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▶ サンシャイン・グオジアン・ファーマシューティカル（シャンハイ）カンパニー・リミテッドの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-12-26
(54)【発明の名称】ヒトＣＤ７３と結合する抗体、その製造方法と使用
(51)【国際特許分類】
C07K 16/28 20060101AFI20241219BHJP
C12N 15/13 20060101ALI20241219BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20241219BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20241219BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20241219BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20241219BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20241219BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20241219BHJP
A61K 47/68 20170101ALI20241219BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20241219BHJP
A61K 35/17 20150101ALI20241219BHJP
G01N 33/573 20060101ALI20241219BHJP
G01N 33/531 20060101ALI20241219BHJP
【ＦＩ】
C07K16/28 ZNA
C12N15/13
C12N15/63 Z
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
A61P35/00
A61K47/68
A61K39/395 T
A61K35/17
G01N33/573 A
G01N33/531 A
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024535882
(86)(22)【出願日】2022-12-16
(85)【翻訳文提出日】2024-08-09
(86)【国際出願番号】 CN2022139741
(87)【国際公開番号】W WO2023109962
(87)【国際公開日】2023-06-22
(31)【優先権主張番号】202111552957.3
(32)【優先日】2021-12-17
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】523029928
【氏名又は名称】サンシャイン・グオジアン・ファーマシューティカル（シャンハイ）カンパニー・リミテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100114188
【弁理士】
【氏名又は名称】小野 誠
(74)【代理人】
【識別番号】100119253
【弁理士】
【氏名又は名称】金山 賢教
(74)【代理人】
【識別番号】100124855
【弁理士】
【氏名又は名称】坪倉 道明
(74)【代理人】
【識別番号】100129713
【弁理士】
【氏名又は名称】重森 一輝
(74)【代理人】
【識別番号】100137213
【弁理士】
【氏名又は名称】安藤 健司
(74)【代理人】
【識別番号】100183519
【弁理士】
【氏名又は名称】櫻田 芳恵
(74)【代理人】
【識別番号】100196483
【弁理士】
【氏名又は名称】川嵜 洋祐
(74)【代理人】
【識別番号】100160255
【弁理士】
【氏名又は名称】市川 祐輔
(74)【代理人】
【識別番号】100219265
【弁理士】
【氏名又は名称】鈴木 崇大
(74)【代理人】
【識別番号】100203208
【弁理士】
【氏名又は名称】小笠原 洋平
(74)【代理人】
【識別番号】100216839
【弁理士】
【氏名又は名称】大石 敏幸
(74)【代理人】
【識別番号】100228980
【弁理士】
【氏名又は名称】副島 由加里
(74)【代理人】
【識別番号】100151448
【弁理士】
【氏名又は名称】青木 孝博
(74)【代理人】
【識別番号】100146318
【弁理士】
【氏名又は名称】岩瀬 吉和
(74)【代理人】
【識別番号】100127812
【弁理士】
【氏名又は名称】城山 康文
(72)【発明者】
【氏名】ジャン，シュエサイ
(72)【発明者】
【氏名】ファン，ハオミン
(72)【発明者】
【氏名】ジュ，ジェンピン
(72)【発明者】
【氏名】デン，シャオロン
(72)【発明者】
【氏名】チェン，ジアンヘ
【テーマコード（参考）】
4B065
4C076
4C085
4C087
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B065AA01X
4B065AA57X
4B065AA72X
4B065AA90X
4B065AB01
4B065BA02
4B065CA24
4B065CA25
4B065CA44
4C076AA95
4C076BB13
4C076BB15
4C076BB16
4C076CC27
4C076CC41
4C076EE59
4C085AA14
4C085AA21
4C085BB01
4C085BB11
4C085EE01
4C085GG02
4C085GG03
4C085GG04
4C087AA01
4C087AA02
4C087BB65
4C087CA04
4C087MA66
4C087NA14
4C087ZB26
4H045AA10
4H045AA11
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA10
4H045BA41
4H045DA50
4H045DA76
4H045EA20
4H045FA72
4H045FA74
(57)【要約】
本発明は、ヒトＣＤ７３と結合する抗体、その製造方法と使用を提供する。本発明のモノクローナル抗体は、高特異的にＣＤ７３抗原と結合することができ、高い親和力があり、かつ顕著な抗腫瘍などの活性を有し、良い臨床応用の将来性がある。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
抗ヒトＣＤ７３抗体またはその抗原結合断片であって、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、前記重鎖可変領域は、以下の３つの重鎖相補性決定領域ＣＤＲ
配列番号１０で示されるＨＣＤＲ１、
配列番号１１で示されるＨＣＤＲ２、
配列番号１２で示されるＨＣＤＲ３；または
配列番号１６で示されるＨＣＤＲ１、
配列番号１７で示されるＨＣＤＲ２、
配列番号１８で示されるＨＣＤＲ３
を含み；ならびに
前記軽鎖可変領域は、以下の３つの軽鎖相補性決定領域ＣＤＲ
配列番号１３で示されるＬＣＤＲ１、
配列番号１４で示されるＬＣＤＲ２、
配列番号１５で示されるＬＣＤＲ３；または
配列番号１９で示されるＬＣＤＲ１、
配列番号２０で示されるＬＣＤＲ２、
配列番号２８で示されるＬＣＤＲ３；
を含み；
前記抗体またはその抗原結合断片のアミノ酸配列のうちの任意の一つのアミノ酸配列は、任意に少なくとも一つのアミノ酸の付加、欠失、修飾および／または置換を有してもよいＣＤ７３結合親和力を維持する誘導配列をさらに含む、
抗ヒトＣＤ７３抗体またはその抗原結合断片。
【請求項2】
前記重鎖可変領域が、配列番号１、４、６、９、２４または２８で示されるアミノ酸配列を有することを特徴とする、請求項１に記載の抗ヒトＣＤ７３抗体またはその抗原結合断片。
【請求項3】
前記重鎖定常領域が、ヒト由来またはネズミ由来のものであり、好ましくは、前記重鎖定常領域が、ヒト由来抗体ＩｇＧ１またはＩｇＧ４の定常領域であることを特徴とする、請求項１に記載の抗ヒトＣＤ７３抗体またはその抗原結合断片。
【請求項4】
前記軽鎖可変領域が、配列番号２、３、５、７、８、２６または３０で示されるアミノ酸配列を有することを特徴とする、請求項１に記載の抗ヒトＣＤ７３抗体またはその抗原結合断片。
【請求項5】
前記軽鎖定常領域が、ヒト由来またはネズミ由来のものであり、好ましくは、前記軽鎖定常領域が、ヒト由来抗体のκ鎖定常領域であることを特徴とする、請求項１に記載の抗ヒトＣＤ７３抗体またはその抗原結合断片。
【請求項6】
前記重鎖可変領域が、１、４、６、９、２４または２８のいずれかで示されるアミノ酸配列を含み、ならびに／あるいは前記軽鎖可変領域が、配列番号２、３、５、７、８、２６または３０のいずれかで示されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項１に記載の抗ヒトＣＤ７３抗体またはその抗原結合断片。
【請求項7】
前記抗体のヒトＣＤ７３タンパク質との結合エピトープが、配列番号２２に相応する以下の群から選ばれる部位を含むことを特徴とする抗ヒトＣＤ７３抗体またはその抗原結合断片：１３２番目のチロシン（Ｙ１３２）、１３３番目のロイシン（Ｌ１３３）、１３９番目のプロリン（Ｐ１３９）、１３７番目のバリン（Ｖ１３７）、１８１番目のロイシン（Ｌ１８１）、１８４番目のロイシン（Ｌ１８４）、１４４番目のバリン（Ｖ１４４）、１８０番目のリシン（Ｋ１８０）。
【請求項8】
前記抗体のヒトＣＤ７３タンパク質との結合エピトープが、配列番号２２に相応する以下の群から選ばれる部位を含むことを特徴とする、請求項１に記載の抗ヒトＣＤ７３抗体またはその抗原結合断片：１３２番目のチロシン（Ｙ１３２）、１３３番目のロイシン（Ｌ１３３）、１３９番目のプロリン（Ｐ１３９）、１３７番目のバリン（Ｖ１３７）、１８１番目のロイシン（Ｌ１８１）、１８４番目のロイシン（Ｌ１８４）、１４４番目のバリン（Ｖ１４４）、１８０番目のリシン（Ｋ１８０）。
【請求項9】
以下のものを含むことを特徴とする組み換えタンパク質：（ｉ）請求項１－８のいずれかに記載の抗体または抗原結合断片；ならびに
（ｉｉ）任意の発現および／または精製を補助するタグ配列。
【請求項10】
以下の群から選ばれるポリペプチドをコードすることを特徴とするポリヌクレオチド：（１） 請求項１－８のいずれかに記載の抗体または抗原結合断片、ならびに
（２） 請求項９に記載の組み換えタンパク質。
【請求項11】
前記重鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドが、配列番号３３、３６、３８、４１、２３または２７で示され、ならびに／あるいは前記軽鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドは配列番号３４、３５、３７、３９、４０、２５または２９で示されることを特徴とする、請求項１０のポリヌクレオチド。
【請求項12】
本発明の請求項１０－１１のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含むことを特徴とするベクター。
【請求項13】
遺伝子工学化された宿主細胞であって、前記の宿主細胞は、請求項１２に記載のベクターを含むか、あるいはゲノムに請求項１０－１１のいずれかに記載のポリヌクレオチドが組み込まれている、宿主細胞。
【請求項14】
以下のものを含むことを特徴とする抗体複合体。（ａ） 請求項１－８のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片、もしくはこれらの組み合わせを含む抗体部分；ならびに
（ｂ） 検出可能なマーカー、薬物、毒素、サイトカイン、放射性核種、酵素、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる、前記抗体部分と複合する複合部分。
【請求項15】
ＣＡＲ構築物であって、前記ＣＡＲ構築物のモノクローナル抗体抗原結合領域のｓｃＦｖ断片はＣＤ７３と特異的に結合する結合領域で、かつ、前記ｓｃＦｖの重鎖可変領域は以下の３つの相補性決定領域ＣＤＲを含み：
配列番号１０で示されるＨＣＤＲ１、
配列番号１１で示されるＨＣＤＲ２、
配列番号１２で示されるＨＣＤＲ３；および
前記ｓｃＦｖの軽鎖可変領域は以下の３つの相補性決定領域ＣＤＲを含み：
配列番号１３で示されるＬＣＤＲ１、
配列番号１４で示されるＬＣＤＲ２、
配列番号１５で示されるＬＣＤＲ３；あるいは
前記ｓｃＦｖの重鎖可変領域は以下の３つの相補性決定領域ＣＤＲを含み：
配列番号１６で示されるＨＣＤＲ１、
配列番号１７で示されるＨＣＤＲ２、
配列番号１８で示されるＨＣＤＲ３；および
前記ｓｃＦｖの軽鎖可変領域は以下の３つの相補性決定領域ＣＤＲを含む：
配列番号１９で示されるＬＣＤＲ１、
配列番号２０で示されるＬＣＤＲ２、
配列番号２１で示されるＬＣＤＲ３；
ことを特徴とするＣＡＲ構築物。
【請求項16】
請求項１５に記載の外来ＣＡＲ構築物を発現することを特徴とする組み換え免疫細胞。
【請求項17】
以下のものを含むことを特徴とする薬物組成物：（ｉ） 請求項１－８のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片、請求項９に記載の組み換えタンパク質、請求項１４に記載の抗体複合体、請求項１６に記載の免疫細胞、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる、活性成分；ならびに
（ｉｉ） 薬学的に許容される担体。
【請求項18】
体外でサンプルにおけるＣＤ７３タンパク質を検出する方法であって、以下の工程を含むことを特徴とする方法：（１） 体外において、前記サンプルを請求項１－８のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片あるいは請求項１４に記載の抗体複合体と接触させる；
（２） 抗原－抗体複合体が形成したか検出し、ここで、複合体が形成したというのはサンプルにＣＤ７３タンパク質が存在することを意味する。
【請求項19】
ＣＤ７３関連疾患を予防および／または治療する方法であって、必要な対象に請求項１－８のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片、請求項１４に記載の抗体複合体、請求項１６に記載の免疫細胞、または請求項１７に記載の薬物組成物、あるいはこれらの組み合わせを施用する工程を含む、方法。
【請求項20】
前記ＣＤ７３関連疾患が、血液癌、リンパ癌、悪性膠細胞腫、黒色腫、皮膚癌、胃癌、消化管間質腫瘍、肝臓癌、胆管癌、胆嚢癌、腹膜癌、結腸直腸癌、小腸癌、肛門癌、多発性骨髄腫、膵癌、乳癌、卵巣癌、子宮癌、子宮頸癌、膣癌、膀胱癌、腎臓癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、前立腺癌、睾丸癌、陰茎癌、甲状腺癌、頭・頚部癌、食道癌、骨癌、肉腫からなる群から選ばれることを特徴とする、請求項１９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、腫瘍治療の分野に属する。具体的に、ヒトＣＤ７３と結合する抗体、その製造方法と使用に関する。
【背景技術】
【0002】
現在、腫瘍免疫治療の分野におけるＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１およびＣＴＬＡ－４などに対する研究の進展につれ、免疫治療は既に癌を攻略する主な方向の一つになってきた。しかしながら、既存の腫瘍免疫治療は、効率が低く、まだ臨床の要求を満足することができず、研究では、腫瘍免疫療法の応答が望ましくない主な原因の一つは、腫瘍微小環境に免疫細胞を抑制する物質が存在し、それによって腫瘍細胞が免疫細胞の殺傷から逃れることである。
【0003】
アデノシンは腫瘍微小環境において腫瘍免疫を抑制する主要な物質の一つで、アデノシン受容体（Ａ２ＡＲ）との結合により、プロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）およびＣｓｋキナーゼを活性化させ、ＬＣＫ、ＭＡＰＫ、ＰＫＣなどの一連の免疫活性化に関連するシグナル経路を抑制し、免疫抑制作用を発揮する。高濃度のアデノシンは、Ｔ細胞およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の活性化および機能を阻害し、強力な免疫抑制につながる一方、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の機能およびマクロファージＭ２の分化を増強する。また、アデノシンの生成過程において、二つの重要な主要段階がある：１）生体に組織の障碍が現れた場合（たとえば炎症、悪性腫瘍など）、細胞内のＡＴＰが大量に細胞外に放出され、これらのＡＴＰは細胞外のヌクレオチド加水分解酵素ＣＤ３９によって加水分解されてＡＤＰとＡＭＰになる；２）ＡＭＰはさらにＣＤ７３の協同作用下において脱リン酸化されて免疫抑制のアデノシンが生成する。
【0004】
ＣＤ７３はＮＴ５Ｅ遺伝子によってコードされる細胞外－５’－ヌクレオチダーゼで、分子量が７０ｋＤで、生体のアデノシン生成の主な律速酵素の一つである。ＣＤ７３の発現は低酸素誘導因子－１（ＨＩＦ－１）、ＴＧＦ－β、ＥＧＦＲ、ＡＫＴ、β－カテニンなどの分子によって調節され、中でも、転写因子の機能を果たすＨＩＦ－１が最も重要である。低酸素（Ｈｙｐｏｘｉａ）は腫瘍微小環境の一つの重要な特徴で、腫瘍微小環境においてＨＩＦ－１の情報調節が誘導され、そしてＣＤ７３の腫瘍における広い発現につながる。そのため、研究では、ＣＤ７３は、乳癌、肺癌、卵巣癌、結腸直腸癌、腎臓癌、胃癌、頭頸部癌などを含む、多くの腫瘍の表面に過剰発現され、そして腫瘍の予後不良と密接に関連することが見出された。
【0005】
臨床前の研究では、ＣＤ７３を抑制すると、Ｔ細胞の活性が刺激され、そしてアデノシン調節のＴ細胞およびほかの免疫細胞のレベルの抗腫瘍免疫モニタリングが増強することが示された。腫瘍微小環境（ＴＭＥ）の免疫エフェクター細胞に対する抑制作用の解除は免疫療法の薬剤耐性を克服し、治療効果を向上させることにおける重要な一面である。
【0006】
しかしながら、本分野の数多い抗ＣＤ７３抗体はまだ不足が多く存在する。そのため、本分野では、患者の治療に適する抗ＣＤ７３抗体の開発が切望されている。
【発明の概要】
【0007】
本発明の目的は、ヒトＣＤ７３と結合する抗体、その製造方法と使用を提供することにある。
【0008】
本発明の第一の側面では、抗ヒトＣＤ７３抗体またはその抗原結合断片であって、以下のような重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含むものを提供する：
