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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-12-26
(54)【発明の名称】サンタレンの組換え製造
(51)【国際特許分類】
C12P 5/00 20060101AFI20241219BHJP
A01K 67/033 20060101ALI20241219BHJP
A01H 5/00 20180101ALI20241219BHJP
C12P 7/02 20060101ALI20241219BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20241219BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20241219BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20241219BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20241219BHJP
C12N 15/60 20060101ALN20241219BHJP
C11B 9/00 20060101ALN20241219BHJP
【ＦＩ】
C12P5/00 ZNA
A01K67/033 501
A01H5/00 A
C12P7/02
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
C12N15/60
C11B9/00 A
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024534705
(86)(22)【出願日】2022-12-12
(85)【翻訳文提出日】2024-07-31
(86)【国際出願番号】 EP2022085351
(87)【国際公開番号】W WO2023110729
(87)【国際公開日】2023-06-22
(31)【優先権主張番号】21214164.2
(32)【優先日】2021-12-13
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】520064986
【氏名又は名称】アイソバイオニクス ベー．フェー．
(74)【代理人】
【識別番号】110002572
【氏名又は名称】弁理士法人平木国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】ドゥライラージュ，ジャナニ
(72)【発明者】
【氏名】ファン，ダイク アールト－ヤン
(72)【発明者】
【氏名】ヘッセリンク，タマラ
(72)【発明者】
【氏名】ビークウィルダー，マルティヌス ユリウス
(72)【発明者】
【氏名】メリロ，エレナ
【テーマコード（参考）】
4B064
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B064AB05
4B064CA19
4B064CC24
4B064DA16
4B065AA01X
4B065AA57X
4B065AA72X
4B065AA87X
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065CA03
4B065CA05
4B065CA51
(57)【要約】
本発明は、サンタレン及び関連生成物の組換え製造の分野に関する。特に、本発明は、ファルネシルピロホスフェートを少なくとも１つのサンタレンに変換する工程を含む、少なくとも１つのサンタレンを含む組成物を製造するための方法であって、上記変換が、サンタレンシンターゼ活性を示すポリペプチドによって行われる、方法に関する。更に、本発明は、本発明の方法により入手可能な過剰なβ－サンタレンを含むβ－サンタレンとα－サンタレンの混合物を含む組成物を意図する。本発明はまた、少なくとも１つのサンタレン、好ましくはβ－サンタレン、より好ましくはβ－サンタレンとα－サンタレンの混合物を含む組成物を製造するための、サンタレンシンターゼポリペプチド、それをコードする異種ポリヌクレオチド、上記ポリヌクレオチドを含むベクター若しくは遺伝子構築物、上記遺伝子構築物若しくはベクターを含む宿主細胞又は非ヒトトランスジェニック生物の使用に関する。更に、本発明は、少なくとも１つのサンタロール、好ましくはβ－サンタロールを含む組成物を製造するための方法であって、本発明の上述の方法によって少なくとも１つのサンタレンを含む組成物を生成することと、少なくとも１つのサンタロール、好ましくはβ－サンタロールを含む組成物を製造するために、上記少なくとも１つのサンタレン、好ましくはβ－サンタレンをそれぞれのアルコールに酸化することと、を含む方法に関する。更に、本発明は、上述のポリペプチド、異種ポリヌクレオチド、ベクター又は遺伝子構築物、宿主細胞又は非ヒトトランスジェニック生物を含む少なくとも１つのサンタレンを含む組成物を製造するためのキット、及び上述の異種ポリヌクレオチド、ベクター、又は遺伝子構築物からサンタレンシンターゼ活性を示すポリペプチドを発現する非ヒト宿主細胞又は非ヒトトランスジェニック生物に関する。
【選択図】なし
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ファルネシルピロホスフェートを少なくとも１つのサンタレンに変換する工程を含む、少なくとも１つのサンタレンを含む組成物を製造するための方法であって、前記変換が、サンタレンシンターゼ活性を示す少なくとも１つのポリペプチドによって行われ、前記少なくとも１つのポリペプチドが、ａ）配列番号１、１８、又は２１～２８のいずれかに示されるようなアミノ酸配列；
ｂ）配列番号１、１８、又は２１～２８のいずれかに示されるようなアミノ酸配列と少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列；
ｃ）配列番号２又は３又は１９のいずれか１つに示されるような核酸配列によってコードされるアミノ酸配列；
ｄ）配列番号２又は３又は１９のいずれか１つに示されるような核酸配列によってコードされるポリペプチドと少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％同一である核酸配列によってコードされるアミノ酸配列；及び
ｅ）（ａ）～（ｄ）のいずれか１つのフラグメントであって、サンタレンシンターゼ活性を示すポリペプチドをコードする前記フラグメントのアミノ酸配列
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、方法。
【請求項2】
前記少なくとも１つのサンタレンが、β－サンタレンである、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記少なくとも１つのサンタレンが、過剰なβ－サンタレンを含むβ－サンタレンとα－サンタレンの混合物であり、好ましくは、セスキツジェンも含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項4】
前記β－サンタレンが、全サンタレンに対して少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、好ましくは約５０％～約８０％、約６０％～約７５％、約６５％～約７０％、より好ましくは少なくとも約６７％の相対量で前記組成物中に存在する、請求項３に記載の方法。
【請求項5】
ファルネシルピロホスフェートを少なくとも１つのサンタレンに変換する前記工程が、宿主細胞内で行われる、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項6】
ファルネシルピロホスフェートを少なくとも１つのサンタレンに変換する前記工程が、非脊椎動物トランスジェニック生物、好ましくは植物又は微生物内で行われる、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項7】
前記組成物が、検出可能な量のセスキツジェンを更に含み、シス－α－ベルガモテン（（ＡＳ番号１８２５２－４６－５）、（Ｅ）－β－ファルネセン（ＣＡＳ番号１８７９４－８４－８）、トランス－β－ベルガモテン（ＣＡＳ番号１５４３８－９４－５）、若しくはβ－ビサボレン（ＣＡＳ番号４９５－６１－４）のいずれも実質的に含まないか、又はこれらの全てを含まない、好ましくは、（Ｅ）－β－ファルネセン（ＣＡＳ番号１８７９４－８４－８）を実質的に含まない、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項8】
サンタレンシンターゼ活性を示す前記ポリペプチドが、異種ポリヌクレオチド、ベクター、又は遺伝子構築物によってコードされる、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項9】
請求項１～８のいずれか一項に記載の方法によって得られ得る過剰なβ－サンタレンを含むβ－サンタレンとα－サンタレンの混合物を含む組成物であって、検出可能な量のセスキツジェンを更に含み、シス－α－ベルガモテン（（ＡＳ番号１８２５２－４６－５）、（Ｅ）－β－ファルネセン（ＣＡＳ番号１８７９４－８４－８）、トランス－β－ベルガモテン（ＣＡＳ番号１５４３８－９４－５）、若しくはβ－ビサボレン（ＣＡＳ番号４９５－６１－４）のいずれも実質的に含まないか、又はこれらの全てを含まない、好ましくは、（Ｅ）－β－ファルネセン（ＣＡＳ番号１８７９４－８４－８）を実質的に含まない、組成物。
【請求項10】
請求項１～８のいずれか一項に記載の方法によって得られ得る過剰なβ－サンタレンを含むβ－サンタレンとα－サンタレンの混合物を含む組成物であって、前記β－サンタレンが、全サンタレンに対して少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、好ましくは約５０％～約８０％、約６０％～約７５％、約６５％～約７０％、より好ましくは少なくとも約６７％の相対量で前記組成物中に存在し、前記組成物が、β－ファルネセンを実質的に含まない、及び／又はセスキツジェンを含む、組成物。
【請求項11】
少なくとも１つのサンタレン、好ましくはβ－サンタレン、より好ましくはβ－サンタレンとα－サンタレンの混合物を含み、最も好ましくはセスキツジェンも含む組成物を製造するための、請求項１に記載のポリペプチド、請求項８に記載の異種ポリヌクレオチド、ベクター、若しくは遺伝子構築物、請求項５に記載の宿主細胞、又は請求項６に記載の非脊椎動物トランスジェニック生物の使用。
【請求項12】
少なくとも１つのサンタロール、好ましくはβ－サンタロールを含む組成物を製造するための方法であって：ａ）請求項１～８のいずれか一項に記載の方法によって少なくとも１つのサンタレンを含む組成物を生成することか、又は請求項１０に記載される若しくは請求項１１に記載される組成物を準備することと、
ｂ）少なくとも１つのサンタロール、好ましくはβ－サンタロールを含む組成物を製造するために、前記少なくとも１つのサンタレン、好ましくはβ－サンタレンをそれぞれのアルコールに酸化することと、を含む方法。
【請求項13】
請求項１に記載のポリペプチド、請求項８に記載の異種ポリヌクレオチド、ベクター、若しくは遺伝子構築物、請求項５に記載の宿主細胞、又は請求項６に記載の非脊椎動物トランスジェニック生物を含む少なくとも１つのサンタレンを含む組成物を製造するためのキット。
【請求項14】
請求項８に記載の異種ポリヌクレオチド、ベクター、又は遺伝子構築物からサンタレンシンターゼ活性を示すポリペプチドを発現する、非ヒト宿主細胞であって、請求項１に記載のサンタレンシンターゼをコードする核酸についてトランスジェニックである、非ヒト宿主細胞。
【請求項15】
請求項８に記載の異種ポリヌクレオチド、ベクター、又は遺伝子構築物からサンタレンシンターゼ活性を示すポリペプチドを発現する、非ヒト又は非脊椎動物トランスジェニック生物であって、請求項１に記載のサンタレンシンターゼをコードする核酸についてトランスジェニックである、非ヒト又は非脊椎動物トランスジェニック生物。
【請求項16】
芳香組成物であって、ｉ）請求項１０に記載の少なくとも１つの組成物、又は請求項１１に記載の組成物、又は請求項１～８の方法のいずれか、及び（ｉｉ）～（ｉｖ）：
ｉｉ）β－サンタレン、α－サンタレン、トランス－α－ベルガモテン、セスキツジェン、及びエピ－β－サンタレンからなる群から選択される化合物以外の少なくとも１つの芳香化学物質（Ｘ）、又は
ｉｉｉ）少なくとも１つの非芳香化学物質担体、又は
ｉｖ）（ｉｉ）と（ｉｉｉ）の両方を含む組成物
のいずれかによって生成された組成物を含む芳香組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、サンタレン及び関連生成物の組換え製造の分野に関する。特に、本発明は、ファルネシルピロホスフェートを少なくとも１つのサンタレンに変換する工程を含む、少なくとも１つのサンタレンを含む組成物を製造するための方法であって、上記変換が、サンタレンシンターゼ活性を示すポリペプチドによって行われる、方法に関する。更に、本発明は、本発明の方法により入手可能な過剰なβ－サンタレンを含むβ－サンタレンとα－サンタレンの混合物を含む組成物を意図する。本発明はまた、少なくとも１つのサンタレン、好ましくはβ－サンタレン、より好ましくはβ－サンタレンとα－サンタレンの混合物を含む組成物を製造するための、サンタレンシンターゼポリペプチド、それをコードする異種ポリヌクレオチド、上記ポリヌクレオチドを含むベクター若しくは遺伝子構築物、上記遺伝子構築物若しくはベクターを含む宿主細胞又は非ヒトトランスジェニック生物の使用に関する。更に、本発明は、少なくとも１つのサンタロール、好ましくはβ－サンタロールを含む組成物を製造するための方法であって、本発明の上述の方法によって少なくとも１つのサンタレンを含む組成物を生成することと、少なくとも１つのサンタロール、好ましくはβ－サンタロールを含む組成物を製造するために、上記少なくとも１つのサンタレン、好ましくはβ－サンタレンをそれぞれのアルコールに酸化することと、を含む方法に関する。更に、本発明は、上述のポリペプチド、異種ポリヌクレオチド、ベクター又は遺伝子構築物、宿主細胞又は非ヒトトランスジェニック生物を含む少なくとも１つのサンタレンを含む組成物を製造するためのキット、及び上述の異種ポリヌクレオチド、ベクター、又は遺伝子構築物からサンタレンシンターゼ活性を示すポリペプチドを発現する非ヒト宿主細胞又は非ヒトトランスジェニック生物に関する。
【背景技術】
【0002】
サンダルウッドオイルは主要な香水成分である。また、多くのアロマセラピー用途にも役立つ。サンダルウッドオイルの主要な成分としては、αサンタロール及びβサンタロールが挙げられる。βサンタロールは、サンダルウッドオイルの主要な芳香剤影響成分である。サンダルウッド植物は栽培が難しいため、サンダルウッドオイルは非常に不足している。βサンタロールはβ－サンタレンから作られる。サンダルウッド植物において、サンタロールの生成は、セスキテルペンシンターゼによって媒介される。
【0003】
セスキテルペンシンターゼは、独特のプロトン移動カスケードによって、遍在する前駆体ファルネシルピロホスフェート（ＦＰＰ）を環化する。環化反応の結果は、テルペンシンターゼの同一性によって決まる。植物のテルペンシンターゼをコードする遺伝子は、微生物によるテルペンの産生に展開できる。微生物によるα－サンタレン、トランス－αベルガモテン、及びβ－サンタレンを含むサンタレンの産生は、クスノキ（Ｃｉｎｎａｍｏｍｕｍ Ｃａｍｐｈｏｒａ）又はサンダルウッド（Ｓａｎｔａｌｕｍ ａｌｂｕｍ）からのサンタレンシンターゼを使用することによって実証されている（米国特許出願公開第２０２０／００１０８２２Ａ１号明細書）。しかしながら、このような微生物は、大部分がα－サンタレン（５０％）で、少量のβ－サンタレン（２０％）のみからなるテルペン混合物を産生する。
【0004】
より高いβ－サンタレン濃度の調製物が、例えば、香料材料にサンダルウッドの印象を与えるために有用であろう。α－サンタレンとβ－サンタレンは物理化学的性質が非常に近いため、高濃度のβ－サンタレンを含む調製物を得るには分離技術が難しい。β－サンタレンを生成する場合、５０％を超えるβ－サンタレンを生成するテルペンシンターゼが必要となる。
【0005】
更に、新規又は改良された嗅覚特性を有する芳香組成物が常に必要とされている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
本発明の根底にある技術的問題は、上述の必要性に適合する手段及び方法の提供として理解されるものとする。この技術的問題は、特許請求の範囲及び下記の本明細書で特徴付けられる実施形態によって解決される。
【課題を解決するための手段】
【0007】
本発明は、ファルネシルピロホスフェートを少なくとも１つのサンタレンに変換する工程を含む、少なくとも１つのサンタレンを含む組成物を製造するための方法であって、上記変換が、サンタレンシンターゼ活性を示す少なくとも１つのポリペプチドによって行われ、上記少なくとも１つのポリペプチドが、
（ｉ）
ａ）配列番号１、１８、若しくは２１～２８のいずれかに示されるようなアミノ酸配列；
ｂ）配列番号１、１８、若しくは２１～２８のいずれかに示されるようなアミノ酸配列と少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列；
ｃ）配列番号２若しくは３若しくは１９に示されるような核酸配列によってコードされるアミノ酸配列；
ｄ）配列番号２若しくは３若しくは１９に示されるような核酸配列と少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％同一である核酸配列によってコードされるアミノ酸配列；及び
ｅ）（ａ）～（ｄ）のいずれか１つのフラグメントであって、サンタレンシンターゼ活性を示すポリペプチドをコードするフラグメントのアミノ酸配列
からなる群から選択されるアミノ酸配列か、又は
（ｉｉ）
ａ）配列番号４～１７のいずれか１つに示されるようなアミノ酸配列；
ｂ）配列番号４～１７に示されるようなアミノ酸配列と少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列；及び
ｃ）（ａ）若しくは（ｄ）のフラグメントであって、サンタレンシンターゼ活性を示すポリペプチドをコードするフラグメントのアミノ酸配列
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、方法に関する。
（ｉ）
ａ）配列番号１、１８、若しくは２１～２８のいずれかに示されるようなアミノ酸配列；
ｂ）配列番号１、１８、若しくは２１～２８のいずれかに示されるようなアミノ酸配列と少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列；
ｃ）配列番号２若しくは３若しくは１９に示されるような核酸配列によってコードされるアミノ酸配列；
ｄ）配列番号２若しくは３若しくは１９に示されるような核酸配列と少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％同一である核酸配列によってコードされるアミノ酸配列；及び
ｅ）（ａ）～（ｄ）のいずれか１つのフラグメントであって、サンタレンシンターゼ活性を示すポリペプチドをコードするフラグメントのアミノ酸配列
からなる群から選択されるアミノ酸配列か、又は
（ｉｉ）
ａ）配列番号４～１７のいずれか１つに示されるようなアミノ酸配列；
ｂ）配列番号４～１７に示されるようなアミノ酸配列と少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列；及び
ｃ）（ａ）若しくは（ｄ）のフラグメントであって、サンタレンシンターゼ活性を示すポリペプチドをコードするフラグメントのアミノ酸配列
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、方法に関する。
【0008】
本発明の方法によって製造される組成物は、本明細書に定義される少なくとも１つのサンタレン、好ましくはβ－サンタレン、又はα－サンタレンとβ－サンタレンの両方の混合物を含む。α－サンタレンとβ－サンタレンの両方が存在する場合、上記組成物は、α－サンタレンより過剰なβ－サンタレンを含むことが好ましい。
【0009】
