特表 2024-546865 Ｎ末端及び／又はＣ末端が切断された可溶性ＰＨ２０ポリペプチド及びその用途

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-12-26

(54)【発明の名称】Ｎ末端及び／又はＣ末端が切断された可溶性ＰＨ２０ポリペプチド及びその用途

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/55 20060101AFI20241219BHJP

   C12N 9/26 20060101ALI20241219BHJP

   C12P 21/02 20060101ALI20241219BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20241219BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20241219BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20241219BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20241219BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20241219BHJP

【ＦＩ】

C12N15/55

C12N9/26 Z ZNA

C12P21/02 A

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

C12N15/63 Z

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024535481

(86)(22)【出願日】2023-06-21

(85)【翻訳文提出日】2024-06-13

(86)【国際出願番号】 KR2023008621

(87)【国際公開番号】W WO2023249408

(87)【国際公開日】2023-12-28

(31)【優先権主張番号】10-2022-0076030

(32)【優先日】2022-06-22

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】517432732

【氏名又は名称】アルテオジェン・インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100139594

【弁理士】

【氏名又は名称】山口 健次郎

(72)【発明者】

【氏名】パク スンジェ

(72)【発明者】

【氏名】キム ギュワン

(72)【発明者】

【氏名】ユン サンフン

(72)【発明者】

【氏名】ソン ヒュンナム

【テーマコード（参考）】

4B064

4B065

【Ｆターム（参考）】

4B064AG01

4B064CA02

4B064CA05

4B064CA06

4B064CA10

4B064CA11

4B064CA19

4B064CC24

4B064CE10

4B064DA01

4B065AA01X

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4B065AA91X

4B065AA93X

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065CA44

(57)【要約】

成熟した動物野生型ＰＨ２０のＮ末端において１個～７個のアミノ酸残基が欠失した組換えＰＨ２０ポリペプチド及びその用途を提供する。本発明で提示する酵素活性及び生産性が増加したＮ末端及び／又はＣ末端が欠失したＰＨ２０ポリペプチドは、既存の組換えＰＨ２０ポリペプチドに比べて優れた発現量と酵素活性を示し、産業上の利用時に生産コストの低減による治療費用の減少をもたらし得る。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

成熟した動物野生型ＰＨ２０のＮ末端において１個～７個のアミノ酸残基が欠失した組換えＰＨ２０ポリペプチド。

【請求項2】

（ａ）配列番号１のアミノ酸配列を有するヒト野生型ＰＨ２０のうち、Ｎ３７～Ｐ４２からなる群から選ばれるアミノ酸残基の前で切断されてＮ末端のアミノ酸残基が欠失した、組換えＰＨ２０ポリペプチド；
（ｂ）配列番号２～配列番号８のいずれか一つのアミノ酸配列を有する霊長類野生型ＰＨ２０のうち、Ｎ３７～Ｐ４２からなる群から選ばれるアミノ酸残基の前で切断されてＮ末端のアミノ酸残基が欠失した、組換えＰＨ２０ポリペプチド；
（ｃ）配列番号９のアミノ酸配列を有するウシ野生型ＰＨ２０のうち、Ｄ３７～Ｐ４２からなる群から選ばれるアミノ酸残基の前で切断されてＮ末端のアミノ酸残基が欠失した、組換えＰＨ２０ポリペプチド；及び
（ｄ）配列番号１０のアミノ酸配列を有するヒツジ野生型ＰＨ２０のうち、Ｄ３７～Ｐ４２からなる群から選ばれるアミノ酸残基の前で切断されてＮ末端のアミノ酸残基が欠失した、組換えＰＨ２０ポリペプチド；
からなる群から選ばれることを特徴とする、請求項１に記載の組換えＰＨ２０ポリペプチド。

【請求項3】

配列番号１のアミノ酸配列のうち、Ｎ３７、Ｆ３８、Ｒ３９、Ａ４０、Ｐ４１、Ｐ４２で始まる配列を含む、請求項１に記載の組換えＰＨ２０ポリペプチド。

【請求項4】

配列番号１のアミノ酸配列のうち、Ｎ３７又はＦ３８で始まる配列を含む、請求項１に記載の組換えＰＨ２０ポリペプチド。

【請求項5】

Ｃ末端における一部のアミノ酸残基がさらに欠失した、請求項１に記載の組換えＰＨ２０ポリペプチド。

【請求項6】

配列番号１のアミノ酸配列においてＦ４６８～Ｙ４８２からなる群から選ばれるアミノ酸残基の次で切断されてＣ末端のアミノ酸残基が欠失したことを特徴とする、請求項５に記載の組換えＰＨ２０ポリペプチド。

【請求項7】

配列番号１のアミノ酸配列のうち、Ｆ４６８又はＹ４８２で終わる配列を含む、請求項６に記載の組換えＰＨ２０ポリペプチド。

【請求項8】

次に構成された群から選ばれることを特徴とする、請求項１に記載の組換えＰＨ２０ポリペプチド：
（１）配列番号１のアミノ酸配列のうちＮ３７で始まり、Ｙ４８２で終わる配列（Ｎ３７－Ｙ４８２）を含むＰＨ２０ポリペプチド；
（２）配列番号１のアミノ酸配列のうちＮ３７で始まり、Ｆ４６８で終わる配列（Ｎ３７－Ｆ４６８）を含むＰＨ２０ポリペプチド；
（３）配列番号１のアミノ酸配列のうちＦ３８で始まり、Ｙ４８２で終わる配列（Ｆ３８－Ｙ４８２）を含むＰＨ２０ポリペプチド；
（４） 配列番号１のアミノ酸配列のうちＦ３８で始まり、Ｆ４６８で終わる配列（Ｆ３８－Ｙ４６８）を含むＰＨ２０ポリペプチド；
（５）配列番号２～配列番号８のいずれか一つのアミノ酸配列のうちＮ３７で始まり、Ｌ４９０で終わる配列（Ｎ３７－Ｌ４９０）を含むＰＨ２０ポリペプチド；
（６）配列番号２～配列番号８のいずれか一つのアミノ酸配列のうちＦ３８で始まり、Ｌ４９０で終わる配列（Ｆ３８－Ｌ４９０）を含むＰＨ２０ポリペプチド；
（７）配列番号９のアミノ酸配列のうちＤ３７で始まり、Ｈ４７８で終わる配列（Ｄ３７－Ｈ４７８）を含むＰＨ２０ポリペプチド；
（８）配列番号９のアミノ酸配列のうちＦ３８で始まり、Ｈ４７８で終わる配列（Ｆ３８－Ｈ４７８）を含むＰＨ２０ポリペプチド；
（９）配列番号１０のアミノ酸配列のうちＤ３７で始まり、Ｈ４７７で終わる配列（Ｄ３７－Ｈ４７７）を含むＰＨ２０ポリペプチド；
（１０）配列番号１０のアミノ酸配列のうちＦ３８で始まり、Ｈ４７７で終わる配列（Ｆ３８－Ｈ４７７）を含むＰＨ２０ポリペプチド；
（１１）配列番号１０のアミノ酸配列のうちＲ３９で始まり、Ｈ４７７で終わる配列（Ｒ３９－Ｈ４７７）を含むＰＨ２０ポリペプチド；及び
（１２）配列番号１０のアミノ酸配列のうちＡ４０で始まり、Ｈ４７７で終わる配列（Ａ４０－Ｈ４７７）を含むＰＨ２０ポリペプチド。

【請求項9】

請求項１～８のいずれか一項に記載の組換えＰＨ２０ポリペプチドをコードする核酸。

【請求項10】

請求項９に記載の核酸を含む組換え発現ベクター。

【請求項11】

請求項１０に記載の組換え発現ベクターで形質転換された宿主細胞。

【請求項12】

動物細胞、植物細胞、酵母、大腸菌及び昆虫細胞からなる群から選ばれるものであることを特徴とする、請求項１１に記載の宿主細胞。

【請求項13】

請求項１２に記載の宿主細胞を培養する段階を含む、組換えＰＨ２０ポリペプチドの製造方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、Ｎ末端及び／又はＣ末端が切断された可溶性ＰＨ２０ポリペプチド及びその用途に関する。

【背景技術】

【0002】

遺伝工学的な方法を用いて産業的に有用なタンパク質を生産する際に、組換え細胞内で或いは組換え細胞から分泌されるタンパク質の発現量を増やそうとする試みは続いてきた。既存に通常の様々な方法が試みられたし、それぞれの方法はそれなりの長短所がある。例えば、クローニング段階でプロモーター（Ｐｒｏｍｏｔｅｒ）を適切に選択する方案が普遍的に用いられている。しかし、この場合には、タンパク質折り畳み（ｆｏｌｄｉｎｇ）が細胞内で律速段階（ｒａｔｅ ｌｉｍｉｔｉｎｇ ｓｔｅｐ）であれば、使用するプロモーターによって組換えタンパク質の発現量が予測した通りに増加しない場合が多い（Ｓｕ Ｘｉａｏ等、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｓｔｒｕｃｔ Ｂｉｏｌ．２０１４，Ｊｕｎｅ３２－３８．）。

