特表 2024-546773 ＬＲＲＣ１５抗原結合ドメインを含む多重特異性Ｔ細胞エンゲージャー

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-12-26

(54)【発明の名称】ＬＲＲＣ１５抗原結合ドメインを含む多重特異性Ｔ細胞エンゲージャー

(51)【国際特許分類】

   C07K 16/28 20060101AFI20241219BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20241219BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20241219BHJP

   C12N 15/13 20060101ALN20241219BHJP

   C07K 14/52 20060101ALN20241219BHJP

【ＦＩ】

C07K16/28 ZNA

A61P35/00

A61K39/395 N

C12N15/13

C07K14/52

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024534536

(86)(22)【出願日】2022-12-12

(85)【翻訳文提出日】2024-08-08

(86)【国際出願番号】 CN2022138466

(87)【国際公開番号】W WO2023104214

(87)【国際公開日】2023-06-15

(31)【優先権主張番号】202111509659.6

(32)【優先日】2021-12-10

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】521437839

【氏名又は名称】スーヂョウ ゼルゲン バイオファーマシューティカルズ カンパニー， リミテッド

【氏名又は名称原語表記】ＳＵＺＨＯＵ ＺＥＬＧＥＮ ＢＩＯＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬＳ ＣＯ．， ＬＴＤ．

【住所又は居所原語表記】Ｎｏ． ２０９ Ｃｈｅｎｆｅｎｇ Ｒｏａｄ， Ｙｕｓｈａｎ Ｔｏｗｎ， Ｋｕｎｓｈａｎ， Ｓｕｚｈｏｕ， Ｊｉａｎｇｓｕ ２１５３００， Ｃｈｉｎａ

(71)【出願人】

【識別番号】522185151

【氏名又は名称】シャンハイ ゼルゲン ファーマ．テック カンパニー，リミテッド

【氏名又は名称原語表記】ＳＨＡＮＧＨＡＩ ＺＥＬＧＥＮ ＰＨＡＲＭＡ．ＴＥＣＨ ＣＯ．，ＬＴＤ．

【住所又は居所原語表記】Ｂｕｉｌｄｉｎｇ ３，９９９ Ｃａｉｌｕｎ Ｒｏａｄ，Ｃｈｉｎａ（Ｓｈａｎｇｈａｉ）Ｐｉｌｏｔ Ｆｒｅｅ Ｔｒａｄｅ Ｚｏｎｅ，Ｐｕｄｏｎｇ Ｎｅｗ Ａｒｅａ，Ｓｈａｎｇｈａｉ ２０１２０３，Ｃｈｉｎａ

(74)【代理人】

【識別番号】110003971

【氏名又は名称】弁理士法人葛和国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】リン，フォン

(72)【発明者】

【氏名】ヂャン，ビン

(72)【発明者】

【氏名】ダイ，トンチョン

(72)【発明者】

【氏名】ション，ジャッキー

(72)【発明者】

【氏名】ルー，ビンファ

(72)【発明者】

【氏名】ション，ズーリン

【テーマコード（参考）】

4C085

4H045

【Ｆターム（参考）】

4C085AA13

4C085AA14

4C085BB11

4C085BB36

4C085BB41

4C085BB42

4C085DD62

4C085EE01

4C085GG01

4H045AA10

4H045AA30

4H045BA09

4H045CA40

4H045DA01

4H045DA76

4H045EA20

4H045EA50

4H045FA74

(57)【要約】

本発明は、多重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（Ｔ Ｃｅｌｌｓ Ｅｎｇａｇｅｒｓ）及びその応用に関する。具体的には、本発明は、標的腫瘍細胞の表面で高度に発現されたロイシンリッチリピート含有タンパク質１５（ＬＲＲＣ１５）分子の第１の標的ドメインを含む同時に、結合Ｔ細胞表面ＣＤ分子の第２の標的ドメイン及び／又は第３の標的ドメインをさらに含む、多重特異性Ｔ細胞エンゲージャーを提供する。本発明のＬＲＲＣ１５関連多重特異性Ｔ細胞エンゲージャーは、Ｔ細胞を効果的に活性化し且つ腫瘍のマトリックス影響を減少させることができ、腫瘍治療として、特にＬＲＲＣ１５高発現腫瘍の効果的な治療剤として使用されることができる。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

多重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（Ｔ Ｃｅｌｌｓ Ｅｎｇａｇｅｒｓ）であって、
前記多重特異性Ｔ細胞エンゲージャーは、
一つ又は複数のＬＲＲＣ１５抗原結合ドメインを含む第１の標的ドメインと、
ＣＤ３、ＣＤ２８、ＣＤ４０、又はＣＤ１３７からなる群から選択される標的タンパク質に結合する第２の標的ドメインと、及び／又は
ＣＤ３、ＣＤ２８、ＣＤ４０、又はＣＤ１３７からなる群から選択される標的タンパク質に結合する任意選択の第３の標的ドメインと、を含むことを特徴とする、前記多重特異性Ｔ細胞エンゲージャー。

【請求項2】

前記標的ドメインは、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、断片可変（Ｆｖ）ヘテロ二量体、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、Ｆａｂ断片、ＴｒｉＦａｂ又はその組み合わせの形態であることを特徴とする
請求項１に記載の多重特異性Ｔ細胞エンゲージャー。

【請求項3】

前記ＬＲＲＣ１５抗原結合ドメインは、配列番号１、２、３、４又は５３に示されるようなアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有する重鎖可変領域と、及び配列番号５、６、７、８又は５４に示されるようなアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有する軽鎖可変領域とを含むことを特徴とする
請求項１に記載の多重特異性Ｔ細胞エンゲージャー。

【請求項4】

前記ＬＲＲＣ１５抗原結合ドメインは、配列番号１に示されるような重鎖可変領域と、及び配列番号５に示されるような軽鎖可変領域とを含むことを特徴とする
請求項３に記載の多重特異性Ｔ細胞エンゲージャー。

【請求項5】

前記ＬＲＲＣ１５抗原結合ドメインは、配列番号５３に示されるような重鎖可変領域と、及び配列番号５４に示されるような軽鎖可変領域とを含むことを特徴とする
請求項３に記載の多重特異性Ｔ細胞エンゲージャー。

【請求項6】

前記第２の標的ドメインは、ＣＤ３抗原結合ドメイン、ＣＤ２８抗原結合ドメイン、ＣＤ４０抗原結合ドメイン、ＣＤ１３７抗原結合ドメイン、ＣＤ４０Ｌ配列、又はＣＤ１３７Ｌ配列からなる群から選択されることを特徴とする
請求項１に記載の多重特異性Ｔ細胞エンゲージャー。

【請求項7】

前記第３の標的ドメインは、ＣＤ３抗原結合ドメイン、ＣＤ２８抗原結合ドメイン、ＣＤ４０抗原結合ドメイン、ＣＤ１３７抗原結合ドメイン、ＣＤ４０Ｌ配列、又はＣＤ１３７Ｌ配列からなる群から選択されることを特徴とする
請求項１に記載の多重特異性Ｔ細胞エンゲージャー。

【請求項8】

抗ＬＲＲＣ１５抗体又はその抗原結合断片であって、
前記抗体又はその抗原結合断片は、
配列番号３２、３５、３８、又は４１に示されるようなアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１、
配列番号３３、３６、３９、又は４２に示されるようなアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ２、及び
配列番号３４、３７、４０、又は４３に示されるようなアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ３のような三つの重鎖可変領域ＣＤＲと、
並びに、
配列番号４４又は４９に示されるようなアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、
配列番号４５、４７、又は５０に示されるようなアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ２、及び
配列番号４６、４８、５１、又は５２に示されるようなアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ３のような三つの軽鎖可変領域ＣＤＲとを含むことを特徴とする、前記抗ＬＲＲＣ１５抗体又はその抗原結合断片。

【請求項9】

請求項１に記載の多重特異性Ｔ細胞エンゲージャーの用途であって、
癌／腫瘍を治療するための薬物の調製に使用されることを特徴とする、前記用途。

【請求項10】

前記癌／腫瘍は、ＬＲＲＣ１５高発現癌／腫瘍であることを特徴とする
請求項９に記載の用途。

【請求項11】

免疫複合体であって、
前記複合体は、
（ｉ）請求項１に記載の多重特異性Ｔ細胞エンゲージャー、又は請求項８に記載の抗体又はその抗原結合断片と、及び
（ｉｉ）検出可能なマーカー、薬物、毒素、サイトカイン、放射性核種、又は酵素からなる群から選択されるカップリング部分とを含むことを特徴とする、前記免疫複合体。

【請求項12】

医薬組成物であって、
前記医薬組成物は、（ａ）請求項１に記載の多重特異性Ｔ細胞エンゲージャー、又は請求項８に記載の抗体又はその抗原結合断片と、及び（ｂ）薬学的に許容される担体とを含むことを特徴とする、前記医薬組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、癌治療の分野に関し、より具体的には、癌の治療に使用される、抗ＬＲＲＣ１５抗体又はその免疫応答断片を含む多重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（Ｔ Ｃｅｌｌｓ Ｅｎｇａｇｅｒｓ）に関する。

【背景技術】

【0002】

癌は、通常、異常な細胞の成長に関する疾患として定義され、体の他の部分に侵入又は拡散される可能性がある。従来の癌治療は、癌組織を除去し且つその拡散を防ぐことを目指す。このような治療の選択には、手術、化学療法、放射線療法、ホルモン療法、標的療法及び緩和治療が含まれる。通常、癌の種類、位置及びレベル並びに患者の健康及び好みに従って治療される。しかし、これらの療法は、無効であり、特に癌が転移した場合があるため、制限されている。さらに、化学療法及び放射線療法は、細胞毒性に関連する一連の副作用がある。

【0003】

現在、抗体を使用した標的療法を含む、癌治療の見通しがある。別の見通しのある分野は、免疫系攻撃及び腫瘍細胞を殺傷する治療方法を開発することである。

【0004】

ロイシンリッチリピート含有タンパク質１５（Ｌｅｕｃｉｎｅ－ｒｉｃｈ ｒｅｐｅａｔ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ、ＬＲＲＣ１５）は、ＬＲＲ（ロイシンリッチリピート含有タンパク質）のスーパーファミリーのメンバーである。ＬＲＲＣ１５は、乳がん、脳腫瘍、膵臓がん、肺がん、黒色腫、高浸潤性肉腫、乳がん骨転移等を含む腫瘍細胞での発現が比較的高いが、正常細胞での発現が比較的低い。さらに、それは、多くの固形腫瘍（例えば、乳房、頭頚部、肺、膵臓）の間質線維芽細胞でも高レベルで発現される。従って、ＬＲＲＣ１５は、例えば抗体薬物複合体、Ｔ細胞エンゲージャー及びＣＡＲ－Ｔ細胞等の標的療法の候補となる。

【0005】

ＣＤ３、ＣＤ２８及びＣＤ１３７は、Ｔ細胞上に存在する受容体である。Ｔ細胞は、ＣＤ３、ＣＤ２８及びＣＤ１３７を介して抗原提示細胞によって活性化され、これらの細胞は、それぞれＭＨＣのクラスＩ及びクラスＩＩの活性化シグナル、ＣＤ８０及びＣＤ８６並びに４－１ＢＢＬを利用する。ＣＤ３は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の一部であり、受容体のシグナル成分である。ＣＤ３には、イプシロン（ｅｐｓｉｌｏｎ）、デルタ（ｄｅｌｔａ）及びガンマ（ｇａｍｍａ）の三つのサブユニットがある。イプシロンは、デルタ及びゼータの両方に関連され、それらは、共同にシグナル伝達を担当する。ＣＤ３シグナルは、Ｔ細胞の活性化に必要なシグナル１であると見なされる。共受容体ＣＤ２８及びＣＤ１３７は、シグナル２であると見なされる。シグナル１及びシグナル２の両方は、Ｔ細胞の完全な活性化、増殖及び生存に必要なものである。

【0006】

ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）は、主に活性化されたＴ細胞によって発現される。ＣＤ４０Ｌは、抗原提示細胞（ＡＰＣ）上のＣＤ４０に結合し、それによってＡＰＣの活性化を誘導する。逆に、ＡＰＣは、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を引き起こす。ＣＤ４０及びＣＤ４０Ｌは、自然免疫及び獲得免疫をつなぐ共刺激分子である。

【0007】

様々な癌の治療に承認されている治療用モノクローナル抗体の数が増えているが、癌が成長し、及び転移に向けて進行する多くの異なる分子経路を考慮すると、これらの抗体に対する耐性がしばしば観察される。免疫系は、癌を予防する主要なメカニズムであるが、癌細胞は、免疫監視に抵抗する。従って、当技術分野では、改善された治療用結合アンタゴニスト又は抗体、ならびにこれらの試薬を用いて癌を治療する方法が緊急に必要とされている。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0008】

本発明は、ＬＲＲＣ１５抗原結合ドメインを含む二重／三重特異性Ｔ細胞エンゲージャーを提供する。二重／三重特異性Ｔ細胞エンゲージャー分子は、ＬＲＲＣ１５に結合し且つＣＤ（分化のクラスター）分子（例えば、ＣＤ３、ＣＤ２８、ＣＤ１３７及びＣＤ４０）を活性化することができる。本発明の抗体及び抗体複合体、その医薬組成物及び製品を使用して、癌等の疾患を治療する方法をさらに提供する。

【課題を解決するための手段】

【0009】

本発明の第１の態様は、多重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（Ｔ Ｃｅｌｌｓ Ｅｎｇａｇｅｒｓ）を提供し、前記多重特異性Ｔ細胞エンゲージャーは、
一つ又は複数のＬＲＲＣ１５抗原結合ドメインを含む第１の標的ドメインと、
ＣＤ３、ＣＤ２８、ＣＤ４０、又はＣＤ１３７からなる群から選択される標的タンパク質に結合する第２の標的ドメインと、及び／又は
ＣＤ３、ＣＤ２８、ＣＤ４０、又はＣＤ１３７からなる群から選択される標的タンパク質に結合する任意選択の第３の標的ドメインとを含む。

【0010】

別の好ましい例において、前記標的ドメインは、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、断片可変（Ｆｖ）ヘテロ二量体、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、Ｆａｂ断片、ＴｒｉＦａｂ又はその組み合わせの形態である。

【0011】

別の好ましい例において、前記ＬＲＲＣ１５抗原結合ドメインは、
配列番号３２、３５、３８、又は４１に示されるようなアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１、
配列番号３３、３６、３９、又は４２に示されるようなアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ２、及び
配列番号３４、３７、４０、又は４３に示されるようなアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ３のような三つの重鎖可変領域ＣＤＲと、
並びに、
配列番号４４又は４９に示されるようなアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、
配列番号４５、４７、又は５０に示されるようなアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ２、及び
配列番号４６、４８、５１、又は５２に示されるようなアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ３のような三つの軽鎖可変領域ＣＤＲとを含む。

【0012】

別の好ましい例において、前記ＬＲＲＣ１５抗原結合ドメインは、以下からなる群から選択される三つの重鎖可変領域ＣＤＲ（ＨＣＤＲ）及び三つの軽鎖可変領域ＣＤＲ（ＬＣＤＲ）を含む。

【表1】

【0013】

別の好ましい例において、前記ＬＲＲＣ１５抗原結合ドメインは、
配列番号３２に示されるようなアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１、
配列番号３３に示されるようなアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ２、及び
配列番号３４に示されるようなアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ３のような三つの重鎖可変領域ＣＤＲと、
並びに、
配列番号４４に示されるようなアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、
配列番号４５に示されるようなアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ２、及び
配列番号４６に示されるようなアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ３のような三つの軽鎖可変領域ＣＤＲとを含む。

【0014】

別の好ましい例において、前記ＬＲＲＣ１５抗原結合ドメインは、
配列番号３５に示されるようなアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１、
配列番号３６に示されるようなアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ２、及び
配列番号３７に示されるようなアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ３のような三つの重鎖可変領域ＣＤＲと、
並びに、
配列番号４４に示されるようなアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、
配列番号４７に示されるようなアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ２、及び
配列番号４８に示されるようなアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ３のような三つの軽鎖可変領域ＣＤＲとを含む。

【0015】

別の好ましい例において、前記ＬＲＲＣ１５抗原結合ドメインは、配列番号１、２、３、又は４に示されるようなアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有する重鎖可変領域と、並びに配列番号５、６、７、又は８に示されるようなアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有する軽鎖可変領域とを含む。

