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特表2024-546938マルチサブユニットサイトカインを含む二重サイトカイン融合タンパク質
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-12-26
(54)【発明の名称】マルチサブユニットサイトカインを含む二重サイトカイン融合タンパク質
(51)【国際特許分類】
C07K 19/00 20060101AFI20241219BHJP
C07K 16/00 20060101ALI20241219BHJP
C07K 14/52 20060101ALI20241219BHJP
A61K 38/19 20060101ALI20241219BHJP
A61K 47/64 20170101ALI20241219BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20241219BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20241219BHJP
A61P 29/00 20060101ALI20241219BHJP
A61P 31/04 20060101ALI20241219BHJP
A61P 1/04 20060101ALI20241219BHJP
A61P 17/06 20060101ALI20241219BHJP
A61K 38/20 20060101ALI20241219BHJP
A61K 38/21 20060101ALI20241219BHJP
C12N 15/13 20060101ALN20241219BHJP
C12N 15/62 20060101ALN20241219BHJP
C12N 15/19 20060101ALN20241219BHJP
【ＦＩ】
C07K19/00 ZNA
C07K16/00
C07K14/52
A61K38/19
A61K47/64
A61K39/395 Y
A61P35/00
A61P29/00
A61P31/04
A61P1/04
A61P17/06
A61K38/20
A61K38/21
C12N15/13
C12N15/62 Z
C12N15/19
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024535875
(86)(22)【出願日】2022-12-13
(85)【翻訳文提出日】2024-08-09
(86)【国際出願番号】 US2022081460
(87)【国際公開番号】W WO2023114775
(87)【国際公開日】2023-06-22
(31)【優先権主張番号】63/265,339
(32)【優先日】2021-12-13
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】63/320,750
(32)【優先日】2022-03-17
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】63/328,990
(32)【優先日】2022-04-08
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】524225730
【氏名又は名称】デカ バイオサイエンシーズ， インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100078282
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 秀策
(74)【代理人】
【識別番号】100113413
【弁理士】
【氏名又は名称】森下 夏樹
(74)【代理人】
【識別番号】100181674
【弁理士】
【氏名又は名称】飯田 貴敏
(74)【代理人】
【識別番号】100181641
【弁理士】
【氏名又は名称】石川 大輔
(74)【代理人】
【識別番号】230113332
【弁護士】
【氏名又は名称】山本 健策
(72)【発明者】
【氏名】マム， ジョン
【テーマコード（参考）】
4C076
4C084
4C085
4H045
【Ｆターム（参考）】
4C076AA95
4C076CC04
4C076CC07
4C076CC10
4C076CC16
4C076CC27
4C076CC32
4C076CC41
4C076EE41
4C076EE59
4C084AA02
4C084BA41
4C084CA53
4C084DA01
4C084DA12
4C084DA14
4C084DA15
4C084DA16
4C084DA18
4C084DA22
4C084DA24
4C084DA25
4C084NA13
4C084NA14
4C084ZA66
4C084ZB11
4C084ZB26
4C084ZB35
4C085AA14
4C085AA25
4C085BB11
4C085DD62
4C085EE01
4H045AA10
4H045AA11
4H045AA30
4H045BA41
4H045CA40
4H045DA02
4H045DA15
4H045DA76
4H045EA20
4H045FA74
(57)【要約】
本出願は、単鎖可変断片足場系に融合したアルファおよびベータマルチサブユニットサイトカイン（ＩＬ－１２またはＩＬ－２７など）および第２のサイトカインを含み、ここで、前述の第２のサイトカインがｓｃＦｖのヒンジ領域中に連結されている二重サイトカイン融合タンパク質の組成物、医薬組成物、および／またはその製剤に関する。また、本出願は、癌、炎症性疾患または障害、ならびに免疫および免疫媒介性の疾患または障害を処置するために二重サイトカイン融合タンパク質の組成物を使用する方法に関する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
モノクローナル抗体の一本鎖可変領域（ｓｃＦｖ）または抗原結合断片に融合された第１のサイトカインの少なくとも第１および第２の単量体サブユニットであって、ここで、各々の単量体サブユニットが、融合タンパク質の末端に融合されている、少なくとも第１および第２の単量体サブユニット；ならびに第２のサイトカインであって、前記第２のサイトカインが、前記ｓｃＦｖまたは抗原結合断片のＶＨ領域とＶＬ領域との間に融合されている、第２のサイトカインを含む、二重サイトカイン融合タンパク質。
【請求項2】
前記第１のサイトカインが、ＩＬ－１２またはＩＬ－２７である、請求項１に記載の二重サイトカイン融合タンパク質。
【請求項3】
前記第１の単量体サブユニットがｐ３５サブユニットであり、前記第２の単量体サブユニットがｐ４０サブユニットである、請求項１に記載の二重サイトカインタンパク質。
【請求項4】
前記第１の単量体サブユニットが配列番号１、１７、１９であり、前記第２の単量体サブユニットが配列番号３、１８、２０である、請求項１に記載の二重サイトカインタンパク質。
【請求項5】
前記第１の単量体サブユニットがｐ２８サブユニットであり、前記第２の単量体サブユニットがＥＢＩ３サブユニットである、請求項１に記載の二重サイトカインタンパク質。
【請求項6】
前記第１の単量体サブユニットが配列番号５であり、前記第２の単量体サブユニットが配列番号７である、請求項１に記載の二重サイトカインタンパク質。
【請求項7】
式（Ｉａ）または（Ｉｂ）：ＮＨ２－（Ｒ１）－（Ｘ１）－（Ｚｎ）－（Ｘ２）－（Ｒ２）－ＣＯＯＨ（式Ｉａ）；
ＮＨ２－（Ｒ２）－（Ｘ１）－（Ｚｎ）－（Ｘ２）－（Ｒ１）－ＣＯＯＨ（式Ｉｂ）
（式中、
「Ｒ１」が、配列番号１、１７、１９、または５から選択される第１のサイトカイン配列のアルファサブユニットであり；
「Ｒ２」が、配列番号３、１８、２０、または７から選択される第１のサイトカイン配列のベータサブユニットであり；
ここで、Ｒ１が配列番号１ １７、または１９であるとき、Ｒ２は配列番号３、１８、２０であり、あるいは、Ｒ１が配列番号５であるとき、Ｒ２は配列番号７であり；
「Ｘ１」が、第１のモノクローナル抗体から得たＶＬ領域またはＶＨ領域であり；
「Ｘ２」が、前記第１のモノクローナル抗体から得たＶＨ領域またはＶＬ領域であり；
ここで、Ｘ１がＶＬであるとき、Ｘ２はＶＨであり、あるいは、Ｘ１がＶＨであるとき、Ｘ２はＶＬであり、
「Ｚ」がサイトカインであり；
「ｎ」が０～２から選択される整数である）の二重サイトカイン融合タンパク質。
【請求項8】
Ｘ１およびＸ２が、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）；ＣＤ１４；ＣＤ５２；多様な免疫チェックポイント標的（ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－１、ＴＩＭ３、ＢＴＬＡ、ＬＡＧ３、またはＣＴＬＡ４などであるが、これらに限定されない）；ＣＤ２０；ＣＤ４７；ＧＤ－２；ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２；ＨＥＲ２；ＰＤＧＦＲ；ＥｐＣＡＭ；ＩＣＡＭ（ＩＣＡＭ－１、－２、－３、－４、－５）、ＶＣＡＭ、ＦＡＰα；５Ｔ４；Ｔｒｏｐ２；ＥＤＢ－ＦＮ；ＴＧＦβ Ｔｒａｐ；ＭＡｄＣＡＭ、β７インテグリンサブユニット；α４β７インテグリン；α４インテグリンＳＲ－Ａ１；ＳＲ－Ａ３；ＳＲ－Ａ４；ＳＲ－Ａ５；ＳＲ－Ａ６；ＳＲ－Ｂ；ｄＳＲ－Ｃ１；ＳＲ－Ｄ１；ＳＲ－Ｅ１；ＳＲ－Ｆ１；ＳＲ－Ｆ２；ＳＲ－Ｇ；ＳＲ－Ｈ１；ＳＲ－Ｈ２；ＳＲ－Ｉ１；ＳＲ－Ｊ１；ＨＩＶ、またはエボラに特異的な前記第１のモノクローナル抗体から得られる、請求項７に記載の二重サイトカイン融合タンパク質。
【請求項9】
前記ＶＬおよびＶＨが、抗ＨＩＶ抗体または抗エボラ抗体である前記第１のモノクローナル抗体から得られる、請求項７に記載の二重サイトカイン融合タンパク質。
【請求項10】
前記抗ＨＩＶモノクローナル抗体または抗エボラモノクローナル抗体由来の前記ＶＬおよびＶＨが、第２の抗体由来の６つのＣＤＲを用いてグラフティングされた（置換された）６つのＣＤＲを含む、請求項９に記載の二重サイトカイン融合タンパク質。
【請求項11】
前記第２の抗体が、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）；ＣＤ１４；ＣＤ５２；多様な免疫チェックポイント標的（ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－１、ＴＩＭ３、ＢＴＬＡ、ＬＡＧ３、またはＣＴＬＡ４などであるが、これらに限定されない）；ＣＤ２０；ＣＤ４７；ＧＤ－２；ＶＥＧＦＲ１；ＶＥＧＦＲ２；ＨＥＲ２；ＰＤＧＦＲ；ＥｐＣＡＭ；ＩＣＡＭ（ＩＣＡＭ－１、－２、－３、－４、－５）、ＶＣＡＭ、ＦＡＰα；５Ｔ４；Ｔｒｏｐ２；ＥＤＢ－ＦＮ；ＴＧＦβ Ｔｒａｐ；ＭＡｄＣＡＭ、β７インテグリンサブユニット；α４β７インテグリン；α４インテグリンＳＲ－Ａ１；ＳＲ－Ａ３；ＳＲ－Ａ４；ＳＲ－Ａ５；ＳＲ－Ａ６；ＳＲ－Ｂ；ｄＳＲ－Ｃ１；ＳＲ－Ｄ１；ＳＲ－Ｅ１；ＳＲ－Ｆ１；ＳＲ－Ｆ２；ＳＲ－Ｇ；ＳＲ－Ｈ１；ＳＲ－Ｈ２；ＳＲ－Ｉ１；またはＳＲ－Ｊ１から選択されるモノクローナル抗体である、請求項１０に記載の二重サイトカイン融合タンパク質。
【請求項12】
前記第２のモノクローナル抗体由来の前記６つのグラフティングされたＣＤＲが、抗ＥＧＦＲ抗体、抗ＨＥＲ２抗体、抗ＶＥＧＦＲ１抗体、または抗ＶＥＧＦＲ２抗体由来の６つのＣＤＲを含み、ここで、前記６つのＣＤＲが、前記ＶＬ由来のＣＤＲ１～３およびＶＨ由来のＣＤＲ１～３を含む、請求項１０に記載の二重サイトカイン融合タンパク質。
【請求項13】
Ｚが、ＩＬ－６、ＩＬ－４、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－５、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、ＩＬ－２６、ＩＬ－２８、ＩＬ－２９、ＧＭ－ＣＳＦ、Ｇ－ＣＳＦ、インターフェロン－α、－β、－γ、ＴＧＦ－β、または腫瘍壊死因子－α、－β、塩基性ＦＧＦ、ＥＧＦ、ＰＤＧＦ、ＩＬ－４、ＩＬ－１１、またはＩＬ－１３から選択されるサイトカインである、請求項７に記載の二重サイトカイン融合タンパク質。
【請求項14】
Ｚがインターフェロン－α、ＩＬ－２８、またはＩＬ－２９である、請求項７に記載の二重サイトカイン融合タンパク質。
【請求項15】
Ｚが整数１である、請求項７に記載の二重サイトカイン融合タンパク質。
【請求項16】
Ｒ１、Ｘ１、Ｚ、Ｘ２、およびＲ２の各々の間にリンカーをさらに含む、請求項７に記載の二重サイトカイン融合タンパク質。
【請求項17】
ＩＬ－１２を含む二重サイトカイン融合タンパク質であって、前記融合タンパク質が、式（ＩＩａ）または（ＩＩｂ）ＮＨ２－（ｐ３５）－（Ｌ）－（Ｘ１）－（Ｌ）－（Ｚｎ）－（Ｌ）－（Ｘ２）－（Ｌ）－（ｐ４０）－ＣＯＯＨ（式ＩＩａ）；
ＮＨ２－（ｐ４０）－（Ｌ）－（Ｘ１）－（Ｌ）－（Ｚｎ）－（Ｌ）－（Ｘ２）－（Ｌ）－（ｐ３５）－ＣＯＯＨ（式ＩＩｂ）；
（式中、
「ｐ３５」が、配列番号１、１７、または１９の配列であり；
「ｐ４０」が、配列番号３、１８、または２０の配列であり；
「Ｌ」がリンカーであり；
「Ｘ１」が、第１のモノクローナル抗体から得たＶＬ領域またはＶＨ領域であり；
「Ｘ２」が、前記第１のモノクローナル抗体から得たＶＨ領域またはＶＬ領域であり；
ここで、Ｘ１がＶＬであるとき、Ｘ２はＶＨであり、あるいは、Ｘ１がＶＨであるとき、Ｘ２はＶＬであり；
「Ｚ」が、ＩＬ－６、ＩＬ－４、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－５、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、ＩＬ－２６、ＩＬ－２７、ＩＬ－２８、ＩＬ－２９、ＧＭ－ＣＳＦ、Ｇ－ＣＳＦ、インターフェロン－α、－β、－γ、ＴＧＦ－β、または腫瘍壊死因子－α、－β、塩基性ＦＧＦ、ＥＧＦ、ＰＤＧＦ、ＩＬ－４、ＩＬ－１１、またはＩＬ－１３から選択されるサイトカインであり；
「ｎ」が０～２から選択される整数である）である、ＩＬ－１２を含む二重サイトカイン融合タンパク質。
【請求項18】
前記ＶＬおよびＶＨが、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）；ＣＤ１４；ＣＤ５２；多様な免疫チェックポイント標的（ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－１、ＴＩＭ３、ＢＴＬＡ、ＬＡＧ３、またはＣＴＬＡ４などであるが、これらに限定されない）；ＣＤ２０；ＣＤ４７；ＧＤ－２；ＶＥＧＦＲ１；ＶＥＧＦＲ２；ＨＥＲ２；ＰＤＧＦＲ；ＥｐＣＡＭ；ＩＣＡＭ（ＩＣＡＭ－１、－２、－３、－４、－５）、ＶＣＡＭ、ＦＡＰα；５Ｔ４；Ｔｒｏｐ２；ＥＤＢ－ＦＮ；ＴＧＦβ Ｔｒａｐ；ＭＡｄＣＡＭ、β７インテグリンサブユニット；α４β７インテグリン；α４インテグリンＳＲ－Ａ１；ＳＲ－Ａ３；ＳＲ－Ａ４；ＳＲ－Ａ５；ＳＲ－Ａ６；ＳＲ－Ｂ；ｄＳＲ－Ｃ１；ＳＲ－Ｄ１；ＳＲ－Ｅ１；ＳＲ－Ｆ１；ＳＲ－Ｆ２；ＳＲ－Ｇ；ＳＲ－Ｈ１；ＳＲ－Ｈ２；ＳＲ－Ｉ１；ＳＲ－Ｊ１；ＨＩＶ、またはエボラに特異的な第１の抗体から得られる、請求項１７に記載のＩＬ－１２融合タンパク質。
【請求項19】
前記ＶＬおよびＶＨが、ＨＩＶまたはエボラに特異的な前記第１の抗体から得られる、請求項１８に記載のＩＬ－１２融合タンパク質。
【請求項20】
前記抗ＨＩＶまたは抗エボラ由来の前記ＶＬおよびＶＨが、第２の抗体由来の６つのＣＤＲを用いてグラフティングされた（置換された）６つのＣＤＲを含む、請求項１９に記載のＩＬ－１２融合タンパク質。
【請求項21】
前記第２の抗体が、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）；ＣＤ１４；ＣＤ５２；多様な免疫チェックポイント標的（ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－１、ＴＩＭ３、ＢＴＬＡ、ＬＡＧ３、またはＣＴＬＡ４などであるが、これらに限定されない）；ＣＤ２０；ＣＤ４７；ＧＤ－２；ＶＥＧＦＲ１；ＶＥＧＦＲ２；ＨＥＲ２；ＰＤＧＦＲ；ＥｐＣＡＭ；ＩＣＡＭ（ＩＣＡＭ－１、－２、－３、－４、－５）、ＶＣＡＭ、ＦＡＰα；５Ｔ４；Ｔｒｏｐ２；ＥＤＢ－ＦＮ；ＴＧＦβ Ｔｒａｐ；ＭＡｄＣＡＭ、β７インテグリンサブユニット；α４β７インテグリン；α４インテグリンＳＲ－Ａ１；ＳＲ－Ａ３；ＳＲ－Ａ４；ＳＲ－Ａ５；ＳＲ－Ａ６；ＳＲ－Ｂ；ｄＳＲ－Ｃ１；ＳＲ－Ｄ１；ＳＲ－Ｅ１；ＳＲ－Ｆ１；ＳＲ－Ｆ２；ＳＲ－Ｇ；ＳＲ－Ｈ１；ＳＲ－Ｈ２；ＳＲ－Ｉ１；またはＳＲ－Ｊ１から選択される抗体である、請求項２０に記載のＩＬ－１２融合タンパク質。
【請求項22】
前記第２の抗体由来の前記６つのグラフティングされたＣＤＲが、抗ＥＧＦＲ抗体、抗ＶＥＧＦＲ１抗体もしくはＶＥＧＦＲ２抗体、抗ＨＥＲ２抗体、または抗（ａｎｔ－）ＣＤ１４抗体から選択される抗体由来の６つのＣＤＲを含み、ここで、前記６つのＣＤＲが、前記ＶＬ由来のＣＤＲ１～３およびＶＨ由来のＣＤＲ１～３を含む、請求項２０に記載のＩＬ－１２融合タンパク質。
【請求項23】
ＩＬ－２７を含む二重サイトカイン融合タンパク質であって、前記融合タンパク質が、式（ＩＩＩａ）または（ＩＩＩｂ）ＮＨ２－（ｐ２８）－（Ｌ）－（Ｘ１）－（Ｌ）－（Ｚｎ）－（Ｌ）－（Ｘ２）－（Ｌ）－（ＥＢＩ３）－ＣＯＯＨ（式ＩＩＩａ）；
ＮＨ２－（ＥＢＩ３）－（Ｌ）－（Ｘ１）－（Ｌ）－（Ｚｎ）－（Ｌ）－（Ｘ２）－（Ｌ）－（ｐ２８）－ＣＯＯＨ（式ＩＩＩｂ）；
（式中、
「ｐ２８」が、配列番号５の配列であり；
「ＥＢＩ３」が、配列番号７の配列であり；
「Ｌ」がリンカーであり；
「Ｘ１」が、第１のモノクローナル抗体から得たＶＬ領域またはＶＨ領域であり；
「Ｘ２」が、前記第１のモノクローナル抗体から得たＶＨ領域またはＶＬ領域であり；
ここで、Ｘ１がＶＬであるとき、Ｘ２はＶＨであり、あるいは、Ｘ１がＶＨであるとき、Ｘ２はＶＬであり；
「Ｚ」が、ＩＬ－６、ＩＬ－４、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－５、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、ＩＬ－２６、ＩＬ－２８、ＩＬ－２９、ＧＭ－ＣＳＦ、Ｇ－ＣＳＦ、インターフェロン－α、－β、－γ、ＴＧＦ－β、または腫瘍壊死因子－α、－β、塩基性ＦＧＦ、ＥＧＦ、ＰＤＧＦ、ＩＬ－４、ＩＬ－１１、またはＩＬ－１３から選択されるサイトカインであり；
「ｎ」が０～２から選択される整数である）である、ＩＬ－２７を含む二重サイトカイン融合タンパク質。
【請求項24】
前記ＶＬおよびＶＨが、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）；ＣＤ１４；ＣＤ５２；多様な免疫チェックポイント標的（ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－１、ＴＩＭ３、ＢＴＬＡ、ＬＡＧ３、またはＣＴＬＡ４などであるが、これらに限定されない）；ＣＤ２０；ＣＤ４７；ＧＤ－２；ＶＥＧＦＲ１；ＶＥＧＦＲ２；ＨＥＲ２；ＰＤＧＦＲ；ＥｐＣＡＭ；ＩＣＡＭ（ＩＣＡＭ－１、－２、－３、－４、－５）、ＶＣＡＭ、ＦＡＰα；５Ｔ４；Ｔｒｏｐ２；ＥＤＢ－ＦＮ；ＴＧＦβ Ｔｒａｐ；ＭＡｄＣＡＭ、β７インテグリンサブユニット；α４β７インテグリン；α４インテグリンＳＲ－Ａ１；ＳＲ－Ａ３；ＳＲ－Ａ４；ＳＲ－Ａ５；ＳＲ－Ａ６；ＳＲ－Ｂ；ｄＳＲ－Ｃ１；ＳＲ－Ｄ１；ＳＲ－Ｅ１；ＳＲ－Ｆ１；ＳＲ－Ｆ２；ＳＲ－Ｇ；ＳＲ－Ｈ１；ＳＲ－Ｈ２；ＳＲ－Ｉ１；ＳＲ－Ｊ１；ＨＩＶ、またはエボラに特異的な第１の抗体から得られる、請求項２３に記載のＩＬ－２７融合タンパク質。
【請求項25】
前記ＶＬおよびＶＨが、ＨＩＶまたはエボラに特異的な前記第１の抗体から得られる、請求項２４に記載のＩＬ－２７融合タンパク質。
【請求項26】
前記抗ＨＩＶまたは抗エボラ由来の前記ＶＬおよびＶＨが、第２の抗体由来の６つのＣＤＲを用いてグラフティングされた（置換された）６つのＣＤＲを含む、請求項２５に記載のＩＬ－２７融合タンパク質。
【請求項27】
前記第２の抗体が、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）；ＣＤ１４；ＣＤ５２；多様な免疫チェックポイント標的（ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－１、ＴＩＭ３、ＢＴＬＡ、ＬＡＧ３、またはＣＴＬＡ４などであるが、これらに限定されない）；ＣＤ２０；ＣＤ４７；ＧＤ－２；ＶＥＧＦＲ１；ＶＥＧＦＲ２；ＨＥＲ２；ＰＤＧＦＲ；ＥｐＣＡＭ；ＩＣＡＭ（ＩＣＡＭ－１、－２、－３、－４、－５）、ＶＣＡＭ、ＦＡＰα；５Ｔ４；Ｔｒｏｐ２；ＥＤＢ－ＦＮ；ＴＧＦβ Ｔｒａｐ；ＭＡｄＣＡＭ、β７インテグリンサブユニット；α４β７インテグリン；α４インテグリンＳＲ－Ａ１；ＳＲ－Ａ３；ＳＲ－Ａ４；ＳＲ－Ａ５；ＳＲ－Ａ６；ＳＲ－Ｂ；ｄＳＲ－Ｃ１；ＳＲ－Ｄ１；ＳＲ－Ｅ１；ＳＲ－Ｆ１；ＳＲ－Ｆ２；ＳＲ－Ｇ；ＳＲ－Ｈ１；ＳＲ－Ｈ２；ＳＲ－Ｉ１；またはＳＲ－Ｊ１から選択される抗体である、請求項２６に記載のＩＬ－２７融合タンパク質。
【請求項28】
前記第２の抗体由来の前記６つのグラフティングされたＣＤＲが、抗ＥＧＦＲ抗体、抗ＶＥＧＦＲ１抗体もしくはＶＥＧＦＲ２抗体、抗ＨＥＲ２抗体、または抗（ａｎｔ－）ＣＤ１４抗体由来の６つのＣＤＲを含み、ここで、前記６つのＣＤＲが、前記ＶＬ由来のＣＤＲ１～３およびＶＨ由来のＣＤＲ１～３を含む、請求項２７に記載のＩＬ－２７融合タンパク質。
【請求項29】
癌を処置する方法であって、有効量の請求項１、２、または７に記載の融合タンパク質を、前記処置を必要とする被験体に投与することを含む、方法。
【請求項30】
前記融合タンパク質が、抗ＨＩＶまたは抗エボラから選択される第１の抗体由来のＶＬ領域およびＶＨ領域を含み、前記第１の抗体の６つのＣＤＲ領域が、抗ＥＧＦＲ抗体、抗ＨＥＲ２抗体、抗ＶＥＧＦＲ１抗体、または抗ＶＥＧＦＲ２抗体、または抗ＣＤ１４から選択される第２の抗体由来の６つのＣＤＲ領域を用いてグラフティングされている、請求項２９に記載の方法。
【請求項31】
前記第１の抗体が抗エボラ抗体であり、前記第２の抗体が抗ＥＧＦＲ抗体、抗ＨＥＲ２抗体、抗ＶＥＧＦＲ１抗体、抗ＶＥＧＦＲ２抗体、または抗ＣＤ１４抗体から選択される、請求項３０に記載の方法。
【請求項32】
前記第１のサイトカインが、ＩＬ－１２またはＩＬ－２７である、請求項２９に記載の方法。
【請求項33】
前記サイトカインまたは「Ｚ」がＩＬ－１２である、請求項３２に記載の方法。
【請求項34】
「Ｚ」についての値「ｎ」が１である、請求項２４に記載の方法。
【請求項35】
前記融合タンパク質を０．０１ｎｇ／ｍｌ～１００ｎｇ／ｍｌで投与する、請求項２１に記載の方法。
【請求項36】
前記融合タンパク質を０．０１ｎｇ／ｍｌ～１０ｎｇ／ｍｌで投与する、請求項２１に記載の方法。
【請求項37】
炎症性疾患を処置する方法であって、有効量の請求項１、２、または７に記載の融合タンパク質を、前記処置を必要とする被験体に投与することを含む、方法。
【請求項38】
前記融合タンパク質が、抗ＨＩＶまたは抗エボラから選択される第１の抗体由来のＶＬ領域およびＶＨ領域を含み、前記第１の抗体の６つのＣＤＲ領域が、抗ＨＥＲ２抗体、抗ＶＥＧＦＲ１、抗ＶＥＧＦＲ２、抗ＥＧＦＲ抗体、または抗ＣＤ１４抗体由来の６つのＣＤＲ領域を用いてグラフティングされている、請求項３７に記載の方法。
【請求項39】
「Ｚ」についての値「ｎ」が１である、請求項３７に記載の方法。
【請求項40】
前記融合タンパク質を０．０１ｎｇ／ｍｌ～１００ｎｇ／ｍｌで投与する、請求項３７に記載の方法。
【請求項41】
前記炎症性疾患が、敗血症、クローン病、関節リウマチ、乾癬、および／または炎症性腸疾患（ＩＢＤ）である、請求項３７に記載の方法。
【請求項42】
敗血症、敗血症性ショック、および／またはこれらに関連する徴候を処置する方法であって、有効量の請求項１、２、または７に記載の融合タンパク質を、前記処置を必要とする被験体に投与することを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願への相互参照
