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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-12-26
(54)【発明の名称】修飾オリゴヌクレオチド－薬物接合体及びその用途
(51)【国際特許分類】
A61K 47/61 20170101AFI20241219BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20241219BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20241219BHJP
A61K 31/337 20060101ALI20241219BHJP
A61K 38/05 20060101ALI20241219BHJP
A61K 31/537 20060101ALI20241219BHJP
A61K 31/7088 20060101ALI20241219BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20241219BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20241219BHJP
C12N 15/115 20100101ALI20241219BHJP
C12N 5/10 20060101ALN20241219BHJP
C12N 5/09 20100101ALN20241219BHJP
【ＦＩ】
A61K47/61
A61K45/00
A61P35/00
A61K31/337
A61K38/05
A61K31/537
A61K31/7088
A61K48/00
A61P43/00 105
C12N15/115 Z ZNA
C12N5/10
C12N5/09
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024536044
(86)(22)【出願日】2022-11-08
(85)【翻訳文提出日】2024-06-14
(86)【国際出願番号】 KR2022017440
(87)【国際公開番号】W WO2023113243
(87)【国際公開日】2023-06-22
(31)【優先権主張番号】63/290,155
(32)【優先日】2021-12-16
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】10-2022-0147564
(32)【優先日】2022-11-08
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】519232334
【氏名又は名称】インターオリゴ・コーポレイション
【氏名又は名称原語表記】ＩＮＴＥＲＯＬＩＧＯ ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ
【住所又は居所原語表記】＃９０２， Ｆ， Ａ－ＤＯＮＧ， ６６， ＢＥＯＬＭＡＬ－ＲＯ， ＤＯＮＧＡＮ－ＧＵ， ＡＮＡＹＡＮＧ－ＳＩ， ＧＹＥＯＮＧＧＩ‐ＤＯ， １４０５８， ＲＥＰＵＢＬＩＣ ＯＦ ＫＯＲＥＡ
(74)【代理人】
【識別番号】110001818
【氏名又は名称】弁理士法人Ｒ＆Ｃ
(72)【発明者】
【氏名】イ，ジュン・ファン
(72)【発明者】
【氏名】イ，ジョン・ウク
【テーマコード（参考）】
4B065
4C076
4C084
4C086
【Ｆターム（参考）】
4B065AB01
4B065AC12
4B065AC20
4B065BA01
4B065CA44
4C076AA95
4C076AA99
4C076CC27
4C076EE30
4C076EE59
4C076FF34
4C084AA02
4C084AA03
4C084AA13
4C084AA17
4C084BA01
4C084BA08
4C084BA14
4C084BA23
4C084BA42
4C084CA59
4C084NA05
4C084NA06
4C084NA07
4C084NA11
4C084NA13
4C084NA15
4C084ZB211
4C084ZB212
4C084ZB261
4C084ZB262
4C086AA01
4C086AA02
4C086BA02
4C086CB22
4C086EA16
4C086MA01
4C086MA04
4C086NA05
4C086NA06
4C086NA07
4C086NA11
4C086NA13
4C086NA15
4C086ZB21
4C086ZB26
(57)【要約】
本発明は、少なくとも１つの修飾核酸を含む修飾オリゴヌクレオチドと、前記修飾オリゴヌクレオチドにコンジュゲートされた薬物とを含む、修飾オリゴヌクレオチド－薬物接合体に関する。本発明の修飾オリゴヌクレオチド－薬物接合体は、体内で高い安定性を示し、優れた抗癌効果を示すことができる。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
下記化学式１で表される修飾オリゴヌクレオチドと、前記修飾オリゴヌクレオチドに含まれるデオキシウリジン（ｄＵ）にコンジュゲートされた薬物とを含む、修飾オリゴヌクレオチド－薬物接合体：【化1】
Ｘ１～Ｘ３及びＸ７～Ｘ９は、それぞれ独立してチミジン（Ｔ）、あるいは下記の化学式３または化学式４で表される修飾核酸であり、
Ｙ１は、デオキシグアノシン（ｄＧ）、あるいは下記の化学式３または化学式４で表される修飾核酸であり、
Ｘ４～Ｘ６は、それぞれ独立してチミジン（Ｔ）、デオキシウリジン（ｄＵ）、あるいは下記の化学式３または化学式４で表される修飾核酸であり、前記Ｘ４～Ｘ６の少なくとも１つはデオキシウリジン（ｄＵ）であり、
Ｍ１及びＭ２は、それぞれ独立して、下記の化学式３または化学式４で表される修飾核酸であり、
Ｎ１及びＮ２は、それぞれ独立してチミジン（Ｔ）、デオキシウリジン（ｄＵ）、デオキシシチジン（ｄＣ）、またはデオキシグアノシン（ｄＧ）であり、
ａ及びｄは、それぞれ独立して０～１０の整数であるが、前記Ｘ１～Ｘ９がいずれもチミジン（Ｔ）であり、前記Ｙ１がデオキシグアノシン（ｄＧ）である場合、前記ａ及びｄは同時に０ではなく、
ｂ及びｃは、それぞれ独立して０～１０の整数である。）、
【化2】
【化3】
Ｒ１は、水素、ハロゲンまたはヒドロキシ基であり、
Ｒ２は、水素、ハロゲンまたはヒドロキシ基であり、
Ｒ３は、水素、ハロゲン、Ｃ１－Ｃ６のアルキル基、Ｃ１－Ｃ６のハロアルキル基、Ｃ２－Ｃ６のアルケニル基、またはＣ２－Ｃ６のハロアルケニル基である（このとき、前記Ｒ１が水素またはヒドロキシ基であり、前記Ｒ２が水素であり、前記Ｒ３が水素またはメチルである場合を除く。））。
【請求項2】
前記の化学式３または化学式４で表される修飾核酸は、５－フルオロデオキシウリジン、５－フルオロウリジン、５－フルオロデオキシシチジン、５－フルオロシチジン、５－ヨードデオキシウリジン、５－ヨードウリジン、５－ヨードデオキシシチジン、５－ヨードシチジン、シトシンアラビノシド、２’，２’－ジフルオロ－２’－デオキシシチジン、およびブロモビニルデオキシウリジンからなる群より選択される、請求項１に記載の修飾オリゴヌクレオチド－薬物接合体。
【請求項3】
前記薬物は、パクリタキセル、モノメチルアウリスタチンＥ（ｍｏｎｏｍｅｔｈｙｌ ａｕｒｉｓｔａｔｉｎ Ｅ）、モノメチルアウリスタチンＦ（ｍｏｎｏｍｅｔｈｙｌ ａｕｒｉｓｔａｔｉｎ Ｆ）、モノメチルアウリスタチンＤ（ＭＭＡＤ）、シタラビン、ゲムシタビン、メイタンシン、ＤＭ１（ｍｅｒｔａｎｓｉｎｅ、メルタンシン）、ＤＭ４、カリケアミシン及びその誘導体、ドキソルビシン、デュオカルマイシン及びその誘導体、ピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）、ＳＮ－３８、α－アマニチン、ツブリシン類似体（Ｔｕｂｕｌｙｓｉｎ ａｎａｌｏｇ）、シクロホスファミド（ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、メクロレタミン（ｍｅｃｈｏｌｒｅｔｈａｍｉｎｅ）、ウラムスチン（ｕｒａｍｕｓｔｉｎｅ）、メルファラン（ｍｅｌｐｈａｌａｎ）、クロラムブシル（ｃｈｌｏｒａｍｂｕｃｉｌ）、イホスファミド（ｉｆｏｓｆａｍｉｄｅ）、ベンダムスチン（ｂｅｎｄａｍｕｓｔｉｎｅ）、カルムスチン（ｃａｒｍｕｓｔｉｎｅ）、ロムスチン（ｌｏｍｕｓｔｉｎｅ）、ストレプトゾシン（ｓｔｒｅｐｔｏｚｏｃｉｎ）、ブスルファン（ｂｕｓｕｌｆａｎ）、ダカルバジン（ｄａｃａｒｂａｚｉｎｅ）、テモゾロミド（ｔｅｍｏｚｏｌｏｍｉｄｅ）、チオテパ（ｔｈｉｏｔｅｐａ）、アルトレタミン（ａｌｔｒｅｔａｍｉｎｅ）、デュオカルマイシン（ｄｕｏｃａｒｍｙｃｉｎ）、シスプラチン（ｃｉｓｐｌａｔｉｎ）、カルボプラチン（ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎ）、ネダプラチン（ｎｅｄａｐｌａｔｉｎ）、オキサリプラチン（ｏｘａｌｉｐｌａｔｉｎ）、サトラプラチン（ｓａｔｒａｐｌａｔｉｎ）、四硝酸トリプラチン（ｔｒｉｐｌａｔｉｎ ｔｅｔｒａｎｉｔｒａｔｅ）、５－フルオロウラシル（５－ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ）、６－メルカプトプリン（６－ｍｅｒｃａｐｔｏｐｕｒｉｎｅ）、カペシタビン（ｃａｐｅｃｉｔａｂｉｎｅ）、クラドリビン（ｃｌａｄｒｉｂｉｎｅ）、クロファラビン（ｃｌｏｆａｒａｂｉｎｅ）、シスタルビン（ｃｙｓｔａｒｂｉｎｅ）、フロクスウリジン（ｆｌｏｘｕｒｉｄｉｎｅ）、フルダラビン（ｆｌｕｄａｒａｂｉｎｅ）、ゲムシタビン（ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ）、ヒドロキシウレア（ｈｙｄｒｏｘｙｕｒｅａ）、メトトレキサート（ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ）、ペメトレキセド（ｐｅｍｅｔｒｅｘｅｄ）、ペントスタチン（ｐｅｎｔｏｓｔａｔｉｎ）、チオグアニン（ｔｈｉｏｇｕａｎｉｎｅ）、カンプトテシン（ｃａｍｐｔｏｔｈｅｃｉｎ）、トポテカン（ｔｏｐｏｔｅｃａｎ）、イリノテカン（ｉｒｉｎｏｔｅｃａｎ）、エトポシド（ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ）、テニポシド（ｔｅｎｉｐｏｓｉｄｅ）、ミトキサントロン（ｍｉｔｏｘａｎｔｒｏｎｅ）、パクリタキセル（ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）、ドセタキセル（ｄｏｃｅｔａｘｅｌ）、イキサベピロン（ｉｚａｂｅｐｉｌｏｎｅ）、ビンブラスチン（ｖｉｎｂｌａｓｔｉｎｅ）、ビンクリスチン（ｖｉｎｃｒｉｓｔｉｎｅ）、ビンデシン（ｖｉｎｄｅｓｉｎｅ）、ビノレルビン（ｖｉｎｏｒｅｌｂｉｎｅ）、エストラムスチン（ｅｓｔｒａｍｕｓｔｉｎｅ）、メイタンシン（ｍａｙｔａｎｓｉｎｅ）、アウリスタチンＥ（ａｕｒｉｓｔａｔｉｎ Ｅ）、アウリスタチンＦ（ａｕｒｉｓｔａｔｉｎ Ｆ）、およびネモルビシン（ｎｅｍｏｒｕｂｉｃｉｎ）からなる群より選択される、請求項１に記載の修飾オリゴヌクレオチド－薬物接合体。
【請求項4】
前記薬物と前記修飾オリゴヌクレオチドに含まれるデオキシウリジン（ｄＵ）は、Ｌ１とＬ２が結合したリンカー（Ｌ）でコンジュゲートされ、前記Ｌ１は、５’－チオール－改質剤Ｃ６、チオール－改質剤Ｃ６Ｓ－Ｓ、ジチオールセリノール、ＰＣアミノ－改質剤、５’－アミノ－改質剤Ｃ３、５’－アミノ－改質剤Ｃ６、５’－アミノ－改質剤Ｃ１２、５’－アミノ－改質剤ＴＥＧ、アミノ－改質剤Ｃ２ ｄＴ、アミノ－改質剤Ｃ６ ｄＴ、Ｓ－Ｂｚ－チオール－改質剤Ｃ６－ｄＴ、ホスホジエステル結合、およびヌクレオチドからなる群より選択され、脱保護過程により得られる、アクリルアミド（ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ）－Ｃ２－ＮＨ２、Ｃ１２－ＮＨ２、Ｃ３－ＮＨ２、アクリルアミド（ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ）－Ｃ６－プロパンアミド（ｐｒｏｐａｎａｍｉｄｅ）－ＳＨ、アクリルアミド（ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ）－Ｃ６－ＮＨ２、Ｃ６－ＮＨ２、Ｃ６－ＳＨから選択され、
前記Ｌ２は、マレイミドカプロイル－バリン－シトルリン－ｐ－アミノベンゾイルオキシカルボニル（ＭＣ－Ｖａｌ－Ｃｉｔ－ＰＡＢ）、スクシンイミジル４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシラート（ＳＭＣＣ）、コハク酸（ｓｕｃｃｉｎｉｃ ａｃｉｄ）、ヒドラゾン、ペプチド、ジスルフィド、チオエーテル、バリン－シトルリン、Ｎ－マレイミドメチルシクロヘキサン－１－カルボキシラート（ＭＣＣ）、マレイミドカプロイル、メルカプトアセトアミドカプロイル、Ｎ－スクシンイミジル４－（２－ピリジルジチオ）ペンタノエート（ＳＰＰ）、Ｎ－スクシンイミジル４－（２－ピリジルチオ）ペンタノエート（ＳＰＤＢ）、ホスホジエステル結合、およびヌクレオチドからなる群より選択される、請求項１に記載の修飾オリゴヌクレオチド－薬物接合体。
【請求項5】
前記修飾オリゴヌクレオチドは、配列番号４～配列番号１０から選択される配列からなる、請求項１に記載の修飾オリゴヌクレオチド－薬物接合体。
【請求項6】
請求項１～５のいずれか一項に記載の修飾オリゴヌクレオチド－薬物接合体を含む、癌の予防または治療用薬学組成物。
【請求項7】
前記癌は、白血病、リンパ腫、乳癌、肝癌、胃癌、卵巣癌、子宮頸部癌腫、神経膠腫癌、大腸癌、肺癌、膵臓癌、前立腺癌、肝癌、胃腺癌、子宮癌、膀胱癌、甲状腺癌、卵巣癌、黒色腫、および子宮頸部癌からなる群より選択される、請求項６に記載の癌の予防または治療用薬学組成物。
【請求項8】
下記化学式２で表される修飾オリゴヌクレオチドと、前記修飾オリゴヌクレオチドの５’末端または３’末端のうちの少なくとも１つにコンジュゲートされた薬物とを含む、修飾オリゴヌクレオチド－薬物接合体：【化4】
Ｘ１～Ｘ９は、それぞれ独立してチミジン（Ｔ）、あるいは下記の化学式３または化学式４で表される修飾核酸であり、
Ｍ１及びＭ２は、それぞれ独立して、下記の化学式３または化学式４で表される修飾核酸であり、
Ｎ１及びＮ２は、それぞれ独立してチミジン（Ｔ）、デオキシウリジン（ｄＵ）、デオキシシチジン（ｄＣ）、またはデオキシグアノシン（ｄＧ）であり、
ａ及びｄは、それぞれ独立して０～１０の整数であり、前記Ｘ１～Ｘ９がいずれもチミジン（Ｔ）である場合、前記ａ及びｄは同時に０ではなく、
ｂ及びｃは、それぞれ独立して０～１０の整数である。）、
【化5】
【化6】
Ｒ１は、水素、ハロゲンまたはヒドロキシ基であり、
Ｒ２は、水素、ハロゲンまたはヒドロキシ基であり、
Ｒ３は、水素、ハロゲン、Ｃ１－Ｃ６のアルキル基、Ｃ１－Ｃ６のハロアルキル基、Ｃ２－Ｃ６のアルケニル基、またはＣ２－Ｃ６のハロアルケニル基である（このとき、前記Ｒ１が水素またはヒドロキシ基であり、前記Ｒ２が水素であり、前記Ｒ３が水素またはメチルである場合を除く。））。
【請求項9】
前記の化学式３または化学式４で表される修飾核酸は、５－フルオロデオキシウリジン、５－フルオロウリジン、５－フルオロデオキシシチジン、５－フルオロシチジン、５－ヨードデオキシウリジン、５－ヨードウリジン、５－ヨードデオキシシチジン、５－ヨードシチジン、シトシンアラビノシド、２’，２’－ジフルオロ－２’－デオキシシチジン、およびブロモビニルデオキシウリジンからなる群より選択される、請求項８に記載の修飾オリゴヌクレオチド－薬物接合体。
【請求項10】
前記薬物は、パクリタキセル、モノメチルアウリスタチンＥ（ｍｏｎｏｍｅｔｈｙｌ ａｕｒｉｓｔａｔｉｎ Ｅ）、モノメチルアウリスタチンＦ（ｍｏｎｏｍｅｔｈｙｌ ａｕｒｉｓｔａｔｉｎ Ｆ）、モノメチルアウリスタチンＤ（ＭＭＡＤ）、シタラビン、ゲムシタビン、メイタンシン、ＤＭ１（ｍｅｒｔａｎｓｉｎｅ、メルタンシン）、ＤＭ４、カリケアミシン及びその誘導体、ドキソルビシン、デュオカルマイシン及びその誘導体、ピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）、ＳＮ－３８、α－アマニチン、ツブリシン類似体（Ｔｕｂｕｌｙｓｉｎ ａｎａｌｏｇ）、シクロホスファミド（ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、メクロレタミン（ｍｅｃｈｏｌｒｅｔｈａｍｉｎｅ）、ウラムスチン（ｕｒａｍｕｓｔｉｎｅ）、メルファラン（ｍｅｌｐｈａｌａｎ）、クロラムブシル（ｃｈｌｏｒａｍｂｕｃｉｌ）、イホスファミド（ｉｆｏｓｆａｍｉｄｅ）、ベンダムスチン（ｂｅｎｄａｍｕｓｔｉｎｅ）、カルムスチン（ｃａｒｍｕｓｔｉｎｅ）、ロムスチン（ｌｏｍｕｓｔｉｎｅ）、ストレプトゾシン（ｓｔｒｅｐｔｏｚｏｃｉｎ）、ブスルファン（ｂｕｓｕｌｆａｎ）、ダカルバジン（ｄａｃａｒｂａｚｉｎｅ）、テモゾロミド（ｔｅｍｏｚｏｌｏｍｉｄｅ）、チオテパ（ｔｈｉｏｔｅｐａ）、アルトレタミン（ａｌｔｒｅｔａｍｉｎｅ）、デュオカルマイシン（ｄｕｏｃａｒｍｙｃｉｎ）、シスプラチン（ｃｉｓｐｌａｔｉｎ）、カルボプラチン（ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎ）、ネダプラチン（ｎｅｄａｐｌａｔｉｎ）、オキサリプラチン（ｏｘａｌｉｐｌａｔｉｎ）、サトラプラチン（ｓａｔｒａｐｌａｔｉｎ）、四硝酸トリプラチン（ｔｒｉｐｌａｔｉｎ ｔｅｔｒａｎｉｔｒａｔｅ）、５－フルオロウラシル（５－ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ）、６－メルカプトプリン（６－ｍｅｒｃａｐｔｏｐｕｒｉｎｅ）、カペシタビン（ｃａｐｅｃｉｔａｂｉｎｅ）、クラドリビン（ｃｌａｄｒｉｂｉｎｅ）、クロファラビン（ｃｌｏｆａｒａｂｉｎｅ）、シスタルビン（ｃｙｓｔａｒｂｉｎｅ）、フロクスウリジン（ｆｌｏｘｕｒｉｄｉｎｅ）、フルダラビン（ｆｌｕｄａｒａｂｉｎｅ）、ゲムシタビン（ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ）、ヒドロキシウレア（ｈｙｄｒｏｘｙｕｒｅａ）、メトトレキサート（ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ）、ペメトレキセド（ｐｅｍｅｔｒｅｘｅｄ）、ペントスタチン（ｐｅｎｔｏｓｔａｔｉｎ）、チオグアニン（ｔｈｉｏｇｕａｎｉｎｅ）、カンプトテシン（ｃａｍｐｔｏｔｈｅｃｉｎ）、トポテカン（ｔｏｐｏｔｅｃａｎ）、イリノテカン（ｉｒｉｎｏｔｅｃａｎ）、エトポシド（ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ）、テニポシド（ｔｅｎｉｐｏｓｉｄｅ）、ミトキサントロン（ｍｉｔｏｘａｎｔｒｏｎｅ）、パクリタキセル（ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）、ドセタキセル（ｄｏｃｅｔａｘｅｌ）、イキサベピロン（ｉｚａｂｅｐｉｌｏｎｅ）、ビンブラスチン（ｖｉｎｂｌａｓｔｉｎｅ）、ビンクリスチン（ｖｉｎｃｒｉｓｔｉｎｅ）、ビンデシン（ｖｉｎｄｅｓｉｎｅ）、ビノレルビン（ｖｉｎｏｒｅｌｂｉｎｅ）、エストラムスチン（ｅｓｔｒａｍｕｓｔｉｎｅ）、メイタンシン（ｍａｙｔａｎｓｉｎｅ）、アウリスタチンＥ（ａｕｒｉｓｔａｔｉｎ Ｅ）、アウリスタチンＦ（ａｕｒｉｓｔａｔｉｎ Ｆ）、およびネモルビシン（ｎｅｍｏｒｕｂｉｃｉｎ）からなる群より選択される、請求項８に記載の修飾オリゴヌクレオチド－薬物接合体。
【請求項11】
前記薬物と前記化学式２で表される修飾オリゴヌクレオチドの５’末端または３’末端のうちの少なくとも１つは、Ｌ１とＬ２が結合したリンカー（Ｌ）でコンジュゲートされ、前記Ｌ１は、５’－チオール－改質剤Ｃ６、チオール－改質剤Ｃ６Ｓ－Ｓ、ジチオールセリノール、ＰＣアミノ－改質剤、５’－アミノ－改質剤Ｃ３、５’－アミノ－改質剤Ｃ６、５’－アミノ－改質剤Ｃ１２、５’－アミノ－改質剤ＴＥＧ、アミノ－改質剤Ｃ２ ｄＴ、アミノ－改質剤Ｃ６ ｄＴ、Ｓ－Ｂｚ－チオール－改質剤Ｃ６－ｄＴ、ホスホジエステル結合、およびヌクレオチドからなる群より選択され、脱保護過程により得られる、アクリルアミド（ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ）－Ｃ２－ＮＨ２、Ｃ１２－ＮＨ２、Ｃ３－ＮＨ２、アクリルアミド（ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ）－Ｃ６－プロパンアミド（ｐｒｏｐａｎａｍｉｄｅ）－ＳＨ、アクリルアミド（ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ）－Ｃ６－ＮＨ２、Ｃ６－ＮＨ２、Ｃ６－ＳＨから選択され、
前記Ｌ２は、マレイミドカプロイル－バリン－シトルリン－ｐ－アミノベンゾイルオキシカルボニル（ＭＣ－Ｖａｌ－Ｃｉｔ－ＰＡＢ）、スクシンイミジル４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシラート（ＳＭＣＣ）、コハク酸（ｓｕｃｃｉｎｉｃ ａｃｉｄ）、ヒドラゾン、ペプチド、ジスルフィド、チオエーテル、バリン－シトルリン、Ｎ－マレイミドメチルシクロヘキサン－１－カルボキシラート（ＭＣＣ）、マレイミドカプロイル、メルカプトアセトアミドカプロイル、Ｎ－スクシンイミジル４－（２－ピリジルジチオ）ペンタノエート（ＳＰＰ）、Ｎ－スクシンイミジル４－（２－ピリジルチオ）ペンタノエート（ＳＰＤＢ）、ホスホジエステル結合、およびヌクレオチドからなる群より選択される、請求項８に記載の修飾オリゴヌクレオチド－薬物接合体。
【請求項12】
前記修飾オリゴヌクレオチドは、配列番号１１または配列番号１２から選択される配列からなる、請求項８に記載の修飾オリゴヌクレオチド－薬物接合体。
【請求項13】
請求項８～１２のいずれか一項に記載の修飾オリゴヌクレオチド－薬物接合体を含む、癌の予防または治療用薬学組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、修飾オリゴヌクレオチド－薬物接合体及びその用途に関する。
【背景技術】
【0002】
