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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-12-26
(54)【発明の名称】リナクロチドの製造方法
(51)【国際特許分類】
C07K 1/02 20060101AFI20241219BHJP
C07K 1/08 20060101ALI20241219BHJP
C07K 1/10 20060101ALI20241219BHJP
C07K 7/54 20060101ALI20241219BHJP
C07K 1/20 20060101ALI20241219BHJP
【ＦＩ】
C07K1/02 ZNA
C07K1/08
C07K1/10
C07K7/54
C07K1/20
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024535355
(86)(22)【出願日】2022-12-12
(85)【翻訳文提出日】2024-08-02
(86)【国際出願番号】 EP2022085451
(87)【国際公開番号】W WO2023110781
(87)【国際公開日】2023-06-22
(31)【優先権主張番号】21214095.8
(32)【優先日】2021-12-13
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】503375175
【氏名又は名称】ケミー ソシエタ ペル アチオニ
(74)【代理人】
【識別番号】110001243
【氏名又は名称】弁理士法人谷・阿部特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】パオラ アンノーニ
(72)【発明者】
【氏名】シルヴァーナ カッペレッティ
(72)【発明者】
【氏名】アレッサンドラ チェローナ
(72)【発明者】
【氏名】バーバラ シモネリ
(72)【発明者】
【氏名】ステファノ トゥルチェッタ
(72)【発明者】
【氏名】ロレンツォ カッペリーニ
【テーマコード（参考）】
4H045
【Ｆターム（参考）】
4H045AA20
4H045AA50
4H045BA16
4H045BA32
4H045EA25
4H045FA30
4H045FA31
4H045FA50
4H045FA61
4H045GA25
(57)【要約】
本発明は、リナクロチドおよびその酢酸塩の製造法に関し、より詳細には、９９．９％以上のクロマトグラフィー純度を有し、かつＩＭＤ－リナクロチドおよびＣｙｓ－１－α－ケトン－リナクロチド不純物の含有量がそれぞれ１００ｐｐｍ以下、好ましくは５０ｐｐｍ以下、より好ましくは４０ｐｐｍ以下である、非晶質高純度リナクロチドまたはその酢酸塩を得る製造法に関する。さらに、本発明は、イオンペアクロマトグラフィー（ＩＰＣ）により、４０ｐｐｍレベル（ＬＯＤ）においてさえＩＭＤ－リナクロチドおよびＣｙｓ－１－α－ケトンリナクロチドを検出し、かつ、５０ｐｐｍレベル（ＬＯＱ）においてさえＩＭＤ－リナクロチドおよびＣｙｓ－１－α－ケトンリナクロチドを定量できる分析方法に関する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
リナクロチド、好ましくは酢酸塩の形態のリナクロチドを製造するための液相方法であって、前記方法は：ａ１） 式（ＩＩ）のFmoc-Asn(Trt)-Pro-OHのジペプチドフラグメントＢ［７－８］を、式（ＩＩＩ）のFmoc-Ala-Cys[Ψ(Dmp,H)pro]-Thr(tBu)-Gly-Cys[Ψ(Dmp,H)pro]-Tyr(tBu)-OtBuのヘキサペプチドフラグメントＣ［９－１４］とカップリングさせて、ペプチド［７－１４］を得る工程と；
ａ２） ペプチド［７－１４］を、式（ＩＶ）のFmoc-Cys(Trt)-OHを有する６位のアミノ酸誘導体とカップリングさせて、ペプチド［６－１４］を得る工程と；
ａ３） ペプチド［６－１４］を、式（Ｖ）のFmoc-Cys(SO3Na)-ONaを有する５位のアミノ酸誘導体とカップリングさせて、ペプチド［５－１４］を得る工程と；
ａ４） ペプチド［５－１４］を式（ＶＩ）のFmoc-Cys(SO3Na)-Cys(SO3Na)-Glu(tBu)-Tyr(tBu)-OHのテトラペプチドフラグメントＡ［１－４］とカップリングさせて、式（ＶＩＩ）のFmoc-Cys(SO3Na)-Cys(SO3Na)-Glu(tBu)-Tyr(tBu)-Cys(SO3Na)-Cys(Trt)-Asn(Trt)-Pro-Ala-Cys[Ψ(Dmp.H)pro]-Thr(tBu)-Gly-Cys[Ψ(Dmp,H)pro]-Tyr(tBu)-OtBuの鎖状保護ペプチドを得る工程と；
ｂ） 第二級塩基およびトリフルオロ酢酸との反応により、化合物（ＶＩＩ）を脱保護し、式（ＶＩＩＩ）のH-Cys(SO3H)-Cys(SO3H)-Glu-Tyr-Cys(SO3H)-Cys-Asn-Pro-Ala-Cys-Thr-Gly-Cys-Tyr-OHのＴＦＡ塩の中間体を得る工程と；
ｃ） 中間体（ＶＩＩＩ）の非酸化的環化を実施して、粗製リナクロチドを得る工程と；
ｄ） 任意選択的に、粗製リナクロチドを精製して精製リナクロチドを得る工程と；
ｅ） 任意選択的に、精製リナクロチドを酢酸で塩変換して、対応する酢酸塩を形成する工程と
を含むことを特徴とする方法。
【請求項2】
工程ｂ）における第二級塩基は、第二級アミン、好ましくはＤＥＡ、ピペリジン、ピペラジンまたはモルホリンであり、トリフルオロ酢酸は少なくとも８０体積％の水溶液であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項3】
工程ｃ）を分子内求核置換によって実施することを特徴とする請求項１または２に記載の方法。
【請求項4】
工程ｃ）をｐＨ７～８の水アルコール緩衝液中で実施することを特徴とする請求項１から３のいずれかに記載の方法。
【請求項5】
工程ｃ）において、粗製リナクロチドは水溶液として得られることを特徴とする請求項１から４のいずれかに記載の方法。
【請求項6】
式（ＩＩ）と式（ＩＩＩ）とのカップリング、および／またはペプチド［７－１４］と式（ＩＶ）とのカップリング、および／またはペプチド［６－１４］と式（Ｖ）との間のカップリング、および／またはペプチド［５－１４］と式（ＶＩ）との間のカップリングを、シアノ（ヒドロキシイミノ）酢酸エチルまたは１，３－ジメチルバルビツール酸誘導体の存在下で実施することを特徴とする請求項１から５のいずれかに記載の方法。
【請求項7】
式（ＩＩ）と式（ＩＩＩ）とのカップリング、および／またはペプチド［７－１４］と式（ＩＶ）とのカップリング、および／またはペプチド［６－１４］と式（Ｖ）とのカップリング、および／またはペプチド［５－１４］と式（ＶＩ）とのカップリングを、極性有機溶媒、好ましくはＤＭＦ、ＮＭＰ、ＡＣＮから選択される溶媒中で実施されることを特徴とする請求項１から６のいずれかに記載の方法。
【請求項8】
式（ＩＩ）と式（ＩＩＩ）とのカップリング、および／またはペプチド［７－１４］と式（ＩＶ）とのカップリング、および／またはペプチド［６－１４］と式（Ｖ）とのカップリング、および／またはペプチド［５－１４］と式（ＶＩ）とのカップリングを、－１０℃～３５℃、好ましくは０℃～２５℃の温度範囲で実施することを特徴とする請求項１から７のいずれかに記載の方法。
【請求項9】
精製工程ｄ）を、逆相高速サンプル置換（ＲＰ－ＨＰＳＤ）、逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ－ＨＰＬＣ）またはそれらの組み合わせによって実施することを特徴とする請求項１から８のいずれかに記載の方法。
【請求項10】
溶離相は水溶液、極性有機溶媒またはそれらの混合物からなり、好ましくは、極性有機溶媒はトリフルオロ酢酸、酢酸、アセトニトリルおよびそれらの混合物から選択され、任意選択的に緩衝液、より好ましくはリン酸緩衝液が添加されることを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項11】
精製リナクロチドは溶液中にあり、好ましくは、前記溶液は、水、酢酸およびアセトニトリルを含むことを特徴とする請求項９または１０に記載の方法。
【請求項12】
リナクロチドは、９９．９％以上のＨＰＬＣ純度を有し、ＩＭＤ－リナクロチドおよびＣｙｓ－１－α－ケトン－リナクロチド不純物の含有量は、それぞれ１００ｐｐｍ未満、好ましくは５０ｐｐｍ未満、より好ましくは４０ｐｐｍ未満であることを特徴とする請求項９から１１のいずれかに記載の方法。
【請求項13】
水アルコール溶液または水性懸濁液から出発する凍結乾燥による単離工程ｆ）をさらに含むことを特徴とする請求項１から１２のいずれかに記載の方法。
【請求項14】
水アルコール溶液は、ｔｅｒｔ－ブタノール、水、酢酸またはそれらの混合物を含有することを特徴とする請求項１３に記載の方法。
【請求項15】
水性懸濁液は、精製リナクロチド溶液の蒸発によって得られ、より好ましくは、水性懸濁液は酢酸を含有することを特徴とする請求項１３に記載の方法。
【請求項16】
９９．９％以上のＨＰＬＣ純度を有し、ＩＭＤ－リナクロチド（不純物１）およびＣｙｓ－１－α－ケトン（不純物２）の含有量は、いずれも１００ｐｐｍ未満、好ましくは５０ｐｐｍ未満、より好ましくは４０ｐｐｍ未満であることを特徴とする非晶質リナクロチドまたはその酢酸塩。
【請求項17】
０．１％面積％以下の多量体含有率を有することを特徴とする請求項１６に記載の非晶質リナクロチドまたはその酢酸塩。
【請求項18】
非晶質高純度リナクロチドまたはその酢酸塩中のＩＭＤ－リナクロチドおよびＣｙｓ－１－α－ケトンの不純物含有量を検出および定量する方法であって、前記方法は、アルキル鎖を含むシリカ固定相と、水溶液、極性有機溶媒、またはそれらの混合物からなる溶離相を有するイオンペアクロマトグラフィー（ＩＰＣ）カラムを通して生成物を溶離させる工程を含み、任意選択的に、溶離相に対して、緩衝液、好ましくはリン酸緩衝液を添加することを特徴とする方法。
【請求項19】
前記アルキル鎖は、オクタデシル型（Ｃ１８）、オクチル型（Ｃ８）またはブチル型（Ｃ４）であり、好ましくはＣ１８であることを特徴とする請求項１８に記載の方法。
【請求項20】
前記極性有機溶媒は、テトラヒドロフラン、ジオキサン、ジクロロメタン、メタノール、エタノール、ｎ－プロパノール、イソプロパノール、ブタノール、ペンタン、ヘキサン、トルエン、トリフルオロ酢酸、アセトニトリル、またはそれらの混合物から選択され；より好ましくは、トリフルオロ酢酸、アセトニトリル、またはそれらの混合物から選択されることを特徴とする請求項１８または１９に記載の方法。
【請求項21】
以下の操作条件：固定相：Ｃ１８アルキル鎖を含む担体シリカ粒子；
溶離液Ａ：リン酸緩衝液 ｐＨ６．２
溶離液Ｂ：ＡＣＮ
にしたがって実施し、以下のグラジエント溶離：
％Ｂ： ７－７（２分）；７－１５（１９分）；１５－６０（２５分）
が適用することを特徴とする請求項１８から２０のいずれかに記載の方法。
【請求項22】
