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▶ ジーンクアンタム ヘルスケア （スーチョウ） シーオー．， エルティーディー．の特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-12-26
(54)【発明の名称】抗体－サイトカイン融合タンパク質及びその用途
(51)【国際特許分類】
C07K 19/00 20060101AFI20241219BHJP
C07K 16/28 20060101ALI20241219BHJP
C07K 14/54 20060101ALI20241219BHJP
C12P 21/02 20060101ALI20241219BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20241219BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20241219BHJP
【ＦＩ】
C07K19/00 ZNA
C07K16/28
C07K14/54
C12P21/02 B
A61P35/00
A61K39/395 D
A61K39/395 N
A61K39/395 E
A61K39/395 T
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024534231
(86)(22)【出願日】2022-12-08
(85)【翻訳文提出日】2024-06-07
(86)【国際出願番号】 CN2022137449
(87)【国際公開番号】W WO2023104134
(87)【国際公開日】2023-06-15
(31)【優先権主張番号】PCT/CN2021/136727
(32)【優先日】2021-12-09
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】516310910
【氏名又は名称】ジーンクアンタム ヘルスケア （スーチョウ） シーオー．， エルティーディー．
【氏名又は名称原語表記】ＧＥＮＥＱＵＡＮＴＵＭ ＨＥＡＬＴＨＣＡＲＥ （ＳＵＺＨＯＵ）ＣＯ．， ＬＴＤ．
(74)【代理人】
【識別番号】100127926
【弁理士】
【氏名又は名称】結田 純次
(74)【代理人】
【識別番号】100216105
【弁理士】
【氏名又は名称】守安 智
(72)【発明者】
【氏名】ギャン・チン
(72)【発明者】
【氏名】ポール・エイチ・ソン
(72)【発明者】
【氏名】トン・ヤン
(72)【発明者】
【氏名】カオ・リュウ
【テーマコード（参考）】
4B064
4C085
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B064AG01
4B064AG03
4B064AG27
4B064CA19
4B064CB30
4B064CC01
4B064CC24
4B064CE11
4B064CE12
4B064DA01
4C085AA13
4C085AA14
4C085BB11
4C085EE01
4C085GG01
4C085GG02
4C085GG03
4C085GG04
4C085GG05
4C085GG06
4C085GG08
4H045AA10
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA09
4H045BA41
4H045DA02
4H045DA76
4H045EA20
4H045FA70
4H045FA74
4H045GA10
4H045GA23
4H045GA26
(57)【要約】
本発明は、抗ＰＤ－Ｌ１抗体及びインターロイキン２１を含む抗体－サイトカイン融合タンパク質、及びその調製方法、並びに前記融合タンパク質の治療目的での用途を提供する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
式（Ｉ）又は（Ｉ’）の構造を有する融合タンパク質であって、［Ｂ－Ｓｐ１－Ｌｋ－Ｓｐ２］ｍ－Ａ （Ｉ）
Ａ－［Ｓｐ１－Ｌｋ－Ｓｐ２－Ｂ］ｍ （Ｉ’）
式中、
Ａは抗ＰＤ－Ｌ１抗体であり、
Ｂはインターロイキン２１（ＩＬ２１）であり、
Ｓｐ１及びＳｐ２はそれぞれ独立してスペーサーであるか又は存在せず、
Ｌｋは、ソルターゼのアクセプター基質認識配列とドナー基質認識配列のコンジュゲーションによって形成されたリンカーであり、
ｍは１～４の整数である、前記融合タンパク質。
【請求項2】
前記アクセプター基質認識配列は、グリシン（Ｇ）及びアラニン（Ａ）からなる群から選択される１～１００個の直列接続構造単位を含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項3】
前記アクセプター基質認識配列は、（Ｇ）ｎの配列を含み、ただし、ｎは２～２０の整数、特に３である、請求項１又は２に記載の融合タンパク質。
【請求項4】
前記ドナー基質認識配列は、Ｘ１Ｘ２Ｘ３ＴＸ４Ｘ５の配列を含み、ただし、Ｘ１はロイシン（Ｌ）又はアスパラギン（Ｎ）であり、Ｘ２はプロリン（Ｐ）又はアラニン（Ａ）であり、Ｘ３は任意の天然又は非天然アミノ酸であり、Ｘ４はグリシン（Ｇ）、セリン（Ｓ）又はアスパラギン（Ｎ）であるか又は存在せず、Ｘ５は１～１０個のアミノ酸を含むアミノ酸配列であるか又は存在しない、請求項１から３のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項5】
Ｘ１Ｘ２Ｘ３ＴＸ４Ｘ５はＬＰＸ３ＴＧ、ＬＰＸ３ＴＧＧ、ＮＰＱＴＮ、ＮＰＫＴＧ、ＬＡＸ３ＴＧ又はＬＰＱＴＳＥＱであり、ただし、Ｘ３は任意の天然又は非天然アミノ酸である、請求項４に記載の融合タンパク質。
【請求項6】
Ｘ１Ｘ２Ｘ３ＴＸ４Ｘ５はＬＰＥＴＧ又はＬＰＥＴＧＧである、請求項４に記載の融合タンパク質。
【請求項7】
前記スペーサーは、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）及びセリン（Ｓ）からなる群から選択される１～１００個の直列接続構造単位を含み、好ましくは、前記スペーサーは、ＧＡ、ＧＧＧ、ＧＡＧ及び（Ｇ）ｏＳ（（Ｇ）ｓＳ）ｔからなる群から選択され、ただし、ｏは１～５の整数であり、ｓは１～１０の整数、特に４であり、ｔは０又は１～１０の整数である、請求項１から５のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項8】
ＬｋはＸ１Ｘ２Ｘ３Ｔ（Ｇ）ｎであり、前記融合タンパク質は、（ＩＩ）又は（ＩＩ’）の構造を有し、［Ｂ－Ｓｐ１－Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｔ（Ｇ）ｎ－Ｓｐ２］ｍ－Ａ （ＩＩ）
Ａ－［Ｓｐ１－Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｔ（Ｇ）ｎ－Ｓｐ２－Ｂ］ｍ （ＩＩ’）
式中、Ｘ１はロイシン（Ｌ）又はアスパラギン（Ｎ）であり、Ｘ２はプロリン（Ｐ）又はアラニン（Ａ）であり、Ｘ３は任意の天然又は非天然アミノ酸であり、ｎは２～２０の整数であり、
ｍは１又は２であり、
Ａ、Ｂ、Ｓｐ１及びＳｐ２は、請求項１で定義された通りである、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項9】
Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｔ（Ｇ）ｎはＬＰＸ３Ｔ（Ｇ）ｎ、ＮＰＸ３Ｔ（Ｇ）ｎ又はＬＡＸ３Ｔ（Ｇ）ｎであり、Ｘ３は任意の天然又は非天然アミノ酸であり、ｎは２～２０の整数である、請求項８に記載の融合タンパク質。
【請求項10】
前記融合タンパク質は（ＩＩＩ）又は（ＩＩＩ’）の構造を有し、［Ｂ－ＧＡＬＰＥＴＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ］ｍ－Ａ （ＩＩＩ）
Ａ－［ＧＡＬＰＥＴＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ－Ｂ］ｍ （ＩＩＩ’）
式中、Ａ及びＢは請求項１で定義された通りである、請求項９に記載の融合タンパク質。
【請求項11】
前記抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ、３Ｆ２又はそれらの操作された抗体であり、好ましくは、前記抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、軽鎖可変領域（ＶＬ）及び重鎖可変領域（ＶＨ）を含み、そのうち、
（１）前記ＶＬは、配列番号２２に示すＣＤＲＬ１配列、配列番号２３に示すＣＤＲＬ２配列及び配列番号２４に示すＣＤＲＬ３配列を含み、前記ＶＨは、配列番号２５に示すＣＤＲＨ１配列、配列番号２６に示すＣＤＲＨ２配列及び配列番号２７に示すＣＤＲＨ３配列を含み、又は
（２）前記ＶＬは、配列番号２８に示すＣＤＲＬ１配列、配列番号２９に示すＣＤＲＬ２配列及び配列番号３０に示すＣＤＲＬ３配列を含み、前記ＶＨは、配列番号３１に示すＣＤＲＨ１配列、配列番号３２に示すＣＤＲＨ２配列及び配列番号３３に示すＣＤＲＨ３配列を含み、
より好ましくは、前記ＶＬは、配列番号３４のアミノ酸配列を含み、前記ＶＨは、配列番号３５のアミノ酸配列を含み、又は前記ＶＬは、配列番号３６のアミノ酸配列を含み、前記ＶＨは、配列番号３７のアミノ酸配列を含み、
最も好ましくは、前記抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、軽鎖及び重鎖を含み、そのうち、
（１）前記軽鎖は、配列番号１のアミノ酸配列を含み、前記重鎖は、配列番号２のアミノ酸配列を含み、又は
（２）前記軽鎖は、配列番号３のアミノ酸配列を含み、前記重鎖は、配列番号４のアミノ酸配列を含む、請求項１から１０のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項12】
前記ＩＬ２１は、野生型ＩＬ２１又はその変異体であり、好ましくは、前記ＩＬ２１は、配列番号９又は配列番号１０のアミノ酸配列を含む、請求項１から１１のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項13】
前記融合タンパク質は、式（ＩＩＩ）の構造を有し、［Ｂ－ＧＡＬＰＥＴＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ］ｍ－Ａ （ＩＩＩ）
式中、
Ａは、配列番号１のアミノ酸配列を有する軽鎖及び配列番号２のアミノ酸配列を有する重鎖、又は配列番号３のアミノ酸配列を有する軽鎖及び配列番号４のアミノ酸配列を有する重鎖を含む抗ＰＤ－Ｌ１抗体であり、
Ｂは、配列番号９又は配列番号１０のアミノ酸配列を含むＩＬ２１であり、
ｍは１又は２である、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項14】
前記ＩＬ２１は、前記抗ＰＤ－Ｌ１抗体の軽鎖及び／又は重鎖のＮ末端でコンジュゲートされ、好ましくは、前記ＩＬ２１は、前記抗ＰＤ－Ｌ１抗体の重鎖のＮ末端でコンジュゲートされる、請求項１１～１３のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項15】
前記融合タンパク質は、（ａ）２つの同一の重鎖部分及び２つの同一の軽鎖部分を含み、そのうち、
（１）前記重鎖部分の各々が配列番号１８又は配列番号２０のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖部分の各々が配列番号１のアミノ酸配列を含み、又は
（２）前記重鎖部分の各々が配列番号１９又は配列番号２１のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖部分の各々が配列番号３のアミノ酸配列を含み、
あるいは、前記融合タンパク質は、
（ｂ）２つの異なる重鎖部分及び２つの同一の軽鎖部分を含み、そのうち、
（１）前記重鎖部分の一方が配列番号１８又は配列番号２０のアミノ酸配列を含み、前記重鎖部分の他方が配列番号１４のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖部分の各々が配列番号１のアミノ酸配列を含み、又は
（２）前記重鎖部分の一方が配列番号１９又は配列番号２１のアミノ酸配列を含み、前記重鎖部分の他方が配列番号１５のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖部分の各々が配列番号３のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項16】
それを必要とする対象の疾患を治療するための医薬品の製造における請求項１から１５のいずれか１項に記載の融合タンパク質の使用であって、好ましくは、前記疾患は、癌であり、
より好ましくは、前記癌は、黒色腫、卵巣癌、乳癌、メルケル細胞癌、肺癌、腎細胞癌、膀胱癌、結腸癌、結腸腺癌、結腸直腸癌、頭頸部扁平上皮癌、中皮腫、ウイルス誘発性癌、子宮頸癌、鼻咽頭癌、軟部肉腫、血液悪性腫瘍、胃癌、胃癌又は胃食道接合部（ＧＥＪ）腺癌、食道癌、食道の扁平上皮癌、子宮内膜癌、原発性縦隔Ｂ細胞リンパ腫（ＰＭＢＣＬ）、尿路上皮癌、マイクロサテライト不安定性高（ＭＳＩ－Ｈ）又はミスマッチ修復欠損（ｄＭＭＲ）の固形腫瘍、肝細胞癌、リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、腎細胞癌腫（ＲＣＣ）、有棘細胞癌（ｃＳＣＣ）、三種陰性乳癌（ＴＮＢＣ）、非小細胞肺癌及び膀胱癌から選択される、前記使用。
【請求項17】
請求項１から１５のいずれか１項に記載の融合タンパク質を産生するための方法であって、（ａ－１）式（Ｉ－１）の構造を有する抗体部分及び式（Ｉ－２）の構造を有するサイトカイン部分を用意するステップと、
［Ｌｋａ－Ｓｐ２］ｍ－Ａ （Ｉ－１）
Ｂ－Ｓｐ１－Ｌｋｄ （Ｉ－２）
（ｂ－１）ソルターゼの存在下で前記抗体部分を前記サイトカイン部分とコンジュゲートして式（Ｉ）の構造を有する融合タンパク質を得るステップと、を含み、
［Ｂ－Ｓｐ１－Ｌｋ－Ｓｐ２］ｍ－Ａ （Ｉ）
又は
（ａ－２）式（Ｉ’－１）の構造を有する抗体部分及び式（Ｉ’－２）の構造を有するサイトカイン部分を用意するステップと、
Ａ－［Ｓｐ１－Ｌｋｄ］ｍ （Ｉ’－１）
Ｌｋａ－Ｓｐ２－Ｂ （Ｉ’－２）
（ｂ－２）ソルターゼの存在下で前記抗体部分を前記サイトカイン部分とコンジュゲートして式（Ｉ’）の構造を有する融合タンパク質を得るステップと、を含み、
Ａ－［Ｓｐ１－Ｌｋ－Ｓｐ２－Ｂ］ｍ （Ｉ’）
式中、
Ｌｋａは前記ソルターゼのアクセプター基質認識配列であり、Ｌｋｄは、前記ソルターゼのドナー基質認識配列であり、
Ａ、Ｂ、Ｓｐ１、Ｓｐ２、Ｌｋ及びｍは請求項１から１５のいずれか１項で定義された通りである、前記方法。
【請求項18】
ステップ（ａ－１）は、（ａ－１－１）Ｌｋａ－Ｓｐ２を前記抗ＰＤ－Ｌ１抗体の重鎖のＮ末端に付加して式（Ｉ－１）の構造を有する前記抗体部分を得るステップと、
［Ｌｋａ－Ｓｐ２］ｍ－Ａ （Ｉ－１）
（ａ－１－２）Ｓｐ１－ＬｋｄをＩＬ２１のＣ末端に付加して式（Ｉ－２）の構造を有する前記サイトカイン部分を得るステップと、を更に含む、請求項１７に記載の方法。
Ｂ－Ｓｐ１－Ｌｋｄ （Ｉ－２）
【請求項19】
ステップ（ａ－２）は、（ａ－２－１）Ｓｐ１－Ｌｋｄを前記抗ＰＤ－Ｌ１抗体の重鎖のＣ末端に付加して式（Ｉ’－１）の構造を有する前記抗体部分を得るステップと、
Ａ－［Ｓｐ１－Ｌｋｄ］ｍ （Ｉ’－１）
（ａ－２－２）Ｌｋａ－Ｓｐ２をＩＬ２１のＮ末端に付加して式（Ｉ’－２）の構造を有する前記サイトカイン部分を得るステップと、を更に含む、請求項１７に記載の方法。
Ｌｋａ－Ｓｐ２－Ｂ （Ｉ’－２）
【請求項20】
前記アクセプター基質認識配列は請求項２又は３で定義された通りである、請求項１７から１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項21】
前記ドナー基質認識配列は請求項４から６で定義された通りである、請求項１７から２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項22】
前記スペーサーは請求項７で定義された通りである、請求項１７から２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項23】
前記抗ＰＤ－Ｌ１抗体は請求項１１で定義された通りである、請求項１７から２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項24】
前記ＩＬ２１は請求項１２で定義された通りである、請求項１７から２３のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本開示はバイオ医薬品の分野に関する。特に、抗ＰＤ－Ｌ１抗体及びインターロイキン２１を含む抗体－サイトカイン融合タンパク質、その調製方法及びその用途を提供する。
【背景技術】
【0002】
インターロイキン２１（ＩＬ２１）は、主にＣＤ４＋ Ｔ細胞、Ｂ細胞、骨髄細胞及びナチュラルキラー（ＮＫ）Ｔ細胞によって分泌される４αヘリックスバンドルサイトカインである。ＩＬ２１は、ＩＬ２１受容体（ＩＬ２１Ｒ）のヘテロ二量体及び共通サイトカイン受容体ガンマ鎖を介してシグナル伝達することで、広範囲の免疫細胞型に多面的効果を発揮し、自然免疫応答及び適応免疫応答の両方を制御する。組換えＩＬ２１の腫瘍内注射は、腫瘍微小環境内の腫瘍関連マクロファージの免疫抑制性Ｍ２表現型から腫瘍阻害性Ｍ１表現型への転換を促進できることが報告されている。ＩＬ２１の抗腫瘍活性は、腎細胞癌、非ホジキンリンパ腫及び黒色腫の第１相又は第２相臨床試験で、単独療法又は他の治療薬との併用療法として実証されている。しかし、ＩＬ２１は半減期が非常に短く、全身投与される場合に重大な副作用を引き起こす。組換えＩＬ２１の腫瘍内投与は、より高い有効性及びより低い全身毒性等の利点をもたらす可能性があるが、大部分の患者にとってかなり困難である。
【0003】
プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ－１）及びプログラム細胞死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）は、Ｔ細胞増殖及び活性を制御する免疫抑制性受容体／リガンドである。ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１経路は、癌細胞により抗腫瘍免疫の抑制に利用され、一般に臨床転帰不良に関連する。ＰＤ－１又はＰＤ－Ｌ１に対する抗体を使用するＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１遮断は、様々な癌種の治療において有望な治療効果を示している。抗ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１免疫療法は臨床的有効性が期待できるものの、その恩恵を受ける患者は、まだ、ごく少数である。
【発明の概要】
【0004】
１つの態様において、式（Ｉ）又は（Ｉ’）の構造を有する融合タンパク質であって、
［Ｂ－Ｓｐ１－Ｌｋ－Ｓｐ２］ｍ－Ａ （Ｉ）
Ａ－［Ｓｐ１－Ｌｋ－Ｓｐ２－Ｂ］ｍ （Ｉ’）
式中、
Ａは抗ＰＤ－Ｌ１抗体であり、
Ｂはインターロイキン２１（ＩＬ２１）であり、
Ｓｐ１及びＳｐ２はそれぞれ独立してスペーサーであるか又は存在せず、
Ｌｋは、ソルターゼのアクセプター基質認識配列とドナー基質認識配列のコンジュゲーションによって形成されたリンカーであり、
ｍは１～４の整数である、前記融合タンパク質を提供する。
［Ｂ－Ｓｐ１－Ｌｋ－Ｓｐ２］ｍ－Ａ （Ｉ）
Ａ－［Ｓｐ１－Ｌｋ－Ｓｐ２－Ｂ］ｍ （Ｉ’）
式中、
Ａは抗ＰＤ－Ｌ１抗体であり、
Ｂはインターロイキン２１（ＩＬ２１）であり、
Ｓｐ１及びＳｐ２はそれぞれ独立してスペーサーであるか又は存在せず、
Ｌｋは、ソルターゼのアクセプター基質認識配列とドナー基質認識配列のコンジュゲーションによって形成されたリンカーであり、
ｍは１～４の整数である、前記融合タンパク質を提供する。
【0005】
いくつかの実施形態において、前記アクセプター基質認識配列は、グリシン（Ｇ）及びアラニン（Ａ）からなる群から選択される１～１００個の直列接続構造単位を含む。特定の実施形態において、前記アクセプター基質認識配列は、（Ｇ）ｎの配列を含み、ただし、ｎは２～２０の整数、特に３である。
【0006】
いくつかの実施形態において、前記ドナー基質認識配列は、Ｘ１Ｘ２Ｘ３ＴＸ４Ｘ５の配列を含み、ただし、Ｘ１はロイシン（Ｌ）又はアスパラギン（Ｎ）であり、Ｘ２はプロリン（Ｐ）又はアラニン（Ａ）であり、Ｘ３は任意の天然又は非天然アミノ酸であり、Ｘ４はグリシン（Ｇ）、セリン（Ｓ）又はアスパラギン（Ｎ）であるか又は存在せず、Ｘ５は１～１０個のアミノ酸を含むアミノ酸配列であるか又は存在しない。
【0007】
特定の実施形態において、Ｘ１Ｘ２Ｘ３ＴＸ４Ｘ５はＬＰＸ３ＴＧ、ＬＰＸ３ＴＧＧ、ＮＰＱＴＮ、ＮＰＫＴＧ、ＬＡＸ３ＴＧ又はＬＰＱＴＳＥＱであり、ただし、Ｘ３は任意の天然又は非天然アミノ酸である。好ましい実施形態において、Ｘ１Ｘ２Ｘ３ＴＸ４Ｘ５はＬＰＥＴＧ又はＬＰＥＴＧＧである。
【0008】
いくつかの実施形態において、前記スペーサーは、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）及びセリン（Ｓ）からなる群から選択される１～１００個の直列接続構造単位を含む。
【0009】
いくつかの実施形態において、前記抗ＰＤ－Ｌ１抗体はアテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ、３Ｆ２又はそれらの操作された抗体である。好ましい実施形態において、前記抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、配列番号１のアミノ酸配列を有する軽鎖及び配列番号２のアミノ酸配列を有する重鎖、又は配列番号３のアミノ酸配列を有する軽鎖及び配列番号４のアミノ酸配列を有する重鎖を含む。
【0010】
いくつかの実施形態において、前記ＩＬ２１は、野生型ＩＬ２１又はその変異体である。好ましい実施形態において、前記ＩＬ２１は配列番号９又は配列番号１０のアミノ酸配列を含む。
【0011】
いくつかの実施形態において、前記ＩＬ２１は、前記抗ＰＤ－Ｌ１抗体の軽鎖及び／又は重鎖のＮ末端でコンジュゲートされる。好ましい実施形態において、前記ＩＬ２１は、前記抗ＰＤ－Ｌ１抗体の重鎖のＮ末端でコンジュゲートされる。
【0012】
いくつかの実施形態において、ＬｋはＸ１Ｘ２Ｘ３Ｔ（Ｇ）ｎであり、前記融合タンパク質は、（ＩＩ）又は（ＩＩ’）の構造を有し、
［Ｂ－Ｓｐ１－Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｔ（Ｇ）ｎ－Ｓｐ２］ｍ－Ａ （ＩＩ）
Ａ－［Ｓｐ１－ Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｔ（Ｇ）ｎ－Ｓｐ２－Ｂ］ｍ （ＩＩ’）
式中、Ｘ１はロイシン（Ｌ）又はアスパラギン（Ｎ）であり、Ｘ２はプロリン（Ｐ）又はアラニン（Ａ）であり、Ｘ３は任意の天然又は非天然アミノ酸であり、ｎは２～２０の整数であり、
ｍは１又は２であり、
Ａ、Ｂ、Ｓｐ１及びＳｐ２は上記で定義された通りである。
［Ｂ－Ｓｐ１－Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｔ（Ｇ）ｎ－Ｓｐ２］ｍ－Ａ （ＩＩ）
Ａ－［Ｓｐ１－ Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｔ（Ｇ）ｎ－Ｓｐ２－Ｂ］ｍ （ＩＩ’）
式中、Ｘ１はロイシン（Ｌ）又はアスパラギン（Ｎ）であり、Ｘ２はプロリン（Ｐ）又はアラニン（Ａ）であり、Ｘ３は任意の天然又は非天然アミノ酸であり、ｎは２～２０の整数であり、
ｍは１又は２であり、
Ａ、Ｂ、Ｓｐ１及びＳｐ２は上記で定義された通りである。
【0013】
特定の実施形態において、前記融合タンパク質は、（ＩＩＩ）又は（ＩＩＩ’）の構造を有し、
［Ｂ－ＧＡＬＰＥＴＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ］ｍ－Ａ （ＩＩＩ）
Ａ－［ＧＡＬＰＥＴＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ－Ｂ］ｍ （ＩＩＩ’）
式中、Ａ及びＢは上記で定義された通りである。
［Ｂ－ＧＡＬＰＥＴＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ］ｍ－Ａ （ＩＩＩ）
Ａ－［ＧＡＬＰＥＴＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ－Ｂ］ｍ （ＩＩＩ’）
式中、Ａ及びＢは上記で定義された通りである。
【0014】
特定の実施形態において、前記融合タンパク質は、式（ＩＩＩ）の構造を有し、
［Ｂ－ＧＡＬＰＥＴＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ］ｍ－Ａ （ＩＩＩ）
式中、
Ａは、配列番号１のアミノ酸配列を有する軽鎖及び配列番号２のアミノ酸配列を有する重鎖、又は配列番号３のアミノ酸配列を有する軽鎖及び配列番号４のアミノ酸配列を有する重鎖を含む抗ＰＤ－Ｌ１抗体であり、
Ｂは、配列番号９又は配列番号１０のアミノ酸配列を含むＩＬ２１であり、
ｍは１又は２である。
［Ｂ－ＧＡＬＰＥＴＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ］ｍ－Ａ （ＩＩＩ）
式中、
Ａは、配列番号１のアミノ酸配列を有する軽鎖及び配列番号２のアミノ酸配列を有する重鎖、又は配列番号３のアミノ酸配列を有する軽鎖及び配列番号４のアミノ酸配列を有する重鎖を含む抗ＰＤ－Ｌ１抗体であり、
Ｂは、配列番号９又は配列番号１０のアミノ酸配列を含むＩＬ２１であり、
ｍは１又は２である。
【0015】
特定の実施形態において、前記融合タンパク質は、２つの同一の重鎖部分及び２つの同一の軽鎖部分を含み、そのうち、
（１）前記重鎖部分の各々が配列番号１８又は配列番号２０のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖部分の各々が配列番号１のアミノ酸配列を含み、又は
（２）前記重鎖部分の各々が配列番号１９又は配列番号２１のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖部分の各々が配列番号３のアミノ酸配列を含む。
（１）前記重鎖部分の各々が配列番号１８又は配列番号２０のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖部分の各々が配列番号１のアミノ酸配列を含み、又は
（２）前記重鎖部分の各々が配列番号１９又は配列番号２１のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖部分の各々が配列番号３のアミノ酸配列を含む。
【0016】
別の特定の実施形態において、前記融合タンパク質は、２つの異なる重鎖部分及び２つの同一の軽鎖部分を含み、そのうち、
（１）前記重鎖部分の一方が配列番号１８又は配列番号２０のアミノ酸配列を含み、前記重鎖部分の他方が配列番号１４のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖部分の各々が配列番号１のアミノ酸配列を含み、又は
（２）前記重鎖部分の一方が配列番号１９又は配列番号２１のアミノ酸配列を含み、前記重鎖部分の他方が配列番号１５のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖部分の各々が配列番号３のアミノ酸配列を含む。
（１）前記重鎖部分の一方が配列番号１８又は配列番号２０のアミノ酸配列を含み、前記重鎖部分の他方が配列番号１４のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖部分の各々が配列番号１のアミノ酸配列を含み、又は
（２）前記重鎖部分の一方が配列番号１９又は配列番号２１のアミノ酸配列を含み、前記重鎖部分の他方が配列番号１５のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖部分の各々が配列番号３のアミノ酸配列を含む。
【0017】
別の態様において、それを必要とする対象の疾患を治療するための医薬品の製造における、本開示に係る融合タンパク質の使用を提供する。好ましくは、前記疾患は、癌である。より好ましくは、前記癌は、黒色腫、卵巣癌、乳癌、メルケル細胞癌、肺癌、腎細胞癌、膀胱癌、結腸癌、結腸腺癌、結腸直腸癌、頭頸部扁平上皮癌、中皮腫、ウイルス誘発性癌、子宮頸癌、鼻咽頭癌、軟部肉腫、血液悪性腫瘍、胃癌、胃癌又は胃食道接合部（ＧＥＪ）腺癌、食道癌、食道の扁平上皮癌、子宮内膜癌、原発性縦隔Ｂ細胞リンパ腫（ＰＭＢＣＬ）、尿路上皮癌、マイクロサテライト不安定性高（ＭＳＩ－Ｈ）又はミスマッチ修復欠損（ｄＭＭＲ）の固形腫瘍、肝細胞癌、リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、腎細胞癌腫（ＲＣＣ）、有棘細胞癌（ｃＳＣＣ）、三種陰性乳癌（ＴＮＢＣ）、非小細胞肺癌及び膀胱癌から選択される。
【0018】
更なる態様において、本開示に係る融合タンパク質を産生するための方法であって、
（ａ－１）式（Ｉ－１）の構造を有する抗体部分及び式（Ｉ－２）の構造を有するサイトカイン部分を用意するステップと、
［Ｌｋａ－Ｓｐ２］ｍ－Ａ （Ｉ－１）
Ｂ－Ｓｐ１－Ｌｋｄ （Ｉ－２）
（ｂ－１）ソルターゼの存在下で前記抗体部分を前記サイトカイン部分とコンジュゲートして式（Ｉ）の構造を有する融合タンパク質を得るステップと、を含み、
［Ｂ－Ｓｐ１－Ｌｋ－Ｓｐ２］ｍ－Ａ （Ｉ）
又は
（ａ－２）式（Ｉ’－１）の構造を有する抗体部分及び式（Ｉ’－２）の構造を有するサイトカイン部分を用意するステップと、
Ａ－［Ｓｐ１－Ｌｋｄ］ｍ （Ｉ’－１）
Ｌｋａ－Ｓｐ２－Ｂ （Ｉ’－２）
（ｂ－２）ソルターゼの存在下で前記抗体部分を前記サイトカイン部分とコンジュゲートして式（Ｉ’）の構造を有する融合タンパク質を得るステップと、を含み、
Ａ－［Ｓｐ１－Ｌｋ－Ｓｐ２－Ｂ］ｍ （Ｉ’）
式中、
Ｌｋａは上記で定義されたソルターゼのアクセプター基質認識配列であり、Ｌｋｄは、上記で定義されたソルターゼのドナー基質認識配列であり、
Ａ、Ｂ、Ｓｐ１、Ｓｐ２、Ｌｋ及びｍは上記で定義された通りである、前記方法を提供する。
（ａ－１）式（Ｉ－１）の構造を有する抗体部分及び式（Ｉ－２）の構造を有するサイトカイン部分を用意するステップと、
［Ｌｋａ－Ｓｐ２］ｍ－Ａ （Ｉ－１）
Ｂ－Ｓｐ１－Ｌｋｄ （Ｉ－２）
（ｂ－１）ソルターゼの存在下で前記抗体部分を前記サイトカイン部分とコンジュゲートして式（Ｉ）の構造を有する融合タンパク質を得るステップと、を含み、
［Ｂ－Ｓｐ１－Ｌｋ－Ｓｐ２］ｍ－Ａ （Ｉ）
又は
（ａ－２）式（Ｉ’－１）の構造を有する抗体部分及び式（Ｉ’－２）の構造を有するサイトカイン部分を用意するステップと、
Ａ－［Ｓｐ１－Ｌｋｄ］ｍ （Ｉ’－１）
Ｌｋａ－Ｓｐ２－Ｂ （Ｉ’－２）
（ｂ－２）ソルターゼの存在下で前記抗体部分を前記サイトカイン部分とコンジュゲートして式（Ｉ’）の構造を有する融合タンパク質を得るステップと、を含み、
Ａ－［Ｓｐ１－Ｌｋ－Ｓｐ２－Ｂ］ｍ （Ｉ’）
式中、
Ｌｋａは上記で定義されたソルターゼのアクセプター基質認識配列であり、Ｌｋｄは、上記で定義されたソルターゼのドナー基質認識配列であり、
Ａ、Ｂ、Ｓｐ１、Ｓｐ２、Ｌｋ及びｍは上記で定義された通りである、前記方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【0019】
【図1】本開示のいくつかの実施形態に係る融合タンパク質の概略図を示す。
【図2A】それぞれ、ＥＬＩＳＡによって分析されたＡｂ００３０及びＡｂ００３３のｈＰＤ－Ｌ１への結合活性を示す。
【図2B】それぞれ、ＥＬＩＳＡによって分析されたＡｂ００３０及びＡｂ００３３のｈＰＤ－Ｌ１への結合活性を示す。
【図3】Ａｂ００３０及びＡｂ００３３から調製された融合タンパク質を含有する抗体－サイトカインコンジュゲーション混合物のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を示す。
【図4】Ａｂ００３０及びＡｂ００３３から調製された精製融合タンパク質のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を示す。
【図5】Ａｂ００３０及びＡｂ００３３から調製された融合タンパク質のＨＩＣ－ＨＰＬＣプロファイルを示す。
【図6】Ａｂ００３０及びＡｂ００３３から調製された融合タンパク質のＨＩＣ－ＨＰＬＣプロファイルを示す。
【図7】ＥＬＩＳＡによって分析された抗体単独又は融合タンパク質のｈＰＤ－Ｌ１への結合活性を示す。
【図8】ＥＬＩＳＡによって分析された抗体単独又は融合タンパク質のＩＬ２１Ｒへの結合活性を示す。
【図9】対照（白抜きヒストグラム）又はｈＩＬ２１、Ａｂ００３３及びＬＣ００３３－１（塗りつぶされたヒストグラム）で刺激されたＰＢＭＣにおけるＳＴＡＴ３リン酸化（ｐＳＴＡＴ３）シグナルのフローサイトメトリ分析を示す。
【図10】第１有効性試験からの実験動物の指定された時点での体重を示す。
【図11】第１有効性試験からの実験動物の指定された時点での腫瘍体積を示す。
【図12】第２有効性試験からの実験動物の指定された時点での体重を示す。
【図13】第２有効性試験からの実験動物の指定された時点での腫瘍体積を示す。
【発明を実施するための形態】
【0020】
定義
別途定義しない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。加えて、生化学、分子生物学、細胞及び組織培養、微生物学及び免疫学に関する用語及び実験手順は、当分野で広範に使用されるものである。また、本開示をより良く理解するために、以下に関連用語の定義及び説明を提供する。
別途定義しない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。加えて、生化学、分子生物学、細胞及び組織培養、微生物学及び免疫学に関する用語及び実験手順は、当分野で広範に使用されるものである。また、本開示をより良く理解するために、以下に関連用語の定義及び説明を提供する。
【0021】
本明細書で使用されるように、「少なくとも１つ」又は「１つ又は複数」という表現は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれ以上を意味する。明確に反対の指示がない限り、本明細書で使用される「一（ａ）」及び「一つ（ａｎ）」は、「少なくとも１つ」と理解すべきである。
【0022】
特定の量、濃度、値又はパラメータが範囲、好ましい範囲、又は好ましい上限若しくは好ましい下限の形態で記載される場合、前記範囲が明示的に記載されているか否かに関わらず、任意の上限又は好ましい値を任意の下限又は好ましい値と組み合わせて形成された任意の範囲が具体的に示されるのに等しいと理解すべきである。特に断らない限り、本明細書に挙げられる数値範囲は、該範囲の両端及び該範囲内の全ての整数と分数（小数）を含むことを意図する。例えば、「ｉは１～２０の整数である」という表現は、ｉは１～２０の任意の整数であることを意味し、例えば、ｉは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０であってもよい。他の同様の表現、例えばｎ及びｍも同様に理解されるべきである。
【0023】
本明細書で使用されるように、用語「任意の（ｏｐｔｉｏｎａｌ）」又は「任意に（ｏｐｔｉｏｎａｌｌｙ）」とは、その後に説明される事象が発生し得るが、必ずしも発生とは限らないことを意味し、該説明は、前記事象又は状況が発生するか又は発生しないケースを含む。