前記重鎖可変領域は、３つの重鎖相補性決定領域ＣＤＲを含み：
配列番号１０で示されるＨＣＤＲ１、
配列番号１１で示されるＨＣＤＲ２、
配列番号１２で示されるＨＣＤＲ３、または
配列番号１６で示されるＨＣＤＲ１、
配列番号１７で示されるＨＣＤＲ２、
配列番号１８で示されるＨＣＤＲ３；ならびに
前記軽鎖可変領域は、３つの軽鎖相補性決定領域ＣＤＲを含む：
配列番号１３で示されるＬＣＤＲ１、
配列番号１４で示されるＬＣＤＲ２、
配列番号１５で示されるＬＣＤＲ３、または
配列番号１９で示されるＬＣＤＲ１、
配列番号２０で示されるＬＣＤＲ２、
配列番号２１で示されるＬＣＤＲ３。
前記重鎖可変領域は、３つの重鎖相補性決定領域ＣＤＲを含み：
配列番号１０で示されるＨＣＤＲ１、
配列番号１１で示されるＨＣＤＲ２、
配列番号１２で示されるＨＣＤＲ３、または
配列番号１６で示されるＨＣＤＲ１、
配列番号１７で示されるＨＣＤＲ２、
配列番号１８で示されるＨＣＤＲ３；ならびに
前記軽鎖可変領域は、３つの軽鎖相補性決定領域ＣＤＲを含む：
配列番号１３で示されるＬＣＤＲ１、
配列番号１４で示されるＬＣＤＲ２、
配列番号１５で示されるＬＣＤＲ３、または
配列番号１９で示されるＬＣＤＲ１、
配列番号２０で示されるＬＣＤＲ２、
配列番号２１で示されるＬＣＤＲ３。
【0009】
前記抗体またはその抗原結合断片のアミノ酸配列のうちの任意の一つのアミノ酸配列は、さらに、任意に少なくとも一つのアミノ酸の付加、欠失、修飾および／または置換がありながら、ＣＤ７３結合親和力を維持する誘導配列を含む。
【0010】
もう一つの好適な例において、上記のいずれのＣＤＲのアミノ酸配列も１、２または３個のアミノ酸の付加、欠失、修飾および／または置換を経た誘導ＣＤＲ配列を含み、かつ前記誘導ＣＤＲ配列のＶＨおよびＶＬからなる誘導抗体がＣＤ７３に結合する親和力を維持するようになっている。
【0011】
もう一つの好適な例において、前記付加、欠失、修飾および／または置換のアミノ酸の数は１－５個（たとえば１－３個、好ましくは１－２個、より好ましくは１個）である。
【0012】
もう一つの好適な例において、前記抗体は重鎖および軽鎖を含み、前記抗体の重鎖は前記の３つの重鎖相補性決定領域ＣＤＲおよび重鎖を連結するための重鎖フレームワーク領域を、そして前記の抗体の軽鎖は前記の３つの軽鎖相補性決定領域ＣＤＲおよび軽鎖を連結するための軽鎖フレームワーク領域を含む。
【0013】
もう一つの好適な例において、前記の重鎖可変領域は配列番号１、４、６、９、２４または２８で示されるアミノ酸配列、好ましくは配列番号１、４、６または９で示されるアミノ酸配列を有する。
【0014】
もう一つの好適な例において、前記重鎖は、さらに、重鎖定常領域を含む。
【0015】
もう一つの好適な例において、前記重鎖定常領域は、ヒト由来またはネズミ由来のものである。
【0016】
もう一つの好適な例において、前記重鎖定常領域はヒト由来抗体重鎖ＩｇＧ１またはＩｇＧ４の定常領域である。
【0017】
もう一つの好適な例において、前記重鎖定常領域の配列は配列番号３１で示される。
【0018】
もう一つの好適な例において、前記軽鎖可変領域は配列番号２、３、５、７、８、２６または３０で示されるアミノ酸配列、好ましくは配列番号２、３、５、７または８で示されるアミノ酸配列を有する。
【0019】
もう一つの好適な例において、前記軽鎖は、さらに、軽鎖定常領域を含む。
【0020】
もう一つの好適な例において、前記軽鎖定常領域は、ヒト由来またはマウス由来のものである。
【0021】
もう一つの好適な例において、前記軽鎖定常領域はヒト由来抗体軽鎖κまたはλの定常領域である。
【0022】
もう一つの好適な例において、前記軽鎖定常領域の配列は配列番号３２で示される。
【0023】
もう一つの好適な例において、前記の抗体は、さらに、重鎖定常領域および／または軽鎖定常領域を含む。
【0024】
もう一つの好適な例において、前記の重鎖定常領域はヒト由来のもので、かつ／または前記の軽鎖定常領域はヒト由来のものである。
【0025】
もう一つの好適な例において、前記重鎖定常領域はヒト由来抗体重鎖ＩｇＧ４（Ｓ２２８Ｐ）定常領域で、かつ前記軽鎖定常領域はヒト由来抗体軽鎖κ定常領域である。
【0026】
もう一つの好適な例において、前記抗体の重鎖定常領域はさらにヒト由来のフレームワーク領域を含み、かつ／または前記抗体の軽鎖定常領域はさらにヒト由来のフレームワーク領域を含む。
【0027】
もう一つの好適な例において、前記抗体の重鎖定常領域はさらにネズミ由来のフレームワーク領域を含み、かつ／または前記抗体の軽鎖定常領域はさらにネズミ由来のフレームワーク領域を含む。
【0028】
もう一つの好適な例において、前記抗体は、動物由来の抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、全ヒト抗体、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる。
【0029】
もう一つの好適な例において、前記の抗体は部分的にまたは全部ヒト化したモノクローナル抗体、あるいは全ヒトのモノクローナル抗体である。
【0030】
もう一つの好適な例において、前記の抗体は二本鎖抗体、または一本鎖抗体である。
【0031】
もう一つの好適な例において、前記抗体は抗体の全長タンパク質、または抗原結合断片である。
【0032】
もう一つの好適な例において、前記抗原結合断片は、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｖ断片を含む。
【0033】
もう一つの好適な例において、前記抗体は二重特異性抗体、または多重特異性抗体である。
【0034】
もう一つの好適な例において、前記の抗体は、薬物複合体の形態である。
【0035】
もう一つの好適な例において、前記の抗体または抗原結合断片は重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、前記の重鎖可変領域は以下の３つの相補性決定領域ＣＤＲを含み：
配列番号１０で示されるＨＣＤＲ１、
配列番号１１で示されるＨＣＤＲ２、
配列番号１２で示されるＨＣＤＲ３；および
前記の軽鎖可変領域は以下の３つの相補性決定領域ＣＤＲを含み：
配列番号１３で示されるＬＣＤＲ１、
配列番号１４で示されるＬＣＤＲ２、
配列番号１５で示されるＬＣＤＲ３；あるいは
前記の重鎖可変領域は以下の３つの相補性決定領域ＣＤＲを含み：
配列番号１６で示されるＨＣＤＲ１、
配列番号１７で示されるＨＣＤＲ２、
配列番号１８で示されるＨＣＤＲ３；および
前記の軽鎖可変領域は以下の３つの相補性決定領域ＣＤＲを含む：
配列番号１９で示されるＬＣＤＲ１、
配列番号２０で示されるＬＣＤＲ２、
配列番号２１で示されるＬＣＤＲ３。
配列番号１０で示されるＨＣＤＲ１、
配列番号１１で示されるＨＣＤＲ２、
配列番号１２で示されるＨＣＤＲ３；および
前記の軽鎖可変領域は以下の３つの相補性決定領域ＣＤＲを含み：
配列番号１３で示されるＬＣＤＲ１、
配列番号１４で示されるＬＣＤＲ２、
配列番号１５で示されるＬＣＤＲ３；あるいは
前記の重鎖可変領域は以下の３つの相補性決定領域ＣＤＲを含み：
配列番号１６で示されるＨＣＤＲ１、
配列番号１７で示されるＨＣＤＲ２、
配列番号１８で示されるＨＣＤＲ３；および
前記の軽鎖可変領域は以下の３つの相補性決定領域ＣＤＲを含む：
配列番号１９で示されるＬＣＤＲ１、
配列番号２０で示されるＬＣＤＲ２、
配列番号２１で示されるＬＣＤＲ３。
【0036】
もう一つの好適な例において、前記抗体の重鎖可変領域は１、４、６、９、２４または２８のいずれかで示されるアミノ酸配列を含み、ならびに／あるいは前記の軽鎖可変領域は２、３、５、７、８、２６または３０のいずれかで示されるアミノ酸配列を含む。
【0037】
もう一つの好適な例において、前記抗体の重鎖可変領域は配列番号１で示されるアミノ酸配列を含み、かつ前記抗体の軽鎖可変領域は配列番号２で示されるアミノ酸配列を含むか、あるいは重鎖可変領域は配列番号１で示されるアミノ酸配列を含み、かつ軽鎖可変領域は配列番号３で示されるアミノ酸配列を含むか、あるいは重鎖可変領域は配列番号４で示されるアミノ酸配列を含み、かつ軽鎖可変領域は配列番号２で示されるアミノ酸配列を含むか、あるいは重鎖可変領域は配列番号４で示されるアミノ酸配列を含み、かつ軽鎖可変領域は配列番号５で示されるアミノ酸配列を含むか、あるいは重鎖可変領域は配列番号４で示されるアミノ酸配列を含み、かつ軽鎖可変領域は配列番号３で示されるアミノ酸配列を含むか、あるいは重鎖可変領域は配列番号６で示されるアミノ酸配列を含み、かつ軽鎖可変領域は配列番号７で示されるアミノ酸配列を含むか、あるいは重鎖可変領域は配列番号６で示されるアミノ酸配列を含み、かつ軽鎖可変領域は配列番号８で示されるアミノ酸配列を含むか、あるいは重鎖可変領域は配列番号９で示されるアミノ酸配列を含み、かつ軽鎖可変領域は配列番号８で示されるアミノ酸配列を含む。
【0038】
もう一つの好適な例において、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号１、４、６、９、２４または２８で示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列相同性または配列同一性を有する。
【0039】
もう一つの好適な例において、前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列表における配列番号２、３、５、７、８、２６または３０で示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列相同性または配列同一性を有する。
【0040】
もう一つの好適な例において、前記抗体はヒト化抗体で、前記抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）は表３に記載のアミノ酸配列から選ばれるものを含む。
【0041】
もう一つの好適な例において、前記抗体のヒトＣＤ７３タンパク質との結合エピトープはＣＤ７３細胞外領域（配列番号２２）に相応する以下の群から選ばれる部位を含む：
１３２番目のチロシン（Ｙ１３２）、１３３番目のロイシン（Ｌ１３３）、１３９番目のプロリン（Ｐ１３９）、１３７番目のバリン（Ｖ１３７）、１８１番目のロイシン（Ｌ１８１）、１８４番目のロイシン（Ｌ１８４）、１４４番目のバリン（Ｖ１４４）、１８０番目のリシン（Ｋ１８０）。
１３２番目のチロシン（Ｙ１３２）、１３３番目のロイシン（Ｌ１３３）、１３９番目のプロリン（Ｐ１３９）、１３７番目のバリン（Ｖ１３７）、１８１番目のロイシン（Ｌ１８１）、１８４番目のロイシン（Ｌ１８４）、１４４番目のバリン（Ｖ１４４）、１８０番目のリシン（Ｋ１８０）。
【0042】
本発明の第二の側面では、組み換えタンパク質であって、以下のものを含むタンパク質を提供する：
（ｉ）本発明の第一の側面に記載の抗体またはその抗原結合断片、ならびに
（ｉｉ）任意の発現および／または精製を補助するタグ配列。
（ｉ）本発明の第一の側面に記載の抗体またはその抗原結合断片、ならびに
（ｉｉ）任意の発現および／または精製を補助するタグ配列。
【0043】
もう一つの好適な例において、前記のタグ配列は６×Ｈｉｓタグを含む。
【0044】
もう一つの好適な例において、前記の組み換えタンパク質（またはポリペプチド）は融合タンパク質を含む。
【0045】
もう一つの好適な例において、前記の組み換えタンパク質は、単量体、二量体、または多量体である。
【0046】
もう一つの好適な例において、前記組み換えタンパク質は、
（ｉ）以下の群から選ばれる抗体であって、前記抗体の重鎖可変領域は１、４、６、９、２４または２８のいずれかで示されるアミノ酸配列を含み、ならびに／あるいは前記の軽鎖可変領域は２、３、５、７、８、２６または３０のいずれかで示されるアミノ酸配列を含むものと、（ｉｉ）任意に発現および／または精製を補助するタグ配列とを含む。
（ｉ）以下の群から選ばれる抗体であって、前記抗体の重鎖可変領域は１、４、６、９、２４または２８のいずれかで示されるアミノ酸配列を含み、ならびに／あるいは前記の軽鎖可変領域は２、３、５、７、８、２６または３０のいずれかで示されるアミノ酸配列を含むものと、（ｉｉ）任意に発現および／または精製を補助するタグ配列とを含む。
【0047】
もう一つの好適な例において、前記組み換えタンパク質は、さらに、ほかの標的に結合する抗体またはその抗原結合断片、たとえば、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１に結合する抗体またはその抗原結合断片を含む。
【0048】
本発明の第三の側面では、以下の群から選ばれるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する：
（１） 本発明の第一の側面の抗体またはその抗原結合断片、ならびに
（２） 本発明の第二の側面に記載の組み換えタンパク質。
（１） 本発明の第一の側面の抗体またはその抗原結合断片、ならびに
（２） 本発明の第二の側面に記載の組み換えタンパク質。
【0049】
もう一つの好適な例において、前記重鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドは配列番号２３、２７、３３、３６、３８、４１で示され、ならびに／あるいは前記軽鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドは配列番号２５、２９、３４、３５、３７、３９、４０で示される。
【0050】
本発明の第四の側面では、本発明の第三の側面に記載のポリヌクレオチドを含有するベクターを提供する。
【0051】
もう一つの好適な例において、前記のベクターは、細菌プラスミド、ファージ、酵母プラスミド、植物細胞ウイルス、哺乳動物細胞ウイルス、たとえばアデノウイルス、レトロウイルス、またはほかのベクターを含む。
【0052】
本発明の第五の側面では、遺伝子工学化された宿主細胞であって、本発明の第四の側面に記載のベクターを含むか、あるいはゲノムに本発明の第三の側面に記載のポリヌクレオチドが組み込まれた宿主細胞を提供する。
【0053】
本発明の第六の側面では、以下のものを含有する抗体複合体を提供する：
（ａ） 本発明の第一の側面に記載の抗体またはその抗原結合断片、ならびに
（ｂ） 検出可能なマーカー、薬物、毒素、サイトカイン、放射性核種、酵素、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる、前記抗体部分と複合する複合部分。
（ａ） 本発明の第一の側面に記載の抗体またはその抗原結合断片、ならびに
（ｂ） 検出可能なマーカー、薬物、毒素、サイトカイン、放射性核種、酵素、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる、前記抗体部分と複合する複合部分。
【0054】
もう一つの好適な例において、前記の抗体部分と前記の複合部分は化学結合またはリンカーを介して複合している。
【0055】
本発明の第七の側面では、ＣＡＲ構築物であって、前記ＣＡＲ構築物のモノクローナル抗体の抗原結合領域のｓｃＦｖ断片はＣＤ７３に特異的に結合する結合領域で、かつ
前記ｓｃＦｖの重鎖可変領域は以下の３つの相補性決定領域ＣＤＲを含み：
配列番号１０で示されるＨＣＤＲ１、
配列番号１１で示されるＨＣＤＲ２、
配列番号１２で示されるＨＣＤＲ３；および
前記ｓｃＦｖの軽鎖可変領域は以下の３つの相補性決定領域ＣＤＲを含み：
配列番号１３で示されるＬＣＤＲ１、
配列番号１４で示されるＬＣＤＲ２、
配列番号１５で示されるＬＣＤＲ３；あるいは
前記ｓｃＦｖの重鎖可変領域は以下の３つの相補性決定領域ＣＤＲを含み：
配列番号１６で示されるＨＣＤＲ１、
配列番号１７で示されるＨＣＤＲ２、
配列番号１８で示されるＨＣＤＲ３；および
前記ｓｃＦｖの軽鎖可変領域は以下の３つの相補性決定領域ＣＤＲを含む：
配列番号１９で示されるＬＣＤＲ１、
配列番号２０で示されるＬＣＤＲ２、
配列番号２１で示されるＬＣＤＲ３。
前記ｓｃＦｖの重鎖可変領域は以下の３つの相補性決定領域ＣＤＲを含み：
配列番号１０で示されるＨＣＤＲ１、
配列番号１１で示されるＨＣＤＲ２、
配列番号１２で示されるＨＣＤＲ３；および
前記ｓｃＦｖの軽鎖可変領域は以下の３つの相補性決定領域ＣＤＲを含み：
配列番号１３で示されるＬＣＤＲ１、
配列番号１４で示されるＬＣＤＲ２、
配列番号１５で示されるＬＣＤＲ３；あるいは
前記ｓｃＦｖの重鎖可変領域は以下の３つの相補性決定領域ＣＤＲを含み：
配列番号１６で示されるＨＣＤＲ１、
配列番号１７で示されるＨＣＤＲ２、
配列番号１８で示されるＨＣＤＲ３；および
前記ｓｃＦｖの軽鎖可変領域は以下の３つの相補性決定領域ＣＤＲを含む：
配列番号１９で示されるＬＣＤＲ１、
配列番号２０で示されるＬＣＤＲ２、
配列番号２１で示されるＬＣＤＲ３。
【0056】
本発明の第八の側面では、外来の本発明の第七の側面に記載のＣＡＲ構築物を発現する組み換え免疫細胞を提供する。
【0057】
もう一つの好適な例において、前記の免疫細胞は、ＮＫ細胞、Ｔ細胞を含む。
【0058】
もう一つの好適な例において、前記の免疫細胞はヒトまたはヒト以外の哺乳動物（たとえばマウス）由来のものである。
【0059】
本発明の第九の側面では、以下のものを含有する薬物組成物を提供する：
（ｉ） 本発明第一の側面に記載の抗体またはその抗原結合断片、本発明第二の側面に記載の組み換えタンパク質、本発明の第六の側面に記載の抗体複合体、本発明の第八の側面に記載の組み換え免疫細胞、あるいはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる、活性成分；ならびに
（ｉｉ） 薬学的に許容される担体。
（ｉ） 本発明第一の側面に記載の抗体またはその抗原結合断片、本発明第二の側面に記載の組み換えタンパク質、本発明の第六の側面に記載の抗体複合体、本発明の第八の側面に記載の組み換え免疫細胞、あるいはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる、活性成分；ならびに
（ｉｉ） 薬学的に許容される担体。
【0060】
もう一つの好適な例において、前記の薬物組成物は液体製剤である。
【0061】
もう一つの好適な例において、前記の薬物組成物は注射剤である。
【0062】
もう一つの好適な例において、前記の薬物組成物、さらに、（ｉｉｉ）ほかの活性成分、好ましくはほかの標的に結合する抗体またはその抗原結合断片、より好ましくはＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１に結合する抗体またはその抗原結合断片を含む。
【0063】
本発明の第十の側面では、体外においてサンプルにおけるＣＤ７３タンパク質を検出する方法であって、以下の工程を含む方法を提供する：
