特表 2024-546920 抗線維性細胞、該細胞を含む医薬品および該細胞を得る方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-12-26

(54)【発明の名称】抗線維性細胞、該細胞を含む医薬品および該細胞を得る方法

(51)【国際特許分類】

   A61K 35/12 20150101AFI20241219BHJP

   A61K 35/76 20150101ALI20241219BHJP

   A61P 13/12 20060101ALI20241219BHJP

   A61P 11/00 20060101ALI20241219BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20241219BHJP

   A61K 38/17 20060101ALI20241219BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20241219BHJP

   C07K 14/78 20060101ALI20241219BHJP

   C12N 15/867 20060101ALI20241219BHJP

   C12N 5/077 20100101ALN20241219BHJP

   C12N 15/12 20060101ALN20241219BHJP

【ＦＩ】

A61K35/12

A61K35/76

A61P13/12

A61P11/00

A61P43/00 105

A61K38/17

C12N5/10 ZNA

C07K14/78

C12N15/867 Z

C12N5/077

C12N15/12

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024535781

(86)(22)【出願日】2022-12-16

(85)【翻訳文提出日】2024-08-06

(86)【国際出願番号】 EP2022086318

(87)【国際公開番号】W WO2023111253

(87)【国際公開日】2023-06-22

(31)【優先権主張番号】102021000031517

(32)【優先日】2021-12-16

(33)【優先権主張国・地域又は機関】IT

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】515143739

【氏名又は名称】ビー．ブラウン アビタム アーゲー

【氏名又は名称原語表記】Ｂ． ＢＲＡＵＮ ＡＶＩＴＵＭ ＡＧ

【住所又は居所原語表記】Ｓｃｈｗａｒｚｅｎｂｅｒｇｅｒ Ｗｅｇ ７３－７９， ３４２１２ Ｍｅｌｓｕｎｇｅｎ， Ｇｅｒｍａｎｙ

(74)【代理人】

【識別番号】100134832

【弁理士】

【氏名又は名称】瀧野 文雄

(74)【代理人】

【識別番号】100165308

【弁理士】

【氏名又は名称】津田 俊明

(74)【代理人】

【識別番号】100115048

【弁理士】

【氏名又は名称】福田 康弘

(72)【発明者】

【氏名】ドミニッチ マッシモ

【テーマコード（参考）】

4B065

4C084

4C087

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B065AA90X

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065CA44

4C084AA02

4C084BA01

4C084BA08

4C084BA22

4C084BA23

4C084BA44

4C084NA14

4C084ZA59

4C084ZA81

4C084ZB21

4C087AA01

4C087AA02

4C087AA03

4C087BB65

4C087CA04

4C087CA09

4C087CA12

4C087NA14

4C087ZA59

4C087ZA81

4C087ZB21

4H045AA10

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA10

4H045CA40

4H045EA20

4H045FA74

(57)【要約】

特に腎線維症の治療のための改変間葉系細胞を製造する方法は、改変細胞がデコリンであるタンパク質をコードするように、細胞をウイルスベクターで改変することからなる。この方法で得られた間葉系細胞は、間葉系細胞に付随するウイルスベクターからなる改変剤で改変され、改変された間葉系細胞がデコリンを発現するようになる。特に腎線維症および肺線維症の治療のための医薬品は、改変剤で改変され、デコリンを発現する間葉系細胞からなる。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

肺または腎臓の線維症の治療に使用するための、改変剤で改変された間葉系細胞であって、前記改変剤が、前記間葉系細胞に感染するデコリンをコードするウイルスベクターを含み、感染した前記間葉系細胞がデコリンを発現する、間葉系細胞。

【請求項2】

前記デコリンが、デコリンアイソフォームＡ、またはアイソフォームＢ、またはアイソフォームＣ、またはアイソフォームＤ、またはアイソフォームＥから選択される、請求項１に記載の使用のための細胞。

【請求項3】

前記デコリンがデコリンアイソフォームＡである、請求項２に記載の使用のための細胞。

【請求項4】

前記間葉系細胞がヒトまたは動物由来の間葉系細胞から選択される、請求項１～３のいずれか１項に記載の使用のための細胞。

【請求項5】

前記間葉系細胞が、自己間葉系細胞または同種間葉系細胞から選択される、請求項１～４のいずれか１項に記載の使用のための細胞。

【請求項6】

前記間葉系細胞が、脂肪組織由来、骨髄由来、子宮内膜組織由来、胎盤組織由来、末梢血由来、臍帯血由来、羊水由来、および／または誘導体由来の間葉系細胞から選択される、請求項１～５のいずれか１項に記載の使用のための細胞。

【請求項7】

前記間葉系細胞が子宮内膜組織に由来する、請求項１に記載の使用のための細胞。

【請求項8】

前記改変された間葉系細胞によって発現されたデコリンが、反復的に発現されたデコリンである、請求項１に記載の使用のための細胞。

【請求項9】

前記ウイルスベクターが、レンチウイルスまたはレトロウイルスから選択される、請求項１～８のいずれか１項に記載の使用のための細胞。

【請求項10】

請求項１～９のいずれか１項に記載の改変剤で改変された間葉系細胞からなり、前記改変剤が、デコリンを発現する改変された細胞からなる前記改変された間葉系細胞に感染するレンチウイルスまたはレトロウイルスから選択されるウイルスベクターからなることを特徴とする、腎臓の線維化過程を予防または遅らせるための医薬。

【請求項11】

請求項１～９のいずれか１項に記載の改変剤で改変された間葉系細胞からなり、前記改変剤が、デコリンを発現する改変された細胞からなる前記改変された間葉系細胞に感染するレンチウイルスまたはレトロウイルスから選択されるウイルスベクターからなることを特徴とする、肺の線維化過程を予防または遅らせるための医薬。

【請求項12】

請求項１～９のいずれか１項に記載の使用のために改変剤で改変された間葉系細胞を製造し、改変された間葉系細胞を得る方法であって、前記改変剤が、タンパク質を安定にコードし、前記タンパク質がデコリンであるウイルスベクターからなり、前記改変された間葉系細胞が前記デコリンを発現することを特徴とする方法。

【請求項13】

前記改変が、前記間葉系細胞に前記ウイルスベクターを感染させることを含むことを特徴とする、請求項１２に記載の方法。

【請求項14】

前記デコリンが、デコリンアイソフォームＡ、またはアイソフォームＢ、またはアイソフォームＣ、またはアイソフォームＤ、またはアイソフォームＥから選択される、請求項１２に記載の方法。

【請求項15】

前記デコリンがデコリンアイソフォームＡである、請求項１４に記載の方法。

【請求項16】

前記ウイルスベクターがレンチウイルスまたはレトロウイルスから選択される、請求項１２に記載の方法。

【請求項17】

前記間葉系細胞がＨＬＡ－Ｇ分子を発現する、請求項１２に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、一般に肺や腎臓における線維症の形成を予防または治療するために使用可能な改変細胞、その改変細胞を含む医薬品、およびその改変細胞を得る方法に関する。

【背景技術】

【0002】

肺や腎臓など、さまざまな組織の線維化や機能不全には多くの原因があることが知られているが、共通しているのは、一貫した病変が繰り返されると、臓器自体の再生能力が制限されることである。

【0003】

これらの病変は線維芽細胞の活性化と遊走を引き起こし、主にコラーゲンなどの細胞外マトリックスとタンパク質の沈着をもたらし、線維症として知られるプロセスにおいて免疫系の細胞と仲介するサイトカインの分泌を引き起こす（Ｍｕｌｌｉｎｓ， Ｌ． ｅｔ ａｌ； “Ｄｉｓｅａｓｅ Ｍｏｄｅｌｓ ａｎｄ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ”； ２０１６．９．１４１９－１４３３）。

【0004】

ＴＧＦ－Ｂｅｔａとも呼ばれるＴＧＦ－βは、線維化プロセスに関与する最も重要なサイトカインの一つである。

【0005】

このサイトカインは、「上皮間葉転換」として知られる過程を経て、上皮細胞から線維芽細胞への転換を引き起こし、その結果、線維芽細胞の数が増加し、コラーゲンが著しく沈着する（Ｋａｌｌｕｒｉら； Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖ． ２００３）。

【0006】

この最先端技術に基づくと、TGF-βを特異的に認識して相互作用し、標的上皮細胞との結合を阻止できるデコイ受容体の使用は、特に腎臓および肺組織（Ｂｏｒｄｅｒ ＷＡ ｅｔ ａｌ． Ｎａｔｕｒｅ． １９９２； ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｍｃ／ａｒｔｉｃｌｅｓ／ＰＭＣ３８１２９４９／ Ｙｕｅ Ｘ ｅｔ ａｌ． Ｃｕｒｒ Ｅｎｚｙｍ Ｉｎｈｉｂ． ２０１０）の線維化プロセス（Ｌａｎ ＨＹ； Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ２０１１）と対照をなす可能性のある戦略となる可能性がある。

【0007】

間葉系細胞（以下、略してＭＣとする場合もある）は、線維化した腎臓と肺においてＴＧＦ－βデコイ受容体を運搬・放出する理想的な細胞ビヒクルとなる。両組織は、いくつかの病態生理学的事象に関連していると報告されているからである（ｈｔｔｐｓ：／／ｊｏｕｒｎａｌｓ．ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ．ｏｒｇ／ｄｏｉ／ｆｕｌｌ／１０．１１５２／ａｊｐｌｕｎｇ．００１５２．２０２１； Ｂｏｌｌｅｎｂｅｃｋｅｒ Ｓ ｅｔ ａｌ． Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ． Ｌｕｎｇ Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ２０２２； ｈｔｔｐｓ：／／ｌｉｎｋ．ｓｐｒｉｎｇｅｒ．ｃｏｍ／ａｒｔｉｃｌｅ／１０．１００７／ｓ４０６２０－０１８－００５６３－１； Ｓｏｒｉｎｏ Ｃ ｅｔ ａｌ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｐｈｒｏｌｏｇｙ ２０１８）。