現在、抗癌剤を含む多くの治療剤が開発され、臨床を経て薬として開発されてきたが、標的抗癌剤のように、治療効果のある物質を所望の発症部位までより選択的かつ効果的に送達するためには継続的な研究が必要である。具体的には、抗癌剤は非腫瘍特異的な全身毒性（ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｔｏｘｉｃｉｔｙ）と細胞毒性（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）のため、治療有効量（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｉｎｄｅｘ）と治療範囲（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｗｉｎｄｏｗ）が低く、長期間の治療時に抗癌剤に対する耐性が生じる可能性があるという欠点がある。そこで、薬物を癌細胞のみに正確に送達して死滅させる、向上した新規治療法が切実に求められている。
【0003】
一方、グアノシンに富むオリゴヌクレオチドは、グアニンとシトシンの三重水素結合に加えて、分子内結合または分子間結合によって特別な構造を有することができる。一般的なアデニンとチミン、グアニンとシトシンの水素結合による二重らせん構造を形成する代わりに、４つのグアニンが１つの平面に位置してフーグスティーン（Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ）水素結合をなし、四角平面構造のグアニンテトラッド（Ｇ－ｔｅｔｒａｄ）を形成し、２つ以上のグアニンテトラッド（Ｇ－ｔｅｔｒａｄ）が積み重なって四重らせん構造のグアニン四重鎖（Ｇ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ）を形成する。このグアニン四重鎖をなすオリゴヌクレオチドは、その構造的な特徴により安定した構造をなしており、優れた細胞透過性を有することが知られている。
【0004】
しかし、グアニン四重鎖を形成するオリゴヌクレオチドは、主に細胞成長阻害効果によるアポトーシスを誘導しなければならないが、アポトーシス率が比較的高くないため、４日から７日程度の一定時間以上、輸液注射によって持続的に処理する必要がある。そのため、必要以上の薬物を長時間投与しなければならない問題がある。そこで、体内で安定して高い細胞透過性を示し、優れた薬効を示す新しい修飾核酸を含む物質を開発するために多数の研究が行われている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
本発明は、修飾オリゴヌクレオチド－薬物接合体を提供することを目的とする。
【0006】
本発明は、修飾オリゴヌクレオチド－薬物接合体を含む、癌の治療または予防用薬学組成物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0007】
１．下記化学式１で表される修飾オリゴヌクレオチドと、前記修飾オリゴヌクレオチドに含まれるデオキシウリジン（ｄＵ）にコンジュゲートされた薬物とを含む、修飾オリゴヌクレオチド－薬物接合体：
（前記化学式１において、
Ｘ１～Ｘ３及びＸ７～Ｘ９は、それぞれ独立してチミジン（Ｔ）、あるいは下記の化学式３または化学式４で表される修飾核酸であり、
Ｙ１は、デオキシグアノシン（ｄＧ）、あるいは下記の化学式３または化学式４で表される修飾核酸であり、
Ｘ４～Ｘ６は、それぞれ独立してチミジン（Ｔ）、デオキシウリジン（ｄＵ）、あるいは下記の化学式３または化学式４で表される修飾核酸であり、前記Ｘ４～Ｘ６の少なくとも１つはデオキシウリジン（ｄＵ）であり、
Ｍ１及びＭ２は、それぞれ独立して、下記の化学式３または化学式４で表される修飾核酸であり、
Ｎ１及びＮ２は、それぞれ独立してチミジン（Ｔ）、デオキシウリジン（ｄＵ）、デオキシシチジン（ｄＣ）、またはデオキシグアノシン（ｄＧ）であり、
ａ及びｄは、それぞれ独立して０～１０の整数であるが、前記Ｘ１～Ｘ９がいずれもチミジン（Ｔ）であり、前記Ｙ１がデオキシグアノシン（ｄＧ）である場合、前記ａ及びｄは同時に０ではなく、
ｂ及びｃは、それぞれ独立して０～１０の整数である。）、
（前記の化学式３または化学式４において、
Ｒ１は、水素、ハロゲンまたはヒドロキシ基であり、
Ｒ２は、水素、ハロゲンまたはヒドロキシ基であり、
Ｒ３は、水素、ハロゲン、Ｃ１－Ｃ６のアルキル基、Ｃ１－Ｃ６のハロアルキル基、Ｃ２－Ｃ６のアルケニル基、またはＣ２－Ｃ６のハロアルケニル基である（このとき、前記Ｒ１が水素またはヒドロキシ基であり、前記Ｒ２が水素であり、前記Ｒ３が水素またはメチルである場合を除く。））。
【化1】
Ｘ１～Ｘ３及びＸ７～Ｘ９は、それぞれ独立してチミジン（Ｔ）、あるいは下記の化学式３または化学式４で表される修飾核酸であり、
Ｙ１は、デオキシグアノシン（ｄＧ）、あるいは下記の化学式３または化学式４で表される修飾核酸であり、
Ｘ４～Ｘ６は、それぞれ独立してチミジン（Ｔ）、デオキシウリジン（ｄＵ）、あるいは下記の化学式３または化学式４で表される修飾核酸であり、前記Ｘ４～Ｘ６の少なくとも１つはデオキシウリジン（ｄＵ）であり、
Ｍ１及びＭ２は、それぞれ独立して、下記の化学式３または化学式４で表される修飾核酸であり、
Ｎ１及びＮ２は、それぞれ独立してチミジン（Ｔ）、デオキシウリジン（ｄＵ）、デオキシシチジン（ｄＣ）、またはデオキシグアノシン（ｄＧ）であり、
ａ及びｄは、それぞれ独立して０～１０の整数であるが、前記Ｘ１～Ｘ９がいずれもチミジン（Ｔ）であり、前記Ｙ１がデオキシグアノシン（ｄＧ）である場合、前記ａ及びｄは同時に０ではなく、
ｂ及びｃは、それぞれ独立して０～１０の整数である。）、
【化2】
【化3】
Ｒ１は、水素、ハロゲンまたはヒドロキシ基であり、
Ｒ２は、水素、ハロゲンまたはヒドロキシ基であり、
Ｒ３は、水素、ハロゲン、Ｃ１－Ｃ６のアルキル基、Ｃ１－Ｃ６のハロアルキル基、Ｃ２－Ｃ６のアルケニル基、またはＣ２－Ｃ６のハロアルケニル基である（このとき、前記Ｒ１が水素またはヒドロキシ基であり、前記Ｒ２が水素であり、前記Ｒ３が水素またはメチルである場合を除く。））。
【0008】
２．前記項目１において、前記の化学式３または化学式４で表される修飾核酸は、５－フルオロデオキシウリジン、５－フルオロウリジン、５－フルオロデオキシシチジン、５－フルオロシチジン、５－ヨードデオキシウリジン、５－ヨードウリジン、５－ヨードデオキシシチジン、５－ヨードシチジン、シトシンアラビノシド、２’，２’－ジフルオロ－２’－デオキシシチジン、およびブロモビニルデオキシウリジンからなる群より選択される、修飾オリゴヌクレオチド－薬物接合体。
【0009】
３．前記項目１において、前記薬物は、パクリタキセル（ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）、モノメチルアウリスタチンＥ（ｍｏｎｏｍｅｔｈｙｌ ａｕｒｉｓｔａｔｉｎ Ｅ、ＭＭＡＥ）、モノメチルアウリスタチンＦ（ｍｏｎｏｍｅｔｈｙｌ ａｕｒｉｓｔａｔｉｎ Ｆ）、モノメチルアウリスタチンＤ（ｍｏｎｏｍｅｔｈｙｌ ａｕｒｉｓｔａｔｉｎ Ｄ）、シタラビン、ゲムシタビン、メイタンシン、ＤＭ１（ｍｅｒｔａｎｓｉｎｅ、メルタンシン）、ＤＭ４、カリケアミシン及びその誘導体、ドキソルビシン、デュオカルマイシン及びその誘導体、ピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）、ＳＮ－３８、α－アマニチン、ツブリシン類似体（Ｔｕｂｕｌｙｓｉｎ ａｎａｌｏｇ）、シクロホスファミド（ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、メクロレタミン（ｍｅｃｈｏｌｒｅｔｈａｍｉｎｅ）、ウラムスチン（ｕｒａｍｕｓｔｉｎｅ）、メルファラン（ｍｅｌｐｈａｌａｎ）、クロラムブシル（ｃｈｌｏｒａｍｂｕｃｉｌ）、イホスファミド（ｉｆｏｓｆａｍｉｄｅ）、ベンダムスチン（ｂｅｎｄａｍｕｓｔｉｎｅ）、カルムスチン（ｃａｒｍｕｓｔｉｎｅ）、ロムスチン（ｌｏｍｕｓｔｉｎｅ）、ストレプトゾシン（ｓｔｒｅｐｔｏｚｏｃｉｎ）、ブスルファン（ｂｕｓｕｌｆａｎ）、ダカルバジン（ｄａｃａｒｂａｚｉｎｅ）、テモゾロミド（ｔｅｍｏｚｏｌｏｍｉｄｅ）、チオテパ（ｔｈｉｏｔｅｐａ）、アルトレタミン（ａｌｔｒｅｔａｍｉｎｅ）、デュオカルマイシン（ｄｕｏｃａｒｍｙｃｉｎ）、シスプラチン（ｃｉｓｐｌａｔｉｎ）、カルボプラチン（ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎ）、ネダプラチン（ｎｅｄａｐｌａｔｉｎ）、オキサリプラチン（ｏｘａｌｉｐｌａｔｉｎ）、サトラプラチン（ｓａｔｒａｐｌａｔｉｎ）、四硝酸トリプラチン（ｔｒｉｐｌａｔｉｎ ｔｅｔｒａｎｉｔｒａｔｅ）、５－フルオロウラシル（５－ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ）、６－メルカプトプリン（６－ｍｅｒｃａｐｔｏｐｕｒｉｎｅ）、カペシタビン（ｃａｐｅｃｉｔａｂｉｎｅ）、クラドリビン（ｃｌａｄｒｉｂｉｎｅ）、クロファラビン（ｃｌｏｆａｒａｂｉｎｅ）、シスタルビン（ｃｙｓｔａｒｂｉｎｅ）、フロクスウリジン（ｆｌｏｘｕｒｉｄｉｎｅ）、フルダラビン（ｆｌｕｄａｒａｂｉｎｅ）、ゲムシタビン（ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ）、ヒドロキシウレア（ｈｙｄｒｏｘｙｕｒｅａ）、メトトレキサート（ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ）、ペメトレキセド（ｐｅｍｅｔｒｅｘｅｄ）、ペントスタチン（ｐｅｎｔｏｓｔａｔｉｎ）、チオグアニン（ｔｈｉｏｇｕａｎｉｎｅ）、カンプトテシン（ｃａｍｐｔｏｔｈｅｃｉｎ）、トポテカン（ｔｏｐｏｔｅｃａｎ）、イリノテカン（ｉｒｉｎｏｔｅｃａｎ）、エトポシド（ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ）、テニポシド（ｔｅｎｉｐｏｓｉｄｅ）、ミトキサントロン（ｍｉｔｏｘａｎｔｒｏｎｅ）、パクリタキセル（ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）、ドセタキセル（ｄｏｃｅｔａｘｅｌ）、イキサベピロン（ｉｚａｂｅｐｉｌｏｎｅ）、ビンブラスチン（ｖｉｎｂｌａｓｔｉｎｅ）、ビンクリスチン（ｖｉｎｃｒｉｓｔｉｎｅ）、ビンデシン（ｖｉｎｄｅｓｉｎｅ）、ビノレルビン（ｖｉｎｏｒｅｌｂｉｎｅ）、エストラムスチン（ｅｓｔｒａｍｕｓｔｉｎｅ）、メイタンシン（ｍａｙｔａｎｓｉｎｅ）、アウリスタチンＥ（ａｕｒｉｓｔａｔｉｎ Ｅ）、アウリスタチンＦ（ａｕｒｉｓｔａｔｉｎ Ｆ）、およびネモルビシン（ｎｅｍｏｒｕｂｉｃｉｎ）からなる群より選択される、修飾オリゴヌクレオチド－薬物接合体。
【0010】
４．前記項目１において、前記薬物と前記修飾オリゴヌクレオチドに含まれるデオキシウリジン（ｄＵ）は、Ｌ１とＬ２が結合したリンカー（Ｌ）でコンジュゲートされ、
前記Ｌ１は、５’－チオール－改質剤Ｃ６、チオール－改質剤Ｃ６Ｓ－Ｓ、ジチオールセリノール、ＰＣアミノ－改質剤、５’－アミノ－改質剤Ｃ３、５’－アミノ－改質剤Ｃ６、５’－アミノ－改質剤Ｃ１２、５’－アミノ－改質剤ＴＥＧ、アミノ－改質剤Ｃ２ ｄＴ、アミノ－改質剤Ｃ６ ｄＴ、Ｓ－Ｂｚ－チオール－改質剤Ｃ６－ｄＴ、ホスホジエステル結合、およびヌクレオチドからなる群より選択され、脱保護過程により得られる、アクリルアミド（ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ）－Ｃ２－ＮＨ２、Ｃ１２－ＮＨ２、Ｃ３－ＮＨ２、アクリルアミド（ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ）－Ｃ６－プロパンアミド（ｐｒｏｐａｎａｍｉｄｅ）－ＳＨ、アクリルアミド（ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ）－Ｃ６－ＮＨ２、Ｃ６－ＮＨ２、Ｃ６－ＳＨから選択され、
前記Ｌ２は、マレイミドカプロイル－バリン－シトルリン－ｐ－アミノベンゾイルオキシカルボニル（ＭＣ－Ｖａｌ－Ｃｉｔ－ＰＡＢ）、スクシンイミジル４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシラート（ＳＭＣＣ）、コハク酸（ｓｕｃｃｉｎｉｃ ａｃｉｄ）、ヒドラゾン、ペプチド、ジスルフィド、チオエーテル、バリン－シトルリン、Ｎ－マレイミドメチルシクロヘキサン－１－カルボキシラート（ＭＣＣ）、マレイミドカプロイル、メルカプトアセトアミドカプロイル、Ｎ－スクシンイミジル４－（２－ピリジルジチオ）ペンタノエート（ＳＰＰ）、Ｎ－スクシンイミジル４－（２－ピリジルチオ）ペンタノエート（ＳＰＤＢ）、ホスホジエステル結合、およびヌクレオチドからなる群より選択される、修飾オリゴヌクレオチド－薬物接合体。
前記Ｌ１は、５’－チオール－改質剤Ｃ６、チオール－改質剤Ｃ６Ｓ－Ｓ、ジチオールセリノール、ＰＣアミノ－改質剤、５’－アミノ－改質剤Ｃ３、５’－アミノ－改質剤Ｃ６、５’－アミノ－改質剤Ｃ１２、５’－アミノ－改質剤ＴＥＧ、アミノ－改質剤Ｃ２ ｄＴ、アミノ－改質剤Ｃ６ ｄＴ、Ｓ－Ｂｚ－チオール－改質剤Ｃ６－ｄＴ、ホスホジエステル結合、およびヌクレオチドからなる群より選択され、脱保護過程により得られる、アクリルアミド（ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ）－Ｃ２－ＮＨ２、Ｃ１２－ＮＨ２、Ｃ３－ＮＨ２、アクリルアミド（ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ）－Ｃ６－プロパンアミド（ｐｒｏｐａｎａｍｉｄｅ）－ＳＨ、アクリルアミド（ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ）－Ｃ６－ＮＨ２、Ｃ６－ＮＨ２、Ｃ６－ＳＨから選択され、
前記Ｌ２は、マレイミドカプロイル－バリン－シトルリン－ｐ－アミノベンゾイルオキシカルボニル（ＭＣ－Ｖａｌ－Ｃｉｔ－ＰＡＢ）、スクシンイミジル４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシラート（ＳＭＣＣ）、コハク酸（ｓｕｃｃｉｎｉｃ ａｃｉｄ）、ヒドラゾン、ペプチド、ジスルフィド、チオエーテル、バリン－シトルリン、Ｎ－マレイミドメチルシクロヘキサン－１－カルボキシラート（ＭＣＣ）、マレイミドカプロイル、メルカプトアセトアミドカプロイル、Ｎ－スクシンイミジル４－（２－ピリジルジチオ）ペンタノエート（ＳＰＰ）、Ｎ－スクシンイミジル４－（２－ピリジルチオ）ペンタノエート（ＳＰＤＢ）、ホスホジエステル結合、およびヌクレオチドからなる群より選択される、修飾オリゴヌクレオチド－薬物接合体。
【0011】
５．前記項目１において、前記修飾オリゴヌクレオチドは、配列番号４～配列番号１０から選択される配列からなる、修飾オリゴヌクレオチド－薬物接合体。
【0012】
６．前記項目１～５のいずれか一つに記載の修飾オリゴヌクレオチド－薬物接合体を含む、癌の予防または治療用薬学組成物。
【0013】
７．前記項目６において、前記癌は、白血病、リンパ腫、乳癌、肝癌、胃癌、卵巣癌、子宮頸部癌腫、神経膠腫癌、大腸癌、肺癌、膵臓癌、前立腺癌、肝癌、胃腺癌、子宮癌、膀胱癌、甲状腺癌、卵巣癌、黒色腫、および子宮頸部癌からなる群より選択される、癌の予防または治療用薬学組成物。
【0014】
８．下記化学式２で表される修飾オリゴヌクレオチドと、前記修飾オリゴヌクレオチドの５’末端または３’末端のうちの少なくとも１つにコンジュゲートされた薬物とを含む、修飾オリゴヌクレオチド－薬物接合体：
（前記化学式２において、
Ｘ１～Ｘ９は、それぞれ独立してチミジン（Ｔ）、あるいは下記の化学式３または化学式４で表される修飾核酸であり、
Ｍ１及びＭ２は、それぞれ独立して、下記の化学式３または化学式４で表される修飾核酸であり、
Ｎ１及びＮ２は、それぞれ独立してチミジン（Ｔ）、デオキシウリジン（ｄＵ）、デオキシシチジン（ｄＣ）、またはデオキシグアノシン（ｄＧ）であり、
ａ及びｄは、それぞれ独立して０～１０の整数であり、前記Ｘ１～Ｘ９がいずれもチミジン（Ｔ）である場合、前記ａ及びｄは同時に０ではなく、
ｂ及びｃは、それぞれ独立して０～１０の整数である。）、
（前記の化学式３または化学式４において、
Ｒ１は、水素、ハロゲンまたはヒドロキシ基であり、
Ｒ２は、水素、ハロゲンまたはヒドロキシ基であり、
Ｒ３は、水素、ハロゲン、Ｃ１－Ｃ６のアルキル基、Ｃ１－Ｃ６のハロアルキル基、Ｃ２－Ｃ６のアルケニル基、またはＣ２－Ｃ６のハロアルケニル基である（このとき、前記Ｒ１が水素またはヒドロキシ基であり、前記Ｒ２が水素であり、前記Ｒ３が水素またはメチルである場合を除く。））。
【化4】
Ｘ１～Ｘ９は、それぞれ独立してチミジン（Ｔ）、あるいは下記の化学式３または化学式４で表される修飾核酸であり、
Ｍ１及びＭ２は、それぞれ独立して、下記の化学式３または化学式４で表される修飾核酸であり、
Ｎ１及びＮ２は、それぞれ独立してチミジン（Ｔ）、デオキシウリジン（ｄＵ）、デオキシシチジン（ｄＣ）、またはデオキシグアノシン（ｄＧ）であり、
ａ及びｄは、それぞれ独立して０～１０の整数であり、前記Ｘ１～Ｘ９がいずれもチミジン（Ｔ）である場合、前記ａ及びｄは同時に０ではなく、
ｂ及びｃは、それぞれ独立して０～１０の整数である。）、
【化5】
【化6】
Ｒ１は、水素、ハロゲンまたはヒドロキシ基であり、
Ｒ２は、水素、ハロゲンまたはヒドロキシ基であり、
Ｒ３は、水素、ハロゲン、Ｃ１－Ｃ６のアルキル基、Ｃ１－Ｃ６のハロアルキル基、Ｃ２－Ｃ６のアルケニル基、またはＣ２－Ｃ６のハロアルケニル基である（このとき、前記Ｒ１が水素またはヒドロキシ基であり、前記Ｒ２が水素であり、前記Ｒ３が水素またはメチルである場合を除く。））。
【0015】
９．前記項目８において、前記の化学式３または化学式４で表される修飾核酸は、５－フルオロデオキシウリジン、５－フルオロウリジン、５－フルオロデオキシシチジン、５－フルオロシチジン、５－ヨードデオキシウリジン、５－ヨードウリジン、５－ヨードデオキシシチジン、５－ヨードシチジン、シトシンアラビノシド、２’，２’－ジフルオロ－２’－デオキシシチジン、およびブロモビニルデオキシウリジンからなる群より選択される、修飾オリゴヌクレオチド－薬物接合体。
【0016】
１０．前記項目８において、前記薬物は、パクリタキセル（ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）、モノメチルアウリスタチンＥ（ｍｏｎｏｍｅｔｈｙｌ ａｕｒｉｓｔａｔｉｎ Ｅ）、モノメチルアウリスタチンＦ（ｍｏｎｏｍｅｔｈｙｌ ａｕｒｉｓｔａｔｉｎ Ｆ）、モノメチルアウリスタチンＤ（ＭＭＡＤ）、シタラビン、ゲムシタビン、メイタンシン、ＤＭ１（ｍｅｒｔａｎｓｉｎｅ、メルタンシン）、ＤＭ４、カリケアミシン及びその誘導体、ドキソルビシン、デュオカルマイシン及びその誘導体、ピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）、ＳＮ－３８、α－アマニチン、ツブリシン類似体（Ｔｕｂｕｌｙｓｉｎ ａｎａｌｏｇ）、シクロホスファミド（ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、メクロレタミン（ｍｅｃｈｏｌｒｅｔｈａｍｉｎｅ）、ウラムスチン（ｕｒａｍｕｓｔｉｎｅ）、メルファラン（ｍｅｌｐｈａｌａｎ）、クロラムブシル（ｃｈｌｏｒａｍｂｕｃｉｌ）、イホスファミド（ｉｆｏｓｆａｍｉｄｅ）、ベンダムスチン（ｂｅｎｄａｍｕｓｔｉｎｅ）、カルムスチン（ｃａｒｍｕｓｔｉｎｅ）、ロムスチン（ｌｏｍｕｓｔｉｎｅ）、ストレプトゾシン（ｓｔｒｅｐｔｏｚｏｃｉｎ）、ブスルファン（ｂｕｓｕｌｆａｎ）、ダカルバジン（ｄａｃａｒｂａｚｉｎｅ）、テモゾロミド（ｔｅｍｏｚｏｌｏｍｉｄｅ）、チオテパ（ｔｈｉｏｔｅｐａ）、アルトレタミン（ａｌｔｒｅｔａｍｉｎｅ）、デュオカルマイシン（ｄｕｏｃａｒｍｙｃｉｎ）、シスプラチン（ｃｉｓｐｌａｔｉｎ）、カルボプラチン（ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎ）、ネダプラチン（ｎｅｄａｐｌａｔｉｎ）、オキサリプラチン（ｏｘａｌｉｐｌａｔｉｎ）、サトラプラチン（ｓａｔｒａｐｌａｔｉｎ）、四硝酸トリプラチン（ｔｒｉｐｌａｔｉｎ ｔｅｔｒａｎｉｔｒａｔｅ）、５－フルオロウラシル（５－ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ）、６－メルカプトプリン（６－ｍｅｒｃａｐｔｏｐｕｒｉｎｅ）、カペシタビン（ｃａｐｅｃｉｔａｂｉｎｅ）、クラドリビン（ｃｌａｄｒｉｂｉｎｅ）、クロファラビン（ｃｌｏｆａｒａｂｉｎｅ）、シスタルビン（ｃｙｓｔａｒｂｉｎｅ）、フロクスウリジン（ｆｌｏｘｕｒｉｄｉｎｅ）、フルダラビン（ｆｌｕｄａｒａｂｉｎｅ）、ゲムシタビン（ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ）、ヒドロキシウレア（ｈｙｄｒｏｘｙｕｒｅａ）、メトトレキサート（ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ）、ペメトレキセド（ｐｅｍｅｔｒｅｘｅｄ）、ペントスタチン（ｐｅｎｔｏｓｔａｔｉｎ）、チオグアニン（ｔｈｉｏｇｕａｎｉｎｅ）、カンプトテシン（ｃａｍｐｔｏｔｈｅｃｉｎ）、トポテカン（ｔｏｐｏｔｅｃａｎ）、イリノテカン（ｉｒｉｎｏｔｅｃａｎ）、エトポシド（ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ）、テニポシド（ｔｅｎｉｐｏｓｉｄｅ）、ミトキサントロン（ｍｉｔｏｘａｎｔｒｏｎｅ）、パクリタキセル（ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）、ドセタキセル（ｄｏｃｅｔａｘｅｌ）、イキサベピロン（ｉｚａｂｅｐｉｌｏｎｅ）、ビンブラスチン（ｖｉｎｂｌａｓｔｉｎｅ）、ビンクリスチン（ｖｉｎｃｒｉｓｔｉｎｅ）、ビンデシン（ｖｉｎｄｅｓｉｎｅ）、ビノレルビン（ｖｉｎｏｒｅｌｂｉｎｅ）、エストラムスチン（ｅｓｔｒａｍｕｓｔｉｎｅ）、メイタンシン（ｍａｙｔａｎｓｉｎｅ）、アウリスタチンＥ（ａｕｒｉｓｔａｔｉｎ Ｅ）、アウリスタチンＦ（ａｕｒｉｓｔａｔｉｎ Ｆ）、およびネモルビシン（ｎｅｍｏｒｕｂｉｃｉｎ）からなる群より選択される、修飾オリゴヌクレオチド－薬物接合体。
【0017】
１１．前記項目８において、前記薬物と前記化学式２で表される修飾オリゴヌクレオチドの５’末端または３’末端のうちの少なくとも１つは、Ｌ１とＬ２が結合したリンカー（Ｌ）でコンジュゲートされ、
