特表 2024-546996 細胞療法に使用するためのＣＤ１１７の識別可能な細胞表面タンパク質変異体

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-12-26

(54)【発明の名称】細胞療法に使用するためのＣＤ１１７の識別可能な細胞表面タンパク質変異体

(51)【国際特許分類】

   C12N 5/10 20060101AFI20241219BHJP

   C12N 15/12 20060101ALI20241219BHJP

   C07K 16/28 20060101ALI20241219BHJP

   A61P 35/02 20060101ALI20241219BHJP

   A61P 7/00 20060101ALI20241219BHJP

   A61K 47/68 20170101ALI20241219BHJP

   A61K 35/12 20150101ALI20241219BHJP

【ＦＩ】

C12N5/10 ZNA

C12N15/12

C07K16/28

A61P35/02

A61P7/00

A61K47/68

A61K35/12

【審査請求】未請求

【予備審査請求】有

(21)【出願番号】P 2024536163

(86)(22)【出願日】2022-12-16

(85)【翻訳文提出日】2024-08-08

(86)【国際出願番号】 EP2022086452

(87)【国際公開番号】W WO2023111311

(87)【国際公開日】2023-06-22

(31)【優先権主張番号】21215028.8

(32)【優先日】2021-12-16

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(31)【優先権主張番号】22164796.9

(32)【優先日】2022-03-28

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(31)【優先権主張番号】22207926.1

(32)【優先日】2022-11-16

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】524227192

【氏名又は名称】ウニバズィテート バーゼル

【氏名又は名称原語表記】ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＡＥＴ ＢＡＳＥＬ

(71)【出願人】

【識別番号】524042805

【氏名又は名称】シメイオ セラピューティクス アーゲー

【氏名又は名称原語表記】ＣＩＭＥＩＯ ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣＳ ＡＧ

(74)【代理人】

【識別番号】110000338

【氏名又は名称】弁理士法人 ＨＡＲＡＫＥＮＺＯ ＷＯＲＬＤ ＰＡＴＥＮＴ ＆ ＴＲＡＤＥＭＡＲＫ

(74)【代理人】

【識別番号】100133503

【弁理士】

【氏名又は名称】関口 一哉

(72)【発明者】

【氏名】ウルリンガー， シュテファニー

(72)【発明者】

【氏名】レポレ， ロザルバ

(72)【発明者】

【氏名】イエカー， ルカス

(72)【発明者】

【氏名】ヴィーダーケア， アメリー

(72)【発明者】

【氏名】シノーポリ， アレサンドロ

(72)【発明者】

【氏名】カミュ， アナ

(72)【発明者】

【氏名】ウェリンガー， リーザ

(72)【発明者】

【氏名】マター－マローネ， ロミーナ

【テーマコード（参考）】

4B065

4C076

4C087

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B065AA90X

4B065AA90Y

4B065AB01

4B065BA02

4B065CA24

4B065CA44

4C076AA95

4C076CC27

4C076CC41

4C076EE41

4C076EE59

4C087AA01

4C087AA02

4C087BB63

4C087NA13

4C087ZB27

4H045AA11

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA10

4H045DA76

4H045EA20

(57)【要約】

本開示は、治療に使用するための、操作されたまたは天然に存在する突然変異を有するが機能的な表面タンパク質を有する識別可能な表面タンパク質を有する細胞の使用に関する。本発明はまた、識別可能なＣＤ１１７表面タンパク質変異体を有するが、治療、特に養子細胞療法に使用するための機能性表面タンパク質を有する細胞の使用に関する。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

それを必要とする患者における医学的治療に使用するためのＣＤ１１７の第１のアイソフォームを発現する哺乳動物細胞または細胞の集団であって、前記患者がＣＤ１１７の第２のアイソフォームを発現する細胞を有し、
前記第１のアイソフォームを発現する前記細胞が、少なくとも１つの多型または遺伝子操作された対立遺伝子を有するゲノムＤＮＡを含み、
前記多型または遺伝子操作された対立遺伝子が、前記ＣＤ１１７の第２のアイソフォームを発現する細胞を有する前記患者のゲノムに存在せず、
前記多型または遺伝子操作された対立遺伝子が、配列番号１の位置Ｅ７３、Ｄ１２１、Ｒ１２２、Ｓ１２３、Ｓ２３９、Ｙ２５９および／またはＳ２６１におけるアミノ酸の少なくとも１つの置換を特徴とする、哺乳動物細胞または細胞の集団。

【請求項2】

前記医学的治療が、前記ＣＤ１１７の第２のアイソフォームを発現する患者の細胞を特異的に枯渇させるために、前記ＣＤ１１７の第２のアイソフォームに特異的に結合する抗原結合領域を含む治療有効量の枯渇剤と併用して、それを必要とする前記患者に前記ＣＤ１１７の第１のアイソフォームを発現する治療有効量の前記細胞または細胞の集団を投与することを含む、請求項１に記載の哺乳動物細胞または細胞の集団。

【請求項3】

前記第１および第２のアイソフォームが実質的に機能的に同一である、請求項１または２に記載の哺乳動物細胞または細胞の集団。

【請求項4】

前記第１および第２のアイソフォームは、ＳＣＦに結合し、ＳＣＦ依存性増殖をもたらし、および／またはＳＣＦ依存性リン酸化をもたらす
請求項１～３のいずれか一項に記載の、哺乳動物細胞または細胞の集団。

【請求項5】

ＣＤ１１７の前記第１および前記第２のアイソフォームが、実質的に同様の程度でＳＣＦに結合し、好ましくは、前記ＣＤ１１７の第１のアイソフォームのＳＣＦに対する前記ＫＤが、前記ＣＤ１１７の第２のアイソフォームのＳＣＦに対する前記ＫＤよりも４倍未満、好ましくは３倍未満、より好ましくは２倍未満、最も好ましくは１．５倍未満高い、請求項１～４のいずれか一項に記載の哺乳動物細胞または細胞の集団。

【請求項6】

残基Ｅ７３が、Ｋ、Ｌ、ＹおよびＲからなる群から選択されるアミノ酸で置換され、および／または残基Ｄ１２１が、Ｙ、Ｈ、Ｋ、ＲまたはＴからなる群から選択されるアミノ酸、最も好ましくはＨまたはＫで置換され、および／または前記残基Ｓ１２３が、Ｐ、ＦまたはＫからなる群から選択されるアミノ酸、好ましくはＫで置換され、および／または前記残基Ｓ２３９が、ＨまたはＫで置換され、および／または前記残基Ｙ２５９が、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｐ、ＣおよびＨからなる群から選択されるアミノ酸、好ましくはＰ、ＡまたはＧ、最も好ましくはＡで置換され、および／または前記残基Ｋ１９３が、Ｇ、Ｔ、Ｍ、ＤおよびＥからなる群から選択されるアミノ酸で置換される、請求項１～５のいずれか一項に記載の哺乳動物細胞または細胞の集団。

【請求項7】

前記ＣＤ１１７の第１のアイソフォームを発現する前記細胞が、前記第１のアイソフォームをコードする核酸において少なくとも１つの天然多型対立遺伝子を有する天然ゲノムＤＮＡを含む対象から選択されている、請求項１～６のいずれか一項に記載の哺乳動物細胞または細胞の集団。

【請求項8】

前記ＣＤ１１７の第１のアイソフォームが、遺伝子編集によって、好ましくは少なくとも第１の抗原結合領域を含む前記薬剤の結合に関与するＣＤ１１７表面タンパク質領域をコードする標的配列内部に部位特異的変異を誘導することができる遺伝子編集酵素を細胞に導入することによって、前記ＣＤ１１７の第１のアイソフォームをコードする前記核酸配列を改変することによって得られる、請求項１～７のいずれか一項に記載の哺乳動物細胞または細胞の集団。

【請求項9】

前記医学的治療が、造血疾患の治療において、好ましくは急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、全身性肥満細胞症、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、芽球性形質細胞様樹状細胞新生物（ＢＰＤＣＮ）、またはＢ－急性リンパ芽球性白血病（Ｂ－ＡＬＬ）などの悪性造血疾患の治療において、免疫療法後に正常な造血を回復させる、請求項１～８のいずれか一項に記載の哺乳動物細胞または細胞の集団。

【請求項10】

前記枯渇剤が、抗体、抗体－薬物コンジュゲートまたは免疫細胞、好ましくは、前記第２のアイソフォームに特異的に結合し、前記第１のアイソフォームに結合しないかまたは実質的により弱く結合する第１の抗原結合領域を含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を有するＴ細胞である、請求項２～９のいずれか一項に記載の哺乳動物細胞または細胞の集団。

【請求項11】

前記枯渇剤の前記第１の抗原結合領域が、配列番号１のアミノ酸Ｅ７３、Ｄ１２１、Ｒ１２２、Ｓ１２３、Ｓ２３９、Ｙ２５９および／またはＳ２６１を含むエピトープに、より好ましくは配列番号１のアミノ酸Ｅ７３、Ｓ１２３、Ｋ１２７および／またはＹ２５９を含むエピトープに特異的に結合する、請求項２～１０のいずれか一項に記載の哺乳動物細胞または細胞の集団。

【請求項12】

前記第１の抗原結合領域が、
ａ）ＶＨＣＤＲ１が配列番号１７であり、ＶＨＣＤＲ２が配列番号１８であり、ＶＨＣＤＲ３が配列番号１９である、前記３つのＣＤＲ、ＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２およびＶＨＣＤＲ３を含む抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）；および
ＶＬＣＤＲ１が配列番号２０であり、ＶＬＣＤＲ２が配列番号２１であり、ＶＬＣＤＲ３が配列番号２２である、前記３つのＣＤＲ、ＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２およびＶＬＣＤＲ３を含む抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、または
ｂ）ＶＨＣＤＲ１が配列番号１７であり、ＶＨＣＤＲ２が配列番号１８であり、ＶＨＣＤＲ３が配列番号１９である、前記３つのＣＤＲ、ＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２およびＶＨＣＤＲ３を含む抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、および
ＶＬＣＤＲ１が配列番号５９であり、ＶＬＣＤＲ２が配列番号２１であり、ＶＬＣＤＲ３が配列番号６０である、前記３つのＣＤＲ、ＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２およびＶＬＣＤＲ３を含む抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、または
ｃ）ＶＨＣＤＲ１が配列番号１７であり、ＶＨＣＤＲ２が配列番号１８であり、ＶＨＣＤＲ３が配列番号１９である、前記３つのＣＤＲ ＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２およびＶＨＣＤＲ３を含む抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）；および
ＶＬＣＤＲ１が配列番号５９であり、ＶＬＣＤＲ２が配列番号２１であり、ＶＬＣＤＲ３が配列番号６１である、前記３つのＣＤＲ ＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２およびＶＬＣＤＲ３を含む抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）
を含む、請求項２～１１のいずれか一項に記載の哺乳動物細胞または細胞の集団。

【請求項13】

前記第１の抗原結合領域が、
ａ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むもしくはからなる重鎖可変ドメインおよび配列番号１６のアミノ酸配列を含むもしくはからなる軽鎖可変ドメイン、または
ｂ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むもしくはからなる重鎖可変ドメインおよび配列番号６２のアミノ酸配列を含むもしくはからなる軽鎖可変ドメイン、または
ｃ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むもしくはからなる重鎖可変ドメインおよび配列番号６３のアミノ酸配列を含むもしくはからなる軽鎖可変ドメイン
を含む、請求項１２に記載の哺乳動物細胞または細胞の集団。

【請求項14】

前記医学的治療が、ＣＤ１１７の第１のアイソフォームを発現する、移入される細胞を特異的に枯渇させるために、前記ＣＤ１１７の第１のアイソフォームに特異的に結合する抗原結合領域を含む治療有効量の枯渇剤と併用して、それを必要とする前記患者に前記ＣＤ１１７の第１のアイソフォームを発現する治療有効量の前記細胞または細胞の集団を投与することを含む、
請求項１に記載の哺乳動物細胞または細胞の集団。

【請求項15】

前記使用が、養子細胞移入療法における使用であり、好ましくは、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、芽球性形質細胞様樹状細胞新生物（ＢＰＤＣＮ）、またはＢ－急性リンパ芽球性白血病（Ｂ－ＡＬＬ）などの悪性造血疾患の治療のための、請求項１４に記載の哺乳動物細胞または細胞の集団。

【請求項16】

移植による移植片対宿主病などの最終的な重篤な副作用を回避するために、前記枯渇剤が、前記ＣＤ１１７の第１のアイソフォームを発現する前記細胞または細胞の集団に続いて投与される、請求項１４または１５に記載の哺乳動物細胞または細胞の集団。

【請求項17】

前記第１のアイソフォームを発現する細胞または細胞の集団が、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を有する免疫細胞、好ましくはＴ細胞である、請求項１４～１６のいずれか一項に記載の哺乳動物細胞または細胞の集団。

【請求項18】

請求項１～１７のいずれか一項に記載の哺乳動物細胞または細胞の集団、任意選択で請求項２から１７のいずれか一項に記載の枯渇剤および薬学的に許容され得る担体を含む医薬組成物。

【請求項19】

ＣＤ１１７の第１のアイソフォームを発現する細胞を投与されたことがある患者において重篤な副作用のリスクを防止することまたは低下させることにおいて使用するための枯渇剤であって、前記患者の天然の細胞が、ＣＤ１１７の第２のアイソフォームを発現し、前記枯渇剤は、前記ＣＤ１１７の第１のアイソフォームに特異的に結合し、前記ＣＤ１１７の第２のアイソフォームに結合しないかまたは実質的により弱く結合する少なくとも第２の抗原結合領域を含む、枯渇剤。

【請求項20】

宿主細胞を、それを必要とする患者において選択的に枯渇させることにおいて使用するための枯渇剤であって、前記患者の天然の細胞が、ＣＤ１１７の第２のアイソフォームを発現し、前記枯渇剤が、ＣＤ１１７の前記第２のアイソフォームに特異的に結合する抗原結合領域を少なくとも含み、前記枯渇剤の前記第１の抗原結合領域が、配列番号１の前記アミノ酸Ｅ７３、Ｄ１２１、Ｒ１２２、Ｓ１２３、Ｓ２３９、Ｙ２５９および／またはＳ２６１を含むエピトープに、より好ましくは配列番号１の前記アミノ酸Ｅ７３、Ｓ１２３、Ｋ１２７および／またはＹ２５９を含むエピトープに特異的に結合する、枯渇剤。

【請求項21】

前記抗原結合領域が、
ａ）ＶＨＣＤ１が配列番号１７であり、ＶＨＣＤ２が配列番号１８であり、ＶＨＣＤＲ３が配列番号１９である、前記３つのＣＤＲ、ＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２およびＶＨＣＤＲ３を含む抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）；および
ＶＬＣＤＲ１が配列番号２０であり、ＶＬＣＤＲ２が配列番号２１であり、ＶＬＣＤＲ３が配列番号２２である、前記３つのＣＤＲ、ＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２およびＶＬＣＤＲ３を含む抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、または
ｂ）ＶＨＣＤＲ１が配列番号１７であり、ＶＨＣＤＲ２が配列番号１８であり、ＶＨＣＤＲ３が配列番号１９である、前記３つのＣＤＲ、ＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２およびＶＨＣＤＲ３を含む抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、および
ＶＬＣＤＲ１が配列番号５９であり、ＶＬＣＤＲ２が配列番号２１であり、ＶＬＣＤＲ３が配列番号６０である、前記３つのＣＤＲ、ＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２およびＶＬＣＤＲ３を含む抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、または
ｃ）ＶＨＣＤＲ１が配列番号１７であり、ＶＨＣＤＲ２が配列番号１８であり、ＶＨＣＤＲ３が配列番号１９である、前記３つのＣＤＲ、ＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２およびＶＨＣＤＲ３を含む抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）；および
ＶＬＣＤＲ１が配列番号５９であり、ＶＬＣＤＲ２が配列番号２１であり、ＶＬＣＤＲ３が配列番号６１である、前記３つのＣＤＲ、ＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２およびＶＬＣＤＲ３を含む抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）
を含む、請求項２０に記載の枯渇剤。

【請求項22】

前記抗原結合領域が、
ａ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むもしくはからなる重鎖可変ドメインおよび配列番号１６のアミノ酸配列を含むもしくはからなる軽鎖可変ドメイン、または
ｂ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むもしくはからなる重鎖可変ドメインおよび配列番号６２のアミノ酸配列を含むもしくはからなる軽鎖可変ドメイン、または
ｃ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むもしくはからなる重鎖可変ドメインおよび配列番号６３のアミノ酸配列を含むもしくはからなる軽鎖可変ドメイン
を含む、請求項２１に記載の枯渇剤。

【請求項23】

組み合わせであって、
ａ）ＣＤ１１７のアイソフォームを発現する哺乳動物細胞または細胞の集団であって、前記ＣＤ１１７のアイソフォームが、野生型ＣＤ１１７の位置１２１のアスパラギン酸のリジンへの置換を特徴とする、哺乳動物細胞または細胞の集団、および
ｂ）枯渇剤であって、
ｉ．ＶＨＣＤＲ１が配列番号１７であり、ＶＨＣＤＲ２が配列番号１８であり、ＶＨＣＤＲ３が配列番号１９である、前記３つのＣＤＲ、ＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２およびＶＨＣＤＲ３を含む抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、および
ＶＬＣＤＲ１が配列番号２０であり、ＶＬＣＤＲ２が配列番号２１であり、ＶＬＣＤＲ３が配列番号２２である、前記３つのＣＤＲ、ＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２およびＶＬＣＤＲ３を含む抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、
ｉｉ．ＶＨＣＤＲ１が配列番号１７であり、ＶＨＣＤＲ２が配列番号１８であり、ＶＨＣＤＲ３が配列番号１９である、前記３つのＣＤＲ、ＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２およびＶＨＣＤＲ３を含む抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、および
ＶＬＣＤＲ１が配列番号５９であり、ＶＬＣＤＲ２が配列番号２１であり、ＶＬＣＤＲ３が配列番号６０である、前記３つのＣＤＲ、ＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２およびＶＬＣＤＲ３を含む抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、または
ｉｉｉ．ＶＨＣＤＲ１が配列番号１７であり、ＶＨＣＤＲ２が配列番号１８であり、ＶＨＣＤＲ３が配列番号１９である、前記３つのＣＤＲ、ＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２およびＶＨＣＤＲ３を含む抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、および
ＶＬＣＤＲ１が配列番号５９であり、ＶＬＣＤＲ２が配列番号２１であり、ＶＬＣＤＲ３が配列番号６１である、前記３つのＣＤＲ、ＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２およびＶＬＣＤＲ３を含む抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含み、
それを必要とする患者における医学的治療に使用するためのものである、枯渇剤
の組み合わせ。

【請求項24】

組み合わせであって、
ａ）ＣＤ１１７のアイソフォームを発現する哺乳動物細胞または細胞の集団であって、前記ＣＤ１１７のアイソフォームが、野生型ＣＤ１１７の位置１２３のセリンのリジンへの置換を特徴とする、哺乳動物細胞または細胞の集団、および
ｂ）枯渇剤であって、
ｉ．ＶＨＣＤＲ１が配列番号１７であり、ＶＨＣＤＲ２が配列番号１８であり、ＶＨＣＤＲ３が配列番号１９である、前記３つのＣＤＲ、ＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２およびＶＨＣＤＲ３を含む抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、および
ＶＬＣＤＲ１が配列番号２０であり、ＶＬＣＤＲ２が配列番号２１であり、ＶＬＣＤＲ３が配列番号２２である、前記３つのＣＤＲ、ＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２およびＶＬＣＤＲ３を含む抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、
ｉｉ．ＶＨＣＤＲ１が配列番号１７であり、ＶＨＣＤＲ２が配列番号１８であり、ＶＨＣＤＲ３が配列番号１９である、前記３つのＣＤＲ、ＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２およびＶＨＣＤＲ３を含む抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、および
ＶＬＣＤＲ１が配列番号５９であり、ＶＬＣＤＲ２が配列番号２１であり、ＶＬＣＤＲ３が配列番号６０である、前記３つのＣＤＲ、ＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２およびＶＬＣＤＲ３を含む抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、または
ｉｉｉ．ＶＨＣＤＲ１が配列番号１７であり、ＶＨＣＤＲ２が配列番号１８であり、ＶＨＣＤＲ３が配列番号１９である、前記３つのＣＤＲ、ＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２およびＶＨＣＤＲ３を含む抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、および
ＶＬＣＤＲ１が配列番号５９であり、ＶＬＣＤＲ２が配列番号２１であり、ＶＬＣＤＲ３が配列番号６１である、前記３つのＣＤＲ、ＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２およびＶＬＣＤＲ３を含む抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含み、
それを必要とする患者における医学的治療に使用するためのものである、枯渇剤
の組み合わせ。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

要約
本開示は、治療に使用するための、操作されたまたは天然に存在する突然変異を有するが機能的な表面タンパク質を有する識別可能な表面タンパク質を有する細胞の使用に関する。本発明はまた、識別可能なＣＤ１１７表面タンパク質変異体を有するが、治療、特に養子細胞療法に使用するための機能性表面タンパク質を有する細胞の使用に関する。

【0002】

資金の記載
本願につながるプロジェクトは、欧州連合のＨｏｒｉｚｏｎ２０２０研究およびイノベーションプログラム（認可合意第８１８８０６番）の下で、欧州研究会議（ＥＲＣ）から資金提供を受けている。

【背景技術】

【0003】

細胞ベースの免疫療法は、抗体を含む組換えタンパク質などの生物製剤に基づく小分子療法および治療後の医学の第３の柱として浮上している。細胞療法は、造血性悪性疾患を治療するための腫瘍学で使用することができるが、遺伝性疾患、固形臓器腫瘍および自己免疫疾患の治療などの他の用途も開発中である。しかしながら、細胞療法は、重度の望ましくない副作用に関連し得る。実際、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞を用いたがん免疫療法は、特定の抗原を発現する悪性細胞を標的化し、根絶することに成功しているが、それは正常細胞と悪性細胞とを区別しないことが多く、したがって、正常な造血系の破壊を誘導する。標的療法は、抗体に基づく療法、例えば従来のモノクローナル抗体、多重特異性抗体、例えばＴ細胞エンゲージャー（例えば、ＢｉＴＥ）および細胞療法、例えばＣＡＲ細胞（例えば、ＣＡＲ Ｔ細胞、ＣＡＲ ＮＫ細胞またはＣＡＲマクロファージ）を含み、標的分子を発現するすべての細胞を排除する。しかしながら、ほとんどのがん細胞表面抗原は、正常な造血細胞または他の細胞と共有される。したがって、健常細胞への損傷を回避しながら腫瘍を含む病んだ細胞を殺傷させる標的を同定することは、標的療法の主要な課題である（Ｐｅｒｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ（２０１７）３２：５０６－５１９）。特に、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）または芽球性形質細胞様樹状細胞新生物（ＢＰＤＣＮ）などの骨髄性悪性腫瘍を含む骨髄性疾患では、ＣＤ１１７、ＣＤ３３またはＣＤ１２３などの細胞表面抗原が正常な骨髄前駆細胞と共有される。したがって、ＭＤＳ、ＡＭＬまたはＰＢＤＣＮに対するＣＤ１１７、ＣＤ３３またはＣＤ１２３抗原を標的とする免疫療法は、患者の悪性細胞に加えて正常な造血細胞の枯渇に関連し得る（Ｇｉｌｌ Ｓ．Ｉ．Ｂｅｓｔ ｐｒａｃｔｉｃｅ＆Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ，２０１９）。結果として、ｍＡｂ、Ｔ細胞エンゲージャーまたはＣＡＲ Ｔを含む標的化免疫療法は、一部には真に疾患特異的な表面抗原が存在しないために、ほとんどが困難であった（Ｇｉｌｌ Ｓ．Ｉ．Ｂｅｓｔ ｐｒａｃｔｉｃｅ＆Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ，２０１９）。

【0004】

ＣＤ３３－ＣＡＲ Ｔ細胞移入によって枯渇した正常な造血を再生するために、ＣＤ３３ ＣＡＲ Ｔ細胞耐性造血細胞が、ＣＤ３３遺伝子全体がノックアウトされるように操作されている（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，２０１８．Ｃｅｌｌ．１７３：１４３９－５３）。しかしながら、ＣＤ３３は、その免疫受容体チロシンベース阻害性モチーフ（ＩＴＩＭ）シグナル伝達ドメインを介して骨髄細胞に対して構成的阻害効果を有する。したがって、ＣＤ３３の喪失がどの程度良好に許容され得るかは不明のままである（Ｗｉβｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ．Ｇｌｉａ（２０２１）６９：１３９３－１４１２）。患者に移植されたＣＤ３３ノックアウト（ＣＤ３３ ＫＯ）操作細胞は、長期の機能的欠陥を示す可能性がある（国際公開第２０１８／１６０７６８号、Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．２０１８．Ｃｅｌｌ．１７３：１４３９－５３，Ｂｏｒｏｔ ｅｔ ａｌ．２０１９．ＰＮＡＳ．１１６：１１９７８－８７，Ｈｕｍｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．２０１９．Ｌｅｕｋｅｍｉａ．３３：７６２－８０８）。実際、ＣＤ３３ ＫＯ細胞の頻度は、長期観察が報告された２匹のサルで減少した。これは、例えばＣＤ３３ ＫＯ長期再増殖ＨＳＣ（ＬＴ－ＨＳＣ）の生着の減少による、または競合的不利益による、ＣＤ３３ ＫＯ細胞の機能障害を示し得る（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．２０１８．Ｃｅｌｌ．１７３：１４３９－５３）。さらに、必須の機能を有する細胞表面抗原の数は非常に限られており、前記冗長な細胞表面抗原の喪失は抗原陰性再発を誘発し得る。ＣＤ１９陰性再発が、ＣＤ１９標的化ＣＡＲ Ｔ療法を受けている患者のおよそ３０％において認められる（Ｏｒｌａｎｄｏ ｅｔ ａｌ．２０１８ Ｎａｔ Ｍｅｄ ２４：１５０４－６）。ＣＤ１９およびＣＤ１２３の二重標的化は、抗原喪失の再発を予防することができる（Ｒｕｅｌｌａ ｅｔ ａｌ．２０１６ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １２６：３８１４－２６）。

