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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-12-26
(54)【発明の名称】組換えタンパク質の発現を増加させる遺伝因子
(51)【国際特許分類】
C12N 1/19 20060101AFI20241219BHJP
C12N 15/31 20060101ALI20241219BHJP
C12P 21/02 20060101ALI20241219BHJP
C12N 15/81 20060101ALI20241219BHJP
【ＦＩ】
C12N1/19 ZNA
C12N15/31
C12P21/02 C
C12N15/81 Z
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024535614
(86)(22)【出願日】2022-12-15
(85)【翻訳文提出日】2024-08-08
(86)【国際出願番号】 US2022053003
(87)【国際公開番号】W WO2023114395
(87)【国際公開日】2023-06-22
(31)【優先権主張番号】63/290,166
(32)【優先日】2021-12-16
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】514009867
【氏名又は名称】インポッシブル フーズ インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100092783
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 浩
(74)【代理人】
【識別番号】100120134
【弁理士】
【氏名又は名称】大森 規雄
(72)【発明者】
【氏名】ロイ チョウドリー，ビスワジョイ
(72)【発明者】
【氏名】バラツカヤ，スヴェトラーナ
(72)【発明者】
【氏名】ホイット，マーティン，アンドリュー
【テーマコード（参考）】
4B064
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B064AG01
4B064AG02
4B064AG27
4B064AG35
4B064CA06
4B064CD06
4B064DA01
4B064DA10
4B065AA72X
4B065AA77X
4B065AA77Y
4B065AA80X
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065CA24
4B065CA25
4B065CA41
4B065CA44
(57)【要約】
１つまたは複数のポリペプチドの発現を増加させるための、逆行性制御タンパク質１（Ｒｔｇ１）などの転写活性化因子の過剰発現に関与する材料および方法。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
第１のプロモーターエレメントに作動可能に連結された、逆行性制御タンパク質（Ｒｔｇ）をコードする第１の外因性核酸と、前記第１のプロモーターエレメントまたは第２のプロモーターエレメントに作動可能に連結された、ポリペプチドをコードする第２の外因性核酸と
を含む酵母細胞。
【請求項2】
前記Ｒｔｇがピキア・パストリス（Pichia pastoris）またはサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）由来のＲｔｇ１またはＲｔｇ２である、請求項１に記載の酵母細胞。
【請求項3】
前記ポリペプチドが、抗体またはその断片、酵素、制御タンパク質、ペプチドホルモン、血液凝固タンパク質、サイトカイン、サイトカインインヒビター、およびヘム結合タンパク質からなる群から選択される、請求項１または請求項２に記載の酵母細胞。
【請求項4】
前記ヘム結合タンパク質が、グロビン、シトクロム、シトクロムｃオキシダーゼ、リグニナーゼ、カタラーゼ、およびペルオキシダーゼからなる群から選択される、請求項３に記載の酵母細胞。
【請求項5】
前記第１の外因性核酸、前記第２の外因性核酸、または前記第１の外因性核酸と前記第２の外因性核酸の両方が、前記酵母細胞の前記ゲノムに安定的に組み込まれる、請求項１～４のいずれか一項に記載の酵母細胞。
【請求項6】
前記第１の外因性核酸、前記第２の外因性核酸、または前記第１の外因性核酸と前記第２の外因性核酸の両方が、複製可能なプラスミドから染色体外に発現される、請求項１～４のいずれか一項に記載の酵母細胞。
【請求項7】
前記第１のプロモーターエレメントが構成的プロモーターエレメントである、請求項１～６のいずれか一項に記載の酵母細胞。
【請求項8】
前記第１のプロモーターエレメント、前記第２のプロモーターエレメント、または前記第１のプロモーターエレメントと前記第２のプロモーターエレメントの両方が誘導性プロモーターエレメントである、請求項１～６のいずれか一項に記載の酵母細胞。
【請求項9】
前記誘導性プロモーターエレメントがメタノール誘導性プロモーターエレメントである、請求項８に記載の酵母細胞。
【請求項10】
前記メタノール誘導性プロモーターエレメントが、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）由来のアルコールオキシダーゼ１（ＡＯＸ１）プロモーターエレメント、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）由来のアルコールオキシダーゼ２（ＡＯＸ２）プロモーターエレメント、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）由来のカタラーゼ１（ＣＡＴ１）プロモーター、ハンセヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha）由来のギ酸脱水素酵素（ＦＭＤ）プロモーター、カンジダ・ボイディニ（Candida boidinii）由来のＡＯＤ１プロモーターエレメント、カンジダ・ボイディニ（Candida boidinii）由来のＦＧＨプロモーターエレメント、ハンセヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha）由来のＭＯＸプロモーターエレメント、ピキア・メタノリカ（Pichia methanolica）由来のＭＯＤＩプロモーターエレメント、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）由来のＤＨＡＳプロモーターエレメント、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）由来のＦＬＤ１プロモーターエレメント、およびピキア・パストリス（Pichia pastoris）由来のＰＥＸ８プロモーターエレメントからなる群から選択される、請求項９に記載の酵母細胞。
【請求項11】
前記第１のプロモーターエレメント、前記第２のプロモーターエレメント、または第３のプロモーターエレメントに作動可能に連結された、メタノール発現制御因子１（Ｍｘｒ１）、メタノール誘導性転写因子１（Ｍｉｔ１）、およびＴｒｍ１から選択される転写活性化因子をコードする第３の外因性核酸をさらに含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の酵母細胞。
【請求項12】
前記Ｍｘｒ１、Ｍｉｔ１、またはＴｒｍ１転写活性化因子がピキア・パストリス（Pichia pastoris）由来のＭｘｒ１、Ｍｉｔ１、またはＴｒｍ１エレメントを含む、請求項１１に記載の酵母細胞。
【請求項13】
前記第３のプロモーターエレメントが構成的プロモーターエレメントまたはメタノール誘導性プロモーターエレメントである、請求項１１または請求項１２に記載の酵母細胞。
【請求項14】
第１のプロモーターエレメントに作動可能に連結されたＲｔｇ１、Ｒｔｇ２、Ｍｘｒ１、Ｍｉｔ１、およびＴｒｍ１から選択される第１の転写活性化因子をコードする第１の外因性核酸と、前記第１のプロモーターエレメントまたは第２のプロモーターエレメントに作動可能に連結されたＲｔｇ１、Ｒｔｇ２、Ｍｘｒ１、Ｍｉｔ１、およびＴｒｍ１から選択される第２の転写活性化因子をコードする第２の外因性核酸であって、前記第１の転写活性化因子と前記第２の転写活性化因子が異なる、第２の外因性核酸と、
前記第１のプロモーターエレメント、前記第２のプロモーターエレメント、または第３のプロモーターエレメントに作動可能に連結されたポリペプチドをコードする第３の外因性核酸と
を含む酵母細胞。
【請求項15】
前記第１のプロモーターエレメント、前記第２のプロモーターエレメント、前記第３のプロモーターエレメント、または第４のプロモーターエレメントに作動可能に連結された１つまたは複数のヘム生合成酵素をコードする第４の外因性核酸をさらに含む、請求項１～１４のいずれか一項に記載の酵母細胞。
【請求項16】
前記１つまたは複数のヘム生合成酵素が、グルタミン酸－１－セミアルデヒド（ＧＳＡ）アミノトランスフェラーゼ、５－アミノレブリン酸（ＡＬＡ）シンターゼ、ＡＬＡデヒドラターゼ、ポルフォビリノーゲン（ＰＢＧ）デアミナーゼ、ウロポルフィリノーゲン（ＵＰＧ）ＩＩＩシンターゼ、ＵＰＧＩＩＩデカルボキシラーゼ、コプロポルフィリノーゲン（ＣＰＧ）ＩＩＩオキシダーゼ、プロトポルフィリノーゲン（ＰＰＧ）オキシダーゼ、およびフェロケラターゼからなる群から選択される、請求項１５に記載の酵母細胞。
【請求項17】
前記第４のプロモーターエレメントが、構成的プロモーターエレメントまたはメタノール誘導性プロモーターエレメントである、請求項１５または請求項１６に記載の酵母細胞。
【請求項18】
メチロトローフ酵母細胞または非メチロトローフ酵母細胞である、請求項１～１７のいずれか一項に記載の酵母細胞。
【請求項19】
前記メチロトローフ酵母細胞がピキア（Pichia）細胞である、請求項１８に記載の酵母細胞。
【請求項20】
前記ピキア（Pichia）細胞がピキア・パストリス（Pichia pastoris）細胞である、請求項１９に記載の酵母細胞。
【請求項21】
ポリペプチドを発現する方法であって、請求項１～２０のいずれか一項に記載の前記酵母細胞を用意するステップと、
前記第１および前記第２の外因性核酸、または前記第１、前記第２および前記第３の外因性核酸の発現に適した条件下で前記酵母細胞を培養するステップと
を含む、方法。
【請求項22】
前記培養するステップが、添加した鉄またはその薬学的もしくは代謝的に許容される塩の存在下で前記酵母細胞を培養するステップを含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項23】
前記培養するステップが、添加メタノールの非存在下または存在下で前記酵母細胞を培養するステップを含む、請求項２１または請求項２２に記載の方法。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
優先権の主張
本出願は、２０２１年１２月１６日に出願された米国仮特許出願第６３／２９０，１６６号の優先権を主張するものであり、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０２１年１２月１６日に出願された米国仮特許出願第６３／２９０，１６６号の優先権を主張するものであり、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【0002】
本開示は、一般的には、核酸構築物、およびそれを使用して酵母細胞（例えばメチロトローフ酵母細胞）を遺伝子操作する方法に関する。
【0003】
配列表
本出願は、「３８７６７－０２６３ＷＯｌ＿ＳＬ＿ＳＴ２６．ＸＭＬ」という名称のＸＭＬファイルとして電子的に提出された配列表リストを含む。２０２２年１２月８日に作成されたＸＭＬファイルは、６４，６４２バイトのサイズである。ＸＭＬファイル内の資料は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本出願は、「３８７６７－０２６３ＷＯｌ＿ＳＬ＿ＳＴ２６．ＸＭＬ」という名称のＸＭＬファイルとして電子的に提出された配列表リストを含む。２０２２年１２月８日に作成されたＸＭＬファイルは、６４，６４２バイトのサイズである。ＸＭＬファイル内の資料は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【0004】
酵母細胞、例えばピキア・パストリス（Pichia pastoris）は、組換えタンパク質の発現に通常使用されている。本明細書では、酵母細胞（例えばメチロトローフ酵母細胞）において１つまたは複数のタンパク質を効率的に発現するために使用することが可能な構築物が提供される。
【発明の概要】
【0005】
本開示は、１つまたは複数の転写活性化因子（例えばＲｔｇ１）を過剰発現して、メタノール利用（ｍｕｔ）遺伝子プロモーターから発現される導入遺伝子の発現を増加させる酵母株の使用を記載しており、これは、１つまたは複数のタンパク質の組換え生産を有意に改善する。さらに、ｍｕｔ遺伝子プロモーター依存性遺伝子発現に対する転写活性化因子の組合せ（例えば、Ｒｔｇ１およびＭｘｒ１）の発現の効果は加法的であり、それにより１つまたは複数のタンパク質の組換え生産がさらに増加した。
【0006】
したがって、本開示の態様は、第１のプロモーターエレメントに作動可能に連結された、逆行性制御タンパク質（retrograde regulation protein）（Ｒｔｇ）をコードする第１の外因性核酸と、第１のプロモーターエレメントまたは第２のプロモーターエレメントに作動可能に連結された、ポリペプチドをコードする第２の外因性核酸とを含む酵母細胞を提供する。一部の実施形態では、Ｒｔｇは、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）またはサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）由来のＲｔｇ１またはＲｔｇ２である。