本出願は、２０２１年１２月１３日出願の米国仮出願第６３／２６５，３３９号（その内容全体が本明細書中で参考として援用される）に基づく優先権の利益を主張する。
本出願は、２０２１年１２月１３日出願の米国仮出願第６３／２６５，３３９号（その内容全体が本明細書中で参考として援用される）に基づく優先権の利益を主張する。
【0002】
電子配列表の参照
電子配列表（０３９４５１－０００８３＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ－Ｌｉｓｔｉｎｇ．ｘｍｌ；サイズ：７６，６６２バイト；および作成日：２０２２年１２月１３日）の内容は、その全体が本明細書中で参考として援用される。
電子配列表（０３９４５１－０００８３＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ－Ｌｉｓｔｉｎｇ．ｘｍｌ；サイズ：７６，６６２バイト；および作成日：２０２２年１２月１３日）の内容は、その全体が本明細書中で参考として援用される。
【0003】
発明の分野
本開示は、生物工学分野、より具体的には、インターロイキン－１２（「ＩＬ－１２」）もしくはインターロイキン－ＩＬ－２７を他の炎症性サイトカインおよび免疫調節サイトカインと組み合わせて含む新規の二重サイトカイン融合タンパク質、炎症性および免疫の疾患もしくは症状を処置する方法、ならびに／または癌を処置する方法に関する。
本開示は、生物工学分野、より具体的には、インターロイキン－１２（「ＩＬ－１２」）もしくはインターロイキン－ＩＬ－２７を他の炎症性サイトカインおよび免疫調節サイトカインと組み合わせて含む新規の二重サイトカイン融合タンパク質、炎症性および免疫の疾患もしくは症状を処置する方法、ならびに／または癌を処置する方法に関する。
【0004】
序論
ＩＬ－１２は、７０ｋＤａヘテロ二量体サイトカインであり、典型的なＴヘルパー１（Ｔｈ１）偏向サイトカインである（Ｍｏｓｓｍａｎ，１９８９；Ａｔｈｉｅ－Ｍｏｒａｌｅｓ，２００４）。ＩＬ－１２は、ＣＤ８＋Ｔ細胞（Ｈｅｎｒｙ，２００８；Ｖａｃａｆｌｏｒｅｓ，２０１７；Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙ，２０１１）、ＮＫ細胞（Ｍａｒｔｉｎｏｖｉｃ，２０１５；Ｐａｒｉｈａｒ，２００２；Ｚｈａｎｇ，２００８）、ＣＤ４＋Ｔ細胞（Ｙｏｏ，２００２；Ｖａｃａｆｌｏｒｅｓ１，２０１６）、および単球（ある程度）（Ｃｏｍａ，２００６）を活性させることによって強力な抗腫瘍免疫を発揮する。したがって、ＩＬ－１２は、主に抗原特異的Ｔ細胞活性化を増強する一方で、部分的にはＮＫ細胞および単球の両方を中程度に刺激することによって先天性免疫系への橋渡しをする。
ＩＬ－１２は、７０ｋＤａヘテロ二量体サイトカインであり、典型的なＴヘルパー１（Ｔｈ１）偏向サイトカインである（Ｍｏｓｓｍａｎ，１９８９；Ａｔｈｉｅ－Ｍｏｒａｌｅｓ，２００４）。ＩＬ－１２は、ＣＤ８＋Ｔ細胞（Ｈｅｎｒｙ，２００８；Ｖａｃａｆｌｏｒｅｓ，２０１７；Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙ，２０１１）、ＮＫ細胞（Ｍａｒｔｉｎｏｖｉｃ，２０１５；Ｐａｒｉｈａｒ，２００２；Ｚｈａｎｇ，２００８）、ＣＤ４＋Ｔ細胞（Ｙｏｏ，２００２；Ｖａｃａｆｌｏｒｅｓ１，２０１６）、および単球（ある程度）（Ｃｏｍａ，２００６）を活性させることによって強力な抗腫瘍免疫を発揮する。したがって、ＩＬ－１２は、主に抗原特異的Ｔ細胞活性化を増強する一方で、部分的にはＮＫ細胞および単球の両方を中程度に刺激することによって先天性免疫系への橋渡しをする。
【0005】
インターフェロン－アルファ（ＩＦＮα－２ａ）は、樹状細胞の成熟を直接誘導し（Ｓｉｍｍｏｎｓ，２０１２；Ｇｅｓｓａｎｉ，２０１４；Ｐａｄｏｖａｎ，２００２）、ＣＤ８＋Ｔ細胞の細胞傷害機能を増強する（Ｈｉｒｏｉｓｈｉ，２０００；Ｋｏｌｕｍａｍ，２００５；Ｌｕ，２０１９）単量体のＩ型インターフェロンである。したがって、ＩＦＮα－２ａは、適応免疫応答に対するより限定的な効果と比較して、先天性免疫系に対してより高い機能を示す。
【0006】
ＩＬ－１２の抗腫瘍効果は、前臨床試験および臨床試験で評価されており（Ｂｒｕｎｄａ，１９９３；Ａｔｋｉｎｓ，１９９７）、有毒であるために、腫瘍内に直接注射して評価されており、臨床投与より優れていることが見出された（Ｈｅｒｐｅｎ，２００４；Ｌｉ Ｓ．，２００５；Ｓａｂｅｌ，２００４）。
【0007】
同様に、ＩＦＮα－２ａは、前臨床試験で評価されており、ＰＥＧ化されたものが臨床試験で評価されており（Ｌｙｒｄａｌ，２００９；Ｓｕｎｅｌａ，２００９；Ｍｅｄｒａｎｏ，２０１７）、いくつかの癌における使用が承認されている（Ｈｏｗ，２０２０）。
【0008】
したがって、頑強な抗腫瘍機能を駆動するために抗腫瘍免疫応答のプライミング（Ｎｅｍｕｎａｉｔｉｓ，２００５）とＣＤ８＋細胞、ＣＤ４＋細胞、およびＮＫ細胞の刺激との両方が必要であることを考慮すると、本発明者らは、ＩＦＮα－２ａおよびＩＬ－１２の両方を、腫瘍微小環境中にこれら２つのサイトカインをターゲティングするためにターゲティング二重サイトカイン足場系（同時係属中の米国特許出願第１７／１１０，１０４号に一般的に記載された「Ｄｉａｋｉｎｅ（商標）」（「ＤＫ」）として公知）上に組み合わせることにより、機能的な抗原提示細胞へのＭ２単球の分化の誘導によるｉｎ ｓｉｔｕプライミングが増強され（Ｖｉｄｙａｒｔｈｉ，２０１８）、Ｔ細胞およびＮＫ細胞の機能が増強されることを見出した。これら２つのサイトカインの組み合わせは、適応免疫系と先天性免疫系との間の刺激の橋渡しをする。
【0009】
インターロイキン１０（ＩＬ－１０）は、インターフェロンｇ（ＩＦＮｇ）と構造が類似する非共有結合性のホモ二量体サイトカインである。ＩＬ－１０受容体は、２分子のＩＬ１０受容体１（ＩＬ１０Ｒ１）および２分子のＩＬ－１０受容体２（ＩＬ１０Ｒ２）からなる（Ｍｏｏｒｅ，２００１）。ＩＬ－１０受容体は、ほとんどの造血細胞の表面上に発現され、マクロファージおよびＴ細胞上で高発現する。
【0010】
ＩＬ－１０は、免疫抑制性サイトカイン（Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ，２０００）および免疫賦活性サイトカイン（Ｍｕｍｍ，２０１１）の両方であることが報告されており、クローン病患者を処置するためのＩＬ－１０の臨床評価では逆の用量応答が示されており（Ｆｅｄｏｒａｋ，２０００；Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ，２０００）、それに対して、ＰＥＧ化ＩＬ－１０を用いた癌患者の処置では用量滴定可能な強力な抗腫瘍応答を示した（Ｎａｉｎｇ，２０１８）。
【0011】
ＩＬ－１０は、ＮＫ細胞およびＣＤ４＋Ｔ細胞の両方によって分泌されたＩＬ－２によって駆動されるＩＦＮｇ産生を抑制することが報告されているが（Ｓｃｏｔｔ，２００６）、ＩＬ－２誘導性のＣＤ８＋Ｔ細胞増殖の補因子として作用することも報告されている（Ｇｒｏｕｘ，１９９８）。
【0012】
また、本発明者らは、ＩＬ－１０およびＩＬ－１２の両方を、腫瘍微小環境中にこれら２つのサイトカインをターゲティングするためにターゲティングＤＫサイトカイン足場系上に組み合わせることにより、ＮＫ細胞およびＴ細胞の機能が増強されることを見出した。
【0013】
ＩＬ－２７は、ＩＬ－１２ファミリーのメンバーであり、２つのサブユニット（ｐ２８およびエプスタイン・バーウイルス誘導性遺伝子３（「ＥＩＢ３」））から構成されるヘテロ二量体サイトカインである。Ｉｌ－２７は、ＩＬ－１０を誘導することが公知である。ＩＬ－２８は、ＣＤ８＋Ｔ細胞を刺激するＩＦＮα－２ａ放出を誘発する３型インターフェロンである。ＩＬ－２８は、２つのイソ型（ＩＬ－２８ＡおよびＩＬ－２８Ｂ）を含む。ＩＬ－２９は、ＩＬ－２８と配列が相同であり、先天性免疫応答および適応免疫応答の両方に関与する３型インターフェロンでもある。
【0014】
また、本発明者らは、他のサイトカインの組み合わせ（ＩＬ－１２のインターロイキン－２８（ＩＬ－２８）またはインターロイキン（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎｇ）－２９（ＩＬ－２９）との組み合わせ、インターロイキン－２７（ＩＬ－２７）のＩＦＮα－２ａ、ＩＬ－２８、またはＩＬ－２９との組み合わせを含むが、これらに限定されない）を、本明細書中に記載の二重サイトカイン足場系中に組み込み得ることを見出した（例えば、図１を参照のこと）。簡潔に述べれば、二重サイトカイン足場系は、マルチサブユニットサイトカイン（例えば、ＩＬ－１２、ＩＬ－２７を含むが、これらに限定されない）を、第２のサイトカイン（例えば、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＦＮａ－２ａ、ＩＬ－１０）と組み合わせたヒト抗ＨＩＶまたはヒト抗エボラモノクローナル抗体の抗原結合ドメインまたは一本鎖可変領域（ｓｃＦｖ）を含む足場系の末端に融合させることが可能であり、ここで、第２のサイトカインは、抗原結合ドメインまたはｓｃＦｖのヒンジ領域中に融合されている。
【0015】
また、本発明者らは、二重サイトカイン足場系が、マルチサブユニットサイトカイン（例えば、ＩＬ－１２、ＩＬ－２７）を、単量体サイトカイン（例えば、ＩＦＮ－α、ＩＬ－２８、ＩＬ－２９）または別のマルチサブユニットサイトカイン（例えば、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－２７）と組み合わせたヒト抗ＨＩＶまたはヒト抗エボラモノクローナル抗体の抗原結合ドメインまたはｓｃＦｖを含む足場系の末端に融合させることが可能であることを見出した。
米国特許第１０，８５８，４１２号に以前に記載のように、非免疫原性重鎖可変（「ＶＨ」）領域および軽鎖可変（「ＶＬ」）領域を含む足場系は、適切に折りたたまれ、機能活性を保持している半減期が延長されたＩＬ－１０を産生した。足場系中へのＩＬ－１０の組み込みは、炎症細胞（例えば、単球／マクロファージ／樹状細胞）および免疫細胞（例えば、ＣＤ８＋Ｔ細胞）の両方においてＩＬ－１０機能を増強した。米国特許出願第１６／８１１，７１８号（その全体が参考として援用される）として２０２０年３月６日出願の米国特許第１０，８５８，４１２号を参照のこと。本出願は、以前に発見されたＩＬ－１０ベースの二重サイトカイン足場系を、ＩＬ－１０の代わりとして他のマルチサブユニットベースのサイトカイン（例えば、ほんの数例を挙げれば、ＩＬ－１２、ＩＬ－２７）で置換し、新規の融合タンパク質中に第２のサイトカインをさらに組み込むによって、炎症性疾患、免疫疾患、および／または癌を処置するためにマルチサブユニットサイトカイン（例えば、ＩＬ－１２またはＩＬ－２７）の生物学をさらにまたは相乗的に増強するという改良を行っている。
米国特許第１０，８５８，４１２号に以前に記載のように、非免疫原性重鎖可変（「ＶＨ」）領域および軽鎖可変（「ＶＬ」）領域を含む足場系は、適切に折りたたまれ、機能活性を保持している半減期が延長されたＩＬ－１０を産生した。足場系中へのＩＬ－１０の組み込みは、炎症細胞（例えば、単球／マクロファージ／樹状細胞）および免疫細胞（例えば、ＣＤ８＋Ｔ細胞）の両方においてＩＬ－１０機能を増強した。米国特許出願第１６／８１１，７１８号（その全体が参考として援用される）として２０２０年３月６日出願の米国特許第１０，８５８，４１２号を参照のこと。本出願は、以前に発見されたＩＬ－１０ベースの二重サイトカイン足場系を、ＩＬ－１０の代わりとして他のマルチサブユニットベースのサイトカイン（例えば、ほんの数例を挙げれば、ＩＬ－１２、ＩＬ－２７）で置換し、新規の融合タンパク質中に第２のサイトカインをさらに組み込むによって、炎症性疾患、免疫疾患、および／または癌を処置するためにマルチサブユニットサイトカイン（例えば、ＩＬ－１２またはＩＬ－２７）の生物学をさらにまたは相乗的に増強するという改良を行っている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0016】
【特許文献1】米国特許第１０，８５８，４１２号明細書
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0017】
発明の種々の態様の要旨
本開示は、一般に、二重サイトカイン融合タンパク質に関する。
本開示は、一般に、二重サイトカイン融合タンパク質に関する。
【0018】
したがって、第１の態様では、本開示は、マルチサブユニットサイトカイン（ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、またはＩＬ－２７およびこれらのバリアントなどであるが、これらに限定されない）である第１のサイトカインであって、前述のサブユニットの各々が、モノクローナル抗体から得たｓｃＦｖまたは抗原結合断片の重鎖可変領域（「ＶＨ」）または軽鎖可変（「ＶＬ」）領域のいずれかに融合されている、第１のサイトカイン、および第２のサイトカインであって、ここで、前述の第２のサイトカインが、前述のｓｃＦｖまたは抗原結合断片のＶＨ領域とＶＬ領域との間に連結されている、第２のサイトカインを含む二重サイトカイン融合タンパク質に関する。ある特定の実施形態では、第１のサイトカインは、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、またはＩＬ－２７の機能を増強する１またはそれを超えるアミノ酸置換（複数可）を含む任意のマルチサブユニットサイトカイン（ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、もしくはＩＬ－２７、またはこれらの機能的なバリアントなどであるが、これらに限定されない）である。第１および第２のサイトカインがｓｃＦｖまたは抗原結合断片のＶＨ領域およびＶＬ領域によって特異的抗原を標的にするときに相加効果または相乗効果があるように、融合タンパク質はマルチサブユニットサイトカイン（例えば、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、またはＩＬ－２７）と連携するサイトカインである第２のサイトカインをさらに含む。これらの第２のサイトカインは、任意のサイトカインであってよく、特に、ＩＬ－６、ＩＬ－４、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－５、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＩＬ－１０、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１ ＩＬ－２６、ＩＬ－２７、ＩＬ－２８、ＩＬ－２９、ＧＭ－ＣＳＦ、Ｇ－ＣＳＦ、インターフェロン－α、－β、－γ、ＴＧＦ－β、または腫瘍壊死因子－α、－β、塩基性ＦＧＦ、ＥＧＦ、ＰＤＧＦ、ＩＬ－４、ＩＬ－１１、またはＩＬ－１３を含む。また、二重サイトカイン融合タンパク質は、ｓｃＦｖの相補決定領域（「ＣＤＲ」）の、二重サイトカイン融合タンパク質を標的抗原に指向する任意のターゲティング抗体由来のＣＤＲを用いたグラフティングまたは置換を含み得る。
【0019】
さらに別の態様では、本開示は、式（Ｉａ）または（Ｉｂ）：
ＮＨ２－（Ｒ１）－（Ｘ１）－（Ｚｎ）－（Ｘ２）－（Ｒ２）－ＣＯＯＨ（式Ｉａ）；
ＮＨ２－（Ｒ２）－（Ｘ１）－（Ｚｎ）－（Ｘ２）－（Ｒ１）－ＣＯＯＨ（式Ｉｂ）；
（式中、
「Ｒ１」が、任意のマルチサブユニットの第１のサイトカイン由来のアルファサブユニット、好ましくは、ＩＬ－１２－アルファサブユニット（ｐ３５）またはＩＬ－２７アルファサブユニット（ｐ２８）のいずれか、より好ましくは配列番号１または５または１７または１９のサブユニットであり；
「Ｒ２」が、任意のマルチサブユニットの第１のサイトカイン由来のベータサブユニット、好ましくは、ＩＬ－１２－ベータサブユニット（ｐ４０）またはＩＬ－２７ベータサブユニット（ＥＢＩ３）のいずれか、より好ましくは配列番号３または７または１８または２０のサブユニットであり；
ここで、Ｒ１が第１のサイトカインのアルファサブユニットであるとき、Ｒ２は前述の第１のサイトカインのベータサブユニットであり；あるいはＲ１がｐ３５であるとき、Ｒ２はｐ４０であり；あるいはＲ１がｐ２８であるとき、Ｒ２はＥＢＩ３であり；あるいはＲ１が配列番号１、１７、または１９であるとき、Ｒ２は配列番号３、１８、または２０であり；あるいはＲ１が配列番号５であるとき、Ｒ２は配列番号７であり；
「Ｘ１」が、第１のモノクローナル抗体から得たＶＬ領域またはＶＨ領域であり；「Ｘ２」が、前述の第１のモノクローナル抗体から得たＶＨ領域またはＶＬ領域であり；ここで、Ｘ１がＶＬであるとき、Ｘ２はＶＨであり、あるいは、Ｘ１がＶＨであるとき、Ｘ２はＶＬであり；
「Ｚ」が、前述のマルチサブユニットサイトカインの生物学的機能を増強する任意のサイトカイン、好ましくはＩＦＮα－２ａ、ＩＬ－２８、ＩＬ－２９であり；そして
「ｎ」が０～２から選択される整数である）の二重サイトカイン融合タンパク質に関する。
１つの実施形態では、ＶＨおよびＶＬは、ヒト抗エボラ抗体から得たｓｃＦｖの形態である。別の実施形態では、ヒト抗エボラ抗体から得たｓｃＦｖの６つのＣＤＲ（ＶＨ由来のＣＤＲ１～３およびＶＬ由来のＣＤＲ１～３）は、二重サイトカイン融合タンパク質が特異的標的（酵素、受容体、細胞外タンパク質、または細胞内タンパク質、例えば、腫瘍（例えば、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ））、炎症応答、または自己免疫疾患に関連するものなどであるが、これらに限定されない）に指向するのを可能にする第２のモノクローナル抗体由来の６つのＣＤＲを用いて置換またはグラフティングされている。第２の抗体は、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）；ＣＤ１４；ＣＤ５２；多様な免疫チェックポイント標的（ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－１、ＴＩＭ３、ＢＴＬＡ、ＬＡＧ３、またはＣＴＬＡ４などであるが、これらに限定されない）；ＣＤ１９；ＣＤ２０；ＣＤ２２；ＣＤ４７；ＣＤ１２３；ＧＤ－２；ＶＥＧＦＲ１；ＶＥＧＦＲ２；ＨＥＲ２；ＰＤＧＦＲ；ＥｐＣＡＭ；ＩＣＡＭ（ＩＣＡＭ－１、－２、－３、－４、－５）、ＶＣＡＭ、ＦＡＰα；５Ｔ４；Ｔｒｏｐ２；ＥＤＢ－ＦＮ；ＴＧＦβ Ｔｒａｐ；ＭＡｄＣＡＭ、β７インテグリンサブユニット；α４β７インテグリン；α４インテグリン；ＢＣＭＡ；ＰＳＡ；ＰＳＭＡ；ＣＥＡ；ＧＰＣ３；ＳＲ－Ａ１；ＳＲ－Ａ３；ＳＲ－Ａ４；ＳＲ－Ａ５；ＳＲ－Ａ６；ＳＲ－Ｂ；ｄＳＲ－Ｃ１；ＳＲ－Ｄ１；ＳＲ－Ｅ１；ＳＲ－Ｆ１；ＳＲ－Ｆ２；ＳＲ－Ｇ；ＳＲ－Ｈ１；ＳＲ－Ｈ２；ＳＲ－Ｉ１；またはＳＲ－Ｊ１を含み得るが、これらに限定されない。
ＮＨ２－（Ｒ１）－（Ｘ１）－（Ｚｎ）－（Ｘ２）－（Ｒ２）－ＣＯＯＨ（式Ｉａ）；
ＮＨ２－（Ｒ２）－（Ｘ１）－（Ｚｎ）－（Ｘ２）－（Ｒ１）－ＣＯＯＨ（式Ｉｂ）；
（式中、
「Ｒ１」が、任意のマルチサブユニットの第１のサイトカイン由来のアルファサブユニット、好ましくは、ＩＬ－１２－アルファサブユニット（ｐ３５）またはＩＬ－２７アルファサブユニット（ｐ２８）のいずれか、より好ましくは配列番号１または５または１７または１９のサブユニットであり；
「Ｒ２」が、任意のマルチサブユニットの第１のサイトカイン由来のベータサブユニット、好ましくは、ＩＬ－１２－ベータサブユニット（ｐ４０）またはＩＬ－２７ベータサブユニット（ＥＢＩ３）のいずれか、より好ましくは配列番号３または７または１８または２０のサブユニットであり；
ここで、Ｒ１が第１のサイトカインのアルファサブユニットであるとき、Ｒ２は前述の第１のサイトカインのベータサブユニットであり；あるいはＲ１がｐ３５であるとき、Ｒ２はｐ４０であり；あるいはＲ１がｐ２８であるとき、Ｒ２はＥＢＩ３であり；あるいはＲ１が配列番号１、１７、または１９であるとき、Ｒ２は配列番号３、１８、または２０であり；あるいはＲ１が配列番号５であるとき、Ｒ２は配列番号７であり；
「Ｘ１」が、第１のモノクローナル抗体から得たＶＬ領域またはＶＨ領域であり；「Ｘ２」が、前述の第１のモノクローナル抗体から得たＶＨ領域またはＶＬ領域であり；ここで、Ｘ１がＶＬであるとき、Ｘ２はＶＨであり、あるいは、Ｘ１がＶＨであるとき、Ｘ２はＶＬであり；
「Ｚ」が、前述のマルチサブユニットサイトカインの生物学的機能を増強する任意のサイトカイン、好ましくはＩＦＮα－２ａ、ＩＬ－２８、ＩＬ－２９であり；そして
「ｎ」が０～２から選択される整数である）の二重サイトカイン融合タンパク質に関する。
１つの実施形態では、ＶＨおよびＶＬは、ヒト抗エボラ抗体から得たｓｃＦｖの形態である。別の実施形態では、ヒト抗エボラ抗体から得たｓｃＦｖの６つのＣＤＲ（ＶＨ由来のＣＤＲ１～３およびＶＬ由来のＣＤＲ１～３）は、二重サイトカイン融合タンパク質が特異的標的（酵素、受容体、細胞外タンパク質、または細胞内タンパク質、例えば、腫瘍（例えば、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ））、炎症応答、または自己免疫疾患に関連するものなどであるが、これらに限定されない）に指向するのを可能にする第２のモノクローナル抗体由来の６つのＣＤＲを用いて置換またはグラフティングされている。第２の抗体は、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）；ＣＤ１４；ＣＤ５２；多様な免疫チェックポイント標的（ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－１、ＴＩＭ３、ＢＴＬＡ、ＬＡＧ３、またはＣＴＬＡ４などであるが、これらに限定されない）；ＣＤ１９；ＣＤ２０；ＣＤ２２；ＣＤ４７；ＣＤ１２３；ＧＤ－２；ＶＥＧＦＲ１；ＶＥＧＦＲ２；ＨＥＲ２；ＰＤＧＦＲ；ＥｐＣＡＭ；ＩＣＡＭ（ＩＣＡＭ－１、－２、－３、－４、－５）、ＶＣＡＭ、ＦＡＰα；５Ｔ４；Ｔｒｏｐ２；ＥＤＢ－ＦＮ；ＴＧＦβ Ｔｒａｐ；ＭＡｄＣＡＭ、β７インテグリンサブユニット；α４β７インテグリン；α４インテグリン；ＢＣＭＡ；ＰＳＡ；ＰＳＭＡ；ＣＥＡ；ＧＰＣ３；ＳＲ－Ａ１；ＳＲ－Ａ３；ＳＲ－Ａ４；ＳＲ－Ａ５；ＳＲ－Ａ６；ＳＲ－Ｂ；ｄＳＲ－Ｃ１；ＳＲ－Ｄ１；ＳＲ－Ｅ１；ＳＲ－Ｆ１；ＳＲ－Ｆ２；ＳＲ－Ｇ；ＳＲ－Ｈ１；ＳＲ－Ｈ２；ＳＲ－Ｉ１；またはＳＲ－Ｊ１を含み得るが、これらに限定されない。
【0020】
さらに別の態様では、本開示は、ＩＬ－１２を含む二重サイトカイン融合タンパク質に関し、前述の融合タンパク質は、式（ＩＩａ）または（ＩＩｂ）：
ＮＨ２－（ｐ３５）－（Ｌ）－（Ｘ１）－（Ｌ）－（Ｚｎ）－（Ｌ）－（Ｘ２）－（Ｌ）－（ｐ４０）－ＣＯＯＨ（式ＩＩａ）；
ＮＨ２－（ｐ４０）－（Ｌ）－（Ｘ１）－（Ｌ）－（Ｚｎ）－（Ｌ）－（Ｘ２）－（Ｌ）－（ｐ３５）－ＣＯＯＨ（式ＩＩｂ）；
（式中、
「ｐ３５」が、配列番号１、１７、または１９の配列を有するＩＬ－１２のアルファサブユニットであり、；
「ｐ４０」が、配列番号３、１８、または２０の配列を有するＩＬ－１２のベータアルファサブユニットであり；
「Ｌ」が任意のリンカーであり；
Ｘ１」が、第１のモノクローナル抗体から得たＶＬ領域またはＶＨ領域であり；「Ｘ２」が、前述の第１のモノクローナル抗体から得たＶＨ領域またはＶＬ領域であり；ここで、Ｘ１がＶＬであるとき、Ｘ２はＶＨであり、あるいは、Ｘ１がＶＨであるとき、Ｘ２はＶＬであり；
「Ｚ」が、ＩＬ－６、ＩＬ－４、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－５、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＩＬ－１０単量体、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１ ＩＬ－２６、ＩＬ－２７、ＩＬ－２８、ＩＬ－２９、ＧＭ－ＣＳＦ、Ｇ－ＣＳＦ、インターフェロン－α、－β、－γ、ＴＧＦ－β、または腫瘍壊死因子－α、－β、塩基性ＦＧＦ、ＥＧＦ、ＰＤＧＦ、ＩＬ－４、ＩＬ－１１、またはＩＬ－１３から選択されるサイトカインであり；そして