【0008】

ＭＣは、損傷した白血球や細胞によって血流中に放出された可溶性分子からリクルートされたため、損傷部位に移動して定着する能力を持っている（Ｄｉ Ｍａｒｉｎｏ ＡＭ． Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２０１３）。

【0009】

多くの組織（脂肪組織、骨髄、臍帯を含む）に存在し、単離が容易で、遺伝子操作が可能で、免疫原性反応を誘導しないことから、ＴＧＦ－βデコイ受容体のような治療目的の化合物を細胞ベースの治療アプローチに導入する際の理想的なベクターとなる。

【0010】

この現状にはいくつかの欠点がある。

【0011】

一つの欠点は、腎線維症が透析のような侵襲的で障害を伴う治療法で治療されることである。

【0012】

透析は腎臓が血液を老廃物から濾過するのを助けることは知られているが、透析を受けた人が治るわけではない。

【0013】

実際、透析は完治をもたらさない治療法であり、透析患者の症状の重さによっては、毎週または毎日行わなければならない。

【0014】

もう一つの欠点は、患者にとって非常に苦痛であることに加えて、透析は心理的にも障害をもたらすことである。なぜなら、透析は本人にとって不快であり、低血圧、かゆみ、不眠、痛み、性的障害を引き起こす身体的不快感をもたらすからである。

【0015】

さらに、透析は病院でしか行えない治療法であるため、患者は定期的な治療のために自宅から移動しなければならず、歩行が困難な場合はさらに不利になる。

【0016】

実際、透析は複雑な治療法であるため、特殊な機械とその使用に熟練した医療従事者の支援が必要である。

【0017】

もう一つの欠点は、透析が腎線維症の唯一の治療法であることに加え、非常に高価な治療法であることで、機械代、試薬代、人件費、病床費など、１４０億から１５０億ユーロが欧州共同体の医療システムに請求されている。

【0018】

さらに、重度の腎臓病患者は移植を受けることになるが、移植は常に可能というわけではなく、副作用や高い社会的・医療的負担を強いられる。

【0019】

最後に、もう一つの欠点も強調しなければならず、すなわちそれは、腎臓線維症の状態が非常に進行している場合、腎臓の機能に何の利益ももたらさないため、透析を使用することができないということである。

【0020】

同様に、肺線維症は心肺医学において印象的ではあるが治癒不可能な影響を及ぼし、健康や社会に非常に重要な影響を及ぼしている（ｈｔｔｐｓ：／／ｏｐｅｎｒｅｓ．ｅｒｓｊｏｕｒｎａｌｓ．ｃｏｍ／ｃｏｎｔｅｎｔ／４／２／０００４５－２０１７： Ｈｉｌｂｅｒｇ Ｏ ｅｔ ａｌ． ＥＲＪ Ｏｐｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２０１８）。

【0021】

線維化における極めて重要な推進因子のひとつがＴＧＦ－βであり、急性／慢性腎臓病や肺疾患だけでなく、がんにおいても役割を果たしている（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｓｃｉｅｎｃｅｄｉｒｅｃｔ．ｃｏｍ／ｓｃｉｅｎｃｅ／ａｒｔｉｃｌｅ／ｐｉｉ／Ｓ１３５９６１０１０５００１１０３： Ｂｉｅｒｉｅ Ｂ ＆ Ｍｏｓｅｓ ＨＬ． Ｃｙｔｏｋｉｎｅ ＆ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｖｉｅｗｓ ２００６）。このため、ＴＧＦ－βの作用に対抗する試みが以前に記載されている。

【0022】

ＵＳ－Ａ１－２０１９／１２５８０４は、オリゴヌクレオチド、抗体またはポリペプチド、特にデコリンの発現を増加させるように遺伝子改変されたヒト臍帯血管周囲細胞（ＨＵＣＰＶＣ）をＴＧＦ－βデコイ結合剤として投与することにより、被験者のがんを治療する方法を開示している（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｓｃｉｅｎｃｅｄｉｒｅｃｔ．ｃｏｍ／ｓｃｉｅｎｃｅ／ａｒｔｉｃｌｅ／ｐｉｉ／Ｓ００２１９２５８２０６２１２６３： Ｆｅｒｄｏｕｓ Ｚ ｅｔ ａｌ． ＪＢＣ ２００７）。この解決法の欠点は、組換えアデノウイルスによるＨＵＣＰＶＣの改変に関連しており、この改変は安定ではないため、ＨＵＣＰＶＣにデコリン産生を誘導する。さらに、免疫原性の観点からは、アデノウイルスの免疫原性のために望ましくない副次的効果が起こりうる（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｆｒｏｎｔｉｅｒｓｉｎ．ｏｒｇ／ａｒｔｉｃｌｅｓ／１０．３３８９／ｆｉｍｍｕ．２０２０．００９０９／ｆｕｌｌ： Ｃｏｕｇｈｌａｎ Ｌ． Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２０２０）。

【0023】

さらに、ＵＳ－Ａ１－２０１９／１１７７０１には、線維症を含む様々な症状に対して治療効果を持つ可能性のある間葉系幹細胞が開示されている。特に、それらの間葉系幹細胞は、ＣＤ２０１、ＣＤ４６、ＣＤ５６、ＣＤ１４７およびＣＤ１６５からなる群から選択される少なくとも１つの細胞表面マーカーを発現する。そのようなマーカーを発現する間葉系幹細胞は、ＣＤ２９、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５及びＣＤ１６６も陽性であり、未分化状態を維持する。ＵＳ－Ａ１－２０１９／１１７７０１は、多種多様な付加的分子の中で、間葉系幹細胞が自発的にデコリンを分泌することを主張している。この文献では、間葉系幹細胞が強制的にデコリンを産生する（あるいは産生を増強する）ように改変することは示唆されていない。さらに、間葉系幹細胞の主な特徴は、ＣＤ２０１、ＣＤ４６、ＣＤ５６、ＣＤ１４７およびＣＤ１６５からなる群から選択される少なくとも１つの細胞表面マーカーを発現することであり、デコリンではない。さらに、ＵＳ－Ａ１－２０１９／１２５８０４に関しては、クレームされた細胞は臍帯、脂肪または骨髄由来であり、ＥＴからのＭＣの使用に関する最小限の示唆もない。本出願の図２に見られるように、ＥＴ由来の細胞はデコリンを自発的に発現しないので、これは特に異なる。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0024】

本発明の目的は、上記の欠点を克服し、腎線維症および肺線維症の治療のための改変ＭＣと、上記の欠点を解決することを可能にする、特に線維症を決定的に治療することを可能にする、病態の解消につながる改変細胞を得る方法を提供することである。

【0025】

本発明のもう一つの技術的目的は、治療が患者にとって苦痛や心理的障害を伴わない、腎線維症の新しい治療法を完成させることである。

【0026】

本発明のさらなる技術的目的は、非常に重大なレベルの罹患率および死亡率を伴う肺線維症に対する新しい治療法を完成させることである。

【0027】

本発明のさらに別の技術的目的は、移動に問題があり酸素要求量が高い人でも容易に利用できるため、患者が病院に行く必要がなく、薬剤として投与できることである。

【0028】

本発明のもう一つの技術的目的は、透析を行うための特殊で高価な機械、病院に２４時間常駐する専門家、特殊な試薬、そしてまだ解決されていないが高価な抗線維化薬を使用する必要がないため、医療制度が負担するコストを大幅に削減することである。

【0029】

本発明のもう一つの技術的目的は、透析ではもはや治療不可能な、特に進行した腎線維症の患者の治療を可能にすることである。

【課題を解決するための手段】

【0030】

本発明の一態様によれば、請求項１に従って、腎臓または肺の線維症の治療に使用するために、改変剤で改変された間葉系細胞が提供される。

【0031】

実施形態に従って、間葉系細胞は子宮内膜組織に由来する。

【0032】

これは、細胞が臍帯血管周囲組織に由来する、例えばＵＳ－Ａ１－２０１９／１２５８０４から公知の先行技術の解決策とは異なる。

【0033】

実施形態によれば、間葉系細胞は、子宮内膜脱落壊死物質から採取された生きた細胞である。

【0034】

本発明の別の態様によれば、請求項１２の特徴に従って、改変剤で改変されたＭＣを産生する方法が提供される。

【0035】

本発明の別の態様によれば、請求項１４に従って、改変剤は、デコリンアイソフォームＡ、デコリンアイソフォームＢ、デコリンアイソフォームＣ、デコリンアイソフォームＤ、デコリンアイソフォームＥから選択される。

【0036】

本発明の別の態様によれば、請求項１７の特徴に従って、改変剤で改変され、ＨＬＡ－Ｇと呼ばれる分子を発現するＭＣを、抗線維化作用および免疫抑制作用を有するように製造する方法が提供される。

【0037】

本発明の別の態様によれば、請求項１０の特徴に従って、特に腎線維症を予防または遅らせるための医薬品が提供される。

【0038】

本発明の別の態様によれば、腎線維症を予防または遅らせるために使用するための医薬が提供される。

【0039】

また、安定な改変剤で改変された間葉系細胞が開示され、ここで改変剤はレンチウイルスおよびレトロウイルスから選択されるウイルスベクターである。

【0040】

本発明により、以下の利点が得られる。
腎線維症に罹患した患者を治療し、病態が進行している場合でも完全な回復を達成する。
特定の機械、専門家、試薬材料を必要とせず、患者の治療を可能にし、治療費を大幅に削減する。
患者が自宅と病院を往復する必要がなくなる。
腎移植手術を減らす。
治療される患者の不快感や痛みをなくす。