【0005】

以前の特許出願において、本発明者らは、表面タンパク質変異体における単一アミノ酸の相違を操作して造血細胞に入れて抗原性を変化させ、特異的および選択的抗体によって識別することができることを示した（国際公開第２０１７／１８６７１８号、国際公開第２０１８／０８３０７１号）。ＣＤ３３ ＫＯ細胞とは対照的に、これらの細胞における表面タンパク質変異体は、それらの正常な発現および機能を保持し、重要な非冗長機能を有する表面タンパク質を標的化することを可能にする。

【0006】

ＣＤ１１７（ｃ－ｋｉｔまたは幹細胞因子受容体（ＳＣＲＦ）とも呼ばれる）は、リガンド幹細胞因子（ＳＣＦ）に結合する単一の膜貫通型受容体チロシンキナーゼである。ＳＣＦは、そのチロシンキナーゼ活性を活性化し、ＰＩ３Ｋ－ＡＫＴおよびＭＡＰＫ経路の両方を介してシグナル伝達するＣＤ１１７のホモ二量体化を誘導する（Ｋｉｎｄｂｌｏｍ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ Ｊ．Ｐａｔｈ．１９９８ １５２（５）：１ ２５９）。

【0007】

ＣＤ１１７は、最初に癌遺伝子として発見され、腫瘍学の分野で研究されてきた（例えば、Ｓｔａｎｋｏｖ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｃｕｒｒ Ｐｈａｒｍ Ｄｅｓ．２０：２８４９－８０参照）。ＣＤ１１７は、造血幹細胞および造血前駆細胞（ＨＳＣ）上に高度に発現される。この発現パターンは、ＣＤ１１７を広範囲の疾患にわたってコンディショニングするための潜在的な標的とする（Ｒｕｓｓｋａｍｐ ｅｔ ａｌ．Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．（２０２１）９５：３１－４５；Ｃｚｅｃｈｏｗｉｃｚ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ（２０１９）１０：６１７）。しかしながら、骨髄移植などの移植のための患者のコンディショニングに有効な抗ＣＤ１１７ベースの治療が依然として必要とされている。

【0008】

本開示は、細胞表面に露出され、ａ）ＣＤ１１７の機能が改変されていないか、または少なくとも実質的に改変されていない、すなわち、ＣＤ１１７の変異体がＣＤ１１７の野生型バージョンと機能的に区別できないように、およびｂ）抗体またはＣＡＲ Ｔ細胞などの、ＣＤ１１７の野生型バージョンに結合するが、ＣＤ１１７の改変バージョンへの結合が実質的に減少しているのを示すかまたは全くない、すなわち、ＣＤ１１７の変異体がＣＤ１１７の野生型バージョンと免疫学的に区別できるように、置換され得るＣＤ１１７のアミノ酸残基を同定することを目的とした。任意の所与の標的タンパク質中のほとんどの単一アミノ酸置換は、アミノ酸置換が結合部分のエピトープの一部であるかまたはそれに近い場合にのみ、部分の結合に影響を及ぼす。同様に理解されるように、標的抗原への結合部分の結合に影響を及ぼす多くの単一アミノ酸置換も、標的抗原の機能性に影響を及ぼす。したがって、標的抗原への部分の結合に影響を及ぼし、同時にその機能に影響を及ぼさない、または実質的に影響を及ぼさない両方の要件を満たすアミノ酸置換を同定することは、非常に高度で予測不可能な課題である。

【0009】

いくつかの抗ＣＤ１１７部分は当技術分野で公知であり、そのうちのいくつかは現在開発中である。抗体ＳＲ－１は、最初にハイブリドーマから単離された（国際公開第１９９２０１７５０５号）。ＳＲ－１のヒト化バージョンを作製した（国際公開第２００７１２７３１７号；国際公開第２０２０１１２６８７号）。抗ＣＤ１１７薬物コンジュゲートは、国際公開第２０１６０２０７９１号に記載されている。他の抗ＣＤ１１７抗体は、国際公開第２０１５０５０９５９号および国際公開第２０１９０８４０６４号に記載されている。特定の抗ＣＤ１１７抗体、例えば抗体１０４Ｄ２ Ｄｉａｎｏｖａ（＃１１７ＰＥ－１００Ｔ）も市販されている。これらおよび他の抗ＣＤ１１７部分は、本開示の文脈において使用され得る。国際公開第２０２１０４１９４５号は、塩基編集によって生成されたＣＤ１１７を含む抗原のゲノム変化を開示している。しかしながら、これらの抗原変化は特徴づけられず、特に変異体の生物学的機能は試験されなかった。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0010】

【特許文献1】国際公開第２０１８／１６０７６８号

【特許文献2】国際公開第２０１７／１８６７１８号

【特許文献3】国際公開第２０１８／０８３０７１号

【特許文献4】国際公開第１９９２０１７５０５号

【特許文献5】国際公開第２００７１２７３１７号

【特許文献6】国際公開第２０２０１１２６８７号

【特許文献7】国際公開第２０１６０２０７９１号

【特許文献8】国際公開第２０１５０５０９５９号

【特許文献9】国際公開第２０１９０８４０６４号

【特許文献10】国際公開第２０２１０４１９４５号

【非特許文献】

【0011】

【非特許文献1】Ｐｅｒｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ（２０１７）３２：５０６－５１９

【非特許文献2】Ｇｉｌｌ Ｓ．Ｉ．Ｂｅｓｔ ｐｒａｃｔｉｃｅ＆Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ，２０１９

【非特許文献3】Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．２０１８．Ｃｅｌｌ．１７３：１４３９－５３

【非特許文献4】Ｗｉβｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ．Ｇｌｉａ（２０２１）６９：１３９３－１４１２

【非特許文献5】Ｂｏｒｏｔ ｅｔ ａｌ．２０１９．ＰＮＡＳ．１１６：１１９７８－８７

【非特許文献6】Ｈｕｍｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．２０１９．Ｌｅｕｋｅｍｉａ．３３：７６２－８０８

【非特許文献7】Ｏｒｌａｎｄｏ ｅｔ ａｌ．２０１８ Ｎａｔ Ｍｅｄ ２４：１５０４－６）

【非特許文献8】Ｒｕｅｌｌａ ｅｔ ａｌ．２０１６ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １２６：３８１４－２６

【非特許文献9】Ｋｉｎｄｂｌｏｍ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ Ｊ．Ｐａｔｈ．１９９８ １５２（５）：１ ２５９）

【非特許文献10】Ｓｔａｎｋｏｖ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｃｕｒｒ Ｐｈａｒｍ Ｄｅｓ．２０：２８４９－８０

【非特許文献11】Ｒｕｓｓｋａｍｐ ｅｔ ａｌ．Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．（２０２１）９５：３１－４５；Ｃｚｅｃｈｏｗｉｃｚ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ（２０１９）１０：６１７

【発明の概要】

【0012】

本開示の目的の１つは、悪性腫瘍、特にがん、血液学的悪性腫瘍、骨髄性疾患を治療するためのより安全な方法を開発することである。したがって、本発明者らは、正常な機能を保持または実質的に保持しながら免疫学的に区別可能であり、アミノ酸変化が単一または複数のアミノ酸またはヌクレオチド変異に由来する表面タンパク質ＣＤ１１７の変異を求めた。特に、本発明者らは、ＣＤ１１７の合理的に設計された天然に存在する変異体を同定し、これらの変異が、その正常な発現および機能、特にＳＣＦへの結合、ＳＣＦ依存性増殖および／またはＳＣＦ依存性リン酸化を保持しながら、ＣＤ１１７の抗原性を特定の抗体に変化させることを示した。

【0013】

本開示は、それを必要とする患者における医学的治療に使用するためのＣＤ１１７の第１のアイソフォームを発現する哺乳動物細胞または細胞の集団であって、前記患者がＣＤ１１７の第２のアイソフォームを発現する細胞を有し、前記第１のアイソフォームを発現する前記細胞が、少なくとも１つの多型または遺伝子操作された対立遺伝子を有するゲノムＤＮＡを含み、前記多型または遺伝子操作された対立遺伝子が、ＣＤ１１７の前記第２のアイソフォームを発現する細胞を有する前記患者の前記ゲノムに存在せず、前記第１および第２のアイソフォームが機能的である、使用のための哺乳動物細胞または細胞の集団。あるいは、前記第１のアイソフォームはＲＮＡ編集を介して生成される。

【0014】

特定の実施形態において、本開示は、それを必要とする患者における医学的治療に使用するための哺乳動物細胞または細胞の集団、好ましくは造血幹細胞に関し、前記医学的治療は、それを必要とする前記患者に前記ＣＤ１１７の第１のアイソフォームを発現する治療有効量の前記細胞または細胞の集団を、前記ＣＤ１１７の第２のアイソフォームに特異的に結合する少なくとも第１の抗原結合領域を含む治療有効量の枯渇剤と併用して投与して、前記ＣＤ１１７の第２のアイソフォームを発現する患者の細胞を特異的に枯渇させ、好ましくは造血疾患、好ましくは急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、芽球性形質細胞様樹状細胞新生物（ＢＰＤＣＮ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、Ｂ－急性リンパ芽球性白血病（Ｂ－ＡＬＬ）、または肥満細胞症などの悪性造血疾患の治療における免疫療法後に正常な造血を回復させることを含む。

【0015】

他の実施形態では、医学的治療は、重症複合免疫不全症候群（ＳＣＩＤ）、鎌状赤血球症（ＳＣＤ）、ベータサラセミア、ファンコーニ貧血またはダイアモンド－ブラックファン貧血などの造血または免疫系の遺伝性疾患における造血機能または免疫機能の回復に関する。

【0016】

他の実施形態では、医学的治療は、造血系および免疫系に由来しないが、改変された造血細胞の使用によって治療することができる遺伝病における正常な機能の回復に関する。

【0017】

他の実施形態では、医学的治療は、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、全身性硬化症（ＳＳｃ）または多発性硬化症（ＭＳ）などの自己免疫疾患における正常な免疫機能の回復に関する。

【0018】

別の特定の実施形態において、本開示は、それを必要とする患者における医学的治療においての使用のための哺乳動物細胞または細胞の集団に関し、前記医学的治療が、第１のアイソフォームを発現する移入された細胞を特異的に枯渇させるために、好ましくは養子細胞移入療法における使用のために、より好ましくは悪性造血疾患、例えば急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、芽球性形質細胞様樹状細胞新生物（ＢＰＤＣＮ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、Ｂ－急性リンパ芽球性白血病（Ｂ－ＡＬＬ）または全身性肥満細胞症の治療のために、前記第１のアイソフォームと特異的に結合する少なくとも第２の抗原結合領域を含む治療有効量の枯渇剤と併用して、それを必要とする前記患者に前記第１のアイソフォームを発現する前記細胞または細胞の集団の治療有効量を投与することであって、再度、より好ましくは、前記枯渇剤は、移植による移植片対宿主病などの最終的な重篤な副作用を回避するために、表面タンパク質の前記第１のアイソフォームを発現する前記細胞または細胞の集団に続いて投与される、投与されることを含む。

【0019】

別の態様では、本開示は、哺乳動物細胞、好ましくは造血幹細胞または免疫細胞、例えば上記のＴ細胞、および好ましくは枯渇剤、および薬学的に許容され得る担体を含む医薬組成物に関する。

【0020】

本開示は、ＣＤ１１７の第１のアイソフォームを発現する細胞を投与されたことがある患者において重篤な副作用のリスクを防止することまたは低下させることにおいて使用するための枯渇剤であって、前記患者の天然の細胞が、ＣＤ１１７の第２のアイソフォームを発現し、前記枯渇剤は、前記ＣＤ１１７の第１のアイソフォームに特異的に結合し、前記ＣＤ１１７の第２のアイソフォームに結合しない少なくとも第２の抗原結合領域を含む枯渇剤に関する。特定の実施形態において、前記枯渇剤は、ＣＤ１１７の前記第２のアイソフォームに対して実質的により弱く結合する。

【0021】

本開示はまた、ＣＤ１１７の第１のアイソフォームを発現する細胞を投与されたことがある患者において重篤な副作用のリスクを防止することまたは低下させることにおいて使用するための枯渇剤であって、前記患者の天然の細胞が、ＣＤ１１７の第２のアイソフォームを発現し、前記枯渇剤は、前記ＣＤ１１７の第１のアイソフォームに特異的に結合し、前記ＣＤ１１７の第２のアイソフォームに結合しない、少なくとも第２の抗原結合領域を含み、前記第１および第２のアイソフォームは実質的に機能的に同一である、枯渇剤に関する。特定の実施形態において、前記枯渇剤は、ＣＤ１１７の前記第２のアイソフォームに対して実質的により弱く結合する。

【0022】

本開示はまた、ＣＤ１１７の第１のアイソフォームを発現する細胞を投与されたことがある患者において重篤な副作用のリスクを防止することまたは低下させることにおいて使用するための枯渇剤であって、前記患者の天然の細胞が、ＣＤ１１７の第２のアイソフォームを発現し、前記枯渇剤は、前記ＣＤ１１７の第１のアイソフォームに特異的に結合し、前記ＣＤ１１７の第２のアイソフォームに結合しない、少なくとも第２の抗原結合領域を含み、前記第１および第２のアイソフォームはＳＣＦに結合し、ＳＣＦ依存性増殖をもたらし、および／またはＳＣＦ依存性リン酸化をもたらす、枯渇剤に関する。特定の実施形態において、前記枯渇剤は、ＣＤ１１７の前記第２のアイソフォームに対して実質的により弱く結合する。

【0023】

本開示はまた、ＣＤ１１７の第１のアイソフォームを発現する細胞を投与された患者において重篤な副作用のリスクを予防または低減するのに使用するための枯渇剤であって、前記患者の天然の細胞はＣＤ１１７の第２のアイソフォームを発現し、前記枯渇剤は、ＣＤ１１７の前記第１のアイソフォームに特異的に結合し、ＣＤ１１７の前記第２のアイソフォームに結合しない少なくとも第２抗原結合領域を含み、前記多型または遺伝子操作された対立遺伝子は、配列番号１の位置Ｅ７３、Ｔ７４、Ｖ１２０、Ｄ１２１、Ｒ１２２、Ｓ１２３、Ｙ１２５、Ｋ１２７、Ｋ１９３、Ｉ２０１、Ｋ２０３、Ｓ２３９、Ｙ２５９、Ｎ２６０、Ｓ２６１、Ｄ２６６、Ｙ２６９またはＲ２７１におけるアミノ酸の少なくとも１つの置換、より好ましくは、配列番号１の位置Ｅ７３、Ｖ１２０、Ｄ１２１、Ｒ１２２、Ｓ１２３、Ｋ１２７、Ｋ１９３、Ｓ２３９、Ｙ２５９またはＳ２６１におけるアミノ酸の少なくとも１つの置換、より好ましくは、配列番号１の位置Ｅ７３、Ｄ１２１、Ｒ１２２、Ｓ１２３、Ｓ２３９、Ｙ２５９またはＳ２６１におけるアミノ酸の少なくとも１つの置換、最も好ましくは、配列番号１の位置Ｅ７３、Ｄ１２１またはＳ１２３におけるアミノ酸の少なくとも１つの置換により特徴づけられる枯渇剤に関する。特定の実施形態において、前記枯渇剤は、ＣＤ１１７の前記第２のアイソフォームに対して実質的により弱く結合する。

【0024】

本開示はまた、ＣＤ１１７の第１のアイソフォームを発現する細胞を投与された患者において重篤な副作用のリスクを予防または低減するのに使用するための枯渇剤であって、前記患者の天然の細胞がＣＤ１１７の第２のアイソフォームを発現し、前記枯渇剤が、前記ＣＤ１１７の第１のアイソフォームに特異的に結合し、ＣＤ１１７の前記第２のアイソフォームに結合しない少なくとも第２の抗原結合領域を含み、アミノ酸残基Ｅ７３が、Ｋ、Ｌ、Ｑ、Ｇ、Ａ、Ｙ、Ｒ、Ｆ、Ｉ、Ｍ、ＰおよびＷからなる群、好ましくはＫ、Ｌ、Ｑ、Ｇ、Ａ、ＹおよびＲからなる群から選択され、より好ましくはＫ、Ｙ、Ｒから選択されるアミノ酸で置換されているか、または残基Ｅ７３が欠失しており、および／または残基Ｄ１２１は、Ｓ、Ｖ、Ｙ、Ｈ、Ｋ、ＲまたはＴ、より好ましくはＹ、Ｈ、Ｋ、ＲまたはＴ、最も好ましくはＨまたはＫで置換され、および／または残基Ｓ１２３は、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｐ、Ｆ、Ｙ、Ｍ、Ｄ、Ｅ、ＫまたはＲ、より好ましくはＰ、ＦまたはＫ、最も好ましくはＫで置換され、および／または残基Ｓ２３９は、ＨおよびＫからなる群から選択されるアミノ酸で置換され、および／または残基Ｙ２５９は、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｐ、ＣおよびＨからなる群から選択されるアミノ酸、好ましくはＰ、ＡまたはＧ、最も好ましくはＡで置換され、および／または残基Ｋ１９３は、Ｇ、Ｔ、Ｍ、ＤおよびＥからなる群から選択されるアミノ酸で置換される、枯渇剤に関する。特定の実施形態において、前記枯渇剤は、ＣＤ１１７の前記第２のアイソフォームに対して実質的により弱く結合する。

【0025】

本開示はまた、造血幹細胞移植の生着を改善するための方法に関する。造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）の前のコンディショニング（ＨＳＣの枯渇）は、生着を促進するために使用される。実際、コンディショニング効果は、生着の改善に関連する。骨髄破壊的（毒性）前処置の１つの欠点は、キメラ現象のレベルの増加をもたらし得ることである。毒性コンディショニングを回避することは、本開示で達成することができる重要な目標である。コンディショニングのための現在の方法は、静脈内ブスルファンの使用を含む。ブスルファンは、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）などの血液疾患を治療するために最初に設計されたＤＮＡアルキル化薬である。しかしながら、ブスルファンは、無菌性、原発性または二次性悪性腫瘍、ならびにさらなる急性および慢性毒性を含む有意な副作用のリスクを有する。

【0026】

本開示はまた、ＣＤ１１７またはＣＤ１１７の変異体への結合について抗原結合領域と競合する抗ＣＤ１１７剤に関し、前記抗ＣＤ１１７剤は、以下を含む：
ａ）ＶＨＣＤＲ１が配列番号１７であり、ＶＨＣＤＲ２が配列番号１８であり、ＶＨＣＤＲ３が配列番号１９である、３つのＣＤＲ、ＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２、およびＶＨＣＤＲ３を含む抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、および
ｂ）３つのＣＤＲ ＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２、およびＶＬＣＤＲ３を含む抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）であって、ＶＬＣＤＲ１は配列番号２０、ＶＬＣＤＲ２は配列番号２１、およびＶＬＣＤＲ３は配列番号２２である、抗体軽鎖可変ドメイン。特定の実施形態において、前記抗原結合領域は、以下の変異を含む：
ａ）ＶＬＣＤＲ１領域（配列番号２０）のアスパラギンがグルタミン酸に置換されており、
ｂ）ＶＬＣＤＲ３領域（配列番号２２）のアスパラギン酸がグルタミン酸に置換されており、任意選択で、
ｃ）ＶＬＣＤＲ３領域（配列番号２２）の第２のアスパラギンがリジンに置換されている。好ましくは、前記抗ＣＤ１１７剤は、ＣＤ１１７のＥ７３Ｋ変異体に結合しない。また好ましくは、前記抗ＣＤ１１７剤は、ＣＤ１１７のＤ１２１Ｋ変異体に結合しない。また好ましくは、前記抗ＣＤ１１７剤はＣＤ１１７のＳ１２３Ｋ変異体に結合しない。

【0027】

本開示はまた、ＣＤ１１７またはＣＤ１１７の変異体への結合について抗原結合領域と競合する抗ＣＤ１１７剤に関し、前記抗ＣＤ１１７剤は、以下を含む：
ａ）ＶＨＣＤＲ１が配列番号２５であり、ＶＨＣＤＲ２が配列番号２６であり、ＶＨＣＤＲ３が配列番号２７である、３つのＣＤＲ、ＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２、およびＶＨＣＤＲ３を含む抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、および
ｂ）３つのＣＤＲ ＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２、およびＶＬＣＤＲ３を含む抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）であって、ＶＬＣＤＲ１は配列番号２８、ＶＬＣＤＲ２は配列番号２９、およびＶＬＣＤＲ３は配列番号３０である、抗体軽鎖可変ドメイン。

【0028】

本開示はまた、ＣＤ１１７またはＣＤ１１７の変異体への結合について抗原結合領域と競合する抗ＣＤ１１７剤に関し、前記抗ＣＤ１１７剤は、以下を含む：
ａ）ＶＨＣＤＲ１が配列番号３３であり、ＶＨＣＤＲ２が配列番号３４であり、ＶＨＣＤＲ３が配列番号３５である、３つのＣＤＲ、ＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２、およびＶＨＣＤＲ３を含む抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、および
ｂ）３つのＣＤＲ ＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２、およびＶＬＣＤＲ３を含む抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）であって、ＶＬＣＤＲ１は配列番号３６、ＶＬＣＤＲ２は配列番号３７、およびＶＬＣＤＲ３は配列番号３８である、抗体軽鎖可変ドメイン。

【図面の簡単な説明】

【0029】

【図1】ヒト野生型ＣＤ１１７または空ベクターでトランスフェクトしたＨＥＫ－２９３Ｔ細胞への抗ＣＤ１１７抗体の結合を示す。各抗体の連続希釈物を、フローサイトメトリーによって免疫反応性について試験した。Ｍａｂフォーマットの６つすべての抗体は、濃度依存的様式でヒトＣＤ１１７に結合する。ＣＤ１１７陰性ＨＥＫ－２９３Ｔ細胞（空のベクターでトランスフェクトした）は、抗体結合を何ら示さなかった。

【図2】ヒト野生型ＣＤ１１７または空ベクターでトランスフェクトしたＨＥＫ－２９３Ｔ細胞への抗ＣＤ１１７ Ｆａｂ断片の結合を示す。完全長抗体と同様に、Ｆａｂ断片も濃度依存的様式でヒトＣＤ１１７に結合する。ＣＤ１１７陰性ＨＥＫ－２９３Ｔ細胞（空のベクターでトランスフェクトした）は、抗体結合を何ら示さなかった。

【図3】試験した６つの抗体のそれぞれについてのヒトＣＤ１１７細胞外ドメインに対するアラニンスキャンの結果を示す。各変異ＣＤ１１７クローンについて、フローサイトメトリーによって決定された平均結合値を発現の関数としてプロットした。抗体結合に重要であると同定されたクローンを灰色の丸で示す。二次クローン、すなわち最初に設定された閾値を満たさなかったが、結合活性の低下および重要な残基への近接性が、変異残基が抗体エピトープの一部であり得ることを示唆したクローンが白丸で示されている。

【図4】選出された組換え精製ＣＤ１１７変異体の凝集挙動を示す。線は、野生型ＣＤ１１７組換え精製タンパク質の単量体含有量を示す。モノマー含有量は、分取サイズ排除クロマトグラムから推定した。ほとんどの変異体の単量体含有量は許容可能であった。ＮＤは「ｎｏｎ－ｄｅｔｅｒｍｉｎａｂｌｅ」の略である。

【図5】選出された組換え精製ＣＤ１１７変異体について得られた産生収率を示す。線は、野生型ＣＤ１１７の収量を示す。ごく少数の変異体を除くすべての変異体の生産収率は十分に高かった。

【図6】選出された組換え精製ＣＤ１１７変異体について測定されたｔ１／２融解温度を示す。線は、野生型ＣＤ１１７の融解温度を示す。１つの変異体、Ｖ１２０Ｐについて、２つの融点を測定した。

【図7】ＷＴとの会合終了時のｎｍシフトを比較することによる、選択されたヒトＣＤ１１７の組換え精製変異体に対する抗体Ｒｅｆｍａｂ＃１の結合を示す。

【図8】選択されたヒトＣＤ１１７の組換え精製変異体に対する抗体Ｒｅｆｍａｂ＃１の結合親和性を示す。パネルＡ：Ｒｅｆｍａｂ＃１に対するすべての変異体のＫＤを決定した。黒丸は、２つの個々の測定から決定された測定ＫＤを示し、白丸は、０．１ｎｍ未満のｎｍシフトまたはシフトが観察されず、２μＭより高い結合親和性を示す。エラーバーは標準偏差を示す。パネルＢ：会合終了時（６００秒）のｎｍシフトを、使用した抗原濃度に対してプロットし、これは２０００～５ｎＭの範囲である。変異体Ｄ１２１Ｋ、Ｓ１２３ＫおよびＳ１２３Ｅは、２０００ｎＭまでいずれの結合も示さない。エラーバーは、２つの個々の測定値の標準偏差を示す。

【図9】ＳＣＦに対する選択されたヒトＣＤ１１７の組換え精製変異体の結合を示す。ＳＣＦの野生型ヒトＣＤ１１７（ＳＣＦに対する結合部位を有するドメイン１、２および３を有する構築物ＣＤ１１７ Ｄ１－２－３を用いて測定）への結合のＫＤの増加が示されている。「決定不能」は、結合が観察されたがＫＤを決定することができなかったことを意味し、「結合なし」は、観察された結合がないことを表す。

【図10】ヒトＣＤ１１７の組換え精製選出変異体のＳＣＦへの結合を示す。ＳＣＦの野生型ヒトＣＤ１１７（ＳＣＦに対する結合部位を有するドメイン１、２および３を有する構築物ＣＤ１１７ Ｄ１－２－３を用いて測定）への結合のＫＤの増加が示されている。結合を、７つの濃度のＣＤ１１７変異体を使用することによって分析した。エラーバーは、２つの個々の測定値からの標準偏差を示す。１未満のＫＤ増加は、ＣＤ１１７ ＷＴと比較した変異体のより強いＳＣＦ結合に対応し、１を超えるＫＤ増加は、ＣＤ１１７ ＷＴと比較した変異体のより弱いＳＣＦ結合に対応する。

【図11】野生型ＴＦ－１細胞、ならびにＣＤ１１７のＥ７３Ｋノックインを保有する細胞が、１００ｎｇ／ｍｌのＳＣＦで刺激されると増殖することを実証する。Ｒｅｆｍａｂ＃１の濃度が増加すると、野生型細胞では増殖が減少するが、Ｅ７３Ｋ細胞では減少しない。２つの独立したノックイン実験から「ＫＩ１」および「ＫＩ２」と命名されたノックイン細胞を得て、続いてＦＡＣＳ選別して純粋なＥ７３Ｋノックイン集団を得た。

