特表 2024-546769 標的複合体の調製のための親水性テトラジン機能化ペイロード

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-12-26

(54)【発明の名称】標的複合体の調製のための親水性テトラジン機能化ペイロード

(51)【国際特許分類】

   C07F 9/6524 20060101AFI20241219BHJP

   A61K 47/68 20170101ALI20241219BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20241219BHJP

   A61K 47/64 20170101ALI20241219BHJP

   A61K 47/55 20170101ALI20241219BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20241219BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20241219BHJP

   C07K 5/06 20060101ALI20241219BHJP

   C07K 5/08 20060101ALI20241219BHJP

   C07K 5/10 20060101ALI20241219BHJP

   C07K 19/00 20060101ALI20241219BHJP

   C12N 15/11 20060101ALI20241219BHJP

   C07F 9/6561 20060101ALI20241219BHJP

   C07B 61/00 20060101ALN20241219BHJP

【ＦＩ】

C07F9/6524 CSP

A61K47/68

A61K39/395 C

A61K39/395 D

A61K39/395 L

A61K39/395 M

A61K39/395 N

A61K39/395 Y

A61K47/64

A61K47/55

A61P35/00

A61K45/00

A61K39/395 E

A61K39/395 T

C07K5/06

C07K5/08

C07K5/10

C07K19/00

C12N15/11 Z

C07F9/6561 Z

C07B61/00 300

【審査請求】未請求

【予備審査請求】有

(21)【出願番号】P 2024534520

(86)(22)【出願日】2022-12-08

(85)【翻訳文提出日】2024-08-07

(86)【国際出願番号】 EP2022084914

(87)【国際公開番号】W WO2023104941

(87)【国際公開日】2023-06-15

(31)【優先権主張番号】21213081.9

(32)【優先日】2021-12-08

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】301076083

【氏名又は名称】ヨーロピアン モレキュラー バイオロジー ラボラトリー

【氏名又は名称原語表記】Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ

(71)【出願人】

【識別番号】524082524

【氏名又は名称】ヴェラクサ バイオテック ゲーエムベーハー

(74)【代理人】

【識別番号】100124648

【弁理士】

【氏名又は名称】赤岡 和夫

(74)【代理人】

【識別番号】100154450

【弁理士】

【氏名又は名称】吉岡 亜紀子

(72)【発明者】

【氏名】レムケ，エドワード，エー

(72)【発明者】

【氏名】シュルツ，カーステン

(72)【発明者】

【氏名】ケーラー，クリスティーヌ

(72)【発明者】

【氏名】ザウター，パウル，フェリクス

【テーマコード（参考）】

4C076

4C084

4C085

4H039

4H045

4H050

【Ｆターム（参考）】

4C076AA95

4C076BB01

4C076BB11

4C076BB13

4C076BB15

4C076BB16

4C076BB21

4C076BB24

4C076BB25

4C076BB29

4C076CC27

4C076CC41

4C076EE41

4C076EE59

4C076FF31

4C076FF68

4C084AA17

4C084MA05

4C084MA52

4C084MA55

4C084MA56

4C084MA58

4C084MA59

4C084MA60

4C084MA65

4C084MA66

4C084NA10

4C084NA13

4C084ZB261

4C085AA13

4C085AA14

4C085CC22

4C085CC23

4C085DD62

4C085EE01

4C085EE05

4C085GG01

4C085GG02

4C085GG03

4C085GG06

4C085GG08

4H039CA42

4H039CH40

4H045AA10

4H045AA11

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA11

4H045BA12

4H045BA13

4H045BA31

4H045BA32

4H045BA50

4H045DA76

4H045EA20

4H045FA10

4H045GA21

4H050AA01

4H050AA02

4H050AA03

4H050AB20

4H050AC80

(57)【要約】

本発明は、機能実体（ペイロード）を標的化剤、特に抗体薬物複合体（ＡＤＣ）などの生物学的標的化剤にバイオコンジュゲーションする分野に関するものであり、１つまたは複数のペイロード分子が標的化剤、例えばモノクローナル抗体にコンジュゲートされる。より具体的には、本発明は、新規な親水性テトラジン分子およびその製造に関するものであり、テトラジンは、モノクローナル抗体などの標的化剤にペイロード分子をより効率的にコンジュゲートすることを可能にする。本発明はまた、対応する機能化されたペイロード分子の製造に有用な特定のテトラジン中間体に関する。本発明はまた、それぞれの複合体、特にバイオ複合体およびその製造方法に関する。本発明はまた、本発明のそのような複合体を医療に使用すること、対応する医薬組成物、ならびに対応する診断および分析キットに関する。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

一般式Ｉのテトラジン化合物であって、

【化102】

ｍは０または１であり、
ｎは１および２から選択される整数を表し、
ｏは０、または１または２から選択される整数を表し、
Ａは切断可能なリンカー部分を表し、
Ｓｐ^１およびＳｐ^２は互いに独立してスペーサー部分を表し、
Ｘは自壊性部分を表し、
Ｙはペイロード残基（カーゴ）を表し、
Ｚはリンおよび／または硫黄含有親水性基を表し、特に、（Ｒ^１Ｏ）_２Ｐ（Ｏ）－、（Ｒ^１ａＯ）_２Ｐ（Ｏ）－Ｏ－、（Ｒ^２Ｏ）_３Ｐ－Ｏ－、Ｒ^３Ｓ（Ｏ）_２－、（Ｒ^４Ｏ）Ｓ（Ｏ）_２Ｏ－、および（Ｒ^４ａＯ）Ｓ（Ｏ）_２－から選択され、
ここで、残基Ｒ^１～Ｒ^４、Ｒ^１ａおよびＲ^４ａは同一または別異であり、互いに独立してＨまたは低級アルキル、特にメチルまたはエチルを表し、さらにより具体的にはＨであり、
または、前記リンおよび／または硫黄含有親水性部分の塩形態である、化合物。

【請求項2】

Ｚは、（Ｒ^１Ｏ）_２Ｐ（Ｏ）－、（Ｒ^１ａＯ）_２Ｐ（Ｏ）－Ｏ－、および、（Ｒ^２Ｏ）_３Ｐ－Ｏ－の親水性基の１つから選択される化合物であって、
残基Ｒ^１、Ｒ^２およびＲ^１ａは、同一または別異であり、互いに独立して、Ｈまたは低級アルキル、特にメチルまたはエチルを表し、さらにより具体的にはＨを表し、
または、親水性部分を含む前記リンの塩形態である、請求項１に記載の化合物。

【請求項3】

前記スペーサーＳｐ^１は、存在しない、または、より具体的には、
ａ）６～１４個の環炭素原子を有する単環式または多環式の、任意に単置換または多置換された芳香族部分、特に１，４－フェニレンであって、
前記１つ以上の任意の置換基は、互いに独立して、－Ｈａｌ、－ＣＨａｌ_３、－ＯＨ、－ＳＨ、－ＮＲ’_２、ＮＯ_２、－ＣＮ、－Ｃ（＝Ｏ）Ｒ’’、－Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ’’’、アルキル、アルケニル、アルキニル、およびアルコキシから選択され、
ここで、Ｒ’、Ｒ’’およびＲ’’’は、互いに独立して、ＨおよびＣ_１～Ｃ_４アルキルから選択され（部分Ｍ１）、
ｂ）一般式Ｘの複素環式残基であって、

【化103】

環部分Ｘ_１～Ｘ_４のうちの１つ、２つまたは３つ、より具体的には１つまたは２つがＮを表し、他が＞ＣＨを表し（部分Ｍ２）、
ｃ）直鎖または分岐の低級アルキレン、特に－（ＣＨ_２）_ｎ１－であって、
ｎ１は１から４の整数であり、より具体的にはメチレンであり（部分Ｍ３）、
ｄ）Ｍ１、Ｍ２、およびＭ３から選択される、少なくとも２つの同一またはより具体的には異なる部分の組み合わせであり、
および／または、
スペーサーＳｐ^２は、
ａ）６～１４個の環炭素原子を有する単環式または多環式の、任意に単置換または多置換された芳香族部分、特に１，２－フェニレン、１，３－フェニレン、または１，４－フェニレン、または式

【化104】

の単環の部分であり、
より具体的には、１，４－フェニレンであり、
前記１つまたは複数の任意の置換基は、互いに独立して、－Ｈａｌ、－ＣＨａｌ_３、－ＯＨ、－ＳＨ、、－ＮＲ’_２、ＮＯ_２、－ＣＮ、－Ｃ（＝Ｏ）Ｒ’’、－Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ’’’、アルキル、アルケニル、アルキニル、およびアルコキシから選択され、
Ｒ’、Ｒ’’およびＲ’’’は、互いに独立して、ＨおよびＣ_１～Ｃ_４アルキルから選択され（部分Ｍ１）、
ｂ）一般式Ｘの複素環式残基であって、

【化105】

ここで、環部分Ｘ_１～Ｘ_４のうちの１つ、２つまたは３つ、より具体的には１つまたは２つはＮを表し、その他は＞ＣＨを表し（部分Ｍ２）、
ｃ）直鎖状または分岐状の低級アルキレン、特に－（ＣＨ_２）_ｎ１－であり、ここでｎ１は１から４までの整数であり、より具体的にはメチレンであり（部分Ｍ３）、
ｄ）直鎖または分岐ポリアルキレンオキシド部分、特に直鎖部分－（（ＣＨ_２）_ｘ１－Ｏ）_ｙ１－または－（Ｏ－（ＣＨ_２）_ｘ１）_ｙ１－およびその分岐類似体から選択され、
ｘ１は互いに独立して１、２、３または４から選択される整数、特に１または２を表し、
ｙ１は互いに独立して１から２０までの整数、特に１から４を表し（部分Ｍ４）、
ｅ）ヘテロ原子含有部分であって、
－Ｎ（Ｒ’’’’）－、
－（ＣＨ_２）_ｘ２－Ｎ（Ｒ’’’’）－、
－Ｎ（Ｒ’’’’）－（ＣＨ_２）_ｘ３－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、
－Ｎ（Ｒ’’’’）－（ＣＨ_２）_ｘ３－Ｃ（Ｏ）－、
－Ｎ（Ｒ’’’’）－（ＣＨ_２）_ｘ４－Ｎ（Ｒ’’’’）－、
－Ｎ（Ｒ’’’’）－Ｃ（Ｏ）－（ＣＨ_２）_ｘ４－Ｎ（Ｒ’’’’）－、
－（ＣＨ_２）_ｘ４－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、および、
－（ＣＨ_２）_ｘ４－Ｃ（Ｏ）－
から選択され、
Ｒ’’’’は、互いに独立して、ＨおよびＣ_１～Ｃ_４アルキルから選択され、
ｘ２は１、２、３または４から選択される整数を表し、特に１または２であり、
ｘ３は１、２、３または４から選択される整数を表し、特に１または２であり、
ｘ４は１、２、３または４から選択される整数を表し、特に１または２であり（部分Ｍ５）、
または、
ｆ）Ｍ１、Ｍ２、Ｍ３、Ｍ４およびＭ５から選択される少なくとも２つの同一またはより具体的には異なる部分の組み合わせである、
請求項１または請求項２に記載の化合物。

【請求項4】

前記リンカー基Ａは、酵素的または化学的に切断可能なリンカー基であり、次のａ）からｄ）から選択されるものであり、
ａ）ペプチジル基、特にジ－、トリ－またはテトラ－ペプチジル基であり、
ｂ）式－（ＣＲ^７Ｒ^８）_ｎ２－Ｓ－Ｓ－（ＣＲ^７Ｒ^８）_ｎ２－Ｘ_５－またはＸ_５’－（ＣＲ^７Ｒ^８）_ｎ２－Ｓ－Ｓ－（ＣＲ^７Ｒ^８）_ｎ２－Ｘ_５－のジスルフィド基であり、
ここで
ｎ２は１から４までの整数を表し、
残基Ｒ^７およびＲ^８は互いに独立してＨまたは低級アルキル、特にメチルから選択され、または２つの残基Ｒ^７およびＲ^８がそれらが結合している炭素原子と一緒になって環状Ｃ_４～Ｃ_８アルキル基を形成し、
部分Ｘ_５は－Ｃ（Ｏ）－および－Ｏ－から選択され、
部分Ｘ_５’は、－Ｃ（Ｏ）－および－（Ｏ）Ｃ－（ＣＨ_２）－ＮＨ－から選択され、
ｃ）ヒドラゾン基は、＞Ｃ＝Ｎ－Ｎ（Ｒ^９）－および－Ｎ（Ｒ^９）－Ｎ＝Ｃ＜から選択され、
ここで、
Ｒ^９はＨまたは低級アルキルであり、
ｄ）β－グルクロニダーゼ感受性切断可能リンカー基、特にβ－グルクロン酸由来トリガー残基を有する、
請求項１から請求項３までのいずれか１項に記載の化合物。

【請求項5】

前記自壊性基Ｘは、以下のａ）からｄ）から選択され、
ａ）式－ＮＨ－ｐ－フェニレン－ＣＨ_２－Ｏ－または－Ｏ－ＣＨ_２－ｐ－フェニレン－ＮＨ－または－ＮＨ－ｐ－フェニレン－ＣＨ_２－Ｎ^＋（Ｒ^２０）_２－のｐ－アミノベンジルアルコール由来基、
ｂ）－Ｏ－Ｃ（Ｏ）－Ｏ－、
ｃ）－Ｏ－Ｃ（Ｏ）－ＮＲ^１０－（ＣＲ^１２Ｒ^１３）_ｚ－ＮＲ^１１－Ｃ（Ｏ）－Ｏ－、または、
－Ｘ^１－Ｃ（Ｏ）－ＮＲ^１０－（ＣＲ^１２Ｒ^１３）_ｚ－ＮＲ^１１－Ｃ（Ｏ）－Ｘ^２－、
ここで、ｚは１～６、特に１～４から選択される整数を表し、
Ｒ^２０は、互いに独立して、Ｈまたは低級アルキル基を表し、
Ｒ^１０およびＲ^１１は、互いに独立して、Ｈまたは低級アルキル基を表し、
Ｒ^１２およびＲ^１３は、互いに独立して、Ｈ、メチルまたはエチル、特にＨまたはメチル、特にＨを表し、そして
Ｘ^１およびＸ^２は互いに独立してＯ、ＳまたはＮＲ^１０を表し、
ｄ）以下の式のメチレンアルコキシカルバメート（ＭＡＣ）型結合
－ＯＣ（Ｏ）－ＮＲ^１３－Ｃ（Ｒ^１４Ｒ^１５）－（Ｏ）－
－ＯＣ（Ｏ）－ＮＲ^１３－Ｃ（Ｒ^１４Ｒ^１５）－（Ｓ）－
－ＯＣ（Ｏ）－ＮＲ^１３－Ｃ（Ｒ^１４Ｒ^１５）－（ＮＲ^１６）－または
－ＯＣ（Ｏ）－ＮＲ^１３－Ｃ（Ｒ^１４Ｒ^１５）－（ＮＲ^１６－Ｃ（Ｏ）Ｏ）－
であり、
ここで、Ｒ^１３、Ｒ^１４、Ｒ^１５、およびＲ^１６は互いに独立してＨまたは低級アルキル、特にＣ_１～Ｃ_４アルキルを表す、
請求項１から請求項４までのいずれか１項に記載の化合物。

【請求項6】

前記ペイロード残基Ｙは、生物活性化合物、標識剤、例えば特に染料、放射性標識および蛍光体、タンパク質分解剤、特にタンパク質分解標的キメラ（ＰＲＯＴＡＣ）に適用可能なペイロード、光増感剤、およびキレート剤から選択される、請求項１から請求項５までのいずれか１項に記載の化合物。

【請求項7】

Ｓｐ^１は
－Ｍ１－Ｍ３－、
－Ｍ２－Ｍ３－、
－Ｍ３－Ｍ１－、
－Ｍ３－Ｍ２－
の部分の組み合わせの１つから選択され、
ここで、前記部分Ｍ１、Ｍ２、Ｍ３間の結合は、独立して、化学結合、エーテル、チオエーテル、エステル、アミド、カルバメート、ジカルバメート、カーボネート、ヒドラジンまたは尿素、およびアルキレンオキシドまたは直鎖または分岐ポリアルキレンオキシド結合から選択され、
および／または、
Ｓｐ^２は、
－Ｍ１－Ｍ３－、
－Ｍ１－Ｍ４－、
－Ｍ２－Ｍ３－、
－Ｍ２－Ｍ４－、
－Ｍ２－Ｍ５－、
－Ｍ３－Ｍ１－、
－Ｍ３－Ｍ２－、
－Ｍ３－Ｍ４－、
－Ｍ１－Ｍ３－Ｍ４－、
－Ｍ１－Ｍ４－Ｍ３－、
－Ｍ２－Ｍ３－Ｍ４－、
－Ｍ２－Ｍ４－Ｍ３－、
－Ｍ３－Ｍ２－Ｍ４－、
－Ｍ３－Ｍ４－Ｍ２－、
－Ｍ２－Ｍ５－Ｍ４－
の部分の組み合わせの１つから選択され、
ここで、前記部分Ｍ１、Ｍ２、Ｍ３、Ｍ４、およびＭ５間の結合は、独立して、化学結合、エーテル、チオエーテル、エステル、アミド、カルバメート、ジカルバメート、カーボネート、ヒドラジンまたは尿素、およびアルキレンオキシドまたは直鎖または分岐ポリアルキレンオキシド結合である、請求項１から請求項６までのいずれか１項に記載の化合物。

【請求項8】

機能化標的化剤を、請求項１から請求項７までのいずれか１項に記載のテトラジン化合物と反応させて、機能化標的化剤と式Ｉのテトラジン化合物との間に共有結合を形成することによって得られる複合体であり、特に、前記機能化標的化剤は、ウイルス、全細胞、ファージ、リポソーム、生体分子、および低分子量または高分子量化合物、特に抗体、抗体誘導体、抗体フラグメント、抗体（フラグメント）融合体、酵素、タンパク質、ペプチド、ペプチド模倣物、炭水化物、単糖類、多糖類、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド、特にＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡおよびＬＮＡ分子、アプタマー、薬物、糖タンパク質、グリカン、脂質、ポリマー、化学療法剤、受容体アゴニストおよびアンタゴニスト、サイトカイン、ホルモン、ステロイド、毒素、およびそれらの誘導体から選択される、複合体。

【請求項9】

前記機能化標的化剤は、官能基として、前記式Ｉの化合物の前記テトラジン部分と反応する少なくとも１つのジエノフィル部分を含む、請求項８に記載の複合体。

【請求項10】

前記機能化標的化剤は、そのアミノ酸配列内に少なくとも１つの非天然アミノ酸残基を有する少なくとも１つのポリペプチド配列を含み、前記非天然アミノ酸残基は、前記式Ｉの化合物の前記テトラジン部分と反応する少なくとも１つのジエノフィル部分を含む、複合体であり、特に、前記機能化生体分子は、ポリクローナルまたはモノクローナル免疫グロブリン分子、特にモノクローナル抗体またはその断片である、請求項８または請求項９に記載の複合体。

【請求項11】

式Ｉのテトラジン化合物と、ディールス・アルダー型環化付加反応を介して反応可能な官能基を有する機能化生体分子との双直交型バイオコンジュゲーションによって形成される、請求項８から請求項１０までのいずれか１項に記載の複合体。

【請求項12】

ディールス・アルダー型環化付加反応を介して反応することができる官能基が、
（ｉｉｉ）次式のトランスシクロオクテニルジエノフィル基

【化106】

であり、
ここで
Ｒ^１は、水素、ハロゲン、Ｃ_１－Ｃ_４－アルキル、（Ｒ^ａＯ）_２Ｐ（Ｏ）Ｏ－Ｃ_１－Ｃ_４－アルキル、（Ｒ^ｂＯ）_２Ｐ（Ｏ）－Ｃ_１－Ｃ_４－アルキル、ＣＦ_３、ＣＮ、ヒドロキシル、Ｃ_１－Ｃ_４－アルコキシ、－Ｏ－ＣＦ_３、Ｃ_２－Ｃ_５－アルケノキシ、Ｃ_２－Ｃ_５－アルカノイルオキシ、Ｃ_１－Ｃ_４－アルキルアミノカルボニルオキシまたはＣ_１－Ｃ_４－アルキルチオ、Ｃ_１－Ｃ_４－アルキルアミノ、ジ－（Ｃ_１－Ｃ_４－アルキル）アミノ、Ｃ_２－Ｃ_５－アルケニルアミノ、Ｃ_２－Ｃ_５－アルケニル－Ｃ_１－Ｃ_４－アルキル－アミノまたはジ－（Ｃ_２－Ｃ_５－アルケニル）アミノであり、
Ｒ^ａ、Ｒ^ｂは独立して水素またはＣ_２－Ｃ_５－アルカノイルオキシメチルであり、または、
（ｉｖ）次式のシクロオクチニルジエノフィル基

【化107】

であって、
ここで、
Ｒ^２は、水素、ハロゲン、Ｃ_１－Ｃ_４－アルキル、（Ｒ^ｃＯ）_２Ｐ（Ｏ）Ｏ－Ｃ_１－Ｃ_４－アルキル、（Ｒ^ｄＯ）_２Ｐ（Ｏ）－Ｃ_１－Ｃ_４－アルキル、ＣＦ_３、ＣＮ、ヒドロキシル、Ｃ_１－Ｃ_４－アルコキシ、－Ｏ－ＣＦ_３、Ｃ_２－Ｃ_５－アルケノキシ、Ｃ_２－Ｃ_５－アルカノイルオキシ、Ｃ_１－Ｃ_４－アルキルアミノカルボニルオキシまたはＣ_１－Ｃ_４－アルキルチオ、Ｃ_１－Ｃ_４－アルキルアミノ、ジ－（Ｃ_１－Ｃ_４－アルキル）アミノ、Ｃ_２－Ｃ_５－アルケニルアミノ、Ｃ_２－Ｃ_５－アルケニル－Ｃ_１－Ｃ_４－アルキル－アミノまたはジ－（Ｃ_２－Ｃ_５－アルケニル）アミノであり、
Ｒ^ｃ、Ｒ^ｄは独立して水素またはＣ_２－Ｃ_５－アルカノイルオキシメチルである、請求項１１に記載の複合体。

【請求項13】

水性の、任意に緩衝化された反応媒体中で、請求項１から請求項７までのいずれか１項に記載のテトラジン化合物を、官能性ジエノフィル基を有する機能化生体分子と反応させ、前記分子間でディールス・アルダー型付加環化反応を行うことを含む、請求項８から請求項１２までのいずれか１項に記載のバイオ複合体を調製する方法。

【請求項14】

一般式ＩＩのテトラジン中間体であって、

【化108】

ここで、
ｎ３は１または２から選択される整数を表し、
Ｓｐ^１およびＳｐ^２は上記で定義したとおりであり、
結合α、βおよびγは互いに独立して、化学結合、またはエーテル、チオエーテル、エステル、アミド、カルボニル、特にケト、カルバメート、ジカルバメート、カーボネート、ヒドラジン、尿素、アルキレンオキシドまたは直鎖または分岐ポリアルキレンオキシド結合から選択され、
Ｚはリン含有親水性基、特に（Ｒ^１Ｏ）_２Ｐ（Ｏ）－、（Ｒ^１ａＯ）_２Ｐ（Ｏ）－Ｏ－、および（Ｒ^２Ｏ）_３Ｐ－Ｏ－を表し、
ここで、
Ｒ^１、Ｒ^１ａ、およびＲ^２は、同一または別異であり、互いに独立して、Ｈまたは低級アルキル、特にメチルまたはエチル、さらに特にＨを表し、
Ｒは、Ｈまたは化学結合を形成できる化学基、またはエーテル、チオエーテル、エステル（スクシンイミジルエステルまたはペンタフルオロフェニルエステルのような活性エステル、アミド、カルバメート、ジカルバメート、カーボネート、ヒドラジン、尿素、アルキレンオキシドまたは直鎖または分岐ポリアルキレンオキシド結合など）を形成できる化学基を表し、より具体的には、Ｒはアミノ基またはカルボキシル基を表し、任意選択で、Ｒは化学保護基を表さず、特に切断可能な保護基を表さず、より具体的にはＮ－、Ｏ－、またはＳ－保護基を表さないという条件付きである、テトラジン中間体。

【請求項15】

一般式ＩＩのテトラジン中間体の製造方法であって、
ａ）（ｉ）一般式ＩＩＩの第１シアノ化合物

【化109】

（式中、ＺおよびＳｐ^１は上記で定義したとおりであり、残基Ｚのヒドロキシル基は任意に保護された、ｉ．ｐ．アルコキシの形態で提供される。）と、
（ｉｉ）一般式ＩＶの第２シアノ化合物

【化110】

（式中、ＲおよびＳｐ^２およびｎ３は上記で定義した通りである。）とを、
（ｉｉｉ）ヒドラジン水和物の存在下で反応させる工程と、
ｂ）その後酸化する工程と、
ｃ）得られたテトラジン化合物を任意に単離する工程と、
ｄ）残基Ｚのヒドロキシル基を任意に脱保護する工程とを含む、方法。

【請求項16】

医療、特に診断および／または治療に使用するためのものである、請求項８から請求項１２までのいずれか１項に記載の複合体。

【請求項17】

請求項８から請求項１２までのいずれか１項に記載の少なくとも１つの複合体を薬学的に許容される担体中に含む、医薬組成物。

【請求項18】

請求項１から請求項７までのいずれか１項に記載のテトラジン化合物を少なくとも１つ含む、診断キットまたは分析キット。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、抗体薬物複合体（ＡＤＣ）などの、１つまたは複数のペイロード分子が標的化剤、例えばモノクローナル抗体にコンジュゲートされるような、実体（ペイロード）の標的化剤、特に生物学的標的化剤への生体共役反応（バイオコンジュゲーション）の分野に関する。より具体的には、本発明は、新規な親水性テトラジン分子およびその調製に関するものであり、テトラジンは、モノクローナル抗体などの標的化剤にペイロード分子をより効率的にコンジュゲーションすることを可能にする。本発明はまた、対応する機能化されたペイロード分子の調製に有用な特定のテトラジン中間体に関する。本発明はまた、それぞれの複合体、特にバイオ複合体およびその調製方法に関する。本発明はまた、本発明のそのような複合体の医療における使用、対応する医薬組成物、ならびに対応する診断および分析キットに関する。

【背景技術】

【0002】

ＡＤＣは、大きな注目を集めている腫瘍治療薬の急成長分野であり、このことは承認されたＡＤＣ薬の数や臨床試験の数の増加に反映されている。

【0003】

各ペイロードをモノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）に結合するために必要なコンジュゲーションは、多くの場合、ランダム結合によって行われる。これにより、通常、現在のＡＤＣ種に関する不均一性が生まれ、薬物抗体比（ＤＡＲ）は、完全に未修飾のｍＡｂｓから、不利な多数の細胞毒性分子が結合したものまでさまざまである。これにより、バッチ間のばらつきの問題が生じ、凝集や、急速なクリアランス、免疫原性、肝毒性などの付随する副作用を引き起こす可能性がある。

【0004】

これらの制限を克服する解決策は、部位特異的結合法による均質なＡＤＣ／放射免疫複合体（ＲＩＣ）の製造である。部位特異的結合法は、ＤＡＲと薬物動態特性を厳密に制御し、投与される薬剤の均一なバッチの製造を可能にする。これにより、望ましくないＡＤＣ種の副作用が消去されるため、治療指数も向上する。

【0005】

すべてのＡＤＣのもう１つの重要な構成要素は、ペイロードの結合に使用されるリンカーである。

【0006】

一般的に、プロテアソーム分解後にのみカーゴを放出する非切断型リンカーと、酵素、還元または酸による切断によって親薬物を放出する切断型リンカーには違いがある。さらに、リンカーの化学は、実際に放出される活性代謝物の特性にも影響する。たとえば、親水性が増すと、膜を介した拡散速度が低下し、細胞内での保持率が高くなり、がん細胞の多剤耐性機構に対する感受性が低下する。

【0007】

本発明者は、タンパク質へのクリック反応のための歪シクロオクチン－リジン誘導体の遺伝子コード化（ティー・プラス、エス・ミルス、シー・ケーラー、シー・シュルツ、イー・エー・レムケ、ドイツ化学会誌 ２０１１、５０、３８７８－８１）と、１，２，４，５－テトラジンとの（歪促進）逆電子要求型ディールス・アルダー環化付加（ＩＥＤＤＡ）を行うことができるｎｃＡＡの合成と遺伝子コード化（ティー・プラス、エス・ミルス、シー・ケーラー、ジェイ・ジマンスキ、アール・ミュラーら、ドイツ化学会誌 ２０１２、５１、４１６６－７０；アイ・ニキッチ、ティー・プラス、オー・シュライト、ジェイ・ジマンスキ、ジェイ・エー・ジー・ブリッグスら、ドイツ化学会誌 ２０１４、５３、２２４５－９；イー・コズマ、アイ・ニキッチ、ビー・アール・ヴァルガ、アイ・ヴィ・アランブル、ジェイ・エイチ・カンら、ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ ２０１６， １７， １５１８－２４；ジーイー・ホフマン、ティー・プラス、アイ・ニキッチ、アイ・ヴィ・アランブル、シー・ケーラー他、Ｃｈｅｍ． Ｅｕｒ． Ｊ． ２０１５、２１、１２２６６－７０）。このＧＣＥ技術の拡張により、昆虫細胞によって生成された非グリコシル化免疫グロブリンにこのようなｎｃＡＡを部位特異的に導入し、その後このクリックケミストリーを介して修飾することが可能になった（シー・ケーラー、ピー・エフ・ザウター、エム・ウォリスジン、ジー・イー・ジローナ、ケー・ガプタら、Ｎａｔ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０１６、１３、９９７－１０００）。

【0008】

マオらはドイツ化学会誌（２０１９），５８，１１０６で、チオール含有プロモーターによる非対称１，２，４，５－テトラジンの有機触媒的かつスケーラブルな合成について説明している。特に、エタノール溶液中の２つの異なるニトリル抽出物とヒドラジン水和物との反応に３－メルカプトプロピオン酸を触媒として適用し、続いて亜硝酸ナトリウムで酸化することにより、一連の非対称置換１，２，４，５－テトラジン誘導体が合成された。特定の化合物の１つは、位置１がメチルホスホネート基で、位置６がメチル基で置換された１，２，４，５－テトラジン誘導体であった。このホスホネート前駆体は、ホーナー・ワズワース・エモンズ反応によってさらに誘導体化され、異なるトランスアルケン部分を含む側鎖が導入された。

【0009】

米国特許出願公開第ＵＳ２０１９２４７５１３Ａ１号は、テトラジン化合物および前記テトラジンと逆電子要求ディールス・アルダー反応を起こすことができるジエノフィル、ならびに生体直交薬物活性化におけるそれらの使用を開示している。特に、化合物３３３および１４．５～１４．７は、蛍光ペイロードを提示すテトラジン誘導体に関するものであり、テトラジンコアから、アリールまたはペプチジルまたはアルキルベースのスペーサー、ならびにポリオキシアルキルベースの親水性基などのさまざまな化学的性質のスペーサーによって離間されている。

【0010】

国際公開公報ＷＯ２０２０／２５６５４４Ａ１号は、クリック結合収率が高いことを特徴とする置換テトラジンに関する。タートラジンコアはピリジルベースのスペーサーに結合しており、スペーサー自体はグルタル基を介してペイロードＲ８７（細胞毒性薬など）および／またはポリオキシアルキル親水性基に結合している。

【0011】

マオら（ドイツ化学会誌（２０２１），６０，２３９３－２３９７）および国際公開公報第ＷＯ２０２０／２３９０３９Ａ１号は、テトラジンコアからアルキルベースのスペーサーによって離間された親水性または化学結合を形成できる化学部分（カルボキシル、ヒドロキシルまたはリン酸ベースの基など）を含むテトラジン化合物を開示している。その点において、マオらは、化学結合を形成できる前記親水性または化学部分が蛍光基に置き換えられた化合物についても記載している。

【0012】

シャイニャン，ビー・エーら（ＣＨＥＭＩＣＡＬ ＡＢＳＴＲＡＣＴＳ ＳＥＲＶＩＣＥ、米国オハイオ州コロンバス、データベースアクセス番号１９８３：４５３７１１）は、パラ置換基としてアルキルスルホン基を有するテトラジンに関する。

【0013】

国際公開第ＷＯ２０１４／０８１３０１Ａ１号は、テトラジンコアが、アリールベースのスペーサーを介して化学結合を形成できるさまざまな親水性または化学部分に連結されているテトラジンを開示している。

【0014】

オラー・サルヴィアら（ドイツ化学会誌（２０１８），５７２８３１－２８３４）は抗体薬物複合体の分野に関し、逆電子要求型ディールス・アルダー付加環化反応により、トラスツズマブをテトラジン修飾モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）に部位選択的にコンジュゲートした構造を開示している。この部位特異的コンジュゲーションに使用されるテトラジンハンドルは、テトラジンコアに結合したアリール部分からなる。

【0015】

ハンドラら（Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ２０２１，２６，４６４０）は、プレ標的戦略におけるＩＥＤＤＡ反応などの生体直交型反応の使用に関する。さまざまなテトラジン代替物が適切なジエンとして開示されており、これらのジエンはアルキルおよび／またはアリールスペーサーを提示するｐ－置換テトラジンコアの存在を特徴とする。開示の図２は、それぞれの反応性に基づく前記テトラジン代替物の分類に関する。

【0016】

１，２，４，５－テトラジン機能化ペイロード分子を、生体直交型反応を介して、対応する機能化標的分子に、より好ましい結合を可能にする、さらに改良された１，２，４，５－テトラジン誘導体が必要である。特に、水性の任意に緩衝化された環境において、大きな立体障害なしに、歪み促進逆電子要求型ディールス・アルダー環化付加（ＳＰＩＥＤＡＣ）を介して、このような生体直交型反応を進行させる、さらに改良された１，２，４，５－テトラジン誘導体が必要である。より具体的には、親水性が増大したことにより、より疎水性のペイロードの結合を可能にし、薬理学的に活性な複合体の場合には、生体内でのこのような複合体のより優れた機能プロファイルを提供する、このようなテトラジン誘導体が必要である。

【発明の概要】

【0017】

上記の問題は、テトラジンＣ置換基として、例えばホスホネート残基などの小さな親水性基を有する１，２，４，５－テトラジン機能化ペイロード分子を提供することによって驚くべきことに解決された。本発明により、破壊の恐れのある有機溶媒の添加や、それに伴う敏感な生物学的因子の使用を必要とせずに、水性緩衝液中のＳＰＩＥＤＡＣを介した生体直交型バイオコンジュゲーションのためのペイロードを容易に使用することが可能になる。また、凝集の防止や、形成されたバイオコンジュゲーション剤の溶解性の向上にも役立つ。サイズが比較的小さいため、ＰＥＧ、グリコシドなどのより大きな可溶化ユニットと比較して立体障害がほとんどなく、最小サイズのペイロードを結合できる。たとえば、複合体内にかさばるＰＥＧリンカーは必ずしも必要ではないため、最終的なペイロードまたはそれぞれの標的複合体のサイズを縮小できる。対応するメチルテトラジン基に基づく同様のサイズのペイロードは、同じ条件下で抗体にコンジュゲートすることはできない。また、請求された方法で親水性を高めることにより、薬物動態が改善された複合体、特にＡＤＣを提供できると同時に、テトラジンの親水性基のサイズが小さくなるため、抗体によってペイロード全体がより適切にマスクされることも観察された。より具体的には、上記の問題は、例えばアミドカップリングまたはカルバメートの形成を介してペイロード分子とのカップリングを可能にする化学部分をさらに有するホスホネート基を有するテトラジンの誘導体を提供することによって解決される。対応するテトラジン機能化ペイロード分子は、本明細書で以下に記載する一般式Ｉで表され、対応するテトラジン機能化中間体は、本明細書で以下に記載する一般式ＩＩで表される。

【図面の簡単な説明】

【0018】

【図1】１，２，４，５－テトラジンを含む、ｍＡｂに部位特異的に組み込まれたＴＣＯ誘導体のＩＥＤＤＡ。

【図2】トラスツズマブＡ１３２ＴＣＯ^＊－５の精製。Ａ：スーパーデックスＳ２００ラン、Ｂ：Ｓ２００ランの画分１０－２０を分析するクマシー染色ＳＤＳ－ＰＡＧＥ。

【図3】トラスツズマブＡ１３２ＴＣＯ^＊－１１の精製：スーパーデックスＳ２００ラン、Ｂ：Ｓ２００ランの画分１０－２０を分析するクマシー染色ＳＤＳ－ＰＡＧＥ

【図4】細胞毒性アッセイ。トラスツズマブ－５（＝化合物５）、トラスツズマブ－１１（＝化合物１１）、およびトラスツズマブＷＴの測定値を示す。

【発明を実施するための形態】

【0019】

Ａ．略語
ＡＤＣ＝抗体薬物複合体
ＡＰＣ＝抗体ペイロード複合体
ａｑ．＝水性の
Ｂｐｓ＝塩基対
ＢＣＮ＝２－アミノ－６－（９－ビオシクロ［６．１．０］ノン－４－イニルメトキシカルボニルアミノ）ヘキサノイド酸
ＢＯＣ＝２－アミノ－６－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニルアミノ）ヘキサン酸、例では「ＢＯＣ」は特に（２Ｓ）－２－アミノ－６－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニルアミノ）ヘキサン酸を指す＝Ｂｏｃ－Ｌ－Ｌｙｓ－
ＯＨ＝Ｎ－α－ｔｅｒｔ－ブチルオキシカルボニル－Ｌ－リジン
ｃｏｎｃ．＝濃縮された
ＤＡＲ＝薬物抗体比
ＤＣＭ＝ジクロロメタン
ＤＤＱ＝２，３－ジクロロ－５，６－ジシアノ－１，４－ベンゾキノン
ＤＩＰＥＡ＝Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン
ＤＭＦ＝ジメチルホルムアミド
ＤＭＳＯ＝ジメチルスルホキシド
ＥＤＣ＝１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド
ｅｑ．＝同等物
ＥｔＯＨ＝エタノール
ＧＣＥ＝遺伝暗号の拡張
ｈ＝時間
ＨＡＴＵ＝１－［ビス（ジメチルアミノ）メチレン］－１Ｈ－１，２，３－トリアゾロ［４，５－ｂ］ピリジニウム３－オキシドヘキサフルオロホスフェート、カップリング剤
ＨＯＢｔ＝ヒドロキシベンゾトリアゾール
ＩＥＤＤＡ＝逆電子要求型ディールス・アルダー付加環化反応
ｋＤａ＝キロダルトン
ｍｉｎ＝分
ＭＭＡＥ＝モノメチルアウリスタチンＥ（（Ｓ）－Ｎ－（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）－１－（（Ｓ）－２－（（１Ｒ，２Ｒ）－３－（（（１Ｓ，２Ｒ）－１－ヒドロキシ－１－フェニルプロパン－２－イル）アミノ）－１－メトキシ－２－メチル－３－オキソプロピル）ピロリジン－１－イル）－３－メトキシ－５－メチル－１－オキソヘプタン－４－イル）－Ｎ，３－ジメチル－２－（（Ｓ）－３－メチル－２－（メチルアミノ）ブタナミド）ブタナミド）、抗腫瘍剤
ＭｅＯＨ＝メタノール
ｎｃＡＡ＝非標準アミノ酸
ＮＥＳ＝核外搬出シグナル
ＮＬＳ＝核局在化シグナル
Ｏ－ｔＲＮＡ＝直交型ｔＲＮＡ
Ｏ－ＲＳ＝直交型ＲＳ
ＰＢＳ＝リン酸緩衝生理食塩水
ＰＭＳＦ＝フェニルメチルスルホニルフルオリド
ＰＮＰクロロホルメート＝４－ニトロフェニルクロロホルメート
ＰＯＩ＝対象ポリペプチド
ｐＲＳ＝原核生物のＲＳ
ｐｔＲＮＡ＝原核生物のｔＲＮＡ
ＰｙｌＲＳ＝ピロリシルｔＲＮＡ合成酵素
ＰｙｌＲＳ^ＡＦ＝アミノ酸置換Ｙ３０６ＡおよびＹ３８４Ｆを含む変異型メタノサルキナ・マゼイピロリシルｔＲＮＡ合成酵素
ＲＣＦ（ｒｃｆ）＝相対遠心力
ＲＰ－ＨＰＬＣ＝逆相高速液体クロマトグラフィー
ＲＳ＝アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素
ＲＴ＝室温／周囲温度（２０～２５℃）
ＳＣＯ＝２－アミノ－６－（シクロオクト－２－イン－１－イルオキシカルボニルアミノ）ヘキサン酸

