知財求人 - 知財ポータルサイト「IP Force」
▶ デイナ ファーバー キャンサー インスティチュート，インコーポレイテッドの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-12-26
(54)【発明の名称】疾患を治療するための組成物及び方法
(51)【国際特許分類】
C07K 19/00 20060101AFI20241219BHJP
C12N 15/62 20060101ALI20241219BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20241219BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20241219BHJP
A61K 47/64 20170101ALI20241219BHJP
A61K 47/68 20170101ALI20241219BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20241219BHJP
A61K 51/08 20060101ALI20241219BHJP
A61K 51/10 20060101ALI20241219BHJP
A61K 38/20 20060101ALI20241219BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20241219BHJP
A61P 37/02 20060101ALI20241219BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20241219BHJP
A61P 37/06 20060101ALI20241219BHJP
A61P 17/00 20060101ALI20241219BHJP
A61P 9/00 20060101ALI20241219BHJP
A61P 29/00 20060101ALI20241219BHJP
C07K 16/00 20060101ALN20241219BHJP
C07K 14/705 20060101ALN20241219BHJP
C12N 15/12 20060101ALN20241219BHJP
C12N 15/13 20060101ALN20241219BHJP
C12N 15/24 20060101ALN20241219BHJP
【ＦＩ】
C07K19/00
C12N15/62 Z
C12N15/63 Z
C12N5/10
A61K47/64
A61K47/68
A61K45/00
A61K51/08 100
A61K51/10 100
A61K38/20
A61K39/395 Y
A61K51/08 200
A61K51/10 200
A61P37/02
A61P43/00 125
A61P43/00 105
A61P37/06
A61P17/00
A61P9/00
A61P29/00
C07K16/00
C07K14/705
C12N15/12
C12N15/13
C12N15/24
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024535370
(86)(22)【出願日】2022-12-14
(85)【翻訳文提出日】2024-07-31
(86)【国際出願番号】 US2022081559
(87)【国際公開番号】W WO2023114847
(87)【国際公開日】2023-06-22
(31)【優先権主張番号】63/289,595
(32)【優先日】2021-12-14
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】63/368,119
(32)【優先日】2022-07-11
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】399052796
【氏名又は名称】デイナ ファーバー キャンサー インスティチュート，インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100102978
【弁理士】
【氏名又は名称】清水 初志
(74)【代理人】
【識別番号】100205707
【弁理士】
【氏名又は名称】小寺 秀紀
(74)【代理人】
【識別番号】100160923
【弁理士】
【氏名又は名称】山口 裕孝
(74)【代理人】
【識別番号】100119507
【弁理士】
【氏名又は名称】刑部 俊
(74)【代理人】
【識別番号】100142929
【弁理士】
【氏名又は名称】井上 隆一
(74)【代理人】
【識別番号】100148699
【弁理士】
【氏名又は名称】佐藤 利光
(74)【代理人】
【識別番号】100188433
【弁理士】
【氏名又は名称】梅村 幸輔
(74)【代理人】
【識別番号】100128048
【弁理士】
【氏名又は名称】新見 浩一
(74)【代理人】
【識別番号】100129506
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 智彦
(74)【代理人】
【識別番号】100114340
【弁理士】
【氏名又は名称】大関 雅人
(74)【代理人】
【識別番号】100214396
【弁理士】
【氏名又は名称】塩田 真紀
(74)【代理人】
【識別番号】100121072
【弁理士】
【氏名又は名称】川本 和弥
(74)【代理人】
【識別番号】100221741
【弁理士】
【氏名又は名称】酒井 直子
(74)【代理人】
【識別番号】100114926
【弁理士】
【氏名又は名称】枝松 義恵
(72)【発明者】
【氏名】ラシディアン ムハンマド
(72)【発明者】
【氏名】タヴァコルプール ソヘイル
【テーマコード（参考）】
4B065
4C076
4C084
4C085
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B065AA90X
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065CA24
4B065CA25
4B065CA44
4B065CA46
4C076CC07
4C076EE41
4C076EE59
4C076FF34
4C084AA02
4C084AA12
4C084AA17
4C084BA41
4C084BA44
4C084DA12
4C084DA13
4C084DA14
4C084NA10
4C084NA14
4C084ZA361
4C084ZA891
4C084ZB071
4C084ZB081
4C084ZB111
4C084ZB211
4C084ZC541
4C084ZC711
4C085AA33
4C085BB36
4C085BB42
4C085DD62
4C085EE01
4C085HH03
4C085HH11
4C085KB82
4H045AA10
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA10
4H045BA41
4H045BA57
4H045BA70
4H045BA71
4H045CA40
4H045DA01
4H045DA02
4H045DA03
4H045DA04
4H045DA50
4H045DA76
4H045DA89
4H045EA20
4H045EA50
4H045FA74
(57)【要約】
本発明の態様は、自己免疫疾患を治療及び予防するための組成物及び方法に向けられる。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
デスモグレイン３（Ｄｓｇ３）の細胞外（ＥＣ）ドメイン若しくはＥＣドメインの一部分、又はデスモグレイン１（Ｄｓｇ１）のＥＣドメイン若しくはＥＣドメインの一部分と、単離された免疫グロブリンＦｃ領域又はその断片と、を含む、融合タンパク質。
【請求項2】
前記融合タンパク質が、配列番号１～４のうちのいずれか１つ又はその断片を含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項3】
配列番号１～４又は２９～３２に対して少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項4】
１つ以上のＢ細胞を標的とする、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項5】
前記Ｂ細胞が、自己反応性抗Ｄｓｇ３ Ｂ細胞又は自己反応性抗Ｄｓｇ１ Ｂ細胞を含む、請求項４に記載の融合タンパク質。
【請求項6】
前記Ｆｃ領域が、配列番号１～４又は２９～３２中のＦｃ領域に対して少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項7】
前記Ｆｃ領域が、ＩｇＧ Ｆｃ領域を含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項8】
前記ＥＣドメインが、図１３に提供される様々な配列識別子（配列番号８～２８）のうちのいずれか１つ以上を含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項9】
前記ＥＣドメインが、ＥＣ１、ＥＣ２、ＥＣ４、ＥＣ５、又はそれらの組み合わせを含む、請求項８に記載の融合タンパク質。
【請求項10】
治療用部分、イメージング部分、捕捉部分、又はそれらの組み合わせを更に含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項11】
前記捕捉部分が、親水性タンパク質、細菌トランスペプチダーゼ酵素、ＧＳＴタグ、Ｈｉｓタグ、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、又はそれらの組み合わせを含む、請求項１０に記載の融合タンパク質。
【請求項12】
前記イメージング部分が、フルオロフォア、放射性同位体、又はそれらの組み合わせを含む、請求項１０に記載の融合タンパク質。
【請求項13】
前記治療用部分が、サイトカイン、毒素、放射線治療薬、Ｔ細胞結合部分、ナチュラルキラー細胞結合部分、又はそれらの組み合わせを含む、請求項１０に記載の融合タンパク質。
【請求項14】
前記治療用部分が、ＩＬ－２、
ＩＬ－１５、又は
ＩＬ－１活性を有する分子
を含む、請求項１３に記載の融合タンパク質。
【請求項15】
請求項１～１４のいずれか一項に記載の融合タンパク質と、薬学的に許容される担体と、を含む、薬学的組成物。
【請求項16】
自己反応性抗Ｄｓｇ３又は抗Ｄｓｇ１ Ｂ細胞を枯渇させる方法であって、対象に、治療有効量の請求項１～１４のいずれか一項に記載の融合タンパク質を投与することを含む、前記方法。
【請求項17】
前記有効量が、前記対象において循環する抗Ｄｓｇ３又は抗Ｄｓｇ１抗体のレベルと正に相関する、請求項１６に記載の方法。
【請求項18】
自己免疫疾患を治療する方法であって、対象に、治療有効量の請求項１～１４のいずれか一項に記載の融合タンパク質を投与することを含み、前記対象が、前記自己免疫疾患を患っている、前記方法。
【請求項19】
前記疾患が、自己免疫性水疱症、狼瘡、強皮症、グッドパスチャー病、グレーブス病、及び免疫介在性血管炎からなる群から選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項20】
前記自己免疫性水疱症が、尋常性天疱瘡、水疱性類天疱瘡、粘膜類天疱瘡、後天性表皮水疱症、又は線状ＩｇＡ水疱性皮膚症を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項21】
治療有効量の融合タンパク質又は薬学的組成物が、前記対象における自己反応性Ｂ細胞を排除するか、又は無能力化する、請求項１８に記載の方法。
【請求項22】
前記融合タンパク質と反応性の自己抗体、又は前記薬学的組成物中の前記融合タンパク質の存在下で有効である、請求項１８に記載の方法。
【請求項23】
請求項１～１４のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードする、核酸。
【請求項24】
請求項１～１４のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードする核酸を含む、ベクター。
【請求項25】
請求項１～１４のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードするベクターを含む、細胞。
【請求項26】
自己反応性抗原と、エフェクター細胞に結合する、抗体のＦｃ部分、又は抗体と
を含む、融合タンパク質。
【請求項27】
前記自己反応性抗原が、デスモプラキン、エンボプラキン、ペリプラキン、プレクチン、水疱性類天疱瘡抗原１、コルネオデスモシン、微小管アクチン架橋因子、エピプラキン及びカドヘリンからなる群からの分子又は分子の断片を含む、請求項２６に記載の融合タンパク質。
【請求項28】
前記自己反応性抗原が、前記分子の細胞外（ＥＣ）ドメイン、又はそのＢ細胞エピトープを含む、請求項２７に記載の融合タンパク質。
【請求項29】
前記ＥＣドメイン、又はそのＢ細胞エピトープが、デスモグレイン－１（Ｄｓｇ１）、デスモグレイン－２（Ｄｓｇ２）、デスモグレイン－３（Ｄｓｇ３）、デスモグレイン－４（Ｄｓｇ４）、デスモコリン－１（Ｄｓｃ１）デスモコリン－２（Ｄｓｃ２）、及びデスモコリン－３（Ｄｓｃ３）からなるデスモソームカドヘリンの群から選択される、請求項２８に記載の融合タンパク質。
【請求項30】
前記ＥＣドメイン、又はそのＢ細胞エピトープが、ＥＣ１、ＥＣ２、ＥＣ３、ＥＣ４、ＥＣ５、及びそれらの組み合わせの全て又は一部分を含む、請求項２８に記載の融合タンパク質。
【請求項31】
前記自己反応性抗原が、自己反応性Ｂ細胞のＢ細胞受容体（ＢＣＲ）に結合する、請求項２６に記載の融合タンパク質。
【請求項32】
前記自己反応性Ｂ細胞が、自己免疫疾患を有する動物由来である、請求項３１に記載の融合タンパク質。
【請求項33】
前記自己免疫疾患が、前記動物における自己抗体の産生によって特徴付けられる、請求項３２に記載の融合タンパク質。
【請求項34】
前記自己免疫疾患が、自己免疫性水疱症、狼瘡、強皮症、グッドパスチャー病、グレーブス病、又は免疫介在性血管炎を含む、請求項３２に記載の融合タンパク質。
【請求項35】
前記自己免疫性水疱症が、尋常性天疱瘡、水疱性類天疱瘡、粘膜類天疱瘡、後天性表皮水疱症、線状ＩｇＡ水疱性皮膚症、落葉状天疱瘡、表皮内好中球性ＩｇＡ皮膚症、及び腫瘍随伴性天疱瘡からなる群から選択される、請求項３４に記載の融合タンパク質。
【請求項36】
前記自己免疫疾患が、ヒト、イヌ、ネコ又はウマに存在する、請求項３２に記載の融合タンパク質。
【請求項37】
前記抗体のＦｃ部分が、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）を有する細胞に結合することができる、請求項２６に記載の融合タンパク質。
【請求項38】
前記ＦｃＲが、Ｆｃ－ガンマ受容体（ＦｃγＲ）、Ｆｃ－アルファ受容体（ＦｃαＲ）、又はＦｃ－エプシロン受容体（ＦｃεＲ）を含む、請求項３７に融合タンパク質。
【請求項39】
前記ＦｃγＲが、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、又はＦｃγＲＩＩＩを含む、請求項３８に記載の融合タンパク質。
【請求項40】
前記ＦｃＲが、Ｂ細胞、濾胞性樹状細胞、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ、好中球、好酸球、好塩基球、血小板又は肥満細胞上に存在する、請求項３７に記載の融合タンパク質。
【請求項41】
前記ＦｃＲが、ナチュラルキラー細胞又はマクロファージ上に存在する、請求項３７に記載の融合タンパク質。
【請求項42】
前記抗体のＦｃ部分が、配列番号１～４又は２９～３２のＦｃ部分に対して少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項２６に記載の融合タンパク質。
【請求項43】
前記エフェクター細胞に結合する前記抗体が、Ｔ細胞に結合する、請求項２６に記載の融合タンパク質。
【請求項44】
前記Ｔ細胞に結合する前記抗体が、抗ＣＤ３抗体を含む、請求項４３に記載の融合タンパク質。
【請求項45】
前記抗ＣＤ３抗体が、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含む、請求項４４に記載の融合タンパク質。
【請求項46】
前記エフェクター細胞が、Ｔ細胞を含む、請求項２６に記載の融合タンパク質。
【請求項47】
サイトカインを更に含む、請求項２６に記載の融合タンパク質。
【請求項48】
前記サイトカインが、ＩＬ－２、
ＩＬ－１５、又は
ＩＬ－１活性を有する分子
を含む、請求項４７に記載の融合タンパク質。
【請求項49】
デスモグレイン又はデスモコリンタンパク質の細胞外部分由来の自己反応性Ｂ細胞エピトープと、Ｆｃ－ガンマ受容体（ＦｃγＲ）、Ｆｃ－アルファ受容体（ＦｃαＲ）、又はＦｃ－エプシロン受容体（ＦｃεＲ）に結合することができる抗体のＦｃ部分と
を含む、融合タンパク質。
【請求項50】
前記自己反応性Ｂ細胞エピトープが、前記融合タンパク質のＮ末端を構成し、前記Ｆｃ部分が、前記融合タンパク質のＣ末端を構成する、請求項４９に記載の融合タンパク質。
【請求項51】
前記自己反応性Ｂ細胞エピトープと前記Ｆｃ部分を接続するアミノ酸スペーサを更に含む、請求項４９に記載の融合タンパク質。
【請求項52】
前記融合タンパク質が、デスモグレイン又はデスモコリンタンパク質の細胞外部分由来の少なくとも２つのＢ細胞エピトープを含む、請求項４９に記載の融合タンパク質。
【請求項53】
前記融合タンパク質が、第１の自己反応性抗原と、抗体重鎖由来の第１のＣＨ３ドメインとを有する、第１のポリペプチドと、
第２の自己反応性抗原と、抗体重鎖由来の第２のＣＨ３ドメインとを有する、第２のポリペプチドと
を含み、
ジスルフィド結合が、前記第１のポリペプチドと前記第２のポリペプチドを接続する、
請求項５２に記載の融合タンパク質。
【請求項54】
前記第１及び第２のＣＨ３ドメインが、優先的にヘテロ二量体化するように構成されている、請求項５３に記載の融合タンパク質。
【請求項55】
前記第１及び第２のＣＨ３ドメイン中のアミノ酸の相補的改変が、優先的な二量体化をもたらす、請求項５４に記載の融合タンパク質。
【請求項56】
前記第１及び第２のＣＨ３ドメインが、ノブ－イントゥ－ホール配置を使用して改変されている、請求項５４に記載の融合タンパク質。
【請求項57】
デスモグレイン又はデスモコリンタンパク質の細胞外部分由来の自己反応性Ｂ細胞エピトープと、エフェクター細胞に結合する抗体と
を含む、融合タンパク質。
【請求項58】
前記エフェクター細胞が、Ｔ細胞を含む、請求項５７に記載の融合タンパク質。
【請求項59】
前記抗体が、抗ＣＤ３抗体を含む、請求項５７に記載の融合タンパク質。
【請求項60】
前記抗体が、抗ＣＤ８（細胞傷害性Ｔ細胞）又は抗ＣＤ４（ヘルパーＴ細胞）抗体を含む、請求項５７に記載の融合タンパク質。
【請求項61】
前記抗体が、マクロファージ（例えば、ＣＤ１４、ＣＤ４０、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ６４、ＣＤ６８）又はナチュラルキラー（ＮＫ）細胞（ＣＤ５６）に特異的な抗体を含む、請求項５７に記載の融合タンパク質。
【請求項62】
前記自己反応性Ｂ細胞エピトープが、前記融合タンパク質のＮ末端を構成し、前記抗体が、前記融合タンパク質のＣ末端を構成する、請求項５７に記載の融合タンパク質。
【請求項63】
前記自己反応性Ｂ細胞エピトープと前記抗体を接続するアミノ酸スペーサを更に含む、請求項５７に記載の融合タンパク質。
【請求項64】
前記アミノ酸スペーサが、約２～約４０個のアミノ酸を含む、請求項６３に記載の融合タンパク質。
【請求項65】
前記アミノ酸スペーサが、可撓性アミノ酸スペーサである、請求項６４に記載の融合タンパク質。
【請求項66】
前記可撓性アミノ酸スペーサが、Ｇｌｙ及びＳｅｒ残基を含む、請求項６５に記載の融合タンパク質。
【請求項67】
前記可撓性アミノ酸スペーサが、（Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ）ｎを含む、請求項６５に記載の融合タンパク質。
【請求項68】
前記可撓性アミノ酸スペーサが、（Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ）３を含む、請求項６５に記載の融合タンパク質。
【請求項69】
前記自己反応性Ｂ細胞エピトープ及び前記抗体が、銅媒介性アジドーアルキン環化付加化学（図８Ａ）を使用して作製されたＣ－Ｃ結合によって接続される、請求項５７に記載の融合タンパク質。
【請求項70】
前記自己反応性Ｂ細胞エピトープ及び前記抗体が、ソルターゼ（図８Ｂ）を使用して作製されたＮ－Ｃ結合によって接続される、請求項５７に記載の融合タンパク質。
【請求項71】
前記自己反応性Ｂ細胞エピトープ及び前記抗体が、アミノ酸配列Ｌｅｕ－Ｐｒｏ－Ｇｌｕ－Ｔｈｒ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙによって接続される、請求項７０に記載の融合タンパク質。
【請求項72】
デスモグレイン又はデスモコリンタンパク質の細胞外部分由来の少なくとも２つのＢ細胞エピトープを含む、請求項５７に記載の融合タンパク質。
【請求項73】
第１のポリペプチドを第２のポリペプチドに接続するための方法であって、前記第１のポリペプチドのＣ末端を、アミノ酸配列Ｌｅｕ－Ｐｒｏ－Ｇｌｕ－Ｔｈｒ－Ｇｌｙを含むように改変することと、
前記第２のポリペプチドのＮ末端を、アミノ酸配列Ｌｅｕ－Ｐｒｏ－Ｇｌｕ－Ｔｈｒ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙを含むように改変することと、
前記第１の改変されたポリペプチド及び前記第２の改変されたポリペプチドが、前記アミノ酸配列Ｌｅｕ－Ｐｒｏ－Ｇｌｕ－Ｔｈｒ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙによって接続されるように、前記改変された第１のポリペプチド及び前記改変された第２のポリペプチドを、トリグリシン（Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ）及びソルターゼの存在下で反応させる、
前記方法。
【請求項74】
自己免疫性水疱症を治療するためのＦｃ媒介性治療薬であって、第１の自己反応性抗原と、第２のＣＨ３ドメインと優先的にヘテロ二量体化することができる抗体重鎖由来の第１のＣＨ３ドメインとを含む、第１のポリペプチドと、
第２の自己反応性抗原と、第１のＣＨ３ドメインと優先的にヘテロ二量体化することができる抗体重鎖由来の第２のＣＨ３ドメインとを含む、第２のポリペプチドと
を含み、
ジスルフィド結合が、前記第１のポリペプチドと前記第２のポリペプチドを共有結合する、
前記Ｆｃ媒介性治療薬。
【請求項75】
前記第１のＣＨ３ドメイン及び前記第２のＣＨ３ドメイン中の相補的アミノ酸が、ノブ－イン－ホール戦略を使用して改変される、請求項７４に記載のＦｃ媒介性治療薬。
【請求項76】
前記第１のＣＨ３ドメイン及び前記第２のＣＨ３ドメインが、前記第１のＣＨ３ドメインと前記第１のＣＨ３ドメインとの二量体化と比較して、かつ、前記第２のＣＨ３ドメインと前記第２のＣＨ３ドメインとの二量体化と比較して、優先的に二量体化する、請求項７４に記載のＦｃ媒介性治療薬。
【請求項77】
請求項７４～７６のいずれか一項に記載のＦｃ媒介性治療薬と、薬学的に許容される担体と、を含む、薬学的組成物。
【請求項78】
自己反応性Ｂ細胞を枯渇させる方法であって、対象に、治療有効量の請求項７４～７６のいずれか一項に記載のＦｃ媒介性治療薬を投与することを含む、前記方法。
【請求項79】
アレルゲン、前記アレルゲンの一部分、又は前記アレルゲンを模倣する分子と、エフェクター細胞に結合する、抗体のＦｃ部分、又は抗体と
を含む、融合タンパク質。
【請求項80】
前記アレルゲン、前記アレルゲンの一部分、又は前記アレルゲンを模倣する分子が、タンパク質、ポリペプチド、又はペプチドを含む、請求項７９に記載の融合タンパク質。
【請求項81】
前記アレルゲン、前記アレルゲンの一部分、又は前記アレルゲンを模倣する分子が、薬物、食品、昆虫、ラテックス、カビ、動物、又は植物に由来する、請求項７９に記載の融合タンパク質。
【請求項82】
前記アレルゲン、前記アレルゲンの一部分、又は前記アレルゲンを模倣する分子が、ＩｇＥを産生するか、又は産生するであろうＢ細胞のＢ細胞受容体（ＢＣＲ）に結合することができる、請求項７９に記載の融合タンパク質。
【請求項83】
前記Ｂ細胞が、アレルギーを有する動物由来である、請求項８２に記載の融合タンパク質。
【請求項84】
前記アレルギーが、Ｉ型過敏症である、請求項８３に記載の融合タンパク質。
【請求項85】
前記抗体のＦｃ部分が、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）を有する細胞に結合することができる、請求項７９に記載の融合タンパク質。
【請求項86】
前記エフェクター細胞に結合する前記抗体が、Ｔ細胞に結合することができる、請求項７９に記載の融合タンパク質。
【請求項87】
Ｔ細胞に結合することができる前記抗体が、抗ＣＤ３抗体を含む、請求項８６に記載の融合タンパク質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本出願は、２０２１年１２月１４日に出願された米国仮出願第６３／２８９，５９５号、及び２０２２年７月１１日に出願された米国仮出願第６３／３６８，１１９号に対する優先権を主張し、その内容全体が、参照によって本明細書に組み込まれる。
【0002】
本明細書に引用される全ての特許、特許出願、及び刊行物は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。本明細書に記載され特許請求される本発明の日付時点での当業者に既知の最新技術をより完全に記載するために、これらの刊行物の開示は、参照により本出願に組み込まれる。
【0003】
本特許開示は、著作権保護の対象となる、材料を含む。著作権所有者は、米国特許商標局の特許ファイル又は記録に表れているような特許文書又は特許開示をいかなる者がファクシミリ複製することにも異議はないが、それ以外では、あらゆる全ての著作権を留保する。
【0004】
発明の分野
本発明の態様は、疾患を治療し、予防するための組成物及び方法に向けられる。複数の実施形態では、疾患は、自己免疫疾患である。
本発明の態様は、疾患を治療し、予防するための組成物及び方法に向けられる。複数の実施形態では、疾患は、自己免疫疾患である。
【0005】
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出されている配列表を含有し、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。［］に作成されたこのＡＳＣＩＩコピーは、［］という名称であり、［］バイトのサイズである。
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出されている配列表を含有し、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。［］に作成されたこのＡＳＣＩＩコピーは、［］という名称であり、［］バイトのサイズである。
【背景技術】
【0006】
発明の背景
ヒトを含む動物には、様々な自己免疫疾患が存在する。自己免疫疾患を治療するための試薬及び方法が関心対象である。
ヒトを含む動物には、様々な自己免疫疾患が存在する。自己免疫疾患を治療するための試薬及び方法が関心対象である。
【発明の概要】
【0007】
自己免疫性水疱症を含む、動物における自己免疫疾患を治療するための試薬及び方法が開示される。いくつかの実施形態では、試薬は、疾患動物由来の自己反応性抗原を含むドメインとエフェクター細胞に結合することができるドメインとを有する融合タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、エフェクター細胞結合ドメインは、エフェクター細胞上のＦｃ受容体に結合することができる抗体のＦｃ部分であり得る。いくつかの実施形態では、エフェクター細胞結合ドメインは、エフェクター細胞に結合することができる抗体であり得る。
【0008】
本発明の態様は、デスモグレイン（遺伝子ＤＳＧ１、２、３若しくは４によってコードされる）又はデスモコリン（遺伝子ＤＳＣ１、２若しくは３によってコードされる）などのデスモソームカドヘリン又はその断片を含む融合タンパク質に向けられる。いくつかの実施形態では、配列番号５～２８（実施例４及び図１３に見出される）は、これらのアミノ酸配列の全て又は一部分を含む。
【0009】
いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、デスモグレイン３（Ｄｓｇ３）、又はデスモグレイン１（Ｄｓｇ１）の細胞外（ＥＣ）ドメインなどの、デスモソームカドヘリンタンパク質のＥＣドメイン、及びそれらの単離された免疫グロブリンＦｃ領域又は断片を含む。複数の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１～４、２９～３２、又はそれらの断片のうちのいずれか１つ以上を含む。複数の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１～４又は２９～３２に対して少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含む。複数の実施形態では、融合タンパク質は、そのデスモソームカドヘリン部分を介して、１つ以上のＢ細胞を標的とする。更なる実施形態では、標的化されたＢ細胞は、自己反応性抗Ｄｓｇ３ Ｂ細胞又は自己反応性抗ＤＳＧ１ Ｂ細胞を含む。複数の実施形態では、融合タンパク質はまた、そのＦｃ領域を介してエフェクター細胞（例えば、ＮＫ細胞、マクロファージ）を標的とする。複数の実施形態では、融合タンパク質のＦｃ領域は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１又は配列番号３２のＦｃ領域に対して少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を含む。複数の実施形態では、Ｆｃ領域は、ＩｇＧ Ｆｃ領域を含む。複数の実施形態では、ＥＣドメインは、図１３に提供される様々な配列ＩＤのうちのいずれか１つ以上を含む。更なる実施形態では、ＥＣドメインは、ＥＣ１、ＥＣ２、及びＥＣ３を含む。複数の実施形態では、融合タンパク質は、治療用部分、イメージング部分、捕捉部分、又はそれらの組み合わせを更に含む。更なる実施形態では、捕捉部分は、親水性タンパク質、細菌トランスペプチダーゼ酵素、ＧＳＴタグ、Ｈｉｓタグ、ポリエチレングリコール（polyethylene glycol、ＰＥＧ）、又はそれらの組み合わせを含む。別の更なる実施形態では、イメージング部分は、フルオロフォア、放射性同位体、又はそれらの組み合わせを含む。別の更なる実施形態では、治療用部分は、サイトカイン、毒素、放射線治療薬、Ｔ細胞結合部分、ナチュラルキラー細胞結合部分、又はそれらの組み合わせを含む。
【0010】
いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、デスモソームカドヘリン又はその断片、及びエフェクター細胞に結合することができる抗体又は断片を含み得る。いくつかの実施形態では、エフェクター細胞は、Ｔ細胞であり得る。
【0011】
いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、デスモソームカドヘリン又はその断片、及び放射線同位体を含み得る。
【0012】
本発明の態様は、本明細書に記載の融合タンパク質と、薬学的に許容される担体と、を含む、薬学的組み合わせに向けられる。
【0013】
本発明の態様は、自己反応性抗Ｄｓｇ又は抗Ｄｓｃ Ｂ細胞を枯渇させる方法であって、対象に、治療有効量の本明細書に記載の融合タンパク質、又は本明細書に記載の薬学的組成物を投与することを含む、方法に向けられる。ある実施形態では、有効量は、対象と循環する抗Ｄｓｇ又はＤｓｃ抗体のレベルと正に相関する。
【0014】
本発明の態様は、自己免疫疾患を治療する方法であって、本方法が、対象に、治療有効量の本明細書に記載の融合タンパク質、又は本明細書に記載の薬学的組成物を投与することを含み、対象が、自己免疫疾患を患っている、方法に向けられる。ある実施形態では、疾患は、自己免疫性水疱症、狼瘡、強皮症、グッドパスチャー病、グレーブス病、及び免疫介在性血管炎からなる群から選択される。複数の実施形態では、自己免疫性水疱症は、尋常性天疱瘡、水疱性類天疱瘡、粘膜類天疱瘡、後天性表皮水疱症、線状ＩｇＡ水疱性皮膚症、筋肉特異的チロシンキナーゼ（muscle-specific tyrosine kinase、ＭｕＳＫ）重症筋無力症（myasthenia gravis、ＭＧ）、ＰＬＡ２Ｒ膜性腎症、又はＦＶＩＩＩ同種抗体を伴う血友病Ａを含む。複数の実施形態では、対象に投与される融合タンパク質又は薬学的組成物の量は、自己免疫疾患に対する免疫応答を誘発する。
【0015】
本発明の態様は、本明細書に記載の融合タンパク質をコードする核酸に向けられる。
【0016】
本発明の態様は、本明細書に記載の融合タンパク質をコードする核酸を含むベクターに向けられる。
【0017】
本発明の態様は、本明細書に記載の融合タンパク質をコードする核酸を含むベクターを含む細胞に向けられる。
【図面の簡単な説明】
【0018】
本発明に対するよりよい理解を可能にするために、特定の図示、チャート、又はフローチャートが提供されている。しかしながら、図面は、本発明の選択された実施形態のみを示しており、したがって、範囲を限定するとみなされるべきではないことに留意されたい。本発明の追加の同等に効果的な実施形態及び用途が存在する。
【図1】皮膚及び粘膜の痛みを伴う重度の水疱形成を生じ得る、患者における尋常性天疱瘡の画像を示す。
【図2】ケラチノサイト間のデスモソーム構造の表示を示す（パネルＡ）。パネルＢは、Ｄｓｇ３タンパク質の構造の概略図を示す。抗Ｄｓｇ３抗体は、ケラチノサイトの剥離（棘細胞離開）を引き起こす。タンパク質の細胞外部分の５つのドメインは、異なるレベルの免疫原性を示す。各ドメインの隣に示されるパーセンテージは、そのドメインに特異的な抗体を有するＰＶ患者のパーセンテージである。患者は、複数のドメインに対する抗体を有し得る。
【図3】（パネルＡ）Ｆｃ媒介性融合タンパク質（例えば、Ｄｓｇは、Ｂ細胞受容体によって結合される、ＮＫ細胞／マクロファージは、Ｆｃ受容体によって結合される）、（パネルＢ）抗体媒介性融合タンパク質（例えば、Ｄｓｇは、Ｂ細胞受容体によって結合される；Ｔ細胞は、抗体によって結合される；このアプローチは、「Ｂ細胞受容体（B-cell receptor、ＢＣＲ）－エフェクター細胞エンゲージャ」アプローチと呼ばれてもよいか、又はエフェクター細胞がＴ細胞である場合、「ＢＣＲ－Ｔ細胞エンゲージャアプローチ」と呼ばれてもよい）、及び（パネルＣ）放射線療法アプローチの概略図を示す。各々のアプローチは、病原性Ｂ細胞の標的化された死滅のために設計される。
【図4】模式的なソルターゼ反応を示す。ＬＰＥＴＧソルターゼタグを備えたタンパク質は、トリグリシン含有ソルターゼ基質で標識することができる。「Ｒ」は、目的の任意の生体分子であり得る。Ｈｉｓタグ（Ｈ６）を使用してタンパク質を精製する。
【図5】受動導入疾患モデルの画像を示す。成体Ｂ６マウスにＡＫ２３ハイブリドーマ細胞を注射した。周囲の脱毛パネルＡ。口の周囲の脱毛パネルＢ。眼の周囲の脱毛パネルＣ。背部の周囲の脱毛パネルＤ。ケラチノサイト細胞接着の喪失のパネルＨ及びＥ。能動免疫モデル。免疫付与Ｄｓｇ３－／－脾細胞をＲａｇ－２－／－マウスに導入した。パネルＥ。Ｄｓｇ３＋／－脾細胞を投与されたマウス（上）とは対照的に、Ｄｓｇ３－／－脾細胞を投与されたマウス（下）では、脾細胞導入後２５～３５日目に有意なサイズ差があった。パネルＦ。Ｄｓｇ３免疫付与Ｄｓｇ３－／－脾細胞を投与されたマウスの鼻及び頬の周囲の結痂性びらん。パネルＧ。Ｄｓｇ３免疫付与Ｄｓｇ３－／－脾細胞を投与されたマウスの上部食道における上皮内水疱は、Ｄｓｇ３免疫付与Ｄｓｇ３＋／－脾細胞を投与されたマウスとは対照的である（パネルＨ）。Ａｍａｇａｉ Ｍ，Ｔｓｕｎｏｄａ Ｋ，Ｓｕｚｕｋｉ Ｈ，Ｎｉｓｈｉｆｕｊｉ Ｋ，Ｋｏｙａｓｕ Ｓ，Ｎｉｓｈｉｋａｗａ Ｔ．Ｕｓｅ ｏｆ ａｕｔｏａｎｔｉｇｅｎ－ｋｎｏｃｋｏｕｔ ｍｉｃｅ ｉｎ ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ ａｎ ａｃｔｉｖｅ ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ ｄｉｓｅａｓｅ ｍｏｄｅｌ ｆｏｒ ｐｅｍｐｈｉｇｕｓ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．２０００ Ｍａｒ；１０５（５）：６２５－６３１．ＰＭＣＩＤ：ＰＭＣ２９２４５５から。
【図6】ソルターゼによってｍＤｓｇ３－ＩｇＧ２ａをＡｌｅｘａ６４７で標識したことを示す（パネルＡ）。（パネルＢ）ｍＤｓｇ３（ＥＣ１－３）－ＩｇＧ２ａ（予想ＭＷ約８０ｋＤａ）のＳＤＳ－ＰＡＧＥ、ゲル内蛍光及びウェスタンブロットによる特性評価。（パネルＣ）ｍＤｓｇ３－ＩｇＧ２ａ－Ａｌｅｘａ６４７、及び陰性対照としてＮａｌｍ６を用いた抗Ｄｓｇ３ Ｆ７７９及びＡＫ２３ハイブリドーマ細胞のフローサイトメトリー分析。（パネルＤ）ＥＬＩＳＡ分析により、患者由来Ｐ３Ｆ３及びマウス由来ＡＫ２３抗Ｄｓｇ３ Ａｂに対するｍＤｓｇ３－ＥＣ１－３－ＩｇＧ２ａの結合が確認された。（パネルＥ）ｍＤｓｇ３－ＩｇＧ２ａ－Ａｌｅｘａ６４７によるマウスＲＡＷ２６４．７マクロファージ細胞の染色。Ｎａｌｍ６細胞を、Ｃに示されるように、陰性対照として使用した：紫色のヒストグラム）。
【図7】ｍＤｓｇ３－ｍＦｃキメラタンパク質の評価のためのインビトロＦｃ媒介細胞傷害性アッセイを示す。抗Ｄｓｇ３ ＡＫ２３（パネルＡ）及びＦ７７９（パネルＢ）細胞、並びに無関係のハイブリドーマ又はＮａｌｍ６対照細胞を、１０ｎＭのｍＤｓｇ３－ＩｇＧ２ａ構築物を含むマウスＲＡＷ２６４．７マクロファージ細胞と共培養した。死滅有効性を、示された時点後に標準的な生－死アッセイを介して測定した。結果を０ｎＭ実験に対して正規化した。＊＊＊ｐ＜０．００１。
【図8】Ｄｓｇ３及び抗ＣＤ３ ｓｃＦｖを融合するためにクリック反応を使用する（パネルＡ）の概略図を示す。（パネルＢ）Ｄｓｇ３抗ＣＤ３融合タンパク質を直接作製するためにソルターゼを使用する。（パネルＣ）直接ソルターゼ反応後の抗ＣＤ１９及び抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ並びに融合タンパク質のＳＤＳ－ＰＡＧＥ（クーマシー染色）特性評価（各ｓｃＦｖは約３５ｋＤａのサイズである）。矢印は、融合を示す（予想質量約７０ｋＤａ）。（パネルＤ）直接ソルターゼアプローチを介して作製された抗ＣＤ１９－抗ＣＤ３融合タンパク質による、ＣＤ１９発現Ｎａｌｍ６及びヒトＣＤ３発現Ｊｕｒｋａｔ細胞のフローサイトメトリー染色。クリック化学融合は、同様の結果を提供した。結果は代表的なものである（各々ｎ＝３～５）。