前記溶離相は、イオンペア試薬、好ましくはヘプタンスルホン化塩を含むことを特徴とする請求項１８から２１のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、リナクロチドおよびその酢酸塩を製造する製造法に関し、より詳細には、９９．９％以上のクロマトグラフィー純度を有し、かつ、ＩＭＤ－リナクロチドおよびＣｙｓ－１－α－ケトン－リナクロチド不純物の含有量がそれぞれ１００ｐｐｍ以下、好ましくは５０ｐｐｍ以下、より好ましくは４０ｐｐｍ以下である非晶質高純度リナクロチドまたはその酢酸塩を得る製造法に関する。
【0002】
さらに、本発明は、４０ｐｐｍレベル（ＬＯＤ）でもＩＭＤ－リナクロチドおよびＣｙｓ－１－α－ケトン－リナクロチドを検出し、５０ｐｐｍレベル（ＬＯＱ）でもＩＭＤ－リナクロチドおよびＣｙｓ－１－α－ケトン－リナクロチドを定量できる、イオンペアクロマトグラフィー（ＩＰＣ）による分析方法に関する。
【背景技術】
【0003】
リナクロチド酢酸塩は、７２、１４５、２９０ｍｃｇカプセルの剤形である、米国市場向け「リンゼス」（登録商標）およびＥＵ市場向け「コンステラ」（登録商標）の市販品に含まれる原薬である。
【0004】
医薬品有効成分は、式（Ｉ）で示される、１４個のアミノ酸から構成され、Ｃｙｓ［１－６］、［２－１０］、［５－１３］間に３つの位置特異的ジスルフィド結合を含む、複雑なＣｙｓ豊富な環状ペプチドである。
【0005】
【化1】
【0006】
この薬剤は、グアニル酸シクラーゼのアゴニストに属し、腸管上皮の内表面に存在するグアニル酸シクラーゼサブタイプＣ受容体に局所的に作用する。リナクロチドによるグアニル酸シクラーゼの活性化は、ｃＧＭＰレベルを上昇させ、その結果、腸管内腔への塩化物および炭酸水素の分泌を活性化し、腸液分泌が増加し、便通を促進する。
【0007】
リナクロチドの構造は、米国特許第７３０４０３６号明細書で初めて報告された。当該文献は、適切に改変された細菌ベクターの発酵または固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）によって、ペプチドの生産を達成できると一般的に記述しているが、化学的手順の完全な記述を与えていない。一方、リナクロチドについて発表された最初の詳細な合成法は、ＳＰＰＳ製造プロセスを報告し、およびジスルフィド架橋部形成のための酸化的方法を提案しているPeptide Science 96 (1), 69-80 (2010)に見出される。
【0008】
リナクロチドの化学的調製手順は、たとえば、国際公開第２０１４／１８８０１１号（Lonza)に記載されている。当該文献においては、逐次的アミノ酸連結(one-by-one aminoacid assembly)戦略を用いるＳＰＰＳによって、樹脂上の鎖状ペプチド主鎖を調製し、次いで鎖状ペプチドの樹脂からの切断および同時の脱保護を行い；３つのジスルフィド架橋部を、ジメチルスルホキシド中の空気酸化によりランダム戦略によって形成し、次いで粗製リナクロチドを逆相クロマトグラフィーで精製し、最終的に５０％ｔｅｒｔ－ブタノール水溶液からの凍結乾燥により、純度未公表の品質で単離している。
【0009】
また、国際公開第２０１５／０２２５７５号(Auro Peptides)も化学合成手順を記載しており、当該手順においては、２つのフラグメントを調製し、ＳＰＰＳ段階的戦略でカップリングさせて樹脂上の鎖状ペプチド主鎖を得て、樹脂からの切断および同時の脱保護を行い、空気および酸化剤（たとえば過酸化水素）を用いたランダム戦略で環化させて３つのジスルフィド架橋部を形成し、最後に精製して凍結乾燥し、最大でも９８．９％のＨＰＬＣ純度を有するリナクロチドを得ている。
【0010】
さらに、国際公開第２０１６／０３８４９７号(Auro Peptides)は、リナクロチドを調製する方法を報告しており、当該方法は、逐次的アミノ酸連結戦略を用いるＳＰＰＳを適用し、樹脂上に鎖状ペプチド主鎖を生成させ、次いで樹脂からの遊離および脱保護（同時または順次的）を行い、空気および酸化剤（たとえば過酸化水素）を用いたランダム戦略で環化し、最終的に逆相クロマトグラフィーで精製し、凍結乾燥を行って、９８．９％のＨＰＬＣ純度または９９％超の汎用ＨＰＬＣ純度を有する最終生成物を得る。当該方法において、生成物中の不純物の詳細は報告されていない。
【0011】
国際公開第２０１７／１０１８１０号(Hybio Pharmaceuticals)は、リナクロチドの位置選択的合成を記載している。当該合成において、逐次的アミノ酸連結を経由するＳＰＰＳによる樹脂上の鎖状ペプチド主鎖の予備調製、樹脂に結合したままのペプチド上での第１のジスルフィド架橋部［１－６］の酸化的形成、溶液中での第２のジスルフィド架橋部［２－１０］の酸化的形成、および最後に２つのメチル化システインの脱保護後の第３のジスルフィド架橋部［５－１３］の酸化的形成で構成される。粗製リナクロチドは、逆相クロマトグラフィーで精製され、凍結乾燥される。合成は位置選択的に進行すると記載されているが、必要なジスルフィド結合を形成するために使用される反応の酸化的性質は、ペプチドの二量体および多量体(multimers)の不純物の形成の回避を可能にしない。さらに、ジエチルエーテルのような工業的に適切とは言い難い溶媒の使用に加えて、最終的なリナクロチドのＨＰＬＣ純度が９９．５％であることを記載しているものの、たとえばＩＭＤ－リナクロチドやＣｙｓ－１－α－ケトン－リナクロチドの不純物の含有量については言及されていない。しかしながら、中間体のビスジスルフィドペプチドの逆相クロマトグラフィーによる追加精製を記載している。
【0012】
また、国際公開第２０１７／１３４６８７号(Cipla)は、リナクロチドの調製法を記載している。当該調製法は、逐次的アミノ酸連結を経由するＳＰＰＳによる樹脂上の鎖状ペプチド主鎖の初期製造、次いで、樹脂からの切断およびＳ－フェニルアセトアミドメチル保護基の除去を同時に実施し、最終的にランダム戦略にて水性溶媒中で生成物を酸化し、逆相クロマトグラフィーで精製し、凍結乾燥して、二量体および多量体の不純物を含まない９９％超の汎用ＨＰＬＣ純度を有する最終生成物を得る。
【0013】
同様に、また、国際公開第２０１９／１１３８７２号(Shenzhen)は、リナクロチドの製造法を詳述している。当該方法は、逐次的アミノ酸連結を経由するＳＰＰＳまたは段階的戦略による樹脂上の鎖状ペプチド主鎖の調製を経由し、得られた鎖状ペプチド主鎖を樹脂から切断せずにＮ－アロゲニルコハク酸イミドを用いる酸化により環化し；次いで、樹脂上の粗製リナクロチドを脱離させ、逆相クロマトグラフィーで精製し、凍結乾燥する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0014】
当技術分野で使用されているリナクロチドの調製方法を参照して、本発明者らは、これらの方法は、少なくとも９９．９％の高純度を有し、およびＩＭＤ－リナクロチドおよびＣｙｓ－１－α－ケトン－リナクロチド不純物の含有量がそれぞれ１００ｐｐｍ未満、好ましくは５０ｐｐｍ未満、より好ましくは４０ｐｐｍ未満である、非晶質リナクロチドが提供しないことを見出した。
【課題を解決するための手段】
【0015】
本発明者らは、簡略化された、工業的に適用可能で、かつ堅牢な、リナクロチドおよびその酢酸塩の調製方法を見出した。当該方法では、中間精製を行わずに、全体を通して液相ペプチド合成（ＬＰＰＳ）により調製される。より詳細には、この方法は、９９．９％以上のクロマトグラフィー純度を有し、および、特にＩＭＤ－リナクロチドとＣｙｓ－１－α－ケトン－リナクロチドの不純物の含有量がそれぞれ１００ｐｐｍ以下、好ましくは５０ｐｐｍ以下（イオンペア分析法のＬＯＱ）、より好ましくは４０ｐｐｍ以下（イオンペア分析法のＬＯＤ）であることを特徴として、非晶質リナクロチドまたはその酢酸塩を製造することができる。
【0016】
第１の態様において、本発明は、以下の一般的な工程：
１． 鎖状保護ペプチドの構築の初期段階；
２． 脱保護の段階；
３． ジスルフィド架橋部の形成段階を経て、粗製リナクロチドを生成する段階；
４． 任意選択的に、精製の段階；および
５． 任意選択的に、非晶質高純度リナクロチドの単離段階、
を含む、リナクロチドまたはその酢酸塩を調製するための液相方法に関する。
１． 鎖状保護ペプチドの構築の初期段階；
２． 脱保護の段階；
３． ジスルフィド架橋部の形成段階を経て、粗製リナクロチドを生成する段階；
４． 任意選択的に、精製の段階；および
５． 任意選択的に、非晶質高純度リナクロチドの単離段階、
を含む、リナクロチドまたはその酢酸塩を調製するための液相方法に関する。
【0017】
本方法は、先行技術に対して顕著な改善を提供し、その利点を以下に要約する：
１． 同一の標準化された一連の工程を周期的に繰り返して、保護された鎖状ペプチドを得る；
２． 保護された鎖状ペプチドは、全体を通して、液相ペプチド合成（ＬＰＰＳ）によって調製される；
３． 鎖状保護ペプチド主鎖の化学合成および鎖状先進中間体の化学合成において、中間体のクロマトグラフィー精製を行わない；
４． ジスルフィド架橋部の形成は非酸化的方法で行われ、環化モル収率は約７０％である；
５． 任意選択的精製は、好ましくは、分取逆相高速サンプル置換法（ＲＰ－ＨＰＳＤ）および分取逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ－ＨＰＬＣ）からなる２つの技術の組み合わせで実施され、クロマトグラフィー精製の全収率は約５５％である；
６． 高純度リナクロチドの単離の任意選択的最終段階を、リナクロチドのｔ－ＢｕＯＨ－水溶液またはリナクロチドの水懸濁液の凍結乾燥により行う；および
７． 最終的な高純度リナクロチドは、非晶質の凍結乾燥粉末である。
１． 同一の標準化された一連の工程を周期的に繰り返して、保護された鎖状ペプチドを得る；
２． 保護された鎖状ペプチドは、全体を通して、液相ペプチド合成（ＬＰＰＳ）によって調製される；
３． 鎖状保護ペプチド主鎖の化学合成および鎖状先進中間体の化学合成において、中間体のクロマトグラフィー精製を行わない；
４． ジスルフィド架橋部の形成は非酸化的方法で行われ、環化モル収率は約７０％である；
５． 任意選択的精製は、好ましくは、分取逆相高速サンプル置換法（ＲＰ－ＨＰＳＤ）および分取逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ－ＨＰＬＣ）からなる２つの技術の組み合わせで実施され、クロマトグラフィー精製の全収率は約５５％である；
６． 高純度リナクロチドの単離の任意選択的最終段階を、リナクロチドのｔ－ＢｕＯＨ－水溶液またはリナクロチドの水懸濁液の凍結乾燥により行う；および
７． 最終的な高純度リナクロチドは、非晶質の凍結乾燥粉末である。
【0018】
第２の態様によれば、本発明は、９９．９％以上のクロマトグラフィー純度を有し、以下に示す不純物：
－ ＩＭＤ－リナクロチド（不純物１）；
－ Ｃｙｓ－１－α－ケトン（不純物２）
の量が、いずれも１００ｐｐｍ未満、好ましくは５０ｐｐｍ未満、より好ましくは４０ｐｐｍ未満である非晶質リナクロチドまたはその酢酸塩に関する。
－ ＩＭＤ－リナクロチド（不純物１）；
－ Ｃｙｓ－１－α－ケトン（不純物２）
の量が、いずれも１００ｐｐｍ未満、好ましくは５０ｐｐｍ未満、より好ましくは４０ｐｐｍ未満である非晶質リナクロチドまたはその酢酸塩に関する。