【化1】

ＳＤＳ－ＰＡＧＥ＝ソデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動
ＳＰＩＥＤＡＣ＝ひずみ促進逆電子要求型ディールス・アルダー付加環化反応
５－ＴＡＭＲＡ＝５－カルボキシテトラメチルローダミン
５－ＴＡＭＲＡ－ＯＳｕ＝５－カルボキシテトラメチルローダミンＮ－スクシンイミジルエステル、蛍光体
ＴＣＯ＝トランスシクロオクテン
ＴＣＯ－Ｌｙｓ＝Ｎ－ε－（（トランス－シクロオクト－４－エン－１－イルオキシ）カルボニル）－Ｌ－リジン
ＴＣＯ^＊－Ｌｙｓ＝Ｎ－ε－（（トランス－シクロオクト－２－エン－１－イルオキシ）カルボニル）－Ｌ－リジン
ＴＣＯ^＃－Ｌｙｓ＝Ｎ－ε－（（トランス－シクロオクト－３－エン－１－イルオキシ）カルボニル）－Ｌ－リジン
ＴＣＯ－Ｅ－Ｌｙｓ＝Ｎ６－（（（（Ｒ，Ｅ）－シクロオクト－４－エン－１－イル）オキシ）カルボニル）－Ｌ－リジン

【化2】

ＴＣＯ^＊Ａ－Ｌｙｓ＝Ｎ６－（（（（Ｓ，Ｅ）－シクロオクト－２－エン－１－イル）オキシ）カルボニル）－Ｌ－リジン

【化3】

ＴＦＡ＝トリフルオロ酢酸
ＴＨＦ＝テトラヒドロフラン
ＴＬＣ＝薄層クロマトグラフィー
ｔＲＮＡ^Ｐｙｌ＝野生型または改変型ＰｙｌＲＳによってピロリシンでアシル化できるｔＲＮＡであり、ｎｃＡＡをＰＯＩに部位特異的に組み込むために、セレクターコドンの逆相補となるアンチコドンを持つ。
ＵＮＡＡ＝非天然アミノ酸、ｎｃＡＡと同義
Ｕ６プロモーター＝哺乳類細胞におけるＵ６ＲＮＡ（小さな核ＲＮＡ）の発現を通常制御するプロモーター
ＵＨＰＬＣ－ＭＳ＝超高速液体クロマトグラフィー／質量分析

【0020】

Ｂ．定義

【0021】

Ｂ１．一般的な定義
本明細書において別途定義されていない限り、本発明に関連して使用される科学技術用語は、当業者に一般的に理解されている意味を有するものとする。用語の意味と範囲は明確であるべきであるが、潜在的な曖昧さがある場合は、ここで提供される定義が辞書や外部の定義よりも優先される。さらに、文脈により別途要求されない限り、単数形の用語は複数形も含み、複数形の用語は単数形も含む。

【0022】

本明細書で使用される「精製された」、「実質的に精製された」および「単離された」という用語は、本発明の化合物が通常その自然状態で関連する他の異なる化合物がない状態を指し、したがって、「精製された」、「実質的に精製された」および「単離された」対象は、所定の試料の質量の少なくとも０．５％、１％、５％、１０％、または２０％、あるいは少なくとも５０％または７５％の重量を占める。一実施形態では、これらの用語は、所与の試料の質量の少なくとも９５、９６、９７、９８、９９または１００％を構成する本発明の化合物を指す。本明細書において、核酸またはタンパク質を指す場合の「精製された」、「実質的に精製された」および「単離された」という用語は、例えば細菌または真菌細胞のような原核生物または真核生物の環境、または哺乳類生物、特に人体内で自然に発生するものとは異なる精製状態または濃度の状態も指す。（１）他の関連する構造または化合物からの精製、または（２）当該原核生物または真核生物の環境で通常は関連しない構造または化合物との関連を含む、自然に発生するものよりも高い程度の精製または濃縮は、「単離」の意味に含まれる。本明細書に記載の核酸またはタンパク質、あるいは核酸またはタンパク質のクラスは、当業者に知られているさまざまな方法およびプロセスに従って、単離されるか、または自然界では通常関連しない構造または化合物と関連付けられてもよい。

【0023】

本明細書および添付の特許請求の範囲の説明の文脈において、「または」の使用は、特に明記しない限り、「および／または」を意味する。

【0024】

同様に、「含有」、「備える」、「備えている」、「含む」、「含める」および「含んでいる」は互換性があり、限定することを意図したものではない。

【0025】

さらに、さまざまな実施形態の説明で「含む」という用語が使用されている場合、特定の場合には、実施形態は「本質的に～からなる」または「～からなる」という用語を使用して説明できることを当業者は理解するであろう。

【0026】

「１つ以上」という用語、または類似の用語「少なくとも１つ」は、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上を指す。

【0027】

数値範囲の下限値と上限値が開示されている場合、その範囲内に含まれる数値とその包含範囲は、その上限値と下限値を含めて具体的に開示されている。特に、本明細書に開示されるあらゆる値の範囲は、あらゆる値、および、より広い範囲内に含まれるより狭い範囲を意味するものと理解されるべきである。

【0028】

「約」という用語は、記載された値の±２５％、具体的には±１５％、±１０％、さらに具体的には±５％、±２％、または±１％の潜在的な変動を示す。

【0029】

「実質的に」という用語は、約８０～１００％、例えば８５～９９．９％、特に９０～９９．９％、より具体的には９５～９９．９％、または９８～９９．９％、とりわけ９９～９９．９％などの値の範囲を表する。

【0030】

「主に」とは、５０％以上の範囲、例えば５１～１００％の範囲、特に７５～９９．９％の範囲、さらに具体的には８５～９８．５％、９５～９９％などの割合を指す。

【0031】

本開示が、異なる優先度の特徴、パラメータ、およびその範囲（一般的な、明示的には好まれない特徴、パラメータ、およびその範囲を含む）に言及する場合、特に明記しない限り、それぞれの優先度に関係なく、そのような特徴、パラメータ、およびその範囲の２つ以上の任意の組み合わせが、本明細書の開示に包含される。

【0032】

Ｂ２．化学的定義
ハロゲンという用語は、いずれの場合もフッ素、臭素、塩素、またはヨウ素のラジカル、特にフッ素ラジカルを表する。

【0033】

「アルキル」は、１～６個、特に１～４個または１、２または３個の炭素原子を有する直鎖または分岐アルキル基を指す。例としては、メチル、Ｃ_１－Ｃ_４－アルキル残基（メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、２－ブチル、イソブチルまたはｔｅｒｔ－ブチルなど）；ｎ－ペンチル、１－メチルブチル、２－メチルブチル、３－メチルブチル、２，２－ジメチルプロピル、１－エチルプロピル、１，１－ジメチルプロピル、１，２－ジメチルプロピル；ｎ－ヘキシル、１－メチルペンチル、２－メチルペンチル、３－メチルペンチル、４－メチルペンチル、１，１－ジメチルブチル、１，２－ジメチルブチル、１，３－ジメチルブチル、２，２－ジメチルブチル、２，３－ジメチルブチル、３，３－ジメチルブチル、１－エチルブチル、２－エチルブチル、１，１，２－トリメチルプロピル、１，２，２－トリメチルプロピル、１－エチル－１－メチルプロピルおよび１－エチル－２－メチルプロピルなどが挙げられる。

【0034】

「低級アルキル」とは、１、２、３または４個、特に１または２個の炭素原子を有する直鎖または分岐アルキル基を指す。例としては、メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、２－ブチル、イソブチルまたはｔｅｒｔ－ブチルが挙げられる。

【0035】

「アルケニル」とは、２、３、４、５または６個の炭素原子を有する単一の化学炭素－炭素二重結合を含む一価不飽和炭化水素ラジカルを指し、例えば、ビニル、アリル（２－プロペン－１－イル）、１－プロペン－１－イル、２－プロペン－２－イル、メタリル（２－メチルプロプ－２－エン－１－イル）などである。

【0036】

「低級アルケニル」とは、２、３または４個の炭素原子を有する単一の化学炭素－炭素二重結合を含む一価不飽和炭化水素ラジカルを指し、例えば、ビニル、アリル（２－プロペン－１－イル）、１－プロペン－１－イル、２－プロペン－２－イル、メタリル（２－メチルプロプ－２－エン－１－イル）などである。

【0037】

「アルキニル」および「低級アルキニル」は、上記のアルケニルまたは低級アルケニル基の類似体に関連し、単一の化学炭素－炭素三重結合を含む一価不飽和炭化水素ラジカルを表す。

【0038】

「アルキレン」とは、１～６個、特に１～４個の炭素原子を有する直鎖または分岐アルキレン基を指す。例としては、メチレン、エチレン、１，２－エチレン、１，３－プロピレン、イソプロピレン、１－４－ブチレン、１－５－ペンチレン、１－６－ヘキシレン、およびそれらの分岐類似体が挙げられる。

【0039】

「低級アルキレン」とは、１～４個の炭素原子を有する直鎖または分岐アルキレン基を指す。例としては、メチレン、エチレン、１，２－エチレン、１，３－プロピレン、イソプロピレン、１－４－ブチレン、およびそれぞれの分岐類似体が挙げられる。

【0040】

「アルコキシ」は、式Ｒ－Ｏ－のラジカルを指し、ここでＲは、本明細書で定義される１～６個、特に１～４個または１～３個の炭素原子を有する、上記で定義される直鎖または分岐アルキル基である。限定されない例としては、メトキシ、エトキシ、ｎ－プロポキシ、イソプロポキシ、ｎ－ブトキシ、２－ブトキシ、イソブトキシまたはｔｅｒｔ－ブトキシが挙げられる。

【0041】

「アルキレンオキシ」は、式－Ｒ－Ｏ－のラジカルを指し、ここでＲは、本明細書で定義される１～６個、特に１～４個または１～３個の炭素原子を有する直鎖または分岐アルキレン基である。

【0042】

「低級アルキレンオキシ」は、式－Ｒ－Ｏ－のラジカルを指し、ここでＲは、本明細書で定義される１～４個または１～３個の炭素原子を有する直鎖または分岐の低級アルキレン基である。例としては、メチレンオキシ、エチレンオキシ、１，２－エチレンオキシ、１，３－プロピレンオキシ、イソプロピレンオキシおよび１－４－ブチレンオキシが挙げられる。

【0043】

「ポリアルキレンオキシ」は、共有結合した、同一または異なる、特に同一の、上記で定義される少なくとも２個の炭素原子を有する低級アルキレンオキシ基、特に２～２０、２～１５、２～１０または２～５個の同一の繰り返し単位を有するポリエチレンオキシおよびポリプロピレンオキシ基の少なくとも２個、例えば２～２０、２～１５、２～１０または２～５個の繰り返し単位を含む部分に関する。

【0044】

「アルケノキシ」は、式Ｒ－Ｏ－のラジカルを指し、ここでＲは、本明細書で定義される１～６個、特に１～４個または１～３個の炭素原子を有する直鎖または分岐アルケニル基である。

【0045】

「アルカノイルオキシ」は、式Ｒ－（ＣＯ）－Ｏ－のラジカルを指し、ここでＲは、本明細書で定義される１～６個、特に１～４個または１～３個の炭素原子を有する直鎖または分岐アルキル基である。

【0046】

「アルキルアミノカルボニルオキシ」は、式Ｒ－ＮＨ－（ＣＯ）－Ｏ－のラジカルを指し、ここでＲは、本明細書で定義される１～６個、特に１～４個または１～３個の炭素原子を有する直鎖または分岐アルキル基である。

【0047】

「アルキルチオ」は、式Ｒ－Ｓ－のラジカルを指し、ここでＲは、本明細書で定義される１～４個、好ましくは１～３個の炭素原子を有するアルキルラジカルである。

【0048】

「アルキルアミノ」は、式Ｒ－ＮＨ－のラジカルを指し、ここでＲは、本明細書で定義される１～６個、特に１～４個の炭素原子を有するアルキルラジカルである。例としては、メチルアミノ、エチルアミノ、ｎ－プロピルアミノ、イソプロピルアミノ、ｎ－ブチルアミノ、２－ブチルアミノ、イソブチルアミノ、ｔｅｒｔ－ブチルアミノなどが挙げられる。

【0049】

「ジアルキルアミノ」は、式ＲＲ’Ｎ－のラジカルを指し、ここでＲおよびＲ’は、互いに独立して、本明細書で定義される１～６個、特に１～４個の炭素原子を有するアルキルラジカルである。例としては、ジメチルアミノ、ジエチルアミノ、Ｎ－メチル－Ｎ－エチルアミノなどが挙げられる。

【0050】

「アルケニルアミノ」は、式Ｒ－ＮＨ－のラジカルを指し、ここでＲは、本明細書で定義される２～６個、特に２～４個の炭素原子を有するアルケニルラジカルである。例としては、ビニルアミノ、アリルアミノ（２－プロペン－１－イルアミノ）、１－プロペン－１－イルアミノ、２－プロペン－２－イルアミノ、メタリルアミノ（２－メチルプロプ－２－エン－１－イルアミノ）などが挙げられる。

【0051】

「Ｎ－アルキル－Ｎ－アルケニルアミノ」は、式ＲＲ’Ｎ－のラジカルを指し、ここでＲは、本明細書で定義される１～６個、特に１～４個の炭素原子を有するアルキルラジカルであり、Ｒ’は、本明細書で定義される２～６個、特に２～４個の炭素原子を有するアルケニルラジカルである。例としては、Ｎ－メチル－Ｎ－ビニルアミノ、Ｎ－メチル－Ｎ－アリルアミノ（Ｎ－メチル－Ｎ－２－プロペン－１－イルアミノ）、Ｎ－メチル－Ｎ－１－プロペン－１－イルアミノ、Ｎ－メチル－Ｎ－２－プロペン－２－イルアミノ、Ｎ－メチル－Ｎ－メタリルアミノ（Ｎ－メチル－Ｎ－２－メチルプロプ－２－エン－１－イルアミノ）などが挙げられる。

【0052】

「ジアルケニルアミノ」は、式ＲＲ’Ｎ－のラジカルを指し、ここでＲおよびＲ’は、互いに独立して、本明細書で定義される２～６個、特に２～４個の炭素原子を有するアルキルラジカルである。例としては、ジビニルアミノ、ジアリルアミノ（ジ－（２－プロペン－１－イル）－アミノ）、Ｎ－ビニル－Ｎ－アリルアミノなどが挙げられる。

【0053】

「アリール」とは、特に６～１４個の環炭素原子を有する一価の単環式または多環式芳香族部分、特にフェニル、フルオレニル、ナフテニルおよびフェナントレニルを指す。

【0054】

「アリーレン」とは、上記のアリール基の二価類似体、特に１，２－、１，３－および１，４－フェニレンを指す。

【0055】

「ハロゲン」はＦ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩを指す。

【0056】

別途記載がない限り、「置換基」という用語は、ハロゲン、Ｃ_１－Ｃ_４－アルキル、ＣＮ、ＣＦ_３、ヒドロキシル、－Ｏ－ＣＦ_３、Ｃ_１－Ｃ_４－アルコキシ、Ｃ_２－Ｃ_４－アルカノイルオキシ、Ｃ_１－Ｃ_４－アルキルアミノカルボニルオキシおよびＣ_１－Ｃ_４－アルキルチオ、カルボキシおよびカルボキシ－Ｃ_１－Ｃ_４－アルキルから選択される。

【0057】

別途記載がない限り、「置換」という用語は、ラジカルが１、２、または３個、特に１個または２個の置換基で置換されていることを意味する。

【0058】

「結合」は、本発明の化合物の２つの隣接する構造モチーフの間に形成され、特に断りのない限り、化学結合であるか、またはエーテル、チオエーテル、エステル、アミド、カルバメート、ジカルバメート、カーボネート、ヒドラジン、尿素、アルキレンオキシド、または任意の可能な配向の直鎖状または分岐状のポリアルキレンオキシド結合から選択される。

【0059】

「エーテル」結合には、（－Ｏ－）タイプの基が少なくとも１つ含まれる。

【0060】

「チオエーテル」結合には、（－Ｓ－）タイプの基が少なくとも１つ含まれる。

【0061】

「アミド」結合には、－Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ）－または－（Ｒ）Ｎ－Ｃ（＝Ｏ）－タイプの基が少なくとも１つ含まれる。

【0062】

「カルバメート」結合には、－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）－Ｎ（Ｒ）－または－Ｎ（Ｒ）－Ｃ（＝Ｏ）－Ｏ－タイプの基が少なくとも１つ含まれる。

【0063】

「ジカルバメート」結合には、－Ｎ（Ｒ）－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－Ｒ’－ＯＣ（＝Ｏ）－Ｎ（Ｒ）－のタイプの基が少なくとも１つ含まれる。

【0064】

「炭酸」結合には、－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－、－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－、または－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）－Ｏ－タイプの基が少なくとも１つ含まれる。

【0065】

「ヒドラジン」結合には、－ＮＨ－ＮＨ－のタイプの基が少なくとも１つ含まれる。

【0066】

「尿素」結合には、－Ｎ（Ｒ）－Ｃ（＝Ｏ）－Ｎ（Ｒ）－のタイプの基が少なくとも１つ含まれる。

【0067】

「アルキレンオキシド」結合には、－（（ＣＨ_２）_ｎ－Ｏ）－または－（Ｏ－（ＣＨ_２）_ｎ）－のタイプの基が少なくとも１つ含まれ、ｎは１、２、３または４、特に１または２である。

【0068】

「ポリアルキレンオキシド」結合は、上記で定義した同じまたは異なるアルキレンオキシド基の繰り返し単位を含み、直鎖または分岐鎖、特に直鎖であり得、例えば、－（（ＣＨ_２）_ｎ－Ｏ）_ｍ－または－（Ｏ－（ＣＨ_２）_ｎ）_ｍ－であり、ｎ＝１、２、３または４、特に１または２であり、ｍ＝２～２０、２～１５、２～１０または２～５である。

【0069】

特定の結合の上記の化学式において、残基Ｒは互いに独立して、Ｈまたは低級アルキル、低級アルケニルまたは低級アルケニル、特にメチル、またはエチルを表すことができ、Ｒ’は低級アルキレン基または低級アルケニレン基、特にメチレンまたはエチレンを表す。

【0070】

「切断可能な基」には、特に生体内または生体外条件下で、酵素的または化学的に切断され得る任意の基が含まれる。酵素的切断は、例えばプロテアーゼの作用によって行われ得、化学的切断は、例えばＳ－Ｓ結合の加水分解的切断または還元的切断によって行われ得る。

【0071】

本発明における「テトラジン」基は、特に定義されない限り、分子式が－Ｃ_２Ｎ_４－で示される４つの窒素原子を含む６員芳香族環からなる残基を表し、特に１，２，４，５－テトラジンまたはｓ－テトラジン異性体から誘導され、環炭素位置３および６を介して隣接する基に結合している。

【0072】

「テトラジン反応性基」とは、特に、いわゆる「生体直交型」または「クリック反応」を介して、本明細書で定義されるテトラジン基と化学的に反応する能力を有する化学部分である。特に、このようなテトラジン反応性基は、ジエノフィルから選択される。より具体的には、生物学的環境においてテトラジン基と反応する能力を有するジエノフィルから選択される。限定されない例としては、イソニトリル基、ノルボルネン基、ビシクロノニニル基、シクロオクテニル基、シクロオクチニル基、シクロプロペニル基、シクロブチニル基、スピロヘキセニル基およびそれらの立体異性体、アルケンまたはアリル基またはジヒドロアゼト基が挙げられる。

【0073】

「テトラジン連結」とは、逆要求型ディールス・アルダー反応におけるトランス－シクロオクテンとｓ－テトラジンの反応と、それに続く逆ディールス・アルダー反応によって窒素（Ｎ_２）を除去する反応を指す。このタイプの反応は高速で進行し、極めて低濃度での生体分子の改変を可能にする。

【0074】

本明細書に記載の化合物は、立体中心、立体軸などの１つ以上の非対称要素、例えば、非対称炭素原子を含む場合があり、そのため、化合物は異なる立体異性体の形で存在することができる。これらの化合物は、例えば、ラセミ体または光学活性体である可能性がある。すべての立体異性体、ジアステレオマー、Ｚ型およびＥ型が、精製された形態および混合物の形態で含まれる。したがって、化合物が特定の名前で記載されている場合、または化合物のクラスが記載されている場合、これらすべての形式が含まれることが意図されている。

【0075】

本明細書に記載の化合物は、構成異性体または位置異性体とも呼ばれる構造異性体の複数の形態で存在する場合もある。これらは、全体的な化学式は同じでありながら、原子または原子団の順序が異なるだけの分子である。

【0076】

したがって、特に明記しない限り、本明細書に記載の各化合物、生体分子および複合体について、そのような潜在的な立体異性体または位置異性体形態、または複数の立体異性体および／または位置異性体形態の混合物は、本発明の範囲内である。

【0077】

「逆電子要求型ディールス・アルダー（ＩＥＤＤＡ）付加環化」は、電子不足のジエンと電子過剰のジエノフィルとの間の反応であり、さまざまな種類の「生体直交型反応」の一例にすぎない。使用されるジエンは、１，２，４，５－テトラジンまたは１，２，４－トリアジンであり得る。ジエノフィルには、トランスシクロオクテン（ＴＣＯ、ノルボルネン、シクロプロペン、アゼチン）などの歪環状アルケンを含むさまざまな分子が含まれる。これらのうち、テトラジンとＴＣＯの反応は、これまでに報告された中で最も速く、生体内の適用に適している（スメークら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｖｏｌｕｍｅ ６０、２０２１年２月、７９－８８ページ）。

【0078】

「生体直交型」という用語は、生体システムの内部、つまり水性環境内で、本来の生化学プロセスに干渉することなく起こり得る化学反応を指す。たとえば、「テトラジン連結反応」は生体直交型反応の一種として挙げられる。生体直交型化学は通常、２つの工程で進行する。まず、細胞基質は、例えば上記で特定した「テトラジン反応性基」の１つなどの生体直交型官能基（化学レポーターとも呼ばれる）で修飾される。細胞基質には、例えば、天然抗体や組み換え抗体などの免疫グロブリンなどが含まれる。化学レポーターは、基質の生物活性に影響を与えないように、基質の構造を劇的に変化させてはならない。第２工程では、相補的な官能基、例えば本明細書に記載のテトラジン基を含むプローブが導入され、基質と反応して標識される。

【0079】

本発明の化合物の「酸または塩基付加塩」は、特に生理学的に許容される酸または塩基との付加塩である。生理学的に許容される酸付加塩は、本発明の化合物の塩基形態を適切な有機酸または無機酸で処理することによって形成することができる。酸性プロトンを含む本発明の化合物は、適切な有機塩基および無機塩基で処理することにより、非毒性の金属またはアミン付加塩形態に変換することができる。本発明の化合物および塩には、水和物および溶媒添加形態、例えば水和物、アルコラートなども含まれる。

【0080】

「生理学的に許容される」酸または塩基は、特に、第１および第２ジエノフィルの組み込みに使用されるシステム（例えば、トランスシクロオクテニル基またはシクロオクチニル基を含むポリペプチドの調製に使用される翻訳システムなどの生物学的システム）によって許容される酸または塩基であり、例えば、生細胞に対して実質的に無毒である。

【0081】

「医薬組成物」は、本発明のＡＤＣに加えて、医薬として許容される保存料、医薬として許容される着色剤、医薬として許容される保護コロイド、医薬として許容されるｐＨ調整剤、および医薬として許容される浸透圧調整剤からなる群から選択される１つ以上の物質を含む。このような物質は、当該技術分野で説明されている。本発明の医薬組成物のより詳細な説明は以下に記載される。

【0082】

本明細書において使用される「有効量」という用語は、疾患またはその１つ以上の症状の重症度および／または持続期間を軽減または緩和する、疾患の進行を防ぐ、疾患の退行を引き起こす、疾患に関連する１つ以上の症状の再発、発現、発症または進行を防ぐ、疾患を検出する、または別の治療法（例えば、予防薬または治療薬）の予防効果または治療効果を高めるまたは改善するのに十分な治療法の量を指す。

【0083】

Ｂ．３ 生化学的定義
「ポリペプチド」とは、任意の長さのアミノ酸残基（天然または非天然、あるいはそれらの組み合わせ）のオリゴマーであり、通常は共有ペプチド結合によって結合されるが、必ずしも共有ペプチド結合によって結合されるわけではない。ポリペプチドは、天然に存在するポリペプチド、組み換え分子遺伝学的手法によって生成されたポリペプチド、細胞または翻訳システムからのポリペプチド、または無細胞合成手段によって生成されたポリペプチドなど、任意の供給源から得ることができる。ポリペプチドは、そのアミノ酸配列、例えばその構成アミノ酸残基の一次構造によって特徴付けられる。本明細書において、ポリペプチドのアミノ酸配列は、全長配列に限定されず、部分配列または完全配列であってもよい。さらに、ポリペプチドは、特定の生物学的活性を有するか有さないかによって制限されることを意図するものではない。

【0084】

ここで使用される用語「タンパク質」はポリペプチドと同義である。用語「ペプチド」は、例えば、長さが２～２５個のアミノ酸である小さなポリペプチドを指すが、これに限定されない。

【0085】

特定の実施形態では、アミノ酸配列に少なくとも１つのｎｃＡＡが組み込まれたタンパク質が、「標的化剤」を形成するために利用される。このような標的化剤の主な目的は、特定の「標的」との共有結合または非共有結合の形成である。標的化剤の第二の目的は、前記標的への「ペイロード分子」の標的輸送である。前記第２の目的を達成するためには、前記標的化剤は、少なくとも１つの「ペイロード分子」と（可逆的または不可逆的に）結合されなければならない。この目的のために、前記標的化剤は、前記少なくとも１つのｎｃＡＡによって機能化される。前記少なくとも１つのｎｃＡＡを有する機能化標的化剤は、前記ｎｃＡＡ残基を介したバイオコンジュゲーションによって前記少なくとも１つのペイロード分子に連結され得る。前記ｎｃＡＡは、ペイロード分子と反応性があり、ペイロード分子は、対応する部分、本件の場合、標的化剤の前記ｎｃＡＡ残基と反応する特定のテトラジン部分を有する。このようにして得られたバイオ複合体により、ペイロード分子を目的の標的に転送することが可能になる。

【0086】

本明細書において使用される「非天然アミノ酸を組み込む」という用語は、例えば標的ポリペプチドに組み込む場合、例えば翻訳または化学合成を介して、標的ポリペプチドの一次構築中に、成長中のポリペプチド鎖に非天然アミノ酸を直接付加することを指す。

【0087】

非天然アミノ酸（「ＵＮＡＡ」）は、当技術分野で知られている数多くの方法のいずれかを使用して、標的ポリペプチドに直接組み込むことができる。多くの実施形態では、非天然アミノ酸を直接組み込む経路として直交型翻訳システムを使用しているが、代わりに他の直接組み込み方法（例えば、インビトロ翻訳システム、固相合成など）を使用することもできる。本明細書の典型的な実施形態では、非天然アミノ酸は好ましくは標的ポリペプチドに組み込まれ、すなわちポリペプチドの構築中に組み込まれ、翻訳後の化学誘導体化によって追加されないことが理解されるであろう。

【0088】

本明細書に記載の特定の実施形態では、非天然アミノ酸は、「直交型ｔＲＮＡ／アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素ペア」を使用して、高効率かつ高忠実度で標的ポリペプチドに部位特異的に組み込むことができる。

【0089】

「翻訳システム」という用語は、成長中のポリペプチド鎖（タンパク質）にアミノ酸を組み込むために必要な構成要素を指す。翻訳システムの構成要素には、例えば、リボソーム、ｔＲＮＡ、合成酵素、ｍＲＮＡなどが含まれる。翻訳システムは、生体内翻訳システムまたはインビトロ翻訳システムである可能性がある。

【0090】

「インビトロ翻訳システム」は、無細胞翻訳システムであってもよい。無細胞翻訳システムは、ｍＲＮＡ翻訳に必要なタンパク質因子を、例えば細胞抽出物の形で取得し、その後この反応をインビトロで再構成することによって、所望のタンパク質を合成するシステムである。このような無細胞システムおよびタンパク質合成におけるその使用は、当該技術分野で既知である。例としては、大腸菌抽出物、小麦胚芽抽出物、またはウサギ網状赤血球溶解物が挙げられる（スピリンおよび主ワルツ、無細胞タンパク質合成、ウィリーＶＣＨフェアラーク、ヴァインハイム、ドイツ、２００８）。

【0091】

アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素（ＲＳ）は、アミノ酸またはアミノ酸類似体でｔＲＮＡをアシル化できる酵素である。便宜上、本発明の方法で使用されるＲＳは、非天然アミノ酸でｔＲＮＡをアシル化できる。

【0092】

本発明の方法は、「ｔＲＮＡ／アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素（ｔＲＮＡ／ＲＳ）対」を便宜的に利用する。好ましくは、本発明のプロセスで使用されるｔＲＮＡ／ＲＳ対は、翻訳システムに対して直交型である。

【0093】

本明細書で使用される用語「直交」は、目的の翻訳システム（例えば、細胞）によって効率が低下して使用される分子（例えば、直交ｔＲＮＡ（Ｏ－ｔＲＮＡ）および／または直交アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素（Ｏ－ＲＳ））を指す。直交とは、直交ｔＲＮＡまたは直交アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素が、目的の翻訳システムの内因性アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素または内因性ｔＲＮＡとともに機能できないか、または効率が低下していること（例えば、２０％未満、１０％未満、５％未満、または１％未満）を指す。例えば、目的の翻訳システム内の直交ｔＲＮＡは、目的の翻訳システムの任意の内因性アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素によってアシル化されるが、内因性ｔＲＮＡが内因性アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素によってアシル化される場合と比較して、効率が低下したり、まったくなくなったりする。別の例では、直交アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素は、目的の翻訳システム内の任意の内因性ｔＲＮＡをアシル化するが、内因性アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素による内因性ｔＲＮＡのアシル化と比較して、効率が低下したり、まったくなくなったりする。

【0094】

本発明の方法で使用される直交ｔＲＮＡ／ＲＳペアは、好ましくは以下の特性を有する：Ｏ－ｔＲＮＡは、Ｏ－ＲＳによって本発明の非天然アミノ酸で優先的にアシル化される。さらに、直交ペアは、目的の翻訳システムで機能し、例えば、翻訳システムは、非天然アミノ酸アシル化Ｏ－ｔＲＮＡを使用して、本発明の非天然アミノ酸をポリペプチド鎖に組み込む。組み込みは、部位特異的な方法で行われ、例えば、Ｏ－ｔＲＮＡは、ポリペプチドをコードするｍＲＮＡ内のセレクターコドン、例えばアンバーストップコドンを認識する。

【0095】

「優先的にアシル化する」という用語は、目的の翻訳システムの内因性ｔＲＮＡまたはアミノ酸と比較して、Ｏ－ＲＳがＯ－ｔＲＮＡを非天然アミノ酸でアシル化する効率が、例えば約５０％効率、約７０％効率、約７５％効率、約８５％効率、約９０％効率、約９５％効率、または約９９％以上の効率であることを意味する。次に、非天然アミノ酸は、高い忠実度で、例えば、所定のセレクターコドンに対して約７５％を超える効率、所定のセレクターコドンに対して約８０％を超える効率、所定のセレクターコドンに対して約９０％を超える効率、所定のセレクターコドンに対して約９５％を超える効率、または所定のセレクターコドンに対して約９９％以上の効率で、成長するポリペプチド鎖に組み込まれる。

【0096】

「セレクターコドン」という用語は、翻訳プロセスでＯ－ｔＲＮＡによって認識され、内因性ｔＲＮＡによって認識されないコドンを指す。Ｏ－ｔＲＮＡアンチコドンループは、ｍＲＮＡ上のセレクターコドンを認識し、そのアミノ酸、例えば非天然アミノ酸をポリペプチドのこの部位に組み込む。セレクターコドンには、例えば、ナンセンスコドン、例えば停止コドン、例えばアンバー、オーカー、およびオパールコドン、４塩基以上のコドン、天然または非天然の塩基対から誘導されたコドンなどが含まれる。所定のシステムでは、セレクターコドンには天然の３塩基コドン（つまり天然トリプレット）の１つも含まれる可能性があり、この場合、内因性システムは前記天然トリプレットを使用しない。例えば、天然トリプレットを認識するｔＲＮＡが欠如しているシステム、または天然トリプレットがまれなコドンであるシステムなどである。

【0097】

「アンチコドン」は、対応するコドンの逆相補配列を有する。

【0098】

Ｏ－ｔＲＮＡ／Ｏ－ＲＳ対は、サプレッサーｔＲＮＡなどのＯ－ｔＲＮＡとＯ－ＲＳから構成される。

【0099】

「サプレッサーｔＲＮＡ」とは、特定の翻訳システムでメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の読み取りを変更するｔＲＮＡである。サプレッサーｔＲＮＡは、たとえば終止コドン、４塩基コドン、またはまれなコドンを読み取ることができる。

【0100】

Ｏ－ｔＲＮＡは内因性合成酵素によってアシル化されず、本明細書で説明するようにセレクターコドンをデコードすることができる。

【0101】

Ｏ－ＲＳは、例えば拡張されたアンチコドンループを持つＯ－ｔＲＮＡを認識し、非天然アミノ酸でＯ－ｔＲＮＡを優先的にアシル化する。

【0102】

本発明のプロセスで使用されるｔＲＮＡおよびＲＳは、天然に存在するか、またはさまざまな生物由来の天然に存在するｔＲＮＡおよび／またはＲＳの変異によって誘導される。さまざまな実施形態では、ｔＲＮＡおよびＲＳは少なくとも１つの生物由来である。別の実施形態では、ｔＲＮＡは、第１の生物由来の天然に存在するｔＲＮＡまたは変異した天然に存在するｔＲＮＡに由来し、ＲＳは、第２の生物由来の天然に存在するＲＳまたは変異した天然に存在するＲＳに由来する。

【0103】

適切なｔＲＮＡ／ＲＳペアは、例えばライブラリスクリーニングの結果に基づいて、変異ｔＲＮＡおよびＲＳのライブラリから選択できる。あるいは、適切なｔＲＮＡ／ＲＳペアは、供給源種から翻訳システムにインポートされた異種ｔＲＮＡ／合成酵素ペアである可能性がある。翻訳システムとして使用される細胞は、前記供給源種とは異なる細胞であるのが好ましい。

【0104】

例えば、適切な直交Ｏ－ｔＲＮＡは、メタノコッカスジャンナシイ、メタノバクテリウムサーモオートトロフィカム、ハロバクテリウム（ハロフェラックスボルカニイ、ハロバクテリウム種ＮＲＣ－Ｉなど）、アーキオグロバスフルギドゥス、ピロコッカスフリオサス、ピロコッカスホリコシイ、アエウロピラムペルニクス、メタノコッカスマリパルディス、メタノピルスカンドレリ、メタノサルシナマゼイ（Ｍｍ）、ピロバキュラムアエロフィラム、ピロコッカスアビッシ、スルフォロバスソルファタリカス（Ｓｓ）、スルフォロバストコダイ、サーモプラズマアシドフィラム、サーモプラズマボルカニウムなどの古細菌、大腸菌、サーマス・サーモフィルス、枯草菌、バチルス・ステアロサーモフィルスなどの真正細菌から誘導され得、一方、直交Ｏ－ＲＳは、例えば、メタノコッカス・ジャンナスキイ、メタノバクテリウム・サーモオートトロフィカムなどの古細菌、ハロフェラックス・ボルカニイおよびハロバクテリウム種ＮＲＣ－Ｊなどのハロバクテリウム、アーキオグロバス・フルギドゥス、ピロコッカス・フリオサス、ピロコッカス・ホリコシイ、アエウロピラム・ペルニクス、メタノコッカス・マリパルディス、メタノピルス・カンドレリ、メタノサルシナ・マゼイ、メタノサルシナ・バケリ、メタノサルシナ・ハフニエンセ、ピロバキュラム・アエロフィラム、ピロコッカス・アビッシ、スルフォロバス・ソルファタリカス、スルフォロバス・トコダイ、サーモプラズマ・アシドフィラム、サーモプラズマ・ボルカニウムなど、または、大腸菌、サーマス・サーモフィルス、枯草菌、バチルス・ステアロサーモフィルスなどの真正細菌の生物または生物の組み合わせから得ることができる。一実施形態では、真核生物源、例えば植物、藻類、原生生物、真菌、酵母、動物、例えば哺乳類、昆虫、節足動物なども、Ｏ－ｔＲＮＡおよびＯ－ＲＳの供給源として使用することができる。

【0105】

ｔＲＮＡ／ＲＳペアを進化させる方法は、例えば国際公開第ＷＯ０２／０８５９２３号および国際公開第ＷＯ０２／０６０７５号に記載されている。

【0106】

好ましくは、ＲＳは、本発明の非天然アミノ酸でｔＲＮＡをアシル化できるピロリシルｔＲＮＡ合成酵素（ｐｙｌＲＳ）である。本発明の方法で使用されるピロリシルｔＲＮＡ合成酵素は、野生型または遺伝子操作されたｐｙｌＲＳである。野生型ｐｙｌＲＳの例には、野生型ｐｙｌＲＳの例としては、メタノサルシナ・マゼイ、メタノサルシナ・バルケリ、メタノコッコイデス・バートニー、メタノサルシナ・アセチボランス、メタノサルシナ・サーモフィラ、デスルフィトバクテリウム・ハフニエンセなどの古細菌や真正細菌のｐｙｌＲＳなどが挙げられるが、これらに限定されない。

【0107】

ピロリシルｔＲＮＡ合成酵素（ＰｙｌＲＳ）は、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素（ＲＳ）である。ＲＳは、アミノ酸またはアミノ酸類似体でｔＲＮＡをアシル化することができる酵素である。便宜上、本発明のＰｙｌＲＳは酵素活性であり、すなわち、特定のアミノ酸またはアミノ酸類似体、好ましくはＵＮＡＡまたはその塩でｔＲＮＡ（ｔＲＮＡ^Ｐｙｌ）をアシル化することができる。

【0108】

本明細書で使用される用語「古細菌ピロリシルｔＲＮＡ合成酵素」（「古細菌ＰｙｌＲＳ」と略記）は、ＰｙｌＲＳアミノ酸配列の少なくとも一部、またはＰｙｌＲＳアミノ酸配列全体が、古細菌由来の天然ＰｙｌＲＳのアミノ酸配列、またはそのような天然ＰｙｌＲＳの酵素活性断片のアミノ酸配列と、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有するＰｙｌＲＳを指す。

【0109】

本発明のＰｙｌＲＳは、変異古細菌ＰｙｌＲＳ、またはその酵素活性断片を含み得る。

【0110】

一般的に、「変異体古細菌ＰｙｌＲＳ」または「変異古細菌ＰｙｌＲＳ」は、１つ以上のアミノ酸残基の追加、置換、および／または欠失を含む点で、対応する野生型ＰｙｌＲＳと異なる。好ましくは、これらはＰｙｌＲＳの安定性を改善し、ＰｙｌＲＳ基質特異性を変更し、および／またはＰｙｌＲＳ酵素活性を強化する改変である。特に好ましい「変異体古細菌ＰｙｌＲＳ」または「変異古細菌ＰｙｌＲＳ」については、以下でより詳しく説明する。