【0016】

別の好ましい例において、前記ＬＲＲＣ１５抗原結合ドメインは、配列番号１に示されるような重鎖可変領域と、及び配列番号５に示されるような軽鎖可変領域とを含む。

【0017】

別の好ましい例において、前記ＬＲＲＣ１５抗原結合ドメインは、配列番号２に示されるような重鎖可変領域と、及び配列番号６に示されるような軽鎖可変領域とを含む。

【0018】

別の好ましい例において、前記ＬＲＲＣ１５抗原結合ドメインは、配列番号３に示されるような重鎖可変領域と、及び配列番号７に示されるような軽鎖可変領域とを含む。

【0019】

別の好ましい例において、前記ＬＲＲＣ１５抗原結合ドメインは、配列番号４に示されるような重鎖可変領域と、及び配列番号８に示されるような軽鎖可変領域とを含む。

【0020】

別の好ましい例において、前記ＬＲＲＣ１５抗原結合ドメインは、配列番号５３に示されるような重鎖可変領域と、及び配列番号５４に示されるような軽鎖可変領域とを含む。

【0021】

別の好ましい例において、前記ＬＲＲＣ１５抗原結合ドメインは、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、又はその組み合わせからなる群から選択される。

【0022】

別の好ましい例において、前記ＬＲＲＣ１５抗原結合ドメインは、ｓｃＦｖである。

【0023】

別の好ましい例において、前記ＬＲＲＣ１５抗原結合ドメインは、Ｆａｂであり、それは、配列番号１、２、３、４又は５３に示されるような重鎖可変領域、及び配列番号５、６、７、８又は５４に示されるような軽鎖可変領域と、並びに
配列番号２６又は２８に示されるような重鎖定常領域ＣＨ１、及び配列番号３０又は３１に示されるような軽鎖定常領域ＣＬとを含む。

【0024】

別の好ましい例において、前記第２の標的ドメインは、ＣＤ３抗原結合ドメイン、ＣＤ２８抗原結合ドメイン、ＣＤ４０抗原結合ドメイン、ＣＤ１３７抗原結合ドメイン、ＣＤ４０Ｌ配列、又はＣＤ１３７Ｌ配列からなる群から選択される。

【0025】

別の好ましい例において、前記第３の標的ドメインは、ＣＤ３抗原結合ドメイン、ＣＤ２８抗原結合ドメイン、ＣＤ４０抗原結合ドメイン、ＣＤ１３７抗原結合ドメイン、ＣＤ４０Ｌ配列、又はＣＤ１３７Ｌ配列からなる群から選択される。

【0026】

別の好ましい例において、前記多重特異性Ｔ細胞エンゲージャーは、Ｆｃ断片をさらに含む。

【0027】

別の好ましい例において、前記Ｆｃ断片は、ＩｇＧ１又はＩｇＧ４に由来する。

【0028】

別の好ましい例において、前記Ｆｃ断片は、配列番号２７に示されるようなアミノ酸配列を有するＩｇＧ１に由来するＦｃ断片である。

【0029】

別の好ましい例において、前記ＩｇＧ１に由来するＦｃ断片は、Ｎ２９７Ａ、
Ｌ２３４Ｆ／Ｌ２３５Ｅ／Ｐ３３１Ｓ、
Ｙ３４９Ｃ／Ｋ３７０Ｅ／Ｋ４０９Ｄ／Ｋ４３９Ｅ、
Ｓ３５４Ｃ／Ｄ３５６Ｋ／Ｅ３５７Ｋ／Ｄ３９９Ｋ、
Ｓ３５４Ｃ／Ｔ３６６Ｗ、
Ｙ３４９Ｃ／Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ、
Ｌ２３４Ｆ／Ｌ２３５Ｅ／Ｐ３３１Ｓ／Ｙ３４９Ｃ／Ｋ３７０Ｅ／Ｋ４０９Ｄ／Ｋ４３９Ｅ、
Ｌ２３４Ｆ／Ｌ２３５Ｅ／Ｐ３３１Ｓ／Ｓ３５４Ｃ／Ｄ３５６Ｋ／Ｅ３５７Ｋ／Ｄ３９９Ｋ、
Ｌ２３４Ｆ／Ｌ２３５Ｅ／Ｐ３３１Ｓ／Ｓ３５４Ｃ／Ｔ３６６Ｗ、
Ｌ２３４Ｆ／Ｌ２３５Ｅ／Ｐ３３１Ｓ／Ｙ３４９Ｃ／Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ、
Ｎ２９７Ａ／Ｙ３４９Ｃ／Ｋ３７０Ｅ／Ｋ４０９Ｄ／Ｋ４３９Ｅ、
Ｎ２９７Ａ／Ｓ３５４Ｃ／Ｄ３５６Ｋ／Ｅ３５７Ｋ／Ｄ３９９Ｋ、
Ｎ２９７Ａ／Ｓ３５４Ｃ／Ｔ３６６Ｗ、
Ｎ２９７Ａ／Ｙ３４９Ｃ／Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ、及び／又は
Ｓ２６７Ｅ、Ｓ２６７Ｅ／Ｇ２３６Ｄ、Ｓ２６７Ｅ／Ｓ２３９Ｄ、Ｓ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆからなる群から選択される突然変異を有する。

【0030】

別の好ましい例において、前記Ｆｃ断片は、配列番号５７～６０のいずれかに示されるようなアミノ酸配列を有する。

【0031】

別の好ましい例において、前記Ｆｃ断片は、配列番号２９に示されるようなアミノ酸配列を有するＩｇＧ４に由来するＦｃ断片である。

【0032】

別の好ましい例において、前記ＩｇＧ４に由来するＦｃ断片は、
Ｙ３４９Ｃ／Ｋ３７０Ｅ／Ｒ４０９Ｄ／Ｋ４３９Ｅ、
Ｓ３５４Ｃ／Ｅ３５６Ｋ／Ｅ３５７Ｋ／Ｄ３９９Ｋ、
Ｓ３５４Ｃ／Ｔ３６６Ｗ、
Ｙ３４９Ｃ／Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ、及び／又は
Ｓ２２８Ｐ／Ｓ２６７Ｅ、
Ｓ２２８Ｐ／Ｓ２６７Ｅ／Ｇ２３６Ｄ、
Ｓ２２８Ｐ／Ｓ２６７Ｅ／Ｓ２３９Ｄ、
Ｓ２２８Ｐ／Ｓ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆからなる群から選択される突然変異を有する。

【0033】

別の好ましい例において、前記多重特異性Ｔ細胞エンゲージャーは、二重／三重特異性Ｔ細胞エンゲージャーである。

【0034】

別の好ましい例において、前記多重特異性Ｔ細胞エンゲージャーは、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーである。

【0035】

別の好ましい例において、前記二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーは、
一つ又は複数のＬＲＲＣ１５抗原結合ドメインを含む第１の標的ドメインと、及びＣＤ３抗原結合ドメインである第２の標的ドメインとを含む。

【0036】

別の好ましい例において、前記二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーは、
一つ又は複数のＬＲＲＣ１５抗原結合ドメインを含む第１の標的ドメインと、及びＣＤ４０抗原結合ドメインである第２の標的ドメインとを含む。

【0037】

別の好ましい例において、前記二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーは、
一つ又は複数のＬＲＲＣ１５抗原結合ドメインを含む第１の標的ドメインと、及びＣＤ１３７抗原結合ドメインである第２の標的ドメインとを含む。

【0038】

別の好ましい例において、前記二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーは、
一つ又は複数のＬＲＲＣ１５抗原結合ドメインを含む第１の標的ドメインと、及び一つ又は複数のＣＤ４０Ｌ配列である第２の標的ドメインとを含む。

【0039】

別の好ましい例において、前記二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーは、
一つ又は複数のＬＲＲＣ１５抗原結合ドメインを含む第１の標的ドメインと、及び一つ又は複数のＣＤ１３７Ｌ配列である第２の標的ドメインとを含む。

【0040】

別の好ましい例において、前記多重特異性Ｔ細胞エンゲージャーは、三重特異性Ｔ細胞エンゲージャーである。

【0041】

別の好ましい例において、前記三重特異性Ｔ細胞エンゲージャーは、
一つ又は複数のＬＲＲＣ１５抗原結合ドメインを含む第１の標的ドメインと、
ＣＤ３抗原結合ドメインである第２の標的ドメインと、及び
ＣＤ２８抗原結合ドメインである第３の標的ドメインとを含む。

【0042】

別の好ましい例において、前記多重特異性Ｔ細胞エンゲージャーは、三重特異性Ｔ細胞エンゲージャーである。

【0043】

別の好ましい例において、前記三重特異性Ｔ細胞エンゲージャーは、
一つ又は複数のＬＲＲＣ１５抗原結合ドメインを含む第１の標的ドメインと、
ＣＤ３抗原結合ドメインである第２の標的ドメインと、及び
ＣＤ４０抗原結合ドメインである第３の標的ドメインとを含む。

【0044】

別の好ましい例において、前記多重特異性Ｔ細胞エンゲージャーは、三重特異性Ｔ細胞エンゲージャーである。

【0045】

別の好ましい例において、前記三重特異性Ｔ細胞エンゲージャーは、
一つ又は複数のＬＲＲＣ１５抗原結合ドメインを含む第１の標的ドメインと、
ＣＤ３抗原結合ドメインである第２の標的ドメインと、及び
ＣＤ１３７抗原結合ドメインである第３の標的ドメインとを含む。

【0046】

別の好ましい例において、前記多重特異性Ｔ細胞エンゲージャーは、三重特異性Ｔ細胞エンゲージャーである。

【0047】

別の好ましい例において、前記三重特異性Ｔ細胞エンゲージャーは、
一つ又は複数のＬＲＲＣ１５抗原結合ドメインを含む第１の標的ドメインと、
ＣＤ３抗原結合ドメインである第２の標的ドメインと、及び
ＣＤ４０Ｌ配列である第３の標的ドメインとを含む。

【0048】

別の好ましい例において、前記三重特異性Ｔ細胞エンゲージャーは、
一つ又は複数のＬＲＲＣ１５抗原結合ドメインを含む第１の標的ドメインと、
ＣＤ３抗原結合ドメインである第２の標的ドメインと、及び
ＣＤ１３７Ｌ配列である第３の標的ドメインとを含む。

【0049】

別の好ましい例において、前記ＣＤ３抗原結合ドメインは、配列番号１１、９、１０、又は１２に示されるようなアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有する重鎖可変領域と、及び配列番号１３に示されるようなアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有する軽鎖可変領域とを含む。

【0050】

別の好ましい例において、前記ＣＤ３抗原結合ドメインは、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、又はその組み合わせからなる群から選択される。

【0051】

別の好ましい例において、前記ＣＤ２８抗原結合ドメインは、配列番号１４に示されるようなアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有する重鎖可変領域と、及び配列番号１５に示されるようなアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有する軽鎖可変領域とを含む。

【0052】

別の好ましい例において、前記ＣＤ２８抗原結合ドメインは、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、又はその組み合わせからなる群から選択される。

【0053】

別の好ましい例において、前記ＣＤ４０抗原結合ドメインは、配列番号１６に示されるようなアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有する重鎖可変領域と、及び配列番号１７に示されるようなアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有する軽鎖可変領域とを含む。

【0054】

別の好ましい例において、前記ＣＤ４０抗原結合ドメインは、配列番号５５に示されるようなアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、及び配列番号５６に示されるようなアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有する軽鎖可変領域とを含む。

【0055】

別の好ましい例において、前記ＣＤ４０抗原結合ドメインは、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、又はその組み合わせからなる群から選択される。

【0056】

別の好ましい例において、前記ＣＤ１３７抗原結合ドメインは、配列番号１８又は２０に示されるようなアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有する重鎖可変領域と、及び配列番号１９又は２１に示されるようなアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有する軽鎖可変領域とを含む。

【0057】

別の好ましい例において、前記ＣＤ１３７抗原結合ドメインは、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、又はその組み合わせからなる群から選択される。

【0058】

別の好ましい例において、前記ＣＤ４０Ｌ配列は、配列番号２３に示されるようなアミノ酸配列を有するＣＤ４０ＬのＲＢＤ受容体結合ドメイン配列である。

【0059】

別の好ましい例において、前記ＣＤ１３７Ｌ配列は、配列番号２５に示されるようなアミノ酸配列を有するＣＤ４０ＬのＲＢＤ受容体結合ドメイン配列である。

【0060】

別の好ましい例において、前記多重特異性Ｔ細胞エンゲージャーは、以下の式Ｉに示されるような構造を有し、

【化1】

式において、「－」は、それぞれ独立して、ペプチド結合又は連結ペプチドであり、

【化2】

は、ペプチド鎖間の連結結合である。

【0061】

ｓｃＦｖ１は、第１の標的ドメインであり、前記ｓｃＦｖ１は、抗ＬＲＲＣ１５ ｓｃＦｖであり、
ｓｃＦｖ２は、第２の標的ドメインであり、前記ｓｃＦｖ２は、抗ＣＤ３ ｓｃＦｖであり、
Ｆｃ１及びＦｃ２は、それぞれ独立して、Ｆｃ断片である。

【0062】

別の好ましい例において、前記抗ＬＲＲＣ１５ ｓｃＦｖは、配列番号１、２、３、４又は５３に示されるような重鎖可変領域と、及び配列番号５、６、７、８又は５４に示されるような軽鎖可変領域とを含む。

【0063】

別の好ましい例において、前記ＬＲＲＣ１５ ｓｃＦｖは、配列番号５３に示されるような重鎖可変領域と、及び配列番号５４に示されるような軽鎖可変領域とを含む。

【0064】

別の好ましい例において、前記抗ＣＤ３ ｓｃＦｖは、配列番号１１、９、１０、又は１２に示されるような重鎖可変領域と、及び配列番号１３に示されるような軽鎖可変領域とを含む。

【0065】

別の好ましい例において、前記抗ＣＤ３ ｓｃＦｖは、配列番号１１に示されるような重鎖可変領域と、及び配列番号１３に示されるような軽鎖可変領域とを含む。

【0066】

別の好ましい例において、前記Ｆｃ断片は、ＩｇＧ１又はＩｇＧ４に由来する。

【0067】

別の好ましい例において、前記Ｆｃ断片は、ＩｇＧ１に由来する。

【0068】

別の好ましい例において、前記Ｆｃ断片は、配列番号５７又は５８に示されるようなアミノ酸配列を有する。

【0069】

別の好ましい例において、前記Ｆｃ１は、配列番号５７に示されるようなアミノ酸配列を有し、前記Ｆｃ２は、配列番号５８に示されるようなアミノ酸配列を有する。

【0070】

別の好ましい例において、前記「ｓｃＦｖ１－ｓｃＦｖ２－Ｆｃ１」のアミノ酸配列は、配列番号６４に示されたとおりであり、前記「Ｆｃ２」のアミノ酸配列は、配列番号５８に示されたとおりである。

【0071】

別の好ましい例において、前記多重特異性Ｔ細胞エンゲージャーは、以下の式ＩＩに示されるような構造（図１Ａ－ｃ）を有し、

【化3】

式において、「－」は、それぞれ独立して、ペプチド結合又は連結ペプチドであり、

【化4】

は、ペプチド鎖間の連結結合である。

【0072】

ｓｃＦｖ１及びＦａｂ１は、第１の標的ドメインであり、前記ｓｃＦｖ１は、抗ＬＲＲＣ１５ ｓｃＦｖであり、前記Ｆａｂ１は、抗ＬＲＲＣ１５ Ｆａｂであり、
ｓｃＦｖ２は、第２の標的ドメインであり、前記ｓｃＦｖ２は、抗ＣＤ３ ｓｃＦｖであり、
Ｆｃ１及びＦｃ２は、それぞれ独立して、Ｆｃ断片である。

【0073】

別の好ましい例において、前記抗ＬＲＲＣ１５ ｓｃＦｖは、配列番号１、２、３、４又は５３に示されるような重鎖可変領域と、及び配列番号５、６、７、８又は５４に示されるような軽鎖可変領域とを含む。

【0074】

別の好ましい例において、前記抗ＬＲＲＣ１５ Ｆａｂは、配列番号１、２、３、４又は５３に示されるような重鎖可変領域と、及び配列番号５、６、７、８又は５４に示されるような軽鎖可変領域とを含む。

【0075】

別の好ましい例において、前記ＬＲＲＣ１５ ｓｃＦｖは、配列番号５３に示されるような重鎖可変領域と、及び配列番号５４に示されるような軽鎖可変領域とを含む。

【0076】

別の好ましい例において、前記抗ＬＲＲＣ１５ Ｆａｂは、配列番号２に示されるような重鎖可変領域と、及び配列番号６に示されるような軽鎖可変領域とを含む。

【0077】

別の好ましい例において、前記抗ＣＤ３ ｓｃＦｖは、配列番号１１、９、１０、又は１２に示されるような重鎖可変領域と、及び配列番号１３に示されるような軽鎖可変領域とを含む。