【図9】ソルターゼを使用してｍＤｓｇ３－ＥＣ１－３をＡｌｅｘａ６４７で標識したデータを示す（パネルＡ）。（パネルＢ）ｍＤｓｇ３（ＥＣ１－３）及びＡｌｅｘａ標識産物（予想ＭＷ：約４０ｋＤａ）のＳＤＳ－ＰＡＧＥ、ゲル内蛍光及びウェスタンブロットによる特性評価。（パネルＣ）ｍＤｓｇ３－Ａｌｅｘａ６４７を有する抗Ｄｓｇ３発現Ｆ７７９、ＰＶＢ－２８及びＡＫ２３ハイブリドーマ細胞のフローサイトメトリー分析。Ｎａｌｍ６細胞を陰性対照として使用した。結果は代表的なものである（各々ｎ＝３～５）。
【図10】ソルターゼを使用してｍＤｓｇ３－ＥＣ１－３をＤＯＴＡで部位特定的に標識したことを示す（パネルＡ）。これは、示されるように２２５－Ａｃ放射性同位体を使用して放射性標識される。（パネルＢ）ｍＤｓｇ３（ＥＣ１－３）のＳＤＳ－ＰＡＧＥ（クーマシー染色）特性評価（下側のバンド、レーン２）及びＤＯＴＡ標識したｍＤｓｇ３（ＥＣ１－３）（わずかに高いバンド、レーン３）。レーン＃１は、マーカーである。（パネルＣ）予想及び観察された質量を伴う、ｍＤｓｇ３（ＥＣ１－３）（上側）及びＤＯＴＡ標識されたｍＤｓｇ３（ＥＣ１－３）（下側）のＬＣ－ＭＳ質量分光光度分析。（パネルＤ）ＤＯＴＡ標識は、結合親和性に影響を与えない。二次抗ＦＬＡＧ抗体染色を用いた、ｍＤｓｇ３（ＥＣ１－３）（陽性対照）及びＤＯＴＡ標識されたｍＤｓｇ３（ＥＣ１－３）（下側）による抗Ｄｓｇ３発現Ｆ７７９細胞のフローサイトメトリー染色。
【図11】（パネルＡ）Ｆｃ媒介性及び（パネルＢ）ＢＣＲ－Ｔ細胞エンゲージャアプローチの概略図を示す。各々のアプローチは、病原性Ｂ細胞の標的化された死滅のために設計される。
【図12】自己反応性病原性Ｂ細胞を標的とし、これを死滅させるためのＦｃ媒介性アプローチの概略図を示す（パネルＡ）。（パネルＢ）Ｄｓｇ３－Ｆｃ構築物のインビトロ特性評価。Ｆ７７９（患者由来の抗Ｄｓｇ３抗体で操作されたＮａｌｍ６－白血病細胞）を様々な濃度のｍＤｓｇ３－ｍＦｃ（ＩｇＧ２ａ）（上側）又はｈＤｓｇ３－ｈＦｃ（ＩｇＧ１）（下側）と共にインキュベートし、フローサイトメトリーによって分析してＥＣ５０値を計算した。（パネルＣ）インビボ実験タイムラインの概略図。（パネルＤ）カプラン・マイヤー生存曲線。治療マウス及び対照マウスのｌｏｇランク生存分析は、治療を受けたマウスの改善された生存を示している。対照対治療（＊＊ｐ＜０．００５）。（パネルＥ）ＢＳＣ＜２になったら、治療又は対照から血液を採取し、治療から逃れたヒト－ＣＤ１９＋ＧＦＰ＋Ｆ７７９細胞の表面上の抗Ｄｓｇ３発現の存在についてフロー分析を行った。治療群は、ほぼ完全な抗原喪失を示した。データは５匹のマウスの代表である。
【図13】デスモソームカドヘリン外部ドメインの多重配列アラインメントを示す（配列番号８～２８）。ヒト、マウス及びウシのＤｓｇ１－４（青色）及びＤｓｃ１－３（橙色）アミノ酸配列を各ＥＣドメインについてアラインメントした。両方のファミリーにわたって保存されている残基を灰色で強調する。Ｄｓｇ又はＤｓｃ内のみで保存されているものを、それぞれ青色及び橙色で強調する。ヒトＤｓｇ２構造及びヒトＤｓｃ１構造に対応する二次構造を、アラインメントの上（青色）及び下（橙色）に示す。Ｏ結合グリカンは、紫色の六角形として示されている。Ｎ結合グリカンは、小麦色の六角形として示されており、保存されていない場合、個々のグリコシル化残基は、更に四角で囲まれている。ジスルフィド結合は、Ｄｇｓについてのアラインメントの上及びＤｓｃについてのアラインメントの下の黄色の線によって示される。＞１０％の溶媒アクセス可能表面積が鎖交換ホモ二量体中に埋もれている界面残基は、青色（Ｄｓｇ２）、橙色（Ｄｓｃ１）及びサーモン色（Ｄｓｃ２）のバーによって示される。ＥＣ５ドメインを欠くＤｓｇ１は、ＥＣ５アラインメントから除外される（Ｈａｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｂａｓｉｓ ｏｆ ｄｅｓｍｏｓｏｍａｌ ｃａｄｈｅｒｉｎ ａｄｈｅｓｉｏｎ，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｊｕｎ ２０１６，１１３（２６）７１６０－７１６５を参照されたい）。
【図14】粘膜に痛みを伴う重度のびらんを引き起こす粘膜優位型尋常性天疱瘡の非限定的で例示的な臨床症状を示す。
【図15】（パネルＡ）Ｆｃ媒介性及び（パネルＢ）ＢＣＲ－Ｔ細胞エンゲージャアプローチの概略図を示す。各々のアプローチは、病原性Ｂ細胞の標的化された死滅のために設計される。
【図16-1】ソルターゼによるＤｓｇ３－（ＥＣ１－３）－Ｆｃ構築物の部位特異的標識を示す（パネルＡ）。（パネルＢ）ゲルの右側に示される、ｍＤｓｇ３－ｍＦｃのＳＤＳ－ＰＡＧＥ、ゲル内蛍光及びウェスタンブロットによる特性評価。（パネルＣ）Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７で標識されたマウス及びヒトＤｓｇ３－Ｆｃを有する抗Ｄｓｇ３＋Ｆ７７９、ＰＶＢ２８、及びＡＫ２３ハイブリドーマ細胞のフローサイトメトリー分析。Ｎａｌｍ６を対照として使用する。（パネルＤ＆Ｅ～Ｇ＆Ｈ）ＥＣ５０値を、フローサイトメトリー分析を介して、Ｆ７７９（Ｄｓｇ３部分について）を使用して、並びにＲａｗ細胞及びヒトＰＢＭＣ（Ｆｃ部分について）を使用して、ｍＤｓｇ３－ｍＦｃ及びｈＤｓｇ３－ｈＦｃ構築物について決定した。ｈＰＢＭＣの約５０％のみがＦｃ－Ｒ＋細胞であり、構築物の特異性を更に示していることに留意されたい。（パネルＦ）ＥＬＩＳＡ分析により、構築物の特異性が更に確認された。結果は、複数の実験（各実験について少なくともｎ＝３）の代表である。
【図16-2】ソルターゼによるＤｓｇ３－（ＥＣ１－３）－Ｆｃ構築物の部位特異的標識を示す（パネルＡ）。（パネルＢ）ゲルの右側に示される、ｍＤｓｇ３－ｍＦｃのＳＤＳ－ＰＡＧＥ、ゲル内蛍光及びウェスタンブロットによる特性評価。（パネルＣ）Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７で標識されたマウス及びヒトＤｓｇ３－Ｆｃを有する抗Ｄｓｇ３＋Ｆ７７９、ＰＶＢ２８、及びＡＫ２３ハイブリドーマ細胞のフローサイトメトリー分析。Ｎａｌｍ６を対照として使用する。（パネルＤ＆Ｅ～Ｇ＆Ｈ）ＥＣ５０値を、フローサイトメトリー分析を介して、Ｆ７７９（Ｄｓｇ３部分について）を使用して、並びにＲａｗ細胞及びヒトＰＢＭＣ（Ｆｃ部分について）を使用して、ｍＤｓｇ３－ｍＦｃ及びｈＤｓｇ３－ｈＦｃ構築物について決定した。ｈＰＢＭＣの約５０％のみがＦｃ－Ｒ＋細胞であり、構築物の特異性を更に示していることに留意されたい。（パネルＦ）ＥＬＩＳＡ分析により、構築物の特異性が更に確認された。結果は、複数の実験（各実験について少なくともｎ＝３）の代表である。
【図17】Ｄｓｇ３－Ｆｃ操作されたタンパク質の有効性を評価するためのインビトロ細胞傷害性アッセイを示す。アッセイは、４８ウェルプレート中の２００，０００個のプレコーティングされたエフェクター細胞を用いて開始した。コーティングの約４～６時間後、２０，０００個の標的細胞、Ｄｓｇ３－Ｆｃ治療（示されるように異なる濃度で）、及び１ｍＭのカルシウムを添加した。生存ＧＦＰ＋細胞を、フローサイトメトリー分析を介して２４時間後及び４８時間後にカウントした（全ての標的細胞はＧＦＰ＋である）。各条件について少なくともｎ＝３を使用した。対照細胞と比較して、全ての試験条件で有意な特異的死滅が観察された（＊＊＊ｐ＜０．００１）。
【図18】抗Ｄｓｇ３自己抗体の存在が、治療のインビトロ有効性を中和しないことを示す。Ｆｃ媒介性細胞傷害性アッセイを、図１７で説明したのと同一の設定であるが、示されるようなＡＫ２３抗体の存在下で行った。ＡＫ２３抗体を混合物に添加したとき、死滅有効性の差は検出されなかった。結果は、各実験について少なくともｎ＝３の代表である。
【図19】ｈＤｓｇ３抗ＣＤ３ｅ ｓｃＦｖ構築物が、株Ｆ７７９及びＪｕｒｋａｔ細胞（ヒトＴ細胞）を特異的に染色するが、対照Ｎａｌｍ－６細胞は染色しないことを示す。
【図20】自己抗体の存在が治療の有効性を阻害しないことを示す。マウスに３用量のＩＶＩＧを投与し（－３日目、－２日目、－１日目、１６ｍｇ／ｋｇ）、ルシフェラーゼ＋ＰＶＢ２８細胞のより迅速な生着を可能にした（０日目に１００万個の細胞を注射した）。ｍＤｓｇ３－ＥＣ１４－ｍＦｃを治療として使用する（週３回を２週間、次いで週１回、４日目から開始）。対照マウスには、アイソタイプＩｇＧ２ａを与えた。Ａｕｔｏ－Ａｂｓ群は、ＡＫ２３、ＡＫ１９及びＡＫ１８の混合物（合計で１５０μｇ）を、治療開始の１日前から開始して２週間にわたって週２回投与された。（パネルＡ）ＢＬＩイメージングは、自己抗体の存在下であっても、治療レシピエントマウスにおいて、より遅いシグナル増強を示した。（パネルＢ）生存率は、対照群と比較して両方の治療レシピエント群において有意に高い（Ｐ値＝０．００２３）。また、自己抗体＋治療（Ａｕｔｏ－Ａｂｓ＋Ｔｘ）群の生存期間の中央値は３８日であり、これは治療群よりも高かった（生存期間の中央値＝３５日、Ｐ値＝０．０４８））。（パネルＣ）エンドポイントでのフローサイトメトリー分析は、治療レシピエントマウスの脾臓におけるＰＶＢ２８細胞の完全な枯渇及び骨髄におけるＰＶＢ２８細胞上の抗Ｄｓｇ３＋の有意な喪失を示した（各群についてｎ＝５のデータの代表）。
【図21】受動導入モデルを示す（パネルＡ～Ｄ）。成体ＲＡＧ２－／－マウスにＡＫ２３ハイブリドーマ細胞を注射した。口（パネルＡ）、目（パネルＢ）、及び背中（パネルＣ）の周囲の脱毛。（パネルＤ）ケラチノサイト細胞接着の喪失のＨ＆Ｅ。（パネルＥ～Ｈ）能動免疫モデル。免疫付与Ｄｓｇ３－／－脾細胞をＲａｇ－２－／－マウスに導入した。（パネルＥ）Ｄｓｇ３＋／－脾細胞を投与されたマウス（上）とは対照的に、免疫付与Ｄｓｇ３－／－脾細胞を投与されたＲａｇ－２－／－マウス（下）では、脾細胞導入後２５～３５日目に有意なサイズ差があった。（パネルＦ）Ｄｓｇ３免疫付与Ｄｓｇ３－／－脾細胞を投与されたマウスの鼻及び頬の周囲の結痂性びらん。（パネルＧ）Ｄｓｇ３免疫付与Ｄｓｇ３－／－脾細胞を投与されたマウスの上部食道における上皮内水疱は、Ｄｓｇ３免疫付与Ｄｓｇ３＋／－脾細胞を投与されたマウスとは対照的である。（パネルＨ）鼻の周りの皮膚について同じ。
【図22】自己抗体の存在下であっても、免疫応答性マウスにおいて治療がサイトカインストーム及び毒性を生じさせないことを示す。（パネルＡ）治療（ｍＤｓｇ３－ＥＣ１４－ｍＦｃ）及び／又は自己抗体の混合物（ＡＫ２３、ＡＫ１９、ＡＫ１８）をマウスに注射するスケジュール。（パネルＢ及びＣ）自己抗体を伴うか、又は伴わない治療レシピエントマウスは、毒性が観察されることなく正常な体重増加を続けた（各群についてｎ＝６、３匹の雄及び３匹の雌）。（パネルＤ）ＥＬＩＳＡ分析は、治療のみ、又は自己抗体のみ、又は自己抗体及び治療の両方（ＥＬＩＳＡ ＭＡＸ（商標）Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｓｅｔ Ｍｏｕｓｅ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）を使用）のいずれかを受けた３つの群のいずれにおいても、サイトカインストームを示さなかった。何も投与されなかった６匹のマウスからの血清を、それぞれの性別において健康な対照のために使用した。２ｍｇ／ｋｇのリポ多糖（ＬＰＳ）を受けた３匹のマウスからの試料を使用して、それぞれの性別におけるサイトカインストームを模倣した。対応のないｔ検定を使用して、群間の有意差について検定した。（ｎｓ、Ｐ＞０．０５；＊、Ｐ≦０．０５；＊＊、Ｐ≦０．０１；＊＊＊，、Ｐ≦０．００１；＊＊＊＊、Ｐ≦０．０００１。）
【図23】治療（ｍＤｓｇ３－ＥＣ１－４－ｍＦｃ）がＡＫ２３抗体の病原性効果を阻害することを示す。全ての動物は、ＡＫ２３（１２ｍｇ／ｋｇ、皮下）を投与された。ＡＫ２３＋治療コホートは、１時間後にｍＤｓｇ３－ｍＦｃを受けた（１５ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）。パネルＡ及びＢは、ＡＫ２３群が、７２時間後に行われたテープストリッピングによって有意な脱毛を示し（パネルＡ）、５日目に重度のＰＶ表現型を示した（すなわち、脱毛及び粘膜びらん（図示せず））（パネルＢ）ことを示す。しかしながら、「ＡＫ２３＋治療」群は、対照健常マウスと同様であった（パネルＡ及びＢ）。各コホートについてｎ＝３のデータの代表。（パネルＣ）ＡＫ２３コホートは、体重減少を示した。しかしながら、体重増加は、ＡＫ２３及び治療を受けたマウスにおいて正常であった。（パネルＤ）７２時間時点で採取された血清に対するＩＬ６のＥＬＩＳＡ分析は、ＡＫ２３コホートにおいて高レベルのサイトカインを示したが、「ＡＫ２３＋治療」群において、健常対照と同様であった。（パネルＥ）実験の生存分析。全てのＡＫ２３マウスは、重度のＰＶを発症し、７日未満で安楽死させなければならなかった。全ての治療マウスは、正常に行動した。実験は、６０日目に終了した（各コホートについてｎ＝３）。
【発明を実施するための形態】
【0019】
発明の詳細な説明
自己反応性Ｂ細胞が罹患動物（例えば、ヒト、イヌ、ネコ、ウマ）において自己抗体を産生する疾患又は状態を治療するための試薬及び方法が本明細書に開示される。試薬及び方法は、自己反応性Ｂ細胞を標的とし、枯渇させるように設計されている。いくつかの実施形態では、試薬及び方法は、尋常性天疱瘡、水疱性類天疱瘡、粘膜類天疱瘡、後天性表皮水疱症、線状ＩｇＡ水疱性皮膚症、落葉状天疱瘡、表皮内好中球性ＩｇＡ皮膚症、腫瘍随伴性天疱瘡などの自己免疫性水疱症を治療するためのものである。いくつかの実施形態では、試薬は、自己反応性Ｂ細胞上のＢ細胞受容体に結合する自己反応性Ｂ細胞エピトープを含有し得る。いくつかの実施形態では、自己反応性Ｂ細胞エピトープは、デスモグレイン（Ｄｓｇ）又はデスモコリン（Ｄｓｃ）分子の細胞外ドメインに由来し得る。様々な実施形態では、自己反応性Ｂ細胞エピトープに加えて、試薬はまた、ＮＫ細胞、マクロファージ及びＴ細胞などの様々なエフェクター細胞に結合することができるエフェクター細胞結合領域を含有し得る。試薬の自己反応性エピトープが、自己反応性Ｂ細胞に結合する場合、試薬のエフェクター細胞結合領域に結合したエフェクター細胞は、Ｂ細胞に近接して位置し、Ｂ細胞を枯渇させることができる。
自己反応性Ｂ細胞が罹患動物（例えば、ヒト、イヌ、ネコ、ウマ）において自己抗体を産生する疾患又は状態を治療するための試薬及び方法が本明細書に開示される。試薬及び方法は、自己反応性Ｂ細胞を標的とし、枯渇させるように設計されている。いくつかの実施形態では、試薬及び方法は、尋常性天疱瘡、水疱性類天疱瘡、粘膜類天疱瘡、後天性表皮水疱症、線状ＩｇＡ水疱性皮膚症、落葉状天疱瘡、表皮内好中球性ＩｇＡ皮膚症、腫瘍随伴性天疱瘡などの自己免疫性水疱症を治療するためのものである。いくつかの実施形態では、試薬は、自己反応性Ｂ細胞上のＢ細胞受容体に結合する自己反応性Ｂ細胞エピトープを含有し得る。いくつかの実施形態では、自己反応性Ｂ細胞エピトープは、デスモグレイン（Ｄｓｇ）又はデスモコリン（Ｄｓｃ）分子の細胞外ドメインに由来し得る。様々な実施形態では、自己反応性Ｂ細胞エピトープに加えて、試薬はまた、ＮＫ細胞、マクロファージ及びＴ細胞などの様々なエフェクター細胞に結合することができるエフェクター細胞結合領域を含有し得る。試薬の自己反応性エピトープが、自己反応性Ｂ細胞に結合する場合、試薬のエフェクター細胞結合領域に結合したエフェクター細胞は、Ｂ細胞に近接して位置し、Ｂ細胞を枯渇させることができる。
【0020】
いくつかの実施形態では、自己反応性Ｂ細胞上のＢ細胞受容体に結合する自己反応性Ｂ細胞エピトープを有する試薬は、抗体のＦｃ部分を含むエフェクター細胞結合領域を有し得る。抗体のＦｃ部分は、マクロファージ、ナチュラルキラー（natural killer、ＮＫ）細胞などのエフェクター細胞を含む、Ｆｃ受容体（Fc receptor、ＦｃＲ）を有する細胞に結合することができる。これらのエフェクター細胞は、自己反応性Ｂ細胞を枯渇させることができる。これらの治療薬は、Ｆｃ媒介性治療薬と呼ばれ得る。
【0021】
いくつかの実施形態では、自己反応性Ｂ細胞上のＢ細胞受容体に結合する自己反応性Ｂ細胞エピトープを有する試薬は、エフェクター細胞に結合することができる抗体を含むエフェクター細胞結合領域を有し得る。いくつかの実施形態では、抗体は、Ｔ細胞に特異的であり得る（抗ＣＤ３抗体）。抗体は、細胞傷害性Ｔ細胞に特異的であり得る。Ｔ細胞は、自己反応性Ｂ細胞を枯渇させることができる。これらの治療薬は、Ｂ細胞受容対（ＢＣＲ）エフェクター細胞エンゲージャと呼ばれ得る。Ｔ細胞であるエフェクター細胞に結合する治療薬は、ＢＣＲ－Ｔ細胞エンゲージャと呼ばれ得る。
【0022】
いくつかの実施形態では、上述の試薬分子は、自己反応性Ｂ細胞エピトープとエフェクター細胞結合領域との間に、又はそれらを接続するスペーサを有し得る。いくつかの実施形態では、スペーサは、アミノ酸スペーサであり得る。スペーサは、可撓性スペーサであり得る。可撓性スペーサは、グリシン及びセリンアミノ酸残基を含有し得る。いくつかの実施形態では、自己反応性Ｂ細胞エピトープとエフェクター細胞結合領域を接続するスペーサは、「クリック」化学を塩宇して作製することができる。いくつかの実施形態では、スペーサは、銅媒介性アジド－アルキン環化付加化学を使用して作製されるＣ－Ｃ結合を含み得る。いくつかの実施形態では、スペーサは、ソルターゼ酵素を使用して作製されたＮ－Ｃ結合を含み得る。
【0023】
１つ以上の実施形態の詳細な説明が本明細書に提供される。しかしながら、本発明が、様々な形態で具現化され得ることが、理解される。したがって、本明細書に開示される特定の詳細は、限定として解釈されるべきではなく、特許請求の範囲の根拠として、及び当業者に本発明を任意の適切な方法で用いるように教示するための代表的な根拠として解釈されるべきである。
【0024】
単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、及び「その（ｔｈｅ）」は、文脈が明確に他のことを指示しない限り、複数の参照を含む。特許請求の範囲及び／又は明細書において「含む」という用語と共に使用されるときの「１つの（ａ）」又は「１つの（ａｎ）」という単語の使用は、「１つ」を意味し得るが、「１つ以上」、「少なくとも１つ」、及び「１つ又は２つ以上」の意味とも一致する。
【0025】
「例えば」、「など」、「含む」などの句のいずれかが本明細書で使用される場合は常に、他に明確に記載されない限り、「限定することなく」という句が付随することが理解される。同様に、「一例」、「例示的」などは、非限定的であると理解される。
【0026】
「実質的に」という用語は、意図した目的に悪影響を与えない記述語からの逸脱を可能にする。記述用語は、「実質的に」という語が明確に列挙されていなくても、「実質的に」という用語によって変更されることが理解される。
【0027】
「含む（comprising）」及び「含む（including）」及び「有する（having）」及び「含む（involving）」（並びに同様に「含む（comprises）」、「含む（includes）」、「有する（has）」、及び「含む（involves）」）などの用語は、交換可能に使用され、同じ意味を有する。具体的には、用語の各々は、「含む（comprising）」の一般的な米国特許法の定義と一致して定義され、したがって、「少なくとも以下（at least the following）」を意味する非限定用語（open term）であると解釈され、追加の特徴、限定、態様などを除外しないとも解釈される。よって、例えば、「ステップａ、ｂ、及びｃを含むプロセス」は、プロセスが少なくともステップａ、ｂ、及びｃを含むことを意味する。「ａ」又は「ａｎ」という用語が使用されている場合は常に、そのような解釈が文脈上無意味でない限り、「１つ以上」と理解される。
【0028】
本明細書で使用される「約」という用語は、おおよそ、大まかに、およそ、又はその領域内を指すことができる。「約」という用語が数値範囲と共に使用される場合、それは、記載された数値の上及び下の境界を拡張することによってその範囲を変更する。一般に、「約」という用語は、本明細書では、２０パーセント上又は下の（より高い又はより低い）分散によって記載された値を上回る、及び下回る数値を変更するために使用される。
【0029】
「対象」又は「患者」という用語は、本発明の態様を、例えば、実験的、診断的、予防的、及び／又は治療的目的で行うことができる任意の生物を指すことができる。本明細書に記載の方法が実施される対象は、霊長類、例えばヒトなどの哺乳動物を含む。獣医学的用途には、多種多様な対象、例えば、ウシ、ヒツジ、ヤギ、雌ウシ、ブタなどの家畜、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、シチメンチョウなどの家禽、並びに飼い慣らされた動物、特にイヌ及びネコなどのペットが好適である。診断用途又は研究用途には、げっ歯類（例えば、マウス、ラット、ハムスター）、ウサギ、霊長類、及び近交系ブタなどのブタなどを含む、多種多様な哺乳動物が適切な対象であろう。「生体対象」という用語は、上記の対象又は生きている別の生物を指すことができる。「生体対象」という用語は、生体対象から切除された部分（例えば、肝臓又は他の臓器）だけではなく、対象又は生物全体を指すことができる。「正常な対象」という用語は、がんに罹患していない対象など、疾患又は状態に罹患していない対象を指すことができる。
【0030】
本明細書で使用される場合、「治療剤」という語句は、対象に投与された場合に所望の薬理学的効果を誘発する任意の薬剤を指すことができる。いくつかの実施形態では、薬剤は、適切な集団にわたって統計的に有意な効果を示す場合、治療剤であると考えられる。いくつかの実施形態では、適切な集団は、モデル生物の集団であり得る。いくつかの実施形態では、適切な集団は、特定の年齢群、性別、遺伝的背景、既存の臨床状態などの様々な基準によって定義され得る。いくつかの実施形態では、治療剤は、疾患、障害、及び／又は状態の１つ以上の症状又は特徴を緩和、改善、軽減、阻害し、その発症を遅延させ、その重症度を低下させ、及び／又はその発生率を低下させるために使用することができる任意の物質である。
【0031】
「治療有効量」という用語は、本明細書で使用される場合、その投与が、関連集団で見た場合に、特定の治療効果の達成と相関するか、又は相関すると合理的に予測される治療剤の量を指すことができる。治療効果は、客観的（すなわち、いくつかの試験又はマーカーによって測定可能）又は主観的（すなわち、対象が効果の徴候を示すか、若しくは効果を感じる）であり得る。いくつかの実施形態では、物質の治療有効量は、疾患、障害、及び／又は状態に罹患しているか、又は罹患しやすい対象に投与された場合に、疾患、障害、及び／又は状態の１つ以上の症状を治療、診断、予防、及び／又は遅延及び／又は緩和するのに十分な量である。疾患の進行は、当業者に明らかな臨床観察、実験室及び画像化調査によってモニタリングすることができる。治療有効量は、複数の単位用量を含み得る投薬レジメンで投与される。治療剤について、治療有効量（及び／又は有効な投薬レジメン内の適切な単位用量）は、例えば、投与経路、他の医薬剤との組み合わせに応じて変化し得る。また、患者に対する具体的な治療有効量（及び／又は単位用量）は、治療される障害及び障害の重症度、用いられる特定の医薬剤の活性、用いられる特定の組成物、患者の年齢、体重、全身健康状態、性別、及び食事、用いられる特定の融合タンパク質の投与時間、投与経路、及び／又は排出若しくは代謝の速度、治療期間、並びに医学分野で周知の同様の因子を含む様々な因子に依存し得る。更に、有効量は、治療レジメン内で単回用量又は複数回用量を介して投与され得る。いくつかの実施形態では、個々の用量又は組成物は、それらが治療レジメンの文脈において用量として有効な量を含有する場合、「治療有効量」を含有するとみなされる。当業者は、用量又は量が、患者の集団に投与されたときに統計的に有意な有効性を示すことが示されているか、又は示されていた場合、有効であるとみなされ得ることを理解するであろう。特定の結果は、本明細書に記載されるように、ある量が治療的に有効であるとみなされるために、特定の個々の患者において達成される必要はない。
【0032】
「治療する」という語は、症状又は状態の予防、治癒、安定化、又は改善がもたらされるという意図での、対象、例えば、ヒトを含む動物の医学的管理を指すことができる。この用語は、積極的治療、すなわち、特に障害の改善に向けられた治療、待期療法、すなわち、障害の治癒ではなく症状の軽減のために設計された治療、予防的治療、すなわち、障害の予防を対象とする治療、及び支持療法、すなわち、障害の改善を対象とする別の特定の療法を補うために用いられる治療を含む。「治療」という用語は、対症療法、すなわち、障害の全身症状に向けられた治療も含む。「治療する」又は「治療」という用語は、療法的治療及び予防的若しくは防御的手段の両方も指すことができ、その目的は、望ましくない生理学的変化又は障害を予防又は減速（軽減）することである。「治療」とは、治療を受けていない場合に予想される生存期間と比較して、生存期間を延長することも指すことができる。治療を必要とする者には、既に状態若しくは障害を患っている者、及び状態若しくは障害を患いやすい者、又は状態若しくは障害を予防する必要がある者が包含される。
【0033】
本発明の化合物により状態を「治療する」ことは、そのような化合物を、単独で、又は組み合わせて、任意の適切な手段によって患者に投与することを伴う。治療は、疾患、障害、及び／若しくは状態に関連する病状を発症するリスクを低下させる目的で、疾患、障害、及び／若しくは状態の兆候を示さない対象（例えば、特定可能な疾患、障害、及び／若しくは状態の前）、並びに／又は疾患、障害、及び／若しくは状態の初期兆候のみを示す対象に実施することができる。
【0034】
「投与」という用語は、本明細書に記載の組成物又は製剤を対象に導入することを指すことができる。組成物の投与経路の１つは静脈内投与である。しかしながら、経口、局所、皮下、腹膜、動脈内、吸入、膣、直腸、経鼻、脳脊髄液への導入、又は身体区画への点滴注入などの任意の投与経路を使用することができる。
【0035】
本明細書において、「アレルゲン」は、アレルギー反応を引き起こし得る物質を指すことができる。例えば、アレルゲンは、異常に強い又は活発な免疫応答（例えば、免疫系の過敏症）を生じ得る。いくつかの実施形態では、過敏症は、Ｉ型過敏症であり得る。いくつかの実施形態では、過敏症は、ＩｇＥによって媒介され得る。
【0036】
本明細書では、「抗体」は、抗原に結合する分子（複数可）を指すことができる。本明細書では、「抗体」は、全ての種類の抗体、断片及び／又は誘導体を指すことができる。抗体には、任意の適切なアイソタイプ又はアイソタイプサブクラスのポリクローナル及びモノクローナル抗体が含まれる。本明細書では、抗体は、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’単鎖抗体、Ｆｖ、単鎖、単一特異性抗体、二重特異性抗体、三重特異性抗体、多価抗体、キメラ抗体、イヌ－ヒトキメラ抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、ＣＤＲ移植抗体、サメ抗体、ナノボディ（例えば、単一の単量体可変ドメインからなる抗体）、ラクダ科抗体（例えば、ラクダ科）微小体、イントラボディ（例えば、細胞内抗体）、及び／又は脱フコシル化抗体及び／又はこれらの誘導体を指すことができるが、これらに限定されない。抗体の模倣物も提供される。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される抗体は、血液脳関門を通過することができる本明細書に開示される化合物の一部である活性薬剤である。
【0037】
「抗体」又は「抗原結合ポリペプチド」は、抗原を特異的に認識して結合するポリペプチド又はポリペプチド複合体を指すことができる。抗体は、全抗体及び任意の抗原結合断片、又はその一本鎖であることができる。例えば、「抗体」は、抗原に結合する生物学的活性を有する免疫グロブリン分子の少なくとも一部を含む、任意のタンパク質又はペプチド含有分子を含むことができる。重鎖若しくは軽鎖又はそのリガンド結合部分の相補性決定領域（ＣＤＲ）、重鎖又は軽鎖の可変領域、重鎖又は軽鎖の定常領域、フレームワーク（ＦＲ）領域、又はそれらの任意の部分、又は結合タンパク質の少なくとも一部である、非限定的な例。本明細書で使用される場合、「抗体」という用語は、免疫グロブリン分子及び免疫グロブリン（Ｉｇ）分子、すなわち、抗原と特異的に結合する（免疫反応する）抗原結合部位を含有する分子の免疫学的に活性な部分を指すことができる。「特異的に結合する」又は「免疫反応する」とは、抗体が所望の抗原の１つ以上の抗原性決定部分と反応して、他のポリペプチドとは反応しないことを意味する。
【0038】
本明細書で使用される場合、「抗体断片」又は「抗原結合断片」という用語は、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖなどの、抗体の一部を指す。抗体断片は、構造に関係なく、完全な抗体によって認識されるのと同じ抗原と結合する。「抗体断片」という用語には、アプタマー（シュピーゲルマーなど）、ミニボディ（minibody）、及びダイアボディ（diabody）を包含させることができる。「抗体断片」という用語にはまた、特定の抗原に結合して複合体を形成することにより抗体のように作用する、任意の合成又は遺伝子操作されたタンパク質を包含させることができる。本明細書に記載の抗体、抗原結合ポリペプチド、バリアント、又は誘導体には、限定されないが、ポリクローナル、モノクローナル、多重特異性、ヒト、ヒト化若しくはキメラ抗体、単鎖抗体、エピトープ結合断片、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、Ｆｖｓ、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、単鎖抗体、ｄＡｂ（ドメイン抗体）、ミニボディ、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、ＶＬ又はＶＨドメインのいずれかを含む断片、Ｆａｂ発現ライブラリーによって生成された断片、及び抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体などが包含される。
【0039】
「単鎖可変断片」又は「ｓｃＦｖ」は、免疫グロブリンの重鎖（ＶＨ）及び軽鎖（ＶＬ）の可変領域の融合タンパク質を指す。単鎖Ｆｖ（「ｓｃＦｖ」）ポリペプチド分子は、共有結合したＶＨ：ＶＬヘテロ二量体であり、これは、ペプチドをコードするリンカーによって連結されたＶＨ及びＶＬコード遺伝子を含む遺伝子融合体から発現されることができる。（Ｈｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ Ｎａｔ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８５（１６）：５８７９－５８８３。）いくつかの態様では、領域は、１０～約２５アミノ酸の短いリンカーペプチドで連結される。リンカーは、柔軟性のためにグリシン、並びに溶解性のためにセリン又はスレオニンが豊富であってよく、ＶＨのＮ末端をＶＬのＣ末端と連結するか、又はその逆のいずれかであり得る。このタンパク質は、定常領域の除去及びリンカーの導入にもかかわらず、元の免疫グロブリンの特異性を保持している。抗体Ｖ領域からの自然に凝集されるが、化学的に分離された、軽及び重ポリペプチド鎖を、抗原結合部位の構造と実質的に類似する三次元構造に折り畳まれるであろう、ｓｃＦｖ分子に変換するための化学構造を識別するための多くの方法が記載されている。例えば米国特許第５，０９１，５１３号、同第５，８９２，０１９号、同第５，１３２，４０５号、及び同第４，９４６，７７８号を参照されたい（それらの各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
【0040】
ヒトから得られる抗体分子は、分子中に存在する重鎖の性質が互いに異なる、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、及びＩｇＤの５つのクラスのイムノグロブリンに分類される。当業者であれば、重鎖が、ガンマ、ミュー、アルファ、デルタ、又はイプシロン（γ、μ、α、δ、ε）として分類され、それらの中にもいくつかのサブクラス（例えば、γ１～γ４）があることを理解するであろう。特定のクラスは、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４などのサブクラスも有する。免疫グロブリンサブクラス（アイソタイプ）、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＧ５などは、十分に特徴付けられており、機能的特殊化を付与することが知られている。ＩｇＧに関しては、標準的な免疫グロブリン分子は、分子量が約２３，０００ダルトンの２つの同一の軽鎖ポリペプチド、及び分子量が５３，０００～７０，０００の２つの同一の重鎖ポリペプチドを含む。４つの鎖は、典型的には「Ｙ」字型にジスルフィド結合によって結合され、軽鎖は「Ｙ」の口から始まり、可変領域を通って続く重鎖を囲む。本明細書に記載の免疫グロブリン又は抗体分子は、免疫グロブリン分子の任意のタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、及びＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２）又はサブクラスであり得る。
【0041】
軽鎖は、カッパ又はラムダ（κ、λ）のいずれかに分類される。各重鎖のクラスは、カッパ又はラムダ軽鎖のいずれかと結合することができる。一般に、軽鎖と重鎖は互いに共有結合し、免疫グロブリンがハイブリドーマ、Ｂ細胞、又は遺伝子操作された宿主細胞のいずれかによって生成される場合、２つの重鎖の「尾」（tail）部は、共有ジスルフィド結合又は非共有結合によって互いに結合する。重鎖では、アミノ酸配列は、Ｙ字型に分岐した末端のＮ末端から各鎖の下部のＣ末端まで伸びている。
【0042】
軽鎖と重鎖のいずれも、構造的及び機能的な相同性領域に分けられる。「定常」及び「可変」という用語が、機能的な意味で使用される。軽鎖部分及び重鎖部分の両方の可変ドメイン（ＶＬ及びＶＨ）が、抗原の認識及び特異性を決定する。逆に、軽鎖及び重鎖の定常ドメイン（ＣＬ、並びにＣＨ１、ＣＨ２若しくはＣＨ３）は、分泌、経胎盤移動性、Ｆｃ受容体結合、補体結合などの重要な生物学的特性を付与する。「抗原結合部位」又は「結合部分」という用語は、抗原結合に関与する免疫グロブリン分子の部分を指すことができる。抗原結合部位は、重（「Ｈ」）鎖及び軽（「Ｌ」）鎖のＮ末端可変（「Ｖ」）領域のアミノ酸残基によって形成される。「超可変領域」と呼ばれる、重鎖及び軽鎖のＶ領域内の３つの高度に異なる区間は、「フレームワーク領域」又は「ＦＲ」として知られるより保存された隣接区間の間に挿入される。したがって、「ＦＲ」という用語は、免疫グロブリンの超可変領域の間、及びそれに隣接して天然に見られるアミノ酸配列を指すことができる。抗体分子において、軽鎖の３つの超可変領域及び重鎖の３つの超可変領域は、三次元空間で互いに対して配置されて、抗原結合表面を形成する。抗原結合表面は、結合した抗原の３次元表面に相補的であり、重鎖及び軽鎖の各々の３つの超可変領域は、「相補性決定領域」又は「complementarity-determining region、ＣＤＲ」と呼ばれる。ＣＤＲを含有する、ＶＨ及びＶＬ領域。
【0043】
本明細書で使用される場合、「モノクローナル抗体」又は「ｍＡｂ」又は「Ｍａｂ」又は「モノクローナル抗体組成物」という用語は、特有の軽鎖遺伝子産物及び特有の重鎖遺伝子産物からなる１つの抗体分子の分子種のみを含有する抗体分子の集団を指すことができる。特に、モノクローナル抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）は、集団の全ての分子で同一である。ＭＡｂは、それに対する特有の結合親和性を特徴とする抗原の特定のエピトープと免疫反応することができる抗原結合部位を含有する。
【0044】
モノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５）によって記載されるものなどの、ハイブリドーマ法を使用して調製することができる。ハイブリドーマ法では、マウス、ハムスター、又は他の適切な宿主動物は、典型的には、免疫剤で免疫化して、免疫剤に特異的に結合するであろう抗体を産生するか、又は産生することができるリンパ球を誘導する。代替として、リンパ球はインビトロで免疫化され得る。
【0045】
本明細書において、「自己抗体」は、動物からの抗原（例えば、「外来」抗原の代わりに自己抗原）と結合又は反応する、動物によって産生される抗体を指すことができる。一般に（例えば、疾患又は状態が存在しない場合）、動物は、自己抗原に対して寛容であり、自己抗体を産生しない。
【0046】
本明細書において、「自己免疫」は、自己抗原に対する免疫応答（例えば、抗体産生）を指すことができる。「自己免疫疾患」は、自己抗原に対する免疫応答から生じる疾患又は状態を指すことができる。
【0047】
本明細書において、「自己反応性」とは、自己免疫応答の成分を指すことができる。例えば、自己抗原に対して反応性の抗体を産生するＢ細胞は、自己反応性Ｂ細胞と呼ぶことができる。抗体は、自己反応性抗体と呼ぶことができる。自己抗体が反応性である自己抗原は、自己反応性抗原と呼ぶことができる。
【0048】
本明細書において、「Ｂ細胞」は、動物の体液性免疫応答において機能するリンパ球の一種を指すことができる。Ｂ細胞は、Ｂ細胞の表面上に提示される抗体を産生する。Ｂ細胞のより分化した形態である形質細胞は、抗体を分泌することができる。
【0049】
本明細書において、「Ｂ細胞受容体」又は「ＢＣＲ」は、シグナル伝達部分と共に表面上に提示される、Ｂ細胞によって産生される抗体を指すことができる。
【0050】
本明細書において、「枯渇させる」とは、除去又は低下させることを指すことができる。本明細書において、枯渇させるとは、自己反応性Ｂ細胞を除去することを指すことができる。枯渇させるとは、自己反応性Ｂ細胞を死滅させることを指すことができる。
【0051】
本明細書において、「デスモグレイン」及び「デスモコリン」は、デスモソームの形成に関与するカドヘリンのファミリーを指すことができる。
【0052】
本明細書において、「エフェクター細胞」は、自己反応性Ｂ細胞を枯渇させることができる細胞を指すことができる。いくつかの実施形態では、エフェクター細胞は、マクロファージ、ＮＫ細胞、Ｔ細胞などであり得る。
【0053】
本明細書において、「エピトープ」は、抗体（例えば、Ｂ細胞受容体）に結合する抗原の部分を指すことができる。このエピトープは、Ｂ細胞エピトープと呼ぶことができ、Ｔ細胞エピトープと区別することができる。
【0054】