【0019】
好ましくは、リナクロチドまたはその酢酸塩は、０．１％面積％以下の多量体含有量を有する。
【0020】
第３の態様によれば、本発明は、リナクロチドまたはその酢酸塩を分析するイオンペアクロマトグラフィー（ＩＰＣ）法に関し、この分析法は、非晶質高純度リナクロチド中の微量の不純物ＩＭＤ－リナクロチドおよびＣｙｓ－１－α－ケトン－リナクロチドを検出（４０ｐｐｍのＬＯＤ）および定量（５０ｐｐｍのＬＯＱ）することができる。不純物であるＩＭＤ－リナクロチドおよびＣｙｓ－１－α－ケトン－リナクロチドの構造を以下に記載する。
【0021】
【化2】
【0022】
【化3】
【図面の簡単な説明】
【0023】
【図1】製造オプション１で得られた非晶質高純度リナクロチド（クロマトグラフィー純度：９９．９４％）のイオンペアクロマトグラム（クロマトグラフィー純度評価用）を示す図である。
【図2】製造オプション２で得られた非晶質高純度リナクロチド（クロマトグラフィー純度：９９．９１％）のイオンペアクロマトグラム（クロマトグラフィー純度評価用）を示す図である。
【図3】ＩＭＤ－リナクロチドおよびＣｙｓ－１－α－ケトン－リナクロチド不純物を添加したリナクロチド（ＩＭＤ－リナクロチド：ＲＲＴ ０．８４－０．８５：１．０質量％、Ｃｙｓ－１－α－ケトン－リナクロチド：ＲＲＴ ０．９１－０．９２：１．０質量％）のイオンペアクロマトグラムを示す図である。
【図4】製造オプション１により得られた非晶質高純度リナクロチドのイオンペアクロマトグラム（ＩＭＤ－リナクロチドおよびＣｙｓ－１－α－ケトン－リナクロチド含有量の評価用）を示す図である。ＩＭＤ－リナクロチド：ＲＲＴ ０．８４－０．８５：ＬＴ ４０ｐｐｍ（ＬＴ ＬＯＤ）。Ｃｙｓ－１－α－ケトン－リナクロチド：ＲＲＴ ０．９１－０．９２：ＬＴ ４０ｐｐｍ（ＬＴ ＬＯＤ）。
【図5】製造オプション２で得られた非晶質高純度リナクロチドのイオンペアクロマトグラム（ＩＭＤ－リナクロチドおよびＣｙｓ－１－α－ケトン－リナクロチド含有量の評価用）を示す図である。ＩＭＤ－リナクロチド：ＲＲＴ ０．８４－０．８５：ＬＴ ４０ｐｐｍ（ＬＴ ＬＯＤ）。Ｃｙｓ－１－α－ケトン－リナクロチド：ＲＲＴ ０．９１－０．９２：ＬＴ ４０ｐｐｍ （ＬＴ ＬＯＤ）。
【図6】製造オプション１で得られた非晶質高純度リナクロチドのＧＰＣクロマトグラム（多量体含有量評価用）を示す図である。多量体（ピークの和）：ＲＲＴ≦０．８１－０．８２：０．０７％。
【図7】製造オプション２で得られた非晶質高純度リナクロチドのＧＰＣクロマトグラム（多量体含有量評価用）を示す図である。多量体（ピークの和）：ＲＲＴ≦０．８１－０．８２：０．０６％。
【図8】製造オプション１で得られた非晶質高純度リナクロチドの粉末Ｘ線回折（ＰＸＲＤ）を示す図である。
【図9】製造オプション１によって得られた非晶質高純度リナクロチドの示差走査熱分析（ＤＳＣ）曲線を示す図である。３０～１００℃の範囲で水－溶媒が失われ、２５０℃まで結晶形態に関連する吸熱／発熱現象は見られない。
【図10】製造オプション２で得られた非晶質高純度リナクロチドの粉末Ｘ線回折（ＰＸＲＤ）を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【0024】
（略語）
ＡＣＮ ： アセトニトリル
ＡｃＯＨ ： 酢酸
ＤＣＨＡ ： ジシクロヘキシルアミン
ＤＣＭ ： ジクロロメタン
ＤＥＡ ： ジエチルアミン
ＤＩＰＥ ： ジイソプロピルエーテル
ＤＭＦ ： Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド
ＤＳＣ ： 示差走査熱分析
ＥＤＣ・ＨＣｌ ： Ｎ－（３－ジメチルアミノプロピル）－Ｎ’－エチルカルボジイミド塩酸塩
Ｆｍｏｃ ： フルオレニルメトキシカルボニル
ＧＰＣ ： ゲル浸透クロマトグラフィー
ＩＰＡ ： イソプロパノール
ｉＰｒＯＡｃ ： 酢酸イソプロピル
ＩＰＣ ： イオンペアクロマトグラフィー
ＬＯＤ ： 検出限界
ＬＯＱ ： 定量限界
ＬＰＰＳ ： 液相ペプチド合成
ＭＴＢＥ ： メチル－ｔｅｒｔ－ブチルエーテル
ＮＭＭ ： Ｎ－メチルモルホリン
ＮＭＰ ： Ｎ－メチルピロリドン
ＯＡｌｌ ： アリルエステル
ＯｔＢｕ ： ｔｅｒｔ－ブチルエステル
Ｏｘｙｍａ ： シアノ（ヒドロキシイミノ）酢酸エチル
Ｏｘｙｍａ－Ｂ ： ５－（ヒドロキシイミノ）－１，３－ジメチルピリミジン－２，４，６（１Ｈ，３Ｈ，５Ｈ）－トリオン
Ｐｄ／Ｃ ： 炭素上パラジウム
Ｐｄ（ＰＰｈ３）４ ： テトラキス（トリフェニルホスフィン）－パラジウム（０）
ＰｈＳｉＨ３ ： フェニルシラン
ＰＳＤ ： 粒度分布
ＰｙＯｘｉｍ ： ［エチルシアノ（ヒドロキシイミノ）アセタト－Ｏ２］トリ－１－ピロリジニルホスホニウムヘキサフルオロホスフェート
ＲＰ－ＨＰＬＣ ： 逆相高速液体クロマトグラフィー
ＲＰ－ＨＰＳＤ ： 逆相高速サンプル置換
ｔＢｕ ： ｔｅｒｔ－ブチル
ｔＢｕＯＨ ： ｔｅｒｔ－ブタノール
ＴＦＡ ： トリフルオロ酢酸
ＴＩＳ ： トリイソプロピルシラン
ＴＯＴＵ ： Ｏ－（エトキシカルボニル）シアノメチレンアミノ－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート
Ｔｒｔ ： トリチル、トリフェニルメチル
ＰＸＲＤ ： 粉末Ｘ線回折
［Ψ（Ｄｍｐ，Ｈ）ｐｒｏ］ ： ジメトキシフェニル－シュードプロリン類
ＡＣＮ ： アセトニトリル
ＡｃＯＨ ： 酢酸
ＤＣＨＡ ： ジシクロヘキシルアミン
ＤＣＭ ： ジクロロメタン
ＤＥＡ ： ジエチルアミン
ＤＩＰＥ ： ジイソプロピルエーテル
ＤＭＦ ： Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド
ＤＳＣ ： 示差走査熱分析
ＥＤＣ・ＨＣｌ ： Ｎ－（３－ジメチルアミノプロピル）－Ｎ’－エチルカルボジイミド塩酸塩
Ｆｍｏｃ ： フルオレニルメトキシカルボニル
ＧＰＣ ： ゲル浸透クロマトグラフィー
ＩＰＡ ： イソプロパノール
ｉＰｒＯＡｃ ： 酢酸イソプロピル
ＩＰＣ ： イオンペアクロマトグラフィー
ＬＯＤ ： 検出限界
ＬＯＱ ： 定量限界
ＬＰＰＳ ： 液相ペプチド合成
ＭＴＢＥ ： メチル－ｔｅｒｔ－ブチルエーテル
ＮＭＭ ： Ｎ－メチルモルホリン
ＮＭＰ ： Ｎ－メチルピロリドン
ＯＡｌｌ ： アリルエステル
ＯｔＢｕ ： ｔｅｒｔ－ブチルエステル
Ｏｘｙｍａ ： シアノ（ヒドロキシイミノ）酢酸エチル
Ｏｘｙｍａ－Ｂ ： ５－（ヒドロキシイミノ）－１，３－ジメチルピリミジン－２，４，６（１Ｈ，３Ｈ，５Ｈ）－トリオン
Ｐｄ／Ｃ ： 炭素上パラジウム
Ｐｄ（ＰＰｈ３）４ ： テトラキス（トリフェニルホスフィン）－パラジウム（０）
ＰｈＳｉＨ３ ： フェニルシラン
ＰＳＤ ： 粒度分布
ＰｙＯｘｉｍ ： ［エチルシアノ（ヒドロキシイミノ）アセタト－Ｏ２］トリ－１－ピロリジニルホスホニウムヘキサフルオロホスフェート
ＲＰ－ＨＰＬＣ ： 逆相高速液体クロマトグラフィー
ＲＰ－ＨＰＳＤ ： 逆相高速サンプル置換
ｔＢｕ ： ｔｅｒｔ－ブチル
ｔＢｕＯＨ ： ｔｅｒｔ－ブタノール
ＴＦＡ ： トリフルオロ酢酸
ＴＩＳ ： トリイソプロピルシラン
ＴＯＴＵ ： Ｏ－（エトキシカルボニル）シアノメチレンアミノ－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート
Ｔｒｔ ： トリチル、トリフェニルメチル
ＰＸＲＤ ： 粉末Ｘ線回折
［Ψ（Ｄｍｐ，Ｈ）ｐｒｏ］ ： ジメトキシフェニル－シュードプロリン類
【0025】
（定義）
特段の定義がない限り、本明細書で使用される全ての用語、表記および他の科学用語は、本開示が関連する当業者によって一般的に理解される意味を有することが意図される。いくつかの場合に、明確化および／または即時参照の目的で、一般的に理解される意味を有する用語を本明細書において定義する。したがって、本明細書がそのような定義を含むことは、当該技術分野において一般的に理解されることとの実質的な相違を表すと解釈されるべきではない。
特段の定義がない限り、本明細書で使用される全ての用語、表記および他の科学用語は、本開示が関連する当業者によって一般的に理解される意味を有することが意図される。いくつかの場合に、明確化および／または即時参照の目的で、一般的に理解される意味を有する用語を本明細書において定義する。したがって、本明細書がそのような定義を含むことは、当該技術分野において一般的に理解されることとの実質的な相違を表すと解釈されるべきではない。
【0026】
本明細書における「約(approximately)」および「約(about)」という用語は、測定において発生する実験誤差の範囲を意味する。
【0027】
本明細書における「高純度」とは、９９．９％以上のクロマトグラフィー純度を有し、ＩＭＤ－リナクロチド不純物およびＣｙｓ－１－α－ケトン－リナクロチド不純物の含有量がそれぞれ１００ｐｐｍ以下、好ましくは５０ｐｐｍ以下、より好ましくは４０ｐｐｍ以下であることを意味する。
【0028】
本明細書における「ＨＰＬＣ純度」または「クロマトグラフィー純度」という用語は、クロマトグラム曲線の下の面積を意味する。
【0029】
本明細書における純度（％）は、クロマトグラフィー純度（クロマトグラフィー面積％）に基づく。
【0030】
用語「含む(comprising)」、「有する(having)」、「含む(including)」および「含有する(containing)」は、オープンエンドの用語（すなわち、「を含むが、それに限定されない」を意味する）として解釈される。これらの用語は、「から実質的になる(consist essentially of)」、「から実質的になる(consisting essentially of)」、「からなる(consist of)」、または「からなる(consisting of)」のような用語に対する支持を提供するものとみなされる。
【0031】
用語「から実質的になる(consist essentially of)」および「から実質的になる(consisting essentially of)」は、半クロースエンドの用語と解釈され、本発明の基本的かつ新規な特性に重大な影響を与える他の成分を含まないことを意味する（任意選択的な賦形剤が含まれる場合もある）。
【0032】
用語「からなる(consist of)」および「からなる(consisting of)」は、クロースエンドの用語と解釈される。
【0033】
（詳細な説明）
本発明の目的は、リナクロチド、好ましくは酢酸塩の形態のリナクロチドを製造するための液相方法であり、当該方法は、以下の工程：
ａ１） 式（ＩＩ）のFmoc-Asn(Trt)-Pro-OHのジペプチドフラグメントＢ［７－８］を、式（ＩＩＩ）のFmoc-Ala-Cys[Ψ(Dmp,H)pro]-Thr(tBu)-Gly-Cys[Ψ(Dmp,H)pro]-Tyr(tBu)-OtBuのヘキサペプチドフラグメントＣ［９－１４］とカップリングさせて、ペプチド［７－１４］を得る工程と；
ａ２） ペプチド［７－１４］を、式（ＩＶ）のFmoc-Cys(Trt)-OHを有する６位のアミノ酸誘導体とカップリングさせて、ペプチド［６－１４］を得る工程と；