（１） 体外において、前記サンプルを本発明第一の側面に記載の抗体または本発明の第六の側面に記載の抗体複合体と接触させる；
（２） 抗原－抗体複合体が形成したか検出し、ここで、複合体が形成したというのはサンプルにＣＤ７３タンパク質が存在することを意味する。
（１） 体外において、前記サンプルを本発明第一の側面に記載の抗体または本発明の第六の側面に記載の抗体複合体と接触させる；
（２） 抗原－抗体複合体が形成したか検出し、ここで、複合体が形成したというのはサンプルにＣＤ７３タンパク質が存在することを意味する。
【0064】
本発明の第十一の側面では、以下のものを含む薬物の組み合わせを提供する：
（ｉ）本発明の第一の側面に記載の抗体、本発明の第六の側面に記載の抗体複合体、本発明の第八の側面に記載の組み換え免疫細胞、または本発明の第九の側面に記載の薬物組成物、あるいはこれらの組み合わせを含む第一活性成分；
（ｉｉ）第二抗体、または化学治療剤を含む第二活性成分。
（ｉ）本発明の第一の側面に記載の抗体、本発明の第六の側面に記載の抗体複合体、本発明の第八の側面に記載の組み換え免疫細胞、または本発明の第九の側面に記載の薬物組成物、あるいはこれらの組み合わせを含む第一活性成分；
（ｉｉ）第二抗体、または化学治療剤を含む第二活性成分。
【0065】
もう一つの好適な例において、前記第二抗体はＣＴＬＡ４抗体、ＰＤ－１抗体、ＰＤ－Ｌ１抗体からなる群から選ばれる。
【0066】
もう一つの好適な例において、前記の第二抗体はＰＤ－１抗体である。
【0067】
もう一つの好適な例において、前記化学治療剤は、ドセタキセル、カルボプラチン、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる。
【0068】
本発明の第十二の側面では、本発明の第一の側面に記載の抗体またはその抗原結合断片、本発明の第二の側面に記載の組み換えタンパク質、本発明の第六の側面に記載の抗体複合体、本発明の第八の側面に記載の組み換え免疫細胞、本発明の第十二の側面に記載の薬物の組み合わせの使用であって、（ａ）試薬またはキットの製造、ならびに／あるいは（ｂ）ＣＤ７３関連疾患を予防および／または治療する薬物の製造のための使用を提供する。
【0069】
本発明の第十三の側面では、ＣＤ７３関連疾患を予防および／または治療する方法であって、必要な対象に本発明の第一の側面に記載の抗体、本発明の第六の側面に記載の抗体複合体、本発明の第八の側面に記載の組み換え免疫細胞、または本発明の第九のの側面に記載の薬物組成物を施用する工程を含む方法を提供する。
【0070】
もう一つの好適な例において、前記ＣＤ７３関連疾患は以下の群から選ばれる：
血液癌、リンパ癌、悪性膠細胞腫、黒色腫、皮膚癌、胃癌、消化管間質腫瘍、肝臓癌、胆管癌、胆嚢癌、腹膜癌、結腸直腸癌、小腸癌、肛門癌、多発性骨髄腫、膵癌、乳癌、卵巣癌、子宮癌、子宮頸癌、膣癌、膀胱癌、腎臓癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、前立腺癌、睾丸癌、陰茎癌、甲状腺癌、頭・頚部癌、食道癌、骨癌、肉腫。
血液癌、リンパ癌、悪性膠細胞腫、黒色腫、皮膚癌、胃癌、消化管間質腫瘍、肝臓癌、胆管癌、胆嚢癌、腹膜癌、結腸直腸癌、小腸癌、肛門癌、多発性骨髄腫、膵癌、乳癌、卵巣癌、子宮癌、子宮頸癌、膣癌、膀胱癌、腎臓癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、前立腺癌、睾丸癌、陰茎癌、甲状腺癌、頭・頚部癌、食道癌、骨癌、肉腫。
【0071】
もちろん、本発明の範囲内において、本発明の上記の各技術特徴および下記（たとえば実施例）の具体的に記述された各技術特徴は互いに組合せ、新しい、または好適な技術方案を構成できることが理解される。紙数に限りがあるため、ここで逐一説明しない。
【図面の簡単な説明】
【0072】
【0073】
具体的な実施形態
本発明者らは、幅広く深く研究し、大量のスクリーニングを行ったところ、初めて抗ＣＤ７３抗体およびそのヒト化抗体を得た。本発明の抗ＣＤ７３抗体は優れた生物活性を有し、ＣＤ７３の酵素活性を抑制することによってアデノシンの生成を遮断することで直接アデノシンが媒介する免疫抑制を破壊することができる。特に、本発明のＣＤ７３を標的とするヒト化抗体はＰＤ１を標的とする抗体と併用すると、協同作用があり、各薬物のそれぞれの治療効果を増強することができる。これに基づき、本発明を完成させた。
本発明者らは、幅広く深く研究し、大量のスクリーニングを行ったところ、初めて抗ＣＤ７３抗体およびそのヒト化抗体を得た。本発明の抗ＣＤ７３抗体は優れた生物活性を有し、ＣＤ７３の酵素活性を抑制することによってアデノシンの生成を遮断することで直接アデノシンが媒介する免疫抑制を破壊することができる。特に、本発明のＣＤ７３を標的とするヒト化抗体はＰＤ１を標的とする抗体と併用すると、協同作用があり、各薬物のそれぞれの治療効果を増強することができる。これに基づき、本発明を完成させた。
【0074】
用語
本発明において、用語「抗体（Ａｎｔｉｂｏｄｙ、略称Ａｂ）」と「免疫グロブリンＧ（Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｇ、略称ＩｇＧ）」は同様な構造上の特徴のヘテロテトラマーの糖タンパク質で、２本の同様の軽鎖（Ｌ）と２本の同様の重鎖（Ｈ）からなるものである。各軽鎖は、重鎖に１つの共有ジスルフィド結合によって結合しているが、重鎖間のジスルフィド結合の数は、免疫グロブリンのアイソタイプ（ｉｓｏｔｙｐｅ）によるものである。各重鎖および軽鎖も、それぞれ一定の間隔の鎖内ジスルフィド結合を有する。各重鎖は、一方の末端に可変領域（ＶＨ）を有し、その先が定常領域で、重鎖の定常領域は三つのドメインＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３で構成される。各軽鎖は、一方の末端に可変領域（ＶＬ）を有し、他方の末端に定常領域を有し、軽鎖の定常領域は一つのドメインＣＬを含む。軽鎖の定常領域は重鎖定常領域のＣＨ１ドメインと、軽鎖の可変領域は重鎖の可変領域と対応している。定常領域は、抗体と抗原との結合には直接関与しないが、たとえば、抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ＡＤＣＣ、ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｅｌｌ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）などに関与し、異なるエフェクター機能を示す。重鎖定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４といったサブタイプを含み、軽鎖定常領域は、κ（Ｋａｐｐａ）またはλ（Ｌａｍｂｄａ）を含む。抗体の重鎖と軽鎖は、重鎖のＣＨ１ドメインと軽鎖のＣＬドメインの間のジスルフィドを介して共有結合し、抗体の二つの重鎖は、ヒンジ領域の間で形成したポリペプチド間ジスルフィドを介して共有結合する。本発明は、完全の抗体だけではなく、免疫活性を有する抗体の断片または抗体とほかの配列からなる融合タンパク質も含む。そのため、本発明は、さらに、前記抗体の断片、誘導体および類似体を含む。本発明において、抗体は、単特異性、二重特異性、三重特異性、またはそれ以上の多重特異性でもよい。
本発明において、用語「抗体（Ａｎｔｉｂｏｄｙ、略称Ａｂ）」と「免疫グロブリンＧ（Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｇ、略称ＩｇＧ）」は同様な構造上の特徴のヘテロテトラマーの糖タンパク質で、２本の同様の軽鎖（Ｌ）と２本の同様の重鎖（Ｈ）からなるものである。各軽鎖は、重鎖に１つの共有ジスルフィド結合によって結合しているが、重鎖間のジスルフィド結合の数は、免疫グロブリンのアイソタイプ（ｉｓｏｔｙｐｅ）によるものである。各重鎖および軽鎖も、それぞれ一定の間隔の鎖内ジスルフィド結合を有する。各重鎖は、一方の末端に可変領域（ＶＨ）を有し、その先が定常領域で、重鎖の定常領域は三つのドメインＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３で構成される。各軽鎖は、一方の末端に可変領域（ＶＬ）を有し、他方の末端に定常領域を有し、軽鎖の定常領域は一つのドメインＣＬを含む。軽鎖の定常領域は重鎖定常領域のＣＨ１ドメインと、軽鎖の可変領域は重鎖の可変領域と対応している。定常領域は、抗体と抗原との結合には直接関与しないが、たとえば、抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ＡＤＣＣ、ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｅｌｌ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）などに関与し、異なるエフェクター機能を示す。重鎖定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４といったサブタイプを含み、軽鎖定常領域は、κ（Ｋａｐｐａ）またはλ（Ｌａｍｂｄａ）を含む。抗体の重鎖と軽鎖は、重鎖のＣＨ１ドメインと軽鎖のＣＬドメインの間のジスルフィドを介して共有結合し、抗体の二つの重鎖は、ヒンジ領域の間で形成したポリペプチド間ジスルフィドを介して共有結合する。本発明は、完全の抗体だけではなく、免疫活性を有する抗体の断片または抗体とほかの配列からなる融合タンパク質も含む。そのため、本発明は、さらに、前記抗体の断片、誘導体および類似体を含む。本発明において、抗体は、単特異性、二重特異性、三重特異性、またはそれ以上の多重特異性でもよい。
【0075】
本発明において、「モノクローナル抗体」とは、１種類のほぼ均一なコロニーから得られた抗体のことで、すなわち、少数のあり得る自然発生の突然変異以外、このコロニーに含まれる単独の抗体が同様である。モノクローナル抗体は、高度特異的に単一の抗原部位に対するものである。そして、通常のポリクローナル抗体製剤（通常は異なる抗原決定基に対する異なる抗体である）と違い、各モノクローナル抗体は、抗原における単一の抗原決定基にたいするものである。それらの特異性以外、モノクローナル抗体の利点は、ハイブリドーマの培養によって合成されるので、他の免疫グロブリンに汚染される恐れがないことにある。修飾語の「モノクローナル」は、抗体の特性を表し、ほぼ均一な抗体コロニーから得られることで、何らかの特殊な方法で抗体を生産する必要があると理解されるべきではない。
【0076】
本発明の「抗原結合断片」とは、特定の抗原に結合できる抗体活性断片、好適にヒトＣＤ７３と特異的に結合する抗体の断片である。本発明の抗原結合断片の例は、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｖ断片などを含む。Ｆａｂ断片はパパインで抗体を消化することによって生じる断片である。Ｆ（ａｂ’）２断片はペプシンで抗体を消化することによって生じる断片である。Ｆｖ断片は抗体の重鎖可変領域と軽鎖可変領域が密接に非共有的にカップリングした二量体からなる。
【0077】
本発明において、用語「Ｆａｂ」および「Ｆｃ」とは、パパインで抗体を二つの完全に同様のＦａｂ断片および一つのＦｃ断片に分解することである。Ｆａｂ断片は、抗体の重鎖のＶＨとＣＨ１および軽鎖のＶＬとＣＬドメインからなるものである。Ｆｃ断片、すなわち、フラグメント結晶化可能（ｆｒａｇｍｅｎｔ ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｂｌｅ、Ｆｃ）断片は、抗体のＣＨ２とＣＨ３ドメインからなるものである。Ｆｃ断片は、抗原結合活性がなく、抗体がエフェクター分子または細胞と相互作用する部位である。
【0078】
本発明において、用語「ｓｃＦｖ」は一本鎖抗体（ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｆｒａｇｍｅｎｔ、ｓｃＦｖ）で、抗体の重鎖可変領域と軽鎖可変領域が、通常、１５～２５のアミノ酸からなる連結する連結短鎖ペプチド（リンカー）を介して連結してなる。
【0079】
本発明の「ネズミ由来抗体」とは、ラットまたはマウス由来抗体のことで、マウスが好ましい。本発明のネズミ由来抗体は、ヒトＣＤ７３を抗原として使用してマウスを免疫させ、そしてハイブリドーマ細胞のスクリーニングを行って得られるものである。
【0080】
本発明の「キメラ抗体」とは、一つの種由来の重鎖と軽鎖の可変領域の配列および別の種由来の定常領域の配列を含む抗体のことで、たとえば、ヒトの定常領域と連結したネズミの重鎖と軽鎖の可変領域を有する抗体が挙げられる。
【0081】
本発明において、「可変」とは、抗体において可変領域のある部分が配列で異なっており、これによって各特定の抗体のその特定の抗原に対する結合および特異性が構成されることを指す。しかし、可変性は、均一に抗体の可変領域全体に分布しているわけではない。重鎖可変領域と軽鎖可変領域における相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ－ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ、ＣＤＲ）または超可変領域と呼ばれる三つの断片に集中している。可変領域において、比較的に保存的な部分は、フレームワーク領域（ｆｒａｍｅ ｒｅｇｉｏｎ、ＦＲ）と呼ばれる。天然の重鎖および軽鎖の可変領域に、それぞれ、基本的にβシート構造となっており、連結ループを形成する３つのＣＤＲで連結され、場合によって部分βシート構造となる４つのＦＲ領域が含まれる。各鎖におけるＣＤＲは、ＦＲ領域で密接し、かつ他方の鎖のＣＤＲと一緒に抗体の抗原結合部位（Ｋａｂａｔら、ＮＩＨ Ｐｕｂｌ．Ｎｏ．９１－３２４２、卷Ｉ、６４７－６６９頁（１９９１））参照する）を形成している。
【0082】
本発明の「ヒト化抗体」とは、そのＣＤＲが非ヒト種（好ましくはマウス）由来で、抗体分子における残りの部分（フレームワーク領域および定常領域を含む）がヒト由来の抗体のことである。また、フレームワーク領域の残基は結合親和性が維持するように変えられてもよい。
【0083】
本明細書で用いられるように、用語「フレームワーク領域」（ＦＲ）とはＣＤＲ間に挿入されるアミノ酸配列で、すなわち、単一の種において異なるグロブリンの間で比較的に保守的なグロブリンの軽鎖と重鎖可変領域のそれらの部分である。グロブリンの軽鎖と重鎖は、それぞれ４つのＦＲを有し、それぞれＦＲ１－Ｌ、ＦＲ２－Ｌ、ＦＲ３－Ｌ、ＦＲ４－ＬおよびＦＲ１－Ｈ、ＦＲ２－Ｈ、ＦＲ３－Ｈ、ＦＲ４－Ｈと呼ばれる。相応的に、軽鎖可変ドメインは（ＦＲ１－Ｌ）－（ＣＤＲ１－Ｌ）－（ＦＲ２－Ｌ）－（ＣＤＲ２－Ｌ）－（ＦＲ３－Ｌ）－（ＣＤＲ３－Ｌ）－（ＦＲ４－Ｌ）と、かつ重鎖可変ドメインは（ＦＲ１－Ｈ）－（ＣＤＲ１－Ｈ）－（ＦＲ２－Ｈ）－（ＣＤＲ２－Ｈ）－（ＦＲ３－Ｈ）－ （ＣＤＲ３－Ｈ）－（ＦＲ４－Ｈ）と表示される。好適に、本発明のＦＲはヒト抗体ＦＲまたはその誘導体で、前記ヒト抗体ＦＲの誘導体は天然に存在するヒト抗体ＦＲとほぼ同様で、すなわち、配列同一性が８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％に達する。ＣＤＲのアミノ酸配列が既知で、当業者は簡単にフレームワーク領域ＦＲ１－Ｌ、ＦＲ２－Ｌ、ＦＲ３－Ｌ、ＦＲ４－Ｌおよび／またはＦＲ１－Ｈ、ＦＲ２－Ｈ、ＦＲ３－Ｈ、ＦＲ４－Ｈを確定することができる。
【0084】
本明細書で用いられるように、用語「ヒトフレームワーク領域」は天然に存在するヒト抗体のフレームワーク領域とほぼ同様（約８５％またはそれ以上、具体的に、９０％、９５％、９７％、９９％または１００％）のフレームワーク領域である。
【0085】
本発明において、用語「抗」、「結合」、「特異的結合」とは、二つの分子の間の非ランダムの結合反応のことで、たとえば、抗体とその対する抗原の間の反応が挙げられる。通常、抗体は約１０－７Ｍ未満、たとえば、約１０－８Ｍ、１０－９Ｍ、１０－１０Ｍ、１０－１１Ｍ未満またはそれ以下の解離平衡定数（ＫＤ）で抗原に結合する。本発明において、用語「ＫＤ」とは特定の抗体－抗原相互作用の平衡解離定数で、抗体と抗原の間の結合親和力を表すためのものである。解離平衡定数が小さいほど、抗体－抗原の結合が緊密で、抗体と抗原の間の親和力が高い。たとえば、表面プラスモン共鳴技術（Ｓｕｒｆａｃｅ Ｐｌａｓｍｏｎ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ、略称ＳＰＲ）によってＢＩＡＣＯＲＥ装置で抗体と抗原の結合親和力を、あるいはＥＬＩＳＡ測定によって抗体と抗原の結合の相対的親和力を測定する。
【0086】
本発明において、用語「エピトープ」とは、抗体と特異的に結合するポリペプチドの抗原決定基のことである。本発明のエピトープは、抗原における抗体と結合する領域である。
【0087】
本発明において、本発明の抗体は、さらにその保存的変異体を含み、本発明の抗体のアミノ酸配列と比較すると、１０個以下、好ましくは８個以下、より好ましくは５個以下、最も好ましくは３個以下のアミノ酸が類似または近い性質を持つアミノ酸で置換されてなるポリペプチドをいう。これらの保存的突然変異のポリペプチドは、表Ａのようにアミノ酸の置換を行って生成することが好ましい。
【0088】
また、本発明は、上記抗体またはその断片または融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド分子を提供する。本発明のポリヌクレオチドは、ＤＮＡ形態でもＲＮＡ形態でもよい。ＤＮＡ形態は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたは人工合成のＤＮＡを含む。ＤＮＡは、一本鎖でも二本鎖でもよい。ＤＮＡは、コード鎖でも非コード鎖でもよい。
【0089】
本発明の抗体またはその断片のＤＮＡ分子の配列は、通常の技術で、たとえば、ＰＣＲ増幅 あるいはゲノムライブラリースクリーニングなどの方法によって得ることができる。また、軽鎖および重鎖のコード配列を一体に融合し、一本鎖抗体を形成してもよい。
【0090】
関連の配列を獲得すれば、組み換え法で大量に関連配列を獲得することができる。この場合、通常、その配列をベクターにクローンした後、細胞に導入し、さらに通常の方法で増殖させた宿主細胞から関連配列を単離して得る。
【0091】
また、特に断片の長さが短い場合、人工合成の方法で関連配列を合成してもよい。通常、まず多数の小さい断片を合成し、そして連接させることにより、配列の長い断片を得ることができる。
【0092】
現在、前記の本発明の抗体（またはその断片、あるいはその誘導体）をコードするＤＮＡ配列を全部化学合成で得ることがすでに可能である。さらに、このＤＮＡ配列を本分野で周知の各種の既知のＤＮＡ分子（あるいはベクターなど）や細胞に導入してもよい。また、化学合成で本発明のタンパク質配列に変異を導入することもできる。