【0078】

別の好ましい例において、前記抗ＣＤ３ ｓｃＦｖは、配列番号１１に示されるような重鎖可変領域と、及び配列番号１３に示されるような軽鎖可変領域とを含む。

【0079】

別の好ましい例において、前記Ｆｃ断片は、ＩｇＧ１又はＩｇＧ４に由来する。

【0080】

別の好ましい例において、前記Ｆｃ断片は、ＩｇＧ１に由来する。

【0081】

別の好ましい例において、前記Ｆｃ断片は、配列番号５７又は５８に示されるようなアミノ酸配列を有する。

【0082】

別の好ましい例において、前記Ｆｃ１は、配列番号５７に示されるようなアミノ酸配列を有し、前記Ｆｃ２は、配列番号５８に示されるようなアミノ酸配列を有する。

【0083】

別の好ましい例において、前記「ｓｃＦｖ１－ｓｃＦｖ２－Ｆｃ１」のアミノ酸配列は、配列番号６４に示されたとおりである。

【0084】

別の好ましい例において、前記「Ｆａｂ１－Ｆｃ２」における「ＨＣ１（重鎖）－Ｆｃ２」アミノ酸配列は、配列番号８１に示されたとおりであり、「ＬＣ１（軽鎖）」のアミノ酸配列は、配列番号８４に示されたとおりである。

【0085】

別の好ましい例において、前記多重特異性Ｔ細胞エンゲージャーは、以下の式ＩＩＩに示されるような構造（図２Ａ－ｃ）を有し、

【化5】

式において、「－」は、それぞれ独立して、ペプチド結合又は連結ペプチドであり、

【化6】

は、ペプチド鎖間の連結結合である。

【0086】

Ｆａｂ１は、第１の標的ドメインであり、前記Ｆａｂ１は、抗ＬＲＲＣ１５ Ｆａｂであり、
ｓｃＦｖ３は、第２の標的ドメインであり、前記ｓｃＦｖ３は、抗ＣＤ４０ ｓｃＦｖであり、
Ｆｃ３は、Ｆｃ断片である。

【0087】

別の好ましい例において、前記

【化7】

は、ジスルフィド結合である。

【0088】

別の好ましい例において、前記抗ＬＲＲＣ１５ Ｆａｂは、配列番号１、２、３、４又は５３に示されるような重鎖可変領域と、及び配列番号５、６、７、８又は５４に示されるような軽鎖可変領域とを含む。

【0089】

別の好ましい例において、前記ＬＲＲＣ１５ Ｆａｂは、配列番号１に示されるような重鎖可変領域と、及び配列番号５に示されるような軽鎖可変領域とを含む。

【0090】

別の好ましい例において、前記抗ＣＤ４０ ｓｃＦｖは、配列番号１６に示されるような重鎖可変領域と、及び配列番号１７に示されるような軽鎖可変領域とを含む。

【0091】

別の好ましい例において、前記Ｆｃ断片は、ＩｇＧ１又はＩｇＧ４に由来する。

【0092】

別の好ましい例において、前記Ｆｃ断片は、ＩｇＧ１に由来する。

【0093】

別の好ましい例において、前記Ｆｃ断片は、配列番号５９又は６０に示されるようなアミノ酸配列を有する。

【0094】

別の好ましい例において、前記「Ｆａｂ１－Ｆｃ３－ｓｃＦｖ３」における「ＨＣ１（重鎖）－Ｆｃ３－ｓｃＦｖ３」のアミノ酸配列は、配列番号７０に示されたとおりであり、「ＬＣ１（軽鎖）」のアミノ酸配列は、配列番号８３に示されたとおりである。

【0095】

別の好ましい例において、前記前記多重特異性Ｔ細胞エンゲージャーは、以下の式ＩＶに示されるような構造（図３Ａ－ｃ）を有し、

【化8】

式において、「－」は、それぞれ独立して、ペプチド結合又は連結ペプチドであり、

【化9】

は、ペプチド鎖間の連結結合である。

【0096】

Ｆａｂ１は、第１の標的ドメインであり、前記Ｆａｂ１は、抗ＬＲＲＣ１５ Ｆａｂであり、
ｓｃＦｖ４は、第２の標的ドメインであり、前記ｓｃＦｖ４は、抗ＣＤ１３７ ｓｃＦｖであり、
Ｆｃ３は、Ｆｃ断片である。

【0097】

別の好ましい例において、前記

【化10】

は、ジスルフィド結合である。

【0098】

別の好ましい例において、前記抗ＬＲＲＣ１５ Ｆａｂは、配列番号１、２、３、４又は５３に示されるような重鎖可変領域と、及び配列番号５、６、７、８又は５４に示されるような軽鎖可変領域とを含む。

【0099】

別の好ましい例において、前記ＬＲＲＣ１５ Ｆａｂは、配列番号１に示されるような重鎖可変領域と、及び配列番号５に示されるような軽鎖可変領域とを含む。

【0100】

別の好ましい例において、前記抗ＣＤ１３７ ｓｃＦｖは、配列番号１８又は２０に示されるような重鎖可変領域と、及び配列番号１９又は２１に示されるような軽鎖可変領域とを含む。

【0101】

別の好ましい例において、前記抗ＣＤ１３７ ｓｃＦｖは、配列番号２０に示されるような重鎖可変領域と、及び配列番号２１に示されるような軽鎖可変領域とを含む。

【0102】

別の好ましい例において、前記Ｆｃ断片は、ＩｇＧ１又はＩｇＧ４に由来する。

【0103】

別の好ましい例において、前記Ｆｃ断片は、ＩｇＧ１に由来する。

【0104】

別の好ましい例において、前記別の好ましい例において、前記Ｆｃ断片は、配列番号５９又は６０に示されるようなアミノ酸配列を有する。

【0105】

別の好ましい例において、前記「Ｆａｂ１－Ｆｃ３－ｓｃＦｖ４」における「ＨＣ１（重鎖）－Ｆｃ３－ｓｃＦｖ４」のアミノ酸配列は、配列番号７７に示されたとおりであり、「ＬＣ１（軽鎖）」のアミノ酸配列は、配列番号８３に示されたとおりである。

【0106】

本発明の第２の態様は、抗ＬＲＲＣ１５抗体又はその抗原結合断片を提供し、前記抗体は、
配列番号３２、３５、３８、又は４１に示されるようなアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１、
配列番号３３、３６、３９、又は４２に示されるようなアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ２、及び
配列番号３４、３７、４０、又は４３に示されるようなアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ３のような三つの重鎖可変領域ＣＤＲと、
並びに、
配列番号４４又は４９に示されるようなアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、
配列番号４５、４７、又は５０に示されるようなアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ２、及び
配列番号４６、４８、５１、又は５２に示されるようなアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ３のような三つの軽鎖可変領域ＣＤＲとを含む。

【0107】

別の好ましい例において、前記抗ＬＲＲＣ１５抗体又はその抗原結合断片は、以下からなる群から選択される三つの重鎖可変領域ＣＤＲ（ＨＣＤＲ）及び三つの軽鎖可変領域ＣＤＲ（ＬＣＤＲ）を含む。

【表2】

【0108】

別の好ましい例において、前記抗ＬＲＲＣ１５抗体又はその抗原結合断片は、配列番号１、２、３、又は４に示されるようなアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有する重鎖可変領域と、及び配列番号５、６、７、又は８に示されるようなアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有する軽鎖可変領域とを含む。

【0109】

別の好ましい例において、前記抗ＬＲＲＣ１５抗体又はその抗原結合断片は、配列番号１に示されるような重鎖可変領域と、及び配列番号５に示されるような軽鎖可変領域とを含む。

【0110】

別の好ましい例において、前記抗ＬＲＲＣ１５抗体又はその抗原結合断片は、配列番号２に示されるような重鎖可変領域と、及び配列番号６に示されるような軽鎖可変領域とを含む。

【0111】

別の好ましい例において、前記抗ＬＲＲＣ１５抗体又はその抗原結合断片は、配列番号３に示されるような重鎖可変領域と、及び配列番号７に示されるような軽鎖可変領域とを含む。

【0112】

別の好ましい例において、前記抗ＬＲＲＣ１５抗体又はその抗原結合断片は、配列番号４に示されるような重鎖可変領域と、及び配列番号８に示されるような軽鎖可変領域とを含む。

【0113】

別の好ましい例において、前記抗ＬＲＲＣ１５抗体又はその抗原結合断片は、配列番号５３に示されるような重鎖可変領域と、及び配列番号５４に示されるような軽鎖可変領域とを含む。

【0114】

別の好ましい例において、前記抗体又はその抗原結合断片は、ヒト抗体、マウス抗体、ヒト化抗体又はキメラ抗体である。

【0115】

別の好ましい例において、前記抗体又はその抗原結合断片は、ヒト抗体である。

【0116】

本発明の第３の態様は、ポリヌクレオチドを提供し、前記ポリヌクレオチドは、本発明の第１の態様に記載の多重特異性Ｔ細胞エンゲージャー又は本発明の第２の態様に記載の抗体をコードする。

【0117】

本発明の第４の態様は、発現ベクターを提供し、前記発現ベクターは、本発明の第３の態様に記載のポリヌクレオチドを含む。

【0118】

別の好ましい例において、前記発現ベクターは、原核発現ベクター及び真核発現ベクターを含む。

【0119】

本発明の第５の態様は、宿主細胞を提供し、前記宿主細胞は、本発明の第４の態様に記載の発現ベクターを含むか、又はゲノムには本発明の第３の態様に記載のポリヌクレオチドが組み込まれる。

【0120】

別の好ましい例において、前記宿主細胞は、原核細胞又は真核細胞を含む。

【0121】

別の好ましい例において、前記宿主細胞は、大腸菌、酵母細胞、ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞、ＣＨＯ細胞からなる群から選択される。

【0122】

本発明の第６の態様は、癌／腫瘍を治療するための薬物の調製に使用される、本発明の第１の態様に記載の多重特異性Ｔ細胞エンゲージャーの用途を提供する。

【0123】

別の好ましい例において、前記癌／腫瘍は、ＬＲＲＣ１５高発現癌／腫瘍である。

【0124】

別の好ましい例において、前記癌／腫瘍は、固形腫瘍及び血液腫瘍を含む。

【0125】

別の好ましい例において、前記癌／腫瘍は、固形腫瘍である。

【0126】

別の好ましい例において、前記癌／腫瘍は、乳がん、頭頚部腫瘍、肺がん、膵臓がん、卵巣がん、黒色腫、神経膠芽腫、肉腫、骨がん、又はその組み合わせからなる群から選択される。

【0127】

本発明の第７の態様は、免疫複合体を提供し、前記複合体は、
（ｉ）本発明の第１の態様に記載の多重特異性Ｔ細胞エンゲージャー、又は本発明の第２の態様に記載の抗体又はその抗原結合断片と、及び
（ｉｉ）検出可能なマーカー、薬物、毒素、サイトカイン、放射性核種、又は酵素からなる群から選択されるカップリング部分とを含む。

【0128】

別の好ましい例において、前記複合体は、蛍光又は発光マーカー、放射性マーカー、ＭＲＩ（磁気共鳴画像法）又はＣＴ（コンピューターＸ線断層撮影法）造影剤、又は検出可能な生成物を生成できる酵素、放射性核種、生物毒素、サイトカイン（例えば、ＩＬ－２等）、抗体、抗体Ｆｃ断片、抗体ｓｃＦｖ断片、金ナノ粒子／ナノロッド、ウイルス粒子、リポソーム、ナノ磁性粒子、プロドラッグ活性化酵素（例えば、ＤＴ－ジアホラーゼ（ＤＴＤ）又はビフェニルヒドロラーゼ－様タンパク質（ＢＰＨＬ））、化学療法剤（例えば、シスプラチン）又は任意形態のナノ粒子等から選択される。

【0129】

本発明の第８の態様は、医薬組成物を提供し、前記医薬組成物は、（ａ）本発明の第１の態様に記載の多重特異性Ｔ細胞エンゲージャー、又は本発明の第２の態様に記載の抗体又はその抗原結合断片、及び（ｂ）薬学的に許容される担体とを含む。

【0130】

別の好ましい例において、前記医薬組成物は、注射剤形である。

【0131】

本発明の第９の態様は、必要とする被験者に本発明の第１の態様に記載の多重特異性Ｔ細胞エンゲージャーを投与することを含む、癌／腫瘍を治療する方法を提供する。

【0132】

別の好ましい例において、前記必要とする被験者は、ヒト又は非ヒト哺乳動物である。

【0133】

別の好ましい例において、前記癌／腫瘍は、ＬＲＲＣ１５高発現癌／腫瘍である。

【0134】

別の好ましい例において、前記癌／腫瘍は、固形腫瘍及び血液腫瘍を含む。

【0135】

別の好ましい例において、前記癌／腫瘍は、固形腫瘍である。

【0136】

別の好ましい例において、前記癌／腫瘍は、乳がん、頭頚部腫瘍、肺がん、膵臓がん、卵巣がん、黒色腫、神経膠芽腫、肉腫、骨がん、又はその組み合わせからなる群から選択される。

【発明の効果】

【0137】

本発明の範囲内で、本発明の上記の各技術的特徴と以下（例えば、実施例）に具体的に説明される各技術的特徴との間を、互いに組み合わせることにより、新しいまたは好ましい技術的解決策を構成することができることに理解されたい。スペースに限りがあるため、ここでは繰り返さない。

【図面の簡単な説明】

【0138】

【図1A-1D】図１Ａは、ＬＲＲＣ１５抗原結合ドメイン及びＣＤ３抗原結合ドメインから構成される三種の二重抗体構造形態（ａ－ｃ）、並びにＬＲＲＣ１５抗原結合ドメイン及びＣＤ３抗原結合ドメイン、ＣＤ２８抗原結合ドメインから構成される二種の三抗構造形態（ｄ－ｅ）を示し、 ここで、ａは、抗ＣＤ３ ｓｃＦｖと抗ＬＲＲＣ１５ Ｆａｂ（ＣＨ１－ＶＨ＋ＣＫ－ＶＬ）との組み合わせを示す抗体構造を示し、ここで、ＩｇＧ１ Ｆｃは、電荷対又はノブアンドホール（ｋｎｏｂ ａｎｄ ｈｏｌｅ）突然変異を通じてヘテロ二量体を形成し、ｂは、抗ＬＲＲＣ１５ ｓｃＦｖ及び抗ＣＤ３ ｓｃＦｖによって形成される抗体構造（ｓｃＦｖ－ｓｃＦｖ－Ｆｃ×Ｆｃ）を示し、ここで、ＩｇＧ１ Ｆｃは、電荷対又はノブアンドホール（ｋｎｏｂ ａｎｄ ｈｏｌｅ）突然変異を通じてヘテロ二量体を形成し、ｃは、抗ＬＲＲＣ１５ ｓｃＦｖ、抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ及び抗ＬＲＲＣ１５ Ｆａｂによって形成される分子構造（ｓｃＦｖ－ｓｃＦｖ－Ｆｃ×Ｆａｂ－Ｆｃ）を示し、ここで、ＩｇＧ１ Ｆｃは、電荷対又はノブアンドホール（ｋｎｏｂ ａｎｄ ｈｏｌｅ）突然変異を通じてヘテロ二量体を形成し、ｄは、抗ＬＲＲＣ１５ ｓｃＦｖ、抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ及び抗ＣＤ２８ Ｆａｂによって形成される分子構造（ｓｃＦｖ－ｓｃＦｖ－Ｆｃ×Ｆａｂ－Ｆｃ）を示し、ここで、ＩｇＧ１ Ｆｃは、電荷対又はノブアンドホール（ｋｎｏｂ ａｎｄ ｈｏｌｅ）突然変異を通じてヘテロ二量体を形成し、ｅは、抗ＣＤ２８ ｓｃＦｖ、抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ及び抗ＬＲＲＣ１５ Ｆａｂによって形成される分子構造（ｓｃＦｖ－ｓｃＦｖ－Ｆｃ×Ｆａｂ－Ｆｃ）を示し、ここで、ＩｇＧ１ Ｆｃは、電荷対又はノブアンドホール（ｋｎｏｂ ａｎｄ ｈｏｌｅ）突然変異を通じてヘテロ二量体を形成する。 図１Ｂは、１５３－Ｌ０６Ｃと名付けられる、図１Ａにおけるｂの例示的な二重特異性抗体構造を示す。 図１Ｃは、３１５－Ｌ０６Ｃ０８と名付けられる、図１Ａにおけるｃの例示的な二重特異性抗体構造を示す。 図１Ｄは、３１５－Ｌ０６と名付けられる、図１Ａにおけるａの例示的な二重特異性抗体を示す。