【0111】

「核外搬出シグナル」（略して「ＮＥＳ」）という用語は、それを含むポリペプチド（本発明のＮＥＳ含有ＰｙｌＲＳなど）を真核細胞の核から搬出するように指示できるアミノ酸配列を指す。この搬出は主にＣｒｍ１（染色体領域維持１、カリオフェリンエクスポーチン１としても知られる）によって媒介されると考えられている。ＮＥＳは当技術分野で知られている。例えば、データベースＶａｌｉｄＮＥＳ（ｈｔｔｐ：／／ｖａｌｉｄｎｅｓｓ．ｙｍ．ｅｄｕ．ｔｗ／）は、実験的に検証されたＮＥＳ含有タンパク質の配列情報を提供する。さらに、ＮＥＳｂａｓｅ１．０（ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｄａｔａｂａｓｅｄ／ＮＥＳｂａｓｅ－１．０／；ラ・クールら、ＮｕｃｌＡｃｉｄｓＲｅｓ３１（１），２００３を参照）などのＮＥＳデータベースや、ＮｅｔＮＥＳ（ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＮｅｔＮＥＳ／；ラ・クールら、ラ・クールら、ＰｒｏｔｅｉｎＥｎｇＤｅｓＳｅｌ１７（６）：５２７－５３６，２００４）、ＮＥＳｐｒｅｄｉｃｔｏｒ（ＮｅｔＮＥＳ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／；フーら、ＮｕｃｌＡｃｉｄｓＲｅｓ４１：Ｄ３３８－Ｄ３４３，２０１３；ラ・クールら、ＰｒｏｔｅｉｎＥｎｇＤｅｓＳｅｌ１７（６）：５２７－５３６，０４））そしてＮＥＳｓｅｎｔｉａｌ（ＶａｌｉｄＮＥＳと組み合わせたウェブインターフェイス）は一般に公開されている。疎水性ロイシンに富むＮＥＳは最も一般的で、現在までに最もよく特徴付けられたＮＥＳの基である。疎水性ロイシンに富むＮＥＳは、３つまたは４つの疎水性残基を持つ非保存的モチーフである。これらのＮＥＳの多くは、保存されたアミノ酸配列パターンＬｘｘＬｘＬ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１１１）またはＬｘｘｘＬｘＬ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１１２）で構成されており、各Ｌはロイシン、イソロイシン、バリン、フェニルアラニン、およびメチオニンアミノ酸残基から独立して選択され、各ｘは任意のアミノ酸から独立して選択される（ラ・クールら、ＰｒｏｔｅｉｎＥｎｇＤｅｓＳｅｌ１７（６）：５２７－５３６、２００４を参照）。

【0112】

「核局在化シグナル」（略称「ＮＬＳ」、当技術分野では「核局在配列」とも呼ばれる）という用語は、それを含むポリペプチド（例えば、野生型古細菌のＰｙｌＲＳ）を真核細胞の核に輸送するように指示できるアミノ酸配列を指す。この輸送は、ＮＬＳを含むポリペプチドがインポーチン（別名カリオフェリン）に結合して、核孔を通過する複合体を形成することによって媒介されると考えられている。ＮＬＳは当技術分野で既知である。ＮＬＳデータベースやＮＬＳ予測ツールは数多く公開されており、ＮＬＳｄｂ（ネアら、ＮｕｃｌＡｃｉｄｓＲｅｓ３１（１），２００３を参照）、ｃＮＬＳＭａｐｐｅｒ（ｗｗｗ．ｎｌｓ－ｍａｐｐｅｒ．ａｉｂ．ｋｅｉｏ．ａｃ．ｊｐ、コスギら、ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ．１０６（２５）：１０１７１－１０１７６，２００９、コスギら、ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ２８４（１）：４７８－４８５，２００９を参照）、ＳｅｑＮＬＳ（リンら、ＰＬｏＳＯｎｅ８（１０）：ｅ７６８６４，２０１３を参照）、ＮｕｃＰｒｅｄ（ｗｗｗ．ｓｂｃ．ｓｕ．ｓｅ／～ｍａｃｃａｌｌｒ／ｎｕｃｐｒｅｄ／、ブランマイアら、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ２３（９）：１１５９－６０，２００７を参照）などがある。

【0113】

上記で定義した本発明の変異古細菌ＰｙｌＲＳは、変異体が由来する前記天然ＰｙｌＲＳに任意に存在するＮＬＳを除去することによって、および／または少なくとも１つのＮＥＳを導入することによって、さらに改変することができる。天然ＰｙｌＲＳのＮＬＳは、例えばｃＮＬＳＭａｐｐｅｒなどの既知のＮＬＳ検出ツールを使用して識別することができる。

【0114】

古細菌のＰｙｌＲＳまたはその変異体からＮＬＳを除去し、および／またはＮＥＳを導入すると、真核細胞で発現したときに、このように改変されたポリペプチドの局在を変えることができ、特に、真核細胞の核におけるポリペプチドの蓄積を回避または低減することができる。したがって、真核細胞で発現された本発明のＰｙｌＲＳ変異体の局在は、ＰｙｌＲＳまたはＰｙｌＲＳ変異体と比較して変えることができ、これは、（依然として）ＮＬＳを含み、ＮＥＳを欠くという点で、本発明のＰｙｌＲＳ変異体とは異なる。

【0115】

本発明の古細菌のＰｙｌＲＳがＮＥＳを含むが（依然として）ＮＬＳを含む場合、ＮＥＳは、ＮＥＳの強度がＮＬＳを上回り、真核細胞の核内でのＰｙｌＲＳの蓄積を防ぐように選択されることが好ましい。

【0116】

本発明のＰｙｌＲＳを得るために、野生型または変異型ＰｙｌＲＳからＮＬＳを除去し、および／または野生型または変異型ＰｙｌＲＳにＮＥＳを導入しても、ＰｙｌＲＳ酵素活性は失われない。好ましくは、ＰｙｌＲＳ酵素活性は基本的に同じレベルに維持され、すなわち、本発明のＰｙｌＲＳは、対応する野生型または変異型ＰｙｌＲＳの酵素活性の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％を有する。

【0117】

ＮＥＳは、本発明のＰｙｌＲＳまたは変異ＰｙｌＲＳ内に適切に配置されており、ＮＥＳが機能するようになっている。例えば、ＮＥＳは、野生型または変異古細菌ＰｙｌＲＳのＣ末端（例えば、最後のアミノ酸残基のＣ末端）またはＮ末端（例えば、アミノ酸残基１、Ｎ末端メチオニン、およびアミノ酸残基２の間）に結合できる。

【0118】

ＮＥＳの組み込みおよび／またはＮＬＳ配列の削除によって改変された変異ＰｙｌＲＳを開示する国際公開第ＷＯ２０１８／０６９４８号の開示は、本明細書に明示的に参照され、参照により組み込まれる。

【0119】

Ｃ．特定の実施形態
以下に記載する一般式（Ｉ）を有する本発明のテトラジン化合物は、複合体、特にバイオ複合体の調製に使用される。この目的のために、式（Ｉ）の化合物は、その官能性テトラジン部分を介して、例えば生体分子、特に標的分子、例えば抗体分子などのコンジュゲーションパートナーが有する適切なテトラジン反応性第２官能基と反応する。

【0120】

前記テトラジン反応性官能基は、例えば、シクロオクチニル基またはトランスシクロオクテニル基であり得る。

【0121】

本発明は、生体内または生体外でこのようなポリペプチドを調製する方法を提供する。特に、前記テトラジン反応性官能基は、１つまたは複数のセレクターコドンを含むポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドに翻訳的に組み込むことができる。

【0122】

本発明は、以下の主な態様およびその特定の実施形態に関する。

【0123】

１．本発明の第１の態様
本発明の第１の態様は、特定のテトラジン基によって機能化されたペイロード分子に関するものであり、このペイロード分子は、機能化されたペイロード分子のテトラジン基と反応する機能的な対応基を有する第２の分子、特に生体分子とのコンジュゲーションに適合している。

【0124】

本発明の第１の実施形態によれば、以下の一般式Ｉのテトラジン機能化化合物が提供される。

【化4】

ここで、
ｍは０または１である。
ｎは１および２から選択される整数を表す。
ｏは０であるか、または１または２から選択される整数を表す。
Ａは切断可能な部分を表す。
Ｓｐ^１およびＳｐ^２は互いに独立してスペーサー部分を表す。
Ｘは自壊性部分を表す。
Ｙはペイロード残基（またはカーゴ）を表す。
Ｚは親水性基を表す。

【0125】

特定の実施形態によれば、ｍは０である。
別の特定の実施形態によれば、ｍは１である。
別の特定の実施形態によれば、ｎは１である。
別の特定の実施形態によれば、ｎは２である。

【0126】

別の特定の実施形態によれば、ｏは０である。
別の特定の実施形態によれば、ｏは１である。
別の特定の実施形態によれば、ｏは２である。

【0127】

別の特定の実施形態によれば、Ｓｐ^１とＳｐ^２は異なる。
別の特定の実施形態によれば、Ｓｐ^１とＳｐ^２は同一である。

【0128】

ｍ、ｎ、ｏ、およびＳｐ^１とＳｐ^２のパラメータの組み合わせの具体的な例は次のとおりである。

【0129】

【表1】

【0130】

本発明の第２の実施形態によれば、第１の実施形態の化合物の一般式Ｉ中の残基Ｚは、以下の親水性基の１つから選択される。

【0131】

ａ）リンおよび／または硫黄含有親水性部分Ｚ、特に（Ｒ^１Ｏ）_２Ｐ（Ｏ）－、（Ｒ^１ａＯ）_２Ｐ（Ｏ）－Ｏ－、（Ｒ^２Ｏ）_３Ｐ－Ｏ－、Ｒ^３Ｓ（Ｏ）_２－、（Ｒ^４Ｏ）Ｓ（Ｏ）_２Ｏ－、または（Ｒ^４ａＯ）Ｓ（Ｏ）_２－
ここで、
残基Ｒ^１～Ｒ^４、Ｒ^１ａおよびＲ^４ａは、同一または別異であり、互いに独立して、Ｈまたは低級アルキル、特にメチルまたはエチルを表し、
または、前記リンおよび／または硫黄含有親水性部分の塩形態、例えば生理学的に許容される塩である。

【0132】

ｂ）直鎖または分岐鎖モノまたはポリアルキレンオキシド部分Ｚ、特に直鎖部分－（（ＣＨ_２）_ｘ－Ｏ）_ｙ－Ｒ^５、－（Ｏ－（ＣＨ_２）_ｘ）_ｙ－Ｈおよび－（Ｏ－（ＣＨ_２）_ｘ）_ｙ－ＯＲ^６およびそれらの分岐鎖類似体から選択され、
ここで、
残基Ｒ^５およびＲ^６は互いに独立してＨまたは低級アルキル、特にＨ、メチルまたはエチルを表し、
ｘは互いに独立して１、２、３または４から選択される整数、特に１または２を表し、
ｙは互いに独立して１から２０までの整数、特に１から１５、１から１０または１から４までの整数、たとえば１、２、３または４を表す。

【0133】

基ａに関して
特定の実施形態によれば、Ｚは（Ｒ^１Ｏ）_２Ｐ（Ｏ）－、（Ｒ^１ａＯ）_２Ｐ（Ｏ）－Ｏ－または（Ｒ^２Ｏ）_３Ｐ－Ｏ－、より具体的には（Ｒ^１Ｏ）_２Ｐ（Ｏ）－であり、
ここで、
残基Ｒ^１、Ｒ^２、およびＲ^１ａは、互いに独立して、同一または別異であり、Ｈ、メチル、またはエチルを表す。

【0134】

基ｂに関して
別の特定の実施形態によれば、Ｚは直鎖モノまたはポリアルキレンオキシド部分である。
さらに別の特定の実施形態によれば、Ｚは直鎖部分－（（ＣＨ_２）_ｘ－Ｏ）_ｙ－Ｒ^５、－（Ｏ－（ＣＨ_２）_ｘ）_ｙ－Ｈ、および－（Ｏ－（ＣＨ_２）_ｘ）_ｙ－ＯＲ^６から選択され、ここで、残基Ｒ^５およびＲ^６は互いに独立してＨ、メチルまたはエチルを表し、
さらに別の特定の実施形態によれば、ｘは互いに独立して１または２から選択される整数を表す。

【0135】

パラメータＺ、ｍ、ｎ、ｏおよびＳｐ^１とＳｐ^２のパラメータの組み合わせの特定の例は次のとおりである。

【0136】

【表2】

【0137】

ここで、Ｒ^１はＨまたは低級アルキルである。または、

【0138】

【表3】

【0139】

または

【0140】

【表4】

【0141】

または

【0142】

【表5】

【0143】

Ｚ、ｍ、ｎ、ｏ、およびＳｐ^１とＳｐ^２のパラメータの組み合わせのさらなる具体的な例は次のとおりである。

【0144】

【表6】

【0145】

ここで、残基Ｒ^６はＨまたは低級アルキル、特にＨ、メチルまたはエチルを表し、
ｘは１または２から選択される整数を表し、
ｙは１～２０、特に１～１５、１～１０または１～４の整数を表し、例えば１、２、３または４である。

【0146】

Ｚ、ｘ、ｙ、Ｒ^６、ｍ、ｎ、ｏ、およびＳｐ^１とＳｐ^２のパラメータの組み合わせの特定の例は次のとおりである。

【0147】

【表7】

【0148】

または

【0149】

【表8】

【0150】

または

【0151】

【表9】

【0152】

または

【0153】

【表10】

【0154】

本発明の第３の実施形態によれば、前述の実施形態のいずれかの式Ｉの化合物のスペーサーＳｐ^１は存在しないか、または、より具体的には、以下から選択される。

【0155】

ａ）６～１４個の環炭素原子を有する単環式または多環式の、任意に単置換または多置換された芳香族部分、特に１，４－フェニレン、ここで、前記１つ以上の任意置換基は、互いに独立して、－Ｈａｌ、－ＣＨａｌ_３、－ＯＨ、－ＳＨ、－ＮＲ’_２、－ＮＯ_２、－ＣＮ、－Ｃ（＝Ｏ）Ｒ’’、－Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ’’’、アルキル、アルケニル、アルキニル、およびアルコキシから選択され、
ここで、
Ｒ’、Ｒ’’、およびＲ’’’は、互いに独立して、ＨおよびＣ_１～Ｃ_４－アルキルから選択される（部分Ｍ１）。

【0156】

ｂ）一般式Ｘの複素環残基であって、

【化5】

ここで、
環部分Ｘ_１からＸ_４の１つ、２つまたは３つはＮを表し、他の部分は＞ＣＨを表す（部分Ｍ２）。

【0157】

ｃ）直鎖または分岐の低級アルキレン、特に－（ＣＨ_２）_ｎ１－、ここでｎ１は１から４の整数であり、より具体的にはメチレン（部分Ｍ３）である。

【0158】

ｄ）Ｍ１、Ｍ２、およびＭ３から選択される、少なくとも２つの同一またはより具体的には異なる部分の組み合わせである。

【0159】

部分Ｍ１に関して
特定の実施形態によれば、部分Ｍ１は、６個の炭素原子を有する単環式非置換芳香族部分、特に１，４－フェニレン、または

【化6】

【0160】

部分Ｍ２に関して
特定の実施形態によれば、部分Ｍ２は一般式Ｘの複素環残基を表し、ここで
環部分Ｘ_１からＸ_４の１つまたは２つはＮを表し、他の１つは＞ＣＨを表す。

【0161】

部分Ｍ３に関して
特定の実施形態によれば、部分Ｍ３は直鎖低級アルキレン、特に－（ＣＨ_２）_ｎ１－を表し、ここでｎ１は１または２の整数であり、より具体的にはメチレンである。

【0162】

本発明の第４の実施形態によれば、前述の実施形態のいずれかの化合物（Ｉ）のスペーサーＳｐ^２は、次から選択される。

【0163】

ａ）６～１４個の環炭素原子を有する単環式または多環式の任意に単置換または多置換された芳香族部分、特に１，２－フェニレン、１，３－フェニレンまたは１，４－フェニレンから選択され、ここで、前記１つ以上の任意置換基は、互いに独立して、－Ｈａｌ、－ＣＨａｌ_３、－ＯＨ、－ＳＨ、、－ＮＲ’_２、ＮＯ_２、－ＣＮ、－Ｃ（＝Ｏ）Ｒ’’、－Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ’’’、アルキル、アルケニル、アルキニル、およびアルコキシから選択され、
ここで
Ｒ’、Ｒ’’およびＲ’’’は、互いに独立して、ＨおよびＣ_１～Ｃ_４アルキルから選択される（部分Ｍ１）。

【0164】

ｂ）一般式Ｘの複素環式残基であり、

【化7】

ここで、環部分Ｘ_１～Ｘ_４のうちの１つ、２つまたは３つはＮを表し、他の１つは＞ＣＨを表す（部分Ｍ２）。

【0165】

ｃ）直鎖または分岐鎖低級アルキレン、特に－（ＣＨ_２）_ｎ１－であり、
ここで
ｎ１は１から４までの整数であり、より具体的にはメチレンである（部分Ｍ３）。

【0166】

ｄ）直鎖または分岐ポリアルキレンオキシド部分、特に直鎖部分－（（ＣＨ_２）_ｘ１－Ｏ）_ｙ１－または－（Ｏ－（ＣＨ_２）_ｘ１）_ｙ１－およびその分岐類似体から選択され、
ここで、
ｘ１は互いに独立して、１、２、３または４から選択される整数、特に１または２を表し、および
ｙ１は互いに独立して、１から２０までの整数、特に１から４を表す（部分Ｍ４）。

【0167】

ｅ）ヘテロ原子含有部分は、
－Ｎ（Ｒ’’’’）－、
－（ＣＨ_２）_ｘ２－Ｎ（Ｒ’’’’）－、
－Ｎ（Ｒ’’’’）－（ＣＨ_２）_ｘ３－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、
－Ｎ（Ｒ’’’’）－（ＣＨ_２）_ｘ３－Ｃ（Ｏ）－、
－Ｎ（Ｒ’’’’）－（ＣＨ_２）_ｘ４－Ｎ（Ｒ’’’’）－、
－Ｎ（Ｒ’’’’）－Ｃ（Ｏ）－（ＣＨ_２）_ｘ４－Ｎ（Ｒ’’’’）－、
－（ＣＨ_２）_ｘ４－Ｃ（Ｏ）－、および
－（ＣＨ_２）_ｘ４－Ｃ（Ｏ）－から選択され、
ここで、
Ｒ’’’’は、互いに独立して、ＨおよびＣ_１～Ｃ_４アルキルから選択され、
ｘ２は、１、２、３または４から選択される整数を表し、特に１または２を表し、
ｘ３は１、２、３または４から選択される整数を表し、特に１または２を表し、および
ｘ４は１、２、３または４から選択される整数を表し、特に１または２を表す（部分Ｍ５）。

【0168】

または、
ｆ）Ｍ１、Ｍ２、Ｍ３およびＭ４から選択される少なくとも２つの同一またはより具体的には異なる部分の組み合わせであり、またはＭ１、Ｍ２、Ｍ３、Ｍ４およびＭ５から選択される少なくとも２つの同一またはより具体的には異なる部分の組み合わせである。

【0169】

部分Ｍ１に関して
特定の実施形態によれば、部分Ｍ１は、６個の炭素原子を有する単環式非置換芳香族部分であり、特に１，２－フェニレン、１，３－フェニレンまたは１，４－フェニレン、より具体的には１，４－フェニレン、または

【化8】

【0170】

部分Ｍ２に関して
特定の実施形態によれば、部分Ｍ２は一般式Ｘの複素環残基を表し、ここで
環部分Ｘ_１～Ｘ_４の１つまたは２つはＮを表し、他の１つは＞ＣＨを表す。

【0171】

部分Ｍ３に関して
特定の実施形態によれば、部分Ｍ３は直鎖低級アルキレン、特に－（ＣＨ_２）_ｎ１－を表し、ここでｎ１は１または２の整数であり、より具体的にはメチレンである。

【0172】

部分Ｍ４に関して
特定の実施形態によれば、部分４は、直鎖ポリアルキレンオキシド部分を表し、直鎖部分－（（ＣＨ_２）_ｘ１－Ｏ）_ｙ１－または－（Ｏ－（ＣＨ_２）_ｘ１）_ｙ１－から選択され、
ここで、
ｘ１は互いに独立して、１または２から選択される整数を表し、および
ｙ１は互いに独立して、２から２０、特に２から４の整数を表す。

【0173】

部分Ｍ５に関して
特定の実施形態によれば、部分５は－Ｎ（Ｒ’’’’）－、－Ｎ（Ｒ’’’’）－（ＣＨ_２）_ｘ３－Ｃ（Ｏ）－または－（ＣＨ_２）_ｘ２－Ｎ（Ｒ’’’’）－を表し、
ここで、
Ｒ’’’’は互いに独立してＨおよびＣ_１－Ｃ_４－アルキル、より具体的にはＨから選択され、
ｘ２は１、２、３または４から選択される整数、特に１または２を表す。

【0174】

本発明の第５の実施形態によれば、前述の実施形態のいずれかの化合物（Ｉ）の前記基Ａは、酵素的または化学的に切断可能なリンカー基であり、以下から選択される。

【0175】

ａ）ペプチジル基、特にジ、トリまたはテトラペプチジル基。

【0176】

ｂ）式－（ＣＲ^７Ｒ^８）_ｎ２－Ｓ－Ｓ－（ＣＲ^７Ｒ^８）_ｎ２－Ｘ_５－またはＸ_５’－（ＣＲ^７Ｒ^８）_ｎ２－Ｓ－Ｓ－（ＣＲ^７Ｒ^８）_ｎ２－Ｘ_５－のジスルフィド基。
ここで
ｎ２は１から４の整数を表し、
残基Ｒ^７およびＲ^８は、互いに独立して、Ｈまたは低級アルキル、特にメチルから選択され、または２つの残基Ｒ^７およびＲ^８は、それらが結合している炭素原子と一緒になって環状Ｃ_４からＣ_８のアルキル基を形成し、および
部分Ｘ_５は－Ｃ（Ｏ）－および－Ｏ－から選択され、
部分Ｘ_５’は、－Ｃ（Ｏ）－および－（Ｏ）Ｃ－（ＣＨ_２）－ＮＨ－から選択される。

【0177】

ｃ）ヒドラゾン基は、＞Ｃ＝Ｎ－Ｎ（Ｒ^９）－および－Ｎ（Ｒ^９）－Ｎ＝Ｃ＜から選択され、
ここで、
Ｒ^９はＨまたは低級アルキルであり、および

【0178】

ｄ）β－グルクロニダーゼ感受性切断可能リンカー基（グルクロニドリンカー基）、特に、β－グルクロン酸由来トリガー残基を有する。

【0179】

特定の実施形態によれば、切断可能なリンカーは特徴ａ）によるペプチジル基である。
別の特定の実施形態によれば、切断可能なリンカーは特徴ｄ）によるグルクロニドリンカー基である。

【0180】

本発明の第６の実施形態によれば、前述の実施形態のいずれかの化合物（Ｉ）の前記自壊性基Ｘは、次から選択される。

【0181】

ａ）ｐ－アミノベンジルアルコール（ＰＡＢ）の式で表される基
－ＮＨ－ｐ－フェニレン－ＣＨ_２－Ｏ－または－Ｏ－ＣＨ_２－ｐ－フェニレン－ＮＨ－または
－ＮＨ－ｐ－フェニレン－ＣＨ_２－Ｎ^＋（Ｒ^２０）_２－

【0182】

ｂ）－Ｏ－Ｃ（Ｏ）－Ｏ－

【0183】

ｃ）－Ｏ－Ｃ（Ｏ）－ＮＲ^１０－（ＣＲ^１２Ｒ^１３）_ｚ－ＮＲ^１１－Ｃ（Ｏ）－Ｏ－または－Ｘ^１－Ｃ（Ｏ）－ＮＲ^１０－（ＣＲ^１２Ｒ^１３）_ｚ－ＮＲ^１１－Ｃ（Ｏ）－Ｘ^２－
ここで、ｚは１から６、特に１から４から選択される整数を表し、
Ｒ^２０は、互いに独立して、Ｈまたは低級アルキル基を表し、
Ｒ^１０およびＲ^１１は、互いに独立して、Ｈまたは低級アルキル基を表し、
Ｒ^１２およびＲ^１３は、互いに独立して、Ｈ、メチルまたはエチル、特にＨまたはメチル、特にＨを表し、そして
Ｘ^１およびＸ^２は互いに独立してＯ、ＳまたはＮＲ^１０を表す。

【0184】

ｄ）式メチレンアルコキシカルバメート（ＭＡＣ）型結合
－ＯＣ（Ｏ）－ＮＲ^１３－Ｃ（Ｒ^１４Ｒ^１５）－（Ｏ）－
－ＯＣ（Ｏ）－ＮＲ^１３－Ｃ（Ｒ^１４Ｒ^１５）－（Ｓ）－
－ＯＣ（Ｏ）－ＮＲ^１３－Ｃ（Ｒ^１４Ｒ^１５）－（ＮＲ^１６）－または
－ＯＣ（Ｏ）－ＮＲ^１３－Ｃ（Ｒ^１４Ｒ^１５）－（ＮＲ^１６－Ｃ（Ｏ）Ｏ）－
ここで
Ｒ^１３、Ｒ^１４、Ｒ^１５、およびＲ^１６は互いに独立してＨまたは低級アルキル、特にＣ_１～Ｃ_４アルキルを表す。

【0185】

特定の実施形態によれば、前記自壊性基Ｘは、特徴ａ）によるＰＡＢ誘導基である。

【0186】

本発明の第７の実施形態によれば、前述の実施形態のいずれかの化合物の前記ペイロード残基Ｙは、生物活性化合物、特に染料、放射性標識、タンパク質分解剤、光増感剤、およびキレート剤などの標識剤から選択される。

【0187】

本発明の第８の実施形態によれば、前述の実施形態のいずれかの化合物は、一般式Ｉａの化合物に対応する。

【化9】

ここで、結合α、β、γおよびδは、互いに独立して、化学結合、またはエーテル、チオエーテル、エステル、アミド、カルバメート、カルボニル（特にケト）、ジカルバメート、カーボネート、ヒドラジン、尿素、アルキレンオキシド、または直鎖状もしくは分岐状のポリアルキレンオキシド結合から選択される。

【0188】

前記ポリアルキレンオキシド結合は、直鎖部分－（（ＣＨ_２）_ｘ１－Ｏ）_ｙ１－または－（Ｏ－（ＣＨ_２）_ｘ１）_ｙ１－から選択され、
ここで
ｘ１は互いに独立して１または２から選択される整数を表し、
ｙ１は互いに独立して２から２０、特に２から４の整数を表す。

【0189】

特定の実施形態によれば、結合α、β、γおよびδはそれぞれ化学結合である。
別の特定の実施形態によれば、結合α、β、γおよびδは化学結合である。
別の特定の実施形態によれば、結合βは化学結合である。
別の特定の実施形態によれば、結合γは化学結合である。
別の特定の実施形態によれば、結合αおよびβはそれぞれ化学結合である。
別の特定の実施形態によれば、結合α、β、およびγはそれぞれ化学結合である。

【0190】

別の特定の実施形態によれば、結合α、β、γはそれぞれ化学結合であり、δはエーテル、チオエーテル、エステル、アミド、カルバメート、カルボニル（特にケト）、ジカルバメート、カーボネート、ヒドラジン、尿素、アルキレンオキシド、または直鎖状もしくは分岐状のポリアルキレンオキシド結合である。

【0191】

別の特定の実施形態によれば、結合α、β、γはそれぞれ化学結合であり、δはエステル、アミド、カルバメート、ジカルバメート、カーボネート、アルキレンオキシド、または直鎖状もしくは分岐状のポリアルキレンオキシド結合である。

【0192】

前記ポリアルキレンオキシド結合は、直鎖部分－（（ＣＨ_２）_ｘ１－Ｏ）_ｙ１－または－（Ｏ－（ＣＨ_２）_ｘ１）_ｙ１－から選択され、
ここで
ｘ１は互いに独立して１または２から選択される整数を表し、
ｙ１は互いに独立して２から４までの整数を表す。

【0193】

本発明の第９の実施形態によれば、前述の実施形態のいずれかの化合物の前記スペーサーＳｐ^１は、以下の部分の組み合わせのうちの１つから選択される。
－Ｍ１－Ｍ３－、－Ｍ２－Ｍ３－、－Ｍ３－Ｍ１－またはＭ３－Ｍ２－
ここで、
前記部分Ｍ１、Ｍ２、Ｍ３間の結合は、独立して、化学結合、エーテル、チオエーテル、エステル、アミド、カルバメート、ジカルバメート、カーボネート、ヒドラジンまたは尿素、およびアルキレンオキシドまたは直鎖または分岐ポリアルキレンオキシド結合から選択される。

【0194】

特定の実施形態では、前記部分Ｍ１、Ｍ２、Ｍ３間の結合はそれぞれ化学結合である。

【0195】

本発明の第１０の実施形態によれば、前述の実施形態のいずれかの化合物の前記スペーサーＳｐ^２は、以下の部分の組み合わせのうちの１つから選択される。
－Ｍ１－Ｍ３－、－Ｍ１－Ｍ４－、－Ｍ２－Ｍ３－、－Ｍ２－Ｍ５－、－Ｍ２－Ｍ４－、－Ｍ３－Ｍ１－、－Ｍ３－Ｍ２－、－Ｍ３－Ｍ４－。－Ｍ１－Ｍ３－Ｍ４－、－Ｍ１－Ｍ４－Ｍ３－、－Ｍ２－Ｍ３－Ｍ４－、－Ｍ２－Ｍ４－Ｍ３－、－Ｍ３－Ｍ２－Ｍ４－。－Ｍ３－Ｍ４－Ｍ２－または－Ｍ２－Ｍ５－Ｍ４－、
ここで、
前記部分Ｍ１、Ｍ２、Ｍ３、Ｍ４およびＭ５間の結合は、化学結合、エーテル、チオエーテル、エステル、アミド、カルバメート、ジカルバメート、カーボネート、ヒドラジンまたは尿素、およびアルキレンオキシドまたは直鎖または分岐ポリアルキレンオキシド結合から独立して選択される。

【0196】

特定の実施形態では、前記部分Ｍ１、Ｍ２、Ｍ３およびＭ４間の結合はそれぞれ化学結合である。

【0197】

Ｓｐ^１およびＳｐ^２のモチーフＭの組み合わせの特定の例を次の表に示す（該当するスペーサー部分は、式Ｉの化合物中に任意の配向で存在することができる）。

【0198】

【表11】

【0199】

Ｓｐ^１およびＳｐ^２のモチーフＭの組み合わせを持つ式Ｉの化合物の特定の例を以下の表に示す（該当するスペーサー部分は、式Ｉの化合物中に任意の配向で存在することができる）。

【0200】

【表12】

【0201】

ここで、Ｒ^１はＨまたは低級アルキルであり、
または

【0202】

【表13】

【0203】

または

【0204】

【表14】

【0205】

または

【0206】

【表15】

【0207】

または

【0208】

【表16】

【0209】

ここで、
残基Ｒ^６はＨまたは低級アルキル、特にＨ、メチルまたはエチルを表し、
ｘは１または２から選択される整数を表し、
ｙは１～２０、特に１～１５、１～１０または１～４の整数を表し、例えば１、２、３、または４を表し、
または

【0210】

【表17】

【0211】

または

【0212】

【表18】

【0213】

【表19】

【0214】

または

【0215】

【表20】

【0216】

または

【0217】

【表21】

【0218】

２．本発明の第２の態様
本発明の第２の態様は、複合体、特にバイオ複合体に関する。
これらは、上記で定義した特定のテトラジン基によって機能化された、本発明の第１の態様の一般式（Ｉ）の少なくとも１つの機能化ペイロード分子の反応によって形成される。前記ペイロード分子は、機能化された標的化剤、特に、機能化されたペイロード分子のテトラジン基と双直交化学反応で反応する機能的な対応基を有する機能化された生体分子とのコンジュゲーションに適合している。

【0219】

本発明の第１１の実施形態によれば、機能化標的化剤と、前述の実施形態のいずれかの式Ｉのテトラジン化合物とを反応させて、前記機能化標的化剤と前記式Ｉのテトラジン化合物との間に共有結合を形成することによって得られる複合体、より具体的にはバイオ複合体が提供される。

【0220】

本発明の第１２の実施形態によれば、第１１の実施形態の前記機能化標的化剤は、以下の実体の対応する機能化形態から選択される：ウイルス、全細胞、ファージ、リポソーム、生体分子および低分子量または高分子量化合物、抗体、抗体誘導体、抗体フラグメント、抗体（フラグメント）融合物、酵素、タンパク質、ペプチド、ペプチド模倣物、炭水化物、単糖類、多糖類、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド、特にＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡおよびＬＮＡ分子、アプタマー、薬物、糖タンパク質、グリカン、脂質、ポリマー、化学療法剤、受容体アゴニストおよびアンタゴニスト、サイトカイン、ホルモン、ステロイド、毒素、およびそれらの誘導体。その特定の実施形態では、標的化剤は、抗体、抗体誘導体、抗体フラグメント、および抗体（フラグメント）融合物から選択される。

【0221】

本発明の第１３の実施形態によれば、実施形態１１および１２のいずれかの複合体が提供され、ここで、前記機能化標的化剤は、官能基として、前記式Ｉの化合物の前記テトラジン部分と反応する少なくとも１つのジエノフィル部分を含む。

【0222】

本発明の第１４の実施形態によれば、実施形態１１～１３のいずれかの複合体が提供され、ここで、前記機能化標的化剤は、少なくとも１つのポリペプチド配列を含み、そのアミノ酸配列内に少なくとも１つの非天然アミノ酸残基を有し、その非天然アミノ酸残基は、前記式Ｉの化合物の前記テトラジン部分と反応する少なくとも１つのジエノフィル部分を含む。

【0223】

本発明の第１５の実施形態によれば、実施形態１１～１４のいずれかの複合体が提供され、ここで、前記機能化生体分子は、ポリクローナルまたはモノクローナル免疫グロブリン分子、特にモノクローナル抗体またはその断片である。

【0224】

本発明の第１６の実施形態によれば、実施形態１１～１５のいずれかの複合体が提供される。これは、式Ｉのテトラジン化合物と、例えばシクロオクチニルジエノフィル、トランスシクロオクテニルジエノフィル、ノルボルネニルジエノフィル、シクロプロペニルジエノフィル、シクロブテニルジエノフィル、スピロヘキセニルジエノフィル、ＢＣＮジエノフィル、アゼチンジエノフィル、またはアルケンなどの、ディールス・アルダー型環化付加反応を介して反応することができる官能基を有する機能化生体分子との双直交バイオコンジュゲーションによって形成される。

【0225】

本発明の第１７の実施形態によれば、実施形態１６の複合体が提供され、ここで、ディールス・アルダー型環化付加反応を介して反応することができる前記官能基は、次から選択される。
（ｉ）次式で表されるトランスシクロオクテニルジエノフィル基

【化10】

ここで、
Ｒ^１は水素、ハロゲン、Ｃ_１－Ｃ_４－アルキル、（Ｒ^ａＯ）_２Ｐ（Ｏ）Ｏ－Ｃ_１－Ｃ_４－アルキル、（Ｒ^ｂＯ）_２Ｐ（Ｏ）－Ｃ_１－Ｃ_４－アルキル、ＣＦ_３、ＣＮ、ヒドロキシル、Ｃ_１－Ｃ_４－アルコキシ、－Ｏ－ＣＦ_３、Ｃ_２－Ｃ_５－アルケノキシ、Ｃ_２－Ｃ_５－アルカノイルオキシ、Ｃ_１－Ｃ_４－アルキルアミノカルボニルオキシまたはＣ_１－Ｃ_４－アルキルチオ、Ｃ_１－Ｃ_４－アルキルアミノ、ジ－（Ｃ_１－Ｃ_４－アルキル）アミノ、Ｃ_２－Ｃ_５－アルケニルアミノ、Ｃ_２－Ｃ_５－アルケニル－Ｃ_１－Ｃ_４－アルキル－アミノまたはジ－（Ｃ_２－Ｃ_５－アルケニル）アミノであり、
Ｒ^ａ、Ｒ^ｂは独立して水素またはＣ_２－Ｃ_５－アルカノイルオキシメチルであり、または
（ｉｉ）次式のシクロオクチニルジエノフィル基であり、

【化11】

ここで、
Ｒ^２は水素、ハロゲン、Ｃ_１－Ｃ_４－アルキル、（Ｒ^ｃＯ）_２Ｐ（Ｏ）Ｏ－Ｃ_１－Ｃ_４－アルキル、（Ｒ^ｄＯ）_２Ｐ（Ｏ）－Ｃ_１－Ｃ_４－アルキル、ＣＦ_３、ＣＮ、ヒドロキシル、Ｃ_１－Ｃ_４－アルコキシ、－Ｏ－ＣＦ_３、Ｃ_２－Ｃ_５－アルケノキシ、Ｃ_２－Ｃ_５－アルカノイルオキシ、Ｃ_１－Ｃ_４－アルキルアミノカルボニルオキシまたはＣ_１－Ｃ_４－アルキルチオ、Ｃ_１－Ｃ_４－アルキルアミノ、ジ－（Ｃ_１－Ｃ_４－アルキル）アミノ、Ｃ_２－Ｃ_５－アルケニルアミノ、Ｃ_２－Ｃ_５－アルケニル－Ｃ_１－Ｃ_４－アルキル－アミノまたはジ－（Ｃ_２－Ｃ_５－アルケニル）アミノであり、
Ｒ^ｃ、Ｒ^ｄは独立して水素またはＣ_２－Ｃ_５－アルカノイルオキシメチルである。

【0226】

３．本発明の第３の態様
本発明の第３の態様は、バイオ複合体を調製する方法に関する。

【0227】

本発明の第１８の態様によれば、実施形態１１から１７のいずれかのバイオ複合体を調製する方法が提供される。前記方法は、水性の、任意に緩衝化された反応媒体中で、実施形態１から１０のいずれかで定義されるテトラジン化合物と、官能性ジエノフィル基を有する機能化生体分子とを反応させ、前記分子間でディールス・アルダー型付加環化反応を行うことを含む。

【0228】

４．本発明の第４の態様
本発明の第４の態様は、例えば式Ｉのテトラジン化合物の製造に有用な特定のテトラジン中間体に関する。

【0229】

本発明の第１９の実施形態によれば、一般式ＩＩのテトラジン中間体が提供される。

【化12】

【0230】

ここで、
ｎ３は１または２から選択される整数を表し、
Ｓｐ^１およびＳｐ^２は上記で定義したとおりであり、
結合α、βおよびγは、互いに独立して、化学結合、またはエーテル、チオエーテル、エステル、アミド、カルボニル（特にケト）、カルバメート、ジカルバメート、カーボネート、ヒドラジン、尿素、アルキレンオキシドまたは直鎖もしくは分岐ポリアルキレンオキシド結合から選択され、
Ｚは、リン含有親水性基、特に（Ｒ^１Ｏ）_２Ｐ（Ｏ）－、（Ｒ^１ａＯ）_２Ｐ（Ｏ）－Ｏ－、および（Ｒ^２Ｏ）_３Ｐ－Ｏ－を表し、
ここで、Ｒ^１、Ｒ^１ａ、およびＲ^２は、同一または別異であり、互いに独立して、Ｈまたは低級アルキル、特にメチルまたはエチルを表し、さらにより具体的にはＨを表し、
Ｒは、Ｈまたは化学結合を形成できる化学基、またはエーテル、チオエーテル、エステル、例えばスクシンイミジルエステルまたはペンタフルオロフェニルエステルのような活性エステル、アミド、カルバメート、ジカルバメート、カーボネート、ヒドラジン、尿素、アルキレンオキシド、または直鎖または分岐ポリアルキレンオキシド結合を形成できる化学基を表し、任意選択で、Ｒは化学保護基を表さず、特に切断可能な保護基を表さず、さらに具体的にはＮ－、Ｏ－、またはＳ－保護基を表さないという条件付きである。