【0093】
さらに、本発明は、上記の適当なＤＮＡ配列および適当なプロモーターあるいは制御配列を含むベクターに関する。これらのベクターは、タンパク質を発現するように、適当な宿主細胞の形質転換に用いることができる。
【0094】
ここで、前記ベクターは本分野の通常の発現ベクターで、適切な調節配列、たとえば、プロモーター配列、ターミネーター配列、ポリアデニル化配列、エンハンサー配列、マーカー遺伝子および／または配列、ならびにほかの適切な配列を含む発現ベクターのことである。前記発現ベクターは、ウイルスまたはプラスミド、たとえば、適切なファージまたはファージミドでもよいが、さらなる技術の詳細は、たとえば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第二版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９を参照する。多くの核酸操作の既知の技術およびプロトコールは、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，第二版，Ａｕｓｕｂｅｌら 編著を参照する。本発明の前記発現ベクターは、ｐＤＲ１、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）、ｐｃＤＮＡ３．１／ＺＥＯ（＋）、ｐＤＨＦＲ、ｐｃＤＮＡ４、ｐＤＨＦＦ、ｐＧＭ－ＣＳＦまたはｐＣＨＯ １．０が好ましい。
【0095】
本発明において、用語「宿主細胞」は本分野の通常の様々な宿主細胞で、ベクターが安定して自己複製し、かつ担持されるポリヌクレオチド分子が有効に発現されるようにさせることができればよい。中では、前記宿主細胞は原核発現細胞および真核発現細胞を含み、前記宿主細胞は、好ましくは、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＮＳ０、ｓｆ９、ｓｆ２１、ＤＨ５α、ＢＬ２１（ＤＥ３）、ＴＧ１、ＢＬ２１（ＤＥ３）、２９３Ｆまたは２９３Ｅ細胞を含む。
【0096】
抗体の製造
通常、本発明の抗体の発現に適切な条件で、形質転換で得られた宿主細胞を培養する。そして、通常のグロブリンの精製工程、例えばプロテインＡ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、分子篩クロマトグラフィーやアフィニティークロマトグラフィーなどの本分野の技術者に熟知の通常の分離精製手段で精製し、本発明のの抗体を得る。
通常、本発明の抗体の発現に適切な条件で、形質転換で得られた宿主細胞を培養する。そして、通常のグロブリンの精製工程、例えばプロテインＡ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、分子篩クロマトグラフィーやアフィニティークロマトグラフィーなどの本分野の技術者に熟知の通常の分離精製手段で精製し、本発明のの抗体を得る。
【0097】
得られたモノクローナル抗体は、通常の手段で同定することができる。たとえば、モノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降、あるいは体外結合試験（たとえば放射免疫測定（ＲＩＡ）または酵素結合免疫吸着測定（ＥＬＩＳＡ））で測定することができる。モノクローナル抗体の結合親和力は、例えばＭｕｎｓｏｎ等， Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０７：２２０（１９８０）のＳｃａｔｃｈａｒｄ分析で測定することができる。
【0098】
本発明の抗体は、細胞内又は細胞膜において発現し、或いは細胞外に分泌することができる。必要であれば、その物理・化学的特性およびほかの特性を利用して各種の単離方法で組み換えタンパク質を単離・精製することができる。これらの方法は、本分野の技術者に熟知である。これらの方法の例として、通用の再生処理、タンパク質沈殿剤による処理（塩析法）、遠心、浸透圧ショック、超音波処理、超遠心、分子篩クロマトグラフィー（ゲルろ過）、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）及びほかの各種の液体クロマトグラフィー技術、並びにこれらの方法の組合せを含むが、これらに限定されない。
【0099】
薬物組成物及び使用
さらに、本発明は組成物を提供する。好ましくは、前記の組成物は薬物組成物で、上記の抗体またはその活性断片あるいはその融合タンパク質と、薬学的に許容される担体とを含有する。通常、これらの物質を無毒で不活性で薬学的に許容される水系担体で配合し、ｐＨ値は配合される物質の性質および治療しようとする疾患にもよるが、ｐＨ値は通常５～８程度、好ましくは６～８程度である。配合された薬物組成物は通常の経路で給与することができ、静脈注射、静脈点滴、皮下注射、局部注射、筋肉注射、腫瘍内注射、腹腔内注射注射（たとえば、腹膜内）、頭蓋内注射、または腔内注射を含むが、これらに限定されない。本発明において、用語「薬物組成物」とは、本発明の抗ＣＤ７３抗体が薬学的に許容される担体と共に薬物製剤組成物を構成することによってより安定して治療効果を発揮することができ、これらの製剤は本発明で公開される抗ＣＤ７３抗体のアミノ酸コア配列の配座の完全性を保つと同時に、タンパク質の多くの官能基の分解（凝集、脱アミノまたは酸化を含むが、これらに限定されない）を防ぐことができる。本発明の薬物組成物は、安全有効量（たとえば０．００１～９９ｗｔ％、好ましくは０．０１～９０ｗｔ％、より好ましくは０．１～８０ｗｔ％）の本発明の上記の抗ＣＤ７３抗体（またはその複合体）と、薬学的に許容される担体または賦形剤とを含有する。このような担体は、食塩水、緩衝液、ブドウ糖、水、グリセリン、エタノール、およびこれらの組み合せを含むが、これらに限定されない。薬物の製剤は投与形態に相応する。本発明の薬物組成物は、注射剤としてもよく、たとえば生理食塩水またはブドウ糖およびほかの助剤を含有する水溶液で通常の方法によって製造することができる。薬物組成物は、注射剤、溶液の場合、無菌条件で製造する。活性成分の投与量は治療有効量、たとえば毎日約１０μｇ／ｋｇ体重～約５０ｍｇ／ｋｇ体重である。また、本発明の抗ＣＤ７３抗体は、ほかの治療剤、たとえば、ほかの免疫分子調節剤（たとえば、ＣＴＬＡ－４抗体、ＰＤ－１抗体）と併用することもできる。
さらに、本発明は組成物を提供する。好ましくは、前記の組成物は薬物組成物で、上記の抗体またはその活性断片あるいはその融合タンパク質と、薬学的に許容される担体とを含有する。通常、これらの物質を無毒で不活性で薬学的に許容される水系担体で配合し、ｐＨ値は配合される物質の性質および治療しようとする疾患にもよるが、ｐＨ値は通常５～８程度、好ましくは６～８程度である。配合された薬物組成物は通常の経路で給与することができ、静脈注射、静脈点滴、皮下注射、局部注射、筋肉注射、腫瘍内注射、腹腔内注射注射（たとえば、腹膜内）、頭蓋内注射、または腔内注射を含むが、これらに限定されない。本発明において、用語「薬物組成物」とは、本発明の抗ＣＤ７３抗体が薬学的に許容される担体と共に薬物製剤組成物を構成することによってより安定して治療効果を発揮することができ、これらの製剤は本発明で公開される抗ＣＤ７３抗体のアミノ酸コア配列の配座の完全性を保つと同時に、タンパク質の多くの官能基の分解（凝集、脱アミノまたは酸化を含むが、これらに限定されない）を防ぐことができる。本発明の薬物組成物は、安全有効量（たとえば０．００１～９９ｗｔ％、好ましくは０．０１～９０ｗｔ％、より好ましくは０．１～８０ｗｔ％）の本発明の上記の抗ＣＤ７３抗体（またはその複合体）と、薬学的に許容される担体または賦形剤とを含有する。このような担体は、食塩水、緩衝液、ブドウ糖、水、グリセリン、エタノール、およびこれらの組み合せを含むが、これらに限定されない。薬物の製剤は投与形態に相応する。本発明の薬物組成物は、注射剤としてもよく、たとえば生理食塩水またはブドウ糖およびほかの助剤を含有する水溶液で通常の方法によって製造することができる。薬物組成物は、注射剤、溶液の場合、無菌条件で製造する。活性成分の投与量は治療有効量、たとえば毎日約１０μｇ／ｋｇ体重～約５０ｍｇ／ｋｇ体重である。また、本発明の抗ＣＤ７３抗体は、ほかの治療剤、たとえば、ほかの免疫分子調節剤（たとえば、ＣＴＬＡ－４抗体、ＰＤ－１抗体）と併用することもできる。
【0100】
薬物組成物の使用時、安全有効量の抗ＣＤ７３抗体またはその免疫複合体を哺乳動物に施用するが、その安全有効量は、通常、少なくとも約１０μｇ／ｋｇ体重で、かつ多くの場合、約５０ｍｇ／ｋｇ体重未満で、好ましくは当該投与量が約１０μｇ／ｋｇ体重～約１０ｍｇ／ｋｇ体重である。勿論、具体的な投与量は、さらに投与の様態、患者の健康状況などの要素を考えるべきで、すべて熟練の医者の技能範囲以内である。
【0101】
抗体－薬物複合体（ＡＤＣ）
また、本発明は本発明の抗体に基づいた抗体薬物複合体（ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｒｕｇ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ、ＡＤＣ）を提供する。
また、本発明は本発明の抗体に基づいた抗体薬物複合体（ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｒｕｇ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ、ＡＤＣ）を提供する。
【0102】
典型的に、前記抗体薬物複合体は前記抗体、およびエフェクター分子を含み、前記抗体と前記エフェクター分子がカップリング、好ましくは化学的にカップリングしている。ここで、前記エフェクター分子は治療活性を有する薬物が好ましい。また、前記エフェクター分子は毒素タンパク質、化学治療薬、小分子薬物または放射性核種のうちの一つまたは複数でもよい。
【0103】
本発明の抗体と前記エフェクター分子の間はカップリング剤によってカップリングしてもよい。前記のカップリング剤の例は、非選択性カップリング剤、カルボキシ基を利用するカップリング剤、ペプチド鎖、ジスルフィド結合を利用するカップリング剤のうちの任意の一つまたは複数でもよい。前記非選択性カップリング剤とは、エフェクター分子と抗体を共役結合させて連結する化合物、たとえばグルタルアルデヒドなどである。前記カルボキシ基を利用するカップリング剤は、シスアコニット酸無水物系カップリング剤（たとえばシスアコニット酸無水物）、アシルヒドラゾン系カップリング剤（カップリング部位はアシルヒドラゾンである）のうちの任意の一つまたは複数でもよい。
【0104】
抗体における一部の残基（たとえばＣｙｓやＬｙｓなど）は多くの機能基との連結に使用され、イメージング試薬（たとえば発色基や蛍光基）、診断試薬（たとえばＭＲＩ造影剤や放射性同位元素）、安定剤（たとえばエチレングリコール重合体）および治療剤を含む。抗体は機能剤にカップリングして抗体－機能剤の複合体を形成してもよい。機能剤（たとえば薬物、検出試薬、安定剤）は抗体にカップリング（共役結合）されている。機能剤は直接、またはリンカーを介して間接に抗体に連結してもよい。
【0105】
抗体は薬物がカップリングすることによって抗体薬物複合体（ＡＤＣ）になってもよい。典型的に、ＡＤＣは薬物と抗体の間に位置するリンカーを含む。リンカーは分解できるリンカーでもよく、分解できないリンカーでもよい。分解できるリンカーは、典型的に、細胞内の環境において分解しやすく、たとえば目的の部位で分解することにより、薬物が抗体から放出される。適切な分解できるリンカーは、たとえば、細胞内におけるプロテアーゼ（たとえばリソソームプロテアーゼやエンドソームプロテアーゼ）によって分解できるペプチジル含有リンカーを含む酵素によって分解されるリンカー、あるいはグルクロニダーゼによって分解できるグルクロン酸含有リンカーのような糖リンカーを含む。ペプチジルリンカーは、たとえばジペプチド、たとえばバリン－シトルリン、フェニルアラニン－リシンやバリン－アラニンを含んでもよい。ほかの適切な分解できるリンカーは、たとえば、ｐＨ感受性リンカー（たとえばｐＨが５．５未満になると加水分解するリンカー、たとえばヒドラゾンリンカー）および還元条件において分解できるリンカー（ジスルフィド結合リンカー）を含む。分解できないリンカーは典型的に抗体がプロテアーゼによって加水分解される条件において薬物を放出する。
【0106】
抗体に連結する前、リンカーはあるアミノ酸残基と反応できる活性反応基を有し、連結は活性反応基を介して実現する。チオール基に特異的な活性反応基が好ましく、たとえばマレイミド系化合物、ハロゲン化アミド（たとえばヨウ化、臭化または塩化のもの）、ハロゲン化エステル（たとえばヨウ化、臭化または塩化のもの）、ハロゲン化メチルケトン（たとえばヨウ化、臭化または塩化のもの）、ハロゲン化ベンジル（たとえばヨウ化、臭化または塩化のもの）、ビニルスルホン、ピリジルジスルフィド、水銀誘導体、たとえば３，６－ジ（水銀メチル）ジオキサン（対イオンは酢酸イオン、塩素イオンまたは硝酸イオンである）、およびポリメチレンジメチルスルフィドチオスルホネートを含む。リンカーは、たとえば、チオスクシンイミドを介して抗体に連結したマレイミドを含んでもよい。
【0107】
薬物は任意の細胞毒性薬物、細胞生長を抑制する薬物または免疫抑制薬物でもよい。実施形態において、リンカーは抗体と薬物を連結し、薬物はリンカーと結合できる機能性基を有する。たとえば、薬物はリンカーと結合できるアミノ基、カルボキシ基、チオール基、ヒドロキシ基、またはケトン基を有してもよい。薬物が直接リンカーに連結する場合、薬物は抗体に連結する前、反応する活性基を有する。
【0108】
有用な薬物の種類は、たとえば、抗チューブリン薬、ＤＮＡ副溝結合試薬、ＤＮＡ複製阻害剤、アルキル化試薬、抗生物質、葉酸拮抗薬、抗代謝薬、化学療法増感剤、トポイソメラーゼ阻害剤、ビンカアルカロイドなどを含む。本発明において、薬物－リンカーは一つの簡単な工程でＡＤＣの形成に使用することができる。別の実施形態において、二機能性リンカー化合物は二工程または多工程の方法でＡＤＣの形成に使用することができる。たとえば、システイン残基が第一の工程でリンカーの反応活性部分と反応し、そして後の工程で、リンカーにおける機能性基が薬物と反応することで、ＡＤＣになる。
【0109】
通常、特異的に薬物部分における適切な反応活性基と反応しやすいように、リンカーにおける機能性基を選択する。非限定的な例として、アジ化合物に基づいた部分は特異的な薬物部分における反応性アルキニル基との反応に使用することができる。薬物はアジ基とアルキニル基の間の１，３－双極子を介して付加することで、リンカーに共役結合する。ほかの有用な機能性基は、たとえばケトン類およびアルデヒド類（ヒドラジド類およびアルコキシアミンとの反応に適する）、ホスフィン（アジ基との反応に適する）、イソシアネートおよびイソチオシアネート（アミン類およびアルコール類との反応に適する）、および活性化したエステル類、たとえばＮ－ヒドロキシスクシンイミドエステル（アミン類およびアルコール類との反応に適する）を含む。これらおよびほかの連結手段は、たとえば「生物カップリング技術」、第二版（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ）に記載されるように、当業者に熟知されている。当業者には、薬物部分およびリンカーの選択性反応について、相補対の反応活性機能基を選択する場合、当該相補対のいずれでも、リンカーにも薬物にも使用することができる。
【0110】
また、本発明は、ＡＤＣを製造する方法であって、さらに、抗体を薬物－リンカー化合物と、抗体複合体（ＡＤＣ）の形成に足りる条件において結合させる工程を含んでもよい方法を提供する。
【0111】
一部の実施形態において、本発明の方法は、抗体－リンカー複合体の形成に足りる条件において、抗体を二機能性リンカー化合物と結合させる工程を含む。これらの実施形態において、本発明の方法は、さらに、薬物部分がリンカーを介して抗体に共役結合するのに足りる条件において、抗体リンカー複合体を薬物部分と結合させる工程を含む。
【0112】
一部の実施形態において、抗体薬物複合体ＡＤＣは以下の分子式で表される。
【0113】
Ａｂは抗体である。
【0114】
ＬＵはリンカーである。
【0115】
Ｄは薬物である。
【0116】
そして、下付き文字ｐは１～８から選ばれる値である。）
本発明の主な利点は以下の通りである。
（１）本発明は、新規なＣＤ７３抗体であって、ヒトＣＤ７３に高い親和力を有し、有効に腫瘍細胞の表面のＣＤ７３タンパク質の酵素活性を抑制する抗体を提供する。
本発明の主な利点は以下の通りである。
（１）本発明は、新規なＣＤ７３抗体であって、ヒトＣＤ７３に高い親和力を有し、有効に腫瘍細胞の表面のＣＤ７３タンパク質の酵素活性を抑制する抗体を提供する。
【0117】
（２）本発明のＣＤ７３抗体は有効にＣＤ７３タンパク質によるＡＭＰ分解または腫瘍細胞の表面のＣＤ７３タンパク質が媒介するＣＤ４＋およびＣＤ８＋ Ｔ細胞の免疫応答の抑制を逆転することができる。
【0118】
（３）本発明のＣＤ７３抗体は良い体内薬効活性を有し、同時にＣＤ７３をほかの免疫分子調節剤（たとえば、ＣＴＬＡ－４抗体、ＰＤ－１抗体）と併用すると、顕著に各薬物のそれぞれの治療効果を増強することができ、非常に将来性のある腫瘍治療策として有用である。
【0119】
以下、具体的な実施例を合わせ、さらに本発明を陳述する。これらの実施例は本発明を説明するために用いられるものだけで、本発明の範囲の制限にはならないと理解されるものである。以下の実施例で詳細な条件が示されていない実験方法は、通常、たとえばＳａｍｂｒｏｏｋら、「モレキュラー・クローニング：研究室マニュアル」（ニューヨーク、コールド・スプリング・ハーバー研究所出版社、１９８９） に記載の条件などの通常の条件に、あるいは、メーカーのお薦めの条件に従う。特に断らない限り、％と部は、重量で計算された。
【0120】
実験材料：
マウス骨髄腫細胞ＳＰ２／０：ＡＴＣＣから購入、カタログ番号ＣＲＬ－１５８１。
マウス骨髄腫細胞ＳＰ２／０：ＡＴＣＣから購入、カタログ番号ＣＲＬ－１５８１。
【0121】
Ｂａｌｂ／ｃマウス：上海霊暢生物科技有限公司から購入。
【0122】
Ｈ１９７５細胞：ＡＴＣＣから購入、カタログ番号ＣＲＬ－１５９６。
【0123】
ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞：ＡＴＣＣから購入、カタログ番号ＨＴＢ－２６。
【0124】
Ｈ２９２細胞：中国科学院細胞バンクから購入、カタログ番号ＳＣＳＰ－５８２。
【0125】
Ａ３７５細胞：中国科学院細胞バンクから購入、カタログ番号ＳＣＳＰ－５３３。
【0126】