「ｎ」が０～２から選択される整数である）である。
１つの実施形態では、ＶＨおよびＶＬは、ヒト抗エボラ抗体から得たｓｃＦｖの形態である。別の実施形態では、ヒト抗エボラ抗体から得たｓｃＦｖの６つのＣＤＲ（ＶＨ由来のＣＤＲ１～３およびＶＬ由来のＣＤＲ１～３）は、二重サイトカイン融合タンパク質が特異的標的（酵素、受容体、細胞外タンパク質、または細胞内タンパク質、例えば、腫瘍（例えば、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ））、炎症応答、または自己免疫疾患に関連するものなどであるが、これらに限定されない）に指向するのを可能にする第２のモノクローナル抗体由来の６つのＣＤＲを用いて置換またはグラフティングされている。第２の抗体は、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）；ＣＤ１４；ＣＤ５２；多様な免疫チェックポイント標的（ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－１、ＴＩＭ３、ＢＴＬＡ、ＬＡＧ３、またはＣＴＬＡ４などであるが、これらに限定されない）；ＣＤ１９；ＣＤ２０；ＣＤ２２；ＣＤ４７；ＣＤ１２３；ＧＤ－２；ＶＥＧＦＲ１；ＶＥＧＦＲ２；ＨＥＲ２；ＰＤＧＦＲ；ＥｐＣＡＭ；ＩＣＡＭ（ＩＣＡＭ－１、－２、－３、－４、－５）、ＶＣＡＭ、ＦＡＰα；５Ｔ４；Ｔｒｏｐ２；ＥＤＢ－ＦＮ；ＴＧＦβ Ｔｒａｐ；ＭＡｄＣＡＭ、β７インテグリンサブユニット；α４β７インテグリン；α４インテグリン；ＢＣＭＡ；ＰＳＡ；ＰＳＭＡ；ＣＥＡ；ＧＰＣ３；ＳＲ－Ａ１；ＳＲ－Ａ３；ＳＲ－Ａ４；ＳＲ－Ａ５；ＳＲ－Ａ６；ＳＲ－Ｂ；ｄＳＲ－Ｃ１；ＳＲ－Ｄ１；ＳＲ－Ｅ１；ＳＲ－Ｆ１；ＳＲ－Ｆ２；ＳＲ－Ｇ；ＳＲ－Ｈ１；ＳＲ－Ｈ２；ＳＲ－Ｉ１；またはＳＲ－Ｊ１を含み得るが、これらに限定されない。
ＮＨ２－（ｐ３５）－（Ｌ）－（Ｘ１）－（Ｌ）－（Ｚｎ）－（Ｌ）－（Ｘ２）－（Ｌ）－（ｐ４０）－ＣＯＯＨ（式ＩＩａ）；
ＮＨ２－（ｐ４０）－（Ｌ）－（Ｘ１）－（Ｌ）－（Ｚｎ）－（Ｌ）－（Ｘ２）－（Ｌ）－（ｐ３５）－ＣＯＯＨ（式ＩＩｂ）；
（式中、
「ｐ３５」が、配列番号１、１７、または１９の配列を有するＩＬ－１２のアルファサブユニットであり、；
「ｐ４０」が、配列番号３、１８、または２０の配列を有するＩＬ－１２のベータアルファサブユニットであり；
「Ｌ」が任意のリンカーであり；
Ｘ１」が、第１のモノクローナル抗体から得たＶＬ領域またはＶＨ領域であり；「Ｘ２」が、前述の第１のモノクローナル抗体から得たＶＨ領域またはＶＬ領域であり；ここで、Ｘ１がＶＬであるとき、Ｘ２はＶＨであり、あるいは、Ｘ１がＶＨであるとき、Ｘ２はＶＬであり；
「Ｚ」が、ＩＬ－６、ＩＬ－４、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－５、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＩＬ－１０単量体、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１ ＩＬ－２６、ＩＬ－２７、ＩＬ－２８、ＩＬ－２９、ＧＭ－ＣＳＦ、Ｇ－ＣＳＦ、インターフェロン－α、－β、－γ、ＴＧＦ－β、または腫瘍壊死因子－α、－β、塩基性ＦＧＦ、ＥＧＦ、ＰＤＧＦ、ＩＬ－４、ＩＬ－１１、またはＩＬ－１３から選択されるサイトカインであり；そして
「ｎ」が０～２から選択される整数である）である。
１つの実施形態では、ＶＨおよびＶＬは、ヒト抗エボラ抗体から得たｓｃＦｖの形態である。別の実施形態では、ヒト抗エボラ抗体から得たｓｃＦｖの６つのＣＤＲ（ＶＨ由来のＣＤＲ１～３およびＶＬ由来のＣＤＲ１～３）は、二重サイトカイン融合タンパク質が特異的標的（酵素、受容体、細胞外タンパク質、または細胞内タンパク質、例えば、腫瘍（例えば、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ））、炎症応答、または自己免疫疾患に関連するものなどであるが、これらに限定されない）に指向するのを可能にする第２のモノクローナル抗体由来の６つのＣＤＲを用いて置換またはグラフティングされている。第２の抗体は、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）；ＣＤ１４；ＣＤ５２；多様な免疫チェックポイント標的（ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－１、ＴＩＭ３、ＢＴＬＡ、ＬＡＧ３、またはＣＴＬＡ４などであるが、これらに限定されない）；ＣＤ１９；ＣＤ２０；ＣＤ２２；ＣＤ４７；ＣＤ１２３；ＧＤ－２；ＶＥＧＦＲ１；ＶＥＧＦＲ２；ＨＥＲ２；ＰＤＧＦＲ；ＥｐＣＡＭ；ＩＣＡＭ（ＩＣＡＭ－１、－２、－３、－４、－５）、ＶＣＡＭ、ＦＡＰα；５Ｔ４；Ｔｒｏｐ２；ＥＤＢ－ＦＮ；ＴＧＦβ Ｔｒａｐ；ＭＡｄＣＡＭ、β７インテグリンサブユニット；α４β７インテグリン；α４インテグリン；ＢＣＭＡ；ＰＳＡ；ＰＳＭＡ；ＣＥＡ；ＧＰＣ３；ＳＲ－Ａ１；ＳＲ－Ａ３；ＳＲ－Ａ４；ＳＲ－Ａ５；ＳＲ－Ａ６；ＳＲ－Ｂ；ｄＳＲ－Ｃ１；ＳＲ－Ｄ１；ＳＲ－Ｅ１；ＳＲ－Ｆ１；ＳＲ－Ｆ２；ＳＲ－Ｇ；ＳＲ－Ｈ１；ＳＲ－Ｈ２；ＳＲ－Ｉ１；またはＳＲ－Ｊ１を含み得るが、これらに限定されない。
【0021】
さらに別の態様では、本開示は、ＩＬ－２７を含む二重サイトカイン融合タンパク質に関し、前述の融合タンパク質は、式（ＩＩＩａ）または（ＩＩＩｂ）：
ＮＨ２－（ｐ２８）－（Ｌ）－（Ｘ１）－（Ｌ）－（Ｚｎ）－（Ｌ）－（Ｘ２）－（Ｌ）－（ＥＢＩ３）－ＣＯＯＨ（式ＩＩＩａ）；
ＮＨ２－（ＥＢＩ３）－（Ｌ）－（Ｘ１）－（Ｌ）－（Ｚｎ）－（Ｌ）－（Ｘ２）－（Ｌ）－（ｐ２８）－ＣＯＯＨ（式ＩＩＩｂ）；
（式中、
「ｐ２８」が、配列番号５の配列を有するＩＬ－２７のアルファサブユニットであり；
「ＥＢＩ３」が、配列番号７の配列を有するＩＬ－２７のベータアルファサブユニットであり；
「Ｌ」が任意のリンカーであり；
Ｘ１」が、第１のモノクローナル抗体から得たＶＬ領域またはＶＨ領域であり；「Ｘ２」が、前述の第１のモノクローナル抗体から得たＶＨ領域またはＶＬ領域であり；ここで、Ｘ１がＶＬであるとき、Ｘ２はＶＨであり、あるいは、Ｘ１がＶＨであるとき、Ｘ２はＶＬであり；
「Ｚ」が、ＩＬ－６、ＩＬ－４、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－５、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＩＬ－１０単量体、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１ ＩＬ－２６、ＩＬ－２７、ＩＬ－２８、ＩＬ－２９、ＧＭ－ＣＳＦ、Ｇ－ＣＳＦ、インターフェロン－α、－β、－γ、ＴＧＦ－β、または腫瘍壊死因子－α、－β、塩基性ＦＧＦ、ＥＧＦ、ＰＤＧＦ、ＩＬ－４、ＩＬ－１１、またはＩＬ－１３から選択されるサイトカインであり；そして
「ｎ」が０～２から選択される整数である）である。
１つの実施形態では、ＶＨおよびＶＬは、ヒト抗エボラ抗体から得たｓｃＦｖの形態である。別の実施形態では、ヒト抗エボラ抗体から得たｓｃＦｖの６つのＣＤＲ（ＶＨ由来のＣＤＲ１～３およびＶＬ由来のＣＤＲ１～３）は、二重サイトカイン融合タンパク質が特異的標的（酵素、受容体、細胞外タンパク質、または細胞内タンパク質、例えば、腫瘍（例えば、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ））、炎症応答、または自己免疫疾患に関連するものなどであるが、これらに限定されない）に指向するのを可能にする第２のモノクローナル抗体由来の６つのＣＤＲを用いて置換またはグラフティングされている。第２の抗体は、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）；ＣＤ１４；ＣＤ５２；多様な免疫チェックポイント標的（ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－１、ＴＩＭ３、ＢＴＬＡ、ＬＡＧ３、またはＣＴＬＡ４などであるが、これらに限定されない）；ＣＤ１９；ＣＤ２０；ＣＤ２２；ＣＤ４７；ＣＤ１２３；ＧＤ－２；ＶＥＧＦＲ１；ＶＥＧＦＲ２；ＨＥＲ２；ＰＤＧＦＲ；ＥｐＣＡＭ；ＩＣＡＭ（ＩＣＡＭ－１、－２、－３、－４、－５）、ＶＣＡＭ、ＦＡＰα；５Ｔ４；Ｔｒｏｐ２；ＥＤＢ－ＦＮ；ＴＧＦβ Ｔｒａｐ；ＭＡｄＣＡＭ、β７インテグリンサブユニット；α４β７インテグリン；α４インテグリン；ＢＣＭＡ；ＰＳＡ；ＰＳＭＡ；ＣＥＡ；ＧＰＣ３；ＳＲ－Ａ１；ＳＲ－Ａ３；ＳＲ－Ａ４；ＳＲ－Ａ５；ＳＲ－Ａ６；ＳＲ－Ｂ；ｄＳＲ－Ｃ１；ＳＲ－Ｄ１；ＳＲ－Ｅ１；ＳＲ－Ｆ１；ＳＲ－Ｆ２；ＳＲ－Ｇ；ＳＲ－Ｈ１；ＳＲ－Ｈ２；ＳＲ－Ｉ１；またはＳＲ－Ｊ１を含み得るが、これらに限定されない。
ＮＨ２－（ｐ２８）－（Ｌ）－（Ｘ１）－（Ｌ）－（Ｚｎ）－（Ｌ）－（Ｘ２）－（Ｌ）－（ＥＢＩ３）－ＣＯＯＨ（式ＩＩＩａ）；
ＮＨ２－（ＥＢＩ３）－（Ｌ）－（Ｘ１）－（Ｌ）－（Ｚｎ）－（Ｌ）－（Ｘ２）－（Ｌ）－（ｐ２８）－ＣＯＯＨ（式ＩＩＩｂ）；
（式中、
「ｐ２８」が、配列番号５の配列を有するＩＬ－２７のアルファサブユニットであり；
「ＥＢＩ３」が、配列番号７の配列を有するＩＬ－２７のベータアルファサブユニットであり；
「Ｌ」が任意のリンカーであり；
Ｘ１」が、第１のモノクローナル抗体から得たＶＬ領域またはＶＨ領域であり；「Ｘ２」が、前述の第１のモノクローナル抗体から得たＶＨ領域またはＶＬ領域であり；ここで、Ｘ１がＶＬであるとき、Ｘ２はＶＨであり、あるいは、Ｘ１がＶＨであるとき、Ｘ２はＶＬであり；
「Ｚ」が、ＩＬ－６、ＩＬ－４、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－５、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＩＬ－１０単量体、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１ ＩＬ－２６、ＩＬ－２７、ＩＬ－２８、ＩＬ－２９、ＧＭ－ＣＳＦ、Ｇ－ＣＳＦ、インターフェロン－α、－β、－γ、ＴＧＦ－β、または腫瘍壊死因子－α、－β、塩基性ＦＧＦ、ＥＧＦ、ＰＤＧＦ、ＩＬ－４、ＩＬ－１１、またはＩＬ－１３から選択されるサイトカインであり；そして
「ｎ」が０～２から選択される整数である）である。
１つの実施形態では、ＶＨおよびＶＬは、ヒト抗エボラ抗体から得たｓｃＦｖの形態である。別の実施形態では、ヒト抗エボラ抗体から得たｓｃＦｖの６つのＣＤＲ（ＶＨ由来のＣＤＲ１～３およびＶＬ由来のＣＤＲ１～３）は、二重サイトカイン融合タンパク質が特異的標的（酵素、受容体、細胞外タンパク質、または細胞内タンパク質、例えば、腫瘍（例えば、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ））、炎症応答、または自己免疫疾患に関連するものなどであるが、これらに限定されない）に指向するのを可能にする第２のモノクローナル抗体由来の６つのＣＤＲを用いて置換またはグラフティングされている。第２の抗体は、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）；ＣＤ１４；ＣＤ５２；多様な免疫チェックポイント標的（ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－１、ＴＩＭ３、ＢＴＬＡ、ＬＡＧ３、またはＣＴＬＡ４などであるが、これらに限定されない）；ＣＤ１９；ＣＤ２０；ＣＤ２２；ＣＤ４７；ＣＤ１２３；ＧＤ－２；ＶＥＧＦＲ１；ＶＥＧＦＲ２；ＨＥＲ２；ＰＤＧＦＲ；ＥｐＣＡＭ；ＩＣＡＭ（ＩＣＡＭ－１、－２、－３、－４、－５）、ＶＣＡＭ、ＦＡＰα；５Ｔ４；Ｔｒｏｐ２；ＥＤＢ－ＦＮ；ＴＧＦβ Ｔｒａｐ；ＭＡｄＣＡＭ、β７インテグリンサブユニット；α４β７インテグリン；α４インテグリン；ＢＣＭＡ；ＰＳＡ；ＰＳＭＡ；ＣＥＡ；ＧＰＣ３；ＳＲ－Ａ１；ＳＲ－Ａ３；ＳＲ－Ａ４；ＳＲ－Ａ５；ＳＲ－Ａ６；ＳＲ－Ｂ；ｄＳＲ－Ｃ１；ＳＲ－Ｄ１；ＳＲ－Ｅ１；ＳＲ－Ｆ１；ＳＲ－Ｆ２；ＳＲ－Ｇ；ＳＲ－Ｈ１；ＳＲ－Ｈ２；ＳＲ－Ｉ１；またはＳＲ－Ｊ１を含み得るが、これらに限定されない。
【0022】
さらに別の態様では、本開示は、２つのマルチサブユニットタンパク質を含む二重サイトカイン融合タンパク質に関し、前述の融合タンパク質が、式（ＩＶ）：
ＮＨ２－（Ｒ１）－（Ｌａ）－（Ｘ１）－（Ｌａ）－（Ｗ１）－（Ｌｂ）－（Ｗ２）－（Ｌａ）－（Ｘ２）－（Ｌａ）－（Ｒ２）－ＣＯＯＨ（式ＩＶ）；
（式中、
「Ｒ１」が、第１のサイトカイン（ＩＬ－１２またはＩＬ－２７など）のアルファサブユニットまたはホモ二量体サイトカイン（ＩＬ－１０など）の第１の単量体であり、ここで、Ｒ１は、好ましくは、ｐ４０であり；
「Ｒ２」が、第１のサイトカイン（ＩＬ－１２またはＩＬ－２７など）のベータアルファサブユニットまたはホモ二量体サイトカイン（ＩＬ－１０など）の第２の単量体であり、ここで、Ｒ２は、好ましくは、ｐ３５であり；
「Ｌａ」が任意のリンカー；好ましくは、配列番号４５の（ＧＧＧＧＳ）４、または配列番号４４の（ＧＧＧＧＳ）５であり；
「Ｌｂ」が任意のリンカー；好ましくは、配列番号４３のＧＧＧＳＧＧＧまたは配列番号４６の（ＧＧＧＧＳ）３であり；
Ｘ１」が、第１のモノクローナル抗体から得たＶＬ領域またはＶＨ領域であり；「Ｘ２」が、前述の第１のモノクローナル抗体から得たＶＨ領域またはＶＬ領域であり；ここで、Ｘ１がＶＬであるとき、Ｘ２はＶＨであり、あるいは、Ｘ１がＶＨであるとき、Ｘ２はＶＬであり；
「Ｗ１」が、第１のサイトカイン（ＩＬ－１２またはＩＬ－２７など）のアルファサブユニットまたはホモ二量体サイトカイン（ＩＬ－１０など）の第１の単量体、好ましくは、ＩＬ－１０の第１の単量体であり；
「Ｗ２」が、第１のサイトカイン（ＩＬ－１２またはＩＬ－２７など）のベータアルファサブユニットまたはホモ二量体サイトカイン（ＩＬ－１０など）の第２の単量体、好ましくは、ＩＬ－１０の第２の単量体である）である。
１つの実施形態では、ＶＨおよびＶＬは、ヒト抗エボラ抗体から得たｓｃＦｖの形態である。別の実施形態では、ヒト抗エボラ抗体から得たｓｃＦｖの６つのＣＤＲ（ＶＨ由来のＣＤＲ１～３およびＶＬ由来のＣＤＲ１～３）は、二重サイトカイン融合タンパク質が特異的標的（酵素、受容体、細胞外タンパク質、または細胞内タンパク質、例えば、腫瘍（例えば、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ））、炎症応答、または自己免疫疾患に関連するものなどであるが、これらに限定されない）に指向するのを可能にする第２のモノクローナル抗体由来の６つのＣＤＲを用いて置換またはグラフティングされている。第２の抗体は、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）；ＣＤ１４；ＣＤ５２；多様な免疫チェックポイント標的（ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－１、ＴＩＭ３、ＢＴＬＡ、ＬＡＧ３、またはＣＴＬＡ４などであるが、これらに限定されない）；ＣＤ１９；ＣＤ２０；ＣＤ２２；ＣＤ４７；ＣＤ１２３；ＧＤ－２；ＶＥＧＦＲ１；ＶＥＧＦＲ２；ＨＥＲ２；ＰＤＧＦＲ；ＥｐＣＡＭ；ＩＣＡＭ（ＩＣＡＭ－１、－２、－３、－４、－５）、ＶＣＡＭ、ＦＡＰα；５Ｔ４；Ｔｒｏｐ２；ＥＤＢ－ＦＮ；ＴＧＦβ Ｔｒａｐ；ＭＡｄＣＡＭ、β７インテグリンサブユニット；α４β７インテグリン；α４インテグリン；ＢＣＭＡ；ＰＳＡ；ＰＳＭＡ；ＣＥＡ；ＧＰＣ３；ＳＲ－Ａ１；ＳＲ－Ａ３；ＳＲ－Ａ４；ＳＲ－Ａ５；ＳＲ－Ａ６；ＳＲ－Ｂ；ｄＳＲ－Ｃ１；ＳＲ－Ｄ１；ＳＲ－Ｅ１；ＳＲ－Ｆ１；ＳＲ－Ｆ２；ＳＲ－Ｇ；ＳＲ－Ｈ１；ＳＲ－Ｈ２；ＳＲ－Ｉ１；またはＳＲ－Ｊ１を含み得るが、これらに限定されない。
ＮＨ２－（Ｒ１）－（Ｌａ）－（Ｘ１）－（Ｌａ）－（Ｗ１）－（Ｌｂ）－（Ｗ２）－（Ｌａ）－（Ｘ２）－（Ｌａ）－（Ｒ２）－ＣＯＯＨ（式ＩＶ）；
（式中、
「Ｒ１」が、第１のサイトカイン（ＩＬ－１２またはＩＬ－２７など）のアルファサブユニットまたはホモ二量体サイトカイン（ＩＬ－１０など）の第１の単量体であり、ここで、Ｒ１は、好ましくは、ｐ４０であり；
「Ｒ２」が、第１のサイトカイン（ＩＬ－１２またはＩＬ－２７など）のベータアルファサブユニットまたはホモ二量体サイトカイン（ＩＬ－１０など）の第２の単量体であり、ここで、Ｒ２は、好ましくは、ｐ３５であり；
「Ｌａ」が任意のリンカー；好ましくは、配列番号４５の（ＧＧＧＧＳ）４、または配列番号４４の（ＧＧＧＧＳ）５であり；
「Ｌｂ」が任意のリンカー；好ましくは、配列番号４３のＧＧＧＳＧＧＧまたは配列番号４６の（ＧＧＧＧＳ）３であり；
Ｘ１」が、第１のモノクローナル抗体から得たＶＬ領域またはＶＨ領域であり；「Ｘ２」が、前述の第１のモノクローナル抗体から得たＶＨ領域またはＶＬ領域であり；ここで、Ｘ１がＶＬであるとき、Ｘ２はＶＨであり、あるいは、Ｘ１がＶＨであるとき、Ｘ２はＶＬであり；
「Ｗ１」が、第１のサイトカイン（ＩＬ－１２またはＩＬ－２７など）のアルファサブユニットまたはホモ二量体サイトカイン（ＩＬ－１０など）の第１の単量体、好ましくは、ＩＬ－１０の第１の単量体であり；
「Ｗ２」が、第１のサイトカイン（ＩＬ－１２またはＩＬ－２７など）のベータアルファサブユニットまたはホモ二量体サイトカイン（ＩＬ－１０など）の第２の単量体、好ましくは、ＩＬ－１０の第２の単量体である）である。
１つの実施形態では、ＶＨおよびＶＬは、ヒト抗エボラ抗体から得たｓｃＦｖの形態である。別の実施形態では、ヒト抗エボラ抗体から得たｓｃＦｖの６つのＣＤＲ（ＶＨ由来のＣＤＲ１～３およびＶＬ由来のＣＤＲ１～３）は、二重サイトカイン融合タンパク質が特異的標的（酵素、受容体、細胞外タンパク質、または細胞内タンパク質、例えば、腫瘍（例えば、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ））、炎症応答、または自己免疫疾患に関連するものなどであるが、これらに限定されない）に指向するのを可能にする第２のモノクローナル抗体由来の６つのＣＤＲを用いて置換またはグラフティングされている。第２の抗体は、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）；ＣＤ１４；ＣＤ５２；多様な免疫チェックポイント標的（ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－１、ＴＩＭ３、ＢＴＬＡ、ＬＡＧ３、またはＣＴＬＡ４などであるが、これらに限定されない）；ＣＤ１９；ＣＤ２０；ＣＤ２２；ＣＤ４７；ＣＤ１２３；ＧＤ－２；ＶＥＧＦＲ１；ＶＥＧＦＲ２；ＨＥＲ２；ＰＤＧＦＲ；ＥｐＣＡＭ；ＩＣＡＭ（ＩＣＡＭ－１、－２、－３、－４、－５）、ＶＣＡＭ、ＦＡＰα；５Ｔ４；Ｔｒｏｐ２；ＥＤＢ－ＦＮ；ＴＧＦβ Ｔｒａｐ；ＭＡｄＣＡＭ、β７インテグリンサブユニット；α４β７インテグリン；α４インテグリン；ＢＣＭＡ；ＰＳＡ；ＰＳＭＡ；ＣＥＡ；ＧＰＣ３；ＳＲ－Ａ１；ＳＲ－Ａ３；ＳＲ－Ａ４；ＳＲ－Ａ５；ＳＲ－Ａ６；ＳＲ－Ｂ；ｄＳＲ－Ｃ１；ＳＲ－Ｄ１；ＳＲ－Ｅ１；ＳＲ－Ｆ１；ＳＲ－Ｆ２；ＳＲ－Ｇ；ＳＲ－Ｈ１；ＳＲ－Ｈ２；ＳＲ－Ｉ１；またはＳＲ－Ｊ１を含み得るが、これらに限定されない。
【0023】
さらに別の態様では、本開示は、２つのマルチサブユニットタンパク質を含む二重サイトカイン融合タンパク質に関し、前述の融合タンパク質は、式（Ｖ）：
ＮＨ２－（Ｐ３５）－（Ｌａ）－（Ｘ１）－（Ｌａ）－（ＩＬ１０単量体）－（Ｌｂ）－（ＩＬ１０単量体）－（Ｌａ）－（Ｘ２）－（Ｌａ）－（Ｐ４０）－ＣＯＯＨ（式Ｖａ）；
ＮＨ２－（Ｐ４０）－（Ｌａ）－（Ｘ１）－（Ｌａ）－（ＩＬ１０単量体）－（Ｌｂ）－（ＩＬ１０単量体）－（Ｌａ）－（Ｘ２）－（Ｌａ）－（Ｐ３５）－ＣＯＯＨ（式Ｖｂ）；
（式中、
「ｐ３５」が、配列番号１、１７、または１９の配列を有するＩＬ－１２のアルファサブユニットであり；
「ｐ４０」が、配列番号３、１８、または２０の配列を有するＩＬ－１２のベータアルファサブユニットであり；
「Ｌａ」が任意のリンカー；好ましくは、配列番号４５の（ＧＧＧＧＳ）４、または配列番号４４の（ＧＧＧＧＳ）５であり；
「Ｌｂ」が任意のリンカー；好ましくは、配列番号４３のＧＧＧＳＧＧＧまたは配列番号４６の（ＧＧＧＧＳ）３であり、；
Ｘ１」が、第１のモノクローナル抗体から得たＶＬ領域またはＶＨ領域であり；「Ｘ２」が、前述の第１のモノクローナル抗体から得たＶＨ領域またはＶＬ領域であり；ここで、Ｘ１がＶＬであるとき、Ｘ２はＶＨであり、あるいは、Ｘ１がＶＨであるとき、Ｘ２はＶＬであり；
「ＩＬ１０単量体」が、配列番号１、３、５、７、１４、または１６、好ましくは、配列番号１６の配列を有するＩＬ－１０の単量体である）である；
１つの実施形態では、ＶＨおよびＶＬは、ヒト抗エボラ抗体から得たｓｃＦｖの形態である。別の実施形態では、ヒト抗エボラ抗体から得たｓｃＦｖの６つのＣＤＲ（ＶＨ由来のＣＤＲ１～３およびＶＬ由来のＣＤＲ１～３）は、二重サイトカイン融合タンパク質が特異的標的（酵素、受容体、細胞外タンパク質、または細胞内タンパク質、例えば、腫瘍（例えば、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ））、炎症応答、または自己免疫疾患に関連するものなどであるが、これらに限定されない）に指向するのを可能にする第２のモノクローナル抗体由来の６つのＣＤＲを用いて置換またはグラフティングされている。第２の抗体は、ＥＧＦＲ；ＣＤ１４；ＣＤ５２；多様な免疫チェックポイント標的（ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－１、ＴＩＭ３、ＢＴＬＡ、ＬＡＧ３、またはＣＴＬＡ４などであるが、これらに限定されない）；ＣＤ１９；ＣＤ２０；ＣＤ２２；ＣＤ４７；ＣＤ１２３；ＧＤ－２；ＶＥＧＦＲ１；ＶＥＧＦＲ２；ＨＥＲ２；ＰＤＧＦＲ；ＥｐＣＡＭ；ＩＣＡＭ（ＩＣＡＭ－１、－２、－３、－４、－５）、ＶＣＡＭ、ＦＡＰα；５Ｔ４；Ｔｒｏｐ２；ＥＤＢ－ＦＮ；ＴＧＦβ Ｔｒａｐ；ＭＡｄＣＡＭ、β７インテグリンサブユニット；α４β７インテグリン；α４インテグリン；ＢＣＭＡ；ＰＳＡ；ＰＳＭＡ；ＣＥＡ；ＧＰＣ３；ＳＲ－Ａ１；ＳＲ－Ａ３；ＳＲ－Ａ４；ＳＲ－Ａ５；ＳＲ－Ａ６；ＳＲ－Ｂ；ｄＳＲ－Ｃ１；ＳＲ－Ｄ１；ＳＲ－Ｅ１；ＳＲ－Ｆ１；ＳＲ－Ｆ２；ＳＲ－Ｇ；ＳＲ－Ｈ１；ＳＲ－Ｈ２；ＳＲ－Ｉ１；またはＳＲ－Ｊ１を含み得るが、これらに限定されない。
ＮＨ２－（Ｐ３５）－（Ｌａ）－（Ｘ１）－（Ｌａ）－（ＩＬ１０単量体）－（Ｌｂ）－（ＩＬ１０単量体）－（Ｌａ）－（Ｘ２）－（Ｌａ）－（Ｐ４０）－ＣＯＯＨ（式Ｖａ）；
ＮＨ２－（Ｐ４０）－（Ｌａ）－（Ｘ１）－（Ｌａ）－（ＩＬ１０単量体）－（Ｌｂ）－（ＩＬ１０単量体）－（Ｌａ）－（Ｘ２）－（Ｌａ）－（Ｐ３５）－ＣＯＯＨ（式Ｖｂ）；
（式中、
「ｐ３５」が、配列番号１、１７、または１９の配列を有するＩＬ－１２のアルファサブユニットであり；
「ｐ４０」が、配列番号３、１８、または２０の配列を有するＩＬ－１２のベータアルファサブユニットであり；
「Ｌａ」が任意のリンカー；好ましくは、配列番号４５の（ＧＧＧＧＳ）４、または配列番号４４の（ＧＧＧＧＳ）５であり；
「Ｌｂ」が任意のリンカー；好ましくは、配列番号４３のＧＧＧＳＧＧＧまたは配列番号４６の（ＧＧＧＧＳ）３であり、；
Ｘ１」が、第１のモノクローナル抗体から得たＶＬ領域またはＶＨ領域であり；「Ｘ２」が、前述の第１のモノクローナル抗体から得たＶＨ領域またはＶＬ領域であり；ここで、Ｘ１がＶＬであるとき、Ｘ２はＶＨであり、あるいは、Ｘ１がＶＨであるとき、Ｘ２はＶＬであり；
「ＩＬ１０単量体」が、配列番号１、３、５、７、１４、または１６、好ましくは、配列番号１６の配列を有するＩＬ－１０の単量体である）である；