【図1E】図１Ｅは、２８３１５－Ｌ０６と名付けられる、図１Ａにおけるｅの例示的な三重特異性抗体を示す。

【図2A-2B】図２Ａは、ＬＲＲＣ１５抗原結合ドメイン及びＣＤ４０抗原結合ドメインから構成される四種の二重抗体構造形態を示し、 ここで、ａは、抗ＬＲＲＣ１５抗体及びＣＤ４０Ｌによって形成される分子構造（ＩｇＧ－ＲＢＤ×ＩｇＧ－ＲＢＤ）を示し、ｂは、抗ＬＲＲＣ１５抗体及びＣＤ４０Ｌによって形成される分子構造（ＩｇＧ－ｔｒｉｍｅｒｉｃ ＲＢＤ×Ｆａｂ－Ｆｃ）を示し、ｃは、抗ＬＲＲＣ１５抗体及び抗ＣＤ４０ ｓｃＦｖによって形成される分子構造（ＩｇＧ－ｓｃＦｖ×ＩｇＧ－ｓｃＦｖ）を示し、ｄは、抗ＣＤ４０抗体及び抗ＬＲＲＣ１５ ｓｃＦｖによって形成される分子構造（ＩｇＧ－ｓｃＦｖ×ＩｇＧ－ｓｃＦｖ）を示す。 図２Ｂは、１５４０－Ｌ０６と名付けられる、図２Ａにおけるｃの例示的な二重特異性抗体構造を示す。

【図2C-2E】図２Ｃは、１５４０Ｌ－Ｌ０６と名付けられる、図２Ａにおけるａの例示的な二重特異性抗体構造を示す。 図２Ｄは、１５４０ＴＬ－Ｌ０６と名付けられる、図２Ａにおけるｂの例示的な二重特異性抗体構造を示す。 図２Ｅは、４０１５－Ｌ０６と名付けられる、図２Ａにおけるｄの例示的な二重特異性抗体構造を示す。

【図3A-1】ＬＲＲＣ１５抗原結合ドメイン及びＣＤ１３７抗原結合ドメインから構成される四種の二重抗体構造形態を示し、 ここで、ａは、抗ＬＲＲＣ１５抗体及びＣＤ１３７Ｌによって形成される分子構造（ＩｇＧ－ＲＢＤ×ＩｇＧ－ＲＢＤ）を示し、ｂは、抗ＬＲＲＣ１５抗体及びＣＤ１３７Ｌによって形成される分子構造（ＩｇＧ－ｔｒｉｍｅｒｉｃ ＲＢＤ×Ｆａｂ－Ｆｃ）を示し、ｃは、抗ＬＲＲＣ１５抗体及び抗ＣＤ１３７ ｓｃＦｖによって形成される分子構造（ＩｇＧ－ｓｃＦｖ×ＩｇＧ－ｓｃＦｖ）を示し、ｄは、抗ＣＤ１３７抗体及び抗ＬＲＲＣ１５ ｓｃＦｖによって形成される分子構造（ＩｇＧ－ｓｃＦｖ×ＩｇＧ－ｓｃＦｖ）を示す。

【図3A-2】ＬＲＲＣ１５抗原結合ドメイン及びＣＤ１３７抗原結合ドメインから構成される四種の二重抗体構造形態を示し、 ここで、ａは、抗ＬＲＲＣ１５抗体及びＣＤ１３７Ｌによって形成される分子構造（ＩｇＧ－ＲＢＤ×ＩｇＧ－ＲＢＤ）を示し、ｂは、抗ＬＲＲＣ１５抗体及びＣＤ１３７Ｌによって形成される分子構造（ＩｇＧ－ｔｒｉｍｅｒｉｃ ＲＢＤ×Ｆａｂ－Ｆｃ）を示し、ｃは、抗ＬＲＲＣ１５抗体及び抗ＣＤ１３７ ｓｃＦｖによって形成される分子構造（ＩｇＧ－ｓｃＦｖ×ＩｇＧ－ｓｃＦｖ）を示し、ｄは、抗ＣＤ１３７抗体及び抗ＬＲＲＣ１５ ｓｃＦｖによって形成される分子構造（ＩｇＧ－ｓｃＦｖ×ＩｇＧ－ｓｃＦｖ）を示す。

【図3B-3D】図３Ｂは、１５ＢＢ－Ｌ０６と名付けられる、図３Ａにおけるｃの例示的な二重特異性抗体構造を示す。 図３Ｃは、１５ＢＢＬ－Ｌ０６と名付けられる、図３Ａにおけるａの例示的な二重特異性抗体構造を示す。 図３Ｄは、１５ＢＢＴＬ－Ｌ０６と名付けられる、図３Ａにおけるｂの例示的な二重特異性抗体構造を示す。

【図3E】図３Ｅは、ＢＢ１５－Ｌ０６と名付けられる、図３Ａにおけるｄの例示的な二重特異性抗体構造を示す。

【図4A-4B】図４Ａは、ヒトＬＲＲＣ１５を発現する細胞株に結合する抗ＬＲＲＣ１５抗体のＦＡＣＳ検出を示す。 図４Ｂは、マウスＬＲＲＣ１５を発現する細胞株に結合する抗ＬＲＲＣ１５抗体のＦＡＣＳ検出を示す。

【図4C-4D】図４Ｃは、カニクイザルＬＲＲＣ１５を発現する細胞株に結合する抗ＬＲＲＣ１５抗体のＦＡＣＳ検出を示す。 図４Ｄは、ヒトＬＲＲＣ１５を発現する細胞株に競合的に結合するＬＲＲＣ１５抗体間のＦＡＣＳ検出を示す。

【図5A】ＬＲＲＣ１５及びＣＤ３を標的とする二重特異性抗体（１５３－Ｌ０６Ｃ及び３１５－Ｌ０６Ｃ０８）の、ヒトＬＲＲＣ１５を発現する細胞株への結合のＦＡＣＳ検出を示す。

【図5B】ＬＲＲＣ１５及びＣＤ３を標的とする二重特異性抗体（１５３－Ｌ０６Ｃ及び３１５－Ｌ０６Ｃ０８）の、カニクイザルＬＲＲＣ１５を発現する細胞株への結合のＦＡＣＳ検出を示す。

【図6】二重特異性抗体（１５３－Ｌ０６Ｃ、３１５－Ｌ０６Ｃ０８）によるＰＢＭＣの刺激後、異なる抗体濃度に応じたＣＤ２５を発現するＴ細胞の比率の変化曲線を示す。

【図7】二重特異性抗体（１５３－Ｌ０６Ｃ、３１５－Ｌ０６Ｃ０８）によるＰＢＭＣの刺激後、異なる抗体濃度に応じたＰＢＭＣからのＩＦＮ－γ放出の変化曲線を示す。

【図8】二重特異性抗体（１５３－Ｌ０６Ｃ、３１５－Ｌ０６Ｃ０８）によるＴ細胞の刺激後、異なる抗体濃度に応じたＴ細胞を増殖する比率の変化曲線を示す。

【図9】二重特異性抗体（１５３－Ｌ０６Ｃ、３１５－Ｌ０６Ｃ０８）によるＰＢＭＣの刺激後、異なる抗体濃度に応じた標的細胞の殺傷比率の変化曲線を示す。

【図10-1】ＰＢＭＣを刺激してサイトカインを放出させる二重特異性抗体（１５３－Ｌ０６Ｃ、３１５－Ｌ０６Ｃ０８）の結果を示す。

【図10-2】ＰＢＭＣを刺激してサイトカインを放出させる二重特異性抗体（１５３－Ｌ０６Ｃ、３１５－Ｌ０６Ｃ０８）の結果を示す。

【図11】ＬＲＲＣ１５及びＣＤ１３７を標的とする二重特異性抗体（１５ＢＢ－Ｌ０６）と４－１ＢＢタンパク質との結合曲線、並びにＬＲＲＣ１５及びＣＤ４０を標的とする二重特異性抗体（１５４０－Ｌ０６）とＣＤ４０タンパク質との結合曲線のＥＬＩＳＡ検出を示す。

【図12】二重特異性抗体（１５ＢＢ－Ｌ０６）によるＰＢＭＣからのＩＬ－２放出を刺激した結果を示す。

【図13】二重特異性抗体（１５４０－Ｌ０６）によるＤＣからのＩＬ－１２ｐ４０放出を刺激した結果を示す。

【図14】二重特異性抗体（１５ＢＢ－Ｌ０６；１５４０－Ｌ０６によるＰＢＭＣからのサイトカイン（ＴＮＦ－α及びＩＬ－６）放出を刺激した結果を示す。

【図15A】投与期間中のＮＣＩ－Ｈ１６５０ ＰＢＭＣマウスにおける腫瘍体積の変化を示す。

【図15B】投与終了後のＮＣＩ－Ｈ１６５０ ＰＢＭＣマウスにおける各群間の腫瘍重量の比較を示す。

【図15C-15D】図１５Ｃは、１５３－Ｌ０６Ｃ又は１５ＢＢ－Ｌ０６の投与後のＭＣ３８モデルマウスにおける抗腫瘍効果を示す。 図１５Ｄは、１５４０－Ｌ０６の投与後のＭＣ３８モデルマウスにおける抗腫瘍効果を示す。

【図16】１５３－Ｌ０６及び３１５－Ｌ０６の殺傷効果の比較を示す。

【図17】１５３－Ｌ０６Ｃ、３１５－Ｌ０６Ｃ０８、３１５－Ｌ０８Ｃ０６及び２８３１５－Ｌ０６の間の殺傷効果の比較を示す。

【発明を実施するための形態】

【0139】

本発明者らは、広範囲かつ詳細な研究の結果、ＬＲＲＣ１５抗原結合ドメインを含む多重特異性Ｔ細胞エンゲージャーを予想外に初めて開発した。前記多重特異性Ｔ細胞エンゲージャーは、腫瘍細胞の表面で高発現的ロイシンリッチリピート含有タンパク質１５（ＬＲＲＣ１５）分子を標的とする第１の標的ドメインを含み、前記第１の標的ドメインは、ＬＲＲＣ１５抗体又はその抗原結合断片であり、同時に、Ｔ細胞の表面上のＣＤ分子に結合する第２の標的ドメイン及び／又は第３の標的ドメインをさらに含む。本発明の多重特異性Ｔ細胞エンゲージャーは、腫瘍細胞及びＴ細胞に同時に結合することができ、腫瘍治療として、特にＬＲＲＣ１５高発現腫瘍の効果的な治療剤として使用されることができる。
これに基づいて、本発明を完成させた。

【0140】

本明細書で使用されるように、「ロイシンリッチリピート含有タンパク質１５」又は「ＬＲＲＣ１５」という用語は、ヒトにおいてＬＲＲＣ１５遺伝子によってコードされるタンパク質を指す。ロイシンリッチリピート含有タンパク質（ＬＲＲ）のドメインは、自然免疫に関連するタンパク質に進化的に保存される。ＬＲＲＣ１５は、多くの固形腫瘍（例えば、乳房、頭頚部、肺、膵臓）のマトリックス間質線維芽細胞上、及び間葉起源の癌細胞のサブセット（例えば、肉腫、黒色腫、神経膠芽腫）上に直接発現されるが、ほとんどの正常組織では、発現が低いか、まったく発現しない。

【0141】

本明細書で使用されるように、「ＣＤ」、「分化のクラスター」又は「分化分子のクラスター」という用語は、ＣＤ３、ＣＤ２８及びＣＤ４０等の白血球を同定及び特徴付けるために使用できる細胞表面マーカーを指す。ＣＤ３は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）複合体のシグナル伝達成分である。Ｔ細胞の活性化にはＣＤ３が必要であるため、これを標的とする薬物（通常、モノクローナル抗体である）が、癌治療のための免疫刺激剤として研究されている。

【0142】

ＣＤ２８は、Ｔ細胞媒介免疫応答を生成するために必要な主要な共刺激分子である。そのリガンドＣＤ８０及びＣＤ８６と相互作用した後、ＣＤ２８は、活性化シグナルを伝達し、抗アポトーシスタンパク質の発現を引き起こし、且つＩＬ－２を含む様々なサイトカインの合成を増強する。ＣＤ２８共刺激受容体は、すべてのＴ細胞に存在する。他のＣＤ２８ファミリーメンバーＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１又はそのリガンドに対する抗体と比較して、ＣＤ２８に対するアゴニスト抗体は、臨床的に重篤な有害事象と関連しており、後者は、腫瘍免疫寛容を克服するチェックポイント阻害剤として作用し、癌免疫治療に使用されることができる。

【0143】

ＣＤ４０は、腫瘍壊死因子－Ｒ（ＴＮＦ－Ｒ）ファミリーに属する細胞表面受容体であり、Ｂ細胞及び樹状細胞等のＡＰＣ上で構成的に発現される。ＣＤ４０Ｌ（ＣＤ１５４）は、誘導性があり、且つ血小板、顆粒球、活性化Ｔ／Ｂ／ＮＫ細胞等の造血系細胞に限定されるＩＩ型膜貫通糖タンパク質である。ＣＤ４０Ｌは、ＣＤ４０に結合してＡＰＣを活性化し、その結果、ＣＤ８０、ＣＤ８６及び他の共刺激分子の上方制御をもたらし、ＣＤ８＋抗原特異性Ｔ細胞応答を刺激する。

【0144】

「Ｆｃ断片」又は「Ｆｃ」という用語は、抗原結合活性を有さないが、容易に結晶化することが最初に観察された抗体の部分を指し、従って、Ｆｃ断片（断片結晶化可能性を表わす）と名付けられる。このような断片は、対になったＣＨ２及びＣＨ３ドメインに対応し、エフェクター分子及び細胞と相互作用する抗体分子の一部である。本明細書に記載のＦｃ断片は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２及びＩｇＧ４抗体に由来することができる。特定の用途については、特定のＩｇＧサブクラスが好ましい場合がある。例えば、ＡＤＣＣ及びＣＤＣの媒介において、ＩｇＧ１は、ＩｇＧ２及びＩｇＧ４よりも効果的である。従って、エフェクター機能が望ましくない場合、ＩｇＧ２ Ｆｃが好ましい場合がある。しかしながら、ＩｇＧ２ Ｆｃ含有分子は、通常、ＩｇＧ１ Ｆｃ含有分子よりも調製が難しく、安定性が低い場合がある。一方、ＦｃγＲＩＩＢへの交差結合は、ＣＤ４０又はＣＤ１３７の共刺激シグナルを増強するために重要であるが、ＩｇＧ４の結合親和性は、ＩｇＧ１の結合親和性よりも約２倍高く、ＩｇＧ２の結合親和性よりも１０倍高い。Ｓ２６７Ｅ及びＬ３２８Ｆ等の突然変異は、ＩｇＧ ＦｃとＦｃγＲＩＩＢとの交差結合（ｃｏｓｓ－ｂｉｎｄｉｎｇ）をさらに増強する可能性がある。さらに、一つ又は複数の突然変異をＦｃに導入することによって、抗体のエフェクター機能を増加又は減少させることができる（例えば、Ｓｔｒｏｈｌ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．、２０：６８５－６９１、２００９を参照する）。

【0145】

本明細書で使用されるように、「抗体」または「免疫グロブリン」という用語は、二つの同一の軽鎖（Ｌ）および二つの同一の重鎖（Ｈ）で構成される、同じ構造的特徴を有する約１５００００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。各軽鎖は、一つの共有ジスルフィド結合によって重鎖に結合し、異なる免疫グロブリンアイソタイプの重鎖間でのジスルフィド結合の数は、異なる。各重鎖および軽鎖には、規則的な間隔で配置された鎖内ジスルフィド結合もある。各重鎖は、一端に可変領域（ＶＨ）があり、その後に複数の定常領域が続く。各軽鎖は、一端に可変領域（ＶＬ）を有し、別の端に定常領域を有し、軽鎖の定常領域は、重鎖の第１の定常領域に対向し、軽鎖の可変領域は、重鎖の可変領域に対向する。特定のアミノ酸残基は、軽鎖と重鎖との可変領域間で界面を形成する。

