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特表2024-546923Ｐ５３腫瘍抗原を標的とするＭＡＮＡＢＯＤＹ及び使用方法

書誌要約請求の範囲詳細な説明課題実施例実施するための形態図面の説明

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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-12-26

(54)【発明の名称】Ｐ５３腫瘍抗原を標的とするＭＡＮＡＢＯＤＹ及び使用方法

(51)【国際特許分類】

C07K 16/30 20060101AFI20241219BHJP

C07K 16/46 20060101ALI20241219BHJP

C07K 16/28 20060101ALI20241219BHJP

C12N 15/13 20060101ALI20241219BHJP

A61P 35/00 20060101ALI20241219BHJP

A61P 35/02 20060101ALI20241219BHJP

A61K 47/65 20170101ALI20241219BHJP

A61K 39/395 20060101ALI20241219BHJP

【ＦＩ】

C07K16/30 ZNA

C07K16/46

C07K16/28

C12N15/13

A61P35/00

A61P35/02

A61K47/65

A61K39/395 E

A61K39/395 T

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024535795

(86)(22)【出願日】2022-12-15

(85)【翻訳文提出日】2024-07-25

(86)【国際出願番号】 US2022053065

(87)【国際公開番号】W WO2023114430

(87)【国際公開日】2023-06-22

(31)【優先権主張番号】63/290,353

(32)【優先日】2021-12-16

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】398076227

【氏名又は名称】ザ・ジョンズ・ホプキンス・ユニバーシティー

(74)【代理人】

【識別番号】100102978

【弁理士】

【氏名又は名称】清水初志

(74)【代理人】

【識別番号】100205707

【弁理士】

【氏名又は名称】小寺秀紀

(74)【代理人】

【識別番号】100160923

【弁理士】

【氏名又は名称】山口裕孝

(74)【代理人】

【識別番号】100119507

【弁理士】

【氏名又は名称】刑部俊

(74)【代理人】

【識別番号】100142929

【弁理士】

【氏名又は名称】井上隆一

(74)【代理人】

【識別番号】100148699

【弁理士】

【氏名又は名称】佐藤利光

(74)【代理人】

【識別番号】100188433

【弁理士】

【氏名又は名称】梅村幸輔

(74)【代理人】

【識別番号】100128048

【弁理士】

【氏名又は名称】新見浩一

(74)【代理人】

【識別番号】100129506

【弁理士】

【氏名又は名称】小林智彦

(74)【代理人】

【識別番号】100114340

【弁理士】

【氏名又は名称】大関雅人

(74)【代理人】

【識別番号】100214396

【弁理士】

【氏名又は名称】塩田真紀

(74)【代理人】

【識別番号】100121072

【弁理士】

【氏名又は名称】川本和弥

(74)【代理人】

【識別番号】100221741

【弁理士】

【氏名又は名称】酒井直子

(74)【代理人】

【識別番号】100114926

【弁理士】

【氏名又は名称】枝松義恵

(72)【発明者】

【氏名】フォーゲルシュタインバート

(72)【発明者】

【氏名】キンズラーケネスダブリュー．

(72)【発明者】

【氏名】パパドプーロスニコラス

(72)【発明者】

【氏名】チョウシビン

(72)【発明者】

【氏名】ディナポリサラ

(72)【発明者】

【氏名】シュエエミリーハン－チュン

(72)【発明者】

【氏名】モグブライアンジェイ．

(72)【発明者】

【氏名】ライトキャサリンエム．

(72)【発明者】

【氏名】ガベリサンドラビー．

【テーマコード（参考）】

4C076

4C085

4H045

【Ｆターム（参考）】

4C076AA95

4C076CC27

4C076CC41

4C076EE41

4C076EE59

4C076FF70

4C085AA13

4C085AA14

4C085BB11

4C085DD62

4C085EE01

4H045AA11

4H045AA20

4H045AA30

4H045DA76

4H045EA28

4H045FA74

(57)【要約】

本明細書に記載されるのは、がんを有するかもしくはがんを有すると疑われる哺乳動物を評価するための、及び／またはがんを有する哺乳動物を治療するための、方法及び組成物である。例えば、修飾ペプチド（例えば、腫瘍抗原）に結合することができる１つ以上の抗原結合ドメイン（例えば、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ））を含む分子、及びそのような分子を使用するための方法が提供される。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

（ｉ）配列番号８を含むかまたはそれからなるｓｃＦｖ軽鎖ＣＤＲ１、
（ｉｉ）配列番号９または配列番号２３を含むかまたはそれからなるｓｃＦｖ軽鎖ＣＤＲ２、
（ｉｉｉ）配列番号１０を含むかまたはそれからなるｓｃＦｖ軽鎖ＣＤＲ３、
（ｉｖ）配列番号１７を含むかまたはそれからなるｓｃＦＶ重鎖ＣＤＲ１、
（ｖ）配列番号１８または配列番号２７を含むかまたはそれからなるｓｃＦＶ重鎖ＣＤＲ２、及び
（ｖｉ）配列番号１９を含むかまたはそれからなるｓｃＦＶ重鎖ＣＤＲ３
を含む第１の抗原結合ドメインを含む、分子。

【請求項2】

前記第１の抗原結合ドメインが、
（ａ）配列番号２３を含むかもしくはそれからなる前記ｓｃＦｖ軽鎖ＣＤＲ２、または
（ｂ）配列番号２７を含むかもしくはそれからなる前記ｓｃＦｖ重鎖ＣＤＲ２、または
（ｃ）配列番号２３を含むかもしくはそれからなる前記ｓｃＦｖ軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２７を含むかもしくはそれからなる前記ｓｃＦｖ重鎖ＣＤＲ２
を含む、請求項１に記載の分子。

【請求項3】

前記第１の抗原結合ドメインが、
（ｉ）配列番号７または配列番号２２と少なくとも９０％同一の配列を含むｓｃＦｖ軽鎖、及び
（ｉｉ）配列番号１６または配列番号２６と少なくとも９０％同一の配列を含むｓｃＦｖ重鎖
を含む、請求項１または２に記載の分子。

【請求項4】

前記第１の抗原結合ドメインが、
（ａ）配列番号７と少なくとも９０％同一の配列を含む前記ｓｃＦｖ軽鎖、及び配列番号２６と少なくとも９０％同一の配列を含む前記ｓｃＦｖ重鎖、または
（ｂ）配列番号２２と少なくとも９０％同一の配列を含む前記ｓｃＦｖ軽鎖、及び配列番号１６と少なくとも９０％同一の配列を含む前記ｓｃＦｖ重鎖、または
（ｃ）配列番号２２と少なくとも９０％同一の配列を含む前記ｓｃＦｖ軽鎖、及び配列番号２６と少なくとも９０％同一の配列を含む前記ｓｃＦｖ重鎖
を含む、請求項３に記載の分子。

【請求項5】

前記第１の抗原結合ドメインが、
（ｉ）配列番号７または配列番号２２と少なくとも９８％同一の配列を含むｓｃＦｖ軽鎖、及び
（ｉｉ）配列番号１６または配列番号２６と少なくとも９８％同一の配列を含むｓｃＦｖ重鎖
を含む、請求項１～４のいずれか１項に記載の分子。

【請求項6】

前記第１の抗原結合ドメインが、
（ａ）配列番号７と少なくとも９８％同一の配列を含む前記ｓｃＦｖ軽鎖、及び配列番号２６と少なくとも９８％同一の配列を含む前記ｓｃＦｖ重鎖、または
（ｂ）配列番号２２と少なくとも９８％同一の配列を含む前記ｓｃＦｖ軽鎖、及び配列番号１６と少なくとも９８％同一の配列を含む前記ｓｃＦｖ重鎖、または
（ｃ）配列番号２２と少なくとも９８％同一の配列を含む前記ｓｃＦｖ軽鎖、及び配列番号２６と少なくとも９８％同一の配列を含む前記ｓｃＦｖ重鎖
を含む、請求項５に記載の分子。

【請求項7】

前記第１の抗原結合ドメインが、
（ｉ）配列番号７または配列番号２２を含むかまたはそれからなるｓｃＦｖ軽鎖、及び
（ｉｉ）配列番号１６または配列番号２６を含むかまたはそれからなるｓｃＦｖ重鎖
を含む、請求項１～６のいずれか１項に記載の分子。

【請求項8】

前記第１の抗原結合ドメインが、
（ａ）配列番号７を含むかもしくはそれからなる前記ｓｃＦｖ軽鎖、及び配列番号２６を含むかもしくはそれからなる前記ｓｃＦｖ重鎖、または
（ｂ）配列番号２２を含むかもしくはそれからなる前記ｓｃＦｖ軽鎖、及び配列番号１６を含むかもしくはそれからなる前記ｓｃＦｖ重鎖、または
（ｃ）配列番号２２を含むかもしくはそれからなる前記ｓｃＦｖ軽鎖、及び配列番号２６を含むかもしくはそれからなる前記ｓｃＦｖ重鎖
を含む、請求項７に記載の分子。

【請求項9】

抗体、抗体断片、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、ＴＣＲ模倣体、タンデムｓｃＦｖ、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー、ダイアボディ、一本鎖ダイアボディ（ｓｃＤｂ）、ｓｃＦｖ－Ｆｃ、二重特異性抗体、及び二重親和性再ターゲティング抗体（ＤＡＲＴ）からなる群から選択される、請求項１～８のいずれか１項に記載の分子。

【請求項10】

ＣＤ３、ＣＤ２８、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１６ａ、ＮＫＧ２Ｄ、ＰＤ－１、ＣＴＬＡ－４、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、及びＣＤ２７からなる群から選択されるエフェクター細胞受容体に結合することができる第２の抗原結合ドメインをさらに含む、請求項１～９のいずれか１項に記載の分子。

【請求項11】

前記第２の抗原結合ドメインが、ＣＤ３に結合することができる、請求項１０に記載の分子。

【請求項12】

ＣＤ３に結合することができる前記第２の抗原結合ドメインが、表３に示されるものから選択される可変軽鎖及び可変重鎖を含む、請求項１１に記載の分子。

【請求項13】

ＣＤ３に結合することができる前記第２の抗原結合ドメインが、表２に示されるもの（配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１）のうちのいずれか１つを含むかまたはそれからなる、請求項１２に記載の分子。

【請求項14】

一本鎖ダイアボディ（ｓｃＤｂ）である、請求項１～１３のいずれか１項に記載の分子。

【請求項15】

前記一本鎖ダイアボディが、Ｎ末端からＣ末端の順に、
（ｉ）（ａ）配列番号８を含むかまたはそれからなるｓｃＦｖ軽鎖ＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号９または配列番号２３を含むかまたはそれからなるｓｃＦｖ軽鎖ＣＤＲ２、
（ｃ）配列番号１０を含むかまたはそれからなるｓｃＦｖ軽鎖ＣＤＲ３
を含む、ｓｃＦｖ軽鎖と、
（ｉｉ）ＣＤ３、ＣＤ２８、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１６ａ、ＮＫＧ２Ｄ、ＰＤ－１、ＣＴＬＡ－４、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、及びＣＤ２７からなる群から選択されるエフェクター細胞受容体に結合することができる、抗原結合ドメインと、
（ｉｉｉ）（ａ）配列番号１７を含むかまたはそれからなるｓｃＦＶ重鎖ＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号１８または配列番号２７を含むかまたはそれからなるｓｃＦＶ重鎖ＣＤＲ２、及び
（ｃ）配列番号１９を含むかまたはそれからなるｓｃＦＶ重鎖ＣＤＲ３
を含む、ｓｃＦｖ重鎖と
を含む、請求項１４に記載の分子。

【請求項16】

前記一本鎖ダイアボディが、
（ａ）配列番号２３を含むかもしくはそれからなる前記ｓｃＦｖ軽鎖ＣＤＲ２、または
（ｂ）配列番号２７を含むかもしくはそれからなる前記ｓｃＦｖ重鎖ＣＤＲ２、または
（ｃ）配列番号２３を含むかもしくはそれからなる前記ｓｃＦｖ軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２７を含むかもしくはそれからなる前記ｓｃＦｖ重鎖ＣＤＲ２
を含む、請求項１５に記載の分子。

【請求項17】

前記一本鎖ダイアボディが、Ｎ末端からＣ末端の順に、
（ｉ）配列番号７または配列番号２２を含むかまたはそれからなるｓｃＦｖ軽鎖と、
（ｉｉ）ＣＤ３、ＣＤ２８、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１６ａ、ＮＫＧ２Ｄ、ＰＤ－１、ＣＴＬＡ－４、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、及びＣＤ２７からなる群から選択されるエフェクター細胞受容体に結合することができる抗原結合ドメインと、
（ｉｉｉ）配列番号１６または配列番号２６を含むかまたはそれからなるｓｃＦｖ重鎖と
を含む、請求項１４～１６のいずれか１項に記載の分子。

【請求項18】

前記一本鎖ダイアボディが、
（ａ）配列番号７を含むかもしくはそれからなる前記ｓｃＦｖ軽鎖、及び配列番号２６を含むかもしくはそれからなる前記ｓｃＦｖ重鎖、または
（ｂ）配列番号２２を含むかもしくはそれからなる前記ｓｃＦｖ軽鎖、及び配列番号１６を含むかもしくはそれからなる前記ｓｃＦｖ重鎖、または
（ｃ）配列番号２２を含むかもしくはそれからなる前記ｓｃＦｖ軽鎖、及び配列番号２６を含むかもしくはそれからなる前記ｓｃＦｖ重鎖
を含む、請求項１７に記載の分子。

【請求項19】

前記抗原結合ドメインが、ＣＤ３抗原結合ドメインである、請求項１５または請求項１７に記載の分子。

【請求項20】

前記ＣＤ３抗原結合ドメインが、表３に示されるものから選択される可変軽鎖及び可変重鎖を含む、請求項１９に記載の分子。

【請求項21】

前記抗原結合ドメインの前記可変軽鎖及び前記可変重鎖が、リンカー、好ましくは３×Ｇ_４Ｓリンカー（配列番号１３）によって分離されている、請求項２０に記載の分子。

【請求項22】

ＣＤ３に結合することができる前記抗原結合ドメインが、表２に示されるもの（配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１）のうちのいずれか１つを含むかまたはそれからなる、請求項１９～２１のいずれか１項に記載の分子。

【請求項23】

前記ｓｃＦｖ軽鎖と前記抗原結合ドメインとの間の第１のリンカー、および
前記抗原結合ドメインと前記ｓｃＦｖ重鎖との間の第２のリンカー
をさらに含む、請求項１５～２２のいずれか１項に記載の分子。

【請求項24】

前記第１のリンカーが、Ｇ４Ｓ（配列番号１１）を含むかまたはそれからなり、前記第２のリンカーが、Ｇ４Ｓ（配列番号１５）を含むかまたはそれからなる、請求項２３に記載の分子。

【請求項25】

を含むかまたはそれからなる変異ペプチドを発現するがんを有する哺乳動物を治療するための方法であって、
請求項１～２４のいずれか１項に記載の分子を前記哺乳動物に投与することを含む、前記方法。

【請求項26】

前記哺乳動物がヒトである、請求項２５に記載の方法。

【請求項27】

前記がんが、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、急性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、骨髄増殖性疾患、肺癌、膵臓癌、胃癌（ｇａｓｔｒｉｃｃａｎｃｅｒ）、結腸直腸癌、卵巣癌、子宮内膜癌、胆道癌、肝臓癌、乳癌、前立腺癌、食道癌、胃癌（ｓｔｏｍａｃｈｃａｎｃｅｒ）、腎臓癌、骨癌、軟部組織癌、頭頸部癌、多形神経膠芽腫、星状細胞腫、甲状腺癌、胚細胞性腫瘍、または黒色腫である、請求項２５または請求項２６に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０２１年１２月１６日に出願された米国仮特許出願第６３／２９０，３５３号の優先権を主張し、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0002】

配列表
本出願は、「４４８０７－０４０７ＷＯ１＿ＳＬ＿ＳＴ２６．ＸＭＬ」という名称のＸＭＬファイルとして電子的に提出された配列表を含む。ＸＭＬファイルは、２０２２年１２月８日に作成され、８２，０６７バイトのサイズである。ＸＭＬファイル内の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0003】

連邦政府支援の研究または開発
本発明は、国立衛生研究所によって授与された助成金ＣＡ００６９７３の下で政府の支援を受けてなされた。政府は、本発明に一定の権利を有する。

【0004】

技術分野
本明細書に記載されるのは、がんを有するかもしくはがんを有すると疑われる哺乳動物を評価するための、及び／またはがんを有する哺乳動物を治療するための、方法及び組成物である。例えば、修飾ペプチド（例えば、腫瘍抗原）に結合することができる１つ以上の抗原結合ドメイン（例えば、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ））を含む分子、及びそのような分子を使用するための方法が提供される。

【背景技術】

【0005】

背景
近年、抗体及び細胞に基づく免疫療法が、有望ながん治療として台頭してきている。しかしながら、腫瘍細胞で発現が上昇した抗原を標的とする多くの免疫療法は、正常細胞における同じ標的の発現が低いために、著しい毒性を有する。理想的な免疫療法は、正常細胞はそのままにして、重要なドライバー変異を内部に有するがん細胞を特異的に同定できるであろう。これらの変異を含有する細胞を標的とすることは、免疫療法に直接アクセスできない細胞内タンパク質をコードするドライバー遺伝子には多くの一般的な変異が存在するため、困難であることが多い。

【0006】

がんにおける体細胞変異は、腫瘍細胞にのみ発現し、正常細胞には発現しないため、がん治療の理想的な標的である。ドライバー遺伝子タンパク質（がん遺伝子タンパク質及び腫瘍抑制タンパク質に広く細分化される）を標的とすることには付加的な利益がある。第一に、これらの変異は、典型的には腫瘍発生の初期に起こるため、本質的に全ての娘がん細胞がこの変異を含有する。第二に、腫瘍は発がん性を付与する能力に依存しているため、抵抗性が起こる可能性がより低い。最後に、ドライバー遺伝子タンパク質は、多くの患者間で共有されるホットスポット変異を有する傾向があるため、単一変異を標的とする治療法は、幅広い患者集団に適用することができる。

