特表 2024-546828 標的異常細胞を治療する新規な方法とそこで使用される細胞傷害性細胞

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-12-26

(54)【発明の名称】標的異常細胞を治療する新規な方法とそこで使用される細胞傷害性細胞

(51)【国際特許分類】

   A61K 35/17 20150101AFI20241219BHJP

   A61K 39/00 20060101ALI20241219BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20241219BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20241219BHJP

   A61P 37/04 20060101ALI20241219BHJP

   C12N 5/0783 20100101ALN20241219BHJP

【ＦＩ】

A61K35/17

A61K39/00 H

A61K39/395 N

A61P35/00

A61P37/04

C12N5/0783 ZNA

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024535250

(86)(22)【出願日】2022-12-12

(85)【翻訳文提出日】2024-08-13

(86)【国際出願番号】 US2022081368

(87)【国際公開番号】W WO2023114719

(87)【国際公開日】2023-06-22

(31)【優先権主張番号】63/288,728

(32)【優先日】2021-12-13

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】521311148

【氏名又は名称】アセポディア バイオテクノロジーズ リミテッド

(74)【代理人】

【識別番号】110000671

【氏名又は名称】ＩＢＣ一番町弁理士法人

(72)【発明者】

【氏名】シャオ，チン－ウェン

(72)【発明者】

【氏名】チェン，ジ－フェイ

(72)【発明者】

【氏名】ウー，タイ－シェン

(72)【発明者】

【氏名】リン，ヤン－リャン

(72)【発明者】

【氏名】リ，ハオ－カン

(72)【発明者】

【氏名】タン，サイ－ウェン

(72)【発明者】

【氏名】ヤン，シュ－ピン

(72)【発明者】

【氏名】シャオ，シー－チア

【テーマコード（参考）】

4B065

4C085

4C087

【Ｆターム（参考）】

4B065AA90X

4B065BD50

4B065CA44

4C085AA02

4C085AA14

4C085DD62

4C085EE01

4C085GG01

4C087AA01

4C087AA02

4C087AA03

4C087BB64

4C087CA04

4C087NA05

4C087NA13

4C087NA14

4C087ZA01

4C087ZA51

4C087ZB02

4C087ZB07

4C087ZB09

4C087ZB26

4C087ZB33

4C087ZB35

4C087ZB38

4C087ZC21

(57)【要約】

【要約】
本発明は、疾患を有する対象に有効量の成分複合体細胞傷害性細胞を投与することを含有し、成分に対して耐性、難治性、非感受性、非反応性、または不十分に反応する標的異常細胞を治療する方法、およびそれに使用される細胞傷害性細胞を提供する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

疾患を有する対象に有効量のエフェクター細胞を投与することを含む、前記疾患を治療する方法であって、前記エフェクター細胞は、表面と、前記エフェクター細胞の表面に複合体化されたターゲティングユニットの集団とを備え、ここで、前記集団中のターゲティングユニットは第１成分を含有し、前記第１成分は、（ａ）前記疾患に関連する異常細胞によって発現される生物学的マーカーとの特異的な相互作用を示すこと、（ｂ）前記エフェクター細胞によって産生されないこと、および（ｃ）前記疾患を有する対象の治療において効果がないか、または十分な効果がないと判断されること、または臨床試験終了時に、前記疾患の治療に効果がないか、または十分な効果がないと結論付けられることを特徴とする、方法。

【請求項2】

疾患を有する対象に有効量のエフェクター細胞を投与することを含む、前記疾患の病変部への免疫細胞の遊走能力を増加させる方法であって、前記エフェクター細胞は、表面と、前記エフェクター細胞の表面に複合体化されたターゲティングユニットの集団とを備え、ここで、前記集団中のターゲティングユニットは第１成分を含有し、前記第１成分は、（ａ）前記疾患の病変部に位置する異常細胞によって発現される生物学的マーカーとの特異的な相互作用を示すこと、（ｂ）前記エフェクター細胞によって産生されないこと、および（ｃ）前記疾患を有する対象の治療において効果がないか、または十分な効果がないと判断されること、または臨床試験終了時に、前記疾患の治療に効果がないか、または十分な効果がないと結論付けられることを特徴とする、方法。

【請求項3】

疾患に関連する複数の異常細胞を有効量のエフェクター細胞と接触させることを含む、前記疾患に関連する異常細胞の数を減少させる生体外の方法であって、前記細胞傷害性細胞は、表面と、前記エフェクター細胞の表面に複合体化されたターゲティングユニットの集団とを備え、ここで、前記集団中のターゲティングユニットは第１成分を含有し、前記第１成分は、（ａ）前記疾患に関連する前記異常細胞によって発現される生物学的マーカーとの特異的な相互作用を示すこと、（ｂ）前記エフェクター細胞によって産生されないこと、および（ｃ）前記疾患に関連する前記異常細胞の治療に効果がないか、または十分な効果がないと判断されることを特徴とする、方法。

【請求項4】

前記エフェクター細胞が細胞傷害性細胞である、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項5】

前記エフェクター細胞が細胞あたり３０００個以上のターゲティングユニットを備える、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項6】

前記エフェクター細胞がＣＤ１６^＋細胞である、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項7】

前記第１成分がＦｃ受容体認識領域を含有する、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項8】

前記第１成分がＡＤＣＣを誘導するＩｇＧサブタイプのモノクローナル抗体であるか、または前記第１成分が他の抗体であるか、または前記第１成分は抗原結合ユニットを含有する、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項9】

前記第１成分が核酸ではない、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項10】

前記エフェクター細胞は抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）応答を媒介することができる、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項11】

前記エフェクター細胞はＣＤ３^＋Ｔ細胞の遊走を誘導することができる、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項12】

前記生物学的マーカーを発現する標的細胞と共培養した後、前記エフェクター細胞がＣＤ１０７ａを発現する、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項13】

前記生物学的マーカーを発現する標的細胞と共培養した後、前記エフェクター細胞がインターフェロン－γ（ＩＦＮ－γ）もしくは腫瘍壊死因子－α（ＴＮＦ－α）、またはそれらの組み合わせを発現する、請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項14】

前記第１成分が、前記疾患の治療のためにＦＤＡに承認された成分である、請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項15】

前記第１成分が、リツキシマブ、トラスツズマブ、セツキシマブ、アレムツズマブ、アベルマブ、ダラツムマブ、エロツズマブ、オビヌツズマブ、ボルセツズマブ、クサツズマブ、デュルバルマブ、ペイントムマブ、またはアマツジマブである、請求項１４に記載の方法。

【請求項16】

前記第１成分が、第Ｉ相臨床試験で成功しているが、前記疾患の治療のためにＦＤＡ承認された成分ではない、請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項17】

前記第１成分が、コドリツズマブ、ソラネツズマブ、ビマグルマブ、トラクロキヌマブ、またはボコシズマブである、請求項１６に記載の方法。

【請求項18】

前記対象に投与される前記エフェクター細胞が、自己エフェクター細胞または同種異系エフェクター細胞に由来する、請求項１から１７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項19】

前記エフェクター細胞が、投与前に細胞増殖を誘導することなく投与される、請求項１から１８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項20】

前記疾患が、過剰増殖性疾患、進行期疾患、ＨＩＶまたは他のウイルス感染性疾患、真菌感染性疾患、細菌感染性疾患、原虫感染性疾患、自己免疫疾患、神経細胞疾患、造血細胞関連疾患、代謝症候群、および病原性疾患からなる群から選択される、請求項１から１９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項21】

前記疾患が、固形腫瘍および液性腫瘍からなる群から選択される過剰増殖性疾患または進行期疾患である、請求項２０に記載の方法。

【請求項22】

前記第１成分が、癌抗原、糖脂質、糖タンパク質、造血系細胞上に存在する分化クラスター抗原、ガンマグルタミルトランスペプチダーゼ、接着タンパク質、ホルモン、成長因子、サイトカイン、リガンド受容体、イオンチャネル、免疫グロブリンμ鎖の膜結合型、アルファフェトプロテイン、Ｃ反応性タンパク質、クロモグラニンＡ、上皮ムチン抗原、ヒト上皮特異抗原、ルイス（ａ）抗原、多剤耐性関連タンパク質、Ｎｅｕ癌遺伝子タンパク質、ニューロン特異的エノラーゼ、Ｐ－糖タンパク質、多剤耐性関連抗原、ｐ１７０、多剤耐性関連抗原、前立腺特異抗原、ＮＣＡＭ、ガングリオシド分子、ＭＡＲＴ－１、熱ショックタンパク質、シアリルＴｎ、チロシナーゼ、ＭＵＣ－１、ＨＥＲ－２／ｎｅｕ、ＫＳＡ、ＰＳＭＡ、ｐ５３、ＲＡＳ、ＥＧＦ－Ｒ、ＶＥＧＦ、およびＭＡＧＥ、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される生物学的マーカーとの特異的相互作用を示すか、または前記第１成分は、ＨＥＲ２／ｎｅｕ（ＥＲＢＢ２）、ＨＥＲ３（ＥＲＢＢ３）、ＥＧＦＲ、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ２、ＧＤ２、ＣＴＬＡ４、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３（Ｓｉｇｌｅｃ－３）、ＣＤ５２（ＣＡＭＰＡＴＨ－１抗原）、ＣＤ３２６（ＥｐＣＡＭ）、ＣＡ－１２５（ＭＵＣ１６）、ＭＭＰ９、ＤＬＬ３、ＣＤ２７４（ＰＤ－Ｌ１）、ＣＥＡ、ＭＳＬＮ（メソセリン）、ＣＡ１９－９、ＣＤ７３、ＣＤ２０５（ＤＥＣ２０５）、ＣＤ５１、ｃ－ＭＥＴ、ＴＲＡＩＬ－Ｒ２、ＩＧＦ－１Ｒ、ＣＤ３、ＭＩＦ、葉酸受容体アルファ（ＦＯＬＲ１）、ＣＳＦ１、ＯＸ－４０、ＣＤ１３７、ＴｆＲ、ＭＵＣ１、ＣＤ２５（ＩＬ－２Ｒ）、ＣＤ１１５（ＣＳＦ１Ｒ）、ＩＬ１Ｂ、ＣＤ１０５（エンドグリン）、ＫＩＲ、ＣＤ４７、ＣＥＡ、ＩＬ－１７Ａ、ＤＬＬ４、ＣＤ５１、アンジオポエチン２、ニューロピリン－１、ＣＤ３７、ＣＤ２２３（ＬＡＧ－３）、ＣＤ４０、ＬＩＶ－１（ＳＬＣ３９Ａ６）、ＣＤ２７（ＴＮＦＲＳＦ７）、ＣＤ２７６（Ｂ７－Ｈ３）、Ｔｒｏｐ２、クローディン１（ＣＬＤＮ１）、ＰＳＭＡ、ＴＩＭ－１（ＨＡＶｃｒ－１）、ＣＥＡＣＡＭ５、ＣＤ７０、ＬＹ６Ｅ、ＢＣＭＡ、ＣＤ１３５（ＦＬＴ３）、ＡＰＲＩＬ、ＴＦ（Ｆ３）、ネクチン－４、ＦＡＰ、ＧＰＣ３、ＦＧＦＲ３、キラー細胞免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）、ＲＯＲ１、ＲＯＲ２、ＰＤ－１（ＣＤ２７９）、ＣＴＬＡ－４（ＣＤ１５２）、ＴＩＭ－３（ＨＡＶＣＲ２）、免疫チェックポイント受容体、免疫チェックポイント受容体リガンド、受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体、ＴＮＦ受容体タンパク質、免疫グロブリンタンパク質、サイトカイン受容体、インテグリン、活性化ＮＫ細胞受容体、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される癌抗原との特異的相互作用を示す、請求項２１に記載の方法。

【請求項23】

前記ターゲティングユニットが、前記第１成分に結合した第１リンカーと前記エフェクター細胞の表面に結合した第２リンカーとの間の相互作用を介して、前記エフェクター細胞の表面に複合体化される、請求項１から２２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項24】

前記第１リンカーが前記第１成分に共有結合または非共有結合しているか、もしくは前記第２リンカーが前記エフェクター細胞の表面に共有結合または非共有結合しているか、またはそれらの組み合わせである、請求項２３に記載の方法。

【請求項25】

前記第１リンカーまたは前記第２リンカーが、前記第１成分または前記エフェクター細胞の表面の天然官能基に結合され、前記天然官能基がアミノ酸、糖、またはアミンである、請求項２３または２４に記載の方法。

【請求項26】

前記天然官能基が糖、アミン、またはアミノ酸を含有するか、または前記天然官能基がアジド修飾された糖ではないか、または前記天然官能基は、リジン、システイン、チロシン、スレオニン、セリン、アスパラギン酸、グルタミン酸およびトリプトファンからなる群から選択されるアミノ酸を含有する、請求項２５に記載の方法。

【請求項27】

前記第２リンカーがエフェクター細胞の天然官能基に直接共有結合しており、ここで、前記第２リンカーとエフェクター細胞の前記天然官能基との間の直接の共有結合は、前記第２リンカーが前記天然官能基に直接共有結合するように、前記エフェクター細胞を前記第２リンカーと接触させることによって調製される、請求項２５または２６に記載の方法。

【請求項28】

前記第１リンカーと前記第２リンカーとが、ＤＮＡ結合ドメインと標的ＤＮＡ、ロイシンジッパーと標的ＤＮＡ、ビオチンとアビジン、ビオチンとストレプトアビジン、カルモジュリン結合タンパク質とカルモジュリン、ホルモンとホルモン受容体、レクチンと炭水化物、細胞膜受容体と受容体リガンド、酵素と基質、抗原と抗体、アゴニストとアンタゴニスト、ポリヌクレオチドハイブリダイズ配列、アプタマーと標的、およびジンクフィンガーと標的ＤＮＡからなる群から選択される、請求項２３から２７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項29】

前記２つのリンカーのうちの少なくとも１つがＰＥＧ領域またはＮＨＳエステルを含有するか、または前記第１成分はカップリング基を介して第１リンカーに結合し、前記カップリング基はＮＨＳエステルまたは他の活性化エステル、ハロゲン化アルキルもしくはハロゲン化アシル、二官能性架橋剤、またはマレイミド基である、請求項２３から２８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項30】

前記第１成分と前記エフェクター細胞とが、１ｎｍ～４００ｎｍの長さ、離れている、請求項１から２９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項31】

前記第１リンカーが第１ポリヌクレオチドであり、前記第２リンカーが第２ポリヌクレオチドである、請求項２３から３０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項32】

前記２つのポリヌクレオチドのうちの少なくとも１つの長さが４ｎｔ～５００ｎｔである、請求項３１に記載の方法。

【請求項33】

前記第１ポリヌクレオチドが第１一本鎖領域を含有し、前記第２ポリヌクレオチドが前記第１一本鎖領域に相補的な第２一本鎖領域を含有し、前記ターゲティングユニットが、第１一本鎖領域と第１一本鎖領域に相補的な第２一本鎖領域との間の相互作用を介して前記エフェクター細胞の表面に複合体化される、請求項３１または３２に記載の方法。

【請求項34】

前記第１のリンカーが第１反応性基を含有し、前記第２リンカーが第２反応性基を含有し、前記ターゲティングユニットが、前記第２反応性基と前記第１反応性基との間の反応によって形成された共有結合を介して前記エフェクター細胞の表面に複合体化される、請求項２３から３０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項35】

前記細胞傷害性細胞が、免疫細胞、リンパ球、ナチュラルキラー細胞、ガンマデルタＴ細胞、他のＴリンパ球、マクロファージ、単球、好中球、樹状細胞、サイトカイン誘導性キラー細胞（ＣＩＫ）、リンホカイン活性化キラー細胞（ＬＡＫ）、細胞溶解性Ｔ細胞（ＣＴＬ）、または腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）である、請求項４に記載の方法。

【請求項36】

前記エフェクター細胞が、免疫不全マウスにおいて非腫瘍形成性であるか、または前記エフェクター細胞が、γ線照射後の同種異系対象において非腫瘍形成性である、請求項１から３５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項37】

前記細胞傷害性細胞が、
（Ａ）ＮＰＭＤに寄託されていて、受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ－０３０１７を有すること、
（Ｂ）染色体を備え、前記染色体の染色体ＤＮＡ配列が、ＮＰＭＤに寄託された受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ－０３０１７を有するナチュラルキラー細胞の対応する染色体の染色体ＤＮＡ配列と少なくとも８０％同一であること、または
（Ｃ）以下の特徴：
ｉ）ＣＤ１６受容体を発現すること、
ｉｉ）少なくとも３か月にわたる継代培養後にその増殖能を保持していること、および
ｉｉｉ）ｘ）ＣＤ１６受容体をコードする合成、遺伝子改変、および／または意図的に送達されたポリヌクレオチドを含まないか、またはｙ）ｄｄＰＣＲシステムを使用して前記細胞傷害性細胞のゲノムＤＮＡを分析することによって、ＣＤ１６ Ｆ１７６Ｖプローブで検出可能なＤＮＡ分子に対するＣＤ１６ Ｆ１７６Ｆプローブで検出可能なＤＮＡ分子の比が１以上であって、ＣＤ１６ Ｆ１７６Ｆプローブの配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７であり、ＣＤ１６ Ｆ１７６Ｖプローブの配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８であること
を持つこと、
を特徴とするナチュラルキラー細胞である、請求項４に記載の方法。

【請求項38】

前記細胞傷害性細胞が、
（１）前記細胞傷害性細胞とナチュラルキラー細胞株ＮＫ３．３とが異なる対象に由来すること、
（２）前記細胞傷害性細胞が癌を有する対象に由来すること、
（３）前記細胞傷害性細胞が白人男性に由来すること、もしくは
（４）前記細胞傷害性細胞と受託番号ＡＴＣＣ ＣＲＬ－２４０７を有するナチュラルキラー細胞とが同じ対象に由来すること、
またはそれらの任意の組み合わせ、
をさらに特徴とする、請求項３７に記載の方法。

【請求項39】

前記エフェクター細胞が、ＣＤ２、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ２５、ＮＫｐ３０、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＣＤ２７、ＯＸ４０、ＣＤ１０７ａ、ＮＫＧ２Ａ、ＰＤ－１、ＴＩＧＩＴ、ＳＩＲＰα、もしくはＣＤ１５８、またはそれらの任意の組み合わせをさらに発現する、請求項１から３８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項40】

前記細胞傷害性細胞がγδＴ細胞であるか、または前記細胞傷害性細胞がＶδ１ Ｔ細胞、Ｖδ２ Ｔ細胞、Ｖδ３ Ｔ細胞、Ｖδ５ Ｔ細胞、またはＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞である、請求項４に記載の方法。

【請求項41】

前記エフェクター細胞が、ＣＤ３、ＮＫｐ４６、ＣＤ５６、ＣＤ１６、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫｐ４４、ＣＤ２５、ＣＤ３８、ＰＤ－１、ＮＫｐ３０、ＣＤ１８、ＴＩＧＩＴ、ＤＮＡＭ－１、ＣＤ３６、ＣＤ１０３、ＣＣＲ７、ＣＸＣＲ３、ＩＦＮγ、グランザイムＢ、もしくはＣＤ６９、またはそれらの任意の組み合わせをさらに発現する、請求項１から３６および４０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項42】

前記生物学的マーカーを発現する標的細胞との共培養後、前記エフェクター細胞がグランザイムＢをさらに発現する、請求項１から３６および４０から４１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項43】

（１）前記エフェクター細胞の少なくとも４％が、細胞あたり少なくとも４００個のＮＫｐ４６分子を発現するか、
（２）前記エフェクター細胞の少なくとも１０％が、細胞あたり少なくとも４００個のＣＤ５６分子を発現するか、
（３）前記エフェクター細胞の少なくとも１０％が、細胞あたり少なくとも４００個のＣＤ１６分子を発現するか、
（４）前記エフェクター細胞の少なくとも３０％が、細胞あたり少なくとも４０個のＮＫＧ２Ｄ分子を発現するか、
（５）前記エフェクター細胞の少なくとも１％が、細胞あたり少なくとも４００個のＮＫｐ４４分子を発現するか、
（６）前記エフェクター細胞の少なくとも８０％が、細胞あたり少なくとも４００個のＣＤ６９分子を発現するか、もしくは
（７）前記エフェクター細胞の少なくとも４０％が、細胞あたり少なくとも４００個のＣＸＣＲ３分子を発現するか、
またはそれらの任意の組み合わせである、請求項１から４２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項44】

（１）前記エフェクター細胞の少なくとも４％がＮＫｐ４６を発現し、前記ＮＫｐ４６を発現するエフェクター細胞は平均で細胞あたり少なくとも４００個のＮＫｐ４６分子を発現するか、
（２）前記エフェクター細胞の少なくとも１０％がＣＤ５６を発現し、前記ＣＤ５６を発現するエフェクター細胞は平均で細胞あたり少なくとも４００個のＣＤ５６分子を発現するか、
（３）前記エフェクター細胞の少なくとも１０％がＣＤ１６を発現し、前記ＣＤ１６を発現するエフェクター細胞は平均で細胞あたり少なくとも４００個のＣＤ１６分子を発現するか、
（４）前記エフェクター細胞の少なくとも３０％がＮＫＧ２Ｄを発現し、前記ＮＫＧ２Ｄを発現するエフェクター細胞は平均で細胞あたり少なくとも４０個のＮＫＧ２Ｄ分子を発現するか、
（５）前記エフェクター細胞の少なくとも１％がＮＫｐ４４を発現し、前記ＮＫｐ４４を発現するエフェクター細胞は平均で細胞あたり少なくとも４００個のＮＫｐ４４分子を発現するか、
（６）前記エフェクター細胞の少なくとも８０％がＣＤ６９を発現し、前記ＣＤ６９を発現するエフェクター細胞は平均で細胞あたり少なくとも４００個のＣＤ６９分子を発現するか、もしくは
（７）前記エフェクター細胞の少なくとも４０％がＣＸＣＲ３を発現し、前記ＣＸＣＲ３を発現するエフェクター細胞は平均で細胞あたり少なくとも４００個のＣＸＣＲ３分子を発現するか、
またはそれらの任意の組み合わせである、請求項１から４３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項45】

前記ターゲティングユニットが第１タイプのターゲティングユニットであり、前記エフェクター細胞が、前記エフェクター細胞の表面に複合体化された第２タイプのターゲティングユニットの集団をさらに備え、前記第２タイプのターゲティングユニットの集団中のターゲティングユニットは、（ａ）前記疾患に関連する前記異常細胞によって発現される前記生物学的マーカーまたは異なる生物学的マーカーへの特異的結合を示すこと、（ｂ）前記エフェクター細胞によって産生されないことを特徴とする第２成分を含有する、請求項１～４４のいずれか一項に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

［電子配列表の参照］
この出願には.XML形式で電子的に提出された配列表が含まれており、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。2022年12月12日に作成された前記 .XML コピーは「7171-0108PWO1.xml」という名前で、サイズは 45,853 バイトである。この.XMLファイルに含まれる配列表は明細書の一部であり、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0002】

［技術分野］
本発明は、成分およびそれに使用される細胞傷害性細胞に対して耐性、難治性、非感受性、非反応性、または不十分に反応する標的異常細胞を治療する方法に関する; より詳細には、成分およびそれに使用される成分と複合体を形成した細胞傷害性細胞に対して耐性、難治性、鈍感性、無反応性、または不十分に反応する標的異常細胞（耐性細胞を含むがこれらに限定されない）を治療方法に関する。

【背景技術】

【0003】

細胞傷害性細胞は感染症や腫瘍の浸潤に対して役割を果たす。細胞傷害性細胞には 2 種類がある。一つはナチュラル キラー細胞、ガンマデルタT細胞、NKT 細胞などの先天性免疫または自然免疫に関与する細胞であり、及び細胞傷害性 T リンパ球などの適応免疫または獲得免疫に関与するものである(Rey et al., 2005.) 。

【0004】

異常細胞を標的とする治療法は、他の細胞に影響を与えることなく、特有な生物学的マーカーを持つ異常細胞を標的とするように設計された成分を使用する治療法である。標的がん療法などの異常細胞を標的とする療法は、過去数十年にわたって開発されてきた(Lupu et al., 2016) 。 しかし、依然として多くの課題に直面している。1つ目の大きな課題は、異常細胞を標的とした治療に利用できる薬剤がほとんどないことである。 実際、コドリツズマブ、ソラネズマブ、ビマグルマブ、トラロキヌマブ、ボコシズマブなど、異常細胞上に発現する生物学的マーカーと特異的に相互作用する（または結合する）大きな可能性を示す多くの成分が第I相試験で成功したが、第II/III相試験では効果がないか、十分な効果ないと判断された。言い換えれば、医薬品開発プロセスを完了しなかったため、これらの大きな可能性を秘めた数多くの成分をすべて産業で使用することができなかったのである。

【0005】

2つ目の大きな課題は薬剤耐性である。 例えば、トラスツズマブやセツキシマブなどの食品医薬品局承認薬（FDA承認薬）は、患者に初めて投与されたときに効果があり、標的の異常細胞を死滅させ、標的の異常細胞の数を減少させる可能性がある。 しかしながら、一定期間が経過すると、同じ薬剤による標的異常細胞の死滅効率が大幅に低下することが判明した (Lee M. Ellis and Daniel J. Hicklin, 2009.) 。

【0006】

薬剤耐性の問題を解決するために、人々は2012年以来、薬剤耐性および疾患に対する理解を深め、他の成分や他のユニークな生物学的特徴に基づいて異常細胞を標的とする新しい治療法を開発しようと努めてきた (Bottsford-Miller et al., 2012) 。 しかしながら、独創的なアイデアから完成品に至る新薬の開発は複雑なプロセスであり、12～15年の歳月と10億ドル以上のコストがかかり、大きな可能性を秘めた成分のほとんどは、臨床試験で失敗することが多い。 さらに、たとえ潜在的な成分の 1 つが医薬品開発プロセスを通過し、食品医薬品局 (FDA) によって承認されたとしても、異常な細胞はこの新薬に対する耐性を獲得する可能性がある。

【0007】

したがって、異常細胞を標的とする治療に利用できる治療薬が市場にほとんどないという問題、および薬剤耐性の問題を解決する方法が依然として急務である。 本発明の発明者らは、細胞傷害性細胞がこれらの問題を解決し、異常細胞を特異的に標的とする細胞治療に応用できる可能性を秘めていると信じている。

【0008】

さらに、現在の効果的な治療法は、ほとんどの患者において「免疫抑制性微小環境」として知られる重要な障壁によって制限されている (David H. Munn and Vincenzo Bronte, 2016) 。 したがって、免疫抑制微小環境に存在する異常細胞の治療に利用できる治療薬がほとんどないという問題を解決する方法が依然として急務となっている。

【発明の概要】

【0009】

本発明の目的は、異常細胞を治療する生体外または生体内の方法、より具体的には、現在のＦＤＡ承認薬に対して抵抗性、難治性、非感受性、非応答性、または不十分に応答する異常細胞を治療するための方法を提供することである。

【0010】

本発明の第二の目的は、異常細胞を治療することができる、より具体的には、現在のＦＤＡ承認薬に対して抵抗性、難治性、非感受性、非反応性、または不十分に反応する異常細胞を治療することができる新規細胞傷害性細胞を提供することである。

【0011】

本発明の第３の目的は、異常細胞を含有する病変への免疫細胞の遊走能力を高める方法を提供することである。より具体的には、現在のFDA承認薬に対して抵抗性、難治性、鈍感性、非反応性、または不十分に反応する異常細胞を含有する病変に遊走する。

【0012】

本発明の第４の目的は、異常細胞を含有する病変への免疫細胞の遊走能力を増大させることができる新規細胞傷害性細胞を提供することである。より具体的には、現在のFDA承認薬に対して抵抗性、難治性、鈍感性、非反応性、または不十分に反応する異常細胞を含有する病変に遊走する。

【0013】

本発明の第５の目的は、化学結合技術に基づく成分と結合した細胞傷害性細胞を提供することであり、この成分は、疾患の治療または疾患を有する対象の治療において効果がないか、または十分な効果がない。

【0014】

本発明の第６の目的は、現在のＦＤＡ承認薬に対して抵抗性、難治性、鈍感性、無反応性、または不十分に反応性である対象における治療の有効性を改善する方法を提供することである。

【0015】

本発明の第七の目的は、第I相試験では成功したが、第II相試験や第III相試験では失敗した成分の有効性を改善する方法を提供することである。

【0016】

第一の観点において、本発明は疾患を有する対象に有効量のエフェクター細胞を投与することを含有する疾患を治療する方法を提供する。 エフェクター細胞は、表面とエフェクター細胞の表面に複合体を形成したターゲティングユニットの集団とを含有し、集団におけるターゲティングユニットは第１の成分を含有する。第１成分の特徴は次のとおりである： (a) 疾患に関連する異常細胞によって発現される生物学的マーカーとの特異的な相互作用を示し; (b) エフェクター細胞によって産生されなくて; c) 臨床試験の終了時に、疾患を有する対象の治療において効果がないか、または十分な効果がないと判断されるか、あるいは疾患の治療において効果がないか、または十分な効果がないと結論付けられる。

【0017】

第二の観点において、 本発明はさらに、疾患を有する対象に有効量のエフェクター細胞を投与することを含有し、疾患の病変への免疫細胞の遊走能力を増加させる方法を提供し; エフェクター細胞は、表面とエフェクター細胞の表面に複合体を形成したターゲティングユニットの集団とを含有し、集団におけるターゲティングユニットは第１の成分を含有する。第１成分の特徴は次のとおりである：(a) 疾患の病変に位置する異常細胞によって発現される生物学的マーカーとの特異的な相互作用を示し; (b) エフェクター細胞によって産生されなくて; c) 臨床試験の終了時に、疾患を有する対象の治療において効果がないか、または十分な効果がないと判断されるか、あるいは疾患の治療において効果がないか、または十分な効果がないと結論付けられる。

【0018】

いくつかの実施形態において、本方法は、疾患を有する対象の病変への免疫細胞の遊走能力を増大させるためのものである。

【0019】

第三の観点において、 本発明はさらに、疾患に関連する複数の異常細胞を有効量のエフェクター細胞と接触させることを含有し、疾患に関連する異常細胞の数を減少させる生体外の方法を提供し; エフェクター細胞は、表面とエフェクター細胞の表面に複合体を形成したターゲティングユニットの集団とを含有し、集団におけるターゲティングユニットは第１の成分を含有する。第１成分の特徴は次のとおりである： (a) 疾患に関連する異常細胞によって発現される生物学的マーカーとの特異的な相互作用を示し; (b) エフェクター細胞によって産生されなくて; (c) 疾患に関連する異常細胞の治療に効果がないか、また十分な効果がないと判断される。

【0020】

いくつかの実施形態において、エフェクター細胞は細胞傷害性細胞である。

【0021】

いくつかの実施形態において、対象に投与される細胞の約5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％、または99.5％以上が、エフェクター細胞の表面に複合体化したターゲティングユニットの集団を含有するエフェクター細胞である。いくつかの実施形態において、対象に投与されるすべての細胞は、エフェクター細胞の表面に複合体化されたターゲティングユニットの集団を含有するエフェクター細胞である。

【0022】

いくつかの実施形態において、対象は脊椎動物である。好ましくは、対象は、ネズミ、サル、ヒト、家畜、スポーツ動物、ペット、および他の哺乳動物からなる群から選択される哺乳動物である。好ましくは、対象はヒトである。

【0023】

いくつかの実施形態において、エフェクター細胞は細胞あたり3000以上のターゲティングユニットを含有する。 いくつかの実施形態において、集団中のターゲティングユニットのそれぞれは、少なくとも１つの第１の成分を含有する。

【0024】

いくつかの実施形態において、エフェクター細胞は、細胞当たり少なくとも2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、8500、9000、9500、10000、10500、11000、11500、12000、12500、13000、13500、14000、14500、15000、15500、16000、16500、17000、 17500、18000、 18500、 19000、 19500、 20000、 40000、 60000、 80000、 100000、110000、 120000、 130000、140000、150000、170000、190000、210000、220000、230000、240000、250000、260000、 270000、 280000、 290000、300000、 320000、 340000、360000、380000、400000のターゲティングユニットを含有する。

【0025】

いくつかの実施形態において、エフェクター細胞はCD16⁺細胞である。

【0026】

いくつかの実施形態において、第1成分は、Fcレセプター認識領域を含有する。

【0027】

いくつかの実施形態において、第1成分は抗体である。好ましくは、第1成分は、ADCCを誘導するIgGサブタイプのモノクローナル抗体であり; または第1成分が他の抗体であり；または第1成分が抗原結合ユニットを含有する。

【0028】

いくつかの実施形態において、Fc受容体認識領域は抗体のFc領域である。

【0029】

いくつかの実施形態において、抗体は、HER1、HER2、HER3、HER4、EGFR、CD20、CD19、ErbB2、ErbB3、CD28、IGF1R、IMC-1121、Met、VEGF、PDGFRα、PDGFRβ、CD22、CD79b、CD32B、IGF-1、IGF-1R、IGF-2、OPN、Ang-2、VEGFR、EpCAM、ROR1、PD-L1、VEGFR1、VEGFR2、またはVEGFR3である。いくつかの実施形態において、エフェクター細胞は、以下のうちの１つ、２つ、またはそれ以上に対する抗体と複合体を形成する：HER1、HER2、HER3、HER4、EGFR、CD20、CD19、ErbB2、ErbB3、CD28、IGF1R、IMC-1121、Met、VEGF、PDGFRα、PDGFRβ、CD22、CD79b、CD32B、IGF-1、IGF-1R、IGF-2、OPN、Ang-2、VEGFR、EpCAM、ROR1、PD-L1、VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3 ( US 10,744,207参照)。

【0030】

いくつかの実施形態において、抗体はポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、または完全ヒト抗体である。

【0031】

いくつかの実施形態において、第1成分は核酸ではない。

【0032】

いくつかの実施形態において、エフェクター細胞は、抗体依存性細胞傷害（ADCC）応答を媒介することができる。

【0033】

いくつかの実施形態において、エフェクター細胞はCD3⁺ T細胞の遊走を誘導することができる。

【0034】

いくつかの実施形態において、生物学的マーカーを発現する標的細胞と共培養した後、エフェクター細胞はCD107aを発現する。

【0035】

いくつかの実施形態において、生物学的マーカーを発現する標的細胞と共培養した後、エフェクター細胞は、インターフェロン-γ（IFN-γ）及び／又は腫瘍壊死因子-α（TNF-α）を発現する。

【0036】

いくつかの実施形態において、表面はエフェクター細胞の外表面である。 いくつかの実施形態において、表面はエフェクター細胞の細胞膜の外表面である。 いくつかの実施形態において、表面はエフェクター細胞の膜構造の外表面である。

【0037】

いくつかの実施形態において、標的細胞は、Raji、Daudi、K562、液体腫瘍に関連する他の標的細胞、A549、SK-OV-3、BT-474、固形腫瘍に関連する他の標的細胞、または疾患に関連する他の標的細胞である。

【0038】

いくつかの実施形態において、第1成分は、疾患の治療のためにFDAに承認された成分である。

【0039】

いくつかの実施形態において、第1成分は、リツキシマブ、トラスツズマブ、セツキシマブ、アレムツズマブ、アベルマブ、ダラツムマブ、エロツズマブ、オビヌツズマブ、ボルセツズマブ、クサツズマブ、デュルバルマブ、パニツムマブ、またはアマツジマブである。

【0040】

いくつかの実施形態において、第1成分は第Ｉ相臨床試験で成功しているが、疾患の治療のためにFDAに承認された成分ではない。

【0041】

いくつかの実施形態において、「第Ｉ相臨床試験では成功したが、疾患の治療に関してFDAが承認した成分ではない第１の成分」は、第Ｉ相臨床試験では成功したが、第II相/第III相臨床試験で効果がない、または十分な有効性がないと判断されたため、疾患の治療薬としてFDAが承認していない成分である。例えば、コドリツズマブは第I相臨床試験で成功した第１の成分だが、この疾患の治療用としてFDAに承認された成分ではない。

【0042】

いくつかの実施形態において、第１の成分は、コドリツズマブ、ソラネズマブ、ビマグルマブ、トラクロキヌマブ、またはボコシズマブである。

【0043】

いくつかの実施形態において、対象に投与されるエフェクター細胞は、自己エフェクター細胞または同種異系エフェクター細胞に由来する。

【0044】

いくつかの実施形態において、エフェクター細胞は自己エフェクター細胞である。 いくつかの他の実施形態において、エフェクター細胞は同種異系対象に由来し、したがって同種異系エフェクター細胞である。 自己細胞療法では、患者は自分の体に由来する自己エフェクター細胞を受け取る。 同種異系細胞療法では、患者は患者ではないドナー（同種異系被験者）由来の同種異系エフェクター細胞を受け取る。

【0045】

いくつかの実施形態において、本方法は以下を含有する：(a) 自己エフェクター細胞または同種異系エフェクター細胞の集団を取得する工程; (b) 1つまたは複数の第1成分を自己エフェクター細胞または同種異系エフェクター細胞と複合体化する工程; (c) 方法(b)からの複合体化細胞を対象に投与することにより、対象の疾患を治療する。 いくつかの実施形態において、方法(a)から(c)は24時間以内に完了する。いくつかの実施形態において、方法(b)からの複合体化細胞（エフェクター細胞）は、投与前に細胞増殖を誘導することなく投与される。

【0046】

いくつかの実施形態において、疾患は、過増殖性疾患、進行期疾患、HIVまたは他のウイルス感染症、真菌感染症、細菌感染症、原虫感染症、自己免疫疾患、神経疾患、造血細胞関連疾患、代謝症候群、および病原性疾患からなる群から選択される。

【0047】

いくつかの実施形態において、疾患は、固形腫瘍および液性腫瘍からなる群から選択される過増殖性または進行期の疾患である。

【0048】

いくつかの実施形態において、過剰増殖性疾患は、表皮腫、腺房細胞癌、聴神経腫、端点黒子黒色腫、先端汗腺腫、急性好酸球性白血病、急性リンパ芽球性白血病、急性巨核芽球性白血病、急性単球性白血病、成熟型急性骨髄芽球性白血病、急性骨髄性樹状細胞白血病、急性骨髄性白血病、急性前骨髄球性白血病、アダマンチノーマ、腺癌、腺様嚢胞癌、腺腫、腺腫様歯原性腫瘍、副腎皮質癌、成人T細胞白血病、進行性NK細胞白血病、エイズ関連癌、エイズ関連リンパ腫、肺胞軟部肉腫、無芽球性線維腫、肛門癌、未分化大細胞リンパ腫、未分化甲状腺癌、血管免疫芽細胞性T細胞リンパ腫、血管筋脂肪腫、血管肉腫、虫垂癌、星細胞腫、非定型奇形性ラブドイド腫瘍、基底細胞癌、基底細胞様癌、B細胞白血病、B細胞リンパ腫、ベリーニ管癌、気管支肺胞癌、褐色腫瘍、バーキットリンパ腫、原発部位不明癌、カルチノイド腫瘍、癌腫、上皮内癌、陰茎癌、原発部位不明の癌、癌肉腫、キャッスルマン病、中枢神経系胎児性腫瘍、小脳星状細胞腫、脳星細胞腫、子宮頸癌、胆管癌、軟骨腫、軟骨肉腫、脊索腫、絨毛癌、脈絡叢乳頭腫、慢性リンパ性白血病、慢性単球性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性骨髄増殖性疾患、慢性好中球性白血病、明細胞腫瘍、結腸癌、結腸直腸癌、頭蓋咽頭腫、皮膚T細胞リンパ腫、デゴス病、隆起性皮膚線維肉腫、類皮嚢腫、線維形成性小円形細胞腫瘍、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫、異胚形成性神経上皮腫瘍、胎児性癌、内皮洞腫瘍、子宮内膜癌、子宮内膜癌、子宮内膜腫瘍、腸疾患関連 T 細胞リンパ腫、上衣芽腫、上衣腫、類上皮肉腫、赤白血病、食道癌、美容神経芽腫、ユーイング家族腫瘍、ユーイング家族肉腫、ユーイング肉腫、頭蓋外胚細胞腫瘍、性腺外生殖細胞腫瘍、肝外胆管癌、乳房外パジェット病、卵管癌、封入奇形胎児、線維腫、線維肉腫、濾胞性リンパ腫、濾胞性甲状腺癌、胆嚢癌、胆嚢癌、神経膠腫、神経神経腫、胃癌、胃リンパ腫、消化管癌、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍、消化管間質腫瘍、胚細胞腫瘍、胚細胞腫、妊娠性絨毛癌、妊娠性絨毛性腫瘍、骨巨細胞腫、多形神経膠芽腫、神経膠腫、脳神経膠腫症、グロムス腫瘍、グルカゴノーマ、性腺芽腫、顆粒膜細胞腫瘍、ヘアリー細胞白血病、ヘアリー細胞白血病、頭頸部癌、頭頸部癌、心臓癌、血管芽腫、血管周囲細胞腫、血管肉腫、血液悪性腫瘍、肝細胞癌、肝脾T細胞リンパ腫、遺伝性乳卵巣癌症候群、ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、下咽頭がん、視床下部神経膠腫、炎症性乳癌、眼内黒色腫、膵島細胞がん、膵島細胞腫瘍、若年性骨髄単球性白血病、カポジ肉腫、カポジ肉腫、腎臓癌、クラットスキン腫瘍、クルケンベルグ腫瘍、喉頭癌、喉頭癌、悪性黒子黒色腫、白血病、唇口腔癌、脂肪肉腫、肺がん、黄体腫、リンパ管腫、リンパ管肉腫、リンパ上皮腫、リンパ性白血病、リンパ腫、マクログロブリン血症、悪性線維性組織球腫、悪性線維性組織球腫、悪性線維の組織球腫骨、悪性神経膠腫、悪性中皮腫、悪性末梢神経鞘腫瘍、悪性ラブドイド腫瘍、悪性トリトン腫瘍、MALTリンパ腫、マントル細胞リンパ腫、肥満細胞性白血病、縦隔胚細胞腫瘍、縦隔腫瘍、甲状腺髄様癌、髄芽腫、髄上皮腫、黒色腫、髄膜腫、メルケル細胞癌腫、中皮腫、潜在性原発性転移性扁平上皮癌、転移性尿路上皮癌、混合ミュラー管腫瘍、単球性白血病、口腔癌、粘液性腫瘍、多発性内分泌新生物症候群、多発性骨髄腫、多発性骨髄腫、菌状息肉症、菌状息肉腫、骨髄異形成疾患、骨髄異形成症候群、骨髄性白血病、骨髄性肉腫、骨髄増殖性疾患、粘液腫、鼻腔癌、上咽頭癌、上咽頭癌、新生物、神経鞘腫、神経芽腫、神経芽腫、神経線維腫、神経腫、結節性黒色腫、非ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、非黒色腫皮膚癌、非小細胞肺癌、眼腫瘍、乏突起星状細胞腫、希突起膠腫、腫瘍細胞腫、視神経鞘髄膜腫、口腔癌、口腔癌、中咽頭癌、骨肉腫、卵巣癌、卵巣癌、卵巣上皮癌、卵巣胚細胞腫瘍、卵巣低悪性度腫瘍、乳房パジェット病、パンコースト腫瘍、膵臓癌、膵臓癌、甲状腺乳頭癌、乳頭腫症、傍神経節腫、副鼻腔癌、副甲状腺癌、陰茎癌、血管周囲類上皮細胞腫瘍、咽頭癌、褐色細胞腫、松果体中間分化実質腫瘍、松果体芽腫、下垂体細胞腫、下垂体腺腫、下垂体腫瘍、形質細胞腫瘍、胸膜肺芽腫、多胚腫、前駆体Tリンパ芽球性リンパ腫、原発性中枢神経系リンパ腫、原発性滲出性リンパ腫、原発性肝細胞癌、原発性肝癌、原発性腹膜癌、原始神経外胚葉腫瘍、前立腺癌、腹膜偽粘液腫、直腸癌、腎細胞癌、15番染色体上のNUT遺伝子を含む気道癌、網膜芽細胞腫、横紋筋腫、横紋筋肉腫、リヒター形質転換、仙尾骨奇形腫、唾液腺癌、肉腫、神経鞘腫症、脂腺癌、二次性新生物、セミノーマ、漿液性腫瘍、セルトリ・ライディッヒ細胞腫瘍、性索間質腫瘍、セザリー症候群、印環細胞癌、皮膚癌、小腫瘍青色円形細胞腫瘍、小細胞癌、小細胞肺癌、小細胞リンパ腫、小腸癌、軟部肉腫、体性スタチノーマ、すすいぼ、脊髄腫瘍、脊髄腫瘍、脾臓辺縁帯リンパ腫、扁平上皮癌、胃癌、表在性黒色腫、テント上原始神経外胚葉腫瘍、表面上皮間質腫瘍、滑膜肉腫、T細胞急性リンパ芽球性白血病、T細胞大粒状リンパ球白血病、T細胞白血病、T細胞リンパ腫、T細胞前リンパ球性白血病、奇形腫、末期リンパ癌、精巣癌、粉瘤、咽頭癌、胸腺癌、胸腺腫、甲状腺癌、腎盂および尿管の移行上皮癌、移行上皮癌、尿膜管癌、尿道癌、泌尿生殖器新生物、子宮肉腫、ブドウ膜黒色腫、膣癌、ヴァーナー・モリソン症候群、疣状癌、視覚路神経膠腫、外陰癌、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、ワルシン腫瘍、ウィルムス腫瘍、およびそれらの組み合わせを含む癌、固形腫瘍または液性腫瘍のうちの少なくとも１つである。 いくつかの実施形態において、標的化された癌細胞は、癌幹細胞などの癌細胞集団内の部分集団を表す。 いくつかの実施形態において、癌はリンパ腫などの造血系のものである(US 10,744,207参照) 。

【0049】

いくつかの実施形態において、HIVまたは他のウイルス感染症はウイルス感染によって引き起こされる。 防御免疫応答の刺激が望ましい感染性ウイルスの例は次のとおりである： レトロウイルス科（例えば、HIV-1（HTLV-111、LAV、HTLV-III/LAV、またはHIV-IIIとも呼ばれる）などのヒト免疫不全ウイルス、およびHIV-LPなどの他の分離株））; ピコルナウイルス科（例えば、ポリオウイルス、A型肝炎ウイルス、エンテロウイルス、ヒトコクサッキーウイルス、ライノウイルス、エコーウイルス）; カルシウイルス科（例えば、胃腸炎を引き起こす株）;トガウイルス科（例えば、馬脳炎ウイルス、風疹ウイルス）; フラウイルス科（例えば、デング熱ウイルス、脳炎ウイルス、黄熱病ウイルス）;コロナウイルス科（例えば、コロナウイルス）。ラブドウイルス科（例えば、水疱性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス）; フィロウイルス科（例えば、エボラウイルス）；パラミクソウイルス科（例えば、パラインフルエンザウイルス、ムンプスウイルス、麻疹ウイルス、RSウイルス）;オルトミクソウイルス科（例えば、インフルエンザウイルス）;ブンガウイルス科（例えば、ハンターンウイルス、ブンガウイルス、フレボウイルス、ナイロウイルス; アリーナウイルス科（出血熱ウイルス）；レオウイルス科 (例えば、レオウイルス、オービウイルス、ロタウイルス);ビルナウイルス科；ヘパドナウイルス科 (B 型肝炎ウイルス);パルボウイルス科 (パルボウイルス);パポバウイルス科（パピローマウイルス、ポリオーマウイルス; アデノウイルス科 (ほとんどのアデノウイルス);ヘルペスウイルス科（単純ヘルペスウイルス（HSV）1および2、水痘帯状疱疹ウイルス、サイトメガロウイルス（CMV）、ヘルペスウイルス）；ポックスウイルス科（痘瘡ウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス）;およびイリドウイルス科（例えば、アフリカ豚コレラウイルス）; および未分類のウイルス（例えば、海綿状脳症の病原体、デルタ肝炎の病原体（B型肝炎ウイルスの欠陥サテライトであると考えられている）、非A型、非B型肝炎の病原体（クラス1=内部感染、クラス 2=非経口感染（すなわち、C型肝炎）；ノーウォークウイルスと関連ウイルス、およびアストロウイルス）。 細菌感染症は細菌の感染によって引き起こされる。 防御免疫応答の刺激が望ましい感染性細菌の例は次のとおりである：ヘリコバクター・パイロン、ボレリア・ブルグドルフェリ、レジオネラ・ニューモフィリア、 マイコバクテリア属菌（例えば、結核菌、鳥型結核菌、イントラセルラー菌、カンサイ菌、ゴルドナク菌）、黄色ブドウ球菌、淋菌、髄膜炎菌、リステリア・モノサイトゲネス、化膿性連鎖球菌（グループA連鎖球菌）、ストレプトコッカス・アガラクチア（B群連鎖球菌）、連鎖球菌（ビリジアン群）、 フェカリス連鎖球菌、 ウシ連鎖球菌、連鎖球菌（嫌気性菌）、 肺炎連鎖球菌、 病原性カンピロバクター属、 エンテロコッカス属、インフルエンザ菌、炭疽菌、ジフテリア菌、コリネバクテリウム属、ブタ丹毒菌、ウェルシュ菌、破傷風菌、エンテロバクター・エアロゲネス、肺炎桿菌、パスツレラ ムルトシダ、 バクテロイデス属、フソバクテリウム・ヌクレアタム、ストレプトバチルス・モニリフォルミス、梅毒トレポネーマ、 トレポネーマ・パーテニュ、 レプトスピラ、およびアクチノマイセス・イスラエリ。防御免疫応答の刺激が望ましい感染性真菌の例は次のとおりである： クリプトコッカス・ネオフォルマンス、 ヒストプラスマ・カプスラーツム、 コクシジオイデス・イミチス, ブラストミセス・デルマチチジス、 クラミジア・トラコマチス、 カンジダ・アルビカンス。 他の感染性微生物（即ち、原生生物）には次のとおりである: 熱帯熱マラリア原虫およびトキソプラズマ・ゴンディ (US 10,744,207参照)。

【0050】

いくつかの実施形態では、第１の成分は、癌抗原、糖脂質、糖タンパク質、造血系の細胞上に存在する分化抗原のクラスター、ガンマ－グルタミルトランスペプチダーゼ、接着タンパク質、ホルモン、成長因子 、サイトカイン、リガンド受容体、イオンチャネル、免疫グロブリンμ鎖の膜結合型、アルファフェトプロテイン、C反応性タンパク質、クロモグラニンA、上皮ムチン抗原、ヒト上皮特異抗原、ルイス(a)抗原、多剤耐性関連タンパク質、Neu癌遺伝子タンパク質、ニューロン特異的エノラーゼ、P-糖タンパク質、多剤耐性-関連抗原、p170、多剤耐性関連抗原、前立腺特異抗原、NCAM、ガングリオシド分子、MART-1、熱ショックタンパク質、シアリルTn、チロシナーゼ、MUC-1、HER-2/neu、KSA、PSMA、p53、RAS 、EGF-R、VEGF、MAGE、またはそれらの任意の組み合わせ; または、第１の成分は、HER2/neu（ERBB2）、HER3（ERBB3）、EGFR、VEGF、VEGFR2、GD2、CTLA4、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33（シグレック-3)、CD52 (CAMPATH-1 抗原)、CD326 (EpCAM)、CA-125 (MUC16)、MMP9、DLL3、CD274 (PD-L1)、CEA、MSLN (メソテリン)、CA19-9、CD73、CD205 ( DEC205)、CD51、c-MET、TRAIL-R2、IGF-1R、CD3、MIF、葉酸受容体アルファ (FOLR1)、CSF1、OX-40、CD137、TfR、MUC1、CD25 (IL-2R)、CD115 (CSF1R) )、IL1B、CD105 (エンドグリン)、KIR、CD47、CEA、IL-17A、DLL4、CD51、アンジオポエチン 2、ニューロピリン-1、CD37、CD223 (LAG-3)、CD40、LIV-1 (SLC39A6)、CD27 ( TNFRSF7)、CD276 (B7-H3)、Trop2、Claudin1 (CLDN1)、PSMA、TIM-1 (HAVcr-1)、CEACAM5、CD70、LY6E、BCMA、CD135 (FLT3)、APRIL、TF(F3)、ネクチン- 4、FAP、GPC3、FGFR3、キラー細胞免疫グロブリン様受容体（KIR）、ROR1、ROR2、PD-1（CD279）、CTLA-4（CD152）、TIM-3（HAVCR2）、免疫チェックポイント受容体、免疫チェックポイント受容体リガンド、受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体、TNF受容体タンパク質、免疫グロブリンタンパク質、サイトカイン受容体、インテグリン、および活性化NK細胞受容体、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される癌抗原との特異的相互作用を示す。

【0051】

いくつかの実施形態において、ターゲティングユニットは、第１の成分に結合した第１のリンカーとエフェクター細胞の表面に結合した第２のリンカーとの間の相互作用を介して、エフェクター細胞の表面に複合体化される。

【0052】

いくつかの実施形態において、第１のリンカーは、第１の成分に共有結合または非共有結合している。または、第２のリンカーがエフェクター細胞の表面に共有結合または非共有結合している。あるいはそれらの組み合わせである。

【0053】

いくつかの実施形態において、第１のリンカーまたは第２のリンカーは、第１の成分の天然官能基またはエフェクター細胞の表面に結合し、天然官能基はアミノ酸、糖、またはアミンである。

【0054】

いくつかの実施形態において、天然官能基は、糖、アミン、αまたはアミノ酸を含有し、または、天然官能基はN-a-アジドアセチルシアル酸（SiaNAz）などのアジド修飾糖ではない。または、天然官能基は、リジン、システイン、チロシン、トレオニン、セリン、アスパラギン酸、グルタミン酸、およびトリプトファンからなる群から選択されるアミノ酸を含有する ( U.S. Pat. No. 10,744,207参照)。

【0055】

いくつかの実施形態において、第２のリンカーは、エフェクター細胞の天然官能基に直接共有結合し、第２のリンカーとエフェクター細胞の天然官能基との間の直接の共有結合は、第２のリンカーが天然官能基に直接共有結合するように、エフェクター細胞を第２のリンカーと接触させることによって調製される( U.S. Pat. No. 10,744,207参照) 。

【0056】

いくつかの実施形態において、第１のリンカーおよび第２のリンカーは、以下からなる群から選択される：DNA結合ドメインと標的DNA; ロイシンジッパーと標的DNA; ビオチンとアビジン; ビオチンとストレプトアビジン; カルモジュリン結合タンパク質とカルモジュリン; ホルモンとホルモン受容体; レクチンと炭水化物; 細胞膜受容体と受容体リガンド; 酵素と基質; 抗原と抗体; アゴニストとアンタゴニスト; ポリヌクレオチドハイブリダイズ配列; アプタマーとターゲット; およびジンクフィンガーと標的DNA。

【0057】

いくつかの実施形態において、２つのリンカーのうちの少なくとも１つは、PEG領域またはNHSエステルを含有する; または、第１成分がカップリング基を介して第１のリンカーに結合し、カップリング基は、NHSエステルまたは他の活性化エステル、ハロゲン化アルキルまたはハロゲン化アシル、二官能性架橋剤、またはマレイミド基である (U.S. Pat. No. 10,744,207参照) 。

