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▶ フラッグシップ パイオニアリング イノベーションズ シックス，エルエルシーの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-12-26
(54)【発明の名称】変性条件下での環状ＲＮＡの濃縮方法
(51)【国際特許分類】
C07H 21/02 20060101AFI20241219BHJP
C12P 1/00 20060101ALI20241219BHJP
C12P 19/34 20060101ALI20241219BHJP
【ＦＩ】
C07H21/02
C12P1/00 A
C12P19/34 A
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024535432
(86)(22)【出願日】2022-12-16
(85)【翻訳文提出日】2024-08-05
(86)【国際出願番号】 US2022081826
(87)【国際公開番号】W WO2023115013
(87)【国際公開日】2023-06-22
(31)【優先権主張番号】63/291,185
(32)【優先日】2021-12-17
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】520445473
【氏名又は名称】フラッグシップ パイオニアリング イノベーションズ シックス，エルエルシー
(74)【代理人】
【識別番号】100078282
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 秀策
(74)【代理人】
【識別番号】100113413
【弁理士】
【氏名又は名称】森下 夏樹
(74)【代理人】
【識別番号】100181674
【弁理士】
【氏名又は名称】飯田 貴敏
(74)【代理人】
【識別番号】100181641
【弁理士】
【氏名又は名称】石川 大輔
(74)【代理人】
【識別番号】230113332
【弁護士】
【氏名又は名称】山本 健策
(72)【発明者】
【氏名】デ ブール， アレクサンドラ ソフィー
(72)【発明者】
【氏名】プラギス， ニコラス マッカートニー
(72)【発明者】
【氏名】クーラ， アンソニー ジョゼフ
(72)【発明者】
【氏名】ファーブ， ジョシュア ネイサン
(72)【発明者】
【氏名】マンヴァール， ディネシュクマール
(72)【発明者】
【氏名】ミスラ， トゥーシャー カンティ
(72)【発明者】
【氏名】ネルソン， ジェニファー エー．
【テーマコード（参考）】
4B064
4C057
【Ｆターム（参考）】
4B064AF27
4B064CA21
4B064CB01
4B064CC30
4B064CE10
4B064CE11
4B064CE12
4B064CE14
4B064CE20
4B064DA01
4C057AA04
4C057BB02
4C057CC01
4C057DD01
4C057MM01
4C057MM02
(57)【要約】
本開示は、例えば、ｃｉｒｃＲＮＡ及び線状ポリリボヌクレオチド（ｌｉｎＲＮＡ）を含むポリリボヌクレオチドの集団からの、環状ポリリボヌクレオチド（ｃｉｒｃＲＮＡ）の濃縮のための方法であって、濃縮が変性条件下で行われる方法に関する。また、変性条件下の溶液中にｃｉｒｃＲＮＡ及びｌｉｎＲＮＡを含むポリリボヌクレオチドの集団を含む組成物も開示される。さらに本開示の範囲には、組成物を１つ又は複数の変性条件に曝露することによって製造された組成物などの、ｃｉｒｃＲＮＡの濃縮集団を含む組成物も包含される。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
環状ポリリボヌクレオチド（ｃｉｒｃＲＮＡ）の濃縮集団を生産するための方法であって、前記方法が、以下：（ａ）ｃｉｒｃＲＮＡ及び線状ポリリボヌクレオチド（ｌｉｎＲＮＡ）を含むポリリボヌクレオチドの集団を含むサンプルを用意するステップと；
（ｂ）ゲル電気泳動の使用を含まない変性条件下で、前記ｌｉｎＲＮＡから前記ｃｉｒｃＲＮＡを分離し、それによって、１，０００以下のヌクレオチドの長さを含むｃｉｒｃＲＮＡの濃縮集団を生産するステップと、
を含む方法。
【請求項2】
ｃｉｒｃＲＮＡの濃縮集団を生産するための方法であって、前記方法が、以下：（ａ）ｃｉｒｃＲＮＡ及びｌｉｎＲＮＡを含むポリリボヌクレオチドの集団を含むサンプルを用意するステップであって、前記ｃｉｒｃＲＮＡが、１，０００以下のヌクレオチドの長さを含むステップと；
（ｂ）ポリリボヌクレオチドの前記集団を変性条件に曝露し、それによって、ｃｉｒｃＲＮＡの前記集団を濃縮するステップと、
を含む方法。
【請求項3】
（ｉ）ポリリボヌクレオチドの前記集団中の前記ポリリボヌクレオチドの総重量が、少なくとも１μｇであり；（ｉｉ）ポリリボヌクレオチドの前記集団を含む前記サンプルの総量が、少なくとも５００μＬであるか；又は
（ｉｉｉ）前記サンプル中のポリリボヌクレオチドの前記集団の濃度が、少なくとも２００ｎｇ／μＬである、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項4】
前記分離ステップ（ｂ）が、ゲル電気泳動の使用を含まない変性条件下で実施され；及び／或いは前記ｃｉｒｃＲＮＡの濃縮集団が、１種若しくは複数種の不純物又は副産物を実質的に含まず、前記１種若しくは複数種の不純物又は副産物が、ポリアクリルアミド、ホウ酸、マグネシウム、又はエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を含む、請求項２又は３に記載の方法。
【請求項5】
前記変性条件が、少なくとも５０℃を含むか；又は前記変性条件が、少なくとも５０℃の温度、続いて３０秒以下の時間内に８℃以下の温度を含む、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項6】
前記変性条件が、５未満のｐＨ又は９を超えるｐＨを含む、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項7】
前記変性条件が、酸、塩基、有機溶媒、カオトロピック剤、クラウディング剤、キレート剤、デタージェント、又は塩溶液による処理を含む化学処理を含む、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項8】
前記酸が、１ｍＭ～５００ｍＭの酢酸、塩酸、サリチル酸、リン酸、ホウ酸、ギ酸、シュウ酸、クエン酸、安息香酸、モノクロロ酢酸、ジクロロ酢酸、トリクロロ酢酸、アスコルビン酸、又は硝酸を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項9】
前記塩基が、１ｍＭ～５００ｍＭの水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、イミダゾール、ヒスチジン、炭酸水素ナトリウム、グアニジン、又はトリエチルアミンを含む、請求項７又は８に記載の方法。
【請求項10】
前記有機溶媒が、少なくとも０．１％（ｖ／ｖ）のジメチルスルホキシド、酢酸トリエチルアンモニウム、メタノール、エタノール、２－プロパノール、イソプロパノール、１－ブタノール、２－ブタノール、ｔ－ブタノール、イソブタノール、フェノール、クロロホルム、ヘキサン、アセトニトリル、ホルムアミド、アセトン、デナトニウム、又はプロピレングリコールを含む、請求項７～９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項11】
前記カオトロピック剤が、１００ｍＭ～８Ｍの尿素、塩化グアニジニウム、過塩素酸リチウム、若しくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含み；及び／又は前記カオトロピック剤が、１００ｍＭ～８Ｍのｎ－ドデシルβ－ｄ－マルトシド、ｎ－オクチルグルコシド、ＣＨＡＰＳ、若しくはデオキシコール酸塩を含む、請求項７～１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項12】
前記クラウディング剤が、１００ｍＭ～８ＭのＰＥＧ、又は尿素を含む、請求項７～１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項13】
前記キレート剤が、１ｍＭ～１０ｍＭのエチレングリコール－ビス（β－アミノエチルエーテル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラ酢酸（ＥＧＴＡ）若しくはその誘導体、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）若しくはその誘導体、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、イミノジコハク酸（ＩＤＳ）、ポリアスパラギン酸、Ｓ，Ｓ－エチレンジアミン－Ｎ，Ｎ’－ジコハク酸（ＥＤＤＳ）、又はメチルグリシン二酢酸（ＭＧＤＡ）を含む、請求項７～１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項14】
前記デタージェントが、０．００５％～０．０５％（ｖ／ｖ）のノニデット（登録商標）（Ｎｏｎｉｄｅｔ）Ｐ－４０（ＮＰ４０）、ＣＨＡＰＳ、オクチルβ－Ｄ－グルコピラノシド、ｎ－ドデシルβ－ｄ－マルトシド、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）－２０、又はＴｗｅｅｎ（登録商標）－８０を含む、請求項７～１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項15】
ステップ（ｂ）が、ポリリボヌクレオチドの前記集団に対してカラムクロマトグラフィーを実施することを含み、カラムクロマトグラフィーを実施することは、平衡化ステップ、サンプルロードステップ、カラム洗浄ステップ、及び溶離ステップを含み、前記分離することが平衡化ステップ、サンプルロードステップ、カラム洗浄ステップの間、及び／又は溶離ステップの間に行われる、請求項１～１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項16】
前記カラムクロマトグラフィーが、高速タンパク質液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）、高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）、陰イオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＣ）、混合モードクロマトグラフィー、又はアフィニティークロマトグラフィーを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項17】
前記ＡＥＣが、以下：（ｉ）陰イオン交換樹脂の使用であって、前記陰イオン交換樹脂は、スチレン－ジビニルベンゼン、シリカ、セファロース、セルロース、デキストラン、エポキシポリアミン、メタクリレート、アガロース、及びアクリルからなる群から選択され；及び／又は前記陰イオン交換樹脂は、第４級アンモニウム、アミノエチル、ジエチルアミノエチル、又はジエチルアミノプロピルからなる群から選択されるイオン交換体を含み；及び／又は前記陰イオン交換樹脂はビーズを含み、前記ビーズは、４５～１６５μｍのビーズ径及び直径１００～１０００ｎｍの孔径を有する、使用；並びに／或いは
（ｉｉ）線形グラジエント溶離又はステップイソクラティック溶離の使用；並びに／或いは
（ｉｉ）１ｍＬ／分～１５０ｍＬ／分の流量の使用
を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項18】
ステップ（ｂ）が、精製ｃｉｒｃＲＮＡの複数の画分をプールすることによって実施される、請求項１～１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項19】
前記ｃｉｒｃＲＮＡ及びｌｉｎＲＮＡが、同じリボヌクレオチド配列を有し；及び／又は前記ｃｉｒｃＲＮＡ及びｌｉｎＲＮＡが、同じ質量を有し；及び／又は前記ｃｉｒｃＲＮＡ及びｌｉｎＲＮＡが、ポリ（Ａ）テールを欠いている、請求項１～１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項20】
前記方法が、前記ｌｉｎＲＮＡのエキソヌクレアーゼ消化を含むか、又は前記方法が、前記ｌｉｎＲＮＡのエキソヌクレアーゼ消化を含まず；及び／又は前記方法が、前記ｃｉｒｃＲＮＡの濃縮を改善する、前記ｃｉｒｃＲＮＡ又は前記ｌｉｎＲＮＡに対する選択的修飾を含まない、請求項１～１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項21】
前記ｃｉｒｃＲＮＡの濃縮集団中の前記ｃｉｒｃＲＮＡのパーセント（ｗ／ｗ）が、前記ポリリボヌクレオチド集団中の前記ｃｉｒｃＲＮＡのパーセント（ｗ／ｗ）の２倍であり；及び／又は前記ｃｉｒｃＲＮＡの濃縮集団中の前記ｃｉｒｃＲＮＡのパーセント（ｗ／ｗ）が、少なくとも６５％であり；及び／又は前記ｃｉｒｃＲＮＡの濃縮集団中の前記ｌｉｎＲＮＡのパーセント（ｗ／ｗ）が、３５％未満である、請求項１～２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項22】
ｃｉｒｃＲＮＡ及びｌｉｎＲＮＡを含むポリリボヌクレオチドの集団を含む組成物であって、前記ｃｉｒｃＲＮＡは、約１，０００ヌクレオチド以下の長さを含み、ポリリボヌクレオチドの前記集団が、変性条件下の溶液中にあり； （ｉ）前記ポリリボヌクレオチドの前記集団中のポリリボヌクレオチドの総重量が、少なくとも１μｇであり；
（ｉｉ）ポリリボヌクレオチドの前記集団を含む前記サンプルの総量が、少なくとも５００μＬであるか；又は
（ｉｉｉ）前記サンプル中のポリリボヌクレオチドの前記集団の濃度が、少なくとも５００ｎｇ／μＬである、組成物。
【請求項23】
ｃｉｒｃＲＮＡの濃縮集団を含む組成物であって、（ａ）前記組成物が、ｃｉｒｃＲＮＡ及びｌｉｎＲＮＡを含むポリリボヌクレオチドの集団を含むサンプルから取得され、前記ｃｉｒｃＲＮＡは、約１，０００ヌクレオチド以下の長さを含み；
（ｂ）前記組成物が、１つ若しくは複数の変性条件に曝露されており；
（ｃ）前記組成物が、１種若しくは複数種の不純物又は副産物を実質的に含まない、組成物。
【請求項24】
前記１種若しくは複数種の不純物又は副産物が、ポリアクリルアミド、ホウ酸、マグネシウム、又はＥＤＴＡを含む、請求項２２又は２３に記載の組成物。
【請求項25】
前記変性条件が、少なくとも５０℃の温度を含むか；又は前記変性条件が、少なくとも５０℃の温度、続いて８℃以下の温度を含む、請求項２２～２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項26】
前記変性条件が、５未満のｐＨ又は９を超えるｐＨを含む、請求項２２～２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項27】
前記変性条件が、酸、塩基、有機溶媒、カオトロピック剤、クラウディング剤、キレート剤、デタージェント、又は塩溶液による処理を含む化学処理を含む、請求項２２～２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項28】
前記酸が、１ｍＭ～５００ｍＭの酢酸、塩酸、サリチル酸、リン酸、ホウ酸、ギ酸、シュウ酸、クエン酸、安息香酸、モノクロロ酢酸、ジクロロ酢酸、トリクロロ酢酸、アスコルビン酸、又は硝酸を含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項29】
前記塩基が、１ｍＭ～５００ｍＭの水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、イミダゾール、ヒスチジン、炭酸水素ナトリウム、グアニジン、又はトリエチルアミンを含む、請求項２７又は２８に記載の方法。
【請求項30】
前記有機溶媒が、少なくとも０．１％（ｖ／ｖ）のジメチルスルホキシド、酢酸トリエチルアンモニウム、メタノール、エタノール、２－プロパノール、イソプロパノール、１－ブタノール、２－ブタノール、ｔ－ブタノール、イソブタノール、フェノール、クロロホルム、ヘキサン、アセトニトリル、ホルムアミド、アセトン、デナトニウム、又はプロピレングリコールを含む、請求項２７～２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項31】
前記カオトロピック剤が、１００ｍＭ～８Ｍの尿素、塩化グアニジニウム、過塩素酸リチウム、若しくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含み；及び／又は前記カオトロピック剤が、１００ｍＭ～８Ｍのｎ－ドデシルβ－ｄ－マルトシド、ｎ－オクチルグルコシド、ＣＨＡＰＳ、若しくはデオキシコール酸塩を含む、請求項２７～３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項32】
前記クラウディング剤が、１００ｍＭ～８Ｍのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、又は尿素を含む、請求項２７～３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項33】
前記キレート剤が、１ｍＭ～１０ｍＭのＥＧＴＡ若しくはその誘導体、ＥＤＴＡ若しくはその誘導体、ＮＴＡ、ＩＤＳ、ＥＤＤＳ、又はＭＧＤＡを含む、請求項２７～３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項34】
前記デタージェントが、０．００５％～０．０５％（ｖ／ｖ）のＮＰ４０、ＣＨＡＰＳ、オクチルβ－Ｄ－グルコピラノシド、ｎ－ドデシルβ－ｄ－マルトシド、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）－２０、又はＴｗｅｅｎ（登録商標）－８０を含む、請求項２７～３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項35】
前記ｃｉｒｃＲＮＡの濃縮集団中の前記ｃｉｒｃＲＮＡのパーセント（ｗ／ｗ）が、前記ポリリボヌクレオチド集団中の前記ｃｉｒｃＲＮＡのパーセント（ｗ／ｗ）の２倍であり；及び／又は前記ｃｉｒｃＲＮＡの濃縮集団中の前記ｃｉｒｃＲＮＡのパーセント（ｗ／ｗ）が、少なくとも６５％であり；及び／又は前記ｃｉｒｃＲＮＡの濃縮集団中の前記ｌｉｎＲＮＡのパーセント（ｗ／ｗ）が、３５％未満である、請求項２２～３４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項36】
前記ｃｉｒｃＲＮＡ及び前記ｌｉｎＲＮＡが、同じリボヌクレオチド配列を有し；及び／又は前記ｃｉｒｃＲＮＡ及び前記ｌｉｎＲＮＡが、同じ質量を有し；及び／又は前記ｃｉｒｃＲＮＡ及び前記ｌｉｎＲＮＡが、ポリ（Ａ）テールを欠いている、請求項２２～３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項37】
ｃｉｒｃＲＮＡの純度を決定する方法であって、前記方法が、以下：（ａ）ｃｉｒｃＲＮＡ及びｌｉｎＲＮＡを含むポリリボヌクレオチドの集団を含むサンプルを用意するステップであって、前記ｃｉｒｃＲＮＡは１，０００ヌクレオチド以下の長さを含む、ステップと；
（ｂ）クロマトグラフィーにより、変性条件下で前記ｃｉｒｃＲＮＡを前記ｌｉｎＲＮＡから分離するステップと；
（ｃ）前記ｃｉｒｃＲＮＡのピーク及び前記ｌｉｎＲＮＡのピークを含む前記サンプルのクロマトグラムを収集するステップと；
（ｄ）各ピーク下の面積を計算して、前記サンプル中の前記ｃｉｒｃＲＮＡの純度を決定するステップと、
を含む方法。
【請求項38】
前記変性条件が、ゲル電気泳動の使用を含まない、請求項３７に記載の方法。
【請求項39】
前記変性条件が、少なくとも５０℃の温度を含むか；又は、前記変性条件が、少なくとも５０℃の温度、続いて３０秒以下の時間内に８℃以下の温度を含む、請求項３７又は３８に記載の方法。
【請求項40】
前記変性条件が、５未満のｐＨ又は９を超えるｐＨを含む、請求項３７～３９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項41】
前記変性条件が、酸、塩基、有機溶媒、カオトロピック剤、クラウディング剤、キレート剤、デタージェント、又は塩溶液による処理を含む化学処理を含む、請求項３７～４０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項42】
前記酸が、１ｍＭ～５００ｍＭの酢酸、塩酸、サリチル酸、リン酸、ホウ酸、ギ酸、シュウ酸、クエン酸、安息香酸、モノクロロ酢酸、ジクロロ酢酸、トリクロロ酢酸、アスコルビン酸、又は硝酸を含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項43】
前記塩基が、１ｍＭ～５００ｍＭの水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、イミダゾール、ヒスチジン、炭酸水素ナトリウム、グアニジン、又はトリエチルアミンを含む、請求項４１又は４２に記載の方法。
【請求項44】
前記有機溶媒が、少なくとも０．１％（ｖ／ｖ）のジメチルスルホキシド、酢酸トリエチルアンモニウム、メタノール、エタノール、２－プロパノール、イソプロパノール、１－ブタノール、２－ブタノール、ｔ－ブタノール、イソブタノール、フェノール、クロロホルム、ヘキサン、アセトニトリル、ホルムアミド、アセトン、デナトニウム、又はプロピレングリコールを含む、請求項４１～４３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項45】
前記カオトロピック剤が、１００ｍＭ～８Ｍの尿素、塩化グアニジニウム、過塩素酸リチウム、若しくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含み；及び／又は前記カオトロピック剤が、１００ｍＭ～８Ｍのｎ－ドデシルβ－ｄ－マルトシド、ｎ－オクチルグルコシド、ＣＨＡＰＳ、若しくはデオキシコール酸塩を含む、請求項４１～４４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項46】
前記クラウディング剤が、１００ｍＭ～８Ｍのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、又は尿素を含む、請求項４１～４５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項47】
前記キレート剤が、１ｍＭ～１０ｍＭのＥＧＴＡ若しくはその誘導体、ＥＤＴＡ若しくはその誘導体、ＮＴＡ、ＩＤＳ、ポリアスパラギン酸、ＥＤＤＳ、又はＭＧＤＡを含む、請求項４１～４６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項48】
前記デタージェントが、０．００５％～０．０５％（ｖ／ｖ）のノニデット（登録商標）（Ｎｏｎｉｄｅｔ）Ｐ－４０（ＮＰ４０）、ＣＨＡＰＳ、オクチルβ－Ｄ－グルコピラノシド、ｎ－ドデシルβ－ｄ－マルトシド、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）－２０、又はＴｗｅｅｎ（登録商標）－８０を含む、請求項４１～４７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項49】
前記クロマトグラフィーが、液体クロマトグラフィーを含み、前記液体クロマトグラフィーは、ＦＰＬＣ、ＨＰＬＣ、ＨＩＣ、ＡＥＣ、ＭＭＣ、又はアフィニティークロマトグラフィーからなる群から選択される、請求項３７～４８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項50】
前記純度の相対標準偏差（ＲＳＤ）が、５％未満である、実施形３７～４９のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【0001】
ポリリボヌクレオチドは、種々の治療及び改変適用に有用である。したがって、ポリリボヌクレオチドを分離及び精製するための新しい組成物及び方法が有用である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0002】
本開示は、概して、例えば、ｃｉｒｃＲＮＡ及び線状ポリリボヌクレオチド（ｌｉｎＲＮＡ）を含むポリリボヌクレオチドの集団からの、環状ポリリボヌクレオチド（ｃｉｒｃＲＮＡ）の濃縮のための方法であって、濃縮が変性条件下で行われる方法に関する。また、変性条件下の溶液中にｃｉｒｃＲＮＡ及びｌｉｎＲＮＡを含むポリリボヌクレオチドの集団を含む組成物も開示される。さらに本開示の範囲には、ｃｉｒｃＲＮＡの濃縮集団を含む組成物、例えば、組成物を１つ又は複数の変性条件に曝露することによって製造された組成物なども包含される。本開示は、部分的には、変性条件下（例えば、熱変性、ｐＨ、又は化学処理）でのｃｉｒｃＲＮＡの分離が、ｃｉｒｃＲＮＡ、ｌｉｎＲＮＡ、又は他の不純物若しくは副産物を含む混合ポリリボヌクレオチドの集団からｃｉｒｃＲＮＡを精製及び濃縮するための頑健な方法であるという本発明者らの発見に基づく。さらに、開示された方法は、ｃｉｒｃＲＮＡ精製プロセスのスケールアップを容易にし、それによって、大量のｃｉｒｃＲＮＡの生産及び精製が可能になる。
【0003】
一態様において、本開示は、ｃｉｒｃＲＮＡの濃縮集団を生産するための方法を提供し、この方法は、以下：（ａ）ｃｉｒｃＲＮＡ及びｌｉｎＲＮＡを含むポリリボヌクレオチドの集団を含むサンプルを用意するステップと；（ｂ）ゲル電気泳動の使用を含まない変性条件下で、ｌｉｎＲＮＡからｃｉｒｃＲＮＡを分離し、それによってｃｉｒｃＲＮＡの濃縮集団を生産するステップと、を含む。また、上述の条件下でｌｉｎＲＮＡの集団からｃｉｒｃＲＮＡの集団を分離する方法も企図され、これは、任意選択で、ｃｉｒｃＲＮＡの集団を定量するステップ及び／又はｌｉｎＲＮＡの集団を定量するステップをさらに含む。
【0004】
一態様において、本開示は、ｃｉｒｃＲＮＡの濃縮集団を生産するための方法を提供し、この方法は、以下：（ａ）ｃｉｒｃＲＮＡ及びｌｉｎＲＮＡを含むポリリボヌクレオチドの集団を含むサンプルを用意するステップと；（ｂ）ポリリボヌクレオチドの集団を変性条件に曝露し、それによって、ｃｉｒｃＲＮＡの集団を濃縮するステップと、を含む。また、上記の条件下で、ｃｉｒｃＲＮＡの集団をｌｉｎＲＮＡの集団から分離する方法も企図され、これは、任意選択で、ｃｉｒｃＲＮＡの集団を定量するステップ及び／又はｌｉｎＲＮＡの集団を定量するステップをさらに含む。
【0005】
いくつかの実施形態では、（ｉ）ポリリボヌクレオチドの集団中のポリリボヌクレオチドの総重量は、少なくとも１μｇ（例えば、少なくとも５μｇ、少なくとも１０、少なくとも２５μｇ、少なくとも５０μｇ、少なくとも１００μｇ、少なくとも２５０μｇ、少なくとも５００μｇ、少なくとも７５０μｇ、少なくとも１ｍｇ、５ｍｇ、１０ｍｇ、１００ｍｇ、若しくは１ｇ；又は５μｇ～１００μｇ、５μｇ～５００μｇ、５μｇ～１ｍｇ、５μｇ～１０ｍｇ、５００μｇ～１００ｍｇ、５００μｇ～１ｇ、５００μｇ～１０ｇ、１００ｍｇ～１ｇ、若しくは１ｇ～１０ｇ）であり；（ｉｉ）ポリリボヌクレオチドの集団を含むサンプルの総量は、少なくとも５００μＬ（例えば、少なくとも１ｍＬ、５ｍＬ、１０ｍＬ、１００ｍＬ、若しくは１Ｌ；又は５００μＬ～１００ｍＬ、５００μＬ～１Ｌ、５００μＬ～１０Ｌ、若しくは１Ｌ～１０Ｌ）であり；又は（ｉｉｉ）サンプル中のポリリボヌクレオチドの集団の濃度は、少なくとも２００ｎｇ／μＬ（例えば、少なくとも５００ｎｇ／μＬ、１ｍｇ／ｍＬ、５ｍｇ／ｍＬ、１０ｍｇ／ｍＬ、若しくは５０ｍｇ／ｍＬ；又は２００ｎｇ／μＬ～１００ｍｇ／ｍＬ、２００ｎｇ／μＬ～５０ｍｇ／ｍＬ、若しくは１ｍｇ／ｍＬ～５０ｍｇ／ｍＬ）である。いくつかの実施形態では、ｃｉｒｃＲＮＡは、約１００ヌクレオチド～約２０，０００ヌクレオチド（例えば、約１００ヌクレオチド～約５００ヌクレオチド、約１００ヌクレオチド～約７５０ヌクレオチド、約１００ヌクレオチド～約１，０００ヌクレオチド、約１００ヌクレオチド～約２，５００ヌクレオチド、約１００ヌクレオチド～約５，０００ヌクレオチド、約１００ヌクレオチド～約１０，０００ヌクレオチド、約５００ヌクレオチド～約７５０ヌクレオチド、約７５０ヌクレオチド～約１，０００ヌクレオチド、約７５０ヌクレオチド～約１，２５０ヌクレオチド、約１，０００ヌクレオチド～約１，２５０ヌクレオチド、約１，０００ヌクレオチド～約２，０００ヌクレオチド、約１，０００ヌクレオチド～約５，０００ヌクレオチド、約２，５００ヌクレオチド～約５，０００ヌクレオチド、約５，０００ヌクレオチド～約１０，０００ヌクレオチド、約５，０００ヌクレオチド～約１５，０００ヌクレオチド、約１０，０００ヌクレオチド～約１５，０００ヌクレオチド、約１５，０００ヌクレオチド～約２０，０００ヌクレオチド、約１００ヌクレオチド、約２００ヌクレオチド、約３００ヌクレオチド、約４００ヌクレオチド、約５００ヌクレオチド、約６００ヌクレオチド、約７００ヌクレオチド、約８００ヌクレオチド、約９００ヌクレオチド、約１，０００ヌクレオチド、約１，２５０ヌクレオチド、約１，５００ヌクレオチド、約１，７５０ヌクレオチド、約２，０００ヌクレオチド、約３，０００ヌクレオチド、約４，０００ヌクレオチド、約５，０００ヌクレオチド、約６，０００ヌクレオチド、約７，０００ヌクレオチド、約８，０００ヌクレオチド、約９，０００ヌクレオチド、約１０，０００ヌクレオチド、約１１，０００ヌクレオチド、約１２，０００ヌクレオチド、約１３，０００ヌクレオチド、約１４，０００ヌクレオチド、約１５，０００ヌクレオチド、約１６，０００ヌクレオチド、約１７，０００ヌクレオチド、約１８，０００ヌクレオチド、約１９，０００ヌクレオチド、又は約２０，０００ヌクレオチド）の長さを有する。いくつかの実施形態では、ｃｉｒｃＲＮＡは、１，０００ヌクレオチド未満の長さを有する。
【0006】
一態様において、本開示は、ｃｉｒｃＲＮＡの濃縮集団を生産するための方法を提供し、この方法は、以下を含む：（ａ）ｃｉｒｃＲＮＡ及びｌｉｎＲＮＡを含むポリリボヌクレオチドの集団を含むサンプルを用意するステップであって、（ｉ）ポリリボヌクレオチドの集団中のポリリボヌクレオチドの総重量が、少なくとも１μｇ（例えば、少なくとも５μｇ、少なくとも１０μｇ、少なくとも２５μｇ、少なくとも５０μｇ、少なくとも１００μｇ、少なくとも２５０μｇ、少なくとも５００μｇ、少なくとも７５０μｇ、少なくとも１ｍｇ、５ｍｇ、１０ｍｇ、１００ｍｇ、若しくは１ｇ；又は５μｇ～１００μｇ、５μｇ～５００μｇ、５μｇ～１ｍｇ、５μｇ～１０ｍｇ、５００μｇ～１００ｍｇ、５００μｇ～１ｇ、５００μｇ～１０ｇ、１００ｍｇ～１ｇ、若しくは１ｇ～１０ｇ）であり；（ｉｉ）ポリリボヌクレオチドの集団を含むサンプルの総量が、少なくとも５００μＬ（例えば、少なくとも１ｍＬ、５ｍＬ、１０ｍＬ、１００ｍＬ、若しくは１Ｌ；又は５００μＬ～１００ｍＬ、５００μＬ～１Ｌ、５００μＬ～１０Ｌ、若しくは１Ｌ～１０Ｌ）であり；又は（ｉｉｉ）サンプル中のポリリボヌクレオチドの集団の濃度が、少なくとも２００ｎｇ／μＬ（例えば、少なくとも５００ｎｇ／μＬ、１ｍｇ／ｍＬ、５ｍｇ／ｍＬ、１０ｍｇ／ｍＬ、若しくは５０ｍｇ／ｍＬ；又は２００ｎｇ／μＬ～１００ｍｇ／ｍＬ、２００ｎｇ／μＬ～５０ｍｇ／ｍＬ、若しくは１ｍｇ／ｍＬ～５０ｍｇ／ｍＬ）であるステップと；（ｂ）変性条件下でｌｉｎＲＮＡからｃｉｒｃＲＮＡを分離し、それによって、ｃｉｒｃＲＮＡの濃縮集団を生産するステップ。また、上述の条件下でｌｉｎＲＮＡの集団からｃｉｒｃＲＮＡの集団を分離する方法も企図され、これは、任意選択で、ｃｉｒｃＲＮＡの集団を定量するステップ及び／又はｌｉｎＲＮＡの集団を定量するステップをさらに含む。
【0007】
いくつかの実施形態では、ポリリボヌクレオチドの集団中のポリリボヌクレオチドの総重量は、１μｇ～１０００ｍｇ（例えば、５μｇ～１０ｍｇ）である。いくつかの実施形態では、ポリリボヌクレオチドの集団を含むサンプルの総量は、５００μＬ～１０００ｍＬである。いくつかの実施形態では、サンプル中のポリリボヌクレオチドの集団の濃度は、２００ｎｇ／μＬ～５０ｍｇ／ｍＬである。
【0008】
いくつかの実施形態では、ｃｉｒｃＲＮＡは、約１００ヌクレオチド～約２０，０００ヌクレオチド（例えば、約１００ヌクレオチド～約５００ヌクレオチド、約１００ヌクレオチド～約７５０ヌクレオチド、約１００ヌクレオチド～約１，０００ヌクレオチド、約１００ヌクレオチド～約２，５００ヌクレオチド、約１００ヌクレオチド～約５，０００ヌクレオチド、約１００ヌクレオチド～約１０，０００ヌクレオチド、約５００ヌクレオチド～約７５０ヌクレオチド、約７５０ヌクレオチド～約１，０００ヌクレオチド、約７５０ヌクレオチド～約１，２５０ヌクレオチド、約１，０００ヌクレオチド～約１，２５０ヌクレオチド、約１，０００ヌクレオチド～約２，０００ヌクレオチド、約１，０００ヌクレオチド～約５，０００ヌクレオチド、約２，５００ヌクレオチド～約５，０００ヌクレオチド、約５，０００ヌクレオチド～約１０，０００ヌクレオチド、約５，０００ヌクレオチド～約１５，０００ヌクレオチド、約１０，０００ヌクレオチド～約１５，０００ヌクレオチド、約１５，０００ヌクレオチド～約２０，０００ヌクレオチド、約１００ヌクレオチド、約２００ヌクレオチド、約３００ヌクレオチド、約４００ヌクレオチド、約５００ヌクレオチド、約６００ヌクレオチド、約７００ヌクレオチド、約８００ヌクレオチド、約９００ヌクレオチド、約１，０００ヌクレオチド、約１，２５０ヌクレオチド、約１，５００ヌクレオチド、約１，７５０ヌクレオチド、約２，０００ヌクレオチド、約３，０００ヌクレオチド、約４，０００ヌクレオチド、約５，０００ヌクレオチド、約６，０００ヌクレオチド、約７，０００ヌクレオチド、約８，０００ヌクレオチド、約９，０００ヌクレオチド、約１０，０００ヌクレオチド、約１１，０００ヌクレオチド、約１２，０００ヌクレオチド、約１３，０００ヌクレオチド、約１４，０００ヌクレオチド、約１５，０００ヌクレオチド、約１６，０００ヌクレオチド、約１７，０００ヌクレオチド、約１８，０００ヌクレオチド、約１９，０００ヌクレオチド、又は約２０，０００ヌクレオチド）の長さを有する。いくつかの実施形態では、ｃｉｒｃＲＮＡは、１，０００ヌクレオチド未満の長さを有する。
【0009】
いくつかの実施形態では、分離ステップ（ｂ）は、ゲル電気泳動の使用を含まない変性条件下で実施される。
【0010】
いくつかの実施形態では、ｃｉｒｃＲＮＡの濃縮集団は、１種若しくは複数種の不純物又は副産物を実質的に含まない。いくつかの実施形態では、１種若しくは複数種の不純物又は副産物は、ポリアクリルアミド、ホウ酸、マグネシウム、又はエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を含む。
【0011】
いくつかの実施形態では、変性条件は、少なくとも５０℃（例えば、少なくとも５５℃、６０℃、６５℃、７０℃、７５℃、又は８０℃）の温度を含む。いくつかの実施形態では、変性条件は、５０℃～８５℃の温度を含む。いくつかの実施形態では、変性条件は、少なくとも５０℃（例えば、少なくとも５５℃、６０℃、６５℃、７０℃、７５℃、又は８０℃）の温度、続いて３０秒以下の時間内に８℃以下（例えば、７℃、６℃、５℃、４℃、３℃、２℃、１℃、０℃、－１℃、－２℃、－３℃、－４℃、－５℃、－６℃、－７℃、－９℃、－１０℃、－１５℃、－２０℃、－２５℃、－３０℃、－３５℃、－４０℃、－４５℃、－５０℃、－５５℃、－６０℃、－６５℃、－７０℃、－７５℃、－８０℃以下、若しくはそれ未満）の温度である。
【0012】
いくつかの実施形態では、変性条件は、５未満（例えば、４、３、２、若しくは１未満）のｐＨ又は９を超える（例えば、１０、１１、１２、若しくは１３超の）ｐＨを含む。いくつかの実施形態では、変性条件は、５未満（例えば、４、３、２、又は１未満）のｐＨを含む。いくつかの実施形態では、変性条件は、９を超える（例えば、１０、１１、１２、又は１３超の）ｐＨを含む。
【0013】
いくつかの実施形態では、変性条件は、化学処理を含む。いくつかの実施形態では、化学処理は、酸、塩基、有機溶媒、カオトロピック剤、クラウディング剤、キレート剤、デタージェント、又は塩溶液による処理を含む。
【0014】
いくつかの実施形態では、酸は、１ｍＭ～５００ｍＭ（例えば、２～４７５ｍＭ、３～４５０ｍＭ、４～４２５ｍＭ、５～４００ｍＭ、１０～３７５ｍＭ、１５～３５０ｍＭ、２０～３２５ｍＭ、３０～３００ｍＭ、４０～２７５ｍＭ、５０～２５０ｍＭ、６０～２２５ｍＭ、７０～２００ｍＭ、８０～１７５ｍＭ、９０～１５０ｍＭ、１００～１２５ｍＭ、又は１１０～１１５ｍＭ）の酢酸、塩酸、サリチル酸、リン酸、ホウ酸、ギ酸、シュウ酸、クエン酸、安息香酸、モノクロロ酢酸、ジクロロ酢酸、トリクロロ酢酸、アスコルビン酸、又は硝酸を含む。
【0015】
いくつかの実施形態では、塩基は、１ｍＭ～５００ｍＭ（例えば、２～４７５ｍＭ、３～４５０ｍＭ、４～４２５ｍＭ、５～４００ｍＭ、１０～３７５ｍＭ、１５～３５０ｍＭ、２０～３２５ｍＭ、３０～３００ｍＭ、４０～２７５ｍＭ、５０～２５０ｍＭ、６０～２２５ｍＭ、７０～２００ｍＭ、８０～１７５ｍＭ、９０～１５０ｍＭ、１００～１２５ｍＭ、若しくは１１０～１１５ｍＭ）水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、イミダゾール、ヒスチジン、炭酸水素ナトリウム、グアニジン、又はトリエチルアミンを含む。
【0016】
いくつかの実施形態では、有機溶媒は、少なくとも０．１％（ｖ／ｖ）（例えば、少なくとも０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、４．５％、５％、５．５％、６％、６．５％、７％、７．５％、８％、８．５％、９％、９．５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、若しくはそれ以上；又は０．０１％～１０％）のジメチルスルホキシド、酢酸トリエチルアンモニウム、メタノール、エタノール、２－プロパノール、イソプロパノール、１－ブタノール、２－ブタノール、ｔ－ブタノール、イソブタノール、フェノール、クロロホルム、ヘキサン、アセトニトリル、ホルムアミド、アセトン、デナトニウム、又はプロピレングリコールを含む。
【0017】
いくつかの実施形態では、カオトロピック剤は、１００ｍＭ～８Ｍ尿素（例えば、１５０ｍＭ～７．５Ｍ、２００ｍＭ～７Ｍ、２５０ｍＭ～６．５Ｍ、３００ｍＭ～６Ｍ、３５０ｍＭ～５．５Ｍ、４００ｍＭ～５Ｍ、４５０ｍＭ～４．５Ｍ、５００ｍＭ～４Ｍ、６００ｍＭ～３．５Ｍ、７００ｍＭ～３Ｍ、８００ｍＭ～２．５Ｍ、９００ｍＭ～２Ｍ、１Ｍ～１．５Ｍ、１．１Ｍ～１．４Ｍ、若しくは１．２～１．３Ｍ）、塩化グアニジニウム、過塩素酸リチウム、又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む。いくつかの実施形態では、カオトロピック剤は、１００ｍＭ～８Ｍ（例えば、１５０ｍＭ～７．５Ｍ、２００ｍＭ～７Ｍ、２５０ｍＭ～６．５Ｍ、３００ｍＭ～６Ｍ、３５０ｍＭ～５．５Ｍ、４００ｍＭ～５Ｍ、４５０ｍＭ～４．５Ｍ、５００ｍＭ～４Ｍ、６００ｍＭ～３．５Ｍ、７００ｍＭ～３Ｍ、８００ｍＭ～２．５Ｍ、９００ｍＭ～２Ｍ、１Ｍ～１．５Ｍ、１．１Ｍ～１．４Ｍ、若しくは１．２～１．３Ｍ）のｎ－ドデシルβ－ｄ－マルトシド、ｎ－オクチルグルコシド、ＣＨＡＰＳ、又はデオキシコール酸塩を含む。
【0018】
いくつかの実施形態では、クラウディング剤は、１００ｍＭ～８Ｍ（例えば、１５０ｍＭ～７．５Ｍ、２００ｍＭ～７Ｍ、２５０ｍＭ～６．５Ｍ、３００ｍＭ～６Ｍ、３５０ｍＭ～５．５Ｍ、４００ｍＭ～５Ｍ、４５０ｍＭ～４．５Ｍ、５００ｍＭ～４Ｍ、６００ｍＭ～３．５Ｍ、７００ｍＭ～３Ｍ、８００ｍＭ～２．５Ｍ、９００ｍＭ～２Ｍ、１Ｍ～１．５Ｍの間、１．１Ｍ～１．４Ｍ、若しくは１．２～１．３Ｍ）のＰＥＧ、又は尿素を含む。
【0019】
いくつかの実施形態では、キレート剤は、１ｍＭ～１０ｍＭ（例えば、１～２ｍＭ、２～３ｍＭ、３～４ｍＭ、４～５ｍＭ、５～６ｍＭ、６～７ｍＭ、７～８ｍＭ、８～９ｍＭ、若しくは９～１０ｍＭ）のエチレングリコール－ビス（β－アミノエチルエーテル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラ酢酸（ＥＧＴＡ）若しくはその誘導体、ＥＤＴＡ若しくはその誘導体、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、イミノジコハク酸（ＩＤＳ）、ポリアスパラギン酸、Ｓ，Ｓ－エチレンジアミン－Ｎ，Ｎ’－ジコハク酸（ＥＤＤＳ）、又はメチルグリシン二酢酸（ＭＧＤＡ）を含む。
【0020】
いくつかの実施形態では、デタージェントは、０．００５％～０．０５％（ｖ／ｖ）（例えば、０．００６～０．０４５％、０．００７～０．０４％、０．００８～０．０３５％、０．００９～０．０３％、０．０１～０．０２５％、０．０１１～０．０２％、０．０１２～０．０１９％、０．０１３～０．０１８％、０．０１４～０．０１７％、又は０．０１５～０．０１６％）のＮｏｎｉｄｅｔ Ｐ－４０（ＮＰ４０）、ＣＨＡＰＳ、オクチルβ－Ｄ－グルコピラノシド、ｎ－ドデシルβ－ｄ－マルトシド、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）－２０、又はＴｗｅｅｎ（登録商標）－８０を含む。
【0021】
一態様において、本開示は、ｃｉｒｃＲＮＡの濃縮集団を生産するための方法を提供し、この方法は以下：（ａ）ｃｉｒｃＲＮＡ及びｌｉｎＲＮＡを含むポリリボヌクレオチドの集団を含むサンプルを用意するステップと；（ｂ）少なくとも５０℃（例えば、少なくとも５５℃、６０℃、６５℃、７０℃、７５℃、８０℃、８５℃、９０℃、９５℃、又は１００℃）の温度でｌｉｎＲＮＡからｃｉｒｃＲＮＡを分離し、それによって、ｃｉｒｃＲＮＡの濃縮集団を生産するステップと、を含む。また、上記の条件下で、ｃｉｒｃＲＮＡの集団をｌｉｎＲＮＡの集団から分離する方法も企図されており、これは、任意選択で、ｃｉｒｃＲＮＡの集団を定量するステップ及び／又はｌｉｎＲＮＡの集団を定量するステップをさらに含む。
【0022】
一態様において、本開示は、ｃｉｒｃＲＮＡの濃縮集団を生産するための方法を提供し、この方法は、以下を含む：（ａ）ｃｉｒｃＲＮＡ及びｌｉｎＲＮＡを含むポリリボヌクレオチドの集団を含むサンプルを用意するステップであって、（ｉ）ポリリボヌクレオチドの集団中のポリリボヌクレオチドの総重量が、少なくとも１μｇ（例えば、少なくとも５μｇ、少なくとも１０、少なくとも２５μｇ、少なくとも５０μｇ、少なくとも１００μｇ、少なくとも２５０μｇ、少なくとも５００μｇ、少なくとも７５０μｇ、少なくとも１ｍｇ、５ｍｇ、１０ｍｇ、１００ｍｇ、若しくは１ｇ；又は５μｇ～１００μｇ、５μｇ～５００μｇ、５μｇ～１ｍｇ、５μｇ～１０ｍｇ、５００μｇ～１００ｍｇ、５００μｇ～１ｇ、５００μｇ～１０ｇ、１００ｍｇ～１ｇ、若しくは１ｇ～１０ｇ）；（ｉｉ）ポリリボヌクレオチドの集団を含むサンプルの総量が、少なくとも５００μＬ（例えば、少なくとも１ｍＬ、５ｍＬ、１０ｍＬ、１００ｍＬ、若しくは１Ｌ；又は５００μＬ～１００ｍＬ、５００μＬ～１Ｌ、５００μＬ～１０Ｌ、若しくは１Ｌ～１０Ｌ）であり；又は（ｉｉｉ）サンプル中のポリリボヌクレオチドの集団の濃度が、少なくとも２００ｎｇ／μＬ（例えば、少なくとも５００ｎｇ／μＬ、１ｍｇ／ｍＬ、５ｍｇ／ｍＬ、１０ｍｇ／ｍＬ、若しくは５０ｍｇ／ｍＬ；又は２００ｎｇ／μＬ～１００ｍｇ／ｍＬ、２００ｎｇ／μＬ～５０ｍｇ／ｍＬ、若しくは１ｍｇ／ｍＬ～５０ｍｇ／ｍＬ）であるステップと；（ｂ）少なくとも５０℃（例えば、少なくとも５５℃、６０℃、６５℃、７０℃、７５℃、８０℃、８５℃、９０℃、９５℃、若しくは１００℃）の温度で、ｌｉｎＲＮＡからｃｉｒｃＲＮＡを分離し、それによって、ｃｉｒｃＲＮＡの濃縮集団を生産するステップ。また、上述の条件下でｌｉｎＲＮＡの集団からｃｉｒｃＲＮＡの集団を分離する方法も企図され、これは、任意選択で、ｃｉｒｃＲＮＡの集団を定量するステップ及び／又はｌｉｎＲＮＡの集団を定量するステップをさらに含む。
【0023】
一態様において、本開示は、ｃｉｒｃＲＮＡの濃縮集団を生産するための方法を提供し、この方法は、以下：（ａ）ｃｉｒｃＲＮＡ及びｌｉｎＲＮＡを含むポリリボヌクレオチドの集団を含むサンプルを用意するステップと；（ｂ）ポリリボヌクレオチドの集団を少なくとも５０℃（例えば、少なくとも５５℃、６０℃、６５℃、７０℃、７５℃、８０℃、８５℃、９０℃、９５℃、若しくは１００℃）の温度に曝露し、それによって、ｃｉｒｃＲＮＡの集団を濃縮するステップと、を含む。いくつかの実施形態では、上記温度は、５０℃～８５℃である。また、上記の条件下で、ｃｉｒｃＲＮＡの集団をｌｉｎＲＮＡの集団から分離する方法も企図され、これは、任意選択で、ｃｉｒｃＲＮＡの集団を定量するステップ及び／又はｌｉｎＲＮＡの集団を定量するステップをさらに含む。
【0024】
一態様において、本開示は、ｃｉｒｃＲＮＡの濃縮集団を生産するための方法を提供し、この方法は、以下：（ａ）ｃｉｒｃＲＮＡ及びｌｉｎＲＮＡを含むポリリボヌクレオチドの集団を含むサンプルを用意するステップと；（ｂ）５未満（例えば、４、３、２、若しくは１未満）又は９超（例えば、１０、１１、１２、若しくは１３超の）ｐＨで、ｌｉｎＲＮＡからｃｉｒｃＲＮＡを分離し、それによって、ｃｉｒｃＲＮＡの濃縮集団を生産するステップと、を含み、上記分離は、ゲル電気泳動の使用を含まない。また、上記の条件下で、ｃｉｒｃＲＮＡの集団をｌｉｎＲＮＡの集団から分離する方法も企図され、これは、任意選択で、ｃｉｒｃＲＮＡの集団を定量するステップ及び／又はｌｉｎＲＮＡの集団を定量するステップをさらに含む。
【0025】
一態様において、本開示は、ｃｉｒｃＲＮＡの濃縮集団を生産するための方法を提供し、この方法は、以下を含む：（ａ）ｃｉｒｃＲＮＡ及びｌｉｎＲＮＡを含むポリリボヌクレオチドの集団を含むサンプルを用意するステップであって、（ｉ）ポリリボヌクレオチドの集団中のポリリボヌクレオチドの総重量が、少なくとも１μｇ（例えば、少なくとも５μｇ、少なくとも１０、少なくとも２５μｇ、少なくとも５０μｇ、少なくとも１００μｇ、少なくとも２５０μｇ、少なくとも５００μｇ、少なくとも７５０μｇ、少なくとも１ｍｇ、５ｍｇ、１０ｍｇ、１００ｍｇ、若しくは１ｇ；又は５μｇ～１００μｇ、５μｇ～５００μｇ、５μｇ～１ｍｇ、５μｇ～１０ｍｇ、５００μｇ～１００ｍｇ、５００μｇ～１ｇ、５００μｇ～１０ｇ、１００ｍｇ～１ｇ、若しくは１ｇ～１０ｇ）；（ｉｉ）ポリリボヌクレオチドの集団を含むサンプルの総量が、少なくとも５００μＬ（例えば、少なくとも１ｍＬ、５ｍＬ、１０ｍＬ、１００ｍＬ、若しくは１Ｌ；又は５００μＬ～１００ｍＬ、５００μＬ～１Ｌ、５００μＬ～１０Ｌ、若しくは１Ｌ～１０Ｌ）であり；又は（ｉｉｉ）サンプル中のポリリボヌクレオチドの集団の濃度が、少なくとも２００ｎｇ／μＬ（例えば、少なくとも５００ｎｇ／μＬ、１ｍｇ／ｍＬ、５ｍｇ／ｍＬ、１０ｍｇ／ｍＬ、若しくは５０ｍｇ／ｍＬ；又は２００ｎｇ／μＬ～１００ｍｇ／ｍＬ、２００ｎｇ／μＬ～５０ｍｇ／ｍＬ、若しくは１ｍｇ／ｍＬ～５０ｍｇ／ｍＬ）であるステップと；（ｂ）５未満（例えば、４、３、２、若しくは１未満）又は９超（例えば、１０、１１、１２、若しくは１３超）のｐＨで、ｌｉｎＲＮＡからｃｉｒｃＲＮＡを分離し、それによって、ｃｉｒｃＲＮＡの濃縮集団を生産するステップ。また、上述の条件下でｌｉｎＲＮＡの集団からｃｉｒｃＲＮＡの集団を分離する方法も企図され、これは、任意選択で、ｃｉｒｃＲＮＡの集団を定量するステップ及び／又はｌｉｎＲＮＡの集団を定量するステップをさらに含む。
【0026】
一態様において、本開示は、ｃｉｒｃＲＮＡの濃縮集団を生産するための方法を提供し、この方法は、以下：（ａ）ｃｉｒｃＲＮＡ及びｌｉｎＲＮＡを含むポリリボヌクレオチドの集団を含むサンプルを用意するステップと；（ｂ）５未満（例えば、４、３、２、若しくは１未満）又は９超（例えば、１０、１１、１２、若しくは１３超の）のｐＨに上記ポリリボヌクレオチドの集団を曝露し、それによってｃｉｒｃＲＮＡの集団を濃縮するステップと、を含む。また、上述の条件下でｌｉｎＲＮＡの集団からｃｉｒｃＲＮＡの集団を分離する方法も企図され、これは、任意選択で、ｃｉｒｃＲＮＡの集団を定量するステップ及び／又はｌｉｎＲＮＡの集団を定量するステップをさらに含む。
【0027】
いくつかの実施形態では、ｐＨは、５未満（例えば、４、３、２、又は１未満）である。いくつかの実施形態では、ｐＨは、９を超える（例えば、１０、１１、１２、又は１３を超える）。
【0028】
一態様において、本開示は、ｃｉｒｃＲＮＡの濃縮集団を生産するための方法を提供し、この方法は：（ａ）ｃｉｒｃＲＮＡ及びｌｉｎＲＮＡを含むポリリボヌクレオチドの集団を含むサンプルを用意するステップと；（ｂ）酸、塩基、有機溶媒、カオトロピック剤、クラウディング剤、キレート剤、デタージェント、又は塩溶液を含む条件下で、ｃｉｒｃＲＮＡをｌｉｎＲＮＡから分離し、それによって、ｃｉｒｃＲＮＡの濃縮集団を生産するステップと、を含み、上記分離は、ゲル電気泳動の使用を含まない。また、上述の条件下でｌｉｎＲＮＡの集団からｃｉｒｃＲＮＡの集団を分離する方法も企図され、これは、任意選択で、ｃｉｒｃＲＮＡの集団を定量するステップ及び／又はｌｉｎＲＮＡの集団を定量するステップをさらに含む。
【0029】
一態様において、本開示は、ｃｉｒｃＲＮＡの濃縮集団を生産するための方法を提供し、この方法は、以下を含む：（ａ）ｃｉｒｃＲＮＡ及びｌｉｎＲＮＡを含むポリリボヌクレオチドの集団を含むサンプルを用意するステップであって、（ｉ）ポリリボヌクレオチドの集団中のポリリボヌクレオチドの総重量が、少なくとも１μｇ（例えば、少なくとも５μｇ、少なくとも１０、少なくとも２５μｇ、少なくとも５０μｇ、少なくとも１００μｇ、少なくとも２５０μｇ、少なくとも５００μｇ、少なくとも７５０μｇ、少なくとも１ｍｇ、５ｍｇ、１０ｍｇ、１００ｍｇ、若しくは１ｇ；又は５μｇ～１００μｇ、５μｇ～５００μｇ、５μｇ～１ｍｇ、５μｇ～１０ｍｇ、５００μｇ～１００ｍｇ、５００μｇ～１ｇ、５００μｇ～１０ｇ、１００ｍｇ～１ｇ、若しくは１ｇ～１０ｇ）；（ｉｉ）ポリリボヌクレオチドの集団を含むサンプルの総量が、少なくとも５００μＬ（例えば、少なくとも１ｍＬ、５ｍＬ、１０ｍＬ、１００ｍＬ、若しくは１Ｌ；又は５００μＬ～１００ｍＬ、５００μＬ～１Ｌ、５００μＬ～１０Ｌ、若しくは１Ｌ～１０Ｌ）であり；又は（ｉｉｉ）サンプル中のポリリボヌクレオチドの集団の濃度が、少なくとも２００ｎｇ／μＬ（例えば、少なくとも５００ｎｇ／μＬ、１ｍｇ／ｍＬ、５ｍｇ／ｍＬ、１０ｍｇ／ｍＬ、若しくは５０ｍｇ／ｍＬ；又は２００ｎｇ／μＬ～１００ｍｇ／ｍＬ、２００ｎｇ／μＬ～５０ｍｇ／ｍＬ、若しくは１ｍｇ／ｍＬ～５０ｍｇ／ｍＬ）であるステップと；（ｂ）酸、塩基、有機溶媒、カオトロピック剤、クラウディング剤、キレート剤、デタージェント、又は塩溶液を含む条件下で、ｌｉｎＲＮＡからｃｉｒｃＲＮＡを分離し、それによって、ｃｉｒｃＲＮＡの濃縮集団を生産するステップ。また、上述の条件下でｌｉｎＲＮＡの集団からｃｉｒｃＲＮＡの集団を分離する方法も企図され、これは、任意選択で、ｃｉｒｃＲＮＡの集団を定量するステップ及び／又はｌｉｎＲＮＡの集団を定量するステップをさらに含む。
【0030】
一態様において、本開示は、ｃｉｒｃＲＮＡの濃縮集団を生産するための方法を提供し、この方法は：（ａ）ｃｉｒｃＲＮＡ及びｌｉｎＲＮＡを含むポリリボヌクレオチドの集団を含むサンプルを用意するステップと；（ｂ）酸、塩基、有機溶媒、カオトロピック剤、クラウディング剤、キレート剤、デタージェント、又は塩溶液にポリリボヌクレオチドの集団を曝露し、それによって、ｃｉｒｃＲＮＡの集団を濃縮するステップと、を含む。また、上述の条件下でｌｉｎＲＮＡの集団からｃｉｒｃＲＮＡの集団を分離する方法も企図され、これは、任意選択で、ｃｉｒｃＲＮＡの集団を定量するステップ及び／又はｌｉｎＲＮＡの集団を定量するステップをさらに含む。
【0031】
いくつかの実施形態では、酸は、少なくとも０．５％（ｖ／ｖ）（例えば、少なくとも１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、４．５％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、若しくはそれ以上）の酢酸、塩酸、サリチル酸、リン酸、ホウ酸、ギ酸、シュウ酸、クエン酸、安息香酸、モノクロロ酢酸、ジクロロ酢酸、トリクロロ酢酸、アスコルビン酸、又は硝酸を含む。
【0032】
いくつかの実施形態では、塩基は、１ｍＭ～５００ｍＭ（例えば、２～４７５ｍＭ、３～４５０ｍＭ、４～４２５ｍＭ、５～４００ｍＭ、１０～３７５ｍＭ、１５～３５０ｍＭ、２０～３２５ｍＭ、３０～３００ｍＭ、４０～２７５ｍＭ、５０～２５０ｍＭ、６０～２２５ｍＭ、７０～２００ｍＭ、８０～１７５ｍＭ、９０～１５０ｍＭ、１００～１２５ｍＭ、若しくは１１０～１１５ｍＭ）の水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、イミダゾール、ヒスチジン、炭酸水素ナトリウム、グアニジン、又はトリエチルアミンを含む。
【0033】
いくつかの実施形態では、有機溶媒は、少なくとも０．１％（ｖ／ｖ）（例えば、少なくとも０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、４．５％、５％、５．５％、６％、６．５％、７％、７．５％、８％、８．５％、９％、９．５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、９０％以上；又は０．０１％～１０％）のジメチルスルホキシド、酢酸トリエチルアンモニウム、メタノール、エタノール、２－プロパノール、イソプロパノール、１－ブタノール、２－ブタノール、ｔ－ブタノール、イソブタノール、フェノール、クロロホルム、ヘキサン、アセトニトリル、ホルムアミド、アセトン、デナトニウム、又はプロピレングリコールを含む。
【0034】
いくつかの実施形態では、カオトロピック剤は、１００ｍＭ～８Ｍ尿素（例えば、１５０ｍＭ～７．５Ｍ、２００ｍＭ～７Ｍ、２５０ｍＭ～６．５Ｍ、３００ｍＭ～６Ｍ、３５０ｍＭ～５．５Ｍ、４００ｍＭ～５Ｍ、４５０ｍＭ～４．５Ｍ、５００ｍＭ～４Ｍ、６００ｍＭ～３．５Ｍ、７００ｍＭ～３Ｍ、８００ｍＭ～２．５Ｍ、９００ｍＭ～２Ｍ、１Ｍ～１．５Ｍ、１．１Ｍ～１．４Ｍ、若しくは１．２～１．３Ｍ）の尿素、塩化グアニジニウム、過塩素酸リチウム、又はＰＥＧを含む。いくつかの実施形態では、カオトロピック剤は、１００ｍＭ～８Ｍ（例えば、１５０ｍＭ～７．５Ｍ、２００ｍＭ～７Ｍ、２５０ｍＭ～６．５Ｍ、３００ｍＭ～６Ｍ、３５０ｍＭ～５．５Ｍ、４００ｍＭ～５Ｍ、４５０ｍＭ～４．５Ｍ、５００ｍＭ～４Ｍ、６００ｍＭ～３．５Ｍ、７００ｍＭ～３Ｍ、８００ｍＭ～２．５Ｍ、９００ｍＭ～２Ｍ、１Ｍ～１．５Ｍ、１．１Ｍ～１．４Ｍ、若しくは１．２～１．３Ｍ）のｎ－ドデシルβ－ｄ－マルトシド、ｎ－オクチルグルコシド、ＣＨＡＰＳ、又はデオキシコール酸塩を含む。
【0035】
いくつかの実施形態では、クラウディング剤は、１００ｍＭ～８Ｍ（例えば、１５０ｍＭ～７．５Ｍ、２００ｍＭ～７Ｍ、２５０ｍＭ～６．５Ｍ、３００ｍＭ～６Ｍ、３５０ｍＭ～５．５Ｍ、４００ｍＭ～５Ｍ、４５０ｍＭ～４．５Ｍ、５００ｍＭ～４Ｍ、６００ｍＭ～３．５Ｍ、７００ｍＭ～３Ｍ、８００ｍＭ～２．５Ｍ、９００ｍＭ～２Ｍ、１Ｍ～１．５Ｍ、１．１Ｍ～１．４Ｍ、若しくは１．２～１．３Ｍ）のＰＥＧ、又は尿素を含む。
【0036】
いくつかの実施形態では、キレート剤は、１ｍＭ～１０ｍＭ（例えば、１～２ｍＭ、２～３ｍＭ、３～４ｍＭ、４～５ｍＭ、５～６ｍＭ、６～７ｍＭ、７～８ｍＭ、８～９ｍＭ、若しくは９～１０ｍＭ）のＥＧＴＡ又はその誘導体、ＥＤＴＡ又はその誘導体、ＮＴＡ、ＩＤＳ、ＥＤＤＳ、又はＭＧＤＡを含む。
【0037】
いくつかの実施形態では、デタージェントは、０．００５％～０．０５％（ｖ／ｖ）（例えば、０．００６～０．０４５％、０．００７～０．０４％、０．００８～０．０３５％、０．００９～０．０３％、０．０１～０．０２５％、０．０１１～０．０２％、０．０１２～０．０１９％、０．０１３～０．０１８％、０．０１４～０．０１７％、又は０．０１５～０．０１６％）のＮＰ４０、ＣＨＡＰＳ、オクチルβ－Ｄ－グルコピラノシド、ｎ－ドデシルβ－ｄ－マルトシド、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）－２０、又はＴｗｅｅｎ（登録商標）－８０を含む。
【0038】
いくつかの実施形態では、ステップ（ｂ）は、ポリリボヌクレオチドの集団に対してカラムクロマトグラフィーを実施する工程を含み、カラムクロマトグラフィーを実施する工程は、平衡化ステップ、サンプルロードステップ、カラム洗浄ステップ、及び溶離ステップを含む。
【0039】
いくつかの実施形態では、分離は、サンプルロードステップ中に実施される。いくつかの実施形態では、分離は、カラム洗浄ステップ中に行われる。いくつかの実施形態では、分離は、溶離ステップ中に行われる。
【0040】
いくつかの実施形態では、カラムクロマトグラフィーは、高速タンパク質液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）、高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）、陰イオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＣ）、混合モードクロマトグラフィー、又はアフィニティークロマトグラフィーを含む。
【0041】
いくつかの実施形態では、ＡＥＣは、スチレン－ジビニルベンゼン、シリカ、セファロース、セルロース、デキストラン、エポキシポリアミン、メタクリレート、アガロース、又はアクリルをはじめとする陰イオン交換樹脂の使用を含む。いくつかの実施形態では、陰イオン交換樹脂は、第４級アンモニウム、アミノエチル、ジエチルアミノエチル、又はジエチルアミノプロピルなどのイオン交換体を含む。いくつかの実施形態では、陰イオン交換樹脂はビーズを含み、ビーズは、４５～１６５μｍのビーズ径及び直径１００～１０００ｎｍの孔径を有する。いくつかの実施形態では、ＡＥＣは、線形グラジエント溶離又はステップイソクラティック溶離の使用を含む。いくつかの実施形態では、ＡＥＣは、流量１ｍＬ／分～１５０ｍＬ／分の使用を含む。
【0042】
いくつかの実施形態では、ＦＰＬＣは、逆相－ＦＰＬＣ（ＲＰ－ＦＰＬＣ）である。
【0043】
いくつかの実施形態では、ステップ（ｂ）は、精製ｃｉｒｃＲＮＡの複数の画分をプールすることによって実施される。
【0044】
いくつかの実施形態では、ｃｉｒｃＲＮＡ及びｌｉｎＲＮＡは、同じリボヌクレオチド配列を有する。いくつかの実施形態では、ｃｉｒｃＲＮＡ及びｌｉｎＲＮＡは、同じ質量を有する。いくつかの実施形態では、ｃｉｒｃＲＮＡ及びｌｉｎＲＮＡは、ポリ（Ａ）テールを欠く。
【0045】
いくつかの実施形態では、本方法は、ｌｉｎＲＮＡのエキソヌクレアーゼ消化を含む。いくつかの実施形態では、本方法は、ｌｉｎＲＮＡのエキソヌクレアーゼ消化を含まない。いくつかの実施形態では、本方法は、ｃｉｒｃＲＮＡの濃縮を改善する、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｌｉｎＲＮＡに対する選択的修飾を含まない。
【0046】
いくつかの実施形態では、ｃｉｒｃＲＮＡの濃縮集団中のｃｉｒｃＲＮＡのパーセント（ｗ／ｗ）は、ポリリボヌクレオチド集団中のｃｉｒｃＲＮＡのパーセント（ｗ／ｗ）の２倍である。いくつかの実施形態では、ｃｉｒｃＲＮＡの濃縮集団中のｃｉｒｃＲＮＡのパーセント（ｗ／ｗ）は、少なくとも６５％（例えば、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％）である。いくつかの実施形態では、ｃｉｒｃＲＮＡの濃縮集団中のｌｉｎＲＮＡのパーセント（ｗ／ｗ）は、３５％未満（例えば、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、又は１％未満）である。
【0047】
いくつかの実施形態では、ｃｉｒｃＲＮＡは、約１００ヌクレオチド～約２０，０００ヌクレオチド（例えば、約１００ヌクレオチド～約５００ヌクレオチド、約１００ヌクレオチド～約７５０ヌクレオチド、約１００ヌクレオチド～約１，０００ヌクレオチド、約１００ヌクレオチド～約２，５００ヌクレオチド、約１００ヌクレオチド～約５，０００ヌクレオチド、約１００ヌクレオチド～約１０，０００ヌクレオチド、約５００ヌクレオチド～約７５０ヌクレオチド、約７５０ヌクレオチド～約１，０００ヌクレオチド、約７５０ヌクレオチド～約１，２５０ヌクレオチド、約１，０００ヌクレオチド～約１，２５０ヌクレオチド、約１，０００ヌクレオチド～約２，０００ヌクレオチド、約１，０００ヌクレオチド～約５，０００ヌクレオチド、約２，５００ヌクレオチド～約５，０００ヌクレオチド、約５，０００ヌクレオチド～約１０，０００ヌクレオチド、約５，０００ヌクレオチド～約１５，０００ヌクレオチド、約１０，０００ヌクレオチド～約１５，０００ヌクレオチド、約１５，０００ヌクレオチド～約２０，０００ヌクレオチド、約１００ヌクレオチド、約２００ヌクレオチド、約３００ヌクレオチド、約４００ヌクレオチド、約５００ヌクレオチド、約６００ヌクレオチド、約７００ヌクレオチド、約８００ヌクレオチド、約９００ヌクレオチド、約１，０００ヌクレオチド、約１，２５０ヌクレオチド、約１，５００ヌクレオチド、約１，７５０ヌクレオチド、約２，０００ヌクレオチド、約３，０００ヌクレオチド、約４，０００ヌクレオチド、約５，０００ヌクレオチド、約６，０００ヌクレオチド、約７，０００ヌクレオチド、約８，０００ヌクレオチド、約９，０００ヌクレオチド、約１０，０００ヌクレオチド、約１１，０００ヌクレオチド、約１２，０００ヌクレオチド、約１３，０００ヌクレオチド、約１４，０００ヌクレオチド、約１５，０００ヌクレオチド、約１６，０００ヌクレオチド、約１７，０００ヌクレオチド、約１８，０００ヌクレオチド、約１９，０００ヌクレオチド、又は約２０，０００ヌクレオチド）の長さを有する。いくつかの実施形態では、ｃｉｒｃＲＮＡは、１，０００ヌクレオチド未満の長さを有する。
【0048】
一態様において、本開示は、ｃｉｒｃＲＮＡ及びｌｉｎＲＮＡを含むポリリボヌクレオチドの集団を含む組成物を提供し、上記ポリリボヌクレオチドの集団は、変性条件下で溶液中にあり；（ｉ）ポリリボヌクレオチドの集団中のポリリボヌクレオチドの総重量は、少なくとも１μｇ（例えば、少なくとも５μｇ、少なくとも１０、少なくとも２５μｇ、少なくとも５０μｇ、少なくとも１００μｇ、少なくとも２５０μｇ、少なくとも５００μｇ、少なくとも７５０μｇ、少なくとも１ｍｇ、５ｍｇ、１０ｍｇ、１００ｍｇ、若しくは１ｇ；又は５μｇ～１００μｇ、５μｇ～５００μｇ、５μｇ～１ｍｇ、５μｇ～１０ｍｇ、５００μｇ～１００ｍｇ、５００μｇ～１ｇ、５００μｇ～１０ｇ、１００ｍｇ～１ｇ、若しくは１ｇ～１０ｇ）であり；（ｉｉ）ポリリボヌクレオチドの集団を含むサンプルの総量は、少なくとも５００μＬ（例えば、少なくとも１ｍＬ、５ｍＬ、１０ｍＬ、１００ｍＬ、若しくは１Ｌ；又は５００μＬ～１００ｍＬ、５００μＬ～１Ｌ、５００μＬ～１０Ｌ、若しくは１Ｌ～１０Ｌ）であり；又は（ｉｉｉ）サンプル中のポリリボヌクレオチドの集団の濃度は、少なくとも５００ｎｇ／μＬ（例えば、少なくとも５００ｎｇ／μＬ、１ｍｇ／ｍＬ、５ｍｇ／ｍＬ、１０ｍｇ／ｍＬ、若しくは５０ｍｇ／ｍＬ；又は２００ｎｇ／μＬ～１００ｍｇ／ｍＬ、２００ｎｇ／μＬ～５０ｍｇ／ｍＬ、若しくは１ｍｇ／ｍＬ～５０ｍｇ／ｍＬ）である。
【0049】
一態様において、本開示は、ｃｉｒｃＲＮＡ及びｌｉｎＲＮＡを含むポリリボヌクレオチドの集団を含む組成物を提供し、上記ポリリボヌクレオチドの集団は、変性条件下で溶液中にあり、上記溶液は、１種若しくは複数種の不純物又は副産物を実質的に含まない。
【0050】
一態様では、本開示は、ｃｉｒｃＲＮＡ及びｌｉｎＲＮＡを含むポリリボヌクレオチドの集団を含む組成物を提供し、（ａ）組成物は、核酸の集団を含むサンプルから取得され；（ｂ）組成物は、１つ若しくは複数の変性条件に曝露されており；（ｃ）組成物は、１種若しくは複数種の不純物又は副産物を実質的に含まない。
【0051】
一態様では、本開示は、ｃｉｒｃＲＮＡの濃縮集団を含む組成物を提供し、（ａ）組成物は、ｃｉｒｃＲＮＡ及びｌｉｎＲＮＡを含むポリリボヌクレオチドの集団を含むサンプルから取得され；（ｂ）組成物は、１つ若しくは複数の変性条件に曝露されており；（ｃ）組成物は、１種若しくは複数種の不純物又は副産物を実質的に含まない。
【0052】
