ｎから選択される１以上の置換を含むプロテアーゼであって、ナンバリングは配列番号８による、プロテアーゼ；及び
（ｃ）配列番号９の配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有し、Ｓ９Ｒ、Ａ１５Ｔ、Ｇ５９Ｅ、Ｖ６６Ａ、Ｈ１１８Ｎ、Ａ１８８Ｐ、Ｖ１９９Ｉ、Ｑ２００Ｅ、Ｎ２１２Ｄ、Ｑ２３９Ｒ、Ｎ２５５Ｄから選択される３以上の置換を含むプロテアーゼであって、ナンバリングは配列番号９におる、プロテアーゼ、から成る群から選択される、請求項１０に記載の組成物
【請求項14】
洗浄を必要とする表面又は物品を、有効量の請求項１～１３のいずれか一項に記載の組成物と接触させる工程を含み、任意に、前記表面又は物品を前記変異体又は酵素組成物と接触させた後に前記表面又は物品をすすぐ工程を更に含む、洗浄方法。
【国際調査報告】