【0024】
「含む」、「包含」、「含有」及び「有する」といった表現は、制限のないものであり、追加の列挙されていない要素、ステップ、又は成分を除外するものではない。「…からなる」という表現は、指定されない任意の要素、ステップ、又は成分を除外する。「…から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」とは、範囲が、指定された要素、ステップ若しくは成分に限定されるか、又は請求される発明主題の本質的で新規な特徴に実質的に影響しない任意に存在する要素、ステップ若しくは成分の群に限定されることを意味する。「含む」という表現は、「…から本質的になる」及び「…からなる」といった表現を包含することを理解すべきである。
【0025】
本明細書で使用されるように、用語「抗体」は、少なくとも１つの抗原結合部位（即ち、パラトープ）を介して抗原のエピトープに特異的に結合する免疫グロブリン（Ｉｇ）分子又はその断片である。本明細書で使用されるように、「抗体（Ａｂ）」の定義は、通常の抗体、組換え抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、完全ヒト抗体、非ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、細胞内抗体、ダイアボディ、抗イディオタイプ抗体及び抗原結合断片を包含する。本明細書に記載の抗原結合断片は、全長抗体の酵素処理及び／又は合成方法によって産生でき、例えば、組換え抗体が１つの抗体のＣＤＲを別の抗体のフレームワークに移植することによって産生される。抗原結合断片の例としては、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、ｓｃｄｓＦｖ、ダイアボディ、Ｆａｂ、ｓｃＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、及び他の断片を含むが、それらに限定されない。本明細書で提供される抗体は、任意の免疫グロブリンタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＡ及びＩｇＹ）、任意のクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２）又はサブクラス（例えば、ＩｇＧ２ａ及びＩｇＧ２ｂ）のメンバーを含む。いくつかの実施形態において、抗体は、ＰＤ－Ｌ１の少なくとも一部を認識する抗ＰＤ－Ｌ１抗体である。いくつかの実施形態において、抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、２つの同一の軽鎖及び２つの同一の重鎖を含む通常の抗体である。
【0026】
「通常の」又は「全長」抗体は、典型的に、２つの重鎖（ＨＣ）及び２つの軽鎖（ＬＣ）といった４つのポリペプチドからなる。各軽鎖は、アミノ末端からカルボキシル末端へ、軽鎖可変領域（ＶＬ）及び軽鎖定常領域（ＣＬ）を含む。各重鎖は、アミノ末端からカルボキシル末端へ、重鎖可変領域（ＶＨ）及び１つ又は複数の重鎖定常領域（ＣＨ）を含む。
【0027】
各ＶＬ及びＶＨは、典型的に３つの超可変「相補性決定領域（ＣＤＲ）」及び４つの比較的保存された「フレームワーク領域（ＦＲ）」を有し、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３及びＦＲ４の順でアミノ末端からカルボキシル末端へと配列される。ＶＬ又はＶＨにおける位置に応じて、ＣＤＲは、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３のような重鎖可変領域ＣＤＲ（ＣＤＲＨ）、又はＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３のような軽鎖可変領域ＣＤＲ（ＣＤＲＬ）と指定される。
【0028】
当業者であれば、ＣＤＲを知り、当分野で周知の方法論、例えば、Ｋａｂａｔ（例えば、Ｋａｂａｔ， Ｅ．Ａ． ｅｔ ａｌ． （１９９１） Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ， Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｕ．Ｓ． Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ， ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ． ９１－３２４２を参照）、Ｃｈｏｔｈｉａ（例えば、Ｃｈｏｔｈｉａ， Ｃ． ｅｔ ａｌ． （１９８７） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １９６：９０１－９１７を参照）、ＡｂＭ（例えば、Ｍａｒｔｉｎ， Ａ．Ｃ．Ｒ． ａｎｄ Ａｌｌｅｎ， Ｊ． （２００７）． Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｔｏｏｌｓ ｆｏｒ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ． Ｉｎ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， Ｓ． Ｄuｂｅｌ （Ｅｄ．）を参照）及びＩＭＧＴ（例えば、Ｌｅｆｒａｎｃ， Ｍ．－Ｐ．， ２０１１ （６）， ＩＭＧＴ， ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ Ｐｒｏｔｏｃ．； ａｎｄ Ｌｅｆｒａｎｃ， Ｍ．－Ｐ． ｅｔ ａｌ．， Ｄｅｖ． Ｃｏｍｐ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， ２７， ５５－７７ （２００３）を参照）を含む様々な番号付けスキームを使用して、ＣＤＲを定義することができる。当業者であれば、所与の抗体のＣＤＲ配列が、使用される番号付けスキームに応じて異なる境界を有し得ることを理解するであろう。本明細書に記載の抗ＰＤ－Ｌ１抗体のＣＤＲ配列は、Ｋａｂａｔ番号付けスキームを使用して定義されるが、任意の他の番号付けスキームによって定義されるＣＤＲ配列が本開示の保護範囲に含まれるものとする。
【0029】
本明細書で使用されるように、用語「結合親和性」は、抗体とその同族抗原（例えば、抗ＰＤ－Ｌ１抗体とＰＤ－Ｌ１）又はリガンドとその受容体（例えば、ＩＬ２１とＩＬ２１Ｒ）のような、２つの結合パートナー間の強度の尺度である。典型的に、タンパク質間の親和性は、通常、平衡解離定数ＫＤによって測定され報告される。ＫＤは、下記等式を使用した動態分析から算出できる。
ＫＤ＝ｋｏｆｆ／ｋｏｎ
式中、ｋｏｆｆ及びｋｏｎは、それぞれ、抗原と抗体の間の解離速度定数及び会合速度定数である。ＫＤと親和性は反比例する。典型的に、抗体とその同族抗原の間のＫＤは、約１０－６Ｍ～約１０－９Ｍ以下、例えば１０－８以下、１０－９以下、又は１０－１０以下である。ｋｏｆｆ及びｋｏｎは、免疫アッセイ、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）（Ｒｉｃｈ ａｎｄ Ｍｙｓｚｋａ （２０００） Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １１：５４； Ｅｎｇｌｅｂｉｅｎｎｅ （１９９８） Ａｎａｌｙｓｔ． １２３：１５９９）、等温滴定熱量測定（ＩＴＣ）又は当分野で既知の他の動態相互作用アッセイ（例えば、Ｐａｕｌ， Ｗ． Ｅ．， Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， ２ｎｄ ｅｄ．， Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ｐａｇｅｓ ３３２－３３６ （１９８９）を参照。また、米国特許ＵＳ７，２２９，６１９も参照）に限定されない標準的な動態分析方法を使用して測定できる。結合速度のリアルタイム検出及び監視のための計器及び方法は既知であり、市場から入手できる（例えば、ＢｉａＣｏｒｅ２０００、ＢｉａｃｏｒｅＡＢ、Ｕｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）。
ＫＤ＝ｋｏｆｆ／ｋｏｎ
式中、ｋｏｆｆ及びｋｏｎは、それぞれ、抗原と抗体の間の解離速度定数及び会合速度定数である。ＫＤと親和性は反比例する。典型的に、抗体とその同族抗原の間のＫＤは、約１０－６Ｍ～約１０－９Ｍ以下、例えば１０－８以下、１０－９以下、又は１０－１０以下である。ｋｏｆｆ及びｋｏｎは、免疫アッセイ、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）（Ｒｉｃｈ ａｎｄ Ｍｙｓｚｋａ （２０００） Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １１：５４； Ｅｎｇｌｅｂｉｅｎｎｅ （１９９８） Ａｎａｌｙｓｔ． １２３：１５９９）、等温滴定熱量測定（ＩＴＣ）又は当分野で既知の他の動態相互作用アッセイ（例えば、Ｐａｕｌ， Ｗ． Ｅ．， Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， ２ｎｄ ｅｄ．， Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ｐａｇｅｓ ３３２－３３６ （１９８９）を参照。また、米国特許ＵＳ７，２２９，６１９も参照）に限定されない標準的な動態分析方法を使用して測定できる。結合速度のリアルタイム検出及び監視のための計器及び方法は既知であり、市場から入手できる（例えば、ＢｉａＣｏｒｅ２０００、ＢｉａｃｏｒｅＡＢ、Ｕｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）。
【0030】
本明細書で使用されるように、用語「ポリペプチド」とは、ペプチド結合によって共有結合した２つ以上のアミノ酸を指す。用語「ポリペプチド」及び「タンパク質」は、本明細書で互換的に使用される。ポリペプチドは、例えば、１つ又は複数のスペーサー又は機能的部分（例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ化）及びグリカン（グリコシル化））等を含むように修飾できる。ポリペプチドの修飾方法は、当業者に周知である。
【0031】
本明細書で使用されるように、「天然アミノ酸」とは、生体内のタンパク質合成に使用されるＬ配置の天然に存在するアミノ酸を指す。天然アミノ酸は、本明細書で、アラニン（Ａ、Ａｌａ）、アルギニン（Ｒ、Ａｒｇ）、アスパラギン（Ｎ、Ａｓｎ）、アルギニン酸（Ｄ、Ａｓｐ）、システイン（Ｃ、Ｃｙｓ）、グルタミン（Ｑ、Ｇｌｎ）、グルタミン酸（Ｅ、Ｇｌｕ）、グリシン（Ｇ、Ｇｌｙ）、ヒスチジン（Ｈ、Ｈｉｓ）、イソロイシン（Ｉ、Ｉｌｅ）、ロイシン（Ｌ、Ｌｅｕ）、リジン（Ｋ、Ｌｙｓ）、メチオニン（Ｍ、Ｍｅｔ）、フェニルアラニン（Ｆ、Ｐｈｅ）、プロリン（Ｐ、Ｐｒｏ）、セリン（Ｓ、Ｓｅｒ）、トレオニン（Ｔ、Ｔｈｒ）、トリプトファン（Ｗ、Ｔｒｐ）、チロシン（Ｙ、Ｔｙｒ）、バリン（Ｖ、Ｖａｌ）、ピロリシン（Ｏ、Ｐｙｌ）、セレノシステイン（Ｕ、Ｓｅｃ）といった、当業者に知られている標準的な１文字又は３文字のコードで表される。非天然アミノ酸の例は、上記の天然アミノ酸のＤ異性体及び誘導体、並びに異常アミノ酸を含む。非天然アミノ酸は、ホモアミノ酸、β－ホモアミノ酸、Ｎ－メチルアミノ酸、α－メチルアミノ酸、シトルリン（Ｃｉｔ）、ヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ）、ノルロイシン（Ｎｌｅ）、３－ニトロチロシン、ニトロアルギニン、オルニチン（Ｏｒｎ）、ナフチルアラニン（Ｎａｌ）、アミノ酪酸（Ａｂｕ）、ジアミノ酪酸（Ｄａｂ）、メチオニンスルホキシド及びメチオニンスルホンを含むが、それらに限定されない。
【0032】
本明細書で使用されるように、ポリペプチドにおけるアミノ酸位置の番号付けは、Ｎ末端からの最初のアミノ酸の位置を位置１と指定するように定義される。
【0033】
本明細書で使用されるように、「スペーサー」とは、融合タンパク質中の２つの部分間に位置し、該２つの部分を空間的に分離する構造を指す。スペーサーの例としては、アミノ酸、アミノ酸誘導体若しくは類似物及びアミノ酸配列を含むが、それらに限定されない。好ましいスペーサーとしては、ＧＡ、ＧＧＧ、ＧＡＧ及び（Ｇ）ｏＳ（（Ｇ）ｓＳ）ｔのようなグリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）及びセリン（Ｓ）のポリマーを含むアミノ酸配列を含んでもよいが、それらに限定されず、ここでｏは１～５の整数であり、ｓは１～１０の整数、特に４であり、ｔは０又は１～１０の整数である。スペーサーは、化学合成、化学若しくは酵素反応又は組換えＤＮＡ技術によってポリペプチド（例えば本明細書に記載の抗体部分又はサイトカイン部分）に組み込まれてもよいが、これに限定されない。
【0034】
本明細書で使用されるように、用語「認識配列」及び「認識モチーフ」は、互換的に使用されて、酵素（例えば、ソルターゼ）によって認識され且つ酵素がその酵素作用を発揮するアミノ酸配列を指す。例えば、それぞれソルターゼのドナー及びアクセプター基質認識配列を含む２つのポリペプチドは、コンジュゲートしてソルターゼの酵素作用によって融合ポリペプチドを形成することができる。
【0035】
本明細書で使用されるように、「配列同一性」は、当分野で認識されている意味を有し、２つの核酸又はポリペプチド間の配列同一性のパーセントは、公開されたアルゴリズム、例えばＢａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）及びＦａｓｔ Ａｄａｐｔｉｖｅ Ｓｈｒｉｎｋａｇｅ／Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄｉｎｇ Ａｌｇｏｒｉｔｈｍ（ＦＡＳＴＡ）（例えばＣｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｌｅｓｋ， Ａ．Ｍ．， ｅｄ．， Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９８８、Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ： Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ， Ｓｍｉｔｈ， Ｄ．Ｗ．， ｅｄ．， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９９３、Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ， Ｐａｒｔ Ｉ， Ｇｒｉｆｆｉｎ， Ａ．Ｍ．， ａｎｄ Ｇｒｉｆｆｉｎ， Ｈ．Ｇ．， ｅｄｓ．， Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ， １９９４を参照）を使用して２つの配列をアライメントすることによって算出できる。２つのポリヌクレオチド又はポリペプチド間の同一性を測定する方法は多数あるが、用語「同一性」は、熟練技術者に周知である（Ｃａｒｒｉｌｌｏ， Ｈ． ＆ Ｌｉｐｍａｎ， Ｄ．， ＳＩＡＭ Ｊ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ ４８：１０７３ （１９８８））。
【0036】
本明細書で使用されるように、参照ポリペプチド（野生型ＩＬ２１等）の「変異体」は、該参照ポリペプチドと比較して１つ又は複数のアミノ酸付加、欠失、挿入及び／又は置換を含む。
【0037】
本明細書で使用されるように、疾患又は症状を有する対象を「治療」するとは、該疾患又は症状を治癒するか、又は該疾患又は症状の徴候を阻止、緩和、改善又は除去する試みで、対象に組成物、手順又はレジメンを投与又は適用することを意味する。よって、用語「治療」は、予防、療法及び／又は治癒を包含する。用語「予防」とは、潜在的な疾患の予防及び／又は徴候の悪化又は疾患の進行の予防を指す。本明細書で使用されるように、治療は、本明細書で提供される融合タンパク質又は医薬組成物の任意の医薬的使用も包含する。
【0038】
本明細書で使用されるように、「対象」の定義は、ヒト及び非ヒト対象、例えば実験動物（例えば、マウス、ウサギ、及びラット並びに非ヒト霊長類）を含み、好ましくはヒトを指す。
【0039】
本明細書で使用されるように、「治療効果」は、疾患又は症状の徴候を変化させ、典型的には改善又は除去する、対象の治療から生じる効果を意味する。
【0040】
本明細書で使用されるように、「治療有効量」とは、対象に投与した後に治療効果を生み出すのに少なくとも十分な、１つ又は複数の活性剤を含有する薬剤、化合物、又は組成物の量を指す。よって、それは、疾患又は障害の徴候を予防、治癒、改善、阻止又は部分的に阻止するために必要な量である。
【0041】
融合タンパク質
一態様において、式（Ｉ）又は（Ｉ’）の構造を有する融合タンパク質を提供し、
［Ｂ－Ｓｐ１－Ｌｋ－Ｓｐ２］ｍ－Ａ （Ｉ）
Ａ－［Ｓｐ１－Ｌｋ－Ｓｐ２－Ｂ］ｍ （Ｉ’）
式中、
Ａは抗ＰＤ－Ｌ１抗体であり、
Ｂはインターロイキン２１（ＩＬ２１）であり、
Ｓｐ１及びＳｐ２はそれぞれ独立してスペーサーであるか又は存在せず、
Ｌｋは、ソルターゼのアクセプター基質認識配列とドナー基質認識配列のコンジュゲーションによって形成されたリンカーであり、
ｍは１～４の整数である。
一態様において、式（Ｉ）又は（Ｉ’）の構造を有する融合タンパク質を提供し、
［Ｂ－Ｓｐ１－Ｌｋ－Ｓｐ２］ｍ－Ａ （Ｉ）
Ａ－［Ｓｐ１－Ｌｋ－Ｓｐ２－Ｂ］ｍ （Ｉ’）
式中、
Ａは抗ＰＤ－Ｌ１抗体であり、
Ｂはインターロイキン２１（ＩＬ２１）であり、
Ｓｐ１及びＳｐ２はそれぞれ独立してスペーサーであるか又は存在せず、
Ｌｋは、ソルターゼのアクセプター基質認識配列とドナー基質認識配列のコンジュゲーションによって形成されたリンカーであり、
ｍは１～４の整数である。
【0042】
融合タンパク質は、リンカーを介してコンジュゲートされた抗ＰＤ－Ｌ１抗体とインターロイキン２１（ＩＬ２１）を含む抗体－サイトカイン融合タンパク質（免疫サイトカインとも呼ばれる）であり、ここでリンカーは、ソルターゼのドナー基質認識配列とコンジュゲートされたアクセプター基質認識配列を含む。いくつかの実施形態において、リンカーは、ソルターゼによって認識されたアクセプター基質認識配列とドナー基質認識配列のソルターゼ媒介部位特異的コンジュゲーションによって形成され、ここで、認識配列の一方は抗ＰＤ－Ｌ１抗体に連結されて抗体部分を形成し、認識配列の他方はＩＬ２１に連結されてサイトカイン部分を形成する。
【0043】
式（Ｉ）中、ＩＬ２１は、ドナー基質認識配列に連結され、抗ＰＤ－Ｌ１抗体はアクセプター基質認識配列に連結される。式（Ｉ’）中、抗ＰＤ－Ｌ１抗体はドナー基質認識配列に連結され、ＩＬ２１はアクセプター基質認識配列に連結される。ソルターゼの酵素作用によって、アクセプター及びドナー基質認識配列は、抗ＰＤ－Ｌ１抗体とＩＬ２１の間のリンカーを形成する。任意に、スペーサーが認識配列と抗ＰＤ－Ｌ１抗体及び／又はＩＬ２１の間に挿入されて空間的分離を提供する。
【0044】
式（Ｉ）及び（Ｉ’）は、それぞれ、ＩＬ２１又は抗ＰＤ－Ｌ１抗体とリンカーの間の連結を定義するが、ＩＬ２１が抗ＰＤ－Ｌ１抗体にコンジュゲートされる位置を限定することが意図されない。式（Ｉ）及び（Ｉ’）のいずれかにおいて、ＩＬ２１は、抗ＰＤ－Ｌ１抗体の任意の位置にコンジュゲートすることができる。
【0045】
いくつかの実施形態において、抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、軽鎖及び重鎖を含む。１つの実施形態において、ＩＬ２１は、抗ＰＤ－Ｌ１抗体の軽鎖及び／又は重鎖のＮ末端でコンジュゲートされる。１つの実施形態において、ＩＬ２１は、抗ＰＤ－Ｌ１抗体の軽鎖及び／又は重鎖のＣ末端でコンジュゲートされる。いくつかの実施形態において、ＩＬ２１は、抗ＰＤ－Ｌ１抗体の非末端位置でコンジュゲートされる。
【0046】
いくつかの好ましい実施形態において、式（Ｉ）中、ＩＬ２１は、抗ＰＤ－Ｌ１抗体の軽鎖及び／又は重鎖のＮ末端でコンジュゲートされる。特定の実施形態において、ＩＬ２１は、抗ＰＤ－Ｌ１抗体の重鎖のＮ末端でコンジュゲートされる。
【0047】
いくつかの好ましい実施形態において、式（Ｉ’）中、ＩＬ２１は、抗ＰＤ－Ｌ１抗体の軽鎖及び／又は重鎖のＣ末端でコンジュゲートされる。特定の実施形態において、ＩＬ２１は抗ＰＤ－Ｌ１抗体の重鎖のＣ末端でコンジュゲートされる。
【0048】
ｍは、抗ＰＤ－Ｌ１抗体にコンジュゲートされたＩＬ２１の数を表す。抗ＰＤ－Ｌ１抗体に連結されるドナー又はアクセプター基質認識配列の数を制御することで、１つ又は複数のＩＬ２１を抗ＰＤ－Ｌ１抗体にコンジュゲートすることができる。いくつかの好ましい実施形態において、ｍは１、２、３及び４から選択される整数である。特定の実施形態において、ｍは１である。別の特定の実施形態において、ｍは２である。
【0049】
抗ＰＤ－Ｌ１抗体
「Ｂ７Ｈ１」又は「ＣＤ２７４」とも呼ばれる「プログラム細胞死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）」は、免疫抑制性受容体プログラム細胞死１（ＰＤ－１）のリガンドである。ＰＤ－Ｌ１は、任意の種、例えばヒト、サル、チンパンジー、ウシ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、ウマ、ラット、マウス、モルモット、ウサギ等からのものであり得る。好ましくは、ＰＤ－Ｌ１はヒトＰＤ－Ｌ１である。ヒトＰＤ－Ｌ１（ｈＰＤ－Ｌ１）の全アミノ酸配列は、例えばＵｎｉｐｒｏｔ及びＧｅｎＢａｎｋ等の公共データベースから入手できる。抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、ＰＤ－Ｌ１（例えば、Ｕｎｉｐｒｏｔ識別名Ｑ９ＮＺＱ７－１、Ｑ９ＮＺＱ７－２又はＱ９ＮＺＱ７－３に示すアミノ酸配列を含むＰＤ－Ｌ１）又はその断片に対する任意の抗体であり得る。好ましくは、抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、ＰＤ－Ｌ１とＰＤ－１の間の結合を遮断し、ＰＤ－Ｌ１シグナル伝達を阻害する。抗ＰＤ－Ｌ１抗体の例としては、アテゾリズマブ（Ｔｅｃｅｎｔｒｉｑ）、アベルマブ（Ｂａｖｅｎｃｉｏ）、デュルバルマブ（Ｉｍｆｉｎｚｉ）又は３Ｆ２（その全ての内容が参照によって本明細書に組み込まれるＷＯ２０２０１６９０６２Ａ１を参照）を含むが、それらに限定されない。抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、更なる修飾を含み得る。修飾は、未修飾抗体と比較した１つ又は複数のアミノ酸付加、欠失、挿入及び／又は置換を含み得る。抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ又は３Ｆ２から調製された操作された抗体であり得る。
「Ｂ７Ｈ１」又は「ＣＤ２７４」とも呼ばれる「プログラム細胞死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）」は、免疫抑制性受容体プログラム細胞死１（ＰＤ－１）のリガンドである。ＰＤ－Ｌ１は、任意の種、例えばヒト、サル、チンパンジー、ウシ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、ウマ、ラット、マウス、モルモット、ウサギ等からのものであり得る。好ましくは、ＰＤ－Ｌ１はヒトＰＤ－Ｌ１である。ヒトＰＤ－Ｌ１（ｈＰＤ－Ｌ１）の全アミノ酸配列は、例えばＵｎｉｐｒｏｔ及びＧｅｎＢａｎｋ等の公共データベースから入手できる。抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、ＰＤ－Ｌ１（例えば、Ｕｎｉｐｒｏｔ識別名Ｑ９ＮＺＱ７－１、Ｑ９ＮＺＱ７－２又はＱ９ＮＺＱ７－３に示すアミノ酸配列を含むＰＤ－Ｌ１）又はその断片に対する任意の抗体であり得る。好ましくは、抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、ＰＤ－Ｌ１とＰＤ－１の間の結合を遮断し、ＰＤ－Ｌ１シグナル伝達を阻害する。抗ＰＤ－Ｌ１抗体の例としては、アテゾリズマブ（Ｔｅｃｅｎｔｒｉｑ）、アベルマブ（Ｂａｖｅｎｃｉｏ）、デュルバルマブ（Ｉｍｆｉｎｚｉ）又は３Ｆ２（その全ての内容が参照によって本明細書に組み込まれるＷＯ２０２０１６９０６２Ａ１を参照）を含むが、それらに限定されない。抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、更なる修飾を含み得る。修飾は、未修飾抗体と比較した１つ又は複数のアミノ酸付加、欠失、挿入及び／又は置換を含み得る。抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ又は３Ｆ２から調製された操作された抗体であり得る。
【0050】
いくつかの実施形態において、抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、ポリクローナル抗体である。いくつかの実施形態において、抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、モノクローナル抗体である。ポリクローナル及びモノクローナル抗体を産生するための方法は当分野で既知である。例えば、抗原としてのＰＤ－Ｌ１断片は、哺乳動物、例えば、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ハムスター、ヤギ又はシップを免疫化するために使用され得、そしてポリクローナル抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、免疫化された哺乳動物の血清から精製され得る。抗ＰＤ－Ｌ１抗体分泌Ｂ細胞は、免疫化された哺乳動物から単離され、骨髄腫細胞と融合してモノクローナル抗ＰＤ－Ｌ１抗体を産生することができる。あるいは、モノクローナル抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、ファージディスプレイ技術及び組換えＤＮＡ技術を使用して生成され得る。
【0051】
いくつかの実施形態において、抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ、３Ｆ２又はそれらの操作された抗体である。特定の実施形態において、抗ＰＤ－Ｌ１抗体はアテゾリズマブ又はその操作された抗体である。別の特定の実施形態において、抗ＰＤ－Ｌ１抗体は抗ＰＤ－Ｌ１抗体３Ｆ２又はその操作された抗体である。
【0052】
いくつかの実施形態において、抗体は、軽鎖可変領域（ＶＬ）及び重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。１つの実施形態において、ＶＬは、配列番号２２に示すＣＤＲＬ１配列、配列番号２３に示すＣＤＲＬ２配列及び配列番号２４に示すＣＤＲＬ３配列を含み、ＶＨは、配列番号２５に示すＣＤＲＨ１配列、配列番号２６に示すＣＤＲＨ２配列及び配列番号２７に示すＣＤＲＨ３配列を含む。別の実施形態において、ＶＬは、配列番号２８に示すＣＤＲＬ１配列、配列番号２９に示すＣＤＲＬ２配列及び配列番号３０に示すＣＤＲＬ３配列を含み、ＶＨは、配列番号３１に示すＣＤＲＨ１配列、配列番号３２に示すＣＤＲＨ２配列及び配列番号３３に示すＣＤＲＨ３配列を含む。
【0053】
別の実施形態において、ＶＬは配列番号３４のアミノ酸配列を含み、ＶＨは配列番号３５のアミノ酸配列を含む。更に別の実施形態において、ＶＬは配列番号３６のアミノ酸配列を含み、ＶＨは配列番号３７のアミノ酸配列を含む。
【0054】
いくつかの実施形態において、抗体は、軽鎖及び重鎖を含む。１つの実施形態において、軽鎖は配列番号１のアミノ酸配列を含み、重鎖は配列番号２のアミノ酸配列を含む。別の実施形態において、軽鎖は配列番号３のアミノ酸配列を含み、重鎖は配列番号４のアミノ酸配列を含む。
【0055】
抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、ファージディスプレイ技術、ハイブリドーマ技術、組換えＤＮＡ技術及び化学合成に限定されない当分野で既知の方法によって得られ得る。抗ＰＤ－Ｌ１抗体は様々な供給源から、例えば、酵母ディスプレイライブラリ又はファージディスプレイライブラリ（例えば、Ｗｉｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．， （１９９４） Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １２：４３３－４５５ ａｎｄ ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．， （１９９０） Ｎａｔｕｒｅ ３４８：５５２－５５３を参照）又はヒト末梢血から、単離され得る。例えば、抗体は、一般に抗体産生用の宿主細胞（例えば、酵母細胞、細菌、昆虫細胞又は哺乳動物細胞）内で発現され得る。抗体発現に好適な哺乳動物宿主細胞としては、骨髄腫細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨＥＫ２９３細胞及び他の抗体発現に好適な哺乳動物細胞を含むが、それらに限定されない。特定の実施形態において、哺乳動物宿主細胞は抗ＰＤ－Ｌ１抗体の軽鎖及び重鎖をコードする発現ベクターで形質転換され、発現された抗体は、タンパク質Ａ親和性カラムを使用して精製される。シグナルペプチドは、抗体の発現、正確な折り畳み及び細胞外分泌を助けることで、抗体の品質、収率及び精製を改善するために使用され得る。軽鎖及び重鎖に付加できるシグナルペプチドの例示的な配列は、それぞれ、配列番号１６及び配列番号１７に示す。
【0056】
インターロイキン２１（ＩＬ２１）
インターロイキン２１（ＩＬ２１）は、およそ１４ｋＤａの４αヘリックスバンドルサイトカインである。ＩＬ２１は、ＩＬ２１受容体（ＩＬ２１Ｒ）及び共通サイトカインγ鎖（ガンマｃ）からなる複合受容体への結合によってシグナル伝達する。特定の理論に縛られることを望むものではないが、ＩＬ２１シグナル伝達は、マクロファージ、Ｂ細胞、ＣＤ４＋ Ｔ細胞、ＣＤ８＋ Ｔ細胞、細胞毒性Ｔ細胞及びナチュラルキラー細胞を含む様々な標的免疫細胞の増殖、分化、又は活性を誘導することで、体液性免疫応答及び細胞媒介免疫応答の両方を強化する。
インターロイキン２１（ＩＬ２１）は、およそ１４ｋＤａの４αヘリックスバンドルサイトカインである。ＩＬ２１は、ＩＬ２１受容体（ＩＬ２１Ｒ）及び共通サイトカインγ鎖（ガンマｃ）からなる複合受容体への結合によってシグナル伝達する。特定の理論に縛られることを望むものではないが、ＩＬ２１シグナル伝達は、マクロファージ、Ｂ細胞、ＣＤ４＋ Ｔ細胞、ＣＤ８＋ Ｔ細胞、細胞毒性Ｔ細胞及びナチュラルキラー細胞を含む様々な標的免疫細胞の増殖、分化、又は活性を誘導することで、体液性免疫応答及び細胞媒介免疫応答の両方を強化する。
【0057】
ＩＬ２１は、任意の種、例えば、サル、チンパンジー、ウシ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、ウマ、ラット、マウス、モルモット、ウサギ等からのものであり得る。好ましくは、ＩＬ２１は、ヒトＩＬ２１（ｈＩＬ２１）である。２つのｈＩＬ２１前駆体、即ちＵｎｉＰｒｏｔ識別名Ｑ９ＨＢＥ４－１（配列番号７、アイソフォーム１前駆体）及びＵｎｉＰｒｏｔ識別名Ｑ９ＨＢＥ４－２（配列番号８、アイソフォーム２前駆体）が同定されており、最初の２４のａａがシグナルペプチドである。野生型ＩＬ２１は、シグナルペプチドを欠いた成熟タンパク質として分泌される場合が多い。成熟ｈＩＬ２１の例示的なアミノ酸配列は、配列番号９（アイソフォーム１）及び配列番号１０（アイソフォーム２）に示す。
【0058】
ＩＬ２１は、野生型ＩＬ２１又はその変異体であり得る。野生型ＩＬ２１は配列番号９又は配列番号１０のアミノ酸配列を有し得る。ＩＬ２１変異体は、配列番号９又は配列番号１０と比較して１つ又は複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０）のアミノ酸置換、付加又は欠失を含み得る。いくつかの実施形態において、ＩＬ２１変異体は、配列番号９又は配列番号１０と少なくとも約３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＩＬ２１変異体は、野生型ＩＬ２１と比較してより低い親和性でＩＬ２１Ｒに結合する。かかるＩＬ２１変異体の例は、関連内容の全てが参照によって本明細書に組み込まれる、Ｓｈｅｎ ｅｔ． ａｌ．， Ｆｒｏｎｔ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， （２０２０） １１：８３２及びＷＯ２０１９０２８３１６Ａ１に記載のＩＬ２１ムテインを含み得る。
【0059】
ＩＬ２１は、当分野で既知の方法によって得ることができる。例えば、ＩＬ２１のコード配列は、組換えＤＮＡ技術によって生成され、ＩＬ２１の発現に好適な宿主細胞に導入され得る。例示的な宿主細胞としては、酵母細胞、細菌、真菌、昆虫細胞及び哺乳動物細胞を含み得るが、それらに限定されない。１つの実施形態において、ＩＬ２１は、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）内で発現される。
【0060】
アクセプター及びドナー基質認識配列
アクセプター及びドナー基質認識配列は、使用されるソルターゼのタイプに対応する。ソルターゼは、天然ソルターゼ、非天然ソルターゼ又はそれらの組み合わせであってもよい。天然ソルターゼは、ソルターゼＡ（ＳｒｔＡ）、ソルターゼＢ（ＳｒｔＢ）、ソルターゼＣ（ＳｒｔＣ）、ソルターゼＤ（ＳｒｔＤ）、ソルターゼＥ（ＳｒｔＥ）、ソルターゼＦ（ＳｒｔＦ）等を含み得る（例えば、ＵＳ２０１１０３２１１８３Ａ１及びＥＰ３６４７４１９Ａ１を参照）。
アクセプター及びドナー基質認識配列は、使用されるソルターゼのタイプに対応する。ソルターゼは、天然ソルターゼ、非天然ソルターゼ又はそれらの組み合わせであってもよい。天然ソルターゼは、ソルターゼＡ（ＳｒｔＡ）、ソルターゼＢ（ＳｒｔＢ）、ソルターゼＣ（ＳｒｔＣ）、ソルターゼＤ（ＳｒｔＤ）、ソルターゼＥ（ＳｒｔＥ）、ソルターゼＦ（ＳｒｔＦ）等を含み得る（例えば、ＵＳ２０１１０３２１１８３Ａ１及びＥＰ３６４７４１９Ａ１を参照）。
【0061】
典型的なアクセプター基質認識配列は、グリシン及びアラニンのＮ末端アミノ基等のようなＮ末端アミノ基を求核剤として含む。いくつかの実施形態において、アクセプター基質認識配列は、グリシン（Ｇ）及びアラニン（Ａ）からなる群から選択される１～１００個の直列接続構造単位を含む。好ましい実施形態において、アクセプター基質認識配列は、（Ｇ）ｎの配列を含み、ここでｎは２～２０の整数、特に３である。
【0062】
いくつかの実施形態において、ドナー基質認識配列はＸ１Ｘ２Ｘ３ＴＸ４Ｘ５であり、ここでＸ１はロイシン（Ｌ）又はアスパラギン（Ｎ）であり、Ｘ２はプロリン（Ｐ）又はアラニン（Ａ）であり、Ｘ３は任意の天然又は非天然アミノ酸であり、Ｘ４はグリシン（Ｇ）、セリン（Ｓ）又はアスパラギン（Ｎ）であるか又は存在せず、Ｘ５は１～１０個のアミノ酸を含むアミノ酸配列であるか又は存在しない。好ましい実施形態において、Ｘ３はグルタミン酸（Ｅ）である。１つの実施形態において、Ｘ５は存在しない。別の実施形態において、Ｘ５は１～１０個のアミノ酸を含むアミノ酸配列であり、ここで各アミノ酸は独立して任意の天然又は非天然アミノ酸である。
【0063】