ａ３） ペプチド［６－１４］を、式（Ｖ）のFmoc-Cys(SO3Na)-ONaを有する５位のアミノ酸誘導体とカップリングさせて、ペプチド［５－１４］を得る工程と；
ａ４） ペプチド［５－１４］を式（ＶＩ）のFmoc-Cys(SO3Na)-Cys(SO3Na)-Glu(tBu)-Tyr(tBu)-OHのテトラペプチドフラグメントＡ［１－４］とカップリングさせて、式（ＶＩＩ）のFmoc-Cys(SO3Na)-Cys(SO3Na)-Glu(tBu)-Tyr(tBu)-Cys(SO3Na)-Cys(Trt)-Asn(Trt)Pro-Ala-Cys[Ψ(Dmp.H)pro]-Thr(tBu)-Gly-Cys[Ψ(Dmp,H)pro]-Tyr(tBu)-OtBuの鎖状保護ペプチドを得る工程と；
ｂ） 第二級塩基およびトリフルオロ酢酸との反応により、化合物（ＶＩＩ）を脱保護し、式（ＶＩＩＩ）のH-Cys(SO3H)-Cys(SO3H)-Glu-Tyr-Cys(SO3H)-Cys-Asn-Pro-Ala-Cys-Thr-Gly-Cys-Tyr-OHのＴＦＡ塩の中間体を得る工程と；
ｃ） 中間体（ＶＩＩＩ）の非酸化的環化を実施して、粗製リナクロチドを得る工程と；
ｄ） 任意選択的に、粗製リナクロチドを精製して精製リナクロチドを得る工程と；
ｅ） 任意選択的に、精製リナクロチドを酢酸で塩変換して、対応する酢酸塩を形成する工程と
を含む。
本発明の目的は、リナクロチド、好ましくは酢酸塩の形態のリナクロチドを製造するための液相方法であり、当該方法は、以下の工程：
ａ１） 式（ＩＩ）のFmoc-Asn(Trt)-Pro-OHのジペプチドフラグメントＢ［７－８］を、式（ＩＩＩ）のFmoc-Ala-Cys[Ψ(Dmp,H)pro]-Thr(tBu)-Gly-Cys[Ψ(Dmp,H)pro]-Tyr(tBu)-OtBuのヘキサペプチドフラグメントＣ［９－１４］とカップリングさせて、ペプチド［７－１４］を得る工程と；
ａ２） ペプチド［７－１４］を、式（ＩＶ）のFmoc-Cys(Trt)-OHを有する６位のアミノ酸誘導体とカップリングさせて、ペプチド［６－１４］を得る工程と；
ａ３） ペプチド［６－１４］を、式（Ｖ）のFmoc-Cys(SO3Na)-ONaを有する５位のアミノ酸誘導体とカップリングさせて、ペプチド［５－１４］を得る工程と；
ａ４） ペプチド［５－１４］を式（ＶＩ）のFmoc-Cys(SO3Na)-Cys(SO3Na)-Glu(tBu)-Tyr(tBu)-OHのテトラペプチドフラグメントＡ［１－４］とカップリングさせて、式（ＶＩＩ）のFmoc-Cys(SO3Na)-Cys(SO3Na)-Glu(tBu)-Tyr(tBu)-Cys(SO3Na)-Cys(Trt)-Asn(Trt)Pro-Ala-Cys[Ψ(Dmp.H)pro]-Thr(tBu)-Gly-Cys[Ψ(Dmp,H)pro]-Tyr(tBu)-OtBuの鎖状保護ペプチドを得る工程と；
ｂ） 第二級塩基およびトリフルオロ酢酸との反応により、化合物（ＶＩＩ）を脱保護し、式（ＶＩＩＩ）のH-Cys(SO3H)-Cys(SO3H)-Glu-Tyr-Cys(SO3H)-Cys-Asn-Pro-Ala-Cys-Thr-Gly-Cys-Tyr-OHのＴＦＡ塩の中間体を得る工程と；
ｃ） 中間体（ＶＩＩＩ）の非酸化的環化を実施して、粗製リナクロチドを得る工程と；
ｄ） 任意選択的に、粗製リナクロチドを精製して精製リナクロチドを得る工程と；
ｅ） 任意選択的に、精製リナクロチドを酢酸で塩変換して、対応する酢酸塩を形成する工程と
を含む。
【0034】
本発明の方法の好ましい実施形態において、工程ｂ）における第二級塩基は、第二級アミン、好ましくはＤＥＡ、ピペリジン、ピペラジンまたはモルホリンであり、トリフルオロ酢酸は少なくとも８０体積％の水溶液である。
【0035】
本発明の方法の好ましい実施形態において、工程ｃ）は分子内求核置換によって実施される。
【0036】
好ましくは、工程ｃ）はｐＨ７～８の水アルコール緩衝液中で行う。
【0037】
さらに好ましい実施形態において、工程ｃ）において、粗製リナクロチドは水溶液として得られる。
【0038】
本発明の方法の好ましい実施形態において、式（ＩＩ）と式（ＩＩＩ）とのカップリング、および／またはペプチド［７－１４］と式（ＩＶ）とのカップリング、および／またはペプチド［６－１４］と式（Ｖ）との間のカップリング、および／またはペプチド［５－１４］と式（ＶＩ）との間のカップリングは、Ｏｘｙｍａとも呼称されるシアノ（ヒドロキシイミノ）酢酸エチル、または、ＰｙＯｘｉｍまたはＴＯＴＵのようなその誘導体、あるいはＯｘｙｍａ－Ｂのような１，３－ジメチルバルビツール酸誘導体の存在下で実施される。
【0039】
本発明の方法のさらに好ましい実施形態において、式（ＩＩ）と式（ＩＩＩ）とのカップリング、および／またはペプチド［７－１４］と式（ＩＶ）とのカップリング、および／またはペプチド［６－１４］と式（Ｖ）とのカップリング、および／またはペプチド［５－１４］と式（ＶＩ）とのカップリングは、有機極性溶媒中、好ましくはＤＭＦ、ＮＭＰ、ＡＣＮから選択される有機極性溶媒中で実施される。
【0040】
本発明の方法のさらに好ましい実施態様において、式（ＩＩ）と式（ＩＩＩ）とのカップリング、および／またはペプチド［７－１４］と式（ＩＶ）とのカップリング、および／またはペプチド［６－１４］と式（Ｖ）とのカップリング、および／またはペプチド［５－１４］と式（ＶＩ）とのカップリングは、－１０℃～３５℃、好ましくは０℃～２５℃の温度範囲で実施される。
【0041】
好ましい実施形態では、精製工程ｄ）は、逆相高速サンプル置換（ＲＰ－ＨＰＳＤ）、逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ－ＨＰＬＣ）またはそれらの組み合わせによって実施される。
【0042】
精製工程ｄ）の好ましい実施形態において、溶離相は水溶液、極性有機溶媒またはそれらの混合物からなり、好ましくは、極性有機溶媒はトリフルオロ酢酸、酢酸、アセトニトリルおよびそれらの混合物から選択される。任意選択的に、溶離相に対して、緩衝液、より好ましくはリン酸緩衝液が添加される。
【0043】
好ましい実施形態において、精製リナクロチドは溶液中にあり、好ましくは、前記溶液は、水、酢酸およびアセトニトリルを含む。
【0044】
好ましくは、本発明の方法は、９９．９％以上のクロマトグラフィー純度を有する非晶質リナクロチドを得ることを可能にする。
【0045】
本発明の方法は、水アルコール溶液または水性懸濁液から出発する凍結乾燥による単離工程ｆ）をさらに含むことができる。
【0046】
好ましくは、水アルコール溶液は、ｔｅｒｔ－ブタノール、水、酢酸またはそれらの混合物を含有する。
【0047】
好ましくは、水性懸濁液は、精製リナクロチド溶液の蒸発によって得られ、より好ましくは、水性懸濁液は酢酸を含有する。
【0048】
本発明のさらなる目的は、９９．９％以上のクロマトグラフィー純度と、以下の不純物：
－ ＩＭＤ－リナクロチド（不純物１）；
－ Ｃｙｓ－１－α－ケトン（不純物２）。
の量がいずれも１００ｐｐｍ未満、好ましくは５０ｐｐｍ（ＬＯＱ）未満、より好ましくは４０ｐｐｍ（ＬＯＤ）未満である、非晶質リナクロチドまたはその酢酸塩である。
－ ＩＭＤ－リナクロチド（不純物１）；
－ Ｃｙｓ－１－α－ケトン（不純物２）。
の量がいずれも１００ｐｐｍ未満、好ましくは５０ｐｐｍ（ＬＯＱ）未満、より好ましくは４０ｐｐｍ（ＬＯＤ）未満である、非晶質リナクロチドまたはその酢酸塩である。
【0049】
好ましくは、非晶質高純度リナクロチドまたはその酢酸塩は、０．１％面積％以下の多量体含有率を有する。
【0050】
本発明のさらなる目的は、生成物である非晶質高純度リナクロチドまたはその酢酸塩中のＩＭＤ－リナクロチドおよびＣｙｓ－１－α－ケトンの不純物含有量を検出（４０ｐｐｍのＬＯＤ）および定量（５０ｐｐｍのＬＯＤ）する方法である。当該方法は、アルキル鎖を含むシリカ固定相と、水溶液、極性有機溶媒、またはそれらの混合物からなる溶離相を有するイオンペアクロマトグラフィー（ＩＰＣ）カラムを通して生成物を溶離させる工程を含む。任意選択的に、溶離相に対して、緩衝液、好ましくはリン酸緩衝液を添加する。
【0051】
本発明による方法の好ましい実施形態では、前記アルキル鎖は、オクタデシル型（Ｃ１８）、オクチル型（Ｃ８）またはブチル型（Ｃ４）であり、好ましくはＣ１８である。
【0052】
好ましくは、前記極性有機溶媒は、テトラヒドロフラン、ジオキサン、ジクロロメタン、メタノール、エタノール、ｎ－プロパノール、イソプロパノール、ブタノール、ペンタン、ヘキサン、トルエン、トリフルオロ酢酸、アセトニトリル、またはそれらの混合物から選択され；より好ましくは、トリフルオロ酢酸、アセトニトリル、またはそれらの混合物から選択される。
【0053】
さらに好ましい実施形態において、本発明の方法は、以下の操作条件：
固定相：Ｃ１８アルキル鎖を含む担体シリカ粒子；
溶離液Ａ：リン酸緩衝液 ｐＨ６．２
溶離液Ｂ：ＡＣＮ
にしたがって実施され、以下のグラジエント溶離：
％Ｂ： ７－７（２分）；７－１５（１９分）；１５－６０（２５分）
が適用されることを特徴とする
固定相：Ｃ１８アルキル鎖を含む担体シリカ粒子；
溶離液Ａ：リン酸緩衝液 ｐＨ６．２
溶離液Ｂ：ＡＣＮ
にしたがって実施され、以下のグラジエント溶離：
％Ｂ： ７－７（２分）；７－１５（１９分）；１５－６０（２５分）
が適用されることを特徴とする
【0054】
本発明による方法の溶離相は、イオンペア試薬、好ましくはヘプタンスルホン化塩を含む。
【0055】
［１． 粗製リナクロチドの化学合成］
本発明の目的である製造方法において、粗製リナクロチドは第１の主要中間体であり、液相ペプチド合成（ＬＰＰＳ）手順により合成される。当該手順は、
１． 鎖状保護ペプチドを調製する第１段階と、
２． 脱保護を行って鎖状先進中間体を得る第２段階と、
３． ジスルフィド架橋部の形成を伴う環化によって、粗製リナクロチドを得る最終段階と
を含み、以下に報告するスキーム１にしたがう。
本発明の目的である製造方法において、粗製リナクロチドは第１の主要中間体であり、液相ペプチド合成（ＬＰＰＳ）手順により合成される。当該手順は、
１． 鎖状保護ペプチドを調製する第１段階と、
２． 脱保護を行って鎖状先進中間体を得る第２段階と、
３． ジスルフィド架橋部の形成を伴う環化によって、粗製リナクロチドを得る最終段階と
を含み、以下に報告するスキーム１にしたがう。
【0056】
【化4】
【0057】
リナクロチドのようなマルチジスルフィド架橋部を有する複雑なペプチドの合成の重要なポイントの１つは、環化工程を適切な方法で進行させ、所望のジスルフィド配置にしたがって正しい位置異性体を得る条件を設定し、ミスフォールドされた不純物の形成および多量体の形成を避けることである。
【0058】
この目標を達成するために、非酸化的環化法が開発された。当該方法において、３つの求核部位（遊離Ｃｙｓのチオール基）と３つの脱離基（残余のＣｙｓ上のスルホン化基）が関与する、ｐＨ７～８の水アルコール緩衝液中で分子内求核置換を実施する。
【0059】
骨格に沿った３つのスルホン化Ｃｙｓ基の最適な位置を選択する目的で、一連の試行を予備的に実施した。鎖状先進ペプチドの全ての可能な組み合わせを化学的に調製し、環化に供した。
【0060】