【0007】
一部の実施形態では、ポリペプチドは、抗体またはその断片、酵素、制御タンパク質、ペプチドホルモン、血液凝固タンパク質、サイトカイン、サイトカインインヒビター、およびヘム結合タンパク質からなる群から選択される。一部の実施形態では、ヘム結合タンパク質は、グロビン、シトクロム、シトクロムｃオキシダーゼ、リグニナーゼ、カタラーゼ、およびペルオキシダーゼからなる群から選択される。
【0008】
一部の実施形態では、第１の外因性核酸、第２の外因性核酸、または第１の外因性核酸と第２の外因性核酸の両方は、酵母細胞のゲノムに安定的に組み込まれる。一部の実施形態では、第１の外因性核酸、第２の外因性核酸、または第１の外因性核酸と第２の外因性核酸の両方は、複製可能なプラスミドから染色体外に発現される。
【0009】
一部の実施形態では、第１のプロモーターエレメントは、構成的プロモーターエレメントである。一部の実施形態では、第１のプロモーターエレメント、第２のプロモーターエレメント、または第１のプロモーターエレメントと第２のプロモーターエレメントの両方は、誘導性プロモーターエレメントである。
【0010】
一部の実施形態では、誘導性プロモーターエレメントは、メタノール誘導性プロモーターエレメントである。一部の実施形態では、メタノール誘導性プロモーターエレメントは、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）由来のアルコールオキシダーゼ１（ＡＯＸ１）プロモーターエレメント、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）由来のアルコールオキシダーゼ２（ＡＯＸ２）プロモーターエレメント、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）由来のカタラーゼ１（ＣＡＴ１）プロモーター、ハンセヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha）由来のギ酸脱水素酵素（ＦＭＤ）プロモーター、カンジダ・ボイディニ（Candida boidinii）由来のＡＯＤ１プロモーターエレメント、カンジダ・ボイディニ（Candida boidinii）由来のＦＧＨプロモーターエレメント、ハンセヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha）由来のＭＯＸプロモーターエレメント、ピキア・メタノリカ（Pichia methanolica）由来のＭＯＤＩプロモーターエレメント、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）由来のＤＨＡＳプロモーターエレメント、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）由来のＦＬＤ１プロモーターエレメント、およびピキア・パストリス（Pichia pastoris）由来のＰＥＸ８プロモーターエレメントからなる群から選択される。
【0011】
一部の実施形態では、酵母細胞は、第１のプロモーターエレメント、第２のプロモーターエレメント、または第３のプロモーターエレメントに作動可能に連結された、メタノール発現制御因子１（Ｍｘｒ１）、メタノール誘導性転写因子１（Ｍｉｔ１）、およびＴｒｍ１から選択される転写活性化因子をコードする第３の外因性核酸をさらに含む。一部の実施形態では、Ｍｘｒ１、Ｍｉｔ１、またはＴｒｍ１転写活性化因子は、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）由来のＭｘｒ１、Ｍｉｔ１、またはＴｒｍ１エレメントを含む。一部の実施形態では、第３のプロモーターエレメントは、構成的プロモーターエレメントまたはメタノール誘導性プロモーターエレメントである。
【0012】
本開示の態様は、第１のプロモーターエレメントに作動可能に連結されたＲｔｇ１、Ｒｔｇ２、Ｍｘｒ１、Ｍｉｔ１、およびＴｒｍ１から選択される第１の転写活性化因子をコードする第１の外因性核酸と、第１のプロモーターエレメントまたは第２のプロモーターエレメントに作動可能に連結されたＲｔｇ１、Ｒｔｇ２、Ｍｘｒ１、Ｍｉｔ１、およびＴｒｍ１から選択される第２の転写活性化因子をコードする第２の外因性核酸であって、第１の転写活性化因子および第２の転写活性化因子が異なる、第２の外因性核酸と、第１のプロモーターエレメント、第２のプロモーターエレメント、または第３のプロモーターエレメントに作動可能に連結された、ポリペプチドをコードする第３の外因性核酸を含む酵母細胞を提供する。
【0013】
一部の実施形態では、酵母細胞は、第１のプロモーターエレメント、第２のプロモーターエレメント、第３のプロモーターエレメント、または第４のプロモーターエレメントに作動可能に連結された、１つまたは複数のヘム生合成酵素をコードする第４の外因性核酸をさらに含む。一部の実施形態では、ヘム生合成酵素は、グルタミン酸－１－セミアルデヒド（ＧＳＡ）アミノトランスフェラーゼ、５－アミノレブリン酸（ＡＬＡ）シンターゼ、ＡＬＡデヒドラターゼ、ポルフォビリノーゲン（ＰＢＧ）デアミナーゼ、ウロポルフィリノーゲン（ＵＰＧ）ＩＩＩシンターゼ、ＵＰＧＩＩＩデカルボキシラーゼ、コプロポルフィリノーゲン（ＣＰＧ）ＩＩＩオキシダーゼ、プロトポルフィリノーゲン（ＰＰＧ）オキシダーゼ、およびフェロケラターゼからなる群から選択される。一部の実施形態では、第４のプロモーターエレメントは、構成的プロモーターエレメントまたはメタノール誘導性プロモーターエレメントである。
【0014】
一部の実施形態では、酵母細胞は、メチロトローフ酵母細胞または非メチロトローフ酵母細胞である。一部の実施形態では、メチロトローフ酵母細胞は、ピキア（Pichia）細胞である。一部の実施形態では、ピキア（Pichia）細胞は、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）細胞である。
【0015】
本開示の態様は、ポリペプチドを発現する方法であって、前記請求項のいずれか一項に記載の酵母細胞を用意するステップと、第１および第２の外因性核酸、または第１、第２および第３の外因性核酸の発現に適した条件下で酵母細胞を培養するステップとを含む、方法を提供する。
【0016】
一部の実施形態では、培養するステップは、添加した鉄またはその薬学的もしくは代謝的に許容される塩の存在下で酵母細胞を培養するステップを含む。一部の実施形態では、培養ステップは、添加メタノールの非存在下または存在下で酵母細胞を培養するステップを含む。
【0017】
別段の定義がない限り、本明細書において使用されるすべての技術用語および科学用語は、方法および物質の組成物が属する技術分野における当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載されたものと類似のまたは同等の方法および材料を方法および物質の組成物の実施または試験において使用することができるが、適切な方法および材料は以下に記載されている。さらに、材料、方法、および例は単なる例示であり、限定を意図するものではない。本明細書で言及されているすべての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、参照によりその全体が組み込まれる。
【発明を実施するための形態】
【0018】
酵母細胞を遺伝子操作してポリペプチドの組換え発現を増加させることができる転写活性化因子（例えば、Ｒｔｇ１、Ｒｔｇ２、Ｍｘｒ１、Ｍｉｔ１、Ｔｒｍ１）をコードする核酸構築物が本明細書で提供される。一部の実施形態では、本明細書で提供される核酸構築物は、誘導分子（例えばメタノール）の非存在下で、誘導性プロモーターからのポリペプチドの組換え発現を増加させることができる。いかなる特定のメカニズムにも縛られるものではないが、本明細書に記載の方法は、１つまたは複数の転写活性化因子の低レベルのネイティブ発現が、１つまたは複数の転写活性化因子に作動可能に連結されたｍｕｔプロモーターをオンにする正のフィードバックループを作製する。これにより、１つまたは複数の転写活性化因子の発現が増加され、また１つまたは複数の転写活性化因子によってオンにされる同一のまたは異なる誘導性プロモーターに作動可能に連結された１つまたは複数の標的ポリペプチドの発現が増加する。あるいは、１つまたは複数の転写活性化因子を構成的プロモーターから発現させ、１つまたは複数の標的ポリペプチドに作動可能に連結されたｍｕｔプロモーターをオンにすることができる。
【0019】
したがって、本開示は、一部の態様では、１つまたは複数の転写活性化因子（例えば、Ｒｔｇ１、Ｒｔｇ２、Ｍｘｒ１、Ｍｉｔ１、Ｔｒｍ１）をコードする核酸構築物、およびポリペプチドを生産するためのその使用方法を提供する。
【0020】
転写活性化因子
本明細書に記載の方法および組成物には、ｍｕｔ遺伝子プロモーターからの導入遺伝子の発現を増加させる転写活性化因子（例えば、Ｒｔｇ１、Ｒｔｇ２、Ｍｘｒ１、Ｍｉｔ１、Ｔｒｍ１）が含まれ、それにより、１つまたは複数のタンパク質の組換え生産が有意に改善される。転写活性化因子および転写活性化因子をコードする核酸（例えば、転写活性化因子をコードする外因性核酸）は当技術分野において公知であり、本明細書に記載されている。一部の例では、転写活性化因子は、ｍｕｔ遺伝子プロモーターに作用することができる。一部の例では、転写活性化因子は、炭素抑制解除中に機能することができる。一部の例では、転写活性化因子は、メタノール誘導中に機能することができる。一部の例では、ｍｕｔ遺伝子プロモーターは、転写活性化因子に対する１つまたは複数の結合部位を有する。一部の例では、転写活性化因子は、メチロトローフ酵母由来でもよい。一部の例では、転写活性化因子は、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）由来でもよい。一部の例では、転写活性化因子は、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）由来でもよい。
本明細書に記載の方法および組成物には、ｍｕｔ遺伝子プロモーターからの導入遺伝子の発現を増加させる転写活性化因子（例えば、Ｒｔｇ１、Ｒｔｇ２、Ｍｘｒ１、Ｍｉｔ１、Ｔｒｍ１）が含まれ、それにより、１つまたは複数のタンパク質の組換え生産が有意に改善される。転写活性化因子および転写活性化因子をコードする核酸（例えば、転写活性化因子をコードする外因性核酸）は当技術分野において公知であり、本明細書に記載されている。一部の例では、転写活性化因子は、ｍｕｔ遺伝子プロモーターに作用することができる。一部の例では、転写活性化因子は、炭素抑制解除中に機能することができる。一部の例では、転写活性化因子は、メタノール誘導中に機能することができる。一部の例では、ｍｕｔ遺伝子プロモーターは、転写活性化因子に対する１つまたは複数の結合部位を有する。一部の例では、転写活性化因子は、メチロトローフ酵母由来でもよい。一部の例では、転写活性化因子は、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）由来でもよい。一部の例では、転写活性化因子は、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）由来でもよい。
【0021】
代表的なピキア・パストリス（Pichia pastoris）のＲｔｇ１核酸配列は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＸＭ＿００２４８９９８４．１（例えば、配列番号１を参照）で確認することができ、代表的なピキア・パストリス（Pichia pastoris）のＲｔｇ１ポリペプチド配列は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＸＰ＿００２４９００２９．１（例えば、配列番号２を参照）で確認することができる。
【0022】
代表的なピキア・パストリス（Pichia pastoris）のＲｔｇ１配列は、１つまたは複数の変異を含み得る。例えば、代表的なピキア・パストリス（Pichia pastoris）のＲｔｇ１核酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＸＭ＿００２４８９９８４．１内に変異を含む（例えば、配列番号３を参照）。別の例では、代表的なピキア・パストリス（Pichia pastoris）のＲｔｇ１ポリペプチド配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＸＰ＿００２４９００２９．１内に変異を含む（例えば、配列番号４を参照）。
【0023】
代表的なピキア・パストリス（Pichia pastoris）のＲｔｇ２核酸配列は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＸＭ＿００２４９２６３３．１（例えば、配列番号５を参照）で確認することができ、代表的なピキア・パストリス（Pichia pastoris）のＲｔｇ２ポリペプチド配列は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＸＰ＿００２４９２６７８．１（例えば、配列番号６を参照）で確認することができる。
【0024】
代表的なピキア・パストリス（Pichia pastoris）のメタノール発現制御因子１（Ｍｘｒ１）核酸配列は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＤＱ３９５１２４（例えば、配列番号７を参照）で確認することができ、代表的なピキア・パストリス（Pichia pastoris）Ｍｘｒ１ポリペプチド配列は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢＤ５７３６５（例えば、配列番号８を参照）で確認することができる。