前記Ｌ１は、５’－チオール－改質剤Ｃ６、チオール－改質剤Ｃ６Ｓ－Ｓ、ジチオールセリノール、ＰＣアミノ－改質剤、５’－アミノ－改質剤Ｃ３、５’－アミノ－改質剤Ｃ６、５’－アミノ－改質剤Ｃ１２、５’－アミノ－改質剤ＴＥＧ、アミノ－改質剤Ｃ２ ｄＴ、アミノ－改質剤Ｃ６ ｄＴ、Ｓ－Ｂｚ－チオール－改質剤Ｃ６－ｄＴ、ホスホジエステル結合、およびヌクレオチドからなる群より選択され、脱保護過程により得られる、アクリルアミド（ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ）－Ｃ２－ＮＨ２、Ｃ１２－ＮＨ２、Ｃ３－ＮＨ２、アクリルアミド（ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ）－Ｃ６－プロパンアミド（ｐｒｏｐａｎａｍｉｄｅ）－ＳＨ、アクリルアミド（ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ）－Ｃ６－ＮＨ２、Ｃ６－ＮＨ２、Ｃ６－ＳＨから選択され、
前記Ｌ２は、マレイミドカプロイル－バリン－シトルリン－ｐ－アミノベンゾイルオキシカルボニル（ＭＣ－Ｖａｌ－Ｃｉｔ－ＰＡＢ）、スクシンイミジル４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシラート（ＳＭＣＣ）、コハク酸（ｓｕｃｃｉｎｉｃ ａｃｉｄ）、ヒドラゾン、ペプチド、ジスルフィド、チオエーテル、バリン－シトルリン、Ｎ－マレイミドメチルシクロヘキサン－１－カルボキシラート（ＭＣＣ）、マレイミドカプロイル、メルカプトアセトアミドカプロイル、Ｎ－スクシンイミジル４－（２－ピリジルジチオ）ペンタノエート（ＳＰＰ）、Ｎ－スクシンイミジル４－（２－ピリジルチオ）ペンタノエート（ＳＰＤＢ）、ホスホジエステル結合、およびヌクレオチドからなる群より選択される、修飾オリゴヌクレオチド－薬物接合体。
前記Ｌ１は、５’－チオール－改質剤Ｃ６、チオール－改質剤Ｃ６Ｓ－Ｓ、ジチオールセリノール、ＰＣアミノ－改質剤、５’－アミノ－改質剤Ｃ３、５’－アミノ－改質剤Ｃ６、５’－アミノ－改質剤Ｃ１２、５’－アミノ－改質剤ＴＥＧ、アミノ－改質剤Ｃ２ ｄＴ、アミノ－改質剤Ｃ６ ｄＴ、Ｓ－Ｂｚ－チオール－改質剤Ｃ６－ｄＴ、ホスホジエステル結合、およびヌクレオチドからなる群より選択され、脱保護過程により得られる、アクリルアミド（ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ）－Ｃ２－ＮＨ２、Ｃ１２－ＮＨ２、Ｃ３－ＮＨ２、アクリルアミド（ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ）－Ｃ６－プロパンアミド（ｐｒｏｐａｎａｍｉｄｅ）－ＳＨ、アクリルアミド（ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ）－Ｃ６－ＮＨ２、Ｃ６－ＮＨ２、Ｃ６－ＳＨから選択され、
前記Ｌ２は、マレイミドカプロイル－バリン－シトルリン－ｐ－アミノベンゾイルオキシカルボニル（ＭＣ－Ｖａｌ－Ｃｉｔ－ＰＡＢ）、スクシンイミジル４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシラート（ＳＭＣＣ）、コハク酸（ｓｕｃｃｉｎｉｃ ａｃｉｄ）、ヒドラゾン、ペプチド、ジスルフィド、チオエーテル、バリン－シトルリン、Ｎ－マレイミドメチルシクロヘキサン－１－カルボキシラート（ＭＣＣ）、マレイミドカプロイル、メルカプトアセトアミドカプロイル、Ｎ－スクシンイミジル４－（２－ピリジルジチオ）ペンタノエート（ＳＰＰ）、Ｎ－スクシンイミジル４－（２－ピリジルチオ）ペンタノエート（ＳＰＤＢ）、ホスホジエステル結合、およびヌクレオチドからなる群より選択される、修飾オリゴヌクレオチド－薬物接合体。
【0018】
１２．前記項目８において、前記修飾オリゴヌクレオチドは、配列番号１１または配列番号１２から選択される配列からなる、修飾オリゴヌクレオチド－薬物接合体。
【0019】
１３．前記項目８～１２のいずれか一つに記載の修飾オリゴヌクレオチド－薬物接合体を含む、癌の予防または治療用薬学組成物。
【発明の効果】
【0020】
本発明の「修飾オリゴヌクレオチド－薬物接合体」は、修飾核酸を含むオリゴヌクレオチド（以下、「修飾オリゴヌクレオチド」）と、それにコンジュゲートされた薬物とを含むことにより、体内で高い安定性を示し、優れた抗癌効果を示すことができる。
【0021】
本発明の「修飾オリゴヌクレオチド－薬物接合体」は、「修飾オリゴヌクレオチド」を単独で使用した場合や、「薬物」を単独で投与した場合よりも優れた抗癌効果を示すことができる。
【0022】
本発明の「修飾オリゴヌクレオチド－薬物接合体」は、接合体に含まれる修飾オリゴヌクレオチドと同量の「修飾オリゴヌクレオチド」に比べて体内での半減期が高い。本発明の「修飾オリゴヌクレオチド－薬物接合体」は、接合体に含まれる薬物と同量の「薬物」に比べて毒性が低い。
【0023】
本発明の「オリゴヌクレオチド修飾体－薬物接合体」は、修飾核酸を含まないオリゴヌクレオチドに薬物のみがコンジュゲートされた「オリゴヌクレオチド－薬物接合体」に比べて、優れた抗癌効果を示すことができる。
【図面の簡単な説明】
【0024】
【図1】図１～図５は、ＩＶＩＳイメージングにより、膵臓癌同所性移植動物モデルにおける修飾オリゴヌクレオチド－薬物接合体の有効性を評価した結果を示す（図１：未処理、図２：ゲムシタビンロードコラーゲンパッチ処理群、図３：ＩＯ１０１Ｌロードコラーゲンパッチ処理群、図４：ＩＯ１７６ロードコラーゲンパッチ処理群、図５：ＩＯ１４２ロードコラーゲンパッチ処理群）。
【図2】図１～図５は、ＩＶＩＳイメージングにより、膵臓癌同所性移植動物モデルにおける修飾オリゴヌクレオチド－薬物接合体の有効性を評価した結果を示す（図１：未処理、図２：ゲムシタビンロードコラーゲンパッチ処理群、図３：ＩＯ１０１Ｌロードコラーゲンパッチ処理群、図４：ＩＯ１７６ロードコラーゲンパッチ処理群、図５：ＩＯ１４２ロードコラーゲンパッチ処理群）。
【図3】図１～図５は、ＩＶＩＳイメージングにより、膵臓癌同所性移植動物モデルにおける修飾オリゴヌクレオチド－薬物接合体の有効性を評価した結果を示す（図１：未処理、図２：ゲムシタビンロードコラーゲンパッチ処理群、図３：ＩＯ１０１Ｌロードコラーゲンパッチ処理群、図４：ＩＯ１７６ロードコラーゲンパッチ処理群、図５：ＩＯ１４２ロードコラーゲンパッチ処理群）。
【図4】図１～図５は、ＩＶＩＳイメージングにより、膵臓癌同所性移植動物モデルにおける修飾オリゴヌクレオチド－薬物接合体の有効性を評価した結果を示す（図１：未処理、図２：ゲムシタビンロードコラーゲンパッチ処理群、図３：ＩＯ１０１Ｌロードコラーゲンパッチ処理群、図４：ＩＯ１７６ロードコラーゲンパッチ処理群、図５：ＩＯ１４２ロードコラーゲンパッチ処理群）。
【図5】図１～図５は、ＩＶＩＳイメージングにより、膵臓癌同所性移植動物モデルにおける修飾オリゴヌクレオチド－薬物接合体の有効性を評価した結果を示す（図１：未処理、図２：ゲムシタビンロードコラーゲンパッチ処理群、図３：ＩＯ１０１Ｌロードコラーゲンパッチ処理群、図４：ＩＯ１７６ロードコラーゲンパッチ処理群、図５：ＩＯ１４２ロードコラーゲンパッチ処理群）。
【図7a】図７ａ～７ｅは、修飾オリゴヌクレオチド－薬物接合体が担持されたコラーゲンパッチを処理した膵臓癌同所性移植動物モデルにおける臓器および腫瘍のサイズを確認した結果を示す（図７ａ：未処理、図７ｂ：ゲムシタビンロードコラーゲンパッチ処理群、図７ｃ：ＩＯ１０１Ｌロードコラーゲンパッチ処理群、図７ｄ：ＩＯ１７６ロードコラーゲンパッチ処理群、図７ｅ：ＩＯ１４２ロードコラーゲンパッチ処理群）。
【図7b】図７ａ～７ｅは、修飾オリゴヌクレオチド－薬物接合体が担持されたコラーゲンパッチを処理した膵臓癌同所性移植動物モデルにおける臓器および腫瘍のサイズを確認した結果を示す（図７ａ：未処理、図７ｂ：ゲムシタビンロードコラーゲンパッチ処理群、図７ｃ：ＩＯ１０１Ｌロードコラーゲンパッチ処理群、図７ｄ：ＩＯ１７６ロードコラーゲンパッチ処理群、図７ｅ：ＩＯ１４２ロードコラーゲンパッチ処理群）。
【図7c】図７ａ～７ｅは、修飾オリゴヌクレオチド－薬物接合体が担持されたコラーゲンパッチを処理した膵臓癌同所性移植動物モデルにおける臓器および腫瘍のサイズを確認した結果を示す（図７ａ：未処理、図７ｂ：ゲムシタビンロードコラーゲンパッチ処理群、図７ｃ：ＩＯ１０１Ｌロードコラーゲンパッチ処理群、図７ｄ：ＩＯ１７６ロードコラーゲンパッチ処理群、図７ｅ：ＩＯ１４２ロードコラーゲンパッチ処理群）。
【図7d】図７ａ～７ｅは、修飾オリゴヌクレオチド－薬物接合体が担持されたコラーゲンパッチを処理した膵臓癌同所性移植動物モデルにおける臓器および腫瘍のサイズを確認した結果を示す（図７ａ：未処理、図７ｂ：ゲムシタビンロードコラーゲンパッチ処理群、図７ｃ：ＩＯ１０１Ｌロードコラーゲンパッチ処理群、図７ｄ：ＩＯ１７６ロードコラーゲンパッチ処理群、図７ｅ：ＩＯ１４２ロードコラーゲンパッチ処理群）。
【図7e】図７ａ～７ｅは、修飾オリゴヌクレオチド－薬物接合体が担持されたコラーゲンパッチを処理した膵臓癌同所性移植動物モデルにおける臓器および腫瘍のサイズを確認した結果を示す（図７ａ：未処理、図７ｂ：ゲムシタビンロードコラーゲンパッチ処理群、図７ｃ：ＩＯ１０１Ｌロードコラーゲンパッチ処理群、図７ｄ：ＩＯ１７６ロードコラーゲンパッチ処理群、図７ｅ：ＩＯ１４２ロードコラーゲンパッチ処理群）。
【発明を実施するための形態】
【0025】
以下、本発明をさらに詳細に説明する。
【0026】
本発明は、少なくとも１つの修飾核酸を含む修飾オリゴヌクレオチドと、前記修飾オリゴヌクレオチドにコンジュゲートされた薬物とを含む、修飾オリゴヌクレオチド－薬物接合体を提供する。
【0027】
修飾オリゴヌクレオチド
修飾オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの修飾核酸を含むことができる。
修飾オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの修飾核酸を含むことができる。
【0028】
修飾オリゴヌクレオチドは、修飾核酸を含み、グアニン四重鎖（Ｇ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ）構造を形成するものであってもよい。
【0029】
オリゴヌクレオチドのグアニン四重鎖構造に寄与するグアノシン（Ｇ）は、２’－デオキシグアノシン（２－ｄｅｏｘｙ－ｇｕａｎｏｓｉｎｅ）、グアノシン（ｇｕａｎｏｓｉｎｅ）、２’－オー－メチル－グアノシン（２’－Ｏ－ｍｅｔｈｙｌ－ｇｕａｎｏｓｉｎｅ）、２’－フルオロ－グアノシン（２’－Ｆ－ｇｕａｎｏｓｉｎｅ）、ＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）－グアノシン、Ｄ－デオキシグアノシン、およびＤ－グアノシンから選択される１種または２種以上であってもよく、ここに治療的効果を有する修飾核酸が含まれるように合成することができる。
【0030】
修飾オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡシンセサイザーを用いた固定相合成法により、グアノシンに富むオリゴヌクレオチドに、前述の修飾核酸が含まれるように製造することができる。
【0031】
修飾オリゴヌクレオチドは、公知のオリゴヌクレオチド配列中の所定のヌクレオチドを修飾核酸で置換するか、または公知のオリゴヌクレオチド配列の３’または５’末端の少なくとも１つに修飾核酸を付加して導入することによって製造することができる。
【0032】
修飾オリゴヌクレオチドは、標的タンパク質に結合力または特異性を有するアプタマーであってもよい。
【0033】
修飾オリゴヌクレオチドの配列および修飾核酸の位置は、標的タンパク質に対する結合力または特異性などに影響を及ぼす可能性がある。したがって、配列および修飾核酸の位置は、標的タンパク質に対する結合力または特異性などを考慮して適宜選択する必要がある。
【0034】
本発明の修飾オリゴヌクレオチド－薬物接合体の有用性は、標的タンパク質に対する結合力または特異性などの要因に応じて示される生理活性効果によって決定することができる。
【0035】
修飾核酸は治療効果を有するものであってもよく、例えば糖（ｓｕｇａｒ）または塩基（ｂａｓｅ）が修飾されたグアノシン、チミジン、シチジンまたはウリジンであってもよいが、これらに限定されない。修飾核酸は、ピリミジン系であってもよい。具体的には、修飾核酸はウリジンまたはシチジン由来のものであってもよい。
【0036】
修飾核酸は、下記の化学式３または化学式４で表される化合物から選択することができる。
【0037】
【化7】
【化8】
Ｒ１は、水素、ハロゲンまたはヒドロキシ基であり、
Ｒ２は、水素、ハロゲンまたはヒドロキシ基であり、
Ｒ３は、水素、ハロゲン、Ｃ１－Ｃ６のアルキル基、Ｃ１－Ｃ６のハロアルキル基、Ｃ２－Ｃ６のアルケニル基、またはＣ２－Ｃ６のハロアルケニル基である（このとき、前記Ｒ１が水素またはヒドロキシ基であり、前記Ｒ２が水素であり、前記Ｒ３が水素またはメチルである場合を除く。））。
【0038】
化学式３におけるＲ１は、水素、ハロゲンまたはヒドロキシ基であってもよく、具体的には水素であってもよい。
【0039】
化学式３におけるＲ２は、水素、ハロゲンまたはヒドロキシ基であってもよく、具体的には水素であってもよい。
【0040】
化学式３におけるＲ３は、水素、ハロゲン、Ｃ１－Ｃ６のアルキル基、Ｃ１－Ｃ６のハロアルキル基、Ｃ２－Ｃ６のアルケニル基、またはＣ２－Ｃ６のハロアルケニル基であってもよく、具体的には、ハロゲン、Ｃ１－Ｃ６のハロアルキル基、またはＣ２－Ｃ６のハロアルケニル基であってもよい。一実施形態によれば、化学式３は５－フルオロデオキシウリジンであってもよい。
【0041】
化学式４におけるＲ１は、水素、ハロゲンまたはヒドロキシ基であってもよく、具体的には、水素またはハロゲン（例えば、フルオロ、クロロ、ブロモ、またはヨード）であってもよい。
【0042】
化学式４におけるＲ２は、水素、ハロゲンまたはヒドロキシ基であってもよく、具体的には、水素またはハロゲン（例えば、フルオロ、クロロ、ブロモ、またはヨード）であってもよい。
【0043】
化学式４におけるＲ３は、水素、ハロゲン、Ｃ１－Ｃ６のアルキル基、Ｃ１－Ｃ６のハロアルキル基、Ｃ２－Ｃ６のアルケニル基、またはＣ２－Ｃ６のハロアルケニル基であってもよく、具体的には、水素またはＣ１－Ｃ６のアルキル基であってもよい。
【0044】
化学式４におけるＲ１及びＲ２はハロゲンであり、Ｒ３は、水素またはＣ１－Ｃ３のアルキル基であってもよい。一実施形態によれば、化学式４はゲムシタビンであってもよい。
【0045】
修飾核酸は、前記の化学式３または化学式４で表される化合物にリン酸基が結合した形態で修飾オリゴヌクレオチドに含まれ得る。具体的には、ホスホロアミダイトの形態で修飾オリゴヌクレオチドに含まれ得る。ヌクレオチドホスホロアミダイトは、グレンリサーチ（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）社、ベリー（Ｂｅｒｒｙ ａｎｄ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ）社、オキアノス（Ｏｋｅａｎｏｓ Ｔｅｃｈ）社、ケムジーン（Ｃｈｅｍｇｅｎｅ）社、プロリゴ（Ｐｒｏｌｉｇｏ）社等から購入するか、または公知の方法（Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｆｒｉｔｚ Ｅｃｋｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．１９９１，ＩＲＬＰｒｅｓｓ：Ｏｘｆｏｒｄ）により製造することができる。
【0046】
修飾核酸は、５－フルオロデオキシウリジン、５－フルオロウリジン、５－フルオロデオキシシチジン、５－フルオロシチジン、５－ヨードデオキシウリジン、５－ヨードウリジン、５－ヨードデオキシシチジン、５－ヨードシチジン、シトシンアラビノシド、２’，２’－ジフルオロ－２’－デオキシシチジン、及びブロモビニルデオキシウリジンからなる群より選択することができる。化学式３または化学式４で表される修飾核酸は、５－フルオロデオキシウリジン、５－フルオロウリジン、５－フルオロデオキシシチジン、５－フルオロシチジン、５－ヨードデオキシウリジン、５－ヨードウリジン、５－ヨードデオキシシチジン、５－ヨードシチジン、シトシンアラビノシド、２’，２’－ジフルオロ－２’－デオキシシチジン、及びブロモビニルデオキシウリジンからなる群より選択することができる。２’，２’－ジフルオロ－２’－デオキシシチジンは、ゲムシタビンであってもよい。
【0047】
例えば、修飾オリゴヌクレオチドは、下記化学式１で表される配列からなっていてもよい。
【0048】
【化9】
【0049】
前記化学式１は、左から５’から３’の方向に示されている。
【0050】
本明細書において、化学式１に示されるＧは、デオキシグアノシン（ｄＧ）であってもよい。
【0051】
前記化学式１中のＸ１～Ｘ３及びＸ７～Ｘ９は、それぞれ独立してチミジン（Ｔ）、あるいは前記の化学式３または化学式４で表される修飾核酸であってもよい。
【0052】
前記化学式１中のＹ１は、デオキシグアノシン（ｄＧ）、あるいは前記の化学式３または化学式４で表される修飾核酸であってもよい。
【0053】
前記化学式１中のＸ４～Ｘ６は、それぞれ独立してチミジン（Ｔ）、デオキシウリジン（ｄＵ）、あるいは前記の化学式３または化学式４で表される修飾核酸であってもよい。
【0054】
前記化学式１中のＸ４～Ｘ６の少なくとも１つは、デオキシウリジン（ｄＵ）であってもよい。
【0055】
前記化学式１中のＭ１及びＭ２は、それぞれ独立して、前記の化学式３または化学式４で表される修飾核酸であってもよい。
【0056】
前記化学式１中のＮ１及びＮ２は、それぞれ独立してチミジン（Ｔ）、デオキシウリジン（ｄＵ）、デオキシシチジン（ｄＣ）、またはデオキシグアノシン（ｄＧ）であってもよい。
【0057】
前記化学式１中のａ及びｄは、それぞれ独立して０～１０の整数であってもよい。
【0058】
前記化学式１において、前記Ｘ１～Ｘ９がいずれもチミジン（Ｔ）であり、前記Ｙ１がデオキシグアノシン（ｄＧ）である場合、前記ａ及びｄは同時に０でなくてもよい。すなわち、化学式１で表される修飾オリゴヌクレオチドは、前記の化学式３または化学式４で表される修飾核酸を少なくとも１つ含む。
【0059】
前記化学式１中のｂ及びｃは、それぞれ独立して０～１０の整数であってもよい。
【0060】
前記化学式１からなる修飾オリゴヌクレオチドのデオキシウリジン（ｄＵ）に、薬物をコンジュゲートすることができる。
【0061】
具体的には、本発明の修飾オリゴヌクレオチドは、下記化学式１で表すことができる。
【0062】
【化10】
Ｘ１～Ｘ３及びＸ７～Ｘ９は、それぞれ独立してチミジン（Ｔ）、あるいは下記の化学式３または化学式４で表される修飾核酸であり、
Ｙ１は、デオキシグアノシン（ｄＧ）、あるいは下記の化学式３または化学式４で表される修飾核酸であり、
Ｘ４～Ｘ６は、それぞれ独立してチミジン（Ｔ）、デオキシウリジン（ｄＵ）、あるいは下記の化学式３または化学式４で表される修飾核酸であり、前記Ｘ４～Ｘ６の少なくとも１つはデオキシウリジン（ｄＵ）であり、
Ｍ１及びＭ２は、それぞれ独立して、下記の化学式３または化学式４で表される修飾核酸であり、
Ｎ１及びＮ２は、それぞれ独立してチミジン（Ｔ）、デオキシウリジン（ｄＵ）、デオキシシチジン（ｄＣ）、またはデオキシグアノシン（ｄＧ）であり、
ａ及びｄは、それぞれ独立して０～１０の整数であるが、前記Ｘ１～Ｘ９がいずれもチミジン（Ｔ）であり、前記Ｙ１がデオキシグアノシン（ｄＧ）である場合、前記ａ及びｄは同時に０ではなく、
ｂ及びｃは、それぞれ独立して０～１０の整数である。）、
【化11】
【化12】
Ｒ１は、水素、ハロゲンまたはヒドロキシ基であり、
Ｒ２は、水素、ハロゲンまたはヒドロキシ基であり、
Ｒ３は、水素、ハロゲン、Ｃ１－Ｃ６のアルキル基、Ｃ１－Ｃ６のハロアルキル基、Ｃ２－Ｃ６のアルケニル基、またはＣ２－Ｃ６のハロアルケニル基である（このとき、前記Ｒ１が水素またはヒドロキシ基であり、前記Ｒ２が水素であり、前記Ｒ３が水素またはメチルである場合を除く。））。
【0063】
いくつかの実施形態によれば、修飾オリゴヌクレオチドは、配列番号４～配列番号１０から選択される配列からなっていてもよい。
【0064】
他の例では、修飾オリゴヌクレオチドは、下記化学式２で表される配列からなっていてもよい。
【0065】
【化13】
【0066】
前記化学式２は、左から５’から３’の方向に示されている。
【0067】
本明細書において、化学式２に示されるＧは、デオキシグアノシン（ｄＧ）であってもよい。
【0068】
前記化学式２中のＸ１～Ｘ９は、それぞれ独立してチミジン（Ｔ）、あるいは前記の化学式３または化学式４で表される修飾核酸であってもよい。
【0069】
前記化学式２中のＭ１及びＭ２は、それぞれ独立して、下記の化学式３または化学式４で表される修飾核酸であってもよい。
【0070】
前記化学式２中のＮ１及びＮ２は、それぞれ独立してチミジン（Ｔ）、デオキシウリジン（ｄＵ）、デオキシシチジン（ｄＣ）、またはデオキシグアノシン（ｄＧ）であってもよい。
【0071】
前記化学式２中のａ及びｄは、それぞれ独立して０～１０の整数であってもよい。
【0072】
前記化学式２中の前記Ｘ１～Ｘ９がいずれもチミジン（Ｔ）である場合、前記ａ及びｄは同時に０でなくてもよい。
【0073】
前記化学式２中のｂ及びｃは、それぞれ独立して０～１０の整数であってもよい。
【0074】
前記化学式１で表される修飾オリゴヌクレオチドの５’末端または３’末端のうちの少なくとも１つに薬物をコンジュゲートすることができる。
【0075】
具体的には、本発明の修飾オリゴヌクレオチドは、下記化学式２で表すことができる。
【0076】
【化14】
Ｘ１～Ｘ９は、それぞれ独立してチミジン（Ｔ）、あるいは下記の化学式３または化学式４で表される修飾核酸であり、
Ｍ１及びＭ２は、それぞれ独立して、下記の化学式３または化学式４で表される修飾核酸であり、
Ｎ１及びＮ２は、それぞれ独立してチミジン（Ｔ）、デオキシウリジン（ｄＵ）、デオキシシチジン（ｄＣ）、またはデオキシグアノシン（ｄＧ）であり、
ａ及びｄは、それぞれ独立して０～１０の整数であり、前記Ｘ１～Ｘ９がいずれもチミジン（Ｔ）である場合、前記ａ及びｄは同時に０ではなく、