「エピトープ」という用語は、免疫グロブリン、ｓｃＦｖ、又はＴ細胞受容体に特異的に結合することができる任意のタンパク質決定因子を含み得る。可変領域は、抗体が抗原上のエピトープを選択的に認識し、特異的に結合することを可能にする。例えば、抗体のＶＬドメイン及びＶＨドメイン、又は相補性決定領域（ＣＤＲ）のサブセットが組み合わされて、三次元抗原結合部位を定義する可変領域を形成する。この四次抗体構造は、Ｙの各アームの末端に存在する抗原結合部位を形成する。エピトープ決定基は、アミノ酸又は糖側鎖などの分子の化学的に活性な表面グルーピングからなっていてもよく、通常は、特異的な三次元構造特徴、及び特異的な電荷特徴を有する。例えば、抗体は、ポリペプチドのＮ末端又はＣ末端ペプチドに対して産生され得る。より具体的には、抗原結合部位は、ＶＨ及びＶＬ鎖の各々の上の３つのＣＤＲ（すなわち、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、ＣＤＲ－Ｈ３、ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２及びＣＤＲ－Ｌ３）によって定義される。
【0055】
本明細書において、「細胞外ドメイン」は、細胞の細胞膜の外表面から延びる細胞膜タンパク質の部分を指すことができる。
【0056】
本明細書において、「Ｆｃ領域」（断片結晶化可能領域）は、Ｆｃ受容体に結合する抗体のテール領域を指すことができる。Ｆｃ領域は、抗体をパパインで消化することにより回収することができる。
【0057】
本明細書において、「Ｆｃ受容体」又は「ＦｃＲ」は、抗体のＦｃ領域に結合することができる受容体を指すことができる。Ｆｃ受容体は、ナチュラルキラー細胞及びマクロファージを含む特定の細胞の表面上に存在する。
【0058】
本明細書で使用される場合、「免疫学的結合」及び「免疫学的結合特性」という用語は、免疫グロブリン分子と免疫グロブリンが特異的である抗原との間で生じるタイプの非共有相互作用を指すことができる。いくつかの実施形態では、これらの用語は、ＦｃドメインのＦｃ受容体への結合を説明し得る。免疫学的結合相互作用の強度、又は親和性は、相互作用の解離定数（Ｋｄ）に関して表すことができ、Ｋｄが小さいほど、より大きな親和性を表す。選択されたポリペプチドの免疫学的結合特性は、当技術分野で周知の方法を使用して定量化することができる。１つのそのような方法は、抗原結合部位／抗原複合体形成及び解離の速度を測定することを伴い、それらの速度は、複合体パートナーの濃度、相互作用の親和性、及び両方向の速度に等しく影響する幾何学的パラメータに依存する。したがって、両方の「オン速度定数」（Ｋｏｎ）及び「オフ速度定数」（Ｋｏｆｆ）は、濃度並びに会合及び解離の実際の速度の計算によって決定することができる。（Ｎａｔｕｒｅ ３６１：１８６－８７（１９９３）を参照されたい）。Ｋｏｆｆ／Ｋｏｎの比は、親和性に関連しない全てのパラメータの相殺を可能にし、平衡結合定数ＫＤに等しい。（一般に、Ｄａｖｉｅｓ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ ５９：４３９－４７３を参照のこと）。本発明の抗体は、動的アッセイ、例えば、放射性リガンド結合アッセイ又は当業者に公知の類似のアッセイ、例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ又はＯｃｔｅｔ（ＢＬＩ）によって測定して、平衡結合定数（ＫＤ）が≦１μＭ、≦１０μＭ、≦１０ｎＭ、≦１０ｐＭ、又は≦１００ｐＭ～約１ｐＭである場合に、エピトープに特異的に結合することができる。例えば、いくつかの実施形態では、ＫＤは、約１Ｅ－１２Ｍ～約１Ｅ－１１Ｍの間のＫＤである。いくつかの実施形態では、ＫＤは、約１Ｅ－１１Ｍ～約１Ｅ－１０Ｍの間のＫＤである。いくつかの実施形態では、ＫＤは、約１Ｅ－１０Ｍ～約１Ｅ－９Ｍの間のＫＤである。いくつかの実施形態では、ＫＤは約１Ｅ－９Ｍ～約１Ｅ－８Ｍの間のＫＤである。くつかの実施形態では、ＫＤは、約１Ｅ－８Ｍ～約１Ｅ－７Ｍの間のＫＤである。いくつかの実施形態では、ＫＤは、約１Ｅ－７Ｍ～約１Ｅ－６Ｍの間のＫＤである。例えば、いくつかの実施形態では、ＫＤは約１Ｅ－１２Ｍであり、他の実施形態では、ＫＤは約１Ｅ－１１Ｍである。いくつかの実施形態では、ＫＤは約１Ｅ－１０Ｍであり、他の実施形態では、ＫＤは約１Ｅ－９Ｍである。いくつかの実施形態では、ＫＤは約１Ｅ－８Ｍであり、他の実施形態では、ＫＤは約１Ｅ－７Ｍである。いくつかの実施形態では、ＫＤは約１Ｅ－６Ｍであり、他の実施形態では、ＫＤは約１Ｅ－５Ｍである。いくつかの実施形態では、例えば、ＫＤは約３Ｅ－１１Ｍであり、他の実施形態では、ＫＤは約３Ｅ－１２Ｍである。いくつかの実施形態では、ＫＤは約６Ｅ－１１Ｍである。「特異的に結合する」又は「特異性を有する」は、抗体の抗原結合ドメインを介してエピトープに結合する抗体を指すことができ、結合は抗原結合ドメインとエピトープとの間のいくつかの相補性を伴う。例えば、抗体は、ランダムな無関係のエピトープに結合するよりも容易に、その抗原結合ドメインを介して、そのエピトープに結合する場合に、エピトープに「特異的に結合する」と言われる。
【0059】
本明細書において、「融合タンパク質」は、元々別々の遺伝子であった遺伝子を接続することによって作製されたタンパク質を指すことができる。
【0060】
本明細書において、「マクロファージ」は、貪食白血球の一種を指すことができる。
【0061】
本明細書において、「ナチュラルキラー細胞」又は「ＮＫ細胞」は、細胞傷害性リンパ球の一種を指すことができる。
【0062】
本明細書において、本明細書で使用される「ポリペプチド」は、単一の「ポリペプチド」及び複数の「ポリペプチド」を包含することができ、アミド結合（ペプチド結合としても知られる）によって直鎖状に連結された単量体（アミノ酸）から構成される分子を指す。「ポリペプチド」という用語は、２つ以上のアミノ酸の任意の１つ以上の鎖を指し、特定の長さの生成物を指すものではない。したがって、ペプチド、ジペプチド、トリペプチド、オリゴペプチド、「タンパク質」、「アミノ酸鎖」、又は２つ以上のアミノ酸の鎖を指すために使用される任意の他の用語は、本明細書では「ポリペプチド」を指すことができ、用語「ポリペプチド」は、これらの用語の代わりに、又はこれらの用語のいずれかと交換可能に使用することができる。「ポリペプチド」はまた、限定されないが、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、既知の保護／ブロック基による誘導体化、タンパク質分解切断、又は天然に存在しないアミノ酸による改変などの、ポリペプチドの発現後改変産物を指すこともできる。ポリペプチドは、天然の生物学的供給源に由来することができるか、又は組換え技術によって産生されることができるが、必ずしも特定の核酸配列から翻訳される必要はない。それは、化学合成を含む任意の方法で生成させ得る。ポリペプチド（抗体など）又はポリヌクレオチドに関連する「組換え」とは、天然には存在しないポリペプチド又はポリヌクレオチドの形態を指し、その非限定的な例は、通常では一緒にはならないポリヌクレオチド又はポリペプチドを組み合わせることによって作製することができる。
【0063】
本明細書において、「ソルターゼ」は、一般にペプチド、ポリペプチド又はタンパク質中のカルボキシ末端認識シグナルを認識及び切断する細菌由来の酵素を指すことができる。いくつかの実施形態では、認識シグナルは、アミノ酸モチーフＬｅｕ－Ｐｒｏ－Ｘ－Ｔｈｒ－Ｇｌｙを含むことができ、ここで「Ｘ」は任意のアミノ酸であり得る。
【0064】
本明細書において、「Ｔ細胞」は、動物の細胞性免疫応答において機能する種類のリンパ球を指すことができる。
【0065】
本明細書において、「標的とする」は、動詞として使用される場合、何か他のものを特異的に攻撃する細胞又は分子を指すことができる（例えば、融合タンパク質がＢ細胞に付着し、Ｂ細胞を枯渇させるエフェクター細胞を運ぶ、その融合タンパク質及びそのエフェクター細胞は、Ｂ細胞を標的とする）。「標的」は、名詞として使用される場合、例えば、枯渇したＢ細胞を指し得る。
【0066】
自己免疫疾患
本明細書に開示される試薬及び方法が、治療するように設計される疾患又は状態は、自己免疫状態又は疾患であり得る。治療される疾患又は状態は、自己反応性Ｂ細胞が、自己抗原又は自己反応性に特異的な自己反応性抗体を産生するものを伴い得る。疾患としては、例えば、自己免疫性水疱症、狼瘡、強皮症、グッドパスチャー病、グレーブス病、免疫介在性血管炎などが挙げられ得る。
本明細書に開示される試薬及び方法が、治療するように設計される疾患又は状態は、自己免疫状態又は疾患であり得る。治療される疾患又は状態は、自己反応性Ｂ細胞が、自己抗原又は自己反応性に特異的な自己反応性抗体を産生するものを伴い得る。疾患としては、例えば、自己免疫性水疱症、狼瘡、強皮症、グッドパスチャー病、グレーブス病、免疫介在性血管炎などが挙げられ得る。
【0067】
疾患は、（ＭｕＳＫ）重症筋無力症（ＭＧ）を含むことができ、これは、異なる病因及び異常な臨床的特徴を有する、ＭＧの稀な、多くの場合、より重度のサブタイプである。
【0068】
疾患は、ＰＬＡ２Ｒ膜性腎症を含むことができる。ＰＬＡ２Ｒは、腎糸球ポドサイトに存在する自己抗原である。膜性腎症（Membranous nephropathy、ＭＮ）は、循環抗体が糸球体基底膜を透過し、上皮下腔において、ポドサイト膜上のエピトープと免疫複合体を形成する場合に起こり得る。
【0069】
その疾患は、ＦＶＩＩＩ同種抗体を伴う血友病Ａを含み得る。
【0070】
いくつかの実施形態では、疾患又は状態は、尋常性天疱瘡、水疱性類天疱瘡、粘膜類天疱瘡、後天性表皮水疱症、線状ＩｇＡ水疱性皮膚症、落葉状天疱瘡、表皮内好中球性ＩｇＡ皮膚症、及び腫瘍随伴性天疱瘡などの自己免疫性水疱症を含み得る。
【0071】
いくつかの実施形態では、疾患又は状態は、ヒト、イヌ、ネコ又はウマを含む動物に存在し得る。
【0072】
いくつかの実施形態では、疾患又は状態を有する動物に存在する自己反応性抗体は、デスモプラキン、エンボプラキン、ペリプラキン、プレクチン、水疱性類天疱瘡抗原１、コルネオデスモシン、微小管アクチン架橋因子、エピプラキン及びカドヘリンなどの分子を含む自己反応性抗原に特異的であり得る。
【0073】
いくつかの実施形態では、自己反応性抗原は、デスモグレイン－１（Ｄｓｇ１）、デスモグレイン－２（Ｄｓｇ２）、デスモグレイン－３（Ｄｓｇ３）、デスモグレイン－４（Ｄｓｇ４）、デスモコリン－１（Ｄｓｃ１）デスモコリン－２（Ｄｓｃ２）、及びデスモコリン－３（Ｄｓｃ３）などのデスモソームカドヘリンであり得る。
【0074】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される試薬及び方法における目的の自己反応性抗原の領域は、図２Ｂ及び図１３に示されるように、細胞外（ＥＣ）ドメインである自己反応性抗原の一部分である。少なくともいくつかの実施形態では、上述の疾患及び状態における自己反応性抗体は、自己反応性抗原のＥＣドメインに特異的であり得る。自己反応性抗体が結合する自己反応性抗原内の特異的エピトープは、自己反応性エピトープと呼ばれ得る。概して、ここでの関心は、自己反応性Ｂ細胞を標的とすることであるため、関連するエピトープは、Ｂ細胞エピトープであり得る。自己反応性抗原のＢ細胞自己反応性エピトープは、自己反応性Ｂ細胞のＢ細胞受容体（ＢＣＲ）に結合することができる。いくつかの実施形態では、それを標的とするように本明細書に開示される試薬及び方法が設計されるＢ細胞は、例えば、Ｄｓｇ１、Ｄｓｇ２、Ｄｓｇ３、Ｄｓｇ４、Ｄｓｃ１、Ｄｓｃ２、及びＤｓｃ３などの分子のＥＣドメイン由来のこれらのエピトープに結合することができるＢＣＲを有する、自己反応性Ｂ細胞である。
【0075】
一般に、上述の自己反応性抗原は、自己反応性抗体の産生を刺激する。いくつかの実施形態では、産生される自己反応性抗体は、「病原性」であり得る。いくつかの実施形態では、産生される自己反応性抗体は、「非病原性」であり得る。病原性抗体は、一般に、天疱瘡などの自己免疫疾患の症状及び／又は病状を生じる。機構に拘束されることを望まないが、病原性抗体は、それらが結合するタンパク質の機能を阻害することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される療法は、病原性自己反応性抗体を産生するＢ細胞を標的とすることができる。
【0076】
一般に、天疱瘡などのいくつかの自己免疫性水疱症について、自己反応性抗原の細胞外（ＥＣ）ドメイン（例えば、図２Ｂ及び１３を参照されたい）は、病原性又は非病原性であり得る。いくつかの実施形態では、デスモグレイン及び／又はデスモコリンのＥＣドメインは、病原性又は非病原性であり得る。いくつかの実施形態では、Ｄｓｇ１、Ｄｓｇ２、Ｄｓｇ３及び／又はＤｓｇ４のＥＣ１、ＥＣ２及び／又はＥＣ４ドメインは、病原性であり得る。いくつかの実施形態では、Ｄｓｇ３及びＤｓｇ１のＥＣ１、ＥＣ２及び／又はＥＣ４ドメインは、病原性であり得る。理論に束縛されることを望まないが、治療薬中に病原性ＥＣドメインと共に非病原性又は低病原性ＥＣドメインを含めることは、本明細書に開示される治療薬の有効性に影響を及ぼすとは考えられない。
【0077】
理論に束縛されることを望まないが、ＥＣドメインの免疫原性のレベル（例えば、図２ＢにおけるＥＣドメインに対する自己反応性抗体を有する天疱瘡患者のパーセントを参照されたい）は、病原性と高度に相関し得るか、又は相関し得ない。
【0078】
自己反応性Ｂ細胞を枯渇させる
本開示は、自己免疫疾患又は状態を有する、ヒトを含む動物における療法のための複数のアプローチを記載する。本明細書に開示される試薬及び方法は、動物における自己反応性Ｂ細胞を標的とし、枯渇させることができる。
本開示は、自己免疫疾患又は状態を有する、ヒトを含む動物における療法のための複数のアプローチを記載する。本明細書に開示される試薬及び方法は、動物における自己反応性Ｂ細胞を標的とし、枯渇させることができる。
【0079】
いくつかの実施形態では、自己反応性Ｂ細胞を枯渇させるために使用される試薬は、融合タンパク質であり得る。融合タンパク質は、別々のドメイン又は領域を有し得る。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、自己反応性エピトープと反応性のＢ細胞の表面上のＢ細胞受容体（ＢＣＲ）に結合する１つ以上の自己反応性エピトープを含有し得る。いくつかの実施形態では、融合タンパク質はまた、エフェクター細胞に結合することができるドメインを含有し得る。いくつかの実施形態では、エフェクター細胞に結合することができるドメインは、抗体のＦｃドメインであり得る。これらの治療薬は、Ｆｃ媒介性治療薬と呼ばれ得る。いくつかの実施形態では、エフェクター細胞に結合することができるドメインは、エフェクター細胞に結合する抗体であり得る。これらの治療薬は、ＢＣＲエフェクター細胞エンゲージャと呼ばれ得る。抗体がＴ細胞に結合することができる実施形態では、治療薬は、ＢＣＲ－Ｔ細胞エンゲージャと呼ばれ得る。
【0080】
いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、１つ以上の自己反応性Ｂ細胞エピトープを含むドメインを有し得る。自己反応性Ｂ細胞エピトープは、上述の自己反応性抗原のいずれかに由来していてもよく、いくつかの実施形態では、自己反応性抗原のＥＣドメインに由来する。融合タンパク質という文脈の中で、自己反応性Ｂ細胞エピトープは、標的自己反応性Ｂ細胞のＢＣＲに結合することができるように構成される。いくつかの実施形態では、自己反応性Ｂ細胞エピトープは、融合タンパク質の末端に位置し得る。いくつかの例では、Ｂ細胞エピトープは、融合タンパク質のＮ末端に位置し得る。
【0081】
いくつかの実施形態では、「ノブ－イントゥ－ホール（ｋｎｏｂ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅ）」戦略を使用して、複数の自己反応性Ｂ細胞エピトープを含む複数のエピトープを含むＦｃ媒介性治療薬を生成することができる。ノブ－イントゥ－ホールは、例えば、２つのＩｇＧ重鎖由来の別個のＣＨ３ドメイン（ＣＨ３ドメインはＦｃ領域の一部分を含有する）を、別個のＣＨ３ドメインのヘテロ二量化が好まれるように「ノブ（ｋｎｏｂ）」又は相補的な「ホール（ｈｏｌｅ）」を含有するように変化させるアプローチである（Ｒｉｄｇｗａｙ，Ｊｏｈｎ ＢＢ，Ｌｅｏｎａｒｄ Ｇ．Ｐｒｅｓｔａ，ａｎｄ Ｐａｕｌ Ｃａｒｔｅｒ．「『Ｋｎｏｂｓ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅｓ』ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｙ ＣＨ３ ｄｏｍａｉｎｓ ｆｏｒ ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ．」Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ９．７（１９９６）：６１７－６２１）。いくつかの実施形態では、２つの組換えポリペプチドが設計される。第１のポリペプチドは、第１の自己反応性抗原（例えば、１つ以上のＥＣドメイン）及び「相補的」ＣＨ３ドメインのうちの１つを含有し得る。第２のポリペプチドは、第２の自己反応性抗原及び「相補的」ＣＨ３ドメインの他方を含有し得る。第１のポリペプチドを第２のポリペプチドと接触させると、２つのＣＨ３ドメインが優先的にヘテロ二量体化し、ポリペプチド間にジスルフィド結合が形成される。ホモ二量体化は好まれない。ヘテロ二量体化した分子は、一般に、機能的Ｆｃ領域及び２つの別個の自己反応性抗原を含有する。いくつかの実施形態では、ヘテロ二量体化した分子は、２つより多い抗原を含有し得る。
【0082】
いくつかの実施形態では、「ノブ－イントゥ－ホール」分子中の別個の抗原は、異なる自己反応性抗原に由来し得る。いくつかの実施形態では、別個の抗原は、同じ自己反応性抗原由来の異なるエピトープを含有し得る。いくつかの実施形態では、別個の抗原は、Ｄｓｇ３及び／又はＤｓｇ１由来であり得る。いくつかの実施形態では、別個の抗原は、デスモグレインの異なる細胞外（ＥＣ）ドメインに由来し得る。いくつかの実施形態では、別個の抗原は、デスモグレイン分子のＥＣ１、ＥＣ２、ＥＣ３、ＥＣ４及びＥＣ５から選択することができる。例えば、別個の抗原は、ＥＣ１及びＥＣ２由来であり得る。
【0083】
いくつかの実施形態では、自己反応性Ｂ細胞エピトープは、デスモソームカドヘリンのＥＣ１、ＥＣ２及び／又はＥＣ４ドメインに由来し得る（Ｃｈｏ，Ａｌｉｃｅ，ｅｔ ａｌ．「Ｓｉｎｇｌｅ－ｃｅｌｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｓｕｇｇｅｓｔｓ ｔｈａｔ ｏｎｇｏｉｎｇ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ ｄｒｉｖｅｓ ｔｈｅ ｅｍｅｒｇｅｎｃｅ ｏｆ ｐｅｍｐｈｉｇｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ ｄｉｓｅａｓｅ．「Ｃｅｌｌ ｒｅｐｏｒｔｓ」２８．４（２０１９）：９０９－９２２を参照されたい）。いくつかの実施形態では、ＥＣ３が含まれ得る。いくつかの実施形態では、自己反応性Ｂ細胞エピトープは、Ｄｓｇ３のＥＣ１、ＥＣ２及び／又はＥＣ４ドメインに由来する。いくつかの実施形態では、自己反応性Ｂ細胞エピトープは、Ｄｓｇ３のＥＣ１及び／又はＥＣ２ドメインに由来する。いくつかの実施形態では、単一融合タンパク質は、１つ以上のデスモグレインからの複数のＥＣドメイン（例えば、ＥＣ１、ＥＣ２及びＥＣ３のうちの２つ以上、（例えば、ＥＣ１－ＥＣ４）を有し得る。いくつかの実施形態では、各々がＤｓｇ３のＥＣ１、ＥＣ２、ＥＣ３又はＥＣ４ドメインの１つを含有する別個の融合タンパク質を組み合わせて組成物とし、患者における療法に使用してもよい。
【0084】
理論に束縛されることを望まないが、治療薬は、患者において自己反応性抗体に結合するものに対応するＥＣドメイン、並びに自己反応性抗体が患者において現在検出されていないものに対応するＥＣドメインの両方を含有するように設計され得る。「エピトープ拡散」として当該分野で公知の現象では、一部の患者は、抗原上の１つのエピトープと反応性であるが、その抗原上の他のエピトープとは反応性でない自己反応性抗体を有する。しかし、時間経過と共に、患者は、最初に自己反応性抗体を刺激しなかったエピトープのうちの１つ以上に対する自己反応性抗体を発生し得る。本明細書に開示される治療薬に、自己反応性抗体が後に出現するエピトープを含めることにより、後に生じる抗体によって引き起こされる疾患の症状を予防又は軽減することができる。いくつかの実施形態では、最初にＤｓｇ３又はＤｓｇ１のＥＣ５のみに対する自己反応性抗体を有する患者において、ＥＣ１、ＥＣ２、ＥＣ４、及びＥＣ５を含有する治療薬を投与することは、患者にとって有益であり得る。
【0085】
いくつかの実施形態では、自己反応性Ｂ細胞エピトープは、プラキン（例えば、エンボプラキン、ペリプラキン、デスモプラキンＩ、デスモプラキンＩＩ、エピプラキン、プレクチン、ＢＰ２３０）、カドヘリン（（Ｄｓｇ３、Ｄｓｇ１、Ｄｓｃ１、Ｄｓｃ２、Ｄｓｃ３、α２－マクログロブリン様分子）、ＢＰ１８０（例えば、ＮＣ１６Ａ、ＬＡＢＤ９７、ＬＡＤ－１ドメイン又はＣ末端エピトープ）、ラミニン３３２、α６β４インテグリン、コラーゲンＶＩＩ、ラミニンガンマ１（ｐ２００）、ＶＩＩ型コラーゲン、表皮トランスグルタミナーゼ、組織トランスグルタミナーゼ、筋内膜又は脱アミド化グリアジンに由来し得る。
【0086】
一般に、自己反応性抗体は、任意のクラスの抗体（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ又はＩｇＭ）であり得る。いくつかの場合では、自己反応性抗体は、ＩｇＡ又はＩｇＧであり得る。
【0087】
いくつかの実施形態では、自己反応性Ｂ細胞エピトープの代わりに、アレルゲン、アレルゲンの一部、又はアレルゲンを模倣することができる分子が、本明細書に開示されるＦｃ媒介性治療薬又はＢＣＲ－Ｔ細胞エンゲージャの一部であり得る。多くの異なるアレルゲンが存在する。アレルゲンの非限定的な例は、薬物、食品、昆虫（例えば、昆虫刺症、チリダニ）、ラテックス、カビ、ペット／動物（例えば、鱗屑）及び花粉に由来し得る。アレルゲンは、ツタウルシ、イースタンポイズンオーク、ウェスタンポイズンオーク、毒ウルシなどの植物に見られるような、ウルシオールを含み得る。いくつかの実施形態では、アレルゲンは、Ｂｅｔ ｖ １などのカバノキ花粉アレルゲンであり得る。いくつかの実施形態では、アレルゲン／アレルゲンの一部は、タンパク質、ポリペプチド又はポリペプチドであり得る。
【0088】
いくつかの例では、アレルギーは、Ｉ型過敏症であり得る。例えば、アレルギーは、ＩｇＥによって媒介され得る。Ｂ細胞は、ＩｇＥを産生することができる。次いで、ＩｇＥは、例えば、肥満細胞、好塩基球などに見出されるＩｇＥ特異的受容体に結合してもよく、これらの細胞は、サイトカイン、血管作用性アミン（例えば、ヒスタミン）、プロテアーゼ、プロスタグランジン、ロイコトリエンなどのようなアレルギーのメディエーターを放出し得る。いくつかの実施形態では、Ｆｃ媒介性治療薬又はＢＣＲ－Ｔ細胞エンゲージャの一部であるアレルゲンは、ＩｇＥを産生するＢ細胞に結合してこれを枯渇させることができる。いくつかの例では、アレルギーは、ＩＩ型、ＩＩＩ型又はＩＶ型過敏症であり得る。
【0089】
いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、エフェクター細胞に結合するドメインを有し得る。自己反応性Ｂ細胞エピトープ及びエフェクター細胞結合ドメインを有する融合タンパク質では、融合タンパク質は、自己反応性Ｂ細胞エピトープのＢ細胞上のＢＣＲに対する結合が、エフェクター細胞がＢ細胞に作用してＢ細胞を枯渇させることができるように、融合タンパク質のエフェクター細胞結合ドメインに結合したエフェクター細胞をＢ細胞に近接して共局在化させるように構成することができる。いくつかの実施形態では、エフェクター細胞に結合するドメインは、抗体のＦｃ部分であり得る。いくつかの実施形態では、エフェクター細胞に結合するドメインは、エフェクター細胞に特異的な抗体であり得る。
【0090】
いくつかの実施形態では、エフェクター細胞結合ドメインは、融合タンパク質の末端に位置し得る。いくつかの例では、エフェクター細胞結合ドメインは、融合タンパク質のＣ末端に位置し得る。
【0091】
いくつかの実施形態では、融合タンパク質のエフェクター細胞結合ドメインが結合することができるエフェクター細胞は、貪食細胞又は食細胞であり得る。食細胞は、いわゆる「プロフェッショナル」及び「非プロフェッショナル」食細胞を含み得る。いくつかの実施形態では、プロフェッショナル食細胞は、単球、マクロファージ、好中球、樹状細胞及び肥満細胞を含み得る。いくつかの実施形態では、非プロフェッショナル食細胞は、特定のＴ細胞（例えば、細胞傷害性Ｔ細胞）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を含み得る。
【0092】
いくつかの実施形態では、エフェクター細胞に結合する融合タンパク質のドメインは、抗体のＦｃ部分又はドメインであり得る。一般に、任意のＦｃ部分が、本明細書に開示される試薬及び方法において使用され得る。いくつかの実施形態では、エフェクター細胞（例えば、ＮＫ細胞、マクロファージなど）に結合することができる任意のＦｃ部分を使用することができる。いくつかの実施形態では、標的病原性Ｂ細胞（例えば、自己反応性Ｂ細胞）の枯渇を媒介することができる任意のＦｃ部分を使用することができる。Ｆｃ部分は、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）を有する細胞に結合することができる。Ｆｃ部分は、細胞上のＦｃＲに結合することができる。いくつかの実施形態では、ＦｃＲは、Ｆｃ－ガンマ受容体（Fc-gamma receptor、ＦｃγＲ）、Ｆｃ－アルファ受容体（Fc-alpha receptor、ＦｃαＲ）、又はＦｃ－エプシロン受容体（Fc-epsilon receptor、ＦｃεＲ）であり得る。いくつかの実施形態では、ＦｃγＲは、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ又はＦｃγＲＩＩＩであり得る。融合タンパク質の文脈では、抗体のＦｃ部分は、細胞上のＦｃ受容体（ＦｃＲ）に結合することができるように構成される。
【0093】
いくつかの実施形態では、本明細書で使用される抗体のＦｃ部分又はドメインは、改変され得る。いくつかの実施形態では、１つの改変又は複数の改変は、様々な細胞上のＦｃ受容体に対するＦｃ領域の結合に影響を及ぼし得る。いくつかの実施形態では、改変は、Ｆｃ領域が結合する細胞の機能に影響を及ぼし得る。いくつかの実施形態では、Ｆｃ部分又はドメインは、Ｆｃドメイン上の保存されたＮ－グリコシル化部位において不均一に改変され得る。いくつかの実施形態では、複雑な二分岐グリカンを、Ｆｃドメイン上の保存されたＮ－グリコシル化部位に結合させることができる（Ｌｉ，Ｔｉｅｚｈｅｎｇ，ｅｔ ａｌ．「Ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ ＩｇＧ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｂｙ Ｆｃ ｇｌｙｃａｎ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．」Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １１４．１３（２０１７）：３４８５－３４９０を参照されたい）。一般に、改変されたＦｃドメインがエフェクター細胞（例えば、ＮＫ細胞、マクロファージなど）に結合することができる限り、任意の種類のＦｃドメイン改変を使用することができる。一般に、改変されたＦｃドメインが標的病原性Ｂ細胞（例えば、自己反応性Ｂ細胞）の枯渇を媒介することができる限り、任意の種類のＦｃドメイン改変を使用することができる。
【0094】
融合タンパク質内で、Ｆｃ部分はまた、Ｆｃ部分が結合するエフェクター細胞が、融合タンパク質の自己反応性Ｂ細胞エピトープが結合する自己反応性Ｂ細胞に近接して共局在化されるように構成され得る。ＦｃＲを有し、融合タンパク質のＦｃ部分が結合することができるエフェクター細胞には、例えば、好中球、単球、マクロファージ、肥満細胞及び樹状細胞が含まれ得る。
【0095】
いくつかの実施形態では、エフェクター細胞に結合する融合タンパク質のドメインは、エフェクター細胞に結合する抗体であり得る。本明細書では、自己反応性抗原及びエフェクター細胞に結合する抗体を含有する融合タンパク質は、ＢＣＲ－エフェクター細胞エンゲージャと呼ばれ得る。いくつかの実施形態では、抗体は、Ｔ細胞に結合する抗体（例えば、抗ＣＤ３抗体）又は特定の種類のＴ細胞であり得る。いくつかの実施形態では、抗体は、細胞傷害性Ｔ細胞に結合する抗体（例えば、抗ＣＤ８抗体）又はヘルパーＴ細胞に結合する抗体（例えば、抗ＣＤ４抗体）であり得る。いくつかの実施形態では、抗体は、例えば、マクロファージ、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞又は他の食細胞に結合する抗体であり得る。いくつかの例では、ＮＫ細胞に結合する抗体又は抗体の組み合わせを使用することができる。いくつかの例では、抗ＣＤ５６抗体が使用され得る。いくつかの実施形態では、抗体は、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）であり得る。
【0096】
融合タンパク質内で、エフェクター細胞に結合する抗体は、特異的なエフェクター細胞に結合することができるように構成される。いくつかの実施形態では、抗体は、１つ以上の所望のエフェクター細胞に結合することができるが、他の細胞には結合しないか、又はより低い効率で結合する。融合タンパク質内で、エフェクター細胞に結合する抗体はまた、抗体が結合するエフェクター細胞が、融合タンパク質の自己反応性Ｂ細胞エピトープが結合する自己反応性Ｂ細胞に近接して共局在化するように構成される。この共局在化は、エフェクター細胞が自己反応性Ｂ細胞と相互作用／作用する能力を促進する。
【0097】
本明細書に開示される融合タンパク質は、スペーサ又はリンカーを更に有し得る。一般に、スペーサは、自己反応性Ｂ細胞エピトープドメインとエフェクター細胞に結合するドメインとの間の融合タンパク質内に位置し得る。スペーサは、融合タンパク質内の別個のドメインがそれぞれ所望の機能を果たすことを促進し得る。例えば、自己反応性Ｂ細胞エピトープを含む融合タンパク質のドメインとエフェクター細胞に結合するドメインとの間に位置するスペーサは、自己反応性Ｂ細胞上のＢＣＲに結合する自己反応性Ｂ細胞エピトープを提供することができ、同時に、エフェクター細胞結合ドメインは、自己反応性Ｂ細胞に近接したエフェクター細胞に結合し、共局在化することができる。スペーサは、自己反応性Ｂ細胞を枯渇させるための共局在化したエフェクター細胞を提供することができる。
【0098】
いくつかの実施形態では、スペーサは、アミノ酸スペーサであり得る。いくつかの実施形態では、スペーサは、約２～５０アミノ酸長であり得る。いくつかの実施形態では、スペーサは、約５～４５、６～４０、７～３５、８～３０、９～２５、又は１０～２０アミノ酸長であり得る。いくつかの実施形態では、スペーサは、融合タンパク質の可撓性を増加させることができる可撓性スペーサであり得る。
【0099】
いくつかの実施形態では、可撓性ペプチドスペーサは、小さい極性（例えば、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ）又は非極性（例えば、Ｇｌｙ）アミノ酸を含み得る。可撓性ペプチドスペーサは、Ｇｌｙ及びＳｅｒ残基の配列（例えば、「ＧＳ」リンカー）を有し得る。例示的なＧＳリンカーアミノ酸配列は、（Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ）ｎを含み得る。例示的なペプチドスペーサは、（Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ）３であり得る。他の種類の可撓性スペーサとしては、ＫＥＳＧＳＶＳＳＥＱＬＡＱＦＲＳＬＤ、ＥＧＫＳＳＧＳＧＳＥＳＫＳＴ、（Ｇｌｙ）８、ＧＳＡＧＳＡＡＧＳＧＥＦ及び（ＧＧＧＧＳ）４を挙げることができる（Ｃｈｅｎ，Ｘｉａｏｙｉｎｇ，Ｊｅｎｎｉｃａ Ｌ．Ｚａｒｏ，ａｎｄ Ｗｅｉ－Ｃｈｉａｎｇ Ｓｈｅｎ．「Ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｌｉｎｋｅｒｓ：ｐｒｏｐｅｒｔｙ，ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｔｙ．」Ａｄｖａｎｃｅｄ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｒｅｖｉｅｗｓ ６５．１０（２０１３）：１３５７－１３６９）。他の例示的な種類のスペーサは、剛性スペーサ又は切断可能スペーサであり得る。
【0100】
融合タンパク質のいくつかの実施形態では、自己反応性Ｂ細胞エピトープ及びエフェクター細胞結合ドメインを含むドメインは、種々の化学を使用して互いに接続され得る。いくつかの実施形態では、いわゆる「クリック」化学を使用することができる。いくつかの実施形態では、ソルターゼ酵素を使用することができる。
【0101】
いくつかの実施形態では、ドメインは、Ｃ－Ｃ融合化学を使用して接続され得る。例えば、ソルターゼを用いて、自己反応性Ｃ細胞エピトープドメインのＣ末端及びエフェクター細胞結合ドメインにクリック「ハンドル」を導入することができる。２つの改変されたドメインを、例えばアジド－アルキンクリック化学を用いて一緒に「クリック」して、Ｃ－Ｃ融合体を生成することができる（図８Ａ）。
【0102】
いくつかの実施形態では、ドメインは、Ｎ－Ｃ融合化学を使用して接続され得る。例えば、ソルターゼ酵素の可逆性を使用して、トリグリシン分子（Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ）は、２つのドメインのＮ－Ｃ融合体の形成を触媒するために使用され得る。ドメインの１つ（第１のドメイン）は、そのＣ末端にＬｅｕ－Ｐｒｏ－Ｇｌｕ－Ｔｈｒ－Ｇｌｙを有するように改変することができる。他方のドメイン（第２のドメイン）は、そのＮ末端にＬｅｕ－Ｐｒｏ－Ｇｌｕ－Ｔｈｒ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙを有するように改変することができる。トリグリシン及びソルターゼの存在下で２つの改変ドメインを反応させることによって、Ｌｅｕ－Ｐｒｏ－Ｇｌｕ－Ｔｈｒセグメントが第２の改変ドメインから除去され、Ｇｌｙ３に変換される。次いで、Ｇｌｙ３－第２のドメインは、改変された第１のドメインと反応して、融合タンパク質を形成することができる（図８Ｂ）。
【0103】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される融合タンパク質は、治療用部分、イメージング部分、捕捉部分、及びそれらの組み合わせなどの追加の部分／ドメインを含み得る。いくつかの実施形態では、クリック化学及び／又はソルターゼ酵素を使用して、これらの部分を融合タンパク質に付加することができる。いくつかの実施形態では、治療用部分は、細胞毒素、毒素、放射線療法剤、Ｔ細胞結合部分、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞結合部分、又はそれらの組み合わせを含み得る。いくつかの実施形態では、治療用部分は、ＩＬ－２又はＩＬ－１活性を有する分子を含み得る。いくつかの実施形態では、イメージング部分は、フルオロフォア、放射性同位体、又はそれらの組み合わせを含み得る。いくつかの実施形態では、捕捉部分は、親水性タンパク質、細菌トランスペプチダーゼ酵素、ＧＳＴタグ、Ｈｉｓタグ、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、又はそれらの組み合わせを含み得る。
【0104】
本明細書中に開示される融合タンパク質及びそれらのタンパク質の個々のドメイン（例えば、自己反応性エピトープ、Ｆｃ領域、エフェクター細胞に結合する抗体）に関して、当業者は、ペプチド、ポリペプチド、若しくはタンパク質配列に対する、又は核酸配列のヌクレオチドに対するアミノ酸の個々の置換、欠失又は付加であって、コードされる配列中の単一のアミノ酸又はわずかな割合のアミノ酸を改変、付加、欠失、又は置換する置換、欠失又は付加が、本明細書中で集合的に「保存的に改変されたバリアント」と呼ばれることを容易に認識するであろう。いくつかの実施形態では、改変は、アミノ酸を、化学的に類似したアミノ酸に置換する。機能的に類似したアミノ酸を提供する保存的置換表は、当該技術分野において周知である。本明細書に開示されるＦｃドメイン又は抗体のそのような保存的に改変されたバリアントは、改変されていない配列と比較して、エフェクター細胞結合の増加を示すことができる。
【0105】
例えば、「保存的アミノ酸置換」とは、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換されているものである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当分野では、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分岐側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）及び芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）として定義されている。したがって、免疫グロブリンポリペプチドの非必須アミノ酸残基は、同じ側鎖ファミリー由来の別のアミノ酸残基で置換される。別の実施形態では、アミノ酸鎖は、側鎖ファミリーメンバーの順序及び／又は組成が異なる構造的に類似する鎖で置換することができる。
【0106】
いくつかの実施形態では、エフェクター細胞間に結合する自己反応性エピトープ、Ｆｃ領域、又は抗体は、本明細書に記載の自己反応性エピトープ、Ｆｃ領域、又はエフェクター細胞結合抗体のアミノ酸配列又はヌクレオチド配列に対して、指定されたパーセンテージの同一性又は類似性を有し得る。例えば、「相同性」又は「同一性」又は「類似性」は、２つのペプチド間又は２つの核酸分子間の配列類似性を指す。相同性は、各配列の位置を比較することによって決定することができ、比較の目的で整列させ得る。比較される配列の位置が同じ塩基又はアミノ酸で占められている場合、その分子はその位置において相同である。配列間の相同性の程度は、配列によって共有される一致する又は相同な位置の数の関数である。例えば、本明細書に記載の分子は、本明細書に記載の分子のいずれか１つの特定の領域又は全長と比較した場合に、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより高いアミノ酸配列同一性を有し得る。例えば、本明細書に記載の分子は、本明細書に記載の抗体のいずれか１つの特定の領域又は全長と比較した場合に、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより高い核酸同一性を有し得る。本発明の核酸及びタンパク質に対する配列同一性又は類似性は、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．編（２００７）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙに記載されているような、当該技術分野で既知のソフトウェアプログラムを使用する、当該技術分野で既知の方法による配列比較及び／又はアラインメントによって決定することができる。（２００７）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙに記載されているものなどの当技術分野で知られているソフトウェアプログラムを使用する配列比較及び／又はアラインメントにより決定することができる。例えば、配列比較アルゴリズム（すなわち、ＢＬＡＳＴ又はＢＬＡＳＴ２．０）、手動アラインメント、又は目視検査を利用して、本発明の核酸及びタンパク質の配列同一性又は類似性パーセントを決定することができる。