【0007】

ほとんどの変異ドライバー遺伝子タンパク質を含めて、ほとんどの変異タンパク質は、細胞内にある。小分子は細胞内タンパク質を標的とすることができるが、その野生型（ＷＴ）対応物ではなく、変異ドライバー遺伝子の活性を特異的に阻害することができる小分子の開発は、そのようなドライバー遺伝子タンパク質の大部分では達成されないままであった。単一アミノ酸変異を識別する能力を有することができる抗体は、典型的には、細胞外エピトープのみを標的とすることができる。

【0008】

免疫系は、抗原の処理及び提示を通して細胞の細胞内含有物をサンプリングする。タンパク質のタンパク質分解に続いて、得られたペプチドの断片は、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）にロードされて細胞表面に送られ、そこで、Ｔ細胞がそのＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を介して自己と非自己ペプチドとを識別するように機能する。例えば、ウイルスに感染した細胞は、そのＨＬＡにウイルスペプチドを提示し、その細胞を殺傷するようにＴ細胞を誘発する。同様に、がんにおいて、変異ペプチドは、がん細胞表面上のＨＬＡに提示され得、これは変異関連ネオアンチゲン（Ｍｕｔａｔｉｏｎ－ＡｓｓｏｃｉａｔｅｄＮｅｏ－Ａｎｔｉｇｅｎ）の略でＭＡＮＡと称される。ある場合には、程度の差はあれ、患者は、これらの変異ペプチド－ＨＬＡネオアンチゲンに対する抗がんＴ細胞応答を開始することができ、チェックポイント遮断抗体が、この応答をさらに増強することができる。しかしながら、多くの患者、特に突然変異量が低い患者は、十分な抗がんＴ細胞応答を開始することができない。したがって、ＭＡＮＡを特異的に標的とする治療法または診断法は、がんを診断または治療するための真に腫瘍特異的な方法を提供することができる。

【0009】

ＨＬＡクラスＩタンパク質は、全ての有核細胞に存在する。３つの古典的なＨＬＡクラスＩ遺伝子、Ａ、Ｂ、及びＣがあり、それらの各々が高度に多型である。各ＨＬＡ対立遺伝子は特定のペプチド結合モチーフを有し、その結果、特定のペプチドのみが特定のＨＬＡ対立遺伝子に結合する。

【0010】

当該技術分野には、がんを診断する、監視する、及び効果的に治療するための新しい改善された方法を開発する必要性が継続して存在する。

【発明の概要】

【0011】

概要
がん細胞に高度に特異的な治療標的の同定は、効果的ながん治療を開発するための最も大きな課題の１つである。

【0012】

本明細書に記載されるのは、がんを有する哺乳動物を治療するための方法及び組成物である。例えば、本文書は、がん（例えば、修飾ペプチドを発現するがん）を有する哺乳動物を治療するために、修飾ペプチド（例えば、ペプチド－ＨＬＡ－β－２ミクログロブリン（ｂ２Ｍまたはβ２Ｍ）複合体中に存在する修飾ペプチド）に結合することができる１つ以上の抗原結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）を含む１つ以上の分子を使用するための方法及び材料を提供する。ある場合には、修飾ペプチド（例えば、ペプチド－ＨＬＡ－β２Ｍ複合体中に存在する修飾ペプチド）に結合することができる１つ以上の抗原結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）を含む１つ以上の分子を、がん（例えば、修飾ペプチドを発現するがん）を有する哺乳動物に投与して哺乳動物を治療することができる。

【0013】

本明細書に示されるように、一般的ながんドライバー変異ｐ５３Ｒ１７５Ｈ（「Ｒ１７５Ｈ」）に由来するＨＬＡ拘束性ＭＡＮＡに存在する多数のＭＡＮＡを標的とする（例えば、それに結合する）ｓｃＦｖが同定された。また、本明細書に示されるように、ｓｃＦｖを使用して、ＭＡＮＡを発現する細胞（例えば、がん細胞）を認識して殺傷することができる、ＭＡＮＡ依存性Ｔ細胞活性化を誘導することができる二重特異性抗体を設計した。

【0014】

ＭＡＮＡは、正常組織（複数可）に存在しないため、高度に特異的ながん標的として使用することができる。ＭＡＮＡを特異的に標的とする能力は、がんを診断及び／または治療するための腫瘍特異的方法を提供する。例えば、ＭＡＮＡを特異的に標的とするｓｃＦｖを、全長抗体もしくはその断片、抗体薬物複合体（ＡＤＣ）、抗体放射性核種複合体、キメラ抗原受容体を発現するＴ細胞（ＣＡＲＴ）、または二重特異性抗体に使用して、がんを有する哺乳動物を診断及び／または治療することができる。さらに、ＭＡＮＡに結合することができる抗体（ＭＡＮＡｂｏｄｙ）、またはＭＡＮＡに結合することができるその断片は、広く適用可能で遺伝的に予測可能な、いつでも入手可能な標的指向型がん免疫療法となる潜在性を有する。

【0015】

近年、抗体及び細胞に基づく免疫療法が、有望ながん治療として台頭してきている。しかしながら、腫瘍細胞で発現が上昇した抗原を標的とする多くの免疫療法は、正常細胞における同じ標的の発現が低いために、著しい毒性を有する。理想的な免疫療法は、正常細胞はそのままにして、重要なドライバー変異を内部に有するがん細胞を特異的に同定できるであろう。これらの変異を含有する細胞を標的とすることは、免疫療法に直接アクセスできない細胞内タンパク質をコードするドライバー遺伝子には多くの一般的な変異が存在するため、困難であることが多い。細胞の主要組織適合性複合体（ｐＭＨＣ）に結合した変異ペプチドとして提示されるがん特異的変異を標的とする可能性が実証されている。二重特異性抗体またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞を使用して、これらの変異ペプチドを提示する細胞を標的とすることは、さもなければ免疫監視機構が検知することがないであろう変異タンパク質を含有する細胞を同定する遺伝的に特異的な治療法を提供する。

【0016】

それにもかかわらず、これらの変異ペプチドに対する高い親和性を有する改善された抗体の必要性が残っている。

【0017】

したがって、本明細書に記載されるのは、（ｉ）配列番号８を含むかまたはそれからなるｓｃＦｖ軽鎖ＣＤＲ１、（ｉｉ）配列番号９または配列番号２３を含むかまたはそれからなるｓｃＦｖ軽鎖ＣＤＲ２、（ｉｉｉ）配列番号１０を含むかまたはそれからなるｓｃＦｖ軽鎖ＣＤＲ３、（ｉｖ）配列番号１７を含むかまたはそれからなるｓｃＦＶ重鎖ＣＤＲ１、（ｖ）配列番号１８または配列番号２７を含むかまたはそれからなるｓｃＦＶ重鎖ＣＤＲ２、及び（ｖｉ）配列番号１９を含むかまたはそれからなるｓｃＦＶ重鎖ＣＤＲ３、を含む第１の抗原結合ドメインを含む、分子である。

【0018】

いくつかの実施形態において、第１の抗原結合ドメインは、（ａ）配列番号２３を含むかもしくはそれからなるｓｃＦｖ軽鎖ＣＤＲ２、または（ｂ）配列番号２７を含むかもしくはそれからなるｓｃＦｖ重鎖ＣＤＲ２、または（ｃ）配列番号２３を含むかもしくはそれからなるｓｃＦｖ軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２７を含むかもしくはそれからなるｓｃＦｖ重鎖ＣＤＲ２を含む。

【0019】

いくつかの実施形態において、第１の抗原結合ドメインは、（ｉ）配列番号７または配列番号２２と少なくとも９０％同一の配列を含むｓｃＦｖ軽鎖、及び（ｉｉ）配列番号１６または配列番号２６と少なくとも９０％同一の配列を含むｓｃＦｖ重鎖を含む。いくつかの実施形態において、第１の抗原結合ドメインは、（ａ）配列番号７と少なくとも９０％同一の配列を含むｓｃＦｖ軽鎖、及び配列番号２６と少なくとも９０％同一の配列を含むｓｃＦｖ重鎖、または（ｂ）配列番号２２と少なくとも９０％同一の配列を含むｓｃＦｖ軽鎖、及び配列番号１６と少なくとも９０％同一の配列を含むｓｃＦｖ重鎖、または（ｃ）配列番号２２と少なくとも９０％同一の配列を含むｓｃＦｖ軽鎖、及び配列番号２６と少なくとも９０％同一の配列を含むｓｃＦｖ重鎖を含む。

【0020】

いくつかの実施形態において、第１の抗原結合ドメインは、（ｉ）配列番号７または配列番号２２と少なくとも９８％同一の配列を含むｓｃＦｖ軽鎖、及び（ｉｉ）配列番号１６または配列番号２６と少なくとも９８％同一の配列を含むｓｃＦｖ重鎖を含む。いくつかの実施形態において、第１の抗原結合ドメインは、（ａ）配列番号７と少なくとも９８％同一の配列を含むｓｃＦｖ軽鎖、及び配列番号２６と少なくとも９８％同一の配列を含むｓｃＦｖ重鎖、または（ｂ）配列番号２２と少なくとも９８％同一の配列を含むｓｃＦｖ軽鎖、及び配列番号１６と少なくとも９８％同一の配列を含むｓｃＦｖ重鎖、または（ｃ）配列番号２２と少なくとも９８％同一の配列を含むｓｃＦｖ軽鎖、及び配列番号２６と少なくとも９８％同一の配列を含むｓｃＦｖ重鎖を含む。

【0021】

いくつかの実施形態において、第１の抗原結合ドメインは、（ｉ）配列番号７または配列番号２２を含むかまたはそれからなるｓｃＦｖ軽鎖、及び（ｉｉ）配列番号１６または配列番号２６を含むかまたはそれからなるｓｃＦｖ重鎖を含む。いくつかの実施形態において、第１の抗原結合ドメインは、（ａ）配列番号７を含むかもしくはそれからなるｓｃＦｖ軽鎖、及び配列番号２６を含むかもしくはそれからなるｓｃＦｖ重鎖、または（ｂ）配列番号２２を含むかもしくはそれからなるｓｃＦｖ軽鎖、及び配列番号１６を含むかもしくはそれからなるｓｃＦｖ重鎖、または（ｃ）配列番号２２を含むかもしくはそれからなるｓｃＦｖ軽鎖、及び配列番号２６を含むかもしくはそれからなるｓｃＦｖ重鎖を含む。

【0022】

いくつかの実施形態において、分子は、抗体、抗体断片、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、ＴＣＲ模倣体、タンデムｓｃＦｖ、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー、ダイアボディ、一本鎖ダイアボディ（ｓｃＤｂ）、ｓｃＦｖ－Ｆｃ、二重特異性抗体、及び二重親和性再ターゲティング抗体（ＤＡＲＴ）からなる群から選択される。

【0023】

いくつかの実施形態において、分子は、ＣＤ３、ＣＤ２８、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１６ａ、ＮＫＧ２Ｄ、ＰＤ－１、ＣＴＬＡ－４、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、及びＣＤ２７からなる群から選択されるエフェクター細胞受容体に結合することができる第２の抗原結合ドメインをさらに含む。いくつかの実施形態において、第２の抗原結合ドメインは、ＣＤ３に結合することができる。いくつかの実施形態において、ＣＤ３に結合することができる第２の抗原結合ドメインは、表３に示されるものから選択される可変軽鎖及び可変重鎖を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ３に結合することができる第２の抗原結合ドメインは、表２に示されるもの（配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１）のうちのいずれか１つを含むかまたはそれからなる。

【0024】

いくつかの実施形態において、分子は一本鎖ダイアボディ（ｓｃＤｂ）である。いくつかの実施形態において、一本鎖ダイアボディは、Ｎ末端からＣ末端の順に、（ｉ）（ａ）配列番号８を含むかまたはそれからなるｓｃＦｖ軽鎖ＣＤＲ１、（ｂ）配列番号９または配列番号２３を含むかまたはそれからなるｓｃＦｖ軽鎖ＣＤＲ２、（ｃ）配列番号１０を含むかまたはそれからなるｓｃＦｖ軽鎖ＣＤＲ３、を含む、ｓｃＦｖ軽鎖と、（ｉｉ）ＣＤ３、ＣＤ２８、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１６ａ、ＮＫＧ２Ｄ、ＰＤ－１、ＣＴＬＡ－４、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、及びＣＤ２７からなる群から選択されるエフェクター細胞受容体に結合することができる、抗原結合ドメインと、（ｉｉｉ）（ａ）配列番号１７を含むかまたはそれからなるｓｃＦＶ重鎖ＣＤＲ１、（ｂ）配列番号１８または配列番号２７を含むかまたはそれからなるｓｃＦＶ重鎖ＣＤＲ２、及び（ｃ）配列番号１９を含むかまたはそれからなるｓｃＦＶ重鎖ＣＤＲ３、を含む、ｓｃＦｖ重鎖と、を含む。

【0025】

いくつかの実施形態において、一本鎖ダイアボディは、（ａ）配列番号２３を含むかもしくはそれからなるｓｃＦｖ軽鎖ＣＤＲ２、または（ｂ）配列番号２７を含むかもしくはそれからなるｓｃＦｖ重鎖ＣＤＲ２、または（ｃ）配列番号２３を含むかもしくはそれからなるｓｃＦｖ軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２７を含むかもしくはそれからなるｓｃＦｖ重鎖ＣＤＲ２を含む。いくつかの実施形態において、一本鎖ダイアボディは、Ｎ末端からＣ末端の順に、（ｉ）配列番号７または配列番号２２を含むかまたはそれからなるｓｃＦｖ軽鎖と、（ｉｉ）ＣＤ３、ＣＤ２８、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１６ａ、ＮＫＧ２Ｄ、ＰＤ－１、ＣＴＬＡ－４、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、及びＣＤ２７からなる群から選択されるエフェクター細胞受容体に結合することができる抗原結合ドメインと、（ｉｉｉ）配列番号１６または配列番号２６を含むかまたはそれからなるｓｃＦｖ重鎖と、を含む。いくつかの実施形態において、一本鎖ダイアボディは、（ａ）配列番号７を含むかもしくはそれからなるｓｃＦｖ軽鎖、及び配列番号２６を含むかもしくはそれからなるｓｃＦｖ重鎖、または（ｂ）配列番号２２を含むかもしくはそれからなるｓｃＦｖ軽鎖、及び配列番号１６を含むかもしくはそれからなるｓｃＦｖ重鎖、または（ｃ）配列番号２２を含むかもしくはそれからなるｓｃＦｖ軽鎖、及び配列番号２６を含むかもしくはそれからなるｓｃＦｖ重鎖を含む。

【0026】

いくつかの実施形態において、抗原結合ドメインは、ＣＤ３抗原結合ドメインである。いくつかの実施形態において、ＣＤ３抗原結合ドメインは、表３に示されるものから選択される可変軽鎖及び可変重鎖を含む。

【0027】

いくつかの実施形態において、抗原結合ドメインの可変軽鎖及び可変重鎖は、リンカー、好ましくは３×Ｇ４Ｓリンカー（配列番号１３）によって分離されている。いくつかの実施形態では、ＣＤ３に結合することができる抗原結合ドメインは、表２に示されるもの（配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１）のうちのいずれか１つを含むかまたはそれからなる。

【0028】

いくつかの実施形態では、分子は、ｓｃＦｖ軽鎖と抗原結合ドメインとの間の第１のリンカー、および抗原結合ドメインとｓｃＦｖ重鎖との間の第２のリンカーをさらに含む。いくつかの実施形態において、第１のリンカーは、Ｇ４Ｓ（配列番号１１）を含むかまたはそれからなり、第２のリンカーは、Ｇ４Ｓ（配列番号１５）を含むかまたはそれからなる。

【0029】

また本明細書では、ＨＭＴＥＶＶＲＨＣ（配列番号１）を含むかまたはそれからなる変異ペプチドを発現するがんを有する哺乳動物を治療するための方法も提供され、該方法は、請求項１～２４のいずれか１項に記載の分子を哺乳動物に投与することを含む。いくつかの実施形態において、上記哺乳動物はヒトである。いくつかの実施形態において、上記がんは、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、急性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、骨髄増殖性疾患、肺癌、膵臓癌、胃癌（ｇａｓｔｒｉｃｃａｎｃｅｒ）、結腸直腸癌、卵巣癌、子宮内膜癌、胆道癌、肝臓癌、乳癌、前立腺癌、食道癌、胃癌（ｓｔｏｍａｃｈｃａｎｃｅｒ）、腎臓癌、骨癌、軟部組織癌、頭頸部癌、多形神経膠芽腫、星状細胞腫、甲状腺癌、胚細胞性腫瘍、または黒色腫である。

【0030】

本出願全体を通して、様々な実施形態が範囲形式で提示される場合がある。範囲形式での記載は、利便性及び簡潔性のために過ぎず、本発明の範囲に対する柔軟性のない限定として解釈されるべきではないことを理解されたい。したがって、範囲の記載は、全ての可能な部分範囲だけでなく、その範囲内の個々の数値を具体的に開示しているとみなされるべきである。例えば、１～６等の範囲の記載は、１～３、１～４、１～５、２～４、２～６、３～６等の部分範囲だけでなく、その範囲内の個々の数、例えば、１、２、３、４、５、及び６も具体的に開示しているとみなされるべきである。これは、範囲の広さにかかわらず当てはまる。

【0031】

本明細書及び特許請求の範囲において使用される場合、単数形の「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈上そうではないと明確に指示されない限り、複数形の指示対象を含む。例えば、「試料（ａｓａｍｐｌｅ）」という用語は、その混合物を含めて、複数の試料を含む。