【図12】ＳＣＦ誘導性リン酸化が、野生型ＣＤ１１７ ＴＦ－１細胞において抗体（Ｒｅｆｍａｂ＃１）によって阻止され得るのに対して、ＳＣＦ誘導性リン酸化は、ＣＤ１１７ ＴＦ－１細胞のＥ７３Ｋ変異体において同じ抗体によって影響されないことを実証する。ＣＤ１１７ノックアウト（ｋｏ）ＴＦ－１細胞は、ＳＣＦ誘導性ＣＤ１１７リン酸化を示さない。

【図13】位置Ｅ７３に対する試験されたｃｒＲＮＡの結合を示すマップを示す。

【図14】位置１２０～１２３に対する試験されたｃｒＲＮＡの結合を示すマップを示す。

【図15】ヒトＣＤ１１７の選択された組換え精製変異体に対する抗体Ｒｅｆｍａｂ＃２およびＲｅｆｍａｂ＃３の結合の定性的分析を示す。「決定不能」は、結合が観察されたが、二相性挙動のためにＫＤを定量できなかったことを意味する。

【図16】ＲｅｆＭａｂ＃１が野生型ＴＦ－１細胞の増殖に対して顕著な阻害効果を有したが、試験したすべてのＣＤ１１７変異体のノックインを有するＴＦ－１細胞の増殖はＲｅｆＭａｂ＃１によって影響されなかったことを示す。

【図17】Ｒｅｆｍａｂ＃１の結合が、ＣＤ１１７変異体Ｅ７３Ｋ、Ｅ７３Ｙ、Ｄ１２１ＫおよびＳ１２３Ｋを発現するＴＦ－１細胞において完全に消失し、一方、ｗｔ ＣＤ１１７を発現する野生型ＴＦ－１細胞が結合していることを示す。

【図18】野生型ＴＦ－１細胞およびＣＤ１１７の変異体であるＥ７３Ｋの２つの独立して作製されたノックイン集団のＴｙｒ７１９の位置におけるＣＤ１１７のＳＣＦ依存性リン酸化を示す。ＣＤ１１７のＤ１２１ＫおよびＳ１２３Ｋ変異体は同様に挙動した（データは示さず）。

【図19】野生型ＴＦ－１細胞におけるＳＣＦ依存性ＣＤ１１７リン酸化が、抗体Ｒｅｆｍａｂ＃１－Ｅｒｎｉｅ（「Ｅｒｎｉｅ」と呼ばれる）およびＲｅｆｍａｂ＃１－Ｂｅｒｔ（「Ｂｅｒｔ」と呼ばれる）によって阻止されるのに対して、ＣＤ１１７リン酸化のＤ１２１ＫおよびＳ１２３Ｋ変異体を有するＴＦ－１細胞では影響を受けないことを示す。同じことが変異体Ｅ７３Ｋ、Ｅ７３ＹおよびＳ１２３Ｆについても観察される（データは示さず）。

【図20】抗体Ｒｅｆｍａｂ＃１－Ｂｅｒｔが、インビボでＣＤ３４＋ヒト化マウスから未編集の野生型ヒトＨＳＰＣを効果的に枯渇させることを示す。

【図21】アイソタイプ対照抗体が未編集の野生型ＣＤ１１７＋骨髄細胞もＥ７３Ｋ編集細胞もインビボで枯渇させないのに対して、抗体Ｒｅｆｍａｂ＃１－Ｂｅｒｔは未編集の野生型ＣＤ１１７＋骨髄細胞を枯渇させ、一方、抗体Ｒｅｆｍａｂ＃１－ＢｅｒｔはＥ７３Ｋ変異体ＣＤ１１７＋骨髄細胞を残すことを示す。アイソタイプ対照抗体の存在下では、ＣＤ３４＋ヒトＥ７３Ｋ変異体ＣＤ１１７細胞は、本質的に、ならびに未編集細胞ＣＤ３４＋ヒト細胞と同様に、免疫不全マウスにおいて生着する。

【図22】ＣＤ１１７のＤ１２１ＫまたはＳ１２３Ｋ変異体でトランスフェクトしたＤＦ－１細胞ではなく、野生型ＤＦ－１細胞が、試験したＡＤＣ（Ｒｅｆｍａｂ＃１－Ｅｒｎｉｅ－ｔｅｓｅｒｉｎｅ（Ａ）およびＲｅｆｍａｂ＃１－Ｂｅｒｔ－ｔｅｓｅｒｉｎｅ（Ｂ））によって枯渇していることを示す。Ｄ１２１Ｋ Ａ５およびＤ１２１Ｋ Ａ６は、同じ変異体に対するプラスミドの２つの異なるバッチを示す。

【図23】抗体Ｒｅｆｍａｂ＃１－Ｂｅｒｔを受けたマウスにおける未編集のＣＤ３４＋前駆細胞（生／ｈＣＤ４５＋／ＣＤ３４＋／ＣＤ３８－としてゲーティング）の枯渇を、アイソタイプ対照抗体を受けたマウスと比較して示す。対照的に、Ｒｅｆｍａｂ＃１－Ｂｅｒｔの注射は、アイソタイプ対照抗体を受けた動物と比較して、Ｅ７３Ｋ、Ｄ１２１ＫおよびＳ１２３Ｋ編集変異体細胞の濃縮をもたらした。ＣＤ１１７特異的抗体クローン１０４Ｄ２およびＳＲ－１で染色することによって、編集されていない細胞および編集された細胞を同定した。細胞を未編集（１０４Ｄ２＋およびＳＲ－１＋）または編集（１０４Ｄ２＋だがＳＲ－１－）として分類した。

【発明を実施するための形態】

【0030】

免疫療法は、がん、遺伝性および自己免疫疾患を治療するための有望な治療法である。腫瘍抗原を対象として抗体または操作された免疫細胞などの免疫枯渇剤は、腫瘍細胞を標的化して殺傷させるために患者に投与される。しかしながら、腫瘍表面タンパク質はまた造血細胞を含む正常細胞の表面で発現されるので、この戦略は、例えば造血を変化させることによって患者に重篤な副作用を誘発することができる。患者における造血を回復させるために、造血細胞をその後に患者に移植することができる。しかしながら、病んだ細胞だけでなく、新たに移植された健常な細胞への枯渇剤の結合は、最大耐量を制限し得るか、または健常な細胞の移植前の治療への使用を制限し得る。あるいは、移植された細胞が、前記免疫枯渇剤によって標的化され、排除されないように、前記免疫枯渇剤に対して耐性である必要がある。本発明者らのアプローチは、そのため、患者における正常な造血を回復させるためのそれらの機能を保持しながら、免疫療法において使用される前記免疫枯渇剤に対して耐性の細胞を選択するものである。

【0031】

本発明者らは、特定の枯渇剤の結合に関与する表面タンパク質領域をコードする遺伝子配列の機能的対立遺伝子変異体を同定する方法を開発する。そのような変異体は、天然に存在する多型および／または設計および操作された変異体であり得る。表面タンパク質の異なるアイソフォームを選択または生成することができる。前記多型の核酸によってコードされる表面タンパク質の前記第１のアイソフォームは、特定の枯渇剤によって認識されない。この変異対立遺伝子は、特に表面タンパク質の機能を変化させないか、または実質的に変化させない。したがって、前記枯渇剤を使用して、一方のアイソフォームに特異的に結合し、他方のアイソフォームには結合しないか、または実質的に結合しないことにより、１つのアイソフォームを発現する細胞を特異的に枯渇させることができる。例えば、枯渇剤が第１のアイソフォームではなく第２のアイソフォームに特異的に結合する場合、前記枯渇剤は、前記第２のアイソフォームを発現する細胞を特異的に枯渇させる。別の実施形態では、前記第１のアイソフォームは、第２の薬剤によって認識され得、したがって、この第２の薬剤は、第２のアイソフォームではなく、第１のアイソフォームを発現する細胞を特異的に枯渇させるために使用され得る。少なくとも１つの変異対立遺伝子によってコードされる表面タンパク質の第１のアイソフォームを発現する細胞は、第２のアイソフォームを発現する細胞を有する患者における医学的治療において、特に、それぞれ第２または第１の薬剤を使用することによって、特異的に移植された細胞または患者の細胞を枯渇させるために有利に使用される。

【0032】

高度なインシリコ分析がなければ、そのようなアプローチにおいて表面抗原のどの変異が使用され得るかを予測することは不可能である。第１に、変異は、枯渇剤にとってアクセス可能な表面抗原の表面露出ストレッチに存在する必要がある。第２に、枯渇剤は、表面抗原の露出領域上のこのストレッチに結合する必要がある。第３に、枯渇剤が第１のアイソフォームを第２のアイソフォームと区別することができるように、結合が十分に影響される必要がある。他のアイソフォームへの残留結合は最小限であるか、またはより良好には完全に存在しないべきである。第４に、突然変異は、表面抗原の機能に影響を及ぼさないか、またはわずかに影響を及ぼすだけであるべきである。変異アイソフォームは、少なくとも所与の治療状況で許容される程度までその生物学的機能を果たすべきである。インシリコ法は最適候補の同定および優先順位付けを支援することができるが、任意の所与の突然変異の有用性を検証するために実験的試験が必要である。

【0033】

枯渇剤
本開示は、細胞上のＣＤ１１７の１つのアイソフォームに特異的に結合し、ＣＤ１１７の別のアイソフォームには結合しない、または実質的により弱く結合する抗原結合領域を含む薬剤に関する。そのような薬剤は、本明細書では「枯渇剤」と呼ばれる。ＣＤ１１７の両方のアイソフォームは機能的であり、すなわち、ＣＤ１１７は少なくとも１つの関連する特性に関して機能的である。好ましくは、ＣＤ１１７の両方のアイソフォームは、同じ機能を有する、すなわち、機能的に区別できない。

【0034】

しかしながら、ＣＤ１１７の２つのアイソフォームは、枯渇剤への結合に関して異なる。枯渇剤は、ＣＤ１１７のアイソフォームの１つにのみ特異的に結合する。したがって、アイソフォームは、機能的に同一（または機能的に実質的に同一）であるが、免疫学的に区別可能であると記載することができる。

【0035】

ＣＤ１１７の第１のアイソフォームおよび第２のアイソフォームは、多型対立遺伝子であり得る。好ましくは、ＣＤ１１７の第１のアイソフォームおよび第２のアイソフォームは、天然に存在する多型対立遺伝子である。また好ましくは、ＣＤ１１７の第１のアイソフォームおよび第２のアイソフォームは、一塩基多型（ＳＮＰ）対立遺伝子である。

【0036】

ＣＤ１１７の第１のアイソフォームおよび第２のアイソフォームはまた、遺伝子操作された対立遺伝子であり得る。好ましくは、ＣＤ１１７の第１のアイソフォームおよび第２のアイソフォームは、１、２、３、４または５アミノ酸異なる。最も好ましくは、ＣＤ１１７の第１のアイソフォームおよび第２のアイソフォームは、１つのアミノ酸が異なる。

【0037】

第２のアイソフォームを生成するためにＣＤ１１７に導入される突然変異を判定するために、様々な方法を使用することができる。例えば、突然変異を表面タンパク質にランダムに挿入し、続いて生成された変異体の機能的および免疫学的スクリーニングを行うことができる。あるいは、突然変異は、例えばＣＤ１１７の二次または三次タンパク質の構造の分析によって合理的に設計することができる。

【0038】

枯渇剤は、細胞上のＣＤ１１７の１つのアイソフォームに特異的に結合し、別のアイソフォームには結合しないか、または実質的により弱く結合する抗原結合領域を含む。本開示の枯渇剤は、２つの主要なカテゴリーに分けることができる。

【0039】

第１に、枯渇剤は、抗原結合領域を含むポリペプチドであり得る。前記ポリペプチドは、１つ以上のポリペプチド鎖からなり得る。好ましくは、抗原結合領域を含む前記ポリペプチドは抗体である。抗原結合領域を含む前記ポリペプチドはまた、抗体断片、抗体薬物コンジュゲート、または抗体もしくは足場の別の変異体であり得る。例示的な抗体断片および足場には、単一ドメイン抗体、マキシボディ、ミニボディ、イントラボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ｖ－ＮＡＲ、ビス－ｓｃＦｖ、ラクダ抗体、アンキリン、センチリン、ドメイン抗体、リポカリン、小型モジュール免疫医薬品、マキシボディ、プロテインＡおよびアフィリンが含まれる。

【0040】

抗原結合領域を含む前記ポリペプチドは、二重特異性、バイスペシフィックまたは多重特異性抗体であってもよい。そのような分子はまた、さらなる機能的ドメインを含有し得る。例えば、抗原結合領域を含む前記ポリペプチドは、Ｔ細胞エンゲージャー、例えばＢｉＴＥであり得る。抗原結合領域を含む前記ポリペプチドはまた、サイトカインもしくはケモカイン、毒素または細胞表面受容体の細胞外ドメインに融合され得る。

【0041】

あるいは、枯渇剤は、抗原結合領域を含む細胞であり得る。例えば、枯渇剤はキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であり得る。本開示の特定の実施形態では、抗原結合領域を含む前記細胞は、ＣＡＲ Ｔ細胞、ＣＡＲ ＮＫ細胞またはＣＡＲマクロファージである。本開示の好ましい実施形態では、抗原結合領域を含む前記細胞はＣＡＲ Ｔ細胞である。本開示の別の好ましい実施形態では、抗原結合領域を含む前記細胞は、ＣＡＲを含む初代Ｔ細胞である。

【0042】

枯渇剤は、ＣＤ１１７の１つのアイソフォームに特異的に結合するが、第２のアイソフォームには結合せず、したがって、１つのアイソフォームを発現する細胞を特異的に枯渇させる。

【0043】

特定の実施形態では、本開示は、ＣＤ１１７の第２のアイソフォームに特異的に結合し、第１のアイソフォームに結合しない第１の抗原結合領域を含む薬剤に関する。他の実施形態では、本開示はまた、ＣＤ１１７の第１のアイソフォームに特異的に結合し、第２のアイソフォームに結合しない第２の抗原結合領域を含む薬剤に関する。特定の実施形態において、前記薬剤は、前記ＣＤ１１７の第２のアイソフォームに対して実質的により弱く結合する。

【0044】

ＣＤ１１７の第１および第２のアイソフォームは、１つのアミノ酸置換のみが互いに異なり得る。第１のアイソフォームと第２のアイソフォームとの間の前記１つのアミノ酸の相違はまた、天然に存在する一塩基多型などの一塩基多型が存在することの結果であり得る。ＣＤ１１７の第１および第２のアイソフォームはまた、１個より多いアミノ酸、例えば２個、３個、または３個より多いアミノ酸が互いに異なっていてもよい。ＣＤ１１７の第１および第２のアイソフォームはまた、アイソフォームの一方が他方のアイソフォームと比較して１個、２個、３個または３個を超えるアミノ酸の挿入を有するという点で互いに異なり得る。ＣＤ１１７の第１および第２のアイソフォームはまた、アイソフォームの一方が他方のアイソフォームと比較して１個、２個、３個または３個を超えるアミノ酸の欠失を有するという点で互いに異なり得る。２つのアイソフォームはまた、アミノ酸の置換、挿入および／または欠失の組み合わせによって互いに異なっていてもよい。好ましい実施形態では、前記枯渇剤は抗体または抗原結合断片である。ＣＤ１１７の２つのアイソフォームが２つ以上のアミノ酸だけ異なる場合、変化したアミノ酸は互いに隣接していてもよく、すなわち直接隣接するアミノ酸であってもよく、またはそれらは分離されていてもよい。

【0045】

本明細書で使用される「抗体」という用語は、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分、すなわち抗原に免疫特異的に結合する抗原結合部位を含む分子を指す。したがって、抗体という用語は、抗体分子全体だけでなく、抗体断片ならびに抗体の変異体（誘導体を含む）も包含する。

【0046】

げっ歯類および霊長類の天然の抗体では、２本の重鎖がジスルフィド結合によって互いに連結されており、各重鎖はジスルフィド結合によって軽鎖に連結されている。ラムダ（λ）とカッパ（κ）という２種類の軽鎖が存在する。ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＥという、抗体分子の機能活性を決定する５つの主要な重鎖クラス（またはアイソタイプ）がある。各鎖は、異なる配列ドメインを含む。典型的なＩｇＧ抗体では、軽鎖は２つのドメイン、可変ドメイン（ＶＬ）および定常ドメイン（ＣＬ）を含む。重鎖は、４つのドメイン、可変ドメイン（ＶＨ）および３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３、総合的にＣＨと呼ばれる）を含む。軽鎖可変領域（ＶＬ）および重鎖可変領域（ＶＨ）の両方が、抗原に対する結合認識および特異性を決定する。軽鎖定常領域ドメイン（ＣＬ）および重鎖定常領域ドメイン（ＣＨ）は、抗体鎖会合、分泌、経胎盤移動性、補体結合、およびＦｃ受容体（ＦｃＲ）への結合などの重要な生物学的特性を付与する。

【0047】

Ｆｖ断片は、免疫グロブリンのＦａｂ断片のＮ末端部分であり、１つの軽鎖および１つの重鎖可変領域からなる。抗体の特異性は、抗体結合部位と抗原決定基との間の構造的相補性にある。抗体結合部位は、主に超可変または相補性決定領域（ＣＤＲ）に由来する残基で構成される。時折、非超可変領域またはフレームワーク領域（ＦＲ）由来の残基は、抗体結合部位に関与し得るか、またはドメイン構造全体、したがって結合部位に影響を及ぼし得る。相補性決定領域、つまりＣＤＲは、天然の免疫グロブリン結合部位の天然のＦｖ領域の結合親和性および特異性を一緒に定めるアミノ酸配列を指す。免疫グロブリンの軽鎖および重鎖はそれぞれ、３つのＣＤＲを有し、Ｌ－ＣＤＲ１、Ｌ－ＣＤＲ２、Ｌ－ＣＤＲ３、およびＨ－ＣＤＲ１、Ｈ－ＣＤＲ２、Ｈ－ＣＤＲ３とそれぞれ呼ばれる。したがって、抗原結合部位は、典型的には、重鎖Ｖ領域および軽鎖Ｖ領域のそれぞれに由来するＣＤＲセットを含む６つのＣＤＲを含む。フレームワーク領域（ＦＲ）は、ＣＤＲ間に介在するアミノ酸配列を指す。したがって、軽鎖および重鎖の可変領域は、典型的には、以下の配列、ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４の４つのフレームワーク領域および３つのＣＤＲを含む。

【0048】

抗体可変ドメインの残基は、従来、Ｋａｂａｔらによって考案されたシステムに従ってナンバリングされる。このシステムは、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，１９８７，ｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，ＵＳ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ，ＵＳＡ（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，１９９２、以降「Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．」）に記載されている。このナンバリングのシステムが、本明細書で使用されている。Ｋａｂａｔの残基表記は、配列番号の配列におけるアミノ酸残基の線形の番号付けと必ずしも直接対応しない。実際の線形のアミノ酸配列は、基本的な可変ドメイン構造のフレームワークまたは相補性決定領域（ＣＤＲ）にかかわらず、構造成分の短縮または挿入に対応する厳密なＫａｂａｔナンバリングよりも少ないまたは付加的なアミノ酸を含み得る。残基の正確なＫａｂａｔナンバリングは、抗体の配列における相同性の残基と「標準的な」Ｋａｂａｔナンバリングのなされた配列とのアラインメントによって、所与の抗体について決定され得る。重鎖可変ドメインのＣＤＲは、Ｋａｂａｔナンバリングシステムに従って、残基３１から３５（Ｈ－ＣＤＲ１）、残基５０から６５（Ｈ－ＣＤＲ２）および残基９５から１０２（Ｈ－ＣＤＲ３）に位置する。軽鎖可変ドメインのＣＤＲは、Ｋａｂａｔナンバリングシステムに従って、残基２４から３４（Ｌ－ＣＤＲ１）、残基５０から５６（Ｌ－ＣＤＲ２）、および残基８９から９７（Ｌ－ＣＤＲ３）に位置する。

【0049】

特定の実施形態では、本明細書において提供される抗体は、抗体断片、より具体的には本明細書に開示される抗体の抗原結合ドメインを含む任意のタンパク質である。抗原結合ドメインはまた、別のタンパク質足場に組み込まれ得る。抗体断片および足場には、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、ｄｓＦｖ、ｓｃＦｖ、ｓｃ（Ｆｖ）２、ダイアボディ、単一ドメイン抗体、マキシボディ、ミニボディ、イントラボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ｖ－ＮＡＲ、ビス－ｓｃＦｖ、ラクダ科抗体、アンキリン、センチリン、ドメイン抗体、リポカリン、小型モジュール免疫医薬品、マキシボディ、プロテインＡおよびアフィリンが含まれるが、これらに限定されない。

【0050】

本明細書で使用される場合、「抗原結合領域」または「抗体の抗原結合断片」は、場合によってはそのネイティブ形態で、特定の抗原に対する抗原結合能力を示す抗体の一部、すなわち抗体の構造の一部に対応する分子を意味する。そのような断片は、特に、対応する４鎖抗体の抗原結合特異性と比較して、前記抗原に対して同じまたは実質的に同じ抗原結合特異性を示す。抗原結合能は、抗体と標的断片との間の親和性を測定することによって、決定することができる。この抗原結合領域は、抗体の「機能的断片」と呼ばれることもある。

【0051】

本開示の薬剤は、抗体およびその断片を含むが、本明細書では抗原結合抗体模倣物とも呼ばれる、抗体の抗原を模倣する、抗原に結合する能力を有する人工タンパク質も含む。抗原結合抗体模倣物は、抗原に特異的に結合するが、抗体に構造的に関連しない有機化合物である。それらは、通常、約３ｋＤａから２０ｋＤａのモル質量を有する人工ペプチドまたは小タンパク質である。

【0052】

「抗原を認識する抗原結合領域」および「抗原に対する特異性を有する抗原結合領域」という語句は、本明細書では「抗原に特異的に結合する抗原結合領域」という用語と互換的に使用される。本明細書で使用される場合、「特異性」という用語は、抗体などの抗原結合領域を含む薬剤が抗原において提示されたエピトープに検出可能に結合できることを指す。

【0053】

「特異的結合」または「特異的に結合する」には、約１０^－８Ｍ（ＫＤ）またはそれより強い一価の親和性での結合が含まれる。好ましくは、結合親和性が１０^－８Ｍ（ＫＤ）から１０^－１２Ｍ（ＫＤ）、任意選択で１０^－８Ｍ（ＫＤ）から１０^－１０Ｍ（ＫＤ）、特に少なくとも１０^－８Ｍ（ＫＤ）である場合、結合は特異的であると考えられる。親和性は、当業者に周知の様々な方法によって決定することができる。これらの方法には、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）、バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）、マイクロスケール熱泳動（ＭＳＴ）およびスキャッチャードプロットが含まれるが、これらに限定されない。結合ドメインが標的と特異的に反応するかまたは標的に結合するかどうかは、とりわけ、前記結合ドメインと標的タンパク質または抗原との反応を、前記結合ドメインと標的タンパク質以外のタンパク質または抗原との反応と比較することによって、容易に試験することができる。

【0054】

本明細書で使用される場合、「エピトープ」という用語は、抗体またはその抗原結合領域が結合する抗原の一部を意味する。タンパク質抗原のエピトープは、立体構造エピトープおよび線状エピトープの２つのカテゴリーに分けることができる。立体構造エピトープは、抗原のアミノ酸配列の不連続の部分に対応する。線状エピトープは、抗原からのアミノ酸の連続した配列に対応する。

【0055】

別の態様では、二重特異性または多重特異性の分子、例えば二重特異性抗体または多重特異性抗体が、本明細書にさらに開示される。例えば、抗体は、少なくとも２つの異なる結合部位または標的分子に結合する二重特異性分子を生成するために、別の機能性分子、例えば別のペプチドまたはタンパク質（例えば、受容体に対する別の抗体またはリガンド）に誘導体化または連結され得る。抗体は、実際には、２つを超える異なる結合部位および／または標的分子に結合する多重特異性分子を生成するために、１つを超える他の機能性分子に誘導体化または連結され得る。そのような多重特異性分子はまた、本明細書で使用される「二重特異性分子」、「二重特異性抗体」、「二重特異性分子」、「二重特異性抗体」、「多重特異性分子」、および「多重特異性抗体」という用語に包含されることが意図される。二重特異性分子を作出するために、本開示の抗体は、二重特異性分子が生じるように、１つまたはそれを超える他の結合分子、例えば、別の抗体、抗体断片、ペプチドまたは結合模倣物、サイトカイン、ケモカイン、毒素または受容体細胞外ドメインに機能的に連結され得る（例えば、化学的カップリング、遺伝子融合、ジスルフィド結合、非共有結合または他の方法によって）。本開示によって企図される特定の二重特異性分子および多重特異性分子は、Ｔ細胞エンゲージャー、例えば二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー、例えばＢｉＴＥである。

【0056】

本明細書で使用される場合、ＣＤ１１７の特定のアイソフォームに結合しないかまたは実質的により弱く結合する薬剤には、前記特定のアイソフォームを発現する細胞に結合することができない薬剤が含まれる。実験的試験のために、前記薬剤を蛍光マーカーで標識してもよく、または前記薬剤に対する二次抗体で検出してもよく、前記蛍光マーカーまたは前記二次抗体を提示する細胞の割合をＦＡＣＳ分析によって決定する。典型的には、試験は、組換え標的タンパク質、すなわちＣＤ１１７を発現する細胞株で行われる。標的タンパク質は、その全体が発現され得る。あるいは、切断型を使用してもよく、前記切断型は、少なくとも、それぞれの抗体エピトープを含有する細胞外ドメインまたは細胞外ドメインの領域を含む必要がある。変異体アイソフォームの発現をモニタリングするために、細胞を２つの薬剤で同時に染色し得、一方は変異体が導入されたエピトープに結合し、第２のものは第１の薬剤によって結合されたものとは異なるエピトープに結合する。第２のエピトープは変化しないままであり、したがって、この染色は発現の制御として働く。非結合制御として、目的のタンパク質を発現しない細胞を使用している。最大限の結合制御として、目的のタンパク質を通常発現しない細胞を、野生型アイソフォームでトランスフェクトしている。異なる細胞株は異なる発現レベルを有するが、発現はプロモーターなどの内因性制御要素を介して制御される。そのような細胞株はまた、枯渇剤の作用様式、異なる作用様式に対する効果的な遮蔽を研究するために、細胞傷害性および細胞傷害性からの遮蔽／耐性を試験するために、または操作された受容体の機能を試験するために使用され得る。ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡまたはＦＡＣＳを使用して、シグナル伝達分子のリン酸化を分析することができる。遺伝子発現変化の分析は、正常な機能と比較して遺伝子発現を分析するのに役立ち得る。ＦＡＣＳに基づくアッセイを使用して、細胞上のＣＤ１１７に対するＳＣＦの結合を分析することができる。細胞はまた、異なるアプローチ、例えば相同組換え修復（ＨＤＲ）、塩基編集またはプライム編集を介して特定の変異体を編集することの実現可能性を実証するために使用され得る。