ｂ及びｃは、それぞれ独立して０～１０の整数である。）、
【化15】
【化16】
Ｒ１は、水素、ハロゲンまたはヒドロキシ基であり、
Ｒ２は、水素、ハロゲンまたはヒドロキシ基であり、
Ｒ３は、水素、ハロゲン、Ｃ１－Ｃ６のアルキル基、Ｃ１－Ｃ６のハロアルキル基、Ｃ２－Ｃ６のアルケニル基、またはＣ２－Ｃ６のハロアルケニル基である（このとき、前記Ｒ１が水素またはヒドロキシ基であり、前記Ｒ２が水素であり、前記Ｒ３が水素またはメチルである場合を除く。））。
【0077】
いくつかの実施形態によれば、修飾オリゴヌクレオチドは、配列番号１１または配列番号１２から選択される配列からなっていてもよい。
【0078】
薬物
薬物は修飾オリゴヌクレオチドにコンジュゲートできる構造を有するものであれば十分であり、具体的な種類を限定しない。
薬物は修飾オリゴヌクレオチドにコンジュゲートできる構造を有するものであれば十分であり、具体的な種類を限定しない。
【0079】
薬物は、修飾オリゴヌクレオチドに直接コンジュゲートすることができる官能基、またはリンカーにコンジュゲートすることができる官能基（例えば、ヒドロキシ基、カルボキシ基、またはアミノ基）を有するものであってもよいが、これらに限定されない。
【0080】
例えば、薬物は、パクリタキセル（ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）、モノメチルアウリスタチンＥ（ｍｏｎｏｍｅｔｈｙｌ ａｕｒｉｓｔａｔｉｎ Ｅ）、モノメチルアウリスタチンＦ（ｍｏｎｏｍｅｔｈｙｌ ａｕｒｉｓｔａｔｉｎ Ｆ）、モノメチルアウリスタチンＤ（ＭＭＡＤ）、シタラビン、ゲムシタビン、メイタンシン、ＤＭ１（ｍｅｒｔａｎｓｉｎｅ、メルタンシン）、ＤＭ４、カリケアミシン及びその誘導体、ドキソルビシン、デュオカルマイシン及びその誘導体、ピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）、ＳＮ－３８、α－アマニチン、ツブリシン類似体（ｔｕｂｕｌｙｓｉｎ ａｎａｌｏｇ）、シクロホスファミド（ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、メクロレタミン（ｍｅｃｈｏｌｒｅｔｈａｍｉｎｅ）、ウラムスチン（ｕｒａｍｕｓｔｉｎｅ）、メルファラン（ｍｅｌｐｈａｌａｎ）、クロラムブシル（ｃｈｌｏｒａｍｂｕｃｉｌ）、イホスファミド（ｉｆｏｓｆａｍｉｄｅ）、ベンダムスチン（ｂｅｎｄａｍｕｓｔｉｎｅ）、カルムスチン（ｃａｒｍｕｓｔｉｎｅ）、ロムスチン（ｌｏｍｕｓｔｉｎｅ）、ストレプトゾシン（ｓｔｒｅｐｔｏｚｏｃｉｎ）、ブスルファン（ｂｕｓｕｌｆａｎ）、ダカルバジン（ｄａｃａｒｂａｚｉｎｅ）、テモゾロミド（ｔｅｍｏｚｏｌｏｍｉｄｅ）、チオテパ（ｔｈｉｏｔｅｐａ）、アルトレタミン（ａｌｔｒｅｔａｍｉｎｅ）、デュオカルマイシン（ｄｕｏｃａｒｍｙｃｉｎ）、シスプラチン（ｃｉｓｐｌａｔｉｎ）、カルボプラチン（ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎ）、ネダプラチン（ｎｅｄａｐｌａｔｉｎ）、オキサリプラチン（ｏｘａｌｉｐｌａｔｉｎ）、サトラプラチン（ｓａｔｒａｐｌａｔｉｎ）、四硝酸トリプラチン（ｔｒｉｐｌａｔｉｎ ｔｅｔｒａｎｉｔｒａｔｅ）、５－フルオロウラシル（５－ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ）、６－メルカプトプリン（６－ｍｅｒｃａｐｔｏｐｕｒｉｎｅ）、カペシタビン（ｃａｐｅｃｉｔａｂｉｎｅ）、クラドリビン（ｃｌａｄｒｉｂｉｎｅ）、クロファラビン（ｃｌｏｆａｒａｂｉｎｅ）、シスタルビン（ｃｙｓｔａｒｂｉｎｅ）、フロクスウリジン（ｆｌｏｘｕｒｉｄｉｎｅ）、フルダラビン（ｆｌｕｄａｒａｂｉｎｅ）、ゲムシタビン（ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ）、ヒドロキシウレア（ｈｙｄｒｏｘｙｕｒｅａ）、メトトレキサート（ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ）、ペメトレキセド（ｐｅｍｅｔｒｅｘｅｄ）、ペントスタチン（ｐｅｎｔｏｓｔａｔｉｎ）、チオグアニン（ｔｈｉｏｇｕａｎｉｎｅ）、カンプトテシン（ｃａｍｐｔｏｔｈｅｃｉｎ）、トポテカン（ｔｏｐｏｔｅｃａｎ）、イリノテカン（ｉｒｉｎｏｔｅｃａｎ）、エトポシド（ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ）、テニポシド（ｔｅｎｉｐｏｓｉｄｅ）、ミトキサントロン（ｍｉｔｏｘａｎｔｒｏｎｅ）、パクリタキセル（ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）、ドセタキセル（ｄｏｃｅｔａｘｅｌ）、イキサベピロン（ｉｚａｂｅｐｉｌｏｎｅ）、ビンブラスチン（ｖｉｎｂｌａｓｔｉｎｅ）、ビンクリスチン（ｖｉｎｃｒｉｓｔｉｎｅ）、ビンデシン（ｖｉｎｄｅｓｉｎｅ）、ビノレルビン（ｖｉｎｏｒｅｌｂｉｎｅ）、エストラムスチン（ｅｓｔｒａｍｕｓｔｉｎｅ）、メイタンシン（ｍａｙｔａｎｓｉｎｅ）、アウリスタチンＥ（ａｕｒｉｓｔａｔｉｎ Ｅ）、アウリスタチンＦ（ａｕｒｉｓｔａｔｉｎ Ｆ）、およびネモルビシン（ｎｅｍｏｒｕｂｉｃｉｎ）からなる群より選択することができる。
【0081】
薬物は修飾オリゴヌクレオチドに直接的または間接的にコンジュゲートすることができる。例えば、薬物は修飾オリゴヌクレオチドに直接コンジュゲートしてもよく、リンカーを介してコンジュゲートしてもよい。
【0082】
薬物は、修飾オリゴヌクレオチドの内部に含まれる少なくとも１つの塩基にコンジュゲートすることができる。具体的には、薬物は修飾オリゴヌクレオチドの内部に含まれるウリジンまたはデオキシウリジン（ｄＵ）にコンジュゲートすることができるが、これらに限定されない。
【0083】
薬物は修飾オリゴヌクレオチドの末端に位置する塩基にコンジュゲートすることができる。具体的には、薬物は、修飾オリゴヌクレオチドの５’または３’末端のうちの少なくとも１つにコンジュゲートすることができる。
【0084】
修飾オリゴヌクレオチドについては前述の通りであるので、具体的な説明を省略する。
【0085】
リンカー
修飾オリゴヌクレオチドと薬物は、リンカー（Ｌ）で連結することができる。リンカー（Ｌ）は、修飾オリゴヌクレオチドと薬物とを連結できるものであれば十分であり、具体的な種類を限定しない。
修飾オリゴヌクレオチドと薬物は、リンカー（Ｌ）で連結することができる。リンカー（Ｌ）は、修飾オリゴヌクレオチドと薬物とを連結できるものであれば十分であり、具体的な種類を限定しない。
【0086】
リンカー（Ｌ）は、Ｌ１とＬ２が結合したものであってもよい。
【0087】
Ｌ１及びＬ２は、それぞれ独立して修飾オリゴヌクレオチドと薬物にコンジュゲートすることができる。Ｌ１及びＬ２は、それぞれ独立して修飾オリゴヌクレオチドと薬物にコンジュゲートすることができ、Ｌ１とＬ２の反応により、修飾オリゴヌクレオチドと薬物をコンジュゲートすることができる。
【0088】
一実施形態によれば、Ｌ１は修飾オリゴヌクレオチドと連結することができ、Ｌ２は薬物と連結することができる。例えば、Ｌ１は修飾オリゴヌクレオチドの内部に含まれるヌクレオチド（例えば、ｄＵ）と連結することができ、Ｌ２は薬物と連結することができる。他の例では、Ｌ１は修飾オリゴヌクレオチドの５’または３’末端のうちの少なくとも１つと連結することができ、Ｌ２は薬物と連結することができる。
【0089】
Ｌ１は化学反応によってＬ２と結合できる官能基を含むものであれば十分であり、その種類を限定しない。Ｌ２は化学反応によってＬ１と結合できる官能基を含むものであれば十分であり、その種類を限定しない。
【0090】
例えば、Ｌ１は－ＳＨ官能基を含み、Ｌ２はマレイミド（ｍａｌｅｉｍｉｄｅ）官能基を含むものであってもよい。他の例では、Ｌ１は－ＮＨ２官能基を含み、Ｌ２は－ＣＯＯＨ官能基を含むものであってもよい。
【0091】
前記Ｌ１は、５’－チオール－改質剤Ｃ６、チオール－改質剤Ｃ６Ｓ－Ｓ、ジチオールセリノール、ＰＣアミノ－改質剤、５’－アミノ－改質剤Ｃ３、５’－アミノ－改質剤Ｃ６、５’－アミノ－改質剤Ｃ１２、５’－アミノ－改質剤ＴＥＧ、アミノ－改質剤Ｃ２ ｄＴ、アミノ－改質剤Ｃ６ ｄＴ、Ｓ－Ｂｚ－チオール－改質剤Ｃ６－ｄＴ、ホスホジエステル結合、およびヌクレオチドからなる群より選択することができるが、これらに限定されない。Ｌ１は、前述の例の脱保護（ｄｅｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ）された形態であってもよく、例えば、アクリルアミド（ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ）－Ｃ２－ＮＨ２、Ｃ１２－ＮＨ２、Ｃ３－ＮＨ２、アクリルアミド（ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ）－Ｃ６－プロパンアミド（ｐｒｏｐａｎａｍｉｄｅ）－ＳＨ、アクリルアミド（ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ）－Ｃ６－ＮＨ２、Ｃ６－ＮＨ２、またはＣ６－ＳＨであってもよいが、これらに限定されない。
【0092】
Ｌ２は、マレイミドカプロイル－バリン－シトルリン－ｐ－アミノベンゾイルオキシカルボニル（ＭＣ－Ｖａｌ－Ｃｉｔ－ＰＡＢ）、スクシンイミジル４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシラート（ＳＭＣＣ）、コハク酸（ｓｕｃｃｉｎｉｃ ａｃｉｄ）、ヒドラゾン、ペプチド、ジスルフィド、チオエーテル、バリン－シトルリン、Ｎ－マレイミドメチルシクロヘキサン－１－カルボキシラート（ＭＣＣ）、マレイミドカプロイル、メルカプトアセトアミドカプロイル、Ｎ－スクシンイミジル４－（２－ピリジルジチオ）ペンタノエート（ＳＰＰ）、Ｎ－スクシンイミジル４－（２－ピリジルチオ）ペンタノエート（ＳＰＤＢ）、ホスホジエステル結合、およびヌクレオチドからなる群より選択することができるが、これらに限定されない。
【0093】
リンカー（Ｌ）を用いて修飾オリゴヌクレオチドと薬物をコンジュゲートする方法のいくつかの例は、以下の通りである。
【0094】
例えば、公知のオリゴヌクレオチド（例えば、比較例１の配列を有するアプタマー）を基準として、所定のヌクレオチドが修飾核酸で置換された修飾オリゴヌクレオチドを製造するステップと、前記修飾オリゴヌクレオチドの一つの末端にＬ１を結合するステップと、
薬物にＬ２を結合するステップと、
Ｌ１が結合した修飾オリゴヌクレオチドと、Ｌ２が結合した薬物とを反応させるステップとを含む方法により、修飾オリゴヌクレオチド－薬物接合体を製造することができる（図１１～１３を参照）。
薬物にＬ２を結合するステップと、
Ｌ１が結合した修飾オリゴヌクレオチドと、Ｌ２が結合した薬物とを反応させるステップとを含む方法により、修飾オリゴヌクレオチド－薬物接合体を製造することができる（図１１～１３を参照）。
【0095】
他の例では、公知のオリゴヌクレオチド（例えば、比較例１の配列を有するアプタマー）の両末端（５’末端または３’末端）のうちの少なくとも１つの末端に少なくとも１つの修飾核酸を付加して修飾オリゴヌクレオチドを製造するステップと、前記修飾オリゴヌクレオチドの一つの末端にＬ１を結合するステップと、
薬物にＬ２を結合するステップと、
Ｌ１が結合した修飾オリゴヌクレオチドと、Ｌ２が結合した薬物とを反応させるステップとを含む方法により、修飾オリゴヌクレオチド－薬物接合体を製造することができる（図１４～１６を参照）。
薬物にＬ２を結合するステップと、
Ｌ１が結合した修飾オリゴヌクレオチドと、Ｌ２が結合した薬物とを反応させるステップとを含む方法により、修飾オリゴヌクレオチド－薬物接合体を製造することができる（図１４～１６を参照）。
【0096】
いくつかの実施形態によれば、リンカー（Ｌ）は、－［ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ－Ｃ６－ＮＨ－（ＣＯ）－（ＣＨ２）２－（ＣＯ）Ｏ］－、－［Ｃ６－ＮＨ－（ＣＯ）－（ＣＨ２）２－（ＣＯ）Ｏ］－、－［Ｃ６－Ｓ－ＭＣ－Ｖａｌ－Ｃｉｔ－ＰＡＢ］－、－［Ｃ６－ＮＨ－ＣＯ－Ａ］－、－［ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ－Ｃ６－ＮＨ－ＣＯ－Ａ］－、または（前記Ａは、
である。）であってもよいが、これらに限定されるものではない。
【化17】
【0097】
修飾オリゴヌクレオチド－薬物接合体
いくつかの実施形態によれば、本発明の修飾オリゴヌクレオチド－薬物接合体は、下記化学式１で表される修飾オリゴヌクレオチドと、前記修飾オリゴヌクレオチドに含まれるデオキシウリジン（ｄＵ）にコンジュゲートされた薬物とを含むことができる。
いくつかの実施形態によれば、本発明の修飾オリゴヌクレオチド－薬物接合体は、下記化学式１で表される修飾オリゴヌクレオチドと、前記修飾オリゴヌクレオチドに含まれるデオキシウリジン（ｄＵ）にコンジュゲートされた薬物とを含むことができる。
【0098】
【化18】
Ｘ１～Ｘ３及びＸ７～Ｘ９は、それぞれ独立してチミジン（Ｔ）、あるいは下記の化学式３または化学式４で表される修飾核酸であり、
Ｙ１は、デオキシグアノシン（ｄＧ）、あるいは下記の化学式３または化学式４で表される修飾核酸であり、
Ｘ４～Ｘ６は、それぞれ独立してチミジン（Ｔ）、デオキシウリジン（ｄＵ）、あるいは下記の化学式３または化学式４で表される修飾核酸であり、前記Ｘ４～Ｘ６の少なくとも１つはデオキシウリジン（ｄＵ）であり、
Ｍ１及びＭ２は、それぞれ独立して、下記の化学式３または化学式４で表される修飾核酸であり、
Ｎ１及びＮ２は、それぞれ独立してチミジン（Ｔ）、デオキシウリジン（ｄＵ）、デオキシシチジン（ｄＣ）、またはデオキシグアノシン（ｄＧ）であり、
ａ及びｄは、それぞれ独立して０～１０の整数であるが、前記Ｘ１～Ｘ９がいずれもチミジン（Ｔ）であり、前記Ｙ１がデオキシグアノシン（ｄＧ）である場合、前記ａ及びｄは同時に０ではなく、
ｂ及びｃは、それぞれ独立して０～１０の整数である。）、
【化19】
【化20】
Ｒ１は、水素、ハロゲンまたはヒドロキシ基であり、
Ｒ２は、水素、ハロゲンまたはヒドロキシ基であり、
Ｒ３は、水素、ハロゲン、Ｃ１－Ｃ６のアルキル基、Ｃ１－Ｃ６のハロアルキル基、Ｃ２－Ｃ６のアルケニル基、またはＣ２－Ｃ６のハロアルケニル基である（このとき、前記Ｒ１が水素またはヒドロキシ基であり、前記Ｒ２が水素であり、前記Ｒ３が水素またはメチルである場合を除く。））。
【0099】
前記薬物と前記デオキシウリジン（ｄＵ）は、リンカー（Ｌ）で連結することができる。リンカーは、前記のＬ１及びＬ２が結合したものであってもよい。
【0100】
前記Ｌ１及びＬ２は、それぞれ独立して、前記修飾オリゴヌクレオチド内のデオキシウリジン（ｄＵ）および前記薬物に結合することができる。
【0101】
具体的には、修飾オリゴヌクレオチドは、配列番号４～配列番号１０から選択される配列からなっていてもよい。
【0102】
修飾核酸、薬物、Ｌ１及びＬ２等については前述の通りであるので、具体的な説明を省略する。
【0103】
いくつかの実施形態によれば、本発明の修飾オリゴヌクレオチド－薬物接合体は、化学式２で表される修飾オリゴヌクレオチドと、前記修飾オリゴヌクレオチドの５’末端または３’末端のうちの少なくとも１つにコンジュゲートされた薬物とを含むことができる。
【0104】
【化21】
Ｘ１～Ｘ９は、それぞれ独立してチミジン（Ｔ）、あるいは下記の化学式３または化学式４で表される修飾核酸であり、
Ｍ１及びＭ２は、それぞれ独立して、下記の化学式３または化学式４で表される修飾核酸であり、
Ｎ１及びＮ２は、それぞれ独立してチミジン（Ｔ）、デオキシウリジン（ｄＵ）、デオキシシチジン（ｄＣ）、またはデオキシグアノシン（ｄＧ）であり、
ａ及びｄは、それぞれ独立して０～１０の整数であり、前記Ｘ１～Ｘ９がいずれもチミジン（Ｔ）である場合、前記ａ及びｄは同時に０ではなく、
ｂ及びｃは、それぞれ独立して０～１０の整数である。）、
【化22】
【化23】
Ｒ１は、水素、ハロゲンまたはヒドロキシ基であり、
Ｒ２は、水素、ハロゲンまたはヒドロキシ基であり、
Ｒ３は、水素、ハロゲン、Ｃ１－Ｃ６のアルキル基、Ｃ１－Ｃ６のハロアルキル基、Ｃ２－Ｃ６のアルケニル基、またはＣ２－Ｃ６のハロアルケニル基である（このとき、前記Ｒ１が水素またはヒドロキシ基であり、前記Ｒ２が水素であり、前記Ｒ３が水素またはメチルである場合を除く。））。
【0105】
前記薬物と前記修飾オリゴヌクレオチドの５’末端または３’末端のうちの少なくとも１つは、リンカー（Ｌ）で連結することができる。リンカーは、前記のＬ１及びＬ２が結合したものであってもよい。
【0106】
前記のＬ１及びＬ２は、それぞれ独立して、前記修飾オリゴヌクレオチドの５’末端または３’末端のうちの少なくとも１つ、および前記薬物に結合することができる。
【0107】
具体的には、修飾オリゴヌクレオチドは、配列番号１１または配列番号１２から選択される配列からなっていてもよい。
【0108】
修飾核酸、薬物、Ｌ１及びＬ２等については前述の通りであるので、具体的な説明を省略する。
【0109】
修飾オリゴヌクレオチド－薬物接合体の用途
また、本発明は、前述の修飾オリゴヌクレオチド－薬物接合体を含む、癌の予防または治療用薬学組成物を提供する。
また、本発明は、前述の修飾オリゴヌクレオチド－薬物接合体を含む、癌の予防または治療用薬学組成物を提供する。
【0110】
癌は、白血病、リンパ腫、乳癌、肝癌、胃癌、卵巣癌、子宮頸部癌腫、神経膠腫癌、大腸癌、肺癌、膵臓癌、前立腺癌、肝癌、胃腺癌、子宮癌、膀胱癌、甲状腺癌、卵巣癌、黒色腫、および子宮頸部癌からなる群より選択することができるが、これらに限定されない。
【0111】
また、本発明は、前述の修飾オリゴヌクレオチド－薬物接合体を個体に投与するステップを含む、癌の予防または治療方法を提供することができる。
【0112】
個体はヒトを含む哺乳類であってもよく、例えば、ヒト、ウシ、ウマ、イヌ、ウサギ、ネコ、ヤギおよびラットであってもよいが、これらに限定されない。
【0113】
修飾オリゴヌクレオチド－薬物接合体、および癌については前述の通りであるので、具体的な説明を省略する。
【0114】
以下、実施例を挙げて本発明の構成及び効果をより具体的に説明する。しかし、以下の実施例は、本発明の理解を容易にするために例示の目的として提供されるものであり、本発明の範疇および範囲を限定するものではない。
【0115】
本発明の発明者らは、修飾核酸を含むグアノシンに富むオリゴヌクレオチド修飾体に薬物を首尾よくコンジュゲートして修飾オリゴヌクレオチド－薬物接合体を合成し、合成された修飾オリゴヌクレオチド－薬物接合体が、毒性がなく安定で優れた癌治療効果を示すことを確認した。
【0116】
１．修飾オリゴヌクレオチド－薬物接合体の製造（ＡｐＤＤＣ；Ａｐｔａｍｅｒ－Ｄｏｕｂｌｅ Ｄｒｕｇ－Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）
下記の方法で表１の実施例（修飾オリゴヌクレオチド－薬物接合体）および比較例を設計および製造した。下記表１において、Ｍはゲムシタビン、Ｎは５－ＦｄＵ（５－フルオロデオキシウリジン）、Ｇはデオキシグアノシン（ｄＧ）、Ｔはチミジン（Ｔ）、Ｕはデオキシウリジン（ｄＵ）である。すなわち、本発明の説明において、配列番号１～１２と、それらを用いて製造された接合体である配列番号１３～３３に示されるＧはデオキシグアノシン（ｄＧ）、Ｔはチミジン（Ｔ）、Ｕはデオキシウリジン（ｄＵ）である。
下記の方法で表１の実施例（修飾オリゴヌクレオチド－薬物接合体）および比較例を設計および製造した。下記表１において、Ｍはゲムシタビン、Ｎは５－ＦｄＵ（５－フルオロデオキシウリジン）、Ｇはデオキシグアノシン（ｄＧ）、Ｔはチミジン（Ｔ）、Ｕはデオキシウリジン（ｄＵ）である。すなわち、本発明の説明において、配列番号１～１２と、それらを用いて製造された接合体である配列番号１３～３３に示されるＧはデオキシグアノシン（ｄＧ）、Ｔはチミジン（Ｔ）、Ｕはデオキシウリジン（ｄＵ）である。
【0117】
【表1-1】
【表1-2】
【表1-3】
【0118】
（１）比較例１の製造
比較例１［：ＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＴＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧ（配列番号１）］は、一般的なＤＮＡ合成方法により製造した。
比較例１［：ＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＴＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧ（配列番号１）］は、一般的なＤＮＡ合成方法により製造した。
【0119】
具体的には、Ｍｅｒｍａｄｅ １２またはＭｅｒｍａｄｅ ４８（バイオオートメーション、米国）を用いて、オリゴヌクレオチドを合成した。脱保護（Ｄｅｂｌｏｃｋｉｎｇ）→結合（Ｃｏｕｐｌｉｎｇ）→不活性化（Ｃａｐｐｉｎｇ）→酸化（Ｏｘｉｄａｔｉｏｎ）の４段階の工程を１つのサイクルとし、１つのヌクレオチド（１ｍｅｒ）ずつ３’末端から５’末端に順次合成した。具体的には、脱保護（Ｄｅｂｌｏｃｋｉｎｇ）→結合（Ｃｏｕｐｌｉｎｇ）→不活性化（Ｃａｐｐｉｎｇ）→酸化（Ｏｘｉｄａｔｉｏｎ）の４段階の工程は、以下の通りである。
【0120】
Ａ．脱保護：ＴＣＡ Ｄｅｂｌｏｃｋを投入して、ＣＰＧ（Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｐｏｒｅ Ｇｌａｓｓ）に支持されているヌクレオチドの４，４－ジメトキシトリイル基（ＤＭＴ）を除去することにより、次のヌクレオチドが結合できるように５’－ヒドロキシル基を生成した。
【0121】
Ｂ．結合（Ｃｏｕｐｌｉｎｇ）：ヌクレオチドホスホアミダイトとＥＴＴ Ａｃｔｉｖａｔｏｒを投入してヌクレオチドを活性化し、ＣＰＧに支持されているヌクレオチドの５’－ヒドロキシル基と結合させた。
【0122】
Ｃ．不活性化（Ｃａｐｐｉｎｇ）：Ｃａｐ ＡとＣａｐ Ｂを投入して、反応に参加していない（ｎ－１）次ヌクレオチドの５’－ヒドロキシル基を不活性化した。
【0123】
Ｄ．酸化（Ｏｘｉｄａｔｉｏｎ）：酸化剤（Ｏｘｉｄｉｚｅｒ）を投入して、ヌクレオチド間のリン酸結合を酸化させた。
【0124】