【0107】
治療製剤
本発明の態様は、治療製剤に向けられる。本明細書で使用される場合、「治療製剤」という用語は、治療効果のために使用又は投与することができる任意の化合物又は組成物（例えば、細胞を含む）を指すことができる。本明細書で使用される場合、「治療効果」という用語は、症状の改善、例えば、関連する医学的状態を治療、治癒、予防若しくは改善する、又はそのような状態の治療、治癒、予防若しくは改善の速度を増加させるのに十分な効果を指すことができる。
本発明の態様は、治療製剤に向けられる。本明細書で使用される場合、「治療製剤」という用語は、治療効果のために使用又は投与することができる任意の化合物又は組成物（例えば、細胞を含む）を指すことができる。本明細書で使用される場合、「治療効果」という用語は、症状の改善、例えば、関連する医学的状態を治療、治癒、予防若しくは改善する、又はそのような状態の治療、治癒、予防若しくは改善の速度を増加させるのに十分な効果を指すことができる。
【0108】
本明細書に記載の実施形態は、意図される投与経路のために調製された医薬組成物又は治療製剤の形態で対象に投与することができる。このような組成物及び製剤は、例えば、活性成分（複数可）及び薬学的に許容される担体を含むことができる。このような組成物及び製剤は、経口、皮下、非経口（例えば、静脈内、腹腔内）、筋肉内、直腸、硬膜外、気管内、鼻腔内、皮膚、膣、頬側、眼、又は肺投与に適合した形態、例えば、末梢経路による投与に適合した形態、又は経口投与に適した形態、又は非経口投与に適した形態であることができる。他の投与経路は、皮下、腹腔内及び静脈内であり、そのような組成物は、例えば、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」，１７．Ｅｄ．Ａｌｆｏｎｓｏ Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ（Ｅｄ．），Ｍａｒｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．，１９８５及びより最近の版並びに「Ｄｒｕｇｓ ａｎｄ ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」ｓｅｒｉｅｓ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒのモノグラフに一般的に記載されているように、当業者に周知の方法で調製することができる。組成物及び調製物は、従来の形態、例えば、注射用の溶液及び懸濁液、カプセル剤及び錠剤、例えば、米国特許第５，３５０，７４１号に開示されているような腸溶性製剤の形態、及び経口投与用の形態で見られることができる。
【0109】
非経口、皮内、又は皮下適用に使用される溶液又は懸濁液は、以下の、無菌希釈剤、例えば注射用水、生理食塩水、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、又は他の合成溶媒、ベンジルアルコール又はメチルパラベンなどの抗菌剤、アスコルビン酸又は重亜硫酸ナトリウムなどの抗酸化剤、エチレンジアミン四酢酸などのキレート剤、酢酸塩、クエン酸塩又はリン酸塩などの緩衝剤、及び塩化ナトリウム又はデキストロースなどの張度を調整するための薬剤の成分を含むことができる。ｐＨは、塩酸又は水酸化ナトリウムなどの酸又は塩基で調整することができる。非経口調製物は、アンプル、使い捨て注射器、又はガラス若しくはプラスチック製の複数用量バイアルに封入することができる。
【0110】
注射可能な使用に適した医薬組成物には、滅菌水溶液（水溶性の場合）又は分散液、及び滅菌注射液又は分散液の即時調製のための滅菌粉末が含まれる。静脈内投与について、適切な担体は、生理食塩水、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ ＥＭ（商標）（ＢＡＳＦ，Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ，Ｎ．Ｊ．）、又はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を含む。全ての場合では、組成物は、無菌であってもよく、容易な注射針通過性が存在する程度に流動性であってもよい。複数の実施形態では、製造及び貯蔵の条件下で安定であり得、細菌及び真菌などの微生物の汚染作用に対して保存され得る。担体は、例えば、水、エタノール、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールのような薬学的に許容されるポリオール、及びそれらの適切な混合物を含有する、溶媒又は分散媒であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散液の場合における必要な粒子サイズの維持によって、及び界面活性剤の使用によって、維持することができる。微生物の作用の防止は、様々な抗細菌剤及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、及びチメロサールによって達成することができる。多くの場合、組成物において等張剤、例えば、糖、マンニトール、ソルビトールなどの多価アルコール、塩化ナトリウムを含めることが有用であり得る。注射可能な組成物の持続的吸収は、組成物において、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンを含めることによって達成することができる。
【0111】
滅菌注射液は、必要量の化合物を、必要に応じて、本明細書に列挙した成分の１つ又は組み合わせと共に適切な溶媒に組み込むこと、続いて濾過滅菌することによって調製することができる。概して、分散液は、活性化合物を、基本的な分散媒及び本明細書に列挙されるものからの必要な他の成分を含有する滅菌ビヒクル中に組み込むことによって調製される。滅菌注射液の調製のための滅菌粉末の場合、有用な調製方法の例は、真空乾燥及び凍結乾燥であり、これにより、活性成分及び任意の追加の所望の成分の粉末が、以前に滅菌濾過されたその溶液から得られる。
【0112】
経口組成物は、不活性な希釈剤又は可食性の担体を含む。それらはゼラチンカプセルに封入するか、又は錠剤に圧縮することができる。経口治療投与の目的のために、活性化合物は、賦形剤と共に組み込まれ、錠剤、トローチ、又はカプセルの形態で使用され得る。経口組成物はまた、洗口剤としての使用のための流体担体を使用して調製することができ、流体担体中の化合物は、経口的に適用され、口の中で回され、吐き出されるか、又は飲み込まれる。薬物の経口処方物は、例えば、薬物の半減期に応じて、１日１回、１日２回、１日３回又は１日４回投与することができる。
【0113】
薬学的に適合性の結合剤、及び／又はアジュバント材料を対象に投与される組成物の一部として含めることができる。錠剤、丸剤、カプセル剤、トローチ剤などは、以下の、微結晶セルロース、トラガカントゴム又はゼラチンなどの結合剤；デンプン又はラクトースなどの賦形剤、アルギン酸、Ｐｒｉｍｏｇｅｌ（登録商標）（デンプングリコール酸ナトリウム）、又はコーンスターチなどの崩壊剤；ステアリン酸マグネシウム又はステアリン酸などの潤滑剤；コロイド状二酸化ケイ素などの流動促進剤；スクロース又はサッカリンなどの甘味剤；又はペパーミント、サリチル酸メチル、又はオレンジ香味料などの香味剤の成分、又は同様の性質の化合物のいずれかを含有することができる。
【0114】
全身投与はまた、経粘膜的又は経皮的手段によるものであり得る。経粘膜又は経皮投与について、浸透させる障壁に適した浸透剤が製剤に使用される。そのような浸透剤は、当技術分野で一般に既知であり、例えば、経粘膜投与について、洗浄剤、胆汁塩、及びフシジン酸誘導体を含む。経粘膜投与は、鼻腔スプレー又は坐剤の使用を通して達成することができる。経皮投与について、活性化合物は、当技術分野で一般に既知の軟膏、膏薬、ゲル、又はクリームに製剤化される。
【0115】
実施形態では、投与することは、所望の効果が生じるような、所望の部位での組成物の少なくとも部分的な局在化をもたらす方法又は経路による、対象への医薬組成物の配置を含むことができる。
【0116】
例えば、医薬組成物は、ボーラス注射又は注入によって投与することができる。ボーラス注射は、シリンジがＩＶアクセスデバイスに接続され、薬物が対象に直接注射される投与経路を指すことができる。「注入」という用語は、血管内注射を指すことができる。
【0117】
本明細書に記載の実施形態は、対象に１回（例えば、単回注射、ボーラス、又は沈着として）投与することができる。あるいは、投与は、対象に１日１回又は２回、ある期間、例えば約２週間～約２８日間であることができる。投与は最大１年まで継続することができる。複数の実施形態では、投与は、対象の生涯にわたって継続することができる。実施形態は、対象に年に１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２回、又はそれらの組み合わせの期間１日１回又は２回投与することもできる。
【0118】
複数の実施形態では、本明細書に記載される組成物は、対象に慢性的に投与されることができる。「慢性投与」は、長期間にわたって治療効果（活性）を維持するためなどの、連続的な投与を指すことができる。
【0119】
特定の患者に対する特定の投与量及び治療計画は、使用される具体的な抗体、そのバリアント又は誘導体、患者の年齢、体重、一般的な健康状態、性別、及び食事、及び投与時間、排泄頻度、薬物の併用、及び治療を受けている特定の疾患の重症度など、様々な要因に依存する。医療従事者によるそのような要因の判断は、当業者の技量の範囲内である。その量はまた、治療される個々の患者、投与経路、製剤の種類、使用される化合物の特性、疾患の重症度、及び所望の効果にも依存すると考えられる。使用される量は、当該技術分野で周知の薬学的及び薬物動態学的原理によって決定することができる。
【0120】
本発明の試薬又は治療組成物の治療有効量は、治療目的を達成するために必要な量とすることができる。上に示されるように、これは、特定の場合には標的の機能を妨害する、試薬又は治療組成物とその標的との間の結合相互作用とすることができる。投与する必要のある量は更に、その特異的な標的についての試薬又は治療組成物の結合親和性に依存し、また、投与された試薬又は治療組成物が、それが投与される他の対象の自由体積から枯渇する速度にも依存する。対象（例えば、患者）に投与される本明細書に記載の結合ポリペプチドの投与量は、典型的には、０．１ｍｇ／ｋｇ～１００ｍｇ／ｋｇ患者体重、０．１ｍｇ／ｋｇ～２０ｍｇ／ｋｇ患者体重、又は１ｍｇ／ｋｇ～１０ｍｇ／ｋｇ患者体重である。ヒト抗体は、外来ポリペプチドに対する免疫応答のため、他の種由来の抗体よりもヒト体内での半減期が長い。したがって、少ない投薬量及び少ない頻度でのヒト抗体の投与が可能ことも多い。更に、本開示の試薬又は治療組成物の投薬量及び投与頻度は、例えば、脂質化などの改変によって抗体の取り込み及び組織への（例えば脳への）浸透を増強することによって低減され得る。本発明の抗体又は抗体断片の治療上有効な投与のための一般的な範囲は、非限定的な例として、約０．１ｍｇ／ｋｇ体重～約５０ｍｇ／ｋｇ体重であり得る。一般的な投与頻度は、例えば、１日２回～１週間に１回の範囲であり得る。
【0121】
断片（例えば、抗体断片）が使用される場合、標的タンパク質の結合ドメインに特異的に結合する最小の阻害性断片が好ましい。例えば、抗体の可変領域配列に基づいて、標的タンパク質配列に結合する能力を保持するペプチド分子を設計することができる。そのようなペプチドは、化学的に合成することができ、かつ／又は組換えＤＮＡ技術によって産生することができる。（例えば、Ｍａｒａｓｃｏ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：７８８９－７８９３（１９９３）を参照されたい）。製剤はまた、治療しようとする具体的な適応症に必要な２つ以上の活性化合物、例えば、互いに悪影響を及ぼさない相補的活性を有するもの、を含有することができる。あるいは、又はそれに加えて、組成物は、その機能を増強する薬剤（例えば、細胞傷害性薬剤、サイトカイン（例えば、ＩＬ－１５）、化学療法剤又は成長阻害剤など）を含み得る。そのような分子は、意図された目的に有効な量で組み合わせて好適に存在する。
【0122】
活性成分はまた、例えば、コアセルベーション技法によって、又は界面重合によって調製されたマイクロカプセル、例えば、それぞれ、コロイド状薬物送達システム（例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子、及びナノカプセル）における、又はマクロエマルジョンにおける、ヒドロキシメチルセルロース又はゼラチン－マイクロカプセル及びポリ－（メチルメタクリレート）マイクロカプセルに封入することができる。徐放性製剤を調製することができる。
【0123】
使用される薬学的又は治療的担体又は希釈剤は、従来の固体又は液体担体であることができる。固体担体の非限定的な例は、ラクトース、白土、スクロース、シクロデキストリン、タルク、ゼラチン、寒天、ペクチン、アカシア、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸又はセルロースの低級アルキルエーテルである。液体担体の非限定的な例は、シロップ、落花生油、オリーブ油、リン脂質、脂肪酸、脂肪酸アミン、ポリオキシエチレン及び水である。同様に、担体又は希釈剤は、単独で、又はワックスと混合された、モノステアリン酸グリセリル又はジステアリン酸グリセリルなどの当技術分野で公知の任意の徐放材料を含むことができる。
【0124】
経口投与用に固体担体を使用する場合、製剤を錠剤化し、粉末若しくはペレット形態の硬質ゼラチンカプセルに入れるか、又はトローチ若しくはロゼンジの形態であることができる。固体担体の量は広く変動するが、通常、約２５ｍｇ～約１ｇである。
【0125】
液体担体を使用する場合、製剤は、シロップ、エマルジョン、軟ゼラチンカプセル又は水性若しくは非水性の液体懸濁液若しくは溶液などの滅菌注射液の形態であることができる。
【0126】
組成物及び／又は調製物はまた、局所又は全身注射又は注入に適した形態であることもでき、それ自体、滅菌水又は等張生理食塩水又はグルコース溶液を用いて製剤化することができる。組成物は、中枢投与可能な形態を除いて、末梢投与のみに適合した形態であることができる。組成物及び／又は製剤は、中枢投与に適合した形態であることができる。
【0127】
組成物及び／又は製剤は、当該分野で周知である従来の滅菌技術によって滅菌されることができる。得られた水溶液は、使用のために包装されることができるか、又は無菌条件下で濾過されることができ、そして凍結乾燥されることができ、凍結乾燥製剤は、投与前に滅菌水溶液と合わせられる。組成物及び／又は製剤は、生理的条件に近づけるために必要とされる薬学的及び／又は治療的に許容される補助物質、例えば、緩衝剤、等張性調整剤など、例えば酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウムなどを含有することができる。
【0128】
天疱瘡などの自己免疫性水疱症を含む自己免疫疾患を有する患者は、血液と共に循環する自己反応性抗体を有する。本明細書に記載される治療薬は、患者における自己反応性抗体がおそらく結合し得る自己反応性エピトープを含有する。潜在的な懸念は、自己反応性抗体が、患者に投与された後に治療薬に結合し、かつ／又はそれを不活性化する可能性があることであり得る。しかしながら、本明細書に提示されるデータ（例えば、実施例７、図１７及び１８を参照されたい）は、自己反応性抗体がこれらの治療薬の有効性を減少させないことを示す。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される治療薬の有効性は、治療薬が投与される患者における自己反応性抗体の存在によって減少しないか、又は最小限に減少する。
【0129】
融合タンパク質を発現する核酸、ベクター及び細胞
本明細書に記載される融合タンパク質の全て又は一部をコードする核酸も開示される。核酸を含む種々のベクター（例えば、プラスミド、ウイルスなど）もまた開示される。核酸又はベクターを含有し、融合タンパク質を発現することができる様々な細胞（例えば、原核細胞、真核細胞）も開示される。
本明細書に記載される融合タンパク質の全て又は一部をコードする核酸も開示される。核酸を含む種々のベクター（例えば、プラスミド、ウイルスなど）もまた開示される。核酸又はベクターを含有し、融合タンパク質を発現することができる様々な細胞（例えば、原核細胞、真核細胞）も開示される。
【実施例】
【0130】
実施例は、本発明のより完全な理解を促進するために以下に提供される。以下の実施例は、本発明を作製及び実施する例示的な様式を例示する。しかしながら、本発明の範囲は、これらの実施例に開示されている特定の実施形態に限定されず、代わりの方法を使用して同様の結果を得ることができるため、例示のみを目的としている。
【0131】
実施例１
自己免疫疾患の標的化治療のための非免疫抑制性の免疫ベースの治療薬の開発
尋常性天疱瘡（ＰＶ）は、皮膚及び粘膜の痛みを伴う水疱形成を特徴とし得る、破壊的な自己免疫性水疱症である。ＰＶは、Ｄｓｇ１に対する抗体の有無にかかわらず、デスモグレイン３（Ｄｓｇ３）に対する自己抗体の産生によって引き起こされ、上皮剥離（棘細胞離開）を引き起こす。ＰＶの治癒法は存在しない。治療戦略は、全身性ステロイド及び免疫抑制剤を含み得る。抗ＣＤ２０抗体（例えば、リツキシマブ）は、中等度から重度の疾患に対するファーストラインの選択肢となっているが、従来の免疫抑制剤よりも低いとはいえ感染のリスクの増加及び治療後の再発の高いリスクを含む、オフターゲット免疫抑制効果を引き起こし得る。ＰＶの再発は、最初の治療中に枯渇していない同じ自己反応性細胞の拡大に起因し得る。したがって、自己反応性Ｂ細胞の完全な枯渇は、治癒法となり得る。現在臨床試験中の新生児Ｆｃ受容体及びブルトン型チロシンキナーゼ阻害剤は、オフターゲット免疫抑制効果を回避することができない。自己ポリクローナル調節性Ｔ細胞及びキメラ自己抗原受容体（ＣＡＡＲ）Ｔ細胞などの初期段階の細胞ベースの療法は、有効であることが証明されたとしても、全体的に免疫抑制性とはなり得ない。しかしながら、細胞ベースの療法は、個別化されなければならず、製造、貯蔵及び輸送のための特定の要件を有し、これは、資源が乏しい地域では実現不可能である。
自己免疫疾患の標的化治療のための非免疫抑制性の免疫ベースの治療薬の開発
尋常性天疱瘡（ＰＶ）は、皮膚及び粘膜の痛みを伴う水疱形成を特徴とし得る、破壊的な自己免疫性水疱症である。ＰＶは、Ｄｓｇ１に対する抗体の有無にかかわらず、デスモグレイン３（Ｄｓｇ３）に対する自己抗体の産生によって引き起こされ、上皮剥離（棘細胞離開）を引き起こす。ＰＶの治癒法は存在しない。治療戦略は、全身性ステロイド及び免疫抑制剤を含み得る。抗ＣＤ２０抗体（例えば、リツキシマブ）は、中等度から重度の疾患に対するファーストラインの選択肢となっているが、従来の免疫抑制剤よりも低いとはいえ感染のリスクの増加及び治療後の再発の高いリスクを含む、オフターゲット免疫抑制効果を引き起こし得る。ＰＶの再発は、最初の治療中に枯渇していない同じ自己反応性細胞の拡大に起因し得る。したがって、自己反応性Ｂ細胞の完全な枯渇は、治癒法となり得る。現在臨床試験中の新生児Ｆｃ受容体及びブルトン型チロシンキナーゼ阻害剤は、オフターゲット免疫抑制効果を回避することができない。自己ポリクローナル調節性Ｔ細胞及びキメラ自己抗原受容体（ＣＡＡＲ）Ｔ細胞などの初期段階の細胞ベースの療法は、有効であることが証明されたとしても、全体的に免疫抑制性とはなり得ない。しかしながら、細胞ベースの療法は、個別化されなければならず、製造、貯蔵及び輸送のための特定の要件を有し、これは、資源が乏しい地域では実現不可能である。
【0132】
ＰＶの治癒法は存在しない。本明細書に記載の治療は、既存の適応免疫機構の特異性を利用するため、根治的なものとなる可能性があり、正確なものであり得る。提案された治療は、全体的に免疫抑制性であるとは予想されず、したがって、既存の治療の主要な副作用を回避する。加えて、ＰＶの標的が普遍的なものであるため、個別化の必要がない。重要なことに、現在のプロジェクトは、ＰＶの治療のためのプラットフォームを提供するだけでなく、従来の非特異的な免疫抑制治療で主に治療される既知の抗原を用いた全ての抗体駆動性自己免疫疾患において使用されるように改変することができる。
【0133】
既存の腫瘍学的治療に基づいて、本願発明者らは、自己反応性抗Ｄｓｇ３ Ｂ細胞を正確に枯渇させるための２つのアプローチ、すなわち、（１）Ｆｃ媒介性、及び（２）ＢＣＲ－Ｔ細胞結合を設計した（図１１を参照されたい）。
【0134】
Ｆｃ媒介性アプローチ：このアプローチは、ＰＶにおけるリツキシマブの使用に類似しており、抗Ｄｓｇ３ Ｂ細胞を標的とするという主な利点を有する。
【0135】
ＢＣＲ－Ｔ細胞エンゲージャアプローチ：Ｄｓｇ３抗ＣＤ３ｅ構築物は、標的抗Ｄｓｇ３ Ｂ細胞とＴ細胞との間の分子クラスター化及び免疫学的シナプスの形成を確立することができ、その結果、Ｔ細胞の増殖及び活性化をもたらして、標的化された抗Ｄｓｇ３ Ｂ細胞を特異的に死滅させ、他のＢ細胞を無傷なままに残す。腫瘍学的用途とは異なり、サイトカイン放出症候群は、自己反応性Ｂ細胞の負荷が悪性クローンよりも低いことを考慮すると、自己免疫疾患の治療においては予想されない。
【0136】
Ｄｓｇ３－Ｆｃを作製する１つの戦略は、安全なものであり得、リツキシマブの使用に取って代わることができる。他のアプローチは、利用可能な治療に応答しない患者にとって魅力的な代替選択肢を提供する。したがって、このプロジェクトは、ＰＶの治療を変えるだけではなく、他の自己免疫性水疱症（例えば、水疱性類天疱瘡、粘膜類天疱瘡、後天性表皮水疱症、線状ＩｇＡ水疱性皮膚症）、狼瘡、強皮症、グッドパスチャー病、グレーブス病のサブタイプから免疫介在性血管炎に及ぶ既知の抗原標的に対するいくつかの自己抗体／免疫複合体媒介性疾患の治療を開発するための道を開く可能性を有する。したがって、理論に束縛されることを望むものではないが、本明細書に開示される治療薬は、自己免疫疾患のための治療ツールボックスへの画期的な追加とみなすことができる。
【0137】
本願発明者らの治療薬は、抗Ｄｓｇ３力価を低下させる他の薬物と同時に使用することができる。更に、確かに、モノクローナル及びポリクローナル抗Ｄｓｇ３ ＩｇＧは、Ｄｓｇ３自己抗体産生Ｂ細胞に特異的なＣＡＡＲ Ｔ細胞の死滅能力に対して有意な効果を有さないことが見出された。
【0138】
実施例２
尋常性天疱瘡（ＰＶ）は、皮膚及び粘膜の痛みを伴う水疱形成を特徴とする自己免疫性水疱症である（図１）。ＰＶは、Ｄｓｇ１に対する抗体の有無にかかわらず、デスモグレイン３（Ｄｓｇ３）に対する自己抗体の産生によって引き起こされ、上皮剥離（棘細胞離開）を引き起こす（図２のパネルＡ～Ｂ）。ＰＶの治癒法は存在しない。治療戦略は、全身性ステロイド及び免疫抑制剤を含み得る。Ｂ細胞に対する抗ＣＤ２０抗体（例えば、リツキシマブ）は、中等度から重度の疾患に対するファーストラインの選択肢となっているが、従来の免疫抑制剤よりも低いとはいえ感染のリスクの増加及び治療後の再発の高いリスクを含む、オフターゲット免疫抑制効果と関連がある。現在臨床試験中の新生児Ｆｃ受容体及びブルトン型チロシンキナーゼ阻害剤は、オフターゲット免疫抑制効果を回避することができない。自己ポリクローナル調節性Ｔ細胞１４及びキメラ自己抗原受容体（ＣＡＡＲ）Ｔ細胞１６などの初期段階の細胞ベースの療法は、有効であることが証明されたとしても、全体的に免疫抑制性とはなり得ない。しかしながら、細胞ベースの療法は、個別化することができ、製造、貯蔵及び輸送のための特定の要件を有し、これは、資源が乏しい地域では、実行可能な場合もあり、実現不可能な場合もある。ＰＶの再発は、典型的には、最初の治療中に枯渇していない同じ自己反応性細胞の拡大に起因する。自己反応性Ｂ細胞の完全な枯渇は、潜在的な治癒法を与える。自己反応性抗Ｄｓｇ３ Ｂ細胞を正確に枯渇させるために、３つのアプローチ、すなわち、（１）Ｆｃ媒介性、（２）ＢＣＲ－Ｔ細胞結合、及び（３）放射線療法アプローチを設計した（図３のパネルＡ～Ｃ）。現在のプロジェクトは、ＰＶだけでなく、既知の抗原による潜在的にいくつかの抗体駆動性自己免疫疾患の治療のためのプラットフォームを提供する。
尋常性天疱瘡（ＰＶ）は、皮膚及び粘膜の痛みを伴う水疱形成を特徴とする自己免疫性水疱症である（図１）。ＰＶは、Ｄｓｇ１に対する抗体の有無にかかわらず、デスモグレイン３（Ｄｓｇ３）に対する自己抗体の産生によって引き起こされ、上皮剥離（棘細胞離開）を引き起こす（図２のパネルＡ～Ｂ）。ＰＶの治癒法は存在しない。治療戦略は、全身性ステロイド及び免疫抑制剤を含み得る。Ｂ細胞に対する抗ＣＤ２０抗体（例えば、リツキシマブ）は、中等度から重度の疾患に対するファーストラインの選択肢となっているが、従来の免疫抑制剤よりも低いとはいえ感染のリスクの増加及び治療後の再発の高いリスクを含む、オフターゲット免疫抑制効果と関連がある。現在臨床試験中の新生児Ｆｃ受容体及びブルトン型チロシンキナーゼ阻害剤は、オフターゲット免疫抑制効果を回避することができない。自己ポリクローナル調節性Ｔ細胞１４及びキメラ自己抗原受容体（ＣＡＡＲ）Ｔ細胞１６などの初期段階の細胞ベースの療法は、有効であることが証明されたとしても、全体的に免疫抑制性とはなり得ない。しかしながら、細胞ベースの療法は、個別化することができ、製造、貯蔵及び輸送のための特定の要件を有し、これは、資源が乏しい地域では、実行可能な場合もあり、実現不可能な場合もある。ＰＶの再発は、典型的には、最初の治療中に枯渇していない同じ自己反応性細胞の拡大に起因する。自己反応性Ｂ細胞の完全な枯渇は、潜在的な治癒法を与える。自己反応性抗Ｄｓｇ３ Ｂ細胞を正確に枯渇させるために、３つのアプローチ、すなわち、（１）Ｆｃ媒介性、（２）ＢＣＲ－Ｔ細胞結合、及び（３）放射線療法アプローチを設計した（図３のパネルＡ～Ｃ）。現在のプロジェクトは、ＰＶだけでなく、既知の抗原による潜在的にいくつかの抗体駆動性自己免疫疾患の治療のためのプラットフォームを提供する。
【0139】
Ｆｃ媒介性：このアプローチは、Ｂ細胞が標的化されるという意味で、ＰＶにおけるリツキシマブの使用に類似しており、抗Ｄｓｇ３ Ｂ細胞のみを標的化するという主な利点を有する。
【0140】
ＢＣＲ－Ｔ細胞エンゲージャ：Ｄｓｇ３抗ＣＤ３ｅ構築物は、標的抗Ｄｓｇ３ Ｂ細胞とＴ細胞との間の分子クラスター化及び免疫学的シナプスの形成を確立することができ、その結果、Ｔ細胞の増殖及び活性化をもたらして、標的化された抗Ｄｓｇ３ Ｂ細胞を特異的に死滅させ、他のＢ細胞を無傷なままに残すことができる。腫瘍学的用途とは異なり、サイトカイン放出症候群は、自己反応性Ｂ細胞の負荷が悪性クローンよりも低いことを考慮すると、自己免疫疾患の治療においては予想されない。
【0141】
放射線療法：臨床診療では、組織内のアルファ粒子の範囲が短い（＜０．１ｍｍ）ことで、隣接組織に損傷を与えることなく標的細胞を選択的に死滅させることが可能である。死滅は、酸素化状態、細胞周期、細胞内在化及び以前の治療とは無関係である。したがって、放射線療法は、従来の療法、リツキシマブ、又は本願発明者らのＤｓｇ３－Ｆｃ及びＤｓｇ３抗ＣＤ３アプローチに対して耐性である患者にとって魅力的な代替法を提供することができる。
【0142】
アプローチ
タンパク質の部位特異的改変。ソルターゼは、「ＬＰＥＴＧ」モチーフを認識し、トレオニンとグリシンとの間の結合を切断してチオ－アシル中間体を形成する細菌性トランスペプチダーゼ酵素であり、チオ－アシル中間体は、トリグリシン含有プローブ（ＧＧＧ－プローブ）で置換される。それにより、ソルターゼは、「タンパク質－ＬＰＥＴＧ」を「タンパク質－ＬＰＥＴ－ＧＧＧ－プローブ」産物に変換することができ、ここで、プローブは、目的の任意の生体分子であってもよく（図４）、ほぼ完全な収率で迅速に変換することができる。本願発明者ら及び他の研究者らは、ソルターゼを使用して、フルオロフォア、ポリマー、放射性同位体又は二次タンパク質を生体分子に導入した。本願発明者らは、ソルターゼを使用して、Ｄｓｇ３タンパク質及び抗体断片上にキレート剤及びフルオロフォアを導入し、他の方法では従来の遺伝的アプローチを使用して生成することが困難又は不可能であるＮ－Ｃ及びＣ－Ｃ融合タンパク質を作製することができる。
タンパク質の部位特異的改変。ソルターゼは、「ＬＰＥＴＧ」モチーフを認識し、トレオニンとグリシンとの間の結合を切断してチオ－アシル中間体を形成する細菌性トランスペプチダーゼ酵素であり、チオ－アシル中間体は、トリグリシン含有プローブ（ＧＧＧ－プローブ）で置換される。それにより、ソルターゼは、「タンパク質－ＬＰＥＴＧ」を「タンパク質－ＬＰＥＴ－ＧＧＧ－プローブ」産物に変換することができ、ここで、プローブは、目的の任意の生体分子であってもよく（図４）、ほぼ完全な収率で迅速に変換することができる。本願発明者ら及び他の研究者らは、ソルターゼを使用して、フルオロフォア、ポリマー、放射性同位体又は二次タンパク質を生体分子に導入した。本願発明者らは、ソルターゼを使用して、Ｄｓｇ３タンパク質及び抗体断片上にキレート剤及びフルオロフォアを導入し、他の方法では従来の遺伝的アプローチを使用して生成することが困難又は不可能であるＮ－Ｃ及びＣ－Ｃ融合タンパク質を作製することができる。
【0143】
Ｄｓｇ３外部ドメインの免疫原性。ＰＶ患者に関する試験は、患者の９１％、７１％、５１％、１９％及び１２％が、それぞれ外部ドメインＥＣ１、ＥＣ２、ＥＣ３、ＥＣ４及びＥＣ５に対する自己抗体を有することを示した（図２のパネルＢ、図１３）。Ｄｓｇ３－ＥＣ１－３はＰＶ患者における生理学的抗Ｄｓｇ３抗体の大部分を網羅し、その産生は完全サイズのＥＣ１－５構築物よりも複雑ではないため、本願発明者らは、Ｄｓｇ３－ＥＣ１－３を使用した。本願発明者らはまた、ＥＣ１－４及び１－５構築物を使用し得る。
【0144】
プラスミド及び細胞株。本願発明者らは、以下の３つの細胞株を使用した：（１）マウスにおいてＰＶを誘導する抗マウスＤｓｇ３抗体を産生するＡＫ２３ハイブリドーマ細胞。ＡＫ２３抗体は、ＥＣ１ドメインを認識し、ヒトＤｓｇ３－ＥＣ１と交差反応する。（２及び３）Ｎａｌｍ－６ Ｆ７７９及びＮａｌｍ－６ ＰＶＢ－２８がん細胞株。Ｎａｌｍ－６は、Ｂ細胞前駆体白血病細胞株であり、Ｆ７７９及びＰＶＢ－２８は、それぞれＤｓｇ３－ＥＣ１及びＤｓｇ３－ＥＣ２ドメインを認識する患者由来の抗Ｄｓｇ３抗体を発現するように操作された細胞である。更に、本願発明者らは、ＰＶ患者から特定された抗ヒトＤｓｇ３抗体（Ｐ３Ｆ３）のためのプラスミドを得た。Ｐ３Ｆ３抗体は、ヒトＤｓｇ３－ＥＣ１ドメインに特異的に結合するＩｇＧ１抗体であり、ヒトケラチノサイトに添加されると強い棘細胞離開を誘導する。
【0145】
動物試験。治療薬の有効性は、下記の２つの検証されたＰＶマウスモデルにおいて試験することができる。
【0146】
受動導入モデル。このモデルでは、本願発明者らは、確立された天疱瘡誘導性ハイブリドーマ細胞株（ＡＫ２３、既に所有）を移植することによって、受動モノクローナル天疱瘡マウス疾患モデルを作製した。以前に記載したように、本願発明者らは、天疱瘡表現型を引き起こす抗Ｄｓｇ３抗体を分泌する約５００万～１０００万個のＡＫ２３ハイブリドーマ細胞、又は対照としての無関係なハイブリドーマ細胞を、２，６，１０，１４－テトラメチル－ペンタデカン（プリスタン）でプライミングした８週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスに注射した（各群ｎ＝１０）。動物は、全ての実験において、ｕｒｎ無作為化法に基づいて治療／対照群に割り当てられた。本願発明者らは、血清抗Ｄｓｇ３力価（３日目及び１０日目に標準的なＥＬＩＳＡによって）、及び皮膚疱疹（２日目、５日目及び１０日目に盲検化された研究者によって評価される）を分析することによって疾患の確立について試験した。ＥＬＩＳＡデータに基づいて、棘細胞離開を観察するために（Ｈ＆Ｅ染色によって）組織採取の時点を決定した。ピーク疾患時間は、約７日目であり得；マウスは、脱毛、体重減少を示す場合があり、かつ、生理的抗Ｄｓｇ３ ＩｇＧレベル（３００～４００ＲＵ／ｍｌ）で表皮ケラチノサイトに結合するＡＫ２３細胞によって産生されるＡＫ２３自己抗体を伴って、毛包及び口腔粘膜に水疱形成を有する場合がある（図５のパネルＡ～Ｄ）。
【0147】
能動導入モデル。ＡＫ２３モデルは利点を有するが、治療により、急速に増殖するハイブリドーマ細胞に打ち勝つことができる。したがって、第２のモデルとして、本願発明者らは、ヒト疾患の臨床表現型を厳密に模倣し、臨床的に起こるものに類似する自己反応性Ｄｓｇ３特異的Ｂ細胞の頻度が低く、最終的に高い血清ポリクローナル自己抗体レベルを有する、能動ＰＶ免疫モデルを使用した。このモデルでは、本願発明者らは、まず、Ｄｓｇ３－／－マウス（ＪＡＸ－００２９１１）をマウスＤｓｇ３の組換え細胞外ドメインで免疫付与し、続いて脾細胞をＲＡＧ２－／－マウスに導入することによって、能動ポリクローナル天疱瘡マウス疾患モデルを開発した。導入された細胞は、概して、Ｄｓｇ３反応性細胞を含み得るＴ細胞及びＢ細胞を含んでいた。文献で行われた観察と同様に、理論に束縛されることを望むものではないが、動物は、抑制された成長を有している可能性があり（図５のパネルＥ）、基底上の棘細胞離開及び水疱を伴う皮膚粘膜びらんを発症する場合がある（図５のパネルＦ～Ｈ）。臨床指標を評価するために、ＥＬＩＳＡを使用して、本願発明者らは、自己抗体レベルをＰＶ患者における生理学的レベル（３００～４００ＲＵ／ｍｌ）と比較した。Ｄｓｇ３反応性抗体が、（理論に束縛されることを望むものではないが）３～４週間で起こり得るそのレベルに等しいか又はそれを超えた場合、治療を開始した。Ｄｓｇ３免疫付与Ｄｓｇ３＋／－動物由来の細胞の養子導入を対照として使用した３８（ｎ＝１０匹のマウス／群）。
【0148】
モニタリング
副作用：動物は、本明細書に記載されるように、適切な対照と共に尾静脈を介して静脈内に治療を受けた。１０匹のマウスを、治療後少なくとも６ヶ月間、両方の疾患モデルから各治療のために維持した。抗Ｄｓｇ３レベルを２～３週間ごとにＥＬＩＳＡによって測定して、長期間続く寛解を試験した。マウスは、皮膚病変をチェックして疾患再発がないことを確実にするために、盲検研究者によって試験された。理論に束縛されることを望むものではないが、マウスは、完全寛解を維持することができる。Ｆｃ媒介性アプローチは、リツキシマブと同様に、いくらかの再発を示す場合があるか、又は示さない場合があるが、理論に束縛されることを望むものではないが、再治療で応答可能である。臨床的解釈を考慮すると、Ｄｓｇ３－Ｆｃ治療に応答することができない少数の患者は、放射線療法及び／又はＢＣＲ－Ｔ細胞エンゲージャアプローチの選択肢を有し得る。
副作用：動物は、本明細書に記載されるように、適切な対照と共に尾静脈を介して静脈内に治療を受けた。１０匹のマウスを、治療後少なくとも６ヶ月間、両方の疾患モデルから各治療のために維持した。抗Ｄｓｇ３レベルを２～３週間ごとにＥＬＩＳＡによって測定して、長期間続く寛解を試験した。マウスは、皮膚病変をチェックして疾患再発がないことを確実にするために、盲検研究者によって試験された。理論に束縛されることを望むものではないが、マウスは、完全寛解を維持することができる。Ｆｃ媒介性アプローチは、リツキシマブと同様に、いくらかの再発を示す場合があるか、又は示さない場合があるが、理論に束縛されることを望むものではないが、再治療で応答可能である。臨床的解釈を考慮すると、Ｄｓｇ３－Ｆｃ治療に応答することができない少数の患者は、放射線療法及び／又はＢＣＲ－Ｔ細胞エンゲージャアプローチの選択肢を有し得る。
【0149】
感染感受性：本願発明者らの療法が免疫系を全体的に抑制するかどうかを試験するために、Ｃ５７ＢＬ／６マウスを活性ＬＣＭＶ－Ｃｌ１３に感染させることができる。動物にＡＫ２３ハイブリドーマを感染２１日後に注射し、続いて本明細書に記載の実験計画に従って本願発明者らの治療戦略を行うことができる。感染マウス及び対照マウスについてのウイルス負荷を、注射の３０日後に比較することができる。あるいは、本願発明者らのＰＶ療法の７日後に、マウスに、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）４０により経口的に、又はＬＣＭＶ感染により静脈内にチャレンジすることができる。肝臓及び脾臓における微生物負荷を感染１０日後にチェックし、感染のみのマウスと比較する。いずれの実験においても、理論に拘束されることを望むものではないが、ウイルス負荷に差はない。
【0150】
抗Ｄｓｇ３ Ｂ細胞の死滅を媒介するＤｓｇ３－Ｆｃ融合タンパク質の能力を試験する
非限定的で例示的な結果。本願発明者らは、マウス及びヒトの両方のＦｃ融合タンパク質であるｍＤｓｇ３－ＥＣ１－３－ＩｇＧ２ａ（ｍＦｃ）及びｈＤｓｇ３－ＥＣ１－３－ＩｇＧ１（ｈＦｃ）を作製した。ヒトＩｇＧ１及びマウスＩｇＧ２ａ由来のＦｃ領域を、それらの高いＦｃ媒介性死滅活性について選択した。タンパク質は、Ｃ末端にＦＬＡＧタグ、ソルターゼ認識モチーフ及びＨｉｓ６タグを有するように操作された。８アミノ酸配列（ＤＹＫＤＤＤＤＫ）であるＦＬＡＧは、ウェスタンブロット及びフローサイトメトリー分析のために使用することができ、その後、インビボで使用される場合、構築物の代謝運命の分析のために使用することができる。Ｈｉｓ６タグを精製に使用し、ソルターゼタグを部位特異的に改変を導入するために使用した。本願発明者らは、哺乳動物Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞を使用して両方の構築物を発現させ、Ｎｉ－ＮＴＡアフィニティーカラムを介して精製し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びウェスタンブロッティング分析を使用して特性評価して、構築物の形成を確認した（図６のパネルＡ～Ｂ）。Ｇｌｙ３－Ａｌｅｘａ６４７ソルターゼ基質を合成し、これを使用して、融合タンパク質をＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７で部位特異的に標識した。ソルターゼ反応は、構築物（５０μＭ）、Ｇｌｙ３－Ａｌｅｘａ６４７基質（５００μＭ）、及びソルターゼ（５μＭ）を４℃で１時間混合することによって行った。Ａｌｅｘａ６４７標識された構築物をサイズ排除カラムクロマトグラフィーによって精製し、構築物のゲル内蛍光スキャンによって標識を更に確認した（図６のパネルＢ）。構築物の機能性を特性評価するために、本願発明者らは、Ａｌｅｘａ６４７標識されたｍＤｓｇ３－ＥＣ１－３－ｍＦｃを使用して、抗ｍｄＳｇ３ ＡＫ２３ハイブリドーマ及び抗ｈＤｓｇ３ Ｆ７７９細胞を染色した。細胞を親和性及び特異性（低ｎＭ濃度での）により染色し（図６のパネルＣ）、これは、Ｆ７７９細胞上の患者由来ＢＣＲがマウスＤｓｇ３タンパク質と交差反応することを示している。対照として使用したＮａｌｍ－６細胞は、いかなる結合も示さなかった（図６のパネルＣ）。Ａｌｅｘａ６４７標識されたｈＤｓｇ３－ＥＣ１－３－ＩｇＧ１（ｈＦｃ）を使用して同様の実験を行い、これは、構築物がＦ７７９細胞に結合し、マウスＡＫ２３細胞も染色したことを示した（図６のパネルＢ～Ｃと同様）。構築物を更に特性評価するために、本願発明者らは、まず、プレートをＡＫ２３ Ａｂでコーティングし、別のプレートをＰ３Ｆ３（抗ヒトＤｓｇ３）でコーティングすることによって、ＥＬＩＳＡアッセイを行った。その結果は更に、本願発明者らが作製したヒト及びマウス構築物が両方の抗体に特異的に結合することを示した（図６のパネルＤ）。Ｐ３Ｆ３抗体を、製造業者のプロトコルに従って、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞において作製した。ＡＫ２３抗体をＡＫ２３ハイブリドーマ培地から精製した。同様のアプローチに従って、本願発明者らは、ヒト及びマウスＦｃに融合したマウス及びヒトＤｓｇ３－ＥＣ１－４及びＤｓｇ３－ＥＣ１－５を生成し、それらの結合を完全に特性評価する。