【0025】
代表的なピキア・パストリス（Pichia pastoris）のメタノール誘導転写因子１（Ｍｉｔ１）核酸配列は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＸＭ＿００２４９３０２１．１（例えば、配列番号９を参照）で確認することができ、代表的なピキア・パストリス（Pichia pastoris）のＭｉｔ１ポリペプチド配列は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＸＰ＿００２４９３０６６．１（例えば、配列番号１０を参照）で確認することができる。一部の実施形態では、転写活性化因子は、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）由来のＭｉｔ１配列である（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＣＡＹ７０８８７を参照）。
【0026】
代表的なピキア・パストリス（Pichia pastoris）のＴｒｍ１核酸配列は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＸＭ＿００２４９３５６３．１（例えば、配列番号１１を参照）で確認することができ、代表的なピキア・パストリス（Pichia pastoris）のＴｒｍ１ポリペプチド配列は、例えばＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＸＰ＿００２４９３６０８．１（例えば、配列番号１２を参照）で確認することができる。
【0027】
代表的なサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）のＲｔｇ１核酸配列は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＸＭ＿００１１８３３２２．１（例えば、配列番号１３を参照）で確認することができ、代表的なサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）のＲｔｇ１ポリペプチド配列は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＸＰ＿０１４５７４．１（例えば、配列番号１４を参照）で確認することができる。
【0028】
代表的なサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）のＲｔｇ２核酸配列は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＸＭ＿００１１８１１１８．１（例えば、配列番号１５を参照）で確認することができ、代表的なサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）のＲｔｇ２ポリペプチド配列は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＸＰ＿０１１２６２．１（例えば、配列番号１６を参照）で確認することができる。
【0029】
【表1-1】
【0030】
【表1-2】
【0031】
【表1-3】
【0032】
【表1-4】
【0033】
【表1-5】
【0034】
【表1-6】
【0035】
適切な転写活性化因子はまた、ハンセヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha）（Ａｄｒ１配列；例えば、核酸配列については、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＥＯＩ０２０００００５、塩基８５８８７３～８６２３５２、アミノ酸配列については、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＥＳＸ０１２５３を参照；Ｍｐｐ１配列；例えば、核酸配列については、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ１９０５２１．１、アミノ酸配列については、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＯ７２７３５．１を参照）、およびカンジダ・ボイディニ（Candida boidinii）（Ｔｒｍ１配列；例えば、核酸配列については、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢ３６５３５５、アミノ酸配列については、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＢＡＦ９９７００を参照；Ｔｒｍ２配列；例えば、核酸配列については、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢ５４８７６０、アミノ酸配列については、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＢＡＪ０７６０８を参照；ＨＡＰ２配列；例えば、核酸配列については、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢ９０９５０１．１、アミノ酸配列については、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＢＡＱ２１４６５．１を参照；ＨＡＰ３配列；例えば、核酸配列については、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢ９０９５０２．１、アミノ酸配列については、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＢＡＱ２１４６６．１を参照；ＨＡＰ５配列；例えば、核酸配列については、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢ９０９５０３．１、アミノ酸配列については、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＢＡＱ２１４６７．１を参照）で確認することができる。
【0036】
２つ以上の転写活性化因子の組合せを使用することができる。一部の例では、組合せにおいて、Ｒｔｇ１、Ｒｔｇ２、Ｍｘｒ１、Ｍｉｔ１、Ｔｒｍ１、Ｔｒｍ２、Ａｄｒ１、Ｍｐｐ１、ＨＡＰ２、ＨＡＰ３、ＨＡＰ５のうちの２つ、３つ、４つ、または５つ以上、およびそれらの任意の組合せが使用される。一部の例では、Ｒｔｇ１、Ｒｔｇ２、Ｍｘｒ１、Ｍｉｔ１、およびＴｒｍ１のうちの２つ、３つ、４つ、または５つが組合せにおいて使用される。一部の例では、Ｒｔｇ１およびＲｔｇ２が組合せにおいて使用される。一部の例では、Ｒｔｇ１およびＭｘｒ１が組合せにおいて使用される。一部の例では、Ｒｔｇ１およびＭｉｔ１が組合せにおいて使用される。一部の例では、Ｒｔｇ１およびＴｒｍ１が組合せにおいて使用される。一部の例では、Ｍｉｔ１およびＭｘｒ１が組合せにおいて使用される。一部の例では、Ｍｉｔ１およびＴｒｍ１が組合せにおいて使用される。一部の例では、Ｍｘｒ１およびＴｒｍ１が組合せにおいて使用される。一部の例では、Ｒｔｇ１、Ｒｔｇ２、およびＭｘｒ１が組合せにおいて使用される。一部の例では、Ｒｔｇ１、Ｍｘｒ１、およびＭｉｔ１が組合せにおいて使用される。一部の例では、Ｒｔｇ１、Ｒｔｇ２、Ｍｘｒ１、およびＭｉｔ１が組合せにおいて使用される。
【0037】
外因性核酸（例えば、ポリペプチドまたは転写活性化因子をコードする核酸）は、誘導性または構成的であるプロモーター（例えば、当技術分野において公知であり、本明細書に記載されているもの）の制御下に置き得る。本明細書において使用される場合、「作動可能に連結された」とは、プロモーターまたは他の発現エレメント（複数可）が、核酸の発現を指示または制御するような方法（例えばインフレーム）で核酸コード配列に対して配置されていることを意味する。
【0038】
産物
本明細書で提供される方法および組成物は、目的の生産物（例えば、目的のタンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、または小分子）を生産するための核酸構築物を包含する。
本明細書で提供される方法および組成物は、目的の生産物（例えば、目的のタンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、または小分子）を生産するための核酸構築物を包含する。
【0039】
例えば、ヌクレオチド配列を含む核酸構築物は、タンパク質をコードする核酸構築物でもよい。例えば、ヌクレオチド配列を含む核酸構築物は、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、リボザイム、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、またはｓｈＲＮＡ）をコードする核酸構築物でもよい。例えば、ヌクレオチド配列を含む核酸構築物は、ＤＮＡをコードする核酸構築物でもよい。例えば、一部の実施形態では、ヌクレオチド配列を含む核酸構築物は、その転写が小分子（例えば、ヘム、エタノール、補因子、代謝物、二次代謝産物、または薬学的に活性な薬剤）の生産をもたらすか、または生産に寄与する核酸構築物でもよい。
【0040】
したがって、本明細書に記載の方法および組成物を使用して生産される産物は、食品、研究、および医薬などの多くの用途に幅広く使用することができる。
【0041】
産物がポリペプチドである場合、ポリペプチドは、デヒドリン、フィターゼ、プロテアーゼ、カタラーゼ、リパーゼ、ペルオキシダーゼ、アミラーゼ、トランスグルタミナーゼ、オキシドレダクターゼ、トランスフェラーゼ、ヒドラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼ、またはリガーゼでもよい。一部の実施形態では、ポリペプチドは、抗体またはその断片（例えば、アダリムマブ、リツキシマブ、トラスツズマブ、ベバシズマブ、インフリキシマブ、もしくはラニビズマブ）、酵素（例えば、治療用酵素、例えば、α－ガラクトシダーゼＡ、α－Ｌ－イズロニダーゼ、Ｎ－アセチルガラクトサミン－４－スルファターゼ、ドルナーゼアルファ、グルコセレブロシダーゼ、組織プラスミノーゲン活性化因子、ラスブリカーゼ、工業用酵素（例えば、カタラーゼ、セルラーゼ、ラッカーゼ、グルタミナーゼ、もしくはグリコシダーゼ）、生体触媒（例えば、生合成または代謝に関与する酵素、トランスアミナーゼ、シトクロムＰ４５０、キナーゼ、ホスホリラーゼ、もしくはイソメラーゼ））、制御タンパク質（例えば、転写因子（例えば、Ｍｘｒ１）、ペプチドホルモン（例えば、インスリン、インスリン様増殖因子１、顆粒球コロニー刺激因子、卵胞刺激ホルモン、もしくはヒト成長ホルモンなどの成長ホルモン）、血液凝固タンパク質（例えば、第ＶＩＩ因子）、サイトカイン（例えば、インターフェロンもしくはエリスロポエチン）、またはサイトカインインヒビター（例えば、エタネルセプト）でもよい。
【0042】
一部の実施形態では、ポリペプチドは、ヘム結合タンパク質（例えば、外因性ヘム結合タンパク質または異種ヘム結合タンパク質）でもよい。一部の実施形態では、ヘム結合タンパク質は、グロビン（ＰｆａｍデータベースのＰＦ０００４２）、シトクロム（例えば、シトクロムＰ４５０、シトクロムａ、シトクロムｂ、シトクロムｃ）、シトクロムｃオキシダーゼ、リグニナーゼ、カタラーゼ、およびペルオキシダーゼからなる群から選択することができる。一部の実施形態では、グロビンは、アンドログロビン、クロロクルオリン、サイトグロビン、エリスロクルオリン、フラボヘモグロビン、グロビンＥ、グロビンＸ、グロビンＹ、ヘモグロビン（例えば、βヘモグロビン、αヘモグロビン）、ヒストグロビン、レグヘモグロビン、ミオグロビン、ニューログロビン、非共生型ヘモグロビン、プロトグロビン、および切断型ヘモグロビン（例えば、ＨｂＮ、ＨｂＯ、Ｇｌｂ３、シアノグロビン）からなる群から選択することができる。一部の実施形態では、ヘム結合タンパク質は、ミオグロビンでもよい。一部の実施形態では、ヘム結合タンパク質は、ヘモグロビンでもよい。一部の実施形態では、ヘム結合タンパク質は、非共生型ヘモグロビンでもよい。一部の実施形態では、ヘム結合タンパク質は、レグヘモグロビンでもよい。一部の実施形態では、ヘム結合タンパク質は、ダイズレグヘモグロビン（ＬｅｇＨ）でもよい。ＬｅｇＨの参照アミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００１２３５２４８．２（例えば、配列番号２０を参照）で提供されている。ＬｅｇＨはヘムに結合するタンパク質であり、約４１５ｎｍでの特徴的な吸収ピーク（Ｓｏｒｅｔピーク）としてはっきりと認識される赤色を生じる。ＬｅｇＨタンパク質（ＬＧＢ２としても公知である）は、ダイズの根粒に天然に存在することが確認されている。また、国際公開第２０１４／１１０５３９号パンフレットおよび国際公開第２０１４／１１０５３２号パンフレットも参照されたい。それぞれの文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。一部の実施形態では、ヘム結合タンパク質は、配列番号１７～４３のいずれかに記載のアミノ酸配列と少なくとも７０％（例えば、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％）同一であるアミノ酸配列を有し得る。一部の実施形態では、ヘム結合タンパク質は、配列番号１７～４３のいずれかに記載のアミノ酸配列である。
【0043】
【表2-1】
【0044】
【表2-2】
【0045】
【表2-3】
【0046】