【0146】

本明細書で使用されるように、「可変」という用語は、抗体中の可変領域の特定の部分の配列が異なることを表し、それは、特定の抗原に対する様々な特定の抗体の結合および特異性を形成する。しかしながら、可変性は、抗体可変領域全体に均等に分散されていない。これは、軽鎖および重鎖の可変領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）または超可変領域と呼ばれる三つのフラグメントに集中する。可変領域のより保存された部分は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる。天然の重鎖および軽鎖の可変領域は、それぞれ、四つのＦＲ領域を含み、それらは、接続環を形成する三つのＣＤＲによって接続された大抵β－フォールディング構成にあり、場合によっては部分的なβフォールディング構造を形成することができる。各鎖のＣＤＲは、ＦＲ領域によって緊密に近接され、かつ別の鎖のＣＤＲとともに抗体の抗原結合部位を形成する（Ｋａｂａｔら、ＮＩＨ Ｐｕｂｌ．Ｎｏ．９１－３２４２、巻Ｉ、６４７～６６９ページ（１９９１）を参照する）。定常領域は、抗体の抗原への結合に直接関与するが、それらは、抗体の抗体依存性細胞毒性に関与する等、様々なエフェクター機能を示す。

【0147】

本出願の抗体は、ポリクローナル、モノクローナル、単一特異性、多重特異性、二重特異性、ヒト、ヒト化、霊長類化、キメラ及び単鎖抗体を含むが、これらに限定されない。本明細書に開示される抗体は、鳥類及び哺乳動物を含む任意の動物源に由来することができる。好ましくは、抗体は、ヒト、マウス、ロバ、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、ラマ、ウマ又はニワトリの抗体である。

【0148】

「抗体断片」又は「抗原結合断片」という用語は、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ、単鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦｖ）、単鎖抗体、ジスルフィド結合したＦｖｓ（ｓｄＦｖ）、ＶＬ又はＶＨドメインを含む断片、Ｆａｂ発現ライブラリーから生成された断片、及び抗イディオタイプ（ａｎｔｉ－Ｉｄ）抗体等の抗体の一部を指すために使用される。構造に関係なく、抗体断片は、すべて完全な抗体によって識別される同じ抗原に結合する。「抗体断片」という用語は、ＤＡＲＴ及び二重抗体を含む。「抗体断片」という用語は、免疫グロブリン可変領域を含む合成タンパク質又は遺伝子工学変換タンパク質をさらに含み、それは、特定の抗原に結合して複合体を形成することにより、抗体のように機能する。「単鎖断片可変領域」又は「ｓｃＦｖ」とは、免疫グロブリンの重鎖（ＶＨ）及び軽鎖（ＶＬ）の可変領域の融合タンパク質を指す。いくつかの態様において、前記ドメインは、１０～約２５個のアミノ酸の短いリンカーペプチドによって接続される。リンカーは、柔軟性を高めるためにグリシン、及び溶解度を高めるためにセリン又はスレオニンを豊富に含むことができ、ＶＨのＮ末端又はＶＬのＣ末端に接続することができ、逆でも同じである。定常領域の除去及びリンカーの導入にもかかわらず、このようなタンパク質は、依然として元の免疫グロブリンの特異性を保持している。ＩｇＧに関しては、標準的な免疫グロブリン分子は、分子量約２３０００ダルトンの二つの同一の軽鎖ポリペプチド及び分子量５３０００～７００００の二つの同一の重鎖ポリペプチドを含む。四つの鎖は、通常、「Ｙ」配置のジスルフィド結合によって接続され、ここで、軽鎖は、「Ｙ」の口から重鎖を囲み（ｂｒａｃｋｅｔ）且つ可変領域を通って伸びる。

【0149】

上記のように、可変領域により、抗体は、抗原上のエピトープを選択的に識別し且つ特異的に結合することができる。即ち、抗体のＶＬドメイン及びＶＨドメイン又は抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）のサブセット（ｓｕｂｓｅｔ）が結合して、三次元抗原結合部位を限定する可変領域を形成する。このような四次元抗体構造は、各Ｙ配置の各アームの末端に存在する抗原結合部位を形成する。より具体的には、当該抗原結合部位は、ＶＨ及びＶＬ鎖におけるそれぞれにある三つのＣＤＲ（即ち、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３）によって限定される。場合によっては、例えば、特定の免疫グロブリン分子は、ラクダ科動物種に由来するか、又はラクダ科動物の免疫グロブリンに基づいて操作される。又は、免疫グロブリン分子は、軽鎖を含まない重鎖のみ、又は重鎖を含まない軽鎖のみから構成されることができる。

【0150】

天然に存在する抗体において、各抗原結合ドメインに存在する六つのＣＤＲは、当該抗体が水性環境で三次元構造をとる際に「抗原結合ドメイン」を形成するように特異的に位置する、短い非連続アミノ酸である。「フレームワーク」ドメインと呼ばれる抗原結合ドメイン内の他のアミノ酸は、分子間の変動制がより小さい。フレームワーク領域は、主要にβ－フォールディング構造をとり、ＣＤＲは、ループを形成し、前記環の接続は、場合によってはβ－フォールディング構造の一部を形成する。従って、フレームワーク領域は、足場を形成する役割を果たし、当該足場は、鎖間の非共有結合性相互作用を通じてＣＤＲを正しい方向に配置される。配置されたＣＤＲによって形成される抗原結合ドメインは、免疫応答性抗原上のエピトープに相補的な表面を限定する。当該相補的な表面により、抗体とその関連エピトープ（ｃｏｇｎａｔｅ ｅｐｉｔｏｐｅ）との非共有結合が促進される。正確に限定されるため、当業者は、任意の所与の重鎖又は軽鎖可変領域について、それぞれＣＤＲ及びフレームワーク領域を含むアミノ酸を容易に同定することができる。

【0151】

本明細書で使用されるように、「軽鎖定常領域（ＣＬ）」という用語は、抗体軽鎖に由来するアミノ酸配列ＣＬ（配列番号３０又は３１）を含む。好ましくは、軽鎖定常領域は、定常κドメイン又は定常λドメインのうちの少なくとも一つを含む。

【0152】

本明細書で使用されるように、「重鎖定常領域（ＣＨ）」という用語は、免疫グロブリン重鎖に由来するアミノ酸配列を含む。重鎖定常領域を含むポリペプチドは、ＣＨ１ドメイン（配列番号２６又は２８）、ヒンジ領域（例えば、上部、中間及び／又は下部のヒンジ領域）ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン又はその変異体又は断片のうちの少なくとも一つを含む。重鎖定常領域は、それらのアミノ酸配列が天然に存在する免疫グロブリン分子とは異なるように修飾されることを理解されたい。

【0153】

本明細書で使用されるように、抗体、抗体断片又は抗体ドメインの「変異体」とは、（１）元の抗体、抗体断片又は抗体ドメインと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有する、及び（２）元の抗体、抗体断片又は抗体ドメインが特異的に結合する同じ標的に特異的に結合する、抗体、抗体断片又は抗体ドメインを指す。「少なくともｘ％同一」又は「少なくともｘ％同一性」の形態で配列同一性を表現する場合、そのような実施形態は、下限以上のあらゆる数値パーセンテージを含むことを理解されたい。さらに、本出願にアミノ酸配列が存在する場合、当該アミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の同一性を有することを開示又は含むと解釈されるべきであることを理解されたい。

【0154】

本発明の多重特異性分子の範囲内には、様々な組成物及び方法が含まれ、これらの組成物及び方法は、非対称ＩｇＧ様抗体（例えば、トリオマブ／クアドローマ（ｔｒｉｏｍａｂ／ｑｕａｄｒｏｍａ））、ボタンホール抗体（ｋｎｏｂｓ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅｓ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）、クロスモノクローナル抗体（Ｃｒｏｓｓ ＭＡｂ）、静電一致抗体、ＬＵＺ－Ｙ、鎖交換改変ドメイン（ＳＥＥＤ）体、Ｆａｂ交換抗体、対称ＩｇＧクラス抗体、ツーインワン抗体、架橋モノクローナル抗体、ｍＡｂ２、Ｃｏｖ Ｘ－ｂｏｄｙ、デュアル可変領域ドメイン（ＤＶＤ）－Ｉｇ融合タンパク質、ＩｇＧ様二重特異性抗体、Ｔｓ２Ａｂ、ＢｓＡｂ、ｓｃＦｖ／Ｆｃ融合、デュアル（ｓｃＦｖ）２－Ｆａｂｓ、Ｆ（ａｂ）２融合タンパク質、複動式又はＢｉｓ－Ｆａｂ、ドックアンドロック（Ｄｏｃｋ－ａｎｄ－Ｌｏｃｋ、ＤＮＬ）、Ｆａｂ－Ｆｖ、ｓｃＦｖ基抗体及び二重抗体基の抗体（例えば、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥｓ）、タンデム二重抗体（Ｔａｎｄａｂ）、ＤＡＲＴｓ、単鎖二重抗体、ＴＣＲ様抗体、ヒト血清アルブミンｓｃＦｖ融合タンパク質、ＣＯＭＢＯＤＩＥＳ及びＩｇＧ／ｎｏｎ－ＩｇＧ融合タンパク質を含む。

【0155】

本明細書で使用されるように、「多重特異性Ｔ細胞エンゲージャー」という語句は、異なる結合特異性を有する少なくとも二つの標的ドメインを含む分子を指し、ここで、少なくとも一つの標的ドメインは、Ｔ細胞表面抗原に特異的に結合する。いくつかの実施形態において、多重特異性阻害剤は、足場、及び異なる抗原又はエピトープを標的とする二つ又はそれ以上の免疫グロブリン抗原結合ドメインを含むポリペプチドである。特定の実施形態において、多重特異性Ｔ細胞エンゲージャーは、二重特異性抗体である。他のいくつかの実施形態において、多重特異性Ｔ細胞エンゲージャーは、三重特異性抗体である。

【0156】

本明細書で使用されるように、「二重特異性」という語句は、異なる結合特異性を有する少なくとも二つの標的ドメインを含む分子を指す。各標的ドメインは、標的分子に特異的に結合し、且つ標的分子に結合する際に標的分子の生物学的機能を阻害することができる。いくつかの実施形態において、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーは、二つ又はそれ以上のペプチドを有するポリマー分子である。いくつかの実施形態において、標的ドメインは、抗体の抗原結合ドメイン又はＣＤＲを含む。いくつかの実施形態において、標的ドメインは、標的タンパク質に特異的に結合するリガンド又はその断片を含む。いくつかの実施形態において、二重特異性阻害剤は、二重特異性抗体である。

【0157】

「二重特異性抗体」及び「二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー」という用語は、本明細書で交換可能に使用され、二種の異なる抗原（又はエピトープ）に特異的に結合できる抗体を指す。いくつかの実施形態において、二重特異性抗体は、二つの結合アーム（一対のＨＣ／ＬＣ）の一つで一つの抗原（又はエピトープ）に結合し、またその第２のアーム（別の一対のＨＣ／ＬＣ）で異なる抗原（又はエピトープ）に結合する、完全長抗体である。これらの実施形態において、二重特異性抗体は、二つの異なる抗原結合アーム（特異性及びＣＤＲ配列の両方において）を有し、それが結合する各抗原は、一価である。

【0158】

他のいくつかの実施形態において、二重特異性抗体は、二つの結合アーム（２対のＨＣ／ＬＣ）のそれぞれで二種の異なる抗原（又はエピトープ）に結合できる完全長抗体である。これらの実施形態において、二重特異性抗体は、二つの同一の抗原結合アームを有し、同じ特異性及び同じＣＤＲ配列を有し、それが結合する各抗原は、すべて二価である。

【0159】

「三重特異性抗体」及び「三重特異性Ｔ細胞エンゲージャー」という用語は、本明細書で交換可能に使用され、三つの異なる結合特異性を有する三つの標的ドメインを含む分子を指す。各標的ドメインは、すべて標的分子に特異的に結合し、且つ標的分子に結合する際に標的分子の生物学的機能を阻害することができる。いくつかの実施形態において、三重特異性アンタゴニストは、二つ又はそれ以上のペプチドを有するポリマー分子である。いくつかの実施形態において、標的ドメインは、抗体の抗原結合ドメイン又はＣＤＲを含む。いくつかの実施形態において、標的ドメインは、標的タンパク質に特異的に結合するリガンド又はその断片を含む。

【0160】

本発明の好ましい実施形態において、図１Ａにおけるａ－ｃに示されるような構造を有する、ＬＲＲＣ１５及びＣＤ３を標的とする二重特異性抗体が構築された。ａ構造の例示的な分子は、図１Ｄに示されたとおりであり、そのうちの抗ＣＤ３ ｓｃＦｖは、本発明に記載の任意の抗ＣＤ３抗体のＶＨ及びＶＬを使用して構築されたｓｃＦｖであり得、抗ＬＲＲＣ１５ Ｆａｂは、本発明に記載の任意の抗ＬＲＲＣ１５抗体のＶＨ及びＶＬを使用して構築されたＦａｂであり得る。ｂ構造の例示的な分子は、図１Ｂに示されたとおりであり、そのうちの抗ＬＲＲＣ１５ ｓｃＦｖは、本発明に記載の任意の抗ＬＲＲＣ１５抗体のＶＨ及びＶＬを使用して構築されたｓｃＦｖであり得、抗ＣＤ３ ｓｃＦｖは、本発明に記載の任意の抗ＣＤ３抗体のＶＨ及びＶＬを使用して構築されたｓｃＦｖであり得る。ｃ構造の例示的な分子は、図１Ｃに示されたとおりであり、そのうちの抗ＬＲＲＣ１５ ｓｃＦｖは、本発明に記載の任意の抗ＬＲＲＣ１５抗体のＶＨ及びＶＬを使用して構築されたｓｃＦｖであり得、抗ＣＤ３ ｓｃＦｖは、本発明に記載の任意の抗ＣＤ３抗体のＶＨ及びＶＬを使用して構築されたｓｃＦｖであり得、抗ＬＲＲＣ１５ Ｆａｂは、本発明に記載の任意の抗ＬＲＲＣ１５抗体のＶＨ及びＶＬを使用して構築されたＦａｂであり得る。

【0161】

本発明の別の好ましい実施形態において、図１Ａにおけるｄ－ｅに示されるような構造を有する、ＬＲＲＣ１５、ＣＤ３及びＣＤ２８を標的とする二重特異性抗体が構築された。ｅ構造の例示的な分子は、図１Ｅに示されたとおりであり、そのうちの抗ＣＤ２８ ｓｃＦｖは、本発明に記載の任意の抗ＣＤ２８抗体のＶＨ及びＶＬを使用して構築されたｓｃＦｖであり得、抗ＣＤ３ ｓｃＦｖは、本発明に記載の任意の抗ＣＤ３抗体のＶＨ及びＶＬを使用して構築されたｓｃＦｖであり得、抗ＬＲＲＣ１５ Ｆａｂは、本発明に記載の任意の抗ＬＲＲＣ１５抗体のＶＨ及びＶＬを使用して構築されたＦａｂであり得る。

【0162】

本発明の別の好ましい実施形態において、図２Ａにおけるａ－ｄに示されるような構造を有する、ＬＲＲＣ１５及びＣＤ４０を標的とする二重特異性抗体が構築された。ａ構造の例示的な分子は、図２Ｃに示されたとおりであり、そのうちの抗ＬＲＲＣ１５ Ｆａｂは、本発明に記載の任意の抗ＬＲＲＣ１５抗体のＶＨ及びＶＬを使用して構築されたＦａｂであり得、ＣＤ４０Ｌは、本発明に記載の任意のＣＤ４０Ｌであり得る。ｂ構造の例示的な分子は、図２Ｄに示されたとおりであり、そのうちの抗ＬＲＲＣ１５ Ｆａｂは、本発明に記載の任意の抗ＬＲＲＣ１５抗体のＶＨ及びＶＬを使用して構築されたＦａｂであり得、ＣＤ４０Ｌは、本発明に記載の任意のＣＤ４０Ｌであり得る。ｃ構造の例示的な分子は、図２Ｂに示されたとおりであり、そのうちの抗ＬＲＲＣ１５ Ｆａｂは、本発明に記載の任意の抗ＬＲＲＣ１５抗体のＶＨ及びＶＬを使用して構築されたＦａｂであり得、抗ＣＤ４０ ｓｃＦｖは、本発明に記載の任意の抗ＣＤ４０抗体のＶＨ及びＶＬを使用して構築されたｓｃＦｖであり得る。ｄ構造の例示的な分子は、図２Ｅに示されたとおりであり、そのうちの抗ＣＤ４０ Ｆａｂは、本発明に記載の任意の抗ＣＤ４０抗体のＶＨ及びＶＬを使用して構築されたＦａｂであり得、抗ＬＲＲＣ１５ ｓｃＦｖは、本発明に記載の任意の抗ＬＲＲＣ１５抗体のＶＨ及びＶＬを使用して構築されたｓｃＦｖであり得る。