【0231】

より具体的には、Ｒはアミノ基またはカルボキシル基を表す。特定の実施形態によれば、結合α、β、およびγはそれぞれ化学結合である。
別の特定の実施形態によれば、結合αは化学結合である。
別の特定の実施形態によれば、結合βは化学結合である。
別の特定の実施形態によれば、結合γは化学結合である。
別の特定の実施形態によれば、結合αおよびβはそれぞれ化学結合である。
別の特定の実施形態によれば、結合α、β、およびγはそれぞれ化学結合である。

【0232】

別の特定の実施形態によれば、Ｚは（Ｒ^１Ｏ）_２Ｐ（Ｏ）－、（Ｒ^１ａＯ）_２Ｐ（Ｏ）－Ｏ－、および（Ｒ^２Ｏ）_３Ｐ－Ｏ－であり、
ここで、
Ｒ^１、Ｒ^１ａおよびＲ^２は、同一または別異であり、互いに独立して、Ｈまたは低級アルキル、特にメチルまたはエチルを表し、さらにより具体的にはＨを表す。

【0233】

以下に、一般式ＩＩの化合物の特に好ましい構造を示す。前記式において、残基Ｒ^１は互いに独立して、上記で定義したとおりである。

【化13】

【化14】

【化15】

【0234】

以下の表に、本発明の一般式ＩＩの合成中間体の具体的な例を示す。

【0235】

【表22】

【表23】

【表24】

【表25】

【表26】

【表27】

【表28】

【表29】

【0236】

５．本発明の第５の態様
本発明の第５の態様は、特定のテトラジン中間体の製造方法に関する。

【0237】

本発明の第２０の実施形態によれば、一般式ＩＩのテトラジン中間体の製造方法であって、以下の工程を含む方法である。
ｉ．ヒドラジン水和物の存在下で、一般式ＩＩＩの第一シアノ化合物を一般式ＩＶの第２のシアノ化合物と反応させ、

【化16】

【化17】

ここで、ＺおよびＳｐ^１は上記で定義した通りであり、残基Ｚのヒドロキシル基は任意に保護された、ｉ．ｐ．アルコキシの形で提供され、
ここで、ＲおよびＳｐ^２およびｎ３は、上記で定義した通りであり、
ｉｉ．続いて、特に工程１で形成された１，４－ジヒドロ－ｓ－テトラジン化合物を、例えばＮａＮＯ_２、ＰｈＩ（ＯＡｃ）_２、ＤＤＱ、または空気酸化から選択される酸化剤を用いて酸化し、
ｉｉｉ．必要に応じて得られたテトラジン化合物を単離し、
そして
ｉｖ．必要に応じて残基Ｚのヒドロキシル基を脱保護する。

【0238】

特定の実施形態によれば、工程ｉ）は触媒の非存在下で実行される。
別の特定の実施形態によれば、工程ｉ）は触媒の存在下で実行される。
本発明の別の特定の実施形態によれば、触媒は、例えばＺｎ（ＯＴｆ）_２などの金属含有触媒である。
別の特定の実施形態によれば、触媒は金属を含まない触媒である。
別の特定の実施形態によれば、金属を含まない触媒は有機触媒である。
別の特定の実施形態によれば、有機触媒は硫黄含有触媒である。
別の特定の実施形態によれば、硫黄含有触媒は、３－メルカプトプロピオン酸、Ｌ－システイン、グルタチオン、２－アミノエタンチオール、１，３－プロパンジチオール、チオグリコール酸およびＮ－アセチル－Ｌ－システインから選択され、特に３－メルカプトプロピオン酸である。

【0239】

別の特定の実施形態によれば、反応工程ｉ）は、式（ＩＩＩ）および（ＩＶ）の化合物に対してヒドラジン化合物のモル過剰、例えば１～２０倍のモル過剰で行われる。
さらに別の特定の実施形態によれば、反応工程ｉ）はアルコール溶媒、特にエタノール中で行われる。
さらに別の特定の実施形態によれば、式（ＩＩＩ）および（ＩＶ）の化合物は、１：１０～１０：１のモル比で使用される。
別の特定の実施形態によれば、反応工程ｉｉ）は、式（ＩＩＩ）および（ＩＶ）の化合物に対して酸化剤のモル過剰、例えば１～２０倍のモル過剰で行われる。

【0240】

さらに別の特定の実施形態によれば、工程ｉｉの酸化剤はＮａＮＯ_２である。
さらに別の特定の実施形態によれば、工程ｉｉの酸化剤はＰｈＩ（ＯＡｃ）_２である。
さらに別の特定の実施形態によれば、工程ｉｉの酸化剤は空気である。

【0241】

６．本発明のさらなる側面
本発明のさらなる側面は、本発明の複合体、およびそれを含む医薬組成物、診断キットまたは分析キットの医療用途に関する。

【0242】

本発明の第２１の実施形態によれば、医療、特に診断および／または治療に使用するための、実施形態１１～１７のいずれかで定義される複合体が提供される。

【0243】

本発明の第２２の実施形態によれば、医薬的に許容される担体中に、実施形態１１～１７のいずれかで定義される少なくとも１つの複合体を含む医薬組成物が提供される。

【0244】

本発明の第２３の実施形態によれば、実施形態１～１０のいずれかで定義される少なくとも１つのテトラジン化合物を含む診断キットまたは分析キットが提供される。

【0245】

Ｄ．さらなる実施形態
１．親水性テトラジン中間体およびその製造
一般式ＩＩのテトラジン中間体は、当業界でよく知られている方法と同様に製造できる。適切な方法は、本明細書で引用したさまざまな刊行物に記載されており、そのすべてが参照により本明細書に組み込まれる。いくつかの方法については、ここで概説する。

【0246】

式ＩＩのテトラジン中間体の金属触媒ワンポット合成は、ヤングらのドイツ化学会誌（２０１２），５１，５２２２の開示に従って行うことができる。

【0247】

マオらはドイツ化学会誌（２０１９），５８，１１０６で、チオール含有促進剤による非対称１，２，４，５－テトラジンの有機触媒的かつスケーラブルな合成について説明している。

【0248】

本発明の特定の態様によれば、一般式ＩＩのテトラジン中間体の製造方法が提供される。

【化18】

【0249】

一般的に、前記方法は以下の工程を含む。
ｉ）一般式ＩＩＩの第一シアノ化合物を、ヒドラジン水和物の存在下で、一般式ＩＶの第二のシアノ化合物と反応させ、

【化19】

【化20】

ここで、ＺおよびＳｐ^１は上記で定義した通りであり、残基Ｚの任意のヒドロキシル基は、保護された、ｉ．ｐ．アルコキシの形で提供され、
ここで、ＲおよびＳｐ^２およびｎ３は上記で定義したとおりであり、
ｉｉ）続いて、工程ｉ）の生成物を酸化し、
ｉｉｉ）必要に応じて、得られたテトラジン化合物を単離し、
ｉｖ）必要に応じて、残基Ｚの任意に保護されたヒドロキシル基を脱保護する。

【0250】

より具体的には、工程ｉ）はワンポット反応で行われる。この目的のために、例えば、一般式（ＩＩＩ）および（ＩＶ）のシアノ遊離体の溶液が提供され、これにヒドラジン化合物、特にヒドラジン水和物が補充され、必要に応じて適切な触媒の存在下で行われる。

【0251】

特定の触媒は、酸性の金属を含まない有機触媒メルカプト化合物、例えば、３－メルカプトプロピオン酸、Ｌ－システイン、グルタチオン、２－アミノエタンチオール、１，３－プロパンジチオール、チオグリコール酸、およびＮ－アセチル－Ｌ－システイン、特に３－メルカプトプロピオン酸、例えば３－メルカトプロピオン酸である。代替触媒は、例えばＺｎ（ＯＴｆ）_２などの金属含有触媒である。

【0252】

工程ｉ）の反応は、完了するまで温度制御下で実施される。その後、結果として生じるジヒドロテトラジン中間体は酸化される。この目的のために、従来の酸化剤、特に亜硝酸ナトリウム／ＨＣｌまたは硝酸が適用できる。

【0253】

必要に応じて、前記シアノ抽出物の混合物は、適切な溶媒中に提供される。使用可能な典型的な溶媒は、ＴＨＦのような極性有機溶媒、および有機アルコール、特にエタノールから選択される。

【0254】

典型的には、式（ＩＩＩ）および（ＩＶ）の化合物は、１：１０から１０：１、例えば１：５から５：１の範囲のモル比で提供される。より具体的には、式ＩＩＩの化合物は、１～１０倍または１～５倍のモル過剰で提供される。

【0255】

典型的には、ヒドラジン化合物は、シアノ抽出物に対してモル過剰で添加され、例えば、化合物（ＩＩＩ）または（ＩＶ）に対して１～２０倍または４～１５倍過剰で添加される。

【0256】

典型的には、触媒量で使用される酸触媒、より具体的には化合物（ＩＩＩ）または（ＩＶ）に対するモル量である。

【0257】

通常、酸は少なくとも１モル、より好ましくはヒドラジン化合物に対して１モル過剰で適用される。

【0258】

反応温度は－１０～＋１０℃の範囲で制御される。

【0259】

工程ｉｉの酸化により、工程ｉ）で形成されたジヒドロテトラジン中間体がそれぞれのテトラジンに変換される。通常、反応は工程ｉ）の反応混合物中で、周囲空気の存在下で、または適切な酸化剤、例えばＮａＮＯ_２、ｐ－ベンゾキノン、ＤＤＱ、またはＰｈＩ（ＯＡｃ）２の添加によって行われる。酸化剤としてのＰｈＩ（ＯＡｃ）２は、例えばセルヴァラーイ，アールらによってＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎＬｅｔｔ．２０１４；５５（３４）：４７９５－４７９７に記載されている。

【0260】

非限定的な例として、２つの異なるリン酸テトラジンの調製を次のスキームで示す（酸化工程は明示的に示されていない）。

【化21】

スキーム１ 親水性ホスホネートテトラジンの合成

【0261】

工程ｉｉの生成物を単離するための任意の工程ｉｉｉは、従来の精製方法によって実行できる。特に、フラッシュクロマトグラフィーやＨＰＬＣなどのクロマトグラフィー法が挙げられる。

【0262】

本発明の方法は、式ＩＩＩの抽出物が適用され、残基Ｚが保護された、例えばエステル化されたヒドロキシル基を含むことを条件として、工程ｉｖも含み、生成されたテトラジンを脱保護された形で使用することが意図される。エステル化されたヒドロキシル基を保護する方法は周知である。有機溶媒中のトリメチルシリルブロミドによる処理による脱保護は、限定されない例として挙げられる。

【0263】

上記の一般的なプロセスを適用することにより、メチルホスホネートテトラジンの特定の誘導体を合成することができる。これらの化合物は、例えばアミドカップリングまたはカルバメートまたはエステル結合の形成を介して、さらなる化学部分と反応することを可能にする官能基を含む。このような化学部分は、上記で特定した基から選択される。
Ｓｐ^２ スペーサー部分（式ＩＶの上記反応物の一部として既に導入されているＳｐ^２部分に加えて任意）
Ａ 切断可能な基
Ｘ 自壊性部分
Ｙ ペイロード残基（カーゴ）
またはそれらの組み合わせ、例えば
－Ａ－Ｘ－Ｙ、－Ａ－Ｙ、－Ｘ－Ｙ、－Ａ－Ｘ－Ｘ－Ｙ、－Ｘ－Ｘ－Ｙ
－Ｓｐ^２－Ａ－Ｘ－Ｙ、－Ｓｐ^２－Ａ－Ｙ、－Ｓｐ^２－Ｘ－Ｙ、－Ｓｐ^２－Ａ－Ｘ－Ｘ－Ｙ

【0264】

２．ペイロード分子Ｙ
一般式Ｉのテトラジン化合物の構成要素として典型的に使用されるペイロード分子Ｙは、生物活性化合物、標識剤、およびキレート剤から選択することができる。それらの非限定的な例を以下の章に示す。

【0265】

２．１ 生理活性化合物
生理活性化合物には、以下が含まれるが、これらに限定されるわけではない。

【0266】

本発明に適用可能な生理活性化合物には、小有機分子薬、ステロイド、脂質、タンパク質、アプタマー、オリゴペプチド、オリゴヌクレオチド、オリゴ糖、ペプチド、ペプトイド、アミノ酸、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド、ヌクレオシド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、毒素、グリカン、免疫グロブリンが含まれるが、これらに限定されるわけではない。

【0267】

本発明の実施において使用できる生物活性化合物の例示的なクラスには、ホルモン、細胞毒素、抗増殖剤／抗腫瘍剤、抗ウイルス剤、抗生物質、サイトカイン、抗炎症剤、降圧剤、化学増感剤、光増感剤および放射線増感剤、抗エイズ物質、抗ウイルス剤、免疫抑制剤、免疫刺激剤、酵素阻害剤、抗パーキンソン病剤、神経毒、チャネル遮断剤、細胞増殖阻害剤および抗接着分子を含む細胞外マトリックス相互作用の調節剤、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはタンパク質合成の阻害剤、ステロイド性および非ステロイド性抗炎症剤、抗血管新生因子、抗アルツハイマー剤などが含まれるが、これらに限定されない。

【0268】

いくつかの実施形態では、生理活性化合物は、低分子量から中分子量の化合物（例えば、約２００～５０００Ｄａ、約２００～約１５００Ｄａ、好ましくは約３００～約１０００Ｄａ）である。

【0269】

例示的な細胞毒性薬は、特に癌治療に使用されるものである。このような薬には、一般に、ＤＮＡ損傷剤、代謝拮抗薬、天然物およびその類似体、ジヒドロ葉酸還元酵素阻害剤およびチミジル酸合成酵素阻害剤などの酵素阻害剤、ＤＮＡ結合剤、ＤＮＡアルキル化剤、放射線増感剤、ＤＮＡインターカレーター、ＤＮＡ切断剤、微小管安定化剤および不安定化剤、トポイソメラーゼ阻害剤が含まれる。例としては、白金系薬、アントラサイクリン系薬、ビンカ系薬、マイトマイシン、ブレオマイシン、細胞毒性ヌクレオシド、タキサン、レキシトロプシン、プテリジン系薬、ジイネン、ポドフィロトキシン、ドラスタチン、メイタンシノイド、分化誘導剤、およびタキソールが含まれるが、これらに限定されない。これらのクラスの特に有用なメンバーとしては、例えば、オーリスタチン、メイタンシン、メイタンシノイド、カリケアマイシン、ダクチノマイシン、デュオカルマイシン、ＣＣ１０６５およびその類似体、カンプトテシンおよびその類似体、ＳＮ－３８およびその類似体、ＤＸｄ、チューブリシンＭ、クリプトフィシン、ピロロベンゾジアゼピンおよびピロロベンゾジアゼピン二量体（ＰＢＤ）、ピリジノベンゾジアゼピン（ＰＤＤ）およびインドリノベンゾジアゼピン（ＩＢＤ）（ＵＳ２０２１０２０６７６３Ａ１参照）、メトトレキサート、メトプテリン、ジクロロメトトレキサート、５－フルオロウラシル、ＤＮＡマイナーグルーブバインダー、６－メルカプトプリン、シトシンアラビノシド、メルファラン、ロイロシン、ロイロシデイン、アクチノマイシン、アントラサイクリン（ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、ダウノルビシン）、ＰＮＵ－１５９６８２（ＵＳ１０，２８８，７４５Ｂ２参照）およびその類似体、マイトマイシンＣ、マイトマイシンＡ、カミノマイシン、アミノプテリン、タリソマイシン、ポドフィロトキシンおよびポドフィロトキシン誘導体、例えばエトポシドまたはエトポシドリン酸、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、タキソール、タキソテール、レチノイン酸、酪酸、Ｎ８－アセチルスペルミジン、スタウロスポリン、コルヒチン、カンプトテシン、エスペラマイシン、エンジインおよびその類似体、ヘミアステリンおよびその類似体が挙げられる。

【0270】

その他の代表的な薬物クラスとしては、血管新生阻害剤、細胞周期進行阻害剤、Ｐ１３Ｋ／ｍ－ＴＯＲ／ＡＫＴ経路阻害剤、ＭＡＰＫシグナル伝達経路阻害剤、キナーゼ阻害剤、タンパク質シャペロン阻害剤、ＨＤＡＣ阻害剤、ＰＡＲＰ阻害剤、Ｗｎｔ／ヘッジホッグシグナル伝達経路阻害剤、ＲＮＡポリメラーゼ阻害剤、およびタンパク質分解剤がある（ｈｔｔｐｓ：／／ｐｕｂｓ．ａｃｓ．ｏｒｇ／ｄｏｉ／１０．１０２１／ａｃｓｃｈｅｍｂｉｏ．０ｃ００２８５を参照）。

【0271】

アウリスタチンの例には、ドラスタチン１０、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）、アウリスタチンＦ、モノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）、アウリスタチンＦヒドロキシプロピルアミド（ＡＦＨＰＡ）、アウリスタチンＦフェニレンジアミン（ＡＦＰ）、モノメチルアウリスタチンＤ（ＭＭＡＤ）、アウリスタチンＰＥ、アウリスタチンＥＢ、アウリスタチンＥＦＰ、アウリスタチンＴＰ、およびアウリスタチンＡＱが含まれる。適切なアウリスタチンは、米国特許出願公開第２００３／００８３２６３号、第２０１１／００２０３４３号、および第２０１１／００７０２４８号、国際出願公開第ＷＯ０９／１１７５３１号、第ＷＯ２００５／０８１７１１号、第ＷＯ０４／０１０９５７号、第ＷＯ０２／０８８１７２号および第ＷＯ０１／２４７６３号、および米国特許第７，４９８，２９８号、第６，８８４，８６９号、第６，３２３，３１５号、第６，２３９，１０４号、第６，１２４，４３１号、第６，０３４，０６５号、第５，７８０，５８８号、第５，７６７，２３７号、第５，６６５，８６０号、第５，６６３，１４９号、第５，６３５，４８３号、第５，５９９，９０２号、第５，５５４，７２５号、第５，５３０，０９７号、第５，５２１，２８４号、第５，５０４，１９１号、第５，４１０，０２４号、第５，１３８，０３６号、第５，０７６，９７３号、第４，９８６，９８８号、第４，９７８，７４４号、第４，８７９，２７８号、第４，８７９，２７８号、第４，８１６，４４４号および第４，４８６，４１４号であり、これらの特許の開示内容は、全体として参照により本明細書に組み込まれる。

【0272】

例示的な薬物としては、ドラスタチンおよびその類似体、例えば、ドラスタチンＡ（米国特許第４，４８６，４１４号）、ドラスタチンＢ（米国特許第４，４８６，４１４号）、ドラスタチン１０（米国特許第４，４８６，４４４号、第５，４１０，０２４号、第５，５０４，１９１号、第５，５２１，２８４号、第５，５３０，０９７号、第５，５９９，９０２号、第５，６３５，４８３号、第５，６６３，１４９号、第５，６６５，８６０号、第５，７８０，５８８号、第６，０３４，０６５号、第６，３２３，３１５号）、ドラスタチン１３（米国特許第４，９８６，９８８号）、ドラスタチン１４（米国特許第５，１３８，０３６号）、ドラスタチン１５（米国特許第４，８７９，２７８号）、ドラスタチン１６（米国特許第６，２３９，１０４号）、ドラスタチン１７（米国特許第６，２３９，１０４号）、およびドラスタチン１８（米国特許第６，２３９，１０４号）であり、各特許は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0273】

例示的なメイタンシン、メイタンシノイド（例えばＤＭ－１およびＤＭ－４）、またはメイタンシノールおよびメイタンシノール類似体を含むメイタンシノイド類似体は、米国特許第４，４２４，２１９号、第４，２５６，７４６号、第４，２９４，７５７号、第４，３０７，０１６号、第４，３１３，９４６号、第４，３１５，９２９号、第４，３３１，５９８号、第４，３６１，６５０号、第４，３６２，６６３号、第４，３６４，８６６号、第４，４５０，２５４号、第４，３２２，３４８号、第４，３７１，５３３号、第５，２０８，０２０号、第５，４１６，０６４号、第５，４７５，０９２号、第５，５８５，４９９号、第５，８４６，５４５号、第６，３３３，４１０号、第６，４４１，１６３号、第６，７１６，８２１号、および第７，２７６，４９７号に記載されている。

【0274】

その他の例としては、メルタンシンおよびアンサミトシンが挙げられる。ピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）には、明示的に二量体および類似体が含まれており、デニー、Ｅｘｐ．Ｏｐｉｎ．Ｔｈｅｒ．Ｐａｔｅｎｔｓ，１０（４）：４５９－４７４（２０００）、ハートリーら、ＥｘｐｅｒｔＯｐｉｎＩｎｖｅｓｔｉｇＤｒｕｇｓ．２０１１，２０（６）：７３３－４４、アントナウら、ＣｈｅｍＲｅｖ．２０１１，１１１（４），２８１５－６４に記載されているものが含まれるが、これらに限定されない。

【0275】

カリケアマイシンには、例えば、エンジイン、エスペラマイシン、および米国特許第５，７１４，５８６号および第５，７３９，１１６号に記載されているものが含まれる。

【0276】

デュオカルマイシンおよびその類似体の例としては、ＣＣ１０６５、デュオカルマイシンＳＡ、デュオカルマイシンＡ、デュオカルマイシンＢ１、デュオカルマイシンＢ２、デュオカルマイシンＣ１、デュオカルマイシンＣ_２、デュオカルマイシンＤ、ＤＵ－８６、ＫＷ－２１８９、アドゼレシン、ビゼレシン、カルゼレシン、セコ－アドゼレシンが挙げられる。他の例としては、例えば、米国特許第５，０７０，０９２号、第５，１０１，０９２号、第５，１８７，１８６号、第５，４７５，０９２号、第５，５９５，４９９号、第５，８４６，５４５号、第６，５３４，６６０号、第６，５４８，５３０号、第６，５８６，６１８号、第６，６６０，７４２号、第６，７５６，３９７号、第７，０４９，３１６号、第７，５５３，８１６号、第８，８１５，２２６号、２０１４年５月２日付け出願の米国ＵＳ２０１５０１０４４０７および２０１４年６月１１日付け出願の米国６２／０１０，９７２に記載されているものが挙げられ、それぞれの開示内容は、その全体が本明細書に組み込まれる。

【0277】

例示的なビンカアルカロイドとしては、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシン、およびナベルビン、ならびに米国公開第２００２／０１０３１３６号および第２０１０／０３０５１４９号、ならびに米国特許第７，３０３，７４９号に開示されているものがあり、これらの開示内容は、全体として参照により本明細書に組み込まれる。

【0278】

例示的なエポチロン化合物としては、エポチロンＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、およびＦ、ならびにそれらの誘導体が挙げられる。適切なエポチロン化合物およびその誘導体は、例えば、米国特許第６，９５６，０３６号、第６，９８９，４５０号、第６，１２１，０２９号、第６，１１７，６５９号、第６，０９６，７５７号、第６，０４３，３７２号、第５，９６９，１４５号、および第５，８８６，０２６号、ならびに国際公開第ＷＯ９７／１９０８６号、第ＷＯ９８／０８８４９号、第Ｗ０９８／２２４６１号、第Ｗ０９８／２５９２９号、第Ｗ０９８／３８１９２号、第ＷＯ９９／０１１２４号、第ＷＯ９９／０２５１４号、第ＷＯ９９／０３８４８号、第ＷＯ９９／０７６９２号、第ＷＯ９９／２７８９０号、および第Ｗ０９９／２８３２４号に記載されており、その開示内容は全体として参照により本明細書に組み込まれる。

【0279】

例示的なクリプトフィシン化合物は、米国特許第６，６８０，３１１号および第６，７４７，０２１号に記載されており、その開示内容は、全体として参照により本明細書に組み込まれる。

【0280】

例示的な白金化合物としては、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、イプロプラチン、オルマプラチン、テトラプラチンが挙げられる。

【0281】

例示的なＤＮＡ結合薬またはアルキル化薬としては、ＣＣ－１０６５およびその類似体、アントラサイクリン、カリケアマイシン、ダクチノマイシン、ミトロマイシン、ピロロベンゾジアゼピンなどが挙げられる。

【0282】

例示的な微小管安定化剤および不安定化剤としては、パクリタキセル、ドセタキセル、テセタキセル、カルバジタキセルなどのタキサン化合物、メイタンシノイド、アウリスタチンおよびその類似体、ビンカアルカロイド誘導体、エポチロン、およびクリプトフィシンが挙げられる。

【0283】

例示的なトポイソメラーゼ阻害剤には、カンプトテシンおよびカンプトテシン誘導体、カンプトテシン類似体、ならびに例えば、ＣＰＴ－１１、ＳＮ－３８、トポテカン、９－アミノカンプトテシン、ルビテカン、ギマテカン、カレニテシン、シラテカン、ルルトテカン、エキサテカン、ＤＸｄ、ジフロメトテカン、ベロテカン、ルルトテカンおよびＳ３９６２５などの非天然カンプトテシンが含まれる。本発明で使用できる他のカンプトテシン化合物には、例えば、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，２９：２３５８－２３６３（１９８６）、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，２３：５５４（１９８０）、Ｊ．ＭｅｄＣｈｅｍ．，３０：１７７４（１９８７）に記載されているものが含まれる。

【0284】

血管新生阻害剤には、ＭｅｔＡＰ２阻害剤、ＶＥＧＦ阻害剤、ＰＩＧＦ阻害剤、ＶＧＦＲ阻害剤、ＰＤＧＦＲ阻害剤、ＭｅｔＡＰ２阻害剤が含まれるが、これらに限定されない。代表的なＶＧＦＲ阻害剤およびＰＤＧＦＲ阻害剤には、ソラフェニブ、スニチニブ、バタラニブが含まれる。代表的なＭｅｔＡＰ２阻害剤には、フマギロール類似体、つまりフマギリンコア構造を含む化合物が含まれる。

【0285】

例示的な細胞周期進行阻害剤としては、例えば、ＢＭＳ－３８７０３２およびＰＤ０３３２９９１などのＣＤＫ阻害剤、例えば、ＡＺＤ７７６２などのＲｈｏキナーゼ阻害剤、例えば、ＡＺＤ１１５２、ＭＬＮ８０５４およびＭＬＮ８２３７などのオーロラキナーゼ阻害剤、例えば、ＢＩ２５３６、ＢＩ６７２７、ＧＳＫ４６１３６４、ＯＮ－０１９１０などのＰＬＫ阻害剤、および例えば、ＳＢ７４３９２１、ＳＢ７１５９９２、ＭＫ－０７３１、ＡＺＤ８４７７、ＡＺ３１４６およびＡＲＲＹ－５２０などのＫＳＰ阻害剤が挙げられる。

【0286】

代表的なＰ１３Ｋ／ｍ－ＴＯＲ／ＡＫＴシグナル伝達経路阻害剤としては、ホスホイノシチド３－キナーゼ（Ｐ１３Ｋ）阻害剤、ＧＳＫ－３阻害剤、ＡＴＭ阻害剤、ＤＮＡ－ＰＫ阻害剤、ＰＤＫ－１阻害剤などがある。

【0287】

例示的なＰ１３キナーゼは、米国特許第６，６０８，０５３号に開示されており、ＢＥＺ２３５、ＢＧＴ２２６、ＢＫＭ１２０、ＣＡＬ２６３、デメトキシビリジン、ＧＤＣ－０９４１、ＧＳＫ６１５、ＩＣ８７１１４、ＬＹ２９４００２、パロミッド５２９、ペリフォシン、ＰＦ－０４６９１５０２、ＰＸ－８６６、ＳＡＲ２４５４０８、ＳＡＲ２４５４０９、ＳＦ１１２６、ワートマンニン、ＸＬ１４７、およびＸＬ７６５が含まれる。

【0288】

例示的なＡＫＴ阻害剤としては、ＡＴ７８６７が挙げられるが、これに限定されるわけではない。

【0289】

代表的なＭＡＰＫシグナル伝達経路阻害剤としては、ＭＥＫ、Ｒａｓ、ＪＮＫ、Ｂ－Ｒａｆ、ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤などがある。

【0290】

例示的なＭＥＫ阻害剤は、米国特許第７，５１７，９４４号に開示されており、ＧＤＣ－０９７３、ＧＳＫｌ１２０２１２、ＭＳＣ１９３６３６９Ｂ、ＡＳ７０３０２６、Ｒ０５１２６７６６およびＲ０４９８７６５５、ＰＤ０３２５９０１、ＡＺＤ６２４４、ＡＺＤ８３３０およびＧＤＣ－０９７３が含まれる。

【0291】

代表的なＢ－ｒａｆ阻害剤としては、ＣＤＣ－０８７９、ＰＬＸ－４０３２、ＳＢ５９０８８５などがある。

【0292】

例示的なＢｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤としては、ＢＩＲＢ７９６、ＬＹ２２２８８２０、およびＳＢ２０２１９０が挙げられる。例示的な受容体チロシンキナーゼ阻害剤としては、ＡＥＥ７８８（ＮＶＰ－ＡＥＥ７８８）、ＢＩＢＷ２９９２（アファチニブ）、ラパチニブ、エルロチニブ（タルセバ）、ゲフィチニブ（イレッサ）、ＡＰ２４５３４（ポナチニブ）、ＡＢＴ－８６９（リニファニブ）、ＡＺＤ２１７１、ＣＨＲ－２５８（ドビチニブ）、スニチニブ（スーテント）、ソラフェニブ（ネクサバール）、およびバタリニブが挙げられるが、これらに限定されない。

【0293】

例示的なタンパク質シャペロン阻害剤には、ＨＳＰ９０阻害剤が含まれる。例示的な阻害剤には、１７ＡＡＧ誘導体、ＢＩＩＢ０２１、ＢＩＩＢ０２８、ＳＮＸ－５４２２、ＮＶＰ－ＡＵＹ－９２２、およびＫＷ－２４７８が含まれる。

【0294】

例示的なＨＤＡＣ阻害剤としては、ベリノスタット（ＰＸＤ１０１）、ＣＵＤＣ－１０１、ドロキシノスタット、ＩＴＦ２３５７（ギビノスタット、ガビノスタット）、ＪＮＪ－２６４８１５８５、ＬＡＱ８２４（ＮＶＰ－ＬＡＱ８２４、ダシノスタット）、ＬＢＨ－５８９（パノビノスタット）、ＭＣ１５６８、ＭＧＣＤ０１０３（モセチノスタット）、ＭＳ－２７５（エンチノスタット）、ＰＣＩ－２４７８１、ピロキサミド（ＮＳＣ６９６０８５）、ＳＢ９３９、トリコスタチンＡ、およびボリノスタット（ＳＡＨＡ）などがある。代表的なＰＡＲＰ阻害剤としては、イニパリブ（ＢＳＩ２０１）、オラパリブ（ＡＺＤ－２２８１）、ＡＢＴ－８８８（ベリパリブ）、ＡＧ０１４６９９、ＣＥＰ９７２２、ＭＫ４８２７、ＫＵ－００５９４３６（ＡＺＤ２２８１）、ＬＴ－６７３、３－アミノベンザミド、Ａ－９６６４９２、ＡＺＤ２４６１などがある。

【0295】

代表的なＷｎｔ／ヘッジホッグシグナル伝達経路阻害剤としては、ビスモデギブ、シクロパミン、ＸＡＶ－９３９などがある。

【0296】

例示的なＲＮＡポリメラーゼ阻害剤には、アマトキシンが含まれる。例示的なアマトキシンには、アルファアマニチン、ベータアマニチン、ガンマアマニチン、イータアマニチン、アマヌリン、アマヌリン酸、アマニサミド、アマノン、およびプロアマヌリンが含まれる。

【0297】

代表的なサイトカインとしては、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、ＴＮＦなどがある。

【0298】

特定の薬剤の非限定的な例としては、オーリスタチン、メイタンシノイド、ＰＢＤ、トポイソメラーゼ阻害剤、アントラサイクリンなどが挙げられる。

【0299】

別の実施形態では、上記のような２つ以上の異なる薬剤の組み合わせが使用される。

【0300】

別の実施形態によれば、生物活性化合物は、特にオリゴまたはポリペプチドまたはタンパク質などの、１つ以上の天然および／または非天然、タンパク質構成および／または非タンパク質構成アミノ酸残基を含む任意の合成または天然化合物から選択され得る。

【0301】

このような化合物の特定の基には、例えば抗体、抗体誘導体、抗体フラグメント、抗体（フラグメント）融合（例えば、二重特異性および三重特異性ｍＡｂフラグメントまたは誘導体）、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体（ヒト抗体、ヒト化抗体、マウス抗体またはキメラ抗体）などの免疫グロブリン分子が含まれる。

【0302】

本発明で使用するための抗体の典型的な非限定的な例は、生物学的に、特に薬理学的に活性な抗体分子から選択される。非限定的な例は、以下の群から選択される：トラスツズマブ、ベバシズマブ、セツキシマブ、パニツムマブ、イピリムマブ、リツキシマブ、アレムツズマブ、オファツムマブ、ゲムツズマブ、ブレンツキシマブ、イブリツモマブ、トシツモマブ、ペルツズマブ、アデカツムマブ、ＩＧＮ１０１、ＩＮＡ０１、ラベツズマブ、ｈｕａ３３、ペムツモマブ、オレゴボマブ、ミンレツモマブ（ＣＣ４９）、ｃＧ２５０、Ｊ５９１、ＭＯｖ－１８、ファルレツズマブ（ＭＯＲＡｂ－００３）、３Ｆ８、ｃｈ１４，１８、ＫＷ－２８７１、ｈｕ３Ｓ１９３、ｌｇＮ３１１、ＩＭ－２Ｃ６、ＣＤＰ－７９１、エタラシズマブ、ボロシキシマブ、ニモツズマブ、ＭＭ－１２１、ＡＭＧ１０２、ＭＥＴＭＡＢ、ＳＣＨ９００１０５、ＡＶＥ１６４２、ＩＭＣ－Ａ１２、ＭＫ－０６４６、Ｒ１５０７、ＣＰ７５１８７１、ＫＢ００４、ＩＩＩＡ４、マパツムマブ、ＨＧＳ－ＥＴＲ２、ＣＳ－１００８、デノスマブ、シブロツズマブ、Ｆ１９、８１Ｃ６、ピナツズマブ、リファツズマブ、グレンバツムマブ、コルツキシマブ、ロルボツズマブ、インダツキシマブ、抗ＰＳＭＡ、ＭＬＮ－０２６４、ＡＢＴ－４１４、ミラツズマブ、ラムシルマブ、アバゴボマブ、アビツズマブ、アデカツムマブ、アフツズマブ、アルツモマブペンテテート、アマツキシマブ、アナツムマブ、アネツマブ、アポリズマブ、アルシツムマブ、アスクリンバキュマブ、アテゾリズマブ、バビツキシマブ、ベクツマブ、ベリムマブ、ビバツズマブ、ブロンチクツズマブ、カンツズマブ、カプロマブ、カトゥマキソマブ、シタツズマブ、シクツムマブ、クリバツズマブ、コドリツズマブ、コナツムマブ、ダセツズマブ、ダロツズマブ、ダラツムマブ、デムシズマブ、デニンツズマブ、デパツキシズマブ、デルロツキシマブ、デツモマブ、ジヌツキシマブ、ドロジツマブ、デュリゴツマブ、デュルバルマブ、デュシギツマブ、エクロメキシマブ、エドレコロマブ、エルゲムツマブ、エマクツズマブ、エナバツズマブ、エミベツズマブ、エンフォルツマブ、エノブリツズマブ、エンシツキシマブ、エプラツズマブ、エルツマキソマブ、エタラシズマブ、ファレツズマブ、フィクラツズマブ、フィギツムマブ、フランボツマブ、フツキシマブ、ガリキシマブ、ガニツマブ、イクルクマブ、イゴボマブ、イマルマブ、インガツズマブ、インドゥサツマブ、イネビリズマブ、インテツムマブ、イラツムマブ、イザツキシマブ、レクサツズマブ、リロトマブ、リンツズマブ、リリルマブ、ルカツムマブ、ルムレツズマブ、マルゲツキシマブ、マツズマブ、ミルベツキシマブ、ミツモマブ、モガムリズマブ、モクセツモマブ、ナコロマブ、ナプツモマブ、ナルナツマブ、ネシツムマブ、ネスバキュマブ、ニモツズマブ、ニボルマブ、ノフェツモマブ、オビヌツズマブ、オカラツズマブ、オファツムマブ、オララツズマブ、オナルツズマブ、オンツシズマブ、オポルツズマブ、オレゴボマブ、オトレルツズマブ、パンコマブ、パルサツズマブ、パソツキズマブ、パトリツマブ、ペンブロリズマブ、ペムツモマブ、ピディリズマブ、ピンツモマブ、ポラツズマブ、プリツムマブ、キリズマブ、ラコツマブ、ラムシルマブ、リロツムマブ、ロバツムマブ、サシツズマブ、サマリズマブ、サツモマブ、セリバンツマブ、シルツキシマブ、ソフィツズマブ、タカツズマブ、タプリツモマブ、タレクツモマブ、テナツモマブ、テプロツムマブ、テツロマブ、チシリムマブ、チガツズマブ、トシツモマブ、トベツマブ、トレメリムマブ、ツコツズマブ、ウブリツキシマブ、ウロクプルマブ、ウレルマブ、ウトミルマブ、バダスツキシマブ、バンドルツズマブ、バンチクツマブ、バヌシズマブ、バルリルマブ、ベルツズマブ、ベセンクマブ、ボロシキシマブ、ボルセツズマブ、ボツムマブ、ザルツムマブ、ザツキシマ、それらの組み合わせおよび誘導体、ならびにＣＡＩ２５、ＣＡＩ５－３、ＣＡＩ９－９、Ｌ６、ルイスＹ、ルイスＸ、アルファフェトプロテイン、ＣＡ２４２、胎盤アルカリホスファターゼ、前立腺特異抗原、前立腺特異膜抗原、前立腺酸性ホスファターゼ、上皮成長因子、ＭＡＧＥ－１、ＭＡＧＥ－２、ＭＡＧＥ－３、ＭＡＧＥ－４、トランスフェリン受容体、ｐ９７、ＭＵＣＩ、ＣＥＡ、ｇｐｌＯＯ、ＭＡＲＴＩ、ＩＬ－２受容体、ＣＤ２０、ＣＤ５２、ＣＤ３３、ＣＤ２２、ヒト絨毛性ゴナドトロピン、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ムチン、Ｐ２１、ＭＰＧ、およびＮｅｕがん遺伝子産物。

【0303】

２．２ 標識剤
本発明に従って使用できる標識剤は、テトラジン部分の反応性に悪影響を与えない、当技術分野で知られている任意のタイプの標識を含むことができる。

【0304】

本発明の標識には、限定ではなく、染料（例えば、蛍光、発光、または燐光染料、例えば、ダンシル、クマリン、フルオレセイン、アクリジン、ローダミン、シリコンローダミン、ＢＯＤＩＰＹ、またはシアニン染料）、発色団（例えば、フィトクロム、フィコビリン、ビリルビンなど）、放射性標識（例えば、トリチウム、フッ素－１８、炭素－１１、炭素－１４、リン－３２、リン－３３、硫黄－３３、硫黄－３５、ヨウ素－１２３、またはヨウ素－１２５などの水素、フッ素、炭素、リン、硫黄、またはヨウ素の放射性形態）、ＭＲＩ感受性スピン標識、アフィニティータグ（例えば、ビオチン、Ｈｉｓタグ、Ｆｌａｇタグ、ストレップタグ、糖、脂質、ステロール、ＰＥＧリンカー、ベンジルグアニン、ベンジルシトシン、または補因子）、ポリエチレングリコール基（例：分岐ＰＥＧ、直鎖ＰＥＧ、異なる分子量のＰＥＧなど）、光架橋剤（ｐ－アジドヨードアセトアニリドなど）、ＮＭＲプローブ、Ｘ線プローブ、ｐＨプローブ、ＩＲプローブ、樹脂、固体支持体を含む。