本発明の方法の１つの好ましい実施形態では、少なくとも１つのサンタレンを含む上記組成物は、以下のもののうちのいずれか１つ又は全てを実質的に含まない：シス－α－ベルガモテン（（ＡＳ番号１８２５２－４６－５）、（Ｅ）－β－ファルネセン（ＣＡＳ番号１８７９４－８４－８）、トランス－β－ベルガモテン（ＣＡＳ番号１５４３８－９４－５）、及びβ－ビサボレン（ＣＡＳ番号４９５－６１－４）。実質的に含まないとは、組成物に検出可能な量のシス－α－ベルガモテン（（ＡＳ番号１８２５２－４６－５）、（Ｅ）－β－ファルネセン（ＣＡＳ番号１８７９４－８４－８）、トランス－β－ベルガモテン（ＣＡＳ番号１５４３８－９４－５）、及び／又はβ－ビサボレン（ＣＡＳ番号４９５－６１－４）が含まれていないことを意味する。
【0010】
本発明の方法の別の好ましい実施形態では、少なくとも１つのサンタレンを含む上記組成物は、検出可能な量のセスキツジェン（ＣＡＳ番号５８３１９－０６－５）を更に含む。好ましくは、検出可能な量のセスキツジェン（ＣＡＳ番号５８３１９－０６－５）は、０．０１％～３％（ｍｏｌ／ｍｏｌ）を意味する。
【0011】
本発明の方法の更に別の好ましい実施形態では、少なくとも１つのサンタレンを含む上記組成物は、検出可能な量のセスキツジェン（ＣＡＳ番号５８３１９－０６－５）を更に含み、組成物は、以下のもののうちのいずれか１つ又は全てを実質的に含まない：シス－α－ベルガモテン（（ＡＳ番号１８２５２－４６－５）、（Ｅ）－β－ファルネセン（ＣＡＳ番号１８７９４－８４－８）、トランス－β－ベルガモテン（ＣＡＳ番号１５４３８－９４－５）、及びβ－ビサボレン（ＣＡＳ番号４９５－６１－４）。
【0012】
本明細書で言及される溶液の濃度の文脈における「％」は、特に示されない限り、パーセント（モル／モル）を意味する。
【0013】
本明細書及び特許請求の範囲において、「１つの（ａ）」又は「１つの（ａｎ）」は、それが使用される文脈に応じて、以下に言及される項目の１つ以上を意味し得ることを理解されたい。したがって、例えば、「１つの」項目に対する言及は、上記項目のうちの少なくとも１つを利用できることを意味し得る。
【0014】
以下に使用されるように、「有する」、「含む」又は「包含する」という用語は、非限定的な意味又は限定的な意味のいずれかを有することが意図される。したがって、限定的な意味のこれらの用語を有することは、記載された実施形態に、これらの用語によって導入された特徴以外の他の特徴が存在しない状況を指す可能性があり、即ち、この用語は、「からなる」又は「から本質的になる」という意味で限定的な意味を有する。非限定的な意味を有する場合、この用語は、記載される実施形態に、これらの用語によって導入される特徴以外に１つ以上の他の特徴が存在する状況を指す。
【0015】
更に、以下で使用されるように、「好ましくは」、「より好ましくは」、「最も好ましくは」、「詳細には」、「より詳細には」、「典型的には」及び「より典型的には」という用語は、これらの特徴が好ましい特徴であることを示すため、特徴と共に使用され、即ち、この用語により、本発明に従って代替的な特徴も想定され得ることが示されるものとする。
【0016】
更に、本明細書で使用される「少なくとも１つの」という用語は、その用語に続いて言及される項目の１つ以上が本発明に従って使用され得ることを意味することが理解されるであろう。例えば、この用語が少なくとも１つの項目を使用しなければならないことを示す場合、このことは、１つの項目又は２つ以上の項目、即ち２つ、３つ、４つ、５つ又は任意の他の数の項目であるものと理解され得る。その用語が言及する項目に応じて、当業者は、存在する場合にその用語がどの上限を指す可能性があるのかについて理解している。
【0017】
本発明による方法は、上述の工程からなり得るか、又は追加の工程を含み得るかのいずれかである。このような追加の工程は、前処理の工程であり得るか、又は精製工程などの少なくとも１つのサンタレンを含む組成物の製造に必要とされる工程であり得る。
【0018】
本明細書で使用される「製造」という用語は、少なくとも１つのサンタレンを含む組成物、特にβ－サンタレンを含む組成物、より好ましくはα－サンタレンとβ－サンタレンの混合物を含む組成物、最も好ましくは過剰なβ－サンタレンを含む組成物の生成を指す。この製造により、組成物中の任意の程度の純度の上記少なくとも１つのサンタレンを得ることができる。想定される純度の程度が高いほど、更に追加の精製が必要となる。本方法は、エキソビボで、例えば１つ以上の反応バイアル中で行われ得る。或いは、方法は、本明細書の他の箇所で言及される宿主細胞を含む植物又は微生物を含む非ヒトトランスジェニック生物、好ましくは非脊椎動物トランスジェニック生物などの生物内で全体的又は部分的に行われ得る。
【0019】
本発明に従って使用される「サンタレン」という用語は、α－サンタレン（ＣＡＳ番号５１２－６１－８；６，７－ジメチル－７－（４－メチルペンタ－３－エニル）－２，３，４，５－テトラヒドロ－１Ｈ－トリシクロ［２．２．１．０２，６］ヘプタン；分子式Ｃ１５Ｈ２４）、β－サンタレン（ＣＡＳ番号５１１－５９－１、（１Ｒ，３Ｒ，４Ｓ）－３－メチル－２－メチリデン－３－（４－メチルペンタ－３－エニル）ビサイクル［２．２．１］ヘプタン；分子式Ｃ１５Ｈ２４）、及びエピ－β－サンタレン（ＣＡＳ番号２５５３２－７８－９；（３Ｓ）－３－メチル－２－メチリデン－３－（４－メチルペンタ－３－エニル）ビサイクル［２．２．１］ヘプタン；分子式Ｃ１５Ｈ２４）、及びトランス－ａ－ベルガモテン（ＣＡＳ番号１３４７４－５９－４；本明細書においてこれ以降、トランス－αベルガモテン又は短縮してベルガモテンとも呼ばれる）からなる群から選択される三環式セスキテルペンに関する。好ましくは、上記サンタレンは、β－サンタレン（ＣＡＳ番号５１１－５９－１、分子式Ｃ１５Ｈ２４）である。
【化1】
【0020】
式Ｉは、（－）－β－サンタレン（ＣＡＳ番号５１１－５９－１、以下、β－サンタレンと称する）を表す。
【0021】
本発明に従って言及される「少なくとも１つのサンタレン」は、好ましくはβ－サンタレンである。より好ましくは、過剰なβ－サンタレンを含むβ－サンタレンとα－サンタレンの混合物である。より好ましくは、上記β－サンタレンは、全サンタレンに対して少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、好ましくは約５０％～約８０％、約６０％～約７５％、約６５％～約７０％、より好ましくは少なくとも約６７％の相対量で組成物中に存在する。本明細書で言及される全サンタレンは、組成物中に見出される全てのサンタレンを包含する。好ましくは、これらは、α－サンタレン、β－サンタレン、及びベルガモテンである。他の少量のサンタレンも同様に発生する可能性がある。
【0022】
更に好ましくは、ベルガモテンのβ－サンタレンに対する比は、１．０未満、例えば、０．９以下、０．８以下、又は０．７以下、例えば、０．５以下、０．４以下、０．３以下、０．２以下、又は更には０．１以下である。本発明の別の態様では、全サンタレンは、１０％以下のみのベルガモテンと、α－サンタレンよりも過剰なβサンタレンと、を含む。本発明の更なる態様では、αサンタレンとベルガモテンを合わせたパーセント（ｍｏｌ／ｍｏｌ）は、サンタレン全体に占めるβ－サンタレンのパーセント（ｍｏｌ／ｍｏｌ）よりも小さい。
【0023】
本発明の更なる態様では、組成物は、少なくとも１つのサンタレン、好ましくはα－サンタレンより過剰なβ－サンタレンを含み、組成物は、更にａ）検出可能な量、好ましくは０．０１％～３％（ｍｏｌ／ｍｏｌ）のセスキツジェン（ＣＡＳ番号５８３１９－０６－５）を含み；ｂ）以下のもののうちのいずれか又は全てを実質的に含まない；シス－α－ベルガモテン（（ＡＳ番号１８２５２－４６－５）、（Ｅ）－β－ファルネセン（β－ファルネセン、ＣＡＳ番号１８７９４－８４－８）、トランス－β－ベルガモテン（ＣＡＳ番号１５４３８－９４－５）、及びβ－ビサボレン（ＣＡＳ番号４９５－６１－４）、又はａ）とｂ）の組み合わせ。
【0024】
（Ｅ）－β－ファルネセンが存在しない、又は少なくとも大幅に量が減少していることは、例えば、サンタロールを生成するためにサンタレンを含む組成物が使用される場合に有用であり、そのような酸化反応では、（Ｅ）－β－ファルネセンの存在があまり望ましくない。
【0025】
本発明に従って使用される「ポリペプチド」という用語は、ペプチド結合によって互いに連結されたアミノ酸の連続配列を指す。本発明によるポリペプチドは、典型的には、アミノ酸鎖が本明細書の他の箇所で言及される酵素活性を発揮するのに必要とされる三次元構造を形成することができるように、少なくとも５０、少なくとも１００又は少なくとも２００アミノ酸長から構成される。「タンパク質」という用語は、本明細書において互換的に用いられ得る。
【0026】
本明細書に使用される「サンタレンシンターゼ活性」という用語は、出発物質としてのファルネシルピロホスフェートを少なくとも１つのサンタレンに変換することができる酵素の活性を指す。典型的には、サンタレンシンターゼは、α－サンタレン、β－サンタレン、エピ－β－サンタレン、及びトランス－αベルガモテンなどの（２Ｅ，６Ｅ）－ファルネシルジホスフェートからのセスキテルペノイド、並びに微量のα－ファルネセン及びβ－ファルネセンの混合物を触媒することができる。これらはまた、α－エンド－ベルガモテン、α－サンタレン、（Ｚ）－β－ファルネセン、エピ－β－サンタレン、及びβ－サンタレンへの変換のための（Ｚ，Ｚ）－ファルネシルジホスフェート異性体を使用してもよい（Ｅ．Ｃ．４．２．３．８１）。
【0027】
好ましくは、本発明に従うサンタレンシンターゼ活性を有するポリペプチドは：
ａ）配列番号１、１８、又は２１～２８のいずれかに示されるようなアミノ酸配列；
ｂ）配列番号１、１８、又は２１～２８のいずれかに示されるようなアミノ酸配列と少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列；
ｃ）配列番号２又は３又は１９に示されるような核酸配列によってコードされるアミノ酸配列；
ｄ）配列番号２又は３又は１９に示されるような核酸配列と少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％同一である核酸配列によってコードされるアミノ酸配列；及び
ｅ）（ａ）～（ｄ）のいずれか１つのフラグメントであって、サンタレンシンターゼ活性を示すポリペプチドをコードするフラグメントのアミノ酸配列
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
ａ）配列番号１、１８、又は２１～２８のいずれかに示されるようなアミノ酸配列；
ｂ）配列番号１、１８、又は２１～２８のいずれかに示されるようなアミノ酸配列と少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列；
ｃ）配列番号２又は３又は１９に示されるような核酸配列によってコードされるアミノ酸配列；
ｄ）配列番号２又は３又は１９に示されるような核酸配列と少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％同一である核酸配列によってコードされるアミノ酸配列；及び
ｅ）（ａ）～（ｄ）のいずれか１つのフラグメントであって、サンタレンシンターゼ活性を示すポリペプチドをコードするフラグメントのアミノ酸配列
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【0028】
本発明の一態様では、ポリペプチドは、二重機能シンターゼである、即ち、ポリペプチドは、サンタレンシンターゼであり、更にはセスキツジェンシンターゼ（ＥＣ ４．２．３．１０２（２Ｅ，６Ｅ）－ファルネシル－ジホスフェートジホスフェート－リアーゼ（セスキツジェン－形成））でもある。
【0029】
本発明の更なる態様では、本発明のポリペプチドは、サンタレン及び／又はセスキツジェンが生成されるときに、実質的な量のβ－ファルネセンを生成しない。
【0030】
好ましくは、サンタレンシンターゼ活性を有するポリペプチドは、オリザ属（Ｏｒｙｚａ）からのポリペプチド、例えば、Ｏ．メリディオナリス（Ｏ．Ｍｅｒｉｄｉｏｎａｌｉｓ）、Ｏ．グルミパトゥラ（Ｏ．ｇｌｕｍｉｐａｔｕｌａ）、Ｏ．サティバ（Ｏ．ｓａｔｉｖａ）、Ｏ．ルフィポゴン（Ｏ．ｒｕｆｉｐｏｇｏｎ）、Ｏ．グラベリマ（Ｏ．ｇｌａｂｅｒｒｉｍａ）、Ｏ．ニヴァラ（Ｏ．ｎｉｖａｒａ）、Ｏ．バルチ（Ｏ．ｂａｒｔｈｉｉ）、Ｏ．プンクタータ（Ｏ．ｐｕｎｃｔａｔａ）からのポリペプチドが挙げられるが、これらに限定されないポリペプチドに由来するか、又はそのポリペプチドに基づく。
【0031】
本発明に従うサンタレンシンターゼ活性を有するポリペプチドは、好ましくは、これらのサンタレン生成に好適な条件下で、１以上、好ましくは少なくとも１．１、より好ましくは少なくとも１．２、更により好ましくは１．３である比で、β－サンタレン及びα－サンタレンを生成している。
【0032】
本発明のこれらのサンタレンシンターゼは、好ましくはＧＣ－ＦＩＤによって測定される、β－サンタレン対α－サンタレンのモル比が１以上；例えば、比は少なくとも１．０５、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、又は少なくとも２である、β－サンタレン及びα－サンタレンを生成する。β－サンタレン対α－サンタレンの比は、少なくとも３：１、好ましくは少なくとも４：１、より好ましくは少なくとも５：１、更により好ましくは６：１、なお更により好ましくは少なくとも７：１、最も好ましくは少なくとも８：１、更には少なくとも９：１であり得る。本発明の一態様では、比は、１００：１以下である。
【0033】
更に、本発明の別の態様は、トランス－αベルガモテンよりも過剰であるαサンタレンよりも過剰なβサンタレンを生成する、本明細書に定義されるサンタレンシンターゼ活性を有するポリペプチドに関する。典型的には、当該技術分野で公知のサンタレンシンターゼは、かなりの量のベルガモテンが生成されるが、これは用途によっては望ましくないサンタレンとなる。驚くべきことに、本発明のサンタレンシンターゼ活性を有するポリペプチドは、少量のベルガモテン（総サンタレンの１０％未満）しか生成せず、αサンタレンよりも過剰なβサンタレンを生成することが示された。
【0034】
上記で本明細書に言及される「配列同一性」は、アミノ酸配列又は核酸配列間の関係を定義し、これらの配列を比較することによって決定することができるものである。通常、配列同一性は、２つの配列を配列の全長にわたって比較することにより決定されるが、互いにアライメントした配列の一部のみでも比較され得る。好ましくは、配列同一性は、本明細書では、配列の全長にわたって比較される。配列同一性は、ポリペプチド配列又は核酸配列間の関連性の程度を指す。配列同一性は、互いに比較された２つの配列内の同一のアミノ酸又はヌクレオチドの割合で表される。したがって、２つの配列をアライメントした際、それらの配列間で一致するアミノ酸又はヌクレオチドの数を一般に決定し、アライメントした配列又は配列の一部におけるアミノ酸又はヌクレオチドの総数と関連付ける。例えば、バリアント配列は、親配列、即ち配列番号１、１８、若しくは２１～２８のいずれか２つに示されるようなアミノ酸配列又は配列番号２若しくは３若しくは１９に示されるような核酸配列と比較したときのそれらの配列同一性によって定義され得る。２つの配列間のパーセント同一性を決定するために、最初の工程で、これらの２つの配列間でペアワイズ配列アライメントを生成し、この２つの配列をそれらの完全、全体又は全長にわたってアライメントする（即ちペアワイズグローバルアライメント）。アライメントは、本明細書に記載されるプログラム又はソフトウェアを用いて生成される。本発明の目的に好ましいアライメントは、最大配列同一性を決定することができるアライメントである。
【0035】
配列アライメントは、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈアルゴリズム－Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ，Ｓａｕｌ Ｂ．＆Ｗｕｎｓｃｈ，Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ Ｄ．（１９７０）．“Ａ ｇｅｎｅｒａｌ ｍｅｔｈｏｄ ａｐｐｌｉｃａｂｌｅ ｔｏ ｔｈｅ ｓｅａｒｃｈ ｆｏｒ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｉｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｔｗｏ ｐｒｏｔｅｉｎｓ”．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ４８（３）：４４３－４５３などの様々なソフトウェアツールを用いて生成される。このアルゴリズムは、例えば、２つの配列の網羅的なアライメントを行う「ＮＥＥＤＬＥ」プログラムに組み込まれる。ＮＥＥＤＬＥプログラムは、例えばＥｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｏｐｅｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｓｕｉｔｅ（ＥＭＢＯＳＳ）内に含有される。ＥＭＢＯＳＳ － 様々なプログラムの一群：Ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｏｐｅｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｓｕｉｔｅ（ＥＭＢＯＳＳ），Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １６（６），２７６（２０００）。ＢＬＯＳＵＭ（ＢＬＯｃｋｓ ＳＵｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ Ｍａｔｒｉｘ） － 例えば、タンパク質ドメインの保存領域のアライメントに基づいて通常生成される（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ Ｓ，Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ＪＧ：Ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ ｍａｔｒｉｃｅｓ ｆｒｏｍ ｐｒｏｔｅｉｎ ｂｌｏｃｋｓ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ＵＳＡ．１９９２ Ｎｏｖ １５；８９（２２）：１０９１５－９）。多くのＢＬＯＳＵＭのうち１つは、「ＢＬＯＳＵＭ６２」であり、これは、タンパク質配列をアラインする際、しばしば多くのプログラムに対する「デフォルト」設定である。ＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ） － 大規模な配列データベースにおいて類似配列を検索するために主に使用されているいくつかの個々のプログラム（ＢｌａｓｔＰ、ＢｌａｓｔＮ）からなる。ＢＬＡＳＴプログラムは、ローカルアライメントも生成する。典型的には、改良バージョン（「ＢＬＡＳＴ２」）である、ＮＣＢＩ（全米バイオテクノロジー情報センター）により提供される「ＢＬＡＳＴ」インターフェースが使用される。「元の」ＢＬＡＳＴ： Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．，Ｇｉｓｈ，Ｗ．，Ｍｉｌｌｅｒ，Ｗ．，Ｍｙｅｒｓ，Ｅ．Ｗ．＆ Ｌｉｐｍａｎ，Ｄ．Ｊ．（１９９０）“Ｂａｓｉｃ ｌｏｃａｌ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｓｅａｒｃｈ ｔｏｏｌ．”Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０；ＢＬＡＳＴ２： Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓｔｅｐｈｅｎ Ｆ．，Ｔｈｏｍａｓ Ｌ．Ｍａｄｄｅｎ，Ａｌｅｊａｎｄｒｏ Ａ．Ｓｃｈａｆｆｅｒ，Ｊｉｎｇｈｕｉ Ｚｈａｎｇ，Ｚｈｅｎｇ Ｚｈａｎｇ，Ｗｅｂｂ Ｍｉｌｌｅｒ，ａｎｄ Ｄａｖｉｄ Ｊ．Ｌｉｐｍａｎ（１９９７），“Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ ａｎｄ ＰＳＩ－ＢＬＡＳＴ：ａ ｎｅｗ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄａｔａｂａｓｅ ｓｅａｒｃｈ ｐｒｏｇｒａｍｓ”，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－３４０２。
【0036】