非限定的で例示的な結果。本願発明者らは、マウス及びヒトの両方のＦｃ融合タンパク質であるｍＤｓｇ３－ＥＣ１－３－ＩｇＧ２ａ（ｍＦｃ）及びｈＤｓｇ３－ＥＣ１－３－ＩｇＧ１（ｈＦｃ）を作製した。ヒトＩｇＧ１及びマウスＩｇＧ２ａ由来のＦｃ領域を、それらの高いＦｃ媒介性死滅活性について選択した。タンパク質は、Ｃ末端にＦＬＡＧタグ、ソルターゼ認識モチーフ及びＨｉｓ６タグを有するように操作された。８アミノ酸配列（ＤＹＫＤＤＤＤＫ）であるＦＬＡＧは、ウェスタンブロット及びフローサイトメトリー分析のために使用することができ、その後、インビボで使用される場合、構築物の代謝運命の分析のために使用することができる。Ｈｉｓ６タグを精製に使用し、ソルターゼタグを部位特異的に改変を導入するために使用した。本願発明者らは、哺乳動物Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞を使用して両方の構築物を発現させ、Ｎｉ－ＮＴＡアフィニティーカラムを介して精製し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びウェスタンブロッティング分析を使用して特性評価して、構築物の形成を確認した（図６のパネルＡ～Ｂ）。Ｇｌｙ３－Ａｌｅｘａ６４７ソルターゼ基質を合成し、これを使用して、融合タンパク質をＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７で部位特異的に標識した。ソルターゼ反応は、構築物（５０μＭ）、Ｇｌｙ３－Ａｌｅｘａ６４７基質（５００μＭ）、及びソルターゼ（５μＭ）を４℃で１時間混合することによって行った。Ａｌｅｘａ６４７標識された構築物をサイズ排除カラムクロマトグラフィーによって精製し、構築物のゲル内蛍光スキャンによって標識を更に確認した（図６のパネルＢ）。構築物の機能性を特性評価するために、本願発明者らは、Ａｌｅｘａ６４７標識されたｍＤｓｇ３－ＥＣ１－３－ｍＦｃを使用して、抗ｍｄＳｇ３ ＡＫ２３ハイブリドーマ及び抗ｈＤｓｇ３ Ｆ７７９細胞を染色した。細胞を親和性及び特異性（低ｎＭ濃度での）により染色し（図６のパネルＣ）、これは、Ｆ７７９細胞上の患者由来ＢＣＲがマウスＤｓｇ３タンパク質と交差反応することを示している。対照として使用したＮａｌｍ－６細胞は、いかなる結合も示さなかった（図６のパネルＣ）。Ａｌｅｘａ６４７標識されたｈＤｓｇ３－ＥＣ１－３－ＩｇＧ１（ｈＦｃ）を使用して同様の実験を行い、これは、構築物がＦ７７９細胞に結合し、マウスＡＫ２３細胞も染色したことを示した（図６のパネルＢ～Ｃと同様）。構築物を更に特性評価するために、本願発明者らは、まず、プレートをＡＫ２３ Ａｂでコーティングし、別のプレートをＰ３Ｆ３（抗ヒトＤｓｇ３）でコーティングすることによって、ＥＬＩＳＡアッセイを行った。その結果は更に、本願発明者らが作製したヒト及びマウス構築物が両方の抗体に特異的に結合することを示した（図６のパネルＤ）。Ｐ３Ｆ３抗体を、製造業者のプロトコルに従って、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞において作製した。ＡＫ２３抗体をＡＫ２３ハイブリドーマ培地から精製した。同様のアプローチに従って、本願発明者らは、ヒト及びマウスＦｃに融合したマウス及びヒトＤｓｇ３－ＥＣ１－４及びＤｓｇ３－ＥＣ１－５を生成し、それらの結合を完全に特性評価する。
【0151】
Ｆｃ媒介性インビトロ死滅アッセイの確立：まず、本願発明者らは、Ｄｓｇ３－Ｆｃ融合体が、そのＦｃ（ＩｇＧ２ａ）を介して、低いｎＭ親和性でマウスマクロファージのＦｃγ受容体に結合することを確認した（図６のパネルＥ）。対照Ｎａｌｍ６細胞は、染色されないままであった。融合タンパク質がＦｃ媒介性死滅を引き起こし得るかどうかを決定するために、マウスＲＡＷ２６４．７マクロファージ細胞と共培養したＦ７７９又はＡＫ２３標的細胞を、ｍＤｓｇ３－ｍＦｃ融合タンパク質で処置した。１０ｎＭ用量は、２４時間後に、Ｆ７７９及びＡＫ２３細胞のそれぞれ６５％及び６０％の死滅を引き起こし、Ｎａｌｍ６又はハイブリドーマ対照細胞のいずれも死滅させなかった。４８時間の時点で、本願発明者らは、Ｆ７７９細胞の９４％の死滅を観察し、対照Ｎａｌｍ－６細胞には変化はなかった（図７）。ＡＫ２３ハイブリドーマ細胞は、抗Ｄｓｇ３抗体を培地中に放出し、これにより、ＰＶ患者における生理学的条件と同様に、構築物を中和することができる。これにもかかわらず、本願発明者らは、１０ｎＭ用量でＡＫ２３細胞とＦ７７９細胞との間で同様の有効な死滅を依然として観察し、Ｄｓｇ３に対する抗体が融合タンパク質の死滅有効性に対して最小限の負の影響を有することを示している。死滅の用量依存性を評価することができるが、これは、これが動物試験及び臨床的解釈に影響を及ぼすためである。同様の実験を、マウス骨髄由来マクロファージ自己抗体を使用して、標準的なＥＬＩＳＡによって行うことができる。また、正常なＢリンパ球数は、ＰＢＭＣ採取時にＣＤ１９及びＣＤ２０によって示すことができる。
【0152】
動物試験
治療：Ｄｓｇ３－Ｆｃ治療のインビボ有効性を試験するために、融合タンパク質をＡＫ２３注射の０、２又は５日後に静脈内注射することができる（モデル１）。これらの時点は、本願発明者らが、疾患負荷と治療の有効性との間の関係を特定すること、すなわち、治療が予防的であるかどうか、及び／又は重度の疾患表現型をレスキューすることができるかどうかを決定するのを助けることができる。治療タンパク質は、最適条件を見出すために、種々の濃度（尾静脈ＩＶ注射を介して１００μｌの最終体積中５ｍｇ／ｋｇ～１５ｍｇ／ｋｇ４６、４７）で使用され得る。範囲は、自己免疫マウスモデルにおけるＢ細胞枯渇のために使用される抗体濃度に基づいて決定され得る。能動疾患モデル（モデル２）の場合、以前の試験では、循環抗Ｄｓｇ３ ＩｇＧが早くも４日目にレシピエントＲａｇ２－／－マウスの血清中に存在し、その後急速に増加し、２１日目頃にプラトー状態になったことが報告されているため、治療を、Ｒａｇ２－／－マウスにおける養子細胞導入の０日後、１４日後、又は２１日後に行う。抗Ｄｓｇ ３ ＥＬＩＳＡ、体重減少、及び皮膚病変／びらんなどの非侵襲的読み出しを、様々な時点（治療後４日目、１０日目、１７日目、２５日目、及び３５日目）で行うことができる（治療群及び対照群についてｎ＝１０匹のマウス）。これらのデータから得られた傾向を使用して、治療を受けなかった対照マウスにおけるピークを確立することができる。試験により、ピークが１０日目と２０日目との間にあることを確立した。ピーク後の時点で、粘膜関門の免疫蛍光及び組織学的染色のために皮膚生検を得ることができる。モデル１及び２の両方で、可溶性抗Ｄｓｇ３抗体は、本願発明者らの構築物の死滅能力を部分的に中和し得る。そうである場合、本願発明者らは、異なる量の構築物を使用して、最適用量（最も低いオフターゲット率で最も高い死滅）を見出す。対照：陰性対照については、Ｄｓｇ１－Ｆｃ及びＤｓｇ３変異Ｆｃ（Ｆｃ機能性を有さない）を、治療タンパク質と同じ濃度で使用する。更に、陽性対照として、本願発明者らは、マウスにおいてＢ細胞を効果的に枯渇させることが示されているため４８（ＡＫ２３ハイブリドーマ細胞が、抗ＣＤ２０抗体により完全に枯渇される場合、又はされない場合があるため、モデル２においてより効果的であり得る）、動物当たり２５０μｇの濃度で抗ＣＤ２０ ＩｇＧ（クローンＳＡ２７１Ｇ２）を使用して調査する。読み出し：モデル１実験の読み出しは、ＡＫ２３ハイブリドーマ細胞（ルシフェラーゼ陽性であるため）の生物発光イメージング（ＩＶＩＳ）であり、これにより、ＡＫ２３細胞の高感度の縦断的測定を可能にする。更に、モデル１及び２の両方について、治療の開始後５日目及び１４日目に測定した血清抗Ｄｓｇ３力価、皮膚びらんの盲検調査、ＩｇＧ沈着を検出するための粘膜試料の免疫蛍光、及び粘膜関門の組織学的評価を行うことができる。Ｂ細胞カウントも同様に実施して、それらが治療の間正常レベル内に維持されることを確実にすることができる。理論に拘束されることを望むものではないが、治療は、疾患の臨床的解決及び組織学的解決をもたらす。
治療：Ｄｓｇ３－Ｆｃ治療のインビボ有効性を試験するために、融合タンパク質をＡＫ２３注射の０、２又は５日後に静脈内注射することができる（モデル１）。これらの時点は、本願発明者らが、疾患負荷と治療の有効性との間の関係を特定すること、すなわち、治療が予防的であるかどうか、及び／又は重度の疾患表現型をレスキューすることができるかどうかを決定するのを助けることができる。治療タンパク質は、最適条件を見出すために、種々の濃度（尾静脈ＩＶ注射を介して１００μｌの最終体積中５ｍｇ／ｋｇ～１５ｍｇ／ｋｇ４６、４７）で使用され得る。範囲は、自己免疫マウスモデルにおけるＢ細胞枯渇のために使用される抗体濃度に基づいて決定され得る。能動疾患モデル（モデル２）の場合、以前の試験では、循環抗Ｄｓｇ３ ＩｇＧが早くも４日目にレシピエントＲａｇ２－／－マウスの血清中に存在し、その後急速に増加し、２１日目頃にプラトー状態になったことが報告されているため、治療を、Ｒａｇ２－／－マウスにおける養子細胞導入の０日後、１４日後、又は２１日後に行う。抗Ｄｓｇ ３ ＥＬＩＳＡ、体重減少、及び皮膚病変／びらんなどの非侵襲的読み出しを、様々な時点（治療後４日目、１０日目、１７日目、２５日目、及び３５日目）で行うことができる（治療群及び対照群についてｎ＝１０匹のマウス）。これらのデータから得られた傾向を使用して、治療を受けなかった対照マウスにおけるピークを確立することができる。試験により、ピークが１０日目と２０日目との間にあることを確立した。ピーク後の時点で、粘膜関門の免疫蛍光及び組織学的染色のために皮膚生検を得ることができる。モデル１及び２の両方で、可溶性抗Ｄｓｇ３抗体は、本願発明者らの構築物の死滅能力を部分的に中和し得る。そうである場合、本願発明者らは、異なる量の構築物を使用して、最適用量（最も低いオフターゲット率で最も高い死滅）を見出す。対照：陰性対照については、Ｄｓｇ１－Ｆｃ及びＤｓｇ３変異Ｆｃ（Ｆｃ機能性を有さない）を、治療タンパク質と同じ濃度で使用する。更に、陽性対照として、本願発明者らは、マウスにおいてＢ細胞を効果的に枯渇させることが示されているため４８（ＡＫ２３ハイブリドーマ細胞が、抗ＣＤ２０抗体により完全に枯渇される場合、又はされない場合があるため、モデル２においてより効果的であり得る）、動物当たり２５０μｇの濃度で抗ＣＤ２０ ＩｇＧ（クローンＳＡ２７１Ｇ２）を使用して調査する。読み出し：モデル１実験の読み出しは、ＡＫ２３ハイブリドーマ細胞（ルシフェラーゼ陽性であるため）の生物発光イメージング（ＩＶＩＳ）であり、これにより、ＡＫ２３細胞の高感度の縦断的測定を可能にする。更に、モデル１及び２の両方について、治療の開始後５日目及び１４日目に測定した血清抗Ｄｓｇ３力価、皮膚びらんの盲検調査、ＩｇＧ沈着を検出するための粘膜試料の免疫蛍光、及び粘膜関門の組織学的評価を行うことができる。Ｂ細胞カウントも同様に実施して、それらが治療の間正常レベル内に維持されることを確実にすることができる。理論に拘束されることを望むものではないが、治療は、疾患の臨床的解決及び組織学的解決をもたらす。
【0153】
追加の試験
インビトロ試験：ソルターゼペプチドのタンパク質操作及び発現、クローニング、並びに合成は、ＰＩの研究室において日常的であり、理論に束縛されることを望むものではないが、タンパク質発現及びペプチド合成の生成及びスケールアップに困難はない。しかしながら、タンパク質発現収率が特定の構築物について低い場合、本願発明者らは、この問題に対処するために以下の異なる経路を調査することができる：（１）発現に使用されるコドンを再最適化する、（２）異なるシグナルペプチド配列を使用する、（３）Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞の代わりにタンパク質発現のための他の系、例えばＣＨＯ細胞又は昆虫細胞を使用する。理論に束縛されることを望むものではないが、可溶性ポリクローナル抗Ｄｓｇ３抗体は、本願発明者らの構築物の効果を完全にではなく部分的に中和する。したがって、本願発明者らは、ポリクローナルＰＶ血清ＩｇＧの存在下で、Ｆ７７９、ＰＶＢ２８及びＡＫ２３細胞に対する本願発明者らの構築物の死滅能力を評価することができる。更に、これらの構築物の投薬は、オマリズマブ（ＩｇＥレベルに基づいて使用されるＩｇＧ１ｋ抗ヒトＩｇＥ）などの薬物と同様であるが、直接的には類似しておらず、患者依存的であり、循環抗Ｄｓｇ３力価のレベルに基づき得るので、本願発明者らは、これを臨床診療における制限とは考えない。加えて、現実世界の状況では、本願発明者らの治療薬は、抗Ｄｓｇ３力価を低下させる他の薬物と同時に使用することができる。更に、モノクローナル及びポリクローナル抗Ｄｓｇ３ ＩｇＧは、Ｄｓｇ３自己抗体産生Ｂ細胞に特異的なＣＡＡＲ Ｔ細胞の死滅能力に対して有意な効果を有さないことが見出された１６。この融合タンパク質の有効性を更に増加させるために、本願発明者らは、ＩＬ－２と融合したＤｓｇ３－Ｆｃを設計し、首尾よく発現させたが、これは（理論に束縛されることを望むものではないが）より多くの細胞に結合し、死滅を増強することができる。他のサイトカイン（例えば、ＩＬ－１５）も同様に調査することができる。しかし、これらのアプローチは、いくつかの副作用を有する場合があり、又は有さない場合がある。陰性対照実験のために、抗Ｄｓｇ３抗体の発現を欠く細胞に加えて、代替法として、本願発明者らが同様に発現及び使用することができるＤｓｇ１融合体の合成のためのプラスミドを設計し、作製した。インビボ試験：長期モニタリング及び任意の潜在的副作用を、上で説明したように実施することができる。本願発明者らは、治療の用量依存性及びそれが抗Ｄｓｇ３自己抗体力価の存在とどのように相関するかを（ＥＬＩＳＡを介して）注意深く調べることができる。生物製剤の広範な使用により、抗薬物抗体は、抗ＴＮＦαからリツキシマブまで及ぶ複数の薬剤について報告されている。免疫複合体沈着などの主要な免疫有害事象が理論化されているが、臨床診療では実現されていない。オマリズマブの場合のように、生物製剤が高循環抗体に直接結合する場合、高いＩｇＥレベルを有する患者への投薬は、免疫有害事象を生じなかった。同様に、理論に束縛されることを望むものではないが、血清中の抗Ｄｓｇ３ ＩｇＧの存在は、いかなる主要な免疫有害事象も生じさせないが、これをモニタリングする。
インビトロ試験：ソルターゼペプチドのタンパク質操作及び発現、クローニング、並びに合成は、ＰＩの研究室において日常的であり、理論に束縛されることを望むものではないが、タンパク質発現及びペプチド合成の生成及びスケールアップに困難はない。しかしながら、タンパク質発現収率が特定の構築物について低い場合、本願発明者らは、この問題に対処するために以下の異なる経路を調査することができる：（１）発現に使用されるコドンを再最適化する、（２）異なるシグナルペプチド配列を使用する、（３）Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞の代わりにタンパク質発現のための他の系、例えばＣＨＯ細胞又は昆虫細胞を使用する。理論に束縛されることを望むものではないが、可溶性ポリクローナル抗Ｄｓｇ３抗体は、本願発明者らの構築物の効果を完全にではなく部分的に中和する。したがって、本願発明者らは、ポリクローナルＰＶ血清ＩｇＧの存在下で、Ｆ７７９、ＰＶＢ２８及びＡＫ２３細胞に対する本願発明者らの構築物の死滅能力を評価することができる。更に、これらの構築物の投薬は、オマリズマブ（ＩｇＥレベルに基づいて使用されるＩｇＧ１ｋ抗ヒトＩｇＥ）などの薬物と同様であるが、直接的には類似しておらず、患者依存的であり、循環抗Ｄｓｇ３力価のレベルに基づき得るので、本願発明者らは、これを臨床診療における制限とは考えない。加えて、現実世界の状況では、本願発明者らの治療薬は、抗Ｄｓｇ３力価を低下させる他の薬物と同時に使用することができる。更に、モノクローナル及びポリクローナル抗Ｄｓｇ３ ＩｇＧは、Ｄｓｇ３自己抗体産生Ｂ細胞に特異的なＣＡＡＲ Ｔ細胞の死滅能力に対して有意な効果を有さないことが見出された１６。この融合タンパク質の有効性を更に増加させるために、本願発明者らは、ＩＬ－２と融合したＤｓｇ３－Ｆｃを設計し、首尾よく発現させたが、これは（理論に束縛されることを望むものではないが）より多くの細胞に結合し、死滅を増強することができる。他のサイトカイン（例えば、ＩＬ－１５）も同様に調査することができる。しかし、これらのアプローチは、いくつかの副作用を有する場合があり、又は有さない場合がある。陰性対照実験のために、抗Ｄｓｇ３抗体の発現を欠く細胞に加えて、代替法として、本願発明者らが同様に発現及び使用することができるＤｓｇ１融合体の合成のためのプラスミドを設計し、作製した。インビボ試験：長期モニタリング及び任意の潜在的副作用を、上で説明したように実施することができる。本願発明者らは、治療の用量依存性及びそれが抗Ｄｓｇ３自己抗体力価の存在とどのように相関するかを（ＥＬＩＳＡを介して）注意深く調べることができる。生物製剤の広範な使用により、抗薬物抗体は、抗ＴＮＦαからリツキシマブまで及ぶ複数の薬剤について報告されている。免疫複合体沈着などの主要な免疫有害事象が理論化されているが、臨床診療では実現されていない。オマリズマブの場合のように、生物製剤が高循環抗体に直接結合する場合、高いＩｇＥレベルを有する患者への投薬は、免疫有害事象を生じなかった。同様に、理論に束縛されることを望むものではないが、血清中の抗Ｄｓｇ３ ＩｇＧの存在は、いかなる主要な免疫有害事象も生じさせないが、これをモニタリングする。
【0154】
抗Ｄｓｇ３ Ｂ細胞の死滅を媒介するＤｓｇ３抗ＣＤ３融合体の能力を試験する
抗ＣＤ３ｅ ｓｃＦｖに対するＤｓｇ３融合体の合成。Ｎ－Ｃ Ｄｓｇ３抗ＣＤ３ｅ融合発現プラスミドを、ｈＤｓｇ３－ＥＣ１－３及びＯＫＴ３抗ＣＤ３ｅ ｓｃＦｖのｃＤＮＡを含有するように設計した。ＯＫＴ３クローンは、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャの抗ＣＤ３部分として臨床で使用されてきた。ＣＤ３ｅは、全ての成熟Ｔリンパ球上に見出される。構築物は、他の二重特異性Ｔ細胞エンゲージャと同様に、Ｎ末端にＤｓｇ３及びＣ末端に抗ＣＤ３ｅを有するように設計された。更に、この構造は、ＥＣ１－ＥＣ３ドメインがＤｓｇ３反応性Ｂ細胞による認識に利用可能であることを確実にすることができる。他の二重特異性Ｔ細胞エンゲージャと同様に、可撓性（Ｇ４Ｓ）３スペーサをＤｓｇ３タンパク質とｓｃＦｖタンパク質との間に含めた。Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞を使用してタンパク質を発現させた。
抗ＣＤ３ｅ ｓｃＦｖに対するＤｓｇ３融合体の合成。Ｎ－Ｃ Ｄｓｇ３抗ＣＤ３ｅ融合発現プラスミドを、ｈＤｓｇ３－ＥＣ１－３及びＯＫＴ３抗ＣＤ３ｅ ｓｃＦｖのｃＤＮＡを含有するように設計した。ＯＫＴ３クローンは、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャの抗ＣＤ３部分として臨床で使用されてきた。ＣＤ３ｅは、全ての成熟Ｔリンパ球上に見出される。構築物は、他の二重特異性Ｔ細胞エンゲージャと同様に、Ｎ末端にＤｓｇ３及びＣ末端に抗ＣＤ３ｅを有するように設計された。更に、この構造は、ＥＣ１－ＥＣ３ドメインがＤｓｇ３反応性Ｂ細胞による認識に利用可能であることを確実にすることができる。他の二重特異性Ｔ細胞エンゲージャと同様に、可撓性（Ｇ４Ｓ）３スペーサをＤｓｇ３タンパク質とｓｃＦｖタンパク質との間に含めた。Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞を使用してタンパク質を発現させた。
【0155】
クリック化学を用いたＣ－Ｃ融合：理論に束縛されることを望むものではないが、ソルターゼを使用することにより、Ｄｓｇ３及び抗ＣＤ３ｅ ｓｃＦｖタンパク質のＣ末端にクリックハンドルを部位特異的に導入することができ、これにより、アジド－アルキンクリック化学を使用してそれらを一緒に「クリック」することができる。これにより、Ｃ－Ｃ融合体の産生が起こり、これは、伝統的な遺伝的アプローチを介して作製することが不可能である。そのようなアプローチは部位特異的であり、それによって、産物は、その機能性を保持することができる。このアプローチを確立するために、本願発明者らは、ブリナツモマブに類似した、抗ＣＤ１９によって抗ＣＤ３ ｓｃＦｖをクリックする融合体を合成することができ、本願発明者らはそれを死滅アッセイの陽性対照として使用することができる。本願発明者らは、両方のｓｃＦｖ（抗ＣＤ３ ＯＫＴ３クローンからなる）についてブリナツモマブの同じ配列を使用した。本願発明者らはまず、そのＣ末端にソルターゼ認識タグ（ＬＰＥＴＧ）を備えた抗ＣＤ３ｅ ｓｃＦｖを細菌により発現させた。抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖを同様に作製した。次に、Ｇｌｙ３－アルキン及びＧｌｙ３－アジドソルターゼ基質を合成した。抗ＣＤ３ｅｓｃＦｖをアルキン基質と共に導入し、抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖをアジド基質と共に導入し、両方ともソルターゼを介してそれらのＣ末端に導入した。クリック官能化ｓｃＦｖをＦＰＬＣによって精製し、その後、銅媒介性アジド－アルキン環化付加化学によって一緒にクリックした（図８のパネルＡ）。生成物をＦＰＬＣにより精製し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びフローサイトメトリー分析を用いて特性評価し、クリックされたＣ－Ｃ融合体がＮａｌｍ６細胞及びヒトＴ細胞の両方を強い親和性で染色することを確認した。本願発明者らは、同様にＤｓｇ３抗ＣＤ３ｅのＣ－Ｃ融合体を作製するためのアプローチを使用する。２．Ｎ－Ｃの融合体のソルターゼ媒介性合成：クリック化学アプローチは、遺伝子的に融合されたヘテロ二量体タンパク質の発現が困難であることが判明した場合、従来の遺伝的融合の代替法である。しかしながら、第２の代替法を提供するために、また、理論に束縛されることを望むものではないが、ソルターゼを介してより「天然の」融合体を作製するために、本願発明者らは、以下のように、いずれのタンパク質にも事前の改変を行うことなく、Ｄｓｇ３抗ＣＤ３ｅのＮ－Ｃ融合体を作製することができる。ソルターゼ反応可逆性を利用して（理論に束縛されることを望むものではないが）、トリグリシン分子（ＧＧＧ）を使用して、Ｃ－Ｎタンパク質融合体の形成を触媒することができる。タンパク質Ａは、Ｃ末端に「ＬＰＥＴＧ」モチーフを有するように操作され、タンパク質Ｂは、Ｎ末端に「ＬＰＥＴＧＧＧ」を有するように操作される。ソルターゼ及びトリグリシン分子の添加により、タンパク質Ｂから「ＬＰＥＴ」部分を除去し、それを「Ｇｌｙ３－Ｂ」に変換することができる。次いで、系内で産生されたＧｌｙ３－Ｂタンパク質は、タンパク質Ａと反応して、クリック化学が関与しない融合産物「Ａ－ＬＰＥＴ－ＧＧＧ－Ｂ」を形成し得る（図８のパネルＢ）。反応は、過剰のＧＧＧ触媒が反応混合物を離れることを可能にする透析カセット中で行うことができ、これは更に反応を融合産物の形成の方へと移動させる。このアプローチを確立するために、本願発明者らは、このような「抗ＣＤ１９抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ融合体」を作製した。抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖは、そのＣ末端に「ＬＰＥＴＧ」ソルターゼタグを有する。本願発明者らは、以下の配列「ＭＨｉｓ６－ＬＰＥＴＧＧＧ－ａｎｔｉ－ＣＤ３ ｓｃＦｖ」を有するように、抗ＣＤ３ ｓｃＦｖタンパク質を操作した（メチオニンコドン（ＡＴＧ）が開始コドンとして働くので、タンパク質は常にＭで開始する、精製を容易にするためにＨｉｓ６を使用した）。次に、本願発明者らは、抗ＣＤ１９及び抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ、Ｇｌｙ３、並びにソルターゼを混合し、反応を４℃で一晩進行させた。産物形成をＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析により確認し、融合タンパク質をＦＰＬＣサイズ排除クロマトグラフィーにより精製した（図８のパネルＣ）。融合体を使用して、Ｎａｌｍ６細胞（ＣＤ１９＋）及びＪｕｒｋａｔ細胞（ＣＤ３＋）を染色した。フローサイトメトリーの結果は、融合体が高い親和性で細胞を染色することを確認した（図８のパネルＤ）。この戦略は、遺伝子融合体として発現させることが困難であるＣ－Ｎタンパク質融合体を作製するために、社会において広範な適用を有し得る、未公開のアプローチである。ｃＤＮＡプラスミドへのソルターゼタグの導入を除いて、いずれのタンパク質に対しても事前の改変が必要とされない。このアプローチにより、Ｄｓｇ３抗ＣＤ３ｅ融合体を作製する。
【0156】
マウス及びヒトＤｓｇ３－ＥＣ１－３を作製し、同様に特性評価した（図９のパネルＡ～Ｂ）。次に、ソルターゼを使用して、それらのＣ末端にＡｌｅｘａ６４７を導入した（図９のパネルＡ）。生成物を特性評価するために、本願発明者らは、抗Ｄｓｇ３細胞（Ｆ７７９、及びＡＫ２３細胞）を染色した。Ａｌｅｘａ６４７標識されたｍＤｓｇ３－ＥＣ１－３は、高い親和性及び特異性で細胞を染色することができた（図９のパネルＣ）。対照として使用したＮａｌｍ６細胞は、いかなる染色も示さなかった。本願発明者らは、クリック及び直接ソートタグ化アプローチの両方に従って、Ｄｓｇ３抗ＣＤ３融合（マウス及びヒト）タンパク質を作製し、これを完全に特性評価する。本願発明者らは、同様に抗マウスＣＤ３ｅ ｓｃＦｖを作製し、特性評価した（クローン２Ｃ１）６１。
【0157】
構築物の死滅有効性を測定する。陽性抗Ｄｓｇ３細胞株（ＡＫ２３、Ｆ７７９及びＰＶＢ－２８）及び陰性細胞株（Ｎａｌｍ６及び無関係のハイブリドーマ）を、新鮮なヒトＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞と共培養する（Ｅ：Ｔ比は１：１、５：１、及び１０：１）。キメラＤｓｇ３抗ＣＤ３ｅ融合タンパク質を標準的な細胞インキュベーター内で３７℃でインキュベートする。融合タンパク質は、最適条件を見出すために様々な濃度（１０μｇ／ｍＬ～１ｎｇ／ｍＬ）で使用される。第２の対照として、抗Ｄｓｇ３細胞と対照細胞との間に細胞死の差がないと予想して、細胞を培地単独でインキュベートする。フローサイトメトリー分析を使用して、細胞の標準的な生－死分析を行う。Ｔ細胞活性化の指標としてのＩＦＮ－γの産生を、ＥＬＩＳｐｏｔアッセイを使用して評価する。インビトロアッセイにおける患者ＰＢＭＣに対するアプローチの有効性を描写する：目的１と同様に、ｈＤｓｇ３抗ｈＣＤ３ｅ融合タンパク質を、ＰＶ患者から得たヒトＰＢＭＣ培養物に添加することができる。健常ＰＢＭＣを対照として使用することができる。（理論に束縛されることを望むものではないが）患者自身のＴ細胞が、標的化された抗Ｄｓｇ３ Ｂ細胞を死滅させるように指向され、活性化されるため、更なるＴ細胞は混合物に添加されない。様々な濃度の融合体を使用して、最適条件を見出すことができる（１０μｇ／ｍＬ～１ｎｇ／ｍＬ）。融合体の添加の４時間後、１２時間後及び２４時間後に、死滅有効性を分析することができる（各実験についてｎ＝１０）。分析は、Ｆｃアプローチと同様に行うことができる。
【0158】
Ｄｓｇ３抗ＣＤ３ｅアプローチを用いた動物試験。組換えタンパク質を、ＡＫ２３細胞注射（モデル１）の０、２又は５日後に、様々な濃度（０．５ｍｇ／ｋｇ～１ｍｇ／ｋｇ）で静脈内に注射することができ、これは、最適条件を見出すために最終体積１００μｌの腫瘍学的治療設定で使用されるものと同様である。能動疾患モデル（モデル２）については、組換えタンパク質を、養子細胞導入後０日目、１４日目、又は２１日目にＲａｇ２－／－マウスに注射した（前述の通り）。陰性対照として、Ｄｓｇ１抗ＣＤ３ｅ複合体を治療タンパク質と同じ濃度で使用することができる。読み出し（目的１に記載される通り）のために、ルシフェラーゼ（モデル１について）、免疫蛍光及び組織学的イメージング、並びに抗Ｄｓｇ３ ＥＬＩＳＡ力価と共に、細胞を、治療したマウス及び治療していないマウスの皮膚生検から単離することができる。ＣＤ３＋細胞の正規化されたカウントを、治療後５日目、１４日目及び２０日目にフローサイトメトリー分析によって分析する。Ｄｓｇ３抗ＣＤ３ｅ治療を注射されたマウスにおいてＴ細胞カウントが増加する場合があり、これは、組換えタンパク質がＴ細胞を動員することができることを確認するものである。長期モニタリング及び任意の潜在的副作用を、本明細書中で説明されるように実施する。
【0159】
追加の試験
インビトロ試験：ソルターゼ反応は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及び／又は質量分析を介してモニタリングすることができる。典型的には、ソルターゼ基質で標識されたタンパク質の９０％より多くが得られたら、産物をサイズ排除クロマトグラフィーによって精製することができる。アジド－アルキン環化付加は、ほぼ完全な収率で、タンパク質のバイオコンジュゲーションのために広く使用される、十分に特性評価された反応である。最終的な融合構築物は、質量分析、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、フローサイトメトリー及び免疫ブロット分析によって更に特性評価され得る。様々な改変ペプチドの合成は、実験室において日常的であり、（理論に束縛されることを望むものではないが）改変ペプチドの製造及び合成のスケールアップにおいて、何らかの困難性がある。しかし、一部のタンパク質は、疎水性基質の添加により可溶性が低下する可能性がある。それが問題になる場合、本願発明者らは、非常に親水性である小さなポリエチレングリコール（ＰＥＧ）スペーサを、Ｇｌｙ３とアルキン官能基との間に含める（例えば、Ｇｌｙ３－ＰＥＧ ５－プロパルギルアルキン）。更に、アルキン－アジドクリック反応が所与の構築物に対して高い生成物収率をもたらさない場合、本願発明者らは、安定なオキシム生成物を形成する、より親水性のアルデヒド及びアミノオキシクリックハンドルなどの代替的なクリックハンドルを使用することができ、本願発明者らはこれについて広範な経験を有している。本願発明者らは、ソルターゼ基質分子中のＧｌｙ３とアルキン又はアジド官能基との間に小さなＰＥＧ３スペーサを含ませた。理論に束縛されることを望むものではないが、ＰＥＧスペーサは、構築物のより高い安定化をもたらすことができる。このＰＥＧスペーサのサイズは、所与の融合体が低い安定性を有するか、又は低い溶解度を有する場合に変化させることができる。更に、本願発明者らは、スペーサのサイズが構築物の死滅能力に影響を及ぼすかどうかを分析することができる。本願発明者らは、本願発明者らのマウス及びヒトＤｓｇ３－ＥＣ１－３構築物が、細菌により発現され、次いでリフォールディングされて、本願発明者の手持ちの全ての抗Ｄｓｇ３細胞及び抗体に対して高い親和性（低ナノモル濃度）で結合することを示した。更に、Ｄｓｇ３のグリコシル化は、患者の抗Ｄｓｇ３抗体に対するその結合において重要な役割を果たさないことが示された。したがって、本願発明者らは、Ｄｓｇ３構築物を作製するために本願発明者らの確立されたアプローチを使用し続ける。本願発明者らは、臨床的解釈を考慮する場合により関連がある可能性があるため、目的１において既に議論された代替（コドン最適化、異なるシグナル配列、及び異なる発現系など）を通して遺伝子融合発現の収率を増加させるために、本願発明者らの最適化の試みを続ける。目的１で考察したＦｃ構築物については、グリコシル化がＦｃ機能性に重要であり、Ｆｃ構築物について良好な発現収率（Ｅｘｐｉ２９３細胞１００ｍＬ当たり約１ｍｇ）が既に得られているので、全てのタンパク質を哺乳動物Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞で発現させたか、又は発現させる。インビボ試験：理論に束縛されることを望むものではないが、抗ＣＤ３治療の副作用は、ＣＤ４ Ｔ細胞、例えば、Ｔ濾胞性ヘルパー細胞（Ｔｆｈ）と自己反応性Ｂ細胞との結合であり得、これにより、それらの拡大、したがって疾患の増悪を引き起こす場合がある。理論に束縛されることを望むものではないが、臨床で使用される二重特異性Ｔ細胞エンゲージャは、ＣＤ８細胞傷害性Ｔ細胞を動員して標的細胞を死滅させるのに有効であるため、これは起こらない。理論に束縛されることを望むものではないが、ＣＤ８ Ｔ細胞動員の頻度は、動員されたＴｆｈ細胞の頻度よりも高い可能性がある。これは、全てではないがほとんどのＣＤ８ Ｔ細胞は、任意のＴＣＲと共に、自己反応性Ｄｓｇ３細胞を死滅させるために動員され得るが、ＣＤ４ Ｔ細胞（無関係のＴＣＲを発現する）と自己反応性Ｂ細胞との結合は、Ｂ細胞の拡大をもたらすとは予想されないためである。おそらく、Ｄｓｇ３由来ペプチド－ＭＨＣ複合体に対する反応性を有するほんの数個のＣＤ４ Ｔ細胞の結合が、自己反応性Ｂ細胞の拡大をもたらし得る。更に、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャ（例えば、ブリナツモマブ）を投与された患者における自己免疫の発生の報告はなく、異なる種類のＢ細胞媒介性自己免疫疾患の発生率がわずかではないことを考慮すると、この観察は、そのような事象の発生がありそうもないことを示唆する。それにもかかわらず、本願発明者らは、この問題をモニタリングする。ＰＶの能動免疫モデル（モデル２）は、この問題を研究するための理想的なモデルであり得るが、これは、抗Ｄｓｇ３力価、Ｄｓｇ３自己反応性Ｂ細胞の数、及びＣＤ４ Ｔ細胞、特にＴｆｈ細胞の数及び表現型をモニタリングすることによって注意深く評価される。Ｆｃ媒介性アプローチと同様に、この治療に対する抗Ｄｓｇ３抗体の効果は、臨床的有意性を有する可能性が低い。加えて、現実世界の状況では、本願発明者らの治療薬は、抗Ｄｓｇ３力価を低下させる他の薬物と同時に使用することができる。それにもかかわらず、この問題をモニタリングし、評価することができる。
インビトロ試験：ソルターゼ反応は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及び／又は質量分析を介してモニタリングすることができる。典型的には、ソルターゼ基質で標識されたタンパク質の９０％より多くが得られたら、産物をサイズ排除クロマトグラフィーによって精製することができる。アジド－アルキン環化付加は、ほぼ完全な収率で、タンパク質のバイオコンジュゲーションのために広く使用される、十分に特性評価された反応である。最終的な融合構築物は、質量分析、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、フローサイトメトリー及び免疫ブロット分析によって更に特性評価され得る。様々な改変ペプチドの合成は、実験室において日常的であり、（理論に束縛されることを望むものではないが）改変ペプチドの製造及び合成のスケールアップにおいて、何らかの困難性がある。しかし、一部のタンパク質は、疎水性基質の添加により可溶性が低下する可能性がある。それが問題になる場合、本願発明者らは、非常に親水性である小さなポリエチレングリコール（ＰＥＧ）スペーサを、Ｇｌｙ３とアルキン官能基との間に含める（例えば、Ｇｌｙ３－ＰＥＧ ５－プロパルギルアルキン）。更に、アルキン－アジドクリック反応が所与の構築物に対して高い生成物収率をもたらさない場合、本願発明者らは、安定なオキシム生成物を形成する、より親水性のアルデヒド及びアミノオキシクリックハンドルなどの代替的なクリックハンドルを使用することができ、本願発明者らはこれについて広範な経験を有している。本願発明者らは、ソルターゼ基質分子中のＧｌｙ３とアルキン又はアジド官能基との間に小さなＰＥＧ３スペーサを含ませた。理論に束縛されることを望むものではないが、ＰＥＧスペーサは、構築物のより高い安定化をもたらすことができる。このＰＥＧスペーサのサイズは、所与の融合体が低い安定性を有するか、又は低い溶解度を有する場合に変化させることができる。更に、本願発明者らは、スペーサのサイズが構築物の死滅能力に影響を及ぼすかどうかを分析することができる。本願発明者らは、本願発明者らのマウス及びヒトＤｓｇ３－ＥＣ１－３構築物が、細菌により発現され、次いでリフォールディングされて、本願発明者の手持ちの全ての抗Ｄｓｇ３細胞及び抗体に対して高い親和性（低ナノモル濃度）で結合することを示した。更に、Ｄｓｇ３のグリコシル化は、患者の抗Ｄｓｇ３抗体に対するその結合において重要な役割を果たさないことが示された。したがって、本願発明者らは、Ｄｓｇ３構築物を作製するために本願発明者らの確立されたアプローチを使用し続ける。本願発明者らは、臨床的解釈を考慮する場合により関連がある可能性があるため、目的１において既に議論された代替（コドン最適化、異なるシグナル配列、及び異なる発現系など）を通して遺伝子融合発現の収率を増加させるために、本願発明者らの最適化の試みを続ける。目的１で考察したＦｃ構築物については、グリコシル化がＦｃ機能性に重要であり、Ｆｃ構築物について良好な発現収率（Ｅｘｐｉ２９３細胞１００ｍＬ当たり約１ｍｇ）が既に得られているので、全てのタンパク質を哺乳動物Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞で発現させたか、又は発現させる。インビボ試験：理論に束縛されることを望むものではないが、抗ＣＤ３治療の副作用は、ＣＤ４ Ｔ細胞、例えば、Ｔ濾胞性ヘルパー細胞（Ｔｆｈ）と自己反応性Ｂ細胞との結合であり得、これにより、それらの拡大、したがって疾患の増悪を引き起こす場合がある。理論に束縛されることを望むものではないが、臨床で使用される二重特異性Ｔ細胞エンゲージャは、ＣＤ８細胞傷害性Ｔ細胞を動員して標的細胞を死滅させるのに有効であるため、これは起こらない。理論に束縛されることを望むものではないが、ＣＤ８ Ｔ細胞動員の頻度は、動員されたＴｆｈ細胞の頻度よりも高い可能性がある。これは、全てではないがほとんどのＣＤ８ Ｔ細胞は、任意のＴＣＲと共に、自己反応性Ｄｓｇ３細胞を死滅させるために動員され得るが、ＣＤ４ Ｔ細胞（無関係のＴＣＲを発現する）と自己反応性Ｂ細胞との結合は、Ｂ細胞の拡大をもたらすとは予想されないためである。おそらく、Ｄｓｇ３由来ペプチド－ＭＨＣ複合体に対する反応性を有するほんの数個のＣＤ４ Ｔ細胞の結合が、自己反応性Ｂ細胞の拡大をもたらし得る。更に、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャ（例えば、ブリナツモマブ）を投与された患者における自己免疫の発生の報告はなく、異なる種類のＢ細胞媒介性自己免疫疾患の発生率がわずかではないことを考慮すると、この観察は、そのような事象の発生がありそうもないことを示唆する。それにもかかわらず、本願発明者らは、この問題をモニタリングする。ＰＶの能動免疫モデル（モデル２）は、この問題を研究するための理想的なモデルであり得るが、これは、抗Ｄｓｇ３力価、Ｄｓｇ３自己反応性Ｂ細胞の数、及びＣＤ４ Ｔ細胞、特にＴｆｈ細胞の数及び表現型をモニタリングすることによって注意深く評価される。Ｆｃ媒介性アプローチと同様に、この治療に対する抗Ｄｓｇ３抗体の効果は、臨床的有意性を有する可能性が低い。加えて、現実世界の状況では、本願発明者らの治療薬は、抗Ｄｓｇ３力価を低下させる他の薬物と同時に使用することができる。それにもかかわらず、この問題をモニタリングし、評価することができる。