【0057】

前記薬剤の結合は、ＣＤ１１７の第１のアイソフォームを発現する細胞の枯渇をもたらし得る。様々な機構が細胞の枯渇をもたらし得る。抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）は、標的タンパク質への薬剤の結合およびＮＫ細胞などによって発現されるＦｃＲによって結合される薬剤へのＦｃ部分を介したＮＫ細胞の活性化から生じる。免疫グロブリンのＦｃ部分は、免疫グロブリンの重鎖のＣ末端領域を指す。Ｆｃ部分は、野生型または操作されたものであり得る。強化され操作されたＦｃ部分の突然変異は、当技術分野で公知である。特定の治療の状況では、エフェクター機能を誘導する抗体の能力を低減または無効にするために、Ｆｃ受容体の１つ以上または全部への野生型ＩｇＧ Ｆｃ領域などの抗体の野生型Ｆｃ領域の正常な結合、および／またはＣ１ｑなどの補体成分への結合を、低減または無効にすることが所望される。例えば、ＦｃｙＲＩ、ＦｃｙＲＩｌａ、ＦｃｙＲＩＩｂ、ＦｃｙＲＩＩＩａなどのＦｃｙ受容体の１つ以上またはすべてに対する抗体のＦｃ領域の結合を低減または無効にすることが所望され得る。エフェクター機能には、以下の、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）、サイトカインの分泌、抗原提示細胞による免疫複合体媒介性の抗原取り込み、ＮＫ細胞への結合、マクロファージへの結合、単球への結合、多形核細胞への結合、アポトーシスを誘導する直接シグナル伝達、標的結合抗体の架橋、樹状細胞の成熟、またはＴ細胞プライミングのうちの１つまたは複数が含まれ得るが、これらに限定されない。前記薬剤の結合はまた、天然受容体リガンドの結合の遮断をもたらし、それによって細胞媒介性枯渇なしに細胞死およびアポトーシスをもたらし得る。

【0058】

Ｆｃ受容体および／またはＣ１ｑへのＦｃ領域の結合の低減または無効は、典型的には、野生型Ｆｃ領域、例えばＩｇＧ１ Ｆｃ領域、より具体的にはヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域を変異させて、前記野生型Ｆｃ領域の変異または操作されたＦｃ領域、例えば変異体ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域をもたらすことによって達成される。結合の低減をもたらす置換が有用であり得る。Ｆｃ受容体に対するＦｃ領域の結合特性を低減または無効にするために、非保存的アミノ酸置換、すなわちあるアミノ酸を異なる構造的および／または化学的特性および／または電荷を有する別のアミノ酸で置換することが好ましい。

【0059】

本開示の特定の実施形態において、抗体のＦｃ領域は、ＬＡＬＡまたはＰＧ－ＬＡＬＡ変異を保有するＩｇＧ１アイソタイプのものであり、すなわち、定常領域は、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５ＡおよびＰ３２９Ｇ変異またはＰＡ－ＬＡＬＡ変異を保有し、すなわち、定常領域は、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５ＡおよびＰ３２９Ａ変異、またはＡＥＡＳＳを保有し、すなわち、定常領域は、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５ＡおよびＰ３２９Ａ変異、またはＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｇ２３７Ａ、Ａ３３０ＳおよびＰ３３１Ｓ変異を保有する。当業者は、所望の効果を得るためにＦｃ領域を操作する可能性を認識するであろう。

【0060】

代用のＡＤＣＣアッセイは、実験のパートに記載されているように、ＡＤＣＣを媒介する薬剤の効力を定量するための業界の標準を構成する。操作されたＪｕｒｋａｔレポーター細胞は、ＮＦＡＴ応答性ルシフェラーゼ遺伝子およびＦｃ受容体、例えばヒトＦｃｇＲＩＩＩａを有する。結合する抗体とのＦｃ受容体の結合は、受容体クラスタ形成によるＮＦＡＴ誘導、したがってルシフェラーゼシグナルを生じる。結合の欠如、したがってクラスタ化はルシフェラーゼシグナルをもたらさない。標的タンパク質を発現しない細胞（例えば、ＨＥＫもしくはＤＦ－１細胞またはＣＤ１１７ノックアウトを有するＴＦ－１、ＫＧ－１もしくはＫＡＳＵＭＩ－１などのヒト骨髄性癌細胞）、野生型タンパク質を発現する細胞（例えば、ＤＦ－１－ＣＤ１１７またはＴＦ－１、ＫＧ－１もしくはＫＡＳＵＭＩ－１細胞株のＨＥＫ－ＣＤ１１７）または個々の変異体を発現する細胞（例えば、ＣＤ１１７変異体）を試験剤（例えば、抗体Ｒｅｆｍａｂ＃１）と共にインキュベートし、ＡＤＣＣレポーター細胞と混合した。次いで、ルシフェラーゼを測定してＡＤＣＣシグナルを定量した。ルシフェラーゼ発光シグナルを、ＨＥＫ－ＣＤ１１７、ＤＦ－１－ＣＤ１１７または対応する骨髄癌細胞株において観察された最大シグナルに対して正規化した。ＡＤＣＣは、ＡＤＣＣレポーターアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｇ７０１５）を用いて測定した。

【0061】

本開示に沿った他の潜在的な作用モードも可能である。これには、ＳＣＦの抗体媒介置換、二量体化遮断薬、または例えばＡＤＣの使用によるこれらの領域のいずれかの外側への抗体結合が含まれる。標的細胞を枯渇させる別の方法は、Ｔ細胞エンゲージャー分子の使用によるものである。例えば、抗体Ｒｅｆｍａｂ＃１由来のＣＤ１１７結合部位とＣＤ３（ＯＫＴ３）結合部位を用いた二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーを用いてもよい。ＡＤＣＣアッセイに使用したのと同じ標的細胞を使用する。初代ヒトＴ細胞および二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーを添加する。ヒトＴ細胞の活性化を、ＣＤ６９アップレギュレーションの頻度を決定することによってＦＡＣＳによって定量した。

【0062】

本開示による枯渇剤は、ＣＤ１１７の１つのアイソフォームに特異的に結合し、前記アイソフォームを発現する細胞の枯渇を可能にする。

【0063】

より好ましくは、特定の実施形態において、本開示による前記枯渇剤は、ＣＤ１１７の第１のアイソフォームに結合しないか実質的により弱く結合するが、ＣＤ１１７の第２のアイソフォームに特異的に結合し、特に本明細書において開示されるような使用方法において、前記ＣＤ１１７の第２のアイソフォームを発現する前記細胞の枯渇を可能にする。特に、細胞ＣＤ１１７の第１のアイソフォームに結合しないか実質的により弱く結合するが、患者の細胞において発現されるＣＤ１１７の第２のアイソフォームに特異的に結合する前記枯渇剤は、患者の細胞を枯渇させるために使用されるが、前記患者において造血を回復させるために移植された前記ＣＤ１１７の第１のアイソフォームを発現する造血幹細胞またはその継代を枯渇させない。

【0064】

別の特定の実施形態において、本開示による前記枯渇剤は、ＣＤ１１７の第２のアイソフォームに結合しないか実質的により弱く結合するが、ＣＤ１１７の第１のアイソフォームに特異的に結合し、特に本明細書において開示されるような使用方法において、前記ＣＤ１１７の第１のアイソフォームを発現する前記細胞の枯渇を可能にする。特に、ＣＤ１１７の第２のアイソフォームに結合しないか実質的により弱く結合するが、移植された細胞において発現されるＣＤ１１７の第１のアイソフォームに特異的に結合する前記枯渇剤は、移植された細胞を特異的に枯渇させて、移植による移植片対宿主病などの最終的な重篤な副作用を回避するために使用される。

【0065】

ＣＤ１１７の特異的アイソフォームを発現する細胞の選択的枯渇は、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）または抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）によって制限なく達成することができる。

【0066】

特定の実施形態では、抗原結合領域を、薬物または毒素などのエフェクター化合物にカップリングさせる。そのようなコンジュゲートは、本明細書では「イムノコンジュゲート」、「抗体－薬物コンジュゲート」、または「ＡＤＣ」と呼ばれる。細胞毒または細胞傷害剤は、細胞に有害な（例えば、殺傷する）任意の薬剤を含む。例としては、タキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１－デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、メイタンシノイド、カリケアマイシン、インドリノベンゾジアゼピン、ピロロベンゾジアゼピン、ピリジノベンゾジアゼピン、カンプトテシン、トポテカン、イリノテカン、ベロテカン、デルテカン、アルファ－アマニチン、ミクロシスチン、アウリスタチン、およびピューロマイシンならびにそれらの類似体またはホモログが挙げられる。

【0067】

別の特定の実施形態において、前記枯渇剤は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）などの抗原受容体を有する免疫細胞である。例えば、Ｍｙｂｕｒｇｈ ｅｔ ａｌ．Ｌｅｕｋｅｍｉａ（２０２０）３４：２６８８－７０３を参照のこと。前記免疫細胞は、その細胞表面に、抗原受容体とも呼ばれる組換え抗原結合領域を発現し得る。「組換え体」とは、その天然の状態で細胞によってコードされない、すなわち異種の非内因性である抗原結合領域を意味する。したがって、組換え抗原結合領域の発現は、免疫細胞に新しい抗原特異性を導入し、細胞に以前に認識されていない抗原を認識させて結合させるということが分かる。抗原受容体は、任意の有用な供給源から単離され得る。本開示の特定の実施形態では、抗原結合領域を含む前記細胞は、ＣＡＲ Ｔ細胞、ＣＡＲ ＮＫ細胞、ＣＡＲ ＴｒｅｇまたはＣＡＲマクロファージである。本開示の好ましい実施形態では、抗原結合領域を含む前記細胞はＣＡＲ Ｔ細胞である。本開示の別の好ましい実施形態では、抗原結合領域を含む前記細胞は、ＣＡＲを含む初代Ｔ細胞である。

【0068】

特定の実施形態では、前記組換え抗原受容体はキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である。ＣＡＲは、ＴＣＲ複合体のシグナル伝達ドメインに連結された、典型的には抗体に由来する抗原結合領域を含む融合タンパク質である。ＣＡＲは、適切な抗原結合領域が選択される場合、Ｔ細胞またはＮＫ細胞などの免疫細胞を標的抗原に対して指向させるために使用することができる。

【0069】

ＣＡＲの抗原結合領域は、典型的には、抗体に由来するｓｃＦｖ（一本鎖可変断片）に基づく。Ｎ末端の細胞外抗体結合領域に加えて、ＣＡＲは、典型的には、それが発現される免疫エフェクター細胞の原形質膜から離れるように抗原結合領域を延ばすためのスペーサーとして機能するヒンジドメイン、膜貫通（ＴＭ）ドメイン、細胞内シグナル伝達ドメイン（例えば、ＴＣＲ複合体のＣＤ３分子のゼータ鎖（ＣＤ３ζ）由来のシグナル伝達ドメイン、または同等物）、および任意選択でＣＡＲを発現する細胞のシグナル伝達または機能性を支援し得る１つまたは複数の共刺激ドメインを含み得る。ＣＤ２８、ＯＸ－４０（ＣＤ１３４）および４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）を含む共刺激分子からのシグナル伝達ドメインは、ＣＡＲ改変免疫細胞の生存を増強し、増殖を増加させるために、単独で（第２世代）または併用して（第３世代）添加することができる。

【0070】

当業者は、本開示に従って使用される免疫細胞をリダイレクトするための上記の適切な抗原結合領域を選択することができる。特定の実施形態では、本開示の方法で使用するための免疫細胞は、リダイレクトされたＴ細胞、例えば、リダイレクトされたＣＤ８＋Ｔ細胞もしくはリダイレクトされたＣＤ４＋Ｔ細胞、またはリダイレクトされたＮＫ細胞である。

【0071】

組換え抗原結合領域を発現するように免疫細胞を遺伝子改変することができる方法は、当技術分野で周知である。抗原受容体をコードする核酸分子は、例えばベクター、または任意の他の適切な核酸構築物の形態で、またはゲノム編集技術を使用して核酸分子をゲノムに挿入することによって、細胞に導入され得る。ベクターおよびそれらの必要な成分は、当技術分野で周知である。抗原結合領域をコードする核酸分子は、当技術分野で公知の任意の方法、例えばＰＣＲを用いた分子クローニングを用いて生成することができる。抗原結合領域配列は、部位特異的突然変異誘発などの一般的に使用される方法を使用して改変することができる。

【0072】

ＣＤ１１７
ＣＤ１１７（ＵｎｉＰｒｏｔ：Ｐ１０７２１；ＫＩＴ、ｃ－ＫｉｔまたはＳＣＦＲとしても知られている）は、造血幹細胞ならびに他の細胞型の表面上に発現されるサイトカイン受容体である。ＣＤ１１７は、ＳＣＦ（ＵｎｉＰｒｏｔ：Ｐ２１５８３；幹細胞因子Ｋｉｔリガンドまたはマスト細胞増殖因子としても知られる）に結合する受容体チロシンキナーゼＩＩＩ型である。ＳＣＦへのＣＤ１１７の結合は、チロシンキナーゼ活性を活性化する二量体の形成をもたらし、それにより、シグナルを細胞内に伝播するシグナル伝達分子を活性化する。ＣＤ１１７を介したシグナル伝達は、細胞の生存、増殖、および分化において役割を果たす。

【0073】

ヒトＣＤ１１７は、以下のアミノ酸配列（配列番号１）を有する：
ＭＲＧＡＲＧＡＷＤＦＬＣＶＬＬＬＬＬＲＶＱＴＧＳＳＱＰＳＶＳＰＧＥＰＳＰＰＳＩＨＰＧＫＳＤＬＩＶＲＶＧＤＥＩＲＬＬＣＴＤ
ＰＧＦＶＫＷＴＦＥＩＬＤＥＴＮＥＮＫＱＮＥＷＩＴＥＫＡＥＡＴＮＴＧＫＹＴＣＴＮＫＨＧＬＳＮＳＩＹＶＦＶＲＤＰＡＫＬＦＬＶ
ＤＲＳＬＹＧＫＥＤＮＤＴＬＶＲＣＰＬＴＤＰＥＶＴＮＹＳＬＫＧＣＱＧＫＰＬＰＫＤＬＲＦＩＰＤＰＫＡＧＩＭＩＫＳＶＫＲＡＹＨ
ＲＬＣＬＨＣＳＶＤＱＥＧＫＳＶＬＳＥＫＦＩＬＫＶＲＰＡＦＫＡＶＰＶＶＳＶＳＫＡＳＹＬＬＲＥＧＥＥＦＴＶＴＣＴＩＫＤＶＳＳ
ＳＶＹＳＴＷＫＲＥＮＳＱＴＫＬＱＥＫＹＮＳＷＨＨＧＤＦＮＹＥＲＱＡＴＬＴＩＳＳＡＲＶＮＤＳＧＶＦＭＣＹＡＮＮＴＦＧＳＡＮ
ＶＴＴＴＬＥＶＶＤＫＧＦＩＮＩＦＰＭＩＮＴＴＶＦＶＮＤＧＥＮＶＤＬＩＶＥＹＥＡＦＰＫＰＥＨＱＱＷＩＹＭＮＲＴＦＴＤＫＷＥ
ＤＹＰＫＳＥＮＥＳＮＩＲＹＶＳＥＬＨＬＴＲＬＫＧＴＥＧＧＴＹＴＦＬＶＳＮＳＤＶＮＡＡＩＡＦＮＶＹＶＮＴＫＰＥＩＬＴＹＤＲ
ＬＶＮＧＭＬＱＣＶＡＡＧＦＰＥＰＴＩＤＷＹＦＣＰＧＴＥＱＲＣＳＡＳＶＬＰＶＤＶＱＴＬＮＳＳＧＰＰＦＧＫＬＶＶＱＳＳＩＤＳ
ＳＡＦＫＨＮＧＴＶＥＣＫＡＹＮＤＶＧＫＴＳＡＹＦＮＦＡＦＫＧＮＮＫＥＱＩＨＰＨＴＬＦＴＰＬＬＩＧＦＶＩＶＡＧＭＭＣＩＩＶ
ＭＩＬＴＹＫＹＬＱＫＰＭＹＥＶＱＷＫＶＶＥＥＩＮＧＮＮＹＶＹＩＤＰＴＱＬＰＹＤＨＫＷＥＦＰＲＮＲＬＳＦＧＫＴＬＧＡＧＡＦ
ＧＫＶＶＥＡＴＡＹＧＬＩＫＳＤＡＡＭＴＶＡＶＫＭＬＫＰＳＡＨＬＴＥＲＥＡＬＭＳＥＬＫＶＬＳＹＬＧＮＨＭＮＩＶＮＬＬＧＡＣ
ＴＩＧＧＰＴＬＶＩＴＥＹＣＣＹＧＤＬＬＮＦＬＲＲＫＲＤＳＦＩＣＳＫＱＥＤＨＡＥＡＡＬＹＫＮＬＬＨＳＫＥＳＳＣＳＤＳＴＮＥ
ＹＭＤＭＫＰＧＶＳＹＶＶＰＴＫＡＤＫＲＲＳＶＲＩＧＳＹＩＥＲＤＶＴＰＡＩＭＥＤＤＥＬＡＬＤＬＥＤＬＬＳＦＳＹＱＶＡＫＧＭ
ＡＦＬＡＳＫＮＣＩＨＲＤＬＡＡＲＮＩＬＬＴＨＧＲＩＴＫＩＣＤＦＧＬＡＲＤＩＫＮＤＳＮＹＶＶＫＧＮＡＲＬＰＶＫＷＭＡＰＥＳ
ＩＦＮＣＶＹＴＦＥＳＤＶＷＳＹＧＩＦＬＷＥＬＦＳＬＧＳＳＰＹＰＧＭＰＶＤＳＫＦＹＫＭＩＫＥＧＦＲＭＬＳＰＥＨＡＰＡＥＭＹ
ＤＩＭＫＴＣＷＤＡＤＰＬＫＲＰＴＦＫＱＩＶＱＬＩＥＫＱＩＳＥＳＴＮＨＩＹＳＮＬＡＮＣＳＰＮＲＱＫＰＶＶＤＨＳＶＲＩＮＳＶ
ＧＳＴＡＳＳＳＱＰＬＬＶＨＤＤＶ
ヒトＳＣＦは、以下のアミノ酸配列を有する（配列番号２）：
ＭＫＫＴＱＴＷＩＬＴＣＩＹＬＱＬＬＬＦＮＰＬＶＫＴＥＧＩＣＲＮＲＶＴＮＮＶＫＤＶＴＫＬＶＡＮＬＰＫＤＹＭＩＴＬＫＹＶＰＧ
ＭＤＶＬＰＳＨＣＷＩＳＥＭＶＶＱＬＳＤＳＬＴＤＬＬＤＫＦＳＮＩＳＥＧＬＳＮＹＳＩＩＤＫＬＶＮＩＶＤＤＬＶＥＣＶＫＥＮＳＳ
ＫＤＬＫＫＳＦＫＳＰＥＰＲＬＦＴＰＥＥＦＦＲＩＦＮＲＳＩＤＡＦＫＤＦＶＶＡＳＥＴＳＤＣＶＶＳＳＴＬＳＰＥＫＤＳＲＶＳＶＴ
ＫＰＦＭＬＰＰＶＡＡＳＳＬＲＮＤＳＳＳＳＮＲＫＡＫＮＰＰＧＤＳＳＬＨＷＡＡＭＡＬＰＡＬＦＳＬＩＩＧＦＡＦＧＡＬＹＷＫＫＲ
ＱＰＳＬＴＲＡＶＥＮＩＱＩＮＥＥＤＮＥＩＳＭＬＱＥＫＥＲＥＦＱＥＶ

【0074】

特定の実施形態では、前記表面タンパク質はＣＤ１１７である。他の実施形態では、前記表面タンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列を含むＣＤ１１７である。他の実施形態では、前記表面タンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列からなるＣＤ１１７である。

【0075】

特定の実施形態では、本開示は、それを必要とする患者における医学的治療に使用するための表面タンパク質、ＣＤ１１７の第１のアイソフォームを発現する哺乳動物細胞または細胞の集団であって、前記患者が前記表面タンパク質の第２のアイソフォームを発現する細胞を有し、前記第１のアイソフォームを発現する前記細胞が、少なくとも１つの多型または遺伝子操作された対立遺伝子を有するゲノムＤＮＡを含み、前記多型または遺伝子操作された対立遺伝子が、前記表面タンパク質の前記第２のアイソフォームを発現する細胞を有する患者のゲノムに存在せず、好ましくは前記第１および第２のアイソフォームが機能的である、使用のための哺乳動物細胞または細胞の集団に関する。

【0076】

特定の実施形態では、本開示は、それを必要とする患者における医学的治療に使用するための表面タンパク質、ＣＤ１１７の第１のアイソフォームを発現する哺乳動物細胞または細胞の集団であって、前記患者が前記表面タンパク質の第２のアイソフォームを発現する細胞を有し、前記第１のアイソフォームを発現する前記細胞が、少なくとも１つの多型または遺伝子操作された対立遺伝子を有するゲノムＤＮＡを含み、前記多型または遺伝子操作された対立遺伝子が、前記表面タンパク質の前記第２のアイソフォームを発現する細胞を有する患者のゲノムに存在せず、前記第１および第２のアイソフォームが機能的である、使用のための哺乳動物細胞または細胞の集団に関する。

【0077】

特定の実施形態において、本開示は、それを必要とする患者における医学的治療に使用するための表面タンパク質ＣＤ１１７の第１のアイソフォームを発現する哺乳動物細胞または細胞の集団であって、前記患者が前記表面タンパク質の第２のアイソフォームを発現する細胞を有し、前記第１のアイソフォームを発現する前記細胞が、少なくとも１つの多型または遺伝子操作された対立遺伝子を有するゲノムＤＮＡを含み、前記多型または遺伝子操作された対立遺伝子が、前記表面タンパク質の前記第２のアイソフォームを発現する細胞を有する患者のゲノムに存在せず、前記第１および第２のアイソフォームが実質的に機能的に同一である、哺乳動物細胞または細胞の集団に関する。

【0078】

いくつかの機能がＣＤ１１７について報告されている。特定の実施形態において、本開示は、両方のアイソフォームが機能的である、ＣＤ１１７の第１および第２のアイソフォームに関する。特定の実施形態において、本開示は、両方のアイソフォームが機能的に区別できないＣＤ１１７の第１および第２のアイソフォームに関する。本発明において、「機能的に区別できない」は、有意な障害を伴わずに細胞内で同じ機能を等しく果たすことができるＣＤ１１７の第１および第２のアイソフォームを指す。言い換えれば、第１および第２のアイソフォームは、機能的にほとんど区別できない。わずかな機能障害が許容され得る。好ましい実施形態では、ＣＤ１１７の前記第１のアイソフォームは機能性のままであり、顕著な障害なしに、細胞内で対応する野生型アイソフォームと同じ機能を実行する能力を保持する。

【0079】

ＣＤ１１７の１つの機能は、ＳＣＦへの結合である。したがって、特定の実施形態では、本開示は、それを必要とする患者における医学的治療に使用するための表面タンパク質、ＣＤ１１７の第１のアイソフォームを発現する哺乳動物細胞または細胞の集団であって、前記患者が前記表面タンパク質の第２のアイソフォームを発現する細胞を有し、前記第１のアイソフォームを発現する前記細胞が、少なくとも１つの多型または遺伝子操作された対立遺伝子を有するゲノムＤＮＡを含み、前記多型または遺伝子操作された対立遺伝子が、前記表面タンパク質の前記第２のアイソフォームを発現する細胞を有する患者のゲノムに存在せず、前記第１および第２のアイソフォームがＳＣＦに結合する、使用のための哺乳動物細胞または細胞の集団に関する。

【0080】

他の実施形態では、本開示は、それを必要とする患者における医学的治療に使用するための表面タンパク質、ＣＤ１１７の第１のアイソフォームを発現する哺乳動物細胞または細胞の集団であって、前記患者が前記表面タンパク質の第２のアイソフォームを発現する細胞を有し、前記第１のアイソフォームを発現する前記細胞が、少なくとも１つの多型または遺伝子操作された対立遺伝子を有するゲノムＤＮＡを含み、前記多型または遺伝子操作された対立遺伝子が、前記表面タンパク質の前記第２のアイソフォームを発現する細胞を有する患者のゲノムに存在せず、前記第１および第２のアイソフォームが実質的に同様の程度でＳＣＦに結合する、使用のための哺乳動物細胞または細胞の集団に関する。

【0081】

他の実施形態では、本開示は、それを必要とする患者における医学的治療に使用するための表面タンパク質、ＣＤ１１７の第１のアイソフォームを発現する哺乳動物細胞または細胞の集団であって、前記患者が前記表面タンパク質の第２のアイソフォームを発現する細胞を有し、前記第１のアイソフォームを発現する前記細胞が、少なくとも１つの多型または遺伝子操作された対立遺伝子を有するゲノムＤＮＡを含み、前記多型または遺伝子操作された対立遺伝子が、前記表面タンパク質の前記ＣＤ１１７の第２のアイソフォームを発現する細胞を有する患者のゲノムに存在せず、前記第１および第２のアイソフォームが配列番号２を含むポリペプチドに結合する、使用のための哺乳動物細胞または細胞の集団に関する。