一態様では、いくつかの実施形態では、ｃｉｒｃＲＮＡは、約１００ヌクレオチド～約２０，０００ヌクレオチド（例えば、約１００ヌクレオチド～約５００ヌクレオチド、約１００ヌクレオチド～約７５０ヌクレオチド、約１００ヌクレオチド～約１，０００ヌクレオチド、約１００ヌクレオチド～約２，５００ヌクレオチド、約１００ヌクレオチド～約５，０００ヌクレオチド、約１００ヌクレオチド～約１０，０００ヌクレオチド、約５００ヌクレオチド～約７５０ヌクレオチド、約７５０ヌクレオチド～約１，０００ヌクレオチド、約７５０ヌクレオチド～約１，２５０ヌクレオチド、約１，０００ヌクレオチド～約１，２５０ヌクレオチド、約１，０００ヌクレオチド～約２，０００ヌクレオチド、約１，０００ヌクレオチド～約５，０００ヌクレオチド、約２，５００ヌクレオチド～約５，０００ヌクレオチド、約５，０００ヌクレオチド～約１０，０００ヌクレオチド、約５，０００ヌクレオチド～約１５，０００ヌクレオチド、約１０，０００ヌクレオチド～約１５，０００ヌクレオチド、約１５，０００ヌクレオチド～約２０，０００ヌクレオチド、約１００ヌクレオチド、約２００ヌクレオチド、約３００ヌクレオチド、約４００ヌクレオチド、約５００ヌクレオチド、約６００ヌクレオチド、約７００ヌクレオチド、約８００ヌクレオチド、約９００ヌクレオチド、約１，０００ヌクレオチド、約１，２５０ヌクレオチド、約１，５００ヌクレオチド、約１，７５０ヌクレオチド、約２，０００ヌクレオチド、約３，０００ヌクレオチド、約４，０００ヌクレオチド、約５，０００ヌクレオチド、約６，０００ヌクレオチド、約７，０００ヌクレオチド、約８，０００ヌクレオチド、約９，０００ヌクレオチド、約１０，０００ヌクレオチド、約１１，０００ヌクレオチド、約１２，０００ヌクレオチド、約１３，０００ヌクレオチド、約１４，０００ヌクレオチド、約１５，０００ヌクレオチド、約１６，０００ヌクレオチド、約１７，０００ヌクレオチド、約１８，０００ヌクレオチド、約１９，０００ヌクレオチド、又は約２０，０００ヌクレオチド）の長さを有する。いくつかの実施形態では、ｃｉｒｃＲＮＡは、１，０００ヌクレオチ以下の長さを有する。
【0053】
いくつかの実施形態では、１種若しくは複数種の不純物又は副産物としては、ポリアクリルアミド、ホウ酸、マグネシウム、又はＥＤＴＡが挙げられる。
【0054】
いくつかの実施形態では、変性条件は、少なくとも５０℃（例えば、少なくとも５５℃、６０℃、６５℃、７０℃、７５℃、８０℃、８５℃、９０℃、９５℃、又は１００℃）の温度を含む。いくつかの実施形態では、変性条件は、５０℃～８５℃の温度を含む。いくつかの実施形態では、変性条件は、少なくとも５０℃（例えば、少なくとも５５℃、６０℃、６５℃、７０℃、７５℃、８０℃、８５℃、９０℃、９５℃、又は１００℃）の温度、続いて８℃以下（例えば、７℃、６℃、５℃、４℃、３℃、２℃、１℃、０℃、－１℃、－２℃、－３℃、－４℃、－５℃、－６℃、－７℃、－９℃、－１０℃、－１５℃、－２０℃、－２５℃、－３０℃、－３５℃、－４０℃、－４５℃、－５０℃、－５５℃、－６０℃、－６５℃、－７０℃、－７５℃、－８０℃以下、若しくはそれ以下）の温度である。
【0055】
いくつかの実施形態では、変性条件は、５未満（例えば、４、３、２、若しくは１未満）のｐＨ又は９を超える（例えば、１０、１１、１２、若しくは１３超の）ｐＨを含む。
【0056】
いくつかの実施形態では、変性条件は、化学処理を含む。いくつかの実施形態では、化学処理は、酸、塩基、有機溶媒、カオトロピック剤、クラウディング剤、キレート剤、デタージェント、又は塩溶液による処理を含む。
【0057】
いくつかの実施形態では、酸は、１ｍＭ～５００ｍＭ（例えば、２～４７５ｍＭ、３～４５０ｍＭ、４～４２５ｍＭ、５～４００ｍＭ、１０～３７５ｍＭ、１５～３５０ｍＭ、２０～３２５ｍＭ、３０～３００ｍＭ、４０～２７５ｍＭ、５０～２５０ｍＭ、６０～２２５ｍＭ、７０～２００ｍＭ、８０～１７５ｍＭ、９０～１５０ｍＭ、１００～１２５ｍＭ、又は１１０～１１５ｍＭ）の酢酸、塩酸、サリチル酸、リン酸、ホウ酸、ギ酸、シュウ酸、クエン酸、安息香酸、モノクロロ酢酸、ジクロロ酢酸、トリクロロ酢酸、アスコルビン酸、又は硝酸を含む。
【0058】
いくつかの実施形態では、塩基は、１ｍＭ～５００ｍＭ（例えば、２～４７５ｍＭ、３～４５０ｍＭ、４～４２５ｍＭ、５～４００ｍＭ、１０～３７５ｍＭ、１５～３５０ｍＭ、２０～３２５ｍＭ、３０～３００ｍＭ、４０～２７５ｍＭ、５０～２５０ｍＭ、６０～２２５ｍＭ、７０～２００ｍＭ、８０～１７５ｍＭ、９０～１５０ｍＭ、１００～１２５ｍＭ、若しくは１１０～１１５ｍＭ）の水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、イミダゾール、ヒスチジン、炭酸水素ナトリウム、グアニジン、又はトリエチルアミンを含む。
【0059】
いくつかの実施形態では、有機溶媒は、少なくとも０．１％（ｖ／ｖ）（例えば、少なくとも０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、４．５％、５％、５．５％、６％、６．５％、７％、７．５％、８％、８．５％、９％、９．５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、９０％以上；又は０．０１％～１０％）のジメチルスルホキシド、酢酸トリエチルアンモニウム、メタノール、エタノール、２－プロパノール、イソプロパノール、１－ブタノール、２－ブタノール、ｔ－ブタノール、イソブタノール、フェノール、クロロホルム、ヘキサン、アセトニトリル、ホルムアミド、アセトン、デナトニウム、若しくはプロピレングリコールを含む。
【0060】
いくつかの実施形態では、カオトロピック剤は、１００ｍＭ～８Ｍ（例えば、１５０ｍＭ～７．５Ｍ、２００ｍＭ～７Ｍ、２５０ｍＭ～６．５Ｍ、３００ｍＭ～６Ｍ、３５０ｍＭ～５．５Ｍ、４００ｍＭ～５Ｍ、４５０ｍＭ～４．５Ｍ、５００ｍＭ～４Ｍ、６００ｍＭ～３．５Ｍ、７００ｍＭ～３Ｍ、８００ｍＭ～２．５Ｍ、９００ｍＭ～２Ｍ、１Ｍ～１．５Ｍ、１．１Ｍ～１．４Ｍ、若しくは１．２～１．３Ｍ）の尿素、塩化グアニジニウム、過塩素酸リチウム、又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む。いくつかの実施形態では、カオトロピック剤は、１００ｍＭ～８Ｍ（例えば、１５０ｍＭ～７．５Ｍ、２００ｍＭ～７Ｍ、２５０ｍＭ～６．５Ｍ、３００ｍＭ～６Ｍ、３５０ｍＭ～５．５Ｍ、４００ｍＭ～５Ｍ、４５０ｍＭ～４．５Ｍ、５００ｍＭ～４Ｍ、６００ｍＭ～３．５Ｍ、７００ｍＭ～３Ｍ、８００ｍＭ～２．５Ｍ、９００ｍＭ～２Ｍ、１Ｍ～１．５Ｍ、１．１Ｍ～１．４Ｍ、若しくは１．２～１．３Ｍ）のｎ－ドデシルβ－ｄ－マルトシド、ｎ－オクチルグルコシド、ＣＨＡＰＳ、又はデオキシコール酸塩を含む。
【0061】
いくつかの実施形態では、クラウディング剤は、１００ｍＭ～８Ｍ（例えば、１５０ｍＭ～７．５Ｍ、２００ｍＭ～７Ｍ、２５０ｍＭ～６．５Ｍ、３００ｍＭ～６Ｍ、３５０ｍＭ～５．５Ｍ、４００ｍＭ～５Ｍ、４５０ｍＭ～４．５Ｍ、５００ｍＭ～４Ｍ、６００ｍＭ～３．５Ｍ、７００ｍＭ～３Ｍ、８００ｍＭ～２．５Ｍ、９００ｍＭ～２Ｍ、１Ｍ～１．５Ｍ、１．１Ｍ～１．４Ｍ、若しくは１．２～１．３Ｍ）のＰＥＧ、又は尿素を含む。
【0062】
いくつかの実施形態では、キレート剤は、１ｍＭ～１０ｍＭ（例えば、１～２ｍＭ、２～３ｍＭ、３～４ｍＭ、４～５ｍＭ、５～６ｍＭ、６～７ｍＭ、７～８ｍＭ、８～９ｍＭ、若しくは９～１０ｍＭ）のＥＧＴＡ又はその誘導体、ＥＤＴＡ又はその誘導体、ＮＴＡ、ＩＤＳ、ＥＤＤＳ、又はＭＧＤＡを含む。
【0063】
いくつかの実施形態では、デタージェントは、０．００５％～０．０５％（ｖ／ｖ）（例えば、０．００６～０．０４５％、０．００７～０．０４％、０．００８～０．０３５％、０．００９～０．０３％、０．０１～０．０２５％、０．０１１～０．０２％、０．０１２～０．０１９％、０．０１３～０．０１８％、０．０１４～０．０１７％、又は０．０１５～０．０１６％）のＮＰ４０、ＣＨＡＰＳ、オクチルβ－Ｄ－グルコピラノシド、ｎ－ドデシルβ－ｄ－マルトシド、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）－２０、又はＴｗｅｅｎ（登録商標）－８０を含む。
【0064】
いくつかの実施形態では、ｃｉｒｃＲＮＡの濃縮集団中のｃｉｒｃＲＮＡのパーセント（ｗ／ｗ）は、ポリリボヌクレオチド集団中のｃｉｒｃＲＮＡのパーセント（ｗ／ｗ）の２倍である。いくつかの実施形態では、ｃｉｒｃＲＮＡの濃縮集団中のｃｉｒｃＲＮＡのパーセント（ｗ／ｗ）は、少なくとも６５％（例えば、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％）である。いくつかの実施形態では、ｃｉｒｃＲＮＡの濃縮集団中のｌｉｎＲＮＡのパーセント（ｗ／ｗ）は、３５％未満（例えば、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、又は１％未満）である。
【0065】
いくつかの実施形態では、ｃｉｒｃＲＮＡ及びｌｉｎＲＮＡは、同じリボヌクレオチド配列を有する。いくつかの実施形態では、ｃｉｒｃＲＮＡ及びｌｉｎＲＮＡは、同じ質量を有する。いくつかの実施形態では、ｃｉｒｃＲＮＡ及びｌｉｎＲＮＡは、ポリ（Ａ）テールを欠く。
【0066】
一態様では、本開示は、ｃｉｒｃＲＮＡの純度を決定する方法を提供し、この方法は、以下：（ａ）ｃｉｒｃＲＮＡ及びｌｉｎＲＮＡを含むポリリボヌクレオチドの集団を含むサンプルを用意するステップと；（ｂ）クロマトグラフィーにより、変性条件下でｌｉｎＲＮＡからｃｉｒｃＲＮＡを分離するステップと；（ｃ）ｃｉｒｃＲＮＡのピーク及びｌｉｎＲＮＡのピークを含むサンプルのクロマトグラムを収集するステップと；（ｄ）各ピーク下の面積を計算して、サンプル中のｃｉｒｃＲＮＡの純度を決定するステップを含む。
【0067】
いくつかの実施形態では、上記変性条件は、ゲル電気泳動の使用を含まない。
【0068】
いくつかの実施形態では、変性条件は、少なくとも５０℃（例えば、少なくとも５５℃、６０℃、６５℃、７０℃、７５℃、８０℃、８５℃、９０℃、９５℃、又は１００℃）の温度を含む。いくつかの実施形態では、変性条件は、５０℃～８５℃の温度を含む。いくつかの実施形態では、変性条件は、少なくとも５０℃の温度、続いて３０秒以下の時間内に８℃以下（例えば、７℃、６℃、５℃、４℃、３℃、２℃、１℃、０℃、－１℃、－２℃、－３℃、－４℃、－５℃、－６℃、－７℃、－９℃、－１０℃、－１５℃、－２０℃、－２５℃、－３０℃、－３５℃、－４０℃、－４５℃、－５０℃、－５５℃、－６０℃、－６５℃、－７０℃、－７５℃、－８０℃以下、若しくはそれ未満）の温度を含む。
【0069】
いくつかの実施形態では、変性条件は、５未満（例えば、４、３、２、若しくは１未満）のｐＨ又は９を超える（例えば、１０、１１、１２、若しくは１３超の）ｐＨを含む。いくつかの実施形態では、変性条件は、５未満（例えば、４、３、２、又は１未満）のｐＨを含む。いくつかの実施形態では、変性条件は、９を超える（例えば、１０、１１、１２、又は１３超の）ｐＨを含む。
【0070】
いくつかの実施形態では、変性条件は、化学処理を含む。いくつかの実施形態では、化学処理は、酸、塩基、有機溶媒、カオトロピック剤、クラウディング剤、キレート剤、デタージェント、又は塩溶液による処理を含む。
【0071】
いくつかの実施形態では、酸は、１ｍＭ～５００ｍＭ（例えば、２～４７５ｍＭ、３～４５０ｍＭ、４～４２５ｍＭ、５～４００ｍＭ、１０～３７５ｍＭ、１５～３５０ｍＭ、２０～３２５ｍＭ、３０～３００ｍＭ、４０～２７５ｍＭ、５０～２５０ｍＭ、６０～２２５ｍＭ、７０～２００ｍＭ、８０～１７５ｍＭ、９０～１５０ｍＭ、１００～１２５ｍＭ、又は１１０～１１５ｍＭ）の酢酸、塩酸、サリチル酸、リン酸、ホウ酸、ギ酸、シュウ酸、クエン酸、安息香酸、モノクロロ酢酸、ジクロロ酢酸、トリクロロ酢酸、アスコルビン酸、又は硝酸を含む。
【0072】
いくつかの実施形態では、塩基は、１ｍＭ～５００ｍＭ（例えば、２～４７５ｍＭ、３～４５０ｍＭ、４～４２５ｍＭ、５～４００ｍＭ、１０～３７５ｍＭ、１５～３５０ｍＭ、２０～３２５ｍＭ、３０～３００ｍＭ、４０～２７５ｍＭ、５０～２５０ｍＭ、６０～２２５ｍＭ、７０～２００ｍＭ、８０～１７５ｍＭ、９０～１５０ｍＭ、１００～１２５ｍＭ、若しくは１１０～１１５ｍＭ）の水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、イミダゾール、ヒスチジン、炭酸水素ナトリウム、グアニジン、又はトリエチルアミンを含む。
【0073】
いくつかの実施形態では、有機溶媒は、少なくとも０．１％（ｖ／ｖ）（例えば、少なくとも０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、４．５％、５％、５．５％、６％、６．５％、７％、７．５％、８％、８．５％、９％、９．５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、若しくはそれ以上；又は０．０１％～１０％）のジメチルスルホキシド、酢酸トリエチルアンモニウム、メタノール、エタノール、２－プロパノール、イソプロパノール、１－ブタノール、２－ブタノール、ｔ－ブタノール、イソブタノール、フェノール、クロロホルム、ヘキサン、アセトニトリル、ホルムアミド、アセトン、デナトニウム、又はプロピレングリコールを含む。
【0074】
いくつかの実施形態では、カオトロピック剤は、１００ｍＭ～８Ｍ（例えば、１５０ｍＭ～７．５Ｍ、２００ｍＭ～７Ｍ、２５０ｍＭ～６．５Ｍ、３００ｍＭ～６Ｍ、３５０ｍＭ～５．５Ｍ、４００ｍＭ～５Ｍ、４５０ｍＭ～４．５Ｍ、５００ｍＭ～４Ｍ、６００ｍＭ～３．５Ｍ、７００ｍＭ～３Ｍ、８００ｍＭ～２．５Ｍ、９００ｍＭ～２Ｍ、１Ｍ～１．５Ｍ、１．１Ｍ～１．４Ｍ、若しくは１．２～１．３Ｍ）の尿素、塩化グアニジニウム、過塩素酸リチウム、又はＰＥＧを含む。いくつかの実施形態では、カオトロピック剤は、１００ｍＭ～８Ｍ（例えば、１５０ｍＭ～７．５Ｍ、２００ｍＭ～７Ｍ、２５０ｍＭ～６．５Ｍ、３００ｍＭ～６Ｍ、３５０ｍＭ～５．５Ｍ、４００ｍＭ～５Ｍ、４５０ｍＭ～４．５Ｍ、５００ｍＭ～４Ｍ、６００ｍＭ～３．５Ｍ、７００ｍＭ～３Ｍ、８００ｍＭ～２．５Ｍ、９００ｍＭ～２Ｍ、１Ｍ～１．５Ｍ、１．１Ｍ～１．４Ｍ、若しくは１．２～１．３Ｍ）のｎ－ドデシルβ－ｄ－マルトシド、ｎ－オクチルグルコシド、ＣＨＡＰＳ、又はデオキシコール酸塩を含む。
【0075】
いくつかの実施形態では、クラウディング剤は、１００ｍＭ～８Ｍ（例えば、１５０ｍＭ～７．５Ｍ、２００ｍＭ～７Ｍ、２５０ｍＭ～６．５Ｍ、３００ｍＭ～６Ｍ、３５０ｍＭ～５．５Ｍ、４００ｍＭ～５Ｍ、４５０ｍＭ～４．５Ｍ、５００ｍＭ～４Ｍ、６００ｍＭ～３．５Ｍ、７００ｍＭ～３Ｍ、８００ｍＭ～２．５Ｍ、９００ｍＭ～２Ｍ、１Ｍ～１．５Ｍ、１．１Ｍ～１．４Ｍ、若しくは１．２～１．３Ｍ）のＰＥＧ、又は尿素を含む。
【0076】
いくつかの実施形態では、キレート剤は、１ｍＭ～１０ｍＭ（例えば、１～２ｍＭ、２～３ｍＭ、３～４ｍＭ、４～５ｍＭ、５～６ｍＭ、６～７ｍＭ、７～８ｍＭ、８～９ｍＭ、若しくは９～１０ｍＭ）のＥＧＴＡ若しくはその誘導体、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）若しくはその誘導体、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、イミノ－ジコハク酸（ＩＤＳ）、ポリアスパラギン酸、Ｓ，Ｓ－エチレンジアミン－Ｎ，Ｎ’－ジコハク酸（ＥＤＤＳ）、又はメチルグリシン二酢酸（ＭＧＤＡ）を含む。
【0077】
いくつかの実施形態では、デタージェントは、０．００５％～０．０５％（ｖ／ｖ）（例えば、０．００６～０．０４５％、０．００７～０．０４％、０．００８～０．０３５％、０．００９～０．０３％、０．０１～０．０２５％、０．０１１～０．０２％、０．０１２～０．０１９％、０．０１３～０．０１８％、０．０１４～０．０１７％、又は０．０１５～０．０１６％）のＮｏｎｉｄｅｔ Ｐ－４０（ＮＰ４０）、ＣＨＡＰＳ、オクチルβ－Ｄ－グルコピラノシド、ｎ－ドデシルβ－ｄ－マルトシド、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）－２０、又はＴｗｅｅｎ（登録商標）－８０を含む。
【0078】
いくつかの実施形態では、クロマトグラフィーは、液体クロマトグラフィーを含む。いくつかの実施形態では、液体クロマトグラフィーは、ＦＰＬＣ、ＨＰＬＣ、ＨＩＣ、ＡＥＣ、ＭＭＣ、又はアフィニティークロマトグラフィーからなる群から選択される。
【0079】
いくつかの実施形態では、純度の相対標準偏差（ＲＳＤ）は、５％未満（例えば、４．５％、４％、３．５％、３％、２．５％、２％、１．５％、１％、０．５％未満）である。
【0080】
定義
本開示の理解を促すため、いくつかの用語が以下に定義される。本明細書で定義される用語は、本開示に関連する領域における当業者によって一般に理解されているような意味を有する。
本開示の理解を促すため、いくつかの用語が以下に定義される。本明細書で定義される用語は、本開示に関連する領域における当業者によって一般に理解されているような意味を有する。
【0081】
本明細書において、「１つの（ａ）」及び「１つの（ａｎ）」は、特に断りのない限り、「少なくとも１つの」又は「１つ若しくは複数の」を意味する。また、単数形の「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、及び「その（ｔｈｅ）」は、文脈から明らかに他の解釈が求められる場合を除き、複数形の指示語を含む。
【0082】
本明細書で使用されるとき、「約」は、列挙値の±１０％の量を指す。
【0083】
本明細書で使用されるとき、「担体」という用語は、細胞への組成物（例えば、環状ポリリボヌクレオチド）の輸送又は送達を、部分又は完全カプセル化をした薬剤、又はその組み合わせを介して、環状ポリリボヌクレオチドの共有結合修飾によって容易にする化合物、組成物、試薬、又は分子である。担体の非限定的な例には、炭水化物担体（例えば、無水物修飾フィトグリコーゲン又はグリコーゲン型物質）、ナノ粒子（例えば、環状ポリリボヌクレオチドにカプセル化又は共有結合されるナノ粒子）、リポソーム、フソソーム、生体外で分化した網状赤血球、エキソソーム、タンパク質担体（例えば、ポリリボヌクレオチドに共有結合したタンパク質）、又はカチオン性担体（例えば、カチオン性リポポリマー又はトランスフェクション試薬）が含まれる。
【0084】
本明細書で使用されるとき、「クロマトグラフィー」という用語は、ｃｉｒｃＲＮＡ及び線状ポリリボヌクレオチド（ｌｉｎＲＮＡ）を含むポリリボヌクレオチドの混合集団から、環状ポリリボヌクレオチド（ｃｉｒｃＲＮＡ）の集団を精製及び濃縮するために使用することができる様々なクロマトグラフィー法を指す。クロマトグラフィーは、カラム及び非カラムクロマトグラフィー、例えば、キャピラリーゲル電気泳動などの電気泳動法を含む。クロマトグラフィーは、低圧又は常圧の液体クロマトグラフィー分離法を含む。これは、ＦＰＬＣ（逆相（ＲＰ）－ＦＰＬＣ及び順相（ＮＰ）－ＦＰＬＣ）、アフィニティークロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、又は混合モードクロマトグラフィーを含み得る。
【0085】
本明細書で使用されるとき、「ｃｉｒｃＲＮＡ」、「環状ポリリボヌクレオチド」、及び「環状ＲＮＡ」という用語は、互換的に使用され、遊離末端（即ち、遊離３’及び／又は５’末端）を有していない構造を有するポリリボヌクレオチド分子、例えば、共有結合又は非共有結合を介して環状又は末端のない構造を形成するポリリボヌクレオチド分子を意味する。環状ポリリボヌクレオチドは、例えば、共有的に閉じているポリリボヌクレオチドであってもよい。
【0086】
本明細書で使用するとき、「変性条件」という用語は、溶液中のポリヌクレオチドの分子構造を破壊する物理的若しくは化学的条件などの任意の条件、又は一連の条件を指す。変性条件下のポリヌクレオチドとしては、ｃｉｒｃＲＮＡ、ｌｉｎＲＮＡ、線状ポリデオキシリボヌクレオチド（ｌｉｎＤＮＡ）、又は環状ポリデオキシリボヌクレオチド（ｃｉｒｃＤＮＡ）を挙げることができる。変性条件とは、相補的な塩基対間の水素結合及び他の非共有結合力（例えば、ファンデルワールス力又は疎水性相互作用）が破壊され、それによって、例えば、二次若しくは三次ポリマー構造（中でも、例えば、二重らせん、ステムループ、スタッキング）などのポリヌクレオチド内の秩序構造を、生理学的条件下で観察される構造と比較して低減又は排除する条件を指す。変性条件は、１つ若しくは複数のポリヌクレオチドの核酸残基間の分子内相互作用又は分子間相互作用を低減、排除、又は再編成し得る。変性条件はまた、ポリマー内の連続する核酸モノマー間の共有結合（例えば、連続ヌクレオシド間のホスホジエステル結合など）が破壊される条件を指すこともある。理論に束縛されることは望まないが、ｃｉｒｃＲＮＡは、その環構造により可能な立体配座の範囲が制限され、変性に対する感受性が低くなるため、ｌｉｎＲＮＡと比較してサンプル中に選択的に濃縮され得るのに対して、ｌｉｎＲＮＡはより柔軟であるため、変性条件による二次及び三次構造の破壊を被りやすくなり得る。変性条件は、ｃｉｒｃＲＮＡ、ｌｉｎＲＮＡ、ｌｉｎＤＮＡ、ｃｉｒｃＤＮＡ、又はポリペプチドが曝露されるいくつかの条件のうちの１つを操作することにより、実験現場で作り出すことができる。変性条件の非限定的な例としては、例えば、熱変性、ショッククーリング、酸性若しくはアルカリ性ｐＨ（例えば、ｐＨ５未満若しくはｐＨ９以上）、又は化学処理（例えば、酸、塩基、有機溶媒、カオトロピック剤、キレート剤、クラウディング剤、デタージェント、又は塩溶液）が挙げられる。
【0087】
本明細書で使用されるとき、「溶出液」という用語は、精製ステップ（例えば、ＲＰ－ＦＰＬＣステップなどのクロマトグラフィーステップ）中に培地（例えば、疎水性固定相）から溶出される分析対象物質（例えば、ｃｉｒｃＲＮＡの濃縮集団）を含む画分を指す。溶出液は、溶出液を培地に適用することによって培地から放出させることができ、それによって分析物が放出される。より具体的には、溶出液は、溶出剤（例えば、有機溶媒を含む緩衝液などの溶出バッファー）の培地への適用後に培地から放出されたｃｉｒｃＲＮＡを含む画分を指すことができる。
【0088】
本明細書で使用されるとき、「ｌｉｎＲＮＡ」及び「線状ポリリボヌクレオチド」という用語は互換的に使用され、５’及び３’末端を有するポリリボヌクレオチドを指す。いくつかの実施形態では、ｌｉｎＲＮＡは、遊離５’末端又は３’末端を有する。いくつかの実施形態では、ｌｉｎＲＮＡは、非共有結合で連結された５’又は３’末端を有する。
【0089】
本明細書で使用されるとき、「修飾オリゴヌクレオチド」という用語は、糖、核酸塩基、又はヌクレオチド間結合に対する少なくとも１つの修飾を有するヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドを意味する。
【0090】
本明細書で使用されるとき、「修飾リボヌクレオチド」という用語は、糖、核酸塩基、又はヌクレオシド間結合に対する少なくとも１つの修飾を有するヌクレオシドを含むリボヌクレオチドを意味する。
【0091】
本明細書で使用されるとき、「裸の送達」という用語は、担体の助けを借りず、細胞への送達を助ける部分への共有結合修飾も使用しない、細胞への送達のための製剤である。裸の送達製剤には、トランスフェクション試薬、カチオン担体、炭水化物担体、ナノ粒子担体、又はタンパク質担体のいずれも含まれない。例えば、環状ポリリボヌクレオチドの裸の送達製剤は、共有結合修飾なしで環状ポリリボヌクレオチドを含み、担体を含まない製剤である。
【0092】
本明細書で使用されるとき、「ポリヌクレオチド」という用語は、１つ又は複数の核酸サブユニット又はヌクレオチドを含む分子を意味し、「核酸」又は「オリゴヌクレオチド」と互換的に使用することができる。ポリヌクレオチドは、アデノシン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）、及びウラシル（Ｕ）、又はそれらの変異体から選択される１つ又は複数のヌクレオチドを含み得る。ヌクレオチドは、ヌクレオシド及び少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、又はそれ以上のリン酸（ＰＯ３）基を含み得る。ヌクレオチドは、核酸塩基、五炭糖（リボース又はデオキシリボースのいずれか）、及び１つ又は複数のリン酸基を含み得る。リボヌクレオチドは、糖がリボースであるヌクレオチドである。ポリリボヌクレオチド、リボ核酸、又はＲＮＡは、ホスホジエステル結合を介して重合された複数のリボヌクレオチドを含む高分子を指し得る。デオキシリボヌクレオチドは、糖がデオキシリボースであるヌクレオチドである。
【0093】
本明細書で使用されるとき、「ポリリボヌクレオチドの混合集団」という語句は、ポリリボヌクレオチドの不均一な集団を指す。このようなポリリボヌクレオチドの不均一な集団は、ｃｉｒｃＲＮＡ、ｌｉｎＲＮＡ、及び任意選択で１つ若しくは複数の不純物又は副産物（例えば、本明細書に記載の１つ若しくは複数の不純物又は副産物）を含む。
【0094】
本明細書で使用されるとき、「ポリペプチド」は、ほとんどの場合ペプチド結合によって一緒に連結されたアミノ酸残基（天然又は非天然）のポリマーを意味する。この用語は、本明細書で使用されるとき、任意のサイズ、構造、又は機能のタンパク質、ポリペプチド、及びペプチドを指す。ポリペプチドには、遺伝子産物、天然に存在するポリペプチド、合成ポリペプチド、相同体、オルソログ、パラログ、それらの断片及び他の同等物、変異体、及び類似体が含まれ得る。ポリペプチドは、単一分子であっても、又は二量体、三量体、若しくは四量体などの多分子複合体であってもよい。ポリペプチドはまた、単鎖、又は抗体若しくはインスリンなどの多重鎖ポリペプチドを含み得、会合又は連結され得る。最も一般的なジスルフィド結合は、多重鎖ポリペプチドに見られる。ポリペプチドという用語は、１つ又は複数のアミノ酸残基が対応する天然に存在するアミノ酸の人工化学類似体であるアミノ酸ポリマーにも適用することができる。
【0095】
本明細書で互換的に使用されるとき、「ポリＡ」及び「ポリＡ配列」という用語は、少なくとも５ヌクレオチド長で、アデノシン残基からなる核酸分子の非翻訳、隣接領域を指す。いくつかの実施形態では、ポリＡ配列は、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、又は少なくとも５０ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、ポリＡ配列は、オープンリーディングフレーム（例えば、ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム）の３’側（例えば、その下流）に位置し、ポリＡ配列は、ポリＡが翻訳されないように、終結エレメント（例えば、停止コドン）の３’側に存在する。いくつかの実施形態では、ポリＡ配列は、終結配列及び３’非翻訳領域の３’側に位置する。
【0096】
本明細書で使用されるとき、「精製する」、「精製すること」、及び「精製」という用語は、他の物質の中でもとりわけ、ｃｉｒｃＲＮＡ及びｌｉｎＲＮＡの不均一な混合物を含むサンプルから、不純物若しくは副産物（例えば、ｌｉｎＲＮＡ）を除去して、不純物若しくは副産物（例えば、ｌｉｎＲＮＡ）のレベルが元の混合物と比較して低下した、ｃｉｒｃＲＮＡの濃縮集団を含む組成物、又はｌｉｎＲＮＡ若しくは物質が、出発混合物と比較して質量ベースで４０％若しくはそれ以上（例えば、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、若しくは９９％又はそれ以上）低下している組成物を生成する、１つ若しくは複数のステップ又はプロセスを指す。
【0097】
本明細書で使用されるとき、「純粋な」及び「純度」という用語は、分析物（例えば、ｃｉｒｃＲＮＡ）が単離されている、他の成分を含まない程度を指す。核酸（例えば、ポリリボヌクレオチド）との関連で、単離された核酸（例えば、ｃｉｒｃＲＮＡ）の純度は、任意の汚染物質（例えば、ｌｉｎＲＮＡ及び他の物質）を含まない核酸の集団に関して表すことができる。例えば、ｃｉｒｃＲＮＡの集団の純度は、単離された材料の全質量当たりのｃｉｒｃＲＮＡが集団にどのくらい存在するかを示し、例えば、参照としての純粋なｃｉｒｃＲＮＡを用いて決定され得る。本開示で見出される純度のレベルは、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９５％超、又は９９％超（ｗ／ｗ）であり得る。本開示のｃｉｒｃＲＮＡの「純粋な」集団は、質量ベースで２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％超、又は最大７０％純粋であり得る。ｃｉｒｃＲＮＡの「実質的に純粋な」集団は、混入物質又は不純物若しくは副産物（例えば、ｌｉｎＲＮＡ）を実質的に含まず、例えば、質量ベースで７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は＞９９％純粋であり得る。いくつかの実施形態では、汚染物質又は不純物又は副産物のレベルは、約２０％、１５％、１２％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、又は１％（ｗ／ｗ）以下である。純度は、特定の分析物（例えば、ｃｉｒｃＲＮＡ）のレベルを、ゲル電気泳動、分光光度法（例えば、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃによるＮａｎｏＤｒｏｐ）、又は核酸の集団の純度の測定に適した他の技術を用いて検出し、（例えば、当該技術分野で公知のアッセイによって決定する場合）全核酸含量に対する分析物のパーセンテージ（ｗ／ｗ）を計算することによって決定することができる。
【0098】
本明細書で使用されるとき、「１つ以上の不純物又は副産物を実質的に含まない」という語句は、１つ以上の不純物若しくは副産物（例えば、本明細書で開示される１つ以上の不純物又は副産物）を含まない、又は最小量の１つ以上の不純物若しくは副産物を含むサンプル、例えば、濃縮されたｃｉｒｃＲＮＡの集団を含むサンプルの特性を指す。最小量の１つ以上の不純物又は副産物は、２０％（ｗ／ｗ）以下（例えば、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％（ｗ／ｗ）以下、又はそれ以下）であってもよい。別の例では、サンプル又は濃縮されたｃｉｒｃＲＮＡの集団は、１つ以上の不純物又は副産物が、１５％（ｗ／ｗ）未満（例えば、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％（ｗ／ｗ）以下、又はそれ以下）の量で存在する場合、１つ以上の不純物又は副産物を実質的に含まない。別の例では、サンプル又は濃縮されたｃｉｒｃＲＮＡの集団は、１つ以上の不純物又は副産物が、１０％（ｗ／ｗ）未満（例えば、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％（ｗ／ｗ）以下、又はそれ以下）の量で存在する場合、１つ以上の不純物又は副産物を実質的に含まない。別の例では、サンプル又は濃縮されたｃｉｒｃＲＮＡの集団は、１つ以上の不純物又は副産物が、５％（ｗ／ｗ）未満（例えば、４％、３％、２％、１％（ｗ／ｗ）以下又はそれ以下）の量で存在する場合、１つ以上の不純物又は副産物を実質的に含まない。さらに別の例では、サンプル又は濃縮されたｃｉｒｃＲＮＡの集団は、１つ以上の不純物又は副産物が、１％未満（０．９％、０．８％、０．７％、０．６％、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％、０．１％（ｗ／ｗ）以下、又はそれ以下）の量で存在する場合、１つ以上の不純物又は副産物を実質的に含まない。
【0099】
本明細書で使用されるとき、「終結要素」は、環状又は線状ポリリボヌクレオチドにおける発現配列の翻訳を終結させる核酸配列などの部分である。
【0100】
本明細書で使用されるとき、「翻訳開始配列」は、環状又は線状ポリリボヌクレオチドにおける発現配列の翻訳を開始させる核酸配列である。
【0101】
本明細書で使用されるとき、「収率」という用語は、出発物質（例えば、ポリリボヌクレオチド、例えば、ｃｉｒｃＲＮＡ及びｌｉｎＲＮＡなどの混合集団）中の分析物の量と比較した、精製ステップ又はプロセス後に得られた分析物（例えば、ｃｉｒｃＲＮＡの集団）の相対量（ｗ／ｗ）を指す。収率は、パーセンテージとして表すことができる。本開示との関連で、出発物質中の分析物（例えば、ｃｉｒｃＲＮＡ）及び精製ステップ後に得られた分析物の量は、アッセイ（例えば、ゲル電気泳動又は分光光度法）を用いて測定することができる。本開示の方法を用いて、例えば、ポリリボヌクレオチドの混合集団又はｃｉｒｃＲＮＡの濃縮集団中に存在する量と比較して、約２０％（ｗ／ｗ）又はそれ以上のｃｉｒｃＲＮＡの濃縮集団の収率をもたらすことができる。例えば、本方法を用いて、約２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、若しくは９０％（ｗ／ｗ）又はそれ以上の精製ｃｉｒｃＲＮＡの収率をもたらすことができる。
【0102】
本発明の他の特徴及び利点は、以下の詳細な説明、図面、及び特許請求の範囲から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【0103】
【図1】５ｍＬ ＤＥＡＥセファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）弱ＡＥＸカラムを用いた、尿素を含まないｃｉｒｃＲＮＡの精製のクロマトグラム結果を示す。
【図2】５ｍＬ ＤＥＡＥセファロース弱ＡＥＸカラムで、変性条件として、カオトロピック塩である尿素を用いたｃｉｒｃＲＮＡの精製のクロマトグラム結果を示す。
【図3】８ｍＬ ＤＥＡＥ弱ＡＥＸモノリスカラムで、変性条件として、カオトロピック塩である尿素を用いたｃｉｒｃＲＮＡの精製のクロマトグラム結果を示す。
【図4】８ｍＬ ＱＡ強ＡＥＸモノリスカラムで、変性条件として、カオトロピック塩である尿素を用いた１５ｍｇのｃｉｒｃＲＮＡの精製のクロマトグラム結果を示す。
【図5】８ｍＬ ＰｒｉｍａＳモノリスカラムで、変性条件として、カオトロピック塩である尿素及びｐＨを用いた７ｍｇのｃｉｒｃＲＮＡを精製のクロマトグラム結果を示す。
【図6】１ｍＬ ＨＩＣモノリスカラムを用いた、高塩及び尿素変性条件によるｃｉｒｃＲＮＡの精製後のクロマトグラム結果を示す。
【図7】１ｍＬ ＨＩＣモノリスカラムを用いた、高塩及び尿素変性条件によるｃｉｒｃＲＮＡの精製後のゲル電気泳動結果を示す。
【図8】温度、カオトロピック剤、及び有機溶媒変性条件を用いた分離後のｃｉｒｃＲＮＡ及びｌｉｎＲＮＡの分離の例示的なクロマトグラム結果を示す。
【図9】温度、カオトロピック剤、及び有機溶媒変性条件を用いたｃｉｒｃＲＮＡ及びｌｉｎＲＮＡの分離後のＨＰＬＣ分析結果を示す。
【図10】温度、カオトロピック剤、及び有機溶媒変性条件を用いたｃｉｒｃＲＮＡ及びｌｉｎＲＮａの分離後のＨＰＬＣ分析結果を示す。
【図11】温度及びカオトロピック剤条件を用いたｃｉｒｃＲＮＡの精製後の例示的なクロマトグラム結果を示す。
【図12】温度及びカオトロピック剤条件を用いたｃｉｒｃＲＮＡの精製後の例示的なゲル電気泳動結果を示す。
【図13】高温及び有機溶媒変性条件を用いたｃｉｒｃＲＮＡの精製後の例示的なクロマトグラム結果を示す。
【図14】２回の水注入後のｃｉｒｃＲＮＡの例示的なクロマトグラムを示す。
【図15】ブランク注入の例示的なクロマトグラムを示す。
【図16】個別のピークを有するｃｉｒｃＲＮＡ及びｌｉｎＲＮＡ標準物質の例示的なクロマトグラムを示す。
【発明を実施するための形態】
【0104】
本明細書には、ｃｉｒｃＲＮＡ及び線状ポリリボヌクレオチド（ｌｉｎＲＮＡ）を含むポリリボヌクレオチドの不均一な集団から、環状ポリリボヌクレオチド（ｃｉｒｃＲＮＡ）を精製及び濃縮する方法が開示され、上記精製及び濃縮は変性条件下で行われる。また、ｃｉｒｃＲＮＡ及びｌｉｎＲＮＡを含むポリリボヌクレオチドの集団を、例えば、１種若しくは複数種の不純物又は副産物を実質的に含まない溶液などの変性条件下の溶液中に含む組成物も開示される。さらに本開示の範囲には、ｃｉｒｃＲＮＡの濃縮集団を含む組成物、例えば、１つ若しくは複数の変性条件に曝露することによって製造された組成物も含まれる。本開示は、部分的には、変性条件（例えば、熱変性、ｐＨ、又は化学処理）下でのｃｉｒｃＲＮＡの分離が、ｃｉｒｃＲＮＡ、ｌｉｎＲＮＡ、又は他の不純物若しくは副産物を含む混合ポリリボヌクレオチドの集団からｃｉｒｃＲＮＡを精製及び濃縮する頑健な方法であり、それによって、他の方法と比較して、回収されたｃｉｒｃＲＮＡの精製及び収率が改善されるという本発明者らの発見に基づく。さらに、開示された方法は、ｃｉｒｃＲＮＡ精製プロセスのスケールアップを容易にし、それによって大量のｃｉｒｃＲＮＡの生産及び精製が可能になる。
【0105】
環状ポリリボヌクレオチドの精製
本開示は、ｃｉｒｃＲＮＡ及びｌｉｎＲＮＡを含むポリリボヌクレオチドの不均一な集団を含むサンプルからｃｉｒｃＲＮＡを精製及び濃縮する方法を特徴とし、精製は、本明細書に開示される変性条件下で行われる。本開示に関連して、精製は、ポリリボヌクレオチドの混合集団（例えば、ｌｉｎＲＮＡ及びｃｉｒｃＲＮＡ）並びに望ましくない不純物又は副産物（例えば、本明細書に記載される不純物又は副産物）を含むサンプルからの標的ポリリボヌクレオチド集団（例えば、ｃｉｒｃＲＮＡ）の単離及び濃縮を指す。したがって、精製後、ｃｉｒｃＲＮＡは、ｃｉｒｃＲＮＡの精製集団が得られたサンプル中と比較して、総ポリリボヌクレオチドの増加したパーセント（ｗ／ｗ）又は高い濃度で存在する。サンプル中の不要な不純物又は副産物は、ｌｉｎＲＮＡ、ポリアクリルアミド、ホウ酸、マグネシウム、若しくはエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、又はそれらの任意の組み合わせであり得る。開示された方法は、ｃｉｒｃＲＮＡの純度が、ｃｉｒｃＲＮＡの濃縮集団中好ましくは可能な限り１００％に近づくように、ポリリボヌクレオチドの混合集団からｃｉｒｃＲＮＡを精製及び濃縮する。本方法を用いて、約５％～約９９％以上（例えば、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９５％超、例えば９７％若しくは９９％、又は９９％超）の純度を有するｃｉｒｃＲＮＡの濃縮集団を調製することができる。いくつかの実施形態では、ｃｉｒｃＲＮＡの濃縮集団の純度は、濃縮集団中のｌｉｎＲＮＡ又は１種若しくは複数種の不純物若しくは副産物のパーセンテージ量に対する濃縮集団のｃｉｒｃＲＮＡの量のパーセンテージ（例えば、パーセンテージ量）として測定される。例えば、９５％の純度を有するｃｉｒｃＲＮＡの濃縮集団は、９５％のｃｉｒｃＲＮＡ及び５％のｌｉｎＲＮＡ又は１種若しくは複数種の不純物若しくは副産物を含む。
本開示は、ｃｉｒｃＲＮＡ及びｌｉｎＲＮＡを含むポリリボヌクレオチドの不均一な集団を含むサンプルからｃｉｒｃＲＮＡを精製及び濃縮する方法を特徴とし、精製は、本明細書に開示される変性条件下で行われる。本開示に関連して、精製は、ポリリボヌクレオチドの混合集団（例えば、ｌｉｎＲＮＡ及びｃｉｒｃＲＮＡ）並びに望ましくない不純物又は副産物（例えば、本明細書に記載される不純物又は副産物）を含むサンプルからの標的ポリリボヌクレオチド集団（例えば、ｃｉｒｃＲＮＡ）の単離及び濃縮を指す。したがって、精製後、ｃｉｒｃＲＮＡは、ｃｉｒｃＲＮＡの精製集団が得られたサンプル中と比較して、総ポリリボヌクレオチドの増加したパーセント（ｗ／ｗ）又は高い濃度で存在する。サンプル中の不要な不純物又は副産物は、ｌｉｎＲＮＡ、ポリアクリルアミド、ホウ酸、マグネシウム、若しくはエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、又はそれらの任意の組み合わせであり得る。開示された方法は、ｃｉｒｃＲＮＡの純度が、ｃｉｒｃＲＮＡの濃縮集団中好ましくは可能な限り１００％に近づくように、ポリリボヌクレオチドの混合集団からｃｉｒｃＲＮＡを精製及び濃縮する。本方法を用いて、約５％～約９９％以上（例えば、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９５％超、例えば９７％若しくは９９％、又は９９％超）の純度を有するｃｉｒｃＲＮＡの濃縮集団を調製することができる。いくつかの実施形態では、ｃｉｒｃＲＮＡの濃縮集団の純度は、濃縮集団中のｌｉｎＲＮＡ又は１種若しくは複数種の不純物若しくは副産物のパーセンテージ量に対する濃縮集団のｃｉｒｃＲＮＡの量のパーセンテージ（例えば、パーセンテージ量）として測定される。例えば、９５％の純度を有するｃｉｒｃＲＮＡの濃縮集団は、９５％のｃｉｒｃＲＮＡ及び５％のｌｉｎＲＮＡ又は１種若しくは複数種の不純物若しくは副産物を含む。
【0106】
加えて、本方法を用いて、ポリリボヌクレオチドの混合集団中又はｃｉｒｃＲＮＡの濃縮集団中に存在する量に対して、約２０％（ｗ／ｗ）以上のｃｉｒｃＲＮＡの濃縮集団の収率をもたらすことができる。例えば、本方法を用いて、濃縮集団中のポリリボヌクレオチドの総量に対して約２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、若しくは９０％（ｗ／ｗ）又はそれ以上の量のｃｉｒｃＲＮＡを含むｃｉｒｃＲＮＡの濃縮集団の収率をもたらすことができる。或いは、ｃｉｒｃＲＮＡの濃縮集団は、ｃｉｒｃＲＮＡ及びｌｉｎＲＮＡを含むポリリボヌクレオチドの混合集団に対して、約２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、若しくは９０％（ｗ／ｗ）又はそれ以上の量のｃｉｒｃＲＮＡを含有し得る。さらにまた、ｃｉｒｃＲＮＡの濃縮集団は、濃縮集団中のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ若しくはＤＮＡ）の総量又はポリリボヌクレオチドの混合集団中のポリヌクレオチドの総量に対して、約２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、若しくは９０％（ｗ／ｗ）又はそれ以上の量のｃｉｒｃＲＮＡを含有し得る。
【0107】
ここに開示される精製方法は、ｃｉｒｃＲＮＡの分取精製方法に使用することができるが、開示されている方法は、ｃｉｒｃＲＮＡの分析精製にも有利である。分取精製は、比較的大量のＲＮＡの精製に関する。例えば、分取精製を用いて、少なくとも０．５ｍｇ（例えば、少なくとも０．６、０．８、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００ｍｇ、又はそれ以上）のＲＮＡ量を精製することができる。この方法の利点は、小規模精製に適した他の方法（例えば、アガロースゲル電気泳動）を用いて可能な量よりも大量のｃｉｒｃＲＮＡを精製できることである。
【0108】
変性条件
理論に拘束されることは望まないが、本開示は、部分的には、変性条件下でｃｉｒｃＲＮＡの精製を実施することができるという本発明者らの驚くべき発見に基づく。本開示に関連して、変性条件は、相補的な塩基対間の水素結合及び他の非共有結合力（例えば、ファンデルワールス力又は疎水性相互作用）が破壊され、それによって、例えば、二次若しくは三次ポリマー構造（例えば、とりわけ、二重らせん、ステムループ、スタッキングなど）のようなポリヌクレオチド内の秩序構造が、生理学的条件下で観察される構造と比較して低減又は排除される条件を指す。変性条件はまた、例えば、連続ヌクレオシド間のホスホジエステル結合のように、ポリマー内の連続核酸モノマー間の共有結合が破壊される条件も指す。さらに、他の不純物又は副産物の中でも、ｌｉｎＲＮＡからのｃｉｒｃＲＮＡの濃縮又は分離は、変性条件によって改善され得る。このような方法は、当技術分野において既知のＲＮＡ精製方法のハイスループットでのスケールアップ又はスケールアウトに特に適している。したがって、本開示は、様々な精製方法、例えば、本明細書に開示されるものを用いて、ポリリボヌクレオチドの混合集団を含むサンプルを処理するために使用され得る様々な変性条件を提供する。
理論に拘束されることは望まないが、本開示は、部分的には、変性条件下でｃｉｒｃＲＮＡの精製を実施することができるという本発明者らの驚くべき発見に基づく。本開示に関連して、変性条件は、相補的な塩基対間の水素結合及び他の非共有結合力（例えば、ファンデルワールス力又は疎水性相互作用）が破壊され、それによって、例えば、二次若しくは三次ポリマー構造（例えば、とりわけ、二重らせん、ステムループ、スタッキングなど）のようなポリヌクレオチド内の秩序構造が、生理学的条件下で観察される構造と比較して低減又は排除される条件を指す。変性条件はまた、例えば、連続ヌクレオシド間のホスホジエステル結合のように、ポリマー内の連続核酸モノマー間の共有結合が破壊される条件も指す。さらに、他の不純物又は副産物の中でも、ｌｉｎＲＮＡからのｃｉｒｃＲＮＡの濃縮又は分離は、変性条件によって改善され得る。このような方法は、当技術分野において既知のＲＮＡ精製方法のハイスループットでのスケールアップ又はスケールアウトに特に適している。したがって、本開示は、様々な精製方法、例えば、本明細書に開示されるものを用いて、ポリリボヌクレオチドの混合集団を含むサンプルを処理するために使用され得る様々な変性条件を提供する。
【0109】
熱変性
本明細書に開示される方法は、例えば、ｃｉｒｃＲＮＡ、ｌｉｎＲＮＡ、及び多様な他の不純物又は副産物（例えば、塩、マグネシウム、尿素、ホウ酸など）を含むポリリボヌクレオチドの混合集団からｃｉｒｃＲＮＡを濃縮するための、高温、低温、又は可変温度条件の使用を包含する。例えば、熱変性は、例えば、少なくとも５０℃、少なくとも５５℃、少なくとも６０℃、少なくとも６５℃、少なくとも７０℃、少なくとも７５℃、少なくとも８０℃、少なくとも８５℃、少なくとも９０℃、少なくとも９５℃、少なくとも１００℃、又はそれ以上の温度のような高温条件下で行うことができる。一例では、熱変性は、少なくとも５０℃の温度下で実施する。別の例では、熱変性は、少なくとも５０℃、且つ８５℃以下の温度下で実施する。これらの温度条件下での熱変性は、例えば、ポリヌクレオチド内の分子内水素結合を破壊することにより、ポリヌクレオチド（中でも、例えばｃｉｒｃＲＮＡ及びｌｉｎＲＮＡ）を変性させるのに十分な時間をかけて実施することができる。例えば、熱変性は、前述の温度で、少なくとも１分、２分、３分、４分、５分、６分、７分、８分、９分、１０分、１１分、１２分、１３分、１４分、１５分、１６分、１７分、１８分、１９分、２０分、２１分、２２分、２３分、２４分、２５分、２６分、２７分、２８分、２９分、３０分、３１分、３２分、３３分、３４分、３５分、３６分、３７分、３８分、３９分、４０分、４１分、４２分、４３分、４４分、４５分、４６分、４７分、４８分、４９分、５０分、又はそれ以上の時間をかけて実施することができる。熱変性条件への曝露は、連続的又は不連続的のいずれでもよい（例えば、３０秒、１分、２分、３分、４分、５分、６分、７分、８分、９分、１０分、又はそれ以上の時間間隔をあけた２つの５分ブロックで、高温条件に１０分曝露）。
本明細書に開示される方法は、例えば、ｃｉｒｃＲＮＡ、ｌｉｎＲＮＡ、及び多様な他の不純物又は副産物（例えば、塩、マグネシウム、尿素、ホウ酸など）を含むポリリボヌクレオチドの混合集団からｃｉｒｃＲＮＡを濃縮するための、高温、低温、又は可変温度条件の使用を包含する。例えば、熱変性は、例えば、少なくとも５０℃、少なくとも５５℃、少なくとも６０℃、少なくとも６５℃、少なくとも７０℃、少なくとも７５℃、少なくとも８０℃、少なくとも８５℃、少なくとも９０℃、少なくとも９５℃、少なくとも１００℃、又はそれ以上の温度のような高温条件下で行うことができる。一例では、熱変性は、少なくとも５０℃の温度下で実施する。別の例では、熱変性は、少なくとも５０℃、且つ８５℃以下の温度下で実施する。これらの温度条件下での熱変性は、例えば、ポリヌクレオチド内の分子内水素結合を破壊することにより、ポリヌクレオチド（中でも、例えばｃｉｒｃＲＮＡ及びｌｉｎＲＮＡ）を変性させるのに十分な時間をかけて実施することができる。例えば、熱変性は、前述の温度で、少なくとも１分、２分、３分、４分、５分、６分、７分、８分、９分、１０分、１１分、１２分、１３分、１４分、１５分、１６分、１７分、１８分、１９分、２０分、２１分、２２分、２３分、２４分、２５分、２６分、２７分、２８分、２９分、３０分、３１分、３２分、３３分、３４分、３５分、３６分、３７分、３８分、３９分、４０分、４１分、４２分、４３分、４４分、４５分、４６分、４７分、４８分、４９分、５０分、又はそれ以上の時間をかけて実施することができる。熱変性条件への曝露は、連続的又は不連続的のいずれでもよい（例えば、３０秒、１分、２分、３分、４分、５分、６分、７分、８分、９分、１０分、又はそれ以上の時間間隔をあけた２つの５分ブロックで、高温条件に１０分曝露）。
【0110】
また、熱変性は、可変温度条件下で行うこともできる。例えば、ショッククーリングは、ｃｉｒｃＲＮＡ及びｌｉｎＲＮＡを含むポリリボヌクレオチドの異種混合物を含むサンプルに対して、初めにサンプルを高温条件（例えば、前述の高温条件）に少なくとも１分、２分、３分、４分、５分、６分、７分、８分、９分、１０分、１１分、１２分、１３分、１４分、１５分、１６分、１７分、１８分、１９分、２０分、又はそれ以上の時間にわたって曝露し、その後直ちに低温条件に曝露する。低温条件は、８℃以下（例えば、７℃、６℃、５℃、４℃、３℃、２℃、１℃、０℃、－１℃、－２℃、－３℃、－４℃、－５℃、－６℃、－７℃、－９℃、－１０℃、－１５℃、－２０℃、－２５℃、－３０℃、－３５℃、－４０℃、－４５℃、－５０℃、－５５℃、－６０℃、－６５℃、－７０℃、－７５℃、－８０℃、若しくは以下）の温度を含み得る。一般に、ショッククーリングは、高温条件と低温条件との間の時間差が短くなるように実施される。したがって、サンプルの高温条件への暴露から低温条件への暴露までの時間は、一般に、１分以下、５５秒以下、５０秒以下、４５秒以下、４０秒以下、３５秒以下、３０秒以下、２５秒以下、２０秒以下、１５秒以下、１０秒以下、９秒以下、８秒以下、７秒以下、６秒以下、５秒以下、４秒以下、３秒以下、２秒以下、１秒以下である。低温条件へのサンプルの暴露は、少なくとも１０秒、２０秒、３０秒、４０秒、５０秒、１分、２分、３分、４分、５分、６分、７分、８分、９分、１０分、１１分、１２分、１３分、１４分、１５分、１６分、１７分、１８分、１９分、２０分、又はそれ以上の時間であってもよい。
【0111】
前述の熱変性プロトコルは、本明細書に開示するクロマトグラフィー分離方法の前にサンプルに対して実施することができる。或いは、熱変性は、開示される方法を用いたクロマトグラフィー分離後のサンプルに対して実施することもできる。さらには、サンプルのクロマトグラフィー精製と並行して（即ち、精製工程中に）熱変性を実施することもできる。例えば、サンプルをクロマトグラフィーカラムにロードする前に、サンプルのポリリボヌクレオチド中の分子内水素結合を変性させるのに十分な高温で、サンプル又は移動相をプレインキュベートすることができる。別の例では、クロマトグラフィー分離工程中の熱変性は、ｌｉｎＲＮＡの変性には十分であるがｃｉｒｃＲＮＡの変性には十分でない所望の温度条件を達成するために、精製に使用するカラムの周囲にジャケット又はスリーブを配置することによって実施してもよい。したがって、サンプル内のｌｉｎＲＮＡの熱変性は、平衡化ステップ、サンプルロードステップ、カラム洗浄ステップ、及び溶離ステップなど、クロマトグラフィー分離プロセスのどの段階でも実施することができる。さらにまた、サンプルのクロマトグラフィー精製がない場合でも、サンプルに対して熱変性を実施することができる。
【0112】
ｐＨ変性
開示された方法によれば、ｃｉｒｃＲＮＡ及びｌｉｎＲＮＡを含むポリリボヌクレオチドの混合集団を含むサンプルから、サンプルを変性ｐＨ条件に曝露することによって、ｃｉｒｃＲＮＡを選択的に精製及び濃縮することができる。例示的なｐＨ条件は、酸性条件（例えば、７未満のｐＨ）又はアルカリ性条件（７超のｐＨ）を含み、これらは、ポリリボヌクレオチドのヌクレオチド内のイオン化可能な基のイオン化を引き起こし、二次構造の消失と、ｃｉｒｃＲＮＡではなくｌｉｎＲＮＡの選択的な変性をもたらす。例えば、好適なｐＨ変性条件としては、５未満のｐＨ（例えば、４．５、４．０、３．５、３．０、若しくはそれ以下のｐＨ）又は９を超えるｐＨ（例えば、９．５、１０、１０．５、１１、若しくはそれ以上のｐＨ）が挙げられる。
開示された方法によれば、ｃｉｒｃＲＮＡ及びｌｉｎＲＮＡを含むポリリボヌクレオチドの混合集団を含むサンプルから、サンプルを変性ｐＨ条件に曝露することによって、ｃｉｒｃＲＮＡを選択的に精製及び濃縮することができる。例示的なｐＨ条件は、酸性条件（例えば、７未満のｐＨ）又はアルカリ性条件（７超のｐＨ）を含み、これらは、ポリリボヌクレオチドのヌクレオチド内のイオン化可能な基のイオン化を引き起こし、二次構造の消失と、ｃｉｒｃＲＮＡではなくｌｉｎＲＮＡの選択的な変性をもたらす。例えば、好適なｐＨ変性条件としては、５未満のｐＨ（例えば、４．５、４．０、３．５、３．０、若しくはそれ以下のｐＨ）又は９を超えるｐＨ（例えば、９．５、１０、１０．５、１１、若しくはそれ以上のｐＨ）が挙げられる。
【0113】
一例では、ｐＨ変性は、ｐＨ４．９で実施される。別の例では、ｐＨ変性は、ｐＨ４．８で実施される。別の例では、ｐＨ変性は、ｐＨ４．７で実施される。別の例では、ｐＨ変性は、ｐＨ４．６で実施される。別の例では、ｐＨ変性は、ｐＨ４．５で実施される。別の例では、ｐＨ変性は、ｐＨ４．４で実施される。別の例では、ｐＨ変性は、ｐＨ４．３で実施される。別の例では、ｐＨ変性は、ｐＨ４．２で実施される。別の例では、ｐＨ変性は、ｐＨ４．１で実施される。別の例では、ｐＨ変性は、ｐＨ４．０で実施される。別の例では、ｐＨ変性は、ｐＨ３．９で実施される。別の例では、ｐＨ変性は、ｐＨ３．８で実施される。別の例では、ｐＨ変性は、ｐＨ３．８で実施される。別の例では、ｐＨ変性は、ｐＨ３．７で実施される。別の例では、ｐＨ変性は、ｐＨ３．６で実施される。別の例では、ｐＨ変性は、ｐＨ３．５で実施される。別の例では、ｐＨ変性は、ｐＨ３．４で実施される。別の例では、ｐＨ変性は、ｐＨ３．３で実施される。別の例では、ｐＨ変性は、ｐＨ３．２で実施される。別の例では、ｐＨ変性は、ｐＨ３．１で実施される。さらに別の例では、ｐＨ変性は、ｐＨ３．０で実施される。
【0114】
さらに別の例では、ｐＨ変性は、ｐＨ９．１で実施される。別の例では、ｐＨ変性は、ｐＨ９．２で実施される。別の例では、ｐＨ変性は、ｐＨ９．３で実施される。別の例では、ｐＨ変性は、ｐＨ９．４で実施される。別の例では、ｐＨ変性は、ｐＨ９．５で実施される。別の例では、ｐＨ変性は、ｐＨ９．６で実施される。別の例では、ｐＨ変性は、ｐＨ９．７で実施される。別の例では、ｐＨ変性は、ｐＨ９．８で実施される。別の例では、ｐＨ変性は、ｐＨ９．９で実施される。別の例では、ｐＨ変性は、ｐＨ１０で実施される。別の例では、ｐＨ変性は、ｐＨ１０．１で実施される。別の例では、ｐＨ変性は、ｐＨ１０．２で実施される。別の例では、ｐＨ変性は、ｐＨ１０．３で実施される。別の例では、ｐＨ変性は、ｐＨ１０．４で実施される。別の例では、ｐＨ変性は、ｐＨ１０．５で実施される。別の例では、ｐＨ変性は、ｐＨ１０．６で実施される。別の例では、ｐＨ変性は、ｐＨ１０．７で実施される。別の例では、ｐＨ変性は、ｐＨ１０．８で実施される。さらに別の例では、ｐＨ変性は、ｐＨ１０．９で実施される。別の例では、ｐＨ変性は、ｐＨ１１で実施される。
【0115】
前述のｐＨ変性プロトコルは、本明細書に開示されるクロマトグラフィー分離方法の前にサンプルに対して実施することができる。或いは、ｐＨ変性は、開示した方法を用いたクロマトグラフィー分離後のサンプルに対して実施することもできる。さらに、ｐＨ変性は、サンプルのクロマトグラフィー精製と並行して（即ち、精製工程中に）実施することができる。例えば、クロマトグラフィーカラム中に使用されるサンプルバッファー（例えば、ローディングバッファー）は、サンプルのポリリボヌクレオチドの分子内水素結合を変性させるのに十分なｐＨを有するように選択又は調節することができる。したがって、サンプル内のｌｉｎＲＮＡのｐＨ変性は、平衡化ステップ、サンプルロードステップ、カラム洗浄ステップ、及び溶離ステップなど、クロマトグラフィー分離プロセスの任意の段階で実施することができる。さらに、サンプルのクロマトグラフィー精製を行わない場合も、サンプルに対してｐＨ変性を実施することができる。
【0116】
化学的変性
ｌｉｎＲＮＡ、ｃｉｒｃＲＮＡ、及び任意選択で１種若しくは複数種の不純物又は副産物を含むポリリボヌクレオチドの混合集団を含むサンプルからｃｉｒｃＲＮＡを選択的に濃縮及び精製するための本開示に包含される別の方法は、化学処理による変性である。本開示に関連して、化学処理による変性は、１種若しくは複数種の変性酸、塩基、有機溶媒、カオトロピック剤、キレート剤、クラウディング剤、デタージェント、又は塩溶液による処理を包含する。
ｌｉｎＲＮＡ、ｃｉｒｃＲＮＡ、及び任意選択で１種若しくは複数種の不純物又は副産物を含むポリリボヌクレオチドの混合集団を含むサンプルからｃｉｒｃＲＮＡを選択的に濃縮及び精製するための本開示に包含される別の方法は、化学処理による変性である。本開示に関連して、化学処理による変性は、１種若しくは複数種の変性酸、塩基、有機溶媒、カオトロピック剤、キレート剤、クラウディング剤、デタージェント、又は塩溶液による処理を包含する。
【0117】
酸変性剤
酸変性は、酸性溶液がＲＮＡ分子内のイオン化可能な基をプロトン化し得るという根拠に基づき、本明細書に開示される精製方法を変性させるのに適した方法である。ｌｉｎＲＮＡ、ｃｉｒｃＲＮＡ、及び任意選択で１種若しくは複数種の不純物又は副産物を含むポリリボヌクレオチドの混合集団を含むサンプルからのｃｉｒｃＲＮＡの選択的濃縮及び精製に使用するのに好適な酸は、少なくとも０．５％（ｖ／ｖ）（例えば、少なくとも１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、４．５％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、若しくはそれ以上）の酢酸、塩酸、サリチル酸、リン酸、ホウ酸、ギ酸、シュウ酸、クエン酸、安息香酸、モノクロロ酢酸、ジクロロ酢酸、トリクロロ酢酸、アスコルビン酸、又は硝酸を含む。いくつかの実施形態では、ｌｉｎＲＮＡ、ｃｉｒｃＲＮＡ、及び任意選択で１種若しくは複数種の不純物又は副産物を含むポリリボヌクレオチドの混合集団を含むサンプルからのｃｉｒｃＲＮＡの選択的濃縮及び精製に使用するのに好適な酸は、１ｍＭ～５００ｍＭ（例えば、２～４７５ｍＭ、３～４５０ｍＭ、４～４２５ｍＭ、５～４００ｍＭ、１０～３７５ｍＭ、１５～３５０ｍＭ、２０～３２５ｍＭ、３０～３００ｍＭ、４０～２７５ｍＭ、５０～２５０ｍＭ、６０～２２５ｍＭ、７０～２００ｍＭ、８０～１７５ｍＭ、９０～１５０ｍＭ、１００～１２５ｍＭ、若しくは１１０～１１５ｍＭ）の酢酸、塩酸、サリチル酸、リン酸、ホウ酸、ギ酸、シュウ酸、クエン酸、安息香酸、モノクロロ酢酸、ジクロロ酢酸、トリクロロ酢酸、アスコルビン酸、又は硝酸を含む。
酸変性は、酸性溶液がＲＮＡ分子内のイオン化可能な基をプロトン化し得るという根拠に基づき、本明細書に開示される精製方法を変性させるのに適した方法である。ｌｉｎＲＮＡ、ｃｉｒｃＲＮＡ、及び任意選択で１種若しくは複数種の不純物又は副産物を含むポリリボヌクレオチドの混合集団を含むサンプルからのｃｉｒｃＲＮＡの選択的濃縮及び精製に使用するのに好適な酸は、少なくとも０．５％（ｖ／ｖ）（例えば、少なくとも１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、４．５％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、若しくはそれ以上）の酢酸、塩酸、サリチル酸、リン酸、ホウ酸、ギ酸、シュウ酸、クエン酸、安息香酸、モノクロロ酢酸、ジクロロ酢酸、トリクロロ酢酸、アスコルビン酸、又は硝酸を含む。いくつかの実施形態では、ｌｉｎＲＮＡ、ｃｉｒｃＲＮＡ、及び任意選択で１種若しくは複数種の不純物又は副産物を含むポリリボヌクレオチドの混合集団を含むサンプルからのｃｉｒｃＲＮＡの選択的濃縮及び精製に使用するのに好適な酸は、１ｍＭ～５００ｍＭ（例えば、２～４７５ｍＭ、３～４５０ｍＭ、４～４２５ｍＭ、５～４００ｍＭ、１０～３７５ｍＭ、１５～３５０ｍＭ、２０～３２５ｍＭ、３０～３００ｍＭ、４０～２７５ｍＭ、５０～２５０ｍＭ、６０～２２５ｍＭ、７０～２００ｍＭ、８０～１７５ｍＭ、９０～１５０ｍＭ、１００～１２５ｍＭ、若しくは１１０～１１５ｍＭ）の酢酸、塩酸、サリチル酸、リン酸、ホウ酸、ギ酸、シュウ酸、クエン酸、安息香酸、モノクロロ酢酸、ジクロロ酢酸、トリクロロ酢酸、アスコルビン酸、又は硝酸を含む。
【0118】
一例では、ｃｉｒｃＲＮＡではなく、ｌｉｎＲＮＡの選択的変性は、ｌｉｎＲＮＡ、ｃｉｒｃＲＮＡ、及び任意で１種若しくは複数種の不純物又は副産物を含むポリリボヌクレオチドの混合集団を含むサンプルを、少なくとも０．５％（ｖ／ｖ）（例えば、少なくとも１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、４．５％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、若しくはそれ以上）の酢酸を含む溶液に曝露するステップによって実施される。いくつかの実施形態では、ｃｉｒｃＲＮＡではなく、ｌｉｎＲＮＡの選択的変性は、ｌｉｎＲＮＡ、ｃｉｒｃＲＮＡ、及び任意選択で１種若しくは複数種の不純物又は副産物を含むポリリボヌクレオチドの混合集団を含むサンプルを、１ｍＭ～５００ｍＭ（例えば、２～４７５ｍＭ、３～４５０ｍＭ、４～４２５ｍＭ、５～４００ｍＭ、１０～３７５ｍＭ、１５～３５０ｍＭ、２０～３２５ｍＭ、３０～３００ｍＭ、４０～２７５ｍＭ、５０～２５０ｍＭ、６０～２２５ｍＭ、７０～２００ｍＭ、８０～１７５ｍＭ、９０～１５０ｍＭ、１００～１２５ｍＭ、若しくは１１０～１１５ｍＭ）の酢酸を含む溶液に曝露するステップによって実施される。
【0119】
別の例では、酸変性は、少なくとも０．５％（ｖ／ｖ）（例えば、少なくとも１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、４．５％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、若しくはそれ以上）の塩酸を含む溶液にサンプルを曝露するステップによって実施される。いくつかの実施形態では、ｃｉｒｃＲＮＡではなく、ｌｉｎＲＮＡの選択的変性は、ｌｉｎＲＮＡ、ｃｉｒｃＲＮＡ、及び任意選択で１種若しくは複数種の不純物又は副産物を含むポリリボヌクレオチドの混合集団を含むサンプルを、１ｍＭ～５００ｍＭ（例えば、２～４７５ｍＭ、３～４５０ｍＭ、４～４２５ｍＭ、５～４００ｍＭ、１０～３７５ｍＭ、１５～３５０ｍＭ、２０～３２５ｍＭ、３０～３００ｍＭ、４０～２７５ｍＭ、５０～２５０ｍＭ、６０～２２５ｍＭ、７０～２００ｍＭ、８０～１７５ｍＭ、９０～１５０ｍＭ、１００～１２５ｍＭ、若しくは１１０～１１５ｍＭ）の塩酸を含む溶液に曝露するステップによって実施される。
【0120】
別の例では、酸変性は、少なくとも０．５％（ｖ／ｖ）（例えば、少なくとも１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、４．５％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、若しくはそれ以上）のサリチル酸を含む溶液にサンプルを曝露するステップによって実施される。いくつかの実施形態では、ｃｉｒｃＲＮＡではなく、ｌｉｎＲＮＡの選択的変性は、ｌｉｎＲＮＡ、ｃｉｒｃＲＮＡ、及び任意選択で１種若しくは複数種の不純物又は副産物を含むポリリボヌクレオチドの混合集団を含むサンプルを、１ｍＭ～５００ｍＭ（例えば、２～４７５ｍＭ、３～４５０ｍＭ、４～４２５ｍＭ、５～４００ｍＭ、１０～３７５ｍＭ、１５～３５０ｍＭ、２０～３２５ｍＭ、３０～３００ｍＭ、４０～２７５ｍＭ、５０～２５０ｍＭ、６０～２２５ｍＭ、７０～２００ｍＭ、８０～１７５ｍＭ、９０～１５０ｍＭ、１００～１２５ｍＭ、若しくは１１０～１１５ｍＭ）のサリチル酸を含む溶液に曝露するステップによって実施される。
【0121】
別の例では、酸変性は、少なくとも０．５％（ｖ／ｖ）（例えば、少なくとも１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、４．５％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、若しくはそれ以上）のリン酸を含む溶液にサンプルを曝露するステップによって実施される。いくつかの実施形態では、ｃｉｒｃＲＮＡではなく、ｌｉｎＲＮＡの選択的変性は、ｌｉｎＲＮＡ、ｃｉｒｃＲＮＡ、及び任意選択で１種若しくは複数種の不純物又は副産物を含むポリリボヌクレオチドの混合集団を含むサンプルを、１ｍＭ～５００ｍＭ（例えば、２～４７５ｍＭ、３～４５０ｍＭ、４～４２５ｍＭ、５～４００ｍＭ、１０～３７５ｍＭ、１５～３５０ｍＭ、２０～３２５ｍＭ、３０～３００ｍＭ、４０～２７５ｍＭ、５０～２５０ｍＭ、６０～２２５ｍＭ、７０～２００ｍＭ、８０～１７５ｍＭ、９０～１５０ｍＭ、１００～１２５ｍＭ、若しくは１１０～１１５ｍＭ）のリン酸を含む溶液に曝露するステップによって実施される。
【0122】