【0041】

本発明の別の態様によれば、請求項１１の特徴に従った、特に肺線維症を予防または遅らせるための医薬品が提供される。

【0042】

本発明の別の態様によれば、肺線維症を予防または遅らせるために使用するための医薬が提供される。

【0043】

本発明により、さらに以下の利点を得ることができる。
肺線維症に罹患した患者を治療し、進行した病態の場合であっても完全な回復を達成する。
特定の機械、特定の抗線維化薬、専門家／介護者、試薬材料を必要とすることなく患者の治療を可能にし、治療費を大幅に削減する。
患者が自宅と病院を往復する必要がなくなる。
治療される患者の不快感や酸素依存をなくす。

【0044】

本発明の他の特徴および利点は、改変剤で改変されたＭＣ、改変剤で改変されたＭＣを製造する方法、医薬品、特に腎線維症および肺線維症を予防するための医薬品の、排他的ではないが好ましいいくつかの実施形態の詳細な説明から明らかになるであろう。これらはすべて、添付の図面に非限定的な例として示されている。

【図面の簡単な説明】

【0045】

【図1】図１は、デコリンをコードする遺伝子でＭＣを改変するために使用されるウイルスベクターの図解である。

【図2】図２は、３つの異なるＭＣの供給源（各供給源について２人ずつ）により、３つの異なる時間に培養液中に分泌されたデコリンの量を示すグラフである。

【図3A】図３Ａは、デコリンシグナル配列に対する陽性を評価するための、対照子宮内膜間葉細胞のサンプルの代表的なサイトフルオロメーター分析である。

【図3B】図３Ｂは、デコリンシグナル配列に対する陽性を評価するための、感染ＥＴ－ＭＣサンプルの代表的なサイトフルオロメーター分析である。遺伝子組み換えサンプルは８９．５％で陽性であった。

【図4】図４は、デコリンを過剰発現していないＥＴ－ＭＣの基底発現量を基準にして正規化した、デコリンのｍ－ＲＮＡ量のグラフである。

【図5】図５は、３つの異なる時間に検出された、デコリンを過剰発現するように改変された細胞に対する対照細胞の培養液中に分泌されたデコリンの量のグラフィック表示である。

【図6A】図６Ａは、脂肪組織から単離されたＭＣ（ＡＴ－ＭＣ）のサンプルの代表的なサイトフルオロメーター分析であり、デコリンシグナル配列に対する陽性を評価するための対照として使用された。

【図6B】図６Ｂは、デコリンシグナル配列に対する陽性を評価するための、対照ＡＴ－ＭＣｓサンプルの代表的なサイトフルオロメーター分析である。遺伝子組み換えサンプルは培養細胞の５４．５％で陽性である。

【図7】図７は、デコリンのｍ－ＲＮＡ量を、標的タンパク質を過剰発現していないＭＣの基底発現量に基づいて正規化したグラフである。

【図8】図８は、コントロールのＡＴ－ＭＣ細胞と、デコリンを過剰発現するように改変したＡＴ－ＭＣ細胞との比較における、培養液中に分泌されたデコリンの量を、３つの異なる時点で示したグラフである。

【図9】図９は、３人のドナーから単離した細胞で実施したアッセイに基づき、４８時間培養後、エンプティベクターＥＴ－ＭＣおよびデコリンを発現するＥＴ－ＭＣの存在下／非存在下で移動した特発性肺線維症（ＩＰＦ）ＣＣ－７２３１由来の線維芽細胞の数のグラフィック表示である。

【図10】図１０は、エンプティベクターET-MCおよびデコリンを発現するET-MCと48時間共培養した線維芽細胞の増殖マーカーとしてのKi-67遺伝子の発現を、2人のドナーで実施したアッセイに基づいてグラフ化したものである。

【図11】図１１は、エンプティベクターＥＴ－ＭＣおよびデコリンを発現するＥＴ－ＭＣとの４８時間の共培養における、線維芽細胞の線維化促進活性のマーカーであるａＳＭＡ遺伝子の発現を示すグラフィック表示である。

【図12】図１２は、バイオプリンティング技術によって得られた真皮および腎臓線維症のバイオミメティック３Ｄモデルの走査型顕微鏡（ＳＥＭ）による分析をまとめたグラフィック表示である。

【図13】図１３は、真皮由来の線維芽細胞を用いたバイオプリンティング技術によって得られた線維症のバイオミメティック３Ｄモデルにおけるフィブロネクチンタンパク質の発現の評価である。

【図14】図１４は、腎臓線維芽細胞を用いたバイオプリンティング技術により得られた線維症のバイオミメティック３Ｄモデルにおけるフィブロネクチンタンパク質の発現の評価である。

【図15】図１５は、デコリン導入の有無にかかわらず、ＥＤＴ－ＭＣにおけるＨＬＡ－Ｇ発現である。

【発明を実施するための形態】

【0046】

本発明に従って、改変間葉系細胞ＭＣを製造する方法は、改変剤、特にタンパク質をコードするウイルスベクターからなる改変剤でＭＣを改変することを提供する。このタンパク質はデコリンであり、改変されたＭＣはこのデコリンを発現する。

【0047】

有利には、ＭＣを改変するステップは、ウイルスベクターでＭＣを感染させることからなる。

【0048】

デコリンは、デコリンアイソフォームＡ、またはアイソフォームＢ、またはアイソフォームＣ、またはアイソフォームＤ、またはアイソフォームＥから選択される。

【0049】

ウイルスベクターは、安定なデコリン産生に結びつくことから、好ましくはレンチウイルスまたはレトロウイルスから選択される。

【0050】

本発明によれば、上記の方法で得られる、改変剤で改変されたＭＣも提供される。特に、改変剤は、ＭＣに感染するレトロウイルスベクターからなり、レトロウイルスベクターに感染したＭＣは、デコリンを発現する感染ＭＣである。

【0051】

デコリンは、デコリンアイソフォームＡ、またはアイソフォームＢ、またはアイソフォームＣ、またはアイソフォームＤ、またはアイソフォームＥから選択され、より好ましくはデコリンアイソフォームＡである。

【0052】

ＭＣはヒト由来または動物由来のＭＣから選択することができる。ＭＣはまた、自家または同種ＭＣから選択することもできる。また、ＭＣが脂肪組織由来のＭＣ、または骨髄由来のＭＣ、子宮内膜組織由来のＭＣ、胎盤組織由来のＭＣ、末梢血由来のＭＣ、臍帯血由来のＭＣ、羊水由来のＭＣおよび／または誘導体由来のＭＣから選択されることを提供することも可能である。好ましい態様では、ＭＣは子宮内膜組織に由来する。

【0053】

有利には、改変間葉系細胞によって発現されるデコリンは、反復的に発現されるデコリンである。

【0054】

上記のような改変されたＭＣは、肺および腎臓の線維化過程の治療に使用するために提供することができる。特に、本発明は、線維症の治療のための医薬として使用するための、レンチウイルスまたはレトロウイルスから選択されるウイルスベクターで改変され、上記のようにデコリンを発現するＭＣを提供する。

【0055】

特に、本発明はまた、上記のように改変剤で改変されたＭＣを含む医薬品を提供し、ここで、改変剤は、デコリンを発現する改変細胞からなる改変ＭＣに感染するレンチウイルスまたはレトロウイルスから選択されるウイルスベクターからなる。

【0056】

従来デコリンアイソフォームＡと呼ばれていたデコリンのアイソフォームが選択され、以下、説明の便宜上この名称で呼ばれるが、これは頭文字をとってＤＣＮ Ａとも呼ばれる。ＤＣＮ ＡはＴＧＦ－βのデコイ受容体アイソフォームの中で最も特徴的である（Ｚｈａｎｇ Ｌ ｅｔ ａｌ， Ａｇｉｎｇ， ２０２１）。

【0057】

本発明では、生物学的見地から最も特徴的なＤＣＮ Ａに言及した。

【0058】

［１ － 材料と方法］
〈１．１ － ＭＣの単離と培養〉
１．１．１－子宮内膜組織（ＥＴ）からのＭＣｓ：子宮内膜組織からの血液（月経血と呼ばれる）を、月経周期の最初の数日間に、健康なボランティアドナー（ｎ＝２、ＥＴ－ＭＣｓドナー＃１およびＥＴ－ＭＣｓドナー＃２とする）から採取した。

【0059】

各ドナーには、血液を採取するための月経カップ（ＤｉｖａＣｕｐ， Ｄｉｖａ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ， Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ， ＣＡ， ＵＳＡ）が提供され、その後、１％ペニシリン／ストレプトマイシン（１０，０００Ｕ／ｍＬ Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ， １０ｍｇ／ｍＬ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ ０．９％ ＮａＣｌ ｓｏｌｕｔｉｏｎ， ＰＡＡＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、３５ｍｇ／ｍＬフルコナゾール（Ｄｉｆｌｕｃａｎ， Ｐｆｉｚｅｒ， ＮｅｗＹｏｒｋ， ＮＹ， ＵＳＡ）、ヘパリン（５００Ｕ／ｍＬ， Ｓｉｇｍａ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ， ＵＳＡ）を含む生理食塩水（ＰＢＳ， ＰＡＡ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｐａｓｃｈｉｎｇ， Ａｕｓｔｒｉａ）に移した。

【0060】

サンプルは、採取後２４－４８時間、治療専門の検査室に届くまで４℃で保存された。
子宮内膜組織が存在する場合はそれを廃棄し、残りの血液を１９Ｇの針に２０回通し、１０ｍＬのシリンジを用いてホモジナイズした。