【0160】
アルファ放射標識Ｄｓｇ３が抗Ｄｓｇ３Ｂ細胞を死滅させる能力の調査
デスモグレイン－３タンパク質の放射性標識。利用可能な同位体のうち、アクチニウム－２２５（２２５Ａｃ）（ｔ１／２＝９．９ｄ）は、臨床で使用されてきた２５、７１。２２５Ａｃによる抗体の標識は、十分に特性評価されたＤＯＴＡキレート剤分子を介して行うことができる。本願発明者らは、Ｇｌｙ３－ＤＯＴＡソルターゼ基質及び基質を用いて部位特異的に改変されたｍＤｓｇ３－ＥＣ１－３タンパク質を合成し、その産物を特性評価し、タンパク質が抗Ｄｓｇ３細胞に対して高い結合親和性を有して機能的なままであることを確認した（図１０）。次に、ＤＯＴＡ標識されたＤｓｇ３を２２５Ａｃ放射性同位体と共に導入する。生成物の形成及び放射化学収率は、放射性ＨＰＬＣ分析を使用して決定される。精製された２２５Ａｃ－Ｄｓｇ３構築物の安定性を、ＰＢＳ中及びヒト血清中、３７℃でインキュベートすることによって評価する。放射性標識がデスモグレインタンパク質の機能性に影響を及ぼさないことを確実にするために、陽性抗Ｄｓｇ３細胞及び陰性細胞を２２５Ａｃ－Ｄｓｇ３と共に３０分間インキュベートする。細胞を３回洗浄し、放射活性を測定する。本願発明者らは、抗Ｄｓｇ３細胞が放射性であるのに対して、陰性細胞は、何らかの放射活性も有し得るか、又は有し得ないと予想する。これにより、放射性標識手順がＤｓｇ３タンパク質の結合能力を損なわなかったことを確認することができる。
デスモグレイン－３タンパク質の放射性標識。利用可能な同位体のうち、アクチニウム－２２５（２２５Ａｃ）（ｔ１／２＝９．９ｄ）は、臨床で使用されてきた２５、７１。２２５Ａｃによる抗体の標識は、十分に特性評価されたＤＯＴＡキレート剤分子を介して行うことができる。本願発明者らは、Ｇｌｙ３－ＤＯＴＡソルターゼ基質及び基質を用いて部位特異的に改変されたｍＤｓｇ３－ＥＣ１－３タンパク質を合成し、その産物を特性評価し、タンパク質が抗Ｄｓｇ３細胞に対して高い結合親和性を有して機能的なままであることを確認した（図１０）。次に、ＤＯＴＡ標識されたＤｓｇ３を２２５Ａｃ放射性同位体と共に導入する。生成物の形成及び放射化学収率は、放射性ＨＰＬＣ分析を使用して決定される。精製された２２５Ａｃ－Ｄｓｇ３構築物の安定性を、ＰＢＳ中及びヒト血清中、３７℃でインキュベートすることによって評価する。放射性標識がデスモグレインタンパク質の機能性に影響を及ぼさないことを確実にするために、陽性抗Ｄｓｇ３細胞及び陰性細胞を２２５Ａｃ－Ｄｓｇ３と共に３０分間インキュベートする。細胞を３回洗浄し、放射活性を測定する。本願発明者らは、抗Ｄｓｇ３細胞が放射性であるのに対して、陰性細胞は、何らかの放射活性も有し得るか、又は有し得ないと予想する。これにより、放射性標識手順がＤｓｇ３タンパク質の結合能力を損なわなかったことを確認することができる。
【0161】
確立された抗Ｄｓｇ３細胞を使用して、放射性標識された構築物の死滅有効性を測定する。陽性抗Ｄｓｇ３ハイブリドーマ細胞及び陰性細胞を丸底４８ウェルプレート中で培養する。放射性標識した２２５Ａｃ－Ｄｓｇ３タンパク質を３７℃で細胞に加える。放射性標識組換え構築物は、最適条件を見出すために様々な濃度（１０μＣｉ／ｍＬ～１ｎＣｉ／ｍＬ）で使用される。対照として、細胞を同量の２２５Ａｃ－ＤＯＴＡ単独（Ｄｓｇ３にコンジュゲートしていない）と共にインキュベートし、これは抗Ｄｓｇ３細胞を死滅させないと予想される。放射性標識されたＤｓｇ３又は対照同位体とのインキュベーションを２０分間行い、続いて非結合試薬／同位体を洗い流して（３回）、照射による非特異的な細胞死を防ぐ。細胞及び放射性標識されたＤｓｇ３のインキュベーションの４時間後、１６時間後、２４時間後及び４８時間後に、フローサイトメトリー及び標準的な生－死分析によって分析を行う。
【0162】
インビトロアッセイにおけるＰＶ患者ＰＢＭＣに対する２２５Ａｃ－放射性標識Ｄｓｇ３構築物の有効性を評価する。目的１及び２と同様に、２２５Ａｃ放射性標識されたＤｓｇ３構築物をヒトＰＢＭＣ細胞（健常試料及び患者試料の両方）に添加し、混合物を標準的な細胞インキュベーター内で３７℃でインキュベートする。様々な濃度の構築物を使用して、最適条件を見出す（１０ｍＣｉ／ｍＬ～１ｎＣｉ／ｍＬ）。対照として、細胞を同量の２２５Ａｃ－ＤＯＴＡ単独と共にインキュベートする。放射性標識されたＤｓｇ３又は対照同位体とのインキュベーションを２０分間行い、続いて非結合試薬／同位体を洗い流して（３回）、照射による非特異的な細胞死を防ぐ。分析は、放射性標識されたＤｓｇ３とのインキュベーションの４、１６、２４及び４８時間後に、抗原特異的ＩｇＧ Ｂ細胞枯渇及び総ＩｇＧ Ｂ細胞枯渇についてのＥＬＩＳｐｏｔアッセイによって行う。本願発明者らは、自己反応性抗Ｄｓｇ３ ＩｇＧ及び総ＩｇＧレベルの減少パーセンテージを測定する。更に、フローサイトメトリー、並びにアッセイの内部標準として作用するＢ細胞及びＴ細胞を含む非特異的細胞に対する標準的な生－死分析を介して分析を行う。対照、包含基準及び除外基準は、目的１及び２で言及したものと同じである。予想される結果は、Ｄｓｇ３自己反応性Ｂ細胞の標的化された死滅を確認する。
【0163】
放射線療法アプローチを用いた動物試験。放射性標識された組換えタンパク質を、ＡＫ２３細胞注射（モデル１）の０、２又は５日後に、２２５Ａｃ標識されたＤｓｇ３構築物と共に静脈内注射する（約３０ｋＢｑの活性及び動物当たり５０μｇのＤｓｇ３ ７２）。本願発明者らは、２２５Ａｃ－ＤＯＴＡ（キレート剤分子）を対照として使用するであろう（同量の活性（約３０ｋＢｑ）、動物当たり約３．０μｇのＤＯＴＡ）。ルシフェラーゼ、免疫蛍光及び組織学的イメージング、並びに抗Ｄｓｇ３ ＥＬＩＳＡ力価と共に読み出すために、治療したマウス及び治療していないマウスの皮膚生検から細胞を単離し、ガンマカウンターを使用して活性を測定する。同様の実験を、目的１で説明した実験戦略に従って、能動免疫モデル２について実施する。エクスビボ生体内分布試験を、本願発明者らが記載したように実施する２９、３０。注射の２、６、２４、及び４８時間後に動物を安楽死させる。次に、それらの主要な臓器及び組織を単離し、秤量し、それらの放射活性を、注射標準（対照としての２２５Ａｃ－ＤＯＴＡ）の放射活性と共に測定する。結果を分析し、組織１グラム当たりの注射用量のパーセンテージ（％ＩＤ／ｇ）として報告する。循環半減期の測定は、複数の時点で血液の液滴を収集し、続いてそれらの活性測定を行うことによって行われる。
【0164】
追加の試験
インビトロ試験：本願発明者らは、タンパク質を放射性標識することにおいて広範な経験を有する。放射性標識は、Ｄｓｇ３タンパク質に対する自己反応性抗体の結合親和性に影響を及ぼし得る。これは、アクチニウムカチオン（３＋）の高い正電荷に起因するものであり得る。放射性標識がＤｓｇ３タンパク質の結合能力に影響を及ぼす場合、本願発明者らは、ＰＥＧスペーサを有するソルターゼ基質（例えば、Ｇｌｙ３－ＰＥＧ５－ＤＯＴＡ）を合成する。これは、Ａｃカチオン（３＋）とＤｓｇ３タンパク質との間の適切な距離を可能にするはずである。ペプチドの合成は、本願発明者らの実験室において日常的である。本願発明者らは、２２５－Ａｃ同位体を使用することを選択したが、これは、それが臨床で使用されているという理由だけでなく、それが他の既存の同位体に対して特有の利点、例えば、組織における限定された範囲、良好な線形エネルギー移動、比較的短い半減期（約１０日）、及び崩壊ごとに放出される複数の（正味４つの）アルファ粒子を有するという理由による。２２５－アクチニウムの使用が他の予期せぬ問題を有することが明らかになった場合、本願発明者らは、代替として、臨床設定においても使用される２１３－ビスマスを使用することができる。インビボ試験：放射線療法の問題は、腎毒性である。本願発明者らは、腎毒性についてモニタリングし、腎臓取り込みを減少させるための生物学的に不活性で親水性のポリマーであるポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の結合などのアプローチを使用する。本願発明者らは、ＰＥＧ化が前臨床研究において放射性標識抗体断片の腎臓取り込みを減少させる（１０倍より多く）ことを示した。更に、いくつかの承認されたＰＥＧ化タンパク質治療薬が存在するため、ＰＥＧ化は臨床において安全であることが示されている。異なるサイズのＰＥＧ（５、１０及び２０ｋＤａ）を使用して、腎臓クリアランスに対するＰＥＧ化の効果を評価する。あるいは、本願発明者らは、１５０ｍｇ／ｋｇのゲロフシン（これは、腎臓取り込み及び腎臓毒性を減少させることが示されている）をマウスに同時注射し得る。本願発明者らは、ＰＥＴ同位体（それぞれ約１２．７時間及び約３．３日のｔ１／２を有する６４Ｃｕ及び８９Ｚｒ）で構築物を標識することによって、構築物の薬物動態及びインビボでの組織生体内分布を試験することができ、これに関して本願発明者らは広範な経験を有している。全身ＰＥＴ画像は、組織の生体分布及び動態を明らかにするだけでなく、構築物のいずれかが任意の臓器において潜在的に捕捉され得るかどうかも明らかにし、構築物は次に臓器損傷をもたらし得る。したがって、ＰＥＴイメージング実験は、潜在的な副作用がある場合、その潜在的な副作用が何であり得るかを明らかにする。本願発明者らは、ＰＥＴイメージングに関する広範な経験を有している。エクスビボオートラジオグラフィーも同様に実施して、非常に高感度で組織生体内分布を定量的に測定する。先の２つのアプローチと同様に、この治療薬に対する抗Ｄｓｇ３自己抗体の効果を注意深く評価する。２２５Ａｃの半減期は、比較的短い（約１０日）。しかしながら、２２５Ａｃ－Ｄｓｇ３の循環半減期の増加が、自己抗体との複合体形成及びＦｃＲｎを介した再利用に起因して起こり、それによって複合体を取り込み得る細胞に対する副作用が増強される場合、非常に短い半減期（約４５分）を有する臨床的に使用される２１３－Ｂｉ同位体を使用することができる。これは、放射性標識されたＤｓｇ３と自己抗体との間の複合体形成から生じる副作用の問題に対処するはずである。臨床的解釈を考慮すると、このアプローチは、既存の治療に失敗した患者のための選択肢であり得、潜在的な将来の適用は、他の自己免疫性水疱症、例えば、免疫抑制の使用がより悪い転帰と関連する場合、腫瘍随伴性又は免疫療法誘導性の自己免疫性水疱症に拡大される８３。加えて、Ｆｃ媒介性及び二重特異性Ｔ細胞エンゲージャアプローチと同様に、現実世界の状況では、放射線療法アプローチは、抗Ｄｓｇ３力価を低下させ、かつ／又はＩＶＩＧなどのＦｃＲｎを飽和させる他の薬物と同時に使用することができる。
インビトロ試験：本願発明者らは、タンパク質を放射性標識することにおいて広範な経験を有する。放射性標識は、Ｄｓｇ３タンパク質に対する自己反応性抗体の結合親和性に影響を及ぼし得る。これは、アクチニウムカチオン（３＋）の高い正電荷に起因するものであり得る。放射性標識がＤｓｇ３タンパク質の結合能力に影響を及ぼす場合、本願発明者らは、ＰＥＧスペーサを有するソルターゼ基質（例えば、Ｇｌｙ３－ＰＥＧ５－ＤＯＴＡ）を合成する。これは、Ａｃカチオン（３＋）とＤｓｇ３タンパク質との間の適切な距離を可能にするはずである。ペプチドの合成は、本願発明者らの実験室において日常的である。本願発明者らは、２２５－Ａｃ同位体を使用することを選択したが、これは、それが臨床で使用されているという理由だけでなく、それが他の既存の同位体に対して特有の利点、例えば、組織における限定された範囲、良好な線形エネルギー移動、比較的短い半減期（約１０日）、及び崩壊ごとに放出される複数の（正味４つの）アルファ粒子を有するという理由による。２２５－アクチニウムの使用が他の予期せぬ問題を有することが明らかになった場合、本願発明者らは、代替として、臨床設定においても使用される２１３－ビスマスを使用することができる。インビボ試験：放射線療法の問題は、腎毒性である。本願発明者らは、腎毒性についてモニタリングし、腎臓取り込みを減少させるための生物学的に不活性で親水性のポリマーであるポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の結合などのアプローチを使用する。本願発明者らは、ＰＥＧ化が前臨床研究において放射性標識抗体断片の腎臓取り込みを減少させる（１０倍より多く）ことを示した。更に、いくつかの承認されたＰＥＧ化タンパク質治療薬が存在するため、ＰＥＧ化は臨床において安全であることが示されている。異なるサイズのＰＥＧ（５、１０及び２０ｋＤａ）を使用して、腎臓クリアランスに対するＰＥＧ化の効果を評価する。あるいは、本願発明者らは、１５０ｍｇ／ｋｇのゲロフシン（これは、腎臓取り込み及び腎臓毒性を減少させることが示されている）をマウスに同時注射し得る。本願発明者らは、ＰＥＴ同位体（それぞれ約１２．７時間及び約３．３日のｔ１／２を有する６４Ｃｕ及び８９Ｚｒ）で構築物を標識することによって、構築物の薬物動態及びインビボでの組織生体内分布を試験することができ、これに関して本願発明者らは広範な経験を有している。全身ＰＥＴ画像は、組織の生体分布及び動態を明らかにするだけでなく、構築物のいずれかが任意の臓器において潜在的に捕捉され得るかどうかも明らかにし、構築物は次に臓器損傷をもたらし得る。したがって、ＰＥＴイメージング実験は、潜在的な副作用がある場合、その潜在的な副作用が何であり得るかを明らかにする。本願発明者らは、ＰＥＴイメージングに関する広範な経験を有している。エクスビボオートラジオグラフィーも同様に実施して、非常に高感度で組織生体内分布を定量的に測定する。先の２つのアプローチと同様に、この治療薬に対する抗Ｄｓｇ３自己抗体の効果を注意深く評価する。２２５Ａｃの半減期は、比較的短い（約１０日）。しかしながら、２２５Ａｃ－Ｄｓｇ３の循環半減期の増加が、自己抗体との複合体形成及びＦｃＲｎを介した再利用に起因して起こり、それによって複合体を取り込み得る細胞に対する副作用が増強される場合、非常に短い半減期（約４５分）を有する臨床的に使用される２１３－Ｂｉ同位体を使用することができる。これは、放射性標識されたＤｓｇ３と自己抗体との間の複合体形成から生じる副作用の問題に対処するはずである。臨床的解釈を考慮すると、このアプローチは、既存の治療に失敗した患者のための選択肢であり得、潜在的な将来の適用は、他の自己免疫性水疱症、例えば、免疫抑制の使用がより悪い転帰と関連する場合、腫瘍随伴性又は免疫療法誘導性の自己免疫性水疱症に拡大される８３。加えて、Ｆｃ媒介性及び二重特異性Ｔ細胞エンゲージャアプローチと同様に、現実世界の状況では、放射線療法アプローチは、抗Ｄｓｇ３力価を低下させ、かつ／又はＩＶＩＧなどのＦｃＲｎを飽和させる他の薬物と同時に使用することができる。
【0165】
追加のインビボ試験：受動導入モデルは、Ｒａｇ２－／－マウスにおいて確立されている３２、３４。本願発明者らは、それを免疫応答性ＷＴマウスにおいて確立し、それに必要なハイブリドーマ細胞の数を最適化することができる。あるいは、Ｒａｇ２－／－におけるＡＫ２３受動導入モデルは、免疫応答性宿主に類似し得るＷＴ Ｃ５７ＢＬ／６脾細胞を投与される。更に、提案された治療について、本願発明者らは、初代ヒト細胞及びハイスループット膜プロテオームアレイを使用することによって毒物学スクリーニングを実施して、開発された治療の各々について任意のオフターゲット細胞傷害性相互作用を特定する。理論に束縛されることを望むものではないが、Ｄｓｇ３含有構築物は、潜在的な長期安定性のために膜貫通ドメインを含む細胞表面上に完全な構造が存在することを必要とするので、それ自体を皮膚内のデスモソームに組み込まない。更に、動物モデルにおけるＤｓｇ３－ＣＡＡＲ Ｔ細胞についての広範な試験は、動物皮膚におけるＤｓｇ３－ＣＡＡＲのいかなる蓄積も示さず、同様に、ヒト皮膚がマウス皮膚に移植された場合、ｈＤｓｇ３－ＣＡＡＲ Ｔ細胞は、移植された皮膚において検出されず、これは、Ｄｓｇ３構築物が、それ自体をデスモソームに組み込むことが予測されないことを示している。これは、組織学的分析を通して試験される。本願発明者らは、既存の抗Ｄｓｇ３抗体が試薬に結合するかどうか、生体内分布に影響を及ぼすかどうか、又はＤｓｇ３自己抗体Ｆｃ受容体を発現する細胞との相互作用をもたらすかどうかを決定することができる。これは、両方の動物モデルにおいて、並びに広範な組織学、ＰＥＴ及びフローサイトメトリー分析によって、試験される。理論に束縛されることを望むものではないが、本願発明者らが開発中の生物製剤は循環半減期が短く、ＣＡＡＲ Ｔ細胞治療などの養子細胞療法とは異なり、レシピエント（マウス又は最終的には患者）に留まらないので、これは大きな問題ではない。開発された治療薬の半減期は、放射線療法剤及び抗ＣＤ３融合体についてはわずか数時間以内であり得、Ｄｓｇ３－Ｆｃ構築物（ＦｃＲｎを介して再利用することができる）については数時間から潜在的に数日間、又は更に数週間以内であり得る。本願発明者らの治療が、他の免疫細胞区画に対して何らかの有害作用を有したかどうかを試験するために、本願発明者らが提案した療法を受けたマウスからＰＢＭＣを収集し、Ｔｈ１、Ｔｈ２、Ｔｈ１７、Ｔｒｅｇ、及びＣＤ８ Ｔ細胞のパーセンテージをフローサイトメトリー分析によって分析する。年齢及び性別を一致させた非操作ＷＴ Ｂ６マウスを対照として使用する。理論に束縛されることを望むものではないが、免疫細胞集団のパーセンテージに差はなく、治療の有害な長期効果がないことを示唆している。
【0166】
自己反応性Ｂ細胞を標的とするための本明細書中のアプローチ、並びにこれらの治療薬を開発するための本願発明者らの戦略（放射性同位体の部位特異的導入、Ｃ－Ｃ融合体の合成及びＮ－Ｃソルターゼ媒介性融合体）は、独特である。Ｄｓｇ３－Ｆｃを作製する本願発明者らの戦略は、安全なものであり、リツキシマブの使用に取って代わることができる。他の２つのアプローチは、利用可能な治療に応答しない患者にとって代替選択肢を提供する。したがって、本明細書に記載の組成物及び方法は、ＰＶの治療を変えるだけではなく、他の自己免疫性水疱症（例えば、水疱性類天疱瘡、粘膜類天疱瘡、後天性表皮水疱症、線状ＩｇＡ水疱性皮膚症）、狼瘡、強皮症、グッドパスチャー病、グレーブス病のサブタイプから免疫介在性血管炎に及ぶ既知の抗原標的に対するいくつかの自己抗体／免疫複合体媒介性疾患の治療を開発するための道を開くことができる。したがって、本願発明者らは、提案された治療薬は、自己免疫疾患の治療ツールボックスへの画期的な追加とみなすことができると考える。
【0167】
実施例３
尋常性天疱瘡は、破壊的なＢ細胞媒介性自己免疫性疾患である。皮膚及び粘膜の細胞間接着に重要なデスモソームタンパク質であるデスモグレイン３（Ｄｓｇ３）を標的とする自己抗体は、疾患表現型の原因である。標準的な治療には、免疫系を全身的に抑制する免疫抑制剤が含まれる。本願発明者らは、Ｄｓｇ３を認識する自己反応性Ｂ細胞のみを特異的かつ正確に標的化して枯渇させる標的化免疫療法アプローチを開発した。本願発明者らのインビトロ及びインビボ試験は、このアプローチが、自己反応性Ｂ細胞の効率的かつ特異的な枯渇をもたらすことを示す。本願発明者らは、疾患の異なる期にあるＰＶ患者から得られた末梢血単核細胞（peripheral blood mononuclear cell、ＰＢＭＣ）を使用してアプローチの有効性及び特異性を決定し、受動疾患及び能動疾患のマウスモデルを使用して更なるインビボ試験を行うことができる。本願発明者らは、ヒトと同様の病因及び表現型を有する疾患を発症するイヌにおいて試験を行う。理論に束縛されることを望むものではないが、本方法は、臨床設定に変換することができる。本明細書中で開発された技術は、全体的な免疫抑制を引き起こすことなく自己反応性細胞を標的化することによって、全ての自己抗体駆動疾患に対してより広い適用を有し得る。
尋常性天疱瘡は、破壊的なＢ細胞媒介性自己免疫性疾患である。皮膚及び粘膜の細胞間接着に重要なデスモソームタンパク質であるデスモグレイン３（Ｄｓｇ３）を標的とする自己抗体は、疾患表現型の原因である。標準的な治療には、免疫系を全身的に抑制する免疫抑制剤が含まれる。本願発明者らは、Ｄｓｇ３を認識する自己反応性Ｂ細胞のみを特異的かつ正確に標的化して枯渇させる標的化免疫療法アプローチを開発した。本願発明者らのインビトロ及びインビボ試験は、このアプローチが、自己反応性Ｂ細胞の効率的かつ特異的な枯渇をもたらすことを示す。本願発明者らは、疾患の異なる期にあるＰＶ患者から得られた末梢血単核細胞（peripheral blood mononuclear cell、ＰＢＭＣ）を使用してアプローチの有効性及び特異性を決定し、受動疾患及び能動疾患のマウスモデルを使用して更なるインビボ試験を行うことができる。本願発明者らは、ヒトと同様の病因及び表現型を有する疾患を発症するイヌにおいて試験を行う。理論に束縛されることを望むものではないが、本方法は、臨床設定に変換することができる。本明細書中で開発された技術は、全体的な免疫抑制を引き起こすことなく自己反応性細胞を標的化することによって、全ての自己抗体駆動疾患に対してより広い適用を有し得る。
【0168】
背景
尋常性天疱瘡（ＰＶ）は、皮膚及び粘膜の痛みを伴う水疱形成及びびらんを特徴とし得る、致命的な自己免疫性水疱症であり、日常生活の活動（例えば、食べる、飲む）を制限し、人の全体的なウェルビーイングに影響を与え、罹患率及び死亡率が高い１～３。ＰＶは、Ｄｓｇ１に対する抗体の有無にかかわらず、デスモグレイン３（Ｄｓｇ３）に対する自己抗体の産生によって引き起こされ、上皮剥離（棘細胞離開）を引き起こす２、４～６。天疱瘡治療には治療上の需要が存在する。ＰＶの治癒法は存在しない。治療戦略は、多数の全身性副作用を伴う全身性ステロイド及び免疫抑制剤に大きく依存する７～９。抗ＣＤ２０抗体（例えば、リツキシマブ）３は、中等度から重度の疾患に対するファーストラインの選択肢となっているが、従来の免疫抑制剤よりも低いとはいえ、現在の現実の人生の意義を有するワクチンに対する液性応答を減らすこと、及び感染のリスクの増加１０、１１、並びに治療後の再発の高いリスク１０～１２を含む、オフターゲット免疫抑制効果と関連がある。現在臨床試験中の新生児Ｆｃ受容体及びブルトン型チロシンキナーゼ阻害剤は、オフターゲット免疫抑制効果を回避することができない。自己ポリクローナル調節性Ｔ細胞１３及びキメラ自己抗原受容体（ＣＡＡＲ）Ｔ細胞１４などの初期段階の細胞ベースの療法は、有効であることが証明されたとしても、全体的に免疫抑制性とはなり得ない。しかしながら、細胞ベースの療法は、個別化されなければならず、製造、貯蔵及び輸送のための特定の要件を有し、これは、資源が乏しい地域では実現不可能である。ＰＶの再発は、典型的には、最初の治療中に枯渇していない同じ自己反応性細胞の拡大に起因する２。理論に束縛されることを望むものではないが、自己反応性Ｂ細胞の完全な枯渇は、治癒を与える。本明細書において、本願発明者らは、自己抗原自体（Ｄｓｇ３）及び一般的に使用されるＦｃ媒介性死滅を使用することによって、特定の自己反応性Ｂ細胞を標的とする治療を記載する。この方法は、全体的な免疫機能に影響を及ぼすことなく、自己反応性の疾患を引き起こす細胞を選択的に標的とする。
尋常性天疱瘡（ＰＶ）は、皮膚及び粘膜の痛みを伴う水疱形成及びびらんを特徴とし得る、致命的な自己免疫性水疱症であり、日常生活の活動（例えば、食べる、飲む）を制限し、人の全体的なウェルビーイングに影響を与え、罹患率及び死亡率が高い１～３。ＰＶは、Ｄｓｇ１に対する抗体の有無にかかわらず、デスモグレイン３（Ｄｓｇ３）に対する自己抗体の産生によって引き起こされ、上皮剥離（棘細胞離開）を引き起こす２、４～６。天疱瘡治療には治療上の需要が存在する。ＰＶの治癒法は存在しない。治療戦略は、多数の全身性副作用を伴う全身性ステロイド及び免疫抑制剤に大きく依存する７～９。抗ＣＤ２０抗体（例えば、リツキシマブ）３は、中等度から重度の疾患に対するファーストラインの選択肢となっているが、従来の免疫抑制剤よりも低いとはいえ、現在の現実の人生の意義を有するワクチンに対する液性応答を減らすこと、及び感染のリスクの増加１０、１１、並びに治療後の再発の高いリスク１０～１２を含む、オフターゲット免疫抑制効果と関連がある。現在臨床試験中の新生児Ｆｃ受容体及びブルトン型チロシンキナーゼ阻害剤は、オフターゲット免疫抑制効果を回避することができない。自己ポリクローナル調節性Ｔ細胞１３及びキメラ自己抗原受容体（ＣＡＡＲ）Ｔ細胞１４などの初期段階の細胞ベースの療法は、有効であることが証明されたとしても、全体的に免疫抑制性とはなり得ない。しかしながら、細胞ベースの療法は、個別化されなければならず、製造、貯蔵及び輸送のための特定の要件を有し、これは、資源が乏しい地域では実現不可能である。ＰＶの再発は、典型的には、最初の治療中に枯渇していない同じ自己反応性細胞の拡大に起因する２。理論に束縛されることを望むものではないが、自己反応性Ｂ細胞の完全な枯渇は、治癒を与える。本明細書において、本願発明者らは、自己抗原自体（Ｄｓｇ３）及び一般的に使用されるＦｃ媒介性死滅を使用することによって、特定の自己反応性Ｂ細胞を標的とする治療を記載する。この方法は、全体的な免疫機能に影響を及ぼすことなく、自己反応性の疾患を引き起こす細胞を選択的に標的とする。
【0169】
尋常性天疱瘡は、他の自己免疫性水疱症と比較して、若い健常の患者群（すなわち、若年／中年成人、平均４０～６０歳）が罹患する。現在の既存の治療戦略は、免疫抑制医薬、例えば、全身性ステロイド、ミコフェノール酸モフェチル、アザチオプリン、及びリツキシマブに限定されており、感染のリスク、長期的には悪性腫瘍のリスクがより高いこと、及び現在の現実の人生の意義を有する新たなワクチン接種に対する応答を減らすことを伴う。この疾患は、免疫抑制の強い期間で寛解させることができるが、再発のリスクは８０％と高い１０。試験は、天疱瘡を有する患者が、がん診断後の患者と同様の外傷後ストレスのリスクを有し、両方の状態が、頻繁な再発を伴って生命を脅かすことを示す１６。この疾患群を有する患者は、その全体的な健康及び免疫機能に影響を与えることなく自己反応性細胞を除去する標的化治療を必要とする。これらを治療する臨床医は、提供する治療のレパートリーが限られており、これらの全てが、毒性、短期及び長期の健康への悪影響（生命を脅かす感染を含む）の多くを有している。保険支払人の観点では、標的化療法は、即時型感染のリスク、長期的な悪性腫瘍のリスクを低下させることによって、全体的な世界的医療費を低下させ、来院、補助的治療及び入院の数を減らすことができる。この標的化された非免疫抑制治療は、患者、臨床医及び保険支払者にとって同様に魅力的なものであり得る。
【0170】
治療薬の臨床効果は、ヒトの目で見ることができ、再発をモニタリングするための血清試験が市販されている。米国における疾患有病率は、１００，０００人の成人当たり５．２症例であると推定される１５。患者は、生涯を通して再発する可能性があり、反復治療を必要とする。ユダヤ人の祖先のものにおいて、より高い発生率が存在する（平均よりも約４倍～１０倍高い）１５、１７。既存の治療（すなわち、プレドニゾン、ミコフェノール酸モフェチル、アザチオプリン、リツキシマブ）及び今後の治療（例えば、新生児Ｆｃ受容体アンタゴニスト、Ｂｕｒｔｏｎのチロシンキナーゼ阻害剤）は、免疫抑制性であるか、又は世界市場（例えば、ＣＡＡＲＴ）に一般化することが困難である。本明細書中の方法は、個別化の必要なく製造することができる共通の共有自己抗原に基づく。
【0171】
非限定的な例示的な製品／溶液
本明細書に記載される治療は、リツキシマブ（外来注入センターで投与することができる）と類似の様式で外来患者環境において使用することができる。この治療は、治療の初期段階及び再発の両方において使用される。疾患集団は、粘膜優位型尋常性天疱瘡を有する患者であり、次のステップで、落葉状天疱瘡（主な自己抗原がＤｓｇ１である）などの将来の他の自己免疫性水疱症に拡張するための明確な目標を有する。この治療は、選択的であり、リツキシマブによるＢ細胞プールの完全な枯渇からのオフターゲット効果／全体的な免疫抑制を有さないため、現在の標準治療であるリツキシマブ（抗ＣＤ２０）に取って代わることができる。抗原－Ｆｃ（Ｄｓｇ３－Ｆｃ）融合タンパク質は、Ｄｓｇ３認識細胞を効果的かつ特異的に死滅させる。構築物のＤｓｇ３部分は、自己反応性病原性Ｂ細胞の抗Ｄｓｇ３ ＢＣＲに結合し、Ｆｃドメインは、貪食細胞及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の動員によってＤｓｇ３認識細胞のＦｃ媒介性死滅を誘導する（図１２のパネルＡ）。本願発明者らは、最大のＦｃ媒介性細胞傷害性を達成するために、マウスＩｇＧ２ａ及びヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインとそれぞれ融合したマウスＤｓｇ３及びヒトＤｓｇ３構築物を操作し、作製した。本願発明者らは、インビトロ試験及びインビボ試験の両方において、治療が自己反応性Ｂ細胞を標的とし、その死滅を媒介することができることを示した。
本明細書に記載される治療は、リツキシマブ（外来注入センターで投与することができる）と類似の様式で外来患者環境において使用することができる。この治療は、治療の初期段階及び再発の両方において使用される。疾患集団は、粘膜優位型尋常性天疱瘡を有する患者であり、次のステップで、落葉状天疱瘡（主な自己抗原がＤｓｇ１である）などの将来の他の自己免疫性水疱症に拡張するための明確な目標を有する。この治療は、選択的であり、リツキシマブによるＢ細胞プールの完全な枯渇からのオフターゲット効果／全体的な免疫抑制を有さないため、現在の標準治療であるリツキシマブ（抗ＣＤ２０）に取って代わることができる。抗原－Ｆｃ（Ｄｓｇ３－Ｆｃ）融合タンパク質は、Ｄｓｇ３認識細胞を効果的かつ特異的に死滅させる。構築物のＤｓｇ３部分は、自己反応性病原性Ｂ細胞の抗Ｄｓｇ３ ＢＣＲに結合し、Ｆｃドメインは、貪食細胞及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の動員によってＤｓｇ３認識細胞のＦｃ媒介性死滅を誘導する（図１２のパネルＡ）。本願発明者らは、最大のＦｃ媒介性細胞傷害性を達成するために、マウスＩｇＧ２ａ及びヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインとそれぞれ融合したマウスＤｓｇ３及びヒトＤｓｇ３構築物を操作し、作製した。本願発明者らは、インビトロ試験及びインビボ試験の両方において、治療が自己反応性Ｂ細胞を標的とし、その死滅を媒介することができることを示した。
【0172】
非限定的で例示的なアプローチ
本願発明者らは、マウス及びヒトの両方のＦｃ融合タンパク質であるｍＤｓｇ３－ｍＩｇＧ２ａ（ｍＦｃ）及びｈＤｓｇ３－ｈＩｇＧ１（ｈＦｃ）を作製した。本願発明者らは、Ｄｓｇ３タンパク質の外部ドメイン１－３（ＥＣ１－３）が免疫原性及び病原性部分であり得るので、これらを使用した（図１３）１８。ヒトＩｇＧ１及びマウスＩｇＧ２ａを、それらの高いＦｃ媒介性死滅活性について選択した１９～２１。タンパク質は、Ｃ末端にＦＬＡＧタグ、ソルターゼ認識モチーフ２２、２３及びＨｉｓ６タグを有するように操作された。８アミノ酸配列（ＤＹＫＤＤＤＤＫ）であるＦＬＡＧは、ウェスタンブロット及びフローサイトメトリー分析のために使用することができ、その後、インビボで使用される場合、構築物の代謝運命の分析のために使用することができる。Ｈｉｓ６タグを精製に使用し、ソルターゼタグを部位特異的に改変（例えば、フルオロフォアの結合）を導入するために使用した。構築物の機能性を特性評価するために、本願発明者らは、Ａｌｅｘａ６４７－ｍＤｓｇ３－ｍＦｃを使用して、抗ｍＤｓｇ３ ＡＫ２３ハイブリドーマ２４及び抗ｈＤｓｇ３ Ｆ７７９細胞１４、患者由来の病原性抗Ｄｓｇ３抗体で操作されたＢリンパ腫細胞株（Ｎａｌｍ６）を染色した。細胞を、より多くの親和性及び特異性（低ｎＭ濃度での）により染色し（図１２のパネルＢ）、これは、Ｆ７７９細胞上の患者由来ＢＣＲがマウスＤｓｇ３タンパク質と交差反応することを示唆している。対照として使用したＮａｌｍ－６細胞は、いかなる結合も示さなかった。Ａｌｅｘａ６４７標識されたｈＤｓｇ３－ｈＦｃを使用して同様の実験を行い、これにより、構築物がＦ７７９細胞に強く結合し（図１２のパネルＢ）、マウスＡＫ２３細胞も染色したことを確認した（図１２のパネルＢと同様）。
本願発明者らは、マウス及びヒトの両方のＦｃ融合タンパク質であるｍＤｓｇ３－ｍＩｇＧ２ａ（ｍＦｃ）及びｈＤｓｇ３－ｈＩｇＧ１（ｈＦｃ）を作製した。本願発明者らは、Ｄｓｇ３タンパク質の外部ドメイン１－３（ＥＣ１－３）が免疫原性及び病原性部分であり得るので、これらを使用した（図１３）１８。ヒトＩｇＧ１及びマウスＩｇＧ２ａを、それらの高いＦｃ媒介性死滅活性について選択した１９～２１。タンパク質は、Ｃ末端にＦＬＡＧタグ、ソルターゼ認識モチーフ２２、２３及びＨｉｓ６タグを有するように操作された。８アミノ酸配列（ＤＹＫＤＤＤＤＫ）であるＦＬＡＧは、ウェスタンブロット及びフローサイトメトリー分析のために使用することができ、その後、インビボで使用される場合、構築物の代謝運命の分析のために使用することができる。Ｈｉｓ６タグを精製に使用し、ソルターゼタグを部位特異的に改変（例えば、フルオロフォアの結合）を導入するために使用した。構築物の機能性を特性評価するために、本願発明者らは、Ａｌｅｘａ６４７－ｍＤｓｇ３－ｍＦｃを使用して、抗ｍＤｓｇ３ ＡＫ２３ハイブリドーマ２４及び抗ｈＤｓｇ３ Ｆ７７９細胞１４、患者由来の病原性抗Ｄｓｇ３抗体で操作されたＢリンパ腫細胞株（Ｎａｌｍ６）を染色した。細胞を、より多くの親和性及び特異性（低ｎＭ濃度での）により染色し（図１２のパネルＢ）、これは、Ｆ７７９細胞上の患者由来ＢＣＲがマウスＤｓｇ３タンパク質と交差反応することを示唆している。対照として使用したＮａｌｍ－６細胞は、いかなる結合も示さなかった。Ａｌｅｘａ６４７標識されたｈＤｓｇ３－ｈＦｃを使用して同様の実験を行い、これにより、構築物がＦ７７９細胞に強く結合し（図１２のパネルＢ）、マウスＡＫ２３細胞も染色したことを確認した（図１２のパネルＢと同様）。
【0173】
まず、本願発明者らは、Ｄｓｇ３－Ｆｃ融合体が、そのＦｃ（ＩｇＧ２ａ）を介して、低いｎＭ親和性でマウスマクロファージ上のＦｃ－ｇ受容体に結合することを確認した。対照Ｎａｌｍ６細胞は、染色されないままであった。融合タンパク質がＦｃ媒介性死滅を引き起こし得るかどうかを決定するために、マウスＲＡＷ２６４．７マクロファージ細胞と共培養したＦ７７９又はＡＫ２３標的細胞を、ｍＤｓｇ３－ｍＦｃ融合タンパク質で処置した。１０ｎＭ用量は、２４時間後に、Ｆ７７９及びＡＫ２３細胞のそれぞれ６５％及び６０％の死滅を引き起こし、Ｎａｌｍ６又はハイブリドーマ対照細胞のいずれも死滅させなかった。４８時間の時点で、本願発明者らは、Ｆ７７９細胞の印象的な９４％の死滅を観察し、対照Ｎａｌｍ－６細胞には変化はなかった。ＡＫ２３ハイブリドーマ細胞は、抗Ｄｓｇ３抗体を培地中に放出し、これにより、ＰＶ患者における生理学的条件と同様に、構築物を中和することができる。これにもかかわらず、本願発明者らは、１０ｎＭ用量でＡＫ２３細胞とＦ７７９細胞との間で同様の有効な死滅を依然として観察し、これは、Ｄｓｇ３に対する抗体が融合タンパク質の死滅有効性に対して最小限の影響を有することを示している。
【0174】
Ｄｓｇ３－Ｆｃ構築物のインビボ有効性を確立する。ルシフェラーゼ陽性Ｆ７７９細胞（１００万個）の尾静脈静脈内（ｉ．ｖ．）注射の２日前に、ＮＳＧ（ＮＯＤ－ｓｃｉｄ－ガンマ）マウスを６００ｍｇ／ｋｇのＩＶＩＧで前治療した（ＦｃγＲを介した非特異的死滅をブロックするため）（図１２のパネルＣ）。Ｆ７７９注射後４日目に、全てのマウスに、機能的マクロファージを有する１０×１０６個のＲａｇ２－／－脾細胞をｉ．ｖ．注射し、続いて、治療群に３０μｇの融合タンパク質及び対照群にＰＢＳを腹腔内（ｉ．ｐ．）注射した（各コホートについてｎ＝５）。ｍＤｓｇ３－ｍＦｃを週に５回注射して、試験期間中、循環中で十分な薬物が利用可能であることを確実にした。疾患の進行を、生物発光イメージング及びマウスボディスコアリングによってモニタリングした。ＢＳＣ＜２になったら、ＰＢＭＣを顎下出血を介して収集し、動物を安楽死させた。その結果は、対照群が２６日の平均生存期間を有したのに対して、治療群は５７日の生存期間を有したことを示した。（図１２のパネルＤ。）２つの群からのＰＢＭＣのフローサイトメトリー分析は、治療群がほぼ１００％の抗原喪失を有したことを明らかにし（図１２のパネルＥ）、これは、治療が抗原陽性Ｆ７７９細胞の枯渇を媒介するのに有効であったことを示している。注目すべきことに、Ｆ７７９細胞は悪性であり、したがって急速に増殖する。このことは、病原性Ｂ細胞が正常な増殖能力を有する診療所の症例には当てはまらない。更に、抗原喪失は患者において問題ではない。自己抗原が病原性Ｂ細胞上で失われた場合、それはもはや病原性ではない。本願発明者らは、より低い用量の治療を用いて実験を繰り返して、完全応答に必要な用量の下限を決定することができる。
【0175】
非限定的で例示的な戦略
疾患の異なるマウスモデルにおいて、抗Ｄｓｇ３ Ｂ細胞の死滅を媒介するＤｓｇ３－Ｆｃ融合タンパク質の能力を更に試験すること。
疾患の異なるマウスモデルにおいて、抗Ｄｓｇ３ Ｂ細胞の死滅を媒介するＤｓｇ３－Ｆｃ融合タンパク質の能力を更に試験すること。
【0176】
受動導入モデル。このモデルでは、本願発明者らは、確立された天疱瘡誘導性ハイブリドーマ細胞株（ＡＫ２３、既に所有）を移植することによって、受動モノクローナル天疱瘡マウス疾患モデルを開発することができる。確立されたように２４、２５、本願発明者らは、天疱瘡表現型を引き起こす抗Ｄｓｇ３抗体を分泌する約１００万個のＡＫ２３ハイブリドーマ細胞をＮＳＧマウスに注射する２４、２５。動物は、全ての実験において、ｕｒｎ無作為化法に基づいて治療／対照群に割り当てられる。本願発明者らは、血清抗Ｄｓｇ３力価（３日目及び１０日目に標準的なＥＬＩＳＡによって）、及び皮膚疱疹（２日目、５日目及び１０日目に盲検化された研究者によって評価される）を分析することによって疾患の確立について試験する。ＥＬＩＳＡデータに基づいて、棘細胞離開を観察するために（Ｈ＆Ｅ染色によって）組織採取の時点を決定する。ピーク疾患時間は、約７日目であると予想される２４；本願発明者らは、マウスが、脱毛２４、体重減少を示し、かつ、生理的抗Ｄｓｇ３ ＩｇＧレベル（３００～４００ＲＵ／ｍｌ）で表皮ケラチノサイトに結合するＡＫ２３細胞によって産生されるＡＫ２３自己抗体を伴って、毛包及び口腔粘膜に水疱形成を有すると予想する２６。
【0177】