いくつかの実施形態において、ソルターゼは、ＳｒｔＡ、例えば黄色ブドウ球菌からのＳｒｔＡであり、Ｘ１Ｘ２Ｘ３ＴＸ４Ｘ５はＬＰＸ３ＴＧＧであってもよく、ここでＸ３は任意の天然又は非天然アミノ酸である。いくつかの実施形態において、ソルターゼは、ＳｒｔＢであり、Ｘ１Ｘ２Ｘ３ＴＸ４Ｘ５はＮＰＸ３ＴＧＧであってもよく、ここでＸ３は任意の天然又は非天然アミノ酸である。いくつかの実施形態において、ソルターゼは、ＳｒｔＣであり、Ｘ１Ｘ２Ｘ３ＴＸ４Ｘ５はＬＰＸ３ＴＧＧであってもよく、ここでＸ３は任意の天然又は非天然アミノ酸である。いくつかの他の実施形態において、ソルターゼは、ＳｒｔＤであり、Ｘ１Ｘ２Ｘ３ＴＸ４Ｘ５はＬＰＸ３ＴＡであってもよく、ここでＸ３は任意の天然又は非天然アミノ酸である。更に他のいくつかの実施形態において、ソルターゼは、ＳｒｔＥであり、Ｘ１Ｘ２Ｘ３ＴＸ４Ｘ５はＬＡＸ３ＴＧＧであってもよく、ここでＸ３は任意の天然又は非天然アミノ酸である。いくつかの他の実施形態において、ソルターゼは、ＳｒｔＦであり、Ｘ１Ｘ２Ｘ３ＴＸ４Ｘ５はＬＰＸ３ＴＧであってもよく、ここでＸ３は、Ａ、Ｒ、Ｅ、Ｎ、Ｄ、Ｑ、Ｉ、Ｌ及びＫからなる群から選択される。いくつかの他の実施形態において、ソルターゼは、化膿連鎖球菌からのＳｒｔＡであり、Ｘ１Ｘ２Ｘ３ＴＸ４Ｘ５はＬＰＸ３ＴＧＸ５であってもよく、ここでＸ５は上記で定義された通りである。いくつかの実施形態において、ソルターゼは、ストレプトマイセス・セリカラーからのＳｒｔＥであり、Ｘ１Ｘ２Ｘ３ＴＸ４Ｘ５はＬＡＸ３ＴＧであってもよい。更に別の実施形態において、ソルターゼはラクトバチルス・プランタルムからのＳｒｔＡであり、Ｘ１Ｘ２Ｘ３ＴＸ４Ｘ５はＬＰＱＴＳＥＱであってもよい。１つの実施形態において、ソルターゼは黄色ブドウ球菌からのＳｒｔＢであり、Ｘ１Ｘ２Ｘ３ＴＸ４Ｘ５はＮＰＱＴＮであってもよい。別の実施形態において、ソルターゼは炭疽菌からのＳｒｔＢであり、Ｘ１Ｘ２Ｘ３ＴＸ４Ｘ５はＮＰＫＴＧであってもよい。
【0064】
いくつかの特定の実施形態において、ソルターゼは、黄色ブドウ球菌からのＳｒｔＡである。したがって、Ｘ１Ｘ２Ｘ３ＴＸ４Ｘ５は、酵素の典型的なドナー基質認識配列ＬＰＸ３ＴＧＧであってもよく、ここでＸ３は、天然又は非天然の任意の単一アミノ酸であってもよい。いくつかの実施形態において、Ｘ１Ｘ２Ｘ３ＴＸ４Ｘ５はＬＰＸ３ＴＧＸ５であり、ここでＸ３は天然又は非天然の任意の単一アミノ酸であり、Ｘ５は存在しないか又は１～１０個のアミノ酸を含むアミノ酸配列である。１つの実施形態において、Ｘ５は存在しない。別の実施形態において、Ｘ５は１～１０個のアミノ酸を含むアミノ酸配列であり、ここで各アミノ酸は独立して任意の天然又は非天然アミノ酸である。特定の実施形態において、Ｘ５は（Ｇ）ｉであり、ここでｉは１～１０の整数である。別の特定の実施形態において、Ｘ１Ｘ２Ｘ３ＴＸ４Ｘ５はＬＰＥＴＧである。更に別の特定の実施形態において、Ｘ１Ｘ２Ｘ３ＴＸ４Ｘ５はＬＰＥＴＧＧである。
【0065】
典型的なソルターゼ触媒コンジュゲーション反応において、ソルターゼはドナー基質認識配列Ｘ１Ｘ２Ｘ３ＴＸ４Ｘ５をトレオニン残基で切断する。切断により、トレオニン残基の下流断片（－Ｘ４Ｘ５）が放出され、上流断片（Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｔ－）は、ソルターゼの活性部位システインとトレオニン－チオエステルを形成してアシル酵素中間体を生成する。続いて、中間体は、ソルターゼに結合したチオエステルをアクセプター基質認識配列のＮ末端アミノ基に連結することで脱アシル化される。（Ｇ）ｎがアクセプター基質認識配列として使用される場合、その形成したリンカーＬｋはＸ１Ｘ２Ｘ３Ｔ（Ｇ）ｎの配列を有し、ここでＸ１はロイシン（Ｌ）又はアスパラギン（Ｎ）であり、Ｘ２はプロリン（Ｐ）又はアラニン（Ａ）であり、Ｘ３は任意の天然又は非天然アミノ酸であり、ｎは２～２０の整数、特に３である。
【0066】
いくつかの実施形態において、Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｔ（Ｇ）ｎはＬＰＸ３Ｔ（Ｇ）ｎ、ＮＰＸ３Ｔ（Ｇ）ｎ又はＬＡＸ３Ｔ（Ｇ）ｎであり、ここでＬはロイシンであり、Ｐはプロリンであり、Ｎはアスパラギンであり、Ａはアラニンであり、Ｘ３は任意の天然又は非天然アミノ酸であり、Ｔはトレオニンであり、Ｇはグリシンであり、ｎは２～２０の整数、特に３である。１つの実施形態において、ｎは２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９及び２０から選択される。好ましい実施形態において、ｎは３である。
【0067】
いくつかの実施形態において、Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｔ（Ｇ）ｎはＬＰＸ３Ｔ（Ｇ）ｎであり、ここでＸ３は任意の天然又は非天然アミノ酸であり、ｎは上記で定義された通りである。１つの実施形態において、Ｘ３はグルタミン酸（Ｅ）である。特定の実施形態において、Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｔ（Ｇ）ｎはＬＰＥＴＧＧＧである。別の実施形態において、Ｘ３はグルタミン（Ｑ）である。特定の実施形態において、Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｔ（Ｇ）ｎはＬＰＱＴＧＧＧである。
【0068】
更に別の実施形態において、Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｔ（Ｇ）ｎはＬＡＸ３Ｔ（Ｇ）ｎであり、ここでＸ３は任意の天然又は非天然アミノ酸であり、ｎは上記で定義された通りである。好ましい実施形態において、Ｘ３はＥである。
【0069】
別の実施形態において、Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｔ（Ｇ）ｎはＮＰＱＴ（Ｇ）ｎ又はＮＰＫＴ（Ｇ）ｎであり、ｎは上記で定義された通りである。
【0070】
スペーサー
いくつかの実施形態において、Ｓｐ１及びＳｐ２の少なくとも一方はスペーサーである。いくつかの実施形態において、Ｓｐ１及びＳｐ２はそれぞれ独立してスペーサーである。
いくつかの実施形態において、Ｓｐ１及びＳｐ２の少なくとも一方はスペーサーである。いくつかの実施形態において、Ｓｐ１及びＳｐ２はそれぞれ独立してスペーサーである。
【0071】
いくつかの実施形態において、スペーサーは、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）及びセリン（Ｓ）からなる群から選択される１～１００個の直列接続構造単位を含む。いくつかの実施形態において、スペーサーはＧＡ、ＧＧＧ、ＧＡＧ及び（Ｇ）ｏＳ（（Ｇ）ｓＳ）ｔからなる群から選択され、ここでｏは１～５の整数であり、ｓは１～１０の整数、特に４であり、ｔは０又は１～１０の整数である。特定の実施形態において、Ｓｐ１は、ＧＡの配列を有するスペーサーであり、Ｓｐ２は、ＧＳＧＧＧＧＳの配列を有するスペーサーである。
【0072】
融合タンパク質の具体的な実施形態
本開示に係る融合タンパク質の例示的な実施形態を以下に提供する。
本開示に係る融合タンパク質の例示的な実施形態を以下に提供する。
【0073】
いくつかの実施形態において、ＬｋはＸ１Ｘ２Ｘ３Ｔ（Ｇ）ｎであり、融合タンパク質は（ＩＩ）又は（ＩＩ’）の構造を有し、
［Ｂ－Ｓｐ１－Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｔ（Ｇ）ｎ－Ｓｐ２］ｍ－Ａ （ＩＩ）
Ａ－［Ｓｐ１－Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｔ（Ｇ）ｎ－Ｓｐ２－Ｂ］ｍ （ＩＩ’）
式中、Ｘ１はロイシン（Ｌ）又はアスパラギン（Ｎ）であり、Ｘ２はプロリン（Ｐ）又はアラニン（Ａ）であり、Ｘ３は任意の天然又は非天然アミノ酸であり、ｎは２～２０の整数であり、
ｍは１又は２であり、
Ａ、Ｂ、Ｓｐ１及びＳｐ２は上記で定義された通りである。
［Ｂ－Ｓｐ１－Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｔ（Ｇ）ｎ－Ｓｐ２］ｍ－Ａ （ＩＩ）
Ａ－［Ｓｐ１－Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｔ（Ｇ）ｎ－Ｓｐ２－Ｂ］ｍ （ＩＩ’）
式中、Ｘ１はロイシン（Ｌ）又はアスパラギン（Ｎ）であり、Ｘ２はプロリン（Ｐ）又はアラニン（Ａ）であり、Ｘ３は任意の天然又は非天然アミノ酸であり、ｎは２～２０の整数であり、
ｍは１又は２であり、
Ａ、Ｂ、Ｓｐ１及びＳｐ２は上記で定義された通りである。
【0074】
いくつかの実施形態において、Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｔ（Ｇ）ｎはＬＰＸ３Ｔ（Ｇ）ｎである。１つの実施形態において、Ｘ３はＥである。別の実施形態において、Ｘ３はＱである。
【0075】
いくつかの実施形態において、Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｔ（Ｇ）ｎはＬＡＸ３Ｔ（Ｇ）ｎである。１つの実施形態において、Ｘ３はＥ又はＱである。
【0076】
いくつかの実施形態において、抗ＰＤ－Ｌ１抗体はアテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ、３Ｆ２又はそれらの操作された抗体である。特定の実施形態において、抗ＰＤ－Ｌ１抗体はＡｂ０００１（アテゾリズマブ）であり、配列番号１のアミノ酸配列を有する軽鎖及び配列番号２のアミノ酸配列を有する重鎖を含む。別の実施形態において、抗ＰＤ－Ｌ１抗体はＡｂ０００２（３Ｆ２）であり、配列番号３のアミノ酸配列を有する軽鎖及び配列番号４のアミノ酸配列を有する重鎖を含む。
【0077】
いくつかの実施形態において、ＩＬ２１は、野生型ＩＬ２１又はその変異体である。１つの実施形態において、ＩＬ２１は配列番号９又は配列番号１０のアミノ酸配列を含む。
【0078】
１つの実施形態において、式（ＩＩ）又は（ＩＩ’）中、ｎは３である。
【0079】
いくつかの実施形態において、Ｓｐ１及びＳｐ２は存在しない。いくつかの実施形態において、Ｓｐ１及びＳｐ２の少なくとも一方は、本明細書に記載のスペーサーである。いくつかの実施形態において、Ｓｐ１及びＳｐ２はそれぞれ独立してスペーサーである。１つの実施形態において、Ｓｐ１はＧＡであり、Ｓｐ２はＧＳＧＧＧＧＳである。
【0080】
１つの実施形態において、Ｓｐ１はＧＡであり、ドナー基質認識配列はＬＰＥＴＧＧであり、アクセプター基質認識配列はＧＧＧであり、Ｓｐ２はＧＳＧＧＧＧＳであり、融合タンパク質は（ＩＩＩ）又は（ＩＩＩ’）の構造を有する。
［Ｂ－ＧＡＬＰＥＴＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ］ｍ－Ａ （ＩＩＩ）
Ａ－［ＧＡＬＰＥＴＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ－Ｂ］ｍ （ＩＩＩ’）
［Ｂ－ＧＡＬＰＥＴＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ］ｍ－Ａ （ＩＩＩ）
Ａ－［ＧＡＬＰＥＴＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ－Ｂ］ｍ （ＩＩＩ’）
【0081】
１つの実施形態において、式（Ｉ）、（Ｉ’）、（ＩＩ）、（ＩＩ’）、（ＩＩＩ）及び（ＩＩＩ’）のいずれか中、抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、配列番号１のアミノ酸配列を有する軽鎖及び配列番号２のアミノ酸配列を有する重鎖、又は配列番号３のアミノ酸配列を有する軽鎖及び配列番号４のアミノ酸配列を有する重鎖を含み、ＩＬ２１は配列番号９又は配列番号１０のアミノ酸配列を含み、ｍは１又は２である。
【0082】
いくつかの実施形態において、式（Ｉ）、（ＩＩ）及び（ＩＩＩ）のいずれか中、抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、軽鎖及び重鎖を含む。１つの実施形態において、ＩＬ２１は抗ＰＤ－Ｌ１抗体の軽鎖及び／又は重鎖のＮ末端でコンジュゲートされる。特定の実施形態において、ＩＬ２１は抗ＰＤ－Ｌ１抗体の重鎖のＮ末端でコンジュゲートされる。
【0083】
いくつかの他の実施形態において、式（Ｉ’）、（ＩＩ’）及び（ＩＩＩ’）のいずれか中、抗ＰＤ－Ｌ１抗体は軽鎖及び重鎖を含む。１つの実施形態において、ＩＬ２１は抗ＰＤ－Ｌ１抗体の軽鎖及び／又は重鎖のＣ末端でコンジュゲートされる。特定の実施形態において、ＩＬ２１は抗ＰＤ－Ｌ１抗体の重鎖のＣ末端でコンジュゲートされる。
【0084】
いくつかの実施形態において、抗ＰＤ－Ｌ１抗体は２つの同一の軽鎖及び２つの同一の重鎖を含み、そのうち各軽鎖が配列番号１のアミノ酸配列を含み、各重鎖が配列番号２のアミノ酸配列を含み、又は各軽鎖が配列番号３のアミノ酸配列を含み、各重鎖が配列番号４のアミノ酸配列を含む。１つの実施形態において、ＩＬ２１は抗ＰＤ－Ｌ１抗体の重鎖のうち少なくとも１つのＮ末端にコンジュゲートされる。１つの実施形態において、本開示に係る融合タンパク質は、２つの同一の軽鎖部分及び２つの同一の重鎖部分を含み、そのうち各重鎖部分が抗ＰＤ－Ｌ１抗体の重鎖の各々のＮ末端にコンジュゲートされたＩＬ２１を含む。別の実施形態において、本開示に係る融合タンパク質は２つの同一の軽鎖部分及び２つの異なる重鎖部分を含み、そのうち重鎖部分の一方のみが、抗ＰＤ－Ｌ１抗体の重鎖のうちの１つにコンジュゲートされたＩＬ２１を含む。
【0085】
特定の実施形態において、融合タンパク質は２つの同一の重鎖部分及び２つの同一の軽鎖部分を含み、そのうち、
（１）重鎖部分の各々が配列番号１８又は配列番号２０のアミノ酸配列を含み、軽鎖部分の各々が配列番号１のアミノ酸配列を含み、又は
（２）重鎖部分の各々が配列番号１９又は配列番号２１のアミノ酸配列を含み、軽鎖部分の各々が配列番号３のアミノ酸配列を含む。
（１）重鎖部分の各々が配列番号１８又は配列番号２０のアミノ酸配列を含み、軽鎖部分の各々が配列番号１のアミノ酸配列を含み、又は
（２）重鎖部分の各々が配列番号１９又は配列番号２１のアミノ酸配列を含み、軽鎖部分の各々が配列番号３のアミノ酸配列を含む。
【0086】
別の特定の実施形態において、融合タンパク質は２つの異なる重鎖部分及び２つの同一の軽鎖部分を含み、そのうち、
（１）重鎖部分の一方が配列番号１８又は配列番号２０のアミノ酸配列を含み、重鎖部分の他方が配列番号１４のアミノ酸配列を含み、軽鎖部分の各々が配列番号１のアミノ酸配列を含み、又は
（２）重鎖部分の一方が配列番号１９又は配列番号２１のアミノ酸配列を含み、重鎖部分の他方が配列番号１５のアミノ酸配列を含み、軽鎖部分の各々が配列番号３のアミノ酸配列を含む。
（１）重鎖部分の一方が配列番号１８又は配列番号２０のアミノ酸配列を含み、重鎖部分の他方が配列番号１４のアミノ酸配列を含み、軽鎖部分の各々が配列番号１のアミノ酸配列を含み、又は
（２）重鎖部分の一方が配列番号１９又は配列番号２１のアミノ酸配列を含み、重鎖部分の他方が配列番号１５のアミノ酸配列を含み、軽鎖部分の各々が配列番号３のアミノ酸配列を含む。
【0087】
融合タンパク質の調製方法
いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、ソルターゼの触媒下で、抗ＰＤ－Ｌ１抗体を含む抗体部分を、ＩＬ２１を含むサイトカイン部分にコンジュゲートすることで産生され、ここで抗体部分及びサイトカイン部分の一方はソルターゼのドナー基質認識配列を更に含み、他方はソルターゼのアクセプター基質認識配列を更に含み、それによってドナー基質認識配列及びアクセプター基質認識配列はソルターゼの酵素作用によりコンジュゲートされる。好適なソルターゼ、アクセプター及びドナー基質認識配列は上記に記載されている。
いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、ソルターゼの触媒下で、抗ＰＤ－Ｌ１抗体を含む抗体部分を、ＩＬ２１を含むサイトカイン部分にコンジュゲートすることで産生され、ここで抗体部分及びサイトカイン部分の一方はソルターゼのドナー基質認識配列を更に含み、他方はソルターゼのアクセプター基質認識配列を更に含み、それによってドナー基質認識配列及びアクセプター基質認識配列はソルターゼの酵素作用によりコンジュゲートされる。好適なソルターゼ、アクセプター及びドナー基質認識配列は上記に記載されている。
【0088】
したがって、別の態様において、本開示に係る融合タンパク質を産生するための方法を提供する。
【0089】
１つの実施形態において、本方法は、
（ａ－１）式（Ｉ－１）の構造を有する抗体部分及び式（Ｉ－２）の構造を有するサイトカイン部分を用意するステップと、
［Ｌｋａ－Ｓｐ２］ｍ－Ａ （Ｉ－１）
Ｂ－Ｓｐ１－Ｌｋｄ （Ｉ－２）
（ｂ－１）ソルターゼの存在下で抗体部分をサイトカイン部分にコンジュゲートして式（Ｉ）の構造を有する融合タンパク質を得るステップと、を含み、
［Ｂ－Ｓｐ１－Ｌｋ－Ｓｐ２］ｍ－Ａ （Ｉ）
式中、
Ｌｋａはソルターゼのアクセプター基質認識配列であり、Ｌｋｄは、ソルターゼのドナー基質認識配列であり、
Ａ、Ｂ、Ｓｐ１、Ｓｐ２、Ｌｋ及びｍは上記で定義された通りである。
（ａ－１）式（Ｉ－１）の構造を有する抗体部分及び式（Ｉ－２）の構造を有するサイトカイン部分を用意するステップと、
［Ｌｋａ－Ｓｐ２］ｍ－Ａ （Ｉ－１）
Ｂ－Ｓｐ１－Ｌｋｄ （Ｉ－２）
（ｂ－１）ソルターゼの存在下で抗体部分をサイトカイン部分にコンジュゲートして式（Ｉ）の構造を有する融合タンパク質を得るステップと、を含み、
［Ｂ－Ｓｐ１－Ｌｋ－Ｓｐ２］ｍ－Ａ （Ｉ）
式中、
Ｌｋａはソルターゼのアクセプター基質認識配列であり、Ｌｋｄは、ソルターゼのドナー基質認識配列であり、
Ａ、Ｂ、Ｓｐ１、Ｓｐ２、Ｌｋ及びｍは上記で定義された通りである。
【0090】
別の実施形態において、本方法は、
（ａ－２）式（Ｉ’－１）の構造を有する抗体部分及び式（Ｉ’－２）の構造を有するサイトカイン部分を用意するステップと、
Ａ－［Ｓｐ１－Ｌｋｄ］ｍ （Ｉ’－１）
Ｌｋａ－Ｓｐ２－Ｂ （Ｉ’－２）
（ｂ－２）ソルターゼの存在下で抗体部分をサイトカイン部分にコンジュゲートして式（Ｉ’）の構造を有する融合タンパク質を得るステップと、を含み、
Ａ－［Ｓｐ１－Ｌｋ－Ｓｐ２－Ｂ］ｍ （Ｉ’）
式中、
Ｌｋａはソルターゼのアクセプター基質認識配列であり、Ｌｋｄは、ソルターゼのドナー基質認識配列であり、
Ａ、Ｂ、Ｓｐ１、Ｓｐ２、Ｌｋ及びｍは上記で定義された通りである。
（ａ－２）式（Ｉ’－１）の構造を有する抗体部分及び式（Ｉ’－２）の構造を有するサイトカイン部分を用意するステップと、
Ａ－［Ｓｐ１－Ｌｋｄ］ｍ （Ｉ’－１）
Ｌｋａ－Ｓｐ２－Ｂ （Ｉ’－２）
（ｂ－２）ソルターゼの存在下で抗体部分をサイトカイン部分にコンジュゲートして式（Ｉ’）の構造を有する融合タンパク質を得るステップと、を含み、
Ａ－［Ｓｐ１－Ｌｋ－Ｓｐ２－Ｂ］ｍ （Ｉ’）
式中、
Ｌｋａはソルターゼのアクセプター基質認識配列であり、Ｌｋｄは、ソルターゼのドナー基質認識配列であり、
Ａ、Ｂ、Ｓｐ１、Ｓｐ２、Ｌｋ及びｍは上記で定義された通りである。
【0091】
１つの特定の実施形態において、ステップ（ａ－１）は、
（ａ－１－１）Ｌｋａ－Ｓｐ２を抗ＰＤ－Ｌ１抗体の重鎖のＮ末端に付加して式（Ｉ－１）の構造を有する抗体部分を得るステップと、
［Ｌｋａ－Ｓｐ２］ｍ－Ａ （Ｉ－１）
（ａ－１－２）Ｓｐ１－ＬｋｄをＩＬ２１のＣ末端に付加して式（Ｉ－２）の構造を有するサイトカイン部分を得るステップと、を更に含む。
Ｂ－Ｓｐ１－Ｌｋｄ （Ｉ－２）
（ａ－１－１）Ｌｋａ－Ｓｐ２を抗ＰＤ－Ｌ１抗体の重鎖のＮ末端に付加して式（Ｉ－１）の構造を有する抗体部分を得るステップと、
［Ｌｋａ－Ｓｐ２］ｍ－Ａ （Ｉ－１）
（ａ－１－２）Ｓｐ１－ＬｋｄをＩＬ２１のＣ末端に付加して式（Ｉ－２）の構造を有するサイトカイン部分を得るステップと、を更に含む。
Ｂ－Ｓｐ１－Ｌｋｄ （Ｉ－２）
【0092】
別の特定の実施形態において、ステップ（ａ－２）は、
（ａ－２－１）Ｓｐ１－Ｌｋｄを抗ＰＤ－Ｌ１抗体の重鎖のＣ末端に付加して式（Ｉ’－１）の構造を有する抗体部分を得るステップと、
Ａ－［Ｓｐ１－Ｌｋｄ］ｍ （Ｉ’－１）
（ａ－２－２）Ｌｋａ－Ｓｐ２をＩＬ２１のＮ末端に付加して式（Ｉ’－２）の構造を有するサイトカイン部分を得るステップと、を更に含む。
Ｌｋａ－Ｓｐ２－Ｂ （Ｉ’－２）
（ａ－２－１）Ｓｐ１－Ｌｋｄを抗ＰＤ－Ｌ１抗体の重鎖のＣ末端に付加して式（Ｉ’－１）の構造を有する抗体部分を得るステップと、
Ａ－［Ｓｐ１－Ｌｋｄ］ｍ （Ｉ’－１）
（ａ－２－２）Ｌｋａ－Ｓｐ２をＩＬ２１のＮ末端に付加して式（Ｉ’－２）の構造を有するサイトカイン部分を得るステップと、を更に含む。
Ｌｋａ－Ｓｐ２－Ｂ （Ｉ’－２）
【0093】
１つの実施形態において、Ｌｋａはグリシン（Ｇ）及びアラニン（Ａ）からなる群から選択される１～１００個の直列接続構造単位を含む。特定の実施形態において、Ｌｋａは（Ｇ）ｎの配列を含み、ここでｎは２～２０の整数、特に３である。
【0094】
１つの実施形態において、ＬｋｄはＸ１Ｘ２Ｘ３ＴＸ４Ｘ５の配列を含み、ここで、Ｘ１はＬ又はＮであり、Ｘ２はＰ又はＡであり、Ｘ３は任意の天然又は非天然アミノ酸であり、Ｘ４はＧ、Ｓ又はＮであるか又は存在せず、Ｘ５は１～１０個のアミノ酸を含むアミノ酸配列であるか又は存在しない。特定の実施形態において、Ｘ１Ｘ２Ｘ３ＴＸ４Ｘ５はＬＰＸ３ＴＧ、ＬＰＸ３ＴＧＧ、ＮＰＱＴＮ、ＮＰＫＴＧ、ＬＡＸ３ＴＧ又はＬＰＱＴＳＥＱであり、ここでＸ３は任意の天然又は非天然アミノ酸である。特定の実施形態において、Ｘ１Ｘ２Ｘ３ＴＸ４Ｘ５はＬＰＥＴＧ又はＬＰＥＴＧＧである。
【0095】
１つの実施形態において、Ｓｐ１及びＳｐ２は存在しない。１つの実施形態において、Ｓｐ１及びＳｐ２の少なくとも一方は、本明細書に記載のスペーサーである。別の実施形態において、Ｓｐ１及びＳｐ２はそれぞれ独立してスペーサーである。ある実施形態において、スペーサーはＧ、Ａ及びＳからなる群から選択される１～１００個の直列接続構造単位を含む。好ましい実施形態において、スペーサーはＧＡ、ＧＧＧ、ＧＡＧ及び（Ｇ）ｏＳ（（Ｇ）ｓＳ）ｔからなる群から選択され、ここでｏは１～５の整数であり、ｓは１～１０の整数、特に４であり、ｔは０又は１～１０の整数である。特定の実施形態において、Ｓｐ１は、ＧＡの配列を有するスペーサーであり、Ｓｐ２は、ＧＳＧＧＧＧＳの配列を有するスペーサーである。
【0096】
１つの実施形態において、抗ＰＤ－Ｌ１抗体はアテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ、３Ｆ２又はそれらの操作された抗体である。１つの実施形態において、抗ＰＤ－Ｌ１抗体はＶＬ及びＶＨを含み、ここでＶＬ及びＶＨは、本明細書に記載のＣＤＲ配列を含む。別の実施形態において、抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、本明細書に記載の配列を有するＶＬ及びＶＨを含む。特定の実施形態において、抗ＰＤ－Ｌ１抗体は配列番号１のアミノ酸配列を有する軽鎖及び配列番号２のアミノ酸配列を有する重鎖、又は配列番号３のアミノ酸配列を有する軽鎖及び配列番号４のアミノ酸配列を有する重鎖を含む。
【0097】
１つの実施形態において、ＩＬ２１は、野生型ＩＬ２１又はその変異体である。特定の実施形態において、ＩＬ２１は配列番号９又は配列番号１０のアミノ酸配列を含む。
【0098】
抗体部分
抗体部分は、上記に記載の抗ＰＤ－Ｌ１抗体を本明細書に記載のアクセプター基質認識配列又はドナー基質認識配列で修飾することによって生成され得る。修飾は、抗ＰＤ－Ｌ１抗体の任意の位置で発生してもよい。いくつかの実施形態において、修飾は抗ＰＤ－Ｌ１抗体のＮ末端及び／又はＣ末端、例えば、抗体軽鎖のＮ末端及び／又は抗体重鎖のＮ末端で発生する。いくつかの実施形態において、修飾は、抗ＰＤ－Ｌ１抗体の非末端位置、例えば、抗体軽鎖及び／又は重鎖の側鎖で発生する。
抗体部分は、上記に記載の抗ＰＤ－Ｌ１抗体を本明細書に記載のアクセプター基質認識配列又はドナー基質認識配列で修飾することによって生成され得る。修飾は、抗ＰＤ－Ｌ１抗体の任意の位置で発生してもよい。いくつかの実施形態において、修飾は抗ＰＤ－Ｌ１抗体のＮ末端及び／又はＣ末端、例えば、抗体軽鎖のＮ末端及び／又は抗体重鎖のＮ末端で発生する。いくつかの実施形態において、修飾は、抗ＰＤ－Ｌ１抗体の非末端位置、例えば、抗体軽鎖及び／又は重鎖の側鎖で発生する。
【0099】
いくつかの実施形態において、ｍは１、２、３及び４から選択される整数である。特定の実施形態において、ｍは１である。別の特定の実施形態において、ｍは２である。
【0100】
１つの実施形態において、（Ｇ）ｎは抗ＰＤ－Ｌ１抗体の軽鎖のＮ末端に導入される。別の実施形態において、（Ｇ）ｎは抗ＰＤ－Ｌ１抗体の重鎖のＮ末端に導入される。更に別の実施形態において、（Ｇ）ｎは抗ＰＤ－Ｌ１抗体の軽鎖及び重鎖のＮ末端に導入される。（Ｇ）ｎ及び抗ＰＤ－Ｌ１抗体は上記で定義された通りである。
【0101】
１つの実施形態において、Ｘ１Ｘ２Ｘ３ＴＸ４Ｘ５は抗ＰＤ－Ｌ１抗体の軽鎖のＣ末端に導入される。別の実施形態において、Ｘ１Ｘ２Ｘ３ＴＸ４Ｘ５は抗ＰＤ－Ｌ１抗体の重鎖のＣ末端に導入される。更に別の実施形態において、Ｘ１Ｘ２Ｘ３ＴＸ４Ｘ５は抗ＰＤ－Ｌ１抗体の軽鎖及び重鎖のＣ末端に導入される。Ｘ１Ｘ２Ｘ３ＴＸ４Ｘ５及び抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、上記で定義された通りである。
【0102】
いくつかの実施形態において、抗体部分は軽鎖を含み、ここで軽鎖は、１）抗ＰＤ－Ｌ１抗体の軽鎖（ＬＣとする）、２）（Ｇ）ｎがＮ末端に導入された抗ＰＤ－Ｌ１抗体の軽鎖を含むＮ末端修飾軽鎖（ＬＣＮＴとする）、又は３）（Ｇ）ｎ－Ｓｐ２がＮ末端に導入された抗ＰＤ－Ｌ１抗体の軽鎖を含むＮ末端修飾軽鎖（ＬＣＮＴＬとする）であり得る。いくつかの他の実施形態において、抗体部分は重鎖を含み、ここで重鎖は、１）抗ＰＤ－Ｌ１抗体の重鎖（ＨＣとする）、２）（Ｇ）ｎがＮ末端に導入された抗ＰＤ－Ｌ１抗体の重鎖を含むＮ末端修飾重鎖（ＨＣＮＴとする）、又は３）（Ｇ）ｎ－Ｓｐ２がＮ末端に導入された抗ＰＤ－Ｌ１抗体の重鎖を含むＮ末端修飾重鎖（ＨＣＮＴＬとする）であり得る。抗体部分の軽鎖及び重鎖を組み合わせることで、８タイプの抗体部分を得ることができ、式（Ｉ）及び（Ｉ’）中のｍは１、２、３及び４であってもよい。
【0103】
特定の実施形態において、抗体部分はＡｂ００３０であり、抗体Ａｂ０００１に由来する。Ａｂ００３０は配列番号１の軽鎖及び配列番号１４の重鎖を含み、ここで重鎖は、Ｎ末端からＣ末端へ、アクセプター基質認識配列ＧＧＧ、スペーサーＧＳＧＧＧＧＳ、及びＡｂ０００１の重鎖（配列番号２）を含む。
【0104】
別の特定の実施形態において、抗体部分はＡｂ００３３であり、抗体Ａｂ０００２に由来する。Ａｂ００３３は、配列番号３の軽鎖及び配列番号１５の重鎖を含み、ここで重鎖は、Ｎ末端からＣ末端へ、アクセプター基質認識配列ＧＧＧ、スペーサーＧＳＧＧＧＧＳ、及びＡｂ０００２の重鎖（配列番号４）を含む。
【0105】
サイトカイン部分
サイトカイン部分は、それぞれ、上記に記載のＩＬ２１をドナー基質認識配列又はアクセプター基質認識配列で修飾することによって生成され得る。
サイトカイン部分は、それぞれ、上記に記載のＩＬ２１をドナー基質認識配列又はアクセプター基質認識配列で修飾することによって生成され得る。
【0106】
いくつかの実施形態において、抗体部分は、抗ＰＤ－Ｌ１抗体及びアクセプター基質認識配列、例えば（Ｇ）ｎを含み、サイトカイン部分はＩＬ２１及びドナー基質認識配列、例えばＸ１Ｘ２Ｘ３ＴＸ４Ｘ５を含む。いくつかの実施形態において、ドナー基質認識配列はサイトカイン部分のＣ末端に位置する。いくつかの実施形態において、ドナー基質認識配列はサイトカイン部分のＮ末端に位置する。いくつかの実施形態において、ドナー基質認識配列はサイトカイン部分の非末端位置に位置する。
【0107】
いくつかの実施形態において、抗体部分は、抗ＰＤ－Ｌ１抗体及びドナー基質認識配列、例えばＸ１Ｘ２Ｘ３ＴＸ４Ｘ５を含み、サイトカイン部分はＩＬ２１及びアクセプター基質認識配列、例えば（Ｇ）ｎを含む。いくつかの実施形態において、アクセプター基質認識配列はサイトカイン部分のＮ末端に位置する。いくつかの実施形態において、アクセプター基質認識配列はサイトカイン部分のＣ末端に位置する。いくつかの実施形態において、アクセプター基質認識配列はサイトカイン部分の非末端位置に位置する。
【0108】
抗体部分及びサイトカイン部分は、化学合成、組換えＤＮＡ技術及びそれらの組み合わせに限定されない当分野で既知の様々な方法によって得ることができる。好ましい実施形態において、抗体部分の軽鎖及び重鎖をコードするポリヌクレオチドは、組換えＤＮＡ技術によって生成され、好適な宿主細胞に導入され、その後、抗体部分を宿主細胞内で発現し、宿主細胞又は培養培地から精製することができる。宿主細胞は、安定的に又は一時的に形質転換されてもよい。抗体部分及びサイトカイン部分の単離及び精製は、当分野で周知の技法を使用して行うことができる。例えば、抗体部分はタンパク質Ａ親和性カラムで精製することができる。
【0109】
例示的な融合タンパク質
１つの実施形態において、サイトカイン部分は、Ｃ末端でスペーサーＧＡ及びドナー基質認識配列ＬＰＥＴＧＧ（配列番号６）によりＩＬ２１（配列番号９又は配列番号１０）を修飾することで得られ、サイトカイン部分は配列番号１１又は配列番号１２のアミノ酸配列を含む。
１つの実施形態において、サイトカイン部分は、Ｃ末端でスペーサーＧＡ及びドナー基質認識配列ＬＰＥＴＧＧ（配列番号６）によりＩＬ２１（配列番号９又は配列番号１０）を修飾することで得られ、サイトカイン部分は配列番号１１又は配列番号１２のアミノ酸配列を含む。
【0110】
１つの実施形態において、抗体部分はＡｂ００３０であり、配列番号１の軽鎖及び配列番号１４の重鎖を含む。Ａｂ００３０は、Ｎ末端でアクセプター基質認識配列ＧＧＧ及びスペーサーＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号５）によりＡｂ０００１の重鎖（配列番号２）を修飾することで、抗ＰＤ－Ｌ１抗体Ａｂ０００１（アテゾリズマブ）から得られる。別の特定の実施形態において、抗体部分はＡｂ００３３であり、配列番号３の軽鎖及び配列番号１５の重鎖を含む。Ａｂ００３３は、Ｎ末端でアクセプター基質認識配列ＧＧＧ及びスペーサーＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号５）によりＡｂ０００２の重鎖（配列番号４）を修飾することで、抗体Ａｂ０００２（３Ｆ２）から得られる。
【0111】
本開示のいくつかの実施形態によれば、サイトカインＩＬ２１及び抗ＰＤ－Ｌ１抗体の配列、及びそれらから得られたサイトカイン部分及び抗体部分の配列は下記表に記載する。
【0112】
【表1】
【0113】
本開示に係る例示的な融合タンパク質は表２に記載する。
【0114】
医薬組成物
本開示に係る融合タンパク質及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物も提供する。
本開示に係る融合タンパク質及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物も提供する。
【0115】
薬学的に許容される担体の例としては、希釈剤（例えば、ラクトース、微結晶セルロース及びデキストロース）、結合剤及び接着剤（例えば、アカシア、ゼラチン、デンプン糊、カルボキシメチルセルロース）、滑沢剤（例えば、ポリエチレングリコール、ステアリン酸カルシウム及びステアリン酸）、崩壊剤（例えば、デンプン、セルロース及び架橋剤ポリマー）、防腐剤、ビヒクル、流動促進剤（例えば、コーンスターチ）、甘味剤（例えば、マンニトール及びサッカリン）、コーティング材（例えば、ポビドン、エチルセルロース及び合成ポリマー）、及び可塑剤（例えば、ヒマシ油、ジアセチル化モノグリセリド、及びポリエチレングリコール）、構造形成賦形剤（例えば、セトステアリルアルコール及び鉱油）、防腐剤（例えば、ベンジルアルコール、プロピルパラベン及び安息香酸ナトリウム）、抗酸化剤（例えば、ブチルヒドロキシルトルエン及びブチルヒドロキシルアニソール）、可溶化剤（例えば、ラノリン及びコレステロール）、ゲル化剤（例えば、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース及びキサンタンガム）、及び皮膚軟化剤（例えば、グリセリン、鉱油、ワセリン及びイソプロピルパルミテート）、溶媒（例えば、水、アルコール、酢酸及びシロップ）、緩衝液（例えば、リン酸緩衝液及び酢酸緩衝液）、抗菌防腐剤（例えば、ベンジルアルコール、ブチルパラベン、フェノール及びチオメルサール）、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸、硫酸水素ナトリウム、チオ尿素及びブチルヒドロキシトルエン）、キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ二ナトリウム、ジヒドロキシエチルグリシン及びクエン酸）、及び乳化剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム、セトリミド及びクロゴールエステル）を含むが、それらに限定されない。
【0116】
本明細書で提供される医薬組成物は、様々な剤形、例えば、固体、半固体、液体、粉末、水性、又は凍結乾燥形態としてもよい。
【0117】
本明細書で提供される医薬組成物は、当分野で既知の任意の方法よって、例えば、全身投与又は局所投与によって、対象に投与することができる。投与経路としては、非経口（例えば、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、又は体腔内）、局所、硬膜外、又は経粘膜（例えば、鼻腔内又は経口）経路を含むが、それらに限定されない。投与される正確な用量は、様々な要因、例えば治療目的、投与経路、及び対象の状況、例えば、患者の健康状態、体重、性別、食事等によって異なる。したがって、最適な治療効果を得るために、治療者は、医薬組成物の用量を決定し、必要に応じて投与経路を修正する必要がある。一般に、本明細書で提供される医薬組成物の投与の用量範囲は、ＰＤ－Ｌ１陽性疾患細胞が除去される所望の効果を生み出すのに十分に大きな量である。
【0118】
好ましい実施形態において、本開示の医薬組成物は、治療有効量でヒト対象に投与することができる。抗体の治療用量は、例えば、好ましくは１回の治療用量当たり０．１～２５ｍｇ／ｋｇ体重であり、最も好ましくは１回の治療用量当たり０．１～１０ｍｇ／ｋｇ体重である。特定の実施形態において、本開示の任意の融合タンパク質は、任意の好適な経路による投与のための従来例に従って製剤化することができ、一般に、例えば、静脈内、腹腔内、皮下、又は筋肉内経路による投与のための液体形態（例えば、生理学的に許容される滅菌緩衝液中の融合タンパク質の溶液）としてもよい。
【0119】
治療
更に、それを必要とする対象の疾患を治療するための方法であって、対象に治療有効量の本開示に係る融合タンパク質又は医薬組成物を投与することを含む、前記方法を提供する。
更に、それを必要とする対象の疾患を治療するための方法であって、対象に治療有効量の本開示に係る融合タンパク質又は医薬組成物を投与することを含む、前記方法を提供する。
【0120】
本開示は、それを必要とする対象の疾患を治療するために使用される、本開示に係る融合タンパク質又は医薬組成物にも関する。
【0121】
本開示は、それを必要とする対象の疾患を治療するための医薬品の製造のための、本開示に係る融合タンパク質又は医薬組成物の使用にも関する。