【0305】

いくつかの実施形態では、例示的な染料には、スペクトルの近赤外領域で蛍光を発するＮＩＲ造影剤が含まれ得る。例示的な近赤外蛍光体には、約６３０～１０００ｎｍ、例えば、約６３０～８００ｎｍ、約８００～９００ｎｍ、約９００～１０００ｎｍ、約６８０～７５０ｎｍ、約７５０～８００ｎｍ、約８００～８５０ｎｍ、約８５０～９００ｎｍ、約９００～９５０ｎｍ、または約９５０～１０００ｎｍの発光波長（例えば、ピーク発光波長）を持つ染料およびその他の蛍光体が含まれる。発光波長（例えば、ピーク発光波長）が１０００ｎｍを超える蛍光体も、本明細書に記載の方法で使用することができる。

【0306】

いくつかの実施形態では、例示的な蛍光体としては、７－アミノ－４－メチルクマリン－３－酢酸（ＡＭＣＡ）、ＴＥＸＡＳ ＲＥＤ^ＴＭ（モレキュラー プローブ インコーポレイテッド、オレゴン州ユージーン）、５－（および－６）－カルボキシ－Ｘ－ローダミン、リサミンローダミンＢ、５－（および－６）－カルボキシフルオレセイン、フルオレセイン－５－イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、７－ジエチルアミノクマリン－３－カルボン酸、テトラメチルローダミン－５－（および－６）－イソチオシアネート、５－（および－６）－カルボキシテトラメチルローダミン、７－ヒドロキシクマリン－３－カルボン酸、６－［フルオレセイン５－（および－６）－カルボキサミド］ヘキサン酸、Ｎ－（４，４－ジフルオロ－５，７－ジメチル－４－ボラ－３ａ，４ａジアザ－３－インダセンプロピオン酸、エオシン－５－イソチオシアネート、エリスロシン－５－イソチオシアネート、ＣＡＳＣＡＤＥ^ＴＭ ブルーアセチルアジド（モレキュラー プローブ インコーポレイテッド、オレゴン州ユージーン）およびＡＴＴＯ染料が含まれる。

【0307】

他の適切な蛍光体は、例えば欧州特許出願公開第ＥＰ３５７２４６８Ａ１号に記載されている。さらなる標識剤は、１７７－ルテチウム、８９－ジルコニウム、１３１－ヨウ素、６８－ガリウム、９９ｍ－テクネシウム、２２５－アクチニウム、２１３－ビスマット、９０－イットリウム、２１２－鉛、１１１－インジウム、６４－銅、６７－銅、１２４－ヨウ素、２２７－トリウムおよび１８８－レニウムである。

【0308】

２．３キレート剤
一般的に適用可能なキレート剤とその略称のリストを以下に示す。対応する塩も適用可能である。

【0309】

アセチルアセトン（ＡＣＡＣ）、エチレンジアミン（ＥＮ）、２－（２－アミノエチルアミノ）エタノール（ＡＥＥＡ）、ジエチレントリアミン（ＤＩＥＮ）、イミノジ酢酸（ＩＤＡ）、トリエチレンテトラミン（ＴＲＩＥＮ）、トリアミノトリエチルアミン、ニトリロトリ酢酸（ＮＴＡ）およびその塩（Ｎａ３ＮＴＡまたはＦｅＮＴＡなど）、エチレンジアミノトリ酢酸（ＴＥＤ）、エチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）およびその塩（Ｎａ２ＥＤＴＡおよびＣａＮａ２ＥＤＴＡなど）、ジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＤＴＰＡ）、１，４，７，１０－ｚテトラアザシクロドデカン－１，４，７，１０－テトラ酢酸（ＤＯＴＡ）、１，４，７－トリアザシクロノナン－１，４，７－トリ酢酸（ＮＯＴＡ）、シュウ酸塩（ＯＸ）、酒石酸塩（ＴＡＲＴ）、クエン酸塩（ＣＩＴ）、ジメチルグリオキシム（ＤＭＧ）、８－ヒドロキシキノリン、２，２’－ビピリジン（ＢＰＹ）、１，１０－フェナントロリン（ＰＨＥＮ）、ジメルカプトコハク酸（ＤＭＳＡ）、１，２－ビス（ジフェニルホスフィノ）エタン（ＤＰＰＥ）、サリチル酸ナトリウム、メトキシサリチル酸、ブリティッシュアンチルイス酸または２，３－ジメルカプロール（ＢＡＬ）、メソ－２，３－ジメルカプトコハク酸（ＤＭＳＡ）；微生物によって分泌されるシデロフォア、例えばストレプトマイセス属菌によって生成されるデスフェリオキサミンまたはデフェロキサミンＢ（別名デフェラル（ノバルティス））、ストレプトマイセスピロサスによって分泌されるトリヒドロキサム酸であるデフェロキサミン（ＤＦＯ）、クルクミノイドやムギネ酸の誘導体（３－ヒドロキシムギネ酸、２’－デオキシムギネ酸など）などの植物化学物質、合成キレート剤（イブプロフェンなど）、カテコール、ヒドロキサメート、ヒドロキシピリジノンの誘導体（ヒドロキサメートデスフェラル、ヒドロキシピリジノンデフェリプロンなど）、デフェリプロン（Ｌ１または１，２－ジメチル－３－ヒドロキシピリド－４－オン）、β－β－ジメチルシステインまたは３－メルカプト－Ｄ－バリンであるＤ－ペニシラミン（ＤＰＡまたはＤ－ＰＥＮ）、テトラエチレンテトラアミン（ＴＥＴＡ）またはトリエンチンとその２つの主要代謝物であるＮ１－アセチルトリエチレンテトラミン（ＭＡＴ）とＮ１，Ｎ１０－ジアセチルトリエチレンテトラミン（ＤＡＴ）、ヒドロキシキノリン、８－ヒドロキシキノリンのハロゲン化誘導体であるクリオキノール、および５，７－ジクロロ－２－［（ジメチルアミノ）メチル］キノリン－８－オール（ＰＢＴ２）。

【0310】

２．４ 光増感剤／タンパク質分解剤
限定されない例として、一般的なＰＲＯＴＡＣが挙げられるが、分解する特定の標的タンパク質と組み合わせたさまざまなＥ３リガーゼ結合分子が多数ある（国際公開第ＷＯ２０１７／２０１４４９Ａ１号参照）。（マネイロら、ＡＣＳＣｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２０２０，１５，６，１３０６－１３１２）。

【0311】

３． ペイロード分子Ｙの親水性テトラジンへの結合

【0312】

３．１ 切断可能な部分Ａ
適切な切断可能な部分Ａは、従来技術からよく知られている。
以下を参照できる。
バーグら、ＣｈｅｍＳｏｃＲｅｖ２０１９，４８（１６），４３６１－４３７４；Ｐｏｒｅｂａ，ＦＥＢＳＪ２０２０，２８７（１０），１９３６－１９６９およびサロモンら、ＭｏｌＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ２０１９１６，（１２），４８１７－４８２５；

【0313】

さらなる例として、β－グルクロン酸由来のトリガー残基を有するβ－グルクロニドリンカーが挙げられる。
その非限定的な例は以下のとおりである。

【化22】

【0314】

３．２ 自壊性基Ｘ
適切な自壊性基Ｘは、先行技術からよく知られている。
以下を参照できる。
サンティら、ＪＭｅｄＣｈｅｍ２０１４，５７（６），２３０３－２３１４；アロウアンら、ドイツ化学会誌２０１５，５４（２６），７４９２－７５０９、コラコウスキら、ドイツ化学会誌２０１６，１２８（２８），８０８０－８０８３

【0315】

４．（バイオ）複合体の形成
本発明のバイオ複合体はバイオコンジュゲーションによって提供され、適切に機能化された生体分子が式Ｉのテトラジン化合物と反応して、前記機能化された生体分子と前記テトラジンとの間に共有結合を形成する。前記生体分子は、式Ｉのテトラジン化合物の一部であるペイロード部分Ｙを特定の対象場所（「標的」）に標的化する「標的化剤」として作用する。このような「標的」の種類に応じて、それぞれ適切な「標的化剤」を選択できる。標的化されると、ペイロード部分を含むバイオ複合体は、標的または前記標的を含む生物学的構造にさらに作用する可能性がある。

【0316】

４．１ 標的化剤とその標的
このような標的化剤の主な目的は、特定の「標的」と共有結合または非共有結合を形成することである。標的化剤の二次目的は、「ペイロード分子」を標的に輸送することである。この二次目的を達成するには、ＰＯＩを少なくとも１つのペイロード分子と（可逆的または不可逆的に）結合する必要がある。この目的のために、ＰＯＩは少なくとも１つのｎｃＡＡを導入して機能化する必要がある。次に、少なくとも１つのｎｃＡＡを担持する機能化ＰＯＩは、ｎｃＡＡ残基を介したバイオコンジュゲーションによって少なくとも１つのペイロード分子に結合できる。このｎｃＡＡはペイロード分子と反応性があり、ペイロード分子はＰＯＩの少なくとも１つのｎｃＡＡ残基と反応する対応する部分を持っている。このようにして得られたバイオ複合体、つまり標的化剤は、ペイロード分子を意図した標的に輸送することを可能にする。

【0317】

例えば、「標的」は、生物、組織、または細胞内および／または表面に存在する任意の分子であり得る。このような標的は、特定の生物、組織、または細胞に対して非特異的または特異的であり得る。標的には、細胞表面標的（受容体、糖タンパク質、グリカン、炭水化物など）、構造タンパク質（アミロイドプラークなど）、豊富な細胞外標的（間質など）、細胞外マトリックス標的（成長因子、プロテアーゼなど）、細胞内標的（ゴルジ体の表面、ミトコンドリアの表面、ＲＮＡ、ＤＮＡ、酵素、細胞シグナル伝達経路の成分など）、および／または異物（ウイルス、細菌、真菌、酵母などの病原体またはその一部など）が含まれる。

【0318】

標的の例には、存在または発現レベルが特定の組織または細胞タイプと相関している、または発現レベルが特定の障害で上方制御または下方制御されているタンパク質などの化合物が含まれる。

【0319】

特に、そのような標的は、（内部移行型または非内部移行型の）受容体などのタンパク質である。

【0320】

標的は、人間や動物の体内、あるいは病原体や寄生虫上の適切な標的から選択できる。

【0321】

適切な標的の非限定的な例としては、細胞膜や細胞壁などの細胞成分、細胞膜受容体などの受容体、ゴルジ体やミトコンドリアなどの細胞内構造、酵素、受容体、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ウイルスまたはウイルス粒子、マクロファージ、腫瘍関連マクロファージ、抗体、タンパク質、炭水化物、単糖類、多糖類、サイトカイン、ホルモン、ステロイド、ソマトスタチン受容体、モノアミンオキシダーゼ、ムスカリン受容体、心筋交感神経系、ロイコトリエン受容体、白血球、ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子受容体（ｕＰＡＲ）、葉酸受容体、アポトーシスマーカー、（抗）血管新生マーカー、ガストリン受容体、ドーパミン作動系、セロトニン作動系、ＧＡＢＡ作動系、アドレナリン作動系、コリン作動系、オピオイド受容体、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ受容体およびその他の血栓関連受容体、フィブリン、カルシトニン受容体、タフトシン受容体、Ｐ糖タンパク質、ニューロテンシン受容体、神経ペプチド受容体、サブスタンスＰ受容体、ＮＫ受容体、ＣＣＫ受容体、シグマ受容体、インターロイキン受容体、単純ヘルペスウイルスチロシンキナーゼ、ヒトチロシンキナーゼ、インテグリン受容体、フィブロネクチン標的、ＡＯＣ３、ＡＬＫ、ＡＸＬ、Ｃ２４２、ＣＡ－１２５、ＣＣＬ１１、ＣＣＲ５、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ１５、ＣＡ１５－３、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＡ１９－９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ３１、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４１、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４５、ＣＤ５１、ＣＤ５２、ＣＤ５４、ＣＤ５６、ＣＤ６２Ｅ、ＣＤ６２Ｐ、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ７０、ＣＤ７２、ＣＤ７４、ＣＤ７９－Ｂ、ＣＤ８０、ＣＤ１０５、ＣＤ１２５、ＣＤ１３８、ＣＤ１４１、ＣＤ１４７、ＣＤ１５２、ＣＤ１５４、ＣＤ１７４、ＣＤ２２７、ＣＤ３２６、ＣＤ３４０、ＶＥＧＦ／ＥＧＦおよびＶＥＧＦ／ＥＧＦ受容体、ＶＥＧＦ－Ａ、ＶＥＧＦＲ２、ＶＥＧＦＲ１、ＴＡＧ７２、ＣＥＡ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＧＰＮＭＢ、ＰＳＭＡ、クリプト、テネイシンＣ、メラノコルチン－１受容体、Ｇ２５０、ＨＬＡ ＤＲ、ＥＤ－Ｂ、ＴＭＥＦＦ２、ＥｐｈＢ２、ＥｐｈＢ４、ＥｐｈＡ２、ＦＡＰ、メソテリン、ＧＤ２、ＧＤ３、ＣＡＩＸ、５Ｔ４、凝集因子、ＣＴＬＡ－４、ＣＸＣＲ２、ＦＧＦＲｌ、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＦＧＦＲ４、ＮａＰｉ２ｂ、ＮＯＴＣＨｌ、ＮＯＴＣＨ２、ＮＯＴＣＨ３、ＮＯＴＣＨ４、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、ＥｐＣＡＭ、ＦＬＴ３、ＨＧＦ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＭＩ２４、ＩＣＡＭ、ＩＣＯＳ－Ｌ、ＩＧＦ－１受容体、ＴＲＰＶ１、ＣＦＴＲ、ｇｄＮＭＢ、ＣＡ９、ｃ－ＫＩＴ、ｃ－ＭＥＴ、ＡＣＥ、ＡＰＰ、アドレナリン受容体ベータ２、クローディン３、ＲＯＮ、ＲＯＲｌ、ＰＤ－Ｌｌ、ＰＤ－Ｌ２、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、ＩＬ－２受容体、ＩＬ－４受容体、ＩＬ－１３受容体、インテグリン、ＩＦＮ－アルファ、ＩＦＮ－ガンマ、ＩｇＥ、ＩＧＦ－１受容体、ＩＬ－１、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－１２、ＩＬ－１３、ＩＬ－２２、ＩＬ－２３、インターフェロン受容体、ＩＴＧＢ２（ＣＤ１８）、ＬＦＡ－１（ＣＤ１１ａ）、Ｌ－セレクチン、Ｐ－セレクチン、Ｅ－セレクチン、ムチン、ミオスタチン、ＮＣＡ－９０、ＮＧＦ、ＰＤＧＦＲアルファ、前立腺癌細胞、緑膿菌、狂犬病、ＲＡＮＫＬ、呼吸器合胞体ウイルス、Ｒｈ因子、ＳＬＡＭＦ７、スフィンゴシン－１－リン酸、ＴＧＦ－１、ＴＧＦベータ２、ＴＧＦベータ、ＴＮＦアルファ、ＴＲＡＩＬ－Ｒ１、ＴＲＡＩＬ－Ｒ２、ＣＴＡＡ１６．８８、ビメンチン、ＭＭＰ２、ＭＭＰ９、ＭＭＰ１４などのマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）、ＬＤＬ受容体、エンドグリン、ポリシアル酸およびそれらに対応するレクチンなどを含む群が挙げられるが、これらに限定されない。フィブロネクチン標的の例としては、フィブロネクチンの選択的スプライシングを受けたエクストラドメインＡ（ＥＤ－Ａ）およびエクストラドメインＢ（ＥＤ－Ｂ）がある。間質における標的の非限定的な例は、ヴィ・ホフマイスター、ディー・スクラマ、ジェイ・シー・ベッカー、ＣａｎｃｅｒＩｍｍｕｎ．；Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２００８、５７、１に記載されており、その内容は参照により本明細書に組み込まれる。

【0322】

より具体的には、上記標的の（特異的な）標的化を可能にするために、標的化剤は、ｎｃＡＡ機能化ペプチド配列を含む化合物を含むことができる。このような化合物には、抗体、抗体誘導体、抗体フラグメント、抗体（フラグメント）融合体（例えば、二重特異性および三重特異性ｍＡｂフラグメントまたは誘導体）、タンパク質、ペプチド（例えば、オクトレオチドおよび誘導体）、ＶＩＰ、ＭＳＨ、ＬＨＲＨ、走化性ペプチド、ボンベシン、エラスチン、ペプチド模倣物、受容体アゴニストおよびアンタゴニスト、サイトカイン、ホルモン、ステロイド、毒素が含まれるが、これらに限定されない。

【0323】

特定の態様によれば、標的は受容体であり、標的に特異的に結合することができる標的化剤が使用される。適切な標的化剤には、受容体に結合するそのような受容体のリガンドまたはその一部（例えば、受容体結合タンパク質リガンドの場合の受容体結合ペプチド）が含まれるが、これらに限定されない。

【0324】

タンパク質の性質を有する標的化剤の他の例としては、インスリン、トランスフェリン、フィブリノーゲン－ガンマ断片、トロンボスポンジン、クローディン、アポリポタンパク質Ｅ、アフィボディ分子（例：ＡＢＹ－０２５）、アンキリン反復タンパク質、アンキリン様反復タンパク質、インターフェロン（例：アルファ、ベータ、ガンマインターフェロン）、インターロイキン、リンホカイン、コロニー刺激因子、およびタンパク質増殖因子（例：アルファ、ベータ腫瘍増殖因子）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、ｕＰＡＲ標的化タンパク質、アポリポタンパク質、ＬＤＬ、アネキシンＶ、エンドスタチン、およびアンジオスタチンが挙げられる。

【0325】

標的化剤に使用される抗体のようなペプチド分子の例には、ＬＨＲＨ受容体標的ペプチド、ＥＣ－１ペプチド、ＲＧＤペプチド、ＨＥＲ２標的ペプチド、ＰＳＭＡ標的ペプチド、ソマトスタチン標的化ペプチド、ボンベシンなどがある。標的薬の他の例には、アンチカリンなどのリポカリンがある。

【0326】

特定の実施形態では、Ａｆｆｉｂｏｄｉｅｓ^ＴＭおよびマルチマーと誘導体を使用する。

【0327】

特定の一実施形態では、抗体を使用して標的化剤を形成する。ＩｇＧ抗体由来の抗体または免疫グロブリンは本発明で使用するのに特に適しているが、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、およびＩｇＥなどのクラスまたはサブクラスの免疫グロブリンを選択してもよい。適切には、免疫グロブリンは、ＩｇＧサブクラス（ＩｇＧ１、２、３、および４）を含むがこれに限定されないクラスＩｇＧまたは抗原上の特定のエピトープに特異的に結合できるクラスＩｇＭである。抗体は、天然源または組み換え源から得られた完全な免疫グロブリンであり、完全な免疫グロブリンの免疫反応性部分であり得る。抗体は、例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ラクダ化単一ドメイン抗体、組み換え抗体、抗イディオタイプ抗体、多重特異性抗体、抗体フラグメント（Ｆｖ、ＶＨＨ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２など）、単鎖可変フラグメント抗体（ｓｃＦｖ）、タンデム／ビス－ｓｃＦｖ、Ｆｃ、ｐＦｃ’、ｓｃＦｖ－Ｆｃ、ジスルフィドＦｖ（ｄｓＦｖ）、ＢｉＴＥ抗体などの二重特異性抗体（ｂｃ－ｓｃＦｖ）、トライボディなどの三重特異性抗体誘導体、ラクダ科抗体、ミニボディ、ナノボディ、表面再形成抗体、ヒト化抗体、完全ヒト抗体、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ、Ｎａｎｏｂｏｄｙ^ＴＭとも呼ばれる）、キメラ抗体、少なくとも１つのヒト定常領域を含むキメラ抗体、デュアルアフィニティ再標的タンパク質（ＤＡＲＴ^ＴＭ）などのデュアルアフィニティ抗体、およびマルチマーと誘導体、例えば、ミニボディ、ダイアボディ、トリアボディ、トリボディ、テトラボディなどを含むがこれらに限定されない二価または多価の単鎖可変フラグメント（例えば、ジｓｃＦｖ、トリｓｃＦｖ）および多価抗体など、さまざまな形で存在し得る。［ＴｒｅｎｄｓｉｎＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ２０１５，３３，２，６５］、［ＴｒｅｎｄｓＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１２，３０，５７５－５８２］、［Ｃａｎｅ．Ｇｅｎ．Ｐｒｏｔ．２０１３１０，１－１８］、［ＢｉｏＤｒｕｇｓ２０１４，２８，３３１－３４３］を参照。これらの内容は参照により本明細書に組み込まれる。

【0328】

「抗体フラグメント」とは、標的に結合する免疫グロブリンの可変領域、すなわち抗原結合領域の少なくとも一部を指す。

【0329】

他の実施形態では、アフィマー、アンチカリン、アビマー、アルファボディ、アフィボディ、ＤＡＲＰｉｎ、およびそれらの多量体および誘導体など（ただしこれらに限定されない）の抗体模倣物を標的化剤として使用する。［ＴｒｅｎｄｓｉｎＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ２０１５、３３、２、６５］を参照のこと。その内容は参照により本明細書に組み込まれる。

【0330】

疑義を避けるために、本発明の文脈において、「抗体」という用語は、特に指定がない限り、この段落で概説されている抗体の変異体、断片、誘導体、融合体、類似体および模倣体のすべてを包含するものとする。

【0331】

好ましい実施形態では、標的化剤は、抗体および抗体誘導体、例えば抗体フラグメント、フラグメント融合体、タンパク質、ペプチド、ペプチド模倣物から誘導される薬剤から選択される。

【0332】

別の好ましい実施形態では、標的化剤は、抗体フラグメント、フラグメント融合体、タンパク質、およびＦｃドメインを含まない他の抗体誘導体に由来する剤から選択される。

【0333】

本発明のｎｃＡＡ修飾標的化剤を形成するためにさらに修飾される抗体分子の典型的な非限定的な例は、生物学的に、特に薬理学的に活性な抗体分子から選択される。非限定的な例は、以下の群から選択される：トラスツズマブ、ベバシズマブ、セツキシマブ、パニツムマブ、イピリムマブ、リツキシマブ、アレムツズマブ、オファツムマブ、ゲムツズマブ、ブレンツキシマブ、イブリツモマブ、トシツモマブ、ペルツズマブ、アデカツムマブ、ＩＧＮ１０１、ＩＮＡ０１、ラベツズマブ、ｈｕａ３３、ペムツモマブ、オレゴボマブ、ミンレツモマブ（ＣＣ４９）、ｃＧ２５０、Ｊ５９１、ＭＯｖ－１８、ファルレツズマブ（ＭＯＲＡｂ－００３）、３Ｆ８、ｃｈ１４，１８、ＫＷ－２８７１、ｈｕ３Ｓ１９３、ｌｇＮ３１ １、ＩＭ－２Ｃ６、ＣＤＰ－７９１、エタラシズマブ、ボロシキシマブ、ニモツズマブ、ＭＭ－１２１、ＡＭＧ１０２、ＭＥＴＭＡＢ、ＳＣＨ９００１０５、ＡＶＥ１６４２、ＩＭＣ－Ａ１２、ＭＫ－０６４６、Ｒ１５０７、ＣＰ７５１８７１、ＫＢ００４、ＩＩＩＡ４、マパツムマブ、ＨＧＳ－ＥＴＲ２、ＣＳ－１００８、デノスマブ、シブロツズマブ、Ｆ１９、８１Ｃ６、ピナツズマブ、リファスツズマブ、グレンバツムマブ、コルツキシマブ、ロルボツズマブ、インダツキシマブ、抗ＰＳＭＡ、ＭＬＮ－０２６４、ＡＢＴ－４１４、ミラツズマブ、ラムシルマブ、アバゴボマブ、アビツズマブ、アデカツムマブ、アフツズマブ、アルツモマブペンテテート、アマツキシマブ、アナツモマブ、アネツマブ、アポリズマブ、アルシツモマブ、アスクリンバキュマブ、アテゾリズマブ、バビツキシマブ、ベクツモマブ、ベリムマブ、ビバツズマブ、ブロンチクツズマブ、カンツズマブ、カプロマブ、カトゥマキソマブ、シタツズマブ、シクツムマブ、クリバツズマブ、コドリツズマブ、コナツムマブ、ダセツズマブ、ダロツズマブ、ダラツムマブ、デムシズマブ、デニンツズマブ、デパツキシズマブ、デルロツキシマブ、デツモマブ、ジヌツキシマブ、ドロジツマブ、デュリゴツマブ、デュルバルマブ、デュシギツマブ、エクロメキシマブ、エドレコロマブ、エルゲムツマブ、エマクツズマブ、エナバツズマブ、エミベツズマブ、エンフォルツマブ、エノブリツズマブ、エンシツキシマブ、エプラツズマブ、エルツマキソマブ、エタラシズマブ、ファレツズマブ、フィクラツズマブ、フィギツムマブ、フランボツマブ、フツキシマブ、ガリキシマブ、ガニツマブ、イクルクマブ、イゴボマブ、イマルマブ、イムガツズマブ、インドゥサツマブ、イネビリズマブ、インテツムマブ、イラツムマブ、イザツキシマブ、レクサツズマブ、リロトマブ、リンツズマブ、リリルマブ、ルカツムマブ、ルムレツズマブ、マルゲツキシマブ、マツズマブ、ミルベツキシマブ、ミツモマブ、モガムリズマブ、モクセツモマブ、ナコロマブ、ナプツモマブ、ナルナツマブ、ネシツムマブ、ネスバキュマブ、ニモツズマブ、ニボルマブ、ノフェツモマブ、オビヌツズマブ、オカラツズマブ、オファツムマブ、オララツマブ、オナルツズマブ、オンツシズマブ、オポルツズマブ、オレゴボマブ、オトレルツズマブ、パンコマブ、パルサツズマブ、パソツキズマブ、パトリツマブ、ペンブロリズマブ、ペムツモマブ、ピディリズマブ、ピンツモマブ、ポラツズマブ、プリツムマブ、キリズマブ、ラコツモマブ、ラムシルマブ、リロツムマブ、ロバツムマブ、サシツズマブ、サマリズマブ、サツモマブ、セリバンツマブ、シルツキシマブ、ソフツズマブ、タカツズマブ、タプリツモマブ、タレクツマブ、テナツモマブ、テプロツムマブ、テツロマブ、チシリムマブ、チガツズマブ、トシツモマブ、トベツマブ、トレメリムマブ、ツコツズマブ、ウブリツキシマブ、ウロクプルマブ、ウレルマブ、ウトミルマブ、バダスツキシマブ、バンドルツズマブ、バンチクツマブ、バヌシズマブ、バルリルマブ、ベルツズマブ、ベセンクマブ、ボロシキシマブ、ボルセツズマブ、ボツムマブ、ザルツムマブ、ザツキシマ、それらの組み合わせおよび誘導体、ならびにＣＡＩ２５、ＣＡＩ５－３、ＣＡＩ９－９、Ｌ６、ルイスＹ、ルイスＸ、アルファフェトプロテイン、ＣＡ２４２、胎盤アルカリホスファターゼ、前立腺特異抗原、前立腺特異膜抗原、前立腺酸性ホスファターゼ、上皮成長因子、ＭＡＧＥ－１、ＭＡＧＥ－２、ＭＡＧＥ－３、ＭＡＧＥ－４、トランスフェリン受容体、ｐ９７、ＭＵＣＩ、ＣＥＡ、ｇｐｌＯＯ、ＭＡＲＴＩ、ＩＬ－２受容体、ＣＤ２０、ＣＤ５２、ＣＤ３３、ＣＤ２２、ヒト絨毛性ゴナドトロピン、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ムチン、Ｐ２１、ＭＰＧ、およびＮｅｕがん遺伝子産物を標的とするその他のモノクローナル抗体。

【0334】

本発明のさらなる特定の実施形態によれば、標的および標的化剤は、癌、炎症、感染症、心血管疾患（例えば血栓、動脈硬化性病変）、低酸素部位（例えば脳卒中）、腫瘍、心血管障害、脳障害、アポトーシス、血管新生、臓器、およびレポーター遺伝子／酵素などの組織または疾患の特定の標的化または標的化の強化をもたらすように選択される。これは、組織、細胞、または疾患特異的発現を有する標的を選択することによって達成することができる。

【0335】

一例として、標的化剤は、特定の細胞集団の細胞表面受容体や抗原などの細胞表面分子と特異的に結合または複合化する。標的化剤が受容体と特異的に結合または複合化すると、薬剤が細胞内に侵入する。

【0336】

本明細書で使用されているように、細胞表面分子、細胞外マトリックス標的、または他の標的を「特異的に結合するか、または複合化する」、または「標的とする」標的化剤は、分子間力を介して標的と優先的に結合する。たとえば、リガンドは、解離定数（ＫｄまたはＫＤ）が約５０ｎＭ未満、約５ｎＭ未満、または約５００ｐＭ未満の標的と優先的に結合できる。

【0337】

４．３ ジエノフィル
標的化剤、特に生体分子は、通常、一般式Ｉのテトラジン化合物の共有結合を可能にするために機能化される必要がある。

【0338】

機能化の方法は当該技術分野でよく知られている。

【0339】

テトラジン部分と反応するのに適した様々なクラスのジエノフィルは、当該技術分野でよく知られている。一般に、単環式または多環式、特に単環式および二環式の不飽和ジエノフィルが適用可能である。

【0340】

このようなジエノフィルは、例えばシクロオクチニルジエノフィル、トランスシクロオクテニルジエノフィル、ノルボルネニルジエノフィル、シクロプロペニルジエノフィル、シクロブテニルジエノフィル、スピロヘキセニルジエノフィル、ＢＣＮジエノフィル、またはアゼチンジエノフィルなどのように、ディールス・アルダー型環化付加反応を介して反応することができる。

【0341】

これらは、例えば、次の先行技術に記載されている（その開示は参照により本明細書に組み込まれる）。
オリヴェイラ，ビー・エルら、ＣｈｅｍＳｏｃＲｅｖ２０１７，４６，４８９５；
コズマ，イー、ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ２０１７，１８，４８６；
シーグル，エス・ジェイら、ＣｈｅｍＥｕｒＪ２０１８，２４，２４２６；
ラミル，シー・ピーら、ＪＡｍＣｈｅｍＳｏｃ２０１７，１３９，１３３７６
リウ，ケーら、ＣｈｅｍＣｏｍｍ，２０１７，５３，１０６０４
ヨーロピアン モレキュラー バイオロジー ラボラトリー名義の国際公開第ＷＯ２０１５／１０７０６４Ａ１号
国際公開第ＷＯ２０１２／１０４４２２Ａ１号
米国特許出願公開第ＵＳ２０１３１３７７６３Ａ１号。

【0342】

４．４ 生体直交型バイオコンジュゲーション
標的化剤、特にポリペプチド部分を含み、１つ以上のＵＮＡＡ残基を含む標的化剤は、本発明に従って、適切な翻訳システム、特に生体内翻訳システムを使用して調製することができる。生体内翻訳システムは、細胞、例えば原核細胞または真核細胞であり得る。細胞は、細菌細胞、例えば大腸菌、真菌細胞、例えば酵母細胞、例えばサッカロマイセス・セレビシエまたはメチロトローフ酵母、植物細胞、または動物細胞、例えば昆虫細胞または哺乳類細胞、例えばＨＥＫ細胞またはＨｅＬａ細胞であり得る。ポリペプチド発現に使用される真核細胞は、単一細胞または多細胞生物の一部であり得る。

【0343】

適用される細胞系は、調製される標的化剤のＵＮＡＡ残基に対応する少なくとも１つの非天然アミノ酸またはその塩を含む（たとえば、供給される）。細胞系はさらに、
（ｉ）本発明のＰｙｌＲＳおよびｔＲＮＡ^Ｐｙｌを含み、ここでＰｙｌＲＳはｔＲＮＡ^ＰｙｌをＵＮＡＡまたはその塩で（好ましくは選択的に）アシル化することができる。
（ｉｉ）標的化剤をコードするポリヌクレオチドを含み、ここでＵＮＡＡ残基によって占められる標的化剤の任意の位置は、ｔＲＮＡ^Ｐｙｌのアンチコドンの逆相補であるコドン（たとえばセレクターコドン）によってコードされる。

【0344】

細胞系は、標的化剤をコードするポリヌクレオチド（ｉｉ）の翻訳を可能にするように培養され、それによって標的化剤が生成される。

【0345】

本発明の方法によれば、標的化剤を製造するために、工程（ｂ）における翻訳は、細胞系を適切な条件下で、好ましくはＵＮＡＡまたはその塩の存在下（例えば、ＵＮＡＡまたはその塩を含む培養培地中）で、細胞のリボソームでの翻訳を可能にするのに適切な時間培養することによって達成することができる。
標的化剤をコードするポリヌクレオチド（および任意でＰｙｌＲＳ、ｔＲＮＡ^Ｐｙｌ）に応じて、例えばアラビノース、イソプロピルβ－Ｄ－チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）またはテトラサイクリンなどの転写を誘導する化合物を添加して発現を誘導することが必要となる場合がある。標的化剤をコードするｍＲＮＡ（およびｔＲＮＡ^Ｐｙｌに含まれるアンチコドンの逆相補コドンである１つ以上のコドンを含む）は、リボソームに結合される。次に、それぞれのアミノアシルｔＲＮＡによって認識（結合）されるコドンによってコード化された位置で、アミノ酸とＵＮＡＡを段階的に付加することでポリペプチドが形成される。このように、ＵＮＡＡは、ｔＲＮＡ^Ｐｙｌに含まれるアンチコドンの逆相補であるコドンによってコード化された位置で、標的化剤に組み込まれる。

【0346】

細胞系は、本発明のＰｙｌＲＳをコードするポリヌクレオチド配列を含み、これにより、細胞によるＰｙｌＲＳの発現が可能になる。同様に、ｔＲＮＡ^Ｐｙｌは、細胞に含まれるｔＲＮＡ^Ｐｙｌをコードするポリヌクレオチド配列に基づいて、細胞系によって生成される。ＰｙｌＲＳをコードするポリヌクレオチド配列とｔＲＮＡ^Ｐｙｌをコードするポリヌクレオチド配列は、同じポリヌクレオチド上に存在しても、別のポリヌクレオチド上に存在してもよい。

【0347】

したがって、一実施形態では、本発明は、１つ以上のＵＮＡＡ残基を含む標的化剤を製造する方法を提供し、この方法は、以下の工程を含む。
（ａ）以下をコードするポリヌクレオチド配列を含む細胞系を提供する。
－ 本発明の少なくとも１つのＰｙｌＲＳ、
－ ＰｙｌＲＳによってアシル化され得る少なくとも１つのｔＲＮＡ（ｔＲＮＡ^Ｐｙｌ）、および
－ 少なくとも１つの標的化剤（標的化剤のＵＮＡＡ残基によって占められる任意の位置は、ｔＲＮＡ^Ｐｙｌのアンチコドンの逆相補であるコドンによってコードされる）、および
（ｂ）ＵＮＡＡまたはその塩の存在下で細胞系によるポリヌクレオチド配列の翻訳を可能にし、それによってＰｙｌＲＳ、ｔＲＮＡ^ＰｙｌおよびＰＯＩを生成する。

【0348】

本明細書に記載の１つ以上の非天然アミノ酸残基を含む標的化剤を調製するために使用される細胞系は、ＰｙｌＲＳ、ｔＲＮＡ^Ｐｙｌ、および標的化剤をコードするポリヌクレオチド配列を（宿主）細胞に導入することによって調製することができる。前記ポリヌクレオチド配列は、同じポリヌクレオチド上または別のポリヌクレオチド上に位置し、当該技術分野で既知の方法（例えば、ウイルス媒介遺伝子送達、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポフェクションなど）によって細胞に導入することができる。

【0349】

翻訳後、本発明に従って調製された標的化剤は、任意で、当該技術分野で一般に知られている手順に従って、部分的にまたは実質的に均質になるまで回収および精製することができる。標的化剤が培養培地に分泌されない限り、回収には通常、細胞破壊が必要である。細胞破壊の方法は当該技術分野でよく知られており、物理的破壊、例えば（超音波）超音波処理、液体せん断破壊（例えば、フレンチプレスによる）、機械的方法（例えば、ブレンダーまたはグラインダーを使用する方法）、または凍結融解サイクル、ならびに脂質－脂質、タンパク質－タンパク質および／またはタンパク質－脂質相互作用を破壊する薬剤（洗剤など）を使用した化学的溶解、および物理的破壊技術と化学的溶解の組み合わせが含まれる。細胞溶解物または培養培地からポリペプチドを精製するための標準的な手順も当技術分野でよく知られており、例えば、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、酸または塩基抽出、カラムクロマトグラフィー、アフィニティーカラムクロマトグラフィー、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、レクチンクロマトグラフィー、ゲル電気泳動などが含まれる。タンパク質の再折り畳み工程は、必要に応じて、正しく折り畳まれた成熟タンパク質を作成する際に使用することができる。高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、アフィニティークロマトグラフィー、または他の適切な方法は、高純度が求められる最終精製工程で使用することができる。本発明のポリペプチドに対して作製された抗体は、精製試薬として、すなわちポリペプチドのアフィニティーベースの精製に使用することができる。様々な精製／タンパク質折り畳み方法が当技術分野でよく知られており、例えば、スコープス、タンパク質精製、シュプリンガー、ベルリン（１９９３）およびドイチャー、酵素学における方法、１８２巻：タンパク質精製ガイド、アカデミックプレス（１９９０）およびそこに引用されている参考文献を含む。

【0350】

前述のように、当業者は、合成、発現および／または精製後、ポリペプチドが、関連するポリペプチドの望ましい立体構造とは異なる立体構造を有する場合があることを認識するであろう。例えば、原核生物系によって生成されるポリペプチドは、適切な折り畳みを達成するためにカオトロピック剤にさらすことによって最適化されることが多い。例えば、大腸菌由来の溶解物からの精製中に、発現されたポリペプチドは、必要に応じて変性され、その後再生される。これは、例えば、タンパク質をグアニジンＨＣｌなどのカオトロピック剤で可溶化することによって達成される。一般に、発現されたポリペプチドを変性および還元し、その後、ポリペプチドを好ましい立体構造に再折り畳みさせることが望ましい場合がある。例えば、グアニジン、尿素、ＤＴＴ、ＤＴＥ、および／またはシャペロニンを、目的の翻訳産物に加えることができる。タンパク質を還元、変性、再生する方法は、当業者によく知られている。ポリペプチドは、例えば酸化グルタチオンおよびＬ－アルギニンを含む酸化還元緩衝液中で再折り畳みすることができる。

【0351】

このようにして調製された標的化剤は、次いで、上記一般式Ｉのテトラジン化合物との反応によって、それぞれのバイオ複合体に変換され得る。

【0352】

５．医薬組成物
本発明の複合体またはバイオ複合体、例えばＡＰＣ、特に本発明のＡＤＣ（すなわち活性剤または成分）は、一般に、治療上および／または予防上有効な量または診断上有効な量の少なくとも１つのそのような活性成分またはその薬学的に許容される塩、および任意に少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤から構成される「医薬組成物」として提供される。

【0353】

前記医薬組成物は、経口、直腸、経粘膜、局所、眼科、耳科、または腸内投与などの適切な投与経路、筋肉内、皮下、髄内注射、ならびに髄腔内、直接脳室内、静脈内、腹腔内、鼻腔内、または眼内注射を含む非経口送達によって送達され得る。