【0082】

他の実施形態では、本開示は、それを必要とする患者における医学的治療に使用するための表面タンパク質、ＣＤ１１７の第１のアイソフォームを発現する哺乳動物細胞または細胞の集団であって、前記患者が前記表面タンパク質の第２のアイソフォームを発現する細胞を有し、前記第１のアイソフォームを発現する前記細胞が、少なくとも１つの多型または遺伝子操作された対立遺伝子を有するゲノムＤＮＡを含み、前記多型または遺伝子操作された対立遺伝子が、前記表面タンパク質の前記ＣＤ１１７の第２のアイソフォームを発現する細胞を有する患者のゲノムに存在せず、前記第１および第２のアイソフォームが配列番号２からなるポリペプチドに結合する、使用のための哺乳動物細胞または細胞の集団に関する。

【0083】

他の実施形態では、本開示は、それを必要とする患者における医学的治療に使用するための表面タンパク質、ＣＤ１１７の第１のアイソフォームを発現する哺乳動物細胞または細胞の集団であって、前記患者が前記表面タンパク質の第２のアイソフォームを発現する細胞を有し、前記第１のアイソフォームを発現する前記細胞が、少なくとも１つの多型または遺伝子操作された対立遺伝子を有するゲノムＤＮＡを含み、前記多型または遺伝子操作された対立遺伝子が、前記表面タンパク質の前記ＣＤ１１７の第２のアイソフォームを発現する細胞を有する患者のゲノムに存在せず、前記第１および第２のアイソフォームが実質的に同様の様式で配列番号２を含むポリペプチドに結合する、使用のための哺乳動物細胞または細胞の集団に関する。他の実施形態では、前記ポリペプチドは配列番号２からなるポリペプチドである。

【0084】

他の実施形態では、本開示は、それを必要とする患者における医学的治療に使用するための表面タンパク質、ＣＤ１１７の第１のアイソフォームを発現する哺乳動物細胞または細胞の集団であって、前記患者が前記表面タンパク質の第２のアイソフォームを発現する細胞を有し、前記第１のアイソフォームを発現する前記細胞が、少なくとも１つの多型または遺伝子操作された対立遺伝子を有するゲノムＤＮＡを含み、前記多型または遺伝子操作された対立遺伝子が、前記表面タンパク質の前記ＣＤ１１７の第２のアイソフォームを発現する細胞を有する患者のゲノムに存在せず、前記第１および第２のアイソフォームが６０％以下、５０％以下、４０％以下、好ましくは３０％以下、より好ましくは２０％以下、さらにより好ましくは１０％以下異なるＫ_Ｄで配列番号２を含むポリペプチドに結合する、使用のための哺乳動物細胞または細胞の集団に関する。他の実施形態では、前記ポリペプチドは、配列番号２からなるポリペプチドである。

【0085】

ＳＣＦへのＣＤ１１７の結合は、ビオチン化ＳＣＦおよび蛍光標識ストレプトアビジンの細胞への結合を滴定および測定するＦＡＣＳアッセイなどの任意の一般的に使用されるアッセイによって当業者によって試験することができる。そのようなアッセイの例は、実施例８に記載されている。

【0086】

ＣＤ１１７の別の機能は、ＳＣＦ依存性増殖である。したがって、特定の実施形態では、本開示は、それを必要とする患者における医学的治療に使用するための表面タンパク質、ＣＤ１１７の第１のアイソフォームを発現する哺乳動物細胞または細胞の集団であって、前記患者が前記表面タンパク質の第２のアイソフォームを発現する細胞を有し、前記第１のアイソフォームを発現する前記細胞が、少なくとも１つの多型または遺伝子操作された対立遺伝子を有するゲノムＤＮＡを含み、前記多型または遺伝子操作された対立遺伝子が、前記表面タンパク質の前記第２のアイソフォームを発現する細胞を有する患者のゲノムに存在せず、前記第１および第２のアイソフォームがＳＣＦ依存性増殖をもたらす、使用のための哺乳動物細胞または細胞の集団に関する。これらの細胞は、ＳＣＦの添加時に増殖の増加を示す。この増殖の増加は、Ｃｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ Ｇｌｏｗ（Ｐｒｏｍｅｇａ）などの細胞生存率を定量するための薬剤を使用して２～５日後に測定される。

【0087】

他の実施形態では、本開示は、それを必要とする患者における医学的治療に使用するための表面タンパク質、ＣＤ１１７の第１のアイソフォームを発現する哺乳動物細胞または細胞の集団であって、前記患者が前記表面タンパク質の第２のアイソフォームを発現する細胞を有し、前記第１のアイソフォームを発現する前記細胞が、少なくとも１つの多型または遺伝子操作された対立遺伝子を有するゲノムＤＮＡを含み、前記多型または遺伝子操作された対立遺伝子が、前記表面タンパク質の前記ＣＤ１１７の第２のアイソフォームを発現する細胞を有する患者のゲノムに存在せず、前記第１および第２のアイソフォームが実質的に同様の様式でＳＣＦ依存性増殖をもたらす、使用のための哺乳動物細胞または細胞の集団に関する。これは、ＳＣＦ依存性細胞株、例えばＴＦ－１またはＨＳＣにおいて試験することができる。そのようなアッセイの例は、実施例９に記載されている。他の実施形態では、本開示は、それを必要とする患者における医学的治療に使用するための表面タンパク質、ＣＤ１１７の第１のアイソフォームを発現する哺乳動物細胞または細胞の集団であって、前記患者が前記表面タンパク質の第２のアイソフォームを発現する細胞を有し、前記第１のアイソフォームを発現する前記細胞が、少なくとも１つの多型または遺伝子操作された対立遺伝子を有するゲノムＤＮＡを含み、前記多型または遺伝子操作された対立遺伝子が、前記ＣＤ１１７の第２のアイソフォームを発現する細胞を有する患者のゲノムに存在せず、前記第１および第２のアイソフォームが４０％以下、好ましくは３０％以下、より好ましくは２０％以下、さらにより好ましくは１０％以下異なるＳＣＦ依存性増殖をもたらす、使用のための哺乳動物細胞または細胞の集団に関する。他の実施形態では、本開示は、それを必要とする患者における医学的治療に使用するための表面タンパク質、ＣＤ１１７の第１のアイソフォームを発現する哺乳動物細胞または細胞の集団であって、前記患者が前記表面タンパク質の第２のアイソフォームを発現する細胞を有し、前記第１のアイソフォームを発現する前記細胞が、少なくとも１つの多型または遺伝子操作された対立遺伝子を有するゲノムＤＮＡを含み、前記多型または遺伝子操作された対立遺伝子が、前記ＣＤ１１７の第２のアイソフォームを発現する細胞を有する患者のゲノムに存在せず、前記第１および第２のアイソフォームがＳＣＦ依存性増殖をもたらし、前記第１のアイソフォームは、第２のアイソフォームと比較して４倍以下、好ましくは３倍以下、より好ましくは２倍以下である結合親和性（Ｋ_Ｄ）の喪失をもたらす、使用のための哺乳動物細胞または細胞の集団に関する。別の実施形態では、前記第１のアイソフォームは、ＦＡＣＳによって測定した場合に、第２のアイソフォームと比較して４０％以下、より好ましくは３５％以下、さらにより好ましくは３０％以下のＥＣ５０の損失をもたらす。

【0088】

ＳＣＦ依存性増殖は、細胞数、コロニー形成単位（ＣＦＵ）アッセイ、細胞タイターグロー（ＣＴＧ；プロメガ）およびカルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）細胞増殖アッセイなどの任意の一般的に使用されるアッセイによって当業者によって試験することができる。細胞数アッセイのために、抗ＣＤ１１７抗体の存在下で液体培地中で培養された非改変ＨＳＣは、ＣＤ１１７のアイソフォームを発現する遺伝子改変ＨＳＣと比較して、経時的に細胞数の増殖の強い減少を示すであろう。１４日間のＣＦＵアッセイにより、ＨＳＣの造血能、すなわち、分化したコロニーを生じさせるそれらの能力が半固形培地において評価される。抗ＣＤ１１７抗体の存在下で培養された非改変ＨＳＣは造血コロニーを形成することができないが、遺伝子改変ＨＳＣは抗ＣＤ１１７抗体から保護され、コロニーを生じる。抗ＣＤ１１７抗体の非存在下で培養した場合、遺伝子改変ＨＳＣは、液体または半固体培養物中で非改変ＨＳＣと同様の増殖を示し、したがってＣＤ１１７アイソフォームの正常な機能の保持が確認される。

【0089】

特定の実施形態では、前記第１のアイソフォームは、ＦＡＣＳによってＥＣ５０を介して測定した場合、第２のアイソフォームと比較して４０％以下、より好ましくは３５％以下、さらにより好ましくは３０％以下の最大増殖の喪失をもたらす。

【0090】

ＣＤ１１７の別の機能は、ＳＣＦ依存性リン酸化である。したがって、特定の実施形態では、本開示は、それを必要とする患者における医学的治療に使用するための表面タンパク質、ＣＤ１１７の第１のアイソフォームを発現する哺乳動物細胞または細胞の集団であって、前記患者が前記表面タンパク質の第２のアイソフォームを発現する細胞を有し、前記第１のアイソフォームを発現する前記細胞が、少なくとも１つの多型または遺伝子操作された対立遺伝子を有するゲノムＤＮＡを含み、前記多型または遺伝子操作された対立遺伝子が、前記表面タンパク質の前記第２のアイソフォームを発現する細胞を有する患者のゲノムに存在せず、前記第１および第２のアイソフォームが細胞培養培地へのＳＣＦの添加時にリン酸化をもたらす（ＳＣＦ依存性リン酸化）、使用のための哺乳動物細胞または細胞の集団に関する。

【0091】

他の実施形態では、本開示は、それを必要とする患者における医学的治療に使用するための表面タンパク質、ＣＤ１１７の第１のアイソフォームを発現する哺乳動物細胞または細胞の集団であって、前記患者が前記表面タンパク質の第２のアイソフォームを発現する細胞を有し、前記第１のアイソフォームを発現する前記細胞が、少なくとも１つの多型または遺伝子操作された対立遺伝子を有するゲノムＤＮＡを含み、前記多型または遺伝子操作された対立遺伝子が、前記ＣＤ１１７の第２のアイソフォームを発現する細胞を有する患者のゲノムに存在せず、前記第１および第２のアイソフォームが実質的に同様の様式でＳＣＦ依存性リン酸化をもたらす、使用のための哺乳動物細胞または細胞の集団に関する。

【0092】

他の実施形態では、本開示は、それを必要とする患者における医学的治療に使用するための表面タンパク質、ＣＤ１１７の第１のアイソフォームを発現する哺乳動物細胞または細胞の集団であって、前記患者が前記表面タンパク質の第２のアイソフォームを発現する細胞を有し、前記第１のアイソフォームを発現する前記細胞が、少なくとも１つの多型または遺伝子操作された対立遺伝子を有するゲノムＤＮＡを含み、前記多型または遺伝子操作された対立遺伝子が、前記ＣＤ１１７の第２のアイソフォームを発現する細胞を有する患者のゲノムに存在せず、前記第１および第２のアイソフォームが３０％以下、より好ましくは２０％以下、さらにより好ましくは１０％以下異なるＳＣＦ依存性リン酸化をもたらす、使用のための哺乳動物細胞または細胞の集団に関する。他の実施形態では、第１のアイソフォームのＳＣＦ依存性リン酸化の減少は、第２のアイソフォームと比較して５０％未満である。

【0093】

ＳＣＦ依存性リン酸化は、酵素結合イムノアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ＦＡＣＳまたはウエスタンブロットなどの任意の一般的に使用されるアッセイによって当業者によって試験することができる。ＣＤ１１７を発現する細胞を、細胞の収集および細胞溶解緩衝液中での凍結の前に、異なる時点（５～１５分間）、ＳＣＦと共にインキュベートする。液体窒素中でのフラッシュ凍結および３７℃での融解による細胞溶解の際に、位置Ｔｙｒ７１９におけるリン酸化ＣＤ１１７の量を、ＣＤ１１７のリン酸化Ｔｙｒ７１９を検出することが特に知られているＥＬＩＳＡまたはウエスタンブロット法、ならびに対照としてのＣＤ１１７の総レベルを使用して評価する。

【0094】

他の実施形態では、本開示は、それを必要とする患者における医学的治療に使用するための表面タンパク質、ＣＤ１１７の第１のアイソフォームを発現する哺乳動物細胞または細胞の集団であって、前記患者が前記表面タンパク質の第２のアイソフォームを発現する細胞を有し、前記第１のアイソフォームを発現する前記細胞が、少なくとも１つの多型または遺伝子操作された対立遺伝子を有するゲノムＤＮＡを含み、前記多型または遺伝子操作された対立遺伝子が、前記ＣＤ１１７の第２のアイソフォームを発現する細胞を有する患者のゲノムに存在せず、ＣＤ１１７～ＳＣＦの第１のアイソフォームのＫＤは、ＣＤ１１７～ＳＣＦの第２のアイソフォームのＫＤよりも４倍未満、好ましくは３倍未満、より好ましくは２倍未満、最も好ましくは１．５倍未満高い、使用のための哺乳動物細胞または細胞の集団に関する。好ましくは、前記第２のアイソフォームは野生型ＣＤ１１７である。

【0095】

他の実施形態では、本開示は、それを必要とする患者における医学的治療に使用するための表面タンパク質、ＣＤ１１７の第１のアイソフォームを発現する哺乳動物細胞または細胞の集団であって、前記患者が前記表面タンパク質の第２のアイソフォームを発現する細胞を有し、前記第１のアイソフォームを発現する前記細胞が、少なくとも１つの多型または遺伝子操作された対立遺伝子を有するゲノムＤＮＡを含み、前記多型または遺伝子操作された対立遺伝子が、前記ＣＤ１１７の第２のアイソフォームを発現する細胞を有する患者のゲノムに存在せず、ＣＤ１１７～ＳＣＦの第１のアイソフォームのＫＤは、ＣＤ１１７～ＳＣＦの第２のアイソフォームのＫＤよりも０．２５倍未満、好ましくは０．３３倍未満、より好ましくは０．５倍未満、最も好ましくは０．６６倍未満低い、使用のための哺乳動物細胞または細胞の集団に関する。

【0096】

本開示に沿って、本開示の方法および組成物の中でＣＤ１１７のさらなる変異体またはアイソフォームを組み合わせることも可能である。そのようなアイソフォームは、例えば二重変異体を含み得る。そのようなアイソフォームは、例えば、単一変異体および二重変異体も含み得る。本開示の方法および組成物はまた、ＣＤ１１７ノックアウト、例えば永続的ノックアウトまたは一時的ノックアウト（例えばＣＲＩＳＰＲｏｆｆを介して）を有する細胞と組み合わせることができる。本開示の方法および組成物はまた、腫瘍の応答を増強するために、固形腫瘍における骨髄細胞の枯渇において使用され得る。

【0097】

本開示の方法および組成物はまた、特に前記表面タンパク質が、ＣＤ４５、ＣＤ１２３、ＣＤ３３、ＣＤ７、ＣＬＥＣ１２Ａ、ＣＤ４４、ＦＬＴ３、ＣＤ３００Ｆ、ＥＶＩ２Ｂ、ＴＰＯおよびそれらの組み合わせなどの他の標的をノックアウトしたＣＤ１１７である場合、細胞の組み合わせと組み合わせることができる。

【0098】

本開示の方法および組成物はまた、ＣＤ１１７の第１のアイソフォーム（ＣＤ１１７変異体）および他の表面タンパク質変異体、例えばＣＤ１２３変異体、ＣＤ３３変異体、ＣＤ７変異体、ＣＬＥＣ１２Ａ変異体、ＣＤ４５変異体ＦＬＴ３変異体、ＣＤ３００Ｆ変異体、ＥＶＩ２Ｂ変異体、ＴＰＯ変異体およびそれらの任意の組み合わせを発現する細胞を含み得る。

【0099】

ＣＤ１１７の多型
本開示によるＣＤ１１７の第１のアイソフォームを発現する細胞は、前記ＣＤ１１７をコードする核酸に、少なくとも１つの多型対立遺伝子を有するゲノムＤＮＡを含む。特に、前記多型は、前記第２のアイソフォームと比較して、特定の薬剤の結合に関与する少なくとも１つの変異を誘導する。

【0100】

前記多型は、好ましくは、第１の薬剤の結合に関与するＣＤ１１７の表面タンパク質領域をコードする核酸配列内部にあり、好ましくはＣＤ１１７の細胞外部分、特に溶媒露出二次構造要素に位置する。より詳細には、前記多型は、第１の薬剤の結合に関与する少なくとも１つの特定のアミノ酸残基をコードする核酸配列内部にある。前記多型は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５または２０ヌクレオチドの欠失、置換、挿入またはそれらの組み合わせなどの突然変異であり得る。特定の実施形態では、前記多型は一塩基多型である。

【0101】

２つのアイソフォームの配列の相違はまた、遺伝的に導入され得る。また、ここで、配列の相違は、好ましくは、第１の薬剤の結合に関与するＣＤ１１７領域をコードする核酸配列内部にあり、好ましくは前記表面タンパク質の細胞外部分、特に溶媒露出二次構造要素に位置する。より詳細には、前記配列の相違は、第１の薬剤の結合に関与する少なくとも１つの特定のアミノ酸残基をコードする核酸配列内部にある。前記配列の相違は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５または２０ヌクレオチドの欠失、置換、および／または挿入などの突然変異であり得る。特定の実施形態では、前記配列の相違は単一点の変異である。

【0102】

本開示は、特に残基Ｅ７３、Ｔ７４、Ｖ１２０、Ｄ１２１、Ｒ１２２、Ｓ１２３、Ｙ１２５、Ｋ１２７、Ｋ１９３、Ｉ２０１、Ｋ２０３、Ｓ２３９、Ｙ２５９、Ｎ２６０、Ｓ２６１、Ｄ２６６、Ｙ２６９またはＲ２７１の置換を含む多型を含む、ＣＤ１１７における多型を提供する。特定の実施形態において、本開示は、残基Ｅ７３、Ｖ１２０、Ｄ１２１、Ｒ１２２、Ｓ１２３、Ｋ１２７、Ｋ１９３、Ｓ２３９、Ｙ２５９またはＳ２６１の置換を含む特定の多型を含む、ＣＤ１１７における多型を提供する。特定の実施形態において、本開示は、残基Ｅ７３、Ｄ１２１、Ｒ１２２、Ｓ１２３、Ｓ２３９、Ｙ２５９またはＳ２６１の置換を含む特定の多型を含む、ＣＤ１１７における多型を提供する。他の実施形態では、本開示は、特に残基Ｅ７３、Ｄ１２１またはＳ１２３の置換を含む多型を含む、ＣＤ１１７の多型を提供する。特に好ましい多型には、残基Ｅ７３の置換が含まれ、Ｅ７３は、Ｋ、Ｌ、Ｑ、Ｇ、ＹおよびＲからなる群から選択されるアミノ酸で置換されている。好ましくは、前記置換は、Ｅ７３Ｋ、Ｅ７３ＹまたはＥ７３Ｒである。他の好ましい多型としては、残基Ｄ１２１の置換が挙げられ、Ｄ１２１は、Ｓ、Ｖ、Ｙ、Ｈ、Ｋ、ＲおよびＴからなる群から選択されるアミノ酸で置換されている。好ましくは、前記置換は、Ｄ１２１Ｙ、Ｄ１２１Ｈ、Ｄ１２１Ｋ、Ｄ１２１ＲまたはＤ１２１Ｔである。最も好ましくは、前記置換はＤ１２１ＨまたはＤ１２１Ｋである。他の好ましい多型としては、残基Ｓ１２３の置換が挙げられ、ここで、Ｓ１２３は、Ｐ、ＦまたはＫで置換される。最も好ましくは、前記置換はＳ１２３Ｋである。他の好ましい多型には、残基Ｓ２３９の置換が含まれ、Ｓ２３９はＨまたはＫで置換されている。他の好ましい多型には、Ｋ１９３がＧ、Ｔ、Ｍ、ＤまたはＥで置換されている、残基Ｋ１９３の置換が含まれる。さらに他の好ましい多型には、Ｙ２５９がＥ、Ａ、Ｇ、Ｐ、ＣおよびＨからなる群から選択されるアミノ酸で置換されている、残基Ｙ２５９の置換が含まれる。好ましくは、前記置換はＹ２５９Ｐ、Ｙ２５９ＡまたはＹ２５９Ｇである。最も好ましくは、前記置換はＹ２５９Ａである。

【0103】

特定の実施形態では、本開示は、ＣＤ１１７の変異体を提供し、前記ＣＤ１１７の変異体は、配列番号１のアミノ酸配列を含み、アミノ酸の１つまたは複数は、Ｅ７３、Ｔ７４、Ｖ１２０、Ｄ１２１、Ｒ１２２、Ｓ１２３、Ｙ１２５、Ｋ１２７、Ｋ１９３、Ｉ２０１、Ｋ２０３、Ｓ２３９、Ｙ２５９、Ｎ２６０、Ｓ２６１、Ｄ２６６、Ｙ２６９およびＲ２７１からなる群から選択され、好ましくはＥ７３、Ｖ１２０、Ｄ１２１、Ｒ１２２、Ｓ１２３、Ｋ１２７、Ｋ１９３、Ｓ２３９、Ｙ２５９およびＳ２６１からなる群から選択され、より好ましくはＥ７３、Ｄ１２１、Ｒ１２２、Ｓ１２３、Ｓ２３９、Ｙ２５９およびＳ２６１からなる群から選択され、最も好ましくはＥ７３、Ｄ１２１およびＳ１２３からなる群から選択され、置換される。特定の好ましい実施形態では、前記アミノ酸はＥ７３である。他の好ましい実施形態では、前記アミノ酸はＤ１２１である。他の好ましい実施形態では、前記アミノ酸はＳ１２３である。他の好ましい実施形態では、前記アミノ酸はＳ２３９である。他の好ましい実施形態では、前記アミノ酸はＹ２５９である。

【0104】

一定の実施形態では、本開示は、ＣＤ１１７の変異体であって、前記ＣＤ１１７の変異体が、配列番号１のアミノ酸配列を含み、残基Ｅ７３が、Ｋ、Ｌ、Ｑ、Ｇ、ＹおよびＲからなる群より選択されるアミノ酸、好ましくはＥ７３Ｋ、Ｅ７３ＹまたはＥ７３Ｒで置換されている変異体を提供する。特定の実施形態では、本開示は、ＣＤ１１７の変異体を提供し、前記ＣＤ１１７の変異体は、配列番号１のアミノ酸配列を含み、残基Ｄ１２１は、Ｓ、Ｖ、Ｙ、Ｈ、Ｋ、ＲおよびＴ、好ましくはＹ、Ｈ、Ｋ、ＲまたはＴ、最も好ましくはＨまたはＫからなる群から選択されるアミノ酸で置換されている。一定の実施形態では、本開示は、ＣＤ１１７の変異体であって、配列番号１のアミノ酸配列を含み、残基Ｓ１２３がＰ、ＦまたはＫ、最も好ましくはＫで置換されている、ＣＤ１１７の変異体を提供する。一定の実施形態では、本開示は、ＣＤ１１７の変異体であって、配列番号１のアミノ酸配列を含み、残基Ｓ２３９がＨまたはＫで置換されている、ＣＤ１１７の変異体を提供する。一定の実施形態では、本開示は、ＣＤ１１７の変異体であって、配列番号１のアミノ酸配列を含み、残基Ｋ１９３がＧ、Ｔ、Ｍ、ＤまたはＥで置換されている、ＣＤ１１７の変異体を提供する。特定の実施形態では、本開示は、ＣＤ１１７の変異体を提供し、前記ＣＤ１１７の変異体は、配列番号１のアミノ酸配列を含み、残基Ｙ２５９は、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｐ、ＣおよびＨ、好ましくはＰ、ＡまたはＧ、最も好ましくはＡからなる群から選択されるアミノ酸で置換されている。

【0105】

一定の実施形態では、本開示は、哺乳動物細胞またはＣＤ１１７の前述の変異体の１つを発現する細胞の集団に関する。

【0106】

アミノ酸は、いずれも当業者によく知られている３文字コードまたは１文字コードによって指定され得ることが理解されよう。

【0107】

表１は、２０個の天然アミノ酸を示す。

【0108】

【表1】

【0109】

天然の多型
特定の実施形態では、本開示による前記細胞は、前記アイソフォームをコードする核酸において、少なくとも１つの天然多型対立遺伝子、好ましくは一塩基多型（ＳＮＰ）を有する天然ゲノムＤＮＡを含む対象から選択される。

【0110】

特定の実施形態では、細胞は、好ましくは前記表面タンパク質の細胞外部分、より好ましくは溶媒露出二次構造要素に位置する、抗ＣＤ１１７剤結合に関与するＣＤ１１７領域をコードする核酸配列において、少なくとも１つの天然多型対立遺伝子、特にＳＮＰを有する天然ゲノムＤＮＡを含む対象から選択される。

【0111】

特定の天然に存在するＳＮＰが文献に記載されている。これらの天然のＳＮＰは、そのようなＳＮＰをＣＤ１１７の別のアイソフォームと区別することができるそれぞれの結合剤と共に、本開示の精神の範囲内で使用され得る。

【0112】

ヒトＣＤ１１７のいくつかの天然に存在するＳＮＰを表２に示す。天然に存在するＳＮＰのリストはまた、ｇｎｏｍＡＤデータベース：ｈｔｔｐｓ：／／ｇｎｏｍａｄ．ｂｒｏａｄｉｎｓｔｉｔｕｔｅ．ｏｒｇ／ｇｅｎｅ／ＥＮＳＧ０００００１５７４０４？ｄａｔａｓｅｔ＝ｇｎｏｍａｄ＿ｒ２＿１で見出せる。

【0113】

【表2】

【0114】

遺伝子編集
別の特定の実施形態では、本開示によるＣＤ１１７の第１のアイソフォームを発現する前記細胞は、遺伝子編集によって、好ましくは患者の天然ゲノムＤＮＡの前記表面タンパク質をコードする配列を変更することによって、得られる。