【0032】

「決定する」、「測定する」、「評価する（ｅｖａｌｕａｔｉｎｇ）」、「評価する（ａｓｓｅｓｓｉｎｇ）」、「アッセイする」、及び「分析する」という用語は、測定の形態を指すために本明細書においてしばしば互換的に使用される。これらの用語は、ある要素が存在するかしないかを決定すること（例えば、検出）を含む。これらの用語は、定量的、定性的、または定量的及び定性的な決定を含むことができる。評価は、相対的または絶対的であり得る。「～の存在を検出する」は、文脈に応じて、それが存在するか存在しないかを決定することに加えて、存在する何かの量を決定することを含むことができる。

【0033】

本明細書で使用される場合、「約」数という用語は、その数のプラスまたはマイナス１０％の数を指す。「約」範囲という用語は、その最低値のマイナス１０％及びその最高値のプラス１０％の範囲を指す。

【0034】

別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術及び科学用語は、本発明が属する当業者により一般に理解されるものと同じ意味を有する。方法及び材料は、本発明で使用するために本明細書に記載されている。当技術分野で知られている他の好適な方法及び材料も使用することができる。材料、方法、及び例は、例示に過ぎず、限定的であることは意図されない。本明細書で言及される公表物、特許出願、特許、配列、データベース入力物、及び他の参考文献は全て、参照によってその全体が組み込まれる。矛盾する場合には、定義を含めて本明細書が優先する。

【0035】

本発明の他の特徴及び利点は、以下の詳細な説明及び図面、ならびに特許請求の範囲から明らかとなるであろう。

【図面の簡単な説明】

【0036】

【図1】バリアントライブラリーの設計を示す。合計１１５９個のバリアントについて、１９個のアミノ酸のそれぞれを有する６つのＣＤＲ全てにわたる６１個の部位で、元のＨ２ｓｃＦｖを修飾した。ｓｃＦｖライブラリーを直接合成し、ファージディスプレイによるパニングのためにｐＡＤＬ－１０ｂベクターにクローニングした。

【図2】ピックしたパニングコロニーにおけるアミノ酸修飾の部位を示す。ＳＳ３２０コンピテント細胞を、パニングの４ラウンド目及び５ラウンド目終了時からのファージプールで感染させ、単一コロニーをピックするためにプレーティングした。１ラウンド当たり１００個のコロニーにサンガーシーケンシングを行い、個々のバリアントを同定した。パニング終了時には高い多様性が残っており、反復するバリアントはほとんどなく、全てのＣＤＲが配列決定されたコロニーに提示された。

【図3】チオシアン酸アンモニウム及び尿素でバリアントをスクリーニングした結果を示す。予測された構造的に関連するファージクローンを、Ｒ１７５Ｈ／Ａ２ｐＭＨＣまたはＲ１７５ＷＴｐＭＨＣでコーティングしたＥＬＩＳＡプレートに塗布した。初回洗浄後、様々な濃度のＮＨ_４ＳＣＮまたは尿素でプレートを処理し、低親和性結合剤を溶出した。ＥＬＩＳＡ吸光度（Ａ_４５０）対洗浄液濃度の線形回帰分析によってバリアントを評価した。元のＨ２バリアント以上のＲ１７５Ｈ：Ｒ１７５ＷＴの結合を示すバリアントの勾配を表示する。

【図4】プールしたファージについてチオシアン酸ベースのスクリーニングの結果を示す。パニングの４ラウンド目からのファージプールは、０．５ＭのＮＨ_４ＳＣＮ洗浄液または対照洗浄液（ＨＢＳＰＥ）でスクリーニングを行った。Ｒ１７５Ｈ／Ａ２モノマーでコーティングされたＥＬＩＳＡプレートにファージを塗布し、ＴＢＳＴで洗浄した後、試験洗浄緩衝液（ＳＣＮまたはＨＢＳＰＥ）で洗浄した。結合したファージを溶出し、ＳＳ３２０細胞を感染させてより多くのファージを生成するために使用した。同じプロトコルを、この単一濃縮ファージプールで繰り返した。バリアントの濃縮は、次世代シーケンシングを用いて追跡した。上位５０パーセンタイルの読み取り値の割合を有する、４ラウンド目開始時のファージプールから少なくとも２倍濃縮されたバリアントが表示される。次いで、選択された濃縮バリアントを、構造的に予測されたバリアントと同様にｓｃＤｂとしてスクリーニングした。

【図5】元のＨ２ｓｃＤｂと比較して、バリアントｓｃＤｂのＲ１７５Ｈ／ＨＬＡ－Ａ２モノマーへの相対的結合性が増加したことを示す。発現したｓｃＤｂがＲ１７５Ｈ／Ａ２モノマーに特異的に結合すること及びＣＤ３に結合することができることを確認するために、ｓｃＤｂをＲ１７５Ｈ／Ａ２モノマー、Ｒ１７５ＷＴ／Ａ２モノマー、またはＣＤ３δ／εヘテロダイマーでコーティングされたプレートに塗布した。ＣＤ３結合シグナルに対して正規化したとき、ほとんどのバリアントｓｃＤｂが、ＥＬＩＳＡによって元のＨ２－ｓｃＤｂと比較すると、Ｒ１７５Ｈ／ＨＬＡ－Ａ２モノマーへの相対的結合性の増加を示した。全てのバリアントは、Ｒ１７５ＷＴ／ＨＬＡ－Ａ２結合を有していなかった。

【図6】ペプチドパルス共培養におけるｓｃＤｂの感受性を試験した結果を示す。ＴＡＰ欠損Ｔ２Ａ３細胞を、様々な濃度のＲ１７５Ｈ９ｍｅｒまたはＲ１７５ＷＴ９ｍｅｒでパルスした。ｓｃＤｂを、低パルス濃度でペプチドパルスした細胞に対してＴ細胞を活性化する能力について試験した。Ｔ細胞を、全ての条件で１ｎＭのｓｃＤｂとともに２：１のエフェクター：標的細胞比で共培養した。Ｔ細胞は、Ｒ１７５Ｈでパルスした細胞に対して高レベルのＩＦＮｇを産生したが、Ｒ１７５ＷＴ細胞では全てのｓｃＤｂで産生されなかった。Ｙ５７Ｉ及びＦ５３ＳｓｃＤｂは、二重変異体及び元のＨ２ｓｃＤｂと比較して、１ｎＭのペプチドでＩＦＮｇ応答の増加をもたらした。

【図7】ＫＭＳ２６細胞との共培養において、Ｈ２バリアントが、元のＨ２ｓｃＤｂよりも低いＥＣ_５０を有することを示す。内因性ｐ５３^{Ｒ１７５Ｈ}（ＴＰ５３Ｒ１７５Ｈ、塗りつぶした記号）またはｐ５３ノックアウト（ＴＰ５３ＫＯ、白抜きの記号）を有する５×１０^４の初代ヒトＴ細胞及び２．５×１０^４のＫＭＳ２６標的細胞を、１０ｎＭ～０．１６９ｐＭのｓｃＤｂの３倍希釈液の存在下で一晩共培養した。Ｈ２バリアントは、同じ濃度のｓｃＤｂで元のＨ２ｓｃＤｂと比較すると、増加した細胞毒性（Ａ）及びインターフェロンγ応答（Ｂ）をもたらす。Ｒ１７５Ｈ細胞株に対するＥＣ_５０値を、５パラメータのロジスティック曲線をフィッティングさせることによって決定した（Ｒ１７５Ｈは実線、ｐ５３ＫＯは点線）。

【図8A】図８Ａ～８Ｄは、Ｈ２バリアントが、内因性Ｒ１７５Ｈ変異を有する標的細胞株に対して強い細胞毒性を生じることを示す。バリアントｓｃＤｂを、２：１のエフェクター対標的細胞比でのヒトＴ細胞と内因性Ｒ１７５ＨＨＬＡ－Ａ２＋細胞株との共培養において、０．０１ｎＭ、０．１ｎＭ、及び１ｎＭで試験した。全ての標的細胞株（ＴＹＫｎｕ、Ａ；ＫＭＳ２６、Ｂ；ＫＬＥ、Ｃ；Ｎａｌｍ６、Ｄ）で、バリアントｓｃＤｂは、元のＨ２ｓｃＤｂよりも活性が増加した。各ｓｃＤｂ濃度での毒性を、Ｔｕｋｅｙの多重比較検定を用いた通常の双方向ＡＮＯＶＡによって比較した。Ｎａｌｍ６Ｒ１７５Ｈは、ＣＲＩＳＰＲ編集によってＴＰ５３Ｒ１７５Ｈ変異を有するように操作されたＨＬＡ－Ａ２陽性細胞株である。Ａ～Ｃ：各ｓｃＤｂのバー、左から右に：Ｒ１７５Ｈ、０．０１ｎＭ；Ｒ１７５Ｈ、０．１ｎＭ；Ｒ１７５Ｈ、１ｎＭ；ｐ５３ＫＯ、０．０１ｎＭ；ｐ５３ＫＯ、０．１ｎＭ；ｐ５３ＫＯ、１ｎＭ；図８Ｄ：各ｓｃＤｂのバー、左から右に：Ｒ１７５Ｈ、０．０１ｎＭ；Ｒ１７５Ｈ、０．１ｎＭ；Ｒ１７５Ｈ、１ｎＭ；ｐ５３ＫＯ、０．０１ｎＭ；ｐ５３ＫＯ、０．１ｎＭ；ｐ５３ＫＯ、１ｎＭ。

【図8B】図８Ａの説明を参照のこと。

【図8C】図８Ａの説明を参照のこと。

【図8D】図８Ａの説明を参照のこと。

【図9A】図９Ａ～９Ｄは、ＳＰＲによって、Ｆ５３Ｓ、Ｙ５７Ｉ及びＦ５３Ｓ／Ｙ５７ＩがＲ１７５Ｈ／ＨＬＡ－Ａ２に対する親和性を増加させたことを示す。元のＨ２（Ａ）、Ｆ５３Ｓ（Ｂ）、Ｙ５７Ｉ（Ｃ）及びＦ５３Ｓ／Ｙ５７Ｉ（Ｄ）ｓｃＤｂの結合親和性を、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって測定した。Ｒ１７５Ｈ／Ａ２（黒い破線）またはＲ１７５ＷＴ／Ａ２（薄いグレーの破線）モノマーでコーティングされたチップを、濃度を増加させたｓｃＤｂに曝露した。元のＨ２（Ａ）、Ｆ５３Ｓ（Ｂ）、Ｙ５７Ｉ（Ｃ）及びＦ５３Ｓ／Ｙ５７Ｉ（Ｄ）について測定された親和性（Ｋ_Ｄ）は、それぞれ、２９．５ｎＭ、１２．９ｎＭ、６．８ｎＭ及び３．３ｎＭである。

【図9B】図９Ａの説明を参照のこと。

【図9C】図９Ａの説明を参照のこと。

【図9D】図９Ａの説明を参照のこと。

【図10A】図１０Ａ～１０Ｉは、Ｈ２バリアントがインビボで腫瘍増殖を制御することができることを示す。Ａ：バリアントｓｃＤｂが元のＨ２ｓｃＤｂと比較してインビボでの有効性を改善したかどうかを試験するために、１３～１５週齢の雌ＮＳＧマウスに、ｓｃＤｂを含む連続注入ポンプ（ｓｃＤｂ用量０．１５ｍｇ／ｋｇ／日を１４日間）で処理する２日前に、１×１０^６のルシフェラーゼ陽性ＫＭＳ２６細胞及び１×１０^７のヒトＴ細胞を接種した。処理群は、－１日目に無作為化した。腫瘍負荷は、ＩＶＩＳシステムを用いた生物発光イメージングによって３日ごとに追跡した。群当たりＮ＝６のマウス。Ｂ～Ｆ：全フラックス測定値を、各マウスについて胸部にわたって測定された注入対照蛍光色素に対して正規化した。Ｂ、元のＨ２、Ｃ、Ｆ５３Ｓ、Ｄ、Ｙ５７Ｉ、Ｅ、Ｆ５３Ｓ／Ｙ５７Ｉ、Ｆ：Ｌ２アイソタイプ対照。Ｇ：各時点での生物発光画像が表示される。全ての時点で６０秒の曝露時間にわたって発光を検出した。Ｈは、Ｙ５７Ｉ及びＦ５３Ｓ／Ｙ５７ＩがインビボでＫＭＳ２６腫瘍増殖を制御することを示す。各時点で各処理ｓｃＤｂを元のＨ２ｓｃＤｂと比較したＧｅｉｓｓｎｅｒ－Ｇｒｅｅｎｈｏｕｓｅ補正を伴う双方向反復測定ＡＮＯＶＡ及びＤｕｎｎｅｔｔの多重比較検定は、Ｙ５７Ｉ及びＦ５３Ｓ／Ｙ５７Ｉが、処理５日目及び８日目にＨ２よりも良好に腫瘍増殖を制御することを示している（Ｐ＜０．０５）。全フラックス測定値を、各マウスについて胸部にわたって測定された注入対照蛍光色素に対して正規化した。Ｉは、Ｙ５７ＩがインビボでＫＭＳ２６腫瘍増殖を制御することを示す。図９Ａ～９Ｇからの生物発光データのＭａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙの多重検定は、Ｙ５７Ｉが、元のＨ２ｓｃＤｂと比較して８日目に腫瘍制御を改善したことを示している（Ｐ＝０．０１９）。処理後２週間で、Ｙ５７Ｉで処理したマウスに腫瘍再発は見られなかった。群当たりＮ＝６のマウス。全フラックス測定値を、各マウスについて胸部にわたって測定された注入対照蛍光色素に対して正規化した。

【図10B】図１０Ａの説明を参照のこと。

【図10C】図１０Ａの説明を参照のこと。

【図10D】図１０Ａの説明を参照のこと。

【図10E】図１０Ａの説明を参照のこと。

【図10F】図１０Ａの説明を参照のこと。

【図10G】図１０Ａの説明を参照のこと。

【図10H】図１０Ａの説明を参照のこと。

【図10I】図１０Ａの説明を参照のこと。

【図11A】図１１Ａ～１１Ｇは、Ｈ２バリアントが、インビボでＮａｌｍ６^{Ｒ１７５Ｈ}腫瘍増殖を制御することを示す。Ａ：Ｈ２バリアントがより低いｓｃＤｂ用量でより速く増殖するＮａｌｍ６^{Ｒ１７５Ｈ}細胞株をより良く制御することができるかどうかを試験するために、７～８週齢の雌ＮＳＧマウスに、ｓｃＤｂを含む連続注入ポンプ（ｓｃＤｂ用量０．０７５ｍｇ／ｋｇ／日を１４日間）で処理する２日前に、５×１０^５のルシフェラーゼ陽性Ｎａｌｍ６^{Ｒ１７５Ｈ}細胞及び１×１０^７のヒトＴ細胞を接種した。処理群は、－１日目に無作為化した。腫瘍負荷は、ＩＶＩＳシステムを用いた生物発光イメージングによって追跡した。ｓｃＤｂ当たりＮ＝６の２つの独立した実験を行った。結果は総計で報告され、Ｎ＝合計１２である。Ｂ～Ｆ：平均輝度値：Ｂ、元のＨ２、Ｃ、Ｆ５３Ｓ、Ｄ、Ｙ５７Ｉ、Ｅ、Ｆ５３Ｓ／Ｙ５７Ｉ、Ｆ：アイソタイプ対照。Ｇ：Ｇｅｉｓｓｎｅｒ－Ｇｒｅｅｎｈｏｕｓｅ補正を伴う双方向反復測定ＡＮＯＶＡ及びＤｕｎｎｅｔｔの多重比較検定は、処理７日目に、全てのＨ２バリアントが腫瘍制御を改善し（Ｈ２対Ｆ５３ＳＰ＝０．００９３、Ｙ５７ＩＰ＝０．０１２６、Ｆ５３Ｓ／Ｙ５７ＩＰ＝０．００３０）、Ｈ２がアイソタイプ対照ｓｃＤｂよりも優れていたことを示している（Ｐ＜０．０００１）。Ｄｕｎｎｅｔｔの多重比較検定によると、Ｆ５３Ｓ／Ｙ５７Ｉは、１４日目にＨ２と比較して優れた腫瘍制御を示した（双方向反復測定ＡＮＯＶＡ、Ｐ＝０．０２９５）。

【図11B】図１１Ａの説明を参照のこと。

【図11C】図１１Ａの説明を参照のこと。

【図11D】図１１Ａの説明を参照のこと。

【図11E】図１１Ａの説明を参照のこと。

【図11F】図１１Ａの説明を参照のこと。

【図11G】図１１Ａの説明を参照のこと。

【図12A】図１２Ａ～１２Ｅは、Ｙ５７ＩｓｃＤｂがインビボの遅延処理モデルにおいてＫＭＳ２６を制御することを示す。Ａ：確立された腫瘍モデルにおいてｓｃＤｂＹ５７Ｉの抗腫瘍有効性を比較するために、７～９週齢の雌ＮＳＧマウスに３．５×１０^５のＫＭＳ２６細胞を接種し、６日後の処理－１日目に無作為化した。腫瘍接種の７日後に、マウスを１×１０^７のヒトＴ細胞で静脈内処理し、マウス腹腔内に外科的に配置された１４日間連続放出ポンプを使用して、０．０７５ｍｇ／ｋｇ／日のｓｃＤｂで処理した群当たりＮ＝５。Ｂ～Ｄ：平均輝度値：Ｂ：元のＨ２；Ｃ：Ｙ５７Ｉ、Ｄ：アイソタイプ。Ｅ：群平均輝度。１４日目の処理終了時に、Ｈ２ｓｃＤｂとＹ５７ＩｓｃＤｂを比較したＭａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙの検定により、Ｙ５７ＩｓｃＤｂで処理したマウスがより低い腫瘍負荷を有していたことが示された（Ｐ＝０．００７９）。

【図12B】図１２Ａの説明を参照のこと。

【図12C】図１２Ａの説明を参照のこと。

【図12D】図１２Ａの説明を参照のこと。

【図12E】図１２Ａの説明を参照のこと。

【発明を実施するための形態】

【0037】

詳細な説明
本明細書は、がんを有するかもしくはがんを有すると疑われる哺乳動物を評価するための、及び／またはがんを有する哺乳動物を治療するための方法及び材料に関する。例えば、本文書は、がんを有する哺乳動物を治療するために、修飾ペプチド（例えば、腫瘍抗原）に結合することができる１つ以上の抗原結合ドメイン（例えば、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ））を含む分子を使用するための方法及び材料を提供する。