【0058】

いくつかの実施形態において、第１のリンカーと第２のリンカーとの間の結合親和性は250nM未満である。 好ましくは、第１のリンカーと第２のリンカーとの間の結合親和性は、200nM、100nM、50nM、10nM、1nM、500pM、100pM、60pM、50pM、20pM、15pM、10pM、5pM、または2pM未満である。

【0059】

いくつかの実施形態において、第１成分とエフェクター細胞は、1nmから400nmの長さで分離される。 好ましくは、第１の成分とエフェクター細胞は、1、2、5、10、15、20、30、32、35、40、45、50、60、62、65、70、75、80、90、100、120、150、180、200、220、250、280、300、320、350、または380nmの長さだけ離れる; あるいは1 nmから200 nm、1 nmから100 nm、1 nmから50 nm、5 nmから100 nm、または5 nmから50 nmの間である。

【0060】

いくつかの実施形態において、ターゲティングユニットとエフェクター細胞は、1nm～20nmまたは1nm～33nmの長さで離れる。 好ましくは、ターゲティングユニットとエフェクター細胞は、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、または32nmの長さだけ離れる。

【0061】

いくつかの実施形態において、生物学的マーカーに対する第１成分の結合親和性は250nM未満である。 好ましくは、生物学的マーカーに対する第１成分の結合親和性は、200nM、100nM、50nM、10nM、1nM、500pM、100pM、60pM、50pM、20pM、15pM、10pM、5pM、または2pM未満である。

【0062】

いくつかの実施形態において、第１のリンカーは第１のポリヌクレオチドであり、第２のリンカーは第２のポリヌクレオチドである。

【0063】

いくつかの実施形態において、第１のポリヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、またはそれらの類似体から構成される化合物であり、 あるいはそれらの組み合わせである。 好ましくは、第２のポリヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、もしくはそれらの類似体、あるいはそれらの任意の組み合わせから構成される化合物である (U.S. Pat. No. 10,744,207参照) 。

【0064】

いくつかの実施形態において、2つのポリヌクレオチドのうちの少なくとも1つは、DNA、RNAもしくはペプチド核酸（PNA）分子、またはそれらの任意の組み合わせである(U.S. Pat. No. 10,744,207参照) 。

【0065】

いくつかの実施形態において、２つのポリヌクレオチドのうちの少なくとも１つの長さは4ntから500ntである。

【0066】

いくつかの実施形態では、２つのポリヌクレオチドのうちの少なくとも１つの長さは、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、120、140、160、180、200、300、400または500ntである。

【0067】

いくつかの実施形態において、第１のポリヌクレオチドは第１の一本鎖領域を含有し、第２のポリヌクレオチドは第１の一本鎖領域に相補的な第２の一本鎖領域を含有し、 ターゲティングユニットは、第１の一本鎖領域と、第１の一本鎖領域に相補的な第２の一本鎖領域との間の相互作用を介して、エフェクター細胞の表面と複合体を形成する(U.S. Pat. No. 10,744,207参照)。

【0068】

いくつかの実施形態において、第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドは、互いに実質的にまたは完全に相補的である。 例えば、２つのポリヌクレオチドは、少なくとも約10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％または100％の相補性を共有する(U.S. Pat. No. 10,744,207参照)。

【0069】

いくつかの実施形態において、第1のポリヌクレオチドまたは第2のポリヌクレオチドは、20-量体ポリ-GGTT、SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、23-量体SEQ ID NO:25、およびSEQ ID NO:26。

【0070】

いくつかの実施形態において、リンカーは、約90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、10％、またはそれ以下のGC含量を有するように設計される。 いくつかの実施形態において、リンカーは、約10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、またはそれ以上のGC含量を有するように選択される。 いくつかの実施形態において、リンカーは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10個のヌクレオチドが1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、または20回繰り返される配列を含有するか、またはそれらからなるように設計され、あるいは、リンカーの終端に達するまで繰り返される（例えば、AAA ... 、ATAT ... ）。 いくつかの実施形態において、リンカーは、約30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃、85℃、またはそれ以上のTmを有するように選択される (U.S. Pat. No. 10,744,207参照) 。

【0071】

いくつかの実施形態において、第１のリンカーは第１の反応性基を含有し、第２のリンカーは第２の反応性基を含有し、 ターゲティングユニットは、第２の反応性基と第１の反応性基との間の反応によって形成される共有結合を介してエフェクター細胞の表面に複合体を形成する。

【0072】

いくつかの実施形態において、細胞傷害性細胞は、免疫細胞、リンパ球、ナチュラルキラー細胞、ガンマデルタＴ細胞、他のＴリンパ球、マクロファージ、単球、好中球、樹状細胞、サイトカイン誘導性キラー細胞（CIK）、リンパ球活性化キラー細胞（LAK）、細胞溶解性 T 細胞 (CTL)、または腫瘍浸潤リンパ球 (TIL)である。

【0073】

いくつかの実施形態において、エフェクター細胞などの細胞は細胞株に由来する。細胞株の例としては、Raw264.7、U-937、oNK、NK92、NK3.3、KHYG-1、NKL、およびそれらのトランスジェニック品種が含まれるが、これらに限定されない。 細胞株は、当業者に知られる様々な供給源から入手可能である(例えば、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション (ATCC) (バージニア州、マナサス) 参照) (US 10,744,207参照).
いくつかの実施形態において、エフェクター細胞などの細胞はＴ細胞である。 T細胞には、CD4⁺ T細胞、CD8⁺ T細胞、CD4⁺CD8⁺T細胞など、CD3を発現するすべての細胞が含まれる。T細胞には、ナイーブ細胞とメモリー細胞の両方（TCM、TEM、TEMRAなど）、ヘルパー細胞（Th1、Th2、Th3、Th9、Th7、TFHなど）、エフェクター細胞（CTLまたはTc細胞など）、NKT細胞、腫瘍浸潤リンパ球（TIL）、制御細胞（Treg、Tr1 細胞など）、リンパ球活性化キラー細胞（LAK）、αβT 細胞、γδT 細胞（ガンマデルタT細胞）、および同様のユニークなクラスの T 細胞系統である。 いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は活性化Ｔ細胞である。 (US 10,744,207参照)。

【0074】

いくつかの実施形態において、エフェクター細胞などの細胞は、サイトカイン誘導キラー（CIK）細胞が豊富な細胞集団である。 CIK細胞を濃縮する方法は、米国特許第10,744,207号に記載されており、これは参照により本明細書に組み込まれる。 いくつかの実施形態において、エフェクター細胞などの細胞は、ESC細胞株などの胚性幹細胞（ESC）である(US 10,744,207参照) 。

【0075】

いくつかの実施形態において、エフェクター細胞は、免疫不全マウスにおいて非腫瘍形成性であり、 または、エフェクター細胞は、γ線の照射後に同種異系被験者において非腫瘍形成性となる。

【0076】

いくつかの実施形態において、エフェクター細胞は、不活性な腫瘍抑制遺伝子、または変異して高発現する癌遺伝子をさらに含有する。

【0077】

いくつかの実施形態では、エフェクター細胞は、投与前に０℃以下で保存される。

【0078】

いくつかの実施形態において、エフェクター細胞は、投与前に-20℃、-80℃、-130℃、または-196℃以下で保存される。

【0079】

いくつかの実施形態において、疾患は癌であり、疾患に関連する異常細胞は癌細胞である。 好ましくは、疾患は腫瘍であり、疾患に関連する異常細胞は腫瘍細胞である。 好ましくは、疾患は細菌感染症であり、疾患に関連する異常細胞は細菌感染細胞である。 好ましくは、疾患はHIVまたは他のウイルス感染症であり、疾患に関連する異常細胞はHIVまたは他のウイルス感染細胞である。 好ましくは、疾患は真菌感染症であり、疾患に関連する異常細胞は真菌感染細胞である。 好ましくは、疾患は原虫感染症であり、疾患に関連する異常細胞は原虫感染細胞である。 好ましくは、疾患に関連する異常細胞は、疾患に関連する異常な場所に位置する健常細胞または異常細胞である。 好ましくは、疾患に関連する異常細胞は、疾患の病変に位置する健常細胞または異常な細胞である。 好ましくは、疾患に関連する異常細胞は、疾患の病変に位置する病理学的状態にある細胞である。

【0080】

いくつかの実施形態において、細胞傷害性細胞は、以下の特徴を有するナチュラルキラー細胞である:
(A) NPMD に寄託されており、受託番号 NITE BP-03017 が付けられる; (B) 染色体を含有し、その染色体の染色体DNA配列は、NPMDに寄託された受託番号NITE BP-03017を有するナチュラルキラー細胞の対応する染色体の染色体DNA配列と少なくとも80％同一である；または (C) 次のような特徴がある:
i) CD16受容体を発現する;
ii) 継代培養後少なくとも 3 か月間は増殖能力を保持する；そして、
iii) x) CD16受容体をコードする合成ポリヌクレオチド、遺伝子改変ポリヌクレオチド、および/または意図的に送達されたポリヌクレオチドを含まない、 または y) ddPCRシステムを使用して細胞傷害性細胞のゲノムDNAを分析することにより、CD16 F176Vプローブで検出可能なDNA分子に対するCD16 F176Fプローブで検出可能なDNA分子の比が1以上であり、 CD16 F176Fプローブの配列はSEQ ID NO: 27であり、CD16 F176Vプローブの配列はSEQ ID NO: 28である.
好ましくは、細胞傷害性細胞は、以下のことをさらに特徴とする:
(1) 細胞傷害性細胞とナチュラルキラー細胞株NK3.3は異なる被験者に由来する;
(2) 細胞傷害性細胞はがん患者に由来する;
(3) 細胞傷害性細胞は白人男性に由来する; または、
(4) 受託番号ATCC CRL-2407を持つ細胞傷害性細胞とナチュラルキラー細胞は同じ被験者に由来する;
または、それらの組み合わせ。

【0081】

いくつかの実施形態において、細胞傷害性細胞は、受託番号NITE BP-03017を有するNPMDに寄託されたナチュラルキラー細胞に由来する。

【0082】

いくつかの実施形態において、細胞傷害性細胞における染色体の染色体ＤＮＡ配列は、受託番号NITE BP-03017を有するNPMDに寄託されたナチュラルキラー細胞の対応する染色体の染色体DNA配列と少なくとも85、90、95、96、97、98、99％、99.99％、または99.995％同一である。

【0083】

いくつかの実施形態において、染色体は以下からなる群から選択される: 1番染色体、2番染色体、3番染色体、4番染色体、5番染色体、6番染色体、7番染色体、8番染色体、9番染色体、10番染色体、11番染色体、12番染色体、13番染色体、14番染色体、15番染色体、16番染色体、 17 、18番染色体、19番染色体、20番染色体、21番染色体、22番染色体、X染色体、およびY染色体。

【0084】

いくつかの実施形態において、染色体は細胞傷害性細胞の１番染色体、２番染色体、３番染色体、４番染色体、５番染色体、６番染色体、７番染色体、８番染色体、９番染色体、１０番染色体、１１番染色体、１２番染色体、１３番染色体、１４番染色体、 １５番染色体、１６番染色体、１７番染色体、１８番染色体、１９番染色体、２０番染色体、２１番染色体、２２番染色体、Ｘ染色体またはＹ染色体であり、対応する染色体はそれぞれ、受託番号NITE BP-03017を有するNPMDに寄託されたナチュラルキラー細胞の１番染色体、２番染色体、 3番染色体、4番染色体、5番染色体、6番染色体、7番染色体、8番染色体、9番染色体、10番染色体、11番染色体、12番染色体、13番染色体、14番染色体、15番染色体、16番染色体、17番染色体、18番染色体、19 番染色体、２０番染色体、２１番染色体、２２番染色体、Ｘ染色体またはＹ染色体である。

【0085】

いくつかの実施形態において、細胞傷害性細胞の全ゲノムは、受託番号NITE BP-03017を有するNPMDに寄託されたナチュラルキラー細胞の全ゲノムと少なくとも95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.95％、99.995％、または99.9995％同一である。

【0086】

いくつかの実施形態において、細胞傷害性細胞は、少なくとも4ヶ月、5ヶ月、6ヶ月、7ヶ月、8ヶ月、9ヶ月、10ヶ月、11ヶ月、1年、2年、3年、4年、5年、6年、7年、または8年の継代培養後に増殖することができる。

【0087】

いくつかの実施形態において、エフェクター細胞は、CD2、CD45、CD4、CD25、NKp30、NKG2D、NKp44、NKp46、CD27、OX40、CD107a、NKG2A、PD-1、TIGIT、SIRPα、もしくはCD158、またはそれらの任意の組み合わせをさらに発現する。

【0088】

いくつかの実施形態において、CD16受容体は、CD16a受容体またはCD16b受容体である。

【0089】

いくつかの実施形態において、CD16受容体をコードする発現ポリヌクレオチドは、第１染色体のqアーム上の1q23.3位置に位置する。

【0090】

いくつかの実施形態において、CD16受容体をコードするポリヌクレオチドは、SEQ ID NO: 29、SEQ ID NO: 30、またはSEQ ID NO: 31のヌクレオチド配列を含有する。

【0091】

いくつかの実施形態において、CD16受容体は、SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 33、またはSEQ ID NO: 34のアミノ酸配列を含有する。

【0092】

いくつかの実施形態において、細胞傷害性細胞はγδT細胞であり；あるいは細胞傷害性細胞はVδ1 T細胞、Vδ2 T細胞、Vδ3 T細胞、Vδ5 T細胞、またはVγ9Vδ2 T細胞である。

【0093】

いくつかの実施形態において、エフェクター細胞は、CD3、NKp46、CD56、CD16、NKG2D、NKp44、CD25、CD38、PD-1、NKp30、CD18、TIGIT、DNAM-1、CD36、CD103、CCR7、CXCR3、IFN-γ、グランザイムB、もしくはCD69、またはそれらの任意の組み合わせをさらに発現する。

【0094】

いくつかの実施形態において、標的細胞との共培養後、エフェクター細胞はさらにグランザイムBを発現する。

【0095】

いくつかの実施形態において、
(1) エフェクター細胞の少なくとも4%が細胞あたり少なくとも400個のNKp46分子を発現し;
(2) エフェクター細胞の少なくとも10%が細胞あたり少なくとも400個のCD56分子を発現し;
(3) エフェクター細胞の少なくとも10％が細胞あたり少なくとも400個のCD16分子を発現し;
(4) エフェクター細胞の少なくとも30％が細胞あたり少なくとも40個のNKG2D分子を発現し;
(5) エフェクター細胞の少なくとも1％が細胞あたり少なくとも400個のNKp44分子を発現し;
(6) エフェクター細胞の少なくとも80％が細胞あたり少なくとも400個のCD69分子を発現し;あるいは、
(7) エフェクター細胞の少なくとも 40％が細胞あたり少なくとも 400個のCXCR3分子を発現し；またはそれらの任意の組み合わせ。

【0096】

いくつかの実施形態において、
(1) エフェクター細胞の少なくとも4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、または50%が細胞あたり少なくとも500個、600個、700個、800個、900個、1000個、1500個、2000個、2500個、3000個、3500個、4000個、4500個、5000個、5500個、6000個、6500個、7000個、7500個、8000個、8500個、9000個、9500個、10000個、15000個、20000個、25000個、30000個、35000個、40000個、45000個、50000個、55000個、60000個、65000個、70000個、75000個、80000個、85000個、90000個、95000個、100000個、110000個、120000個、130000個、40000個、150000個、160000個、170000個、180000個、190000個、または200000個のNKp46分子を発現し;
(2) エフェクター細胞の少なくとも10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、または50％が細胞あたり少なくとも500個、600個、700個、800個、900個、1000個、1500個、2000個、2500個、3000個、3500個、4000個、4500個、5000個、5500個、6000個、6500個、7000個、7500個、8000個、8500個、 9000個、9500個、10000個、15000個、20000個、25000個、30000個、35000個、40000個、45000個、50000個、55000個、60000個、65000個、70000個、75000個、80000個、85000個、90000個、95000個、100000個、110000個、120000個、130000個、140000個、150000個、160000個、170000個、180000個、190000個、または200000個、210000個、220000個、230000個、240000個、250000個、260000個、270000個、280000個、290000, 300000, 310000, 320000, 330000, 340000, 350000, 360000, 370000, 380000, 390000, 400000, 410000, 420000, 430000, 440000, 450000, 460000、 470000個、480000個、490000個、500000個、510000個、520000個、530000個、540000個、550000個、560000個、570000個、580000個、590000個、600000個、610000個、620000個、630000個、640000個、6500000個、6600000個、670000個、680000個、690000個、または700000個のCD56分子を発現し;
(3) エフェクター細胞の少なくとも10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、または50％が細胞あたり少なくとも500個、600個、700個、800個、900個、1000個、1500個、2000個、2500個、3000個、3500個、4000個、4500個、5000個、5500個、6000個、6500個、7000個、7500個、8000個、8500個、 9000個、9500個、10000個、15000個、20000個、25000個、30000個、35000個、40000個、45000個、50000個、55000個、60000個、65000個、70000個、75000個、80000個、85000個、90000個、95000個、100000個、110000個、120000個、130000個、140000個、150000個、160000個、170000個、180000個、190000個、または200000個、210000個、220000個、230000個、240000個、250000個、260000個、270000個、280000個、290000個、300000個、310000個、320000個、330000個、340000個、350000個、360000個、370000個、380000個、390000個、400000個、410000個、420000個、430000個、440000個、450000個、460000個、 470000個、480000個、490000個、500000個、510000個、520000個、530000個、540000個、550000個、560000個、570000個、580000個、590000個、600000個、610000個、620000個、630000、640000、6500000個、660000個、670000個、680000個、690000個、または700000個のCD16分子を発現し;
(4) エフェクター細胞の少なくとも30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、または70％が細胞あたり少なくとも50個、60個、70個、80個、90個、100個、200個、300個、400個、500個、600個、700個、800個、900個、1000個、1500個、2000個、2500個、3000個、3500個、4000個、4500個、5000個、5500個、6000個、 6500個、7000個、7500個、8000個、8500個、9000個、9500個、10000個、15000個、25000個、30000個、35000個、40000個、 45000個、50000個、55000個、60000個、65000個、70000個、75000個、80000個、85000個、90000個、95000個、100000個、110000個、120000個、130000,個、140000個、150000個、160000個、170000個、180000個、190000個、 200000個、210000個、220000個、230000個、240000個、250000個、260000個、270000個、280000個、290000個、300000個、310000個、320000個、 330000個、340000個、 350000個、 360000個、370000個、380000個、390000, 400000, 410000, 420000個、430000個、440000個、450000個、460000個、470000個、480000個、490000個、500000個、510000個、520000個、530000個、540000個、550000個、560000個、570000個、580000個、590000個、600000個、610000, 620000個、630000個、640000個、650000個、660000個、670000個、680000個、690000個、700000個、710000個、720000個、730000個、740000個、750000個、760000個、770000個、780000個、790000個、800000個、810000個、820000個、830000個、840000個、850000個、860000個、870000個、880000個, 890000個、900000個、910000、920000個、930000個、840000個、850000個、860000個、870000個、880000個、950000個、960000個、970000個、980000個、990000個、1000000個、1250000個、1500000個、1750000個、2000000個、2250000個、2500000個、2750000個、3000000個、3250000個、3500000個、3750000個、4000000個、4250000個、450000個、4750000個、5000000個、5250000個、5500000個、5750000個、6000000個、6250000個、6500000個、6750000個、または770000個のNKG2D分子を発現し；
(5) エフェクター細胞の少なくとも1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、または50％が細胞あたり少なくとも500個、600個、700個、800個、900個、1000個、1500個、2000個、2500個、3000個、3500個、4000個、4500個、5000個、5500個、6000個、6500個、7000個、7500個、8000個、8500個、 9000個、9500個、10000個、15000個、20000個、25000個、30000個、35000個、40000個、45000個、50000個、55000個、60000個、65000個、70000個、75000個、80000個、85000個、90000個、95000個、100000個、110000個、120000個、130000個、140000個、150000個、160000個、170000個、180000個、190000個、または200000個のNKp44分子を発現し；
(6) エフェクター細胞の少なくとも80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、または90％が細胞あたり少なくとも500個、600個、700個、800個、900個、1000個、1500個、2000個、2500個、3000個、3500個、4000個、4500個、5000個、5500個、6000個、6500個、7000個、7500個、8000個、 8500個、9000個、9500個、10000個、15000個、20000個、25000個、30000個、35000個、40000個、45000個、50000個、55000個、60000個、65000個、70000個、75000個、80000個、85000個、90000個、95000個、100000個、110000個、120000個、130000個、140000個、150000個、160000個、170000個、180000個、190000個、または200000個、210000個、220000個、230000個、240000個、250000個、260000個、270000個、280000個、290000個、300000個、310000個、320000個、330000個、340000個、350000個、360000個、370000個、380000個、390000個、400000個、410000個、420000個、430000個、440000個、450000個、460000個、 470000個、480000個、490000個、500000個、510000個、520000個、530000個、540000個、550000個、560000個、570000個、580000個、590000個、600000個、610000個、620000個、630000個、640000個、6500000個、6600000個、670000個、680000個、690000個、または700000個のCD69分子を発現し；あるいは
(7) エフェクター細胞の少なくとも50％、55％、60％、63％、67％、70％、73％、77％、80％、83％、87％、90％、93％、97％または90％が細胞あたり少なくとも6000個、6500個、7000個、7500個、8000個、8500個、9000個、9500個、10000個、15000個、または20000個、25000個、30000個、35000個、40000個、45000個、50000個、 55000個、60000個、65000個、70000個、75000個、80000個、85000個、90000個、95000個、100000個、110000個、120000個、130000個、140000個、 150000個、160000個、170000個、180000個、190000個、または200000個、210000個、220000個、230000個、240000個、250000個、260000個、270000個、280000個、290000個、300000個、310000個、320000個、330000個、340000個、350000個、360000個、370000個、380000個、390000個、400000個、410000個、420000個、430000個、440000個、450000個、460000個、470000個、480000個、490000個、500000個、510000個、520000個、530000個、540000個、550000個、560000個、570000個、580000個、590000個、600000個、610000個、620000個、630000個、640000個、6500000個、660000個、670000個、680000個、690000個、または700000個のCXCR3分子を発現し；またはそれらの任意の組み合わせ。

【0097】

いくつかの実施形態において、
(1) エフェクター細胞の少なくとも4%がNKp46を発現し、NKp46発現エフェクター細胞は平均して細胞あたり少なくとも400個のNKp46分子を発現し;
(2) エフェクター細胞の少なくとも10%がCD56を発現し、CD56発現エフェクター細胞は平均して細胞あたり少なくとも400個のCD56分子を発現し;
(3) エフェクター細胞の少なくとも10%がCD16を発現し、CD16発現エフェクター細胞は平均して細胞当たり少なくとも400個のCD16分子を発現し;
(4) エフェクター細胞の少なくとも30%がNKG2Dを発現し、NKG2D発現エフェクター細胞は平均して細胞当たり少なくとも40個のNKG2D分子を発現し;
(5) エフェクター細胞の少なくとも1%がNKp44を発現し、NKp44発現エフェクター細胞は平均して細胞当たり少なくとも400個のNKp44分子を発現し;
(6) エフェクター細胞の少なくとも80%がCD69を発現し、CD69発現エフェクター細胞は平均して細胞当たり少なくとも400個のCD69分子を発現し; あるいは
(7) エフェクター細胞の少なくとも40％がCXCR3を発現し、CXCR3発現エフェクター細胞は平均して細胞あたり少なくとも400個のCXCR3分子を発現し；またはそれらの任意の組み合わせ。

【0098】

いくつかの実施形態において、
(1) エフェクター細胞の少なくとも4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、または50%がNKp46を発現し、NKp46発現エフェクター細胞は平均して細胞あたり少なくとも500個、600個、700個、800個、900個、1000個、1500個、2000個、2500個、3000個、3500個、4000個、4500個、5000個、5500個、6000個、6500個、7000個、7500個、8000個、8500個、9000個、9500個、10000個、15000個、または20000個、25000個、30000個、35000個、40000個、45000個、50000個、55000個、60000個、65000個、70000個、75000個、80000個、85000個、90000個、95000個、100000個、110000個、120000個、130000個、140000個、150000個、160000個、170000個、180000個、190000個、または200000個のNKp46分子を発現し;
(2) エフェクター細胞の少なくとも10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、または50%がCD56を発現し、CD56発現エフェクター細胞は平均して細胞あたり少なくとも500個、600個、700個、800個、900個、1000個、1500個、2000個、2500個、3000個、3500個、4000個、4500個、5000個、5500個、6000個、6500個、7000個、7500個、8000個、8500個、9000個、9500個、10000個、15000個、または20000個、25000個、30000個、35000個、40000個、45000個、50000個、55000個、60000個、65000個、70000個、75000個、80000個、85000個、90000個、95000個、100000個、110000個、120000個、130000個、140000個、150000個、160000個、170000個、180000個、190000個、または200000個、210000個、220000個、230000個、240000個、250000個、260000個、270000個、280000個、290000個、300000個、310000個、320000個、330000個、340000個、350000個、360000個、370000個、380000個、390000個、400000個、410000個、420000個、430000個、440000個、450000個、460000個、470000個、480000個、490000個、500000個、510000個、520000個、530000個、540000個、550000個、560000個、570000個、580000個、590000個、600000個、610000個、620000個、630000個、640000個、650000個、660000個、670000個、680000個、690000個、または700000個のCD56分子を発現し;
(3) エフェクター細胞の少なくとも10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%, または50%がCD16を発現し、CD16発現エフェクター細胞は平均して細胞当たり少なくとも500個、600個、700個、800個、900個、1000個、1500個、2000個、2500個、3000個、3500個、4000個、4500個、5000個、5500個、6000個、6500個、7000個、7500個、8000個、8500個、9000個、9500個、10000個、15000個、20000個、25000個、30000個、35000個、40000個、45000個、50000個、55000個、60000個、65000個、70000個、75000個、80000個、85000個、90000個、95000個、100000個、110000個、120000個、130000個、140000個、150000個、160000個、170000個、180000個、190000個、または 200000個、210000個、220000個、230000個、240000個、250000個、260000個、270000個、280000個、290000個、300000個、310000個、320000個、330000個、340000個、350000個、360000個、370000個、380000個、390000個、400000個、410000個、420000個、430000個、440000個、450000個、460000個、47000個、 480000個、490000個、500000個、510000個、520000個、530000個、540000個、550000個、560000個、570000個、580000個、590000個、600000個、610000個、620000個、630000個、640000個、650000個、660000個、670000個、680000個、690000個、または700000個のCD16分子を発現し;
(4) エフェクター細胞の少なくとも30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、または70%がNKG2Dを発現し、NKG2D発現エフェクター細胞は平均して細胞当たり少なくとも50個、60個、70個、80個、90個、100個、200個、300個、400個、500個、600個、700個、800個、900個、1000個、1500個、2000個、2500個、3000個、3500個、4000個、4500個、5000個、5500, 6000個、6500個、7000個、7500個、8000個、8500個、900個、 9500個、10000個、15000個、20000個、25000個、30000個、35000個、40000個、45000個、50000個、55000個、60000個、65000個、70000個、75000個、80000個、85000個、90000個、95000個、100000個、110000個、120000個、130000個、140000個、150000個、160000個、170000個、180000個、190000個、200000個、210000個、220000個、230000個、240000個、250000個、260000個、270000個、280000個、290000個、300000個、310000個、320000個、330000個、340000個、350000個、 360000個、370000個、380000個、390000個、400000個、410000個、420000個、430000個、440000個、450000個、460000個、470000個、480000個、490000個、500000個、10000個、520000個、530000個、540000個、550000個、560000個、570000個、580000個、590000, 600000個、610000個、620000個、630000個、640000個、650000個、660000個、670000個、680000個、690000個、700000個、710000個、720000個、730000個、 740000個、750000個、760000個、770000個、 780000個、790000個、800000個、810000個、820000 830000, 840000, 850000, 860000個、870000個、880000個、890000, 900000, 910000, 920000, 930000, 940000, 950000個、960000個、 970000個、980000個、990000個、1000000個、1250000個、1500000個、1750000個、2000000個、2250000個、2500000個、2750000個、3000000個、3250000個、3500000個、3750000個、4000000個、4250000個、4500000個、4750000個、5000000個、5250000個、5500000個、5750000個、6000000個, 6250000個, 6500000個, 6750000個、または7000000個のNKG2D分子を発現し;
(5) エフェクター細胞の少なくとも1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、または50%がNKp44を発現し、NKp44発現エフェクター細胞は平均して細胞当たり少なくとも500個、600個、700個、800個、900個、1000個、1500個、2000個、2500個、3000個、3500個、4000個、4500個、5000個、5500個、6000個、6500個、7000個、7500個、8000個、8500個、9000個、9500個、10000個、15000個、20000個、25000個、30000個、35000個、40000個、45000個、50000個、55000個、60000個、65000個、70000個、75000個、80000個、85000個、90000個、95000個、100000個、110000個、120000個、130000個、140000個、150000個、160000個、170000個、180000個、190000個、または200000個のNKp44分子を発現し;
(6) エフェクター細胞の少なくとも80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、または90%がCD69を発現し、CD69発現エフェクター細胞は平均して細胞当たり少なくとも500個、600個、700個、800個、900個、1000個、1500個、2000個、2500個、3000個、3500個、4000個、4500個、5000個、5500個、6000個、6500個、7000個、7500個、8000個、8500個、9000個、9500個、10000個、15000個、20000個、25000個、30000個、35000個、40000個、45000個、50000個、55000個、60000個、65000個、70000個、75000個、80000個、85000個、90000個、95000個、100000個、110000個、120000個、130000個、140000個、150000個、160000個、170000個、180000個、190000, または200000個、210000個、220000個、230000個、240000個、250000個、260000個、270000個、280000個、290000個、300000個、310000個、320000個、330000個、340000個、350000個、360000個、370000個、380000個、390000個、400000個、410000個、420000個、430000個、440000個、450000個、460000個、470000個、480000個、490000個、500000個、510000個、520000個、530000個、540000個、550000個、560000個、570000個、580000個、590000個、600000個、610000個、620000個、630000個、640000個、650000個、660000個、670000個、680000個、690000個、または700000個のCD69分子を発現し; あるいは
(7) エフェクター細胞の少なくとも40%、45%、50%、55%、60%、63%、67%、70%、73%、77%、 80%、83%、87%、90%、93%、97%、または90%がCXCR3を発現し、CXCR3発現エフェクター細胞は平均して細胞あたり少なくとも6000個、6500個、7000個、7500個、8000個、8500個、9000個、9500個、10000個、15000個、20000個、25000個、30000個、35000個、40000個、45000個、50000個、55000個、60000個、65000個、70000個、75000個、80000個、85000個、90000個、95000個、100000個、110000個、120000個、130000個、140000個、150000個、160000個、170000個、180000個、190000個、または200000個、210000個、220000個、230000個、240000個、250000個、260000個、270000個、280000個、290000個、300000個、310000個、320000個、330000個、340000個、350000個、360000個、370000個、380000個、390000個、400000個、410000個、420000個、430000個、440000個、450000個、460000個、470000個、480000個、490000個、500000個、510000個、520000個、530000個、540000個、550000個、560000個、570000個、580000個、590000個、600000個、610000個、620000個、630000個、640000個、650000個、660000個、670000個、680000個、690000個、または700000個のCXCR3分子を発現し；またはそれらの任意の組み合わせ。

【0099】

いくつかの実施形態では、エフェクター細胞の10％～90％がエフェクターメモリーT細胞（EM細胞）である。

【0100】

いくつかの実施形態において、エフェクター細胞の 5％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、または89％ がエフェクターメモリーT細胞(EM 細胞) である。

【0101】

いくつかの実施形態において、エフェクター細胞の90％～10％は、最終分化エフェクターメモリーT細胞（TDEM細胞）である。

【0102】

いくつかの実施形態において、エフェクター細胞の85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、14％、13％、12％、または11％が最終分化エフェクターメモリーT細胞（TDEM細胞）である。

【0103】

いくつかの実施形態において、ターゲティングユニットは第１のタイプのターゲティングユニットであり、エフェクター細胞は、エフェクター細胞の表面に複合体化された第２のタイプのターゲティングユニットの集団をさらに含有し、 第２のタイプのターゲティングユニットの集団におけるターゲティングユニットは、以下のことを特徴とする第２の成分を含有する。(a) 生物学的マーカーまたは疾患に関連する異常細胞によって発現される異なる生物学的マーカーと特異的結合を示すことであり；(b) エフェクター細胞によって産生されないことである。 いくつかの実施形態において、第２の成分は抗体である。いくつかの実施形態において、第２の成分は、ADCCを誘導するIgGサブタイプのモノクローナル抗体であり; または 第２の成分が他の抗体であり；あるいは、第２の成分は抗原結合ユニットを含有する。 いくつかの実施形態において、第２の成分は核酸ではない。いくつかの実施形態において、第２の成分は、疾患治療のためにFDAに承認された成分である。いくつかの実施形態において、第２の成分は、リツキシマブ、トラスツズマブ、セツキシマブ、アレムツズマブ、アベルマブ、ダラツムマブ、エロツズマブ、オビヌツズマブ、ボルセツズマブ、クサツズマブ、デュルバルマブ、ペイントムマブ、またはアマツジマブである。 いくつかの実施形態において、第２の成分は第Ｉ相臨床試験で成功しているが、疾患の治療のためにFDAに承認された成分ではない。 いくつかの実施形態において、第２の成分は、コドリツズマブ、ソラネズマブ、ビマグルマブ、トラクロキヌマブ、またはボコシズマブである。

【図面の簡単な説明】

【0104】

【図1A】トラスツズマブ反応性癌細胞を死滅させるための、トラスツズマブ複合体ヒトCD16⁺ナチュラルキラー細胞と非複合体ヒトCD16⁺ナチュラルキラー細胞との間の細胞傷害機能の比較を示す棒グラフである。

【図1B】トラスツズマブ耐性癌細胞を死滅させるための、トラスツズマブ複合体ヒトCD16⁺ナチュラルキラー細胞と非複合体ヒトCD16⁺ナチュラルキラー細胞との間の細胞傷害機能の比較を示す棒グラフである。

【図2】トラスツズマブ耐性がん細胞に対して、トラスツズマブ、ヒトCD16⁺ナチュラルキラー細胞、トラスツズマブと共培養したヒトCD16⁺ナチュラルキラー細胞、およびトラスツズマブ複合体ヒトCD16⁺ナチュラルキラー細胞の細胞毒性効果を示す棒グラフである。

【図3A】図3A-3Bは10日目に採取されたガンマデルタT細胞のヒストグラムである。

【図3B】図3A-3Bは10日目に採取されたガンマデルタT細胞のヒストグラムである。

【図4A】図4A-4B は14日目に採取されたガンマデルタT細胞のヒストグラムである。

【図4B】図4A-4B は14日目に採取されたガンマデルタT細胞のヒストグラムである。

【図5A】Quantum^ＴＭSimply Cellular^Ｒキット由来の蛍光色素PE結合マウス抗ヒトCD56の標準曲線である。

【図5B】Quantum^ＴＭSimply Cellular^Ｒキット由来の蛍光色素PE-Cy7結合マウス抗ヒトCD16の標準曲線である。

【図5C】Quantum^ＴＭSimply Cellular^Ｒキット由来の蛍光色素PE-Cy7結合マウス抗ヒトNKG2Dの標準曲線である。

【図5D】Quantum^ＴＭSimply Cellular^Ｒキット由来の蛍光色素PE-Cy7結合マウス抗ヒトNKp44の標準曲線である。

【図5E】Quantum^ＴＭSimply Cellular^Ｒキット由来の蛍光色素PE-Cy7結合マウス抗ヒトNKp46の標準曲線である。

【図6A】正常な癌細胞死滅させるための、トラスツズマブ複合体ヒトガンマデルタＴ細胞と非複合体ヒトガンマデルタＴ細胞との間の細胞傷害機能の比較を示す棒グラフである。

【図6B】トラスツズマブ耐性癌細胞を死滅させるための、トラスツズマブ体化ヒトガンマデルタT細胞と非複合体化ヒトガンマデルタT細胞との間の細胞傷害機能の比較を示す棒グラフである。

【図7A】正常な癌細胞を死滅させるための、セツキシマブ複合体化ヒトガンマデルタT細胞と非複合体化ヒトガンマデルタT細胞との間の細胞傷害機能の比較を示す棒グラフである。

【図7B】セツキシマブ耐性癌細胞を死滅させるための、セツキシマブ複合体化ヒトガンマデルタT細胞と非複合体ヒトガンマデルタT細胞との間の細胞傷害機能の比較を示す棒グラフである。

【図8A】成分複合体化細胞傷害性細胞と非複合体化ヒト細胞傷害性細胞の細胞傷害性機能に対する低酸素の影響を示す棒グラフである。

【図8B】成分複合体化細胞傷害性細胞の細胞傷害機能に対する乳酸（代謝廃棄物）の影響を示す棒グラフである。

【図8C】成分と複合体化ヒト細胞傷害性細胞の細胞傷害性機能に対する腹水抽出物（免疫抑制性サイトカインを含有する）の効果を示す棒グラフである。

【図9A】成分複合体化細胞毒性細胞遊走試験のアッセイデザインを示す。

【図9B】癌細胞が存在する領域への成分複合体化細胞傷害性細胞の遊走能力を示す棒グラフである。

【図10A】CD3⁺ T細胞遊走試験のアッセイデザインを示す。

【図10B】癌細胞が存在する領域へのCD3⁺ T細胞の遊走能力に対する成分複合体細胞傷害性細胞の効果を示す棒グラフである。

【図11】トラスツズマブ耐性癌細胞を死滅させるための、異なる数のトラスツズマブと複合体化ヒトガンマデルタT細胞間の細胞傷害機能の比較を示す棒グラフである。

【図12】リツキシマブ耐性癌細胞を死滅させるための、異なる数のリツキシマブと複合体化したヒトガンマデルタＴ細胞間の細胞傷害機能の比較を示す棒グラフである。

【図13】異なる数のリツキシマブと複合体化ヒトガンマデルタＴ細胞の、癌細胞が存在する領域への遊走能力の比較を示す棒グラフである。

【図14】癌細胞を死滅させるための、抗GPC3抗体複合体化ヒトCD16⁺ナチュラルキラー細胞と非複合体ヒトCD16⁺ナチュラルキラー細胞との間の細胞傷害機能の比較を示す棒グラフである。

【図15】癌細胞を死滅させるための、抗GPC3抗体複合体化ヒトガンマデルタＴ細胞と非複合体ヒトガンマデルタＴ細胞との間の細胞傷害機能の比較を示す棒グラフである。

【発明を実施するための形態】

【0105】

「第１成分」または「第２成分」などの「成分」という用語は、対象への投与時に何らかの有益な効果を与える任意の物質、分子、化合物、タンパク質、細胞、または活性成分を指す。 有益な効果には、生物学的マーカーの認識、異常細胞の認識、異常細胞によって発現される生物学的マーカーとの特異的相互作用、異常な細胞によって発現される生物学的マーカーとの特異的な相互作用（または結合）、 疾患、症状、障害、または病理学的状態の改善、診断判断の有効化、一般的には疾患、症状、障害、または病理学的状態の対策、 および病気、症状、障害、状態の発症を軽減または予防することが含まれる. 成分の例としては、細胞、抗体、ホルモンまたは他のリガンド、レクチン、炭水化物、核酸（RNAまたはDNA）ハイブリダイズ配列、アプタマー、他の成分などが含まれるが、これらに限定されない(US 10,744,207参照)。

【0106】

「有効量」という用語は、有益な影響を与えるか、または所望の結果を生み出すのに十分な成分の量を指す。 「有効量」の他の定義は、教科書または米国特許第10,744,207号のような文書に記載されているように、当業者によく知られており、これらを参照により本明細書に組み込む。(US 10,744,207参照).
「疾患の治療のためにFDAが承認した成分」という用語は、疾患の治療のためにFDAによって承認された任意の成分を指す。 例えば、リツキシマブ、トラスツズマブ、セツキシマブ、アレムツズマブ、アベルマブ、ダラツムマブ、エロツズマブは、異なる癌または腫瘍の治療薬として FDA に承認された成分である。

【0107】

「成分は第 I 相臨床試験で成功したが、疾患の治療に FDA が承認した成分ではない」という用語は、この成分は疾患を治療する可能性があり、第 I 相臨床試験では成功したが、例えば、第II/III相試験で効果がないか、十分な効果がないと判断されているため、疾患の治療にFDAが承認した成分でないことを指す。 例えば、コドリツズマブは第 I 相臨床試験で成功した成分だが、癌または腫瘍の治療薬として FDA に承認された成分ではない。

【0108】

「抗原結合ユニット」という用語は、一般に抗原に対して高い親和性を有する部分を指す。抗原結合ユニットの非限定的な例としては、アプタマーおよび抗体が含まれる(US 10,744,207参照)。いくつかの実施形態において、抗原結合ユニットを含有する第１成分などのいくつかの成分は、Ｆｃ受容体認識領域を含有する抗体であり、したがって、これらの成分はFc受容体によって認識され得る（例えば、Fcガンマ受容体によって認識される）。 いくつかの実施形態において、抗原結合ユニットを含有する第１成分などのいくつかの成分は、IgGサブタイプのモノクローナル抗体である。

【0109】

「細胞傷害性細胞」という用語は、他の生きた細胞を殺すか破壊する能力を有する任意の細胞を指し、例えば、細胞傷害性T細胞、ナチュラルキラー細胞、ガンマデルタT細胞、マクロファージ、または他の生細胞を殺すか破壊する能力を有するか、または抗体依存性細胞傷害(ADCC)を含むがこれらに限定されない任意の細胞傷害を媒介するその他の細胞である。

【0110】

「疾患の病変」という用語は、例えば卵巣癌の病変などの疾患に起因または疾患に関連する損傷、または異常な変化を受けた器官または組織内の任意の領域を指す。

【0111】

「疾患に関連する異常な細胞」という用語は、一般に疾患に起因または疾患に関連する異常な変化を受けており、したがって、細胞は任意の分子の異常な発現などの少なくとも異常な特徴を有するか、または異常な微環境に位置する任意の細胞を指す。

【0112】

「疾患を有する対象の治療において効果がないか、または十分な効果がないと判断された成分」という用語は、一般に、（成分の投与前または投与後）疾患を有する対象の治療に効果がないか、または十分な効果がないと判断された任意の成分（疾患治療のためにFDAが承認した成分など）を指す。 何故ならば、例えば、(1) 対象または対象の異常細胞が成分に対して無反応、不十分に反応、鈍感、難治性、または耐性である、または (2) 対象の異常細胞には、その成分によって特異的に認識できる十分な生物学的マーカーが存在しないということである。

【0113】

「臨床試験終了時に疾患の治療に効果がないか、または十分な効果がないと結論付けられた成分」という用語は、一般的に、例えば第II/III相臨床試験において、疾患の 治療に効果がない、または十分な効果がないと結論付けられた、または判定された任意の成分（第I相臨 床試験で成功したが、疾患の治療薬としてFDAに承認された成分ではないなど）を指す。

【0114】

「gdT細胞」、「γδT細胞」、または「γδT細胞」という用語は、T細胞受容体（TCR）の異なる鎖の組み合わせであるγδ TCR（αβ TCRではなく）を表面に発現するT細胞のサブセットを指し、 Vγ2、Vγ3、Vγ4、Vγ5、Vγ8、Vγ9、Vγ11などのTCR-γ鎖と、Vδ1、Vδ2、Vδ3、Vδ5などのTCR-δ鎖から構成される。「gdT 細胞」という用語には、特に gdT 細胞のすべてのサブセットおよびその組み合わせが含まれる。 (Pistoia et al., 2018; WO2020117862A1参照) 。

【0115】

第１リンカーと第２リンカー間の相互作用は、直接的または間接的であり得る。 一般に、間接的相互作用とは、1つ以上の中間化合物によって媒介されるものである。 中間体化合物は、一方または両方のリンカーと同じタイプでも異なるタイプでもよい。 いくつかの実施形態において、第１および第２のリンカーは同じであり、中間化合物との同時相互作用を介して相互作用する。 例えば、第１および第２のリンカーは同じ抗体であってもよく、抗体が向けられる抗原の２つ以上のコピーを含有する中間化合物を同時に結合することによって間接的に相互作用する。 いくつかの実施形態において、第１のリンカーと第２のリンカーは異なる。 いくつかの実施形態において、第１および第２のリンカーは直接相互作用する。 一般に、直接相互作用とは、中間化合物との相互作用を必要としない相互作用である。 いくつかの実施形態において、ターゲティングユニットは、第１のポリヌクレオチドに結合した標的化部分を含有し、 治療ユニットは、第２のポリヌクレオチドに結合した治療薬を含有し、前記ターゲティングユニットおよび前記治療ユニットは、第１のポリヌクレオチドと第２のポリヌクレオチドとの間の、またはアダプターポリヌクレオチドとの相補性を介して複合体を形成する。 第１および第２のポリヌクレオチドは、互いにハイブリダイズすることなどにより直接相互作用し得る。第１および第２のポリヌクレオチドは、中間化合物との相互作用などを介して、間接的に相互作用し得る。 いくつかの実施形態において、中間化合物は本明細書に記載されるようなアダプターポリヌクレオチドである。 例えば、第１および第２のポリヌクレオチドは、アダプターポリヌクレオチドの一部との相補性を介して間接的に相互作用し得る。いくつかの実施形態において、第１および第２のリンカーは、互いに反応して共有結合を形成する反応性基である。各反応性基は、最初にそれが結合している実体（例えば、標的化部分または治療薬）と直接反応して、共有結合を形成することができる (US 10,744,207参照)。

【0116】

いくつかの実施形態において、第１リンカーおよび第２リンカーは、１つまたは複数の中間化合物との相互作用を介して、間接的に相互作用する。 例えば、第１のリンカーポリヌクレオチドおよび第２のリンカーポリヌクレオチドは、アダプターポリヌクレオチドの異なる部分と相補性を介して相互作用し得る。 アダプターポリヌクレオチドは、DNA、RNA、ヌクレオチド類似体、非標準ヌクレオチド、標識ヌクレオチド、修飾ヌクレオチド、またはそれらの組み合わせを含有し得る。 アダプターポリヌクレオチドは、一本鎖、二本鎖、または部分二重鎖であり得る。 一般に、部分二重鎖アダプターは、1つ以上の一本鎖領域と1つ以上の二本鎖領域を含有する。二本鎖アダプターは、互いにハイブリダイズした 2つの別個のオリゴヌクレオチド (「オリゴヌクレオチド二本鎖」とも呼ばれまる) を含有し得る、ハイブリダイゼーションにより、1つまたは複数の 3' オーバーハング、1つまたは複数の 5' オーバーハング、ミスマッチおよび/または不対ヌクレオチドに起因する 1つまたは複数のバルジ、またはこれらの組み合わせが残り得る。 第１のリンカーポリヌクレオチドおよび第２のリンカーポリヌクレオチドの両方と相互作用するアダプターポリヌクレオチドは、連続した骨格を含有し得る。 例えば、第１および第２のリンカーは、一本鎖アダプターポリヌクレオチドの異なる部分にハイブリダイズし得る。代わりに、第1のリンカーポリヌクレオチドは、二本鎖リンカーの第1の鎖にハイブリダイズしてもよく、第2のリンカーポリヌクレオチドは、二本鎖リンカーの第2の鎖にハイブリダイズしてもよく、アダプターの第1および第2の鎖は互いにハイブリダイズしてもよく、そんな第1および第2のリンカーは、二本鎖アダプターポリヌクレオチドとの配列相補性を介して間接的に相互作用する。 アダプターポリヌクレオチドは、2本以上の二本鎖アダプターポリヌクレオチド（例えば、2、3、4、5、またはそれ以上）が鎖状にハイブリダイズし、第1のリンカーポリヌクレオチドが鎖の一端にハイブリダイズし、第2のリンカーポリヌクレオチドが鎖の他端にハイブリダイズするような不連続な骨格を含有し得る。(US 10,744,207参照).
いくつかの実施形態において、対象複合体は、ターゲティングユニットおよび治療ユニットを含有し、それぞれがリンカーを含有し、相互作用して２つのユニットを一緒にして複合体を形成する。例えば、第１リンカーに結合した第１の部位（標的化部位など）は、第１と第２のリンカー間の相互作用を介して、第２のリンカーに結合した第２の部位（治療薬や細胞など）と複合体を形成する。 いくつかの実施形態において、リンカー間の相互作用は共有結合の形成である。 いくつかの実施形態において、リンカー間の相互作用は、静電相互作用、疎水性結合、水素結合、ファンデルワールス相互作用、または磁気相互作用などの非共有結合相互作用である。いくつかの実施形態において、リンカー間の相互作用は、ターゲティングユニットと治療ユニットとの間に形成される複合体が可逆的複合体であるように、可逆的相互作用である。一般に、可逆的複合体は、可逆的複合体を含む溶液の条件など、複合体がさらされる１つまたは複数の条件を変更することによって破壊され得る複合体である。 例えば、可逆的相互作用は、温度を変える（例えば、熱を加える）、pHを変える（例えば、pHを下げるまたは上げる）、酵素活性を変える（例えば、酵素分解）、イオン強度を変える（例えば、塩濃度を下げる）、またはこれらの2つ以上の組み合わせによって破壊される可能性がある。可逆的相互作用の例は、2つの相補的ポリヌクレオチド間の相互作用である。 例えば、第１リンカーは、第２のリンカーポリヌクレオチドの一本鎖領域と相補的な一本鎖領域を有するポリヌクレオチドであってもよく、その結果、リンカーはさらなる処理なしで配列相補性を介して互いにハイブリダイズする。 もう一つの例として、 第１リンカーは、第２リンカーポリヌクレオチドの二本鎖または一本鎖の領域と相補的な二本鎖領域を有するポリヌクレオチドであってもよい、 その結果、第１リンカーと第２リンカーの間の相互作用は、結合部分を処理してリンカーの相補部分（単数または複数）を一本鎖にすることによって引き起こされる(US 10,744,207参照) 。

【0117】

本明細書に開示される対象複合体に具体化されるターゲティングユニットは、典型的には、優先的な相互作用または結合を示すことによって標的と非標的を区別する能力をターゲティングユニットに与える標的化部分（成分など）を含有する。 したがって、ターゲティングユニットの標的化部分（成分など）には、複合混合物中の非標的化合物または複合体よりも標的化合物または複合体に対して高い結合親和性を有する化合物または複合体が含まれる。 標的化部分は、標的細胞に関連するバイオマーカーなどの所望の標的に対する結合親和性を有するか、または有するように産生されることに基づいて選択され得る (US 10,744,207参照).
成分などの標的化部分が向けられ得る細胞に関連する生物学的マーカーには、細胞表面マーカーが含まれる。細胞表面マーカーの非限定的な例としては、炭水化物；糖脂質；糖タンパク質；造血系細胞上に存在するCD（分化クラスター）抗原（例えば、CD2、CD4、CD8、CD21など、 CD2、CD4、CD8、CD21など）；γ-グルタミルトランスプチダーゼ；接着タンパク質（ICAM-1、ICAM-2、ELAM-1、VCAM-1など）；ホルモン、成長因子、サイトカイン、その他のリガンドレセプター；イオンチャネル；および免疫グロブリンμ鎖の膜結合型である。 いくつかの実施形態において、標的細胞に関連する生物学的マーカーは、細胞当たり約100000、50000、10000、5000、1000、750、500、100、50、またはそれ未満のコピー数で標的細胞の表面上に存在する。 いくつかの実施形態において、標的細胞の集団における標的細胞の表面に関連する生物学的マーカーの平均密度は、細胞あたり約100000、50000、10000、5000、1000、750、500、100、50、またはそれ未満のコピー数である。

【0118】

いくつかの実施形態において、 生物学的マーカーは、細胞が生物学的マーカーを分泌する場所など、標的細胞からより離れた流体または組織内で見られるよりも、生物学的マーカーが標的細胞の周囲の流体またはそれが存在する組織内におけるマーカーの濃度が増加することによって、標的細胞と関連付けられる。 特に興味深いのは、疾患または疾患状態に関連する生物学的マーカーであり、さらに特に興味深いのは、疾患または病状に関連する標的細胞（異常細胞など）によって発現される疾患関連生物学的マーカーである。非常に多様な疾患関連の生物学的マーカーが同定されており、アルファフェトプロテイン (AFP) 、 C 反応性タンパク質(CRP) 、癌抗原-50 (CA-50)、卵巣癌に関連する癌抗原-125 (CA-125)、乳癌に関連する癌抗原 15-3 (CA15-3)、消化器癌に関連する癌抗原-19 (CA-19) および癌抗原-242、癌胎児性抗原 (CEA)、癌腫関連抗原 (CAA)、クロモグラニンA、上皮ムチン抗原(MC5)、ヒト上皮特異抗原(HEA)、ルイス(a)抗原、黒色腫抗原、黒色腫関連抗原 100、25、および 150、ムチン様癌関連抗原、多剤耐性関連タンパク質 (MRPm6)、多剤耐性関連タンパク質 (MRP41)、Neu 癌遺伝子タンパク質 (C-erbB-2)、ニューロン特異的エノラーゼ (NSE)、P 糖タンパク質(mdr1 遺伝子産物)、多剤耐性関連抗原、p170、多剤耐性関連抗原、前立腺特異抗原 (PSA)、CD56、および NCAMを直接標的とする標的部分など、対応する標的部分が生成されてきた (US 10,744,207参照) 。

【0119】

治療薬（細胞傷害性細胞など）または標的化部分（例えば、成分、抗体）に結合するのに適したリンカーは、結合対のメンバーであり得る。 結合対の第一の分子は一般に、非結合分子よりも結合対の第二の分子に対して高い親和性を示す。 結合対の例としては、抗原-抗体、受容体-ホルモン、受容体-リガンド、アゴニスト-アンタゴニスト、レクチン-炭水化物、ポリヌクレオチド（RNAまたはDNA）ハイブリダイズ配列、アプタマー-ターゲット、アビジン-ビオチン、ストレプトアビジン-ビオチン、ロイシンジッパー-ターゲットポリヌクレオチド、ジンクフィンガーターゲットポリヌクレオチドなどが含まれるが、これらに限定されるものではない。いくつかの実施形態において、リンカーは細胞に結合する外因性リンカーである。 この文脈において、「外因性」は、リンカーが結合している細胞によって産生されなかったことを示すために使用される。 例えば、別の供給源からの外因性リンカーを細胞と混合して、リンカーを細胞に結合させることができる (US 10,744,207参照) 。