【0115】

細胞は、表面タンパク質のアミノ酸の挿入、欠失および／または置換をもたらす前記多型を誘導する遺伝子編集システムを細胞に導入することによって、遺伝子操作することができる。前記遺伝子編集モダリティは、本明細書では上記の第１の薬剤結合に関与する表面タンパク質領域をコードする標的配列と呼ばれる核酸配列を標的とする。特に、前記表面タンパク質がＣＤ１１７である場合、前記遺伝子編集様式は、配列番号１の位置Ｅ７３、Ｔ７４、Ｖ１２０、Ｄ１２１、Ｒ１２２、Ｓ１２３、Ｙ１２５、Ｋ１２７、Ｋ１９３、Ｉ２０１、Ｋ２０３、Ｓ２３９、Ｙ２５９、Ｎ２６０、Ｓ２６１、Ｄ２６６、Ｙ２６９またはＲ２７１の少なくとも１つのアミノ酸残基をコードする核酸を標的とする。好ましくは、アミノ残基Ｅ７３は、Ｋ、Ｌ、Ｑ、Ｇ、ＹおよびＲからなる群から選択される、好ましくはＫ、ＹおよびＲからなる群から選択されるアミノ酸で置換される。また好ましくは、アミノ酸残基Ｄ１２１は、Ｓ、Ｖ、Ｙ、Ｈ、Ｋ、ＲまたはＴ、好ましくはＹ、Ｈ、Ｋ、ＲまたはＴ、最も好ましくはＨまたはＫで置換される。また、好ましくは、アミノ酸残基Ｓ１２３は、Ｐ、ＦまたはＫ、最も好ましくはＫで置換される。また、好ましくは、アミノ酸残基Ｋ１９３は、Ｇ、Ｔ、Ｍ、ＤまたはＥで置換される。また好ましくは、アミノ酸残基Ｓ２３９は、ＨまたはＫで置換される。また、好ましくは、アミノ酸残基Ｙ２５９は、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｐ、ＣまたはＨ、より好ましくはＰ、ＡまたはＧ、最も好ましくはＡで置換される。

【0116】

遺伝子編集酵素は、配列特異的ヌクレアーゼ、塩基エディタ、プライムエディタまたはＣＲＩＳＰＲトランスポゾンベースの系であり得る。

【0117】

「ヌクレアーゼ」という用語は、核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）分子、好ましくはＤＮＡ分子のヌクレオチド間のホスホジエステル結合の加水分解（切断）を触媒することができる野生型または変異型酵素を指す。「切断」とは、二本鎖切断または一本鎖切断事象を意味する。

【0118】

「配列特異的ヌクレアーゼ」という用語は、配列特異的に核酸を切断するヌクレアーゼを指す。メガヌクレアーゼ、ＴＡＬヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、または集まって規則的に間を空けて配置された短い回文配列の繰り返し（ＣＲＩＳＰＲ）／Ｃａｓ系およびアルゴノートのようなＲＮＡ／ＤＮＡガイドエンドヌクレアーゼなど、異なるタイプの部位特異的ヌクレアーゼを使用することができる（Ｒｅｖｉｅｗ ｉｎ Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｓｉｇｎａｌ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｔｈｅｒａｐｙ，５，２０２０；Ｇｕｈａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｊｏｕｒｎａｌ，２０１７，１５，１４６－１６０）。

【0119】

本開示によれば、ヌクレアーゼは、標的配列内にＤＮＡ切断を生じさせ、前記標的配列は、上記のように第１の薬剤結合に関与する表面タンパク質領域をコードする。特定の実施形態では、本発明者らは、ＣＲＩＳＰＲのシステムを使用して、上記のように第１の薬剤によって認識される表面タンパク質領域をコードする標的配列内で切断を誘導する。

【0120】

「標的配列」とは、上記のように記載した第１の薬剤結合に関与するＣＤ１１７の領域をコードする配列の一部および／または特に第１の薬剤結合に関与するＣＤ１１７の前記領域に隣接する最大５０ヌクレオチド、好ましくは前記薬剤結合部位に隣接する２０、１５、１０、９、８、７、６または５ヌクレオチドの第１の薬剤結合に関与するＣＤ１１７の前記領域に隣接する少なくとも１つ（１つまたは２つ）の配列を標的とすることを意図する。

【0121】

ＣＲＩＳＰＲシステムは、２つ以上の成分、Ｃａｓタンパク質（ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質）およびガイドＲＮＡを含む。ガイドＲＮＡは、単一ガイドＲＮＡまたは二重ガイドＲＮＡであり得る。Ｃａｓタンパク質は、ガイドＲＮＡ配列をガイドとして使用して、標的配列に相補的なＤＮＡの二本鎖の切断を認識および生成するＤＮＡエンドヌクレアーゼである。一本鎖切断を生じるＣａｓ系は、１つのヌクレアーゼドメインのみを必要とする。二本鎖切断を生じるＣａｓ系は、２つのヌクレアーゼドメインを必要とする。Ｃａｓタンパク質は、２つの活性切断部位、例えばＨＮＨヌクレアーゼドメインおよびＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメインを含み得る。

【0122】

Ｃａｓタンパク質はまた、標的核酸配列を切断することができるＣａｓ ９の操作されたエンドヌクレアーゼ、ホモログまたはオルソログを意味する。特定の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、二本鎖切断または一本鎖切断のいずれかに対応し得る核酸標的配列の切断を誘導し得る。Ｃａｓタンパク質変異体は、天然には存在せず、タンパク質のエンジニアリングまたはランダムな突然変異誘発によって得られるＣａｓエンドヌクレアーゼであり得る。Ｃａｓタンパク質は、当技術分野で公知のＣａｓタンパク質の１つのタイプであり得る。Ｃａｓタンパク質の非限定的な例としては、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９（ＣｓｎｌおよびＣｓｘｌ２としても知られる）、ＳａＣａｓ９、Ｃａｓ１２、Ｃａｓ１２ａ（Ｃｐｆ１）、ＣａｓｌＯ、Ｃｓｙｌ、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅｌ、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃｌ、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｍｒｌ、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｎｒｒ６、Ｃｓｂｌ、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘｌ７、ＣｓｘＭ、ＣｓｘｌＯ、Ｃｓｌ６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｌ、Ｃｓｘｌ５、Ｃｓｆｌ、Ｃｓｆ２、ＣｓＯ、Ｃｓｆ４、そのホモログ、オルソログ、またはそれらの改変型が挙げられる。好ましくは、Ｃａｓタンパク質は化膿性連鎖球菌Ｃａｓ９タンパク質である。

【0123】

Ｃａｓを、標的配列との相補的な配列を含むように設計されたガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）と接触させて、前記標的配列内、特に本開示によれば、上記の薬剤によって認識される表面タンパク質領域をコードする標的配列の一部の相補配列のＤＮＡ切断を特異的に誘導する。

【0124】

本明細書で使用される場合、「ガイドＲＮＡ」、「ｇＲＮＡ」、「ｓｇＲＮＡ」または「単一ガイドＲＮＡ」は、標的核酸へのｇＲＮＡ／Ｃａｓ複合体の特異的標的化またはホーミングを促進する核酸を指す。

【0125】

特に、ｇＲＮＡは、トランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）およびｃｒＲＮＡを含むＲＮＡを指す。好ましくは、前記ガイドＲＮＡは、単一のガイドＲＮＡを生成するため別々に使用され得るかまたは一緒に融合され得るｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡに対応する。標的配列との相補的な配列対合は、Ｃａｓを動員して、標的配列においてＤＮＡに結合して切断する。

【0126】

本開示によれば、ｃｒＲＮＡは、薬剤によって認識される表面タンパク質領域を標的化することができるように、薬剤によって認識される表面タンパク質領域をコードする上記の標的配列の一部に相補的な配列を含むように操作される。好ましい実施形態では、ｓｇＲＮＡは、前記結合剤の結合部位を標的化するために使用される。別の好ましい実施形態では、ガイドＲＮＡは、当業者に公知の化学修飾を含む。

【0127】

特定の実施形態では、ｃｒＲＮＡは、標的配列に相補的な５～５０ヌクレオチド、好ましくは１５～３０ヌクレオチド、より好ましくは２０ヌクレオチドの配列を含む。本明細書で使用される場合、「相補配列」という用語は、標準的な低ストリンジェントな条件下でポリヌクレオチドの別の部分にハイブリダイズすることができるポリヌクレオチド（例えばｃｒＲＮＡまたはｔｒａｃＲＮＡの一部）の配列部分を指す。好ましくは、配列は、鎖間のワトソン－クリック塩基対合、すなわちアデニン・チミン（Ａ－Ｔ）ヌクレオチドとグアニン・シトシン（Ｇ－Ｃ）ヌクレオチドとの間の固有の塩基対合に依存する２つの核酸鎖間の相補性に従って、互いに相補的である。前記ｇＲＮＡは、本開示を考慮して当業者に公知の任意の方法によって設計することができる。

【0128】

本開示によれば、前記標的配列は、第１の薬剤結合に関与するＣＤ１１７の表面タンパク質領域をコードし、好ましくはＣＤ１１７の細胞外部分に位置し、より好ましくは前記第２のアイソフォームと比較して細胞外ループに位置し、やはりより好ましくは、薬剤の結合に関与するアミノ酸残基を含む。

【0129】

好ましい実施形態では、表面タンパク質がＣＤ１１７である場合、前記標的配列は、上に開示されるような抗ＣＤ１１７剤結合などの第１の薬剤の結合に関与するＣＤ１１７領域をコードする。好ましくは、前記標的配列は、配列番号１のＥ７３、Ｔ７４、Ｖ１２０、Ｄ１２１、Ｒ１２２、Ｓ１２３、Ｙ１２５、Ｋ１２７、Ｋ１９３、Ｉ２０１、Ｋ２０３、Ｓ２３９、Ｙ２５９、Ｎ２６０、Ｓ２６１、Ｄ２６６、Ｙ２６９またはＲ２７１位の少なくとも１つの残基をコードする。

【0130】

特定の実施形態では、前記ｃｒＲＮＡは、第１の薬剤の結合に関与するＣＤ１１７領域をコードする配列を標的とし、特に表３に記載の配列の１つ（ｃｒＲＮＡ配列）を含み得る。

【0131】

【表3】

【0132】

換言すれば、表面タンパク質がＣＤ１１７である場合、前記核酸構築物は、好ましくは、以下を含み得る
－配列番号１のアミノ酸残基Ｅ７３をコードする配列を標的とする配列番号３～８のｇＲＮＡ配列、または
－配列番号１のアミノ酸残基Ｖ１２０、Ｄ１２１、Ｒ１２２、Ｓ１２３をコードする配列を標的とする、配列番号９～１４からなる群から選択されるｇＲＮＡ配列。

【0133】

他の特定の実施形態において、遺伝子編集は、ＨＤＲを介して行われ、ＨＤＲ鋳型は、表４に示される配列のうちの１つを含み得る。

【0134】

【表4】

【0135】

本開示によるヌクレアーゼによって導入されるＤＮＡ鎖の切断は、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）を介した切断部位でのＤＮＡの突然変異をもたらし得、これは頻繁に、相同組換え修復（ＨＤＲ）を介した切断部位周囲のＤＮＡの小さな挿入および／または欠失または置換をもたらす。

【0136】

好ましい実施形態では、ＣＤ１１７のアイソフォームをコードする核酸内部の前記多型は、ＤＮＡ切断後のＨＤＲ修復、および本明細書でＨＤＲ鋳型と呼ばれる外因性ヌクレオチド配列の導入を介して誘導される。

【0137】

ＨＤＲ鋳型は、標的配列の領域５’および３’にそれぞれ相同な配列の第１および第２の部分と、多型を含む中間配列部分とを含む。標的配列の切断に続いて、標的配列を含有するゲノムとＨＤＲ鋳型との間で相同組換え事象が達成され、標的配列を含有するゲノム配列が外因性配列によって置き換えられる。

【0138】

好ましくは、少なくとも２０ｂｐ、好ましくは３０ｂｐ超、好ましくは５０ｂｐ超、より好ましくは２００ｂｐ未満の相同配列が使用される。相同配列は、ｄｓＤＮＡまたはｓｓＤＮＡであり得る。好ましくは、相同配列はｄｓ ＤＮＡである。実際、共有するＤＮＡ相同性は、切断部位の上流および下流に隣接する領域に位置し、導入される外因性配列は、２つのアームの間に位置するはずである。隣接する配列は、対称であっても非対称であってもよい。標的核酸の両方の鎖、すなわちプラス鎖またはマイナス鎖が標的化され得る。任意選択で、ＨＤＲを改善するためにサイレンシングされ得るＰＡＭシーケンスが使用されてもよい。

【0139】

好ましい実施形態では、本開示による細胞は、上記のような前記第１の薬剤によって認識されるＣＤ１１７の領域をコードする配列およびＨＤＲ鋳型を標的とする前記部位特異的ヌクレアーゼを前記細胞に導入することによって遺伝子操作される。

【0140】

別の特定の実施形態では、前記遺伝子編集酵素は、Ｋｏｍｏｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ５３３，４２０－４２４，ａｎｄ ｉｎ Ｒｅｅｓ ＨＡ，Ｌｉｕ ＤＲ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｇｅｎｅｔ．２０１８；１９：７７０－７８８に記載されているＤＮＡ塩基エディタであるか、またはＡｎｚａｌｏｎｅ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ，２０１９，５７６：１４９－１５７，Ｍａｔｓｏｕｋａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｆｒｏｎｔ Ｇｅｎｅｔ．（２０２０）１１：５２８，Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ（２０２１）１８４：５６３５－５２，Ｋｏｂｌａｎ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ（２０２１）３９：１４１４－２５ ａｎｄ Ｋａｎｔｏｒ Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｓｃｉ．２０２０，２１（６２４０）で説明されているように、プライムエディタである。塩基エディタまたはプライムエディタを使用して、標的配列の特定の部位に突然変異を導入することができる。

【0141】

本開示によれば、塩基エディタまたはプライムエディタは、第１の薬剤結合に関与するＣＤ１１７の領域をコードする配列の配列特異的標的化によって標的配列の内部に突然変異を生成する。

【0142】

特に、前記塩基エディタまたはプライムエディタは、ＣＲＩＳＰＲベースまたはプライムエディタである。前記ＣＲＩＳＰＲ塩基またはプライムエディタは、触媒的に不活性な配列特異的ヌクレアーゼとして、死んだＣａｓタンパク質（ｄＣａｓ）を含み得る。それはまた、変異ヌクレアーゼドメインを有するＣａｓ９を含み得る。ｄＣａｓは、エンドヌクレアーゼ活性を欠く改変Ｃａｓヌクレアーゼを指す。ヌクレアーゼ活性は、Ｃａｓタンパク質のＨＮＨおよび／またはＲｕｖＣ様触媒ドメインにおける１つ以上の突然変異および／または１つ以上の欠失によって、ｄＣａｓタンパク質において阻害または防止され得る。得られたｄＣａｓタンパク質はヌクレアーゼ活性を欠くが、特異的標的配列に対して高い特異性および効率でガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）－ＤＮＡ複合体に結合する。特定の実施形態では、前記ｄＣａｓは、Ｃａｓの１つの触媒ドメインが阻害または防止されるＣａｓニッカーゼであり得る。

【0143】

前記塩基エディタを、標的核酸配列の相補的配列を含むように設計されたガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）と複合体を形成させて、上記のように前記標的配列に特異的に結合させる。

【0144】

前記ｇＲＮＡは、本開示を考慮して当業者に公知の任意の方法によって設計することができる。特定の実施形態では、前記ｇＲＮＡは、上記のように前記第１の薬剤によって認識されるＣＤ１１７上の領域をコードする配列を標的とし得る。

【0145】

非限定的な例として、前記塩基エディタは、死んだＣａｓタンパク質、特にＣａｓニッカーゼに融合したヌクレオチドデアミナーゼドメインである。前記ヌクレオチドデアミナーゼは、アデノシンデアミナーゼまたはシチジンデアミナーゼであり得る。前記ヌクレオチドデアミナーゼは、天然または操作されたデアミナーゼであり得る。

【0146】

特定の実施形態では、前記塩基エディタは、ＢＥ１、ＢＥ２、ＢＥ３、ＢＥ４、ＨＦ－ＢＥ３、Ｓａ－ＢＥ３、Ｓａ－ＢＥ４、ＢＥ４－Ｇａｍ、ｓａＢＥ４－Ｇａｍ、ＹＥ１－ＢＥ３、ＥＥ－ＢＥ３、ＹＥ２－ＢＥ３、ＹＥＥ－ＢＥ３、ＶＱＲ－ＢＥ３、ＶＲＥＲ－ＢＥ３、ＳａＫＫＨ－ＢＥ３、ｃａｓ１２ａ－ＢＥ、Ｔａｒｇｅｔ－ＡＩＤ、Ｔａｒｇｅｔ－ＡＩＤ－ＮＧ、ｘＢＥ３、ｅＡ３Ａ－ＢＥ３、Ａ３Ａ－ＢＥ３、ＢＥ－ＰＬＵＳ、ＴＡＭ、ＣＲＩＰＳ－Ｘ、ＡＢＥ７．９、ＡＢＥ７．１０、ＡＢＥ７．１０＊ｘＡＢＥ、ＡＢＥＳａ、ＡＢＥｍａｘ、ＡＢＥ８ｅ、ＶＱＲ－ＡＢＥ、ＶＲＥＲ－ＡＢＥおよびＳａＫＫＨ－ＡＢＥからなる群から選択される非限定的な例であってもよい。

【0147】

前記プライムエディタは、上記の触媒的に不活性な配列特異的ヌクレアーゼ、特にＣａｓニッカーゼと触媒的に活性な操作された逆転写酵素（ＲＴ）酵素との融合からなる。前記融合タンパク質は、特に表面タンパク質がＣＤ１１７である場合、上記の標的配列と相補的な配列を含むプライム編集ガイドＲＮＡ（ｐｅｇＲＮＡ）と併用して使用され、表３に記載の配列の１つと、ＤＮＡのプライマー結合部位領域に結合する配列も含む追加の配列を含む。特定の実施形態では、前記逆転写酵素は、マロニーマウス白血病ウイルスＲＴ酵素およびその変異体である。前記プライムエディタは、ＰＥ１、ＰＥ２、ＰＥ３およびＰＥ３ｂ、またはＣｈｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ（２０２１）１８４：５６３５－５２ ｏｒ Ｋｏｂｌａｎ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ（２０２１）３９：１４１４－２５に記載されているプライムエディタのいずれかからなる群から選択される非限定的な例であり得る。

【0148】

抗ＣＤ１１７剤
いくつかの抗ＣＤ１１７部分は当技術分野で公知であり、そのうちのいくつかは現在開発中である。抗体ＳＲ－１は、最初にハイブリドーマから単離された（国際公開第１９９２０１７５０５号）。ＳＲ－１のヒト化バージョンを作製した（国際公開第２００７１２７３１７号；国際公開第２０２０１１２６８７号）。抗ＣＤ１１７薬物コンジュゲートは、国際公開第２０１６０２０７９１号に記載されている。他の抗ＣＤ１１７抗体は、国際公開第２０１５０５０９５９号および国際公開第２０１９０８４０６４号に記載されている。特定の抗ＣＤ１１７抗体、例えば抗体１０４Ｄ２ Ｄｉａｎｏｖａ（＃１１７ＰＥ－１００Ｔ）も市販されている。これらおよび他の抗ＣＤ１１７部分は、本開示の文脈において使用され得る。いくつかの抗ＣＤ１１７抗体もまた、本開示において、完全長抗体フォーマットで、同様にまた、Ｆａｂフォーマットで作製された。詳細は実施例１に提供される。

【0149】

特定の実施形態では、ＣＤ１１７の前記第２のアイソフォームに結合し、上記のようにＣＤ１１７の前記第１のアイソフォームに結合しないかまたは実質的に弱く結合する前記枯渇剤は、配列番号１のアミノ酸Ｅ７３、Ｔ７４、Ｖ１２０、Ｄ１２１、Ｒ１２２、Ｓ１２３、Ｙ１２５、Ｋ１２７、Ｋ１９３、Ｉ２０１、Ｋ２０３、Ｓ２３９、Ｙ２５９、Ｎ２６０、Ｓ２６１、Ｄ２６６、Ｙ２６９および／またはＲ２７１を含むエピトープに特異的に結合する。より好ましくは、前記枯渇剤は、配列番号１のアミノ酸Ｅ７３、Ｖ１２０、Ｄ１２１、Ｒ１２２、Ｓ１２３、Ｋ１２７、Ｋ１９３、Ｓ２３９、Ｙ２５９および／またはＳ２６１を含むエピトープに特異的に結合する。さらにより好ましくは、前記枯渇剤は、配列番号１のアミノ酸Ｅ７３、Ｄ１２１、Ｒ１２２、Ｓ１２３、Ｓ２３９、Ｙ２５９および／またはＳ２６１を含むエピトープに特異的に結合する。最も好ましくは、前記枯渇剤は、配列番号１のアミノ酸Ｅ７３、Ｄ１２１および／またはＳ１２３を含むエピトープに特異的に結合する。

【0150】

好ましい実施形態では、前記抗ＣＤ１１７剤は、以下を含む抗原結合領域を含む、
ａ）ＶＨＣＤＲ１が配列番号１７であり、ＶＨＣＤＲ２が配列番号１８であり、ＶＨＣＤＲ３が配列番号１９である、３つのＣＤＲ、ＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２、およびＶＨＣＤＲ３を含む抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、および
ｂ）３つのＣＤＲ ＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２、およびＶＬＣＤＲ３を含む抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）であって、ＶＬＣＤＲ１は配列番号２０、ＶＬＣＤＲ２は配列番号２１、およびＶＬＣＤＲ３は配列番号２２である、抗体軽鎖可変ドメイン。

【0151】

別の好ましい実施形態では、前記抗ＣＤ１１７剤は、ＣＤ１１７またはＣＤ１１７の変異体への結合について抗原結合領域と競合し、前記抗ＣＤ１１７剤は、以下を含む：
ａ）ＶＨＣＤＲ１が配列番号１７であり、ＶＨＣＤＲ２が配列番号１８であり、ＶＨＣＤＲ３が配列番号１９である、３つのＣＤＲ、ＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２、およびＶＨＣＤＲ３を含む抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、および
ｂ）３つのＣＤＲ ＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２、およびＶＬＣＤＲ３を含む抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）であって、ＶＬＣＤＲ１は配列番号２０、ＶＬＣＤＲ２は配列番号２１、およびＶＬＣＤＲ３は配列番号２２である、抗体軽鎖可変ドメイン。

【0152】

別の実施形態では、前記抗ＣＤ１１７剤は、以下を含む抗原結合領域を含む、
ａ）ＶＨＣＤＲ１が配列番号１７であり、ＶＨＣＤＲ２が配列番号１８であり、ＶＨＣＤＲ３が配列番号１９である、３つのＣＤＲ、ＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２、およびＶＨＣＤＲ３を含む抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、および
ｂ）３つのＣＤＲ ＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２、およびＶＬＣＤＲ３を含む抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）であって、ＶＬＣＤＲ１は配列番号２０、ＶＬＣＤＲ２は配列番号２１、およびＶＬＣＤＲ３は配列番号２２である、抗体軽鎖可変ドメイン、
抗原結合領域は、以下の変異を含む：
●ＶＬＣＤＲ１領域（配列番号２０）のアスパラギンがグルタミン酸に置換されており、
●ＶＬＣＤＲ３領域（配列番号２２）のアスパラギン酸がグルタミン酸に置換されており、任意選択で、
●ＶＬＣＤＲ３領域（配列番号２２）の第２のアスパラギンがリジンに置換されている。

【0153】

別の好ましい実施形態では、前記抗ＣＤ１１７剤は、ＣＤ１１７またはＣＤ１１７の変異体への結合について抗原結合領域と競合し、前記抗ＣＤ１１７剤は、以下を含む：
ａ）ＶＨＣＤＲ１が配列番号１７であり、ＶＨＣＤＲ２が配列番号１８であり、ＶＨＣＤＲ３が配列番号１９である、３つのＣＤＲ、ＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２、およびＶＨＣＤＲ３を含む抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、および
ｂ）３つのＣＤＲ ＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２、およびＶＬＣＤＲ３を含む抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）であって、ＶＬＣＤＲ１は配列番号２０、ＶＬＣＤＲ２は配列番号２１、およびＶＬＣＤＲ３は配列番号２２である、抗体軽鎖可変ドメイン。
抗原結合領域は、以下の変異を含む：
●ＶＬＣＤＲ１領域（配列番号２０）のアスパラギンがグルタミン酸に置換されており、
●ＶＬＣＤＲ３領域（配列番号２２）のアスパラギン酸がグルタミン酸に置換されており、任意選択で、
●ＶＬＣＤＲ３領域（配列番号２２）の第２のアスパラギンがリジンに置換されている。

【0154】

別の実施形態では、前記抗ＣＤ１１７剤は、以下を含む抗原結合領域を含む、
ａ）ＶＨＣＤＲ１が配列番号１７であり、ＶＨＣＤＲ２が配列番号１８であり、ＶＨＣＤＲ３が配列番号１９である、３つのＣＤＲ、ＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２、およびＶＨＣＤＲ３を含む抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、および
ｂ）３つのＣＤＲ ＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２、およびＶＬＣＤＲ３を含む抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）であって、ＶＬＣＤＲ１は配列番号５９、ＶＬＣＤＲ２は配列番号２１、およびＶＬＣＤＲ３は配列番号６０である、抗体軽鎖可変ドメイン。

【0155】

別の好ましい実施形態では、前記抗ＣＤ１１７剤は、ＣＤ１１７またはＣＤ１１７の変異体への結合について抗原結合領域と競合し、前記抗ＣＤ１１７剤は、以下を含む：
ａ）ＶＨＣＤＲ１が配列番号１７であり、ＶＨＣＤＲ２が配列番号１８であり、ＶＨＣＤＲ３が配列番号１９である、３つのＣＤＲ、ＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２、およびＶＨＣＤＲ３を含む抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、および
ｂ）３つのＣＤＲ ＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２、およびＶＬＣＤＲ３を含む抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）であって、ＶＬＣＤＲ１は配列番号５９、ＶＬＣＤＲ２は配列番号２１、およびＶＬＣＤＲ３は配列番号６０である、抗体軽鎖可変ドメイン。

【0156】

別の実施形態では、前記抗ＣＤ１１７剤は、以下を含む抗原結合領域を含む、
ａ）ＶＨＣＤＲ１が配列番号１７であり、ＶＨＣＤＲ２が配列番号１８であり、ＶＨＣＤＲ３が配列番号１９である、３つのＣＤＲ、ＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２、およびＶＨＣＤＲ３を含む抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、および
ｂ）３つのＣＤＲ ＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２、およびＶＬＣＤＲ３を含む抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）であって、ＶＬＣＤＲ１は配列番号５９、ＶＬＣＤＲ２は配列番号２１、およびＶＬＣＤＲ３は配列番号６１である、抗体軽鎖可変ドメイン。