所望されるリナクロチド最終生成物のクロマトグラフィー純度および分析における最良の結果は、スルホン化基を１、２、５位のＣｙｓ上に配置した試験で得られた。しかしながら、それ以外の組み合わせでは最悪の結果をもたらし、いくつかの場合には主要ピークのない位置異性体の複雑なクロマトグラフィーパターンを与えることさえあった。
【0061】
したがって、驚くべきことに、分子内求核置換は、１つのジスルフィド架橋部の形成に有利な合成法であるだけでなく、２つ以上のジスルフィド架橋部の形成（たとえば、リナクロチドのような複雑なマルチジスルフィド架橋ペプチドの製造）に特に効率的である。
【0062】
リナクロチドのような複雑なマルチジスルフィド架橋ペプチドの合成におけるもう１つの重要なポイントは、上記のスルホン化Ｃｙｓ（具体的な発明では６位、１０位、１３位）と環化する必要のある残余のＣｙｓ上の保護基の選択である。
【0063】
一連の試験を予備的に実施し、最終的なクロマトグラフィー純度、直交性、副反応、扱いやすさの点に関する最良の結果は、６位のＣｙｓをＴｒｔで官能基化し、１０位および１３位のＣｙｓをＣｙｓ－シュードプロリンで官能基化した場合に得られた。
【0064】
Ｃｙｓ－シュードプロリンは、カップリング活性化の際にラセミ化しにくい５員環のチオケタリック(tiochetalic)なヒンダード環を有する、システインのマスク形態を表す。骨格に沿ってこの部分を導入することは、成長中のペプチドに対してより高い溶解性を保証するだけでなく、凝集効果も減少し、ワークアップの改善につながるという利点もある。
【0065】
Ｃｙｓのチオール基をシュードプロリンとして保護することは最近の発見である。現在入手可能な文献はＳＰＰＳ用途に関するもののみであり、ペプチド合成における相対的な用途は、依然として先駆的なものである。
【0066】
この理由により、合成の対象がリナクロチドのようなマルチジスルフィド架橋部を持つ複雑なＣｙｓ豊富なペプチドであることも考慮すると、ここに記載したようなＬＰＰＳ製造方法におけるＣｙｓ－シュードプロリンの使用は、革新的な応用といえる。
【0067】
鎖状保護ペプチドに沿ったスルホン化基の位置と、ならびに残余のＣｙｓの保護基の種類および位置（環化工程の前に脱保護する必要がある）を画定した後に、液相ペプチド合成（ＬＰＰＳ）の全体を設計した。
【0068】
鎖状保護ペプチドを調製するための予備合成段階として、以下の３つのフラグメントを合成しなければならない：
・ フラグメントＡ（ＶＩ）：１位および２位のＣｙｓをスルホン化ナトリウム塩として誘導体化している、１位→４位のアミノ酸を含有するテトラペプチド。
Fmoc-Cys(SO3Na)-Cys(SO3Na)-Glu(tBu)-Tyr(tBu)-OH （ＶＩ）
・ フラグメントＢ（ＩＩ）：７→８位のアミノ酸を含有するジペプチド。
Fmoc-Asn(Trt)-Pro-OH （ＩＩ）
・ フラグメントＣ（ＩＩＩ）：１０位および１３位のＣｙｓをＣｙｓ－シュードプロリン（符号Cys[Ψ(Dmp,H)pro]）として保護している、９→１４位のアミノ酸を含むヘキサペプチド。
Fmoc-Ala-Cys[Ψ(Dmp,H)pro]-Thr(tBu)-Gly-Cys[Ψ(Dmp,H)pro]-Tyr(tBu)-OtBu （ＩＩＩ）
３種のフラグメントのそれぞれは、９０％以下のＨＰＬＣ純度を特徴とする。
・ フラグメントＡ（ＶＩ）：１位および２位のＣｙｓをスルホン化ナトリウム塩として誘導体化している、１位→４位のアミノ酸を含有するテトラペプチド。
Fmoc-Cys(SO3Na)-Cys(SO3Na)-Glu(tBu)-Tyr(tBu)-OH （ＶＩ）
・ フラグメントＢ（ＩＩ）：７→８位のアミノ酸を含有するジペプチド。
Fmoc-Asn(Trt)-Pro-OH （ＩＩ）
・ フラグメントＣ（ＩＩＩ）：１０位および１３位のＣｙｓをＣｙｓ－シュードプロリン（符号Cys[Ψ(Dmp,H)pro]）として保護している、９→１４位のアミノ酸を含むヘキサペプチド。
Fmoc-Ala-Cys[Ψ(Dmp,H)pro]-Thr(tBu)-Gly-Cys[Ψ(Dmp,H)pro]-Tyr(tBu)-OtBu （ＩＩＩ）
３種のフラグメントのそれぞれは、９０％以下のＨＰＬＣ純度を特徴とする。
【0069】
鎖状保護ペプチドの調製の引き続く工程のために、フラグメントＡ（ＶＩ）、フラグメントＢ（ＩＩ）、フラグメントＣ（ＩＩＩ）、および６位の２つのアミノ酸誘導体Fmoc-Cys(Trt)-OH（ＩＶ）および５位の２つのアミノ酸誘導体Fmoc-Cys(SO3Na)-ONa（Ｖ）の収束的連結を行い、以下の１４アミノ酸含有(14-mer)鎖状保護ペプチド（ＶＩＩ）を得る。
Fmoc-Cys(SO3Na)-Cys(SO3Na)-Glu(tBu)-Tyr(tBu)-Cys(SO3Na)-Cys(Trt)-Asn(Trt)-Pro-Ala-Cys[Ψ(Dmp,H)pro]-Thr(tBu)-Gly-Cys[Ψ(Dmp,H)pro]-Tyr(tBu)-OtBu （ＶＩＩ）
Fmoc-Cys(SO3Na)-Cys(SO3Na)-Glu(tBu)-Tyr(tBu)-Cys(SO3Na)-Cys(Trt)-Asn(Trt)-Pro-Ala-Cys[Ψ(Dmp,H)pro]-Thr(tBu)-Gly-Cys[Ψ(Dmp,H)pro]-Tyr(tBu)-OtBu （ＶＩＩ）
【0070】
フラグメントＡ（ＶＩ）、フラグメントＢ（ＩＩ）、フラグメントＣ（ＩＩＩ）、および６位のFmoc-Cys(Trt)-OH（ＩＶ）と５位のFmoc-Cys(SO3Na)-ONa（Ｖ）の２つのアミノ酸誘導体を連結して鎖状保護ペプチドを得るために、以下のスキーム２に報告されている簡単で工業的に適用可能であり、かつ堅牢な合成プロトコルを反復する。
【0071】
【化5】
【0072】
鎖状保護ペプチドは、ＨＰＬＣ純度が６５％以上であることを特徴とする。
【0073】
鎖状先進中間体の調製の引き続く工程において、保護基の除去を２つの別個の工程
・ 第二級塩基によって媒介されるＦｍｏｃ除去、および
・ 少なくとも８０体積％のＴＦＡ水溶液によって媒介される、酸に不安定な保護基（ｔＢｕエステル、Ｔｒｔ、シュードプロリンなど）の除去
で実施し、その結果、最終的に鎖状先進中間体（ＶＩＩＩ）：
H-Cys(SO3H)-Cys(SO3H)-Glu-Tyr-Cys(SO3H)-Cys-Asn-Pro-Ala-Cys-Thr-Gly-Cys-Tyr-OHのＴＦＡ塩 （ＶＩＩＩ）
を得る。鎖状先進中間体のＨＰＬＣ純度は少なくとも５５％である。
・ 第二級塩基によって媒介されるＦｍｏｃ除去、および
・ 少なくとも８０体積％のＴＦＡ水溶液によって媒介される、酸に不安定な保護基（ｔＢｕエステル、Ｔｒｔ、シュードプロリンなど）の除去
で実施し、その結果、最終的に鎖状先進中間体（ＶＩＩＩ）：
H-Cys(SO3H)-Cys(SO3H)-Glu-Tyr-Cys(SO3H)-Cys-Asn-Pro-Ala-Cys-Thr-Gly-Cys-Tyr-OHのＴＦＡ塩 （ＶＩＩＩ）
を得る。鎖状先進中間体のＨＰＬＣ純度は少なくとも５５％である。
【0074】
溶液中の粗製リナクロチドを製造する最終工程において、鎖状先進中間体の環化を、以下の特徴を有する製造方法により実施する。
ａ． ６位、１０位および１３位のＣｙｓの遊離チオール基が求核部位の役割を果たし、１位、２位および５位のＣｙｓのスルホン化基が脱離基となる、分子内求核置換に基づく方法によってフォールディングを実施する、非酸化的方法。
ｂ． 得られる位置異性体の数が統計的に可能な組みあわせより小さい、半位置選択的方法であって、その目標は、既存の半位置選択的方法に記載されている逐次的な環化反応と相違し、より有利である独特のステップ反応によって達成され、粗製リナクロチドの溶液を得ることを可能にする、半位置選択的方法。
ａ． ６位、１０位および１３位のＣｙｓの遊離チオール基が求核部位の役割を果たし、１位、２位および５位のＣｙｓのスルホン化基が脱離基となる、分子内求核置換に基づく方法によってフォールディングを実施する、非酸化的方法。
ｂ． 得られる位置異性体の数が統計的に可能な組みあわせより小さい、半位置選択的方法であって、その目標は、既存の半位置選択的方法に記載されている逐次的な環化反応と相違し、より有利である独特のステップ反応によって達成され、粗製リナクロチドの溶液を得ることを可能にする、半位置選択的方法。
【0075】
【化6】
【0076】
溶液中の粗製リナクロチドは、通常４５～５５％のＨＰＬＣ純度で得られるが、これは特に驚くべきこと、かつ有利なことである。なぜなら、中間精製を行うことなくこの純度に達し、既存の方法と比較して時間の節約、コストの削減、および生産性の向上が可能になるからである。
【0077】
［２． 高純度リナクロチドの精製と単離］
粗製リナクロチドはさらに２つの精製技術を組み合わせて処理される。それら技術は、逆相高速サンプル置換法（ＲＰ－ＨＰＳＤ）および逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ－ＨＰＬＣ）である。最終的に、スキーム３で報告されているフローチャートにしたがって、精製リナクロチド溶液（ＡｃＯＨを含むＡＣＮ－水溶液）から開始される２つの別個の製造オプションのいずれかを適用して単離する：
（製造オプション１）
溶媒をＡＣＮからｔ－ＢｕＯＨに置換して、ｔ－ＢｕＯＨ－水（ＡｃＯＨ含有）溶液から凍結乾燥を行う。
（製造オプション２）
水性（ＡｃＯＨ含有）懸濁液から濃縮および凍結乾燥を行う。
粗製リナクロチドはさらに２つの精製技術を組み合わせて処理される。それら技術は、逆相高速サンプル置換法（ＲＰ－ＨＰＳＤ）および逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ－ＨＰＬＣ）である。最終的に、スキーム３で報告されているフローチャートにしたがって、精製リナクロチド溶液（ＡｃＯＨを含むＡＣＮ－水溶液）から開始される２つの別個の製造オプションのいずれかを適用して単離する：
（製造オプション１）
溶媒をＡＣＮからｔ－ＢｕＯＨに置換して、ｔ－ＢｕＯＨ－水（ＡｃＯＨ含有）溶液から凍結乾燥を行う。
（製造オプション２）
水性（ＡｃＯＨ含有）懸濁液から濃縮および凍結乾燥を行う。
【0078】
【化7】
【0079】
詳細に関して、クロマトグラフィー精製の工程は、２種の別個の技術の組み合わせ（ＲＰ－ＨＰＳＤ＋ＲＰ－ＨＰＬＣ）の粗製リナクロチド溶液への適用により実施される。
【0080】
ＲＰ－ＨＰＳＤ法は、サンプル分子がカラムに結合し、固定相との親和性に応じて互いに分離するというコンセプトに基づいている。この技術は、カラムへのサンプル電荷の過負荷を予見し、低パーセンテージの有機溶媒を有する穏やかな勾配のグラジエントにより、リナクロチドとその不純物の分離を保証する。
【0081】
全体的なクロマトグラフィー精製プロセスは、以下に報告するスキーム４で表すことができる。
【0082】
【化8】
【0083】
精製工程終了後、粗製リナクロチド溶液（約４５～５５％のＨＰＬＣ純度）から、最低９９．９％のクロマトグラフィー純度を有する精製リナクロチド溶液が得られる。ＩＭＤ－リナクロチドおよびＣｙｓ－１－α－ケトン－リナクロチドの不純物の残存量は１００ｐｐｍを越えず、それぞれの値は典型的には５０ｐｐｍ（ＬＯＱ）未満、より典型的には４０ｐｐｍ（ＬＯＤ）未満である。