ＳＫＯＶ３細胞：中国科学院細胞バンクから購入、カタログ番号ＴＣＨｕ１８５。
【0127】
ＨＲＰ－ヒツジ抗マウス二次抗体：Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅから購入、カタログ番号ＡＰ１８１Ｐ。
【0128】
ＨＲＰ－ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆａｂ二次抗体：Ｓｉｇｍａから購入、カタログ番号Ａ０２９３－１ＭＬ
ＨＲＰ：ｓｉｇｍａから購入、カタログ番号Ａ０１７０－１ＭＬ。
ＨＲＰ：ｓｉｇｍａから購入、カタログ番号Ａ０１７０－１ＭＬ。
【0129】
ロバ抗マウスＰＥ蛍光二次抗体：Ｊａｃｋｓｏｎから購入、カタログ番号７１５－１１６－１５０。
【0130】
ヒツジ抗ヒトＰＥ蛍光二次抗体：Ｊａｃｋｓｏｎから購入、カタログ番号１０９－１１５－０９８。
【0131】
ＦＩＴＣ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ－Ｆｃ二次抗体：Ａｂｃａｍから購入、カタログ番号９７２２４。
【0132】
ＴＭＢ：ＫＰＬ社から購入、カタログ番号５２－００－０３。
【0133】
ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）：生工から購入、カタログ番号Ａ６００３３２－０１００
ＲＰＭＩ １６４０培地：Ｇｉｂｃｏ社から購入、カタログ番号６１８７０１２７
ペニシリン－ストレプトマイシン（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ－ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）：Ｇｉｂｃｏ社から購入、カタログ番号１５１４０１２２
ウシ胎児血清（ＦＢＳ）：Ｇｉｂｃｏ社から購入、カタログ番号１００９１－１４８
ポリエチレングリコール溶液：ｓｉｇｍａ社から購入、カタログ番号Ｐ７１８１
Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ－ＳＦＭ：ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社から購入、カタログ番号１２０４５－０７６
ＨＡＴ：Ｇｉｂｃｏから購入、カタログ番号２１０６００１７。
ＲＰＭＩ １６４０培地：Ｇｉｂｃｏ社から購入、カタログ番号６１８７０１２７
ペニシリン－ストレプトマイシン（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ－ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）：Ｇｉｂｃｏ社から購入、カタログ番号１５１４０１２２
ウシ胎児血清（ＦＢＳ）：Ｇｉｂｃｏ社から購入、カタログ番号１００９１－１４８
ポリエチレングリコール溶液：ｓｉｇｍａ社から購入、カタログ番号Ｐ７１８１
Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ－ＳＦＭ：ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社から購入、カタログ番号１２０４５－０７６
ＨＡＴ：Ｇｉｂｃｏから購入、カタログ番号２１０６００１７。
【0134】
ｐｃＤＮＡ ３．４：ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒから購入、カタログ番号Ａ１４６９７。
【0135】
ＨＥＫ－２９３Ｆ：Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒから購入、カタログ番号Ａ１４５２７。
【0136】
Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ（ＳＡ、ストレプトアビジン）：Ｓｉｇｍａから購入、カタログ番号Ｓ０６７７。
Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ ＨＲＰ： ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎから購入、カタログ番号５５４０６６。
Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ ＨＲＰ： ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎから購入、カタログ番号５５４０６６。
【0137】
ＥＺ－Ｌｉｎｋ ＮＨＳ－ビオチン試薬：Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒから購入、カタログ番号２０２１７。
【0138】
Ｃｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ－Ｇｌｏ：Ｐｒｏｍｅｇａから購入、カタログ番号Ｇ７５７０。
【0139】
ＡＭＰ：Ｓｉｇｍａから購入、カタログ番号Ａ１７５２。
【0140】
ＡＴＰ：Ｓｉｇｍａから購入、カタログ番号Ａ７６５５。
【0141】
ＨＢＳ－ＥＰ ｐＨ７．４緩衝液：ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅから購入、カタログ番号ＢＲ－１００６－６９。
【0142】
プロテインＡ／Ｇチップ：ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅから購入、カタログ番号ＢＲ－１００５－３０。
【0143】
ＣＤ８マイクロビーズ、ヒト：Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃから購入、カタログ番号１３０－０９７－０５７。
【0144】
ナイーブＣＤ４＋ Ｔ細胞分離キットＩＩ、ヒト：Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃから購入、カタログ番号１３０－０９４－１３。
【0145】
ＬＳ Ｃｏｌｕｍｎｓ ｐｌｕｓチューブ：Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃから購入、カタログ番号１３０－１２２－７２９１。
【0146】
アメチシン：Ｔｏｋｙｏ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｙから購入、カタログ番号Ｍ２３２０。
【0147】
ＣＤ３モノクローナル抗体（ＯＫＴ３）、ファンクショナルグレード：ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅから購入、カタログ番号１６－００３７－８５。
【0148】
ＣＤ２８モノクローナル抗体（ＣＤ２８．２）、ファンクショナルグレード：ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅから購入、カタログ番号１６－０２８９－８５。
【0149】
組み換えヒトＩＬ－２タンパク質：Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓから購入、カタログ番号２０２－ＩＬ－５０。
【0150】
ＥＨＮＡ：Ｓｉｇｍａから購入、カタログ番号Ｅ１１４。
【0151】
精製されたＮＡ／ＬＥマウス抗ヒトＩＦＮ－γ：ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎから購入、カタログ番号５５４５４７。
【0152】
組み換えヒトＩＦＮ－γ：ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎから購入、カタログ番号５５４６１７。
【0153】
ビオチンマウス抗ヒトＩＦＮ－γ：ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎから購入、カタログ番号５５４５５０。
【0154】
実施例１ 抗原免疫動物およびハイブリドーマの製造とスクリーニング
１．抗原発現
通常の遺伝子合成および分子クローニングの方法によってＣＤ７３の細胞外領域の遺伝子（配列はＵｎｉＰｒｏｔからのもので、登録番号がＰ２１５８９である）をｐｃＤＮＡ ３．４発現ベクターに構築し、そしてそのＮ末端にシグナルペプチド配列を、Ｃ末端に６×Ｈｉｓタグを加え、ＨＥＫ－２９３Ｆ細胞に形質移入し、５ｄ発現させた後、細胞の培養上清を収集して精製してＣＤ７３－Ｈｉｓタンパク質を得た。同様に、上記６×ＨｉｓタグをヒトＩｇＧ１のＦｃ配列に変えてＨＥＫ－２９３Ｆに形質移入し、発現させて精製してＣＤ７３－Ｆｃタンパク質を得た。
１．抗原発現
通常の遺伝子合成および分子クローニングの方法によってＣＤ７３の細胞外領域の遺伝子（配列はＵｎｉＰｒｏｔからのもので、登録番号がＰ２１５８９である）をｐｃＤＮＡ ３．４発現ベクターに構築し、そしてそのＮ末端にシグナルペプチド配列を、Ｃ末端に６×Ｈｉｓタグを加え、ＨＥＫ－２９３Ｆ細胞に形質移入し、５ｄ発現させた後、細胞の培養上清を収集して精製してＣＤ７３－Ｈｉｓタンパク質を得た。同様に、上記６×ＨｉｓタグをヒトＩｇＧ１のＦｃ配列に変えてＨＥＫ－２９３Ｆに形質移入し、発現させて精製してＣＤ７３－Ｆｃタンパク質を得た。
【0155】
ＣＤ７３細胞外領域のアミノ酸配列（配列番号２２）：
ＷＥＬＴＩＬＨＴＮＤＶＨＳＲＬＥＱＴＳＥＤＳＳＫＣＶＮＡＳＲＣＭＧＧＶＡＲＬＦＴＫＶＱＱＩＲＲＡＥＰＮＶＬＬＬＤＡＧＤＱＹＱＧＴＩＷＦＴＶＹＫＧＡＥＶＡＨＦＭＮＡＬＲＹＤＡＭＡＬＧＮＨＥＦＤＮＧＶＥＧＬＩＥＰＬＬＫＥＡＫＦＰＩＬＳＡＮＩＫＡＫＧＰＬＡＳＱＩＳＧＬＹＬＰＹＫＶＬＰＶＧＤＥＶＶＧＩＶＧＹＴＳＫＥＴＰＦＬＳＮＰＧＴＮＬＶＦＥＤＥＩＴＡＬＱＰＥＶＤＫＬＫＴＬＮＶＮＫＩＩＡＬＧＨＳＧＦＥＭＤＫＬＩＡＱＫＶＲＧＶＤＶＶＶＧＧＨＳＮＴＦＬＹＴＧＮＰＰＳＫＥＶＰＡＧＫＹＰＦＩＶＴＳＤＤＧＲＫＶＰＶＶＱＡＹＡＦＧＫＹＬＧＹＬＫＩＥＦＤＥＲＧＮＶＩＳＳＨＧＮＰＩＬＬＮＳＳＩＰＥＤＰＳＩＫＡＤＩＮＫＷＲＩＫＬＤＮＹＳＴＱＥＬＧＫＴＩＶＹＬＤＧＳＳＱＳＣＲＦＲＥＣＮＭＧＮＬＩＣＤＡＭＩＮＮＮＬＲＨＴＤＥＭＦＷＮＨＶＳＭＣＩＬＮＧＧＧＩＲＳＰＩＤＥＲＮＮＧＴＩＴＷＥＮＬＡＡＶＬＰＦＧＧＴＦＤＬＶＱＬＫＧＳＴＬＫＫＡＦＥＨＳＶＨＲＹＧＱＳＴＧＥＦＬＱＶＧＧＩＨＶＶＹＤＬＳＲＫＰＧＤＲＶＶＫＬＤＶＬＣＴＫＣＲＶＰＳＹＤＰＬＫＭＤＥＶＹＫＶＩＬＰＮＦＬＡＮＧＧＤＧＦＱＭＩＫＤＥＬＬＲＨＤＳＧＤＱＤＩＮＶＶＳＴＹＩＳＫＭＫＶＩＹＰＡＶＥＧＲＩＫ
２．抗原によるマウスの免疫
ＣＤ７３－Ｈｉｓタンパク質でＢａｌｂ／ｃマウスに対して通常の免疫を行った。１日目に、可溶性ヒトＣＤ７３－Ｈｉｓタンパク質をフロイント完全アジュバントと乳化させた後、Ｂａｌｂ／ｃマウスに対して皮下の複数箇所の注射を行い（ＣＤ７３－Ｈｉｓタンパク質、１００μｇ／マウス／０．５ｍＬ）、１４日目に、可溶性ＣＤ７３－Ｈｉｓタンパク質をフロイント不完全アジュバントと乳化させた後、Ｂａｌｂ／ｃマウスに対して皮下注射を行い（ＣＤ７３－Ｈｉｓタンパク質、５０μｇ／マウス／０．５ｍＬ）、２８日目に、可溶性ＣＤ７３－Ｈｉｓタンパク質をフロイント不完全アジュバントと乳化させた後、Ｂａｌｂ／ｃマウスに対して皮下注射を行い（ＣＤ７３－Ｈｉｓタンパク質、５０μｇ／マウス／０．５ｍＬ）、三週間後、可溶性ＣＤ７３－Ｈｉｓ蛋白を使用し、５０μｇ／マウス／０．２ｍＬで、腹腔内注射して免疫を誘導し、３－４日後、マウスの脾臓を取り出して融合実験を行った。
ＷＥＬＴＩＬＨＴＮＤＶＨＳＲＬＥＱＴＳＥＤＳＳＫＣＶＮＡＳＲＣＭＧＧＶＡＲＬＦＴＫＶＱＱＩＲＲＡＥＰＮＶＬＬＬＤＡＧＤＱＹＱＧＴＩＷＦＴＶＹＫＧＡＥＶＡＨＦＭＮＡＬＲＹＤＡＭＡＬＧＮＨＥＦＤＮＧＶＥＧＬＩＥＰＬＬＫＥＡＫＦＰＩＬＳＡＮＩＫＡＫＧＰＬＡＳＱＩＳＧＬＹＬＰＹＫＶＬＰＶＧＤＥＶＶＧＩＶＧＹＴＳＫＥＴＰＦＬＳＮＰＧＴＮＬＶＦＥＤＥＩＴＡＬＱＰＥＶＤＫＬＫＴＬＮＶＮＫＩＩＡＬＧＨＳＧＦＥＭＤＫＬＩＡＱＫＶＲＧＶＤＶＶＶＧＧＨＳＮＴＦＬＹＴＧＮＰＰＳＫＥＶＰＡＧＫＹＰＦＩＶＴＳＤＤＧＲＫＶＰＶＶＱＡＹＡＦＧＫＹＬＧＹＬＫＩＥＦＤＥＲＧＮＶＩＳＳＨＧＮＰＩＬＬＮＳＳＩＰＥＤＰＳＩＫＡＤＩＮＫＷＲＩＫＬＤＮＹＳＴＱＥＬＧＫＴＩＶＹＬＤＧＳＳＱＳＣＲＦＲＥＣＮＭＧＮＬＩＣＤＡＭＩＮＮＮＬＲＨＴＤＥＭＦＷＮＨＶＳＭＣＩＬＮＧＧＧＩＲＳＰＩＤＥＲＮＮＧＴＩＴＷＥＮＬＡＡＶＬＰＦＧＧＴＦＤＬＶＱＬＫＧＳＴＬＫＫＡＦＥＨＳＶＨＲＹＧＱＳＴＧＥＦＬＱＶＧＧＩＨＶＶＹＤＬＳＲＫＰＧＤＲＶＶＫＬＤＶＬＣＴＫＣＲＶＰＳＹＤＰＬＫＭＤＥＶＹＫＶＩＬＰＮＦＬＡＮＧＧＤＧＦＱＭＩＫＤＥＬＬＲＨＤＳＧＤＱＤＩＮＶＶＳＴＹＩＳＫＭＫＶＩＹＰＡＶＥＧＲＩＫ
２．抗原によるマウスの免疫
ＣＤ７３－Ｈｉｓタンパク質でＢａｌｂ／ｃマウスに対して通常の免疫を行った。１日目に、可溶性ヒトＣＤ７３－Ｈｉｓタンパク質をフロイント完全アジュバントと乳化させた後、Ｂａｌｂ／ｃマウスに対して皮下の複数箇所の注射を行い（ＣＤ７３－Ｈｉｓタンパク質、１００μｇ／マウス／０．５ｍＬ）、１４日目に、可溶性ＣＤ７３－Ｈｉｓタンパク質をフロイント不完全アジュバントと乳化させた後、Ｂａｌｂ／ｃマウスに対して皮下注射を行い（ＣＤ７３－Ｈｉｓタンパク質、５０μｇ／マウス／０．５ｍＬ）、２８日目に、可溶性ＣＤ７３－Ｈｉｓタンパク質をフロイント不完全アジュバントと乳化させた後、Ｂａｌｂ／ｃマウスに対して皮下注射を行い（ＣＤ７３－Ｈｉｓタンパク質、５０μｇ／マウス／０．５ｍＬ）、三週間後、可溶性ＣＤ７３－Ｈｉｓ蛋白を使用し、５０μｇ／マウス／０．２ｍＬで、腹腔内注射して免疫を誘導し、３－４日後、マウスの脾臓を取り出して融合実験を行った。
【0156】
３．ハイブリドーマの製造とスクリーニング
マウスの最後の免疫から３－４日で、通常のハイブリドーマのプロトコールを使用し、マウスの脾臓細胞をマウス骨髄腫細胞ＳＰ２／０とＰＥＧ融合した。融合後の細胞を完全培地において均一に懸濁させたが、完全培地はＲＰＭＩ１６４０－ＧＬＵＭＡＸに１％ ペニシリン－ストレプトマイシン、２０％ ＦＢＳ、１×ＨＡＴを入れてなる培地である。融合後の細胞を３×１０４個細胞／２００μｌ／ウェルで、計６２枚の９６ウェル細胞培養プレートに敷き、インキュベーターにおいて培養した。７－１２日後、上清液を回収し、 ＥＬＩＳＡ方法によってヒトＣＤ７３結合活性が陽性のハイブリドーマウェルをスクリーニングした。
マウスの最後の免疫から３－４日で、通常のハイブリドーマのプロトコールを使用し、マウスの脾臓細胞をマウス骨髄腫細胞ＳＰ２／０とＰＥＧ融合した。融合後の細胞を完全培地において均一に懸濁させたが、完全培地はＲＰＭＩ１６４０－ＧＬＵＭＡＸに１％ ペニシリン－ストレプトマイシン、２０％ ＦＢＳ、１×ＨＡＴを入れてなる培地である。融合後の細胞を３×１０４個細胞／２００μｌ／ウェルで、計６２枚の９６ウェル細胞培養プレートに敷き、インキュベーターにおいて培養した。７－１２日後、上清液を回収し、 ＥＬＩＳＡ方法によってヒトＣＤ７３結合活性が陽性のハイブリドーマウェルをスクリーニングした。
【0157】
ここで、ＥＬＩＳＡ方法によってヒトＣＤ７３結合活性が陽性のハイブリドーマウェルをスクリーニングする方法は以下の通りである：ＣＤ７３－ＦｃをＰＢＳ緩衝液で１μｇ／ｍｌになるように希釈し、１００μｌ ／ウェルでＥＬＩＳＡプレートに入れ、４℃で一晩コーティングした。翌日に上清を捨て、ＰＢＳＴでプレートを１回洗浄し、ＰＢＳで調製された５％脱脂粉乳を入れ、３７℃で２ ｈブロッキングし、ＰＢＳＴでプレートを３回洗浄して使用に備えた。回収されたハイブリドーマ上清液を順にブロッキングされたＥＬＩＳＡプレートに１００μｌ／ウェルで入れ、３７℃で１ ｈ置いた。ＰＢＳＴでプレートを３回洗浄し、ＨＲＰで標識されたヒツジ抗マウスＩｇＧ二次抗体を入れ、３７℃で３０ ｍｉｎ置いた。ＰＢＳＴでプレートを３回洗浄した後、吸水紙においてなるべく残留液滴をなくし、各ウェルに１００μｌのＴＭＢを入れ、室温で光を避けて５ ｍｉｎ呈色させた。各ウェルに５０μｌの２Ｍ Ｈ２ＳＯ４停止液を入れて基質の反応を停止させ、多機能プレートリーダーによって４５０ ｎｍでＯＤ値を読み取り、被験抗体の標的抗原ＣＤ７３との結合能力を分析した。スクリーニングによって計３０株のハイブリドーマ細胞株を得た。血清含有完全培地においてスクリーニングによって得られた３０株のハイブリドーマ細胞株を増幅させ、遠心して無血清ハイブリドーマ－ＳＦＭ培地に交換し、細胞密度が１～２×１０７／ｍｌになるようにし、８％ ＣＯ２、３７℃の条件において１週間培養し、遠心して培養上清を得、プロテインＧアフィニティクロマトグラフィーによって精製し、抗ヒトＣＤ７３の各ネズミ由来モノクローナル抗体タンパク質を得てそれぞれ名付けた。
【0158】
実施例３ ネズミ由来抗体のヒトＣＤ７３－Ｈｉｓタンパク質に対する結合能力
間接酵素結合免疫吸着測（ＥＬＩＳＡ）によってネズミ由来抗体のヒトＣＤ７３－Ｈｉｓタンパク質に対する結合能力を測定した。具体的な方法は以下の通りである。
間接酵素結合免疫吸着測（ＥＬＩＳＡ）によってネズミ由来抗体のヒトＣＤ７３－Ｈｉｓタンパク質に対する結合能力を測定した。具体的な方法は以下の通りである。
【0159】
コーティング液（５０ｍＭの炭酸塩コーティング緩衝液、ｐＨ ９．６）でＳＡタンパク質を１．５μｇ／ｍＬに希釈してＥＬＩＳＡプレートを４℃で一晩コーティングした。上清を捨て、ＰＢＳＴで３回プレートを洗浄し、さらにＰＢＳで調製された５％脱脂粉乳でブロッキングし、３７℃で２ ｈインキュベートした。ＰＢＳＴでプレートを１回洗浄した後、ＣＤ７３－ビオチンタンパク質（ＥＺ－Ｌｉｎｋ ＮＨＳ－ビオチン試薬の説明書に従ってＣＤ７３－Ｈｉｓタンパク質をビオチン化したもの）を０．５μｇ／ｍＬに希釈し、１００ μＬ／ウェルで、室温で１ ｈインキュベートした。ＰＢＳＴでプレートを３回洗浄し、製造された抗ヒトＣＤ７３の各ネズミ由来モノクローナル抗体をＰＢＳＴで調製された１％ＢＳＡ緩衝液で勾配希釈し、１００μｌ／ウェルで上記ＥＬＩＳＡプレートに入れ、３７℃で１ ｈインキュベートした。ＰＢＳＴでプレートを３回洗浄し、ＨＲＰで標識されたヒツジ抗マウスＩｇＧ二次抗体を入れ、３７℃で３０ ｍｉｎインキュベートした。ＰＢＳＴでプレートを３回洗浄した後、吸水紙においてなるべく残留液滴をなくし、各ウェルに１００μｌのＴＭＢ呈色液を入れ、室温で光を避けて５ ｍｉｎ呈色させ、各ウェルに５０μｌの２Ｍ Ｈ２ＳＯ４停止液を入れて基質の反応を停止させ、多機能プレートリーダーによって４５０ ｎｍでＯＤ値を読み取り、被験抗体の標的抗原ヒトＣＤ７３－Ｈｉｓとの結合能力を分析した。
【0160】
代表的な実験結果は図１および表１に示すように、ネズミ由来抗体４８Ａ１１、５６Ｂ１０はＣＤ７３タンパク質に対する結合活性が比較的に強いことがわかる。
【0161】
ＣＤ７３は酵素で、アデノシン一リン酸（ＡＭＰ）が脱リン酸化してアデノシンになるのを触媒する。ここで、ＡＴＰを検出する方法によってネズミ由来抗体のＨ１９７５細胞の表面のＣＤ７３タンパク質の酵素活性に対する抑制作用を測定した。具体的な方法は以下の通りである。