一部の実施形態では、ポリペプチドは、ヘム生合成酵素（例えば、外因性ヘム生合成酵素または異種ヘム生合成酵素）でもよい。一部の実施形態では、ヘム生合成酵素は、グルタミン酸－１－セミアルデヒド（ＧＳＡ）アミノトランスフェラーゼ、５－アミノレブリン酸（ＡＬＡ）シンターゼ、ＡＬＡデヒドラターゼ、ポルフォビリノーゲン（ＰＢＧ）デアミナーゼ、ウロポルフィリノーゲン（ＵＰＧ）ＩＩＩシンターゼ、ＵＰＧＩＩＩデカルボキシラーゼ、コプロポルフィリノーゲン（ＣＰＧ）ＩＩＩオキシダーゼ、プロトポルフィリノーゲン（ＰＰＧ）オキシダーゼ、およびフェロキラターゼからなる群から選択することができる。また、２０２０年４月２４日に出願された米国特許出願公開第２０２０／０３４００００号明細書も参照されたい。なお、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【0047】
また、所定の配列とは異なるポリペプチド（例えば、当技術分野において公知であり、本明細書に記載されているもの）も提供される。ポリペプチドは、所定のポリペプチド配列と少なくとも５０％の配列同一性（例えば、少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性）を有し得る。一部の実施形態では、ポリペプチドは、所定のポリペプチド配列と１００％の配列同一性を有し得る。
【0048】
配列同一性のパーセントの計算においては、２つの配列をアラインメントさせ、２つの配列間のヌクレオチドまたはアミノ酸残基の同一マッチ数が決定される。同一マッチ数は、アラインメントされた領域の長さ（すなわち、アラインメントされたヌクレオチドまたはアミノ酸残基の数）で割り、１００を掛けることによって算出され、配列同一性パーセント値が得られる。アラインメントされた領域の長さは、一方の配列または両方の配列の一部から最も短い配列の完全長サイズまでとすることができることは理解されよう。また、単一の配列が複数の他の配列とアラインメントする可能性があり、したがって、アラインメントされたそれぞれの領域ごとに異なる配列同一性パーセント値を有し得ることも理解されよう。
【0049】
配列同一性のパーセントを決定する２つ以上の配列のアラインメントは、コンピュータプログラムＣｌｕｓｔａｌＷとデフォルトのパラメータを使用して実行することができ、これにより核酸またはポリペプチド配列のアラインメントをその全長（グローバルアライメント）にわたって行うことができる。Chenna et al., 2003, Nucleic Acids Res., 31(13):3497-500。ＣｌｕｓｔａｌＷは、クエリーと１つまたは複数の対象配列の間の最適なマッチングを計算し、同一性、類似性、差異が決定され得るようにそれらをアラインメントする。配列アラインメントを最大化するために、１つまたは複数の残基のギャップをクエリー配列、対象配列、またはその両方に挿入することができる。核酸配列の高速ペアワイズアラインメントの場合、デフォルトのパラメータを使用することができる（すなわち、ワードサイズ：２、ウィンドウサイズ：４、スコアリング方法：パーセンテージ、トップ対角線の数：４；ギャップペナルティ：５）；複数の核酸配列のアラインメントの場合、以下のパラメータを使用することができる：ギャップオープニングペナルティ：１０．０、ギャップエクステンションペナルティ：５．０、ウェイトトランジション：あり。ポリペプチド配列の高速ペアワイズアラインメントの場合、以下のパラメータを使用することができる：ワードサイズ：１、ウィンドウサイズ：５、スコアリング方法：パーセンテージ、トップ対角の数：５、ギャップペナルティ：３。ポリペプチド配列の多重アラインメントの場合、以下のパラメータを使用することができる：ウェイトマトリックス：ブロッサム；ギャップ開始ペナルティ：１０．０；ギャップエクステンションペナルティ：０．０５、親水性ギャップ：オン；親水性残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、およびＬｙｓ；残基特異的ギャップペナルティ：オン。ＣｌｕｓｔａｌＷは、例えば、ベイラー医科大学（Baylor College of Medicine）のＳｅａｒｃｈ Ｌａｕｎｃｈｅｒ Ｗｅｂサイト、またはＷｏｒｌｄ Ｗｉｄｅ Ｗｅｂ上のＥｕｒｏｐｅａｎ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｗｅｂサイトで実行することができる。
【0050】
プロモーター
転写活性化因子（例えば、Ｒｔｇ１、Ｒｔｇ２、Ｍｘｒ１、Ｍｉｔ１、Ｔｒｍ１）および／またはポリペプチドをコードする外因性核酸は、酵母細胞における転写活性化因子および／またはポリペプチドの発現に適した任意のプロモーターに作動可能に連結され得る。本明細書において使用される場合、「作動可能に連結される」とは、プロモーターまたは他の発現エレメントが、核酸の発現を指示または制御するような方法（例えば、インフレーム）で核酸コード配列に対して配置されていることを意味する。プロモーターは、構成的プロモーターまたは誘導性プロモーター（例えば、メタノール誘導性プロモーター）でもよい。
転写活性化因子（例えば、Ｒｔｇ１、Ｒｔｇ２、Ｍｘｒ１、Ｍｉｔ１、Ｔｒｍ１）および／またはポリペプチドをコードする外因性核酸は、酵母細胞における転写活性化因子および／またはポリペプチドの発現に適した任意のプロモーターに作動可能に連結され得る。本明細書において使用される場合、「作動可能に連結される」とは、プロモーターまたは他の発現エレメントが、核酸の発現を指示または制御するような方法（例えば、インフレーム）で核酸コード配列に対して配置されていることを意味する。プロモーターは、構成的プロモーターまたは誘導性プロモーター（例えば、メタノール誘導性プロモーター）でもよい。
【0051】
構成的プロモーターおよび構成的プロモーターエレメントは、当技術分野において公知である。例えば、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）由来の一般的に使用される構成的プロモーターは、構成的に強力に転写される転写伸長因子ＥＦ－１α遺伝子（ＴＥＦ１）由来のプロモーターまたはその一部である。しかし、他の構成的プロモーター、またはそれら由来のプロモーターエレメントも使用することができ、これには、限定するものではないが、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）由来のグリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨもしくはＧＡＰ）プロモーター（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｕ６２６４８．１を参照）、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）由来の潜在的グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）－アンカータンパク質、ＧＣＷ１４ｐ（ＰＡＳ＿ｃｈｒｌ－４＿０５８６）からのプロモーター（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＸＭ＿００２４９０６７８を参照）、またはピキア・パストリス（Pichia pastoris）由来の３－ホスホグリセリン酸キナーゼ遺伝子（ＰＧＫ１）からのプロモーター（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ２８８２９６を参照）が含まれる。宿主生物（例えば、メチロトローフ酵母細胞または非メチロトローフ酵母細胞などの酵母細胞）由来の構成的プロモーターおよび構成的プロモーターエレメントを使用することができる。
【0052】
酵母を遺伝子操作する場合に使用することができる誘導性プロモーターは多数ある。例えば、メタノール誘導性プロモーター、またはそれからのプロモーターエレメントを使用することができる。メタノール誘導性プロモーターは、当技術分野において公知である。例えば、一般的に使用されているピキア・パストリス（Pichia pastoris）由来のメタノール誘導性プロモーターは、メタノールに応答して強く転写されるアルコールオキシダーゼ１（ＡＯＸ１）遺伝子のプロモーターまたはその一部である。しかし、他のメタノール誘導性プロモーターまたはそれらのプロモーターエレメントを使用することもでき、これには、限定するものではないが、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）由来のアルコールオキシダーゼ２（ＡＯＸ２）プロモーター（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｘ７９８７１．１を参照）、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）由来のカタラーゼ１（ＣＡＴ１）プロモーター（Vogl et al., 2016, ACS Synth Biol 5:172-186を参照）、ハンセヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha）由来のギ酸脱水素酵素（ＦＭＤ）プロモーター、ハンセヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha）由来のアルコールオキシダーゼ（ＭＯＸ）プロモーター（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｘ０２４２５を参照）、カンジダ・ボイディニ（Candida boidinii）由来のアルコールオキシダーゼ（ＡＯＤ１）プロモーター（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＹＳＡＡＯＤ１Ａを参照）、カンジダ・ボイディニ（Candida boidinii）由来のＳ－ホルミルグルタチオンヒドラーゼ（ＦＧＨ）プロモーター、ピキア・メタノリカ（Pichia methanolica）由来のＭＯＤ１またはＭ０Ｄ２プロモーター（例えば、Raymond et al., 1998, Yeast, 14:11-23；およびNakagawa et al., 1999, Yeast, 15:1223-30を参照）、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）由来のジヒドロキシアセトンシンターゼ１または２（ＤＨＡＳまたはＤＡＳ）プロモーター（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＦＪ７５２５５１を参照）またはそのプロモーターエレメント、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）由来のホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＦＬＤ１）プロモーター（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ０６６０５４を参照）、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）由来のジヒドロキシアセトンキナーゼ（ＤＡＫ１）プロモーター、またはピキア・パストリス（Pichia pastoris）由来のペルオキシソームマトリックスタンパク質（ＰＥＸ８）プロモーター（例えば、Kranthi et al., 2010, Yeast, 27:705-11を参照）が含まれる。一部の実施形態では、メタノール誘導性プロモーターは、メチロトローフ酵母由来である。一部の実施形態では、メタノール誘導性プロモーターは、メタノール利用経路における遺伝子のプロモーターである。一部の実施形態では、メタノール誘導性プロモーターは、アルコールオキシダーゼプロモーターである。これらのプロモーターのすべては、メタノールによって誘導されることが知られている。
【0053】
本開示の範囲内にはまた、参照プロモーター配列と比較した場合に１つまたは複数の変異を含む配列を有するプロモーターを含む核酸構築物が含まれる。例えば、ＡＯＸ１遺伝子（ｐＡＯＸ１とも呼ばれる）に関するピキア・パストリス（Pichia pastoris）プロモーターからの発現は、非誘導性炭素源（例えば、グルコースまたはグリセロール）の存在下では、典型的には存在しないか、または非常に乏しく、メタノールの非存在下または添加メタノールの非存在下では、ｐＡＯＸ１からの有意な発現を可能にする１つまたは複数の変異がｐＡＯＸ１に含まれ得る。一部の例では、メタノールが存在する場合にｐＡＯＸ１からの発現をさらに増加させることを可能にする１つまたは複数の変異がｐＡＯＸ１に含まれ得る。
【0054】
参照ｐＡＯＸ１配列は、配列番号４４で提供されている。また、２０２０年４月１７日に出願された米国特許出願公開第２０２０／０３３２２６７号明細書も参照されたい。これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【0055】
【表3】
【0056】
また本明細書では、参照プロモーター配列と少なくとも７０％（例えば、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％）の配列同一性を有するプロモーター配列を含む核酸構築物も提供される。例えば、プロモーター配列は、アルコールオキシダーゼプロモーター配列（例えば、配列番号４４）と少なくとも７０％（例えば、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％）の配列同一性を有し得る。一部の実施形態では、プロモーター配列は配列番号４４の配列を有し得る。
【0057】
また本明細書では、参照プロモーター配列と比較した場合に１つまたは複数（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個、またはそれ以上）の変異を含む配列を有するプロモーター配列を含む核酸構築物が提供される。