【0157】

別の好ましい実施形態では、前記抗ＣＤ１１７剤は、ＣＤ１１７またはＣＤ１１７の変異体への結合について抗原結合領域と競合し、前記抗ＣＤ１１７剤は、以下を含む：
ａ）ＶＨＣＤＲ１が配列番号１７であり、ＶＨＣＤＲ２が配列番号１８であり、ＶＨＣＤＲ３が配列番号１９である、３つのＣＤＲ、ＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２、およびＶＨＣＤＲ３を含む抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、および
ｂ）３つのＣＤＲ ＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２、およびＶＬＣＤＲ３を含む抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）であって、ＶＬＣＤＲ１は配列番号５９、ＶＬＣＤＲ２は配列番号２１、およびＶＬＣＤＲ３は配列番号６１である、抗体軽鎖可変ドメイン。

【0158】

別の好ましい実施形態では、前記抗ＣＤ１１７剤は、以下を含む抗原結合領域を含む、
ａ）配列番号１５の可変重鎖を含む抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）；および
ｂ）配列番号１６の可変軽鎖を含む抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）。

【0159】

別の好ましい実施形態では、前記抗ＣＤ１１７剤は、ＣＤ１１７またはＣＤ１１７の変異体への結合について抗原結合領域と競合し、前記抗ＣＤ１１７剤は、以下を含む：
ａ）配列番号１５の可変重鎖を含む抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）；および
ｂ）配列番号１６の可変軽鎖を含む抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）。

【0160】

別の好ましい実施形態では、前記抗ＣＤ１１７剤は、以下を含む抗原結合領域を含む、
ａ）配列番号１５の可変重鎖を含む抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）；および
ｂ）配列番号６２の可変軽鎖を含む抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）。

【0161】

別の好ましい実施形態では、前記抗ＣＤ１１７剤は、ＣＤ１１７またはＣＤ１１７の変異体への結合について抗原結合領域と競合し、前記抗ＣＤ１１７剤は、以下を含む：
ａ）配列番号１５の可変重鎖を含む抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）；および
ｂ）配列番号６２の可変軽鎖を含む抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）。

【0162】

別の好ましい実施形態では、前記抗ＣＤ１１７剤は、以下を含む抗原結合領域を含む、
ａ）配列番号１５の可変重鎖を含む抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）；および
ｂ）配列番号６３の可変軽鎖を含む抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）。

【0163】

別の好ましい実施形態では、前記抗ＣＤ１１７剤は、ＣＤ１１７またはＣＤ１１７の変異体への結合について抗原結合領域と競合し、前記抗ＣＤ１１７剤は、以下を含む：
ａ）配列番号１５の可変重鎖を含む抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）；および
ｂ）配列番号６３の可変軽鎖を含む抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）。

【0164】

別の好ましい実施形態では、前記抗ＣＤ１１７剤は、以下を含む抗原結合領域を含む、
ａ）ＶＨＣＤＲ１が配列番号２５であり、ＶＨＣＤＲ２が配列番号２６であり、ＶＨＣＤＲ３が配列番号２７である、３つのＣＤＲ、ＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２、およびＶＨＣＤＲ３を含む抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、および
ｂ）３つのＣＤＲ ＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２、およびＶＬＣＤＲ３を含む抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）であって、ＶＬＣＤＲ１は配列番号２８、ＶＬＣＤＲ２は配列番号２９、およびＶＬＣＤＲ３は配列番号３０である、抗体軽鎖可変ドメイン。

【0165】

別の好ましい実施形態では、前記抗ＣＤ１１７剤は、ＣＤ１１７またはＣＤ１１７の変異体への結合について抗原結合領域と競合し、前記抗ＣＤ１１７剤は、以下を含む：
ａ）ＶＨＣＤＲ１が配列番号２５であり、ＶＨＣＤＲ２が配列番号２６であり、ＶＨＣＤＲ３が配列番号２７である、３つのＣＤＲ、ＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２、およびＶＨＣＤＲ３を含む抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、および
ｂ）３つのＣＤＲ ＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２、およびＶＬＣＤＲ３を含む抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）であって、ＶＬＣＤＲ１は配列番号２８、ＶＬＣＤＲ２は配列番号２９、およびＶＬＣＤＲ３は配列番号３０である、抗体軽鎖可変ドメイン。

【0166】

別の好ましい実施形態では、前記抗ＣＤ１１７剤は、以下を含む抗原結合領域を含む、
ａ）配列番号２３の可変重鎖を含む抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）；および
ｂ）配列番号２４の可変軽鎖を含む抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）。

【0167】

別の好ましい実施形態では、前記抗ＣＤ１１７剤は、ＣＤ１１７またはＣＤ１１７の変異体への結合について抗原結合領域と競合し、前記抗ＣＤ１１７剤は、以下を含む：
ａ）配列番号２３の可変重鎖を含む抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）；および
ｂ）配列番号２４の可変軽鎖を含む抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）。

【0168】

別の好ましい実施形態では、前記抗ＣＤ１１７剤は、以下を含む抗原結合領域を含む、
ａ）ＶＨＣＤＲ１が配列番号３３であり、ＶＨＣＤＲ２が配列番号３４であり、ＶＨＣＤＲ３が配列番号３５である、３つのＣＤＲ、ＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２、およびＶＨＣＤＲ３を含む抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、および
ｂ）３つのＣＤＲ ＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２、およびＶＬＣＤＲ３を含む抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）であって、ＶＬＣＤＲ１は配列番号３６、ＶＬＣＤＲ２は配列番号３７、およびＶＬＣＤＲ３は配列番号３８である、抗体軽鎖可変ドメイン。

【0169】

別の好ましい実施形態では、前記抗ＣＤ１１７剤は、ＣＤ１１７またはＣＤ１１７の変異体への結合について抗原結合領域と競合し、前記抗ＣＤ１１７剤は、以下を含む：
ａ）ＶＨＣＤＲ１が配列番号３３であり、ＶＨＣＤＲ２が配列番号３４であり、ＶＨＣＤＲ３が配列番号３５である、３つのＣＤＲ、ＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２、およびＶＨＣＤＲ３を含む抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、および
ｂ）３つのＣＤＲ ＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２、およびＶＬＣＤＲ３を含む抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）であって、ＶＬＣＤＲ１は配列番号３６、ＶＬＣＤＲ２は配列番号３７、およびＶＬＣＤＲ３は配列番号３８である、抗体軽鎖可変ドメイン。

【0170】

別の好ましい実施形態では、前記抗ＣＤ１１７剤は、以下を含む抗原結合領域を含む、
ａ）配列番号３１の可変重鎖を含む抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）；および
ｂ）配列番号３２の可変軽鎖を含む抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）。

【0171】

別の好ましい実施形態では、前記抗ＣＤ１１７剤は、ＣＤ１１７またはＣＤ１１７の変異体への結合について抗原結合領域と競合し、前記抗ＣＤ１１７剤は、以下を含む：
ａ）配列番号３１の可変重鎖を含む抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）；および
ｂ）配列番号３２の可変軽鎖を含む抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）。

【0172】

別の好ましい実施形態では、前記抗ＣＤ１１７剤は、以下を含む抗原結合領域を含む、
ａ）ＶＨＣＤＲ１が配列番号４１であり、ＶＨＣＤＲ２が配列番号４２であり、ＶＨＣＤＲ３が配列番号４３である、３つのＣＤＲ、ＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２、およびＶＨＣＤＲ３を含む抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、および
ｂ）３つのＣＤＲ ＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２、およびＶＬＣＤＲ３を含む抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）であって、ＶＬＣＤＲ１は配列番号４４、ＶＬＣＤＲ２は配列番号４５、およびＶＬＣＤＲ３は配列番号４６である、抗体軽鎖可変ドメイン。

【0173】

別の好ましい実施形態では、前記抗ＣＤ１１７剤は、ＣＤ１１７またはＣＤ１１７の変異体への結合について抗原結合領域と競合し、前記抗ＣＤ１１７剤は、以下を含む：
ａ）ＶＨＣＤＲ１が配列番号４１であり、ＶＨＣＤＲ２が配列番号４２であり、ＶＨＣＤＲ３が配列番号４３である、３つのＣＤＲ、ＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２、およびＶＨＣＤＲ３を含む抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、および
ｂ）３つのＣＤＲ ＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２、およびＶＬＣＤＲ３を含む抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）であって、ＶＬＣＤＲ１は配列番号４４、ＶＬＣＤＲ２は配列番号４５、およびＶＬＣＤＲ３は配列番号４６である、抗体軽鎖可変ドメイン。

【0174】

別の好ましい実施形態では、前記抗ＣＤ１１７剤は、以下を含む抗原結合領域を含む、
ａ）配列番号３９の可変重鎖を含む抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）；および
ｂ）配列番号４０の可変軽鎖を含む抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）。

【0175】

別の好ましい実施形態では、前記抗ＣＤ１１７剤は、ＣＤ１１７またはＣＤ１１７の変異体への結合について抗原結合領域と競合し、前記抗ＣＤ１１７剤は、以下を含む：
ａ）配列番号３９の可変重鎖を含む抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）；および
ｂ）配列番号４０の可変軽鎖を含む抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）。

【0176】

別の好ましい実施形態では、前記抗ＣＤ１１７剤は、以下を含む抗原結合領域を含む、
ａ）ＶＨＣＤＲ１が配列番号４９であり、ＶＨＣＤＲ２が配列番号５０であり、ＶＨＣＤＲ３が配列番号５１である、３つのＣＤＲ、ＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２、およびＶＨＣＤＲ３を含む抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、および
ｂ）３つのＣＤＲ ＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２、およびＶＬＣＤＲ３を含む抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）であって、ＶＬＣＤＲ１は配列番号５２、ＶＬＣＤＲ２は配列番号５３、およびＶＬＣＤＲ３は配列番号５４である、抗体軽鎖可変ドメイン。

【0177】

別の好ましい実施形態では、前記抗ＣＤ１１７剤は、ＣＤ１１７またはＣＤ１１７の変異体への結合について抗原結合領域と競合し、前記抗ＣＤ１１７剤は、以下を含む：
ａ）ＶＨＣＤＲ１が配列番号４９であり、ＶＨＣＤＲ２が配列番号５０であり、ＶＨＣＤＲ３が配列番号５１である、３つのＣＤＲ、ＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２、およびＶＨＣＤＲ３を含む抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、および
ｂ）３つのＣＤＲ ＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２、およびＶＬＣＤＲ３を含む抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）であって、ＶＬＣＤＲ１は配列番号５２、ＶＬＣＤＲ２は配列番号５３、およびＶＬＣＤＲ３は配列番号５４である、抗体軽鎖可変ドメイン。

【0178】

別の好ましい実施形態では、前記抗ＣＤ１１７剤は、以下を含む抗原結合領域を含む、
ａ）配列番号４７の可変重鎖を含む抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）；および
ｂ）配列番号４８の可変軽鎖を含む抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）。

【0179】

別の好ましい実施形態では、前記抗ＣＤ１１７剤は、ＣＤ１１７またはＣＤ１１７の変異体への結合について抗原結合領域と競合し、前記抗ＣＤ１１７剤は、以下を含む：
ａ）配列番号４７の可変重鎖を含む抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）；および
ｂ）配列番号４８の可変軽鎖を含む抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）。

【0180】

抗ＣＤ１１７の抗原結合領域は、上で定義されたそれらの結合特性についてさらにスクリーニングまたは最適化され得ることがさらに企図される。特に、その前記抗原結合領域は、本明細書において提供されるモノクローナル抗体の１、２、３、４、５または６つのＣＤＲのアミノ酸配列において１、２、３、４、５、６またはそれを超える変化を有し得ることが企図される。抗原結合領域の軽鎖可変領域または重鎖可変領域のＶＪ領域またはＶＤＪ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、ＣＤＲ４、ＣＤＲ５、またはＣＤＲ６の１位、２位、３位、４位、５位、６位、７位、８位、９位または１０位のアミノ酸は、保存アミノ酸または非保存アミノ酸による挿入、欠失または置換を有し得ることが企図される。置換され得るかまたは置換を構成し得るそのようなアミノ酸は、上に開示されている。

【0181】

いくつかの実施形態では、アミノ酸の相違は、保存的置換、すなわち、類似の化学的または物理的特性（サイズ、電荷、または極性）を有する別のアミノ酸による１つのアミノ酸の置換であり、この置換は、一般に、抗体の生化学的、生物物理学的、および／または生物学的特性に悪影響を及ぼさない。特に、置換は、抗体とＣＤ１１７抗原との相互作用を破壊しない。前記保存的置換は、有利には、以下の５つの群、第１群－小脂肪性、非極性またはわずかに極性の残基（Ａ、Ｓ、Ｔ、Ｐ、Ｇ）；第２群－極性、負に荷電した残基、およびそれらのアミド（Ｄ、Ｎ、Ｅ、Ｑ）；第３群－極性、正に荷電した残基（Ｈ、Ｒ、Ｋ）；第４群－大脂肪、非極性残基（Ｍ、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｃ）；および第５群－大きな、芳香族残基（Ｆ、Ｙ、Ｗ）の中で選択される。

【0182】

より特定の実施形態では、前記第１の抗原結合領域が、配列番号１５、２３、３１、３９および４７から選択されるアミノ酸配列のいずれか１つを含むもしくはそれからなる重鎖可変ドメイン、および／または配列番号１６、６２、６３、２４、３２、４０および４８から選択されるアミノ酸配列のいずれか１つを含むもしくはそれからなる軽鎖可変ドメインを含む。

【0183】

上で定義されたアミノ酸配列のいずれか１つと少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を有するその前記第１の抗原結合領域はまた、本開示の一部であり、典型的には、第１の抗原結合領域は、配列番号１５、２３、３１、３９および４７から選択されるアミノ酸配列のいずれか１つからなる重鎖および／乾燥または、配列番号１６、６２、６３、２４、３２、４０および４８から選択されるアミノ酸配列のいずれか１つを含むまたはからなる軽鎖可変ドメインからなる前記第１の抗原結合領域と少なくとも同等またはそれより高次の結合活性を有する。

【0184】

特定の実施形態では、前記抗ＣＤ１１７剤は、ＣＤ１１７に対する少なくとも１つの第１の結合特異性、例えば本明細書に記載の抗ＣＤ１１７の１つの抗原結合領域、および第２の標的エピトープまたは標的抗原に対する第２の結合特異性を含む二重特異性ＣＤ１１７抗体であり得る。

【0185】

本開示によれば、前記抗ＣＤ１１７剤は、ＣＤ１１７標的抗原受容体、例えばＣＤ１１７標的ＣＡＲを有する免疫細胞であり得、前記抗原受容体は上記の抗原結合領域を含む。

【0186】

特定の実施形態では、ＣＤ１１７標的ＣＡＲを有する前記免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）は、それを必要とする患者において発現されるＣＤ１１７の第２のアイソフォームを認識し、ＣＤ１１７の第１のアイソフォームを認識しない。特に、前記免疫細胞は、配列番号１のアミノ酸Ｅ７３、Ｔ７４、Ｖ１２０、Ｄ１２１、Ｒ１２２、Ｓ１２３、Ｙ１２５、Ｋ１２７、Ｋ１９３、Ｉ２０１、Ｋ２０３、Ｓ２３９ Ｙ２５９、Ｎ２６０、Ｓ２６１、Ｄ２６６、Ｙ２６９および／またはＲ２７１を含むエピトープに特異的に結合し得る。より好ましくは、前記免疫細胞は、配列番号１のアミノ酸Ｅ７３、Ｖ１２０、Ｄ１２１、Ｒ１２２、Ｓ１２３、Ｋ１２７、Ｋ１９３、Ｓ２３９、Ｙ２５９および／またはＳ２６１を含むエピトープに特異的に結合する。さらにより好ましくは、前記免疫細胞は、配列番号１のアミノ酸Ｅ７３、Ｄ１２１、Ｒ１２２、Ｓ１２３、Ｓ２３９、Ｙ２５９および／またはＳ２６１を含むエピトープに特異的に結合する。最も好ましくは、前記免疫細胞は、配列番号１のアミノ酸Ｅ７３、Ｄ１２１および／またはＳ１２３を含むエピトープに特異的に結合する。

【0187】

特定の実施形態では、前記抗ＣＤ１１７剤は、ＣＡＲを有する免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）であり得、前記ＣＡＲは、抗原結合領域、例えばｓｃＦｖを含み、抗原結合領域は以下を含む、
ａ）ＶＨＣＤＲ１が配列番号１７であり、ＶＨＣＤ２が配列番号１８であり、ＶＨＣＤＲ３が配列番号１９である、３つのＣＤＲ、ＶＨＣＤ１、ＶＨＣＤＲ２、およびＶＨＣＤＲ３を含む抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、および
ｂ）３つのＣＤＲ ＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２、およびＶＬＣＤＲ３を含む抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）であって、ＶＬＣＤＲ１は配列番号２０、ＶＬＣＤＲ２は配列番号２１、ＶＬＣＤＲ３は配列番号２２である、抗体軽鎖可変ドメイン。

【0188】

特定の実施形態では、前記抗ＣＤ１１７剤は、ＣＡＲを有する免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）であり得、前記ＣＡＲは、抗原結合領域、例えばｓｃＦｖを含み、抗原結合領域は以下を含む、
ａ）ＶＨＣＤＲ１が配列番号１７であり、ＶＨＣＤ２が配列番号１８であり、ＶＨＣＤＲ３が配列番号１９である、３つのＣＤＲ、ＶＨＣＤ１、ＶＨＣＤＲ２、およびＶＨＣＤＲ３を含む抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、および
ｂ）３つのＣＤＲ ＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２、およびＶＬＣＤＲ３を含む抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）であって、ＶＬＣＤＲ１は配列番号５９、ＶＬＣＤＲ２は配列番号２１、およびＶＬＣＤＲ３は配列番号６０である、抗体軽鎖可変ドメイン。

【0189】

特定の実施形態では、前記抗ＣＤ１１７剤は、ＣＡＲを有する免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）であり得、前記ＣＡＲは、抗原結合領域、例えばｓｃＦｖを含み、抗原結合領域は以下を含む、
ａ）ＶＨＣＤＲ１が配列番号１７であり、ＶＨＣＤ２が配列番号１８であり、ＶＨＣＤＲ３が配列番号１９である、３つのＣＤＲ、ＶＨＣＤ１、ＶＨＣＤＲ２、およびＶＨＣＤＲ３を含む抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、および
ｂ）３つのＣＤＲ ＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２、およびＶＬＣＤＲ３を含む抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）であって、ＶＬＣＤＲ１は配列番号５９、ＶＬＣＤＲ２は配列番号２１、およびＶＬＣＤＲ３は配列番号６１である、抗体軽鎖可変ドメイン。

【0190】

より特定の実施形態では、前記抗ＣＤ１１７剤は、前記第１の抗原結合領域、例えばｓｃＦｖを含むＣＡＲを有する免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）であり得、それは、配列番号１５のアミノ酸配列を含むもしくはそれからなる重鎖可変ドメイン、および／または配列番号１６のアミノ酸配列を含むもしくはそれからなる軽鎖可変ドメインを含む。

【0191】

より特定の実施形態では、前記抗ＣＤ１１７剤は、前記第１の抗原結合領域、例えばｓｃＦｖを含むＣＡＲを有する免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）であり得、それは、配列番号１５のアミノ酸配列を含むもしくはそれからなる重鎖可変ドメイン、および／または配列番号６２のアミノ酸配列を含むもしくはそれからなる軽鎖可変ドメインを含む。

【0192】

より特定の実施形態では、前記抗ＣＤ１１７剤は、前記第１の抗原結合領域、例えばｓｃＦｖを含むＣＡＲを有する免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）であり得、それは、配列番号１５のアミノ酸配列を含むもしくはそれからなる重鎖可変ドメイン、および／または配列番号６３のアミノ酸配列を含むもしくはそれからなる軽鎖可変ドメインを含む。

【0193】

本開示によれば、前記抗ＣＤ１１７剤は、ＣＤ１１７を標的とする抗原受容体、例えばＣＤ１１７の特異的アイソフォームを標的とするＣＡＲを有する免疫細胞であり得、前記抗原受容体は上記の抗原結合領域を含み、前記免疫細胞はＣＤ１１７を発現しないか、または前記ＣＡＲによって認識されないＣＤ１１７のアイソフォームを発現する。

【0194】

特定の実施形態では、前記抗ＣＤ１１７剤は、ＣＡＲを有する免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）であり得、ＣＤ１１７の特異的アイソフォームを標的とするＣＡＲは、ｓｃＦｖなどの抗原結合領域を含み、抗原結合領域は、以下を含む。
ａ）ＶＨＣＤＲ１が配列番号１７であり、ＶＨＣＤ２が配列番号１８であり、ＶＨＣＤＲ３が配列番号１９である、３つのＣＤＲ、ＶＨＣＤ１、ＶＨＣＤＲ２、およびＶＨＣＤＲ３を含む抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、および
ｂ）３つのＣＤＲ ＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２、およびＶＬＣＤＲ３を含む抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）であって、ＶＬＣＤＲ１は配列番号２０、ＶＬＣＤＲ２は配列番号２１、およびＶＬＣＤＲ３は配列番号２２である、抗体軽鎖可変ドメイン、
また、前記免疫細胞は、ＣＤ１１７を発現しないか、または前記ＣＡＲによって認識されないＣＤ１１７のアイソフォームを発現するかのいずれかである。

【0195】

特定の実施形態では、前記抗ＣＤ１１７剤は、ＣＡＲを有する免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）であり得、ＣＤ１１７の特異的アイソフォームを標的とするＣＡＲは、ｓｃＦｖなどの抗原結合領域を含み、抗原結合領域は、以下を含む。
ａ）ＶＨＣＤＲ１が配列番号１７であり、ＶＨＣＤ２が配列番号１８であり、ＶＨＣＤＲ３が配列番号１９である、３つのＣＤＲ、ＶＨＣＤ１、ＶＨＣＤＲ２、およびＶＨＣＤＲ３を含む抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、および
ｂ）３つのＣＤＲ ＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２、およびＶＬＣＤＲ３を含む抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）であって、ＶＬＣＤＲ１は配列番号５９、ＶＬＣＤＲ２は配列番号２１、およびＶＬＣＤＲ３は配列番号６０である、抗体軽鎖可変ドメイン、
また、前記免疫細胞は、ＣＤ１１７を発現しないか、または前記ＣＡＲによって認識されないＣＤ１１７のアイソフォームを発現するかのいずれかである。

【0196】

特定の実施形態では、前記抗ＣＤ１１７剤は、ＣＡＲを有する免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）であり得、ＣＤ１１７の特異的アイソフォームを標的とするＣＡＲは、ｓｃＦｖなどの抗原結合領域を含み、抗原結合領域は、以下を含む。
ａ）ＶＨＣＤＲ１が配列番号１７であり、ＶＨＣＤ２が配列番号１８であり、ＶＨＣＤＲ３が配列番号１９である、３つのＣＤＲ、ＶＨＣＤ１、ＶＨＣＤＲ２、およびＶＨＣＤＲ３を含む抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、および
ｂ）３つのＣＤＲ ＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２、およびＶＬＣＤＲ３を含む抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）であって、ＶＬＣＤＲ１は配列番号５９、ＶＬＣＤＲ２は配列番号２１、およびＶＬＣＤＲ３は配列番号６１である、抗体軽鎖可変ドメイン、
また、前記免疫細胞は、ＣＤ１１７を発現しないか、または前記ＣＡＲによって認識されないＣＤ１１７のアイソフォームを発現するかのいずれかである。

【0197】

より特定の実施形態では、前記抗ＣＤ１１７剤は、前記第１の抗原結合領域、例えばｓｃＦｖを含むＣＡＲを有する免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）であり得、それは、配列番号１５のアミノ酸配列を含むまたはからなる重鎖可変ドメイン、および配列番号１６のアミノ酸配列を含むもしくはそれからなる軽鎖可変ドメインを含み、前記免疫細胞は、前記ＣＡＲによって認識されないＣＤ１１７のアイソフォームを発現する。

【0198】

別の特定の実施形態では、前記抗ＣＤ１１７剤は、前記第１の抗原結合領域、例えばｓｃＦｖを含むＣＡＲを有する免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）であり得、それは、配列番号１５のアミノ酸配列を含むまたはからなる重鎖可変ドメイン、および配列番号６２のアミノ酸配列を含むもしくはそれからなる軽鎖可変ドメインを含み、前記免疫細胞は、前記ＣＡＲによって認識されないＣＤ１１７のアイソフォームを発現する。

【0199】

別の特定の実施形態では、前記抗ＣＤ１１７剤は、前記第１の抗原結合領域、例えばｓｃＦｖを含むＣＡＲを有する免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）であり得、それは、配列番号１５のアミノ酸配列を含むまたはからなる重鎖可変ドメイン、および配列番号６３のアミノ酸配列を含むもしくはそれからなる軽鎖可変ドメインを含み、前記免疫細胞は、前記ＣＡＲによって認識されないＣＤ１１７のアイソフォームを発現する。

【0200】

より好ましい実施形態では、前記抗ＣＤ１１７剤は、実施例に記載のようにＲｅｆｍａｂ ＃１抗体である。

【0201】

別の好ましい実施形態では、前記抗ＣＤ１１７剤は、実施例に記載のＣＤ１１７の特定のアイソフォームを標的とするＣＡＲを有する免疫細胞であり得る。

【0202】

特に、本開示はまた、それを必要とする対象において、宿主細胞または移入細胞をそれぞれ選択的に枯渇させるのに使用するための第１または第２の抗原結合領域を含む上記の抗ＣＤ１１７剤（例えば、ＣＡＲ細胞組成物または抗体）を枯渇させることに関する。

【0203】

ＣＤ１１７の第１のアイソフォームを発現する細胞
本開示は、哺乳動物細胞、好ましくは造血細胞、またはＣＤ１１７の第１のアイソフォームを発現する細胞の集団に関し、前記細胞または細胞の集団は、前記第１のアイソフォームをコードする核酸において少なくとも１つの多型対立遺伝子を含むＣＤ１１７の第１のアイソフォームを発現し、前記第１のアイソフォームは、本明細書に記載の第１の抗原結合領域を含む枯渇剤によって認識されない。