【0003】

細胞外に分泌されるタンパク質の発現量を高めるために、発現しようとするタンパク質のＮ末端に位置する固有のシグナルペプチドを他のタンパク質のシグナルペプチドで置換し、タンパク質の発現を増やす方法も用いられた（Ｋｏｂｅｒ，Ｌ．，Ｚｅｈｅ，Ｃ．＆ Ｂｏｄｅ，Ｊ．，２０１３．Ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ Ｓｉｇｎａｌ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｉｇｈ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ＣＨＯ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅｓ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，１１０（４）、ｐｐ．１１６４－１１７３．）。この場合、タンパク質発現がそれ自体のシグナルペプチドを使用した時に比べてより増加する場合もあるが、たまにはタンパク質が発現して細胞内の小胞体（Ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ Ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ）の細胞膜を通過しながらシグナルペプチダーゼによって切断される時にシグナルペプチドと成熟したタンパク質のＮ末端アミノ酸との間を正確に切断できない場合が発生することもある。

【0004】

タンパク質の発現量を高めるための他の試みとしては、発現させようとするタンパク質とシャペロン（Ｃｈａｐｅｒｏｎｅ）を共に発現させることにより、組換えタンパク質の折り畳み（ｆｏｌｄｉｎｇ）を助けるとともに、発現するタンパク質が凝集（ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ）することを防ぎ、発現量を増やす方法などがある。しかしながら、この方法は、膜結合シャペロン（ｍｅｍｂｒａｎｅ ｂｏｕｎｄ Ｃｈａｐｅｒｏｎｅ）を同時に組換え細胞内で発現させなければならない技術的な問題、及びシャペロン発現による細胞内での生理学的な問題などから、産業的にはよく使用されない。

【0005】

タンパク質の発現量を高めるためのさらに他の試みとしては、組換えタンパク質の特定部位に部位特異的突然変異（Ｓｉｔｅ Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）を起こしてアミノ酸を置換することによって発現量を増加させる方法がある。ポリペプチドで構成されたタンパク質は、細胞内で生産される時に折り畳みによって３次構造を有するが、タンパク質の特定部位のアミノ酸を他のアミノ酸で置換することによって折り畳みに有利な状況を作り、続いて、これはタンパク質の発現量の増加につながり得る。この場合、多くの成功事例もあるが、アミノ酸修飾による免疫原性（ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ）増加の虞などの現実的な問題を抱えている。

【0006】

ヒアルロナン（ヒアルロン酸：ＨＡ）は、多くの細胞の細胞外基質、特に、軟結合組織内で発見されるポリペプチドである。ヒアルロナンは、また、哺乳動物の皮膚、軟骨及び潤滑液（ｓｙｎｏｖｉａｌ ｆｌｕｉｄ）から主に発見される。また、ヒアルロナンは目の硝子体液の主要な構成要素である。ヒアルロナンは水と血漿タンパク質の恒常性におけるような各種の生理過程で働く（Ｌａｕｒｅｎｔ ＴＣ等（１９９２） ＦＡＳＥＢ Ｊ６：２３９７－２４０４）。特定の疾患は、ヒアルロナンの発現及び／又は生産と関連がある。ヒアルロニダーゼは、ヒアルロナンを分解する酵素である。ヒアルロナンの加水分解を触媒することにより、ヒアルロニダーゼは、ヒアルロナン又は他のグリコサミノグリカンの蓄積に関連した疾患又は障害を治療することに使われてよい。また、ヒアルロナンは、皮下又は障壁の主な成分であるため、ヒアルロニダーゼは組織透過性を増加させ、したがって、皮下注射時に治療薬剤の分散及び伝達を増加させるために使用されてよい。

【0007】

天然型ＰＨ２０ポリペプチドに基づく様々なヒアルロニダーゼ（例えば、ハイダーゼ（Ｈｙｄａｓｅ）^TM、ビトラーゼ（Ｖｉｔｒａｓｅ）^TM、ワイダーゼ（Ｗｙｄａｓｅ）^TM）が他の治療剤との併用によって、一般的に分散剤又は散布剤として使用されている。それらの多数は、ヒツジの睾丸又はウシの睾丸から抽出したＰＨ２０を含む形態である。

【0008】

ヒトＰＨ２０タンパク質は総５０９個のアミノ酸で構成されており、精子の血漿膜（ｐｌａｓｍａ ｍｅｍｂｒａｎｅ）に存在する糖リン脂質結合（ｇｌｙｃｏｐｈｏｓｐｈｏｉｎｏｓｉｔｏｌ ｌｉｐｉｄ ａｎｃｈｏｒｅｄ）タンパク質として知られている。ＰＨ２０は、血液内に存在するヒアルロニダーゼであるＨｙａｌ１、Ｈｙａｌ２、Ｈｙｌａ３、或いはＨｙａｌ４が酸性ｐＨにおいてのみ活性があるのとは違い、中性ｐＨにおいても活性を有しているため、薬物と共に混合して皮下注射用に開発され、産業的に有用に使用されている。

【0009】

最近では、ＰＨ２０のＣ末端で糖リン脂質アンカー（ｇｌｙｃｏｐｈｏｓｐｈｏｉｎｏｓｉｔｏｌ ａｎｃｈｏｒ）位置を構成する一部のアミノ酸が切断されて可溶性に転換した４４７個アミノ酸で構成された組換えヒトＰＨ２０ポリペプチドであるハイレネックス（Ｈｙｌｅｎｅｘ）^TMが使用されており、これとは別にヒトＰＨ２０ポリペプチド変異体を用いた物質も開発されている。

【0010】

一方、ヒトＰＨ２０は、６箇所にＮ結合型グリコシル化（Ｎ－ｌｉｎｋｅｄ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）された糖タンパク質であって、非常に複雑な３次構造を有しており、産業的に有用な酵素を生産するためには、ＣＨＯ細胞などの動物細胞で発現後に複雑な精製過程を経て使用される。したがって、ヒトＰＨ２０の産業的利用には、ヒトＰＨ２０遺伝子を含有する動物細胞の発酵培地内における発現量による生産性の向上が非常に重要である。

【0011】

このような技術的背景の下に、本発明者らは、Ｎ末端の切断、又はＮ末端及びＣ末端の切断が可溶性組換えＰＨ２０ポリペプチドの生産性を向上させ得ることを確認し、本発明を完成するに至った。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0012】

本発明の目的は、生産性が向上した、Ｎ末端及び／又はＣ末端が切断された可溶性組換えＰＨ２０ポリペプチドを提供することである。

【0013】

本発明の目的は、前記Ｎ末端及び／又はＣ末端が切断された可溶性組換えＰＨ２０ポリペプチドをコードする核酸を提供することである。

【0014】

本発明の目的は、前記核酸を含む組換え発現ベクターを提供することである。

【0015】

本発明の目的は、前記組換え発現ベクターで形質転換された宿主細胞を提供することである。

【0016】

本発明の目的は、前記宿主細胞を培養する段階を含むＮ末端及び／又はＣ末端が切断された可溶性組換えＰＨ２０ポリペプチドの製造方法を提供することである。

【課題を解決するための手段】

【0017】

本発明は、成熟した動物野生型ＰＨ２０のＮ末端において１個～７個のアミノ酸残基が欠失した組換えＰＨ２０ポリペプチドを提供する。

【0018】

具体的には、本発明に係る成熟した動物野生型ＰＨ２０のＮ末端においてアミノ酸残基が欠失した組換えＰＨ２０ポリペプチドは、
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列を有するヒト野生型ＰＨ２０のうち、Ｎ３７～Ｐ４２からなる群から選ばれるアミノ酸残基の前で切断されてＮ末端のアミノ酸残基が欠失した、組換えＰＨ２０ポリペプチド；
（ｂ）配列番号２～配列番号８のいずれか一つのアミノ酸配列を有する霊長類野生型ＰＨ２０のうち、Ｎ３７～Ｐ４２からなる群から選ばれるアミノ酸残基の前で切断されてＮ末端のアミノ酸残基が欠失した、組換えＰＨ２０ポリペプチド；
（ｃ）配列番号９のアミノ酸配列を有するウシ野生型ＰＨ２０のうち、Ｄ３７～Ｐ４２からなる群から選ばれるアミノ酸残基の前で切断されてＮ末端のアミノ酸残基が欠失した、組換えＰＨ２０ポリペプチド；及び
（ｄ）配列番号１０のアミノ酸配列を有するヒツジ野生型ＰＨ２０のうち、Ｄ３７～Ｐ４２からなる群から選ばれるアミノ酸残基の前で切断されてＮ末端のアミノ酸残基が欠失した、組換えＰＨ２０ポリペプチド；
からなる群から選ばれることを特徴とし得るが、これに限定されるものではない。

【0019】

本発明は、前記組換えＰＨ２０ポリペプチドをコードする核酸と、該核酸を含む組換え発現ベクターを提供する。

【0020】

また、本発明は、前記組換え発現ベクターで形質転換された宿主細胞と、該宿主細胞を培養する段階を含むＮ末端及び／又はＣ末端が切断された可溶性組換えＰＨ２０ポリペプチドの製造方法を提供する。