本明細書で使用されるような配列同一性は、好ましくは、ＥＭＢＯＳＳペアワイズアライメントアルゴリズム「Ｎｅｅｄｌｅ」により決定されるような値である。特に、「最長同一性」を計算するＮＯＢＲＩＥＦオプション（‘Ｂｒｉｅｆ ｉｄｅｎｔｉｔｙ ａｎｄ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ’ ｔｏ ＮＯ）を使用して、ＥＭＢＯＳＳパッケージからＮＥＥＤＬＥプログラムを使用することができる（バージョン２．８．０以降、ＥＭＢＯＳＳ：Ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｏｐｅｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｓｕｉｔｅ－Ｒｉｃｅ，Ｐ．，ｅｔ ａｌ．Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（２０００）１６；２７６－２７７；ｈｔｔｐ：／／ｅｍｂｏｓｓ．ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．ｎｌ）。このような場合、アライメントされた２つの配列間の同一性は、以下のように計算される：両配列において同一のアミノ酸を示すアライメントにおける対応する位置の数を、アライメントにおけるギャップの総数の減算後のアライメントの全長により除する。アミノ酸配列のアライメントでは、デフォルトパラメータは、マトリクス＝Ｂｌｏｓｕｍ６２；オープンギャップペナルティ＝１０．０；ギャップ伸長ペナルティ＝０．５である。核酸配列のアライメントでは、デフォルトパラメータは、マトリクス＝ＤＮＡｆｕｌｌ；オープンギャップペナルティ＝１０．０；ギャップ伸長ペナルティ＝０．５である。
【0037】
本明細書で言及されるバリアントアミノ酸配列又は核酸配列は、対立遺伝子バリアント又はオーソログ、パラロガス若しくは相同バリアントなどの天然に存在するバリアントであり得る。或いは、このような配列は、例えば、分子進化若しくは合理的設計のような当業者に公知の生物学的技術により、又は当技術分野で公知であり、本明細書の他の箇所に記載される変異誘発技術（ランダム変異誘発、部位特異的変異誘発、定向進化、遺伝子組換えなど）を使用することにより、酵素又は核酸の特性を改善（例えば、酵素の発現の改善又は酵素の酵素活性の増加）するために人為的に生成され得る。典型的には、本発明に従うサンタレンシンターゼ活性を有するポリペプチドのバリアントは、配列番号１、１８、又は２１～２８のいずれかのアミノ酸配列、好ましくは、人工アミノ酸配列と比較して、１つ又はいくつかのアミノ酸置換を有するポリペプチドである。
【0038】
配列番号２若しくは３若しくは１９に示されるような核酸配列によってコードされるアミノ酸配列又は配列番号２若しくは３若しくは１９に示されるような核酸配列と少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％若しくは少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列によってコードされるバリアント核酸配列は、少なくとも１つのヌクレオチド置換、付加及び／又は欠失により、本明細書の他の箇所に記載される理由のために配列番号２若しくは３若しくは１９に示される核酸配列と異なり得る。本明細書で言及されるそのようなバリアント核酸配列を含むポリヌクレオチドは、好ましくは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で互いにハイブリダイズできることが理解されるであろう。本明細書で言及されるストリンジェントなハイブリダイゼーション条件とは、好ましくは、約４５℃で６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）、続いて５０～６５℃で０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で１回以上の洗浄工程を行うことである。当業者は、これらのハイブリダイゼーション条件が、緩衝液の温度及び濃度に関して、例えば有機溶媒が存在する場合、核酸の種類に応じて異なることを知っている。例えば、「標準的なハイブリダイゼーション条件」下では、温度は、核酸の種類に応じて異なり、０．１～５×ＳＳＣ（ｐＨ７．２）の濃度の水性緩衝液中で４２℃～５８℃である。上述した緩衝液中に有機溶媒が存在する、例えば５０％ホルムアミドである場合、標準条件下の温度は約４２℃である。ＤＮＡ：ＤＮＡハイブリッドのハイブリダイゼーション条件は、好ましくは、０．１×ＳＳＣで２０℃～４５℃、好ましくは３０℃～４５℃である。ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドのハイブリダイゼーション条件は、好ましくは、０．１×ＳＳＣで３０℃～５５℃、好ましくは４５℃～５５℃である。上述したハイブリダイゼーション温度は、例えば、ホルムアミドの非存在下の長さ約１００ｂｐ（＝塩基対）及びＧ＋Ｃ含有量５０％の核酸に対して決定されたものである。当業者であれば、上記の教本又は以下の教本：Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ”，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８９；Ｈａｍｅｓ ａｎｄ Ｈｉｇｇｉｎｓ（Ｅｄ．）１９８５，”Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ”，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ ａｔ Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ；Ｂｒｏｗｎ（Ｅｄ．）１９９１，“Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ”，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ ａｔ Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄのような教本を参照することにより、必要とされるハイブリダイゼーション条件をどのように決定するかを知っている。したがって、バリアント核酸配列は、配列番号２若しくは３若しくは１９に示されるような核酸配列によってコードされるアミノ酸配列又は配列番号２若しくは３若しくは１９に示されるような核酸配列と少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％若しくは少なくとも９９％同一である核酸配列によってコードされるアミノ酸配列をコードする核酸配列と、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドから誘導することができる。
【0039】
本発明は、更に、サンタレンシンターゼ活性を有するバリアントポリペプチドを調製するための方法であって、
（ａ）配列番号２又は３又は１９のいずれか１つに記載の核酸を選択する工程と、
（ｂ）選択された核酸を改変して、少なくとも１つの変異核酸を得る工程と、
（ｃ）本明細書に定義される宿主細胞又は単細胞生物を変異核酸配列で形質転換して、変異核酸配列によってコードされるポリペプチドを発現させる工程と、
（ｄ）少なくとも１つの改変された特性についてポリペプチドをスクリーニングする工程と、
（ｅ）任意選択により、ポリペプチドに所望のバリアントサンタレンシンターゼ活性がない場合、本明細書に定義される所望のバリアントサンタレンシンターゼ活性を有するポリペプチドが得られるまでプロセス工程（ａ）～（ｄ）を繰り返す工程と、
（ｆ）任意選択により、工程（ｄ）で所望のバリアントサンタレンシンターゼ活性を有するポリペプチドが同定された場合、工程（ｃ）で得られた対応する変異核酸を単離する工程とを含む方法に関する。
（ａ）配列番号２又は３又は１９のいずれか１つに記載の核酸を選択する工程と、
（ｂ）選択された核酸を改変して、少なくとも１つの変異核酸を得る工程と、
（ｃ）本明細書に定義される宿主細胞又は単細胞生物を変異核酸配列で形質転換して、変異核酸配列によってコードされるポリペプチドを発現させる工程と、
（ｄ）少なくとも１つの改変された特性についてポリペプチドをスクリーニングする工程と、
（ｅ）任意選択により、ポリペプチドに所望のバリアントサンタレンシンターゼ活性がない場合、本明細書に定義される所望のバリアントサンタレンシンターゼ活性を有するポリペプチドが得られるまでプロセス工程（ａ）～（ｄ）を繰り返す工程と、
（ｆ）任意選択により、工程（ｄ）で所望のバリアントサンタレンシンターゼ活性を有するポリペプチドが同定された場合、工程（ｃ）で得られた対応する変異核酸を単離する工程とを含む方法に関する。
【0040】
上述のフラグメントは、上記で特定したサンタレンシンターゼ活性を示すのに十分な長さを有する、上述の配列及び配列バリアントの任意のアミノ酸配列からなるポリペプチドであってもよい。したがって、好ましくは、ポリペプチドの上述の生物活性を有するフラグメントが、サンタレンシンターゼの触媒的に活性な領域のアミノ酸配列を含んでいることが想定される。典型的には、フラグメントは、上述の配列又は配列バリアントに由来する少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも１５０、又は少なくとも２００の連続したアミノ酸長からなる。
【0041】
好ましくは、本明細書で言及されるポリペプチドのフラグメント又は本明細書で言及されるバリアントポリペプチドは、少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つ、より好ましくは３つのＰｆａｍドメインを含む。典型的には、本発明に従って言及されるＰｆａｍドメインは、テルペンシンターゼのＮ末端ドメイン（ＰＦ０１３９７．２１）、テルペンシンターゼの金属結合ドメイン（ＰＦ０３９３６．１６）、及びトリコジエンシンターゼＴＲＩ５のＰｆａｍドメイン（ＰＦ０６３３０．１１）である。本明細書で言及されるＰｆａｍドメインは、ＰＦＡＭのバージョン３２．０を使用して分析され、ＰＦＡＭの詳細については、“Ｔｈｅ Ｐｆａｍ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆａｍｉｌｉｅｓ ｄａｔａ－ｂａｓｅ ｉｎ ２０１９：Ｓ．Ｅｌ－Ｇｅｂａｌｉ，Ｊ．Ｍｉｓｔｒｙ，Ａ．Ｂａｔｅｍａｎ，Ｓ．Ｒ．Ｅｄｄｙ，Ａ．Ｌｕｃｉａｎｉ，Ｓ．Ｃ．Ｐｏｔｔｅｒ，Ｍ．Ｑｕｒｅｓｈｉ，Ｌ．Ｊ．Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ，Ｇ．Ａ．Ｓａｌａｚａｒ，Ａ．Ｓｍａｒｔ，Ｅ．Ｌ．Ｌ．Ｓｏｎｎｈａｍｍｅｒ，Ｌ．Ｈｉｒｓｈ，Ｌ．Ｐａｌａｄｉｎ，Ｄ．Ｐｉｏｖｅｓａｎ，Ｓ．Ｃ．Ｅ．Ｔｏｓａｔｔｏ，Ｒ．Ｄ．Ｆｉｎｎ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２０１９）及びｈｔｔｐ：／／ｐｆａｍ．ｘｆａｍ．ｏｒｇ／．を参照されたい。
【0042】
好ましくは、本発明に従うサンタレンシンターゼ活性を有するポリペプチド又はフラグメントは、図４に示す保存されたドメインの少なくとも１つ、好ましくは全てを含むものとする。保存されたドメインは、図４に黒い背景に薄い文字で示されている。好ましくは、保存されたドメインは、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１５、又は少なくとも２０のアミノ酸からなるものとする。本発明に従って言及される特に好ましい保存されたドメインは、配列番号１の以下のアミノ酸：アミノ酸８２～９６、１３３～１４６、１４８～１５６、１６３～１８５、１９５～２０５、２１４～２２５、２２７～２３３、２３５～２４２、３４５～３５２、３７５～３８２、４００～４０９、及び４１１～４１９を有するものである。
【0043】
別の実施形態では、本発明のサンタレンシンターゼは、アミノ酸グリシンの後にアルギニンが続き、任意のアミノ酸が続き、その後にシステインが続き、その後に任意のタイプの４つのアミノ酸が続き、最後にトリプトファンであることを特徴とする、Ｎ末端領域にＧＲＸＣＸ４Ｗモチーフ（配列番号２０）を含む。
【0044】
好ましい実施形態では、本発明のサンタレンシンターゼ又はそのフラグメントは、配列番号１のアミノ酸ストレッチと比較して、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１、又は０個以下の変化を有する配列番号１のアミノ酸位置２８１～３４１に対応するアミノ酸ストレッチを有する。本発明の更なる態様では、配列番号１の２８１位から３４１位に対応する上記アミノ酸ストレッチの変化は、配列番号１の２９３位から２９５位及び／又は３１７位に対応するアミノ酸のいずれかにある。
【0045】
好ましくは、本発明に従うサンタレンシンターゼ活性を有するポリペプチドは：
ａ）配列番号４～１７のいずれか１つに示されるようなアミノ酸配列；
ｂ）配列番号４～１７に示されるようなアミノ酸配列と少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列；
ｃ）（ａ）又は（ｄ）のフラグメントであって、サンタレンシンターゼ活性を示すポリペプチドをコードするフラグメントのアミノ酸配列
からなる群から選択されるアミノ酸配列を更に含み得る。
ａ）配列番号４～１７のいずれか１つに示されるようなアミノ酸配列；
ｂ）配列番号４～１７に示されるようなアミノ酸配列と少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列；
ｃ）（ａ）又は（ｄ）のフラグメントであって、サンタレンシンターゼ活性を示すポリペプチドをコードするフラグメントのアミノ酸配列
からなる群から選択されるアミノ酸配列を更に含み得る。
【0046】
サンタレンシンターゼ活性を示す上述のポリペプチドはまた、融合ポリペプチドに含まれていてもよい。このような融合ポリペプチドは、サンタレンシンターゼ活性を示すポリペプチドのアミノ酸配列に加えて、１つ以上の追加のアミノ酸配列を含む。上記追加のアミノ酸配列は、本明細書の他の箇所で特定されるファルネシルピロホスフェートシンターゼ若しくはシトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼなどの他の酵素活性を有するポリペプチド、又は例えば適切な発現をモニターするため若しくは精製目的のためのマーカー若しくは標識機能を有するポリペプチド若しくはペプチド、例えばタグ（例えば、ＭＹＣタグ、ＦＬＡＧタグ、Ｈｉｓタグなど）若しくは蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ、ＢＦＰ、ＹＦＰ若しくはＣＦＰ）であり得る。
【0047】
更に、本開示は、サンタレン及びサンタロールを調製するための方法であって、タグペプチドを含む第１セグメントと本発明に従うサンタレンシンターゼを含む第２セグメントとを含む酵素の存在下で、ファルネシルジホスフェート（ＦＰＰ）サンタレンを変換することを含む方法に関する。上記第１セグメントと上記第２セグメントとを含む酵素は、本明細書では、「タグ付き酵素」と称される。
【0048】
タグペプチドは、好ましくは、窒素利用タンパク質（ＮｕｓＡ）、チオレドキシン（Ｔｒｘ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、グルタチオンＳ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、小ユビキチン様修飾因子（ＳＵＭＯ）、又はカルシウム結合ンパク質（Ｆｈ８）、及びそれらの機能的相同体の群から選択される。本明細書で使用する場合、タグペプチドの機能的相同体は、タグなし酵素と比較して、タグ付き酵素の溶解度に対して少なくともほぼ同じ効果を有するタグペプチドである。典型的には、相同体は、その相同体のペプチドに１つ以上のアミノ酸残基が挿入、置換、欠失又は延長されている点で異なる。相同体は、特に、親水性アミノ酸の別の親水性アミノ酸への１つ以上の置換又は疎水性アミノ酸の別の疎水性アミノ酸への１つ以上の置換を含み得る。相同体は、特に、ＮｕｓＡ、Ｔｒｘ、ＭＢＰ、ＧＳＴ、ＳＵＭＯ又はＦｈ８の配列と少なくとも４０％、より詳細には少なくとも５０％、好ましくは少なくとも５５％、より好ましくは少なくとも６０％の配列同一性、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有し得る。
【0049】
特に好適なものは、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）由来のマルトース結合タンパク質又はその機能的相同体である。
【0050】
本発明によるタグ付き酵素を使用することは、生成物の増加、具体的にはテルペノイド又はテルペン、例えばサンタレン及び／又はセスキツジェンの細胞生成の増加に寄与し得る点で特に有利である。
【0051】
（タグなしの酵素と比較して）タグ付き酵素の溶解性を向上させるため、酵素の第１セグメントは、そのＣ末端で第２セグメントのＮ末端に結合することが好ましい。或いは、タグ付き酵素の第１のセグメントは、そのＮ末端で第２のセグメントのＣ末端に結合する。
【0052】
更に、本発明は、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸に関し、ポリペプチドは、タグペプチド、好ましくはＭＢＰ、ＮｕｓＡ、Ｔｒｘ、ＧＳＴ、ＳＵＭＯ若しくはＦｈ８－タグ又はこれらのいずれかの機能的相同体を含む第１のセグメントと、サンタレンシンターゼを含む第２のセグメントとを含む。第２のセグメントは、例えば、配列番号１、４～１７のいずれか１つに示されるようなアミノ酸配列又はその機能的類似体を含み得る。一例は、配列番号１８の合成融合タンパク質である。
【0053】
更に、本発明は、上記タグ付きサンタレンシンターゼをコードする上記核酸を含む宿主細胞に関する。
【0054】
タグ付き酵素をコードする本発明による特定の核酸を、配列番号１９に示す。宿主細胞は、特に、それらの配列のいずれかを含む遺伝子又はその機能的類似体を含み得る。
【0055】
本発明の方法では、ファルネシルピロホスフェートは、本明細書で特定されるサンタレンシンターゼによって少なくとも１つのサンタレンに酵素的に変換される。
【0056】
上述の変換工程は、インビトロで、即ち上記に記載されるような変換に必要とされる全ての成分を含有する好適な反応バイアル中で実施され得る。当業者は、反応が効率的に行われるように、反応条件をどのように調整するのかを十分に認識している。例えば、好適な緩衝液を使用して、好適なｐＨ及び好適な塩濃度を有する環境で成分を供給することができる。このような設定における好適な温度も同様にそのまま適用することができる。
【0057】
或いは、変換工程は、本明細書の他の箇所で記載されているような宿主細胞中で行われ得る。好ましくは、宿主細胞は、細菌細胞、酵母細胞、真菌細胞、藻細胞又はシアノバクテリア細胞、非ヒト動物細胞又は非ヒト哺乳動物細胞及び植物細胞からなる群から選択される。宿主細胞がサンタレンを産生できるものとすることを理解すべきである。必要であれば、宿主細胞は、上述のサンタレンシンターゼを含むサンタレン合成に必要な酵素又はタンパク質を発現させるために遺伝子改変される必要がある。宿主細胞は、上述の酵素を発現させ、ファルネシルピロホスフェートを少なくとも１つのサンタレンに変換することが可能となるのに十分な条件下及び時間で培養するものとする。特に好ましい条件は、以下の添付の実施例にも記載されているか、又は当業者に知られている。
【0058】
更に、本発明の方法の変換工程は、生物、典型的には本明細書の他の箇所で言及されるトランスジェニック非ヒト生物などの多細胞生物でも実施することができる。典型的には、上記生物は、ファルネシルピロホスフェートを少なくとも１つのサンタレンに変換するのに必要とされる酵素が発現されるように遺伝子改変される。しかしながら、当業者は、所与の非ヒトトランスジェニック生物の選択に応じて、どのような条件を適用する必要があるのかを十分に認識している。
【0059】
本発明の方法がインビボで、すなわち宿主細胞又は非ヒトトランスジェニック生物内で行われる場合、上記宿主細胞又は非ヒトトランスジェニック生物は、ファルネシルピロホスフェートの少なくとも１つのサンタレンへの変換が上記宿主細胞又は非ヒトトランスジェニック生物内で行われ得るように、上で特定されるようなサンタレンシンターゼ活性を示すポリペプチドを発現するものと理解されるであろう。好ましくは、サンタレンシンターゼ活性を示す上記ポリペプチドは、異種ポリヌクレオチド、ベクター、又は遺伝子構築物によってコードされる。
【0060】