【0120】

本明細書に記載のリンカーおよび部分は、当技術分野で知られている任意の適切な手段によって結合させることができる。 標的部分（例えば、成分、抗体）または治療ユニット（例えば、細胞）に結合されたリンカーは、共有結合または非共有結合を介して結合され得る。 いくつかの実施形態において、リンカーは、細胞表面に天然に存在する官能基またはタンパク質の天然官能基のような、標的化部分（例えば、成分、抗体）または治療ユニットの天然官能基に結合される。 細胞表面には、アミノ酸や糖など、任意の適切な天然官能基を含めることができる。 例えば、マレイミド、ジスルフィドなどの試薬やアシル化プロセスを使用して、細胞表面タンパク質上のシステインと直接共有結合を形成できます。 アミドカップリングは、アスパラギン酸塩とグルタミン酸塩でアミド結合を形成するために使用できる。 ジアゾニウムカップリング、アシル化、およびアルキル化を細胞表面のチロシンで使用して、アミド結合を形成できる。 オリゴヌクレオチドと細胞表面の結合である直接共有結合を形成するために、任意のアミノ酸(20アミノ酸または任意の非天然アミノ酸）のいずれかを使用することが可能である。 20種類のアミノ酸とは、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、スレオニン、トリプトファン、とバリン（必須アミノ酸）、とアラニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、プロリン、セリン、とチロシン（非必須アミノ酸）、さらにアルギニン、およびヒスチジンである。 いくつかの実施形態において、天然官能基は、リジン、システイン、チロシン、スレオニン、セリン、アスパラギン酸、グルタミン酸またはトリプトファンなどのアミノ酸であり得る。 他の実施形態において、天然官能基はリジンである。いくつかの他の実施形態において、天然官能基はN末端セリンまたはスレオニンであり得る(US 10,744,207参照).
いくつかの実施形態において、リンカーは、カップリング基を使用してターゲティングユニットまたは治療ユニットに結合され得る。 例えば、カップリング基は、活性化エステル(例えば、NHSエステル、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド(EDC)エステル、ジシクロヘキシルカルボジイミド(DCC)エステルなど)、またはハロゲン化アルキルもしくはハロゲン化アシル（例えば、-Cl、-Br、-I）であり得る。 いくつかの実施形態において、活性化エステルは単離および／または精製される。 いくつかの実施形態において、活性化エステルはその場で生成および／または使用される。場合によっては、カップリング基は、天然官能基（例えば、アミノ酸）を事前に修飾することなく、治療薬（例えば、治療薬として使用される細胞の表面）に直接結合することができる。 例えば、リンカーは、標的部分（例えば、抗体、アプタマー）または細胞表面上のアミノ酸との結合（例えば、アミド結合またはエステル結合）の形成によって、ターゲティングユニットまたは治療ユニットに結合させることができる。 いくつかの実施形態において、カップリング基はＮＨＳエステルであり、ターゲティンユニットまたは治療ユニット上の求核性天然官能基と反応して、アシル化生成物が得られる。 例えば、天然官能基はアミンであり、NHS エステルを介して結合してアミドを形成する。あるいは、天然官能基はヒドロキシル基またはスルフヒドリル基であってもよく、これらはNHSエステルを介して共役して、それぞれエステルまたはスルホヒドリルエステル結合を形成することができる (US 10,744,207参照)。

【0121】

いくつかの実施形態において、リンカーは、二官能性架橋剤を使用してターゲティングユニットまたは治療ユニットに結合され得る。 二官能性架橋剤は、ペプチド、タンパク質、高分子、半導体ナノ結晶、または基板などの２つの異なる機能性標的に結合できる２つの異なる反応性基を含むことができる。 ２つの反応性基は同じでも異なっていてもよく、チオール、カルボキシレート、カルボニル、アミン、ヒドロキシル、アルデヒド、ケトン、活性水素、エステル、スルフヒドリルまたは光反応性部分などの反応性基が含まれるが、これらに限定されない。 いくつかの実施形態において、架橋剤は、官能性末端に1つのアミン反応性基およびチオール反応性基を有することができる。 他の実施形態において、二官能性架橋剤は、アミン含有分子およびスルフヒドリル含有分子の共有結合を可能にするＮ－ヒドロキシスクシンイミド（NHS）エステルおよびマレイミド基を含有し、NHS-PEO-マレイミドであり得る。 リンカーをターゲティングユニットまたは治療ユニットに結合させるために使用され得るヘテロ二官能性架橋剤のさらなる例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない: アミン反応性+スルフヒドリル反応性架橋剤、カルボニル反応性+スルフヒドリル反応性架橋剤、アミン反応性+光反応性架橋剤、 スルフヒドリル反応性 + 光反応性架橋剤、カルボニル反応性 + 光反応性架橋剤、カルボキシレート反応性 + 光反応性架橋剤、およびアルギニン反応性 + 光反応性架橋剤である (US 10,744,207参照)。

【0122】

典型的な架橋剤は次のカテゴリに分類できる（官能基の例とともに）:
1. アミン反応性: 架橋剤はアミン (NH2) 含有分子に結合し、例えば、イソチオシアネート、イソシアネート、 アシルアジド、NHSエステル、塩化スルホニル、アルデヒドとグリオキサール、エポキシドとオキシラン、 カーボネート、アリール化剤、イミドエステル、カルボジイミド、無水物、アルキン類;
2. チオール反応性：架橋剤はスルフヒドリル（SH）含有分子に結合し、例えば、ハロアセチルとハロゲン化アルキル誘導体、マレイミド、アジリジン、アクリロイル誘導体、アリール化剤、チオールジスルフィド交換試薬;
3. カルボキシレート反応性：架橋剤はカルボン酸（COOH）含有分子に結合し、 例えば、カルボニルジイミダゾールとカルボジイミドなどのジアゾアルカンとジアゾアセチル化合物;
4. ヒドロキシル反応性：架橋剤はヒドロキシル（-OH）含有分子に結合し、例えば、エポキシドとオキシラン、カルボニルジイミダゾール、過ヨウ素酸塩による酸化、N,N'-ジスクシンイミジルカーボネートまたはN-ヒドロキシルスクシミジルクロロホルメート、酵素酸化、アルキルハロゲン、イソシアネート;
5. アルデヒドおよびケトン反応性：架橋剤はアルデヒド（-CHO）またはケトン（R2CO）を含有分子に結合し、例えば、シッフ塩基形成または還元アミノ化のためのヒドラジン誘導体;
6. 活性水素反応性、例えばマンニッヒ縮合およびヨウ素化反応用のジアゾニウム誘導体; そして
7. 光反応性、例えばアリールアジドおよびハロゲン化アリールアジド、ベンゾフェノン、ジアゾ化合物、ジアジリン誘導体(US 10,744,207参照)。

【0123】

一部の反応性基は複数の官能基と反応できるため、カテゴリごとに、つまり特定の化学物質が官能基をターゲットにするかどうかにいくつかのサブカテゴリがある。これらのサブカテゴリーごとに、化学物質の例が多数ある。 これらの化学物質の多くと上記のサブカテゴリのリストは、Greg T Hermanson著「Bioconjugate Techniques」、Academic Press、サンディエゴ、1996年に記載されており、参照により本明細書に組み込まれる。(US 10,744,207参照).
別の実施形態において、ポリエチレンオキシド（PEO）とも呼ばれるポリエチレングリコール（PEG）スペーサーを含有する架橋剤を、純粋な炭化水素スペーサーアームを有する試薬の代替品として使用することができる。PEG スペーサーは試薬と複合体の水溶性を改善し、複合体の凝集の可能性を減らし、架橋の柔軟性を高めため、スペーサー自体に対する免疫原性反応が減少します。 異なるPEG鎖長の不均一混合物を含む典型的なPEG試薬とは対照的に、これらのPEO試薬は規定の分子量とスペーサー5アーム長の均一な化合物であり、架橋用途の最適化と特性評価においてより高い精度を提供する。例えば、実施例におけるスクシンイミジル-[(N-マレイミドプロピオンアミド)-ヘキサエチレングリコール]エステルを使用して、5 mgのNHS-PEO6-マレイミド(Pierce Biotechnology, Inc. ロックフォード、イリノイ州61105)を溶解することによって原液を作製した。(US 10,744,207参照).
いくつかの実施形態において、結合により、カルボキシル基もしくはカルボニル基、またはそれらのアミノもしくはチオ等価物が生じ得る。 このような基の例としては、ケトン、イミド、チオンアミド、イミドアミド、チオアミド、エステル、イミドエステル、チオエステル、カルバメート、尿素、チオ尿素、カーボネート、カルボイミデートおよびカルボチオエートが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、結合によりヒドラゾン結合またはオキシム結合が生じ得る。 いくつかの実施形態において、結合によりジスルフィド結合が生じ得る。 いくつかの実施形態において、リンカーは、ネイティブケミカルライゲーション（ＮＣＬ）法を使用して結合させることができる。

【0124】

リンカーおよびカップリング基のさらなる例は、WO2010118235A1に開示されており、これは参照により本明細書に組み込まれる (US 10,744,207参照) 。

【0125】

場合によっては、リンカーを細胞表面に直接結合させることもできる。 リンカーの結合前に細胞膜（細胞表面、細胞の外側、またはその構成要素）が積極的に修飾または変化されていない場合、細胞は「直接」結合される。 具体的には、結合は細胞表面上の天然官能基に行われるため、「直接」とは、リンカー結合の前に天然官能基が修飾されていないことを意味する。(US 10,744,207参照) 。

【0126】

結合用の緩衝液は、化学リンカーまたは架橋剤の選択と、細胞の増殖条件の維持（つまり、細胞溶解の防止）に基づいて選択できる。 いくつかの実施形態において、緩衝液の範囲はpH6～8であり、結合リンカー（例えば、一本鎖ポリヌクレオチド）と反応するために化学リンカーに使用されるのと同じ官能基を含まない。pH 7.2 を使用できるが、pH は中性である必要はなく、通常は化学反応と細胞の状態との適合性に依存する(US 10,744,207参照)。

【0127】

いくつかの実施形態において、緩衝液は、N-ヒドロスクシンイミド（NHS）エステル（例えば、NHS-PEO-マレイミド）をカップリング基として使用できるように、中性pHのリン酸緩衝液である。反応は一般に、リンカーと部分（例えば、抗体、アプタマー、細胞表面）の結合を可能にする条件下で行われる。NHSエステル架橋剤およびリン酸緩衝溶液が使用されるいくつかの実施形態において、反応は、中性pH(例えば、pH7.2)および室温で、特定の時間（例えば、約1、3、5、10、15、20、30、45、60分またはそれ以）実施される(US 10,744,207参照)。

【0128】

リンカーはポリヌクレオチドであり得る。 例示的なポリヌクレオチドとしては、デオキシリボ核酸（DNA）、リボ核酸（RNA）、ペプチド核酸（PNA）、モルホリノおよびロックド核酸（LNA）、グリコール核酸（GNA）、トレオース核酸 (TNA)、一本鎖 DNA (ssDNA)、アプタマー、およびフッ素化核酸などの他の核酸部分が含まれるが、これらに限定されない。場合によっては、リンカーはアプタマーであり得る。アプタマーは、三次元構造をとり、特定の標的分子に結合できるオリゴヌクレオチドである (US 10,744,207参照)。

【0129】

いくつかの実施形態において、本開示は、その外表面に複合体化された少なくとも2つの異なるターゲティングユニット（例えば、第1のタイプおよび第2のタイプ）を含有する細胞を提供し、異なるターゲティングユニットの各々は、複合体化される細胞によって産生されない別個の成分を含有し、生物学的マーカー中の異なる結合部位（異なるエピトープなど）または異なる生物学的マーカーと特異的に相互作用する（例えば、第1のエピトープまたは第1の生物学的マーカーと特異的に相互作用する（または結合する）第1のタイプ、および第2のエピトープまたは第2の生物学的マーカーと特異的に相互作用する（または結合する）第2のタイプ）。 いくつかの実施形態において、細胞は2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、またはそれ以上の異なるターゲティングユニットと複合体化される。いくつかの実施形態において、同じ細胞表面の別のターゲティングユニットに対する1つのターゲティングユニットの比率は1からXで、Xは約1、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、50、75、100、またはそれ以上である (US 10,744,207参照) 。

【0130】

いくつかの実施形態において、本開示は、転写および翻訳のプロセスを介して細胞によって産生されるのではなく、外因性手段によって細胞と会合するようになる成分を含有する接合生細胞を提供する。(US 10,744,207参照) 。

【0131】

方法:
成分を第１のポリヌクレオチドと反応させてターゲティングユニットを生成する工程、および生細胞を第２のポリヌクレオチドと反応させて結合細胞を生成する工程では、多種多様な技術が利用可能である。 例えば、第１のポリヌクレオチドは、二官能性架橋剤を使用して成分に結合させることができる。 二官能性架橋剤は、ペプチド、タンパク質、高分子、半導体ナノ結晶、または基板などの２つの異なる機能性ターゲットに結合できる２つの異なる反応性基を含有することができる。 ２つの反応性基は同じでも異なっていてもよく、チオール、カルボキシレート、カルボニル、アミン、ヒドロキシル、アルデヒド、ケトン、活性水素、エステル、スルフヒドリルまたは光反応性部分などの反応性基が含まれるが、これらに限定されない。 いくつかの実施形態において、架橋剤は、官能末端上に１つのアミン反応性基およびチオール反応性基を有することができる。 他の実施形態において、二官能性架橋剤は、アミン含有分子およびスルフヒドリル含有分子の共有結合を可能にするＮ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステルおよびマレイミド基を含有し、NHS-PEO-マレイミドであり得る (US 10,744,207参照) 。

【0132】

いくつかの実施形態において、 生物学的マーカーは、細胞が生物学的マーカー（細胞外マーカーとも呼ばれる）を分泌する場所など、標的細胞からより離れた流体または組織内で見られるよりも、生物学的マーカーが標的細胞の周囲の流体またはそれが存在する組織内におけるマーカーの濃度が増加することによって、標的細胞と関連付けられる。いくつかの実施形態において、細胞外マーカーは、細胞または組織の損傷に応答して細胞から分泌または放出されるマーカーである。 例えば、CK-MB とトロポニン I は胸痛の発症から4～8時間後に放出され、不可逆的な損傷(すなわち、壊死) が発生した後に放出される。Nourin-1は心筋虚血に反応して心臓組織から5分以内に放出される炎症性ポリペプチドである (US 10,744,207参照)。

【0133】

いくつかの実施形態において、複合体（細胞傷害性細胞は、細胞傷害性細胞の表面に複合体化されたターゲティングユニットの集団を含有する）を投与することは、治療の一部を形成する。 療法は神経学的疾患、障害、欠損に対するものであり得る。治療は機能的回復および/または認知的回復が改善される可能性がある。治療法は脳卒中、末梢動脈疾患、神経障害、または組織再生、血管再生、または局所抗炎症作用を必要とするその他の疾患または障害に対するものであり得る。 パーキンソン病、アルツハイマー病、脳卒中、ALSなどの神経障害、疾患、欠損；リソソーム貯蔵障害；心筋梗塞、うっ血性心不全、末梢動脈疾患、糖尿病性潰瘍、創傷治癒などの心血管障害；特発性肺線維症、呼吸窮迫症候群、慢性閉塞性肺疾患、特発性肺高血圧症、嚢胞性線維症、喘息を含む肺の病気；糖尿病（iまたはii）、関節リウマチ、変形性関節症、狼瘡、クローン病、炎症性腸疾患、移植片対宿主病などの代謝性または炎症性疾患；加齢黄斑変性症、シュタルガルト病、糖尿病網膜症、網膜色素変性症などの失明の原因となる網膜疾患；および多発性硬化症、脳性麻痺、橋中心髄鞘溶解症、背側脊髄炎、デビック病、進行性多巣性白質脳症、視神経炎、白質ジストロフィー、ギラン・バレー症候群、抗MAG末梢神経障害とシャルコー・マリー・トゥースなどの脱髄疾患が含まれるが、これらに限定されない (US 10,744,207参照)。

【0134】

対象に投与される複合体は、医薬組成物の成分などの任意の適切な形態であってもよく、これは、1つまたは複数の薬学的に許容される担体および場合により1つまたは複数の追加の治療薬（例えば、組み合わせ組成物中）をさらに含有し得る。薬学的に許容される担体としては、薬学的投与に適合する溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などが含まれるが、これらに限定されない。 例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences (2005) を参照。 非経口投与に適した製剤としては、例えば、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、および製剤を意図する対象者の血液と等張にする溶質を含み得る水性無菌注射液；および懸濁化剤および増粘剤を含み得る水性および非水性無菌懸濁液が挙げられる。 補助活性化合物を組成物に組み込むこともできる。医薬組成物は通常、意図された投与経路に適合するように製剤化される。 投与経路の例としては、非経口、例えば、静脈内、皮内、皮下、経口（例えば吸入）、経皮（局所）、経粘膜、および直腸投与が含まれる。 非経口、皮内または皮下適用に使用される溶液または懸濁液は、以下の成分の1つ以上を含まれる：注射用水、生理食塩水、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、または他の合成溶媒などの滅菌希釈剤：ベンジルアルコールやメチルパラベンなどの抗菌剤； アスコルビン酸や硫酸水素ナトリウムなどの抗酸化剤；エチレンジアミン四酢酸などのキレート剤； 酢酸塩、クエン酸塩、リン酸塩などの緩衝液、および塩化ナトリウムやブドウ糖などの張度調整剤。 pHは塩酸や水酸化ナトリウムなどの酸または塩基で調整できる。非経口製剤は、ガラスまたはプラスチック製のアンプル、使い捨て注射器、または複数回投与用バイアルに封入できる (US 10,744,207参照)。

【0135】

いくつかの実施形態において、相乗的に有効な治療量の複合体は、単独で使用した場合の複合体のメンバーの相加効果よりも大きな効果を生み出す。 (US 10,744,207参照).
実例
以下は、本発明の実施形態ならびに本発明の技術および特徴を使用して詳細な説明であり、しかしながら、これらの実施形態は本発明を限定することを意図するものではなく、この技術に精通した者によって本発明の精神および範囲から逸脱することなく行われるあらゆる変更および修正は本発明の範囲に含まれるものである。

【0136】

実施形態 1: 成分反応性または成分耐性の癌細胞を死滅させる成分複合体細胞傷害性細胞の細胞傷害機能
以下に、成分複合体ナチュラルキラー細胞および成分複合体ガンマデルタＴ細胞を調製する特定の実施形態、ならびにそれらの使用を記載するが、本発明の適用はこれに限定されず、任意の細胞傷害性細胞と結合した任意の成分を意味する。本発明の範囲に含まれるものとする。

【0137】

実施形態 1-1: 成分複合化体ヒトCD16⁺ナチュラルキラー細胞の、成分反応性または成分耐性の癌細胞を死滅させる細胞傷害性機能
実施形態 1-1-1 ヒトCD16⁺ナチュラルキラー細胞の培養
本実施形態において、2019年9月2日に〒292-0818 千葉県木更津市一里山2-5-8 ＃122の住所でNPMDに寄託され、受託番号NITE BP-03017を有するヒトCD16⁺ナチュラルキラー細胞株（「ｏＮＫ細胞」と呼ばれる）が使用された。NPMDに寄託された受託番号NITE BP-03017を有するヒトCD16⁺ナチュラルキラー細胞を100~1000xg の速度で 3~5 分間遠心した。 上清を除去した。細胞を1mLの細胞培養培地で再懸濁した後、細胞懸濁液を最初の容器に入れて、40 mLの細胞培養培地中に6.54×10⁵個のヒトCD16⁺ナチュラルキラー細胞が含まれるようにした;
細胞培養培地は以下を含有する:
(1) 0.5% - 30% (体積パーセント、vol％、v/v) ヒト血小板溶解物;
(2) 100 - 3000 IU/mL インターロイキン 2 (IL-2) ;または
(3) DMEM培地（Dulbecco's Modified Eagle Medium）、Eagle's minimum essential mediumのα改変培地、およびXVIVO 10培、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される培地；そして
ここで、第1の容器は、例えば、T-75フラスコ、T-150フラスコ、T-225フラスコ、またはG-Rex培養装置であり；G-Rex培養装置は、養を完全に通気するために底部に通気性および不透水性の膜を備えた培養容器である。

【0138】

少なくとも7日間の培養後、培養oNK細胞を含有する細胞懸濁液(「培養oNK細胞懸濁液」と呼ばられる)が得られた。.
実施形態 1-1-2 培養細胞の細胞状態および細胞表面マーカーの検出
この実施形態には２つの実験試行がある。 受託番号NITE BP-03017を有するヒトCD16＋ナチュラルキラー細胞の第1バッチと、受託番号NITE BP-03017を有するヒトCD16＋ナチュラルキラー細胞の第2バッチとを、それぞれ実施形態1-1-1の培養方法により培養し、第1実験試行の培養oNK細胞懸濁液と、第2実験試行の培養oNK細胞懸濁液を得た。ヒトCD16⁺ナチュラルキラー細胞の第１バッチは合計35日間培養され、ヒトCD16⁺ナチュラルキラー細胞の第２バッチは少なくとも202日目まで長期間培養された。

【0139】

本実施形態（実施形態1-1-2）において異なる時点で得られた細胞懸濁液の各サンプルを遠心分離し; 上清を除去し、細胞をバッファーに再懸濁し、1μL のヨウ化プロピジウム (PI); 3μL のCD56蛍光標識抗体（Cat. No. 318304, Biolegend, 米国）、CD3蛍光標識抗体（Cat. No. 300410, Biolegend, 米国）、CD2蛍光標識抗体（Cat. No. 300222, Biolegend, 米国）の混合物; または1μL のCD16蛍光標識抗体（Cat No.302016、Biolegend、米国）と混合した。セルソーターまたはフローサイトメーターを使用して、(1) 細胞がヨウ化プロピジウムで染色されているかどうか； (2) 細胞が CD56 分子、CD3 分子、および/または CD2 分子を示したかどうか； (3) 細胞が CD16 受容体を示したかどうかを検出した。

【0140】

表1と表2を参照。 表1に第1回目の実験から得られた培養oNK細胞懸濁液の結果を示し、表2に第2回目の実験から得られた培養oNK細胞懸濁液の結果を示す。

【0141】

表1において、最初の列「day」は培養日数を示し; 2 番目の列「PI⁺」は、培養 oNK 細胞懸濁液中の細胞の総数を 100% として、アポトーシスを起こしている細胞または死滅した細胞の割合を示し; ナチュラルキラー細胞、CD4⁺ T 細胞、およびCD8⁺ T 細胞はすべて CD56⁺ を示すため (Pernick, N、2018)、3 列目の「CD56⁺」は培養oNK細胞懸濁液中の細胞の総数を100%として、ナチュラルキラー細胞、CD4⁺ T 細胞、CD8⁺ T 細胞の総数の割合を示し; T 細胞はすべて CD3⁺ を示すため (Pernick, N、2018)、4 番目の列「CD3^-」は、培養 oNK 細胞懸濁液中の細胞の総数を 100% として、T 細胞ではない細胞の割合を示し; ナチュラルキラー細胞、末梢血 T 細胞、およびほとんどの胸腺細胞はすべて CD2⁺ を示し (Pernick, N, 2018)、本実験で検出される細胞は末梢血に由来するため、5番目の列「CD2⁺」は、培養oNK細胞懸濁液中の細胞の総数を100%として、ナチュラルキラー細胞とT細胞の総数の割合を示し; 6番目の列「CD56⁺CD3^-」は、培養oNK細胞懸濁液中の細胞の総数を100%として、ナチュラルキラー細胞の割合を示し; 7列目の「CD56⁺CD2⁺」は、培養oNK細胞懸濁液中の細胞の総数を100%としたときの、ナチュラルキラー細胞とT細胞の総数の割合を示し; ナチュラルキラー細胞とマクロファージは CD16⁺ を示し (Pernick, N, 2018)、CD16 は抗体依存性細胞傷害 (ADCC) に関与しているため、 8列目の「CD16+」は、培養oNK細胞懸濁液中の細胞の総数を100%として、ADCC機能を有するナチュラルキラー細胞およびマクロファージの総数の割合を示し; 9 列目の「CD56⁺CD16⁺」は、培養 oNK 細胞懸濁液中のナチュラルキラー細胞 (すなわち、CD56⁺CD3^- 細胞) の総数を 100% として、ADCC 機能を持つナチュラルキラー細胞の割合を示す。

【0142】

表2の第1列目から第8列目の表示は表1と同じであり; 9列目の「死滅試験」に「u」マークが付いている場合は、培養oNK細胞懸濁液中の細胞の一定時点における細胞傷害機能を同時に試験し、細胞傷害機能を有することが確認されたことを示す。

【0143】

【表1】

【0144】

【表2】

【0145】

実施形態 1-1-3 培養細胞の活性化マーカー、抑制性マーカー、その他のNK細胞マーカーの検出
本実施例において、実施例1-1-1で開示した培養方法で９３日間培養して得られた細胞懸濁液（９３日培養ｏＮＫ細胞懸濁液という）を使用した。 93 日培養 oNK 細胞懸濁液中の細胞を 19 のグループに均等に割り当てた。 第1グループの細胞を遠心分離した。上清を除去し、 細胞をバッファーに再懸濁し、1 μLのCD56 蛍光標識抗体 (Cat. No. 318304、Biolegend、米国) 、1 μLのCD3 蛍光標識抗体 (Cat. No. 300410、Biolegend、米国) 、および1 μLのCD2 蛍光標識抗体 (Cat. No. 300222、Biolegend、米国)と混合し、 CD56 分子、CD3 分子、および/または CD2 分子を発現する細胞を同時に標識した。 最後に、セルソーターまたはフローサイトメーターを使用して、細胞がCD56分子、CD3分子、および/またはCD2分子を示すかどうかを分析し、様々な細胞表面メーカーを持つ細胞の割合を計算した。

【0146】

他の18グループの細胞を遠心分離した。 上清を除去し、 細胞をバッファーに再懸濁し、 次に、CD16蛍光標識抗体（Cat. No. 302016, Biolegend, 米国）、CD45蛍光標識抗体（Cat. No. 368512, Biolegend, 米国）、CD4蛍光標識抗体(Cat. No. 300514, Biolegend, 米国), CD8蛍光標識抗体(Cat. No. 344706, Biolegend, 米国), CD19蛍光標識抗体(Cat. No. 302210, Biolegend, 米国)、CD25蛍光標識抗体（Cat.No.302614, Biolegend, 米国）、NKp30蛍光標識抗体（Cat.No.325214, Biolegend, 米国）、NKG2D蛍光標識抗体（Cat.No.320812, Biolegend, 米国）、NKp44 蛍光標識抗体（Cat. No. 325116, Biolegend, 米国）、NKp46 蛍光標識抗体（Cat. No. 331916, Biolegend, 米国）、CD27 蛍光標識抗体（Cat. No. 47-0279-42, Invitrogen, 米国）、OX40 蛍光標識抗体（Cat. No. 350004, Biolegend, 米国）、CD107a 蛍光標識抗体（Cat. No. 328630, Biolegend, 米国）、NKG2A 蛍光標識抗体（Cat. No. FAB1059P, R&D Systems, 米国）、PD-1蛍光標識抗体（Cat.No.367406、Biolegend、米国）、TIGIT蛍光標識抗体（Cat.No.372704、Biolegend、米国）、SIRPα蛍光標識抗体（Cat.No.372104、Biolegend、米国）、およびCD158蛍光標識抗体（Cat.No.FAB1848P、R&D Systems、米国）とそれぞれ1μLずつ混合した。

【0147】

最後に、セルソーターを用いて、細胞がCD16レセプター、CD45マーカー、CD4マーカー、CD8マーカー、CD19マーカー、CD25マーカー、NKp30マーカー、NKG2Dマーカー、NKp44マーカー、NKp46マーカー、CD27マーカー、OX40マーカー、CD107aマーカー、NKG2Aマーカー、PD-1マーカー、TIGITマーカー、SIRPαマーカー、およびCD158マーカーを示すかどうかを分析した。

【0148】

これらのマーカーのうち、CD16、CD25、NKp30、NKG2D、NKp44、NKp46、CD107a は活性化マーカーであり、 一方、NKG2A、PD-1、TIGIT、SIRPα。 CD27、OX40、および CD158 は阻害マーカーである。 当業者の知識に基づいて、活性化マーカーの発現はNK細胞の抗腫瘍活性を増強し、一方、阻害マーカーの発現はNK細胞の機能阻害を増強する。

【0149】

表3を参照。 表３は、実施形態1-1-1で得られた細胞懸濁液中の細胞の活性化マーカー、抑制性マーカー、その他のＮＫ細胞マーカーの試験結果を示す。

【0150】

表3は、精製されたCD16+集団がCD56（98.0±0.2％）、CD2（99.5±0.2％）、CD45 (99.7±0.1%)、CD4 (0.8±0.3%)、CD3 (0.0±0.0%)、CD8 (0.0±0.0%)、CD19 (0.0±0.0%)、CD16 (85.7±7.0%)、CD25 (42.3±13.1%)、NKp30 (93.6±4.3%)、 NKG2D (46.1±17.4%)、 NKp44 (75.1±13.3%)、NKp46 (46.4±16.9%)、CD27 (0.62±0.08%)、OX40 (0.11±0.03%)、CD107a (96.1±4.3%)、NKG2A (0.14±0.15%)、PD-1 (27.0±19.4%)、TIGIT (4.3±6.5%)、SIRPα (3.2±3.0%)、および CD158 (0.4±0.3%)を発現することを示す。 精製されたCD16⁺細胞集団中のCD16受容体を発現する前述の細胞はすべて、分析後にCD3^-CD56⁺の特徴を持つ。 好ましくは、精製されたCD16+細胞集団においてCD16受容体を発現する前述の細胞は、CD2、CD45、およびCD4に対して陽性であり、CD8およびCD19に対して陰性である。CD4の陽性は予想外の結果であった。

【0151】

【表3】

【0152】

実施形態 1-1-4 トラスツズマブ複合体化ヒト CD16+ ナチュラル キラー細胞およびセツキシマブ複合体化ヒト CD16+ ナチュラル キラー細胞の調製
実施の形態1-1-1で開示した培養方法により16日間培養して得られた培養oNK細胞懸濁液（本発明の16日間培養oNK細胞懸濁液、16日間培養oNK細胞懸濁液と呼ばれる）を使用し、成分複合体化ヒトCD16+ナチュラルキラー細胞を調製した。相補的な細胞リンカーと成分リンカーを使用し、16日間培養したoNK細胞懸濁液中の細胞にトラスツズマブまたはセツキシマブなどの成分を結合させた後、トラスツズマブ複合体化ヒトCD16+ナチュラルキラー細胞懸濁液またはセツキシマブ複合体化ヒトCD16+ナチュラルキラー細胞懸濁液が得られた。

【0153】

成分（例：トラスツズマブ、セツキシマブ、リツキシマブ、アレムツズマブ、アベルマブ、ダラツムマブ、エロツズマブ、コドリツズマブ）を細胞（例えば、本実験における培養oNK細胞懸濁液中の全細胞、受託番号NITE BP-03017を有するNPMDに寄託されたヒトCD16+ナチュラルキラー細胞、他のナチュラルキラー細胞、ガンマデルタT細胞、他のTリンパ球、マクロファージ、または他の細胞傷害性細胞など）に結合させる手順は次の通りである: (A) 細胞-ssDNA結合体を調製するために、細胞リンカーを調製し、細胞リンカーを細胞に結合させる工程; (B) 成分-ssDNA結合体を調製するために、成分リンカーを調製し、成分リンカーを成分に結合する工程; (C) 成分複合体化ヒトCD16+ナチュラルキラー細胞または成分複合体化ヒトガンマデルタT細胞などの成分複合体細胞を調製するために、細胞-ssDNA結合体と成分-ssDNA結合体を混合して、細胞リンカーおよび成分リンカー上のその相補的配列を介して細胞-ssDNA結合体と成分-ssDNA結合体を組み合わせる。

【0154】

細胞リンカーを調製し、細胞リンカーを細胞に結合させるステップ（A）は、以下の工程（a1）～（a4）を含有する:
工程（ａ1） 第１の一本鎖ＤＮＡが得られ、第1の一本鎖DNAの配列は、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、またはSEQ ID NO：7であった。

【0155】

工程（a2） 第１の一本鎖ＤＮＡの５’末端を5'末端チオール修飾第1の一本鎖DNAとして修飾し、細胞リンカーストックを得た。 細胞リンカーストックはIntegrated DNA Technologies社からも市販されている。 実際の修飾方法は当業者には既知であるか、明らかとなるであろう(Zimmermann, J, 2010)。

【0156】

工程 (a3) 10～500μLの細胞リンカーストックと0.1～10μLのNHS-マレイミド(Fisher Scientificから市販)を混合し、1～60分間インキュベートした。

【0157】

工程(a4)に、 工程(a3)で得られた混合物を1 × 10⁶ ~ 1 × 10⁸個の細胞（例えば、培養oNK懸濁液中の培養oNK細胞を含む全細胞）と混合し、1 - 60 分間インキュベートし、細胞-ssDNA 結合体を得た。

【0158】

成分リンカーを調製し、成分リンカーを成分に結合する工程（Ｂ）は、以下の工程（b1）～（b4）を含有する:
工程（b1）第2の一本鎖DNAが得られ、ここで、第2の一本鎖DNAの配列は、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 6、またはSEQ ID NO: 8であり、第2の一本鎖DNAの配列は、第1の一本鎖DNAの相補鎖である。

【0159】

工程（b2） 第2の一本鎖DNAの5'末端を5'末端チオール修飾第2の一本鎖DNAとして修飾し、成分リンカーストックを得た。 細胞リンカーストックはIntegrated DNA Technologies社からも市販されている。 実際の修飾方法は当業者には既知であるか、明らかとなるであろう(Zimmermann, J, 2010)。

【0160】

Step (b3) 10～500μLの成分リンカーストックと0.1～10μLのNHS-マレイミド(Fisher Scientificから市販)を混合し、1～60分間インキュベートした。

【0161】

工程(b4)、工程 (b3)で得られた混合物を成分(ロシュから市販されている10～100μLの成分ストックなど)と混合し、10分～3時間インキュベートして、成分-ssDNA結合体を得た。.
細胞-ssDNA結合体および成分-ssDNA結合体を混合して、トラスツズマブ複合体化ヒトCD16+ナチュラルキラー細胞懸濁液中の細胞またはセツキシマブ複合体化ヒトCD16+ナチュラルキラー細胞懸濁液中の細胞などの成分複合体細胞を得た。

【0162】

実施形態 1-1-5 トラスツズマブ複合体化ヒトCD16+ナチュラルキラー細胞のトラスツズマブ反応性あるいはトラスツズマブ耐性ヒト乳癌細胞に対する細胞傷害性機能
本実施形態において、xCELLigence Real Time Cell Analysis System（xCELLigence RTCAシステム、ACEA Biosciences Inc.、米国）を使用して、標的細胞に対するエフェクター細胞の細胞傷害能力を検出した。 本実施形態は、細胞毒性試験を実施するために96ウェルのxCELLigence E-Plateを含有し、xCELLigence E-Plateのウェルはコントロールウェル、ACE1702 ET2実験ウェル、ACE1702 ET5実験ウェル、Ctrl-oNK ET2実験ウェル、Ctrl-oNK ET5実験ウェル、および標的細胞最大溶解コントロールウェルに分けられた。

【0163】

本実施形態で使用したエフェクター細胞は、37日間培養oNK細胞懸濁液中の細胞およびトラスツズマブ複合体化ヒトCD16+ナチュラルキラー細胞懸濁液中の細胞であり、トラスツズマブは、ハーセプチン（スイスのロシュ社より購入）という製品名を有するHER2タンパク質に対する抗体である。 標的細胞は、ヒト乳癌細胞株BT474（HTB-20、ATCCより購入）、またはBT474由来のトラスツズマブ耐性クローンBT474クローン5（CRL-3247、ATCCより購入）であった。 標的細胞 (BT474 または BT474 クローン 5) をコントロール ウェル、ACE1702 ET2 実験ウェル、ACE1702 ET5 実験ウェル、Ctrl-oNK ET2 実験ウェル、Ctrl-oNK ET5 実験ウェル、およびターゲット細胞最大溶解コントロール ウェルに播種し、20,000 個の標的細胞が各ウェルに十分に含まれている状態で 30 分間放置した。

【0164】

トラスツズマブ複合体化ヒトCD16+ナチュラルキラー細胞懸濁液（ACE1702）のサンプルを、ACE1702 ET2実験ウェルおよびACE1702 ET5実験ウェルに添加し、標的細胞（BT474またはBT474クローン5）数に対するエフェクター細胞数の比率をそれぞれ2および5とした。37 日間培養oNK 細胞懸濁液 (Ctrl-oNK) のサンプルを Ctrl-oNK ET2 実験ウェルおよび Ctrl-oNK ET5 実験ウェルに添加し、エフェクター細胞数と標的細胞数の比率 ( BT474 または BT474 クローン 5) もそれぞれ 2 と 5 でした。 標的細胞最大溶解コントロールウェル内のサンプルに10分の1等量の溶解バッファーを追加し、コントロールウェルにはサンプルまたは溶解バッファーが添加されていない。xCELLigence E-Plate を xCELLigence Real Time Cell Analysis System に設置し、37℃、5%二酸化炭素の条件下で細胞指数(CI)の変化をリアルタイムで検出した。

【0165】

xCELLigence E-Plateの底面に付着している標的細胞の数が多いほど、xCELLigenceReal Time Cell Analysis Systemによって検出される細胞指数は高くなる。 したがって、細胞指標を使用して、実験ウェル内で溶解された標的細胞の割合を換算することができる。

【0166】

細胞指数を実験ウェル内で溶解された標的細胞の割合に換算するために使用される式は次のとおりである:
溶解された標的細胞の割合 (%) = 1 - [(実験ウェルの細胞指標 - 標的細胞最大溶解コントロールウェルの細胞指標) ÷ (コントロールウェルの細胞指標 - 標的細胞最大溶解コントロールウェルの細胞指標] × 100%
図 1A および 1B を参照。図1Aは、トラスツズマブ応答性癌細胞（トラスツズマブ応答性ヒト乳癌細胞株BT474）を死滅させるための、トラスツズマブ複合体化ヒトCD16⁺ナチュラルキラー細胞と非複合体ヒトCD16⁺ナチュラルキラー細胞との間の細胞傷害機能の比較を示す棒グラフである。 図1Bは、トラスツズマブ耐性癌細胞（トラスツズマブ耐性ヒト乳癌細胞株BT474 クローン 5)を死滅させるための、トラスツズマブ複合体化ヒトCD16⁺ナチュラルキラー細胞と非複合体化ヒトCD16⁺ナチュラルキラー細胞との間の細胞傷害機能の比較を示す棒グラフである。 図1Aおよび1Bに示すように、ヒトCD16⁺ ナチュラルキラー細胞 (Ctrl-oNK) が トラスツズマブ反応性ヒト乳癌細胞株 BT474 とトラスツズマブ耐性ヒト乳がん細胞株 BT474 クローン 5 を死滅能力は類似していた。 予想外なことに、 トラスツズマブと複合体化ヒト CD16⁺ ナチュラルキラー細胞（ACE1702、トラスツズマブと複合体化したヒトCD16⁺ナチュラルキラー細胞）のトラスツズマブ応答性ヒト乳癌細胞株BT474 および トラスツズマブ耐性ヒト乳がん細胞株BT474クローン5に対する殺傷能力も同様であった。

【0167】

さらに図2を参照。 図2は、トラスツズマブ耐性癌細胞に対して、トラスツズマブ、ヒトCD16⁺ナチュラルキラー細胞、トラスツズマブと共培養したヒトCD16⁺ナチュラルキラー細胞、およびトラスツズマブと複合化したヒトCD16⁺ナチュラルキラー細胞の細胞傷害効果を示す棒グラフである。 図 2 に示すように、高用量のトラスツズマブ (4 μg) は少量のトラスツズマブ耐性癌細胞のみを死滅することができ、1.93 ng のトラスツズマブと共培養したヒト CD16⁺ ナチュラルキラー細胞の死滅効果は (Ctrl-oNK + 1.93 ng トラスツズマブ) 、ヒト CD16⁺ ナチュラル キラー細胞 (Ctrl-oNK) の効果よりも有意に高いわけではない。 予想外なことに、 1.93 ng のトラスツズマブと複合体化したヒトCD16⁺ ナチュラルキラー細胞 (ACE-oNK-HER2、1.93 ng のトラスツズマブと複合体化したヒト CD16⁺ ナチュラルキラー細胞) の死滅効果は、ヒト CD16⁺ ナチュラルキラー細胞(Ctrl- oNK)の死滅効果よりも有意に高く 、細胞毒性が約 2 倍増加した。 これは予想外の結果であり、トラスツズマブ複合体化ヒトCD16⁺ナチュラルキラー細胞におけるトラスツズマブとヒトCD16⁺ナチュラルキラー細胞が、トラスツズマブ耐性癌細胞の死滅において相乗効果を発揮することを示している。

【0168】

したがって、トラスツズマブとヒトCD16⁺ナチュラルキラー細胞（Ctrl-oNK）を複合体化することによって得られるトラスツズマブ複合体化ヒトCD16⁺ナチュラルキラー細胞(ACE1702)などの成分複合化細胞傷害性細胞は、耐性、難治性、非感受性、非反応性、または不十分な反応性を有する異常細胞を治療するために使用することができ、トラスツズマブ複合体ヒトCD16⁺ナチュラルキラー細胞（ACE1702）などの成分複合体細胞傷害性細胞は現在のFDA承認薬（FDA承認セツキシマブなど）に対して耐性、難治性、非感受性、非反応性、または不十分な反応性を有する異常細胞を治療できる薬物がないという問題を解決する。また、成分に対して耐性、難治性、非感受性、非反応性、または不十分な反応性を有する対象における成分の治療効果も改善できる。

【0169】

実施形態 1-1-6 セツキシマブ複合体化ヒトCD16⁺ナチュラルキラー細胞のセツキシマブ反応性あるいはセツキシマブ耐性ヒト結腸癌細胞に対する細胞傷害性機能
本実施例の実験方法は実施形態1-1-5とほぼ同様であるが、次の点が異なる:
(1) 本実験で使用したエフェクター細胞は、［１］16 日間培養した oNK 細胞懸濁液中の細胞であり、または［２］セツキシマブ複合体化ヒトCD16⁺ナチュラルキラー細胞懸濁液中の細胞であり、セツキシマブがアービタックス（Merck、Bristol-Myers-Squibbより購入）という製品名を有する上皮成長因子受容体（EGFR）に対する抗体である；および
(2) 本実験で使用した標的細胞は、［１］ 本実験で使用した標的細胞は、［１］セツキシマブ耐性のないヒト大腸腺癌細胞株HCC827-luc（JCRB1516、JCRBより購入）であり、または［２］ セツキシマブ耐性ヒト大腸腺癌細胞株HT-29（HTB-38、ATCCより購入）である。

【0170】

本発明の発明者らは次のことを期待している:
(1) ヒトCD16+ナチュラルキラー細胞（Ctrl-oNK）のセツキシマブ反応性ヒト肺腺癌細胞株HCC827-lucとセツキシマブ耐性ヒト大腸腺癌細胞株HT-29に対する死滅能力は同様であった。 予想外なことに、セツキシマブ反応性ヒト肺腺癌細胞株HCC827-lucおよびセツキシマブ耐性ヒト大腸腺癌細胞株HT-29に対するセツキシマブ複合体化ヒトCD16⁺ナチュラルキラー細胞の死滅能力も同様であった;
(2) セツキシマブは少量のセツキシマブ耐性癌細胞のみを死滅させることができ、セツキシマブと共培養したヒト CD16⁺ナチュラルキラー細胞(Ctrl-oNK + セツキシマブ) の死滅効果は、ヒトCD16⁺ ナチュラルキラー細胞(Ctrl-oNK)の効果よりも有意に高いわけではない。 予想外なことに、セツキシマブと複合体化したヒトCD16⁺ナチュラルキラー細胞の死滅効果は、ヒトCD16⁺ナチュラルキラー細胞（Ctrl-oNK）の死滅効果よりも有意に高い。これは予想外の結果であり、セツキシマブ複合体化ヒトCD16⁺ナチュラルキラー細胞におけるセツキシマブとヒトCD16⁺ナチュラルキラー細胞（Ctrl-oNK）がセツキシマブ耐性癌細胞の死滅において相乗効果を示す。

【0171】

したがって、セツキシマブとヒトCD16⁺ナチュラルキラー細胞（Ctrl-oNK）を複合体化することによって得られるセツキシマブ複合体化ヒトCD16⁺ナチュラルキラー細胞（Ctrl-oNK）などの成分複合体化細胞傷害性細胞は、耐性、難治性、非感受性、非反応性、または不十分な反応性を有する異常細胞を治療するために使用することができ、 現在のFDA承認薬（FDA承認セツキシマブなど）に対して耐性、難治性、非感受性、非反応性、または不十分な反応性を有する異常細胞を治療できる薬物がないという問題を解決する。また、成分に対して耐性、難治性、非感受性、非反応性、または不十分な反応性を有する対象における成分の治療効果も改善できる。

【0172】

実施形態 1-1-7 セツキシマブ複合体化ヒトCD16⁺ナチュラルキラー細胞のセツキシマブ反応性あるいはセツキシマブ耐性ヒト舌癌細胞に対する細胞傷害性機能
本実施例の実験方法は実施形態1-1-5とほぼ同様であるが、次の点が異なる:
(1) 本実験で使用したエフェクター細胞は、［１］56 日間培養した oNK 細胞懸濁液中の細胞であり、または［２］ セツキシマブ複合体化ヒトCD16+ナチュラルキラー細胞懸濁液中の細胞、および
(2) 本実験で使用した標的細胞は、［１］ セツキシマブに耐性のないヒト舌扁平上皮癌細胞株 HSC-4 (JCRB0264、JCRB より購入)であり、または［２］ セツキシマブ耐性ヒト舌扁平上皮癌細胞株SAS（JCRB0260、JCRBより購入）である。

【0173】

本発明の発明者らは次のことを期待している:
(1) ヒトCD16⁺ナチュラルキラー細胞（Ctrl-oNK）のセツキシマブ反応性ヒト舌扁平上皮癌細胞株HSC-4とセツキシマブ耐性ヒト舌扁平上皮癌細胞株SASに対する死滅能力は同様であった。 予想外なことに、セツキシマブ反応性ヒト舌扁平上皮癌細胞株HSC-4およびセツキシマブ耐性ヒト舌扁平上皮癌細胞株SASに対するセツキシマブ複合体化ヒトCD16⁺ナチュラルキラー細胞の死滅能力も同様であった;
(2) セツキシマブは少量のセツキシマブ耐性癌細胞のみを死滅させることができ、セツキシマブと共培養したヒトCD16⁺ナチュラルキラー細胞（Ctrl-oNK+セツキシマブ）の死滅効果は、ヒトCD16⁺ナチュラルキラー細胞（Ctrl-oNK）の効果より有意に高いわけではない。 予想外なことに、セツキシマブと複合化したヒトCD16⁺ナチュラルキラー細胞の死滅効果は、ヒトCD16⁺ナチュラルキラー細胞（Ctrl-oNK）の死滅効果よりも有意に高い。これは予想外の結果であり、セツキシマブ複合体化したヒトCD16⁺ナチュラルキラー細胞におけるセツキシマブとヒトCD16⁺ナチュラルキラー細胞（Ctrl-oNK）がセツキシマブ耐性癌細胞の死滅において相乗効果を示す。

【0174】

したがって、セツキシマブとヒトCD16⁺ナチュラルキラー細胞（Ctrl-oNK）を複合体化することによって得られるセツキシマブ複合体化ヒトCD16⁺ナチュラルキラー細胞（Ctrl-oNK）などの成分複合化細胞傷害性細胞は、耐性、難治性、非感受性、非反応性、または不十分な反応性を有する異常細胞を治療するために使用することができ、 現在のFDA承認薬（FDA承認セツキシマブなど）に対して耐性、難治性、非感受性、非反応性、または不十分な反応性を有する異常細胞を治療できる薬物がないという問題を解決する。また、成分に対して耐性、難治性、非感受性、非反応性、または不十分な反応性を有する対象における成分の治療効果も改善できる。

【0175】

実施形態 1-2: 成分反応性または成分耐性のがん細胞を死滅されるための成分複合体化ヒトガンマデルタT細胞の細胞傷害性機能
実施形態 1-2-1 ヒトガンマデルタT細胞の培養
末梢血単核球（PBMC）は、自己対象または同種異系対象から得られ、自己または同種異系対象は、健康な対象または癌患者であった。 好ましくは、PBMCは健康なドナーから得られたものである。

【0176】

5本のPBMCバイアル（バイアル番号：#1217-01、#1217-02、#1217L-01、1217L-02、および#1231、異なるドナーから得た）を37℃のウォーターバスに入れ、それぞれ細胞を解凍した。

【0177】

最低限の準備で、各バイアルの解凍末梢血単核球（PBMC）1mLを完全増殖培地9mLと混合し、それぞれ細胞を懸濁し、完全増殖培地はRPMI-1640ベース（Gibco、Sigma Aldrich、Biological Industries、STEMCELL Technologiesなどから市販）で、100~2500IU/mL(0.0612~1.53μg/mL)のヒトインターロイキン2(IL-2)を含む1%(v/v)~30%(v/v)のヒト血小板溶解物（StemCell Technologies、Sigma Aldrich、Milliporeなどから市販）を補足した。 細胞懸濁液を室温で400 x gで３～５分間遠心分離し、続いて上清を５ mLの新しい完全増殖培地と交換した。 5×106～200×106個の細胞を含む細胞懸濁液を培養容器例えば、T-75フラスコ、T-150フラスコ、T-225フラスコ、G-Rex培養装置など）に移し、培養容器の最大容量まで培地を満たした。 G-Rex培養装置は、底部に通気性と不透水性の膜を備え、十分に通気培養できる培養容器である。 培地には 1% ～ 30% のヒト血小板溶解物が補足され、0 日目に 200 ～ 3000 IU/mL のヒト IL-2 を含む 0.1 ～ 20μM のゾレドロネートが添加された。 2日目と4日目に、細胞培養に100～2500IU/mLのヒトIL-2を補充した。 7日目に、細胞培養を、1％～30％のヒト血小板溶解物を補足し、100～2500IU/mLのヒトIL-2含有新鮮な完全増殖培地に交換した。9日目と11日目に、100～2500IU/mLのヒトIL-2を細胞培養に補充した。 １０日目および１４日目に、培養細胞の各バッチ中のガンマデルタＴ細胞を含有する細胞懸濁液（「ガンマデルタＴ細胞懸濁液」と呼ばれる）を回収した。

【0178】

拡大増殖のために、細胞培養を100～2500 IU/mLのIL-2と1%～30%のヒト血小板溶解物を含む新鮮な完全増殖培地に交換される。同様の増殖手順は、新たに単離されたPBMC の大量培養でも実行できる。

【0179】

実施形態 1-2-2 培養細胞の細胞状態および細胞表面マーカーの検出
実施形態1-2-1で得られた細胞を、室温で400×gで3分間遠心分離した。 上清を除去し、細胞ペレットを再懸濁し、1mLのリン酸緩衝生理食塩水（DPBS）で洗浄した。 細胞懸濁液をもう一度遠心分離し、上清を除去した。 細胞ペレットをダルベッコリン酸緩衝生理食塩水 (DPBS) で再懸濁し、0.1 mL の細胞懸濁液 (5 x 105 細胞) を 1.5 mL エッペンドルフに分注した。 1マイクロリットルの蛍光色素FITC標識抗TCRVδ2抗体(BioLegend, #331406)およびPE-Cy5標識抗CD3抗体(BioLegend, #300410)を、一回分分注した細胞懸濁液と混合した。抗TCRδ2抗体および抗CD3抗体で染色された細胞を、室温で10分間遮光でPE標識マウス抗ヒトCD56（BioLegend, #304606）、マウス抗ヒトCD16（BioLegend, #331406）、マウス抗ヒトNKG2D（BioLegend, #320812）、 マウス抗ヒトNKp44（BioLegend, #325116）、マウス抗ヒトNKp46（BioLegend,#331916）、APC-Cy7標識抗CD107a（BioLegend, #328630）およびPE標識抗CD69（BioLegend, #310906）抗体で個別に染色した。さらに1回分分注した細胞懸濁液を、Alexa Fluor^Ｒ 488標識TCRαβ抗体（BioLegend、#306712）およびPE-Cy5標識CD3抗体で、光を避けながら室温で10分間染色した。 その後、細胞混合物を室温で400 x gで3分間遠心分離した。 上清を除去し、細胞ペレットを1mLのDPBSで再懸濁した。 遠心分離を繰り返し、0.5mLのDPBS再懸濁したTCRVδ2⁺/CD3⁺ゲートされた生細胞をフローサイトメトリーでCD56⁺、CD16⁺、NKG2D⁺、NKp44⁺、NKp46⁺、CD107a⁺およびCD69⁺集団の割合および/または平均蛍光強度について分析した。

【0180】

図3A~3Bおよび図4A~4Bを参照。 図3A~3B は、10 日目に収集されたガンマデルタT細胞のヒストグラムである。 図4A~4Bは、14日目に収集されたガンマデルタT細胞のヒストグラムである。

【0181】

図 3A、3B、4A、および 4BのPE標識マウス抗ヒトCD56抗体（BioLegend, #304606）とPE-Cy7標識マウス抗ヒトCD16抗体（BioLegend, #331406）、マウス抗ヒトNKG2D抗体（BioLegend, #320812）、マウス抗ヒトNKp44抗体 (BioLegend, #325116)、およびマウス抗ヒトNKp46抗体(BioLegend,#331916)の平均蛍光強度を細胞表面上の各受容体(CD56、CD16、NKG2D、NKp44、および NKp46)の平均数に変換するために、Quantum^ＴＭSimply Cellular^Ｒキットに由来する標準曲線を作成しました。Quantum^ＴＭSimply Cellular^Ｒ キットに、5本のマイクロスフェア（増加量の抗マウスIgG Fc抗体でコーティングされた「#1、#2、#3、および#4」の4つの集団、１つはコーティングされないブランク）がある。 #1、#2、#3、#4 を含む 10 マイクロリットルの抗マウス IgG Fc 抗体結合マイクロスフェアを、合計 0.1 mL の反応容量中、5 μg/mL の対応する抗体(PE標識マウス抗ヒトCD56、およびPE-Cy7標識マウス抗ヒトCD16、マウス抗ヒトNKG2D、マウス抗ヒトNKp44、またはマウス抗ヒトNKp46抗体）の 1 つと室温で個別に10分間インキュベートしました。 ブランクマイクロスフェアは対応する抗体なしでインキュベートした。 マイクロスフェアを0.5mLのDPBSで洗浄し、懸濁液を400×gで室温で5分間遠心分離した。上清を除去し、懸濁した QSC マイクロスフェアをフローサイトメトリーで分析した。 各マイクロスフェアの取得した平均蛍光強度値をメーカー提供の計算シート (QuickCal V2.3) の各列に挿入し、メーカーの指示に従って対応する標準曲線を作成した。標準曲線を作成した後（図 5A~5E 参照）、PE 標識マウス抗ヒト CD56とPE-Cy7 標識マウス抗ヒト CD16、マウス抗ヒト NKG2D、マウス抗ヒト NKp44、またはマウス抗ヒト NKp46 抗体で染色したγδT 細胞の平均蛍光強度値を QuickCal シートに挿入し、細胞表面の各受容体の対応する数に変換した（表 4 参照）。