【図面の簡単な説明】

【0021】

【図1】本発明の具体的実施例によって、配列番号１のＣ末端がＹ４８２又はＦ４６８である場合にそれぞれＮ末端がＬ３６、Ｎ３７、Ｆ３８、Ｒ３９、Ａ４０で始まるＰＨ２０ポリペプチドの培養液における酵素活性を示す図である。各活性は、最も長いアミノ酸長を有するＬ３６－Ｙ４８２を基準にして相対活性百分率で表示している。

【図2】本発明の具体的実施例によって、配列番号１のＣ末端がＹ４８２又はＦ４６８である場合にそれぞれＮ末端がＬ３６、Ｎ３７、Ｆ３８、Ｒ３９、Ａ４０で始まる精製されたＰＨ２０ポリペプチドのｐＨ ５．３における酵素活性を比活性（Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ａｃｔｉｖｉｔｙ）で示す図である。各活性は、最も長いアミノ酸長を有するＬ３６－Ｙ４８２を基準にして相対活性百分率で表示している。

【図3】本発明の具体的実施例によって、配列番号１のＣ末端がＹ４８２又はＦ４６８である場合にそれぞれＮ末端がＬ３６、Ｎ３７、Ｆ３８、Ｒ３９、Ａ４０で始まる精製されたＰＨ２０ポリペプチドのｐＨ ７．０における酵素活性を比活性で示す図である。各活性は、最も長いアミノ酸長を有するＬ３６－Ｙ４８２を基準にして相対活性百分率で表示している。

【図4】配列番号１、配列番号２、配列番号９、配列番号１０のアミノ酸配列をＣｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｍｓａ／ｃｌｕｓｔａｌｏ／）を用いて多重配列整列（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）を行った結果である。

【図5】本発明の具体的実施例によって、配列番号２（Ｃ末端がＹ４８３）、配列番号９（Ｃ末端がＨ４７８）、配列番号１０（Ｃ末端がＨ４７７）の場合にそれぞれＮ末端がＬ３６、Ｎ３７、又はＤ３７、Ｆ３８、Ｒ３９、Ａ４０、Ｐ４１で始まるＰＨ２０ポリペプチドの培養液の酵素活性を示す図である。各活性は測定値で表示している。

【図6】本発明の具体的実施例によって、配列番号２（Ｃ末端がＹ４８３）、配列番号９（Ｃ末端がＨ４７８）、配列番号１０（Ｃ末端がＨ４７７）の場合にそれぞれＮ末端がＬ３６、Ｎ３７、Ｆ３８、Ｒ３９、Ａ４０、Ｐ４１で始まる精製されたＰＨ２０ポリペプチドのｐＨ ５．３における酵素活性を比活性で示す図である。各活性は測定値で表示している。

【図7】本発明の具体的実施例によって、配列番号１のＬ３６－Ｙ４８２、Ｎ３７－４８２、Ｆ３８－Ｙ４８２に対して、シグナルペプチド（ｓｉｇｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ）を異ならせ、培養液と精製された状態でのＰＨ２０ポリペプチドのｐＨ ５．３における酵素活性を測定した結果である。ヒト血清アルブミン（Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｕｍ Ａｌｂｕｍｉｎ）のシグナルペプチド（ｓｉｇｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ）を使用する場合の培養液及び精製タンパク質の酵素活性、ヒトＰＨ２０のシグナルペプチド（ｓｉｇｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ）を使用する場合の培養液及び精製タンパク質の酵素活性、ヒト免疫グロブリンカッパ（Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｋａｐｐａ）のシグナルペプチド（ｓｉｇｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ）を使用する場合の培養液及び精製タンパク質の酵素活性を表示している。培養液の酵素活性の尺度は、棒グラフで主Ｙ軸に示されており、精製タンパク質の活性の尺度は、折れ線グラフで従Ｙ軸に示されている。

【発明を実施するための形態】

【0022】

特に定義しない限り、本明細書で使われる全ての技術的及び科学的用語は、本発明の属する技術の分野における熟練した専門家によって通常理解されるのと同じ意味を有する。一般に、本明細書で使われる命名法は、本技術分野によく知られており、通常使われるものである。

【0023】

ＰＨ２０のＣ末端で切断されて可溶性に転換された組換えＰＨ２０ポリペプチドの産業上の利用可能性を拡張するために、本発明では、ＰＨ２０のＮ末端をさらに切断し、生産性が格段に増加したＮ末端及び／又はＣ末端切断ＰＨ２０ポリペプチドを提示する。本発明において「可溶性（ｓｏｌｕｂｌｅ）」とは、水溶液中で凝集などが起きず、活性を有する３次元構造の形態を意味する。

【0024】

これにより、本発明は、成熟した動物野生型ＰＨ２０のＮ末端において１個～７個のアミノ酸残基、好ましくは１～６個のアミノ酸残基、より好ましくは１～５個のアミノ酸残基、さらに好ましくは１～４個のアミノ酸残基、なかんずく好ましくは１～３個のアミノ酸残基、とりわけ好ましくは１～２個のアミノ酸残基、特に好ましくは１個のアミノ酸残基が欠失した組換えＰＨ２０ポリペプチドに関する。

【0025】

本発明において「成熟した動物野生型ＰＨ２０」は、目的とする機能を示す形態の組換えＰＨ２０ポリペプチドを意味できる。本発明に係る成熟した動物野生型ＰＨ２０は、例えば、細胞の外部に成熟した動物野生型ＰＨ２０の分泌を促進させるシグナルペプチドなどが分泌過程で切断された状態を意味できる。

【0026】

前記動物は、例えば、哺乳類、齧歯類などであってよく、例えば、ヒト、ラット、マウス、ハムスター、ウサギ、ブタ、ウシ、シカ、ヒツジ、サルなどであってよいが、これに限定されるものではない。

【0027】

本発明に係る動物野生型ＰＨ２０は、例えば、
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列を有するヒト野生型ＰＨ２０のうち、Ｎ３７～Ｐ４２からなる群から選ばれるアミノ酸残基の前で切断されてＮ末端のアミノ酸残基が欠失した、組換えＰＨ２０ポリペプチド；
（ｂ）配列番号２～配列番号８のいずれか一つのアミノ酸の配列を有する霊長類野生型ＰＨ２０のうち、Ｎ３７～Ｐ４２からなる群から選ばれるアミノ酸残基の前で切断されてＮ末端のアミノ酸残基が欠失した、組換えＰＨ２０ポリペプチド；
（ｃ）配列番号９のアミノ酸配列を有するウシ野生型ＰＨ２０のうち、Ｄ３７～Ｐ４２からなる群から選ばれるアミノ酸残基の前で切断されてＮ末端のアミノ酸残基が欠失した、組換えＰＨ２０ポリペプチド；又は
（ｄ）配列番号１０のアミノ酸配列を有するヒツジ野生型ＰＨ２０のうち、Ｄ３７～Ｐ４２からなる群から選ばれるアミノ酸残基の前で切断されてＮ末端のアミノ酸残基が欠失した、組換えＰＨ２０ポリペプチドを含んでよいが、これに限定されるものではない。

【0028】

【表1】

【0029】

【表2】

【0030】

人体に存在するヒアルロニダーゼは、血漿（Ｐｌａｓｍａ）又はその他器官に存在し、酸性ｐＨにおいて活性を持つＨｙａｌ１、Ｈｙａｌ２、Ｈｙａｌ３、Ｈｙａｌ４があり、精子の先体で発現し、受精過程で働きをするＰＨ２０がある。

【0031】

このうち、配列番号１のアミノ酸配列を有するヒトＰＨ２０ポリペプチドは、Ｍ１～Ｔ３５のシグナル配列（Ｓｉｇｎａｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）と、Ｌ３６～Ｓ４９０のヒアルロニダーゼ活性部位、Ａ４９１～Ｌ５０９のＣ末端ＧＰＩ結合配列（Ｇｌｙｃｏｓｙｌ－ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌ ｉｎｏｓｉｔｏｌ－ａｎｃｈｏｒｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）で構成されており、Ｃ末端ＧＰＩ結合配列の全部を欠如した形態であって、可溶性に転換した形態の組換えＰＨ２０ポリペプチドは、生体内で治療剤、分散剤又は散布剤として使用されている。特に、Ｃ末端のアミノ酸配列のうちの一部、すなわち、Ｉ４６５～Ｌ５０９のうちのいかなる部分を切断しても可溶性は維持しながら酵素活性も維持されるという報告がある。商業用製品として開発される場合には、Ｃ末端を４８２番としている。しかし、この場合には、シグナル配列を除くＮ末端のＬ３６で始まる配列は維持していた（ＷＯ２０１０／０７７２９７Ａなど）。

【0032】

近年、ヒトＰＨ２０ポリペプチドの変異体においてＮ末端を切断し、Ｌ３６の他、Ｎ３７、Ｆ３８、Ｒ３９、Ａ４０、Ｐ４１、Ｐ４２で始まるヒトＰＨ２０ポリペプチド変異体も酵素活性を有することを提示し、これに基づき、熱安定性及び酵素活性に優れたヒアルロニダーゼ変異体が開発されたことがある（ＷＯ２０２０／０２２７９１Ａなど）。