【0163】

本発明の別の好ましい実施形態において、図３Ａにおけるａ－ｄに示されるような構造を有する、ＬＲＲＣ１５及びＣＤ１３７を標的とする二重特異性抗体が構築された。ａ構造の例示的な分子は、図３Ｃに示されたとおりであり、そのうちの抗ＬＲＲＣ１５ Ｆａｂは、本発明に記載の任意の抗ＬＲＲＣ１５抗体のＶＨ及びＶＬを使用して構築されたＦａｂであり得、ＣＤ１３７Ｌは、本発明に記載の任意のＣＤ１３７Ｌであり得る。ｂ構造の例示的な分子は、図３Ｄに示されたとおりであり、そのうちの抗ＬＲＲＣ１５ Ｆａｂは、本発明に記載の任意の抗ＬＲＲＣ１５抗体のＶＨ及びＶＬを使用して構築されたＦａｂであり得、ＣＤ１３７Ｌは、本発明に記載の任意のＣＤ１３７Ｌであり得る。ｃ構造の例示的な分子は、図３Ｂに示されたとおりであり、そのうちの抗ＬＲＲＣ１５ Ｆａｂは、本発明に記載の任意の抗ＬＲＲＣ１５抗体のＶＨ及びＶＬを使用して構築されたＦａｂであり得、抗ＣＤ１３７ ｓｃＦｖは、本発明に記載の任意の抗ＣＤ１３７抗体のＶＨ及びＶＬを使用して構築されたｓｃＦｖであり得る。ｄ構造の例示的な分子は、図３Ｅに示されたとおりであり、そのうちの抗ＣＤ１３７ Ｆａｂは、本発明に記載の任意の抗ＣＤ１３７抗体のＶＨ及びＶＬを使用して構築されたＦａｂであり得、抗ＬＲＲＣ１５ ｓｃＦｖは、本発明に記載の任意の抗ＬＲＲＣ１５抗体のＶＨ及びＶＬを使用して構築されたｓｃＦｖであり得る。

【0164】

本発明は、上記抗体又はその断片をコードするポリヌクレオチド分子をさらに提供する。本発明のポリヌクレオチドは、ＤＮＡ形態またはＲＮＡ形態であり得る。ＤＮＡ形態は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたは合成ＤＮＡを含む。ＤＮＡは、一本鎖または二本鎖であり得る。ＤＮＡは、コード鎖または非コード鎖であり得る。成熟ポリペプチドをコードするコード領域配列は、本発明の抗体のコード領域配列と同一であってもよく、又は縮重された変異体であってもよい。本明細書で使用されるように、本発明における「縮重された変異体」とは、本発明のポリペプチドと同じアミノ酸配列を有するが、コード領域に異なる配列を有する核酸配列をコードする核酸配列を指す。

【0165】

本発明の成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、成熟ポリペプチドのみをコードするコード配列、成熟ポリペプチドのコード配列および様々な追加のコード配列、成熟ポリペプチドのコード配列（および任意の追加のコード配列）および非コード配列を含む。

【0166】

「ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド」という用語は、このポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むか、または追加のコード配列および／または非コード配列を含むポリヌクレオチドをさらに含む。

【0167】

本発明は、前記配列とハイブリダイズし、二つの配列間で少なくとも５０％、好ましくは、少なくとも７０％、より好ましくは、少なくとも８０％の同一性を有するポリヌクレオチドにさらに関する。本発明は、特に、ストリンジェント条件下で本発明の前記ポリヌクレオチドとハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドに関する。本発明において、「ストリンジェント条件」とは、（１）例えば、０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６０oＣ等のより低いイオン強度およびより高い温度でのハイブリダイズおよび溶出、または（２）ハイブリダイズ中に、例えば、５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミド、０．１％子牛血清／０．１％フィコール（Ｆｉｃｏｌｌ）、４２oＣ等の変性剤の添加、または（３）二つの配列間の同一性が少なくとも９０％以上、より好ましくは、９５％以上である場合にのみおこるハイブリダイズを指す。さらに、ハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．９に示される成熟ポリペプチドと同じ生物学的機能及び活性を有する。

【0168】

本発明の抗体の全長ヌクレオチド配列またはそのフラグメントは、通常、ＰＣＲ増幅法、組換え法または人工合成法によって得ることができる。特にフラグメントの長さが短い場合、実行可能な方法は、人工合成法を使用して関連する配列を合成することである。一般に、最初に複数の小さなフラグメントを合成した後、接続して非常に長い配列のフラグメントを獲得する。さらに、重鎖のコード配列および発現タグ（例えば、６Ｈｉｓ）を融合させて、融合タンパク質を形成することができる。

【0169】

関連する配列を得られたら、組換え法を使用して、関連する配列を大量に得ることができる。通常、これは、それをベクターにクローニングし、次に細胞に形質転換し、次に従来の方法によって増殖した宿主細胞から関連する配列を単離することによって得られる。本発明に関与する生体分子（核酸、タンパク質等）は、単離された形態で存在する生体分子を含む。

【0170】

現在、完全に化学的合成によって本発明のタンパク質（またはそのフラグメントまたはその誘導体）をコードするＤＮＡ配列を得ることができる。次に、当該ＤＮＡ配列を当技術分野で知られている様々な既存のＤＮＡ分子（またはベクター等）および細胞に導入することができる。さらに、化学的合成によって突然変異を本発明のタンパク質配列に導入することができる。
本発明は、前記適切なＤＮＡ配列および適切なプロモーターまたは制御配列を含むベクターにさらに関する。これらのベクターは、タンパク質を発現できるように適切な宿主細胞に形質転換するために使用されることができる。

【0171】

宿主細胞は、例えば、細菌細胞等の原核細胞、または例えば、酵母細胞等の下等真核細胞、または例えば、哺乳動物細胞等の上等真核細胞であり得る。代表的な例としては、大腸菌、ストレプトマイセス、チャイニーズハムスター菌の細菌細胞、酵母などの真菌細胞、ドロソフィラＳ２またはＳｆ９の昆虫細胞、ＣＨＯ、ＣＯＳ７および２９３細胞の動物細胞等を含む。

【0172】

組換えＤＮＡによる宿主細胞の形質転換は、当業者に周知の従来の技術によって実施することができる。宿主が大腸菌などの原核生物である場合、ＤＮＡ吸収することができるコンピテント細胞は、指数増殖期の後にＣａＣｌ_２法で処理されることによって獲得され、使用される段階は、当技術分野でよく知られている。別の方法は、ＭｇＣｌ_２を使用することである。必要に応じて、エレクトロポレーションの方法によって、形質転換を行うこともできる。宿主が真核生物である場合、リン酸カルシウム共沈法，マイクロインジェクションおよびエレクトロポレーション等の従来の機械的方法、リポソームパッケージ等のようなＤＮＡトランスフェクション方法を選択することができる。

【0173】

得られた形質転換体を従来の方法で培養して、本発明の遺伝子がコードするポリペプチドを発現させることができる。使用される宿主細胞に応じて、培養に使用される培地は、様々な従来の培地から選択することができる。宿主細胞の増殖に適した条件下で培養する。宿主細胞が適切な細胞密度まで増殖した後、適切な方法（例えば、温度変換または化学的誘導）を使用して選択されたプロモーターを誘導し、細胞を一定期間さらに培養する。

【0174】

前記方法における組換えポリペプチドは、細胞内、または細胞膜で発現されるか、または細胞外に分泌されることができる。必要に応じて、物理的、化学的およびその他の特性を使用して、様々な単離方法で組換えされたタンパク質を単離および精製することができる。これらの方法は、当業者によく知られている。これらの方法の例は、従来の再生処理、タンパク質沈殿剤による処理（塩析法）、遠心分離、浸透圧滅菌、超処理、超遠心分離、モレキュラーシーブクロマトグラフィー（ゲルろ過）、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、高速液相クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）および他の様々な液体クロマトグラフィー技術ならびにこれらの方法の組み合わせを含むが、これらに限定されない。

【0175】

本発明の抗体は、単独で使用することができ、検出可能なマーカー（診断目的のために）、治療剤、ＰＫ（プロテインキナーゼ）修飾部分または任意のこれらの物質の組み合わせと結合またはカップリングすることができる。

【0176】

診断目的の検出可能なマーカーは、蛍光または発光マーカー、放射性マーカー、ＭＲＩ（核磁気共鳴画像法）またはＣＴ（コンピュータ断層撮影技術）造影剤、または検出可能な生成物を生成することができる酵素を含むが、これらに限定されない。

【0177】

カップリングできる治療剤は、インスリン、ＩＬ－２、インターフェロン、カルシトニン、ＧＨＲＨペプチド、腸ペプチド類似体、アルブミン、抗体断片、サイトカイン、およびホルモンを含むが、これらに限定されない。

【0178】

本発明は、組成物をさらに提供する。好ましい例において、前記組成物は、本発明の上記抗体またはその活性フラグメントまたはその融合タンパク質および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物である。通常、これらの物質を、毒性がなく、不活性で、薬学的に許容される水性ベクター媒体で処方することができ、ここで、ｐＨは、通常、約５～８、好ましくは、約６～８であり、ｐＨ値は、処方される物質の性質および治療される病症によって異なる。処方された医薬組成物は、従来の経路で投与されることができ、ここで、経口、呼吸器、腫瘍内、静脈内、または局所投与を含む（これらに限定されない）。

【0179】

本発明の医薬組成物は、癌／腫瘍、特に固形腫瘍、特にＬＣＲＲ１５の高発現を有する固形腫瘍を治療するために使用されることができる。

【0180】

本発明の医薬組成物は、安全かつ有効な量（例えば、０．００１～９９ｗｔ％、好ましくは、０．０１～９０ｗｔ％、より好ましくは、０．１～８０ｗｔ％）の本発明の上記モノクローナル抗体（またはその複合体）および薬学的に許容される担体または賦形剤を含む。このようなベクターは、生理食塩水、緩衝液、グルコース、水、グリセロール、エタノール、およびそれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない。薬物製剤は、投与方法と一致する必要がある。本発明の医薬組成物は、例えば、生理食塩水またはグルコースと他のアジュバントとを含む水溶液を使用して、従来の方法によって注射の形態で調製することができる。注射剤および溶液等の医薬組成物は、無菌条件下で調製する必要がある。有効成分の投与量は、治療有效量であり、例えば、毎日の約１μｇ／ｋｇ体重～約１０ｍｇ／ｋｇ体重である。さらに、本発明の医薬組成物は、他の治療剤とともに使用することもできる。

【0181】

医薬組成物を使用する場合、安全かつ有効な量の免疫複合体を哺乳動物に投与し、ここで、当該安全かつ有効な量は、通常、少なくとも約１０μｇ／ｋｇ体重であり、ほとんどの場合、約８ｍｇ／ｋｇ体重を超えなく、好ましくは、当該投与量は、約１０μｇ／ｋｇ体重～約１ｍｇ／ｋｇ体重である。もちろん，具体的な投与量は、投与経路および患者の健康状態等の要因を考慮する必要があり、これらは、すべて熟練した医師のスキル範囲内にある。

【0182】

本発明の主な利点は、次のとおりである。
（１）癌関連間質線維芽細胞（ＣＡＦｓ）は、ほとんどの固形腫瘍の微小環境の重要な構成要素であり、これらの細胞は、腫瘍細胞の成長をサポートし、腫瘍細胞外マトリックスの再構築に関与し、血管新生を促進し、腫瘍誘発性炎症を調節することにより、癌の進行を促進する。ＣＡＦｓは、癌マトリックス内でＣＤ４０を発現する免疫細胞及び内皮細胞等の他の細胞と共存する。このように、ＬＲＲＣ１５は、ＣＡＦで特異的に発現するため、即ち、当該標的に対して二重／三重抗体を設計して、免疫活性化シグナルを腫瘍マトリックスに届けることができ、それによりほとんどの固形腫瘍の治療においてコールド腫瘍をホット腫瘍に変換するのに役立つ。

【0183】

（２）一般的な腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）標的と比較して、様々な固形腫瘍及びＣＡＦｓ上でのＬＲＲＣ１５の発現により、本発明におけるＬＲＲＣ１５抗原結合ドメインを含む二重／三重特異性抗体の応用がより広範的になる。

【0184】

（３）腫瘍マトリックスの遮断効果により、通常のＴＡＡ標的二重抗体が免疫調節剤を腫瘍細胞の位置に直接運ぶことは困難である。しかし、一端がＣＡＦｓ上で標的発現されたＬＲＲＣ１５二重抗体は、もう一端を利用して活性化調節標的（例えば、ＴＮＦＲＳＦを標的とする）に結合する方法で、免疫細胞の活性化を誘導して腫瘍マトリックスで役割を果たすことが容易にできる。

【0185】

（４）本発明におけるＬＲＲＣ１５関連二重／三重抗体は、Ｔ細胞を効果的に活性化し、且つ腫瘍のマトリックス影響を軽減することができる。

【0186】

以下、本発明は、具体的実施例と併せてさらに説明される。これらの実施例は、本発明を説明するためにのみ使用され、本発明の範囲を限定するものではないことを理解されたい。以下の実施例において、具体的条件を示さない実験方法は、通常、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、分子クローニング：実験マニュアル（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９８９）に記載される条件等の従来の条件、またはメーカーによって提案された条件に従う。特に明記されない限り、パーセンテージおよび部数は、重量パーセンテージおよび重量部数で計算される。

【0187】

本発明の多重特異性Ｔ細胞エンゲージャーを調製するために使用される配列
ＬＲＲＣ１５抗体配列

【表3】

【0188】

【表4】

【0189】

ＣＤ３抗体配列

【表5】

【0190】

ＣＤ２８抗体配列

【表6】

【0191】

ＣＤ４０抗体配列

【表7】

【0192】

ＣＤ１３７抗体配列

【表8】

【0193】

ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）配列
ＣＤ４０ＬＲＢＤの変異体は、ＣＤ４０リガンド配列における１１２～２６１セグメント、１１３～２６１セグメント、１１６～２６１セグメント、１１７～２６１セグメント、１１９～２６１セグメント及び１２１～２６１セグメントのうちの一つを使用することができる。

【表9】

【0194】

ＣＤ１３７リガンド（ＣＤ１３７Ｌ）配列
ＣＤ１３７ＬＲＢＤの変異体は、ＣＤ１３７リガンド配列における５２～２４８セグメント、５８～２４８セグメント、７１～２４８セグメント、８０～２４８セグメント、８５～２４８セグメント、５２～２５４セグメント、５８～２５４セグメント、７１～２５４セグメント、８０～２５４セグメント及び８５～２５４セグメントのうちの一つを使用することができる。

【表10】

【0195】

ＩｇＧ１ ＣＨ 配列

【表11】

【0196】

前記Ｆｃ領域は、次の突然変異を含むことができる。

【表12】

【0197】

本発明の好ましい実施形態において、前記Ｆｃ領域は、以下の配列を有する。

【表13】

【0198】

ＩｇＧ４ ＣＨ 配列

【表14】

【0199】

前記Ｆｃ領域は、以下の突然変異を含むことができる。

【表15】

【0200】

ＣＬ配列

【表16】

【0201】

選択可能なリンカー配列

【表17】

【0202】

実施例１．抗ＬＲＲＣ１５抗体の調製及び検証
本発明のＬＲＲＣ１５抗体は、ファージライブラリーからスクリーニングされ、ファージスクリーニング技術は、（例えば、Ｋａｙ、Ｂ．Ｗｉｎｔｅｒ、Ｊ． ＆ ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ、Ｊ．（ｅｄｓ．）（１９９６）Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ ｏｆ Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ））を参照する。スクリーニングプロセス中に、特異的な結合分子は、ＥＬＩＳＡ及びＦＡＣＳの方法によって、ＬＲＲＣ１５の細胞外領域に対してスクリーニングされ、その後シーケンシングによって配列を確認する。最終的には、四つの候補抗体：Ｌ１５－０６、Ｌ１５－０８、Ｌ１５－０３及びＬ１５－０７が得られる。