【0182】

表4から表6まで、5つのγδT細胞バッチ（すなわち、#1217-01、#1217-02、#1217L-01、#1217L-02と#1231）をNK様マーカープロファイル解析にかけた。 表4では、PBMC由来のγδT細胞の5つのバッチを、前述の拡大培養手順で説明したように拡大培養した。 10 日目では、総Tリンパ球 (CD3+) 中のγδT細胞(CD3+TCRVδ2+) の割合は 50.28% から89.50% の範囲内であった。 14日目の総Tリンパ球中のγδT細胞の割合は32.84%～91.00%の範囲内にあった。 両日の総細胞に占める T 細胞の割合は 93.00% ～ 98.35% の範囲内にあった。ナチュラルキラー細胞（NK）様γδT細胞の細胞傷害機能に関しては、病原体認識受容体CD56、抗体依存性細胞傷害受容体CD16+、ヒト天然細胞傷害性受容体NKG2D⁺、NKp44⁺とNKp46⁺、脱顆粒マーカーCD107⁺、および早期活性化マーカーCD69⁺の発現が分析された。10日目、γδT細胞の5つのバッチにおけるCD56⁺、CD16⁺、NKG2D⁺、NKp44⁺およびNKp46⁺の集団の割合は、それぞれ28.25％～44.77％、28.43％～71.05％、97.79％～99.25％、17.22％～21.20％および17.00％～22.18％の範囲内であった。 これらの細胞バッチ上の表面受容体の平均数は、それぞれ45297 ～59450、8486 ～ 55095、30722 ～ 54176、8790 ～ 10943、および 7448 ～9171 であった。 CD107a⁺ 集団の割合は 1.40% ～ 7.05% の範囲内にあったが、#1231 における CD69⁺ 集団の割合は 35.63% であった。 14 日目、γδT細胞の5つのバッチにおける CD56⁺、CD16⁺、NKG2D⁺、NKp44⁺、および NKp46⁺ 集団の割合は、それぞれ28.82% ～ 56.49%、30.67% ～72.99%、96.19% ～ 97.38%、14.22% ～ 25.49%、および12.60%～24.95%である。これらの細胞バッチ上の表面受容体の平均数は、それぞれ32871 ～ 55575、11503 ～ 54094、28527 ～ 36013、9134 ～ 10306、および 7108 ～9392 であった。 CD107a⁺ 集団の割合は 0.76% ~ 3.61% の範囲内にあったが、#1231 における CD69⁺ 集団の割合は24.82%であった。

【0183】

表5では、PBMC由来γδT細胞の#1217-01、#1217-02、#1217L-01、#1217L-02および#1231バッチは、それぞれ10 日目と14 日目の総Tリンパ球におけるCD56⁺CD3^-(NK)集団の5.21%および7.23%以下を示した。 これら5つの細胞バッチは、総Tリンパ球中のCD3+Vαβ+ 集団の割合がそれぞれ 10 日目と14 日目に4.18% ～ 40.07%、および4.43% ～54.84% の範囲であった。

【0184】

In γδT集団サブセットには、ナイーブ集団 (CD45RA+CD27+)、中枢メモリー集団 (CD45RA-CD27+)、エフェクターメモリー集団 (CD45RA-CD27-)、および最終分化集団 (CD45RA+CD27-) がある。表 6 では、PBMC 由来 γδT細胞の #1217-01、#1217-02、#1217L-01、#1217L-02、および #1231 バッチには、10日目に、ナイーブ細胞が 8.72% ～ 36.91%、中枢メモリー細胞が 7.45% ～ 23.87% 、エフェクターメモリーが10.93%～38.64%、と最終分化集団が19.15%～52.02%を含まれた。 表 6 では、PBMC 由来 γδT細胞の #４、および #５ バッチには、10日目に、ナイーブ細胞が 8.72% ～ 36.91%、中央メモリー細胞が 7.45% ～ 23.87% 、エフェクターメモリーが10.93%～38.64%、と最終分化集団が19.15%～52.02%を含まれた。

【0185】

NK細胞傷害性受容体（CD56、CD16、NKG2D、NKp44とNKp46）および脱顆粒マーカー（CD107a）の発現は、NK様抗腫瘍活性を有するγδT細胞を増強し、一方、エフェクターメモリーと最終分化集団の増加は、γδT細胞が腫瘍の炎症性微小環境に局在するのに役立つ。 CD69の発現はγδT細胞の活性化を表す。

【0186】

本実験の γδT細胞がより多くの細胞傷害性受容体 (CD56、CD16、NKG2D、NKp44 および NKp46)、より多くの脱顆粒マーカー (CD107a)、とより多くの CD69 を発現していることを示している。

【0187】

【表4】

【0188】

【表5】

【0189】

【表6】

【0190】

実施形態 1-2-3 トラスツズマブ複合体ヒトガンマデルタT細胞、セツキシマブ複合体化ヒトガンマデルタT細胞、リツキシマブ複合体化ヒトガンマデルタT細胞、およびアベルマブ複合体化ヒトガンマデルタT細胞の調製
実施の形態1-2-1で開示した培養方法で14日間培養して得られたガンマデルタＴ細胞懸濁液（本発明の14日間ガンマデルタT細胞懸濁液、14日間ガンマデルタT細胞懸濁液と呼ばれる）を使用して、成分複合体化ヒトガンマデルタT細胞を調製した。 相補的な細胞リンカーと成分リンカーを使用して、トラスツズマブまたはセツキシマブなどの成分を14日間ガンマデルタT細胞懸濁液中の細胞に結合させた後、トラスツズマブ複合体化ヒトガンマデルタT細胞懸濁液、セツキシマブ複合体化ヒトガンマデルタT細胞懸濁液、リツキシマブ複合体化ヒトガンマデルタＴ細胞懸濁液、またはアベルマブ複合体化ヒトガンマデルタＴ細胞懸濁液が得られた。

【0191】

成分（例えば、トラスツズマブ、セツキシマブ、リツキシマブ、アレムツズマブ、アベルマブ、ダラツムマブ、エロツズマブ、コドリツズマブ）を細胞（例えば、本実験におけるガンマデルタT細胞懸濁液中の全細胞）に結合させる手順は、実施形態1-1-4と同様であった。

【0192】

細胞-ssDNA結合体と成分-ssDNA結合体を混合した後、トラスツズマブ複合体化ヒトガンマデルタT細胞懸濁液中の細胞、セツキシマブ複合体化ヒトガンマデルタT細胞懸濁液中の細胞、リツキシマブ複合体化ヒトガンマデルタT細胞懸濁液中の細胞、またはアベルマブ複合体化ヒトガンマデルタT細胞懸濁液中の細胞などの成分複合体化細胞を得た。

【0193】

実施形態 1-2-4 トラスツズマブ反応性またはトラスツズマブ耐性ヒト乳癌細胞を死滅させるトラスツズマブ複合体化ヒトガンマデルタT細胞の細胞傷害機能
本実施例の実験方法は実施形態1-1-5とほぼ同様であるが、次の点が異なる。 ［１］ 14日間のガンマデルタT細胞懸濁液中の細胞(Ctrl-gdT)）であり、または［２］ トラスツズマブ複合体化ヒトガンマデルタT細胞懸濁液(ACE-gdT-HER2)中の細胞である。

【0194】

図6Aと図6Bを参照。図6Aは、トラスツズマブ反応性癌細胞（トラスツズマブ反応性ヒト乳癌細胞株BT474）を死滅させるための、トラスツズマブ複合体化ヒトガンマデルタT細胞と非複合体化ヒトガンマデルタT細胞との間の細胞傷害機能の比較を示す棒グラフである。 図6Bは、トラスツズマブ耐性がん細胞（トラスツズマブ耐性ヒト乳癌細胞株BT474クローン5）を死滅させるための、トラスツズマブ複合体化ヒトガンマデルタT細胞と非複合体化ヒトガンマデルタT細胞との間の細胞傷害機能の比較を示す棒グラフである。 図6Aと6Bに示すように、ヒトガンマデルタT細胞（Ctrl-gdT）がトラスツズマブ反応性ヒト乳癌細胞株BT474とトラスツズマブ耐性ヒト乳癌細胞株BT474クローン5を死滅させる能力は同様であった。 予想外なことに、トラスツズマブ反応性ヒト乳癌細胞株BT474とトラスツズマブ耐性ヒト乳癌細胞株BT474クローン5に対するトラスツズマブ複合体化ヒトガンマデルタT細胞（ACE-gdT-HER2、トラスツズマブと複合体化したヒトガンマデルタT細胞）の死滅能力も同様であった。

【0195】

図1A、図1Bおよび図2と同様に、図6Aおよび図6Bの実験結果によれば、本発明者らは次のことを期待している:
トラスツズマブは少量のトラスツズマブ耐性癌細胞のみを死滅させることができ、トラスツズマブと共培養したヒトガンマデルタT細胞 (Ctrl-gdT + トラスツズマブ) の死滅効果は、ヒトガンマデルタT細胞( Ctrl-gdT)の効果よりも有意に高いわけではない。 予想外なことに、トラスツズマブと複合化したヒトガンマデルタT細胞（ACE-gdT-HER2、トラスツズマブと複合化したヒトガンマデルタT細胞）の死滅効果は、ヒトガンマデルタT細胞（Ctrl-gdT）の死滅効果よりも有意に高い。 これは予想外の結果であり、トラスツズマブ複合体化ヒトガンマデルタT細胞におけるトラスツズマブとヒトガンマデルタT細胞（Ctrl-gdT）が、トラスツズマブ耐性癌細胞の死滅において相乗効果を発揮することを示している。

【0196】

したがって、トラスツズマブとヒトガンマデルタT細胞 (Ctrl-gdT) を複合体化することで得られるトラスツズマブ複合体化ヒトガンマデルタT細胞 (ACE-gdT-HER2) などの成分複合体化細胞傷害性細胞は、耐性、難治性、非感受性、非反応性、または不十分な反応性を有する異常細胞を治療するために使用することができ、 トラスツズマブ複合体化ヒトガンマデルタT細胞などの成分複合体化細胞傷害性細胞は、現在の FDA 承認薬（FDA承認のトラスツズマブなど）に対して耐性、難治性、非感受性、非反応性、または不十分な反応性を有する異常細胞を治療できる薬物がないという問題を解決できる。また、成分に対して耐性、難治性、非感受性、非反応性、または不十分な反応性を有する対象における成分の治療効果を改善できる。

【0197】

実施形態 1-2-5 セツキシマブ反応性またはセツキシマブ耐性ヒト癌細胞を死滅されるためのセツキシマブ複合体化ヒトガンマデルタT細胞の細胞傷害性機能
本実施形態の実験方法は、実験-1-6とほぼ同様であるが、本実験で使用したエフェクター細胞は、［１］ 16日間のガンマデルタT細胞懸濁液内の細胞 (Ctrl-gdT)であり、または［２］ セツキシマブ複合体化ヒトガンマデルタT細胞懸濁液(ACE2016)中の細胞である。

【0198】

図７Ａは、セツキシマブ反応性癌細胞（セツキシマブ反応性ヒト腺癌細胞株HCC827）を死滅させるための、セツキシマブ複合体化ヒトガンマデルタＴ細胞と非複合体化ヒトガンマデルタＴ細胞との間の細胞傷害性機能の比較を示す棒グラフである。図7Bは、セツキシマブ耐性癌細胞（セツキシマブ耐性ヒト結腸直腸腺癌細胞株HT-29）を死滅させるための、セツキシマブ複合体化ヒトガンマデルタＴ細胞と非複合体化ヒトガンマデルタＴ細胞との間の細胞傷害性機能の比較を示す棒グラフである。 図7Aおよび7Bに示すように、ヒトガンマデルタT細胞（Ctrl-gdT）のセツキシマブ反応性ヒト腺癌細胞株HCC827およびセツキシマブ耐性ヒト結腸直腸腺癌細胞株HT-29に対する死滅能力は同様であった。 予想外なことに、セツキシマブ複合体化ヒトガンマデルタT細胞 (ACE2016、セツキシマブと複合体化したヒトガンマデルタT細胞) の、セツキシマブ反応性ヒト腺癌細胞株 HCC827 およびセツキシマブ耐性ヒト結腸直腸腺癌細胞株 HT-29 に対する死滅能力も同様であった。

【0199】

図1A、図1Bおよび図2と同様に、図7Aおよび図7Bの実験結果によれば、本発明者らは以下のことを期待している:
セツキシマブは少量のセツキシマブ耐性癌細胞のみを死滅させることができ、セツキシマブと共培養したヒトガンマデルタT細胞 (Ctrl-gdT + セツキシマブ) の死滅効果は、ヒトガンマデルタT細胞( Ctrl-gdT)の効果よりも有意に高いわけではない。 予想外なことに、セツキシマブと複合体化したヒトガンマデルタT細胞 (ACE2016、セツキシマブと複合体化したヒトガンマデルタT細胞) の死滅効果は、ヒトガンマデルタT細胞 (Ctrl-gdT) の死滅効果よりも有意に高い。 これは予想外の結果であり、セツキシマブ複合体化ヒトガンマデルタT細胞におけるセツキシマブとヒトガンマデルタT細胞（Ctrl-gdT）が、セツキシマブ耐性癌細胞の死滅において相乗効果を発揮することを示している。

【0200】

したがって、セツキシマブとヒトガンマデルタT細胞（Ctrl-gdT）を複合体化することによって得られるセツキシマブ複合体化ヒトガンマデルタT細胞などの成分複合体化細胞傷害性細胞は、耐性、難治性、非感受性、非応答性 、または不十分な反応性を有する異常細胞を治療するために使用することができ、セツキシマブ複合体化ヒトガンマデルタT細胞などの成分複合体化細胞傷害性細胞は、現在の FDA 承認薬（FDA承認のセツキシマブなど）に対して耐性、難治性、非感受性、非反応性、または不十分な反応性を有する異常細胞を治療できる薬物がないという問題を解決できる。また、成分に対して耐性、難治性、非感受性、非反応性、または不十分な反応性を有する対象における成分の治療効果を改善できる。

【0201】

実施形態 1-2-6 セツキシマブ反応性またはセツキシマブ耐性ヒト舌癌細胞を死滅させるためのセツキシマブ複合体化ヒトガンマデルタT細胞の細胞傷害機能
本実施形態の実験方法は、実施形態1-1-7とほぼ同様であるが、本実験で使用したエフェクター細胞は、 ［１］ 16日間のガンマデルタT細胞懸濁液中の細胞であり、または ［２］ セツキシマブ複合体化ヒトガンマデルタT細胞懸濁液中の細胞である。

【0202】

本発明者らは以下のことを期待している:
(1) ヒトガンマデルタT細胞 (Ctrl-gdT) がセツキシマブ反応性ヒト舌扁平上皮癌細胞株 HSC-4 とセツキシマブ耐性ヒト舌扁平上皮癌細胞株 SAS に対する死滅能力は同様であった。 予想外なことに、セツキシマブ複合体化ヒトガンマデルタT細胞の、セツキシマブ反応性ヒト舌扁平上皮癌細胞株HSC-4およびセツキシマブ耐性ヒト舌扁平上皮癌細胞株SASに対する死滅能力も同様であった;
(2) セツキシマブは少量のセツキシマブ耐性癌細胞のみを死滅させることができ、セツキシマブと共培養したヒトガンマデルタT細胞 (Ctrl-gdT + セツキシマブ) の死滅効果は、ヒトガンマ デルタT細胞( Ctrl-gdT)の効果よりも有意に高いわけではない。予想外なことに、セツキシマブと複合体化したヒトガンマデルタT 細胞の死滅効果は、ヒトガンマデルタT細胞 (Ctrl-gdT) の死滅効果よりも有意に高い。これは予想外の結果であり、セツキシマブ複合体化ヒトガンマデルタT細胞におけるセツキシマブとヒトガンマデルタT細胞（Ctrl-gdT）が、セツキシマブ耐性癌細胞の死滅において相乗効果を発揮することを示している。

【0203】

したがって、セツキシマブとヒトガンマデルタT細胞（Ctrl-gdT）を複合体化することによって得られるセツキシマブ複合体化ヒトガンマデルタT細胞などの成分複合体化細胞傷害性細胞は、耐性、難治性、非感受性、非反応性 、または不十分な反応性を有する異常細胞を治療するために使用することができ、セツキシマブ複合体化ヒトガンマデルタT細胞などの成分複合体化細胞傷害性細胞は、現在の FDA 承認薬（FDA承認のセツキシマブなど）に対して耐性、難治性、非感受性、非反応性、または不十分な反応性を有する異常細胞を治療できる薬物がないという問題を解決できる。また、成分に対して耐性、難治性、非感受性、非反応性、または不十分な反応性を有する対象における成分の治療効果を改善できる。

【0204】

実施形態 1-2-7 リツキシマブ反応性またはリツキシマブ耐性ヒトリンパ腫細胞を死滅させるリツキシマブ複合体ヒトガンマデルタT細胞の細胞傷害性機能
この実施形態では、CellTiter-Glo^Ｒ発光細胞生存率アッセイ（Promega、米国）を使用して、標的細胞に対する培養エフェクター細胞の細胞傷害性能力を検出する。 まず、CELLSTAR^Ｒ 96ウェルプレート（Cat.No.655083、Greinerより購入）のウェルを以下のように分割した:
(1) 標的コントロールウェル、
(2) リツキシマブ基礎ウェル、
(3) リツキシマブと標的実験ウェル、
(4) Ctrl-gdT 基礎ウェル、
(5) Ctrl-gdT と標的実験ウェル、
(6) Ctrl-gdTとリツキシマブ基礎ウェル、
(7) Ctrl-gdTとリツキシマブおよび標的細胞実験ウェル、
(8) ACE-gdT基底ウェル、および
(9) ACE-gdTと標的細胞実験ウェル。

【0205】

本実験で使用したエフェクター細胞は ［１］ 16日間のガンマデルタT細胞懸濁液中の細胞であり、または［２］ リツキシマブ複合体化ヒトガンマデルタT細胞懸濁液中の細胞であり、 リツキシマブは、製品名がMabtheraであるCD20タンパク質に対する抗体である(Creative BioLabs、Roche、Amgen、Pfizerより購入)。

【0206】

本実験で使用した標的細胞は、 ［１］ リツキシマブに耐性のない懸濁ヒトバーキットリンパ腫細胞株Raji（CCL-86、ATCCより購入）であり、または ［２］リツキシマブ耐性ヒトリンパ腫細胞株Raji-2R80（本発明の発明者らは、Rajiからこのリツキシマブ耐性クローンRaji-2R80を樹立した）であり; リツキシマブ耐性クローンの開発方法は、当業者には公知であるか、または明らかであろうが、例えば、参考文献 (1) Czuczman et al. Clin. Cancer Res. (2008); 14:1561.-1570 (10.1158/1078-0432.CCR-07-1254); あるいは (2) Jazirehi et al. Cancer Res. (2007); 67:1270-1281 (10.1158/0008-5472.CAN-06-2184)にしたがって開発する。

【0207】

標的細胞 (Raji または Raji-2R80 細胞) が以下のウェルを播種した：
標的コントロールウェル
リツキシマブと標的実験ウェル
Ctrl-gdTと標的実験ウェル、
Ctrl-gdTとリツキシマブおよび標的細胞実験ウェル、および
ACE-gdTと標的細胞実験ウェル、
各ウェルに5000個の標的細胞が含まれるようにした。

【0208】

リツキシマブ複合体化ヒトガンマデルタT細胞懸濁液(ACE-gdT-CD20)のサンプルを、以下のように添加した:
ACE-gdT基礎ウェル、および
ACE-gdTと標的細胞の実験ウェル、
エフェクター細胞数と標的細胞（RajiまたはRaji-2R80細胞）数の比率がそれぞれ2、5、または10になるようにした。

【0209】

16日間のガンマデルタT細胞懸濁液（Ctrl-gdT）のサンプルを、以下のように加えた:
Ctrl-gdT基底ウェル、
Ctrl-gdTと標的実験ウェル、
Ctrl-gdTとリツキシマブ基礎ウェル、および
Ctrl-gdTとリツキシマブおよび標的細胞の実験ウェル、
エフェクター細胞数と標的細胞（RajiまたはRaji-2R80細胞）数の比率がそれぞれ2、5、または10になるようにした。

【0210】

0.8、2、または4 ngのリツキシマブをそれぞれ「Ctrl-gdTとリツキシマブ基礎ウェル」、および「Ctrl-gdTとリツキシマブおよび標的細胞実験ウェル」に添加した。 したがって、「Ctrl-gdT とリツキシマブ基礎ウェル」内のリツキシマブの量は、「ACE-gdT 基礎ウェル」内の細胞に結合したリツキシマブの総量とそれぞれ同じであり、エフェクター細胞数と標的細胞数の比率が2、5、または 10 でした。 「Ctrl-gdTおよびリツキシマブおよび標的細胞実験ウェル」内のリツキシマブの量は、「ACE-gdTおよび標的細胞実験ウェル」内の細胞に結合したリツキシマブの総量とそれぞれ同じであり、エフェクター細胞数と標的細胞数の比率が2、5、または 10 でした。

【0211】

CELLSTAR^Ｒ 96ウェルプレートを37℃、5% CO2で4時間インキュベートした。 培養4時間後、培養液を50uLのCellTiter-Glo^Ｒ 基質（CellTiter-Glo^Ｒ発光細胞生存率アッセイキット（Promega, Cat. G7570） と混合し、光を当てずに室温で12分間インキュベートした。 各ウェルの発光をルミネッセンスプレートリーダー（Synergy H1、BioTek Instruments、米国）によって測定および記録した。

【0212】

ウェルに残存する生細胞数が多いほど、Synergy H1システムで検出される発光は高くなる。 したがって、発光を利用して、実験ウェル内で溶解された標的細胞の割合を換算することができる。 発光を実験ウェル内で溶解された標的細胞の割合に変換するために使用する式は次のとおりである:
「リツキシマブと標的実験ウェル」における標的細胞の溶解率 (%) = 1 - [(リツキシマブと標的実験ウェルの発光 - リツキシマブ基礎ウェルの発光) ÷ (標的コントロールウェルの発光)] × 100%
「Ctrl-gdTと標的実験ウェル」における標的細胞の溶解率 (%) = 1 - [(Ctrl-gdTと標的実験ウェルの発光 - Ctrl-gdT基底ウェルの発光) ÷ (標的コントロールウェルの発光)] × 100%
「Ctrl-gdT とリツキシマブおよび標的細胞の実験ウェル」における溶解された標的細胞の割合 (%) = 1 - [(Ctrl-gdT とリツキシマブおよび標的細胞実験ウェルの発光 - Ctrl-gdT とリツキシマブ基礎ウェルの発光) ÷ (標的コントロールウェルの発光)] × 100%
「ACE-gdTと標的細胞実験ウェル」における溶解された標的細胞の割合 (%) = 1 - [(ACE-gdTと標的細胞実験ウェルの発光 - ACE-gdT 基礎ウェルの発光) ÷ (標的コントロールウェルの発光)] × 100%
本発明の発明者らは次のことを期待している:
(1) ヒトガンマデルタT細胞 (Ctrl-gdT) がリツキシマブ反応性 Raji 細胞とリツキシマブ耐性 Raji-2R80 細胞に対する死滅能力は同様であった。 予想外なことに、リツキシマブ複合体化ヒトガンマデルタT細胞の、リツキシマブ反応性 Raji 細胞およびリツキシマブ耐性 Raji-2R80 細胞に対する死滅能力も同様であった;
(2) リツキシマブは少量のリツキシマブ耐性癌細胞のみを死滅させることができ、リツキシマブと共培養したヒトガンマデルタT細胞 (Ctrl-gdT + リツキシマブ) の死滅効果は、ヒトガンマ デルタT細胞( Ctrl-gdT)の効果よりも有意に高いわけではない。 予想外なことに、リツキシマブと複合体化したヒトガンマデルタT細胞の死滅効果は、ヒトガンマデルタT細胞 (Ctrl-gdT) の死滅効果よりも有意に高い。これは予想外の結果であり、リツキシマブ複合体化ヒトガンマデルタT細胞におけるリツキシマブとヒトガンマデルタT細胞（Ctrl-gdT）が、リツキシマブ耐性癌細胞の死滅において相乗効果を発揮することを示している。

【0213】

したがって、リツキシマブとヒトガンマデルタT細胞（Ctrl-gdT）を複合体化することによって得られるリツキシマブ複合体化ヒトガンマデルタT細胞などの成分複合体化細胞傷害性細胞は、耐性、難治性、非感受性、非応答性、または不十分な応答性を有する異常細胞の治療に使用でき、リツキシマブ複合体化ヒトガンマデルタT細胞などの成分複合体化細胞傷害性細胞は、現在の FDA 承認薬 (FDA 承認リツキシマブなど) に対して耐性、難治性、鈍感性、非反応性、または不十分な反応性を有する異常細胞を治療できる薬物がないという問題を解決できる。また、成分に対して耐性、難治性、非感受性、非反応性、または不十分な反応性を有する対象における成分の治療効果を改善できる。

【0214】

実施形態 1-2-8 正常細胞またはリツキシマブ耐性ヒトリンパ腫細胞を死滅させるリツキシマブ複合体化ヒトガンマデルタT細胞の細胞傷害機能
実施形態の実験方法は、実施形態1-2-7とほぼ同様であるが、次の点が異なる。本実験で使用した標的細胞は、 ［１］ リツキシマブに耐性のないヒトリンパ腫細胞株 Daudi (CCL-213、ATCC より購入)であり、または ［２］ リツキシマブ耐性ヒトリンパ腫細胞株Daudi-RR（本発明の発明者らは、Daudiからこのリツキシマブ耐性クローンDaudi-RRを樹立した）であり; リツキシマブ耐性クローンを開発する方法は、当業者には公知であるか、または明らかであろうか、例えば、参考文献 (1) Czuczman et al. Clin. Cancer Res. (2008); 14:1561-1570 (10.1158/1078-0432.CCR-07-1254); または (2) Jazirehi et al. Cancer Res. (2007); 67:1270-1281 (10.1158/0008-5472.CAN-06-2184) にしたがって開発する。

【0215】

本発明の発明者らは次のことを期待している:
(1) ヒトガンマデルタT細胞 (Ctrl-gdT) がリツキシマブ反応性 Daudi 細胞とリツキシマブ耐性Daudi-RR 細胞に対する死滅能力は同様であった。 予想外なことに、リツキシマブ複合体化ヒトガンマデルタT細胞の、リツキシマブ反応性Daudi 細胞およびリツキシマブ耐性Daudi-RR 細胞に対する死滅能力も同様であった;
(2) リツキシマブは少量のリツキシマブ耐性癌細胞のみを死滅させることができ、リツキシマブと共培養したヒトガンマデルタT細胞 (Ctrl-gdT + リツキシマブ) の死滅効果は、ヒトガンマデルタT細胞( Ctrl-gdT)の効果よりも有意に高いわけではない。 予想外なことに、リツキシマブと複合体を形成したヒトガンマデルタT細胞の死滅効果は、ヒトガンマデルタT細胞 (Ctrl-gdT) の死滅効果よりも有意に高い。これは予想外の結果であり、リツキシマブ複合体化ヒトガンマデルタT細胞におけるリツキシマブとヒトガンマデルタT細胞（Ctrl-gdT）が、リツキシマブ耐性癌細胞の死滅において相乗効果を発揮することを示している。

【0216】

したがって、リツキシマブとヒトガンマデルタT細胞（Ctrl-gdT）を複合体化することによって得られるリツキシマブ複合体化ヒトガンマデルタT細胞などの成分複合体細胞傷害性細胞は、耐性、難治性、非感受性、非応答性、または不十分な応答性を有する異常細胞の治療に使用でき、 リツキシマブ複合体化ヒトガンマデルタT細胞などの成分複合体化細胞傷害性細胞は、現在の FDA 承認薬 (FDA 承認リツキシマブなど) に対して耐性、難治性、非感受性、非反応性、または不十分な反応性を有する異常細胞を治療できる薬物がないという問題を解決できる。また、成分に対して耐性、難治性、非感受性、非反応性、または不十分な反応性を有する対象における成分の治療効果を改善できる。

【0217】

実施形態 1-2-9 アベルマブ反応性またはアベルマブ耐性ヒト乳癌細胞を死滅させるための、アベルマブ複合体化ヒトガンマデルタT細胞の細胞傷害性機能
実施形態の実験方法は、実施形態1-2-7とほぼ同様であるが、次の点が異なる:
(1) 本実験で使用したエフェクター細胞は、 ［１］ 16日間のガンマデルタT細胞懸濁液中の細胞、または［２］ アベルマブ複合体化ヒトガンマデルタT細胞懸濁液中の細胞であって、アベルマブがバベンシオ^Ｒ（Merck KGaA, Pfizer社より購入）という製品名を有するPD-L1タンパク質に対する抗体である、および
(2) 本実験で使用した標的細胞は ［１］ アベルマブに耐性のないヒト乳癌細胞株MDA-MB-231（HTB-26、ATCCより購入）であり、または ［２］ アベルマブ耐性ヒト乳癌細胞株 MDA-MB-468 (HTB-132、ATCC より購入)である。

【0218】

本発明の発明者らは次のことを期待している:
(1) ヒトガンマデルタT細胞 (Ctrl-gdT) がアベルマブ反応性ヒト乳癌細胞株 MDA-MB-231 とアベルマブ耐性ヒト乳癌細胞株 MDA-MB-468 を死滅させる能力は同様であった。ヒトガンマデルタT細胞 (Ctrl-gdT) がアベルマブ反応性ヒト乳癌細胞株 MDA-MB-231 とアベルマブ耐性ヒト乳癌細胞株 MDA-MB-468 を死滅させる能力は同様であった;
(2) アベルマブは少量のアベルマブ耐性癌細胞のみを死滅させることができ、アベルマブと共培養したヒトガンマデルタT細胞 (Ctrl-gdT + アベルマブ) の死滅効果は、ヒトガンマデルタT細胞( Ctrl-gdT)の効果よりも有意に高い。 予想外なことに、アベルマブと複合体を形成したヒトガンマデルタT細胞の死滅効果は、ヒトガンマデルタT細胞 (Ctrl-gdT) の死滅効果よりも有意に高い。 これは予想外の結果であり、アベルマブ複合体化ヒトガンマデルタT細胞におけるアベルマブとヒトガンマデルタT細胞（Ctrl-gdT）が、アベルマブ耐性癌細胞の死滅において相乗効果を発揮することを示している。

【0219】

したがって、アベルマブとヒトガンマデルタT細胞 (Ctrl-gdT) を複合体化することによって得られるアベルマブ複合体化ヒトガンマデルタT細胞などの成分複合体化細胞傷害性細胞は、耐性、難治性、非感受性、非応答性、または不十分な応答性を有する異常細胞の治療に使用でき、アベルマブ複合体化ヒトガンマデルタT細胞などの成分複合体細胞傷害性細胞は、現在の FDA 承認薬(FDA 承認アベルマブなど) に対して耐性、難治性、非感受性、非反応性、または不十分な反応性を有する異常細胞を治療できる薬物がないという問題を解決できる。また、成分に対して耐性、難治性、非感受性、非反応性、または不十分な反応性を有する対象における成分の治療効果を改善できる。

【0220】

実施形態 1-2-10 正常またはアベルマブ耐性ヒト肺癌細胞を死滅させるための、アベルマブ複合体化ヒトガンマデルタT細胞の細胞傷害性機能
本実施形態の実験方法はて実施形態1-2-9とほぼ同様であるが、次の点が異なる: 本実験で使用した標的細胞は、 ［１］ アベルマブに耐性のないヒト肺がん細胞株 H1650 (CRL-5883、ATCC より購入)であり、または ［２］ アベルマブ耐性ヒト肺癌細胞株H2087（CRL-5922、ATCCより購入）である。

【0221】

本発明の発明者らは次のことを期待している:
(1) ヒトガンマデルタT細胞 (Ctrl-gdT) がアベルマブ反応性ヒト肺癌細胞株 H1650 とアベルマブ耐性ヒト肺癌細胞株 H2087 を死滅させる能力は同様であった。 予想外なことに、アベルマブ複合体化ヒトガンマデルタT細胞の正常ヒト肺癌細胞株H1650 およびアベルマブ耐性ヒト肺癌細胞株 H2087 に対する死滅能力も同様であった;
(2) アベルマブは少量のアベルマブ耐性癌細胞のみを死滅させることができ、アベルマブと共培養したヒトガンマデルタT細胞 (Ctrl-gdT + アベルマブ) の死滅効果は、ヒトガンマデルタT 細胞 ( Ctrl-gdT)の効果よりも有意に高い。 予想外なことに、アベルマブと複合体を形成したヒトガンマデルタT細胞の死滅効果は、ヒトガンマデルタT細胞 (Ctrl-gdT) の死滅効果よりも有意に高い。 これは予想外の結果であり、アベルマブ複合体化ヒトガンマデルタT細胞におけるアベルマブとヒトガンマデルタT細胞（Ctrl-gdT）が、アベルマブ耐性癌細胞の死滅において相乗効果を発揮することを示している。

【0222】

したがって、アベルマブとヒトガンマデルタT細胞 (Ctrl-gdT) を複合体化することによって得られるアベルマブ複合体化ヒトガンマデルタT細胞などの成分複合体化細胞傷害性細胞は、耐性、難治性、非感受性、非応答性、または不十分な応答性を有する異常細胞の治療に使用でき、アベルマブ複合体化ヒトガンマデルタT細胞などの成分複合体細胞傷害性細胞は、現在の FDA 承認薬(FDA 承認アベルマブなど) に対して耐性、難治性、非感受性、非反応性、または不十分な反応性を有する異常細胞を治療できる薬物がないという問題を解決できる。また、成分に対して耐性、難治性、非感受性、非反応性、または不十分な反応性を有する対象における成分の治療効果を改善できる。

【0223】

実施形態 2: 成分反応性または成分耐性標的細胞との共培養後の成分複合体化細胞傷害性細胞の活性化マーカーおよび細胞傷害性分子の発現
CD107aは活性化マーカーであり、IFN-γ、TNF-α、グランザイムBは細胞傷害性分子である。 したがって、細胞傷害性細胞におけるCD107a、IFN-γ、TNF-α、およびグランザイムBの発現は、細胞傷害性細胞の活性化状態を示すために使用される。

【0224】

実施形態 2-1: 成分反応性または成分耐性標的細胞と共培養した後の成分複合体化ヒトCD16⁺ナチュラルキラー細胞の活性化マーカーおよび細胞傷害性分子の発現
実施形態 2-1-1 トラスツズマブ反応性またはトラスツズマブ耐性ヒト乳癌細胞との共培養後のトラスツズマブ複合体化ヒトCD16⁺ナチュラルキラー細胞の活性化マーカーおよび細胞傷害性分子の発現
本実施形態は、細胞毒性試験を実施するための96ウェル細胞培養プレートを含有し、96ウェル細胞培養プレート内のウェルは、ACE1702 ET2実験ウェル、ACE1702 ET5実験ウェル、ACE1702 ET10実験ウェル、Ctrl-oNK ET2実験ウェル、 Ctrl-oNK ET5実験ウェル、Ctrl-oNK ET10実験ウェル、Ctrl-oNKとトラスツズマブET2実験ウェル、Ctrl-oNKとトラスツズマブET5実験ウェル、Ctrl-oNKとトラスツズマブET10実験ウェル、標的コントロールウェル、培地バックグラウンドコントロールウェルに分けた。

【0225】

本実施形態で使用したエフェクター細胞は、32日間培養したoNK細胞懸濁液中の細胞、またはトラスツズマブ複合体化ヒトCD16+ナチュラルキラー細胞懸濁液中の細胞であり、 標的細胞は、接着性ヒト乳癌細胞株である感受性 BT-474 (HTB-20、ATCC より購入) または耐性BT-474クローン5細胞株 (CRL-3247、ATCC より購入) であった。

【0226】

BT-474またはBT-474クローン5標的細胞を、ACE1702 ET2実験ウェル、ACE1702 ET5実験ウェル、ACE1702 ET10実験ウェル、Ctrl-oNK ET2実験ウェル、Ctrl-oNK ET5実験ウェル、 Ctrl-oNK ET10実験ウェル、Ctrl-oNKとトラスツズマブET2実験ウェル、Ctrl-oNKとトラスツズマブET5実験ウェル、Ctrl-oNKとトラスツズマブET10実験ウェル、および標的コントロールウェルに播種した; したがって、各ウェルには10000個の標的細胞が含まれ、30分間静置した後、細胞培養プレートを37℃、5％二酸化炭素の条件下で 2 時間インキュベートした。

【0227】

16日間培養したoNK細胞懸濁液（Ctrl-oNK）またはトラスツズマブ複合体化ヒトCD16+ナチュラルキラー細胞懸濁液（ACE1702）のサンプルを、ACE1702 ET2実験ウェル、ACE1702 ET5実験ウェル、ACE1702 ET10実験ウェル、 Ctrl-oNK ET2実験ウェル、Ctrl-oNK ET5実験ウェル、Ctrl-oNK ET10実験ウェル、Ctrl-oNKとトラスツズマブET2実験ウェル、Ctrl-oNKとトラスツズマブET5実験ウェル、Ctrl-oNKとトラスツズマブET10実験ウェルに添加し、 標的細胞（ターゲット細胞）数に対するエフェクター細胞数の比率は、2、5、10であった。細胞培養プレートを37℃、5%二酸化炭素の条件でインキュベーターに5時間置いた。

【0228】

96ウェル細胞培養プレートを400 x gで5分間遠心分離した。 上清を除去し、細胞ペレットを0.2mLのDPBSで洗浄した。 洗浄した細胞ペレットを、FITC-抗ヒトTNF-α抗体（BioLegend, Cat.502906）、抗PE-抗ヒトCD56抗体（BioLegend, Cat.）、PE/Cy7-抗ヒトIFN^γ抗体（BioLegend, Cat.502528） 、Alexa Fluor 647-抗ヒトグランザイム B 抗体 (BioLegend, Cat.)、および APC-Cy7-抗ヒト CD107a 抗体(BioLegend, Cat.328630)をを 1:50 希釈で含む 100 uL の DPBS で 10 分間染色しました。 染色した細胞を遠心分離し、0.2mLのDPBSで洗浄した。 洗浄した細胞を0.5 mLのDPBSで再懸濁し、さらにCD56陽性ゲート集団をTNF-α+、IFN-γ+、グランザイムB+、およびCD107a+の割合についてさらに分析した。 CD56 陽性ゲート集団の平均蛍光強度も分析した。

【0229】

本発明の発明者らは次のことを期待している：
(1) BT-474癌細胞またはBT-474クローン5癌細胞と共培養すると、ヒトCD16⁺ナチュラルキラー細胞（Ctrl-oNK）は少量のTNF-α、IFN-γ、グランザイムBおよびCD107aのみ発現する。

【0230】

(2) トラスツズマブを添加してBT-474癌細胞と共培養すると、ヒトCD16+ナチュラルキラー細胞（Ctrl-oNK）はより多くのTNF-α、IFN-γ、グランザイムBおよびCD107aを発現する。 しかしながら、トラスツズマブを添加した BT-474 クローン 5 癌細胞と共培養した場合、ヒト CD16+ ナチュラルキラー細胞 (Ctrl-oNK) は、トラスツズマブを添加したBT-474癌細胞と共培養した場合ほど多くの TNF α、IFN γ、グランザイム B および CD107a を発現しなかった。 この結果は、BT-474細胞の場合、トラスツズマブの添加によりヒトCD16+ナチュラルキラー細胞（Ctrl-oNK）が高度に活性化され、抗体依存性細胞傷害性（ADCC）などのメカニズムによりBT-474腫瘍細胞を破壊できることを示している。 しかしながら、BT-474クローン5細胞の場合、トラスツズマブを添加しても、ヒトCD16+ナチュラルキラー細胞（Ctrl-oNK）を高度に活性化することができず、抗体依存性細胞傷害性（ADCC）などのメカニズムによってトラスツズマブ耐性のBT-474クローン5腫瘍細胞を破壊することができなかった。

【0231】

(3) 予想外なことに、BT-474 または BT-474 クローン 5 癌細胞と共培養したかどうかにかかわらず、トラスツズマブ複合体化ヒト CD16⁺ ナチュラルキラー細胞 (ACE1702) は、大量の TNF α、IFN γ、グランザイム B、および CD107a を発現し、TNF アルファ、IFN ガンマ、グランザイム B、およびCD107a などのさまざまな分子の発現レベルは、両方のグループで同様である。 等量のトラスツズマブによるヒト CD16⁺ナチュラルキラー細胞 (Ctrl-oNK) の活性化と比較して、BT-474 および BT-474 クローン 5 の両方に対する ACE1702 の細胞毒性の有意な増強が観察された。 これらの結果は、トラスツズマブの添加（トラスツズマブ耐性のBT-474クローン5腫瘍細胞を破壊するためにヒトCD16⁺ナチュラルキラー細胞を高度に活性化できなかった）と比較して、 複合体化トラスツズマブは、トラスツズマブ複合体化ヒト CD16+ ナチュラルキラー細胞 (ACE1702) を高度に活性化し、抗体依存性細胞傷害 (ADCC) などのメカニズムを介して BT-474 癌細胞とトラスツズマブ耐性BT-474クローン5癌細胞の両方を破壊できることを示している。

【0232】

実施形態 2-1-2 セツキシマブ反応性またはセツキシマブ耐性ヒト結腸癌細胞との共培養後のセツキシマブ複合体化ヒトCD16⁺ナチュラルキラー細胞の活性化マーカーおよび細胞傷害性分子の発現
実施形態の実験方法は、実施形態2-1-1とほぼ同様であるが、次の点が異なる:
(1) 本実験で使用したエフェクター細胞は、 ［１］ 45日間培養したoNK細胞懸濁液中の細胞であり、または ［２］ セツキシマブ複合体化ヒトCD16+ナチュラルキラー細胞懸濁液中の細胞であり、および
(2) 本実験で使用した標的細胞は［１］ セツキシマブに耐性のないヒト結腸直腸腺癌細胞株 HCC827-luc (JCRB1516、JCRB より購入)であり、または［２］ セツキシマブ耐性ヒト結腸直腸腺癌細胞株 HT-29 (HTB-38、ATCC より購入)である。

【0233】

本発明の発明者らは次のことを期待している：
(1) NCI-H508癌細胞またはHT-29癌細胞と共培養しても、ヒトCD16+ナチュラルキラー細胞（Ctrl-oNK）はTNF-α、IFN-γ、グランザイムBおよびCD107aを少量しか発現しない。

【0234】

(2) セツキシマブを添加してHCC827-luc癌細胞と共培養すると、ヒトCD16+ナチュラルキラー細胞（Ctrl-oNK）はより多くTNF-α、IFN-γ、グランザイムB、CD107aを発現した。 しかしながら、セツキシマブを添加して HT-29 癌細胞と共培養すると、ヒト CD16+ ナチュラルキラー細胞 (Ctrl-oNK) は、セツキシマブを添加してHCC827-lucがん細胞と共培養した場合ほど多くの TNF-α、IFN-γ、グランザイム B、CD107a を発現しなかった。

【0235】

この結果は、HCC827-luc 細胞の場合、セツキシマブを添加するとヒト CD16+ ナチュラルキラー細胞 (Ctrl-oNK) を高度に活性化し、抗体依存性細胞傷害 (ADCC) などのメカニズムによってHCC827-luc腫瘍細胞を破壊できることを示している。 しかしながら、HT-29細胞の場合、セツキシマブを添加しても、ヒトCD16+ナチュラルキラー細胞（Ctrl-oNK）を高度に活性化することができず、抗体依存性細胞傷害性（ADCC）などのメカニズムによってセツキシマブ耐性HT-29腫瘍細胞を破壊することができなかった。

【0236】

(3) 予想外なことに、HCC827-luc または HT-29 癌細胞と共培養したかどうかにかかわらず、セツキシマブ複合体化ヒト CD16+ ナチュラルキラー細胞は、大量の TNF α、IFN γ、グランザイム B、および CD107a を発現し、TNF α、IFN γ、グランザイム B、および CD107a などのさまざまな分子の発現レベルは、両方のグループで同様である。 これらの結果は、セツキシマブの共培養（セツキシマブ耐性HT-29腫瘍細胞を破壊するためにヒトCD16+ナチュラルキラー細胞を高度に活性化できなかった）と比較して、複合体化セツキシマブはセツキシマブと複合体化したヒト CD16+ ナチュラルキラー細胞を高度に活性化して、抗体依存性細胞傷害（ADCC）などのメカニズムを通じて、HCC827-luc 腫瘍細胞とセツキシマブ耐性 HT-29 腫瘍細胞の両方を破壊することを示している。

【0237】

実施形態 2-1-3 セツキシマブ反応性またはセツキシマブ耐性ヒト舌癌細胞との共培養後のセツキシマブ複合体化ヒトCD16+ナチュラルキラー細胞の活性化マーカーおよび細胞傷害性分子の発現
実施形態の実験方法は、実施形態2-1-1とほぼ同様であるが、次の点が異なる:
(1) 本実験で使用したエフェクター細胞は、 ［１］ 37日間培養したoNK細胞懸濁液中の細胞であり、または ［２］ セツキシマブ複合体化ヒトCD16+ナチュラルキラー細胞懸濁液中の細胞である；および
(2) 本実験で使用した標的細胞は ［１］ セツキシマブに耐性のないヒト舌扁平上皮癌細胞株HSC-4（JCRB0264、JCRBより購入）であり、または ［２］ セツキシマブ耐性ヒト舌扁平上皮癌細胞株 SAS (JCRB0260、JCRBより購入)である。

【0238】

本発明の発明者らは次のことを期待している：
(1) HSC-4 癌細胞または SAS 癌細胞と共培養しても、ヒト CD16+ ナチュラルキラー細胞 (Ctrl-oNK) は、TNF-α、IFN-γ、グランザイム B、および CD107a を少量しか発現しない。

【0239】

(2) セツキシマブを添加してHSC-4癌細胞と共培養すると、ヒトCD16+ナチュラルキラー細胞（Ctrl-oNK）はより多くTNF-α、IFN-γ、グランザイムB、CD107aを発現した。 しかしながら、セツキシマブを添加してSAS癌細胞と共培養した場合、ヒトCD16+ナチュラルキラー細胞（Ctrl-oNK）は、セツキシマブを添加してHSC-4癌細胞と共培養した場合ほど多くのTNF-α、IFN-γ、グランザイムBおよびCD107aを発現しなかった。 この結果は、HSC-4 細胞の場合、セツキシマブを添加によりヒト CD16+ ナチュラルキラー細胞 (Ctrl-oNK) を高度に活性化し、抗体依存性細胞傷害 (ADCC) などのメカニズムにより HSC-4 腫瘍細胞を破壊できることを示している。 しかしながら、SAS 細胞の場合、セツキシマブを添加しても、ヒト CD16+ ナチュラルキラー細胞 (Ctrl-oNK) を高度に活性化することができず、抗体依存性細胞傷害 (ADCC) などのメカニズムを通じてセツキシマブ耐性 SAS 腫瘍細胞を破壊することはできなかった。

【0240】

(3) 予想外なことに、HSC-4 または SAS 癌細胞と共培養したかどうかにかかわらず、セツキシマブ複合体化ヒト CD16+ ナチュラルキラー細胞は、大量の TNF α、IFN γ、グランザイム B、および CD107aを発現し、TNF α、IFN γ、グランザイム B、および CD107a などのさまざまな分子の発現レベルは、両方のグループで同様である。 等量のセツキシマブによるヒト CD16+ ナチュラルキラー細胞(Ctrl-oNK)の活性化 と比較して、HSC-4 および SAS の両方に対するセツキシマブ複合体化ヒト CD16+ ナチュラルキラー細胞の細胞毒性の有意な増強が観察された。 これらの結果は、セツキシマブの共培養（セツキシマブ耐性SAS腫瘍細胞を破壊するためにヒトCD16+ナチュラルキラー細胞を高度に活性化できなかった）と比較して、複合体化セツキシマブはセツキシマブと複合体化したヒトCD16+ナチュラルキラー細胞を高度に活性化し、抗体依存性細胞傷害 (ADCC) などのメカニズムによる HSC-4 腫瘍細胞およびセツキシマブ耐性 SAS 腫瘍細胞の両方を破壊できることを示している。

【0241】

実施形態 2-2: 成分反応性または成分耐性の標的細胞と共培養した後の成分複合体化ヒトガンマデルタT細胞の活性化マーカーおよび細胞傷害性分子の発現
実施形態 2-2-1 トラスツズマブ反応性またはトラスツズマブ耐性ヒト乳癌細胞との共培養後のトラスツズマブ複合体化ヒトガンマデルタT細胞の活性化マーカーおよび細胞傷害性分子の発現
本実施形態の実験方法は、実施形態２－１－１とほぼ同様であるが、異なるのは本実験で使用したエフェクター細胞が、 ［１］ 16日間のガンマデルタT細胞懸濁液中の細胞であり、または ［２］ トラスツズマブ複合体化ヒトガンマデルタT細胞懸濁液中の細胞である。

【0242】

本発明の発明者らは次のことを期待している:
(1) BT-474癌細胞またはBT-474 クローン 5癌細胞と共培養しても、ヒトCD16⁺ナチュラルキラー細胞（Ctrl-oNK）はTNF-α、IFN-γ、グランザイムBおよびCD107aを少量しか発現しない。

【0243】

(2) トラスツズマブを添加して BT-474 癌細胞と共培養すると、ヒトガンマデルタT細胞はより多くの TNF-α、IFN-γ、グランザイム B、および CD107a を発現した。 しかしながら、トラスツズマブを添加してBT-474クローン5癌細胞と共培養した場合、ヒトガンマデルタT細胞は、トラスツズマブを添加してBT-474癌細胞と共培養した場合ほど多くのTNF-α、IFN-γ、グランザイムBおよびCD107aを発現しなかった。 この結果は、BT-474 細胞の場合、トラスツズマブを添加によりヒトガンマデルタT細胞が高度に活性化し、抗体依存性細胞傷害 (ADCC) などのメカニズムにより BT-474 腫瘍細胞を破壊できることを示している。 しかしながら、BT-474クローン5細胞の場合、トラスツズマブを添加しても、ヒトガンマデルタT細胞を高度に活性化することはできず、抗体依存性細胞傷害 (ADCC) などのメカニズムを通じてトラスツズマブ耐性BT-474クローン5腫瘍細胞を破壊することはできなかった。

【0244】

(3) 予想外なことに、BT-474 または BT-474 クローン 5 癌細胞と共培養したかどうかにかかわらず、トラスツズマブ複合体化ヒトガンマデルタT細胞は、大量の TNF-α、IFN-γ、グランザイム B、および CD107a を発現し、TNF-α、IFN-γ、グランザイム B、CD107a などのさまざまな分子の発現レベルは、両方のグループで同様である。 これらの結果は、トラスツズマブの共培養物（トラスツズマブ耐性BT-474クローン5腫瘍細胞を破壊するためにヒトガンマデルタT細胞を高度に活性化することができなかった）と比較して、複合体化トラスツズマブはトラスツズマブと複合体化したヒトガンマデルタT細胞を高度に活性化し、抗体依存性細胞傷害（ADCC）などのメカニズムによるBT-474 腫瘍細胞とトラスツズマブ耐性BT-474クローン 5 腫瘍細胞の両方を破壊できることを示している。

【0245】

実施形態 2-2-2 セツキシマブ反応性肺癌細胞またはセツキシマブ耐性ヒト結腸癌細胞との共培養後のセツキシマブ複合体化ヒトガンマデルタT細胞の活性化マーカーおよび細胞傷害性分子の発現
本実施形態の実験方法は、実施形態2-1-2とほぼ同様であるが、異なるのは本実験で使用したエフェクター細胞が、［１］ 16日間のガンマデルタT細胞懸濁液中の細胞であり、または ［２］ セツキシマブ複合体化ヒトガンマデルタT細胞懸濁液中の細胞である。

【0246】

本発明の発明者らは次のことを期待している:
(1) HCC827-luc 癌細胞または HT-29 癌細胞と共培養しても、ヒトガンマデルタT細胞は TNF-α、IFN-γ、グランザイム B、および CD107a を少量しか発現しない。

【0247】

(2) セツキシマブを添加して HCC827-luc 癌細胞と共培養すると、ヒトガンマデルタT細胞はより多くの TNF-α、IFN-γ、グランザイム B、および CD107a を発現した。 しかしながら、セツキシマブを添加してHT-29癌細胞と共培養した場合、ヒトガンマデルタT細胞は、セツキシマブを添加してHCC827-luc癌細胞と共培養した場合ほど多くのTNF-α、IFN-γ、グランザイムB、およびCD107aを発現しなかった。 この結果は、HCC827-luc 細胞の場合、セツキシマブの添加によりヒトガンマデルタT細胞が高度に活性化し、抗体依存性細胞傷害 (ADCC) などのメカニズムにより HCC827-luc 腫瘍細胞が破壊できることが示している。しかしながら、HT-29細胞の場合、セツキシマブを添加してもヒトガンマデルタT細胞を高度に活性化することはできず、抗体依存性細胞傷害（ADCC）などのメカニズムを通じてセツキシマブ耐性HT-29腫瘍細胞を破壊することはできなかった。

【0248】

(3) 予想外なことに、HCC827-luc または HT-29 癌細胞と共培養したかどうかにかかわらず、セツキシマブ複合体化ヒトガンマデルタT細胞は、大量の TNF-α、IFN-γ、グランザイム B、および CD107a を発現し、 TNF-α、IFN-γ、グランザイム B、CD107a などのさまざま分子の発現レベルは、両方のグループで同様である。 これらの結果は、セツキシマブの共培養（セツキシマブ耐性HT-29腫瘍細胞を破壊するためにヒトガンマデルタT細胞を高度に活性化することができなかった）と比較して、複合体化セツキシマブはセツキシマブと複合体化したヒトガンマデルタT細胞を高度に活性化して、抗体依存性細胞傷害 (ADCC) などのメカニズムによるNCI-H508腫瘍細胞とセツキシマブ耐性 HT-29 腫瘍細胞の両方を破壊できることを示している。

【0249】

実施形態 2-2-3 セツキシマブ反応性またはセツキシマブ耐性ヒト舌癌細胞との共培養後のセツキシマブ複合体化ヒトガンマデルタT細胞の活性化マーカーおよび細胞傷害性分子の発現
実施形態の実験方法は、実施形態2-1-1とほぼ同様であるが、次の点が異なる:
(1) 本実験で使用したエフェクター細胞は、 ［１］ 16日間のガンマデルタT細胞懸濁液中の細胞であり、または ［２］ セツキシマブ複合体化ヒトガンマデルタT細胞懸濁液中の細胞、および
(2) 本実験で使用した標的細胞は、 ［１］ セツキシマブに耐性のないヒト舌扁平上皮癌細胞株 HSC-4 (JCRB0264、JCRBより購入)であり、または ［２］ セツキシマブ耐性ヒト舌扁平上皮癌細胞株 SAS (JCRB0260、JCRBより購入)である。

【0250】

本発明の発明者らは次のことを期待している:
(1) HSC-4癌細胞やSAS癌細胞と共培養しても、ヒトガンマデルタT細胞はTNF-α、IFN-γ、グランザイムB、CD107aを少量しか発現しない。