【0033】

サル（Ｎａｓａｌｉｓ ｌａｒｖａｔｕｓ）のＰＨ２０ポリペプチドは、ヒトＰＨ２０ポリペプチドと９３．１％の配列相同性を有している。したがって、図４の多重配列分析結果に基づき、サル（Ｎａｓａｌｉｓ ｌａｒｖａｔｕｓ）のＰＨ２０ポリペプチドではＣ末端がＹ４８３で終わることが予測可能である。

【0034】

ウシ（Ｂｏｓ ｔａｕｒｕｓ）のＰＨ２０ポリペプチドとヒツジ（Ｏｖｉｓ ａｒｉｅｓ）のＰＨ２０ポリペプチドは、互いに９０．６％の配列相同性を有し、ヒトＰＨ２０ポリペプチドとはそれぞれ６３．６％、６３．５％の配列相同性を有している。Ｍｅｙｅｒ等（１９９７）によれば、ウシ（Ｂｏｓ ｔａｕｒｕｓ）のＰＨ２０ポリペプチドにおいて、可溶性ポリペプチドはＣ末端がＨ４７８で終わると報告されている。このような結果から、図４の多重配列分析結果に基づけば、ヒツジ（Ｏｖｉｓ ａｒｉｅｓ）のＰＨ２０ポリペプチドではＣ末端がＨ４７７で終わることが予測可能である。

【0035】

本発明では、成熟した天然型ＰＨ２０ポリペプチドにおいてもＮ末端をさらに切断、すなわちアミノ酸残基をさらに欠失させることにより、生産性が増加したＮ末端及びＣ末端切断組換えＰＨ２０ポリペプチドを提示する。本発明において、Ｎ末端及びＣ末端切断組換えＰＨ２０ポリペプチドは、「ＰＨ２０変異体」と実質的に同じ概念で使われる。

【0036】

本発明に係る組換えＰＨ２０ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列を有する野生型ＰＨ２０においてＮ３７～Ｐ４２からなる群から選ばれるアミノ酸残基の前で切断されてＮ末端のアミノ酸残基が欠失する。

【0037】

具体的には、本発明に係る組換えＰＨ２０ポリペプチドは、Ｎ３７～Ｐ４２からなる群から選ばれるアミノ酸残基の前で切断されて配列番号１のアミノ酸配列のうちＮ３７、Ｆ３８、Ｒ３９、Ａ４０、Ｐ４１、Ｐ４２で始まる配列を含んでよい。より具体的には、本発明に係る組換えＰＨ２０ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列のうちＮ３７又はＦ３８で始まる配列を含んでよい。

【0038】

Ｎ３７～Ｐ４２からなる群から選ばれるアミノ酸残基の前で切断されたということは、Ｎ末端のＮ３７～Ｐ４２からなる群から選ばれるアミノ酸残基の直前のアミノ酸残基まで切断されて欠失したという意味である。

【0039】

例えば、Ｎ３７、Ｆ３８、Ｒ３９、Ａ４０、Ｐ４１、Ｐ４２のアミノ酸残基の前で切断が起きたという表現は、それぞれ、配列番号１のアミノ酸配列においてＮ３７の直前の残基である３６番残基まで、Ｆ３８の直前の残基である３７残基まで、Ｒ３９の直前の残基である３８残基まで、Ａ４０の直前の残基である３９残基まで、Ｐ４１の直前の残基である４０残基まで、Ｐ４２の直前の残基である４１残基まで切断されて除去されたということを意味する。

【0040】

本発明に係る組換えＰＨ２０ポリペプチドはさらに、Ｃ末端における一部のアミノ酸残基が欠失してよい。具体的には、本発明に係る組換えＰＨ２０ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列のうちＦ４６８～Ｙ４８２からなる群から選ばれるアミノ酸残基の次で切断され、Ｃ末端のアミノ酸残基が欠失してよい。より具体的には、本発明に係る組換えＰＨ２０ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列のうちＦ４６８又はＹ４８２で終わる配列を含んでよい。

【0041】

配列番号１のアミノ酸配列のうちＦ４６８～Ｙ４８２からなる群から選ばれるアミノ酸残基の次で切断され、Ｃ末端のアミノ酸残基が欠失したということは、Ｆ４６８～Ｙ４８２からなる群から選ばれるアミノ酸残基の直後のアミノ酸残基から始まって切断されて欠失したという意味である。例えば、Ｆ４６８又はＹ４８２残基の次で切断されたとは、配列番号１のアミノ酸配列のうちＦ４６８又はＹ４８２の次の残基から始まって切断されて除去されたことを意味する。

【0042】

具体的な実施例において、本発明に係る組換えＰＨ２０ポリペプチドは、次のように構成された群から選ばれてよい：
（１）配列番号１のアミノ酸配列のうちＮ３７で始まり、Ｙ４８２で終わる配列（Ｎ３７－Ｙ４８２）を含むＰＨ２０ポリペプチド；
（２）配列番号１のアミノ酸配列のうちＮ３７で始まり、Ｆ４６８で終わる配列（Ｎ３７－Ｆ４６８）を含むＰＨ２０ポリペプチド；
（３）配列番号１のアミノ酸配列のうちＦ３８で始まり、Ｙ４８２で終わる配列（Ｆ３８－Ｙ４８２）を含むＰＨ２０ポリペプチド；
（４）配列番号１のアミノ酸配列のうちＦ３８で始まり、Ｆ４６８で終わる配列（Ｆ３８－Ｙ４６８）を含むＰＨ２０ポリペプチド；
（５）配列番号２～配列番号８のいずれか一つのアミノ酸配列のうちＮ３７で始まり、Ｌ４９０で終わる配列（Ｎ３７－Ｌ４９０）を含むＰＨ２０ポリペプチド；
（６）配列番号２～配列番号８のいずれか一つのアミノ酸配列のうちＦ３８で始まり、Ｌ４９０で終わる配列（Ｆ３８－Ｌ４９０）を含むＰＨ２０ポリペプチド；
（７）配列番号９のアミノ酸配列のうちＤ３７で始まり、Ｈ４７８で終わる配列（Ｄ３７－Ｈ４７８）を含むＰＨ２０ポリペプチド；
（８）配列番号９のアミノ酸配列のうちＦ３８で始まり、Ｈ４７８で終わる配列（Ｆ３８－Ｈ４７８）を含むＰＨ２０ポリペプチド；
（９）配列番号１０のアミノ酸配列のうちＤ３７で始まり、Ｈ４７７で終わる配列（Ｄ３７－Ｈ４７７）を含むＰＨ２０ポリペプチド；
（１０）配列番号１０のアミノ酸配列のうちＦ３８で始まり、Ｈ４７７で終わる配列（Ｆ３８－Ｈ４７７）を含むＰＨ２０ポリペプチド；
（１１）配列番号１０のアミノ酸配列のうちＲ３９で始まり、Ｈ４７７で終わる配列（Ｒ３９－Ｈ４７７）を含むＰＨ２０ポリペプチド；及び
（１２）配列番号１０のアミノ酸配列のうちＡ４０で始まり、Ｈ４７７で終わる配列（Ａ４０－Ｈ４７７）を含むＰＨ２０ポリペプチド。

【0043】

本発明は、他の側面において、前記組換えＰＨ２０ポリペプチドを含む癌治療用組成物及びこれを用いた癌治療方法を提供する。

【0044】

前記癌は、特に限定されず、固形癌及び血液癌のいずれをも含む。このような癌の例には、黒色腫などの皮膚癌、肝癌、肝細胞癌（ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、胃癌、乳癌、肺癌、卵巣癌、気管支癌、鼻咽頭癌、喉頭癌、膵癌、膀胱癌、大腸癌、結腸癌、子宮頸癌、脳癌、前立腺癌、骨癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、腎臓癌、食道癌、胆道癌、精巣癌、直腸癌、頭頸部癌、頸椎癌、尿管癌、骨肉腫、神経芽細胞腫、線維肉腫、横紋筋肉腫、星状細胞腫、神経芽細胞腫、及び神経膠腫からなる群から選ばれてよいが、これに限定されるものではない。好ましくは、本発明の組成物で治療可能な癌は、大腸癌、乳癌、肺癌及び腎臓癌からなる群から選ばれてよいが、これに限定されるものではない。

【0045】

前記組成物は薬学組成物であってよい。前記薬学組成物は、薬学的に許容可能な担体をさらに含んでよく、前記担体は、薬物の製剤化に通常利用されるものであり、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、澱粉、アカシアガム、リン酸カルシウム、アルジネート、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、ヒドロキシ安息香酸メチル、ヒドロキシ安息香酸プロピル、滑石、ステアリン酸マグネシウム、ミネラルオイルなどからなる群から選ばれる１種以上であってよいが、これに限定されるものではない。前記薬学組成物は、また、薬学組成物の製造に通常使用される希釈剤、賦形剤、潤滑剤、湿潤剤、甘味剤、香味剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤からなる群から選ばれる１種以上をさらに含んでよい。