本文脈における「異種ポリペプチド」という用語は、サンタレンシンターゼ活性を示すポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、それが導入される宿主細胞又は生物に天然に存在しないことを意味する。したがって、異種ポリヌクレオチドは、第１の種に由来するか、又は人工的に改変されたポリヌクレオチドであり、一方、宿主細胞又は非ヒトトランスジェニック生物は、上記第１の種とは異なる第２の種に由来する。異種ポリヌクレオチドは、本明細書において以下に特定されるようなベクター又は遺伝子構築物に含まれていてもよい。或いは、異種ポリヌクレオチドは、ゲノムへの組み込みにより、上記異種ポリヌクレオチドによってコードされるサンタレンシンターゼ活性を示すポリペプチドが発現されるように、宿主細胞又は非ヒトトランスジェニック生物のゲノムに導入され得る。典型的には、異種ポリヌクレオチドは、例えば内在性プロモーターの近傍など、異種ポリヌクレオチドの発現を可能にする遺伝子座で宿主細胞又は非ヒトトランスジェニック生物のゲノムに組み込まれるものとする。
【0061】
「ベクター」という用語は、好ましくは、ファージ、プラスミド、コスミド、ウイルスベクター及び細菌又は酵母人工染色体（ＹＡＣ）などの人工染色体を包含する。本発明のポリヌクレオチドを包含するベクターは、好ましくは、宿主における増殖及び／又は選択のための選択マーカーを更に含む。ベクターは、当技術分野でよく知られた様々な技術によって宿主細胞に組み込まれ得る。宿主細胞に導入する場合、ベクターは、細胞質に存在し得るか、又はゲノムに組み込まれ得る。後者の場合、ベクターは、相同組換え又は異種挿入を可能にする核酸配列を更に含み得ることを理解されたい。ベクターは、従来の形質転換技術又はトランスフェクション技術によって原核細胞又は真核細胞に導入することができる。これに関連して使用される場合、「形質転換」及び「トランスフェクション」、コンジュゲーション及び形質導入という用語は、リン酸カルシウム、塩化ルビジウム又は塩化カルシウム共沈、ＤＥＡＥ－デキストラン媒介トランスフェクション、リポフェクション、ｆ因子による接合、天然コンピテンス、炭素系クラスター、化学的媒介導入、エレクトロポレーション又は微粒子銃を含む、外来核酸（例えばＤＮＡ）を宿主細胞に導入するための複数の先行技術のプロセスを含むことが意図される。植物細胞を含む宿主細胞の形質転換又はトランスフェクションに好適な方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（ｌｏｃ．ｃｉｔ．）ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌｓ，ｓｕｃｈ ａｓ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９９５，Ｖｏｌ．４４，Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｅｄ．：Ｇａｒｔｌａｎｄ ａｎｄ Ｄａｖｅｙ，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙに見出すことができる。或いは、熱ショック又はエレクトロポレーション技術によってプラスミドベクターを導入し得る。ベクターがウイルスである場合、宿主細胞に適用する前に適切なパッケージング細胞株を使用してインビトロでパッケージングし得る。
【0062】
好ましくは、本明細書で言及されるベクターは、クローニングベクター、即ち微生物系で複製可能なクローニングベクターとして好適である。このようなベクターにより、細菌、好ましくは酵母又は真菌における効率的なクローニングが確実となり、植物の安定的な形質転換が可能となる。挙げるべきベクターは、特に、Ｔ ＤＮＡに媒介される形質転換に好適な様々なバイナリーベクター系及び同時組み込みベクター系である。このようなベクター系は、通例、少なくともｖｉｒ遺伝子（アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）に媒介される形質転換に必要とされる）と、Ｔ－ＤＮＡの境界を定める配列（Ｔ－ＤＮＡボーダー）とを含むことを特徴とする。これらのベクター系には、好ましくは、プロモーター及びターミネーターなどの更なるシス調節領域並びに／又は好適な形質転換宿主細胞若しくは生物を同定することができる選択マーカーも含まれる。同時組み込みベクター系は、ｖｉｒ遺伝子とＴ ＤＮＡ配列とが同じベクター上に配置されている一方、バイナリー系は、少なくとも２つのベクターをベースとしたものであり、その一方は、ｖｉｒ遺伝子を有するが、Ｔ－ＤＮＡがなく、第２のものは、Ｔ ＤＮＡを有するが、ｖｉｒ遺伝子がない。結果として、後者で述べたベクターは比較的小さく、操作が容易であり、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）及びアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の両方で複製可能である。これらのバイナリーベクターとしては、ｐＢＩＢ－ＨＹＧ、ｐＰＺＰ、ｐＢｅｃｋｓ、ｐＧｒｅｅｎシリーズのベクターが挙げられる。好ましくは、本発明に従って使用されるのは、Ｂｉｎ１９、ｐＢＩ１０１、ｐＢｉｎＡＲ、ｐＧＰＴＶ及びｐＣＡＭＢＩＡである。バイナリーベクター及びそれらの使用についての概要は、Ｈｅｌｌｅｎｓ ｅｔ ａｌ，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０００）５，４４６－４５１に見出すことができる。更に、適切なクローニングベクターを使用することにより、ポリヌクレオチドを宿主細胞又は植物若しくは動物などの生物に導入することが可能となり、これにより、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，Ｆｌｏｒｉｄａ），ｃｈａｐｔｅｒ ６／７，ｐｐ．７１－１１９（１９９３）；Ｆ．Ｆ．Ｗｈｉｔｅ，Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ｉｎ Ｈｉｇｈｅｒ Ｐｌａｎｔｓ；ｉｎ；Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｐｌａｎｔｓ，ｖｏｌ．１，Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａｎｄ Ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ，Ｅｄ．；Ｋｕｎｇ ａｎｄ Ｒ．Ｗｕ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９９３，１５－３８；Ｂ．Ｊｅｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ，ｉｎ；Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｐｌａｎｔｓ，ｖｏｌ．１，Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａｎｄ Ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ，Ｅｄ．；Ｋｕｎｇ ａｎｄ Ｒ．Ｗｕ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９９３），１２８－１４３；Ｐｏｔｒｙｋｕｓ １９９１，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．４２，２０５ ２２５に公開及び引用されているものなどのような植物の形質転換に使用することができる。
【0063】
より好ましくは、本発明のベクターは発現ベクターである。このような発現ベクターでは、即ち、本発明のポリヌクレオチドを含むベクターは、原核細胞若しくは真核細胞又はその単離分画に発現させることができる、発現制御配列（「発現カセット」とも呼ばれる）に作動可能に連結された核酸配列を有する。好適な発現ベクターは当該技術分野で公知であり、例えば、Ｏｋａｙａｍａ－Ｂｅｒｇ ｃＤＮＡ発現ベクターであるｐｃＤＶ１（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ｐＣＤＭ８、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐｃＤＮＡ１、ｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）又はｐＳＰＯＲＴ１（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ）である。更なる典型的な融合発現ベクターの例は、ｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ；Ｓｍｉｔｈ １９８８，Ｇｅｎｅ ６７：３１－４０）、ｐＭＡＬ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）及びｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）であり、それぞれ、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースＥ結合タンパク質及びプロテインＡが組換え標的タンパク質と融合されている。好適な誘導可能な非融合性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発現ベクターの例は、特に、ｐＴｒｃ（Ａｍａｎｎ １９８８，Ｇｅｎｅ ６９：３０１－３１５）及びｐＥＴ １１ｄ（Ｓｔｕｄｉｅｒ １９９０，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５，６０－８９）である。ｐＴｒｃベクターの標的遺伝子の発現は、宿主のＲＮＡポリメラーゼによるハイブリッドｔｒｐ－ｌａｃ融合プロモーターからの転写に基づいて行われる。ｐＥＴ １１ｄベクターによる標的遺伝子の発現は、Ｔ７－ｇｎ１０－ｌａｃ融合プロモーターの転写に基づいて行われ、この転写は、同時発現させたウイルスＲＮＡポリメラーゼ（Ｔ７ ｇｎ１）によって媒介される。このウイルスポリメラーゼは、ｌａｃＵＶ ５プロモーターの転写制御下にあるＴ７ ｇｎ１遺伝子を保有する常在性ラムダ－プロファージに由来する宿主株ＢＬ２１（ＤＥ３）又はＨＭＳ１７４（ＤＥ３）により提供される。当業者は、原核生物に好適な他のベクターに精通しており、これらのベクターは、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ではｐＬＧ３３８、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＢＲ３２２などのｐＢＲシリーズ、ｐＵＣ１８又はｐＵＣ１９などのｐＵＣシリーズ、Ｍ１１３ｍｐシリーズ、ｐＫＣ３０、ｐＲｅｐ４、ｐＨＳ１、ｐＨＳ２、ｐＰＬｃ２３６、ｐＭＢＬ２４、ｐＬＧ２００、ｐＵＲ２９０、ｐＩＮ－ＩＩＩ１１３－Ｂ１、ｌａｍｂｄａｇｔ１１又はｐＢｄＣｌ、ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）ではｐｌＪ１０１、ｐｌＪ３６４、ｐｌＪ７０２又はｐｌＪ３６１、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ではｐＵＢ１１０、ｐＣ１９４又はｐＢＤ２１４、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ではｐＳＡ７７又はｐＡＪ６６７である。酵母であるＳ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）における発現用のベクターの例は、ｐＹｅｐ Ｓｅｃ１（Ｂａｌｄａｒｉ １９８７，Ｅｍｂｏ Ｊ．６：２２９－２３４）、ｐＭＦａ（Ｋｕｒｊａｎ １９８２，Ｃｅｌｌ ３０：９３３－９４３）、ｐＪＲＹ８８（Ｓｃｈｕｌｔｚ １９８７，Ｇｅｎｅ ５４：１１３－１２３）及びｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を含む。ベクター及び糸状菌などの他の真菌に使用するのに好適なベクターを構築するためのプロセスは、ｖａｎ ｄｅｎ Ｈｏｎｄｅｌ，Ｃ．Ａ．Ｍ．Ｊ．Ｊ．，＆Ｐｕｎｔ，Ｐ．Ｊ．（１９９１）“Ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｓｙｓｔｅｍｓ ａｎｄ ｖｅｃｔｏｒ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｆｏｒ ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ ｆｕｎｇｉ，ｉｎ；Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｏｆ ｆｕｎｇｉ，Ｊ．Ｆ．Ｐｅｂｅｒｄｙ ｅｔ ａｌ．，Ｅｄ．，ｐｐ．１－２８，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ；Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ又はＭｏｒｅ Ｇｅｎｅ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｆｕｎｇｉ（Ｊ．Ｗ．Ｂｅｎｎｅｔｔ＆Ｌ．Ｌ．Ｌａｓｕｒｅ，Ｅｄ．，ｐｐ．３９６－４２８；Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ）に詳細に記載されているプロセスが含まれる。更に好適な酵母ベクターは、例えば、ｐＡＧ－１、ＹＥｐ６、ＹＥｐ１３又はｐＥＭＢＬＹｅ２３である。別の方法として、本発明のポリヌクレオチドは、バキュロウイルス発現ベクターを使用して昆虫細胞に発現させることもできる。培養した昆虫細胞（例えばＳｆ９細胞）にタンパク質を発現させるために利用可能なバキュロウイルスベクターは、ｐＡｃシリーズ（Ｓｍｉｔｈ １９８３，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．３：２１５６－２１６５）及びｐＶＬシリーズ（Ｌｕｃｋｌｏｗ １９８９，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７０：３１－３９）を含む。
【0064】
更に、ベクターは、組み込みベクターであり得る。組み込みベクターは、例えば、細菌のゲノムなどの微生物のゲノムに組み込むことができる直鎖状又は環状ＤＮＡ分子を指し、本発明のサンタレンシンターゼなどの目的のポリペプチドをコードする遺伝子の安定な遺伝的形質をもたらす。組み込みベクターは、一般に、その転写をもたらす更なる核酸セグメントの制御下で（即ち作動可能に連結された）目的のポリペプチドをコードする遺伝子配列を含む１つ以上のセグメントを含む。
【0065】
このような更なるセグメントは、プロモーター及び終結配列並びに通常、相同組換えのプロセスによって標的細胞のゲノムに目的遺伝子の組み込みを誘発する１つ以上のセグメントを含み得る。典型的には、組み込みベクターは、標的細胞に導入することができるベクターであるが、その生物で機能しないレプリコンを有する。目的遺伝子を含むセグメントの組み込みは、そのセグメント内に適切なマーカーが含まれる場合に選択され得る。本発明の宿主細胞で発現させるポリペプチドに天然には関係しない、適切なシグナルペプチドをコードする１つ以上の核酸配列が、（発現）ベクターに組み込まれ得る。例えば、シグナルペプチドリーダーのＤＮＡ配列は、本発明のサンタレンシンターゼがシグナルペプチドを含む融合タンパク質として最初に翻訳されるように、本発明の核酸にインフレームで融合され得る。シグナルペプチドの性質に応じて、発現されるポリペプチドは、異なる標的化を受ける。意図される宿主細胞において機能的な分泌シグナルペプチドにより、例えば、発現されたポリペプチドの細胞外分泌が促進される。他のシグナルペプチドにより、発現されたポリペプチドが、葉緑体、ミトコンドリア及びペルオキシソームのような特定のオルガネラに誘導される。シグナルペプチドは、意図されるオルガネラへの輸送時又は細胞からの輸送時にポリペプチドから切断され得る。ポリペプチドのアミノ末端又はカルボキシル末端では、更なるペプチド配列の融合を生じさせることが可能である。
【0066】
本明細書で使用される「遺伝子構築物」という用語は、本発明のポリヌクレオチド及び追加の機能的な核酸配列を含むポリヌクレオチドを指す。本発明による遺伝子構築物は、好ましくは、線状ＤＮＡ分子である。典型的には、本発明による遺伝子構築物は、標的構築物のゲノムＤＮＡへのランダム又は部位特異的組み込みが可能な標的構築物であり得る。このような標的構築物は、好ましくは、下記に詳細に記載されるように、相同組換え又は異種組換えのいずれかを行うのに十分な長さのＤＮＡを含む。いずれの場合も、構築物は、好ましくは、プロモーター、転写開始部位、ポリアデニル化部位及び転写終結部位などの遺伝子発現を制御するための構造を有する、完璧なものでなければならない。
【0067】
好ましくは、本発明の方法は、上記製造された少なくとも１つのサンタレンを含む組成物を得る工程を含む。
【0068】
本明細書で使用される「入手する」という用語は、任意の純度の少なくとも１つのサンタレンを含む組成物を提供することを指す。したがって、組成物は、本質的に純粋な形態の少なくとも１つのサンタレンから本質的に構成されていてもよい、又は少なくとも１つのサンタレン以外の追加成分を含む混合物であってもよい。したがって、本発明の方法は、１つ以上の精製工程を包含し得る。適用する必要のある精製技術は、本発明の方法をどのように実施するのかによる。例えば、方法がインビトロで、即ち単離された成分、例えば単離された酵素、付加物及び補助成分、例えば反応緩衝液を使用して反応バイアル中で実施された場合、より少ない精製が必要となることが理解されるであろう。しかしながら、方法をインビボで、即ち本明細書の他の箇所で定義されるような宿主細胞において実施する場合、更なる精製工程と前処理工程とが必要となる可能性がある。典型的には、宿主細胞は採取される必要があり、採取された細胞は、上記細胞から少なくとも１つのサンタレンを含む組成物を放出するために溶解される。その後の精製工程では、残存成分から少なくとも１つのサンタレンを精製することを目的として、細胞片も同様に除去しなければならない。更に、工程を動物又は植物においてインビボで実施する場合、より更なる前処理及び／又は精製工程が必要となる可能性がある。当業者は、方法が実施され得る所与の状況に応じた好適な前処理及び／又は精製工程を十分に認識している。想定される精製技術は、抽出技術、ＬＣ、ＧＣ又はＨＰＬＣなどのクロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、蒸留、遠心分離、濾過などであり得る。想定される前処理工程は、回収、熱処理、超音波処理、化学物質及び／又は酵素による処理などであり得る。特に好ましい処置は、下記に添付される実施例に記載されている。
【0069】
有利には、本発明の基礎となる研究により、推定上のイネβ－サンタレンシンターゼは細菌内での発現により合成可能であり、α－サンタレンとβ－サンタレンを含むサンタレンの混合物が過剰に合成されることが明らかになった。従来、サンタレンシンターゼは、ほんのわずかな量のβ－サンタレンを含むファルネシルピロホスフェートからα－サンタレンを主に生成することが報告されている。更に、本質的にα－サンタレンを含む組成物からのβ－サンタレンの精製又は濃縮は、煩雑である。本発明及び本発明に従って見出されたサンタレンシンターゼ活性を示すポリペプチドの驚くべき特性のおかげで、サンタレン、及び好ましくはβ－サンタレンを含む組成物は、より効率的に、特に組換え製造アプローチにおいて製造することができる。
【0070】
以上の本明細書でなされた用語の定義及び説明は、別途指定される場合を除いて、本発明の以下の実施形態に変更すべき点を変更して適用される。
【0071】
本発明の方法の好ましい実施形態では、ファルネシルピロホスフェートを少なくとも１つのサンタレンに変換する工程は、宿主細胞内で行われる。
【0072】
本明細書で使用される「宿主細胞」という用語は、ファルネシルピロホスフェートを少なくとも１つのサンタレンに変換することができる原核細胞又は真核細胞であって、上記変換が、サンタレンシンターゼ活性を示すポリペプチドによって行われる、原核細胞又は真核細胞に関する。したがって、本発明の宿主細胞は、サンタレンシンターゼ活性を示すポリペプチドを発現することができる。好ましくは、上記サンタレンシンターゼ活性を示すポリペプチドは、本発明の異種ポリヌクレオチド又はベクター又は遺伝子構築物によってコードされ得る。宿主細胞は、典型的には、上で特定したサンタレンシンターゼ活性を示すポリペプチドが発現できるように、上記異種ポリヌクレオチド、ベクター、又は遺伝子構築物で形質転換される。形質転換されたベクター又は遺伝子構築物は、非組み込み型ベクター、例えばプラスミドとして維持され得るか、又は代替的に、本明細書の他の箇所でより詳細に明記されているように宿主細胞ゲノムに組み込まれ得る。