別の例では、酸変性は、少なくとも０．５％（ｖ／ｖ）（例えば、少なくとも１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、４．５％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、若しくはそれ以上）のホウ酸を含む溶液にサンプルを曝露するステップによって実施される。いくつかの実施形態では、ｃｉｒｃＲＮＡではなく、ｌｉｎＲＮＡの選択的変性は、ｌｉｎＲＮＡ、ｃｉｒｃＲＮＡ、及び任意選択で１種若しくは複数種の不純物又は副産物を含むポリリボヌクレオチドの混合集団を含むサンプルを、１ｍＭ～５００ｍＭ（例えば、２～４７５ｍＭ、３～４５０ｍＭ、４～４２５ｍＭ、５～４００ｍＭ、１０～３７５ｍＭ、１５～３５０ｍＭ、２０～３２５ｍＭ、３０～３００ｍＭ、４０～２７５ｍＭ、５０～２５０ｍＭ、６０～２２５ｍＭ、７０～２００ｍＭ、８０～１７５ｍＭ、９０～１５０ｍＭ、１００～１２５ｍＭ、若しくは１１０～１１５ｍＭ）のホウ酸を含む溶液に曝露するステップによって実施される。
【0123】
さらに別の例では、酸変性は、少なくとも０．５％（ｖ／ｖ）（例えば、少なくとも１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、４．５％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、若しくはそれ以上）のギ酸を含む溶液にサンプルを曝露するステップによって実施される。いくつかの実施形態では、ｃｉｒｃＲＮＡではなく、ｌｉｎＲＮＡの選択的変性は、ｌｉｎＲＮＡ、ｃｉｒｃＲＮＡ、及び任意選択で１種若しくは複数種の不純物又は副産物を含むポリリボヌクレオチドの混合集団を含むサンプルを、１ｍＭ～５００ｍＭ（例えば、２～４７５ｍＭ、３～４５０ｍＭ、４～４２５ｍＭ、５～４００ｍＭ、１０～３７５ｍＭ、１５～３５０ｍＭ、２０～３２５ｍＭ、３０～３００ｍＭ、４０～２７５ｍＭ、５０～２５０ｍＭ、６０～２２５ｍＭ、７０～２００ｍＭ、８０～１７５ｍＭ、９０～１５０ｍＭ、１００～１２５ｍＭ、若しくは１１０～１１５ｍＭ）のギ酸を含む溶液に曝露するステップによって実施される。
【0124】
さらに別の例では、酸変性は、少なくとも０．５％（ｖ／ｖ）（例えば、少なくとも１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、４．５％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、若しくはそれ以上）のシュウ酸を含む溶液にサンプルを曝露するステップによって実施される。いくつかの実施形態では、ｃｉｒｃＲＮＡではなく、ｌｉｎＲＮＡの選択的変性は、ｌｉｎＲＮＡ、ｃｉｒｃＲＮＡ、及び任意選択で１種若しくは複数種の不純物又は副産物を含むポリリボヌクレオチドの混合集団を含むサンプルを、１ｍＭ～５００ｍＭ（例えば、２～４７５ｍＭ、３～４５０ｍＭ、４～４２５ｍＭ、５～４００ｍＭ、１０～３７５ｍＭ、１５～３５０ｍＭ、２０～３２５ｍＭ、３０～３００ｍＭ、４０～２７５ｍＭ、５０～２５０ｍＭ、６０～２２５ｍＭ、７０～２００ｍＭ、８０～１７５ｍＭ、９０～１５０ｍＭ、１００～１２５ｍＭ、若しくは１１０～１１５ｍＭ）のシュウ酸を含む溶液に曝露するステップによって実施される。
【0125】
さらに別の例では、酸変性は、少なくとも０．５％（ｖ／ｖ）（例えば、少なくとも１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、４．５％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、若しくはそれ以上）のクエン酸を含む溶液にサンプルを曝露するステップによって実施される。いくつかの実施形態では、ｃｉｒｃＲＮＡではなく、ｌｉｎＲＮＡの選択的変性は、ｌｉｎＲＮＡ、ｃｉｒｃＲＮＡ、及び任意選択で１種若しくは複数種の不純物又は副産物を含むポリリボヌクレオチドの混合集団を含むサンプルを、１ｍＭ～５００ｍＭ（例えば、２～４７５ｍＭ、３～４５０ｍＭ、４～４２５ｍＭ、５～４００ｍＭ、１０～３７５ｍＭ、１５～３５０ｍＭ、２０～３２５ｍＭ、３０～３００ｍＭ、４０～２７５ｍＭ、５０～２５０ｍＭ、６０～２２５ｍＭ、７０～２００ｍＭ、８０～１７５ｍＭ、９０～１５０ｍＭ、１００～１２５ｍＭ、若しくは１１０～１１５ｍＭ）のクエン酸を含む溶液に曝露するステップによって実施される。
【0126】
さらに別の例では、酸変性は、少なくとも０．５％（ｖ／ｖ）（例えば、少なくとも１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、４．５％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、若しくはそれ以上）の安息香酸を含む溶液にサンプルを曝露するステップによって実施される。いくつかの実施形態では、ｃｉｒｃＲＮＡではなく、ｌｉｎＲＮＡの選択的変性は、ｌｉｎＲＮＡ、ｃｉｒｃＲＮＡ、及び任意選択で１種若しくは複数種の不純物又は副産物を含むポリリボヌクレオチドの混合集団を含むサンプルを、１ｍＭ～５００ｍＭ（例えば、２～４７５ｍＭ、３～４５０ｍＭ、４～４２５ｍＭ、５～４００ｍＭ、１０～３７５ｍＭ、１５～３５０ｍＭ、２０～３２５ｍＭ、３０～３００ｍＭ、４０～２７５ｍＭ、５０～２５０ｍＭ、６０～２２５ｍＭ、７０～２００ｍＭ、８０～１７５ｍＭ、９０～１５０ｍＭ、１００～１２５ｍＭ、若しくは１１０～１１５ｍＭ）の安息香酸を含む溶液に曝露するステップによって実施される。
【0127】
さらに別の例では、酸変性は、少なくとも０．５％（ｖ／ｖ）（例えば、少なくとも１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、４．５％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、若しくはそれ以上）のモノクロロ酢酸を含む溶液にサンプルを曝露するステップによって実施される。いくつかの実施形態では、ｃｉｒｃＲＮＡではなく、ｌｉｎＲＮＡの選択的変性は、ｌｉｎＲＮＡ、ｃｉｒｃＲＮＡ、及び任意選択で１種若しくは複数種の不純物又は副産物を含むポリリボヌクレオチドの混合集団を含むサンプルを、１ｍＭ～５００ｍＭ（例えば、２～４７５ｍＭ、３～４５０ｍＭ、４～４２５ｍＭ、５～４００ｍＭ、１０～３７５ｍＭ、１５～３５０ｍＭ、２０～３２５ｍＭ、３０～３００ｍＭ、４０～２７５ｍＭ、５０～２５０ｍＭ、６０～２２５ｍＭ、７０～２００ｍＭ、８０～１７５ｍＭ、９０～１５０ｍＭ、１００～１２５ｍＭ、若しくは１１０～１１５ｍＭ）のモノクロロ酢酸を含む溶液に曝露するステップによって実施される。
【0128】
さらに別の例では、酸変性は、少なくとも０．５％（ｖ／ｖ）（例えば、少なくとも１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、４．５％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、若しくはそれ以上）のジクロロ酢酸を含む溶液にサンプルを曝露するステップによって実施される。いくつかの実施形態では、ｃｉｒｃＲＮＡではなく、ｌｉｎＲＮＡの選択的変性は、ｌｉｎＲＮＡ、ｃｉｒｃＲＮＡ、及び任意選択で１種若しくは複数種の不純物又は副産物を含むポリリボヌクレオチドの混合集団を含むサンプルを、１ｍＭ～５００ｍＭ（例えば、２～４７５ｍＭ、３～４５０ｍＭ、４～４２５ｍＭ、５～４００ｍＭ、１０～３７５ｍＭ、１５～３５０ｍＭ、２０～３２５ｍＭ、３０～３００ｍＭ、４０～２７５ｍＭ、５０～２５０ｍＭ、６０～２２５ｍＭ、７０～２００ｍＭ、８０～１７５ｍＭ、９０～１５０ｍＭ、１００～１２５ｍＭ、若しくは１１０～１１５ｍＭ）のジクロロ酢酸を含む溶液に曝露するステップによって実施される。
【0129】
さらに別の例では、酸変性は、少なくとも０．５％（ｖ／ｖ）（例えば、少なくとも１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、４．５％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、若しくはそれ以上）のトリクロロ酢酸を含む溶液にサンプルを曝露するステップによって実施される。いくつかの実施形態では、ｃｉｒｃＲＮＡではなく、ｌｉｎＲＮＡの選択的変性は、ｌｉｎＲＮＡ、ｃｉｒｃＲＮＡ、及び任意選択で１種若しくは複数種の不純物又は副産物を含むポリリボヌクレオチドの混合集団を含むサンプルを、１ｍＭ～５００ｍＭ（例えば、２～４７５ｍＭ、３～４５０ｍＭ、４～４２５ｍＭ、５～４００ｍＭ、１０～３７５ｍＭ、１５～３５０ｍＭ、２０～３２５ｍＭ、３０～３００ｍＭ、４０～２７５ｍＭ、５０～２５０ｍＭ、６０～２２５ｍＭ、７０～２００ｍＭ、８０～１７５ｍＭ、９０～１５０ｍＭ、１００～１２５ｍＭ、若しくは１１０～１１５ｍＭ）のトリクロロ酢酸を含む溶液に曝露するステップによって実施される。
【0130】
さらに別の例では、酸変性は、少なくとも０．５％（ｖ／ｖ）（例えば、少なくとも１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、４．５％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、若しくはそれ以上）のアスコルビン酸を含む溶液にサンプルを曝露するステップによって実施される。いくつかの実施形態では、ｃｉｒｃＲＮＡではなく、ｌｉｎＲＮＡの選択的変性は、ｌｉｎＲＮＡ、ｃｉｒｃＲＮＡ、及び任意選択で１種若しくは複数種の不純物又は副産物を含むポリリボヌクレオチドの混合集団を含むサンプルを、１ｍＭ～５００ｍＭ（例えば、２～４７５ｍＭ、３～４５０ｍＭ、４～４２５ｍＭ、５～４００ｍＭ、１０～３７５ｍＭ、１５～３５０ｍＭ、２０～３２５ｍＭ、３０～３００ｍＭ、４０～２７５ｍＭ、５０～２５０ｍＭ、６０～２２５ｍＭ、７０～２００ｍＭ、８０～１７５ｍＭ、９０～１５０ｍＭ、１００～１２５ｍＭ、若しくは１１０～１１５ｍＭ）のアスコルビン酸を含む溶液に曝露するステップによって実施される。
【0131】
さらに別の例では、酸変性は、少なくとも０．５％（ｖ／ｖ）（例えば、少なくとも１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、４．５％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、若しくはそれ以上）の硝酸を含む溶液にサンプルを曝露するステップによって実施される。いくつかの実施形態では、ｃｉｒｃＲＮＡではなく、ｌｉｎＲＮＡの選択的変性は、ｌｉｎＲＮＡ、ｃｉｒｃＲＮＡ、及び任意選択で１種若しくは複数種の不純物又は副産物を含むポリリボヌクレオチドの混合集団を含むサンプルを、１ｍＭ～５００ｍＭ（例えば、２～４７５ｍＭ、３～４５０ｍＭ、４～４２５ｍＭ、５～４００ｍＭ、１０～３７５ｍＭ、１５～３５０ｍＭ、２０～３２５ｍＭ、３０～３００ｍＭ、４０～２７５ｍＭ、５０～２５０ｍＭ、６０～２２５ｍＭ、７０～２００ｍＭ、８０～１７５ｍＭ、９０～１５０ｍＭ、１００～１２５ｍＭ、若しくは１１０～１１５ｍＭ）の硝酸を含む溶液に曝露するステップによって実施される。
【0132】
酸性変性条件へのサンプルの暴露は、ポリリボヌクレオチド（中でも、例えば、ｌｉｎＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ）を変性させるのに十分な時間をかけて行うことができる。例えば、酸性変性条件へのサンプルの暴露は、３０秒、４５秒、１分、２分、３分、４分、５分、６分、７分、８分、９分、１０分、又はそれ以上の時間をかけて行われ得る。
【0133】
前述した酸性変性プロトコルは、本明細書に開示されるクロマトグラフィー分離法の前にサンプルに対して実施することができる。或いは、酸性変性は、開示した方法を用いたクロマトグラフィー分離後のサンプルに対して実施してもよい。さらに、酸性変性は、サンプルのクロマトグラフィー精製と並行して（即ち、精製工程中に）実施してもよい。例えば、クロマトグラフィーカラム中に使用されるサンプルバッファー（例えば、ローディングバッファー）は、サンプルのポリリボヌクレオチドの分子内水素結合を変性させるのに十分な濃度で上に挙げた酸を含むことができる。したがって、サンプル内のｌｉｎＲＮＡの酸性変性は、平衡化ステップ、サンプルロードステップ、カラム洗浄ステップ、及び溶離ステップなど、クロマトグラフィー分離プロセスの任意の段階で実施することができる。さらにまた、サンプルのクロマトグラフィー精製を行わない場合も、サンプルに対して酸性変性を実施することができる。
【0134】
アルカリ変性剤
アルカリ変性は、アルカリ溶液が、ＲＮＡ分子内のイオン化可能な基を脱プロトン化し得るという根拠に基づき、本明細書に開示する精製方法を変性させるのに適した方法である。ｌｉｎＲＮＡ、ｃｉｒｃＲＮＡ、及び任意選択で１種若しくは複数種の不純物又は副産物を含むポリリボヌクレオチドの混合集団を含むサンプルからのｃｉｒｃＲＮＡの選択的濃縮及び精製に使用するのに適したアルカリ条件は、少なくとも０．５％（ｖ／ｖ）（例えば、少なくとも１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、４．５％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、若しくはそれ以上）の水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、イミダゾール、ヒスチジン、炭酸水素ナトリウム、又はグアニジンを含む溶液を含む。いくつかの実施形態では、ｃｉｒｃＲＮＡではなく、ｌｉｎＲＮＡの選択的変性は、ｌｉｎＲＮＡ、ｃｉｒｃＲＮＡ、及び任意選択で１種若しくは複数種の不純物又は副産物を含むポリリボヌクレオチドの混合集団を含むサンプルを、１ｍＭ～５００ｍＭ（例えば、２～４７５ｍＭ、３～４５０ｍＭ、４～４２５ｍＭ、５～４００ｍＭ、１０～３７５ｍＭ、１５～３５０ｍＭ、２０～３２５ｍＭ、３０～３００ｍＭ、４０～２７５ｍＭ、５０～２５０ｍＭ、６０～２２５ｍＭ、７０～２００ｍＭ、８０～１７５ｍＭ、９０～１５０ｍＭ、１００～１２５ｍＭ、若しくは１１０～１１５ｍＭ）の水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、イミダゾール、ヒスチジン、炭酸水素ナトリウム、グアニジン、又はトリエチルアミンを含む溶液に曝露するステップによって実施される。
アルカリ変性は、アルカリ溶液が、ＲＮＡ分子内のイオン化可能な基を脱プロトン化し得るという根拠に基づき、本明細書に開示する精製方法を変性させるのに適した方法である。ｌｉｎＲＮＡ、ｃｉｒｃＲＮＡ、及び任意選択で１種若しくは複数種の不純物又は副産物を含むポリリボヌクレオチドの混合集団を含むサンプルからのｃｉｒｃＲＮＡの選択的濃縮及び精製に使用するのに適したアルカリ条件は、少なくとも０．５％（ｖ／ｖ）（例えば、少なくとも１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、４．５％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、若しくはそれ以上）の水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、イミダゾール、ヒスチジン、炭酸水素ナトリウム、又はグアニジンを含む溶液を含む。いくつかの実施形態では、ｃｉｒｃＲＮＡではなく、ｌｉｎＲＮＡの選択的変性は、ｌｉｎＲＮＡ、ｃｉｒｃＲＮＡ、及び任意選択で１種若しくは複数種の不純物又は副産物を含むポリリボヌクレオチドの混合集団を含むサンプルを、１ｍＭ～５００ｍＭ（例えば、２～４７５ｍＭ、３～４５０ｍＭ、４～４２５ｍＭ、５～４００ｍＭ、１０～３７５ｍＭ、１５～３５０ｍＭ、２０～３２５ｍＭ、３０～３００ｍＭ、４０～２７５ｍＭ、５０～２５０ｍＭ、６０～２２５ｍＭ、７０～２００ｍＭ、８０～１７５ｍＭ、９０～１５０ｍＭ、１００～１２５ｍＭ、若しくは１１０～１１５ｍＭ）の水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、イミダゾール、ヒスチジン、炭酸水素ナトリウム、グアニジン、又はトリエチルアミンを含む溶液に曝露するステップによって実施される。
【0135】
一例では、ｃｉｒｃＲＮＡではなく、ｌｉｎＲＮＡの選択的変性は、ｌｉｎＲＮＡ、ｃｉｒｃＲＮＡ、及び任意選択で１種若しくは複数種の不純物又は副産物を含むポリリボヌクレオチドの混合集団を含むサンプルを、少なくとも０．５％（ｖ／ｖ）（例えば、少なくとも１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、４．５％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、若しくはそれ以上）の水酸化ナトリウムを含む溶液に曝露するステップによって実施される。いくつかの実施形態では、ｃｉｒｃＲＮＡではなく、ｌｉｎＲＮＡの選択的変性は、ｌｉｎＲＮＡ、ｃｉｒｃＲＮＡ、及び任意選択で１種若しくは複数種の不純物又は副産物を含むポリリボヌクレオチドの混合集団を含むサンプルを、１ｍＭ～５００ｍＭ（例えば、２～４７５ｍＭ、３～４５０ｍＭ、４～４２５ｍＭ、５～４００ｍＭ、１０～３７５ｍＭ、１５～３５０ｍＭ、２０～３２５ｍＭ、３０～３００ｍＭ、４０～２７５ｍＭ、５０～２５０ｍＭ、６０～２２５ｍＭ、７０～２００ｍＭ、８０～１７５ｍＭ、９０～１５０ｍＭ、１００～１２５ｍＭ、若しくは１１０～１１５ｍＭ）の水酸化ナトリウムを含む溶液に曝露するステップによって実施される。
【0136】
別の例では、アルカリ変性は、少なくとも０．５％（ｖ／ｖ）（例えば、少なくとも１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、４．５％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、若しくはそれ以上）の水酸化カリウムを含む溶液にサンプルを曝露するステップによって実施される。いくつかの実施形態では、ｃｉｒｃＲＮＡではなく、ｌｉｎＲＮＡの選択的変性は、ｌｉｎＲＮＡ、ｃｉｒｃＲＮＡ、及び任意選択で１種若しくは複数種の不純物又は副産物を含むポリリボヌクレオチドの混合集団を含むサンプルを、１ｍＭ～５００ｍＭ（例えば、２～４７５ｍＭ、３～４５０ｍＭ、４～４２５ｍＭ、５～４００ｍＭ、１０～３７５ｍＭ、１５～３５０ｍＭ、２０～３２５ｍＭ、３０～３００ｍＭ、４０～２７５ｍＭ、５０～２５０ｍＭ、６０～２２５ｍＭ、７０～２００ｍＭ、８０～１７５ｍＭ、９０～１５０ｍＭ、１００～１２５ｍＭ、若しくは１１０～１１５ｍＭ）の水酸化カリウムを含む溶液に曝露するステップによって実施される。
【0137】
別の例では、アルカリ変性は、少なくとも０．５％（ｖ／ｖ）（例えば、少なくとも１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、４．５％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、若しくはそれ以上）のイミダゾールを含む溶液にサンプルを曝露するステップによって実施される。いくつかの実施形態では、ｃｉｒｃＲＮＡではなく、ｌｉｎＲＮＡの選択的変性は、ｌｉｎＲＮＡ、ｃｉｒｃＲＮＡ、及び任意選択で１種若しくは複数種の不純物又は副産物を含むポリリボヌクレオチドの混合集団を含むサンプルを、１ｍＭ～５００ｍＭ（例えば、２～４７５ｍＭ、３～４５０ｍＭ、４～４２５ｍＭ、５～４００ｍＭ、１０～３７５ｍＭ、１５～３５０ｍＭ、２０～３２５ｍＭ、３０～３００ｍＭ、４０～２７５ｍＭ、５０～２５０ｍＭ、６０～２２５ｍＭ、７０～２００ｍＭ、８０～１７５ｍＭ、９０～１５０ｍＭ、１００～１２５ｍＭ、若しくは１１０～１１５ｍＭ）のイミダゾールを含む溶液に曝露するステップによって実施される。
【0138】
別の例では、アルカリ変性は、少なくとも０．５％（ｖ／ｖ）（例えば、少なくとも１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、４．５％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、若しくはそれ以上）のヒスチジンを含む溶液にサンプルを曝露するステップによって実施される。いくつかの実施形態では、ｃｉｒｃＲＮＡではなく、ｌｉｎＲＮＡの選択的変性は、ｌｉｎＲＮＡ、ｃｉｒｃＲＮＡ、及び任意選択で１種若しくは複数種の不純物又は副産物を含むポリリボヌクレオチドの混合集団を含むサンプルを、１ｍＭ～５００ｍＭ（例えば、２～４７５ｍＭ、３～４５０ｍＭ、４～４２５ｍＭ、５～４００ｍＭ、１０～３７５ｍＭ、１５～３５０ｍＭ、２０～３２５ｍＭ、３０～３００ｍＭ、４０～２７５ｍＭ、５０～２５０ｍＭ、６０～２２５ｍＭ、７０～２００ｍＭ、８０～１７５ｍＭ、９０～１５０ｍＭ、１００～１２５ｍＭ、若しくは１１０～１１５ｍＭ）のヒスチジンを含む溶液に曝露するステップによって実施される。
【0139】
別の例では、アルカリ変性は、少なくとも０．５％（ｖ／ｖ）（例えば、少なくとも１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、４．５％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、若しくはそれ以上）の炭酸水素ナトリウムを含む溶液にサンプルを曝露するステップによって実施される。いくつかの実施形態では、ｃｉｒｃＲＮＡではなく、ｌｉｎＲＮＡの選択的変性は、ｌｉｎＲＮＡ、ｃｉｒｃＲＮＡ、及び任意選択で１種若しくは複数種の不純物又は副産物を含むポリリボヌクレオチドの混合集団を含むサンプルを、１ｍＭ～５００ｍＭ（例えば、２～４７５ｍＭ、３～４５０ｍＭ、４～４２５ｍＭ、５～４００ｍＭ、１０～３７５ｍＭ、１５～３５０ｍＭ、２０～３２５ｍＭ、３０～３００ｍＭ、４０～２７５ｍＭ、５０～２５０ｍＭ、６０～２２５ｍＭ、７０～２００ｍＭ、８０～１７５ｍＭ、９０～１５０ｍＭ、１００～１２５ｍＭ、若しくは１１０～１１５ｍＭ）の炭酸水素ナトリウムを含む溶液に曝露するステップによって実施される。
【0140】
さらに別の例では、アルカリ変性は、少なくとも０．５％（ｖ／ｖ）（例えば、少なくとも１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、４．５％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、若しくはそれ以上）のグアニジンを含む溶液にサンプルを曝露するステップによって実施される。いくつかの実施形態では、ｃｉｒｃＲＮＡではなく、ｌｉｎＲＮＡの選択的変性は、ｌｉｎＲＮＡ、ｃｉｒｃＲＮＡ、及び任意選択で１種若しくは複数種の不純物又は副産物を含むポリリボヌクレオチドの混合集団を含むサンプルを、１ｍＭ～５００ｍＭ（例えば、２～４７５ｍＭ、３～４５０ｍＭ、４～４２５ｍＭ、５～４００ｍＭ、１０～３７５ｍＭ、１５～３５０ｍＭ、２０～３２５ｍＭ、３０～３００ｍＭ、４０～２７５ｍＭ、５０～２５０ｍＭ、６０～２２５ｍＭ、７０～２００ｍＭ、８０～１７５ｍＭ、９０～１５０ｍＭ、１００～１２５ｍＭ、若しくは１１０～１１５ｍＭ）のグアニジンを含む溶液に曝露するステップによって実施される。
【0141】
さらに別の例では、アルカリ変性は、少なくとも０．５％（ｖ／ｖ）（例えば、少なくとも１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、４．５％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、若しくはそれ以上）のトリチルアミンを含む溶液にサンプルを曝露するステップによって実施される。いくつかの実施形態では、ｃｉｒｃＲＮＡではなくｌｉｎＲＮＡの選択的変性は、ｌｉｎＲＮＡ、ｃｉｒｃＲＮＡ、及び任意選択で１種若しくは複数種の不純物又は副産物を含むポリリボヌクレオチドの混合集団を含むサンプルを、１ｍＭ～５００ｍＭ（例えば、２～４７５ｍＭ、３～４５０ｍＭ、４～４２５ｍＭ、５～４００ｍＭ、１０～３７５ｍＭ、１５～３５０ｍＭ、２０～３２５ｍＭ、３０～３００ｍＭ、４０～２７５ｍＭ、５０～２５０ｍＭ、６０～２２５ｍＭ、７０～２００ｍＭ、８０～１７５ｍＭ、９０～１５０ｍＭ、１００～１２５ｍＭ、若しくは１１０～１１５ｍＭ）のトリチルアミンを含む溶液に曝露するステップによって実施される。
【0142】
アルカリ変性条件へのサンプルの暴露は、ポリリボヌクレオチド（中でも、例えば、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｌｉｎＲＮＡ）を変性させるのに十分な時間をかけて行うことができる。例えば、アルカリ変性条件へのサンプルの暴露は、３０秒、４５秒、１分、２分、３分、４分、５分、６分、７分、８分、９分、１０分、又はそれ以上の時間をかけて行われ得る。
【0143】
前述したアルカリ変性プロトコルは、本明細書に開示されるクロマトグラフィー分離法の前にサンプルに対して実施することができる。或いは、アルカリ変性は、開示した方法を用いたクロマトグラフィー分離後のサンプルに対して実施してもよい。さらに、アルカリ変性は、サンプルのクロマトグラフィー精製と並行して（即ち、精製工程中に）実施してもよい。例えば、クロマトグラフィーカラム中に使用されるサンプルバッファー（例えば、ローディングバッファー）は、サンプルのポリリボヌクレオチドの分子内水素結合を変性させるのに十分な濃度で前述の塩基を含み得る。したがって、サンプル内のｌｉｎＲＮＡのアルカリ変性は、平衡化ステップ、サンプルロードステップ、カラム洗浄ステップ、及び溶離ステップなど、クロマトグラフィー分離プロセスの任意の段階で実施することができる。さらにまた、サンプルのクロマトグラフィー精製を行わない場合も、アルカリ性変性をサンプルに対して行うことができる。
【0144】
有機溶媒
開示された方法と一緒に使用するのに適した変性剤として、有機溶媒を使用することができる。ｌｉｎＲＮＡ、ｃｉｒｃＲＮＡ、及び任意選択で１種若しくは複数種の不純物又は副産物を含むポリリボヌクレオチドの混合集団を含むサンプルからのｃｉｒｃＲＮＡの選択的濃縮及び精製に使用するのに適した有機溶媒は、少なくとも０．１％（ｖ／ｖ）（例えば、少なくとも０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、４．５％、５％、５．５％、６％、６．５％、７％、７．５％、８％、８．５％、９％、９．５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、若しくはそれ以上）のジメチルスルホキシド、酢酸トリエチルアンモニウム、メタノール、エタノール、２－プロパノール、イソプロパノール、１－ブタノール、２－ブタノール、ｔ－ブタノール、イソブタノール、フェノール、クロロホルム、ヘキサン、アセトニトリル、ホルムアミド、アセトン、デナトニウム、又はプロピレングリコールを含む。
開示された方法と一緒に使用するのに適した変性剤として、有機溶媒を使用することができる。ｌｉｎＲＮＡ、ｃｉｒｃＲＮＡ、及び任意選択で１種若しくは複数種の不純物又は副産物を含むポリリボヌクレオチドの混合集団を含むサンプルからのｃｉｒｃＲＮＡの選択的濃縮及び精製に使用するのに適した有機溶媒は、少なくとも０．１％（ｖ／ｖ）（例えば、少なくとも０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、４．５％、５％、５．５％、６％、６．５％、７％、７．５％、８％、８．５％、９％、９．５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、若しくはそれ以上）のジメチルスルホキシド、酢酸トリエチルアンモニウム、メタノール、エタノール、２－プロパノール、イソプロパノール、１－ブタノール、２－ブタノール、ｔ－ブタノール、イソブタノール、フェノール、クロロホルム、ヘキサン、アセトニトリル、ホルムアミド、アセトン、デナトニウム、又はプロピレングリコールを含む。
【0145】
一例では、ｃｉｒｃＲＮＡではなくｌｉｎＲＮＡの選択的変性は、ｌｉｎＲＮＡ、ｃｉｒｃＲＮＡ、及び任意選択で１種若しくは複数種の不純物又は副産物を含むポリリボヌクレオチドの混合集団を含むサンプルを、少なくとも０．１％（ｖ／ｖ）（例えば、少なくとも０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、４．５％、５％、５．５％、６％、６．５％、７％、７．５％、８％、８．５％、９％、９．５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、若しくはそれ以上）のジメチルスルホキシドを含む溶液に曝露するステップによって実施される。
【0146】
別の例では、変性は、少なくとも０．１％（ｖ／ｖ）（例えば、少なくとも０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、４．５％、５％、５．５％、６％、６．５％、７％、７．５％、８％、８．５％、９％、９．５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、若しくはそれ以上）の酢酸トリエチルアンモニウムを含む溶液にサンプルを曝露するステップによって実施される。
【0147】
別の例では、変性は、少なくとも０．１％（ｖ／ｖ）（例えば、少なくとも０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、４．５％、５％、５．５％、６％、６．５％、７％、７．５％、８％、８．５％、９％、９．５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、若しくはそれ以上）のメタノールを含む溶液にサンプルを曝露するステップによって実施される。
【0148】
別の例では、変性は、少なくとも０．１％（ｖ／ｖ）（例えば、少なくとも０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、４．５％、５％、５．５％、６％、６．５％、７％、７．５％、８％、８．５％、９％、９．５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、若しくはそれ以上）のエタノールを含む溶液にサンプルを曝露するステップによって実施される。
【0149】
別の例では、変性は、少なくとも０．１％（ｖ／ｖ）（例えば、少なくとも０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、４．５％、５％、５．５％、６％、６．５％、７％、７．５％、８％、８．５％、９％、９．５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、若しくはそれ以上）の２－プロパノールを含む溶液にサンプルを曝露するステップによって実施される。
【0150】
別の例では、変性は、少なくとも０．１％（ｖ／ｖ）（例えば、少なくとも０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、４．５％、５％、５．５％、６％、６．５％、７％、７．５％、８％、８．５％、９％、９．５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、若しくはそれ以上）のイソプロパノールを含む溶液にサンプルを曝露するステップによって実施される。
【0151】
別の例では、変性は、少なくとも０．１％（ｖ／ｖ）（例えば、少なくとも０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、４．５％、５％、５．５％、６％、６．５％、７％、７．５％、８％、８．５％、９％、９．５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、若しくはそれ以上）のブタノール（例えば、１－ブタノール、２－ブタノール、ｔ－ブタノール、又はイソブタノール）を含む溶液にサンプルを曝露するステップによって実施される。
【0152】
別の例では、変性は、少なくとも０．１％（ｖ／ｖ）（例えば、少なくとも０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、４．５％、５％、５．５％、６％、６．５％、７％、７．５％、８％、８．５％、９％、９．５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、若しくはそれ以上）の１－ブタノールを含む溶液にサンプルを曝露するステップによって実施される。
【0153】
別の例では、変性は、少なくとも０．１％（ｖ／ｖ）（例えば、少なくとも０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、４．５％、５％、５．５％、６％、６．５％、７％、７．５％、８％、８．５％、９％、９．５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、若しくはそれ以上）の２－ブタノールを含む溶液にサンプルを曝露するステップによって実施される。
【0154】
別の例では、変性は、少なくとも０．１％（ｖ／ｖ）（例えば、少なくとも０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、４．５％、５％、５．５％、６％、６．５％、７％、７．５％、８％、８．５％、９％、９．５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、若しくはそれ以上）のｔ－ブタノールを含む溶液にサンプルを曝露するステップによって実施される。
【0155】
別の例では、変性は、少なくとも０．１％（ｖ／ｖ）（例えば、少なくとも０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、４．５％、５％、５．５％、６％、６．５％、７％、７．５％、８％、８．５％、９％、９．５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、若しくはそれ以上）のイソブタノールを含む溶液にサンプルを曝露するステップによって実施される。
【0156】
別の例では、変性は、少なくとも０．１％（ｖ／ｖ）（例えば、少なくとも０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、４．５％、５％、５．５％、６％、６．５％、７％、７．５％、８％、８．５％、９％、９．５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、若しくはそれ以上）のフェノールを含む溶液にサンプルを曝露するステップによって実施される。
【0157】
別の例では、変性は、少なくとも０．１％（ｖ／ｖ）（例えば、少なくとも０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、４．５％、５％、５．５％、６％、６．５％、７％、７．５％、８％、８．５％、９％、９．５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、若しくはそれ以上）のクロロホルムを含む溶液にサンプルを曝露するステップによって実施される。
【0158】
別の例では、変性は、少なくとも０．１％（ｖ／ｖ）（例えば、少なくとも０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、４．５％、５％、５．５％、６％、６．５％、７％、７．５％、８％、８．５％、９％、９．５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、若しくはそれ以上）のヘキサンを含む溶液にサンプルを曝露するステップによって実施される。
【0159】
別の例では、変性は、少なくとも０．１％（ｖ／ｖ）（例えば、少なくとも０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、４．５％、５％、５．５％、６％、６．５％、７％、７．５％、８％、８．５％、９％、９．５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、若しくはそれ以上）のアセトニトリルを含む溶液にサンプルを曝露するステップによって実施される。
【0160】
別の例では、変性は、少なくとも０．１％（ｖ／ｖ）（例えば、少なくとも０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、４．５％、５％、５．５％、６％、６．５％、７％、７．５％、８％、８．５％、９％、９．５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、若しくはそれ以上）のホルムアミドを含む溶液にサンプルを曝露するステップによって実施される。
【0161】
さらに別の例では、変性は、少なくとも０．１％（ｖ／ｖ）（例えば、少なくとも０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、４．５％、５％、５．５％、６％、６．５％、７％、７．５％、８％、８．５％、９％、９．５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、若しくはそれ以上）のプロピレングリコールを含む溶液にサンプルを曝露するステップによって実施される。
【0162】
変性溶媒へのサンプルの暴露は、ポリリボヌクレオチド（中でも、例えば、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｌｉｎＲＮＡ）を変性させるのに十分な時間をかけて行うことができる。例えば、アルカリ変性条件へのサンプルの暴露は、３０秒、４５秒、１分、２分、３分、４分、５分、６分、７分、８分、９分、１０分、又はそれ以上の時間をかけて行われ得る。
【0163】
前述した変性プロトコルは、本明細書に開示されるクロマトグラフィー分離方法の前にサンプルに対して実施することができる。或いは、変性は、開示した方法を用いたクロマトグラフィー分離後のサンプルに対して実施してもよい。さらに、アルカリ性変性は、サンプルのクロマトグラフィー精製と並行して（即ち、精製工程中に）実施してもよい。例えば、クロマトグラフィーカラム中に使用されるサンプルバッファー（例えば、ローディングバッファー）は、サンプルのポリリボヌクレオチドの分子内水素結合を変性させるのに十分な濃度で前述の有機溶媒を含み得る。したがって、サンプル内のｌｉｎＲＮＡの変性は、平衡化ステップ、サンプルロードステップ、カラム洗浄ステップ、及び溶離ステップなど、クロマトグラフィー分離プロセスの任意の段階で実施することができる。さらにまた、サンプルのクロマトグラフィー精製を行わない場合も、変性をサンプルに対して行うことができる。
【0164】
カオトロピック剤
開示される方法と一緒に使用するのに適した変性剤として、カオトロピック剤（例えば、カオトロピック塩）を使用することができる。ｌｉｎＲＮＡ、ｃｉｒｃＲＮＡ、及び任意選択で１種若しくは複数種の不純物又は副産物を含むポリリボヌクレオチドの混合集団を含むサンプルからのｃｉｒｃＲＮＡの選択的濃縮及び精製に使用するのに適したカオトロピック剤（例えば、カオトロピック塩）は、少なくとも１％（ｖ／ｖ）（例えば、少なくとも１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、４．５％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、若しくはそれ以上）の尿素、塩化グアニジニウム、過塩素酸リチウム、又はＰＥＧを含む。いくつかの実施形態では、ｌｉｎＲＮＡ、ｃｉｒｃＲＮＡ、及び任意選択で１種若しくは複数種の不純物又は副産物を含むポリリボヌクレオチドの混合集団を含むサンプルからのｃｉｒｃＲＮＡの選択的濃縮及び精製に使用するのに適したカオトロピック剤は、１００ｍＭ～８Ｍ（例えば、１５０ｍＭ～７．５Ｍ、２００ｍＭ～７Ｍ、２５０ｍＭ～６．５Ｍ、３００ｍＭ～６Ｍ、３５０ｍＭ～５．５Ｍ、４００ｍＭ～５Ｍ、４５０ｍＭ～４．５Ｍ、５００ｍＭ～４Ｍ、６００ｍＭ～３．５Ｍ、７００ｍＭ～３Ｍ、８００ｍＭ～２．５Ｍ、９００ｍＭ～２Ｍ、１Ｍ～１．５Ｍ、１．１Ｍ～１．４Ｍ、若しくは１．２～１．３Ｍ）の尿素、塩化グアニジニウム、過塩素酸リチウム、又はＰＥＧを含む。
開示される方法と一緒に使用するのに適した変性剤として、カオトロピック剤（例えば、カオトロピック塩）を使用することができる。ｌｉｎＲＮＡ、ｃｉｒｃＲＮＡ、及び任意選択で１種若しくは複数種の不純物又は副産物を含むポリリボヌクレオチドの混合集団を含むサンプルからのｃｉｒｃＲＮＡの選択的濃縮及び精製に使用するのに適したカオトロピック剤（例えば、カオトロピック塩）は、少なくとも１％（ｖ／ｖ）（例えば、少なくとも１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、４．５％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、若しくはそれ以上）の尿素、塩化グアニジニウム、過塩素酸リチウム、又はＰＥＧを含む。いくつかの実施形態では、ｌｉｎＲＮＡ、ｃｉｒｃＲＮＡ、及び任意選択で１種若しくは複数種の不純物又は副産物を含むポリリボヌクレオチドの混合集団を含むサンプルからのｃｉｒｃＲＮＡの選択的濃縮及び精製に使用するのに適したカオトロピック剤は、１００ｍＭ～８Ｍ（例えば、１５０ｍＭ～７．５Ｍ、２００ｍＭ～７Ｍ、２５０ｍＭ～６．５Ｍ、３００ｍＭ～６Ｍ、３５０ｍＭ～５．５Ｍ、４００ｍＭ～５Ｍ、４５０ｍＭ～４．５Ｍ、５００ｍＭ～４Ｍ、６００ｍＭ～３．５Ｍ、７００ｍＭ～３Ｍ、８００ｍＭ～２．５Ｍ、９００ｍＭ～２Ｍ、１Ｍ～１．５Ｍ、１．１Ｍ～１．４Ｍ、若しくは１．２～１．３Ｍ）の尿素、塩化グアニジニウム、過塩素酸リチウム、又はＰＥＧを含む。
【0165】
一例では、ｃｉｒｃＲＮＡではなく、ｌｉｎＲＮＡの選択的変性は、ｌｉｎＲＮＡ、ｃｉｒｃＲＮＡ、及び任意選択で１種若しくは複数種の不純物又は副産物を含むポリリボヌクレオチドの混合集団を含むサンプルを、少なくとも１％（ｖ／ｖ）（例えば、少なくとも１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、４．５％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、若しくはそれ以上）の塩化グアニジニウムを含む溶液に曝露するステップによって実施される。いくつかの実施形態では、ｃｉｒｃＲＮＡではなくｌｉｎＲＮＡの選択的変性は、ｌｉｎＲＮＡ、ｃｉｒｃＲＮＡ、及び任意選択で１種若しくは複数種の不純物又は副産物を含むポリリボヌクレオチドの混合集団を含むサンプルを、１００ｍＭ～８Ｍ（例えば、１５０ｍＭ～７．５Ｍ、２００ｍＭ～７Ｍ、２５０ｍＭ～６．５Ｍ、３００ｍＭ～６Ｍ、３５０ｍＭ～５．５Ｍ、４００ｍＭ～５Ｍ、４５０ｍＭ～４．５Ｍ、５００ｍＭ～４Ｍ、６００ｍＭ～３．５Ｍ、７００ｍＭ～３Ｍ、８００ｍＭ～２．５Ｍ、９００ｍＭ～２Ｍ、１Ｍ～１．５Ｍ、１．１Ｍ～１．４Ｍ、若しくは１．２～１．３Ｍ）の尿素を含む溶液に曝露するステップによって実施される。
【0166】
別の実施形態では、変性は、少なくとも１％（ｖ／ｖ）（例えば、少なくとも１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、４．５％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、若しくはそれ以上）の過塩素酸リチウムを含む溶液にサンプルを曝露するステップによって実施される。いくつかの実施形態では、ｃｉｒｃＲＮＡではなく、ｌｉｎＲＮＡの選択的変性は、ｌｉｎＲＮＡ、ｃｉｒｃＲＮＡ、及び任意選択で１種若しくは複数種の不純物又は副産物を含むポリリボヌクレオチドの混合集団を含むサンプルを、１００ｍＭ～８Ｍ（例えば、１５０ｍＭ～７．５Ｍ、２００ｍＭ～７Ｍ、２５０ｍＭ～６．５Ｍ、３００ｍＭ～６Ｍ、３５０ｍＭ～５．５Ｍ、４００ｍＭ～５Ｍ、４５０ｍＭ～４．５Ｍ、５００ｍＭ～４Ｍ、６００ｍＭ～３．５Ｍ、７００ｍＭ～３Ｍ、８００ｍＭ～２．５Ｍ、９００ｍＭ～２Ｍ、１Ｍ～１．５Ｍ、１．１Ｍ～１．４Ｍ、若しくは１．２～１．３Ｍ）の過塩素酸リチウムを含む溶液に曝露するステップによって実施される。
【0167】
別の実施形態では、ｃｉｒｃＲＮＡではなく、ｌｉｎＲＮＡの選択的変性は、ｌｉｎＲＮＡ、ｃｉｒｃＲＮＡ、及び任意選択で１種若しくは複数種の不純物又は副産物を含むポリリボヌクレオチドの混合集団を含むサンプルを、１％未満（例えば、１％、０．９％、０．８％、０．７％、０．６％、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％、０．１％未満、若しくはそれ以下）のｎ－ドデシルβ－ｄ－マルトシド、ｎ－オクチルグルコシド、ＣＨＡＰＳ、又はデオキシコレートを含む溶液に曝露するステップによって実施される。いくつかの実施形態では、ｃｉｒｃＲＮＡではなく、ｌｉｎＲＮＡの選択的変性は、ｌｉｎＲＮＡ、ｃｉｒｃＲＮＡ、及び任意選択で１種若しくは複数種の不純物又は副産物を含むポリリボヌクレオチドの混合集団を含むサンプルを、１００ｍＭ～８Ｍ（例えば、１５０ｍＭ～７．５Ｍ、２００ｍＭ～７Ｍ、２５０ｍＭ～６．５Ｍ、３００ｍＭ～６Ｍ、３５０ｍＭ～５．５Ｍ、４００ｍＭ～５Ｍ、４５０ｍＭ～４．５Ｍ、５００ｍＭ～４Ｍ、６００ｍＭ～３．５Ｍ、７００ｍＭ～３Ｍ、８００ｍＭ～２．５Ｍ、９００ｍＭ～２Ｍ、１Ｍ～１．５Ｍ、１．１Ｍ～１．４Ｍ、若しくは１．２～１．３Ｍ）のデオキシコレートを含む溶液に曝露するステップによって実施される。
【0168】
一例では、変性は、少なくとも０．１％（ｖ／ｖ）（例えば、少なくとも０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、４．５％、５．５％、６％、６．５％、７％、７．５％、８％、８．５％、９％、９．５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、若しくはそれ以上）のｎ－ドデシルβ－ｄ－マルトシドを含む溶液にサンプルを曝露するステップによって実施される。いくつかの実施形態では、ｃｉｒｃＲＮＡではなく、ｌｉｎＲＮＡの選択的変性は、ｌｉｎＲＮＡ、ｃｉｒｃＲＮＡ、及び任意選択で１種若しくは複数種の不純物又は副産物を含むポリリボヌクレオチドの混合集団を含むサンプルを、１００ｍＭ～８Ｍ（例えば、１５０ｍＭ～７．５Ｍ、２００ｍＭ～７Ｍ、２５０ｍＭ～６．５Ｍ、３００ｍＭ～６Ｍ、３５０ｍＭ～５．５Ｍ、４００ｍＭ～５Ｍ、４５０ｍＭ～４．５Ｍ、５００ｍＭ～４Ｍ、６００ｍＭ～３．５Ｍ、７００ｍＭ～３Ｍ、８００ｍＭ～２．５Ｍ、９００ｍＭ～２Ｍ、１Ｍ～１．５Ｍ、１．１Ｍ～１．４Ｍ、若しくは１．２～１．３Ｍ）のβ－ｄ－マルトシドを含む溶液に曝露するステップによって実施される。
【0169】
別の実施形態では、変性は、少なくとも０．１％（ｖ／ｖ）（例えば、少なくとも０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、４．５％、５．５％、６％、６．５％、７％、７．５％、８％、８．５％、９％、９．５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、若しくはそれ以上）のｎ－オクチルグルコシドを含む溶液にサンプルを曝露するステップによって実施される。いくつかの実施形態では、ｃｉｒｃＲＮＡではなく、ｌｉｎＲＮＡの選択的変性は、ｌｉｎＲＮＡ、ｃｉｒｃＲＮＡ、及び任意選択で１種若しくは複数種の不純物又は副産物を含むポリリボヌクレオチドの混合集団を含むサンプルを、１００ｍＭ～８Ｍ（例えば、１５０ｍＭ～７．５Ｍ、２００ｍＭ～７Ｍ、２５０ｍＭ～６．５Ｍ、３００ｍＭ～６Ｍ、３５０ｍＭ～５．５Ｍ、４００ｍＭ～５Ｍ、４５０ｍＭ～４．５Ｍ、５００ｍＭ～４Ｍ、６００ｍＭ～３．５Ｍ、７００ｍＭ～３Ｍ、８００ｍＭ～２．５Ｍ、９００ｍＭ～２Ｍ、１Ｍ～１．５Ｍ、１．１Ｍ～１．４Ｍ、若しくは１．２～１．３Ｍ）のｎ－オクチルグルコシドを含む溶液に曝露するステップによって実施される。
【0170】
別の実施形態では、変性は、少なくとも０．１％（ｖ／ｖ）（例えば、少なくとも０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、４．５％、５．５％、６％、６．５％、７％、７．５％、８％、８．５％、９％、９．５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、若しくはそれ以上）のＣＨＡＰＳを含む溶液にサンプルを曝露するステップによって実施される。いくつかの実施形態では、ｃｉｒｃＲＮＡではなくｌｉｎＲＮＡの選択的変性は、ｌｉｎＲＮＡ、ｃｉｒｃＲＮＡ、及び任意選択で１種若しくは複数種の不純物又は副産物を含むポリリボヌクレオチドの混合集団を含むサンプルを、１００ｍＭ～８Ｍ（例えば、１５０ｍＭ～７．５Ｍ、２００ｍＭ～７Ｍ、２５０ｍＭ～６．５Ｍ、３００ｍＭ～６Ｍ、３５０ｍＭ～５．５Ｍ、４００ｍＭ～５Ｍ、４５０ｍＭ～４．５Ｍ、５００ｍＭ～４Ｍ、６００ｍＭ～３．５Ｍ、７００ｍＭ～３Ｍ、８００ｍＭ～２．５Ｍ、９００ｍＭ～２Ｍ、１Ｍ～１．５Ｍ、１．１Ｍ～１．４Ｍ、若しくは１．２～１．３Ｍ）のＣＨＡＰＳを含む溶液に曝露するステップによって実施される。
【0171】
別の実施形態では、変性は、少なくとも０．１％（ｖ／ｖ）（例えば、少なくとも０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、４．５％、５．５％、６％、６．５％、７％、７．５％、８％、８．５％、９％、９．５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、若しくはそれ以上）のデオキシコレートを含む溶液にサンプルを曝露するステップによって実施される。いくつかの実施形態では、ｃｉｒｃＲＮＡではなく、ｌｉｎＲＮＡの選択的変性は、ｌｉｎＲＮＡ、ｃｉｒｃＲＮＡ、及び任意選択で１種若しくは複数種の不純物又は副産物を含むポリリボヌクレオチドの混合集団を含むサンプルを、１００ｍＭ～８Ｍ（例えば、１５０ｍＭ～７．５Ｍ、２００ｍＭ～７Ｍ、２５０ｍＭ～６．５Ｍ、３００ｍＭ～６Ｍ、３５０ｍＭ～５．５Ｍ、４００ｍＭ～５Ｍ、４５０ｍＭ～４．５Ｍ、５００ｍＭ～４Ｍ、６００ｍＭ～３．５Ｍ、７００ｍＭ～３Ｍ、８００ｍＭ～２．５Ｍ、９００ｍＭ～２Ｍ、１Ｍ～１．５Ｍ、１．１Ｍ～１．４Ｍ、若しくは１．２～１．３Ｍ）のデオキシコレートを含む溶液に曝露するステップによって実施される。
【0172】
変性用カオトロピック剤へのサンプルの暴露は、ポリリボヌクレオチド（中でも、例えば、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｌｉｎＲＮＡ）を変性させるのに十分な時間をかけて行うことができる。例えば、アルカリ性変性条件へのサンプルの暴露は、３０秒、４５秒、１分、２分、３分、４分、５分、６分、７分、８分、９分、１０分、１１分、１２分、１３分、１４分、１５分、１６分、１７分、１８分、１９分、２０分を超える、又はそれ以上の時間にわたって行われ得る。
【0173】
前述した変性プロトコルは、本明細書に開示されるクロマトグラフィー分離法の前にサンプルに対して実施することができる。或いは、カオトロピック剤を用いた変性は、開示した方法を用いたクロマトグラフィー分離後のサンプルに対して実施してもよい。さらに、オトロピック剤を用いた変性は、サンプルのクロマトグラフィー精製と並行して（即ち、精製工程中に）実施してもよい。例えば、クロマトグラフィーカラム中に使用されるサンプルバッファー（例えば、ローディングバッファー）は、サンプルのポリリボヌクレオチドの分子内水素結合を変性するのに十分な濃度で前述のカオトロピック剤を含み得る。したがって、サンプル内のｌｉｎＲＮＡの変性は、平衡化ステップ、サンプルロードステップ、カラム洗浄ステップ、及び溶離ステップを含む、クロマトグラフィー分離プロセスの任意の段階で実施することができる。さらにまた、サンプルのクロマトグラフィー精製を行わない場合も、変性をサンプルに対して行うことができる。
【0174】
クラウディング剤
クラウディング剤は、他の分子間の水素結合が起こらないように溶液をクラウディングさせることができるという根拠に基づいて、開示される方法と一緒に使用するのに適した変性剤として使用することができる。ｌｉｎＲＮＡ、ｃｉｒｃＲＮＡ、及び任意選択で１種若しくは複数種の不純物又は副産物を含むポリリボヌクレオチドの混合集団を含むサンプルからのｃｉｒｃＲＮＡの選択的濃縮及び精製に使用するのに適したクラウディング剤は、ＰＥＧ及び尿素を含む。
クラウディング剤は、他の分子間の水素結合が起こらないように溶液をクラウディングさせることができるという根拠に基づいて、開示される方法と一緒に使用するのに適した変性剤として使用することができる。ｌｉｎＲＮＡ、ｃｉｒｃＲＮＡ、及び任意選択で１種若しくは複数種の不純物又は副産物を含むポリリボヌクレオチドの混合集団を含むサンプルからのｃｉｒｃＲＮＡの選択的濃縮及び精製に使用するのに適したクラウディング剤は、ＰＥＧ及び尿素を含む。
【0175】
一例では、変性は、少なくとも０．１％（ｖ／ｖ）（例えば、少なくとも０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、４．５％、５％、５．５％、６％、６．５％、７％、７．５％、８％、８．５％、９％、９．５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、若しくはそれ以上）のＰＥＧを含む溶液にサンプルを曝露するステップによって実施される。いくつかの実施形態では、ｃｉｒｃＲＮＡではなく、ｌｉｎＲＮＡの選択的変性は、ｌｉｎＲＮＡ、ｃｉｒｃＲＮＡ、及び任意選択で１種若しくは複数種の不純物又は副産物を含むポリリボヌクレオチドの混合集団を含むサンプルを、１００ｍＭ～８Ｍ（例えば、１５０ｍＭ～７．５Ｍ、２００ｍＭ～７Ｍ、２５０ｍＭ～６．５Ｍ、３００ｍＭ～６Ｍ、３５０ｍＭ～５．５Ｍ、４００ｍＭ～５Ｍ、４５０ｍＭ～４．５Ｍ、５００ｍＭ～４Ｍ、６００ｍＭ～３．５Ｍ、７００ｍＭ～３Ｍ、８００ｍＭ～２．５Ｍ、９００ｍＭ～２Ｍ、１Ｍ～１．５Ｍ、１．１Ｍ～１．４Ｍ、若しくは１．２～１．３Ｍ）のＰＥＧを含む溶液に曝露するステップによって実施される。
【0176】
ＰＥＧは、一般式（ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ）ｎの基を指し、式中、ｎは整数であり、例えば、ＰＥＧ２～ＰＥＧ１００である。いくつかの実施形態では、ＰＥＧは、２００Ｄａ～６０００Ｄａ（例えば、４００Ｄａ～２５００Ｄａ、８００Ｄａ～２２００Ｄａ、１０００Ｄａ～２０００Ｄａ、２００Ｄａ、４００Ｄａ、６００Ｄａ、８００Ｄａ、１０００Ｄａ、１２００Ｄａ、１５００Ｄａ、２０００Ｄａ、２２００Ｄａ、２５００Ｄａ、３０００Ｄａ、３５００Ｄａ、４０００Ｄａ、４５００Ｄａ、５０００Ｄａ、５５００Ｄａ、又は６０００Ｄａ）の分子量を有する。
【0177】
前述した変性プロトコルは、本明細書に開示されるクロマトグラフィー分離方法の前にサンプルに対して実施することができる。或いは、変性は、開示した方法を用いたクロマトグラフィー分離後のサンプルに対して実施してもよい。さらに、アルカリ性変性は、サンプルのクロマトグラフィー精製と並行して（即ち、精製工程中に）実施してもよい。例えば、クロマトグラフィーカラム中に使用されるサンプルバッファー（例えば、ローディングバッファー）は、サンプルのポリリボヌクレオチドの分子内水素結合を変性するのに十分な濃度で前述のクラウディング剤を含み得る。したがって、サンプル内のｌｉｎＲＮＡの変性は、平衡化ステップ、サンプルロードステップ、カラム洗浄ステップ、及び溶離ステップなど、クロマトグラフィー分離プロセスの任意の段階で実施することができる。さらにまた、サンプルのクロマトグラフィー精製を行わない場合も、変性をサンプルに対して行うことができる。
【0178】
キレート剤
キレート剤は、ＲＮＡ分子（例えば、ｌｉｎＲＮＡ）内のＲＮＡ二次構造及び三次構造に結合して安定化させる金属イオン（中でも、例えば、Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋、Ｎａ＋、及びＫ＋）とキレート化する（即ち、結合する）可能性があるという根拠に基づいて、開示された方法と組み合わせて使用するのに適した変性剤として使用することができる。ｌｉｎＲＮＡ、ｃｉｒｃＲＮＡ、及び任意選択で１種若しくは複数種の不純物又は副産物を含むポリリボヌクレオチドの混合集団を含むサンプルからのｃｉｒｃＲＮＡの選択的濃縮及び精製に使用するのに適したキレート剤としては、エチレングリコール－ビス（β－アミノエチルエーテル）－Ｎ、Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラ酢酸（ＥＧＴＡ）又はその誘導体、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）又はその誘導体、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、イミノ－ジコハク酸（ＩＤＳ）、ポリアスパラギン酸、Ｓ，Ｓ－エチレンジアミン－Ｎ，Ｎ’－ジコハク酸（ＥＤＤＳ）、又はメチルグリシン二酢酸（ＭＧＤＡ）が挙げられる。いくつかの実施形態では、ｃｉｒｃＲＮＡではなく、ｌｉｎＲＮＡの選択的変性は、ｌｉｎＲＮＡ、ｃｉｒｃＲＮＡ、及び任意選択で１種若しくは複数種の不純物又は副産物を含むポリリボヌクレオチドの混合集団を含むサンプルを、１～１０ｍＭ（例えば、１～２ｍＭ、２～３ｍＭ、３～４ｍＭ、４～５ｍＭ、５～６ｍＭ、６～７ｍＭ、７～８ｍＭ、８～９ｍＭ、若しくは９～１０ｍＭ）のＥＧＴＡ若しくはその誘導体、ＥＤＴＡ若しくはその誘導体、ＮＴＡ、ＩＤＳ、ＥＤＤＳ、又はＭＧＤＡを含む溶液に曝露するステップによって実施される。
キレート剤は、ＲＮＡ分子（例えば、ｌｉｎＲＮＡ）内のＲＮＡ二次構造及び三次構造に結合して安定化させる金属イオン（中でも、例えば、Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋、Ｎａ＋、及びＫ＋）とキレート化する（即ち、結合する）可能性があるという根拠に基づいて、開示された方法と組み合わせて使用するのに適した変性剤として使用することができる。ｌｉｎＲＮＡ、ｃｉｒｃＲＮＡ、及び任意選択で１種若しくは複数種の不純物又は副産物を含むポリリボヌクレオチドの混合集団を含むサンプルからのｃｉｒｃＲＮＡの選択的濃縮及び精製に使用するのに適したキレート剤としては、エチレングリコール－ビス（β－アミノエチルエーテル）－Ｎ、Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラ酢酸（ＥＧＴＡ）又はその誘導体、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）又はその誘導体、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、イミノ－ジコハク酸（ＩＤＳ）、ポリアスパラギン酸、Ｓ，Ｓ－エチレンジアミン－Ｎ，Ｎ’－ジコハク酸（ＥＤＤＳ）、又はメチルグリシン二酢酸（ＭＧＤＡ）が挙げられる。いくつかの実施形態では、ｃｉｒｃＲＮＡではなく、ｌｉｎＲＮＡの選択的変性は、ｌｉｎＲＮＡ、ｃｉｒｃＲＮＡ、及び任意選択で１種若しくは複数種の不純物又は副産物を含むポリリボヌクレオチドの混合集団を含むサンプルを、１～１０ｍＭ（例えば、１～２ｍＭ、２～３ｍＭ、３～４ｍＭ、４～５ｍＭ、５～６ｍＭ、６～７ｍＭ、７～８ｍＭ、８～９ｍＭ、若しくは９～１０ｍＭ）のＥＧＴＡ若しくはその誘導体、ＥＤＴＡ若しくはその誘導体、ＮＴＡ、ＩＤＳ、ＥＤＤＳ、又はＭＧＤＡを含む溶液に曝露するステップによって実施される。
【0179】
一例では、ｃｉｒｃＲＮＡではなく、ｌｉｎＲＮＡの選択的変性は、ｌｉｎＲＮＡ、ｃｉｒｃＲＮＡ、及び任意選択で１種若しくは複数種の不純物又は副産物を含むポリリボヌクレオチドの混合集団を含むサンプルを、ＥＧＴＡ又はその誘導体を含む溶液に曝露するステップによって実施される。いくつかの実施形態では、溶液は、１～１０ｍＭ（例えば、１～２ｍＭ、２～３ｍＭ、３～４ｍＭ、４～５ｍＭ、５～６ｍＭ、６～７ｍＭ、７～８ｍＭ、８～９ｍＭ、若しくは９～１０ｍＭ）のＥＧＴＡ又はその誘導体を含む。
【0180】
別の例では、ＥＤＴＡ又はその誘導体を含む溶液にサンプルを曝露するステップによって、変性を実施する。いくつかの実施形態では、溶液は、１～１０ｍＭ（例えば、１～２ｍＭ、２～３ｍＭ、３～４ｍＭ、４～５ｍＭ、５～６ｍＭ、６～７ｍＭ、７～８ｍＭ、８～９ｍＭ、若しくは９～１０ｍＭ）のＥＤＴＡ又はその誘導体を含む。
【0181】
別の例では、ＮＴＡを含む溶液にサンプルを曝露するステップによって、変性を実施する。いくつかの実施形態では、溶液は、１～１０ｍＭ（例えば、１～２ｍＭ、２～３ｍＭ、３～４ｍＭ、４～５ｍＭ、５～６ｍＭ、６～７ｍＭ、７～８ｍＭ、８～９ｍＭ、若しくは９～１０ｍＭ）のＮＴＡを含む。
【0182】
別の例では、ＩＤＳを含む溶液にサンプルを曝露するステップによって、変性を実施する。いくつかの実施形態では、溶液は、１～１０ｍＭ（例えば、１～２ｍＭ、２～３ｍＭ、３～４ｍＭ、４～５ｍＭ、５～６ｍＭ、６～７ｍＭ、７～８ｍＭ、８～９ｍＭ、若しくは９～１０ｍＭ）のＩＤＳを含む。
【0183】
別の例では、ポリアスパラギン酸を含む溶液にサンプルを曝露するステップによって、変性を実施する。いくつかの実施形態では、溶液は、１～１０ｍＭ（例えば、１～２ｍＭ、２～３ｍＭ、３～４ｍＭ、４～５ｍＭ、５～６ｍＭ、６～７ｍＭ、７～８ｍＭ、８～９ｍＭ、若しくは９～１０ｍＭ）のポリアスパラギン酸を含む。
【0184】
別の例では、ＥＤＤＳを含む溶液にサンプルを曝露するステップによって、変性を実施する。いくつかの実施形態では、溶液は、１～１０ｍＭ（例えば、１～２ｍＭ、２～３ｍＭ、３～４ｍＭ、４～５ｍＭ、５～６ｍＭ、６～７ｍＭ、７～８ｍＭ、８～９ｍＭ、若しくは９～１０ｍＭ）のＥＤＤＳを含む。
【0185】
さらに別の例では、ＭＧＤＡを含む溶液にサンプルを曝露するステップによって、変性を実施する。いくつかの実施形態では、溶液は、１～１０ｍＭ（例えば、１～２ｍＭ、２～３ｍＭ、３～４ｍＭ、４～５ｍＭ、５～６ｍＭ、６～７ｍＭ、７～８ｍＭ、８～９ｍＭ、若しくは９～１０ｍＭ）のＭＧＤＡを含む。
【0186】
変性キレート剤へのサンプルの暴露は、ポリリボヌクレオチド（中でも、例えば、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｌｉｎＲＮＡ）を変性させるのに十分な時間をかけて行うことができる。例えば、変性キレート剤へのサンプルの暴露は、３０秒、４５秒、１分、２分、３分、４分、５分、６分、７分、８分、９分、１０分、１１分、１２分、１３分、１４分、１５分、１６分、１７分、１８分、１９分、２０分、又はそれ以上の時間をかけて行われ得る。
【0187】
前述した変性プロトコルは、本明細書に開示されるクロマトグラフィー分離方法の前にサンプルに対して実施することができる。或いは、変性は、開示した方法を用いたクロマトグラフィー分離後のサンプルに対して実施してもよい。さらに、キレート剤を用いた変性は、サンプルのクロマトグラフィー精製と並行して（即ち、精製工程中に）実施してもよい。例えば、クロマトグラフィーカラム中に使用されるサンプルバッファー（例えば、ローディングバッファー）は、サンプルのポリリボヌクレオチドの分子内水素結合を変性するのに十分な濃度で前述のキレート剤を含み得る。したがって、サンプル内のｌｉｎＲＮＡの変性は、平衡化ステップ、サンプルロードステップ、カラム洗浄ステップ、及び溶離ステップなど、クロマトグラフィー分離プロセスの任意の段階で実施することができる。さらにまた、サンプルのクロマトグラフィー精製を行わない場合も、変性をサンプルに対して行うことができる。
【0188】
デタージェント
開示された方法と一緒に使用するのに適した変性剤としてデタージェントを使用することができる。ｌｉｎＲＮＡ、ｃｉｒｃＲＮＡ、及び任意選択で１種若しくは複数種の不純物又は副産物を含むポリリボヌクレオチドの混合集団を含むサンプルからのｃｉｒｃＲＮＡの選択的濃縮及び精製に使用するのに適したデタージェントとしては、ノニデット（登録商標）（Ｎｏｎｉｄｅｔ）Ｐ－４０（ＮＰ４０）、ポリソルベート（例えば、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）－２０、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）－４０、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）－６０、若しくはＴｗｅｅｎ（登録商標）－８０）、ＣＨＡＰＳ、オクチルβ－Ｄ－グルコピラノシド、又はｎ－ドデシルβ－マルトシドが挙げられる。いくつかの実施形態では、ｃｉｒｃＲＮＡではなく、ｌｉｎＲＮＡの選択的変性は、０．００５～０．０５％（例えば、０．００６～０．０４５％、０．００７～０．０４％、０．００８～０．０３５％、０．００９～０．０３％、０．０１～０．０２５％、０．０１１～０．０２％、０．０１２～０．０１９％、０．０１３～０．０１８％、０．０１４～０．０１７％、若しくは０．０１５～０．０１６％）のＮＰ４０、ポリソルベート（例えば、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）－２０、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）－４０、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）－６０、若しくはＴｗｅｅｎ（登録商標）－８０）、ＣＨＡＰＳ、オクチルβ－Ｄ－グルコピラノシド、又はｎ－ドデシルβ－マルトシドを含むポリリボヌクレオチドの混合集団を含むサンプルを曝露するステップによって実施される。