合成されたオリゴヌクレオチドを溶液（アンモニア水、５５℃）に移してＣＰＧ支持体を分離し、保護基を分離した。
【0125】
脱保護されたオリゴヌクレオチドの精製および分析は、Ｗａｔｅｒｓ Ｐｒｅｐ１５０（Ｗａｔｅｒｓ、米国）およびＷａｔｅｒｓ ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ Ｈ－Ｃｌａｓｓ ＰＬＵＳ Ｂｉｏ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｗａｔｅｒｓ、米国）に逆相Ｃ１８カラムで行った。また、精製された核酸リガンドの質量分析をＷａｔｅｒｓ Ｘｅｖｏ Ｇ２－ＸＳ Ｑ－ＴＯＦ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｗａｔｅｒｓ、米国）で行った。
【0126】
（２）比較例２の製造
比較例２［：ＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＴＧＵＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧ（配列番号２）のＵにパクリタキセルが接合されたオリゴヌクレオチド－薬物接合体］は、一般的なＤＮＡ合成方法と薬物コンジュゲーションの２段階で製造した（図１７を参照）。
比較例２［：ＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＴＧＵＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧ（配列番号２）のＵにパクリタキセルが接合されたオリゴヌクレオチド－薬物接合体］は、一般的なＤＮＡ合成方法と薬物コンジュゲーションの２段階で製造した（図１７を参照）。
【0127】
１）オリゴヌクレオチドの合成
比較例１と同様の方法により、
を合成した。
比較例１と同様の方法により、
【化24】
【0128】
２）薬物コンジュゲーション
と、パクリタキセル－コハク酸（ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ－ｓｕｃｃｉｎｉｃ ａｃｉｄ、ＰＴＸ－ＳＡ ９８％， ＭｅｄＫｏｏ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｃａｔ＃６２０１０１）とをコンジュゲートして、比較例２のオリゴヌクレオチド－薬物接合体を合成した。比較例２のオリゴヌクレオチド－薬物接合体における配列番号２の配列のＵとパクリタキセルとを連結するリンカー（Ｌ）は、「－アクリルアミド－Ｃ６－ＮＨ－コハク酸－」である（アクリルアミドは、配列番号２のＵと連結される部分であり、コハク酸は、パクリタキセルと連結される部分である。）。
【化25】
【0129】
具体的には、パクリタキセル－コハク酸をＤＭＳＯに溶かし、ＥＤＣ（－（３－Ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）－Ｎ′－ｅｔｈｙｌｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）と超純水（ｕｌｔｒａ－ｐｕｒｅ ｗａｔｅｒ）に溶かしたＳｕｌｆｏ－ＮＨＳ（Ｎ－ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ）を加えて、室温（ＲＴ；Ｒｏｏｍ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）で１時間反応させた。前記配列番号１３の配列をｐＨ８．４のバッファーに溶解し、活性化したパクリタキセル混合物を入れた。ＲＴで１時間反応させ、Ｗａｔｅｒｓ ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ Ｈ－Ｃｌａｓｓ ＰＬＵＳ Ｂｉｏ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｗａｔｅｒｓ、米国）を用いて反応の進行を観察した。
【0130】
製造された比較例２（オリゴヌクレオチド－薬物接合体）の配列の精製および分析は、Ｗａｔｅｒｓ Ｐｒｅｐ１５０（Ｗａｔｅｒｓ、米国）およびＷａｔｅｒｓ ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ Ｈ－Ｃｌａｓｓ ＰＬＵＳ Ｂｉｏ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｗａｔｅｒｓ、米国）に逆相Ｃ１８カラムで行った。また、精製された核酸リガンドの質量分析をＷａｔｅｒｓ Ｘｅｖｏ Ｇ２－ＸＳ Ｑ－ＴＯＦ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｗａｔｅｒｓ、米国）で行った。
【0131】
（３）比較例３の製造
比較例３［：ＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＵＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧ（配列番号３）のＵにパクリタキセルが接合されたオリゴヌクレオチド－薬物接合体］を製造した。
比較例３［：ＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＵＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧ（配列番号３）のＵにパクリタキセルが接合されたオリゴヌクレオチド－薬物接合体］を製造した。
【0132】
１）オリゴヌクレオチドの合成
比較例１と同様の方法により、
を合成した。
比較例１と同様の方法により、
【化26】
【0133】
２）薬物コンジュゲーション
配列番号１３の配列の代わりに配列番号１４の配列を使用した以外は、比較例２の薬物コンジュゲーション方法と同様にして、比較例３のオリゴヌクレオチド－薬物接合体を合成した。比較例３のオリゴヌクレオチド－薬物接合体における配列番号３の配列のＵとパクリタキセルとを連結するリンカー（Ｌ）は、「－アクリルアミド－Ｃ６－ＮＨ－コハク酸－」である（アクリルアミドは、配列番号３のＵと連結される部分であり、コハク酸は、パクリタキセルと連結される部分である。）。
配列番号１３の配列の代わりに配列番号１４の配列を使用した以外は、比較例２の薬物コンジュゲーション方法と同様にして、比較例３のオリゴヌクレオチド－薬物接合体を合成した。比較例３のオリゴヌクレオチド－薬物接合体における配列番号３の配列のＵとパクリタキセルとを連結するリンカー（Ｌ）は、「－アクリルアミド－Ｃ６－ＮＨ－コハク酸－」である（アクリルアミドは、配列番号３のＵと連結される部分であり、コハク酸は、パクリタキセルと連結される部分である。）。
【0134】
（４）実施例１の製造
実施例１［：ＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＵＭＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧ（配列番号４）のＵにパクリタキセルが接合された修飾オリゴヌクレオチド－薬物接合体、ここで、Ｍ＝ゲムシタビン］を製造した。
実施例１［：ＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＵＭＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧ（配列番号４）のＵにパクリタキセルが接合された修飾オリゴヌクレオチド－薬物接合体、ここで、Ｍ＝ゲムシタビン］を製造した。
【0135】
１）オリゴヌクレオチドの合成
比較例１と同様の方法により、
を合成した。
比較例１と同様の方法により、
【化27】
【0136】
２）薬物コンジュゲーション
配列番号１３の配列の代わりに配列番号１５の配列を使用した以外は、比較例２の薬物コンジュゲーション方法と同様にして、実施例１の修飾オリゴヌクレオチド－薬物接合体を製造した。実施例１の修飾オリゴヌクレオチド－薬物接合体における配列番号４の配列のＵとパクリタキセルとを連結するリンカー（Ｌ）は、「－アクリルアミド－Ｃ６－ＮＨ－コハク酸－」である（アクリルアミドは、配列番号４のＵと連結される部分であり、コハク酸は、パクリタキセルと連結される部分である。）。
配列番号１３の配列の代わりに配列番号１５の配列を使用した以外は、比較例２の薬物コンジュゲーション方法と同様にして、実施例１の修飾オリゴヌクレオチド－薬物接合体を製造した。実施例１の修飾オリゴヌクレオチド－薬物接合体における配列番号４の配列のＵとパクリタキセルとを連結するリンカー（Ｌ）は、「－アクリルアミド－Ｃ６－ＮＨ－コハク酸－」である（アクリルアミドは、配列番号４のＵと連結される部分であり、コハク酸は、パクリタキセルと連結される部分である。）。
【0137】
（５）実施例２の製造
実施例２［：ＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＵＴＭＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧ（配列番号５）のＵにパクリタキセルが接合された修飾オリゴヌクレオチド－薬物接合体、ここで、Ｍ＝ゲムシタビン］を製造した。
実施例２［：ＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＵＴＭＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧ（配列番号５）のＵにパクリタキセルが接合された修飾オリゴヌクレオチド－薬物接合体、ここで、Ｍ＝ゲムシタビン］を製造した。
【0138】
１）オリゴヌクレオチドの合成
比較例１と同様の方法により、
を合成した。
比較例１と同様の方法により、
【化28】
【0139】
２）薬物コンジュゲーション
配列番号１３の配列の代わりに配列番号１７の配列を使用した以外は、比較例２の薬物コンジュゲーション方法と同様にして、実施例２の修飾オリゴヌクレオチド－薬物接合体を製造した。
配列番号１３の配列の代わりに配列番号１７の配列を使用した以外は、比較例２の薬物コンジュゲーション方法と同様にして、実施例２の修飾オリゴヌクレオチド－薬物接合体を製造した。
【0140】
実施例２の修飾オリゴヌクレオチド－薬物接合体における配列番号５のＵとパクリタキセルとを連結するリンカー（Ｌ）は、「－アクリルアミド－Ｃ６－ＮＨ－コハク酸－」である（アクリルアミドは、配列番号５のＵと連結される部分であり、コハク酸は、パクリタキセルと連結される部分である。）。
【0141】
（６）実施例３の製造
実施例３［：ＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＵＭＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧ（配列番号６）のＵにパクリタキセルが接合された修飾オリゴヌクレオチド－薬物接合体、ここで、Ｍ＝ゲムシタビン］を製造した。
実施例３［：ＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＵＭＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧ（配列番号６）のＵにパクリタキセルが接合された修飾オリゴヌクレオチド－薬物接合体、ここで、Ｍ＝ゲムシタビン］を製造した。
【0142】
１）オリゴヌクレオチドの合成
比較例１と同様の方法により、
を合成した。
比較例１と同様の方法により、
【化29】
【0143】
２）薬物コンジュゲーション
配列番号１３の配列の代わりに配列番号１８の配列を使用した以外は、比較例２の薬物コンジュゲーション方法と同様にして、実施例３の修飾オリゴヌクレオチド－薬物接合体を製造した。
配列番号１３の配列の代わりに配列番号１８の配列を使用した以外は、比較例２の薬物コンジュゲーション方法と同様にして、実施例３の修飾オリゴヌクレオチド－薬物接合体を製造した。
【0144】
実施例３の修飾オリゴヌクレオチド－薬物接合体における配列番号６の配列のＵとパクリタキセルとを連結するリンカー（Ｌ）は、「－アクリルアミド－Ｃ６－ＮＨ－コハク酸－」である（アクリルアミドは、配列番号６のＵと連結される部分であり、コハク酸は、パクリタキセルと連結される部分である。）。
【0145】
（７）実施例４の製造
実施例４［：ＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＵＧＭＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧ（配列番号７）のＵにパクリタキセルが接合された修飾オリゴヌクレオチド－薬物接合体、ここで、Ｍ＝ゲムシタビン］を製造した。
実施例４［：ＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＵＧＭＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧ（配列番号７）のＵにパクリタキセルが接合された修飾オリゴヌクレオチド－薬物接合体、ここで、Ｍ＝ゲムシタビン］を製造した。
【0146】
１）オリゴヌクレオチドの合成
比較例１と同様の方法により、
を合成した。
比較例１と同様の方法により、
【化30】
【0147】
２）薬物コンジュゲーション
配列番号１３の配列の代わりに配列番号１９の配列を使用した以外は、比較例２の薬物コンジュゲーション方法と同様にして、実施例４の修飾オリゴヌクレオチド－薬物接合体を製造した。
配列番号１３の配列の代わりに配列番号１９の配列を使用した以外は、比較例２の薬物コンジュゲーション方法と同様にして、実施例４の修飾オリゴヌクレオチド－薬物接合体を製造した。
【0148】
実施例４の修飾オリゴヌクレオチド－薬物接合体における配列番号７の配列のＵとパクリタキセルとを連結するリンカー（Ｌ）は、「－アクリルアミド－Ｃ６－ＮＨ－コハク酸－」である（アクリルアミドは、配列番号７のＵと連結される部分であり、コハク酸は、パクリタキセルと連結される部分である。）。
【0149】
（８）実施例５の製造
実施例５［：ＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＭＵＧＭＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧ（配列番号８）のＵにパクリタキセルが接合された修飾オリゴヌクレオチド－薬物接合体、ここで、Ｍ＝ゲムシタビン］を製造した。
実施例５［：ＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＭＵＧＭＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧ（配列番号８）のＵにパクリタキセルが接合された修飾オリゴヌクレオチド－薬物接合体、ここで、Ｍ＝ゲムシタビン］を製造した。
【0150】
１）オリゴヌクレオチドの合成
比較例１と同様の方法により、
を合成した。
比較例１と同様の方法により、
【化31】
【0151】
２）薬物コンジュゲーション
配列番号１３の配列の代わりに配列番号２０の配列を使用した以外は、比較例２の薬物コンジュゲーション方法と同様にして、実施例５の修飾オリゴヌクレオチド－薬物接合体を製造した。
配列番号１３の配列の代わりに配列番号２０の配列を使用した以外は、比較例２の薬物コンジュゲーション方法と同様にして、実施例５の修飾オリゴヌクレオチド－薬物接合体を製造した。
【0152】
実施例５の修飾オリゴヌクレオチド－薬物接合体における配列番号８の配列のＵとパクリタキセルとを連結するリンカー（Ｌ）は、「－アクリルアミド－Ｃ６－ＮＨ－コハク酸－」である（アクリルアミドは、配列番号８のＵと連結される部分であり、コハク酸は、パクリタキセルと連結される部分である。）。
【0153】
（９）実施例６の製造
実施例６［：ＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＵＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＭＧＧ（配列番号９）のＵにパクリタキセルが接合された修飾オリゴヌクレオチド－薬物接合体、ここで、Ｍ＝ゲムシタビン］を製造した。
実施例６［：ＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＵＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＭＧＧ（配列番号９）のＵにパクリタキセルが接合された修飾オリゴヌクレオチド－薬物接合体、ここで、Ｍ＝ゲムシタビン］を製造した。
【0154】
１）オリゴヌクレオチドの合成
比較例１と同様の方法により、
を合成した。
比較例１と同様の方法により、
【化32】
【0155】
２）薬物コンジュゲーション
配列番号１３の配列の代わりに配列番号２１の配列を使用した以外は、比較例２の薬物コンジュゲーション方法と同様にして、実施例６の修飾オリゴヌクレオチド－薬物接合体を製造した。
配列番号１３の配列の代わりに配列番号２１の配列を使用した以外は、比較例２の薬物コンジュゲーション方法と同様にして、実施例６の修飾オリゴヌクレオチド－薬物接合体を製造した。
【0156】
実施例６の修飾オリゴヌクレオチド－薬物接合体における配列番号９の配列のＵとパクリタキセルとを連結するリンカー（Ｌ）は、「－アクリルアミド－Ｃ６－ＮＨ－コハク酸－」である（アクリルアミドは、配列番号９のＵと連結される部分であり、コハク酸は、パクリタキセルと連結される部分である。）。
【0157】
（１０）実施例７の製造
実施例７［：ＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＴＧＵＧＧＴＧＧＴＧＧＭＧＧ（配列番号１０）のＵにパクリタキセルが接合された修飾オリゴヌクレオチド－薬物接合体、ここで、Ｍ＝ゲムシタビン］を製造した。
実施例７［：ＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＴＧＵＧＧＴＧＧＴＧＧＭＧＧ（配列番号１０）のＵにパクリタキセルが接合された修飾オリゴヌクレオチド－薬物接合体、ここで、Ｍ＝ゲムシタビン］を製造した。
【0158】
１）オリゴヌクレオチドの合成
比較例１と同様の方法により、
を合成した。
比較例１と同様の方法により、
【化33】
【0159】
２）薬物コンジュゲーション
配列番号１３の配列の代わりに配列番号２２の配列を使用した以外は、比較例２の薬物コンジュゲーション方法と同様にして、実施例７の修飾オリゴヌクレオチド－薬物接合体を製造した。
配列番号１３の配列の代わりに配列番号２２の配列を使用した以外は、比較例２の薬物コンジュゲーション方法と同様にして、実施例７の修飾オリゴヌクレオチド－薬物接合体を製造した。
【0160】
実施例７の修飾オリゴヌクレオチド－薬物接合体における配列番号１０の配列のＵとパクリタキセルとを連結するリンカー（Ｌ）は、「－アクリルアミド－Ｃ６－ＮＨ－コハク酸－」である（アクリルアミドは、配列番号１０のＵと連結される部分であり、コハク酸は、パクリタキセルと連結される部分である。）。
【0161】
（１１）実施例８の製造
以下の方法により、実施例８［：ＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＴＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＭＭ（配列番号１１）の５’末端（すなわち、１番ヌクレオチド）にパクリタキセルが接合された修飾オリゴヌクレオチド－薬物接合体、ここで、Ｍ＝ゲムシタビン］を製造した（図１８を参照）。
以下の方法により、実施例８［：ＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＴＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＭＭ（配列番号１１）の５’末端（すなわち、１番ヌクレオチド）にパクリタキセルが接合された修飾オリゴヌクレオチド－薬物接合体、ここで、Ｍ＝ゲムシタビン］を製造した（図１８を参照）。
【0162】
１）オリゴヌクレオチドの合成
比較例１と同様の方法により、
を合成した。
比較例１と同様の方法により、
【化34】
【0163】
２）薬物コンジュゲーション
配列番号１３の代わりに配列番号２３の配列を使用した以外は、比較例２の薬物コンジュゲーション方法と同様にして、実施例８の修飾オリゴヌクレオチド－薬物接合体を製造した。
配列番号１３の代わりに配列番号２３の配列を使用した以外は、比較例２の薬物コンジュゲーション方法と同様にして、実施例８の修飾オリゴヌクレオチド－薬物接合体を製造した。
【0164】
実施例８の修飾オリゴヌクレオチド－薬物接合体における配列番号１１の配列の５’末端の最初のヌクレオチド（Ｇ）とパクリタキセルとを連結するリンカー（Ｌ）は、「－Ｃ６－ＮＨ－コハク酸－」である（Ｃ６は、配列番号１１の５’末端と連結される部分であり、コハク酸は、パクリタキセルと連結される部分である。）。
【0165】
（１２）比較例４の製造
比較例４［：ＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＴＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧ（配列番号１）の５’末端（すなわち、１番ヌクレオチド）にＭＭＡＥが接合されたオリゴヌクレオチド－薬物接合体］は、一般的なＤＮＡ合成方法と薬物コンジュゲーションの２段階で製造した。
比較例４［：ＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＴＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧ（配列番号１）の５’末端（すなわち、１番ヌクレオチド）にＭＭＡＥが接合されたオリゴヌクレオチド－薬物接合体］は、一般的なＤＮＡ合成方法と薬物コンジュゲーションの２段階で製造した。
【0166】
１）オリゴヌクレオチドの合成
比較例１と同様の方法により、
を合成した。
比較例１と同様の方法により、
【化35】
【0167】
２）薬物コンジュゲーション
配列番号２４のＺをジチオトレイトール（Ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ、ＤＴＴ）で還元して、