【0203】

さらに、本発明のＬＲＲＣ１５抗体とＬＲＲＣ１５を発現するＣＨＯ細胞との結合能を試験する。ここで、ＬＲＲＣ１５を発現するＣＨＯ細胞は、ヒト、マウス、サルのＬＲＲＣ１５の全長配列遺伝子断片を完全遺伝子合成によって得られ、次いでそれぞれこれらの断片を安定的な発現ベクターの骨格に挿入して、発現プラスミドベクターが得られる。これら三種のプラスミドは、ＣＨＯ細胞をトランスフェクションし、ピューロマイシンの圧力下でモノクローナル細胞株がスクリーニングされ、即ち、本実施例で使用されるフローサイトメトリー検出細胞株である。

【0204】

ＬＲＲＣ１５発現ＣＨＯ細胞をＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ中０．５％ＢＳＡ）で洗浄し、且つ２Ｅ６細胞／ｍｌ及び段階希釈したＬＲＲＣ１５抗体で再懸濁する。再懸濁液を氷上で３０分間インキュベートし、次いでＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、且つ氷上で二次抗体を３０分間インキュベートする。再懸濁した細胞をＦＡＣＳ緩衝液で再度洗浄した後にフローサイトメトリーで検出する。測定された平均蛍光強度に基づいて、各種の抗体の最大有効濃度の半分（ＥＣ_５０）を測定する。

【0205】

当該分析の結果は、図４Ａ－Ｃに示されたとおりである。ヒトＬＲＲＣ１５を発現する細胞に対する四つの抗体の結合能は類似しているが、マウスＬＲＲＣ１５を発現する細胞に対する結合能は、かなり異なり、ここで、Ｌ１５－０６結合能が最も強く、次いではＬ１５－０８であり、Ｌ１５－０３が弱く、Ｌ１５－０７が最も弱い。さらに、四つの抗体は、すべて強力なサル交差結合能を有する。

【0206】

さらに、抗体結合に関する競合実験をさらに実行する。四つのモノクローナル抗体分子をＬＲＲＣ１５発現ＣＨＯ細胞に結合した後にビオチン（Ｂｉｏｔｉｎ）標識モノクローナル抗体分子を使用して去競合的に結合し、次いでＳＡ－ＦＩＴＣを使用してシグナル強度を検出し、シグナルが減少するほど、競合が強くなる。結果によると、Ｌ１５－０８は、Ｌ１５－Ｌ０６に対してほとんど競合効果を有さないことを示し、これは、Ｌ１５－０６及びＬ１５－０８がＬＲＲＣ１５の異なるエピトープに結合することを示す（図４Ｄ）。

【0207】

実施例２．本発明の多重特異性Ｔ細胞エンゲージャー分子の調製
実施例１で得られた四つの異なるＬＲＲＣ１５抗体配列、及びＬ１５－０６由来の抗体配列（Ｌ１５－０６Ｃ）に基づいて、様々な多重特異性抗体分子を設計する。
全遺伝子合成の方法によって、多重特異性抗体の分子配列断片遺伝子が得られ、次いで従来の遺伝子クローニング法によって、標的配列を発現ベクターに挿入する（例えば、Ｌｏ． Ｂ．Ｋ．Ｃ ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ． Ｖｏｌｕｍｅ ２４８、２００４． Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇを参照する）。

【0208】

多重特異性分子携帯するベクターでＨＥＫ２９３Ｅ細胞をトランスフェクションする。３７℃、５％ＣＯ_２で７日間培養し、Ｆ１７培地（１ＬのＦ１７＋１０ｍＬの１０％ＰＦ６８＋３０ｍｌの２００ｍＭ Ｌ－グルタミン）で対応する分子が生成されることができる。発現が完了後、上清を回収し且つ生成して、多重特異性Ｔ細胞エンゲージャー分子を取得し、その後様々な実験分析に使用されることができる。

【0209】

上記方法を使用して、以下の多重特異性分子を取得し、
（１）図１Ａにおけるａ－ｃに示されるような構造を有するＬＲＲＣ１５抗原結合ドメイン、ＣＤ３抗原結合ドメインから構成される二重特異性抗体であり、ｄ－ｅに示される構造のＬＲＲＣ１５抗原結合ドメイン、ＣＤ３抗原結合ドメイン、ＣＤ２８抗原結合ドメインから構成される三重特異性抗体である。

【0210】

図１Ａにおけるａ構造の二重特異性抗体は、３１５－Ｌ０６と名づけられ、その構造は、図１Ｄに示されたとおりであり、
ｂ構造の二重特異性抗体は、１５３－Ｌ０６Ｃと名付けられ、その構造は、図１Ｂに示されたとおりであり、ｂ構造の別の二重特異性抗体命は、１５３－Ｌ０７と名付けられ、１５３－Ｌ０６Ｃとの違いは、そのうちの抗ＬＲＲＣ１５ ｓｃＦｖがＬ１５－０７のＶＨ及びＶＬを使用することであり、ｂ構造の別の二重特異性抗体は、１５３－Ｌ０６と名付けられ、１５３－Ｌ０６Ｃとの違いは、そのうちの抗ＬＲＲＣ１５ ｓｃＦｖがＬ１５－０６のＶＨ及びＶＬを使用することであり、
ｃ構造の二重特異性抗体は、３１５－Ｌ０６Ｃ０８と名付けられ、その構造は、図１Ｃに示されたとおりであり、ｃ構造の別の二重特異性抗体は、３１５－Ｌ０６０８と名付けられ、３１５－Ｌ０６Ｃ０８との違いは、そのうちの抗ＬＲＲＣ１５ ｓｃＦｖがＬ１５－０６のＶＨ及びＶＬを使用することであり、ｃ構造の別の二重特異性抗体は、３１５－Ｌ０８０６と名付けられ、３１５－Ｌ０６Ｃ０８との違いは、そのうちの抗ＬＲＲＣ１５ ｓｃＦｖがＬ１５－０８のＶＨ及びＶＬを使用し、抗ＬＲＲＣ１５ ＦａｂがＬ１５－０６のＶＨ及びＶＬを使用することであり、ｃ構造の別の二重特異性抗体は、３１５－Ｌ０８Ｃ０６と名付けられ、３１５－Ｌ０６Ｃ０８との違いは、そのうちの抗ＬＲＲＣ１５ ｓｃＦｖがＬ１５－０８ＣのＶＨ及びＶＬを使用し、抗ＬＲＲＣ１５ ＦａｂがＬ１５－０６のＶＨ及びＶＬを使用することであり、
ｅ構造の三重特異性抗体は、２８３１５－Ｌ０６と名付けられ、その構造は、図１Ｅに示されたとおりである。

【0211】

（２）図２Ａにおけるａ－ｄに示されるようなＬＲＲＣ１５抗原結合ドメイン及びＣＤ４０抗原結合ドメインから構成される二重特異性抗体。

【0212】

図２Ａにおけるａ構造の二重特異性抗体は、１５４０Ｌ－Ｌ０６と名付けられ、その構造は、図２Ｃに示されたとおりであり、
ｂ構造の二重特異性抗体は、１５４０ＴＬ－Ｌ０６と名付けられ、構造は、図２Ｄに示されたとおりであり、
ｃ構造の二重特異性抗体は、１５４０－Ｌ０６と名付けられ、その構造は、図２Ｂに示されたとおりであり、
ｄ構造の二重特異性抗体は、４０１５－Ｌ０６と名付けられ、その構造は、図２Ｅに示されたとおりであり、ｄ構造の別の二重特異性抗体は、４０Ｄ１５－Ｌ０６Ｃと名付けられ、４０１５－Ｌ０６との違いは、そのうちの抗ＣＤ４０ ＩｇＧがＣＤ４０ｄのＶＨ及びＶＬを使用し、抗ＬＲＲＣ１５ ｓｃＦｖがＬ１５－０６ＣのＶＨ及びＶＬを使用することであり、ｄ構造の別の二重特異性抗体は、４０Ｄ１５－Ｌ０６ＣＳと名付けられ、４０１５－Ｌ０６との違いは、そのうちの抗ＣＤ４０ ＩｇＧがＣＤ４０ｄのＶＨ及びＶＬを使用し、Ｆｃ断片は、配列番号６０に示される断片に置き換え、抗ＬＲＲＣ１５ ｓｃＦｖがＬ１５－０６ＣのＶＨ及びＶＬを使用することである。

【0213】

（３）図３Ａにおけるａ－ｄに示されるようなＬＲＲＣ１５抗原結合ドメイン及びＣＤ１３７抗原結合ドメインから構成される二重特異性抗体。
図３Ａにおけるａ構造の二重特異性抗体は、１５ＢＢＬ－Ｌ０６と名付けられ、その構造は、図３Ｃに示されたとおりであり、
ｂ構造の二重特異性抗体は、１５ＢＢＴＬ－Ｌ０６と名付けられ、構造は、図３Ｄに示されたとおりであり、
ｃ構造の二重特異性抗体は、１５ＢＢ－Ｌ０６と名付けられ、その構造は、図３Ｂに示されたとおりであり、ｃ構造の別の二重特異性抗体は、１５ＢＢｅ－Ｌ０６と名付けられ、１５ＢＢ－Ｌ０６との違いは、そのうちの抗ＣＤ１３７ ｓｃＦｖがＣＤ１３７ｅのＶＨ及びＶＬを使用することであり、
ｄ構造の二重特異性抗体は、ＢＢ１５－Ｌ０６と名付けられ、構造は、図３Ｅに示されたとおりであり、ｄ構造の別の二重特異性抗体は、ＢＢｅ１５－Ｌ０６と名付けられ、ＢＢ１５－Ｌ０６との違いは、そのうちの抗ＣＤ１３７ ＩｇＧがＣＤ１３７ｅのＶＨ及びＶＬを使用することである。

【0214】

本実施例で調製された例示的な分子は、次のとおりである。

【表18】

【0215】

実施例３．ＬＲＲＣ１５及びＣＤ３を標的とする二重特異性抗体分子の標的分子への結合の検証
ＬＲＲＣ１５及びＣＤ３二重特異性抗体分子を標的とし（１５３－Ｌ０６Ｃ、構造は、図１Ｂに示されたとおりであり、３１５－Ｌ０６Ｃ０８、構造は、図１Ｃに示されたとおりである）、対照サンプルＢＭ二重抗体分子（配列は、ＷＯ２０２１０２２３０４Ａ２を参照する）を、ヒトＬＲＲＣ１５を発現するＣＨＯ細胞及びカニクイザルＬＲＲＣ１５を発現するＣＨＯ細胞への結合について試験し、方法は、実施例１に記載されたとおりである。

【0216】

その結果、ヒトＬＲＲＣ１５を発現するＣＨＯ細胞の場合、３１５－Ｌ０６Ｃ０８は、結合ＥＣ_５０値が最も低く、結合能がより強く、１５３－Ｌ０６Ｃは、結合プラトーが最も高く、飽和用量でより多くの抗体分子に結合することができることを示す（図５Ａ）。

【0217】

カニクイザルＬＲＲＣ１５を発現するＣＨＯ細胞の場合、各分子の結合傾向は、ヒトＬＲＲＣ１５を発現するＣＨＯ細胞の結合傾向と類似している（図５Ｂ）。

【0218】

実施例４．ＬＲＲＣ１５及びＣＤ３を標的とする二重特異性抗体分子の性能検出
４．１．ＬＲＲＣ１５及びＣＤ３を標的とする二重特異性抗体分子のＴ細胞活性化実験
ＬＲＲＣ１５及びＣＤ３を標的とする二重特異性抗体分子（１５３－Ｌ０６Ｃ及び３１５－Ｌ０６Ｃ０８）がＴ細胞を活性化する能力を測定し、上記ＢＭ分子を対照サンプルとして使用する。具体的な方法は、次のとおりである。

【0219】

ＰＢＭＣ緩衝液（ＲＰＭＩ－１６４０＋１０％ＦＢＳ＋１％ペンストレプ）でＬＲＲＣ１５発現ＣＨＯ細胞（ＬＲＲＣ１５を発現しない野生型ＣＨＯを対照として使用する）を洗浄し、２Ｅ６細胞／ｍｌ、及び段階希釈した試験する抗体で再懸濁する。Ｅ／Ｔ細胞比が１０：１になるように、調製したＰＢＭＣ細胞を再懸濁液に加える。３７℃で４８時間インキュベートし、次いでＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、氷上で抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２５の二次抗体を３０分間共インキュベートする。再懸濁した細胞をＦＡＣＳ緩衝液で再度洗浄した後、フローサイトメトリーで検出する。測定された平均蛍光強度に基づいて、各抗体の最大有効濃度の半分（ＥＣ_５０）を計算する。

【0220】

ＣＤ２５は、Ｔ細胞活性化の重要な標識である。その結果、三つの二重抗体分子は、いずれも標的細胞の存在下でＴ細胞に対して活性化効果を有するが、標的タンパク質を発現しない細胞の存在下ではいずれもＴ細胞の活性化には影響を及ぼさないことを示す。ここで、ＢＭの活性化ＥＣ_５０は、最も小さいが、活性化細胞の最大割合は、最も小さい。１５３－Ｌ０６Ｃの活性化用量は、最も多いが、活性化細胞の最大割合も最も大きく、３１５－Ｌ０６Ｃ０８は、その中間位置にある（図６）。

【0221】

４．２． ＬＲＲＣ１５及びＣＤ３を標的とする二重特異性抗体分子によるＰＢＭＣのＩＦＮ－γ放出刺激に関する実験
ＬＲＲＣ１５及びＣＤ３を標的とする二重特異性抗体分子（１５３－Ｌ０６Ｃ及び３１５－Ｌ０６Ｃ０８）がＰＢＭＣからのＩＦＮ－γ放出を刺激する能力を測定し、上記ＢＭ分子を対照サンプルとして使用する。具体的な方法は、次のとおりである。

【0222】

ＰＢＭＣ緩衝液（ＲＰＭＩ－１６４０＋１０％ＦＢＳ＋１％ペンストレプ）でＬＲＲＣ１５発現ＣＨＯ細胞（ＬＲＲＣ１５を発現しない野生型ＣＨＯを対照として使用する）を洗浄し、２Ｅ６細胞／ｍｌ、及び段階希釈した試験する抗体で再懸濁する。Ｅ／Ｔ細胞比が１０：１になるように、調製したＰＢＭＣ細胞を再懸濁液に加える。３７℃で４８時間インキュベートする。上清を採取し、ＩＦＮ－γ検出キットを使用してＩＦＮ－γの含有量を試験する。

【0223】

その結果、三つの二重抗体分子は、標的細胞の存在下で、ＰＢＭＣを刺激してＩＦＮ－γを放出させることができるが、標的細胞の非存在下で、ＩＦＮ－γの放出を刺激しないことを示す。ここで、ＢＭの刺激作用は、最も弱い。１５３－Ｌ０６Ｃの最大ＩＦＮ－γ放出量は、最も高いが、ＩＦＮ－γ放出量については３１５－Ｌ０６Ｃ０８のＥＣ_５０値と比較すると、大きな差がある（図７）。

【0224】

４．３．ＬＲＲＣ１５及びＣＤ３を標的とする二重特異性抗体分子によるＴ細胞増殖刺激に関する実験
ＬＲＲＣ１５及びＣＤ３を標的とする二重特異性抗体分子（１５３－Ｌ０６Ｃ及び３１５－Ｌ０６Ｃ０８）がＴ細胞増殖を刺激する能力を測定し、上記ＢＭ分子を対照サンプルとして使用する。具体的な方法は、次のとおりである。

【0225】

Ｐａｎ Ｔ細胞単離キット（ｃａｔ＃ １３０－０９６－５３５、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を使用して、ＰＢＭＣ中のＴ細胞を単離し且つＣＦＳＥで標識する。９６ウェルプレートの各ウェルで、５０μｌの標識したＴ細胞（５Ｅ４個細胞を含む）と１００μｌの１Ｅ４個のＬＲＲＣ１５発現ＣＨＯ細胞（ＬＲＲＣ１５を発現しない野生型ＣＨＯを対照として使用する）とを混合し、且つ５０μｌの段階希釈した試験する抗体と再懸濁する。３７℃で５日間インキュベートする。次いでＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した後にフローサイトメトリーで検出する。異なる条件下でのＴ細胞の増殖に基づいて、対応するＣＦＳＥ染色シグナル値に従って、各種の抗体の最大有効濃度の半分（ＥＣ_５０）を測定する。

【0226】

その結果、１５３－Ｌ０６Ｃ及び３１５－Ｌ０６Ｃ０８の両方が標的細胞の存在下で細胞増殖を促進できることを示すが、ＬＲＲＣ１５を発現しない細胞の存在下で、三つの二重抗体分子のいずれも、増殖促進に有意な効果を示さない。ここで、ＢＭは、Ｔ細胞の増殖を促進する効果がほとんどない。１５３－Ｌ０６Ｃは、最大限に増殖するＴ細胞の割合が最も高いが、増殖を促進する３１５－Ｌ０６Ｃ０８のＥＣ_５０値と比較すると、大きな差がある（図８）。