開示された方法と一緒に使用するのに適した変性剤としてデタージェントを使用することができる。ｌｉｎＲＮＡ、ｃｉｒｃＲＮＡ、及び任意選択で１種若しくは複数種の不純物又は副産物を含むポリリボヌクレオチドの混合集団を含むサンプルからのｃｉｒｃＲＮＡの選択的濃縮及び精製に使用するのに適したデタージェントとしては、ノニデット（登録商標）（Ｎｏｎｉｄｅｔ）Ｐ－４０（ＮＰ４０）、ポリソルベート（例えば、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）－２０、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）－４０、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）－６０、若しくはＴｗｅｅｎ（登録商標）－８０）、ＣＨＡＰＳ、オクチルβ－Ｄ－グルコピラノシド、又はｎ－ドデシルβ－マルトシドが挙げられる。いくつかの実施形態では、ｃｉｒｃＲＮＡではなく、ｌｉｎＲＮＡの選択的変性は、０．００５～０．０５％（例えば、０．００６～０．０４５％、０．００７～０．０４％、０．００８～０．０３５％、０．００９～０．０３％、０．０１～０．０２５％、０．０１１～０．０２％、０．０１２～０．０１９％、０．０１３～０．０１８％、０．０１４～０．０１７％、若しくは０．０１５～０．０１６％）のＮＰ４０、ポリソルベート（例えば、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）－２０、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）－４０、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）－６０、若しくはＴｗｅｅｎ（登録商標）－８０）、ＣＨＡＰＳ、オクチルβ－Ｄ－グルコピラノシド、又はｎ－ドデシルβ－マルトシドを含むポリリボヌクレオチドの混合集団を含むサンプルを曝露するステップによって実施される。
【0189】
別の例では、変性は、ＮＰ４０を含む溶液にサンプルを曝露するステップによって実施される。いくつかの実施形態では、変性は、０．００５～０．０５％（例えば、０．００６～０．０４５％、０．００７～０．０４％、０．００８～０．０３５％、０．００９～０．０３％、０．０１～０．０２５％、０．０１１～０．０２％、０．０１２～０．０１９％、０．０１３～０．０１８％、０．０１４～０．０１７％、若しくは０．０１５～０．０１６％）のＮＰ４０を含む溶液にサンプルを曝露するステップによって実施される。
【0190】
別の例では、変性は、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）－２０を含む溶液にサンプルを曝露するステップによって実施される。いくつかの実施形態では、変性は、０．００５～０．０５％（例えば、０．００６～０．０４５％、０．００７～０．０４％、０．００８～０．０３５％、０．００９～０．０３％、０．０１～０．０２５％、０．０１１～０．０２％、０．０１２～０．０１９％、０．０１３～０．０１８％、０．０１４～０．０１７％、又は０．０１５～０．０１６％）のＴｗｅｅｎ（登録商標）－２０を含む溶液にサンプルを曝露するステップによって実施される。
【0191】
別の例では、変性は、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）－８０を含む溶液にサンプルを曝露するステップによって実施される。いくつかの実施形態では、変性は、０．００５～０．０５％（例えば、０．００６～０．０４５％、０．００７～０．０４％、０．００８～０．０３５％、０．００９～０．０３％、０．０１～０．０２５％、０．０１１～０．０２％、０．０１２～０．０１９％、０．０１３～０．０１８％、０．０１４～０．０１７％、若しくは０．０１５～０．０１６％）のＴｗｅｅｎ（登録商標）－８０を含む溶液にサンプルを曝露するステップによって実施される。
【0192】
別の例では、変性は、ＣＨＡＰＳを含む溶液にサンプルを曝露するステップによって実施される。いくつかの実施形態では、変性は、０．００５～０．０５％（例えば、０．００６～０．０４５％、０．００７～０．０４％、０．００８～０．０３５％、０．００９～０．０３％、０．０１～０．０２５％、０．０１１～０．０２％、０．０１２～０．０１９％、０．０１３～０．０１８％、０．０１４～０．０１７％、若しくは０．０１５～０．０１６％）のＣＨＡＰＳを含む溶液にサンプルを曝露するステップによって実施される。
【0193】
別の例では、変性は、オクチルβ－Ｄ－グルコピラノシドを含む溶液にサンプルを曝露するステップによって実施される。いくつかの実施形態では、変性は、０．００５～０．０５％（例えば、０．００６～０．０４５％、０．００７～０．０４％、０．００８～０．０３５％、０．００９～０．０３％、０．０１～０．０２５％、０．０１１～０．０２％、０．０１２～０．０１９％、０．０１３～０．０１８％、０．０１４～０．０１７％、若しくは０．０１５～０．０１６％）のオクチルβ－Ｄ－グルコピラノシドを含む溶液にサンプルを曝露するステップによって実施される。
【0194】
別の例では、変性は、ｎ－ドデシルβ－マルトシドを含む溶液にサンプルを曝露するステップによって実施される。いくつかの実施形態では、変性は、０．００５～０．０５％（例えば、０．００６～０．０４５％、０．００７～０．０４％、０．００８～０．０３５％、０．００９～０．０３％、０．０１～０．０２５％、０．０１１～０．０２％、０．０１２～０．０１９％、０．０１３～０．０１８％、０．０１４～０．０１７％、若しくは０．０１５～０．０１６％）のドデシルβ－マルトシドを含む溶液にサンプルを曝露するステップによって実施される。
【0195】
変性デタージェントへのサンプルの暴露は、ポリリボヌクレオチド（中でも、例えば、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｌｉｎＲＮＡ）を変性させるのに十分な時間をかけて行うことができる。例えば、変性デタージェント条件へのサンプルの暴露は、３０秒、４５秒、１分、２分、３分、４分、５分、６分、７分、８分、９分、１０分、１１分、１２分、１３分、１４分、１５分、１６分、１７分、１８分、１９分、２０分、又はそれ以上の時間をかけて行われ得る。
【0196】
前述した変性プロトコルは、本明細書に開示されるクロマトグラフィー分離法の前にサンプルに対して実施することができる。或いは、変性は、開示した方法を用いたクロマトグラフィー分離後のサンプルに対して実施してもよい。さらに、デタージェントを用いた変性は、サンプルのクロマトグラフィー精製と並行して（即ち、精製工程中に）実施してもよい。例えば、クロマトグラフィーカラム中に使用されるサンプルバッファー（例えば、ローディングバッファー）は、サンプルのポリリボヌクレオチドの分子内水素結合を変性するのに十分な濃度で前述のデタージェントを含み得る。したがって、サンプル内のｌｉｎＲＮＡの変性は、平衡化ステップ、サンプルロードステップ、カラム洗浄ステップ、及び溶離ステップを含む、クロマトグラフィー分離プロセスの任意の段階で実施することができる。さらにまた、サンプルのクロマトグラフィー精製を行わない場合も、変性をサンプルに対して行うことができる。
【0197】
塩溶液
核酸ポリマーの二次構造形成は塩濃度に大きく依存し、この塩濃度は、ポリヌクレオチド内での塩基対形成と水素結合形成の自由エネルギーを決定する。したがって、塩溶液の使用は、本明細書に記載されているように、ポリリボヌクレオチドの変性精製に適した方法である。ｌｉｎＲＮＡ、ｃｉｒｃＲＮＡ、及び任意選択で１種若しくは複数種の不純物又は副産物を含むポリリボヌクレオチドの混合集団を含むサンプルからのｃｉｒｃＲＮＡの選択的濃縮及び精製に使用するのに適した塩溶液としては、当技術分野で公知の中でも、例えば、以下：塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、塩化カリウム（ＫＣｌ）、塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ）、塩化カルシウム（ＣａＣｌ）、ＣｓＳＯ４、ＮａＳＯ４、塩化リチウム（ＬｉＣｌ）、臭化リチウム（ＬｉＢｒ）を含む溶液が挙げられる。いくつかの実施形態では、塩溶液は、１００ｍＭ～１Ｍ（例えば、１５０～９５０ｍＭ、２００～９００ｍＭ、２５０～８５０ｍＭ、３００～８００ｍＭ、３５０～７５０ｍＭ、４００～７００ｍＭ、４５０～６５０ｍＭ、５００～６００ｍＭ、若しくは５２５～５７５ｍＭ）のＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ、ＣａＣｌ、ＣｓＳＯ４、ＮａＳＯ４、ＬｉＣｌ、又はＬｉＢｒを含む。
核酸ポリマーの二次構造形成は塩濃度に大きく依存し、この塩濃度は、ポリヌクレオチド内での塩基対形成と水素結合形成の自由エネルギーを決定する。したがって、塩溶液の使用は、本明細書に記載されているように、ポリリボヌクレオチドの変性精製に適した方法である。ｌｉｎＲＮＡ、ｃｉｒｃＲＮＡ、及び任意選択で１種若しくは複数種の不純物又は副産物を含むポリリボヌクレオチドの混合集団を含むサンプルからのｃｉｒｃＲＮＡの選択的濃縮及び精製に使用するのに適した塩溶液としては、当技術分野で公知の中でも、例えば、以下：塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、塩化カリウム（ＫＣｌ）、塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ）、塩化カルシウム（ＣａＣｌ）、ＣｓＳＯ４、ＮａＳＯ４、塩化リチウム（ＬｉＣｌ）、臭化リチウム（ＬｉＢｒ）を含む溶液が挙げられる。いくつかの実施形態では、塩溶液は、１００ｍＭ～１Ｍ（例えば、１５０～９５０ｍＭ、２００～９００ｍＭ、２５０～８５０ｍＭ、３００～８００ｍＭ、３５０～７５０ｍＭ、４００～７００ｍＭ、４５０～６５０ｍＭ、５００～６００ｍＭ、若しくは５２５～５７５ｍＭ）のＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ、ＣａＣｌ、ＣｓＳＯ４、ＮａＳＯ４、ＬｉＣｌ、又はＬｉＢｒを含む。
【0198】
一例では、ｃｉｒｃＲＮＡではなく、ｌｉｎＲＮＡの選択的変性は、ｌｉｎＲＮＡ、ｃｉｒｃＲＮＡ、及び任意選択で１種若しくは複数種の不純物又は副産物を含むポリリボヌクレオチドの混合集団を含むサンプルを、ＮａＣｌを含む溶液に曝露することによって実施される。いくつかの実施形態では、ｃｉｒｃＲＮＡではなく、ｌｉｎＲＮＡの選択的変性は、ｌｉｎＲＮＡ、ｃｉｒｃＲＮＡ、及び任意選択で１種若しくは複数種の不純物又は副産物を含むポリリボヌクレオチドの混合集団を含むサンプルを、１００ｍＭ～１Ｍ（例えば、１５０～９５０ｍＭ、２００～９００ｍＭ、２５０～８５０ｍＭ、３００～８００ｍＭ、３５０～７５０ｍＭ、４００～７００ｍＭ、４５０～６５０ｍＭ、５００～６００ｍＭ、若しくは５２５～５７５ｍＭ）のＮａＣｌを含む溶液に曝露するステップによって実施される。
【0199】
別の例では、ＫＣｌを含む溶液にサンプルを曝露するステップによって変性を実施する。いくつかの実施形態では、ｃｉｒｃＲＮＡではなく、ｌｉｎＲＮＡの選択的変性は、ｌｉｎＲＮＡ、ｃｉｒｃＲＮＡ、及び任意選択で１種若しくは複数種の不純物又は副産物を含むポリリボヌクレオチドの混合集団を含むサンプルを、１００ｍＭ～１Ｍ（例えば、１５０～９５０ｍＭ、２００～９００ｍＭ、２５０～８５０ｍＭ、３００～８００ｍＭ、３５０～７５０ｍＭ、４００～７００ｍＭ、４５０～６５０ｍＭ、５００～６００ｍＭ、若しくは５２５～５７５ｍＭ）のＫＣｌを含む溶液に曝露するステップによって実施される。
【0200】
別の例では、ＭｇＣｌを含む溶液にサンプルを曝露するステップによって変性を実施する。いくつかの実施形態では、ｃｉｒｃＲＮＡではなく、ｌｉｎＲＮＡの選択的変性は、ｌｉｎＲＮＡ、ｃｉｒｃＲＮＡ、及び任意選択で１種若しくは複数種の不純物又は副産物を含むポリリボヌクレオチドの混合集団を含むサンプルを、１００ｍＭ～１Ｍ（例えば、１５０～９５０ｍＭ、２００～９００ｍＭ、２５０～８５０ｍＭ、３００～８００ｍＭ、３５０～７５０ｍＭ、４００～７００ｍＭ、４５０～６５０ｍＭ、５００～６００ｍＭ、若しくは５２５～５７５ｍＭ）のＭｇＣｌを含む溶液に曝露するステップによって実施される。
【0201】
別の例では、ＣａＣｌを含む溶液にサンプルを曝露するステップによって変性を実施する。いくつかの実施形態では、ｃｉｒｃＲＮＡではなく、ｌｉｎＲＮＡの選択的変性は、ｌｉｎＲＮＡ、ｃｉｒｃＲＮＡ、及び任意選択で１種若しくは複数種の不純物又は副産物を含むポリリボヌクレオチドの混合集団を含むサンプルを、１００ｍＭ～１Ｍ（例えば、１５０～９５０ｍＭ、２００～９００ｍＭ、２５０～８５０ｍＭ、３００～８００ｍＭ、３５０～７５０ｍＭ、４００～７００ｍＭ、４５０～６５０ｍＭ、５００～６００ｍＭ、若しくは５２５～５７５ｍＭ）のＣａＣｌを含む溶液に曝露するステップによって実施される。
【0202】
別の例では、ＣｓＳＯ４を含む溶液にサンプルを曝露するステップによって変性を実施する。いくつかの実施形態では、ｃｉｒｃＲＮＡではなく、ｌｉｎＲＮＡの選択的変性は、ｌｉｎＲＮＡ、ｃｉｒｃＲＮＡ、及び任意選択で１種若しくは複数種の不純物又は副産物を含むポリリボヌクレオチドの混合集団を含むサンプルを、１００ｍＭ～１Ｍ（例えば、１５０～９５０ｍＭ、２００～９００ｍＭ、２５０～８５０ｍＭ、３００～８００ｍＭ、３５０～７５０ｍＭ、４００～７００ｍＭ、４５０～６５０ｍＭ、５００～６００ｍＭ、若しくは５２５～５７５ｍＭ）のＣｓＳＯ４を含む溶液に曝露するステップによって実施される。
【0203】
別の例では、ＮａＳＯ４を含む溶液にサンプルを曝露するステップによって変性を実施する。いくつかの実施形態では、ｃｉｒｃＲＮＡではなく、ｌｉｎＲＮＡの選択的変性は、ｌｉｎＲＮＡ、ｃｉｒｃＲＮＡ、及び任意選択で１種若しくは複数種の不純物又は副産物を含むポリリボヌクレオチドの混合集団を含むサンプルを、１００ｍＭ～１Ｍ（例えば、１５０～９５０ｍＭ、２００～９００ｍＭ、２５０～８５０ｍＭ、３００～８００ｍＭ、３５０～７５０ｍＭ、４００～７００ｍＭ、４５０～６５０ｍＭ、５００～６００ｍＭ、若しくは５２５～５７５ｍＭ）のＮａＳＯ４を含む溶液に曝露するステップによって実施される。
【0204】
別の例では、ＬｉＣｌを含む溶液にサンプルを曝露するステップによって変性を実施する。いくつかの実施形態では、ｃｉｒｃＲＮＡではなく、ｌｉｎＲＮＡの選択的変性は、ｌｉｎＲＮＡ、ｃｉｒｃＲＮＡ、及び任意選択で１種若しくは複数種の不純物又は副産物を含むポリリボヌクレオチドの混合集団を含むサンプルを、１００ｍＭ～１Ｍ（例えば、１５０～９５０ｍＭ、２００～９００ｍＭ、２５０～８５０ｍＭ、３００～８００ｍＭ、３５０～７５０ｍＭ、４００～７００ｍＭ、４５０～６５０ｍＭ、５００～６００ｍＭ、若しくは５２５～５７５ｍＭ）のＬｉＣｌを含む溶液に曝露するステップによって実施される。
【0205】
別の例では、ＬｉＢｒを含む溶液にサンプルを曝露するステップによって変性を実施する。いくつかの実施形態では、ｃｉｒｃＲＮＡではなく、ｌｉｎＲＮＡの選択的変性は、ｌｉｎＲＮＡ、ｃｉｒｃＲＮＡ、及び任意選択で１種若しくは複数種の不純物又は副産物を含むポリリボヌクレオチドの混合集団を含むサンプルを、１００ｍＭ～１Ｍ（例えば、１５０～９５０ｍＭ、２００～９００ｍＭ、２５０～８５０ｍＭ、３００～８００ｍＭ、３５０～７５０ｍＭ、４００～７００ｍＭ、４５０～６５０ｍＭ、５００～６００ｍＭ、若しくは５２５～５７５ｍＭ）のＬｉＢｒを含む溶液に曝露するステップによって実施される。
【0206】
変性塩溶液へのサンプルの暴露は、ポリリボヌクレオチド（中でも、例えば、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｌｉｎＲＮＡ）を変性させるのに十分な時間をかけて行うことができる。例えば、変性塩溶液条件へのサンプルの暴露は、３０秒、４５秒、１分、２分、３分、４分、５分、６分、７分、８分、９分、１０分、１１分、１２分、１３分、１４分、１５分、１６分、１７分、１８分、１９分、２０分、又はそれ以上の時間をかけて行われ得る。
【0207】
前述した変性プロトコルは、本明細書に開示されるクロマトグラフィー分離方法の前にサンプルに対して実施することができる。或いは、変性は、開示した方法を用いたクロマトグラフィー分離後のサンプルに対して実施してもよい。さらに、塩溶液を用いた変性は、サンプルのクロマトグラフィー精製と並行して（即ち、精製工程中に）実施してもよい。例えば、クロマトグラフィーカラム中に使用されるサンプルバッファー（例えば、ローディングバッファー）は、サンプルのポリリボヌクレオチドの分子内水素結合を変性するのに十分な濃度で前述の塩を含み得る。したがって、サンプル内のｌｉｎＲＮＡの変性は、平衡化ステップ、サンプルロードステップ、カラム洗浄ステップ、及び溶離ステップを含む、クロマトグラフィー分離プロセスの任意の段階で実施することができる。さらにまた、サンプルのクロマトグラフィー精製を行わない場合も、塩溶液変性をサンプルに対して行うことができる。
【0208】
組み合わせ又は複数の変性剤
本開示はさらに、ｃｉｒｃＲＮＡ、ｌｉｎＲＮＡ、及び他の物質を含むポリリボヌクレオチドの混合集団からｃｉｒｃＲＮＡの濃縮集団を生産するために、前述の変性条件の２つ、３つ、４つ又はそれ以上を組み合わせた使用を提供する。ｃｉｒｃＲＮＡ及びｌｉｎＲＮＡの混合集団を含むサンプルは、開示された変性条件の２つ、３つ、４つ若しくはそれ以上に同時に又は順次（時間的間隔を置いて、若しくは置かずに）供することができる。２つ以上の変性条件は、例えば、同じカテゴリーの変性剤からのもの、例えば、本明細書に記載のカオトロピック剤から選択される２種以上のカオトロピック剤、本明細書に記載の酸変性剤から選択される２種以上の酸変性剤、本明細書に記載のアルカリ変性剤から選択される２種以上のアルカリ変性剤、本明細書に記載の有機溶媒から選択の２種以上の有機溶媒、本明細書に記載のキレート剤から選択される２種以上のキレート剤、本明細書に記載のデタージェントから選択される２種以上のデタージェント、又は本明細書に記載の塩溶液から選択される２種以上の塩溶液であってよい。２つ以上の変性条件は、異なるカテゴリーの変性剤からのものであってもよい。例えば、２つ以上の変性条件の組み合わせは、表１に記載される通りであってもよく、熱変性は、本明細書に記載される任意の熱変性条件から選択され、ｐＨ変性は、本明細書に記載される任意のｐＨ変性条件から選択され、酸変性剤は、本明細書に記載される任意の酸変性条件から選択され、アルカリ変性剤は、本明細書に記載される任意のアルカリ変性条件から選択され、有機溶媒は、本明細書に記載される任意の有機溶媒条件から選択され、カオトロピック剤は、本明細書に記載される任意のカオトロピック剤条件から選択され、キレート剤は、本明細書に記載される任意のキレート剤条件から選択され、デタージェントは、本明細書に記載される任意のデタージェント条件から選択され、塩溶液は、本明細書に記載される任意の塩溶液条件から選択される。
本開示はさらに、ｃｉｒｃＲＮＡ、ｌｉｎＲＮＡ、及び他の物質を含むポリリボヌクレオチドの混合集団からｃｉｒｃＲＮＡの濃縮集団を生産するために、前述の変性条件の２つ、３つ、４つ又はそれ以上を組み合わせた使用を提供する。ｃｉｒｃＲＮＡ及びｌｉｎＲＮＡの混合集団を含むサンプルは、開示された変性条件の２つ、３つ、４つ若しくはそれ以上に同時に又は順次（時間的間隔を置いて、若しくは置かずに）供することができる。２つ以上の変性条件は、例えば、同じカテゴリーの変性剤からのもの、例えば、本明細書に記載のカオトロピック剤から選択される２種以上のカオトロピック剤、本明細書に記載の酸変性剤から選択される２種以上の酸変性剤、本明細書に記載のアルカリ変性剤から選択される２種以上のアルカリ変性剤、本明細書に記載の有機溶媒から選択の２種以上の有機溶媒、本明細書に記載のキレート剤から選択される２種以上のキレート剤、本明細書に記載のデタージェントから選択される２種以上のデタージェント、又は本明細書に記載の塩溶液から選択される２種以上の塩溶液であってよい。２つ以上の変性条件は、異なるカテゴリーの変性剤からのものであってもよい。例えば、２つ以上の変性条件の組み合わせは、表１に記載される通りであってもよく、熱変性は、本明細書に記載される任意の熱変性条件から選択され、ｐＨ変性は、本明細書に記載される任意のｐＨ変性条件から選択され、酸変性剤は、本明細書に記載される任意の酸変性条件から選択され、アルカリ変性剤は、本明細書に記載される任意のアルカリ変性条件から選択され、有機溶媒は、本明細書に記載される任意の有機溶媒条件から選択され、カオトロピック剤は、本明細書に記載される任意のカオトロピック剤条件から選択され、キレート剤は、本明細書に記載される任意のキレート剤条件から選択され、デタージェントは、本明細書に記載される任意のデタージェント条件から選択され、塩溶液は、本明細書に記載される任意の塩溶液条件から選択される。
【0209】
【表1】
【0210】
表１に示す組み合わせを、第３、第４、第５、又はそれ以上のさらなる変性条件と組み合わせてもよい。
【0211】
例えば、上記の変性熱条件を上記の変性ｐＨ条件と組み合わせて、ｃｉｒｃＲＮＡとｌｉｎＲＮＡを含むポリリボヌクレオチドの混合集団からｃｉｒｃＲＮＡの濃縮集団を生産することができる。或いは、変性熱条件を本明細書に記載の１種又は複数の化学変性剤と組み合わせて、ｃｉｒｃＲＮＡの濃縮集団を生産することもできる。さらに、ｃｉｒｃＲＮＡの濃縮集団は、ポリリボヌクレオチドの混合集団をｐＨ変性剤及び化学変性剤と接触させることによって、ポリリボヌクレオチドの混合集団から生産することができる。
【0212】
本開示はまた、本明細書に記載の１つ又は複数の変性条件を、当技術分野で公知の１つ又は複数の非変性条件（例えば、温度、ｐＨ、バッファー）と組み合わせて使用することも提供する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の熱変性は、変性ｐＨ条件と組み合わせて、ｃｉｒｃＲＮＡ及びｌｉｎＲＮＡを含むポリリボヌクレオチドの混合集団を含むサンプルに対して実施され得る。例えば、本明細書に記載のポリリボヌクレオチド（例えば、ｃｉｒｃＲＮＡ及びｌｉｎＲＮＡを含むポリリボヌクレオチドの混合集団又はｃｉｒｃＲＮＡの濃縮集団）を、変性温度、例えば、少なくとも５０℃の温度、例えば、５０℃～８５℃（例えば、５０℃、５１℃、５２℃、５３℃、５４℃、５５℃、５６℃、５７℃、５８℃、５９℃、６０℃、６１℃、６２℃、６３℃、６４℃、６５℃、６６℃、６７℃、６８℃、６９℃、７０℃、７１℃、７２℃、７３℃、７４℃、７５℃、７６℃、７７℃、７８℃、７９℃、８０℃、８１℃、８２℃、８３℃、８４℃、又は８５℃）に、変性ｐＨ条件（例えば、５超且つ９未満のｐＨ、例えば、以下：５．０１、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８．０、８．１、８．２、８．３、８．４、８．５、８．６、８．７、８．８、８．９、又は８．９９のｐＨ）と組み合わせて曝露することができる。
【0213】
いくつか他の実施形態では、本明細書に記載の熱変性は、非変性ｐＨ条件と組み合わせて、ｃｉｒｃＲＮＡ及びｌｉｎＲＮＡを含むポリリボヌクレオチドの混合集団を含むサンプルに対して実施してもよい。例えば、本明細書に記載のポリリボヌクレオチド（例えば、ｃｉｒｃＲＮＡ及びｌｉｎＲＮＡを含むポリリボヌクレオチドの混合集団又はｃｉｒｃＲＮＡの濃縮集団）を、少なくとも５０℃の温度などの変性温度、例えば、５０℃～８５℃（例えば、５０℃、５１℃、５２℃、５３℃、５４℃、５５℃、５６℃、５７℃、５８℃、５９℃、６０℃、６１℃、６２℃、６３℃、６４℃、６５℃、６６℃、６７℃、６８℃、６９℃、７０℃、７１℃、７２℃、７３℃、７４℃、７５℃、７６℃、７７℃、７８℃、７９℃、８０℃、８１℃、８２℃、８３℃、８４℃、又は８５℃）の温度に、非変性ｐＨ条件（例えば、５超且つ９未満のｐＨ、例えば、以下：５．０１、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８．０、８．１、８．２、８．３、８．４、８．５、８．６、８．７、８．８又は８．９のｐＨ）と組み合わせて曝露することができる。
【0214】
別の例では、本明細書に記載のポリリボヌクレオチド（例えば、ｃｉｒｃＲＮＡ及びｌｉｎＲＮＡを含むポリリボヌクレオチドの混合集団又はｃｉｒｃＲＮＡの濃縮集団）を、変性ｐＨ条件（例えば、５超且つ９未満のｐＨ、例えば、以下：５．０１、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８．０、８．１、８．２、８．３、８．４、８．５、８．６、８．７、８．８、８．９、又は８．９９のｐＨ）に、非変性温度、例えば、５０℃未満（例．４９℃、４８℃、４７℃、４６℃、４５℃、４４℃、４３℃、４２℃、４１℃、４０℃、３９℃、３８℃、３７℃、３６℃、３５℃、３４℃、３３℃、３２℃、３１℃、３０℃、２９℃、２８℃、２７℃、２６℃、２５℃、２４℃、２３℃、２２℃、２１℃、２０℃、１９℃、１８℃、１７℃、１６℃、１５℃、１４℃、１３℃、１２℃、１１℃、１０℃、又はそれ以下）の温度と組み合わせて曝露することができる。
【0215】
別の例では、本明細書に記載のポリリボヌクレオチド（例えば、ｃｉｒｃＲＮＡ及びｌｉｎＲＮＡを含むポリリボヌクレオチドの混合集団又はｃｉｒｃＲＮＡの濃縮集団）を、変性カオトロピック剤条件、例えば、少なくとも１％（ｖ／ｖ）（例えば、少なくとも１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、４．５％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、若しくはそれ以上）の濃度の尿素、加えて、１種若しくは複数種の変性有機溶媒条件、例えば、少なくとも０．１％（ｖ／ｖ）（例えば、少なくとも０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、４．５％、５％、５．５％、６％、６．５％、７％、７．５％、８％、８．５％、９％、９．５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、若しくはそれ以上）の濃度のアセトニトリル及びジメチルスルホキシドに曝露することができる。
【0216】
別の例では、本明細書に記載のポリリボヌクレオチド（例えば、ｃｉｒｃＲＮＡ及びｌｉｎＲＮＡを含むポリリボヌクレオチドの混合集団又はｃｉｒｃＲＮＡの濃縮集団）を、変性カオトロピック剤条件、例えば、少なくとも１％（ｖ／ｖ）（例えば、少なくとも１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、４．５％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、若しくはそれ以上）の濃度の尿素、加えて、１種若しくは複数種の変性有機溶媒条件、例えば、少なくとも０．１％（ｖ／ｖ）（例えば、少なくとも０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、４．５％、５％、５．５％、６％、６．５％、７％、７．５％、８％、８．５％、９％、９．５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、若しくはそれ以上）の濃度のアセトニトリル及びジメチルスルホキシド、さらに加えて、少なくとも５０℃の温度などの変性温度、例えば、５０℃～８５℃（例えば、５０℃、５１℃、５２℃、５３℃、５４℃、５５℃、５６℃、５７℃、５８℃、５９℃、６０℃、６１℃、６２℃、６３℃、６４℃、６５℃、６６℃、６７℃、６８℃、６９℃、７０℃、７１℃、７２℃、７３℃、７４℃、７５℃、７６℃、７７℃、７８℃、７９℃、８０℃、８１℃、８２℃、８３℃、８４℃、又は８５℃）の温度に曝露してもよい。
【0217】
別の例では、本明細書に記載のポリリボヌクレオチド（例えば、ｃｉｒｃＲＮＡ及びｌｉｎＲＮＡを含むポリリボヌクレオチドの混合集団又はｃｉｒｃＲＮＡの濃縮集団）を、変性カオトロピック剤条件、例えば、少なくとも１％（ｖ／ｖ）（例えば、少なくとも１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、４．５％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、若しくはそれ以上）の濃度の尿素、加えて、少なくとも５０℃の温度などの変性温度、例えば、５０℃～８５℃（例えば、５０℃、５１℃、５２℃、５３℃、５４℃、５５℃、５６℃、５７℃、５８℃、５９℃、６０℃、６１℃、６２℃、６３℃、６４℃、６５℃、６６℃、６７℃、６８℃、６９℃、７０℃、７１℃、７２℃、７３℃、７４℃、７５℃、７６℃、７７℃、７８℃、７９℃、８０℃、８１℃、８２℃、８３℃、８４℃、又は８５℃）の温度に曝露することができる。別の例では、本明細書に記載のポリリボヌクレオチド（例えば、ｃｉｒｃＲＮＡ及びｌｉｎＲＮＡを含むポリリボヌクレオチドの混合集団又はｃｉｒｃＲＮＡの濃縮集団）を、変性カオトロピック剤条件、例えば、少なくとも１％（ｖ／ｖ）（例えば、少なくとも１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、４．５％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、若しくはそれ以上）の濃度の尿素、加えて、変性ｐＨ条件（例えば、５超且つ９未満のｐＨ、例えば、以下：５．０１、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８．０、８．１、８．２、８．３、８．４、８．５、８．６、８．７、８．８、８．９、又は８．９９のｐＨ）に曝露することができる。
【0218】
別の例では、本明細書に記載のポリリボヌクレオチド（例えば、ｃｉｒｃＲＮＡ及びｌｉｎＲＮＡを含むポリリボヌクレオチドの混合集団又はｃｉｒｃＲＮＡの濃縮集団）を、変性有機溶媒条件、例えば、少なくとも０．１％（ｖ／ｖ）（例えば、少なくとも０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、４．５％、５％、５．５％、６％、６．５％、７％、７．５％、８％、８．５％、９％、９．５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、若しくはそれ以上）の濃度のアセトニトリル及びジメチルスルホキシド、加えて、少なくとも５０℃の温度などの変性温度、例えば、５０℃～８５℃（例えば、５０℃、５１℃、５２℃、５３℃、５４℃、５５℃、５６℃、５７℃、５８℃、５９℃、６０℃、６１℃、６２℃、６３℃、６４℃、６５℃、６６℃、６７℃、６８℃、６９℃、７０℃、７１℃、７２℃、７３℃、７４℃、７５℃、７６℃、７７℃、７８℃、７９℃、８０℃、８１℃、８２℃、８３℃、８４℃、又は８５℃）の温度に曝露することができる。
【0219】
別の例では、本明細書に記載のポリリボヌクレオチド（例えば、ｃｉｒｃＲＮＡ及びｌｉｎＲＮＡを含むポリリボヌクレオチドの混合集団又はｃｉｒｃＲＮＡの濃縮集団）を、１種若しくは複数種の変性有機溶媒条件、例えば、少なくとも０．１％（ｖ／ｖ）（例えば、少なくとも０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、４．５％、５％、５．５％、６％、６．５％、７％、７．５％、８％、８．５％、９％、９．５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、若しくはそれ以上）の濃度のアセトニトリル及びジメチルスルホキシド、加えて、変性ｐＨ条件（例えば、５超且つ９未満のｐＨ、例えば、以下：５．０１、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８．０、８．１、８．２、８．３、８．４、８．５、８．６、８．７、８．８、８．９、又は８．９９のｐＨ）に曝露することができる。
【0220】
別の例では、本明細書に記載のポリリボヌクレオチド（例えば、ｃｉｒｃＲＮＡ及びｌｉｎＲＮＡを含むポリリボヌクレオチドの混合集団又はｃｉｒｃＲＮＡの濃縮集団）を、変性塩条件、例えば、１００ｍＭ～１Ｍ（例えば、１５０～９５０ｍＭ、２００～９００ｍＭ、２５０～８５０ｍＭ、３００～８００ｍＭ、３５０～７５０ｍＭ、４００～７００ｍＭ、４５０～６５０ｍＭ、５００～６００ｍＭ、若しくは５２５～５７５ｍＭ）のＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ、ＣａＣｌ、ＣｓＳＯ４、ＮａＳＯ４、ＬｉＣｌ、又はＬｉＢｒ、加えて、変性ｐＨ条件（例えば、５超且つ９未満のｐＨ、例えば、以下：５．０１、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８．０、８．１、８．２、８．３、８．４、８．５、８．６、８．７、８．８、８．９、又は８．９９のｐＨ）に曝露してもよい。
【0221】
精製方法
本明細書には、変性条件下で、ｃｉｒｃＲＮＡ及びｌｉｎＲＮＡの混合集団を含むサンプルからｃｉｒｃＲＮＡを精製するために使用され得る様々な方法が開示される。いくつかの実施形態では、精製方法は、カラムクロマトグラフィー精製方法である。カラムクロマトグラフィー法は概して、溶解した目的の物質を含む溶液（一般に移動相と呼ばれる）を、多孔性顆粒から構成される固定相をロードしたクロマトグラフィーカラムを介して流すプロセスを使用する。ロードされる溶液はカラムを通過し、分析物の物理化学的特性によって決定される固定相との相互作用に基づいて物質が分離される。精製方法には、例えば、高速タンパク質液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ；例えば逆相（ＲＰ）－ＦＰＬＣ）、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）、陰イオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＣ）、ミックスモードクロマトグラフィー（ＭＭＣ）、又はアフィニティークロマトグラフィーなどのカラムクロマトグラフィーを含む。これらの方法については、以下にさらに詳しく説明する。
本明細書には、変性条件下で、ｃｉｒｃＲＮＡ及びｌｉｎＲＮＡの混合集団を含むサンプルからｃｉｒｃＲＮＡを精製するために使用され得る様々な方法が開示される。いくつかの実施形態では、精製方法は、カラムクロマトグラフィー精製方法である。カラムクロマトグラフィー法は概して、溶解した目的の物質を含む溶液（一般に移動相と呼ばれる）を、多孔性顆粒から構成される固定相をロードしたクロマトグラフィーカラムを介して流すプロセスを使用する。ロードされる溶液はカラムを通過し、分析物の物理化学的特性によって決定される固定相との相互作用に基づいて物質が分離される。精製方法には、例えば、高速タンパク質液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ；例えば逆相（ＲＰ）－ＦＰＬＣ）、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）、陰イオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＣ）、ミックスモードクロマトグラフィー（ＭＭＣ）、又はアフィニティークロマトグラフィーなどのカラムクロマトグラフィーを含む。これらの方法については、以下にさらに詳しく説明する。
【0222】
高速液体クロマトグラフィー
本明細書に記載の方法は、ｃｉｒｃＲＮＡ及びｌｉｎＲＮＡの１つ若しくは複数の異なる集団、又は他の物質を含む混合ポリリボヌクレオチドを含むサンプルからｃｉｒｃＲＮＡを精製及び濃縮するためのＦＰＬＣ法の使用を含む。
本明細書に記載の方法は、ｃｉｒｃＲＮＡ及びｌｉｎＲＮＡの１つ若しくは複数の異なる集団、又は他の物質を含む混合ポリリボヌクレオチドを含むサンプルからｃｉｒｃＲＮＡを精製及び濃縮するためのＦＰＬＣ法の使用を含む。
【0223】
ＦＰＬＣは、物質の複雑な混合物を分離するための確立された方法であり、生化学、分析化学、及び臨床化学に関する用途に一般に使用されている。ＦＰＬＣ法は、概して、２種類のＦＰＬＣ法、即ち、逆相（ＲＰ）－ＦＰＬＣと順相（ＮＰ）－ＦＰＬＣがある。ＲＰ－ＦＰＬＣが非極性（即ち、疎水性）固定相と極性又は中極性移動相を用いるのに対し、ＮＰ－ＦＰＬＣは極性（親水性）固定相及び非極性移動相を用いる点で、ＲＰ－ＦＰＬＣは、ＮＰ－ＦＰＬＣと異なる。ＦＰＬＣが、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）と異なるのは、主に、ＨＰＬＣと比べて低い操作圧力（例えば、＜５バール）及び高い流量（ベンチトップ型システムでは１～５ｍＬ／分；工業規模の精製ではリットル／分）を使用するところである。一般に、ＦＰＬＣカラムは、最大圧力３～４ＭＰａ（４３５～５８０ｐｓｉ）までしか使用できない。ＲＰ－ＦＰＬＣは一般に、少なくとも、移動相を含む溶離液リザーバを備えるポンプ、サンプルインプットシステムと、疎水性固定相（中でも、例えば、樹脂、ビーズ、フィルム）を含む分離カラムと、検出器と、を含む装置で実施される。ＲＰ－ＦＰＬＣ装置の追加要素には、分離プロセス中に収集された個々の画分を収集するための画分コレクターが含まれ得る。ＲＰ－ＦＰＬＣの根底にある中核原理は、非極性分析物、非極性固定分析物、並びにより極性の分析物についての保持時間及び溶離時間の短縮の間の相互作用である。これは、極性溶媒に対する分析物の疎水性セグメントの曝露が減少すると、規則正しい分析物－極性溶媒界面の最小化に伴って自由エネルギーが減少するためである。したがって、分析物の疎水性指標は、クロマトグラフィーカラムからの溶離時間に大まかに比例する。移動相の極性を低下させることにより、非極性分析物の結合が低減し、これによってクロマトグラフィーカラムからの分析物の溶離が起こる。分析物の保持時間に影響を与えるその他の要因には、移動相中の無機塩の存在があり、それらが及ぼす移動相への影響（即ち、表面張力の増加）によって分析物の保持時間が長くなる。また、分析物の疎水性を改変することによって、移動相のｐＨにより保持時間は影響され得る。一般に、移動相バッファーは、分析物に残留する全ての電荷を中和して、分析物と固定相との疎水性相互作用を促進する目的でｐＨを調節するために使用される。同様に、イオン相互作用によって分析物の電荷を中和するイオンペアリング剤を使用することにより、荷電した分析物の極性を低下させることができる。
【0224】
本明細書に開示される方法は、ｃｉｒｃＲＮＡとｌｉｎＲＮＡの間の機能的疎水性の違いを利用することにより、ｃｉｒｃＲＮＡとｌｉｎＲＮＡを含む混合ポリリボヌクレオチドの集団からｃｉｒｃＲＮＡの集団を分離することを可能にする；即ち、ｃｉｒｃＲＮＡは、ｌｉｎＲＮＡと比較してより高い疎水性を示すことから、ｃｉｒｃＲＮＡの固定相への吸着が強くなり、その結果、溶出時間がより長くなる。ＲＰ－ＦＰＬＣで逆相として使用するのに適した材料としては、限定されないが、多孔性ポリスチレンポリマー、（非アルキル化）（多孔性）ポリスチレンジビニルベンゼンポリマー、多孔性シリカゲル、非極性残基で修飾された多孔性シリカゲル、特にアルキル含有残基、より好ましくは、ブチル、オクチル又はオクタデシル含有残基で修飾された多孔性シリカゲル、フェニル残基で修飾された多孔性シリカゲル、多孔性ポリメタクリレートが挙げられ、この場合、特に、多孔性ポリスチレンポリマー又は非アルキル化（多孔性）ポリスチレンジビニルベンゼンを使用することができる。ポリスチレンジビニルベンゼンを用いた固定相は、それ自体公知である。商業的に入手可能なＦＰＬＣ法に既に使用されているそれ自体公知のポリスチレンジビニルベンゼンを、本発明による方法に使用することができる。本発明による方法に、とりわけ極めて好ましい非アルキル化多孔性ポリスチレンジビニルベンゼンは、限定されないが、８．０±１．５μｍ、特に８．０±０．５μｍの粒子サイズ、及び１０００～１５００Ａ、特に１０００～１２００Ａ又は３５００～４５００Ａの孔径を有し得るものである。
【0225】
疎水性相互作用クロマトグラフィー
ＨＩＣは、ＨＩＣ移動相と目的の標的分子（例えば、ｃｉｒｃＲＮＡ）の疎水性部位との相互作用を利用する精製法である。ＨＩＣは、標的分子が溶出段階で溶出されるまで固定相に結合する結合・溶離モード、又は不純物若しくは副産物が固定相に結合する間に目的の分子が移動相を介して流れるフロースルーモードで実施することができる。いくつかの実施形態では、ＨＩＣは、結合・溶離モードとフロースルーモードの組み合わせを使用することができる。
ＨＩＣは、ＨＩＣ移動相と目的の標的分子（例えば、ｃｉｒｃＲＮＡ）の疎水性部位との相互作用を利用する精製法である。ＨＩＣは、標的分子が溶出段階で溶出されるまで固定相に結合する結合・溶離モード、又は不純物若しくは副産物が固定相に結合する間に目的の分子が移動相を介して流れるフロースルーモードで実施することができる。いくつかの実施形態では、ＨＩＣは、結合・溶離モードとフロースルーモードの組み合わせを使用することができる。
【0226】
ＨＩＣは、１つ又は複数の疎水性リガンドを用いることができる。ＨＩＣ疎水性リガンドの非限定的な例としては、アルキルリガンド、アリールリガンド、及びそれらの組み合わせが挙げられる。例えば、ＨＩＣ固定相は、ブチル、ヘキシル、フェニル、オクチル、又はポリプロピレングリコールリガンドからなる群から選択され得る。いくつかの実施形態では、ＨＩＣカラムは、以下：ＣａｐｔｏＰｈｅｎｙｌ、低置換度又は高置換度のＰｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ、Ｐｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ、Ｏｃｔｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ（商標）ＥＭＤ Ｐｒｏｐｙｌ、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ（商標）ＥＭＤ Ｐｈｅｎｙｌ、Ｍａｃｒｏ－Ｐｒｅｐ（商標）Ｍｅｔｈｙｌ、Ｍａｃｒｏ－Ｐｒｅｐ（商標）ｔ－Ｂｕｔｙｌ、ＷＰ ＨＩＩ－Ｐｒｏｐｙｌ（Ｃ３）（商標）、ＣＩＭｍｕｌｔｕｓ Ｃ４ ＨＬＤ、ＣＩＭｍｕｌｔｕｓ（登録商標）ＯＨ、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ（商標）エーテル、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ（商標）フェニル、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ（商標）ブチル、ＴｏｙｏＳｃｒｅｅｎ ＰＰＧ、ＴｏｙｏＳｃｒｅｅｎ Ｐｈｅｎｙｌ、ＴｏｙｏＳｃｒｅｅｎ Ｂｕｔｙｌ、ＴｏｙｏＳｃｒｅｅｎ Ｈｅｘｙｌ、ＨｉＳｃｒｅｅｎ Ｂｕｔｙｌ ＦＦ、ＨｉＳｃｒｅｅｎ Ｏｃｔｙｌ ＦＦ、及びＴｏｓｏｈ Ｈｅｘｙｌからなる群から選択される。
【0227】
本明細書に開示された方法によれば、ＨＩＣには、塩を含むロードバッファー又は洗浄バッファーを使用することができる。ＨＩＣに適した塩の非限定的な例としては、硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化アンモニウム、臭化ナトリウム、又はそれらの組み合わせが挙げられる。いくつかの実施形態では、ロードバッファー及び洗浄バッファーとしては、硫酸塩、クエン酸塩、又はそれらの組み合わせが挙げられる。様々な実施形態では、ロードバッファー又は洗浄バッファーは、Ｂａ２＋、Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋、Ｌｉ＋、Ｃｓ＋、Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｒｂ＋、若しくはＮＨ４
＋などの陽イオン、又はＰＯ４
３－、ＳＯ４
２－、ＣＨ３ＣＯ３
－、Ｃｌ－、Ｂｒ－、ＮＯ３
－、ＣｌＯ４
－、Ｉ－、若しくはＳＣＮ－などの陰イオン、又はそれらの組み合わせを含む。疎水性相互作用は、塩濃度が高いほど強くなる。ＨＩＣカラムに対する目的のｃｉｒｃＲＮＡの集団の吸着は、高い塩濃度によって促進されるが、実際の濃度は、目的のｃｉｒｃＲＮＡの性質、塩の種類、及び選択された特定のＨＩＣリガンドによって広範に変化し得る。いくつかの実施形態では、塩濃度は、一部には塩の種類及びＨＩＣ吸着剤に応じて、例えば、約５０ｍＭ～約５０００ｍＭ、約１００ｍＭ～約４０００ｍＭ、約１０００ｍＭ～約４０００ｍＭ、約５０ｍＭ～約２０００ｍＭの範囲である。一実施形態では、塩濃度は、約５０ｍＭ、約５５ｍＭ、約６０ｍＭ、約６５ｍＭ、約７０ｍＭ、約７５ｍＭ、約８０ｍＭ、約８５ｍＭ、約９０ｍＭ、約１００ｍＭ、約２００ｍＭ、約３００ｍＭ、約４００ｍＭ、約５００ｍＭ、約６００ｍＭ、約７００ｍＭ、約８００ｍＭ、約９００ｍＭ、約１０００ｍＭ、約１２００ｍＭ、約１４００ｍＭ、約１６００ｍＭ、約１８００ｍＭ又は約２０００ｍＭである。いくつかの実施形態では、ロードバッファー及び洗浄バッファーは、約４．０～８．５、又は約５．０～７．０のｐＨを有する。特定の実施形態では、ロードバッファー及び洗浄バッファーは、約４．０、約４．５、約５．０、約５．５、約６、約６．５、約７．０、約７．５、約８．０、又は約８．５のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、ロードバッファー及び洗浄バッファーは、同じであるか、又は実質的に同じである。
【0228】
ＨＩＣ分離を行う例示的な方法では、サンプル（例えば、ｃｉｒｃＲＮＡ及びｌｉｎＲＮＡなどのポリリボヌクレオチドの混合集団を含むサンプル）を、例えば、バッチ精製技術を用いて、或いはカラム若しくはメンブレンクロマトグラフィー又はモノリス材料（ＨＩＣ媒体又は樹脂と呼ばれる）を用いて、ＨＩＣ媒体と接触させる。例えば、クロマトグラフィー分離に関して、一般に円筒形をしたクロマトグラフィー装置を使用して、適切な緩衝液で調製されたクロマトグラフィー支持媒体（例えば、ＨＩＣ媒体）を収容する。クロマトグラフィー材料をクロマトグラフィー装置に添加したら、目的のｃｉｒｃＲＮＡ又は不純物若しくは副産物の実質的部分をＨＩＣ媒体に結合させることができるように、ローディングバッファーの存在下で、目的のｃｉｒｃＲＮＡの集団を含むサンプルをクロマトグラフィー材料に接触させる。サンプル中の目的のｃｉｒｃＲＮＡの集団は、ＨＩＣ媒体に結合するのに対して、例えば、ｌｉｎＲＮＡのような不純物又は副産物は通過して流れ、不純物又は副産物を含むフロースルー画分を形成する。結合したｃｉｒｃＲＮＡは、溶離段階で溶離され、それにより、ｃｉｒｃＲＮＡの濃縮集団を形成する。いくつかの実施形態では、ＨＩＣ媒体に結合するｃｉｒｃＲＮＡの集団は、サンプル中のポリリボヌクレオチド総量の少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％又は少なくとも約９８％である。
【0229】
陰イオン交換クロマトグラフィー
ＡＥＣは、目的の核酸（例えば、ｃｉｒｃＲＮＡ）の局所電荷とクロマトグラフィー材料の局所電荷との間の差異に基づいて分子を分離する。充填されたＡＥＣカラム又はメンブレンデバイスは、結合・溶離モード、フロースルー、又はハイブリッドモードで操作することができる。カラム又はメンブレンデバイスを平衡化バッファー、又はｐＨ若しくは導電率が異なる別のバッファーで洗浄した後、溶出バッファーのイオン強度（即ち導電率）を高めて、ＡＥＣマトリックスの荷電部位について溶質と競合させることにより、生成物の回収を達成する。ｐＨを変化させ、それによって溶質の電荷を変化させることは、溶質の溶離を達成するもう一つの方法である。導電率又はｐＨの変化は、漸進的（グラジエント溶離）又は段階的（ステップ溶離）である。
ＡＥＣは、目的の核酸（例えば、ｃｉｒｃＲＮＡ）の局所電荷とクロマトグラフィー材料の局所電荷との間の差異に基づいて分子を分離する。充填されたＡＥＣカラム又はメンブレンデバイスは、結合・溶離モード、フロースルー、又はハイブリッドモードで操作することができる。カラム又はメンブレンデバイスを平衡化バッファー、又はｐＨ若しくは導電率が異なる別のバッファーで洗浄した後、溶出バッファーのイオン強度（即ち導電率）を高めて、ＡＥＣマトリックスの荷電部位について溶質と競合させることにより、生成物の回収を達成する。ｐＨを変化させ、それによって溶質の電荷を変化させることは、溶質の溶離を達成するもう一つの方法である。導電率又はｐＨの変化は、漸進的（グラジエント溶離）又は段階的（ステップ溶離）である。
【0230】
クロマトグラフィー用のアニオン又はカチオン支持体を形成するために、アニオン又はカチオン置換基をマトリックスに結合させることができる。アニオン交換置換基の非限定的な例としては、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）、第４級アミノエチル（ＱＡＥ）及び第４級アミン（Ｑ）基が挙げられる。カチオン性置換基としては、カルボキシメチル（ＣＭ）、スルホエチル（ＳＥ）、スルホプロピル（ＳＰ）、リン酸塩（Ｐ）及びスルホン酸塩（Ｓ）が挙げられる。ＤＥ２３（商標）、ＤＥ３２（商標）、ＤＥ５２（商標）、ＣＭ－２３（商標）、ＣＭ－３２（商標）及びＣＭ－５２（商標）のようなセルロースイオン交換媒体は、Ｗｈａｔｍａｎ Ｌｔｄ．，Ｍａｉｄｓｔｏｎｅ，Ｋｅｎｔ，Ｕ．Ｋ．から入手可能である。ＳＥＰＨＡＤＥＸ（登録商標）ベース及び架橋イオン交換体も知られている。例えば、ＤＥＡＥ－、ＱＡＥ－、ＣＭ－、及びＳＰ－ＳＥＰＨＡＤＥＸ（登録商標）、並びにＤＥＡＥ－、Ｑ－、ＣＭ－、及びＳ－ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（登録商標）、並びにＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（登録商標）Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ、並びにＣａｐｔｏ（商標）Ｓは全て、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅから入手可能である。さらに、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ（商標）ＤＥＡＥ－６５０Ｓ又はＭ及びＴＯＹＯＰＥＡＲＬ（商標）ＣＭ－６５０Ｓ又はＭなどのＤＥＡＥ及びＣＭ誘導体化エチレングリコール－メタクリレートコポリマはいずれも、Ｔｏｓｏ Ｈａａｓ Ｃｏ．，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｐａ．，から入手可能であり、ＣＩＭｍｕｌｔｕｓ（登録商標）ＱＡ、ＣＩＭｍｕｌｔｕｓ（登録商標）ＤＥＡＥ、ＣＩＭｍｕｌｔｕｓ（登録商標）ＥＶ、ＣＩＭｍｕｌｔｕｓ（登録商標）ＥＤＡ、及びＣＩＭｍｕｌｔｕｓ（登録商標）ＳＯ３は、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓから、或いはＮｕｖｉａ Ｓ及びＵＮＯＳｐｈｅｒｅ（商標）Ｓは、ＢｉｏＲａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，Ｃａｌｉｆ．から、またＥｓｈｍｕｎｏ（登録商標）Ｓは、ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，Ｃａｌｉｆ．から入手可能である。
【0231】
混合モードクロマトグラフィー
ＭＭＣは、混合モード媒体、例えば、限定されないが、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅから入手可能なＣａｐｔｏＡｄｈｅｒｅ、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓから入手可能なＣＩＭｍｕｌｔｕｓ（登録商標）ＰｒｉｍａＳ、及びＣＩＭｍｕｌｔｕｓ（登録商標）Ｈ－Ｂｏｎｄなどを使用するクロマトグラフィーである。このような媒体は、ＭＭＣリガンドを含む。いくつかの実施形態では、このようなリガンドは、結合しようとする物質と相互作用する少なくとも２つの、異なるが、協同的な部位を提供することができるリガンドを指す。これらの部位の１つは、リガンドと目的の核酸との間に魅力的なタイプの電荷－電荷相互作用を付与する。もう一方の部位は、通常、電子受容体－供与体相互作用、又は疎水性若しくは親水性相互作用を付与する。電子供与体－受容体相互作用としては、とりわけ、水素結合、π－π、カチオン－π、電荷移動、双極子－双極子、誘導双極子などの相互作用が挙げられる。混合モードの機能性は、従来のアニオン交換体と比較して異なる選択性を付与することができる。ＭＭＣリガンドは、「マルチモーダル」クロマトグラフィーリガンドとしても知られている。
ＭＭＣは、混合モード媒体、例えば、限定されないが、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅから入手可能なＣａｐｔｏＡｄｈｅｒｅ、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓから入手可能なＣＩＭｍｕｌｔｕｓ（登録商標）ＰｒｉｍａＳ、及びＣＩＭｍｕｌｔｕｓ（登録商標）Ｈ－Ｂｏｎｄなどを使用するクロマトグラフィーである。このような媒体は、ＭＭＣリガンドを含む。いくつかの実施形態では、このようなリガンドは、結合しようとする物質と相互作用する少なくとも２つの、異なるが、協同的な部位を提供することができるリガンドを指す。これらの部位の１つは、リガンドと目的の核酸との間に魅力的なタイプの電荷－電荷相互作用を付与する。もう一方の部位は、通常、電子受容体－供与体相互作用、又は疎水性若しくは親水性相互作用を付与する。電子供与体－受容体相互作用としては、とりわけ、水素結合、π－π、カチオン－π、電荷移動、双極子－双極子、誘導双極子などの相互作用が挙げられる。混合モードの機能性は、従来のアニオン交換体と比較して異なる選択性を付与することができる。ＭＭＣリガンドは、「マルチモーダル」クロマトグラフィーリガンドとしても知られている。
【0232】
本開示によれば、ＭＭＣ媒体は、ベースマトリックスと呼ばれることもある有機又は無機支持体に、直接又はスペーサーを介して結合した混合モードリガンドを含んでもよい。支持体は、特に、本質的に球状の粒子、モノリス、フィルター、膜、表面、毛細管などの粒子の形態であってもよい。特定の実施形態では、支持体は、中でも、例えば、アガロース、寒天、セルロース、デキストラン、キトサン、コンニャク、カラギーナン、ゲラン、アルギン酸塩などの架橋炭水化物材料などのネイティブポリマーから調製される。高い吸着能を得るためには、支持体を多孔質にすることができ、次にリガンドを外部表面だけでなく細孔表面にも結合させる。このようなネイティブポリマー支持体は、逆懸濁ゲル化法（Ｓ Ｈｊｅｒｔｅｎ：ＢＩＯＣＨＩＭ ＢＩＯＰＨＹＳ ＡＣＴＡ ７９（２），３９３－９８（１９６４）などの標準的な方法に従って調製することができる。或いは、支持体は、合成ポリマー、中でも、例えば、架橋合成ポリマー、例えば、スチレン又はスチレン誘導体、ジビニルベンゼン、アクリルアミド、アクリル酸エステル、メタクリル酸エステル、ビニルエステル、ビニルアミドなどから調製することができる。このような合成ポリマーは、標準的な方法に従って製造することができ、例えば、“Ｓｔｙｒｅｎｅ ｂａｓｅｄ ｐｏｌｙｍｅｒ ｓｕｐｐｏｒｔｓ ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ ｂｙ ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ”（Ｒ Ａｒｓｈａｄｙ：Ｃｈｉｍｉｃａ ｅ Ｌ’Ｉｎｄｕｓｔｒｉａ ７０（９），７０－７５（１９８８））を参照されたい。多孔性のネイティブ又は合成ポリマー支持体は、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎなどの市販品供給者からも入手可能である。
【0233】
純度の評価
ｃｉｒｃＲＮＡの濃縮集団の純度の評価は、当技術分野で周知の方法によって実施することができる。一実施形態では、ｃｉｒｃＲＮＡは、質量ベースで少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の純度を有する。純度は、例えば、質量分析、ＨＰＬＣ、チップベースの電気泳動、顕微鏡、円偏光二色性（ＣＤ）分光法、分光光度法、フルオロメトリー（例えば、Ｑｕｂｉｔ）、ポリアクリルアミドゲル電気泳動イメージング、ＵＶ－Ｖｉｓ分光光度法、ＲＮＡ電気泳動、ＲＮＡｓｅ Ｈ分析、又はそれらの任意の組み合わせによって測定することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の調製物中のポリリボヌクレオチドの総質量の少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％が、ｃｉｒｃＲＮＡ分子に含まれる。
ｃｉｒｃＲＮＡの濃縮集団の純度の評価は、当技術分野で周知の方法によって実施することができる。一実施形態では、ｃｉｒｃＲＮＡは、質量ベースで少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の純度を有する。純度は、例えば、質量分析、ＨＰＬＣ、チップベースの電気泳動、顕微鏡、円偏光二色性（ＣＤ）分光法、分光光度法、フルオロメトリー（例えば、Ｑｕｂｉｔ）、ポリアクリルアミドゲル電気泳動イメージング、ＵＶ－Ｖｉｓ分光光度法、ＲＮＡ電気泳動、ＲＮＡｓｅ Ｈ分析、又はそれらの任意の組み合わせによって測定することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の調製物中のポリリボヌクレオチドの総質量の少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％が、ｃｉｒｃＲＮＡ分子に含まれる。
【0234】
いくつかの実施形態では、ｃｉｒｃＲＮＡ調製物は、質量分析法、ＨＰＬＣ、チップベースの電気泳動、顕微鏡法、ＣＤ分光法、分光光度法、フルオロメトリー（例えば、Ｑｕｂｉｔ）、ポリアクリルアミドゲル電気泳動イメージング、ＵＶ－Ｖｉｓ分光光度法、ＲＮＡ電気泳動、又はＲＮＡｓｅ Ｈ分析によって測定された場合、閾値量（例えば、閾値量は、ｃｉｒｃＲＮＡ調製物の参照基準、例えば、医薬品放出規格である）未満のｌｉｎＲＮＡ分子を含む。いくつかの実施形態では、ｃｉｒｃＲＮＡ調製物は、検出不可能なレベルのｌｉｎＲＮＡ分子を含む。
【0235】
一実施形態では、ｃｉｒｃＲＮＡ（例えば、ｃｉｒｃＲＮＡ医薬調製物若しくは組成物又はｃｉｒｃＲＮＡ生産工程の中間体）は、１ｎｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、１５ｎｇ／ｍＬ、２０ｎｇ／ｍＬ、２５ｎｇ／ｍＬ、３０ｎｇ／ｍＬ、３５ｎｇ／ｍＬ、４０ｎｇ／ｍＬ、５０ｎｇ／ｍＬ、６０ｎｇ／ｍＬ、７０ｎｇ／ｍＬ、８０ｎｇ／ｍＬ、９０ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ、２００ｎｇ／ｍＬ、３００ｎｇ／ｍＬ、４００ｎｇ／ｍＬ、５００ｎｇ／ｍＬ、１０００μｇ／ｍＬ、５０００μｇ／ｍＬ、１０，０００μｇ／ｍＬ、又は１００，０００μｇ／ｍＬ未満のモノヌクレオチド含量を有する。
【0236】
一実施形態では、ｃｉｒｃＲＮＡは、質量ベースで、総ヌクレオチドの０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％未満、又はそれらの間の任意のパーセンテージのモノヌクレオチド含量を有し、総ヌクレオチド含量は、デオキシリボヌクレオチド分子及びリボヌクレオチド分子の総質量である。
【0237】
一実施形態では、ｃｉｒｃＲＮＡ（例えば、ｃｉｒｃＲＮＡ医薬調製物若しくは組成物又はｃｉｒｃＲＮＡ生産工程の中間体）は、１ｎｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、１５ｎｇ／ｍＬ、２０ｎｇ／ｍＬ、２５ｎｇ／ｍＬ、３０ｎｇ／ｍＬ、３５ｎｇ／ｍＬ、４０ｎｇ／ｍＬ、５０ｎｇ／ｍＬ、６ ０ｎｇ／ｍＬ、７０ｎｇ／ｍＬ、８０ｎｇ／ｍＬ、９０ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ、２００ｎｇ／ｍＬ、３００ｎｇ／ｍＬ、４００ｎｇ／ｍＬ、５００ｎｇ／ｍＬ、６００ｎｇ／ｍＬ、１ｍｇ／ｍＬ、１．５ｍｇ／ｍＬ、又は２ｍｇ／ｍＬ未満のｌｉｎＲＮＡ含有量、例えば、ｌｉｎＲＮＡ対応物又はＲＮＡ断片を有する。
【0238】
一実施形態では、ｃｉｒｃＲＮＡ（例えば、ｃｉｒｃＲＮＡ医薬調製物若しくは組成物又はｃｉｒｃＲＮＡ生産工程の中間体）は、０．１％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、又は５０％未満のｌｉｎＲＮＡを有する。
【0239】
一実施形態では、ｃｉｒｃＲＮＡ（例えば、ｃｉｒｃＲＮＡ医薬調製物若しくは組成物又はｃｉｒｃＲＮＡ生産工程の中間体）は、１ｎｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、１５ｎｇ／ｍＬ、２０ｎｇ／ｍＬ、２５ｎｇ／ｍＬ、３０ｎｇ／ｍＬ、３５ｎｇ／ｍＬ、４０ｎｇ／ｍＬ、５０ｎｇ／ｍＬ、６０ｎｇ／ｍＬ、７０ｎｇ／ｍＬ、８０ｎｇ／ｍＬ、９０ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ、２００ｎｇ／ｍＬ、３００ｎｇ／ｍＬ、４００ｎｇ／ｍＬ、５００ｎｇ／ｍＬ、１０００μｇ／ｍＬ、５０００μｇ／ｍＬ、１０，０００μｇ／ｍＬ、又は１００，０００μｇ／ｍＬ未満のＤＮＡ含量、例えば、鋳型ＤＮＡ、例えば、細胞ＤＮＡ（例えば、宿主細胞ＤＮＡ）を有する。
【0240】
一実施形態では、ｃｉｒｃＲＮＡ（例えば、ｃｉｒｃＲＮＡ医薬調製物若しくは組成物又はｃｉｒｃＲＮＡ生産工程の中間体）は、質量ベースで、総ヌクレオチドの０．１％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％未満のＤＮＡ含有量を有し、総ヌクレオチド分子は、デオキシリボヌクレオチド含量及びリボヌクレオチド分子の総質量である。
【0241】
一実施形態では、ｃｉｒｃＲＮＡ（例えば、ｃｉｒｃＲＮＡ医薬調製物若しくは組成物又はｃｉｒｃＲＮＡ生産工程の中間体）は、０．１ｎｇ／ｍＬ、１ｎｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、１５ｎｇ／ｍＬ、２０ｎｇ／ｍＬ、２５ｎｇ／ｍＬ、３０ｎｇ／ｍＬ、３５ｎｇ／ｍＬ、４０ｎｇ／ｍＬ、５０ｎｇ／ｍＬ、６０ｎｇ／ｍＬ、７０ｎｇ／ｍＬ、８０ｎｇ／ｍＬ、９０ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ、２００ｎｇ／ｍＬ、３００ｎｇ／ｍＬ、４００ｎｇ／ｍＬ、又は５００ｎｇ／ｍＬ未満のタンパク質（例えば、細胞タンパク質（ＣＰ）、例えば、酵素）混入を有する。
【0242】
一実施形態では、ｃｉｒｃＲＮＡ（例えば、ｃｉｒｃＲＮＡ医薬調製物若しくは組成物又はｃｉｒｃＲＮＡ生産工程の中間体）は、ｃｉｒｃＲＮＡのミリグラム（ｍｇ）当たり０．１ｎｇ、１ｎｇ、５ｎｇ、１０ｎｇ、１５ｎｇ、２０ｎｇ、２５ｎｇ、３０ｎｇ、３５ｎｇ、４０ｎｇ、５０ｎｇ、６０ｎｇ、７０ｎｇ、８０ｎｇ、９０ｎｇ、１００ｎｇ、２００ｎｇ、３００ｎｇ、４００ｎｇ、又は５００ｎｇ未満のタンパク質（例えば、ＣＰ、例えば、酵素）混入を有する。
【0243】
一実施形態では、ｃｉｒｃＲＮＡ（例えば、ｃｉｒｃＲＮＡ医薬調製物若しくは組成物又はｃｉｒｃＲＮＡ生産工程の中間体）は、少なくとも０．１ｎｇ／ｍＬ、０．５ｎｇ／ｍＬ、１ｎｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、５０ｎｇ／ｍＬ、０．１μｇ／ｍＬ、０．５μｇ／ｍＬ、１μｇ／ｍＬ、２μｇ／ｍＬ、５μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ、２０μｇ／ｍＬ、３０μｇ／ｍＬ、４０μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬ、６０μｇ／ｍＬ、７０μｇ／ｍＬ、８０μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬ、２００μｇ／ｍＬ、３００μｇ／ｍＬ、５００μｇ／ｍＬ、１０００μｇ／ｍＬ、５０００μｇ／ｍＬ、１０，０００μｇ／ｍＬ、又は１００，０００μｇ／ｍＬのｃｉｒｃＲＮＡ濃度を有する。
【0244】
いくつかの実施形態では、ｃｉｒｃＲＮＡは、クロマトグラフィー、例えば、液体クロマトグラフィー、例えば、ＦＰＬＣ（例えば、順相若しくは逆相ＦＰＬＣ）、ＨＰＬＣ、ＨＩＣ、ＡＥＣ、ＭＭＣ、又はアフィニティークロマトグラフィーにより精製する。
【0245】
分取方法
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の任意の条件を、ｃｉｒｃＲＮＡ及びｌｉｎＲＮＡを含むポリリボヌクレオチドの混合集団又はｃｉｒｃＲＮＡの濃縮集団からのｃｉｒｃＲＮＡの分取方法として使用することができる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の任意の条件を、ｃｉｒｃＲＮＡ及びｌｉｎＲＮＡを含むポリリボヌクレオチドの混合集団又はｃｉｒｃＲＮＡの濃縮集団からのｃｉｒｃＲＮＡの分取方法として使用することができる。
【0246】