を得た。配列番号２５のＬ１とＭＣ（ｍａｌｅｉｍｉｄｅ－ｃａｐｒｏｉｃ ａｃｉｄ）－Ｖａｌ－Ｃｉｔ－ＰＡＢ（ｐａｒａ－ａｍｉｎｏｂｅｎｚｙｌ ｃａｒｂａｍａｔｅ）－ＭＭＡＥ（Ｍｏｎｏｍｅｔｈｙｌ ａｕｒｉｓｔａｔｉｎ Ｅ）（：ＶｃＭＭＡＥ ９６％、ＭｅｄＫｏｏ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｃａｔ＃４０７４０６）をコンジュゲートして、比較例４のオリゴヌクレオチド－薬物接合体を製造した。比較例４のオリゴヌクレオチド－薬物接合体における配列番号１の５’末端の最初のヌクレオチド（Ｇ）とＭＭＡＥとを連結するリンカー（Ｌ）は、「－Ｃ６－Ｓ－ＭＣ－Ｖａｌ－Ｃｉｔ－ＰＡＢ－」である（Ｃ６は、配列番号１の５’末端と連結される部分であり、ＰＡＢは、ＭＭＡＥと連結される部分である。）。
配列番号２４のＺをジチオトレイトール（Ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ、ＤＴＴ）で還元して、
【化36】
【0168】
具体的には、ｐＨ８．５のバッファーに溶解したＤＴＴを
に入れ、ＲＴで反応させた後、残りのＤＴＴを除去するために４℃で遠心分離を行った。活性化された
をｐＨ６．０のバッファーに溶解した後、ＤＭＳＯに溶解したＶｃＭＭＡＥを加えて室温（ＲＴ）で１時間反応させ、Ｗａｔｅｒｓ ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ Ｈ－Ｃｌａｓｓ ＰＬＵＳ Ｂｉｏ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｗａｔｅｒｓ、米国）を用いて反応の進行を観察した。
【化37】
【化38】
【0169】
製造された比較例４の精製および分析は、Ｗａｔｅｒｓ Ｐｒｅｐ１５０（Ｗａｔｅｒｓ、米国）およびＷａｔｅｒｓ ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ Ｈ－Ｃｌａｓｓ ＰＬＵＳ Ｂｉｏ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｗａｔｅｒｓ、米国）に逆相Ｃ１８カラムで行った。また、精製された核酸リガンドの質量分析をＷａｔｅｒｓ Ｘｅｖｏ Ｇ２－ＸＳ Ｑ－ＴＯＦ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｗａｔｅｒｓ、米国）で行った。
【0170】
（１３）実施例９の製造
実施例９［：ＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＴＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＭＭ（配列番号１１）の５’末端（すなわち、最初のヌクレオチド）にＭＭＡＥが接合された修飾オリゴヌクレオチド－薬物接合体、ここで、Ｍ＝ゲムシタビン］を製造した。
実施例９［：ＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＴＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＭＭ（配列番号１１）の５’末端（すなわち、最初のヌクレオチド）にＭＭＡＥが接合された修飾オリゴヌクレオチド－薬物接合体、ここで、Ｍ＝ゲムシタビン］を製造した。
【0171】
１）オリゴヌクレオチドの合成
比較例１と同様の方法により、
を合成した。
比較例１と同様の方法により、
【化39】
【0172】
２）薬物コンジュゲーション
配列番号２４の配列の代わりに配列番号２６の配列をＤＴＴで還元した以外は、比較例４の薬物コンジュゲーション方法と同様にして、
を取得し、前記配列番号２７のＬ１とＶｃＭＭＡＥをコンジュゲートして実施例９を製造した。
配列番号２４の配列の代わりに配列番号２６の配列をＤＴＴで還元した以外は、比較例４の薬物コンジュゲーション方法と同様にして、
【化40】
【0173】
実施例９の修飾オリゴヌクレオチド－薬物接合体における配列番号１１の５’末端の最初のヌクレオチド（Ｇ）とＭＭＡＥとを連結するリンカー（Ｌ）は、「－Ｃ６－Ｓ－ＭＣ－Ｖａｌ－Ｃｉｔ－ＰＡＢ－」である（Ｃ６は、配列番号１１の５’末端と連結される部分であり、ＰＡＢは、ＭＭＡＥと連結される部分である。）。
【0174】
（１４）比較例５の製造
比較例５［：ＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＴＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧ（配列番号１）の５’末端（すなわち、１番ヌクレオチド）にＤＭ１が接合されたオリゴヌクレオチド－薬物接合体］は、一般的なＤＮＡ合成方法と薬物コンジュゲーションの２段階で製造した。
比較例５［：ＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＴＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧ（配列番号１）の５’末端（すなわち、１番ヌクレオチド）にＤＭ１が接合されたオリゴヌクレオチド－薬物接合体］は、一般的なＤＮＡ合成方法と薬物コンジュゲーションの２段階で製造した。
【0175】
１）オリゴヌクレオチドの合成
比較例１の実験方法により、
を合成した。
比較例１の実験方法により、
【化41】
【0176】
２）薬物コンジュゲーション
配列番号２８の配列とＭｅｒｔａｎｓｉｎ（ＤＭ１）－ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ－４－（Ｎ－ｍａｌｅｉｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌ）－ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ－１－ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ（ＳＭＣＣ）（：ＤＭ１－ＳＭＣＣ ９９％、ＭｅｄＫｏｏ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｃａｔ♯４０７２０２）をコンジュゲートして比較例５を製造した。比較例５のオリゴヌクレオチド－薬物接合体における配列番号１の５’末端の最初のヌクレオチド（Ｇ）とＤＭ１とを連結するリンカー（Ｌ）は、「－Ｃ６－ＮＨ－ＳＭＣＣ－」である（Ｃ６は、配列番号１の５’末端と連結される部分であり、ＳＭＣＣは、ＭＭＡＥと連結される部分である。）。
配列番号２８の配列とＭｅｒｔａｎｓｉｎ（ＤＭ１）－ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ－４－（Ｎ－ｍａｌｅｉｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌ）－ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ－１－ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ（ＳＭＣＣ）（：ＤＭ１－ＳＭＣＣ ９９％、ＭｅｄＫｏｏ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｃａｔ♯４０７２０２）をコンジュゲートして比較例５を製造した。比較例５のオリゴヌクレオチド－薬物接合体における配列番号１の５’末端の最初のヌクレオチド（Ｇ）とＤＭ１とを連結するリンカー（Ｌ）は、「－Ｃ６－ＮＨ－ＳＭＣＣ－」である（Ｃ６は、配列番号１の５’末端と連結される部分であり、ＳＭＣＣは、ＭＭＡＥと連結される部分である。）。
【0177】
具体的には、
をｐＨ８．５のバッファーに溶解し、ＤＭＳＯに溶解したＤＭ１－ＳＭＣＣを入れた。常温で１時間反応させ、Ｗａｔｅｒｓ ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ Ｈ－Ｃｌａｓｓ ＰＬＵＳ Ｂｉｏ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｗａｔｅｒｓ、米国）を用いて反応の進行を観察した。製造した比較例５の精製および分析は、Ｗａｔｅｒｓ Ｐｒｅｐ１５０（Ｗａｔｅｒｓ、米国）およびＷａｔｅｒｓ ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ Ｈ－Ｃｌａｓｓ ＰＬＵＳ Ｂｉｏ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｗａｔｅｒｓ、米国）に逆相Ｃ１８カラムで行った。また、精製された核酸リガンドの質量分析は、Ｗａｔｅｒｓ Ｘｅｖｏ Ｇ２－ＸＳ Ｑ－ＴＯＦ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｗａｔｅｒｓ、米国）で行った。
【化42】
【0178】
（１５）実施例１０の製造
実施例１０［ＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＴＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＭＭ（配列番号１１）の５’末端（すなわち、最初のヌクレオチド）にＤＭ１が接合された修飾オリゴヌクレオチド－薬物接合体、ここで、Ｍ＝ゲムシタビン］を製造した。
実施例１０［ＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＴＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＭＭ（配列番号１１）の５’末端（すなわち、最初のヌクレオチド）にＤＭ１が接合された修飾オリゴヌクレオチド－薬物接合体、ここで、Ｍ＝ゲムシタビン］を製造した。
【0179】
１）オリゴヌクレオチドの合成
比較例１の実験方法により、
を合成した。
比較例１の実験方法により、
【化43】
【0180】
２）薬物コンジュゲーション
配列番号２８の配列の代わりに配列番号２９の配列とＤＭ１－ＳＭＣＣとをコンジュゲートした以外は、比較例５の薬物コンジュゲーション方法と同様にして、実施例１０を製造した。
配列番号２８の配列の代わりに配列番号２９の配列とＤＭ１－ＳＭＣＣとをコンジュゲートした以外は、比較例５の薬物コンジュゲーション方法と同様にして、実施例１０を製造した。
【0181】
実施例１０の修飾オリゴヌクレオチド－薬物接合体における配列番号１１の５’末端の最初のヌクレオチド（Ｇ）とＤＭ１とを連結するリンカー（Ｌ）は、「－Ｃ６－ＮＨ－ＳＭＣＣ－」である（Ｃ６は、配列番号１１の５’末端と連結される部分であり、ＳＭＣＣは、ＤＭ１と連結される部分である。）。
【0182】
（１６）比較例６の製造
比較例６［：ＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＵＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧ（配列番号３）のＵにＤＭ１が接合されたオリゴヌクレオチド－薬物接合体］を製造した。
比較例６［：ＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＵＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧ（配列番号３）のＵにＤＭ１が接合されたオリゴヌクレオチド－薬物接合体］を製造した。
【0183】
１）オリゴヌクレオチドの合成
比較例１の実験方法により、
を合成した。
比較例１の実験方法により、
【化44】
【0184】
２）薬物コンジュゲーション
配列番号２８の配列の代わりに配列番号３０の配列とＤＭ１－ＳＭＣＣとをコンジュゲートした以外は、比較例５の薬物コンジュゲーション方法と同様にして、比較例６を製造した。比較例６のオリゴヌクレオチド－薬物接合体における配列番号３のＵとＤＭ１とを連結するリンカー（Ｌ）は、「－アクリルアミド－Ｃ６－ＮＨ－ＳＭＣＣ－」である（アクリルアミドは、配列番号３のＵと連結される部分であり、ＳＭＣＣは、ＤＭ１と連結される部分である。）。
配列番号２８の配列の代わりに配列番号３０の配列とＤＭ１－ＳＭＣＣとをコンジュゲートした以外は、比較例５の薬物コンジュゲーション方法と同様にして、比較例６を製造した。比較例６のオリゴヌクレオチド－薬物接合体における配列番号３のＵとＤＭ１とを連結するリンカー（Ｌ）は、「－アクリルアミド－Ｃ６－ＮＨ－ＳＭＣＣ－」である（アクリルアミドは、配列番号３のＵと連結される部分であり、ＳＭＣＣは、ＤＭ１と連結される部分である。）。
【0185】
（１７）実施例１１の製造
実施例１１［：ＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＭＵＧＭＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧ（配列番号８）のＵにＤＭ１が接合された修飾オリゴヌクレオチド－薬物接合体、ここで、Ｍ＝ゲムシタビン］を製造した。
実施例１１［：ＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＭＵＧＭＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧ（配列番号８）のＵにＤＭ１が接合された修飾オリゴヌクレオチド－薬物接合体、ここで、Ｍ＝ゲムシタビン］を製造した。
【0186】
１）オリゴヌクレオチドの合成
比較例１の実験方法により、
を合成した。
比較例１の実験方法により、
【化45】
【0187】
２）薬物コンジュゲーション
配列番号２８の配列の代わりに配列番号３１の配列とＤＭ１－ＳＭＣＣとをコンジュゲートした以外は、比較例５の薬物コンジュゲーション方法と同様にして、実施例１１を製造した。実施例１１の修飾オリゴヌクレオチド－薬物接合体における９のＵとＤＭ１とを連結するリンカー（Ｌ）は、「－アクリルアミド－Ｃ６－ＮＨ－ＳＭＣＣ－」である（アクリルアミドは、配列番号８のＵと連結される部分であり、ＳＭＣＣは、ＤＭ１と連結される部分である。）。
配列番号２８の配列の代わりに配列番号３１の配列とＤＭ１－ＳＭＣＣとをコンジュゲートした以外は、比較例５の薬物コンジュゲーション方法と同様にして、実施例１１を製造した。実施例１１の修飾オリゴヌクレオチド－薬物接合体における９のＵとＤＭ１とを連結するリンカー（Ｌ）は、「－アクリルアミド－Ｃ６－ＮＨ－ＳＭＣＣ－」である（アクリルアミドは、配列番号８のＵと連結される部分であり、ＳＭＣＣは、ＤＭ１と連結される部分である。）。
【0188】
（１８）比較例７の製造
比較例７［：ＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＴＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧ（配列番号１）の５’末端にパクリタキセルが接合されたオリゴヌクレオチド－薬物接合体］を製造した。
比較例７［：ＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＴＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧ（配列番号１）の５’末端にパクリタキセルが接合されたオリゴヌクレオチド－薬物接合体］を製造した。
【0189】
１）オリゴヌクレオチドの合成
比較例１と同様の方法により、
を合成した。
比較例１と同様の方法により、
【化46】
【0190】
２）薬物コンジュゲーション
配列番号１３の代わりに配列番号３２の配列を使用した以外は、比較例２の薬物コンジュゲーション方法と同様にして、比較例７を製造した。
配列番号１３の代わりに配列番号３２の配列を使用した以外は、比較例２の薬物コンジュゲーション方法と同様にして、比較例７を製造した。
【0191】
比較例７のオリゴヌクレオチド－薬物接合体における配列番号１の配列の５’末端の最初のヌクレオチド（Ｇ）とパクリタキセルとを連結するリンカー（Ｌ）は、「－Ｃ６－ＮＨ－コハク酸－」である（Ｃ６は、配列番号１の５’末端と連結される部分であり、コハク酸は、パクリタキセルと連結される部分である。）。
【0192】
（１９）実施例１２の製造
実施例１２［ＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＴＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＮＮ（配列番号１２）の５’末端にパクリタキセルが接合された修飾オリゴヌクレオチド－薬物接合体、ここで、Ｎ＝５－ＦｄＵ］を製造した。
実施例１２［ＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＴＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＮＮ（配列番号１２）の５’末端にパクリタキセルが接合された修飾オリゴヌクレオチド－薬物接合体、ここで、Ｎ＝５－ＦｄＵ］を製造した。
【0193】
１）オリゴヌクレオチドの合成
比較例１と同様の方法により、
を合成した。
比較例１と同様の方法により、
【化47】
【0194】
２）薬物コンジュゲーション
配列番号１３の代わりに配列番号３３の配列を使用した以外は、比較例２の薬物コンジュゲーション方法と同様にして、実施例１２を製造した。
配列番号１３の代わりに配列番号３３の配列を使用した以外は、比較例２の薬物コンジュゲーション方法と同様にして、実施例１２を製造した。
【0195】
実施例１２の修飾オリゴヌクレオチド－薬物接合体における配列番号１２の配列の５’末端の最初のヌクレオチド（Ｇ）とパクリタキセルとを連結するリンカー（Ｌ）は、「－Ｃ６－ＮＨ－コハク酸－」である（Ｃ６は、配列番号１２の５’末端と連結される部分であり、コハク酸は、パクリタキセルと連結される部分である。）。
【0196】
２．修飾オリゴヌクレオチド－薬物接合体の抗癌効果の確認－試験管内試験（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）
膵臓癌細胞株を用いて修飾オリゴヌクレオチド－薬物接合体のｉｎ ｖｉｔｒｏ抗癌効果を検証した。０、０．０１、０．１、１、１０、１００、５００、１０００μＭの濃度で、前述の実施例及び比較例を膵臓癌細胞株（ＢｘＰＣ－３）に処理した。具体的なＩＣ５０の測定方法及び測定結果は以下の通りである。
膵臓癌細胞株を用いて修飾オリゴヌクレオチド－薬物接合体のｉｎ ｖｉｔｒｏ抗癌効果を検証した。０、０．０１、０．１、１、１０、１００、５００、１０００μＭの濃度で、前述の実施例及び比較例を膵臓癌細胞株（ＢｘＰＣ－３）に処理した。具体的なＩＣ５０の測定方法及び測定結果は以下の通りである。
【0197】
（１）細胞の培養
全ての細胞株は、３７℃、５％ＣＯ２培養器で培養した。ＢｘＰＣ－３膵臓癌細胞株は、ＡＴＣＣ修飾（ｍｏｄｉｆｉｅｄ）ＲＰＭＩ－１６４０（サーモサイエンティフィック、米国）に１０％ＦＢＳ、１％の抗生剤を入れた培地で培養した。培地は２～３日に一度交換し、細胞が培養皿の７０～９０％程度を満たす時点で継代培養した。まず、ＰＢＳで細胞を洗浄した後、０．０５％Ｔｒｙｐｓｉｎ－ＥＤＴＡを添加して３７℃で２分間培養した後、新しい培地を添加してトリプシンを不活性化した。細胞は、遠心分離機を用いてトリプシンおよび培地から分離した後、新しい培地を添加して１：４の割合で継代した後、培養した。全ての細胞は周期的にマイコプラズマの汚染有無をキット（イントロン、韓国）により確認し、汚染が検出されなかった細胞のみを用いてｉｎ ｖｉｔｒｏ効能評価実験を行った。
全ての細胞株は、３７℃、５％ＣＯ２培養器で培養した。ＢｘＰＣ－３膵臓癌細胞株は、ＡＴＣＣ修飾（ｍｏｄｉｆｉｅｄ）ＲＰＭＩ－１６４０（サーモサイエンティフィック、米国）に１０％ＦＢＳ、１％の抗生剤を入れた培地で培養した。培地は２～３日に一度交換し、細胞が培養皿の７０～９０％程度を満たす時点で継代培養した。まず、ＰＢＳで細胞を洗浄した後、０．０５％Ｔｒｙｐｓｉｎ－ＥＤＴＡを添加して３７℃で２分間培養した後、新しい培地を添加してトリプシンを不活性化した。細胞は、遠心分離機を用いてトリプシンおよび培地から分離した後、新しい培地を添加して１：４の割合で継代した後、培養した。全ての細胞は周期的にマイコプラズマの汚染有無をキット（イントロン、韓国）により確認し、汚染が検出されなかった細胞のみを用いてｉｎ ｖｉｔｒｏ効能評価実験を行った。
【0198】
（２）膵臓癌細胞の増殖阻害効果の確認
ＷＳＴ試薬（ＤｏｎｇｉｎＬＳ、韓国）を用いて、薬物処理による膵臓癌細胞の増殖阻害効果の確認およびＩＣ５０の測定を行った。細胞内のミトコンドリア脱水素酵素により、ＷＳＴでホルマザン（ｆｏｒｍａｚａｎ）と呼ばれるオレンジ色の発色物質が生成するが、これは生きている細胞のみに有効である。具体的な試験方法は以下の通りである。
ＷＳＴ試薬（ＤｏｎｇｉｎＬＳ、韓国）を用いて、薬物処理による膵臓癌細胞の増殖阻害効果の確認およびＩＣ５０の測定を行った。細胞内のミトコンドリア脱水素酵素により、ＷＳＴでホルマザン（ｆｏｒｍａｚａｎ）と呼ばれるオレンジ色の発色物質が生成するが、これは生きている細胞のみに有効である。具体的な試験方法は以下の通りである。
【0199】
前述の方法で培養した細胞を９６ウェル培養容器の各ウェルに２×１０４個ずつ分注し、２４時間培養した。培養容器に付着した細胞の培地を、５％ＦＢＳが含まれたＡＴＣＣ修飾ＲＰＭＩ－１６４０培地に交換し、前述の修飾オリゴヌクレオチド－薬物接合体のサンプル（実施例１－７、９－１２及び比較例１－７のそれぞれ）を０、０．０１、０．１、１、１０、１００、５００、１０００μＭの濃度で処理した。７２時間後、各ウェルにＷＳＴ試薬を１０ｕｌずつ加え、２時間反応させた。Ｇｌｏｍａｘプレート測定器（プロメガ、米国）を用いて、４５０ｎｍの吸光度で生成されたホルマザンを測定し、機器内のプロトコルに従ってＩＣ５０を評価した。ＩＣ５０の評価結果およびグラフを下記表２及び図１９～２７に示す（表２において、Ｍ＝ゲムシタビン、Ｎ＝５－ＦｄＵ）。
【0200】
【表2-1】
【表2-2】
【0201】
対照アプタマー（Ｃｏｎｔｒｏｌ ａｐｔａｍｅｒ）である比較例１のＩＣ５０は８９．９νＭである。一方、修飾オリゴヌクレオチド－薬物接合体の実施例は、対照アプタマーである比較例１と比較して数～数十倍低いＩＣ５０の値を示した。
【0202】