【0251】

(2) セツキシマブを添加して HSC-4 がん細胞と共培養すると、ヒトガンマデルタT細胞はより多くの TNF-α、IFN-γ、グランザイム B、および CD107a を発現した。 しかしながら、セツキシマブを添加してSASがん細胞と共培養した場合、ヒトガンマデルタT細胞は、セツキシマブを添加してHSC-4がん細胞と共培養した場合ほど多くのTNF-α、IFN-γ、グランザイムBおよびCD107aを発現しなかった。 この結果は、HSC-4 細胞の場合、セツキシマブを添加によりヒトガンマデルタT細胞を高度に活性化し、抗体依存性細胞傷害 (ADCC) などのメカニズムにより HSC-4 腫瘍細胞を破壊できることを示している。しかしながら、SAS細胞の場合、セツキシマブを添加してもヒトガンマデルタT細胞を高度に活性化することはできず、抗体依存性細胞傷害（ADCC）などの機構を通じてセツキシマブ耐性SAS腫瘍細胞を破壊することはできなかった。

【0252】

(3) 予想外なことに、HSC-4 または SAS 癌細胞と共培養したかどうかにかかわらず、セツキシマブ複合体化ヒトガンマデルタT細胞は、大量のTNF-α、IFN-γ、グランザイム B、および CD107a を発現し、 TNF-α、IFN-γ、グランザイム B、CD107a などのさまざま分子の発現レベルは、両方のグループで同様である。 これらの結果は、セツキシマブの共培養（セツキシマブ耐性SAS腫瘍細胞を破壊するためにヒトガンマデルタT細胞を高度に活性化することができなかった）と比較して、複合体化セツキシマブはセツキシマブと複合体化したヒトガンマデルタT細胞を高度に活性化して、抗体依存性細胞傷害 (ADCC) などのメカニズムによるHSC-4 腫瘍細胞とセツキシマブ耐性 SAS 腫瘍細胞の両方を破壊できることを示している。

【0253】

実施形態 2-2-4 リツキシマブ反応性またはリツキシマブ耐性ヒトリンパ腫細胞との共培養後のリツキシマブ複合体化ヒトガンマデルタT細胞の活性化マーカーおよび細胞傷害性分子の発現
実施形態の実験方法は、実施形態2-1-1とほぼ同様であるが、次の点が異なる:
(1) 本実験で使用したエフェクター細胞は、 ［１］ 16日間のガンマデルタT細胞懸濁液中の細胞であり、または ［２］ リツキシマブ複合体化ヒトガンマデルタT細胞懸濁液中の細胞であり、および
(2) 本実験で使用した標的細胞は、 ［１］ リツキシマブに耐性のない懸濁ヒトバーキットリンパ腫細胞株 Raji (CCL-86、ATCCより購入)、または ［２］ リツキシマブ耐性ヒトリンパ腫細胞株Raji-2R80（またはRaji-2RH；本発明の発明者らは、Rajiからこのリツキシマブ耐性クローンRaji-2R80またはRaji-2RHを樹立した）であり；リツキシマブ耐性クローンの開発方法は公知であるか、または当業者には明らかであろう、例えば、参考文献 (1) Czuczman et al. Clin. Cancer Res. (2008); 14:1561-1570 (10.1158/1078-0432.CCR-07-1254); または (2) Jazirehi et al. Cancer Res. (2007); 67:1270-1281 (10.1158/0008-5472.CAN-06-2184)。

【0254】

本発明の発明者らは次のことを期待している:
(1) Raji 癌細胞、Raji-2R80 癌細胞、または Raji-2RH 癌細胞と共培養しても、ヒトガンマデルタT細胞はTNF-α、IFN-γ、グランザイムB、CD107aを少量しか発現しない。

【0255】

(2) リツキシマブを添加してRaji癌細胞と共培養すると、ヒトガンマデルタT細胞はより多くの TNF-α、IFN-γ、グランザイム B、および CD107a を発現した。 しかしながら、リツキシマブを添加して Raji-2R80 (または Raji-2RH) 癌細胞と共培養した場合、ヒトガンマデルタT細胞は、リツキシマブを添加してRaji癌細胞と共培養した場合ほど多くの TNF-α、IFN-γ、グランザイム BおよびCD107a を発現しなかった。この結果は、Raji細胞の場合、リツキシマブを添加によりヒトガンマデルタT細胞が高度に活性し、抗体依存性細胞傷害 (ADCC) などのメカニズムによりRaji腫瘍細胞を破壊できることを示している。しかしながら、Raji-2R80 (または Raji-2RH) 細胞の場合、リツキシマブを添加してもヒトガンマデルタT細胞を高度に活性化することはできず、依存性細胞傷害性 (ADCC)などの機構を通じてリツキシマブ耐性 Raji-2R80 (または Raji-2RH) 腫瘍細胞を破壊することはできなかった。

【0256】

(3) 予想外なことに、Raji、Raji-2R80、または Raji-2RH 癌細胞と共培養したかどうかにかかわらず、リツキシマブ複合体化ヒトガンマデルタT細胞は、大量の TNF-α、IFN-γ、グランザイム B、および CD107a を発現し、TNF-α、IFN-γ、グランザイム B、CD107a などのさまざまな分子の発現レベルは、両方のグループで同様である。 これらの結果は、リツキシマブの共培養（リツキシマブ耐性Raji-2R80腫瘍細胞を破壊するためにヒトガンマデルタT細胞を高度に活性化することができなかった）と比較して、複合体化リツキシマブはリツキシマブと複合体化したヒトガンマデルタT細胞を高度に活性化して、抗体依存性細胞傷害 (ADCC) などのメカニズムによるRaji 腫瘍細胞とリツキシマブ耐性 Raji-2R80 (または Raji-2RH) 腫瘍細胞の両方を破壊できることを示している。

【0257】

実施形態 2-2-5 リツキシマブ反応性またはリツキシマブ耐性ヒトリンパ腫細胞との共培養後のリツキシマブ複合体化ヒトガンマデルタT細胞の活性化マーカーおよび細胞傷害性分子の発現
実施形態の実験方法は、実施形態2-1-1とほぼ同様であるが、次の点が異なる:
(1) 本実験で使用したエフェクター細胞は、 ［１］ 16日間のガンマデルタT細胞懸濁液中の細胞であり、または［２］ リツキシマブ複合体化ヒトガンマデルタT細胞懸濁液中の細胞であり、および
(2) 本実験で使用した標的細胞は、 ［１］ リツキシマブに耐性のないヒトリンパ腫細胞株 Daudi (CCL-213、ATCCより購入)であり、または［２］ リツキシマブ耐性ヒトリンパ腫細胞株Daudi-RR（本発明の発明者らは、Daudiからこのリツキシマブ耐性クローンDaudi-RRを樹立した）であり；リツキシマブ耐性クローンの開発方法は公知であるか、当業者には明らかであろう、例えば、参考文献 Jazirehi et al. Cancer Res. (2007); 67:1270-1281 (10.1158/0008-5472.CAN-06-2184)。

【0258】

本発明の発明者らは次のことを期待している:
(1) Daudi 癌細胞または Daudi-RR 癌細胞と共培養しても、ヒトガンマデルタT細胞はTNF-α、IFN-γ、グランザイム B、および CD107a を少量しか発現しない。

【0259】

(2) リツキシマブを添加してDaudi癌細胞と共培養すると、ヒトガンマデルタT細胞はより多くのTNF-α、IFN-γ、グランザイムB、およびCD107aを発現した。 しかしながら、リツキシマブを添加してDaudi-RR癌細胞と共培養した場合、ヒトガンマデルタT細胞は、リツキシマブを添加してDaudi-RR癌細胞と共培養した場合ほど多くのTNF-α、IFN-γ、グランザイムBおよびCD107aを発現しなかった。 この結果は、Daudi 細胞の場合、リツキシマブを添加によりヒトガンマデルタT細胞を高度に活性化し、抗体依存性細胞傷害 (ADCC) などのメカニズムにより Daudi 腫瘍細胞を破壊できることを示している。 しかしながら、Daudi-RR細胞の場合、リツキシマブを添加してもヒトガンマデルタT細胞を高度に活性化することはできず、抗体依存性細胞傷害（ADCC）などの機構を通じてリツキシマブ耐性Daudi-RR腫瘍細胞を破壊することはできなかった。

【0260】

(3) 予想外なことに、Daudi 癌細胞または Daudi-RR 癌細胞と共培養したかどうかにかかわらず、リツキシマブ複合体化ヒトガンマデルタT細胞は、大量のTNF-α、IFN-γ、グランザイム B、および CD107a を発現し、TNF-α、IFN-γ、グランザイム B、CD107aなどのさまざまな分子の発現レベルは、両方のグループで同様である。これらの結果は、リツキシマブの共培養（リツキシマブ耐性Daudi-RR腫瘍細胞を破壊するためにヒトガンマデルタT細胞を高度に活性化することができなかった）と比較して、複合体化リツキシマブはリツキシマブと複合体化したヒトガンマデルタT細胞を高度に活性化して、抗体依存性細胞傷害（ADCC）などのメカニズムによるDaudi 腫瘍細胞とリツキシマブ耐性 Daudi-RR 腫瘍細胞の両方を破壊きることを示している。

【0261】

実施形態 2-2-6 アベルマブ反応性またはアベルマブ耐性ヒト乳癌細胞との共培養した後のアベルマブ複合体化ヒトガンマデルタT細胞の活性化マーカーおよび細胞傷害性分子の発現
実施形態の実験方法は、実施形態2-1-1とほぼ同様であるが、次の点が異なる:
(1) 本実験で使用したエフェクター細胞は、 ［１］ 16日間のガンマデルタT細胞懸濁液中の細胞であり、または［２］ アベルマブ複合体化ヒトガンマデルタT細胞懸濁液中の細胞であり；および
(2) 本実験で使用した標的細胞は、 ［１］ アベルマブに耐性のないヒト乳癌細胞株MDA-MB-231（HTB-26、ATCCより購入）、または［２］ アベルマブ耐性ヒト乳癌細胞株MDA-MB-468（HTB-132、ATCCより購入）である。

【0262】

本発明の発明者らは次のことを期待している:
(1) MDA-MB-231 癌細胞または MDA-MB-468 癌細胞と共培養しても、ヒトガンマデルタT細胞はTNF-α、IFN-γ、グランザイム B、および CD107a を少量しか発現しない。

【0263】

(2) アベルマブを添加して MDA-MB-231 癌細胞と共培養すると、ヒトガンマデルタT細胞はより多くの TNF-α、IFN-γ、グランザイム B、および CD107a を発現した。 しかしながら、アベルマブを添加して MDA-MB-468 癌細胞と共培養した場合、ヒトガンマデルタT細胞は、アベルマブを添加してMDA-MB 癌細胞と共培養した場合ほど多くの TNF-α、IFN-γ、グランザイム B、およびCD107a を発現しなかった。 この結果は、MDA-MB-231 細胞の場合、アベルマブを添加によりヒトガンマデルタT細胞が高度に活性化し、抗体依存性細胞傷害 (ADCC) などのメカニズムにより MDA-MB-231 腫瘍細胞を破壊できることを示している。しかしながら、MDA-MB-468細胞の場合、アベルマブを添加してもヒトガンマデルタT細胞を高度に活性化することはできず、抗体依存性細胞傷害（ADCC）などの機構を通じてアベルマブ耐性MDA-MB-468腫瘍細胞を破壊することはできなかった。

【0264】

(3) 予想外なことに、MDA-MB-231 または MDA-MB-468 癌細胞と共培養したかどうかにかかわらず、アベルマブ複合体化ヒトガンマデルタT細胞は、大量のTNF-α、IFN-γ、グランザイム B、および CD107a を発現し、 TNF-α、IFN-γ、グランザイム B、CD107a などのさまざまな分子の発現レベルは、両グループで同様である。 これらの結果は、アベルマブの共培養（アベルマブ耐性MDA-MB-468腫瘍細胞を破壊するためにヒトガンマデルタT細胞を高度に活性化することができなかった）と比較して、複合体化アベルマブはアベルマブと複合体化したヒトガンマデルタT細胞を高度に活性化し、抗体依存性細胞傷害 (ADCC) などのメカニズムによるMDA-MB-231 腫瘍細胞とアベルマブ耐性 MDA-MB-468 腫瘍細胞の両方を破壊できることを示している。

【0265】

実施形態 2-2-7 アベルマブ反応性またはアベルマブ耐性ヒト肺癌細胞との共培養後におけるアベルマブ複合体化ヒトガンマデルタT細胞の活性化マーカーおよび細胞傷害性分子の発現
実施形態の実験方法は、実施形態2-1-1とほぼ同様であるが、次の点が異なる:
(1) 本実験で使用したエフェクター細胞は、 ［１］ 16 日間のガンマデルタT細胞懸濁液中の細胞であり、または［２］ アベルマブ複合体化ヒトガンマデルタT細胞懸濁液中の細胞であり；および
(2) 本実験で使用した標的細胞は、 ［１］ アベルマブに耐性のないヒト肺癌細胞株H1650（CRL-5883、ATCCより購入）、または ［２］ アベルマブ耐性ヒト肺癌細胞株H2087（CRL-5922、ATCCより購入）。

【0266】

本発明の発明者らは次のことを期待している:
(1) H1650 癌細胞またはH2087 癌細胞と共培養しても、ヒトガンマデルタT細胞はTNF α、IFN ガンマ、グランザイム B、および CD107a を少量しか発現しない。

【0267】

(2) アベルマブを添加して H1650 癌細胞と共培養すると、ヒトガンマデルタT細胞はより多くの TNF-α、IFN-γ、グランザイム B、および CD107a を発現した。 しかしながら、アベルマブを添加してH2087癌細胞と共培養した場合、ヒトガンマデルタT細胞は、アベルマブを添加してH1650癌細胞と共培養した場合ほど多くのTNF-α、IFN-γ、グランザイムBおよびCD107aを発現しなかった。 この結果は、H1650 細胞の場合、アベルマブの添加によりヒトガンマデルタT細胞が高度に活性化し、抗体依存性細胞傷害 (ADCC) などのメカニズムにより H1650 腫瘍細胞を破壊できることを示している。 しかしながら、H2087細胞の場合、アベルマブを添加してもヒトガンマデルタT細胞を高度に活性化することはできず、抗体依存性細胞傷害（ADCC）などのメカニズムを通じてアベルマブ耐性H2087腫瘍細胞を破壊することはできなかった。

【0268】

(3) 予想外なことに、H1650 または H2087 癌細胞と共培養したかどうかにかかわらず、アベルマブ複合体化ヒトガンマデルタT細胞は、大量のTNF-α、IFN-γ、グランザイム B、および CD107aを発現し、 TNF-α、IFN-γ、グランザイム B、CD107a などのさまざまな分子の発現レベルは、両方のグループで同様である。 これらの結果は、アベルマブの共培養（アベルマブ耐性 H2087 腫瘍細胞を破壊するためにヒトガンマデルタT細胞を高度に活性化することができなかった）と比較して、複合体化アベルマブはアベルマブと複合体化したヒトガンマデルタT細胞を高度に活性化し、抗体依存性細胞傷害 (ADCC) などのメカニズムによるH1650 腫瘍細胞とアベルマブ耐性 H2087 腫瘍細胞の両方を破壊できることを示している。

【0269】

実施形態 3: 成分複合体化ヒト細胞傷害性細胞の細胞傷害性機能に対する免疫抑制微小環境の影響
実施形態 3-1: 成分複合体化ヒト細胞傷害性細胞の細胞傷害性機能に対する低酸素の影響
この実施形態において、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）細胞毒性アッセイキット（Cat No.88954、Pierce Biotechnology社、米国）を使用し、標的細胞に対するエフェクター細胞の細胞毒性能力を検出した。 本実施形態において、細胞毒性試験を実施するために96ウェル培養プレートを含有し、ウェルをエフェクター細胞自発的LDH放出対照ウェル（ESR、ACE1702自発的LDH放出対照ウェルおよびCtrl-oNK自発的LDH放出対照ウェルを含む）、標的細胞自発的LDH放出コントロールウェル(TSR)、実験ウェル(ACE1702実験ウェルおよびCtrl-oNK実験ウェルを含む)、標的細胞最大LDH放出コントロールウェル(TMR)、容積補正コントロールウェル（VCC、このウェルは溶解バッファー添加による容積増加を補正するためのもの）、および培養培地バックグラウンドコントロールウェル（CMB、このウェルは血清を含む培養培地中に存在する可能性のあるLDH活性による寄与を補正するためのもの）に分けた。

【0270】

本実施形態で使用したエフェクター細胞は、 ［１］ 26日間培養したoNK細胞懸濁液中の細胞（Ctrl-oNK）、または［２］ トラスツズマブ複合体化ヒトCD16+ナチュラルキラー細胞懸濁液（ACE1702）中の細胞である。および、標的細胞は接着性ヒト卵巣癌細胞株SK-OV-3（HTB-77、ATCCより購入）である。

【0271】

標的細胞は、標的細胞自発的 LDH 放出制御ウェル (TSR)、実験用ウェル、および標的細胞最大 LDH 放出制御ウェル (TMR) に播種された; したがって、各ウェルには1.2×104個の標的細胞が含まれ、2～4時間静置した。

【0272】

エフェクター細胞 (ACE1702 または Ctrl-oNK) とターゲット細胞 (SK-OV-3) を、低酸素条件 (0% 酸素条件) で 37℃ で 18 時間前処理した。 前処理したエフェクター細胞（ACE1702またはCtrl-oNK）を、エフェクター細胞自発的LDH放出コントロールウェル（ESR）と実験ウェルに添加し、標的細胞数に対するエフェクター細胞数の比率は5であった。 同量の血清含有培地を、容積補正コントロールウェル (VCC) および培養培地バックグラウンドコントロールウェル (CMB) に添加した。

【0273】

エフェクター細胞と標的細胞を96ウェル培養プレートで低酸素条件下で18時間共培養し、10μLの溶解バッファーを標的細胞最大LDH放出コントロールウェル(TMR)および体積補正コントロールウェル(VCC)に添加した後、上清を採取した。

【0274】

96 ウェル培養プレートを室温で 400 x g で 3 分間遠心分離し、50 μL の上清を各ウェルから別の新しい 96 ウェル プレートの新しいウェルにそれぞれ移しました。ウェルを顕微鏡で観察し、細胞が存在するかどうかを検査した。 50μLの反応混合液（乳酸脱水素酵素の基質「テトラゾリウム塩」を含む；Pierce Biotechnology社から市販；乳酸脱水素酵素細胞毒性アッセイキット、Cat No 88954）を新しいウェルのそれぞれに加え、穏やかに混合した後、室温で5～15分間インキュベートした。 ストップ液を新しい各ウェルに加え、490nmと680nmの吸光度を測定した。

【0275】

OD₄₉₀ - OD₆₈₀が大きいほど、溶解した標的細胞から放出される乳酸脱水素酵素が多くなるため、OD₄₉₀ - OD₆₈₀を使用して、実験ウェル内で溶解した標的細胞の割合を変換することができる。乳酸脱水素酵素（LDH）細胞毒性アッセイキット（Cat No.88954、Pierce Biotechnology社、米国）に記載されている計算式を参照して、OD₄₉₀ - OD₆₈₀を実験ウェルで溶解した標的細胞の割合に変換する。

【0276】

図8Aを参照。図8Aは、成分複合体化細胞傷害性細胞および非複合体化ヒト細胞傷害性細胞の細胞傷害性機能に対する低酸素の影響を示す棒グラフである。 トラスツズマブ複合体化ヒト CD16⁺ ナチュラルキラー細胞懸濁液 (ACE1702) 中の細胞を低酸素条件で前処理し、低酸素条件で卵巣癌細胞株SK-OV-3 細胞とE/T 比 5で37℃で18時間共培養したところ、SK-OV-3細胞の溶解率は43%であった。 Ctrl-oNKの細胞毒性に関しては、24日間培養したoNK細胞懸濁液（Ctrl-oNK）中の細胞によるSK-OV-3の溶解の割合は25％であった。 この結果は、低酸素条件などの免疫抑制微小環境において、ACE1702細胞がCtrl-oNK細胞と比較して、ヒト卵巣癌細胞株SK-OV-3細胞に対して増強された細胞毒性を維持していることを示している。

【0277】

実施形態 3-2: 成分複合体化ヒト細胞傷害性細胞の細胞傷害性機能に対する乳酸（代謝廃棄物）の影響
実施形態の実験方法は、実施形態3-1とほぼ同様であるが、次の点が異なる:
(1) 本実験で使用したエフェクター細胞は、トラスツズマブ複合体化ヒトCD16⁺ナチュラルキラー細胞懸濁液中の細胞であり；および
(2) エフェクター細胞を、低酸素条件（0%酸素条件）で37℃で18時間前処理する代わりに、0または75 mMの乳酸で室温で1時間前処理した。

【0278】

(3) 実験ウェルには、0 mM 乳酸実験ウェルと 75 mM 乳酸実験ウェルがある。

【0279】

(4) 96ウェル培養プレート中のエフェクター細胞と標的細胞を15時間共培養した。

【0280】

図8Bを参照。図8Bは、成分複合体化細胞毒性細胞の細胞毒性機能に対する乳酸（代謝廃棄物）の影響を示す棒グラフである。 トラスツズマブ複合体化ヒト CD16⁺ ナチュラルキラー細胞懸濁液 (ACE1702) 中の細胞を 75 mM 乳酸で前処理し、卵巣癌細胞株SK-OV-3細胞とE/T比5で37℃で、15時間共培養したところ、SK-OV-3細胞の溶解率は80％であった。 0mMの乳酸で前処理したACE1702の細胞毒性に関しては、SK-OV-3細胞の溶解率は90％であった（p>0.05）。 この結果は、酸性条件などの免疫抑制性微小環境において、ACE1702細胞がヒト卵巣癌細胞株SK-OV-3細胞に対して高い細胞毒性を維持することを示している。

【0281】

実施形態 3-3: 腹水抽出物（免疫抑制性サイトカインを含む）が成分複合体化ヒト細胞傷害性細胞の細胞傷害性機能に及ぼす影響
実施形態の実験方法は、実施形態3-1とほぼ同様であるが、次の点が異なる:
(1) 本実験で使用したエフェクター細胞は、トラスツズマブ複合体化ヒトCD16+ナチュラルキラー細胞懸濁液（ACE1702）中の細胞であった；および
(2) エフェクター細胞は、37℃で18時間の低酸素条件（酸素0％）で前処理しなかった。

【0282】

(3) 実験ウェルには 、0% 腹水抽出物実験ウェルと 50% 腹水抽出物実験ウェルがある。

【0283】

(4) 96 ウェル培養プレート中のエフェクター細胞とターゲット細胞を、50% (v/v %) の腹水抽出物の非存在下または存在下で oNK 増殖培地中で E:T 比 10 で 18 時間共培養した。ここで、腹水抽出物は以下の方法に基づいて得られたものである:
腹腔穿刺は医師によって行われた。 簡単に説明すると、卵巣癌を患う被験者の腹部に穿刺針がゆっくりと刺し、被験者から腹腔液を採取した。 採取した腹腔液を1500×gで5分間遠心分離し、浮遊細胞を除去した。 上清を腹水抽出物として採取した。腹水抽出物を顕微鏡またはフローサイトメトリーで検査し、無細胞であることを確認した。

【0284】

図8Cを参照。図8Cは、成分複合体化ヒト細胞傷害性細胞の細胞傷害性機能に対する腹水抽出物（免疫抑制性サイトカインを含む）の効果を示す棒グラフである。トラスツズマブ複合体化ヒト CD16⁺ ナチュラルキラー細胞懸濁液 (ACE1702) 中の細胞を、卵巣癌細胞株 SK-OV-3 細胞と E/T 比 5で37℃で、腹水抽出物50% (v/v) の存在下で 18 時間共培養したところ、SK-OV-3細胞の溶解率は90%であった。腹水抽出物の非存在下で培養したACE1702の細胞毒性に関しては、SK-OV-3細胞の溶解率は95％であった（p>0.05）。 この結果は、免疫抑制性サイトカインを含む免疫抑制性微小環境において、ACE1702細胞がヒト卵巣癌細胞株SK-OV-3細胞に対して高い細胞毒性を維持していることを示している。

【0285】

実施形態 4： 被験者における成分耐性固形腫瘍に対する成分複合体化細胞傷害性細胞の細胞毒性
実施形態 4-1: 対象における成分耐性固形腫瘍に対する成分複合体化ヒトCD16⁺ナチュラルキラー細胞の細胞毒性
ルシフェラーゼ発現トラスツズマブ耐性乳癌細胞株BT474クローン5（CRL-3247、ATCCより購入）を、0日目に25匹の雌性NOGマウス（Jackson Laboratory）にそれぞれ腹腔内注射した。 マウスをランダムに5つのグループに分けた。

【0286】

(1) Ctrl-oNKグループのマウスを、0、3、7、10、14および17日目に、24日間培養したoNK細胞懸濁液中の5000000細胞で処理した。

【0287】

(2) ACE1702グループのマウスを、0、3、7、10、14および17日目に、トラスツズマブ複合体化ヒトCD16+ナチュラルキラー細胞懸濁液中の5000000細胞で処理した。

【0288】

(3) Ctrl-oNKおよびトラスツズマブグループのマウスを、0、3、7、10、14および17日目に24日間培養したoNK細胞懸濁液中の5000000細胞と2.75ngのトラスツズマブ（Herceptinという製品名を持つHER2タンパク質に対する抗体はスイスRocheより購入）で処理した。

【0289】

したがって、Ctrl-oNKおよびトラスツズマブグループのマウスに投与されたトラスツズマブの量（2.75 ngのトラスツズマブ）は、ACE1702グループのマウスに投与された細胞に連結されたトラスツズマブの総量と同等であった。

【0290】

(4) トラスツズマブグループのマウスを、0、3、7、10、14および17日目に2.75ngのトラスツズマブで処理した。

【0291】

(5) コントロールグループのマウスを、0、3、7、10、14および17日目にビヒクル（実験1-1-1に記載の細胞培養液、DMEM培養液、またはXVIVO 10培養液などの細胞培地のみ）で処理した。

【0292】

発光は、0、3、7、10、14および17日目以降は実験終了まで毎週、AMI HTX (スペクトルイメージング)によって検出された。

【0293】

本発明の発明者らは次のことを期待している:
マウスの蛍光画像は次のことを示している: トラスツズマブ複合体化ヒトCD16⁺ナチュラルキラー細胞懸濁液中の細胞で処理したマウスの生物発光画像は、有意な減少を示している。したがって、本発明の成分複合体化細胞傷害性細胞は、固形腫瘍などの免疫抑制性微小環境に位置する異常細胞を治療するだけでなく、被験体における成分耐性固形腫瘍を治療することもできる可能性がある。

【0294】

本発明の成分複合体化細胞傷害性細胞が、固形腫瘍などの免疫抑制微小環境に位置する異常細胞を減少させるメカニズムをさらに理解するために、本発明者は、実施形態5および実施形態6の細胞遊走試験を進めた。

【0295】

実施形態 4-2 被験者における成分耐性固形腫瘍に対する成分複合体化ヒトガンマデルタT細胞の細胞毒性
ルシフェラーゼ発現トラスツズマブ耐性乳癌細胞株 BT474 クローン 5 (CRL-3247、ATCC より購入) を、0 日目に 25 匹の雌 NOG マウス(Jackson Laboratory) のそれぞれに腹腔内注射した。マウスをランダムに5つのグループに分けた。

【0296】

(1) Ctrl-gdT グループのマウスを、0、3、7、10、14、および17日目に、16 日間のガンマデルタT細胞懸濁液中の 10000000 細胞で処理した。

【0297】

(2) ACE-gdT-HER2 グループのマウスを、0、3、7、10、14、および17日目に、トラスツズマブ複合体化ヒトガンマデルタT細胞懸濁液中の 10000000 細胞で処理した。

【0298】

(3) Ctrl-gdTおよびトラスツズマブグループのマウスを、0、3、7、10、14および17日目に16日間のガンマデルタT細胞懸濁液中の10000000細胞と2.75ngのトラスツズマブ（Herceptinという製品名を持つHER2タンパク質に対する抗体はスイスRocheより購入）で処理した。 したがって、Ctrl-gdT およびトラスツズマブグループのマウスに投与されたトラスツズマブの量 (2.75 ngのトラスツズマブ) は、ACE-gdT-HER2 グループのマウスに投与された細胞に連結されたトラスツズマブの総量と同等であった。

【0299】

(4) トラスツズマブグループのマウスを、0、3、7、10、14および17日目に2.75ngのトラスツズマブで処理した。

【0300】

(5) コントロールグループのマウスを、0、3、7、10、14および17日目にビヒクル（実験1-2-1に記載の完全増殖培地などの細胞培地のみ）で処理した。

【0301】

発光は、0、3、7、10、14および17日目以降は実験終了まで毎週、AMI HTX (スペクトルイメージング)によって検出された。

【0302】

本発明の発明者らは次のことを期待している:
マウスの蛍光画像は次のことを示している: トラスツズマブ複合体化ヒトガンマデルタT細胞懸濁液中の細胞で処理したマウスの生物発光画像は、有意な減少を示している。したがって、本発明の成分複合体化細胞傷害性細胞は、固形腫瘍などの免疫抑制性微小環境に位置する異常細胞を治療するだけでなく、被験体における成分耐性固形腫瘍を治療することもできる可能性がある。

【0303】

本発明の成分複合体化細胞傷害性細胞が、固形腫瘍などの免疫抑制微小環境に位置する異常細胞を減少させるメカニズムをさらに理解するために、本発明者は、実施形態5および実施形態6の細胞遊走試験を進めた。

【0304】

実施形態 5： 成分を複合体化細胞毒性細胞遊走試験
図9Aを参照。図9Aは、成分複合体化細胞毒性細胞遊走試験のアッセイ設計を示す。 本実施形態で使用した外側チャンバーは、24ウェルプレート（ThermoScientific社製、Cat.142475）であった。 外側チャンバーのウェルは培地ウェルとSK-OV-3ウェルに分けられた。本実施形態で使用した内側チャンバーは、ポリカーボネート製細胞培養インサート（Millipore社製、Cat.PITP01250）であった。 細胞培地（実験 1-1-1 に記載の細胞培地、DMEM 培地、XVIVO 10 培地など）または細胞培地中の 2 x 10⁵ 個の SK-OV-3 細胞（ターゲット細胞）を外側チャンバーのウェルに播種した。 接着2時間後、孔径3μmのポリカーボネート製細胞培養インサート（ミリセル細胞培養インサート）を、外側チャンバーの各ウェルに挿入し、トラスツズマブ複合体化ヒト CD16+ ナチュラルキラー細胞懸濁液中の 1 x 10⁶ 細胞を各内側チャンバーに播種し、19 時間インキュベートした。

【0305】

外側チャンバー内の細胞を採取し、PE結合マウス抗ヒトCD56 (BioLegend、#304606)およびPE-Cy5結合CD3抗体で、光を避けながら室温で10分間染色した。 次いで、細胞混合物を室温で400 x gで3分間遠心分離した。上清を除去し、細胞ペレットを1 mLのDPBSで再懸濁した。 遠心分離を繰り返し、DPBS で再懸濁した CD56⁺/CD3 ゲート細胞 0.5 mL をフローサイトメトリーで分析した。

【0306】

図９Ｂを参照。図9Bは、癌細胞が位置する領域への成分複合体化細胞傷害性細胞の遊走能力を示す棒グラフである。 図9Bは、少量のトラスツズマブ複合体ヒトCD16+ナチュラルキラー細胞（CD56およびCD16を発現するトラスツズマブ複合体化oNK細胞）が培地ウェルで検出されたことを示している。一方、SK-OV-3ウェルでは、大量のトラスツズマブ複合体化ヒトCD16+ナチュラルキラー細胞（CD56およびCD16を発現するトラスツズマブ複合体化oNK細胞）が検出された。 さらに、SK-OV-3ウェルにおけるトラスツズマブ複合体化ヒトCD16⁺ナチュラルキラー細胞の量は、培地ウェルの量より9.1倍多い。 すなわち、培地を含む外側チャンバーに移動する成分複合体化細胞傷害性細胞の数と比較すると、 ポリカーボネート製細胞培養インサートの底部の膜を通過して、標的細胞を含む外側チャンバーに移動する成分複合体化細胞傷害性細胞の数は9.1 倍と大幅に増加した (各条件は3 回実行され、データは平均 ± SD として表示され、統計分析は t 検定を使用して実行された。 **、p < 0.01。)

【0307】

本発明の発明者らは、前述のSK-OV-3を成分耐性の標的細胞（BT-474クローン5細胞株、HT-29細胞株、SAS細胞株など）に置き換えた場合、内側チャンバー内の成分と複合化した大量の細胞傷害性細胞（成分複合体化細胞傷害性細胞）も、ポリカーボネート製細胞培養インサートの底部の膜を通過し、成分耐性の標的細胞を含む外側チャンバーに移動することができると期待している。

【0308】

実施形態 6： CD3⁺ T細胞遊走試験
実施形態 6-1： CD3⁺ T細胞の遊走能力に対する成分複合体化ヒトCD16⁺ ナチュラルキラー細胞の影響
図10Aを参照。図10Aは、CD3⁺T細胞遊走試験のアッセイ設計を示す。 本実施形態で使用した外側チャンバーは、24ウェルプレート（ThermoScientific社製、Cat.142475）であった。本実施形態で使用した内側チャンバーは、孔径3μmのポリカーボネート製細胞培養インサート（Millicell cell culture insert; Cat. PITP01250）であった。

【0309】

本実施形態では、(1)培地グループ、(2)SK-OV-3グループ、(3)ACE1702グループ、および(4)SK-OV-3グループとACE1702グループの4つのグループがあった。

【0310】

(1) 培地グループ：細胞培地（実験1-1-1に記載の細胞培養培地、DMEM培養培地、またはXVIVO 10培養培地など）を外側チャンバーに添加し、19時間インキュベートした。 上清を新しい外側チャンバーに移した。 次いで、1x10⁶個のドナー由来 PBMC 細胞を新しい外側チャンバーに配置された内側チャンバーに播種し、その後 3 時間インキュベートして、PBMC 細胞中の CD3⁺ T 細胞の遊走を評価した。

【0311】

(2) SK-OV-3 グループ: 4x10⁵ 個の SK-OV-3 細胞 (標的細胞) を外側チャンバーに播種し、19 時間インキュベートした。 上清を新しい外側チャンバーに移した。 次いで、1x10⁶個のドナー由来 PBMC 細胞を新しい外側チャンバーに配置された内側チャンバーに播種し、その後 3 時間インキュベートして、PBMC 細胞中の CD3⁺ T 細胞の遊走を評価した。

【0312】

(3) ACE1702 グループ: 1x10⁶ 個のトラスツズマブ複合体化ヒト CD16+ ナチュラルキラー細胞懸濁液中の細胞を外側チャンバーに播種し、19 時間インキュベートした。 上清を新しい外側チャンバーに移した。 次いで、1x10⁶ 個のドナー由来 PBMC 細胞を新しい外側チャンバーに配置された内側チャンバーに播種し、その後 3 時間インキュベートして、PBMC 細胞中の CD3⁺ T 細胞の遊走を評価した。

【0313】

(4) SK-OV-3とACE1702グループ： 4x10⁵個のSK-OV-3細胞（標的細胞）と1x10⁶個のトラスツズマブ複合体化ヒトCD16⁺ナチュラルキラー細胞懸濁液中の細胞を外側チャンバーに播種し、19時間インキュベートした。 上清を新しい外側チャンバーに移した。次いで、1x10⁶個のドナー由来 PBMC 細胞を新しい外側チャンバーに配置された内側チャンバーに播種し、その後 3 時間インキュベートして、PBMC 細胞中の CD3⁺ T 細胞の遊走を評価した。

【0314】

外側チャンバー内の細胞を採取し、CD3 抗体で光を避けながら室温で10分間染色した。次いで、細胞混合物を室温で400 x gで3分間遠心分離した。 上清を除去し、細胞ペレットを1mLのDPBSで再懸濁した。遠心分離を繰り返し、DPBSで再懸濁したCD3+ゲート細胞0.5mLをフローサイトメトリーで分析した。

【0315】

図10Bを参照。図10Bは、癌細胞が存在する領域へのCD3+ T細胞の遊走能に対する成分複合体化細胞傷害性細胞の効果を示す棒グラフである。 図10Bは、培地グループの外側のチャンバーに35個のCD3+ T細胞が含まれ、SK-OV-3 グループの外側チャンバーには 8031 個の CD3+ T 細胞が含まれ、ACE1702 グループの外側チャンバーには 2257 個の CD3+ T 細胞が含まれ、 SK-OV-3とACE1702 グループの外側チャンバーには 23183 個の CD3+ T 細胞が含まれることを示す。 すなわち、培地を含む外側チャンバーに移動するCD3+ T細胞の数と比較して、ポリカーボネート製細胞培養インサートの底部の膜を通って、標的細胞単独、ACE1702単独、およびACE1702と標的細胞の共培養を含む外側チャンバーに移動するCD3+ T細胞の数は、それぞれ229.5倍、64.5倍、および662.4倍まで有意に増加した (各条件は 3 回実行され、データは平均 ± SD として表示され、統計分析は t 検定を使用して実行された。 *、p< 0.05；**、 p< 0.01；***、p< 0.001。)

【0316】

これらの結果は、SK-OV-3 細胞などの標的細胞を含有する外側チャンバー内の成分複合体化細胞傷害性細胞(病変シミュレーション) が、病変への CD3+ T 細胞の遊走能力を大幅に増加させることを示している。

【0317】

SK-OV-3グループおよびACE1702グループのCD3+ T細胞遊走効果を比較すると、SK-OV-3とACE1702グループの外側チャンバー内の標的細胞（SK-OV-3など）と成分複合体化細胞傷害性細胞は、予想外にCD3⁺ T細胞遊走効果において相乗効果を示す。

【0318】

前述のSK-OV-3を成分に対して耐性を有する標的細胞（BT-474クローン5細胞株、HT-29細胞株、SAS細胞株など）に置き換えた場合、本発明の発明者らは、以下のような前述の実験と同様の結果が得られると期待する:
(1) 成分に耐性を有する標的細胞を含有する外側チャンバー（病変シミュレーション）内で成分と複合体化した細胞傷害性細胞（成分複合体化細胞傷害性細胞）は、CD3⁺ T 細胞の病変への遊走能力を大幅に増加させる; および
(2) 成分に耐性を有する標的細胞と外側チャンバー内の成分と複合体化した細胞傷害性細胞は、CD3⁺ T 細胞の遊走効果において予想外の相乗効果を示す。

【0319】

実施形態 6-2： CD3⁺ T細胞およびCD56+CD3-NK細胞の遊走能力に対する成分複合体化ヒトガンマデルタT細胞の影響
本実施形態では、(1)培地グループ、(2)SK-OV-3グループ、(3)ACE-gdT-HER2グループ、および(4)SK-OV-3とACE-gdT-HER2グループの4つのグループがあった。.
(1) 培地グループ: 細胞培地 (実験 1-2-1 に記載の完全増殖培地など) を外側チャンバーに添加し、19 時間インキュベートした。 上清を新しい外側チャンバーに移した。 次いで、1x10⁶ 個のドナー由来 PBMC 細胞を新しい外側チャンバーに配置された内側チャンバーに播種し、その後 3 時間インキュベートして、PBMC 細胞内の CD3⁺ T 細胞および CD56⁺CD3^-NK 細胞の遊走を評価した。

【0320】

(2) SK-OV-3 グループ: 4x10⁵ 個の SK-OV-3 細胞 (標的細胞) を外側チャンバーに播種し、19 時間インキュベートした。 上清を新しい外側チャンバーに移した。 次いで、1x10⁶ 個のドナー由来 PBMC 細胞を新しい外側チャンバーに配置された内側チャンバーに播種し、その後 3 時間インキュベートして、PBMC 細胞内の CD3⁺ T 細胞および CD56⁺CD3^-NK 細胞の遊走を評価した。

【0321】

(3) ACE-gdT-HER2 グループ: トラスツズマブ複合体化ヒトガンマデルタT細胞懸濁液中の 1x10⁶ 細胞を外側チャンバーに播種し、19 時間インキュベートした。 上清を新しい外側チャンバーに移した。 次いで、1x10⁶ 個のドナー由来 PBMC 細胞を新しい外側チャンバーに配置された内側チャンバーに播種し、その後 3 時間インキュベートして、PBMC 細胞内の CD3⁺ T 細胞および CD56⁺CD3^-NK 細胞の遊走を評価した。

【0322】

(4) SK-OV-3とACE-gdT-HER2 グループ: 4x105 個の SK-OV-3 細胞 (標的細胞) および1x106 個のトラスツズマブ複合体化ヒトガンマデルタT細胞懸濁液中の細胞を外側チャンバーに播種し、19 時間インキュベートした。上清を新しい外側チャンバーに移した。 次いで、1x10⁶ 個のドナー由来 PBMC 細胞を新しい外側チャンバーに配置された内側チャンバーに播種し、その後 3 時間インキュベートして、PBMC 細胞内の CD3⁺ T 細胞および CD56⁺CD3^-NK 細胞の遊走を評価した。

【0323】

外側チャンバー内の細胞を採取し、CD56およびCD3 抗体で光を避けながら室温で 10 分間染色した。次いで、細胞混合物を室温で400 x gで3分間遠心分離した。 上清を除去し、細胞ペレットを1mLのDPBSで再懸濁した。遠心分離を繰り返し、DPBSで再懸濁したCD3+およびCD56⁺CD3^-ゲート細胞0.5mLをフローサイトメトリーで分析した。

【0324】

本発明の発明者らは、SK-OV-3細胞などの標的細胞含有する外側チャンバー内の成分複合体化細胞傷害性細胞（病変シミュレーション）が、病変部へのCD3＋T細胞およびCD56^＋CD3^-NK細胞の遊走能力を大幅に増加させると期待している。SK-OV-3グループおよび ACE-gdT-HER2 グループのCD3⁺T細胞と CD56⁺CD3^- NK 細胞の遊走効果を比較すると、SK-OV-3とACE-gdT-HER2 グループの外側チャンバー内の標的細胞 (SK-OV-3 など) と成分複合体化細胞傷害性細胞は、予想外に CD3⁺T細胞とCD56+CD3-NK 細胞の遊走効果において相乗効果を示す。

【0325】

前述のSK-OV-3を成分に対して耐性を有する標的細胞(BT-474クローン5細胞株、HT-29細胞株、SAS細胞株など)に置き換えた場合、本発明の発明者らは、以下のような前述の実験と同様の結果が得られると期待する：
(1) 成分に耐性を有する標的細胞を含有する外側チャンバー（病変シミュレーション）内で成分と複合体化した細胞傷害性細胞（成分複合体化細胞傷害性細胞）は、CD3+ T 細胞および CD56+CD3-NK 細胞の病変への遊走能力を大幅に増加させる; および
(2) 成分に耐性を有する標的細胞と外側チャンバー内の成分と複合体化した細胞傷害性細胞は、CD3+ T 細胞およびCD56+CD3-NK細胞の遊走効果において予想外の相乗効果を示す。

【0326】

実施形態 7: 成分複合体化細胞傷害性細胞の機能に対する複合体化成分数の影響
実施形態 7-1: 成分複合体化ヒトCD16⁺ナチュラルキラー細胞の機能に対する複合体成分数の影響
実施形態 7-1-1 異なる数の成分と複合体化したヒトCD16+ナチュラルキラー細胞の調製
本実験では、実験1-1-1に記載の培養方法により２４日間培養して得られた培養oNK細胞懸濁液（本発明の２４日間培養ｏＮＫ細胞懸濁液、２４日間培養oNK細胞懸濁液と呼ばれる）を使用し、異なる数の成分（トラスツズマブ、セツキシマブ、リツキシマブ、またはアベルマブなど）と複合体化したヒト CD16+ ナチュラルキラー細胞を調製した。

【0327】

24日間培養したoNK細胞懸濁液中の細胞に異なる量の細胞リンカーを結合させて細胞-ssDNA複合体を調製した後、実施形態1-1-4に記載の化学複合体技術に従って細胞-ssDNA複合体と成分-ssDNAを混合し、異なる数の成分（トラスツズマブ、セツキシマブ、リツキシマブ、またはアベルマブなど）と複合体化したヒトCD16+ナチュラルキラー細胞が得られた。

【0328】

成分複合体化したヒト CD16+ ナチュラルキラー細胞懸濁液を、フィコエリトリン結合ヤギ抗ヒトFab抗体 (例えば、Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. より購入) と混合し、複合体化した成分 (トラスツズマブ、セツキシマブ、リツキシマブ、またはアベルマブなど）は、フィコエリトリン結合ヤギ抗ヒトFab抗体と特異的に相互作用した。

【0329】

フィコエリトリン結合ヤギ抗ヒト Fab 抗体の平均蛍光強度を、各ヒト CD16+ ナチュラルキラー細胞上に複合体化した成分 (トラスツズマブ、セツキシマブ、リツキシマブ、アベルマブなど) の数に変換するために、Quantum^ＴＭSimply Cellular^Ｒキット (Bangs Laboratories, Inc. #815)に由来する標準曲線が開発された。Quantum^ＴＭSimply Cellular^Ｒキットには、5 本のマイクロスフェアボトル (増加量の抗ヒト IgG 抗体でコーティングされた 4 つの集団「#1、#2、#3 および #4」、1 つはコーティングされなかったブランク) があった。 1、#2、#3および#4マイクロスフェアを含む10マイクロリットルの抗ヒトIgG抗体結合マイクロスフェアを、1μg/mLの成分（トラスツズマブ、セツキシマブ、リツキシマブまたはアベルマブなど）と共に、合計0.1mLの反応容量で室温で30分間個別にインキュベートした。 ブランクマイクロスフェアについては、成分 (トラスツズマブ、セツキシマブ、リツキシマブ、またはアベルマブなど) を加えずに同様の手順を実行した。 次いで、トラスツズマブ結合＃１～＃４マイクロスフェアおよびブランクマイクロスフェアを、上記のフィコエリトリン結合ヤギ抗ヒトFab抗体によって検出した。マイクロスフェアを 0.5 mL の DPBS で洗浄し、懸濁液を 400 x g で室温で5分間遠心分離した。

【0330】

上清を除去し、懸濁した QSC マイクロスフェアをフローサイトメトリーで分析した。 各マイクロスフェアの取得した平均蛍光強度値をメーカー提供の計算シート (QuickCal V2.3) の各欄に挿入し、メーカーの指示に従って対応する標準曲線を作成した。 各成分 (トラスツズマブ、セツキシマブ、リツキシマブ、またはアベルマブなど) の絶対数の標準曲線を個別に作成した後、0、1000 ± 500、3000 ± 500、6000 ± 500、12000 ± 3000、20000 ± 5000、30000 ±5000、50000 ± 5000、または 130000 ± 5000の成分分子 (トラスツズマブ分子、セツキシマブ分子、リツキシマブ分子、またはアベルマブ分子など) を QuickCal シートに挿入して、細胞あたり 0、1000±500、3000±500、6000±500、12000±3000、20000±5000、30000±5000、50000±5000、または130000±5000 の成分分子と複合体化したフィコエリトリン結合ヤギ抗ヒト Fab 抗体染色したヒト CD16+ ナチュラルキラー細胞の対応する蛍光強度値に変換する。

【0331】

セルソーター（BD FACSMelody、BD FACSAria III、SONY SH800Sなど）を使用して、細胞あたり0、1000±500、3000±500、6000±500、12000±3000、20000±5000、30000±5000、50000±5000、または130000±5000の成分分子（トラスツズマブ分子、セツキシマブ分子、リツキシマブ分子、またはアベルマブ分子など）と複合体化したヒトCD16⁺ナチュラルキラー細胞を単離した。

【0332】

以下の実施形態7-1-2～7-1-5で使用したエフェクター細胞は9種類であった:
0 個トラスツズマブ分子と複合体化した oNK 細胞 (Ctrl-oNK 細胞): このグループでは、28 日間培養した oNK 細胞懸濁液中の細胞を使用した。
1000 個のトラスツズマブ分子と複合体化した oNK 細胞: このグループでは、細胞あたり 500 ～1500 個のトラスツズマブ分子と複合体化したヒト CD16⁺ ナチュラルキラー細胞を使用した。
3000 個のトラスツズマブ分子と複合体化した oNK 細胞: このグループでは、細胞あたり 2500 ～3500 個のトラスツズマブ分子と複合体化したヒト CD16⁺ ナチュラルキラー細胞を使用した。
6000 個のトラスツズマブ分子と複合体化した oNK 細胞: このグループでは、細胞あたり 5500 ～6500 個のトラスツズマブ分子と複合体化したヒト CD16⁺ ナチュラルキラー細胞を使用した。
12000 個のトラスツズマブ分子と複合体化した oNK 細胞: このグループでは、細胞あたり 9000 ～15000 個のトラスツズマブ分子と複合体化したヒト CD16⁺ ナチュラルキラー細胞を使用した。
20000 個のトラスツズマブ分子と複合体化した oNK 細胞: このグループでは、細胞あたり 15000 ～25000 個のトラスツズマブ分子と複合体化したヒト CD16⁺ ナチュラルキラー細胞を使用した。
30000 個のトラスツズマブ分子と複合体化した oNK 細胞: このグループでは、細胞あたり 25000 ～35000 個のトラスツズマブ分子と複合体化したヒト CD16⁺ ナチュラルキラー細胞を使用した。
50000 個のトラスツズマブ分子と複合体化した oNK 細胞: このグループでは、細胞あたり 45000 ～55000 個のトラスツズマブ分子と複合体化したヒト CD16⁺ ナチュラルキラー細胞を使用した。
130000 個のトラスツズマブ分子と複合体化した oNK 細胞: このグループでは、細胞あたり 125000 ～135000 個のトラスツズマブ分子と複合体化したヒト CD16⁺ ナチュラルキラー細胞を使用した。

【0333】

実施形態 7-1-2 成分複合体化ヒトCD16+ナチュラルキラー細胞の細胞傷害性機能に対する複合体化成分の数の影響
本実施形態では、CellTiter-Glo^Ｒ発光細胞生存率アッセイ（Promega、米国）を使用して、標的細胞に対するエフェクター細胞の細胞傷害性能力を検出した。 まず、CELLSTAR^Ｒ 96ウェルプレート（Cat.No.655083、Greinerより購入）のウェルを以下のように分割した:
(1) 目標コントロールウェル、
(2) 0 個のトラスツズマブ分子と複合化したoNK細胞ベースウェル、
(3) 0 個のトラスツズマブ分子と複合体化したoNK細胞と標的実験ウェル、
(4) 1000 個のトラスツズマブ分子と複合化したoNK細胞ベースウェル、
(5) 1000 個のトラスツズマブ分子と複合体化したoNK細胞と標的実験ウェル、
(6) 3000 個のトラスツズマブ分子と複合化したoNK細胞ベースウェル、
(7) 3000 個のトラスツズマブ分子と複合体化したoNK細胞と標的実験ウェル、
(8) 6000 個のトラスツズマブ分子と複合化したoNK細胞ベースウェル、
(9) 6000 個のトラスツズマブ分子と複合体化したoNK細胞と標的実験ウェル、
(10) 12000 個のトラスツズマブ分子と複合化したoNK細胞ベースウェル、および
(11) 12000 個のトラスツズマブ分子と複合体化したoNK細胞と標的実験ウェル。

【0334】

本実験で使用した標的細胞は、 ［１］ ヒト乳癌細胞株BT474 (HTB-20、ATCCより購入)、または ［２］ BT474 由来のトラスツズマブ耐性クローン BT474 クローン 5 (CRL-3247、ATCCより購入)。

【0335】

標的細胞 (BT474 または BT474 クローン 5 細胞) を:
目標コントロールウェル、
0 個のトラスツズマブ分子と複合体化したoNK細胞と標的実験ウェル、
1000 個のトラスツズマブ分子と複合体化したoNK細胞と標的実験ウェル、
3000 個のトラスツズマブ分子と複合体化したoNK細胞と標的実験ウェル、
6000 個のトラスツズマブ分子と複合体化したoNK細胞と標的実験ウェル、 および
12000 個のトラスツズマブ分子と複合体化したoNK細胞と標的実験ウェルに、
各ウェルが5000個の標的細胞を含むように播種した。

【0336】

28日間培養したoNK細胞懸濁液のサンプルを以下のウェルに添加した:
0 個のトラスツズマブ分子と複合化したoNK細胞ベースウェル、および
0 個のトラスツズマブ分子と複合体化したoNK細胞と標的実験ウェル。

【0337】

細胞あたり500から1500個のトラスツズマブ分子と複合体化したヒトCD16+ナチュラルキラー細胞のサンプルを、以下のウェルに添加した:
1000 個のトラスツズマブ分子と複合化したoNK細胞ベースウェル、および
1000 個のトラスツズマブ分子と複合体化したoNK細胞と標的実験ウェル。

【0338】

細胞あたり2500から3500のトラスツズマブ分子と複合体化したヒトCD16+ナチュラルキラー細胞のサンプルを、以下のウェルに添加した:
3000 個のトラスツズマブ分子と複合化したoNK細胞ベースウェル、および
3000 個のトラスツズマブ分子と複合体化したoNK細胞と標的実験ウェル。

【0339】

細胞あたり5500から6500のトラスツズマブ分子と複合体化したヒトCD16+ナチュラルキラー細胞のサンプルを、以下のウェルに添加した:
6000 個のトラスツズマブ分子と複合化したoNK細胞ベースウェル、および
6000 個のトラスツズマブ分子と複合体化したoNK細胞と標的実験ウェル。

【0340】

細胞あたり9000から15000のトラスツズマブ分子と複合体化したヒトCD16+ナチュラルキラー細胞のサンプルを、以下のウェルに添加した:
12000 個のトラスツズマブ分子と複合化したoNK細胞ベースウェル、および
12000 個のトラスツズマブ分子と複合体化したoNK細胞と標的実験ウェル。

【0341】

これらのウェルにおけるエフェクター細胞数と標的細胞 (BT474 または BT474 クローン 5 細胞) 数の比率は各グループで同じであった。

【0342】

CELLSTAR^Ｒ 96ウェルプレートを37℃、5% CO2で4時間インキュベートした。 4時間のインキュベーション後、培養物を50μLのCellTiter Glo基質（CellTiter-Glo^Ｒ 発光細胞生存率アッセイキット、Promega、Cat. G7570）と混合し、光を当てずに室温で12分間インキュベートした。 各ウェルの発光を発光プレートリーダー（Synergy H1、BioTek Instruments、米国）によって測定および記録した。