１つの実施形態では、ＶＨおよびＶＬは、ヒト抗エボラ抗体から得たｓｃＦｖの形態である。別の実施形態では、ヒト抗エボラ抗体から得たｓｃＦｖの６つのＣＤＲ（ＶＨ由来のＣＤＲ１～３およびＶＬ由来のＣＤＲ１～３）は、二重サイトカイン融合タンパク質が特異的標的（酵素、受容体、細胞外タンパク質、または細胞内タンパク質、例えば、腫瘍（例えば、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ））、炎症応答、または自己免疫疾患に関連するものなどであるが、これらに限定されない）に指向するのを可能にする第２のモノクローナル抗体由来の６つのＣＤＲを用いて置換またはグラフティングされている。第２の抗体は、ＥＧＦＲ；ＣＤ１４；ＣＤ５２；多様な免疫チェックポイント標的（ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－１、ＴＩＭ３、ＢＴＬＡ、ＬＡＧ３、またはＣＴＬＡ４などであるが、これらに限定されない）；ＣＤ１９；ＣＤ２０；ＣＤ２２；ＣＤ４７；ＣＤ１２３；ＧＤ－２；ＶＥＧＦＲ１；ＶＥＧＦＲ２；ＨＥＲ２；ＰＤＧＦＲ；ＥｐＣＡＭ；ＩＣＡＭ（ＩＣＡＭ－１、－２、－３、－４、－５）、ＶＣＡＭ、ＦＡＰα；５Ｔ４；Ｔｒｏｐ２；ＥＤＢ－ＦＮ；ＴＧＦβ Ｔｒａｐ；ＭＡｄＣＡＭ、β７インテグリンサブユニット；α４β７インテグリン；α４インテグリン；ＢＣＭＡ；ＰＳＡ；ＰＳＭＡ；ＣＥＡ；ＧＰＣ３；ＳＲ－Ａ１；ＳＲ－Ａ３；ＳＲ－Ａ４；ＳＲ－Ａ５；ＳＲ－Ａ６；ＳＲ－Ｂ；ｄＳＲ－Ｃ１；ＳＲ－Ｄ１；ＳＲ－Ｅ１；ＳＲ－Ｆ１；ＳＲ－Ｆ２；ＳＲ－Ｇ；ＳＲ－Ｈ１；ＳＲ－Ｈ２；ＳＲ－Ｉ１；またはＳＲ－Ｊ１を含み得るが、これらに限定されない。
【0024】
他の態様では、本開示は、マルチサブユニット二重サイトカイン融合タンパク質をコードする核酸分子に関する。これらは、式（Ｉａ）、（Ｉｂ）、（ＩＩａ）、（ＩＩｂ）、（ＩＩＩａ）、（ＩＩＩｂ）、（ＩＶ）、（Ｖａ）、および（Ｖｂ）によって表される二重サイトカイン融合タンパク質をコードする核酸分子を含むであろう
【0025】
他の態様では、本開示は、二重サイトカイン融合タンパク質を作製および精製する方法に関する。１つの実施形態では、二重サイトカイン融合タンパク質を作製する方法は、二重サイトカイン融合タンパク質をコードする核酸を組み換えによって発現させることを含む。
【0026】
他の態様では、本開示は、癌を処置する方法であって、有効量の二重サイトカイン融合タンパク質を、前述の処置を必要とする被験体に投与することを含む、方法に関する。
【0027】
他の態様では、本開示は、炎症性疾患または症状を処置する方法であって、有効量の二重サイトカイン融合タンパク質を、前述の処置を必要とする被験体に投与することを含む、方法に関する。好ましくは、炎症性疾患は、クローン病、乾癬、および／または関節リウマチである。
【0028】
他の態様では、本開示は、免疫疾患または症状を処置する方法であって、有効量の二重サイトカイン融合タンパク質を、前述の処置を必要とする被験体に投与することを含む、方法に関する。
【0029】
他の態様では、本開示は、敗血症および／または敗血症性ショックならびにこれらに関連する徴候を処置、阻害、および／または緩和する方法に関する。
【0030】
上記の代表的な態様の簡潔な概要は、本開示の基本知識を提供するのに役立つ。この概要は、全ての意図する態様を広く概説しておらず、全ての態様の肝要または重要な要素を特定することや、本開示の任意のまたは全ての態様の範囲を詳述することを意図しない。その唯一の目的は、以下に続く開示のより詳細な説明の導入部として１またはそれを超える態様を簡潔な形態で提供することである。前述の目的を達成するために、本開示の１またはそれを超える態様は、記載の特徴を含み、特許請求の範囲の例として挙げている。
【図面の簡単な説明】
【0031】
【0032】
【図2】図２は、本開示で具体化された二重サイトカイン融合タンパク質の代表である概要図であり、ここで、二重サイトカイン融合タンパク質は、末端で連結されたＩＬ－１２α（ｐ３５）およびＩＬ－１２β（ｐ４０）サブユニットを含み、第２のサイトカインは、抗Ｘ抗体由来の（例えば、ヒト抗エボラ抗体由来の）ＶＨとＶＬとの間のｓｃＦｖのリンカーに組み込まれている。６つのＣＤＲ（ＶＨ由来の３つおよびＶＬ由来の３つ）を、必要に応じて、第２の抗体（例えば、ＴＡＡを標的にする抗体、例えば、抗ＨＥＲ２抗体、抗ＥＧＦＲ抗体、抗ＶＥＧＦＲ１抗体、または抗ＶＥＧＦＲ２抗体など）由来の６つのＣＤＲを用いて置換またはグラフティングし得る。
【0033】
【図3】図３は、本開示で具体化された二重サイトカイン融合タンパク質の代表である概要図であり、ここで、二重サイトカイン融合タンパク質は、末端で連結されたＩＬ－２７α（ｐ２８）およびＩＬ－２７β（ＥＢＩ３）サブユニットを含み、第２のサイトカインは、抗Ｘ抗体由来の（例えば、ヒト抗エボラ抗体由来の）ＶＨとＶＬとの間のｓｃＦｖのリンカーに組み込まれている。６つのＣＤＲ（ＶＨ由来の３つおよびＶＬ由来の３つ）を、必要に応じて、第２の抗体（例えば、ＴＡＡを標的にする抗体（抗ＨＥＲ２抗体、抗ＨＥＲ３抗体、抗ＥＧＦＲ抗体、抗ＶＥＧＦＲ１抗体、または抗ＶＥＧＦＲ２抗体などであるが、これらに限定されない）など）由来の６つのＣＤＲを用いて置換またはグラフティングし得る。
【0034】
【0035】
【0036】
【0037】
【0038】
【0039】
【0040】
【発明を実施するための形態】
【0041】
詳細な説明
例示的な態様を、マルチサブユニットの第１のサイトカイン（ＩＬ－１２またはＩＬ－２７など）を含む二重サイトカイン融合タンパク質、マルチサブユニットの第１のサイトカイン（ＩＬ－１２またはＩＬ－２７など）を含む二重サイトカイン融合タンパク質を作製する方法、ならびに炎症性疾患または症状、免疫疾患または症状の処置、癌の処置および／または予防のためにマルチサブユニットの第１のサイトカイン（ＩＬ－１２またはＩＬ－２７など）を含む二重サイトカイン融合タンパク質を使用する方法に関して本明細書中に記載する。当業者は、以下の説明が例示のみを目的とし、いかなる制限も意図しないことを理解するであろう。他の態様は、それ自体が当業者に本開示の利点を有することを容易に示唆させるであろう。添付の図面に例示のように、例示的な態様の実装形態についてここに詳細に言及するであろう。同一または類似の項目について言及するために、図面および以下の説明にわたって可能な範囲で同一の符号を使用するであろう。
例示的な態様を、マルチサブユニットの第１のサイトカイン（ＩＬ－１２またはＩＬ－２７など）を含む二重サイトカイン融合タンパク質、マルチサブユニットの第１のサイトカイン（ＩＬ－１２またはＩＬ－２７など）を含む二重サイトカイン融合タンパク質を作製する方法、ならびに炎症性疾患または症状、免疫疾患または症状の処置、癌の処置および／または予防のためにマルチサブユニットの第１のサイトカイン（ＩＬ－１２またはＩＬ－２７など）を含む二重サイトカイン融合タンパク質を使用する方法に関して本明細書中に記載する。当業者は、以下の説明が例示のみを目的とし、いかなる制限も意図しないことを理解するであろう。他の態様は、それ自体が当業者に本開示の利点を有することを容易に示唆させるであろう。添付の図面に例示のように、例示的な態様の実装形態についてここに詳細に言及するであろう。同一または類似の項目について言及するために、図面および以下の説明にわたって可能な範囲で同一の符号を使用するであろう。
【0042】
本明細書中に記載の方法および材料に類似するか等価な方法および材料のいくつかを記載の様々な実施形態の実施において使用することができるが、好ましい方法および材料を本明細書中に記載する。
【0043】
別段の指示がない限り、本明細書中に記載の実施形態は、当業者に周知の分子生物学、生化学、薬理学、化学、および免疫学の従来の方法および技術を使用する。マルチサブユニットの第１のサイトカイン（ＩＬ－１２またはＩＬ－２７など）を含む二重サイトカイン融合タンパク質をデザインおよび作製するための一般的技術、ならびにマルチサブユニットの第１のサイトカイン（ＩＬ－１２またはＩＬ－２７など）を含む二重サイトカイン融合タンパク質の発現および機能を試験するためのアッセイの多くは、当該分野で容易に利用可能であり、かつ詳述されている周知の方法である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９８９）；Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ｓ．Ｃｏｌｏｗｉｃｋ ａｎｄ Ｎ．Ｋａｐｌａｎ ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｓ．Ｉ－ＩＶ（Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ ａｎｄ Ｃ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ ｅｄｓ．，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ）；Ａ．Ｌ．Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｗｏｒｔｈ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．，ｃｕｒｒｅｎｔ ａｄｄｉｔｉｏｎ）を参照のこと。また、Ｎ末端アルデヒドベースのペグ化化学は、当該分野で周知である。
【0044】
定義
以下の用語を、本明細書中で考察された多様な実施形態を説明するために使用し、以下に示すように定義されることを意図する。
以下の用語を、本明細書中で考察された多様な実施形態を説明するために使用し、以下に示すように定義されることを意図する。
【0045】
種々の実施形態の説明において本明細書中で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」には、内容上そうでないと明確に示されない限り、複数の指示対象が含まれる。
【0046】
用語「約」は、示した数値または数値の範囲からの０．０００１～５％の逸脱を指す。１つの実施形態では、用語「約」は、示した数値または数値の範囲からの１～１０％の逸脱を指す。１つの実施形態では、用語「約」は、示した数値または数値の範囲からの２５％までの逸脱を指す。より具体的な実施形態では、用語「約」は、野生型配列と比較した時のヌクレオチド配列相同性またはアミノ酸配列相同性の１～２５％の相違を指す。
【0047】
用語「マルチサブユニットサイトカイン」は、ヘテロ二量体を作製するための少なくともアルファサブユニットおよびベータサブユニットまたはホモ二量体を作製するための２つの単量体を含むサイトカインタンパク質を指す。参考として、マルチサブユニットサイトカインは、とりわけ、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、またはＩＬ－２７を含み得る。他のマルチサブユニットサイトカインは、当業者に公知であり、本明細書中に記載の二重サイトカイン融合タンパク質の末端に置換され得る。
【0048】
用語「インターロイキン－１２」または「ＩＬ－１２」は、非共有結合により連結してヘテロ二量体を形成するアルファ（ｐ３５）およびベータ（ｐ４０）サブユニットを含むタンパク質を指す。本明細書中で使用される場合、別段の指示がない限り、「インターロイキン－１２」および「ＩＬ－１２」は、任意の形態のＩＬ－１２（ヒト；マウス、またはバリアントの形態を含むが、これらに限定されない）を指す。したがって、例えば、用語「野生型」または「未変性」は、アルファおよびベータサブユニットについて自然界でもっとも一般的に見出されるアミノ酸配列に対応するであろう。１つの実施形態では、ｐ３５は、配列番号１、１７、または１９の配列であり、ｐ４０は、配列番号３、１８、または２０の配列である。
【0049】
用語「インターロイキン－２７」または「ＩＬ－２７」は、非共有結合により連結してヘテロ二量体を形成するアルファ（ｐ２８）およびベータ（ＥＢＩ３）サブユニットを含むタンパク質を指す。本明細書中で使用される場合、別段の指示がない限り、「インターロイキン－１２」および「ＩＬ－１２」は、任意の形態のＩＬ－１２（ヒト；マウス、またはバリアントの形態を含むが、これらに限定されない）を指す。したがって、例えば、用語「野生型」または「未変性」は、アルファおよびベータサブユニットについて自然界でもっとも一般的に見出されるアミノ酸配列に対応するであろう。１つの実施形態では、ｐ２８は、配列番号５の配列であり、ＥＢＩ３は、配列番号７の配列である。
【0050】
用語「インターロイキン－１０」または「ＩＬ－１０」は、連結してホモ二量体を形成する２つの単量体を含むタンパク質である。本明細書中で使用される場合、別段の指示がない限り、「インターロイキン－１０」および「ＩＬ－１０」は、任意の形態のＩＬ－１０（ヒト；マウス、またはバリアントの形態を含むが、これらに限定されない）を指す。したがって、例えば、用語「野生型」または「未変性」は、アルファおよびベータサブユニットについて自然界でもっとも一般的に見出されるアミノ酸配列に対応するであろう。１つの実施形態では、ヒトＩＬ－１０は配列番号３１の配列であり、マウスＩＬ－１０は配列番号３７の配列であり、ウイルス形態のＩＬ－１０は、配列番号３３を有するＥＢＶ ＩＬ－１０および配列番号３５を有するＣＭＶ ＩＬ－１０を含む。
【0051】
用語「バリアント」、「アナログ」、および「ムテイン」は、所望の活性（例えば、抗炎症活性など）を保持する参照分子の生物学的に活性な誘導体を指す。一般に、用語「バリアント」、「バリアント」、「アナログ」、および「ムテイン」は、ポリペプチドに関する場合、未変性分子と比較して１またはそれを超えるアミノ酸の付加、置換（事実上保存的であり得る）、および／または欠失を有する未変性のポリペプチド配列および構造を有する化合物を指す。そのようなものとして、用語「ＩＬ－１２バリアント」、「バリアントＩＬ－１２」、ＩＬ－１２バリアント分子」、「ＩＬ－２７バリアント」、「バリアントＩＬ－２７」、「ＩＬ－２７バリアント分子」、ならびにこれらの文法上のバリエーションおよび複数形の全ては、野生型ＩＬ－１２またはＩＬ－２７と異なるＩＬ－１２またはＩＬ－２７のアミノ酸（または核酸）配列を指す等価な用語であることが意図される。ＩＬ－１２またはＩＬ－２７のアミノ酸配列の相違は、任意の場所に１～２５％の配列の同一性または相同性が存在するような、アルファ、ベータ、または両方のサブユニット内の付加、欠失、または置換であり得る。これらのバリアント形態は、タンパク質に対するそのグリコシル化（脱グリコシル化またはアグリコシル化）形態への修飾を含む。ＩＬ－１０バリアント形態は、野生型ＩＬ－１０と比較したときに結合親和性が増加または減少している形態を含み得る。したがって、１つの実施形態では、結合親和性が増加したかより高いＩＬ－１０のバリアント形態は、配列番号４１のＩＬ－１０バリアント（本明細書中でＤＶ０７と示す）または結合親和性が減少しているかより低い配列番号３９のＩＬ－１０バリアント（本明細書中でＤＶ０６と示す）を含む。
【0052】
用語「融合タンパク質」は、天然には存在しない新規のタンパク質の配置を生じる２またはそれを超えるタンパク質またはポリペプチドの組み合わせまたは抱合を指す。融合タンパク質は、２またはそれを超えるタンパク質またはポリペプチドの共有結合の結果である。融合タンパク質から構成される２またはそれを超えるタンパク質は、アミノ末端（「ＮＨ２」）からカルボキシ末端（「ＣＯＯＨ」）まで任意の配座で配置され得る。したがって、例えば、あるタンパク質のカルボキシ末端を、別のタンパク質のカルボキシ末端またはアミノ末端のいずれかに共有結合し得る。例示的な融合タンパク質は、（Ｎ末端からＣ末端への方向に）ＩＬ－１２のアルファサブユニット－抗体ＶＨドメイン－第２のサイトカイン（ＩＦＮ－アルファ、ＩＬ－２８、またはＩＬ－２９など）－ＶＬドメイン（結果としてＶＨおよびＶＬドメインがＶＨ／ＶＬ対を形成する）－ＩＬ－１２のベータサブユニットの組み合わせを含み得る。別の例示的な融合タンパク質は、（Ｎ末端からＣ末端への方向に）ＩＬ－２７のアルファサブユニット－抗体ＶＨドメイン－第２のサイトカイン（ＩＦＮ－アルファ、ＩＬ－２８、またはＩＬ－２９など）－ＶＬドメイン（結果としてＶＨおよびＶＬドメインがＶＨ／ＶＬ対を形成する）－ＩＬ－２７のベータサブユニットの組み合わせを含み得る。さらに別の例示的な融合タンパク質は、（Ｎ末端からＣ末端への方向に）ＩＬ－１２のアルファサブユニット－抗体ＶＨドメイン－ホモ二量体サイトカイン（ＩＬ－１０など）の第１の単量体－ホモ二量体サイトカイン（ＩＬ－１０など）の第２の単量体－ＶＬドメイン（結果としてＶＨおよびＶＬドメインがＶＨ／ＶＬ対を形成する）－ＩＬ－１２のベータサブユニットの組み合わせを含み得る。１つの好ましい実施形態では、マルチサブユニット二重サイトカイン融合タンパク質の代表的な形態は、単量体サイトカイン（ＩＬ－６、ＩＬ－４、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－５、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１ ＩＬ－２６、ＩＬ－２７、ＩＬ－２８、ＩＬ－２９、ＧＭ－ＣＳＦ、Ｇ－ＣＳＦ、インターフェロン－α、－β、－γ、ＴＧＦ－β、または腫瘍壊死因子－α、－β、塩基性ＦＧＦ、ＥＧＦ、ＰＤＧＦ、ＩＬ－４、ＩＬ－１１、またはＩＬ－１３など）と組み合わせたヘテロ二量体サイトカイン（ＩＬ－１２またはＩＬ－２７など）を含み得る。別の実施形態では、マルチサブユニット二重サイトカイン融合タンパク質は、ホモ二量体サイトカイン（ＩＬ－１０、ＩＬ－１０バリアント、マウスＩＬ－１０、ＤＶ０７（配列番号４１）、またはＤＶ０６（配列番号３９）など）と組み合わせたヘテロ二量体サイトカイン（ＩＬ－１２またはＩＬ－２７など）を含み得る。
【0053】
用語「ホモログ」、「相同性」、「相同な」、または「実質的に相同な」は、少なくとも２つのポリヌクレオチド配列または少なくとも２つのポリペプチド配列の間の同一率を指す。分子の規定の長さにわたって配列が少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約７５％、より好ましくは少なくとも約８０％～８５％，好ましくは少なくとも約９０％、最も好ましくは少なくとも約９５％～９８％の配列同一性を示す場合、配列は相互に相同である。
【0054】
用語「配列同一性」は、正確なヌクレオチド対ヌクレオチド対応またはアミノ酸対アミノ酸対応を指す。配列同一性は、１００％配列同一性から５０％配列同一性までの範囲であり得る。配列同一率を、種々の方法（配列をアラインメントし、２つのアラインメントした配列の間の正確なマッチ数をカウントし、参照配列の長さで除し、結果に１００を掛けることによる、２分子（参照配列および参照配列との同一率が未知の配列）の間の配列情報の直接比較を含むが、これに限定されない）を使用して決定することができる。容易に利用可能なコンピュータプログラムを使用して、同一率の同定を補助することができる。
【0055】
用語「被験体」、「個体」、または「患者」は、本明細書中で互換的に使用され、脊椎動物、好ましくは哺乳動物を指す。哺乳動物としては、マウス、げっ歯類、サル、ヒト、家畜、競技用動物、およびある特定のペットを含むが、これらに限定されない。
【0056】
用語「投与」は、本出願の有効成分がその意図する機能を発揮することが可能な投与経路を含む。
【0057】
「治療有効量」は、例えば、本明細書中に記載の二重サイトカイン融合タンパク質の投与に関する場合、ある特定の生物学的活性を促進するのに十分な二重サイトカイン融合タンパク質の量を指す。これらには、例えば、骨髄性細胞機能の抑制、クッパー細胞活性の増強、および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞に及ぼす任意の影響の欠如またはＣＤ８＋Ｔ細胞活性の増強、ならびにＦｃ受容体の肥満細胞上方制御の遮断または脱顆粒の防止を含み得る。したがって、「有効量」は、病状の徴候または兆候を改善するか防止するであろう。また、有効量は、診断を可能にするか容易にするのに十分な量を意味する。
【0058】
用語「処置する」または「処置」は、疾患または症状の影響を低下させる方法を指す。また、処置は、単なる徴候よりもむしろ疾患または症状自体の根本原因を軽減する方法を指すことができる。処置は、元のレベルからの任意の低下であり得、疾患、症状、または疾患もしくは症状の徴候の完全な消失であり得るが、これに限定されない。
【0059】
二重サイトカイン融合タンパク質の構造
本開示は、以前に米国特許第１０，８５８，４１２号（米国特許出願第１６／８１１，７１８号として出願）（その全体が参考として援用される）に記載のＩＬ－１０融合タンパク質の実施形態を改善する。図６は、米国特許第１０，８５８，４１２号に記載の以前に開示のＩＬ－１０融合タンパク質構築物のうちの１つを表す概要図である。図１は、本開示が元のＩＬ－１０融合タンパク質をどのように改善したかを示す一般的な略図を提供している。ＩＬ－１０融合タンパク質の改善点は、（１）ＩＬ－１０単量体の、マルチサブユニットサイトカインのアルファおよびベータサブユニットとの置換、および（２）第２のサイトカイン分子の、ｓｃＦｖのＶＨとＶＬドメインとの間（すなわち、ｓｃＦｖのヒンジ領域中）への組み込みを含む。本出願の二重サイトカイン融合タンパク質を、ＶＨおよびＶＬ（ｓｃＦｖ）を含む足場系上に構築することができ、このタンパク質は、アルファサブユニットがＮ末端上に融合され、ベータサブユニットがＣ末端に融合された（または逆も同様）マルチサブユニットサイトカインのアルファおよびベータサブユニットを特徴とする。したがって、「末端」に融合されたという用語は、アルファ（またはベータ）サブユニットが融合タンパク質のＮ末端上に配置されているか、ベータ（またはアルファ）サブユニットが融合タンパク質のＣ末端上に配置されているかのいずれかを意味するであろう。足場系は、好ましくはＨＩＶまたはエボラに特異的な抗体から得たｓｃＦｖを含むであろう（好ましくは、ｓｃＦｖはヒト抗エボラ抗体から得られる）。二重サイトカイン融合タンパク質は、６つの相補性決定領域（「ＣＤＲ」）を有するｓｃＦｖ（好ましくは、ヒト抗エボラ抗体から得た）を含み、ここで、ＶＨ中に３つのＣＤＲ（ＣＤＲ１～３）が存在し、ＶＬ中に３つのＣＤＲ（ＣＤＲ１～３）が存在する。必要に応じて、ＶＨ領域およびＶＬ領域は、二重サイトカイン融合タンパク質に特異的抗原を標的にさせることができる。ＶＨおよびＶＬ対の６つのＣＤＲ領域（ＶＨ中の３つのＣＤＲおよびＶＬ中の３つのＣＤＲ）を受容体もしくは抗原を標的にする抗体またはその抗原結合断片のＶＨおよびＶＬ由来の６つのＣＤＲ領域と置換することによってこれを達成し得る。また、このプロセスは、ＣＤＲグラフティングまたはＣＤＲエングラフトメントとして一般に公知である。当業者は、ｓｃＦｖフレームワーク領域中または本明細書中に記載のｓｃＦｖ足場中への６つのＣＤＲの置換およびエングラフトメントまたはグラフティングの置換および最適化が可能である。これらは周知であり、当業者によって使用される技術によって実施される。例えば、ヒト抗エボラ抗体から得たｓｃＦｖ由来の６つのＣＤＲ領域を、任意のモノクローナル抗体由来の６つのＣＤＲ（当業者は、目的の特異的標的に基づいて決定することができるであろう）と置換する。例えば、特異的標的は、酵素、受容体、細胞外タンパク質、または細胞内タンパク質（腫瘍（例えば、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ））、炎症応答、または自己免疫疾患に関連するものなど）を含み得るが、これらに限定されない。したがって、特異的標的を標的にする６つのＣＤＲは、任意の抗体（ＥＧＦＲ；ＣＤ１４；ＣＤ５２；多様な免疫チェックポイント標的（ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－１、ＴＩＭ３、ＢＴＬＡ、ＬＡＧ３、またはＣＴＬＡ４などであるが、これらに限定されない）；ＣＤ１９；ＣＤ２０；ＣＤ２２；ＣＤ４７；ＣＤ１２３；ＧＤ－２；ＶＥＧＦＲ１；ＶＥＧＦＲ２；ＨＥＲ２；ＰＤＧＦＲ；ＥｐＣＡＭ；ＩＣＡＭ（ＩＣＡＭ－１、－２、－３、－４、－５）、ＶＣＡＭ、ＦＡＰα；５Ｔ４；Ｔｒｏｐ２；ＥＤＢ－ＦＮ；ＴＧＦβ Ｔｒａｐ；ＭＡｄＣＡＭ、β７インテグリンサブユニット；α４β７インテグリン；α４インテグリン；ＢＣＭＡ；ＰＳＡ；ＰＳＭＡ；ＣＥＡ；ＧＰＣ３；ＳＲ－Ａ１；ＳＲ－Ａ３；ＳＲ－Ａ４；ＳＲ－Ａ５；ＳＲ－Ａ６；ＳＲ－Ｂ；ｄＳＲ－Ｃ１；ＳＲ－Ｄ１；ＳＲ－Ｅ１；ＳＲ－Ｆ１；ＳＲ－Ｆ２；ＳＲ－Ｇ；ＳＲ－Ｈ１；ＳＲ－Ｈ２；ＳＲ－Ｉ１；またはＳＲ－Ｊ１に特異的な抗体を含むが、これらに限定されない）であり得る。上記のリストは、本開示の二重サイトカイン融合タンパク質中に組み込み得る可能なターゲティング抗体の代表であり、当業者は、他のターゲティング抗体、特に、癌または炎症組織上の表面マーカーを標的にする抗体由来のＣＤＲが足場中にグラフティングされ得ることを認識することができるであろう。好ましい実施形態では、抗体は、抗ＨＥＲ２抗体、抗ＨＥＲ３抗体、抗ＥＧＦＲ抗体、抗ＶＥＧＦＲ１抗体、抗ＶＥＧＦＲ２抗体、抗ＢＣＭＡ抗体、抗ＰＳＡ抗体、抗ＰＳＭＡ抗体、抗ＣＤ１９抗体、抗ＣＤ２０抗体、抗ＣＤ２２抗体、抗ＣＥＡ抗体、抗ＧＰＣ３、または抗ＣＤ１４抗体である。