【0073】
本発明の一態様では、本発明の宿主細胞は、トランスジェニック細胞、すなわち本発明のサンタレンシンターゼをコードする核酸についてトランスジェニックである細胞、好ましくはトランスジェニック微生物細胞などのトランスジェニック非植物細胞である。
【0074】
本発明による宿主細胞は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｄ．Ｗ．“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ；Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ” ３ｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，（２００１）；及びＦ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ，ｅｄｓ．，“Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ”，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８７）並びにそれに対する後日の追補に記載されているような、一般に当該技術分野で公知の標準的な遺伝学的及び分子生物学技術に基づいて作製され得る。
【0075】
好ましくは、上記宿主細胞は、細菌細胞、酵母細胞、真菌細胞、藻細胞又はシアノバクテリア細胞、非ヒト動物細胞又は非ヒト哺乳動物細胞及び植物細胞からなる群から選択される。より好ましくは、宿主細胞は、以下の生物のいずれか１つから選択することができる。
【0076】
細菌：
細菌宿主細胞は、例えばエシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、ヘリコバクター属（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、アミコラトプシス属（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ）、ロドバクター属（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、パラコッカス属（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ）、ラクトコッカス属（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、エンシファー属（Ｅｎｓｉｆｅｒ）、又はパントエア属（Ｐａｎｔｏｅａ）からなる群から選択され得る。
細菌宿主細胞は、例えばエシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、ヘリコバクター属（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、アミコラトプシス属（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ）、ロドバクター属（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、パラコッカス属（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ）、ラクトコッカス属（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、エンシファー属（Ｅｎｓｉｆｅｒ）、又はパントエア属（Ｐａｎｔｏｅａ）からなる群から選択され得る。
【0077】
グラム陽性：バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）：有用なグラム陽性細菌宿主細胞としては、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞、例えば、バチルス・アルカロフィウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｌｋａｌｏｐｈｉｕｓ）、バチルス・アミロリクエファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルス・ブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）、バチルス・シルキュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、バチルス・クラウシイ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｌａｕｓｉｉ）、バチルス・コアギュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、バチルス・フィルムス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｉｒｍｕｓ）、バチルス・ジャウツス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ Ｊａｕｔｕｓ）、バチルス・レンツス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｅｎｔｕｓ）、バチルス・リシェニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、バチルス・プミルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓ）、バチルス・ステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）及びバチルス・ツリンギエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）が挙げられるが、限定されない。最も好ましい原核生物は、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞、好ましくは、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・プミルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓ）、バチルス・リシェニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）又はバチルス・レンツス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｅｎｔｕｓ）のバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞である。
【0078】
いくつかの他の好ましい細菌としては、放線菌目（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ）、好ましくはストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、好ましくはストレプトマイセス・スフェロイデス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐｈｅｒｏｉｄｅｓ）（ＡＴＴＣ２３９６５）、ストレプトマイセス・サーモビオラセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｔｈｅｒｍｏｖｉｏｌａｃｅｕｓ）（ＩＦＯ１２３８２）、ストレプトマイセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ）又はストレプトマイセス・ムリヌス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｍｕｒｉｎｕｓ）又はストレプトベルティシラム・ベルティシリウム種ベルティシリウム（Ｓｔｒｅｐｔｏｖｅｒｔｉｃｉｌｌｕｍ ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ ｓｓｐ． ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ）の株が挙げられる。他の好ましい細菌としては、ロドバクター・スフェロイデス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）、ロドモナス・パルストリ（Ｒｈｏｄｏｍｏｎａｓ ｐａｌｕｓｔｒｉ）、ストレプトコッカス・ラクティス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）が挙げられる。更なる好ましい細菌としては、ミクソコッカス属（Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ）に属する株、例えばＭ．ビレスセンス（Ｍ．ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ）が挙げられる。
【0079】
グラム陰性： エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、ロドバクター属（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ）、パラコッカス属（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ）、エンシファー属（Ｅｎｓｉｆｅｒ）又はパントエア属（Ｐａｎｔｏｅａ）の菌種：好ましいグラム陰性細菌は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）ｓｐ．、好ましくはシュードモナス・プロシニア（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｒｒｏｃｉｎｉａ）（ＡＴＣＣ１５９５８）又はシュードモナス・フルオレセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）（ＮＲＲＬ Ｂ－１１）又はシュードモナス・デニトリフィカンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）、ロドバクター・カプスラツス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ）又はロドバクター・スフェロイデス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）、パラコッカス・カロチニファシエンス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ ｃａｒｏｔｉｎｉｆａｃｉｅｎｓ）、パラコッカス・ゼアキサンチニファシエンス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ ｚｅａｘａｎｔｈｉｎｉｆａｃｉｅｎｓ）、パントエア・アナナチス（Ｐａｎｔｏｅａ ａｎａｎａｔｉｓ）、又はエンシファー・メリロチ（Ｅｎｓｉｆｅｒ ｍｅｌｉｌｏｔｉ）としても知られるシノリゾビウム・メリロチ（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｍｅｌｉｌｏｔｉ）である。
【0080】
真菌：
アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、フザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）：宿主細胞は、真菌細胞であり得る。「真菌」は、本明細書中で使用される場合、子嚢菌門（ｐｈｙｌａ Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ）、担子菌門（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｏｔａ）、ツボカビ門（Ｃｈｙｔｒｉｄｉｏｍｙｃｏｔａ）及び接合菌門（Ｚｙｇｏｍｙｃｏｔａ）並びに卵菌門（Ｏｏｍｙｃｏｔａ）及び不完全菌亜門（Ｄｅｕｔｅｒｏｍｙｃｏｔｉｎａ）及び全ての栄養胞子形成真菌を含む。子嚢菌門（Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ）の代表的な群としては、例えば、ニューロスポラ属（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、ユーペニシリウム属（Ｅｕｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）（＝ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ））、エメリセラ属（Ｅｍｅｒｉｃｅｌｌａ）（＝アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ））、ユーロチウム属（Ｅｕｒｏｔｉｕｍ）（＝アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ））及び以下で挙げられる真正酵母が挙げられる。担子菌門（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｏｔａ）の例としては、キノコ、さび病及び黒穂病が挙げられる。ツボカビ門（Ｃｈｙｔｒｉｄｉｏｍｙｃｏｔａ）の代表的な群としては、例えば、カワリミズカビ属（Ａｌｌｏｍｙｃｅｓ）、ブラストクラジエラ属（Ｂｌａｓｔｏｃｌａｄｉｅｌｌａ）、ボウフラキン属（Ｃｏｅｌｏｍｏｍｙｃｅｓ）及び水生真菌が挙げられる。卵菌門（Ｏｏｍｙｃｏｔａ）の代表的な群としては、例えばアクリャ属（Ａｃｈｌｙａ）などのサプロレグニオミセトス（Ｓａｐｒｏｌｅｇｎｉｏｍｙｃｅｔｏｕｓ）水生真菌（ミズカビ）が挙げられる。栄養胞子形成真菌の例としては、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）及びアルテルナリア属（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ）が挙げられる。接合菌門（Ｚｙｇｏｍｙｃｏｔａ）の代表的な群としては、例えばリゾプス属（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）及びムコール属（Ｍｕｃｏｒ）が挙げられる。
アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、フザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）：宿主細胞は、真菌細胞であり得る。「真菌」は、本明細書中で使用される場合、子嚢菌門（ｐｈｙｌａ Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ）、担子菌門（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｏｔａ）、ツボカビ門（Ｃｈｙｔｒｉｄｉｏｍｙｃｏｔａ）及び接合菌門（Ｚｙｇｏｍｙｃｏｔａ）並びに卵菌門（Ｏｏｍｙｃｏｔａ）及び不完全菌亜門（Ｄｅｕｔｅｒｏｍｙｃｏｔｉｎａ）及び全ての栄養胞子形成真菌を含む。子嚢菌門（Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ）の代表的な群としては、例えば、ニューロスポラ属（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、ユーペニシリウム属（Ｅｕｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）（＝ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ））、エメリセラ属（Ｅｍｅｒｉｃｅｌｌａ）（＝アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ））、ユーロチウム属（Ｅｕｒｏｔｉｕｍ）（＝アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ））及び以下で挙げられる真正酵母が挙げられる。担子菌門（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｏｔａ）の例としては、キノコ、さび病及び黒穂病が挙げられる。ツボカビ門（Ｃｈｙｔｒｉｄｉｏｍｙｃｏｔａ）の代表的な群としては、例えば、カワリミズカビ属（Ａｌｌｏｍｙｃｅｓ）、ブラストクラジエラ属（Ｂｌａｓｔｏｃｌａｄｉｅｌｌａ）、ボウフラキン属（Ｃｏｅｌｏｍｏｍｙｃｅｓ）及び水生真菌が挙げられる。卵菌門（Ｏｏｍｙｃｏｔａ）の代表的な群としては、例えばアクリャ属（Ａｃｈｌｙａ）などのサプロレグニオミセトス（Ｓａｐｒｏｌｅｇｎｉｏｍｙｃｅｔｏｕｓ）水生真菌（ミズカビ）が挙げられる。栄養胞子形成真菌の例としては、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）及びアルテルナリア属（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ）が挙げられる。接合菌門（Ｚｙｇｏｍｙｃｏｔａ）の代表的な群としては、例えばリゾプス属（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）及びムコール属（Ｍｕｃｏｒ）が挙げられる。
【0081】
いくつかの好ましい真菌としては、ジューテロミコチナ亜門（Ｄｅｕｔｅｒｏｍｙｃｏｔｉｎａ）に属する菌種、糸状不完全菌類（Ｈｙｐｈｏｍｙｃｅｔｅｓ）のクラス、例えば、フザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、フミコラ属（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｏｄｅｒｍａ）、ミロセシウム属（Ｍｙｒｏｔｈｅｃｉｕｍ）、ベルティシリウム属（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｕｍ）、アルスロマイセス属（Ａｒｔｈｒｏｍｙｃｅｓ）、カルダリオマイセス属（Ｃａｌｄａｒｉｏｍｙｃｅｓ）、ウロクラジウム属（Ｕｌｏｃｌａｄｉｕｍ）、エムべリシア属（Ｅｍｂｅｌｌｉｓｉａ）、クラドスポリウム属（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ）又はドレスクレラ属（Ｄｒｅｓｃｈｌｅｒａ）、特にフザリウム・オキシスポルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）（ＤＳＭ２６７２）、フミコラ・インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｉｎｓｏｌｅｎｓ）、トリコデルマ・レシイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｓｉｉ）、ミロテシウム・ベルカナ（Ｍｙｒｏｔｈｅｃｉｕｍ ｖｅｒｒｕｃａｎａ）（ＩＦＯ６１１３）、ベルティシリウム・アルボアツルム（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｕｍ ａｌｂｏａｔｒｕｍ）、ベルティシリウム・ダーリイ（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｕｍ ｄａｈｌｉｅ）、アルスロマイセス・ラモサス（Ａｒｔｈｒｏｍｙｃｅｓ ｒａｍｏｓｕｓ）（ＦＥＲＭ Ｐ－７７５４）、カルダリオマイセス・フマゴ（Ｃａｌｄａｒｉｏｍｙｃｅｓ ｆｕｍａｇｏ）、ウロクラジウム・チャルタルム（Ｕｌｏｃｌａｄｉｕｍ ｃｈａｒｔａｒｕｍ）、エムべリシア・アリ（Ｅｍｂｅｌｌｉｓｉａ ａｌｌｉ）又はドレスクレラ・ハロデス（Ｄｒｅｓｃｈｌｅｒａ ｈａｌｏｄｅｓ）が挙げられる。他の好ましい真菌としては、バシジオミコチナ亜門（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｏｔｉｎａ）に属する菌種、担子菌（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｅｔｅｓ）のクラス、例えばコプリナス属（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ）、ファネロカエテ属（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ）、コリオルス属（Ｃｏｒｉｏｌｕｓ）又はトラメテス属（Ｔｒａｍｅｔｅｓ）、特にコプリヌス・シネレウス ｆ．ミクロスポルス（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ ｃｉｎｅｒｅｕｓ ｆ．ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｓ）（ＩＦＯ８３７１）、コプリヌス・マクロリズス（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ ｍａｃｒｏｒｈｉｚｕｓ）、ファネロカエテ・クリソスポリウム（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）（例えばＮＡ－１２）又はトラメテス属（Ｔｒａｍｅｔｅｓ）（ポリポルス属（Ｐｏｌｙｐｏｒｕｓ）と以前呼ばれる）、例えばＴ．ベルシカラー（Ｔ．ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ）（例えばＰＲ４ ２８－Ａ）が挙げられる。更なる好ましい真菌としては、接合菌亜門（Ｚｙｇｏｍｙｃｏｔｉｎａ）に属する菌種、マイコラセア（Ｍｙｃｏｒａｃｅａｅ）のクラス、例えばリゾプス属（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）及びムコール属（Ｍｕｃｏｒ）、特にムコール・ヒエマリス（Ｍｕｃｏｒ ｈｉｅｍａｌｉｓ）が挙げられる。