【0343】

ウェルに残存する生細胞の数が多いほど、Synergy H1システムによって検出される発光は高くなる。 したがって、発光を使用して、実験ウェル内で溶解された標的細胞の割合を変換することができる。 発光を、実験ウェルで溶解された標的細胞の割合に変換するために使用した式は以下の通りである:
「0 個のトラスツズマブ分子と複合化したoNK細胞ベースウェル」における溶解された標的細胞の割合 (%) = 1 - [(0 個のトラスツズマブ分子と複合化したoNK細胞ベースウェルの発光 - 0 個のトラスツズマブ分子と複合化したoNK細胞ベースウェルの発光) ÷ (目標コントロールウェルの発光)] × 100%
「1000 個のトラスツズマブ分子と複合化したoNK細胞ベースウェル」における溶解された標的細胞の割合 (%) = 1 - [(1000 個のトラスツズマブ分子と複合体を形成したoNK細胞と標的実験ウェルの発光 - 1000 個のトラスツズマブ分子と複合化したoNK細胞ベースウェルの発光) ÷ (目標コントロールウェルの発光)] × 100%
「3000 個のトラスツズマブ分子と複合化したoNK細胞ベースウェル」における溶解された標的細胞の割合 (%) = 1 - [(3000 個のトラスツズマブ分子と複合体を形成したoNK細胞と標的実験ウェルの発光 - 3000 個のトラスツズマブ分子と複合化したoNK細胞ベースウェルの発光) ÷ (目標コントロールウェルの発光)] × 100%
「6000 個のトラスツズマブ分子と複合化したoNK細胞ベースウェル」における溶解された標的細胞の割合 (%) = 1 - [(6000 個のトラスツズマブ分子と複合体を形成したoNK細胞と標的実験ウェルの発光 - 6000 個のトラスツズマブ分子と複合化したoNK細胞ベースウェルの発光) ÷ (目標コントロールウェルの発光)] × 100%
「12000 個のトラスツズマブ分子と複合化したoNK細胞ベースウェル」における溶解された標的細胞の割合 (%) = 1 - [(12000 個のトラスツズマブ分子と複合体を形成したoNK細胞と標的実験ウェルの発光 - 12000 個のトラスツズマブ分子と複合化したoNK細胞ベースウェルの発光) ÷ (目標コントロールウェルの発光)] × 100%
本発明の結果は、次のことを示唆している:
Ctrl-oNK細胞と比較して、細胞あたり少なくとも1000個のトラスツズマブ分子と複合体化したoNK細胞（例えば、細胞あたり1000個、3000個、3500個、6000個、または12000個のトラスツズマブ分子と複合体化したもの）は、より多くのBT474細胞を死滅させることができる（p<0.05）;
対照的に、Ctrl-oNK細胞と比較すると、細胞あたり1000～3000個のトラスツズマブ分子と複合体化したoNK細胞は、より多くのトラスツズマブ耐性のBT474クローン5細胞を死滅させることができない。また、 細胞あたり3000個以上のトラスツズマブ分子と複合体化したoNK細胞（例えば、細胞あたり3500個、6000個、または12000個のトラスツズマブ分子と複合体化したもの）は、Ctrl-oNK細胞と比較して、より多くのトラスツズマブ耐性BT474クローン5細胞を死滅させることができる（p<0.05）。

【0344】

さらに、本発明の結果は、前述のトラスツズマブ複合体化ヒトCD16+ナチュラルキラー細胞をセツキシマブ複合体化ヒトCD16+ナチュラルキラー細胞に置き換え、BT474およびBT474クローン5細胞を標的細胞HCC827およびHT-29 (またはHSC-4 および SAS)に置き換えれば、前述の実験と同様の結果が得られることが示唆される。 すなわち、本発明の結果は次のことを示唆している:
Ctrl-oNK 細胞と比較して、細胞あたり少なくとも 1000 個のセツキシマブ分子と複合体化した oNK 細胞（例えば、細胞あたり 1000個、3000個、3500個、6000個、または 12000 個のセツキシマブ分子と複合体化したもの）は、より多くの HCC827 細胞（または HSC-4 細胞）を死滅させることができる (p<0.05);
対照的に、Ctrl-oNK 細胞と比較すると、細胞あたり 1000 ～ 3000 個のセツキシマブ分子と複合体化した oNK 細胞は、より多くのセツキシマブ耐性 HT-29 細胞 (または SAS 細胞) を死滅させることができない。また、細胞あたり 3000個以上のセツキシマブ分子と複合体化した oNK 細胞（例えば、細胞あたり 3500個、6000個、または 12000 個のセツキシマブ分子と複合体化したもの）は、Ctrl-oNK 細胞と比較して、より多くのセツキシマブ耐性 HT-29 細胞（または SAS 細胞）を死滅させることができる(p<0.05)。

【0345】

さらに、本発明の結果は、前述のトラスツズマブ複合体化ヒトCD16+ナチュラルキラー細胞をリツキシマブ複合体化ヒトCD16+ナチュラルキラー細胞に置き換え、BT474およびBT474クローン5細胞を標的細胞RajiおよびRaji-2R80 (または Raji-2RH)に置き換えれば 、前述の実験と同様の結果が得られることが示唆される。 すなわち、本発明の結果は次のことを示唆している:
Ctrl-oNK 細胞と比較して、細胞あたり少なくとも 1000 個のリツキシマブ分子と複合体化した oNK 細胞（例えば、細胞あたり 1000個、3000個、3500個、6000個、または 12000 個のリツキシマブ分子と複合体化したもの）は、より多くの Raji 細胞を死滅させることができる（p<0.05）;
対照的に、Ctrl-oNK 細胞と比較して、細胞あたり 1000 ～ 3000 個のリツキシマブ分子と複合体化した oNK 細胞は、より多くのリツキシマブ耐性 Raji-2R80 (または Raji-2RH) を死滅させることができない。また、細胞あたり 3000 個以上のリツキシマブ分子と複合体化した oNK 細胞（例えば、細胞あたり 3500個、6000個、または12000 個のリツキシマブ分子と複合体化したもの）は、Ctrl-oNK と比較して、より多くのリツキシマブ耐性 Raji-2R80（または Raji-2RH）を死滅させることができる (p<0.05)。

【0346】

さらに、本発明の結果は、前述のトラスツズマブ複合体化ヒトCD16+ナチュラルキラー細胞をアベルマブ複合体化ヒトCD16+ナチュラルキラー細胞に置き換え、BT474およびBT474クローン5細胞を標的細胞MDA-MB-231 および MDA-MB-468 (または H1650 および H2087)に置き換えれば、前述の実験と同様の結果が得られることが示唆される。すなわち、本発明の結果は次のことを示唆している:
Ctrl-oNK 細胞と比較して、細胞あたり少なくとも 1000 アベルマブ分子と複合体化した oNK 細胞（例えば、細胞あたり 細胞あたり 1000個、3000個、3500個、6000個、または12000 個のアベルマブ分子と複合体化したもの）は、より多くの MDA-MB-231 細胞（またはH1650) を死滅させることができる(p<0.05);
ベルマブ分子と複合体化した oNK 細胞は、より多くのアベルマブ耐性 MDA-MB-468 (または H2087) を死滅させることができない。また、細胞あたり 3000 個以上のアベルマブ分子と複合体化した oNK 細胞（例えば、細胞あたり 3500個、6000個、または 12000 個のアベルマブ分子と複合体化したもの）は、Ctrl-oNK と比較して、より多くのアベルマブ耐性 MDA-MB-468（または H2087）を死滅させることができる (p<0.05)。

【0347】

実施形態 7-1-3 成分反応性または成分耐性標的細胞と共培養した後の成分複合体化ヒトCD16+ナチュラルキラー細胞における活性化マーカーおよび細胞傷害性分子の発現に対する複合体成分数の影響
本実施形態では、細胞毒性試験を実施するために96ウェル細胞培養プレートを含有し、96ウェル細胞培養プレートのウェルを以下のように分割した:
0 個のトラスツズマブ分子と複合体化したoNK細胞実験ウェル、
1000 個のトラスツズマブ分子と複合体化したoNK細胞実験ウェル、
3000 個のトラスツズマブ分子と複合体化したoNK細胞実験ウェル、
6000 個のトラスツズマブ分子と複合体化したoNK細胞実験ウェル、
12000 個のトラスツズマブ分子と複合体化したoNK細胞実験ウェル、
目標コントロールウェル、および
培地バックグラウンドコントロールウェル。

【0348】

本実施形態で使用した標的細胞は、接着性ヒト乳癌細胞株である反応性BT-474（HTB-20、ATCCより購入）または耐性BT-474クローン5細胞株（CRL-3247、ATCCより購入）であった。

【0349】

BT-474またはBT-474クローン5の標的細胞を以下のウェルに播種した:
0 個のトラスツズマブ分子と複合体化したoNK細胞実験ウェル、
1000 個のトラスツズマブ分子と複合体化したoNK細胞実験ウェル、
3000 個のトラスツズマブ分子と複合体化したoNK細胞実験ウェル、
6000 個のトラスツズマブ分子と複合体化したoNK細胞実験ウェル、
12000 個のトラスツズマブ分子と複合体化したoNK細胞実験ウェル、および
目標コントロールウェル。したがって、各ウェルには10000個の標的細胞が含まれ、30分間静置した後、細胞培養プレートを37℃、5％二酸化炭素の条件下で 2 時間インキュベートした。

【0350】

23日間培養したoNK細胞懸濁液のサンプルを、0 個のトラスツズマブ分子と複合体化したoNK細胞実験ウェルに添加した。

【0351】

細胞当たり500～1500個のトラスツズマブ分子と複合体化したヒトCD16+ナチュラルキラー細胞のサンプルを、1000 個のトラスツズマブ分子と複合体化したoNK細胞実験ウェルに添加した。

【0352】

細胞当たり2500～3500個のトラスツズマブ分子と複合体化したヒトCD16+ナチュラルキラー細胞のサンプルを、3000個のトラスツズマブ分子と複合体化したoNK細胞実験ウェルに添加した。

【0353】

細胞当たり5500～6500個のトラスツズマブ分子と複合体化したヒトCD16+ナチュラルキラー細胞のサンプルを、6000個のトラスツズマブ分子と複合体化したoNK細胞実験ウェルに添加した。

【0354】

細胞当たり9000～15000個のトラスツズマブ分子と複合体化したヒトCD16+ナチュラルキラー細胞のサンプルを、12000個のトラスツズマブ分子と複合体化したoNK細胞実験ウェルに添加した。

【0355】

これらのウェルにおけるエフェクター細胞数と標的細胞 (BT474 または BT474 クローン 5 細胞) 数の比率は 1:1 であった。 細胞培養プレートを37℃、5％二酸化炭素の条件下で５時間インキュベーターに置いた。

【0356】

96ウェル細胞培養プレートを400 x gで5分間遠心分離した。 上清を除去し、細胞ペレットを0.2mLのDPBSで洗浄した。 次いで、洗浄した細胞ペレットを、1:50希釈のFITC-抗ヒトTNF-α抗体（BioLegend、Cat.502906）、抗PE-抗ヒトCD56抗体（BioLegend、Cat.）、PE/Cy7-抗ヒト IFN ガンマ抗体 (BioLegend、Cat.502528)、Alexa Fluor 647-抗ヒト グランザイム B 抗体 (BioLegend、Cat.)、および APC-Cy7-抗ヒト CD107a 抗体 (BioLegend、Cat.328630)を含む 100uL の DPBS で 10分間染色した。染色した細胞を遠心分離し、0.2mLのDPBSで洗浄した。洗浄した細胞を0.5 mLのDPBSで再懸濁し、CD56陽性ゲート集団をTNF-α+、IFN-γ+、グランザイムB+、およびCD107a+の割合についてさらに分析した。 CD56 陽性ゲート集団の平均蛍光強度も分析した。

【0357】

本発明の発明者らは次のことを期待している:
細胞あたり少なくとも1000個のトラスツズマブ分子と複合体化したoNK細胞（例えば、細胞あたり1000個、3000個、3500個、6000個、または12000個のトラスツズマブ分子と複合体化したもの）は、BT474細胞との共培養後、Ctrl-oNK細胞がBT474細胞との共培養後に発現したものと比較して、より多くのTNF-α、IFN-γ、グランザイムB、およびCD107aを発現することができる（p<0.05）；
対照的に、細胞当たり1000～3000個のトラスツズマブ分子と複合体化したoNK細胞は、トラスツズマブ耐性BT474クローン5細胞と共培養した後、Ctrl-oNKがBT474 クローン 5 細胞と共培養した後に発現したものと比較して、より多くのTNF-α、IFN-γ、グランザイムB、CD107aを発現できない。細胞あたり3000個以上のトラスツズマブ分子と複合体化したoNK細胞（例えば、細胞あたり 3500個、6000個、または 12000 個のトラスツズマブ分子と複合体を形成したもの）は、トラスツズマブ耐性BT474クローン5細胞との共培養後、Ctrl-oNK細胞がBT474クローン5細胞との共培養後に発現したものと比較して、より多くのTNF-α、IFN-γ、グランザイムBおよびCD107aを発現することができる（p<0.05）。

【0358】

本発明の発明者らは、前述のトラスツズマブ複合体化ヒトCD16+ナチュラルキラー細胞がセツキシマブ複合体化ヒトCD16+ナチュラルキラー細胞に置き換え、BT474およびBT474クローン5細胞が標的細胞HCC827およびHT-29(またはHSC-4 および SAS)に置き換えれば、前述の実験と同様の結果が得られると期待している。 すなわち、本発明の発明者らは次のことを期待している:
細胞あたり 1000 個のセツキシマブ分子と複合体化した oNK 細胞（例えば、細胞あたり 1000個、3000個、3500個、6000個、または 12000 個のセツキシマブ分子と複合体化したもの）は、 HCC827 細胞 (またはHSC-4 細胞) と共培養した後、Ctrl-oNK細胞が発現したものと比較して、より多くのTNF-α、IFN-γ、グランザイムB、およびCD107aを発現することができる（p<0.05）;
対照的に、細胞あたり1000～3000個のセツキシマブ分子と複合体化したoNK細胞は、セツキシマブ耐性HT-29細胞（またはSAS細胞）と共培養した後、Ctrl-oNK細胞がセツキシマブ耐性HT-29細胞（またはSAS細胞）と共培養した後に発現したものと比較して、より多くのTNF-α、IFN-γ、グランザイムBおよびCD107aを発現できない。 細胞あたり 3000 個以上のセツキシマブ分子と複合体化した oNK 細胞（例えば、細胞あたり 3500個、6000個、または 12000 個のセツキシマブ分子と複合体化したもの）は、セツキシマブ耐性HT-29細胞（またはSAS細胞）と共培養後、より多くの TNF-α、IFN-γ、グランザイム B、および CD107a を発現できる（p<0.05）。

【0359】

本発明の発明者らは、前述のトラスツズマブ複合体化ヒトCD16+ナチュラルキラー細胞をリツキシマブ複合体化ヒトCD16+ナチュラルキラー細胞に置き換え、BT474およびBT474クローン5細胞が標的細胞RajiおよびRaji-2R80(またはRaji-2RH)に置き換えれば、前述の実験と同様の結果が得られると期待している。 すなわち、本発明の発明者らは次のことを期待している:
細胞あたり 1000 個のリツキシマブ分子と複合体化した oNK 細胞（例えば、細胞あたり 1000個、3000個、3500個、6000個、または 12000 個のリツキシマブ分子と複合体化したもの）は、 Raji 細胞と共培養した後、 Ctrl-oNK 細胞がRaji細胞との共培養後に発現したものと比較して、 より多くのTNF-α、IFN-γ、グランザイムB、およびCD107aを発現することができる（p<0.05）;
対照的に、細胞あたり1000～3000個のリツキシマブ分子と複合化したoNK細胞は、リツキシマブ耐性のRaji-2R80（またはRaji-2RH）と共培養した後、Ctrl-oNK細胞がリツキシマブ耐性のRaji-2R80（またはRaji-2RH）と共培養した後に発現したものと比較して、より多くのTNF-α、IFN-γ、グランザイムBおよびCD107aを発現することができない。細胞あたり3000個以上のリツキシマブ分子と複合体化したoNK細胞（例えば、細胞あたり3500個、6000個、または12000個のリツキシマブ分子と複合体化したもの）は、リツキシマブ耐性Raji-2R80（またはRaji-2RH）との共培養後、Ctrl-oNK細胞がRaji-2R80との共培養後に発現したものと比較して、より多くのTNF-α、IFN-γ、グランザイムB、およびCD107aを発現することができる（p<0.05）。

【0360】

本発明の発明者らは、前述のトラスツズマブ複合体化ヒトCD16+ナチュラルキラー細胞をアベルマブ複合化ヒトCD16+ナチュラルキラー細胞に置き換え、BT474およびBT474クローン5細胞を標的細胞MDA-MB-231およびMDA-MB-468（またはH1650およびH2087）に置き換えれば、前述の実験と同様の結果が得られると期待している。 すなわち、本発明の発明者らは次のことを期待している:
細胞あたり少なくとも1000個のアベルマブ分子と複合体化したoNK細胞（例えば、細胞あたり1000個、3000個、3500個、6000個、または12000個のアベルマブ分子と複合体化したもの）は、MDA-MB-231細胞（またはH1650）と共培養した後、Ctrl-oNK細胞がMDA-MB-231細胞（またはH1650）と共培養した後に発現したものと比較して、より多くのTNF-α、IFN-γ、グランザイムB、およびCD107aを発現することができる（p<0.05）;
対照的に、細胞あたり1000～3000個のアベルマブ分子と複合体化したoNK細胞は、アベルマブ耐性のMDA-MB-468（またはH2087）と共培養した後、Ctrl-oNK細胞がアベルマブ耐性のMDA-MB-468（またはH2087）と共培養した後に発現したものと比較して、より多くのTNF-α、IFN-γ、グランザイムBおよびCD107aを発現することができない。 細胞あたり3000個以上のアベルマブ分子と複合体化したoNK細胞（例えば、細胞あたり3500、6000、または12000のアベルマブ分子と複合体化した）は、アベルマブ耐性のMDA-MB-468（またはH2087）との共培養後、Ctrl-oNK細胞がMDA-MB-468（またはH2087）との共培養後に発現したものと比較して、より多くのTNF-α、IFN-γ、グランザイムB、およびCD107aを発現することができる（p<0.05）。

【0361】

実施形態 7-1-4 成分複合体化ヒトCD16+ナチュラルキラー細胞の遊走に対する複合体化成分の数の影響
本実施形態で使用した外側チャンバーは、24ウェルプレート（ThermoScientific社製、Cat.142475）であった。本実施形態で使用した内側チャンバーは、ポリカーボネート製細胞培養インサート（Millipore社製、Cat.PITP01250）であった。本実施形態では6つのグループがあった:
0 個のトラスツズマブ分子と複合体化したoNK細胞実験グループ: 2 x 10⁵個の標的細胞(BT474 または BT474 クローン 5 細胞) を外側チャンバーに播種した。 付着2時間後、孔径5μmのポリカーボネート製細胞培養インサート（ミリセル製細胞培養インサート）を外側チャンバーに挿入し、36日間培養したoNK細胞懸濁液中の1×10⁶細胞を各内側チャンバーに播種し、19時間インキュベートした。
1000個のトラスツズマブ分子と複合体化したoNK細胞実験グループ: 2 x 10⁵個の標的細胞(BT474 または BT474 クローン 5 細胞) を外側チャンバーに播種した。 付着2時間後、孔径3μmのポリカーボネート製細胞培養インサート（ミリセル社製細胞培養インサート）を外側チャンバーに挿入し、細胞あたり500～1500個のトラスツズマブ分子と複合体化した1×10⁶個のヒトCD16⁺ナチュラルキラー細胞を各内側チャンバーに播種し、 19 時間インキュベートした。
3000個のトラスツズマブ分子と複合体化したoNK細胞実験グループ: 2 x 10⁵個の標的細胞(BT474 または BT474 クローン 5 細胞) を外側チャンバーに播種した。 付着2時間後、孔径3μmのポリカーボネート製細胞培養インサート（ミリセル社製細胞培養インサート）を外側チャンバーに挿入し、細胞あたり2500～3500個のトラスツズマブ分子と複合体化した1×10⁶個のヒトCD16⁺ナチュラルキラー細胞を各内側チャンバーに播種し、 19 時間インキュベートした。
6000個のトラスツズマブ分子と複合体化したoNK細胞実験グループ: 2 x 10⁵個の標的細胞(BT474 または BT474 クローン 5 細胞) を外側チャンバーに播種した。付着2時間後、孔径3μmのポリカーボネート製細胞培養インサート（ミリセル社製細胞培養インサート）を外側チャンバーに挿入し、細胞あたり5500～6500個のトラスツズマブ分子と複合体化した1×10⁶個のヒトCD16⁺ナチュラルキラー細胞を各内側チャンバーに播種し、 19 時間インキュベートした。
12000個のトラスツズマブ分子と複合体化したoNK細胞実験グループ: 2 x 10⁵個の標的細胞(BT474 または BT474 クローン 5 細胞) を外側チャンバーに播種した。 付着2時間後、孔径3μmのポリカーボネート製細胞培養インサート（ミリセル社製細胞培養インサート）を外側チャンバーに挿入し、細胞あたり9000～15000個のトラスツズマブ分子と複合体化した1×10⁶個のヒトCD16⁺ナチュラルキラー細胞を各内側チャンバーに播種し、 19 時間インキュベートした。
30000個のトラスツズマブ分子と複合体化したoNK細胞実験グループ: 2x10⁵個の標的細胞(BT474またはBT474クローン5細胞) を外側チャンバーに播種した。 付着2時間後、孔径3μmのポリカーボネート製細胞培養インサート（ミリセル社製細胞培養インサート）を外側チャンバーに挿入し、細胞あたり25000～35000個のトラスツズマブ分子と複合体化した1×10⁶個のヒトCD16⁺ナチュラルキラー細胞を各内側チャンバーに播種し、 19時間インキュベートした。

【0362】

外側チャンバー内の細胞を採取し、PE結合マウス抗ヒトCD56 (BioLegend、#304606)およびPE-Cy5結合CD3抗体で、光を避けながら室温で10分間染色した。 次いで、細胞混合物を室温で400 x gで3分間遠心分離した。上清を除去し、細胞ペレットを1 mLのDPBSで再懸濁した。 遠心分離を繰り返し、DPBS で再懸濁した CD56+/CD3 ゲート細胞 0.5 mL をフローサイトメトリーで分析した。

【0363】

本発明の結果は、次のことを示唆している
BT474細胞を含む外側チャンバーに移動するCtrl-oNK細胞の量と比較し、内側チャンバーで細胞あたり少なくとも1000個のトラスツズマブ分子と複合体化した（例えば、細胞あたり1000個、3000個、6000個、12000個、または30000個のトラスツズマブ分子と複合体化したもの）oNK細胞は、ポリカーボネート製細胞培養インサートの底部の膜を通過し、BT474細胞を含む外側チャンバーに移動することができる（p<0.05）;
対照的に、トラスツズマブ耐性BT474クローン5細胞を含む外側チャンバーに移動するCtrl-oNK細胞の量と比較すると、細胞あたり1000～3000個のトラスツズマブ分子と複合体化した同量のoNK細胞が、ポリカーボネート製細胞培養インサートの底部の膜を通過して、トラスツズマブ耐性BT474クローン5細胞を含む外側チャンバーに移動し、 内側チャンバー内で細胞あたり3000個以上のトラスツズマブ分子と複合体化した（例えば、細胞あたり6000個、12000個、または30000個のトラスツズマブ分子と複合体化したもの）より多くのoNK細胞は、ポリカーボネート製細胞培養インサートの底部の膜を通過し、トラスツズマブ耐性BT474クローン5細胞を含む外側チャンバーに移動することができる（p<0.05）。

【0364】

さらに、本発明の結果は、前述のトラスツズマブ複合体化ヒトCD16+ナチュラルキラー細胞をセツキシマブ複合体化ヒトCD16+ナチュラルキラー細胞に置き換え、BT474およびBT474クローン5細胞を標的細胞HCC827-lucおよびHT-29（またはHSC-4およびSAS）に置き換えれば、前述の実験と同様の結果が得られることを示唆する。すなわち、本発明の結果は以下のことを示唆している:
HCC827-luc細胞（またはHSC-4細胞）を含む外側チャンバーに移動するCtrl-oNK細胞の量と比較し、細胞あたり少なくとも1000個のセツキシマブ分子と複合体化した（例えば、細胞あたり1000個、3000個、6000個、12000個、または30000個のセツキシマブ分子と複合体化した）より多くのoNK細胞は、ポリカーボネート製細胞培養インサートの底部の膜を通過し、HCC827-luc細胞（またはHSC-4細胞）を含む外側チャンバーに移動することができる（p<0. 05);
対照的に、セツキシマブ耐性HT-29細胞（またはSAS細胞）を含む外側チャンバーに移動するCtrl-oNK細胞の量と比較すると、細胞あたり1000～3000個のセツキシマブ分子と複合体化した同量のoNK細胞が、ポリカーボネート製細胞培養インサートプレートの底部の膜を通過して、セツキシマブ耐性HT-29細胞（またはSAS細胞）を含む外側のチャンバーに移動し、内側チャンバー内で細胞あたり 3000 個以上のセツキシマブ分子と複合体化した (例えば、細胞あたり 6000個、12000個、または30000 個のセツキシマブ分子と複合体化したもの) より多くの oNK 細胞は、ポリカーボネート製細胞培養インサートの底部の膜を通過し、セツキシマブ耐性HT-29細胞（またはSAS細胞）を含む外側チャンバーに移動することができる（p<0.05）。

【0365】

さらに、本発明の結果は、前述のトラスツズマブ複合体化ヒトCD16+ナチュラルキラー細胞をリツキシマブ複合体化ヒトCD16+ナチュラルキラー細胞に置き換え、BT474およびBT474クローン5細胞を標的細胞RajiおよびRaji-2R80(またはRaji-2RH)に置き換えれば、前述の実験と同様の結果が得られることを示唆する。すなわち、本発明の結果は、次のことを示唆している:
Raji細胞を含む外側チャンバーに移動するCtrl-oNK細胞の量と比較し、細胞当たり少なくとも1000個のリツキシマブ分子と複合体化した（例えば、細胞あたり1000、3000、6000、12000、または30000個のリツキシマブ分子と複合体化したもの）より多くのoNK細胞は、ポリカーボネート製細胞培養インサートの底部の膜を通過し、Raji 細胞を含む外側チャンバーに移動することができる (p<0.05);
対照的に、リツキシマブ耐性Raji-2R80（またはRaji-2RH）を含む外側チャンバーに移動するCtrl-oNK細胞の量と比較すると、細胞あたり1000～3000個のリツキシマブ分子と複合体化した同量のoNK細胞が、ポリカーボネート製細胞培養インサートの底部の膜を通過して、リツキシマブ耐性のRaji-2R80（またはRaji-2RH）を含む外側のチャンバーに移動し、 内側チャンバー内で細胞あたり3000個以上のリツキシマブ分子と複合体化した（例えば、細胞あたり6000個、12000個、または30000個のリツキシマブ分子と複合体化したもの）より多くのoNK細胞は、ポリカーボネート製細胞培養インサートの底部の膜を通過し、リツキシマブ耐性Raji-2R80（またはRaji-2RH）を含む外側チャンバーに移動することができる（p<0.05）。

【0366】

さらに、本発明の結果は、前述のトラスツズマブ複合体化ヒトCD16+ナチュラルキラー細胞をアベルマブ複合体化ヒトCD16+ナチュラルキラー細胞に置き換え、BT474およびBT474クローン5細胞を標的細胞MDA-MB-231 および MDA-MB-468 (または H1650 および H2087) に置き換えれば、 前述の実験と同様の結果が得られることを示唆する。すなわち、本発明の結果は以下のことを示唆している:
MDA-MB-231細胞（またはH1650）を含む外側チャンバーに移動するCtrl-oNK細胞の量と比較し、細胞当たり少なくとも1000個のアベルマブ分子と複合体化した（例えば、細胞あたり1000個、3000個、 6,000個、12,000個、または 30,000 個のアベルマブ分子と複合体化したもの）より多くのoNK細胞は、ポリカーボネート製細胞培養インサートの底部の膜を通過し、MDA-MB-231 細胞（または H1650）を含む外側チャンバーに移動することができる（p<0.05）,
対照的に、アベルマブ耐性 MDA-MB-468 (または H2087) を含む外側チャンバーに移動する Ctrl-oNK 細胞の量と比較すると、細胞あたり 1000 ～ 3000 個のアベルマブ分子と複合体体した同量の oNK 細胞が、ポリカーボネート製細胞培養インサートの底部の膜を通過して、アベルマブ耐性 MDA-MB-468 (または H2087) を含む外側チャンバーに移動し、 内側チャンバー内で細胞あたり3000 個以上のアベルマブ分子と複合体化した(例えば、細胞あたり 6000個、12,000個、または 30,000 個のアベルマブ分子と複合体化したもの) より多くの oNK 細胞は、ポリカーボネート製細胞培養インサートの底部の膜を通過し、アベルマブ耐性MDA-MB-468 (または H2087) を含む外側チャンバーに移動する (p<0.05)。

【0367】

実施形態 7-1-5 CD3+ T細胞の遊走能力に対する異なる数の成分と複合体化したヒトCD16+ ナチュラルキラー細胞の影響
本実施形態で使用した外側チャンバーは、24ウェルプレート（ThermoScientific社製、Cat.142475）であった。本実施形態で使用した内側チャンバーは、孔径3μmのポリカーボネート製細胞培養インサート（Millipore社製、Cat.PITP01250）であった。

【0368】

本実施形態では6つのグループがあった:
0 個のトラスツズマブ分子と複合体化したoNK細胞グループ：4x10⁵個の標的細胞（BT474細胞またはBT474クローン5細胞）と33日間培養したoNK細胞懸濁液中の1x106細胞を外側チャンバーに播種し、19時間インキュベートした。 上清を新しい外側チャンバーに移した。 次いで、1x10⁶個のドナー由来 PBMC 細胞を、新しい外側チャンバーに配置された内側チャンバーに播種し、その後3時間インキュベートして、PBMC 細胞におけるCD3⁺ T細胞の遊走を評価した。
1000 個のトラスツズマブ分子と複合体化したoNK細胞グループ: 4x10⁵ 個の標的細胞 (BT474 または BT474 クローン5細胞) と、細胞あたり500から1500個のトラスツズマブ分子と複合体化した 1x10⁶ 個のヒト CD16⁺ ナチュラルキラー細胞を外側チャンバーに播種し、19 時間インキュベートした。 上清を新しい外側チャンバーに移した。 次いで、1x10⁶ 個のドナー由来 PBMC 細胞を、新しい外側チャンバーに配置された内側チャンバーに播種し、その後3時間インキュベートして、PBMC 細胞におけるCD3⁺ T細胞の遊走を評価した。
3000 個のトラスツズマブ分子と複合体化したoNK細胞グループ: 4x10⁵ 個の標的細胞 (BT474 または BT474クローン5 細胞)と、細胞あたり2500から3500個のトラスツズマブ分子と複合体化した 1x10⁶ 個のヒト CD16⁺ ナチュラルキラー細胞を外側チャンバーに播種し、19 時間インキュベートした。上清を新しい外側チャンバーに移した。 次いで、1x10⁶ 個のドナー由来 PBMC 細胞を、新しい外側チャンバーに配置された内側チャンバーに播種し、その後3時間インキュベートして、PBMC 細胞におけるCD3⁺ T細胞の遊走を評価した。
6000 個のトラスツズマブ分子と複合体化したoNK細胞グループ: 4x10⁵ 個の標的細胞 (BT474 または BT474クローン5 細胞)と、細胞あたり5500から6500個のトラスツズマブ分子と複合体化した 1x10⁶ 個のヒト CD16⁺ ナチュラルキラー細胞を外側チャンバーに播種し、19 時間インキュベートした。 上清を新しい外側チャンバーに移した。 次いで、1x10⁶ 個のドナー由来 PBMC 細胞を、新しい外側チャンバーに配置された内側チャンバーに播種し、その後3時間インキュベートして、PBMC 細胞におけるCD3⁺ T細胞の遊走を評価した。
12000 個のトラスツズマブ分子と複合体化したoNK細胞グループ: 4x10⁵ 個の標的細胞 (BT474 または BT474クローン5 細胞)と、細胞あたり9000から15000個のトラスツズマブ分子と複合体化した 1x10⁶ 個のヒト CD16⁺ ナチュラルキラー細胞を外側チャンバーに播種し、19 時間インキュベートした。 上清を新しい外側チャンバーに移した。 次いで、1x10⁶ 個のドナー由来 PBMC 細胞を、新しい外側チャンバーに配置された内側チャンバーに播種し、その後3時間インキュベートして、PBMC 細胞におけるCD3⁺ T細胞の遊走を評価した。
30000 個のトラスツズマブ分子と複合体化したoNK細胞グループ: 4x10⁵ 個の標的細胞 (BT474 または BT474クローン5 細胞)と、細胞あたり25000から35000個のトラスツズマブ分子と複合体化した 1x10⁶ 個のヒト CD16⁺ ナチュラルキラー細胞を外側チャンバーに播種し、19 時間インキュベートした。 上清を新しい外側チャンバーに移した。 次いで、1x10⁶ 個のドナー由来 PBMC 細胞を、新しい外側チャンバーに配置された内側チャンバーに播種し、その後3時間インキュベートして、PBMC 細胞におけるCD3⁺ T細胞の遊走を評価した。

【0369】

外側チャンバー内の細胞を採取し、光を避けながら室温で 10 分間 CD3 抗体で染色した。 次いで、細胞混合物を室温で400 x gで3分間遠心分離した。 上清を除去し、細胞ペレットを1mLのDPBSで再懸濁した。 遠心分離を繰り返し、DPBS で再懸濁した CD3+ ゲート細胞 0.5 mL をフローサイトメトリーで分析した。

【0370】

本発明の発明者らは次のことを期待している:
内側チャンバー内の大量のCD3⁺T細胞は、ポリカーボネート製細胞培養インサートの底部の膜を通過し、細胞あたり少なくとも1000個のトラスツズマブ分子と複合体化したBT474細胞とoNK細胞を含む外側のチャンバーに移動することができるが、 CD3⁺T細胞は、トラスツズマブ耐性BT474クローン5細胞および複合体化したトラスツズマブ数が細胞あたり3000個以上のトラスツズマブ分子に達するまで細胞あたり少数のトラスツズマブ分子と複合体化したoNK細胞を含む外側チャンバーに移動する場合、ポリカーボネート製細胞培養インサートの底部の膜を通過することができない。

【0371】

さらに、本発明の発明者らは、前述のトラスツズマブ複合体化ヒトCD16+ナチュラルキラー細胞をセツキシマブ複合体化ヒトCD16+ナチュラルキラー細胞に置き換え、BT474およびBT474クローン5細胞が標的細胞HCC827およびHT-29(またはHSC-4 および SAS)に置き換えれば、前述の実験と同様の結果が得られると期待している。すなわち、本発明の発明者らは、大量のCD3+ T細胞がポリカーボネート製細胞培養インサートの底部の膜を通過して、細胞あたり少なくとも1000個のセツキシマブ分子と複合体化したHCC827細胞(またはHSC-4細胞)およびoNK細胞を含む外側チャンバーに移動することができるが、CD3+ T細胞は、セツキシマブ耐性HT-29細胞（またはSAS細胞）および複合体化したセツキシマブ数が細胞あたり3000個以上のセツキシマブ分子に達するまで細胞あたり少数のセツキシマブ分子と複合体化したoNK細胞を含む外側チャンバーに移動する場合、ポリカーボネート製細胞培養インサートの底部の膜を通過することができないと期待している。

【0372】

さらに、本発明の発明者らは、前述のトラスツズマブ複合体化ヒトCD16+ナチュラルキラー細胞をリツキシマブ複合体化ヒトCD16+ナチュラルキラー細胞に置き換え、BT474およびBT474クローン5細胞を標的細胞RajiおよびRaji-2R80（またはRaji-2RH)に置き換えれば、前述の実験と同様の結果が得られると期待している。 すなわち、本発明の発明者らは、大量のCD3+ T細胞がポリカーボネート細胞培養インサートの底部の膜を通過し、細胞あたり少なくとも1000個のリツキシマブ分子と複合体化したRaji細胞およびoNK細胞を含む外側チャンバーに移動できるが、CD3+ T細胞は、リツキシマブ耐性Raji-2R80（またはRaji-2RH）および複合体化したリツキシマブ数が細胞あたり 3000 以上のリツキシマブ分子に達するまで細胞あたり少数のリツキシマブ分子と複合体化したoNK細胞を含む外側チャンバーに移動する場合、ポリカーボネート製細胞培養インサートの底部の膜を通過することができないと期待している。

【0373】

本発明の発明者らは、前述のトラスツズマブ複合体化ヒトCD16+ナチュラルキラー細胞をアベルマブ複合体化ヒトCD16+ナチュラルキラー細胞に置き換え、BT474およびBT474クローン5細胞を標的細胞MDA-MB-231およびMDA-MB-231および MB-468 (または H1650 および H2087) に置き換えれば、前述の実験と同様の結果が得られると期待している。すなわち、本発明の発明者らは、大量のCD3+ T細胞がポリカーボネート細胞培養インサートの底部の膜を通過し、細胞あたり少なくとも1000個のアベルマブ分子と複合体化したMDA-MB-231細胞（またはH1650）およびoNK細胞を含む外側チャンバーに移動することができるが、CD3+ T 細胞は、、アベルマブ耐性 MDA-MB-468 (または H2087) および複合体化したアベルマブ数が細胞あたり 3000 個以上の アベルマブ分子に達するまで細胞あたり少数のアベルマブ分子と複合体化した oNK 細胞を含む外側チャンバーに移動する場合、ポリカーボネート製細胞培養インサートの底部の膜を通過することができないと期待している。

【0374】

実施形態 7-2: 成分複合体ヒトガンマデルタT細胞の機能に対する複合体成分数の影響
実施形態 7-2-1 異なる数の成分と複合体化したヒトガンマデルタT細胞の調製
本実験では、実験1-2-1に記載の培養方法により16日間培養して得られた培養ガンマデルタＴ細胞懸濁液（本発明の16日間ガンマデルタＴ細胞懸濁液、１6日間ガンマデルタT細胞懸濁液と呼ばれる）を使用し、 異なる数の成分（トラスツズマブ、セツキシマブ、リツキシマブ、またはアベルマブなど）と複合体化したヒトガンマデルタT細胞を調製した。

【0375】

16日間のガンマデルタＴ細胞懸濁液中の細胞に異なる量の細胞リンカーを結合させて細胞－ssDNA複合体を調製した後、実施形態1-1-4に記載の化学複合技術に従って細胞－ssDNA複合体と成分－ssDNAを混合し、 異なる数の成分（トラスツズマブ、セツキシマブ、リツキシマブ、またはアベルマブなど）と複合体化したガンマデルタT細胞が得られた。

【0376】

成分複合化ヒトガンマデルタT細胞懸濁液を、フィコエリトリン結合ヤギ抗ヒトFab抗体（例えば、Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.より購入）と混合し、複合体化した成分（トラスツズマブ、セツキシマブ、リツキシマブ、またはアベルマブなど）は、フィコエリトリン結合ヤギ抗ヒトFab抗体と特異的に相互作用した。

【0377】

フィコエリトリン結合ヤギ抗ヒト Fab 抗体の平均蛍光強度を、各ヒトガンマデルタT細胞上に複合体化した成分 (トラスツズマブ、セツキシマブ、リツキシマブ、アベルマブなど) の数に変換するために、Quantum^ＴＭSimply Cellular^Ｒキット (Bangs Laboratories, Inc. #815)に由来する標準曲線が開発された。Quantum^ＴＭSimply Cellular^Ｒキットには、5 本のマイクロスフェアボトル (増加量の抗ヒト IgG 抗体でコーティングされた 4 つの集団「#1、#2、#3 および #4」、1 つはコーティングされなかったブランク) があった。 #1、#2、#3、および#4 マイクロスフェアを含む10 マイクロリットルの抗ヒトIgG 抗体結合マイクロスフェアを、1 μg/mLの成分 (トラスツズマブ、セツキシマブ、リツキシマブ、またはアベルマブなど) と共に、合計0.1mLの反応容量で室温で30分間個別にインキュベートした。 ブランクマイクロスフェアについては、成分 (トラスツズマブ、セツキシマブ、リツキシマブ、またはアベルマブなど) を加えずに同様の手順を実行した。次いで、トラスツズマブ結合＃１～＃４マイクロスフェアおよびブランクマイクロスフェアを、上記のフィコエリトリン結合ヤギ抗ヒトFab抗体によって検出した。マイクロスフェアを 0.5 mL の DPBS で洗浄し、懸濁液を 400 x g で室温で5分間遠心分離した。 上清を除去し、懸濁した QSC マイクロスフェアをフローサイトメトリーで分析した。各マイクロスフェアの取得した平均蛍光強度値をメーカー提供の計算シート (QuickCal V2.3) の各欄に挿入し、メーカーの指示に従って対応する標準曲線を作成した。 各成分（トラスツズマブ、セツキシマブ、リツキシマブ、またはアベルマブなど）の絶対数の標準曲線を個別に作成した後、0、1000 ± 500、3000 ± 500、6000 ± 500、12000 ± 3000、20000 ± 5000、30000 ±次に、5000、50000 ± 5000、または 130000 ± 5000 の成分分子 (トラスツズマブ分子、セツキシマブ分子、リツキシマブ分子、またはアベルマブ分子など) を QuickCal シートに挿入して、細胞あたり0、1000±500、3000±500、6000±500、12000±3000、20000±5000、30000±5000、50000±5000、または130000±5000の成分分子と複合体化したフィコエリトリン結合ヤギ抗ヒトFab抗体染色したヒトガンマデルタT細胞の対応する蛍光強度値に変換する。

【0378】

セルソーター(BD FACSMelody、BD FACSAria III、_SONY SH800S など) を使用して、細胞あたり0、1000 ± 500、3000 ± 500、6000 ± 500、12000 ± 3000、20000 ± 5000、30000 ± 5000、50000 ± 5000、または 130000 ± 5000 の成分分子 (トラスツズマブ分子、セツキシマブ分子、リツキシマブ分子、またはアベルマブ分子など)と複合体化したヒトガンマデルタT細胞を分離した。

【0379】

各実施形態7-2-2～7-2-5で使用したエフェクター細胞は9種類であった:
0個トラスツズマブ分子と複合化したgdT細胞: このグループには、16日ガンマデルタT細胞懸濁液の細胞を使用した。
1000個トラスツズマブ分子と複合化したgdT細胞: このグループでは、細胞当たり500～1500個のトラスツズマブ分子と複合体化したヒトガンマデルタT細胞を使用した。
3000個トラスツズマブ分子と複合化したgdT細胞: このグループでは、細胞当たり2500～3500個のトラスツズマブ分子と複合体化したヒトガンマデルタT細胞を使用した。
6000個トラスツズマブ分子と複合化したgdT細胞: このグループでは、細胞当たり5500～6500個のトラスツズマブ分子と複合体化したヒトガンマデルタT細胞を使用した。
12000個トラスツズマブ分子と複合化したgdT細胞: このグループでは、細胞当たり9000～15000個のトラスツズマブ分子と複合体化したヒトガンマデルタT細胞を使用した。
20000個トラスツズマブ分子と複合化したgdT細胞: このグループでは、細胞当たり15000～25000個のトラスツズマブ分子と複合体化したヒトガンマデルタT細胞を使用した。
30000個トラスツズマブ分子と複合化したgdT細胞: このグループでは、細胞当たり25000～35000個のトラスツズマブ分子と複合体化したヒトガンマデルタT細胞を使用した。
50000個トラスツズマブ分子と複合化したgdT細胞: このグループでは、細胞当たり45000～55000個のトラスツズマブ分子と複合体化したヒトガンマデルタT細胞を使用した。
130000個トラスツズマブ分子と複合化したgdT細胞: このグループでは、細胞当たり125000～135000個のトラスツズマブ分子と複合体化したヒトガンマデルタT細胞を使用した。

【0380】

実施形態 7-2-2 成分複合体化ヒトガンマデルタT細胞の細胞傷害機能に対する複合体成分数の影響
本実施形態では、CellTiter-Glo^Ｒ発光細胞生存率アッセイ（Promega、米国）を使用して、標的細胞に対するエフェクター細胞の細胞傷害性能力を検出した。まず、CELLSTAR^Ｒ 96 ウェル プレート (Cat.No.655083、Greinerより購入) のウェルを以下のように分割した:
(1) 目標コントロールウェル、
(2) 0 個のトラスツズマブ分子と複合体化したgdT細胞ベースウェル、
(3) 0 個のトラスツズマブ分子と複合体化したgdT細胞と標的実験ウェル、
(4) 1000 個のトラスツズマブ分子と複合体化したgdT細胞ベースウェル、
(5) 1000 個のトラスツズマブ分子と複合体化したgdT細胞と標的実験ウェル、
(6) 3000 個のトラスツズマブ分子と複合体化したgdT細胞ベースウェル、
(7) 3000 個のトラスツズマブ分子と複合体化したgdT細胞と標的実験ウェル、
(8) 6000 個のトラスツズマブ分子と複合体化したgdT細胞ベースウェル、および
(9) 6000 個のトラスツズマブ分子と複合体化したgdT細胞と標的実験ウェル。

【0381】

(10) 12000 個のトラスツズマブ分子と複合体化したgdT細胞ベースウェル、および
(11) 12000 個のトラスツズマブ分子と複合体化したgdT細胞と標的実験ウェル。

【0382】

本実験で使用した標的細胞は、 ［１］ ヒト乳癌細胞株BT474（HTB-20、ATCCより購入）であり、または ［２］ BT474由来のトラスツズマブ耐性クローンBT474クローン5（CRL-3247、ATCCより購入）である。

【0383】

標的細胞（BT474またはBT474クローン5細胞）を:
目標コントロールウェル、
0 個のトラスツズマブ分子と複合体化したgdT細胞と標的実験ウェル、
1000 個のトラスツズマブ分子と複合体化したgdT細胞と標的実験ウェル、
3000 個のトラスツズマブ分子と複合体化したgdT細胞と標的実験ウェル、
6000 個のトラスツズマブ分子と複合体化したgdT細胞と標的実験ウェル、および
12000 個のトラスツズマブ分子と複合体化したgdT細胞と標的実験ウェルに
各ウェルが5000個の標的細胞を含むように播種した。

【0384】

16日間のガンマデルタT細胞懸濁液(Ctrl-gdT 細胞) のサンプルを以下のウェルに添加した:
0 個のトラスツズマブ分子と複合体化したgdT細胞ベースウェル、 および
0 個のトラスツズマブ分子と複合体化したgdT細胞と標的実験ウェル。

【0385】

細胞あたり500 から1500個のトラスツズマブ分子と複合体化したヒトガンマデルタT細胞のサンプルを、以下のウェルに添加した:
1000 個のトラスツズマブ分子と複合体化したgdT細胞ベースウェル、および
1000 個のトラスツズマブ分子と複合体化したgdT細胞と標的実験ウェル。

【0386】

細胞あたり2500から3500個のトラスツズマブ分子と複合体化したヒトガンマデルタT細胞のサンプルを、以下のウェルに添加した:
3000 個のトラスツズマブ分子と複合体化したgdT細胞ベースウェル、および
3000 個のトラスツズマブ分子と複合体化したgdT細胞と標的実験ウェル。

【0387】

細胞あたり5500から6500個のトラスツズマブ分子と複合体化したヒトガンマデルタT細胞のサンプルを、以下のウェルに添加した:
6000 個のトラスツズマブ分子と複合体化したgdT細胞ベースウェル、および
6000 個のトラスツズマブ分子と複合体化したgdT細胞と標的実験ウェル。

【0388】

細胞あたり9000から15000個のトラスツズマブ分子と複合体化したヒトガンマデルタT細胞のサンプルを、以下のウェルに添加した:
12000 個のトラスツズマブ分子と複合体化したgdT細胞ベースウェル、および
12000 個のトラスツズマブ分子と複合体化したgdT細胞と標的実験ウェル。

【0389】

これらのウェルにおけるエフェクター細胞数と標的細胞 (BT474 または BT474 クローン 5 細胞) 数の比率は各グループで同じであった。

【0390】

CELLSTAR^Ｒ 96 ウェルプレートを 37℃、5% CO2 で 4 時間インキュベートした。 ４時間のインキュベーション後、培養物を50μLのCellTiter Glo基質（CellTiter-Glo^Ｒ 発光細胞生存率アッセイキット、Promega、Cat. G7570）と混合し、光を当てずに室温で12分間インキュベートした。各ウェルの発光を発光プレートリーダー（Synergy H1、BioTek Instruments、米国）によって測定および記録した。

【0391】

ウェルに残存する生細胞の数が多いほど、Synergy H1システムによって検出される発光は高くなる。したがって、発光を使用して、実験ウェル内で溶解された標的細胞の割合を変換することができる。発光を、実験ウェルで溶解された標的細胞の割合に変換するために使用した式は以下の通りである:
「0 個のトラスツズマブ分子と複合体化したgdT細胞と標的実験ウェル」における溶解された標的細胞の割合 (%) = 1 - [(0 個のトラスツズマブ分子と複合体化したgdT細胞と標的実験ウェルの発光 - 0 個のトラスツズマブ分子と複合体化したgdT細胞ベースウェルの発光) ÷ (目標コントロールウェルの発光)] × 100%
「1000 個のトラスツズマブ分子と複合体化したgdT細胞と標的実験ウェル」における溶解された標的細胞の割合 (%) = 1 - [(1000 個のトラスツズマブ分子と複合体化したgdT細胞と標的実験ウェルの発光 - 1000 個のトラスツズマブ分子と複合体化したgdT細胞ベースウェルの発光) ÷ (目標コントロールウェルの発光)] × 100%
「3000 個のトラスツズマブ分子と複合体化したgdT細胞と標的実験ウェル」における溶解された標的細胞の割合 (%) = 1 - [(3000 個のトラスツズマブ分子と複合体化したgdT細胞と標的実験ウェルの発光 - 3000 個のトラスツズマブ分子と複合体化したgdT細胞ベースウェルの発光) ÷ (目標コントロールウェルの発光)] × 100%
「6000 個のトラスツズマブ分子と複合体化したgdT細胞と標的実験ウェル」における溶解された標的細胞の割合 (%) = 1 - [(6000 個のトラスツズマブ分子と複合体化したgdT細胞と標的実験ウェルの発光 - 6000 個のトラスツズマブ分子と複合体化したgdT細胞ベースウェルの発光) ÷ (目標コントロールウェルの発光)] × 100%
「12000 個のトラスツズマブ分子と複合体化したgdT細胞と標的実験ウェル」における溶解された標的細胞の割合(%) = 1 - [(12000 個のトラスツズマブ分子と複合体化したgdT細胞と標的実験ウェルの発光 - 12000 個のトラスツズマブ分子と複合体化したgdT細胞ベースウェルの発光) ÷ (目標コントロールウェルの発光)] × 100%
本発明の結果は、次のことを示唆している:
Ctrl-gdT細胞と比較して、細胞あたり少なくとも1000個のトラスツズマブ分子と複合体化したgdT細胞（例えば、細胞あたり1000個、3000個、3500個、6000個、または12000個のトラスツズマブ分子と複合体化したもの）は、より多くのBT474細胞を死滅させることができる（p<0.05）;
対照的に、図11を参照。Ctrl-gdT細胞と比較すると、細胞あたり1000～3000個のトラスツズマブ分子と複合体化したgdT細胞は、より多くのトラスツズマブ耐性BT474クローン5細胞を死滅させることができない。また、細胞あたり 3000 個以上のトラスツズマブ分子と複合体化した gdT 細胞 (例えば、細胞あたり3500個、6000個、または 12000 個のトラスツズマブ分子と複合体化したもの) は、Ctrl-gdT 細胞と比較して、より多くのトラスツズマブ耐性 BT474 クローン 5 細胞を死滅させることができます (p<0.05)。

【0392】

さらに、本発明の結果は、前述のトラスツズマブ複合体化ヒトガンマデルタＴ細胞をセツキシマブ複合体化ヒトガンマデルタＴ細胞に置き換え、BT474およびBT474クローン5細胞が標的細胞HCC827およびHT-29(またはHSC-4 および SAS)に置き換えれば 、前述の実験と同様の結果が得られることが示唆される。 すなわち、本発明の結果は次のことを示唆している:
Ctrl-oNK 細胞と比較して、細胞あたり少なくとも 1000 個のセツキシマブ分子と複合体化した gdT 細胞（例えば、細胞あたり 1000個、3000個、3500個、6000個、または 12000 個のセツキシマブ分子と複合体化したもの）は、より多くの HCC827 細胞（または HSC-4 細胞）を死滅させることができる (p<0.05);
対照的に、Ctrl-gdT 細胞と比較すると、細胞あたり 1000 ～ 3000 個のセツキシマブ分子と複合体化した gdT 細胞は、より多くのセツキシマブ耐性 HT-29 細胞 (または SAS 細胞) を死滅させることができない。また、細胞あたり 3000 個以上のセツキシマブ分子と複合体化した gdT 細胞（例えば、細胞あたり 3500個、6000個、または 12000 個のセツキシマブ分子と複合体化したもの）は、Ctrl-gdT 細胞と比較して、より多くのセツキシマブ耐性 HT-29 細胞（または SAS 細胞）を死滅させることができる (p<0.05)。

【0393】

さらに、結果は、前述のトラスツズマブ複合体化ヒトガンマデルタＴ細胞をリツキシマブ複合体化ヒトガンマデルタＴ細胞（抗CD20抗体複合化ヒトガンマデルタT細胞）に置き換え、BT474細胞およびBT474クローン5細胞を標的細胞RajiおよびRaji-2R80(またはRaji-2RH)に置き換えれば 、前述の実験と同様の結果が得られることが示唆される。 すなわち、本発明の結果は次のことを示唆している:
Ctrl-gdT細胞と比較して、細胞当たり少なくとも1000個のリツキシマブ分子と複合体化したgdT細胞（例えば、細胞当たり1000個、3000個個、3500個、6000個、12000個、20000個、50000個、または130000個のリツキシマブ分子と複合体化したもの）は、より多くのRaji細胞を死滅させることができる(p<0.05);
対照的に、図12を参照。Ctrl-gdT細胞と比較して、細胞あたり1000～3000個のリツキシマブ分子と複合体化したgdT細胞は、より多くのリツキシマブ耐性Raji-2R80（またはRaji-2RH）を死滅させることができない。また、細胞あたり 3000 個以上のリツキシマブ分子と複合体化した gdT 細胞 (例えば、細胞あたり3500個、6000個、12000個、20000個、50000個、または130000 個のリツキシマブ分子と複合体化したもの) は、より多くのリツキシマブ耐性 Raji-2R80 (または Raji-2RH) を死滅させることができる (p<0.05)。

【0394】

さらに、本発明の結果は、前述のトラスツズマブ複合体化ヒトガンマデルタＴ細胞をアベルマブ複合体化ヒトガンマデルタＴ細胞に置き換え、BT474およびBT474クローン5細胞を標的細胞MDA-MB-231 および MDA-MB-468 (または H1650 および H2087)に置き換えれば、前述の実験と同様の結果が得られることが示唆される。すなわち、本発明の結果は次のことを示唆している:
Ctrl-gdT 細胞と比較して、細胞あたり少なくとも 1000 個のアベルマブ分子と複合体化した gdT 細胞（例えば、細胞あたり 1000個、3000個、3500個、6000個、または 12000 個のアベルマブ分子と複合体化したもの）は、より多くの MDA-MB-231 細胞（またはH1650)を死滅させることができる (p<0.05);
対照的に、Ctrl-gdT 細胞と比較して、細胞あたり少なくとも 1000～3000個のアベルマブ分子と複合体化した gdT 細胞は、より多くの MDA-MB-231（またはH1650)を死滅させることができない。また、細胞あたり3000個以上のアベルマブ分子と複合体化したgdT細胞（例えば、細胞あたり3500個、6000個、または12000個のアベルマブ分子と複合化したもの）は、より多くのアベルマブ耐性のMDA-MB-468（またはH2087）を死滅させることができる。