【0162】
対数増殖期にあるＨ１９７５細胞を収集し、遠心で細胞培養液を除去し、ＰＢＳ緩衝液で細胞を１回洗浄した。計数して１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ－１６４０培地で３×１０４／ウェルに希釈し、細胞を９６ウェル細胞培養プレートに敷き、１００ μＬ／ウェルで、インキュベーターにおいて３７℃で一晩培養した。翌日に、細胞培養上清を捨て、被験抗体をＲＰＭＩ－１６４０培地で１０μｇ／ｍｌに希釈し、５倍勾配で希釈した後、５０μＬ／ウェルで、上記細胞培養プレートに入れ、３７℃で３０ ｍｉｎインキュベートした。さらに８００μＭのＡＭＰを入れ、５０μＬ／ウェルで、３７℃で３ ｈインキュベートし、２５μＬの培養上清と２５μＬの８０μＭのＡＴＰを取って９６ウェル白色不透光検出プレートにおいて均一に混合した後、５０μＬのＣｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ－Ｇｌｏ検出試薬を例、室温で５ ｍｉｎインキュベートし、多機能プレートリーダーにおいて蛍光強度を読み取って分析した。
【0163】
代表的な実験結果は図２および表２に示すように、ほかのネズミ由来モノクローナル抗体と比べ、４８Ａ１１、５６Ｂ１０はＨ１９７５細胞の表面のＣＤ７３タンパク質の酵素活性に対する抑制作用が最も強い。
【0164】
本実施例は、分子生物学の関連方法によってネズミ由来抗体４８Ａ１１、５６Ｂ１０の重鎖可変領域および軽鎖可変領域を獲得し、さらにキメラ抗体を構築した。
【0165】
Ｔｒｉｚｏｌによってそれぞれ４８Ａ１１、５６Ｂ１０ハイブリドーマのＲＮＡを抽出してｍＲＮＡ逆転写を行ってｃＤＮＡを獲得した後、ｃＤＮＡを鋳型とし、それぞれネズミ由来抗体の重鎖および軽鎖の縮重プライマー（《Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ》Ｖｏｌｕｍｅ １，Ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｒｏｌａｎｄ Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ ａｎｄ Ｓｔｅｆａｎ Ｄｕｅｂｅｌ、組み合わせプライマーの配列は３２３頁から）でＰＣＲを行い、獲得されたＰＣＲ産物をシークエンシングしてｋａｂａｔデータベースで分析し、獲得された配列がネズミ由来抗体の可変領域の配列であると確認された。
【0166】
関連配列の情報は以下の通りである。
【0167】
４８Ａ１１重鎖可変領域の遺伝子配列は、全長がいずれも３５１ｂｐで、それぞれ１１７のアミノ酸残基をコードし、ヌクレオチド配列は以下の通りである（配列番号２３）：
ＣＡＧＧＴＣＣＡＡＣＴＧＣＡＧＣＡＧＣＣＴＧＧＧＧＣＴＧＡＡＣＴＧＧＴＧＡＡＧＣＣＴＧＧＧＧＣＴＴＣＡＧＴＧＡＡＧＣＴＧＴＣＣＴＧＣＡＡＧＧＣＴＴＣＴＧＧＣＴＡＣＡＣＣＴＴＣＡＣＣＡＧＣＴＡＣＴＧＧＡＴＧＣＡＣＴＧＧＧＴＧＡＡＧＣＡＧＡＧＧＣＣＴＧＧＡＣＡＡＧＧＣＣＴＴＧＡＧＴＧＧＡＴＴＧＧＡＧＡＧＡＴＴＡＡＴＣＣＴＡＧＣＡＴＣＧＧＴＣＧＴＡＣＴＡＡＣＴＡＣＡＡＴＧＡＧＡＡＧＴＴＣＡＡＧＡＧＣＡＡＧＧＣＣＡＣＡＣＴＧＡＣＴＧＴＡＧＡＣＡＡＡＴＣＣＴＣＣＡＧＣＡＣＡＧＣＣＴＴＣＡＴＧＣＡＡＣＴＣＡＧＣＡＧＴＣＴＧＡＣＡＴＣＴＧＡＧＧＡＣＴＣＴＧＣＧＧＴＣＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＡＡＧＡＡＧＧＧＴＣＴＡＴＧＧＴＡＣＴＡＴＧＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＴＣＡＡＧＧＡＡＣＣＴＣＡＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡ
４８Ａ１１重鎖可変領域のアミノ酸配列は以下の通りである（配列番号２４）：
ＱＶＱＬＱＱＰＧＡＥＬＶＫＰＧＡＳＶＫＬＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＷＭＨＷＶＫＱＲＰＧＱＧＬＥＷＩＧＥＩＮＰＳＩＧＲＴＮＹＮＥＫＦＫＳＫＡＴＬＴＶＤＫＳＳＳＴＡＦＭＱＬＳＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＹＣＡＲＲＶＹＧＴＭＤＹＷＧＱＧＴＳＶＴＶＳＳ
４８Ａ１１軽鎖可変領域の遺伝子配列は、全長がいずれも３１８ｂｐで、それぞれ１０６のアミノ酸残基をコードし、ヌクレオチド配列は以下の通りである（配列番号２５）：
ＧＡＣＡＴＣＡＡＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＴＣＣＡＴＣＴＴＣＣＡＴＧＴＡＴＧＣＡＴＣＴＣＴＡＧＧＡＧＡＧＡＧＡＧＴＣＡＣＴＡＴＣＡＣＴＴＧＣＡＡＧＧＣＧＡＧＴＣＡＧＧＡＣＡＴＴＡＡＴＡＧＣＴＡＴＴＴＡＡＧＣＴＧＧＴＴＣＣＡＧＣＡＧＡＡＡＣＣＡＧＧＧＡＡＡＴＣＴＣＣＴＡＡＧＡＣＣＣＴＧＡＴＣＴＡＴＣＧＴＧＣＡＡＡＣＡＴＡＴＧＧＧＴＡＧＡＴＧＧＧＧＴＣＣＣＡＴＣＡＡＧＧＴＴＣＡＧＴＧＧＣＡＧＴＧＧＡＴＣＴＧＧＧＣＡＡＧＡＴＴＡＴＴＣＴＣＴＣＡＣＣＡＴＣＡＧＣＡＧＣＣＴＧＧＡＧＴＡＴＧＡＡＧＡＴＡＴＧＧＧＡＡＴＴＴＡＴＴＡＴＴＧＴＣＴＡＣＡＧＴＡＴＧＡＴＧＡＧＴＴＡＴＡＣＡＣＧＴＴＣＧＧＡＧＧＧＧＧＧＡＣＣＡＡＧＣＴＧＧＡＡＡＴＡＡＡＡ
４８Ａ１１軽鎖可変領域のアミノ酸配列は以下の通りである（配列番号２６）：
ＤＩＫＭＴＱＳＰＳＳＭＹＡＳＬＧＥＲＶＴＩＴＣＫＡＳＱＤＩＮＳＹＬＳＷＦＱＱＫＰＧＫＳＰＫＴＬＩＹＲＡＮＩＷＶＤＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＱＤＹＳＬＴＩＳＳＬＥＹＥＤＭＧＩＹＹＣＬＱＹＤＥＬＹＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ
５６Ｂ１０重鎖可変領域の遺伝子配列は、全長がいずれも３５７ｂｐで、それぞれ１１９のアミノ酸残基をコードし、ヌクレオチド配列は以下の通りである（配列番号２７）：
ＣＡＧＧＴＣＣＡＧＣＴＧＣＡＧＣＡＧＴＣＴＧＧＡＣＣＴＧＡＧＣＴＧＧＴＧＡＡＧＣＣＴＧＧＧＧＣＴＴＣＡＧＴＧＡＧＧＡＴＡＴＣＣＴＧＣＡＡＧＡＣＴＴＣＴＧＧＣＴＡＣＡＣＣＴＴＣＡＣＡＡＧＡＴＡＣＴＡＴＡＴＡＴＡＴＴＧＧＧＴＧＡＡＧＣＡＧＡＧＧＣＣＴＧＧＡＣＡＧＧＧＡＣＴＴＧＡＧＴＧＧＡＴＴＧＧＡＴＧＧＡＴＴＴＡＴＣＣＴＧＧＡＡＡＴＴＴＴＡＡＴＡＣＴＡＡＧＴＡＣＡＡＴＧＡＧＡＡＧＴＴＣＡＡＧＧＧＣＡＡＧＧＣＣＡＣＡＣＴＧＡＣＴＧＣＡＧＡＣＡＣＡＴＣＣＴＣＣＡＧＣＡＣＡＧＣＣＴＡＣＡＴＧＣＡＧＣＴＣＡＧＣＡＧＣＣＴＧＡＣＣＴＣＴＧＡＧＧＡＣＴＣＴＧＣＧＧＴＣＴＡＴＴＴＣＴＧＴＧＣＡＡＧＡＧＡＴＧＴＡＴＡＴＧＡＴＴＡＣＧＣＧＧＧＡＴＴＴＧＣＴＴＡＣＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＧＡＣＴＣＴＧＧＴＣＡＣＴＧＴＣＴＣＴＧＣＡ
５６Ｂ１０重鎖可変領域のアミノ酸配列は以下の通りである（配列番号２８）：
ＱＶＱＬＱＱＳＧＰＥＬＶＫＰＧＡＳＶＲＩＳＣＫＴＳＧＹＴＦＴＲＹＹＩＹＷＶＫＱＲＰＧＱＧＬＥＷＩＧＷＩＹＰＧＮＦＮＴＫＹＮＥＫＦＫＧＫＡＴＬＴＡＤＴＳＳＳＴＡＹＭＱＬＳＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＦＣＡＲＤＶＹＤＹＡＧＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＡ
５６Ｂ１０軽鎖可変領域の遺伝子配列は、全長がいずれも３２１ｂｐで、それぞれ１０７のアミノ酸残基をコードし、ヌクレオチド配列は以下の通りである（配列番号２９）：
ＧＡＣＡＴＴＧＴＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＴＣＡＣＡＧＡＴＴＣＴＴＧＴＣＣＡＣＡＴＣＡＧＴＡＧＧＡＧＡＣＡＧＧＧＴＣＡＧＣＡＴＣＡＣＣＴＧＣＡＡＧＧＣＣＡＧＴＣＡＧＧＧＴＧＴＧＧＣＴＡＣＴＧＣＴＧＴＴＧＣＣＴＧＧＴＡＴＣＡＡＣＡＧＡＡＡＣＣＡＧＧＡＣＡＡＴＣＴＣＣＴＡＡＡＣＴＣＣＴＧＡＴＴＴＡＣＴＧＧＧＣＡＴＣＣＡＣＣＣＧＧＣＡＣＡＣＴＧＧＡＧＴＣＣＣＴＧＡＴＣＧＣＴＴＣＡＣＡＧＧＣＡＧＴＧＧＡＴＣＴＧＧＧＡＣＡＧＡＴＴＴＣＡＣＴＣＴＣＡＣＣＡＴＴＡＧＣＡＡＴＧＴＧＣＡＧＴＣＴＧＡＡＧＡＣＴＴＧＧＣＡＧＡＴＴＡＴＴＴＣＴＧＴＣＡＧＣＡＡＴＡＴＡＧＣＡＧＣＴＡＴＣＣＧＴＧＧＡＣＧＴＴＣＧＧＴＧＧＡＧＧＣＡＣＣＡＡＧＣＴＧＧＡＡＡＴＣＡＡＡ
５６Ｂ１０軽鎖可変領域のアミノ酸配列は以下の通りである（配列番号３０）：
ＤＩＶＭＴＱＳＨＲＦＬＳＴＳＶＧＤＲＶＳＩＴＣＫＡＳＱＧＶＡＴＡＶＡＷＹＱＱＫＰＧＱＳＰＫＬＬＩＹＷＡＳＴＲＨＴＧＶＰＤＲＦＴＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＮＶＱＳＥＤＬＡＤＹＦＣＱＱＹＳＳＹＰＷＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ
得られた各ハイブリドーマの重鎖可変領域の配列をヒトＩｇＧ４（Ｓ２２８Ｐ）の定常領域（アミノ酸配列は配列番号３１）と連結し、軽鎖可変領域の配列をヒトκ鎖の定常領域（アミノ酸配列は配列番号３２）と連結し、それぞれ各キメラ抗体の重鎖および軽鎖をｐｃＤＮＡ３．４発現ベクターに構築し、ＨＥＫ－２９３Ｆ細胞に形質移入して発現させ、そして精製して各キメラ抗体を得たが、それぞれ４８Ａ１１－ｃｈ、５６Ｂ１０－ｃｈと名付けた。
ＣＡＧＧＴＣＣＡＡＣＴＧＣＡＧＣＡＧＣＣＴＧＧＧＧＣＴＧＡＡＣＴＧＧＴＧＡＡＧＣＣＴＧＧＧＧＣＴＴＣＡＧＴＧＡＡＧＣＴＧＴＣＣＴＧＣＡＡＧＧＣＴＴＣＴＧＧＣＴＡＣＡＣＣＴＴＣＡＣＣＡＧＣＴＡＣＴＧＧＡＴＧＣＡＣＴＧＧＧＴＧＡＡＧＣＡＧＡＧＧＣＣＴＧＧＡＣＡＡＧＧＣＣＴＴＧＡＧＴＧＧＡＴＴＧＧＡＧＡＧＡＴＴＡＡＴＣＣＴＡＧＣＡＴＣＧＧＴＣＧＴＡＣＴＡＡＣＴＡＣＡＡＴＧＡＧＡＡＧＴＴＣＡＡＧＡＧＣＡＡＧＧＣＣＡＣＡＣＴＧＡＣＴＧＴＡＧＡＣＡＡＡＴＣＣＴＣＣＡＧＣＡＣＡＧＣＣＴＴＣＡＴＧＣＡＡＣＴＣＡＧＣＡＧＴＣＴＧＡＣＡＴＣＴＧＡＧＧＡＣＴＣＴＧＣＧＧＴＣＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＡＡＧＡＡＧＧＧＴＣＴＡＴＧＧＴＡＣＴＡＴＧＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＴＣＡＡＧＧＡＡＣＣＴＣＡＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡ
４８Ａ１１重鎖可変領域のアミノ酸配列は以下の通りである（配列番号２４）：
ＱＶＱＬＱＱＰＧＡＥＬＶＫＰＧＡＳＶＫＬＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＷＭＨＷＶＫＱＲＰＧＱＧＬＥＷＩＧＥＩＮＰＳＩＧＲＴＮＹＮＥＫＦＫＳＫＡＴＬＴＶＤＫＳＳＳＴＡＦＭＱＬＳＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＹＣＡＲＲＶＹＧＴＭＤＹＷＧＱＧＴＳＶＴＶＳＳ
４８Ａ１１軽鎖可変領域の遺伝子配列は、全長がいずれも３１８ｂｐで、それぞれ１０６のアミノ酸残基をコードし、ヌクレオチド配列は以下の通りである（配列番号２５）：
ＧＡＣＡＴＣＡＡＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＴＣＣＡＴＣＴＴＣＣＡＴＧＴＡＴＧＣＡＴＣＴＣＴＡＧＧＡＧＡＧＡＧＡＧＴＣＡＣＴＡＴＣＡＣＴＴＧＣＡＡＧＧＣＧＡＧＴＣＡＧＧＡＣＡＴＴＡＡＴＡＧＣＴＡＴＴＴＡＡＧＣＴＧＧＴＴＣＣＡＧＣＡＧＡＡＡＣＣＡＧＧＧＡＡＡＴＣＴＣＣＴＡＡＧＡＣＣＣＴＧＡＴＣＴＡＴＣＧＴＧＣＡＡＡＣＡＴＡＴＧＧＧＴＡＧＡＴＧＧＧＧＴＣＣＣＡＴＣＡＡＧＧＴＴＣＡＧＴＧＧＣＡＧＴＧＧＡＴＣＴＧＧＧＣＡＡＧＡＴＴＡＴＴＣＴＣＴＣＡＣＣＡＴＣＡＧＣＡＧＣＣＴＧＧＡＧＴＡＴＧＡＡＧＡＴＡＴＧＧＧＡＡＴＴＴＡＴＴＡＴＴＧＴＣＴＡＣＡＧＴＡＴＧＡＴＧＡＧＴＴＡＴＡＣＡＣＧＴＴＣＧＧＡＧＧＧＧＧＧＡＣＣＡＡＧＣＴＧＧＡＡＡＴＡＡＡＡ
４８Ａ１１軽鎖可変領域のアミノ酸配列は以下の通りである（配列番号２６）：
ＤＩＫＭＴＱＳＰＳＳＭＹＡＳＬＧＥＲＶＴＩＴＣＫＡＳＱＤＩＮＳＹＬＳＷＦＱＱＫＰＧＫＳＰＫＴＬＩＹＲＡＮＩＷＶＤＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＱＤＹＳＬＴＩＳＳＬＥＹＥＤＭＧＩＹＹＣＬＱＹＤＥＬＹＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ
５６Ｂ１０重鎖可変領域の遺伝子配列は、全長がいずれも３５７ｂｐで、それぞれ１１９のアミノ酸残基をコードし、ヌクレオチド配列は以下の通りである（配列番号２７）：
ＣＡＧＧＴＣＣＡＧＣＴＧＣＡＧＣＡＧＴＣＴＧＧＡＣＣＴＧＡＧＣＴＧＧＴＧＡＡＧＣＣＴＧＧＧＧＣＴＴＣＡＧＴＧＡＧＧＡＴＡＴＣＣＴＧＣＡＡＧＡＣＴＴＣＴＧＧＣＴＡＣＡＣＣＴＴＣＡＣＡＡＧＡＴＡＣＴＡＴＡＴＡＴＡＴＴＧＧＧＴＧＡＡＧＣＡＧＡＧＧＣＣＴＧＧＡＣＡＧＧＧＡＣＴＴＧＡＧＴＧＧＡＴＴＧＧＡＴＧＧＡＴＴＴＡＴＣＣＴＧＧＡＡＡＴＴＴＴＡＡＴＡＣＴＡＡＧＴＡＣＡＡＴＧＡＧＡＡＧＴＴＣＡＡＧＧＧＣＡＡＧＧＣＣＡＣＡＣＴＧＡＣＴＧＣＡＧＡＣＡＣＡＴＣＣＴＣＣＡＧＣＡＣＡＧＣＣＴＡＣＡＴＧＣＡＧＣＴＣＡＧＣＡＧＣＣＴＧＡＣＣＴＣＴＧＡＧＧＡＣＴＣＴＧＣＧＧＴＣＴＡＴＴＴＣＴＧＴＧＣＡＡＧＡＧＡＴＧＴＡＴＡＴＧＡＴＴＡＣＧＣＧＧＧＡＴＴＴＧＣＴＴＡＣＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＧＡＣＴＣＴＧＧＴＣＡＣＴＧＴＣＴＣＴＧＣＡ
５６Ｂ１０重鎖可変領域のアミノ酸配列は以下の通りである（配列番号２８）：
ＱＶＱＬＱＱＳＧＰＥＬＶＫＰＧＡＳＶＲＩＳＣＫＴＳＧＹＴＦＴＲＹＹＩＹＷＶＫＱＲＰＧＱＧＬＥＷＩＧＷＩＹＰＧＮＦＮＴＫＹＮＥＫＦＫＧＫＡＴＬＴＡＤＴＳＳＳＴＡＹＭＱＬＳＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＦＣＡＲＤＶＹＤＹＡＧＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＡ
５６Ｂ１０軽鎖可変領域の遺伝子配列は、全長がいずれも３２１ｂｐで、それぞれ１０７のアミノ酸残基をコードし、ヌクレオチド配列は以下の通りである（配列番号２９）：
ＧＡＣＡＴＴＧＴＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＴＣＡＣＡＧＡＴＴＣＴＴＧＴＣＣＡＣＡＴＣＡＧＴＡＧＧＡＧＡＣＡＧＧＧＴＣＡＧＣＡＴＣＡＣＣＴＧＣＡＡＧＧＣＣＡＧＴＣＡＧＧＧＴＧＴＧＧＣＴＡＣＴＧＣＴＧＴＴＧＣＣＴＧＧＴＡＴＣＡＡＣＡＧＡＡＡＣＣＡＧＧＡＣＡＡＴＣＴＣＣＴＡＡＡＣＴＣＣＴＧＡＴＴＴＡＣＴＧＧＧＣＡＴＣＣＡＣＣＣＧＧＣＡＣＡＣＴＧＧＡＧＴＣＣＣＴＧＡＴＣＧＣＴＴＣＡＣＡＧＧＣＡＧＴＧＧＡＴＣＴＧＧＧＡＣＡＧＡＴＴＴＣＡＣＴＣＴＣＡＣＣＡＴＴＡＧＣＡＡＴＧＴＧＣＡＧＴＣＴＧＡＡＧＡＣＴＴＧＧＣＡＧＡＴＴＡＴＴＴＣＴＧＴＣＡＧＣＡＡＴＡＴＡＧＣＡＧＣＴＡＴＣＣＧＴＧＧＡＣＧＴＴＣＧＧＴＧＧＡＧＧＣＡＣＣＡＡＧＣＴＧＧＡＡＡＴＣＡＡＡ
５６Ｂ１０軽鎖可変領域のアミノ酸配列は以下の通りである（配列番号３０）：
ＤＩＶＭＴＱＳＨＲＦＬＳＴＳＶＧＤＲＶＳＩＴＣＫＡＳＱＧＶＡＴＡＶＡＷＹＱＱＫＰＧＱＳＰＫＬＬＩＹＷＡＳＴＲＨＴＧＶＰＤＲＦＴＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＮＶＱＳＥＤＬＡＤＹＦＣＱＱＹＳＳＹＰＷＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ
得られた各ハイブリドーマの重鎖可変領域の配列をヒトＩｇＧ４（Ｓ２２８Ｐ）の定常領域（アミノ酸配列は配列番号３１）と連結し、軽鎖可変領域の配列をヒトκ鎖の定常領域（アミノ酸配列は配列番号３２）と連結し、それぞれ各キメラ抗体の重鎖および軽鎖をｐｃＤＮＡ３．４発現ベクターに構築し、ＨＥＫ－２９３Ｆ細胞に形質移入して発現させ、そして精製して各キメラ抗体を得たが、それぞれ４８Ａ１１－ｃｈ、５６Ｂ１０－ｃｈと名付けた。
【0168】
実施例６ キメラ抗体のヒトＣＤ７３－Ｈｉｓタンパク質に対する結合活性
実施例３を参照してキメラ抗体４８Ａ１１－ｃｈ、５６Ｂ１０－ｃｈのヒトＣＤ７３－ｈｉｓタンパク質に対する結合親和力を測定した。実験結果は図３に示すように、４８Ａ１１－ｃｈ、５６Ｂ１０－ｃｈのヒトＣＤ７３－ｈｉｓタンパク質に対する結合のＥＣ５０はそれぞれ０．０６７ ｎＭおよび０．０９ ｎＭであった。
実施例３を参照してキメラ抗体４８Ａ１１－ｃｈ、５６Ｂ１０－ｃｈのヒトＣＤ７３－ｈｉｓタンパク質に対する結合親和力を測定した。実験結果は図３に示すように、４８Ａ１１－ｃｈ、５６Ｂ１０－ｃｈのヒトＣＤ７３－ｈｉｓタンパク質に対する結合のＥＣ５０はそれぞれ０．０６７ ｎＭおよび０．０９ ｎＭであった。
【0169】
実施例３を参照してキメラ抗体４８Ａ１１－ｃｈ、５６Ｂ１０－ｃｈのヒトＣＤ７３－ｈｉｓタンパク質に対する結合親和力を測定した。実験結果は図３に示すように、４８Ａ１１－ｃｈ、５６Ｂ１０－ｃｈのヒトＣＤ７３－ｈｉｓタンパク質に対する結合のＥＣ５０はそれぞれ０．０６７ ｎＭおよび０．０９ ｎＭであった。
【0170】
実施例７ ヒト化抗体の構築および製造
各候補のネズミ由来抗体の軽鎖可変領域と重鎖可変領域ののアミノ酸配列を分析し、Ｋａｂａｔルールでネズミ由来抗体の４８Ａ１１と５６Ｂ１０の抗原相補性決定領域（ＣＤＲ）および４つのフレームワーク領域（ＦＲ）を決定した。ここで、４８Ａ１１の重鎖相補性決定領域のアミノ酸配列は以下の通りである。
各候補のネズミ由来抗体の軽鎖可変領域と重鎖可変領域ののアミノ酸配列を分析し、Ｋａｂａｔルールでネズミ由来抗体の４８Ａ１１と５６Ｂ１０の抗原相補性決定領域（ＣＤＲ）および４つのフレームワーク領域（ＦＲ）を決定した。ここで、４８Ａ１１の重鎖相補性決定領域のアミノ酸配列は以下の通りである。
【0171】
ＨＣＤＲ１：ＳＹＷＭＨ 配列番号１０
ＨＣＤＲ２：ＥＩＮＰＳＩＧＲＴＮＹＮＥＫＦＫＳ 配列番号１１
ＨＣＤＲ３：ＲＶＹＧＴＭＤＹ 配列番号１２
軽鎖相補性決定領域のアミノ酸配列は以下の通りである。
ＨＣＤＲ２：ＥＩＮＰＳＩＧＲＴＮＹＮＥＫＦＫＳ 配列番号１１
ＨＣＤＲ３：ＲＶＹＧＴＭＤＹ 配列番号１２
軽鎖相補性決定領域のアミノ酸配列は以下の通りである。
【0172】
ＬＣＤＲ１：ＫＡＳＱＤＩＮＳＹＬＳ 配列番号１３
ＬＣＤＲ２：ＲＡＮＩＷＶＤ 配列番号１４
ＬＣＤＲ３：ＬＱＹＤＥＬＹＴ 配列番号１５
５６Ｂ１０の重鎖相補性決定領域のアミノ酸配列は以下の通りである。