本開示は、以前に米国特許第１０，８５８，４１２号（米国特許出願第１６／８１１，７１８号として出願）（その全体が参考として援用される）に記載のＩＬ－１０融合タンパク質の実施形態を改善する。図６は、米国特許第１０，８５８，４１２号に記載の以前に開示のＩＬ－１０融合タンパク質構築物のうちの１つを表す概要図である。図１は、本開示が元のＩＬ－１０融合タンパク質をどのように改善したかを示す一般的な略図を提供している。ＩＬ－１０融合タンパク質の改善点は、（１）ＩＬ－１０単量体の、マルチサブユニットサイトカインのアルファおよびベータサブユニットとの置換、および（２）第２のサイトカイン分子の、ｓｃＦｖのＶＨとＶＬドメインとの間（すなわち、ｓｃＦｖのヒンジ領域中）への組み込みを含む。本出願の二重サイトカイン融合タンパク質を、ＶＨおよびＶＬ（ｓｃＦｖ）を含む足場系上に構築することができ、このタンパク質は、アルファサブユニットがＮ末端上に融合され、ベータサブユニットがＣ末端に融合された（または逆も同様）マルチサブユニットサイトカインのアルファおよびベータサブユニットを特徴とする。したがって、「末端」に融合されたという用語は、アルファ（またはベータ）サブユニットが融合タンパク質のＮ末端上に配置されているか、ベータ（またはアルファ）サブユニットが融合タンパク質のＣ末端上に配置されているかのいずれかを意味するであろう。足場系は、好ましくはＨＩＶまたはエボラに特異的な抗体から得たｓｃＦｖを含むであろう（好ましくは、ｓｃＦｖはヒト抗エボラ抗体から得られる）。二重サイトカイン融合タンパク質は、６つの相補性決定領域（「ＣＤＲ」）を有するｓｃＦｖ（好ましくは、ヒト抗エボラ抗体から得た）を含み、ここで、ＶＨ中に３つのＣＤＲ（ＣＤＲ１～３）が存在し、ＶＬ中に３つのＣＤＲ（ＣＤＲ１～３）が存在する。必要に応じて、ＶＨ領域およびＶＬ領域は、二重サイトカイン融合タンパク質に特異的抗原を標的にさせることができる。ＶＨおよびＶＬ対の６つのＣＤＲ領域（ＶＨ中の３つのＣＤＲおよびＶＬ中の３つのＣＤＲ）を受容体もしくは抗原を標的にする抗体またはその抗原結合断片のＶＨおよびＶＬ由来の６つのＣＤＲ領域と置換することによってこれを達成し得る。また、このプロセスは、ＣＤＲグラフティングまたはＣＤＲエングラフトメントとして一般に公知である。当業者は、ｓｃＦｖフレームワーク領域中または本明細書中に記載のｓｃＦｖ足場中への６つのＣＤＲの置換およびエングラフトメントまたはグラフティングの置換および最適化が可能である。これらは周知であり、当業者によって使用される技術によって実施される。例えば、ヒト抗エボラ抗体から得たｓｃＦｖ由来の６つのＣＤＲ領域を、任意のモノクローナル抗体由来の６つのＣＤＲ（当業者は、目的の特異的標的に基づいて決定することができるであろう）と置換する。例えば、特異的標的は、酵素、受容体、細胞外タンパク質、または細胞内タンパク質（腫瘍（例えば、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ））、炎症応答、または自己免疫疾患に関連するものなど）を含み得るが、これらに限定されない。したがって、特異的標的を標的にする６つのＣＤＲは、任意の抗体（ＥＧＦＲ；ＣＤ１４；ＣＤ５２；多様な免疫チェックポイント標的（ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－１、ＴＩＭ３、ＢＴＬＡ、ＬＡＧ３、またはＣＴＬＡ４などであるが、これらに限定されない）；ＣＤ１９；ＣＤ２０；ＣＤ２２；ＣＤ４７；ＣＤ１２３；ＧＤ－２；ＶＥＧＦＲ１；ＶＥＧＦＲ２；ＨＥＲ２；ＰＤＧＦＲ；ＥｐＣＡＭ；ＩＣＡＭ（ＩＣＡＭ－１、－２、－３、－４、－５）、ＶＣＡＭ、ＦＡＰα；５Ｔ４；Ｔｒｏｐ２；ＥＤＢ－ＦＮ；ＴＧＦβ Ｔｒａｐ；ＭＡｄＣＡＭ、β７インテグリンサブユニット；α４β７インテグリン；α４インテグリン；ＢＣＭＡ；ＰＳＡ；ＰＳＭＡ；ＣＥＡ；ＧＰＣ３；ＳＲ－Ａ１；ＳＲ－Ａ３；ＳＲ－Ａ４；ＳＲ－Ａ５；ＳＲ－Ａ６；ＳＲ－Ｂ；ｄＳＲ－Ｃ１；ＳＲ－Ｄ１；ＳＲ－Ｅ１；ＳＲ－Ｆ１；ＳＲ－Ｆ２；ＳＲ－Ｇ；ＳＲ－Ｈ１；ＳＲ－Ｈ２；ＳＲ－Ｉ１；またはＳＲ－Ｊ１に特異的な抗体を含むが、これらに限定されない）であり得る。上記のリストは、本開示の二重サイトカイン融合タンパク質中に組み込み得る可能なターゲティング抗体の代表であり、当業者は、他のターゲティング抗体、特に、癌または炎症組織上の表面マーカーを標的にする抗体由来のＣＤＲが足場中にグラフティングされ得ることを認識することができるであろう。好ましい実施形態では、抗体は、抗ＨＥＲ２抗体、抗ＨＥＲ３抗体、抗ＥＧＦＲ抗体、抗ＶＥＧＦＲ１抗体、抗ＶＥＧＦＲ２抗体、抗ＢＣＭＡ抗体、抗ＰＳＡ抗体、抗ＰＳＭＡ抗体、抗ＣＤ１９抗体、抗ＣＤ２０抗体、抗ＣＤ２２抗体、抗ＣＥＡ抗体、抗ＧＰＣ３、または抗ＣＤ１４抗体である。
【0060】
第１の態様では、本出願は、ＩＬ－１２またはＩＬ－２７および少なくとも１つの他のサイトカインを含む二重サイトカイン融合タンパク質に関し、前述の二重サイトカイン融合タンパク質は、個別のＩＬ－１２またはＩＬ－２７および他のサイトカイン融合物と比較したときに、組み合わせた機能性または相乗的な機能性を有する。図１は、融合タンパク質の末端に融合されたマルチサブユニットサイトカインのアルファおよびベータサブユニットを含む改善された二重サイトカイン融合タンパク質の代表的な線図である。特に、改善された二重サイトカイン融合タンパク質は、同一のまたは実質的に同一のＶＨおよびＶＬ ｓｃＦｖから構成される足場系に適応し、それにより、ＩＬ－１２またはＩＬ－２７のアルファおよびベータサブユニットは、例えば、二重融合タンパク質のアミノ末端およびカルボキシ末端にある（例えば、図２～５を参照のこと）。ある特定の実施形態では、ＩＬ－１２サブユニットは、アルファサブユニットもしくは配列番号１、１７、もしくは１９のｐ３５またはベータサブユニットもしくは配列番号３、１８、もしくは２０のｐ４０であり、ここで、ｓｃＦｖに融合したアミノ酸サブユニットは、シグナルペプチドやリーダー配列を欠く。他の実施形態では、ＩＬ－２７サブユニットは、アルファサブユニットもしくは配列番号５のｐ２８またはベータサブユニットもしくは配列番号７のＥＢＩ３であり、ここで、ｓｃＦｖに融合したアミノ酸は、シグナルペプチドやリーダー配列を欠く。ある特定の実施形態では、ＩＬ－１２またはＩＬ－２７の一方または両方のサブユニットに対する修飾は、おそらく、付加、欠失、または置換を含む。これらの修飾は、結合親和性を変化（増加または減少）させるか、グリコシル化部位を変化させるか、免疫原性を減少させる修飾を含み得る。ある特定の実施形態では、ＩＬ－２７中、好ましくは、ＥＩＢ３中のグリコシル化部位、より好ましくは、配列番号７のアミノ酸５５～５７位および／または１０５～１０７位、さらにより好ましくは、配列番号７の５７位および／または１０７位が修飾されている（トレオニンが置換されている）。第２のサイトカインは、ｓｃＦｖのヒンジ領域であるｓｃＦｖのＶＨ領域とＶＬ領域との間で融合されることによって二重サイトカイン融合タンパク質に抱合されている（例えば、図１～５を参照のこと）。二重サイトカイン融合タンパク質は、機能性タンパク質複合体を形成することができ、それにより、アルファおよびベータサブユニットはヘテロ二量体化され、これに伴ってＶＨ領域およびＶＬ領域が共に会合して対を形成し、それによりｓｃＦｖ複合体を形成する。
【0061】
ある特定の実施形態では、マルチサブユニットサイトカインを含む二重サイトカイン融合タンパク質は、式ＩａまたはＩｂ：
ＮＨ２－（Ｒ１）－（Ｘ１）－（Ｚｎ）－（Ｘ２）－（Ｒ２）－ＣＯＯＨ（式Ｉａ）；
ＮＨ２－（Ｒ２）－（Ｘ１）－（Ｚｎ）－（Ｘ２）－（Ｒ１）－ＣＯＯＨ（式Ｉｂ）
（式中、
「Ｒ１」が、配列番号１、１７、１９、または５から選択される第１のサイトカイン配列のアルファサブユニットであり；
「Ｒ２」が、配列番号３、１８、２０、または７から選択される第１のサイトカイン配列のベータサブユニットであり；
ここで、Ｒ１が配列番号１、１７、または１９であるとき、Ｒ２が配列番号３、１８、または２０であり、あるいは、Ｒ１が配列番号５であるとき、Ｒ２が配列番号７であり；
「Ｘ１」が、第１のモノクローナル抗体から得たＶＬ領域またはＶＨ領域であり；
「Ｘ２」が、前述の第１のモノクローナル抗体から得たＶＨ領域またはＶＬ領域であり；
ここで、Ｘ１がＶＬであるとき、Ｘ２はＶＨであり、あるいは、Ｘ１がＶＨであるとき、Ｘ２はＶＬであり
「Ｚ」がサイトカインであり；
「ｎ」が０～２から選択される整数である）を有する構造である。
ＮＨ２－（Ｒ１）－（Ｘ１）－（Ｚｎ）－（Ｘ２）－（Ｒ２）－ＣＯＯＨ（式Ｉａ）；
ＮＨ２－（Ｒ２）－（Ｘ１）－（Ｚｎ）－（Ｘ２）－（Ｒ１）－ＣＯＯＨ（式Ｉｂ）
（式中、
「Ｒ１」が、配列番号１、１７、１９、または５から選択される第１のサイトカイン配列のアルファサブユニットであり；
「Ｒ２」が、配列番号３、１８、２０、または７から選択される第１のサイトカイン配列のベータサブユニットであり；
ここで、Ｒ１が配列番号１、１７、または１９であるとき、Ｒ２が配列番号３、１８、または２０であり、あるいは、Ｒ１が配列番号５であるとき、Ｒ２が配列番号７であり；
「Ｘ１」が、第１のモノクローナル抗体から得たＶＬ領域またはＶＨ領域であり；
「Ｘ２」が、前述の第１のモノクローナル抗体から得たＶＨ領域またはＶＬ領域であり；
ここで、Ｘ１がＶＬであるとき、Ｘ２はＶＨであり、あるいは、Ｘ１がＶＨであるとき、Ｘ２はＶＬであり
「Ｚ」がサイトカインであり；
「ｎ」が０～２から選択される整数である）を有する構造である。
【0062】
別の実施形態では、二重サイトカイン融合タンパク質は、式ＩＩａまたはＩＩｂ：
ＮＨ２－（ｐ３５）－（Ｌ）－（Ｘ１）－（Ｌ）－（Ｚｎ）－（Ｌ）－（Ｘ２）－（Ｌ）－（ｐ４０）－ＣＯＯＨ（式ＩＩａ）；
ＮＨ２－（ｐ４０）－（Ｌ）－（Ｘ１）－（Ｌ）－（Ｚｎ）－（Ｌ）－（Ｘ２）－（Ｌ）－（ｐ３５）－ＣＯＯＨ（式ＩＩｂ）；
（式中、
「ｐ３５」が、配列番号１、１７、または１９の配列であり；
「ｐ４０」が、配列番号３、１８、または２０の配列であり；
「Ｌ」がリンカーであり；
「Ｘ１」が、第１のモノクローナル抗体から得たＶＬ領域またはＶＨ領域であり；
「Ｘ２」が、前述の第１のモノクローナル抗体から得たＶＨ領域またはＶＬ領域であり；
ここで、Ｘ１がＶＬであるとき、Ｘ２はＶＨであり、あるいは、Ｘ１がＶＨであるとき、Ｘ２はＶＬであり；
「Ｚ」が、ＩＬ－６、ＩＬ－４、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－５、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、ＩＬ－２６、ＩＬ－２７、ＩＬ－２８、ＩＬ－２９、ＧＭ－ＣＳＦ、Ｇ－ＣＳＦ、インターフェロン－α、－β、－γ、ＴＧＦ－β、または腫瘍壊死因子－α、－β、塩基性ＦＧＦ、ＥＧＦ、ＰＤＧＦ、ＩＬ－４、ＩＬ－１１、またはＩＬ－１３から選択されるサイトカインであり；
「ｎ」が０～２から選択される整数である）を有する構造である。
ＮＨ２－（ｐ３５）－（Ｌ）－（Ｘ１）－（Ｌ）－（Ｚｎ）－（Ｌ）－（Ｘ２）－（Ｌ）－（ｐ４０）－ＣＯＯＨ（式ＩＩａ）；
ＮＨ２－（ｐ４０）－（Ｌ）－（Ｘ１）－（Ｌ）－（Ｚｎ）－（Ｌ）－（Ｘ２）－（Ｌ）－（ｐ３５）－ＣＯＯＨ（式ＩＩｂ）；
（式中、
「ｐ３５」が、配列番号１、１７、または１９の配列であり；
「ｐ４０」が、配列番号３、１８、または２０の配列であり；
「Ｌ」がリンカーであり；
「Ｘ１」が、第１のモノクローナル抗体から得たＶＬ領域またはＶＨ領域であり；
「Ｘ２」が、前述の第１のモノクローナル抗体から得たＶＨ領域またはＶＬ領域であり；
ここで、Ｘ１がＶＬであるとき、Ｘ２はＶＨであり、あるいは、Ｘ１がＶＨであるとき、Ｘ２はＶＬであり；
「Ｚ」が、ＩＬ－６、ＩＬ－４、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－５、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、ＩＬ－２６、ＩＬ－２７、ＩＬ－２８、ＩＬ－２９、ＧＭ－ＣＳＦ、Ｇ－ＣＳＦ、インターフェロン－α、－β、－γ、ＴＧＦ－β、または腫瘍壊死因子－α、－β、塩基性ＦＧＦ、ＥＧＦ、ＰＤＧＦ、ＩＬ－４、ＩＬ－１１、またはＩＬ－１３から選択されるサイトカインであり；
「ｎ」が０～２から選択される整数である）を有する構造である。
【0063】
別の実施形態では、二重サイトカイン融合タンパク質は、式ＩＩＩａまたはＩＩＩｂ：
ＮＨ２－（ｐ２８）－（Ｌ）－（Ｘ１）－（Ｌ）－（Ｚｎ）－（Ｌ）－（Ｘ２）－（Ｌ）－（ＥＢＩ３）－ＣＯＯＨ（式ＩＩＩａ）；
ＮＨ２－（ＥＢＩ３）－（Ｌ）－（Ｘ１）－（Ｌ）－（Ｚｎ）－（Ｌ）－（Ｘ２）－（Ｌ）－（ｐ２８）－ＣＯＯＨ（式ＩＩＩｂ）；
（式中、
「ｐ２８」が、配列番号５の配列であり；
「ＥＢＩ３」が、配列番号７の配列であり；
「Ｌ」がリンカーであり；
「Ｘ１」が、第１のモノクローナル抗体から得たＶＬ領域またはＶＨ領域であり；
「Ｘ２」が、前述の第１のモノクローナル抗体から得たＶＨ領域またはＶＬ領域であり；
ここで、Ｘ１がＶＬであるとき、Ｘ２はＶＨであり、あるいは、Ｘ１がＶＨであるとき、Ｘ２はＶＬであり；
「Ｚ」が、ＩＬ－６、ＩＬ－４、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－５、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、ＩＬ－２６、ＩＬ－２８、ＩＬ－２９、ＧＭ－ＣＳＦ、Ｇ－ＣＳＦ、インターフェロン－α、－β、－γ、ＴＧＦ－β、または腫瘍壊死因子－α、－β、塩基性ＦＧＦ、ＥＧＦ、ＰＤＧＦ、ＩＬ－４、ＩＬ－１１、またはＩＬ－１３から選択されるサイトカインであり；
「ｎ」が０～２から選択される整数である）を有する構造である。
ＮＨ２－（ｐ２８）－（Ｌ）－（Ｘ１）－（Ｌ）－（Ｚｎ）－（Ｌ）－（Ｘ２）－（Ｌ）－（ＥＢＩ３）－ＣＯＯＨ（式ＩＩＩａ）；
ＮＨ２－（ＥＢＩ３）－（Ｌ）－（Ｘ１）－（Ｌ）－（Ｚｎ）－（Ｌ）－（Ｘ２）－（Ｌ）－（ｐ２８）－ＣＯＯＨ（式ＩＩＩｂ）；
（式中、
「ｐ２８」が、配列番号５の配列であり；
「ＥＢＩ３」が、配列番号７の配列であり；
「Ｌ」がリンカーであり；
「Ｘ１」が、第１のモノクローナル抗体から得たＶＬ領域またはＶＨ領域であり；
「Ｘ２」が、前述の第１のモノクローナル抗体から得たＶＨ領域またはＶＬ領域であり；
ここで、Ｘ１がＶＬであるとき、Ｘ２はＶＨであり、あるいは、Ｘ１がＶＨであるとき、Ｘ２はＶＬであり；
「Ｚ」が、ＩＬ－６、ＩＬ－４、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－５、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、ＩＬ－２６、ＩＬ－２８、ＩＬ－２９、ＧＭ－ＣＳＦ、Ｇ－ＣＳＦ、インターフェロン－α、－β、－γ、ＴＧＦ－β、または腫瘍壊死因子－α、－β、塩基性ＦＧＦ、ＥＧＦ、ＰＤＧＦ、ＩＬ－４、ＩＬ－１１、またはＩＬ－１３から選択されるサイトカインであり；
「ｎ」が０～２から選択される整数である）を有する構造である。
【0064】
別の実施形態では、ＶＨ領域およびＶＬ領域は、抗体、その抗体断片、または抗原結合断片に由来する。抗原結合断片は、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｖ－ＮＡＲ、ダイアボディ、またはナノボディを含むが、これらに限定されない。好ましくは、ＶＨおよびＶＬは、単鎖可変断片（「ｓｃＦｖ」）に由来する。
【0065】
別の実施形態では、第１のマルチサブユニットサイトカイン（例えば、ＩＬ－１２またはＩＬ－２７）を含む二重サイトカイン融合タンパク質は、単一の抗体由来のＶＨとＶＬの対を含む。ＶＨとＶＬの対は、マルチサブユニットサイトカインのアルファおよびベータサブユニットが機能的なサイトカインにヘテロ二量体化することが可能であり得るように第１のマルチサブユニットサイトカインが付着され得る足場として作用する。したがって、当業者は、融合タンパク質中で使用されるＶＨおよびＶＬの足場を、第１のマルチサブユニットサイトカイン（例えば、ＩＬ－１２またはＩＬ－２７）の適切なヘテロ二量体化に必要な望ましい物理的性質および／またはＶＨおよびＶＬのターゲティング能力の維持の要望に基づいて選択され得ることを認識するであろう。同様に、当業者はまた、ＶＨとＶＬの対内の６つのＣＤＲ（ＶＨ由来の３つのＣＤＲおよびＶＬ由来の３つのＣＤＲ）を他の抗体由来の６つのＣＤＲと置換して、特異的に標的化された融合タンパク質を得ることもできると理解するであろう。１つの実施形態では、任意のモノクローナル抗体のＶＨ由来の３つのＣＤＲおよびＶＬ由来の３つのＣＤＲ（すなわち、ＶＨとＶＬの対）を、足場系にグラフティングし得る。融合タンパク質がいかなる特異的抗原も標的にすることを意図しない場合、ＶＨとＶＬの対を、いかなる特定の抗原（またはｉｎ ｖｉｖｏでの存在量が少ない抗原である）も標的にしない足場として選択し得ることも想起される（ヒト抗ＨＩＶおよび／またはヒト抗エボラ抗体由来のＶＨとＶＬの対など）。融合タンパク質は、１～４個の範囲の可変領域を含み得る。別の実施形態では、可変領域は、同一の抗体または少なくとも２つの異なる抗体に由来し得る。マルチサブユニットサイトカインをコードするアミノ酸配列は、シグナルペプチド（またはリーダー配列）を持たないｓｃＦｖ足場に融合されているであろう。
【0066】
さらに別の態様では、二重サイトカイン融合タンパク質は、２つのマルチサブユニットタンパク質を含み得る。例えば、二重サイトカイン融合タンパク質は、ヘテロ二量体（ＩＬ１２またはＩＬ２７などであるが、これらに限定されない）である第１のサイトカイン、および次に第２のホモ二量体サイトカイン（ＩＬ１０などであるが、これらに限定されない）を含み得る。第２のホモ二量体サイトカインを、ＶＨ領域とＶＬ領域との間に融合することができるであろう。２つのマルチサブユニット二重サイトカイン融合タンパク質の代表的な画像を、図７および８に提供する。したがって、本発明の１つの実施形態では、前述の融合タンパク質は、式（ＩＶ）の一般式：
ＮＨ２－（Ｒ１）－（Ｌａ）－（Ｘ１）－（Ｌｂ）－（Ｗ１）－（Ｌｃ）－（Ｗ２）－（Ｌｂ）－（Ｘ２）－（Ｌａ）－（Ｒ２）－ＣＯＯＨ（式ＩＶ）
（式中、
「Ｒ１」が、第１のサイトカイン（ＩＬ－１２またはＩＬ－２７など）のアルファサブユニットまたはホモ二量体サイトカイン（ＩＬ－１０など）の第１の単量体、好ましくは（ｐ４０）であり；
「Ｒ２」が、第１のサイトカイン（ＩＬ－１２またはＩＬ－２７など）のベータアルファサブユニットまたはホモ二量体サイトカイン（ＩＬ－１０など）の第２の単量体、好ましくはｐ３５であり；
「Ｌａ」が任意のリンカー；好ましくは、配列番号４６の（ＧＧＧＧＳ）３、配列番号４５の（ＧＧＧＧＳ）４、または配列番号４４の（ＧＧＧＧＳ）５であり；
「Ｌｂ」が任意のリンカー；好ましくは、配列番号４６の（ＧＧＧＧＳ）３、配列番号４５の（ＧＧＧＧＳ）４、または配列番号４４の（ＧＧＧＧＳ）５であり；
「Ｌｃ」が任意のリンカー；好ましくは、配列番号４３のＧＧＧＳＧＧＧまたは配列番号４６の（ＧＧＧＧＳ）３であり、；
Ｘ１」が、第１のモノクローナル抗体から得たＶＬ領域またはＶＨ領域であり；「Ｘ２」が、前述の第１のモノクローナル抗体から得たＶＨ領域またはＶＬ領域であり；ここで、Ｘ１がＶＬであるとき、Ｘ２はＶＨであり、あるいは、Ｘ１がＶＨであるとき、Ｘ２はＶＬであり；
「Ｗ１」が、第１のサイトカイン（ＩＬ－１２またはＩＬ－２７など）のアルファサブユニットまたはホモ二量体サイトカイン（ＩＬ－１０など）の第１の単量体、好ましくは、配列番号３１、３３、３５、３７、３９、または４１のＩＬ－１０の第１の単量体であり；
「Ｗ２」が、第１のサイトカイン（ＩＬ－１２またはＩＬ－２７など）のベータアルファサブユニットまたはホモ二量体サイトカイン（ＩＬ－１０など）の第２の単量体、好ましくは、配列番号３１、３３、３５、３７、３９、または４１のＩＬ－１０の第２の単量体である）を有するであろう。
１つの実施形態では、ＶＨおよびＶＬは、ヒト抗エボラ抗体から得たｓｃＦｖの形態である。別の実施形態では、ヒト抗エボラ抗体から得たｓｃＦｖの６つのＣＤＲ（ＶＨ由来のＣＤＲ１～３およびＶＬ由来のＣＤＲ１～３）は、二重サイトカイン融合タンパク質が特異的標的（酵素、受容体、細胞外タンパク質、または細胞内タンパク質、例えば、腫瘍（例えば、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ））、炎症応答、または自己免疫疾患に関連するものなどであるが、これらに限定されない）に指向するのを可能にする第２のモノクローナル抗体由来の６つのＣＤＲを用いて置換またはグラフティングされている。第２の抗体は、ＥＧＦＲ；ＣＤ１４；ＣＤ５２；多様な免疫チェックポイント標的（ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－１、ＴＩＭ３、ＢＴＬＡ、ＬＡＧ３、またはＣＴＬＡ４などであるが、これらに限定されない）；ＣＤ１９；ＣＤ２０；ＣＤ２２；ＣＤ４７；ＣＤ１２３；ＧＤ－２；ＶＥＧＦＲ１；ＶＥＧＦＲ２；ＨＥＲ２；ＰＤＧＦＲ；ＥｐＣＡＭ；ＩＣＡＭ（ＩＣＡＭ－１、－２、－３、－４、－５）、ＶＣＡＭ、ＦＡＰα；５Ｔ４；Ｔｒｏｐ２；ＥＤＢ－ＦＮ；ＴＧＦβ Ｔｒａｐ；ＭＡｄＣＡＭ、β７インテグリンサブユニット；α４β７インテグリン；α４インテグリン；ＢＣＭＡ；ＰＳＡ；ＰＳＭＡ；ＣＥＡ；ＧＰＣ３；ＳＲ－Ａ１；ＳＲ－Ａ３；ＳＲ－Ａ４；ＳＲ－Ａ５；ＳＲ－Ａ６；ＳＲ－Ｂ；ｄＳＲ－Ｃ１；ＳＲ－Ｄ１；ＳＲ－Ｅ１；ＳＲ－Ｆ１；ＳＲ－Ｆ２；ＳＲ－Ｇ；ＳＲ－Ｈ１；ＳＲ－Ｈ２；ＳＲ－Ｉ１；またはＳＲ－Ｊ１を含み得るが、これらに限定されない。より好ましい実施形態では、２つのマルチサブユニットタンパク質を含む二重サイトカイン融合タンパク質は、式ＶａまたはＶｂ：
ＮＨ２－（Ｐ３５）－（Ｌａ）－（Ｘ１）－（Ｌｂ）－（ＩＬ１０単量体）－（Ｌｃ）－（ＩＬ１０単量体）－（Ｌｂ）－（Ｘ２）－（Ｌａ）－（Ｐ４０）－ＣＯＯＨ（式Ｖａ）；
ＮＨ２－（Ｐ４０）－（Ｌａ）－（Ｘ１）－（Ｌａ）－（ＩＬ１０単量体）－（Ｌｃ）－（ＩＬ１０単量体）－（Ｌｂ）－（Ｘ２）－（Ｌａ）－（Ｐ３５）－ＣＯＯＨ（式Ｖｂ）；
（式中、
「ｐ３５」が、配列番号１、１７、１９の配列を有するＩＬ－１２のアルファサブユニットであり；
「ｐ４０」が、配列番号３、１８、２０の配列を有するＩＬ－１２のベータアルファサブユニットであり；
「Ｌａ」が任意のリンカー；好ましくは、配列番号４６の（ＧＧＧＧＳ）３、配列番号４５の（ＧＧＧＧＳ）４、または配列番号４４の（ＧＧＧＧＳ）５であり；
「Ｌｂ」が任意のリンカー；好ましくは、配列番号４６の（ＧＧＧＧＳ）３、配列番号４５の（ＧＧＧＧＳ）４、または配列番号４４の（ＧＧＧＧＳ）５であり；
「Ｌｃ」が任意のリンカー；好ましくは、配列番号４３のＧＧＧＳＧＧＧまたは配列番号４６の（ＧＧＧＧＳ）３であり、