【0058】
核酸
本明細書に記載の方法において使用される核酸分子は、典型的にはＤＮＡ分子であるが、ＲＮＡ分子も適切な状況下では使用され得る。本明細書において使用される場合、「外因性」とは、例えば、同一の生物もしくは異なる生物から細胞に導入される任意の核酸配列、または合成によって生成される核酸（例えば、コドン最適化された核酸配列）を指す。例えば、外因性核酸は、異なる酵母の属または種に導入される、ある微生物（例えば、ある酵母の属または種）由来の核酸でもよいが、しかし外因性核酸はまた、対応する天然の核酸配列が存在するにもかかわらず、酵母に追加コピーとして組換え的に導入される酵母由来の核酸、または酵母に天然の配列と比較して１つもしくは複数の変異、挿入もしくは欠失を含む酵母に組換え的に導入される酵母由来の核酸でもよい。例えば、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）は、ＡＬＡシンターゼをコードする内因性核酸を含有しており、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）ＡＬＡシンターゼ核酸の追加コピー（例えば、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）に組換え的に導入されるもの）は外因性であると考えられる。同様に、「外因性」タンパク質は、外因性核酸によってコードされているタンパク質である。
本明細書に記載の方法において使用される核酸分子は、典型的にはＤＮＡ分子であるが、ＲＮＡ分子も適切な状況下では使用され得る。本明細書において使用される場合、「外因性」とは、例えば、同一の生物もしくは異なる生物から細胞に導入される任意の核酸配列、または合成によって生成される核酸（例えば、コドン最適化された核酸配列）を指す。例えば、外因性核酸は、異なる酵母の属または種に導入される、ある微生物（例えば、ある酵母の属または種）由来の核酸でもよいが、しかし外因性核酸はまた、対応する天然の核酸配列が存在するにもかかわらず、酵母に追加コピーとして組換え的に導入される酵母由来の核酸、または酵母に天然の配列と比較して１つもしくは複数の変異、挿入もしくは欠失を含む酵母に組換え的に導入される酵母由来の核酸でもよい。例えば、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）は、ＡＬＡシンターゼをコードする内因性核酸を含有しており、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）ＡＬＡシンターゼ核酸の追加コピー（例えば、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）に組換え的に導入されるもの）は外因性であると考えられる。同様に、「外因性」タンパク質は、外因性核酸によってコードされているタンパク質である。
【0059】
場合によっては、外因性核酸は異種核酸でもよい。本明細書において使用される場合、「異種」核酸とは、ある生物に天然には存在しない核酸配列を指す（例えば、異種核酸は、異なる酵母の属または種に導入される、ある微生物（例えば、コドン最適化されているか否かにかかわらず、ある酵母の属または種）由来の核酸でもよい）。同様に、「異種」タンパク質は、異種核酸によってコードされているタンパク質である。
【0060】
核酸分子は、その任意の一部（例えば、プロモーター配列またはコード化されたタンパク質の配列）が宿主生物に対して外因性である場合、宿主生物に対して外因性であると考えられる。核酸分子は、その任意の一部（例えば、プロモーター配列またはコード化されたタンパク質の配列）が宿主生物に対して異種である場合、宿主生物に対して異種であると考えられる。
【0061】
本明細書では、酵母細胞（例えば、メチロトローフ酵母細胞）を遺伝子操作することを可能にする核酸構築物が提供される。一部の実施形態では、本明細書では、酵母細胞（例えば、メチロトローフ酵母細胞）を遺伝子操作してＲＮＡを産生することを可能にする核酸構築物が提供される。組換えによって産生されたＲＮＡは、例えばＲＮＡ干渉によって、またはＤＮＡ編集のガイドとして、細胞の機能を改変するために使用され得る。一部の実施形態では、本明細書では、酵母細胞（例えば、メチロトローフ酵母細胞）を遺伝子操作して、産物（例えば、タンパク質もしくは小分子）、外因性産物（例えば、外因性タンパク質）、異種産物（例えば、異種タンパク質）、またはそれらの組合せを産生することを可能にする核酸構築物が提供される。一部の実施形態では、本明細書では、酵母細胞（例えば、メチロトローフ酵母細胞）を遺伝子操作して、メタノールの非存在下で産物（例えば、タンパク質または小分子）を産生することを可能にする核酸構築物が提供される。一部の実施形態では、本明細書では、酵母細胞（例えば、メチロトローフ酵母細胞）を遺伝子操作して、メタノールの存在下で産物（例えば、タンパク質または小分子）を産生することを可能にする核酸構築物が提供される。さらに、本明細書では、酵母細胞（例えば、メチロトローフ酵母細胞）を遺伝子操作して、ヘム結合タンパク質および／または１つもしくは複数のヘム生合成酵素の発現を増加させることを可能にする核酸構築物が提供される。
【0062】
組換え核酸は、発現エレメントを含み得る。発現エレメントは、核酸コード配列の発現を指示および制御する核酸配列を含む。発現エレメントの一例は、プロモーター配列である。発現エレメントはまた、イントロン、エンハンサー配列、インスレーター、サイレンサー、オペレーター、認識部位、結合部位、切断部位、応答エレメント、誘導エレメント、シス制御エレメント、または核酸の発現をモジュレートするトランス制御エレメントを含むことができる。発現エレメントは、細菌起源、酵母起源、昆虫起源、哺乳動物起源またはウイルス起源のものであってもよく、ベクターは異なる起源のエレメントの組合せを含むことができる。
【0063】
本明細書に記載のいずれかのプロモーターエレメントに作動可能に連結されたヌクレオチド配列を含む核酸構築物が目的のヌクレオチド配列を含み得ることは理解されよう。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列の転写および／または翻訳は、目的の産物（例えば、タンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、または小分子）の生産をもたらし得る。例えば、一部の実施形態では、ヌクレオチド配列を含む核酸構築物は、タンパク質をコードする核酸構築物でもよい。例えば、一部の実施形態では、ヌクレオチド配列を含む核酸構築物は、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、リボザイム、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、またはｓｈＲＮＡ）をコードする核酸構築物でもよい。例えば、一部の実施形態では、ヌクレオチド配列を含む核酸構築物は、ＤＮＡをコードする核酸構築物でもよい。例えば、一部の実施形態では、ヌクレオチド配列を含む核酸構築物は、その転写により小分子（例えば、ヘム、エタノール、補因子、代謝物、二次代謝物、または薬学的に活性な薬剤）の産生をもたらすか、またはその生産に寄与する核酸構築物でもよい。
【0064】
一部の実施形態では、ヌクレオチド配列を含む核酸構築物（例えば、第１の核酸構築物、第２の核酸構築物など）は、タンパク質（例えば、第１のタンパク質、第２のタンパク質など）をコードする核酸構築物でもよい。
【0065】
本明細書に記載の核酸構築物は、酵母細胞（例えば、メチロトローフ酵母細胞）のゲノムに安定的に組み込み得るか、または複製可能なプラスミドから染色体外に発現し得る。両方を達成する方法は周知であり、当技術分野において日常的に使用されている。
【0066】
さらに、プロモーターエレメント（例えば、本明細書に記載のプロモーターエレメント）に作動可能に連結されたヌクレオチド配列（例えば、第１のタンパク質（例えば、ヘム結合タンパク質）をコードするもの）を含む第１の核酸構築物は、プロモーターエレメント（例えば、本明細書に記載のプロモーターエレメント）に作動可能に連結されたヌクレオチド配列（例えば、第２のタンパク質（例えば、転写因子）をコードするもの）を含む第２の核酸構築物とは物理的に離れていてもよい（すなわち、第１の核酸構築物と第２の核酸構築物は完全に別々の分子でもよい）ことに留意されたい。あるいは、プロモーターエレメント（例えば、本明細書に記載のプロモーターエレメント）に作動可能に連結されたヌクレオチド配列（例えば、第１のタンパク質をコードするもの）を含む第１の核酸構築物と、プロモーターエレメント（例えば、本明細書に記載のプロモーターエレメント）に作動可能に連結されたヌクレオチド配列（例えば、第２のタンパク質をコードするもの）を含む第２の核酸構築物は、同じ核酸構築物に含まれ得る。一部の実施形態では、プロモーターエレメントに作動可能に連結されたヌクレオチド配列（例えば、第１のタンパク質をコードするもの）を含む第１の核酸構築物は、プロモーターエレメントに作動可能に連結されたヌクレオチド配列（例えば、第２のタンパク質をコードするもの）を含む第２の核酸構築物と隣接し得る。ヌクレオチド配列（例えば、第２のタンパク質をコードするもの）を含む第２の核酸構築物が、ヌクレオチド配列（例えば、目的のタンパク質をコードするもの）を含む第１の核酸構築物と隣接している場合、単一のプロモーター、またはそれからのプロモーターエレメントを使用して両方のヌクレオチド配列またはすべてのヌクレオチド配列（例えば、第１のタンパク質ならびに第２のタンパク質をコードする核酸）の転写を駆動できることは、当業者には理解されよう。一部の実施形態では、第１の核酸構築物は、１つまたは複数のプロモーターエレメント（例えば、本明細書に記載のプロモーターエレメント）に作動可能に連結された２つ以上のヌクレオチド配列（例えば、第１のタンパク質および第２のタンパク質（例えば、ヘム結合タンパク質および転写因子、ヘム結合タンパク質およびヘム生合成酵素、２つの異なる転写因子、または２つの異なるヘム生合成酵素）をコードするもの）を含むことが可能であり、２つ以上のヌクレオチド配列は、隣接していてもよく、または物理的に離れていてもよい。
【0067】
本明細書において使用される場合、核酸はＤＮＡおよびＲＮＡを含んでいてもよく、また１つまたは複数のヌクレオチド類似体または骨格改変を含む核酸を含む。核酸は一本鎖または二本鎖であってもよく、通常はその目的の用途に応じて決まる。所定の配列とは異なる核酸もまた提供される。核酸は、所定の核酸配列と少なくとも５０％の配列同一性（例えば、少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性）を有し得る。一部の実施形態では、核酸は、所定の核酸配列と１００％の配列同一性を有し得る。
【0068】
また、本明細書に記載の核酸構築物（例えば、本明細書に記載のプロモーターエレメントに作動可能に連結された、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列）を含む構築物またはベクターも本開示の範囲内である。発現構築物またはベクターを含む構築物またはベクターは、市販されているか、または当技術分野において日常的な組換えＤＮＡ技術によって生成され得る。核酸を含む構築物またはベクターは、そのような核酸に作動可能に連結された発現エレメントを有し得るが、さらに選択マーカー（例えば、抗生物質耐性遺伝子）をコードする配列などの配列を含むことができる。核酸を含む構築物またはベクターは、キメラポリペプチドまたは融合ポリペプチド（すなわち、ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端のいずれかにあり得る異種ポリペプチドに作動可能に連結されたポリペプチド）をコードし得る。代表的な異種ポリペプチドは、コード化ポリペプチドの精製において使用され得るものである（例えば、６ｘＨｉｓタグ、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ））。
【0069】
変異
核酸分子に変化が導入されることにより、コード化ポリペプチドのアミノ酸配列に変化がもたらされ得る。例えば、変異誘発（例えば、部位特異的変異誘発、ＰＣＲ介在変異誘発、トランスポゾン変異誘発、化学的変異誘発、ＵＶ変異誘発、または放射線誘導型変異誘発）を使用して、またはそのような変化を有する核酸分子を化学的に合成することによって、変化を核酸コード配列に導入することができる。このような核酸の変化は、１つまたは複数のアミノ酸残基における保存的アミノ酸置換および／または非保存的アミノ酸置換をもたらし得る。「保存的アミノ酸置換」とは、１つのアミノ酸残基が、類似の側鎖を有する異なるアミノ酸残基と置き換えられたものであり（例えば、アミノ酸置換の頻度表を提供している、Dayhoff et al., 1978, Atlas of Protein Sequence and Structure, 5(Suppl. 3):345-352を参照されたい）、非保存的置換とは、アミノ酸残基が、類似の側鎖を持たないアミノ酸残基と置き換えられたものである。核酸配列および／またはポリペプチド配列は、限定するものではないが、発現の増加（例えば、転写および／または翻訳）、制御の厳密化、制御の解除、カタボライト抑制の消失、特異性の改変、分泌、熱安定性、溶媒安定性、酸化安定性、プロテアーゼ耐性、触媒活性、および／または色などの１つまたは複数の特性を改善するように本明細書に記載のようにして改変され得る。