【0038】

細胞内ドライバー遺伝子を標的とする二重特異性抗体の一例は、ＨＬＡ－Ａ２上で９ｍｅｒペプチドとして提示されるＴＰ５３Ｒ１７５Ｈ変異（変異ペプチド

配列番号３の１６８～１７６位に対応し、１７５位にＲ→Ｈ変異を有する）；ＷＴペプチド

を標的とするＨ２二重特異性抗体である。Ｈｓｉｕｅｅｔａｌ．，“ＴａｒｇｅｔｉｎｇａＮｅｏａｎｔｉｇｅｎＤｅｒｉｖｅｄｆｒｏｍａＣｏｍｍｏｎＴＰ５３Ｍｕｔａｔｉｏｎ，”Ｓｃｉｅｎｃｅ３７１（６５３３）：ｅａｂｃ８６９７（２０２１）を参照されたい。また、ＷＯ２０２１／１２７８４も参照されたい。これらの各々は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。Ｈ２二重特異性抗体は、分子の一端に抗ＣＤ３結合ドメインを含み、反対側の端にｐＭＨＣ結合ドメインを含む。Ｔ細胞のＴ細胞受容体複合体中の標的細胞ｐＭＨＣ及びＣＤ３に結合すると、二重特異性抗体は、Ｔ細胞を活性化して、サイトカイン放出と標的細胞のＴ細胞媒介性殺傷の両方を誘導する。このＨ２二重特異性抗体は、インビトロでの抗がん細胞による殺傷を促進し、インビボでの腫瘍増殖を制限することができるが、さらなる改善は、インビボでの腫瘍クリアランス及び性能の改善を可能にし得る。実際、他のものは、二重特異性抗体の結合親和性を増加させることにより、それらの効力を有意に改善することができることを示した。

【0039】

とりわけ、ｐＭＨＣ結合ドメイン内の単一アミノ酸変化を含むバリアントを選択し、次いで相対的親和性によって特異的バリアントを区別するためのスクリーニング方法によって識別される、インビトロ及びインビボの両方で改善された性能を有するＲ１７５Ｈ変異ペプチドに対する特異性を維持する親和性成熟Ｈ２バリアントが本明細書に記載される。この方法によって同定された高い相対的親和性を有するバリアントは、インビトロ及びインビボの両方で元のＨ２バリアントよりも優れている。これらのバリアント二重特異性抗体は、Ｒ１７５Ｈ変異ペプチドに対して同じ特異性を維持しながら、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって測定されるより高い親和性を有する。これらの親和性成熟Ｈ２バリアントは、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）または他のｓｃＦｖに基づく治療法として使用するために適合させることもできる。

【0040】

がんを有するかもしくはがんを有すると疑われる哺乳動物を評価するための、及び／またはがんを有する哺乳動物を治療するための方法及び組成物もまた、本明細書に記載される。例えば、ＴＰ５３Ｒ１７５Ｈ変異ペプチドを標的とする（例えば、それに結合する）ことができる１つ以上の抗原結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）を含む１つ以上の分子を使用して、がんを有するかもしくはがんを有すると疑われる哺乳動物を評価すること、及び／またはがん（例えば、１つ以上の修飾ペプチドを発現するがん）を有する哺乳動物を治療することができる。ある場合には、ＴＰ５３Ｒ１７５Ｈ変異ペプチドを標的とする（例えば、それに結合する）ことができる１つ以上の抗原結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）を含む１つ以上の分子を使用して、がんを有するかまたはがんを有すると疑われる哺乳動物から得られた試料中の１つ以上の修飾ペプチドの存在または非存在を検出することができる。ある場合には、ＴＰ５３Ｒ１７５Ｈ変異ペプチドを標的とする（例えば、それに結合する）ことができる１つ以上の抗原結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）を含む１つ以上の分子を、がん（例えば、修飾ペプチドを発現するがん）を有する哺乳動物に投与して哺乳動物を治療することができる。

【0041】

本明細書で使用される場合、修飾ペプチドは、修飾ポリペプチドに由来するペプチドである。修飾ポリペプチドは、任意の適切な修飾ポリペプチド（例えば、発がん性遺伝子の変異または腫瘍抑制遺伝子の変異等の疾患を引き起こす変異を有するポリペプチド）であり得る。修飾ペプチドは、ＷＴペプチド（例えば、修飾ポリペプチドが由来するＷＴポリペプチドに由来するペプチド）に対して１つ以上のアミノ酸修飾（例えば、置換）を有することができる。修飾ペプチドはまた、変異ペプチドとも称され得る。ある場合には、修飾ペプチドは、腫瘍抗原であり得る。腫瘍抗原の例としては、ＭＡＮＡ、腫瘍関連抗原、及び腫瘍特異的抗原が挙げられるが、これらに限定されない。

【0042】

修飾ペプチドは、任意の適切な長さであり得る。ある場合には、修飾ペプチドは、約７アミノ酸～約２５アミノ酸長（例えば、約８アミノ酸～約２５アミノ酸、約９アミノ酸～約２５アミノ酸、約１０アミノ酸～約２５アミノ酸、約１１アミノ酸～約２５アミノ酸、約１２アミノ酸～約２５アミノ酸、約１３アミノ酸～約２５アミノ酸、約１５アミノ酸～約２５アミノ酸、約１８アミノ酸～約２５アミノ酸、約２０アミノ酸～約２５アミノ酸、約７アミノ酸～約２２アミノ酸、約７アミノ酸～約２０アミノ酸、約７アミノ酸～約１８アミノ酸、約７アミノ酸～約１５アミノ酸、約７アミノ酸～約１２アミノ酸、約７アミノ酸～約１０アミノ酸、約７アミノ酸～約９アミノ酸、約８アミノ酸～約２２アミノ酸、約１０アミノ酸～約１８アミノ酸、約１２アミノ酸～約１５アミノ酸、約８アミノ酸～約１２アミノ酸、約１２アミノ酸～約１８アミノ酸、約１８アミノ酸～約２２アミノ酸、または約９アミノ酸～約１０アミノ酸）であり得る。例えば、修飾ペプチドは、約９アミノ酸長であり得る。例えば、修飾ペプチドは、約１０アミノ酸長であり得る。修飾ペプチドは、任意の修飾ポリペプチドに由来し得る。本明細書に記載の修飾ペプチドが由来し得る修飾ポリペプチドの例としてはｐ５３が挙げられるが、これに限定されない。

【0043】

本明細書に記載の修飾ＴＰ５３Ｒ１７５Ｈ変異ペプチド（例えば、配列番号１を含むかまたはそれからなる）は、任意の適切なＨＬＡとの複合体中にあり得る。ＨＬＡは、任意の適切なＨＬＡ対立遺伝子であり得る。ある場合には、ＨＬＡは、クラスＩＨＬＡ（例えば、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、及びＨＬＡ－Ｃ）対立遺伝子であり得る。ある場合には、ＨＬＡは、クラスＩＩＨＬＡ（例えば、ＨＬＡ－ＤＰ、ＨＬＡ－ＤＭ、ＨＬＡ－ＤＯＡ、ＨＬＡ－ＤＯＢ、ＨＬＡ－ＤＱ、及びＨＬＡ－ＤＲ）対立遺伝子であり得る。本明細書に記載の修飾ペプチドが複合体化することができるＨＬＡ対立遺伝子の例としては、ＨＬＡ－Ａ１及びＨＬＡ－Ａ２が挙げられるが、これらに限定されない。特定の修飾ペプチドの例示的なＨＬＡ対立遺伝子を表１に示す。例えば、本明細書に記載の修飾ＴＰ５３Ｒ１７５Ｈ変異ペプチド（例えば、配列番号１を含むかまたはそれからなる）は、ＨＬＡ－Ａ２及びβ２Ｍとの複合体中にあり得る。

【0044】

本明細書に記載されるのは、本明細書に記載の修飾ＴＰ５３Ｒ１７５Ｈ変異ペプチド（例えば、配列番号１を含むかまたはそれからなる）に結合することができる１つ以上の抗原結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）を含む分子である。ある場合には、本明細書に記載の修飾ＴＰ５３Ｒ１７５Ｈ変異ペプチド（例えば、配列番号１を含むかまたはそれからなる）に結合することができる１つ以上の抗原結合ドメインを含む分子は、本明細書に記載の非複合体化修飾ペプチド（例えば、複合体（例えば、ペプチド－ＨＬＡ－β２Ｍ複合体）中に存在しない本明細書に記載の修飾ペプチドを、例えば、含むかまたはそれからなる）を標的としない（例えば、それに結合しない）。ある場合には、本明細書に記載の修飾ＴＰ５３Ｒ１７５Ｈ変異ペプチド（例えば、配列番号１を含むかまたはそれからなる）に結合することができる１つ以上の抗原結合ドメインを含む分子は、ＷＴペプチド（例えば、修飾ポリペプチドが由来するＷＴポリペプチドに由来するペプチド）を標的としない（例えば、それに結合しない）。

【0045】

本明細書に記載の修飾ＴＰ５３Ｒ１７５Ｈ変異ペプチド（例えば、配列番号１を含むかまたはそれからなる）に結合することができる１つ以上の抗原結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）を含む分子は、任意の適切なタイプの分子であり得る。ある場合には、分子は、一価分子（例えば、単一抗原結合ドメインを含む）であり得る。ある場合には、分子は、多価分子（例えば、２つ以上の抗原結合ドメインを含み、２つ以上の抗原を同時に標的とする）であり得る。例えば、二重特異性分子は、２つの抗原結合ドメインを含むことができ、三重特異性分子は、３つの抗原結合ドメインを含むことができ、四重特異性分子は、４つの抗原結合ドメインを含むことができる等である。抗原結合ドメインを含有する分子の例としては、抗体、抗体断片、ｓｃＦｖ、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、ＴＣＲ模倣体、タンデムｓｃＦｖ、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー、ダイアボディ、ｓｃＤｂ、ｓｃＦｖ－Ｆｃ、二重特異性抗体、二重特異性一本鎖Ｆｃ、二重親和性再ターゲティング抗体（ＤＡＲＴ）、ならびに少なくとも１つの可変重鎖（ＶＨ）及び少なくとも１つの可変軽鎖（ＶＬ）を含む任意の他の分子が挙げられるが、これらに限定されない。これらの分子のうちのいずれかを、本明細書に記載の材料及び方法に従って使用することができる。ある場合には、抗原結合ドメインは、ｓｃＦｖであり得る。例えば、本明細書に記載の修飾ペプチドに結合することができる１つ以上の抗原結合ドメイン（例えば、１つ以上のｓｃＦｖ）を含む分子は、ＣＡＲであり得る。例えば、本明細書に記載の修飾ペプチドに結合することができる２つのｓｃＦｖを含む分子は、一本鎖ダイアボディ（ｓｃＤｂ）であり得る。

【0046】

ある場合には、本明細書に記載の修飾ＴＰ５３Ｒ１７５Ｈ変異ペプチド（例えば、配列番号１を含むかまたはそれからなる）に結合することができる１つ以上の抗原結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）を含む分子が多価分子（例えば、二重特異性分子）である場合、第１の抗原結合ドメインは、本明細書に記載の修飾ペプチドに結合することができ、第２の抗原結合ドメインは、エフェクター細胞（例えば、エフェクター細胞上に存在する抗原）に結合することができる。エフェクター細胞の例としては、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、Ｂ細胞、形質細胞、マクロファージ、単球、ミクログリア、樹状細胞、好中球、線維芽細胞、及び肥満細胞が挙げられるが、これらに限定されない。エフェクター細胞上に存在する抗原の例としては、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２８、ＮＫＧ２Ｄ、ＰＤ－１、ＣＴＬＡ－４、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＣＤ２７、Ｆｃ受容体（例えば、ＣＤ１６ａ）、及び任意の他のエフェクター細胞表面受容体が挙げられるが、これらに限定されない。ある場合には、本明細書に記載の分子は、本明細書に記載の修飾ＴＰ５３Ｒ１７５Ｈ変異ペプチド（例えば、配列番号１を含むかまたはそれからなる）に結合することができる第１の抗原結合ドメインと、Ｔ細胞上に存在する抗原（例えば、ＣＤ３）に結合することができる第２の抗原結合ドメインとを含むことができる。ある場合には、ＣＤ３に結合することができる配列（例えば、ｓｃＦｖ配列）は、表２または表３に示される通りであり得る。ある場合には、ＣＤ３に結合することができる配列（例えば、ｓｃＦｖ配列）は、他に記載される通りであり得る（例えば、Ｒｏｄｒｉｇｕｅｓｅｔａｌ．，１９９２ＩｎｔＪＣａｎｃｅｒＳｕｐｐｌ．７：４５－５０、Ｓｈａｌａｂｙｅｔａｌ．，１９９２ＪＥｘｐＭｅｄ．１７５：２１７－２５、Ｂｒｉｓｃｈｗｅｉｎｅｔａｌ．，２００６ＭｏｌＩｍｍｕｎｏｌ．４３：１１２９－４３、Ｌｉｅｔａｌ．，２００５Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．１１６：４８７－９８、ＷＯ２０１２１６２０６７、ＵＳ２００７００６５４３７、ＵＳ２００７００６５４３７、ＵＳ２００７００６５４３７、ＵＳ２００７００６５４３７、ＵＳ２００７００６５４３７、及びＵＳ２００７００６５４３７を参照されたい）。ある場合には、本明細書に記載の分子は、本明細書に記載の修飾ペプチドに結合することができる第１の抗原結合ドメインと、ＮＫ細胞上に存在する抗原（例えば、ＣＤ１６ａまたはＮＫＧ２Ｄ）に結合することができる第２の抗原結合ドメインとを含むことができる。ある場合には、ＣＤ１６ａに結合することができる配列（例えば、ｓｃＦｖ配列）は、表４に示される通りであり得る。修飾ペプチドとエフェクター細胞の両方に結合することによって、多価分子は、（例えば、ＨＬＡ複合体の一部として）修飾ペプチドを発現する細胞をエフェクター細胞に近接させることができ、エフェクター細胞が修飾ペプチドを発現する細胞に作用することを可能にする。

【0047】

ある場合には、本明細書に記載の修飾ＴＰ５３Ｒ１７５Ｈ変異ペプチド（例えば、配列番号１を含むかまたはそれからなる）に結合することができる１つ以上の抗原結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）を含む分子が多価分子（例えば、二重特異性分子）である場合、分子は、少なくとも１つのＶＨ及び少なくとも１つのＶＬを含む任意の適切なフォーマットであり得る。例えば、ＶＨ及びＶＬは、任意の適切な配向にあってもよい。ある場合には、ＶＨは、ＶＬに対してＮ末端側にあり得る。ある場合には、ＶＨは、ＶＬに対してＣ末端側にあり得る。ある場合には、リンカーアミノ酸配列は、ＶＨとＶＬとの間に配置され得る。

【0048】

ある場合には、二重特異性分子がタンデムｓｃＦｖを含む場合、タンデムｓｃＦｖは、任意の適切な配向にあり得る。ｓｃＦｖ－Ａ及びｓｃＦｖ－Ｂを含むタンデムｓｃＦｖ配向の例としては、ＶＬＡ－ＬＬ－ＶＨＡ－ＳＬ－ＶＬＢ－ＬＬ－ＶＨＢ、ＶＬＡ－ＬＬ－ＶＨＡ－ＳＬ－ＶＨＢ－ＬＬ－ＶＬＢ、ＶＨＡ－ＬＬ－ＶＬＡ－ＳＬ－ＶＬＢ－ＬＬ－ＶＨＢ、ＶＨＡ－ＬＬ－ＶＬＡ－ＳＬ－ＶＨＢ－ＬＬ－ＶＬＢ、ＶＬＢ－ＬＬ－ＶＨＢ－ＳＬ－ＶＬＡ－ＬＬ－ＶＨＡ、ＶＬＢ－ＬＬ－ＶＨＢ－ＳＬ－ＶＨＡ－ＬＬ－ＶＬＡ、ＶＨＢ－ＬＬ－ＶＬＢ－ＳＬ－ＶＬＡ－ＬＬ－ＶＨＡ、及びＶＨＢ－ＬＬ－ＶＬＢ－ＳＬ－ＶＨＡ－ＬＬ－ＶＬＡが挙げられるが、これらに限定されず、ＳＬは短いリンカーであり、ＬＬは長いリンカーである。短いリンカーは、約３アミノ酸～約１０アミノ酸長であり得る。短いリンカーは、任意の適切なアミノ酸（例えば、グリシン及びセリン）を任意の適切な組み合わせで含むことができる。長いリンカーは、約１０アミノ酸～約２５アミノ酸長であり得る。長いリンカーは、任意の適切なアミノ酸（例えば、グリシン及びセリン）を任意の適切な組み合わせで含むことができる。

【0049】

ある場合には、二重特異性分子がダイアボディである場合、ダイアボディは、任意の適切な配向にあり得る。ｓｃＦｖ－Ａ及びｓｃＦｖ－Ｂを含むダイアボディの配向の例としては、ＶＬＡ－ＳＬ－ＶＨＢ及びＶＬＢ－ＳＬ－ＶＨＡ、ＶＬＡ－ＳＬ－ＶＬＢ及びＶＨＢ－ＳＬ－ＶＨＡ、ＶＨＡ－ＳＬ－ＶＬＢ及びＶＨＢ－ＳＬ－ＶＬＡ、ＶＬＢ－ＳＬ－ＶＨＡ及びＶＬＡ－ＳＬ－ＶＨＢ、ＶＬＢ－ＳＬ－ＶＬＡ及びＶＨＡ－ＳＬ－ＶＨＢ、ならびにＶＨＢ－ＳＬ－ＶＬＡ及びＶＨＡ－ＳＬ－ＶＬＢが挙げられるが、これらに限定されず、ＳＬは短いリンカーである。短いリンカーは、約３アミノ酸～約１０アミノ酸長であり得る。短いリンカーは、任意の適切なアミノ酸（例えば、グリシン及びセリン）を任意の適切な組み合わせで含むことができる。