【0354】

投与の性質または方法および剤形に応じて、前記組成物、前記少なくとも１つの追加の医薬賦形剤は異なっていてもよい。

【0355】

「賦形剤」とは、有効成分と一緒に配合される物質であり、長期安定化、少量の強力な有効成分を含む固形製剤の増量（そのため、「増量剤」、「充填剤」、または「希釈剤」と呼ばれることが多い）、または最終剤形の有効成分に治療効果を付与する（例えば、薬物の吸収を促進する、粘度を下げる、溶解性を高めるなど）など、さまざまな目的で配合される。賦形剤は、予想される保存期間にわたって変性や凝集を防ぐなどのインビトロ安定性を助けるだけでなく、粉末の流動性や非粘着性を促進するなど、有効成分の問題の取り扱いを助けるため、医薬組成物の製造プロセスにも役立つ。適切な賦形剤の選択は、投与経路や剤形だけでなく、特定の有効成分やその他の要因にも依存する。

【0356】

賦形剤は、免疫アジュバント、抗付着剤、結合剤、コーティング剤、着色剤、崩壊剤、香料、流動促進剤、潤滑剤、保存料、吸着剤、甘味料、および賦形剤の中から選択できる。

【0357】

賦形剤の非限定的な例としては、希釈剤、保存料、安定剤、乳化剤（ポリソルベートやポロキサマーなどの乳化ポリマーなど）、抗酸化剤、抗刺激剤、キレート剤、安定化塩（塩化物、硫酸塩、リン酸塩、二リン酸塩、臭化水素酸塩、硝酸塩など）、懸濁剤、抗菌剤、抗真菌剤などがある。さらに、緩衝剤（低分子量有機酸とそれぞれの塩の緩衝システムなど）、または無機緩衝物質（リン酸緩衝液など）も使用できる。さらに適切な成分は、関連する薬理学標準文献からも知られている。また、各種成分の割合は、使用される特定の成分の性質に応じて変化し、当業者には一般に知られている（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ´ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓｃｉｅｎｃｅ（「ＨａｎｄｂｏｏｋｏｆＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＥｘｃｉｐｉｅｎｔｓ」、第２版、（１９９４年）、ＡＷａｄｅおよびＰＪＷｅｌｌｅｒ編集、またはＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ、ＭａｃｋＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＣｏ．（Ａ．ＲＧｅｎｎａｒｏ編集、１９８５年））。

【0358】

本明細書で使用される医薬組成物は、「投与形態」または「単位用量」の形態で提供され、本明細書で説明されるような１つ以上のＡＰＣ、特にＡＤＣを含むことができる。したがって、本明細書で使用される医薬組成物は、例えば、単位用量で混合された２つの活性剤を提供したり、活性剤が物理的に分離されている投与形態で組み合わされた２つの活性剤を提供したりすることができる。

【0359】

さらに、例えば内皮細胞特異的抗体でコーティングされたリポソームなどの標的薬物送達システムで医薬組成物を投与することもできる。

【0360】

本発明の医薬組成物は、それ自体既知の方法、例えば、従来の混合、溶解、乳化、カプセル化、封入、またはそれらの組み合わせによって製造することができる。適切な処方は、選択された投与経路に依存する。

【0361】

ここで使用される「薬学的に許容される」という語句は、健全な医学的判断の範囲内で、過度の毒性、刺激、アレルギー反応、または合理的なリスク／ベネフィット比に見合ったその他の問題や合併症を伴わずに患者の組織と接触して使用するのに適した化合物、材料、組成物、および／または投与形態を指すために使用されている。

【0362】

本発明には、活性成分の「薬学的に許容される塩形態」がすべて含まれる。薬学的に許容される塩とは、対イオンが化合物の生理学的活性または毒性に大きく寄与せず、薬理学的同等物として機能する塩である。これらの塩は、市販の試薬を使用して一般的な有機技術に従って製造することができる。アニオン塩形態には、酢酸塩、酢酸塩、ベシル酸塩、臭化物、塩化物、クエン酸塩、フマル酸塩、グルクロン酸塩、臭化水素酸塩、塩酸塩、ヨウ化水素酸塩、ヨウ化物、乳酸塩、マレイン酸塩、メシル酸塩、硝酸塩、パモ酸塩、リン酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、酒石酸塩、トシル酸塩、キシノホ酸塩などがある。陽イオン塩の形態としては、アンモニウム、アルミニウム、ベンザチン、ビスマス、カルシウム、コリン、ジエチルアミン、ジエタノールアミン、リチウム、マグネシウム、メグルミン、４－フェニルシクロヘキシルアミン、ピペラジン、カリウム、ナトリウム、トロメタミン、亜鉛などがある。

【0363】

「治療有効量」および／または「予防有効量」とは、ヒトまたは非ヒト患者に投与された場合に、治療および／または予防効果をもたらすのに有効な量を意味する。より具体的には、「治療有効量」とは、本明細書に開示された有効成分または２つ以上の有効成分の組み合わせの量であり、病状の進行を完全にまたは部分的に抑制するか、病状の１つ以上の症状を少なくとも部分的に緩和する。

【0364】

「診断有効量」とは、患者から病状の状態または進行に関する診断上価値のある情報を得るのに有効な量を意味する。

【0365】

治療上の利点は、病気の患者の症状の緩和、例えば、病気の患者の症状を軽減するのに有効な量である。特定の状況では、患者は治療中の疾患の症状を示さないことがある。したがって、化合物の予防的に有効な量は、疾患、障害、または状態の兆候に有意なプラス効果をもたらすのに十分な量でもあり、例えば、疾患の症状の発生頻度と重症度を大幅に軽減するのに十分な量である。

【0366】

治療上有効な量は、予防上有効な量でもある。

【0367】

本明細書において「患者」とは、ヒトまたは非ヒト、特にヒトの動物を指す。

【0368】

「投与形態」とは、本明細書に記載の１つ以上の有効成分の投与単位（「単位投与量」）のことである。

【0369】

「治療」または「処置」という用語は、次のことを指す。
（ｉ）疾患、障害、または症状にかかりやすい可能性があるが、まだ診断されていない患者において、疾患、障害、または症状の発生を防ぐこと。
（ｉｉ）疾患、障害、または症状を阻害すること、すなわち、その進行を止めること。
（ｉｉｉ）疾患、障害、または症状を軽減すること、すなわち、疾患、障害、および症状の退行を引き起こすこと。特に、予防的または治療的処置、またはそれらの組み合わせが含まれる。

【0370】

投与の「頻度」は、使用する化合物と治療する感染症の種類によって異なる。１日１回の投与も可能である。有効成分を１日に数回、たとえば２回から１０回、２、３、４、５、６、７、８、９、１０回投与する投与方法の方が、場合によってはより効果的である。

【0371】

ただし、特定の患者に対する特定の投与量レベルおよび頻度は、使用される特定の化合物の活性、年齢、体重、一般的な健康状態、性別、食事、投与時間、投与経路、排泄速度、薬剤の組み合わせ、および治療を受けている患者の特定の疾患の重症度を含むさまざまな要因に依存することが理解される。患者は、通常、治療または予防される状態に適したアッセイを使用して、治療または予防の有効性について監視される可能性があり、これは当業者にはよく知られている。

【0372】

本発明による医薬組成物の特定の例は、溶液、懸濁液、乳剤などの液体形態の製剤であり、治療有効量の少なくとも１つのＡＰＣ、特に上記で定義されるＡＤＣ成分を、任意に上記で定義される少なくとも１つのさらなる医薬的に許容される賦形剤とともに含み、任意の適切な経路で投与することができる。

【0373】

本発明による医薬組成物のさらなる例としては、粉末、錠剤、丸剤、カプセル、カシェ剤、坐剤、および分散性顆粒などの固形製剤が挙げられる。

【0374】

本明細書に開示された内容を熟考すれば当業者には直ちに明らかとなる多数の可能な変形も本発明の範囲内に含まれる。

【0375】

以下の例は説明のみを目的としており、本明細書に記載された実施形態の範囲を制限することを意図するものではない。

【実施例】

【0376】

Ａ）材料と方法
試薬は市販の供給元から購入し、精製せずに使用した。無水溶媒を含むすべての溶媒は、市販の供給元から入手した状態で使用した。空気と水に敏感な試薬と反応は、通常、アルゴン雰囲気下で取り扱われた。

【0377】

反応の進行は、Ｍｅｒｃｋシリカゲルプレート６０Ｆ２５４上のＴＬＣまたはＵＨＰＬＣ－ＭＳによって監視された。ＴＬＣ検出は、２５４ｎｍのＵＶ光または過マンガン酸カリウム染色によって実行された。

【0378】

フラッシュクロマトグラフィー精製は、シリカゲル（０．０６０－０．２００ｍｍ）、ＫＰ－Ｓｉｌカートリッジを使用して、ＢｉｏｔａｇｅＩｓｏｌｅｒａＯｎｅ精製システムで実行された。

【0379】

分取ＨＰＬＣ精製は、Ａｇｉｌｅｎｔ１２６０分取ポンプ、１２６０分取オートサンプラー、１２６０フラクションコレクター、および１２６０多波長検出器ＶＬで構成されるＡｇｉｌｅｎｔＩｎｆｉｎｉｔｙ１２６０シリーズ装置で実施した。使用した分取カラムは、ＷａｔｅｒｓＸ－ＢｒｉｄｇｅＰｒｅｐＣ１８カラム：５μｍ、１９ｘ１５０ｍｍで、溶媒として０．１％ＴＦＡを含むＨ_２Ｏとアセトニトリルの直線勾配で操作した。

【0380】

核磁気共鳴スペクトルは、室温でＢｒｕｋｅｒＡｖａｎｃｅ（４００ＭＨｚ）ＮＭＲシステムで記録された。化学シフト（δ）は百万分率（ｐｐｍ）で示され、結合定数（Ｊ）はヘルツ（Ｈｚ）で示され、多重度は標準的な略語を使用して報告される。

【0381】

ＵＨＰＬＣ－ＭＳ分析は、Ａｇｉｌｅｎｔ１２９０クォータナリポンプ、１２９０サンプラー、１２９０サーモスタットカラムコンパートメント、および四重極ＬＣ／ＭＳ６１２０とＩｎｆｉｎｉｔｙ１２６０ＥＬＳＤを備えた１２９０ダイオードアレイ検出器ＶＬ＋で構成されるＡｇｉｌｅｎｔＩｎｆｉｎｉｔｙ１２９０シリーズ装置で実施された。使用した分析カラムは、ＡｃｑｕｉｔｙＵＰＬＣＢＥＨＣ１８カラム：１．７μｍ、２．１ｘ５０ｍｍで、溶媒として０．１％ＴＦＡを含むＨ_２Ｏとアセトニトリルの直線勾配で操作された。

【0382】

Ｂ）化合物の合成
実施例１
ジエチル（（６－（４－（アミノメチル）フェニル）－１，２，４，５－テトラジン－３－イル）メチル）ホスホネート（１）の合成

【化23】

【0383】

４－アミノメチルベンゾニトリル（１６９ｍｇ、１．００ｍｍｏｌ、１．００ｅｑ）およびジエチルシアノメチルホスホネート（６５１μＬ、７０９ｍｇ、４．００ｍｍｏｌ、４．００ｅｑ）のＥｔＯＨ（０．５ｍＬ）溶液に、３－メルカプトプロピオン酸（８７．０μＬ、１０６ｍｇ、１．００ｍｍｏｌ、１．００ｅｑ）を、続いてヒドラジン一水和物（７７６μＬ、８０１ｍｇ、１６．０ｍｍｏｌ、１６．０ｅｑ）を０℃で加えた。混合物を室温で一晩撹拌した。その後、Ｈ_２Ｏ中のＮａＮＯ_２（１．３８ｇ、２０．０ｍｍｏｌ、２０．０ｅｑ）を加え、１ＭＨＣｌａｑを滴下してｐＨ約３に酸性化した。

【0384】

ＨＰＬＣによる精製により、１がピンク色のオイル（３００ｍｇ）として得られ、これを次の工程に直接使用した。

【0385】

実施例２
（（６－（４－（アミノメチル）フェニル）－１，２，４，５－テトラジン－３－イル）メチル）ホスホン酸（２）の合成

【化24】

【0386】

１（３００ｍｇ）のＤＭＦ溶液に、０℃でトリメチルシリルブロミド（５３０μＬ、６１４ｍｇ、４．０１ｍｍｏｌ、５．００当量）を加えた。混合物を室温で一晩撹拌した。その後、ＭｅＯＨとＨ_２Ｏで希釈し、溶媒を蒸発させた。

【0387】

ＨＰＬＣによる精製により、２がピンク色の粉末（２段階で３０．０ｍｇ、８％）として得られた。

【0388】

実施例３
４－（６－（（ジエトキシホスホリル）メチル）－１，２，４，５－テトラジン－３－イル）安息香酸（３）の合成

【化25】

【0389】

４－シアノ安息香酸（５８８ｍｇ、４．００ｍｍｏｌ、１．００ｅｑ）とジエチルシアノメチルホスホネート（２．６０ｍＬ、２．８４ｇ、１６．０ｍｍｏｌ、４．００ｅｑ）のＥｔＯＨ（２ｍＬ）溶液に、３－メルカプトプロピオン酸（３４８μＬ、４２４ｍｇ、４．００ｍｍｏｌ、１．００ｅｑ）を加え、続いてヒドラジン一水和物（３．１０ｍＬ、３．２０ｇ、６４．０ｍｍｏｌ、１６．０ｅｑ）を０℃で加えた。混合物を室温で一晩撹拌した。その後、Ｈ_２Ｏ中のＮａＮＯ_２（５．５２ｇ、８０．０ｍｍｏｌ、２０．０ｅｑ）を加え、１ＭＨＣｌａｑを滴下してｐＨ約３に酸性化した。ピンク色の沈殿物を濾過し、０．１ＭＨＣｌａｑで洗浄した。

【0390】

フラッシュクロマトグラフィー（ジクロロメタン／ＭｅＯＨ ２０：１）による精製により、３がピンク色の粉末（３０４ｍｇ、２２％）として得られた。

【0391】

実施例４
２－（６－（ジメチルアミノ）－３－（ジメチルイミニオ）－３Ｈ－キサンテン－９－イル）－５－（（４－（６－（ホスホノメチル）－１，２，４，５－テトラジン－３－イル）ベンジル）カルバモイル）ベンゾエート（４）の合成

【化26】

【0392】

２（５．００ｍｇ、１７．８μｍｏｌ、１．００ｅｑ）のＤＭＦ（０．２ｍＬ）溶液に、ＤＩＰＥＡ（１２．４μＬ、９．２０ｍｇ、７１．２μｍｏｌ、４．００ｅｑ）および５－ＴＡＭＲＡ－ＯＳｕ（１０．３ｍｇ、１９．６μｍｏｌ、１．１０ｅｑ）を加え、混合物を室温で一晩撹拌した。粗反応混合物を直接ＨＰＬＣで精製した。

【0393】

ＨＰＬＣによる精製により、４が赤褐色粉末（４．０ｍｇ、３２％）として得られた。

【0394】

実施例５
（（６－（４－（（（Ｓ）－１－（（（Ｓ）－１－（（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）－１－（（Ｓ）－２－（（１Ｒ，２Ｒ）－３－（（（１Ｓ，２Ｒ）－１－ヒドロキシ－１－フェニルプロパン－２－イル）アミノ）－１－メトキシ－２－メチル－３－オキソプロピル）ピロリジン－１－イル）－３－メトキシ－５－メチル－１－オキソヘプタン－４－イル）（メチル）アミノ）－３－メチル－１－オキソブタン－２－イル）アミノ）－３－メチル－１－オキソブタン－２－イル）（メチル）カルバモイル）フェニル）－１，２，４，５－テトラジン－３－イル）メチル）ホスホン酸（５）の合成

【化27】

【0395】

３（５．５７ｍｇ、１５．８μｍｏｌ、１．００ｅｑ）の溶液にＤＩＰＥＡ（６．８８μＬ、５．１１ｍｇ、３９．５μｍｏｌ、２．５０ｅｑ）とＨＡＴＵ（９．０１ｍｇ、２３．７μｍｏｌ、１．５０ｅｑ）を加え、混合物を室温で３０分間撹拌した。その後、ＭＭＡＥ（１２．５ｍｇ、１７．４μｍｏｌ、１．１０ｅｑ）を加え、混合物を室温で一晩撹拌した。ジクロロメタンで希釈し、Ｈ_２Ｏで洗浄し、有機相を乾燥させ、溶媒を減圧下で蒸発させた。

【0396】

粗生成物をＤＭＦ（０．５ｍＬ）に溶解し、０℃でトリメチルシリルブロミド（１０．４μＬ、１２．１ｍｇ、７９．０μｍｏｌ、５．００当量）を加えた。混合物を室温で一晩撹拌し、ＨＰＬＣで直接精製した。

【0397】

ＨＰＬＣによる精製により、５がピンク色の粉末（２段階で５．０ｍｇ、３２％）として得られた。

【0398】

実施例６
２，５－ジオキソピロリジン－１－イル４－（６－（（ジエトキシホスホリル）メチル）－１，２，４，５－テトラジン－３－イル）ベンゾエート（６）の合成

【化28】

【0399】

３（１００ｍｇ、２８４μｍｏｌ、１．００ｅｑ）のジクロロメタン（２．８ｍＬ）溶液に、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（４９．０ｍｇ、４２６μｍｏｌ、１．５０ｅｑ）およびＥＤＣ塩酸塩（８１．６ｍｇ、４２６μｍｏｌ、１．５０ｅｑ）を加え、混合物を室温で１時間撹拌した。

【0400】

フラッシュクロマトグラフィー（ジクロロメタン／ＭｅＯＨ ２０：１）による精製により、６がピンク色の固体（１１８ｍｇ、９３％）として得られた。

【0401】

実施例７
（４－（６－（（ジエトキシホスホリル）メチル）－１，２，４，５－テトラジン－３－イル）ベンゾイル）－Ｌ－バリル－Ｌ－アラニン（７）の合成

【化29】

【0402】

６（１１８ｍｇ、２６３μｍｏｌ、１．００ｅｑ）のＤＭＦ（２．６ｍＬ）溶液に、Ｈ－Ｖａｌ－Ａｌａ－ＯＨ（７４．１ｍｇ、３９４μｍｏｌ、１．５０ｅｑ）とＮＥｔ３（７２．８μＬ、５２５μｍｏｌ、２．００ｅｑ）を加え、混合物を室温で撹拌した。ジクロロメタンで希釈し、Ｈ_２Ｏと１ＭＨＣｌａｑで洗浄した。有機相を乾燥させ、溶媒を減圧下で蒸発させた。

【0403】

フラッシュクロマトグラフィー（ジクロロメタン／ＭｅＯＨ ２０：１→１０：１）による精製により、７がピンク色の固体（１３５ｍｇ、９８％）として得られた。

【0404】

実施例８
ジエチル（（６－（４－（（（Ｓ）－１－（（（Ｓ）－１－（（４－（ヒドロキシメチル）フェニル）アミノ）－１－オキソプロパン－２－イル）アミノ）－３－メチル－１－オキソブタン－２－イル）カルバモイル）フェニル）－１，２，４，５－テトラジン－３－イル）メチル）ホスホネート（８）の合成

【化30】

【0405】

７（１１６ｍｇ、２２２μｍｏｌ、１．００ｅｑ）のＤＭＦ（２．２ｍＬ）溶液に、ｐ－アミノベンジルアルコール（４１．０ｍｇ、３３３μｍｏｌ、１．５０ｅｑ）、ＨＡＴＵ（１２７ｍｇ、３３３μｍｏｌ、１．５０ｅｑ）、およびＤＩＰＥＡ（９６．７μＬ、５５５μｍｏｌ、２．５０ｅｑ）を加え、混合物を室温で撹拌した。ジクロロメタンで希釈し、Ｈ_２Ｏおよび１ＭＨＣｌａｑで洗浄した。有機相を乾燥させ、溶媒を減圧下で蒸発させた。

【0406】

フラッシュクロマトグラフィー（ジクロロメタン／ＭｅＯＨ ２０：１→１０：１）による精製により、８がピンク色の固体（１３１ｍｇ、９４％）として得られた。

【0407】

実施例９
４－（（Ｓ）－２－（（Ｓ）－２－（４－（６－（（ジエトキシホスホリル）メチル）－１，２，４，５－テトラジン－３－イル）ベンズアミド）－３－メチルブタナミド）プロパンアミド）ベンジル（４－ニトロフェニル）炭酸塩（９）の合成

【化31】

【0408】

８（１３１ｍｇ、２０９μｍｏｌ、１．００ｅｑ）のジクロロメタン（２．１ｍＬ）溶液に、ＰＮＰクロロホルメート（６３．１ｍｇ、３１３μｍｏｌ、１．５０ｅｑ）とＤＩＰＥＡ（５４．５μＬ、３１３μｍｏｌ、１．５０ｅｑ）を加え、混合物を室温で撹拌した。３時間後、ＰＮＰクロロホルメート２０ｍｇを加え、混合物をさらに１時間撹拌した。ジクロロメタンで希釈し、飽和ＮａＨＣＯ３ａｑで洗浄した。有機相を乾燥させ、溶媒を減圧下で蒸発させた。

【0409】

フラッシュクロマトグラフィー（ジクロロメタン／ＭｅＯＨ ２０：１→１０：１）による精製により、９がピンク色の固体（１０１ｍｇ、６１％）として得られた。

【0410】

実施例１０
４－（（Ｓ）－２－（（Ｓ）－２－（４－（６－（（ジエトキシホスホリル）メチル）－１，２，４，５－テトラジン－３－イル）ベンズアミド）－３－メチルブタンアミド）プロパンアミド）ベンジルの合成（（Ｓ）－１－（（（Ｓ）－１－（（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）－１－（（Ｓ）－２－（（１Ｒ，２Ｒ）－３－（（（１Ｓ，２Ｒ）－１－ヒドロキシ－１－フェニルプロパン－２－イル）アミノ）－１－メトキシ－２－メチル－３－オキソプロピル）ピロリジン－１－イル）－３－メトキシ－５－メチル－１－オキソヘプタン－４－イル）（メチル）アミノ）－３－メチル－１－オキソブタン－２－イル）アミノ）－３－メチル－１－オキソブタン－２－イル）（メチル）カルバメート（１０）

【化32】

【0411】

９（２０．０ｍｇ，２５．２μｍｏｌ，１．００ｅｑ）およびＭＭＡＥ（１８．１ｍｇ，２５．２μｍｏｌ，１．００ｅｑ）のＤＭＦ（０．２ｍＬ）溶液に、ピリジン（０．１ｍＬ）、ＨＯＢｔ一水和物（０．７７３ｍｇ，５．０５μｍｏｌ，０．２００ｅｑ）およびＤＩＰＥＡ（４．３９μＬ，２５．２μｍｏｌ，１．００ｅｑ）を加え、混合物を室温で一晩撹拌した。これをジクロロメタンで希釈し、Ｈ_２Ｏで洗浄した。有機相を乾燥させ、溶媒を減圧下で蒸発させた。

【0412】

粗生成物１０（３４．０ｍｇ、９８％）を次の工程に直接使用した。

【0413】

実施例１１
（（６－（４－（（（Ｓ）－１－（（（Ｓ）－１－（（４－（（５Ｓ，８Ｓ，１１Ｓ，１２Ｒ）－１１－（（Ｓ）－ｓｅｃ－ブチル）－１２－（２－（（Ｓ）－２－（（１Ｒ，２Ｒ）－３－（（（１Ｓ，２Ｒ）－１－ヒドロキシ－１－フェニルプロパン－２－イル）アミノ）－１－メトキシ－２－メチル－３－オキソプロピル）ピロリジン－１－イル）－２－オキソエチル）－５の合成、８－ジイソプロピル－４，１０－ジメチル－３，６，９－トリオキソ－２，１３－ジオキサ－４，７，１０－トリアザテトラデシル）フェニル）アミノ）－１－オキソプロパン－２－イル）アミノ）－３－メチル－１－オキソブタン－２－イル）カルバモイル）フェニル）－１，２，４，５－テトラジン－３－イル）メチル）ホスホン酸（１１）

【化33】

【0414】

粗１０（３４．０ｍｇ、２４．８μｍｏｌ、１．００ｅｑ）のＤＭＦ（０．５ｍＬ）溶液にトリメチルシリルブロミド（３２．７μＬ、２４８μｍｏｌ、１０．０ｅｑ）を加え、混合物を室温で一晩撹拌した。それをＭｅＯＨおよびＨ_２Ｏで希釈し、混合物を直接ＨＰＬＣで精製した。

【0415】

ＨＰＬＣによる精製により、１１（２．１ｍｇ、６％）がピンク色の固体として得られた。

【0416】

実施例１２
（（６－（４－（（（２，５－ジオキソピロリジン－１－イル）オキシ）カルボニル）フェニル）－１，２，４，５－テトラジン－３－イル）メチル）ホスホン酸（１２）の合成

【化34】

【0417】

６（３０．８ｍｇ，６８．５μｍｏｌ，１．００ｅｑ）のジクロロメタン（０．７ｍＬ）溶液に、０℃でトリメチルシリルブロミド（２７．１μＬ，２０６μｍｏｌ，３．００ｅｑ）を加え、混合物をこの温度で３時間撹拌した。ＤＭＦ（０．７ｍＬ）を加え、混合物を室温で３日間撹拌した。それをＭｅＯＨおよびＨ_２Ｏで希釈し、溶媒を減圧下で蒸発させた。

【0418】

ＨＰＬＣによる精製により、１２がピンク色の粉末（１７．４ｍｇ、６５％）として得られた。

【0419】

実施例１３
（（６－（４－（（（２Ｓ）－１－（（（２Ｓ）－１－（（４－（（（（（２Ｓ）－１－（（（１４Ｓ，３２Ｓ，３３Ｒ，２Ｓ，４Ｓ，１０Ｅ，１２Ｅ，１４Ｒ）－８６－クロロ－１４－ヒドロキシ－８５，１４－ジメトキシ－３３，２，７，１０－テトラメチル－１２，６－ジオキソ－７－アザ－１（６，４）－オキサジナナ－３（２，３）－オキシラナ－８（１，３）－ベンゼンシクロヘキシルの合成テトラデカファン－１０，１２－ジエン－４－イル）オキシ）－１－オキソプロパン－２－イル）（メチル）カルバモイル）オキシ）メチル）フェニル）アミノ）－１－オキソプロパン－２－イル）アミノ）－３－メチル－１－オキソブタン－２－イル）カルバモイル）フェニル）－１，２，４，５－テトラジン－３－イル）メチル）ホスホン酸（１３）

【化35】

【0420】

Ｈ－Ｖａｌ－Ａｌａ－ＰＡＢ－メイタンシノイド２８（１２．５ｍｇ，１２．９μｍｏｌ，１．００ｅｑ）および１２（１１．２ｍｇ，２８．４μｍｏｌ，２．２０ｅｑ）のＤＭＦ（０．５ｍＬ）溶液にＮＥｔ３（１６．１μＬ，１１６μｍｏｌ，９．００ｅｑ）を加え、混合物を室温で一晩撹拌した。これをＨＣｌａｑで希釈し、混合物を直接ＨＰＬＣで精製した。

【0421】

ＨＰＬＣによる精製により、１３（７．８ｍｇ、４８％）がピンク色の粉末として得られた。

【0422】

実施例１４
５－（６－（（ジエトキシホスホリル）メチル）－１，２，４，５－テトラジン－３－イル）イソフタル酸（１４）の合成

【化36】

【0423】

５－シアノイソフタル酸（２８７ｍｇ、１．５０ｍｍｏｌ、１．００ｅｑ）およびジエチルシアノメチルホスホネート（９７２μＬ、６．００ｍｍｏｌ、４．００ｅｑ）のＥｔＯＨ（１．５ｍＬ）溶液に、３－メルカプトプロピオン酸（１３１μＬ、１．５０ｍｍｏｌ、１．００ｅｑ）を、続いてヒドラジン一水和物（１．１７ｍＬ、２４．０ｍｍｏｌ、１６．０ｅｑ）を０℃で加えた。混合物を室温で一晩撹拌した。その後、Ｈ_２Ｏ中のＮａＮＯ_２（２．０７ｇ、３０．０ｍｍｏｌ、２０．０ｅｑ）を加え、１ＭＨＣｌａｑを滴下してｐＨ約１に酸性化した。ピンク色の沈殿物を濾過し、０．１ＭＨＣｌａｑで洗浄した。

【0424】

粗生成物１４（５９４ｍｇ）は、それ以上精製することなく、次の工程に直接使用した。

【0425】

実施例１５
ビス（２，５－ジオキソピロリジン－１－イル）５－（６－（（ジエトキシホスホリル）メチル）－１，２，４，５－テトラジン－３－イル）イソフタレート（１５）の合成

【化37】

【0426】

１４（５９４ｍｇ、１．５０ｍｍｏｌ、１．００ｅｑ）のジクロロメタン（１５ｍＬ）混合物に、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（６９１ｍｇ、６．００ｍｍｏｌ、４．００ｅｑ）およびＥＤＣ塩酸塩（１．１５ｇ、６．００ｍｍｏｌ、４．００ｅｑ）を加え、混合物を室温で撹拌した。

【0427】

フラッシュクロマトグラフィー（ジクロロメタン／ＭｅＯＨ ２０：１）による精製により、１５がピンク色の固体（７５０ｍｇ、２段階で８５％）として得られた。

【0428】

実施例１６
１，１’－（５－（６－（（ジエトキシホスホリル）メチル）－１，２，４，５－テトラジン－３－イル）－１，３－フェニレン）ビス（１－オキソ－５，８，１１，１４，１７，２０，２３，２６－オクタオキサ－２－アザノナコサン－２９－酸）（１６）の合成

【化38】

【0429】

１５（３００ｍｇ、５０８μｍｏｌ、１．００ｅｑ）のＤＭＦ（５ｍＬ）混合物に、ＮＥｔ３（１４０μＬ、１０３ｍｇ、１．０２ｍｍｏｌ、２．００ｅｑ）および１－アミノ－３，６，９，１２，１５，１８，２１，２４－オクタオキサヘプタコサン－２７－酸（４４９ｍｇ、１．０２ｍｍｏｌ、２．００ｅｑ）を加え、混合物を室温で撹拌した。それをＨ２Ｏで希釈し、混合物を直接ＨＰＬＣで精製した。

【0430】

ＨＰＬＣによる精製により、１６がピンク色のオイル（８３ｍｇ、１３％）として得られた。

【0431】

実施例１７
２－（６－（（ジエトキシホスホリル）メチル）－１，２，４，５－テトラジン－３－イル）酢酸（１７）の合成

【化39】

【0432】

シアノ酢酸（３．４０ｇ、４０．０ｍｍｏｌ、４．００ｅｑ）およびシアノメチルホスホン酸ジエチル（１．６２ｍＬ、１０．０ｍｍｏｌ、１．００ｅｑ）のＥｔＯＨ（１０ｍＬ）溶液に、３－メルカプトプロピオン酸（８７１μＬ、１０．０ｍｍｏｌ、１．００ｅｑ）を０℃で加え、続いてヒドラジン一水和物（７．７６ｍＬ、１６０ｍｍｏｌ、１６．０ｅｑ）を加えた。混合物を室温で一晩撹拌した。その後、Ｈ２Ｏ中のＮａＮＯ_２（１３．８ｇ、２００ｍｍｏｌ、２０．０ｅｑ）を加え、１ＭＨＣｌａｑを滴下してｐＨ約１に酸性化した。それを酢酸エチルで抽出し、有機相を乾燥させ、溶媒を減圧下で蒸発させた。

【0433】

フラッシュクロマトグラフィー（ジクロロメタン／ＭｅＯＨ５０：１→１０：１および２０：１→１０：１）による２回の精製により、１７がピンク色の油（２６０ｍｇ、９％）として得られた。

【0434】

実施例１８
ジエチル（（６－（５－アミノピリジン－２－イル）－１，２，４，５－テトラジン－３－イル）メチル）ホスホネート（１８）の合成

【化40】

【0435】

５－アミノ－２－ピリジンカルボニトリル（１．２０ｇ、１０．１ｍｍｏｌ、１．００ｅｑ）およびジエチルシアノメチルホスホネート（６．５２ｍＬ、７．１４ｇ、４０．３ｍｍｏｌ、４．００ｅｑ）のＥｔＯＨ（１０ｍＬ）溶液に、３－メルカプトプロピオン酸（８７８μＬ、１．０７ｇ、１０．１ｍｍｏｌ、１．００ｅｑ）を、続いてヒドラジン一水和物（７．８２ｍＬ、８．０７ｇ、１６１ｍｍｏｌ、１６．０ｅｑ）を０℃で加えた。混合物を室温で一晩撹拌した。

【0436】

溶媒はロータリーエバポレーターで除去し、残留物は逆相フラッシュクロマトグラフィーで精製した。ジヒドロテトラジン中間体を含む画分を空気中で一晩酸化した後、溶媒を蒸発させて粗生成物１８を得た。

【0437】

フラッシュクロマトグラフィー（ジクロロメタン／ＭｅＯＨ２０：１）による精製により、１８が暗赤色の固体（５５５ｍｇ、１７％）として得られた。

【0438】

実施例１９
（（６－（５－アミノピリジン－２－イル）－１，２，４，５－テトラジン－３－イル）メチル）ホスホン酸（１９）の合成

【化41】

【0439】

１８（７８．０ｍｇ、２４１μｍｏｌ、１．００ｅｑ）のジクロロメタン／ＤＭＦ（２：１、３ｍＬ）溶液に、０℃でトリメチルシリルブロミド（１５９μＬ、１８４ｍｇ、１．２０ｍｍｏｌ、５．００ｅｑ）を加えた。混合物を室温で一晩撹拌した。その後、ＭｅＯＨおよびＨ_２Ｏで希釈し、溶媒を蒸発させた。

【0440】

ＨＰＬＣによる精製により、１９が赤ピンク色の粉末（３６．０ｍｇ、５６％）として得られた。

【0441】

実施例２０－ジエチル（（６－（４－（１３－ヒドロキシ－２，５，８，１１－テトラオキサトリデシル）フェニル）－１，２，４，５－テトラジン－３－イル）メチル）ホスホネート（２０）の合成

【化42】

【0442】

４－（１３－ヒドロキシ－２，５，８，１１－テトラオキサトリデシル）ベンゾニトリル（９８０ｍｇ、３．１７ｍｍｏｌ、５．００ｅｑ）、ジエチルシアノメチルホスホネート（１０３μＬ、１１２ｍｇ、６３４μｍｏｌ、１．００ｅｑ）、ヒドラジン一水和物（１．５４ｍＬ、１．５９ｇ、３１．７ｍｍｏｌ、５０．０ｅｑ）およびＺｎ（ＯＴｆ）_２（１１．５ｍｇ、３１．７μｍｏｌ、０．０５００ｅｑ）の混合物を６０℃で３０分間撹拌した。その後、ＮａＮＯ_２（８７５ｍｇ、１２．７ｍｍｏｌ、２０．０ｅｑ）の水溶液を加え、１ＭＨＣｌａｑを滴下してｐＨ約３に酸性化した。これをＤＣＭで抽出し、溶媒を蒸発させた。

【0443】

フラッシュクロマトグラフィー（ジクロロメタン／ＭｅＯＨ４０：１→１０：１）による精製により、２０が濃いピンク色の油状物（９．０ｍｇ、３％）として得られた。

【0444】

実施例２１
（（６－（４－（１３－ヒドロキシ－２，５，８，１１－テトラオキサトリデシル）フェニル）－１，２，４，５－テトラジン－３－イル）メチル）ホスホン酸（２１）の合成

【化43】

【0445】

２０（９．０ｍｇ，１７．５μｍｏｌ，１．００ｅｑ）のＤＭＦ（０．２ｍＬ）溶液に、０℃でトリメチルシリルブロミド（１１．６μＬ，８７．５μｍｏｌ，５．００ｅｑ）を加え、混合物を室温で９０分間撹拌した。反応をＭｅＯＨおよびＨ_２Ｏで停止し、混合物を直接ＨＰＬＣ精製にかけた。

【0446】

ＨＰＬＣによる精製により、２１が濃いピンク色の油（１．７ｍｇ、２１％）として得られた。

【0447】

実施例２２
４－（６－（２，５，８，１１，１４，１７，２０，２３，２６，２９，３２，３５，３８－トリデカオキサノナトリアコンチル）－１，２，４，５－テトラジン－３－イル）安息香酸（２２）の合成

【化44】

【0448】

２，５，８，１１，１４，１７，２０，２３，２６，２９，３２，３５，３８－トリデカオキサテトラコンタン－４０－ニトリル（１．２０ｇ、２．００ｍｍｏｌ、１．００ｅｑ）、４－シアノ安息香酸（１．１８ｇ、８．００ｍｍｏｌ、４．００ｅｑ）のＥｔＯＨ（２ｍＬ）混合物に、３－メルカプトプロピオン酸（１７４μＬ、２１２ｍｇ、２．００ｍｍｏｌ、１．００ｅｑ）を加え、続いてヒドラジン一水和物（１．５５ｍＬ、１．６０ｇ、３２．０ｍｍｏｌ、１６．０ｅｑ）を０℃で加えた。混合物を室温で一晩撹拌した。その後、ＮａＮＯ_２（５．５２ｇ、８０．０ｍｍｏｌ、２０．０ｅｑ）の水溶液を加え、１ＭＨＣｌａｑを滴下してｐＨ約３に酸性化した。ＤＣＭで抽出し、溶媒を蒸発させた。

【0449】

フラッシュクロマトグラフィー（ジクロロメタン／ＭｅＯＨ２０：１→１０：１）による精製により、２２がピンク色の油状物（３５２ｍｇ、２３％）として得られた。

【0450】

実施例２３
４－（（Ｓ）－２－（（Ｓ）－２－（４－（６－（２，５，８，１１，１４，１７，２０，２３，２６，２９，３２，３５，３８－トリデカオキサノナトリアコンチル）－１，２，４，５－テトラジン－３－イル）ベンズアミド）－３－メチルブタンアミド）プロパンアミド）ベンジルの合成（（Ｓ）－１－（（（Ｓ）－１－（（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）－１－（（Ｓ）－２－（（１Ｒ，２Ｒ）－３－（（（１Ｓ，２Ｒ）－１－ヒドロキシ－１－フェニルプロパン－２－イル）アミノ）－１－メトキシ－２－メチル－３－オキソプロピル）ピロリジン－１－イル）－３－メトキシ－５－メチル－１－オキソヘプタン－４－イル）（メチル）アミノ）－３－メチル－１－オキソブタン－２－イル）アミノ）－３－メチル－１－オキソブタン－２－イル）（メチル）カルバメート（２３）

【化45】

【0451】

Ｈ－Ｖａｌ－Ａｌａ－ＰＡＢ－ＭＭＡＥ（２７）（１１．０ｍｇ、１０．６μｍｏｌ、１．００ｅｑ）の溶液に、２２（９．８６ｍｇ、１２．７μｍｏｌ、１．２０ｅｑ）、ＨＡＴＵ（６．０５ｍｇ、１５．９μｍｏｌ、１．５０ｅｑ）およびＤＩＰＥＡ（４．６２μＬ、３．４２ｍｇ、２６．５μｍｏｌ、２．５０ｅｑ）を加え、混合物を室温で１時間撹拌した。粗反応混合物を直接ＨＰＬＣ精製にかけた。

【0452】

ＨＰＬＣによる精製により、２３がピンク色の粉末（３．９ｍｇ、２０％）として得られた。

【0453】

実施例２４
エチル水素（（６－（４－（アミノメチル）フェニル）－１，２，４，５－テトラジン－３－イル）メチル）ホスホネート（２４）の合成

【化46】

【0454】

４－アミノメチルベンゾニトリル（１６９ｍｇ、１．００ｍｍｏｌ、１．００ｅｑ）とジエチルシアノメチルホスホネート（１．６２ｍＬ、１．７７ｇ、１０．０ｍｍｏｌ、１０．０ｅｑ）の混合物に、ヒドラジン一水和物（２．４３μｍ、２．５０ｇ、５０．０ｍｍｏｌ、５０．０ｅｑ）とＺｎ（ＯＴｆ）_２（１８．２ｍｇ、５０．０μｍｏｌ、０．０５００ｅｑ）を加えた。混合物を室温で一晩撹拌した。その後、Ｈ_２Ｏ中のＮａＮＯ_２（１．３８ｇ、２０．０ｍｍｏｌ、２０．０ｅｑ）を加え、１ＭＨＣｌａｑを滴下してｐＨ約３に酸性化した。