【0084】
精製リナクロチド溶液が得られたならば、以下の択一的な製造オプションの一方を適用して、最終的な非晶質高純度リナクロチドを単離することができる。
【0085】
（製造オプション１）
精製リナクロチド溶液をＲＰカラムに充填し、第１相（水－ＡｃＯＨ １００ｍＭ）および第２相（ｔ－ＢｕＯＨ）の１：１混合物の相を用いてカラムから溶離させ、ＡＣＮからｔＢｕＯＨへの交換を行う。次いで、ｔ－ＢｕＯＨ－水（ＡｃＯＨ含有）溶液を凍結乾燥し、非晶質の高純度リナクロチド粉末を得る。
精製リナクロチド溶液をＲＰカラムに充填し、第１相（水－ＡｃＯＨ １００ｍＭ）および第２相（ｔ－ＢｕＯＨ）の１：１混合物の相を用いてカラムから溶離させ、ＡＣＮからｔＢｕＯＨへの交換を行う。次いで、ｔ－ＢｕＯＨ－水（ＡｃＯＨ含有）溶液を凍結乾燥し、非晶質の高純度リナクロチド粉末を得る。
【0086】
（製造オプション２）
精製リナクロチド溶液を真空下で濃縮し、ＡＣＮを除去する。次いで、得られた水性（ＡｃＯＨ）懸濁液をトレイに移し、凍結乾燥して非晶質の高純度リナクロチド粉末を得る。
精製リナクロチド溶液を真空下で濃縮し、ＡＣＮを除去する。次いで、得られた水性（ＡｃＯＨ）懸濁液をトレイに移し、凍結乾燥して非晶質の高純度リナクロチド粉末を得る。
【0087】
［３． ＡＰＩ特性評価］
非晶質高純度リナクロチドの特徴は以下の通りである：
非晶質高純度リナクロチドの特徴は以下の通りである：
【0088】
（Ａ． イオンペアクロマトグラフィー（ＩＰＣ）による、純度、分析およびＩＭＤ－リナクロチドおよびＣｙｓ－１－α－ケトン－リナクロチドの不純物の評価）
この分析法は、イオンペアクロマトグラフィー（ＩＰＣ）の原理に基づく。この技術は、分析対象物に対して反対の電荷を持つ親油性イオンからなる特定の修飾剤を含む移動相を用いて、イオン性分析対象物の分離を可能にする。移動相の親油性イオンは分析物と相互作用し、イオン電荷をバランスさせる。
この分析法は、イオンペアクロマトグラフィー（ＩＰＣ）の原理に基づく。この技術は、分析対象物に対して反対の電荷を持つ親油性イオンからなる特定の修飾剤を含む移動相を用いて、イオン性分析対象物の分離を可能にする。移動相の親油性イオンは分析物と相互作用し、イオン電荷をバランスさせる。
【0089】
分析変数の最適化は、イオン性種／イオン化可能種と中性分析物の両方を含む複雑なサンプル混合物の分離も可能にする。
【0090】
（分析法の説明）
カラム：Ｇｅｍｉｎｉ－ＮＸ、５μｍ、４．６×２５０ｍｍ
溶離液Ａ：２０ｍＭ （ＮＨ４）３ＰＯ４緩衝液（ｐＨ６．２）＋
５ｍＭ １－ヘプタンスルホン酸ナトリウム一水和物（イオンペア試薬）
溶離液Ｂ：ＡＣＮ
グラジエント％Ｂ：７－７（２分）；７－１５（１９分）；１５－６０（２５分）
流速：１．０ ｍｌ／分、Ｔ：３０℃、ＵＶ：２２０ｎｍ
ＩＭＤ－リナクロチド： ＲＲＴ ０．８４－０．８５
Ｃｙｓ－１－α－ケトン－リナクロチド ＲＲＴ ０．９１－０．９２
検出限界（ＬＯＤ）：４０ ｐｐｍ
定量限界（ＬＯＱ）：５０ ｐｐｍ
カラム：Ｇｅｍｉｎｉ－ＮＸ、５μｍ、４．６×２５０ｍｍ
溶離液Ａ：２０ｍＭ （ＮＨ４）３ＰＯ４緩衝液（ｐＨ６．２）＋
５ｍＭ １－ヘプタンスルホン酸ナトリウム一水和物（イオンペア試薬）
溶離液Ｂ：ＡＣＮ
グラジエント％Ｂ：７－７（２分）；７－１５（１９分）；１５－６０（２５分）
流速：１．０ ｍｌ／分、Ｔ：３０℃、ＵＶ：２２０ｎｍ
ＩＭＤ－リナクロチド： ＲＲＴ ０．８４－０．８５
Ｃｙｓ－１－α－ケトン－リナクロチド ＲＲＴ ０．９１－０．９２
検出限界（ＬＯＤ）：４０ ｐｐｍ
定量限界（ＬＯＱ）：５０ ｐｐｍ
【0091】
（Ｂ． 多量体の含有量）
ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）による。
ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）による。
【0092】
（分析法の説明）
カラム：ＴＳＫ Ｇｅｌ Ｇ２０００ＳＷＸＬ、５μｍ、７．８×３００ｍｍ
溶離液：７０％ ＡＣＮ ＋ ０．０２％ ＴＦＡ
グラジエント：イソクラティック（４０分）
流速：０．６ｍｌ／分、Ｔ：３０℃、ＵＶ：２１５ｎｍ
多量体（ピークの和） ＲＲＴ ≦０．８１－０．８２
カラム：ＴＳＫ Ｇｅｌ Ｇ２０００ＳＷＸＬ、５μｍ、７．８×３００ｍｍ
溶離液：７０％ ＡＣＮ ＋ ０．０２％ ＴＦＡ
グラジエント：イソクラティック（４０分）
流速：０．６ｍｌ／分、Ｔ：３０℃、ＵＶ：２１５ｎｍ
多量体（ピークの和） ＲＲＴ ≦０．８１－０．８２
【0093】
（Ｃ． 物理的形状）
非晶質高純度リナクロチドの物理的形状を、以下の分析：
・ 結晶構造の評価のためのＰＸＲＤ（粉末Ｘ線回折）、
・ 可能性がある結晶性汚染物質の存在に関連する吸熱／発熱現象を評価するためのＤＳＣ（示差走査熱分析）、
によって評価する。
非晶質高純度リナクロチドの物理的形状を、以下の分析：
・ 結晶構造の評価のためのＰＸＲＤ（粉末Ｘ線回折）、
・ 可能性がある結晶性汚染物質の存在に関連する吸熱／発熱現象を評価するためのＤＳＣ（示差走査熱分析）、
によって評価する。
【0094】
以下の実施例は、本発明をさらに説明するためのものであるが、本発明を限定するものではない。
【実施例】
【0095】
（実施例１）
フラグメントＡ ［１－５］の合成
Fmoc-Cys(SO3Na)-Cys(SO3Na)-Glu(tBu)-Tyr(tBu)-OH
［分子量１０５５．１４、二ナトリウム塩］。
フラグメントＡ ［１－５］の合成
Fmoc-Cys(SO3Na)-Cys(SO3Na)-Glu(tBu)-Tyr(tBu)-OH
［分子量１０５５．１４、二ナトリウム塩］。
【0096】
(工程Ｉ） H-Glu(tBu)-Tyr(tBu)-OAllのＴＦＡ塩の合成
１２４０グラムのTrt-Glu(tBu)-OHのＤＣＨＡ塩を８．７ＬのｉＰｒＯＡｃに溶解させ、有機溶液をＫＨＳＯ４の水溶液で洗浄し、次いで濃縮し、残渣をＮＭＰ（５．６Ｌ）に溶解させた。H-Tyr(tBu)-OAllの塩酸塩（５９０グラム）を加え、ＰｙＯｘｉｍ／ＮＭＭ系でカップリング反応を行った。
１２４０グラムのTrt-Glu(tBu)-OHのＤＣＨＡ塩を８．７ＬのｉＰｒＯＡｃに溶解させ、有機溶液をＫＨＳＯ４の水溶液で洗浄し、次いで濃縮し、残渣をＮＭＰ（５．６Ｌ）に溶解させた。H-Tyr(tBu)-OAllの塩酸塩（５９０グラム）を加え、ＰｙＯｘｉｍ／ＮＭＭ系でカップリング反応を行った。
【0097】
反応混合物をｉＰｒＯＡｃで希釈し、ペプチド豊富な有機溶液をＮａＨＣＯ３水溶液およびＮａＣｌ水溶液で洗浄し、次いで濃縮し、残渣をＤＣＭ（６．１Ｌ）に溶解させた。ＴＦＡ－ＴＩＳ混合物を用いて、酸性脱保護を行った。反応液を濃縮し、ｎ－ヘプタン－ＤＩＰＥ混合溶液で沈殿させ、濾取、洗浄、乾燥させた。
【0098】
９９．８％のＨＰＬＣ純度および８９％の収率で、H-Glu(tBu)-Tyr(tBu)-OAllのＴＦＡ塩を得た。
【0099】
(工程ＩＩ） Fmoc-Cys(SO3Na)-Cys(SO3Na)-Glu(tBu)-Tyr(tBu)-OHの合成
９５２グラムのH-Glu(tBu)-Tyr(tBu)-OAllのＴＦＡ塩および８１０グラムのFmoc-Cys(SO3Na)-ONaを４．８ＬのＤＭＦに溶解させ、ＰｙＯｘｉｍ／２，４，６－コリジン系でカップリング反応を行った。
９５２グラムのH-Glu(tBu)-Tyr(tBu)-OAllのＴＦＡ塩および８１０グラムのFmoc-Cys(SO3Na)-ONaを４．８ＬのＤＭＦに溶解させ、ＰｙＯｘｉｍ／２，４，６－コリジン系でカップリング反応を行った。
【0100】
反応混合物をｉＰｒＯＡｃで希釈し、ペプチド豊富な有機溶液をＫＨＳＯ４水溶液、ＮａＨＣＯ３水溶液、およびＮａＣｌ水溶液で洗浄し、次いで濃縮し、残渣をｉＰｒＯＡｃに溶解させた。ＤＥＡを用いて塩基性脱保護を行った。
【0101】
反応混合物をｉＰｒＯＡｃで希釈し、ペプチド豊富な有機溶液をＮａＨＣＯ３水溶液、ＫＨＳＯ４水溶液、およびＮａＣｌ水溶液で洗浄した後、濃縮し、残渣をＤＭＦ（７．９Ｌ）に溶解させた。
【0102】
Fmoc-Cys(SO3Na)-ONa（６９５グラム）を加え、ＰｙＯｘｉｍ／２，４，６－コリジン系でカップリング反応を行った。反応混合物をＤＣＭで希釈し、ペプチド豊富な有機溶液をＫＨＳＯ４水溶液、ＮａＨＣＯ３水溶液、およびＮａＣｌ水溶液で洗浄し、次いで濃縮し、残渣をＤＣＭ（１９．７Ｌ）に溶解した。
【0103】
ＰｈＳｉＨ３およびＰｄ（ＰＰｈ３）４を用いて、アリルエステル除去を行った。ＮａＣｌ水溶液の添加により反応混合物の反応を停止し、２相を分離し、有機相にＮａＨＣＯ３水溶液を添加した。ＤＣＭのさらなる添加により、水相からペプチドを抽出した。有機相を濃縮し、ＭＴＢＥを加えて沈殿させ、濾取、洗浄、乾燥させた。
【0104】
９４．３％のＨＰＬＣ純度および６５％の収率で、Fmoc-Cys(SO3Na)-Cys(SO3Na)-Glu(tBu)-Tyr(tBu)-OHを得た。
【0105】
（実施例２）
フラグメントＢ ［７－８］の合成
Fmoc-Asn(Trt)-Pro-OH
［分子量６９３．８０］。
フラグメントＢ ［７－８］の合成
Fmoc-Asn(Trt)-Pro-OH
［分子量６９３．８０］。
【0106】
１７７グラムのH-Pro-OBzl塩酸塩を１．８ＬのＤＭＦに懸濁させた。Fmoc-Asn(Trt)-OH（３５０グラム）を加え、ＰｙＯｘｉｍ／２，４，６－コリジン系でカップリング反応を行った。反応混合物にＮａＨＣＯ３水溶液を加えて沈殿させ、濾取、洗浄、乾燥した。
【0107】
反応溶媒としてＩＰＡ（１７．０Ｌ）および水（１．０Ｌ）を用い、５％Ｐｄ／Ｃ（５０％湿潤）（１２０ｇ）を触媒として、乾燥した生成物を水素化して、ベンジルエステル保護を除去した。反応を３時間５０分以上にわたってＨ２下に維持した。懸濁液を濾過し、触媒ケーキをＩＰＡ－水の混合液で洗浄し、回収した溶液をＫＨＳＯ４水溶液に投入して沈殿させた。懸濁液を濾取、洗浄、乾燥した。
【0108】
９７．０％のＨＰＬＣ純度および７９％の収率で、Fmoc-Asn(Trt)-OHを得た。
【0109】
（実施例３）
フラグメントＣ ［９－１４］の合成
Fmoc-Ala-Cys[Ψ(Dmp,H)pro]-Thr(tBu)- Gly-Cys[Ψ(Dmp,H)pro]-Tyr(tBu)-OtBu
［分子量１３０３．６０］。
フラグメントＣ ［９－１４］の合成
Fmoc-Ala-Cys[Ψ(Dmp,H)pro]-Thr(tBu)- Gly-Cys[Ψ(Dmp,H)pro]-Tyr(tBu)-OtBu
［分子量１３０３．６０］。
【0110】
（工程Ｉ） Fmoc-Gly-Cys[Ψ(Dmp,H)pro]-Tyr(tBu)-OtBuの合成
９５０グラムのFmoc-Gly-Cys[Ψ(Dmp,H)pro]-OHおよび５８２グラムのH-Tyr(tBu)-OtBu塩酸塩を４．８ＬのＮＭＰに溶解させ、ＴＯＴＵ／ＮＭＭ系でカップリング反応を行った。反応混合物をＫＨＳＯ４の水溶液で沈殿させ、濾取、洗浄、乾燥した。
９５０グラムのFmoc-Gly-Cys[Ψ(Dmp,H)pro]-OHおよび５８２グラムのH-Tyr(tBu)-OtBu塩酸塩を４．８ＬのＮＭＰに溶解させ、ＴＯＴＵ／ＮＭＭ系でカップリング反応を行った。反応混合物をＫＨＳＯ４の水溶液で沈殿させ、濾取、洗浄、乾燥した。