【0046】

前記薬学組成物は、経口又は非経口で投与できる。非経口投与の場合には、静脈内注入、皮下注入、筋肉注入、腹腔注入、内皮投与、局所投与、鼻内投与、肺内投与及び直腸内投与などで投与できる。経口投与時に、タンパク質又はペプチドが消化されるため、経口用組成物は活性薬剤をコートしてもよく、胃における分解から保護されるように剤形化されてもよい。また、前記組成物は、活性物質を標的細胞に移動可能にする任意の装置によって投与されてよい。

【0047】

前記薬学的組成物は、オイル又は水性媒質中の溶液、懸濁液、シロップ剤又は乳化液の形態であるか、エキス剤、散剤、粉末剤、顆粒剤、錠剤又はカプセル剤などの形態で剤形化でき、剤形化のために分散剤又は安定化剤をさらに含んでよい。

【0048】

特に、本発明に係る癌治療用組成物は、他の抗癌剤との併用治療用途に使用されることを特徴とする。

【0049】

前記併用治療用途に使用可能な抗癌剤は、化学抗癌剤、抗体形態の抗癌剤、ＲＮＡｉ、細胞治療剤などが好ましいが、これに限定されるものではない。

【0050】

前記併用治療用途に使用可能な抗癌剤は、免疫抗癌剤、特に好ましくは免疫チェックポイント阻害剤（ｉｍｍｕｎｅ ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）であるが、これに限定されるものではない。

【0051】

本発明は、他の観点において、本発明に係る成熟した動物野生型ＰＨ２０のＮ末端及び／又はＣ末端におけるアミノ酸残基が欠失した組換えＰＨ２０ポリペプチドをコードする核酸に関する。

【0052】

本明細書において使用される核酸は、細胞、細胞溶解物（ｌｙｓａｔｅ）中に存在してもよく、又は部分的に精製された形態又は実質的に純粋な形態で存在してもよい。核酸は、アルカリ／ＳＤＳ処理、ＣｓＣｌバンド化（ｂａｎｄｉｎｇ）、カラムクロマトグラフィー、アガロースゲル電気泳動及び当該技術の分野によく知られたその他のものを含む標準技術により、他の細胞成分又はその他汚染物質、例えば、他の細胞の核酸又はタンパク質から精製されて出る場合に「単離」されるか又は「実質的に純粋になった」ものである。本発明の核酸は、例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡであってよい。

【0053】

本発明は、さらに他の観点において、前記核酸を含むベクター、特に組換え発現ベクターに関する。本発明に係る組換えＰＨ２０組換えポリペプチドの発現のために、ＰＨ２０組換えポリペプチドをコードするＤＮＡを標準分子生物学技術（例えば、ＰＣＲ増幅又はＰＨ２０組換えポリペプチドを発現させるハイブリドーマを使用したｃＤＮＡクローニング）によって得ることができ、ＤＮＡが転写及び翻訳制御配列に「作動するように結合」して発現ベクター内に挿入されてよい。

【0054】

本明細書で使われる用語「作動するように結合」は、ベクター内の転写及び翻訳制御配列が、ＰＨ２０組換えポリペプチドをコードする遺伝子の転写及び翻訳を調節する意図された機能を担うように、ＰＨ２０組換えポリペプチドをコードする遺伝子がベクター内にライゲイションされることを意味できる。発現ベクター及び発現制御配列は、使用される発現用宿主細胞に適するように選択される。ＰＨ２０組換えポリペプチドをコードする遺伝子は、標準方法（例えば、ＰＨ２０組換えポリペプチドをコードする遺伝子断片及びベクター上の相補性制限酵素部位のライゲイション、又は制限酵素部位が全く存在しない場合にブラント（ｂｌｕｎｔ）末端ライゲイション）によって発現ベクター内に挿入される。

【0055】

また、前記組換え発現ベクターは、宿主細胞においてＰＨ２０組換えポリペプチドをコードする遺伝子の発現を制御する調節配列を有する。「調節配列」は、ＰＨ２０組換えポリペプチドをコードする遺伝子の転写又は翻訳を制御するプロモーター、エンハンサー、及びその他発現制御要素（例えば、ポリアデニル化信号）を含んでよい。通常の技術者は、形質転換させる宿主細胞の選択、タンパク質の発現レベルなどのような因子にしたがって調節配列を別々に選択し、発現ベクターのデザインが変わり得ることが認識できる。

【0056】

本発明は、さらに他の観点において、前記核酸又は前記ベクターを含む宿主細胞に関する。本発明に係る宿主細胞は、動物細胞、植物細胞、酵母、大腸菌及び昆虫細胞からなる群から選ばれることが好ましいが、これに限定されるものではない。

【0057】

具体的には、本発明に係る宿主細胞は、大腸菌、バチルスサブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）、プロテウスミラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）又はスタフィロコカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）のような原核細胞であってよい。また、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐ．）のような真菌、ピチアパストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、サッカロミケスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロミケス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）及びノイロスポラクラサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）のような酵母、その他の下等真核細胞、及び昆虫からの細胞のような高等真核生物の細胞のような真核細胞であってよい。

【0058】

また、本発明に係る宿主細胞は、植物又は哺乳動物に由来するものであってよい。好ましくは、サル腎臓細胞７（ＣＯＳ７：ｍｏｎｋｅｙ ｋｉｄｎｅｙ ｃｅｌｌｓ）細胞、ＮＳＯ細胞、ＳＰ２／０、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ：Ｃｈｉｎｅｓｅ ｈａｍｓｔｅｒ ｏｖａｒｙ）細胞、Ｗ１３８、幼いハムスター腎臓（ＢＨＫ：ｂａｂｙ ｈａｍｓｔｅｒ ｋｉｄｎｅｙ）細胞、ＭＤＣＫ、骨髄腫細胞株、ＨｕＴ７８細胞、及びＨＥＫ２９３細胞などが利用可能であるが、これに限定されない。特に好ましくは、ＣＨＯ細胞が利用されてよい。

【0059】

上記の核酸又はベクターは、宿主細胞に形質注入又はトランスフェクション（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）される。「形質注入」又は「トランスフェクション」させるために、原核又は真核宿主細胞内に外因性核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）を導入するが、一般的に用いられる様々な技術、例えば、電気泳動法、リン酸カルシウム沈殿法、ＤＥＡＥ－デキストラントランスフェクション又はリポフェクション（ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｏｎ）などを用いることができる。本発明に係るＰＨ２０組換えポリペプチドを発現させるために、様々な発現宿主／ベクター組合せが用いられてよい。真核宿主に適する発現ベクターには、これらに限定されるものではないが、ＳＶ４０、ウシ乳頭腫ウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス（ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ）、サイトメガロウイルス及びレトロウイルスに由来する発現調節配列が含まれる。細菌宿主に使用可能な発現ベクターには、ｐＥＴ、ｐＲＳＥＴ、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＧＥＸ２Ｔ、ｐＵＣベクター、ｃｏｌ Ｅ１、ｐＣＲ１、ｐＢＲ３２２、ｐＭＢ９及びそれらの誘導体のように大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）から得られる細菌性プラスミド、ＲＰ４のように、より広い宿主範囲を有するプラスミド、λｇｔ１０、λｇｔ１１、ＮＭ９８９のような非常に様々なファージラムダ（ｐｈａｇｅ ｌａｍｂｄａ）誘導体として例示可能なファージＤＮＡ、及びＭ１３とフィラメント性単一鎖のＤＮＡファージのようなその他のＤＮＡファージが含まれる。酵母細胞に有用な発現ベクターは、２μｍプラスミド及びその誘導体である。昆虫細胞に有用なベクターは、ｐＶＬ９４１である。

【0060】

本発明は、さらに他の観点において、宿主細胞を培養し、本発明に係る組換えＰＨ２０組換えポリペプチドを発現させる段階を含む、本発明に係る組換えＰＨ２０組換えポリペプチドの製造方法に関する。

【0061】

前記組換えＰＨ２０組換えポリペプチドを発現させ得る組換え発現ベクターが哺乳類宿主細胞内に導入される場合に、ＰＨ２０組換えポリペプチドは宿主細胞で発現するのに十分な期間、又はより好ましくは宿主細胞が培養される培養培地内にＰＨ２０組換えポリペプチドが分泌されるのに十分な期間にわたって宿主細胞を培養することによって製造されてよい。

【0062】

場合によって、発現したＰＨ２０組換えポリペプチドは、宿主細胞から分離し、均一となるように精製してよい。前記ＰＨ２０組換えポリペプチドの分離又は精製は、通常のタンパク質において用いられている分離、精製方法、例えば、クロマトグラフィーによって行われてよい。前記クロマトグラフィーは、例えば、親和性クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー又は疎水性クロマトグラフィーから選ばれる１つ以上の組合せであり得るが、これに限定されない。前記クロマトグラフィーに加え、濾過、超濾過、塩析、透析などを組み合わせて用いることができる。

【0063】

以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明する。これらの実施例は単に本発明を例示するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例によって限定されるものと解釈されないことは、当該技術の分野における通常の知識を有する者にとって明らかであろう。