また、比較例１の配列の一部のアミノ酸に薬物がコンジュゲートされ、同時に他のアミノ酸が修飾核酸で置換されるか、または修飾核酸をさらに含む実施例（ｅ．ｇ．実施例１～１２）は、修飾核酸への置換なしに一部のアミノ酸に薬物のみがコンジュゲートされた比較例（比較例２～７）に比べて、少なくは２倍、多くは４０倍程度に低いＩＣ５０値を有することを確認した。
【0203】
これは、本発明の修飾オリゴヌクレオチド－薬物接合体が、対照アプタマーに比べて優れた抗癌効果を示すことができることを意味する。
【0204】
３．修飾オリゴヌクレオチド－薬物接合体の抗癌効果の確認－動物実験（ｉｎ ｖｉｖｏ）
ＩＣ５０の測定結果が優れた実施例５（ＩＯ１４２）及び実施例９（ＩＯ１７６）を選択して動物実験を行った。
ＩＣ５０の測定結果が優れた実施例５（ＩＯ１４２）及び実施例９（ＩＯ１７６）を選択して動物実験を行った。
【0205】
（１）修飾オリゴヌクレオチド－薬物接合体が担持された「パッチ型コラーゲン薬物送達体」の製造
動物モデルに修飾オリゴヌクレオチド－薬物接合体を送達するために、高純度のコラーゲン（ＣＯＬＴＲＩＸ（登録商標）Ｔｅｎｄｏｒｅｇｅｎ、Ｕｂｉｏｓｉｓ社）分散液（１．０％）と試験対象のサンプル（ｅ．ｇ．修飾オリゴヌクレオチド－薬物接合体、ゲムシタビンなど）を混合し、直径１ｃｍの円形シリコンモールドに注ぎ、凍結乾燥して、サンプルがコラーゲンに担持された「パッチ型コラーゲン薬物送達体」を製造した。パッチ型コラーゲン薬物送達体１個当たりに担持されたサンプルの量は、下記表３の通りである（表３において、配列番号１６は、５’－（Ｇｅｍ）（Ｇｅｍ）［ＴＧＧ］４［ＴＴＧ］［ＴＧＧ］５－３’、ここで、Ｇｅｍ＝ゲムシタビン）。
動物モデルに修飾オリゴヌクレオチド－薬物接合体を送達するために、高純度のコラーゲン（ＣＯＬＴＲＩＸ（登録商標）Ｔｅｎｄｏｒｅｇｅｎ、Ｕｂｉｏｓｉｓ社）分散液（１．０％）と試験対象のサンプル（ｅ．ｇ．修飾オリゴヌクレオチド－薬物接合体、ゲムシタビンなど）を混合し、直径１ｃｍの円形シリコンモールドに注ぎ、凍結乾燥して、サンプルがコラーゲンに担持された「パッチ型コラーゲン薬物送達体」を製造した。パッチ型コラーゲン薬物送達体１個当たりに担持されたサンプルの量は、下記表３の通りである（表３において、配列番号１６は、５’－（Ｇｅｍ）（Ｇｅｍ）［ＴＧＧ］４［ＴＴＧ］［ＴＧＧ］５－３’、ここで、Ｇｅｍ＝ゲムシタビン）。
【0206】
【表3】
【0207】
具体的には、高純度のコラーゲンに試験対象のサンプル（ゲムシタビン、ＩＯ１０１Ｌ（配列番号１６）、修飾オリゴヌクレオチド－薬物接合体（実施例５及び実施例９）のそれぞれを添加した後、マルチミキサー（ＳＬＲＭ－３、ＭＹＬＡＢ）を用いて４℃で１時間均一に混合した。その後、コラーゲン－薬物混合物を直径１ｃｍの円筒状のシリコンモールドに一定量分注した。コラーゲン－薬物混合物が分注された円筒状のシリコンモールドを－２０℃で４時間以上一次凍結した。一次凍結が完了した混合物を円筒状のシリコンモールドから分離し、滅菌皿または滅菌プレートに移した後、－８０℃で２時間以上二次凍結した。凍結乾燥機のコールドトラップの温度が－８０℃になるように予備凍結した後、凍結乾燥機に混合物を入れて１６時間以上凍結乾燥した。凍結乾燥した混合物を、アクリルプレートを用いてパッチ型に圧着した後、アルミニウムポーチに入れて密封した。包装されたパッチ型コラーゲン薬物送達体は４℃で冷蔵保存した。
【0208】
以下では、前述の方法で製造されたパッチ型コラーゲン薬物送達体をパッチ（ｐａｔｃｈ）または薬物ロードコラーゲンパッチで表した。
【0209】
（２）修飾オリゴヌクレオチド－薬物接合体が担持された「パッチ型コラーゲン薬物送達体」の動物モデルにおける安定性および有効性の評価
１）膵臓癌同所性移植動物モデル（Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｃａｎｃｅｒ ｏｒｔｈｏｔｏｐｉｃ ｍｏｄｅｌ）の構築、及びパッチ型コラーゲン薬物送達体の移植
凍結した癌細胞株（ＢｘＰＣ－３－Ｌｕｃ）（Ａｓａｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ）を解凍し、その後、３７℃、５％ ＣＯ２の条件で１０％ウシ胎児血清（ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ、Ｂｉｏｗｅｓｔ、Ｃａｔ♯．Ｓ１４８０）と１％抗生剤（ｇｉｂｃｏ、Ｃａｔ＃．１５２４００６２）が供給されたＲＰＭＩ１６４０培地（Ｂｉｏｗｅｓｔ、Ｃａｔ＃．Ｌ０４９８－１００）で培養した。解凍した細胞を１週間培養し、形態、生存率、倍加時間（Ｄｏｕｂｌｉｎｇ ｔｉｍｅ）に問題がないことを確認した。
１）膵臓癌同所性移植動物モデル（Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｃａｎｃｅｒ ｏｒｔｈｏｔｏｐｉｃ ｍｏｄｅｌ）の構築、及びパッチ型コラーゲン薬物送達体の移植
凍結した癌細胞株（ＢｘＰＣ－３－Ｌｕｃ）（Ａｓａｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ）を解凍し、その後、３７℃、５％ ＣＯ２の条件で１０％ウシ胎児血清（ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ、Ｂｉｏｗｅｓｔ、Ｃａｔ♯．Ｓ１４８０）と１％抗生剤（ｇｉｂｃｏ、Ｃａｔ＃．１５２４００６２）が供給されたＲＰＭＩ１６４０培地（Ｂｉｏｗｅｓｔ、Ｃａｔ＃．Ｌ０４９８－１００）で培養した。解凍した細胞を１週間培養し、形態、生存率、倍加時間（Ｄｏｕｂｌｉｎｇ ｔｉｍｅ）に問題がないことを確認した。
【0210】
マウスに移植するために、細胞生存率が９５％以上の癌細胞を準備した。トリプシンを用いて細胞を回収し、ＲＰＭＩ１６４０培地に混濁して、５×１０５細胞／２５μｌ／マウスで移植できるように準備した。１週間安定化した６週齢のＢＡＬＢ／ｃ－ｎｕｄｅオスマウス（Ｊａｂｉｏ社、韓国）を腹腔麻酔し、腹部位を切開した後、膵臓を取り出して５×１０５ｃｅｌｌｓ／２５μｌの細胞を移植した。２週間後、ルシフェラーゼ・イメージング（ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ｉｍａｇｉｎｇ）により腫瘍形成を確認した。その後、下記表４のように、マウスを５匹ずつグループ化した。前記「（１）」で製造したパッチ型コラーゲン薬物送達体を各グループのマウスの腫瘍部位に挿入（Ｉｎｔｒａ－Ａｂｄｏｍｉｎａｌ ｃａｖｉｔｙ ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ｓｕｒｇｅｒｙ）した。本試験に含まれる全ての動物実験は、韓国のアサン生命科学研究院の動物実験倫理委員会（ＩＡＣＵＣ）の承認を受けた動物実験計画書［２０２２－１４－０５８］に従って行った。
【0211】
【表4】
【0212】
２）ＩＶＩＳイメージングを用いた有効性の評価
パッチ型コラーゲン薬物送達体を挿入（ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ）した後、週３回間隔で４週間ＩＶＩＳイメージング装置（Ｘｅｎｏｇｅｎ ＩＶＩＳ ｓｐｅｃｔｒｕｍ ｓｙｓｔｅｍ；Ｃａｌｉｐｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｉnｃ．，Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ，ＭＡ）を用いて腫瘍サイズの変化を観察し、体重を確認した。マウス１匹あたり１５０ｍｇ／ｋｇの濃度でルシフェリンを腹腔内注射し、７分間反応させた後、ＩＶＩＳ（ｉｎ ｖｉｖｏ ｉｍａｇｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ）撮影を行った。パッチ型コラーゲン薬物送達体を挿入した後、２８日目にＩＶＩＳイメージングを行い、体重測定終了後にマウスを犠牲にして重要臓器（心臓、肺、脾臓、腎臓、肝臓）、膵臓および腫瘍を摘出して臓器の重量を測定し、写真撮影を行った。パッチ型コラーゲン薬物送達体の挿入当日は、マウスが回復する期間が必要であるため、挿入翌日にＩＶＩＳ（ｉｎ ｖｉｖｏ ｉｍａｇｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ）撮影を行った。
パッチ型コラーゲン薬物送達体を挿入（ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ）した後、週３回間隔で４週間ＩＶＩＳイメージング装置（Ｘｅｎｏｇｅｎ ＩＶＩＳ ｓｐｅｃｔｒｕｍ ｓｙｓｔｅｍ；Ｃａｌｉｐｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｉnｃ．，Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ，ＭＡ）を用いて腫瘍サイズの変化を観察し、体重を確認した。マウス１匹あたり１５０ｍｇ／ｋｇの濃度でルシフェリンを腹腔内注射し、７分間反応させた後、ＩＶＩＳ（ｉｎ ｖｉｖｏ ｉｍａｇｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ）撮影を行った。パッチ型コラーゲン薬物送達体を挿入した後、２８日目にＩＶＩＳイメージングを行い、体重測定終了後にマウスを犠牲にして重要臓器（心臓、肺、脾臓、腎臓、肝臓）、膵臓および腫瘍を摘出して臓器の重量を測定し、写真撮影を行った。パッチ型コラーゲン薬物送達体の挿入当日は、マウスが回復する期間が必要であるため、挿入翌日にＩＶＩＳ（ｉｎ ｖｉｖｏ ｉｍａｇｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ）撮影を行った。
【0213】
２－１）ＩＶＩＳ全身画像（ＩＶＩＳ ｗｈｏｌｅ ｂｏｄｙ ｉｍａｇｅ）
薬物未処理マウス群（グループ１）とＩＯ１０１Ｌ２．０ｍｇ－ロードコラーゲンパッチが挿入されたマウス群（グループ３）の場合、死亡したマウスが存在し、時間が経つにつれて、ますます発光（Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ）が増加した。実施例９（ＩＯ１７６） ０．２ｍｇ－ロードコラーゲンパッチが挿入されたマウス群（グループ４）、実施例５（ＩＯ１４２） ２．０ｍｇ－ロードコラーゲンパッチが挿入されたマウス群（グループ５）の場合は、蛍光の変化が減少した。発光の増加は癌の増殖を意味し、発光の減少は腫瘍抑制効果が示されることを意味する（図１～図５を参照）。
薬物未処理マウス群（グループ１）とＩＯ１０１Ｌ２．０ｍｇ－ロードコラーゲンパッチが挿入されたマウス群（グループ３）の場合、死亡したマウスが存在し、時間が経つにつれて、ますます発光（Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ）が増加した。実施例９（ＩＯ１７６） ０．２ｍｇ－ロードコラーゲンパッチが挿入されたマウス群（グループ４）、実施例５（ＩＯ１４２） ２．０ｍｇ－ロードコラーゲンパッチが挿入されたマウス群（グループ５）の場合は、蛍光の変化が減少した。発光の増加は癌の増殖を意味し、発光の減少は腫瘍抑制効果が示されることを意味する（図１～図５を参照）。
【0214】
２－２）体重の変化
パッチ型コラーゲン薬物送達体を挿入した後、マウスの体重を週３回間隔で４週間測定した。日別の測定結果において、０日目の体重を分けて、０日目に対するマウス体重の割合変化を観察した。パッチ型コラーゲン薬物送達体を挿入した全てのマウス群（グループ２～グループ５）において、試験物質の挿入後２～６日間は体重が減少したが、徐々に体重が回復することを確認した（図６参照）。
パッチ型コラーゲン薬物送達体を挿入した後、マウスの体重を週３回間隔で４週間測定した。日別の測定結果において、０日目の体重を分けて、０日目に対するマウス体重の割合変化を観察した。パッチ型コラーゲン薬物送達体を挿入した全てのマウス群（グループ２～グループ５）において、試験物質の挿入後２～６日間は体重が減少したが、徐々に体重が回復することを確認した（図６参照）。
【0215】
２－３）摘出臓器の撮影および重量の測定
パッチ型コラーゲン薬物送達体の挿入後２８日目にマウスを犠牲にし、主要臓器（心臓、肺、脾臓、腎臓、肝臓）、膵臓及び腫瘍を摘出して写真を撮影し、臓器の重量を測定した。
パッチ型コラーゲン薬物送達体の挿入後２８日目にマウスを犠牲にし、主要臓器（心臓、肺、脾臓、腎臓、肝臓）、膵臓及び腫瘍を摘出して写真を撮影し、臓器の重量を測定した。
【0216】
前記「２－２）」の実験結果と同様に、実施例９（ＩＯ１７６） ０．２ｍｇ－ロードコラーゲンパッチが挿入されたマウス群（グループ４）の腫瘍サイズが最も小さく、転移した腫瘍は観察されなかった。また、実施例９（ＩＯ１７６） ０．２ｍｇ－ロードコラーゲンパッチが挿入されたマウス群（グループ４）の腫瘍重量が最も低く、実施例５（ＩＯ１４２） ２．０ｍｇ－ロードコラーゲンパッチが挿入されたマウス群（グループ５）、ＩＯ１０１Ｌ ２．０ｍｇ－ロードコラーゲンパッチが挿入されたマウス群（グループ３）の順に低い重量が観察された（図７Ａ～図７Ｅ及び図８を参照）。
【0217】
ＩＶＩＳ全身画像、腫瘍サイズおよび重量の測定結果から、実施例９（ＩＯ１７６） ０．２ｍｇ－ロードコラーゲンパッチが挿入されたマウス群（グループ４）、および実施例５（ＩＯ１４２） ２．０ｍｇ－ロードコラーゲンパッチが挿入されたマウス群（グループ５）では、マウスが死亡することなく、優れた腫瘍抑制効果が確認された。また、試験群のマウスを解剖した結果、投与した薬物ロードコラーゲンパッチが観察されなかったので、全て溶けて吸収されたと判断する。
【0218】
４．修飾オリゴヌクレオチド－薬物接合体の薬動学的評価－ラットの使用
ラットに実施例９（ＩＯ１７６） ４０ｍｇ／ｋｇ、実施例９に含まれるモノメチルアウリスタチンＥ（Ｍｏｎｏｍｅｔｈｙｌ ａｕｒｉｓｔａｔｉｎ Ｅ、以下「ＭＭＡＥ」という。）と同量のＭＭＡＥ（ＭｅｄＣｈｅｍＥｘｐｒｅｓｓ、ＣａＴ♯．ＨＹ－１５１６２）の４ｍｇ／ｋｇ、及び実施例９に含まれるゲムシタビン（Ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ）と同量のゲムシタビン（ＢｅｔａＰｈａｒｍａ（ｓｈａｎｇｈａｉ）Ｃｏ．，Ｌｔｄ，Ｃａｔ＃．８６－３９１５７）の２ｍｇ／ｋｇをそれぞれ頸静脈投与した後、ｉ）ＭＭＡＥの薬動学係数と、ｉｉ）ゲムシタビン及びゲムシタビンの不活性代謝体であるｄＦｄＵの薬動学係数を算出して比較した。
ラットに実施例９（ＩＯ１７６） ４０ｍｇ／ｋｇ、実施例９に含まれるモノメチルアウリスタチンＥ（Ｍｏｎｏｍｅｔｈｙｌ ａｕｒｉｓｔａｔｉｎ Ｅ、以下「ＭＭＡＥ」という。）と同量のＭＭＡＥ（ＭｅｄＣｈｅｍＥｘｐｒｅｓｓ、ＣａＴ♯．ＨＹ－１５１６２）の４ｍｇ／ｋｇ、及び実施例９に含まれるゲムシタビン（Ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ）と同量のゲムシタビン（ＢｅｔａＰｈａｒｍａ（ｓｈａｎｇｈａｉ）Ｃｏ．，Ｌｔｄ，Ｃａｔ＃．８６－３９１５７）の２ｍｇ／ｋｇをそれぞれ頸静脈投与した後、ｉ）ＭＭＡＥの薬動学係数と、ｉｉ）ゲムシタビン及びゲムシタビンの不活性代謝体であるｄＦｄＵの薬動学係数を算出して比較した。
【0219】
具体的には、Ｓｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙ雄性ラット（８週齢、ＹＯＵＮＧ ＢＩＯ社）を韓国のカトリック大学のソンシン校庭の動物室で１週間馴化した後、薬動学実験を行った。ラットを吸入麻酔薬であるイソフルラン（ｉｓｏｆｌｕｒａｎｅ）で誘導麻酔し、ＰＥ５０（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｔｕｂｉｎｇ、Ｃｌａｙ Ａｄａｍｓ、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、ＮＪ、ＵＳＡ）を頸動脈（血液採取用）と頸静脈（薬物投与用）に挿入して縫合糸で縫合し、その端部を首の後ろに固定した。手術中はエーテル（ｅｔｈｅｒ）を用いて麻酔を維持し、ヘパリン（２０ｕｎｉｔｓ／ｍＬ）が含有された生理食塩水を約０．５ｍＬ注入して、カニューレ（ｃａｎｎｕｌａ）に血液が凝固することを防止した。手術が終わった後、ラットをそれぞれ代謝ケージ（ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｃａｇｅ）に入れて麻酔剤から完全に回復させた後（４～５時間）、実施例９（ＩＯ１７６）単独投与（ｎ＝６）、ＭＭＡＥ単独投与（ｎ＝７）、およびゲムシタビン単独投与（ｎ＝６）の３つの群に分けて各試料（実施例９、ＭＭＡＥ単独、ゲムシタビン単独）を投与した。実施例９、ＭＭＡＥ及びゲムシタビンを全て生理食塩水に溶かし、体重１ｋｇ当たり２ｍＬで溶かし、それぞれ４０ｍｇ／ｋｇ、４ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇの用量で頸静脈に投与した。採血において、０．２ｍＬの血液中のゲムシタビンがシチジンデアミナーゼ（ｃｙｔｉｄｉｎｅ ｄｅａｍｉｎａｓｅ）によって代謝体に変化することを防ぐために、シチジンデアミナーゼ阻害剤であるテトラヒドロウリジン（ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｕｒｉｄｉｎｅ、以下「ＴＨＵ」という。）を１０ｍｇ／ｍＬの濃度で蒸留水に溶かした溶液２μＬを予め入れた遮光エッペンドルフチューブを用意した。３つの群において、各薬物の投与直前（０分）、１、５、１０、１５、３０分、１時間、２時間、４時間、６時間、８時間、１０時間、２０時間、２４時間及び３０時間後、頸動脈を介して、予め冷凍保存した遮光エッペンドルフチューブにそれぞれ血液０．２ｍＬを採取した。採血が終わった直後、氷浴（ｉｃｅ－ｂａｔｈ）に保存した血漿を４℃で直ちに遠心分離し、血漿を遮光エッペンドルフチューブに１００μＬ分注した。分注した血漿を直ちにｉｃｅ－ｂａｔｈに保存し、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析まで－８０℃で保存した。頸動脈の採血後、ＣＯ２ガスチャンバーでラットを安楽死させた。
【0220】
（１）血漿中の濃度分析方法
１）ＭＭＡＥの濃度分析方法
試料をタンパク質沈殿法で前処理した後、韓国のカトリック大学薬学大学薬物学／薬物動態学実験室で確立した液体クロマトグラフィータンデム質量分析法（Ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ－ｔａｎｄｅｍ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ、以下「ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ」という。）を用いて、ＭＭＡＥの血漿中濃度を分析した。全ての分析手順は遮光条件で行った。
１）ＭＭＡＥの濃度分析方法
試料をタンパク質沈殿法で前処理した後、韓国のカトリック大学薬学大学薬物学／薬物動態学実験室で確立した液体クロマトグラフィータンデム質量分析法（Ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ－ｔａｎｄｅｍ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ、以下「ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ」という。）を用いて、ＭＭＡＥの血漿中濃度を分析した。全ての分析手順は遮光条件で行った。
【0221】
イ．ＬＣ－ＭＳ／ＭＳの条件
－分析機器：Ａｇｉｌｅｎｔ １２９０ ｓｅｒｉｅｓ ＨＰＬＣ、Ｑｔｒａｐ ５５００ ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ
－検出器：Ｔａｎｄｅｍ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ（ｔｒｉｐｌｅ ｑｕａｄｒｏｕｐｌｅ ｔｙｐｅ）
イオン源（Ｉｏｎ ｓｏｕｒｃｅ）：Ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ（ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｉｏｎ ｍｏｄｅ）
脱溶媒温度（Ｄｅｓｏｌｖａｔｉｏｎ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）：５００℃
Ｎｅｂｕｌｉｚｉｎｇ ｇａｓ：Ｎｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃｏｌｌｉｓｉｏｎ ｇａｓ：Ｎｉｔｒｏｇｅｎ
定量（Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ）：ＭＲＭ（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ）ｍｏｄｅ
－固定相：Ｌｕｎａ Ｃ１８（２．０×１００ｍｍ、３μｍ、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、 Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、ＵＳＡ）
－固定相の温度：４０℃
－移動相：０．１％ギ酸（ｆｏｒｍｉｃ ａｃｉｄ）含有蒸留水（Ａ）／０．１％ギ酸 含有アセトニトリル（Ｂ）（５０：５０、ｖ／ｖ）（下記［表５］を参照）
－流速：０．３ｍＬ／ｍｉｎ
－質量パラメータ（Ｍａｓｓ ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ）：下記［表６］を参照（ＣＥ：Ｃｏｌｌｉｓｉｏｎ ｅｎｅｒｇｙ）
－分析機器：Ａｇｉｌｅｎｔ １２９０ ｓｅｒｉｅｓ ＨＰＬＣ、Ｑｔｒａｐ ５５００ ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ
－検出器：Ｔａｎｄｅｍ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ（ｔｒｉｐｌｅ ｑｕａｄｒｏｕｐｌｅ ｔｙｐｅ）
イオン源（Ｉｏｎ ｓｏｕｒｃｅ）：Ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ（ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｉｏｎ ｍｏｄｅ）