【0455】

ＨＰＬＣによる精製により、２４がピンク色の粉末（２６．１ｍｇ、３０％）として得られた。

【0456】

実施例２５
（（６－（４－（アミノメチル）フェニル）－１，２，４，５－テトラジン－３－イル）メチル）ホスホン酸（２５）の合成

【化47】

【0457】

２４（９４．０ｍｇ、２７２μｍｏｌ、１．００ｅｑ）のＤＭＦ溶液に、０℃でトリメチルシリルブロミド（３８２μＬ、４１６ｍｇ、２．７２ｍｍｏｌ、１０．０ｅｑ）を加えた。混合物を室温で５時間撹拌した。その後、ＭｅＯＨとＨ_２Ｏで希釈し、溶媒を蒸発させた。

【0458】

ＨＰＬＣによる精製により、２がピンク色の粉末（２６．１ｍｇ、３０％）として得られた。

【0459】

実施例２６
４－（６－（ホスホノメチル）－１，２，４，５－テトラジン－３－イル）安息香酸（２６）の合成

【化48】

【0460】

４－シアノ安息香酸（６４９ｍｇ、４．３７ｍｍｏｌ、１．００ｅｑ）およびジエチルシアノメチルホスホネート（３．１５ｍＬ、３．４５ｇ、３０．０ｍｍｏｌ、６．８６ｅｑ）の溶液に、ヒドラジン一水和物（７．２８ｍＬ、７．５１ｇ、１５０ｍｍｏｌ、３４．３ｅｑ）およびＺｎ（ＯＴｆ）_２（５４．５ｍｇ、１５０μｍｏｌ、０．０５００ｅｑ）を加えた。混合物を室温で４時間撹拌した。その後、Ｈ_２Ｏ中のＮａＮＯ_２（５．５２ｇ、８０．０ｍｍｏｌ、２０．０ｅｑ）を加え、１ＭＨＣｌａｑを滴下してｐＨ約３に酸性化した。ピンク色の沈殿物を濾過し、０．１ＭＨＣｌａｑで洗浄して、３と４－（６－（（エトキシ（ヒドロキシ）ホスホリル）メチル）－１，２，４，５－テトラジン－３－イル）安息香酸の粗混合物を得た。

【0461】

ＤＭＦ中の粗沈殿物の溶液に、０℃でトリメチルシリルブロミド（２．６４ｍＬ、３．０６ｇ、２０．０ｍｍｏｌ、５．００当量）を加えた。混合物を室温で５時間撹拌した。その後、ＭｅＯＨとＨ_２Ｏで希釈し、溶媒を蒸発させた。

【0462】

ＨＰＬＣによる精製により、２６がピンク色の粉末（６４．５ｍｇ、５％）として得られた。

【0463】

実施例２７
Ｈ－Ｖａｌ－Ａｌａ－ＰＡＢ－ＭＭＡＥ（４－（（Ｓ）－２－（（Ｓ）－２－アミノ－３－メチルブタンアミド）プロパンアミド）ベンジル（（Ｓ）－１－（（（Ｓ）－１－（（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）－１－（（Ｓ）－２－（（１Ｒ，２Ｒ）－３－（（（１Ｓ，２Ｒ）－１－ヒドロキシ－１－フェニルプロパン－２－イル）アミノ）－１－メトキシ－２－メチル－３－オキソプロピル）ピロリジン－１－イル）－３－メトキシ－５－メチル－１－オキソヘプタン－４－イル）（メチル）アミノ）－３－メチル－１－オキソブタン－２－イル）アミノ）－３－メチル－１－オキソブタン－２－イル）（メチル）カルバメート）（２７）の合成

【化49】

【0464】

Ｆｍｏｃ－Ｖａｌ－Ａｌａ－ＰＡＢ－ＰＮＰ（３４．１ｍｇ、５０．１μｍｏｌ、１．００ｅｑ）およびＭＭＡＥ（３６．０ｍｇ、５０．１μｍｏｌ、１．００ｅｑ）のＤＭＦ（０．５ｍＬ）溶液に、ピリジン（０．２５ｍＬ）、ＨＯＢｔ（０．７６８ｍｇ、５．０１μｍｏｌ、０．１００ｅｑ）およびＤＩＰＥＡ（８．７３μＬ、６．４８ｍｇ、５０．１μｍｏｌ、１．００ｅｑ）を加え、混合物を室温で８時間撹拌した。完全に変換された後、ピペリジン（０．１２５ｍＬ）を加え、混合物をさらに５分間撹拌し、その後直接ＨＰＬＣ精製にかけた。

【0465】

ＨＰＬＣによる精製により、２７（４４．３ｍｇ、８５％）が白色固体として得られた。

【0466】

実施例２８
Ｈ－Ｖａｌ－Ａｌａ－ＰＡＢ－メイタンシノイド（（１４Ｓ，３２Ｓ，３３Ｒ，２Ｓ，４Ｓ，１０Ｅ，１２Ｅ，１４Ｒ）－８６－クロロ－１４－ヒドロキシ－８５，１４－ジメトキシ－３３，２，７，１０－テトラメチル－１２，６－ジオキソ－７－アザ－１（６，４）－オキサジナナ－３（２，３）－オキシラナ－８（１，３）－ベンゼンシクロテトラデカファン－１０，１２－ジエン－４－イルＮ－（（（４－（（Ｓ）－２－（（Ｓ）－２－アミノ－３－メチルブタンアミド）プロパンアミド）ベンジル）オキシ）カルボニル）－Ｎ－メチル－Ｌ－アラニネート）（２８）の合成

【化50】

【0467】

Ｆｍｏｃ－Ｖａｌ－Ａｌａ－ＰＡＢ－ＰＮＰ（４１．０ｍｇ、６３．０μｍｏｌ、１．００ｅｑ）およびメイタンシノイド（４２．９ｍｇ、６３．０μｍｏｌ、１．００ｅｑ）のＤＭＦ（０．６ｍＬ）溶液に、ピリジン（０．２８ｍＬ）、ＨＯＢｔ（０．９６５ｍｇ、６．３０μｍｏｌ、０．１００ｅｑ）およびＤＩＰＥＡ（１０．９μＬ、８．１４ｍｇ、６３．０μｍｏｌ、１．００ｅｑ）を加え、混合物を室温で８時間撹拌した。完全に変換された後、ピペリジン（０．１５ｍＬ）を加え、混合物をさらに５分間撹拌し、その後直接ＨＰＬＣ精製にかけた。

【0468】

ＨＰＬＣによる精製により、２８（２５．８ｍｇ、４２％）が白色固体として得られた。

【0469】

実施例２９
ジエチル（６－シアノピリジン－３－イル）ホスホネート（２９）の合成

【化51】

【0470】

ジエチルホスファイト（５６７μＬ、６０８ｍｇ、４．４０ｍｍｏｌ、１．１０ｅｑ）、ＮＥｔ３（６１０μＬ、４４５ｍｇ、４．４０ｍｍｏｌ、１．１０ｅｑ）およびＰｄ（ＰＰｈ３）４（２３１ｍｇ、２００μｍｏｌ、０．０５００ｅｑ）の混合物に、５－ブロモ－２－シアノピリジン（７３２ｍｇ、４．００ｍｍｏｌ、１．００ｅｑ）およびトルエン１ｍＬを加え、混合物を９０℃で１時間撹拌した。

【0471】

フラッシュクロマトグラフィー（シクロヘキサン／酢酸エチル１：１）による精製により、２９が無色油状物（６５０ｍｇ、６８％）として得られた。

【0472】

実施例３０
３－（６－（４－（ヒドロキシ（メトキシ）ホスホリル）フェニル）－１，２，４，５－テトラジン－３－イル）プロパン酸（３０）の合成

【化52】

【0473】

ジメチル（４－シアノフェニル）ホスホネート（５４．０ｍｇ、２５６μｍｏｌ、１．００ｅｑ）および３－シアノプロピオン酸（８７．０ｍｇ、８７８μｍｏｌ、３．４３ｅｑ）のＥｔＯＨ（０．２６ｍＬ）溶液に、ヒドラジン一水和物（１７０μＬ、１７６ｍｇ、３．５１ｍｍｏｌ、１３．７ｅｑ）を加え、続いて３－メルカプトプロピオン酸（１９．１μＬ、２３．３ｍｇ、２２０μｍｏｌ、０．８５９ｅｑ）を加えた。混合物を室温で一晩撹拌した。その後、亜硝酸ナトリウム（３０３ｍｇ、４．３９ｍｍｏｌ、２０．０ｅｑ）を加え、１ＭＨＣｌａｑを滴下して溶液を酸性化した。これを酢酸エチル（３回）で抽出し、合わせた有機相を硫酸ナトリウムで乾燥させ、減圧下で蒸発させた。

【0474】

逆相フラッシュクロマトグラフィー（Ｈ_２Ｏ中０－５０％ＭｅＯＨ）による精製により、３０がピンク色の固体（４０．４ｍｇ、４９％）として得られた。

【0475】

実施例３１
３－（６－（４－ホスホノフェニル）－１，２，４，５－テトラジン－３－イル）プロパン酸（３１）の合成

【化53】

【0476】

３０（１５．４ｍｇ、４７．５μｍｏｌ、１．００ｅｑ）のＤＭＦ（０．５ｍＬ）溶液に、０℃でトリメチルシリルブロミド（３１．３μＬ、３６．４ｍｇ、２３７μｍｏｌ、５．００ｅｑ）を加えた。混合物を室温で３０分間撹拌した。水を加え、混合物を直接精製した。

【0477】

逆相フラッシュクロマトグラフィー（Ｈ_２Ｏ中０－５０％ＭｅＯＨ）による精製により、３１がピンク色の固体（１２．３ｍｇ、８３％）として得られた。

【0478】

実施例３２
（４－（６－（３－（（２，５－ジオキソピロリジン－１－イル）オキシ）－３－オキソプロピル）－１，２，４，５－テトラジン－３－イル）フェニル）ホスホン酸（３２）の合成

【化54】

【0479】

３１（９．５０ｍｇ、３０．６μｍｏｌ、１．００ｅｑ）のＤＭＦ（０．３ｍＬ）溶液に、ＮＥｔ３（５．０９μＬ、３．７２ｍｇ、３６．８μｍｏｌ、１．２０ｅｑ）およびＮ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′－テトラメチル－Ｏ－（Ｎ－スクシンイミジル）ウロニウムテトラフルオロボラート（ＴＳＴＵ）（１１．１ｍｇ、３６．８μｍｏｌ、１．２０ｅｑ）を加えた。混合物を室温で撹拌した。１．５時間後、さらに１０ｍｇのＴＳＴＵと４μＬのＮＥｔ３を加え、混合物をさらに３０分間撹拌した。それを水で希釈し、混合物を直接ＨＰＬＣで精製した。

【0480】

ＨＰＬＣによる精製により、３２がピンク色の固体（２．２ｍｇ、１８％）として得られた。

【0481】

実施例３３
２－（６－（ホスホノメチル）－１，２，４，５－テトラジン－３－イル）酢酸（３３）の合成

【化55】

【0482】

１７（３０．０ｍｇ、１０３μｍｏｌ、１．００ｅｑ）のＤＭＦ（０．５ｍＬ）溶液に、０℃でトリメチルシリルブロミド（１３６μＬ、１５８ｍｇ、１．０３ｍｍｏｌ、１０．０ｅｑ）を加えた。混合物を室温で３．５時間撹拌した。水を加え、混合物を直接ＨＰＬＣで精製した。

【0483】

ＨＰＬＣによる精製により、３３がピンク色の固体（２．８ｍｇ、１２％）として得られた。

【0484】

実施例３４
ジエチル（４－（６－（５－アミノピリミジン－２－イル）－１，２，４，５－テトラジン－３－イル）フェニル）ホスホネート（３４）の合成

【化56】

【0485】

ジエチル（４－シアノフェニル）ホスホネート（３９８ｍｇ、２５６μｍｏｌ、２．００ｅｑ）および２－シアノ－５－アミノピリミジン（１００ｍｇ、８３３μｍｏｌ、１．００ｅｑ）のＥｔＯＨ（０．８ｍＬ）溶液に、ヒドラジン一水和物（６４６μＬ、６６７ｍｇ、１３．３ｍｍｏｌ、１６．０ｅｑ）を加え、続いて３－メルカプトプロピオン酸（２１８μＬ、２６５ｍｇ、２．５０ｍｍｏｌ、３．００ｅｑ）を加えた。混合物を室温で一晩撹拌した。反応物を水で希釈し、ジクロロメタン（２回）で抽出した。合わせた有機相を硫酸ナトリウムで乾燥させ、減圧下で蒸発させた。

【0486】

残渣をジクロロメタン５ｍＬに溶解し、ｐ－ベンゾキノン１５０ｍｇを加え、混合物を５分間撹拌し、直接カラムクロマトグラフィーにかけた。

【0487】

フラッシュクロマトグラフィー（ジクロロメタン／ＭｅＯＨ、２０：１から１０：１の勾配）による精製により、３４がオレンジがかった茶色の油（１３９ｍｇ、４３％）として得られた。

【0488】

実施例３５
（４－（６－（５－アミノピリミジン－２－イル）－１，２，４，５－テトラジン－３－イル）フェニル）ホスホン酸（３５）の合成

【化57】

【0489】

３４（２２．８ｍｇ，５８．９μｍｏｌ，１．００ｅｑ）のＤＭＦ（０．６ｍＬ）溶液に、０℃でトリメチルシリルブロミド（１５５μＬ，１８０ｍｇ，１．１８ｍｍｏｌ，２０．０ｅｑ）を加えた。混合物を室温で２時間撹拌した。水を加え、混合物を５分間撹拌した。形成された沈殿物を濾過し、水およびアセトンで洗浄した。

【0490】

３５は赤色の固体（２．８ｍｇ、１２％）として単離された。

【0491】

実施例３６
ジエチル（６－（６－（５－アミノピリジン－２－イル）－１，２，４，５－テトラジン－３－イル）ピリジン－３－イル）ホスホネート（３６）の合成

【化58】

【0492】

２９（２４０ｍｇ，９９９μｍｏｌ，１．００ｅｑ）および２－シアノ－５－アミノピリジン（４７６ｍｇ，４．００ｍｍｏｌ，４．００ｅｑ）のＥｔＯＨ（１ｍＬ）溶液に、ヒドラジン一水和物（７７５μＬ，８００ｍｇ，１３．３ｍｍｏｌ，１６．０ｅｑ）を加え、続いて３－メルカプトプロピオン酸（８７．１μＬ，１０６ｍｇ，９９９μｍｏｌ，１．００ｅｑ）を加えた。混合物を室温で一晩撹拌した。次に、形成された沈殿物を溶解するために１ｍＬのＤＭＦを加え、混合物を６０℃で４時間撹拌した。混合物を直接逆相カラムクロマトグラフィーにより精製した。

【0493】

単離したジヒドロテトラジン化合物（９．９ｍｇ）を０．５ｍＬＤＭＦ／ＭｅＯＨに溶解し、２．７ｍｇのｐ－ベンゾキノンを加えて５分間撹拌した。混合物を直接ＨＰＬＣで精製した。

【0494】

ＨＰＬＣによる精製により、３６がオレンジ色の固体（７．３ｍｇ、２％）として得られた。

【0495】

実施例３７
（６－（６－（５－アミノピリジン－２－イル）－１，２，４，５－テトラジン－３－イル）ピリジン－３－イル）ホスホン酸（３７）の合成

【化59】

【0496】

３６（３．８ｍｇ，９．８１μｍｏｌ，１．００ｅｑ）のＤＭＦ（０．１ｍＬ）溶液に、トリメチルシリルブロミド（１２．９μＬ，１５．０ｍｇ，９８．１μｍｏｌ，１０．０ｅｑ）を０℃で加えた。混合物を室温で一晩撹拌した。その後、１２μＬのＴＭＳ－Ｂｒを加え、混合物を室温で５時間撹拌した。その後、２０μＬのＴＭＳ－Ｂｒを加え、混合物を室温で６時間撹拌した。水を加え、混合物を直接ＨＰＬＣで精製した。

【0497】

ＨＰＬＣによる精製により、３７がオレンジ色の固体（１．８ｍｇ、５５％）として得られた。

【0498】

実施例３８
（６－（６－（（ジエトキシホスホリル）メチル）－１，２，４，５－テトラジン－３－イル）ピリジン－３－イル）グリシン（３８）の合成

【化60】

【0499】

（６－シアノピリジン－３－イル）グリシン（３４０ｍｇ、１．９２ｍｍｏｌ、１．００ｅｑ）およびジエチルシアノメチルホスホネート（６２１μＬ、６８０ｍｇ、３．８４ｍｍｏｌ、２．００ｅｑ）のＥｔＯＨ（２ｍＬ）溶液に、ヒドラジン一水和物（１．４９ｍＬ、１．５４ｇ、３０．７ｍｍｏｌ、１６．０ｅｑ）を加え、続いて３－メルカプトプロピオン酸（５０２μＬ、６１１ｍｇ、５．７６ｍｍｏｌ、３．００ｅｑ）を加えた。混合物を室温で一晩撹拌した。その後、揮発性成分を減圧下で除去し、残渣を逆相カラムクロマトグラフィーで精製した。

【0500】

単離したジヒドロテトラジン化合物（３２０ｍｇ）を１０ｍＬのＤＭＦ／ＭｅＯＨに溶解し、１０８ｍｇのｐ－ベンゾキノンを加え、混合物を５分間撹拌した。

【0501】

混合物を直接カラムクロマトグラフィーで精製し、３５ｍｇの生成物３８を得た。さらに、単離した混合画分をＨＰＬＣで精製した。

【0502】

ＨＰＬＣによる精製により、３８が赤色固体（１３０ｍｇ、１８％）として得られた。

【0503】

実施例３９
（６－（６－（ホスホノメチル）－１，２，４，５－テトラジン－３－イル）ピリジン－３－イル）グリシン（３９）の合成

【化61】

【0504】

３８（３５．０ｍｇ，９１．５μｍｏｌ，１．００ｅｑ）のＤＭＦ（１ｍＬ）溶液に、０℃でトリメチルシリルブロミド（１０９μＬ，１２６ｍｇ，８２４μｍｏｌ，９．００ｅｑ）を加えた。混合物を室温で４時間撹拌した。水を加え、混合物を３０分間撹拌した。これを酢酸エチルで抽出し、水相を凍結乾燥した。得られた油状物をアセトンから沈殿させ、濾過した。

【0505】

３９は赤色の固体（３０．０ｍｇ、９０％）として単離された。

【0506】

実施例４０
Ｂｏｃ－Ｖａｌ－Ｃｉｔ－ＰＡＢ－ＭＭＡＥ４－（（Ｓ）－２－（（Ｓ）－２－（（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）アミノ）－３－メチルブタナミド）－５－ウレイドペンタナミド）ベンジル（（Ｓ）－１－（（（Ｓ）－１－（（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）－１－（（Ｓ）－２－（（１Ｒ，２Ｒ）－３－（（（１Ｓ，２Ｒ）－１－ヒドロキシ－１－フェニルプロパン－２－イル）アミノ）－１－メトキシ－２－メチル－３－オキソプロピル）ピロリジン－１－イル）－３－メトキシ－５－メチル－１－オキソヘプタン－４－イル）（メチル）アミノ）－３－メチル－１－オキソブタン－２－イル）アミノ）－３－メチル－１－オキソブタン－２－イル）（メチル）カルバメート（４０）の合成

【化62】

【0507】

Ｂｏｃ－Ｖａｌ－Ｃｉｔ－ＰＡＢ－ＰＮＰ（１８．０ｍｇ、２７．９μｍｏｌ、１．００ｅｑ）およびＭＭＡＥ（２０．０ｍｇ、２７．９μｍｏｌ、１．００ｅｑ）のＤＭＦ（０．２５ｍＬ）溶液に、ピリジン（０．１２５ｍＬ）、ＨＯＢｔ（０．４２８ｍｇ、２．７９μｍｏｌ、０．１００ｅｑ）およびＤＩＰＥＡ（４．８６μＬ、３．６１ｍｇ、２７．９μｍｏｌ、１．００ｅｑ）を加え、混合物を室温で２日間撹拌した。その後、混合物を直接ＨＰＬＣ精製にかけた。

【0508】

ＨＰＬＣによる精製により、４０（２５．２ｍｇ、７４％）が白色固体として得られた。

【0509】

実施例４１
Ｈ－Ｖａｌ－Ｃｉｔ－ＰＡＢ－ＭＭＡＥ４－（（Ｓ）－２－（（Ｓ）－２－アミノ－３－メチルブタナミド）－５－ウレイドペンタナミド）ベンジル（（Ｓ）－１－（（（Ｓ）－１－（（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）－１－（（Ｓ）－２－（（１Ｒ，２Ｒ）－３－（（（１Ｓ，２Ｒ）－１－ヒドロキシ－１－フェニルプロパン－２－イル）アミノ）－１－メトキシ－２－メチル－３－オキソプロピル）ピロリジン－１－イル）－３－メトキシ－５－メチル－１－オキソヘプタン－４－イル）（メチル）アミノ）－３－メチル－１－オキソブタン－２－イル）アミノ）－３－メチル－１－オキソブタン－２－イル）（メチル）カルバメート（４１）の合成

【化63】

【0510】

４０（２５．２ｍｇ、２０．６μｍｏｌ、１．００当量）のジクロロメタン（０．８ｍＬ）溶液にトリフルオロ酢酸（０．２ｍＬ）を加え、混合物を室温で１５分間撹拌した。その後、溶媒を減圧下で除去した。

【0511】

ＨＰＬＣによる精製により、４１（１７．０ｍｇ、７３％）が白色固体として得られた。

【0512】

実施例４２
４－（（Ｓ）－２－（（Ｓ）－２－（２－（（６－（６－（（ジエトキシホスホリル）メチル）－１，２，４，５－テトラジン－３－イル）ピリジン－３－イル）アミノ）アセトアミド）－３－メチルブタナミド）－５－ウレイドペンタナミド）ベンジルの合成（（Ｓ）－１－（（（Ｓ）－１－（（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）－１－（（Ｓ）－２－（（１Ｒ，２Ｒ）－３－（（（１Ｓ，２Ｒ）－１－ヒドロキシ－１－フェニルプロパン－２－イル）アミノ）－１－メトキシ－２－メチル－３－オキソプロピル）ピロリジン－１－イル）－３－メトキシ－５－メチル－１－オキソヘプタン－４－イル）（メチル）アミノ）－３－メチル－１－オキソブタン－２－イル）アミノ）－３－メチル－１－オキソブタン－２－イル）（メチル）カルバメート（４２）

【化64】

【0513】

４１（１７．０ｍｇ，１５．１μｍｏｌ，１．００ｅｑ）のＤＭＦ（０．３ｍＬ）溶液に、３８（５．７９ｍｇ，１５．１μｍｏｌ，１．００ｅｑ）、ＥＤＣ（３．４８ｍｇ，１８．２μｍｏｌ，１．２０ｅｑ）およびＮＥｔ３（３．１５μＬ，２．３０ｍｇ，２２．７μｍｏｌ，１．５０ｅｑ）を加え、混合物を室温で４時間撹拌した。その後、さらに３８１０ｍｇ、ＥＤＣ８ｍｇおよびＮＥｔ３８μＬを加え、混合物をさらに４時間撹拌した。混合物を直接ＨＰＬＣ精製にかけた。

【0514】

ＨＰＬＣによる精製により、淡赤色の固体として４２（２．４ｍｇ、１１％）が得られた。

【0515】

実施例４３
（（６－（５－（（２－（（（Ｓ）－１－（（（Ｓ）－１－（（４－（（５Ｓ、８Ｓ、１１Ｓ、１２Ｒ）－１１－（（Ｓ）－ｓｅｃ－ブチル）－１２－（２－（（Ｓ）－２－（（１Ｒ、２Ｒ）－３－（（（１Ｓ、２Ｒ）－１－ヒドロキシ－１－フェニルプロパン－２－イル）アミノ）－１－メトキシ－２－メチル－３－オキソプロピル）ピロリジン－１－イル）－２－オキソエチル）－５，８－ジイソプロピルの合成１－４，１０－ジメチル－３，６，９－トリオキソ－２，１３－ジオキサ－４，７，１０－トリアザテトラデシル）フェニル）アミノ）－１－オキソ－５－ウレイドペンタン－２－イル）アミノ）－３－メチル－１－オキソブタン－２－イル）アミノ）－２－オキソエチル）アミノ）ピリジン－２－イル）－１，２，４，５－テトラジン－３－イル）メチル）ホスホン酸（４３）

【化65】

【0516】

４２（２．４ｍｇ、１．６１μｍｏｌ、１．００ｅｑ）のＤＭＦ（０．１ｍＬ）溶液にＴＭＳ－Ｂｒ（１０．６μＬ、１２．３ｍｇ、８０．７μｍｏｌ、５０．０ｅｑ）を加え、混合物を室温で２日間撹拌した。水を加え、混合物を酢酸エチルで抽出した。水相を凍結乾燥した。

【0517】

４３は淡赤色の固体（１ｍｇ、４３％）として単離された。

【0518】

実施例４４
（２Ｓ，３Ｓ，４Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）－６－（２－（３－アミノプロパンアミド）－４－（（５Ｓ，８Ｓ，１１Ｓ，１２Ｒ）－１１－（（Ｓ）－ｓｅｃ－ブチル）－１２－（２－（（Ｓ）－２－（（１Ｒ，２Ｒ）－３－（（（１Ｓ，２Ｒ）－１－ヒドロキシ－１－フェニルプロパン－２－イル）アミノ）－１－メトキシ－２－メチル－３－オキソプロピル）ピロリジン－１－イル）－２－オキソエチル）－５，８－ジイソプロピル－４，１０－ジメチル－３，６，９－トリオキソ－２，１３－ジオキサ－４，７，１０－トリアザテトラデシル）フェノキシ）－３，４，５－トリヒドロキシテトラヒドロ－２Ｈ－ピラン－２－カルボン酸（４４）の合成

【化66】

【0519】

ＭＭＡＥ（１９．６ｍｇ，２７．４μｍｏｌ，１．００ｅｑ）およびβ－Ｄ－グルクロニド－ＰＮＰ－カーボネート（２５．０ｍｇ，２７．４μｍｏｌ，１．００ｅｑ）のＤＭＦ（０．５ｍＬ）溶液に、ピリジン（０．２５ｍＬ）、ＨＯＢｔ（０．４１９ｍｇ，２．７４μｍｏｌ，０．１００ｅｑ）およびＤＩＰＥＡ（４．７７μＬ，２７．４μｍｏｌ，１．００ｅｑ）を加えた。混合物を室温で一晩撹拌した。その後、１ＭＮａＯＨａｑ（０．２７４ｍＬ，２７４μｍｏｌ，１０．０ｅｑ）を加え、混合物を室温で１時間撹拌した。反応混合物を直接ＨＰＬＣで精製した。

【0520】

ＨＰＬＣによる精製で４４（１７．０ｍｇ、５５％）が得られた。

【0521】

実施例４５
（２Ｓ，３Ｓ，４Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）－６－（２－（３－アミノプロパンアミド）－４－（（（（（１Ｓ，９Ｓ）－９－エチル－５－フルオロ－９－ヒドロキシ－４－メチル－１０，１３－ジオキソ－２，３，９，１０，１３，１５－ヘキサヒドロ－１Ｈ，１２Ｈ－ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２－ｂ］キノリン－１－イル）カルバモイル）オキシ）メチル）フェノキシ）－３，４，５－トリヒドロキシテトラヒドロ－２Ｈ－ピラン－２－カルボン酸（４５）の合成

【化67】

【0522】

ＤＭＦ（０．５ｍＬ）中のエキサテカンメシル酸塩（１４．５ｍｇ、２７．４μｍｏｌ、１．００ｅｑ）およびβ－Ｄ－グルクロニド－ＰＮＰ－炭酸塩（２５．０ｍｇ、２７．４μｍｏｌ、１．００ｅｑ）の溶液に、ピリジン（０．２５ｍＬ）、ＨＯＢｔ（０．４１９ｍｇ、２．７４μｍｏｌ、０．１００ｅｑ）およびＤＩＰＥＡ（４．７７μＬ、２７．４μｍｏｌ、１．００ｅｑ）を加えた。混合物を室温で一晩撹拌した。その後、１ＭＮａＯＨａｑ（０．２７４ｍＬ、２７４μｍｏｌ、１０．０ｅｑ）を加え、混合物を室温で１時間撹拌した。反応混合物を直接ＨＰＬＣで精製した。

【0523】

ＨＰＬＣによる精製で４５（３．０ｍｇ、１３％）が得られた。

【0524】

実施例４６
４－（（Ｓ）－４－アミノ－２－（（Ｓ）－２－（（Ｓ）－２－アミノプロパンアミド）プロパンアミド）－４－オキソブタンアミド）ベンジル（（Ｓ）－１－（（（Ｓ）－１－（（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）－１－（（Ｓ）－２－（（１Ｒ，２Ｒ）－３－（（（１Ｓ，２Ｒ）－１－ヒドロキシ－１－フェニルプロパン－２－イル）アミノ）－１－メトキシ－２－メチル－３－オキソプロピル）ピロリジン－１－イル）－３－メトキシ－５－メチル－１－オキソヘプタン－４－イル）（メチル）アミノ）－３－メチル－１－オキソブタン－２－イル）アミノ）－３－メチル－１－オキソブタン－２－イル）（メチル）カルバメート（４６）の合成

【化68】

【0525】

ＭＭＡＥ（２８．１ｍｇ，３９．１μｍｏｌ，１．００ｅｑ）およびＦｍｏｃ－Ａｌａ－Ａｌａ－Ａｓｎ－ＰＡＢ－ＰＮＰ（３０．０ｍｇ，３９．１μｍｏｌ，１．００ｅｑ）のＤＭＦ（０．５ｍＬ）溶液に、ピリジン（０．２５ｍＬ）、ＨＯＢｔ（０．５９８ｍｇ，３．９１μｍｏｌ，０．１００ｅｑ）およびＤＩＰＥＡ（６．８１μＬ，３９．１μｍｏｌ，１．００ｅｑ）を加えた。混合物を室温で一晩撹拌した。その後、１ＭＮａＯＨａｑ（０．３９１ｍＬ，３９１μｍｏｌ，１０．０ｅｑ）を加え、混合物を室温で１時間撹拌した。反応混合物を直接ＨＰＬＣで精製した。

【0526】

ＨＰＬＣによる精製で４６（１６．６ｍｇ、３８％）が得られた。

【0527】

実施例４７
（３Ｒ，４Ｓ，７Ｓ，１０Ｓ）－４－（（Ｓ）－ｓｅｃ－ブチル）－３－（２－（（Ｓ）－２－（（１Ｒ，２Ｒ）－３－（（（１Ｓ，２Ｒ）－１－ヒドロキシ－１－フェニルプロパン－２－イル）アミノ）－１－メトキシ－２－メチル－３－オキソプロピル）ピロリジン－１－イル）－２－オキソエチル）－７，１０－ジイソプロピル－５，１１－ジメチル－６，９，１２－トリオキソ－２－オキサ－１５，１６－ジチア－５，８，１１－トリアザノナデカン－１９－酸（４７）の合成

【0528】

【化69】

【0529】

３，３’－ジチオジプロピオン酸（２９．３ｍｇ、１３９．３μｍｏｌ、２．００ｅｑ）とＨＡＴＵ（２６．５ｍｇ、６９．６μｍｏｌ、１．００ｅｑ）のＤＭＦ（０．５ｍＬ）溶液にＤＩＰＥＡ（１２．１μＬ、６９．６μｍｏｌ、１．００ｅｑ）を加え、混合物を室温で１時間撹拌した。その後、ＭＭＡＥ（５０．０ｍｇ、６９．６μｍｏｌ、１．００ｅｑ）とＤＩＰＥＡ（１２．１μＬ、６９．６μｍｏｌ、１．００ｅｑ）を加え、反応混合物を室温で一晩撹拌し、直接ＨＰＬＣ精製にかけた。

【0530】

ＨＰＬＣによる精製で４７（４３．０ｍｇ、６８％）が得られた。

【0531】

実施例４８
ｔｅｒｔ－ブチル（２－（６－（（ジエトキシホスホリル）メチル）－１，２，４，５－テトラジン－３－イル）エチル）カルバメート（４８）の合成

【化70】

【0532】

ｔｅｒｔ－ブチルＮ－（２－シアノエチル）カルバメート（５００ｍｇ、２．９４ｍｍｏｌ、１．００ｅｑ）、ジエチルシアノメチルホスホネート（９５０μＬ、５．８８ｍｍｏｌ、２．００ｅｑ）、および３－メルカプトプロピオン酸（７６８μＬ、８．８１３ｍｍｏｌ、３．００ｅｑ）のＥｔＯＨ／ＤＭＦ（１：１、１０ｍＬ）溶液をヒドラジン一水和物（２．２８ｍＬ、４７．０ｍｍｏｌ、１６．０ｅｑ）に加え、混合物を室温で一晩撹拌した。その後、Ｈ_２Ｏ中のＮａＮＯ_２（４．９９ｇ、５８．８ｍｍｏｌ、２０．０ｅｑ）を加え、１ＭＨＣｌａｑを滴下してｐＨを約３に酸性化した。形成された沈殿物を濾過し、水相を酢酸エチルで抽出した。合わせた有機層はＮａ２ＳＯ４で乾燥し、減圧下で蒸発させた。逆相カラムクロマトグラフィーで精製して４８（３６０ｍｇ、３３％）を得た。

【0533】

実施例４９
ジエチル（（６－（２－アミノエチル）－１，２，４，５－テトラジン－３－イル）メチル）ホスホネート（４９）の合成

【0534】

【化71】

【0535】

４８（１６０ｍｇ、０．４２６ｍｍｏｌ、１．００ｅｑ）のＤＣＭ（２ｍｌ）溶液にＴＦＡ（３２８μｌ、４．２６ｍｍｏｌ、１０．０ｅｑ）を加え、混合物を室温で一晩撹拌した。溶媒を減圧下で除去した。

【0536】

蒸発により粗４９（１９２ｍｇ）が得られ、これはその後の反応の粗生成物として使用された。

【0537】

実施例５０
（（６－（２－アミノエチル）－１，２，４，５－テトラジン－３－イル）メチル）ホスホン酸（５０）の合成

【化72】

【0538】

粗４９（１００ｍｇ、２５７μｍｏｌ、１．００当量）のＤＭＦ（５．１ｍＬ）溶液に、トリメチルシリルブロミド（１７０μＬ、１．２８ｍｍｏｌ、５．００当量）を０℃で加え、混合物を室温で一晩撹拌した。水を加え、溶媒を減圧下で蒸発させた。逆相クロマトグラフィー（Ｈ_２Ｏ／ＭｅＯＨ、０－５０％、１０ｇＳｆａｅｒＣ１８）による精製

【0539】

逆相クロマトグラフィーによる精製で５０（１２．５ｍｇ、２２％）が得られた。

【0540】

実施例５１
ジエチル（（６－（５－アミノピリミジン－２－イル）－１，４－ジヒドロ－１，２，４，５－テトラジン－３－イル）メチル）ホスホネート（５１）の合成

【化73】

【0541】

５－アミノ－２－ピリミジンカルボニトリル（２００ｍｇ、１．６７ｍｍｏｌ、１．００ｅｑ）、ジエチルシアノメチルホスホネート（０．５３９ｍＬ、３．３３ｍｍｏｌ、２．００ｅｑ）、および３－メルカプトプロピオン酸（４３５μＬ、５．００ｍｍｏｌ、３．００ｅｑ）のＥｔＯＨ／ＤＭＦ（１：１、５ｍＬ）溶液をヒドラジン一水和物（１．２９ｍＬ、２６．６ｍｍｏｌ、１６．０ｅｑ）に加え、混合物を室温で一晩撹拌した。溶媒を減圧下で蒸発させた。逆相カラムクロマトグラフィーで精製すると、混合画分が得られた。生成物を含む合わせた画分をフラッシュクロマトグラフィーで精製した。

【0542】

フラッシュクロマトグラフィー（ＤＣＭ中のＭｅＯＨ、０％から１５％の勾配に従う）による精製により５１（９７．０ｍｇ、１８％）が得られた。

【0543】

実施例５２
ジエチル（（６－（５－アミノピリミジン－２－イル）－１，２，４，５－テトラジン－３－イル）メチル）ホスホネート（５２）の合成

【化74】

【0544】

ＴＨＦ／ＭｅＯＨ（９：１、３ｍＬ）中の５１（９７．０ｍｇ、２９６μｍｏｌ、１．００ｅｑ）の溶液にｐ－ベンゾキノン（３９．４ｍｇ、３６５μｍｏｌ、１．２３ｅｑ）を加え、混合物を室温で５分間撹拌した。それをＤＣＭで希釈し、Ｈ_２ＯおよびＮａＨＣＯ３の飽和水溶液を加えて反応を停止した。それを酢酸エチル（３回）で抽出し、合わせた有機相を硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を減圧下で蒸発させた。

【0545】

フラッシュクロマトグラフィー（ＤＣＭ中のＭｅＯＨ、０％から３０％の勾配に従う）による精製により５２（３３．０ｍｇ、３４％）が得られた。

【0546】

実施例５３
（（６－（５－アミノピリミジン－２－イル）－１，２，４，５－テトラジン－３－イル）メチル）ホスホン酸（５３）の合成

【化75】

【0547】

５２（１００ｍｇ、３０７μｍｏｌ、１．００ｅｑ）のＤＭＦ（１ｍＬ）溶液に、０℃でトリメチルシリルブロミド（２０３μＬ、１．５４ｍｍｏｌ、５．００ｅｑ）を加え、混合物を室温で一晩撹拌した。水を加え、溶媒を減圧下で蒸発させた。逆相カラムクロマトグラフィーで精製して、５３（３６．０ｍｇ、４４％）を得た。

【0548】

実施例５４
（（６－（５－（（３Ｒ，４Ｓ，７Ｓ，１０Ｓ）－４－（（Ｓ）－ｓｅｃ－ブチル）－３－（２－（（Ｓ）－２－（（１Ｒ，２Ｒ）－３－（（（１Ｓ，２Ｒ）－１－ヒドロキシ－１－フェニルプロパン－２－イル）アミノ）－１－メトキシ－２－メチル－３－オキソプロピル）ピロリジン－１－イル）－２－オキソエチル）－７，１０－ジイソプロピル－５，１１－ジメチル－６，９，１２－トリオキソ－２－オキサ－１５，１６－ジチア－５，８，１１－トリアザノナデカン－１９－アミド）ピリミジン－２－イル）－１，２，４，５－テトラジン－３－イル）メチル）ホスホン酸（５４）の合成

【化76】

【0549】

４７（１０．０ｍｇ，１３．２μｍｏｌ，１．００ｅｑ）およびＨＡＴＵ（４．１７ｍｇ，１１．０μｍｏｌ，１．００ｅｑ）のＤＭＦ（０．５ｍＬ）溶液にトリエチルアミン（１．５μＬ，１１．０μｍｏｌ，１．００ｅｑ）を加え、混合物を室温で１時間撹拌した。その後、５３（４．６０ｍｇ，１３．２μｍｏｌ，１．２０ｅｑ）およびトリエチルアミン（１．５３μＬ，１１．０μｍｏｌ，１．００ｅｑ）を加え、混合物を室温で一晩撹拌した。反応混合物を直接ＨＰＬＣ精製にかけた。