【0064】

実施例１． Ｎ末端及びＣ末端が切断された組換えＰＨ２０ヒアルロニダーゼのクローニング
ＰＨ２０ポリペプチドの発現のために、天然型ヒトＰＨ２０ポリペプチドのＬ３６からＳ５０９までのアミノ酸を暗号化している配列、サル（Ｎａｓａｌｉｓ ｌａｒｖａｔｕｓ）のＰＨ２０ポリペプチド（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ：Ｈ２ＤＪＡ７）はアミノ酸Ｍ１～Ｌ５１０を暗号化するＤＮＡ配列、ウシ（Ｂｏｓ ｔａｕｒｕｓ）のＰＨ２０ポリペプチド（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ：Ｆ１ＭＴＶ１）はアミノ酸Ｌ３６～Ｈ４７８を暗号化するＤＮＡ配列、ヒツジ（Ｏｖｉｓ ａｒｉｅｓ）のＰＨ２０ポリペプチド（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ：Ｗ５ＮＳＵ１）はアミノ酸Ｌ３６～Ｈ４７７を暗号化するＤＮＡ配列をそれぞれＧｅｎｓｃｒｉｐｔ社（韓国）で合成した。

【0065】

合成されたそれぞれのＰＨ２０ポリペプチド遺伝子を重合酵素連鎖反応（以下、ＰＣＲという。）によって増幅させ、ｐｃＤＮＡ３．４－ＴＯＰＯベクターのＸｈｏＩ及びＮｏｔＩ制限酵素部位に挿入した。ＥｘｐｉＣＨＯ細胞における発現のために、ヒト血清アルブミンシグナルペプチドを使用した。ＨｉｓＴｒａｐカラムを用いたタンパク質精製のために、Ｈｉｓ－ＴａｇのＤＮＡ配列をＰＨ２０ｃ ＤＮＡの３’末端に位置させた。Ｎ末端及びＣ末端切断ＰＨ２０ポリペプチドは、ＰＣＲを用いて行ったし、ＤＮＡ塩基配列分析によってアミノ酸置換を確認した。

【0066】

ヒトＰＨ２０ポリペプチドのＮ末端が切断された変異体の作製のために、Ｌ３６－Ｙ４８２を含むプラスミドを作製し、これを鋳型として使用し、順次にＮ末端のアミノ酸がさらに１個ずつ除去された４種の変異体を作製したし、各変異体に対してＣ末端がＦ４６８で終わる４種の変異体も作製した。

【0067】

サル（Ｎａｓａｌｉｓ ｌａｒｖａｔｕｓ）ＰＨ２０ポリペプチドのＮ末端が切断された変異体の作製のために、Ｌ３６～Ｙ４８３を含むプラスミドを作製し、これを鋳型として使用し、順次にＮ末端のアミノ酸がさらに１個ずつ除去された５種の変異体を作製した。

【0068】

ウシ（Ｂｏｓ Ｔａｕｒｕｓ）ＰＨ２０のＮ末端が切断された変異体の作製のために、Ｌ３６～Ｈ４７８を含むプラスミドを作製し、これを鋳型として使用し、順次にＮ末端のアミノ酸がさらに１個ずつ除去された５種の変異体を作製した。

【0069】

ヒツジ（Ｏｖｉｓ ａｒｉｅｓ）ＰＨ２０のＮ末端が切断された変異体の作製のために、Ｌ３６～Ｈ４７７を含むプラスミドを作製し、これを鋳型として使用し、順次にＮ末端のアミノ酸がさらに１個ずつ除去された５種の変異体を作製した。

【0070】

実施例２． Ｎ末端及びＣ末端が切断された組換えＰＨ２０ヒアルロニダーゼの発現及び精製
Ｎ末端及びＣ末端が切断されたＰＨ２０ポリペプチドの発現は、ＥｘｐｉＣＨＯ発現システムを用いて行った。ＥｘｐｉＣＨＯ細胞の細胞密度が６×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍＬに到達した時に、ｐｃＤＮＡ３．４－ＴＯＰＯベクターに挿入されたＮ末端及びＣ末端切断ＰＨ２０ポリペプチドのｃＤＮＡを含むプラスミドを、ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ ＣＨＯ試薬を使ってＥｘｐｉＣＨＯ細胞内に形質感染させた。細胞培養培地として、ＥｘｐｉＣＨＯ発現培地（１００～５００ｍＬ）を使用した。形質感染後にＥｘｐｉＣＨＯ細胞を総６日間１３０ｒｐｍで振盪培養したが、このとき、細胞を３７℃で１日間培養し、 ３２℃のより低い温度で５日間さらに培養した。培養完了後に、細胞上澄液を１０，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離して収集した。

【0071】

ＥｘｐｉＣＨＯ細胞で生産したＣ末端にＨｉｓ－ｔａｇが付いたＰＨ２０ポリペプチドは、ＡＫＴＡ ｐｒｉｍｅ装備又はこれと類似の装備（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を用いて２段階のカラムクロマトグラフィーで精製したが、このヒトＰＨ２０、Ｎａｓａｌｉｓ ｌａｒｖａｔｕｓ ＰＨ２０においては、ｐＩが６に近いため、アニオン交換クロマトグラフィー（Ａｎｉｏｎ Ｅｘｃｈａｎｇｅ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）であるＱ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅを使用し、ウシとヒツジのＰＨ２０ポリペプチドにおいては、ｐＩが８以上であるため、カチオン交換クロマトグラフィー（Ｃａｔｉｏｎ Ｅｘｃｈａｎｇｅ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）であるＣａｐｔｏ Ｓカラムを使用して１段階精製を行ったし、各タンパク質は、Ｈｉｓ－Ｔａｇ親和クロマトグラフィーであるＨｉｓＴｒａｐ ＨＰカラムで２段階精製を行った。

【0072】

Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムを用いたタンパク質の精製のために、バッファーＡ（２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ ７．５）とバッファーＢ（２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ ７．５、０．５Ｍ ＮａＣｌ）を製造した。タンパク質をＱ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムに結合させ、バッファーＡを５ＣＶ流して非特異的に結合したタンパク質を除去した後、０～１００％の濃度勾配でバッファーＢを５ＣＶ流し、タンパク質を溶出した。

【0073】

Ｃａｐｔｏ Ｓカラムを用いたタンパク質の精製のために、バッファーＡ（２０ｍＭリン酸ナトリウム、１５ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ ６．０）とバッファーＢ（２０ｍＭリン酸ナトリウム、５００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ ６．０）をそれぞれ製造した。培養液のｐＨ及び伝導度（ｃｏｎｄｕｃｔｉｖｉｔｙ）をバッファーＡと同一に合わせ、０．２２μｍ孔径の膜（ｍｅｍｂｒａｎｅ）に培養液を濾過させた。次に、Ｃａｐｔｏ Ｓカラムにタンパク質を結合させた後、バッファーＡを３ＣＶ（ｃｏｌｕｍｎ ｖｏｌｕｍｅ）流し、非特異的（ｎｏｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ）に結合したタンパク質を除去した。バッファーＢを順次に４ＣＶ流し、ターゲットタンパク質を溶出した。

【0074】

ＨｉｓＴｒａｐ ＨＰカラムを用いたタンパク質の精製のために、バッファーＡ（２０ｍＭリン酸ナトリウム、５００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ ７．５）とバッファーＢ（２０ｍＭリン酸ナトリウム、５００ｍＭ ＮａＣｌ、５００ｍＭイミダゾール、ｐＨ ７．５）をそれぞれ製造した。タンパク質試料をＨｉｓＴｒａｐ ＨＰカラムに結合させた後、非特異的に結合したタンパク質を除去するために７％バッファーＢを７ＣＶ流したし、ターゲットタンパク質の溶出のために４０％バッファーＢを３ＣＶ流した。カラム溶出液は、透析バッファー（Ｄｉａｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ）（２０ｍＭリン酸ナトリウム、１００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ ７．０）を用いて透析した。

【0075】

実施例３． Ｎ末端及びＣ末端が切断された組換えＰＨ２０ヒアルロニダーゼのＮ末端配列分析
精製されたＮ末端及びＣ末端が切断されたＰＨ２０ポリペプチドを、７．５％ ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルのレーン当たりに１０μｇずつロード（Ｌｏａｄｉｎｇ）し、電気泳動（１５０Ｖ、１時間）を行った。その後、電気泳動で展開されたタンパク質が含まれたゲルを、ＰＶＤＦ膜と共にブロッティングキット（Ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｋｉｔ）に入れ、１００Ｖ電圧で９０分間トランスファー（Ｔｒａｎｓｆｅｒ）し、よくトランスファーされたかをＰｏｎｃｅａｕ Ｓ染色で確認した。最終的に、各タンパク質帯を切開して得た試料をＰＰＳＱ－５３Ａプロテインシーケンサ（Ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ）（Ｓｈｉｍａｄｚｕ社，日本）を用いてＮ末端５個のアミノ酸に対して配列分析を行った。