【0061】

この細胞懸濁液を、以下に述べるように培養した。

【0062】

１．１．２ － 脂肪組織（ＡＴ）由来のＭＣ：ＡＴ－ＭＣは、健康なドナーの皮下組織から脂肪吸引法で採取した脂肪吸引サンプル（ｎ＝２、ＡＴ－ＭＣドナー＃１とＡＴ－ＭＣドナー＃２）から得た。

【0063】

このサンプルは、患者のインフォームド・コンセントを得た上で、地方倫理委員会（Ａｚｉｅｎｄａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔａｒｉｏ－Ｏｓｐｅｄａｌｉｅｒａ， Ｐｏｌｉｃｌｉｎｉｃｏ ｄｉ Ｍｏｄｅｎａ）の承認を得て、「脂肪組織から単離された間葉系／間質系前駆細胞の使用に基づく新規抗腫瘍療法の開発」（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｎｏｖｅｌ ａｎｔｉ－ｔｕｍｏｒ ｔｈｅｒａｐｉｅｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ／ｓｔｒｏｍａｌ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ａｄｉｐｏｓｅ ｔｉｓｓｕｅ Ｐｏｌｉｃｌｉｎｉｃｏ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ）と題されたプロジェクト（プロトコル番号０００４８２７／２０）の枠内で使用された。

【0064】

脂肪吸引液（１ｃｃ）を、同量の生理食塩水（ＰＢＳ Ｃｏｄｅ： １４１９０－０９４、ＧＩＢＣＯ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）で広範囲に洗浄し、その後０．０７５％コラゲナーゼで３７℃、３０分間消化することにより、ＡＴ－ＭＣｓ前駆体を得た。

【0065】

その後、酵素活性をＤＭＥＭ（Ｃｏｄｅ： ４１９６６－０２９． ＧＩＢＣＯ， Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， Ｗａｌｔｈａｍ， ＭＡ， ＵＳＡ）で中和し、１０％熱不活性化ＦＢＳ（Ｃｏｄｅ： ＳＨ３００７０．０３． ＨｙＣｌｏｎｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｉｎｃ， Ｌｏｇａｎ， Ｕｔａｈ， ＵＳＡ）を加え、１２００ｇで１０分間遠心して細胞ペレットを得た。

【0066】

このペレットを１６０ ｍＭ ＮＨ_４Ｃｌ（Ｃｏｄｅ： Ａ９４３４， Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ Ｉｎｃ， ＵＳＡ）に懸濁し、周囲温度で１０分間インキュベートして汚染赤血球を溶解した。

【0067】

その後、得られた細胞を遠心分離で回収し、１００ μｍのフィルターで濾過して細胞の残骸を取り除き、対照培地（ＤＭＥＭ、１０％ ＦＢＳ）中、３７℃／５％ ＣＯ_２で一晩培養した。

【0068】

このインキュベーションの後、プレートをＰＢＳ（Ｃｏｄｅ： １４１９０－０９４、ＧＩＢＣＯ， Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， Ｗａｌｔｈａｍ， ＭＡ， ＵＳＡ）で数回洗浄し、残存する非付着赤血球を除去した

【0069】

１．１．３ － 骨髄（ＢＭ）からのＭＣ：ＢＭサンプルを後腸骨稜から採取した。

【0070】

サンプル（ＢＭ－ＭＣｓドナー＃１およびＢＭ－ＭＣｓドナー＃２とする）は、０．５～１ｍＬのクエン酸Ｎａ（３８ｍｇ／ｍＬ）（コード：ＰＨＲ１４１６、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ Ｉｎｃ、米国）を含む１０ｍＬルアーロックシリンジで吸引し、以下のように処理した。ＢＭをＣａ ２／Ｍｇ２を含まない滅菌ＰＢＳ（ＰＢＳコード：１４１９０－０９４、ＧＩＢＣＯ， Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， Ｗａｌｔｈａｍ， ＭＡ， ＵＳＡ）で１：１（ｖ：ｖ）に希釈し、１９Ｇの針を備えた１０ｍＬ滅菌シリンジ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｐｌａｓｔｉｐａｋ， Ｄｒｏｇｈｅｄａ， Ｉｒｅｌａｎｄ）を２０回通過させた。この細胞懸濁液を以下に述べるように培養した。サンプルは、患者のインフォームド・コンセントを得た上で、地元倫理委員会（Ａｚｉｅｎｄａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔａｒｉｏ－Ｏｓｐｅｄａｌｉｅｒａ， Ｐｏｌｉｃｌｉｎｉｃｏ ｄｉ Ｍｏｄｅｎａ， “Ｃｅｌｌｕｌａｒ ｔｈｅｒａｐｉｅｓ ｆｏｒ ｃａｎｃｅｒ”， ｐｒｏｔｏｃｏｌ ｃｏｄｅ ｎｒ． ３３５／ＣＥ）の承認を得て使用した。

【0071】

〈１．２ － 細胞培養法〉
ＡＴ－ＭＣおよびＥＴ－ＭＣは、２．５％ ＰＬＰ（Ｈｕｍａｎ Ｐｌａｔｅｌｅｔ Ｌｙｓａｔｅ、Ｃｏｄｅ： ＢＣ０１９００３０ Ｍａｃｏｐｈａｒｍａ Ｉｔａｌｙ ＳＲＬ、Ｍｉｌａｎ、Ｉｔａｌｙ）、２ｍＭ Ｌ－グルタミン（Ｃｏｄｅ： ＥＣＢ３０００Ｄ． Ｅｕｒｏｃｌｏｎｅ ＳｐＡ， Ｉｔａｌｙ）、１国際単位（ＩＵ）／ｍＬヘパリン（Ｃｏｄｅ： Ｈ３１４９． Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ Ｉｎｃ， ＵＳＡ）、および１０μｇ／ｍＬシプロフロキサシン（Ｃｏｄｅ： Ａ１５５７１／ＡＩＴ．Ｆｒｅｓｅｎｉｕｓ Ｋａｂｉ Ｉｔａｌｉａ Ｓｒｌ， Ｖｅｒｏｎａ， Ｉｔａｌｙ）を添加したαＭＥＭ（Ｃｏｄｅ： ２２５６１－０２１． ＧＩＢＣＯ， Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， Ｗａｌｔｈａｍ， ＭＡ， ＵＳＡ）で培養した。

【0072】

ＢＭ－ＭＣは、８％ＰＬＰ（Ｈｕｍａｎ Ｐｌａｔｅｌｅｔ Ｌｙｓａｔｅ、コード：ＢＣ０１９００３０ Ｍａｃｏｐｈａｒｍａ Ｉｔａｌｙ ＳＲＬ、ミラノ、イタリア）、２ｍＭ Ｌ－グルタミン（コード：ＥＣＢ３０００Ｄ、Ｅｕｒｏｃｌｏｎｅ ＳｐＡ、イタリア）、１ＩＵ／ｍＬヘパリン（Ｃｏｄｅ： Ｈ３１４９． Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ Ｉｎｃ， ＵＳＡ）、１０μｇ／ｍＬシプロフロキサシン（Ｃｏｄｅ： Ａ１５５７１／ＡＩＴ． Ｆｒｅｓｅｎｉｕｓ Ｋａｂｉ Ｉｔａｌｉａ Ｓｒｌ， Ｖｅｒｏｎａ， Ｉｔａｌｙ）を添加したαＭＥＭ（コード：２２５６１－０２１、ＧＩＢＣＯ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ウォルサム、マサチューセッツ州、米国）中で培養した。

【0073】

ヒト胚性腎細胞２９３Ｔは、１０％ＦＢＳ熱不活性化定義血清（Ｃｏｄｅ： ＳＨ３００７０．０３． ＨｙＣｌｏｎｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｉｒｅｓ， Ｉｎｃ， Ｌｏｇａｎ， Ｕｔａｈ， ＵＳＡ）、２ｍＭ Ｌ－グルタミン（Ｃｏｄｅ： ＥＣＢ３０００Ｄ． Ｅｕｒｏｃｌｏｎｅ ＳｐＡ， Ｉｔａｌｙ）、１％ペニシリン／ストレプトマイシン（ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ， Ｃｏｄｅ： ＭＳ００５８１００９． Ｃａｒｌｏ Ｅｒｂａ Ｒｅａｇｅｎｔｓ Ｓｒｌ， Ｃｏｒｎａｒｅｄｏ， Ｉｔａｌｙ）を添加したＤＭＥＭ （Ｃｏｄｅ： ４１９６６－０２９． ＧＩＢＣＯ， Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， Ｗａｌｔｈａｍ， ＭＡ， ＵＳＡ）で培養した。

【0074】

非病理学的腎臓から単離したヒト線維芽細胞を凍結保存細胞として入手した（Ｃｏｄｅ： Ｈ６０１６， Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ Ｉｎｃ．， ＵＳＡ）。解凍後、ベース培地に加え、以下のサプリメントＦＧＦ０．５ｍＬ、ヒドロコルチゾン０．５ｍＬ、Ｌ－グルタミン５ｍＬ、抗真菌抗生物質溶液５ｍＬ、ＦＢＳ５０ｍＬ、で構成される完全線維芽細胞培地（Ｍ２２６７ － Ｋｉｔ， Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ Ｉｎｃ．， ＵＳＡ）で培養した。容量は培養液５００ｍＬに相関する。細胞の接着能力を高めることができるゼラチンベースのコンディショニング溶液（Ｃｏｄｅ： ６９５０， Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ Ｉｎｃ， ＵＳＡ）を用いて、前処理したフラスコで３７℃、２０－３０分間細胞を培養する。