【0082】
酵母、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属：真菌宿主細胞は、酵母細胞であり得る。酵母は、本明細書中で使用される場合、有子嚢胞子（ａｓｃｏｓｐｏｒｏｇｅｎｏｕｓ）酵母（エンドミセタレス（Ｅｎｄｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ））、担子胞子（ｂａｓｉｄｉｏｓｐｏｒｏｇｅｎｏｕｓ）酵母）及び不完全真菌（ブラストマイセス属（Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｔｅｓ））に属する酵母を含む。有子嚢胞子（ａｓｃｏｓｐｏｒｏｇｅｎｏｕｓ）酵母は、スペルモフトラ科（Ｓｐｅｒｍｏｐｈｔｈｏｒａｃｅａｅ）及びサッカロミケス科（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｔａｃｅａｅ）に分けられる。後者は、４つの亜科、シゾサッカロミコイデア（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｉｄｅａｅ）（例えばシゾサッカロマイセス属（ｇｅｎｕｓ Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ））、ナドソニオイデア（Ｎａｄｓｏｎｉｏｉｄｅａｅ）、リポミコイデア（Ｌｉｐｏｍｙｃｏｉｄｅａｅ）及びサッカロミコイデア（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｉｄｅａｅ）（例えばクリベロマイセス属（ｇｅｎｅｒａ Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）及びサッカロマイセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ））から構成される。担子胞子（ｂａｓｉｄｉｏｓｐｏｒｏｇｅｎｏｕｓ）酵母としては、ロイコスポリジム属（ｇｅｎｅｒａ Ｌｅｕｃｏｓｐｏｒｉｄｉｍ）、ロドスポリジウム属（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）、スポリジオボルス属（Ｓｐｏｒｉｄｉｏｂｏｌｕｓ）、フィロバシジウム属（Ｆｉｌｏｂａｓｉｄｉｕｍ）及びフィロバシジエラ属（Ｆｉｌｏｂａｓｉｄｉｅｌｌａ）が挙げられる。不完全真菌に属する酵母は、２つの科、スポロボロミセタセア（Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｔａｃｅａｅ）（例えばスポロボロマイセス属（Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ）及びブレラ属（Ｂｕｌｌｅｒａ））及びクリプトコッカセア（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃａｃｅａｅ）（例えばカンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ））に分けられる。
【0083】
真核生物：
真核宿主細胞としては、非ヒト動物細胞、非ヒト哺乳動物細胞、鳥類細胞、爬虫類細胞、昆虫細胞又は植物細胞が更に挙げられるが、限定されない。
真核宿主細胞としては、非ヒト動物細胞、非ヒト哺乳動物細胞、鳥類細胞、爬虫類細胞、昆虫細胞又は植物細胞が更に挙げられるが、限定されない。
【0084】
最も好ましくは、宿主細胞は、細菌宿主細胞、特にロドバクター属（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ）宿主細胞である。
【0085】
本発明の方法の別の好ましい実施形態では、ファルネシルピロホスフェートを少なくとも１つのサンタレンに変換する工程は、本明細書の以下で定義される非ヒトトランスジェニック生物、又は植物若しくは微生物などの非脊椎動物トランスジェニック生物内で行われる。
【0086】
本明細書で使用される「トランスジェニック非ヒト生物」という用語は、本発明のポリヌクレオチド、ベクター又は遺伝子構築物を含むように遺伝子改変された生物を指す。上記遺伝子改変は、相同組換え事象若しくは異種組換え事象、変異誘発又は遺伝子編集プロセスのいかなる種類の結果であり得る。したがって、トランスジェニック非ヒト生物は、そのゲノムに天然に存在しない（即ち異種）ポリヌクレオチド、ベクター又は遺伝子構築物を含む点でその非トランスジェニック対応物と異なるものとする。本発明によるトランスジェニック非ヒト生物として想定される非ヒト生物は、多細胞生物であることが好ましい。更に、非ヒト生物は、動物又は植物であることが好ましい。好ましい動物は、哺乳動物、特にげっ歯類、例えばマウス、ラット、ウサギなどのような実験動物又はヒツジ、ヤギ、ウシ、ウマなどのような畜産動物である。好ましい植物は、特に、アラビドプシス属種（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｓｐｐ．）、ニコチアナ属種（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｓｐｐ）、シコルム・インチブス（Ｃｉｃｈｏｒｕｍ ｉｎｔｙｂｕｓ）、ラクツカ・サティバ（Ｌａｃｔｕｃａ ｓａｔｉｖａ）、メンタ属種（Ｍｅｎｔｈａ ｓｐｐ）、アルテミシア・アニュア（Ａｒｔｅｍｉｓｉａ ａｎｎｕａ）、塊茎形成植物、油料作物、例えばブラシカ属種（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｓｐｐ．）又はブラシカ・ナピュス（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）、果実のなる顕花植物（被子植物）及び樹木からなる群から選択される作物又は野菜である。
【0087】
トランスジェニック非ヒト生物を生成する方法は、当該技術分野でよく知られており、例えばＬｅｅ－Ｙｏｏｎ Ｌｏｗ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｐｌａｎｔｓ；Ｇｅｎｅ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ，ｖｅｃｔｏｒ ａｎｄ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ．２０１８．ＤＯＩ．１０．５７７２／ｉｎｔｅｃｈｏｐｅｎ．７９３６９；Ｐｉｎｋｅｒｔ，Ｃ．Ａ．（ｅｄ．）１９９４．Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ａｎｉｍａｌ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｈａｎｄｂｏｏｋ．Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｄｏ，Ｃａｌｉｆ．；Ｍｏｎａｓｔｅｒｓｋｙ Ｇ．Ｍ．ａｎｄ Ｒｏｂｌ，Ｊ．Ｍ．（ｅｄ．）（１９９５）Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｉｎ Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ａｎｉｍａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ．ＡＳＭ Ｐｒｅｓｓ．Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｌｏｃ．ｃｉｔ，Ａｕｓｕｂｅｌ，ｌｏｃ．ｃｉｔ）を参照されたい。
【0088】
好ましくは、上記非ヒトトランスジェニック生物は、植物又は犠牲にされる非ヒト動物である。したがって、後者によれば、動物を治療する方法は本発明の方法には含まれない。
【0089】
本発明はまた、本発明の方法により入手可能な過剰なβ－サンタレンを含むβ－サンタレンとα－サンタレンの混合物を含む組成物に関する。好ましくは、上記β－サンタレンは、全サンタレンに対して少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、好ましくは約５０％～約８０％、約６０％～約７５％、約６５％～約７０％、より好ましくは少なくとも約６７％の相対量で組成物中に存在する。好ましくは、組成物は、β－ファルネセンを実質的に含まない。本発明の組成物は、好ましくは、親油性組成物である。
【0090】
本発明の別の態様では、上記発明の組成物は、更に、セスキツジェンを、好ましくは少なくとも０．０１％の量で含む。
【0091】
驚くべきことに、本発明のサンタレン組成物中にセスキツジェンが存在することにより、本発明のサンタレン組成物の嗅覚特性が改善されることが見出された。典型的なサンタレン組成物と比較して、本発明の組成物は、より強いウッディノートを有する。これまでのところ、セスキツジェンが嗅覚特性に影響を与えることは報告されていない。
【0092】
本発明の更に別の態様では、本発明のサンタレンシンターゼの助けを借りて生成される組成物中のベルガモテン、好ましくはトランス－αベルガモテンとβ－サンタレンの比は、１：２、１：３、１：４、１：５、又は１：１０以下である。
【0093】
本発明の別の態様では、生成される組成物は、シス－α－ベルガモテン（（ＡＳ番号１８２５２－４６－５）、（Ｅ）－β－ファルネセン（ＣＡＳ番号１８７９４－８４－８）、トランス－β－ベルガモテン（ＣＡＳ番号１５４３８－９４－５）、若しくはβ－ビサボレン（ＣＡＳ番号４９５－６１－４）のいずれか１つを実質的に含まないか、又はこれらの全てを実質的に含まない、好ましくは、（Ｅ）－β－ファルネセン（ＣＡＳ番号１８７９４－８４－８）を実質的に含まない。
【0094】
一実施形態では、本発明の組成物は、実質的に、β－サンタレン、α－サンタレン、トランス－α－ベルガモテン、セスキツジェン、及びエピ－β－サンタレン、好ましくは、β－サンタレン、α－サンタレン、トランス－α－ベルガモテン、及びセスキツジェンからなる。
【0095】
本発明は、少なくとも１つのサンタレン、好ましくはβ－サンタレン、より好ましくはβ－サンタレンとα－サンタレンの混合物、更により好ましくはβ－サンタレンとα－サンタレンとセスキツジェンの混合物を含む組成物を製造するための、上述のポリペプチド、異種ポリヌクレオチド、ベクター若しくは遺伝子構築物、宿主細胞、又は非ヒトトランスジェニック生物の使用に関する。本発明の方法によって生成されるβ－サンタレン、αサンタレン、セスキツジェン、若しくはベルガモテン、又は本発明の組成物は、香味料又は香料用途、化粧品用途、医薬品、防虫剤若しくは誘虫剤として、又は作物保護若しくは動物飼育用といった農業などに使用してもよい。
【0096】
更に、本発明は、少なくとも１つのサンタロール、好ましくはβ－サンタロールを含む組成物を製造するための方法であって：
ａ）上述の本発明の方法によって、少なくとも１つのサンタレンを含む組成物を生成することと；
ｂ）少なくとも１つのサンタロール、好ましくはβ－サンタロールを含む組成物を製造するために、少なくとも１つのサンタレン、好ましくはβ－サンタレンをそれぞれのアルコールに酸化することと
を含む方法に関する。
ａ）上述の本発明の方法によって、少なくとも１つのサンタレンを含む組成物を生成することと；
ｂ）少なくとも１つのサンタロール、好ましくはβ－サンタロールを含む組成物を製造するために、少なくとも１つのサンタレン、好ましくはβ－サンタレンをそれぞれのアルコールに酸化することと
を含む方法に関する。
【0097】
好ましくは、少なくとも１つのサンタロール、好ましくはβ－サンタロールを含む組成物を製造するための本発明の方法の工程ａ）で生成される組成物は、（Ｅ）－β－ファルネセンを実質的に含まないか、又はその量が少なくとも大幅に減少している。
【0098】
好ましくは、上記方法は、少なくとも１つのサンタロールを含む上記組成物を得る工程を更に含む。より好ましくは、上記組成物は、過剰なβ－サンタレンを含むα－サンタレンとβ－サンタレンの混合物を含む。
【0099】
本明細書で使用される「サンタロール」という用語は、アルコール性セスキテルペンを指す。この用語は、αサンタロールである（Ｚ）－５－（２，３－ジメチルトリシクロ［２．２．１．０２，６］ヘプタ－３－イル）－２－メチルペンタ－２－エン－１－オール；ＣＡＳ番号：１１５－７１－９；分子式Ｃ１５Ｈ２４Ｏ）及びβサンタロールである（２Ｚ）－２－メチル－５－［（１Ｓ，２Ｒ，４Ｒ）－２－メチル－３－メチリデンビシクロ［２．２．１］ヘプタン－２－イル］ペンタ－２－エン－１－オール；ＣＡＳ番号：７７－４２－９；分子式Ｃ１５Ｈ２４Ｏ）を包含する。
【0100】
本発明の上述の方法では、少なくとも１つのサンタレンを含む組成物は、本明細書の他の箇所で本発明の方法によって記載されているように、第１の工程、工程（ａ）で生成される。続く工程、工程（ｂ）では、組成物に含まれる上記少なくとも１つのサンタレンは、上で言及した少なくとも１つのサンタロールを含む組成物を製造するために酸化される。本発明の一態様では、少なくとも１つのサンタレンの酸化は、好ましくは酵素的に行われる。サンタレンを酸化してサンタロールに変換できる好適な酵素は、当該技術分野で周知である。好ましくは、シトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ（ＣＹＰ）が、サンタレンをサンタロールに酸化するために使用される。より好ましくは、ＣＹＰは：ＣＹＰ７６Ｆ３７ｖ１、ＣＹＰ７６Ｆ３７ｖ２、ＣＹＰ７６Ｆ３８ｖ１、ＣＹＰ７６Ｆ３８ｖ２、ＣＹＰ７６Ｆ３９ｖ１、ＣＹＰ７６Ｆ４１、ＣＹＰ７６Ｆ４２、ＣＹＰ７６Ｆ３９ｖ２、ＣＹＰ７６Ｆ４０、及びＣＹＰ７３６Ａ１６７からなる群から選択される。更に、酸化は化学的に行うこともできる。
【0101】
上述の方法の工程（ｂ）はまた、典型的には工程（ａ）がどのように実施されるかに応じて、インビボ又はエクスビボで実施され得る。したがって、工程（ａ）がインビボ、例えば、本明細書の他の箇所で特定される宿主細胞又は非ヒトトランスジェニック生物内で実施される場合、好ましくは、工程（ｂ）も同様にインビボで、好ましくは、同じ宿主細胞又は非ヒトトランスジェニック生物内で実施されることが想定される。典型的には、宿主細胞又は非ヒトトランスジェニック生物は、サンタレンをサンタロールに酸化することができるものとする。好ましくは、上記宿主細胞又は非ヒトトランスジェニック生物は、したがって、上記で指定したようにＣＹＰを発現し得る。この目的のために、上記ＣＹＰをコードする異種ポリヌクレオチド、又はそのようなポリヌクレオチドを含むベクター若しくは遺伝子構築物は、宿主細胞又は非ヒトトランスジェニック生物中に存在し得る。このような異種ポリヌクレオチド、ベクター又は遺伝子構築物を、上記宿主細胞又は非ヒトトランスジェニック生物にどのように導入できるかは当該技術分野で周知であり、本明細書の他の箇所で詳細に記載される。
【0102】
或いは、少なくとも１つのサンタロールを含む組成物を製造するための方法の工程ｂ）は、酵素プロセスではなく化学プロセスによって実施される。好ましくは、サンタロールへの化学的酸化は、国際公開第２０２１／０６３８３１号パンフレットに開示されているように実施される。
【0103】
本発明は、また、本発明の方法によって生成されるβ－サンタレンとαサンタレンの両方を含む前駆体組成物から生成される、β－サンタロール及びα－サンタロールを含む組成物であって、本明細書のβ－サンタロールが、前駆体組成物中の過剰なβサンタレン含量により、αサンタロールよりもｗ／ｗベースで多量に存在する、組成物に関する。これらの組成物中のβ－サンタロールのα－サンタロールに対する比は、１超であり、好ましくは、比は、少なくとも１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、又は少なくとも２である。β－サンタロールのα－サンタロールに対する比は、少なくとも３：１、好ましくは少なくとも４：１、より好ましくは少なくとも５：１、更により好ましくは６：１、なお更により好ましくは少なくとも７：１、最も好ましくは少なくとも８：１、更には少なくとも９：１であり得る。本発明の一態様では、比は、１００：１以下である。
【0104】
したがって、本発明はまた、ａ）α－サンタロールへの変換前にα－サンタレン含量を減少させること、及び／又はｂ）蒸留若しくは他の手段により、サンタレンからの変換後にβ－サンタロール含量を増加させることを必要とせずに、α－サンタロールよりも過剰なβ－サンタロールを含む組成物を生成するための方法であって、本発明の方法により、α－サンタレンよりも過剰なβ－サンタレンを含む組成物を生成する工程と、その後の１つ以上の工程において、β－サンタレンをβ－サンタロールに酸化し、α－サンタレンをα－サンタロールに酸化する工程とを含む、方法を意図する。
【0105】
このサンタレンの変換は、それぞれのアルコールに生合成的及び／又は化学的に行われ得る。サンタロールへの変換に続いて、他の化合物を除去するための蒸留などの精製工程が含まれる場合があり、必要に応じて、β－サンタロールとα－サンタロールの比率が蒸留によって変更される場合があるが、α－サンタロールよりも多くのβ－サンタロールを含む組成物は、改良されたβサンタレンシンターゼを使用することによって、α－サンタレンよりも過剰なβ－サンタレンを含む組成物を提供した後、β－サンタロール対α－サンタロールの比を更に変更することなく達成することができる。したがって、本発明の一態様は、α－サンタロールよりも過剰なβ－サンタロールを含む組成物を生成するための方法であって、方法は、本発明の方法によりα－サンタレンよりも過剰なβ－サンタレンを含む組成物を生成する工程と、その後の１つ以上の工程において、β－サンタレンをβ－サンタロールに酸化し、α－サンタレンをα－サンタロールに酸化する工程とを含み、サンタロールの精製のために、サンタレンの酸化に続くサンタロールの蒸留が、β－サンタロール含量をα－サンタロール含量よりも実質的に増加させることなく行われる、方法である。
【0106】
本発明はまた、本発明の改良されたβサンタレンシンターゼ又は本発明の宿主細胞を用いて、本発明の方法のいずれかにより生成されるα－サンタロールよりも過剰なβ－サンタロールを含む組成物であって、任意選択的に、組成物中のベルガモトールの合計が１０％（ｗ／ｗ）未満、又は更には８％（ｗ／ｗ）未満である組成物に関する。別の態様では、本発明の改良されたβサンタレンシンターゼ又は本発明の宿主細胞を用いて、本発明の方法のいずれかにより生成されるα－サンタロールよりも過剰なβ－サンタロールを含む本発明の組成物は、３％未満のエピ－β－サンタロールを含む。
【0107】
サンタロールの生成においてサンタレン及びセスキツジェンを含む本発明の組成物を使用することには、更なる利点を有する。セスキツジェンを含むサンタロール組成物は改善された嗅覚特性を有するため、得られるサンタロール組成物の嗅覚特性も改善される。
【0108】