能動導入モデル。ＡＫ２３モデルは、読み出しが容易であるなどの利点を有するが、治療は、急速に増殖するハイブリドーマ細胞に打ち勝つことができる。したがって、第２のモデルとして、本願発明者らは、ヒト疾患の臨床表現型を模倣し、臨床的に起こるものに類似する自己反応性Ｄｓｇ３特異的Ｂ細胞の頻度が低く、最終的に高い血清ポリクローナル自己抗体レベルを有する、能動ＰＶ免疫モデルを使用する。このモデルでは、本願発明者らは、まず、Ｄｓｇ３－／－マウス（ＪＡＸ－００２９１１）をマウスＤｓｇ３の組換え細胞外ドメインで免疫付与し、続いて脾細胞をＲＡＧ２－／－マウスに導入することによって、能動ポリクローナル天疱瘡マウス疾患モデルを開発することができる２７、２８。導入された細胞は、Ｄｓｇ３反応性細胞を含むＴ細胞及びＢ細胞を含有する。文献２７～２９においてなされた観察と同様に、本願発明者らは、動物が抑制された成長を有し、基底上の棘細胞離開及び水疱を伴う皮膚粘膜びらんを発症すると予想する。臨床指標を評価するために、ＥＬＩＳＡを使用して、本願発明者らは、自己抗体レベルをＰＶ患者における生理学的レベル（３００～４００ＲＵ／ｍｌ）と比較する２６。Ｄｓｇ３反応性抗体が、３～４週間で起こると予想されるそのレベル以上になったら２６、３０、治療を開始する。Ｄｓｇ３免疫付与Ｄｓｇ３＋／－動物由来の細胞の養子導入を対照として使用する２９（ｎ＝１０匹のマウス／群）。
【0178】
イヌにおける自己反応性Ｂ細胞の枯渇を媒介する抗原－Ｆｃ融合タンパク質の能力を試験すること。イヌ、ネコ及びウマは、ヒトと同様の病因を有する天疱瘡を発症する３１～３７。天疱瘡は、獣医学において診断される最も一般的な自己免疫皮膚疾患であり、それに対する治癒法は存在せず、予後は不良のままである３１～３７。イヌ天疱瘡における一般的な自己抗原は、Ｄｓｇ３（尋常性天疱瘡）及びＤｓｃ１（デスモコリン－１、落葉状天疱瘡（pemphigus foliaceus、ＰＦ））である３１、３８～４１。
【0179】
イヌにおける天疱瘡は、デスモソームタンパク質に対する自己反応性のために発生し、ヒトと類似の表現型を有するため、イヌモデルは、前臨床試験とヒト試験との間の橋渡しとして役立ち得る。本願発明者らの標的化治療の能力を更に評価し、臨床的解釈のための段階を設定するために、本願発明者らは、マウスにおいて本願発明者らの予備試験アプローチを使用して、天疱瘡と診断されたイヌを治療する。本願発明者らは、ヒトＩｇＧ１と等価であるイヌＩｇＧ１と融合したイヌＤｓｇ３及びＤｓｇ１を使用して、類似の構築物を作製する４２。このようなタンパク質の産生は、現在本願発明者らの研究室では簡単であり、大量のこれらのタンパク質を作製する際に障害がないと予想される。治療の最初の３ヶ月間の病変及び循環中の自己抗体力価の改善を注意深く評価する。
【0180】
成功した完了により、アプローチの臨床的解釈のための段階を設定することができる。本明細書に記載の組成物及び方法は、天疱瘡の治療を変えるだけではなく、他の自己免疫性水疱症（例えば、落葉状天疱瘡、水疱性類天疱瘡、粘膜類天疱瘡、後天性表皮水疱症、線状ＩｇＡ水疱性皮膚症）、狼瘡、乾癬、強皮症、グッドパスチャー病、グレーブス病のサブタイプから免疫介在性血管炎に及ぶ既知の抗原標的に対するいくつかの自己抗体／免疫複合体媒介性疾患の治療を開発するための道を開くことができる。代替として、本願発明者らは、臨床で利用可能な二重特異性Ｔ細胞エンゲージャ治療薬と同様に、Ｔ細胞を標的化細胞に結合させるために、抗原抗ＣＤ３抗体（抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ抗体に融合したＤｓｇ３）の融合体を作製した。本願発明者らは、天疱瘡のための標的化療法を開発しているが、本明細書に記載される組成物及び方法は、自己免疫疾患のための治療ツールボックスであり得る。
【0181】
本実施例で引用されている参考文献
【0182】
実施例４
ｍＤｓｇ３（ＥＣ１３）－ｍＦｃ（配列番号１）：
ｈＤｓｇ３（ＥＣ１３）－ｈＦｃ（配列番号２）：
ｍＤｓｇ３（ＥＣ１４）－ｍＦｃ（配列番号３）
ｈＤｓｇ３（ＥＣ１４）－ｈＦｃ（配列番号４）
ｈＤｓｇ３（ＥＣ１－５）－ｈＦｃ（配列番号２９）
ｍＤｓｇ３（ＥＣ１－５）－ｍＦｃ（配列番号３０）
ｈＤｓｇ１（ＥＣ１－４）－ｈＦｃ（配列番号３１）
ｍＤｓｇ１（ＥＣ１－４）－ｍＦｃ（配列番号３２）
ｍＤｓｇ３（ＥＣ１３）－ｍＦｃ（配列番号１）：
【0183】
ヒトＤｓｇ３アミノ酸配列（配列番号５）
【0184】
ヒトＤｓｇ１アミノ酸配列、アイソフォーム１（配列番号６）
【0185】
ヒトＤｓｇ１アミノ酸配列、アイソフォーム２（配列番号７）
【0186】
実施例５
尋常性天疱瘡（ＰＶ）
－ 破壊的な慢性自己免疫疾患は、皮膚及び粘膜の痛みを伴う水疱形成を特徴とし得る
－ 約５～１５％の死亡率で生命を脅かす可能性がある治療しなければ、１年以内に１０名のうち８名が死亡する
－ 米国有病率：３０，０００～４０，０００症例、ＷＷ発生率１～１０症例／１００万人
－ 通常は遺伝的ではなく、後年に環境因子によって誘発される
－ Ｂ細胞上に提示される、デスモグレイン３（Ｄｓｇ３）に対する自己Ａｂの産生によって引き起こされる
－ Ｄｓｇ３は、脊椎動物上皮細胞におけるデスモソームのカルシウム結合膜貫通糖タンパク質成分である
－ デスモソームは、上皮、心筋、及び特定の他の細胞型の間の細胞間接合である
－ 不治
－ 治療戦略
－ 全身性ステロイド使用及び／又は免疫抑制薬
－ 抗ＣＤ２０抗体（例えば、リツキシマブ）は、ファーストラインの選択肢である（全てのＢ細胞を標的とする）
－ 感染症のリスクの増加を含むオフターゲット免疫抑制効果
－ 治療後の再発のリスクが高い
－ Ｂ細胞枯渇を示す抗Ｄｓｇ３：
－ Ｃａｂａｌｅｔｔａ Ｂｉｏ：キメラ自己抗体受容体Ｔ細胞（Chimeric AutoAntibody Receptor T-Cells、ＣＡＡＲ－Ｔ）に基づく潜在的な治療－ＩＮＤクリア
－ 追加の新しい戦略が必要である
尋常性天疱瘡（ＰＶ）
－ 破壊的な慢性自己免疫疾患は、皮膚及び粘膜の痛みを伴う水疱形成を特徴とし得る
－ 約５～１５％の死亡率で生命を脅かす可能性がある治療しなければ、１年以内に１０名のうち８名が死亡する
－ 米国有病率：３０，０００～４０，０００症例、ＷＷ発生率１～１０症例／１００万人
－ 通常は遺伝的ではなく、後年に環境因子によって誘発される
－ Ｂ細胞上に提示される、デスモグレイン３（Ｄｓｇ３）に対する自己Ａｂの産生によって引き起こされる
－ Ｄｓｇ３は、脊椎動物上皮細胞におけるデスモソームのカルシウム結合膜貫通糖タンパク質成分である
－ デスモソームは、上皮、心筋、及び特定の他の細胞型の間の細胞間接合である
－ 不治
－ 治療戦略
－ 全身性ステロイド使用及び／又は免疫抑制薬
－ 抗ＣＤ２０抗体（例えば、リツキシマブ）は、ファーストラインの選択肢である（全てのＢ細胞を標的とする）
－ 感染症のリスクの増加を含むオフターゲット免疫抑制効果
－ 治療後の再発のリスクが高い
－ Ｂ細胞枯渇を示す抗Ｄｓｇ３：
－ Ｃａｂａｌｅｔｔａ Ｂｉｏ：キメラ自己抗体受容体Ｔ細胞（Chimeric AutoAntibody Receptor T-Cells、ＣＡＡＲ－Ｔ）に基づく潜在的な治療－ＩＮＤクリア
－ 追加の新しい戦略が必要である
【0187】
抗Ｄｓｇ３－Ａｂ提示Ｂ細胞の選択的枯渇－２つの非限定的で例示的なアプローチ
Ａ）「Ｆｃ媒介性」
－ リツキシマブと同様であるが、ここではＤｓｇ３－Ｂ細胞に対して選択的である（より安全／より少ない副反応）
－ ＣＡＡＲ－Ｔ（自己細胞療法）の技術的課題／コストを回避する
Ｂ）「ＢＣＲ－Ｔ細胞エンゲージャを含む、ＢＣＲ－エフェクター細胞エンゲージャ」
－ 選択的
－ 多目的－既知の抗原性標的に対する自己抗体／免疫複合体媒介性疾患
－ 水疱性類天疱瘡、粘膜類天疱瘡、後天性表皮水疱症、線状ＩｇＡ水疱性皮膚症
－ 狼瘡、強皮症、グッドパスチャー病、グレーブス病のサブタイプ
－ マウスマクロファージのマウスＦｃγ受容体に対するＤｓｇ３－Ｆｃ融合体のインビトロ結合、及び４８時間での標的Ｂ細胞の９４％の死滅を示す（１０ｎＭ当たり）
－ マウスタンパク質構築物を産生するために作製された細胞株は、インビボモデルで作用している
－ Ｄｓｇ３タンパク質に対する自己反応性Ｂ細胞を有するＰＶ患者由来の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）に対するインビトロ効果を示すことができる（異なる疾患期）
Ａ）「Ｆｃ媒介性」
－ リツキシマブと同様であるが、ここではＤｓｇ３－Ｂ細胞に対して選択的である（より安全／より少ない副反応）
－ ＣＡＡＲ－Ｔ（自己細胞療法）の技術的課題／コストを回避する
Ｂ）「ＢＣＲ－Ｔ細胞エンゲージャを含む、ＢＣＲ－エフェクター細胞エンゲージャ」
－ 選択的
－ 多目的－既知の抗原性標的に対する自己抗体／免疫複合体媒介性疾患
－ 水疱性類天疱瘡、粘膜類天疱瘡、後天性表皮水疱症、線状ＩｇＡ水疱性皮膚症
－ 狼瘡、強皮症、グッドパスチャー病、グレーブス病のサブタイプ
－ マウスマクロファージのマウスＦｃγ受容体に対するＤｓｇ３－Ｆｃ融合体のインビトロ結合、及び４８時間での標的Ｂ細胞の９４％の死滅を示す（１０ｎＭ当たり）
－ マウスタンパク質構築物を産生するために作製された細胞株は、インビボモデルで作用している
－ Ｄｓｇ３タンパク質に対する自己反応性Ｂ細胞を有するＰＶ患者由来の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）に対するインビトロ効果を示すことができる（異なる疾患期）
【0188】
本明細書に記載される主題の非限定的な例
－ Ｆｃ－Ｄｓｇ３融合構築物配列
－ ＰＶの治療
－ Ｆｃ－Ｄｓｇ３融合構築物配列
－ ＰＶの治療
【0189】
実施例６
治療用部分、イメージング部分、捕捉部分、又はそれらの組み合わせの結合のための非限定的で例示的な方法
特定の実施形態では、ソルターゼ技術を使用して、目的の任意の生体分子をタンパク質のＣ末端に部位特異的に結合することができる。特定の臨床実施形態では、目的の生体分子は、例えば、遊離システインとのマレイミド反応、又はリジン側鎖の遊離アミンとのＮＨＳ活性基を介して、同様に非特異的に結合することができる。
治療用部分、イメージング部分、捕捉部分、又はそれらの組み合わせの結合のための非限定的で例示的な方法
特定の実施形態では、ソルターゼ技術を使用して、目的の任意の生体分子をタンパク質のＣ末端に部位特異的に結合することができる。特定の臨床実施形態では、目的の生体分子は、例えば、遊離システインとのマレイミド反応、又はリジン側鎖の遊離アミンとのＮＨＳ活性基を介して、同様に非特異的に結合することができる。
【0190】
特定の実施形態は、単一の融合タンパク質上に複数の抗原を含み得る。ある実施形態は、ノブ－イントゥ－ホールＦｃを含む。一実施形態では、抗原がホール上に配置され、第２の抗原がノブ上に配置される。このような実施形態は、１つの薬物中に２つの主要な抗原を含めることを可能にする。例として、複数の実施形態は、Ｄｓｇ３－ノブ及びＤｓｇ１－ホールを含むことができ、逆もまた同様である。複数の実施形態は、例えば、これらの治療薬に含まれる抗原として、Ｄｓｇ１又はＤｓｇ３の特異的細胞外（ＥＣ）ドメインを含み得る。このような実施形態は、天疱瘡患者の治療に有用であり得る。
【0191】
種々の実施形態は、自己免疫障害の治療に利用され得る
例示的な自己免疫障害は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第７，３３２，１６８号に提供される。自己免疫障害の非限定的な例を（特定の治療用構築物における使用に適した例示的な自己抗原と共に）以下に提供する。
腫瘍随伴性天疱瘡（主にプラキン（エンボプラキン、ペリプラキン、デスモプラキンＩ、デスモプラキンＩＩ、エピプラキン、プレクチン、ＢＰ２３０）、カドヘリン（Ｄｓｇ３、Ｄｓｇ１、Ｄｓｃ１、Ｄｓｃ２、Ｄｓｃ３）、α２－マクログロブリン様分子に対するＩｇＧ Ａｂ）
ＩｇＡ天疱瘡：Ｄｓｇ１、Ｄｓｇ３、Ｄｓｃ１、Ｄｓｃ２、Ｄｓｃ３に対するＩｇＡ
増殖性天疱瘡：Ｄｓｇ３、Ｄｓｇ１、Ｄｓｃ３に対するＩｇＧ
紅斑性天疱瘡：ＩｇＧ Ｄｓｇ１
天疱瘡ヘルペティフォルミス：ＩｇＧ Ｄｓｇ１、Ｄｓｇ３、Ｄｓｃ１、Ｄｓｃ３
薬剤誘発性天疱瘡：ＩｇＧ Ｄｓｇ１、Ｄｓｇ３
水疱性類天疱瘡：ＢＰ１８０（ＮＣ１６Ａドメイン）、ＢＰ２３０に対する抗ＩｇＧ
扁平苔癬天疱瘡：ＢＰ１８０（ＮＣ１６Ａ）ドメイン、ＢＰ２３０に対するＩｇＧ
産後類天疱瘡：ＢＰ１８０に対する抗ＩｇＧ（ＮＣ１６Ａドメイン、症例の９０％）、ＢＰ２３０（有病率が低い）
線形ＩｇＡ皮膚病：ＢＰ１８０ ＮＣ１６Ａ／ＬＡＢＤ９７／ＬＡＤ－１ドメイン、及びＢＰ ２３０に対するＩｇＡ
粘膜類天疱瘡：ＢＰ１８０［ＮＣ１６Ａドメイン／Ｃ末端エピトープ］、ラミニン３３２、ＢＰ２３０、α６β４インテグリン、及びコラーゲンＶＩＩに対するＩｇＧ／ＩｇＡ
抗ラミニンガンマ１／ｐ２００類天疱瘡：ラミニンガンマ１（ｐ２００）に対するＩｇＧ
後天性表皮水疱症：ＶＩＩ型コラーゲンに対するＩｇＧ
皮膚炎ヘルペティフォルミス：表皮トランスグルタミナーゼ、組織トランスグルタミナーゼ、筋内膜、脱アミド化グリアジンに対するＩｇＡ／Ｇ
重症筋無力症
グレーブス病
免疫性血小板減少性紫斑病
乾癬
白斑
全身性エリテマトーデス
１型糖尿病
関節リウマチ
多発性硬化症
クローン病
潰瘍性大腸炎
アジソン病
シェーグレン症候群
橋本甲状腺炎
自己免疫性血管炎
悪性貧血
セリアック病
強直性脊椎炎
ベーチェット症候群
先天性副腎過形成
グッドパスチャー症候群
遺伝性ヘモクロマトーシス
突発性膜性糸球体腎炎
ナルコレプシー
サルコイドーシス
自己免疫性腎疾患、例えば、Ｚｈａｎｇ Ｗ，Ｒｈｏ Ｊ－ｈ，Ｒｏｅｈｒｌ ＭＷ，Ｒｏｅｈｒｌ ＭＨ，Ｗａｎｇ ＪＹ（２０１９）Ａ ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ ｏｆ １２４ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ａｕｔｏａｎｔｉｇｅｎｓ ｆｏｒ ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ ｋｉｄｎｅｙ ｄｉｓｅａｓｅｓ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ｂｙ ｄｅｒｍａｔａｎ ｓｕｌｆａｔｅ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ ｏｆ ｋｉｄｎｅｙ ｔｉｓｓｕｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．ＰＬｏＳ ＯＮＥ １４（６）（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載される１２４の自己抗原を参照されたい。
例示的な自己免疫障害は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第７，３３２，１６８号に提供される。自己免疫障害の非限定的な例を（特定の治療用構築物における使用に適した例示的な自己抗原と共に）以下に提供する。
腫瘍随伴性天疱瘡（主にプラキン（エンボプラキン、ペリプラキン、デスモプラキンＩ、デスモプラキンＩＩ、エピプラキン、プレクチン、ＢＰ２３０）、カドヘリン（Ｄｓｇ３、Ｄｓｇ１、Ｄｓｃ１、Ｄｓｃ２、Ｄｓｃ３）、α２－マクログロブリン様分子に対するＩｇＧ Ａｂ）
ＩｇＡ天疱瘡：Ｄｓｇ１、Ｄｓｇ３、Ｄｓｃ１、Ｄｓｃ２、Ｄｓｃ３に対するＩｇＡ
増殖性天疱瘡：Ｄｓｇ３、Ｄｓｇ１、Ｄｓｃ３に対するＩｇＧ
紅斑性天疱瘡：ＩｇＧ Ｄｓｇ１
天疱瘡ヘルペティフォルミス：ＩｇＧ Ｄｓｇ１、Ｄｓｇ３、Ｄｓｃ１、Ｄｓｃ３
薬剤誘発性天疱瘡：ＩｇＧ Ｄｓｇ１、Ｄｓｇ３
水疱性類天疱瘡：ＢＰ１８０（ＮＣ１６Ａドメイン）、ＢＰ２３０に対する抗ＩｇＧ
扁平苔癬天疱瘡：ＢＰ１８０（ＮＣ１６Ａ）ドメイン、ＢＰ２３０に対するＩｇＧ
産後類天疱瘡：ＢＰ１８０に対する抗ＩｇＧ（ＮＣ１６Ａドメイン、症例の９０％）、ＢＰ２３０（有病率が低い）
線形ＩｇＡ皮膚病：ＢＰ１８０ ＮＣ１６Ａ／ＬＡＢＤ９７／ＬＡＤ－１ドメイン、及びＢＰ ２３０に対するＩｇＡ
粘膜類天疱瘡：ＢＰ１８０［ＮＣ１６Ａドメイン／Ｃ末端エピトープ］、ラミニン３３２、ＢＰ２３０、α６β４インテグリン、及びコラーゲンＶＩＩに対するＩｇＧ／ＩｇＡ
抗ラミニンガンマ１／ｐ２００類天疱瘡：ラミニンガンマ１（ｐ２００）に対するＩｇＧ
後天性表皮水疱症：ＶＩＩ型コラーゲンに対するＩｇＧ
皮膚炎ヘルペティフォルミス：表皮トランスグルタミナーゼ、組織トランスグルタミナーゼ、筋内膜、脱アミド化グリアジンに対するＩｇＡ／Ｇ
重症筋無力症
グレーブス病
免疫性血小板減少性紫斑病
乾癬
白斑
全身性エリテマトーデス
１型糖尿病
関節リウマチ
多発性硬化症
クローン病
潰瘍性大腸炎
アジソン病
シェーグレン症候群
橋本甲状腺炎
自己免疫性血管炎
悪性貧血
セリアック病
強直性脊椎炎
ベーチェット症候群
先天性副腎過形成
グッドパスチャー症候群
遺伝性ヘモクロマトーシス
突発性膜性糸球体腎炎
ナルコレプシー
サルコイドーシス
自己免疫性腎疾患、例えば、Ｚｈａｎｇ Ｗ，Ｒｈｏ Ｊ－ｈ，Ｒｏｅｈｒｌ ＭＷ，Ｒｏｅｈｒｌ ＭＨ，Ｗａｎｇ ＪＹ（２０１９）Ａ ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ ｏｆ １２４ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ａｕｔｏａｎｔｉｇｅｎｓ ｆｏｒ ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ ｋｉｄｎｅｙ ｄｉｓｅａｓｅｓ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ｂｙ ｄｅｒｍａｔａｎ ｓｕｌｆａｔｅ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ ｏｆ ｋｉｄｎｅｙ ｔｉｓｓｕｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．ＰＬｏＳ ＯＮＥ １４（６）（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載される１２４の自己抗原を参照されたい。
【0192】
実施例７
背景及び有意性。尋常性天疱瘡（ＰＶ）は、皮膚及び粘膜の痛みを伴う水疱形成を特徴とし得る、破壊的な自己免疫疾患である１～４。カドヘリンファミリーの一部であるデスモグレインは、重層上皮におけるケラチノサイト間の主要な細胞接着剤である。デスモグレイン分子に対する自己抗体は、それらの接着機能を阻害し、棘細胞離開として知られる細胞間接着の喪失を引き起こす５、６。加えて、細胞間接着における自己抗体の干渉は、病的な自己免疫応答を増大させ、棘細胞離開に寄与する細胞シグナル伝達経路をもたらす２、３、７。粘膜優位型ＰＶは、デスモグレイン－３（Ｄｓｇ３）に対する自己抗体の産生によって引き起こされ、痛みを伴う粘膜びらんを引き起こす８、２９（図１４）。口腔粘膜びらんは、特に痛みを伴い、患者にとって厄介であり、飲食を困難にする。粘膜びらんは、鼻粘膜、膣粘膜、肛門周囲粘膜、喉頭／食道粘膜、泌尿生殖器粘膜、及び結膜粘膜を含む他の粘膜サービス（mucosal service）においても起こり得る（図１４）。ＰＶの治癒法は存在しない。治療戦略は、典型的には、全身性ステロイド及び免疫抑制剤を含む１０～２２。自己反応性Ｂ細胞由来の抗Ｄｓｇ３抗体は、粘膜優位型ＰＶの主要な駆動因子である２３、２４。天疱瘡における病原性自己抗体の直接的な役割が確立されており、一価自己抗体がこの疾患を引き起こすのに十分であることが示されている８、２５、２６。抗ＣＤ２０抗体（例えば、リツキシマブ）は、中等度から重度の疾患に対するファーストラインの選択肢となっているが１１、４、２７～３０、感染のリスクの増加（従来の免疫抑制剤よりも低いとはいえ）、Ｂ細胞の枯渇、ワクチン接種に対する液性応答を減らすこと、又は６ヶ月間以上にわたる新しい感染、及び治療後の再発の高いリスクを含む、オフターゲット免疫抑制効果と関連がある２９、３１～３４。新生児Ｆｃ受容体アンタゴニスト３５、３６、Ｂ細胞活性化因子受容体に対する遮断抗体（ＢＡＦＦ－Ｒ）３７、及びブルトンのチロシンキナーゼ阻害剤（ＢＴＫｉ）３８、３９を含む治療選択肢は、いくつかは現在臨床試験中であるが、特に新生児Ｆｃ受容体アンタゴニスト４０の場合、全体的な体液性免疫を弱めるオフターゲット免疫抑制効果を回避せず、重度の低ガンマグロブリン症の高いリスクを有する。加えて、ＢＴＫｉの初期動物試験は、イヌ落葉状天疱瘡（イヌにおける抗デスモコリン自己抗体及び抗デスモグレイン自己抗体によって駆動される天疱瘡の表在性バリアント）について有効性を示すが、完全な治癒を示さない。ＢＴＫｉは、全てのイヌにおいて自己抗体の産生を完全に抑制することができなかったが、これは疾患の寛解及び治癒の鍵である３９。ＰＶの再発は、最初の治療中に枯渇していない同じ自己反応性細胞の拡大に起因し得る４１～４３。したがって、自己反応性Ｂ細胞の完全な枯渇は、治癒法を与え得る。自己ポリクローナル調節性Ｔ細胞４４及びキメラ自己抗原受容体（ＣＡＡＲ）Ｔ細胞４５などの初期段階の細胞ベースの療法は、有効であることが証明されたとしても、全体的に免疫抑制性とはなり得ない。しかし、細胞ベースの療法は、個々の患者に対して個別化することができ、製造、保管、及び輸送のための特定の要件を有するが、これは、この疾患群を治療する全ての病院及び診療所において実行可能であるとは限らない。抗誘導性共刺激因子（Inducible Co-Stimulator、ＩＣＯＳ）抗体による、Ｔ細胞上に発現される共刺激受容体であるＩＣＯＳ分子（抗Ｄｓｇ３病原性Ｂ細胞の発生において重要な役割を果たす濾胞性ヘルパーＴ細胞の活性に影響を及ぼす）の標的化は、動物モデルにおいてＰＶの進行を遅延させる結果を示している４６。しかしながら、これは、抗Ｄｓｇ３ Ｂ細胞自体を標的とすることと比較して、抗Ｄｓｇ３抗体産生を標的とするあまり直接的でない方法であり、理論に束縛されることを望むものではないが、疾患の進行を遅延させることしかできず、他の防御抗体の産生に悪影響を及ぼし得る。防御免疫を保存しながら自己反応性細胞を正確に枯渇させる標的化治療の開発は、満たされていない必要性であり、多くの患者にとって救命的である。
背景及び有意性。尋常性天疱瘡（ＰＶ）は、皮膚及び粘膜の痛みを伴う水疱形成を特徴とし得る、破壊的な自己免疫疾患である１～４。カドヘリンファミリーの一部であるデスモグレインは、重層上皮におけるケラチノサイト間の主要な細胞接着剤である。デスモグレイン分子に対する自己抗体は、それらの接着機能を阻害し、棘細胞離開として知られる細胞間接着の喪失を引き起こす５、６。加えて、細胞間接着における自己抗体の干渉は、病的な自己免疫応答を増大させ、棘細胞離開に寄与する細胞シグナル伝達経路をもたらす２、３、７。粘膜優位型ＰＶは、デスモグレイン－３（Ｄｓｇ３）に対する自己抗体の産生によって引き起こされ、痛みを伴う粘膜びらんを引き起こす８、２９（図１４）。口腔粘膜びらんは、特に痛みを伴い、患者にとって厄介であり、飲食を困難にする。粘膜びらんは、鼻粘膜、膣粘膜、肛門周囲粘膜、喉頭／食道粘膜、泌尿生殖器粘膜、及び結膜粘膜を含む他の粘膜サービス（mucosal service）においても起こり得る（図１４）。ＰＶの治癒法は存在しない。治療戦略は、典型的には、全身性ステロイド及び免疫抑制剤を含む１０～２２。自己反応性Ｂ細胞由来の抗Ｄｓｇ３抗体は、粘膜優位型ＰＶの主要な駆動因子である２３、２４。天疱瘡における病原性自己抗体の直接的な役割が確立されており、一価自己抗体がこの疾患を引き起こすのに十分であることが示されている８、２５、２６。抗ＣＤ２０抗体（例えば、リツキシマブ）は、中等度から重度の疾患に対するファーストラインの選択肢となっているが１１、４、２７～３０、感染のリスクの増加（従来の免疫抑制剤よりも低いとはいえ）、Ｂ細胞の枯渇、ワクチン接種に対する液性応答を減らすこと、又は６ヶ月間以上にわたる新しい感染、及び治療後の再発の高いリスクを含む、オフターゲット免疫抑制効果と関連がある２９、３１～３４。新生児Ｆｃ受容体アンタゴニスト３５、３６、Ｂ細胞活性化因子受容体に対する遮断抗体（ＢＡＦＦ－Ｒ）３７、及びブルトンのチロシンキナーゼ阻害剤（ＢＴＫｉ）３８、３９を含む治療選択肢は、いくつかは現在臨床試験中であるが、特に新生児Ｆｃ受容体アンタゴニスト４０の場合、全体的な体液性免疫を弱めるオフターゲット免疫抑制効果を回避せず、重度の低ガンマグロブリン症の高いリスクを有する。加えて、ＢＴＫｉの初期動物試験は、イヌ落葉状天疱瘡（イヌにおける抗デスモコリン自己抗体及び抗デスモグレイン自己抗体によって駆動される天疱瘡の表在性バリアント）について有効性を示すが、完全な治癒を示さない。ＢＴＫｉは、全てのイヌにおいて自己抗体の産生を完全に抑制することができなかったが、これは疾患の寛解及び治癒の鍵である３９。ＰＶの再発は、最初の治療中に枯渇していない同じ自己反応性細胞の拡大に起因し得る４１～４３。したがって、自己反応性Ｂ細胞の完全な枯渇は、治癒法を与え得る。自己ポリクローナル調節性Ｔ細胞４４及びキメラ自己抗原受容体（ＣＡＡＲ）Ｔ細胞４５などの初期段階の細胞ベースの療法は、有効であることが証明されたとしても、全体的に免疫抑制性とはなり得ない。しかし、細胞ベースの療法は、個々の患者に対して個別化することができ、製造、保管、及び輸送のための特定の要件を有するが、これは、この疾患群を治療する全ての病院及び診療所において実行可能であるとは限らない。抗誘導性共刺激因子（Inducible Co-Stimulator、ＩＣＯＳ）抗体による、Ｔ細胞上に発現される共刺激受容体であるＩＣＯＳ分子（抗Ｄｓｇ３病原性Ｂ細胞の発生において重要な役割を果たす濾胞性ヘルパーＴ細胞の活性に影響を及ぼす）の標的化は、動物モデルにおいてＰＶの進行を遅延させる結果を示している４６。しかしながら、これは、抗Ｄｓｇ３ Ｂ細胞自体を標的とすることと比較して、抗Ｄｓｇ３抗体産生を標的とするあまり直接的でない方法であり、理論に束縛されることを望むものではないが、疾患の進行を遅延させることしかできず、他の防御抗体の産生に悪影響を及ぼし得る。防御免疫を保存しながら自己反応性細胞を正確に枯渇させる標的化治療の開発は、満たされていない必要性であり、多くの患者にとって救命的である。
【0193】
Ｄｓｇ３及びＤｓｇ１は、皮膚及び粘膜において異なる発現パターンを有する１。Ｄｓｇ３は、粘膜を通して、及び成体皮膚のより深い層において発現され得る。Ｄｓｇ１及びカドヘリンは、粘膜優位型ＰＶの粘膜におけるＤｓｇ３機能の喪失を補うことができない。抗デスモグレイン自己抗体は、ケラチノサイト間の接着の喪失並びに水疱及びびらんの形成を誘導する際に病原性の役割を果たす。実験モデルは、Ｄｓｇ３及びＤｓｇ１自己抗体が直接的に病原性であることを示している２４、２５、４７。抗Ｄｓｇ１自己抗体レベル及び抗Ｄｓｇ３自己抗体レベルは、疾患重症度と相関し得る４８。自己反応性抗体を産生するために一緒に働く病変周囲の自己反応性Ｂ及びＴリンパ球は、疾患の病因における細胞プレーヤーである４９。再発は、共に働いて疾患表現型を引き起こす自己反応性Ｔ細胞及びＢ細胞の戻りと相関し得る。寛解は、デスモグレインを標的とする自己反応性抗体の低下又は枯渇によって誘導される。再発は、自己反応性Ｂ細胞の不完全な枯渇を有する患者において、より高い５０。したがって、疾患表現型の直接的なエフェクター細胞である、デスモグレインを認識する自己反応性Ｂ細胞の完全な標的化枯渇は、自己抗体駆動疾患のこの群を治療する鍵である。自己反応性Ｂ細胞を伴わない自己反応性Ｔ細胞単独は、自己反応性Ｂ細胞の抑制が寛解を維持するのに重要であるため、疾患表現型を誘導することができない可能性がある４３、５１。
【0194】
本願発明者らは、全体的なＢ細胞プールに影響を及ぼすことなく、タンパク質操作技術を活用し、病原性Ｂ細胞を正確に標的化して枯渇させるための新しいツールを生成することによって、この問題に取り組むことができる。本願発明者らは、抗Ｄｓｇ３自己反応性Ｂ細胞によって駆動される粘膜優位型ＰＶを説明することができる。リツキシマブ２９を含む既存の治療用モノクローナル抗体に類似した機構では、理論に拘束されることを望むものではないが、抗体のＦｃ部分に融合したＤｓｇ３タンパク質は、自己反応性Ｄｓｇ３を認識するＢ細胞の死滅を効果的かつ特異的に媒介することができる。構築物のＤｓｇ３部分は、自己反応性Ｂ細胞の抗Ｄｓｇ３ Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）に結合する。次いで、Ｆｃ部分は、貪食細胞及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の動員によって、Ｄｓｇ３を認識する病原性Ｂ細胞のＦｃ媒介性死滅を誘導する（図１５のパネルＡ）。本願発明者らは、マウス及びヒトＤｓｇ３－Ｆｃ融合体を作製し、これらの構築物が特異性及び親和性を有しつつそれらの標的に結合することを示した。加えて、本願発明者らのデータは、操作されたタンパク質が、インビトロ及びインビボでの確立されたＤｓｇ３特異的Ｂ細胞の死滅を、有効性を伴って媒介することを示す（完全応答は、インビボ動物モデルにおいて観察される）。代替的なアプローチとして、本願発明者らは、抗ＣＤ３ｅ ｓｃＦｖに融合したＤｓｇ３タンパク質を使用して、腫瘍学的治療における既存の二重特異性Ｔ細胞エンゲージャ療法と類似の機構において、Ｄｓｇ３を認識する病原性Ｂ細胞を死滅させるようにＴ細胞を指向させ、結合させることができる（図１５のパネルＢ）５２、５３。
【0195】
理論に束縛されることを望むものではないが、本明細書に記載の組成物及び方法は、天疱瘡の他のバリアントである粘膜優位型ＰＶだけでなく、既知の抗原を用いた抗体駆動性自己免疫疾患の治療のためのプラットフォームを提供することができる。
【0196】
天疱瘡に対する治癒法は存在せず、治療は全体的に免疫抑制性である。正常なＢ細胞に影響を与えることなくＤｓｇ３自己反応性病原性Ｂ細胞の正確な標的化及び枯渇を可能にする、本明細書に記載のＦｃ媒介性アプローチ（及び本願発明者らの代替的なＴ細胞媒介性アプローチ）は、固有のものである。本明細書に提示されるデータは、本明細書に記載の組成物及び方法が、粘膜優位型ＰＶの治療を変えるだけではなく、他の自己免疫性水疱症（例えば、粘膜皮膚尋常性天疱瘡、落葉状天疱瘡、水疱性類天疱瘡、粘膜類天疱瘡、後天性表皮水疱症、線状ＩｇＡ水疱性皮膚症）、狼瘡、強皮症、グッドパスチャー病、グレーブス病のサブタイプから免疫介在性血管炎に及ぶ既知の抗原標的を用いた自己抗体／免疫複合体媒介性疾患の治療を開発するための道を開くことができることを示す。本願発明者らは、提案された治療薬は、自己免疫疾患の治療ツールボックスへの画期的な追加とみなすことができると考える。
【0197】
生物学的活性は、標準化されたインビトロアッセイを用いて確立することができる。広範なエクスビボ生体内分布及び代謝運命分析を行うことができる。実験の各セットについて、１群当たり少なくとも約１０匹のマウスを使用して、統計分析を可能にし、固有の動物間変動性を説明することができる。適用可能な場合、有意レベルα≦０．０５で対応のないスチューデント両側ｔ検定を使用して統計分析を行うことができる。生存分析は、ｌｏｇランク（Ｍａｎｔｅｌ－Ｃｏｘ）検定を使用して行うことができる。動物は、各実験内で年齢を一致させることができる。実験は、治療薬に対する応答における性差を説明するために、雄マウス及び雌マウスの両方を含み得る。動物における療法試験は、観察者バイアスが確実に回避されるように、二重盲検様式で行うことができる。市販されていない生物製剤及び化学物質を認証することができる。
【0198】
タンパク質の部位特異的改変。細菌トランスペプチダーゼであるソルターゼを使用して、Ｃ末端でタンパク質を改変することができる（図１６のパネルＡ）５４、５５。この酵素は、短い認識配列（ＬＰＥＴＧ）を有し、ＴとＧとの間を切断して中間体チオエステルを形成し、Ｇｌｙ３含有基質との求核反応による分解を可能にする。反応は、ほぼ定量的な収率を提供することができ、迅速、堅牢、かつ再現可能であり得る。本願発明者らは、ソルターゼを使用して、フルオロフォア、ポリマー、及び放射性同位体などの機能性をタンパク質上に導入した５６～６１。ソルターゼ媒介性部位特異的標識は、タンパク質の結合能力が標識後に損なわれないことを確実にし、したがって、ここで、本願発明者らは、ソルターゼ技術を使用してタンパク質を改変する。
【0199】
Ｄｓｇ３外部ドメインの免疫原性。ＰＶ患者に関する試験は、患者の９１％、７１％、５１％、１９％及び１２％が、それぞれ外部ドメインＥＣ１、ＥＣ２、ＥＣ３、ＥＣ４及びＥＣ５に対する自己抗体を有することを示している（図１３）６２。そのアプローチを確立するために、Ｄｓｇ３－ＥＣ１－３はＰＶ患者における生理学的抗Ｄｓｇ３抗体の大部分を網羅し、その産生は完全サイズのＥＣ１－５構築物よりも複雑ではないため、本願発明者らは、Ｄｓｇ３－ＥＣ１－３を使用することができる。更に、非限定的で例示的な結果（以下）は、標的化された外部ドメインに依存しない自己反応性Ｂ細胞の同様の死滅を示す。一旦確立されると、本願発明者らは、ＥＣ１－４及び１－５構築物を作製し、これは、臨床的解釈を考慮する場合に、より適切であり得、抗Ｄｓｇ３反応性病原性Ｂ細胞の全スペクトルをカバーする。
【0200】
抗Ｄｓｇ３細胞株及び抗体。本願発明者らは、以下の３つの細胞株及び４つの抗Ｄｓｇ３抗体を使用することができる：（１）マウスにおいてＰＶを誘導する抗マウスＤｓｇ３抗体を産生するＡＫ２３ハイブリドーマ細胞６３。ＡＫ２３抗体は、ＥＣ１ドメインを認識し、ヒトＤｓｇ３－ＥＣ１と交差反応する；（２及び３）Ｎａｌｍ－６ Ｆ７７９及びＮａｌｍ－６ ＰＶＢ２８がん細胞株。Ｎａｌｍ－６は、Ｂ細胞前駆体白血病細胞株であり、Ｆ７７９及びＰＶＢ２８は、それぞれＤｓｇ３－ＥＣ１及びＤｓｇ３－ＥＣ２ドメインを認識する患者由来の抗Ｄｓｇ３抗体を発現するように操作されたＮａｌｍ－６細胞である４５。更に、本願発明者らは、ＰＶ患者から特定された４つの抗ヒトＤｓｇ３抗体（Ｐ３Ｆ３、Ｐ１Ｆ５、Ｐ５Ｄ４及びＰ５Ｇ６）のプラスミドを得た６４。Ｐ３Ｆ３抗体は、ヒトＤｓｇ３－ＥＣ１ドメインに特異的に結合するＩｇＧ１抗体であり、ヒトケラチノサイトに添加されると強い棘細胞離開を誘導する６４。Ｐ１Ｆ５、Ｐ５Ｄ４、及びＰ５Ｇ６抗体は、それぞれＤｓｇ３－ＥＣ２、Ｄｓｇ３－ＥＣ４、及びＤｓｇ３－ＥＣ１ドメインに結合し、一緒になって強い棘細胞離開を誘導する６４。組み合わされたモノクローナル抗体は、それらのいずれか１つよりも高いケラチノサイトの解離を引き起こす。
【0201】
インビトロ環境において抗Ｄｓｇ３自己反応性Ｂ細胞を標的とし、その死滅を媒介するＤｓｇ３－Ｆｃ融合タンパク質を開発すること。
【0202】
ｍＤｓｇ３－ｍＦｃ及びｈＤｓｇ３－ｈＦｃ構築物の開発及び特性評価。本明細書において考察されるように、アプローチを確立するために、本願発明者らは、Ｄｓｇ３－ＥＣ１－３ドメインを開発した。したがって、本願発明者らは、マウス及びヒトの両方のＦｃ融合タンパク質であるｍＤｓｇ３－ＥＣ１－３－ＩｇＧ２ａ及びｈＤｓｇ３－ＥＣ１－３－ＩｇＧ１（ここからは、ｍＤｓｇ３－ｍＦｃ、及びｈＤｓｇ３－ｈＦｃと呼ぶ）を作製した。ヒトＩｇＧ１及びマウスＩｇＧ２ａを、それらの高いＦｃ媒介性死滅活性について選択した６５～６７。タンパク質は、Ｃ末端にＦＬＡＧタグ、ソルターゼ認識モチーフ及びＨｉｓ６タグを有するように操作された（図１６のパネルＡ）。８アミノ酸配列（ＤＹＫＤＤＤＤＫ）であるＦＬＡＧは、ウェスタンブロット及びフローサイトメトリー分析のために使用することができ、その後、インビボで使用される場合、構築物の代謝運命及び薬物動態の分析のために使用することができる。Ｈｉｓ６タグを精製に使用し、ソルターゼタグ（ＬＰＥＴＧ）を部位特異的に改変を導入するために使用した。本願発明者らは、確立されたクローニング技術に従って両方の構築物についてプラスミドを作製し、サンガー配列決定を介して最終配列を確認した。次いで、本願発明者らは、哺乳動物ＨＥＫ２９３細胞を使用して両方の構築物を発現させ、Ｎｉ－ＮＴＡアフィニティーカラムを介して精製し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びウェスタンブロッティング分析を使用して特性評価して、構築物の形成を確認した（図１６のパネルＡ～Ｂ）。Ｇｌｙ３－Ａｌｅｘａ６４７ソルターゼ基質を合成し、これを使用して、融合タンパク質をＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７で部位特異的に標識した。ソルターゼ反応は、構築物（５０μＭ）、Ｇｌｙ３－Ａｌｅｘａ６４７基質（５００μＭ）、及びソルターゼ（５μＭ）を４℃で１時間混合することによって行った。Ａｌｅｘａ６４７標識された構築物をサイズ排除カラムクロマトグラフィーによって精製し、構築物のゲル内蛍光スキャンによって、フルオロフォアの導入を更に確認した（図１６のパネルＢ）。構築物の機能性を特性評価するために、本願発明者らは、Ａｌｅｘａ６４７標識されたｍＤｓｇ３－ｍＦｃを使用して、抗ｍｄＳｇ３ ＡＫ２３ハイブリドーマ及び抗ｈＤｓｇ３ Ｆ７７９及びＰＶＢ２８細胞を染色した。細胞を、より多くの親和性及び特異性（１０ｎＭ濃度での）により染色し（図１６のパネルＣ）、これは、Ｆ７７９及びＰＶＢ２８細胞上の患者由来ＢＣＲがマウスＤｓｇ３タンパク質と交差反応することを示唆している。対照として使用したＮａｌｍ－６細胞は、いかなる結合も示さず、構築物の特異性を確認する（図１６のパネルＣ）。Ａｌｅｘａ６４７標識されたｈＤｓｇ３－ｈＦｃ融合タンパク質を使用して同様の実験を行ったところ、Ｆ７７９及びＰＶＢ２８細胞に強く結合し、マウスＡＫ２３細胞も染色することが確認され、これは、ＡＫ２３抗マウスＤｓｇ３抗体がヒトＤｓｇ３タンパク質と交差反応することが示唆している（図１６のパネルＣ）。注目すべきことに、ヒトＤｓｇ３は、マウスＤｓｇ３に類似しており（８６％の配列相同性）６８、マウスＤｓｇ３欠損を機能的にレスキューする６９。構築物を更に分析するために、本願発明者らは、異なる濃度のＡｌｅｘａ６４７標識されたタンパク質を使用することによって、ｍＤｓｇ３－ｍＦｃ及びｈＤｓｇ３－ｈＦｃ構築物の両方についてのＥＣ５０値を測定した。結果は、ｈＤｓｇ３－ｈＦｃ及びｍＤｓｇ３－ｍＦｃが、それぞれ１．８±０．８ｎＭ及び２．３±０．９ｎＭのＥＣ５０でＦ７７９細胞に結合することを示した（図１６のパネルＤ～Ｅ）。構築物を更に特性評価するために、本願発明者らは、まず、プレートをＡＫ２３抗体でコーティングし、別のプレートをＰ３Ｆ３（抗ヒトＤｓｇ３）でコーティングし６４、次いで、コーティングされたプレートに対する構築物の結合を分析することによって、ＥＬＩＳＡアッセイを行った。その結果は更に、本願発明者らが作製したヒト及びマウス構築物が両方の抗Ｄｓｇ３抗体に特異的に結合するが、対照プレートには特異的に結合しないことを確認した（図１６のパネルＦ）。Ｐ３Ｆ３抗体を、製造業者のプロトコルに従って、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞において作製した。ＡＫ２３抗体を、プロテインＧアフィニティーカラムを用いてＡＫ２３ハイブリドーマ培地から精製した。同様のアプローチに従って、本願発明者らは、マウスＩｇＧ２ａ及びヒトＩｇＧ１ Ｆｃに融合したマウス及びヒトＤｓｇ３－ＥＣ１－４、及びＤｓｇ３－ＥＣ１－５を生成することができ、それらを同様に特性評価する。
【0203】