Ｘ１」が、第１のモノクローナル抗体から得たＶＬ領域またはＶＨ領域であり；「Ｘ２」が、前述の第１のモノクローナル抗体から得たＶＨ領域またはＶＬ領域であり；ここで、Ｘ１がＶＬであるとき、Ｘ２はＶＨであり、あるいは、Ｘ１がＶＨであるとき、Ｘ２はＶＬであり；
「ＩＬ１０単量体」が、配列番号３１、３３、３５、３７、３９、または４１、好ましくは、配列番号４１の配列を有するＩＬ－１０の単量体である）によって表される。
第１のモノクローナル抗体は、抗エボラ抗体（米国特許出願公開第２０１８／０１８０６１４号（その全体が参考として援用される）、特に、表２、３、および４に記載のｍＡｂ）であり、前述の抗体は、ＥＧＦＲ；ＣＤ１４；ＣＤ５２；多様な免疫チェックポイント標的（ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－１、ＴＩＭ３、ＢＴＬＡ、ＬＡＧ３、またはＣＴＬＡ４などであるが、これらに限定されない）；ＣＤ１９；ＣＤ２０；ＣＤ２２；ＣＤ４７；ＣＤ１２３；ＧＤ－２；ＶＥＧＦＲ１；ＶＥＧＦＲ２；ＨＥＲ２；ＰＤＧＦＲ；ＥｐＣＡＭ；ＩＣＡＭ（ＩＣＡＭ－１、－２、－３、－４、－５）、ＶＣＡＭ、ＦＡＰα；５Ｔ４；Ｔｒｏｐ２；ＥＤＢ－ＦＮ；ＴＧＦβ Ｔｒａｐ；ＭＡｄＣＡＭ、β７インテグリンサブユニット；α４β７インテグリン；α４インテグリン；ＢＣＭＡ；ＰＳＡ；ＰＳＭＡ；ＣＥＡ；ＧＰＣ３；ＳＲ－Ａ１；ＳＲ－Ａ３；ＳＲ－Ａ４；ＳＲ－Ａ５；ＳＲ－Ａ６；ＳＲ－Ｂ；ｄＳＲ－Ｃ１；ＳＲ－Ｄ１；ＳＲ－Ｅ１；ＳＲ－Ｆ１；ＳＲ－Ｆ２；ＳＲ－Ｇ；ＳＲ－Ｈ１；ＳＲ－Ｈ２；ＳＲ－Ｉ１；またはＳＲ－Ｊ１のうちのいずれか１つに特異性を有する第２の抗体由来の６つのＣＤＲを用いてグラフティングされ得る。
表２ａ～２ｄは、式ＩＶによって表されたＩＬ－１２およびＩＬ－１０を含む二重サイトカイン融合タンパク質の異なる組み合わせである。
ＩＬ－１２サブユニット（Ｐ４０およびＰ３５）を、上の表２ａ～２ｄに記述のように、野生型、脱グリコシル化形態、またはアグリコシル化形態のＩＬ－１２から選択し得る。さらに、ＩＬ－１２は、ヒトＩＬ－１２もしくはマウスＩＬ－１２、または野生型ＩＬ－１２と比較したときにＩＬ－１２の機能を保持するか、増強するか、減少させるＩＬ－１２の任意のバリアントに由来し得る。上の表２ａ～２ｄに列挙したＩＬ－１０単量体は、ヒトＩＬ－１０、ＥＢＶ ＩＬ－１０、ＣＭＶ ＩＬ－１０、高親和性バリアント形態のＩＬ－１０（ＤＶ０７、配列番号４１など）、または低親和性バリアント形態のＩＬ－１０（ＤＶ０６、配列番号３９など）から選択され得る。さらに、ＩＬ－１０単量体は、野生型ＩＬ－１０と比較したときにＩＬ－１０の機能を保持するか、増強するか、減少させるＩＬ－１０の任意のバリアントであり得る。
ＮＨ２－（Ｒ１）－（Ｌａ）－（Ｘ１）－（Ｌｂ）－（Ｗ１）－（Ｌｃ）－（Ｗ２）－（Ｌｂ）－（Ｘ２）－（Ｌａ）－（Ｒ２）－ＣＯＯＨ（式ＩＶ）
（式中、
「Ｒ１」が、第１のサイトカイン（ＩＬ－１２またはＩＬ－２７など）のアルファサブユニットまたはホモ二量体サイトカイン（ＩＬ－１０など）の第１の単量体、好ましくは（ｐ４０）であり；
「Ｒ２」が、第１のサイトカイン（ＩＬ－１２またはＩＬ－２７など）のベータアルファサブユニットまたはホモ二量体サイトカイン（ＩＬ－１０など）の第２の単量体、好ましくはｐ３５であり；
「Ｌａ」が任意のリンカー；好ましくは、配列番号４６の（ＧＧＧＧＳ）３、配列番号４５の（ＧＧＧＧＳ）４、または配列番号４４の（ＧＧＧＧＳ）５であり；
「Ｌｂ」が任意のリンカー；好ましくは、配列番号４６の（ＧＧＧＧＳ）３、配列番号４５の（ＧＧＧＧＳ）４、または配列番号４４の（ＧＧＧＧＳ）５であり；
「Ｌｃ」が任意のリンカー；好ましくは、配列番号４３のＧＧＧＳＧＧＧまたは配列番号４６の（ＧＧＧＧＳ）３であり、；
Ｘ１」が、第１のモノクローナル抗体から得たＶＬ領域またはＶＨ領域であり；「Ｘ２」が、前述の第１のモノクローナル抗体から得たＶＨ領域またはＶＬ領域であり；ここで、Ｘ１がＶＬであるとき、Ｘ２はＶＨであり、あるいは、Ｘ１がＶＨであるとき、Ｘ２はＶＬであり；
「Ｗ１」が、第１のサイトカイン（ＩＬ－１２またはＩＬ－２７など）のアルファサブユニットまたはホモ二量体サイトカイン（ＩＬ－１０など）の第１の単量体、好ましくは、配列番号３１、３３、３５、３７、３９、または４１のＩＬ－１０の第１の単量体であり；
「Ｗ２」が、第１のサイトカイン（ＩＬ－１２またはＩＬ－２７など）のベータアルファサブユニットまたはホモ二量体サイトカイン（ＩＬ－１０など）の第２の単量体、好ましくは、配列番号３１、３３、３５、３７、３９、または４１のＩＬ－１０の第２の単量体である）を有するであろう。
１つの実施形態では、ＶＨおよびＶＬは、ヒト抗エボラ抗体から得たｓｃＦｖの形態である。別の実施形態では、ヒト抗エボラ抗体から得たｓｃＦｖの６つのＣＤＲ（ＶＨ由来のＣＤＲ１～３およびＶＬ由来のＣＤＲ１～３）は、二重サイトカイン融合タンパク質が特異的標的（酵素、受容体、細胞外タンパク質、または細胞内タンパク質、例えば、腫瘍（例えば、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ））、炎症応答、または自己免疫疾患に関連するものなどであるが、これらに限定されない）に指向するのを可能にする第２のモノクローナル抗体由来の６つのＣＤＲを用いて置換またはグラフティングされている。第２の抗体は、ＥＧＦＲ；ＣＤ１４；ＣＤ５２；多様な免疫チェックポイント標的（ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－１、ＴＩＭ３、ＢＴＬＡ、ＬＡＧ３、またはＣＴＬＡ４などであるが、これらに限定されない）；ＣＤ１９；ＣＤ２０；ＣＤ２２；ＣＤ４７；ＣＤ１２３；ＧＤ－２；ＶＥＧＦＲ１；ＶＥＧＦＲ２；ＨＥＲ２；ＰＤＧＦＲ；ＥｐＣＡＭ；ＩＣＡＭ（ＩＣＡＭ－１、－２、－３、－４、－５）、ＶＣＡＭ、ＦＡＰα；５Ｔ４；Ｔｒｏｐ２；ＥＤＢ－ＦＮ；ＴＧＦβ Ｔｒａｐ；ＭＡｄＣＡＭ、β７インテグリンサブユニット；α４β７インテグリン；α４インテグリン；ＢＣＭＡ；ＰＳＡ；ＰＳＭＡ；ＣＥＡ；ＧＰＣ３；ＳＲ－Ａ１；ＳＲ－Ａ３；ＳＲ－Ａ４；ＳＲ－Ａ５；ＳＲ－Ａ６；ＳＲ－Ｂ；ｄＳＲ－Ｃ１；ＳＲ－Ｄ１；ＳＲ－Ｅ１；ＳＲ－Ｆ１；ＳＲ－Ｆ２；ＳＲ－Ｇ；ＳＲ－Ｈ１；ＳＲ－Ｈ２；ＳＲ－Ｉ１；またはＳＲ－Ｊ１を含み得るが、これらに限定されない。より好ましい実施形態では、２つのマルチサブユニットタンパク質を含む二重サイトカイン融合タンパク質は、式ＶａまたはＶｂ：
ＮＨ２－（Ｐ３５）－（Ｌａ）－（Ｘ１）－（Ｌｂ）－（ＩＬ１０単量体）－（Ｌｃ）－（ＩＬ１０単量体）－（Ｌｂ）－（Ｘ２）－（Ｌａ）－（Ｐ４０）－ＣＯＯＨ（式Ｖａ）；
ＮＨ２－（Ｐ４０）－（Ｌａ）－（Ｘ１）－（Ｌａ）－（ＩＬ１０単量体）－（Ｌｃ）－（ＩＬ１０単量体）－（Ｌｂ）－（Ｘ２）－（Ｌａ）－（Ｐ３５）－ＣＯＯＨ（式Ｖｂ）；
（式中、
「ｐ３５」が、配列番号１、１７、１９の配列を有するＩＬ－１２のアルファサブユニットであり；
「ｐ４０」が、配列番号３、１８、２０の配列を有するＩＬ－１２のベータアルファサブユニットであり；
「Ｌａ」が任意のリンカー；好ましくは、配列番号４６の（ＧＧＧＧＳ）３、配列番号４５の（ＧＧＧＧＳ）４、または配列番号４４の（ＧＧＧＧＳ）５であり；
「Ｌｂ」が任意のリンカー；好ましくは、配列番号４６の（ＧＧＧＧＳ）３、配列番号４５の（ＧＧＧＧＳ）４、または配列番号４４の（ＧＧＧＧＳ）５であり；
「Ｌｃ」が任意のリンカー；好ましくは、配列番号４３のＧＧＧＳＧＧＧまたは配列番号４６の（ＧＧＧＧＳ）３であり、
Ｘ１」が、第１のモノクローナル抗体から得たＶＬ領域またはＶＨ領域であり；「Ｘ２」が、前述の第１のモノクローナル抗体から得たＶＨ領域またはＶＬ領域であり；ここで、Ｘ１がＶＬであるとき、Ｘ２はＶＨであり、あるいは、Ｘ１がＶＨであるとき、Ｘ２はＶＬであり；
「ＩＬ１０単量体」が、配列番号３１、３３、３５、３７、３９、または４１、好ましくは、配列番号４１の配列を有するＩＬ－１０の単量体である）によって表される。
第１のモノクローナル抗体は、抗エボラ抗体（米国特許出願公開第２０１８／０１８０６１４号（その全体が参考として援用される）、特に、表２、３、および４に記載のｍＡｂ）であり、前述の抗体は、ＥＧＦＲ；ＣＤ１４；ＣＤ５２；多様な免疫チェックポイント標的（ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－１、ＴＩＭ３、ＢＴＬＡ、ＬＡＧ３、またはＣＴＬＡ４などであるが、これらに限定されない）；ＣＤ１９；ＣＤ２０；ＣＤ２２；ＣＤ４７；ＣＤ１２３；ＧＤ－２；ＶＥＧＦＲ１；ＶＥＧＦＲ２；ＨＥＲ２；ＰＤＧＦＲ；ＥｐＣＡＭ；ＩＣＡＭ（ＩＣＡＭ－１、－２、－３、－４、－５）、ＶＣＡＭ、ＦＡＰα；５Ｔ４；Ｔｒｏｐ２；ＥＤＢ－ＦＮ；ＴＧＦβ Ｔｒａｐ；ＭＡｄＣＡＭ、β７インテグリンサブユニット；α４β７インテグリン；α４インテグリン；ＢＣＭＡ；ＰＳＡ；ＰＳＭＡ；ＣＥＡ；ＧＰＣ３；ＳＲ－Ａ１；ＳＲ－Ａ３；ＳＲ－Ａ４；ＳＲ－Ａ５；ＳＲ－Ａ６；ＳＲ－Ｂ；ｄＳＲ－Ｃ１；ＳＲ－Ｄ１；ＳＲ－Ｅ１；ＳＲ－Ｆ１；ＳＲ－Ｆ２；ＳＲ－Ｇ；ＳＲ－Ｈ１；ＳＲ－Ｈ２；ＳＲ－Ｉ１；またはＳＲ－Ｊ１のうちのいずれか１つに特異性を有する第２の抗体由来の６つのＣＤＲを用いてグラフティングされ得る。
表２ａ～２ｄは、式ＩＶによって表されたＩＬ－１２およびＩＬ－１０を含む二重サイトカイン融合タンパク質の異なる組み合わせである。
【表2a-1】
【表2a-2】
【表2a-3】
【表2b】
【表2c-1】
【表2c-2】
【表2d-1】
【表2d-2】
【0067】
別の１つの実施形態では、表３ａ～３ｄは、式ＩＶによって表されたＩＬ－２７およびＩＬ－１０を含む二重サイトカイン融合タンパク質の異なる組み合わせである。
【表3a-1】
【表3a-2】
【表3b】
【表3c-d】
【0068】
ＩＬ－２７サブユニット（Ｐ２８およびＥＢＩ３）を、上の表３ａ～３ｄに記述のように、野生型、脱グリコシル化形態、またはアグリコシル化形態のＩＬ－２７から選択し得る。さらに、ＩＬ－２７は、ヒトＩＬ－２７もしくはマウスＩＬ－２７、または野生型ＩＬ－２７と比較したときにＩＬ－２７の機能を保持するか、増強するか、減少させるＩＬ－２７の任意のバリアントに由来し得る。上の表２ａ～２ｄに列挙したＩＬ－１０単量体は、ヒトＩＬ－１０、ＥＢＶ ＩＬ－１０、ＣＭＶ ＩＬ－１０、高親和性バリアント形態のＩＬ－１０（ＤＶ０７、配列番号４１など）、または低親和性バリアント形態のＩＬ－１０（ＤＶ０６、配列番号３９など）から選択され得る。さらに、ＩＬ－１０単量体は、野生型ＩＬ－１０と比較したときにＩＬ－１０の機能を保持するか、増強するか、減少させるＩＬ－１０の任意のバリアントであり得る。
【0069】
別の実施形態では、抗体可変鎖またはＶＨとＶＬの対またはＶＨとＶＬの対の６つのＣＤＲの標的特異性は、タンパク質、細胞受容体、および／または腫瘍関連抗原を標的にするものを含み得るが、これらに限定されない。別の実施形態では、任意のＶＨとＶＬの対由来のＣＤＲ領域を、上記の二重サイトカイン足場系にグラフティングし得る（図１～５によって図示）。さらに別の実施形態では、可変領域またはＶＨとＶＬの対またはＶＨとＶＬの対の６つのＣＤＲは、多様な疾患（例えば、癌）に関連する抗原または健常被験体の血清中に典型的に見出されないか、見出されるのが稀である抗原を標的にする抗体から得られる（例えば、ＥＧＦＲ、ＰＤＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、Ｈｅｒ２Ｎｅｕ、ＦＧＦＲ、ＧＰＣ３、もしくは他の腫瘍関連抗原、ＭＡｄＣＡＭ、ＩＣＡＭ、ＶＣＡＭ、ＣＤ１４、もしくは他の炎症関連細胞表面タンパク質、ＨＩＶ、および／またはエボラに指向する抗体由来の可変領域）。したがって、１つの実施形態では、可変領域は、例えば、抗ＥＧＦＲ抗体、抗ＭＡｄＣＡＭ抗体、抗ＨＩＶ抗体（Ｃｈａｎ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，２０１８，９２（１８）：ｅ００６４１１－１９）、抗ＩＣＡＭ抗体、抗ＶＣＡＭ抗体、抗ＣＤ１４抗体、または抗エボラ抗体（米国特許出願公開第２０１８／０１８０６１４号（その全体が参考として援用される）、特に、表２、３、および４に記載のｍＡｂ）から得られるか、由来する。別の実施形態では、可変領域は、ＩＬ－１２およびＩＬ－２７がその生物学的効果をより有効に誘発することができるように、特異的標的領域にサイトカイン（ＩＦＮ－アルファ、ＩＬ－２８、またはＩＬ－２９と組み合わせたＩＬ－１２またはＩＬ－２７など）の濃度を増加させることができる抗体から得られるか、由来する。かかる抗体は、ある特定の罹患領域中の過剰発現された、または上方制御された受容体もしくは抗原を標的にする抗体またはある特定の影響を受けた領域中に特異的に発現された抗体を含み得る。例えば、可変領域またはＣＤＲは、ＥＧＦＲ；ＣＤ１４；ＣＤ５２；多様な免疫チェックポイント標的（ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－１、ＴＩＭ３、ＢＴＬＡ、ＬＡＧ３、またはＣＴＬＡ４などであるが、これらに限定されない）；ＣＤ１９；ＣＤ２０；ＣＤ２２；ＣＤ４７；ＣＤ１２３；ＧＤ－２；ＶＥＧＦＲ１；ＶＥＧＦＲ２；ＨＥＲ２；ＰＤＧＦＲ；ＥｐＣＡＭ；ＩＣＡＭ（ＩＣＡＭ－１、－２、－３、－４、－５）、ＶＣＡＭ、ＦＡＰα；５Ｔ４；Ｔｒｏｐ２；ＥＤＢ－ＦＮ；ＴＧＦβ Ｔｒａｐ；ＭＡｄＣＡＭ、β７インテグリンサブユニット；α４β７インテグリン；α４インテグリン；ＢＣＭＡ；ＰＳＡ；ＰＳＭＡ；ＣＥＡ；ＧＰＣ３；ＳＲ－Ａ１；ＳＲ－Ａ３；ＳＲ－Ａ４；ＳＲ－Ａ５；ＳＲ－Ａ６；ＳＲ－Ｂ；ｄＳＲ－Ｃ１；ＳＲ－Ｄ１；ＳＲ－Ｅ１；ＳＲ－Ｆ１；ＳＲ－Ｆ２；ＳＲ－Ｇ；ＳＲ－Ｈ１；ＳＲ－Ｈ２；ＳＲ－Ｉ１；またはＳＲ－Ｊ１などに特異的な抗体から得てよい。
【0070】
また、二重サイトカイン融合タンパク質または二重サイトカイン融合タンパク質複合体は、抗原標的機能性を有し得る。二重サイトカイン融合タンパク質または二重サイトカイン融合タンパク質複合体は、共に会合して抗原結合部位またはＡＢＳを形成することができるＶＨとＶＬの対を含むであろう。可変領域は、（例えば、付加、引き抜き、または置換による）被験体における抗原性を低下させる１またはそれを超えるアミノ酸の変更によってさらに修飾され得る。可変領域に対する他の修飾は、ＶＨ領域およびＶＬ領域の６つのＣＤＲ領域の外側に見出され、ｓｃＦｖのＶＨ領域およびＶＬ領域の安定性および発現を増大させるのに役立つアミノ酸の置換、欠失、または付加を含み得る。当業者は、ｓｃＦｖを安定化させ、そして／あるいは発現を目的とする配列を最適にする他の修飾を決定することができるであろう。
【0071】
ＶＨおよびＶＬ対は、足場を形成し、足場上に複数の抗体について得たＣＤＲ領域を置換またはグラフティングし得る。かかる抗体ＣＤＲ領域は、公知かつ上記の抗体ＣＤＲ領域を含む。上記のＶＨおよびＶＬ足場中のＣＤＲ領域は、ＣＤＲエングラフトメント／挿入に利用可能な以下の数のアミノ酸位置を含むであろう：
好ましい実施形態では、第１のマルチサブユニットサイトカイン（例えば、ＩＬ－１２またはＩＬ－２７）を含む二重サイトカイン融合タンパク質は、ヒト抗エボラ抗体（米国特許出願公開第２０１８／０１８０６１４号（その全体が参考として援用される）、特に、表２、３、および４に記載のｍＡｂ）由来のＶＨとＶＬの対を含むであろう。そのため、前述のヒト抗エボラ抗体由来の６つのＣＤＲ領域が除去され、特異的ターゲティング抗体（ＥＧＦＲ；ＣＤ１４；ＣＤ５２；多様な免疫チェックポイント標的（ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－１、ＴＩＭ３、ＢＴＬＡ、ＬＡＧ３、またはＣＴＬＡ４などであるが、これらに限定されない）；ＣＤ１９；ＣＤ２０；ＣＤ２２；ＣＤ４７；ＣＤ１２３；ＧＤ－２；ＶＥＧＦＲ１；ＶＥＧＦＲ２；ＨＥＲ２；ＰＤＧＦＲ；ＥｐＣＡＭ；ＩＣＡＭ（ＩＣＡＭ－１、－２、－３、－４、－５）、ＶＣＡＭ、ＦＡＰα；５Ｔ４；Ｔｒｏｐ２；ＥＤＢ－ＦＮ；ＴＧＦβ Ｔｒａｐ；ＭＡｄＣＡＭ、β７インテグリンサブユニット；α４β７インテグリン；α４インテグリン；ＢＣＭＡ；ＰＳＡ；ＰＳＭＡ；ＣＥＡ；ＧＰＣ３；ＳＲ－Ａ１；ＳＲ－Ａ３；ＳＲ－Ａ４；ＳＲ－Ａ５；ＳＲ－Ａ６；ＳＲ－Ｂ；ｄＳＲ－Ｃ１；ＳＲ－Ｄ１；ＳＲ－Ｅ１；ＳＲ－Ｆ１；ＳＲ－Ｆ２；ＳＲ－Ｇ；ＳＲ－Ｈ１；ＳＲ－Ｈ２；ＳＲ－Ｉ１；またはＳＲ－Ｊ１を標的にする抗体などであるが、これらに限定されない）のＶＨとＶＬの対を用いてグラフティングされている。一実施形態では、６つのヒト抗エボラＣＤＲ領域は、抗ＥＧＦＲ、抗ＭＡｄＣＡＭ、抗ＶＥＧＦＲ１、抗ＶＥＧＦＲ２、抗ＰＤＧＦＲ、または抗ＣＤ１４由来の６つのＣＤＲ領域で置換されている。好ましい実施形態では、第２のサイトカイン（ＩＬ－２８、ＩＬ－２９、ＩＦＮαなどであるが、これらに限定されない）は、ヒト抗エボラ抗体から得たｓｃＦｖのＶＨとＶＬとの間のヒンジ領域中で連結されている。また、前述のエングラフトメントストラテジーを、上記に列挙した式ＩＶおよびＶａおよびＶｂによって表した２つのマルチサブユニットサイトカインを含む二重サイトカイン融合タンパク質に適用し得る。
【表A】
【0072】
さらに別の実施形態では、図１～５に示すように、第２のサイトカインは、ｓｃＦｖのＶＨとＶＬとの間に融合されている。第２のサイトカインは、第２のサイトカインがその機能性を保持するように、ＶＨ領域またはＶＬ領域の間に抱合されている。１つの実施形態では、第２のサイトカインは、第１のマルチサブユニットサイトカイン（例えば、ＩＬ－１２またはＩＬ－２７）と異なる。１つの実施形態では、第２のサイトカインは、ＩＬ－６、ＩＬ－４、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－５、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、ＩＬ－２６、ＩＬ－２７、ＩＬ－２８、ＩＬ－２９、ＧＭ－ＣＳＦ、Ｇ－ＣＳＦ、インターフェロン－α、－β、－γ、ＴＧＦ－β、または腫瘍壊死因子－α、－β、塩基性ＦＧＦ、ＥＧＦ、ＰＤＧＦ、ＩＬ－４、ＩＬ－１１、またはＩＬ－１３である。好ましい実施形態では、二重サイトカイン融合タンパク質中の第２のサイトカインは、ＩＬ－２８、ＩＬ－２９、またはＩＦＮ－アルファを含む。
【0073】
いくつかの実施形態では、第２のサイトカインは、別のマルチサブユニットサイトカイン（ＩＬ－１０など）であり得る。この場合、第２のサイトカインはまた、足場系のＶＨとＶＬとの間に融合されるであろう（代表的な構造については、図７および８を参照のこと）。上記の式ＩＶ、Ｖａ、およびＶｂは、これらのタイプの融合タンパク質を説明するのに役立つ。
さらなる他の実施形態では、第１のマルチサブユニットサイトカイン（例えば、ＩＬ－１２またはＩＬ－２７）を含む二重サイトカイン融合タンパク質は、リンカーを組み込んでいる。当業者は、様々な融合タンパク質部分の配座を空間的に適切にするためにリンカーまたはスペーサーを使用することを承知しており、それ故、第１のマルチサブユニットサイトカイン（例えば、ＩＬ－１２またはＩＬ－２７）を含む二重サイトカイン融合タンパク質の形成での使用に適切なリンカーを選択し得る。より好ましい実施形態では、リンカーまたはスペーサーは、配列番号４３、４４、４５、４６、４７、および４８の無作為なアミノ酸配列であり得る。表２ａ～２ｄまたは３ａ～３ｄ中の上記組み合わせのうちのいずれかを、配列番号４６、４５、および４７をそれぞれ有する（ＧＧＧＧＳ）３、（ＧＧＧＧＳ）４、または（ＧＧＧＧＳ）５から選択されるリンカー（「Ｌａ」）および「（Ｌｂ」）、ならびに配列番号４３および４６にそれぞれ対応するＧＧＧＳＧＧＧまたは（ＧＧＧＧＳ）３のリンカー（「Ｌｃ」）と組み合わせ得る。１つの好ましい実施形態では、式ＩＶは、以下の表４の通りのリンカーの組み合わせを含み得る。
さらに別の好ましい実施形態では、式ＩＶは、以下の表４の通りの好ましいリンカーの組み合わせを含み得る
さらなる他の実施形態では、第１のマルチサブユニットサイトカイン（例えば、ＩＬ－１２またはＩＬ－２７）を含む二重サイトカイン融合タンパク質は、リンカーを組み込んでいる。当業者は、様々な融合タンパク質部分の配座を空間的に適切にするためにリンカーまたはスペーサーを使用することを承知しており、それ故、第１のマルチサブユニットサイトカイン（例えば、ＩＬ－１２またはＩＬ－２７）を含む二重サイトカイン融合タンパク質の形成での使用に適切なリンカーを選択し得る。より好ましい実施形態では、リンカーまたはスペーサーは、配列番号４３、４４、４５、４６、４７、および４８の無作為なアミノ酸配列であり得る。表２ａ～２ｄまたは３ａ～３ｄ中の上記組み合わせのうちのいずれかを、配列番号４６、４５、および４７をそれぞれ有する（ＧＧＧＧＳ）３、（ＧＧＧＧＳ）４、または（ＧＧＧＧＳ）５から選択されるリンカー（「Ｌａ」）および「（Ｌｂ」）、ならびに配列番号４３および４６にそれぞれ対応するＧＧＧＳＧＧＧまたは（ＧＧＧＧＳ）３のリンカー（「Ｌｃ」）と組み合わせ得る。１つの好ましい実施形態では、式ＩＶは、以下の表４の通りのリンカーの組み合わせを含み得る。
【表4-1】
【表4-2】
【表4-3】
【表4-4】
【表5-1】
【0074】
２つのマルチサブユニットサイトカインを含む好ましい二重サイトカイン融合タンパク質は、配列番号２１～３０に列挙したものを含む。
【0075】
他の態様では、本開示は、第１のマルチサブユニットサイトカイン（例えば、ＩＬ－１２またはＩＬ－２７）および第２のサイトカインを含む二重サイトカイン融合タンパク質をコードする核酸分子に関する。これらは、式Ｉａ、Ｉｂ、ＩＩａ、ＩＩｂ、ＩＩＩａ、ＩＩＩｂ、ＶＩ、Ｖａ、またはＶｂによって表した二重サイトカイン融合タンパク質をコードする核酸配列を含むであろう。したがって、１つの実施形態は、７０％～９９％の配列相同性を共有するタンパク質をコードする核酸配列を含む。また、第１のマルチサブユニットサイトカイン（例えば、ＩＬ－１２またはＩＬ－２７）および第２のサイトカイン（例えば、ＩＬ－１０、ＩＦＮ－アルファ、ＩＬ－２８、ＩＬ－２９）を含む二重サイトカイン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列は、記載の二重サイトカイン融合タンパク質の機能特性を変化させない修飾を含み得る。かかる修飾は、従来の組換えＤＮＡ技術および方法を使用するであろう。例えば、特異的アミノ酸配列の付加または置換を、合成オリゴヌクレオチドを使用した部位特異的変異誘発法（この方法も当該分野で周知である）を使用して、核酸（ＤＮＡ）レベルで第１のマルチサブユニットサイトカイン（例えば、ＩＬ－１２またはＩＬ－２７）配列に導入し得る。好ましい実施形態では、二重サイトカイン融合タンパク質をコードする核酸分子は、第１のマルチサブユニットサイトカイン（例えば、ＩＬ－１２またはＩＬ－２７）、第２のサイトカイン、またはｓｃＦｖのＶＨ領域またはＶＬ領域の機能性を変化させない挿入、欠失、または置換（例えば、縮重コード）を含み得る。本明細書中に記載の二重サイトカイン融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、遺伝暗号の縮重に起因してアミノ酸配列が相違する場合があり、前述の配列に対して７０～９９％、好ましくは、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％相同であり得る。
【0076】
本明細書中に記載の二重サイトカイン融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、例えば、タンパク質の発現、産生、または分泌を補助する周知の配列をさらに含み得る。かかる配列は、例えば、リーダー配列、シグナルペプチド、および／または翻訳開始部位／配列（例えば、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列）を含み得る。また、本明細書中に記載のヌクレオチド配列は、様々な発現系／ベクターへの挿入を可能にする１またはそれを超える制限酵素部位を含み得る。
【0077】