【0122】
いくつかの実施形態において、前記対象は、哺乳動物、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、チンパンジー、類人猿、ウシ及びヒトである。いくつかの好ましい実施形態において、前記対象は、ヒトである。
【0123】
いくつかの実施形態において、前記疾患は、癌である。好ましくは、前記癌は、ＰＤ－Ｌ１陽性癌である。いくつかの実施形態において、前記癌は、黒色腫、卵巣癌、乳癌、メルケル細胞癌、肺癌（小細胞肺癌及び非小細胞肺癌（扁平上皮癌及び非扁平上皮非小細胞肺癌等）を含む）、腎細胞癌、膀胱癌、結腸癌、結腸腺癌、結腸直腸癌、頭頸部扁平上皮癌、中皮腫、ウイルス誘発性癌、子宮頸癌、鼻咽頭癌、軟部肉腫、血液悪性腫瘍、胃癌、胃癌又は胃食道接合部（ＧＥＪ）腺癌、食道癌、食道の扁平上皮癌、子宮内膜癌、原発性縦隔Ｂ細胞リンパ腫（ＰＭＢＣＬ）、尿路上皮癌、マイクロサテライト不安定性高（ＭＳＩ－Ｈ）又はミスマッチ修復欠損（ｄＭＭＲ）の固形腫瘍、肝細胞癌、リンパ腫、ホジキン病（ホジキンリンパ腫）、非ホジキン病（非ホジキンリンパ腫）、及びびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫から選択される。いくつかの実施形態において、癌は、結腸直腸癌、黒色腫、腎細胞癌腫（ＲＣＣ）、有棘細胞癌（ｃＳＣＣ）、三種陰性乳癌（ＴＮＢＣ）、非小細胞肺癌及び膀胱癌から選択される悪性癌である。いくつかの好ましい実施形態において、癌は胃癌、乳癌、結腸癌、結腸腺癌、尿路上皮癌、肺癌、肝癌、子宮内膜癌、頭頸部癌及び卵巣癌から選択される。
【0124】
特定の実施形態を参照しながら本開示を説明したが、これらの実施形態は本開示の用途及び原理を単に例示するものに過ぎないことが理解される。本開示の精神及び範囲から逸脱することなく修正が可能である。
【0125】
有益な効果
本開示に係る融合タンパク質は、
（１）ＰＤ－Ｌ１シグナル伝達の特異的阻害及びＩＬ２１シグナル伝達の活性化と、
（２）ＣＤ４＋ Ｔ細胞の効果的な活性化と、
（３）より高い抗腫瘍活性及びより低い毒性と、の技術効果の少なくとも１つを達成する。
本開示に係る融合タンパク質は、
（１）ＰＤ－Ｌ１シグナル伝達の特異的阻害及びＩＬ２１シグナル伝達の活性化と、
（２）ＣＤ４＋ Ｔ細胞の効果的な活性化と、
（３）より高い抗腫瘍活性及びより低い毒性と、の技術効果の少なくとも１つを達成する。
【0126】
更に、従来の組換えＤＮＡ技術は抗体－サイトカイン融合タンパク質（免疫サイトカイン）の生成に使用される場合が多い。しかし、従来の方法を使用して調製された組換え免疫サイトカインの収率は、裸の抗体（サイトカインにコンジュゲートされていない）と比較して極めて低い可能性があり、多数の免疫サイトカインの臨床応用を妨げている。本開示に係る酵素媒介コンジュゲーション方法を使用すると、融合タンパク質を非常に高い収率及び純度で調製することができる。
【0127】
実施例
別段記載がない限り、修飾又は未修飾抗ＰＤ－Ｌ１抗体及びＩＬ２１の調製には、一般に使用される分子生物学、生化学、及び細胞生物学の技法が利用される。別段記載がない限り、実施例で使用される計器及び試薬は市場から入手できる。試薬は更なる精製なく直接使用できる。
別段記載がない限り、修飾又は未修飾抗ＰＤ－Ｌ１抗体及びＩＬ２１の調製には、一般に使用される分子生物学、生化学、及び細胞生物学の技法が利用される。別段記載がない限り、実施例で使用される計器及び試薬は市場から入手できる。試薬は更なる精製なく直接使用できる。
【0128】
フローサイトメトリ：ＣｙｔｏＦＬＥＸ Ｓ
ＨＩＣ－ＨＰＬＣ：ブチルＨＩＣ。移動相Ａ：２５ｍＭのＰＢ、２Ｍの（ＮＨ４）２ＳＯ４、ｐＨ７．０。移動相Ｂ：２５ｍＭのＰＢ、ｐＨ７．０。流量：０．８ｍＬ／ｍｉｎ。取得時間：２５ｍｉｎ。注入量：２０μｇ。カラム温度：２５℃。検出波長：２８０ｎｍ。サンプルインジェクター温度：８℃。
ＳＥＣ－ＨＰＬＣ：カラム：ＴＳＫ－ｇｅｌ Ｇ３０００ ＳＷＸＬ、ＴＯＳＯＨ ７．８ｍｍ ＩＤ×３００ｍｍ、５μｍ。移動相：０．２ＭのＫＨ２ＰＯ４、０．２５ＭのＫＣｌ、ｐＨ６．２。流量：０．５ｍＬ／ｍｉｎ。取得時間：３０ｍｉｎ。注入量：５０μＬ。カラム温度：２５℃。検出波長：２８０ｎｍ。サンプルトレイ温度：８℃。
ＣＨＯはＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから入手され、ｐｃＤＮＡ３．３はＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから入手され、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ Ｓｕｒｅ ＰｒｏＡはＧＥから入手された。
黄色ブドウ球菌に由来する最適化組換え酵素ソルターゼＡは大腸菌中で調製された。
ＨＩＣ－ＨＰＬＣ：ブチルＨＩＣ。移動相Ａ：２５ｍＭのＰＢ、２Ｍの（ＮＨ４）２ＳＯ４、ｐＨ７．０。移動相Ｂ：２５ｍＭのＰＢ、ｐＨ７．０。流量：０．８ｍＬ／ｍｉｎ。取得時間：２５ｍｉｎ。注入量：２０μｇ。カラム温度：２５℃。検出波長：２８０ｎｍ。サンプルインジェクター温度：８℃。
ＳＥＣ－ＨＰＬＣ：カラム：ＴＳＫ－ｇｅｌ Ｇ３０００ ＳＷＸＬ、ＴＯＳＯＨ ７．８ｍｍ ＩＤ×３００ｍｍ、５μｍ。移動相：０．２ＭのＫＨ２ＰＯ４、０．２５ＭのＫＣｌ、ｐＨ６．２。流量：０．５ｍＬ／ｍｉｎ。取得時間：３０ｍｉｎ。注入量：５０μＬ。カラム温度：２５℃。検出波長：２８０ｎｍ。サンプルトレイ温度：８℃。
ＣＨＯはＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから入手され、ｐｃＤＮＡ３．３はＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから入手され、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ Ｓｕｒｅ ＰｒｏＡはＧＥから入手された。
黄色ブドウ球菌に由来する最適化組換え酵素ソルターゼＡは大腸菌中で調製された。
【0129】
実施例１ 抗体部分の構築と発現
１．１ Ａｂ００３０及びＡｂ００３３の発現プラスミドの構築
２つの抗体部分Ａｂ００３０及びＡｂ００３３をそれぞれ抗ＰＤ－Ｌ１抗体Ａｂ０００１（アテゾリズマブ）及びＡｂ０００２（３Ｆ２）に基づいて調製した。Ａｂ０００１及びＡｂ０００２のアミノ酸配列（配列番号）は表１Ａに示す。
１．１ Ａｂ００３０及びＡｂ００３３の発現プラスミドの構築
２つの抗体部分Ａｂ００３０及びＡｂ００３３をそれぞれ抗ＰＤ－Ｌ１抗体Ａｂ０００１（アテゾリズマブ）及びＡｂ０００２（３Ｆ２）に基づいて調製した。Ａｂ０００１及びＡｂ０００２のアミノ酸配列（配列番号）は表１Ａに示す。
【0130】
【表1A】
【0131】
具体的には、Ａｂ０００１（配列番号２）の重鎖及びＡｂ０００２（配列番号４）の重鎖のＮ末端を、ペプチド配列ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号５、即ち、スペーサーを有するアクセプター基質認識配列）の付加によって修飾した。
【0132】
抗体部分の発現及び細胞外分泌を促進するために、軽鎖シグナルペプチド（配列番号１６）及び重鎖シグナルペプチド（配列番号１７）のコード配列をそれぞれ軽鎖及び重鎖のコード配列のＮ末端に付加した。
【0133】
Ａｂ００３０及びＡｂ００３３のコード配列を、ＣＨＯ細胞内での効率的な発現のためにコドン最適化し、各抗体部分のプラスミド対を得るためにｐｃＤＮＡ３．３ベクターにクローニングした。
【0134】
１．２ Ａｂ００３０及びＡｂ００３３の発現
実施例１．１で得られたＡｂ００３０及びＡｂ００３３の発現プラスミドを質量比２：１でＣＨＯ細胞に一時的にトランスフェクトした。発酵後、抗体を含有する細胞培養上清を収集した。ＥＬＩＳＡアッセイによって測定されたＡｂ００３０及びＡｂ００３３の発現レベルはそれぞれ７５７．６０ｍｇ／Ｌ及び６２２．９６ｍｇ／Ｌであった。
実施例１．１で得られたＡｂ００３０及びＡｂ００３３の発現プラスミドを質量比２：１でＣＨＯ細胞に一時的にトランスフェクトした。発酵後、抗体を含有する細胞培養上清を収集した。ＥＬＩＳＡアッセイによって測定されたＡｂ００３０及びＡｂ００３３の発現レベルはそれぞれ７５７．６０ｍｇ／Ｌ及び６２２．９６ｍｇ／Ｌであった。
【0135】
１．３ Ａｂ００３０及びＡｂ００３３の精製
タンパク質Ａカラム（ＭａｂＳｅｌｅｃｔ Ｓｕｒｅ ＰｒｏＡ、２０ｃｍ ｘ ５．０ｃｍ）を平衡緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４）で洗浄した。実施例１．２からの細胞培養上清を０．２２μｍフィルタで濾過し、カラムにロードした。サンプルのロードが完了すると、カラムを５～１０カラム容量の平衡緩衝液で洗浄した。抗体をｐＨ３．５の５０ｍＭのクエン酸緩衝液中で溶出させ、収集した。抗体溶液のｐＨを６％（ｖ／ｖ）のｐＨ１０．５の１ＭのＴｒｉｓを添加することで５．５～６．５に調整した。最後に、抗体溶液の緩衝液を限外濾過によって平衡緩衝液に交換した。ＵＶ分光計を使用してＡｂ００３０及びＡｂ００３３の濃度を測定した。Ａｂ００３０及びＡｂ００３３を小分けして－８０℃で保存した。精製抗体部分Ａｂ００３０は配列番号１の軽鎖及び配列番号１４の重鎖を含む。精製抗体部分Ａｂ００３０は配列番号３の軽鎖及び配列番号１５の重鎖を含む（表１Ｂを参照）。
タンパク質Ａカラム（ＭａｂＳｅｌｅｃｔ Ｓｕｒｅ ＰｒｏＡ、２０ｃｍ ｘ ５．０ｃｍ）を平衡緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４）で洗浄した。実施例１．２からの細胞培養上清を０．２２μｍフィルタで濾過し、カラムにロードした。サンプルのロードが完了すると、カラムを５～１０カラム容量の平衡緩衝液で洗浄した。抗体をｐＨ３．５の５０ｍＭのクエン酸緩衝液中で溶出させ、収集した。抗体溶液のｐＨを６％（ｖ／ｖ）のｐＨ１０．５の１ＭのＴｒｉｓを添加することで５．５～６．５に調整した。最後に、抗体溶液の緩衝液を限外濾過によって平衡緩衝液に交換した。ＵＶ分光計を使用してＡｂ００３０及びＡｂ００３３の濃度を測定した。Ａｂ００３０及びＡｂ００３３を小分けして－８０℃で保存した。精製抗体部分Ａｂ００３０は配列番号１の軽鎖及び配列番号１４の重鎖を含む。精製抗体部分Ａｂ００３０は配列番号３の軽鎖及び配列番号１５の重鎖を含む（表１Ｂを参照）。
【0136】
【表1B】
【0137】
１．４ Ａｂ００３０及びＡｂ００３３の特徴付け
Ａｂ００３０及びＡｂ００３３をＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動で分析した。予想通り、ＳＤＳ－ＰＡＧＥで測定された重鎖及び軽鎖の分子量はそれぞれ約５０ｋＤａ及び約２５ｋＤａである。ＳＥＣ－ＨＰＬＣ分析は、Ａｂ００３０及びＡｂ００３３モノマーの百分率がそれぞれ約９７．５％及び９６．２％であり、融合タンパク質の調製要件を満たすことを実証する。
Ａｂ００３０及びＡｂ００３３をＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動で分析した。予想通り、ＳＤＳ－ＰＡＧＥで測定された重鎖及び軽鎖の分子量はそれぞれ約５０ｋＤａ及び約２５ｋＤａである。ＳＥＣ－ＨＰＬＣ分析は、Ａｂ００３０及びＡｂ００３３モノマーの百分率がそれぞれ約９７．５％及び９６．２％であり、融合タンパク質の調製要件を満たすことを実証する。
【0138】
Ａｂ００３０及びＡｂ００３３のＰＤ－Ｌ１結合活性を酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）で測定した。組換えｈＰＤ－Ｌ１をコーティング緩衝液（１ｘ ＰＢＳ）中で０．５μｇ／ｍＬに希釈し、ＥＬＩＳＡプレートに４℃で一晩コーティングした。プレートをコーティング緩衝液中の５％脱脂粉乳で３７℃にて１ｈブロックした。段階希釈したＡｂ００３０及びＡｂ００３３をプレートに添加し、その後プレートを３７℃にて１ｈインキュベートした。最後に、１：５０００に希釈した抗ヒト－ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）－ＨＲＰを添加した。３７℃にて１ｈインキュベートした後、発色のためにＴＭＢ基質を添加した。マイクロプレートリーダーを使用してデータを収集した。
【0139】
【0140】
実施例２ サイトカイン部分の構築と発現
オーバーラップＰＣＲを使用することで、ペプチド配列ＧＡＬＰＥＴＧＧ（配列番号６、ソルターゼのドナー基質認識配列Ａ（ＬＰＥＴＧＧ）及びスペーサーＧＡを含む）をコードするポリヌクレオチドを、ｈＩＬ２１（アミノ酸配列が配列番号９又は配列番号１０に示される）をコードするポリヌクレオチドの３’に付加して、サイトカイン部分（アミノ酸配列がそれぞれ配列番号１１又は配列番号１２に示される）をコードするポリヌクレオチドを生成した。サイトカイン部分の発現及び細胞外分泌を促進するために、シグナルペプチドのコード配列（配列番号１３）を、配列番号１１又は配列番号１２をコードするポリヌクレオチドの５’に付加した。精製サイトカイン部分は、配列番号１１又は配列番号１２のアミノ酸配列を有する。
オーバーラップＰＣＲを使用することで、ペプチド配列ＧＡＬＰＥＴＧＧ（配列番号６、ソルターゼのドナー基質認識配列Ａ（ＬＰＥＴＧＧ）及びスペーサーＧＡを含む）をコードするポリヌクレオチドを、ｈＩＬ２１（アミノ酸配列が配列番号９又は配列番号１０に示される）をコードするポリヌクレオチドの３’に付加して、サイトカイン部分（アミノ酸配列がそれぞれ配列番号１１又は配列番号１２に示される）をコードするポリヌクレオチドを生成した。サイトカイン部分の発現及び細胞外分泌を促進するために、シグナルペプチドのコード配列（配列番号１３）を、配列番号１１又は配列番号１２をコードするポリヌクレオチドの５’に付加した。精製サイトカイン部分は、配列番号１１又は配列番号１２のアミノ酸配列を有する。
【0141】
ｈＩＬ２１を大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）内で発現させた。発現後、組換えｈＩＬ２１をＮｉ－ＮＴＡカラムで精製した。精製されたｈＩＬ２１を１ｘ ＰＢＳ緩衝液で保存した。
【0142】
実施例３ 融合タンパク質の調製
実施例１で調製された抗体部分Ａｂ００３０及びＡｂ００３３を、ソルターゼ媒介部位特異的コンジュゲーションによって、実施例２で調製されたサイトカイン部分とコンジュゲートすることで、融合タンパク質を得た。
実施例１で調製された抗体部分Ａｂ００３０及びＡｂ００３３を、ソルターゼ媒介部位特異的コンジュゲーションによって、実施例２で調製されたサイトカイン部分とコンジュゲートすることで、融合タンパク質を得た。
【0143】
ステップ１）前処理
好適な孔径を有する限外濾過膜を使用してＡｂ００３０及びＡｂ００３３並びにサイトカイン部分を前処理し、次に濃縮し、コンジュゲーション緩衝液に緩衝液交換した。
好適な孔径を有する限外濾過膜を使用してＡｂ００３０及びＡｂ００３３並びにサイトカイン部分を前処理し、次に濃縮し、コンジュゲーション緩衝液に緩衝液交換した。
【0144】
ステップ２）酵素媒介コンジュゲーション
Ａｂ００３０及びＡｂ００３３（１～１００ｍｇ／ｍＬ）並びにサイトカイン部分（配列番号１１、１～１００ｍｇ／ｍＬ）を別々に反応緩衝液中で調製した。黄色ブドウ球菌に由来する固定化組換えＳｒｔＡを含有するコンジュゲーションカラムを、ＮａＯＨ及び高塩で前処理し、空気浴又は水浴中で３０ｍｉｎ以上にわたって１０～４０℃に前加温した。抗体部分及びサイトカイン部分を含有する反応溶液を一定の比率で混合し、コンジュゲーションカラムに緩徐に通してコンジュゲーション反応を行った。あるいは、反応溶液を固定化組換えＳｒｔＡ又は精製組換えＳｒｔＡと５ｍｉｎ～２４ｈ混合してコンジュゲーション反応を行ってもよい。
Ａｂ００３０及びＡｂ００３３（１～１００ｍｇ／ｍＬ）並びにサイトカイン部分（配列番号１１、１～１００ｍｇ／ｍＬ）を別々に反応緩衝液中で調製した。黄色ブドウ球菌に由来する固定化組換えＳｒｔＡを含有するコンジュゲーションカラムを、ＮａＯＨ及び高塩で前処理し、空気浴又は水浴中で３０ｍｉｎ以上にわたって１０～４０℃に前加温した。抗体部分及びサイトカイン部分を含有する反応溶液を一定の比率で混合し、コンジュゲーションカラムに緩徐に通してコンジュゲーション反応を行った。あるいは、反応溶液を固定化組換えＳｒｔＡ又は精製組換えＳｒｔＡと５ｍｉｎ～２４ｈ混合してコンジュゲーション反応を行ってもよい。
【0145】
更なる精製及びＤＡＲ（ＤＡＲ＝抗ＰＤ－Ｌ１抗体にコンジュゲートされたｈＩＬ２１の平均数）測定のために、融合タンパク質を含有する抗体－サイトカインコンジュゲーション混合物を収集した。
【0146】
ステップ３）融合タンパク質の精製
融合タンパク質を陽イオン交換クロマトグラフィーによって精製した。要するに、クロマトグラフィーカラムにＣａｐｔｏ Ｓ ＩｍｐＡｃｔ培地を充填し、ｐＨ５．０～６．０のクエン酸－クエン酸ナトリウム緩衝液で平衡化した。ステップ２）からのコンジュゲーション混合物をカラムにロードした。所望のオフセット（ベースライン）に達するまで、カラムをｐＨ５．０～６．０のクエン酸－クエン酸ナトリウム緩衝液で洗い流した。コンジュゲートされていない抗体部分及びサイトカイン部分を、ｐＨ５．０～６．０のクエン酸－クエン酸ナトリウム緩衝液、１００～５００ｍＭのＮａＣｌで溶出させた。クエン酸－クエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０～６．０）中のＮａＣｌ濃度を０．５Ｍから１Ｍに増加させることで融合タンパク質を溶出させた。意外なことに、このステップで、２つの異なる融合タンパク質集団を表す２つの画分が溶出した。その後、２つの画分をＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析に供した。第１画分は、ＤＡＲ値が１である主要な集団（ＤＡＲ１集団と呼ばれ、各融合タンパク質が１つのｈＩＬ２１を含有する）を表し、第２画分は、ＤＡＲ値が２である少数集団（ＤＡＲ２集団と呼ばれ、各融合タンパク質が２つのｈＩＬ２１を含有する）を表すことが確認された。ｈＩＬ２１（アイソフォーム１）を１つのみ含有する融合タンパク質はそれぞれ、ＬＣ００３０－１（Ａｂ００３０から調製）及びＬＣ００３３－１（Ａｂ００３３から調製）と命名される。ｈＩＬ２１（アイソフォーム１）を２つ含有する融合タンパク質はそれぞれ、Ａｂ００３０から調製されたＬＣ００３０－２及びＡｂ００３３から調製されたＬＣ００３３－２と命名される。図３は、それぞれ、ＬＣ００３０－１及びＬＣ００３０－２を含有する２つの画分のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を示す。図４はＬＣ００３３－１を含有する画分のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を示す。
融合タンパク質を陽イオン交換クロマトグラフィーによって精製した。要するに、クロマトグラフィーカラムにＣａｐｔｏ Ｓ ＩｍｐＡｃｔ培地を充填し、ｐＨ５．０～６．０のクエン酸－クエン酸ナトリウム緩衝液で平衡化した。ステップ２）からのコンジュゲーション混合物をカラムにロードした。所望のオフセット（ベースライン）に達するまで、カラムをｐＨ５．０～６．０のクエン酸－クエン酸ナトリウム緩衝液で洗い流した。コンジュゲートされていない抗体部分及びサイトカイン部分を、ｐＨ５．０～６．０のクエン酸－クエン酸ナトリウム緩衝液、１００～５００ｍＭのＮａＣｌで溶出させた。クエン酸－クエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０～６．０）中のＮａＣｌ濃度を０．５Ｍから１Ｍに増加させることで融合タンパク質を溶出させた。意外なことに、このステップで、２つの異なる融合タンパク質集団を表す２つの画分が溶出した。その後、２つの画分をＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析に供した。第１画分は、ＤＡＲ値が１である主要な集団（ＤＡＲ１集団と呼ばれ、各融合タンパク質が１つのｈＩＬ２１を含有する）を表し、第２画分は、ＤＡＲ値が２である少数集団（ＤＡＲ２集団と呼ばれ、各融合タンパク質が２つのｈＩＬ２１を含有する）を表すことが確認された。ｈＩＬ２１（アイソフォーム１）を１つのみ含有する融合タンパク質はそれぞれ、ＬＣ００３０－１（Ａｂ００３０から調製）及びＬＣ００３３－１（Ａｂ００３３から調製）と命名される。ｈＩＬ２１（アイソフォーム１）を２つ含有する融合タンパク質はそれぞれ、Ａｂ００３０から調製されたＬＣ００３０－２及びＡｂ００３３から調製されたＬＣ００３３－２と命名される。図３は、それぞれ、ＬＣ００３０－１及びＬＣ００３０－２を含有する２つの画分のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を示す。図４はＬＣ００３３－１を含有する画分のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を示す。
【0147】
ｐＨ５．０～６．０のクエン酸－クエン酸ナトリウム緩衝液、１ＭのＮａＣｌを使用してカラムを再生し、１ＭのＮａＯＨを使用して定置洗浄（ＣＩＰ）を実施した。
【0148】
ステップ４）融合タンパク質の限外濾過
好適な孔径を有する限外濾過膜を使用して精製融合タンパク質を濃縮し、保存緩衝液に緩衝液交換し、その後２～８℃又は－８０℃で保存した。
好適な孔径を有する限外濾過膜を使用して精製融合タンパク質を濃縮し、保存緩衝液に緩衝液交換し、その後２～８℃又は－８０℃で保存した。
【0149】
ｈＩＬ２１（アイソフォーム２）（サイトカイン部分が配列番号１２のアミノ酸配列を有する）を含有する融合タンパク質を上記と同じ方法で調製した。ｈＩＬ２１（アイソフォーム２）を１つのみ含有する融合タンパク質はそれぞれ、ＬＣ００３０’－１（Ａｂ００３０から調製）及びＬＣ００３３’－１（Ａｂ００３３から調製）と命名される。ｈＩＬ２１（アイソフォーム２）を２つ含有する融合タンパク質はそれぞれ、ＬＣ００３０’－２（Ａｂ００３０から調製）及びＬＣ００３３’－２（Ａｂ００３３から調製）と命名される。
【0150】
調製された融合タンパク質は表２に記載する。
【0151】
【表2】
【0152】
実施例４ 融合タンパク質のＨＩＣ－ＨＰＬＣ分析
実施例３で調製された融合タンパク質をブチルＨＩＣ ＨＰＬＣ分析に供してＤＡＲ分布を測定した。
実施例３で調製された融合タンパク質をブチルＨＩＣ ＨＰＬＣ分析に供してＤＡＲ分布を測定した。
【0153】
結果は図５及び図６に示す。ＬＣ００３０－１のピーク位置はＡｂ００３０と比較して前方にシフトし、ＬＣ００３０－２のピーク位置はＬＣ００３０－１と比較して前方にシフトし、これは、融合タンパク質ＬＣ００３０－１及びＬＣ００３０－２の疎水性がＡｂ００３０より低いことを示す（図５）。興味深いことに、ＬＣ００３３－１のピーク位置はＡｂ００３３と比較して後方にシフトし、ＬＣ００３３－２のピーク位置はＬＣ００３３－２と比較して後方にシフトし、これは、ＬＣ００３３－１及びＬＣ００３３－２の疎水性がＡｂ００３３より強いことを示す（図６）。これらの差異は、Ａｂ００３０とＡｂ００３３の間のアミノ酸及び構造の差異によるものである可能性がある。
【0154】
実施例５ 融合タンパク質のｈＰＤ－Ｌ１への結合活性の測定
融合タンパク質のヒトＰＤ－Ｌ１（ｈＰＤ－Ｌ１）への結合活性をＥＬＩＳＡで測定した。組換えｈＰＤ－Ｌ１タンパク質（Ａｃｒｏｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＰＤ１－Ｈ５２５３）をコーティング緩衝液（１ｘ ＰＢＳ）で０．５μｇ／ｍＬに希釈し、ＥＬＩＳＡプレートに４℃で一晩コーティングした。プレートをコーティング緩衝液中の５％脱脂粉乳で３７℃にて１ｈブロックした。段階希釈したＡｂ００３０、Ａｂ００３３、ＬＣ００３０－１及びＬＣ００３３－１を添加し、その後プレートを３７℃にて１ｈインキュベートした。最後に、１：５０００に希釈した抗ヒト－ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）－ＨＲＰを添加した。３７℃で１ｈインキュベートした後、発色のためにＴＭＢ基質を添加した。マイクロプレートリーダーを使用してデータを収集した。
融合タンパク質のヒトＰＤ－Ｌ１（ｈＰＤ－Ｌ１）への結合活性をＥＬＩＳＡで測定した。組換えｈＰＤ－Ｌ１タンパク質（Ａｃｒｏｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＰＤ１－Ｈ５２５３）をコーティング緩衝液（１ｘ ＰＢＳ）で０．５μｇ／ｍＬに希釈し、ＥＬＩＳＡプレートに４℃で一晩コーティングした。プレートをコーティング緩衝液中の５％脱脂粉乳で３７℃にて１ｈブロックした。段階希釈したＡｂ００３０、Ａｂ００３３、ＬＣ００３０－１及びＬＣ００３３－１を添加し、その後プレートを３７℃にて１ｈインキュベートした。最後に、１：５０００に希釈した抗ヒト－ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）－ＨＲＰを添加した。３７℃で１ｈインキュベートした後、発色のためにＴＭＢ基質を添加した。マイクロプレートリーダーを使用してデータを収集した。
【0155】
結果は図７に示す。ＬＣ００３０－１及びＬＣ００３３－１の両方とも、Ａｂ００３０及びＡｂ００３３と同様の親和性で抗原ＰＤ－Ｌ１に特異的に結合することができ、これは、融合タンパク質中の抗ＰＤ－Ｌ１抗体のＰＤ－Ｌ１－結合活性が保持されることを示す。
【0156】
実施例６ 融合タンパク質のＩＬ２１受容体（ＩＬ２１Ｒ）への結合活性の測定
融合タンパク質のヒトＩＬ２１受容体（ｈＩＬ２１Ｒ又はＨｕ－ＩＬ２１Ｒ）への結合活性をＥＬＩＳＡで測定した。組換えｈＩＬ２１Ｒタンパク質をコーティング緩衝液（１ｘ ＰＢＳ）で０．５μｇ／ｍＬに希釈し、ＥＬＩＳＡプレートに４℃で一晩コーティングした。プレートをコーティング緩衝液中の５％脱脂粉乳で３７℃にて１ｈブロックした。段階希釈したＡｂ００３０、Ａｂ００３３、ＬＣ００３０－１及びＬＣ００３３－１をプレートに添加し、その後プレートを３７℃にて１ｈインキュベートした。最後に、１：５０００に希釈した抗ヒト－ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）－ＨＲＰを添加した。３７℃で１ｈインキュベートした後、発色のためにＴＭＢ基質を添加した。マイクロプレートリーダーを使用してデータを収集した。
融合タンパク質のヒトＩＬ２１受容体（ｈＩＬ２１Ｒ又はＨｕ－ＩＬ２１Ｒ）への結合活性をＥＬＩＳＡで測定した。組換えｈＩＬ２１Ｒタンパク質をコーティング緩衝液（１ｘ ＰＢＳ）で０．５μｇ／ｍＬに希釈し、ＥＬＩＳＡプレートに４℃で一晩コーティングした。プレートをコーティング緩衝液中の５％脱脂粉乳で３７℃にて１ｈブロックした。段階希釈したＡｂ００３０、Ａｂ００３３、ＬＣ００３０－１及びＬＣ００３３－１をプレートに添加し、その後プレートを３７℃にて１ｈインキュベートした。最後に、１：５０００に希釈した抗ヒト－ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）－ＨＲＰを添加した。３７℃で１ｈインキュベートした後、発色のためにＴＭＢ基質を添加した。マイクロプレートリーダーを使用してデータを収集した。
【0157】
結果は図８に示す。ＬＣ００３０－１及びＬＣ００３３－１はｈＩＬ２１Ｒに特異的に結合することができるが、Ａｂ００３０及びＡｂ００３３はｈＩＬ２１Ｒに結合しない。抗ヒト－ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）－ＨＲＰが抗体のヒトＦｃ部分に結合するため、結果は、抗ＰＤ－Ｌ１抗体のｈＩＬ２１へのコンジュゲーションが成功し、融合タンパク質とｈＩＬ２１Ｒが特異的に結合することを示唆する。
【0158】
実施例７ 融合タンパク質のｈＰＤ－Ｌ１及びｈＩＬ２１Ｒへの結合親和性の測定
Ｂｉａｃｏｒｅ（Ｂｉａｃｏｒｅ、ＩＮＣ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ Ｎ．Ｊ．）を使用して表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を行ってＬＣ００３３－１及びＡｂ００３３のｈＰＤ－Ｌ１又はｈＩＬ２１Ｒへの結合親和性を測定した。Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００バイオセンサーにセンサーチッププロテインＡを装備した。所望のタンパク質密度（約３００ＲＵ）に達するために、試験すべきタンパク質（１μｇ／ｍＬに希釈）を１０μＬ／ｍｉｎでＢｉａｃｏｒｅ Ｔ２００バイオセンサーに５０ｓｅｃ注入した。続いて、Ｈｉｓタグ付きヒトＩＬ２１Ｒ（ｈＩＬ２１Ｒ－Ｈｉｓ、２００ｎＭ）又はヒトＰＤ－Ｌ１（ｈＰＤ－Ｌ１－Ｈｉｓ、１００ｎＭ）を３０μＬ／ｍｉｎでシステムに１８０ｓｅｃ注入した。解離を６００ｓｅｃ監視した。各サイクル後、ｐＨ１．７のグリシン緩衝液（３０μＬ／ｍｉｎ、３０ｓｅｃ）を使用してチップを再生した。
Ｂｉａｃｏｒｅ（Ｂｉａｃｏｒｅ、ＩＮＣ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ Ｎ．Ｊ．）を使用して表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を行ってＬＣ００３３－１及びＡｂ００３３のｈＰＤ－Ｌ１又はｈＩＬ２１Ｒへの結合親和性を測定した。Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００バイオセンサーにセンサーチッププロテインＡを装備した。所望のタンパク質密度（約３００ＲＵ）に達するために、試験すべきタンパク質（１μｇ／ｍＬに希釈）を１０μＬ／ｍｉｎでＢｉａｃｏｒｅ Ｔ２００バイオセンサーに５０ｓｅｃ注入した。続いて、Ｈｉｓタグ付きヒトＩＬ２１Ｒ（ｈＩＬ２１Ｒ－Ｈｉｓ、２００ｎＭ）又はヒトＰＤ－Ｌ１（ｈＰＤ－Ｌ１－Ｈｉｓ、１００ｎＭ）を３０μＬ／ｍｉｎでシステムに１８０ｓｅｃ注入した。解離を６００ｓｅｃ監視した。各サイクル後、ｐＨ１．７のグリシン緩衝液（３０μＬ／ｍｉｎ、３０ｓｅｃ）を使用してチップを再生した。
【0159】
データをＢｉａｃｏｒｅ Ｔ２００評価ソフトウェア３．０で処理した。データを１：１ラングミュア結合モデルに全体的にフィッティングすることによって結合動態を分析して会合速度（ｋｏｎ）及び解離速度（ｋｏｆｆ）を得る。親和性（ＫＤ）を式：ＫＤ＝ｋｏｆｆ／ｋｏｎで算出した。
【0160】
結果は表３に示す。ＬＣ００３３－１及びＡｂ００３３は、同様の親和性でｈＰＤ－Ｌ１－Ｈｉｓに結合することができる。ＬＣ００３３－１は高い親和性でＩＬ２１Ｒに結合することができる。
【0161】
【表3】
【0162】
実施例８ 融合タンパク質のＣＤ４＋ Ｔ細胞を活性化する能力の測定
ＳＴＡＴ３リン酸化（ｐＳＴＡＴ３）アッセイを使用してＬＣ００３３－１のインビトロＰＢＭＣ細胞刺激活性を測定した。ＳＴＡＴ３リン酸化はＣＤ４＋ Ｔ細胞刺激の指標である。市販のＰＢＭＣ細胞（ＡｌｌＣｅｌｌｓ、カタログ番号ＦＰＢ００３Ｆ－Ｃ）を３７℃で解凍して回復させ、次に前加温した培養バチ（ＲＰＭＩ１６４０）に懸濁させ、３００ｇで３ｍｉｎ遠心分離した。懸濁及び遠心分離プロセスを３回繰り返した。その後、細胞を１００μＬの培地中の９６ウェルプレートに１０５細胞／ウェルで添加した。続いて、段階希釈したＡｂ００３３、ＬＣ００３３－１又はｈＩＬ２１を各ウェルに１００μＬ添加し（等量のＰＢＳをブランク対照として対照ウェルに添加）、３７℃で３０ｍｉｎインキュベートした。ＰＢＳ中の４％ホルムアルデヒドの作用濃度になるまで等量の固定液を細胞に添加し、細胞を室温で１５ｍｉｎ固定した。細胞を３００ｇで３ｍｉｎ遠心分離して上清を除去し、２００μＬのＰＢＳで洗浄した。細胞内染色について、細胞を１００％氷冷メタノールに再懸濁させ、氷上で３０ｍｉｎインキュベートした。３００ｇで３ｍｉｎ遠心分離した後、細胞をＰＢＳ＋０．５％ＢＳＡで３回洗浄した。染色のために、５μＬの直接標識した抗体（Ｐｈｏｓｐｈｏ－ＳＴＡＴ３（Ｔｙｒ７０５）モノクローナル抗体（ＬＵＶＮＫＬＡ）、ＡＰＣ、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（商標）、カタログ番号１７－９０３３－４２及びＣＤ４モノクローナル抗体（ＲＰＡ－Ｔ４）、ＦＩＴＣ、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（商標）、カタログ番号１１－００４９－４２）を各ウェルに添加した。４℃で３０ｍｉｎインキュベートした後、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ－ＩｎｔｅｌｌｉＣｙｔ（登録商標）ｉＱｕｅフローサイトメーターを使用して細胞を分析した。
ＳＴＡＴ３リン酸化（ｐＳＴＡＴ３）アッセイを使用してＬＣ００３３－１のインビトロＰＢＭＣ細胞刺激活性を測定した。ＳＴＡＴ３リン酸化はＣＤ４＋ Ｔ細胞刺激の指標である。市販のＰＢＭＣ細胞（ＡｌｌＣｅｌｌｓ、カタログ番号ＦＰＢ００３Ｆ－Ｃ）を３７℃で解凍して回復させ、次に前加温した培養バチ（ＲＰＭＩ１６４０）に懸濁させ、３００ｇで３ｍｉｎ遠心分離した。懸濁及び遠心分離プロセスを３回繰り返した。その後、細胞を１００μＬの培地中の９６ウェルプレートに１０５細胞／ウェルで添加した。続いて、段階希釈したＡｂ００３３、ＬＣ００３３－１又はｈＩＬ２１を各ウェルに１００μＬ添加し（等量のＰＢＳをブランク対照として対照ウェルに添加）、３７℃で３０ｍｉｎインキュベートした。ＰＢＳ中の４％ホルムアルデヒドの作用濃度になるまで等量の固定液を細胞に添加し、細胞を室温で１５ｍｉｎ固定した。細胞を３００ｇで３ｍｉｎ遠心分離して上清を除去し、２００μＬのＰＢＳで洗浄した。細胞内染色について、細胞を１００％氷冷メタノールに再懸濁させ、氷上で３０ｍｉｎインキュベートした。３００ｇで３ｍｉｎ遠心分離した後、細胞をＰＢＳ＋０．５％ＢＳＡで３回洗浄した。染色のために、５μＬの直接標識した抗体（Ｐｈｏｓｐｈｏ－ＳＴＡＴ３（Ｔｙｒ７０５）モノクローナル抗体（ＬＵＶＮＫＬＡ）、ＡＰＣ、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（商標）、カタログ番号１７－９０３３－４２及びＣＤ４モノクローナル抗体（ＲＰＡ－Ｔ４）、ＦＩＴＣ、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（商標）、カタログ番号１１－００４９－４２）を各ウェルに添加した。４℃で３０ｍｉｎインキュベートした後、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ－ＩｎｔｅｌｌｉＣｙｔ（登録商標）ｉＱｕｅフローサイトメーターを使用して細胞を分析した。
【0163】
結果は図９に示す。ブランク対照（白抜きヒストグラム）と比較して、ＬＣ００３３－１及びｈＩＬ２１（塗りつぶされたヒストグラム）のピークは、明らかに右にシフトし、これは、該２つの分子がＣＤ４＋ Ｔ細胞内のリン酸化を誘導するのに有効であり、そのためＣＤ４＋ Ｔ細胞刺激に有効であることを示す。
【0164】
実施例９ 融合タンパク質のインビボ有効性の評価
本開示に係る融合タンパク質のインビボ有効性を評価しヒトにおける治療効果を予測するために、ヒト化ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１マウス（ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１遺伝子ヒト化マウス。関連内容の全てが参照によって本明細書に組み込まれるＷＯ２０１８０４１１１８Ａ１及びＷＯ２０１８００１２４１Ａ１を参照）を使用して結腸腺癌のマウスモデルを確立した。