【0076】

Ｎ末端配列分析の結果、他のＰＨ２０ポリペプチドにおいては予想される配列が確認されたが、ヒトＰＨ２０ポリペプチドにおいてＮ３７－Ｙ４８２、Ｎ３７－Ｆ４６８の場合には、Ｎ末端のアミノ酸がアスパラギン（Ａｓｐａｒａｇｉｎｅ）ではなくアスパルテート（Ａｓｐａｒｔａｔｅ）として一部発見され、アミド分解（Ｄｅ－ａｍｉｄａｔｉｏｎ）が発生したことが見られた。この結果及び図４の多重配列分析結果によれば、当該アミノ酸がウシ又はヒツジではアスパルテートとして発見されることから、この位置のアミノ酸は、アスパルテートがタンパク質の構造を安定化させる役割を担うと推定可能である。

【0077】

実施例４． Ｎ末端及びＣ末端が切断された組換えＰＨ２０ヒアルロニダーゼ活性測定
ヒアルロニダーゼの活性は、濁度分析法で測定したが、これは、ヒアルロン酸がアルブミン（ＢＳＡ）と混合される時に生成される沈殿物によって発生する濁度の程度を吸光度として測定する方法である。ヒアルロン酸がＰＨ２０ポリペプチドによって加水分解されると、アルブミンとの混合時に生成される沈殿物の濁度／吸光度が減少する。この分析は、ｐＨ ５．３で一般に次のように行われる。活性（ｕｎｉｔｓ）を知っているヒアルロニダーゼ標準物質を６、８、１０、１２、１５及び２０ｕｎｉｔｓ／ｍＬに希釈し、各試験管に製造した。精製されたタンパク質試料を、緩衝液（２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ ５．３、７７ｍＭ塩化ナトリウム、及び０．０１％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン）で、希釈因子を標準曲線範囲内に属するように調整することによって希釈した。５０μｌの希釈された試料を９６ウェルプレートの各ウェルに分注し、３７℃で１０分間加温反応させた。０．０６％ヒアルロン酸５０μｌを各ウェルにさらに分注した。０．０６％ヒアルロン酸は、３００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ ５．３に溶解されている状態である。試料と０．０６％ヒアルロン酸を３７℃で４５分間反応させた。反応終了後に、酵素－基質反応溶液４０μｌを酸性アルブミン溶液２００μｌに分注し、室温で１９分間放置した。その後、分光光度計を用いて６００ｎｍで吸光度を測定した。酸性アルブミン溶液は、０．１％アルブミン（ＢＳＡ）が２４ｍＭ酢酸ナトリウム、７９ｍＭ酢酸、ｐＨ ３．７５緩衝液に溶解されている溶液である。測定された試料の吸光度値を、活性標準品による標準曲線によって活性に転換させた。

【0078】

上の過程をｐＨ ７．０で行う場合には、タンパク質試料緩衝液を、２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ ７．０、７７ｍＭ塩化ナトリウム、及び０．０１％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミンを使用したし、０．０６％ヒアルロン酸水溶液は、２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ ７．０、７０ｍＭ塩化ナトリウムに溶かしたものを使用し、同一過程を行った。

【0079】

このような活性測定は培養液においても測定可能であるが、この場合には、３００ｕｎｉｔｓ／ｍＬ以下の値は信頼性がないため、定量限界（Ｌｉｍｉｔ ｏｆ Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ＬＯＱ）は３００ｕｎｉｔｓ／ｍＬに設定し、それ以下の値は活性無し、０と表示した。また、精製したタンパク質試料を用いた活性測定においては、定量限界（ＬＯＱ）を１５ｕｎｉｔｓ／μｇに設定される。

【0080】

配列番号１の天然型ＰＨ２０ポリペプチドのＭ１－Ｔ３５のシグナル配列を除く部分においてＮ末端をＬ３６、Ｎ３７、Ｆ３８、Ｒ３９、Ａ４０に調整し、Ｃ末端としてはＦ４６８、Ｙ４８２を選定し、総１０個のＮ末端及びＣ末端が切断されたＰＨ２０ポリペプチドを、実施例１の方法で作製した。このように製造された各クローンを、動物細胞の一過性トランスフェクション（Ｔｒａｎｓｉｅｎｔ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）培養によって得た培養液で精製し、酵素活性を、ｐＨ ５．３とｐＨ ７．０において実施例２の方法で比較した。

【0081】

図１に示すように、各培養液のヒトＰＨ２０の活性を比較した結果、天然型Ｎ末端を有している成熟したＬ３６－Ｙ４８２の培養液における活性に対比し、驚くべきことにＮ３７－Ｙ４８２の培養液における活性が３倍以上高かったし、Ｎ末端のアミノ酸残基が２個さらに欠失したＦ３８－Ｙ４８２においても培養液のヒトＰＨ２０活性が２倍以上高かった。

【0082】

しかし、Ｎ末端のアミノ酸残基が３個欠如したＲ３９－Ｙ４８２においては酵素の発現が殆どなかったし、Ｎ末端アミノ酸残基が４個欠如した場合にも、培養液における酵素の発現は殆どなかった。

【0083】

結論的に、ヒトヒアルロニダーゼＰＨ２０は、成熟したヒトヒアルロニダーゼＰＨ２０においてＮ末端アミノ酸残基が１個或いは２個欠如した変異体が、培養液における発現量が格段に増加することを確認した。特に、ヒトヒアルロニダーゼＰＨ２０が注射剤として産業上の利用可能性があることを考慮するとき、Ｎ末端アミノ酸を１個或いは２個切断した形態の変異体酵素を生産する場合に産業的に優れた経済性を有する変異体を得ることができるということを示す。

【0084】

なお、図２及び図３に示すように、Ｌ３６－Ｙ４８２、Ｎ３７－Ｙ４８２、Ｆ３８－Ｙ４８２の比活性（Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ａｃｔｉｖｉｔｙ）を測定したとき、比活性には差異が殆どないため、図１でのヒトヒアルロニダーゼＰＨ２０の活性の差異は、生産性の差異に起因するものと確認された。しかも、酵素のＣ末端がＹ４８２で終わるタンパク質に比べてＣ末端アミノ酸が１４個短いＰＨ２０変異体においては、Ｎ末端アミノ酸が１個欠如したＮ３７－Ｆ４６８のみが唯一に培養液で活性を示した。

【0085】

特に、図２では、精製された各ポリペプチドの活性を、ｐＨ ５．３における比活性で示したが、Ｃ末端をＹ４８２とする場合には、Ｌ３６－Ｙ４８２、Ｎ３７－Ｙ４８２、Ｆ３８－Ｙ４８２の差異が殆どなかったが、Ｃ末端をＦ４６８とする場合には、Ｎ３７－Ｆ４６８、Ｆ３８－Ｆ４６８においてＬ３６－Ｆ４６８に比べて比活性が１．５～２倍程度高いことが確認された。このような様相は、ｐＨ ７．０における比活性からも確認できた。

【0086】

すなわち、図２及び図３などの結果に見られるように、ＰＨ２０のＣ末端アミノ酸を現在商用されているＰＨ２０の４８２番よりもさらに短縮し、さらに切断されて４６８位置で終わる酵素の場合、Ｌ３６－Ｆ４６８は動物細胞で殆ど発現しなかった。この場合、発現した極微量のＬ３６－Ｆ４６８変異体を精製して比活性を測定した結果、酵素の比活性はＬ３６－Ｙ４８２に比べて約６０％レベルであることが分かり、このような事実から、ＰＨ２０ポリペプチドのヒアルロニダーゼ活性又は生産性は、成熟したヒトヒアルロニダーゼＰＨ２０においてＮ末端のアミノ酸残基が１個又は２個さらに欠失する場合に各段に増加するということが分かる。

【0087】

結論的に、Ｌ３６－Ｆ４６８で構成されたヒトヒアルロニダーゼＰＨ２０変異体酵素は、Ｌ３６－Ｙ４８２ ＰＨ２０変異体酵素に比べて比活性は大きく低下しなかったが、組換え細胞内における発現が極微量であるため、産業的に有用に使用するには適切でない形態のＰＨ２０変異体であることが分かる。

【0088】

一方、Ｎ３７－Ｆ４６８変異体は、細胞における発現が非常に増加したし、これは、Ｌ３６－Ｙ４８２変異体の発現量の結果と類似な傾向であるが、Ｎ末端アミノ酸が１個さらに切断されたＮ３７－Ｆ４６８の細胞内における発現量は、Ｌ３６－Ｆ４６８に比べて少なくとも１００倍も画期的に増加することが見られる。

【0089】

ＰＨ２０の分子モデリングと本発明の実験結果を総合すると、ＰＨ２０のＮ末端のアミノ酸とＣ末端に位置したアミノ酸との相互作用は、組換えＰＨ２０タンパク質が細胞内で発現する時にタンパク質の転写及び転移過程において安定性、折り畳み速度などに影響を及ぼし、さらには細胞から分泌される組換えタンパク質の発現量に大きな影響を及ぼすことが分かる。これは、ＰＨ２０及び変異体の生産性に非常に重大な影響を及ぼす。このような結果は、ヒトＰＨ２０の他、ウシ又はヒツジなどから抽出した哺乳類由来のＰＨ２０にも適用されてよく、ひいてはヒトＰＨ２０と構造的或いは物理化学的に類似の性質を有する他のＰＨ２０にも適用可能であることが予測できる。