【0050】

ある場合には、二重特異性分子がｓｃＤｂである場合、ｓｃＤｂは、任意の適切な配向にあり得る。ｓｃＦｖ－Ａ及びｓｃＦｖ－Ｂを含むｓｃＤｂの配向の例としては、ＶＬＡ－ＳＬ－ＶＨＢ－ＬＬ－ＶＬＢ－ＳＬ－ＶＨＡ、ＶＨＡ－ＳＬ－ＶＬＢ－ＬＬ－ＶＨＢ－ＳＬ－ＶＬＡ、ＶＬＡ－ＳＬ－ＶＬＢ－ＬＬ－ＶＨＢ－ＳＬ－ＶＨＡ、ＶＨＡ－ＳＬ－ＶＨＢ－ＬＬ－ＶＬＢ－ＳＬ－ＶＬＡ、ＶＬＢ－ＳＬ－ＶＨＡ－ＬＬ－ＶＬＡ－ＳＬ－ＶＨＢ、ＶＨＢ－ＳＬ－ＶＬＡ－ＬＬ－ＶＨＡ－ＳＬ－ＶＬＢ、ＶＬＢ－ＳＬ－ＶＬＡ－ＬＬ－ＶＨＡ－ＳＬ－ＶＨＢ、及びＶＨＢ－ＳＬ－ＶＨＡ－ＬＬ－ＶＬＡ－ＳＬ－ＶＬＢが挙げられるが、これらに限定されず、ＳＬは短いリンカーであり、ＬＬは長いリンカーである。短いリンカーは、約３アミノ酸～約１０アミノ酸長であり得る。短いリンカーは、任意の適切なアミノ酸（例えば、グリシン及びセリン）を任意の適切な組み合わせで含むことができる。長いリンカーは、約１０アミノ酸～約２５アミノ酸長であり得る。長いリンカーは、任意の適切なアミノ酸（例えば、グリシン及びセリン）を任意の適切な組み合わせで含むことができる。

【0051】

ある場合には、二重特異性分子がｓｃＦｖ－Ｆｃである場合、ｓｃＦｖ－Ｆｃは、任意の適切な配向にあり得る。ｓｃＦｖ－Ｆｃ－Ａ、ｓｃＦｖ－Ｆｃ－Ｂ、及びＦｃドメインを含むｓｃＦｖ－Ｆｃの配向の例としては、ＶＬＡ－ＬＬ－ＶＨＡ－ヒンジ－Ｆｃ及びＶＬＢ－ＬＬ－ＶＨＢ－ヒンジ－Ｆｃ、ＶＨＡ－ＬＬ－ＶＬＡ－ヒンジ－Ｆｃ及びＶＨＢ－ＬＬ－ＶＬＢ－ヒンジ－Ｆｃ、ＶＬＡ－ＬＬ－ＶＨＡ－ヒンジ－Ｆｃ及びＶＨＢ－ＬＬ－ＶＬＢ－ヒンジ－Ｆｃ、ＶＨＡ－ＬＬ－ＶＬＡ－ヒンジ－Ｆｃ及びＶＬＢ－ＬＬ－ＶＨＢ－ヒンジ－Ｆｃが挙げられるが、これらに限定されず、ＬＬは短いリンカーである。長いリンカーは、約１０アミノ酸～約２５アミノ酸長であり得る。長いリンカーは、任意の適切なアミノ酸（例えば、グリシン及びセリン）を任意の適切な組み合わせで含むことができる。ある場合には、ｓｃＦｖ－ＦｃのＦｃドメインは、ｓｃＦｖ－Ｆｃのヘテロ二量体化を増加させる、及び／またはホモ二量体化を減少させるために、１つ以上の修飾を含むことができる。ある場合には、ｓｃＦｖ－Ｆｃ内のＦｃドメインは、ヒンジドメインを除外することができる。ある場合には、ｓｃＦｖ－ＦｃのＦｃドメインは、ｓｃＦｖのＮ末端にあり得る。

【0052】

ある場合には、二重特異性分子が二重特異性一本鎖Ｆｃである場合、二重特異性一本鎖Ｆｃは、任意の適切な配向にあり得る。二重特異性一本鎖Ｆｃの配向の例としては、ＶＬＡ－ＬＬ－ＶＨＡ－ＳＬ－ＶＨＢ－ＬＬ－ＶＬＢ－ＳＬ－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３－ＬＬ－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３、ＶＬＡ－ＬＬ－ＶＨＡ－ＳＬ－ＶＬＢ－ＬＬ－ＶＨＢ－ＳＬ－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３－ＬＬ－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３、ＶＨＡ－ＬＬ－ＶＬＡ－ＳＬ－ＶＬＢ－ＬＬ－ＶＨＢ－ＳＬ－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３－ＬＬ－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３、ＶＨＡ－ＬＬ－ＶＬＡ－ＳＬ－ＶＨＢ－ＬＬ－ＶＬＢ－ＳＬ－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３－ＬＬ－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３、及びＶＬＡ－ＳＬ－ＶＨＢ－ＬＬ－ＶＬＢ－ＶＨＡ－ＳＬ－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３－ＬＬ－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３が挙げられるが、これらに限定されず、ＳＬは短いリンカーであり、ＬＬは長いリンカーである。短いリンカーは、約３アミノ酸～約８アミノ酸長であり得る。短いリンカーは、任意の適切なアミノ酸（例えば、グリシン及びセリン）を任意の適切な組み合わせで含むことができる。長いリンカーは、約１０アミノ酸～約２５アミノ酸長であり得る。長いリンカーは、任意の適切なアミノ酸（例えば、グリシン及びセリン）を任意の適切な組み合わせで含むことができる。任意の適切なＦｃドメインを二重特異性一本鎖Ｆｃに使用することができる。ある場合には、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ（例えば、天然ＩｇＧ）に由来するアミノ酸配列を含むことができる。場合によっては、Ｆｃドメインは、１つ以上の修飾（例えば、分子の安定性を高めるための、及び／または１つ以上のＦｃ受容体への結合を増加もしくは減少させるための１つ以上の修飾）を含むアミノ酸配列を含むことができる。ある場合には、二重特異性一本鎖Ｆｃに使用することができるＦｃドメインは、ヒンジドメインを除外することができる。ある場合には、二重特異性一本鎖Ｆｃに使用することができるＦｃドメインは、ｓｃＦｖのＮ末端にあり得る。いくつかの場合では、二重特異性一本鎖Ｆｃで使用することができるＦｃドメインは、他に記載される通りであり得る（例えば、国際特許出願公開第ＷＯ２０１７／１３４１３４Ａ１号の配列番号２５～３２；ならびに国際特許出願公開第ＷＯ２０１７／１３４１５８Ａ１号の、例えば、表３８及び配列番号２５～３２を参照されたい）。

【0053】

本明細書に記載の修飾ＴＰ５３Ｒ１７５Ｈ変異ペプチド（例えば、配列番号１を含むかまたはそれからなる）に結合することができる１つ以上の抗原結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）を含む分子は、任意の適切な相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むことができる。例えば、本明細書に記載の修飾ペプチドに結合することができる１つ以上の抗原結合ドメインを含む分子は、３つのＶＨ相補性決定領域（ＣＤＲ－ＶＨ）を有する可変重鎖（ＶＨ）、及び３つのＶＬＣＤＲ（ＣＤＲ－ＶＬ）を有する可変軽鎖（ＶＬ）を含むことができる。

【0054】

ある場合には、本明細書に記載の修飾ＴＰ５３Ｒ１７５Ｈ変異ペプチド（例えば、配列番号１を含むかまたはそれからなる）に結合することができる分子は、Ｙ５７Ｉ、Ｓ９２Ｎ、Ａ３１Ｓ、Ｓ９５Ｔ、Ｓ９２Ｅ、Ｓ９５Ｄ、Ｓ９５Ｋ、Ｒ２４Ｄ、Ｖ２９Ｄ、Ｆ５３Ｓ、Ｓ２６Ｐ、Ｖ２９Ｅ、Ｑ９０Ｄ、及びＹ５７Ｌからなる群から選択されるＨ２（配列番号４）に対する１つ以上の変異を含む。いくつかの場合において、本明細書に記載の修飾ＴＰ５３Ｒ１７５Ｈ変異ペプチド（例えば、配列番号１を含むかまたはそれからなる）に結合することができる分子は、Ｙ５７Ｉ、Ｓ９２Ｎ、Ａ３１Ｓ、Ｓ９５Ｔ、Ｓ９２Ｅ、Ｓ９５Ｄ、Ｓ９５Ｋ、Ｒ２４Ｄ、Ｖ２９Ｄ、Ｆ５３Ｓ、Ｓ２６Ｐ、Ｖ２９Ｅ、Ｑ９０Ｄ、及びＹ５７Ｌからなる群から選択される１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１４個の変異を含む。いくつかの場合において、本明細書に記載の修飾ＴＰ５３Ｒ１７５Ｈ変異ペプチド（例えば、配列番号１を含むかまたはそれからなる）に結合することができる分子は、Ｈ２（配列番号４）に対するＦ５３Ｓ及び／またはＹ５７Ｉ変異を含む。したがって、本明細書に記載の修飾ＴＰ５３Ｒ１７５Ｈ変異ペプチド（例えば、配列番号１を含むかまたはそれからなる）に結合することができる分子は、Ｈ２ＣＤＲ（ＣＤＲ－ＶＬ１：配列番号８、ＣＤＲ－ＶＬ２：配列番号９、ＣＤＲ－ＶＬ３：配列番号１０、ＣＤＲ－ＶＨ１：配列番号１７、ＣＤＲ－ＶＨ２：配列番号１８、及びＣＤＲ－ＶＨ３：配列番号１９）をそれぞれ１つ含むことができるが、但し、Ｙ５７Ｉ、Ｓ９２Ｎ、Ａ３１Ｓ、Ｓ９５Ｔ、Ｓ９２Ｅ、Ｓ９５Ｄ、Ｓ９５Ｋ、Ｒ２４Ｄ、Ｖ２９Ｄ、Ｆ５３Ｓ、Ｓ２６Ｐ、Ｖ２９Ｅ、Ｑ９０Ｄ、及びＹ５７Ｌからなる群から選択される１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１４個の変異（Ｈ２、配列番号４に対する）を含むものとする。ある場合には、変異（複数可）は、Ｆ５３Ｓ及び／またはＹ５７Ｉである。

【0055】

例えば、本明細書に記載の修飾ＴＰ５３Ｒ１７５Ｈ変異ペプチド（例えば、配列番号１を含むかまたはそれからなる）に結合することができる分子は、以下に記載のＣＤＲをそれぞれ１つ含むことができる：
ＣＤＲ－ＶＬ１：配列番号８、
ＣＤＲ－ＶＬ２：配列番号９または配列番号２３、
ＣＤＲ－ＶＬ３：配列番号１０、
ＣＤＲ－ＶＨ１：配列番号１７、
ＣＤＲ－ＶＨ２：配列番号１８または配列番号２７、及び
ＣＤＲ－ＶＨ３：配列番号１９、
この場合、
ｉ）ＣＤＲ－ＶＬ２は、配列番号２３であるか、または
ｉｉ）ＣＤＲ－ＶＨ２は、配列番号２７であるか、または
ｉｉｉ）ＣＤＲ－ＶＬ２は、配列番号２３であり、ＣＤＲ－ＶＨ２は、配列番号２７である。

【0056】

例えば、本明細書に記載の修飾ＴＰ５３Ｒ１７５Ｈ変異ペプチド（例えば、配列番号１を含むかまたはそれからなる）に結合することができる分子は、以下に記載のＣＤＲをそれぞれ１つ含むことができる：
ＣＤＲ－ＶＬ１：配列番号８、
ＣＤＲ－ＶＬ２：配列番号２３、
ＣＤＲ－ＶＬ３：配列番号１０、
ＣＤＲ－ＶＨ１：配列番号１７、
ＣＤＲ－ＶＨ２：配列番号１８または配列番号２７、及び
ＣＤＲ－ＶＨ３：配列番号１９。

【0057】

例えば、本明細書に記載の修飾ＴＰ５３Ｒ１７５Ｈ変異ペプチド（例えば、配列番号１を含むかまたはそれからなる）に結合することができる分子は、以下に記載のＣＤＲをそれぞれ１つ含むことができる：
ＣＤＲ－ＶＬ１：配列番号８、
ＣＤＲ－ＶＬ２：配列番号２３、
ＣＤＲ－ＶＬ３：配列番号１０、
ＣＤＲ－ＶＨ１：配列番号１７、
ＣＤＲ－ＶＨ２：配列番号１８、及び
ＣＤＲ－ＶＨ３：配列番号１９。

【0058】

例えば、本明細書に記載の修飾ＴＰ５３Ｒ１７５Ｈ変異ペプチド（例えば、配列番号１を含むかまたはそれからなる）に結合することができる分子は、以下に記載のＣＤＲをそれぞれ１つ含むことができる：
ＣＤＲ－ＶＬ１：配列番号８、
ＣＤＲ－ＶＬ２：配列番号２３、
ＣＤＲ－ＶＬ３：配列番号１０、
ＣＤＲ－ＶＨ１：配列番号１７、
ＣＤＲ－ＶＨ２：配列番号２７、及び
ＣＤＲ－ＶＨ３：配列番号１９。

【0059】

【0060】

例えば、本明細書に記載の修飾ＴＰ５３Ｒ１７５Ｈ変異ペプチド（例えば、配列番号１を含むかまたはそれからなる）に結合することができる分子は、以下に記載のＣＤＲをそれぞれ１つ含むことができる：
ＣＤＲ－ＶＬ１：配列番号８、
ＣＤＲ－ＶＬ２：配列番号９、
ＣＤＲ－ＶＬ３：配列番号１０、
ＣＤＲ－ＶＨ１：配列番号１７、
ＣＤＲ－ＶＨ２：配列番号２７、及び
ＣＤＲ－ＶＨ３：配列番号１９。

【0061】

例えば、本明細書に記載の修飾ＴＰ５３Ｒ１７５Ｈ変異ペプチド（例えば、配列番号１を含むかまたはそれからなる）に結合することができる分子は、以下に記載のＣＤＲをそれぞれ１つ含むことができる：
ＣＤＲ－ＶＬ１：配列番号８、
ＣＤＲ－ＶＬ２：配列番号２３、
ＣＤＲ－ＶＬ３：配列番号１０、
ＣＤＲ－ＶＨ１：配列番号１７、
ＣＤＲ－ＶＨ２：配列番号２７、及び
ＣＤＲ－ＶＨ３：配列番号１９。

【0062】

ある場合には、本明細書に記載の修飾ＴＰ５３Ｒ１７５Ｈ変異ペプチド（例えば、配列番号１を含むかまたはそれからなる）に結合することができる１つ以上の抗原結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）を含む分子は、任意の適切なＣＤＲ配列のセット（例えば、本明細書に記載のＣＤＲ配列セットのうちのいずれか）を含むことができる。

【0063】

本明細書に記載の修飾ＴＰ５３Ｒ１７５Ｈ変異ペプチド（例えば、配列番号１を含むかまたはそれからなる）に結合することができる１つ以上の抗原結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）を含む分子は、任意の適切な配列を含むことができる。例えば、本明細書に記載の修飾ＴＰ５３Ｒ１７５Ｈ変異ペプチド（例えば、配列番号１を含むかまたはそれからなる）に結合することができる分子は、限定されないが、配列番号２０、配列番号２４、または配列番号２８のいずれか１つに示されるｓｃＦｖ配列を含むことができる。特定の修飾ペプチドに結合することができる配列（例えば、ｓｃＦｖ配列）の例を表１に示す。ある場合には、本明細書に記載の修飾ＴＰ５３Ｒ１７５Ｈ変異ペプチド（例えば、配列番号１を含むかまたはそれからなる）に結合することができる１つ以上の抗原結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）を含む分子は、時にはバリアント配列と称されることがある、表１に示される配列から逸脱する配列を有することができる。例えば、本明細書に記載の修飾ペプチドに結合することができる１つ以上の抗原結合ドメインを含む分子は、バリアント配列が本明細書に記載の修飾ペプチドに結合する能力を維持する限り、表１に示される配列のうちのいずれかに対して、少なくとも７５％の配列同一性（例えば、少なくとも８０％の配列同一性、少なくとも８５％の配列同一性、少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９６％の配列同一性、少なくとも９７％の配列同一性、少なくとも９８％の配列同一性、少なくとも９９％の配列同一性、またはそれ以上）を有することができる。例えば、本明細書に記載の修飾ペプチドに結合することができる１つ以上の抗原結合ドメインを含む分子は、バリアント配列が本明細書に記載の修飾ペプチドに結合する能力を維持する限り、表１に示される配列と比較して、１つ以上（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０つ、またはそれ以上）の修飾（例えば、１つ以上のアミノ酸置換）を有することができる。ある場合には、本明細書に記載の修飾ペプチドに結合することができる１つ以上の抗原結合ドメインを含む分子は、任意の適切な本明細書に記載のＣＤＲ配列のセットを含むことができ、表１に示される配列からの任意の配列逸脱は、足場の配列（複数可）にあり得る。