ＬＣＤＲ２：ＲＡＮＩＷＶＤ 配列番号１４
ＬＣＤＲ３：ＬＱＹＤＥＬＹＴ 配列番号１５
５６Ｂ１０の重鎖相補性決定領域のアミノ酸配列は以下の通りである。
【0173】
ＨＣＤＲ１：ＲＹＹＩＹ 配列番号１６
ＨＣＤＲ２：ＷＩＹＰＧＮＦＮＴＫＹＮＥＫＦＫＧ 配列番号１７
ＨＣＤＲ３：ＤＶＹＤＹＡＧＦＡＹ 配列番号１８
軽鎖相補性決定領域のアミノ酸配列は以下の通りである。
ＨＣＤＲ２：ＷＩＹＰＧＮＦＮＴＫＹＮＥＫＦＫＧ 配列番号１７
ＨＣＤＲ３：ＤＶＹＤＹＡＧＦＡＹ 配列番号１８
軽鎖相補性決定領域のアミノ酸配列は以下の通りである。
【0174】
ＬＣＤＲ１：ＫＡＳＱＧＶＡＴＡＶＡ 配列番号１９
ＬＣＤＲ２：ＷＡＳＴＲＨＴ 配列番号２０
ＬＣＤＲ３：ＱＱＹＳＳＹＰＷＴ 配列番号２１
Ｇｅｒｍｌｉｎｅデータベースから上記各ネズミ由来抗体の非ＦＲ領域に最適にマッチするヒト化の鋳型を選出した。その後、ヒト由来鋳型のＣＤＲ領域に代わってネズミ由来抗体のＣＤＲ領域を選ばれたヒト化鋳型に移植し、さらに重鎖可変領域をヒトＩｇＧ４定常領域と、軽鎖可変領域をヒトκ鎖定常領域と組み換え、同時に当該抗体の三次元構造に基づき、埋め込み残基、ＣＤＲ領域と直接相互作用する残基、および各抗体のＶＬとＶＨの配座に大きく影響する残基に対して回帰突然変異を行い、最終的にいくつかのヒト化抗体を得たが、各ヒト化抗体に相応する重鎖、軽鎖の可変領域および配列は表３に示す。それぞれ各ヒト化抗体の重鎖と軽鎖をｐｃＤＮＡ３．４発現ベクターに構築し、ＨＥＫ－２９３Ｆ細胞に形質移入して発現させ、そして精製して各ヒト化抗体を得た。
ＬＣＤＲ２：ＷＡＳＴＲＨＴ 配列番号２０
ＬＣＤＲ３：ＱＱＹＳＳＹＰＷＴ 配列番号２１
Ｇｅｒｍｌｉｎｅデータベースから上記各ネズミ由来抗体の非ＦＲ領域に最適にマッチするヒト化の鋳型を選出した。その後、ヒト由来鋳型のＣＤＲ領域に代わってネズミ由来抗体のＣＤＲ領域を選ばれたヒト化鋳型に移植し、さらに重鎖可変領域をヒトＩｇＧ４定常領域と、軽鎖可変領域をヒトκ鎖定常領域と組み換え、同時に当該抗体の三次元構造に基づき、埋め込み残基、ＣＤＲ領域と直接相互作用する残基、および各抗体のＶＬとＶＨの配座に大きく影響する残基に対して回帰突然変異を行い、最終的にいくつかのヒト化抗体を得たが、各ヒト化抗体に相応する重鎖、軽鎖の可変領域および配列は表３に示す。それぞれ各ヒト化抗体の重鎖と軽鎖をｐｃＤＮＡ３．４発現ベクターに構築し、ＨＥＫ－２９３Ｆ細胞に形質移入して発現させ、そして精製して各ヒト化抗体を得た。
【0175】
得られた関連配列の情報は以下の通りである。
【0176】
【0177】
配列番号１
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＴＳＧＹＴＦＴＲＹＹＩＹＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＩＧＷＩＹＰＧＮＦＮＴＫＹＮＥＫＦＫＧＲＡＴＬＴＡＤＴＳＡＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＶＹＤＹＡＧＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号２
ＤＩＱＬＴＱＳＰＳＦＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＫＡＳＱＧＶＡＴＡＶＡＷＹＱＱＫＰＧＱＳＰＫＬＬＩＹＷＡＳＴＲＨＴＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＥＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＹＳＳＹＰＷＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ
配列番号３
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＦＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＫＡＳＱＧＶＡＴＡＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＳＰＫＬＬＩＹＷＡＳＴＲＨＴＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＥＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＦＣＱＱＹＳＳＹＰＷＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ
配列番号４
ＱＶＱＬＱＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＲＹＹＩＹＷＶＲＱＲＰＧＱＧＬＥＷＩＧＷＩＹＰＧＮＦＮＴＫＹＮＥＫＦＫＧＲＡＴＬＴＡＤＴＳＡＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＴＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＶＹＤＹＡＧＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号５
ＤＩＱＬＴＱＳＰＳＦＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＫＡＳＱＧＶＡＴＡＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＷＡＳＴＲＨＴＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＥＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＹＳＳＹＰＷＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ
配列番号６
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＷＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＩＧＥＩＮＰＳＩＧＲＴＮＹＮＥＫＦＫＳＲＡＴＬＴＶＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＲＶＹＧＴＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号７
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＫＡＳＱＤＩＮＳＹＬＳＷＦＱＱＫＰＧＫＳＰＫＴＬＩＹＲＡＮＩＷＶＤＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＱＤＹＴＦＴＩＳＳＬＱＰＥＤＩＡＴＹＹＣＬＱＹＤＥＬＹＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ
配列番号８
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＫＡＳＱＤＩＮＳＹＬＳＷＦＱＱＫＰＧＫＳＰＫＬＬＩＹＲＡＮＩＷＶＤＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＱＤＹＴＦＴＩＳＳＬＱＰＥＤＩＡＴＹＹＣＬＱＹＤＥＬＹＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ
配列番号９
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＷＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＩＧＥＩＮＰＳＩＧＲＴＮＹＮＥＫＦＫＳＲＶＴＬＴＲＤＴＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＲＶＹＧＴＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
実施例８ ヒト化抗体のヒトＣＤ７３－Ｈｉｓタンパク質に対する結合活性
実施例３を参照して各ヒト化抗体のヒトＣＤ７３－ｈｉｓタンパク質に対する結合親和力を測定した。
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＴＳＧＹＴＦＴＲＹＹＩＹＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＩＧＷＩＹＰＧＮＦＮＴＫＹＮＥＫＦＫＧＲＡＴＬＴＡＤＴＳＡＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＶＹＤＹＡＧＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号２
ＤＩＱＬＴＱＳＰＳＦＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＫＡＳＱＧＶＡＴＡＶＡＷＹＱＱＫＰＧＱＳＰＫＬＬＩＹＷＡＳＴＲＨＴＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＥＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＹＳＳＹＰＷＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ
配列番号３
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＦＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＫＡＳＱＧＶＡＴＡＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＳＰＫＬＬＩＹＷＡＳＴＲＨＴＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＥＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＦＣＱＱＹＳＳＹＰＷＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ
配列番号４
ＱＶＱＬＱＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＲＹＹＩＹＷＶＲＱＲＰＧＱＧＬＥＷＩＧＷＩＹＰＧＮＦＮＴＫＹＮＥＫＦＫＧＲＡＴＬＴＡＤＴＳＡＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＴＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＶＹＤＹＡＧＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号５
ＤＩＱＬＴＱＳＰＳＦＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＫＡＳＱＧＶＡＴＡＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＷＡＳＴＲＨＴＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＥＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＹＳＳＹＰＷＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ
配列番号６
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＷＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＩＧＥＩＮＰＳＩＧＲＴＮＹＮＥＫＦＫＳＲＡＴＬＴＶＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＲＶＹＧＴＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号７
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＫＡＳＱＤＩＮＳＹＬＳＷＦＱＱＫＰＧＫＳＰＫＴＬＩＹＲＡＮＩＷＶＤＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＱＤＹＴＦＴＩＳＳＬＱＰＥＤＩＡＴＹＹＣＬＱＹＤＥＬＹＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ
配列番号８
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＫＡＳＱＤＩＮＳＹＬＳＷＦＱＱＫＰＧＫＳＰＫＬＬＩＹＲＡＮＩＷＶＤＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＱＤＹＴＦＴＩＳＳＬＱＰＥＤＩＡＴＹＹＣＬＱＹＤＥＬＹＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ
配列番号９
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＷＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＩＧＥＩＮＰＳＩＧＲＴＮＹＮＥＫＦＫＳＲＶＴＬＴＲＤＴＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＲＶＹＧＴＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
実施例８ ヒト化抗体のヒトＣＤ７３－Ｈｉｓタンパク質に対する結合活性
実施例３を参照して各ヒト化抗体のヒトＣＤ７３－ｈｉｓタンパク質に対する結合親和力を測定した。
【0178】
実験結果は図４および表４に示すように、５６Ｂ１０の各ヒト化抗体はＣＤ７３タンパク質に対する結合親和力がキメラ抗体５６Ｂ１０－ｃｈに相当する。
【0179】
図５および表５に示すように、４８Ａ１１の各ヒト化抗体はＣＤ７３タンパク質に対する結合親和力がキメラ抗体４８Ａ１１－ｃｈに相当する。
【0180】
ＣＤ７３－Ｈｉｓタンパク質をＴｒｉｓ－ＭｇＣｌ２ （２５ ｍＭ Ｔｒｉｓ、５ ｍＭ ＭｇＣｌ２、ｐＨ＝７．５）溶液で０．５ μｇ／ｍＬに希釈し、２５ μＬ／ウェルで白色９６ウェル細胞培養プレートに入れた。Ｔｒｉｓ－ＭｇＣｌ２溶液で各抗体を勾配希釈し、２５ μＬ／ウェルで上記９６ウェルプレートに入れて３７℃で１ ｈインキュベートした。
【0181】
２５ μＬ／ウェルで予め均一に混合したＡＭＰ／ＡＴＰ溶液 （ＡＭＰとＡＴＰの最終濃度がそれぞれ３００ μＭと１００ μＭである）を入れ、３７℃で１ｈインキュベートした。各ウェルに７５ μＬｍのＣｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ－Ｇｌｏ検出液を入れ、２分振とうして均一に混合した後、室温で５－８分反応させた。その後、９６ウェルプレートを多機能プレートリーダーに置いて蛍光強度を検出し、各抗体のＣＤ７３の酵素活性に対する抑制作用を算出した。
【0182】
実験結果は図６および表６に示すように、４８Ａ１１－ＨｕＶ２２はＣＤ７３タンパク質のＡＭＰ酵素分解活性に対する抑制作用が最も弱く、５６Ｂ１０－ＨｕＶ３３および４８Ａ１１－ＨｕＶ３３は抑制作用が相当し、５６Ｂ１０－ＨｕＶ３１は抑制作用が最も強い。
【0183】
プロテインＡ／Ｇが共有結合したチップで各被験抗体を捕獲し、関連する操作パラメーターは、抗体濃度２ μｇ／ｍＬ、接触時間７５ ｓ、流速１０ μＬ／ｍｉｎ、再生接触時間３０ ｓであった。ＨＢＳ－ＥＰ ｐＨ７．４緩衝液でＣＤ７３－ｈｉｓ抗原を希釈し、最高濃度が１００ ｎＭで、２倍勾配希釈で０．７８ ｎＭまで、重複ウェルおよび０濃度を設け、６Ｍ 塩化グアニジニウム溶液を再生緩衝液とし、Ｂｉａｃｏｒｅ ８Ｋにおいて結合時間１８０ｓ、解離時間９００ｓ、流速３０μＬ／ｍｉｎ、再生接触時間３０ｓのようなパラメーターで仕込んだ。操作終了後、Ｂｉａｃｏｒｅ ８Ｋ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅによって「１：１ ｂｉｎｄｉｎｇ ｋｉｎｅｔｉｃｓ ｍｏｄｅｌ」でデータを分析し、各抗体のＣＤ７３に対する結合の動態学パラメーターを得た。
【0184】
結果は表７に示すように、ヒト化抗体５６Ｂ１０－ＨｕＶ３１および４８Ａ１１－ＨｕＶ３３はＣＤ７３に対する結合定数（ｋａ）、解離定数（ｋｄ）および平衡解離定数（ＫＤ）がいずれも同様のレベルにある。
【0185】
それぞれ対数生長期にあるＭＤＡ－ＭＢ－２３１（トリプルネガティブ乳癌）、Ｈ２９２（ヒト肺癌細胞）およびＡ３７５（ヒト悪性黒色腫細胞）の細胞を収集し、ＲＰＭＩ－１６４０基礎培地で細胞を一回洗浄し、そしてそれぞれ１％ＢＳＡ含有ＲＰＭＩ－１６４０基礎培地（抗体希釈液）もぽて細胞濃度が２．０×１０６個／ｍＬになるように調整した。抗体希釈液で３倍勾配で被験抗体を希釈し、そして１００ μＬの各濃度の被験抗体を取って１００ μＬの細胞と９６ウェル細胞培養プレートにおいて均一に混合し、４℃で１ｈインキュベートした（被験抗体の最高使用濃度が５００ ｎＭで、標的細胞が１×１０５個／ウェルである）。ＰＢＳで細胞を２回洗浄して結合しなかった被験抗体を除去し、さらに細胞を２００μＬ、５ μｇ／ｍＬ、ＦＩＴＣ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ－Ｆｃ二次抗体と均一に混合し、４℃で３０ ｍｉｎインキュベートした。ＰＢＳで細胞を２回洗浄して結合しなかった二次抗体を除去し、最後に細胞を２００μＬ ＰＢＳに再懸濁させ、フローサイトメーターによって被験抗体の当該細胞に対する結合親和力を測定した。
【0186】
図７に示すように、５６Ｂ１０－ＨｕＶ３１および４８Ａ１１－ＨｕＶ３３はいずれもＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞と結合することができ、かつ４８Ａ１１－ＨｕＶ３３は親和力がより強く、ＥＣ５０がそれぞれ１．３８７ｎＭおよび１．９２７ｎＭであった。
【0187】
図８に示すように、５６Ｂ１０－ＨｕＶ３１および４８Ａ１１－ＨｕＶ３３はいずれもＨ２９２細胞と結合することができ、かつ４８Ａ１１－ＨｕＶ３３は親和力がより強く、ＥＣ５０がそれぞれ２．５４９ｎＭおよび２．３０５ｎＭであった。
【0188】
図９に示すように、５６Ｂ１０－ＨｕＶ３１および４８Ａ１１－ＨｕＶ３３はいずれもＡ３７５細胞と結合することができ、かつ４８Ａ１１－ＨｕＶ３３は親和力がより強く、ＥＣ５０がそれぞれ１．２６９ｎＭおよび０．７８９ｎＭであった。