【0075】

真皮から単離したヒト線維芽細胞は、凍結保存細胞としてＡＴＣＣから入手した。解凍後、細胞は１０％ＦＢＳ（Ｃｏｄｅ： ＳＨ３００７０．０３． ＨｙＣｌｏｎｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｉｒｅｓ， Ｉｎｃ， Ｌｏｇａｎ， Ｕｔａｈ， ＵＳＡ）、２ｍＭ Ｌ－グルタミン（Ｃｏｄｅ： ＥＣＢ３０００Ｄ． Ｅｕｒｏｃｌｏｎｅ ＳｐＡ， Ｉｔａｌｙ）、１％ペニシリン／ストレプトマイシン（ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ， Ｃｏｄｅ： ＭＳ００５８１００９． Ｃａｒｌｏ Ｅｒｂａ Ｒｅａｇｅｎｔｓ Ｓｒｌ， Ｃｏｒｎａｒｅｄｏ， Ｉｔａｌｙ）を添加したＤＭＥＭ（Ｃｏｄｅ： ４１９６６－０２９． ＧＩＢＣＯ， Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， Ｗａｌｔｈａｍ， ＭＡ， ＵＳＡ）で培養した。

【0076】

特発性肺線維症由来のヒト肺線維芽細胞は、継代２で凍結バイアル（Ｃａｔ： ＣＣ－７２３１； Ｌｏｎｚａ Ｇｒｏｕｐ Ｌｔｄ．）で入手した（以下、ＣＣ７２３１と呼ぶ）。

【0077】

特発性肺線維症由来の肥大線維芽細胞は、腎臓の肥大線維芽細胞とは異なり、市販されているため、また、後者と線維化プロセスの根幹にある生物学的メカニズムとデコリン（ＴＧＦβ； Ｏｎｇ ＣＨら、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ、２０２１年）の標的が同じであるため、研究の標的細胞として選択された。

【0078】

受領後、１０％熱不活性化ＦＢＳ（Ｃｏｄｅ： ＳＨ３００７０．０３． ＨｙＣｌｏｎｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｉｒｅｓ， Ｉｎｃ， Ｌｏｇａｎ， Ｕｔａｈ， ＵＳＡ）、２ｍＭ Ｌ－グルタミン（Ｃｏｄｅ： ＥＣＢ３０００Ｄ． Ｅｕｒｏｃｌｏｎｅ ＳｐＡ， イタリア）、１％ ペニシリン／ストレプトマイシン（ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ， Ｃｏｄｅ： ＭＳ００５８１００９． Ｃａｒｌｏ Ｅｒｂａ Ｒｅａｇｅｎｔｓ Ｓｒｌ， Ｃｏｒｎａｒｅｄｏ， イタリア）を添加したＤＭＥＭ（Ｃｏｄｅ： ４１９６６－０２９． ＧＩＢＣＯ， Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， Ｗａｌｔｈａｍ， ＭＡ， ＵＳＡ）で解凍し、２５００／ｃｍ２の密度で播種し、以下の培地Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ（商標） ＦＧＭ（商標）－２ ＢｕｌｌｅｔＫｉｔ（商標） （Ｃａｔ： ＣＣ－３１３２； Ｌｏｎｚａ Ｇｒｏｕｐ Ｌｔｄ．）で培養した。

【0079】

〈１．３ － ウイルスの産生とＭＣへの感染〉
２９３Ｔ細胞は、発現ベクターとヘルパープラスミドの組み合わせ：ウイルスベクター（ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｅｄ ｂｙ ＯｒｉＧｅｎｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．）を用いて、トランスフェクション試薬ＪｅｔＰＥＩ ＤＮＡ（Ｃｏｄｅ １０１－４０Ｎ． Ｐｏｌｙｐｌｕｓ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ， Ｉｌｌｋｉｒｃｈ， Ｆｒａｎｃｅ）を用いてトランスフェクションされた。

【0080】

トランスフェクトされた２９３Ｔから産生されたレトロウイルス上清１ｍＬに、６μｇ／ｍＬのポリブレン（Ｃｏｄｅ ＴＲ１００３． Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ Ｉｎｃ． ＵＳＡ）を加え、４５０００／ｃｍ^２のＥＴ－ＭＣおよびＡＴ－ＭＣを初期継代（ｐ２／ｐ４）で形質導入した。感染は２回繰り返され、その後、ピューロマイシン２μｇ／ｍＬ中で細胞増殖と選択が行われた。
ウイルス上清は新鮮なまま、あるいは－８０℃で凍結して使用した。

【0081】

〈１．４ － サイトフルオロメーター分析〉
野生型および形質転換ＥＴ－ＭＣとＡＴ－ＭＣのＭＹＫの細胞内染色は、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ Ｋｉｔ（コード：５５４７１４、ＢＤ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ、ＮＪ、ＵＳＡ）を用いて行った。

【0082】

ＭＹＫ発現を評価するため、ＭＣを一次抗体マウス抗ヒトＭＹＫ（Ｃｏｄｅ： ＴＡ１５０１２１， ＯｒｉＧｅｎｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．）で標識し、二次抗体ＡＰＣヤギ抗マウスＩｇ（ＡＰＣ Ｇｏａｔ ＡｎｔｉＭｏｕｓｅ Ｉｇ ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ； Ｃｏｄｅ： ５５０８２６． ＢＤ， Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ， ＮＪ， ＵＳＡ）で標識した。

【0083】

ＨＬＡ－Ｇ発現を評価するために、ＥＴ－ＭＣを一次抗ＨＬＡ－Ｇ ＦＩＴＣ標識モノクローナル抗体（ＭｏＡｂ） （８７Ｇ， Ｅｘｂｉｏ， Ｐｒａｈａ， Ｃｚｅｃｈ Ｒｅｐｕｂｌｉｃ） ＡＰＣヤギ抗マウスＩｇ（ＡＰＣ Ｇｏａｔ ＡｎｔｉＭｏｕｓｅ Ｉｇ ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ； Ｃｏｄ：５５０８２６． ＢＤ， Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ， ＮＪ， ＵＳＡ）で標識した。

【0084】

データはＦＡＣＳ Ａｒｉａ ＩＩＩ（ＢＤ）フローサイトメーターを用いて収集し、ＦＡＣＳ Ｄｉｖａソフトウェア（ＢＤ）を用いて解析した。

【0085】

［２ － 分子生物学］
ＴＲＩｚｏｌ（商標） （Ｃｏｄｅ： １５５９６０２６． Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＭＮ， ＵＳＡ）を用い、使用説明書に従って全ＲＮＡを単離した。

【0086】

その後、ＲｅｖｅｒｔＡｉｄ Ｈ ｍｉｎｕｓ ｆｉｒｓｔ－ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ （Ｃｏｄｅ： Ｋ１６２２． Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ， Ｗａｌｔｈａｍ， ＭＡ， ＵＳＡ）というキットを用いて、２μｇの全ＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。

【0087】

ｃＤＮＡは分光光度計（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ ＤＵ（商標） ７３０， Ｐａｓａｄｅｎａ， ＣＡ， ＵＳＡ）を用いて定量した。

【0088】

定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ－ＰＣＲ）は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＳｔｅｐＯｎｅ（商標） Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍと試薬Ｆａｓｔ ＳＹＢＲ（商標） Ｇｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘを用いて行った。

【0089】

ｑＲＴ－ＰＣＲ反応（１０μｌ）は、５０ｎｇ ｃＤＮＡ、Ｆａｓｔ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｃｏｄｅ： ４３８５６１２、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ、ＵＳＡ）、および３００ｎＭのフォワードプライマーとリバースプライマーからなる。

【0090】

それぞれのプライマーの配列は表１に記載されている。
標的遺伝子の相対発現量は、対照遺伝子としてヒトβ－アクチンとＧＡＰＤＨ遺伝子を用い、２－ΔΔＣｔ法により算出した。

【0091】

【表1】

【0092】

〈２．１ － ＥＬＩＳＡアッセイ〉
ＥＴ－ＭＣｓおよびＡＴ－ＭＣｓサンプル中のＤＣＮ Ａのレベルは、Ｄｕｏ Ｓｅｔ Ｅｌｉｓａ ｋｉｔ（ＤＹ１４３． Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ， ６１４ ＭｃＫｉｎｌｅｙ Ｐｌａｃｅ ＮＥ， Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ， ＭＮ， ＵＳＡ）を用いて、使用説明書に従って測定した。このアッセイは、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ法）に基づいている。

【0093】

〈２．２ － 遊走アッセイ〉
１日目に、ＥＴ－ＭＣを２４ウェルのプレートに１００００／ｃｍ^２の濃度で培養液に播種した（各条件につき３ウェル）。

【0094】

ＣＣ－７２３１は、１００００／ｃｍ^２（各条件３ウェル）の密度で、熱で不活化したＮｕＳｅｒｕｍ（商標）ＩＶ 培養サプリメント（Ｃｏｄｅ：３５５１０４，ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）２．５％、Ｌ－グルタミン（Ｃｏｄｅ：ＥＣＢ３０００Ｄ．Ｅｕｒｏｃｌｏｎｅ ＳｐＡ， Ｉｔａｌｙ）２ｍＭ、ペニシリン／ストレプトマイシン（ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ，Ｃｏｄｅ：ＭＳ００５８１００９． Ｃａｒｌｏ Ｅｒｂａ Ｒｅａｇｅｎｔｓ Ｓｒｌ，Ｃｏｒｎａｒｅｄｏ，Ｉｔａｌｙ）１％を含むＤＭＥＭ（Ｃｏｄｅ：４１９６６－０２９．ＧＩＢＣＯ，Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）のＴｒａｎｓｗｅｌｌ Ｐｅｒｍｅａｂｌｅ Ｓｕｐｐｏｒｔ（Ｃｏｄｅ：３４２２，Ｃｏｓｔａｒ Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ，ＵＳＡ）上に播種された。