【0064】

本明細書に記載の修飾ＴＰ５３Ｒ１７５Ｈ変異ペプチド（例えば、配列番号１を含むかまたはそれからなる）に結合することができる１つ以上の抗原結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）を含む分子は、標識（例えば、検出可能な標識）に結合（例えば、共有結合または非共有結合）させることができる。検出可能な標識は、任意の適切な標識であり得る。ある場合には、標識を使用して、本明細書に記載の１つ以上の修飾ペプチドの存在または非存在の検出を補助することができる。例えば、標識された本明細書に記載の分子をインビトロで使用して、哺乳動物から得られた試料中のがん細胞（例えば、本明細書に記載の修飾ペプチドを発現するがん細胞）を検出することができる。ある場合には、標識（例えば、検出可能な標識）を使用して、本明細書に記載の１つ以上の修飾ペプチドの位置の決定を補助することができる。例えば、標識された本明細書に記載の分子を使用して、哺乳動物において抗腫瘍療法を監視するために、及び／またはがん細胞（例えば、本明細書に記載の修飾ペプチドを発現するがん細胞）を検出することができる。本明細書に記載の分子に結合させることができる標識の例としては、放射性核種、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）で使用される造影剤、コンピュータ断層撮影法（ＣＴ）、超音波（ＵＳ）、及び他の画像法、発色団、酵素、及び蛍光分子（例えば、緑色蛍光タンパク質及び近赤外線蛍光）が挙げられるが、これらに限定されない。

【0065】

本明細書に記載の修飾ＴＰ５３Ｒ１７５Ｈ変異ペプチド（例えば、配列番号１を含むかまたはそれからなる）に結合することができる１つ以上の抗原結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）を含む分子は、治療剤に結合（例えば、共有結合または非共有結合）させることができる。治療剤は、任意の治療剤であり得る。ある場合には、治療薬は、抗がん剤であり得る。本明細書に記載の分子に結合させることができる治療薬の例としては、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）、モノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）、メイタンシン、メルタンシン／エムタンシン（ＤＭ１）、ラブタンシン／ソラフタンシン（ＤＭ４）、ＳＮ－３８、カリケアマイシン、Ｄ６．５、二量体ピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）、α－アマンチン（ＡＡＭＴ）、ＰＮＵ－１５９６８２、リシン、シュードモナス外毒素Ａ、ジフテリア毒素、及びゲロニン等の抗がん剤が挙げられるが、これらに限定されない。

【0066】

本明細書はまた、本明細書に記載の修飾ＴＰ５３Ｒ１７５Ｈ変異ペプチド（例えば、配列番号１を含むかまたはそれからなる）に結合することができる１つ以上の抗原結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）を含む１つ以上の分子を使用するための方法を提供する。例えば、本明細書に記載の修飾ＴＰ５３Ｒ１７５Ｈ変異ペプチド（例えば、配列番号１を含むかまたはそれからなる）を標的とする（例えば、それに結合する）ことができる１つ以上の抗原結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）を含む１つ以上の分子を使用して、がんを有するかもしくはがんを有すると疑われる哺乳動物を評価すること、及び／またはがんを有する哺乳動物を治療することができる（例えば、本明細書に記載の修飾ＴＰ５３Ｒ１７５Ｈ変異ペプチド（例えば、配列番号１を含むかまたはそれからなる）を発現するがん）。ある場合には、本明細書に記載の修飾ＴＰ５３Ｒ１７５Ｈ変異ペプチド（例えば、配列番号１を含むかまたはそれからなる）に結合することができる１つ以上の抗原結合ドメインを含む１つ以上の分子を使用して、がんを有するかまたはがんを有すると疑われる哺乳動物から得られた試料中の本明細書に記載の修飾ＴＰ５３Ｒ１７５Ｈ変異ペプチド（例えば、配列番号１を含むかまたはそれからなる）の存在または非存在を検出することができる。ある場合には、本明細書に記載の修飾ＴＰ５３Ｒ１７５Ｈ変異ペプチド（例えば、配列番号１を含むかまたはそれからなる）に結合することができる１つ以上の抗原結合ドメインを含む１つ以上の分子を、がん（例えば、修飾ペプチドを発現するがん）を有する哺乳動物に投与して哺乳動物を治療することができる。がんを有する哺乳動物（例えば、ヒト）に、本明細書に記載の修飾ＴＰ５３Ｒ１７５Ｈ変異ペプチド（例えば、配列番号１を含むかまたはそれからなる）に結合することができる１つ以上の抗原結合ドメインを含む１つ以上の分子を投与することは、哺乳動物を治療するのに有効であり得る。

【0067】

任意の種類の哺乳動物を、本明細書に記載されるように評価及び／または治療することができる。本明細書に記載されるように評価及び／または治療され得る哺乳動物の例としては、霊長類（例えば、ヒト、及び非ヒト霊長類、例えば、チンパンジー、ヒヒ、またはサル）、イヌ、ネコ、ブタ、ヒツジ、ウサギ、マウス、及びラットが挙げられるが、これらに限定されない。ある場合には、哺乳動物はヒトであり得る。

【0068】

哺乳動物は、任意の適切ながんについて評価及び／または治療することができる。ある場合には、がんは、本明細書に記載の修飾ＴＰ５３Ｒ１７５Ｈ変異ペプチド（例えば、配列番号１を含むかまたはそれからなる）を発現することができる。がんは、原発性がんであり得る。がんは、転移性がんであり得る。がんは、１つ以上の固形腫瘍を含み得る。がんは、１つ以上の非固形腫瘍を含み得る。本明細書に記載されるように評価され得るがんの例（例えば、本明細書に記載の１つ以上の修飾ペプチドの存在に少なくとも部分的に基づいて、例えば、それを含むかまたはそれからなる）及び／または本明細書に記載されるように治療され得るがんの例（例えば、本明細書に記載の修飾ペプチドに結合することができる１つ以上の抗原結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）を含む１つ以上の分子を投与することによって、例えば、それを含むかまたはそれからなる）としては、血液癌（例えば、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、多発性骨髄腫、ＭＤＳ、及び骨髄増殖性疾患）、肺癌、膵臓癌、胃癌（ｇａｓｔｒｉｃｃａｎｃｅｒ）、結腸癌（例えば、結腸直腸癌）、卵巣癌、子宮内膜癌、胆道癌、肝臓癌、骨及び軟部組織癌（例えば、肉腫）、乳癌、前立腺癌、食道癌、胃癌（ｓｔｏｍａｃｈｃａｎｃｅｒ）、腎臓癌、頭頸部癌、脳癌（例えば、多形神経膠芽腫及び星状細胞腫）、甲状腺癌、胚細胞性腫瘍、及び黒色腫が挙げられるが、これらに限定されない。

【0069】

がんを有するかまたはがんを有すると疑われる哺乳動物を評価する場合、本明細書に記載の修飾ＴＰ５３Ｒ１７５Ｈ変異ペプチド（例えば、配列番号１を含むかまたはそれからなる）に結合することができる１つ以上の抗原結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）を含む１つ以上の分子を使用して、本明細書に記載の１つ以上の修飾ペプチドの存在または非存在を評価することができる。例えば、ヒトから得られた試料中の本明細書に記載の修飾ＴＰ５３Ｒ１７５Ｈ変異ペプチド（例えば、配列番号１を含むかまたはそれからなる）の存在、非存在、またはレベルを用いて、ヒトが、がんを有するか否かを決定することができる。ある場合には、哺乳動物から得られた試料中の本明細書に記載の修飾ＴＰ５３Ｒ１７５Ｈ変異ペプチド（例えば、配列番号１を含むかまたはそれからなる）の存在を用いて、哺乳動物を、がんを有すると同定することができる。例えば、哺乳動物から得られた試料が、本明細書に記載の修飾ＴＰ５３Ｒ１７５Ｈ変異ペプチド（例えば、配列番号１を含むかまたはそれからなる）を有する場合、哺乳動物は、がんを有すると同定することができる。

【0070】

哺乳動物から得られた任意の適切な試料を、本明細書に記載の修飾ＴＰ５３Ｒ１７５Ｈ変異ペプチド（例えば、配列番号１を含むかまたはそれからなる）の存在、非存在、またはレベルについて評価することができる。例えば、組織試料（例えば、乳房組織、及びパパニコロウ（Ｐａｐ）検査等からの子宮頸部組織）、流体試料（例えば、血液、血清、血漿、尿、唾液、痰、及び脳脊髄液）、及び固体試料（例えば、糞便）等の生体試料を哺乳動物から得て、本明細書に記載の修飾ＴＰ５３Ｒ１７５Ｈ変異ペプチド（例えば、配列番号１を含むかまたはそれからなる）の存在、非存在、またはレベルについて評価することができる。任意の適切な方法を用いて、本明細書に記載の修飾ＴＰ５３Ｒ１７５Ｈ変異ペプチド（例えば、配列番号１を含むかまたはそれからなる）の存在、非存在、またはレベルを検出することができる。例えば、サンガーシーケンシング、化学的シーケンシング、ナノポアシーケンシング、ライゲーションによるシーケンシング（ＳＯＬｉＤシーケンシング）、質量分析を用いたシーケンシング、全エクソームシーケンシング、全ゲノムシーケンシング、及び／または次世代シーケンシングを含むがこれらに限定されないシーケンシング技術を用いて、哺乳動物から得られた試料中の本明細書に記載の修飾ＴＰ５３Ｒ１７５Ｈ変異ペプチド（例えば、配列番号１を含むかまたはそれからなる）の存在、非存在、またはレベルを決定することができる。

【0071】

がんを有する哺乳動物を治療する場合、本明細書に記載の修飾ＴＰ５３Ｒ１７５Ｈ変異ペプチド（例えば、配列番号１を含むかまたはそれからなる）に結合することができる１つ以上の抗原結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）を含む１つ以上の分子を、がんを有する哺乳動物に投与して哺乳動物を治療することができる。ある場合には、哺乳動物は、本明細書に記載の修飾ＴＰ５３Ｒ１７５Ｈ変異ペプチド（例えば、配列番号１を含むかまたはそれからなる）を発現するがんを有し得る。例えば、本明細書に記載の修飾ＴＰ５３Ｒ１７５Ｈ変異ペプチド（例えば、配列番号１を含むかまたはそれからなる）に結合することができる１つ以上の抗原結合ドメインを含む１つ以上の分子を、修飾ペプチドを発現するがんを有する哺乳動物に投与して哺乳動物を治療することができる。例えば、本明細書に記載の修飾ＴＰ５３Ｒ１７５Ｈ変異ペプチド（例えば、配列番号１を含むかまたはそれからなる）に結合することができる１つ以上のｓｃＦｖ（例えば、１つ以上のｓｃＤｂ）を含む１つ以上の分子を、修飾ペプチドを発現するがんを有する哺乳動物に投与して哺乳動物を治療することができる。

【0072】

ある場合には、本明細書に記載の修飾ＴＰ５３Ｒ１７５Ｈ変異ペプチド（例えば、配列番号１を含むかまたはそれからなる）に結合することができる１つ以上の抗原結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）を含む１つ以上の分子は、数日から数週間の範囲の期間にわたって１回または複数回、哺乳動物（例えば、がんを有する哺乳動物）に投与することができる。

【0073】

ある場合には、本明細書に記載の修飾ＴＰ５３Ｒ１７５Ｈ変異ペプチド（例えば、配列番号１を含むかまたはそれからなる）に結合することができる１つ以上の抗原結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）を含む１つ以上の分子は、哺乳動物（例えば、がんを有する哺乳動物）に投与するための組成物（例えば、薬学的に許容される組成物）に製剤化することができる。例えば、本明細書に記載の修飾ＴＰ５３Ｒ１７５Ｈ変異ペプチド（例えば、配列番号１を含むかまたはそれからなる）に結合することができる１つ以上の抗原結合ドメインは、１つ以上の薬学的に許容される担体（添加剤）、賦形剤、及び／または希釈剤とともに製剤化することができる。ある場合には、薬学的に許容される担体、賦形剤、または希釈剤は、天然に存在する薬学的に許容される担体、賦形剤、または希釈剤であり得る。ある場合には、薬学的に許容される担体、賦形剤、または希釈剤は、天然に存在しない（例えば、人工的または合成的な）薬学的に許容される担体、賦形剤、または希釈剤であり得る。本明細書に記載の組成物に使用することができる薬学的に許容される担体、賦形剤、及び希釈剤の例としては、スクロース、ラクトース、デンプン（例えば、デンプングリコレート）、セルロース、セルロース誘導体（例えば、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）及びセルロースエーテルヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）等の微結晶セルロース及びセルロースエーテル等の変性セルロース）、キシリトール、ソルビトール、マンニトール、ゼラチン、ポリマー（例えば、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、架橋ポリビニルピロリドン（クロスポビニドン）、カルボキシメチルセルロース、ポリエチレン－ポリオキシプロピレンブロックポリマー、ならびに架橋カルボキシメチルセルロースナトリウム（クロスカルメロースナトリウム））、酸化チタン、アゾ色素、シリカゲル、ヒュームド・シリカ、タルク、炭酸マグネシウム、植物性ステアリン、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸アルミニウム、ステアリン酸、抗酸化物質（例えば、ビタミンＡ、ビタミンＥ、ビタミンＣ、パルミチン酸レチニル、及びセレン）、クエン酸、クエン酸ナトリウム、ベンジルアルコール、塩酸リジン、トレハロース二水和物、水酸化ナトリウム、パラベン（例えば、メチルパラベン及びプロピルパラベン）、ワセリン、ジメチルスルホキシド、鉱油、血清タンパク質（例えば、ヒト血清アルブミン）、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、水、塩または電解質（例えば、生理食塩水、プロタミン硫酸塩、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、及び亜鉛塩）、コロイド状シリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリアクリレート、蝋、羊毛脂、レシチン、及びトウモロコシが挙げられるが、これらに限定されない。ある場合には、薬学的に許容される担体、賦形剤、または希釈剤は、抗接着剤、結合剤、着色剤、崩壊剤、香料（例えば、果物抽出物等の天然香料または人工香料）、流動促進剤、潤滑剤、防腐剤、吸着剤、及び／または甘味料であり得る。

【0074】

本明細書に記載の修飾ＴＰ５３Ｒ１７５Ｈ変異ペプチド（例えば、配列番号１を含むかまたはそれからなる）に結合することができる１つ以上の抗原結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）を含む１つ以上の分子を含む組成物（例えば、医薬組成物）は、任意の適切な剤形に製剤化することができる。剤形の例としては、ガム、カプセル、錠剤（例えば、チュアブル錠、及び腸溶性コーティング錠）、坐剤、液剤、浣腸剤、懸濁剤、液剤（例えば、無菌溶液）、徐放性製剤、遅延放出性製剤、丸剤、散剤、及び顆粒剤を含むが、これらに限定されない固体または液体形態が挙げられる。

【0075】

本明細書に記載の修飾ＴＰ５３Ｒ１７５Ｈ変異ペプチド（例えば、配列番号１を含むかまたはそれからなる）に結合することができる１つ以上の抗原結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）を含む１つ以上の分子を含む組成物は、経口、非経口（皮下、筋肉内、静脈内、及び皮内を含む）、または腫瘍内投与のために設計することができる。非経口投与に好適な組成物には、抗酸化剤、緩衝液、静菌剤、及び製剤を対象となるレシピエントの血液と等張にする溶質を含み得る水性及び非水性の滅菌注射液が含まれる。製剤は、単位用量または複数用量の容器、例えば、密封されたアンプル及びバイアルで提示され得、使用の直前に、注射用の滅菌液体担体、例えば、水の添加のみを必要とするフリーズドライ（凍結乾燥）状態で保存され得る。即席の注射液及び懸濁液は、滅菌粉末、顆粒、及び錠剤から調製されてもよい。

【0076】

本明細書に記載の修飾ＴＰ５３Ｒ１７５Ｈ変異ペプチド（例えば、配列番号１を含むかまたはそれからなる）に結合することができる１つ以上の抗原結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）を含む１つ以上の分子を含む組成物は、任意の適切な技術を用いて、任意の適切な場所に投与することができる。本明細書に記載の修飾ＴＰ５３Ｒ１７５Ｈ変異ペプチド（例えば、配列番号１を含むかまたはそれからなる）に結合することができる１つ以上の抗原結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）を含む１つ以上の分子を含む組成物は、局所的に（例えば、腫瘍内に）または全身的に投与することができる。例えば、本明細書で提供される組成物は、腫瘍内投与（例えば、腫瘍への注射）によって、または腫瘍によって浸潤された生物学的空間への投与（例えば、脊髄内投与、小脳内投与、腹腔内投与及び／または胸膜投与）によって局所的に投与することができる。例えば、本明細書で提供される組成物は、哺乳動物（例えば、ヒト）への経口投与または静脈内投与（例えば、注射または注入）によって全身的に投与することができる。

【0077】

有効用量は、がんのリスク及び／または重症度、投与経路、対象の年齢及び一般的な健康状態、賦形剤の使用、他の薬剤の使用等の他の治療的処置との併用の可能性、ならびに治療する医師の判断に応じて変化し得る。本明細書に記載の修飾ＴＰ５３Ｒ１７５Ｈ変異ペプチド（例えば、配列番号１を含むかまたはそれからなる）に結合することができる１つ以上の抗原結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）を含む１つ以上の分子を含む組成物の有効量は、対象に著しい毒性を引き起こすことなく、対象内に存在するがんを治療する任意の量であり得る。特定の対象が特定の量に応答しない場合、本明細書に記載の修飾ＴＰ５３Ｒ１７５Ｈ変異ペプチド（例えば、配列番号１を含むかまたはそれからなる）に結合することができる１つ以上の抗原結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）を含む１つ以上の分子の量を、（例えば、２倍、３倍、４倍、またはそれ以上）増加させることができる。このより多くの量を投与された後、哺乳動物は、治療への応答性及び毒性症状の両方について監視され、それに応じて調整が行われる。有効量は、一定のままであり得るか、または治療に対する対象の応答に応じて、スライディングスケールもしくは可変用量として調整され得る。様々な要因が、特定の用途に使用される実際の有効量に影響を及ぼし得る。例えば、投与頻度、治療期間、複数の治療薬の使用、投与経路、及び状態（例えば、がん）の重症度によって、投与される実際の有効量の増加または減少が必要となり得る。