本発明の一態様は、β－サンタレンとα－サンタレン及び／又はβ－サンタロールとαサンタロールを含み、β－サンタレン対α－サンタレンの比又はβ－サンタロール対α－サンタロールの比が、それぞれ、少なくとも１．３以上、１．５以上、又は２以上である、α－サンタロールよりも過剰なβ－サンタロールを生成する本発明のサンタレンシンターゼ活性を有するポリペプチド、そのようなものをコードする核酸、そのような核酸を含む発現カセット、そのような発現カセットを含む宿主細胞、本発明の方法、並びに本発明の酵素及び方法により生成される組成物に関する。
【0109】
本発明はまた、セスキツジェン又はセスキツジェンを含む組成物を製造するための方法であって：
ａ）本発明の方法により、少なくとも１つのサンタレン及びセスキツジェンを含む組成物を生成することと；任意選択的に
ｂ）組成物からセスキツジェンを単離すること
を含む方法に関する。
ａ）本発明の方法により、少なくとも１つのサンタレン及びセスキツジェンを含む組成物を生成することと；任意選択的に
ｂ）組成物からセスキツジェンを単離すること
を含む方法に関する。
【0110】
本発明はまた、上述のポリペプチド、異種ポリヌクレオチド、ベクター若しくは遺伝子構築物、宿主細胞、又は非ヒトトランスジェニック生物を含む少なくとも１つのサンタレンを含む組成物を製造するためのキットであって、組成物が、好ましくは、β－ファルネセンを実質的に含まない、及び／又はセスキツジェンを含む、キットに関する。
【0111】
本明細書で使用される「キット」という用語は、少なくとも１つのサンタレンを含む組成物を製造するための本発明の方法を実施するのに必要とされる構成要素の集合を指す。キットは、上述の構成要素のいずれかを、単一構成要素又はその任意の組み合わせのいずれかとして含むものとする。典型的には、キットの構成要素は、別々の容器において又は単一の容器内に提供される。容器は、典型的には、少なくとも１つのサンタレンを含む組成物を製造するための本発明の方法を実施するための指示書も含む。更に、キットは、好ましくは、インキュベーション試薬、培養培地、洗浄溶液、溶媒及び／又は少なくとも１つのサンタレンを含む組成物の精製に必要となる試薬若しくは手段など、本発明の方法を実施するために必要な更なる構成要素を含み得る。
【0112】
また、本発明は、上述の異種ポリヌクレオチド、ベクター又は遺伝子構築物からサンタレンシンターゼ活性を示すポリペプチドを発現する、非ヒト宿主細胞を意図する。好ましくは、上記宿主細胞は、細菌細胞、酵母細胞、真菌細胞、藻細胞又はシアノバクテリア細胞、非ヒト動物細胞又は非ヒト哺乳動物細胞及び植物細胞からなる群から選択される。より好ましくは、上記非ヒト宿主細胞は、少なくとも１つのサンタレン、好ましくはβ－サンタレンを産生する。
【0113】
本発明は、前に言及したような異種ポリヌクレオチド、ベクター又は遺伝子構築物からサンタレンシンターゼ活性を示すポリペプチドを発現する、非ヒトトランスジェニック生物に関する。好ましくは、上記非ヒトトランスジェニック生物は、植物又は非ヒト動物である。より好ましくは、上記非ヒト宿主細胞は、少なくとも１つのサンタレン、好ましくはβ－サンタレンを産生する。
【0114】
本発明の非ヒト宿主細胞、非ヒトトランスジェニック生物、及び方法は、本発明のサンタレンシンターゼ活性を示すポリペプチド、及び更に以下の名称：ＣｉＣａＳＳｙ（ＱＮＶ６９５８８）若しくはＳａｎｔａｌｕｍ ａｌｂｕｍサンタレンシンターゼ（Ｅ３Ｗ２０２）、及び／又は出願番号ＰＣＴ／ＥＰ２０２１／０６４６４２号の国際特許出願に含まれるそれらのサンタレンシンターゼで当該技術分野で知られているものを含む、サンタレンシンターゼ活性を示す１つ以上の更なるポリペプチドを含んでもよい。
【0115】
最後に、本発明は、請求項１０に記載の少なくとも１つの組成物、又は請求項１１に記載の組成物、又は請求項１～８の方法のいずれか、及び（ｉｉ）～（ｉｖ）：
（ｉｉ）β－サンタレン、α－サンタレン、トランス－α－ベルガモテン、セスキツジェン、及びエピ－β－サンタレンからなる群から選択される化合物以外の少なくとも１つの芳香化学物質（Ｘ）、又は
（ｉｉｉ）少なくとも１つの非芳香化学物質担体、又は
（ｉｖ）（ｉｉ）と（ｉｉｉ）の両方を含む組成物
のいずれかによって生成された組成物を含む芳香組成物に関する。
（ｉｉ）β－サンタレン、α－サンタレン、トランス－α－ベルガモテン、セスキツジェン、及びエピ－β－サンタレンからなる群から選択される化合物以外の少なくとも１つの芳香化学物質（Ｘ）、又は
（ｉｉｉ）少なくとも１つの非芳香化学物質担体、又は
（ｉｖ）（ｉｉ）と（ｉｉｉ）の両方を含む組成物
のいずれかによって生成された組成物を含む芳香組成物に関する。
【0116】
好ましい実施形態では、請求項１０に記載の少なくとも１つの組成物、又は請求項１１に定義されるか若しくは請求項１～８のいずれかによって生成される組成物は、芳香組成物の総重量に基づいて、０．０１重量％以上～７０．０重量％以下の範囲で存在する。
【0117】
別の好ましい実施形態では、少なくとも１つの非芳香化学物質担体（ｉｉｉ）は、界面活性剤、オイル成分、酸化防止剤、消臭活性剤、又は溶媒から選択される。
【0118】
なお更なる好ましい実施形態では、組成物は、香水組成物、ボディケア組成物、衛生用品、洗浄組成物、繊維製品洗剤組成物、香りディスペンサー用組成物、食品、栄養補助食品、医薬組成物、又は作物保護組成物から選択される。
【0119】
以下の実施形態は、本発明に従って想定される特に好ましい実施形態である。上記でなされた用語の定義及び説明の全ては、変更すべき点を変更して適用される。
【0120】
実施形態１．ファルネシルピロホスフェートを少なくとも１つのサンタレンに変換する工程を含む、少なくとも１つのサンタレンを含む組成物を製造するための方法であって、上記変換が、サンタレンシンターゼ活性を示すポリペプチドによって行われ、上記ポリペプチドが、
（ｉｉ）
ａ）配列番号１、１８、若しくは２１～２８のいずれかに示されるようなアミノ酸配列；
ｂ）配列番号１、１８、若しくは２１～２８のいずれかに示されるようなアミノ酸配列と少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列；
ｃ）配列番号２若しくは３若しくは１９のいずれか１つに示されるような核酸配列によってコードされるアミノ酸配列；
ｄ）配列番号２若しくは３若しくは１９のいずれか１つに示されるような核酸配列と少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％同一である核酸配列によってコードされるアミノ酸配列；及び
ｅ）（ａ）～（ｄ）のいずれか１つのフラグメントであって、サンタレンシンターゼ活性を示すポリペプチドをコードするフラグメントのアミノ酸配列
からなる群から選択されるアミノ酸配列、又は
（ｉｉ）
ａ）配列番号４～１７のいずれか１つに示されるようなアミノ酸配列；
ｂ）配列番号４～１７に示されるようなアミノ酸配列と少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列；
ｃ）（ａ）若しくは（ｄ）のフラグメントであって、サンタレンシンターゼ活性を示すポリペプチドをコードするフラグメントのアミノ酸配列
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、方法。
（ｉｉ）
ａ）配列番号１、１８、若しくは２１～２８のいずれかに示されるようなアミノ酸配列；
ｂ）配列番号１、１８、若しくは２１～２８のいずれかに示されるようなアミノ酸配列と少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列；
ｃ）配列番号２若しくは３若しくは１９のいずれか１つに示されるような核酸配列によってコードされるアミノ酸配列；
ｄ）配列番号２若しくは３若しくは１９のいずれか１つに示されるような核酸配列と少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％同一である核酸配列によってコードされるアミノ酸配列；及び
ｅ）（ａ）～（ｄ）のいずれか１つのフラグメントであって、サンタレンシンターゼ活性を示すポリペプチドをコードするフラグメントのアミノ酸配列
からなる群から選択されるアミノ酸配列、又は
（ｉｉ）
ａ）配列番号４～１７のいずれか１つに示されるようなアミノ酸配列；
ｂ）配列番号４～１７に示されるようなアミノ酸配列と少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列；
ｃ）（ａ）若しくは（ｄ）のフラグメントであって、サンタレンシンターゼ活性を示すポリペプチドをコードするフラグメントのアミノ酸配列
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、方法。
【0121】
実施形態２：上記少なくとも１つのサンタレンが、β－サンタレンである、実施形態１に記載の方法。
【0122】
実施形態３：上記少なくとも１つのサンタレンが、過剰なβ－サンタレンを含むβ－サンタレンとα－サンタレンの混合物であり、好ましくは、組成物が、セスキツジェンも含む、実施形態１又は２に記載の方法。
【0123】
実施形態４：上記β－サンタレンが、全サンタレンに対して少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、好ましくは約５０％～約８０％、約６０％～約７５％、約６５％～約７０％、より好ましくは少なくとも約６７％の相対量で組成物中に存在する、実施形態３に記載の方法。
【0124】
実施形態５：ファルネシルピロホスフェートを少なくとも１つのサンタレンに変換する工程が、宿主細胞内で行われる、実施形態１～４のいずれか１つに記載の方法。
【0125】
実施形態６：上記宿主細胞が、細菌細胞、酵母細胞、真菌細胞、藻細胞又はシアノバクテリア細胞、非ヒト動物細胞又は非ヒト哺乳動物細胞及び植物細胞からなる群から選択される、実施形態５に記載の宿主細胞。
【0126】
実施形態７：ファルネシルピロホスフェートを少なくとも１つのサンタレンに変換する工程が、非ヒトトランスジェニック生物内で行われる、実施形態１～４のいずれか１つに記載の方法。
【0127】
実施形態８：上記非ヒトトランスジェニック生物が、植物又は犠牲にされる非ヒト動物である、実施形態７に記載の方法。
【0128】
実施形態９：上記サンタレンシンターゼ活性を示すポリペプチドが、異種ポリヌクレオチド、ベクター、又は遺伝子構築物によってコードされる、実施形態５～８のいずれか１つに記載の方法。
【0129】
実施形態１０：少なくとも１つのサンタレンを含む組成物を得る工程を更に含む、実施形態１～９のいずれか１つに記載の方法。
【0130】
実施形態１１：過剰なβ－サンタレンを含むβ－サンタレンとα－サンタレンの混合物を含む、好ましくは、実施形態１～１０のいずれか１つに記載の方法によって得られ得るセスキツジェンも含む、組成物。
【0131】
実施形態１２：上記β－サンタレンが、全サンタレンに対して少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、好ましくは約５０％～約８０％、約６０％～約７５％、約６５％～約７０％、より好ましくは少なくとも約６７％の相対量で組成物中に存在する、実施形態１１に記載の組成物。
【0132】
実施形態１３：少なくとも１つのサンタレン、好ましくはβ－サンタレン、より好ましくはβ－サンタレンとα－サンタレンの混合物、更により好ましくはβ－サンタレンとα－サンタレンとセスキツジェンの混合物、最も好ましくは実施形態１１又は１２で定義されるものを含む組成物を製造するための、実施形態１～４のいずれか１つに記載のポリペプチド、実施形態９に記載の異種ポリヌクレオチド、ベクター若しくは遺伝子構築物、実施形態５若しくは６に記載の宿主細胞、又は実施形態７若しくは８に記載の非ヒトトランスジェニック生物の使用。
【0133】
実施形態１４：上記サンタレンが、香味料、香料、薬剤、又は化粧品を生成するために使用される、実施形態１３に記載の使用。
【0134】
実施形態１５：少なくとも１つのサンタロール、好ましくはβ－サンタロールを含む組成物を製造するための方法であって：
ａ）実施形態１～１０のいずれか１つに記載の方法によって少なくとも１つのサンタレンを含む組成物を生成することと；
ｂ）少なくとも１つのサンタロール、好ましくはβ－サンタロールを含む組成物を製造するために、上記少なくとも１つのサンタレン、好ましくはβ－サンタレンをそれぞれのアルコールに酸化することと、を含む方法。
ａ）実施形態１～１０のいずれか１つに記載の方法によって少なくとも１つのサンタレンを含む組成物を生成することと；
ｂ）少なくとも１つのサンタロール、好ましくはβ－サンタロールを含む組成物を製造するために、上記少なくとも１つのサンタレン、好ましくはβ－サンタレンをそれぞれのアルコールに酸化することと、を含む方法。
【0135】
実施形態１６：少なくとも１つのサンタロールを含む上記組成物を得る工程を更に含む、実施形態１５に記載の方法。
【0136】
実施形態１７：上記組成物が、過剰なβ－サンタレンを含むα－サンタレンとβ－サンタレンの混合物を含む、実施形態１５又は１６に記載の方法。
【0137】
実施形態１８：実施形態１に記載のポリペプチド、実施形態９に記載の異種ポリヌクレオチド、ベクター若しくは遺伝子構築物、実施形態５若しくは６に記載の宿主細胞、又は実施形態７若しくは８に記載の非ヒトトランスジェニック生物を含む少なくとも１つのサンタレンを含む組成物を製造するためのキットであって、組成物が、β－ファルネセンを実質的に含まない、好ましくはセスキツジェンを含む、キット。
【0138】
実施形態１９：実施形態９に記載の異種ポリヌクレオチド、ベクター又は遺伝子構築物からサンタレンシンターゼ活性を示すポリペプチドを発現する、非ヒト宿主細胞。
【0139】
実施形態２０：上記宿主細胞が：細菌細胞、酵母細胞、真菌細胞、藻細胞又はシアノバクテリア細胞、非ヒト動物細胞又は非ヒト哺乳動物細胞及び植物細胞からなる群から選択される、実施形態１９に記載の非ヒト宿主細胞。
【0140】
実施形態２１：上記非ヒト宿主細胞が、少なくとも１つのサンタレン、好ましくはβ－サンタレンを産生する、実施形態１９又は２０に記載の非ヒト宿主細胞。
【0141】
実施形態２２：実施形態９に記載の異種ポリヌクレオチド、ベクター又は遺伝子構築物からサンタレンシンターゼ活性を示すポリペプチドを発現する、非ヒトトランスジェニック生物。
【0142】
実施形態２３：上記非ヒトトランスジェニック生物が、植物又は非ヒト動物である、実施形態２２に記載の非ヒトトランスジェニック生物。
【0143】
実施形態２４：上記非ヒト宿主細胞が、少なくとも１つのサンタレン、好ましくはβ－サンタレンを産生する、実施形態２２又は２３に記載の非ヒトトランスジェニック生物。
【0144】
本明細書全体を通して引用される全ての参考文献は、その全体又は具体的に言及される開示内容に関して参照により本明細書に組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【0145】
【図1】ベクターｐ－ｍ－ＳＰｐｐａ－ＭＢＰ－ＯｍＢＳＳ－ｍｐｍｉｉ ａｌｔの概略図。
【図2-1】大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるβ－サンタレンの産生。ＢＬ２１－ＤＥ３－ｐＭＥＶ－ｐＡＣ－ＯｍＢＳＳ（Ａ）及びＢＬ２１－ＤＥ３－ｐＭＥＶ－ｐＡＣＹＣ－ＤＵＥＴ－１（Ｂ）のドデカン相のＧＣ－ＭＳ分析。
【図3】大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるβ－サンタレンの産生。Ｒｓ２６５－９ｃ／ｐ－ｍ－ＳＰｐｐａ－ＯｍＢＳＳ－ｍｐｍｉｉ ａｌｔのドデカン相のＧＣ分析。全サンタレンのパーセンテージ：α－サンタレン：２５．７％；β－サンタレン：６７．３％；トランス－αベルガモテン７．０％。
【図4-1】配列番号１を有するオリザ属（Ｏｒｙｚａ）サンタレンシンターゼ及び他のオリザ属（Ｏｒｙｚａ）種由来のタンパク質のアミノ酸アラインメント。アラインメントは、ＭＵＳＣＬＥ（Ｌｏｇ－Ｅｘｐｅｃｔａｔｉｏｎによる複数配列比較）及び標準パラメータを使用して行われた。
【発明を実施するための形態】
【0146】
以下の配列は、本明細書全体及び添付の配列プロトコルにおいて参照される。
配列番号１：推定上のオリザ・メリディオナリス（Ｏｒｙｚａ ｍｅｒｉｄｉｏｎａｌｉｓ）β－サンタレンシンターゼ（ＯｍＢＳＳ）タンパク質
配列番号２：大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の合成コード配列ＯｍＢＳＳ
配列番号３：ロドバクター（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ）の合成コード配列ＯｍＢＳＳ
配列番号４：ＮＭ４９１６４オリザ・サティバ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）アミノ酸配列
配列番号５：Ａ０Ａ０Ｄ９Ｚ７Ｐ２＿９ＯＲＹＺ特性評価されていないオリザ・グルミパトゥラ（Ｏｒｙｚａ ｇｌｕｍｉｐａｔｕｌａ）タンパク質
配列番号６：Ａ２ＸＧＹ８＿ＯＲＹＳＩ特性評価されていないオリザ・サティバ亜種インディカ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ ｓｕｂｓｐ．ｉｎｄｉｃａ）タンパク質
配列番号７：Ａ０Ａ０Ｅ０ＮＶＤ９＿ＯＲＹＲＵ特性評価されていないオリザ・ルフィポゴン（Ｏｒｙｚａ ｒｕｆｉｐｏｇｏｎ）タンパク質
配列番号８：Ａ０Ａ０Ｎ７ＫＨＡ７｜Ａ０Ａ０Ｎ７ＫＨＡ７＿ＯＲＹＳＪ Ｏｓ０３ｇ０３６１７００オリザ・サティバ亜種ジャポニカ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ ｓｕｂｓｐ．ｊａｐｏｎｉｃａ）タンパク質（フラグメント）
配列番号９：Ｑ１０Ｌ２４＿ＯＲＹＳＪテルペンシンターゼファミリー、金属結合ドメイン含有タンパク質、オリザ・サティバ亜種ジャポニカ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ ｓｕｂｓｐ．ｊａｐｏｎｉｃａ）を発現した
配列番号１０：Ｉ１ＰＢＨ４＿ＯＲＹＧＬ特性評価されていないオリザ・グラベリマ（Ｏｒｙｚａ ｇｌａｂｅｒｒｉｍａ）タンパク質
配列番号１１：Ｃ７Ｊ０Ｑ６＿ＯＲＹＳＪ Ｏｓ０３ｇ０３６１７００オリザ・サティバ亜種ジャポニカ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ ｓｕｂｓｐ．ｊａｐｏｎｉｃａ）タンパク質
配列番号１２：Ａ０Ａ０Ｅ０ＧＭＭ５＿ＯＲＹＮＩ特性評価されていないオリザ・ニヴァラ（Ｏｒｙｚａ ｎｉｖａｒａ）タンパク質
配列番号１３：Ａ０Ａ０Ｄ３ＦＩＲ１＿９ＯＲＹＺ特性評価されていないオリザ・バルチ（Ｏｒｙｚａ ｂａｒｔｈｉｉ）タンパク質
配列番号１４：Ａ３ＡＩ６４＿ＯＲＹＳＪ特性評価されていないオリザ・サティバ亜種ジャポニカ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ ｓｕｂｓｐ．ｊａｐｏｎｉｃａ）タンパク質
配列番号１５：Ａ０Ａ０Ｅ０ＮＶＥ４＿ＯＲＹＲＵ特性評価されていないオリザ・ルフィポゴン（Ｏｒｙｚａ ｒｕｆｉｐｏｇｏｎ）タンパク質
配列番号１６：Ａ０Ａ０Ｅ０Ｄ０Ｘ２＿９ＯＲＹＺ特性評価されていないオリザ・メリディオナリス（Ｏｒｙｚａ ｍｅｒｉｄｉｏｎａｌｉｓ）タンパク質
配列番号１７：Ａ０Ａ０Ｄ３ＦＩＲ４＿９ＯＲＹＺ特性評価されていないオリザ・バルチ（Ｏｒｙｚａ ｂａｒｔｈｉｉ）タンパク質
配列番号１８：マルトース結合タンパク質ＭＢＰ及びオリザ・メリディオナリス（Ｏｒｙｚａ ｍｅｒｉｄｉｏｎａｌｉｓ）β－サンタレンシンターゼ（ＯｍＢＳＳ）の合成融合タンパク質
配列番号１９：マルトース結合タンパク質及びオリザ・メリディオナリス（Ｏｒｙｚａ ｍｅｒｉｄｉｏｎａｌｉｓ）β－サンタレンシンターゼ（ＯｍＢＳＳ）の合成融合タンパク質をコードする合成コード配列
配列番号２０：ＧＲＸＣＸ４Ｗモチーフ
配列番号２１：合成サンタレンシンターゼＳｙｎＢＳＳ１
配列番号２２：合成サンタレンシンターゼＳｙｎＢＳＳ２
配列番号２３：合成サンタレンシンターゼＳｙｎＢＳＳ３
配列番号２４：合成サンタレンシンターゼＳｙｎＢＳＳ４
配列番号２５：合成サンタレンシンターゼＳｙｎＢＳＳ５
配列番号２６：合成サンタレンシンターゼＳｙｎＢＳＳ６
配列番号２７：合成サンタレンシンターゼＳｙｎＢＳＳ７
配列番号２８：合成サンタレンシンターゼＳｙｎＢＳＳ８
配列番号１：推定上のオリザ・メリディオナリス（Ｏｒｙｚａ ｍｅｒｉｄｉｏｎａｌｉｓ）β－サンタレンシンターゼ（ＯｍＢＳＳ）タンパク質
配列番号２：大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の合成コード配列ＯｍＢＳＳ
配列番号３：ロドバクター（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ）の合成コード配列ＯｍＢＳＳ