Ｆｃ媒介性インビトロ死滅アッセイを確立する。まず、本願発明者らは、ｍＤｓｇ３－ｍＦｃ構築物が、そのＦｃ部分（ＩｇＧ２ａ）を介して、低いｎＭ親和性でマウスマクロファージ上のＦｃγ受容体に結合することを確認した（図１６のパネルＧ、ＥＣ５０値２．３±０．８ ｎＭ）。対照Ｎａｌｍ６細胞は、染色されないままであった。融合タンパク質がＦｃ媒介性死滅を引き起こし得るかどうかを決定するために、マウスＲＡＷ２６４．７マクロファージ細胞と共培養したＦ７７９標的細胞（エフェクタ：標的の比が１０：１）をｍＤｓｇ３－ｍＦｃ融合タンパク質で処置した。１ｎＭ程度の低濃度の構築物が、Ｆ７７９標的細胞の効率的な死滅を媒介することができた（２４時間後及び４８時間後にそれぞれ約６０％及び約８０％の死滅、Ｎａｌｍ６対照細胞の死滅はなかった、図１７）。（ＥＣ２に結合する）標的細胞としてＰＶＢ２８を用いて同様の実験を行った。結果は、標的細胞の同様に有効な死滅を示し、これは、治療が、Ｄｓｇ３上の標的化エピトープにかかわらず、異なる自己反応性細胞の死滅を媒介し得ることを示している（図１７）。異なる用量のｍＤｓｇ３－ｍＦｃ（１、１０及び１００ｎＭ）を用いて実験を繰り返して、治療濃度の効果及びより高い治療濃度で起こり得る任意の潜在的な非特異的死滅を試験した。結果は、１０及び１００ｎＭで、抗Ｄｓｇ３陰性Ｎａｌｍ６細胞の非特異的死滅を伴わずに、標的細胞の高死滅率（約９０％死滅）を示し、治療が、より高い濃度範囲で非常に有効かつ特異的なままであることを示唆している（図１７）。本願発明者らは、エフェクター細胞としてＲＡＷ２６４．７マクロファージ細胞、並びに標的細胞としてＦ７７９及びＰＶＢ２８を使用して同様の実験を行ったが、今回はｈＤｓｇ３－ｈＦｃ構築物を使用した（マウスＦｃγ受容体（ＦｃγＲ）はヒトＦｃを認識することが知られている。しかしながら、ヒトＦｃＲは、マウスＦｃを認識しない）６５。結果は、上記で考察したｍＤｓｇ３－ｍＦｃ実験の結果と同様に、非常に有効かつ特異的な死滅を示した（図１７）。次に、本願発明者らは、同様の設定で実験を繰り返したが、今回は、エフェクター細胞としてＴＨＰ１細胞７０（ＡＭＬ患者に由来する広く使用され、確立されたヒト単球細胞株）を使用し、治療としてｈＤｓｇ３－ｈＦｃ構築物を使用した。結果は、標的細胞の効果的な死滅を示し、対照の抗Ｄｓｇ３陰性Ｎａｌｍ－６細胞は死滅しなかった（図１７）。本願発明者らは、治療のためにある範囲の用量（０、１、１０、及び１００ｎＭのｈＤｓｇ３－ｈＦｃ構築物を使用して死滅アッセイを実施し（図１７）、試験した全ての濃度について有効な死滅効力を観察し、これは、治療が、低濃度で有効であり、高濃度で高度に特異的なままであることを示唆している。
【0204】
潜在的な懸念は、抗Ｄｓｇ３自己抗体（ＰＶ患者において生じる）の存在が、治療が標的細胞に結合するのを遮断し、したがって治療有効性を減少させるか、又は中和する可能性があるかどうかである。この問題を試験するために、本願発明者らはまず、抗Ｄｓｇ３抗体を培地中に放出する十分に確立されたＡＫ２３ハイブリドーマ細胞を使用した。ＡＫ２３抗体は、上述のように、Ｄｓｇ３上のＥＣ１ドメインを認識し、したがって、治療を潜在的に中和することができる。実験は、上記と同じ設定に従って行った。結果は、本願発明者らがＦ７７９及びＰＶＢ２８細胞について観察したものと同様に（図１７）、ＡＫ２３細胞の非常に有効な死滅を示した（エフェクター細胞としてＲａｗ細胞又はＴＨＰ１細胞のいずれかを用い、治療としてｍＤｓｇ３－ｍＦｃ又はｈＤｓｇ３－ｈＦｃを用いた場合）。抗Ｄｓｇ３自己抗体の存在の影響のより系統的な分析を行うために、本願発明者らは、標的細胞としてＡＫ２３細胞及びＦ７７９細胞、エフェクター細胞としてＲａｗ細胞、治療として１０ｎＭのｍＤｓｇ３－Ｆｃ又はｈＤｓｇ３－Ｆｃを使用し、上記と同じ設定に従って死滅アッセイを繰り返した（エフェクタ：標的の比１０：１）。しかしながら、今回、本願発明者らは、抗Ｄｓｇ３抗体の存在が死滅有効性に影響を及ぼし得るかどうかを評価するために、ある範囲の既知量のＡＫ２３抗体を混合物に添加した。驚くべきことに、本願発明者らは、試験した条件のいずれにおいても死滅有効性の変化を観察しなかった（１００ｐＭ～５００ｎＭの範囲のＡＫ２３抗体を試験した。図１８を参照されたい。各セットの最初の２列は２４時間評価であり、次の２列は４８時間評価である）。本願発明者らは、全ての４つの異なる細胞（対照としてＮａｌｍ－６、次いで標的細胞としてＡＫ２３、Ｆ７７９及びＰＶＢ２８）を使用してアッセイを繰り返し、今回は、１００ｎＭのＡＫ２３抗体の存在下で、エフェクター細胞としてＴＨＰ－１細胞を使用し、治療として異なる用量のｈＤｓｇ３－ｈＦｃ（０、１、１０及び１００ｎＭ）を使用した。驚くべきことに、かつ、上記と同様に、遮断は観察されず、試験した全ての条件において有効な死滅が得られた（図１８）。これは、Ｄｓｇ３に対する自己抗体の存在が、Ｄｓｇ３－Ｆｃ融合タンパク質の死滅有効性に対して最小限の負の影響を有し得ることを示している。
【0205】
この潜在的な問題を更に評価し、ポリクローナル抗Ｄｓｇ３抗体の存在がアプローチの有効性にどのように影響し得るかを詳細に説明するために、本願発明者らは、４名の異なる患者由来の抗Ｄｓｇ３抗体Ｐ３Ｆ３及びＰ５Ｇ６（Ｄｓｇ３－ＥＣ１に結合する）、Ｐ１Ｆ５（Ｄｓｇ３－ＥＣ２に結合する）及びＰ５Ｄ４（Ｄｓｇ３－ＥＣ４に結合する）を作製した。本願発明者らは既にＰ３Ｆ３抗体を作製しており、他の３つの抗体の産生は進行中である。本願発明者らは、ＡＫ２３、Ｆ７７９、及びＰＶＢ２８細胞についての死滅アッセイを、本願発明者らが上記で行ったもの（ＡＫ２３、Ｐ３Ｆ３、Ｐ５Ｄ４、Ｐ５Ｇ６、Ｐ１Ｆ５）と同様の濃度範囲で、これら５つの抗体の混合物の存在下で繰り返す。加えて、本願発明者らは、生理学的条件を厳密に模倣するために、抗Ｄｓｇ３抗体の混合物の存在下で標的細胞（ＡＫ２３、Ｆ７７９、ＰＶＢ２８）の混合物を使用するアッセイを実施する。理論に束縛されることを望むものではないが、治療により、ポリクローナル自己抗体の存在下でポリクローナル病原性Ｂ細胞の標的化死滅を継続することができる。
【0206】
全体として、インビトロデータは、Ｄｓｇ３－Ｆｃ構築物が、抗Ｄｓｇ３自己抗体の存在下であっても、抗Ｄｓｇ３＋標的細胞の死滅を効果的かつ特異的に媒介することができることを示している。
【0207】
患者ＰＢＭＣを使用したインビトロアッセイにおけるヒト構築物（ｈＤｓｇ３－ｈＦｃ）の有効性を描写する。理論に束縛されることを望むものではないが、本願発明者らは、患者の血液中に存在するポリクローナル抗Ｄｓｇ３ ＩｇＧの存在下で、正常Ｂ細胞に影響を及ぼすことなく病原性Ｂ細胞を死滅させる際のアプローチの有効性を描写することができる。本願発明者らは、Ｄｓｇ３タンパク質に対する自己反応性Ｂ細胞が確認されたＰＶ患者（少なくともｎ＝１０）からＰＢＭＣを得る７１。（１）治療未経験、及び（２）疾患の再発を含む異なる疾患期の抗Ｄｓｇ３陽性患者から得たＰＢＭＣを、丸底４８ウェルプレート中で培養する（各群についてｎ＝１０）。ｈＤｓｇ３－ｈＦｃ融合タンパク質（１ｎＭ及び１０ｎＭ）を、標準的な細胞インキュベーター内での３７℃でのインキュベーション後に細胞に加える。ＰＢＭＣ中に存在する患者自身の貪食細胞及びＮＫ細胞が、標的化された抗Ｄｓｇ３＋病原性Ｂ細胞を死滅させることができると予想されるので、更なる貪食細胞は混合物に添加されない。細胞のインキュベーション及び治療（ｈＤｓｇ３－ｈＦｃ）の１日後及び２日後に、ＥＬＩＳｐｏｔアッセイを実施して、抗原特異的及び総ＩｇＧ Ｂ細胞枯渇について評価する。結果は、総ＩｇＧレベル（影響を受けていないと予想される、したがって、対照として使用する）と比較した自己反応性抗Ｄｓｇ３ ＩｇＧの減少パーセンテージを明らかにする。分析は、フローサイトメトリー、並びにアッセイの内部標準として作用するＢ細胞及びＴ細胞を含む標準的な生－死分析を介して行われる。ＣＤ３＋、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋及びＣＤ２０＋細胞をゲーティングするために抗体を使用することに加えて、本願発明者らは、フルオロフォア標識されたｈＤｓｇ３構築物（ｈＤｓｇ３－Ａｌｅｘａ６４７）を使用してＰＢＭＣを染色する。ｈＤｓｇ３タンパク質（Ｆｃを含まない）は既に手元にある。本願発明者らは、ｈＤｓｇ３タンパク質（ＥＣ１－３）を、本願発明者らが記載のタンパク質を作製するために使用したのと同様のプロトコルに従って作製した（標準的なクローニング、その後の発現、精製、及びＡｌｅｘａ６４７を導入するためのソルターゼによる部位特異的標識）。これは、ＰＶ患者のＰＢＭＣ中に存在する抗Ｄｓｇ３＋Ｂ細胞に対するゲーティングを可能にする。Ａｌｅｘａ６４７標識されたＤｓｇ３タンパク質での染色を含むアッセイの前後のフローサイトメトリー分析は、抗Ｄｓｇ３細胞がいかに効果的に標的化され、死滅したかを明らかにする。第２の対照として、健康なＰＢＭＣを同じ設定で使用して、観察された結果を更に確認する（ここで、本願発明者らは変化が起こらないと予想する）。ＰＶ患者のＰＢＭＣは、以下の包含／除外基準を満たす患者から収集される。包含基準：（１）生検によりＰＶと証明された、（２）標準的なＥＬＩＳＡによる、循環抗Ｄｓｇ３ ＩｇＧ自己抗体、（３）ＰＢＭＣ収集時にＣＤ１９及びＣＤ２０によって示された正常Ｂリンパ球カウント。除外基準：（１）Ｂ及びＴ細胞リンパ腫／白血病を含む既知の血液由来悪性腫瘍を有する患者。ＰＢＭＣのレベル又は機能に影響を及ぼし得る任意の治療を含む、ＰＢＭＣ収集の１２ヶ月前及びＰＢＭＣ収集時の治療を記録する。理論に束縛されることを望むものではないが、患者のＰＢＭＣ中の病原性Ｂ細胞を、正常なＢ細胞に影響を及ぼすことなく、効率的かつ特異的に死滅させることができる。
【0208】
本願発明者らは、既に１５０ｍｇを超えるｍＤｓｇ３－ＥＣ１－３－ｍＦｃ、１５０ｍｇを超えるｈＤｓｇ３－ＥＣ１－３－ｈＦｃ、２００ｍｇを超えるｍＤｓｇ３－ＥＣ１－３、及び２００ｍｇを超えるｈＤｓｇ３－ＥＣ１－３を作製しており、これらは提案された実験に必要な量を超えており、必要に応じて、これより多く作製することができる。本願発明者らは、マウス及びヒトＤｓｇ３－ＥＣ１－４－Ｆｃ及びＤｓｇ３－ＥＣ１－５－Ｆｃを含有する構築物を同様に作製する。タンパク質発現収率が特定の構築物について低い場合、本願発明者らは、この問題に対処するために、例えば、限定されないが、以下の異なる経路を調査することができる。（１）発現に使用されるヌクレオチドコドンを再最適化する、（２）異なるシグナルペプチド配列を使用する、及び／又は（３）ＨＥＫ２９３細胞の代わりにタンパク質発現のための他の系、例えばＣＨＯ、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ又は昆虫細胞を使用する。
【0209】
自己抗体の存在及び中和の懸念に関して、結果は、ＰＶ患者における生理学的状態において生じるような自己抗体の存在が、治療を中和しない（又は少なくとも完全には中和しない）ことを示す。理論に束縛されることを望むものではないが、これは、抗原－抗体相互作用の動的かつ可逆的な性質に起因するものであり、エフェクター細胞を介して標的細胞を死滅させる不可逆的プロセスとは対照的である。更に、エフェクター細胞と標的細胞との間で生じるクラスター化は、２つの細胞を架橋するいくつかのＤｓｇ３－Ｆｃ分子を介して起こり、Ｄｓｇ３－Ｆｃ分子との自己抗体相互作用と比較して、親和性に関して、より強い可能性があり、それによって自己抗体の存在下であっても死滅プロセスを前方に駆動する。重要なことに、抗体は、Ｄｓｇ３タンパク質上の異なるエピトープに結合することができる。したがって、多くの抗体は、重複しないエピトープを有する。したがって、自己抗体がＤｓｇ３－Ｆｃ治療構築物に結合している場合であっても、複合体（Ｄｓｇ３－Ｆｃに結合した抗体）は、非重複エピトープを有する抗Ｄｓｇ３ ＢＣＲ（病原性Ｂ細胞の表面上）に依然として結合することができ、したがって、エフェクタを標的細胞に架橋し、２つの細胞間でクラスターを形成するのを助け、したがって標的細胞の死滅を媒介する。したがって、Ｄｓｇ３タンパク質上の多くの潜在的エピトープ及び相互作用の動的性質を考慮すると、Ｄｓｇ３－Ｆｃ構築物が抗Ｄｓｇ３ ＢＣＲの全ての病原性クローンに到達する可能性は、統計的に高いままである。更に、重要なことに、これらの構築物の投薬は、オマリズマブ（ＩｇＥレベルに基づいて使用されるＩｇＧ１ｋ抗ヒトＩｇＥ）などの薬物と同様であるが、直接的には類似しておらず、患者依存的であり、循環抗Ｄｓｇ３力価のレベルに潜在的に基づき得るので、本願発明者らは、これを臨床診療における制限とは考えない。加えて、現実世界の状況では、治療薬は、ＩＶＩＧなどの抗Ｄｓｇ３力価を低下させる他の薬物と同時に使用することができる７２～７６。循環抗Ｄｓｇ３自己抗体を低下させるために臨床で使用される別のアプローチは、循環自己抗体の力価を低下させることができ、通常、重度の天疱瘡を有する患者に使用される、血漿交換及び免疫吸着である７７～８０。したがって、この（潜在的な）問題に対処する複数の方法が存在し、本願発明者らは、実験を進めるにつれて、また、上で論じたように、これを注意深く評価し続ける。更に、確かに、モノクローナル及びポリクローナル抗Ｄｓｇ３ ＩｇＧは、Ｄｓｇ３自己抗体産生Ｂ細胞に特異的なＣＡＡＲ Ｔ細胞のインビボでの死滅能力に対して有意な効果を有さないことが見出された４５。したがって、データだけでなく、抗Ｄｓｇ３ ＣＡＡＲ Ｔ細胞の有効性も、循環抗Ｄｓｇ３抗体が治療の効果を遮断しないことを示唆している。別の例は（現在のプロポーザルに直接的に類似していないが）、多発性骨髄腫患者におけるＢ細胞成熟抗原（B-cell maturation antigen、ＢＣＭＡ）ＣＡＲ Ｔ細胞の有効性であり、ほとんどの患者は、γ－セクレターゼによって引き起こされる排出に起因して、循環中に高レベルの可溶性ＢＣＭＡ抗原を有する８１。しかしながら、循環中に高レベルの可溶性ＢＣＭＡが存在するにもかかわらず、ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞を投与された患者は、顕著な応答を示しており、これは、ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞が、可溶性ＢＣＭＡの存在下であっても、特異性及び有効性を有しつつＢＣＭＡ＋多発性骨髄腫細胞を効率的に死滅させることができることを示唆している。全体として、これらの観察は、可溶性抗原（又は自己抗体）の存在が、標的細胞を死滅させるエフェクター細胞の活性を損なわないことを示す。これは、上で考察したように、相互作用の動的性質、重複しないエピトープ、及びエフェクター細胞と標的細胞との間のクラスター化効果に起因し得る。
【0210】
Ｆｃ媒介性アプローチの有効性を更に増加させるために、本願発明者らは、ＩＬ－２と融合したＤｓｇ３－Ｆｃを設計し、首尾よく発現させたが、これにより、より多くの細胞に結合し、死滅を増強することができる。これが有効性を増加させる場合、本願発明者らは、他のサイトカイン（例えば、ＩＬ－１５）も同様に調査することができる。陰性対照実験のために、抗Ｄｓｇ３抗体の発現を欠く細胞に加えて、代替法として、本願発明者らが同様に発現及び使用することができるＤｓｇ１－Ｆｃ融合体の合成のためのプラスミドを設計し、作製した。
【0211】
本願発明者らは、Ｄｓｇ１タンパク質について類似の構築物を生成することができる。Ｄｓｇ１及びＤｓｇ３は、粘膜の扁平層全体にわたって発現されるが、Ｄｓｇ３はＤｓｇ１よりも高レベルで発現される１、３、２３。皮膚では、Ｄｓｇ１は表皮全体に発現しているが、表層により多く存在している。Ｄｓｇ１とは対照的に、Ｄｓｇ３は、基底層及び傍基底層を含む表皮の下部でより強く発現され、表層ではより少ない程度で発現される。皮膚及び粘膜におけるこれらの異なる発現パターンの結果として、（ｉ）Ｄｓｇ３は、粘膜優位型の尋常性天疱瘡を有する患者において主要な病原性抗原として挙動し、この患者は、皮膚の関与がないか又は最小限である粘膜において深いびらんを発症する（Ｄｓｇ１が皮膚においてそれを補うことができるため）。全ての粘膜優位型ＰＶ患者が、高レベルの抗Ｄｓｇ３ ＩｇＧ自己抗体を有する３、２３。（ｉｉ）高レベルの抗Ｄｓｇ３及び抗Ｄｓｇ１ ＩｇＧ自己抗体を有する患者は、皮膚粘膜型の尋常性天疱瘡を発症し、粘膜及び皮膚において深いびらんを示す。また、（ｉｉｉ）落葉状天疱瘡（ＰＦ）を有する患者は、高レベルの抗Ｄｓｇ１自己反応性抗体のみを有し、粘膜の関与を伴わない表在性皮膚水疱のみを示し、これは、Ｄｓｇ１がＰＦにおける主要な病原性自己抗原であることを示唆している。本願発明者らは、粘膜優位型のＰＶを治療するために使用することができるＤｓｇ３－Ｆｃ融合タンパク質を開発し、特性評価することができる。本願発明者らは、Ｄｓｇ１について類似の構築物を同様に作製することができる。理論に束縛されることを望むものではないが、粘膜皮膚ＰＶを有する患者は、Ｄｓｇ３－ＦｃとＤｓｇ１－Ｆｃとの混合物で治療することができ、ＰＦを有する患者は、Ｄｓｇ１－Ｆｃで治療することができる。加えて、本願発明者らは、Ｆｃ部分におけるＣＨ３のヘテロ二量体化を可能にし、したがって、Ｄｓｇ１及びＤｓｇ３自己反応性病原性Ｂ細胞の両方を標的とすることができる、Ｄｓｇ３－Ｄｓｇ１－Ｆｃノブ－イントゥ－ホール構造８２（Ｄｓｇ３－ノブ＋Ｄｓｇ１－ホール）を生成することができる。
【0212】
追加の試験では、本願発明者らは、抗ＣＤ３ｅ単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）抗体断片に融合されたＤｓｇ３－ＥＣ１－３を作製し、これは、病原性自己反応性Ｂ細胞を標的とし、死滅させるようにＴ細胞を指向させ、結合させることができる（図１５のパネルＢ）。このアプローチは、潜在的なＦｃＲ飽和を回避することができ、病原性Ｂ細胞がＦｃ媒介性アプローチによる死滅に対して耐性である場合、このＴ細胞媒介性アプローチは、代替法を提供することができる。例えば、一部の患者は、遺伝子多型に起因してリツキシマブに対する耐性を示し、これは、抗体依存性細胞傷害性の減少をもたらす８３～８５。Ｄｓｇ３－抗ＣＤ３ｅ構築物は、理論に拘束されることを望むものではないが、標的抗Ｄｓｇ３ Ｂ細胞とＴ細胞との間の分子クラスター化及び免疫学的シナプスの形成を確立し、その結果、Ｔ細胞の活性化をもたらし５２、５３、標的化された抗Ｄｓｇ３ Ｂ細胞を特異的に死滅させ、他のＢ細胞を無傷なままに残す５２、５３、８６～８８。腫瘍学的用途とは異なり、サイトカイン放出症候群は、自己反応性Ｂ細胞の負荷が悪性クローンよりもはるかに低いことを考慮すると、自己免疫疾患の治療においては予想されない。したがって、Ｎ－Ｃ Ｄｓｇ３抗ＣＤ３ｅ融合プラスミドを、ｈＤｓｇ３－ＥＣ１－３及びＯＫＴ３抗ＣＤ３ｅ ｓｃＦｖのｃＤＮＡを含有するように設計した。ＯＫＴ３クローンは、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャの抗ＣＤ３ｅ部分として臨床で使用されており８９、そのため、本願発明者は、このクローンを選択する。注目すべきことに、ＣＤ３ｅは、全ての成熟Ｔリンパ球上に見出される。構築物は、他の二重特異性Ｔ細胞エンゲージャと同様に、Ｎ末端にＤｓｇ３及びＣ末端に抗ＣＤ３ｅ ｓｃＦｖを有するように設計された。更に、この構造は、最も病原性であるＤｓｇ３－ＥＣ１及びＥＣ２ドメインが、Ｄｓｇ３反応性Ｂ細胞による認識に利用可能であることを確実にする。他の二重特異性Ｔ細胞エンゲージャと同様に、可撓性（Ｇ４Ｓ）３スペーサ／リンカーをＤｓｇ３タンパク質とｓｃＦｖタンパク質との間に含めた。タンパク質を、ＨＥＫ２９３細胞を使用して発現させ、Ｎｉ－ＮＴＡビーズ及びサイズ排除クロマトグラフィーを介して精製し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、抗ＦＬＡＧウェスタンブロット及びフローサイトメトリー分析によって更に特性評価した。フローサイトメトリー分析は、融合タンパク質が、確立された抗Ｄｓｇ３ Ｂ細胞及びＣＤ３＋Ｊｕｒｋａｔ細胞（ヒトＴ細胞）に高い特異性及び親和性で結合するが、対照Ｎａｌｍ－６細胞には結合しないことを明らかにした（図１９）。本願発明者らは、既に１０ｍｇを超えるタンパク質を作製しており、必要に応じて更に作製する。
【0213】
インビボで抗Ｄｓｇ３自己反応性Ｂ細胞を標的とし、その死滅を媒介するＤｓｇ３－Ｆｃ融合タンパク質の有効性を試験すること。
【0214】
いくつかの実施形態では、Ｄｓｇ３－Ｆｃ構築物は、循環抗Ｄｓｇ３＋自己反応性Ｂ細胞の標的化された枯渇を媒介することができる。いくつかの実施形態では、自己抗体の存在は、標的化された枯渇に影響を及ぼさない。
【0215】
循環抗Ｄｓｇ３＋Ｂ細胞の特異的標的化及び枯渇に対するＤｓｇ３－Ｆｃ融合タンパク質のインビボ有効性を試験するために、抗ＤＳＧ発現ＰＶＢ－２８悪性細胞を免疫不全ＮＯＤ－ｓｃｉｄガンマ（NOD-scid gamma、ＮＳＧ）マウスに移植した。ＮＳＧマウスは、成熟Ｔ細胞、Ｂ細胞、及びＮＫ細胞を欠き、樹状細胞機能の低下、及びマクロファージ活性の欠損を示し、したがって、前臨床試験のための広範囲のヒト細胞の生着に広く使用されている。したがって、ＮＳＧマウスに、０日目に、ルシフェラーゼ陽性ＰＶＢ２８細胞（１×１０６個）を尾静脈を介して静脈内（ｉ．ｖ．）注射した。ＰＢＶ２８細胞投与前の－３、－２及び－１日目に、マウスを１６ｍｇ／ｋｇのＩＶＩＧ（腹腔内（ｉ．ｐ．）注射）で前治療して、ＦｃγＲを介した非特異的死滅を遮断した（すなわち、ＰＶＢ２８細胞の生着を増強した）。ｍＤｓｇ３－ｍＦｃ治療を治療群に投与し、４日目に開始して、ｉ．ｐ．注射を２週間にわたって週に３回、次いで週に１回行った。対照群にはアイソタイプＩｇＧ２ａを与えた。自己抗体群には、ＡＫ２３、ＡＫ１９及びＡＫ１８の混合物（１５０μｇ、ハイブリドーマからの抗Ｄｓｇ抗体）を治療開始の前日（すなわち、３日目）に開始して、全てのマウス（治療及び対照）に対して、週２回を２週間にわたって投与した。疾患の進行を生物発光イメージング（ＢＬＩ）によってモニタリングした。
【0216】
図２０のパネルＡは、自己抗体の存在下であっても、治療レシピエントマウスにおいて、より遅いシグナル増強を示すＢＬＩイメージングを示す。図２０のパネルＢは、生存率が、対照群と比較して両方の治療レシピエント群において有意に高い（Ｐ値＝０．００２３）ことを示す。また、自己抗体＋治療（Ａｕｔｏ－Ａｂｓ＋Ｔｘ）群の生存期間の中央値は３８日であり、これは治療群よりも高かった（生存期間の中央値＝３５日、Ｐ値＝０．０４８）。図２０のパネルＣは、エンドポイントでのフローサイトメトリー分析を示し、治療レシピエントマウスの骨髄におけるＰＢＶ２８細胞の完全な枯渇を示した（各群についてｎ＝５のデータの代表）。
【0217】
ＰＶマウスモデルにおける動物試験。このアプローチの有効性を下記の２つのＰＶマウスモデルで試験する。
【0218】
受動導入モデル。このモデルにおいて、本願発明者らは、ＡＫ２３抗体を注射することによって、受動モノクローナル天疱瘡マウス疾患モデルを開発することができ９１、これは、皮膚及び粘膜の両方において水疱の発生を引き起こすことが知られている２６。このマウスモデルは、ＰＶ患者において記載された主要な特徴を再現する２６。したがって、動物に２００μｇのＡＫ２３抗体を、治療の開始の２日前から開始して週に３回、治療の持続期間にわたって前注射するという違いのみを除き、上記で説明したものと同一の設定で実験を行うことができる。これにより、マウスが治療期間中、循環中に常に高い量の抗Ｄｓｇ３自己抗体を有することを確実にすることができる。この実験の目的は、治療の有効性に対する循環中の病原性抗Ｄｓｇ３自己抗体の存在の影響を描写することである。読み出しは、上記と同じＢＬＩ分析及び生存である。一旦確立されたら、同じ実験を繰り返すことができるが、今回は、ポリクローナル病原性Ｂ細胞（Ｆ７７９及びＰＶＢ２８の混合物）及びポリクローナル抗Ｄｓｇ３自己抗体（ＡＫ２３、Ｐ１Ｆ５、Ｐ３Ｆ３、Ｐ５Ｇ６、及びＰ５Ｄ４抗体の混合物、注射当たり２００μｇの総抗体、それぞれ４０μｇ）を注射することができる。これにより、治療がポリクローナル自己抗体及びポリクローナル病原性Ｄｓｇ３反応性Ｂ細胞の存在下でさえ有効なままであることを示すことができる。この設定は、ＰＶ患者における生理学的状態に似ている可能性がある。本願発明者らは、病原性抗体の注射後１週間に３回、血清抗Ｄｓｇ３力価（標準的なＥＬＩＳＡによる）及び皮膚疱疹（盲検化された研究者によって評価される）を分析することによって疾患の確立について試験することができる。理論に束縛されることを望むものではないが、マウスは、脱毛、体重減少を示す場合があり、かつ、表皮ケラチノサイトに結合する自己抗体を伴って、毛包及び口腔粘膜に水疱形成を有する場合がある（図２１のパネルＡ～Ｄ）９１、４８。ＢＬＩイメージングを使用して、上記と同様に、治療の死滅有効性をモニタリングすることができる。治療を受けないマウス（陰性対照）、及び治療を受けるが自己抗体を投与されないマウス（陽性対照；本願発明者らは、この設定においてほぼ完全な応答の治療結果を既に示している）の２セットの対照を使用することができる。
【0219】
能動導入モデル。受動疾患モデルには利点がある。しかしながら、治療は、急速に増殖する悪性細胞に打ち勝つべきであり、これはＰＶ患者の症例には当てはまらない可能性がある。したがって、第２のモデルとして、本願発明者らは、ヒト疾患の臨床表現型を厳密に模倣し、臨床的に起こるものに類似する自己反応性Ｄｓｇ３特異的Ｂ細胞の頻度が低く、最終的に高い血清ポリクローナル抗Ｄｓｇ３自己抗体レベルを有する、能動ＰＶ免疫モデルを使用することができる。このモデルでは、本願発明者らは、まず、Ｄｓｇ３－／－マウス（ＪＡＸ－００２９１１）をマウスＤｓｇ３の組換え細胞外ドメインで免疫付与し（既に産生され、手元にある）、続いて脾細胞をＲＡＧ２－／－マウスに導入することによって、能動ポリクローナル天疱瘡マウス疾患モデルを開発することができる９５～９７。導入された細胞は、病原性Ｄｓｇ３反応性Ｂ細胞を含み得るＢ細胞（及びＴ細胞）を含有する。文献で行われた観察と同様に９５、９６、９８、理論に束縛されることを望むものではないが、動物は、抑制された成長を有している可能性があり（図２１のパネルＥ）、基底上の棘細胞離開及び水疱を伴う皮膚粘膜びらんを発症する場合がある（図２１のパネルＦ～Ｈ）。臨床指標を評価するために、ＥＬＩＳＡを使用して、本願発明者らは、自己抗体レベルをＰＶ患者における生理学的レベル（３００～４００ＲＵ／ｍｌ）と比較することができる４８。Ｄｓｇ３反応性抗体がそのレベルに等しいか、又はそれを超える場合、これは３～４週間で起こり得る４２、４８が、上記と同じ設定を使用して治療を開始することができる（マウス１匹当たり２００μｇのｍＤｓｇ３－ｍＦｃ、週３回を２週間）。Ｄｓｇ３免疫付与Ｄｓｇ３＋／－動物由来の細胞の養子導入を対照として使用することができる９８（群当たり少なくともｎ＝１０匹のマウス）。
【0220】
治療の開始後５日目及び１４日目に測定された血清抗Ｄｓｇ３力価、皮膚びらんの盲検調査、ＩｇＧ沈着を検出するための粘膜試料の免疫蛍光、粘膜関門の組織学的評価、及び組織病理学の定量化を行って、アプローチの有効性を更に評価することができる。Ｂ細胞カウントも同様に実施して、それらが治療の間正常レベル内に維持されることを確実にすることができる。理論に束縛されることを望むものではないが、治療は、疾患の臨床的解決及び組織学的解決、意図された転帰をもたらすことができる。
【0221】
治療の安全性及びオフターゲット細胞傷害性相互作用がないことを更に確実にするために、本願発明者らは、初代ヒト細胞及びハイスループット膜プロテオームアレイを使用して毒性学スクリーニングを実施することができる。理論に束縛されることを望むものではないが、ＢＣＲ結合誘導性エンドサイトーシスは、本願発明者らの治療薬、例えば、他の受容体の共結合なしに抗Ｄｓｇ３ ＢＣＲのみに結合するＤｓｇ３－Ｆｃなどの「抗原」を用いて起こり得、したがって、低い速度のエンドサイトーシスを誘導する９９。加えて、インビトロ及びインビボでのデータは、Ｄｓｇ３－Ｆｃと抗Ｄｓｇ３ ＢＣＲとの結合が、Ｄｓｇ３を認識する自己反応性Ｂ細胞の標的化されたほぼ完全な死滅をもたらすことを裏付けている。したがって、現在の証拠に基づくと、抗ＢＣＲ結合誘導性エンドサイトーシス及び分解が起こる場合、それは臨床的意義を有することができない。加えて、Ｄｓｇ３を認識する自己反応性Ｂ細胞（本願発明者らの治療薬の標的）によって産生される抗体は、定義によれば、本願発明者らの治療薬を本質的に標的とする（Ｄｓｇ３－Ｆｃ）。したがって、本願発明者らは、有効性を減少させるリツキシマブ又は抗ＴＮＦ－アルファなどの他の治療薬において見られるような、及び上で詳細に議論されるような「中和抗体」の生成について心配していない。特に、非重複エピトープがどのようにして中和問題の克服に積極的に寄与し得るかについての本願発明者らの考察を参照されたい。
【0222】
能動疾患モデルでは、抗Ｄｓｇ３レベルは、長期寛解を試験するために週１回のＥＬＩＳＡによって測定することができる。マウスは、皮膚病変をチェックして疾患再発がないことを確実にするために、盲検研究者によって試験することができる。Ｆｃ媒介性アプローチは、リツキシマブと同様に、再発を示す場合があるが、理論に束縛されることを望むものではないが、再治療で応答可能である。興味深いことに、いくつかの試験は、複数サイクルのリツキシマブで数年間にわたって治療された患者の大部分が長期寛解を示すことを示している１００。しかしながら、リツキシマブは、患者の全Ｂ細胞プールを枯渇させ、反復注入は、Ｂ細胞の再増殖の遅延をもたらし得るので、それは感染のリスクを有し、新たな感染又はワクチン接種に対する体液性応答を消失させる。本明細書で開発されたＤｓｇ３－Ｆｃアプローチの標的化された性質は、いかなる主要な副作用の恐れもなく、複数サイクルでの連続治療としての使用を可能にする。例えば、最初の一連の治療が終わった後に、患者が寛解したとき、患者は、３ヶ月に１回（又は更に頻繁に）、１年又は更に長い間、再注射され得る。連続及び多サイクルのリツキシマブ治療に類似した機構では、これにより、全てのＤｓｇ３病原性Ｂ細胞が枯渇することを確実にすることができる。Ｄｓｇ３－Ｆｃアプローチは、正常なＢ細胞プールに影響を与えないので、理論に束縛されることを望むものではないが、数ヶ月にわたる患者へのその複数回の使用は、大きな問題に直面しないはずであり、したがって、長期寛解を可能にする。これは、抗ＣＤ２０生物製剤よりも有利である。したがって、本明細書中で提案されるように、自己反応性Ｂ細胞の完全な標的化枯渇は、長期から永続的な寛解をもたらし得る。
【0223】
本願発明者らは、治療の用量依存性及びその有効性が抗Ｄｓｇ３自己抗体力価の存在とどのように相関するかを（ＥＬＩＳＡを介して）調べることができる。生物製剤の広範な使用により、抗薬物抗体は、抗ＴＮＦα１０１からリツキシマブ１０２、１０３まで及ぶ複数の薬剤について報告されている。免疫複合体沈着などの主要な免疫有害事象が理論化されているが１０４、臨床診療では実現されていない。オマリズマブの場合のように、生物製剤が高循環抗体に結合する場合、高いＩｇＥレベルを有する患者への投薬は、免疫有害事象を生じなかった１０５。同様に、血清中の抗Ｄｓｇ３抗体の存在は、いかなる主要な免疫有害事象も引き起こさない。これは、本明細書で説明するようにモニタリングすることができる。能動ＰＶモデル実験のために、及び陽性対照として、本願発明者らは、抗ＣＤ２０ ＩｇＧ（クローンＳＡ２７１Ｇ２、動物当たり２５０μｇ）を使用して調査することができる。これがマウスにおいてＢ細胞を効果的に枯渇させることが示されてからである１０６。
【0224】
受動導入ＰＶモデル（モデル１）では、病原性抗体を注射する代替法として、ルシフェラーゼ陽性ＡＫ２３細胞のみをＮＳＧマウスに注射することができ４５、これは、その細胞が疾患を引き起こすことが知られている病原性抗Ｄｓｇ３抗体を産生するからである４５。読み出しは、本明細書で説明したのと同じＢＬＩである。
【0225】
Ｄｓｇ３－Ｆｃ治療が、免疫系を全体的に抑制しないことを確認するために、Ｄｓｇ３－Ｆｃによる治療後の能動ＰＶを有する動物（モデル２）を活動性ＬＣＭＶ－Ｃｌ１３（２×１０６ＰＦＵ、ｉ．ｖ．）により感染させることができる。Ｃ５７ＢＬ／６を陽性対照として使用した。感染マウスの肝臓及び血液中のウイルス負荷は、プラークアッセイを用いて注射後３０日目に比較することができる１０７～１０９。あるいは、治療後の急性感染のために、マウスを、リステリア・モノサイトゲネス（１０４～１０５ ＣＦＵ）で経口的に、又はＬＣＭＶ Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ（２×１０５ＰＦＵ）により腹腔内にチャレンジすることができる１１０～１１２。肝臓及び脾臓における微生物負荷を感染１０日後にチェックし、感染のみのマウスと比較することができる。いずれの実験においても、理論に拘束されることを望むものではないが、ウイルス負荷に差はない。
【0226】
ＢＣＲ－Ｔ細胞エンゲージャアプローチ（抗ＣＤ３に対するＤｓｇ３融合）は、本明細書で考察されるように、代替アプローチであり得る。これを達成するために、本願発明者らは、Ｄｓｇ３抗ＣＤ３ｅ融合タンパク質を作製し、本明細書において考察されるようにそれを特性評価した。この種類の分子に関する臨床的問題は、それらのサイズが小さいことに起因して、それらが最適なインビボ薬物動態特性よりも少ない場合があることである１１３（短い半減期、ｔ１／２が約０．６時間）。この問題を解決するために、本願発明者らは、一方のアーム上にＤｓｇ３外部ドメインを有し、他方のアーム上に抗ＣＤ３ ｓｃＦｖを有する二重特異性抗体構築物を開発することができる。本願発明者らは、ノブ－イントゥ－ホールアプローチを使用して、２つの異なる標的化剤を１つの抗体構造に結合させる一方で、ＬＡＬＡ変異を使用してマクロファージ動員がないことを確実にすることができる１１４。この構造は、Ｆｃ領域に起因する高い薬物動態学的特性、並びにより良好な発現、安定性、及び臨床適用性を確実にすることができる。
【0227】
本明細書中で議論される実施されたインビボ実験について、本願発明者らは、雄マウス及び雌マウスの両方を使用し、対照群又は治療群のいずれかにおいて性別間に差異は観察されなかった（例えば、合計ｎ＝２７のＮＳＧマウスが、各実験に無作為に割り当てられた８匹の雄及び１９匹の雌で、インビボ試験のために使用された）。性別にかかわらず、対照マウスは、増加したＢＬＩシグナルを示し、約３０日目までに安楽死させなければならなかったが、治療マウスは、エンドポイントで約１００％の抗原喪失を示したか、又は完全な応答を示し、検出可能なＢＬＩシグナルを伴わずに健康であり続けた（ＰＶＢ２８実験について）（図２０Ａ～図Ｃ）。本願発明者らは、実験において両方の性別を使用し続け、本願発明者らが観察し得る任意の差異を、特に能動ＰＶモデルについてモニタリングする。
【0228】
方法。クローニング、タンパク質産生及び特性決定、ウェスタンブロット、フローサイトメトリー及びＥＬＩＳＡ分析、及び動物ＢＬＩイメージングを、標準的な実験室アプローチに従って実施した。インビトロ及びインビボでの有効性評価実験を上記で説明したように行った。ＰＶ受動モデル及び能動モデルの開発に関する詳細については、脊椎動物のセクションを参照されたい。
【0229】
この実施例で引用されている参考文献
【0230】
実施例８
マウスにおける天疱瘡疾患の動物モデルは、公知である（本明細書において考察される）。実験において、本明細書に開示される治療薬は、マウスにおける疾患に対するそれらの効果を決定するために、これらのマウスに投与された（例えば、実施例７）。これらの実験からのデータは、治療薬が有効であることを示す。このような更なる試験は、この実施例に記載される。
マウスにおける天疱瘡疾患の動物モデルは、公知である（本明細書において考察される）。実験において、本明細書に開示される治療薬は、マウスにおける疾患に対するそれらの効果を決定するために、これらのマウスに投与された（例えば、実施例７）。これらの実験からのデータは、治療薬が有効であることを示す。このような更なる試験は、この実施例に記載される。
【0231】
図２２のパネルＡ～Ｄは、有効性を示し、また、自己抗体の存在下であっても、免疫応答性マウスにおいて治療がサイトカインストームも毒性も生じさせないことも示す。治療（ｍＤｓｇ３－ＥＣ１４－ｍＦｃ）及び／又は自己抗体の混合物（ＡＫ２３、ＡＫ１９、ＡＫ１８）をマウスに注射するためのスケジュールをパネルＡに示す。パネルＢ及びＣでは、自己抗体を伴うか、又は伴わない治療レシピエントマウスは、毒性が観察されることなく、正常な体重増加を続けることが示される（各群についてｎ＝６、３匹の雄及び３匹の雌）。パネルＤは、ＥＬＩＳＡ分析が、治療単独、又は自己抗体のみ、又は自己抗体及び治療の両方（ＥＬＩＳＡ ＭＡＸ（商標）Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｓｅｔ Ｍｏｕｓｅ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）を使用して）のいずれかを受けた３つの群のいずれかにおいて、サイトカインストームを示さなかった。何も投与されなかった６匹のマウスからの血清を、それぞれの性別において健康な対照のために使用した。２ｍｇ／ｋｇのリポ多糖（ＬＰＳ）を受けた３匹のマウスからの試料を使用して、それぞれの性別におけるサイトカインストームを模倣した。対応のないｔ検定を使用して、群間の有意差について検定した。（ｎｓ、Ｐ＞０．０５；＊、Ｐ≦０．０５；＊＊、Ｐ≦０．０１；＊＊＊、Ｐ≦０．００１；＊＊＊＊、Ｐ≦０．０００１。）
【0232】
図２３のパネルＡ～Ｅは、治療（ｍＤｓｇ３－ＥＣ１－４－ｍＦｃ）がＡＫ２３抗体の病原性効果を阻害することを示す。全ての動物は、ＡＫ２３（１２ｍｇ／ｋｇ、皮下）を投与された。ＡＫ２３＋治療コホートは、１時間後にｍＤｓｇ３－ｍＦｃを受けた（１５ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）。パネルＡ及びＢは、ＡＫ２３群が、７２時間後に行われたテープストリッピングによって有意な脱毛を示し（パネルＡ）、５日目に重度のＰＶ表現型を示した（すなわち、脱毛及び粘膜びらん（図示せず））（パネルＢ）ことを示す。しかしながら、「ＡＫ２３＋治療」群は、対照健常マウスと同様であった（パネルＡ及びＢ）。各コホートについてｎ＝３のデータの代表。パネルＣは、ＡＫ２３コホートが体重減少を示したことを示す。しかしながら、体重増加は、ＡＫ２３及び治療を受けたマウスにおいて正常であった。パネルＤは、７２時間時点で採取された血清に対するＩＬ６のＥＬＩＳＡ分析が、ＡＫ２３コホートにおいて高レベルのサイトカインを示したが、「ＡＫ２３＋治療」群において、健常対照と同様であったことを示す。パネルＥは、実験の生存分析を示す。全てのＡＫ２３マウスは、重度のＰＶを発症し、７日未満で安楽死させなければならなかった。全ての治療マウスは正常に行動し、生存している（各コホートについてｎ＝３）。
【0233】
同等物
当業者であれば、ルーチンの実験以上のものを使用せずに、本明細書に具体的に記載された特定の物質及び手順に対する多数の同等物を認識するであろう、又は確認できるであろう。このような同等物は、本発明の範囲内であると考えられる。
当業者であれば、ルーチンの実験以上のものを使用せずに、本明細書に具体的に記載された特定の物質及び手順に対する多数の同等物を認識するであろう、又は確認できるであろう。このような同等物は、本発明の範囲内であると考えられる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16-1】
【図16-2】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【国際調査報告】