核酸分子に変化が導入されることにより、コード化ポリペプチドのアミノ酸配列に変化がもたらされ得る。例えば、変異誘発（例えば、部位特異的変異誘発、ＰＣＲ介在変異誘発、トランスポゾン変異誘発、化学的変異誘発、ＵＶ変異誘発、または放射線誘導型変異誘発）を使用して、またはそのような変化を有する核酸分子を化学的に合成することによって、変化を核酸コード配列に導入することができる。このような核酸の変化は、１つまたは複数のアミノ酸残基における保存的アミノ酸置換および／または非保存的アミノ酸置換をもたらし得る。「保存的アミノ酸置換」とは、１つのアミノ酸残基が、類似の側鎖を有する異なるアミノ酸残基と置き換えられたものであり（例えば、アミノ酸置換の頻度表を提供している、Dayhoff et al., 1978, Atlas of Protein Sequence and Structure, 5(Suppl. 3):345-352を参照されたい）、非保存的置換とは、アミノ酸残基が、類似の側鎖を持たないアミノ酸残基と置き換えられたものである。核酸配列および／またはポリペプチド配列は、限定するものではないが、発現の増加（例えば、転写および／または翻訳）、制御の厳密化、制御の解除、カタボライト抑制の消失、特異性の改変、分泌、熱安定性、溶媒安定性、酸化安定性、プロテアーゼ耐性、触媒活性、および／または色などの１つまたは複数の特性を改善するように本明細書に記載のようにして改変され得る。
【0070】
一部の実施形態では、核酸における変異は、挿入、欠失、または置換でもよい。一部の実施形態では、核酸における変異は、置換（例えば、グアノシンからシトシンへの変異）でもよい。一部の実施形態では、核酸における変異は、非コード配列中に存在し得る。一部の実施形態では、コード配列（例えば、タンパク質をコードする配列）における置換は、サイレント変異（例えば、同じアミノ酸がコードされている）でもよい。一部の実施形態では、コード配列における置換は、非同義変異（例えば、ミスセンス変異またはナンセンス変異）でもよい。一部の実施形態では、コード配列における置換は、ミスセンス変異（例えば、異なるアミノ酸がコードされている）でもよい。一部の実施形態では、コード配列における置換は、ナンセンス変異（例えば、中途終止コドンがコードされている）でもよい。例えば、ＣＲＩＳＰＲ、ＴＡＬＥＮ、および／またはジンクフィンガーヌクレアーゼを使用して内因性核酸を変更するために変異を使用し得ることは理解されよう。
【0071】
一部の実施形態では、タンパク質配列における変異は、挿入、欠失、または置換でもよい。タンパク質をコードする核酸における変異がタンパク質配列における変異を引き起こし得ることは理解されよう。一部の実施形態では、タンパク質配列における変異は、置換（例えば、システインからセリンへの変異、またはシステインからアラニンへの変異）である。
【0072】
本明細書において使用される場合、参照核酸配列とは異なる核酸配列内の（例えば、切断された、伸長された、または変異した核酸配列内の）「対応する」核酸位置（または置換）は、目的の核酸配列間の配列アラインメントを実施することによって同定され得る。場合によっては、核酸アラインメントにギャップが存在する可能性があることは理解されよう。同様に、参照タンパク質配列とは異なるタンパク質配列内の（例えば、参照ミオグロビンタンパク質配列と比較した異なる生物のミオグロビンタンパク質配列、例えば配列番号３４内の）「対応する」アミノ酸位置（または置換）は、目的のタンパク質配列間の配列アラインメントを実施することによって同定され得る。場合によっては、タンパク質アラインメントにギャップが存在する可能性があることは理解されよう。本明細書において使用される場合、参照配列「に対する」ヌクレオチドまたはアミノ酸の位置は、参照配列内の対応するヌクレオチドまたはアミノ酸の位置でもよい。
【0073】
一部の実施形態では、参照配列は、比較配列と同じ分類学的ランク由来でもよい。一部の実施形態では、参照配列は、比較配列と同じドメイン由来でもよい。例えば、一部の実施形態では、参照配列および比較配列の両配列は、真核生物ドメイン（domain Eukarya）由来でもよい。一部の実施形態では、参照配列は、比較配列と同じ界由来でもよい。例えば、一部の実施形態では、参照配列および比較配列の両配列は、真菌界（kingdom Fungi）由来でもよい。一部の実施形態では、参照配列は、比較配列と同じ門由来でもよい。例えば、一部の実施形態では、参照配列および比較配列の両配列は、子嚢菌門（phylum Ascomycota）由来でもよい。一部の実施形態では、参照配列は、比較配列と同じ綱由来でもよい。例えば、一部の実施形態では、参照配列および比較配列の両配列は、サッカロミセス綱（class Saccharomycetes）由来でもよい。一部の実施形態では、参照配列は、比較配列と同じ目由来でもよい。例えば、一部の実施形態では、参照配列および比較配列の両配列は、サッカロミセス目（order Saccharomycetales）由来でもよい。一部の実施形態では、参照配列は、比較配列と同じ科由来でもよい。例えば、一部の実施形態では、参照配列と比較配列の両方がサッカロミセス科（family Saccharomycetaceae）由来でもよい。一部の実施形態では、参照配列は、比較配列と同じ属由来でもよい。例えば、一部の実施形態では、参照配列および比較配列の両配列は、ピキア属（genus Pichia）由来でもよい。一部の実施形態では、参照配列は、比較配列と同じ種由来でもよい。
【0074】
一部の実施形態では、参照配列および比較配列は、両方とも酵母（例えば、メチロトローフ酵母）由来でもよい。一部の実施形態では、参照配列および比較配列は、少なくとも５０％（例えば、少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９９％）の配列同一性を有し得る。
【0075】
酵母細胞
本明細書ではまた、本明細書に記載の核酸構築物のいずれかを含む酵母細胞が提供される。酵母細胞は、１つまたは複数のポリペプチドを生産するのに適した任意の酵母細胞でもよい。酵母細胞の非限定的な例としては、ピキア（Pichia）（例えば、ピキア・メタノリカ（Pichia methanolica）、ピキア・パストリス（Pichia pastoris））細胞、カンジダ（Candida）（例えば、カンジダ・ボイディニ（Candida boidinii））細胞、ハンセヌラ（Hansenula）（例えば、ハンセヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha））細胞、トルロプシス（Torulopsis）細胞、およびサッカロミセス（Saccharomyces）（例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae））細胞が挙げられる。一部の実施形態では、酵母細胞はメチロトローフ酵母細胞でもよい。メチロトローフ酵母細胞の非限定的な例としては、ピキア（Pichia）細胞、カンジダ（Candida）細胞、ハンセヌラ（Hansenula）細胞、およびトルロプシス（Torulopsis）細胞が挙げられる。一部の実施形態では、酵母細胞は、ピキア（Pichia）細胞またはサッカロミセス（Saccharomyces）細胞でもよい。メチロトローフ酵母細胞は、ピキア（Pichia）細胞、カンジダ（Candida）細胞、ハンセヌラ（Hansenula）細胞、またはトルロプシス（Torulopsis）細胞でもよい。メチロトローフ酵母細胞は、ピキア・メタノリカ（Pichia methanolica）細胞、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）細胞、カンジダ・ボイディニ（Candida boidinii）細胞、またはハンセヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha）細胞でもよい。メチロトローフ酵母細胞は、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）細胞であってもよい。一部の実施形態では、酵母細胞は非メチロトローフ酵母細胞でもよい。非メチロトローフ酵母細胞は、サッカロミセス（Saccharomyces）（例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae））細胞、ヤロウィア・リポリティカ（Yarrowia lipolytica）細胞、クルイベロミセス・ラクティス（Kluyveromyces lactis）細胞、クルイベロミセス・マルシアヌス（Kluyveromyces marxianus）細胞、アルクスラ・アデニニボランス（Arxula adeninivorans）細胞、サッカロミセス・オクシデンタリス（Saccharomyces occidentalis）細胞、スチゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）細胞、ピキア・スティピテス（Pichia stipites）細胞、ジゴサッカロミセス・ベイリイ（Zygosaccharomyces bailii）細胞、またはジゴサッカロミセス・ルーキシイ（Zygosaccharomyces rouxii）細胞でもよい。
本明細書ではまた、本明細書に記載の核酸構築物のいずれかを含む酵母細胞が提供される。酵母細胞は、１つまたは複数のポリペプチドを生産するのに適した任意の酵母細胞でもよい。酵母細胞の非限定的な例としては、ピキア（Pichia）（例えば、ピキア・メタノリカ（Pichia methanolica）、ピキア・パストリス（Pichia pastoris））細胞、カンジダ（Candida）（例えば、カンジダ・ボイディニ（Candida boidinii））細胞、ハンセヌラ（Hansenula）（例えば、ハンセヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha））細胞、トルロプシス（Torulopsis）細胞、およびサッカロミセス（Saccharomyces）（例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae））細胞が挙げられる。一部の実施形態では、酵母細胞はメチロトローフ酵母細胞でもよい。メチロトローフ酵母細胞の非限定的な例としては、ピキア（Pichia）細胞、カンジダ（Candida）細胞、ハンセヌラ（Hansenula）細胞、およびトルロプシス（Torulopsis）細胞が挙げられる。一部の実施形態では、酵母細胞は、ピキア（Pichia）細胞またはサッカロミセス（Saccharomyces）細胞でもよい。メチロトローフ酵母細胞は、ピキア（Pichia）細胞、カンジダ（Candida）細胞、ハンセヌラ（Hansenula）細胞、またはトルロプシス（Torulopsis）細胞でもよい。メチロトローフ酵母細胞は、ピキア・メタノリカ（Pichia methanolica）細胞、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）細胞、カンジダ・ボイディニ（Candida boidinii）細胞、またはハンセヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha）細胞でもよい。メチロトローフ酵母細胞は、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）細胞であってもよい。一部の実施形態では、酵母細胞は非メチロトローフ酵母細胞でもよい。非メチロトローフ酵母細胞は、サッカロミセス（Saccharomyces）（例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae））細胞、ヤロウィア・リポリティカ（Yarrowia lipolytica）細胞、クルイベロミセス・ラクティス（Kluyveromyces lactis）細胞、クルイベロミセス・マルシアヌス（Kluyveromyces marxianus）細胞、アルクスラ・アデニニボランス（Arxula adeninivorans）細胞、サッカロミセス・オクシデンタリス（Saccharomyces occidentalis）細胞、スチゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）細胞、ピキア・スティピテス（Pichia stipites）細胞、ジゴサッカロミセス・ベイリイ（Zygosaccharomyces bailii）細胞、またはジゴサッカロミセス・ルーキシイ（Zygosaccharomyces rouxii）細胞でもよい。
【0076】
酵母細胞の遺伝子操作は、典型的には、酵母細胞に組換え核酸構造を導入することを含む。したがって、一部の実施形態では、本明細書に記載の酵母細胞は、本明細書に記載のプロモーターエレメントに作動可能に連結されたヌクレオチド配列を含む核酸構築物（例えば、第１の核酸構築物、第２の核酸構築物など）を含む。本明細書において、「作動可能に連結されている」とは、プロモーターまたは他の発現エレメントが、コード配列の発現を指示または制御するような方法（例えば、インフレーム）でコード配列に対して配置されていることを意味する。ヌクレオチド配列を含む核酸構築物は、目的のポリペプチドを生産するのに適した任意のヌクレオチド配列を含み得る。
【0077】
産物を生産する方法
本明細書ではまた、本明細書に記載の任意の核酸構築物および／または細胞を使用して、産物（例えば、タンパク質または小分子）を生産する方法が提供される。このような方法は、本明細書に記載の任意の１つまたは複数の核酸を含む酵母細胞を培養することを含む。酵母細胞に核酸を導入する方法は当技術分野において公知であり、限定するものではないが、形質導入、エレクトロポレーション、微粒子銃送達、および化学変換を含む。
本明細書ではまた、本明細書に記載の任意の核酸構築物および／または細胞を使用して、産物（例えば、タンパク質または小分子）を生産する方法が提供される。このような方法は、本明細書に記載の任意の１つまたは複数の核酸を含む酵母細胞を培養することを含む。酵母細胞に核酸を導入する方法は当技術分野において公知であり、限定するものではないが、形質導入、エレクトロポレーション、微粒子銃送達、および化学変換を含む。