【0395】

実施形態 7-2-3 成分反応性または成分耐性標的細胞との共培養後の成分複合体化ヒトガンマデルタT細胞における活性化マーカーおよび細胞傷害性分子の発現に対する複合体化成分数の影響
本実施形態では、細胞毒性試験を実施するために96ウェル細胞培養プレートを含有し、96ウェル細胞培養プレートのウェルを以下のように分割した:
0 個のトラスツズマブ分子と複合体化したgdT細胞実験ウェル、
1000 個のトラスツズマブ分子と複合体化したgdT細胞実験ウェル、
3000 個のトラスツズマブ分子と複合体化したgdT細胞実験ウェル、
6000 個のトラスツズマブ分子と複合体化したgdT細胞実験ウェル、
12000 個のトラスツズマブ分子と複合体化したgdT細胞実験ウェル、および
培地バックグラウンドコントロールウェル。

【0396】

本実施形態で使用した標的細胞は、接着性ヒト乳癌細胞株である感受性BT-474（HTB-20、ATCCより購入）または耐性BT-474クローン5細胞株（CRL-3247、ATCCより購入）であった。

【0397】

BT-474またはBT-474クローン5の標的細胞を以下のウェルに播種した:
0 個のトラスツズマブ分子と複合体化したgdT細胞実験ウェル、
1000 個のトラスツズマブ分子と複合体化したgdT細胞実験ウェル、
3000 個のトラスツズマブ分子と複合体化したgdT細胞実験ウェル、
6000 個のトラスツズマブ分子と複合体化したgdT細胞実験ウェル、
12000 個のトラスツズマブ分子と複合体化したgdT細胞実験ウェル、および
目標コントロールウェル。したがって、各ウェルには5000個の標的細胞が含まれ、30分間静置した後、細胞培養プレートを37℃、5％二酸化炭素の条件下で 2 時間インキュベートした。

【0398】

16日間のガンマデルタT細胞懸濁液のサンプルを、0個のトラスツズマブ分子と複合体化したgdT細胞実験ウェルに添加した。

【0399】

細胞あたり500～1500個のトラスツズマブ分子と複合体化したヒトガンマデルタT細胞のサンプルを、1000個のトラスツズマブ分子と複合体化したgdT細胞実験ウェルに添加した。

【0400】

細胞あたり2500～3500個のトラスツズマブ分子と複合体化したヒトガンマデルタT細胞のサンプルを、3000個のトラスツズマブ分子と複合体化したgdT細胞実験ウェルに添加した。

【0401】

細胞あたり5500～6500個のトラスツズマブ分子と複合体化したヒトガンマデルタT細胞のサンプルを、6000個のトラスツズマブ分子と複合体化したgdT細胞実験ウェルに添加した。

【0402】

細胞あたり9000～15000個のトラスツズマブ分子と複合体化したヒトガンマデルタT細胞のサンプルを、12000個のトラスツズマブ分子と複合体化したgdT細胞実験ウェルに添加した。

【0403】

これらのウェルにおけるエフェクター細胞数と標的細胞 (BT474 または BT474 クローン 5 細胞) 数の比率は各グループで同じでした。細胞培養プレートを37℃、5%二酸化炭素の条件下で５時間インキュベーターに置いた。

【0404】

96ウェル細胞培養プレートを400 x gで5分間遠心分離した。上清を除去し、細胞ペレットを0.2mLのDPBSで洗浄した。 次いで、洗浄した細胞ペレットを、1:50希釈のFITC-抗ヒトTNF-α抗体（BioLegend、Cat.502906）、抗PE-抗ヒトCD56抗体（BioLegend、Cat.）、PE/Cy7-抗ヒトIFN-γ抗体 (BioLegend、Cat.502528)、Alexa Fluor 647-抗ヒトグランザイムB抗体 (BioLegend、Cat.)、およびAPC-Cy7-抗ヒトCD107a抗体(BioLegend、Cat.328630)を含む100uLのDPBSで10分間染色した。 染色した細胞を遠心分離し、0.2mLのDPBSで洗浄した。 洗浄した細胞を0.5 mLのDPBSで再懸濁し、CD56陽性ゲート集団をTNF-α+、IFN-γ+、グランザイムB+、およびCD107a+の割合についてさらに分析した。CD56陽性ゲート集団の平均蛍光強度も分析した。

【0405】

本発明の発明者らは次のことを期待している：
細胞あたり少なくとも1000個のトラスツズマブ分子と複合体化したgdT細胞（例えば、細胞あたり1000個、3000個、3500個、6000個、または 12000 個のトラスツズマブ分子と複合体化したもの）は、 BT474 細胞との共培養後、 Ctrl-gdT 細胞が BT474 細胞と共培養した後に発現したものと比較して、より多くのTNF-α、IFN-γ、グランザイムB、およびCD107aを発現することができる（p<0.05);
対照的に、細胞あたり1000～3000個のトラスツズマブ分子と複合体化したgdT細胞は、トラスツズマブ耐性BT474クローン5細胞と共培養した後、Ctrl-gdT細胞が BT474 クローン 5 細胞との共培養した後に発現したものと比較して、より多くのTNF-α、IFN-γ、グランザイムBおよびCD107aを発現することができない（p<0.05）。細胞あたり3000個以上のトラスツズマブ分子と複合体化したgdT細胞（例えば、細胞あたり3500、6000または12000個のトラスツズマブ分子と複合化したもの）は、トラスツズマブ耐性BT474クローン5細胞との共培養後、Ctrl-gdT細胞がBT474クローン5細胞との共培養後に発現したものと比較して、より多くのTNF-α、IFN-γ、グランザイムBおよびCD107aを発現することができる。

【0406】

さらに、本発明の発明者らは、前述のトラスツズマブ複合体化ヒトガンマデルタＴ細胞をセツキシマブ複合体化ヒトガンマデルタＴ細胞に置き換え、BT474およびBT474クローン5細胞を標的細胞HCC827およびHT-29（またはHSC-4およびSAS）に置き換えれば、前述の実験と同様の結果が得られると期待している。 すなわち、本発明の発明者らは次のことを期待している:
細胞あたり少なくとも1000個のセツキシマブ分子と複合体化したgdT細胞（例えば、細胞あたり1000個、3000個、3500個、6000個、または12000個のセツキシマブ分子と複合体化したもの）は、HCC827細胞（またはHSC-4細胞）と共培養した後、Ctrl-gdT細胞がHCC827細胞（またはHSC-4細胞）と共培養した後に発現したものと比較して、より多くのTNF-α、IFN-γ、グランザイムBおよびCD107aを発現することができる（p<0.05）;
対照的に、1細胞あたり1000～3000個のセツキシマブ分子と複合体化したgdT細胞は、セツキシマブ耐性HT-29細胞（またはSAS細胞）と共培養した後、Ctrl-gdT細胞がセツキシマブ耐性HT-29細胞（またはSAS細胞）との共培養した後に発現したものと比較して、より多くのTNF-α、IFN-γ、グランザイムBおよびCD107aを発現することできない。 細胞あたり 3000 個以上のセツキシマブ分子と複合体化した gdT 細胞（例えば、細胞あたり3500個、6000個、または12000個のセツキシマブ分子と複合体化したもの）は、セツキシマブ耐性HT-29細胞（またはSAS細胞）との共培養後、より多くのTNF-α、IFN-γ、グランザイムBおよびCD107aを発現することができる（p<0.05）。

【0407】

さらに、本発明の発明者らは、前述のトラスツズマブ複合体化ヒトガンマデルタＴ細胞をリツキシマブ複合体化ヒトガンマデルタＴ細胞に置き換え、BT474およびBT474クローン5細胞を標的細胞RajiおよびRaji-2R80（またはRaji-2RH）に置き換えれば、前述の実験と同様の結果が得られると期待している。 すなわち、本発明の発明者らは次のことを期待している:
細胞当たり少なくとも1000個のリツキシマブ分子と複合体化したgdT細胞（例えば、細胞当たり1000個、3000個、3500個、6000個、または12000個のリツキシマブ分子と複合化したもの）は、Raji細胞との共培養した後、Ctrl-gdT細胞がRaji細胞との共培養した後に発現したものと比較して、より多くのTNF-α、IFN-γ、グランザイムBおよびCD107aを発現することができる。
対照的に、細胞あたり 1000 ～ 3000 個のリツキシマブ分子と複合体化した gdT 細胞は、リツキシマブ耐性 Raji-2R80 (または Raji-2RH) と共培養した後、Ctrl-gdT細胞がリツキシマブ耐性Raji-2R80（またはRaji-2RH）との共培養した後に発現したものと比較して、より多くのTNF α、IFN γ、グランザイム B および CD107a を発現することができない; また、細胞あたり 3000個 以上のリツキシマブ分子と複合体化した gdT 細胞（例えば、細胞あたり 3500個、6000個、または12000 個のリツキシマブ分子と複合体化したもの）は、リツキシマブ耐性Raji-2R80 (またはRaji-2RH)との共培養後、より多くの TNF-α、IFN-γ、グランザイム B、および CD107a を発現することができる (p<0.05)。

【0408】

さらに、本発明の発明者らは、前述のトラスツズマブ複合体化ヒトガンマデルタＴ細胞をアベルマブ複合体化ヒトガンマデルタＴ細胞に置き換え、BT474およびBT474クローン5細胞を標的細胞MDA-MB-231およびMDA-MB-468（またはH1650およびH2087）に置き換えれば、前述の実験と同様の結果が得られると期待している。 すなわち、本発明の発明者らは次のことを期待している:
細胞あたり少なくとも1000個のアベルマブ分子と複合体化したgdT細胞（例えば、細胞あたり1000個、3000個、3500個、6000個、または 12000個のアベルマブ分子と複合体化したもの）は、 MDA-MB-231細胞 (またはH1650) との共培養した後、 Ctrl-gdT細胞がMDA-MB-231細胞 (または H1650)との共培養した後に発現したものと比較して、より多くのTNF-α、IFN-γ、グランザイムBおよびCD107aを発現することができる (p<0.05);
対照的に、細胞あたり1000～3000個のアベルマブ分子と複合体化したgdT細胞は、アベルマブ耐性 MDA-MB-468 (または H2087) と共培養した後、Ctrl-gdT 細胞がアベルマブ耐性 MDA-MB-468 (または H2087) との共培養した後に発現したものと比較して、より多くのTNF α、IFN γ、グランザイムB およびCD107aを発現することができない。また、細胞あたり 3,000 個以上のアベルマブ分子と複合体化した gdT 細胞（例えば、細胞あたり 3500個、6000個、または 12000 個のアベルマブ分子と複合体したもの）は、アベルマブ耐性 MDA-MB-468 (または H2087)との共培養後、より多くの TNF-α、IFN-γ、グランザイムB、およびCD107aを発現することができる (p<0.05)。

【0409】

実施形態 7-2-4 成分複合体化ヒトガンマデルタT細胞の遊走に対する複合体化成分数の影響
本実施形態で使用した外側のチャンバーは、24ウェルプレート（ThermoScientific、Cat.142475）であった。本実施形態で使用した内側チャンバーは、ポリカーボネート製細胞培養インサート（Millipore社製、Cat.PITP01250）であった。 本実施形態では6つのグループがあった:
0個のトラスツズマブ分子と複合体化したgdT細胞グループ: 2x10⁵個の標的細胞 (BT474またはBT474クローン5細胞) を外側チャンバーに播種した。 付着2 時間後、 孔径3μmのポリカーボネート製細胞培養インサート (ミリセル細胞培養インサート) を外側チャンバーに挿入し、16日間のガンマデルタT細胞懸濁液中の1x10⁶細胞を各内側チャンバーに播種し、19時間インキュベートした。
1000個のトラスツズマブ分子と複合体化したgdT細胞グループ: 2x10⁵個の標的細胞 (BT474またはBT474クローン5細胞) を外側チャンバーに播種した。 付着2時間後、孔径3μmのポリカーボネート製細胞培養インサート (ミリセル細胞培養インサート) を外側チャンバーに挿入し、細胞あたり500～1500個のトラスツズマブ分子と複合体化した1x10⁶個のヒトガンマデルタT細胞を各内側チャンバーに播種し、 19時間インキュベートした。
3000個のトラスツズマブ分子と複合体化したgdT細胞グループ: 2x10⁵個の標的細胞 (BT474またはBT474クローン5細胞) を外側チャンバーに播種した。 付着2時間後、孔径3μmのポリカーボネート製細胞培養インサート (ミリセル細胞培養インサート) を外側チャンバーに挿入し、細胞あたり2500～3500個のトラスツズマブ分子と複合体化した1x10⁶個のヒトガンマデルタT細胞を各内側チャンバーに播種し、 19時間インキュベートした。
6000個のトラスツズマブ分子と複合体化したgdT細胞グループ: 2x10⁵個の標的細胞 (BT474またはBT474クローン5細胞) を外側チャンバーに播種した。 付着2時間後、孔径3μmのポリカーボネート製細胞培養インサート (ミリセル細胞培養インサート) を外側チャンバーに挿入し、細胞あたり5500～6500個のトラスツズマブ分子と複合体化した1x10⁶個のヒトガンマデルタT細胞を各内側チャンバーに播種し、 19時間インキュベートした。
12000個のトラスツズマブ分子と複合体化したgdT細胞グループ: 2x10⁵個の標的細胞 (BT474またはBT474クローン5細胞) を外側チャンバーに播種した。 付着2時間後、孔径3μmのポリカーボネート製細胞培養インサート (ミリセル細胞培養インサート) を外側チャンバーに挿入し、細胞あたり9000～15000個のトラスツズマブ分子と複合体化した1x10⁶個のヒトガンマデルタT細胞を各内側チャンバーに播種し、 19時間インキュベートした。
30000個のトラスツズマブ分子と複合体化したgdT細胞グループ: 2x10⁵個の標的細胞(BT474またはBT474クローン5細胞) を外側チャンバーに播種した。 付着2時間後、孔径3μmのポリカーボネート製細胞培養インサート (ミリセル細胞培養インサート) を外側チャンバーに挿入し、細胞あたり25000～35000個のトラスツズマブ分子と複合体化した1 x 10⁶個のヒトガンマデルタT細胞を各内側チャンバーに播種し、 19時間インキュベートした。

【0410】

外側チャンバー内の細胞を採取し、FITC結合マウス抗ヒトTCRVd2 (BioLegend、#331406)およびPE-Cy5結合CD3抗体で、光を避けながら室温で10分間染色した。 次いで、細胞混合物を室温で400 x gで3分間遠心分離した。上清を除去し、細胞ペレットを1 mLのDPBSで再懸濁した。 遠心分離を繰り返し、DPBSで再懸濁したTCRVd2⁺/CD3⁺ゲート細胞0.5 mLをフローサイトメトリーで分析した。

【0411】

本発明の結果は、次のことを示唆している:
BT474 細胞を含む外側チャンバーに移動するCtrl-gdT 細胞の量と比較して、内側チャンバーで細胞あたり少なくとも1000個のトラスツズマブ分子と複合体化した (例えば、細胞当たり1000個、3000個、6000個、12000個、または 30000個のトラスツズマブと複合体化したもの）より多くのgdT細胞は、ポリカーボネート製細胞培養インサートの底部の膜を通過し、BT474細胞を含む外側チャンバーに移動することができる (p<0.05);
対照的に、トラスツズマブ耐性BT474クローン 5細胞を含む外側チャンバーに移動する Ctrl-gdT細胞の量と比較すると、細胞あたり1000～3000個のトラスツズマブ分子と複合体化した同量のgdT細胞が、ポリカーボネート製細胞培養インサートの底部の膜を通過して、トラスツズマブ耐性BT474クローン5細胞を含む外側チャンバーに移動し、 内部チャンバー内で細胞あたり3000個以上のトラスツズマブ分子と複合体化した (例えば、細胞あたり6000個、12000個、または30000個のトラスツズマブ分子と複合体化したもの) より多くのgdT 細胞は、ポリカーボネート製細胞培養インサートの底部の膜を通過し、トラスツズマブ耐性 BT474クローン5細胞を含む外側チャンバーに移動することができる (p<0.05)。

【0412】

さらに、本発明の結果は、前述のトラスツズマブ複合体化ヒトガンマデルタＴ細胞をセツキシマブ複合体化ヒトガンマデルタＴ細胞に置き換え、BT474およびBT474クローン5細胞を標的細胞NCI-H508 and HT-29 (or HSC-4 and SAS)に置き換えれば、前述の実験と同様の結果が得られることが示唆される。すなわち、本発明の結果は次のことを示唆している:
HCC827細胞（またはHSC-4細胞）を含む外側チャンバーに移動するCtrl-gdT細胞の量と比較して、細胞当たり少なくとも1000個のセツキシマブ分子と複合体化した（例えば、細胞当たり1000個、3000個、6,000個、12,000個、または 30,000 個のセツキシマブ分子と複合体化したもの)より多くのgdT細胞は、ポリカーボネート製細胞培養インサートの底部の膜を通過し、HCC827 細胞 (または HSC-4 細胞) を含む外側のチャンバーに移動することができる (p<0.05);
対照的に、セツキシマブ耐性 HT-29 細胞 (または SAS 細胞) を含む外側チャンバーに移動する Ctrl-gdT 細胞の量と比較すると、細胞あたり 1000 ～ 3000 個のセツキシマブ分子と複合体化した同量のgdT 細胞が、ポリカーボネート製細胞培養インサートの底部の膜を通過して、セツキシマブ耐性 HT-29 細胞 (またはSAS細胞) を含む外側チャンバーに移動し、 内部チャンバー内で細胞あたり3000個以上のセツキシマブ分子と複合体化した (例えば、細胞あたり6000個、12000個、または 30000個のセツキシマブ分子と複合体化したもの) より多くのgdT 細胞は、ポリカーボネート製細胞培養インサートの底部の膜を通過し、セツキシマブ耐性HT-29細胞（またはSAS細胞）を含む外側チャンバーに移動することができる（p<0.05）。

【0413】

さらに、図13を参照。図13は、前述のトラスツズマブ複合体化ヒトガンマデルタＴ細胞をリツキシマブ複合体化ヒトガンマデルタＴ細胞に置き換え、BT474およびBT474クローン5細胞が標的細胞RajiおよびＲRaji-2R80（またはRaji-2RH）に置き換えれば、前述の実験と同様の結果が得られると期待している。 すなわち、図13は次のことを示している:
Raji細胞を含む外側チャンバーに移動するCtrl-gdT細胞の量と比較して、細胞当たり少なくとも1000個のリツキシマブ分子と複合体化した（例えば、細胞あたり1000個、3000個、6000個、12000個、または30000個のリツキシマブ分子と複合体化したもの）より多くのgdT細胞は、ポリカーボネート製細胞培養インサートの底部の膜を通過し、Raji 細胞を含む外側チャンバーに移動することができる (p<0.05);
対照的に、リツキシマブ耐性Raji-2R80 (または Raji-2RH)を含む外側チャンバーに移動する Ctrl-gdT細胞の量と比較すると、細胞あたり1000 ～ 3000個のリツキシマブ分子と複合体化した同量のgdT細胞が、ポリカーボネート製細胞培養インサートの底部の膜を通過し、リツキシマブ耐性 Raji-2R80 (または Raji-2RH) を含む外側チャンバーに移動し、内部チャンバー内で細胞あたり3000個以上のリツキシマブ分子と複合体化した (例えば、細胞あたり6000個、12000個、または30000個のリツキシマブ分子と複合体化したもの) より多くのgdT細胞は、ポリカーボネート製細胞培養インサートの底部の膜を通過し、リツキシマブ耐性Raji-2R80（またはRaji-2RH）を含む外側チャンバーに移動することができる（p<0.05）。

【0414】

さらに、本発明の結果は、前述のトラスツズマブ複合体化ヒトガンマデルタＴ細胞をアベルマブ複合体化ヒトガンマデルタＴ細胞に置き換え、BT474クローン5細胞が標的細胞MDA-MB-231 および MDA-MB-468 (または H1650 および H2087)に置き換えれば、前述の実験と同様の結果が得られることが示唆される。すなわち、本発明の結果は次のことを示唆している:
MDA-MB-231細胞（またはH1650）を含む外側チャンバーに移動するCtrl-gdT細胞の量と比較して、細胞当たり少なくとも1000個のアベルマブ分子と複合体化した（例えば、細胞あたり1000個、3000個、6000個、12000個、または 30,000個のアベルマブ分子と複合体化したもの）より多くのgdT細胞は、ポリカーボネート製細胞培養インサートの底部の膜を通過し、MDA-MB-231細胞（または H1650）を含む外側チャンバーに移動することができる（p<0.05）,
対照的に、アベルマブ耐性MDA-MB-468(または H2087)を含む外側チャンバーに移動するCtrl-gdT細胞の量と比較すると、細胞あたり1000 ～ 3000個のアベルマブ分子と複合体化した同量のgdT細胞が、ポリカーボネート細胞培養インサートの底部の膜を通過し、アベルマブ耐性MDA-MB-468(または H2087)を含む外側チャンバーに移動し、 内部チャンバー内で細胞あたり 3000個以上のアベルマブ分子と複合体化した (例えば、細胞あたり6000個、12000個、または30000個のアベルマブ分子と複合体化したもの) より多くのgdT細胞は、ポリカーボネート製細胞培養インサートの底部の膜を通過し、アベルマブ耐性MDA-MB-468(または H2087)を含む外側チャンバーに移動することができる (p<0.05)。

【0415】

実施形態 7-2-5 CD3+ T 細胞および CD56+CD3-NK 細胞の遊走能力に対する異なる数の成分と複合体化したヒトガンマデルタT細胞の影響
本実施形態で使用した外側チャンバーは、24ウェルプレート（ThermoScientific社製、Cat.142475）であった。本実施形態で使用した内側チャンバーは、孔径3μmのポリカーボネート製細胞培養インサート（Millipore社製、Cat.PITP01250）であった。

【0416】

本実施形態では、グループ(1)、グループ(2)、グループ(3)、グループ(3)'、グループ(4)、グループ(4)'、グループ(5)、グループ(5)'、グループ(6)、グループ(6)'、グループ(7)、グループ(7)'、グループ(8)、およびグループ(8)'を含有する14グループがあった:
培地グループ（グループ(1)): gdT 細胞の基礎培地 (RPMI-1640、Sigma-Aldrich、ThermoFisher Scientific、ATCC などより購入) を外側チャンバーに入れ、19時間インキュベートした。 上清を新しい外側チャンバーに移した。 次いで、1x10⁶個のドナー由来 PBMC 細胞を、新しい外側チャンバーに配置された内側チャンバーに播種し、その後3時間インキュベートして、PBMC細胞におけるCD3⁺ T細胞および CD56⁺CD3^-の遊走を評価した。
標的細胞単独グループ（グループ(2)）: 4x10⁵個の標的細胞 (BT474またはBT474クローン5細胞) を外側チャンバーに播種し、19時間インキュベートした。 上清を新しい外側チャンバーに移した。 次いで、1x10⁶個のドナー由来PBMC細胞を、新しい外側チャンバーに配置された内側チャンバーに播種し、その後3時間インキュベートして、PBMC細胞におけるCD3⁺ T細胞およびCD56⁺CD3^-の遊走を評価した。
0 個のトラスツズマブ分子と複合体化したgdT細胞グループ: 4x10⁵ 個の標的細胞 (BT474またはBT474クローン5細胞) の存在下 (グループ (3)) または非存在下 (グループ (3)') で、16日間のガンマデルタT細胞懸濁液中の1x10⁶個の細胞を外側チャンバーに播種し、19時間インキュベートした。 上清を新しい外側チャンバーに移した。 次いで、1x10⁶個のドナー由来PBMC細胞を、新しい外側チャンバーに配置された内側チャンバーに播種し、その後3時間インキュベートして、PBMC細胞におけるCD3⁺ T細胞およびCD56⁺CD3^-の遊走を評価した。
1000 個のトラスツズマブ分子と複合体化したgdT細胞グループ: 4x105個の標的細胞（BT474細胞またはBT474クローン5細胞）の存在下（グループ(4)）または非存在下（グループ(4)'）で、細胞あたり500～1500個のトラスツズマブ分子と複合体化した1x106個のヒトガンマデルタT細胞を外側チャンバーに播種し、19時間インキュベートした。上清を新しい外側チャンバーに移した。 次いで、1x10⁶個のドナー由来 PBMC 細胞を、新しい外側チャンバーに配置された内側チャンバーに播種し、その後3時間インキュベートして、PBMC 細胞における CD3⁺ T 細胞および CD56⁺CD3^- の遊走を評価した。
3000 個のトラスツズマブ分子と複合体化したgdT細胞グループ: 4x10⁵個の標的細胞（BT474細胞またはBT474クローン5細胞）の存在下（グループ(5)）または非存在下（グループ(5)'）で、細胞あたり2500～3500個のトラスツズマブ分子と複合体化した1x10個のヒトガンマデルタT細胞を外側チャンバーに播種し、19時間インキュベートした。上清を新しい外側チャンバーに移した。 次いで、1x10⁶個のドナー由来 PBMC 細胞を、新しい外側チャンバーに配置された内側チャンバーに播種し、その後3時間インキュベートして、PBMC細胞におけるCD3⁺ T細胞およびCD56⁺CD3^-の遊走を評価した。
6000 個のトラスツズマブ分子と複合体化したgdT細胞グループ: 4x10⁵個の標的細胞（BT474細胞またはBT474クローン5細胞）の存在下（グループ(6)）または非存在下（グループ(6)'）で、細胞あたり5500～6500個のトラスツズマブ分子と複合体化した1x10⁶個のヒトガンマデルタT細胞を外側チャンバーに播種し、19時間インキュベートした。 上清を新しい外側チャンバーに移した。 次いで、1x10⁶個のドナー由来PBMC細胞を、新しい外側チャンバーに配置された内側チャンバーに播種し、その後3時間インキュベートして、PBMC細胞におけるCD3⁺ T細胞およびCD56⁺CD3^-の遊走を評価した。
12000 個のトラスツズマブ分子と複合体化したgdT細胞グループ: 4x10⁵個の標的細胞（BT474細胞またはBT474クローン5細胞）の存在下（グループ(7)）または非存在下（グループ(7)'）で、細胞あたり9000～15000個のトラスツズマブ分子と複合体化した1x10⁶個のヒトガンマデルタT細胞を外側チャンバーに播種し、19時間インキュベートした。 上清を新しい外側チャンバーに移した。 次いで、1x10⁶個のドナー由来 PBMC 細胞を、新しい外側チャンバーに配置された内側チャンバーに播種し、その後3時間インキュベートして、PBMC細胞におけるCD3⁺ T細胞およびCD56⁺CD3^-の遊走を評価した。
30000 個のトラスツズマブ分子と複合体化したgdT細胞グループ: 4x10⁵個の標的細胞（BT474細胞またはBT474クローン5細胞）の存在下（グループ(8)）または非存在下（グループ(8)'）で、細胞あたり25000～35000個のトラスツズマブ分子と複合体化した1x10⁶個のヒトガンマデルタT細胞を外側チャンバーに播種し、19時間インキュベートした。 上清を新しい外側チャンバーに移した。 次いで、1x10⁶個のドナー由来PBMC細胞を、新しい外側チャンバーに配置された内側チャンバーに播種し、その後3時間インキュベートして、PBMC細胞における CD3⁺ T細胞およびCD56⁺CD3^-の遊走を評価した。

【0417】

外側チャンバー内の細胞を採取し、光を避けながら室温で10分間 CD3 抗体で染色した。次いで、細胞混合物を室温で400 x gで3分間遠心分離した。 上清を除去し、細胞ペレットを1 mLのDPBSで再懸濁した。 遠心分離を繰り返し、DPBSで再懸濁したCD3⁺およびCD56⁺CD3^-ゲート細胞0.5 mLをフローサイトメトリーで分析した。

【0418】

本発明の発明者らは次のことを期待している:
内側チャンバー内の大量のCD3⁺T細胞は、ポリカーボネート製細胞培養インサートの底部の膜を通過し、細胞あたり少なくとも1000個のトラスツズマブ分子と複合体化したBT474細胞およびgdT細胞を含む外側チャンバーに移動することができるが、CD3+ T細胞は、トラスツズマブ耐性BT474クローン5細胞および複合体化したトラスツズマブ数が細胞あたり3000個以上のトラスツズマブ分子に達するまで、細胞あたり少数のトラスツズマブ分子と複合体化したgdT細胞を含む外側チャンバーに移動する場合、ポリカーボネート製細胞培養インサートの底部の膜を通過することができない。

【0419】

さらに、本発明の発明者らは、前述のトラスツズマブ複合体化ヒトガンマデルタT細胞をセツキシマブ複合体化ヒトガンマデルタT細胞に置き換え、BT474およびBT474クローン5細胞を標的細胞NCI-H508およびHT-29（またはHSC-4およびSAS）に置き換えれば、前述の実験と同様の結果が得られると期待している。 すなわち、本発明の発明者らは、大量のCD3⁺T細胞がポリカーボネート製細胞培養インサートの底部の膜を通過し、細胞あたり少なくとも1000個のセツキシマブ分子と複合体化したHCC827細胞（またはHSC-4細胞）およびgdT細胞を含む外側チャンバーに移動することができるが、CD3⁺T細胞は、セツキシマブ耐性 HT-29 細胞 (または SAS 細胞) および複合体化したセツキシマブ数が細胞あたり 3000個以上のセツキシマブ分子に達するまで、細胞あたり少数のセツキシマブ分子と複合体化したgdT細胞を含む外側チャンバーに移動する場合、ポリカーボネート製細胞培養インサートの底部の膜を通過することができないと期待している。

【0420】

さらに、本発明の発明者らは、前述のトラスツズマブ複合体化ヒトガンマデルタT細胞をリツキシマブ複合化ヒトガンマデルタT細胞に置き換え、BT474およびBT474クローン5細胞を標的細胞RajiおよびRaji-2R80（またはRaji-2RH）に置き換えれば、前述の実験と同様の結果が得られると期待している。すなわち、本発明の発明者らは、大量のCD3+T細胞がポリカーボネート製細胞培養インサートの底部の膜を通過し、細胞あたり少なくとも1000個のリツキシマブ分子と複合体化したRaji細胞およびgdT細胞を含む外側チャンバーに移動することができるが、CD3+T細胞は、リツキシマブ耐性Raji-2R80（またはRaji-2RH）および複合体化したリツキシマブ数が細胞あたり3000個以上の リツキシマブ分子に達するまで、細胞当たり少数のリツキシマブ分子と複合体化したgdT細胞を含む外側チャンバーに移動する場合、ポリカーボネート製細胞培養インサートの底部の膜を通過することができないと期待している。

【0421】

さらに、本発明の発明者らは、前述のトラスツズマブ複合体化ヒトガンマデルタT細胞をアベルマブ複合体化ヒトガンマデルタT細胞に置き換え、BT474およびBT474クローン5細胞を標的細胞MDA-MB-231および MDA-MB-468 (または H1650 および H2087)に置き換えれば、前述の実験と同様の結果が得られると期待している。 すなわち、本発明の発明者らは、大量のCD3+ T細胞がポリカーボネート製細胞培養インサートの底部の膜を通過して、細胞あたり少なくとも1000個のアベルマブ分子と複合体化したMDA-MB-231細胞(またはH1650)およびgdT細胞を含む外側チャンバーに移動することができるが、CD3+ T 細胞は、アベルマブ耐性 MDA-MB-468 (または H2087) および複合体化したアベルマブの数が細胞あたり3000個以上の アベルマブ分子に達するまで、 細胞あたり少数のアベルマブ分子と複合体化したgdT細胞を含む外側チャンバーに移動する場合、ポリカーボネート製細胞培養インサートの底部の膜を通過することができないと期待している。

【0422】

実施形態 8: 疾患の治療において効果がないか、十分な効果がないと結論付けられた成分と複合体化した細胞傷害性細胞、および疾患の治療における成分複合体化細胞傷害性細胞の使用
コドリツズマブ（GC33）はグリピカン-3（GPC3）に対する抗体である。グリピカン-3 (GPC3) は、肝細胞癌などの一部の種類の腫瘍で過剰発現する。コドリツズマブは第I相臨床試験では成功したものの、第II相臨床試験では失敗したため、肝細胞癌などの腫瘍の治療薬としてFDAから承認された成分ではない（Takahiro Nishida と Hiroaki Kataoka, 2019年）・
以下に、コドリツズマブ複合体ナチュラルキラー細胞およびコドリツズマブ複合体ガンマデルタＴ細胞を調製する具体的な実施形態、ならびにそれらの使用を記載するが、本発明の適用はこれに限定されず、細胞傷害性細胞と結合する疾患の治療において効果がないか、または十分な効力を持たないものも本発明の範囲に含まれるものとする。

【0423】

実施形態 8-1: 疾患の治療に効果がないか、または十分な効果がないと結論付けられた成分と複合体化したヒトCD16+ナチュラルキラー細胞、および疾患の治療における成分と複合体化したヒトCD16+ナチュラルキラー細胞の使用
実施形態 8-1-1: ヒト肝細胞癌細胞株を死滅させるためのコドリツズマブ複合体化ヒトCD16+ナチュラルキラー細胞の細胞傷害性機能
本実施形態では、xCELLigence Real Time Cell Analysis System（xCELLigence RTCAシステム、ACEA Biosciences Inc.、米国）を使用して、標的細胞に対するエフェクター細胞の細胞毒性能力を検出した:
(1) xCELLigence E-Plate のウェルはコントロールウェル、コドリツズマブ C2 実験ウェル、コドリツズマブ C5 実験ウェル、コドリツズマブ C10 実験ウェル、Ctrl-oNK ET2 実験ウェル、Ctrl-oNK ET5 実験ウェル、Ctrl-oNK ET10 実験ウェル、Ctrl-oNKとコドリツズマブ ET2 実験ウェル、Ctrl-oNKとコドリツズマブ ET5 実験ウェル、Ctrl-oNKとコドリツズマブ ET10 実験ウェル、ACE-GPC3-oNK ET2 実験ウェル、ACE-GPC3-oNK ET5 実験ウェル、ACE-GPC3-oNK ET10実験ウェル、および標的細胞最大溶解コントロールウェルに分けられた。

【0424】

(2) 本実験で用いたエフェクター細胞は、［１］23日間培養したoNK細胞懸濁液中の細胞、または［２］コドリツズマブ複合体化ヒトCD16+ナチュラルキラー細胞懸濁液中の細胞である; および
(3) 本実験で使用した標的細胞はヒト肝細胞癌細胞株HuH-7（JCRB0403、JCRBより購入）であった。

【0425】

HuH-7 標的細胞をコントロールウェル、コドリツズマブ C2 実験ウェル、コドリツズマブ C5 実験ウェル、コドリツズマブ C10 実験ウェル、Ctrl-oNK ET2 実験ウェル、Ctrl-oNK ET5 実験ウェル、Ctrl-oNK ET10 実験ウェル、Ctrl- oNKとコドリツズマブ ET2 実験ウェル、Ctrl-oNKとコドリツズマブ ET5 実験ウェル、Ctrl-oNKとコドリツズマブ ET10 実験ウェル、ACE-GPC3-oNK ET2 実験ウェル、ACE-GPC3-oNK ET5 実験ウェル、ACE-GPC3-oNK ET10 実験ウェルウェル、およびターゲット細胞最大溶解コントロールウェルに播種した; したがって、各ウェルには2万個の標的細胞が含まれ、30分間放置された.
コドリツズマブ複合体化ヒトCD16+ナチュラルキラー細胞懸濁液中の 40000個、100000個、または 200000個の細胞を、それぞれ ACE-GPC3-oNK ET2 実験ウェル、ACE-GPC3-oNK ET5 実験ウェル、および ACE-GPC3-oNK ET10 実験ウェルに添加しました; したがって、HuH-7 細胞 (標的細胞) 数に対するエフェクター細胞 (コドリツズマブ複合体化ヒトCD16+ナチュラルキラー細胞懸濁液中の総細胞)数の比率は 2、5、および 10 であった。

【0426】

23日間培養したoNK 懸濁液中の40000個、100000個、または 200000個の細胞と1.10、2.75、または 5.5ngのコドリツズマブ (Creative Biolabs より購入)の両方を「Ctrl-oNKとコドリツズマブ ET2 実験ウェル」、「Ctrl -oNKとコドリツズマブ ET5 実験ウェル」、または「Ctrl-oNKとコドリツズマブ ET10 実験ウェル」に添加した。したがって、HuH-7 細胞 (標的細胞) 数に対するエフェクター細胞 (23 日間培養した oNK 懸濁液中の全細胞) 数の比率は 2、5、または 10であった; 「Ctrl-oNK とコドリツズマブ ET2 実験ウェル」、「Ctrl-oNK とコドリツズマブ ET5 実験ウェル」、または「Ctrl-oNK とコドリツズマブ ET10 実験ウェル」中のコドリツズマブ量は、それぞれ「ACE-GPC3-oNK ET2実験ウェル」、「ACE-GPC3-oNK ET5実験ウェル」、または「ACE-GPC3-oNK ET10実験ウェル」中の細胞に結合したコドリツズマブの総量と同じであった。

【0427】

「コドリツズマブ C2 実験ウェル」、「コドリツズマブ C5 実験ウェル」、または「コドリツズマブ C10 実験ウェル」に、それぞれコドリツズマブ (Creative Biolabs より購入) 1.10、2.75、または 5.5 ng を添加した。 したがって、「コドリツズマブ C2 実験ウェル」、「コドリツズマブ C5 実験ウェル」、または「コドリツズマブ C10 実験ウェル」中のコドリツズマブ量は、それぞれ「ACE-GPC3- 「oNK ET2 実験ウェル」、「ACE-GPC3-oNK ET5 実験ウェル」、または「ACE-GPC3-oNK ET10 実験ウェル」中の細胞に結合したコドリツズマブの総量と同じであった。

【0428】

サンプルと同量の溶解バッファー10分の1を標的細胞最大溶解対照ウェルに添加すし、コントロールウェルにはサンプルも溶解バッファーも添加しなかった。 xCELLigence E-PlateをxCELLigence Real Time Cell Analysis Systemにセットし、37℃、5％二酸化炭素条件下でセルインデックス（CI）の変化をリアルタイムで検出した。 図14を参照。図14は、コドリツズマブと複合体化したヒトCD16+ナチュラルキラー細胞（ACE-GPC3-oNK）の死滅効果が、ヒトCD16+ナチュラルキラー細胞（Ctrl-oNK）の死滅効果よりも有意に高いことを示す。

【0429】

本発明の発明者らは次のように期待している: 「コドリツズマブC2実験ウェル」（または「コドリツズマブC5実験ウェル」、または「コドリツズマブC10実験ウェル」）と「Ctrl-oNK ET2実験ウェル」（または「Ctrl-oNK ET5実験ウェル」、または「Ctrl-oNK ET10実験ウェル」）の細胞毒性効果を比較することにより、「ACE-GPC3-oNK ET2 実験ウェル」 （または「ACE-GPC3-oNK ET5 実験ウェル」または「ACE-GPC3-oNK ET10 実験ウェル」）中のコドリツズマブと Ctrl-oNK は細胞毒性効果において驚くべき相乗効果を示し、「ACE-GPC3-oNK ET2実験ウェル」（または「ACE-GPC3-oNK ET5実験ウェル」または「ACE-GPC3-oNK ET10実験ウェル」）の細胞の死滅能力は「Ctrl-oNK およびコドリツズマブ ET2 実験ウェル」（または「Ctrl-oNK およびコドリツズマブ ET5 実験ウェル」または「Ctrl-oNK およびコドリツズマブ ET10 実験ウェル」）の細胞の死滅能力よりも有意に高かったことが期待される。

【0430】

実施形態 8-1-2: 対象における肝細胞癌（固形腫瘍）に対するコドリツズマブ複合体化ヒトCD16+ナチュラルキラー細胞の細胞傷害性
ルシフェラーゼ発現肝細胞癌細胞株HuH-7(JCRB1600、JCRB より購入)を0日目に25 匹の雌 NSG マウス (Jackson Laboratory) にそれぞれに腹腔内注射した。マウスをランダムに5つのグループに分けた。

【0431】

(1) Ctrl-oNKグループのマウスは、0、3、7、10、14、および17日目に、24日間培養したoNK細胞懸濁液中の5000000個の細胞で処理された。

【0432】

(2) ACE-GPC3-oNKグループのマウスは、0、3、7、10、14、および17日目に、コドリツズマブ複合体化ヒトCD16⁺ナチュラルキラー細胞懸濁液中の5000000個の細胞で処理された。

【0433】

(3) Ctrl-oNKとコドリツズマブグループのマウスは、0、3、7、10、14、および 17 日目に、23日間培養したoNK細胞懸濁液中の5000000個の細胞と2.75ngのコドリツズマブ(Creative BioLabs より購入)で処理された。したがって、Ctrl-oNKとコドリツズマブグループのマウスに投与されたコドリツズマブの量 (2.75 ngのコドリツズマブ) は、ACE-GPC3-oNK グループのマウスに投与された細胞に結合したコドリツズマブの総量と同じであった。

【0434】

(4) コドリツズマブグループのマウスは、0、3、7、10、14、および17日目に2.75ngのコドリツズマブで処理された。

【0435】

(6) コントロールグループのマウスは、0、3、7、10、14および17日目にビヒクル（実験1-1-1で記載した細胞培養培地、DMEM培養培地またはXVIVO 10培養培地などの細胞培地のみ）で処理された。

【0436】

発光は、0、3、7、10、14、および17日目以降実験終了まで毎週、AMI HTX (スペクトルイメージング)により検出された。

【0437】

本発明の発明者らは次のことを期待している:
(1) マウスの発光画像は次のことを示す: コドリツズマブ複合体化ヒトCD16+ナチュラルキラー細胞懸濁液中の細胞で処理したマウスの生物発光画像は、有意な減少を示す。 したがって、本発明の成分複合体化細胞傷害性細胞は、被験者の固形腫瘍を治療できるだけでなく、固形腫瘍などの免疫抑制微小環境に位置する異常細胞を治療することもできる。

【0438】

(2) 「Ctrl-oNK グループ」と「コドリツズマブグループ 」のマウスにおける細胞傷害効果を比較すると、「ACE-GPC3-oNK グループ」のマウスでは、コドリツズマブと Ctrl-oNK が驚くべき相乗効果を発揮することが期待され 、「ACE-GPC3-oNK グループ」のマウスにおける細胞傷害効果は「Ctrl-oNK とコドリツズマブグループ」よりも有意に高かった。

【0439】

実施形態 8-1-3： CD3+ T細胞の遊走能力に対するコドリツズマブ複合体化ヒトCD16+ ナチュラルキラー細胞の影響
本実施形態では、(1)培地グループ、(2)HuH-7グループ、(3)ACE-GPC3-oNKグループ、(4)HuH-7とACE-GPC3-oNKグループの4つのグループがあった。

【0440】

(1) 培地グループ: 細胞培地（実験1-1-1に記載の細胞培地、DMEM培地、またはXVIVO 10培地など）を外側チャンバーに添加し、19時間インキュベートした。 上清を新しい外側チャンバーに移した。 次いで、1x10⁶個のドナー由来 PBMC 細胞を、新しい外側チャンバーに配置された内側チャンバーに播種し、その後 3 時間インキュベートして、PBMC 細胞中のCD3+ T細胞の遊走を評価しました。

【0441】

(2) HuH-7グループ: 4×10⁵個のHuH-7細胞(標的細胞)を外側チャンバーに播種し、19時間インキュベートした。 上清を新しい外側チャンバーに移した。 次いで、1x10⁶ 個のドナー由来 PBMC 細胞を、新しい外側チャンバーに配置された内側チャンバーに播種し、その後 3 時間インキュベートして、PBMC 細胞中のCD3+ T細胞の遊走を評価しました。

【0442】

(3) ACE-GPC3-oNKグループ: コドリツズマブ複合体化ヒCD16+ナチュラルキラー細胞浮遊細胞培地（実験1-1-1に記載の細胞培養培地、DMEM培養培地、またはXVIVO 10培養培地など）中の1×106個の細胞を外側チャンバーに添加し、19時間インキュベートした。上清を新しい外側チャンバーに移した。 次いで、1x10⁶個のドナー由来 PBMC 細胞を、新しい外側チャンバーに配置された内側チャンバーに播種し、その後 3 時間インキュベートして、PBMC 細胞中のCD3+ T細胞の遊走を評価しました。

【0443】

(4) HuH-7とACE-GPC3-oNKグループ: 4x10⁵個のHuH-7細胞（標的細胞）およびコドリツズマブ複合体化ヒトCD16⁺ナチュラルキラー細胞懸濁液中の1x10⁶個の細胞を外側チャンバーに播種し、19時間インキュベートした。 上清を新しい外側チャンバーに移した。 上清を新しい外側チャンバーに移した。 次いで、1x10⁶個のドナー由来 PBMC 細胞を、新しい外側チャンバーに配置された内側チャンバーに播種し、その後 3時間インキュベートして、PBMC 細胞中のCD3⁺T細胞の遊走を評価した。

【0444】

外側チャンバー内の細胞を採取し、光を避けながら室温で10分間 CD3 抗体で染色した。次いで、細胞混合物を室温で400 x gで3分間遠心分離した。 上清を除去し、細胞ペレットを1 mLのDPBSで再懸濁した。 遠心分離を繰り返し、DPBSで再懸濁したCD3⁺ゲート細胞0.5 mLをフローサイトメトリーで分析した。

【0445】

本発明の発明者らは、HuH-7細胞などの標的細胞を含む外側チャンバー（病変シミュレーション）内で成分と複合体化した細胞傷害性細胞が、CD3⁺T細胞の病変への遊走能力を大幅に増加させるであろうと期待する。 HuH-7グループとACE-GPC3-oNKグループのCD3⁺T細胞遊走効果を比較すると、HuH-7グループとACE-GPC3-oNKグループの外側チャンバー中の標的細胞（HuH-7など）と成分複合体化細胞傷害性細胞は、CD3⁺T細胞遊走効果において驚くべき相乗効果を発揮することが期待される。

【0446】

実施形態 8-2: 疾患の治療において効果がないか、または十分な効果がないと結論付けられた成分と複合体化したヒトガンマデルタT細胞、および疾患の治療における成分と複合体化したヒトガンマデルタT細胞の使用
実施形態 8-2-1: ヒト肝細胞癌細胞株を死滅させるためのコドリツズマブ複合体化ヒトガンマデルタT細胞の細胞傷害性機能
本実施形態では、xCELLigence Real Time Cell Analysis System（(xCELLigence RTCA system, ACEA Biosciences Inc., 米国)を使用して、標的細胞に対するエフェクター細胞の細胞傷害性機能を検出した:
(1) xCELLigence E-Plate のウェルは、コントロール ウェル、コドリツズマブC2実験ウェル、コドリツズマブC5実験ウェル、コドリツズマブC10実験ウェル、Ctrl-gdT ET2実験ウェル、Ctrl-gdT ET5実験ウェル、Ctrl-gdT ET10実験ウェル、Ctrl -gdTとコドリツズマブET2実験ウェル、Ctrl-gdTとコドリツズマブET5実験ウェル、Ctrl-gdTとコドリツズマブET10実験ウェル、ACE-gdT-GPC3 ET2実験ウェル、ACE-gdT-GPC3 ET5 実験ウェル、ACE-gdT-GPC3 ET10実験ウェル、および標的細胞最大溶解コントロールウェルに分けられた。

【0447】

(2) 本実験で使用したエフェクター細胞は、 ［１］ 16日間のガンマデルタT細胞懸濁液中の細胞、あるいは［２］ コドリツズマブ複合体化ヒトガンマデルタT細胞懸濁液中の細胞; および
(3) 本実験で使用した標的細胞は、ヒト肝細胞癌細胞株HuH-7（JCRB0403、JCRBより購入）であった。

【0448】

HuH-7標的細胞をコントロールウェル、コドリツズマブ C2実験ウェル、コドリツズマブ C5実験ウェル、コドリツズマブ C10実験ウェル、Ctrl-gdT ET2実験ウェル、Ctrl-gdT ET5実験ウェル、Ctrl-gdT ET10実験ウェル、Ctrl- gdTとコドリツズマブ ET2 実験ウェル、Ctrl-gdTとコドリツズマブ ET5実験ウェル、Ctrl-gdTとコドリツズマブ ET10実験ウェル、ACE-gdT-GPC3 ET2実験ウェル、ACE-gdT-GPC3 ET5実験ウェル、ACE-gdT-GPC3 ET10実験ウェルウェル、および標的細胞最大溶解コントロールウェル。したがって、各ウェルには 20000 個の標的細胞が含まれ、30 分間放置した。

【0449】

コドリツズマブ複合体化ヒトガンマデルタT細胞懸濁液中の 40000個、100000個、または 200000個細胞を、それぞれ ACE-gdT-GPC3 ET2 実験ウェル、ACE-gdT-GPC3 ET5 実験ウェル、および ACE-gdT-GPC3 ET10 実験ウェルに添加した。したがって、HuH-7 細胞 (標的細胞) の数に対するエフェクター細胞 (コドリツズマブ複合体ヒトガンマデルタT細胞懸濁液中の総細胞) 数の比率は 2、5、および10であった。

【0450】

16日間のガンマデルタT細胞懸濁液中の40000個、100000個、または 200000個の細胞と1.10、2.75、または5.5ngのコドリツズマブ (Creative BioLabs より購入) のすべてをそれぞれ「Ctrl-gdTとコドリツズマブ ET2 実験ウェル」、「Ctrl-gdT およびコドリツズマブ ET5 実験ウェル」、または「Ctrl-gdT およびコドリツズマブ ET10 実験ウェル」に添加した。 したがって、HuH-7 細胞 (標的細胞) の数に対するエフェクター細胞 (16日間のガンマデルタT細胞懸濁液中の総細胞) 数の比率は 2、5、または 10 であった； 「Ctrl-gdT とコドリツズマブ ET2 実験ウェル」、「Ctrl-gdT とコドリツズマブ ET5 実験ウェル」、または「Ctrl-gdT とコドリツズマブ ET10 実験ウェル」中のコドリツズマブ量は、それぞれ 「ACE-gdT-GPC3 ET2実験ウェル」、「ACE-gdT-GPC3 ET5実験ウェル」、または「ACE-gdT-GPC3 ET10 実験ウェル」中の細胞に結合したコドリツズマブの総量と同じであった。

【0451】

「コドリツズマブ C2実験ウェル」、「コドリツズマブ C5実験ウェル」、または「コドリツズマブ C10実験ウェル」に、それぞれコドリツズマブ (Creative BioLabs より購入) 1.10、2.75、または 5.5 ng を添加した。したがって、「コドリツズマブ C2 実験ウェル」、「コドリツズマブ C5 実験ウェル」、または「コドリツズマブ C10 実験ウェル」におけるコドリツズマブの量は、それぞれ「ACE-gdT- 「GPC3 ET2 実験ウェル」、「ACE-gdT-GPC3 ET5 実験ウェル」、または「ACE-gdT-GPC3 ET10 実験ウェル」中の細胞に結合したコドリツズマブの総量と同じであった。

【0452】

サンプルと同量の溶解バッファー10分の1を標的細胞最大溶解対照ウェルに添加すし、コントロールウェルにはサンプルも溶解バッファーも添加しなかった。 xCELLigence E-PlateをxCELLigence Real Time Cell Analysis Systemにセットし、37℃、5％二酸化炭素条件下でセルインデックス（CI）の変化をリアルタイムで検出した。 図15を参照。図15は、コドリツズマブと複合体化したヒトガンマデルタT細胞 (Cryo-ACE-NgdT-GPC3) の死滅効果が、ヒトガンマデルタT細胞 (Cryo-Ctrl -NgdT) の死滅効果よりも有意に高いことを示す。

【0453】

本発明の発明者らは次のように期待している： 「コドリツズマブC2実験ウェル」（または「コドリツズマブC5実験ウェル」、または「コドリツズマブC10実験ウェル」）と「Ctrl-gdT ET2実験ウェル」（または「Ctrl-gdT ET5実験ウェル」、または「Ctrl-gdT ET10実験ウェル」）の細胞毒性効果を比較することにより、 「ACE-gdT-GPC3 ET2実験ウェル」（または「ACE-gdT-GPC3 ET5実験ウェル」または「ACE-gdT-GPC3 ET10実験ウェル」）中のコドリツズマブとCtrl-gdTは細胞毒性効果において驚くべき相乗効果を示し、「ACE-gdT-GPC3 ET2実験ウェル」（または「ACE-gdT-GPC3 ET5実験ウェル」、または「ACE-gdT-GPC3 ET10実験ウェル」）の細胞の死滅能力は「Ctrl-gdTとコドリツズマブET2実験ウェル」（または「Ctrl-gdTとコドリツズマブET5実験ウェル」、または「Ctrl-gdTおよびコドリツズマブET10実験ウェル」）の細胞の死滅能力よりも有意に高かったことが期待される。

【0454】

実施形態 8-2-2: 被験者における肝細胞癌（固形腫瘍）に対するコドリツズマブ複合体化ヒトガンマデルタT細胞の細胞傷害性
ルシフェラーゼ発現肝細胞癌細胞株 HuH-7 (JCRB1600、JCRB より購入) を 0 日目に 25 匹の雌 NSG マウス (Jackson Laboratory) のそれぞれに腹腔内注射した。マウスを 5 つのグループに分けた。

【0455】

(1) Ctrl-gdT グループのマウスは、0、3、7、10、14、および 17 日目に、16 日間のガンマデルタT細胞懸濁液中の 5000000個の細胞で処理された。

【0456】

(2) ACE-gdT-GPC3 グループのマウスは、0、3、7、10、14、および 17 日目に、コドリツズマブ複合体化ヒトガンマデルタT細胞懸濁液中の 5000000細胞で処理された。

【0457】

(3) Ctrl-gdTとコドリツズマブグループのマウスは、0、3、7、10、14、および 17 日目に、16日間のガンマデルタT細胞懸濁液中の 5000000細胞と2.75 ngのコドリツズマブ (Creative BioLabs より購入) で処理された。 したがって、Ctrl-gdTとコドリツズマブグループのマウスに投与されるコドリツズマブの量（コドリツズマブ2.75ng）は、ACE-gdT-GPC3グループのマウスに投与された細胞に結合したコドリツズマブの総量と同じであった。

【0458】

(4) コドリツズマブグループのマウスは、0、3、7、10、14、および17日目に2.75ngのコドリツズマブで処理された。

【0459】

(5) コントロールグループのマウスは、0、3、7、10、14、および17日目にビヒクル（実験1-2-1に記載の完全増殖培地などの細胞培地のみ）で処理された。

【0460】

発光は、0日目、3日目、7日目、および7日目以降は実験終了まで毎週、AMI HTX (スペクトルイメージング)によって検出された。

【0461】

本発明の発明者らは次のことを期待している:
(1) マウスの発光画像は次のことを示す: コドリツズマブ複合体化ヒトガンマデルタT細胞懸濁液中の細胞で処理したマウスの生物発光画像は、有意な減少を示す。したがって、本発明の成分複合体化細胞傷害性細胞は、被験者の固形腫瘍を治療できるだけでなく、固形腫瘍などの免疫抑制微小環境に位置する異常細胞を治療することもできる。