【0078】

本明細書に記載の修飾ＴＰ５３Ｒ１７５Ｈ変異ペプチド（例えば、配列番号１を含むかまたはそれからなる）に結合することができる１つ以上の抗原結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）を含む１つ以上の分子の投与頻度は、哺乳動物に著しい毒性を引き起こすことなく、がんを有する哺乳動物を効果的に治療する任意の頻度であり得る。例えば、本明細書に記載の修飾ＴＰ５３Ｒ１７５Ｈ変異ペプチド（例えば、配列番号１を含むかまたはそれからなる）に結合することができる１つ以上の抗原結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）を含む１つ以上の分子の投与頻度は、１週間に約２回～約３回～１年に約２～約３回であり得る。ある場合には、がんを有する対象は、本明細書に記載の１つ以上の抗体の単回投与を受けることができる。本明細書に記載の修飾ＴＰ５３Ｒ１７５Ｈ変異ペプチド（例えば、配列番号１を含むかまたはそれからなる）に結合することができる１つ以上の抗原結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）を含む１つ以上の分子の投与頻度は、治療期間中、一定のままであり得るか、または可変であり得る。本明細書に記載の修飾ＴＰ５３Ｒ１７５Ｈ変異ペプチド（例えば、配列番号１を含むかまたはそれからなる）に結合することができる１つ以上の抗原結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）を含む１つ以上の分子を含む組成物による治療過程は、休薬期間を含むことができる。例えば、本明細書に記載の修飾ＴＰ５３Ｒ１７５Ｈ変異ペプチド（例えば、配列番号１を含むかまたはそれからなる）に結合することができる１つ以上の抗原結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）を含む１つ以上の分子を含む組成物を、２年の期間にわたって１ヶ月おきに投与して、その後６ヶ月の休薬期間があってもよく、そのようなレジメンを複数回繰り返すことができる。有効量と同様に、様々な要因が、特定の用途に使用される実際の投与頻度に影響を及ぼし得る。例えば、有効量、治療期間、複数の治療薬の使用、投与経路、及び状態（例えば、がん）の重症度によって、投与頻度の増加または減少を必要とし得る。

【0079】

本明細書に記載の修飾ＴＰ５３Ｒ１７５Ｈ変異ペプチド（例えば、配列番号１を含むかまたはそれからなる）に結合することができる１つ以上の抗原結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）を含む１つ以上の分子を含む組成物を投与するための有効期間は、哺乳動物に著しい毒性を引き起こすことなく、哺乳動物内に存在するがんを効果的に治療する任意の期間であり得る。ある場合には、有効期間は、数ヶ月から数年まで変化し得る。一般に、がんを有する哺乳動物を治療するための有効期間は、約１ヶ月または２ヶ月～５年以上の期間であり得る。複数の要因が、特定の治療に使用される実際の有効期間に影響を及ぼし得る。例えば、有効期間は、投与頻度、有効量、複数の治療薬の使用、投与経路、及び治療される状態の重症度によって変化し得る。

【0080】

特定の場合において、哺乳動物内のがんを監視して、がん治療の有効性を評価することができる。任意の適切な方法を用いて、がんを有する哺乳動物を治療するかどうかを決定することができる。例えば、撮像技術または実験室アッセイを使用して、哺乳動物内に存在するがん細胞の数及び／または腫瘍のサイズを評価することができる。例えば、撮像技術または実験室アッセイを使用して、哺乳動物内に存在するがん細胞及び／または腫瘍の位置を評価することができる。

【0081】

ある場合には、本明細書に記載の修飾ＴＰ５３Ｒ１７５Ｈ変異ペプチド（例えば、配列番号１を含むかまたはそれからなる）に結合することができる１つ以上の抗原結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）を含む１つ以上の分子は、１つ以上の追加のがん治療（例えば、抗がん剤）との併用療法として、がんを有する哺乳動物に投与することができる。がん治療は、任意の適切ながん治療を含むことができる。ある場合には、がん治療は、手術を含み得る。ある場合には、がん治療は、放射線療法を含み得る。ある場合には、がん治療は、１つ以上の治療薬（例えば、１つ以上の抗がん剤）の投与を含み得る。抗がん剤の例としては、白金化合物（例えば、シスプラチンまたはカルボプラチン）、タキサン（例えば、パクリタキセル、ドセタキセル、またはｎａｂ－パクリタキセル等のアルブミン結合パクリタキセル）、アルトレタミン、カペシタビン、シクロホスファミド、エトポシド（ｖｐ－１６）、ゲムシタビン、イホスファミド、イリノテカン（ｃｐｔ－１１）、リポソーマルドキソルビシン、メルファラン、ペメトレキセド、トポテカン、ビノレルビン、黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）アゴニスト（例えば、ゴセレリン及びロイプロリド）、抗エストロゲン（例えば、タモキシフェン）、アロマターゼ阻害剤（例えば、レトロゾール、アナストロゾール、及びエキセメスタン）、血管新生阻害剤（例えば、ベバシズマブ）、ポリ（ＡＤＰ）－リボースポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）阻害剤（例えば、オラパリブ、ルカパリブ、及びニラパリブ）、放射性リン、抗ＣＴＬＡ－４抗体、抗ＰＤ－１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、ＩＬ－２抗体及び他のサイトカイン、他の二重特異性抗体、ならびにそれらの任意の組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。本明細書に記載の修飾ＴＰ５３Ｒ１７５Ｈ変異ペプチド（例えば、配列番号１を含むかまたはそれからなる）に結合することができる１つ以上の抗原結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）を含む１つ以上の分子が、１つ以上の追加のがん治療薬と組み合わせて使用される場合、１つ以上の追加のがん治療薬は、同時にまたは独立して投与することができる。例えば、本明細書に記載の修飾ＴＰ５３Ｒ１７５Ｈ変異ペプチド（例えば、配列番号１を含むかまたはそれからなる）に結合することができる１つ以上の抗原結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）を含む１つ以上の分子を含む組成物を最初に投与して、１つ以上の追加のがん治療薬を２番目に投与してもよいか、またはその逆であってもよい。

【0082】

また、本明細書に記載の修飾ＴＰ５３Ｒ１７５Ｈ変異ペプチド（例えば、配列番号１を含むかまたはそれからなる）に結合することができる１つ以上の抗原結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）を含む１つ以上の分子を含むキットも、本明細書で提供される。例えば、キットは、本明細書に記載の修飾ＴＰ５３Ｒ１７５Ｈ変異ペプチド（例えば、配列番号１を含むかまたはそれからなる）に結合することができる１つ以上の抗原結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）を含む１つ以上の分子を含む組成物（例えば、薬学的に許容される組成物）を含むことができる。ある場合には、キットは、本明細書に記載の方法のうちのいずれかを実施するための説明書を含むことができる。ある場合には、キットは、本明細書に記載の組成物（例えば、薬学的組成物）のうちのいずれかの少なくとも１つの用量を含むことができる。ある場合には、キットは、本明細書に記載の組成物（例えば、薬学的組成物）のうちのいずれかを投与するための手段（例えば、注射器）を提供することができる。

【0083】

本発明は、特許請求の範囲に記載される本発明の範囲を限定しない以下の実施例においてさらに記載される。

【実施例】

【0084】

本発明は、特許請求の範囲に記載された本発明の範囲を限定しない以下の実施例にさらに説明される。

【0085】

実施例１：改善された結合特性のための単一変異バリアントのスクリーニング
元のＨ２Ｒ１７５Ｈを標的とするｓｃＦｖ（配列番号４）からの単一アミノ酸変化をそれぞれ有する１１５９個の一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）からなるファージディスプレイライブラリーを使用して、Ｒ１７５Ｈ／ＨＬＡ－Ａ２を標的とする改善されたバリアントについてスクリーニングを行った。６つの相補性決定領域（ＣＤＲ）にわたる合計６１個の部位を、各部位に提示される２０個全てのアミノ酸（野生型を除く）を有する単一変異体ライブラリーに含めた（図１）。Ｒ１７５Ｈ／ＨＬＡ－Ａ２ｐＭＨＣに対して高い特異性を示すクローンを同定するために、Ｒ１７５ＷＴｐＭＨＣ及びＴＰ５３Ｒ１７５ＷＴＨＬＡ－Ａ２陽性細胞株に対する陰性選択を伴う５ラウンドのパニング、続いてＲ１７５ＨｐＭＨＣについて陽性選択を完了した。初期試験は、５ラウンドのパニング後、ファージプールが、６つ全てのＣＤＲにわたって存在するバリアントを含み、多様性を保持していたことを示した（図２）。

【0086】

ＨＬＡ－Ａ２に結合したＨ２Ｆａｂの結晶構造からのデータを使用して、よりストリンジェントな結合条件下でスクリーニングするために、潜在的な構造的関連性を有するパニングクローンを選択した。チオシアン酸アンモニウム（ＮＨ_４ＳＣＮ）及び尿素洗浄液を用いて、Ｒ１７５Ｈモノマーへの結合が弱いｓｃＦｖを除去し、Ｒ１７５ＷＴよりもＲ１７５Ｈに特異的なクローンを同定した（図３）。パニングの４及び５ラウンド目からプールされたファージの追加のＮＨ_４ＳＣＮベースのスクリーニングにより、チオシアネート洗浄液で濃縮されたいくつかのバリアントを同定した（図４）。

【0087】

実施例２：ＳＣＮ耐性バリアントは、Ｒ１７５Ｈ／ＨＬＡ－Ａ２モノマーに対して強い相対的結合性を有する
ストリンジェントな洗浄条件下でＲ１７５Ｈモノマーに対する強い結合を維持したバリアントを、次いで、機能試験のために一本鎖ダイアボディ（ｓｃＤｂ）二重特異性抗体フォーマットに変換した。順に、各ｓｃＤｂは、ＩＬ－２シグナル配列（配列番号６）、ｐＨＬＡを標的とするｓｃＦｖ軽鎖（配列番号７の変異体）、ＧＧＧＧＳ（Ｇ４Ｓ）リンカー（配列番号１１）、抗ＣＤ３ｓｃＦｖ重鎖（配列番号１２）、３×Ｇ４Ｓリンカー（配列番号１３）、抗ＣＤ３ｓｃＦｖ軽鎖（配列番号１４）、Ｇ４Ｓ（配列番号１５）、ｐＨＬＡを標的とするｓｃＦｖ重鎖（配列番号１６の変異体）、及び精製のための５ｘＨｉｓ親和性タグを含む。ｓｃＤｂは、ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞で発現し、ＮｉＮＴＡ樹脂を使用して精製した。

【0088】

発現したｓｃＤｂがＲ１７５Ｈ／Ａ２モノマーに特異的に結合すること及びＣＤ３に結合することができることを確認するために、ｓｃＤｂをＲ１７５Ｈ／Ａ２モノマー、Ｒ１７５ＷＴ／Ａ２モノマー、またはＣＤ３δ／εヘテロダイマーでコーティングされたプレートに塗布した。ＣＤ３結合シグナルに対して正規化したとき、ほとんどのバリアントｓｃＤｂが、ＥＬＩＳＡによって元のＨ２－ｓｃＤｂと比較すると、Ｒ１７５Ｈ／ＨＬＡ－Ａ２モノマーへの相対的結合性の増加を示した（図５）。

【0089】

実施例３：インビトロでＲ１７５Ｈ－ＨＬＡ－Ａ２に対する改善された感受性及び活性を有するバリアントの同定
最も強力な２つの単一変異体を組み合わせた二重変異体を含む３つの候補バリアント（Ｆ５３Ｓ（配列番号２１）、Ｙ５７Ｉ（配列番号２５）、及びＦ５３Ｓ／Ｙ５７Ｉ（配列番号２９））について、インビトロ及びインビボでｓｃＤｂとして機能試験を行った。バリアント発現プラスミドを部位特異的変異誘発によって生成し、ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞で各ｓｃＤｂを発現させるために使用した。インビボ試験のためのｓｃＤｂをより大規模に生成し、サイズ排除クロマトグラフィーによって精製した。バリアントｓｃＤｂを、様々なレベルのＲ１７５ＨまたはＲ１７５ＷＴ９ｍｅｒペプチドでパルスしたＴＡＰ欠損Ｔ２Ａ３細胞との共培養においてヒトＴ細胞を活性化する能力について試験した。バリアントＹ５７Ｉ及びＦ５３Ｓは、元のＨ２ｓｃＤｂと比較して、低いペプチドパルス濃度（１ｎＭ）で改善された感受性を示した（図６）。全てのＨ２バリアントは、様々な濃度のｓｃＤｂの存在下でのＫＭＳ２６細胞及びヒトＴ細胞との一晩共培養において、元のＨ２ｓｃＤｂよりも増加した細胞毒性、インターフェロンγ応答、及び低いＥＣ_５０値を有していた（図７Ａ～図７Ｂ）。ＫＭＳ２６－ｐ５３^{Ｒ１７５Ｈ}に対するＦ５３Ｓ、Ｙ５７Ｉ、及びＦ５３Ｓ／Ｙ５７Ｉの細胞毒性ＥＣ_５０値は、Ｈ２ｓｃＤｂの３．０６１×１０^－１１Ｍと比較して、７．８６４×１０^－１２Ｍ、４．７４９×１０^－１２Ｍ、及び４．１５４×１０^－１２Ｍであった。低いｓｃＤｂ濃度（１３．７ｐＭ及び４．５７ｐＭ）では、Ｔｕｋｅｙの多重比較検定を用いた通常の双方向ＡＮＯＶＡは、全てのＨ２バリアントがＨ２ｓｃＤｂと比較して細胞毒性が増加し（Ｐ＜０．０００１）、Ｙ５７Ｉ及びＦ５３Ｓ／Ｙ５７ＩがＨ２ｓｃＤｂと比較してインターフェロンγの増加をもたらしたことを示している（Ｐ＜０．０００１）。Ｈ２バリアントはまた、内因性ＴＰ５３Ｒ１７５Ｈ変異を有する様々なＨＬＡ－Ａ２陽性細胞株に対する共培養で改善された活性を有する（図８Ａ～８Ｄ）。実際、Ｙ５７Ｉ及びＦ５３Ｓ／Ｙ５７Ｉは、元のＨ２ｓｃＤｂと比較して１０倍低い二重特異性抗体濃度でＫＭＳ２６細胞株に対して類似のまたはより高い活性を示す。

【0090】

実施例４：バリアントｓｃＤｂは、より高い親和性でＲ１７５Ｈ／ＨＬＡ－Ａ２複合体に結合する。
Ｈ２バリアントが、元のＨ２ｓｃＤｂとは異なる親和性でＲ１７５Ｈペプチド－ＭＨＣ複合体に結合するかどうかを決定するために、Ｒ１７５Ｈ／Ａ２モノマーへのＦ５３Ｓ、Ｙ５７Ｉ及びＦ５３Ｓ／Ｙ５７ＩｓｃＤｂの結合を、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって測定した（図９Ａ～図９Ｄ）。全てのバリアントが、元のＨ２ｓｃＤｂよりも高い親和性でＲ１７５ＨｐＭＨＣ複合体に結合した。バリアントのＫＤは、元のＨ２ｓｃＤｂの２９．５ｎＭと比較して、Ｆ５３Ｓ、Ｙ５７Ｉ及びＦ５３Ｓ／Ｙ５７Ｉで１２．９ｎＭ、６．８ｎＭ及び３．３ｎＭである。バリアントは、ｐ５３ＷＴ／Ａ２ｐＭＨＣへの結合の増加を示さなかった。

【0091】

実施例５：バリアントｓｃＤｂは、インビボで元のＨ２ｓｃＤｂよりも優れている
３つのＨ２バリアントＦ５３Ｓ、Ｙ５７Ｉ及びＦ５３Ｓ／Ｙ５７Ｉのインビボでの抗腫瘍有効性を元のＨ２ｓｃＤｂと比較するために、１３～１５週齢の雌ＮＳＧマウス（ＮＯＤｓｃｉｄＩＬ２ｒｇ）に、ルシフェラーゼを発現する１×１０^６のＫＭＳ２６細胞（ＴＰ５３Ｒ１７５Ｈ、ＨＬＡ－Ａ２）及び１×１０^７のヒトＴ細胞を静脈内に接種した。２日後、マウス腹腔内に外科的に配置された１４日間連続放出ポンプを使用して、マウスを０．１５ｍｇ／ｋｇ／日のｓｃＤｂで処理した（図１０Ａ～図１０Ｇ）。群当たりＮ＝６のマウス。腫瘍負荷を生物発光イメージングによって監視した。全フラックス測定値を、各マウスについて胸部にわたって測定された注入対照蛍光色素に対して正規化した。図１０Ｈは、Ｆ５３Ｓ、Ｙ５７Ｉ及びＦ５３Ｓ／Ｙ５７Ｉが、処理２日目の元のＨ２ｓｃＤｂと比較して腫瘍制御を改善し、Ｙ５７Ｉ及びＦ５３Ｓ／Ｙ５７Ｉが、処理５日目及び８日目の元のＨ２ｓｃＤｂと比較して腫瘍制御を改善したことを示す（Ｐ＜０．０５、Ｇｅｉｓｓｎｅｒ－Ｇｒｅｅｎｈｏｕｓｅ補正を伴う双方向反復測定ＡＮＯＶＡ及びＤｕｎｎｅｔｔの多重比較検定）。図１０Ｉは、Ｙ５７ＩがインビボでＫＭＳ２６腫瘍増殖を制御したことを示す。図１０Ａ～１０Ｇからの生物発光データのＭａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙの多重検定は、Ｙ５７Ｉが、元のＨ２ｓｃＤｂと比較して８日目に腫瘍制御を改善したことを示している（Ｐ＝０．０１９）。処理後２週間で、Ｙ５７Ｉで処理したマウスに腫瘍再発は見られなかった。