別の実施形態では、二重サイトカイン融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を、遺伝子治療において直接使用し得る。１つの実施形態では、本出願の二重サイトカイン融合タンパク質を、当該分野で公知の任意の方法（二重サイトカイン融合タンパク質をコードするベクター中の遺伝子の直接投与を含む）によって送達させることができる。遺伝子治療を、プラスミドＤＮＡまたはウイルスベクター（アデノ随伴ウイルスベクター、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクターなど）を使用して行い得る。いくつかの実施形態では、本出願のウイルスベクターを、ウイルス粒子として投与し、他の方法としては、プラスミド（例えば、「裸の」ＤＮＡ）として投与する。
【0078】
ヌクレオチド配列の他の送達方法は、当該分野で既知の方法を含む。これらの方法は、細胞透過性ペプチド、疎水性部分、静電複合体、リポソーム、リガンド、リポソームナノ粒子、リポタンパク質（好ましくは、ＨＤＬまたはＬＤＬ）、葉酸標的化リポソーム、抗体（葉酸受容体、トランスフェリン受容体など）、ターゲティングペプチド、またはアプタマーによる二重サイトカイン融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列（ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、またはこれらのバリアントなどであるが、これらに限定されない）の送達を含むであろう。二重サイトカイン融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を、直接的な注射、注入、パッチ、包帯、ミストもしくはエアロゾル、または薄膜送達によって被験体に送達し得る。ヌクレオチド（またはタンパク質）を、サイトカイン刺激の標的化送達を所望する任意の領域に指向させ得る。これらは、例えば、肺、胃腸管、皮膚、肝臓、頭蓋内注射を介した脳、超音波ガイド下の注射による深在性転移性腫瘍病変を含むであろう。
【0079】
別の態様では、本開示は、二重サイトカイン融合タンパク質を調製および精製する方法に関する。例えば、本明細書中に記載の二重サイトカイン融合タンパク質をコードする核酸配列を使用して、融合タンパク質を組換えによって産生し得る。例えば、従来の分子生物学およびタンパク質発現技術を使用して、本明細書中に記載の二重サイトカイン融合タンパク質を発現させ、哺乳動物細胞系から精製し得る。これらの系は、周知の真核細胞発現ベクター系および宿主細胞を含む。二重サイトカイン融合タンパク質の発現および導入のために使用することができる種々の好適な発現ベクターを使用してよく、これらは当業者に周知である。これらのベクターは、例えば、ｐＵＣ型ベクター、ｐＢＲ型ベクター、ｐＢＩ型ベクター、ｐＧＡ型、ｐＢｉｎｌ９、ｐＢＩ１２１、ｐＧｒｅｅｎシリーズ、ｐＣＡＭＢＲＩＡシリーズ、ｐＰＺＰシリーズ、ｐＰＣＶ００１、ｐＧＡ４８２、ｐＣＬＤ０４５４１、ｐＢＩＢＡＣシリーズ、ｐＹＬＴＡＣシリーズ、ｐＳＢ１１、ｐＳＢ１、ｐＧＰＴＶシリーズ、およびウイルスベクターなどを含み、これらを使用することができる。周知の宿主細胞系は、ＣＨＯ細胞での発現を含むが、これに限定されない。
【0080】
また、二重サイトカイン融合タンパク質を保有する発現ベクターは、ベクターが機能するのに必要な他のベクター構成要素を含む。例えば、ベクターは、シグナル配列、ｔａｇ配列、プロテアーゼ同定配列、選択マーカー、および二重サイトカイン融合タンパク質の適切な複製および発現に必要な他の配列制御配列（プロモーターなど）を含み得る。ベクター中で利用される特定のプロモーターは、種々の宿主細胞型での二重サイトカイン融合タンパク質の発現を駆動することができる限り、特に制限はない。同様に、Ｔａｇプロモーターのタイプは、Ｔａｇ配列によって発現された二重サイトカイン融合タンパク質がより簡潔にまたは容易に精製される限り、制限はない。これらは、例えば、６－ヒスチジン、ＧＳＴ、ＭＢＰ、ＨＡＴ、ＨＮ、Ｓ、ＴＦ、Ｔｒｘ、Ｎｕｓ、ビオチン、ＦＬＡＧ、ｍｙｃ、ＲＣＦＰ、およびＧＦＰなどを含んでよく、これらを使用することができる。プロテアーゼ認識配列は特に制限されず、例えば、第Ｘａ因子、トロンビン、ＨＲＶ、３Ｃプロテアーゼなどの認識配列を使用することができる。マーカーの選択は、これらが形質転換されたイネ科植物細胞を検出することができる限り特に制限されず、例えば、ネオマイシン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、およびハイグロマイシン耐性遺伝子などを使用することができる。
【0081】
また、上記の二重サイトカイン融合タンパク質は、製造プロセス中に融合タンパク質の回収または精製を補助するさらなるアミノ酸配列を含み得る。これらは、多様な配列修飾または親和性タグ（プロテインＡ、アルブミン結合タンパク質、アルカリホスファターゼ、ＦＬＡＧエピトープ、ガラクトース結合タンパク質、ヒスチジンタグ、および当該分野で周知の任意の他のタグなどであるが、これらに限定されない）を含み得る。例えば、Ｋｉｍｐｌｅ ｅｔ ａｌ（Ｃｕｒｒ．Ｐｒｏｔｏｃ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．，２０１３，７３：Ｕｎｉｔ ９．９，Ｔａｂｌｅ ９．９１（その全体が本明細書中で参考として援用される））を参照のこと。１つの態様では、親和性タグは、ＨＨＨＨＨＨのアミノ酸配列（配列番号４２）を有するヒスチジンタグである。ヒスチジンタグは、最終生成物から除去されるか、インタクトなままであり得る。別の実施形態では、親和性タグは、融合タンパク質（例えば、本明細書中に記載の融合タンパク質のＶＨ領域）に組み込まれたプロテインＡ修飾である。当業者は、本明細書中に記載の任意の二重サイトカイン融合タンパク質配列を、当該分野で記載のように抗体フレームワーク領域内にアミノ酸点置換を挿入することによってプロテインＡ修飾を組み込むように修飾することができることを理解するであろう。
【0082】
別の態様では、二重サイトカイン融合タンパク質をコードするタンパク質および核酸分子を、治療有効量の二重サイトカイン融合タンパク質ならびに薬学的担体および／または薬学的に許容され得る賦形剤を含む医薬組成物として製剤化し得る。医薬組成物を、一般的に使用される緩衝液、賦形剤、防腐剤、安定剤を用いて製剤化し得る。二重サイトカイン融合タンパク質を含む医薬組成物を、薬学的に許容され得る担体または賦形剤と混合する。多様な薬学的担体が当該分野で公知であり、医薬組成物において使用し得る。例えば、担体は、本特許出願の二重サイトカイン融合タンパク質組成物の患者への送達に好適な任意の適合可能な無毒の物質であり得る。好適な担体の例は、通常の生理食塩水、リンゲル液、デキストロース溶液、およびハンクス液を含む。また、担体は、当業者に一般的に知られている任意のポロクサマー（２９００（Ｌ６４）、３４００（Ｐ６５）、４２００（Ｐ８４）、４６００（Ｐ８５）、１１，４００（Ｆ８８）、４９５０（Ｐ１０３）、５９００（Ｐ１０４）、６５００（Ｐ１０５）、１４，６００（Ｆ１０８）、５７５０（Ｐ１２３）、および１２，６００（Ｆ１２７）の分子量を有するものを含むが、これらに限定されない）を含み得る。また、担体は、乳化剤（例えば、ポリソルベート２０、ポリソルベート４０、ポリソルベート６０、およびポリソルベート８０を含むが、これらに限定されない）を含み得る。固定油およびオレイン酸エチルなどの非水性担体も使用され得る。また、担体は、等張性および化学安定性を増強する物質などの添加物（例えば、緩衝液および防腐剤）を含み得る（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ａｎｄ Ｕ．Ｓ．Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ：Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｆｏｒｍｕｌａｒｙ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．（１９８４）を参照のこと）。治療剤および診断剤の製剤を、例えば、凍結乾燥された粉末、スラリー、水溶液、または懸濁液の形態で生理学的に許容され得る担体、賦形剤、または安定剤と混合することによって調製し得る。
【0083】
医薬組成物を、所望の治療結果を提供するのに十分な治療有効量での患者への投与のために製剤化するであろう。好ましくは、かかる量は、負の副作用が最少である。１つの実施形態では、二重サイトカイン融合タンパク質の投与量は、炎症性疾患または症状を処置または予防するのに十分であろう。別の実施形態では、二重サイトカイン融合タンパク質の投与量は、免疫疾患または免疫障害を処置または予防するのに十分であろう。さらに別の実施形態では、二重サイトカイン融合タンパク質の投与量は、癌を処置または予防するのに十分であろう。投与量は、患者によって変動してよく、被験体または患者の疾患または症状、患者の健康全般、投与方法、および副作用の重症度などを考慮することによって決定される必要があるであろう。
【0084】
特定の患者の有効量は、処置される症状、患者の健康全般、投与方法、投与経路、および投与量、ならびに副作用の重症度などの要因に応じて変動し得る。患者への適切な投与用量を、典型的には、処置に影響を及ぼすか、処置に影響を及ぼすと予測されることが当該分野で公知であるか、疑われるパラメーターまたは要因を使用して臨床医が決定する。一般に、用量は、最適な用量よりいくらか少ない量から開始し、その後、任意の負の副作用と比較して所望のまたは最適な効果が達成されるまで、少しずつ増加させる。重要な診断基準は、例えば、炎症の徴候または炎症性サイトカインの産生レベルの診断基準を含む。
【0085】
本明細書中に記載の二重サイトカイン融合タンパク質の用量の決定方法は、米国特許第１０，８５８，４１２号に記載の方法と実質的に類似するであろう。一般に、本明細書中に記載の二重サイトカイン融合タンパク質は、０．５マイクログラム／キログラム～１００マイクログラム／キログラムの範囲の用量を有するであろう。二重サイトカイン融合タンパク質を、毎日、１週間に３回、１週間に２回、毎週、２ヶ月に１回、または毎月投与し得る。有効量の治療薬は、徴候を軽減することによって炎症または疾患または症状のレベルに影響を及ぼすであろう。例えば、影響は、疾患または症状が軽減されるか、完全に処置されるように、少なくとも１０％；少なくとも２０％；少なくとも約３０％；少なくとも４０％；少なくとも５０％；またはそれを超える影響レベルを含み得る。
【0086】
本出願の組成物を、経口または注射によって体内に投与することができる。また、経口用の製剤は、胃腸管中のプロテアーゼから二重サイトカイン融合タンパク質をさらに保護するための化合物を含むことができる。注射は、通常、筋肉内、皮下、皮内、または静脈内である。あるいは、関節内注射または他の経路を、適切な環境で使用することができる。非経口投与される二重サイトカイン融合タンパク質を、好ましくは、薬学的担体および／または薬学的に許容され得る賦形剤と共に単位投薬量を注射可能な形態（液剤、懸濁剤、乳剤）に製剤化する。他の実施形態では、本出願の組成物を、移植可能なまたは注射可能な薬物送達システムによって患者の体内に導入し得る。
【0087】
二重サイトカイン融合タンパク質の試験
所望の生物学的機能を試験するための複数のスクリーニングアッセイが、当業者に公知であり、利用可能である。１つの実施形態では、所望の生物学的機能は、抗炎症応答の低下、Ｔ細胞刺激の低下、Ｔ細胞機能の増強、クッパー細胞機能性の増強、および肥満細胞脱顆粒の低下を含むが、これらに限定されない。
所望の生物学的機能を試験するための複数のスクリーニングアッセイが、当業者に公知であり、利用可能である。１つの実施形態では、所望の生物学的機能は、抗炎症応答の低下、Ｔ細胞刺激の低下、Ｔ細胞機能の増強、クッパー細胞機能性の増強、および肥満細胞脱顆粒の低下を含むが、これらに限定されない。
【0088】
例えば、ＩＬ－１０曝露によってＴ細胞がプライミングされ、Ｔ細胞受容体の刺激の際により多くのＩＦＮγが生成および分泌されることが公知である。同時に、ＩＬ－１０曝露は、ＬＰＳに応答して単球／マクロファージから分泌されるＴＮＦα、ＩＬ－６、および他の炎症促進性サイトカインの分泌を防止する。また、ＩＬ－１０は、ＦｏｘＰ３＋ＣＤ４＋Ｔｒｅｇの増殖を抑制する。１つの実施形態では、単球／マクロファージ抑制を最大にするがＴ細胞効果（刺激応答および抑制応答の両方を含む）を欠く二重サイトカイン融合タンパク質を正に選択するであろう。１つの実施形態では、自己免疫、抗炎症性疾患、またはその両方の処置のための抗炎症作用を増加させる二重サイトカイン融合タンパク質を、スクリーニングにより正に選択するであろう。別の実施形態では、また、クッパー細胞の除去を増強し、かつＴｒｅｇ抑制を欠く二重サイトカイン融合タンパク質を、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）および／または非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）の処置を開発するために選択するであろう。さらに別の実施形態では、Ｔ細胞生物学（刺激応答および抑制応答の両方を含む）を最大にし、かつクッパー細胞の除去の増強もされた二重サイトカイン融合タンパク質を、癌の処置を開発するために選択するであろう。二重サイトカイン融合タンパク質をスクリーニングするための多様なアッセイおよび方法は、以前に同時係属中の米国特許第１０，８５８，４１２号（その全体が参考として援用される）に記載されている。米国特許出願第１６／８１１，７１８号明細書の３９～４２頁を参照のこと。
【0089】
二重サイトカインを使用した処置および／または予防方法
他の態様では、本開示は、悪性疾患もしくは症状または癌を処置および／または予防する方法であって、治療有効量の、第１のマルチサブユニットサイトカイン（例えば、ＩＬ－１２またはＩＬ－２７）および第２のサイトカイン（ＩＦＮアルファ、ＩＬ２８、ＩＬ２９、およびＩＬ１０など）を含む二重サイトカイン融合タンパク質を、前述の処置および／または予防を必要とする被験体に投与することを含む、方法に関する。好ましい実施形態では、二重サイトカイン融合タンパク質は、ＩＬ－１２もしくはＩＬ－２７およびＩＬ－１０またはこれらのバリアント、ＩＦＮ－アルファ、ＩＬ２８、もしくはＩＬ－２９およびこれらのバリアンを第２のサイトカインとして含む。他の実施形態では、ヒト抗エボラｓｃＦｖの６つのＣＤＲ領域は、抗Ｈｅｒ２／Ｎｅｕ；抗ＰＤＧＦＲ；抗ＶＥＧＦＲ１および抗ＶＥＧＦＲ２、抗ＦＧＦＲ；抗ＣＤ１９、抗ＣＤ２０、抗ＣＤ２２、抗ＢＣＭＡ、抗ＰＳＡ、抗ＰＳＭＡ、抗ＨＥＲ３；抗ＥＧＦＲ、抗ＣＥＡ、または抗ＧＰＣ３由来の６つのＣＤＲと置換されている。好ましくは、６つのＣＤＲは、抗ＥＧＦＲ、または抗ＨＥＲ２から得る。別の好ましい実施形態では、第２のサイトカインは、ＩＬ－２８、ＩＬ－２９、ＩＬ－１０、またはＩＦＮ－アルファであり、ここで、ＩＬ－１０は、ＤＶ０７またはＤＶ０６のいずれかである。
他の態様では、本開示は、悪性疾患もしくは症状または癌を処置および／または予防する方法であって、治療有効量の、第１のマルチサブユニットサイトカイン（例えば、ＩＬ－１２またはＩＬ－２７）および第２のサイトカイン（ＩＦＮアルファ、ＩＬ２８、ＩＬ２９、およびＩＬ１０など）を含む二重サイトカイン融合タンパク質を、前述の処置および／または予防を必要とする被験体に投与することを含む、方法に関する。好ましい実施形態では、二重サイトカイン融合タンパク質は、ＩＬ－１２もしくはＩＬ－２７およびＩＬ－１０またはこれらのバリアント、ＩＦＮ－アルファ、ＩＬ２８、もしくはＩＬ－２９およびこれらのバリアンを第２のサイトカインとして含む。他の実施形態では、ヒト抗エボラｓｃＦｖの６つのＣＤＲ領域は、抗Ｈｅｒ２／Ｎｅｕ；抗ＰＤＧＦＲ；抗ＶＥＧＦＲ１および抗ＶＥＧＦＲ２、抗ＦＧＦＲ；抗ＣＤ１９、抗ＣＤ２０、抗ＣＤ２２、抗ＢＣＭＡ、抗ＰＳＡ、抗ＰＳＭＡ、抗ＨＥＲ３；抗ＥＧＦＲ、抗ＣＥＡ、または抗ＧＰＣ３由来の６つのＣＤＲと置換されている。好ましくは、６つのＣＤＲは、抗ＥＧＦＲ、または抗ＨＥＲ２から得る。別の好ましい実施形態では、第２のサイトカインは、ＩＬ－２８、ＩＬ－２９、ＩＬ－１０、またはＩＦＮ－アルファであり、ここで、ＩＬ－１０は、ＤＶ０７またはＤＶ０６のいずれかである。
【0090】
さらに他の態様では、本開示は、炎症性疾患または症状を処置および／または予防する方法であって、治療有効量の二重サイトカイン融合タンパク質を、前述の処置および／または予防を必要とする被験体に投与することを含む、方法に関する。好ましい実施形態では、炎症性疾患または障害は、クローン病、乾癬、および関節リウマチ（「ＲＡ」）を含むが、これらに限定されない。
【0091】
さらに別の態様では、本開示は、免疫疾患または症状を処置および／または予防する方法であって、治療有効量の二重サイトカイン融合タンパク質を、前述の処置および／または予防を必要とする被験体に投与することを含む、方法に関する。
【0092】
他の実施形態では、本開示はまた、当該分野で周知の第２の治療剤（例えば、サイトカイン、ステロイド、化学療法剤、抗生物質、抗炎症剤、または照射）を用いた同時投与または処置の方法を企図する。これらの方法は、以下のうちの１つまたは複数などであるが、これらに限定されない他の治療剤との併用処置を含み得る：化学療法薬、インターフェロン－β、例えば、ＩＦＮβ－１αおよびＩＦＮ－β－１β；ミエリン塩基性タンパク質を模倣するタンパク質；コルチコステロイド；ＩＬ－１阻害剤；ＴＮＦ阻害剤；抗ＴＮＦα抗体、抗ＩＬ－６抗体、ＩＬ－１ｂｒ－Ｉｇ融合物、抗ＩＬ－２３抗体、ＣＤ４０リガンドおよびＣＤ８０に対する抗体；ＩＬ－１２およびＩＬ－２３のアンタゴニスト、例えば、ＩＬ－１２およびＩＬ－２３のｐ４０サブユニットのアンタゴニスト（例えば、ｐ４０サブユニットに対する阻害抗体）；ＩＬ－２２アンタゴニスト；小分子阻害剤、例えば、メトトレキサート、レフルノミド、シロリムス（ラパマイシン）、およびこれらのアナログ、例えば、ＣＣＩ－７７９；Ｃｏｘ－２およびｃＰＬＡ２阻害剤；ＮＳＡＩＤ；ｐ３８阻害剤；ＴＰＬ－２；Ｍｋ－２；ＮＦｋβ阻害剤；ＲＡＧＥまたは可溶性ＲＡＧＥ；Ｐ－セレクチンまたはＰＳＧＬ－１阻害剤（例えば、小分子阻害剤、その抗体、例えば、Ｐ－セレクチンに対する抗体）；エストロゲン受容体ベータ（ＥＲＢ）アゴニストまたはＥＲＢ－ＮＦｋβアンタゴニスト。
【0093】
さらに、二重サイトカイン融合タンパク質を用いた投与に有用な併用処置は、ＴＮＦ阻害剤を含んでよく、前述の阻害剤は、例えば、ＴＮＦに結合するキメラ抗体、ヒト化抗体、有効ヒト抗体、ヒト抗体、もしくはｉｎ ｖｉｔｒｏで生成された抗体、またはこれらの抗原結合断片；ＴＮＦ受容体の可溶性断片、例えば、ｐ５５もしくはｐ７５ヒトＴＮＦ受容体またはこれらの誘導体、例えば、７５ｋｄＴＮＦＲ－ＩｇＧ（７５ｋＤ ＴＮＦ受容体－ＩｇＧ融合タンパク質、エンブレル（商標））、ｐ５５ｋＤ ＴＮＦ受容体－ＩｇＧ融合タンパク質；ならびにＴＮＦ酵素アンタゴニスト、例えば、ＴＮＦα変換酵素（ＴＡＣＥ）阻害剤を含む。標準的な非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）およびシクロオキシゲナーゼ－２阻害剤を含むが、これらに限定されない抗炎症剤／薬を用いた他の併用処置。ＮＳＡＩＤは、アスピリン、セレコキシブ、ジクロフェナック、ジフルニサル、エトドラク、イブプロフェン、インドメタシン、ケトプロフェン、ケトロラック、ナブメトン、ナプロキセン、オキサプロジン、ピロキシカム、サルサラート、スリンダク、および／またはトルメチンを含み得る。本出願の組成物中で使用されるシクロオキシゲナーゼ－２阻害剤は、例えば、セレコキシブまたはロフェコキシブであり得る。
【0094】
二重サイトカイン融合タンパク質と同時投与および／または同時製剤化することができるさらなる治療剤は、以下のうちの１つまたは複数を含む：インターフェロン－β、例えば、ＩＦＮβ－１αおよびＩＦＮβ－１β；ＣＯＰＡＸＯＮＥ（登録商標）；コルチコステロイド；ＩＬ－１阻害剤；ＴＮＦアンタゴニスト（例えば、ＴＮＦ受容体の可溶性断片、例えば、ｐ５５またはｐ７５ヒトＴＮＦ受容体またはその誘導体、例えば、７５ｋｄＴＮＦＲ－ＩｇＧ；ＣＤ４０リガンドおよびＣＤ８０に対する抗体；ならびにＩＬ－１２および／またはＩＬ－２３のアンタゴニスト、例えば、ＩＬ－１２およびＩＬ－２３のｐ４０サブユニットのアンタゴニスト（例えば、ＩＬ－１２およびＩＬ－２３のｐ４０サブユニットに結合する阻害抗体）；メトトレキサート、レフルノミド、およびシロリムス（ラパマイシン）、またはこれらのアナログ、例えば、ＣＣＩ－７７９。他の治療剤は、イムフィムジまたはアテゾリズマブ（Ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍｂ）を含み得る。
【0095】
ＮＡＳＨを処置する目的のために、例えば、二重サイトカイン融合タンパク質を、コレステロール低下剤（スタチンおよび非スタチン薬など）と組み合わせ得る。これらの薬剤は、シンバスタチン、アトルバスタチン、ロスバスタチン、ロバスタチン、プラバスタチン、ゲムフィブロジル、フルバスタチン、コレスチラミン、フェノフィブラート、コレステロール吸収阻害剤、胆汁酸結合樹脂もしくは捕捉剤、および／またはミクロソームトリグリセリド輸送タンパク質（ＭＴＰ）阻害剤を含むが、これらに限定されない。
【0096】