【0090】

また、サル（Ｎａｓａｌｉｓ ｌａｒｖａｔｕｓ）、ウシ（Ｂｏｓ ｔａｕｒｕｓ）及びヒツジ（Ｏｖｉｓ ａｒｉｅｓ）においても、図５及び図６に示すように、ヒトＰＨ２０ポリペプチドの特性及び配列構造が類似しており、生体の機能が同一である哺乳類ＰＨ２０、特に、表１に記載のサル（Ｎａｓａｌｉｓ ｌａｒｖａｔｕｓ）、ウシ（Ｂｏｓ ｔａｕｒｕｓ）、ヒツジ（Ｏｖｉｓ ａｒｉｅｓ）においてもこのような特性が維持されることが見られた。特に、ヒツジＰＨ２０ポリペプチドは、Ｎ末端がＡ４０で始まる場合に発現量が高いことが見られた。

【0091】

要するに、このような本発明の結果によれば、成熟したＰＨ２０タンパク質、特にヒトＰＨ２０などの動物ＰＨ２０において、Ｎ末端のアミノ酸残基をさらに１個～４個、好ましくは１個又は２個除去することによって組換え細胞から発現率を画期的に増加させ、タンパク質生産性を増大させることができた。

【0092】

ヒトＰＨ２０は、Ｃ末端がＹ４８２で終結する場合に、成熟したＰＨ２０においてＮ末端の一部のアミノ酸残基がさらに除去されたＰＨ２０は、ヒアルロニダーゼの固有活性に大きな変動無しで発現量が大きく増加する様相を示したし、Ｃ末端がＦ４６８で終結する場合は、成熟したＰＨ２０において１個又は２個のＮ末端アミノ酸残基がさらに除去された変異体が、Ｎ末端が成熟した状態のタンパク質に比べて酵素の比活性がむしろ増加する様相を示した。ヒトＰＨ２０のアミノ酸の特定部位において他のアミノ酸で置換してタンパク質の比活性を増加させる試みはあったが、Ｎ末端のアミノ酸を除去してタンパク質の活性を維持或いは増加させながら細胞における発現率を大きく増加させた事例は今までなかった。Ｎ末端が欠失した（ｄｅｌｅｔｉｏｎ）変異体は、ＰＨ２０の特定部位にアミノ酸を置換（ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）したＰＨ２０に比べて、人体に長期間投与しても免疫原性（ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ）の側面で有利であるということが予測できる。

【0093】

成熟したタンパク質においてＮ末端を切断した場合に発現量が増加するという報告は、Ｈｕｍａｎ ａｌｐｈａ１－ａｎｔｉｔｒｙｐｓｉｎ（Ｈ．Ｊｏｈａｎｓｅｎ等、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．１９８７，４：２９１－３０５）、Ｈｕｍａｎ ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ Ｌ１ ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｍ．Ｗｅｉ等、Ｅｍｅｒｇｉｎｇ Ｍｉｃｒｏｂｅｓ ＆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ，２０１８，７：１６０）に見られるが、各事例においてＮ末端部位のアミノ酸の位置及び切断数字などにおいて互いに共通する類似点は発見し難い。例えば、Ｈｕｍａｎ ａｌｐｈａ １－ａｎｔｉｔｒｙｐｓｉｎにおいては、Ｎ末端アミノ酸を５個～１０個切断（ｄｅｌｅｔｉｏｎ）した場合に細胞内で発現量は増加したが、酵素の活性は変わらなかったし、Ｈｕｍａｎ ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ Ｌ１ ｐｒｏｔｅｉｎにおいてＮ末端アミノ酸を１０個或いは１５個切断する場合に、タンパク質の全発現量には変わりがないが、タンパク質の溶解性（ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ）を増加させる場合があった。特に、ＰＨ２０のようなヒアルロニダーゼにおいてはこのような試みがなかったし、本発明のようにＮ末端アミノ酸の１個或いは２個の切断によって発現量が画期的に増加し、活性も増加する事例は発見されなかった。

【0094】

ヒトＰＨ２０の３次結晶構造は未だ明らかになっていない。しかし、タンパク質の３次構造を予測するプログラムを用いてＰＨ２０の３次構造を予測してみた結果、ＰＨ２０のＮ末端にある３７番位置のアスパラギン側鎖（Ａｓｐａｒａｇｉｎｅ ｓｉｄｅ ｃｈａｉｎ）と近づいてＦ３８、Ｒ３９、Ｙ４３４などのアミノ酸が位置しており、適切な電荷相互作用（Ｃｈａｒｇｅ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ）をなしているのに対し、成熟したタンパク質のアミノ酸であるＬｅｕ３６が周囲のアミノ酸と特定結合をなさず、疎水性（ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ）のアミノ酸が水溶液に露出されることにより、タンパク質の発現時に接合の速度又は安定性ひいては発現に悪影響を及ぼすということが予測できる。

【0095】

成熟した野生型動物ＰＨ２０タンパク質では、タンパク質３次構造を大きく修飾しない範囲内でアミノ酸を置換した変異体においても本発明と同じ結果が予測できる。ヒトＰＨ２０との相同性が６３．６％、６３．５％であるウシ、ヒツジＰＨ２０からも、９３．１％以上である霊長類ＰＨ２０からもその効果を確認したので、各ＰＨ２０との相同性が６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％であるＰＨ２０も、タンパク質３次構造が大きく修飾されない範囲で本発明と同じ結果が予測できる。

【0096】

実施例５． シグナルペプチドを異ならせたＮ末端及びＣ末端が切断された組換えＰＨ２０ヒアルロニダーゼの製造及び活性測定
シグナルペプチド（Ｓｉｇｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ）による変化を確認するために、ヒトＰＨ２０、ヒト血清ホルモン又はＩｇ ｋａｐｐａのシグナルペプチドに替えた９種の変異体を作製した。シグナルペプチドの配列は、下の表２に記載した通りである。

【0097】

先の実施例ではシグナルペプチドをヒト血清アルブミン（Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｕｍ Ａｌｂｕｍｉｎ，ＨＳＡ）のシグナルペプチドを使用したが、このシグナルペプチドに表２に記載の他のシグナルペプチドを適用しても上のような結果が見られるかを確認した。

【0098】

表２のシグナルペプチドを適用した以外は、実施例１及び実施例２と同一に組換えヒトＰＨ２０のＬ３６－Ｙ４８２、Ｎ３７－Ｙ４８２、Ｆ３８－Ｙ４８２を製造し、実施例４のような活性分析を行ってその結果を図７に示した。

【0099】

図７に示すように、ヒトＰＨ２０又はＩｇ ｋａｐｐａのシグナルペプチドを使用した場合にも、ヒト血清ホルモンを使用した場合と類似に、成熟したＰＨ２０のＮ末端における更なるアミノ酸欠失が起きた場合の生産性増加と類似の傾向を示し、成熟したＰＨ２０のＮ末端における更なるアミノ酸欠失が起きた場合の発現量と生産性が増加する現象はシグナルペプチドの種類とは関連が少ないことを確認した。

【産業上の利用可能性】

【0100】

本発明で提示する酵素活性及び生産性が増加したＮ末端及び／又はＣ末端が切断されたＰＨ２０ポリペプチドは、既存の組換えＰＨ２０ポリペプチドに比べて優れた発現量と高い酵素活性を示し、産業上の利用時に生産コストの低減による治療費用の減少をもたらし得る。

【0101】

以上、本発明の内容の特定の部分を詳細に記述したところ、当業界における通常の知識を有する者にとって、このような具体的記述は単に好ましい実施の態様であるだけで、これによって本発明の範囲が限定されるものでない点は明らかであろう。したがって、本発明の実質的な範囲は、添付する請求項とそれらの等価物によって定義されるといえよう。

【0102】

参考文献
1. H. Johansen, J. Sultiphong, G. Sathe, P. Jacobs, A. Cravador, A. Bollen, M. Rosenberg, and A. Shatzman, “High-level production of fully active human alpha 1-antitrypsin in Escherichia coli.” Mol. Biol. Med. (1987) 4:291-305,
2. J.H. Dunham, R.C. Meyer, E.L. Garcia, and R.A. Hall, “GPR37 Surface Expression Enhancement via N-Terminal Truncation or Protein-Protein Interactions”, Biochemistry (2009) 48:10286-10297
3. M. Wei, D. Wang, Z. Li, S. Song, X. Kong, X. Mo, Y. Yang, M. He, Z. Li, B. Huang, Z. Lin, H. Pan, Q. Zheng, H. Yu, Y. Gu, J. Zhang, S. Li and N. Xia, “N-terminal truncations on L1 proteins of human papillomaviruses promote their soluble expression in Escherichia coli and self-assembly in vitro”, Emerging Microbes & Infections (2018) 7:160
4. M. F. Meyer, G. Kreil, and H. Aschauer, “The soluble hyaluronidase from bull testes is a fragment of the membrane-bound PH-20 enzyme”, FEBS letter (1997) 413:385-388

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【配列表】

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【国際調査報告】