本開示に係る融合タンパク質のインビボ有効性を評価しヒトにおける治療効果を予測するために、ヒト化ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１マウス（ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１遺伝子ヒト化マウス。関連内容の全てが参照によって本明細書に組み込まれるＷＯ２０１８０４１１１８Ａ１及びＷＯ２０１８００１２４１Ａ１を参照）を使用して結腸腺癌のマウスモデルを確立した。
【0165】
上記したヒト化ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１マウス（６～７週）のホモ接合体（Ｂｉｏｃｙｔｏｇｅｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ （Ｂｅｉｊｉｎｇ） Ｃｏ．， Ｌｔｄ．、カタログ番号１２０５２２）を使用して２つのインビボ有効性試験を行った。要するに、マウスにマウス結腸腺癌細胞ＭＣ３８－ｈＰＤ－Ｌ１（５×１０５／１００μＬ ＰＢＳ）（Ｂｉｏｃｙｔｏｇｅｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ （Ｂｅｉｊｉｎｇ） Ｃｏ．， Ｌｔｄ．）を皮下接種した。腫瘍が約１００～１５０ｍｍ３になった時、マウスをそれらの腫瘍体積に基づいて治療群又は対照群に無作為に割り当てた。治療群マウスをＡｂ００３３、ｈＩＬ２１、ＬＣ００３３－１、ＬＣ００３３－２、又はｈＩＬ２１及びＡｂ００３３（等モル）の組み合わせの投与について無作為化した。対照群マウスに等量の生理食塩水を注射した。マウスに週２回（ＢＩＷ）、合計６回（静脈内（ｉ．ｖ．）、第１有効性試験。又は腹腔内（ｉ．ｐ．）、第２有効性試験）投与を実施した。マウスの腫瘍体積及び体重を週２回測定した。マウス１匹の腫瘍体積が３０００ｍｍ３に達した時、マウスを安楽死させ、実験を終了した。２つの試験の投与レジメンはそれぞれ表４及び６にまとめる。
【0166】
９．１ 第１有効性試験
第１有効性試験の投与レジメンは表４に示す。
第１有効性試験の投与レジメンは表４に示す。
【0167】
【表4】
【0168】
群分け日（０日目）及び群分け１４日（１４日目）又は２６日（２６日目）後の腫瘍体積は表５にまとめた。腫瘍成長阻害値（ＴＧＩＴＶ％）を式：ＴＧＩＴＶ（％）＝［１－（Ｔｉ－Ｔ０）／（Ｖｉ－Ｖ０）］×１００で算出した。Ｔｉはｉ日目の治療群の平均腫瘍体積である。Ｔ０は０日目の治療群の平均腫瘍体積である。Ｖｉはｉ日目の対照群の平均腫瘍体積である。Ｖ０は０日目の対照群の平均腫瘍体積である。
【0169】
【表5】
【0170】
全体的に、各群内のマウスは実験中に健康状態が良好であった。治療群及び対照群は体重及び体重変化に有意差を示さなかった（図１０）。実験の最後に、各群内のマウスの体重が増加し、治療群及び対照群の体重に有意差がなく、これは、薬物の忍容性が高かったことを示す。結果は、ＬＣ００３３－１、ＬＣ００３３－２及びＡｂ００３３が安全であり、動物に重大な副作用がないことを示す。
【0171】
図１１から分かるように、対照マウスにおける腫瘍は実験中に成長が継続したが、治療群からのマウスにおける腫瘍成長は異なる程度に抑制された。特に、ＬＣ００３３－１及びＬＣ００３３－２群（Ｇ６、Ｇ８及びＧ１０）における腫瘍成長は、他の治療群（Ｇ２、Ｇ３、Ｇ４、Ｇ５、Ｇ７及びＧ９）と比較して有意に抑制され、これは、Ａｂ００３３又はｈＩＬ２１による単独療法又はそれらの併用療法と比較して、ＬＣ００３３－１及びＬＣ００３３－２が優れたインビボ腫瘍阻害活性を示したことを示す。
【0172】
表５及び図１１から分かるように、実験の終了時点で、ＬＣ００３３－１（Ｇ６及びＧ８）又はＬＣ００３３－２（Ｇ１０）で治療した全てのマウスの腫瘍体積は対照マウス（Ｇ１）より有意に小さくなっており、これは、ＬＣ００３３－１及びＬＣ００３３－２が低用量で腫瘍阻害効果を有することを示す。更に、ＬＣ００３３－１及びＬＣ００３３－２は同じ用量で同様の有効性を示した（ＴＧＩＴＶ％：５８．２１％対５４．０５％）。ＬＣ００３３－１の用量が１ｍｇ／ｋｇから３ｍｇ／ｋｇに増加した場合、ＴＧＩＴＶ％は５８．２１％から６７．２６％に増加し、腫瘍阻害効果が僅かに増加した。融合タンパク質（Ｇ８及びＧ１０）の顕著な抗腫瘍活性と比較して、Ａｂ００３３のみ、ｈＩＬ２１のみ又はＡｂ００３３とｈＩＬ２１の組み合わせで治療した群からのＴＧＩＴＶ％は２５％未満であり、これは、Ａｂ００３３、ｈＩＬ２１及びそれらの組み合わせが顕著な抗腫瘍活性を示さなかったことを示す。
【0173】
９．２ 第２有効性試験
第２有効性試験の投与レジメンは表６に示す。
第２有効性試験の投与レジメンは表６に示す。
【0174】
【表6】
【0175】
群分け日（０日目）及び群分け１４日（１４日目）又は２４日（２４日目）後の腫瘍体積を表７にまとめ、腫瘍成長阻害値（ＴＧＩＴＶ％）を計算した。
【0176】
【表7】
【0177】
全体的に、各群内のマウスは実験中に健康状態が良好であった。治療群及び対照群は体重及び体重変化に有意差を示さなかった（図１２）。実験の最後に、各群内のマウスの体重が増加し、治療群及び対照群の体重に有意差がなく、これは、薬物の忍容性が高かったことを示す。結果は、ＬＣ００３３－１及びＡｂ００３３が安全であり、動物に重大な副作用がないことを示す。
【0178】
表７及び図１３から分かるように、対照マウスにおける腫瘍は実験中に成長が継続したが、治療群からのマウスにおける腫瘍成長は異なる程度に抑制された。実験の最後に（２４日目）、Ｇ２～Ｇ７からのマウスの腫瘍体積は、対照マウス（Ｇ１）より小さくなっており、これは、ＬＣ００３３－１及びＡｂ００３３が異なる用量で異なる腫瘍阻害効果を有することを示す。また、ＬＣ００３３－１治療は、用量依存的腫瘍阻害を示し、低用量でかなりの腫瘍阻害効果を示した（Ｇ５、ＴＧＩＴＶ％＝８０．３％）。高用量のＡｂ００３３（Ｇ４、ＴＧＩＴＶ％＝８４．１％）は中用量のＬＣ００３３－１と同等の抗腫瘍活性（Ｇ６、ＴＧＩＴＶ％＝８５．３％）を示したが、低用量（Ｇ２、ＴＧＩＴＶ％＝４０．０％）及び中用量（Ｇ３、ＴＧＩＴＶ％＝２２．９％）で腫瘍成長を阻害できなかった。
【0179】
同じ用量及び投与頻度で、ＬＣ００３３－１（Ｇ５－Ｇ７）は、Ａｂ００３３（Ｇ２～Ｇ４）より高い有効性を示し、これは、抗ＰＤ－Ｌ１抗体のインビボ腫瘍阻害効果がＩＬ２１との融合により効果的に向上したことを示す。
【0180】
図１３から分かるように、等モルのＡｂ００３３（Ｇ２）と比較して、３ｍｇ／ｋｇでのＬＣ００３３－１（Ｇ５）は腫瘍成長を効果的に阻害した。
【0181】
各治療群内のマウス１匹からのデータも研究した。３ｍｇ／ｋｇのＬＣ００３３－１群（Ｇ５）では、マウス全体における腫瘍の成長が遅く、腫瘍成長が阻害された。２．７３ｍｇ／ｋｇのＡｂ００３３群（Ｇ２）では、腫瘍が有意に阻害されたマウスがただ１匹であった。
【0182】
ＬＣ００３３－１について、中用量群（Ｇ６）における抗腫瘍活性は低用量群（Ｇ５）より高く、対応する用量（Ｇ３対Ｇ２）でのＡｂ００３３は顕著な抗腫瘍活性を示さなかった。高用量Ａｂ００３３（Ｇ４）は腫瘍成長を効果的に阻害し、抗腫瘍活性が低用量ＬＣ００３３－１（Ｇ５）と同等であった。ＬＣ００３３－１の抗腫瘍活性は高用量（Ｇ７）で更に増加したが、低用量群（Ｇ５）と比較して腫瘍阻害が有意に増加せず、即ち、顕著な用量依存的効果が観察されず、その原因は、３ｍｇ／ｋｇでのＬＣ００３３－１が既に顕著な抗腫瘍活性を示したため、ＭＣ３８腫瘍モデルについて、ＬＣ００３３－１用量の更なる増加が腫瘍を完全に除去していなかったことであるかもしれない。
【0183】
配列表
【表8】
【表9】
【表10】
【表11】
【表12】
【表13】
【図1】
【図2A】
【図2B】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2024-07-05
【手続補正1】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本開示はバイオ医薬品の分野に関する。特に、抗ＰＤ－Ｌ１抗体及びインターロイキン２１を含む抗体－サイトカイン融合タンパク質、その調製方法及びその用途を提供する。
【背景技術】
【0002】
インターロイキン２１（ＩＬ２１）は、主にＣＤ４＋ Ｔ細胞、Ｂ細胞、骨髄細胞及びナチュラルキラー（ＮＫ）Ｔ細胞によって分泌される４αヘリックスバンドルサイトカインである。ＩＬ２１は、ＩＬ２１受容体（ＩＬ２１Ｒ）のヘテロ二量体及び共通サイトカイン受容体ガンマ鎖を介してシグナル伝達することで、広範囲の免疫細胞型に多面的効果を発揮し、自然免疫応答及び適応免疫応答の両方を制御する。組換えＩＬ２１の腫瘍内注射は、腫瘍微小環境内の腫瘍関連マクロファージの免疫抑制性Ｍ２表現型から腫瘍阻害性Ｍ１表現型への転換を促進できることが報告されている。ＩＬ２１の抗腫瘍活性は、腎細胞癌、非ホジキンリンパ腫及び黒色腫の第１相又は第２相臨床試験で、単独療法又は他の治療薬との併用療法として実証されている。しかし、ＩＬ２１は半減期が非常に短く、全身投与される場合に重大な副作用を引き起こす。組換えＩＬ２１の腫瘍内投与は、より高い有効性及びより低い全身毒性等の利点をもたらす可能性があるが、大部分の患者にとってかなり困難である。
【0003】
プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ－１）及びプログラム細胞死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）は、Ｔ細胞増殖及び活性を制御する免疫抑制性受容体／リガンドである。ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１経路は、癌細胞により抗腫瘍免疫の抑制に利用され、一般に臨床転帰不良に関連する。ＰＤ－１又はＰＤ－Ｌ１に対する抗体を使用するＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１遮断は、様々な癌種の治療において有望な治療効果を示している。抗ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１免疫療法は臨床的有効性が期待できるものの、その恩恵を受ける患者は、まだ、ごく少数である。
【発明の概要】
【0004】
１つの態様において、式（Ｉ）又は（Ｉ’）の構造を有する融合タンパク質であって、
［Ｂ－Ｓｐ１－Ｌｋ－Ｓｐ２］ｍ－Ａ （Ｉ）
Ａ－［Ｓｐ１－Ｌｋ－Ｓｐ２－Ｂ］ｍ （Ｉ’）
式中、
Ａは抗ＰＤ－Ｌ１抗体であり、
Ｂはインターロイキン２１（ＩＬ２１）であり、
Ｓｐ１及びＳｐ２はそれぞれ独立してスペーサーであるか又は存在せず、
Ｌｋは、ソルターゼのアクセプター基質認識配列とドナー基質認識配列のコンジュゲーションによって形成されたリンカーであり、
ｍは１～４の整数である、前記融合タンパク質を提供する。
［Ｂ－Ｓｐ１－Ｌｋ－Ｓｐ２］ｍ－Ａ （Ｉ）
Ａ－［Ｓｐ１－Ｌｋ－Ｓｐ２－Ｂ］ｍ （Ｉ’）
式中、
Ａは抗ＰＤ－Ｌ１抗体であり、
Ｂはインターロイキン２１（ＩＬ２１）であり、
Ｓｐ１及びＳｐ２はそれぞれ独立してスペーサーであるか又は存在せず、
Ｌｋは、ソルターゼのアクセプター基質認識配列とドナー基質認識配列のコンジュゲーションによって形成されたリンカーであり、
ｍは１～４の整数である、前記融合タンパク質を提供する。
【0005】
いくつかの実施形態において、前記アクセプター基質認識配列は、グリシン（Ｇ）及びアラニン（Ａ）からなる群から選択される１～１００個の直列接続構造単位を含む。特定の実施形態において、前記アクセプター基質認識配列は、（Ｇ）ｎの配列を含み、ただし、ｎは２～２０の整数、特に３である。
【0006】
いくつかの実施形態において、前記ドナー基質認識配列は、Ｘ１Ｘ２Ｘ３ＴＸ４Ｘ５の配列を含み、ただし、Ｘ１はロイシン（Ｌ）又はアスパラギン（Ｎ）であり、Ｘ２はプロリン（Ｐ）又はアラニン（Ａ）であり、Ｘ３は任意の天然又は非天然アミノ酸であり、Ｘ４はグリシン（Ｇ）、セリン（Ｓ）又はアスパラギン（Ｎ）であるか又は存在せず、Ｘ５は１～１０個のアミノ酸を含むアミノ酸配列であるか又は存在しない。
【0007】
特定の実施形態において、Ｘ１Ｘ２Ｘ３ＴＸ４Ｘ５はＬＰＸ３ＴＧ、ＬＰＸ３ＴＧＧ、ＮＰＱＴＮ、ＮＰＫＴＧ、ＬＡＸ３ＴＧ又はＬＰＱＴＳＥＱであり、ただし、Ｘ３は任意の天然又は非天然アミノ酸である。好ましい実施形態において、Ｘ１Ｘ２Ｘ３ＴＸ４Ｘ５はＬＰＥＴＧ又はＬＰＥＴＧＧである。
【0008】
いくつかの実施形態において、前記スペーサーは、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）及びセリン（Ｓ）からなる群から選択される１～１００個の直列接続構造単位を含む。
【0009】
いくつかの実施形態において、前記抗ＰＤ－Ｌ１抗体はアテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ、３Ｆ２又はそれらの操作された抗体である。好ましい実施形態において、前記抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、配列番号１のアミノ酸配列を有する軽鎖及び配列番号２のアミノ酸配列を有する重鎖、又は配列番号３のアミノ酸配列を有する軽鎖及び配列番号４のアミノ酸配列を有する重鎖を含む。
【0010】
いくつかの実施形態において、前記ＩＬ２１は、野生型ＩＬ２１又はその変異体である。好ましい実施形態において、前記ＩＬ２１は配列番号９又は配列番号１０のアミノ酸配列を含む。
【0011】
いくつかの実施形態において、前記ＩＬ２１は、前記抗ＰＤ－Ｌ１抗体の軽鎖及び／又は重鎖のＮ末端でコンジュゲートされる。好ましい実施形態において、前記ＩＬ２１は、前記抗ＰＤ－Ｌ１抗体の重鎖のＮ末端でコンジュゲートされる。
【0012】
いくつかの実施形態において、ＬｋはＸ１Ｘ２Ｘ３Ｔ（Ｇ）ｎであり、前記融合タンパク質は、（ＩＩ）又は（ＩＩ’）の構造を有し、
［Ｂ－Ｓｐ１－Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｔ（Ｇ）ｎ－Ｓｐ２］ｍ－Ａ （ＩＩ）
Ａ－［Ｓｐ１－ Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｔ（Ｇ）ｎ－Ｓｐ２－Ｂ］ｍ （ＩＩ’）
式中、Ｘ１はロイシン（Ｌ）又はアスパラギン（Ｎ）であり、Ｘ２はプロリン（Ｐ）又はアラニン（Ａ）であり、Ｘ３は任意の天然又は非天然アミノ酸であり、ｎは２～２０の整数であり、
ｍは１又は２であり、
Ａ、Ｂ、Ｓｐ１及びＳｐ２は上記で定義された通りである。
［Ｂ－Ｓｐ１－Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｔ（Ｇ）ｎ－Ｓｐ２］ｍ－Ａ （ＩＩ）
Ａ－［Ｓｐ１－ Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｔ（Ｇ）ｎ－Ｓｐ２－Ｂ］ｍ （ＩＩ’）
式中、Ｘ１はロイシン（Ｌ）又はアスパラギン（Ｎ）であり、Ｘ２はプロリン（Ｐ）又はアラニン（Ａ）であり、Ｘ３は任意の天然又は非天然アミノ酸であり、ｎは２～２０の整数であり、
ｍは１又は２であり、
Ａ、Ｂ、Ｓｐ１及びＳｐ２は上記で定義された通りである。
【0013】
特定の実施形態において、前記融合タンパク質は、（ＩＩＩ）又は（ＩＩＩ’）の構造を有し、
［Ｂ－ＧＡＬＰＥＴＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ］ｍ－Ａ （ＩＩＩ）
Ａ－［ＧＡＬＰＥＴＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ－Ｂ］ｍ （ＩＩＩ’）
式中、Ａ及びＢは上記で定義された通りである。
［Ｂ－ＧＡＬＰＥＴＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ］ｍ－Ａ （ＩＩＩ）
Ａ－［ＧＡＬＰＥＴＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ－Ｂ］ｍ （ＩＩＩ’）
式中、Ａ及びＢは上記で定義された通りである。
【0014】
特定の実施形態において、前記融合タンパク質は、式（ＩＩＩ）の構造を有し、
［Ｂ－ＧＡＬＰＥＴＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ］ｍ－Ａ （ＩＩＩ）
式中、
Ａは、配列番号１のアミノ酸配列を有する軽鎖及び配列番号２のアミノ酸配列を有する重鎖、又は配列番号３のアミノ酸配列を有する軽鎖及び配列番号４のアミノ酸配列を有する重鎖を含む抗ＰＤ－Ｌ１抗体であり、
Ｂは、配列番号９又は配列番号１０のアミノ酸配列を含むＩＬ２１であり、
ｍは１又は２である。
［Ｂ－ＧＡＬＰＥＴＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ］ｍ－Ａ （ＩＩＩ）
式中、
Ａは、配列番号１のアミノ酸配列を有する軽鎖及び配列番号２のアミノ酸配列を有する重鎖、又は配列番号３のアミノ酸配列を有する軽鎖及び配列番号４のアミノ酸配列を有する重鎖を含む抗ＰＤ－Ｌ１抗体であり、
Ｂは、配列番号９又は配列番号１０のアミノ酸配列を含むＩＬ２１であり、
ｍは１又は２である。
【0015】
特定の実施形態において、前記融合タンパク質は、２つの同一の重鎖部分及び２つの同一の軽鎖部分を含み、そのうち、
（１）前記重鎖部分の各々が配列番号１８又は配列番号２０のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖部分の各々が配列番号１のアミノ酸配列を含み、又は
（２）前記重鎖部分の各々が配列番号１９又は配列番号２１のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖部分の各々が配列番号３のアミノ酸配列を含む。
（１）前記重鎖部分の各々が配列番号１８又は配列番号２０のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖部分の各々が配列番号１のアミノ酸配列を含み、又は
（２）前記重鎖部分の各々が配列番号１９又は配列番号２１のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖部分の各々が配列番号３のアミノ酸配列を含む。
【0016】
別の特定の実施形態において、前記融合タンパク質は、２つの異なる重鎖部分及び２つの同一の軽鎖部分を含み、そのうち、
（１）前記重鎖部分の一方が配列番号１８又は配列番号２０のアミノ酸配列を含み、前記重鎖部分の他方が配列番号１４のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖部分の各々が配列番号１のアミノ酸配列を含み、又は
（２）前記重鎖部分の一方が配列番号１９又は配列番号２１のアミノ酸配列を含み、前記重鎖部分の他方が配列番号１５のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖部分の各々が配列番号３のアミノ酸配列を含む。
（１）前記重鎖部分の一方が配列番号１８又は配列番号２０のアミノ酸配列を含み、前記重鎖部分の他方が配列番号１４のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖部分の各々が配列番号１のアミノ酸配列を含み、又は
（２）前記重鎖部分の一方が配列番号１９又は配列番号２１のアミノ酸配列を含み、前記重鎖部分の他方が配列番号１５のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖部分の各々が配列番号３のアミノ酸配列を含む。
【0017】
別の態様において、それを必要とする対象の疾患を治療するための医薬品の製造における、本開示に係る融合タンパク質の使用を提供する。好ましくは、前記疾患は、癌である。より好ましくは、前記癌は、黒色腫、卵巣癌、乳癌、メルケル細胞癌、肺癌、腎細胞癌、膀胱癌、結腸癌、結腸腺癌、結腸直腸癌、頭頸部扁平上皮癌、中皮腫、ウイルス誘発性癌、子宮頸癌、鼻咽頭癌、軟部肉腫、血液悪性腫瘍、胃癌、胃癌又は胃食道接合部（ＧＥＪ）腺癌、食道癌、食道の扁平上皮癌、子宮内膜癌、原発性縦隔Ｂ細胞リンパ腫（ＰＭＢＣＬ）、尿路上皮癌、マイクロサテライト不安定性高（ＭＳＩ－Ｈ）又はミスマッチ修復欠損（ｄＭＭＲ）の固形腫瘍、肝細胞癌、リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、腎細胞癌腫（ＲＣＣ）、有棘細胞癌（ｃＳＣＣ）、三種陰性乳癌（ＴＮＢＣ）、非小細胞肺癌及び膀胱癌から選択される。
【0018】
更なる態様において、本開示に係る融合タンパク質を産生するための方法であって、
（ａ－１）式（Ｉ－１）の構造を有する抗体部分及び式（Ｉ－２）の構造を有するサイトカイン部分を用意するステップと、
［Ｌｋａ－Ｓｐ２］ｍ－Ａ （Ｉ－１）
Ｂ－Ｓｐ１－Ｌｋｄ （Ｉ－２）
（ｂ－１）ソルターゼの存在下で前記抗体部分を前記サイトカイン部分とコンジュゲートして式（Ｉ）の構造を有する融合タンパク質を得るステップと、を含み、
［Ｂ－Ｓｐ１－Ｌｋ－Ｓｐ２］ｍ－Ａ （Ｉ）
又は
（ａ－２）式（Ｉ’－１）の構造を有する抗体部分及び式（Ｉ’－２）の構造を有するサイトカイン部分を用意するステップと、
Ａ－［Ｓｐ１－Ｌｋｄ］ｍ （Ｉ’－１）
Ｌｋａ－Ｓｐ２－Ｂ （Ｉ’－２）
（ｂ－２）ソルターゼの存在下で前記抗体部分を前記サイトカイン部分とコンジュゲートして式（Ｉ’）の構造を有する融合タンパク質を得るステップと、を含み、
Ａ－［Ｓｐ１－Ｌｋ－Ｓｐ２－Ｂ］ｍ （Ｉ’）
式中、
Ｌｋａは上記で定義されたソルターゼのアクセプター基質認識配列であり、Ｌｋｄは、上記で定義されたソルターゼのドナー基質認識配列であり、
Ａ、Ｂ、Ｓｐ１、Ｓｐ２、Ｌｋ及びｍは上記で定義された通りである、前記方法を提供する。
（ａ－１）式（Ｉ－１）の構造を有する抗体部分及び式（Ｉ－２）の構造を有するサイトカイン部分を用意するステップと、
［Ｌｋａ－Ｓｐ２］ｍ－Ａ （Ｉ－１）
Ｂ－Ｓｐ１－Ｌｋｄ （Ｉ－２）
（ｂ－１）ソルターゼの存在下で前記抗体部分を前記サイトカイン部分とコンジュゲートして式（Ｉ）の構造を有する融合タンパク質を得るステップと、を含み、
［Ｂ－Ｓｐ１－Ｌｋ－Ｓｐ２］ｍ－Ａ （Ｉ）
又は
（ａ－２）式（Ｉ’－１）の構造を有する抗体部分及び式（Ｉ’－２）の構造を有するサイトカイン部分を用意するステップと、
Ａ－［Ｓｐ１－Ｌｋｄ］ｍ （Ｉ’－１）
Ｌｋａ－Ｓｐ２－Ｂ （Ｉ’－２）
（ｂ－２）ソルターゼの存在下で前記抗体部分を前記サイトカイン部分とコンジュゲートして式（Ｉ’）の構造を有する融合タンパク質を得るステップと、を含み、
Ａ－［Ｓｐ１－Ｌｋ－Ｓｐ２－Ｂ］ｍ （Ｉ’）
式中、
Ｌｋａは上記で定義されたソルターゼのアクセプター基質認識配列であり、Ｌｋｄは、上記で定義されたソルターゼのドナー基質認識配列であり、
Ａ、Ｂ、Ｓｐ１、Ｓｐ２、Ｌｋ及びｍは上記で定義された通りである、前記方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【0019】
【図1】本開示のいくつかの実施形態に係る融合タンパク質の概略図を示す。
【図2A】それぞれ、ＥＬＩＳＡによって分析されたＡｂ００３０及びＡｂ００３３のｈＰＤ－Ｌ１への結合活性を示す。
【図2B】それぞれ、ＥＬＩＳＡによって分析されたＡｂ００３０及びＡｂ００３３のｈＰＤ－Ｌ１への結合活性を示す。
【図3】Ａｂ００３０及びＡｂ００３３から調製された融合タンパク質を含有する抗体－サイトカインコンジュゲーション混合物のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を示す。
【図4】Ａｂ００３０及びＡｂ００３３から調製された精製融合タンパク質のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を示す。
【図5】Ａｂ００３０及びＡｂ００３３から調製された融合タンパク質のＨＩＣ－ＨＰＬＣプロファイルを示す。
【図6】Ａｂ００３０及びＡｂ００３３から調製された融合タンパク質のＨＩＣ－ＨＰＬＣプロファイルを示す。
【図7】ＥＬＩＳＡによって分析された抗体単独又は融合タンパク質のｈＰＤ－Ｌ１への結合活性を示す。
【図8】ＥＬＩＳＡによって分析された抗体単独又は融合タンパク質のＩＬ２１Ｒへの結合活性を示す。
【図9】対照（白抜きヒストグラム）又はｈＩＬ２１、Ａｂ００３３及びＬＣ００３３－１（塗りつぶされたヒストグラム）で刺激されたＰＢＭＣにおけるＳＴＡＴ３リン酸化（ｐＳＴＡＴ３）シグナルのフローサイトメトリ分析を示す。
【図10】第１有効性試験からの実験動物の指定された時点での体重を示す。
【図11】第１有効性試験からの実験動物の指定された時点での腫瘍体積を示す。
【図12】第２有効性試験からの実験動物の指定された時点での体重を示す。
【図13】第２有効性試験からの実験動物の指定された時点での腫瘍体積を示す。
【発明を実施するための形態】
【0020】
定義
別途定義しない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。加えて、生化学、分子生物学、細胞及び組織培養、微生物学及び免疫学に関する用語及び実験手順は、当分野で広範に使用されるものである。また、本開示をより良く理解するために、以下に関連用語の定義及び説明を提供する。
別途定義しない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。加えて、生化学、分子生物学、細胞及び組織培養、微生物学及び免疫学に関する用語及び実験手順は、当分野で広範に使用されるものである。また、本開示をより良く理解するために、以下に関連用語の定義及び説明を提供する。
【0021】
本明細書で使用されるように、「少なくとも１つ」又は「１つ又は複数」という表現は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれ以上を意味する。明確に反対の指示がない限り、本明細書で使用される「一（ａ）」及び「一つ（ａｎ）」は、「少なくとも１つ」と理解すべきである。
【0022】
特定の量、濃度、値又はパラメータが範囲、好ましい範囲、又は好ましい上限若しくは好ましい下限の形態で記載される場合、前記範囲が明示的に記載されているか否かに関わらず、任意の上限又は好ましい値を任意の下限又は好ましい値と組み合わせて形成された任意の範囲が具体的に示されるのに等しいと理解すべきである。特に断らない限り、本明細書に挙げられる数値範囲は、該範囲の両端及び該範囲内の全ての整数と分数（小数）を含むことを意図する。例えば、「ｉは１～２０の整数である」という表現は、ｉは１～２０の任意の整数であることを意味し、例えば、ｉは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０であってもよい。他の同様の表現、例えばｎ及びｍも同様に理解されるべきである。
【0023】
本明細書で使用されるように、用語「任意の（ｏｐｔｉｏｎａｌ）」又は「任意に（ｏｐｔｉｏｎａｌｌｙ）」とは、その後に説明される事象が発生し得るが、必ずしも発生とは限らないことを意味し、該説明は、前記事象又は状況が発生するか又は発生しないケースを含む。
【0024】
「含む」、「包含」、「含有」及び「有する」といった表現は、制限のないものであり、追加の列挙されていない要素、ステップ、又は成分を除外するものではない。「…からなる」という表現は、指定されない任意の要素、ステップ、又は成分を除外する。「…から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」とは、範囲が、指定された要素、ステップ若しくは成分に限定されるか、又は請求される発明主題の本質的で新規な特徴に実質的に影響しない任意に存在する要素、ステップ若しくは成分の群に限定されることを意味する。「含む」という表現は、「…から本質的になる」及び「…からなる」といった表現を包含することを理解すべきである。
【0025】
本明細書で使用されるように、用語「抗体」は、少なくとも１つの抗原結合部位（即ち、パラトープ）を介して抗原のエピトープに特異的に結合する免疫グロブリン（Ｉｇ）分子又はその断片である。本明細書で使用されるように、「抗体（Ａｂ）」の定義は、通常の抗体、組換え抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、完全ヒト抗体、非ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、細胞内抗体、ダイアボディ、抗イディオタイプ抗体及び抗原結合断片を包含する。本明細書に記載の抗原結合断片は、全長抗体の酵素処理及び／又は合成方法によって産生でき、例えば、組換え抗体が１つの抗体のＣＤＲを別の抗体のフレームワークに移植することによって産生される。抗原結合断片の例としては、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、ｓｃｄｓＦｖ、ダイアボディ、Ｆａｂ、ｓｃＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、及び他の断片を含むが、それらに限定されない。本明細書で提供される抗体は、任意の免疫グロブリンタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＡ及びＩｇＹ）、任意のクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２）又はサブクラス（例えば、ＩｇＧ２ａ及びＩｇＧ２ｂ）のメンバーを含む。いくつかの実施形態において、抗体は、ＰＤ－Ｌ１の少なくとも一部を認識する抗ＰＤ－Ｌ１抗体である。いくつかの実施形態において、抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、２つの同一の軽鎖及び２つの同一の重鎖を含む通常の抗体である。
【0026】
「通常の」又は「全長」抗体は、典型的に、２つの重鎖（ＨＣ）及び２つの軽鎖（ＬＣ）といった４つのポリペプチドからなる。各軽鎖は、アミノ末端からカルボキシル末端へ、軽鎖可変領域（ＶＬ）及び軽鎖定常領域（ＣＬ）を含む。各重鎖は、アミノ末端からカルボキシル末端へ、重鎖可変領域（ＶＨ）及び１つ又は複数の重鎖定常領域（ＣＨ）を含む。
【0027】
各ＶＬ及びＶＨは、典型的に３つの超可変「相補性決定領域（ＣＤＲ）」及び４つの比較的保存された「フレームワーク領域（ＦＲ）」を有し、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３及びＦＲ４の順でアミノ末端からカルボキシル末端へと配列される。ＶＬ又はＶＨにおける位置に応じて、ＣＤＲは、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３のような重鎖可変領域ＣＤＲ（ＣＤＲＨ）、又はＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３のような軽鎖可変領域ＣＤＲ（ＣＤＲＬ）と指定される。
【0028】
当業者であれば、ＣＤＲを知り、当分野で周知の方法論、例えば、Ｋａｂａｔ（例えば、Ｋａｂａｔ， Ｅ．Ａ． ｅｔ ａｌ． （１９９１） Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ， Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｕ．Ｓ． Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ， ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ． ９１－３２４２を参照）、Ｃｈｏｔｈｉａ（例えば、Ｃｈｏｔｈｉａ， Ｃ． ｅｔ ａｌ． （１９８７） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １９６：９０１－９１７を参照）、ＡｂＭ（例えば、Ｍａｒｔｉｎ， Ａ．Ｃ．Ｒ． ａｎｄ Ａｌｌｅｎ， Ｊ． （２００７）． Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｔｏｏｌｓ ｆｏｒ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ． Ｉｎ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， Ｓ． Ｄuｂｅｌ （Ｅｄ．）を参照）及びＩＭＧＴ（例えば、Ｌｅｆｒａｎｃ， Ｍ．－Ｐ．， ２０１１ （６）， ＩＭＧＴ， ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ Ｐｒｏｔｏｃ．； ａｎｄ Ｌｅｆｒａｎｃ， Ｍ．－Ｐ． ｅｔ ａｌ．， Ｄｅｖ． Ｃｏｍｐ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， ２７， ５５－７７ （２００３）を参照）を含む様々な番号付けスキームを使用して、ＣＤＲを定義することができる。当業者であれば、所与の抗体のＣＤＲ配列が、使用される番号付けスキームに応じて異なる境界を有し得ることを理解するであろう。本明細書に記載の抗ＰＤ－Ｌ１抗体のＣＤＲ配列は、Ｋａｂａｔ番号付けスキームを使用して定義されるが、任意の他の番号付けスキームによって定義されるＣＤＲ配列が本開示の保護範囲に含まれるものとする。
【0029】
本明細書で使用されるように、用語「結合親和性」は、抗体とその同族抗原（例えば、抗ＰＤ－Ｌ１抗体とＰＤ－Ｌ１）又はリガンドとその受容体（例えば、ＩＬ２１とＩＬ２１Ｒ）のような、２つの結合パートナー間の強度の尺度である。典型的に、タンパク質間の親和性は、通常、平衡解離定数ＫＤによって測定され報告される。ＫＤは、下記等式を使用した動態分析から算出できる。
ＫＤ＝ｋｏｆｆ／ｋｏｎ
式中、ｋｏｆｆ及びｋｏｎは、それぞれ、抗原と抗体の間の解離速度定数及び会合速度定数である。ＫＤと親和性は反比例する。典型的に、抗体とその同族抗原の間のＫＤは、約１０－６Ｍ～約１０－９Ｍ以下、例えば１０－８以下、１０－９以下、又は１０－１０以下である。ｋｏｆｆ及びｋｏｎは、免疫アッセイ、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）（Ｒｉｃｈ ａｎｄ Ｍｙｓｚｋａ （２０００） Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １１：５４； Ｅｎｇｌｅｂｉｅｎｎｅ （１９９８） Ａｎａｌｙｓｔ． １２３：１５９９）、等温滴定熱量測定（ＩＴＣ）又は当分野で既知の他の動態相互作用アッセイ（例えば、Ｐａｕｌ， Ｗ． Ｅ．， Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， ２ｎｄ ｅｄ．， Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ｐａｇｅｓ ３３２－３３６ （１９８９）を参照。また、米国特許ＵＳ７，２２９，６１９も参照）に限定されない標準的な動態分析方法を使用して測定できる。結合速度のリアルタイム検出及び監視のための計器及び方法は既知であり、市場から入手できる（例えば、ＢｉａＣｏｒｅ２０００、ＢｉａｃｏｒｅＡＢ、Ｕｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）。
ＫＤ＝ｋｏｆｆ／ｋｏｎ