【0111】
９８．８％の純度ＨＰＬＣおよび９０％の工程収率で、Fmoc-Gly-Cys[Ψ(Dmp,H)pro]-Tyr(tBu)-OtBuを得た。
【0112】
（工程ＩＩ） H-Gly-Cys[Ψ(Dmp,H)pro]-Tyr(tBu)-OtBuの合成
１２７７グラムのFmoc-Gly-Cys[Ψ(Dmp,H)pro]-Tyr(tBu)-OtBuを５．７ＬのＡＣＮに溶解させた。ＤＥＡを用いて塩基性脱保護を行った。
１２７７グラムのFmoc-Gly-Cys[Ψ(Dmp,H)pro]-Tyr(tBu)-OtBuを５．７ＬのＡＣＮに溶解させた。ＤＥＡを用いて塩基性脱保護を行った。
【0113】
反応混合物をｉＰｒＯＡｃで希釈し、ペプチド豊富な有機溶液をＫＨＳＯ４水溶液およびＮａＣｌ水溶液で洗浄した後、濃縮し、残渣をｉＰｒＯＡｃに溶解させた。ｎ－ヘプタンを加えて溶液を沈殿させ、濾取、洗浄、乾燥した。
【0114】
９５．１％のＨＰＬＣ純度および９３％の収率で、H-Gly-Cys[Ψ(Dmp,H)pro]-Tyr(tBu)-OtBuを得た。
【0115】
（工程ＩＩＩ） Fmoc-Thr(tBu)-Gly-Cys[Ψ(Dmp,H)pro]-Tyr(tBu)-OtBuの合成
８６５ｇのH-Gly-Cys[Ψ(Dmp,H)pro]-OHおよび５７２ｇのFmoc-Thr(tBu)-OHを４．３ＬのＮＭＰに溶解させ、ＰｙＯｘｉｍ／ＮＭＭ系でカップリング反応を行った。反応混合物をＩＰＡで希釈し、ＮａＨＣＯ３水溶液を加えて沈殿させ、濾取、洗浄、乾燥した。
８６５ｇのH-Gly-Cys[Ψ(Dmp,H)pro]-OHおよび５７２ｇのFmoc-Thr(tBu)-OHを４．３ＬのＮＭＰに溶解させ、ＰｙＯｘｉｍ／ＮＭＭ系でカップリング反応を行った。反応混合物をＩＰＡで希釈し、ＮａＨＣＯ３水溶液を加えて沈殿させ、濾取、洗浄、乾燥した。
【0116】
９３．９％のＨＰＬＣ純度および８７％の収率で、Fmoc-Thr(tBu)-Gly-Cys[Ψ(Dmp,H)pro]-Tyr(tBu)-OtBuを得た。
【0117】
（工程ＩＶ） Fmoc-Ala-Cys[Ψ(Dmp,H)pro]-Thr(tBu)-Gly-Cys[Ψ(Dmp,H)pro]-Tyr(tBu)-OtBuの合成
１２２４グラムのFmoc-Thr(tBu)-Gly-Cys[Ψ(Dmp,H)pro]-Tyr(tBu)-OtBuを６．１ＬのｉＰｒＯＡｃに溶解させた。ＤＥＡを用いて塩基性脱保護を行った。
１２２４グラムのFmoc-Thr(tBu)-Gly-Cys[Ψ(Dmp,H)pro]-Tyr(tBu)-OtBuを６．１ＬのｉＰｒＯＡｃに溶解させた。ＤＥＡを用いて塩基性脱保護を行った。
【0118】
反応混合物をｉＰｒＯＡｃで希釈し、ペプチド豊富な有機溶液をＫＨＳＯ４水溶液およびＮａＣｌ水溶液で洗浄した後、濃縮し、残渣をＮＭＰ（６．１Ｌ）に溶解させた。
【0119】
Fmoc-Ala-Cys[Ψ(Dmp,H)pro]-OH（６８８グラム）を加え、ＴＯＴＵ／ＮＭＭシステムによりカップリング反応を行った。反応混合物をＩＰＡで希釈し、ＮａＨＣＯ３水溶液で沈殿させ、濾取および洗浄した。その後、生成物を乾燥させた。
【0120】
９１．９％の純度ＨＰＬＣおよび９３％の収率で、Fmoc-Ala-Cys[Ψ(Dmp,H)pro]-Thr(tBu)-Gly-Cys[Ψ(Dmp,H)pro]-Tyr(tBu)-OtBuを得た。
【0121】
（実施例４）
鎖状保護リナクロチドの合成
Fmoc-Cys(SO3Na)-Cys(SO3Na)-Glu(tBu)-Tyr(tBu)-Cys(SO3Na)-Cys(Trt)-Asn(Trt)-Pro-Ala-Cys[Ψ(Dmp,H)pro]-Thr(tBu)-Gly-Cys[Ψ(Dmp,H)pro]-Tyr(tBu)-OtBu
［分子量３１２２．６８］。
鎖状保護リナクロチドの合成
Fmoc-Cys(SO3Na)-Cys(SO3Na)-Glu(tBu)-Tyr(tBu)-Cys(SO3Na)-Cys(Trt)-Asn(Trt)-Pro-Ala-Cys[Ψ(Dmp,H)pro]-Thr(tBu)-Gly-Cys[Ψ(Dmp,H)pro]-Tyr(tBu)-OtBu
［分子量３１２２．６８］。
【0122】
（工程Ｉ） H-Ala-Cys[Ψ(Dmp,H)pro]-Thr(tBu)-Gly-Cys[Ψ(Dmp,H)pro]-Tyr(tBu)-OtBuの合成
１４７６ｇのフラグメントＣを６．６ＬのＡＣＮに溶解させた。ＤＥＡを用いて塩基性脱保護を行った。反応混合物をｉＰｒＯＡｃで希釈し、ペプチド豊富な有機溶液をＫＨＳＯ４水溶液およびＮａＣｌ水溶液で洗浄した後、濃縮し、残渣をｉＰｒＯＡｃに溶解した。ＤＩＰＥを加えて溶液を沈殿させ、ろ過、洗浄、乾燥した。
１４７６ｇのフラグメントＣを６．６ＬのＡＣＮに溶解させた。ＤＥＡを用いて塩基性脱保護を行った。反応混合物をｉＰｒＯＡｃで希釈し、ペプチド豊富な有機溶液をＫＨＳＯ４水溶液およびＮａＣｌ水溶液で洗浄した後、濃縮し、残渣をｉＰｒＯＡｃに溶解した。ＤＩＰＥを加えて溶液を沈殿させ、ろ過、洗浄、乾燥した。
【0123】
９０．３％のＨＰＬＣ純度および９１％の収率で、H-Ala-Cys[Ψ(Dmp,H)pro]-Thr(tBu)-Gly-Cys[Ψ(Dmp,H)pro]-Tyr(tBu)-OtBuを得た。
【0124】
（工程ＩＩ） Fmoc-Asn(Trt)-Pro-Ala-Cys[Ψ(Dmp,H)pro]-Thr(tBu)-Gly-Cys[Ψ(Dmp,H)pro]-Tyr(tBu)-OtBuの合成
１０８７グラムのH-Ala-Cys[Ψ(Dmp,H)pro]-Thr(tBu)-Gly-Cys[Ψ(Dmp,H)pro]-Tyr(tBu)-OtBuおよび６９８グラムのフラグメントＢを５．４ＬのＡＣＮに溶解させ、Ｏｘｙｍａ－ＥＤＣ・ＨＣｌ／ＮＭＭシステムでカップリング反応を行った。反応混合物にＮａＨＣＯ３水溶液を加えて沈殿させ、濾取、洗浄、乾燥した。
１０８７グラムのH-Ala-Cys[Ψ(Dmp,H)pro]-Thr(tBu)-Gly-Cys[Ψ(Dmp,H)pro]-Tyr(tBu)-OtBuおよび６９８グラムのフラグメントＢを５．４ＬのＡＣＮに溶解させ、Ｏｘｙｍａ－ＥＤＣ・ＨＣｌ／ＮＭＭシステムでカップリング反応を行った。反応混合物にＮａＨＣＯ３水溶液を加えて沈殿させ、濾取、洗浄、乾燥した。
【0125】
８７．３％のＨＰＬＣ純度および９８％の収率で、Fmoc-Asn(Trt)-Pro-Ala-Cys[Ψ(Dmp,H)pro]-Thr(tBu)-Gly-Cys[Ψ(Dmp,H)pro]-Tyr(tBu)-OtBuを得た。
【0126】
（工程ＩＩＩ） H-Asn(Trt)-Pro-Ala-Cys[Ψ(Dmp,H)pro]-Thr(tBu)-Gly-Cys[Ψ(Dmp,H)pro]-Tyr(tBu)-OtBuの合成
１７２７グラムのFmoc-Asn(Trt)-Pro-Ala-Cys[Ψ(Dmp,H)pro]-Thr(tBu)-Gly-Cys[Ψ(Dmp,H)pro]-Tyr(tBu)-OtBuを８．６ＬのｉＰｒＯＡｃに溶解させた。ＤＥＡを用いて塩基性脱保護を行った。
１７２７グラムのFmoc-Asn(Trt)-Pro-Ala-Cys[Ψ(Dmp,H)pro]-Thr(tBu)-Gly-Cys[Ψ(Dmp,H)pro]-Tyr(tBu)-OtBuを８．６ＬのｉＰｒＯＡｃに溶解させた。ＤＥＡを用いて塩基性脱保護を行った。
【0127】
反応混合物をｉＰｒＯＡｃで希釈し、ペプチド豊富な有機溶液をＫＨＳＯ４水溶液およびＮａＣｌ水溶液で洗浄した後、濃縮し、残渣をｉＰｒＯＡｃに溶解した。ＤＩＰＥを加えて溶液を沈殿させ、濾取および洗浄した。その後、生成物を乾燥させた。
【0128】
８９．０％のＨＰＬＣ純度および８９％の収率で、H-Asn(Trt)-Pro-Ala-Cys[Ψ(Dmp,H)pro]-Thr(tBu)-Gly-Cys[Ψ(Dmp,H)pro]-Tyr(tBu)-OtBuを得た。
【0129】
（工程ＩＶ） Fmoc-Cys(Trt)-Asn(Trt)-Pro-Ala-Cys[Ψ(Dmp,H)pro]-Thr(tBu)-Gly-Cys[Ψ(Dmp,H)pro]-Tyr(tBu)-OtBuの合成
１３３９ｇのH-Asn(Trt)-Pro-Ala-Cys[Ψ(Dmp,H)pro]-Thr(tBu)-Gly-Cys[Ψ(Dmp,H)pro]-Tyr(tBu)-OtBuおよび５１２ｇのFmoc-Cys(Trt)-OHを６．７ＬのＤＭＦに溶解させ、ＴＯＴＵ／ＮＭＭ系を用いてカップリング反応を行った。反応混合物をＮａＨＣＯ３水溶液で沈殿させ、濾取、洗浄、乾燥させた。
１３３９ｇのH-Asn(Trt)-Pro-Ala-Cys[Ψ(Dmp,H)pro]-Thr(tBu)-Gly-Cys[Ψ(Dmp,H)pro]-Tyr(tBu)-OtBuおよび５１２ｇのFmoc-Cys(Trt)-OHを６．７ＬのＤＭＦに溶解させ、ＴＯＴＵ／ＮＭＭ系を用いてカップリング反応を行った。反応混合物をＮａＨＣＯ３水溶液で沈殿させ、濾取、洗浄、乾燥させた。
【0130】
８４．３％のＨＰＬＣ純度および９５％の収率で、Fmoc-Cys(Trt)-Asn(Trt)-Pro-Ala-Cys[Ψ(Dmp,H)pro]-Thr(tBu)-Gly-Cys[Ψ(Dmp,H)pro]-Tyr(tBu)-OtBuを得た。
【0131】
（工程Ｖ） H-Cys(SO3Na)-Cys(Trt)-Asn(Trt)-Pro-Ala-Cys[Ψ(Dmp,H)pro]-Thr(tBu)-Gly-Cys[Ψ(Dmp,H)pro]-Tyr(tBu)-OtBuの合成
１７３３グラムのFmoc-Cys(Trt)-Asn(Trt)-Pro-Ala-Cys[Ψ(Dmp,H)pro]-Thr(tBu)-Gly-Cys[Ψ(Dmp,H)pro]-Tyr(tBu)-OtBuを８．７ＬのｉＰｒＯＡｃに溶解させた。ＤＥＡを用いて塩基性脱保護を行った。反応混合物をｉＰｒＯＡｃで希釈し、最初にペプチド豊富な有機溶液をＫＨＳＯ４水溶液、ＮａＨＣＯ３水溶液およびＮａＣｌ水溶液で洗浄し、次いで濃縮し、得られた残渣をＤＭＦ（８．７Ｌ）に溶解させた。
１７３３グラムのFmoc-Cys(Trt)-Asn(Trt)-Pro-Ala-Cys[Ψ(Dmp,H)pro]-Thr(tBu)-Gly-Cys[Ψ(Dmp,H)pro]-Tyr(tBu)-OtBuを８．７ＬのｉＰｒＯＡｃに溶解させた。ＤＥＡを用いて塩基性脱保護を行った。反応混合物をｉＰｒＯＡｃで希釈し、最初にペプチド豊富な有機溶液をＫＨＳＯ４水溶液、ＮａＨＣＯ３水溶液およびＮａＣｌ水溶液で洗浄し、次いで濃縮し、得られた残渣をＤＭＦ（８．７Ｌ）に溶解させた。
【0132】
Fmoc-Cys(SO3Na)-ONa（４０４グラム）を加え、ＰｙＯｘｉｍ／２，４，６－コリジン系でカップリング反応を行った。反応混合物をＮａＨＣＯ３水溶液で沈殿させ、濾取、洗浄、乾燥した。乾燥した生成物を８．７ＬのｉＰｒＯＡｃに溶解させた。ＤＥＡを用いて塩基性脱保護を行った。
【0133】
反応混合物をｉＰｒＯＡｃで希釈し、ペプチド豊富な有機溶液をＫＨＳＯ４水溶液およびＮａＣｌ水溶液で洗浄し、次いで濃縮し、得られた残渣をｉＰｒＯＡｃに溶解させた。得られた溶液にＤＩＰＥを加えて沈殿させ、濾取および洗浄した。その後、生成物を乾燥させた。