【0189】
実施例１２ ヒト化抗体の腫瘍細胞の表面のＣＤ７３タンパク質の酵素活性に対する抑制作用
それぞれ対数生長期にあるＭＤＡ－ＭＢ－２３１、Ｈ２９２およびＡ３７５の細胞を収集し、ＲＰＭＩ－１６４０基礎培地で細胞を一回洗浄し、そして１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ－１６４０基礎培地で細胞濃度が１×１０５個／ｍＬ， １×１０５および１×１０６個／ｍＬになるように調整し、１００ μＬ／ウェルで細胞懸濁液を９６ウェル細胞培養プレートに敷き、３７℃でインキュベーターにおいて一晩培養した。翌日に、細胞上清を捨て、そしてＴｒｉｓ－ＭｇＣｌ２溶液で細胞を一回洗浄した。Ｔｒｉｓ－ＭｇＣｌ２溶液で３倍勾配で被験抗体を連続希釈し、そして５０ μＬの各濃度の被験抗体を取って各細胞培養ウェルに入れ、３７℃のインキュベーターにおいて０．５ ｈインキュベートした（被験抗体の最高使用濃度が１００ μｇ／ｍＬである）。細胞培養プレートにＡＭＰを入れ、最終濃度が３００ μＭで、５０ ｕＬ／ウェルで入れ、３７℃のインキュベーターにおいて続いて３ ｈインキュベートした。５０ μＬの上記細胞インキュベート上清を９６ウェル白色細胞培養プレートに取り、等体積のＡＴＰを入れ、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞ではＡＴＰの最終濃度が１００ μＭ（ＡＴＰ：ＡＭＰ＝１：３）、Ｈ２９２およびＡ３７５細胞ではＡＴＰの最終濃度が６０ μＭ（ＡＴＰ：ＡＭＰ＝１：５）であった。その後、白色細胞培養プレートを３７℃のインキュベーターにおいて１５ ｍｉｎインキュベートした。等体積のＣｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ－Ｇｌｏ試薬を入れて１０ｍｉｎ反応させ、多機能プレートリーダーにおいて蛍光値を読み取り、各サンプルの腫瘍細胞の表面のＣＤ７３タンパク質の酵素活性に対する抑制作用を分析した。
それぞれ対数生長期にあるＭＤＡ－ＭＢ－２３１、Ｈ２９２およびＡ３７５の細胞を収集し、ＲＰＭＩ－１６４０基礎培地で細胞を一回洗浄し、そして１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ－１６４０基礎培地で細胞濃度が１×１０５個／ｍＬ， １×１０５および１×１０６個／ｍＬになるように調整し、１００ μＬ／ウェルで細胞懸濁液を９６ウェル細胞培養プレートに敷き、３７℃でインキュベーターにおいて一晩培養した。翌日に、細胞上清を捨て、そしてＴｒｉｓ－ＭｇＣｌ２溶液で細胞を一回洗浄した。Ｔｒｉｓ－ＭｇＣｌ２溶液で３倍勾配で被験抗体を連続希釈し、そして５０ μＬの各濃度の被験抗体を取って各細胞培養ウェルに入れ、３７℃のインキュベーターにおいて０．５ ｈインキュベートした（被験抗体の最高使用濃度が１００ μｇ／ｍＬである）。細胞培養プレートにＡＭＰを入れ、最終濃度が３００ μＭで、５０ ｕＬ／ウェルで入れ、３７℃のインキュベーターにおいて続いて３ ｈインキュベートした。５０ μＬの上記細胞インキュベート上清を９６ウェル白色細胞培養プレートに取り、等体積のＡＴＰを入れ、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞ではＡＴＰの最終濃度が１００ μＭ（ＡＴＰ：ＡＭＰ＝１：３）、Ｈ２９２およびＡ３７５細胞ではＡＴＰの最終濃度が６０ μＭ（ＡＴＰ：ＡＭＰ＝１：５）であった。その後、白色細胞培養プレートを３７℃のインキュベーターにおいて１５ ｍｉｎインキュベートした。等体積のＣｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ－Ｇｌｏ試薬を入れて１０ｍｉｎ反応させ、多機能プレートリーダーにおいて蛍光値を読み取り、各サンプルの腫瘍細胞の表面のＣＤ７３タンパク質の酵素活性に対する抑制作用を分析した。
【0190】
図１０に示すように、５６Ｂ１０－ＨｕＶ３１および４８Ａ１１－ＨｕＶ３３はいずれも有効にＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞の表面のＣＤ７３タンパク質のＡＭＰ酵素分解活性を抑制することができ、ＩＣ５０がそれぞれ０．６１０ｎＭおよび０．５６６ｎＭであった。
【0191】
図１１に示すように、５６Ｂ１０－ＨｕＶ３１および４８Ａ１１－ＨｕＶ３３はいずれも有効にＨ２９２細胞の表面のＣＤ７３タンパク質のＡＭＰ酵素分解活性を抑制することができ、ＩＣ５０がそれぞれ０．８１８ｎＭおよび０．８５９ｎＭであった。
【0192】
図１２に示すように、５６Ｂ１０－ＨｕＶ３１および４８Ａ１１－ＨｕＶ３３はいずれも有効にＡ３７５細胞の表面のＣＤ７３タンパク質のＡＭＰ酵素分解活性を抑制することができ、ＩＣ５０がそれぞれ１．３３９ｎＭおよび１．４８２ｎＭであった。
【0193】
実施例１３ ヒト化抗体による腫瘍細胞のＡＭＰ分解のＣＤ４＋およびＣＤ８＋ Ｔ細胞応答に対する抑制の逆転
１．Ｔ細胞の分別
新しく購入されたＰＢＭＣ細胞（Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｓａｉｙｕ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．から購入）を氷の上に置き、計数し、それぞれＣＤ８＋ＴとＣＤ４＋Ｔ細胞の磁気ビーズ分別の説明書の要求に従い、ＣＤ８＋ＴとＣＤ４＋Ｔ細胞を分別し、使用に備えた。
１．Ｔ細胞の分別
新しく購入されたＰＢＭＣ細胞（Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｓａｉｙｕ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．から購入）を氷の上に置き、計数し、それぞれＣＤ８＋ＴとＣＤ４＋Ｔ細胞の磁気ビーズ分別の説明書の要求に従い、ＣＤ８＋ＴとＣＤ４＋Ｔ細胞を分別し、使用に備えた。
【0194】
２．腫瘍細胞の処理
対数生長期にあるＨ２９２細胞を取り、細胞培養上清を除去し、新しく調製された５０ μｇ／ｍＬ アメチシン含有ＲＰＭＩ－１６４０完全培地を入れ、細胞を３７℃のインキュベーターにおいて続いて３ ｈ培養した。
対数生長期にあるＨ２９２細胞を取り、細胞培養上清を除去し、新しく調製された５０ μｇ／ｍＬ アメチシン含有ＲＰＭＩ－１６４０完全培地を入れ、細胞を３７℃のインキュベーターにおいて続いて３ ｈ培養した。
【0195】
３．腫瘍細胞とＴ細胞の共培養
上記分別されたＣＤ８＋ＴとＣＤ４＋Ｔ細胞を、５×１０４／１００μｌ／ウェルでそれぞれ予め１μｇ／ｍＬおよび３μｇ／ｍＬのＣＤ３抗体がコーティングされた９６ウェル細胞培養プレートに敷いた。その後、それぞれ３μｇ／ｍＬのＣＤ２８抗体およびＲＰＭＩ－１６４０完全培地で調製されたＩＬ－２（使用濃度が１００ ＩＵ／ｍＬ）を入れてＴ細胞を活性化させた。各実験ウェルに最終濃度が０．５μＭのＥＨＮＡおよび最終濃度が３００μＭのＡＭＰを入れた。さらに各細胞培養ウェルに異なる濃度の各被験抗体および上記アメチシンを作用させたＨ２９２細胞を入れ、細胞密度が２．５×１０４／５０μｌ ／ウェルであった。当該９６ウェル細胞培養プレートをインキュベーターにおいて４ｄ作用させ、細胞培養上清を収集してＩＦＮ－γ検出を行った。
上記分別されたＣＤ８＋ＴとＣＤ４＋Ｔ細胞を、５×１０４／１００μｌ／ウェルでそれぞれ予め１μｇ／ｍＬおよび３μｇ／ｍＬのＣＤ３抗体がコーティングされた９６ウェル細胞培養プレートに敷いた。その後、それぞれ３μｇ／ｍＬのＣＤ２８抗体およびＲＰＭＩ－１６４０完全培地で調製されたＩＬ－２（使用濃度が１００ ＩＵ／ｍＬ）を入れてＴ細胞を活性化させた。各実験ウェルに最終濃度が０．５μＭのＥＨＮＡおよび最終濃度が３００μＭのＡＭＰを入れた。さらに各細胞培養ウェルに異なる濃度の各被験抗体および上記アメチシンを作用させたＨ２９２細胞を入れ、細胞密度が２．５×１０４／５０μｌ ／ウェルであった。当該９６ウェル細胞培養プレートをインキュベーターにおいて４ｄ作用させ、細胞培養上清を収集してＩＦＮ－γ検出を行った。
【0196】
４．ＩＦＮ－γ検出
ＥＬＩＳＡコーティング液でマウス抗ヒトＩＦＮ－γ抗体を１ μｇ／ｍＬに希釈し、ＥＬＩＳＡプレートをコーティングを１００ μＬ／ウェルで、湿潤ボックスにおいて、４ ℃で、１６ ｈコーティングした。ＰＢＳＴでＥＬＩＳＡプレートを３回洗浄し、結合しなかった抗原を除去し、そしてＥＬＩＳＡプレートを吸水紙で乾燥させ、余分な液体を除去し、さらにＰＢＳで調製された２％ＢＳＡで、２００ μＬ／ウェルで、室温で２ ｈブロッキングした。ＰＢＳＴで一回洗浄し、余分なブロッキング液を流し、そしてＥＬＩＳＡプレートを叩いて乾燥させ、余分な液体を除去し、異なる濃度の抗体の作用における上記細胞上清を１００ μＬ／ウェルで入れ、室温で１ｈインキュベートした。ＰＢＳＴでＥＬＩＳＡプレートを３回洗浄し、ビオチン－マウス抗ヒトＩＦＮ－γ抗体を１ μｇ／ｍＬに希釈し、ＥＬＩＳＡプレートに１００ μＬ／ウェルで入れ、室温で１ ｈインキュベートした。ＰＢＳＴでＥＬＩＳＡプレートを３回洗浄し、ＨＲＰ－ＳＡで１：５０００で希釈し、ＥＬＩＳＡプレートに１００ μＬ／ウェルで入れ、室温で３０ ｍｉｎインキュベートした。ＰＢＳＴでＥＬＩＳＡプレートを５回洗浄し、そしてＥＬＩＳＡプレートを吸水紙で乾燥させ、余分な液体を除去し、ＴＭＢ呈色液を１００ μＬ／ウェルで入れ、適切な濃さまで呈色させ、２Ｍ Ｈ２ＳＯ４を５０ μＬ／ウェルで入れ、呈色を停止させ、そして多機能プレートリーダーにおいて波長４５０ｎｍでその吸光度を測定し、データを分析した。
ＥＬＩＳＡコーティング液でマウス抗ヒトＩＦＮ－γ抗体を１ μｇ／ｍＬに希釈し、ＥＬＩＳＡプレートをコーティングを１００ μＬ／ウェルで、湿潤ボックスにおいて、４ ℃で、１６ ｈコーティングした。ＰＢＳＴでＥＬＩＳＡプレートを３回洗浄し、結合しなかった抗原を除去し、そしてＥＬＩＳＡプレートを吸水紙で乾燥させ、余分な液体を除去し、さらにＰＢＳで調製された２％ＢＳＡで、２００ μＬ／ウェルで、室温で２ ｈブロッキングした。ＰＢＳＴで一回洗浄し、余分なブロッキング液を流し、そしてＥＬＩＳＡプレートを叩いて乾燥させ、余分な液体を除去し、異なる濃度の抗体の作用における上記細胞上清を１００ μＬ／ウェルで入れ、室温で１ｈインキュベートした。ＰＢＳＴでＥＬＩＳＡプレートを３回洗浄し、ビオチン－マウス抗ヒトＩＦＮ－γ抗体を１ μｇ／ｍＬに希釈し、ＥＬＩＳＡプレートに１００ μＬ／ウェルで入れ、室温で１ ｈインキュベートした。ＰＢＳＴでＥＬＩＳＡプレートを３回洗浄し、ＨＲＰ－ＳＡで１：５０００で希釈し、ＥＬＩＳＡプレートに１００ μＬ／ウェルで入れ、室温で３０ ｍｉｎインキュベートした。ＰＢＳＴでＥＬＩＳＡプレートを５回洗浄し、そしてＥＬＩＳＡプレートを吸水紙で乾燥させ、余分な液体を除去し、ＴＭＢ呈色液を１００ μＬ／ウェルで入れ、適切な濃さまで呈色させ、２Ｍ Ｈ２ＳＯ４を５０ μＬ／ウェルで入れ、呈色を停止させ、そして多機能プレートリーダーにおいて波長４５０ｎｍでその吸光度を測定し、データを分析した。
【0197】
結果はそれぞれ図１３および図１４に示すように、ヒト化抗体４８Ａ１１－ＨｕＶ３３は顕著に腫瘍細胞Ｈ２９２のＡＭＰ分解にあるアデノシンのＣＤ４＋とＣＤ８＋ Ｔ細胞応答に対する抑制作用を逆転させることができ、その活性が明らかに５６Ｂ１０－ＨｕＶ３１よりも良かった。
【0198】
実施例１４ ヒト化抗体の異なる種属のＣＤ７３タンパク質に対するクロス反応性
実験方法は実施例１０を参照し、ここで、抗原はそれぞれカニクイザルＣＤ７３タンパク質（Ｓｉｎｏ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌから購入、カタログ番号９０１９２－Ｃ０８Ｈ）およびマウスＣＤ７３タンパク質（Ｓｉｎｏ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌから購入、カタログ番号５０２３１－Ｍ０８Ｈ）を使用した。
実験方法は実施例１０を参照し、ここで、抗原はそれぞれカニクイザルＣＤ７３タンパク質（Ｓｉｎｏ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌから購入、カタログ番号９０１９２－Ｃ０８Ｈ）およびマウスＣＤ７３タンパク質（Ｓｉｎｏ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌから購入、カタログ番号５０２３１－Ｍ０８Ｈ）を使用した。
【0199】
実験結果は表８に示すように、４８Ａ１１－ＨｕＶ３３および５６Ｂ１０－ＨｕＶ３１はいずれも有効にカニクイザルＣＤ７３タンパク質と結合することができたが、マウスＣＤ７３タンパク質と結合しなかったことから、カニクイザルは後続の薬物動態学・毒理の研究の関連種属として有用であることが示された。
【0200】
本実施例では、ヒト末梢血単核球ｈＰＢＭＣ（Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｓａｉｙｕ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．から購入）でＮＳＧマウス体内においてヒト由来免疫系を再構築し、そしてこのマウスに基づいてヒト肺癌ＮＣＩ－Ｈ２９２皮下移植腫瘍モデルを構築して候補抗体の体内における薬効活性を評価した。
【0201】
具体的な実施手順は以下の通りである：体外において培養されたヒト人肺癌ＮＣＩ－Ｈ２９２細胞を収集し、細胞懸濁液の濃度が５×１０７／ｍｌになるように調整し、マトリゲルと１：１の等比率で混合した。ＰＢＳで新しく再生させたＰＢＭＣ細胞を再懸濁させ、ＰＢＭＣ懸濁液の濃度が１×１０７／ｍｌになるように調整した。混合できた腫瘍細胞懸濁液をＰＢＭＣ懸濁液と１：１で混合した。無菌条件において、２００μｌの細胞混合懸濁液をＮＳＧマウスの右側の上背部の皮下に接種した。当日に混合細胞を接種されたマウスを体重によって８匹／群でランダムに群分けした。ブランク対照群、投与量１ ｍｇ／ｋｇの抗ＰＤ１モノクローナル抗体６０９Ａ群（特許出願ＰＣＴ／ＣＮ２０１８／０７３５７５を参照）、投与量がいずれも１０ ｍｇ／ｋｇの５６Ｂ１０－ＨｕＶ３１、４８Ａ１１－ＨｕＶ３３を含む、抗ＣＤ７３モノクローナル抗体群、ならびに抗ＣＤ７３モノクローナル抗体のそれぞれ６０９Ａとの併用群を含む。毎週２回腹腔投与し、計８回投与した。週に２回腫瘍体積を測定した。
【0202】
各群の腫瘍の経時生長曲線は図１５に示すように、実験の終了時点において、対照群に対し、６０９Ａの単独投与はＨ２９２に対するマウス皮下移植腫瘍抑制率が３４．４％で、５６Ｂ１０－ＨｕＶ３１は２５．３％で、４８Ａ１１－ＨｕＶ３３は２４．４％で、５６Ｂ１０－ＨｕＶ３１を６０９Ａと併用すると、抑制率が６１．２％で、４８Ａ１１－ＨｕＶ３３を６０９Ａと併用すると、抑制率が５２．９％であったことがわかるが、これによってＣＤ７３を標的とするヒト化抗体５６Ｂ１０－ＨｕＶ３１および４８Ａ１１－ＨｕＶ３３のＰＤ１を標的とする抗体６０９Ａとの併用は顕著に薬物それぞれの治療効果を増強することができることが示された。
【0203】
実施例１６ ヒト化抗体のＣＤ７３に対する結合エピトープの測定
ＣＤ７３配列のドメインの特徴および文献資料の研究結果（ＤＯＩ： １０．１０１６／ｊ．ｓｔｒ．２０１２．１０．００１）により、ＣＤ７３細胞外領域を二つの部分に分けて発現させ、それぞれ１番目のアミノ酸Ｗから２９１番目のアミノ酸ＤのＮ末端領域および３１１番目のアミノ酸Ｑから５２３番目のアミノ酸ＳのＣ末端領域で、実施例１の方法を参照して発現・精製を行い、そしてそれぞれＣＤ７３－ＮＤ－ｈｉｓおよびＣＤ７３－ＣＤ－ｈｉｓと名付けた。
ＣＤ７３配列のドメインの特徴および文献資料の研究結果（ＤＯＩ： １０．１０１６／ｊ．ｓｔｒ．２０１２．１０．００１）により、ＣＤ７３細胞外領域を二つの部分に分けて発現させ、それぞれ１番目のアミノ酸Ｗから２９１番目のアミノ酸ＤのＮ末端領域および３１１番目のアミノ酸Ｑから５２３番目のアミノ酸ＳのＣ末端領域で、実施例１の方法を参照して発現・精製を行い、そしてそれぞれＣＤ７３－ＮＤ－ｈｉｓおよびＣＤ７３－ＣＤ－ｈｉｓと名付けた。
【0204】
実施例３の実施方法を参照し、４８Ａ１１－ＨｕＶ３３および５６Ｂ１０－ＨｕＶ３１のＣＤ７３タンパク質との結合領域を測定した。結果はそれぞれ図１６および１７に示すように、４８Ａ１１－ＨｕＶ３３および５６Ｂ１０－ＨｕＶ３１はいずれもＣＤ７３－ＮＤ－ｈｉｓのみと結合し、ＣＤ７３－ＣＤ－ｈｉｓとは結合しなかったことから、ヒト化抗体４８Ａ１１－ＨｕＶ３３および５６Ｂ１０－ＨｕＶ３１はいずれもＣＤ７３タンパク質のＮ末端ドメインにおいて結合することが示された。
【0205】
さらに４８Ａ１１－ＨｕＶ３３および５６Ｂ１０－ＨｕＶ３１のＣＤ７３タンパク質に対する結合の特徴により、ＣＤ７３タンパク質のＮ末端ドメインの１３３番目のアミノ酸Ｙから１４４番目のアミノ酸Ｖおよび１８０番目のアミノ酸Ｋから１８７番目のアミノ酸Ｎの二つの配列断片を選択し、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）によってアラニンスキャニング部位特異的突然変異を行い、さらに実施例１を参照して発現および精製を行い、各ＣＤ７３－ＮＤ突然変異体を得た。
【0206】
実施例３の実験方法を参照し、４８Ａ１１－ＨｕＶ３３のＣＤ７３－ＮＤ各突然変異体タンパク質の親和力を測定し、その中では、ＳＡタンパク質を１μｇ／ｍＬに希釈してＥＬＩＳＡプレートをコーティングし、ビオチン化されたＣＤ７３タンパク質（ＣＤ７３－ビオチン）の使用濃度が０．１μｇ／ｍＬで、実験結果は図１８～図２１に示すように、各突然変異体タンパク質の４８Ａ１１－ＨｕＶ３３に対する結合の親和力低下倍数（Ｒａｔｉｏ（ＥＣ５０））および高プラトー値低下倍数（Ｒａｔｉｏ（Ｔｏｐ））はそれぞれ表９～表１２に示すように、Ｙ１３２、Ｌ１３３、Ｐ１３９の三つのアミノ酸部位が４８Ａ１１－ＨｕＶ３３のＣＤ７３に対する結合に影響する重要な部位で、それぞれ突然変異した後、結合のＥＣ５０が１０倍以上低下し、高プラトー値Ｔｏｐが２倍以上低下し、次はＶ１３７、Ｌ１８１、Ｌ１８４で、それぞれ突然変異した後、結合のＥＣ５０が３－１０倍低下し、あるいは高プラトー値Ｔｏｐが１．５－２倍低下し、その次はＶ１４４、Ｋ１８０で、それぞれ突然変異した後、結合のＥＣ５０が２－３倍低下したことがわかる。
【0207】
上記各部位のＣＤ７３結晶の３Ｄ構造図（ＰＤＢ： ６ＶＣ９から）における位置は図２２に示された通りで、さらに、４８Ａ１１－ＨｕＶ３３のＣＤ７３との結合エピトープは上記重要アミノ酸部位を含む連続しない空間エピトープであることが示された。
【0208】
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【配列表】
【国際調査報告】