【0550】

ＨＰＬＣによる精製で５４（５．０ｍｇ、３９％）が得られた。

【0551】

実施例５５
２－（２－（（６－（６－（（ジエトキシホスホリル）メチル）－１，２，４，５－テトラジン－３－イル）ピリジン－３－イル）アミノ）－２－オキソエトキシ）酢酸（５５）の合成

【化77】

【0552】

１８（６４．８ｍｇ、２００μｍｏｌ、１．００ｅｑ）およびジグリコール酸無水物（２７．８ｍｇ、２４０μｍｏｌ、１．２０ｅｑ）のＤＭＦ（２ｍＬ）溶液に４－（ジメチルアミノ）ピリジン（２．４４ｍｇ、２０．０μｍｏｌ、０．１００ｅｑ）を加え、混合物を室温で一晩撹拌した。溶媒を減圧下で蒸発させた。

【0553】

逆相カラムクロマトグラフィーによる精製により、５５（７２．０ｍｇ、８２％）がピンク色の油として得られた。

【0554】

実施例５６
４－（（６－（６－（（ジエトキシホスホリル）メチル）－１，２，４，５－テトラジン－３－イル）ピリジン－３－イル）アミノ）－４－オキソブタン酸（５６）の合成

【化78】

【0555】

１８（６０．０ｍｇ、１８５μｍｏｌ、１．００ｅｑ）とコハク酸無水物（２２．２ｍｇ、２２２μｍｏｌ、１．２０ｅｑ）のＣＨＣｌ_３（０．４ｍＬ）溶液を６０℃で一晩撹拌した。反応混合物をＤＣＭで希釈した。ピンク色の沈殿物を濾過し、ＤＣＭで洗浄した。

【0556】

５６（６９．０ｍｇ、８８％）がピンク色の固体として単離された。

【0557】

実施例５７
ｔｅｒｔ－ブチル（２－（（６－（６－（（ジエトキシホスホリル）メチル）－１，２，４，５－テトラジン－３－イル）ピリジン－３－イル）アミノ）－２－オキソエチル）カルバメート（５７）の合成

【化79】

【0558】

Ｎ－Ｂｏｃ－グリシン（４８６ｍｇ、２．７８ｍｍｏｌ、２．００ｅｑ）のＴＨＦ（５ｍＬ）溶液に、Ｎ－メチルモルホリン（７６３μＬ、６．９４ｍｍｏｌ、５．００ｅｑ）およびイソブチルクロロホルメート（３６０μＬ、２．７８ｍｍｏｌ、２．００ｅｑ）を０℃で加え、混合物を５分間撹拌した。次に、１８（４５０ｍｇ、１．３９ｍｍｏｌ、１．００ｅｑ）を０℃で加え、混合物を室温で一晩撹拌した。水および酢酸エチルを加え、相を分離し、水相を酢酸エチル（２回）で抽出した。合わせた有機相を飽和ＮａＨＣＯ３水溶液で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、溶媒を減圧下で蒸発させた。

【0559】

逆相クロマトグラフィーによる精製で５７（３００ｍｇ、４５％）が得られた。

【0560】

実施例５８
（（６－（５－（２－アミノアセトアミド）ピリジン－２－イル）－１，２，４，５－テトラジン－３－イル）メチル）ホスホン酸（５８）の合成

【化80】

【0561】

５７（２００ｍｇ、４１５μｍｏｌ、１．００ｅｑ）のＤＭＦ（１ｍＬ）溶液に、０℃でトリメチルシリルブロミド（２７４μＬ、２．０８ｍｍｏｌ、５．００ｅｑ）を加え、混合物を室温で一晩撹拌した。ＭｅＯＨおよび水を加え、溶媒を減圧下で蒸発させた。

【0562】

逆相カラムクロマトグラフィーによる精製で５８（６６．０ｍｇ、４９％）が得られた。

【0563】

実施例５９
（（６－（５－（（３Ｒ，４Ｓ，７Ｓ，１０Ｓ）－４－（（Ｓ）－ｓｅｃ－ブチル）－３－（２－（（Ｓ）－２－（（１Ｒ，２Ｒ）－３－（（（１Ｓ，２Ｒ）－１－ヒドロキシ－１－フェニルプロパン－２－イル）アミノ）－１－メトキシ－２－メチル－３－オキソプロピル）ピロリジン－１－イル）－２－オキソエチル）－７，１０－ジイソプロピル－５，１１－ジメチル－６，９，１２，１９－テトラオキソ－２－オキサ－１５，１６－ジチア－５，８，１１，２０－テトラアザドコサン－２２－アミド）ピリジン－２－イル）－１，２，４，５－テトラジン－３－イル）メチル）ホスホン酸（５９）の合成

【化81】

【0564】

４７（１０．０ｍｇ，１１．０μｍｏｌ，１．００ｅｑ）およびＨＡＴＵ（４．１７ｍｇ，１１．０μｍｏｌ，１．００ｅｑ）のＤＭＦ（０．５ｍＬ）溶液にトリエチルアミン（１．５３μＬ，１１．０μｍｏｌ，１．００ｅｑ）を加え、混合物を室温で１時間撹拌した。その後、５８（５．３５ｍｇ，１３．２μｍｏｌ，１．２０ｅｑ）およびトリエチルアミン（１．５３μＬ，１１．０μｍｏｌ，１．００ｅｑ）を加え、混合物を室温で一晩撹拌し、直接ＨＰＬＣ精製にかけた。

【0565】

ＨＰＬＣによる精製で５９（１．７ｍｇ、１３％）が得られた。

【0566】

実施例６０
ｔｅｒｔ－ブチル（２－（（２－（６－（（ジエトキシホスホリル）メチル）－１，２，４，５－テトラジン－３－イル）ピリミジン－５－イル）アミノ）－２－オキソエチル）カルバメート（６０）の合成

【化82】

【0567】

Ｎ－Ｂｏｃ－グリシン（２５５ｍｇ、１．４６ｍｍｏｌ、２．００ｅｑ）のＴＨＦ（５ｍＬ）溶液に、Ｎ－メチルモルホリン（０．４０１ｍＬ、３．６４ｍｍｏｌ、５．００ｅｑ）およびイソブチルクロロホルメート（０．１８９ｍＬ、１．４６ｍｍｏｌ、２．００ｅｑ）を０℃で加え、混合物を５分間撹拌した。次に、５２（２３７ｍｇ、０．７２９ｍｍｏｌ、１．００ｅｑ）を加え、混合物を室温で一晩撹拌した。水および酢酸エチルを加え、相を分離し、水相を酢酸エチル（２回）で抽出した。合わせた有機相を飽和ＮａＨＣＯ３水溶液で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、溶媒を減圧下で蒸発させた。

【0568】

逆相カラムクロマトグラフィーによる精製で６０（１５２ｍｇ、４３％）が得られた。

【0569】

実施例６１
ジエチル（（６－（５－（２－アミノアセトアミド）ピリミジン－２－イル）－１，２，４，５－テトラジン－３－イル）メチル）ホスホネート（６１）の合成

【化83】

【0570】

６０（１３０ｍｇ、０．２６９ｍｍｏｌ、１．００ｅｑ）のＤＣＭ（２ｍＬ）溶液に、ＴＦＡ（２０８μｌ、２．７０ｍｍｏｌ、１０．０ｅｑ）を室温で加え、混合物を一晩撹拌した。溶媒を減圧下で除去した。

【0571】

蒸発により６１（７９ｍｇ、５９％）が得られた。

【0572】

実施例６２
（（６－（５－（２－アミノアセトアミド）ピリミジン－２－イル）－１，２，４，５－テトラジン－３－イル）メチル）ホスホン酸（６２）の合成

【化84】

【0573】

６１（６７．０ｍｇ、１３５μｍｏｌ、１．００ｅｑ）のＤＭＦ（０．５ｍＬ）溶液に、ＴＭＳ－Ｂｒ（１７８μＬ、１．３５ｍｍｏｌ、１０．０ｅｑ）を０℃で加え、混合物を室温で一晩撹拌した。ＭｅＯＨおよび水を加え、溶媒を減圧下で蒸発させた。

【0574】

逆相カラムクロマトグラフィーによる精製により、ＤＭＦとの混合物として６２（９２ｍｇ）が得られた。生成物は、そのまま次の反応に使用された。

【0575】

実施例６３
（（６－（５－（（３Ｒ，４Ｓ，７Ｓ，１０Ｓ）－４－（（Ｓ）－ｓｅｃ－ブチル）－３－（２－（（Ｓ）－２－（（１Ｒ，２Ｒ）－３－（（（１Ｓ，２Ｒ）－１－ヒドロキシ－１－フェニルプロパン－２－イル）アミノ）－１－メトキシ－２－メチル－３－オキソプロピル）ピロリジン－１－イル）－２－オキソエチル）－７，１０－ジイソプロピル－５，１１－ジメチル－６，９，１２，１９－テトラオキソ－２－オキサ－１５，１６－ジチア－５，８，１１，２０－テトラアザドコサン－２２－アミド）ピリミジン－２－イル）－１，２，４，５－テトラジン－３－イル）メチル）ホスホン酸（６３）の合成

【化85】

【0576】

ＤＭＦ（０．５ｍＬ）中の４７（１０．０ｍｇ、１１．０μｍｏｌ、１．００ｅｑ）およびＨＡＴＵ（４．１７ｍｇ、１１．０μｍｏｌ、１．００ｅｑ）の溶液にトリエチルアミン（１．５３μＬ、１１．０μｍｏｌ、１．００ｅｑ）を加え、混合物を室温で１時間撹拌した。その後、６２（５．３７ｍｇ、１３．１８μｍｏｌ、１．２０ｅｑ）トリエチルアミン（１．５３μＬ、１１．０μｍｏｌ、１．００ｅｑ）を加え、混合物を室温で一晩撹拌し、直接ＨＰＬＣ精製にかけた。

【0577】

ＨＰＬＣによる精製で６３（１．２ｍｇ、９％）が得られた。

【0578】

実施例６４
（６－（６－（５－（（３Ｒ，４Ｓ，７Ｓ，１０Ｓ）－４－（（Ｓ）－ｓｅｃ－ブチル）－３－（２－（（Ｓ）－２－（（１Ｒ，２Ｒ）－３－（（（１Ｓ，２Ｒ）－１－ヒドロキシ－１－フェニルプロパン－２－イル）アミノ）－１－メトキシ－２－メチル－３－オキソプロピル）ピロリジン－１－イル）－２－オキソエチル）－７，１０－ジイソプロピル－５，１１－ジメチル－６，９，１２－トリオキソ－２－オキサ－１５，１６－ジチア－５，８，１１－トリアザノナデカン－１９－アミド）ピリジン－２－イル）－１，２，４，５－テトラジン－３－イル）ピリジン－３－イル）ホスホン酸（６４）の合成

【化86】

【0579】

ＤＭＦ（０．５ｍＬ）中の４７（２．７５ｍｇ、３．０２μｍｏｌ、１．００ｅｑ）およびＨＡＴＵ（１．１５ｍｇ、３．０２μｍｏｌ、１．００ｅｑ）の溶液にトリエチルアミン（０．４２μＬ、３．０２μｍｏｌ、１．００ｅｑ）を加え、混合物を室温で１時間撹拌した。その後、３７（１．００ｍｇ、３．０２μｍｏｌ、１．００ｅｑ）およびトリエチルアミン（０．４２μＬ、３．０２μｍｏｌ、１．００ｅｑ）を加え、混合物を室温で一晩撹拌し、直接ＨＰＬＣ精製にかけた。

【0580】

ＨＰＬＣによる精製で６４（１ｍｇ、２７％）が得られた。

【0581】

実施例６５
（２Ｓ，３Ｓ，４Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）－６－（４－（（５Ｓ，８Ｓ，１１Ｓ，１２Ｒ）－１１－（（Ｓ）－ｓｅｃ－ブチル）－１２－（２－（（Ｓ）－２－（（１Ｒ，２Ｒ）－３－（（（１Ｓ，２Ｒ）－１－ヒドロキシ－１－フェニルプロパン－２－イル）アミノ）－１－メトキシ－２－メチル－３－オキソプロピル）ピロリジン－１－イル）－２－オキソエチル）－５，８－ジイソプロピルの合成ピル－４，１０－ジメチル－３，６，９－トリオキソ－２，１３－ジオキサ－４，７，１０－トリアザテトラデシル）－２－（３－（３－（６－（４－ホスホノフェニル）－１，２，４，５－テトラジン－３－イル）プロパンアミド）プロパンアミド）フェノキシ）－３，４，５－トリヒドロキシテトラヒドロ－２Ｈ－ピラン－２－カルボン酸（６５）

【化87】

【0582】

３２（２．００ｍｇ、４．９１μｍｏｌ、１．００ｅｑ）と４４（４．４４ｍｇ、３．９３μｍｏｌ、０．８００ｅｑ）のＤＭＦ（０．３ｍＬ）溶液にトリエチルアミン（０．７５３μＬ、５．４０μｍｏｌ、１．１０ｅｑ）を加え、混合物を室温で３時間撹拌し、直接ＨＰＬＣ精製にかけた。

【0583】

ＨＰＬＣによる精製で６５（４．４ｍｇ、６３％）が得られた。

【0584】

実施例６６
（２Ｓ，３Ｓ，４Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）－６－（４－（（（（１Ｓ，９Ｓ）－９－エチル－５－フルオロ－９－ヒドロキシ－４－メチル－１０，１３－ジオキソ－２，３，９，１０，１３，１５－ヘキサヒドロ－１Ｈ，１２Ｈ－ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２－ｂ］キノリン－１－イル）カルバモイル）オキシ）メチル）－２－（３－（４－（６－（ホスホノメチル）－１，２，４，５－テトラジン－３－イル）ベンズアミド）プロパンアミド）フェノキシ）－３，４，５－トリヒドロキシテトラヒドロ－２Ｈ－ピラン－２－カルボン酸（６６）の合成

【化88】

【0585】

１２（０．９２８ｍｇ、２．３６μｍｏｌ、１．００ｅｑ）と４５（２．００ｍｇ、２．３６μｍｏｌ、１．００ｅｑ）の溶液にトリエチルアミン（０．３６２μＬ、２．６０μｍｏｌ、１．１０ｅｑ）を加え、室温で３時間撹拌し、直接ＨＰＬＣ精製にかけた。

【0586】

ＨＰＬＣによる精製で６６（０．６ｍｇ、２３％）が得られた。

【0587】

実施例６７
（（６－（４－（（（Ｓ）－１－（（（Ｓ）－１－（（（Ｓ）－４－アミノ－１－（（４－（（５Ｓ、８Ｓ、１１Ｓ、１２Ｒ）－１１－（（Ｓ）－ｓｅｃ－ブチル）－１２－（２－（（Ｓ）－２－（（１Ｒ、２Ｒ）－３－（（（１Ｓ、２Ｒ）－１－ヒドロキシ－１－フェニルプロパン－２－イル）アミノ）－１－メトキシ－２－メチル－３－オキソプロピル）ピロリジン－１－イル）－２－オキソエチル）－５，８の合成－ジイソプロピル－４，１０－ジメチル－３，６，９－トリオキソ－２，１３－ジオキサ－４，７，１０－トリアザテトラデシル）フェニル）アミノ）－１，４－ジオキソブタン－２－イル）アミノ）－１－オキソプロパン－２－イル）アミノ）－１－オキソプロパン－２－イル）カルバモイル）フェニル）－１，２，４，５－テトラジン－３－イル）メチル）ホスホン酸（６７）

【化89】

【0588】

１２（１．４０ｍｇ、３．５６μｍｏｌ、１．００ｅｑ）と４６（４．００ｍｇ、３．５６μｍｏｌ、１．００ｅｑ）のＤＭＦ（０．５ｍＬ）溶液にトリエチルアミン（０．５４５μＬ、３．９１μｍｏｌ、１．１０ｅｑ）を加え、室温で３時間撹拌し、直接ＨＰＬＣ精製にかけた。

【0589】

ＨＰＬＣによる精製で６７（１．０ｍｇ、２０％）が得られた。

【0590】

実施例６８
３－（６－（（ジエトキシホスホリル）メチル）－１，２，４，５－テトラジン－３－イル）プロパン酸（６８）の合成

【化90】

【0591】

３－シアノプロピオン酸（４００ｍｇ、４．０４ｍｍｏｌ、１．００ｅｑ）、シアノメチルホスホン酸ジエチル（２．６１ｍＬ、１６．１ｍｍｏｌ、４．００ｅｑ）および３－メルカプトプロピオン酸（１．０６ｍＬ、１２．１ｍｍｏｌ、３．００ｅｑ）のＥｔＯＨ（１ｍＬ）溶液を、５０℃でヒドラジン一水和物（３．１３ｍＬ、６４．６ｍｍｏｌ、１６．０ｅｑ）に加え、混合物をこの温度で５時間撹拌した。その後、反応混合物を０℃に冷却し、Ｈ_２Ｏ中のＮａＮＯ_２（６．８６ｇ、８０．７ｍｍｏｌ、２０．０ｅｑ）を加え、１ＭＨＣｌａｑを滴下してｐＨ約３に酸性化した。形成された沈殿物を濾過し、水相を酢酸エチル（２回）で抽出した。合わせた有機相をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、溶媒を減圧下で蒸発させた。

【0592】

逆相カラムクロマトグラフィーによる精製で混合画分が得られた。生成物を含む画分を合わせ、溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣を水（５ｍＬ）に溶解した。形成された沈殿物を濾過し、濾液を凍結乾燥した。

【0593】

６８（１４０ｍｇ、１１％）がピンク色のオイルとして単離された。

【0594】

実施例６９
２，５－ジオキソピロリジン－１－イル３－（６－（（ジエトキシホスホリル）メチル）－１，２，４，５－テトラジン－３－イル）プロパノエート（６９）の合成

【化91】

【0595】

６８（１２０ｍｇ、０．３９４ｍｍｏｌ、１．００ｅｑ）およびＴＳＴＵ（１４２ｍｇ、０．４７３ｍｍｏｌ、１．２０ｅｑ）のＤＣＭ（０．５ｍＬ）溶液にＤＩＰＥＡ（８２．４μＬ、０．４７３ｍｍｏｌ、１．２０ｅｑ）を加え、混合物を室温で一晩撹拌した。溶媒を減圧下で蒸発させた。

【0596】

逆相カラムクロマトグラフィーによる精製で６９（８８．０ｍｇ、５６％）が得られた。

【0597】

実施例７０
４－（（Ｓ）－４－アミノ－２－（（Ｓ）－２－（（Ｓ）－２－（３－（６－（（ジエトキシホスホリル）メチル）－１，２，４，５－テトラジン－３－イル）プロパンアミド）プロパンアミド）プロパンアミド）－４－オキソブタンアミド）ベンジルの合成（（Ｓ）－１－（（（Ｓ）－１－（（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）－１－（（Ｓ）－２－（（１Ｒ，２Ｒ）－３－（（（１Ｓ，２Ｒ）－１－ヒドロキシ－１－フェニルプロパン－２－イル）アミノ）－１－メトキシ－２－メチル－３－オキソプロピル）ピロリジン－１－イル）－３－メトキシ－５－メチル－１－オキソヘプタン－４－イル）（メチル）アミノ）－３－メチル－１－オキソブタン－２－イル）アミノ）－３－メチル－１－オキソブタン－２－イル）（メチル）カルバメート（７０）

【化92】

【0598】

６９（１．４３ｍｇ，３．５６μｍｏｌ，１．００ｅｑ）と４６（４．００ｍｇ，３．５６μｍｏｌ，１．００ｅｑ）のＤＭＦ（０．３ｍＬ）溶液にトリエチルアミン（０．９９２μＬ，７．１２μｍｏｌ，２．００ｅｑ）を加え、混合物を室温で３時間撹拌し、直接ＨＰＬＣ精製にかけた。

【0599】

ＨＰＬＣによる精製で７０（１．８ｍｇ、３６％）が得られた。

【0600】

実施例７１
（２Ｓ，３Ｓ，４Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）－６－（４－（（５Ｓ，８Ｓ，１１Ｓ，１２Ｒ）－１１－（（Ｓ）－ｓｅｃ－ブチル）－１２－（２－（（Ｓ）－２－（（１Ｒ，２Ｒ）－３－（（（１Ｓ，２Ｒ）－１－ヒドロキシ－１－フェニルプロパン－２－イル）アミノ）－１－メトキシ－２－メチル－３－オキソプロピル）ピロリジン－１－イル）－２－オキソエチル）－５，８－ジイソプロピル－４，１０－ジメチル－３，６，９－トリオキソ－２，１３－ジオキサ－４，７，１０－トリアザテトラデシル）－２－（３－（３－（６－（（ジエトキシホスホリル）メチル）－１，２，４，５－テトラジン－３－イル）プロパンアミド）プロパンアミド）フェノキシ）－３，４，５－トリヒドロキシテトラヒドロ－２Ｈ－ピラン－２－カルボン酸（７１）

【化93】

【0601】

６９（１．５６ｍｇ、３．８９μｍｏｌ、１．１０ｅｑ）と４５（４．００ｍｇ、３．５４μｍｏｌ、１．００ｅｑ）のＤＭＦ（０．３ｍＬ）溶液にトリエチルアミン（０．９８６μＬ、７．０８μｍｏｌ、２．００ｅｑ）を加え、混合物を室温で３時間撹拌し、直接ＨＰＬＣ精製にかけた。

【0602】

ＨＰＬＣによる精製で７１（１．２ｍｇ、２４％）が得られた。

【0603】

実施例７２
（（６－（３，５－ビス（（（２，５－ジオキソピロリジン－１－イル）オキシ）カルボニル）フェニル）－１，２，４，５－テトラジン－３－イル）メチル）ホスホン酸（７２）の合成

【化94】

【0604】

１５（１３５ｍｇ、２２９μｍｏｌ、１．００ｅｑ）のＤＭＦ（２．２ｍＬ）溶液に、０℃でＴＭＳ－Ｂｒ（１５１μＬ、１．１４ｍｍｏｌ、５．００ｅｑ）を加え、混合物を室温で一晩撹拌した。水とＭｅＣＮを加え、混合物を逆相カラムクロマトグラフィーで直接精製した。

【0605】

逆相カラムクロマトグラフィーによる精製により、７２（１１．２ｍｇ、９％）がピンク色の固体として得られた。

【0606】

実施例７３
ジエチル（（６－（３，５－ビス（（（３Ｒ，４Ｓ，７Ｓ，１０Ｓ）－４－（（Ｓ）－ｓｅｃ－ブチル）－３－（２－（（Ｓ）－２－（（１Ｒ，２Ｒ）－３－（（（１Ｓ，２Ｒ）－１－ヒドロキシ－１－フェニルプロパン－２－イル）アミノ）－１－メトキシ－２－メチル－３－オキソプロピル）ピロリジン－１－イル）－２－オキソエチル）－７，１０－ジイソプロピル－５，１１－ジメチル－６，９，１２－トリオキソ－２，１５，１８，２１，２４，２７，３０，３３，３６－ノナオキサ－５，８，１１－トリアザオクタトリアコンタン－３８－イル）カルバモイル）フェニル）－１，２，４，５－テトラジン－３－イル）メチル）ホスホネートの合成（７３）

【化95】

【0607】

１６（２３．３ｍｇ，１８．７μｍｏｌ，１．００ｅｑ）とＭＭＡＥ（３２．３ｍｇ，４５．０μｍｏｌ，２．４０ｅｑ）のＤＭＦ（０．２ｍＬ）溶液に、ＨＡＴＵ（２１．４ｍｇ，５６．２μｍｏｌ，３．００ｅｑ）とトリエチルアミン（１３．０μＬ，９３．７μｍｏｌ，５．００ｅｑ）を加え、混合物を室温で２時間撹拌した。その後、水を加え、混合物を直接ＨＰＬＣ精製にかけた。

【0608】

ＨＰＬＣによる精製により、７３（２２．５ｍｇ，４５％）がピンク色のオイルとして得られた。

【0609】

実施例７４
（（６－（３，５－ビス（（（３Ｒ，４Ｓ，７Ｓ，１０Ｓ）－４－（（Ｓ）－ｓｅｃ－ブチル）－３－（２－（（Ｓ）－２－（（１Ｒ，２Ｒ）－３－（（（１Ｓ，２Ｒ）－１－ヒドロキシ－１－フェニルプロパン－２－イル）アミノ）－１－メトキシ－２－メチル－３－オキソプロピル）ピロリジン－１－イル）－２－オキソエチル）－７，１０－ジイソプロピル－５，１１－ジメチル－６，９，１２－トリオキソ－２，１５，１８，２１，２４，２７，３０，３３，３６－ノナオキサ－５，８，１１－トリアザオクタトリアコンタン－３８－イル）カルバモイル）フェニル）－１，２，４，５－テトラジン－３－イル）メチル）ホスホン酸（７４）の合成

【化96】

【0610】

７３（２２．０ｍｇ，８．３２μｍｏｌ，１．００ｅｑ）のＤＭＦ（０．２ｍＬ）溶液に、ＴＭＳ－Ｂｒ（１１．０μＬ，８３．２μｍｏｌ，１０．０ｅｑ）を０℃で加え、混合物を室温で６時間撹拌した。その後、ＴＭＳ－Ｂｒ２０μＬを加え、混合物を一晩撹拌した。その後、ＴＭＳ－Ｂｒ４０μＬを加え、混合物を８日間撹拌した。水を加え、混合物を直接ＨＰＬＣで精製した。

【0611】

ＨＰＬＣによる精製により、ピンク色の粉末として７４（３．５ｍｇ、１６％）が得られた。

【0612】

実施例７５
ジエチル（（６－（３，５－ビス（（２－アミノエチル）カルバモイル）フェニル）－１，２，４，５－テトラジン－３－イル）メチル）ホスホネート（７５）の合成

【化97】

【0613】

１，２－ジアミノエタン（４４．８μＬ、６７１μｍｏｌ、６．００ｅｑ）のＤＭＦ（０．６ｍＬ）溶液に、１５（６６．０ｍｇ、１１２μｍｏｌ、１．００ｅｑ）のＤＭＦ（０．６ｍＬ）溶液を加え、混合物を室温で１５分間撹拌した。その後、０．５ｍＬの１ＭＨＣｌａｑを加え、混合物を直接ＨＰＬＣで精製した。

【0614】

ＨＰＬＣによる精製により、ピンク色のオイルとして７５（８．０ｍｇ、１５％）が得られた。

【0615】

実施例７６
（（６－（３，５－ビス（（２－アミノエチル）カルバモイル）フェニル）－１，２，４，５－テトラジン－３－イル）メチル）ホスホン酸（７６）の合成

【化98】

【0616】

７５（８．００ｍｇ、１６．７μｍｏｌ、１．００ｅｑ）のＤＭＦ（０．２ｍＬ）溶液に、ＴＭＳ－Ｂｒ（４４．０μＬ、３３３μｍｏｌ、２０．０ｅｑ）を０℃で加え、混合物を室温で２時間撹拌した。水を加え、混合物を直接ＨＰＬＣで精製した。

【0617】

ＨＰＬＣによる精製により、７６（４．０ｍｇ、５７％）がピンク色の固体として得られた。

【0618】

実施例７７
３－（（３－（（（Ｓ）－１－（（（１４Ｓ，１６Ｓ，３２Ｒ，３３Ｓ，２Ｓ，４Ｓ，１０Ｅ，１２Ｅ，１４Ｒ）－８６－クロロ－１４－ヒドロキシ－８５，１４－ジメトキシ－３３，２，７，１０－テトラメチル－１２，６－ジオキソ－７－アザ－１（６，４）－オキサジナナ－３（２，３）－オキシラナ－８（１，３）－ベンゼンシクロテトラデカファン－１０，１２－ジエン－４－イル）オキシ）－１－オキソプロパン－２－イル）（メチル）アミノ）－３－オキソプロピル）ジスルファニル）プロパン酸（７７）の合成

【化99】

【0619】

３，３’－ジチオジプロピオン酸（１９．４ｍｇ、９２．３μｍｏｌ、２．００ｅｑ）とＨＡＴＵ（１７．５ｍｇ、４６．１μｍｏｌ、１．００ｅｑ）のＤＭＦ（０．５ｍＬ）溶液にＤＩＰＥＡ（８．０４μＬ、４６．１μｍｏｌ、１．００ｅｑ）を加え、混合物を室温で１時間撹拌した。その後、メイタンシノール－Ａｌａ（３０．０ｍｇ、４６．１μｍｏｌ、１．００ｅｑ）とＤＩＰＥＡ（８．０４μＬ、４６．１μｍｏｌ、１．００ｅｑ）を加え、反応混合物を室温で一晩撹拌し、直接ＨＰＬＣ精製にかけた。

【0620】

ＨＰＬＣによる精製で７７（１５．２ｍｇ、６８％）が得られた。

【0621】

実施例７８
（（６－（５－（３－（（３－（（（Ｓ）－１－（（（１４Ｓ、１６Ｓ、３２Ｒ、３３Ｓ、２Ｓ、４Ｓ、１０Ｅ、１２Ｅ、１４Ｒ）－８６－クロロ－１４－ヒドロキシ－８５、１４－ジメトキシ－３３、２、７、１０－テトラメチル－１２、６－ジオキソ－７－アザ－１（６、４）－オキサジナナ－３（２、３）－オキシラナ－８（１、３）－ベンゼンシクロテトラデカファン－１０、１２－ジエン－４－イル）オキシ）－１－オキソプロパン－２－イル）（メチル）アミノ）－３－オキソプロピル）ジスルファニル）プロパンアミド）ピリミジン－２－イル）－１、２、４、５－テトラジン－３－イル）メチル）ホスホン酸（７８）の合成

【化100】

【0622】

７７（８．００ｍｇ，９．５０μｍｏｌ，１．００ｅｑ）およびＨＡＴＵ（３．６１ｍｇ，９．５０μｍｏｌ，１．００ｅｑ）のＤＭＦ（０．５０ｍＬ）溶液にトリエチルアミン（１．３２μＬ，９．５０μｍｏｌ，１．００ｅｑ）を加え、混合物を室温で１時間撹拌した。その後、５３（３．８２ｍｇ，１４．２５μｍｏｌ，１．５０ｅｑ）およびトリエチルアミン（１．３２μＬ，９．５０μｍｏｌ，１．００ｅｑ）を加え、混合物を室温で３時間撹拌した。反応混合物を直接ＨＰＬＣ精製にかけた。

【0623】

ＨＰＬＣによる精製により７８（遊離７７との混合物）（３．２０ｍｇ（純度７５％）、２２％）が得られた。

【0624】

実施例７９
（（６－（２－（３－（（３－（（（Ｓ）－１－（（（１４Ｓ、１６Ｓ、３２Ｒ、３３Ｓ、２Ｓ、４Ｓ、１０Ｅ、１２Ｅ、１４Ｒ）－８６－クロロ－１４－ヒドロキシ－８５、１４－ジメトキシ－３３、２、７、１０－テトラメチル－１２、６－ジオキソ－７－アザ－１（６、４）－オキサジナナ－３（２、３）－オキシラナ－８（１、３）－ベンゼンシクロテトラデカファン－１０、１２－ジエン－４－イル）オキシ）－１－オキソプロパン－２－イル）（メチル）アミノ）－３－オキソプロピル）ジスルファニル）プロパンアミド）エチル）－１、２、４、５－テトラジン－３－イル）メチル）ホスホン酸（７９）の合成

【化101】

【0625】

７７（７．２０ｍｇ，８．５５μｍｏｌ，１．００ｅｑ）およびＨＡＴＵ（３．２５ｍｇ，８．５５μｍｏｌ，１．００ｅｑ）のＤＭＦ（０．５０ｍＬ）溶液にトリエチルアミン（１．１９μＬ，８．５５μｍｏｌ，１．００ｅｑ）を加え、混合物を室温で１時間撹拌した。その後、５０（３．８２ｍｇ，１４．２５μｍｏｌ，１．５０ｅｑ）およびトリエチルアミン（１．１９μＬ，８．５５μｍｏｌ，１．００ｅｑ）を加え、混合物を室温で３時間撹拌した。反応混合物を直接ＨＰＬＣ精製にかけた。

【0626】

ＨＰＬＣによる精製で７９（０．９０ｍｇ、１０％）が得られた。

【0627】

Ｃ）ＡＤＣの調製と細胞毒性アッセイ
調製例１ トラスツズマブＡ１３２ＴＣＯ^＊Ａの調製
トラスツズマブＡ１３２ＴＣＯ^＊Ａは、バキュロウイルスベースの形質導入システムを利用して昆虫細胞（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞、Ｓｆ２１）で発現された。したがって、Ａ１３２位にアンバー終止コドンとＣ末端６－Ｈｉｓタグを含むトラスツズマブの重鎖遺伝子を、ｐＡＣＥＢａｃ－ＤＵＡＬプラスミド（たとえばＷＯ２０１７／０９３２５４に記載されている）の第１マルチクローニングサイトにクローニングした。トラスツズマブの軽鎖遺伝子は、プラスミドの第２マルチクローニングサイトに、それ以上の改変なしでクローニングした。

【0628】

得られたプラスミド、ｐＡＣＥＢａｃＤＵＡＬ－トラスツズマブヘビーＡ１３２ＴＡＧ－６Ｈｉｓ－ライトは、ＮＥＳ－ＰｙｌＲＳ^ＡＦの発現カセット（例えばＷＯ２０１８／０６９４８１に記載されている）とＵ６（Ｓｆ２１）－ｔＲＮＡ^Ｐｙｌ（例えばＷＯ２０１７／０９３２５４に記載されている）をＢａｃｍｉｄのバックボーンに持つＢａｃｍｉｄを含むＤＨ１０ＭｕｌｔｉＢａｃ－ＴＡＧ細胞に形質転換された。形質転換の結果、プラスミドがＢａｃｍｉｄ－ＤＮＡに組み込まれる。Ｂａｃｍｉｄ－ＤＮＡを調製した後、昆虫細胞（Ｓｆ２１細胞）にＢａｃｍｉｄ－ＤＮＡをトランスフェクトした。３日後、Ｖ０ウイルスを収穫し、新鮮なＳｆ２１細胞のバッチに形質導入して、Ｖ１ウイルスを生成した。このウイルスを使用して、大規模な発現培養（リットルスケール）に形質導入した。ＴＣＯ^＊Ａ－Ｌｙｓを添加した後、発現を４日間行った。細胞はＢｅｃｋｍａｎローター（ＪＬＡ８．１０００）を使用して５００ｒｃｆで４℃で１時間採取した。

【0629】

細胞を溶解緩衝液（４ｘＰＢＳ、０．２ｍＭＴＣＥＰ、１ｍＭＰＭＳＦ、５ｍＭイミダゾール、ｐＨ８）に再懸濁し、氷上で３０秒間超音波処理を３回行った。固定角ローター（ＪＡ２５．５０、Ｂｅｃｋｍａｎ）で２７１４３．１ＲＣＦで４℃で１時間遠心分離した後、澄んだ溶解液をロッカー上でニッケルビーズ上で４℃で１時間インキュベートした。ニッケルビーズをポリプロピレン（ＰＰ）カラム（Ｑｉａｇｅｎ、カタログ番号：３４９６４）に集め、１０ｎＭイミダゾールを含む溶解緩衝液で洗浄した。溶解緩衝液中の５００ｍＭイミダゾールを使用して、ニッケルビーズからトラスツズマブを溶出させた。溶出画分は、緩衝液（０．０２ＭＮａ２ＰＯ４、０．１５ＭＮａＣｌ、ｐＨ７．２）で平衡化したＭａｂＳｅｌｅｃｔＰｒｉｓｍＡカラムにロードされた。緩衝液Ａで洗浄工程の後、トラスツズマブは、１００％緩衝液Ｂ（０．１Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ３．２）までの勾配を使用してカラムから溶出された。溶出試料を中和するために１ＭＴｒｉｓｐＨ１０を含む画分が収集された。ＳＤＳ－ＰＡＧＥで画分を分析した後、トラスツズマブを含む画分をプールし、アミコンフィルターデバイス（３０ｋＤａカットオフ）を使用して濃縮した。試料は、１ｘＰＢＳ緩衝液で平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘＳ２００（１０／３０）カラムを使用してさらに精製された。画分が収集され、ＳＤＳ－ＰＡＧＥで分析された。対応する画分を濃縮した後、試料は細胞毒性ペイロードによる標識に使用された。

【0630】

調製例２ トラスツズマブ－ＴＣＯ^＊Ａ－５の調製
１０ｎｍｏｌのトラスツズマブＡ１３２ＴＣＯ^＊Ａを１ｘＰＢＳで４０ｎｍｏｌのホスホネート－テトラジン－ＭＭＡＥ（５）とともに３７℃で６００ｒｐｍで１時間振とうしながらインキュベートした。反応ミックスをフィルター装置（Ａｍｉｃｏｎフィルター装置、３０ｋＤａカットオフ）で１ｘＰＢＳで洗浄し、未反応の薬剤を除去した。ＡＤＣは、１ｘＰＢＳで平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘＩｎｃｒｅａｓｅＳ２００カラムを使用したサイズ排除クロマトグラフィーによってさらに精製された（図２Ａ）。収集した画分はＳＤＳ－ＰＡＧＥで分析し、クマシーブルーで染色した（図２Ｂ）。ＡＤＣを含む画分をプールし、Ａｍｉｃｏｎフィルター装置で濃縮した。

【0631】

調製例３ トラスツズマブ－ＴＣＯ^＊Ａ－１１の調製
１０ｎｍｏｌトラスツズマブＡ１３２ＴＣＯ^＊Ａを１ｘＰＢＳで４０ｎｍｏｌホスホネート－テトラジン－Ｖａｌ－Ａｌａ－ＰＡＢ－ＭＭＡＥ（１１）とともに３７Ｃ°で６００ｒｐｍで１時間振とうしながらインキュベートした。反応ミックスをフィルター装置（Ａｍｉｃｏｎフィルター装置、３０ｋＤａカットオフ）で１ｘＰＢＳで洗浄し、未反応の薬剤を除去した。ＡＤＣは、１ｘＰＢＳで平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘＩｎｃｒｅａｓｅＳ２００カラムを使用したサイズ排除クロマトグラフィーによってさらに精製された（図３Ａ）。収集した画分はＳＤＳ－ＰＡＧＥで分析し、クマシーブルーで染色した（図３Ｂ）。ＡＤＣを含む画分をプールし、Ａｍｉｃｏｎフィルター装置で濃縮した。

【0632】

Ｄ）細胞毒性アッセイ
アッセイ例１ 細胞毒性アッセイ
乳がん細胞株ＳＫ－ＢＲ－３の細胞を、ＡＤＣ適用の２日前に黒色の９６ウェルプレートに５０００細胞／ウェルで播種した。さまざまなＡＤＣまたはＡｂ（ネガティブコントロールとして）の濃度は５μＭに調整した。０～１００ｎＭの範囲で連続希釈液を調製した。９６ウェルプレートから培地を吸引し、ＡＤＣまたはＡｂの希釈液で置き換えた。ＡＤＣとして、トラスツズマブＡ１３２ＴＣＯ^＊Ａ－５およびトラスツズマブＡ１３２ＴＣＯ^＊Ａ－１１に加え、改変のないトラスツズマブＷＴもテストした。５日間培養した後、プレートをインキュベーターから取り出し、室温で３０分間温め、各ウェルに１００μｌのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）２．０Ｃｅｌｌ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を加えた。プレートをロッカーで５０ｒｐｍで２分間振とうし、室温で１０分間培養した。次に、プレートリーダーを使用して発光信号を読み取った。発光信号は、時点０ｎＭ（ネガティブコントロール）での測定値に正規化された。図４のプロットは、異なる濃度（Ｍ）での２つのＡＤＣとトラスツズマブＷＴの正規化された発光信号を示している。

【0633】

この説明で相互参照されている文書の内容は参照により組み込まれる。

【図1】

【図2A】

【図2B】

【図3A】

【図3B】

【図4】

【国際調査報告】