【0134】
８２．９％のＨＰＬＣ純度および８３％の収率で、H-Cys(SO3Na)-Cys(Trt)-Asn(Trt)-Pro-Ala-Cys[Ψ(Dmp,H)pro]-Thr(tBu)-Gly-Cys[Ψ(Dmp,H)pro]-Tyr(tBu)-OtBuを得た。
【0135】
（工程ＶＩ） 鎖状保護ペプチドFmoc-Cys(SO3Na)-Cys(SO3Na)-Glu(tBu)-Tyr(tBu)-Cys(SO3Na)-Cys(Trt)-Asn(Trt)-Pro-Ala-Cys[Ψ(Dmp,H)pro]-Thr(tBu)-Gly-Cys[Ψ(Dmp,H)pro]-Tyr(tBu)-OtBuの合成
【0136】
１４００グラムのH-Cys(SO3Na)-Cys(Trt)-Asn(Trt)-Pro-Ala-Cys[Ψ(Dmp,H)pro]-Thr(tBu)-Gly-Cys[Ψ(Dmp,H)pro]-Tyr(tBu)-OtBuおよび８５０グラムのフラグメントＡを７．０ＬのＡＣＮに溶解させ、Ｏｘｙｍａ／Ｂ－ＥＤＣ・ＨＣｌ／２，４，６－コリジン系でカップリング反応を行った。反応混合物をＮａＨＣＯ３水溶液で沈殿させ、濾取、洗浄、乾燥した。
【0137】
６６．７％のＨＰＬＣ純度および定量的収率で、鎖状保護ペプチドを得た。
【0138】
（実施例５）
鎖状先進中間体の合成
H-Cys(SO3H)-Cys(SO3H)-Glu-Tyr-Cys(SO3H)-Cys-Asn-Pro-Ala-Cys-Thr-Gly-Cys-Tyr-OHのＴＦＡ塩
［分子量１７７２．９８、遊離塩基］。
鎖状先進中間体の合成
H-Cys(SO3H)-Cys(SO3H)-Glu-Tyr-Cys(SO3H)-Cys-Asn-Pro-Ala-Cys-Thr-Gly-Cys-Tyr-OHのＴＦＡ塩
［分子量１７７２．９８、遊離塩基］。
【0139】
（工程Ｉ） H-Cys(SO3Na)-Cys(SO3Na)-Glu(tBu)-Tyr(tBu)-Cys(SO3Na)-Cys(Trt)-Asn(Trt)-Pro-Ala-Cys[Ψ(Dmp,H)pro]-Thr(tBu)-Gly-Cys[Ψ(Dmp,H)pro]-Tyr(tBu)-OtBuの合成
２１２６グラムの鎖状保護ペプチドを１０．６ＬのＡＣＮに溶解させた。ＤＥＡを用いて塩基性脱保護を行った。反応混合物をｉＰｒＯＡｃで希釈し、ペプチド豊富な有機溶液をＫＨＳＯ４水溶液およびＮａＣｌ水溶液で洗浄し、次いで濃縮し、得られた残渣をｉＰｒＯＡｃに溶解させた。ｎ－ヘプタンを加えて溶液を沈殿させ、濾取、洗浄、乾燥した。
２１２６グラムの鎖状保護ペプチドを１０．６ＬのＡＣＮに溶解させた。ＤＥＡを用いて塩基性脱保護を行った。反応混合物をｉＰｒＯＡｃで希釈し、ペプチド豊富な有機溶液をＫＨＳＯ４水溶液およびＮａＣｌ水溶液で洗浄し、次いで濃縮し、得られた残渣をｉＰｒＯＡｃに溶解させた。ｎ－ヘプタンを加えて溶液を沈殿させ、濾取、洗浄、乾燥した。
【0140】
６１．７％のＨＰＬＣ純度および８９％の収率で、H-Cys(SO3Na)-Cys(SO3Na)-Glu(tBu)-Tyr(tBu)-Cys(SO3Na)-Cys(Trt)-Asn(Trt)-Pro-Ala-Cys[Ψ(Dmp,H)pro]-Thr(tBu)-Gly-Cys[Ψ(Dmp,H)pro]-Tyr(tBu)-OtBuを得た。
【0141】
（工程ＩＩ） 鎖状先進中間体H-Cys(SO3H)-Cys(SO3H)-Glu-Tyr-Cys(SO3H)-Cys-Asn-Pro-Ala-Cys-Thr-Gly-Cys-Tyr-OHのＴＦＡ塩の合成
４５０グラムのH-Cys(SO3Na)-Cys(SO3Na)-Glu(tBu)-Tyr(tBu)-Cys(SO3Na)-Cys(Trt)-Asn(Trt)-Pro-Ala-Cys[Ψ(Dmp,H)pro]-Thr(tBu)-Gly-Cys[Ψ(Dmp,H)pro]-Tyr(tBu)-OtBuをＴＦＡ－水－ＴＩＳ溶液（２０．３Ｌ－２．３Ｌ－０．５Ｌ）で処理した。ＭＴＢＥの添加により反応混合物を沈殿させ、濾取、洗浄、乾燥させた。
４５０グラムのH-Cys(SO3Na)-Cys(SO3Na)-Glu(tBu)-Tyr(tBu)-Cys(SO3Na)-Cys(Trt)-Asn(Trt)-Pro-Ala-Cys[Ψ(Dmp,H)pro]-Thr(tBu)-Gly-Cys[Ψ(Dmp,H)pro]-Tyr(tBu)-OtBuをＴＦＡ－水－ＴＩＳ溶液（２０．３Ｌ－２．３Ｌ－０．５Ｌ）で処理した。ＭＴＢＥの添加により反応混合物を沈殿させ、濾取、洗浄、乾燥させた。
【0142】
５７．９％のＨＰＬＣ純度および９２％の収率で、鎖状先進中間体を得た。
【0143】
（実施例６）
粗製リナクロチド溶液の合成
粗製リナクロチド溶液の合成
【0144】
【化9】
【0145】
９０グラムの鎖状先進中間体（推定４９グラムのペプチド１００％）をリン酸緩衝液（ｐＨ＝７．４）およびＩＰＡの混合液に投入し、１６～３２時間にわたって反応混合物を撹拌した。混合物を濃縮してＩＰＡを除去し、ろ過した。
【0146】
５３．８％のＨＰＬＣ純度および７２％の環化収率で、粗製リナクロチド溶液（ペプチド含量３０グラム）を得た。
【0147】
（実施例７）
粗製リナクロチド溶液の精製
粗製リナクロチド溶液の精製
【0148】
粗製リナクロチド溶液（リナクロチド含有量７５．４ｇ）をＣ１８カラム（直径１００ｍｍ×最大高さ３５０ｍｍ）に充填し、３種の別個かつ連続したクロマトグラフィー工程を適用して精製した。
－ 第１工程
グラジエント：１８０分間において、溶離液Ｂの０％から１００％まで
溶離液Ａ：０．１５％ ＴＦＡ
溶離液Ｂ：溶離液Ａ－ＡＣＮ １－１
－ 第２工程
グラジエント：１８０分間において、溶離液Ｂの０％から１００％まで
溶離液Ａ：２０ｍＭ ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４緩衝液（ｐＨ ６）
溶離液Ｂ：溶離液Ａ－ＡＣＮ １－１
－ 第３工程
グラジエント：１８０分間において、溶離液Ｂの０％から１００％まで
溶離液Ａ：２０～１００ｍＭ ＡｃＯＨ
溶離液Ｂ：溶離液Ａ－ＡＣＮ １－１
－ 第１工程
グラジエント：１８０分間において、溶離液Ｂの０％から１００％まで
溶離液Ａ：０．１５％ ＴＦＡ
溶離液Ｂ：溶離液Ａ－ＡＣＮ １－１
－ 第２工程
グラジエント：１８０分間において、溶離液Ｂの０％から１００％まで
溶離液Ａ：２０ｍＭ ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４緩衝液（ｐＨ ６）
溶離液Ｂ：溶離液Ａ－ＡＣＮ １－１
－ 第３工程
グラジエント：１８０分間において、溶離液Ｂの０％から１００％まで
溶離液Ａ：２０～１００ｍＭ ＡｃＯＨ
溶離液Ｂ：溶離液Ａ－ＡＣＮ １－１
【0149】
最終的に、７５．４グラムから、９９．９７％のクロマトグラフィー純度および５５％の収率（３段階）で、４１．７グラムの精製リナクロチドの溶液を得た。
【0150】
（実施例８）
ｔＢｕＯＨ－水溶液からの高純度リナクロチド単離（オプション１）
精製リナクロチド溶液（４１．７グラム、リナクロチド濃度４．２ｇ／Ｌ）を以下のように処理した：
・ 以下の手法によりＡＣＮからｔＢｕＯＨへの交換を行った：上記の溶液を先の例のＣ１８カラムに充填し、ＡｃＯＨ（１００ｍＭ）－ｔＢｕＯＨ １－１溶液で溶離させ、最終的にリナクロチドの水（ＡｃＯＨ）およびｔＢｕＯＨ溶液を得た；
・ 上記の溶液を以下のサイクル：
常圧下、－５０℃におけるマトリックスの凍結；
－２０℃、真空下における一次凍結乾燥段階；および
真空下、＋２０℃において凍結乾燥品を乾燥させる二次凍結乾燥段階、
に従って凍結乾燥した。
ｔＢｕＯＨ－水溶液からの高純度リナクロチド単離（オプション１）
精製リナクロチド溶液（４１．７グラム、リナクロチド濃度４．２ｇ／Ｌ）を以下のように処理した：
・ 以下の手法によりＡＣＮからｔＢｕＯＨへの交換を行った：上記の溶液を先の例のＣ１８カラムに充填し、ＡｃＯＨ（１００ｍＭ）－ｔＢｕＯＨ １－１溶液で溶離させ、最終的にリナクロチドの水（ＡｃＯＨ）およびｔＢｕＯＨ溶液を得た；
・ 上記の溶液を以下のサイクル：
常圧下、－５０℃におけるマトリックスの凍結；
－２０℃、真空下における一次凍結乾燥段階；および
真空下、＋２０℃において凍結乾燥品を乾燥させる二次凍結乾燥段階、
に従って凍結乾燥した。
【0151】
４０．９グラムのリナクロチド１００％に相当する、４６．４グラムの非晶質高純度リナクロチド粉末を得た（分析８８．１％）。
【0152】
得られた製品は次のような分析属性を有する：
・ クロマトグラフィー純度（ＩＰＣ） ９９．９４％ （図１）、
・ ＩＭＤ－リナクロチド ＬＴ ４０ｐｐｍ（ＬＴ ＬＯＤ） （図４）、
・ Ｃｙｓ－１－α－ケトン－リナクロチド ＬＴ ４０ｐｐｍ（ＬＴ ＬＯＤ） （図４）、
・ 多量体含有率 ０．０７％（図６）、
・ 単離収率 ９８％。
・ クロマトグラフィー純度（ＩＰＣ） ９９．９４％ （図１）、
・ ＩＭＤ－リナクロチド ＬＴ ４０ｐｐｍ（ＬＴ ＬＯＤ） （図４）、
・ Ｃｙｓ－１－α－ケトン－リナクロチド ＬＴ ４０ｐｐｍ（ＬＴ ＬＯＤ） （図４）、
・ 多量体含有率 ０．０７％（図６）、
・ 単離収率 ９８％。
【0153】
【0154】
（実施例９）
水懸濁液からの高純度リナクロチド単離（オプション２）
精製リナクロチド溶液（リナクロチド含有量４２．９ｇ、濃度４．３ｇ／Ｌ）を以下のように処理した：
・ 真空下での濃縮を実施してＡＣＮを除去し、水性懸濁液を得た；
・ 上記の溶液を以下のサイクル：
常圧下、－５０℃におけるマトリックスの凍結；
－２０℃、真空下における一次凍結乾燥段階；および
真空下、＋２０℃において凍結乾燥品を乾燥させる二次凍結乾燥段階、
に従って凍結乾燥した。
水懸濁液からの高純度リナクロチド単離（オプション２）
精製リナクロチド溶液（リナクロチド含有量４２．９ｇ、濃度４．３ｇ／Ｌ）を以下のように処理した：
・ 真空下での濃縮を実施してＡＣＮを除去し、水性懸濁液を得た；
・ 上記の溶液を以下のサイクル：
常圧下、－５０℃におけるマトリックスの凍結；
－２０℃、真空下における一次凍結乾燥段階；および
真空下、＋２０℃において凍結乾燥品を乾燥させる二次凍結乾燥段階、
に従って凍結乾燥した。
【0155】
３９．１ｇのリナクロチド１００％に相当する、４０．９ｇの非晶質高純度リナクロチド粉末を得た（分析９５．７％）。
【0156】
得られた製品は次のような分析属性を有する：
・ クロマトグラフィー純度（ＩＰＣ） ９９．９１％ （図２）、
・ ＩＭＤ－リナクロチド ＬＴ ４０ｐｐｍ（ＬＴ ＬＯＤ） （図５）、
・ Ｃｙｓ－１－α－ケトン－リナクロチド ＬＴ ４０ｐｐｍ（ＬＴ ＬＯＤ） （図５）、
・ 多量体含有率 ０．０６％（図７）、
・ 単離収率 ９１％。
・ クロマトグラフィー純度（ＩＰＣ） ９９．９１％ （図２）、
・ ＩＭＤ－リナクロチド ＬＴ ４０ｐｐｍ（ＬＴ ＬＯＤ） （図５）、
・ Ｃｙｓ－１－α－ケトン－リナクロチド ＬＴ ４０ｐｐｍ（ＬＴ ＬＯＤ） （図５）、
・ 多量体含有率 ０．０６％（図７）、
・ 単離収率 ９１％。
【0157】
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【国際調査報告】