脱溶媒温度（Ｄｅｓｏｌｖａｔｉｏｎ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）：５００℃
Ｎｅｂｕｌｉｚｉｎｇ ｇａｓ：Ｎｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃｏｌｌｉｓｉｏｎ ｇａｓ：Ｎｉｔｒｏｇｅｎ
定量（Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ）：ＭＲＭ（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ）ｍｏｄｅ
－固定相：Ｌｕｎａ Ｃ１８（２．０×１００ｍｍ、３μｍ、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、 Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、ＵＳＡ）
－固定相の温度：４０℃
－移動相：０．１％ギ酸（ｆｏｒｍｉｃ ａｃｉｄ）含有蒸留水（Ａ）／０．１％ギ酸 含有アセトニトリル（Ｂ）（５０：５０、ｖ／ｖ）（下記［表５］を参照）
－流速：０．３ｍＬ／ｍｉｎ
－質量パラメータ（Ｍａｓｓ ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ）：下記［表６］を参照（ＣＥ：Ｃｏｌｌｉｓｉｏｎ ｅｎｅｒｇｙ）
【0222】
【表5】
【0223】
【表6】
【0224】
ロ．検量線の作成
ＭＭＭＥ標準品をアセトニトリルに溶かして１ｍｇ／ｍＬの貯蔵溶液を製造して冷凍保存し、貯蔵溶液をアセトニトリルで希釈して各濃度が０．２５０、０．５００、２．５０、５．００、１２．５、５０．０μｇ／ｍＬとなるように作業溶液を作って冷蔵庫に保管した。内部標準物質（Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｓｔａｎｄａｒｄ、ＩＳ）であるベラパミル（ｖｅｒａｐａｍｉｌ）をアセトニトリルに溶かし、２００ｎｇ／ｍＬの作業溶液を製造した。ＭＭＡＥの作業溶液をＴＨＵが含まれたラット共血漿に添加して、ＭＭＡＥの血漿中濃度が１０、２０、１００、２００、５００、２０００ｎｇ／ｍＬとなるように標準血漿試料をそれぞれ製造した。
ＭＭＭＥ標準品をアセトニトリルに溶かして１ｍｇ／ｍＬの貯蔵溶液を製造して冷凍保存し、貯蔵溶液をアセトニトリルで希釈して各濃度が０．２５０、０．５００、２．５０、５．００、１２．５、５０．０μｇ／ｍＬとなるように作業溶液を作って冷蔵庫に保管した。内部標準物質（Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｓｔａｎｄａｒｄ、ＩＳ）であるベラパミル（ｖｅｒａｐａｍｉｌ）をアセトニトリルに溶かし、２００ｎｇ／ｍＬの作業溶液を製造した。ＭＭＡＥの作業溶液をＴＨＵが含まれたラット共血漿に添加して、ＭＭＡＥの血漿中濃度が１０、２０、１００、２００、５００、２０００ｎｇ／ｍＬとなるように標準血漿試料をそれぞれ製造した。
【0225】
ハ．血漿試料の処理方法
２５μＬのラット血漿に、アセトニトリルに溶かした内部標準物質であるベラパミル（２００ｎｇ／ｍＬ）の２００μＬを入れ、１０分間ボルテックス（ｖｏｒｔｅｘ）した後、１４，０００ｒｐｍで４℃において５分間遠心分離した。その後、上澄液１９０μＬを採取し、０．２μｍのシリンジフィルター（Ｓｙｒｉｎｇｅ ｆｉｌｔｅｒ）を経てＬＣ－ＭＳ／ＭＳバイアルに移した後、２μＬを注入してＬＣ－ＭＳ／ＭＳで分析した。
２５μＬのラット血漿に、アセトニトリルに溶かした内部標準物質であるベラパミル（２００ｎｇ／ｍＬ）の２００μＬを入れ、１０分間ボルテックス（ｖｏｒｔｅｘ）した後、１４，０００ｒｐｍで４℃において５分間遠心分離した。その後、上澄液１９０μＬを採取し、０．２μｍのシリンジフィルター（Ｓｙｒｉｎｇｅ ｆｉｌｔｅｒ）を経てＬＣ－ＭＳ／ＭＳバイアルに移した後、２μＬを注入してＬＣ－ＭＳ／ＭＳで分析した。
【0226】
ニ．分析の適合性の判定
分析過程の適合性を判断するために、試料処理中に分析試料のバッチ毎に検量線作成用試料を分析した後、分析適合性試料（ＭＭＡＥ最低定量限界：ＬＬｏＱ、１０ｎｇ／ｍＬ、低濃度：ＬｏＱＣ、２５ｎｇ／ｍＬ、中濃度：ＭｉＱＣ、２５０ｎｇ／ｍＬ、高濃度：ＨｉＱＣ、１５００ｎｇ／ｍＬ）を２回ずつ分析した。適合性試料の６個中で少なくとも６７％（例えば、６個中４個）が理論値の±１５％以内であり、同濃度で５０％以上が理論値の±１５％以内であるかを確認した。
分析過程の適合性を判断するために、試料処理中に分析試料のバッチ毎に検量線作成用試料を分析した後、分析適合性試料（ＭＭＡＥ最低定量限界：ＬＬｏＱ、１０ｎｇ／ｍＬ、低濃度：ＬｏＱＣ、２５ｎｇ／ｍＬ、中濃度：ＭｉＱＣ、２５０ｎｇ／ｍＬ、高濃度：ＨｉＱＣ、１５００ｎｇ／ｍＬ）を２回ずつ分析した。適合性試料の６個中で少なくとも６７％（例えば、６個中４個）が理論値の±１５％以内であり、同濃度で５０％以上が理論値の±１５％以内であるかを確認した。
【0227】
ホ．血漿薬物濃度の計算
得られたクロマトグラムから内部標準物質のピーク面積に対するＭＭＡＥのピーク面積比を求め、予め作成した検量線から血漿中ＭＭＡＥの濃度を計算した。
得られたクロマトグラムから内部標準物質のピーク面積に対するＭＭＡＥのピーク面積比を求め、予め作成した検量線から血漿中ＭＭＡＥの濃度を計算した。
【0228】
２）ゲムシタビン及びｄＦｄＵの濃度分析方法
イ．ＬＣ－ＭＳ／ＭＳの条件
－分析機器：Ａｇｉｌｅｎｔ １２９０ ｓｅｒｉｅｓ ＨＰＬＣ、Ｑｔｒａｐ ５５００ ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ
－検出器：Ｔａｎｄｅｍ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ（ｔｒｉｐｌｅ ｑｕａｄｒｏｕｐｌｅ ｔｙｐｅ）
イオン源（Ｉｏｎ ｓｏｕｒｃｅ）：Ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ（ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｉｏｎ ｍｏｄｅ）
脱溶媒温度（Ｄｅｓｏｌｖａｔｉｏｎ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）：５００℃
霧化ガス（Ｎｅｂｕｌｉｚｉｎｇ ｇａｓ）：Ｎｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃｏｌｌｉｓｉｏｎ ｇａｓ：Ｎｉｔｒｏｇｅｎ
定量（Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ）
：ＭＲＭ（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ）ｍｏｄｅ
－固定相：Ｈｙｐｅｒｓｉｌ ｇｏｌｄ Ｃ１８ ｃｏｌｕｍｎ （２．１×１００ｍｍ、１．９μｍ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．，Ｂｏｓｔｏｎ、ＵＳＡ）
－固定相の温度：４０℃
－移動相：それぞれ０．１％ギ酸（ｆｏｒｍｉｃ ａｃｉｄ）含有蒸留水（Ａ）とアセトニトリル（Ｂ）（９５：５、ｖ／ｖ）（下記［表７］を参照）
－流速：０．２２ｍＬ／ｍｉｎ
－質量パラメータ（Ｍａｓｓ ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ）：下記［表８］を参照（ＣＥ：Ｃｏｌｌｉｓｉｏｎ ｅｎｅｒｇｙ）
イ．ＬＣ－ＭＳ／ＭＳの条件
－分析機器：Ａｇｉｌｅｎｔ １２９０ ｓｅｒｉｅｓ ＨＰＬＣ、Ｑｔｒａｐ ５５００ ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ
－検出器：Ｔａｎｄｅｍ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ（ｔｒｉｐｌｅ ｑｕａｄｒｏｕｐｌｅ ｔｙｐｅ）
イオン源（Ｉｏｎ ｓｏｕｒｃｅ）：Ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ（ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｉｏｎ ｍｏｄｅ）
脱溶媒温度（Ｄｅｓｏｌｖａｔｉｏｎ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）：５００℃
霧化ガス（Ｎｅｂｕｌｉｚｉｎｇ ｇａｓ）：Ｎｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃｏｌｌｉｓｉｏｎ ｇａｓ：Ｎｉｔｒｏｇｅｎ
定量（Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ）
：ＭＲＭ（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ）ｍｏｄｅ
－固定相：Ｈｙｐｅｒｓｉｌ ｇｏｌｄ Ｃ１８ ｃｏｌｕｍｎ （２．１×１００ｍｍ、１．９μｍ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．，Ｂｏｓｔｏｎ、ＵＳＡ）
－固定相の温度：４０℃
－移動相：それぞれ０．１％ギ酸（ｆｏｒｍｉｃ ａｃｉｄ）含有蒸留水（Ａ）とアセトニトリル（Ｂ）（９５：５、ｖ／ｖ）（下記［表７］を参照）
－流速：０．２２ｍＬ／ｍｉｎ
－質量パラメータ（Ｍａｓｓ ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ）：下記［表８］を参照（ＣＥ：Ｃｏｌｌｉｓｉｏｎ ｅｎｅｒｇｙ）
【0229】
【表7】
【0230】
【表8】
【0231】
ロ．検量線の作成
ゲムシタビン及びｄＦｄＵの各標準品を蒸留水に溶かし、４００μｇ／ｍＬ、７００μｇ／ｍＬの貯蔵溶液を製造して冷凍保存した。貯蔵溶液を３次蒸留水で希釈して各濃度が０．２００、０．４００、０．８００、２．００、１０．０、４０．０μｇ／ｍＬとなるように作業溶液を作って冷蔵庫に保管した。内部標準物質（ＩＳ）である５’－デオキシ－５－フルオロシチジンは、アセトニトリルに溶かし、５０ｎｇ／ｍＬの作業溶液を製造した。ゲムシタビンとｄＦｄＵの作業溶液をＴＨＵが含まれたラットの共血漿に添加して、ゲムシタビンとｄＦｄＵの血漿中濃度がそれぞれ１０、２０、４０、１００、５００、２０００ｎｇ／ｍＬとなるように標準血漿試料を製造した。
ゲムシタビン及びｄＦｄＵの各標準品を蒸留水に溶かし、４００μｇ／ｍＬ、７００μｇ／ｍＬの貯蔵溶液を製造して冷凍保存した。貯蔵溶液を３次蒸留水で希釈して各濃度が０．２００、０．４００、０．８００、２．００、１０．０、４０．０μｇ／ｍＬとなるように作業溶液を作って冷蔵庫に保管した。内部標準物質（ＩＳ）である５’－デオキシ－５－フルオロシチジンは、アセトニトリルに溶かし、５０ｎｇ／ｍＬの作業溶液を製造した。ゲムシタビンとｄＦｄＵの作業溶液をＴＨＵが含まれたラットの共血漿に添加して、ゲムシタビンとｄＦｄＵの血漿中濃度がそれぞれ１０、２０、４０、１００、５００、２０００ｎｇ／ｍＬとなるように標準血漿試料を製造した。
【0232】
ハ．血漿試料の処理方法
２０μＬのラット血漿に、アセトニトリルに溶かした内部標準物質５’－デオキシ－５－フルオロシチジン（５０ｎｇ／ｍＬ）の１５０μＬを加え、１０分間ボルテックス（ｖｏｒｔｅｘ）した後、１４，０００ｒｐｍで４℃において５分間遠心分離した。その後、上澄液１５０μＬを取って、他のエッペンドルフチューブに移した後、窒素気流下で有機溶媒を乾燥した。乾燥したエッペンドルフチューブに３次蒸留水１００μＬを入れて再溶解した。その後、１０分間ボルテックスし、１４，０００ｒｐｍで－４℃において５分間遠心分離した後、上澄液を９０μＬ取る。その後、上澄液を９０μＬ取って、別のエッペンドルフチューブに移した後、１４，０００ｒｐｍで－４℃において５分間遠心分離した。上澄液を８０μＬ取ってＬＣ－ＭＳ／ＭＳバイアルに移した後、５μＬを注入してＬＣ－ＭＳ／ＭＳで分析した。
２０μＬのラット血漿に、アセトニトリルに溶かした内部標準物質５’－デオキシ－５－フルオロシチジン（５０ｎｇ／ｍＬ）の１５０μＬを加え、１０分間ボルテックス（ｖｏｒｔｅｘ）した後、１４，０００ｒｐｍで４℃において５分間遠心分離した。その後、上澄液１５０μＬを取って、他のエッペンドルフチューブに移した後、窒素気流下で有機溶媒を乾燥した。乾燥したエッペンドルフチューブに３次蒸留水１００μＬを入れて再溶解した。その後、１０分間ボルテックスし、１４，０００ｒｐｍで－４℃において５分間遠心分離した後、上澄液を９０μＬ取る。その後、上澄液を９０μＬ取って、別のエッペンドルフチューブに移した後、１４，０００ｒｐｍで－４℃において５分間遠心分離した。上澄液を８０μＬ取ってＬＣ－ＭＳ／ＭＳバイアルに移した後、５μＬを注入してＬＣ－ＭＳ／ＭＳで分析した。
【0233】
二．分析の適合性の判定
分析過程の適合性を判断するために、試料処理中に分析試料のバッチ毎に検量線作成用試料を分析した後、分析適合性試料（ゲムシタビン及びｄＦｄＵそれぞれの最低定量限界：ＬＬｏＱ、１０ｎｇ／ｍＬ、低濃度：ＬｏＱＣ、３０ｎｇ／ｍＬ、中濃度：ＭｉＱＣ、３００ｎｇ／ｍＬ、高濃度：ＨｉＱＣ、９００ｎｇ／ｍＬ）を２回ずつ分析した。適合性試料の６個中で少なくとも６７％（例えば、６個中４個）が理論値の±１５％以内であり、同濃度で５０％以上が理論値の±１５％以内であるかを確認した。
分析過程の適合性を判断するために、試料処理中に分析試料のバッチ毎に検量線作成用試料を分析した後、分析適合性試料（ゲムシタビン及びｄＦｄＵそれぞれの最低定量限界：ＬＬｏＱ、１０ｎｇ／ｍＬ、低濃度：ＬｏＱＣ、３０ｎｇ／ｍＬ、中濃度：ＭｉＱＣ、３００ｎｇ／ｍＬ、高濃度：ＨｉＱＣ、９００ｎｇ／ｍＬ）を２回ずつ分析した。適合性試料の６個中で少なくとも６７％（例えば、６個中４個）が理論値の±１５％以内であり、同濃度で５０％以上が理論値の±１５％以内であるかを確認した。
【0234】
ホ．血漿薬物濃度の計算
得られたクロマトグラムから内部標準物質のピーク面積に対するゲムシタビン及びｄＦｄＵのピーク面積比を求め、予め作成した検量線から血漿中ゲムシタビン及びｄＦｄＵの濃度を計算した。
得られたクロマトグラムから内部標準物質のピーク面積に対するゲムシタビン及びｄＦｄＵのピーク面積比を求め、予め作成した検量線から血漿中ゲムシタビン及びｄＦｄＵの濃度を計算した。
【0235】
３）薬動学パラメータの計算法及び統計処理
ＭＭＡＥ、ゲムシタビン及びｄＦｄＵの薬動学パラメータは、Ｐｈｏｅｎｉｘ ＷｉｎｎｏｎｌｉｎＴＭ（６．４バージョン、Ｃｅｒｔａｒａ）プログラムを用いて、ノンコンパートメント解析（ｎｏｎ－ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔ ａｎａｌｙｓｉｓ）によって分析した。血漿濃度－時間曲線下面積（ＡＵＣｔ）の値は、薬物投与後、最終定量時点までの血漿濃度－時間曲線から対数線形（ｌｏｇ－ｌｉｎｅａｒ）台形法によって求めた。無限時間までの血漿濃度－時間曲線下面積（ＡＵＣｉｎｆ）の値は、下記の［数学式１］を用いて求めた。末端消失速度定数（γＺ）と半減期（ｔ１／２）は、血漿濃度の推移の消失相の勾配から求めた。
ＭＭＡＥ、ゲムシタビン及びｄＦｄＵの薬動学パラメータは、Ｐｈｏｅｎｉｘ ＷｉｎｎｏｎｌｉｎＴＭ（６．４バージョン、Ｃｅｒｔａｒａ）プログラムを用いて、ノンコンパートメント解析（ｎｏｎ－ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔ ａｎａｌｙｓｉｓ）によって分析した。血漿濃度－時間曲線下面積（ＡＵＣｔ）の値は、薬物投与後、最終定量時点までの血漿濃度－時間曲線から対数線形（ｌｏｇ－ｌｉｎｅａｒ）台形法によって求めた。無限時間までの血漿濃度－時間曲線下面積（ＡＵＣｉｎｆ）の値は、下記の［数学式１］を用いて求めた。末端消失速度定数（γＺ）と半減期（ｔ１／２）は、血漿濃度の推移の消失相の勾配から求めた。
【0236】
［数学式１］
ＡＵＣｉｎｆ＝ＡＵＣｔ＋Ｃｔ／γＺ（Ｃｔ：最終定量濃度、γＺ：末端消失速度定数）
ＡＵＣｉｎｆ＝ＡＵＣｔ＋Ｃｔ／γＺ（Ｃｔ：最終定量濃度、γＺ：末端消失速度定数）
【0237】
各２つの群の薬動学パラメータを比較するための統計処理は、Ｔ検定（ｔ－ｔｅｓｔ）を用いて行った。
【0238】
（２）血漿中の濃度分析の結果
１）ＭＭＡＥの濃度分析の結果
ラットに実施例９（ＩＯ１７６）４０ｍｇ／ｋｇ静脈投与及び同量のＭＭＡＥ単独４ｍｇ／ｋｇ静脈投与時、ｉ）ＭＭＡＥの血漿中濃度を図９に示し、ｉｉ）ＭＭＡＥの薬動学係数を下記［表９］にまとめた。
１）ＭＭＡＥの濃度分析の結果
ラットに実施例９（ＩＯ１７６）４０ｍｇ／ｋｇ静脈投与及び同量のＭＭＡＥ単独４ｍｇ／ｋｇ静脈投与時、ｉ）ＭＭＡＥの血漿中濃度を図９に示し、ｉｉ）ＭＭＡＥの薬動学係数を下記［表９］にまとめた。
【0239】
ＭＭＡＥの４ｍｇ／ｋｇを静脈投与した場合、実験した７匹のラットは、投与後４８０分～６００分で全て死亡した。これに対し、実施例９（ＩＯ１７６）４０ｍｇ／ｋｇ静脈投与群では、投与後１分目にＭＭＡＥの血漿中濃度が６０５±１６５ｎｇ／ｍＬであり、ＭＭＡＥ４ｍｇ／ｋｇ単独静脈投与群（２９６４０±７１９０ｎｇ／ｍＬ）よりも約５０倍低く検出され、投与後のＭＭＡＥの血漿中濃度が６０分～１２０分目から徐々に増加して最後の採血時間である１８００分目まで増加し、実験した全てのラットが死ぬことなく生きていた（図９参照）。投与後の初期時間である１２０分目までのＭＭＡＥのＡＵＣ値は、ＭＭＡＥ４ｍｇ／ｋｇ単独静脈投与群の場合は、７１．７±９．６１μｇ ｍｉｎ／ｍＬであり、実施例９（ＩＯ１７６）４０ｍｇ／ｋｇ静脈投与群（７．３９±１．０５μｇ ｍｉｎ／ｍＬ）よりも約９．７０倍高く計算された。しかし、最後の採血時間である１８００分目までのＡＵＣ値は、むしろ実施例９（ＩＯ１７６）４０ｍｇ／ｋｇ静脈投与群が約１．５５倍高かった（下記表９を参照）。
【0240】
実施例９（ＩＯ１７６）にコンジュゲートされたＭＭＡＥが血漿に放出される速度が非常に遅いため、実施例９は統計的に有意に低い血漿ＭＭＡＥ濃度を示すことができる。これにより、ＭＭＡＥの細胞毒性が減少し、実験したラットの中で死亡個体がなかったと推定される。
【0241】
【表9】
【0242】
２）ゲムシタビン及びｄＦｄＵの濃度分析の結果
実施例９（ＩＯ１７６）４０ｍｇ／ｋｇ静脈投与および同量のゲムシタビン単独２ｍｇ／ｋｇ静脈投与時、ｉ）ゲムシタビン及びその代謝体であるｄＦｄＵの血漿中濃度を図１０に示し、ｉｉ）ゲムシタビン及びその代謝体であるｄＦｄＵの薬動学係数を下記［表１０］にまとめた。
実施例９（ＩＯ１７６）４０ｍｇ／ｋｇ静脈投与および同量のゲムシタビン単独２ｍｇ／ｋｇ静脈投与時、ｉ）ゲムシタビン及びその代謝体であるｄＦｄＵの血漿中濃度を図１０に示し、ｉｉ）ゲムシタビン及びその代謝体であるｄＦｄＵの薬動学係数を下記［表１０］にまとめた。
【0243】
ゲムシタビンに関する分析結果は以下の通りである（下記表１０を参照）。実施例９（ＩＯ１７６）投与群は、同量のゲムシタビン単独静脈投与群よりも統計的に有意に高いゲムシタビン血漿濃度を示した（図１０の左図）。その結果、ゲムシタビンのＡＵＣｔ値は、それぞれ６１０±５２．２μｇｍｉｎ／ｍＬおよび４３８±１２４μｇ ｍｉｎ／ｍＬと約１．３９倍高く計算された。また、実施例９（ＩＯ１７６）投与群において、ゲムシタビンの血漿半減期（ｔ１／２）が統計的に有意に増加したことを確認した。このことから、ＩＯ１７６（実施例９）投与群において、ゲムシタビンの初期放出速度が高くてゲムシタビンの血漿濃度が高く持続するが、持続的に放出されて血漿半減期が増加したと推定した。
【0244】
ゲムシタビンの不活性代謝体であるｄＦｄＵに関する分析結果は以下の通りである（下記表１０を参照）。実施例９（ＩＯ１７６）投与群では血漿濃度がやや高い傾向を示したが、ＡＵＣｔの値は、それぞれ１１１±２２．３μｇｍｉｎ／ｍＬおよび７９．８±４４．２μｇ ｍｉｎ／ｍＬであり、統計的有意性が見られなかった。ｄＦｄＵのＣｍａｘ（最高血漿濃度）は、実施例９（ＩＯ１７６）投与群において統計的に有意に高い値を示した。しかし、両群において、不活性代謝体の代謝変換率（ＡＵＣｔ、ｄＦｄＵ／ＡＵＣｔ、ゲムシタビン）は、それぞれ０．１８２±０．０２６３および０．１７０±０．０６２１であり、統計的な有意性が見られなかった。したがって、実施例９（ＩＯ１７６）から、血漿中に遊離したゲムシタビンは、不活性代謝体変換率に影響しないことが分かる。
【0245】
下記表１０において、ＡＵＣｔは０分から最後の採血時間までの曲線下面積、ｔ１／２は血漿消失半減期（ｔｅｒｍｉｎａｌ ｈａｌｆ－ｌｉｆｅ）、ＣＬはトータルボディクリアランス（ｔｏｔａｌ ｂｏｄｙ ｃｌｅａｒａｎｃｅ）、Ｖｄｓｓは体内分布容積、ＭＲＴは薬物の平均滞留時間（ｍｅａｎ ｒｅｓｉｄｅｎｃｅ ｔｉｍｅ）、Ｔｍａｘはｍｅｄｉａｎ（ｒａｎｇｅｓ）であり、代謝変換率（Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ ｒａｔｉｏ）の値は、ｄＦｄＵのＡＵＣｔ値をゲムシタビンのＡＵＣｔ値で除して計算した値である。
【0246】
【表10】
【0247】
［本発明を支援した国家研究開発事業］
［課題固有番号］１４２５１６２６２６
［課題番号］Ｓ３００４８６７
［部署名］中小ベンチャー企業部
［課題管理（専門）機関名］中小企業技術情報振興院
［研究事業名］中小企業技術革新開発
［研究課題名］多薬剤結合アプタマーを用いた新規抗癌剤の開発技術
［貢献率］１／１
［課題実施機関名］インターオリゴ・コーポレイション
［研究期間］２０２００９２１～２０２２０９２０
［課題固有番号］１４２５１６２６２６
［課題番号］Ｓ３００４８６７
［部署名］中小ベンチャー企業部
［課題管理（専門）機関名］中小企業技術情報振興院
［研究事業名］中小企業技術革新開発
［研究課題名］多薬剤結合アプタマーを用いた新規抗癌剤の開発技術
［貢献率］１／１
［課題実施機関名］インターオリゴ・コーポレイション
［研究期間］２０２００９２１～２０２２０９２０
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7a】
【図7b】
【図7c】
【図7d】
【図7e】
【図8a】
【図8b】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】
【図27】
【配列表】
【国際調査報告】