配列番号４：ＮＭ４９１６４オリザ・サティバ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）アミノ酸配列
配列番号５：Ａ０Ａ０Ｄ９Ｚ７Ｐ２＿９ＯＲＹＺ特性評価されていないオリザ・グルミパトゥラ（Ｏｒｙｚａ ｇｌｕｍｉｐａｔｕｌａ）タンパク質
配列番号６：Ａ２ＸＧＹ８＿ＯＲＹＳＩ特性評価されていないオリザ・サティバ亜種インディカ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ ｓｕｂｓｐ．ｉｎｄｉｃａ）タンパク質
配列番号７：Ａ０Ａ０Ｅ０ＮＶＤ９＿ＯＲＹＲＵ特性評価されていないオリザ・ルフィポゴン（Ｏｒｙｚａ ｒｕｆｉｐｏｇｏｎ）タンパク質
配列番号８：Ａ０Ａ０Ｎ７ＫＨＡ７｜Ａ０Ａ０Ｎ７ＫＨＡ７＿ＯＲＹＳＪ Ｏｓ０３ｇ０３６１７００オリザ・サティバ亜種ジャポニカ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ ｓｕｂｓｐ．ｊａｐｏｎｉｃａ）タンパク質（フラグメント）
配列番号９：Ｑ１０Ｌ２４＿ＯＲＹＳＪテルペンシンターゼファミリー、金属結合ドメイン含有タンパク質、オリザ・サティバ亜種ジャポニカ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ ｓｕｂｓｐ．ｊａｐｏｎｉｃａ）を発現した
配列番号１０：Ｉ１ＰＢＨ４＿ＯＲＹＧＬ特性評価されていないオリザ・グラベリマ（Ｏｒｙｚａ ｇｌａｂｅｒｒｉｍａ）タンパク質
配列番号１１：Ｃ７Ｊ０Ｑ６＿ＯＲＹＳＪ Ｏｓ０３ｇ０３６１７００オリザ・サティバ亜種ジャポニカ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ ｓｕｂｓｐ．ｊａｐｏｎｉｃａ）タンパク質
配列番号１２：Ａ０Ａ０Ｅ０ＧＭＭ５＿ＯＲＹＮＩ特性評価されていないオリザ・ニヴァラ（Ｏｒｙｚａ ｎｉｖａｒａ）タンパク質
配列番号１３：Ａ０Ａ０Ｄ３ＦＩＲ１＿９ＯＲＹＺ特性評価されていないオリザ・バルチ（Ｏｒｙｚａ ｂａｒｔｈｉｉ）タンパク質
配列番号１４：Ａ３ＡＩ６４＿ＯＲＹＳＪ特性評価されていないオリザ・サティバ亜種ジャポニカ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ ｓｕｂｓｐ．ｊａｐｏｎｉｃａ）タンパク質
配列番号１５：Ａ０Ａ０Ｅ０ＮＶＥ４＿ＯＲＹＲＵ特性評価されていないオリザ・ルフィポゴン（Ｏｒｙｚａ ｒｕｆｉｐｏｇｏｎ）タンパク質
配列番号１６：Ａ０Ａ０Ｅ０Ｄ０Ｘ２＿９ＯＲＹＺ特性評価されていないオリザ・メリディオナリス（Ｏｒｙｚａ ｍｅｒｉｄｉｏｎａｌｉｓ）タンパク質
配列番号１７：Ａ０Ａ０Ｄ３ＦＩＲ４＿９ＯＲＹＺ特性評価されていないオリザ・バルチ（Ｏｒｙｚａ ｂａｒｔｈｉｉ）タンパク質
配列番号１８：マルトース結合タンパク質ＭＢＰ及びオリザ・メリディオナリス（Ｏｒｙｚａ ｍｅｒｉｄｉｏｎａｌｉｓ）β－サンタレンシンターゼ（ＯｍＢＳＳ）の合成融合タンパク質
配列番号１９：マルトース結合タンパク質及びオリザ・メリディオナリス（Ｏｒｙｚａ ｍｅｒｉｄｉｏｎａｌｉｓ）β－サンタレンシンターゼ（ＯｍＢＳＳ）の合成融合タンパク質をコードする合成コード配列
配列番号２０：ＧＲＸＣＸ４Ｗモチーフ
配列番号２１：合成サンタレンシンターゼＳｙｎＢＳＳ１
配列番号２２：合成サンタレンシンターゼＳｙｎＢＳＳ２
配列番号２３：合成サンタレンシンターゼＳｙｎＢＳＳ３
配列番号２４：合成サンタレンシンターゼＳｙｎＢＳＳ４
配列番号２５：合成サンタレンシンターゼＳｙｎＢＳＳ５
配列番号２６：合成サンタレンシンターゼＳｙｎＢＳＳ６
配列番号２７：合成サンタレンシンターゼＳｙｎＢＳＳ７
配列番号２８：合成サンタレンシンターゼＳｙｎＢＳＳ８
【実施例】
【0147】
実施例は、本発明を単に説明するものとする。これらは、決して範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
【0148】
実施例１：イネサンタレンシンターゼを同定する
ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ａ０Ａ０Ｅ０Ｄ０Ｘ４（配列番号１）で示されるタンパク質配列は、オリザ・メリディオナリス（Ｏｒｙｚａ ｍｅｒｉｄｉｏｎａｌｉｓ）ゲノムから抽出された（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｅ．ｊｐ／ｄｂｇｅｔ－ｂｉｎ／ｗｗｗ＿ｂｇｅｔ？ｕｎｉｐｒｏｔ：Ａ０Ａ０Ｅ０Ｄ０Ｘ４＿９ＯＲＹＺ）。
Ａ０Ａ０Ｅ０Ｄ０Ｘ４：
ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ａ０Ａ０Ｅ０Ｄ０Ｘ４（配列番号１）で示されるタンパク質配列は、オリザ・メリディオナリス（Ｏｒｙｚａ ｍｅｒｉｄｉｏｎａｌｉｓ）ゲノムから抽出された（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｅ．ｊｐ／ｄｂｇｅｔ－ｂｉｎ／ｗｗｗ＿ｂｇｅｔ？ｕｎｉｐｒｏｔ：Ａ０Ａ０Ｅ０Ｄ０Ｘ４＿９ＯＲＹＺ）。
Ａ０Ａ０Ｅ０Ｄ０Ｘ４：
【化2】
【0149】
ＢＬＡＳＴＰ分析（ｎｒデータベース）において、最も優れたブラストヒット（９８．４％同一）は、オリザ・サティバ・ジャポニカ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ ｊａｐｏｎｉｃａ）の（＋）－ゲルマクレンＤシンターゼとして注釈が付けられた配列を有する。＋／－７つの他の配列は９０％の同一性内でマッピングされ、これらの配列は他のイネのバリアント（オリザ・サティバ・インディカ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ ｉｎｄｉｃａ）など）で見つかる。配列番号１及び関連配列のＭＵＳＣＬＥアラインメントを図４に示す。最良のヒットは９５％が特性評価されていないオリザ・グルミパトゥラ（Ｏｒｙｚａ ｇｌｕｍｉｐａｔｕｌａ）タンパク質であった。
【0150】
しかしながら、既知のサンタレンシンターゼタンパク質との配列同一性は非常に限られている：ＣｉＣａＳＳｙ（ＱＮＶ６９５８８）：３０．９％Ｓａｎｔａｌｕｍ ａｌｂｕｍサンタレンシンターゼ（Ｅ３Ｗ２０２）：２７．４％。
【0151】
このタンパク質の使用を試験するために、このタンパク質を大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）及びロドバクター・スフェロイデス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）で発現させた。
【0152】
実施例２：大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で発現させるためのクローニング。
以下の配列は、標準配列サービスプロバイダーを使用して合成され、ＢａｍＨＩ及びＮｏｔＩ制限部位を使用して発現ベクターｐＡＣＹＣ－Ｄｕｅｔ－１（Ｎｏｖａｇｅｎ）にクローン化された。プラスミドはｐＡＣ－ＯｓＢＳＳと標識された。
大腸菌（Ｅ ｃｏｌｉ）発現用のＡ０Ａ０Ｅ０Ｄ０Ｘ４をコードする合成配列（配列番号２）：
以下の配列は、標準配列サービスプロバイダーを使用して合成され、ＢａｍＨＩ及びＮｏｔＩ制限部位を使用して発現ベクターｐＡＣＹＣ－Ｄｕｅｔ－１（Ｎｏｖａｇｅｎ）にクローン化された。プラスミドはｐＡＣ－ＯｓＢＳＳと標識された。
大腸菌（Ｅ ｃｏｌｉ）発現用のＡ０Ａ０Ｅ０Ｄ０Ｘ４をコードする合成配列（配列番号２）：
【化3】
【0153】
このプラスミドは、Ｓｃｈｍｉｄｔ ｅｔ ａｌ．２０１７（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ｜７：８６２｜ＤＯＩ：１０．１０３８／ｓ４１５９８－０１７－００８９３－３）に記載されているｐＭＥＶを保有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１ ＤＥ３に導入された。形質転換体をＬＢ寒天プレート＋クロラムフェニコール（３０μｇ／ｍＬ）＋カナマイシン（３０μｇ／ｍＬ）＋１％グルコース上で選択した。陽性の形質転換体（ミニプレップ及び制限消化によって試験した）を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１－ＤＥ３－ｐＭＥＶ－ｐＡＣ－ＯｍＢＳＳと標識した。同じ方法を使用して、ｐＭＥＶ及びｐＡＣＹＣ－ＤＵＥＴ－１を含む対照株を作成し、ＢＬ２１－ＤＥ３－ｐＭＥＶ－ｐＡＣＹＣ－ＤＵＥＴ－１と標識した。
【0154】
実施例３：大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるβ－サンタレンの産生
株ＢＬ２１－ＤＥ３－ｐＭＥＶ－ｐＡＣ－ＯｍＢＳＳ及びＢＬ２１－ＤＥ３－ｐＭＥＶ－ｐＡＣＹＣ－ＤＵＥＴ－１を、５ｍＬのＬＢ液体培地＋クロラムフェニコール（３０μｇ／ｍＬ）＋カナマイシン（３０μｇ／ｍＬ）＋１％グルコースに接種し、３７℃及び２５０ｒｐｍで一晩インキュベートした。翌日、培養物を１０ｍＬの２ｘＹＴ培地＋クロラムフェニコール（３０μｇ／ｍＬ）＋カナマイシン（３０μｇ／ｍＬ）で１：２５に希釈し、Ａ６００が０．５になるまで３７℃及び２５０ｒｐｍで増殖させた。続いて、誘導剤として１ｍＭのＩＰＴＧを添加し、生成物を捕捉するために１ｍＬのｎ－ドデカンを添加し、培養物を２８℃、２５０ｒｐｍで更に２４時間インキュベートした。
株ＢＬ２１－ＤＥ３－ｐＭＥＶ－ｐＡＣ－ＯｍＢＳＳ及びＢＬ２１－ＤＥ３－ｐＭＥＶ－ｐＡＣＹＣ－ＤＵＥＴ－１を、５ｍＬのＬＢ液体培地＋クロラムフェニコール（３０μｇ／ｍＬ）＋カナマイシン（３０μｇ／ｍＬ）＋１％グルコースに接種し、３７℃及び２５０ｒｐｍで一晩インキュベートした。翌日、培養物を１０ｍＬの２ｘＹＴ培地＋クロラムフェニコール（３０μｇ／ｍＬ）＋カナマイシン（３０μｇ／ｍＬ）で１：２５に希釈し、Ａ６００が０．５になるまで３７℃及び２５０ｒｐｍで増殖させた。続いて、誘導剤として１ｍＭのＩＰＴＧを添加し、生成物を捕捉するために１ｍＬのｎ－ドデカンを添加し、培養物を２８℃、２５０ｒｐｍで更に２４時間インキュベートした。
【0155】
ＧＣ－ＭＳ分析の場合、ドデカンを遠心分離によって培養物から分離し、酢酸エチルで２００倍に希釈した。２μＬをＣａｎｋａｒ ｅｔ ａｌ．（２０１５）に詳細に記載されているようなガスクロマトグラフを用いるＧＣ／ＭＳによって分析した。
【0156】
驚くべきことに、ＢＬ２１－ＤＥ３－ｐＭＥＶ－ｐＡＣＹＣ－ＤＵＥＴ－１と比較した場合、ＢＬ２１－ＤＥ３－ｐＭＥＶ－ｐＡＣ－ＯｍＢＳＳは、α－サンタレン、トランス－αベルガモテン、及びβ－サンタレンを生成した。この系におけるＯｍＢＳＳの主なサンタレン生成物は、β－サンタレンであることが判明した（図２）。
【0157】
実施例４：ロドバクター・スフェロイデス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）においてＯｍＢＳＳを発現させるための構築物。
以下の合成ＤＮＡは、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔから注文された。
ロドバクター（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ）発現のための合成遺伝子ＯｍＢＳＳ（配列番号３）：
以下の合成ＤＮＡは、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔから注文された。
ロドバクター（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ）発現のための合成遺伝子ＯｍＢＳＳ（配列番号３）：
【化4】
【0158】
このフラグメントを、米国特許出願公開第２０２０００１０８２２Ａ１号明細書からのプラスミドｐ－ｍ－ＳＰｐｐａ－ＭＢＰ－ＣｉＣａＳＳｙ－ｍｐｍｉｉ－ａｌｔに、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＢａｍＨＩ制限部位を使用してクローニングした。ライゲーション混合物を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｓ１７－１細胞に形質転換した。結合によるＳ１７－１からＲ．スフェロイデス（Ｒ．ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）Ｒｓ２６５－９ｃへのｐ－ｍ－ＳＰｐｐａ－ＭＢＰ－ＯｍＢＳＳ－ｍｐｍｉｉ ａｌｔの転写（図１）は、標準手順を用いて実施した（米国特許第９，２６０，７０９Ｂ２号明細書）。発現された融合タンパク質を配列番号１８に示す。
【0159】
実施例５：ロドバクター・スフェロイデス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）におけるβ－サンタレンの産生
Ｒｓ２６５－９ｃ／ｐ－ｍ－ＳＰｐｐａ－ＭＢＰ－ＯｍＢＳＳ－ｍｐｍｉｉ ａｌｔの種培養を、バッフルなしの１００ｍＬ振盪フラスコ中で、１００ｍｇ／Ｌネオマイシンを含む２０ｍＬのＲＳ１０２培地及びグリセロールストックのループを用いて実施した。種培養フラスコを、１１０ｒｐｍで軌道５０ｍｍの振盪インキュベーター内で３０℃で７２時間培養した。
Ｒｓ２６５－９ｃ／ｐ－ｍ－ＳＰｐｐａ－ＭＢＰ－ＯｍＢＳＳ－ｍｐｍｉｉ ａｌｔの種培養を、バッフルなしの１００ｍＬ振盪フラスコ中で、１００ｍｇ／Ｌネオマイシンを含む２０ｍＬのＲＳ１０２培地及びグリセロールストックのループを用いて実施した。種培養フラスコを、１１０ｒｐｍで軌道５０ｍｍの振盪インキュベーター内で３０℃で７２時間培養した。
【0160】
２つの底面バッフルを備えた３００ｍＬの振盪フラスコで振盪フラスコ生成実験を行った。２０ｍＬのＲＳ１０２培地（米国特許出願公開第２０２０００１０８２２Ａ１号明細書に記載されている）と最終濃度を１００ｍｇ／Ｌとしたネオマイシンを、２ｍＬの滅菌ｎ－ドデカンと共にフラスコに加えた。２０ｍＬの培地中で最終的なＯＤ６００値が０．０５となるように、接種物の量を調整した。このフラスコを、１１０ｒｐｍで軌道５０ｍｍの振盪インキュベーター内で３０℃で７２時間保持した。振盪フラスコ実験は二重に実施した。
【0161】
ＧＣ－ＭＳ分析の場合、ドデカンを遠心分離によって培養物から分離し、アセトンで１０倍に希釈した。
【0162】
ガスクロマトグラフィーは、Ｒｅｓｔｅｋ ＲＴＸ－５Ｓｉｌ ＭＳキャピラリーカラム（３０ｍ×０．２５ｍｍ、０．５μｍ）を備えたＳｈｉｍａｄｚｕ ＧＣ２０１０ Ｐｌｕｓで実施した。インジェクター及びＦＩＤ検出器の温度は、それぞれ２８０℃及び３００℃に設定された。カラムを通るガス流量は、４０ｍＬ／分に設定された。オーブンの初期温度は１６０℃であったが、２℃／分の速度で１８０℃まで上昇させ、更に５０℃／分の速度で３００℃まで上昇させ、その温度で３分間保持した。注入したサンプル量は１μＬ、分割比１：５０、窒素補給流量は３０ｍＬ／分であった。
【0163】
Ｒｓ２６５－９ｃ／ｐ－ｍ－ＳＰｐｐａ－ＭＢＰ－ＯｍＢＳＳ－ｍｐｍｉｉ ａｌｔ培養物のドデカン層で見つかった化合物は、保持時間に従って同定され、クロマトグラムのピーク面積を積分することで定量された（図３）。ピーク面積の分析により、全サンタレンの２６％がα－サンタレン、７％がトランス－α－ベルガモテン、６７％がβ－サンタレンであることが明らかになった。
【0164】
第２の実験は、生成されたテルペン物質を更に詳細に分析するために、特に他のサンタレンシンターゼから知られているそのようなテルペンについて分析するために行われた。ドデカン層で見つかった化合物のＧＣ分析の結果を表Ｉに示す。驚くべきことに、既知のサンタレンシンターゼによって生成されることが知られているテルペンの一部は生成されず、本発明のサンタレンシンターゼはセスキツジェンの生成を含む新規で非常に異なる生成物プロファイルを有することが見出された。
【0165】
【表1】
【0166】
斜体の物質は存在すると予想されたが、ＯｍＢＳＳによって生成されなかった。他の既知のサンタレンシンターゼは、同じ設定で検出可能な量のこれらを生成することが確認された。
【0167】
ＲＴ＝保持時間 Ｆｏｕｎｄ ＲＩ＝実験的なＲＩ、Ｌｉｔ．ＲＩ＝公表されたものからのＲＩ、ＮＤは検出されず。
【0168】
実施例６：本発明の新規サンタレン組成物と既知のサンタレン組成物の嗅覚比較
サンタレン及びセスキツジェンを含むサンタレン組成物は、前の実施例に記載したように生成した。比較のために、最先端のサンタレン組成物は、国際公開第２０１８／１６００６６号パンフレットに記載されているように生成された。
サンタレン及びセスキツジェンを含むサンタレン組成物は、前の実施例に記載したように生成した。比較のために、最先端のサンタレン組成物は、国際公開第２０１８／１６００６６号パンフレットに記載されているように生成された。
【0169】
本発明のサンタレン組成物を既知のサンタレン組成物と比較して嗅いだ場合、本発明の組成物はウッディノートが増加し、改善された嗅覚特性を有していた。
【0170】
サンタレン及びセスキツジェンを含む組成物は、サンタレンを含む既知の組成物が使用されるのと同様に芳香組成物に使用することができ、サンタロールを含む本発明の組成物は、既知のサンタロール組成物が使用されるのと同様に芳香組成物に使用することができる。
【0171】
好適な芳香組成物は、例えば、香水組成物、ボディケア組成物（化粧品組成物並びに口腔及び歯科衛生用製品を含む）、衛生用品、洗浄組成物（食器洗い組成物を含む）、繊維製品洗剤組成物、香りディスペンサー用組成物、食品、栄養補助食品、医薬組成物及び作物保護組成物であるが、これらに限定されない。
【0172】
香水組成物は、ファインフレグランス、液体形態、ゲル状形態又は固体担体に適用された形態の室内用芳香剤、エアゾールスプレー、香気付けされたクリーナー、香水キャンドル及びランプオイル又はマッサージ用オイルなどのオイルから選択することができる。
【0173】
ファインフレグランスの例は、香水抽出物、オードパルファム、オードトワレ、オーデコロン、オードソリド（Ｅａｕ ｄｅ Ｓｏｌｉｄｅ）及びエクストラパルファム（Ｅｘｔｒａｉｔ Ｐａｒｆｕｍ）である。
【0174】
本発明の組成物はまた、香味付けのために使用することもできる。
【0175】
有利な組成物
サンタレンとセスキツジェンの混合物を含む本発明の組成物は、表ＩＩ及び表ＩＩＩに従って香水組成物中に配合され、化合物Ａと表示された。
サンタレンとセスキツジェンの混合物を含む本発明の組成物は、表ＩＩ及び表ＩＩＩに従って香水組成物中に配合され、化合物Ａと表示された。
【0176】
サンタレンとセスキツジェンの本発明の混合物は、表ＩＩ及び表ＩＩＩに従った組成物として配合された。表Ｉに示された混合物は、表ＩＩ及び表ＩＩＩでは「化合物Ａ」と表示された。
【0177】
【表2】
【0178】
【表3】
【0179】
表ＩＩ及び表ＩＩＩによる組成物、即ち、１Ａ、１Ｂ、２Ａ、２Ｂは、デオポンプスプレー、クリーンヘアコンディショナー、フェイスウォッシュジェル、フォームバス濃縮液、ヘアジェル、セルフフォーミングボディウォッシュ、スプレー式サンケアエマルジョン、スプレー式サンプロテクションエマルジョン、エモリエントフェイシャルジェル、２相オイルフォームバス、シャンプー、シャワーバス、含水アルコールＡＰ／デオポンプスプレー、エアゾール、水性／アルコールＡＰ／デオロールオン、スタイリングジェルタイプ「アウトオブベッド（Ｏｕｔ ｏｆ Ｂｅｄ）」、シェービングフォーム、敏感肌用ベビーシャンプー、敏感肌用ボディウォッシュ、敏感頭皮用グロスエンハンシングシャンプー、デオスティック、乳児用拭き取りシート、アフターシェーブバーム、フェイスジェル、フェイスデイケアクリーム、フェイスクレンザー、ボディローション、サンケアＳＰＦ５０＋、スプレー式ローション、ハンドディッシュクリーナー（レギュラー）、ハンドディッシュクリーナー（濃縮液）、サニタリー用洗剤（濃縮液）、汎用洗浄剤、抗菌柔軟剤、洗剤組成物、粉末洗剤組成物及び液体洗剤組成物からなる群から選択される様々な組成物に含まれ得る。
【0180】
当業者は、上述の製品における様々な一般的な配合に精通しているであろう。
【0181】
組成物１Ａ、１Ｂ、２Ａ及び２Ｂは、例えば、ＩＰ．ｃｏｍ番号：ＩＰＣＯＭ０００２５８６１４Ｄ、表題Ｎｅｗ Ａｒｏｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、６～４６ページ、表１～表Ｄ１３に開示されているような特定の配合で配合することができ、この場合、「香料組成物１Ａ」は、同一量の組成物１Ａ、１Ｂ、２Ａ、又は２Ｂで置き換えられる。
【図1】
【図2-1】
【図2-2】
【図3】
【図4-1】
【図4-2】
【図4-3】
【配列表】
【国際調査報告】