【0078】
酵母細胞を培養する方法は、当技術分野において公知である。例えば、Pichia Protocols, Methods In Molecular Biology, 389, Cregg. Ed., 2007, 2nd Ed., Humana Press, Inc.を参照されたい。一部の状況下では、目的の１つまたは複数のポリペプチドの高レベルでの効率的な発現を得るためにメタノールは必要ないが、培養培地にメタノールを導入または添加することが望まれる場合がある。一部の状況下では（例えば、鉄補因子の生合成に関与する酵素（複数可）をコードする１つまたは複数の核酸が発現される場合）、鉄またはその薬学的もしくは代謝的に許容される（またはＧＲＡＳ）塩を培養培地に補充することが望まれる場合がある。
【0079】
本明細書で提供される方法はまた、発現タンパク質を精製することを含み得る。本明細書において使用される場合、「濃縮」タンパク質は、産生細胞の質量の乾燥重量で少なくとも５％（例えば、少なくとも６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、もしくはそれ以上）を占めるタンパク質であるか、または産生細胞溶解物（例えば、細胞壁もしくは膜物質を除く）の質量の乾燥重量で少なくとも１０％（例えば、少なくとも１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、９０％、９５％、または９９％）を占めるタンパク質である。本明細書において使用される場合、「精製」タンパク質とは、天然にそれに伴う細胞成分から分離されたタンパク質のことである。典型的には、タンパク質は、他のタンパク質および自然では関連している天然分子を含まずに、乾燥重量で少なくとも７０％（例えば、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％）の場合、「精製された」と考えられる。
【0080】
本明細書では、選択のための配列を欠く（すなわち、選択マーカーを欠く）株を生成するために使用され得る方法が記載されている。これらの方法は、環状プラスミドＤＮＡベクターおよび線状ＤＮＡ配列を使用することを含むが、環状プラスミドＤＮＡベクターは、選択マーカーおよびＤＮＡ複製起点（自律複製配列（ＡＲＳ）とも呼ばれる）を含み、線状ＤＮＡ配列は、相同組換えによって酵母細胞ゲノムに組み込むための配列を含む。線状ＤＮＡ分子は、さらに、限定するものではないが、ヘム結合タンパク質、デヒドリン、フィターゼ、プロテアーゼ、カタラーゼ、リパーゼ、ペルオキシダーゼ、アミラーゼ、トランスグルタミナーゼ、酸化還元酵素、トランスフェラーゼ、加水分解酵素、リアーゼ、イソメラーゼ、リガーゼ、小分子、例えばヘム、エタノール、乳酸、ブタノール、アジピン酸もしくはコハク酸の生産経路に関与する１つもしくは複数の酵素、またはそのようなタンパク質に対する抗体などの１つまたは複数の目的のタンパク質をコードする核酸配列を含み得る。
【0081】
酵母細胞（例えばメチロトローフ酵母細胞（例えばピキア（Pichia））は、環状プラスミドＤＮＡベクターおよび線状ＤＮＡ配列の両方で形質転換させることができ、形質転換体は、環状プラスミド上の選択マーカーの存在によって選択さる。次いで、形質転換体は、例えばＰＣＲを使用してスクリーニングされ、線状ＤＮＡ分子のゲノムへの組み込みについてスクリーニングされ得る。マーカーを含まない線状ＤＮＡ分子が正しく組み込まれた形質転換体が同定された場合、環状プラスミドの選択なしに細胞を増殖させることができる。マーカーを保持するプラスミドは、選択なしの場合には安定的に維持されないため、選択が緩和されると、プラスミドは非常に急速に失われることが多い。得られた株は、選択のための異種配列がない状態で組み込まれた線状ＤＮＡを保持する。したがって、このアプローチは、組換え産物（例えば、タンパク質）の収量にほとんどまたは全く影響を与えることなく選択マーカー（例えば、異種選択マーカー）を欠く株（例えば、ピキア（Pichia）株）を構築するために使用され得る。Ｃｒｅ－Ｌｏｘ組換え、ＦＬＴ－ＦＲＴ組換え、またはＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９などの他の方法もまた、マーカーを含まない株の構築に使用され得る。
【0082】
本明細書で提供される方法は、産物（例えば、タンパク質または小分子）の力価を増加させる。一部の実施形態では、産物（例えば、タンパク質または小分子）の力価は、本明細書に記載の核酸構築物を欠いている対応する方法と比較して、少なくとも５％（例えば、少なくとも６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１５０％、２００％、２５０％、３００％、３５０％、４００％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％、１０００％、またはそれ以上）増加し得る。
【0083】
一般的に、「力価」とは、溶液中の物質の量を測定値である。本明細書において使用される場合、産物（例えば、タンパク質または小分子）の「力価」は、その産物の総量を指す。産物がヘム結合タンパク質である場合、力価は、特段の指定のない限り、ヘムに結合しているか否かにかかわらず、ポリペプチドの総量を指す。産物（例えば、タンパク質または小分子）の力価は、任意の適切な方法、例えば、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、高速液体クロマトグラフィー質量分析（ＨＰＬＣ ＭＳ）、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、あるいは紫外線分光法および／または可視光（ＵＶ－Ｖｉｓ）分光法によって測定することができる。
【0084】
本明細書において使用される場合、「対応する方法」とは、特定された相違を除き、すべての点で参照方法と本質的に同一である方法である。例えば、転写活性化因子（例えば、Ｒｔｇ１）をコードする核酸を発現する対応する方法は、対応する方法が転写活性化因子（例えば、Ｒｔｇ１）の発現を欠くことを除き、すべての局面（例えば、細胞の遺伝子構成、培養の温度および時間など）において同じでもよい。
【0085】
本開示に従って、当技術分野の範囲内の従来の分子生物学技術、微生物学技術、生化学技術、および組換えＤＮＡ技術を用いることができる。このような技術は、文献において十分に説明されている。本開示の材料および方法は、以下の実施例においてさらに説明されるが、これらは、特許請求の範囲に記載されている方法および物質の組成物の範囲を限定するものではない。
【実施例】
【0086】
[実施例１]
Ｒｔｇ１過剰発現による外因性タンパク質の発現の増加
この実施例では、空のプラスミド（対照）またはＲｔｇ１過剰発現プラスミド（ｐＧＡＰ－Ｒｔｇ１またはｐＡＯＸ１－Ｒｔｇ１）を、ＡＯＸ１プロモーター下で赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）を発現するピキア・パストリス（Pichia pastoris）株に形質転換した。Ｒｔｇ１は、構成的ＧＡＰプロモーター（ｐＧＡＰ－Ｒｔｇ１）または誘導性ＡＯＸ１プロモーター（ｐＡＯＸ１－Ｒｔｇ１）の下で発現された。増殖は、デキストロースおよび３００μｇ／ｍｌのジェネテシン（Ｇ４１８）を含む３０℃のＹＰ培地で４８時間実施した。蛍光は、蛍光プレートリーダーを使用して測定した。測定は、励起５２０ｎｍおよび発光５８５ｎｍで実施した。測定前にサンプルを水で５０倍希釈した。下の表４に示すように、Ｒｔｇ１発現は、ＲＦＰ発現を１８～３８％増加させた。ｐＡＯＸ１またはｐＧＡＰのいずれかからのＲｔｇ１過剰発現は、ＲＦＰ発現の増加をもたらす可能性があり、このことは、非ｍｕｔプロモーター下でのＲｔｇ１過剰発現もまたｍｕｔプロモーター下でのＲＦＰ遺伝子発現の増加につながる可能性があるので、正のフィードバックループの有無にかかわらず、有益性が達成され得ることを示唆している。
Ｒｔｇ１過剰発現による外因性タンパク質の発現の増加
この実施例では、空のプラスミド（対照）またはＲｔｇ１過剰発現プラスミド（ｐＧＡＰ－Ｒｔｇ１またはｐＡＯＸ１－Ｒｔｇ１）を、ＡＯＸ１プロモーター下で赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）を発現するピキア・パストリス（Pichia pastoris）株に形質転換した。Ｒｔｇ１は、構成的ＧＡＰプロモーター（ｐＧＡＰ－Ｒｔｇ１）または誘導性ＡＯＸ１プロモーター（ｐＡＯＸ１－Ｒｔｇ１）の下で発現された。増殖は、デキストロースおよび３００μｇ／ｍｌのジェネテシン（Ｇ４１８）を含む３０℃のＹＰ培地で４８時間実施した。蛍光は、蛍光プレートリーダーを使用して測定した。測定は、励起５２０ｎｍおよび発光５８５ｎｍで実施した。測定前にサンプルを水で５０倍希釈した。下の表４に示すように、Ｒｔｇ１発現は、ＲＦＰ発現を１８～３８％増加させた。ｐＡＯＸ１またはｐＧＡＰのいずれかからのＲｔｇ１過剰発現は、ＲＦＰ発現の増加をもたらす可能性があり、このことは、非ｍｕｔプロモーター下でのＲｔｇ１過剰発現もまたｍｕｔプロモーター下でのＲＦＰ遺伝子発現の増加につながる可能性があるので、正のフィードバックループの有無にかかわらず、有益性が達成され得ることを示唆している。
【0087】
【表4】
【0088】
[実施例２]
Ｒｔｇ１の過剰発現による外因性ヘム結合タンパク質の発現の増加
この実施例では、空のプラスミド（対照）またはＲｔｇ１過剰発現プラスミド（ｐＧＡＰ－Ｒｔｇ１またはｐＡＯＸ１－Ｒｔｇ１）を、ＡＯＸ１プロモーター下でヘム結合タンパク質レグヘモグロビン（ＬｅｇＨ）およびヘム生合成酵素を発現するピキア・パストリス（Pichia pastoris）株に形質転換した。Ｒｔｇ１は、構成的ＧＡＰプロモーター（ｐＧＡＰ－Ｒｔｇ１）または誘導性ＡＯＸ１プロモーター（ｐＡＯＸ１－Ｒｔｇ１）下で発現された。増殖は、デキストロースおよび３００μｇ／ｍｌのジェネテシン（Ｇ４１８）を含む３０℃のＹＰ培地で４８時間実施した。ＬｅｇＨ力価は、サイズ排除クロマトグラフィーにより精製した溶解物の分光光度法によって測定した。検量線は、精製したＬｅｇＨで２８０ｎｍ（タンパク質）および４１５ｎｍ（ヘム）の吸光度を使用して作成した。試験サンプルのＬｅｇＨ力価は、検量サンプルと比較して測定した。下の表５に示すように、Ｒｔｇ１発現は、ＬｅｇＨ力価を１６～１９％増加させた。ＬｅｇＨの定量化に関する詳細は以下に記載されている。ｐＡＯＸ１またはｐＧＡＰのいずれかからのＲｔｇ１過剰発現は、ＬｅｇＨ発現の増加をもたらす可能性があり、このことは、非ｍｕｔプロモーター下でのＲｔｇ１過剰発現もまたｍｕｔプロモーター下でのＬｅｇＨ遺伝子発現の増加につながる可能性があるので、正のフィードバックループの有無にかかわらず、有益性が達成され得ることを示唆している。
Ｒｔｇ１の過剰発現による外因性ヘム結合タンパク質の発現の増加
この実施例では、空のプラスミド（対照）またはＲｔｇ１過剰発現プラスミド（ｐＧＡＰ－Ｒｔｇ１またはｐＡＯＸ１－Ｒｔｇ１）を、ＡＯＸ１プロモーター下でヘム結合タンパク質レグヘモグロビン（ＬｅｇＨ）およびヘム生合成酵素を発現するピキア・パストリス（Pichia pastoris）株に形質転換した。Ｒｔｇ１は、構成的ＧＡＰプロモーター（ｐＧＡＰ－Ｒｔｇ１）または誘導性ＡＯＸ１プロモーター（ｐＡＯＸ１－Ｒｔｇ１）下で発現された。増殖は、デキストロースおよび３００μｇ／ｍｌのジェネテシン（Ｇ４１８）を含む３０℃のＹＰ培地で４８時間実施した。ＬｅｇＨ力価は、サイズ排除クロマトグラフィーにより精製した溶解物の分光光度法によって測定した。検量線は、精製したＬｅｇＨで２８０ｎｍ（タンパク質）および４１５ｎｍ（ヘム）の吸光度を使用して作成した。試験サンプルのＬｅｇＨ力価は、検量サンプルと比較して測定した。下の表５に示すように、Ｒｔｇ１発現は、ＬｅｇＨ力価を１６～１９％増加させた。ＬｅｇＨの定量化に関する詳細は以下に記載されている。ｐＡＯＸ１またはｐＧＡＰのいずれかからのＲｔｇ１過剰発現は、ＬｅｇＨ発現の増加をもたらす可能性があり、このことは、非ｍｕｔプロモーター下でのＲｔｇ１過剰発現もまたｍｕｔプロモーター下でのＬｅｇＨ遺伝子発現の増加につながる可能性があるので、正のフィードバックループの有無にかかわらず、有益性が達成され得ることを示唆している。
【0089】
【表5】
【0090】
ＬｅｇＨは、２０２０年４月２４日に出願された米国特許出願公開第２０２０／０３４００００号明細書に記載されているように定量したが、この公報は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。ＬｅｇＨの定量を開始するために細胞ブロスのサンプルをペレット化し（４０００ｘｇ、４℃、３０分）、デカントした。次いで、ペレットサンプルを溶解バッファー（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ リン酸カリウム、ｐＨ７．４）で４倍希釈した。各再懸濁液３００μＬを、細胞溶解用に１ウェルあたり１２０μＬのビーズ（ジルコニウム／シリカビーズ（０．５ｍｍ））を入れた９６ウェル深型プレートに分注した。溶解はミニビーズビーター（mini bead beater）で３分間行い、次いでプレートを氷上で５分間冷却した後、さらに２分間ビーズビートした。次いで、プレートを遠心分離した（４０００ｘｇ、４℃、３０分）。上清を０．２μｍのフィルタープレートを通して濾過した（４０００ｘｇ、４℃、６０分）。
【0091】