式中、ｋｏｆｆ及びｋｏｎは、それぞれ、抗原と抗体の間の解離速度定数及び会合速度定数である。ＫＤと親和性は反比例する。典型的に、抗体とその同族抗原の間のＫＤは、約１０－６Ｍ～約１０－９Ｍ以下、例えば１０－８以下、１０－９以下、又は１０－１０以下である。ｋｏｆｆ及びｋｏｎは、免疫アッセイ、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）（Ｒｉｃｈ ａｎｄ Ｍｙｓｚｋａ （２０００） Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １１：５４； Ｅｎｇｌｅｂｉｅｎｎｅ （１９９８） Ａｎａｌｙｓｔ． １２３：１５９９）、等温滴定熱量測定（ＩＴＣ）又は当分野で既知の他の動態相互作用アッセイ（例えば、Ｐａｕｌ， Ｗ． Ｅ．， Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， ２ｎｄ ｅｄ．， Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ｐａｇｅｓ ３３２－３３６ （１９８９）を参照。また、米国特許ＵＳ７，２２９，６１９も参照）に限定されない標準的な動態分析方法を使用して測定できる。結合速度のリアルタイム検出及び監視のための計器及び方法は既知であり、市場から入手できる（例えば、ＢｉａＣｏｒｅ２０００、ＢｉａｃｏｒｅＡＢ、Ｕｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）。
【0030】
本明細書で使用されるように、用語「ポリペプチド」とは、ペプチド結合によって共有結合した２つ以上のアミノ酸を指す。用語「ポリペプチド」及び「タンパク質」は、本明細書で互換的に使用される。ポリペプチドは、例えば、１つ又は複数のスペーサー又は機能的部分（例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ化）及びグリカン（グリコシル化））等を含むように修飾できる。ポリペプチドの修飾方法は、当業者に周知である。
【0031】
本明細書で使用されるように、「天然アミノ酸」とは、生体内のタンパク質合成に使用されるＬ配置の天然に存在するアミノ酸を指す。天然アミノ酸は、本明細書で、アラニン（Ａ、Ａｌａ）、アルギニン（Ｒ、Ａｒｇ）、アスパラギン（Ｎ、Ａｓｎ）、アルギニン酸（Ｄ、Ａｓｐ）、システイン（Ｃ、Ｃｙｓ）、グルタミン（Ｑ、Ｇｌｎ）、グルタミン酸（Ｅ、Ｇｌｕ）、グリシン（Ｇ、Ｇｌｙ）、ヒスチジン（Ｈ、Ｈｉｓ）、イソロイシン（Ｉ、Ｉｌｅ）、ロイシン（Ｌ、Ｌｅｕ）、リジン（Ｋ、Ｌｙｓ）、メチオニン（Ｍ、Ｍｅｔ）、フェニルアラニン（Ｆ、Ｐｈｅ）、プロリン（Ｐ、Ｐｒｏ）、セリン（Ｓ、Ｓｅｒ）、トレオニン（Ｔ、Ｔｈｒ）、トリプトファン（Ｗ、Ｔｒｐ）、チロシン（Ｙ、Ｔｙｒ）、バリン（Ｖ、Ｖａｌ）、ピロリシン（Ｏ、Ｐｙｌ）、セレノシステイン（Ｕ、Ｓｅｃ）といった、当業者に知られている標準的な１文字又は３文字のコードで表される。非天然アミノ酸の例は、上記の天然アミノ酸のＤ異性体及び誘導体、並びに異常アミノ酸を含む。非天然アミノ酸は、ホモアミノ酸、β－ホモアミノ酸、Ｎ－メチルアミノ酸、α－メチルアミノ酸、シトルリン（Ｃｉｔ）、ヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ）、ノルロイシン（Ｎｌｅ）、３－ニトロチロシン、ニトロアルギニン、オルニチン（Ｏｒｎ）、ナフチルアラニン（Ｎａｌ）、アミノ酪酸（Ａｂｕ）、ジアミノ酪酸（Ｄａｂ）、メチオニンスルホキシド及びメチオニンスルホンを含むが、それらに限定されない。
【0032】
本明細書で使用されるように、ポリペプチドにおけるアミノ酸位置の番号付けは、Ｎ末端からの最初のアミノ酸の位置を位置１と指定するように定義される。
【0033】
本明細書で使用されるように、「スペーサー」とは、融合タンパク質中の２つの部分間に位置し、該２つの部分を空間的に分離する構造を指す。スペーサーの例としては、アミノ酸、アミノ酸誘導体若しくは類似物及びアミノ酸配列を含むが、それらに限定されない。好ましいスペーサーとしては、ＧＡ、ＧＧＧ、ＧＡＧ及び（Ｇ）ｏＳ（（Ｇ）ｓＳ）ｔのようなグリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）及びセリン（Ｓ）のポリマーを含むアミノ酸配列を含んでもよいが、それらに限定されず、ここでｏは１～５の整数であり、ｓは１～１０の整数、特に４であり、ｔは０又は１～１０の整数である。スペーサーは、化学合成、化学若しくは酵素反応又は組換えＤＮＡ技術によってポリペプチド（例えば本明細書に記載の抗体部分又はサイトカイン部分）に組み込まれてもよいが、これに限定されない。
【0034】
本明細書で使用されるように、用語「認識配列」及び「認識モチーフ」は、互換的に使用されて、酵素（例えば、ソルターゼ）によって認識され且つ酵素がその酵素作用を発揮するアミノ酸配列を指す。例えば、それぞれソルターゼのドナー及びアクセプター基質認識配列を含む２つのポリペプチドは、コンジュゲートしてソルターゼの酵素作用によって融合ポリペプチドを形成することができる。
【0035】
本明細書で使用されるように、「配列同一性」は、当分野で認識されている意味を有し、２つの核酸又はポリペプチド間の配列同一性のパーセントは、公開されたアルゴリズム、例えばＢａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）及びＦａｓｔ Ａｄａｐｔｉｖｅ Ｓｈｒｉｎｋａｇｅ／Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄｉｎｇ Ａｌｇｏｒｉｔｈｍ（ＦＡＳＴＡ）（例えばＣｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｌｅｓｋ， Ａ．Ｍ．， ｅｄ．， Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９８８、Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ： Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ， Ｓｍｉｔｈ， Ｄ．Ｗ．， ｅｄ．， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９９３、Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ， Ｐａｒｔ Ｉ， Ｇｒｉｆｆｉｎ， Ａ．Ｍ．， ａｎｄ Ｇｒｉｆｆｉｎ， Ｈ．Ｇ．， ｅｄｓ．， Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ， １９９４を参照）を使用して２つの配列をアライメントすることによって算出できる。２つのポリヌクレオチド又はポリペプチド間の同一性を測定する方法は多数あるが、用語「同一性」は、熟練技術者に周知である（Ｃａｒｒｉｌｌｏ， Ｈ． ＆ Ｌｉｐｍａｎ， Ｄ．， ＳＩＡＭ Ｊ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ ４８：１０７３ （１９８８））。
【0036】
本明細書で使用されるように、参照ポリペプチド（野生型ＩＬ２１等）の「変異体」は、該参照ポリペプチドと比較して１つ又は複数のアミノ酸付加、欠失、挿入及び／又は置換を含む。
【0037】
本明細書で使用されるように、疾患又は症状を有する対象を「治療」するとは、該疾患又は症状を治癒するか、又は該疾患又は症状の徴候を阻止、緩和、改善又は除去する試みで、対象に組成物、手順又はレジメンを投与又は適用することを意味する。よって、用語「治療」は、予防、療法及び／又は治癒を包含する。用語「予防」とは、潜在的な疾患の予防及び／又は徴候の悪化又は疾患の進行の予防を指す。本明細書で使用されるように、治療は、本明細書で提供される融合タンパク質又は医薬組成物の任意の医薬的使用も包含する。
【0038】
本明細書で使用されるように、「対象」の定義は、ヒト及び非ヒト対象、例えば実験動物（例えば、マウス、ウサギ、及びラット並びに非ヒト霊長類）を含み、好ましくはヒトを指す。
【0039】
本明細書で使用されるように、「治療効果」は、疾患又は症状の徴候を変化させ、典型的には改善又は除去する、対象の治療から生じる効果を意味する。
【0040】
本明細書で使用されるように、「治療有効量」とは、対象に投与した後に治療効果を生み出すのに少なくとも十分な、１つ又は複数の活性剤を含有する薬剤、化合物、又は組成物の量を指す。よって、それは、疾患又は障害の徴候を予防、治癒、改善、阻止又は部分的に阻止するために必要な量である。
【0041】
融合タンパク質
一態様において、式（Ｉ）又は（Ｉ’）の構造を有する融合タンパク質を提供し、
［Ｂ－Ｓｐ１－Ｌｋ－Ｓｐ２］ｍ－Ａ （Ｉ）
Ａ－［Ｓｐ１－Ｌｋ－Ｓｐ２－Ｂ］ｍ （Ｉ’）
式中、
Ａは抗ＰＤ－Ｌ１抗体であり、
Ｂはインターロイキン２１（ＩＬ２１）であり、
Ｓｐ１及びＳｐ２はそれぞれ独立してスペーサーであるか又は存在せず、
Ｌｋは、ソルターゼのアクセプター基質認識配列とドナー基質認識配列のコンジュゲーションによって形成されたリンカーであり、
ｍは１～４の整数である。
一態様において、式（Ｉ）又は（Ｉ’）の構造を有する融合タンパク質を提供し、
［Ｂ－Ｓｐ１－Ｌｋ－Ｓｐ２］ｍ－Ａ （Ｉ）
Ａ－［Ｓｐ１－Ｌｋ－Ｓｐ２－Ｂ］ｍ （Ｉ’）
式中、
Ａは抗ＰＤ－Ｌ１抗体であり、
Ｂはインターロイキン２１（ＩＬ２１）であり、
Ｓｐ１及びＳｐ２はそれぞれ独立してスペーサーであるか又は存在せず、
Ｌｋは、ソルターゼのアクセプター基質認識配列とドナー基質認識配列のコンジュゲーションによって形成されたリンカーであり、
ｍは１～４の整数である。
【0042】
融合タンパク質は、リンカーを介してコンジュゲートされた抗ＰＤ－Ｌ１抗体とインターロイキン２１（ＩＬ２１）を含む抗体－サイトカイン融合タンパク質（免疫サイトカインとも呼ばれる）であり、ここでリンカーは、ソルターゼのドナー基質認識配列とコンジュゲートされたアクセプター基質認識配列を含む。いくつかの実施形態において、リンカーは、ソルターゼによって認識されたアクセプター基質認識配列とドナー基質認識配列のソルターゼ媒介部位特異的コンジュゲーションによって形成され、ここで、認識配列の一方は抗ＰＤ－Ｌ１抗体に連結されて抗体部分を形成し、認識配列の他方はＩＬ２１に連結されてサイトカイン部分を形成する。
【0043】
式（Ｉ）中、ＩＬ２１は、ドナー基質認識配列に連結され、抗ＰＤ－Ｌ１抗体はアクセプター基質認識配列に連結される。式（Ｉ’）中、抗ＰＤ－Ｌ１抗体はドナー基質認識配列に連結され、ＩＬ２１はアクセプター基質認識配列に連結される。ソルターゼの酵素作用によって、アクセプター及びドナー基質認識配列は、抗ＰＤ－Ｌ１抗体とＩＬ２１の間のリンカーを形成する。任意に、スペーサーが認識配列と抗ＰＤ－Ｌ１抗体及び／又はＩＬ２１の間に挿入されて空間的分離を提供する。
【0044】
式（Ｉ）及び（Ｉ’）は、それぞれ、ＩＬ２１又は抗ＰＤ－Ｌ１抗体とリンカーの間の連結を定義するが、ＩＬ２１が抗ＰＤ－Ｌ１抗体にコンジュゲートされる位置を限定することが意図されない。式（Ｉ）及び（Ｉ’）のいずれかにおいて、ＩＬ２１は、抗ＰＤ－Ｌ１抗体の任意の位置にコンジュゲートすることができる。
【0045】
いくつかの実施形態において、抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、軽鎖及び重鎖を含む。１つの実施形態において、ＩＬ２１は、抗ＰＤ－Ｌ１抗体の軽鎖及び／又は重鎖のＮ末端でコンジュゲートされる。１つの実施形態において、ＩＬ２１は、抗ＰＤ－Ｌ１抗体の軽鎖及び／又は重鎖のＣ末端でコンジュゲートされる。いくつかの実施形態において、ＩＬ２１は、抗ＰＤ－Ｌ１抗体の非末端位置でコンジュゲートされる。
【0046】
いくつかの好ましい実施形態において、式（Ｉ）中、ＩＬ２１は、抗ＰＤ－Ｌ１抗体の軽鎖及び／又は重鎖のＮ末端でコンジュゲートされる。特定の実施形態において、ＩＬ２１は、抗ＰＤ－Ｌ１抗体の重鎖のＮ末端でコンジュゲートされる。
【0047】
いくつかの好ましい実施形態において、式（Ｉ’）中、ＩＬ２１は、抗ＰＤ－Ｌ１抗体の軽鎖及び／又は重鎖のＣ末端でコンジュゲートされる。特定の実施形態において、ＩＬ２１は抗ＰＤ－Ｌ１抗体の重鎖のＣ末端でコンジュゲートされる。
【0048】
ｍは、抗ＰＤ－Ｌ１抗体にコンジュゲートされたＩＬ２１の数を表す。抗ＰＤ－Ｌ１抗体に連結されるドナー又はアクセプター基質認識配列の数を制御することで、１つ又は複数のＩＬ２１を抗ＰＤ－Ｌ１抗体にコンジュゲートすることができる。いくつかの好ましい実施形態において、ｍは１、２、３及び４から選択される整数である。特定の実施形態において、ｍは１である。別の特定の実施形態において、ｍは２である。
【0049】
抗ＰＤ－Ｌ１抗体
「Ｂ７Ｈ１」又は「ＣＤ２７４」とも呼ばれる「プログラム細胞死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）」は、免疫抑制性受容体プログラム細胞死１（ＰＤ－１）のリガンドである。ＰＤ－Ｌ１は、任意の種、例えばヒト、サル、チンパンジー、ウシ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、ウマ、ラット、マウス、モルモット、ウサギ等からのものであり得る。好ましくは、ＰＤ－Ｌ１はヒトＰＤ－Ｌ１である。ヒトＰＤ－Ｌ１（ｈＰＤ－Ｌ１）の全アミノ酸配列は、例えばＵｎｉｐｒｏｔ及びＧｅｎＢａｎｋ等の公共データベースから入手できる。抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、ＰＤ－Ｌ１（例えば、Ｕｎｉｐｒｏｔ識別名Ｑ９ＮＺＱ７－１、Ｑ９ＮＺＱ７－２又はＱ９ＮＺＱ７－３に示すアミノ酸配列を含むＰＤ－Ｌ１）又はその断片に対する任意の抗体であり得る。好ましくは、抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、ＰＤ－Ｌ１とＰＤ－１の間の結合を遮断し、ＰＤ－Ｌ１シグナル伝達を阻害する。抗ＰＤ－Ｌ１抗体の例としては、アテゾリズマブ（Ｔｅｃｅｎｔｒｉｑ）、アベルマブ（Ｂａｖｅｎｃｉｏ）、デュルバルマブ（Ｉｍｆｉｎｚｉ）又は３Ｆ２（その全ての内容が参照によって本明細書に組み込まれるＷＯ２０２０１６９０６２Ａ１を参照）を含むが、それらに限定されない。抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、更なる修飾を含み得る。修飾は、未修飾抗体と比較した１つ又は複数のアミノ酸付加、欠失、挿入及び／又は置換を含み得る。抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ又は３Ｆ２から調製された操作された抗体であり得る。
「Ｂ７Ｈ１」又は「ＣＤ２７４」とも呼ばれる「プログラム細胞死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）」は、免疫抑制性受容体プログラム細胞死１（ＰＤ－１）のリガンドである。ＰＤ－Ｌ１は、任意の種、例えばヒト、サル、チンパンジー、ウシ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、ウマ、ラット、マウス、モルモット、ウサギ等からのものであり得る。好ましくは、ＰＤ－Ｌ１はヒトＰＤ－Ｌ１である。ヒトＰＤ－Ｌ１（ｈＰＤ－Ｌ１）の全アミノ酸配列は、例えばＵｎｉｐｒｏｔ及びＧｅｎＢａｎｋ等の公共データベースから入手できる。抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、ＰＤ－Ｌ１（例えば、Ｕｎｉｐｒｏｔ識別名Ｑ９ＮＺＱ７－１、Ｑ９ＮＺＱ７－２又はＱ９ＮＺＱ７－３に示すアミノ酸配列を含むＰＤ－Ｌ１）又はその断片に対する任意の抗体であり得る。好ましくは、抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、ＰＤ－Ｌ１とＰＤ－１の間の結合を遮断し、ＰＤ－Ｌ１シグナル伝達を阻害する。抗ＰＤ－Ｌ１抗体の例としては、アテゾリズマブ（Ｔｅｃｅｎｔｒｉｑ）、アベルマブ（Ｂａｖｅｎｃｉｏ）、デュルバルマブ（Ｉｍｆｉｎｚｉ）又は３Ｆ２（その全ての内容が参照によって本明細書に組み込まれるＷＯ２０２０１６９０６２Ａ１を参照）を含むが、それらに限定されない。抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、更なる修飾を含み得る。修飾は、未修飾抗体と比較した１つ又は複数のアミノ酸付加、欠失、挿入及び／又は置換を含み得る。抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ又は３Ｆ２から調製された操作された抗体であり得る。
【0050】
いくつかの実施形態において、抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、ポリクローナル抗体である。いくつかの実施形態において、抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、モノクローナル抗体である。ポリクローナル及びモノクローナル抗体を産生するための方法は当分野で既知である。例えば、抗原としてのＰＤ－Ｌ１断片は、哺乳動物、例えば、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ハムスター、ヤギ又はヒツジを免疫化するために使用され得、そしてポリクローナル抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、免疫化された哺乳動物の血清から精製され得る。抗ＰＤ－Ｌ１抗体分泌Ｂ細胞は、免疫化された哺乳動物から単離され、骨髄腫細胞と融合してモノクローナル抗ＰＤ－Ｌ１抗体を産生することができる。あるいは、モノクローナル抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、ファージディスプレイ技術及び組換えＤＮＡ技術を使用して生成され得る。
【0051】
いくつかの実施形態において、抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ、３Ｆ２又はそれらの操作された抗体である。特定の実施形態において、抗ＰＤ－Ｌ１抗体はアテゾリズマブ又はその操作された抗体である。別の特定の実施形態において、抗ＰＤ－Ｌ１抗体は抗ＰＤ－Ｌ１抗体３Ｆ２又はその操作された抗体である。
【0052】
いくつかの実施形態において、抗体は、軽鎖可変領域（ＶＬ）及び重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。１つの実施形態において、ＶＬは、配列番号２２に示すＣＤＲＬ１配列、配列番号２３に示すＣＤＲＬ２配列及び配列番号２４に示すＣＤＲＬ３配列を含み、ＶＨは、配列番号２５に示すＣＤＲＨ１配列、配列番号２６に示すＣＤＲＨ２配列及び配列番号２７に示すＣＤＲＨ３配列を含む。別の実施形態において、ＶＬは、配列番号２８に示すＣＤＲＬ１配列、配列番号２９に示すＣＤＲＬ２配列及び配列番号３０に示すＣＤＲＬ３配列を含み、ＶＨは、配列番号３１に示すＣＤＲＨ１配列、配列番号３２に示すＣＤＲＨ２配列及び配列番号３３に示すＣＤＲＨ３配列を含む。
【0053】
別の実施形態において、ＶＬは配列番号３４のアミノ酸配列を含み、ＶＨは配列番号３５のアミノ酸配列を含む。更に別の実施形態において、ＶＬは配列番号３６のアミノ酸配列を含み、ＶＨは配列番号３７のアミノ酸配列を含む。
【0054】
いくつかの実施形態において、抗体は、軽鎖及び重鎖を含む。１つの実施形態において、軽鎖は配列番号１のアミノ酸配列を含み、重鎖は配列番号２のアミノ酸配列を含む。別の実施形態において、軽鎖は配列番号３のアミノ酸配列を含み、重鎖は配列番号４のアミノ酸配列を含む。
【0055】
抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、ファージディスプレイ技術、ハイブリドーマ技術、組換えＤＮＡ技術及び化学合成に限定されない当分野で既知の方法によって得られ得る。抗ＰＤ－Ｌ１抗体は様々な供給源から、例えば、酵母ディスプレイライブラリ又はファージディスプレイライブラリ（例えば、Ｗｉｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．， （１９９４） Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １２：４３３－４５５ ａｎｄ ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．， （１９９０） Ｎａｔｕｒｅ ３４８：５５２－５５３を参照）又はヒト末梢血から、単離され得る。例えば、抗体は、一般に抗体産生用の宿主細胞（例えば、酵母細胞、細菌、昆虫細胞又は哺乳動物細胞）内で発現され得る。抗体発現に好適な哺乳動物宿主細胞としては、骨髄腫細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨＥＫ２９３細胞及び他の抗体発現に好適な哺乳動物細胞を含むが、それらに限定されない。特定の実施形態において、哺乳動物宿主細胞は抗ＰＤ－Ｌ１抗体の軽鎖及び重鎖をコードする発現ベクターで形質転換され、発現された抗体は、タンパク質Ａ親和性カラムを使用して精製される。シグナルペプチドは、抗体の発現、正確な折り畳み及び細胞外分泌を助けることで、抗体の品質、収率及び精製を改善するために使用され得る。軽鎖及び重鎖に付加できるシグナルペプチドの例示的な配列は、それぞれ、配列番号１６及び配列番号１７に示す。
【0056】
インターロイキン２１（ＩＬ２１）
インターロイキン２１（ＩＬ２１）は、およそ１４ｋＤａの４αヘリックスバンドルサイトカインである。ＩＬ２１は、ＩＬ２１受容体（ＩＬ２１Ｒ）及び共通サイトカインγ鎖（ガンマｃ）からなる複合受容体への結合によってシグナル伝達する。特定の理論に縛られることを望むものではないが、ＩＬ２１シグナル伝達は、マクロファージ、Ｂ細胞、ＣＤ４＋ Ｔ細胞、ＣＤ８＋ Ｔ細胞、細胞毒性Ｔ細胞及びナチュラルキラー細胞を含む様々な標的免疫細胞の増殖、分化、又は活性を誘導することで、体液性免疫応答及び細胞媒介免疫応答の両方を強化する。
インターロイキン２１（ＩＬ２１）は、およそ１４ｋＤａの４αヘリックスバンドルサイトカインである。ＩＬ２１は、ＩＬ２１受容体（ＩＬ２１Ｒ）及び共通サイトカインγ鎖（ガンマｃ）からなる複合受容体への結合によってシグナル伝達する。特定の理論に縛られることを望むものではないが、ＩＬ２１シグナル伝達は、マクロファージ、Ｂ細胞、ＣＤ４＋ Ｔ細胞、ＣＤ８＋ Ｔ細胞、細胞毒性Ｔ細胞及びナチュラルキラー細胞を含む様々な標的免疫細胞の増殖、分化、又は活性を誘導することで、体液性免疫応答及び細胞媒介免疫応答の両方を強化する。
【0057】
ＩＬ２１は、任意の種、例えば、サル、チンパンジー、ウシ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、ウマ、ラット、マウス、モルモット、ウサギ等からのものであり得る。好ましくは、ＩＬ２１は、ヒトＩＬ２１（ｈＩＬ２１）である。２つのｈＩＬ２１前駆体、即ちＵｎｉＰｒｏｔ識別名Ｑ９ＨＢＥ４－１（配列番号７、アイソフォーム１前駆体）及びＵｎｉＰｒｏｔ識別名Ｑ９ＨＢＥ４－２（配列番号８、アイソフォーム２前駆体）が同定されており、最初の２４のａａがシグナルペプチドである。野生型ＩＬ２１は、シグナルペプチドを欠いた成熟タンパク質として分泌される場合が多い。成熟ｈＩＬ２１の例示的なアミノ酸配列は、配列番号９（アイソフォーム１）及び配列番号１０（アイソフォーム２）に示す。
【0058】
ＩＬ２１は、野生型ＩＬ２１又はその変異体であり得る。野生型ＩＬ２１は配列番号９又は配列番号１０のアミノ酸配列を有し得る。ＩＬ２１変異体は、配列番号９又は配列番号１０と比較して１つ又は複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０）のアミノ酸置換、付加又は欠失を含み得る。いくつかの実施形態において、ＩＬ２１変異体は、配列番号９又は配列番号１０と少なくとも約３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＩＬ２１変異体は、野生型ＩＬ２１と比較してより低い親和性でＩＬ２１Ｒに結合する。かかるＩＬ２１変異体の例は、関連内容の全てが参照によって本明細書に組み込まれる、Ｓｈｅｎ ｅｔ． ａｌ．， Ｆｒｏｎｔ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， （２０２０） １１：８３２及びＷＯ２０１９０２８３１６Ａ１に記載のＩＬ２１ムテインを含み得る。
【0059】
ＩＬ２１は、当分野で既知の方法によって得ることができる。例えば、ＩＬ２１のコード配列は、組換えＤＮＡ技術によって生成され、ＩＬ２１の発現に好適な宿主細胞に導入され得る。例示的な宿主細胞としては、酵母細胞、細菌、真菌、昆虫細胞及び哺乳動物細胞を含み得るが、それらに限定されない。１つの実施形態において、ＩＬ２１は、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）内で発現される。
【0060】
アクセプター及びドナー基質認識配列
アクセプター及びドナー基質認識配列は、使用されるソルターゼのタイプに対応する。ソルターゼは、天然ソルターゼ、非天然ソルターゼ又はそれらの組み合わせであってもよい。天然ソルターゼは、ソルターゼＡ（ＳｒｔＡ）、ソルターゼＢ（ＳｒｔＢ）、ソルターゼＣ（ＳｒｔＣ）、ソルターゼＤ（ＳｒｔＤ）、ソルターゼＥ（ＳｒｔＥ）、ソルターゼＦ（ＳｒｔＦ）等を含み得る（例えば、ＵＳ２０１１０３２１１８３Ａ１及びＥＰ３６４７４１９Ａ１を参照）。
アクセプター及びドナー基質認識配列は、使用されるソルターゼのタイプに対応する。ソルターゼは、天然ソルターゼ、非天然ソルターゼ又はそれらの組み合わせであってもよい。天然ソルターゼは、ソルターゼＡ（ＳｒｔＡ）、ソルターゼＢ（ＳｒｔＢ）、ソルターゼＣ（ＳｒｔＣ）、ソルターゼＤ（ＳｒｔＤ）、ソルターゼＥ（ＳｒｔＥ）、ソルターゼＦ（ＳｒｔＦ）等を含み得る（例えば、ＵＳ２０１１０３２１１８３Ａ１及びＥＰ３６４７４１９Ａ１を参照）。
【0061】
典型的なアクセプター基質認識配列は、グリシン及びアラニンのＮ末端アミノ基等のようなＮ末端アミノ基を求核剤として含む。いくつかの実施形態において、アクセプター基質認識配列は、グリシン（Ｇ）及びアラニン（Ａ）からなる群から選択される１～１００個の直列接続構造単位を含む。好ましい実施形態において、アクセプター基質認識配列は、（Ｇ）ｎの配列を含み、ここでｎは２～２０の整数、特に３である。
【0062】
いくつかの実施形態において、ドナー基質認識配列はＸ１Ｘ２Ｘ３ＴＸ４Ｘ５であり、ここでＸ１はロイシン（Ｌ）又はアスパラギン（Ｎ）であり、Ｘ２はプロリン（Ｐ）又はアラニン（Ａ）であり、Ｘ３は任意の天然又は非天然アミノ酸であり、Ｘ４はグリシン（Ｇ）、セリン（Ｓ）又はアスパラギン（Ｎ）であるか又は存在せず、Ｘ５は１～１０個のアミノ酸を含むアミノ酸配列であるか又は存在しない。好ましい実施形態において、Ｘ３はグルタミン酸（Ｅ）である。１つの実施形態において、Ｘ５は存在しない。別の実施形態において、Ｘ５は１～１０個のアミノ酸を含むアミノ酸配列であり、ここで各アミノ酸は独立して任意の天然又は非天然アミノ酸である。
【0063】
いくつかの実施形態において、ソルターゼは、ＳｒｔＡ、例えば黄色ブドウ球菌からのＳｒｔＡであり、Ｘ１Ｘ２Ｘ３ＴＸ４Ｘ５はＬＰＸ３ＴＧＧ（配列番号３９）であってもよく、ここでＸ３は任意の天然又は非天然アミノ酸である。いくつかの実施形態において、ソルターゼは、ＳｒｔＢであり、Ｘ１Ｘ２Ｘ３ＴＸ４Ｘ５はＮＰＸ３ＴＧＧ（配列番号４６）であってもよく、ここでＸ３は任意の天然又は非天然アミノ酸である。いくつかの実施形態において、ソルターゼは、ＳｒｔＣであり、Ｘ１Ｘ２Ｘ３ＴＸ４Ｘ５はＬＰＸ３ＴＧＧであってもよく、ここでＸ３は任意の天然又は非天然アミノ酸である。いくつかの他の実施形態において、ソルターゼは、ＳｒｔＤであり、Ｘ１Ｘ２Ｘ３ＴＸ４Ｘ５はＬＰＸ３ＴＡ（配列番号４７）であってもよく、ここでＸ３は任意の天然又は非天然アミノ酸である。更に他のいくつかの実施形態において、ソルターゼは、ＳｒｔＥであり、Ｘ１Ｘ２Ｘ３ＴＸ４Ｘ５はＬＡＸ３ＴＧＧ（配列番号４８）であってもよく、ここでＸ３は任意の天然又は非天然アミノ酸である。いくつかの他の実施形態において、ソルターゼは、ＳｒｔＦであり、Ｘ１Ｘ２Ｘ３ＴＸ４Ｘ５はＬＰＸ３ＴＧ（配列番号４９）であってもよく、ここでＸ３は、Ａ、Ｒ、Ｅ、Ｎ、Ｄ、Ｑ、Ｉ、Ｌ及びＫからなる群から選択される。いくつかの他の実施形態において、ソルターゼは、化膿連鎖球菌からのＳｒｔＡであり、Ｘ１Ｘ２Ｘ３ＴＸ４Ｘ５はＬＰＸ３ＴＧＸ５（配列番号５０）であってもよく、ここでＸ５は上記で定義された通りである。いくつかの実施形態において、ソルターゼは、ストレプトマイセス・セリカラーからのＳｒｔＥであり、Ｘ１Ｘ２Ｘ３ＴＸ４Ｘ５はＬＡＸ３ＴＧ（配列番号４２）であってもよい。更に別の実施形態において、ソルターゼはラクトバチルス・プランタルムからのＳｒｔＡであり、Ｘ１Ｘ２Ｘ３ＴＸ４Ｘ５はＬＰＱＴＳＥＱ（配列番号４３）であってもよい。１つの実施形態において、ソルターゼは黄色ブドウ球菌からのＳｒｔＢであり、Ｘ１Ｘ２Ｘ３ＴＸ４Ｘ５はＮＰＱＴＮ（配列番号４０）であってもよい。別の実施形態において、ソルターゼは炭疽菌からのＳｒｔＢであり、Ｘ１Ｘ２Ｘ３ＴＸ４Ｘ５はＮＰＫＴＧ（配列番号４１）であってもよい。
【0064】
いくつかの特定の実施形態において、ソルターゼは、黄色ブドウ球菌からのＳｒｔＡである。したがって、Ｘ１Ｘ２Ｘ３ＴＸ４Ｘ５は、酵素の典型的なドナー基質認識配列ＬＰＸ３ＴＧＧであってもよく、ここでＸ３は、天然又は非天然の任意の単一アミノ酸であってもよい。いくつかの実施形態において、Ｘ１Ｘ２Ｘ３ＴＸ４Ｘ５はＬＰＸ３ＴＧＸ５であり、ここでＸ３は天然又は非天然の任意の単一アミノ酸であり、Ｘ５は存在しないか又は１～１０個のアミノ酸を含むアミノ酸配列である。１つの実施形態において、Ｘ５は存在しない。別の実施形態において、Ｘ５は１～１０個のアミノ酸を含むアミノ酸配列であり、ここで各アミノ酸は独立して任意の天然又は非天然アミノ酸である。特定の実施形態において、Ｘ５は（Ｇ）ｉであり、ここでｉは１～１０の整数である。別の特定の実施形態において、Ｘ１Ｘ２Ｘ３ＴＸ４Ｘ５はＬＰＥＴＧ（配列番号４４）である。更に別の特定の実施形態において、Ｘ１Ｘ２Ｘ３ＴＸ４Ｘ５はＬＰＥＴＧＧ（配列番号４５）である。
【0065】
典型的なソルターゼ触媒コンジュゲーション反応において、ソルターゼはドナー基質認識配列Ｘ１Ｘ２Ｘ３ＴＸ４Ｘ５をトレオニン残基で切断する。切断により、トレオニン残基の下流断片（－Ｘ４Ｘ５）が放出され、上流断片（Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｔ－）は、ソルターゼの活性部位システインとトレオニン－チオエステルを形成してアシル酵素中間体を生成する。続いて、中間体は、ソルターゼに結合したチオエステルをアクセプター基質認識配列のＮ末端アミノ基に連結することで脱アシル化される。（Ｇ）ｎがアクセプター基質認識配列として使用される場合、その形成したリンカーＬｋはＸ１Ｘ２Ｘ３Ｔ（Ｇ）ｎの配列を有し、ここでＸ１はロイシン（Ｌ）又はアスパラギン（Ｎ）であり、Ｘ２はプロリン（Ｐ）又はアラニン（Ａ）であり、Ｘ３は任意の天然又は非天然アミノ酸であり、ｎは２～２０の整数、特に３である。
【0066】
いくつかの実施形態において、Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｔ（Ｇ）ｎはＬＰＸ３Ｔ（Ｇ）ｎ（配列番号５１）、ＮＰＸ３Ｔ（Ｇ）ｎ（配列番号５２）又はＬＡＸ３Ｔ（Ｇ）ｎ（配列番号５３）であり、ここでＬはロイシンであり、Ｐはプロリンであり、Ｎはアスパラギンであり、Ａはアラニンであり、Ｘ３は任意の天然又は非天然アミノ酸であり、Ｔはトレオニンであり、Ｇはグリシンであり、ｎは２～２０の整数、特に３である。１つの実施形態において、ｎは２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９及び２０から選択される。好ましい実施形態において、ｎは３である。
【0067】
いくつかの実施形態において、Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｔ（Ｇ）ｎはＬＰＸ３Ｔ（Ｇ）ｎであり、ここでＸ３は任意の天然又は非天然アミノ酸であり、ｎは上記で定義された通りである。１つの実施形態において、Ｘ３はグルタミン酸（Ｅ）である。特定の実施形態において、Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｔ（Ｇ）ｎはＬＰＥＴＧＧＧ（配列番号５４）である。別の実施形態において、Ｘ３はグルタミン（Ｑ）である。特定の実施形態において、Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｔ（Ｇ）ｎはＬＰＱＴＧＧＧ（配列番号５５）である。
【0068】
更に別の実施形態において、Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｔ（Ｇ）ｎはＬＡＸ３Ｔ（Ｇ）ｎであり、ここでＸ３は任意の天然又は非天然アミノ酸であり、ｎは上記で定義された通りである。好ましい実施形態において、Ｘ３はＥである。
【0069】
別の実施形態において、Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｔ（Ｇ）ｎはＮＰＱＴ（Ｇ）ｎ（配列番号５６）又はＮＰＫＴ（Ｇ）ｎ（配列番号５７）であり、ｎは上記で定義された通りである。
【0070】
スペーサー
いくつかの実施形態において、Ｓｐ１及びＳｐ２の少なくとも一方はスペーサーである。いくつかの実施形態において、Ｓｐ１及びＳｐ２はそれぞれ独立してスペーサーである。
いくつかの実施形態において、Ｓｐ１及びＳｐ２の少なくとも一方はスペーサーである。いくつかの実施形態において、Ｓｐ１及びＳｐ２はそれぞれ独立してスペーサーである。
【0071】
いくつかの実施形態において、スペーサーは、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）及びセリン（Ｓ）からなる群から選択される１～１００個の直列接続構造単位を含む。いくつかの実施形態において、スペーサーはＧＡ、ＧＧＧ、ＧＡＧ及び（Ｇ）ｏＳ（（Ｇ）ｓＳ）ｔ（配列番号５９）からなる群から選択され、ここでｏは１～５の整数であり、ｓは１～１０の整数、特に４であり、ｔは０又は１～１０の整数である。特定の実施形態において、Ｓｐ１は、ＧＡの配列を有するスペーサーであり、Ｓｐ２は、ＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号５８）の配列を有するスペーサーである。
【0072】
融合タンパク質の具体的な実施形態
本開示に係る融合タンパク質の例示的な実施形態を以下に提供する。
本開示に係る融合タンパク質の例示的な実施形態を以下に提供する。
【0073】
いくつかの実施形態において、ＬｋはＸ１Ｘ２Ｘ３Ｔ（Ｇ）ｎであり、融合タンパク質は（ＩＩ）又は（ＩＩ’）の構造を有し、
［Ｂ－Ｓｐ１－Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｔ（Ｇ）ｎ－Ｓｐ２］ｍ－Ａ （ＩＩ）
Ａ－［Ｓｐ１－Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｔ（Ｇ）ｎ－Ｓｐ２－Ｂ］ｍ （ＩＩ’）
式中、Ｘ１はロイシン（Ｌ）又はアスパラギン（Ｎ）であり、Ｘ２はプロリン（Ｐ）又はアラニン（Ａ）であり、Ｘ３は任意の天然又は非天然アミノ酸であり、ｎは２～２０の整数であり、
ｍは１又は２であり、
Ａ、Ｂ、Ｓｐ１及びＳｐ２は上記で定義された通りである。
［Ｂ－Ｓｐ１－Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｔ（Ｇ）ｎ－Ｓｐ２］ｍ－Ａ （ＩＩ）