【0227】

４．４．ＬＲＲＣ１５及びＣＤ３を標的とする二重特異性抗体分子による標的細胞に対するＰＢＭＣの殺傷刺激の実験
ＬＲＲＣ１５及びＣＤ３を標的とする二重特異性抗体分子（１５３－Ｌ０６Ｃ及び３１５－Ｌ０６Ｃ０８）がＰＢＭＣを刺激して標的細胞を殺傷する能力を測定し、上記ＢＭ分子を対照サンプルとして使用する。具体的な方法は、次のとおりである。

【0228】

ＰＢＭＣ緩衝液（ＲＰＭＩ－１６４０＋１０％ＦＢＳ＋１％ペンストレプ）を使用してＬＲＲＣ１５を発現するＣＨＯ細胞を洗浄し、２Ｅ６個細胞／ｍｌ、及び段階希釈した試験する抗体で再懸濁する。Ｅ／Ｔ細胞比が１０：１になるように、調製したＰＢＭＣ細胞を再懸濁液に加える。３７℃で４８時間インキュベートする。インキュベートした９６ウェルプレートにＣｙｔｏＴｏｘ－ＧｌｏＴＭ細胞毒性検出試薬を加える。測定した化学発光強度に基づいて、各種の抗体による標的細胞の殺傷状況を測定する。

【0229】

その結果、三つの二重抗体分子は、標的細胞の存在下でＰＢＭＣを刺激して標的細胞を殺傷することができるが、ＬＲＲＣ１５を発現する細胞の非存在下で、明らかな殺傷効果を示さないことが示される。ここで、ＢＭは、殺傷効果が最も弱く、且つ明らかフック状エフェクターがある。１５３－Ｌ０６Ｃの最大殺傷比率が最も高いが、３１５－Ｌ０６Ｃ０８が殺傷するＥＣ_５０値と比較すると、大きな差がある（図９）。

【0230】

４．５．ＬＲＲＣ１５及びＣＤ３を標的とする二重特異性抗体分子によるＰＢＭＣからのサイトカイン放出刺激実験
ＬＲＲＣ１５及びＣＤ３を標的とする二重特異性抗体分子（１５３－Ｌ０６Ｃ及び３１５－Ｌ０６Ｃ０８、構造は、図１Ｂ及び１Ｃに示されたとおりである）がＰＢＭＣを刺激してサイトカインを放出する能力を刺激し、上記ＢＭ分子を対照サンプルとして使用し、ＣＤ３抗体（ＯＫＴ３）を陽性対照として使用する。具体的な方法は、次のとおりである。

【0231】

解凍し且つ９６ウェルプレートでＰＢＭＣ緩衝液（ＲＰＭＩ－１６４０＋１０％ＦＢＳ＋１％ペンストレプ）を使用して、四つの異なるドナー（Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３、Ｄ４）からのＰＢＭＣ細胞を１０Ｅ７細胞／ｍｌに希釈した後、３７℃のインキュベーターに入れて４８時間培養する。ＰＢＭＣ緩衝液で試験する抗体を１０ｎＭに希釈し且つＰＢＭＣ細胞を含む９６ウェルプレートに加え、３７℃で２４時間インキュベートする。ＢＤ^ＴＭ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ Ｂｅａｄ Ａｒｒａｙ（ＣＢＡ）キットを使用して培養上清中のサイトカイン含有量を捕獲し且つ検出し、各種の抗体が皓となるドナーＰＢＭＣからのサイトカイン放出をどのように刺激するかを実証することが可能である。

【0232】

その結果、三つの二重抗体分子は、６種のサイトカインの放出に対して有意な促進効果を示さないが、陽性対照として使用するＣＤ３抗体（ＯＫＴ３）は、すべてサイトカインを様々な程度で放出することを示す。未処理（Ｕｎｔｒｅａｔｅｄ）は、抗体を添加しないグループであり、陰性対照として、すべて明らかなサイトカインの放出がない（図１０）。

【0233】

実施例５．ＬＲＲＣ１５及びＣＤ１３７／ＣＤ４０を標的とする二重特異性抗体分子と標的分子との結合検証
ＬＲＲＣ１５及びＣＤ１３７を標的とする二重特異性抗体分子（１５ＢＢ－Ｌ０６、構造は、図３Ｂに示されたとおりである）は、４－１ＢＢタンパク質に結合し、ＬＲＲＣ１５及びＣＤ４０を標的とする二重特異性抗体分子（１５４０－Ｌ０６、構造は、図２Ｂに示されたとおりである）とＣＤ４０タンパク質との結合は、ＥＬＩＳＡ法によって検出される。具体的な方法は、次のとおりである。

【0234】

４－１ＢＢ又はＣＤ４０の抗原タンパク質を４℃で一晩コーティングし、０．０５％ＰＢＳＴ溶液で３回洗浄し、９６ウェルプレートの各ウェルに２００μｌの１％ＢＳＡを加え、室温で１時間ブロックする。０．０５％ＰＢＳＴでプレートを３回洗浄する。１％ＢＳＡを使用して段階希釈した抗体分子（１５ＢＢ－Ｌ０６又は１５４０－Ｌ０６）を再懸濁した後にウェルあたり１００μｌを９６ウェルプレートに二重に加える。０．０５％ＰＢＳＴでプレートを３回洗浄する。抗ｈＩｇＧ－ＨＲＰ二次抗体を加え、室温で３０分間インキュベートする。０．０５％ＰＢＳＴでプレートを３回洗浄する。次いでＴＭＢ試薬を加えて発色させ、且つマイクロプレートリーダーで４５０ｎｍで読み取る。測定した平均ＯＤ４５０値に基づいて、各種の抗体の最大有効濃度の半分（ＥＣ_５０）を測定する。

【0235】

その結果、１５ＢＢ－Ｌ０６は、４－１ＢＢに結合することができ、１５４０－Ｌ０６は、ＣＤ４０に結合することができることを示す（図１１）。また、二重特異性抗体分子における４－１ＢＢ抗体部分又はＣＤ４０抗体部分は、ｓｃＦｖ形態であり、そのＩｇＧ形態と比較して、抗体が抗原に結合した後に過剰な活性化を引き起こさないため、投与中の二重抗体分子のリスクが軽減される。

【0236】

実施例６．ＬＲＲＣ１５及びＣＤ１３７／ＣＤ４０を標的とする二重特異性抗体分子の性能検出
ＬＲＲＣ１５及びＣＤ１３７を標的とする二重特異性抗体（１５ＢＢ－Ｌ０６）がＰＢＭＣを刺激してＩＬ－２を放出する能力、並びにＬＲＲＣ１５及びＣＤ４０を標的とする二重特異性抗体（１５４０－Ｌ０６）がＤＣを刺激してＩＬ－１２ｐ４０を放出する能力を測定する。

【0237】

９６ウェルプレートに１０μｇ／ｍｌのＣＤ３抗体（ＯＫＴ３、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）をウェルあたり１００μｌで事前に加え、３７℃で２時間インキュベートする。ＰＢＭＣ緩衝液（ＲＰＭＩ－１６４０＋１０％ＦＢＳ＋１％ペンストレプ）でＬＲＲＣ１５発現ＣＨＯ細胞（ＬＲＲＣ１５を発現しない野生型ＣＨＯを対照として使用する）を洗浄し、２Ｅ６個細胞／ｍｌ、及び段階希釈した試験する抗体で再懸濁する。Ｅ／Ｔ細胞比が１０：１になるように、調製したＰＢＭＣ細胞を再懸濁液に加える。３７℃で４８時間インキュベートする。上清を採取し、ＩＬ－２検出キットでＩＬ－２の含有量を試験する。

【0238】

その結果、１５ＢＢ－Ｌ０６は、標的細胞の存在下で、ウレルマブ（Ｕｒｅｌｕｍａｂ）（４－１ＢＢ単一特異性抗体）よりも高いＩＬ－２を放出するが、標的タンパク質を発現しない細胞の存在下で、ＩＬ－２の放出は、対照ＩｇＧと同様であり、抗体分子の標的特異性の有効性を反映することを示す。対照モノクローナル抗体ウレルマブには、この特異性がない（図１２）。

【0239】

単核細胞単離キット（ｃａｔ＃１３０－０９６－５３７、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を使用してＰＢＭＣから単核細胞を単離する。２０ｎｇ／ｍｌのＧＭ－ＣＳＦ及びＩＬ－４を加えて単核細胞のＤＣ細胞への分化を誘導し、７日後にＤＣ細胞を収穫する。ＰＢＭＣ緩衝液（ＲＰＭＩ－１６４０＋１０％ＦＢＳ＋１％ペンストレプ）でＬＲＲＣ１５発現ＣＨＯ細胞（ＬＲＲＣ１５を発現しない野生型ＣＨＯを対照として使用する）を洗浄し、２Ｅ６個細胞／ｍｌ、及び段階希釈した試験する抗体で再懸濁する。Ｅ／Ｔ細胞比率が３：１になるように、再懸濁液に調製したＤＣ細胞を加える。３７℃で２４時間インキュベートする。上清を採取し、ＩＬ－１２ｐ４０検出キットでＩＬ－１２ｐ４０の含有量を試験する。

【0240】

その結果、１５４０－Ｌ０６は、標的細胞の存在下で、セリクレルマブ（Ｓｅｌｉｃｒｅｌｕｍａｂ）（ＣＤ４０単一特異性抗体）よりもわずかに低いＩＬ－１２ｐ４０を放出するが、標的タンパク質を発現しない細胞の存在下で、ＩＬ－１２ｐ４０の放出が大幅に減少し、抗体の分子標的特異性の有効性を反映することを示す。対照モノクローナル抗体セリクレルマブには、この特異性がない（図１３）。
さらに、上記二重抗体分子がＰＢＭＣを刺激してサイトカイン（ＴＮＦ－α及びＩＬ－６）を放出する能力を測定し、ＣＤ３抗体（ＯＫＴ３）を陽性対照として使用する。具体的な方法は、次のとおりである。

【0241】

解凍し、且つ五つの異なるドナーからのＰＢＭＣ細胞を、９６ウェルプレートでＰＢＭＣ緩衝液（ＲＰＭＩ－１６４０＋１０％ＦＢＳ＋１％ペンストレプ）を使用して、１０Ｅ７細胞／ｍｌにそれぞれ希釈した後、３７℃のインキュベーターに入れて４８時間培養する。ＰＢＭＣ緩衝液で試験する抗体を１０ｎＭに希釈し且つＰＢＭＣ細胞を含む９６ウェルプレートに加え、３７℃で２４時間インキュベートする。それぞれＴＮＦ－α及びＩＬ－６検出キットを使用して、培養上清中のサイトカインの含有量を捕獲及び検出し、各種の抗体が異なるドナーのＰＢＭＣからのサイトカイン放出状況をどのように刺激するかを示すことができる。

【0242】

その結果、二つの二重抗体分子１５４０－Ｌ０６及び１５ＢＢ－Ｌ０６は、ＴＮＦ－α及びＩＬ－６の二種のサイトカインに対して明らかな促進効果がないことを示す（図１４）。

【0243】

実施例７．ＬＲＲＣ１５を標的とする二重特異性抗体分子のインビボ有効性実験
７．１．ＮＣＩ－Ｈ１６５０モデル
ＮＯＧマウスにＮＣＩ－Ｈ１６５０細胞（１×１０^７細胞／匹）を接種し、１５日後にＰＢＭＣを接種し、平均腫瘍体積が約２００ｍｍ^３に成長した際にグループに分けて投与し始める（対照群にはＰＢＳを投与し、実験群にはそれぞれ１５３－Ｌ０６Ｃ及び３１５－Ｌ０６Ｃ０８投与する）。生脈内注射し、週に２回、７回連続して投与する。この期間中に腫瘍体積を測定し（図１５Ａ）且つマウスの以上の有無を観察する。

【0244】

その結果、等モル用量下で、１５３－Ｌ０６Ｃ（０．２ｍｇ／ｋｇ）及び３１５－Ｌ０６Ｃ０８（０．２８８ｍｇ／ｋｇ）は、同様の抗腫瘍効果を示し、ＴＧＩは、それぞれ３７％及び３９％である。投与期間の動物の耐性は、良好である。実験終了後、腫瘍を採取し且つ秤量し、腫瘍重量の結果は、１５３－Ｌ０６Ｃ及び３１５－Ｌ０６Ｃ０８の抗腫瘍効果をより明確に反映し、腫瘍重量は、それぞれ対照群の５５％及５７％である（図１５Ｂ）。

【0245】

７．２．ＭＣ３８モデル
ヒト化ｈＣＤ３ｅ／ｈ４－１ＢＢ二重遺伝子ノックインＣ５７ＢＬ／６マウスにＭＣ３８－ｈｕＬＲＲＣ１５細胞（２×１０^６細胞／匹）を接種し、平均腫瘍体積が約１２０ｍｍ^３に成長した際にグループに分けて投与し始める（対照群には、生理食塩水を投与し、実験群には、それぞれ１５３－Ｌ０６Ｃ及び１５ＢＢ－Ｌ０６を投与する）。生脈内注射し、週に２回、４回連続して投与する。

【0246】

その結果、１５３－Ｌ０６Ｃ（１ｍｇ／ｋｇ）及び１５ＢＢ－Ｌ０６（１ｍｇ／ｋｇ）の両方は、同様の抗腫瘍効果を示すことを示し、ＴＧＩは、それぞれ２４％及び４３％である（図１５Ｃ）。

【0247】

ヒト化ｈＣＤ４０遺伝子ノックインＣ５７ＢＬ／６マウスにＭＣ３８－ｈｕＬＲＲＣ１５細胞（２×１０^６細胞／匹）を接種し、平均腫瘍体積が約１２０ｍｍ^３に成長した際にグループに分けて投与し始める（対照群には、生理食塩水を投与し、実験群には、１５４０－Ｌ０６を投与する）。生脈内注射し、週に２回（最初の２回の投与量は、１ｍｇ／ｋｇであり、３回目の投与量は、６ｍｇ／ｋｇである）、３回連続して投与し、投与量を６ｍｇ／ｋｇに調整した後、１５４０－Ｌ０６は、明らかな抗腫瘍効果を示し、ＴＧＩは、５９％である（図１５Ｄ）。

【0248】

比較例１．異なる構造を有する多重特異性Ｔ細胞エンゲージャー分子の性能比較
実施例２で調製したＬＲＲＣ１５及びＣＤ３を標的とする二重特異性抗体分子（１５３－Ｌ０６及び３１５－Ｌ０６）がＰＢＭＣを刺激して標的細胞を殺傷する能力を測定する。具体的な方法は、実施例４．４を参照する。

【0249】

その結果、１５３－Ｌ０６の殺傷効果は、３１５－Ｌ０６の殺傷効果よりも有意に優れていることを示し、これは、１５３－Ｌ０６構造を有する分子がより標的細胞の殺傷を刺激する能力に優れていることを示す（図１６）。

【0250】

実施例２で調製したＬＲＲＣ１５及びＣＤ３を標的とする二重特異性抗体分子（１５３－Ｌ０６Ｃ、３１５－Ｌ０６Ｃ０８、３１５－Ｌ０８Ｃ０６）並びにＬＲＲＣ１５、ＣＤ３及びＣＤ２８を標的とする三重特異性抗体分子２８３１５－Ｌ０６がＰＢＭＣを刺激して標的細胞を殺傷する能力を測定する。具体的な方法は、実施例４．４を参照する。

【0251】

その結果、３１５－Ｌ０６Ｃ０８の殺傷効果は、他の分子の殺傷効果よりも有意に優れていることを示し、これは、３１５－Ｌ０６Ｃ０８構造を有する分子が標的細胞の殺傷を刺激する能力に優れていることを示す（図１７）。

【0252】

本発明で言及されたすべての文書は、あたかも各文書が個別に参照として引用されたかのように、本出願における参照として引用される。さらに、本発明の上記の教示内容を読んだ後、当業者は本発明に様々な変更または修正を加えることができ、これらの同等の形態も、本出願の添付の請求範囲によって定義される範囲に含まれる。

【図1A-1D】

【図1E】

【図2A-2B】

【図2C-2E】

【図3A-1】

【図3A-2】

【図3B-3D】

【図3E】

【図4A-4B】

【図4C-4D】

【図5A】

【図5B】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10-1】

【図10-2】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15A】

【図15B】

【図15C-15D】

【図16】

【図17】

【配列表】

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【国際調査報告】