いくつかの実施形態では、少なくとも０．５ｍｇ（例えば、少なくとも０．６、０．８、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００ｍｇ、又はそれ以上）の量のｃｉｒｃＲＮＡを生産する分取方法。本発明の方法は、高度にスケーラブルであるという点で有利である。
【0247】
分析方法
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の任意の条件は、ｃｉｒｃＲＮＡ及びｌｉｎＲＮＡを含むポリリボヌクレオチドの混合集団又はｃｉｒｃＲＮＡの濃縮集団からｃｉｒｃＲＮＡの純度を決定するための分析方法として使用することができる。本発明は、本明細書に記載の１つ又は複数の変性条件を使用して、濃縮されたｃｉｒｃＲＮＡのバッチの純度を反復して決定するための方法を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の任意の条件は、ｃｉｒｃＲＮＡ及びｌｉｎＲＮＡを含むポリリボヌクレオチドの混合集団又はｃｉｒｃＲＮＡの濃縮集団からｃｉｒｃＲＮＡの純度を決定するための分析方法として使用することができる。本発明は、本明細書に記載の１つ又は複数の変性条件を使用して、濃縮されたｃｉｒｃＲＮＡのバッチの純度を反復して決定するための方法を含む。
【0248】
いくつかの実施形態では、本分析方法は、クロマトグラフィー、例えば、液体クロマトグラフィー、例えば、ＦＰＬＣ（例えば、順相若しくは逆相ＦＰＬＣ）、ＨＰＬＣ、ＨＩＣ、ＡＥＣ、ＭＭＣ、又はアフィニティークロマトグラフィーを使用して、ｃｉｒｃＲＮＡの純度を決定する。
【0249】
いくつかの実施形態では、本分析方法は、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、又は０．１％未満の相対標準偏差（ＲＳＤ）を有する。いくつかの実施形態では、ＲＳＤは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０のｃｉｒｃＲＮＡサンプルに基づいて計算される。
【0250】
いくつかの実施形態では、分析方法は、移動相の使用を含む。いくつかの実施形態では、移動相は、尿素、ビス－トリスプロパン（ＢＴＰ）、アセトニトリル、ＮａＣｌ、水、塩酸（ＨＣｌ）、又はＤＭＳＯを含む。
【0251】
いくつかの実施形態では、変性条件は、移動相に見出される。
【0252】
いくつかの実施形態では、クロマトグラフィーカラムは、変性を提供するために加熱される。いくつかの実施形態では、ｃｉｒｃＲＮＡサンプルは、カラムへの導入の前に、変性のために加熱する。
【0253】
いくつかの実施形態では、上述したような変性剤の組み合わせ、例えば、尿素とアセトニトリルの組み合わせを用いて、ｃｉｒｃＲＮＡサンプルを変性させる。
【0254】
いくつかの実施形態では、分析方法は、不純物又は副産物レベルを決定するステップを含む。
【0255】
いくつかの実施形態では、分析方法は、少なくとも０．５ｍｇ（例えば、少なくとも０．６、０．８、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００ｍｇ、又はそれ以上）の量のｃｉｒｃＲＮＡの純度を定量することを含む。
【0256】
不純物及び副産物
本開示の方法は、ｃｉｒｃＲＮＡの集団を含み、且つ例えば、本開示の方法による精製前のサンプル中の不純物若しくは副産物のレベルと比較して、又は１００％（ｗ／ｗ）のｃｉｒｃＲＮＡを含む別のサンプル中の不純物若しくは副産物のレベルと比較して低下したレベルの不純物若しくは副産物を有する調製物を生成するのに適している。いくつかの実施形態では、本発明の方法は、目的のｃｉｒｃＲＮＡの集団を有し、且つ総不純物又は副産物のレベルが低下した組成物を生成する。いくつかの実施形態では、総不純物又は副産物のレベルが低下した調製物は、不純物若しくは副産物を含まないか、又は実質的に含まない。例えば、低不純物又は副産物組成物は、約１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１．５％、１．４％、１．３％、１．２％、１．１％、１％、０．５％、若しくはそれ以下の総不純物又は副産物を含有し得る。いくつかの実施形態では、低不純物又は副産物組成物は、約５％、４％、３％、２．５％、２．４％、２．３％、２．２％、２．１％、２％、１．５％、１．４％、１．３％、１．２％、１．１％、１％、０．５％、０．１％、若しくはそれ以下の総不純物又は副産物を含む。
本開示の方法は、ｃｉｒｃＲＮＡの集団を含み、且つ例えば、本開示の方法による精製前のサンプル中の不純物若しくは副産物のレベルと比較して、又は１００％（ｗ／ｗ）のｃｉｒｃＲＮＡを含む別のサンプル中の不純物若しくは副産物のレベルと比較して低下したレベルの不純物若しくは副産物を有する調製物を生成するのに適している。いくつかの実施形態では、本発明の方法は、目的のｃｉｒｃＲＮＡの集団を有し、且つ総不純物又は副産物のレベルが低下した組成物を生成する。いくつかの実施形態では、総不純物又は副産物のレベルが低下した調製物は、不純物若しくは副産物を含まないか、又は実質的に含まない。例えば、低不純物又は副産物組成物は、約１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１．５％、１．４％、１．３％、１．２％、１．１％、１％、０．５％、若しくはそれ以下の総不純物又は副産物を含有し得る。いくつかの実施形態では、低不純物又は副産物組成物は、約５％、４％、３％、２．５％、２．４％、２．３％、２．２％、２．１％、２％、１．５％、１．４％、１．３％、１．２％、１．１％、１％、０．５％、０．１％、若しくはそれ以下の総不純物又は副産物を含む。
【0257】
いくつかの実施形態では、不純物又は副産物は、プロセス関連の不純物又は副産物である。本明細書で使用される場合、「プロセス関連不純物又は副産物」という用語は、目的のｃｉｒｃＲＮＡの集団を含む組成物中に存在するが、ｃｉｒｃＲＮＡ自体に由来するものではない不純物又は副産物を指す。プロセス関連の不純物又は副産物としては、限定されないが、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）、宿主細胞核酸、クロマトグラフィー材料、及び媒体成分が挙げられる。例えば、プロセス関連不純物又は副産物は、ポリアクリルアミド、ホウ酸、マグネシウム、ＥＤＴＡを含み得る。本明細書で使用される「低不純物組成物」は、不純物又は副産物が低減されていない組成物と比較して、低レベルのプロセス関連不純物又は副産物を含む組成物を指す。例えば、低プロセス関連不純物組成物は、約１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、又はそれ以下のプロセス関連不純物若しくは副産物を含み得る。一実施形態では、低プロセス関連不純物組成物は、プロセス関連不純物若しくは副産物を含まないか、又はプロセス関連不純物若しくは副産物を実質的に含まない。
【0258】
いくつかの実施形態では、ｃｉｒｃＲＮＡ（例えば、ｃｉｒｃＲＮＡ医薬調製物若しくは組成物又はｃｉｒｃＲＮＡ生産工程の中間体）は、不純物又は副産物を実質的に含まない。様々な実施形態では、ｃｉｒｃＲＮＡを含む組成物中の少なくとも１つの不純物又は副産物のレベルは、不純物若しくは副産物を除去する精製又は処理前の組成物の少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、若しくは少なくとも９５％低減される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのプロセス関連不純物又は副産物のレベルは、不純物若しくは副産物を除去する精製又は処理前の組成物の少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、若しくは少なくとも９５％低減される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの産物関連物質のレベルは、不純物若しくは副産物を除去する精製又は処理の前の組成物の少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％低減される。
【0259】
サンプル中に存在する不純物又は副産物の定量には、当技術分野で公知の方法を用いることができる。例えば、紫外線（ＵＶ）、近赤外分光法（ＮＩＲ）、フーリエ変換赤外分光法（ＦＴＩＲ）、蛍光分光法、又はラマン分光法などの分光法を使用して、オンライン、アットライン、若しくはインラインモードで不純物又は副産物のレベルを監視することができる。いくつかの実施形態では、オンライン、アットライン、又はインラインモニタリング法は、所望のｃｉｒｃＲＮＡ品質／回収率の達成を可能にするために、クロマトグラフィーステップの洗浄ライン又は回収容器内のいずれかで使用することができる。いくつかの実施形態では、適切な産物品質／回収を達成するための代替物として、ＵＶシグナルを使用することができ、ＵＶシグナルは、通常のプロセス変動性が処理され、且つ、目標産物品質が達成され得るように、適切に処理することができ、そうしたものとして限定されないが、積分、微分、移動平均などのプロセス技術が挙げられる。いくつかの実施形態では、このような測定は、ロード／洗浄物のイオン濃度／導電率をフィードバックによって制御できるように、インライン希釈法と組み合わせることができ、それによって産物の品質管理を促進する。
【0260】
環状ポリリボヌクレオチドの生産
本開示は、例えば、組換え技術又は化学合成など、環状ＲＮＡを生産する方法を提供する。例えば、ＲＮＡ環を生産するために使用されるＤＮＡ分子は、天然に存在する本来の核酸配列のＤＮＡ配列、その修飾形態、又は通常自然界に存在しない合成ポリペプチド（例えば、キメラ分子又は融合タンパク質）をコードするＤＮＡ配列を含み得る。ＤＮＡ及びＲＮＡ分子は、限定されないが、以下を含む様々な技術を用いて修飾することができる：古典的な突然変異誘発技術及び組換え技術、例えば、部位特異的突然変異誘発、突然変異を誘発するための核酸分子の化学処理、核酸断片の制限酵素切断、核酸断片のライゲーション、核酸配列の選択領域のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅又は突然変異誘発、オリゴヌクレオチド混合物の合成、並びに核酸分子の混合物を「構築」するための混合物群のライゲーション並びにそれらの組み合わせ。
本開示は、例えば、組換え技術又は化学合成など、環状ＲＮＡを生産する方法を提供する。例えば、ＲＮＡ環を生産するために使用されるＤＮＡ分子は、天然に存在する本来の核酸配列のＤＮＡ配列、その修飾形態、又は通常自然界に存在しない合成ポリペプチド（例えば、キメラ分子又は融合タンパク質）をコードするＤＮＡ配列を含み得る。ＤＮＡ及びＲＮＡ分子は、限定されないが、以下を含む様々な技術を用いて修飾することができる：古典的な突然変異誘発技術及び組換え技術、例えば、部位特異的突然変異誘発、突然変異を誘発するための核酸分子の化学処理、核酸断片の制限酵素切断、核酸断片のライゲーション、核酸配列の選択領域のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅又は突然変異誘発、オリゴヌクレオチド混合物の合成、並びに核酸分子の混合物を「構築」するための混合物群のライゲーション並びにそれらの組み合わせ。
【0261】
ｃｉｒｃＲＮＡは、限定されないが、化学合成及び酵素合成をはじめとする利用可能な技術に従って調製することができる。一部の実施形態では、線状一次構築物又は線状ＲＮＡを環化又は連結して、本明細書に記載のｃｉｒｃＲＮＡを作出することができる。環化又は連結の機構は、例えば、化学的、酵素的、スプリントライゲーション、又はリボザイム触媒法などの方法によって起こり得る。新たに形成される５’－３’結合は、分子内結合又は分子間結合のいずれであってもよい。例えば、スプリントライゲーションの場合、ＳｐｌｉｎｔＲ（登録商標）リガーゼなどのスプリントリガーゼを用いることができる。この方法によれば、一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡなどの一本鎖ポリヌクレオチド（スプリント）を、ｌｉｎＲＮＡの両末端とハイブリダイズするように設計し、それにより、一本鎖スプリントとのハイブリダイゼーションの際に２つの末端を並置させることができる。したがって、スプリントリガーゼは、並置されたｌｉｎＲＮＡの２つの末端のライゲーションを触媒し、ｃｉｒｃＲＮＡを生成することができる。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ又はＲＮＡリガーゼを環状ポリヌクレオチドの合成に使用してもよい。非限定的な例として、リガーゼは、ｃｉｒｃリガーゼ又は環状リガーゼあり得る。
【0262】
別の例では、ｌｉｎＲＮＡの５’末端又は３’末端のいずれかが、リガーゼリボザイム配列をコードすることができ、それにより、インビトロ転写の間に、得られる線状ｃｉｒｃＲＮＡは、ｌｉｎＲＮＡの５’末端をｌｉｎＲＮＡの３’末端に連結することができる活性リボザイム配列を含む。リガーゼリボザイムは、グループＩイントロン、肝炎デルタウイルス、ヘアピンリボザイムに由来するものであってもよいし、又はＳＥＬＥＸ（指数関数的濃縮によるリガンドの系統的進化）によって選択されたものであってもよい。
【0263】
別の例では、ｌｉｎＲＮＡは、少なくとも１つの非核酸部分を用いることにより、環化又は連結することができる。例えば、少なくとも１つの非核酸部分は、ｌｉｎＲＮＡを環化又は連結するために、ｌｉｎＲＮＡの５’末端付近又は３’末端付近の領域若しくは特徴と反応することができる。別の例では、少なくとも１つの非核酸部分は、ｌｉｎＲＮＡの５’末若しくは３’末端に位置してもよいし、或いはそれに連結されるか、又はその近傍で連結されてもよい。非核酸部分は、相同又は異種のいずれであってもよい。非限定的な例として、非核酸部分は、疎水性連結、イオン性連結、生分解性連結又は切断性連結などの連結であってもよい。別の非限定的な例として、非核酸部分は、連結部分である。さらに別の非限定的な例として、非核酸部分は、オリゴヌクレオチド又はペプチド部分、例えば、本明細書に記載のアプタマー又は非核酸リンカーであってもよい。
【0264】
別の例では、ｌｉｎＲＮＡは、セルフスプライシングによって環化又は連結してもよい。いくつかの実施形態では、ｌｉｎＲＮＡは、セルフライゲーションするためのループＥ配列を含み得る。別の実施形態では、ｌｉｎＲＮＡは、自己環状化イントロン、例えば、５’及び３’スライスジャンクション、又はグループＩ、グループＩＩ若しくはグループＩＩＩイントロンのような自己環状化触媒イントロンを含んでもよい。グループＩイントロン自己スプライシング配列の非限定的な例としては、Ｔ４バクテリオファージ遺伝子ｔｄ、及びテトラヒメナ属（Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ）の介在配列（ＩＶＳ）ｒＲＮＡ、シアノバクテリアアナベナ属（Ａｎａｂａｅｎａ）プレ－ｔＲＮＡ－Ｌｅｕ遺伝子、又はテトラヒメナ属（Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ）プレ－ｒＲＮＡ由来の自己スプライシング置換イントロン－エキソン配列が挙げられる。
【0265】
いくつかの実施形態では、ポリリボヌクレオチドは、触媒イントロン断片、例えば、グループＩ触媒イントロン断片の３’半分及びグループＩ触媒イントロン断片の５’半分などを含み得る。第１及び第２アニーリング領域は、触媒イントロン断片内に配置され得る。グループＩ触媒イントロンは、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ前駆体から、２－金属イオンリン酸基転移機構を介してそれらの自己切断を触媒する自己スプライシングリボザイムである。重要なことは、リガーゼのような外来性酵素を必要とせずに、ＲＮＡ自体が、イントロン除去を自己触媒することである。
【0266】
いくつかの実施形態では、グループＩ触媒イントロン断片の３’半分及びグループＩ触媒イントロン断片の５’半分は、シアノバクテリアアナベナ属（Ａｎａｂａｅｎａ）プレ－ｔＲＮＡ－Ｌｅｕ遺伝子、又はテトラヒメナ属（Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ）プレ－ｒＲＮＡ由来である。
【0267】
いくつかの実施形態では、グループＩ触媒イントロン断片の３’半分及びグループＩ触媒イントロン断片の５’半分は、シアノバクテリアアナベナ属（Ａｎａｂａｅｎａ）プレ－ｔＲＮＡ－Ｌｅｕ遺伝子由来であり、３’エキソン断片は、第１のアニーリング領域を含み、５’エキソン断片は、第２のアニーリング領域を含む。第１のアニーリング領域は、例えば、５～５０、例えば、１０～１５（例えば、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５）のリボヌクレオチドを含み、第２のアニーリング領域は、例えば、５～５０、例えば、１０～１５（例えば、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５）のリボヌクレオチドを含み得る。
【0268】
いくつかの実施形態では、グループＩ触媒イントロン断片の３’半分及びグループＩ触媒イントロン断片の５’半分は、テトラヒメナ属（Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ）プレ－ＲＮＡ由来であり、グループＩ触媒イントロン断片の３’半分は、第１のアニーリング領域を含み、５’エキソン断片は、第２のアニーリング領域を含む。いくつかの実施形態では、３’エキソンは、第１のアニーリング領域を含み、グループＩ触媒イントロン断片の５’半分は第２のアニーリング領域を含む。第１のアニーリング領域は、例えば、６～５０、例えば、１０～１６（例えば、１０、１１、１２、１３、１４、１５、又は１６）のリボヌクレオチドを含み、また、第２のアニーリング領域は、例えば、６～５０、例えば、１０～１６（例えば、１０、１１、１２、１３、１４、１５、又は１６）のリボヌクレオチドを含み得る。
【0269】
いくつかの実施形態では、グループＩ触媒イントロン断片の３’半分及びグループＩ触媒イントロン断片の５’半分は、シアノバクテリアアナベナ属（Ａｎａｂａｅｎａ）プレ－ｔＲＮＡ－Ｌｅｕ遺伝子、テトラヒメナ属（Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ）プレ－ｒＲＮＡ、又はＴ４ファージｔｄ遺伝子由来である。
【0270】
いくつかの実施形態では、グループＩ触媒イントロン断片の３’半分及び５’グループＩ触媒イントロン断片は、Ｔ４ファージｔｄ遺伝子由来である。３’エキソン断片は、第１のアニーリング領域を含んでもよく、また、グループＩ触媒イントロン断片の５’半分は、第２のアニーリング領域を含み得る。第１のアニーリング領域は、例えば、２～１６、例えば、１０～１６（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、又は１６）のリボヌクレオチドを含んでもよく、また、第２のアニーリング領域は、例えば、２～１６、例えば、１０～１６（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、又は１６）のリボヌクレオチドを含み得る。
【0271】
いくつかの実施形態では、グループＩ触媒イントロン断片の３’半分は、線状ポリヌクレオチドの５’末端である。
【0272】
いくつかの実施形態では、グループＩ触媒イントロン断片の５’半分は、線状ポリリボヌクレオチドの３’末端である。
【0273】
別の例では、ｌｉｎＲＮＡは、ｌｉｎＲＮＡの５’及び３’末端、若しくはその付近にあるか、又はｌｉｎＲＮＡの５’及び３’末端に連結している原子、分子表面間の引力を引き起こす非核酸部分によって環化又は連結され得る。分子間力又は分子内力によって、１つ若しくは複数のｌｉｎＲＮＡを環化又は連結することができる。分子間力の非限定的な例としては、双極子－双極子力、双極子－誘導双極子力、誘導双極子－誘導双極子力、ファンデルワールス力、及びロンドン分散力が挙げられる。分子内力の非限定的な例としては、共有結合、金属結合、イオン結合、共鳴結合、アグノスティック結合、双極子性結合、共役結合、超共役結合及び反結合が挙げられる。
【0274】
別の例では、ｌｉｎＲＮＡは、５’末端付近及び３’末端付近にリボザイムＲＮＡ配列を含み得る。リボザイムＲＮＡ配列は、当該配列が、残りのリボザイムに曝露されると、ペプチドと共有結合し得る。リボザイムＲＮＡ配列と５’末端付近及び３’末端付近で共有結合したペプチドは互いに会合し、それにより、ｌｉｎＲＮＡを環化又は連結させる。別の例では、５’末端及び３’末端付近のリボザイムＲＮＡに共有結合したペプチドは、限定されないが、タンパク質ライゲーションなどの当技術分野で公知の様々な方法を用いて連結された後、線状一次構築物又は線状ｍＲＮＡを環状化又は連結させる。本発明の線状一次構築物又はｌｉｎＲＮＡに使用されるリボザイムの非限定的な例、又はペプチドを組み込む、若しくはペプチドと共有結合させる方法の非網羅的なリストは、米国特許出願第２００３００８２７６８号明細書に記載されており、その内容は参照によりその全体がここに組み込まれる。
【0275】
さらに別の例では、ｃｉｒｃＲＮＡを生成するために、化学的な環化方法を使用することができる。このような方法としては、限定されないが、クリックケミストリー（例えば、アルキン及びアジドベースの方法若しくはクリック可能な塩基）、オレフィンメタセシス、ホスホルアミデートライゲーション、ヘミアミナール－イミン架橋、塩基修飾、又はそれらの任意の組み合わせが挙げられる。
【0276】
別の例では、環状ポリリボヌクレオチドは、無細胞系で転写されたデオキシリボヌクレオチド鋳型を用いて（例えば、インビトロ転写によって）線状ＲＮＡを産生する。線状ポリリボヌクレオチドは、スプライシング適合性ポリリボヌクレオチドを産生し、このポリリボヌクレオチドは、自己スプライシングされて、環状ポリリボヌクレオチドを産生し得る。
【0277】
いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、線状ポリリボヌクレオチドを用意するステップと；線状ポリリボヌクレオチドの３’及び５’スプライス部位のスプライシングに適した条件下で線状ポリリボヌクレオチドを自己スプライシングさせ、それにより環状ポリリボヌクレオチドを産生させるステップによって（例えば、無細胞系中に）生産される。
【0278】
いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、線状ポリリボヌクレオチドをコードするデオキシリボヌクレオチドを用意するステップ；無細胞系でデオキシリボヌクレオチドを転写して、線状ポリリボヌクレオチドを産生させるステップ；任意選択で、スプライシング適合性線状ポリリボヌクレオチドを精製するステップ；並びに線状ポリリボヌクレオチドの３’及び５’スプライス部位のスプライシングに適した条件下で、線状ポリリボヌクレオチドを自己スプライシングさせ、それにより環状ポリリボヌクレオチドを産生させるステップによって生産される。
【0279】
いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、線状ポリリボヌクレオチドをコードするデオキシリボヌクレオチドを用意するステップ；無細胞系でデオキシリボヌクレオチドを転写して、線状ポリリボヌクレオチドを産生させるステップであって、上記転写は、線状ポリリボヌクレオチドの３’及び５’スプライス部位のスプライシングに適した条件下で、溶液中で起こり、それによって環状ポリリボヌクレオチドを産生させるステップによって生産される。いくつかの実施形態では、線状ポリリボヌクレオチドは、５’スプリットイントロン及び３’スプリットイントロン（例えば、ｃｉｒｃＲＮＡを産生するための自己スプライシング構築物）を含む。いくつかの実施形態では、線状ポリリボヌクレオチドは、５’アニーリング領域及び３’アニーリング領域を含む。
【0280】
いくつかの実施形態では、線状ポリリボヌクレオチドは、デオキシリボ核酸、例えば、ＤＮＡベクター、線状化ＤＮＡベクター、又はｃＤＮＡなどの本明細書に記載されるデオキシリボ核酸から産生される。いくつかの実施形態では、線状ポリリボヌクレオチドは、無細胞系における転写（例えば、インビトロ転写）によってデオキシリボ核酸から転写される。
【0281】
別の例において、環状ポリリボヌクレオチドは、細胞、例えば、原核細胞又は真核細胞において産生され得る。いくつかの実施形態では、外来性ポリリボヌクレオチドが細胞に供給される（例えば、本明細書に記載の線状ポリリボヌクレオチド又は本明細書に記載の線状ポリリボヌクレオチドの転写をコードするＤＮＡ分子）。線状ポリリボヌクレオチドは、細胞に供給された外来性ＤＮＡ分子から細胞内で転写され得る。線状ポリリボヌクレオチドは、細胞に一過性に供給された外来性組換えＤＮＡ分子から細胞内で転写され得る。いくつかの実施形態では、外来性ＤＮＡ分子は、細胞のゲノムに組み込まれない。いくつかの実施形態では、線状ポリリボヌクレオチドは、細胞のゲノムに組み込まれる組換えＤＮＡ分子から細胞内で転写される。
【0282】
いくつかの実施形態では、細胞は原核細胞である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリリボヌクレオチドを含む原核細胞は、細菌細胞又は古細菌細胞であってもよい。例えば、本明細書に記載のポリリボヌクレオチドを含む原核細胞は、大腸菌（Ｅ ｃｏｌｉ）、好塩性古細菌（例えば、ハアロフェラックス・ボルカニ（Ｈａｌｏｆｅｒａｘ ｖｏｌｃａｎｉｉｉ））、スフィンゴモナス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ）、シアノバクテリア（例えば、シネココッカス・エロンガツス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｅｌｏｎｇａｔｕｓ）、スピルリナ（アルトロスピラ属（Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ）種、及びシネコシスティス属（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）種）、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、放線菌（例えば、ノノムラエア（Ｎｏｎｏｍｕｒａｅａ）、キタサトスポラ（Ｋｉｔａｓａｔｏｓｐｏｒａ）、又はテルモビフィラ（Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ））、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種（例えば、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ）、バチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ））、ベータプロテオバクテリア綱（ｂｅｔａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）種（例えば、ブルクホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ））、アルファプロテオバクテリア綱（ａｌｐｈａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａｌ）種（例えば、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ））、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種（例えば、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ））、及び腸内細菌（ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａ）であってよい。原核細胞は、培地中で増殖させることができる。原核細胞は、バイオリアクターに導入してもよい。
【0283】
細胞は真核細胞であってもよい。いくつかの実施形態では、真核細胞は、単細胞真核細胞である。いくつかの実施形態では、単細胞真核生物は、酵母細胞（例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）及び他のサッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）種、ブレタノマイセス属（Ｂｒｅｔｔａｎｏｍｙｃｅｓ）種、シゾサッカロミセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）種、トルラスポラ属（Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ）種、及びピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）種）などの単細胞真菌細胞である。いくつかの実施形態では、単細胞真核細胞は、単細胞動物細胞である。単細胞動物細胞は、多細胞動物から単離した後、培養して増殖させた細胞、又はその娘細胞であってもよい。いくつかの実施形態では、単細胞動物細胞は、脱分化していてもよい。いくつかの実施形態では、単細胞真核細胞は、単細胞植物細胞である。単細胞植物細胞は、多細胞植物から単離した後、培養して増殖させた細胞、又はその娘細胞であってもよい。いくつかの実施形態では、単細胞植物細胞は、脱分化していてもよい。いくつかの実施形態では、単細胞植物細胞は、植物カルス由来である。いくつかの実施形態では、単細胞生物細胞は、植物細胞プロトプラストである。いくつかの実施形態では、単細胞真核細胞は、単細胞緑藻、珪藻、ユーグレナイド、又は渦鞭毛藻などの単細胞真核藻細胞である。目的とする単細胞真核藻類の非限定的な例としては、デュナリエラ・サリナ（Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ ｓａｌｉｎａ）、クロレラ・ブルガリス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓ）、クロレラ・ゾフィジエンシス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｚｏｆｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）、ヘマトコッカス・プルビアリス（Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓ）、ネオクロリス・オレオアブンダンス（Ｎｅｏｃｈｌｏｒｉｓ ｏｌｅｏａｂｕｎｄａｎｓ）及び他のネオクロリス属（Ｎｅｏｃｈｌｏｒｉｓ）種、プロトシフォン・ボトリオイズ（Ｐｒｏｔｏｓｉｐｈｏｎ ｂｏｔｒｙｏｉｄｅｓ）、ボツリオコッカス・ブラウニー（Ｂｏｔｒｙｏｃｏｃｃｕｓ ｂｒａｕｎｉｉ）、クリプトコッカス属（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）種、コナミドリムシ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ）及び他のクラミドモナス種（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｓｐｐ）が挙げられる。いくつかの実施形態では、単細胞真核細胞は、原生生物細胞である。いくつかの実施形態では、単細胞真核細胞は、原生動物細胞である。
【0284】
いくつかの実施形態では、真核細胞は、多細胞真核生物の細胞である。例えば、多細胞真核生物は、脊椎動物、無脊椎動物、多細胞菌類、多細胞藻類、及び多細胞植物からなる群より選択され得る。いくつかの実施形態では、真核生物は、ヒトである。いくつかの実施形態では、真核生物は、ヒト以外の脊椎動物である。いくつかの実施形態では、真核生物は、無脊椎動物である。いくつかの実施形態では、真核生物は、多細胞真菌である。いくつかの実施形態では、真核生物は、多細胞植物である。複数の実施形態では、真核細胞は、ヒトの細胞、又は非ヒト霊長類（例えば、サル、類人猿）、偶蹄類（例えば、ウシ、バッファロー、バイソン、ヒツジ、ヤギ、及びジャコウウシを含むウシ科動物；ブタ；ラクダ、ラマ、及びアルパカを含むラクダ科動物；シカ、カモシカ；並びにウマ及びロバを含むウマ科動物）、肉食動物（例えば、イヌ、ネコ）、げっ歯類（例えば、ラット、マウス、モルモット、ハムスター、リス）、又はウサギ目動物（例えば、ウサギ、ノウサギ）などの非ヒト哺乳動物の細胞である。複数の実施形態では、真核細胞は、鳥類、例えば、鳥類分類キジ目（Ｇａｌｌｉｆｏｒｍｅｓ）（例えば、ニワトリ、七面鳥、キジ、ウズラ）、カモ目（Ａｎｓｅｒｉｆｏｒｍｅｓ）（例えば、アヒル、ガン）、古顎類（Ｐａｌｅａｏｇｎａｔｈａｅ）（例えば、ダチョウ、エミュー）、ハト目（Ｃｏｌｕｍｂｉｆｏｒｍｅｓ）（例えば、ハト（ｐｉｇｅｏｎ）、ハト（ｄｏｖｅ））、又はオウム目（Ｐｓｉｔｔａｃｉｆｏｒｍｅｓ）（例えば、オウム）のメンバーの細胞である。いくつかの実施形態では、真核細胞は、節足動物（例えば、昆虫、クモ類、甲殻類）、線虫、環形動物、蠕虫、又は軟体動物の細胞である。いくつかの実施形態では、真核細胞は、多細胞植物、例えば、被子植物（双子葉植物又は単子葉植物であり得る）、裸子植物（例えば、針葉樹、ソテツ、イチョウ）、シダ、スギナ、ヒカゲノカズラ類、又は蘚苔類などの細胞である。複数の実施形態では、真核細胞は、真核多細胞藻類の細胞である。
【0285】
真核細胞は、培養培地中で増殖させることができる。真核細胞は、バイオリアクターに収容してもよい。
【0286】
バイオリアクターの例として、限定はされないが、撹拌タンク（例えば、十分に混合された）バイオリアクター及び平板（例えば、プラグフロー）バイオリアクター、エアリフト型バイオリアクター、膜撹拌式タンク（ｍｅｍｂｒａｎｅ ｓｔｉｒｒｅｄ ｔａｎｋ）、スピンフィルター撹拌式タンク、振動ミキサー、流動層リアクター、及び膜バイオリアクターが挙げられる。バイオリアクターを運転するモードは、バッチ又は連続プロセスであってもよい。バイオリアクターは、試薬及び産物の流れが継続的に供与され、システムから取り出される場合、連続的である。バッチバイオリアクターは、連続再循環フローを有し得るが、試薬又は産物ハーベストの連続供給がない。
【0287】
本開示のいくつかの方法は、環状ポリリボヌクレオチドの大規模生産に関する。大規模生産方法の場合、本方法は、１リットル（Ｌ）～５０Ｌ、又はそれ以上（例えば、５Ｌ、１０Ｌ、１５Ｌ、２０Ｌ、２５Ｌ、３０Ｌ、３５Ｌ、４０Ｌ、４５Ｌ、５０Ｌ、又はそれ以上）の容量で実施することができる。いくつかの実施形態では、本方法は、５Ｌ～１０Ｌ、５Ｌ～１５Ｌ、５Ｌ～２０Ｌ、５Ｌ～２５Ｌ、５Ｌ～３０Ｌ、５Ｌ～３５Ｌ、５Ｌ～４０Ｌ、５Ｌ～４５Ｌ、１０Ｌ～１５Ｌ、１０Ｌ～２０Ｌ、１０Ｌ～２５Ｌ、２０Ｌ～３０Ｌ、１０Ｌ～３５Ｌ、１０Ｌ～４０Ｌ、１０Ｌ～４５Ｌ、１０Ｌ～５０Ｌ、１５Ｌ～２０Ｌ、１５Ｌ～２５Ｌ、１５Ｌ～３０Ｌ、１５Ｌ～３５Ｌ、１５Ｌ～４０Ｌ、１５Ｌ～４５Ｌ、又は１５～５０Ｌの容量で実施することができる。いくつかの実施形態において、バイオリアクターは、少なくとも１ｇの環状ＲＮＡを生産し得る。いくつかの実施形態において、バイオリアクターは、１～２００ｇの環状ＲＮＡ（例えば、１～１０ｇ、１～２０ｇ、１～５０ｇ、１０～５０ｇ、１０～１００ｇ、５０～１００ｇ、又は５０～２００ｇのｃｉｒｃＲＮＡ）を生産し得る。いくつかの実施形態では、生産される量は、１リットル当たり（例えば、１リットル当たり１～２００ｇ）、バッチ若しくは反応当たり（例えば、バッチ若しくは反応当たり１～２００ｇ）、又は単位時間当たり（例えば、１時間若しくは１日当たり１～２００ｇ）で測定される。いくつかの実施形態では、生産能力を増加するために、２つ以上のバイオリアクターを連続的に利用することができる（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、又は９つのバイオリアクターを連続的に使用することができる）。
【0288】
本明細書に記載のｃｉｒｃＲＮＡの作製方法は、例えば、Ｋｈｕｄｙａｋｏｖ ＆ Ｆｉｅｌｄｓ，Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ＤＮＡ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ（２００２）；Ｚｈａｏ，Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ｔｏｏｌｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，（Ｆｉｒｓｔ Ｅｄｉｔｉｏｎ），Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（２０１３）；Ｍｕｌｌｅｒ ａｎｄ Ａｐｐｅｌ，ｆｒｏｍ ＲＮＡ Ｂｉｏｌ，２０１７，１４（８）：１０１８－１０２７；及びＥｇｌｉ ＆ Ｈｅｒｄｅｗｉｊｎ，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ，（Ｆｉｒｓｔ Ｅｄｉｔｉｏｎ），Ｗｉｌｅｙ－ＶＣＨ（２０１２）に記載されている。環状ポリリボヌクレオチドを製造する他の方法は、例えば、国際公開第２０２２／２４７９４３号パンフレット、米国特許第１１０００５４７号明細書、国際公開第２０１８／１９１７２２号パンフレット、同第２０１９／２３６６７３号パンフレット、同第２０２０／０２３５９５号パンフレット、同第２０２２／２０４４６０号パンフレット、同第２０２２／２０４４６４号パンフレット、及び同第２０２２／２０４４６６号パンフレットに記載されている。
【0289】
ｃｉｒｃＲＮＡを合成する様々な方法は、他にも記載されている（例えば、米国特許第６２１０９３１号明細書、同第５７７３２４４号明細書、同第５７６６９０３号明細書、同第５７１２１２８号明細書、同第５４２６１８０号明細書、米国特許出願公開第２０１００１３７４０７号明細書、国際公開第１９９２００１８１３号パンフレット、同第２０１００８４３７１号パンフレット、及びＰｅｔｋｏｖｉｃ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．４３：２４５４－６５（２０１５）；これら各々の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
【0290】
環状ポリリボヌクレオチド
本開示は、ｃｉｒｃＲＮＡ組成物、並びにｃｉｒｃＲＮＡを作製及び精製する方法を特徴とする。いくつかの実施形態では、ｃｉｒｃＲＮＡは、ｌｉｎＲＮＡから産生される（例えば、酵素ライゲーション又は自己触媒ＲＮＡによるものを含め、当技術分野で公知の方法によって）。いくつかの実施形態では、ｌｉｎＲＮＡは、デオキシリボヌクレオチド鋳型（例えば、ベクター、線状化ベクター、又はｃＤＮＡ）から転写される。
本開示は、ｃｉｒｃＲＮＡ組成物、並びにｃｉｒｃＲＮＡを作製及び精製する方法を特徴とする。いくつかの実施形態では、ｃｉｒｃＲＮＡは、ｌｉｎＲＮＡから産生される（例えば、酵素ライゲーション又は自己触媒ＲＮＡによるものを含め、当技術分野で公知の方法によって）。いくつかの実施形態では、ｌｉｎＲＮＡは、デオキシリボヌクレオチド鋳型（例えば、ベクター、線状化ベクター、又はｃＤＮＡ）から転写される。
【0291】
ｃｉｒｃＲＮＡは、１つ若しくは複数のコード配列、１つ若しくは複数の非コード配列、又はそれらの組み合わせなどの特徴を含み得る。ｃｉｒｃＲＮＡは、例えば、ポリペプチドの発現をコードするコード配列など、１つ若しくは複数のコード配列を含み得る。各コード配列は、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）若しくは１つ若しくは複数の調節配列、又はそれらの組み合わせに作動可能に連結されていてもよい。ｃｉｒｃＲＮＡは、１つ若しくは複数の非コード配列、例えば、タンパク質や核酸などの標的に特異的に結合する非コード配列を含んでいてもよい。ｃｉｒｃＲＮＡの特徴は、例えば、国際特許公開第２０１９／１１８９１９号パンフレット、同第２０２０／０２３６５５号パンフレット、同第２０２０／１８０７５１号パンフレット、同第２０２０／１８０７５２号パンフレット、同第２０２０／１８１０１３号パンフレット、同第２０２０／１９８４０３号パンフレット、同第２０２０／２５７７３０号パンフレット、同第２０２０／２５７７２７号パンフレット、同第２０２０／２５２４３６号パンフレットに記載されており、その各々は、そこに記載されたｃｉｒｃＲＮＡに関して参照により組み込まれる。
【0292】
精製されるｃｉｒｃＲＮＡのサイズは、本明細書に開示される精製方法に適した任意のサイズであってよい。
【0293】
例えば、精製しようとするｃｉｒｃＲＮＡは、少なくとも２０，０００ヌクレオチド、少なくとも１９，０００ヌクレオチド、少なくとも１８，０００ヌクレオチド、少なくとも１７，０００ヌクレオチド、少なくとも１６，０００ヌクレオチド、少なくとも１５，０００ヌクレオチド、少なくとも１４，０００ヌクレオチド、少なくとも１３，０００ヌクレオチド、少なくとも１２，０００ヌクレオチド、少なくとも１１，０００ヌクレオチド、少なくとも１０，０００ヌクレオチド、少なくとも９，０００ヌクレオチド、少なくとも８，０００ヌクレオチド、少なくとも７，０００ヌクレオチド、少なくとも６，０００ヌクレオチド、少なくとも５，０００ヌクレオチド、少なくとも４，０００ヌクレオチド、少なくとも３，０００ヌクレオチド、少なくとも２，０００ヌクレオチド、少なくとも１，０００ヌクレオチド、少なくとも９００ヌクレオチド、少なくとも８００ヌクレオチド、少なくとも７００ヌクレオチド、少なくとも６００ヌクレオチド、少なくとも５００ヌクレオチド、少なくとも４００ヌクレオチド、少なくとも３００ヌクレオチド、少なくとも２００ヌクレオチド、又は少なくとも１００ヌクレオチドの長さを有し得る。
【0294】
例えば、精製しようとするｃｉｒｃＲＮＡは、約２０，０００ヌクレオチド未満、約１９，０００ヌクレオチド未満、約１８，０００ヌクレオチド未満、約１７，０００ヌクレオチド未満、約１６，０００ヌクレオチド未満、約１５，０００ヌクレオチド未満、約１４，０００ヌクレオチド未満、約１５，０００ヌクレオチド未満、約１４，００００ヌクレオチド未満、約１３，０００ヌクレオチド未満、約１２，０００ヌクレオチド未満、約１１，０００ヌクレオチド未満、約１０，０００ヌクレオチド未満、約９，０００ヌクレオチド未満、約８，０００ヌクレオチド未満、約７，０００ヌクレオチド未満、約６，０００ヌクレオチド未満、約５，０００ヌクレオチド未満、約４，０００ヌクレオチド未満、約３，０００ヌクレオチド未満、約２，０００ヌクレオチド未満、約１，０００ヌクレオチド未満、約９００ヌクレオチド未満、約８００ヌクレオチド未満、約７００ヌクレオチド未満、約６００ヌクレオチド未満、約５００ヌクレオチド未満、約４００ヌクレオチド未満、約３００ヌクレオチド未満、約２００ヌクレオチド未満、又は約１００ヌクレオチド未満の長さを有し得る。
【0295】
例えば、精製しようとするｃｉｒｃＲＮＡは、約１００ヌクレオチド～約２０，０００ヌクレオチド（例えば、約１００ヌクレオチド～約５００ヌクレオチド、約１００ヌクレオチド～約７５０ヌクレオチド、約１００ヌクレオチド～約１，０００ヌクレオチド、約１００ヌクレオチド～約２，５００ヌクレオチド、約１００ヌクレオチド～約５，０００ヌクレオチド、約１００ヌクレオチド～約１０，０００ヌクレオチド、約５００ヌクレオチド～約７５０ヌクレオチド、約７５０ヌクレオチド～約１，０００ヌクレオチド、約７５０ヌクレオチド～約１，２５０ヌクレオチド、約１，０００ヌクレオチド～約１，２５０ヌクレオチド、約１，０００ヌクレオチド～約２，０００ヌクレオチド、約１，０００ヌクレオチド～約５，０００ヌクレオチド、約２，５００ヌクレオチド～約５，０００ヌクレオチド、約５，０００ヌクレオチド～約１０，０００ヌクレオチド、約５，０００ヌクレオチド～約１５，０００ヌクレオチド、約１０，０００ヌクレオチド～約１５，０００ヌクレオチド、約１５，０００ヌクレオチド～約２０，０００ヌクレオチド、約１００ヌクレオチド、約２００ヌクレオチド、約３００ヌクレオチド、約４００ヌクレオチド、約５００ヌクレオチド、約６００ヌクレオチド、約７００ヌクレオチド、約８００ヌクレオチド、約９００ヌクレオチド、約１，０００ヌクレオチド、約１，２５０ヌクレオチド、約１，５００ヌクレオチド、約１，７５０ヌクレオチド、約２，０００ヌクレオチド、約３，０００ヌクレオチド、約４，０００ヌクレオチド、約５，０００ヌクレオチド、約６，０００ヌクレオチド、約７，０００ヌクレオチド、約８，０００ヌクレオチド、約９，０００ヌクレオチド、約１０，０００ヌクレオチド、約１１，０００ヌクレオチド、約１２，０００ヌクレオチド、約１３，０００ヌクレオチド、約１４，０００ヌクレオチド、約１５，０００ヌクレオチド、約１６，０００ヌクレオチド、約１７，０００ヌクレオチド、約１８，０００ヌクレオチド、約１９，０００ヌクレオチド、又は約２０，０００ヌクレオチド）の長さを有し得る。
【0296】
本明細書に開示された方法に従って、ポリリボヌクレオチドの混合集団からのｃｉｒｃＲＮＡの精製は、一本鎖又は二本鎖ｃｉｒｃＲＮＡ、二次構造を備えるｃｉｒｃＲＮＡ及び二次構造がないｃｉｒｃＲＮＡ、標識又は非標識ｃｉｒｃＲＮＡ（中でも、例えば、蛍光標識、放射性標識、抗体標識など）を含め、あらゆる種類のｃｉｒｃＲＮＡに対しても実施することができる。
【0297】
精製のために選択されるｃｉｒｃＲＮＡは、天然に存在するＤＮＡ若しくはＲＮＡヌクレオシド（例えば、アデニン、チミジン、グアノシン、シチジン、ウリジン、若しくはイノシン）を含んでもよいし、又はｃｉｒｃＲＮＡは、天然に存在しない（即ち、修飾された）核酸塩基、ヌクレオシド間結合、若しくは糖を含んでもよい。いくつかの実施形態では、精製のために選択されるｃｉｒｃＲＮＡは、天然に存在するヌクレオシドを含む。ｃｉｒｃＲＮＡが修飾されている場合、それは、修飾リボヌクレオシド（例えば、修飾核酸塩基又は修飾リボース部分を含む）又は修飾ヌクレオシド間連結（中でも、例えば、ホスホロチオエート及びホスホロアミデートなど）を含み得る。一般に、このような修飾は、ＲＮＡ分子を安定化し、ヌクレアーゼによる加水分解を低減するために組み込まれる。本開示が特に企図するｃｉｒｃＲＮＡの修飾には、国際公開第２０２０／１９８４０３号パンフレットに記載されている核酸塩基修飾が含まれる。
【0298】
一部の実施形態では、本開示のｃｉｒｃＲＮＡのヌクレオシド又はヌクレオシド間連結の実質的に全てが、修飾ヌクレオシドである。一部の実施形態では、開示されるｃｉｒｃＲＮＡのヌクレオシド又はヌクレオシド間結合は全て、修飾ヌクレオシドである。「実質的に全てのヌクレオシドが、修飾ヌクレオシドである」ｃｉｒｃＲＮＡは、大部分が修飾されているが、全体が修飾されているわけではなく、５、４、３、２、又は１以下の天然に存在するヌクレオシドを含み得る。いくつかの実施形態では、ｃｉｒｃＲＮＡは、５、４、３、２、又は１以下の代替ヌクレオシドを含み得る。いくつかの実施形態では、修飾ｃｉｒｃＲＮＡは、少なくとも１（例えば、少なくとも２、５、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００、５５００、６０００、６５００、７０００又はそれ以上）の修飾ヌクレオシドを含む。核酸塩基、糖部分に対する修飾、又はヌクレオシド間結合をはじめとする前述の修飾は、未修飾ＲＮＡ配列にコードされる情報（例えば、各コドンによってコードされるアミノ酸）を保持し、且つ、タンパク質翻訳を妨害しない範囲で、本明細書に記載のｃｉｒｃＲＮＡに組み込むことができる。
【0299】
ポリペプチド発現配列
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリリボヌクレオチドは、１つ以上の発現配列を含み、ここで各発現配列は、ポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０又はそれ以上の発現配列を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリリボヌクレオチドは、１つ以上の発現配列を含み、ここで各発現配列は、ポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０又はそれ以上の発現配列を含む。
【0300】
各コードポリペプチドは、直鎖状又は分岐状であってもよい。ポリペプチドは、約５～約４０，０００アミノ酸、約１５～約３５，０００アミノ酸、約２０～約３０，０００アミノ酸、約２５～約２５，０００アミノ酸、約５０～約２０，０００アミノ酸、約１００～約１５，０００アミノ酸、約２００～約１０，０００アミノ酸、約５００～約５，０００アミノ酸、約１，０００～約２，５００アミノ酸、又はそれらの間の任意の範囲の長さを有し得る。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、有用であり得る、約４０，０００アミノ酸未満、約３５，０００アミノ酸未満、約３０，０００アミノ酸未満、約２５，０００アミノ酸未満、約２０，０００アミノ酸未満、約１５，０００アミノ酸未満、約１０，０００アミノ酸未満、約９，０００アミノ酸未満、約８，０００アミノ酸未満、約７，０００アミノ酸未満、約６，０００アミノ酸未満、約５，０００アミノ酸未満、約４，０００アミノ酸未満、約３，０００アミノ酸未満、約２，５００アミノ酸未満、約２，０００アミノ酸未満、約１，５００アミノ酸未満、約１，０００アミノ酸未満、約９００アミノ酸未満、約８００アミノ酸未満、約７００アミノ酸未満、約６００アミノ酸未満、約５００アミノ酸未満、約４００アミノ酸未満、約３００アミノ酸未満、又はそれ以下の長さを有する。
【0301】
本明細書に含まれるポリペプチドは、天然に存在するポリペプチド又は天然に存在しないポリペプチドを含み得る。いくつかの例では、ポリペプチドは、参照ポリペプチドの機能断片又は変異体（例えば、酵素の酵素活性断片又は変異体）であるか又はそれを含む。例えば、ポリペプチドは、例えば、特定領域にわたり、又は全配列にわたり、本明細書に記載のポリペプチド又は天然に存在するポリペプチドの配列と少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有する、本明細書に記載のポリペプチドのいずれかの機能的に活性のある変異体であってもよい。いくつかの場合、ポリペプチドは、目的のタンパク質と少なくとも５０％（例えば、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９９％、又はそれ以上）の同一性を有し得る。
【0302】
ポリペプチドのいくつかの例として、限定はされないが、蛍光タグ若しくはマーカー、抗原、治療用ポリペプチド、又は農業用途のポリペプチドが挙げられる。
【0303】
治療用ポリペプチドは、ホルモン、神経伝達物質、成長因子、酵素（例えば、オキシドレダクターゼ、代謝酵素、ミトコンドリア酵素、オキシゲナーゼ、デヒドロゲナーゼ、ＡＴＰ非依存性酵素、リソソーム酵素、デサチュラーゼ）、サイトカイン、抗原結合ポリペプチド（例えば、抗原結合抗体又は抗体様断片、例えば、一本鎖抗体、ナノボディ又は他のＩｇ重鎖若しくは軽鎖を含むポリペプチド）、Ｆｃ融合タンパク質、抗凝固剤、血液因子、骨形成タンパク質、インターフェロン、インターロイキン、又は血栓溶解剤であってもよい。
【0304】
農業用途のポリペプチドは、バクテリオシン、溶解素、抗菌ポリペプチド、抗真菌ポリペプチド、根粒Ｃリッチペプチド、菌細胞調節ペプチド（ｂａｃｔｅｒｉｏｃｙｔｅ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｐｅｐｔｉｄｅ）、ペプチド毒素、殺虫性（ｐｅｓｔｉｃｉｄａｌ）ポリペプチド（例えば、殺虫性（ｉｎｓｅｃｔｉｃｉｄａｌ）ポリペプチド又は殺線虫性ポリペプチド）、抗原結合ポリペプチド（例えば、抗原結合抗体又は抗体様断片、例えば、一本鎖抗体、ナノボディ又は他のＩｇ重鎖若しくは軽鎖を含むポリペプチド）、酵素（例えば、ヌクレアーゼ、アミラーゼ、セルラーゼ、ペプチダーゼ、リパーゼ、キチナーゼ）、ペプチドフェロモン、又は転写因子であってもよい。
【0305】
場合によっては、ポリリボヌクレオチドは、ヒトタンパク質を発現する。場合によっては、ポリリボヌクレオチドは、非ヒトタンパク質を発現する。
【0306】
いくつかの実施形態では、ポリリボヌクレオチドは、抗体、例えば、抗体断片、又はその一部分を発現する。いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドによって発現される抗体は、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭなどの任意のアイソタイプであり得る。いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、抗体の一部分、例えば、軽鎖、重鎖、Ｆｃ断片、ＣＤＲ（相補性決定領域）、Ｆｖ断片、又はＦａｂ断片、そのさらなる一部分を発現する。いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、抗体の１つ以上の部分を発現する。例えば、環状ポリリボヌクレオチドは、２つ以上の発現配列を含むことができ、それらの各々は、抗体の一部分を発現し、それらの和は、抗体を構成し得る。いくつかの場合、環状ポリリボヌクレオチドは、抗体の重鎖をコードする１つの発現配列、及び抗体の軽鎖をコードする別の発現配列を含む。いくつかの場合、環状ポリリボヌクレオチドが細胞又は無細胞環境下で発現される場合、軽鎖及び重鎖は、適切な修飾、フォールディング、又は他の翻訳後修飾を受け、機能的抗体を形成し得る。
【0307】
実施形態では、ポリペプチドは、複数のポリペプチド、例えば、１つのポリペプチド配列の複数のコピー、又は複数の異なるポリペプチド配列を含む。実施形態では、複数のポリペプチドは、リンカーアミノ酸又はスペーサーアミノ酸によって接続される。
【0308】
いくつかの実施形態では、発現配列は、（例えば、発現配列の３’末端に）ポリＡ配列を含む。いくつかの実施形態では、ポリＡ配列の長さは、１０を超えるヌクレオチドの長さである。一実施形態では、ポリＡ配列は、１５を超えるヌクレオチドの長さである（例えば、少なくとも約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００、１，１００、１，２００、１，３００、１，４００、１，５００、１，６００、１，７００、１，８００、１，９００、２，０００、２，５００、又は３，０００ヌクレオチドであるか又はそれを超える）。いくつかの実施形態では、ポリＡ配列は、全体が参照により本明細書に援用される国際公開第２０１９／１１８９１９Ａ１号パンフレットの［０２０２］～［０２０４］におけるポリＡ配列の記載に従って設計される。いくつかの実施形態では、発現配列は、（例えば、発現配列の３’末端で）ポリＡ配列を欠いている。
【0309】
いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、環状ポリリボヌクレオチドの１つ以上の特徴を調節するため、ポリＡを含むか、ポリＡを欠いているか、又は修飾ポリＡを有する。いくつかの実施形態では、ポリＡを欠いているか又は修飾ポリＡを有する環状ポリリボヌクレオチドは、１つ以上の機能特性、例えば、免疫原性（例えば、免疫又は炎症性応答の１つ以上のマーカーのレベル）、半減期、及び／又は発現効率を改良する。
【0310】
内部リボソーム進入部位
いくつかの実施形態では、ポリリボヌクレオチドは１つ以上の内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）要素を含む。いくつかの実施形態では、ＩＲＥＳは、１つ以上の発現配列に作動可能に連結される（例えば、各ＩＲＥＳは、１つ以上の発現配列に作動可能に連結される）。実施形態では、ＩＲＥＳは、異種プロモーターとコード配列の５’末端との間に位置する。
いくつかの実施形態では、ポリリボヌクレオチドは１つ以上の内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）要素を含む。いくつかの実施形態では、ＩＲＥＳは、１つ以上の発現配列に作動可能に連結される（例えば、各ＩＲＥＳは、１つ以上の発現配列に作動可能に連結される）。実施形態では、ＩＲＥＳは、異種プロモーターとコード配列の５’末端との間に位置する。
【0311】
ポリリボヌクレオチド内に含めるのに適したＩＲＥＳ要素は、真核生物リボソームと会合することが可能なＲＮＡ配列を含む。いくつかの実施形態では、ＩＲＥＳ要素は、少なくとも約５ｎｔ、少なくとも約８ｎｔ、少なくとも約９ｎｔ、少なくとも約１０ｎｔ、少なくとも約１５ｎｔ、少なくとも約２０ｎｔ、少なくとも約２５ｎｔ、少なくとも約３０ｎｔ、少なくとも約４０ｎｔ、少なくとも約５０ｎｔ、少なくとも約１００ｎｔ、少なくとも約２００ｎｔ、少なくとも約２５０ｎｔ、少なくとも約３５０ｎｔ、又は少なくとも約５００ｎｔである。
【0312】
いくつかの実施形態では、ＩＲＥＳ要素は、限定はされないが、ウイルス、哺乳動物、又はショウジョウバエを含む生物のＤＮＡに由来する。このようなウイルスＤＮＡは、限定はされないが、ピコルナウイルス相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）とともに、ＥＭＣＶ ｃＤＮＡ及びポリオウイルス（ｐｏｌｉｏｖｉｒｕｓ）ｃＤＮＡに由来し得る。一実施形態では、ＩＲＥＳ要素の由来元であるショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）ＤＮＡは、限定はされないが、キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）由来のアンテナペディア遺伝子を含む。
【0313】
いくつかの実施形態では、存在する場合、ＩＲＥＳ配列は、タウラ症候群ウイルス、トリアトマウイルス、タイラー脳脊髄炎ウイルス、シミアンウイルス４０、ソレノプシスインビクタウイルス１、ムギクビレアブラムシウイルス、細網内皮症ウイルス、ヒトポリオウイルス１、チャバネアオカメムシ腸管ウイルス、カシミール蜂ウイルス、ヒトライノウイルス２（ＨＲＶ－２）、ヒメヨコバイ（Ｈｏｍａｌｏｄｉｓｃａ ｃｏａｇｕｌａｔａ）ウイルス－１、ヒト免疫不全ウイルス１型、ヒメヨコバイ（Ｈｏｍａｌｏｄｉｓｃａ ｃｏａｇｕｌａｔａ）ウイルス－１、ヒメトビＰウイルス（Ｈｉｍｅｔｏｂｉ Ｐ ｖｉｒｕｓ）、Ｃ型肝炎ウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、ＧＢ型肝炎ウイルス、口蹄疫ウイルス、ヒトエンテロウイルス７１、ウマ鼻炎ウイルス（Ｅｑｕｉｎｅ ｒｈｉｎｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ）、チャシャクガピコルナ様ウイルス、脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）、ショウジョウバエＣウイルス、アブラナ科トバモ（Ｃｒｕｃｉｆｅｒ ｔｏｂａｍｏ）ウイルス、クリケット麻痺（Ｃｒｉｃｋｅｔ ｐａｒａｌｙｓｉｓ）ウイルス、ウシウイルス性下痢ウイルス１、黒色女王蜂児ウイルス、アブラムシ致死性麻痺ウイルス（Ａｐｈｉｄ ｌｅｔｈａｌ ｐａｒａｌｙｓｉｓ ｖｉｒｕｓ）、トリ脳脊髄炎ウイルス（ＡＥＶ）、急性蜂麻痺ウイルス、ハイビスカス退緑輪点ウイルス（Ｈｉｂｉｓｃｕｓ ｃｈｌｏｒｏｔｉｃ ｒｉｎｇｓｐｏｔ ｖｉｒｕｓ）、古典的ブタ熱ウイルス、ヒトＦＧＦ２、ヒトＳＦＴＰＡｌ、ヒトＡＭＬｌ／ＲＵＮＸｌ、ショウジョウバエアンテナペディア（ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａ）、ヒトＡＱＰ４、ヒトＡＴ１Ｒ、ヒトＢＡＧ－１、ヒトＢＣＬ２、ヒトＢｉＰ、ヒトｃ－ＩＡＰｌ、ヒトｃ－ｍｙｃ、ヒトｅＩＦ４Ｇ、マウスＮＤＳＴ４Ｌ、ヒトＬＥＦ１、マウスＨＩＦ１α、ヒトｎ．ｍｙｃ、マウスＧｔｘ、ヒトｐ２７ｋｉｐｌ、ヒトＰＤＧＦ２／ｃ－ｓｉｓ、ヒトｐ５３、ヒトＰｉｍ－１、マウスＲｂｍ３、ショウジョウバエリーパー（ｒｅａｐｅｒ）、イヌスカンパー（Ｓｃａｍｐｅｒ）、ショウジョウバエＵｂｘ、ヒトＵＮＲ、マウスＵｔｒＡ、ヒトＶＥＧＦ－Ａ、ヒトＸＩＡＰ、サリウイルス（Ｓａｌｉｖｉｒｕｓ）、コサウイルス、パレコウイルス、ショウジョウバエヘアレス（ｈａｉｒｌｅｓｓ）、酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＴＦＩＩＤ、酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＹＡＰ１、ヒトｃ－ｓｒｃ、ヒトＦＧＦ－１、サルピコマウイルス（ｐｉｃｏｍａｖｉｒｕｓ）、カブクリンクルウイルス（Ｔｕｒｎｉｐｃｒｉｎｋｌｅｖｉｒｕｓ）、アイチウイルス、クローヒウイルス、エコウイルス１１、ｅＩＦ４Ｇに対するアプタマー、コクサッキーウイルスＢ３（ＣＶＢ３）又はコクサッキーウイルスＡ（ＣＶＢ１／２）のＩＲＥＳ配列である。さらに別の実施形態では、ＩＲＥＳは、コクサッキーウイルスＢ３（ＣＶＢ３）のＩＲＥＳ配列である。さらなる実施形態では、ＩＲＥＳは脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）のＩＲＥＳ配列である。さらに別の実施形態では、ＩＲＥＳは、タイラー脳脊髄炎ウイルスのＩＲＥＳ配列である。
【0314】
いくつかの実施形態では、ＩＲＥＳ配列は、野生型ＩＲＥＳ配列と比較して、修飾された配列を有する。いくつかの実施形態では、野生型ＩＲＥＳの最後のヌクレオチドがシトシン核酸残基でない場合、野生型ＩＲＥＳ配列の最後のヌクレオチドは、それがシトシン残基であるように修飾され得る。例えば、いくつかの実施形態では、ＩＲＥＳ配列は、末端アデノシン残基がシトシン残基に修飾されたＣＶＢ３ ＩＲＥＳ配列である。いくつかの実施形態では、ＩＲＥＳ配列は、末端グアノシン残基がシトシン残基に修飾されたエンテロウイルス７１（ＥＶ１７）ＩＲＥＳである。いくつかの実施形態では、ポリリボヌクレオチドは、少なくとも１つ（例えば、２、３、４、５又はそれ以上）の発現配列にフランキングする少なくとも１つのＩＲＥＳを含む。いくつかの実施形態では、ＩＲＥＳは、少なくとも１つ（例えば、２、３、４、５又はそれ以上）の発現配列の両側にフランキングする。いくつかの実施形態では、ポリリボヌクレオチドは、各発現配列の片側又は両側に１つ若しくは複数のＩＲＥＳ配列を含み、得られるペプチド及び又はポリペプチドの分離をもたらす。
【0315】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリリボヌクレオチドは、ＩＲＥＳ（例えば、コード領域に作動可能に連結されたＩＲＥＳ）を含む。例えば、ポリリボヌクレオチドは、以下：Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ ８１（２０）：４３００－４３１８，２０２１；Ｊｏｐｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ２０：２６６４－２６７０，２００１；Ｂａｒａｎｉｃｋ ｅｔ ａｌ．ＰＮＡＳ １０５（１２）：４７３３－４７３８，２００８；Ｌａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｅｌｌ １３（５）：１７９２－１８０１，２００２；Ｄｏｒｏｋｈｏｖ ｅｔ ａｌ．ＰＮＡＳ ９９（８）：５３０１－５３０６，２００２；Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３３（７）：２２４８－２２５８，２００５；Ｐｅｔｚ ｅｔ ａ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３５（８）：２４７３－２４８２，２００７；Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６８：４１５－４１７，１９９５；Ｆａｎ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ １３（１）：３７５１－３７６５，２０２２、及び国際公開第２０２１／２６３１２４号パンフレットに記載されており、これらの各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【0316】
調節要素
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリリボヌクレオチドは、１つ以上の調節要素を含む。いくつかの実施形態では、ポリリボヌクレオチドは、調節要素、例えば、ポリリボヌクレオチド内の発現配列の発現を調節する配列を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリリボヌクレオチドは、１つ以上の調節要素を含む。いくつかの実施形態では、ポリリボヌクレオチドは、調節要素、例えば、ポリリボヌクレオチド内の発現配列の発現を調節する配列を含む。
【0317】