【0092】

バリアントｓｃＤｂ及び元のＨ２は、０．１５ｍｇ／ｋｇ／日の投与レジメンでＫＭＳ２６に対する抗腫瘍有効性を有していたため、バリアントｓｃＤｂを、より速い増殖速度を有する第２の腫瘍モデルＮａｌｍ６に対する抗腫瘍有効性について５０％低い用量で試験した。ルシフェラーゼ発現Ｎａｌｍ６細胞を、ホモ接合性ｐ５３^{Ｒ１７５Ｈ}変異を有するようにＣＲＩＳＰＲによって遺伝子改変した。７～８週齢のＮＳＧ（ＮＯＤｓｃｉｄＩＬ２ｒｇ）マウスに、５×１０^５のＮａｌｍ６^{Ｒ１７５Ｈ}細胞及び１×１０^７のヒトＴ細胞を静脈内に接種した（図１１Ａ）。２日後、マウス腹腔内に外科的に配置された１４日間連続放出ポンプを使用して、マウスを０．０７５ｍｇ／ｋｇ／日のｓｃＤｂで処理した（図１１Ｂ～図１１Ｇ）。腫瘍負荷を生物発光イメージングによって監視した。２つの独立した実験（ｓｃＤｂ当たりＮ＝６）からの生物発光データを組み合わせ、合計でｓｃＤｂ当たりＮ＝１２とした。処理７日目に、Ｈ２ｓｃＤｂに対するＧｅｉｓｓｎｅｒ－Ｇｒｅｅｎｈｏｕｓｅ補正を伴う双方向反復測定ＡＮＯＶＡ及びＤｕｎｎｅｔｔの多重比較検定は、全てのＨ２バリアントが腫瘍制御を改善し（Ｈ２対Ｆ５３ＳＰ＝０．００９３、Ｙ５７ＩＰ＝０．０１２６、Ｆ５３Ｓ／Ｙ５７ＩＰ＝０．００３０）、Ｈ２がアイソタイプ対照ｓｃＤｂよりも優れていたことを示した（Ｐ＜０．０００１）。Ｄｕｎｎｅｔｔの多重比較試験によると、Ｆ５３Ｓ／Ｙ５７Ｉは、１４日目のＨ２と比較して優れた腫瘍制御を示した（双方向反復測定ＡＮＯＶＡ、Ｐ＝０．０２９５）。

【0093】

Ｙ５７Ｉが、確立された腫瘍モデルにおいて元のＨ２ｓｃＤｂよりも良好に機能するかどうかを決定するために、Ｙ５７ＩｓｃＤｂを、ＫＭＳ２６細胞を用いた遅延処理モデルにおいて試験した。７～９週齢のＮＳＧ（ＮＯＤｓｃｉｄＩＬ２ｒｇ）マウスに、３．５×１０^５のルシフェラーゼ発現ＫＭＳ２６細胞を静脈内に接種した。７日後、マウスを１×１０^７のヒトＴ細胞で静脈内処理し、マウス腹腔内に外科的に配置された１４日間連続放出ポンプを使用して、０．０７５ｍｇ／ｋｇ／日のｓｃＤｂで処理した（図１２Ａ～図１２Ｅ）。腫瘍負荷を生物発光イメージングによって監視した。群当たりＮ＝５。１４日目の処理終了時に、Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙの検定により、Ｙ５７Ｉ処理マウスが、元のＨ２ｓｃＤｂで処理したマウスよりも低い腫瘍負荷を有することが示された（Ｐ＝０．００７９）。

【0094】

配列
配列番号１Ｐ５３Ｒ１７５Ｈ変異ペプチド
ＨＭＴＥＶＶＲＨＣ
配列番号２Ｐ５３Ｒ１７５野生型ペプチド
ＨＭＴＥＶＶＲＲＣ
配列番号３ｐ５３
＞ｓｐ｜Ｐ０４６３７｜ｐ５３＿ヒト細胞腫瘍抗原ｐ５３ＯＳ＝ホモサピエンスＯＸ＝９６０６ＧＮ＝ＴＰ５３ＰＥ＝１ＳＶ＝４
ＭＥＥＰＱＳＤＰＳＶＥＰＰＬＳＱＥＴＦＳＤＬＷＫＬＬＰＥＮＮＶＬＳＰＬＰＳＱＡＭＤＤＬＭＬＳＰＤＤＩＥＱＷＦＴＥＤＰＧＰＤＥＡＰＲＭＰＥＡＡＰＰＶＡＰＡＰＡＡＰＴＰＡＡＰＡＰＡＰＳＷＰＬＳＳＳＶＰＳＱＫＴＹＱＧＳＹＧＦＲＬＧＦＬＨＳＧＴＡＫＳＶＴＣＴＹＳＰＡＬＮＫＭＦＣＱＬＡＫＴＣＰＶＱＬＷＶＤＳＴＰＰＰＧＴＲＶＲＡＭＡＩＹＫＱＳＱＨＭＴＥＶＶＲＲＣＰＨＨＥＲＣＳＤＳＤＧＬＡＰＰＱＨＬＩＲＶＥＧＮＬＲＶＥＹＬＤＤＲＮＴＦＲＨＳＶＶＶＰＹＥＰＰＥＶＧＳＤＣＴＴＩＨＹＮＹＭＣＮＳＳＣＭＧＧＭＮＲＲＰＩＬＴＩＩＴＬＥＤＳＳＧＮＬＬＧＲＮＳＦＥＶＲＶＣＡＣＰＧＲＤＲＲＴＥＥＥＮＬＲＫＫＧＥＰＨＨＥＬＰＰＧＳＴＫＲＡＬＰＮＮＴＳＳＳＰＱＰＫＫＫＰＬＤＧＥＹＦＴＬＱＩＲＧＲＥＲＦＥＭＦＲＥＬＮＥＡＬＥＬＫＤＡＱＡＧＫＥＰＧＧＳＲＡＨＳＳＨＬＫＳＫＫＧＱＳＴＳＲＨＫＫＬＭＦＫＴＥＧＰＤＳＤ
配列番号４Ｈ２ｓｃＦｖ
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＤＶＮＴＡＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＳＡＹＦＬＹＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＲＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＹＳＲＹＳＰＶＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＴＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＡＳＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＮＶＹＡＳＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＫＩＹＰＤＳＤＹＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＡＤＴＳＫＮＴＡＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＳＲＤＳＳＦＹＹＶＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号５Ｈ２ｓｃＤｂ
ＭＹＲＭＱＬＬＳＣＩＡＬＳＬＡＬＶＴＮＳＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＤＶＮＴＡＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＳＡＹＦＬＹＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＲＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＹＳＲＹＳＰＶＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＧＧＧＧＳＥＶＱＬＱＱＳＧＰＥＬＶＫＰＧＡＳＭＫＩＳＣＫＡＳＧＹＳＦＴＧＹＴＭＮＷＶＫＱＳＨＧＫＮＬＥＷＭＧＬＩＮＰＹＫＧＶＳＴＹＮＱＫＦＫＤＫＡＴＬＴＶＤＫＳＳＳＴＡＹＭＥＬＬＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＹＣＡＲＳＧＹＹＧＤＳＤＷＹＦＤＶＷＧＡＧＴＴＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＩＱＭＴＱＴＴＳＳＬＳＡＳＬＧＤＲＶＴＩＳＣＲＡＳＱＤＩＲＮＹＬＮＷＹＱＱＫＰＤＧＴＶＫＬＬＩＹＹＴＳＲＬＨＳＧＶＰＳＫＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＳＬＴＩＳＮＬＥＱＥＤＩＡＴＹＦＣＱＱＧＮＴＬＰＷＴＦＡＧＧＴＫＬＥＩＫＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＮＶＹＡＳＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＫＩＹＰＤＳＤＹＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＡＤＴＳＫＮＴＡＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＳＲＤＳＳＦＹＹＶＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＨＨＨＨＨＨ
配列番号６Ｈ２ＩＬ－２シグナル配列
ＭＹＲＭＱＬＬＳＣＩＡＬＳＬＡＬＶＴＮＳ
配列番号７Ｈ２Ｒ１７５Ｈペプチドを標的とするｓｃＦｖ軽鎖
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＤＶＮＴＡＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＳＡＹＦＬＹＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＲＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＹＳＲＹＳＰＶＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ
配列番号８Ｈ２Ｒ１７５Ｈペプチドを標的とするｓｃＦｖ軽鎖ＣＤＲ１
ＲＡＳＱＤＶＮＴＡＶＡ
配列番号９Ｈ２Ｒ１７５Ｈペプチドを標的とするｓｃＦｖ軽鎖ＣＤＲ２
ＳＡＹＦＬＹＳ
配列番号１０Ｈ２Ｒ１７５Ｈペプチドを標的とするｓｃＦｖ軽鎖ＣＤＲ３
ＱＱＹＳＲＹＳＰＶ
配列番号１１リンカー
ＧＧＧＧＳ
配列番号１２Ｈ２ＣＤ３を標的とする重鎖
ＥＶＱＬＱＱＳＧＰＥＬＶＫＰＧＡＳＭＫＩＳＣＫＡＳＧＹＳＦＴＧＹＴＭＮＷＶＫＱＳＨＧＫＮＬＥＷＭＧＬＩＮＰＹＫＧＶＳＴＹ
ＮＱＫＦＫＤＫＡＴＬＴＶＤＫＳＳＳＴＡＹＭＥＬＬＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＹＣＡＲＳＧＹＹＧＤＳＤＷＹＦＤＶＷＧＡＧＴＴＶＴＶ
ＳＳ
配列番号１３リンカー
ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ
配列番号１４Ｈ２ＣＤ３を標的とする軽鎖
ＤＩＱＭＴＱＴＴＳＳＬＳＡＳＬＧＤＲＶＴＩＳＣＲＡＳＱＤＩＲＮＹＬＮＷＹＱＱＫＰＤＧＴＶＫＬＬＩＹＹＴＳＲＬＨＳＧＶＰＳ
ＫＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＳＬＴＩＳＮＬＥＱＥＤＩＡＴＹＦＣＱＱＧＮＴＬＰＷＴＦＡＧＧＴＫＬＥＩＫ
配列番号１５リンカー
ＧＧＧＧＳ
配列番号１６Ｈ２Ｒ１７５Ｈペプチドを標的とするｓｃＦｖ重鎖
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＮＶＹＡＳＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＫＩＹＰＤＳＤＹＴＹＹ
ＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＡＤＴＳＫＮＴＡＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＳＲＤＳＳＦＹＹＶＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳ
Ｓ
配列番号１７Ｈ２Ｒ１７５Ｈペプチドを標的とするｓｃＦｖ重鎖ＣＤＲＨ１
ＦＮＶＹＡＳＧＭＨ
配列番号１８Ｈ２Ｒ１７５Ｈペプチドを標的とするｓｃＦｖ重鎖ＣＤＲＨ２
ＶＡＫＩＹＰＤＳＤＹＴＹＹ
配列番号１９Ｈ２Ｒ１７５Ｈペプチドを標的とするｓｃＦｖ重鎖ＣＤＲＨ３
ＳＲＤＳＳＦＹＹＶＹＡＭ
配列番号２０Ｆ５３ＳｓｃＦｖ
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＤＶＮＴＡＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＳＡＹＳＬＹＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＲＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＹＳＲＹＳＰＶＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＴＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＡＳＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＮＶＹＡＳＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＫＩＹＰＤＳＤＹＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＡＤＴＳＫＮＴＡＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＳＲＤＳＳＦＹＹＶＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号２１Ｆ５３ＳＲ１７５Ｈペプチドを標的とするｓｃＤｂ（シグナル配列またはＨｉｓタグなし）
ＭＹＲＭＱＬＬＳＣＩＡＬＳＬＡＬＶＴＮＳＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＤＶＮＴＡＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＳＡＹＳＬＹＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＲＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＹＳＲＹＳＰＶＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＧＧＧＧＳＥＶＱＬＱＱＳＧＰＥＬＶＫＰＧＡＳＭＫＩＳＣＫＡＳＧＹＳＦＴＧＹＴＭＮＷＶＫＱＳＨＧＫＮＬＥＷＭＧＬＩＮＰＹＫＧＶＳＴＹＮＱＫＦＫＤＫＡＴＬＴＶＤＫＳＳＳＴＡＹＭＥＬＬＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＹＣＡＲＳＧＹＹＧＤＳＤＷＹＦＤＶＷＧＡＧＴＴＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＩＱＭＴＱＴＴＳＳＬＳＡＳＬＧＤＲＶＴＩＳＣＲＡＳＱＤＩＲＮＹＬＮＷＹＱＱＫＰＤＧＴＶＫＬＬＩＹＹＴＳＲＬＨＳＧＶＰＳＫＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＳＬＴＩＳＮＬＥＱＥＤＩＡＴＹＦＣＱＱＧＮＴＬＰＷＴＦＡＧＧＴＫＬＥＩＫＧＧＧＧＳＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＮＶＹＡＳＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＫＩＹＰＤＳＤＹＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＡＤＴＳＫＮＴＡＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＳＲＤＳＳＦＹＹＶＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号２２Ｆ５３ＳＲ１７５Ｈペプチドを標的とするｓｃＦｖ軽鎖
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＤＶＮＴＡＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＳＡＹＳＬＹＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＲＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＹＳＲＹＳＰＶＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ
配列番号２３Ｆ５３ＳＲ１７５Ｈペプチドを標的とするｓｃＦｖ軽鎖ＣＤＲ２
ＳＡＹＳＬＹＳ
配列番号２４Ｙ５７ＩｓｃＦｖ
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＤＶＮＴＡＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＳＡＹＦＬＹＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＲＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＹＳＲＹＳＰＶＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＴＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＡＳＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＮＶＹＡＳＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＫＩＹＰＤＳＤＩＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＡＤＴＳＫＮＴＡＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＳＲＤＳＳＦＹＹＶＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号２５Ｙ５７ＩＲ１７５Ｈペプチドを標的とするｓｃＤｂ（シグナル配列またはＨｉｓタグなし）
ＭＹＲＭＱＬＬＳＣＩＡＬＳＬＡＬＶＴＮＳＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＤＶＮＴＡＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＳＡＹＦＬＹＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＲＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＹＳＲＹＳＰＶＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＧＧＧＧＳＥＶＱＬＱＱＳＧＰＥＬＶＫＰＧＡＳＭＫＩＳＣＫＡＳＧＹＳＦＴＧＹＴＭＮＷＶＫＱＳＨＧＫＮＬＥＷＭＧＬＩＮＰＹＫＧＶＳＴＹＮＱＫＦＫＤＫＡＴＬＴＶＤＫＳＳＳＴＡＹＭＥＬＬＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＹＣＡＲＳＧＹＹＧＤＳＤＷＹＦＤＶＷＧＡＧＴＴＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＩＱＭＴＱＴＴＳＳＬＳＡＳＬＧＤＲＶＴＩＳＣＲＡＳＱＤＩＲＮＹＬＮＷＹＱＱＫＰＤＧＴＶＫＬＬＩＹＹＴＳＲＬＨＳＧＶＰＳＫＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＳＬＴＩＳＮＬＥＱＥＤＩＡＴＹＦＣＱＱＧＮＴＬＰＷＴＦＡＧＧＴＫＬＥＩＫＧＧＧＧＳＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＮＶＹＡＳＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＫＩＹＰＤＳＤＩＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＡＤＴＳＫＮＴＡＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＳＲＤＳＳＦＹＹＶＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号２６Ｙ５７ＩＲ１７５Ｈペプチドを標的とするｓｃＦｖ重鎖
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＮＶＹＡＳＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＫＩＹＰＤＳＤＩＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＡＤＴＳＫＮＴＡＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＳＲＤＳＳＦＹＹＶＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号２７Ｙ５７ＩＲ１７５Ｈペプチドを標的とするｓｃＦｖ重鎖ＣＤＲ２
ＶＡＫＩＹＰＤＳＤＩＴＹＹ
配列番号２８Ｆ５３Ｓ／Ｙ５７ＩｓｃＦｖ
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＤＶＮＴＡＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＳＡＹＳＬＹＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＲＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＹＳＲＹＳＰＶＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＴＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＡＳＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＮＶＹＡＳＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＫＩＹＰＤＳＤＩＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＡＤＴＳＫＮＴＡＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＳＲＤＳＳＦＹＹＶＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳ
配列番号２９Ｆ５３Ｓ／Ｙ５７ＩＲ１７５Ｈペプチドを標的とするｓｃＤｂ（シグナル配列またはＨｉｓタグなし）
ＭＹＲＭＱＬＬＳＣＩＡＬＳＬＡＬＶＴＮＳＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＤＶＮＴＡＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＳＡＹＳＬＹＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＲＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＹＳＲＹＳＰＶＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＧＧＧＧＳＥＶＱＬＱＱＳＧＰＥＬＶＫＰＧＡＳＭＫＩＳＣＫＡＳＧＹＳＦＴＧＹＴＭＮＷＶＫＱＳＨＧＫＮＬＥＷＭＧＬＩＮＰＹＫＧＶＳＴＹＮＱＫＦＫＤＫＡＴＬＴＶＤＫＳＳＳＴＡＹＭＥＬＬＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＹＣＡＲＳＧＹＹＧＤＳＤＷＹＦＤＶＷＧＡＧＴＴＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＩＱＭＴＱＴＴＳＳＬＳＡＳＬＧＤＲＶＴＩＳＣＲＡＳＱＤＩＲＮＹＬＮＷＹＱＱＫＰＤＧＴＶＫＬＬＩＹＹＴＳＲＬＨＳＧＶＰＳＫＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＳＬＴＩＳＮＬＥＱＥＤＩＡＴＹＦＣＱＱＧＮＴＬＰＷＴＦＡＧＧＴＫＬＥＩＫＧＧＧＧＳＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＮＶＹＡＳＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＫＩＹＰＤＳＤＩＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＡＤＴＳＫＮＴＡＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＳＲＤＳＳＦＹＹＶＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ

【0095】

（表１）Ｒ１７５Ｈペプチドを標的とするｓｃＦｖ