【0462】

(2) 「Ctrl-gdT群」と「コドリツズマブ群」のマウスにおける細胞傷害効果と比較すると、「ACE-gdT-GPC3群」のマウスでは、コドリツズマブとCtrl-gdTが驚くべき相乗効果を発揮することが期待され 、「ACE-gdT-GPC3グループ」のマウスにおける細胞傷害効果は「Ctrl-gdTとコドリツズマブグループ」よりも有意に高かった。

【0463】

実施形態 8-2-3： CD3+ T細胞の遊走能力に対するコドリツズマブ複合体化ヒトガンマデルタT細胞の影響
本実施形態では、(1)培地グループ、(2)HuH-7グループ、(3)ACE-gdT-GPC3グループ、(4)HuH-7とACE-gdT-GPC3グループの4つのグループがあった。

【0464】

(1) 培地グループ: 細胞培地 (実験1-2-1に記載の完全増殖培地など) を外側チャンバーに添加した。 2時間後、内側チャンバーを外側チャンバーに挿入し、19時間インキュベートした。上清を新しい外側チャンバーに移した。 次いで、1x10⁶ 個のドナー由来 PBMC 細胞を、新しい外側チャンバーに配置された内側チャンバーに播種し、その後 3 時間インキュベートして、PBMC 細胞中のCD3+ T細胞の遊走を評価しました。

【0465】

(2) HuH-7グループ: 4×105個のHuH-7細胞(標的細胞)を外側チャンバーに播種し、19時間インキュベートした。上清を新しい外側チャンバーに移した。 次いで、1x10⁶ 個のドナー由来 PBMC 細胞を、新しい外側チャンバーに配置された内側チャンバーに播種し、その後 3 時間インキュベートして、PBMC 細胞中のCD3+ T細胞の遊走を評価しました。

【0466】

(3) ACE-gdT-GPC3グループ: コドリツズマブ複合体化ヒトガンマデルタT細胞懸濁液中の 1x10⁶ 個の細胞を外側チャンバーに播種し、19 時間インキュベートした。上清を新しい外側チャンバーに移した。 次いで、1x10⁶個のドナー由来 PBMC 細胞を、新しい外側チャンバーに配置された内側チャンバーに播種し、その後 3 時間インキュベートして、PBMC 細胞中のCD3+ T細胞の遊走を評価しました。

【0467】

(4) HuH-7とACE-gdT-GPC3グループ: コドリツズマブ複合体化ヒトガンマデルタT細胞懸濁液中の1×106個の細胞および4×105個のHuH-7細胞(標的細胞)を外側チャンバーに播種し、19時間インキュベートした。 上清を新しい外側チャンバーに移した。 次いで、1x10⁶個のドナー由来 PBMC 細胞を、新しい外側チャンバーに配置された内側チャンバーに播種し、その後 3 時間インキュベートして、PBMC 細胞中のCD3+ T細胞の遊走を評価しました。

【0468】

外側チャンバー内の細胞を採取し、光を避けながら室温で10分間 CD3 抗体で染色した。次いで、細胞混合物を室温で400 x gで3分間遠心分離した。上清を除去し、細胞ペレットを1 mLのDPBSで再懸濁した。遠心分離を繰り返し、DPBS で再懸濁した CD3+ ゲート細胞 0.5 mL をフローサイトメトリーで分析した。

【0469】

本発明の発明者らは、HuH-7細胞などの標的細胞を含む外側チャンバー（病変シミュレーション）内で成分と複合体化した細胞傷害性細胞が、CD3⁺T細胞の病変への遊走能力を大幅に増加させるであろうと期待する。HuH-7 グループと ACE-gdT-GPC3 グループの CD3+T細胞遊走効果を比較すると、HuH-7 と ACE-gdT-GPC3 グループの外側チャンバー中の標的細胞 (HuH-7 など) と成分複合体化細胞傷害性細胞は、CD3+T 細胞遊走効果において驚くべき相乗効果を発揮することが期待される。

【0470】

本発明の実施形態、被験者の免疫系、および成分の薬理学的メカニズムから、当業者であれば、開示、教示、または示唆に基づく細胞傷害性細胞の全てと複合体化（又は結合体化、又は連結）された成分の全てが、成分に対して耐性、難治性、非感受性、非反応性、または不十分な反応性を示す異常細胞の治療においる当該成分（FDA承認薬、または第I相試験では成功したが第II相試験もしくは第III相試験では失敗した成分など）の有効性を改善するために使用できることを理解するであろう。 したがって、本発明の成分複合体化細胞傷害性細胞は、過剰増殖性疾患、進行期疾患、HIVまたは他のウイルス感染症、真菌感染症、細菌感染症などの様々な種類の疾患に関連する様々な種類の異常細胞の治療に使用することができる。 、原虫感染症、自己免疫疾患、神経疾患、造血細胞関連疾患、メタボリックシンドローム、病原性疾患などの各種疾患に伴う各種異常細胞の治療に用いることができる。

【0471】

前述の説明は、本発明の好ましい実施形態に過ぎず、本発明の特許出願の範囲を限定することを意図するものではない。したがって、本明細書に開示された精神から逸脱しないあらゆる変更または修正は、本発明の特許出願の範囲内に含まれるものとする。

【0472】

参考文献 1 - J Rey 1, D Olive, G Sebahoun, T O'Callaghan, Regis T Costello, 2005. 細胞傷害性エフェクター細胞に関する新たな洞察。 Bull Cancer. 92(11):935-943.
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<151>2020-7-15
<160>34
<170>

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<210>28
<211>51
<212>DNA
<213>人工配列
<220>
<223> 合成
<400>28
tctgaagaca catttttact cccaacaagc cccctgcaga agtaggagcc g 51

<210> 29
<211>2137
<212> DNA
<213>ホモ・サピエンス（ヒト）
<400> 29
cttgtccact ccagtgtggc atcatgtggc agctgctcct cccaactgct ctgctacttc 60
tagtttcagc tggcatgcgg actgaagatc tcccaaaggc tgtggtgttc ctggagcctc 120
aatggtacag ggtgctcgag aaggacagtg tgactctgaa gtgccaggga gcctactccc 180
ctgaggacaa ttccacacag tggtttcaca atgagagcct catctcaagc caggcctcga 240
gctacttcat tgacgctgcc acagttgacg acagtggaga gtacaggtgc cagacaaacc 300
tctccaccct cagtgacccg gtgcagctag aagtccatat cggctggctg ttgctccagg 360
cccctcggtg ggtgttcaag gaggaagacc ctattcacct gaggtgtcac agctggaaga 420
acactgctct gcataaggtc acatatttac agaatggcaa aggcaggaag tattttcatc 480
ataattctga cttctacatt ccaaaagcca cactcaaaga cagcggctcc tacttctgca 540
gggggcttgt tgggagtaaa aatgtgtctt cagagactgt gaacatcacc atcactcaag 600
gtttgtcagt gtcaaccatc tcatcattct ttccacctgg gtaccaagtc tctttctgct 660
tggtgatggt actccttttt gcagtggaca caggactata tttctctgtg aagacaaaca 720
ttcgaagctc aacaagagac tggaaggacc ataaatttaa atggagaaag gaccctcaag 780
acaaatgacc cccatcccat gggggtaata agagcagtag cagcagcatc tctgaacatt 840
tctctggatt tgcaacccca tcatcctcag gcctctctac aagcagcagg aaacatagaa 900
ctcagagcca gatcccttat ccaactctcg acttttcctt ggtctccagt ggaagggaaa 960
agcccatgat cttcaagcag ggaagcccca gtgagtagct gcattcctag aaattgaagt 1020
ttcagagcta cacaaacact ttttctgtcc caaccgttcc ctcacagcaa agcaacaata 1080
caggctaggg atggtaatcc tttaaacata caaaaattgc tcgtgttata aattacccag 1140
tttagagggg aaaaaaaaac aattattcct aaataaatgg ataagtagaa ttaatggttg 1200
aggcaggacc atacagagtg tgggaactgc tggggatcta gggaattcag tgggaccaat 1260
gaaagcatgg ctgagaaata gcaggtagtc caggatagtc taagggaggt gttcccatct 1320
gagcccagag ataagggtgt cttcctagaa cattagccgt agtggaatta acaggaaatc 1380
atgagggtga cgtagaattg agtcttccag gggactctat cagaactgga ccatctccaa 1440
gtatataacg atgagtcctc ttaatgctag gagtagaaaa tggtcctagg aaggggactg 1500
aggattgcgg tggggggtgg ggtggaaaag aaagtacaga acaaaccctg tgtcactgtc 1560
ccaagttgct aagtgaacag aactatctca gcatcagaat gagaaagcct gagaagaaag 1620
aaccaaccac aagcacacag gaaggaaagc gcaggaggtg aaaatgcttt cttggccagg 1680
gtagtaagaa ttagaggtta atgcagggac tgtaaaacca ccttttctgc ttcaatatct 1740
aattcctgtg tagctttgtt cattgcattt attaaacaaa tgttgtataa ccaatactaa 1800
atgtactact gagcttcgct gagttaagtt atgaaacttt caaatccttc atcatgtcag 1860
ttccaatgag gtggggatgg agaagacaat tgttgcttat gaaagaaagc tttagctgtc 1920
tctgttttgt aagctttaag cgcaacattt cttggttcca ataaagcatt ttacaagatc 1980
ttgcatgcta ctcttagata gaagatggga aaaccatggt aataaaatat gaatgataaa 2040
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2100
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaa 2137


<210> 30
<211>820
<212> DNA
<213>ホモ・サピエンス（ヒト）
<400> 30
cactccagtg tggcatcatg tggcagctgc tcctcccaac tgctctgcta cttctagttt 60
cagctggcat gcggactgaa gatctcccaa aggctgtggt gttcctggag cctcaatggt 120
acagcgtgct tgagaaggac agtgtgactc tgaagtgcca gggagcctac tcccctgagg 180
acaattccac acagtggttt cacaatgaga gcctcatctc aagccaggcc tcgagctact 240
tcattgacgc tgccacagtc aacgacagtg gagagtacag gtgccagaca aacctctcca 300
ccctcagtga cccggtgcag ctagaagtcc atatcggctg gctgttgctc caggcccctc 360
ggtgggtgtt caaggaggaa gaccctattc acctgaggtg tcacagctgg aagaacactg 420
ctctgcataa ggtcacatat ttacagaatg gcaaagacag gaagtatttt catcataatt 480
ctgacttcca cattccaaaa gccacactca aagatagcgg ctcctacttc tgcagggggc 540
ttgttgggag taaaaatgtg tcttcagaga ctgtgaacat caccatcact caaggtttgg 600
cagtgtcaac catctcatca ttctctccac ctgggtacca agtctctttc tgcttggtga 660
tggtactcct ttttgcagtg gacacaggac tatatttctc tgtgaagaca aacatttgaa 720
gctcaacaag agactggaag gaccataaac ttaaatggag aaaggaccct caagacaaat 780
gacccccatc ccatgggagt aataagagca gtggcagcag 820

<210>31
<211>765
<212> DNA
<213>ホモ・サピエンス（ヒト）
<400>31
atgtggcagctgctcctcccaactgctctgctacttctagtttcagctggcatgcggact 60
gaagatctcccaaaggctgtggtgttcctggagcctcaatggtacagggtgctcgagaag120
gacagtgtgactctgaagtgccagggagcctactcccctgaggacaattccacacagtgg180
tttcacaatgagagcctcatctcaagccaggcctcgagctacttcattgacgctgccaca240
gtcgacgacagtggagagtacaggtgccagacaaacctctccaccctcagtgacccggtg300
cagctagaagtccatatcggctggctgttgctccaggcccctcggtgggtgttcaaggag360
gaagaccctattcacctgaggtgtcacagctggaagaacactgctctgcataaggtcaca420
tatttacagaatggcaaaggcaggaagtattttcatcataattctgacttctacattcca480
aaagccacactcaaagacagcggctcctacttctgcagggggctttttgggagtaaaaat540
gtgtcttcagagactgtgaacatcaccatcactcaaggtttggcagtgtcaaccatctca600
tcattctttccacctgggtaccaagtctctttctgcttggtgatggtactcctttttgca660
gtggacacaggactatatttctctgtgaagacaaacattcgaagctcaacaagagactgg720
aaggaccataaatttaaatggagaaaggaccctcaagacaaatga 765

<210> 32
<211> 254
<212> PRT
<213>ホモ・サピエンス（ヒト）
<400> 32
MetTrpGlnLeuLeuLeuProThrAlaLeuLeuLeuLeuValSerAla
1 5 10 15
GlyMetArgThrGluAspLeuProLysAlaValValPheLeuGluPro
20 25 30
GlnTrpTyrArgValLeuGluLysAspSerValThrLeuLysCysGln
35 40 45
GlyAlaTyrSerProGluAspAsnSerThrGlnTrpPheHisAsnGlu
50 55 60
SerLeuIleSerSerGlnAlaSerSerTyrPheIleAspAlaAlaThr
65 70 75 80
ValAspAspSerGlyGluTyrArgCysGlnThrAsnLeuSerThrLeu
85 90 95
SerAspProValGlnLeuGluValHisIleGlyTrpLeuLeuLeuGln
100 105 110
AlaProArgTrpValPheLysGluGluAspProIleHisLeuArgCys
115 120 125
HisSerTrpLysAsnThrAlaLeuHisLysValThrTyrLeuGlnAsn
130 135 140
GlyLysGlyArgLysTyrPheHisHisAsnSerAspPheTyrIlePro
145 150 155 160
LysAlaThrLeuLysAspSerGlySerTyrPheCysArgGlyLeuPhe
165 170 175
GlySerLysAsnValSerSerGluThrValAsnIleThrIleThrGln
180 185 190
GlyLeuAlaValSerThrIleSerSerPhePheProProGlyTyrGln
195 200 205
ValSerPheCysLeuValMetValLeuLeuPheAlaValAspThrGly
210 215 220
LeuTyrPheSerValLysThrAsnIleArgSerSerThrArgAspTrp
225 230 235 240
LysAspHisLysPheLysTrpArgLysAspProGlnAspLys
245 250

<210> 33
<211>233
<212> PRT
<213>ホモ・サピエンス（ヒト）
<400> 33
Met Trp Gln Leu Leu Leu Pro Thr Ala Leu Leu Leu Leu Val Ser Ala
1 5 10 15
Gly Met Arg Thr Glu Asp Leu Pro Lys Ala Val Val Phe Leu Glu Pro
20 25 30
Gln Trp Tyr Ser Val Leu Glu Lys Asp Ser Val Thr Leu Lys Cys Gln
35 40 45
Gly Ala Tyr Ser Pro Glu Asp Asn Ser Thr Gln Trp Phe His Ser Glu
50 55 60
Ser Leu Ile Ser Ser Gln Ala Ser Ser Tyr Phe Ile Asp Ala Ala Thr
65 70 75 80
Val Asn Glu Ser Gly Glu Tyr Arg Cys Gln Thr Asn Leu Ser Thr Leu
85 90 95
Ser Asp Pro Val Gln Leu Glu Val His Ile Gly Trp Leu Leu Leu Arg
100 105 110
Ala Pro Arg Trp Val Phe Lys Glu Glu Asp Pro Ile His Leu Arg Cys
115 120 125
His Ser Trp Lys Asn Thr Ala Leu His Lys Val Thr Tyr Leu Gln Asn
130 135 140
Gly Lys Asp Arg Lys Tyr Phe His His Asn Ser Asp Phe His Ile Pro
145 150 155 160
Lys Ala Thr Leu Lys Asp Ser Gly Ser Tyr Phe Cys Arg Gly Leu Val
165 170 175
Gly Ser Lys Asn Val Ser Ser Glu Thr Val Asn Ile Thr Ile Thr Gln
180 185 190
Gly Leu Ala Val Ser Thr Ile Ser Ser Phe Ser Pro Pro Gly Tyr Gln
195 200 205
Val Ser Phe Cys Leu Val Met Val Leu Leu Phe Ala Val Asp Thr Gly
210 215 220
Leu Tyr Phe Ser Val Lys Thr Asn Ile
225 230

<210>34
<211>80
<212>PRT
<213>ホモ・サピエンス（ヒト）
<400>34
His Ser Trp Lys Asn Thr Ala Leu His Lys Val Thr Tyr Leu Gln Asn
1 5 10 15
Gly Lys Gly Arg Lys Tyr Phe His His Asn Ser Asp Phe Tyr Ile Pro
20 25 30
Lys Ala Thr Leu Lys Asp Ser Gly Ser Tyr Phe Cys Arg Gly Leu Phe
35 40 45
Gly Ser Lys Asn Val Ser Ser Glu Thr Val Asn Ile Thr Ile Thr Gln
50 55 60
Gly Leu Ala Val Ser Thr Ile Ser Ser Phe Phe Pro Pro Gly Tyr Gln
65 70 75 80

【図1A】

【図1B】

【図2】

【図3A】

【図3B】

【図4A】

【図4B】

【図5A】

【図5B】

【図5C】

【図5D】

【図5E】

【図6A】

【図6B】

【図7A】

【図7B】

【図8A】

【図8B】

【図8C】

【図9A】

【図9B】

【図10A】

【図10B】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【配列表】

2024546828000001.xml

【手続補正書】

【提出日】2024-12-13

【手続補正1】

【補正対象書類名】特許請求の範囲

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

【請求項1】

疾患を治療するための剤の製造におけるエフェクター細胞の使用であって、前記エフェクター細胞は、表面と、前記エフェクター細胞の表面に複合体化されたターゲティングユニットの集団とを備え、ここで、前記集団中のターゲティングユニットは第１成分を含有し、前記第１成分は、（ａ）前記第１成分が、前記疾患に関連する異常細胞によって発現される生物学的マーカーとの特異的な相互作用を示すこと、（ｂ）前記第１成分が、前記エフェクター細胞によって産生されないこと、および（ｃ）前記第１成分が、前記疾患を有する対象の治療において効果がないか、または十分な効果がないと判断されること、または臨床試験終了時に、前記疾患の治療に効果がないか、または十分な効果がないと結論付けられること、を特徴とする、使用。

【請求項2】

疾患の病変部への免疫細胞の遊走能力を増加させるための剤の製造におけるエフェクター細胞の使用であって、前記エフェクター細胞は、表面と、前記エフェクター細胞の表面に複合体化されたターゲティングユニットの集団とを備え、ここで、前記集団中のターゲティングユニットは第１成分を含有し、前記第１成分は、（ａ）前記第１成分が、前記疾患の病変部に位置する異常細胞によって発現される生物学的マーカーとの特異的な相互作用を示すこと、（ｂ）前記第１成分が、前記エフェクター細胞によって産生されないこと、および（ｃ）前記第１成分が、前記疾患を有する対象の治療において効果がないか、または十分な効果がないと判断されること、または臨床試験終了時に、前記疾患の治療に効果がないか、または十分な効果がないと結論付けられること、を特徴とする、使用。

【請求項3】

疾患に関連する複数の異常細胞を有効量のエフェクター細胞と接触させることを含む、前記疾患に関連する異常細胞の数を減少させる生体外の方法におけるエフェクター細胞の使用であって、前記エフェクター細胞は、表面と、前記エフェクター細胞の表面に複合体化されたターゲティングユニットの集団とを備え、ここで、前記集団中のターゲティングユニットは第１成分を含有し、前記第１成分は、（ａ）前記第１成分が、前記疾患に関連する前記異常細胞によって発現される生物学的マーカーとの特異的な相互作用を示すこと、（ｂ）前記第１成分が、前記エフェクター細胞によって産生されないこと、および（ｃ）前記第１成分が、前記疾患に関連する前記異常細胞の治療に効果がないか、または十分な効果がないと判断されることを特徴とする、使用。

【請求項4】

前記エフェクター細胞が細胞傷害性細胞である、請求項１から３のいずれか一項に記載の使用。

【請求項5】

前記エフェクター細胞が細胞あたり３０００個以上のターゲティングユニットを備える、請求項１から３のいずれか一項に記載の使用。

【請求項6】

前記エフェクター細胞がＣＤ１６^＋細胞である、請求項１から３のいずれか一項に記載の使用。

【請求項7】

前記第１成分がＦｃ受容体認識領域を含有する；前記疾患を有する前記対象が前記第１成分に対する耐性を有する；又は前記疾患に関連する異常細胞が前記第１成分に対する耐性を有する、請求項１から３のいずれか一項に記載の使用。

【請求項8】

前記第１成分がＡＤＣＣを誘導するＩｇＧサブタイプのモノクローナル抗体であるか、または前記第１成分が他の抗体であるか、または前記第１成分は抗原結合ユニットを含有する、請求項１から３のいずれか一項に記載の使用。

【請求項9】

前記第１成分が核酸ではない、請求項１から３のいずれか一項に記載の使用。

【請求項10】

前記エフェクター細胞は抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）応答を媒介することができる、請求項１から３のいずれか一項に記載の使用。

【請求項11】

前記エフェクター細胞はＣＤ３^＋Ｔ細胞の遊走を誘導することができる、請求項１から３のいずれか一項に記載の使用。

【請求項12】

前記生物学的マーカーを発現する標的細胞と共培養した後、前記エフェクター細胞がＣＤ１０７ａを発現する、請求項１から３のいずれか一項に記載の使用。

【請求項13】

前記生物学的マーカーを発現する標的細胞と共培養した後、前記エフェクター細胞がインターフェロン－γ（ＩＦＮ－γ）もしくは腫瘍壊死因子－α（ＴＮＦ－α）、またはそれらの組み合わせを発現する、請求項１から３のいずれか一項に記載の使用。

【請求項14】

前記第１成分が、前記疾患の治療のためにＦＤＡに承認された成分である、請求項１から３のいずれか一項に記載の使用。

【請求項15】

前記第１成分が、リツキシマブ、トラスツズマブ、セツキシマブ、アレムツズマブ、アベルマブ、ダラツムマブ、エロツズマブ、オビヌツズマブ、ボルセツズマブ、クサツズマブ、デュルバルマブ、ペイントムマブ、またはアマツキシマブである、請求項１４に記載の使用。

【請求項16】

前記第１成分が、第Ｉ相臨床試験で成功しているが、前記疾患の治療のためにＦＤＡ承認された成分ではない、請求項１から３のいずれか一項に記載の使用。

【請求項17】

前記第１成分が、コドリツズマブ、ソラネツズマブ、ビマグルマブ、トラロキヌマブ、またはボコシズマブである、請求項１６に記載の使用。

【請求項18】

前記対象に投与される前記エフェクター細胞が、自己エフェクター細胞または同種異系エフェクター細胞に由来する、請求項１から３のいずれか一項に記載の使用。

【請求項19】

前記エフェクター細胞が、投与前に細胞増殖を誘導することなく投与される、請求項１から３のいずれか一項に記載の使用。

【請求項20】

前記疾患が、過剰増殖性疾患、進行期疾患、ＨＩＶまたは他のウイルス感染性疾患、真菌感染性疾患、細菌感染性疾患、原虫感染性疾患、自己免疫疾患、神経細胞疾患、造血細胞関連疾患、代謝症候群、および病原性疾患からなる群から選択される、請求項１から３のいずれか一項に記載の使用。

【請求項21】

前記疾患が、固形腫瘍および液性腫瘍からなる群から選択される過剰増殖性疾患または進行期疾患である、請求項２０に記載の使用。

【請求項22】

前記第１成分が、癌抗原、糖脂質、糖タンパク質、造血系細胞上に存在する分化クラスター抗原、ガンマグルタミルトランスペプチダーゼ、接着タンパク質、ホルモン、成長因子、サイトカイン、リガンド受容体、イオンチャネル、免疫グロブリンμ鎖の膜結合型、アルファフェトプロテイン、Ｃ反応性タンパク質、クロモグラニンＡ、上皮ムチン抗原、ヒト上皮特異抗原、ルイス（ａ）抗原、多剤耐性関連タンパク質、Ｎｅｕ癌遺伝子タンパク質、ニューロン特異的エノラーゼ、Ｐ－糖タンパク質、多剤耐性関連抗原、ｐ１７０、多剤耐性関連抗原、前立腺特異抗原、ＮＣＡＭ、ガングリオシド分子、ＭＡＲＴ－１、熱ショックタンパク質、シアリルＴｎ、チロシナーゼ、ＭＵＣ－１、ＨＥＲ－２／ｎｅｕ、ＫＳＡ、ＰＳＭＡ、ｐ５３、ＲＡＳ、ＥＧＦ－Ｒ、ＶＥＧＦ、およびＭＡＧＥ、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される生物学的マーカーとの特異的相互作用を示すか、または前記第１成分は、ＨＥＲ２／ｎｅｕ（ＥＲＢＢ２）、ＨＥＲ３（ＥＲＢＢ３）、ＥＧＦＲ、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ２、ＧＤ２、ＣＴＬＡ４、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３（Ｓｉｇｌｅｃ－３）、ＣＤ５２（ＣＡＭＰＡＴＨ－１抗原）、ＣＤ３２６（ＥｐＣＡＭ）、ＣＡ－１２５（ＭＵＣ１６）、ＭＭＰ９、ＤＬＬ３、ＣＤ２７４（ＰＤ－Ｌ１）、ＣＥＡ、ＭＳＬＮ（メソセリン）、ＣＡ１９－９、ＣＤ７３、ＣＤ２０５（ＤＥＣ２０５）、ＣＤ５１、ｃ－ＭＥＴ、ＴＲＡＩＬ－Ｒ２、ＩＧＦ－１Ｒ、ＣＤ３、ＭＩＦ、葉酸受容体アルファ（ＦＯＬＲ１）、ＣＳＦ１、ＯＸ－４０、ＣＤ１３７、ＴｆＲ、ＭＵＣ１、ＣＤ２５（ＩＬ－２Ｒ）、ＣＤ１１５（ＣＳＦ１Ｒ）、ＩＬ１Ｂ、ＣＤ１０５（エンドグリン）、ＫＩＲ、ＣＤ４７、ＣＥＡ、ＩＬ－１７Ａ、ＤＬＬ４、ＣＤ５１、アンジオポエチン２、ニューロピリン－１、ＣＤ３７、ＣＤ２２３（ＬＡＧ－３）、ＣＤ４０、ＬＩＶ－１（ＳＬＣ３９Ａ６）、ＣＤ２７（ＴＮＦＲＳＦ７）、ＣＤ２７６（Ｂ７－Ｈ３）、Ｔｒｏｐ２、クローディン１（ＣＬＤＮ１）、ＰＳＭＡ、ＴＩＭ－１（ＨＡＶｃｒ－１）、ＣＥＡＣＡＭ５、ＣＤ７０、ＬＹ６Ｅ、ＢＣＭＡ、ＣＤ１３５（ＦＬＴ３）、ＡＰＲＩＬ、ＴＦ（Ｆ３）、ネクチン－４、ＦＡＰ、ＧＰＣ３、ＦＧＦＲ３、キラー細胞免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）、ＲＯＲ１、ＲＯＲ２、ＰＤ－１（ＣＤ２７９）、ＣＴＬＡ－４（ＣＤ１５２）、ＴＩＭ－３（ＨＡＶＣＲ２）、免疫チェックポイント受容体、免疫チェックポイント受容体リガンド、受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体、ＴＮＦ受容体タンパク質、免疫グロブリンタンパク質、サイトカイン受容体、インテグリン、活性化ＮＫ細胞受容体、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される癌抗原との特異的相互作用を示す、請求項２１に記載の使用。

【請求項23】

前記ターゲティングユニットが、前記第１成分に結合した第１リンカーと前記エフェクター細胞の表面に結合した第２リンカーとの間の相互作用を介して、前記エフェクター細胞の表面に複合体化される、請求項１から３のいずれか一項に記載の使用。

【請求項24】

前記第１リンカーが前記第１成分に共有結合または非共有結合しているか、もしくは前記第２リンカーが前記エフェクター細胞の表面に共有結合または非共有結合しているか、またはそれらの組み合わせである、請求項２３に記載の使用。

【請求項25】

前記第１リンカーまたは前記第２リンカーが、前記第１成分または前記エフェクター細胞の表面の天然官能基に結合され、前記天然官能基がアミノ酸、糖、またはアミンである、請求項２３に記載の使用。

【請求項26】

前記天然官能基が糖、アミン、またはアミノ酸を含有するか、または前記天然官能基がアジド修飾された糖ではないか、または前記天然官能基は、リジン、システイン、チロシン、スレオニン、セリン、アスパラギン酸、グルタミン酸およびトリプトファンからなる群から選択されるアミノ酸を含有する、請求項２５に記載の使用。

【請求項27】

前記第２リンカーがエフェクター細胞の天然官能基に直接共有結合しており、ここで、前記第２リンカーとエフェクター細胞の前記天然官能基との間の直接の共有結合は、前記第２リンカーが前記天然官能基に直接共有結合するように、前記エフェクター細胞を前記第２リンカーと接触させることによって調製される、請求項２５に記載の使用。

【請求項28】

前記第１リンカーと前記第２リンカーとが、ＤＮＡ結合ドメインと標的ＤＮＡ、ロイシンジッパーと標的ＤＮＡ、ビオチンとアビジン、ビオチンとストレプトアビジン、カルモジュリン結合タンパク質とカルモジュリン、ホルモンとホルモン受容体、レクチンと炭水化物、細胞膜受容体と受容体リガンド、酵素と基質、抗原と抗体、アゴニストとアンタゴニスト、ポリヌクレオチドハイブリダイズ配列、アプタマーと標的、およびジンクフィンガーと標的ＤＮＡからなる群から選択される、請求項２３に記載の使用。

【請求項29】

前記２つのリンカーのうちの少なくとも１つがＰＥＧ領域またはＮＨＳエステルを含有するか、または前記第１成分はカップリング基を介して第１リンカーに結合し、前記カップリング基はＮＨＳエステルまたは他の活性化エステル、ハロゲン化アルキルもしくはハロゲン化アシル、二官能性架橋剤、またはマレイミド基である、請求項２３に記載の使用。

【請求項30】

前記第１成分と前記エフェクター細胞とが、１ｎｍ～４００ｎｍの長さ、離れている、請求項１から３のいずれか一項に記載の使用。

【請求項31】

前記第１リンカーが第１ポリヌクレオチドであり、前記第２リンカーが第２ポリヌクレオチドである、請求項２３に記載の使用。

【請求項32】

前記２つのポリヌクレオチドのうちの少なくとも１つの長さが４ｎｔ～５００ｎｔである、請求項３１に記載の使用。

【請求項33】

前記第１ポリヌクレオチドが第１一本鎖領域を含有し、前記第２ポリヌクレオチドが前記第１一本鎖領域に相補的な第２一本鎖領域を含有し、前記ターゲティングユニットが、第１一本鎖領域と第１一本鎖領域に相補的な第２一本鎖領域との間の相互作用を介して前記エフェクター細胞の表面に複合体化される、請求項３１に記載の使用。

【請求項34】

前記第１のリンカーが第１反応性基を含有し、前記第２リンカーが第２反応性基を含有し、前記ターゲティングユニットが、前記第２反応性基と前記第１反応性基との間の反応によって形成された共有結合を介して前記エフェクター細胞の表面に複合体化される、請求項２３に記載の使用。

【請求項35】

前記細胞傷害性細胞が、免疫細胞、リンパ球、ナチュラルキラー細胞、ガンマデルタＴ細胞、他のＴリンパ球、マクロファージ、単球、好中球、樹状細胞、サイトカイン誘導性キラー細胞（ＣＩＫ）、リンホカイン活性化キラー細胞（ＬＡＫ）、細胞溶解性Ｔ細胞（ＣＴＬ）、または腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）である、請求項４に記載の使用。

【請求項36】

前記エフェクター細胞が、免疫不全マウスにおいて非腫瘍形成性であるか、または前記エフェクター細胞が、γ線照射後の同種異系対象において非腫瘍形成性である、請求項１から３のいずれか一項に記載の使用。

【請求項37】

前記細胞傷害性細胞が、
（Ａ）ＮＰＭＤに寄託されていて、受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ－０３０１７を有すること、
（Ｂ）染色体を備え、前記染色体の染色体ＤＮＡ配列が、ＮＰＭＤに寄託された受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ－０３０１７を有するナチュラルキラー細胞の対応する染色体の染色体ＤＮＡ配列と少なくとも８０％同一であること、または
（Ｃ）以下の特徴：
ｉ）ＣＤ１６受容体を発現すること、
ｉｉ）少なくとも３か月にわたる継代培養後にその増殖能を保持していること、および
ｉｉｉ）ｘ）ＣＤ１６受容体をコードする合成、遺伝子改変、および／または意図的に送達されたポリヌクレオチドを含まないか、またはｙ）ｄｄＰＣＲシステムを使用して前記細胞傷害性細胞のゲノムＤＮＡを分析することによって、ＣＤ１６ Ｆ１７６Ｖプローブで検出可能なＤＮＡ分子に対するＣＤ１６ Ｆ１７６Ｆプローブで検出可能なＤＮＡ分子の比が１以上であって、ＣＤ１６ Ｆ１７６Ｆプローブの配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７であり、ＣＤ１６ Ｆ１７６Ｖプローブの配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８であること
を持つこと、
を特徴とするナチュラルキラー細胞である、請求項４に記載の使用。

【請求項38】

前記細胞傷害性細胞が、
（１）前記細胞傷害性細胞とナチュラルキラー細胞株ＮＫ３．３とが異なる対象に由来すること、
（２）前記細胞傷害性細胞が癌を有する対象に由来すること、
（３）前記細胞傷害性細胞が白人男性に由来すること、もしくは
（４）前記細胞傷害性細胞と受託番号ＡＴＣＣ ＣＲＬ－２４０７を有するナチュラルキラー細胞とが同じ対象に由来すること、
またはそれらの任意の組み合わせ、
をさらに特徴とする、請求項３７に記載の使用。

【請求項39】

前記エフェクター細胞が、ＣＤ２、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ２５、ＮＫｐ３０、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＣＤ２７、ＯＸ４０、ＣＤ１０７ａ、ＮＫＧ２Ａ、ＰＤ－１、ＴＩＧＩＴ、ＳＩＲＰα、もしくはＣＤ１５８、またはそれらの任意の組み合わせをさらに発現する、請求項１から３のいずれか一項に記載の使用。

【請求項40】

前記細胞傷害性細胞がγδＴ細胞であるか、または前記細胞傷害性細胞がＶδ１ Ｔ細胞、Ｖδ２ Ｔ細胞、Ｖδ３ Ｔ細胞、Ｖδ５ Ｔ細胞、またはＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞である、請求項４に記載の使用。

【請求項41】

前記エフェクター細胞が、ＣＤ３、ＮＫｐ４６、ＣＤ５６、ＣＤ１６、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫｐ４４、ＣＤ２５、ＣＤ３８、ＰＤ－１、ＮＫｐ３０、ＣＤ１８、ＴＩＧＩＴ、ＤＮＡＭ－１、ＣＤ３６、ＣＤ１０３、ＣＣＲ７、ＣＸＣＲ３、ＩＦＮγ、グランザイムＢ、もしくはＣＤ６９、またはそれらの任意の組み合わせをさらに発現する、請求項１から３のいずれか一項に記載の使用。

【請求項42】

前記生物学的マーカーを発現する標的細胞との共培養後、前記エフェクター細胞がグランザイムＢをさらに発現する、請求項１から３のいずれか一項に記載の使用。

【請求項43】

（１）前記エフェクター細胞の少なくとも４％が、細胞あたり少なくとも４００個のＮＫｐ４６分子を発現するか、
（２）前記エフェクター細胞の少なくとも１０％が、細胞あたり少なくとも４００個のＣＤ５６分子を発現するか、
（３）前記エフェクター細胞の少なくとも１０％が、細胞あたり少なくとも４００個のＣＤ１６分子を発現するか、
（４）前記エフェクター細胞の少なくとも３０％が、細胞あたり少なくとも４０個のＮＫＧ２Ｄ分子を発現するか、
（５）前記エフェクター細胞の少なくとも１％が、細胞あたり少なくとも４００個のＮＫｐ４４分子を発現するか、
（６）前記エフェクター細胞の少なくとも８０％が、細胞あたり少なくとも４００個のＣＤ６９分子を発現するか、もしくは
（７）前記エフェクター細胞の少なくとも４０％が、細胞あたり少なくとも４００個のＣＸＣＲ３分子を発現するか、
またはそれらの任意の組み合わせである、請求項１から３のいずれか一項に記載の使用。

【請求項44】

（１）前記エフェクター細胞の少なくとも４％がＮＫｐ４６を発現し、前記ＮＫｐ４６を発現するエフェクター細胞は平均で細胞あたり少なくとも４００個のＮＫｐ４６分子を発現するか、
（２）前記エフェクター細胞の少なくとも１０％がＣＤ５６を発現し、前記ＣＤ５６を発現するエフェクター細胞は平均で細胞あたり少なくとも４００個のＣＤ５６分子を発現するか、
（３）前記エフェクター細胞の少なくとも１０％がＣＤ１６を発現し、前記ＣＤ１６を発現するエフェクター細胞は平均で細胞あたり少なくとも４００個のＣＤ１６分子を発現するか、
（４）前記エフェクター細胞の少なくとも３０％がＮＫＧ２Ｄを発現し、前記ＮＫＧ２Ｄを発現するエフェクター細胞は平均で細胞あたり少なくとも４０個のＮＫＧ２Ｄ分子を発現するか、
（５）前記エフェクター細胞の少なくとも１％がＮＫｐ４４を発現し、前記ＮＫｐ４４を発現するエフェクター細胞は平均で細胞あたり少なくとも４００個のＮＫｐ４４分子を発現するか、
（６）前記エフェクター細胞の少なくとも８０％がＣＤ６９を発現し、前記ＣＤ６９を発現するエフェクター細胞は平均で細胞あたり少なくとも４００個のＣＤ６９分子を発現するか、もしくは
（７）前記エフェクター細胞の少なくとも４０％がＣＸＣＲ３を発現し、前記ＣＸＣＲ３を発現するエフェクター細胞は平均で細胞あたり少なくとも４００個のＣＸＣＲ３分子を発現するか、
またはそれらの任意の組み合わせである、請求項１から３のいずれか一項に記載の使用。

【請求項45】

前記ターゲティングユニットが第１タイプのターゲティングユニットであり、前記エフェクター細胞が、前記エフェクター細胞の表面に複合体化された第２タイプのターゲティングユニットの集団をさらに備え、前記第２タイプのターゲティングユニットの集団中のターゲティングユニットは第２成分を含有し、前記第２成分は、（ａ）前記第２成分が前記疾患に関連する前記異常細胞によって発現される前記生物学的マーカーまたは異なる生物学的マーカーへの特異的結合を示すこと、及び（ｂ）前記第２成分が前記エフェクター細胞によって産生されないこと、を特徴とする、請求項１～３のいずれか一項に記載の使用。

【手続補正2】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００３９

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0039】

いくつかの実施形態において、第1成分は、リツキシマブ、トラスツズマブ、セツキシマブ、アレムツズマブ、アベルマブ、ダラツムマブ、エロツズマブ、オビヌツズマブ、ボルセツズマブ、クサツズマブ、デュルバルマブ、パニツムマブ、またはアマツキシマブである。

【手続補正3】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００４２

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0042】

いくつかの実施形態において、第１の成分は、コドリツズマブ、ソラネズマブ、ビマグルマブ、トラロキヌマブ、またはボコシズマブである。

【手続補正4】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００４９

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0049】

いくつかの実施形態において、HIVまたは他のウイルス感染症はウイルス感染によって引き起こされる。 防御免疫応答の刺激が望ましい感染性ウイルスの例は次のとおりである： レトロウイルス科（例えば、HIV-1（HTLV-III、LAV、HTLV-III/LAV、またはHIV-IIIとも呼ばれる）などのヒト免疫不全ウイルス、およびHIV-LPなどの他の分離株））; ピコルナウイルス科（例えば、ポリオウイルス、A型肝炎ウイルス、エンテロウイルス、ヒトコクサッキーウイルス、ライノウイルス、エコーウイルス）; カリシウイルス科（例えば、胃腸炎を引き起こす株）;トガウイルス科（例えば、馬脳炎ウイルス、風疹ウイルス）; フラビウイルス科（例えば、デング熱ウイルス、脳炎ウイルス、黄熱病ウイルス）;コロナウイルス科（例えば、コロナウイルス）。ラブドウイルス科（例えば、水疱性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス）; フィロウイルス科（例えば、エボラウイルス）；パラミクソウイルス科（例えば、パラインフルエンザウイルス、ムンプスウイルス、麻疹ウイルス、RSウイルス）;オルトミクソウイルス科（例えば、インフルエンザウイルス）; ブニヤウイルス科（例えば、ハンターンウイルス、ブンガウイルス、フレボウイルス、ナイロウイルス; アリーナウイルス科（出血熱ウイルス）；レオウイルス科 (例えば、レオウイルス、オービウイルス、ロタウイルス);ビルナウイルス科；ヘパドナウイルス科 (B 型肝炎ウイルス);パルボウイルス科 (パルボウイルス);パポバウイルス科（パピローマウイルス、ポリオーマウイルス; アデノウイルス科 (ほとんどのアデノウイルス);ヘルペスウイルス科（単純ヘルペスウイルス（HSV）1および2、水痘帯状疱疹ウイルス、サイトメガロウイルス（CMV）、ヘルペスウイルス）；ポックスウイルス科（痘瘡ウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス）;およびイリドウイルス科（例えば、アフリカ豚コレラウイルス）; および未分類のウイルス（例えば、海綿状脳症の病原体、デルタ肝炎の病原体（B型肝炎ウイルスの欠陥サテライトであると考えられている）、非A型、非B型肝炎の病原体（クラス1=内部感染、クラス 2=非経口感染（すなわち、C型肝炎）；ノーウォークウイルスと関連ウイルス、およびアストロウイルス）。 細菌感染症は細菌の感染によって引き起こされる。 防御免疫応答の刺激が望ましい感染性細菌の例は次のとおりである：ヘリコバクター・パイロン、ボレリア・ブルグドルフェリ、レジオネラ・ニューモフィリア、マイコバクテリア属菌（例えば、結核菌、鳥型結核菌、イントラセルラー菌、カンサイ菌、ゴルドナク菌）、黄色ブドウ球菌、淋菌、髄膜炎菌、リステリア・モノサイトゲネス、化膿性連鎖球菌（グループA連鎖球菌）、ストレプトコッカス・アガラクチア（B群連鎖球菌）、連鎖球菌（ビリジアン群）、 フェカリス連鎖球菌、 ウシ連鎖球菌、連鎖球菌（嫌気性菌）、 肺炎連鎖球菌、 病原性カンピロバクター属、 エンテロコッカス属、インフルエンザ菌、炭疽菌、ジフテリア菌、コリネバクテリウム属、ブタ丹毒菌、ウェルシュ菌、破傷風菌、エンテロバクター・エアロゲネス、肺炎桿菌、パスツレラ ムルトシダ、 バクテロイデス属、フソバクテリウム・ヌクレアタム、ストレプトバチルス・モニリフォルミス、梅毒トレポネーマ、 トレポネーマ・パーテニュ、 レプトスピラ、およびアクチノマイセス・イスラエリ。防御免疫応答の刺激が望ましい感染性真菌の例は次のとおりである： クリプトコッカス・ネオフォルマンス、 ヒストプラスマ・カプスラーツム、 コクシジオイデス・イミチス, ブラストミセス・デルマチチジス、 クラミジア・トラコマチス、 カンジダ・アルビカンス。 他の感染性微生物（即ち、原生生物）には次のとおりである: 熱帯熱マラリア原虫およびトキソプラズマ・ゴンディ (US 10,744,207参照)。

【手続補正5】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００５４

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0054】

いくつかの実施形態において、天然官能基は、糖、アミン、αまたはアミノ酸を含有し、または、天然官能基はN-アジドアセチルシアル酸（SiaNAz）などのアジド修飾糖ではない。または、天然官能基は、リジン、システイン、チロシン、トレオニン、セリン、アスパラギン酸、グルタミン酸、およびトリプトファンからなる群から選択されるアミノ酸を含有する ( U.S. Pat. No. 10,744,207参照)。

【手続補正6】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００７３

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0073】

いくつかの実施形態において、エフェクター細胞などの細胞は細胞株に由来する。細胞株の例としては、Raw264.7、U-937、oNK、NK92、NK3.3、KHYG-1、NKL、およびそれらのトランスジェニック品種が含まれるが、これらに限定されない。 細胞株は、当業者に知られる様々な供給源から入手可能である(例えば、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション (ATCC) (バージニア州、マナサス) 参照) (US 10,744,207参照).
いくつかの実施形態において、エフェクター細胞などの細胞はＴ細胞である。 T細胞には、CD4⁺ T細胞、CD8⁺ T細胞、CD4⁺CD8⁺T細胞など、CD3を発現するすべての細胞が含まれる。T細胞には、ナイーブ細胞とメモリー細胞の両方（TCM、TEM、TEMRAなど）、ヘルパー細胞（Th1、Th2、Th3、Th9、Th7、TFHなど）、エフェクター細胞（CTLまたはTc細胞など）、NKT細胞、腫瘍浸潤リンパ球（TIL）、制御細胞（Treg、Tr1 細胞など）、リンパ球活性化キラー細胞、αβT 細胞、γδT 細胞（ガンマデルタT細胞）、および同様のユニークなクラスの T 細胞系統である。 いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は活性化Ｔ細胞である。 (US 10,744,207参照)。

【手続補正7】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０１０３

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0103】

いくつかの実施形態において、ターゲティングユニットは第１のタイプのターゲティングユニットであり、エフェクター細胞は、エフェクター細胞の表面に複合体化された第２のタイプのターゲティングユニットの集団をさらに含有し、 第２のタイプのターゲティングユニットの集団におけるターゲティングユニットは、以下のことを特徴とする第２の成分を含有する。(a) 生物学的マーカーまたは疾患に関連する異常細胞によって発現される異なる生物学的マーカーと特異的結合を示すことであり；(b) エフェクター細胞によって産生されないことである。 いくつかの実施形態において、第２の成分は抗体である。
いくつかの実施形態において、第２の成分は、ADCCを誘導するIgGサブタイプのモノクローナル抗体であり; または 第２の成分が他の抗体であり；あるいは、第２の成分は抗原結合ユニットを含有する。 いくつかの実施形態において、第２の成分は核酸ではない。いくつかの実施形態において、第２の成分は、疾患治療のためにFDAに承認された成分である。いくつかの実施形態において、第２の成分は、リツキシマブ、トラスツズマブ、セツキシマブ、アレムツズマブ、アベルマブ、ダラツムマブ、エロツズマブ、オビヌツズマブ、ボルセツズマブ、クサツズマブ、デュルバルマブ、ペイントムマブ、またはアマツキシマブである。 いくつかの実施形態において、第２の成分は第Ｉ相臨床試験で成功しているが、疾患の治療のためにFDAに承認された成分ではない。 いくつかの実施形態において、第２の成分は、コドリツズマブ、ソラネズマブ、ビマグルマブ、トラロキヌマブ、またはボコシズマブである。

【手続補正8】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０１６９

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0169】

実施形態 1-1-6 セツキシマブ複合体化ヒトCD16⁺ナチュラルキラー細胞のセツキシマブ反応性あるいはセツキシマブ耐性ヒト結腸癌細胞に対する細胞傷害性機能
本実施例の実験方法は実施形態1-1-5とほぼ同様であるが、次の点が異なる:
(1) 本実験で使用したエフェクター細胞は、［１］16 日間培養した oNK 細胞懸濁液中の細胞であり、または［２］セツキシマブ複合体化ヒトCD16⁺ナチュラルキラー細胞懸濁液中の細胞であり、セツキシマブがアービタックス（Merck、Bristol-Myers-Squibbより購入）という製品名を有する上皮成長因子受容体（EGFR）に対する抗体である；および
(2) 本実験で使用した標的細胞は、［１］ 本実験で使用した標的細胞は、［１］セツ
キシマブ耐性のないヒト肺腺癌細胞株HCC827-luc（JCRB1516、JCRBより購入）であり、または［２］ セツキシマブ耐性ヒト大腸腺癌細胞株HT-29（HTB-38、ATCCより購入）である。

【手続補正9】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０２２８

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0228】

96ウェル細胞培養プレートを400 x gで5分間遠心分離した。 上清を除去し、細胞ペレットを0.2mLのDPBSで洗浄した。 洗浄した細胞ペレットを、FITC-抗ヒトTNF-α抗体（BioLegend, Cat.502906）、抗PE-抗ヒトCD56抗体（BioLegend）、PE/Cy7-抗ヒトIFN^γ抗体（BioLegend, Cat.502528） 、Alexa Fluor 647-抗ヒトグランザイム B 抗体 (BioLegend)、および APC-Cy7-抗ヒト CD107a 抗体(BioLegend, Cat.328630)をを 1:50 希釈で含む 100 uL の DPBS で 10 分間染色しました。 染色した細胞を遠心分離し、0.2mLのDPBSで洗浄した。 洗浄した細胞を0.5 mLのDPBSで再懸濁し、さらにCD56陽性ゲート集団をTNF-α+、IFN-γ+、グランザイムB+、およびCD107a+の割合についてさらに分析した。 CD56 陽性ゲート集団の平均蛍光強度も分析した。

【手続補正10】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０３５６

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0356】

96ウェル細胞培養プレートを400 x gで5分間遠心分離した。 上清を除去し、細胞ペレットを0.2mLのDPBSで洗浄した。 次いで、洗浄した細胞ペレットを、1:50希釈のFITC-抗ヒトTNF-α抗体（BioLegend、Cat.502906）、抗PE-抗ヒトCD56抗体（BioLegend）、PE/Cy7-抗ヒト IFN ガンマ抗体 (BioLegend、Cat.502528)、Alexa Fluor 647-抗ヒトグランザイム B 抗体 (BioLegend)、および APC-Cy7-抗ヒト CD107a 抗体 (BioLegend、Cat.328630)を含む 100uL の DPBS で 10分間染色した。染色した細胞を遠心分離し、0.2mLのDPBSで洗浄した。洗浄した細胞を0.5 mLのDPBSで再懸濁し、CD56陽性ゲート集団をTNF-α+、IFN-γ+、グランザイムB+、およびCD107a+の割合についてさらに分析した。 CD56 陽性ゲート集団の平均蛍光強度も分析した。

【手続補正11】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０３６１

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0361】

実施形態 7-1-4 成分複合体化ヒトCD16+ナチュラルキラー細胞の遊走に対する複合体化成分の数の影響
本実施形態で使用した外側チャンバーは、24ウェルプレート（ThermoScientific社製、Cat.142475）であった。本実施形態で使用した内側チャンバーは、ポリカーボネート製細胞培養インサート（Millipore社製、Cat.PITP01250）であった。本実施形態では6つのグループがあった:
（１）0 個のトラスツズマブ分子と複合体化したoNK細胞実験グループ: 2 x 10⁵個の標的細胞(BT474 または BT474 クローン 5 細胞) を外側チャンバーに播種した。 付着2時間後、孔径3μmのポリカーボネート製細胞培養インサート（ミリセル製細胞培養インサート）を外側チャンバーに挿入し、36日間培養したoNK細胞懸濁液中の1×10⁶細胞を各内側チャンバーに播種し、19時間インキュベートした。
（２）1000個のトラスツズマブ分子と複合体化したoNK細胞実験グループ: 2 x 10⁵個の標的細胞(BT474 または BT474 クローン 5 細胞) を外側チャンバーに播種した。 付着2時間後、孔径3μmのポリカーボネート製細胞培養インサート（ミリセル社製細胞培養インサート）を外側チャンバーに挿入し、細胞あたり500～1500個のトラスツズマブ分子と複合体化した1×10⁶個のヒトCD16⁺ナチュラルキラー細胞を各内側チャンバーに播種し、 19 時間インキュベートした。
（３）3000個のトラスツズマブ分子と複合体化したoNK細胞実験グループ: 2 x 10⁵個の標的細胞(BT474 または BT474 クローン 5 細胞) を外側チャンバーに播種した。 付着2時間後、孔径3μmのポリカーボネート製細胞培養インサート（ミリセル社製細胞培養インサート）を外側チャンバーに挿入し、細胞あたり2500～3500個のトラスツズマブ分子と複合体化した1×10⁶個のヒトCD16⁺ナチュラルキラー細胞を各内側チャンバーに播種し、 19 時間インキュベートした。
（４）6000個のトラスツズマブ分子と複合体化したoNK細胞実験グループ: 2 x 10⁵個の標的細胞(BT474 または BT474 クローン 5 細胞) を外側チャンバーに播種した。付着2時間後、孔径3μmのポリカーボネート製細胞培養インサート（ミリセル社製細胞培養インサート）を外側チャンバーに挿入し、細胞あたり5500～6500個のトラスツズマブ分子と複合体化した1×10⁶個のヒトCD16⁺ナチュラルキラー細胞を各内側チャンバーに播種し、 19 時間インキュベートした。
（５）12000個のトラスツズマブ分子と複合体化したoNK細胞実験グループ: 2 x 10⁵個の標的細胞(BT474 または BT474 クローン 5 細胞) を外側チャンバーに播種した。 付着2時間後、孔径3μmのポリカーボネート製細胞培養インサート（ミリセル社製細胞培養インサート）を外側チャンバーに挿入し、細胞あたり9000～15000個のトラスツズマブ分子と複合体化した1×10⁶個のヒトCD16⁺ナチュラルキラー細胞を各内側チャンバーに播種し、 19 時間インキュベートした。
（６）30000個のトラスツズマブ分子と複合体化したoNK細胞実験グループ: 2x10⁵個の標的細胞(BT474またはBT474クローン5細胞) を外側チャンバーに播種した。 付着2時間後、孔径3μmのポリカーボネート製細胞培養インサート（ミリセル社製細胞培養インサート）を外側チャンバーに挿入し、細胞あたり25000～35000個のトラスツズマブ分子と複合体化した1×10⁶個のヒトCD16⁺ナチュラルキラー細胞を各内側チャンバーに播種し、 19時間インキュベートした。

【手続補正12】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０４０４

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0404】

96ウェル細胞培養プレートを400 x gで5分間遠心分離した。上清を除去し、細胞ペレットを0.2mLのDPBSで洗浄した。 次いで、洗浄した細胞ペレットを、1:50希釈のFITC-抗ヒトTNF-α抗体（BioLegend、Cat.502906）、抗PE-抗ヒトCD56抗体（BioLegend）、PE/Cy7-抗ヒトIFN-γ抗体 (BioLegend、Cat.502528)、Alexa Fluor 647-抗ヒトグランザイムB抗体 (BioLegend)、およびAPC-Cy7-抗ヒトCD107a抗体(BioLegend、Cat.328630)を含む100uLのDPBSで10分間染色した。 染色した細胞を遠心分離し、0.2mLのDPBSで洗浄した。 洗浄した細胞を0.5 mLのDPBSで再懸濁し、CD56陽性ゲート集団をTNF-α+、IFN-γ+、グランザイムB+、およびCD107a+の割合についてさらに分析した。CD56陽性ゲート集団の平均蛍光強度も分析した。

【国際調査報告】