Ａ－［Ｓｐ１－Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｔ（Ｇ）ｎ－Ｓｐ２－Ｂ］ｍ （ＩＩ’）
式中、Ｘ１はロイシン（Ｌ）又はアスパラギン（Ｎ）であり、Ｘ２はプロリン（Ｐ）又はアラニン（Ａ）であり、Ｘ３は任意の天然又は非天然アミノ酸であり、ｎは２～２０の整数であり、
ｍは１又は２であり、
Ａ、Ｂ、Ｓｐ１及びＳｐ２は上記で定義された通りである。
【0074】
いくつかの実施形態において、Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｔ（Ｇ）ｎはＬＰＸ３Ｔ（Ｇ）ｎである。１つの実施形態において、Ｘ３はＥである。別の実施形態において、Ｘ３はＱである。
【0075】
いくつかの実施形態において、Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｔ（Ｇ）ｎはＬＡＸ３Ｔ（Ｇ）ｎである。１つの実施形態において、Ｘ３はＥ又はＱである。
【0076】
いくつかの実施形態において、抗ＰＤ－Ｌ１抗体はアテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ、３Ｆ２又はそれらの操作された抗体である。特定の実施形態において、抗ＰＤ－Ｌ１抗体はＡｂ０００１（アテゾリズマブ）であり、配列番号１のアミノ酸配列を有する軽鎖及び配列番号２のアミノ酸配列を有する重鎖を含む。別の実施形態において、抗ＰＤ－Ｌ１抗体はＡｂ０００２（３Ｆ２）であり、配列番号３のアミノ酸配列を有する軽鎖及び配列番号４のアミノ酸配列を有する重鎖を含む。
【0077】
いくつかの実施形態において、ＩＬ２１は、野生型ＩＬ２１又はその変異体である。１つの実施形態において、ＩＬ２１は配列番号９又は配列番号１０のアミノ酸配列を含む。
【0078】
１つの実施形態において、式（ＩＩ）又は（ＩＩ’）中、ｎは３である。
【0079】
いくつかの実施形態において、Ｓｐ１及びＳｐ２は存在しない。いくつかの実施形態において、Ｓｐ１及びＳｐ２の少なくとも一方は、本明細書に記載のスペーサーである。いくつかの実施形態において、Ｓｐ１及びＳｐ２はそれぞれ独立してスペーサーである。１つの実施形態において、Ｓｐ１はＧＡであり、Ｓｐ２はＧＳＧＧＧＧＳである。
【0080】
１つの実施形態において、Ｓｐ１はＧＡであり、ドナー基質認識配列はＬＰＥＴＧＧであり、アクセプター基質認識配列はＧＧＧであり、Ｓｐ２はＧＳＧＧＧＧＳであり、融合タンパク質は（ＩＩＩ）又は（ＩＩＩ’）の構造を有する。
［Ｂ－ＧＡＬＰＥＴＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ］ｍ－Ａ （ＩＩＩ）
Ａ－［ＧＡＬＰＥＴＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ－Ｂ］ｍ （ＩＩＩ’）
ＧＡＬＰＥＴＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳは、配列番号６０として示される。
［Ｂ－ＧＡＬＰＥＴＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ］ｍ－Ａ （ＩＩＩ）
Ａ－［ＧＡＬＰＥＴＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ－Ｂ］ｍ （ＩＩＩ’）
ＧＡＬＰＥＴＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳは、配列番号６０として示される。
【0081】
１つの実施形態において、式（Ｉ）、（Ｉ’）、（ＩＩ）、（ＩＩ’）、（ＩＩＩ）及び（ＩＩＩ’）のいずれか中、抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、配列番号１のアミノ酸配列を有する軽鎖及び配列番号２のアミノ酸配列を有する重鎖、又は配列番号３のアミノ酸配列を有する軽鎖及び配列番号４のアミノ酸配列を有する重鎖を含み、ＩＬ２１は配列番号９又は配列番号１０のアミノ酸配列を含み、ｍは１又は２である。
【0082】
いくつかの実施形態において、式（Ｉ）、（ＩＩ）及び（ＩＩＩ）のいずれか中、抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、軽鎖及び重鎖を含む。１つの実施形態において、ＩＬ２１は抗ＰＤ－Ｌ１抗体の軽鎖及び／又は重鎖のＮ末端でコンジュゲートされる。特定の実施形態において、ＩＬ２１は抗ＰＤ－Ｌ１抗体の重鎖のＮ末端でコンジュゲートされる。
【0083】
いくつかの他の実施形態において、式（Ｉ’）、（ＩＩ’）及び（ＩＩＩ’）のいずれか中、抗ＰＤ－Ｌ１抗体は軽鎖及び重鎖を含む。１つの実施形態において、ＩＬ２１は抗ＰＤ－Ｌ１抗体の軽鎖及び／又は重鎖のＣ末端でコンジュゲートされる。特定の実施形態において、ＩＬ２１は抗ＰＤ－Ｌ１抗体の重鎖のＣ末端でコンジュゲートされる。
【0084】
いくつかの実施形態において、抗ＰＤ－Ｌ１抗体は２つの同一の軽鎖及び２つの同一の重鎖を含み、そのうち各軽鎖が配列番号１のアミノ酸配列を含み、各重鎖が配列番号２のアミノ酸配列を含み、又は各軽鎖が配列番号３のアミノ酸配列を含み、各重鎖が配列番号４のアミノ酸配列を含む。１つの実施形態において、ＩＬ２１は抗ＰＤ－Ｌ１抗体の重鎖のうち少なくとも１つのＮ末端にコンジュゲートされる。１つの実施形態において、本開示に係る融合タンパク質は、２つの同一の軽鎖部分及び２つの同一の重鎖部分を含み、そのうち各重鎖部分が抗ＰＤ－Ｌ１抗体の重鎖の各々のＮ末端にコンジュゲートされたＩＬ２１を含む。別の実施形態において、本開示に係る融合タンパク質は２つの同一の軽鎖部分及び２つの異なる重鎖部分を含み、そのうち重鎖部分の一方のみが、抗ＰＤ－Ｌ１抗体の重鎖のうちの１つにコンジュゲートされたＩＬ２１を含む。
【0085】
特定の実施形態において、融合タンパク質は２つの同一の重鎖部分及び２つの同一の軽鎖部分を含み、そのうち、
（１）重鎖部分の各々が配列番号１８又は配列番号２０のアミノ酸配列を含み、軽鎖部分の各々が配列番号１のアミノ酸配列を含み、又は
（２）重鎖部分の各々が配列番号１９又は配列番号２１のアミノ酸配列を含み、軽鎖部分の各々が配列番号３のアミノ酸配列を含む。
（１）重鎖部分の各々が配列番号１８又は配列番号２０のアミノ酸配列を含み、軽鎖部分の各々が配列番号１のアミノ酸配列を含み、又は
（２）重鎖部分の各々が配列番号１９又は配列番号２１のアミノ酸配列を含み、軽鎖部分の各々が配列番号３のアミノ酸配列を含む。
【0086】
別の特定の実施形態において、融合タンパク質は２つの異なる重鎖部分及び２つの同一の軽鎖部分を含み、そのうち、
（１）重鎖部分の一方が配列番号１８又は配列番号２０のアミノ酸配列を含み、重鎖部分の他方が配列番号１４のアミノ酸配列を含み、軽鎖部分の各々が配列番号１のアミノ酸配列を含み、又は
（２）重鎖部分の一方が配列番号１９又は配列番号２１のアミノ酸配列を含み、重鎖部分の他方が配列番号１５のアミノ酸配列を含み、軽鎖部分の各々が配列番号３のアミノ酸配列を含む。
（１）重鎖部分の一方が配列番号１８又は配列番号２０のアミノ酸配列を含み、重鎖部分の他方が配列番号１４のアミノ酸配列を含み、軽鎖部分の各々が配列番号１のアミノ酸配列を含み、又は
（２）重鎖部分の一方が配列番号１９又は配列番号２１のアミノ酸配列を含み、重鎖部分の他方が配列番号１５のアミノ酸配列を含み、軽鎖部分の各々が配列番号３のアミノ酸配列を含む。
【0087】
融合タンパク質の調製方法
いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、ソルターゼの触媒下で、抗ＰＤ－Ｌ１抗体を含む抗体部分を、ＩＬ２１を含むサイトカイン部分にコンジュゲートすることで産生され、ここで抗体部分及びサイトカイン部分の一方はソルターゼのドナー基質認識配列を更に含み、他方はソルターゼのアクセプター基質認識配列を更に含み、それによってドナー基質認識配列及びアクセプター基質認識配列はソルターゼの酵素作用によりコンジュゲートされる。好適なソルターゼ、アクセプター及びドナー基質認識配列は上記に記載されている。
いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、ソルターゼの触媒下で、抗ＰＤ－Ｌ１抗体を含む抗体部分を、ＩＬ２１を含むサイトカイン部分にコンジュゲートすることで産生され、ここで抗体部分及びサイトカイン部分の一方はソルターゼのドナー基質認識配列を更に含み、他方はソルターゼのアクセプター基質認識配列を更に含み、それによってドナー基質認識配列及びアクセプター基質認識配列はソルターゼの酵素作用によりコンジュゲートされる。好適なソルターゼ、アクセプター及びドナー基質認識配列は上記に記載されている。
【0088】
したがって、別の態様において、本開示に係る融合タンパク質を産生するための方法を提供する。
【0089】
１つの実施形態において、本方法は、
（ａ－１）式（Ｉ－１）の構造を有する抗体部分及び式（Ｉ－２）の構造を有するサイトカイン部分を用意するステップと、
［Ｌｋａ－Ｓｐ２］ｍ－Ａ （Ｉ－１）
Ｂ－Ｓｐ１－Ｌｋｄ （Ｉ－２）
（ｂ－１）ソルターゼの存在下で抗体部分をサイトカイン部分にコンジュゲートして式（Ｉ）の構造を有する融合タンパク質を得るステップと、を含み、
［Ｂ－Ｓｐ１－Ｌｋ－Ｓｐ２］ｍ－Ａ （Ｉ）
式中、
Ｌｋａはソルターゼのアクセプター基質認識配列であり、Ｌｋｄは、ソルターゼのドナー基質認識配列であり、
Ａ、Ｂ、Ｓｐ１、Ｓｐ２、Ｌｋ及びｍは上記で定義された通りである。
（ａ－１）式（Ｉ－１）の構造を有する抗体部分及び式（Ｉ－２）の構造を有するサイトカイン部分を用意するステップと、
［Ｌｋａ－Ｓｐ２］ｍ－Ａ （Ｉ－１）
Ｂ－Ｓｐ１－Ｌｋｄ （Ｉ－２）
（ｂ－１）ソルターゼの存在下で抗体部分をサイトカイン部分にコンジュゲートして式（Ｉ）の構造を有する融合タンパク質を得るステップと、を含み、
［Ｂ－Ｓｐ１－Ｌｋ－Ｓｐ２］ｍ－Ａ （Ｉ）
式中、
Ｌｋａはソルターゼのアクセプター基質認識配列であり、Ｌｋｄは、ソルターゼのドナー基質認識配列であり、
Ａ、Ｂ、Ｓｐ１、Ｓｐ２、Ｌｋ及びｍは上記で定義された通りである。
【0090】
別の実施形態において、本方法は、
（ａ－２）式（Ｉ’－１）の構造を有する抗体部分及び式（Ｉ’－２）の構造を有するサイトカイン部分を用意するステップと、
Ａ－［Ｓｐ１－Ｌｋｄ］ｍ （Ｉ’－１）
Ｌｋａ－Ｓｐ２－Ｂ （Ｉ’－２）
（ｂ－２）ソルターゼの存在下で抗体部分をサイトカイン部分にコンジュゲートして式（Ｉ’）の構造を有する融合タンパク質を得るステップと、を含み、
Ａ－［Ｓｐ１－Ｌｋ－Ｓｐ２－Ｂ］ｍ （Ｉ’）
式中、
Ｌｋａはソルターゼのアクセプター基質認識配列であり、Ｌｋｄは、ソルターゼのドナー基質認識配列であり、
Ａ、Ｂ、Ｓｐ１、Ｓｐ２、Ｌｋ及びｍは上記で定義された通りである。
（ａ－２）式（Ｉ’－１）の構造を有する抗体部分及び式（Ｉ’－２）の構造を有するサイトカイン部分を用意するステップと、
Ａ－［Ｓｐ１－Ｌｋｄ］ｍ （Ｉ’－１）
Ｌｋａ－Ｓｐ２－Ｂ （Ｉ’－２）
（ｂ－２）ソルターゼの存在下で抗体部分をサイトカイン部分にコンジュゲートして式（Ｉ’）の構造を有する融合タンパク質を得るステップと、を含み、
Ａ－［Ｓｐ１－Ｌｋ－Ｓｐ２－Ｂ］ｍ （Ｉ’）
式中、
Ｌｋａはソルターゼのアクセプター基質認識配列であり、Ｌｋｄは、ソルターゼのドナー基質認識配列であり、
Ａ、Ｂ、Ｓｐ１、Ｓｐ２、Ｌｋ及びｍは上記で定義された通りである。
【0091】
１つの特定の実施形態において、ステップ（ａ－１）は、
（ａ－１－１）Ｌｋａ－Ｓｐ２を抗ＰＤ－Ｌ１抗体の重鎖のＮ末端に付加して式（Ｉ－１）の構造を有する抗体部分を得るステップと、
［Ｌｋａ－Ｓｐ２］ｍ－Ａ （Ｉ－１）
（ａ－１－２）Ｓｐ１－ＬｋｄをＩＬ２１のＣ末端に付加して式（Ｉ－２）の構造を有するサイトカイン部分を得るステップと、を更に含む。
Ｂ－Ｓｐ１－Ｌｋｄ （Ｉ－２）
（ａ－１－１）Ｌｋａ－Ｓｐ２を抗ＰＤ－Ｌ１抗体の重鎖のＮ末端に付加して式（Ｉ－１）の構造を有する抗体部分を得るステップと、
［Ｌｋａ－Ｓｐ２］ｍ－Ａ （Ｉ－１）
（ａ－１－２）Ｓｐ１－ＬｋｄをＩＬ２１のＣ末端に付加して式（Ｉ－２）の構造を有するサイトカイン部分を得るステップと、を更に含む。
Ｂ－Ｓｐ１－Ｌｋｄ （Ｉ－２）
【0092】
別の特定の実施形態において、ステップ（ａ－２）は、
（ａ－２－１）Ｓｐ１－Ｌｋｄを抗ＰＤ－Ｌ１抗体の重鎖のＣ末端に付加して式（Ｉ’－１）の構造を有する抗体部分を得るステップと、
Ａ－［Ｓｐ１－Ｌｋｄ］ｍ （Ｉ’－１）
（ａ－２－２）Ｌｋａ－Ｓｐ２をＩＬ２１のＮ末端に付加して式（Ｉ’－２）の構造を有するサイトカイン部分を得るステップと、を更に含む。
Ｌｋａ－Ｓｐ２－Ｂ （Ｉ’－２）
（ａ－２－１）Ｓｐ１－Ｌｋｄを抗ＰＤ－Ｌ１抗体の重鎖のＣ末端に付加して式（Ｉ’－１）の構造を有する抗体部分を得るステップと、
Ａ－［Ｓｐ１－Ｌｋｄ］ｍ （Ｉ’－１）
（ａ－２－２）Ｌｋａ－Ｓｐ２をＩＬ２１のＮ末端に付加して式（Ｉ’－２）の構造を有するサイトカイン部分を得るステップと、を更に含む。
Ｌｋａ－Ｓｐ２－Ｂ （Ｉ’－２）
【0093】
１つの実施形態において、Ｌｋａはグリシン（Ｇ）及びアラニン（Ａ）からなる群から選択される１～１００個の直列接続構造単位を含む。特定の実施形態において、Ｌｋａは（Ｇ）ｎの配列を含み、ここでｎは２～２０の整数、特に３である。
【0094】
１つの実施形態において、ＬｋｄはＸ１Ｘ２Ｘ３ＴＸ４Ｘ５の配列を含み、ここで、Ｘ１はＬ又はＮであり、Ｘ２はＰ又はＡであり、Ｘ３は任意の天然又は非天然アミノ酸であり、Ｘ４はＧ、Ｓ又はＮであるか又は存在せず、Ｘ５は１～１０個のアミノ酸を含むアミノ酸配列であるか又は存在しない。特定の実施形態において、Ｘ１Ｘ２Ｘ３ＴＸ４Ｘ５はＬＰＸ３ＴＧ（配列番号３８）、ＬＰＸ３ＴＧＧ、ＮＰＱＴＮ、ＮＰＫＴＧ、ＬＡＸ３ＴＧ又はＬＰＱＴＳＥＱであり、ここでＸ３は任意の天然又は非天然アミノ酸である。特定の実施形態において、Ｘ１Ｘ２Ｘ３ＴＸ４Ｘ５はＬＰＥＴＧ又はＬＰＥＴＧＧである。
【0095】
１つの実施形態において、Ｓｐ１及びＳｐ２は存在しない。１つの実施形態において、Ｓｐ１及びＳｐ２の少なくとも一方は、本明細書に記載のスペーサーである。別の実施形態において、Ｓｐ１及びＳｐ２はそれぞれ独立してスペーサーである。ある実施形態において、スペーサーはＧ、Ａ及びＳからなる群から選択される１～１００個の直列接続構造単位を含む。好ましい実施形態において、スペーサーはＧＡ、ＧＧＧ、ＧＡＧ及び（Ｇ）ｏＳ（（Ｇ）ｓＳ）ｔからなる群から選択され、ここでｏは１～５の整数であり、ｓは１～１０の整数、特に４であり、ｔは０又は１～１０の整数である。特定の実施形態において、Ｓｐ１は、ＧＡの配列を有するスペーサーであり、Ｓｐ２は、ＧＳＧＧＧＧＳの配列を有するスペーサーである。
【0096】
１つの実施形態において、抗ＰＤ－Ｌ１抗体はアテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ、３Ｆ２又はそれらの操作された抗体である。１つの実施形態において、抗ＰＤ－Ｌ１抗体はＶＬ及びＶＨを含み、ここでＶＬ及びＶＨは、本明細書に記載のＣＤＲ配列を含む。別の実施形態において、抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、本明細書に記載の配列を有するＶＬ及びＶＨを含む。特定の実施形態において、抗ＰＤ－Ｌ１抗体は配列番号１のアミノ酸配列を有する軽鎖及び配列番号２のアミノ酸配列を有する重鎖、又は配列番号３のアミノ酸配列を有する軽鎖及び配列番号４のアミノ酸配列を有する重鎖を含む。
【0097】
１つの実施形態において、ＩＬ２１は、野生型ＩＬ２１又はその変異体である。特定の実施形態において、ＩＬ２１は配列番号９又は配列番号１０のアミノ酸配列を含む。
【0098】
抗体部分
抗体部分は、上記に記載の抗ＰＤ－Ｌ１抗体を本明細書に記載のアクセプター基質認識配列又はドナー基質認識配列で修飾することによって生成され得る。修飾は、抗ＰＤ－Ｌ１抗体の任意の位置で発生してもよい。いくつかの実施形態において、修飾は抗ＰＤ－Ｌ１抗体のＮ末端及び／又はＣ末端、例えば、抗体軽鎖のＮ末端及び／又は抗体重鎖のＮ末端で発生する。いくつかの実施形態において、修飾は、抗ＰＤ－Ｌ１抗体の非末端位置、例えば、抗体軽鎖及び／又は重鎖の側鎖で発生する。
抗体部分は、上記に記載の抗ＰＤ－Ｌ１抗体を本明細書に記載のアクセプター基質認識配列又はドナー基質認識配列で修飾することによって生成され得る。修飾は、抗ＰＤ－Ｌ１抗体の任意の位置で発生してもよい。いくつかの実施形態において、修飾は抗ＰＤ－Ｌ１抗体のＮ末端及び／又はＣ末端、例えば、抗体軽鎖のＮ末端及び／又は抗体重鎖のＮ末端で発生する。いくつかの実施形態において、修飾は、抗ＰＤ－Ｌ１抗体の非末端位置、例えば、抗体軽鎖及び／又は重鎖の側鎖で発生する。
【0099】
いくつかの実施形態において、ｍは１、２、３及び４から選択される整数である。特定の実施形態において、ｍは１である。別の特定の実施形態において、ｍは２である。
【0100】
１つの実施形態において、（Ｇ）ｎは抗ＰＤ－Ｌ１抗体の軽鎖のＮ末端に導入される。別の実施形態において、（Ｇ）ｎは抗ＰＤ－Ｌ１抗体の重鎖のＮ末端に導入される。更に別の実施形態において、（Ｇ）ｎは抗ＰＤ－Ｌ１抗体の軽鎖及び重鎖のＮ末端に導入される。（Ｇ）ｎ及び抗ＰＤ－Ｌ１抗体は上記で定義された通りである。
【0101】
１つの実施形態において、Ｘ１Ｘ２Ｘ３ＴＸ４Ｘ５は抗ＰＤ－Ｌ１抗体の軽鎖のＣ末端に導入される。別の実施形態において、Ｘ１Ｘ２Ｘ３ＴＸ４Ｘ５は抗ＰＤ－Ｌ１抗体の重鎖のＣ末端に導入される。更に別の実施形態において、Ｘ１Ｘ２Ｘ３ＴＸ４Ｘ５は抗ＰＤ－Ｌ１抗体の軽鎖及び重鎖のＣ末端に導入される。Ｘ１Ｘ２Ｘ３ＴＸ４Ｘ５及び抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、上記で定義された通りである。
【0102】
いくつかの実施形態において、抗体部分は軽鎖を含み、ここで軽鎖は、１）抗ＰＤ－Ｌ１抗体の軽鎖（ＬＣとする）、２）（Ｇ）ｎがＮ末端に導入された抗ＰＤ－Ｌ１抗体の軽鎖を含むＮ末端修飾軽鎖（ＬＣＮＴとする）、又は３）（Ｇ）ｎ－Ｓｐ２がＮ末端に導入された抗ＰＤ－Ｌ１抗体の軽鎖を含むＮ末端修飾軽鎖（ＬＣＮＴＬとする）であり得る。いくつかの他の実施形態において、抗体部分は重鎖を含み、ここで重鎖は、１）抗ＰＤ－Ｌ１抗体の重鎖（ＨＣとする）、２）（Ｇ）ｎがＮ末端に導入された抗ＰＤ－Ｌ１抗体の重鎖を含むＮ末端修飾重鎖（ＨＣＮＴとする）、又は３）（Ｇ）ｎ－Ｓｐ２がＮ末端に導入された抗ＰＤ－Ｌ１抗体の重鎖を含むＮ末端修飾重鎖（ＨＣＮＴＬとする）であり得る。抗体部分の軽鎖及び重鎖を組み合わせることで、８タイプの抗体部分を得ることができ、式（Ｉ）及び（Ｉ’）中のｍは１、２、３及び４であってもよい。
【0103】
特定の実施形態において、抗体部分はＡｂ００３０であり、抗体Ａｂ０００１に由来する。Ａｂ００３０は配列番号１の軽鎖及び配列番号１４の重鎖を含み、ここで重鎖は、Ｎ末端からＣ末端へ、アクセプター基質認識配列ＧＧＧ、スペーサーＧＳＧＧＧＧＳ、及びＡｂ０００１の重鎖（配列番号２）を含む。
【0104】
別の特定の実施形態において、抗体部分はＡｂ００３３であり、抗体Ａｂ０００２に由来する。Ａｂ００３３は、配列番号３の軽鎖及び配列番号１５の重鎖を含み、ここで重鎖は、Ｎ末端からＣ末端へ、アクセプター基質認識配列ＧＧＧ、スペーサーＧＳＧＧＧＧＳ、及びＡｂ０００２の重鎖（配列番号４）を含む。
【0105】
サイトカイン部分
サイトカイン部分は、それぞれ、上記に記載のＩＬ２１をドナー基質認識配列又はアクセプター基質認識配列で修飾することによって生成され得る。
サイトカイン部分は、それぞれ、上記に記載のＩＬ２１をドナー基質認識配列又はアクセプター基質認識配列で修飾することによって生成され得る。
【0106】
いくつかの実施形態において、抗体部分は、抗ＰＤ－Ｌ１抗体及びアクセプター基質認識配列、例えば（Ｇ）ｎを含み、サイトカイン部分はＩＬ２１及びドナー基質認識配列、例えばＸ１Ｘ２Ｘ３ＴＸ４Ｘ５を含む。いくつかの実施形態において、ドナー基質認識配列はサイトカイン部分のＣ末端に位置する。いくつかの実施形態において、ドナー基質認識配列はサイトカイン部分のＮ末端に位置する。いくつかの実施形態において、ドナー基質認識配列はサイトカイン部分の非末端位置に位置する。
【0107】
いくつかの実施形態において、抗体部分は、抗ＰＤ－Ｌ１抗体及びドナー基質認識配列、例えばＸ１Ｘ２Ｘ３ＴＸ４Ｘ５を含み、サイトカイン部分はＩＬ２１及びアクセプター基質認識配列、例えば（Ｇ）ｎを含む。いくつかの実施形態において、アクセプター基質認識配列はサイトカイン部分のＮ末端に位置する。いくつかの実施形態において、アクセプター基質認識配列はサイトカイン部分のＣ末端に位置する。いくつかの実施形態において、アクセプター基質認識配列はサイトカイン部分の非末端位置に位置する。
【0108】
抗体部分及びサイトカイン部分は、化学合成、組換えＤＮＡ技術及びそれらの組み合わせに限定されない当分野で既知の様々な方法によって得ることができる。好ましい実施形態において、抗体部分の軽鎖及び重鎖をコードするポリヌクレオチドは、組換えＤＮＡ技術によって生成され、好適な宿主細胞に導入され、その後、抗体部分を宿主細胞内で発現し、宿主細胞又は培養培地から精製することができる。宿主細胞は、安定的に又は一時的に形質転換されてもよい。抗体部分及びサイトカイン部分の単離及び精製は、当分野で周知の技法を使用して行うことができる。例えば、抗体部分はタンパク質Ａ親和性カラムで精製することができる。
【0109】
例示的な融合タンパク質
１つの実施形態において、サイトカイン部分は、Ｃ末端でスペーサーＧＡ及びドナー基質認識配列ＬＰＥＴＧＧ（配列番号６）によりＩＬ２１（配列番号９又は配列番号１０）を修飾することで得られ、サイトカイン部分は配列番号１１又は配列番号１２のアミノ酸配列を含む。
１つの実施形態において、サイトカイン部分は、Ｃ末端でスペーサーＧＡ及びドナー基質認識配列ＬＰＥＴＧＧ（配列番号６）によりＩＬ２１（配列番号９又は配列番号１０）を修飾することで得られ、サイトカイン部分は配列番号１１又は配列番号１２のアミノ酸配列を含む。
【0110】
１つの実施形態において、抗体部分はＡｂ００３０であり、配列番号１の軽鎖及び配列番号１４の重鎖を含む。Ａｂ００３０は、Ｎ末端でアクセプター基質認識配列ＧＧＧ及びスペーサーＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号５）によりＡｂ０００１の重鎖（配列番号２）を修飾することで、抗ＰＤ－Ｌ１抗体Ａｂ０００１（アテゾリズマブ）から得られる。別の特定の実施形態において、抗体部分はＡｂ００３３であり、配列番号３の軽鎖及び配列番号１５の重鎖を含む。Ａｂ００３３は、Ｎ末端でアクセプター基質認識配列ＧＧＧ及びスペーサーＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号５）によりＡｂ０００２の重鎖（配列番号４）を修飾することで、抗体Ａｂ０００２（３Ｆ２）から得られる。
【0111】
本開示のいくつかの実施形態によれば、サイトカインＩＬ２１及び抗ＰＤ－Ｌ１抗体の配列、及びそれらから得られたサイトカイン部分及び抗体部分の配列は下記表に記載する。
【0112】
【表1】
【0113】
本開示に係る例示的な融合タンパク質は表２に記載する。
【0114】
医薬組成物
本開示に係る融合タンパク質及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物も提供する。
本開示に係る融合タンパク質及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物も提供する。
【0115】
学的に許容される担体の例としては、希釈剤（例えば、ラクトース、微結晶セルロース及びデキストロース）、結合剤及び接着剤（例えば、アカシア、ゼラチン、デンプン糊、カルボキシメチルセルロース）、滑沢剤（例えば、ポリエチレングリコール、ステアリン酸カルシウム及びステアリン酸）、崩壊剤（例えば、デンプン、セルロース及び架橋剤ポリマー）、防腐剤、ビヒクル、流動促進剤（例えば、コーンスターチ）、甘味剤（例えば、マンニトール及びサッカリン）、コーティング材（例えば、ポビドン、エチルセルロース及び合成ポリマー）、及び可塑剤（例えば、ヒマシ油、ジアセチル化モノグリセリド、及びポリエチレングリコール）、構造形成賦形剤（例えば、セトステアリルアルコール及び鉱油）、防腐剤（例えば、ベンジルアルコール、プロピルパラベン及び安息香酸ナトリウム）、抗酸化剤（例えば、ブチルヒドロキシルトルエン及びブチルヒドロキシルアニソール）、可溶化剤（例えば、ラノリン及びコレステロール）、ゲル化剤（例えば、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース及びキサンタンガム）、及び皮膚軟化剤（例えば、グリセリン、鉱油、ワセリン及びイソプロピルパルミテート）、溶媒（例えば、水、アルコール、酢酸及びシロップ）、緩衝液（例えば、リン酸緩衝液及び酢酸緩衝液）、抗菌防腐剤（例えば、ベンジルアルコール、ブチルパラベン、フェノール及びチオメルサール）、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸、硫酸水素ナトリウム、チオ尿素及びブチルヒドロキシトルエン）、キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ二ナトリウム、ジヒドロキシエチルグリシン及びクエン酸）、及び乳化剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム、セトリミド及びクロゴールエステル）を含むが、それらに限定されない。
【0116】
本明細書で提供される医薬組成物は、様々な剤形、例えば、固体、半固体、液体、粉末、水性、又は凍結乾燥形態としてもよい。
【0117】
本明細書で提供される医薬組成物は、当分野で既知の任意の方法よって、例えば、全身投与又は局所投与によって、対象に投与することができる。投与経路としては、非経口（例えば、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、又は体腔内）、局所、硬膜外、又は経粘膜（例えば、鼻腔内又は経口）経路を含むが、それらに限定されない。投与される正確な用量は、様々な要因、例えば治療目的、投与経路、及び対象の状況、例えば、患者の健康状態、体重、性別、食事等によって異なる。したがって、最適な治療効果を得るために、治療者は、医薬組成物の用量を決定し、必要に応じて投与経路を修正する必要がある。一般に、本明細書で提供される医薬組成物の投与の用量範囲は、ＰＤ－Ｌ１陽性疾患細胞が除去される所望の効果を生み出すのに十分に大きな量である。
【0118】
好ましい実施形態において、本開示の医薬組成物は、治療有効量でヒト対象に投与することができる。抗体の治療用量は、例えば、好ましくは１回の治療用量当たり０．１～２５ｍｇ／ｋｇ体重であり、最も好ましくは１回の治療用量当たり０．１～１０ｍｇ／ｋｇ体重である。特定の実施形態において、本開示の任意の融合タンパク質は、任意の好適な経路による投与のための従来例に従って製剤化することができ、一般に、例えば、静脈内、腹腔内、皮下、又は筋肉内経路による投与のための液体形態（例えば、生理学的に許容される滅菌緩衝液中の融合タンパク質の溶液）としてもよい。
【0119】
治療
更に、それを必要とする対象の疾患を治療するための方法であって、対象に治療有効量の本開示に係る融合タンパク質又は医薬組成物を投与することを含む、前記方法を提供する。
更に、それを必要とする対象の疾患を治療するための方法であって、対象に治療有効量の本開示に係る融合タンパク質又は医薬組成物を投与することを含む、前記方法を提供する。
【0120】
本開示は、それを必要とする対象の疾患を治療するために使用される、本開示に係る融合タンパク質又は医薬組成物にも関する。
【0121】
本開示は、それを必要とする対象の疾患を治療するための医薬品の製造のための、本開示に係る融合タンパク質又は医薬組成物の使用にも関する。
【0122】
いくつかの実施形態において、前記対象は、哺乳動物、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、チンパンジー、類人猿、ウシ及びヒトである。いくつかの好ましい実施形態において、前記対象は、ヒトである。
【0123】
いくつかの実施形態において、前記疾患は、癌である。好ましくは、前記癌は、ＰＤ－Ｌ１陽性癌である。いくつかの実施形態において、前記癌は、黒色腫、卵巣癌、乳癌、メルケル細胞癌、肺癌（小細胞肺癌及び非小細胞肺癌（扁平上皮癌及び非扁平上皮非小細胞肺癌等）を含む）、腎細胞癌、膀胱癌、結腸癌、結腸腺癌、結腸直腸癌、頭頸部扁平上皮癌、中皮腫、ウイルス誘発性癌、子宮頸癌、鼻咽頭癌、軟部肉腫、血液悪性腫瘍、胃癌、胃癌又は胃食道接合部（ＧＥＪ）腺癌、食道癌、食道の扁平上皮癌、子宮内膜癌、原発性縦隔Ｂ細胞リンパ腫（ＰＭＢＣＬ）、尿路上皮癌、マイクロサテライト不安定性高（ＭＳＩ－Ｈ）又はミスマッチ修復欠損（ｄＭＭＲ）の固形腫瘍、肝細胞癌、リンパ腫、ホジキン病（ホジキンリンパ腫）、非ホジキン病（非ホジキンリンパ腫）、及びびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫から選択される。いくつかの実施形態において、癌は、結腸直腸癌、黒色腫、腎細胞癌腫（ＲＣＣ）、有棘細胞癌（ｃＳＣＣ）、三種陰性乳癌（ＴＮＢＣ）、非小細胞肺癌及び膀胱癌から選択される悪性癌である。いくつかの好ましい実施形態において、癌は胃癌、乳癌、結腸癌、結腸腺癌、尿路上皮癌、肺癌、肝癌、子宮内膜癌、頭頸部癌及び卵巣癌から選択される。
【0124】
特定の実施形態を参照しながら本開示を説明したが、これらの実施形態は本開示の用途及び原理を単に例示するものに過ぎないことが理解される。本開示の精神及び範囲から逸脱することなく修正が可能である。
【0125】
有益な効果
本開示に係る融合タンパク質は、
（１）ＰＤ－Ｌ１シグナル伝達の特異的阻害及びＩＬ２１シグナル伝達の活性化と、
（２）ＣＤ４＋ Ｔ細胞の効果的な活性化と、
（３）より高い抗腫瘍活性及びより低い毒性と、の技術効果の少なくとも１つを達成する。
本開示に係る融合タンパク質は、
（１）ＰＤ－Ｌ１シグナル伝達の特異的阻害及びＩＬ２１シグナル伝達の活性化と、
（２）ＣＤ４＋ Ｔ細胞の効果的な活性化と、
（３）より高い抗腫瘍活性及びより低い毒性と、の技術効果の少なくとも１つを達成する。
【0126】
更に、従来の組換えＤＮＡ技術は抗体－サイトカイン融合タンパク質（免疫サイトカイン）の生成に使用される場合が多い。しかし、従来の方法を使用して調製された組換え免疫サイトカインの収率は、裸の抗体（サイトカインにコンジュゲートされていない）と比較して極めて低い可能性があり、多数の免疫サイトカインの臨床応用を妨げている。本開示に係る酵素媒介コンジュゲーション方法を使用すると、融合タンパク質を非常に高い収率及び純度で調製することができる。
【0127】
実施例
別段記載がない限り、修飾又は未修飾抗ＰＤ－Ｌ１抗体及びＩＬ２１の調製には、一般に使用される分子生物学、生化学、及び細胞生物学の技法が利用される。別段記載がない限り、実施例で使用される計器及び試薬は市場から入手できる。試薬は更なる精製なく直接使用できる。
別段記載がない限り、修飾又は未修飾抗ＰＤ－Ｌ１抗体及びＩＬ２１の調製には、一般に使用される分子生物学、生化学、及び細胞生物学の技法が利用される。別段記載がない限り、実施例で使用される計器及び試薬は市場から入手できる。試薬は更なる精製なく直接使用できる。
【0128】
フローサイトメトリ：ＣｙｔｏＦＬＥＸ Ｓ
ＨＩＣ－ＨＰＬＣ：ブチルＨＩＣ。移動相Ａ：２５ｍＭのＰＢ、２Ｍの（ＮＨ４）２ＳＯ４、ｐＨ７．０。移動相Ｂ：２５ｍＭのＰＢ、ｐＨ７．０。流量：０．８ｍＬ／ｍｉｎ。取得時間：２５ｍｉｎ。注入量：２０μｇ。カラム温度：２５℃。検出波長：２８０ｎｍ。サンプルインジェクター温度：８℃。
ＳＥＣ－ＨＰＬＣ：カラム：ＴＳＫ－ｇｅｌ Ｇ３０００ ＳＷＸＬ、ＴＯＳＯＨ ７．８ｍｍ ＩＤ×３００ｍｍ、５μｍ。移動相：０．２ＭのＫＨ２ＰＯ４、０．２５ＭのＫＣｌ、ｐＨ６．２。流量：０．５ｍＬ／ｍｉｎ。取得時間：３０ｍｉｎ。注入量：５０μＬ。カラム温度：２５℃。検出波長：２８０ｎｍ。サンプルトレイ温度：８℃。
ＣＨＯはＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから入手され、ｐｃＤＮＡ３．３はＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから入手され、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ Ｓｕｒｅ ＰｒｏＡはＧＥから入手された。
黄色ブドウ球菌に由来する最適化組換え酵素ソルターゼＡは大腸菌中で調製された。
ＨＩＣ－ＨＰＬＣ：ブチルＨＩＣ。移動相Ａ：２５ｍＭのＰＢ、２Ｍの（ＮＨ４）２ＳＯ４、ｐＨ７．０。移動相Ｂ：２５ｍＭのＰＢ、ｐＨ７．０。流量：０．８ｍＬ／ｍｉｎ。取得時間：２５ｍｉｎ。注入量：２０μｇ。カラム温度：２５℃。検出波長：２８０ｎｍ。サンプルインジェクター温度：８℃。
ＳＥＣ－ＨＰＬＣ：カラム：ＴＳＫ－ｇｅｌ Ｇ３０００ ＳＷＸＬ、ＴＯＳＯＨ ７．８ｍｍ ＩＤ×３００ｍｍ、５μｍ。移動相：０．２ＭのＫＨ２ＰＯ４、０．２５ＭのＫＣｌ、ｐＨ６．２。流量：０．５ｍＬ／ｍｉｎ。取得時間：３０ｍｉｎ。注入量：５０μＬ。カラム温度：２５℃。検出波長：２８０ｎｍ。サンプルトレイ温度：８℃。
ＣＨＯはＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから入手され、ｐｃＤＮＡ３．３はＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから入手され、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ Ｓｕｒｅ ＰｒｏＡはＧＥから入手された。
黄色ブドウ球菌に由来する最適化組換え酵素ソルターゼＡは大腸菌中で調製された。
【0129】
実施例１ 抗体部分の構築と発現
１．１ Ａｂ００３０及びＡｂ００３３の発現プラスミドの構築
２つの抗体部分Ａｂ００３０及びＡｂ００３３をそれぞれ抗ＰＤ－Ｌ１抗体Ａｂ０００１（アテゾリズマブ）及びＡｂ０００２（３Ｆ２）に基づいて調製した。Ａｂ０００１及びＡｂ０００２のアミノ酸配列（配列番号）は表１Ａに示す。
１．１ Ａｂ００３０及びＡｂ００３３の発現プラスミドの構築
２つの抗体部分Ａｂ００３０及びＡｂ００３３をそれぞれ抗ＰＤ－Ｌ１抗体Ａｂ０００１（アテゾリズマブ）及びＡｂ０００２（３Ｆ２）に基づいて調製した。Ａｂ０００１及びＡｂ０００２のアミノ酸配列（配列番号）は表１Ａに示す。
【0130】
【表1A】
【0131】
具体的には、Ａｂ０００１（配列番号２）の重鎖及びＡｂ０００２（配列番号４）の重鎖のＮ末端を、ペプチド配列ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号５、即ち、スペーサーを有するアクセプター基質認識配列）の付加によって修飾した。
【0132】
抗体部分の発現及び細胞外分泌を促進するために、軽鎖シグナルペプチド（配列番号１６）及び重鎖シグナルペプチド（配列番号１７）のコード配列をそれぞれ軽鎖及び重鎖のコード配列のＮ末端に付加した。
【0133】
Ａｂ００３０及びＡｂ００３３のコード配列を、ＣＨＯ細胞内での効率的な発現のためにコドン最適化し、各抗体部分のプラスミド対を得るためにｐｃＤＮＡ３．３ベクターにクローニングした。
【0134】
１．２ Ａｂ００３０及びＡｂ００３３の発現
実施例１．１で得られたＡｂ００３０及びＡｂ００３３の発現プラスミドを質量比２：１でＣＨＯ細胞に一時的にトランスフェクトした。発酵後、抗体を含有する細胞培養上清を収集した。ＥＬＩＳＡアッセイによって測定されたＡｂ００３０及びＡｂ００３３の発現レベルはそれぞれ７５７．６０ｍｇ／Ｌ及び６２２．９６ｍｇ／Ｌであった。