調節要素は、発現産物をコードする発現配列に隣接して位置する配列を含んでもよい。調節要素は、隣接配列に作動可能に連結されてもよい。調節要素は、調節要素が存在しない場合に発現される産物の量又は数と比較して、発現される産物の量を増加させ得る。さらに、１つの調節要素が、並んで結合された複数の発現配列について発現される産物の量を増加させ得る。したがって、１つの調節要素が、１つ以上の発現配列の発現を促進することができる。複数の調節エレメントを、例えば、異なる発現配列の発現を差次的に調節するために使用することもできる。
【0318】
いくつかの実施形態では、調節要素は、翻訳モジュレーターである。翻訳モジュレーターは、ポリリボヌクレオチド中の発現配列の翻訳を調節し得る。翻訳モジュレーターは、翻訳エンハンサー又はサプレッサーであり得る。いくつかの実施形態では、ポリリボヌクレオチドは、少なくとも１つの発現配列に隣接した少なくとも１つの翻訳モジュレーターを含む。いくつかの実施形態では、ポリリボヌクレオチドは、各発現配列に隣接した翻訳モジュレーターを含む。いくつかの実施形態では、翻訳モジュレーターは、各発現配列の片側又は両側にあり、発現産物、例えばペプチド及び／又はポリペプチドの分離をもたらす。
【0319】
いくつかの実施形態では、調節要素は、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）又はｍｉＲＮＡ結合部位である。
【0320】
調節要素のさらなる例が、例えば、全体が参照により本明細書に援用される国際公開第２０１９／１１８９１９号パンフレットの段落［０１５４］～［０１６１］に記載されている。
【0321】
翻訳開始配列
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリリボヌクレオチドは、少なくとも１つの翻訳開始配列を含む。いくつかの実施形態では、ポリリボヌクレオチドは、発現配列に作動可能に連結されている翻訳開始配列を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリリボヌクレオチドは、少なくとも１つの翻訳開始配列を含む。いくつかの実施形態では、ポリリボヌクレオチドは、発現配列に作動可能に連結されている翻訳開始配列を含む。
【0322】
いくつかの実施形態では、ポリリボヌクレオチドは、ポリペプチドをコードし、翻訳開始配列、例えば開始コドンを含み得る。いくつかの実施形態では、翻訳開始配列は、コザック又はシャイン・ダルガノ配列を含む。いくつかの実施形態では、ポリリボヌクレオチドは、発現配列に隣接する翻訳開始配列、例えば、コザック配列を含む。ある実施形態では、翻訳開始配列は、非コード開始コドンである。ある実施形態では、翻訳開始配列、例えば、コザック配列は、各発現配列の１つの側又は両側に存在して、発現産物の分離をもたらす。ある実施形態では、ポリリボヌクレオチドは、発現配列に隣接する少なくとも１つの翻訳開始配列を含む。ある実施形態では、翻訳開始配列は、ポリリボヌクレオチドに立体配座柔軟性を与える。ある実施形態では、翻訳開始配列は、環状ポリリボヌクレオチドの実質的に一本鎖領域内にある。翻訳開始配列のさらなる例が、全体が参照により本明細書に援用される国際公開第２０１９／１１８９１９号パンフレットの段落［０１６３］～［０１６５］に記載されている。
【0323】
ポリリボヌクレオチドは、限定はされないが、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０又は６０を超える開始コドンなどの２つ以上の開始コドンを含んでもよい。翻訳は、第１の開始コドンで開始し得るか、又は第１の開始コドンの下流で開始し得る。
【0324】
いくつかの実施形態では、ポリリボヌクレオチドは、第１の開始コドン、例えばＡＵＧでないコドンで開始し得る。ポリリボヌクレオチドの翻訳は、代替的な翻訳開始配列、例えば限定はされないが、ＡＣＧ、ＡＧＧ、ＡＡＧ、ＣＴＧ／ＣＵＧ、ＧＴＧ／ＧＵＧ、ＡＴＡ／ＡＵＡ、ＡＴＴ／ＡＵＵ、ＴＴＧ／ＵＵＧで開始し得る。いくつかの実施形態では、翻訳は、選択的条件、例えばストレス誘導条件下で、代替的な翻訳開始配列で開始する。非限定的な例として、ポリリボヌクレオチドの翻訳は、代替的な翻訳開始配列、例えばＡＣＧで開始し得る。別の非限定的な例として、ポリリボヌクレオチドの翻訳は、代替的な翻訳開始配列のＣＴＧ／ＣＵＧで開始し得る。別の非限定的な例として、ポリリボヌクレオチドの翻訳は、代替的な翻訳開始配列のＧＴＧ／ＧＵＧで開始し得る。別の非限定的な例として、ポリリボヌクレオチドは、リピート関連非ＡＵＧ（ＲＡＮ）配列、例えば、反復ＲＮＡの短いストレッチ、例えば、ＣＧＧ、ＧＧＧＧＣＣ、ＣＡＧ、ＣＴＧを含む代替的な翻訳開始配列で翻訳を開始し得る。
【0325】
終結配列
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリリボヌクレオチドは、少なくとも（ｌｅａｓｔ）１つの終結配列を含む。いくつかの実施形態では、ポリリボヌクレオチドは、発現配列に作動可能に連結されている終結配列を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、終結配列を欠いている。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリリボヌクレオチドは、少なくとも（ｌｅａｓｔ）１つの終結配列を含む。いくつかの実施形態では、ポリリボヌクレオチドは、発現配列に作動可能に連結されている終結配列を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、終結配列を欠いている。
【0326】
いくつかの実施形態では、ポリリボヌクレオチドは、１つ以上の発現配列を含み、各発現配列は、終結配列を有する場合も有しない場合もある。いくつかの実施形態では、ポリリボヌクレオチドは、１つ以上の発現配列を含み、発現配列は、終結配列を欠いていることで、ポリリボヌクレオチドは、継続的に翻訳される。終結配列の除外は、ローリングサークル翻訳又は発現産物の連続的発現をもたらし得る。
【0327】
いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、１つ以上の発現配列を含み、各発現配列は、終結配列を有する場合も有しない場合もある。いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、１つ以上の発現配列を含み、発現配列は、終結配列を欠いていることで、環状ポリリボヌクレオチドは、継続的に翻訳される。終結配列の除外は、リボソーム停止又は脱落の欠如に起因して、ローリングサークル翻訳又は発現産物、例えばペプチド又はポリペプチドの連続的発現をもたらし得る。このような実施形態では、ローリングサークル翻訳は、各発現配列を通じて、連続的発現産物を発現する。いくつかの他の実施形態では、発現配列の終結配列は、スタガー要素の一部であり得る。いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチド中の１つ以上の発現配列は、終結配列を含む。しかし、環状ポリリボヌクレオチド中の後続の（例えば、第２、第３、第４、第５などの）発現配列のローリングサークル翻訳又は発現が実施される。このような場合、発現産物は、リボソームが終結配列、例えば停止コドンに遭遇し、翻訳を終結させる場合、リボソームから脱落し得る。いくつかの実施形態では、翻訳は、リボソーム、例えば、リボソームの少なくとも１つのサブユニットが環状ポリリボヌクレオチドとの接触状態を維持しながら終結される。
【0328】
いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、１つ以上の発現配列の末端に終結配列を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の発現配列は、後続の２つ以上の終結配列を含む。このような実施形態では、翻訳が終結され、ローリングサークル翻訳が終結される。いくつかの実施形態では、リボソームは、環状ポリリボヌクレオチドと完全に隔てられる。いくつかのこのような実施形態では、環状ポリリボヌクレオチド中の後続の（例えば、第２、第３、第４、第５などの）発現配列の生成において、翻訳の開始前に環状ポリリボヌクレオチドと再会合するため、リボソームを必要とし得る。一般に、終結配列は、翻訳の終結を伝えるインフレームのヌクレオチドトリプレット、例えば、ＵＡＡ、ＵＧＡ、ＵＡＧを含む。いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチド中の１つ以上の終結配列は、フレームシフトされた終結配列、例えば限定はされないが、翻訳を終結し得る、オフフレーム又は－１及び＋１シフトされたリーディングフレーム（例えば、隠れた停止）である。フレームシフトされた終結配列は、発現配列の第２及び第３のリーディングフレーム内に出現する三重ヌクレオチド、ＴＡＡ、ＴＡＧ、及びＴＧＡを含む。フレームシフトされた終結配列は、細胞に対して有害であることが多い、ｍＲＮＡの誤読を防止するのに重要であり得る。いくつかの実施形態では、終結配列は、停止コドンである。
【0329】
終結配列のさらなる例が、全体が参照により本明細書に援用される国際公開第２０１９／１１８９１９号パンフレットの段落［０１６９］～［０１７０］に記載されている。
【0330】
非翻訳領域
ある実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、非翻訳領域（ＵＴＲ）を含む。遺伝子を含むゲノム領域のＵＴＲは、転写され得るが、翻訳されていない。ある実施形態では、ＵＴＲは、本明細書に記載される発現配列の翻訳開始配列の上流に含まれ得る。ある実施形態では、ＵＴＲは、本明細書に記載される発現配列の下流に含まれ得る。ある場合において、第１の発現配列のための１つのＵＴＲは、第２の発現配列のための別のＵＴＲと同じであるか又はそれと連続しているか又はそれと重複している。ある実施形態では、イントロンは、ヒトイントロンである。
ある実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、非翻訳領域（ＵＴＲ）を含む。遺伝子を含むゲノム領域のＵＴＲは、転写され得るが、翻訳されていない。ある実施形態では、ＵＴＲは、本明細書に記載される発現配列の翻訳開始配列の上流に含まれ得る。ある実施形態では、ＵＴＲは、本明細書に記載される発現配列の下流に含まれ得る。ある場合において、第１の発現配列のための１つのＵＴＲは、第２の発現配列のための別のＵＴＲと同じであるか又はそれと連続しているか又はそれと重複している。ある実施形態では、イントロンは、ヒトイントロンである。
【0331】
例示的な非翻訳領域が、全体が参照により本明細書に援用される国際公開第２０１９／１１８９１９号パンフレットの段落［０１９７］～［２０１］に記載されている。
【0332】
ある実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、ポリＡ配列を含む。例示的なポリＡ配列が、全体が参照により本明細書に援用される国際公開第２０１９／１１８９１９号パンフレットの段落［０２０２］～［０２０５］に記載されている。ある実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、ポリＡ配列を欠いている。
【0333】
いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、アデノシン及びウリジンの１つ又は複数のストレッチが内包されたＵＴＲを含む。これらのＡＵリッチのシグネチャーは、発現産物のターンオーバー速度を増加させ得る。
【0334】
ＵＴＲのＡＵリッチエレメント（ＡＲＥ）の導入、除去、又は修飾は、環状ポリリボヌクレオチドの安定性、又は免疫原性（例えば、免疫又は炎症性応答の１つ又は複数のマーカーのレベル）を調節するのに有用であり得る。特定の環状ポリリボヌクレオチドを改変するとき、ＡＲＥの１つ又は複数コピーを環状ポリリボヌクレオチドに導入してもよく、ＡＲＥのコピーは、発現産物の翻訳及び／又は産生を調節し得る。同様に、ＡＲＥを、同定及び除去し、又は環状ポリリボヌクレオチドに改変することで、細胞内安定性を調節し、ひいては得られるタンパク質の翻訳及び産生に作用することができる。
【0335】
任意の遺伝子からの任意のＵＴＲが環状ポリリボヌクレオチドの各隣接領域に組み込まれてもよいことは理解されるべきである。
【0336】
いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、５’ＵＴＲを欠いており、その１つ又は複数の発現配列からのタンパク質発現の能力がある。いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、３’ＵＴＲを欠いており、その１つ又は複数の発現配列からのタンパク質発現の能力がある。いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、ポリＡ配列を欠いており、その１つ又は複数の発現配列からのタンパク質発現の能力がある。いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、終結配列を欠いており、その１つ又は複数の発現配列からのタンパク質発現の能力がある。いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、内部リボソーム進入部位を欠いており、その１つ又は複数の発現配列からのタンパク質発現の能力がある。いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、キャップを欠いており、その１つ又は複数の発現配列からのタンパク質発現の能力がある。いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、及びＩＲＥＳを欠いており、その１つ又は複数の発現配列からのタンパク質発現の能力がある。いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、以下の配列：１つ又は複数のｍｉＲＮＡをコードする配列、１つ又は複数の複製タンパク質をコードする配列、外因性遺伝子をコードする配列、治療（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ）をコードする配列、調節要素（例えば、翻訳モジュレーター、例えば、翻訳エンハンサー又はサプレッサー）、翻訳開始配列、内因性遺伝子を標的にする１つ又は複数の調節核酸（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ）、及び治療的ｍＲＮＡ又はタンパク質をコードする配列、の１つ又は複数を含む。
【0337】
いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、５’ＵＴＲを欠いている。いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、３’ＵＴＲを欠いている。いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、ポリＡ配列を欠いている。いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、終結配列を欠いている。いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、内部リボソーム進入部位を欠いている。いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、エキソヌクレアーゼによる分解感受性を欠いている。いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドが分解感受性を欠いているという事実は、環状ポリリボヌクレオチドがエキソヌクレアーゼによって分解されない、又はエキソヌクレアーゼの存在下で限られた範囲に限って分解される、例えば、エキソヌクレアーゼの不在下で同等又は類似的であることを意味し得る。いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、エキソヌクレアーゼによって分解されない。いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、エキソヌクレアーゼに曝露されるとき、分解が低下している。いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、キャップ結合タンパク質への結合を欠いている。いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、５’キャップを欠いている。
【0338】
スタガー要素
いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、発現配列に隣接した少なくとも１つのスタガー要素を含む。いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、各発現配列に隣接したスタガー要素を含む。いくつかの実施形態では、スタガー要素は、各発現配列の片側又は両側にあり、発現産物、例えばペプチド及び／又はポリペプチドの分離をもたらす。いくつかの実施形態では、スタガー要素は、１つ以上の発現配列の一部分である。いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、１つ以上の発現配列を含み、１つ以上の発現配列のそれぞれが、環状ポリリボヌクレオチドにおけるスタガー要素によって後続の発現配列から隔てられる。いくつかの実施形態では、スタガー要素は、（ａ）単一の発現配列の２回の翻訳から、又は（ｂ）２つ以上の発現配列の１回以上の翻訳からの単一のポリペプチドの生成を防止する。いくつかの実施形態では、スタガー要素は、１つ以上の発現配列から切り離された配列である。いくつかの実施形態では、スタガー要素は、１つ以上の発現配列のうちの発現配列の一部を含む。
いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、発現配列に隣接した少なくとも１つのスタガー要素を含む。いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、各発現配列に隣接したスタガー要素を含む。いくつかの実施形態では、スタガー要素は、各発現配列の片側又は両側にあり、発現産物、例えばペプチド及び／又はポリペプチドの分離をもたらす。いくつかの実施形態では、スタガー要素は、１つ以上の発現配列の一部分である。いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、１つ以上の発現配列を含み、１つ以上の発現配列のそれぞれが、環状ポリリボヌクレオチドにおけるスタガー要素によって後続の発現配列から隔てられる。いくつかの実施形態では、スタガー要素は、（ａ）単一の発現配列の２回の翻訳から、又は（ｂ）２つ以上の発現配列の１回以上の翻訳からの単一のポリペプチドの生成を防止する。いくつかの実施形態では、スタガー要素は、１つ以上の発現配列から切り離された配列である。いくつかの実施形態では、スタガー要素は、１つ以上の発現配列のうちの発現配列の一部を含む。
【0339】
非コード配列
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリリボヌクレオチドは、１つ以上の非コード配列、例えば、ポリペプチドの発現をコードしない配列を含む。いくつかの実施形態では、ポリリボヌクレオチドは、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０若しくはそれ以上の非コード配列を含む。いくつかの実施形態では、ポリリボヌクレオチドは、ポリペプチド発現配列をコードしない。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリリボヌクレオチドは、１つ以上の非コード配列、例えば、ポリペプチドの発現をコードしない配列を含む。いくつかの実施形態では、ポリリボヌクレオチドは、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０若しくはそれ以上の非コード配列を含む。いくつかの実施形態では、ポリリボヌクレオチドは、ポリペプチド発現配列をコードしない。
【0340】
非コード配列は、天然又は合成配列であり得る。いくつかの実施形態では、非コード配列は、細胞挙動、例えば、リンパ球挙動などを改変し得る。いくつかの実施形態では、非コード配列は、細胞ＲＮＡ配列に対してアンチセンスである。
【0341】
いくつかの実施形態では、ポリリボヌクレオチドは、典型的に、（特定のＲＮＡ構造（例えば、５～３０ｂｐのｍｉＲＮＡ、２００～５００ｂｐのｌｎｃＲＮＡ）に応じて約５～５００塩基対（ｂｐ）のＲＮＡ又はＲＮＡ様構造である調節核酸を含み、細胞内の発現された標的遺伝子におけるコード配列と同一（相補的）又はほぼ同一（実質的に相補的）である核酸塩基配列を有し得る。実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、より小さいｍｉＲＮＡ中間体又は成熟ｍｉＲＮＡにプロセシング可能である、約５０～約１０００ｂｐであり得る、より小さいＲＮＡにプロセシング可能であるＲＮＡ前駆体、例えばｍｉＲＮＡ前駆体をコードする調節核酸を含む。
【0342】
長い非コードＲＮＡ（ＩｎｃＲＮＡ）は、１００ヌクレオチドより長い非タンパク質コード転写物と定義される。多くのＩｎｃＲＮＡは、組織特異性として特徴づけられる。近傍のタンパク質コード遺伝子に対して逆方向に転写される多様なＩｎｃＲＮＡは、有意な割合（例えば、哺乳動物ゲノムにおける全ＩｎｃＲＮＡの約２０％）を含み、おそらくは近傍遺伝子の転写を調節する。一実施形態では、本明細書に提供されるポリリボヌクレオチドは、ＩｎｃＲＮＡのセンス鎖を含む。一実施形態では、本明細書に提供されるポリリボヌクレオチドは、ＩｎｃＲＮＡのアンチセンス鎖を含む。
【0343】
タンパク質結合配列
いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、タンパク質、例えば、リボソームがＲＮＡ配列内の内部部位に結合することを可能にする、１つ又は複数のタンパク質結合部位を含む。タンパク質結合部位、例えば、リボソーム結合部位を環状ポリリボヌクレオチド中に設計することにより、環状ポリリボヌクレオチドは、環状ポリリボヌクレオチドを宿主の免疫系の成分からマスクすることによって、宿主の免疫系による検知を逃避し得るか又は低下させているか、分解を調節しているか、又は翻訳を調節している。
いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、タンパク質、例えば、リボソームがＲＮＡ配列内の内部部位に結合することを可能にする、１つ又は複数のタンパク質結合部位を含む。タンパク質結合部位、例えば、リボソーム結合部位を環状ポリリボヌクレオチド中に設計することにより、環状ポリリボヌクレオチドは、環状ポリリボヌクレオチドを宿主の免疫系の成分からマスクすることによって、宿主の免疫系による検知を逃避し得るか又は低下させているか、分解を調節しているか、又は翻訳を調節している。
【0344】
いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、少なくとも１つの免疫タンパク質結合部位を含むことで、例えば、免疫応答、例えば、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答を逃避する。いくつかの実施形態では、免疫タンパク質結合部位は、免疫タンパク質に結合し、外因性としての環状ポリリボヌクレオチドのマスキングを補助するヌクレオチド配列である。いくつかの実施形態では、免疫タンパク質結合部位は、免疫タンパク質に結合し、外因性又は外来性としての環状ポリリボヌクレオチドの隠蔽を補助するヌクレオチド配列である。
【0345】
線状ＲＮＡへのリボソーム会合の伝統的機構は、ＲＮＡのキャップされた５’末端へのリボソーム結合を含む。リボソームは、５’末端から開始コドンに移動するとすぐに、第１のペプチド結合が形成される。本開示によると、環状ポリリボヌクレオチドの翻訳の内部開始（即ち、キャップ非依存性）は、遊離末端又はキャップ末端を必要としない。むしろ、リボソームは、非キャップ内部部位に結合し、それにより、リボソームは、ポリペプチド伸長を開始コドンで開始させる。いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、リボソーム結合部位、例えば、開始コドンを含む、１つ又は複数のＲＮＡ配列を含む。
【0346】
天然５’ＵＴＲは、翻訳開始における役割を果たす特徴を有する。それは、リボソームが多数の遺伝子の翻訳を開始させるプロセスに関与することが一般に知られるコザック配列のようなシグネチャーを内包する。コザック配列は、コンセンサスＣＣＲ（Ａ／Ｇ）ＣＣＡＵＧＧ（ここでＲは、開始コドン（ＡＵＧ）の３塩基上流のプリン（アデニン又はグアニン）である）を有し、それにもう一つの「Ｇ」が後続する。５’ＵＴＲは、伸長因子結合に関与する二次構造を形成することも知られている。
【0347】
いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、タンパク質に結合するタンパク質結合配列をコードする。いくつかの実施形態では、タンパク質結合配列は、環状ポリリボヌクレオチドを特異的標的に標的化し、又は局在化する。いくつかの実施形態では、タンパク質結合配列は、タンパク質のアルギニンリッチ領域に特異的に結合する。
【0348】
いくつかの実施形態では、タンパク質結合部位として、限定はされないが、ＡＣＩＮ１、ＡＧＯ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｆ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ、ＡＴＸＮ２、ＡＵＨ、ＢＣＣＩＰ、ＣＡＰＲＩＮ１、ＣＥＬＦ２、ＣＰＳＦ１、ＣＰＳＦ２、ＣＰＳＦ６、ＣＰＳＦ７、ＣＳＴＦ２、ＣＳＴＦ２Ｔ、ＣＴＣＦ、ＤＤＸ２１、ＤＤＸ３、ＤＤＸ３Ｘ、ＤＤＸ４２、ＤＧＣＲ８、ＥＩＦ３Ａ、ＥＩＦ４Ａ３、ＥＩＦ４Ｇ２、ＥＬＡＶＬ１、ＥＬＡＶＬ３、ＦＡＭ１２０Ａ、ＦＢＬ、ＦＩＰ１Ｌ１、ＦＫＢＰ４、ＦＭＲ１、ＦＵＳ、ＦＸＲ１、ＦＸＲ２、ＧＮＬ３、ＧＴＦ２Ｆ１、ＨＮＲＮＰＡ１、ＨＮＲＮＰＡ２Ｂ１、ＨＮＲＮＰＣ、ＨＮＲＮＰＫ、ＨＮＲＮＰＬ、ＨＮＲＮＰＭ、ＨＮＲＮＰＵ、ＨＮＲＮＰＵＬ１、ＩＧＦ２ＢＰ１、ＩＧＦ２ＢＰ２、ＩＧＦ２ＢＰ３、ＩＬＦ３、ＫＨＤＲＢＳ１、ＬＡＲＰ７、ＬＩＮ２８Ａ、ＬＩＮ２８Ｂ、ｍ６Ａ、ＭＢＮＬ２、ＭＥＴＴＬ３、ＭＯＶ１０、ＭＳＩ１、ＭＳＩ２、ＮＯＮＯ、ＮＯＮＯ－、ＮＯＰ５８、ＮＰＭ１、ＮＵＤＴ２１、ＰＣＢＰ２、ＰＯＬＲ２Ａ、ＰＲＰＦ８、ＰＴＢＰ１、ＲＢＦＯＸ２、ＲＢＭ１０、ＲＢＭ２２、ＲＢＭ２７、ＲＢＭ４７、ＲＮＰＳ１、ＳＡＦＢ２、ＳＢＤＳ、ＳＦ３Ａ３、ＳＦ３Ｂ４、ＳＩＲＴ７、ＳＬＢＰ、ＳＬＴＭ、ＳＭＮＤＣ１、ＳＮＤ１、ＳＲＲＭ４、ＳＲＳＦ１、ＳＲＳＦ３、ＳＲＳＦ７、ＳＲＳＦ９、ＴＡＦ１５、ＴＡＲＤＢＰ、ＴＩＡ１、ＴＮＲＣ６Ａ、ＴＯＰ３Ｂ、ＴＲＡ２Ａ、ＴＲＡ２Ｂ、Ｕ２ＡＦ１、Ｕ２ＡＦ２、ＵＮＫ、ＵＰＦ１、ＷＤＲ３３、ＸＲＮ２、ＹＢＸ１、ＹＴＨＤＣ１、ＹＴＨＤＦ１、ＹＴＨＤＦ２、ＹＷＨＡＧ、ＺＣ３Ｈ７Ｂ、ＰＤＫ１、ＡＫＴ１、又は、ＲＮＡに結合する任意の他のタンパク質などのタンパク質への結合部位が挙げられる。
【0349】
使用方法
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のとおりに作製されたポリリボヌクレオチド（例えば、環状ポリリボヌクレオチド）は、治療又は農業におけるエフェクターとして使用される。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のとおりに作製されたポリリボヌクレオチド（例えば、環状ポリリボヌクレオチド）は、治療又は農業におけるエフェクターとして使用される。
【0350】
例えば、本明細書に記載の方法によって精製されたポリリボヌクレオチドは、（例えば、医薬、動物、又は農業組成物で）対象に投与してもよい。いくつかの実施形態では、対象は、脊椎動物（例えば、哺乳動物、鳥類、魚類、爬虫類、又は両生類）である。いくつかの実施形態では、対象はヒトである。いくつかの実施形態では、対象は非ヒト哺乳動物である。実施形態では、対象は、非ヒト霊長類（例えば、サル、類人猿）、有蹄動物（例えば、ウシ、水牛、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ラクダ、ラマ、アルパカ、シカ、ウマ、ロバ）、肉食動物（例えば、イヌ、ネコ）、齧歯類（例えば、ラット、マウス）、又はウサギ類（例えば、ウサギ）などの非ヒト哺乳動物である。実施形態では、対象は、キジ目（Ｇａｌｌｉｆｏｒｍｅｓ）（例えば、ニワトリ、シチメンチョウ、キジ、ウズラ）、ガンカモ目（Ａｎｓｅｒｉｆｏｒｍｅｓ）（例えば、アヒル、ガチョウ）、古顎類（Ｐａｌｅａｏｇｎａｔｈａｅ）（例えば、ダチョウ、エミュー）、ハト目（Ｃｏｌｕｍｂｉｆｏｒｍｅｓ）（例えば、ハト（ｐｉｇｅｏｎｓ）、ハト（ｄｏｖｅｓ））、又はオウム目（Ｐｓｉｔｔａｃｉｆｏｒｍｅｓ）（例えば、オウム）といった鳥類分類群のメンバーなどの鳥類である。実施形態では、対象は、節足動物（例えば、昆虫、クモ類、甲殻類）、線虫、環形動物、蠕虫、又は軟体類などの無脊椎動物である。実施形態では、対象は、無脊椎動物の農業害虫又は無脊椎動物若しくは脊椎動物宿主に対する寄生虫である無脊椎動物である。実施形態では、対象は、被子植物（双子葉又は単子葉であり得る）又は裸子植物（例えば、針葉樹、ソテツ、マオウ門（Ｇｎｅｔｏｐｈｙｔｅ）、イチョウ）、シダ、ツクシ、ヒカゲノカズラ、又はコケ植物などの植物である。実施形態では、対象は、真核藻類（単細胞又は多細胞）である。実施形態では、対象は、作条作物、果実生成植物及び樹木、野菜、樹木、及び観賞植物、例えば、観賞花、低木、樹木、グランドカバー、及び芝生などの農業又は園芸上重要な植物である。
【0351】
いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に記載の組成物又は調製物を対象に提供することによる、対象を変更する方法を提供する。いくつかの実施形態では、組成物又は調製物は、核酸分子（例えば、本明細書に記載のＤＮＡ分子又はＲＮＡ分子）であるか又はそれを含み、ポリヌクレオチドは、真核生物対象に提供される。いくつかの実施形態では、組成物又は調製物は、本明細書に記載の核酸を含む真核又は原核細胞であるか又はそれを含む。
【0352】
いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に記載の組成物又は調製物を対象に提供することによる、それを必要とする対象における症状を処置する方法を提供する。いくつかの実施形態では、組成物又は調製物は、核酸分子（例えば、本明細書に記載のＤＮＡ分子又はポリリボヌクレオチド）であるか又はそれを含み、ポリヌクレオチドは、真核生物対象に提供される。いくつかの実施形態では、組成物又は調製物は、本明細書に記載の核酸を含む真核又は原核細胞であるか又はそれを含む。
【0353】
いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に記載のポリヌクレオチドを含む真核生物又は原核細胞を対象に提供することによる、ポリリボヌクレオチド（例えば、環状ポリリボヌクレオチド）を対象に提供する方法を提供する。
【0354】
調製物
本開示のいくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリリボヌクレオチド（例えば、環状ポリリボヌクレオチド）又は本方法により調製されるその調整物は、組成物、例えば、細胞、植物、無脊椎動物、非ヒト脊椎動物、又はヒト対象への送達のための組成物、例えば、農業、動物、又は医薬組成物で製剤化することができる。いくつかの実施形態では、ポリリボヌクレオチドは、医薬組成物で製剤化される。いくつかの実施形態では、組成物は、ポリリボヌクレオチド及び希釈剤、担体、アジュバント、又はそれらの組み合わせを含む。特定の実施形態では、組成物は、本明細書に記載のポリリボヌクレオチド及び担体又は担体を全く含まない希釈剤を含む。いくつかの実施形態では、ポリリボヌクレオチドと担体を全く含まない希釈剤とを含む組成物は、ポリリボヌクレオチド（例えば、環状ポリリボヌクレオチド）の対象へのネイキッド送達に使用される。
本開示のいくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリリボヌクレオチド（例えば、環状ポリリボヌクレオチド）又は本方法により調製されるその調整物は、組成物、例えば、細胞、植物、無脊椎動物、非ヒト脊椎動物、又はヒト対象への送達のための組成物、例えば、農業、動物、又は医薬組成物で製剤化することができる。いくつかの実施形態では、ポリリボヌクレオチドは、医薬組成物で製剤化される。いくつかの実施形態では、組成物は、ポリリボヌクレオチド及び希釈剤、担体、アジュバント、又はそれらの組み合わせを含む。特定の実施形態では、組成物は、本明細書に記載のポリリボヌクレオチド及び担体又は担体を全く含まない希釈剤を含む。いくつかの実施形態では、ポリリボヌクレオチドと担体を全く含まない希釈剤とを含む組成物は、ポリリボヌクレオチド（例えば、環状ポリリボヌクレオチド）の対象へのネイキッド送達に使用される。
【0355】
医薬組成物は、任意選択的に、１つ以上の追加的な活性物質、例えば、治療及び／又は予防活性物質を含んでもよい。医薬組成物は、任意選択的に、本明細書に記載の組成物（例えば、環状ポリリボヌクレオチド、例えば、米国食品医薬品局（Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）（ＦＤＡ）によって承認され、不活性成分データベース内に列記されている不活性成分のいずれか１つを含む組成物）の媒体又は培地として役立つ不活性物質を含んでもよい。本発明の医薬組成物は、無菌及び／又はパイロジェンフリーであってもよい。医薬品の製剤化及び／又は製造における一般的考察は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ ２１ｓｔ ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ & Ｗｉｌｋｉｎｓ，２００５（参照により本明細書中に援用される）において見出すことができる。不活性物質の非限定例として、溶媒、水性溶媒、非水性溶媒、分散媒、希釈剤、分散体、懸濁補助剤、表面活性剤、等張剤、増粘剤、乳化剤、保存剤、ポリマー、ペプチド、タンパク質、細胞、ヒアルロニダーゼ、分散剤、造粒剤、崩壊剤、結合剤、緩衝剤（例えば、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ））、平滑剤、油、及びこれらの混合物が挙げられる。
【0356】
本明細書に提供される医薬組成物の説明は、主にヒトへの投与に適する医薬組成物を対象とするが、このような組成物が任意の他の動物、例えば非ヒト動物、例えば非ヒト哺乳類への投与に一般的に適することは当業者によって理解されるであろう。ヒトへの投与に適する医薬組成物の、組成物を様々な動物への投与にとって好適なものにする修飾は、十分に理解されており、通常の技能を有する獣医薬理学者は、単に通常の（可能であれば）実験を行うことで、そのような修飾を設計及び／又は実施することができる。医薬組成物の投与が企図される対象として、限定はされないが、ヒト及び／若しくは他の霊長類；ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ネコ、イヌ、マウス、及び／若しくはラットなどの商業的に重要な哺乳類を含む哺乳類；並びに／又は家禽、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、及び／若しくはシチメンチョウなどの商業的に重要な鳥類を含む鳥類が挙げられる。
【0357】
本明細書に記載の医薬組成物の調製物は、薬理学の分野における公知の又は以降に開発されている任意の方法によって調製することができる。一般に、そのような予備的方法は、活性成分を賦形剤及び／又は１つ以上の他の付属成分と会合状態にし、そして次に、必要である場合及び／又は望ましい場合、製品を分割、形成及び／又はパッケージングするステップを含む。
【0358】
いくつかの実施形態では、調製物中に存在する線状ポリリボヌクレオチド分子の量についての参照基準は、線状ポリリボヌクレオチド分子の１ｎｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、１５ｎｇ／ｍＬ、２０ｎｇ／ｍＬ、２５ｎｇ／ｍＬ、３０ｎｇ／ｍＬ、３５ｎｇ／ｍＬ、４０ｎｇ／ｍＬ、５０ｎｇ／ｍＬ、６０ｎｇ／ｍＬ、７０ｎｇ／ｍＬ、８０ｎｇ／ｍＬ、９０ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ、２００ｎｇ／ｍＬ、３００ｎｇ／ｍＬ、４００ｎｇ／ｍＬ、５００ｎｇ／ｍＬ、６００ｎｇ／ｍＬ、１μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬ、２００ｇ／ｍＬ、３００μｇ／ｍＬ、４００μｇ／ｍＬ、５００μｇ／ｍＬ、６００μｇ／ｍＬ、７００μｇ／ｍＬ、８００μｇ／ｍＬ、９００μｇ／ｍＬ、１ｍｇ／ｍＬ、１．５ｍｇ／ｍｌ、又は２ｍｇ／ｍｌ以下の存在である。
【0359】
いくつかの実施形態では、調製物中に存在する環状ポリリボヌクレオチド分子の量についての参照基準は、医薬調製物中の全リボヌクレオチド分子の少なくとも３０％（ｗ／ｗ）、４０％（ｗ／ｗ）、５０％（ｗ／ｗ）、６０％（ｗ／ｗ）、７０％（ｗ／ｗ）、８０％（ｗ／ｗ）、８５％（ｗ／ｗ）、９０％（ｗ／ｗ）、９１％（ｗ／ｗ）、９２％（ｗ／ｗ）、９３％（ｗ／ｗ）、９４％（ｗ／ｗ）、９５％（ｗ／ｗ）、９６％（ｗ／ｗ）、９７％（ｗ／ｗ）、９８％（ｗ／ｗ）、９９％（ｗ／ｗ）、９９．１％（ｗ／ｗ）、９９．２％（ｗ／ｗ）、９９．３％（ｗ／ｗ）、９９．４％（ｗ／ｗ）、９９．５％（ｗ／ｗ）、９９．６％（ｗ／ｗ）、９９．７％（ｗ／ｗ）、９９．８％（ｗ／ｗ）、９９．９％（ｗ／ｗ）、又は１００％（ｗ／ｗ）の分子である。
【0360】
いくつかの実施形態では、調製物中に存在する線状ポリリボヌクレオチド分子の量についての参照基準は、医薬調製物中の全リボヌクレオチド分子の０．５％（ｗ／ｗ）、１％（ｗ／ｗ）、２％（ｗ／ｗ）、５％（ｗ／ｗ）、１０％（ｗ／ｗ）、１５％（ｗ／ｗ）、２０％（ｗ／ｗ）、２５％（ｗ／ｗ）、３０％（ｗ／ｗ）、４０％（ｗ／ｗ）、５０％（ｗ／ｗ）以下の線状ポリリボヌクレオチド分子である。
【0361】
いくつかの実施形態では、調製物中に存在するニックポリリボヌクレオチド分子の量についての参照基準は、医薬調製物中の全リボヌクレオチド分子の０．５％（ｗ／ｗ）、１％（ｗ／ｗ）、２％（ｗ／ｗ）、５％（ｗ／ｗ）、１０％（ｗ／ｗ）、又は１５％（ｗ／ｗ）以下のニックポリリボヌクレオチド分子である。
【0362】
いくつかの実施形態では、調製物中に存在するニック及び線状ポリリボヌクレオチド分子の組み合わせの量についての参照基準は、医薬調製物中の全リボヌクレオチド分子の０．５％（ｗ／ｗ）、１％（ｗ／ｗ）、２％（ｗ／ｗ）、５％（ｗ／ｗ）、１０％（ｗ／ｗ）、１５％（ｗ／ｗ）、２０％（ｗ／ｗ）、２５％（ｗ／ｗ）、３０％（ｗ／ｗ）、４０％（ｗ／ｗ）、５０％（ｗ／ｗ）以下のニック及び線状ポリリボヌクレオチド分子の組み合わせである。いくつかの実施形態では、医薬調製物は、最終の環状ポリリボヌクレオチド製剤の中間医薬調製物である。いくつかの実施形態では、医薬調製物は、原体又は活性医薬成分（ＡＰＩ）である。いくつかの実施形態では、医薬調製物は、対象への投与のための製剤である。
【0363】
いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドの調製物は、（線状ＲＮＡの減少の前、間又は後に）さらに処理され、ＤＮＡ、タンパク質汚染物質（例えば、宿主細胞タンパク質などの細胞タンパク質又はプロセス不純物タンパク質）、内毒素、モノヌクレオチド分子、及び／又はプロセス関連不純物が実質的に除去される。
【0364】
塩
いくつかの場合、本明細書に提供される組成物又は医薬組成物は、１つ又は複数の塩を含む。浸透圧を制御するため、ナトリウム塩などの生理学的塩が、本明細書に提供される組成物に含まれ得る。他の塩は、塩化カリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸二ナトリウム、及び／又は塩化マグネシウムなどを含み得る。いくつかの場合、組成物は、１つ又は複数の薬学的に許容できる塩と共に製剤化される。１つ又は複数の薬学的に許容できる塩は、例えば、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウムイオンなどの無機イオンのものを含み得る。そのような塩は、塩酸、臭化水素酸、リン酸、硝酸、硫酸、メタンスルホン酸、ｐ－トルエンスルホン酸、酢酸、フマル酸、コハク酸、乳酸、マンデル酸、リンゴ酸、クエン酸、酒石酸、又はマレイン酸などの無機酸又は有機酸の塩を含み得る。ポリリボヌクレオチドは、線状又は環状のいずれかの形態で存在し得る。
いくつかの場合、本明細書に提供される組成物又は医薬組成物は、１つ又は複数の塩を含む。浸透圧を制御するため、ナトリウム塩などの生理学的塩が、本明細書に提供される組成物に含まれ得る。他の塩は、塩化カリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸二ナトリウム、及び／又は塩化マグネシウムなどを含み得る。いくつかの場合、組成物は、１つ又は複数の薬学的に許容できる塩と共に製剤化される。１つ又は複数の薬学的に許容できる塩は、例えば、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウムイオンなどの無機イオンのものを含み得る。そのような塩は、塩酸、臭化水素酸、リン酸、硝酸、硫酸、メタンスルホン酸、ｐ－トルエンスルホン酸、酢酸、フマル酸、コハク酸、乳酸、マンデル酸、リンゴ酸、クエン酸、酒石酸、又はマレイン酸などの無機酸又は有機酸の塩を含み得る。ポリリボヌクレオチドは、線状又は環状のいずれかの形態で存在し得る。
【0365】
緩衝剤／ｐＨ
本明細書に提供される組成物又は医薬組成物は、トリス緩衝剤；ホウ酸緩衝剤；コハク酸緩衝剤；ヒスチジン緩衝剤（例えば、水酸化アルミニウムアジュバントを有する）；又はクエン酸緩衝剤などの１つ又は複数の緩衝剤を含み得る。緩衝剤は、いくつかの場合、５～２０ｍＭの範囲内に含まれる。
本明細書に提供される組成物又は医薬組成物は、トリス緩衝剤；ホウ酸緩衝剤；コハク酸緩衝剤；ヒスチジン緩衝剤（例えば、水酸化アルミニウムアジュバントを有する）；又はクエン酸緩衝剤などの１つ又は複数の緩衝剤を含み得る。緩衝剤は、いくつかの場合、５～２０ｍＭの範囲内に含まれる。
【0366】
本明細書に提供される組成物又は医薬組成物は、約５．０～約８．５の間、約６．０～約８．０の間、約６．５～約７．５の間、又は約７．０～約７．８の間のｐＨを有し得る。組成物又は医薬組成物は、約７のｐＨを有し得る。ポリリボヌクレオチドは、線状又は環状のいずれかの形態で存在し得る。
【0367】
希釈剤
いくつかの実施形態では、本開示の組成物は、ポリリボヌクレオチド、又は本明細書に記載の方法によって調製されたその調製物、及び希釈剤を含む。
いくつかの実施形態では、本開示の組成物は、ポリリボヌクレオチド、又は本明細書に記載の方法によって調製されたその調製物、及び希釈剤を含む。
【0368】
希釈剤は、非担体賦形剤であり得る。非担体賦形剤は、本明細書に記載される環状ポリリボヌクレオチドなどの、組成物のためのビヒクル又は媒体として働く。非担体賦形剤は、本明細書に記載される線状ポリリボヌクレオチドなどの、組成物のためのビヒクル又は媒体として働く。非担体賦形剤の非限定的な例としては、溶媒、水性溶媒、非水性溶媒、分散媒、希釈剤、分散体、懸濁助剤、表面活性剤、等張剤、増粘剤、乳化剤、保存料、ポリマー、ペプチド、タンパク質、細胞、ヒアルロニダーゼ、分散剤、造粒剤、崩壊剤、結合剤、緩衝剤（例えば、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ））、滑沢剤、油、又はそれらの混合物が挙げられる。非担体賦形剤は、米国食品医薬品局（Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）（ＦＤＡ）によって承認され、細胞透過効果を示さないＩｎａｃｔｉｖｅ Ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔ Ｄａｔａｂａｓｅに列挙された非有効成分のいずれかであり得る。非担体賦形剤は、例えば、獣医学的使用に好適な非ヒト動物への投与に好適な任意の不活性成分であり得る。組成物を様々な動物への投与に好適にするための、ヒトへの投与に好適な組成物の変更は、十分に理解されており、通常の技能を有する獣医薬理学者は、あったとしても通常の実験のみでこのような変更を設計及び／又は行うことができる。
【0369】
ある実施形態では、ポリリボヌクレオチド（例えば、環状ポリリボヌクレオチド）は、希釈剤を含むものなどのネイキッド送達製剤として送達され得る。ネイキッド送達製剤は、担体を用いずに、修飾又はポリリボヌクレオチドの部分的若しくは完全な封入、キャップされたポリリボヌクレオチド、又はその複合体なしで、ポリリボヌクレオチドを細胞に送達する。
【0370】
ネイキッド送達製剤は、担体を含まない製剤であり、ポリリボヌクレオチド（例えば、環状ポリリボヌクレオチド）は、細胞への送達を助ける部分に結合する共有結合修飾を有さず、又はポリリボヌクレオチドの部分的若しくは完全な封入なしである。ある実施形態では、細胞への送達を助ける部分に結合する共有結合修飾を有さないポリリボヌクレオチドは、タンパク質、小分子、粒子、ポリマー、又はバイオポリマーに共有結合されないポリリボヌクレオチドである。細胞への送達を助ける部分に結合する共有結合修飾を有さないポリリボヌクレオチドは、修飾リン酸基を含まない。例えば、細胞への送達を助ける部分に結合する共共有結合修飾を有さないポリリボヌクレオチドは、ホスホロチオエート、ホスホロセレネート、ボラノホスフェート、ボラノリン酸エステル、水素ホスホネート、ホスホロアミダート、ホスホロジアミダート、アルキル又はアリールホスホネート、又はホスホトリエステルを含まない。
【0371】
ある実施形態では、ネイキッド送達製剤は、トランスフェクション試薬、カチオン性担体、炭水化物担体、ナノ粒子担体、又はタンパク質担体のうちのいずれか又は全てを含まない。ある実施形態では、ネイキッド送達製剤は、フィトグリコーゲンオクテニルスクシネート、フィトグリコーゲンβ－デキストリン、無水物修飾フィトグリコーゲンβ－デキストリン、リポフェクタミン、ポリエチレンイミン、ポリ（トリメチレンイミン）、ポリ（テトラメチレンイミン）、ポリプロピレンイミン、アミノグリコシド－ポリアミン、ジデオキシ－ジアミノ－β－シクロデキストリン、スペルミン、スペルミジン、ポリ（２－ジメチルアミノ）エチルメタクリレート、ポリ（リジン）、ポリ（ヒスチジン）、ポリ（アルギニン）、カチオン化ゼラチン、デンドリマー、キトサン、１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウム－プロパン（ＤＯＴＡＰ）、Ｎ－［１－（２，３－ジオレオイルオキシ）プロピル］－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）、１－［２－（オレオイルオキシ）エチル］－２－オレイル－３－（２－ヒドロキシエチル）イミダゾリニウムクロリド（ＤＯＴＩＭ）、２，３－ジオレイルオキシ－Ｎ－［２（スペルミンカルボキサミド）エチル］－Ｎ，Ｎ－ジメチル－１－プロパンアミニウムトリフルオロアセテート（ＤＯＳＰＡ）、３Ｂ－［Ｎ－（Ｎ，Ｎ’－ジメチルアミノエタン）－カルバモイル］コレステロール塩酸塩（ＤＣ－コレステロールＨＣｌ）、ジヘプタデシルアミドグリシルスペルミジン（ＤＯＧＳ）、Ｎ，Ｎ－ジステアリル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）、Ｎ－（１，２－ジミリスチルオキシプロパ－３－イル）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－Ｎ－ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＭＲＩＥ）、Ｎ，Ｎ－ジオレイル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、低比重リポタンパク質（ＬＤＬ）、高比重リポタンパク質（ＨＤＬ）、又はグロブリンを含まない。
【0372】
ある実施形態では、ネイキッド送達製剤は、非担体賦形剤を含む。ある実施形態では、非担体賦形剤は、細胞透過効果を示さない不活性成分を含む。ある実施形態では、非担体賦形剤は、緩衝液、例えばＰＢＳを含む。ある実施形態では、非担体賦形剤は、溶媒、非水性溶媒、希釈剤、懸濁助剤、表面活性剤、等張剤、増粘剤、乳化剤、保存料、ポリマー、ペプチド、タンパク質、細胞、ヒアルロニダーゼ、分散剤、造粒剤、崩壊剤、結合剤、緩衝剤、滑沢剤、又は油である。
【0373】
ある実施形態では、ネイキッド送達製剤は、希釈剤を含む。希釈剤は、液体希釈剤又は固体希釈剤であり得る。ある実施形態では、希釈剤は、ＲＮＡ可溶化剤、緩衝液、又は等張剤である。ＲＮＡ可溶化剤の例としては、水、エタノール、メタノール、アセトン、ホルムアミド、又は２－プロパノールが挙げられる。緩衝液の例としては、２－（Ｎ－モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、ビス－トリス、２－［（２－アミノ－２－オキソエチル）－（カルボキシメチル）アミノ］酢酸（ＡＤＡ）、Ｎ－（２－アセトアミド）－２－アミノエタンスルホン酸（ＡＣＥＳ）、ピペラジン－Ｎ，Ｎ’－ビス（２－エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）、２－［［１，３－ジヒドロキシ－２－（ヒドロキシメチル）プロパン－２－イル］アミノ］エタンスルホン酸（ＴＥＳ）、３－（Ｎ－モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、トリス、トリシン、Ｇｌｙ－Ｇｌｙ、ビシン、又はホスフェートが挙げられる。等張剤の例としては、グリセリン、マンニトール、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、トレハロース、又はスクロースが挙げられる。
【0374】
脂質ナノ粒子
本開示によって提供される組成物、方法、及び送達システムは、特定の実施形態において、本明細書に記載の脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を含む任意の好適な担体又は送達モダリティを用い得る。脂質ナノ粒子は、ある実施形態では、１つ以上のイオン性脂質、例えば、非カチオン性脂質（例えば、中性又はアニオン性、又は両性脂質）；１つ以上のコンジュゲート脂質（ＰＥＧコンジュゲート脂質又は全体が参照により本明細書に援用される国際公開第２０１９２１７９４１号パンフレットの表５に記載されるポリマーにコンジュゲートされた脂質など）；１つ以上のステロール（例えば、コレステロール）を含む。
本開示によって提供される組成物、方法、及び送達システムは、特定の実施形態において、本明細書に記載の脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を含む任意の好適な担体又は送達モダリティを用い得る。脂質ナノ粒子は、ある実施形態では、１つ以上のイオン性脂質、例えば、非カチオン性脂質（例えば、中性又はアニオン性、又は両性脂質）；１つ以上のコンジュゲート脂質（ＰＥＧコンジュゲート脂質又は全体が参照により本明細書に援用される国際公開第２０１９２１７９４１号パンフレットの表５に記載されるポリマーにコンジュゲートされた脂質など）；１つ以上のステロール（例えば、コレステロール）を含む。
【0375】
ナノ粒子形成において使用され得る脂質（例えば、脂質ナノ粒子）は、例えば、参照により援用される国際公開第２０１９２１７９４１号パンフレットの表４に記載されるものを含み－例えば、脂質含有ナノ粒子は、国際公開第２０１９２１７９４１号パンフレットの表４中の脂質の１つ以上を含み得る。脂質ナノ粒子は、さらなる要素、例えば、ポリマー、例えば、参照により援用される国際公開第２０１９２１７９４１号パンフレットの表５に記載されるポリマーを含み得る。
【0376】
ある実施形態では、コンジュゲート脂質は、存在する場合、ＰＥＧ－ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）（ｌ－（モノメトキシ－ポリエチレングリコール）－２，３－ジミリストイルグリセロール（ＰＥＧ－ＤＭＧ）など）、ＰＥＧ－ジアルキルオキシプロピル（ＤＡＡ）、ＰＥＧ－リン脂質、ＰＥＧ－セラミド（Ｃｅｒ）、ペグ化ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ－ＰＥ）、ＰＥＧスクシネートジアシルグリセロール（ＰＥＧＳ－ＤＡＧ）（４－０－（２’，３’－ジ（テトラデカノイルオキシ）プロピル－ｌ－０－（ｗ－メトキシ（ポリエトキシ）エチル）ブタンジオエート（ＰＥＧ－Ｓ－ＤＭＧ）など）、ＰＥＧジアルコキシプロピルカルバム、Ｎ－（カルボニル－メトキシポリエチレングリコール２０００）－１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミンナトリウム塩、及び国際公開第２０１９０５１２８９号パンフレット（参照により援用される）の表２に記載されるもの、又は上記のものの組合せのうちの１つ以上を含み得る。追加の例示的なＰＥＧ－脂質コンジュゲートは、例えば、米国特許第５，８８５，６１３号明細書、同第６，２８７，５９１号明細書、米国特許出願公開第２００３／００７７８２９号明細書、同第２００５／０１７５６８２号明細書、同第２００８／００２００５８号明細書、同第２０１１／０１１７１２５号明細書、同第２０１０／０１３０５８８号明細書、同第２０１６／０３７６２２４号明細書、同第２０１７／０１１９９０４号明細書、同第２０１８／００２８６６４号明細書、及び国際公開第２０１７／０９９８２３号パンフレットに記載されており、これらの全ての内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【0377】
ある実施形態では、脂質ナノ粒子に組み込まれ得るステロールとしては、参照により援用される国際公開第２００９／１２７０６０号パンフレット又は米国特許出願公開第２０１０／０１３０５８８号明細書に記載されるものなどの、コレステロール又はコレステロール誘導体の１つ以上が挙げられる。さらなる例示的なステロールとしては、参照により本明細書に援用される、Ｅｙｇｅｒｉｓ ｅｔ ａｌ．（２０２０）、ｄｘ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０２１／ａｃｓ．ｎａｎｏｌｅｔｔ．０ｃ０１３８６に記載されるものを含む植物ステロールが挙げられる。
【0378】
ある実施形態では、脂質粒子は、イオン化可能な脂質、非カチオン性脂質、粒子の凝集を阻害するコンジュゲート脂質、及びステロールを含む。
【0379】
脂質ナノ粒子製剤に使用され得る例示的なイオン化可能な脂質としては、限定はされないが、参照により本明細書に援用される国際公開第２０１９０５１２８９号パンフレットの表１に列挙されるものが挙げられる。さらなる例示的な脂質としては、限定はされないが、以下の式の１つ以上：米国特許出願公開第２０１６／０３１１７５９号明細書のＸ；米国特許出願公開第２０１５０３７６１１５号明細書又は米国特許出願公開第２０１６／０３７６２２４号明細書のＩ；米国特許出願公開第２０１６０１５１２８４号明細書のＩ、ＩＩ又はＩＩＩ；米国特許出願公開第２０１７０２１０９６７号明細書のＩ、ＩＡ、ＩＩ、又はＩＩＡ；米国特許出願公開第２０１５０１４００７０号明細書のＩ－ｃ；米国特許出願公開第２０１３／０１７８５４１号明細書のＡ；米国特許出願公開第２０１３／０３０３５８７号明細書又は米国特許出願公開第２０１３／０１２３３３８号明細書のＩ；米国特許出願公開第２０１５／０１４１６７８号明細書のＩ；米国特許出願公開第２０１５／０２３９９２６号明細書のＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、又はＶ；米国特許出願公開第２０１７／０１１９９０４号明細書のＩ；国際公開第２０１７／１１７５２８号パンフレットのＩ又はＩＩ；米国特許出願公開第２０１２／０１４９８９４号明細書のＡ；米国特許出願公開第２０１５／００５７３７３号明細書のＡ；国際公開第２０１３／１１６１２６号パンフレットのＡ；米国特許出願公開第２０１３／００９０３７２号明細書のＡ；米国特許出願公開第２０１３／０２７４５２３号明細書のＡ；米国特許出願公開第２０１３／０２７４５０４号明細書のＡ；米国特許出願公開第２０１３／００５３５７２号明細書のＡ；国際公開第２０１３／０１６０５８号パンフレットのＡ；国際公開第２０１２／１６２２１０号パンフレットのＡ；米国特許出願公開第２００８／０４２９７３号明細書のＩ；米国特許出願公開第２０１２／０１２８７６７０号明細書のＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、又はＩＶ；米国特許出願公開第２０１４／０２００２５７号明細書のＩ又はＩＩ；米国特許出願公開第２０１５／０２０３４４６号明細書のＩ、ＩＩ、又はＩＩＩ；米国特許出願公開第２０１５／０００５３６３号明細書のＩ又はＩＩＩ；米国特許出願公開第２０１４／０３０８３０４号明細書のＩ、ＩＡ、ＩＢ、ＩＣ、ＩＤ、ＩＩ、ＩＩＡ、ＩＩＢ、ＩＩＣ、ＩＩＤ、又はＩＩＩ～ＸＸＩＶ；米国特許出願公開第２０１３／０３３８２１０号明細書の；国際公開第２００９／１３２１３１号パンフレットのＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、又はＩＶ；米国特許出願公開第２０１２／０１０１１４７８号明細書のＡ；米国特許出願公開第２０１２／００２７７９６号明細書のＩ又はＸＸＸＶ；米国特許出願公開第２０１２／００５８１４４号明細書のＸＩＶ又はＸＶＩＩ；米国特許出願公開第２０１３／０３２３２６９号明細書の；米国特許出願公開第２０１１／０１１７１２５号明細書のＩ；米国特許出願公開第２０１１／０２５６１７５号明細書のＩ、ＩＩ、又はＩＩＩ；米国特許出願公開第２０１２／０２０２８７１号明細書のＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、Ｘ、ＸＩ、ＸＩＩ；米国特許出願公開第２０１１／００７６３３５号明細書のＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、Ｘ、ＸＩＩ、ＸＩＩＩ、ＸＩＶ、ＸＶ、又はＸＶＩ；米国特許出願公開第２００６／００８３７８号明細書のＩ又はＩＩ；米国特許出願公開第２０１３／０１２３３３８号明細書のＩ；米国特許出願公開第２０１５／００６４２４２号明細書のＩ又はＸ－Ａ－Ｙ－Ｚ；米国特許出願公開第２０１３／００２２６４９号明細書のＸＶＩ、ＸＶＩＩ、又はＸＶＩＩＩ；米国特許出願公開第２０１３／０１１６３０７号明細書のＩ、ＩＩ、又はＩＩＩ；米国特許出願公開第２０１３／０１１６３０７号明細書のＩ、ＩＩ、又はＩＩＩ；米国特許出願公開第２０１０／００６２９６７号明細書のＩ又はＩＩ；米国特許出願公開第２０１３／０１８９３５１号明細書のＩ～Ｘ；米国特許出願公開第２０１４／００３９０３２号明細書のＩ；米国特許出願公開第２０１８／００２８６６４号明細書のＶ；米国特許出願公開第２０１６／０３１７４５８号明細書のＩ；米国特許出願公開第２０１３／０１９５９２０号明細書のＩ；米国特許出願公開第１０，２２１，１２７号明細書の５、６、又は１０；国際公開第２０１８／０８１４８０号パンフレットのＩＩＩ－３；国際公開第２０２０／０８１９３８号パンフレットのＩ－５又はＩ－８；米国特許出願公開第９，８６７，８８８号明細書の１８又は２５；米国特許出願公開第２０１９／０１３６２３１号明細書のＡ；国際公開第２０２０／２１９８７６号パンフレットのＩＩ；米国特許出願公開第２０１２／００２７８０３号明細書の１；米国特許出願公開第２０１９／０２４０３４９号明細書のＯＦ－０２；米国特許出願公開第１０，０８６，０１３号明細書の２３；Ｍｉａｏ ｅｔ ａｌ（２０２０）のｃＫＫ－Ｅ１２／Ａ６；国際公開第２０１０／０５３５７２号パンフレットのＣ１２－２００；Ｄａｈｌｍａｎ ｅｔ ａｌ（２０１７）の７Ｃ１；Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ ｅｔ ａｌの３０４－Ｏ１３又は５０３－Ｏ１３；米国特許第９，７０８，６２８号明細書のＴＳ－Ｐ４Ｃ２；国際公開第２０２０／１０６９４６号パンフレットのＩ；国際公開第２０２０／１０６９４６号パンフレットのＩ；及び国際公開第２０２１／１１３７７７号パンフレットの（１）、（２）、（３）又は（４）が挙げられる。例示的脂質としては、国際公開第２０２１／１１３７７７号パンフレットの表１～表１６のいずれか１つの脂質がさらに挙げられる。
【0380】
例示的な非カチオン性脂質としては、限定はされないが、ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－ホスホエタノールアミン、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジオレイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ジオレオイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、ジオレオイル－ホスファチジルエタノールアミン４－（Ｎ－マレイミドメチル）－シクロヘキサン－１－カルボキシレート（ＤＯＰＥ－ｍａｌ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジミリストイルホスホエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジステアロイル－ホスファチジル－エタノールアミン（ＤＳＰＥ）、モノメチル－ホスファチジルエタノールアミン（１６－Ｏ－モノメチルＰＥなど）、ジメチル－ホスファチジルエタノールアミン（１６－Ｏ－ジメチルＰＥなど）、ｌ８－ｌ－ｔｒａｎｓ ＰＥ、ｌ－ステアロイル－２－オレオイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＳＯＰＥ）、水素化大豆ホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ）、卵ホスファチジルコリン（ＥＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルセリン（ＤＯＰＳ）、スフィンゴミエリン（ＳＭ）、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、ジミリストイルホスファチジルグリセロール（ＤＭＰＧ）、ジステアロイルホスファチジルグリセロール（ＤＳＰＧ）、ジエルコイルホスファチジルコリン（ＤＥＰＣ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルグリセロール（ＰＯＰＧ）、ジエライドイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＥＰＥ）、レシチン、ホスファチジルエタノールアミン、リゾレシチン、リゾホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、スフィンゴミエリン、卵スフィンゴミエリン（ＥＳＭ）、セファリン、カルジオリピン、ホスファチジン酸、セレブロシド、ジセチルホスフェート、リゾホスファチジルコリン、ジリノレオイルホスファチジルコリン、又はそれらの混合物が挙げられる。他のジアシルホスファチジルコリン及びジアシルホスファチジルエタノールアミンリン脂質も使用され得ることが理解される。これらの脂質中のアシル基は、好ましくは、Ｃ１０～Ｃ２４炭素鎖を有する脂肪酸に由来するアシル基、例えば、ラウロイル、ミリストイル、パルミトイル、ステアロイル、又はオレオイルである。さらなる例示的な脂質としては、特定の実施形態において、限定はされないが、参照により本明細書に援用される、Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．（２０２０）ｄｘ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０２１／ａｃｓ．ｎａｎｏｌｅｔｔ．０ｃ０１３８６に記載されるものが挙げられる。このような脂質としては、ある実施形態では、ｍＲＮＡ（例えば、ＤＧＴＳ）との肝臓トランスフェクションを改善することが分かっている植物脂質が挙げられる。
【0381】
脂質ナノ粒子に使用するのに好適な非カチオン性脂質の他の例としては、限定はされないが、非リン脂質、例えば、ステアリルアミン、ドデシルアミン、ヘキサデシルアミン、パルミチン酸アセチル、リシノール酸グリセロール、ステアリン酸ヘキサデシル、ミリスチン酸イソプロピル、両性アクリルポリマー、ラウリル硫酸トリエタノールアミン、アルキル－アリールサルフェートポリエチルオキシ化脂肪酸アミド、ジオクタデシルジメチルアンモニウムブロミド、セラミド、スフィンゴミエリンなどが挙げられる。他の非カチオン性脂質が、国際公開第２０１７／０９９８２３号パンフレット又は米国特許出願公開第２０１８／００２８６６４号明細書（全内容が参照により本明細書に援用される）に記載される。