【0095】

４日目に支持体を取り出し、ＤＰＢＳ １Ｘ（Ｃｏｄｅ：１４１９０－０９４、Ｇｉｂｃｏ）で洗浄した後、冷メタノールで固定した。固定後、蒸留水でさらに洗浄し、移動していない細胞の層をバッファーで除去し、残ったものをクリスタルバイオレット０．４％（Ｃｏｄｅ：Ｃ００７５ Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）で染色した。蒸留水でさらに洗浄した後、顕微鏡で観察し、手動でカウントする前に乾燥させた。

【0096】

〈２．３ － 増殖アッセイ〉
密度 １００００／ｃｍ^２（各条件につき６ウェル）のＣＣ－７２３１を、熱で不活化した２．５％ＮｕＳｅｒｕｍ（商標）ＩＶ 培養サプリメント（コード：３５５１０４、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、２ｍＭＬ－グルタミン（コード：ＥＣＢ３０００Ｄ、Ｅｕｒｏｃｌｏｎｅ ＳｐＡ、イタリア）、および１％ペニシリン／ストレプトマイシン（ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ、コード：ＭＳ００５８１００９、Ｃａｒｌｏ Ｅｒｂａ Ｒｅａｇｅｎｔｓ Ｓｒｌ、イタリア、コルナレド）を含むＤＭＥＭ（コード：４１９６６－０２９、ＧＩＢＣＯ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国マサチューセッツ州ウォルサム）で２４ウェルのプレートに播種した。

【0097】

ＥＴ－ＭＣと特発性線維症の線維芽細胞を１：１の割合で共培養した。詳細には、ＥＴ－ＭＣをＭＷウェルの底に播種し、線維芽細胞をＥＴ－ＭＣ培養物の上に設置したトランスウェルに播種した。トランスウェルは３ｕｍの多孔度を持ち、培地とそこに含まれる溶質の交換が可能である。このようにして得られた共培養は４８時間継続され、その後、細胞が溶解され、使用説明書に従ってトリゾール（コード：１５５９６０２６、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国ミネソタ州カールスバッド）でＲＮＡが抽出された。

【0098】

その後、ＲｅｖｅｒｔＡｉｄ Ｈ ｍｉｎｕｓ ｆｉｒｓｔ－ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ （Ｃｏｄｅ：Ｋ１６２２．Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ， ＭＡ，ＵＳＡ）というキットを用いて、２μｇの全ＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。

【0099】

ｃＤＮＡは分光光度計（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ ＤＵ（商標） ７３０， Ｐａｓａｄｅｎａ， ＣＡ， ＵＳＡ）を用いて定量した。

【0100】

定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ－ＰＣＲ）は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＳｔｅｐＯｎｅ（商標） Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍと試薬Ｆａｓｔ ＳＹＢＲ（商標） Ｇｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘを用いて行った。

【0101】

ｑＲＴ－ＰＣＲ反応（１０μｌ）は、５０ｎｇのｃＤＮＡ、Ｆａｓｔ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（コード：４３８５６１２、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ、ＵＳＡ）、およびＫｉ－６７遺伝子のフォワードプライマーとリバースプライマー３００ｎＭから構成される。

【0102】

［３ － ａＳＭＡ発現の評価アッセイ］
ＣＣ－７２３１を１００００／ｃｍ^２の密度（各条件につき６ウェル）で、熱で不活化した２．５％ＮｕＳｅｒｕｍ（商標） ＩＶ培養サプリメント（Ｃｏｄｅ：３５５１０４、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、２ｍＭ Ｌ－グルタミン（Ｃｏｄｅ：ＥＣＢ３０００Ｄ、Ｅｕｒｏｃｌｏｎｅ ＳｐＡ、Ｉｔａｌｙ）、および１％ペニシリン／ストレプトマイシン（ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ、Ｃｏｄｅ：ＭＳ００５８１００９、Ｃａｒｌｏ Ｅｒｂａ Ｒｅａｇｅｎｔｓ Ｓｒｌ、Ｃｏｒｎａｒｅｄｏ，Ｉｔａｌｙ）を含むＤＭＥＭ（Ｃｏｄｅ：４１９６６－０２９．ＧＩＢＣＯ，Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）で２４ウェルのプレートに播種した。

【0103】

ＥＴ－ＭＣと特発性線維症由来の線維芽細胞を１：１の割合で共培養した。詳細には、ＥＴ－ＭＣをＭＷウェルの底に播種し、線維芽細胞をＥＴ－ＭＣ培養物の上に設置したトランスウェルに播種した。このトランスウェルは、培地とそこに含まれる溶質の交換を可能にする３ミクロンの多孔度を備えている。培養２４時間および４８時間後、細胞を溶解し、ＴＲＩＺＯＬでＲＮＡを抽出した。

【0104】

続いて、ＲｅｖｅｒｔＡｉｄ Ｈ ｍｉｎｕｓ ｆｉｒｓｔ－ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ （Ｃｏｄｅ： Ｋ１６２２． Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ， Ｗａｌｔｈａｍ， ＭＡ， ＵＳＡ）というキットを用いて、２μｇの全ＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。

【0105】

ｃＤＮＡは分光光度計（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ ＤＵ（商標） ７３０， Ｐａｓａｄｅｎａ， ＣＡ， ＵＳＡ）を用いて定量した。

【0106】

定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ－ＰＣＲ）は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＳｔｅｐＯｎｅ（商標） Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲシステムと試薬Ｆａｓｔ ＳＹＢＲ（商標） Ｇｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘを用いて行った。

【0107】

ｑＲＴ－ＰＣＲ反応（１０μｌ）は、５０ｎｇのｃＤＮＡ、Ｆａｓｔ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｃｏｄｅ：４３８５６１２．Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ，ＵＳＡ）、およびａＳＭＡ遺伝子のフォワードプライマーとリバースプライマー３００ｎＭから構成される。

【0108】

［４ － バイオプリンティング技術による線維症のバイオミメティック３ＤモデルのＳＥＭ顕微鏡分析］
バイオプリンティングによって得られたバイオミメティックモデルは、真皮または腎臓から単離した線維芽細胞を天然由来の３次元マトリックス中で増殖させたものである。分析は、ＳＥＭ（ＴＭ４０００ Ｐｌｕｓ ＩＩ、卓上顕微鏡、株式会社日立テクノロジー、日本）を用いて行った。電子ビームと検査対象試料の原子との相互作用により、非常に高倍率の画像を生成し、組織の微細構造の変化を分析することができる。顕微鏡写真は、電子ビームの加速電圧１０ｋＶ、中真空条件下で、二次電子検出器を用いて１０００倍の倍率で得られた。

【0109】

［５ － フィブロネクチンの免疫蛍光（ＩＦ）反応］
パラフィンに包埋したバイオミメティックモデルをミクロトーム処理し、厚さ４ミクロンの切片に切り出した。３７℃で乾燥させた後、切片は脱パラフィンされ、濃度を高めたアルコールに段階的に通して再水和された。クエン酸（Ｃｏｄｅ：４０３７２７，Ｃａｒｌｏ Ｅｒｂａ Ｒｅａｇｅｎｔｓ ｓｐａ，Ａｒｅｓｅ，Ｍｉｌａｎ）によるアンマスキング後、切片を、１：１００の濃度の抗フィブロネクチン一次抗体（コード：ａｂ２４１３、Ａｂｃａｍ）とともに室温で１時間インキュベートし、次に１：７００の濃度のロバ抗ウサギ二次抗体ＩｇＧ－ｈ＋Ｉ Ｄｙｌｉｇｈｔ ５９４ 結合抗ウサギ（コード：Ａ１２０－１０８Ｄ４、Ｂｅｔｈｙｌ）とともに室温で１時間インキュベートした。核は、色素ＤＡＰＩ（Ｃｏｄｅ： １０２３６２７６００１， Ｒｏｃｈｅ）で１：２００の濃度で５分間、周囲温度で染色した。その後、切片を緩衝グリセリンにマウントした。解析は、ＡｘｉｏＺｏｏｍ Ｖ１６顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ）を用い、１倍の対物レンズ（Ｐｌａｎ ＮｅｏＦｌｕａｒ Ｚ １ｘ／０．２５ ＦＷＤ ５３．１ｍｍ、Ｚｅｉｓｓ）と１８０倍のデジタル倍率で行った。

【0110】

シグナルの定量はＺＥＮ Ｐｒｏ ＺｅｉｓｓソフトウェアのＩｍａｇｅＡｎａｌｙｓｉｓプラグインで行った。

【0111】

分析結果は、ネガティブコントロールを１００％の発現と見なし、μｍ^２で表され、パーセンテージとして報告した。

【0112】

［６ － 結果］
ＤＣＮ Ａの遺伝子は、ピューロマイシンの遺伝子も挿入されたバイシストロニックウイルスベクターにクローニングされた（ＯｒｉＧｅｎｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ． ＮＭ＿００１９２０）。

【0113】

図１に示されている、遺伝子を内部に持つウイルスベクター（この場合はレンチウイルス型が好ましいが、これに限定されるわけではない）を、大量の目的ＤＮＡを生成できる細菌で増幅し、エンプティベクターをネガティブコントロールとして使用した。

【0114】

細菌産物を精製し、その後、レンチウイルスベクターに挿入された遺伝子配列の特徴を明らかにするために塩基配列を決定した。配列解析の結果、増幅の段階で変異が起こっていないことが確認された。

【0115】

治療標的を運ぶための正しいＭＣの供給源を特定するために、脂肪組織（ＡＴ）、骨髄（ＢＭ）、子宮内膜組織（ＥＴ）からＭＣを分離し、各供給源から２人のドナーを分離した。