濾過した溶解物を、サイズ排除カラム（Ａｃｑｕｉｔｙ ＢＥＨ ＳＥＣカラム、２００Å、１．７ｕｍ、４．６ｘ１５０ｍｍ）を備えたＵＨＰＬＣにロードした。方法パラメータ：１）移動相：５ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ リン酸カリウム（ｐＨ７．４）、２）流速：０．３ｍＬ／分、３）注入量：１０μＬ、４）実施時間：１５分、５）サンプルトレイ温度：４℃。検量線は、精製したＬｅｇＨ標準で２８０ｎｍおよび４１５ｎｍの吸光度を使用して作成した。定量は、谷間ピーク積分法によるピーク面積を使用して行った。２８０ｎｍでの吸光度は存在するポリペプチドの量に比例し、４１５ｎｍでの吸光度は存在するヘムの量に比例する。両波長で同じ溶出時間にピークが見られる場合、ヘム含有タンパク質が検出される。
【0092】
[実施例３]
Ｒｔｇ１の過剰発現による外因性タンパク質の発現の増加
この実施例では、空のプラスミド（対照）またはＲｔｇ１過剰発現プラスミド（ｐＡＯＸ１－Ｒｔｇ１）を、ＡＯＸ１プロモーター下でウシミオグロビン（Ｍｂ）を発現するピキア・パストリス（Pichia pastoris）株に形質転換した。増殖は、デキストロースおよび３００μｇ／ｍｌのジェネテシン（Ｇ４１８）を含む３０℃のＹＰ培地で４８時間実施した。検量線は、精製ミオグロビンを使用して作成した。下の表６に示すように、Ｒｔｇ１発現は、ＡＯＸ１プロモーター下で発現した場合、Ｍｂ力価を２８％増加させた。
Ｒｔｇ１の過剰発現による外因性タンパク質の発現の増加
この実施例では、空のプラスミド（対照）またはＲｔｇ１過剰発現プラスミド（ｐＡＯＸ１－Ｒｔｇ１）を、ＡＯＸ１プロモーター下でウシミオグロビン（Ｍｂ）を発現するピキア・パストリス（Pichia pastoris）株に形質転換した。増殖は、デキストロースおよび３００μｇ／ｍｌのジェネテシン（Ｇ４１８）を含む３０℃のＹＰ培地で４８時間実施した。検量線は、精製ミオグロビンを使用して作成した。下の表６に示すように、Ｒｔｇ１発現は、ＡＯＸ１プロモーター下で発現した場合、Ｍｂ力価を２８％増加させた。
【0093】
【表6】
【0094】
[実施例４]
Ｒｔｇ１の過剰発現によるメタノール利用（ｍｕｔ）遺伝子プロモーター下での外因性タンパク質発現の増加
この実施例では、Ｒｔｇ１ ＯＲＦをＡＯＸ１プロモーターおよびターミネータープラスミドとともに含むカセットを親株に組み込んで「親株＋Ｒｔｇ１」を得た。ｍｕｔ遺伝子プロモーター（ＡＯＸ１、ＤＡＳ１、ＦＬＤ１）下に緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を含むプラスミドを親株および「親株＋Ｒｔｇ１」に形質転換した。増殖は、デキストロースおよび３００μｇ／ｍｌのジェネテシン（Ｇ４１８）を含む３０℃のＹＰ培地で４８時間実施した。蛍光は、蛍光プレートリーダーを使用して測定した。測定は、励起４８５ｎｍおよび発光５２５ｎｍで実施した。測定前にサンプルを水で５０倍希釈した。正規化は、ＧＦＰ発現を駆動する同じプロモーターについて、「親株＋Ｒｔｇ１」のＧＦＰ蛍光／ＯＤ６００を親株と比較して計算することにより行った。下の表７に示すように、Ｒｔｇ１発現は、ＧＦＰが発現されるプロモーターに応じて、ＧＦＰ発現を１１％～９８％増加させた。
Ｒｔｇ１の過剰発現によるメタノール利用（ｍｕｔ）遺伝子プロモーター下での外因性タンパク質発現の増加
この実施例では、Ｒｔｇ１ ＯＲＦをＡＯＸ１プロモーターおよびターミネータープラスミドとともに含むカセットを親株に組み込んで「親株＋Ｒｔｇ１」を得た。ｍｕｔ遺伝子プロモーター（ＡＯＸ１、ＤＡＳ１、ＦＬＤ１）下に緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を含むプラスミドを親株および「親株＋Ｒｔｇ１」に形質転換した。増殖は、デキストロースおよび３００μｇ／ｍｌのジェネテシン（Ｇ４１８）を含む３０℃のＹＰ培地で４８時間実施した。蛍光は、蛍光プレートリーダーを使用して測定した。測定は、励起４８５ｎｍおよび発光５２５ｎｍで実施した。測定前にサンプルを水で５０倍希釈した。正規化は、ＧＦＰ発現を駆動する同じプロモーターについて、「親株＋Ｒｔｇ１」のＧＦＰ蛍光／ＯＤ６００を親株と比較して計算することにより行った。下の表７に示すように、Ｒｔｇ１発現は、ＧＦＰが発現されるプロモーターに応じて、ＧＦＰ発現を１１％～９８％増加させた。
【0095】
【表7】
【0096】
[実施例５]
Ｒｔｇ１の過剰発現によるメタノール利用（ｍｕｔ）遺伝子プロモーター下での天然タンパク質の発現の増加
この実施例では、Ｒｔｇ１ ＯＲＦをＡＯＸ１プロモーターおよびターミネータープラスミドとともに含むカセットを親株に組み込んで「親株＋Ｒｔｇ１」を得た。増殖は、デキストロースおよび３００μｇ／ｍｌのジェネテシン（Ｇ４１８）を含む３０℃のＹＰ培地で４８時間実施した。ＡＯＸ２プロモーター下で発現されるメタノール利用（ｍｕｔ）経路のタンパク質であるＡＯＸ２のタンパク質レベルをショットガンプロテオミクスによりモニターした。下の表８に示すように、Ｒｔｇ１発現は、ＡＯＸ２発現を１８９％増加させた。
Ｒｔｇ１の過剰発現によるメタノール利用（ｍｕｔ）遺伝子プロモーター下での天然タンパク質の発現の増加
この実施例では、Ｒｔｇ１ ＯＲＦをＡＯＸ１プロモーターおよびターミネータープラスミドとともに含むカセットを親株に組み込んで「親株＋Ｒｔｇ１」を得た。増殖は、デキストロースおよび３００μｇ／ｍｌのジェネテシン（Ｇ４１８）を含む３０℃のＹＰ培地で４８時間実施した。ＡＯＸ２プロモーター下で発現されるメタノール利用（ｍｕｔ）経路のタンパク質であるＡＯＸ２のタンパク質レベルをショットガンプロテオミクスによりモニターした。下の表８に示すように、Ｒｔｇ１発現は、ＡＯＸ２発現を１８９％増加させた。
【0097】
【表8】
【0098】
[実施例６]
Ｒｔｇ１およびＭｘｒ１の過剰発現による外因性タンパク質発現の相加的な増加
この実施例では、「親株＋Ｒｔｇ１」株、「親株＋Ｍｘｒ１」株、および「親株＋Ｒｔｇ１＋Ｍｘｒ１」株における緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の発現レベルを測定した。「親株＋Ｒｔｇ１」株と「親株＋Ｍｘｒ１」株は、それぞれゲノム内のＡＯＸ１プロモーター下にＲｔｇ１またはＭｘｒ１の外来コピーを含んでいた。「親株＋Ｒｔｇ１＋Ｍｘｒ１」株は、そのゲノム内のＡＯＸ１プロモーター下にＲｔｇ１およびＭｘｒ１の両方のコピーを含んでいた。ＡＯＸ１プロモーターまたはＤＡＳ１プロモーター下のＧＦＰを含むプラスミドを上記の親株および娘株に形質転換した。増殖は、デキストロースおよび３００μｇ／ｍｌのジェネテシン（Ｇ４１８）を含む３０℃のＹＰ培地で４８時間実施した。正規化は、ＧＦＰ発現を駆動する同じプロモーターについて、各娘株のＧＦＰ蛍光／ＯＤ６００を親株と比較して計算することにより行った。
Ｒｔｇ１およびＭｘｒ１の過剰発現による外因性タンパク質発現の相加的な増加
この実施例では、「親株＋Ｒｔｇ１」株、「親株＋Ｍｘｒ１」株、および「親株＋Ｒｔｇ１＋Ｍｘｒ１」株における緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の発現レベルを測定した。「親株＋Ｒｔｇ１」株と「親株＋Ｍｘｒ１」株は、それぞれゲノム内のＡＯＸ１プロモーター下にＲｔｇ１またはＭｘｒ１の外来コピーを含んでいた。「親株＋Ｒｔｇ１＋Ｍｘｒ１」株は、そのゲノム内のＡＯＸ１プロモーター下にＲｔｇ１およびＭｘｒ１の両方のコピーを含んでいた。ＡＯＸ１プロモーターまたはＤＡＳ１プロモーター下のＧＦＰを含むプラスミドを上記の親株および娘株に形質転換した。増殖は、デキストロースおよび３００μｇ／ｍｌのジェネテシン（Ｇ４１８）を含む３０℃のＹＰ培地で４８時間実施した。正規化は、ＧＦＰ発現を駆動する同じプロモーターについて、各娘株のＧＦＰ蛍光／ＯＤ６００を親株と比較して計算することにより行った。
【0099】
下の表９に示すように、Ｒｔｇ１とＭｘｒ１の過剰発現は、親株と比較して、ＡＯＸ１プロモーター駆動によるＧＦＰ発現をそれぞれ７０％と２５２％増加させ、組み合わせた場合にはＧＦＰ発現を４７２％増加させた。同様に、Ｒｔｇ１とＭｘｒ１の過剰発現は、親株と比較して、ＤＡＳ１プロモーター駆動によるＧＦＰ発現をそれぞれ１５％と１０８％増加させ、組み合わせた場合にはＧＦＰ発現を２５１％増加させた。
【0100】
【表9】
【0101】
[実施例７]
Ｒｔｇ２の過剰発現による外因性タンパク質の発現の増加
この実施例では、Ｒｔｇ２ ＯＲＦをＡＯＸ１プロモーターおよびターミネータープラスミドとともに含むカセットを親株に組み込んで「親株＋Ｒｔｇ２」を得た。ＡＯＸ１プロモーター下の緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を含むプラスミドを親株および「親株＋Ｒｔｇ２」に形質転換した。増殖は、デキストロースおよび３００μｇ／ｍｌのジェネテシン（Ｇ４１８）を含む３０℃のＹＰ培地で４８時間実施した。正規化は、「親株＋Ｒｔｇ２」のＧＦＰ蛍光／ＯＤ６００を親株と比較して計算することにより行った。下の表１０に示すように、Ｒｔｇ２の発現はＧＦＰの発現を４０％増加させた。
Ｒｔｇ２の過剰発現による外因性タンパク質の発現の増加
この実施例では、Ｒｔｇ２ ＯＲＦをＡＯＸ１プロモーターおよびターミネータープラスミドとともに含むカセットを親株に組み込んで「親株＋Ｒｔｇ２」を得た。ＡＯＸ１プロモーター下の緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を含むプラスミドを親株および「親株＋Ｒｔｇ２」に形質転換した。増殖は、デキストロースおよび３００μｇ／ｍｌのジェネテシン（Ｇ４１８）を含む３０℃のＹＰ培地で４８時間実施した。正規化は、「親株＋Ｒｔｇ２」のＧＦＰ蛍光／ＯＤ６００を親株と比較して計算することにより行った。下の表１０に示すように、Ｒｔｇ２の発現はＧＦＰの発現を４０％増加させた。
【0102】
【表10】
【0103】
[実施例８]
Ｍｘｒ１、Ｒｔｇ１、およびＲｔｇ２の過剰発現による外因性タンパク質の発現の増加
この実施例では、Ｒｔｇ１、Ｒｔｇ２、および／またはＭｘｒ１をＡＯＸ１プロモーターおよびターミネータープラスミドとともに含むカセットを親株に組み込んだ。ＡＯＸ１プロモーター下の緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を含むプラスミドを各株に形質転換した。増殖は、デキストロースおよび３００μｇ／ｍｌのジェネテシン（Ｇ４１８）を含む３０℃のＹＰ培地で４８時間実施した。正規化は、各株のＧＦＰ蛍光／ＯＤ６００を親株と比較して計算することにより行った。下の表１１に示すように、Ｍｘｒ１、Ｒｔｇ１、およびＲｔｇ２の発現はＧＦＰ発現を５００％超増加させた。
Ｍｘｒ１、Ｒｔｇ１、およびＲｔｇ２の過剰発現による外因性タンパク質の発現の増加
この実施例では、Ｒｔｇ１、Ｒｔｇ２、および／またはＭｘｒ１をＡＯＸ１プロモーターおよびターミネータープラスミドとともに含むカセットを親株に組み込んだ。ＡＯＸ１プロモーター下の緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を含むプラスミドを各株に形質転換した。増殖は、デキストロースおよび３００μｇ／ｍｌのジェネテシン（Ｇ４１８）を含む３０℃のＹＰ培地で４８時間実施した。正規化は、各株のＧＦＰ蛍光／ＯＤ６００を親株と比較して計算することにより行った。下の表１１に示すように、Ｍｘｒ１、Ｒｔｇ１、およびＲｔｇ２の発現はＧＦＰ発現を５００％超増加させた。
【0104】
【表11】
【0105】
[実施例９]
Ｒｔｇ１およびＭｉｔ１またはＴｒｍ１の過剰発現による外因性タンパク質の発現の増加
この実施例では、Ｒｔｇ１とＭｉｔ１またはＴｒｍ１をＡＯＸ１プロモーターおよびターミネータープラスミドとともに含むカセットを親株に組み込んだ。ＡＯＸ１プロモーター下の緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を含むプラスミドを各株に形質転換した。増殖は、デキストロースおよび３００μｇ／ｍｌのジェネテシン（Ｇ４１８）を含む３０℃のＹＰ培地で４８時間実施した。正規化は、各株のＧＦＰ蛍光／ＯＤ６００を親株と比較して計算することにより行った。下の表１２に示すように、Ｍｉｔ１単独、またはＲｔｇ１との組合せはＧＦＰ発現を９００％超増加させた。また表１２に示すように、Ｍｘｒ１とＲｔｇ１の組合せはＴｒｍ１の有無にかかわらず、ＧＦＰ発現を少なくとも６００％増加させた。
Ｒｔｇ１およびＭｉｔ１またはＴｒｍ１の過剰発現による外因性タンパク質の発現の増加
この実施例では、Ｒｔｇ１とＭｉｔ１またはＴｒｍ１をＡＯＸ１プロモーターおよびターミネータープラスミドとともに含むカセットを親株に組み込んだ。ＡＯＸ１プロモーター下の緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を含むプラスミドを各株に形質転換した。増殖は、デキストロースおよび３００μｇ／ｍｌのジェネテシン（Ｇ４１８）を含む３０℃のＹＰ培地で４８時間実施した。正規化は、各株のＧＦＰ蛍光／ＯＤ６００を親株と比較して計算することにより行った。下の表１２に示すように、Ｍｉｔ１単独、またはＲｔｇ１との組合せはＧＦＰ発現を９００％超増加させた。また表１２に示すように、Ｍｘｒ１とＲｔｇ１の組合せはＴｒｍ１の有無にかかわらず、ＧＦＰ発現を少なくとも６００％増加させた。
【0106】
【表12】
【0107】
他の実施形態
本発明をその詳細な説明と併せて説明したが、前述の説明は、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲を説明することを意図しており、本発明の範囲を限定するものではないことを理解されたい。他の態様、利点、および変更は、以下の特許請求の範囲内である。
本発明をその詳細な説明と併せて説明したが、前述の説明は、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲を説明することを意図しており、本発明の範囲を限定するものではないことを理解されたい。他の態様、利点、および変更は、以下の特許請求の範囲内である。
【配列表】
【国際調査報告】