【0382】
番号付けした実施形態
［１］ 環状ポリリボヌクレオチド（ｃｉｒｃＲＮＡ）の濃縮集団を生産するための方法であって、上記方法が、以下：（ａ）ｃｉｒｃＲＮＡ及び線状ポリリボヌクレオチド（ｌｉｎＲＮＡ）を含むポリリボヌクレオチドの集団を含むサンプルを用意するステップと；（ｂ）ゲル電気泳動の使用を含まない変性条件下で、ｌｉｎＲＮＡからｃｉｒｃＲＮＡを分離し、それによってｃｉｒｃＲＮＡの濃縮集団を生産するステップと、を含む方法。
［２］ ｃｉｒｃＲＮＡの濃縮集団を生産するための方法であって、上記方法が、以下：（ａ）ｃｉｒｃＲＮＡ及びｌｉｎＲＮＡを含むポリリボヌクレオチドの集団を含むサンプルを用意するステップと；（ｂ）ポリリボヌクレオチドの集団を変性条件に曝露し、それによって、ｃｉｒｃＲＮＡの集団を濃縮するステップと、を含む方法。
［３］ （ｉ）ポリリボヌクレオチドの集団中のポリリボヌクレオチドの総重量が、少なくとも１μｇであり；（ｉｉ）ポリリボヌクレオチドの集団を含むサンプルの総量が、少なくとも５００μＬであるか；又は（ｉｉｉ）サンプル中のポリリボヌクレオチドの集団の濃度が、少なくとも２００ｎｇ／μＬである、実施形態［１］又は［２］に記載の方法。
［４］ ｃｉｒｃＲＮＡの濃縮集団を生産するための方法であって、上記方法が、以下：（ａ）ｃｉｒｃＲＮＡ及びｌｉｎＲＮＡを含むポリリボヌクレオチドの集団を含むサンプルを用意するステップであって、（ｉ）ポリリボヌクレオチドの集団中のポリリボヌクレオチドの総重量が、少なくとも１μｇであり；（ｉｉ）ポリリボヌクレオチドの集団を含むサンプルの総量が、少なくとも５００μＬであり；又は（ｉｉｉ）サンプル中のポリリボヌクレオチドの集団の濃度が、少なくとも２００ｎｇ／μＬである、ステップと；（ｂ）変性条件下でｌｉｎＲＮＡからｃｉｒｃＲＮＡを分離し、それによって、ｃｉｒｃＲＮＡの濃縮集団を生産するステップを含む方法。
［５］ ポリリボヌクレオチドの集団中のポリリボヌクレオチドの総重量が、１μｇ～１０００ｍｇである、実施形態［１］～［４］のいずれか１つに記載の方法。
［６］ リリボヌクレオチドの集団中のポリリボヌクレオチドの総量が、５００μＬ～１０００ｍＬである、実施形態［１］～［５］のいずれか１つに記載の方法。
［７］ ポリリボヌクレオチドの集団中のポリリボヌクレオチドの濃度が、２００ｎｇ／μＬ～５０ｍｇ／ｍＬである、実施形態［１］～［６］のいずれか１つに記載の方法。
［８］ 分離ステップ（ｂ）が、ゲル電気泳動の使用を含まない変性条件下で実施される、実施形態［４］～［７］のいずれか１つに記載の方法。
［９］ ｃｉｒｃＲＮＡの濃縮集団が、１種若しくは複数種の不純物又は副産物を実質的に含まない、実施形態［１］～［８］のいずれか１つに記載の方法。
［１０］ １種若しくは複数種の不純物又は副産物が、ポリアクリルアミド、ホウ酸、マグネシウム、又はエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を含む、実施形態［９］に記載の方法。
［１１］ 変性条件が、少なくとも５０℃の温度を含む、実施形態［１］～［１０］のいずれか１つに記載の方法。
［１２］ 変性条件が、５０℃～８５℃の温度を含む、実施形態［１１］に記載の方法。
［１３］ 変性条件が、少なくとも５０℃の温度、続いて３０秒以下の時間内に８℃以下の温度を含む、実施形態［１］～［１２］のいずれか１つに記載の方法。
［１４］ 変性条件が、５未満のｐＨ又は９を超えるｐＨを含む、実施形態［１］～［１３］のいずれか１つに記載の方法。
［１５］ 変性条件が、５未満のｐＨを含む、実施形態［１４］に記載の方法。
［１６］ 変性条件が、９を超える、実施形態［１４］に記載の方法。
［１７］ 変性条件が、化学処理を含む、実施形態［１］～［１６］のいずれか１つに記載の方法。
［１８］ 化学処理が、酸、塩基、有機溶媒、カオトロピック剤、クラウディング剤、キレート剤、デタージェント、又は塩溶液による処理を含む、実施形態［１７］に記載の方法。
［１９］ 上記酸が、１ｍＭ～５００ｍＭの酢酸、塩酸、サリチル酸、リン酸、ホウ酸、ギ酸、シュウ酸、クエン酸、安息香酸、モノクロロ酢酸、ジクロロ酢酸、トリクロロ酢酸、アスコルビン酸、又は硝酸を含む、実施形態［１８］に記載の方法。
［２０］ 上記塩基が、１ｍＭ～５００ｍＭの水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、イミダゾール、ヒスチジン、炭酸水素ナトリウム、グアニジン、又はトリエチルアミンを含む、実施形態［１８］又は［１９］に記載の方法。
［２１］ 上記有機溶媒が、少なくとも０．１％（ｖ／ｖ）のジメチルスルホキシド、酢酸トリエチルアンモニウム、メタノール、エタノール、２－プロパノール、イソプロパノール、１－ブタノール、２－ブタノール、ｔ－ブタノール、イソブタノール、フェノール、クロロホルム、ヘキサン、アセトニトリル、ホルムアミド、アセトン、デナトニウム、又はプロピレングリコールを含む、実施形態［１８］～［２０］のいずれか１つに記載の方法。
［２２］ 上記カオトロピック剤が、１００ｍＭ～８Ｍの尿素、塩化グアニジニウム、過塩素酸リチウム、又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む、実施形態［１８］～［２１］のいずれか１つに記載の方法。
［２３］ 上記カオトロピック剤が、１００ｍＭ～８Ｍのｎ－ドデシルβ－ｄ－マルトシド、ｎ－オクチルグルコシド、ＣＨＡＰＳ、又はデオキシコール酸塩を含む、実施形態［１８］～［２２］のいずれか１つに記載の方法。
［２４］ 上記クラウディング剤が、１００ｍＭ～８ＭのＰＥＧ、又は尿素を含む、実施形態［１８］～［２３］のいずれか１つに記載の方法。
［２５］ 上記キレート剤が、１ｍＭ～１０ｍＭのエチレングリコール－ビス（β－アミノエチルエーテル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラ酢酸（ＥＧＴＡ）若しくはその誘導体、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）若しくはその誘導体、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、イミノジコハク酸（ＩＤＳ）、ポリアスパラギン酸、Ｓ，Ｓ－エチレンジアミン－Ｎ，Ｎ’－ジコハク酸（ＥＤＤＳ）、又はメチルグリシン二酢酸（ＭＧＤＡ）を含む、実施形態［１８］～［２４］のいずれか１つに記載の方法。
［２６］ 上記デタージェントが、０．００５％～０．０５％（ｖ／ｖ）のノニデット（登録商標）（Ｎｏｎｉｄｅｔ）Ｐ－４０（ＮＰ４０）、ＣＨＡＰＳ、オクチルβ－Ｄ－グルコピラノシド、ｎ－ドデシルβ－ｄ－マルトシド、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）－２０、又はＴｗｅｅｎ（登録商標）－８０を含む、実施形態［１８］～［２５］のいずれか１つに記載の方法。
［２７］ ｃｉｒｃＲＮＡの濃縮集団を生産するための方法であって、上記方法が、以下：（ａ）ｃｉｒｃＲＮＡ及びｌｉｎＲＮＡを含むポリリボヌクレオチドの集団を含むサンプルを用意するステップと；（ｂ）少なくとも５０℃の温度でｌｉｎＲＮＡからｃｉｒｃＲＮＡを分離し、それによって、ｃｉｒｃＲＮＡの濃縮集団を生産するステップと、を含み、分離ステップは、ゲル電気泳動の使用を含まない方法。
［２８］ ｃｉｒｃＲＮＡの濃縮集団を生産するための方法であって、上記方法が、以下：（ａ）ｃｉｒｃＲＮＡ及びｌｉｎＲＮＡを含むポリリボヌクレオチドの集団を含むサンプルを用意するステップであって、（ｉ）ポリリボヌクレオチドの集団中のポリリボヌクレオチドの総重量が、少なくとも１μｇであり；（ｉｉ）ポリリボヌクレオチドの集団を含むサンプルの総量が、少なくとも５００μＬであるか；又は（ｉｉｉ）サンプル中のポリリボヌクレオチドの集団の濃度が、少なくとも２００ｎｇ／μＬであるステップと；（ｂ）少なくとも５０℃の温度で、ｌｉｎＲＮＡからｃｉｒｃＲＮＡを分離し、それによって、ｃｉｒｃＲＮＡの濃縮集団を生産するステップと、を含む方法。
［２９］ ｃｉｒｃＲＮＡの濃縮集団を生産するための方法であって、上記方法が、以下：（ａ）ｃｉｒｃＲＮＡ及びｌｉｎＲＮＡを含むポリリボヌクレオチドの集団を含むサンプルを用意するステップと；（ｂ）ポリリボヌクレオチドの集団を少なくとも５０℃の温度に曝露し、それによって、ｃｉｒｃＲＮＡの集団を濃縮するステップと、を含む方法。
［３０］ 温度が、５０℃～８５℃である、［２７］～［２９］のいずれか１つに記載の方法。
［３１］ ｃｉｒｃＲＮＡの濃縮集団を生産するための方法であって、上記方法が、以下：（ａ）ｃｉｒｃＲＮＡ及びｌｉｎＲＮＡを含むポリリボヌクレオチドの集団を含むサンプルを用意するステップと；（ｂ）５未満又は９超のｐＨで、ｌｉｎＲＮＡからｃｉｒｃＲＮＡを分離し、それによって、ｃｉｒｃＲＮＡの濃縮集団を生産するステップと、を含み、上記分離は、ゲル電気泳動の使用を含まない、方法。
［３２］ ｃｉｒｃＲＮＡの濃縮集団を生産するための方法であって、上記方法が、以下：（ａ）ｃｉｒｃＲＮＡ及びｌｉｎＲＮＡを含むポリリボヌクレオチドの集団を含むサンプルを用意するステップであって、（ｉ）ポリリボヌクレオチドの集団中のポリリボヌクレオチドの総重量が、少なくとも１μｇであり；（ｉｉ）ポリリボヌクレオチドの集団を含むサンプルの総量が、少なくとも５００μＬであるか；又は（ｉｉｉ）サンプル中のポリリボヌクレオチドの集団の濃度が、少なくとも２００ｎｇ／μＬである、ステップと；（ｂ）５未満又は９超のｐＨで、ｌｉｎＲＮＡからｃｉｒｃＲＮＡを分離し、それによって、ｃｉｒｃＲＮＡの濃縮集団を生産するステップを含む方法。
［３３］ ｃｉｒｃＲＮＡの濃縮集団を生産するための方法であって、上記方法が、以下：（ａ）ｃｉｒｃＲＮＡ及びｌｉｎＲＮＡを含むポリリボヌクレオチドの集団を含むサンプルを用意するステップと；（ｂ）ポリリボヌクレオチドの集団を５未満又は９超のｐＨに曝露し、それによって、ｃｉｒｃＲＮＡの集団を濃縮するステップと、を含む方法。
［３４］ ｐＨが、５未満である、実施形態［３１］～［３３］のいずれか１つに記載の方法。
［３５］ ｐＨが、９を超える、実施形態［３１］～［３３］のいずれか１つに記載の方法。
［３６］ ｃｉｒｃＲＮＡの濃縮集団を生産するための方法であって、上記方法が、以下：（ａ）ｃｉｒｃＲＮＡ及びｌｉｎＲＮＡを含むポリリボヌクレオチドの集団を含むサンプルを用意するステップと；（ｂ）酸、塩基、有機溶媒、カオトロピック剤、クラウディング剤、キレート剤、デタージェント、又は塩溶液を含む条件下で、ｃｉｒｃＲＮＡをｌｉｎＲＮＡから分離し、それによって、ｃｉｒｃＲＮＡの濃縮集団を生産するステップと、を含み、上記分離は、ゲル電気泳動の使用を含まない、方法。
［３７］ ｃｉｒｃＲＮＡの濃縮集団を生産するための方法であって、上記方法が、以下：（ａ）ｃｉｒｃＲＮＡ及びｌｉｎＲＮＡを含むポリリボヌクレオチドの集団を含むサンプルを用意するステップであって、（ｉ）ポリリボヌクレオチドの集団中のポリリボヌクレオチドの総重量が、少なくとも１μｇであり；（ｉｉ）ポリリボヌクレオチドの集団を含むサンプルの総量が、少なくとも５００μＬであるか；又は（ｉｉｉ）サンプル中のポリリボヌクレオチドの集団の濃度が、少なくとも２００ｎｇ／μＬである、ステップと；（ｂ）酸、塩基、有機溶媒、カオトロピック剤、クラウディング剤、キレート剤、デタージェント、又は塩溶液を含む条件下で、ｌｉｎＲＮＡからｃｉｒｃＲＮＡを分離し、それによって、ｃｉｒｃＲＮＡの濃縮集団を生産するステップと、を含む方法。
［３８］ ｃｉｒｃＲＮＡの濃縮集団を生産するための方法であって、上記方法が、以下：（ａ）ｃｉｒｃＲＮＡ及びｌｉｎＲＮＡを含むポリリボヌクレオチドの集団を含むサンプルを用意するステップと；（ｂ）ポリリボヌクレオチドの集団を、酸、塩基、有機溶媒、カオトロピック剤、クラウディング剤、キレート剤、デタージェント、又は塩溶液に曝露し、それによって、ｃｉｒｃＲＮＡの集団を濃縮するステップと、を含む方法。
［３９］ 上記酸が、少なくとも０．５％（ｖ／ｖ）の酢酸、塩酸、サリチル酸、リン酸、ホウ酸、ギ酸、シュウ酸、クエン酸、安息香酸、モノクロロ酢酸、ジクロロ酢酸、トリクロロ酢酸、アスコルビン酸、又は硝酸を含む、実施形態［３６］～［３８］のいずれか１つに記載の方法。
［４０］ 上記塩基が、１ｍＭ～５００ｍＭの水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、イミダゾール、ヒスチジン、炭酸水素ナトリウム、グアニジン、又はトリエチルアミンを含む、実施形態［３６］～［３８］のいずれか１つに記載の方法。
［４１］ 上記有機溶媒が、少なくとも０．１％（ｖ／ｖ）のジメチルスルホキシド、酢酸トリエチルアンモニウム、メタノール、エタノール、２－プロパノール、イソプロパノール、１－ブタノール、２－ブタノール、ｔ－ブタノール、イソブタノール、フェノール、クロロホルム、ヘキサン、アセトニトリル、ホルムアミド、アセトン、デナトニウム、又はプロピレングリコールを含む、実施形態［３６］～［３８］のいずれか１つに記載の方法。
［４２］ 上記カオトロピック剤が、１００ｍＭ～８Ｍの尿素、塩化グアニジニウム、過塩素酸リチウム、又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む、実施形態［３６］～［３８］のいずれか１つに記載の方法。
［４３］ 上記カオトロピック剤が、１００ｍＭ～８Ｍのｎ－ドデシルβ－ｄ－マルトシド、ｎ－オクチルグルコシド、ＣＨＡＰＳ、又はデオキシコール酸塩を含む、［３６］～［３８］のいずれか１つに記載の方法。
［４４］ 上記クラウディング剤が、１００ｍＭ～８Ｍのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、又は尿素を含む、［３６］～［３８］のいずれか１つに記載の方法。
［４５］ 上記キレート剤が、１ｍＭ～１０ｍＭのＥＧＴＡ若しくはその誘導体、ＥＤＴＡ若しくはその誘導体、ＮＴＡ、ＩＤＳ、ＥＤＤＳ、又はＭＧＤＡを含む、実施形態［３６］～［３８］のいずれか１つに記載の方法。
［４６］ 上記デタージェントが、０．００５％～０．０５％（ｖ／ｖ）のＮＰ４０、ＣＨＡＰＳ、オクチルβ－Ｄ－グルコピラノシド、ｎ－ドデシルβ－ｄ－マルトシド、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）－２０、又はＴｗｅｅｎ（登録商標）－８０を含む、実施形態［３６］～［３８］のいずれか１つに記載の方法。
［４７］ ステップ（ｂ）が、ポリリボヌクレオチドの集団に対してカラムクロマトグラフィーを実施する工程を含み、カラムクロマトグラフィーを実施する工程は、平衡化ステップ、サンプルロードステップ、カラム洗浄ステップ、及び溶離ステップを含む、実施形態［１］～［４６］のいずれか１つに記載の方法。
［４８］ 上記分離ステップが、サンプルロードステップ中に実施される、実施形態［４７］に記載の方法。
［４９］ 上記分離ステップが、カラム洗浄ステップ中に実施される、実施形態［４６］又は［４７］に記載の方法。
［５０］ 上記分離ステップが、溶離ステップ中に実施される、実施形態［４７］～［４９］のいずれか１つに記載の方法。
［５１］ カラムクロマトグラフィーが、高速タンパク質液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）、高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）、陰イオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＣ）、混合モードクロマトグラフィー、又はアフィニティークロマトグラフィーを含む、実施形態［４７］～［５０］のいずれか１つに記載の方法。
［５２］ 上記ＡＥＣが、以下：スチレン－ジビニルベンゼン、シリカ、セファロース、セルロース、デキストラン、エポキシポリアミン、メタクリレート、アガロース、及びアクリルからなる群から選択される陰イオン交換樹脂の使用を含む、実施形態［５１］に記載の方法。
［５３］ 上記陰イオン交換樹脂が、第４級アンモニウム、アミノエチル、ジエチルアミノエチル、又はジエチルアミノプロピルからなる群から選択されるイオン交換体を含む、実施形態［５２］に記載の方法。
［５４］ 上記陰イオン交換樹脂が、ビーズを含み、上記ビーズは、４５～１６５μｍのビーズ径及び直径１００～１０００ｎｍの孔径を有する、実施形態［５２］又は［５３に記載の方法。
［５５］ 上記ＡＥＣが、線形グラジエント溶離又はステップイソクラティック溶離の使用を含む、実施形態［５１］～［５４］のいずれか１つに記載の方法。
［５６］ 上記ＡＥＣが、流量１ｍＬ／分～１５０ｍＬ／分の使用を含む、実施形態［５１］～［５５］のいずれか１つに記載の方法。
［５７］ 上記ＦＰＬＣが、逆相－ＦＰＬＣ（ＲＰ－ＦＰＬＣ）である、実施形態［５１］に記載の方法。
［５８］ ステップ（ｂ）が、精製ｃｉｒｃＲＮＡの複数の画分をプールすることによって実施される、実施形態［１］～［５７］のいずれか１つに記載の方法。
［５９］ ｃｉｒｃＲＮＡ及びｌｉｎＲＮＡが、同じリボヌクレオチド配列を有する、実施形態［１］～［５８］のいずれか１つに記載の方法。
［６０］ ｃｉｒｃＲＮＡ及びｌｉｎＲＮＡが、同じ質量を有する、実施形態［１］～［５９］のいずれか１つに記載の方法。
［６１］ ｃｉｒｃＲＮＡ及びｌｉｎＲＮＡが、ポリ（Ａ）テールを欠いている、実施形態［１］～［６０］のいずれか１つに記載の方法。
［６２］ 上記方法が、ｌｉｎＲＮＡのエキソヌクレアーゼ消化を含む、実施形態［１］～［６１］のいずれか１つに記載の方法。
［６３］ 上記方法が、ｌｉｎＲＮＡのエキソヌクレアーゼ消化を含まない、実施形態［１］～［６１］のいずれか１つに記載の方法。
［６４］ 上記方法が、ｃｉｒｃＲＮＡの濃縮を改善する、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｌｉｎＲＮＡに対する選択的修飾を含まない、実施形態［１］～［６３］のいずれか１つに記載の方法。
［６５］ ｃｉｒｃＲＮＡの濃縮集団中のｃｉｒｃＲＮＡのパーセント（ｗ／ｗ）が、ポリリボヌクレオチド集団中のｃｉｒｃＲＮＡのパーセント（ｗ／ｗ）の２倍である、実施形態［１］－［６４］のいずれか１つに記載の方法。
［６６］ ｃｉｒｃＲＮＡの濃縮集団中のｃｉｒｃＲＮＡのパーセント（ｗ／ｗ）が、少なくとも６５％である、実施形態［１］～［６５］のいずれか１つに記載の方法。
［６７］ ｃｉｒｃＲＮＡの濃縮集団中のｌｉｎＲＮＡのパーセント（ｗ／ｗ）が、３５％未満である、実施形態［１］～［６６］のいずれか１つに記載の方法。
［６８］ ｃｉｒｃＲＮＡが、約１，０００ヌクレオチド以下の長さを含む、実施形態［１］～［６７］のいずれか１つに記載の方法。
［６９］ ｃｉｒｃＲＮＡ及びｌｉｎＲＮＡを含むポリリボヌクレオチドの集団を含む組成物であって、上記ポリリボヌクレオチドの集団が、変性条件下の溶液中であり；（ｉ）ポリリボヌクレオチドの集団中のポリリボヌクレオチドの総重量は、少なくとも１μｇであり；（ｉｉ）ポリリボヌクレオチドの集団を含むサンプルの総量は、少なくとも５００μＬであるか；又は（ｉｉｉ）サンプル中のポリリボヌクレオチドの集団の濃度は、少なくとも５００ｎｇ／μＬである、組成物。
［７０］ ｃｉｒｃＲＮＡ及びｌｉｎＲＮＡを含むポリリボヌクレオチドの集団を含む組成物であって、上記ポリリボヌクレオチドの集団が、変性条件下の溶液中であり、上記溶液は、１種若しくは複数種の不純物又は副産物を実質的に含まない、組成物。
［７１］ ｃｉｒｃＲＮＡ及びｌｉｎＲＮＡを含むポリリボヌクレオチドの集団を含む組成物であって、
（ａ）組成物が、核酸の集団を含むサンプルから取得され；
（ｂ）組成物が、１つ若しくは複数の変性条件に曝露されており；
（ｃ）組成物が、１種若しくは複数種の不純物又は副産物を実質的に含まない、組成物。
［７２］ ｃｉｒｃＲＮＡ及びｌｉｎＲＮＡを含むポリリボヌクレオチドの集団を含む組成物であって、
（ａ）組成物が、ｃｉｒｃＲＮＡ及びｌｉｎＲＮＡを含むポリリボヌクレオチドの集団を含むサンプルから取得され；
（ｂ）組成物が、１つ若しくは複数の変性条件に曝露されており；
（ｃ）組成物が、１種若しくは複数種の不純物又は副産物を実質的に含まない、組成物。
［７３］ １種若しくは複数種の不純物又は副産物が、ポリアクリルアミド、ホウ酸、マグネシウム、又はＥＤＴＡを含む、実施形態［６９］～［７２］のいずれか１つに記載の組成物。
［７４］ 変性条件が、少なくとも５０℃の温度を含む、実施形態［６９］～［７３］のいずれか１つに記載の組成物。
［７５］ 変性条件が、５０℃～８５℃の温度を含む、実施形態［６９］～［７４］のいずれか１つに記載の組成物。
［７６］ 変性条件が、少なくとも５０℃の温度、続いて８℃以下の温度を含む、実施形態［６９］～［７５］のいずれか１つに記載の組成物。
［７７］ 変性条件が、５未満のｐＨ又は９を超えるｐＨを含む、実施形態［６９］～［７３］のいずれか１つに記載の組成物。
［７８］ 変性条件が化学処理を含む、実施形態［６９］～［７３］のいずれか１つに記載の組成物。
［７９］ 上記化学処理が、酸、塩基、有機溶媒、カオトロピック剤、クラウディング剤、キレート剤、デタージェント、又は塩溶液による処理を含む、実施形態［７８］に記載の組成物。
［８０］ 上記酸が、１ｍＭ～５００ｍＭの酢酸、塩酸、サリチル酸、リン酸、ホウ酸、ギ酸、シュウ酸、クエン酸、安息香酸、モノクロロ酢酸、ジクロロ酢酸、トリクロロ酢酸、アスコルビン酸、又は硝酸を含む、実施形態［７９］に記載の組成物。
［８１］ 上記塩基が、１ｍＭ～５００ｍＭの水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、イミダゾール、ヒスチジン、炭酸水素ナトリウム、グアニジン、又はトリエチルアミンを含む、実施形態［７９］又は［８０］に記載の組成物。
［８２］ 上記有機溶媒が、少なくとも０．１％（ｖ／ｖ）のジメチルスルホキシド、酢酸トリエチルアンモニウム、メタノール、エタノール、２－プロパノール、イソプロパノール、１－ブタノール、２－ブタノール、ｔ－ブタノール、イソブタノール、フェノール、クロロホルム、ヘキサン、アセトニトリル、ホルムアミド、アセトン、デナトニウム、又はプロピレングリコールを含む、実施形態［７９］～［８１］のいずれか１つに記載の組成物。
［８３］ 上記カオトロピック剤が、１００ｍＭ～８Ｍの尿素、塩化グアニジニウム、過塩素酸リチウム、又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む、実施形態［７９］～［８２］のいずれか１つに記載の組成物。
［８４］ 上記カオトロピック剤が、１００ｍＭ～８Ｍのｎ－ドデシルβ－ｄ－マルトシド、ｎ－オクチルグルコシド、ＣＨＡＰＳ、又はデオキシコール酸塩を含む、実施形態［７９］～［８２］のいずれか１つに記載の組成物。
［８５］ 上記クラウディング剤が、１００ｍＭ～８Ｍのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、又は尿素を含む、実施形態［７９］～［８４］のいずれか１つに記載の組成物。
［８６］ 上記キレート剤が、１ｍＭ～１０ｍＭのＥＧＴＡ若しくはその誘導体、ＥＤＴＡ若しくはその誘導体、ＮＴＡ、ＩＤＳ、ＥＤＤＳ、又はＭＧＤＡを含む、実施形態［７９］～［８５］のいずれか１つに記載の組成物。
［８７］ 上記デタージェントが、０．００５％～０．０５％（ｖ／ｖ）のＮＰ４０、ＣＨＡＰＳ、オクチルβ－Ｄ－グルコピラノシド、ｎ－ドデシルβ－ｄ－マルトシド、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）－２０、又はＴｗｅｅｎ（登録商標）－８０を含む、実施形態［７９］～［８６］のいずれか１つに記載の組成物。
［８８］ ｃｉｒｃＲＮＡの濃縮集団中のｃｉｒｃＲＮＡのパーセント（ｗ／ｗ）が、ポリリボヌクレオチド集団中のｃｉｒｃＲＮＡのパーセント（ｗ／ｗ）の２倍である、実施形態［６９］～［８７］のいずれか１つに記載の組成物。
［８９］ ｃｉｒｃＲＮＡの濃縮集団中のｃｉｒｃＲＮＡのパーセント（ｗ／ｗ）が、少なくとも６５％である、実施形態［６９］～［８８］のいずれか１つに記載の組成物。
［９０］ ｃｉｒｃＲＮＡの濃縮集団中のｌｉｎＲＮＡのパーセント（ｗ／ｗ）が、３５％未満である、実施形態［６９］～［８９］のいずれか１つに記載の組成物。
［９１］ ｃｉｒｃＲＮＡ及びｌｉｎＲＮＡが、同じリボヌクレオチド配列を有する、実施形態［６９］～［９０］のいずれか１つに記載の組成物。
［９２］ ｃｉｒｃＲＮＡ及びｌｉｎＲＮＡが、同じ質量を有する、実施形態［６９］～［９１］のいずれか１つに記載の組成物。
［９３］ ｃｉｒｃＲＮＡ及びｌｉｎＲＮＡが、ポリ（Ａ）テールを欠いている、実施形態［６９］～［９２］のいずれか１つに記載の組成物。
［９４］ ｃｉｒｃＲＮＡが、約１，０００ヌクレオチド以下の長さを含む、実施形態［６９］～［９３］のいずれか１つに記載の組成物。
［９５］ ｃｉｒｃＲＮＡの純度を決定する方法であって、上記方法が、以下：（ａ）ｃｉｒｃＲＮＡ及びｌｉｎＲＮＡを含むポリリボヌクレオチドの集団を含むサンプルを用意するステップと；（ｂ）クロマトグラフィーにより、変性条件下でｃｉｒｃＲＮＡをｌｉｎＲＮＡから分離するステップと；（ｃ）ｃｉｒｃＲＮＡのピーク及びｌｉｎＲＮＡのピークを含むサンプルのクロマトグラムを収集するステップと；（ｄ）各ピーク下の面積を計算して、サンプル中のｃｉｒｃＲＮＡの純度を決定するステップと、を含む方法。
［９６］ 上記変性条件が、ゲル電気泳動の使用を含まない、実施形態［９５］に記載の方法。
［９７］ 上記変性条件が、少なくとも５０℃の温度を含む、実施形態［９５］又は［９６］に記載の方法。
［９８］ 上記変性条件が、５０℃～８５℃の温度を含む、実施形態［９７］に記載の方法。
［９９］ 上記変性条件が、少なくとも５０℃の温度、続いて３０秒以下の時間内に８℃以下の温度を含む、実施形態［９５］～［９８］のいずれか１つに記載の方法。
［１００］ 上記変性条件が、５未満のｐＨ又は９を超えるｐＨを含む、実施形態［９５］～［９９］のいずれか１つに記載の方法。
［１０１］ 上記変性条件が、５未満のｐＨを含む、実施形態［１００］に記載の方法。
［１０２］ 上記変性条件が、９を超えるｐＨを含む、実施形態［１００］に記載の方法。
［１０３］ 上記変性条件が、化学処理を含む、実施形態［９５］～［１０２］のいずれか１つに記載の方法。
［１０４］ 上記化学処理が、酸、塩基、有機溶媒、カオトロピック剤、クラウディング剤、キレート剤、デタージェント、又は塩溶液による処理を含む、実施形態［１０３］に記載の方法。
［１０５］ 上記酸が、１ｍＭ～５００ｍＭの酢酸、塩酸、サリチル酸、リン酸、ホウ酸、ギ酸、シュウ酸、クエン酸、安息香酸、モノクロロ酢酸、ジクロロ酢酸、トリクロロ酢酸、アスコルビン酸、又は硝酸を含む、実施形態［１０４］に記載の方法。
［１０６］ 上記塩基が、１ｍＭ～５００ｍＭの水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、イミダゾール、ヒスチジン、炭酸水素ナトリウム、グアニジン、又はトリエチルアミンを含む、実施形態［１０４］又は［１０５］に記載の方法。
［１０７］ 上記有機溶媒が、少なくとも０．１％（ｖ／ｖ）のジメチルスルホキシド、酢酸トリエチルアンモニウム、メタノール、エタノール、２－プロパノール、イソプロパノール、１－ブタノール、２－ブタノール、ｔ－ブタノール、イソブタノール、フェノール、クロロホルム、ヘキサン、アセトニトリル、ホルムアミド、アセトン、デナトニウム、又はプロピレングリコールを含む、実施形態［１０４］～［１０６］のいずれか１つに記載の方法。
［１０８］ 上記カオトロピック剤が、１００ｍＭ～８Ｍの尿素、塩化グアニジニウム、過塩素酸リチウム、又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む、実施形態［１０４］～［１０７］のいずれか１つに記載の方法。
［１０９］ 上記カオトロピック剤が、１００ｍＭ～８Ｍのｎ－ドデシルβ－ｄ－マルトシド、ｎ－オクチルグルコシド、ＣＨＡＰＳ、又はデオキシコール酸塩を含む、実施形態［１０４］～［１０８］のいずれか１つに記載の方法。
［１１０］ 上記クラウディング剤が、１００ｍＭ～８Ｍのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、又は尿素を含む、実施形態［１０４］～［１０９］のいずれか１つに記載の方法。
［１１１］ 上記キレート剤が、１ｍＭ～１０ｍＭのＥＧＴＡ若しくはその誘導体、ＥＤＴＡ若しくはその誘導体、ＮＴＡ、ＩＤＳ、ＥＤＤＳ、又はＭＧＤＡを含む、実施形態［１０４］～［１１０］のいずれか１つに記載の方法。
［１１２］ 上記デタージェントが、０．００５％～０．０５％（ｖ／ｖ）のノニデット（登録商標）（Ｎｏｎｉｄｅｔ）Ｐ－４０（ＮＰ４０）、ＣＨＡＰＳ、オクチルβ－Ｄ－グルコピラノシド、ｎ－ドデシルβ－ｄ－マルトシド、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）－２０、又はＴｗｅｅｎ（登録商標）－８０を含む、実施形態［１０４］～［１１１］のいずれか１つに記載の方法。
［１１３］ 上記クロマトグラフィーが、液体クロマトグラフィーを含む、実施形態［９５］～［１１２］のいずれか１つに記載の方法。
［１１４］ 上記液体クロマトグラフィーが、ＦＰＬＣ、ＨＰＬＣ、ＨＩＣ、ＡＥＣ、ＭＭＣ、又はアフィニティークロマトグラフィーからなる群から選択される、実施形態［１１３］に記載の方法。
［１１５］ 純度の相対標準偏差（ＲＳＤ）が、５％未満である、実施形態［９５］～［１１４］のいずれか１つに記載の方法。
［１１６］ ｃｉｒｃＲＮＡが、約１，０００ヌクレオチド以下の長さを含む、実施形態［９５］～［１１５］のいずれか１つに記載の組成物。
［１１７］ ｃｉｒｃＲＮＡの濃縮集団を生産するための方法であって、上記方法が、以下：（ａ）ｃｉｒｃＲＮＡ及びｌｉｎＲＮＡを含むポリリボヌクレオチドの集団を含むサンプルを用意するステップと；（ｂ）ゲル電気泳動の使用を含まない変性条件下で、ｃｉｒｃＲＮＡをｌｉｎＲＮＡから分離し、それによって、ｃｉｒｃＲＮＡの濃縮集団を生産するステップと、を含む方法。
［１１８］ ｃｉｒｃＲＮＡの濃縮集団を生産するための方法であって、上記方法が、以下：（ａ）ｃｉｒｃＲＮＡ及びｌｉｎＲＮＡを含むポリリボヌクレオチドの集団を含むサンプルを用意するステップと；（ｂ）ポリリボヌクレオチドの集団を変性条件に曝露し、それによって、ｃｉｒｃＲＮＡの集団を濃縮するステップと、を含む方法。
［１１９］ （ｉ）ポリリボヌクレオチドの集団中のポリリボヌクレオチドの総重量が、少なくとも１μｇであり；（ｉｉ）ポリリボヌクレオチドの集団を含むサンプルの総量が、少なくとも５００μＬであるか；又は（ｉｉｉ）サンプル中のポリリボヌクレオチドの集団の濃度が、少なくとも２００ｎｇ／μＬである、実施形態［１１７］又は［１１８］に記載の方法。
［１２０］ 上記分離ステップ（ｂ）が、ゲル電気泳動の使用を含まない変性条件下で実施され：及び／又はｃｉｒｃＲＮＡの濃縮集団が、１種若しくは複数種の不純物又は副産物を実質的に含まず、１種若しくは複数種の不純物又は副産物が、ポリアクリルアミド、ホウ酸、マグネシウム、又はエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を含む、実施形態［１１８］又は［１１９］に記載の方法。
［１２１］ 上記変性条件が、少なくとも５０℃の温度を含むか；又は上記変性条件が、少なくとも５０℃の温度、続いて３０秒以下の時間内に８℃以下の温度を含む、実施形態［１１７］～［１２０］のいずれか１つに記載の方法。
［１２２］上記変性条件が、５未満のｐＨ又は９を超えるｐＨを含む、実施形態［１１７］～［１２１］のいずれか１つに記載の方法。
［１２３］ 上記変性条件が、酸、塩基、有機溶媒、カオトロピック剤、クラウディング剤、キレート剤、デタージェント、又は塩溶液による化学処理を含む、実施形態［１１７］～［１２２］のいずれか１つに記載の方法。
［１２４］ 上記酸が、１ｍＭ～５００ｍＭの酢酸、塩酸、サリチル酸、リン酸、ホウ酸、ギ酸、シュウ酸、クエン酸、安息香酸、モノクロロ酢酸、ジクロロ酢酸、トリクロロ酢酸、アスコルビン酸、又は硝酸を含む、実施形態［１２３］に記載の方法。
［１２５］ 上記塩基が、１ｍＭ～５００ｍＭの水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、イミダゾール、ヒスチジン、炭酸水素ナトリウム、グアニジン、又はトリエチルアミンを含む、実施形態［１２３］又は［１２４］に記載の方法。
［１２６］ 上記有機溶媒が、少なくとも０．１％（ｖ／ｖ）のジメチルスルホキシド、酢酸トリエチルアンモニウム、メタノール、エタノール、２－プロパノール、イソプロパノール、１－ブタノール、２－ブタノール、ｔ－ブタノール、イソブタノール、フェノール、クロロホルム、ヘキサン、アセトニトリル、ホルムアミド、アセトン、デナトニウム、又はプロピレングリコールを含む、実施形態［１２３］～［１２５］のいずれか１つに記載の方法。
［１２７］ 上記カオトロピック剤が、１００ｍＭ～８Ｍの尿素、塩化グアニジニウム、過塩素酸リチウム、又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含み；及び／又は、上記カオトロピック剤が、１００ｍＭ～８Ｍのｎ－ドデシルβ－ｄ－マルトシド、ｎ－オクチルグルコシド、ＣＨＡＰＳ、又はデオキシコール酸塩を含む、実施形態［１２３］～［１２６］のいずれか１つに記載の方法。
［１２８］ 上記クラウディング剤が、１００ｍＭ～８ＭのＰＥＧ、又は尿素を含む、実施形態［１２３］～［１２７］のいずれか１つに記載の方法。
［１２９］ 上記キレート剤が、１ｍＭ～１０ｍＭのエチレングリコール－ビス（β－アミノエチルエーテル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラ酢酸（ＥＧＴＡ）若しくはその誘導体、ＥＤＴＡ若しくはその誘導体、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、イミノジコハク酸（ＩＤＳ）、ポリアスパラギン酸、Ｓ，Ｓ－エチレンジアミン－Ｎ，Ｎ’－ジコハク酸（ＥＤＤＳ）、又はメチルグリシン二酢酸（ＭＧＤＡ）を含む、実施形態［１２３］～［１２８］のいずれか１つに記載の方法。
［１３０］ 上記デタージェントが、０．００５％～０．０５％（ｖ／ｖ）のノニデット（登録商標）（Ｎｏｎｉｄｅｔ）Ｐ－４０（ＮＰ４０）、ＣＨＡＰＳ、オクチルβ－Ｄ－グルコピラノシド、ｎ－ドデシルβ－ｄ－マルトシド、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）－２０、又はＴｗｅｅｎ（登録商標）－８０を含む、実施形態［１２３］～［１２９］のいずれか１つに記載の方法。
［１３１］ ステップ（ｂ）が、ポリリボヌクレオチドの集団に対してカラムクロマトグラフィーを実施する工程を含み、カラムクロマトグラフィーを実施する工程は、平衡化ステップ、サンプルロードステップ、カラム洗浄ステップ、及び溶離ステップを含み；上記分離ステップが、サンプルロードステップ、カラム洗浄ステップ、及び／又は溶離ステップ中に実施される、実施形態［１１７］～［１３０］のいずれか１つに記載の方法。
［１３２］ カラムクロマトグラフィーが、高速タンパク質液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）、高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）、陰イオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＣ）、混合モードクロマトグラフィー、又はアフィニティークロマトグラフィーを含む、実施形態［１３１］に記載の方法。
［１３３］ 上記ＡＥＣが、以下：（ｉ）陰イオン交換樹脂の使用（陰イオン交換樹脂は、スチレン－ジビニルベンゼン、シリカ、セファロース、セルロース、デキストラン、エポキシポリアミン、メタクリレート、アガロース、及びアクリルからなる群から選択され；及び／又は上記陰イオン交換樹脂は、第４級アンモニウム、アミノエチル、ジエチルアミノエチル、及びジエチルアミノプロピルからなる群から選択されるイオン交換体を含み；及び／又は上記陰イオン交換樹脂は、ビーズを含み、上記ビーズは、４５～１６５μｍのビーズ径及び直径１００～１０００ｎｍの孔径を有する）；並びに／或いは線形グラジエント溶離又はステップイソクラティック溶離の使用；並びに／或いは１ｍＬ／分～１５０ｍＬ／分の流量の使用を含む、実施形態［１３２］に記載の方法。
［１３４］ ステップ（ｂ）が、精製ｃｉｒｃＲＮＡの複数の画分をプールすることによって実施される、実施形態［１１７］～［１３３］のいずれか１つに記載の方法。
［１３５］ ｃｉｒｃＲＮＡ及びｌｉｎＲＮＡが、同じリボヌクレオチド配列を有し；及び／又はｃｉｒｃＲＮＡ及びｌｉｎＲＮＡが、同じ質量を有し；及び／又はｃｉｒｃＲＮＡ及びｌｉｎＲＮＡが、ポリ（Ａ）テールを欠いている、実施形態［１１７］～［１３４］のいずれか１つに記載の方法。
［１３６］上記方法が、ｌｉｎＲＮＡのエキソヌクレアーゼ消化を含むか、又は上記方法が、ｌｉｎＲＮＡのエキソヌクレアーゼ消化を含まず；及び／又は上記方法は、ｃｉｒｃＲＮＡの濃縮を改善する、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｌｉｎＲＮＡに対する選択的修飾を含まない、実施形態［１１７］～［１３５］のいずれか１つに記載の方法。
［１３７］ｃｉｒｃＲＮＡの濃縮集団中のｃｉｒｃＲＮＡのパーセント（ｗ／ｗ）が、ポリリボヌクレオチド集団中のｃｉｒｃＲＮＡのパーセント（ｗ／ｗ）の２倍であり；及び／又はｃｉｒｃＲＮＡの濃縮集団中のｃｉｒｃＲＮＡのパーセント（ｗ／ｗ）が、少なくとも６５％であり；及び／又はｃｉｒｃＲＮＡの濃縮集団中のｌｉｎＲＮＡのパーセント（ｗ／ｗ）が、３５％未満である、実施形態［１１７］～［１３６］のいずれか１つに記載の方法。
［１３８］ ｃｉｒｃＲＮＡが、１，０００ヌクレオチド以下の長さを有する、実施形態［１１７］～［１３７］のいずれか１つに記載の方法。
［１３９］ ｃｉｒｃＲＮＡ及びｌｉｎＲＮＡを含むポリリボヌクレオチドの集団を含む組成物であって、上記ポリリボヌクレオチドの集団は、変性条件下の溶液中であり；（ｉ）ポリリボヌクレオチドの集団中のポリリボヌクレオチドの総重量は、少なくとも１μｇあり；（ｉｉ）ポリリボヌクレオチドの集団を含むサンプルの総量は、少なくとも５００μＬであり；又は（ｉｉｉ）サンプル中のポリリボヌクレオチドの集団の濃度は、少なくとも５００ｎｇ／μＬである、組成物。
［１４０］ ｃｉｒｃＲＮＡの濃縮集団を含む組成物であって、（ａ）組成物が、ｃｉｒｃＲＮＡ及びｌｉｎＲＮＡを含むポリリボヌクレオチドの集団を含むサンプルから取得され；（ｂ）組成物が、１つ若しくは複数の変性条件に曝露されており；（ｃ）組成物が、１種若しくは複数種の不純物又は副産物を実質的に含まない、組成物。
［１４１］ １種若しくは複数種の不純物又は副産物が、ポリアクリルアミド、ホウ酸、マグネシウム、又はＥＤＴＡを含む、［１３９］又は［１４０］に記載の組成物。
［１４２］ 変性条件が、少なくとも５０℃の温度を含むか；又は変性条件が、少なくとも５０℃の温度、続いて８℃以下の温度を含む、実施形態［１３９］～［１４１］のいずれか１つに記載の組成物。
［１４３］ 上記変性条件が、５未満のｐＨ又は９を超えるｐＨを含む、実施形態［１３９］～［１４２］のいずれか１つに記載の組成物。
［１４４］ 上記変性条件が、酸、塩基、有機溶媒、カオトロピック剤、クラウディング剤、キレート剤、デタージェント、又は塩溶液による化学処理を含む、実施形態［１３９］～［１４３］のいずれか１つに記載の組成物。
［１４５］ 上記酸が、１ｍＭ～５００ｍＭの酢酸、塩酸、サリチル酸、リン酸、ホウ酸、ギ酸、シュウ酸、クエン酸、安息香酸、モノクロロ酢酸、ジクロロ酢酸、トリクロロ酢酸、アスコルビン酸、又は硝酸を含む、実施形態［１４４］に記載の組成物。
［１４６］ 上記塩基が、１ｍＭ～５００ｍＭの水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、イミダゾール、ヒスチジン、炭酸水素ナトリウム、グアニジン、又はトリエチルアミンを含む、実施形態［１４４］又は［１４５］に記載の組成物。
［１４７］ 上記有機溶媒が、少なくとも０．１％（ｖ／ｖ）のジメチルスルホキシド、酢酸トリエチルアンモニウム、メタノール、エタノール、２－プロパノール、イソプロパノール、１－ブタノール、２－ブタノール、ｔ－ブタノール、イソブタノール、フェノール、クロロホルム、ヘキサン、アセトニトリル、ホルムアミド、アセトン、デナトニウム、又はプロピレングリコールを含む、実施形態［１４４］～［１４６］のいずれか１つに記載の組成物。
［１４８］ 上記カオトロピック剤が、１００ｍＭ～８Ｍの尿素、塩化グアニジニウム、過塩素酸リチウム、又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含み；及び／又は、上記カオトロピック剤が、１００ｍＭ～８Ｍのｎ－ドデシルβ－ｄ－マルトシド、ｎ－オクチルグルコシド、ＣＨＡＰＳ、又はデオキシコール酸塩を含む、実施形態［１４４］～［１４７］のいずれか１つに記載の組成物。
［１４９］ 上記クラウディング剤が、１００ｍＭ～８Ｍのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、又は尿素を含む、実施形態［１４４］～［１４８］のいずれか１つに記載の組成物。
［１５０］ 上記キレート剤が、１ｍＭ～１０ｍＭのＥＧＴＡ若しくはその誘導体、ＥＤＴＡ若しくはその誘導体、ＮＴＡ、ＩＤＳ、ＥＤＤＳ、又はＭＧＤＡを含む、実施形態［１４４］～［１４９］のいずれか１つに記載の組成物。
［１５１］ 上記デタージェントが、０．００５％～０．０５％（ｖ／ｖ）のＮＰ４０、ＣＨＡＰＳ、オクチルβ－Ｄ－グルコピラノシド、ｎ－ドデシルβ－ｄ－マルトシド、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）－２０、又はＴｗｅｅｎ（登録商標）－８０を含む、実施形態［１４４］～［１５０］のいずれか１つに記載の組成物。
［１５２］ ｃｉｒｃＲＮＡの濃縮集団中のｃｉｒｃＲＮＡのパーセント（ｗ／ｗ）は、ポリリボヌクレオチド集団中のｃｉｒｃＲＮＡのパーセント（ｗ／ｗ）の２倍であり；及び／又はｃｉｒｃＲＮＡの濃縮集団中のｃｉｒｃＲＮＡのパーセント（ｗ／ｗ）が、少なくとも６５％であり；及び／又はｃｉｒｃＲＮＡの濃縮集団中のｌｉｎＲＮＡのパーセント（ｗ／ｗ）が、３５％未満である、実施形態［１３９］～［１５１］のいずれか１つに記載の組成物。
［１５３］ ｃｉｒｃＲＮＡ及びｌｉｎＲＮＡが、同じリボヌクレオチド配列を有する；及び／又はｃｉｒｃＲＮＡ及びｌｉｎＲＮＡが、同じ質量を有する；及び／又はｃｉｒｃＲＮＡ及びｌｉｎＲＮＡが、ポリ（Ａ）テールを欠いている、実施形態［１３９］～［１５２］のいずれか１つに記載の組成物。
［１５４］ ｃｉｒｃＲＮＡが、１，０００ヌクレオチド以下の長さを有する、実施形態［１３９］～［１５３］のいずれか１つに記載の組成物。
［１５５］ ｃｉｒｃＲＮＡの純度を決定する方法であって、上記方法が、以下：（ａ）ｃｉｒｃＲＮＡ及びｌｉｎＲＮＡを含むポリリボヌクレオチドの集団を含むサンプルを用意するステップと；（ｂ）クロマトグラフィーにより、変性条件下でｃｉｒｃＲＮＡをｌｉｎＲＮＡから分離するステップと；（ｃ）ｃｉｒｃＲＮＡのピーク及びｌｉｎＲＮＡのピークを含むサンプルのクロマトグラムを収集するステップと；（ｄ）各ピーク下の面積を計算して、サンプル中のｃｉｒｃＲＮＡの純度を決定するステップと、を含む方法。
［１５６］ 上記変性条件が、ゲル電気泳動の使用を含まない、実施形態［１５５］に記載の方法。
［１５７］ 上記変性条件が、少なくとも５０℃の温度を含むか；又は、上記変性条件は、少なくとも５０℃の温度、続いて３０秒以下の時間内に８℃以下の温度を含む、実施形態［１５５］又は［１５６］に記載の方法。
［１５８］ 上記変性条件が、５未満のｐＨ又は９を超えるｐＨを含む、実施形態［１５５］～［１５７］のいずれか１つに記載の方法。
［１５９］ 上記変性条件が、酸、塩基、有機溶媒、カオトロピック剤、クラウディング剤、キレート剤、デタージェント、又は塩溶液による処理などの化学処理を含む、実施形態［１５５］～［１５８］のいずれか１つに記載の方法。
［１６０］ 上記酸が、１ｍＭ～５００ｍＭの酢酸、塩酸、サリチル酸、リン酸、ホウ酸、ギ酸、シュウ酸、クエン酸、安息香酸、モノクロロ酢酸、ジクロロ酢酸、トリクロロ酢酸、アスコルビン酸、又は硝酸を含む、実施形態［１５９］に記載の方法。
［１６１］ 上記塩基が、１ｍＭ～５００ｍＭの水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、イミダゾール、ヒスチジン、炭酸水素ナトリウム、グアニジン、又はトリエチルアミンを含む、実施形態［１５９］又は［１６０］に記載の方法。
［１６２］ 上記有機溶媒が、少なくとも０．１％（ｖ／ｖ）のジメチルスルホキシド、酢酸トリエチルアンモニウム、メタノール、エタノール、２－プロパノール、イソプロパノール、１－ブタノール、２－ブタノール、ｔ－ブタノール、イソブタノール、フェノール、クロロホルム、ヘキサン、アセトニトリル、ホルムアミド、アセトン、デナトニウム、又はプロピレングリコールを含む、実施形態［１５９］～［１６１］のいずれか１つに記載の方法。
［１６３］ 上記カオトロピック剤が、１００ｍＭ～８Ｍの尿素、塩化グアニジニウム、過塩素酸リチウム、若しくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含み；及び／又は上記カオトロピック剤が、１００ｍＭ～８Ｍのｎ－ドデシルβ－ｄ－マルトシド、ｎ－オクチルグルコシド、ＣＨＡＰＳ、若しくはデオキシコール酸塩を含む、実施形態［１５９］～［１６２］のいずれか１つに記載の方法。
［１６４］ 上記クラウディング剤が、１００ｍＭ～８Ｍのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、又は尿素を含む、実施形態［１５９］～［１６２］のいずれか１つに記載の方法。
［１６５］ 上記キレート剤が、１ｍＭ～１０ｍＭのＥＧＴＡ若しくはその誘導体、ＥＤＴＡ若しくはその誘導体、ＮＴＡ、ＩＤＳ、ポリアスパラギン酸、ＥＤＤＳ、又はＭＧＤＡを含む、実施形態［１５９］～［１６４］のいずれか１つに記載の方法。
［１６６］ 上記デタージェントが、０．００５％～０．０５％（ｖ／ｖ）のノニデット（登録商標）（Ｎｏｎｉｄｅｔ）Ｐ－４０（ＮＰ４０）、ＣＨＡＰＳ、オクチルβ－Ｄ－グルコピラノシド、ｎ－ドデシルβ－ｄ－マルトシド、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）－２０、又はＴｗｅｅｎ（登録商標）－８０を含む、実施形態［１５９］～［１６５］のいずれか１つに記載の方法。
［１６７］ 上記クロマトグラフィーが、液体クロマトグラフィーを含み、上記液体クロマトグラフィーは、ＦＰＬＣ、ＨＰＬＣ、ＨＩＣ、ＡＥＣ、ＭＭＣ、又はアフィニティークロマトグラフィーからなる群から選択される、実施形態［１５５］～［１６６］のいずれか１つに記載の方法。
［１６８］ 純度の相対標準偏差（ＲＳＤ）が、５％未満である、実施形態［１５５］～［１６７］のいずれか１つに記載の方法。
［１６９］ ｃｉｒｃＲＮＡが、約１，０００ヌクレオチド以下の長さを含む、実施形態［１５５］～［１６８］のいずれか１つに記載の方法。
［１］ 環状ポリリボヌクレオチド（ｃｉｒｃＲＮＡ）の濃縮集団を生産するための方法であって、上記方法が、以下：（ａ）ｃｉｒｃＲＮＡ及び線状ポリリボヌクレオチド（ｌｉｎＲＮＡ）を含むポリリボヌクレオチドの集団を含むサンプルを用意するステップと；（ｂ）ゲル電気泳動の使用を含まない変性条件下で、ｌｉｎＲＮＡからｃｉｒｃＲＮＡを分離し、それによってｃｉｒｃＲＮＡの濃縮集団を生産するステップと、を含む方法。
［２］ ｃｉｒｃＲＮＡの濃縮集団を生産するための方法であって、上記方法が、以下：（ａ）ｃｉｒｃＲＮＡ及びｌｉｎＲＮＡを含むポリリボヌクレオチドの集団を含むサンプルを用意するステップと；（ｂ）ポリリボヌクレオチドの集団を変性条件に曝露し、それによって、ｃｉｒｃＲＮＡの集団を濃縮するステップと、を含む方法。
［３］ （ｉ）ポリリボヌクレオチドの集団中のポリリボヌクレオチドの総重量が、少なくとも１μｇであり；（ｉｉ）ポリリボヌクレオチドの集団を含むサンプルの総量が、少なくとも５００μＬであるか；又は（ｉｉｉ）サンプル中のポリリボヌクレオチドの集団の濃度が、少なくとも２００ｎｇ／μＬである、実施形態［１］又は［２］に記載の方法。
［４］ ｃｉｒｃＲＮＡの濃縮集団を生産するための方法であって、上記方法が、以下：（ａ）ｃｉｒｃＲＮＡ及びｌｉｎＲＮＡを含むポリリボヌクレオチドの集団を含むサンプルを用意するステップであって、（ｉ）ポリリボヌクレオチドの集団中のポリリボヌクレオチドの総重量が、少なくとも１μｇであり；（ｉｉ）ポリリボヌクレオチドの集団を含むサンプルの総量が、少なくとも５００μＬであり；又は（ｉｉｉ）サンプル中のポリリボヌクレオチドの集団の濃度が、少なくとも２００ｎｇ／μＬである、ステップと；（ｂ）変性条件下でｌｉｎＲＮＡからｃｉｒｃＲＮＡを分離し、それによって、ｃｉｒｃＲＮＡの濃縮集団を生産するステップを含む方法。
［５］ ポリリボヌクレオチドの集団中のポリリボヌクレオチドの総重量が、１μｇ～１０００ｍｇである、実施形態［１］～［４］のいずれか１つに記載の方法。
［６］ リリボヌクレオチドの集団中のポリリボヌクレオチドの総量が、５００μＬ～１０００ｍＬである、実施形態［１］～［５］のいずれか１つに記載の方法。
［７］ ポリリボヌクレオチドの集団中のポリリボヌクレオチドの濃度が、２００ｎｇ／μＬ～５０ｍｇ／ｍＬである、実施形態［１］～［６］のいずれか１つに記載の方法。
［８］ 分離ステップ（ｂ）が、ゲル電気泳動の使用を含まない変性条件下で実施される、実施形態［４］～［７］のいずれか１つに記載の方法。
［９］ ｃｉｒｃＲＮＡの濃縮集団が、１種若しくは複数種の不純物又は副産物を実質的に含まない、実施形態［１］～［８］のいずれか１つに記載の方法。
［１０］ １種若しくは複数種の不純物又は副産物が、ポリアクリルアミド、ホウ酸、マグネシウム、又はエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を含む、実施形態［９］に記載の方法。
［１１］ 変性条件が、少なくとも５０℃の温度を含む、実施形態［１］～［１０］のいずれか１つに記載の方法。
［１２］ 変性条件が、５０℃～８５℃の温度を含む、実施形態［１１］に記載の方法。
［１３］ 変性条件が、少なくとも５０℃の温度、続いて３０秒以下の時間内に８℃以下の温度を含む、実施形態［１］～［１２］のいずれか１つに記載の方法。
［１４］ 変性条件が、５未満のｐＨ又は９を超えるｐＨを含む、実施形態［１］～［１３］のいずれか１つに記載の方法。
［１５］ 変性条件が、５未満のｐＨを含む、実施形態［１４］に記載の方法。
［１６］ 変性条件が、９を超える、実施形態［１４］に記載の方法。
［１７］ 変性条件が、化学処理を含む、実施形態［１］～［１６］のいずれか１つに記載の方法。
［１８］ 化学処理が、酸、塩基、有機溶媒、カオトロピック剤、クラウディング剤、キレート剤、デタージェント、又は塩溶液による処理を含む、実施形態［１７］に記載の方法。
［１９］ 上記酸が、１ｍＭ～５００ｍＭの酢酸、塩酸、サリチル酸、リン酸、ホウ酸、ギ酸、シュウ酸、クエン酸、安息香酸、モノクロロ酢酸、ジクロロ酢酸、トリクロロ酢酸、アスコルビン酸、又は硝酸を含む、実施形態［１８］に記載の方法。
［２０］ 上記塩基が、１ｍＭ～５００ｍＭの水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、イミダゾール、ヒスチジン、炭酸水素ナトリウム、グアニジン、又はトリエチルアミンを含む、実施形態［１８］又は［１９］に記載の方法。
［２１］ 上記有機溶媒が、少なくとも０．１％（ｖ／ｖ）のジメチルスルホキシド、酢酸トリエチルアンモニウム、メタノール、エタノール、２－プロパノール、イソプロパノール、１－ブタノール、２－ブタノール、ｔ－ブタノール、イソブタノール、フェノール、クロロホルム、ヘキサン、アセトニトリル、ホルムアミド、アセトン、デナトニウム、又はプロピレングリコールを含む、実施形態［１８］～［２０］のいずれか１つに記載の方法。
［２２］ 上記カオトロピック剤が、１００ｍＭ～８Ｍの尿素、塩化グアニジニウム、過塩素酸リチウム、又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む、実施形態［１８］～［２１］のいずれか１つに記載の方法。
［２３］ 上記カオトロピック剤が、１００ｍＭ～８Ｍのｎ－ドデシルβ－ｄ－マルトシド、ｎ－オクチルグルコシド、ＣＨＡＰＳ、又はデオキシコール酸塩を含む、実施形態［１８］～［２２］のいずれか１つに記載の方法。
［２４］ 上記クラウディング剤が、１００ｍＭ～８ＭのＰＥＧ、又は尿素を含む、実施形態［１８］～［２３］のいずれか１つに記載の方法。
［２５］ 上記キレート剤が、１ｍＭ～１０ｍＭのエチレングリコール－ビス（β－アミノエチルエーテル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラ酢酸（ＥＧＴＡ）若しくはその誘導体、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）若しくはその誘導体、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、イミノジコハク酸（ＩＤＳ）、ポリアスパラギン酸、Ｓ，Ｓ－エチレンジアミン－Ｎ，Ｎ’－ジコハク酸（ＥＤＤＳ）、又はメチルグリシン二酢酸（ＭＧＤＡ）を含む、実施形態［１８］～［２４］のいずれか１つに記載の方法。
［２６］ 上記デタージェントが、０．００５％～０．０５％（ｖ／ｖ）のノニデット（登録商標）（Ｎｏｎｉｄｅｔ）Ｐ－４０（ＮＰ４０）、ＣＨＡＰＳ、オクチルβ－Ｄ－グルコピラノシド、ｎ－ドデシルβ－ｄ－マルトシド、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）－２０、又はＴｗｅｅｎ（登録商標）－８０を含む、実施形態［１８］～［２５］のいずれか１つに記載の方法。
［２７］ ｃｉｒｃＲＮＡの濃縮集団を生産するための方法であって、上記方法が、以下：（ａ）ｃｉｒｃＲＮＡ及びｌｉｎＲＮＡを含むポリリボヌクレオチドの集団を含むサンプルを用意するステップと；（ｂ）少なくとも５０℃の温度でｌｉｎＲＮＡからｃｉｒｃＲＮＡを分離し、それによって、ｃｉｒｃＲＮＡの濃縮集団を生産するステップと、を含み、分離ステップは、ゲル電気泳動の使用を含まない方法。
［２８］ ｃｉｒｃＲＮＡの濃縮集団を生産するための方法であって、上記方法が、以下：（ａ）ｃｉｒｃＲＮＡ及びｌｉｎＲＮＡを含むポリリボヌクレオチドの集団を含むサンプルを用意するステップであって、（ｉ）ポリリボヌクレオチドの集団中のポリリボヌクレオチドの総重量が、少なくとも１μｇであり；（ｉｉ）ポリリボヌクレオチドの集団を含むサンプルの総量が、少なくとも５００μＬであるか；又は（ｉｉｉ）サンプル中のポリリボヌクレオチドの集団の濃度が、少なくとも２００ｎｇ／μＬであるステップと；（ｂ）少なくとも５０℃の温度で、ｌｉｎＲＮＡからｃｉｒｃＲＮＡを分離し、それによって、ｃｉｒｃＲＮＡの濃縮集団を生産するステップと、を含む方法。
［２９］ ｃｉｒｃＲＮＡの濃縮集団を生産するための方法であって、上記方法が、以下：（ａ）ｃｉｒｃＲＮＡ及びｌｉｎＲＮＡを含むポリリボヌクレオチドの集団を含むサンプルを用意するステップと；（ｂ）ポリリボヌクレオチドの集団を少なくとも５０℃の温度に曝露し、それによって、ｃｉｒｃＲＮＡの集団を濃縮するステップと、を含む方法。
［３０］ 温度が、５０℃～８５℃である、［２７］～［２９］のいずれか１つに記載の方法。
［３１］ ｃｉｒｃＲＮＡの濃縮集団を生産するための方法であって、上記方法が、以下：（ａ）ｃｉｒｃＲＮＡ及びｌｉｎＲＮＡを含むポリリボヌクレオチドの集団を含むサンプルを用意するステップと；（ｂ）５未満又は９超のｐＨで、ｌｉｎＲＮＡからｃｉｒｃＲＮＡを分離し、それによって、ｃｉｒｃＲＮＡの濃縮集団を生産するステップと、を含み、上記分離は、ゲル電気泳動の使用を含まない、方法。
［３２］ ｃｉｒｃＲＮＡの濃縮集団を生産するための方法であって、上記方法が、以下：（ａ）ｃｉｒｃＲＮＡ及びｌｉｎＲＮＡを含むポリリボヌクレオチドの集団を含むサンプルを用意するステップであって、（ｉ）ポリリボヌクレオチドの集団中のポリリボヌクレオチドの総重量が、少なくとも１μｇであり；（ｉｉ）ポリリボヌクレオチドの集団を含むサンプルの総量が、少なくとも５００μＬであるか；又は（ｉｉｉ）サンプル中のポリリボヌクレオチドの集団の濃度が、少なくとも２００ｎｇ／μＬである、ステップと；（ｂ）５未満又は９超のｐＨで、ｌｉｎＲＮＡからｃｉｒｃＲＮＡを分離し、それによって、ｃｉｒｃＲＮＡの濃縮集団を生産するステップを含む方法。
［３３］ ｃｉｒｃＲＮＡの濃縮集団を生産するための方法であって、上記方法が、以下：（ａ）ｃｉｒｃＲＮＡ及びｌｉｎＲＮＡを含むポリリボヌクレオチドの集団を含むサンプルを用意するステップと；（ｂ）ポリリボヌクレオチドの集団を５未満又は９超のｐＨに曝露し、それによって、ｃｉｒｃＲＮＡの集団を濃縮するステップと、を含む方法。
［３４］ ｐＨが、５未満である、実施形態［３１］～［３３］のいずれか１つに記載の方法。
［３５］ ｐＨが、９を超える、実施形態［３１］～［３３］のいずれか１つに記載の方法。
［３６］ ｃｉｒｃＲＮＡの濃縮集団を生産するための方法であって、上記方法が、以下：（ａ）ｃｉｒｃＲＮＡ及びｌｉｎＲＮＡを含むポリリボヌクレオチドの集団を含むサンプルを用意するステップと；（ｂ）酸、塩基、有機溶媒、カオトロピック剤、クラウディング剤、キレート剤、デタージェント、又は塩溶液を含む条件下で、ｃｉｒｃＲＮＡをｌｉｎＲＮＡから分離し、それによって、ｃｉｒｃＲＮＡの濃縮集団を生産するステップと、を含み、上記分離は、ゲル電気泳動の使用を含まない、方法。
［３７］ ｃｉｒｃＲＮＡの濃縮集団を生産するための方法であって、上記方法が、以下：（ａ）ｃｉｒｃＲＮＡ及びｌｉｎＲＮＡを含むポリリボヌクレオチドの集団を含むサンプルを用意するステップであって、（ｉ）ポリリボヌクレオチドの集団中のポリリボヌクレオチドの総重量が、少なくとも１μｇであり；（ｉｉ）ポリリボヌクレオチドの集団を含むサンプルの総量が、少なくとも５００μＬであるか；又は（ｉｉｉ）サンプル中のポリリボヌクレオチドの集団の濃度が、少なくとも２００ｎｇ／μＬである、ステップと；（ｂ）酸、塩基、有機溶媒、カオトロピック剤、クラウディング剤、キレート剤、デタージェント、又は塩溶液を含む条件下で、ｌｉｎＲＮＡからｃｉｒｃＲＮＡを分離し、それによって、ｃｉｒｃＲＮＡの濃縮集団を生産するステップと、を含む方法。
［３８］ ｃｉｒｃＲＮＡの濃縮集団を生産するための方法であって、上記方法が、以下：（ａ）ｃｉｒｃＲＮＡ及びｌｉｎＲＮＡを含むポリリボヌクレオチドの集団を含むサンプルを用意するステップと；（ｂ）ポリリボヌクレオチドの集団を、酸、塩基、有機溶媒、カオトロピック剤、クラウディング剤、キレート剤、デタージェント、又は塩溶液に曝露し、それによって、ｃｉｒｃＲＮＡの集団を濃縮するステップと、を含む方法。
［３９］ 上記酸が、少なくとも０．５％（ｖ／ｖ）の酢酸、塩酸、サリチル酸、リン酸、ホウ酸、ギ酸、シュウ酸、クエン酸、安息香酸、モノクロロ酢酸、ジクロロ酢酸、トリクロロ酢酸、アスコルビン酸、又は硝酸を含む、実施形態［３６］～［３８］のいずれか１つに記載の方法。
［４０］ 上記塩基が、１ｍＭ～５００ｍＭの水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、イミダゾール、ヒスチジン、炭酸水素ナトリウム、グアニジン、又はトリエチルアミンを含む、実施形態［３６］～［３８］のいずれか１つに記載の方法。
［４１］ 上記有機溶媒が、少なくとも０．１％（ｖ／ｖ）のジメチルスルホキシド、酢酸トリエチルアンモニウム、メタノール、エタノール、２－プロパノール、イソプロパノール、１－ブタノール、２－ブタノール、ｔ－ブタノール、イソブタノール、フェノール、クロロホルム、ヘキサン、アセトニトリル、ホルムアミド、アセトン、デナトニウム、又はプロピレングリコールを含む、実施形態［３６］～［３８］のいずれか１つに記載の方法。
［４２］ 上記カオトロピック剤が、１００ｍＭ～８Ｍの尿素、塩化グアニジニウム、過塩素酸リチウム、又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む、実施形態［３６］～［３８］のいずれか１つに記載の方法。
［４３］ 上記カオトロピック剤が、１００ｍＭ～８Ｍのｎ－ドデシルβ－ｄ－マルトシド、ｎ－オクチルグルコシド、ＣＨＡＰＳ、又はデオキシコール酸塩を含む、［３６］～［３８］のいずれか１つに記載の方法。
［４４］ 上記クラウディング剤が、１００ｍＭ～８Ｍのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、又は尿素を含む、［３６］～［３８］のいずれか１つに記載の方法。
［４５］ 上記キレート剤が、１ｍＭ～１０ｍＭのＥＧＴＡ若しくはその誘導体、ＥＤＴＡ若しくはその誘導体、ＮＴＡ、ＩＤＳ、ＥＤＤＳ、又はＭＧＤＡを含む、実施形態［３６］～［３８］のいずれか１つに記載の方法。
［４６］ 上記デタージェントが、０．００５％～０．０５％（ｖ／ｖ）のＮＰ４０、ＣＨＡＰＳ、オクチルβ－Ｄ－グルコピラノシド、ｎ－ドデシルβ－ｄ－マルトシド、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）－２０、又はＴｗｅｅｎ（登録商標）－８０を含む、実施形態［３６］～［３８］のいずれか１つに記載の方法。
［４７］ ステップ（ｂ）が、ポリリボヌクレオチドの集団に対してカラムクロマトグラフィーを実施する工程を含み、カラムクロマトグラフィーを実施する工程は、平衡化ステップ、サンプルロードステップ、カラム洗浄ステップ、及び溶離ステップを含む、実施形態［１］～［４６］のいずれか１つに記載の方法。
［４８］ 上記分離ステップが、サンプルロードステップ中に実施される、実施形態［４７］に記載の方法。
［４９］ 上記分離ステップが、カラム洗浄ステップ中に実施される、実施形態［４６］又は［４７］に記載の方法。
［５０］ 上記分離ステップが、溶離ステップ中に実施される、実施形態［４７］～［４９］のいずれか１つに記載の方法。
［５１］ カラムクロマトグラフィーが、高速タンパク質液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）、高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）、陰イオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＣ）、混合モードクロマトグラフィー、又はアフィニティークロマトグラフィーを含む、実施形態［４７］～［５０］のいずれか１つに記載の方法。
［５２］ 上記ＡＥＣが、以下：スチレン－ジビニルベンゼン、シリカ、セファロース、セルロース、デキストラン、エポキシポリアミン、メタクリレート、アガロース、及びアクリルからなる群から選択される陰イオン交換樹脂の使用を含む、実施形態［５１］に記載の方法。
［５３］ 上記陰イオン交換樹脂が、第４級アンモニウム、アミノエチル、ジエチルアミノエチル、又はジエチルアミノプロピルからなる群から選択されるイオン交換体を含む、実施形態［５２］に記載の方法。
［５４］ 上記陰イオン交換樹脂が、ビーズを含み、上記ビーズは、４５～１６５μｍのビーズ径及び直径１００～１０００ｎｍの孔径を有する、実施形態［５２］又は［５３に記載の方法。
［５５］ 上記ＡＥＣが、線形グラジエント溶離又はステップイソクラティック溶離の使用を含む、実施形態［５１］～［５４］のいずれか１つに記載の方法。
［５６］ 上記ＡＥＣが、流量１ｍＬ／分～１５０ｍＬ／分の使用を含む、実施形態［５１］～［５５］のいずれか１つに記載の方法。
［５７］ 上記ＦＰＬＣが、逆相－ＦＰＬＣ（ＲＰ－ＦＰＬＣ）である、実施形態［５１］に記載の方法。
［５８］ ステップ（ｂ）が、精製ｃｉｒｃＲＮＡの複数の画分をプールすることによって実施される、実施形態［１］～［５７］のいずれか１つに記載の方法。
［５９］ ｃｉｒｃＲＮＡ及びｌｉｎＲＮＡが、同じリボヌクレオチド配列を有する、実施形態［１］～［５８］のいずれか１つに記載の方法。
［６０］ ｃｉｒｃＲＮＡ及びｌｉｎＲＮＡが、同じ質量を有する、実施形態［１］～［５９］のいずれか１つに記載の方法。
［６１］ ｃｉｒｃＲＮＡ及びｌｉｎＲＮＡが、ポリ（Ａ）テールを欠いている、実施形態［１］～［６０］のいずれか１つに記載の方法。
［６２］ 上記方法が、ｌｉｎＲＮＡのエキソヌクレアーゼ消化を含む、実施形態［１］～［６１］のいずれか１つに記載の方法。
［６３］ 上記方法が、ｌｉｎＲＮＡのエキソヌクレアーゼ消化を含まない、実施形態［１］～［６１］のいずれか１つに記載の方法。
［６４］ 上記方法が、ｃｉｒｃＲＮＡの濃縮を改善する、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｌｉｎＲＮＡに対する選択的修飾を含まない、実施形態［１］～［６３］のいずれか１つに記載の方法。