【0116】

分離後、ＡＴ－ＭＣ、ＢＭ－ＭＣ、ＥＴ－ＭＣ野生型細胞によって生理的に産生されたデコリンアイソフォームＡの量を、図２に示すように、各細胞タイプについて２人のドナーから採取した上清において、異なる時間（２４時間、４８時間、７２時間）の初期継代（Ｐ２）で分析した。

【0117】

ＡＴ－ＭＣは、２２０８５～９９７７４ｐｇ／ｍＬの範囲で最大量のＤＣＮ Ａを分泌することが示された。

【0118】

対照的に、ＥＴ－ＭＣは低量のＤＣＮ Ａを分泌し、その範囲は２０６から６８８ｐｇ／ｍＬで、ＡＴ－ＭＣの３０倍以上少ない。

【0119】

ＢＭ－ＭＣは、前述べたＤＣＮ Ａの供給源の中間の量を分泌することが示されており、その値は１９４２５～２４８６３ｐｇ／ｍＬの範囲で変化する。

【0120】

これらのデータは、当業者にとって予測不可能であることが証明された。というのも、本発明に至るまで、ＭＣにおけるＤＣＮ Ａの分泌が明確に刺激されたことはなく、文献や以前の文献によって、直接的または間接的に当業者に示唆されたこともなかったからである。

【0121】

［７ － 子宮内膜間葉細胞（ＥＴ－ＭＣ）］
ＭＣおよび配列決定されたバイシストロニックベクターによるＤＣＮ Ａの既知の基礎分泌（これまでに分析されたソースの中で最も低い）から開始して、３人のＥＴ－ＭＣドナーが感染した。

【0122】

感染後のＥＴ－ＭＣを精製し、ＤＣＮ Ａについて完全に純粋な集団を得るために、細胞をピューロマイシンで９６時間選択した。

【0123】

細胞を選択するための用量は、抗生物質の０．５μｇ／ｍＬから５μｇ／ｍＬの範囲で最適化した。

【0124】

ＤＣＮ Ａベクターによる感染効率を検証し定量化するために、プラスミドに挿入されＤＣＮ Ａ遺伝子の発現と相関するシグナル配列であるＭＹＫに対するＥＴ－ＭＣの陽性度について分析した。

【0125】

このシグナル配列により、改変細胞で誘導されたタンパク質の量を評価することができ、内在性のものと区別することができる。

【0126】

ＤＣＮ Ａを発現するように誘導されたＥＴ－ＭＣのドナーは、エンプティベクターを発現するコントロールと比較して８９．５％の陽性率を示し、したがって良好な感染効率を示した（図３Ａ、３Ｂ）。

【0127】

感染したＥＴ－ＭＣにおけるＤＣＮ Ａ遺伝子の発現を定量化するために、それらのｍ－ＲＮＡを収集し、ｃＤＮＡに再転写し、ＲＴ－ＰＣＲによって解析した。

【0128】

図４は、感染後のサンプルにおいてＤＣＮ Ａの遺伝子がいかに過剰発現しているかを示しており、対応する発現量（ＲＱ．ＥＴ－ＭＣｓ）は、エンプティベクター対照と比較して３２．３８±１０．４５倍高くなっていた。

【0129】

エンプティベクターＥＴ－ＭＣｓまたはＤＣＮ Ａを感染させたＥＴ－ＭＣｓが培地に放出するタンパク質の量を比較するためにＥＬＩＳＡアッセイを行った。

【0130】

図５に示すように、培養液中に放出されたアイソフォームＡの量は、感染ＥＴ－ＭＣｓとエンプティベクターの差が２３０倍に達するまで増加した。

【0131】

さらに、ＥＴ－ＭＣ細胞によるＨＬＡ－Ｇの同時産生をＦＡＣＳ分析によって評価した。実施された分析から、デコリンで改変されたＥＴ－ＭＣ細胞は、ＥＴ－ＭＣエンプティベクターと比較してより大きな割合でＨＬＡ－Ｇのレベルを発現することが推論された。

【0132】

［８ － 脂肪組織由来の間葉系細胞（ＡＴ－ＭＣ）］
ＭＣと配列決定されたバイシストロンベクターによるＤＣＮ Ａの、既知の基礎分泌量（以前に分析されたソースの中で最も高い）から出発して、ＡＴ－ＭＣの２つのドナーを感染させた。

【0133】

感染後のＡＴ－ＭＣを精製し、ＤＣＮ Ａについて完全に純粋な集団を得るために、細胞をピューロマイシンで９６時間選択した。

【0134】

細胞を選択する用量は、抗生物質の０．５μｇ／ｍＬから５μｇ／ｍＬの範囲で最適化した。

【0135】

ＤＣＮ Ａベクターによる感染効率を検証し定量化するために、ＡＴ－ＭＣをプラスミドに挿入されたシグナル配列であるＭＹＫに対する陽性度を分析し、ＤＣＮ Ａ遺伝子の発現と相関させた。

【0136】

このシグナル配列により、改変細胞で誘導されたタンパク質の量を評価することができ、内在性のものと区別することができる。

【0137】

ＤＣＮ Ａを発現するように誘導されたＡＴ－ＭＣのドナーは、エンプティベクターを発現するコントロールと比較して５４．５％の陽性率を示し、したがって良好な感染効率を示している（図６Ａ－６Ｂ）。

【0138】

形質導入されたＡＴ－ＭＣにおけるデコリンアイソフォームＡ遺伝子の発現を定量化するために、それらのｍ－ＲＮＡを収集し、ｃＤＮＡに再転写し、ＲＴ－ＰＣＲによって解析した。

【0139】

図７は、感染後のサンプルにおいてＤＣＮ Ａの遺伝子がどのように過剰発現しているかを示しており、対応する発現（ＲＱ．ＡＴ－ＭＣｓ）は、エンプティベクター対照と比較して３．０５±１．１４倍高い。

【0140】

ＥＬＩＳＡアッセイは、エンプティベクターＡＴ－ＭＣｓまたはＤＣＮ Ａを感染させたＡＴ－ＭＣｓによって培地中に放出されたタンパク質の量を比較するために行った。

【0141】

図８に示すように、培養液中に放出されたデコリンアイソフォームＡの量は、上述のＥＴ－ＭＣの改変後に到達する絶対量には達していないにもかかわらず、統計的に有意な方法で増加している。この現象は、ＡＴ－ＭＣのすでに高い基礎分泌（他のソースから分離された ＭＣ の基礎分泌と比較して）によって引き起こされた可能性があり、これが対象のベクターによって誘導されたタンパク質の生成および／または安定性を妨げる。

【0142】

ＥＴ－ＭＣと前述のＤＣＮ Ａを改変したＡＴ－ＭＣ間の分泌タンパク質の絶対量の違いを検証し、ＥＴ－ＭＣがより多くのＤＣＮ Ａ（ｐｇ／ｍＬで表した値）を産生できることを確認した後、ＥＴ－ＭＣによって産生されたＤＣＮ Ａの標的細胞、すなわち肥大線維芽細胞に対する有効性を評価した。

【0143】

［９ － 機能研究］
特発性肺線維症由来の肥大線維芽細胞は、腎臓の肥大線維芽細胞とは異なり市販されており、また、線維化プロセスの根底にある生物学的メカニズムとＤＣＮ Ａの同じ標的であるＴＧＦβを共有しているため、研究の標的細胞として選択した（Ｏｎｇ ＣＨら、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ、２０２１年）。

【0144】

増殖後、肥大化した線維芽細胞を、ＤＣＮ Ａを発現するように改変したＥＴ－ＭＣまたはエンプティベクターの存在下で、移動および増殖する能力について分析した。

【0145】

ＥＴ－ＭＣをプレートに播種し、その上に線維芽細胞を、上記の研究のために開発したグリッドに播種して４８時間後に行った移動試験では、ＥＴ－ＭＣなしで培養したＣＣ－７２３１の移動能力がほとんどゼロであることが示された。エンプティベクターのＥＴ－ＭＣで培養すると、培地中に放出される因子によって移動能が増加するが、ＤＣＮ Ａを発現しているＥＴ－ＭＣで培養すると、調べたすべてのドナーで移動能が半減した。一つの仮説は、線維芽細胞がＥＴ－ＭＣに引き寄せられるのは、線維化プロセスにおける線維芽細胞の移動の主要な活性化因子の１つであるＴＧＦβによる活性化を含む化学誘引因子がＥＴ－ＭＣから放出されるおかげである、というものである（Ｆｒａｎｇｏｇｉａｎｎｉｓ ＮＧ 他 Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ． ２０２０）。しかしこの現象は、ＤＣＮ Ａを放出するＥＴ－ＭＣの存在下で減速される。これは、ＤＣＮ ＡがＴＧＦβと結合することで、そのレセプターとの結合を阻止し、図９に示すように、移動する線維芽細胞の数を減少させるからである。

【0146】

肥大線維芽細胞（ＣＣ－７２３１）の増殖に関する研究は、エンプティベクターＥＴ－ＭＣとデコリンを発現するＥＴ－ＭＣを１：１の割合で共培養することによって行った。

【0147】

図１０は、コントロールとして示した線維芽細胞の培養で標準化したＫｉ－６７遺伝子の発現レベルを示す。このデータから、培養液のみで表されるコントロールと比較すると、エンプティベクターＥＴ－ＭＣとの共培養では、ＫＩ６７遺伝子の統計的に有意な増加が観察され、ＭＣから放出される因子による増殖刺激が示された。デコリンで改変したＥＴ－ＭＣとの共培養では、この増殖刺激はかなり減少した。この生物学的反応は、細胞培養の維持に使用された特定の培養液中で利用可能なＴＧＦβが減少したことに起因すると考えられる。これは、改変されたＥＴ－ＭＣによって分泌されたデコリンとの以前の結合により、受容体との結合が欠如しているためである。得られた結果は、増殖と移動を減らす上でデコリンが役割を果たしていることを示唆している。