実施例１．１で得られたＡｂ００３０及びＡｂ００３３の発現プラスミドを質量比２：１でＣＨＯ細胞に一時的にトランスフェクトした。発酵後、抗体を含有する細胞培養上清を収集した。ＥＬＩＳＡアッセイによって測定されたＡｂ００３０及びＡｂ００３３の発現レベルはそれぞれ７５７．６０ｍｇ／Ｌ及び６２２．９６ｍｇ／Ｌであった。
【0135】
１．３ Ａｂ００３０及びＡｂ００３３の精製
タンパク質Ａカラム（ＭａｂＳｅｌｅｃｔ Ｓｕｒｅ ＰｒｏＡ、２０ｃｍ ｘ ５．０ｃｍ）を平衡緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４）で洗浄した。実施例１．２からの細胞培養上清を０．２２μｍフィルタで濾過し、カラムにロードした。サンプルのロードが完了すると、カラムを５～１０カラム容量の平衡緩衝液で洗浄した。抗体をｐＨ３．５の５０ｍＭのクエン酸緩衝液中で溶出させ、収集した。抗体溶液のｐＨを６％（ｖ／ｖ）のｐＨ１０．５の１ＭのＴｒｉｓを添加することで５．５～６．５に調整した。最後に、抗体溶液の緩衝液を限外濾過によって平衡緩衝液に交換した。ＵＶ分光計を使用してＡｂ００３０及びＡｂ００３３の濃度を測定した。Ａｂ００３０及びＡｂ００３３を小分けして－８０℃で保存した。精製抗体部分Ａｂ００３０は配列番号１の軽鎖及び配列番号１４の重鎖を含む。精製抗体部分Ａｂ００３３は配列番号３の軽鎖及び配列番号１５の重鎖を含む（表１Ｂを参照）。
タンパク質Ａカラム（ＭａｂＳｅｌｅｃｔ Ｓｕｒｅ ＰｒｏＡ、２０ｃｍ ｘ ５．０ｃｍ）を平衡緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４）で洗浄した。実施例１．２からの細胞培養上清を０．２２μｍフィルタで濾過し、カラムにロードした。サンプルのロードが完了すると、カラムを５～１０カラム容量の平衡緩衝液で洗浄した。抗体をｐＨ３．５の５０ｍＭのクエン酸緩衝液中で溶出させ、収集した。抗体溶液のｐＨを６％（ｖ／ｖ）のｐＨ１０．５の１ＭのＴｒｉｓを添加することで５．５～６．５に調整した。最後に、抗体溶液の緩衝液を限外濾過によって平衡緩衝液に交換した。ＵＶ分光計を使用してＡｂ００３０及びＡｂ００３３の濃度を測定した。Ａｂ００３０及びＡｂ００３３を小分けして－８０℃で保存した。精製抗体部分Ａｂ００３０は配列番号１の軽鎖及び配列番号１４の重鎖を含む。精製抗体部分Ａｂ００３３は配列番号３の軽鎖及び配列番号１５の重鎖を含む（表１Ｂを参照）。
【0136】
【表1B】
【0137】
１．４ Ａｂ００３０及びＡｂ００３３の特徴付け
Ａｂ００３０及びＡｂ００３３をＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動で分析した。予想通り、ＳＤＳ－ＰＡＧＥで測定された重鎖及び軽鎖の分子量はそれぞれ約５０ｋＤａ及び約２５ｋＤａである。ＳＥＣ－ＨＰＬＣ分析は、Ａｂ００３０及びＡｂ００３３モノマーの百分率がそれぞれ約９７．５％及び９６．２％であり、融合タンパク質の調製要件を満たすことを実証する。
Ａｂ００３０及びＡｂ００３３をＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動で分析した。予想通り、ＳＤＳ－ＰＡＧＥで測定された重鎖及び軽鎖の分子量はそれぞれ約５０ｋＤａ及び約２５ｋＤａである。ＳＥＣ－ＨＰＬＣ分析は、Ａｂ００３０及びＡｂ００３３モノマーの百分率がそれぞれ約９７．５％及び９６．２％であり、融合タンパク質の調製要件を満たすことを実証する。
【0138】
Ａｂ００３０及びＡｂ００３３のＰＤ－Ｌ１結合活性を酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）で測定した。組換えｈＰＤ－Ｌ１をコーティング緩衝液（１ｘ ＰＢＳ）中で０．５μｇ／ｍＬに希釈し、ＥＬＩＳＡプレートに４℃で一晩コーティングした。プレートをコーティング緩衝液中の５％脱脂粉乳で３７℃にて１ｈブロックした。段階希釈したＡｂ００３０及びＡｂ００３３をプレートに添加し、その後プレートを３７℃にて１ｈインキュベートした。最後に、１：５０００に希釈した抗ヒト－ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）－ＨＲＰを添加した。３７℃にて１ｈインキュベートした後、発色のためにＴＭＢ基質を添加した。マイクロプレートリーダーを使用してデータを収集した。
【0139】
【0140】
実施例２ サイトカイン部分の構築と発現
オーバーラップＰＣＲを使用することで、ペプチド配列ＧＡＬＰＥＴＧＧ（配列番号６、ソルターゼのドナー基質認識配列Ａ（ＬＰＥＴＧＧ）及びスペーサーＧＡを含む）をコードするポリヌクレオチドを、ｈＩＬ２１（アミノ酸配列が配列番号９又は配列番号１０に示される）をコードするポリヌクレオチドの３’に付加して、サイトカイン部分（アミノ酸配列がそれぞれ配列番号１１又は配列番号１２に示される）をコードするポリヌクレオチドを生成した。サイトカイン部分の発現及び細胞外分泌を促進するために、シグナルペプチドのコード配列（配列番号１３）を、配列番号１１又は配列番号１２をコードするポリヌクレオチドの５’に付加した。精製サイトカイン部分は、配列番号１１又は配列番号１２のアミノ酸配列を有する。
オーバーラップＰＣＲを使用することで、ペプチド配列ＧＡＬＰＥＴＧＧ（配列番号６、ソルターゼのドナー基質認識配列Ａ（ＬＰＥＴＧＧ）及びスペーサーＧＡを含む）をコードするポリヌクレオチドを、ｈＩＬ２１（アミノ酸配列が配列番号９又は配列番号１０に示される）をコードするポリヌクレオチドの３’に付加して、サイトカイン部分（アミノ酸配列がそれぞれ配列番号１１又は配列番号１２に示される）をコードするポリヌクレオチドを生成した。サイトカイン部分の発現及び細胞外分泌を促進するために、シグナルペプチドのコード配列（配列番号１３）を、配列番号１１又は配列番号１２をコードするポリヌクレオチドの５’に付加した。精製サイトカイン部分は、配列番号１１又は配列番号１２のアミノ酸配列を有する。
【0141】
ｈＩＬ２１を大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）内で発現させた。発現後、組換えｈＩＬ２１をＮｉ－ＮＴＡカラムで精製した。精製されたｈＩＬ２１を１ｘ ＰＢＳ緩衝液で保存した。
【0142】
実施例３ 融合タンパク質の調製
実施例１で調製された抗体部分Ａｂ００３０及びＡｂ００３３を、ソルターゼ媒介部位特異的コンジュゲーションによって、実施例２で調製されたサイトカイン部分とコンジュゲートすることで、融合タンパク質を得た。
実施例１で調製された抗体部分Ａｂ００３０及びＡｂ００３３を、ソルターゼ媒介部位特異的コンジュゲーションによって、実施例２で調製されたサイトカイン部分とコンジュゲートすることで、融合タンパク質を得た。
【0143】
ステップ１）前処理
好適な孔径を有する限外濾過膜を使用してＡｂ００３０及びＡｂ００３３並びにサイトカイン部分を前処理し、次に濃縮し、コンジュゲーション緩衝液に緩衝液交換した。
好適な孔径を有する限外濾過膜を使用してＡｂ００３０及びＡｂ００３３並びにサイトカイン部分を前処理し、次に濃縮し、コンジュゲーション緩衝液に緩衝液交換した。
【0144】
ステップ２）酵素媒介コンジュゲーション
Ａｂ００３０及びＡｂ００３３（１～１００ｍｇ／ｍＬ）並びにサイトカイン部分（配列番号１１、１～１００ｍｇ／ｍＬ）を別々に反応緩衝液中で調製した。黄色ブドウ球菌に由来する固定化組換えＳｒｔＡを含有するコンジュゲーションカラムを、ＮａＯＨ及び高塩で前処理し、空気浴又は水浴中で３０ｍｉｎ以上にわたって１０～４０℃に前加温した。抗体部分及びサイトカイン部分を含有する反応溶液を一定の比率で混合し、コンジュゲーションカラムに緩徐に通してコンジュゲーション反応を行った。あるいは、反応溶液を固定化組換えＳｒｔＡ又は精製組換えＳｒｔＡと５ｍｉｎ～２４ｈ混合してコンジュゲーション反応を行ってもよい。
Ａｂ００３０及びＡｂ００３３（１～１００ｍｇ／ｍＬ）並びにサイトカイン部分（配列番号１１、１～１００ｍｇ／ｍＬ）を別々に反応緩衝液中で調製した。黄色ブドウ球菌に由来する固定化組換えＳｒｔＡを含有するコンジュゲーションカラムを、ＮａＯＨ及び高塩で前処理し、空気浴又は水浴中で３０ｍｉｎ以上にわたって１０～４０℃に前加温した。抗体部分及びサイトカイン部分を含有する反応溶液を一定の比率で混合し、コンジュゲーションカラムに緩徐に通してコンジュゲーション反応を行った。あるいは、反応溶液を固定化組換えＳｒｔＡ又は精製組換えＳｒｔＡと５ｍｉｎ～２４ｈ混合してコンジュゲーション反応を行ってもよい。
【0145】
更なる精製及びＤＡＲ（ＤＡＲ＝抗ＰＤ－Ｌ１抗体にコンジュゲートされたｈＩＬ２１の平均数）測定のために、融合タンパク質を含有する抗体－サイトカインコンジュゲーション混合物を収集した。
【0146】
ステップ３）融合タンパク質の精製
融合タンパク質を陽イオン交換クロマトグラフィーによって精製した。要するに、クロマトグラフィーカラムにＣａｐｔｏ Ｓ ＩｍｐＡｃｔ培地を充填し、ｐＨ５．０～６．０のクエン酸－クエン酸ナトリウム緩衝液で平衡化した。ステップ２）からのコンジュゲーション混合物をカラムにロードした。所望のオフセット（ベースライン）に達するまで、カラムをｐＨ５．０～６．０のクエン酸－クエン酸ナトリウム緩衝液で洗い流した。コンジュゲートされていない抗体部分及びサイトカイン部分を、ｐＨ５．０～６．０のクエン酸－クエン酸ナトリウム緩衝液、１００～５００ｍＭのＮａＣｌで溶出させた。クエン酸－クエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０～６．０）中のＮａＣｌ濃度を０．５Ｍから１Ｍに増加させることで融合タンパク質を溶出させた。意外なことに、このステップで、２つの異なる融合タンパク質集団を表す２つの画分が溶出した。その後、２つの画分をＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析に供した。第１画分は、ＤＡＲ値が１である主要な集団（ＤＡＲ１集団と呼ばれ、各融合タンパク質が１つのｈＩＬ２１を含有する）を表し、第２画分は、ＤＡＲ値が２である少数集団（ＤＡＲ２集団と呼ばれ、各融合タンパク質が２つのｈＩＬ２１を含有する）を表すことが確認された。ｈＩＬ２１（アイソフォーム１）を１つのみ含有する融合タンパク質はそれぞれ、ＬＣ００３０－１（Ａｂ００３０から調製）及びＬＣ００３３－１（Ａｂ００３３から調製）と命名される。ｈＩＬ２１（アイソフォーム１）を２つ含有する融合タンパク質はそれぞれ、Ａｂ００３０から調製されたＬＣ００３０－２及びＡｂ００３３から調製されたＬＣ００３３－２と命名される。図３は、それぞれ、ＬＣ００３０－１及びＬＣ００３０－２を含有する２つの画分のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を示す。図４はＬＣ００３３－１を含有する画分のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を示す。
融合タンパク質を陽イオン交換クロマトグラフィーによって精製した。要するに、クロマトグラフィーカラムにＣａｐｔｏ Ｓ ＩｍｐＡｃｔ培地を充填し、ｐＨ５．０～６．０のクエン酸－クエン酸ナトリウム緩衝液で平衡化した。ステップ２）からのコンジュゲーション混合物をカラムにロードした。所望のオフセット（ベースライン）に達するまで、カラムをｐＨ５．０～６．０のクエン酸－クエン酸ナトリウム緩衝液で洗い流した。コンジュゲートされていない抗体部分及びサイトカイン部分を、ｐＨ５．０～６．０のクエン酸－クエン酸ナトリウム緩衝液、１００～５００ｍＭのＮａＣｌで溶出させた。クエン酸－クエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０～６．０）中のＮａＣｌ濃度を０．５Ｍから１Ｍに増加させることで融合タンパク質を溶出させた。意外なことに、このステップで、２つの異なる融合タンパク質集団を表す２つの画分が溶出した。その後、２つの画分をＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析に供した。第１画分は、ＤＡＲ値が１である主要な集団（ＤＡＲ１集団と呼ばれ、各融合タンパク質が１つのｈＩＬ２１を含有する）を表し、第２画分は、ＤＡＲ値が２である少数集団（ＤＡＲ２集団と呼ばれ、各融合タンパク質が２つのｈＩＬ２１を含有する）を表すことが確認された。ｈＩＬ２１（アイソフォーム１）を１つのみ含有する融合タンパク質はそれぞれ、ＬＣ００３０－１（Ａｂ００３０から調製）及びＬＣ００３３－１（Ａｂ００３３から調製）と命名される。ｈＩＬ２１（アイソフォーム１）を２つ含有する融合タンパク質はそれぞれ、Ａｂ００３０から調製されたＬＣ００３０－２及びＡｂ００３３から調製されたＬＣ００３３－２と命名される。図３は、それぞれ、ＬＣ００３０－１及びＬＣ００３０－２を含有する２つの画分のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を示す。図４はＬＣ００３３－１を含有する画分のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を示す。
【0147】
ｐＨ５．０～６．０のクエン酸－クエン酸ナトリウム緩衝液、１ＭのＮａＣｌを使用してカラムを再生し、１ＭのＮａＯＨを使用して定置洗浄（ＣＩＰ）を実施した。
【0148】
ステップ４）融合タンパク質の限外濾過
好適な孔径を有する限外濾過膜を使用して精製融合タンパク質を濃縮し、保存緩衝液に緩衝液交換し、その後２～８℃又は－８０℃で保存した。
好適な孔径を有する限外濾過膜を使用して精製融合タンパク質を濃縮し、保存緩衝液に緩衝液交換し、その後２～８℃又は－８０℃で保存した。
【0149】
ｈＩＬ２１（アイソフォーム２）（サイトカイン部分が配列番号１２のアミノ酸配列を有する）を含有する融合タンパク質を上記と同じ方法で調製した。ｈＩＬ２１（アイソフォーム２）を１つのみ含有する融合タンパク質はそれぞれ、ＬＣ００３０’－１（Ａｂ００３０から調製）及びＬＣ００３３’－１（Ａｂ００３３から調製）と命名される。ｈＩＬ２１（アイソフォーム２）を２つ含有する融合タンパク質はそれぞれ、ＬＣ００３０’－２（Ａｂ００３０から調製）及びＬＣ００３３’－２（Ａｂ００３３から調製）と命名される。
【0150】
調製された融合タンパク質は表２に記載する。
【0151】
【表2】
【0152】
実施例４ 融合タンパク質のＨＩＣ－ＨＰＬＣ分析
実施例３で調製された融合タンパク質をブチルＨＩＣ ＨＰＬＣ分析に供してＤＡＲ分布を測定した。
実施例３で調製された融合タンパク質をブチルＨＩＣ ＨＰＬＣ分析に供してＤＡＲ分布を測定した。
【0153】
結果は図５及び図６に示す。ＬＣ００３０－１のピーク位置はＡｂ００３０と比較して前方にシフトし、ＬＣ００３０－２のピーク位置はＬＣ００３０－１と比較して前方にシフトし、これは、融合タンパク質ＬＣ００３０－１及びＬＣ００３０－２の疎水性がＡｂ００３０より低いことを示す（図５）。興味深いことに、ＬＣ００３３－１のピーク位置はＡｂ００３３と比較して後方にシフトし、ＬＣ００３３－２のピーク位置はＬＣ００３３－１と比較して後方にシフトし、これは、ＬＣ００３３－１及びＬＣ００３３－２の疎水性がＡｂ００３３より強いことを示す（図６）。これらの差異は、Ａｂ００３０とＡｂ００３３の間のアミノ酸及び構造の差異によるものである可能性がある。
【0154】
実施例５ 融合タンパク質のｈＰＤ－Ｌ１への結合活性の測定
融合タンパク質のヒトＰＤ－Ｌ１（ｈＰＤ－Ｌ１）への結合活性をＥＬＩＳＡで測定した。組換えｈＰＤ－Ｌ１タンパク質（Ａｃｒｏｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＰＤ１－Ｈ５２５３）をコーティング緩衝液（１ｘ ＰＢＳ）で０．５μｇ／ｍＬに希釈し、ＥＬＩＳＡプレートに４℃で一晩コーティングした。プレートをコーティング緩衝液中の５％脱脂粉乳で３７℃にて１ｈブロックした。段階希釈したＡｂ００３０、Ａｂ００３３、ＬＣ００３０－１及びＬＣ００３３－１を添加し、その後プレートを３７℃にて１ｈインキュベートした。最後に、１：５０００に希釈した抗ヒト－ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）－ＨＲＰを添加した。３７℃で１ｈインキュベートした後、発色のためにＴＭＢ基質を添加した。マイクロプレートリーダーを使用してデータを収集した。
融合タンパク質のヒトＰＤ－Ｌ１（ｈＰＤ－Ｌ１）への結合活性をＥＬＩＳＡで測定した。組換えｈＰＤ－Ｌ１タンパク質（Ａｃｒｏｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＰＤ１－Ｈ５２５３）をコーティング緩衝液（１ｘ ＰＢＳ）で０．５μｇ／ｍＬに希釈し、ＥＬＩＳＡプレートに４℃で一晩コーティングした。プレートをコーティング緩衝液中の５％脱脂粉乳で３７℃にて１ｈブロックした。段階希釈したＡｂ００３０、Ａｂ００３３、ＬＣ００３０－１及びＬＣ００３３－１を添加し、その後プレートを３７℃にて１ｈインキュベートした。最後に、１：５０００に希釈した抗ヒト－ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）－ＨＲＰを添加した。３７℃で１ｈインキュベートした後、発色のためにＴＭＢ基質を添加した。マイクロプレートリーダーを使用してデータを収集した。
【0155】
結果は図７に示す。ＬＣ００３０－１及びＬＣ００３３－１の両方とも、Ａｂ００３０及びＡｂ００３３と同様の親和性で抗原ＰＤ－Ｌ１に特異的に結合することができ、これは、融合タンパク質中の抗ＰＤ－Ｌ１抗体のＰＤ－Ｌ１－結合活性が保持されることを示す。
【0156】
実施例６ 融合タンパク質のＩＬ２１受容体（ＩＬ２１Ｒ）への結合活性の測定
融合タンパク質のヒトＩＬ２１受容体（ｈＩＬ２１Ｒ又はＨｕ－ＩＬ２１Ｒ）への結合活性をＥＬＩＳＡで測定した。組換えｈＩＬ２１Ｒタンパク質をコーティング緩衝液（１ｘ ＰＢＳ）で０．５μｇ／ｍＬに希釈し、ＥＬＩＳＡプレートに４℃で一晩コーティングした。プレートをコーティング緩衝液中の５％脱脂粉乳で３７℃にて１ｈブロックした。段階希釈したＡｂ００３０、Ａｂ００３３、ＬＣ００３０－１及びＬＣ００３３－１をプレートに添加し、その後プレートを３７℃にて１ｈインキュベートした。最後に、１：５０００に希釈した抗ヒト－ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）－ＨＲＰを添加した。３７℃で１ｈインキュベートした後、発色のためにＴＭＢ基質を添加した。マイクロプレートリーダーを使用してデータを収集した。
融合タンパク質のヒトＩＬ２１受容体（ｈＩＬ２１Ｒ又はＨｕ－ＩＬ２１Ｒ）への結合活性をＥＬＩＳＡで測定した。組換えｈＩＬ２１Ｒタンパク質をコーティング緩衝液（１ｘ ＰＢＳ）で０．５μｇ／ｍＬに希釈し、ＥＬＩＳＡプレートに４℃で一晩コーティングした。プレートをコーティング緩衝液中の５％脱脂粉乳で３７℃にて１ｈブロックした。段階希釈したＡｂ００３０、Ａｂ００３３、ＬＣ００３０－１及びＬＣ００３３－１をプレートに添加し、その後プレートを３７℃にて１ｈインキュベートした。最後に、１：５０００に希釈した抗ヒト－ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）－ＨＲＰを添加した。３７℃で１ｈインキュベートした後、発色のためにＴＭＢ基質を添加した。マイクロプレートリーダーを使用してデータを収集した。
【0157】
結果は図８に示す。ＬＣ００３０－１及びＬＣ００３３－１はｈＩＬ２１Ｒに特異的に結合することができるが、Ａｂ００３０及びＡｂ００３３はｈＩＬ２１Ｒに結合しない。抗ヒト－ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）－ＨＲＰが抗体のヒトＦｃ部分に結合するため、結果は、抗ＰＤ－Ｌ１抗体のｈＩＬ２１へのコンジュゲーションが成功し、融合タンパク質とｈＩＬ２１Ｒが特異的に結合することを示唆する。
【0158】
実施例７ 融合タンパク質のｈＰＤ－Ｌ１及びｈＩＬ２１Ｒへの結合親和性の測定
Ｂｉａｃｏｒｅ（Ｂｉａｃｏｒｅ、ＩＮＣ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ Ｎ．Ｊ．）を使用して表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を行ってＬＣ００３３－１及びＡｂ００３３のｈＰＤ－Ｌ１又はｈＩＬ２１Ｒへの結合親和性を測定した。Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００バイオセンサーにセンサーチッププロテインＡを装備した。所望のタンパク質密度（約３００ＲＵ）に達するために、試験すべきタンパク質（１μｇ／ｍＬに希釈）を１０μＬ／ｍｉｎでＢｉａｃｏｒｅ Ｔ２００バイオセンサーに５０ｓｅｃ注入した。続いて、Ｈｉｓタグ付きヒトＩＬ２１Ｒ（ｈＩＬ２１Ｒ－Ｈｉｓ、２００ｎＭ）又はヒトＰＤ－Ｌ１（ｈＰＤ－Ｌ１－Ｈｉｓ、１００ｎＭ）を３０μＬ／ｍｉｎでシステムに１８０ｓｅｃ注入した。解離を６００ｓｅｃ監視した。各サイクル後、ｐＨ１．７のグリシン緩衝液（３０μＬ／ｍｉｎ、３０ｓｅｃ）を使用してチップを再生した。
Ｂｉａｃｏｒｅ（Ｂｉａｃｏｒｅ、ＩＮＣ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ Ｎ．Ｊ．）を使用して表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を行ってＬＣ００３３－１及びＡｂ００３３のｈＰＤ－Ｌ１又はｈＩＬ２１Ｒへの結合親和性を測定した。Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００バイオセンサーにセンサーチッププロテインＡを装備した。所望のタンパク質密度（約３００ＲＵ）に達するために、試験すべきタンパク質（１μｇ／ｍＬに希釈）を１０μＬ／ｍｉｎでＢｉａｃｏｒｅ Ｔ２００バイオセンサーに５０ｓｅｃ注入した。続いて、Ｈｉｓタグ付きヒトＩＬ２１Ｒ（ｈＩＬ２１Ｒ－Ｈｉｓ、２００ｎＭ）又はヒトＰＤ－Ｌ１（ｈＰＤ－Ｌ１－Ｈｉｓ、１００ｎＭ）を３０μＬ／ｍｉｎでシステムに１８０ｓｅｃ注入した。解離を６００ｓｅｃ監視した。各サイクル後、ｐＨ１．７のグリシン緩衝液（３０μＬ／ｍｉｎ、３０ｓｅｃ）を使用してチップを再生した。
【0159】
データをＢｉａｃｏｒｅ Ｔ２００評価ソフトウェア３．０で処理した。データを１：１ラングミュア結合モデルに全体的にフィッティングすることによって結合動態を分析して会合速度（ｋｏｎ）及び解離速度（ｋｏｆｆ）を得る。親和性（ＫＤ）を式：ＫＤ＝ｋｏｆｆ／ｋｏｎで算出した。
【0160】
結果は表３に示す。ＬＣ００３３－１及びＡｂ００３３は、同様の親和性でｈＰＤ－Ｌ１－Ｈｉｓに結合することができる。ＬＣ００３３－１は高い親和性でＩＬ２１Ｒに結合することができる。
【0161】
【表3】
【0162】
実施例８ 融合タンパク質のＣＤ４＋ Ｔ細胞を活性化する能力の測定
ＳＴＡＴ３リン酸化（ｐＳＴＡＴ３）アッセイを使用してＬＣ００３３－１のインビトロＰＢＭＣ細胞刺激活性を測定した。ＳＴＡＴ３リン酸化はＣＤ４＋ Ｔ細胞刺激の指標である。市販のＰＢＭＣ細胞（ＡｌｌＣｅｌｌｓ、カタログ番号ＦＰＢ００３Ｆ－Ｃ）を３７℃で解凍して回復させ、次に前加温した培養バチ（ＲＰＭＩ１６４０）に懸濁させ、３００ｇで３ｍｉｎ遠心分離した。懸濁及び遠心分離プロセスを３回繰り返した。その後、細胞を１００μＬの培地中の９６ウェルプレートに１０５細胞／ウェルで添加した。続いて、段階希釈したＡｂ００３３、ＬＣ００３３－１又はｈＩＬ２１を各ウェルに１００μＬ添加し（等量のＰＢＳをブランク対照として対照ウェルに添加）、３７℃で３０ｍｉｎインキュベートした。ＰＢＳ中の４％ホルムアルデヒドの作用濃度になるまで等量の固定液を細胞に添加し、細胞を室温で１５ｍｉｎ固定した。細胞を３００ｇで３ｍｉｎ遠心分離して上清を除去し、２００μＬのＰＢＳで洗浄した。細胞内染色について、細胞を１００％氷冷メタノールに再懸濁させ、氷上で３０ｍｉｎインキュベートした。３００ｇで３ｍｉｎ遠心分離した後、細胞をＰＢＳ＋０．５％ＢＳＡで３回洗浄した。染色のために、５μＬの直接標識した抗体（Ｐｈｏｓｐｈｏ－ＳＴＡＴ３（Ｔｙｒ７０５）モノクローナル抗体（ＬＵＶＮＫＬＡ）、ＡＰＣ、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（商標）、カタログ番号１７－９０３３－４２及びＣＤ４モノクローナル抗体（ＲＰＡ－Ｔ４）、ＦＩＴＣ、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（商標）、カタログ番号１１－００４９－４２）を各ウェルに添加した。４℃で３０ｍｉｎインキュベートした後、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ－ＩｎｔｅｌｌｉＣｙｔ（登録商標）ｉＱｕｅフローサイトメーターを使用して細胞を分析した。
ＳＴＡＴ３リン酸化（ｐＳＴＡＴ３）アッセイを使用してＬＣ００３３－１のインビトロＰＢＭＣ細胞刺激活性を測定した。ＳＴＡＴ３リン酸化はＣＤ４＋ Ｔ細胞刺激の指標である。市販のＰＢＭＣ細胞（ＡｌｌＣｅｌｌｓ、カタログ番号ＦＰＢ００３Ｆ－Ｃ）を３７℃で解凍して回復させ、次に前加温した培養バチ（ＲＰＭＩ１６４０）に懸濁させ、３００ｇで３ｍｉｎ遠心分離した。懸濁及び遠心分離プロセスを３回繰り返した。その後、細胞を１００μＬの培地中の９６ウェルプレートに１０５細胞／ウェルで添加した。続いて、段階希釈したＡｂ００３３、ＬＣ００３３－１又はｈＩＬ２１を各ウェルに１００μＬ添加し（等量のＰＢＳをブランク対照として対照ウェルに添加）、３７℃で３０ｍｉｎインキュベートした。ＰＢＳ中の４％ホルムアルデヒドの作用濃度になるまで等量の固定液を細胞に添加し、細胞を室温で１５ｍｉｎ固定した。細胞を３００ｇで３ｍｉｎ遠心分離して上清を除去し、２００μＬのＰＢＳで洗浄した。細胞内染色について、細胞を１００％氷冷メタノールに再懸濁させ、氷上で３０ｍｉｎインキュベートした。３００ｇで３ｍｉｎ遠心分離した後、細胞をＰＢＳ＋０．５％ＢＳＡで３回洗浄した。染色のために、５μＬの直接標識した抗体（Ｐｈｏｓｐｈｏ－ＳＴＡＴ３（Ｔｙｒ７０５）モノクローナル抗体（ＬＵＶＮＫＬＡ）、ＡＰＣ、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（商標）、カタログ番号１７－９０３３－４２及びＣＤ４モノクローナル抗体（ＲＰＡ－Ｔ４）、ＦＩＴＣ、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（商標）、カタログ番号１１－００４９－４２）を各ウェルに添加した。４℃で３０ｍｉｎインキュベートした後、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ－ＩｎｔｅｌｌｉＣｙｔ（登録商標）ｉＱｕｅフローサイトメーターを使用して細胞を分析した。
【0163】
結果は図９に示す。ブランク対照（白抜きヒストグラム）と比較して、ＬＣ００３３－１及びｈＩＬ２１（塗りつぶされたヒストグラム）のピークは、明らかに右にシフトし、これは、該２つの分子がＣＤ４＋ Ｔ細胞内のリン酸化を誘導するのに有効であり、そのためＣＤ４＋ Ｔ細胞刺激に有効であることを示す。
【0164】
実施例９ 融合タンパク質のインビボ有効性の評価
本開示に係る融合タンパク質のインビボ有効性を評価しヒトにおける治療効果を予測するために、ヒト化ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１マウス（ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１遺伝子ヒト化マウス。関連内容の全てが参照によって本明細書に組み込まれるＷＯ２０１８０４１１１８Ａ１及びＷＯ２０１８００１２４１Ａ１を参照）を使用して結腸腺癌のマウスモデルを確立した。
本開示に係る融合タンパク質のインビボ有効性を評価しヒトにおける治療効果を予測するために、ヒト化ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１マウス（ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１遺伝子ヒト化マウス。関連内容の全てが参照によって本明細書に組み込まれるＷＯ２０１８０４１１１８Ａ１及びＷＯ２０１８００１２４１Ａ１を参照）を使用して結腸腺癌のマウスモデルを確立した。
【0165】
上記したヒト化ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１マウス（６～７週）のホモ接合体（Ｂｉｏｃｙｔｏｇｅｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ （Ｂｅｉｊｉｎｇ） Ｃｏ．， Ｌｔｄ．、カタログ番号１２０５２２）を使用して２つのインビボ有効性試験を行った。要するに、マウスにマウス結腸腺癌細胞ＭＣ３８－ｈＰＤ－Ｌ１（５×１０５／１００μＬ ＰＢＳ）（Ｂｉｏｃｙｔｏｇｅｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ （Ｂｅｉｊｉｎｇ） Ｃｏ．， Ｌｔｄ．）を皮下接種した。腫瘍が約１００～１５０ｍｍ３になった時、マウスをそれらの腫瘍体積に基づいて治療群又は対照群に無作為に割り当てた。治療群マウスをＡｂ００３３、ｈＩＬ２１、ＬＣ００３３－１、ＬＣ００３３－２、又はｈＩＬ２１及びＡｂ００３３（等モル）の組み合わせの投与について無作為化した。対照群マウスに等量の生理食塩水を注射した。マウスに週２回（ＢＩＷ）、合計６回（静脈内（ｉ．ｖ．）、第１有効性試験。又は腹腔内（ｉ．ｐ．）、第２有効性試験）投与を実施した。マウスの腫瘍体積及び体重を週２回測定した。マウス１匹の腫瘍体積が３０００ｍｍ３に達した時、マウスを安楽死させ、実験を終了した。２つの試験の投与レジメンはそれぞれ表４及び６にまとめる。
【0166】
９．１ 第１有効性試験
第１有効性試験の投与レジメンは表４に示す。
第１有効性試験の投与レジメンは表４に示す。
【0167】
【表4】
【0168】
群分け日（０日目）及び群分け１４日（１４日目）又は２６日（２６日目）後の腫瘍体積は表５にまとめた。腫瘍成長阻害値（ＴＧＩＴＶ％）を式：ＴＧＩＴＶ（％）＝［１－（Ｔｉ－Ｔ０）／（Ｖｉ－Ｖ０）］×１００で算出した。Ｔｉはｉ日目の治療群の平均腫瘍体積である。Ｔ０は０日目の治療群の平均腫瘍体積である。Ｖｉはｉ日目の対照群の平均腫瘍体積である。Ｖ０は０日目の対照群の平均腫瘍体積である。
【0169】
【表5】
【0170】
全体的に、各群内のマウスは実験中に健康状態が良好であった。治療群及び対照群は体重及び体重変化に有意差を示さなかった（図１０）。実験の最後に、各群内のマウスの体重が増加し、治療群及び対照群の体重に有意差がなく、これは、薬物の忍容性が高かったことを示す。結果は、ＬＣ００３３－１、ＬＣ００３３－２及びＡｂ００３３が安全であり、動物に重大な副作用がないことを示す。
【0171】
図１１から分かるように、対照マウスにおける腫瘍は実験中に成長が継続したが、治療群からのマウスにおける腫瘍成長は異なる程度に抑制された。特に、ＬＣ００３３－１及びＬＣ００３３－２群（Ｇ６、Ｇ８及びＧ１０）における腫瘍成長は、他の治療群（Ｇ２、Ｇ３、Ｇ４、Ｇ５、Ｇ７及びＧ９）と比較して有意に抑制され、これは、Ａｂ００３３又はｈＩＬ２１による単独療法又はそれらの併用療法と比較して、ＬＣ００３３－１及びＬＣ００３３－２が優れたインビボ腫瘍阻害活性を示したことを示す。
【0172】
表５及び図１１から分かるように、実験の終了時点で、ＬＣ００３３－１（Ｇ６及びＧ８）又はＬＣ００３３－２（Ｇ１０）で治療した全てのマウスの腫瘍体積は対照マウス（Ｇ１）より有意に小さくなっており、これは、ＬＣ００３３－１及びＬＣ００３３－２が低用量で腫瘍阻害効果を有することを示す。更に、ＬＣ００３３－１及びＬＣ００３３－２は同じ用量で同様の有効性を示した（ＴＧＩＴＶ％：６０．５％対５６．２％）。ＬＣ００３３－１の用量が１ｍｇ／ｋｇから３ｍｇ／ｋｇに増加した場合、ＴＧＩＴＶ％は６０．５％から６９．９％に増加し、腫瘍阻害効果が僅かに増加した。融合タンパク質（Ｇ８及びＧ１０）の顕著な抗腫瘍活性と比較して、Ａｂ００３３のみ、ｈＩＬ２１のみ又はＡｂ００３３とｈＩＬ２１の組み合わせで治療した群からのＴＧＩＴＶ％は２５％未満であり（Ｇ７を除く）、これは、Ａｂ００３３、ｈＩＬ２１及びそれらの組み合わせが顕著な抗腫瘍活性を示さなかったことを示す。
【0173】
９．２ 第２有効性試験
第２有効性試験の投与レジメンは表６に示す。
第２有効性試験の投与レジメンは表６に示す。
【0174】
【表6】
【0175】
群分け日（０日目）及び群分け１４日（１４日目）又は２４日（２４日目）後の腫瘍体積を表７にまとめ、腫瘍成長阻害値（ＴＧＩＴＶ％）を計算した。
【0176】
【表7】
【0177】
全体的に、各群内のマウスは実験中に健康状態が良好であった。治療群及び対照群は体重及び体重変化に有意差を示さなかった（図１２）。実験の最後に、各群内のマウスの体重が増加し、治療群及び対照群の体重に有意差がなく、これは、薬物の忍容性が高かったことを示す。結果は、ＬＣ００３３－１及びＡｂ００３３が安全であり、動物に重大な副作用がないことを示す。
【0178】
表７及び図１３から分かるように、対照マウスにおける腫瘍は実験中に成長が継続したが、治療群からのマウスにおける腫瘍成長は異なる程度に抑制された。実験の最後に（２４日目）、Ｇ２～Ｇ７からのマウスの腫瘍体積は、対照マウス（Ｇ１）より小さくなっており、これは、ＬＣ００３３－１及びＡｂ００３３が異なる用量で異なる腫瘍阻害効果を有することを示す。また、ＬＣ００３３－１治療は、用量依存的腫瘍阻害を示し、低用量でかなりの腫瘍阻害効果を示した（Ｇ５、ＴＧＩＴＶ％＝８０．３％）。高用量のＡｂ００３３（Ｇ４、ＴＧＩＴＶ％＝８４．１％）は中用量のＬＣ００３３－１と同等の抗腫瘍活性（Ｇ６、ＴＧＩＴＶ％＝８５．３％）を示したが、低用量（Ｇ２、ＴＧＩＴＶ％＝４０．０％）及び中用量（Ｇ３、ＴＧＩＴＶ％＝２２．９％）で腫瘍成長を阻害できなかった。
【0179】
同じ用量及び投与頻度で、ＬＣ００３３－１（Ｇ５－Ｇ７）は、Ａｂ００３３（Ｇ２～Ｇ４）より高い有効性を示し、これは、抗ＰＤ－Ｌ１抗体のインビボ腫瘍阻害効果がＩＬ２１との融合により効果的に向上したことを示す。
【0180】
図１３から分かるように、等モルのＡｂ００３３（Ｇ２）と比較して、３ｍｇ／ｋｇでのＬＣ００３３－１（Ｇ５）は腫瘍成長を効果的に阻害した。
【0181】
各治療群内のマウス１匹からのデータも研究した。３ｍｇ／ｋｇのＬＣ００３３－１群（Ｇ５）では、マウス全体における腫瘍の成長が遅く、腫瘍成長が阻害された。２．７３ｍｇ／ｋｇのＡｂ００３３群（Ｇ２）では、腫瘍が有意に阻害されたマウスがただ１匹であった。
【0182】
ＬＣ００３３－１について、中用量群（Ｇ６）における抗腫瘍活性は低用量群（Ｇ５）より高く、対応する用量（Ｇ３対Ｇ２）でのＡｂ００３３は顕著な抗腫瘍活性を示さなかった。高用量Ａｂ００３３（Ｇ４）は腫瘍成長を効果的に阻害し、抗腫瘍活性が低用量ＬＣ００３３－１（Ｇ５）と同等であった。ＬＣ００３３－１の抗腫瘍活性は高用量（Ｇ７）で更に増加したが、低用量群（Ｇ５）と比較して腫瘍阻害が有意に増加せず、即ち、顕著な用量依存的効果が観察されず、その原因は、３ｍｇ／ｋｇでのＬＣ００３３－１が既に顕著な抗腫瘍活性を示したため、ＭＣ３８腫瘍モデルについて、ＬＣ００３３－１用量の更なる増加が腫瘍を完全に除去していなかったことであるかもしれない。
【0183】
配列表
【表8】
【表9】
【表10】
【表11】
【表12】
【表13】
【表14】
【国際調査報告】