［６５］ ｃｉｒｃＲＮＡの濃縮集団中のｃｉｒｃＲＮＡのパーセント（ｗ／ｗ）が、ポリリボヌクレオチド集団中のｃｉｒｃＲＮＡのパーセント（ｗ／ｗ）の２倍である、実施形態［１］－［６４］のいずれか１つに記載の方法。
［６６］ ｃｉｒｃＲＮＡの濃縮集団中のｃｉｒｃＲＮＡのパーセント（ｗ／ｗ）が、少なくとも６５％である、実施形態［１］～［６５］のいずれか１つに記載の方法。
［６７］ ｃｉｒｃＲＮＡの濃縮集団中のｌｉｎＲＮＡのパーセント（ｗ／ｗ）が、３５％未満である、実施形態［１］～［６６］のいずれか１つに記載の方法。
［６８］ ｃｉｒｃＲＮＡが、約１，０００ヌクレオチド以下の長さを含む、実施形態［１］～［６７］のいずれか１つに記載の方法。
［６９］ ｃｉｒｃＲＮＡ及びｌｉｎＲＮＡを含むポリリボヌクレオチドの集団を含む組成物であって、上記ポリリボヌクレオチドの集団が、変性条件下の溶液中であり；（ｉ）ポリリボヌクレオチドの集団中のポリリボヌクレオチドの総重量は、少なくとも１μｇであり；（ｉｉ）ポリリボヌクレオチドの集団を含むサンプルの総量は、少なくとも５００μＬであるか；又は（ｉｉｉ）サンプル中のポリリボヌクレオチドの集団の濃度は、少なくとも５００ｎｇ／μＬである、組成物。
［７０］ ｃｉｒｃＲＮＡ及びｌｉｎＲＮＡを含むポリリボヌクレオチドの集団を含む組成物であって、上記ポリリボヌクレオチドの集団が、変性条件下の溶液中であり、上記溶液は、１種若しくは複数種の不純物又は副産物を実質的に含まない、組成物。
［７１］ ｃｉｒｃＲＮＡ及びｌｉｎＲＮＡを含むポリリボヌクレオチドの集団を含む組成物であって、
（ａ）組成物が、核酸の集団を含むサンプルから取得され；
（ｂ）組成物が、１つ若しくは複数の変性条件に曝露されており；
（ｃ）組成物が、１種若しくは複数種の不純物又は副産物を実質的に含まない、組成物。
［７２］ ｃｉｒｃＲＮＡ及びｌｉｎＲＮＡを含むポリリボヌクレオチドの集団を含む組成物であって、
（ａ）組成物が、ｃｉｒｃＲＮＡ及びｌｉｎＲＮＡを含むポリリボヌクレオチドの集団を含むサンプルから取得され；
（ｂ）組成物が、１つ若しくは複数の変性条件に曝露されており；
（ｃ）組成物が、１種若しくは複数種の不純物又は副産物を実質的に含まない、組成物。
［７３］ １種若しくは複数種の不純物又は副産物が、ポリアクリルアミド、ホウ酸、マグネシウム、又はＥＤＴＡを含む、実施形態［６９］～［７２］のいずれか１つに記載の組成物。
［７４］ 変性条件が、少なくとも５０℃の温度を含む、実施形態［６９］～［７３］のいずれか１つに記載の組成物。
［７５］ 変性条件が、５０℃～８５℃の温度を含む、実施形態［６９］～［７４］のいずれか１つに記載の組成物。
［７６］ 変性条件が、少なくとも５０℃の温度、続いて８℃以下の温度を含む、実施形態［６９］～［７５］のいずれか１つに記載の組成物。
［７７］ 変性条件が、５未満のｐＨ又は９を超えるｐＨを含む、実施形態［６９］～［７３］のいずれか１つに記載の組成物。
［７８］ 変性条件が化学処理を含む、実施形態［６９］～［７３］のいずれか１つに記載の組成物。
［７９］ 上記化学処理が、酸、塩基、有機溶媒、カオトロピック剤、クラウディング剤、キレート剤、デタージェント、又は塩溶液による処理を含む、実施形態［７８］に記載の組成物。
［８０］ 上記酸が、１ｍＭ～５００ｍＭの酢酸、塩酸、サリチル酸、リン酸、ホウ酸、ギ酸、シュウ酸、クエン酸、安息香酸、モノクロロ酢酸、ジクロロ酢酸、トリクロロ酢酸、アスコルビン酸、又は硝酸を含む、実施形態［７９］に記載の組成物。
［８１］ 上記塩基が、１ｍＭ～５００ｍＭの水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、イミダゾール、ヒスチジン、炭酸水素ナトリウム、グアニジン、又はトリエチルアミンを含む、実施形態［７９］又は［８０］に記載の組成物。
［８２］ 上記有機溶媒が、少なくとも０．１％（ｖ／ｖ）のジメチルスルホキシド、酢酸トリエチルアンモニウム、メタノール、エタノール、２－プロパノール、イソプロパノール、１－ブタノール、２－ブタノール、ｔ－ブタノール、イソブタノール、フェノール、クロロホルム、ヘキサン、アセトニトリル、ホルムアミド、アセトン、デナトニウム、又はプロピレングリコールを含む、実施形態［７９］～［８１］のいずれか１つに記載の組成物。
［８３］ 上記カオトロピック剤が、１００ｍＭ～８Ｍの尿素、塩化グアニジニウム、過塩素酸リチウム、又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む、実施形態［７９］～［８２］のいずれか１つに記載の組成物。
［８４］ 上記カオトロピック剤が、１００ｍＭ～８Ｍのｎ－ドデシルβ－ｄ－マルトシド、ｎ－オクチルグルコシド、ＣＨＡＰＳ、又はデオキシコール酸塩を含む、実施形態［７９］～［８２］のいずれか１つに記載の組成物。
［８５］ 上記クラウディング剤が、１００ｍＭ～８Ｍのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、又は尿素を含む、実施形態［７９］～［８４］のいずれか１つに記載の組成物。
［８６］ 上記キレート剤が、１ｍＭ～１０ｍＭのＥＧＴＡ若しくはその誘導体、ＥＤＴＡ若しくはその誘導体、ＮＴＡ、ＩＤＳ、ＥＤＤＳ、又はＭＧＤＡを含む、実施形態［７９］～［８５］のいずれか１つに記載の組成物。
［８７］ 上記デタージェントが、０．００５％～０．０５％（ｖ／ｖ）のＮＰ４０、ＣＨＡＰＳ、オクチルβ－Ｄ－グルコピラノシド、ｎ－ドデシルβ－ｄ－マルトシド、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）－２０、又はＴｗｅｅｎ（登録商標）－８０を含む、実施形態［７９］～［８６］のいずれか１つに記載の組成物。
［８８］ ｃｉｒｃＲＮＡの濃縮集団中のｃｉｒｃＲＮＡのパーセント（ｗ／ｗ）が、ポリリボヌクレオチド集団中のｃｉｒｃＲＮＡのパーセント（ｗ／ｗ）の２倍である、実施形態［６９］～［８７］のいずれか１つに記載の組成物。
［８９］ ｃｉｒｃＲＮＡの濃縮集団中のｃｉｒｃＲＮＡのパーセント（ｗ／ｗ）が、少なくとも６５％である、実施形態［６９］～［８８］のいずれか１つに記載の組成物。
［９０］ ｃｉｒｃＲＮＡの濃縮集団中のｌｉｎＲＮＡのパーセント（ｗ／ｗ）が、３５％未満である、実施形態［６９］～［８９］のいずれか１つに記載の組成物。
［９１］ ｃｉｒｃＲＮＡ及びｌｉｎＲＮＡが、同じリボヌクレオチド配列を有する、実施形態［６９］～［９０］のいずれか１つに記載の組成物。
［９２］ ｃｉｒｃＲＮＡ及びｌｉｎＲＮＡが、同じ質量を有する、実施形態［６９］～［９１］のいずれか１つに記載の組成物。
［９３］ ｃｉｒｃＲＮＡ及びｌｉｎＲＮＡが、ポリ（Ａ）テールを欠いている、実施形態［６９］～［９２］のいずれか１つに記載の組成物。
［９４］ ｃｉｒｃＲＮＡが、約１，０００ヌクレオチド以下の長さを含む、実施形態［６９］～［９３］のいずれか１つに記載の組成物。
［９５］ ｃｉｒｃＲＮＡの純度を決定する方法であって、上記方法が、以下：（ａ）ｃｉｒｃＲＮＡ及びｌｉｎＲＮＡを含むポリリボヌクレオチドの集団を含むサンプルを用意するステップと；（ｂ）クロマトグラフィーにより、変性条件下でｃｉｒｃＲＮＡをｌｉｎＲＮＡから分離するステップと；（ｃ）ｃｉｒｃＲＮＡのピーク及びｌｉｎＲＮＡのピークを含むサンプルのクロマトグラムを収集するステップと；（ｄ）各ピーク下の面積を計算して、サンプル中のｃｉｒｃＲＮＡの純度を決定するステップと、を含む方法。
［９６］ 上記変性条件が、ゲル電気泳動の使用を含まない、実施形態［９５］に記載の方法。
［９７］ 上記変性条件が、少なくとも５０℃の温度を含む、実施形態［９５］又は［９６］に記載の方法。
［９８］ 上記変性条件が、５０℃～８５℃の温度を含む、実施形態［９７］に記載の方法。
［９９］ 上記変性条件が、少なくとも５０℃の温度、続いて３０秒以下の時間内に８℃以下の温度を含む、実施形態［９５］～［９８］のいずれか１つに記載の方法。
［１００］ 上記変性条件が、５未満のｐＨ又は９を超えるｐＨを含む、実施形態［９５］～［９９］のいずれか１つに記載の方法。
［１０１］ 上記変性条件が、５未満のｐＨを含む、実施形態［１００］に記載の方法。
［１０２］ 上記変性条件が、９を超えるｐＨを含む、実施形態［１００］に記載の方法。
［１０３］ 上記変性条件が、化学処理を含む、実施形態［９５］～［１０２］のいずれか１つに記載の方法。
［１０４］ 上記化学処理が、酸、塩基、有機溶媒、カオトロピック剤、クラウディング剤、キレート剤、デタージェント、又は塩溶液による処理を含む、実施形態［１０３］に記載の方法。
［１０５］ 上記酸が、１ｍＭ～５００ｍＭの酢酸、塩酸、サリチル酸、リン酸、ホウ酸、ギ酸、シュウ酸、クエン酸、安息香酸、モノクロロ酢酸、ジクロロ酢酸、トリクロロ酢酸、アスコルビン酸、又は硝酸を含む、実施形態［１０４］に記載の方法。
［１０６］ 上記塩基が、１ｍＭ～５００ｍＭの水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、イミダゾール、ヒスチジン、炭酸水素ナトリウム、グアニジン、又はトリエチルアミンを含む、実施形態［１０４］又は［１０５］に記載の方法。
［１０７］ 上記有機溶媒が、少なくとも０．１％（ｖ／ｖ）のジメチルスルホキシド、酢酸トリエチルアンモニウム、メタノール、エタノール、２－プロパノール、イソプロパノール、１－ブタノール、２－ブタノール、ｔ－ブタノール、イソブタノール、フェノール、クロロホルム、ヘキサン、アセトニトリル、ホルムアミド、アセトン、デナトニウム、又はプロピレングリコールを含む、実施形態［１０４］～［１０６］のいずれか１つに記載の方法。
［１０８］ 上記カオトロピック剤が、１００ｍＭ～８Ｍの尿素、塩化グアニジニウム、過塩素酸リチウム、又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む、実施形態［１０４］～［１０７］のいずれか１つに記載の方法。
［１０９］ 上記カオトロピック剤が、１００ｍＭ～８Ｍのｎ－ドデシルβ－ｄ－マルトシド、ｎ－オクチルグルコシド、ＣＨＡＰＳ、又はデオキシコール酸塩を含む、実施形態［１０４］～［１０８］のいずれか１つに記載の方法。
［１１０］ 上記クラウディング剤が、１００ｍＭ～８Ｍのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、又は尿素を含む、実施形態［１０４］～［１０９］のいずれか１つに記載の方法。
［１１１］ 上記キレート剤が、１ｍＭ～１０ｍＭのＥＧＴＡ若しくはその誘導体、ＥＤＴＡ若しくはその誘導体、ＮＴＡ、ＩＤＳ、ＥＤＤＳ、又はＭＧＤＡを含む、実施形態［１０４］～［１１０］のいずれか１つに記載の方法。
［１１２］ 上記デタージェントが、０．００５％～０．０５％（ｖ／ｖ）のノニデット（登録商標）（Ｎｏｎｉｄｅｔ）Ｐ－４０（ＮＰ４０）、ＣＨＡＰＳ、オクチルβ－Ｄ－グルコピラノシド、ｎ－ドデシルβ－ｄ－マルトシド、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）－２０、又はＴｗｅｅｎ（登録商標）－８０を含む、実施形態［１０４］～［１１１］のいずれか１つに記載の方法。
［１１３］ 上記クロマトグラフィーが、液体クロマトグラフィーを含む、実施形態［９５］～［１１２］のいずれか１つに記載の方法。
［１１４］ 上記液体クロマトグラフィーが、ＦＰＬＣ、ＨＰＬＣ、ＨＩＣ、ＡＥＣ、ＭＭＣ、又はアフィニティークロマトグラフィーからなる群から選択される、実施形態［１１３］に記載の方法。
［１１５］ 純度の相対標準偏差（ＲＳＤ）が、５％未満である、実施形態［９５］～［１１４］のいずれか１つに記載の方法。
［１１６］ ｃｉｒｃＲＮＡが、約１，０００ヌクレオチド以下の長さを含む、実施形態［９５］～［１１５］のいずれか１つに記載の組成物。
［１１７］ ｃｉｒｃＲＮＡの濃縮集団を生産するための方法であって、上記方法が、以下：（ａ）ｃｉｒｃＲＮＡ及びｌｉｎＲＮＡを含むポリリボヌクレオチドの集団を含むサンプルを用意するステップと；（ｂ）ゲル電気泳動の使用を含まない変性条件下で、ｃｉｒｃＲＮＡをｌｉｎＲＮＡから分離し、それによって、ｃｉｒｃＲＮＡの濃縮集団を生産するステップと、を含む方法。
［１１８］ ｃｉｒｃＲＮＡの濃縮集団を生産するための方法であって、上記方法が、以下：（ａ）ｃｉｒｃＲＮＡ及びｌｉｎＲＮＡを含むポリリボヌクレオチドの集団を含むサンプルを用意するステップと；（ｂ）ポリリボヌクレオチドの集団を変性条件に曝露し、それによって、ｃｉｒｃＲＮＡの集団を濃縮するステップと、を含む方法。
［１１９］ （ｉ）ポリリボヌクレオチドの集団中のポリリボヌクレオチドの総重量が、少なくとも１μｇであり；（ｉｉ）ポリリボヌクレオチドの集団を含むサンプルの総量が、少なくとも５００μＬであるか；又は（ｉｉｉ）サンプル中のポリリボヌクレオチドの集団の濃度が、少なくとも２００ｎｇ／μＬである、実施形態［１１７］又は［１１８］に記載の方法。
［１２０］ 上記分離ステップ（ｂ）が、ゲル電気泳動の使用を含まない変性条件下で実施され：及び／又はｃｉｒｃＲＮＡの濃縮集団が、１種若しくは複数種の不純物又は副産物を実質的に含まず、１種若しくは複数種の不純物又は副産物が、ポリアクリルアミド、ホウ酸、マグネシウム、又はエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を含む、実施形態［１１８］又は［１１９］に記載の方法。
［１２１］ 上記変性条件が、少なくとも５０℃の温度を含むか；又は上記変性条件が、少なくとも５０℃の温度、続いて３０秒以下の時間内に８℃以下の温度を含む、実施形態［１１７］～［１２０］のいずれか１つに記載の方法。
［１２２］上記変性条件が、５未満のｐＨ又は９を超えるｐＨを含む、実施形態［１１７］～［１２１］のいずれか１つに記載の方法。
［１２３］ 上記変性条件が、酸、塩基、有機溶媒、カオトロピック剤、クラウディング剤、キレート剤、デタージェント、又は塩溶液による化学処理を含む、実施形態［１１７］～［１２２］のいずれか１つに記載の方法。
［１２４］ 上記酸が、１ｍＭ～５００ｍＭの酢酸、塩酸、サリチル酸、リン酸、ホウ酸、ギ酸、シュウ酸、クエン酸、安息香酸、モノクロロ酢酸、ジクロロ酢酸、トリクロロ酢酸、アスコルビン酸、又は硝酸を含む、実施形態［１２３］に記載の方法。
［１２５］ 上記塩基が、１ｍＭ～５００ｍＭの水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、イミダゾール、ヒスチジン、炭酸水素ナトリウム、グアニジン、又はトリエチルアミンを含む、実施形態［１２３］又は［１２４］に記載の方法。
［１２６］ 上記有機溶媒が、少なくとも０．１％（ｖ／ｖ）のジメチルスルホキシド、酢酸トリエチルアンモニウム、メタノール、エタノール、２－プロパノール、イソプロパノール、１－ブタノール、２－ブタノール、ｔ－ブタノール、イソブタノール、フェノール、クロロホルム、ヘキサン、アセトニトリル、ホルムアミド、アセトン、デナトニウム、又はプロピレングリコールを含む、実施形態［１２３］～［１２５］のいずれか１つに記載の方法。
［１２７］ 上記カオトロピック剤が、１００ｍＭ～８Ｍの尿素、塩化グアニジニウム、過塩素酸リチウム、又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含み；及び／又は、上記カオトロピック剤が、１００ｍＭ～８Ｍのｎ－ドデシルβ－ｄ－マルトシド、ｎ－オクチルグルコシド、ＣＨＡＰＳ、又はデオキシコール酸塩を含む、実施形態［１２３］～［１２６］のいずれか１つに記載の方法。
［１２８］ 上記クラウディング剤が、１００ｍＭ～８ＭのＰＥＧ、又は尿素を含む、実施形態［１２３］～［１２７］のいずれか１つに記載の方法。
［１２９］ 上記キレート剤が、１ｍＭ～１０ｍＭのエチレングリコール－ビス（β－アミノエチルエーテル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラ酢酸（ＥＧＴＡ）若しくはその誘導体、ＥＤＴＡ若しくはその誘導体、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、イミノジコハク酸（ＩＤＳ）、ポリアスパラギン酸、Ｓ，Ｓ－エチレンジアミン－Ｎ，Ｎ’－ジコハク酸（ＥＤＤＳ）、又はメチルグリシン二酢酸（ＭＧＤＡ）を含む、実施形態［１２３］～［１２８］のいずれか１つに記載の方法。
［１３０］ 上記デタージェントが、０．００５％～０．０５％（ｖ／ｖ）のノニデット（登録商標）（Ｎｏｎｉｄｅｔ）Ｐ－４０（ＮＰ４０）、ＣＨＡＰＳ、オクチルβ－Ｄ－グルコピラノシド、ｎ－ドデシルβ－ｄ－マルトシド、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）－２０、又はＴｗｅｅｎ（登録商標）－８０を含む、実施形態［１２３］～［１２９］のいずれか１つに記載の方法。
［１３１］ ステップ（ｂ）が、ポリリボヌクレオチドの集団に対してカラムクロマトグラフィーを実施する工程を含み、カラムクロマトグラフィーを実施する工程は、平衡化ステップ、サンプルロードステップ、カラム洗浄ステップ、及び溶離ステップを含み；上記分離ステップが、サンプルロードステップ、カラム洗浄ステップ、及び／又は溶離ステップ中に実施される、実施形態［１１７］～［１３０］のいずれか１つに記載の方法。
［１３２］ カラムクロマトグラフィーが、高速タンパク質液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）、高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）、陰イオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＣ）、混合モードクロマトグラフィー、又はアフィニティークロマトグラフィーを含む、実施形態［１３１］に記載の方法。
［１３３］ 上記ＡＥＣが、以下：（ｉ）陰イオン交換樹脂の使用（陰イオン交換樹脂は、スチレン－ジビニルベンゼン、シリカ、セファロース、セルロース、デキストラン、エポキシポリアミン、メタクリレート、アガロース、及びアクリルからなる群から選択され；及び／又は上記陰イオン交換樹脂は、第４級アンモニウム、アミノエチル、ジエチルアミノエチル、及びジエチルアミノプロピルからなる群から選択されるイオン交換体を含み；及び／又は上記陰イオン交換樹脂は、ビーズを含み、上記ビーズは、４５～１６５μｍのビーズ径及び直径１００～１０００ｎｍの孔径を有する）；並びに／或いは線形グラジエント溶離又はステップイソクラティック溶離の使用；並びに／或いは１ｍＬ／分～１５０ｍＬ／分の流量の使用を含む、実施形態［１３２］に記載の方法。
［１３４］ ステップ（ｂ）が、精製ｃｉｒｃＲＮＡの複数の画分をプールすることによって実施される、実施形態［１１７］～［１３３］のいずれか１つに記載の方法。
［１３５］ ｃｉｒｃＲＮＡ及びｌｉｎＲＮＡが、同じリボヌクレオチド配列を有し；及び／又はｃｉｒｃＲＮＡ及びｌｉｎＲＮＡが、同じ質量を有し；及び／又はｃｉｒｃＲＮＡ及びｌｉｎＲＮＡが、ポリ（Ａ）テールを欠いている、実施形態［１１７］～［１３４］のいずれか１つに記載の方法。
［１３６］上記方法が、ｌｉｎＲＮＡのエキソヌクレアーゼ消化を含むか、又は上記方法が、ｌｉｎＲＮＡのエキソヌクレアーゼ消化を含まず；及び／又は上記方法は、ｃｉｒｃＲＮＡの濃縮を改善する、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｌｉｎＲＮＡに対する選択的修飾を含まない、実施形態［１１７］～［１３５］のいずれか１つに記載の方法。
［１３７］ｃｉｒｃＲＮＡの濃縮集団中のｃｉｒｃＲＮＡのパーセント（ｗ／ｗ）が、ポリリボヌクレオチド集団中のｃｉｒｃＲＮＡのパーセント（ｗ／ｗ）の２倍であり；及び／又はｃｉｒｃＲＮＡの濃縮集団中のｃｉｒｃＲＮＡのパーセント（ｗ／ｗ）が、少なくとも６５％であり；及び／又はｃｉｒｃＲＮＡの濃縮集団中のｌｉｎＲＮＡのパーセント（ｗ／ｗ）が、３５％未満である、実施形態［１１７］～［１３６］のいずれか１つに記載の方法。
［１３８］ ｃｉｒｃＲＮＡが、１，０００ヌクレオチド以下の長さを有する、実施形態［１１７］～［１３７］のいずれか１つに記載の方法。
［１３９］ ｃｉｒｃＲＮＡ及びｌｉｎＲＮＡを含むポリリボヌクレオチドの集団を含む組成物であって、上記ポリリボヌクレオチドの集団は、変性条件下の溶液中であり；（ｉ）ポリリボヌクレオチドの集団中のポリリボヌクレオチドの総重量は、少なくとも１μｇあり；（ｉｉ）ポリリボヌクレオチドの集団を含むサンプルの総量は、少なくとも５００μＬであり；又は（ｉｉｉ）サンプル中のポリリボヌクレオチドの集団の濃度は、少なくとも５００ｎｇ／μＬである、組成物。
［１４０］ ｃｉｒｃＲＮＡの濃縮集団を含む組成物であって、（ａ）組成物が、ｃｉｒｃＲＮＡ及びｌｉｎＲＮＡを含むポリリボヌクレオチドの集団を含むサンプルから取得され；（ｂ）組成物が、１つ若しくは複数の変性条件に曝露されており；（ｃ）組成物が、１種若しくは複数種の不純物又は副産物を実質的に含まない、組成物。
［１４１］ １種若しくは複数種の不純物又は副産物が、ポリアクリルアミド、ホウ酸、マグネシウム、又はＥＤＴＡを含む、［１３９］又は［１４０］に記載の組成物。
［１４２］ 変性条件が、少なくとも５０℃の温度を含むか；又は変性条件が、少なくとも５０℃の温度、続いて８℃以下の温度を含む、実施形態［１３９］～［１４１］のいずれか１つに記載の組成物。
［１４３］ 上記変性条件が、５未満のｐＨ又は９を超えるｐＨを含む、実施形態［１３９］～［１４２］のいずれか１つに記載の組成物。
［１４４］ 上記変性条件が、酸、塩基、有機溶媒、カオトロピック剤、クラウディング剤、キレート剤、デタージェント、又は塩溶液による化学処理を含む、実施形態［１３９］～［１４３］のいずれか１つに記載の組成物。
［１４５］ 上記酸が、１ｍＭ～５００ｍＭの酢酸、塩酸、サリチル酸、リン酸、ホウ酸、ギ酸、シュウ酸、クエン酸、安息香酸、モノクロロ酢酸、ジクロロ酢酸、トリクロロ酢酸、アスコルビン酸、又は硝酸を含む、実施形態［１４４］に記載の組成物。
［１４６］ 上記塩基が、１ｍＭ～５００ｍＭの水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、イミダゾール、ヒスチジン、炭酸水素ナトリウム、グアニジン、又はトリエチルアミンを含む、実施形態［１４４］又は［１４５］に記載の組成物。
［１４７］ 上記有機溶媒が、少なくとも０．１％（ｖ／ｖ）のジメチルスルホキシド、酢酸トリエチルアンモニウム、メタノール、エタノール、２－プロパノール、イソプロパノール、１－ブタノール、２－ブタノール、ｔ－ブタノール、イソブタノール、フェノール、クロロホルム、ヘキサン、アセトニトリル、ホルムアミド、アセトン、デナトニウム、又はプロピレングリコールを含む、実施形態［１４４］～［１４６］のいずれか１つに記載の組成物。
［１４８］ 上記カオトロピック剤が、１００ｍＭ～８Ｍの尿素、塩化グアニジニウム、過塩素酸リチウム、又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含み；及び／又は、上記カオトロピック剤が、１００ｍＭ～８Ｍのｎ－ドデシルβ－ｄ－マルトシド、ｎ－オクチルグルコシド、ＣＨＡＰＳ、又はデオキシコール酸塩を含む、実施形態［１４４］～［１４７］のいずれか１つに記載の組成物。
［１４９］ 上記クラウディング剤が、１００ｍＭ～８Ｍのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、又は尿素を含む、実施形態［１４４］～［１４８］のいずれか１つに記載の組成物。
［１５０］ 上記キレート剤が、１ｍＭ～１０ｍＭのＥＧＴＡ若しくはその誘導体、ＥＤＴＡ若しくはその誘導体、ＮＴＡ、ＩＤＳ、ＥＤＤＳ、又はＭＧＤＡを含む、実施形態［１４４］～［１４９］のいずれか１つに記載の組成物。
［１５１］ 上記デタージェントが、０．００５％～０．０５％（ｖ／ｖ）のＮＰ４０、ＣＨＡＰＳ、オクチルβ－Ｄ－グルコピラノシド、ｎ－ドデシルβ－ｄ－マルトシド、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）－２０、又はＴｗｅｅｎ（登録商標）－８０を含む、実施形態［１４４］～［１５０］のいずれか１つに記載の組成物。
［１５２］ ｃｉｒｃＲＮＡの濃縮集団中のｃｉｒｃＲＮＡのパーセント（ｗ／ｗ）は、ポリリボヌクレオチド集団中のｃｉｒｃＲＮＡのパーセント（ｗ／ｗ）の２倍であり；及び／又はｃｉｒｃＲＮＡの濃縮集団中のｃｉｒｃＲＮＡのパーセント（ｗ／ｗ）が、少なくとも６５％であり；及び／又はｃｉｒｃＲＮＡの濃縮集団中のｌｉｎＲＮＡのパーセント（ｗ／ｗ）が、３５％未満である、実施形態［１３９］～［１５１］のいずれか１つに記載の組成物。
［１５３］ ｃｉｒｃＲＮＡ及びｌｉｎＲＮＡが、同じリボヌクレオチド配列を有する；及び／又はｃｉｒｃＲＮＡ及びｌｉｎＲＮＡが、同じ質量を有する；及び／又はｃｉｒｃＲＮＡ及びｌｉｎＲＮＡが、ポリ（Ａ）テールを欠いている、実施形態［１３９］～［１５２］のいずれか１つに記載の組成物。
［１５４］ ｃｉｒｃＲＮＡが、１，０００ヌクレオチド以下の長さを有する、実施形態［１３９］～［１５３］のいずれか１つに記載の組成物。
［１５５］ ｃｉｒｃＲＮＡの純度を決定する方法であって、上記方法が、以下：（ａ）ｃｉｒｃＲＮＡ及びｌｉｎＲＮＡを含むポリリボヌクレオチドの集団を含むサンプルを用意するステップと；（ｂ）クロマトグラフィーにより、変性条件下でｃｉｒｃＲＮＡをｌｉｎＲＮＡから分離するステップと；（ｃ）ｃｉｒｃＲＮＡのピーク及びｌｉｎＲＮＡのピークを含むサンプルのクロマトグラムを収集するステップと；（ｄ）各ピーク下の面積を計算して、サンプル中のｃｉｒｃＲＮＡの純度を決定するステップと、を含む方法。
［１５６］ 上記変性条件が、ゲル電気泳動の使用を含まない、実施形態［１５５］に記載の方法。
［１５７］ 上記変性条件が、少なくとも５０℃の温度を含むか；又は、上記変性条件は、少なくとも５０℃の温度、続いて３０秒以下の時間内に８℃以下の温度を含む、実施形態［１５５］又は［１５６］に記載の方法。
［１５８］ 上記変性条件が、５未満のｐＨ又は９を超えるｐＨを含む、実施形態［１５５］～［１５７］のいずれか１つに記載の方法。
［１５９］ 上記変性条件が、酸、塩基、有機溶媒、カオトロピック剤、クラウディング剤、キレート剤、デタージェント、又は塩溶液による処理などの化学処理を含む、実施形態［１５５］～［１５８］のいずれか１つに記載の方法。
［１６０］ 上記酸が、１ｍＭ～５００ｍＭの酢酸、塩酸、サリチル酸、リン酸、ホウ酸、ギ酸、シュウ酸、クエン酸、安息香酸、モノクロロ酢酸、ジクロロ酢酸、トリクロロ酢酸、アスコルビン酸、又は硝酸を含む、実施形態［１５９］に記載の方法。
［１６１］ 上記塩基が、１ｍＭ～５００ｍＭの水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、イミダゾール、ヒスチジン、炭酸水素ナトリウム、グアニジン、又はトリエチルアミンを含む、実施形態［１５９］又は［１６０］に記載の方法。
［１６２］ 上記有機溶媒が、少なくとも０．１％（ｖ／ｖ）のジメチルスルホキシド、酢酸トリエチルアンモニウム、メタノール、エタノール、２－プロパノール、イソプロパノール、１－ブタノール、２－ブタノール、ｔ－ブタノール、イソブタノール、フェノール、クロロホルム、ヘキサン、アセトニトリル、ホルムアミド、アセトン、デナトニウム、又はプロピレングリコールを含む、実施形態［１５９］～［１６１］のいずれか１つに記載の方法。
［１６３］ 上記カオトロピック剤が、１００ｍＭ～８Ｍの尿素、塩化グアニジニウム、過塩素酸リチウム、若しくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含み；及び／又は上記カオトロピック剤が、１００ｍＭ～８Ｍのｎ－ドデシルβ－ｄ－マルトシド、ｎ－オクチルグルコシド、ＣＨＡＰＳ、若しくはデオキシコール酸塩を含む、実施形態［１５９］～［１６２］のいずれか１つに記載の方法。
［１６４］ 上記クラウディング剤が、１００ｍＭ～８Ｍのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、又は尿素を含む、実施形態［１５９］～［１６２］のいずれか１つに記載の方法。
［１６５］ 上記キレート剤が、１ｍＭ～１０ｍＭのＥＧＴＡ若しくはその誘導体、ＥＤＴＡ若しくはその誘導体、ＮＴＡ、ＩＤＳ、ポリアスパラギン酸、ＥＤＤＳ、又はＭＧＤＡを含む、実施形態［１５９］～［１６４］のいずれか１つに記載の方法。
［１６６］ 上記デタージェントが、０．００５％～０．０５％（ｖ／ｖ）のノニデット（登録商標）（Ｎｏｎｉｄｅｔ）Ｐ－４０（ＮＰ４０）、ＣＨＡＰＳ、オクチルβ－Ｄ－グルコピラノシド、ｎ－ドデシルβ－ｄ－マルトシド、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）－２０、又はＴｗｅｅｎ（登録商標）－８０を含む、実施形態［１５９］～［１６５］のいずれか１つに記載の方法。
［１６７］ 上記クロマトグラフィーが、液体クロマトグラフィーを含み、上記液体クロマトグラフィーは、ＦＰＬＣ、ＨＰＬＣ、ＨＩＣ、ＡＥＣ、ＭＭＣ、又はアフィニティークロマトグラフィーからなる群から選択される、実施形態［１５５］～［１６６］のいずれか１つに記載の方法。
［１６８］ 純度の相対標準偏差（ＲＳＤ）が、５％未満である、実施形態［１５５］～［１６７］のいずれか１つに記載の方法。
［１６９］ ｃｉｒｃＲＮＡが、約１，０００ヌクレオチド以下の長さを含む、実施形態［１５５］～［１６８］のいずれか１つに記載の方法。
【実施例】
【0383】
以下の実施例は、本明細書に記載される組成物及び方法がどのように使用され、作製され、評価され得るかの説明を当業者に提供するために提示され、本開示を純粋に例示するものであることが意図されており、本発明者らが本発明とみなすものの範囲を限定することは意図されていない。
【0384】
実施例１：ｃｉｒｃＲＮＡ及びｌｉｎＲＮＡを含むＲＮＡの混合集団を含むサンプルからの変性条件下でのｃｉｒｃＲＮＡの濃縮
本明細書に開示される方法に従って、当業者は、本明細書に記載の１つ又は複数の変性条件にサンプルを付すことにより、ｃｉｒｃＲＮＡ、線状ＲＮＡ（ｌｉｎＲＮＡ）、又は他の不純物若しくは副産物（例えば、本明細書に記載の不純物若しくは副産物）を含むポリリボヌクレオチドの混合集団から、環状ＲＮＡ（ｃｉｒｃＲＮＡ）の濃縮集団を生産することができる。
本明細書に開示される方法に従って、当業者は、本明細書に記載の１つ又は複数の変性条件にサンプルを付すことにより、ｃｉｒｃＲＮＡ、線状ＲＮＡ（ｌｉｎＲＮＡ）、又は他の不純物若しくは副産物（例えば、本明細書に記載の不純物若しくは副産物）を含むポリリボヌクレオチドの混合集団から、環状ＲＮＡ（ｃｉｒｃＲＮＡ）の濃縮集団を生産することができる。
【0385】
最初に、ｃｉｒｃＲＮＡ及びｌｉｎＲＮＡを含むポリリボヌクレオチドの混合集団を含むサンプルを取得する。このサンプルは、少なくとも２００μｇの総質量のポリリボヌクレオチドを含むか、少なくとも５００μＬの総量を有するか、又はサンプル中少なくとも２００ｎｇ／μＬの濃度のポリリボヌクレオチドを有する。次に、インビトロ転写（ＩＶＴ）ＲＮＡサンプルを調製し、当技術分野で公知の初期精製ステップに付す。精製前にＩＶＴサンプルを前処理することにより、大きな混入物、残屑、その他の高分子を除去してもよい。また、ＩＶＴサンプルを遠心分離して、沈殿物及び上清を分離してもよい。必要に応じて、バッファー洗浄と遠心分離を数ラウンド実施することができる。本明細書に記載される１つ若しくは複数の変性条件（例えば、熱変性、ｐＨ変性、酸、塩基、有機溶媒、カオトロピック剤、クラウディング剤、キレート剤、デタージェント、又は塩溶を用いた化学変性）にＩＶＴサンプルを付すことによって、精製を実施するが、その際、上記の変性条件は、ｌｉｎＲＮＡ及びｃｉｒｃＲＮＡ内の構造的関係を実質的に変性させる。変性条件による精製は、単独で、又は当技術分野で公知のカラムクロマトグラフィー分離技術（例えば、陰イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ミックスモードクロマトグラフィー、又はアフィニティークロマトグラフィー）と組み合わせて実施される。カラムクロマトグラフィー精製を実施する場合、ポリリボヌクレオチドを含むサンプルの変性条件への曝露は、平衡化ステップ、サンプルロードステップ、カラム洗浄ステップ、又は溶離ステップ中に実施する。この方法は、サンプル中のｌｉｎＲＮＡ分子のエキソヌクレアーゼ媒介消化を含んでも、含まなくてもよい。
【0386】
したがって、精製は、サンプルからｃｉｒｃＲＮＡの望ましい純度が達成される程度まで実施される。複数の実施形態では、ｃｉｒｃＲＮＡの濃縮集団中のｃｉｒｃＲＮＡのパーセント（ｗ／ｗ）は、サンプル中の混合ポリリボヌクレオチドの集団中のｃｉｒｃＲＮＡの２％（ｗ／ｗ）である。複数の実施形態では、ｃｉｒｃＲＮＡの濃縮集団中のｃｉｒｃＲＮＡのパーセント（ｗ／ｗ）は、サンプル中の混合ポリリボヌクレオチドの集団中のｃｉｒｃＲＮＡの３％（ｗ／ｗ）である。複数の実施形態では、ｃｉｒｃＲＮＡの濃縮集団中のｃｉｒｃＲＮＡのパーセント（ｗ／ｗ）は、サンプル中の混合ポリリボヌクレオチドの集団中のｃｉｒｃＲＮＡの４％（ｗ／ｗ）である。複数の実施形態では、ｃｉｒｃＲＮＡの濃縮集団中のｃｉｒｃＲＮＡのパーセント（ｗ／ｗ）は、サンプル中の混合ポリリボヌクレオチドの集団中のｃｉｒｃＲＮＡの５％（ｗ／ｗ）である。複数の実施形態では、ｃｉｒｃＲＮＡの濃縮集団中のｃｉｒｃＲＮＡのパーセント（ｗ／ｗ）は、サンプル中の混合ポリリボヌクレオチドの集団中のｃｉｒｃＲＮＡの６％（ｗ／ｗ）である。複数の実施形態では、ｃｉｒｃＲＮＡの濃縮集団中のｃｉｒｃＲＮＡのパーセント（ｗ／ｗ）は、サンプル中の混合ポリリボヌクレオチドの集団中のｃｉｒｃＲＮＡの７％（ｗ／ｗ）である。複数の実施形態では、ｃｉｒｃＲＮＡの濃縮集団中のｃｉｒｃＲＮＡのパーセント（ｗ／ｗ）は、サンプル中の混合ポリリボヌクレオチドの集団中のｃｉｒｃＲＮＡの８％（ｗ／ｗ）である。複数の実施形態では、ｃｉｒｃＲＮＡの濃縮集団中のｃｉｒｃＲＮＡのパーセント（ｗ／ｗ）は、サンプル中の混合ポリリボヌクレオチドの集団中のｃｉｒｃＲＮＡの９％（ｗ／ｗ）である。複数の実施形態では、ｃｉｒｃＲＮＡの濃縮集団中のｃｉｒｃＲＮＡのパーセント（ｗ／ｗ）は、サンプル中の混合ポリリボヌクレオチドの集団中のｃｉｒｃＲＮＡの１０％（ｗ／ｗ）である。複数の実施形態では、ｃｉｒｃＲＮＡの濃縮集団中のｃｉｒｃＲＮＡのパーセント（ｗ／ｗ）は、サンプル中の混合ポリリボヌクレオチドの集団中のｃｉｒｃＲＮＡの１１％（ｗ／ｗ）である。複数の実施形態では、ｃｉｒｃＲＮＡの濃縮集団中のｃｉｒｃＲＮＡのパーセント（ｗ／ｗ）は、サンプル中の混合ポリリボヌクレオチドの集団中のｃｉｒｃＲＮＡの１２％（ｗ／ｗ）である。複数の実施形態では、ｃｉｒｃＲＮＡの濃縮集団中のｃｉｒｃＲＮＡのパーセント（ｗ／ｗ）は、サンプル中の混合ポリリボヌクレオチドの集団中のｃｉｒｃＲＮＡの１３％（ｗ／ｗ）である。複数の実施形態では、ｃｉｒｃＲＮＡの濃縮集団中のｃｉｒｃＲＮＡのパーセント（ｗ／ｗ）は、サンプル中の混合ポリリボヌクレオチドの集団中のｃｉｒｃＲＮＡの１４％（ｗ／ｗ）である。複数の実施形態では、ｃｉｒｃＲＮＡの濃縮集団中のｃｉｒｃＲＮＡのパーセント（ｗ／ｗ）は、サンプル中の混合ポリリボヌクレオチドの集団中のｃｉｒｃＲＮＡの１５％（ｗ／ｗ）である。複数の実施形態では、ｃｉｒｃＲＮＡの濃縮集団中のｃｉｒｃＲＮＡのパーセント（ｗ／ｗ）は、サンプル中の混合ポリリボヌクレオチドの集団中のｃｉｒｃＲＮＡの１６％（ｗ／ｗ）である。複数の実施形態では、ｃｉｒｃＲＮＡの濃縮集団中のｃｉｒｃＲＮＡのパーセント（ｗ／ｗ）は、サンプル中の混合ポリリボヌクレオチドの集団中のｃｉｒｃＲＮＡの１７％（ｗ／ｗ）である。複数の実施形態では、ｃｉｒｃＲＮＡの濃縮集団中のｃｉｒｃＲＮＡのパーセント（ｗ／ｗ）は、サンプル中の混合ポリリボヌクレオチドの集団中のｃｉｒｃＲＮＡの１８％（ｗ／ｗ）である。複数の実施形態では、ｃｉｒｃＲＮＡの濃縮集団中のｃｉｒｃＲＮＡのパーセント（ｗ／ｗ）は、サンプル中の混合ポリリボヌクレオチドの集団中のｃｉｒｃＲＮＡの１９％（ｗ／ｗ）である。複数の実施形態では、ｃｉｒｃＲＮＡの濃縮集団中のｃｉｒｃＲＮＡのパーセント（ｗ／ｗ）は、サンプル中の混合ポリリボヌクレオチドの集団中のｃｉｒｃＲＮＡの２０％（ｗ／ｗ）である。複数の実施形態では、ｃｉｒｃＲＮＡの濃縮集団中のｃｉｒｃＲＮＡのパーセント（ｗ／ｗ）は、サンプル中の混合ポリリボヌクレオチドの集団中のｃｉｒｃＲＮＡの２１％（ｗ／ｗ）である。複数の実施形態では、ｃｉｒｃＲＮＡの濃縮集団中のｃｉｒｃＲＮＡのパーセント（ｗ／ｗ）は、サンプル中の混合ポリリボヌクレオチドの集団中のｃｉｒｃＲＮＡの２２％（ｗ／ｗ）である。複数の実施形態では、ｃｉｒｃＲＮＡの濃縮集団中のｃｉｒｃＲＮＡのパーセント（ｗ／ｗ）は、サンプル中の混合ポリリボヌクレオチドの集団中のｃｉｒｃＲＮＡの２３％（ｗ／ｗ）である。複数の実施形態では、ｃｉｒｃＲＮＡの濃縮集団中のｃｉｒｃＲＮＡのパーセント（ｗ／ｗ）は、サンプル中の混合ポリリボヌクレオチドの集団中のｃｉｒｃＲＮＡの２４％（ｗ／ｗ）である。複数の実施形態では、ｃｉｒｃＲＮＡの濃縮集団中のｃｉｒｃＲＮＡのパーセント（ｗ／ｗ）は、サンプル中の混合ポリリボヌクレオチドの集団中のｃｉｒｃＲＮＡの２５％（ｗ／ｗ）である。複数の実施形態では、ｃｉｒｃＲＮＡの濃縮集団中のｃｉｒｃＲＮＡのパーセント（ｗ／ｗ）は、サンプル中の混合ポリリボヌクレオチドの集団中のｃｉｒｃＲＮＡの２６％（ｗ／ｗ）である。複数の実施形態では、ｃｉｒｃＲＮＡの濃縮集団中のｃｉｒｃＲＮＡのパーセント（ｗ／ｗ）は、サンプル中の混合ポリリボヌクレオチドの集団中のｃｉｒｃＲＮＡの２７％（ｗ／ｗ）である。複数の実施形態では、ｃｉｒｃＲＮＡの濃縮集団中のｃｉｒｃＲＮＡのパーセント（ｗ／ｗ）は、サンプル中の混合ポリリボヌクレオチドの集団中のｃｉｒｃＲＮＡの２８％（ｗ／ｗ）である。複数の実施形態では、ｃｉｒｃＲＮＡの濃縮集団中のｃｉｒｃＲＮＡのパーセント（ｗ／ｗ）は、サンプル中の混合ポリリボヌクレオチドの集団中のｃｉｒｃＲＮＡの２９％（ｗ／ｗ）である。複数の実施形態では、ｃｉｒｃＲＮＡの濃縮集団中のｃｉｒｃＲＮＡのパーセント（ｗ／ｗ）は、サンプル中の混合ポリリボヌクレオチドの集団中のｃｉｒｃＲＮＡの３０％（ｗ／ｗ）である。複数の実施形態では、ｃｉｒｃＲＮＡの濃縮集団中のｃｉｒｃＲＮＡのパーセント（ｗ／ｗ）は、サンプル中の混合ポリリボヌクレオチドの集団中のｃｉｒｃＲＮＡの３１％（ｗ／ｗ）である。複数の実施形態では、ｃｉｒｃＲＮＡの濃縮集団中のｃｉｒｃＲＮＡのパーセント（ｗ／ｗ）は、サンプル中の混合ポリリボヌクレオチドの集団中のｃｉｒｃＲＮＡの３２％（ｗ／ｗ）である。複数の実施形態では、ｃｉｒｃＲＮＡの濃縮集団中のｃｉｒｃＲＮＡのパーセント（ｗ／ｗ）は、サンプル中の混合ポリリボヌクレオチドの集団中のｃｉｒｃＲＮＡの３３％（ｗ／ｗ）である。複数の実施形態では、ｃｉｒｃＲＮＡの濃縮集団中のｃｉｒｃＲＮＡのパーセント（ｗ／ｗ）は、サンプル中の混合ポリリボヌクレオチドの集団中のｃｉｒｃＲＮＡの３４％（ｗ／ｗ）である。複数の実施形態では、ｃｉｒｃＲＮＡの濃縮集団中のｃｉｒｃＲＮＡのパーセント（ｗ／ｗ）は、サンプル中の混合ポリリボヌクレオチドの集団中のｃｉｒｃＲＮＡの３５％（ｗ／ｗ）である。複数の実施形態では、ｃｉｒｃＲＮＡの濃縮集団は、少なくとも３５％（ｗ／ｗ）（例えば、少なくとも３６％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくはそれ以上）の量のｃｉｒｃＲＮと、６５％（ｗ／ｗ）未満（例えば、６４％、６０％、５５％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％未満、若しくはそれ以下）のｌｉｎＲＮＡ量を有する。例えば、ｃｉｒｃＲＮＡの濃縮集団中のｃｉｒｃＲＮＡのパーセント（ｗ／ｗ）は、サンプル中の混合ポリリボヌクレオチドの集団におけるｃｉｒｃＲＮＡの２倍（ｗ／ｗ）であり得る。
【0387】
実施例２：変性条件として、様々な濃度のカオトロピック剤及び塩を用いたｃｉｒｃＲＮＡの精製
様々な濃度のカオトロピック剤（この場合は、６Ｍ尿素）及び塩（この場合は、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ））が、ｃｉｒｃＲＮＡを変性させ、分離又はさらに精製する能力を評価するために、以下の実験を実施した。
様々な濃度のカオトロピック剤（この場合は、６Ｍ尿素）及び塩（この場合は、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ））が、ｃｉｒｃＲＮＡを変性させ、分離又はさらに精製する能力を評価するために、以下の実験を実施した。
【0388】
スプリントライゲーションによって生成した環状ＲＮＡを精製するために、５ｍＬのＤＥＡＥセファロースカラムを使用した。カラムを５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７で平衡化及び洗浄し、環状ＲＮＡをロードした。カラムは、３００ｍＭ ＮａＣｌ、７００ｍＭ ＮａＣｌ、１Ｍ ＮａＣｌ、３Ｍ ＮａＣｌの段階溶離、又は３００ｍＭ ＮａＣｌ＋０．６Ｍ尿素、７００ｍＭ ＮａＣｌ＋１．５Ｍ尿素、１Ｍ ＮａＣｌ＋１．８Ｍ尿素、及び３Ｍ ＮａＣｌ＋６Ｍ尿素での尿素による段階溶離で溶離した。関連画分をプールし、得られた濃縮物をＰＡＧＥにより分析した。データを表２に示す。尿素を含まないクロマトグラムを図１に示す。５８．００ｍＬに示されるピークは、ｃｉｒｃＲＮＡであり、他のピークは全て不純物である。尿素が存在するクロマトグラムを図２に示すが、これは、尿素が存在する段階溶離を表している。５６．８９ｍＬに示されるピークは、ｃｉｒｃＲＮＡであり、他のピークは全て不純物である。
【0389】
【表2】
【0390】
両精製前に、出発物質の純度は、ＰＡＧＥ法によりそれぞれ測定したｃｉｒｃＲＮＡ及びｌｉｎＲＮＡのパーセンテージについて、４４．６％及び５５．４％であった。尿素が存在しない場合、ｃｉｒｃＲＮＡの純度は、５６．４％であり、ｌｉｎＲＮＡの純度は、４３．６％であった。６Ｍ尿素を添加すると、ｃｉｒｃＲＮＡ及びｌｉｎＲＮＡの純度は、それぞれ６５．９及び３４．１％となった。１ｍＬ～８Ｌ若しくはそれ以上のカラム容量でのスケーラブルなプロセスを開発する目的で、定濃度の尿素の純度向上を理解するために以下の精製を実施した。
【0391】
実施例３：カオトロピック剤と高塩変性条件によるＣｉｒｃＲＮＡの精製
様々な濃度のカオトロピック剤（この場合は、６Ｍ尿素）及び塩（この場合は、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ））が、ｃｉｒｃＲＮＡを変性させ、分離又はさらに精製する能力を評価するために、以下の実験を実施した。
様々な濃度のカオトロピック剤（この場合は、６Ｍ尿素）及び塩（この場合は、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ））が、ｃｉｒｃＲＮＡを変性させ、分離又はさらに精製する能力を評価するために、以下の実験を実施した。
【0392】
環状ＲＮＡを精製するために、８ｍＬのＤＥＡＥモノリスカラムを６Ｍ尿素の存在下で使用した。
【0393】
ライゲーション後に洗浄していない環状ＲＮＡ約２００ｍｇ／ｍＬ、ｐＨ７に対して、実験を実施した。サンプルは、最終濃度を３Ｍ尿素までサンプルバッファー（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ７．０、６Ｍ尿素、１０ｍＭ ＥＤＴＡ）で１：１に希釈し、７．５ｍｇを８ｍＬカラムにロードした。サンプルロード後、カラムを５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．０、６Ｍ尿素、５ｍＭ ＥＤＴＡで平衡化及び洗浄し、１００％の５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣＬ ｐＨ７．０、６Ｍ尿素、１Ｍ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡまでの２０ＣＶ線形グラジエント、続いて１００％の５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣＬ ｐＨ７．０、６Ｍ尿素、３Ｍ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡまでの１０ＣＶ線形グラジエントで溶離した。再平衡化の前に１Ｍ ＮａＯＨでカラムを洗浄した。図３に示すように、クロマトグラムを評価し、ピークをプールした。ＰＡＧＥにより、ロード物質と比較した純度のために２００ｎｇを定量し、以下の表３に表示する。
【0394】
【表3】
【0395】
ＰＡＧＥによる出発物質ｃｉｒｃＲＮＡ純度パーセントは、４７％であり、すぐ上に記載した条件を用いて精製した後、ｃｉｒｃＲＮＡ純度は、５８．％であった。
【0396】
バッファーのｐＨが、ｐＨ８．０であることを除き、ＢＩＡ分離からのＱＡ８ｍＬモノリスカラムについて、すぐ上に記載したのと同じ実験条件を実施した。ＰＡＧＥにより測定した純度を記録し、表４に示す。図４は、７ｍｇのｃｉｒｃＲＮＡ ＩＶＴ出発物質の精製を示す。図５において、１３６．８９ｍＬでのピークは不純物であり、ｃｉｒｃＲＮＡピークは、それぞれ２４２．４３ｍＬでクロマトグラムに示されている。
【0397】
【表4】
【0398】
インプットされた出発物質又はロードは、６ＰＡＧＥにより定量された４９％のｃｉｒｃＲＮＡである。画分Ｂ４内に溶出したｃｉｒｃＲＮＡは、ｃｉｒｃＲＮＡについては純度６２％であり、画分Ｂ５については純度６４％である。
【0399】
実施例４：高塩、高ｐＨ、キレート剤、及びカオトロピック剤変性条件によるｃｉｒｃＲＮＡの精製
２つ以上の変性条件がｃｉｒｃＲＮＡを変性させ、分離又はさらに精製する能力を評価するために、以下の実験を行った。
２つ以上の変性条件がｃｉｒｃＲＮＡを変性させ、分離又はさらに精製する能力を評価するために、以下の実験を行った。
【0400】
インビトロ転写後の２８ｍｇ／ｍＬ（Ｑｕｉｂｉｔにより約５６ｍｇ）のｃｉｒｃＲＮＡ、２ｍＬを水で９ｍＬまで希釈した後、１：１サンプルバッファー（ｐＨ７．０、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、６Ｍ尿素、１０ｍＭ ＥＤＴＡ）で１８ｍＬまで希釈した。サンプルを水素結合及び陰イオン交換を用いた８ｍＬカラムにロードした。カラムを５０ｍＭ重炭酸ｐＨ７．０、６Ｍ尿素、５ｍＭ ＥＤＴＡで平衡化及び洗浄し、１００％の５０ｍＭ重炭酸ｐＨ１０．０、６Ｍ尿素、５ｍＭ ＥＤＴＡ、１Ｍ ＮａＣｌまで２０ＣＶ線形グラジエントを、続いて、１００％の５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ１０．０、６Ｍ尿素、５ｍＭ ＥＤＴＡ、３Ｍ ＮａＣまで１０ＣＶ線形グラジエントを適用した。再平衡化の前に、カラムを０．１Ｍ ＮａＯＨ ３Ｍ ＮａＣｌ及び０．１Ｍ酢酸 ３Ｍ ＮａＣｌで洗浄した。クロマトグラムの結果を図５に示す。
【0401】
【表5】
【0402】
ＰＡＧＥ定量により、ロードｃｉｒｃＲＮＡ％は６０％、線状については３７％であった。ＰＡＧＥにより、２６３．２２ｍＬでのピークは、６２．９１％のｃｉｒｃＲＮＡ純度及び３５．１９％のｌｉｎＲＮＡ純度を含んでいた。他のピークは全て不純物である。
【0403】
実施例５：高塩、キレート剤、温度及びカオトロピック剤変性条件によるｃｉｒｃＲＮＡの精製
２つ以上の変性条件が、ｃｉｒｃＲＮＡを変性させ、分離又はさらに精製する能力を評価するために、変性条件として、高塩、キレート剤、温度、及びカオトロピック剤（この場合は尿素）を用いて以下の実験を行った。
２つ以上の変性条件が、ｃｉｒｃＲＮＡを変性させ、分離又はさらに精製する能力を評価するために、変性条件として、高塩、キレート剤、温度、及びカオトロピック剤（この場合は尿素）を用いて以下の実験を行った。
【0404】
ｃｉｒｃＲＮＡ、ｌｉｎＲＮＡ、又は他の不純物若しくは副産物（例えば、本明細書に記載の不純物又は副産物）を含むポリリボヌクレオチドの混合集団を含むサンプルに対して、ＨＩＣ精製を用いて実験を行った。３Ｍ ＮａＣｌの存在下、サンプル中で精製を実施した後、３Ｍ ＮａＣｌ、６Ｍ尿による溶離、その直後に０Ｍ ＮａＣｌ、６Ｍ尿素、次いで直ちに０Ｍ ＮａＣｌ、０Ｍ尿素による追加のステップ溶離が続き、これらは、全て５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０、５ｍＭ ＥＤＴＡのベースバッファーを含む同じカラム及びサンプルロードに対して同じラン工程中に順次実施した。３Ｍ ＮａＣｌ、５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０、５ｍＭ ＥＤＴＡの存在下、２．１７ｍｇ／ｍＬ（カラム容量）の環状ＲＮＡについて、以下の条件を試験した：室温、５０℃、６０℃及び７５℃でそれぞれ１０分間経過した後、１ｍＬブチル高リガンド密度（ＨＬＤ）ＨＩＣカラムに室温でサンプルをロードする。
【0405】
図６、図７、及び表６は、１ｍＬのＣ４ ＨＬＤカラムを用いた環状ＲＮＡの精製後の結果を示しており、このカラムでは、サンプルを前述したように２０℃で１０分間インキュベートした後、２．１７ｍｇをカラムにロードした。
【0406】
【表6】
【0407】
最初のゲルのインプット出発物質は、６１．５％ｃｉｒｃＲＮＡであった。フロースルー（ＦＴ）には、ＲＮＡはほとんど含まれておらず、ＲＮＡの大部分はカラムに結合した。画分３．Ｃ．６～３．Ｃ．１２を含む５８．５２ｍＬの最初の溶出ピークは、どの画分を試験したかに応じて、ＰＡＧＥによる５８．０～７１．２％ｃｉｒｃＲＮＡ純度のｃｉｒｃＲＮＡ純度範囲を有した。画分３．Ｅ．１及び３．Ｅ．２を含む８８．４０ｍＬの２番目の溶出ピークは、ＰＡＧＥによる６３．７％及び６０．４％のｃｉｒｃＲＮＡ純度をそれぞれ含んだ。
【0408】
実施例６：高温、カオトロピック剤、有機溶媒、高塩変性条件によるｃｉｒｃＲＮＡの精製
２つ以上の変性条件が、ｃｉｒｃＲＮＡを変性させ、分離又はさらに精製する能力を評価するために、以下の実験を行った。
２つ以上の変性条件が、ｃｉｒｃＲＮＡを変性させ、分離又はさらに精製する能力を評価するために、以下の実験を行った。
【0409】
ｃｉｒｃＲＮＡとｌｉｎＲＮＡの混合物を含むＩＶＴ ＲＮＡのサンプル１０ｍｇを陰イオン交換オリゴヌクレオチドカラムにロードし、インラインフローヒーターを用いて、８０℃で精製全体を実施した。平衡化及び洗浄のためのカラム条件は、２０ｍＭビス－トリスプロパン、６Ｍ尿素、２０％ＡＣＮ、ｐＨ７．０であり、２０ｍＭビス－トリスプロパン、６Ｍ尿素、１Ｍ ＮａＣｌ、２０％ＡＣＮ、ｐＨ７．０までの３０％～６０％及び６ＣＶ線形グラジエントにより、サンプルを溶離した。図８に示すクロマトグラムを収集し、ｃｉｒｃＲＮＡをＰＮ：７、また線状ＲＮＡをＰＮ：８及びＰＮ：９と表記した。結果を表７に示す。
【0410】
【表7】
【0411】
ｃｉｒｃＲＮＡを含む画分７、８及び９は、ＨＰＬＣ分析法により、それぞれ５７％、９６％、及び９４％のｃｉｒｃＲＮＡ純度で、０．５ｍｇ、１．５ｍｇ及び０．９ｍｇの物質が得られた。画分１０、１１、及び１２を含むｌｉｎＲＮＡピークは、ＨＰＬＣ分析法によりそれぞれ８％、２％及び２％のｃｉｒｃＲＮＡ純度で０．４、０．７、及び０．６ｍｇの物質を含んだ。
【0412】
画分８及び９のＨＰＬＣ分析結果を図９に示す。
【0413】
画分１０、１１、及び１２のＨＰＬＣ分析結果を図１０に示す。
【0414】
実施例７：様々な温度、キレート剤、カオトロピック剤変性条件を用いたｃｉｒｃＲＮＡの精製
本実施例では、ｌｉｎＲＮＡ、及びその他の不純物又は副産物からｃｉｒｃＲＮＡを分離する際の変性条件として、温度、キレート剤、カオトロピック剤の使用を実証するが、この場合、０．５Ｍグアニジン－ＨＣｌが実験を通して存在する。
本実施例では、ｌｉｎＲＮＡ、及びその他の不純物又は副産物からｃｉｒｃＲＮＡを分離する際の変性条件として、温度、キレート剤、カオトロピック剤の使用を実証するが、この場合、０．５Ｍグアニジン－ＨＣｌが実験を通して存在する。
【0415】
０．１ｍｌ ＱＡモノリスカラムを使用し、５℃のオートサンプラー内でＩＶＴにより生成したｃｉｒｃＲＮＡサンプルを、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、６Ｍ尿素、５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８で平衡化したカラムに注入した。１００％の５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、６Ｍ尿素、５ｍＭ ＥＤＴＡ、１Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ８までの線形グラジエントでカラムを溶離し、それぞれ図１１及び図１２に示すように、４５℃、５５℃、６５℃、７５℃及び８５℃（８５℃のクロマトグラフィー曲線は図示していない）、１ｍｌ／分で実施した。クロマトグラム内に表示された各番号は、分析のためにＰＡＧＥにロードされたサンプルに対応する。
【0416】
実施例８：高温及び有機溶媒変性条件を用いたｃｉｒｃＲＮＡの精製
２つ以上の変性条件が、ｃｉｒｃＲＮＡを変性させ、分離又はさらに精製する能力を評価するために、以下の実験を行った。
２つ以上の変性条件が、ｃｉｒｃＲＮＡを変性させ、分離又はさらに精製する能力を評価するために、以下の実験を行った。
【0417】
この方法では、温度及び有機溶媒変性条件を用いてｃｉｒｃＲＮＡとｌｉｎＲＮＡを分離するために、イオンペア逆相ＨＰＬＣを使した。ｃｉｒｃＲＮＡ／ｌｉｎＲＮＡのサンプルを陰イオン交換オリゴヌクレオチドカラム（例えば、ＤＮＡＰａｃ ＰＡ２００オリゴヌクレオチドカラム）に注入した。初期クロマトグラフィー条件は、５３％移動相Ａ（水中１００ｍＭ ＴＥＡＡ）及び４７％移動相Ｂ（２５％アセトニトリル水溶液中１００ｍＭ ＴＥＡＡ）であった。ラン工程中、カラムを７５℃に加熱した。ｃｉｒｃＲＮＡ及びｌｉｎＲＮＡの溶離は、表８に従って行った。図１３は、例示的なクロマトグラム結果を示す。
【0418】
【表8】
【0419】
実施例９：様々なｐＨ変性条件を用いたＣｉｒｃＲＮＡの精製
本実施例では、ｌｉｎＲＮＡ、及び他の不純物又は副産物からｃｉｒｃＲＮＡを分離する際の変性条件としてのｐＨの使用について説明する。５未満（例えば、４．５、４、３．５、３、２．５、２、１．５、１、若しくは１未満）又は９超（例えば、９．５、１０、１０．５、１１、１１．５、１２、１２．５、１３、若しくは１３超）の変性ｐＨ条件を試験する。
本実施例では、ｌｉｎＲＮＡ、及び他の不純物又は副産物からｃｉｒｃＲＮＡを分離する際の変性条件としてのｐＨの使用について説明する。５未満（例えば、４．５、４、３．５、３、２．５、２、１．５、１、若しくは１未満）又は９超（例えば、９．５、１０、１０．５、１１、１１．５、１２、１２．５、１３、若しくは１３超）の変性ｐＨ条件を試験する。
【0420】
実施例１０：塩及び様々ｐＨ変性条件を用いたｃｉｒｃＲＮＡの精製
本実施例では、ｌｉｎＲＮＡ、及び他の不純物又は副産物からｃｉｒｃＲＮＡを分離する際の、様々なｐＨ及び塩溶液変性条件の使用について説明する。
本実施例では、ｌｉｎＲＮＡ、及び他の不純物又は副産物からｃｉｒｃＲＮＡを分離する際の、様々なｐＨ及び塩溶液変性条件の使用について説明する。
【0421】
試験しようとする塩は、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ、ＣａＣｌ、ＣｓＳＯ４、ＮａＳＯ４、ＬｉＣｌ、及び／又はＬｉＢｒである。１００ｍＭ～１Ｍの変性塩溶液濃度を、５未満（例えば、４．５、４、３．５、３、２．５、２、１．５、１、若しくは１未満）又は９超（例えば、９．５、１０、１０．５、１１、１１．５、１２、１２．５、１３、若しくは１３超）の変性ｐＨ条件と共に試験する。試験しようとする塩溶液及び／又はｐＨ条件は、洗浄ステップで添加するか、精製前のサンプルに直接添加するか、又は平衡化バッファー又は溶出バッファーに添加する。
【0422】
実施例１１：有機溶媒変性条件を用いたｃｉｒｃＲＮＡの精製
本実施例では、ｌｉｎＲＮＡ、及び他の不純物又は副産物からｃｉｒｃＲＮＡを分離する際の変性条件としての有機溶媒の使用について説明する。少なくとも１０％（ｖ／ｖ）の変性有機溶媒濃度を試験する。試験対象の有機溶媒としては、ジメチルスルホキシド、酢酸トリエチルアンモニウム、メタノール、エタノール、２－プロパノール、イソプロパノール、１－ブタノール、２－ブタノール、ｔ－ブタノール、イソブタノール、フェノール、クロロホルム、ヘキサン、アセトニトリル、ホルムアミド、アセトン、デナトニウム、及び／又はプロピレングリコールが挙げられる。試験しようとする有機溶媒は、洗浄ステップで添加するか、精製前のサンプルに直接添加するか、又は平衡化バッファー又は溶出バッファーに添加する。
本実施例では、ｌｉｎＲＮＡ、及び他の不純物又は副産物からｃｉｒｃＲＮＡを分離する際の変性条件としての有機溶媒の使用について説明する。少なくとも１０％（ｖ／ｖ）の変性有機溶媒濃度を試験する。試験対象の有機溶媒としては、ジメチルスルホキシド、酢酸トリエチルアンモニウム、メタノール、エタノール、２－プロパノール、イソプロパノール、１－ブタノール、２－ブタノール、ｔ－ブタノール、イソブタノール、フェノール、クロロホルム、ヘキサン、アセトニトリル、ホルムアミド、アセトン、デナトニウム、及び／又はプロピレングリコールが挙げられる。試験しようとする有機溶媒は、洗浄ステップで添加するか、精製前のサンプルに直接添加するか、又は平衡化バッファー又は溶出バッファーに添加する。
【0423】
実施例１２：デタージェント変性条件を用いたＣｉｒｃＲＮＡの精製
本実施例では、ｌｉｎＲＮＡ、及び他の不純物又は副産物からｃｉｒｃＲＮＡを分離する際の変性条件としてのデタージェントの使用について説明する。試験しようとするデタージェントとしては、ノニデット（登録商標）（Ｎｏｎｉｄｅｔ）Ｐ－４０（ＮＰ４０）、ポリソルベート（例えば、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）－２０、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）－４０、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）－６０、又はＴｗｅｅｎ（登録商標）－８０）、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標） Ｘ １００、ＣＨＡＰＳ、オクチルβ－Ｄ－グルコピラノシド、及び／又はｎ－ドデシルβ－マルトシドが挙げられ、濃度は、０．００００１％～２０％の範囲である。試験しようとするデタージェントは、洗浄ステップで添加するか、精製前のサンプルに直接添加するか、又は平衡化バッファー又は溶出バッファーに添加する。
本実施例では、ｌｉｎＲＮＡ、及び他の不純物又は副産物からｃｉｒｃＲＮＡを分離する際の変性条件としてのデタージェントの使用について説明する。試験しようとするデタージェントとしては、ノニデット（登録商標）（Ｎｏｎｉｄｅｔ）Ｐ－４０（ＮＰ４０）、ポリソルベート（例えば、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）－２０、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）－４０、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）－６０、又はＴｗｅｅｎ（登録商標）－８０）、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標） Ｘ １００、ＣＨＡＰＳ、オクチルβ－Ｄ－グルコピラノシド、及び／又はｎ－ドデシルβ－マルトシドが挙げられ、濃度は、０．００００１％～２０％の範囲である。試験しようとするデタージェントは、洗浄ステップで添加するか、精製前のサンプルに直接添加するか、又は平衡化バッファー又は溶出バッファーに添加する。
【0424】
実施例１３：変性条件下での分析方法
本実施例は、分析方法における変性条件の使用を実証するものである。
本実施例は、分析方法における変性条件の使用を実証するものである。
【0425】
分析陰イオン交換（ＡＥＸ）ＨＰＬＣ－ＵＶ法は、ｌｉｎＲＮＡからｃｉｒｃＲＮＡを分離することが可能であり、したがって、ｌｉｎＲＮＡの存在下でｃｉｒｃＲＮＡサンプルの純度を決定するのに適していることが実証された。
【0426】
この方法では、ｃｉｒｃＲＮＡサンプルを陰イオン交換オリゴヌクレオチドカラム（例えば、ＤＮＡＰａｃ ＰＡ２００オリゴヌクレオチドカラム）に注入した。初期クロマトグラフィー条件は、８５％移動相Ａ（２０ｍＭ Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ、６Ｍ尿素、ｐＨ７．０）と１５％移動相Ｂ（２０ｍＭ Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ、６Ｍ尿素、１Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．０）であった。ラン工程中、カラムを８０℃に加熱した。ｃｉｒｃＲＮＡ及びｌｉｎＲＮＡの溶離は、１０％移動相Ａ／９０％移動相Ｂまでのグラジエントを用いて行った。
【0427】
図１４は、続いて２回の水注入を伴う水中濃度０．２２２３ｍｇ／ｍＬのｃｉｒｃＲＮＡの例示的なクロマトグラムである。
【0428】
実施例１４：変性条件下での分析方法
本実施例は、分析方法における変性条件の使用を示す。
本実施例は、分析方法における変性条件の使用を示す。
【0429】
実施例９で前述した分析方法を、移動相に濃度２０％の有機変性剤アセトニトリルを添加することによりさらに変更した。その他の変更には、移動相の緩衝能を向上させるための緩衝塩の変更が含まれる。
【0430】
具体的には、ｃｉｒｃＲＮＡサンプルを陰イオン交換オリゴヌクレオチドカラムに注入した。サンプルは、変性剤（例えば、ＤＭＳＯ）を用いた希釈により調製するか、又は移動相Ａ（２０ｍＭビス－トリスプロパン、６Ｍ尿素、ｐＨ７．０）に直接希釈した後、注入した。初期クロマトグラフィー条件は、８５％移動相Ａ及び１５％移動相Ｂ（２０ｍＭビス－トリスプロパン、６Ｍ尿素、１Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．０）であった。ラン工程中、カラムを８０℃に加熱した。ｃｉｒｃＲＮＡ及びｌｉｎＲＮＡの溶離は、１０％移動相Ａ（２０ｍＭ Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ、６Ｍ尿素、ｐＨ７．０）及び９０％移動相Ｂ（２０ｍＭ Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ、６Ｍ尿素、１Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．０）までのグラジエントを用いて実施した。図１５は、ブランク注入のクロマトグラムを示す。ｃｉｒｃＲＮＡ及びｌｉｎＲＮＡ標準物質は、図１６に示すように別々のピークを示した。
【0431】
その他の実施形態
上記の明細書に挙げた全ての刊行物、特許、及び特許出願は、個々の刊行物、特許、又は特許出願が、参照によりその全体が組み込まれることが具体的且つ個別に示されている場合と同じ程度に、参照により本明細書に組み込まれる。記載される本発明の方法、医薬組成物、及びキットの様々な変更及び変形は、本発明の範囲及び種子から逸脱することなく、当業者には明らかであろう。本発明を特定の実施形態に関連して説明してきたが、本発明はさらなる変更が可能であり、特許請求される本発明がそのような特定の実施形態に不当に限定されるべきではないことが理解されるであろう。実際、当業者には自明である、本発明を実施するための記載された態様の様々な変更は、本発明の範囲に含まれることが意図される。本出願は、一般に、本発明の原理に従い、本発明のあらゆる変形、使用、又は適応を対象とすることを意図しており、これらは、本開示からのそうした逸脱を含め、本発明が関係する技術分野において周知の慣例の範囲内にあり、本明細書に記載の本質的特徴に適用され得る。
上記の明細書に挙げた全ての刊行物、特許、及び特許出願は、個々の刊行物、特許、又は特許出願が、参照によりその全体が組み込まれることが具体的且つ個別に示されている場合と同じ程度に、参照により本明細書に組み込まれる。記載される本発明の方法、医薬組成物、及びキットの様々な変更及び変形は、本発明の範囲及び種子から逸脱することなく、当業者には明らかであろう。本発明を特定の実施形態に関連して説明してきたが、本発明はさらなる変更が可能であり、特許請求される本発明がそのような特定の実施形態に不当に限定されるべきではないことが理解されるであろう。実際、当業者には自明である、本発明を実施するための記載された態様の様々な変更は、本発明の範囲に含まれることが意図される。本出願は、一般に、本発明の原理に従い、本発明のあらゆる変形、使用、又は適応を対象とすることを意図しており、これらは、本開示からのそうした逸脱を含め、本発明が関係する技術分野において周知の慣例の範囲内にあり、本明細書に記載の本質的特徴に適用され得る。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【国際調査報告】