【0148】

最後に、線維芽細胞による筋線維芽細胞の活性化の優れたマーカーであるａＳＭＡ遺伝子の発現が評価された。線維芽細胞による活性化は線維症の典型的な表現型であり、収縮能力を持つ細胞が細胞外マトリックスを分泌して病理像を悪化させる（Ｋｕｈｎ ａｎｄ ＭｃＤｏｎａｌｄ， Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ １９９１； Ｆｌａｈｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｒｅｓｐｉｒ． Ｃｒｉｔ． Ｃａｒｅ Ｍｅｄ． ２００３； Ｗｈｉｔｅら、Ｊ． Ｐａｔｈｏｌ． ２００３； Ｈｉｎｚ， Ｐｒｏｃ． Ａｍ． Ｔｈｏｒａｃ． Ｓｏｃ ２０１２）。

【0149】

特発性線維芽細胞ＣＣ－７２３１とエンプティベクターＥＴ－ＭＣおよびデコリン発現ＥＴ－ＭＣを１：１の割合で共培養した後の、図１１に示すａＳＭＡ遺伝子の発現に関する結果は、改変ＭＣの役割を強調している。共培養の２４時間と４８時間の両方で、ａＳＭＡの発現の統計的に有意な減少が、デコリンを発現するＥＴ－ＭＣと共培養した線維芽細胞で観察された。

【0150】

この結果は、デコリンの役割による肥大線維芽細胞の活性化状態の減少を示している。

【0151】

特発性肺線維症から単離した市販の線維芽細胞におけるデコリンの役割に関する証拠を集めたので、健常および線維化真皮、健常および線維化腎間質組織のバイオミメティックマトリックスに対する影響を評価したいと考えた。

【0152】

印刷技術により、線維芽細胞（真皮と腎臓の両方から単離された）は、線維化病態を模倣できる三次元マトリックスに浸された（図１２）。未処理のモデル (CNTRL) は、豊富な細胞外マトリックスによってコラーゲン原線維がカプセル化された、緻密でコンパクトな表面を示す（左列）。エンプティベクターを含むＥＴ－ＭＣから得られた上清は、コラーゲン原線維の部分的なリモデリングと細胞外マトリックスの堆積の悪さを特徴とする固体表面をモデルに与える。一方、デコリンを発現しているＥＴ－ＭＣから得られた上清は、細胞外マトリックスのない印刷組織の密度を著しく低下させ、フィブリルはより細く断片化して見える。

【0153】

図１３は、線維症のさらなる指標として、真皮由来の線維芽細胞を用いて得られた三次元モデルにおけるフィブロネクチンタンパク質の免疫蛍光検出を示している（Ｏ’Ｃｏｎｎｅｌｌ ｅｔ ａｌ Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ： Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｃｏｎｃｅｐｔｓ ｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ， Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ ２０１２）。

【0154】

フィブロネクチンの存在に関連するシグナルの強度と局在は、ＣＮＴＲＬの症例では特に強い。逆に、ＭＣの上清で刺激した症例では、このタンパク質はほとんど存在しない。

【0155】

特に、デコリンを過剰発現しているＥＴ－ＭＣの上清でモデルを刺激した場合に、発現レベルが最も低いことが観察された。

【0156】

染色の定量化により、ＥＴ－ＭＣおよびデコリンを発現しているＥＴ－ＭＣから得られた上清で処理した症例では、コントロールの症例と比較して、フィブロネクチン発現レベルが統計的に有意に低下していることが確認された（ｐ値＜０．０５）。デコリンを発現しているＥＴ－ＭＣから採取した上清で処理したバイオミメティックモデルは、対照例と比較してだけでなく、ＥＴ－ＭＣとの関係においても有意に低い発現レベルを示した。

【0157】

腎線維芽細胞で得られた三次元モデルについても、同様の解析を行った。

【0158】

図１４では、蛍光（赤）がモデル中のフィブロネクチンタンパク質の存在を示している。

【0159】

フィブロネクチンの存在に関連したシグナルの強度と局在は、ＣＮＴＲＬのケースで特に強い。対照的に、エンプティベクターを含むＥＴ－ＭＣの上清およびデコリンを過剰発現するＥＴ－ＭＣで処理したケースでは、タンパク質はほとんど存在しない。画像解析プラグイン（ＺＥＮ ＰＲＯ、Ｚｅｉｓｓ）を用いた染色の定量化により、エンプティベクターを用いたＥＴ－ＭＣの上清で処理した症例とデコリンを過剰発現させたＥＴ－ＭＣで処理した症例では、フィブロネクチンの発現レベルが統計的に有意に減少していることが確認された（ｐ値＜０．０５）。詳細には、デコリンを過剰発現させたＥＴ－ＭＣの上清で処理した症例は、コントロールの症例と比較してだけでなく、エンプティベクターでＥＴ－ＭＣの上清で処理した症例と比較しても、発現レベルが有意に低下している。

【0160】

図１５では、ＨＬＡ－ＧをＥＤＴ－ＭＣエンプティベクターとデコリンを発現するように改変したＥＤＴ－ＭＣの両方で試験した。試験は、ＦＩＴＣまたはＡＰＣ結合抗ＨＬＡ－Ｇモノクローナル抗体を用いてＦＡＣＳで行った。２つの異なるＭＣドナーが検討された。図からわかるように、すべてのサンプルはデコリン遺伝子の改変に関連した差異（ｐ＞０．０５）なしにＨＬＡ－Ｇを発現していた。

【0161】

［１０ － 結論］
本発明によれば、異なる供給源に由来するＭＣによるＤＣＮ Ａの内因性分泌が調査された。
それぞれの供給源は、異なるレベルのタンパク質を分泌することが示され、これらのうちＥＴ－ＭＣは弱く分泌する細胞として、ＡＴ－ＭＣは同定されたデコイ受容体を強く分泌する細胞として選択され、遺伝子改変が細胞自体に与える効果をよりよく理解することができた。
ＤＣＮ Ａとピューロマイシンの遺伝子を含むウイルスベクターによる感染方法を最適化し、効率的な感染を実現した。

【0162】

感染後のＭＣは、苦しみの徴候、形態の変化、および/またはＭＣの典型的なマーカーの発現の変化を示さなかった。

【0163】

Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ－ＰＣＲによる遺伝子の定量化、およびサイトフルオロメーター分析によるシグナル配列の定量化のプロトコルが最適化され、ＤＣＮ Ａ遺伝子の増加が証明された。

【0164】

タンパク質の分泌はＥＬＩＳＡアッセイによって証明され、ＤＣＮ Ａを産生するように誘導されたＭＣにおける放出の増加を示し、ＤＣＮ Ａ遺伝子のより大きな発現を示す分子分析によって得られたデータ、およびＤＣＮ Ａを発現するように誘導されたＭＣがエンプティベクターを持つＭＣと比較して陽性の増加を示すサイトフルオロメーター分析によって得られたデータを確認した。

【0165】

さらに、ＭＣの異なる供給源間で実施された比較により、サイトフルオロメーター分析によりＭＹＣシグナル配列に対してより高い陽性性を示し、ｍＲＮＡの発現がより増加し、その結果、分泌されるタンパク質の量が増加するＥＴ－ＭＣが最良の供給源として選択された。このような理由から、ＥＴ－ＭＣは、本発明で実施可能な細胞治療および遺伝子治療のアプローチで発現される本発明の目的に最適な担体である。

【0166】

線維化環境における改変ＥＴ－ＭＣの機能性を検証するために、共培養モデルをデザインし、増殖能、移動能力、代謝活性を評価した。

【0167】

特発性肺線維症由来の市販の肥大線維芽細胞を、改変ＥＴ－ＭＣ（空のウイルスベクターまたはＤＣＮ Ａを発現）と培養した。この共培養は、ＥＴ－ＭＣと関連する増殖性・線維化促進性表現型への影響を観察し、放出されたＴＧＦβデコイが細胞増殖、移動、代謝活性などの細胞挙動に及ぼす機能性を評価するために行われた。

【0168】

改変されたＥＴ－ＭＣによって生成されるＤＣＮ Ａタンパク質は、線維性線維芽細胞の増殖、線維芽細胞の移動、生体内での線維化プロセスにおける基本的なイベントを妨害するだけでなく、線維芽細胞の代謝活動も妨害する。

【0169】

さらに、驚くべきことに、ＴＧＦ－βの遮断は、ＴＧＦ－βを増殖因子として使用することが知られているＭＣのレベルでは損傷を引き起こさず、生体外でのＭＣの性能に損傷を与えない。

【0170】

当業者であれば、本発明に記載の改変剤で改変されたＭＣを製造する方法およびその方法で得られた改変ＭＣは、非限定的な例として、腎線維症、心臓線維症、肝線維症、肺線維症、または関節、骨髄、脳、眼、腸、腹膜および後腹膜、膵臓および皮膚などの他の組織および器官に生じる線維症の治療にも使用できることを理解するであろう。

【0171】

実際には、本発明が意図した目的を達成することが判明している。考案された本発明は、修正および変形が可能であり、そのすべてが本発明の概念の範囲内にある。さらに、すべての細部を他の技術的に同等な要素に置き換えることができる。実際の実施において、使用される材料、ならびにそれらの形状およびサイズは、要求に応じてどのようなものであってもよく、それによって以下の特許請求の範囲の保護範囲から逸脱することはない。

【図1】

【図2】

【図3A】

【図3B】

【図4】

【図5】

【図6A】

【図6B】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【配列表】

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【国際調査報告】