本明細書中に記載の二重サイトカイン融合タンパク質と同時投与され得る代表的な化学療法剤は、以下の包括的でないリストの化学療法剤を含み得る：アルキル化剤、例えば、チオテパおよびシクロホスファミド（ｃｙｃｌｏｓｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）（ＣＹＴＯＸＡＮ（商標））；スルホン酸アルキル、例えば、ブスルファン、インプロスルファン、およびピポスルファン；アジリジン、例えば、ベンゾドパ、カルボコン、メツレドパ、およびウレドパ；エチレンイミンおよびメチルメラミン（ｍｅｔｈｙｌａｍｅｌａｍｉｎｅ）であって、以下を含む：アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホルアミド（ｔｒｉｅｔｙｌｅｎｅｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｅ）、トリエチレンチオホスホルアミド（ｔｒｉｅｔｈｙｌｅｎｅｔｈｉｏｐｈｏｓｐｈａｏｒａｍｉｄｅ）およびトリメチロールメラミン（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｏｌｏｍｅｌａｍｉｍｅ）ナイトロジェンマスタード、例えば、クロラムブシル（ｃｈｉｏｒａｍｂｕｃｉｌ）、クロルナファジン、クロホスファミド、エストラムスチン、イフォスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシド塩酸塩、メルファラン、ノブエンビキン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタード；ニトロソ尿素（ｎｉｔｒｏｓｕｒｅａ）、例えば、カルムスチン、クロロゾトシン、ホテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチン；抗生物質、例えば、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、アウトラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カリチアマイシン、カラビシン、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６－ジアゾ－５－オキソ－Ｌ－ノルロイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ぺプロマイシン、ポトフィロマイシン、ピューロマイシン、クエラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシン；代謝拮抗物質、例えば、メトトレキサートおよび５－フルオロウラシル（５－ＦＵ）；葉酸アナログ、例えば、デノプテリン、メトトレキサート、プテロプテリン、トリメトレキサート；プリンアナログ、例えば、フルダラビン、６－メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニン；ピリミジンアナログ、例えば、アンシタビン、アザシチジン、６－アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジン、５－ＦＵ；アンドロゲン、例えば、カルステロン、ドロモスタノロンプロピオナート、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン；アンチアドレナル、例えば、アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタン；葉酸補充薬、例えば、フォリン酸（ｆｒｏｌｉｎｉｃ ａｃｉｄ）；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；アムサクリン；ベストラブシル；ビサントレン；エダトラキサート；デフォファミン；デメコルシン；ジアジクオン；エフロルニチン（ｅｌｆｏｒｎｉｔｈｉｎｅ）；エリプチニウムアセタート；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダニン；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダモール；ニトラクリン；ペントスタチン；フェナメット；ピラルビシン；ポドフィリン酸；２－エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ（登録商標）；ラゾキサン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジコン；２，２’，２”－トリクロロトリエチルアミン；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン；アラビニノシド（Ａｒａ－Ｃ）；シクロホスファミド；チオテパ；タキソイド、例えば、パクリタキセル（ＴＡＸＯＬ（登録商標）Ｂｒｉｓｔｏｌ－Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，Ｎ．Ｊ．）およびドキセタキセル（Ｔａｘｏｔｅｒｅ（商標）、Ｒｈｏｎｅ－Ｐｏｕｌｅｎｃ Ｒｏｒｅｒ，Ａｎｔｏｎｙ，Ｆｒａｎｃｅ）；クロラムブシル；ゲムシタビン；６－チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；白金アナログ、例えば、シスプラチンおよびカルボプラチン；ビンブラスチン；白金；エトポシド（ＶＰ－１６）；イフォスファミド；マイトマイシンＣ；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ビノレルビン；ナベルビン；ノバントロン；テニポシド；ダウノマイシン；アミノプテリン；Ｘｅｌｏｄａ（登録商標）Ｒｏｃｈｅ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ；イバンドロネート；ＣＰＴ１１；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイン酸；エスペラミシン；カペシタビン；ならびに上記のいずれかの薬学的に許容され得る塩、酸、または誘導体。腫瘍に対するホルモン作用を制御または阻害するように作用する抗ホルモン剤、例えば、抗エストロゲン（例えば、タモキシフェン、ラロキシフェン、アロマターゼ阻害４（５）－イミダゾール、４－ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン、ＬＹ１１７０１８、オナプリストン、およびトレミフェン（フェアストン）を含む）；ならびに抗アンドロゲン、例えば、フルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、ロイプロリド、およびゴセレリン；ならびに上記のいずれかの薬学的に許容され得る塩、酸、または誘導体もこの定義に含まれる。
【実施例】
【0097】
実施例１：ＩＬ－１２およびＩＬ－ＩＦＮ－アルファ二重サイトカイン融合タンパク質のｉｎ ｖｉｔｒｏ研究
２つのサイトカインが腫瘍を標的にするｉｎ ｖｉｔｒｏ効果を評価するために、ＩＬ－１２およびＩＦＮ－アルファを含む二重サイトカイン融合タンパク質（「ＤＫα１２」と称した構造の代表的な線図として図２を参照のこと）を、以下の構成要素から構築する：
（ａ）抗ＥＧＦＲ抗体、抗ＨＥＲ２抗体、抗ＶＥＧＦＲ１抗体、抗ＶＥＧＦＲ１抗体、または抗ＣＤ１４抗体のうちのいずれか１つ由来の６つのＣＤＲを用いてグラフティングされたヒト抗エボラｓｃＦｖの末端に融合されたｐ３５およびｐ４０サブユニット；および
（ｂ）ＩＦＮ－アルファ（配列番号９）；
ここで、ＩＦＮ－アルファは、抗ＥＧＦＲ抗体、抗ＨＥＲ２抗体、抗ＶＥＧＦＲ１抗体、抗ＶＥＧＦＲ１抗体、または抗ＣＤ１４抗体由来の６つのＣＤＲを用いてグラフティングされたヒト抗エボラｓｃＦｖのＶＨとＶＬとの間のヒンジ（またはリンカー）領域中に抱合または連結されている。
２つのサイトカインが腫瘍を標的にするｉｎ ｖｉｔｒｏ効果を評価するために、ＩＬ－１２およびＩＦＮ－アルファを含む二重サイトカイン融合タンパク質（「ＤＫα１２」と称した構造の代表的な線図として図２を参照のこと）を、以下の構成要素から構築する：
（ａ）抗ＥＧＦＲ抗体、抗ＨＥＲ２抗体、抗ＶＥＧＦＲ１抗体、抗ＶＥＧＦＲ１抗体、または抗ＣＤ１４抗体のうちのいずれか１つ由来の６つのＣＤＲを用いてグラフティングされたヒト抗エボラｓｃＦｖの末端に融合されたｐ３５およびｐ４０サブユニット；および
（ｂ）ＩＦＮ－アルファ（配列番号９）；
ここで、ＩＦＮ－アルファは、抗ＥＧＦＲ抗体、抗ＨＥＲ２抗体、抗ＶＥＧＦＲ１抗体、抗ＶＥＧＦＲ１抗体、または抗ＣＤ１４抗体由来の６つのＣＤＲを用いてグラフティングされたヒト抗エボラｓｃＦｖのＶＨとＶＬとの間のヒンジ（またはリンカー）領域中に抱合または連結されている。
【0098】
ＤＫα１２を、これら２つのサイトカイン（ＩＬ－１２およびＩＦＮ－アルファ）の、ＮＫ、ＣＤ４＋、およびＣＤ８＋Ｔ細胞由来のＩＦＮγの誘導に対する組み合わせ効果を評価するために生成する。
【0099】
末梢血単球、ＮＫ、ＣＤ４＋、およびＣＤ８＋Ｔ細胞を、ＤＫα１２の機能を評価するために磁性ビーズポジティブ選択によって単離し、次いで、ｉｎ ｖｉｔｒｏ試験で評価した。一連の細胞ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイを使用して、ヒトの体内に皮下注射した分子の曝露サイクルにおける異なる時点での免疫学的機能を模倣またはモデル化した。これらのアッセイは、米国特許第１０，８５８，４１２号および米国特許出願第１７／１１０，１０４号に記載されている。
【0100】
第１に、ＩＬ－１２のみの効果、ＩＦＮ－アルファのみの効果、ＩＬ－１２とＩＦＮ－アルファの組み合わせ効果、および単一サイトカインｓｃＦｖ足場系に組み込まれたＩＬ－１２の効果（例えば、ｐ３５およびｐ４０サブユニットを足場系の末端上のＩＬ－１０単量体の代わりに用いる場合、図６を参照のこと）を、単球／マクロファージに対するＤＫα１２の効果と比較する。ＩＦＮ－アルファのみおよびＤＫα１２に組み込まれたときは、ＬＰＳ媒介性のＩＬ－１０の誘導を阻害するが、ＴＲＡＩＬの放出を誘導する。ＩＦＮ－アルファでの処置は、ＭＨＣ ＩおよびＣＤ８０の細胞表面発現を増加させる。ＩＬ－１２は、単球に影響を及ぼさない。
【0101】
第２に、ＩＬ－１２のみの効果、ＩＦＮ－アルファのみの効果、ＩＬ－１２とＩＦＮ－アルファの組み合わせ効果、および単一サイトカインｓｃＦｖ足場系に組み込まれたＩＬ－１２の効果（例えば、ｐ３５およびｐ４０サブユニットを足場系の末端上のＩＬ－１０単量体の代わりに用いる場合、図６を参照のこと）を、Ｔ細胞に対するＤＫα１２の効果と比較する。Ｔ細胞アッセイは、ＣＤ８＋Ｔ細胞に対するＩＬ－１０の主な機能（主に、Ｔ細胞受容体連結の際にのみ放出されるＩＦＮγの増強作用）を解明するために直接使用されている（Ｃｈａｎ，２０１５；Ｍｕｍｍ Ｊ．，２０１１；Ｅｍｍｅｒｉｃｈ，２０１２）。また、この同一のアッセイは、他のサイトカイン（ＩＬ－１２など）に適用可能であり、Ｔ細胞刺激を同定するために使用され得る。このアッセイにおいて、ＩＬ－１２のみまたはＤＫα１２に組み込まれたときに、ＩＦＮ－アルファ分泌を誘導する。ＩＦＮ－アルファでＴ細胞を処置してもＩＦＮ－アルファは誘導されない。ＩＦＮ－アルファでＣＤ８＋Ｔ細胞を処置すると、前述の細胞が相当に増殖する。ＤＫα１２と組み合わせるかカップリングしたときのＩＦＮ－アルファおよびＩＬ－１２で処置すると、Ｔ細胞増殖が増加し、かつＩＦＮ－アルファ分泌を有意に増強する。
【0102】
実施例２：ＩＬ－１２およびＩＦＮ－アルファ二重サイトカイン融合タンパク質のｉｎ ｖｉｖｏ研究
安定に発現されたヒトＥＧＦＲ ＣＴ２６マウス結腸直腸腫瘍細胞株の生成に基づいた腫瘍微小環境中への抗ＥＧＦＲ ｓｃＦｖを介した高親和性ＩＬ－１０バリアント（ＤＶ０７と称される）のターゲティング（ここで、ＤＶ０７は、６つのグラフティングした抗ＥＧＦＲ ＣＤＲを含むヒト抗エボラＳｃＦｖ足場から得たＶＨおよびＶＬを含むｓｃＦｖに融合されている；「Ｄｅｇｆｒ：ＤＶ０７」）は、ＰＥＧ－ｒＨｕＩＬ－１０と比較した場合に優れた抗腫瘍機能を示すことが以前に示された。米国特許第１０，８５８，４１２号を参照のこと。同一のｉｎ ｖｉｖｏ腫瘍研究を使用して、ＤＫα１２を評価し、ヒトＥＧＦＲ発現ＣＴ２６細胞マウス腫瘍細胞株においてＤｅｇｆｒ：ＤＶ０７と比較する。
安定に発現されたヒトＥＧＦＲ ＣＴ２６マウス結腸直腸腫瘍細胞株の生成に基づいた腫瘍微小環境中への抗ＥＧＦＲ ｓｃＦｖを介した高親和性ＩＬ－１０バリアント（ＤＶ０７と称される）のターゲティング（ここで、ＤＶ０７は、６つのグラフティングした抗ＥＧＦＲ ＣＤＲを含むヒト抗エボラＳｃＦｖ足場から得たＶＨおよびＶＬを含むｓｃＦｖに融合されている；「Ｄｅｇｆｒ：ＤＶ０７」）は、ＰＥＧ－ｒＨｕＩＬ－１０と比較した場合に優れた抗腫瘍機能を示すことが以前に示された。米国特許第１０，８５８，４１２号を参照のこと。同一のｉｎ ｖｉｖｏ腫瘍研究を使用して、ＤＫα１２を評価し、ヒトＥＧＦＲ発現ＣＴ２６細胞マウス腫瘍細胞株においてＤｅｇｆｒ：ＤＶ０７と比較する。
【0103】
平均１００ｍｍ３の腫瘍を有するＣＴ２６（ｈＥＧＦＲ＋）腫瘍保有Ｂ細胞ｋ．ｏ．Ｂａｌｂ／Ｃマウスを、表５に規定の被験物質、用量、および頻度で処置した。全ての被験物質を、頸部に皮下投与した。全ての被験物質を、１５日間にわたって毎日投薬した。
腫瘍の長さおよび幅を、電子カリパスによって３日毎に測定し、腫瘍容積を計算した（（Ｌ×Ｗ２）／２））。この実施例では、用語「Ｄｅｇｆｒ：ＤＶ０７」は、ヒトＥＧＦＲ標的化ＤＶ０７である；ＤＫα１２ｅｇｆｒは、「ＤＫα１２」と略され、セツキシマブＣＤＲをグラフティングした抗エボラｓｃＦｖ足場を介してＩＬ－１２とカップリングしたヒトＩＦＮ－アルファである。
【表5-2】
【0104】
方法
ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞培養：ＣＴ２６（ｈＥＧＦＲ＋）腫瘍細胞（ＡＴＣＣ）を、完全ＲＰＭＩ、１０％ＦＣＳ、および１０ｕｇ／ｍＬピューロマイシン中で７０％コンフルエンシーまで成長させる。細胞を、移植前にｉｎ ｖｉｔｒｏで３回以上継代する。細胞を、Ａｃｃｕｔａｓｅ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を使用して細胞培養プレートから取り出し、完全ＲＰＭＩ中で４００ｇにて４℃で１０分間スピンして洗浄する。
ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞培養：ＣＴ２６（ｈＥＧＦＲ＋）腫瘍細胞（ＡＴＣＣ）を、完全ＲＰＭＩ、１０％ＦＣＳ、および１０ｕｇ／ｍＬピューロマイシン中で７０％コンフルエンシーまで成長させる。細胞を、移植前にｉｎ ｖｉｔｒｏで３回以上継代する。細胞を、Ａｃｃｕｔａｓｅ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を使用して細胞培養プレートから取り出し、完全ＲＰＭＩ中で４００ｇにて４℃で１０分間スピンして洗浄する。
【0105】
腫瘍の移植：腫瘍細胞を、１００μＬの５０％成長因子低減Ｍａｔｒｉｇｅｌを含むか含まない５０～１００％ＲＰＭＩ中、１～２×１０５細胞／マウスで、Ｂ細胞ノックアウトマウスまたは野生型マウスの右脇腹の皮下に移植する。
【0106】
結果
腫瘍成長におけるＤｅｇｆｒ：ＩＬ－１２とＤＫα１２との比較：安定にトランスフェクトした腫瘍細胞上に存在するＥＧＦＲへの結合を介した腫瘍微小環境へのＩＬ－１２のターゲティングは、有効であることが以前に示されていた。米国特許第１０，８５８，４１２号を参照のこと。同一の腫瘍系を使用して、Ｄｅｇｆｒ：ＩＬ－１２とＤＫα１２とを比較する。
腫瘍成長におけるＤｅｇｆｒ：ＩＬ－１２とＤＫα１２との比較：安定にトランスフェクトした腫瘍細胞上に存在するＥＧＦＲへの結合を介した腫瘍微小環境へのＩＬ－１２のターゲティングは、有効であることが以前に示されていた。米国特許第１０，８５８，４１２号を参照のこと。同一の腫瘍系を使用して、Ｄｅｇｆｒ：ＩＬ－１２とＤＫα１２とを比較する。
【0107】
腫瘍を、１週間に３回測定する（表２）。７５ｍｍ３のＣＴ２６（ｈＥＧＦＲ＋）腫瘍を有する雌Ｂａｌｂ／Ｃ Ｂ細胞ノックアウトマウスを、被験物質を多様な投薬頻度で皮下処置する。この実験のために、ＣＴ２６（ｈＥＧＦＲ＋）細胞を、腫瘍抗原に対するマウスの免疫化を制限するために、０～５０％成長因子低減Ｍａｔｒｉｇｅｌ中１～２×１０５細胞で移植する。
【0108】
１ｍｇ／ｋｇでのＤｅｇｆｒ：ＩＬ－１２の抗腫瘍効果を、同一用量のＤＫα１２ならびに２および４ｍｇ／ｋｇの用量と比較する。
【0109】
ＤＫα１２の安全性査定：ＤＫα１２投薬の安全性を試験するために、ＤＫα１２で処置した腫瘍担持マウスの体重を評価する。
【0110】
生存に対するＤＫα１２投薬の効果：ＤＫα１２に対するＣＴ２６（ｈｅｇｆｒ＋）腫瘍担持マウスの生存可能性を査定する。
【0111】
実施例３：ＩＬ－２７およびＩＬ－２８またはＩＬ－２９二重サイトカイン融合タンパク質
腫瘍への２つのサイトカインのｉｎ ｖｉｔｒｏでのターゲティング効果を評価するために、（１）ＩＬ－２７およびＩＬ－２８（「ＤＫ２８２７」と称した構造の代表的な線図として図４を参照のこと）ならびに（２）ＩＬ－２７およびＩＬ－２９（「ＤＫ２９２７」と称した構造の代表的な線図として図５を参照のこと）を含む二重サイトカイン融合タンパク質を、以下の構成要素から構築する：
ＤＫ２８２７：
（ａ）抗ＥＧＦＲ抗体、抗ＨＥＲ２抗体、抗ＶＥＧＦＲ１抗体、抗ＶＥＧＦＲ１抗体、または抗ＣＤ１４抗体のうちのいずれか１つ由来の６つのＣＤＲを用いてグラフティングされたヒト抗エボラｓｃＦｖの末端に融合されたｐ２８およびＥＢＩ３サブユニット；および
（ｂ）ＩＬ－２８（配列番号１１）；
ここで、ＩＬ－２８は、抗ＥＧＦＲ抗体、抗ＨＥＲ２抗体、抗ＶＥＧＦＲ１抗体、抗ＶＥＧＦＲ１抗体、または抗ＣＤ１４抗体由来の６つのＣＤＲを用いてグラフティングされたヒト抗エボラｓｃＦｖのＶＨとＶＬとの間のヒンジ（またはリンカー）領域中に抱合または連結されている。
ＤＫ２９２７：
（ａ）抗ＥＧＦＲ抗体、抗ＨＥＲ２抗体、抗ＶＥＧＦＲ１抗体、抗ＶＥＧＦＲ１抗体、または抗ＣＤ１４抗体のうちのいずれか１つ由来の６つのＣＤＲを用いてグラフティングされたヒト抗エボラｓｃＦｖの末端に融合されたｐ２８およびＥＢＩ３サブユニット；および
（ｂ）ＩＬ－２９（配列番号１６）；
ここで、ＩＬ－２９は、抗ＥＧＦＲ抗体、抗ＨＥＲ２抗体、抗ＶＥＧＦＲ１抗体、抗ＶＥＧＦＲ１抗体、または抗ＣＤ１４抗体由来の６つのＣＤＲを用いてグラフティングされたヒト抗エボラｓｃＦｖのＶＨとＶＬとの間のヒンジ（またはリンカー）領域中に抱合または連結されている。
腫瘍への２つのサイトカインのｉｎ ｖｉｔｒｏでのターゲティング効果を評価するために、（１）ＩＬ－２７およびＩＬ－２８（「ＤＫ２８２７」と称した構造の代表的な線図として図４を参照のこと）ならびに（２）ＩＬ－２７およびＩＬ－２９（「ＤＫ２９２７」と称した構造の代表的な線図として図５を参照のこと）を含む二重サイトカイン融合タンパク質を、以下の構成要素から構築する：
ＤＫ２８２７：
（ａ）抗ＥＧＦＲ抗体、抗ＨＥＲ２抗体、抗ＶＥＧＦＲ１抗体、抗ＶＥＧＦＲ１抗体、または抗ＣＤ１４抗体のうちのいずれか１つ由来の６つのＣＤＲを用いてグラフティングされたヒト抗エボラｓｃＦｖの末端に融合されたｐ２８およびＥＢＩ３サブユニット；および
（ｂ）ＩＬ－２８（配列番号１１）；
ここで、ＩＬ－２８は、抗ＥＧＦＲ抗体、抗ＨＥＲ２抗体、抗ＶＥＧＦＲ１抗体、抗ＶＥＧＦＲ１抗体、または抗ＣＤ１４抗体由来の６つのＣＤＲを用いてグラフティングされたヒト抗エボラｓｃＦｖのＶＨとＶＬとの間のヒンジ（またはリンカー）領域中に抱合または連結されている。
ＤＫ２９２７：
（ａ）抗ＥＧＦＲ抗体、抗ＨＥＲ２抗体、抗ＶＥＧＦＲ１抗体、抗ＶＥＧＦＲ１抗体、または抗ＣＤ１４抗体のうちのいずれか１つ由来の６つのＣＤＲを用いてグラフティングされたヒト抗エボラｓｃＦｖの末端に融合されたｐ２８およびＥＢＩ３サブユニット；および
（ｂ）ＩＬ－２９（配列番号１６）；
ここで、ＩＬ－２９は、抗ＥＧＦＲ抗体、抗ＨＥＲ２抗体、抗ＶＥＧＦＲ１抗体、抗ＶＥＧＦＲ１抗体、または抗ＣＤ１４抗体由来の６つのＣＤＲを用いてグラフティングされたヒト抗エボラｓｃＦｖのＶＨとＶＬとの間のヒンジ（またはリンカー）領域中に抱合または連結されている。
【0112】
ＤＫ２８２７およびＤＫ２９２７の両方を、二重サイトカイン（ＩＬ－２７とＩＬ－２８およびＩＬ－２８とＩＬ－２９）の、ＮＫ、ＣＤ４＋、およびＣＤ８＋Ｔ細胞由来のＩＦＮγの誘導に対する組み合わせ効果を評価するために生成する。上記の手順およびアッセイ（実施例１）を、これらの二重サイトカインを用いて両方の単球／マクロファージ、Ｔ細胞（ＣＤ４＋およびＣＤ８＋）、およびＮＫ細胞に対して繰り返す。
【0113】
実施例４：ＩＬ－２７とＩＬ－２８およびＩＬ－２７とＩＬ－２９の二重サイトカイン融合タンパク質のｉｎ ｖｉｖｏ研究
同一のｉｎ ｖｉｖｏ腫瘍研究を用いて、ＤＫ２８２７およびＤＫ２９２７の両方を評価し、ヒトＥＧＦＲ発現ＣＴ２６細胞マウス腫瘍細胞株において単一標的化サイトカインと比較する。上記の手順およびアッセイ（実施例２）を、これらの二重サイトカインを用いて繰り返す。
同一のｉｎ ｖｉｖｏ腫瘍研究を用いて、ＤＫ２８２７およびＤＫ２９２７の両方を評価し、ヒトＥＧＦＲ発現ＣＴ２６細胞マウス腫瘍細胞株において単一標的化サイトカインと比較する。上記の手順およびアッセイ（実施例２）を、これらの二重サイトカインを用いて繰り返す。
【0114】
実施例５：ＣＤ１９ ＢｉＴＥと組み合わせたｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞死滅アッセイにおけるＩＬ－１２とＩＬ－１０の二重サイトカイン融合タンパク質
この研究を、ＣＤ１９二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＣＤ１９ ＢｉＴＥ）と組み合わせたときに、ＥＧＦＲを標的にするＣＤＲを用いてグラフティングされた抗エボラ足場上でＩＬ－１２およびＩＬ－１０（ＤＶ０７）を組み合わせている分子（本明細書中でＤＫ１２１０ＥＧＦＲと示す）において、ＣＤ８＋Ｔ細胞の細胞傷害機能に対してリンカーの長さが影響を及ぼすかどうかを評価するためにデザインした。
この研究を、ＣＤ１９二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＣＤ１９ ＢｉＴＥ）と組み合わせたときに、ＥＧＦＲを標的にするＣＤＲを用いてグラフティングされた抗エボラ足場上でＩＬ－１２およびＩＬ－１０（ＤＶ０７）を組み合わせている分子（本明細書中でＤＫ１２１０ＥＧＦＲと示す）において、ＣＤ８＋Ｔ細胞の細胞傷害機能に対してリンカーの長さが影響を及ぼすかどうかを評価するためにデザインした。
【0115】
ＣＤ８＋Ｔ細胞を、製造者が推奨するプロトコール（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）にしたがって、抗ＣＤ８＋磁性ビーズ単離によって新鮮なドナーＬｅｕｋｏｐａｋから単離した。
【0116】
単離されたＣＤ８＋Ｔ細胞を、２×１０６細胞／ウェルでプレートし、多様な濃度（０または２００ｎｇ／ｍＬ）のＤＫ１２１０ＥＧＦＲを含むＡＩＭＶ中に２日間曝露した。多様な濃度の、ＩＬ１０側およびＩＬ－１２側の両方に標準的なリンカーを有するＤＫ１２１０ＥＧＦＲまたは伸長リンカーを有するＤＫ１２１０ＥＧＦＲへの曝露の２日後に、ＣＤ８＋Ｔ細胞を採取し、カウントし、洗浄し、最後に、対応する濃度のＤＫ１２１０ＥＧＦＲに再懸濁した。同時に、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を構成性に発現するＲａｊｉ細胞をカウントし、洗浄し、種々の濃度（０および０．１（データ示さず）、または１ｎｇ／ｍＬ）のＣＤ１９ ＢｉＴＥ中に再懸濁した。次いで、ＣＤ８＋細胞（エフェクター）およびＲａｊｉ－ＧＦＰ細胞（標的）を、１０：１のエフェクター対標的比で組み合わせる。（１）処置なし、（２）ＣＤ１９ ＢｉＴＥのみ、（３）ＤＫ２１０ＥＧＦＲのみ、または（４）ＣＤ１９ ＢｉＴＥとＤＫ２１０ＥＧＦＲの組み合わせに曝露したエフェクターおよび標的細胞の混合物を、ＩｎｃｕＣｙｔｅを使用して２日間にわたってモニタリングした。２日間の曝露後、ＧＦＰの消失率を、細胞傷害性の指標として測定する。
【0117】
ブリナツモマブとしても公知のＣＤ１９ ＢｉＴＥは、現在、唯一のＦＤＡで承認されているＢｉＴＥ治療である。本発明者らは、ＣＤ１９ ＢｉＴＥの、ＩＬ１０およびＩＬ２を含む他の二重サイトカイン融合タンパク質（本明細書中でＤＫ２１０と称する）との組み合わせが、ＣＤ１９ ＢｉＴＥ細胞傷害性を増強することを示していた（データは提供せず）。ここで、本発明者らは、同一のアッセイシステムを使用して、ＣＤ１９ ＢｉＴＥの、（１）標準的なリンカー（例えば、配列番号４６）を有するＤＫ１２１０ＥＧＦＲとの組み合わせが、（２）伸長リンカー（例えば、配列番号４４）を有するＤＫ１２１０ＥＧＦＲとの組み合わせによる、正常で健常なヒトドナー由来のＣＤ８＋Ｔ細胞の駆動による標的癌細胞の細胞溶解を改善するのかどうかを判定する。図９および１０を参照のこと。
【0118】
標準的なリンカーを有するＤＫ１２１０ＥＧＦＲと伸長リンカーを有するＤＫ１２１０ＥＧＦＲとの両方を用いたＣＤ１９ ＢｉＴＥに対する健常なヒトドナー由来のＣＤ８＋Ｔ細胞の応答を比較した査定は、伸長リンカーが、２つの様式の組み合わせがＣＤ８＋Ｔ細胞による標的Ｒａｊｉ細胞の細胞溶解能力を増強する能力を総じて改善することを示唆している。
【0119】
この文書による説明は、好ましい実施形態を含む本開示の態様を開示するための例を使用し、当業者は、任意のデバイスまたはシステムの作製および使用ならびに任意の組み入れられた方法の実施を含むその態様を実施することもできる。これらの態様の特許性のある範囲は、特許請求の範囲によって定義され、当業者が思いつく他の例を含み得る。かかる他の例は、これらが特許請求の範囲の文言と異ならない構成要素を有する場合、あるいは、これらが特許請求の範囲の文言と実質的に異ならない等価な構成要素を含む場合に、特許請求の範囲の範囲内にあることが意図される。当業者は、本出願の原理にしたがって、記載の多様な実施形態由来の態様、ならびに各々のかかる態様についての他の公知の均等物を組み合わせるか適合させて、さらなる実施形態および技術を構築することができる。
【化1-1】
【化1-2】
【化1-3】
【化1-4】
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【配列表】
【国際調査報告】