【0204】

前記細胞または細胞の集団は、ＣＤ１１７の第２のアイソフォームを発現する患者における医学的治療に特に有用である。

【0205】

特定の実施形態において、枯渇剤（例えば造血細胞）によって認識されない前記ＣＤ１１７の第１のアイソフォームをコードするかまたは発現する前記細胞（例えば造血幹細胞）は、免疫療法後に正常な造血を回復させるための医学的治療、例えば、前記第２のアイソフォームを発現する患者における養子細胞移入において特に有用であり、具体的には、前記治療は、前記ＣＤ１１７の第１のアイソフォームを発現する治療有効量の前記造血細胞を、前記ＣＤ１１７の第２のアイソフォームを標的化する治療有効量の枯渇剤と組み合わせて投与することを含む。特に、前記造血細胞、好ましくは造血幹細胞は、前記枯渇剤に続いて投与される。別の特定の実施形態において、前記造血細胞、好ましくは造血幹細胞は、前記枯渇剤の前に、または前記枯渇剤と同時に投与され得る

【0206】

別の特定の実施形態においてＣＤ１１７の、第２のアイソフォームに結合しないかまたは実質的により弱く結合する枯渇剤によって特異的に認識される前記ＣＤ１１７の第１のアイソフォームを発現する前記細胞は、前記ＣＤ１１７の第２のアイソフォームを発現する患者における医学的治療において、特に、第１のアイソフォームを有する移植される細胞に関連する重篤な副作用を回避するために（安全スイッチ）特に有用であり、前記治療は、前記ＣＤ１１７の第１のアイソフォームを標的とする治療有効量の枯渇剤を投与することを含む。特に、前記造血細胞、好ましくはＣＡＲを有する免疫細胞は、前記枯渇剤の前に投与される。

【0207】

本明細書で使用される場合、細胞という用語は、哺乳動物の細胞、好ましくはヒトの細胞に関する。

【0208】

特定の実施形態では、前記細胞は造血細胞である。造血細胞は、Ｂ細胞およびＴ細胞などのリンパ球、ナチュラルキラー細胞、単球などの骨髄細胞、マクロファージ、好酸球、肥満細胞、好塩基球、顆粒球、樹状細胞（ＤＣ）および板状樹状細胞（ｐＤＣ）を含む免疫細胞を含む。

【0209】

好ましい実施形態では、前記免疫細胞はＴ細胞である。別の好ましい実施形態では、前記免疫細胞は初代Ｔ細胞である。本明細書で使用される場合、「Ｔ細胞」という用語は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を有する細胞、またはＴＣＲを有するＴ細胞に由来する細胞を含む。本開示によるＴ細胞は、炎症性Ｔリンパ球、細胞傷害性Ｔリンパ球、制御性Ｔリンパ球、メモリーＴリンパ球、腫瘍浸潤リンパ球、または１型および２型ヘルパーＴ細胞とＴｈ１７ヘルパー細胞の両方を含むヘルパーＴリンパ球からなる群から選択することができる。別の実施形態では、前記細胞は、ＣＤ４＋Ｔリンパ球およびＣＤ８＋Ｔリンパ球または非古典的Ｔ細胞、例えばＭＲ１拘束性Ｔ細胞、ＭＡＩＴ細胞、ＮＫＴ細胞、ガンマデルタＴ細胞、または自然免疫様Ｔ細胞からなる群に由来し得る。

【0210】

Ｔ細胞は、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位からの組織、腹水、胸水、脾臓組織および腫瘍を含む複数の非限定的な供給源から得ることができる。特定の実施形態では、Ｔ細胞は、当業者に公知の任意の数の技術を使用して、対象から採取された血液の単位から得ることができる。あるいは、Ｔ細胞をｉＰＳ細胞から分化させることができる。

【0211】

別の好ましい実施形態では、前記造血細胞は造血幹細胞である。幹細胞は、成体幹細胞、胚性幹細胞、より具体的には非ヒト幹細胞、臍帯血幹細胞、前駆細胞、骨髄幹細胞、人工多能性幹細胞、全能性幹細胞、または造血幹細胞であり得る。代表的なヒト幹細胞はＣＤ３４^＋細胞である。造血幹細胞は、ｉＰＳ細胞から分化され得るか、または臍帯血から、骨髄から、または動員されたもしくは動員されていない末梢血から採取され得る。

【0212】

特定の実施形態では、細胞は、細胞を受け入れる人のＨＬＡ遺伝子型と同一、類似または異なるＨＬＡ遺伝子型を呈するドナーに由来する細胞を指す同種細胞である。ドナーは、血縁者であっても非血縁者であってもよい。特定の実施形態では、細胞は、細胞を受けている同じ人に由来する細胞を指す自己細胞である。

【0213】

前記細胞は、健常なドナーまたは患者、特にがん、遺伝性疾患または自己免疫疾患と診断された患者または感染症と診断された患者に由来し得る。造血細胞は、血液、骨髄から抽出され得るか、または幹細胞に由来し得る。ＨＳＣは、例えば、ｉＰＳ（人工多能性幹細胞）に由来し得る。

【0214】

当業者は、移植される患者または対象に応じてより適切な細胞を選択されよう。

【0215】

本開示はさらに、本明細書に開示される治療に使用するための細胞または細胞の集団の組成物に関する。

【0216】

ＣＡＲ
養子細胞移入療法に使用するために、本開示によるＣＤ１１７の第１のアイソフォームを発現する前記細胞を、所望の特異性および増強された機能性を示すように改変することができる。特定の実施形態では、前記細胞は、上記のようにその細胞表面に抗原受容体とも呼ばれる組換え抗原結合領域を発現し得る。特定の実施形態では、前記組換え抗原受容体はキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である。本開示によれば、ＣＤ１１７の第１のアイソフォームおよびＣＡＲを発現する前記免疫細胞は、ＣＤ１１７の前記第１のアイソフォームに特異的に結合するがＣＤ１１７の第２のアイソフォームには結合しない第２の抗原結合領域を含む治療有効量の薬剤の投与によって特異的に枯渇させることができ、それにより、前記免疫細胞の移植に起因する最終的な重篤な副作用を回避する。

【0217】

特定の実施形態では、免疫細胞はがん抗原に対して再配向される。「がん抗原」とは、がんに関連する任意の抗原（すなわち、免疫応答を誘導することができる分子）を意味する。本明細書で定義される抗原は、免疫応答を誘導する任意の種類の分子であり得、例えば、多糖または脂質であり得るが、最も好ましくはペプチド（またはタンパク質）である。ヒトがん抗原は、ヒトまたはヒト由来であり得る。がん抗原は腫瘍特異的抗原であり得、これは健常な細胞には見られない抗原を意味する。腫瘍特異的抗原は、一般に、健康なヒトのプロテオームには見られない全く新しいアミノ酸配列を生成する突然変異、特にフレームシフト突然変異から生じる。

【0218】

がん抗原には、腫瘍関連抗原も含まれ、腫瘍関連抗原は、その発現または産生が腫瘍細胞に関連するが、これに限定されない抗原である。腫瘍関連抗原の例としては、例えばＨｅｒ２、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、アルファ－フェトプロテイン（ＡＦＰ）、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、がん抗原－１２５（ＣＡ－１２５）、ＣＡ１９－９、カルレチニン、ＭＵＣ－１、上皮膜タンパク質（ＥＭＡ）、上皮腫瘍抗原（ＥＴＡ）、チロシナーゼ、メラノーマ関連抗原（ＭＡＧＥ）、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ９９、ＣＤ１１７、ＣＤ１２３、クロモグラニン、サイトケラチン、デスミン、グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）、総嚢胞性疾患液タンパク質（ＧＣＤＦＰ－１５）、ＨＭＢ－４５抗原、タンパク質メラン－Ａ（Ｔリンパ球によって認識されるメラノーマ抗原；ＭＡＲＴ－１）、ｍｙｏ－Ｄｌ、筋特異的アクチン、神経線維、ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）、胎盤アルカリホスファターゼ、シナプトフィシン、サイログロブリン、甲状腺転写因子－１、ピルビン酸キナーゼアイソエンザイムＭ２型（腫瘍Ｍ２－ＰＫ）の二量体形態、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ１２３、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＣＤ７０、ＧＤ２（ガングリオシドＧ２）、ＥＧＦＲｖＩＩＩ（上皮成長因子変異体ＩＩＩ）、精子タンパク質１７（Ｓｐｌ７）、メソテリン、ＰＡＰ（前立腺酸性ホスファターゼ）、プロステイン、ＴＡＲＰ（Ｔ細胞受容体ガンマ鎖代替リーディングフレームタンパク質）、Ｔｒｐ－ｐ８、ＳＴＥＡＰ１（前立腺６膜貫通上皮抗原１）、異常なｒａｓタンパク質または異常なｐ５３タンパク質が挙げられる。別の特定の実施形態では、前記腫瘍関連抗原または腫瘍特異的抗原は、インテグリンανβ３（ＣＤ６１）、ガラクチン、Ｋ－Ｒａｓ（Ｖ－Ｋｉ－ｒａｓ２ Ｋｉｒｓｔｅｎラット肉腫ウイルス癌遺伝子）、またはＲａｌ－Ｂである。

【0219】

特定の実施形態では、養子細胞移入療法に使用するために、好ましくは急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）またはＢ－急性リンパ芽球性白血病（Ｂ－ＡＬＬ）などの悪性造血疾患の治療のために、本開示による免疫細胞は、ＣＤ１１７標的ＣＡＲなどの組換え抗原結合領域を発現する。第１のアイソフォームを発現し、ＣＡＲ（例えば、ＣＡＲ－ＣＤ１１７）を発現する前記細胞は、ＣＤ１１７の第１のアイソフォームに特異的に結合するが、ＣＤ１１７の第２のアイソフォームには結合しないか、または実質的により弱く結合する第２の抗原結合領域を含む枯渇剤を投与することによって、さらに特異的に枯渇され得、それにより、移植に起因する移植片対宿主病などの最終的な重篤な副作用が回避される。

【0220】

特定の実施形態では、第１のアイソフォームを発現する前記免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）は、ＣＤ１１７を標的とするＣＡＲを有し、前記ＣＡＲは、Ｎ末端ドメイン内、またはアミノ酸Ｅ７３、Ｔ７４、Ｖ１２０、Ｄ１２１、Ｒ１２２、Ｓ１２３、Ｙ１２５、Ｋ１２７、Ｋ１９３、Ｉ２０１、Ｋ２０３、Ｓ２３９ Ｙ２５９、Ｎ２６０、Ｓ２６１、Ｄ２６６、Ｙ２６９および／もしくはＲ２７１、より好ましくは配列番号１のアミノ酸Ｅ７３、Ｖ１２０、Ｄ１２１、Ｒ１２２、Ｓ１２３、Ｋ１２７、Ｋ１９３、Ｓ２３９、Ｙ２５９および／もしくはＳ２６１、さらにより好ましくは配列番号１のアミノ酸Ｅ７３、Ｄ１２１、Ｒ１２２、Ｓ１２３、Ｓ２３９、Ｙ２５９および／またはＳ２６１、最も好ましくは配列番号１のアミノ酸Ｅ７３、Ｄ１２１および／またはＳ１２３を含むポリペプチド内に位置するＣＤ１１７のエピトープに特異的に結合する抗原結合領域を含む抗原結合領域、例えばｓｃＦｖを含む。

【0221】

特に、第１のアイソフォームを発現する前記免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）は、抗原結合領域、例えばｓｃＦｖを含むＣＤ１１７標的ＣＡＲを有し、抗原結合領域は、以下を含み
ａ）ＶＨＣＤＲ１が配列番号１７であり、ＶＨＣＤ２が配列番号１８であり、ＶＨＣＤＲ３が配列番号１９である、３つのＣＤＲ、ＶＨＣＤ１、ＶＨＣＤＲ２、およびＶＨＣＤＲ３を含む抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、および
ｂ）３つのＣＤＲ ＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２、およびＶＬＣＤＲ３を含む抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）であって、ＶＬＣＤＲ１は配列番号２０、ＶＬＣＤＲ２は配列番号２１、およびＶＬＣＤＲ３は配列番号２２である、抗体軽鎖可変ドメイン、
より好ましくは、配列番号１５のアミノ酸配列を含むもしくはからなる重鎖可変ドメインおよび／または配列番号１６のアミノ酸配列を含むもしくはからなる軽鎖可変ドメインを含む抗原結合領域を含む。

【0222】

あるいは、第１のアイソフォームを発現する前記免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）は、抗原結合領域、例えばｓｃＦｖを含むＣＤ１１７標的ＣＡＲを有し、抗原結合領域は、以下を含み
ａ）ＶＨＣＤＲ１が配列番号１７であり、ＶＨＣＤ２が配列番号１８であり、ＶＨＣＤＲ３が配列番号１９である、３つのＣＤＲ、ＶＨＣＤ１、ＶＨＣＤＲ２、およびＶＨＣＤＲ３を含む抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、および
ｂ）３つのＣＤＲ ＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２、およびＶＬＣＤＲ３を含む抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）であって、ＶＬＣＤＲ１は配列番号５９、ＶＬＣＤＲ２は配列番号２１、およびＶＬＣＤＲ３は配列番号６０である、抗体軽鎖可変ドメイン、
より好ましくは、配列番号１５のアミノ酸配列を含むもしくはからなる重鎖可変ドメインおよび／または配列番号６２のアミノ酸配列を含むもしくはからなる軽鎖可変ドメインを含む抗原結合領域を含む。

【0223】

あるいは、第１のアイソフォームを発現する前記免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）は、抗原結合領域、例えばｓｃＦｖを含むＣＤ１１７標的ＣＡＲを有し、抗原結合領域は、以下を含み
ａ）ＶＨＣＤＲ１が配列番号１７であり、ＶＨＣＤ２が配列番号１８であり、ＶＨＣＤＲ３が配列番号１９である、３つのＣＤＲ、ＶＨＣＤ１、ＶＨＣＤＲ２、およびＶＨＣＤＲ３を含む抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、および
ｂ）３つのＣＤＲ ＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２、およびＶＬＣＤＲ３を含む抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）であって、ＶＬＣＤＲ１は配列番号５９、ＶＬＣＤＲ２は配列番号２１、およびＶＬＣＤＲ３は配列番号６１である、抗体軽鎖可変ドメイン、
より好ましくは、配列番号１５のアミノ酸配列を含むもしくはからなる重鎖可変ドメインおよび／または配列番号６３のアミノ酸配列を含むもしくはからなる軽鎖可変ドメインを含む抗原結合領域を含む。

【0224】

第１のアイソフォームを発現する細胞を調製するインビトロの方法
本開示によるＣＤ１１７の第１のアイソフォームを発現する細胞は、上記の遺伝子編集酵素および／またはＨＤＲ鋳型を含む少なくとも１つの遺伝子編集酵素またはリボ核タンパク質複合体をコードする核酸構築物（例えばｍＲＮＡ）を前記細胞に導入することによって、遺伝子操作することができる。あるいは、遺伝子編集系は、アデノウイルス系などのウイルス系を介して前記細胞に形質導入される。前記細胞はまた、上記のＣＡＲをコードする核酸構築物を前記細胞にさらに導入することによって、遺伝子操作され得る。特に、前記方法は、細胞の培養物に対して行われるエクスビボな方法である。

【0225】

本明細書で使用される「核酸構築物」という用語は、組換えＤＮＡ技術の使用から生じる核酸分子を指す。核酸構築物は、一本鎖または二本鎖のいずれかの核酸分子であり、核酸配列のセグメントを含むように修飾されており、普通なら自然界に存在しない様式で組み合わされ、並置される。核酸構築物は、通常、「ベクター」、すなわち外因的に作製されたＤＮＡを宿主細胞に送達するために使用される核酸分子である。

【0226】

好ましくは、核酸構築物は、１つ以上の制御配列に作動可能に連結された前記遺伝子編集酵素、ＨＤＲ鋳型および／またはＣＡＲを含む。前記制御配列は、標的器官（すなわち、造血細胞）の細胞において機能的である遍在性、組織特異的または誘導性プロモーターであり得る。当技術分野で周知のそのような配列には、特にプロモーター、および導入遺伝子の発現をさらに制御することができるさらなる調節配列、例えば限定されないが、エンハンサー、ターミネーター、イントロン、サイレンサーが含まれる。

【0227】

上記のような核酸構築物は、発現ベクターに含まれていてもよい。ベクターは、自律複製ベクター、すなわち、その複製が染色体の複製とは無関係である染色体外実体として存在するベクター、例えば、プラスミド、染色体外エレメント、ミニ染色体または人工染色体であり得る。ベクターは、自己複製を保証するための任意の手段を含み得る。あるいは、ベクターは、宿主細胞に導入されると、ゲノムに組み込まれ、組み込まれた染色体と共に複製されるものであり得る。

【0228】

適切なベクターの例としては、組換え組込み型または非組込み型ウイルスベクター、および組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡまたはコスミドＤＮＡに由来するベクターが挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、ベクターは組換え組込み型または非組込み型ウイルスベクターである。組換えウイルスベクターの例としては、ヘルペスウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルスまたはウシパピローマウイルスに由来するベクターが挙げられるが、これらに限定されない。

【0229】

本開示は、上記の遺伝子編集酵素および／またはＨＤＲ鋳型を含む遺伝子編集酵素またはリボ核タンパク質複合体をコードする核酸構築物（例えばｍＲＮＡ）を細胞に導入することによって、細胞表面タンパク質の第１のアイソフォームを細胞において発現させる方法に関する。前記方法は、ＣＡＲをコードする核酸構築物を前記細胞に導入する工程をさらに含み得る。前記方法は、Ｃａｓタンパク質、塩基エディタまたはプライムエディタおよびガイドＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮａ、または融合ガイドＲＮＡまたはｐｅｇＲＮＡ）などの遺伝子編集酵素を細胞に導入することを含む。特に、前記遺伝子編集酵素は、上記のＣＲＩＳＰＲ／ｃａｓ遺伝子編集酵素である。より特定の実施形態では、前記遺伝子編集酵素は、ガイドＲＮＡおよびＣａｓタンパク質を含む部位特異的ヌクレアーゼ、より好ましくはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼであり、Ｃａｓタンパク質と併用した前記ガイドＲＮＡは、上記のように薬剤結合に関与する表面タンパク質領域をコードする核酸を含む前記標的配列内部で切断する、および切断を誘導する。

【0230】

好ましい実施形態では、前記核酸構築物は、枯渇剤への結合に関与するＣＤ１１７の領域をコードする核酸配列を標的化することができるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼを含み、好ましくは、前記核酸構築物は、以下を含む。
－配列番号１のアミノ酸残基Ｅ７３をコードする配列を標的とする配列番号３～８のｇＲＮＡ配列、または
－配列番号１のアミノ酸残基Ｖ１２０、Ｄ１２１、Ｒ１２２、Ｓ１２３をコードする配列を標的とする、配列番号９～１４からなる群から選択されるｇＲＮＡ配列。

【0231】

前記Ｃａｓヌクレアーゼは、高忠実度Ｃａｓ９ヌクレアーゼなどの高忠実度Ｃａｓヌクレアーゼであり得る。

【0232】

上記のような前記遺伝子編集酵素、好ましくはガイドＲＮＡおよび／またはＣａｓタンパク質、塩基エディタまたはプライムエディタは、核酸構築物、好ましくは上記のようなガイドＲＮＡおよび／またはＣａｓタンパク質、塩基エディタまたはプライムエディタなどの前記遺伝子編集酵素をコードする発現ベクターの細胞への導入の結果として、細胞でインサイチュで合成され得る。あるいは、ガイドＲＮＡおよび／またはＣａｓタンパク質、塩基エディタまたはプライムエディタなどの前記遺伝子編集酵素は、細胞外で産生され、次いでそれに導入され得る。

【0233】

前記核酸構築物または発現ベクターは、当技術分野で公知の任意の方法によって細胞に導入することができ、非限定的な例として、核酸構築物または発現ベクターが細胞のゲノムに組み込まれる安定的な形質導入方法、核酸構築物または発現ベクターが細胞のゲノムに組み込まれない一過性のトランスフェクション方法、およびウイルス媒介方法が挙げられる。例えば、一過性の形質転換方法は、例えば、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、細胞スクイージング、粒子衝撃またはインビボターゲティングアプローチを含む。

【0234】

インビボ編集
本開示によるＣＤ１１７の第１のアイソフォームを発現する細胞はまた、インビボで編集され得る。ウイルスベクター、脂質ナノ粒子およびウイルス様粒子を含む、治療的なインビボ遺伝子編集を可能にする様々な技術が存在する（例えば、Ｃｅｌｌ（２０２２）１８５：２８０６－２７を参照のこと）。ＣＤ１１７を、枯渇剤によって認識されないＣＤ１１７の第１のアイソフォームに変換する分子機構は、これらの方法のいずれかによって達成することができる。

【0235】

特定の実施形態において、本開示は、遺伝子および枯渇剤をインビボで編集することができる分子機構を含む医薬組成物に関し、
遺伝子をインビボ編集することができる前記分子機構が、標的細胞における野生型ＣＤ１１７の点変異をＣＤ１１７のアイソフォームに導入するために必要とされる全成分を含み、
前記枯渇剤は野生型ＣＤ１１７に結合するが、ＣＤ１１７の前記アイソフォームには結合せず
それを必要とする患者における医学的治療に使用するためのものである。

【0236】

好ましくは、ＣＤ１１７の前記アイソフォームは、野生型ＣＤ１１７の位置１２１のアスパラギン酸のリジンへの置換を特徴とする。あるいは、ＣＤ１１７の前記アイソフォームは、野生型ＣＤ１１７の位置１２３のセリンのリジンへの置換を特徴とする。

【0237】

また好ましくは、前記枯渇剤は、以下を含む、
ｉ．ＶＨＣＤＲ１が配列番号１７であり、ＶＨＣＤＲ２が配列番号１８であり、ＶＨＣＤＲ３が配列番号１９である、３つのＣＤＲ、ＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２、およびＶＨＣＤＲ３を含む抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、および
ｉｉ．３つのＣＤＲ ＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２、およびＶＬＣＤＲ３を含む抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）であって、ＶＬＣＤＲ１は配列番号５９、ＶＬＣＤＲ２は配列番号２１、およびＶＬＣＤＲ３は配列番号６０である、抗体軽鎖可変ドメイン。

【0238】

あるいは、前記枯渇剤は、以下を含む、
ｉ．ＶＨＣＤＲ１が配列番号１７であり、ＶＨＣＤＲ２が配列番号１８であり、ＶＨＣＤＲ３が配列番号１９である、３つのＣＤＲ、ＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２、およびＶＨＣＤＲ３を含む抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、および
ｉｉ．３つのＣＤＲ ＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２、およびＶＬＣＤＲ３を含む抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）であって、ＶＬＣＤＲ１は配列番号５９、ＶＬＣＤＲ２は配列番号２１、およびＶＬＣＤＲ３は配列番号６１である、抗体軽鎖可変ドメイン。

【0239】

あるいは、前記枯渇剤は、以下を含む、
ｉ．ＶＨＣＤＲ１が配列番号１７であり、ＶＨＣＤＲ２が配列番号１８であり、ＶＨＣＤＲ３が配列番号１９である、３つのＣＤＲ、ＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２、およびＶＨＣＤＲ３を含む抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、および
ｉｉ．３つのＣＤＲ ＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２、およびＶＬＣＤＲ３を含む抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）であって、ＶＬＣＤＲ１は配列番号２０、ＶＬＣＤＲ２は配列番号２１、およびＶＬＣＤＲ３は配列番号２２である、抗体軽鎖可変ドメイン。

【0240】

本明細書で使用される「遺伝子を編集することができる分子機構」という用語は、それぞれのビヒクルを介して標的部位または細胞に送達される場合、インビボで標的遺伝子を編集するのに必要な遺伝子および／または核酸の配置を指す。機構はまた、それぞれの送達ビヒクル、例えばウイルスベクター、脂質ナノ粒子またはウイルス様粒子を含む。

【0241】

医薬組成物および治療的使用
さらなる態様では、本開示はまた、１つまたは複数の薬学的または生理学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤と共に、上記のＣＤ１１７の第１のアイソフォームを発現する細胞または細胞の集団を含む医薬組成物を提供する。

【0242】

特定の実施形態では、ＣＤ１１７の第１のアイソフォームを発現する前記細胞は造血幹細胞である。

【0243】

別の特定の実施形態では、前記ＣＤ１１７の第１のアイソフォームを発現する前記細胞は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、好ましくは上記のように前記患者の細胞によって発現されるＣＤ１１７の第２のアイソフォームを標的とするＣＡＲを有する免疫細胞、好ましくはＴ細胞、より好ましくは初代Ｔ細胞である。

【0244】

医薬組成物は、上記のような第１または第２の抗原結合領域を含む枯渇剤をさらに含み得る。

【0245】

医薬組成物は、投与経路に従って薬学的に許容され得る担体中に製剤化される。好ましくは、組成物は、静脈内注射によって投与されるように製剤化される。そのような投与に適した医薬組成物は、１つ以上の薬学的に許容され得る滅菌等張水溶液もしくは非水溶液（例えば、平衡塩類溶液（ＢＳＳ））、分散液、懸濁液もしくはエマルジョン、または使用直前に滅菌注射液もしくは分散液に再構成され得る滅菌粉末と併用して、上記の第１のアイソフォームを発現する細胞を含み得、これは抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、溶質もしくは懸濁剤もしくは増粘剤を含み得る。

【0246】

任意選択で、ＣＤ１１７の第１のアイソフォームを発現する細胞を含む組成物は、細胞の保存に適切な任意の温度で保存のために凍結され得る。例えば、細胞は、約－２０℃、－８０℃または任意の他の適切な温度で凍結され得る。極低温凍結細胞は、細胞への損傷のリスクを低減し、細胞が融解後に生存する可能性を最大化するために、適切な容器に保存され、保存用に調製され得る。あるいは、細胞を冷蔵の室温、例えば約４℃に維持し得る。

【0247】

本開示は、医薬として使用するための、特に患者における養子細胞移入療法などの免疫療法に使用するための、上記のＣＤ１１７の第１のアイソフォームを発現する細胞または細胞の集団に関する。

【0248】

本開示によれば、上記のようなＣＤ１１７の第１のアイソフォームを発現する前記細胞または細胞の集団（例えば、造血細胞）は、それを必要とする患者の医学的治療に使用され、前記医学的治療は、前記ＣＤ１１７の前記第１のアイソフォームを発現する治療有効量の細胞または細胞の集団を、前記ＣＤ１１７の第２のアイソフォームまたは第１のアイソフォームに特異的に結合する治療有効量の枯渇剤（例えば、ＣＡＲ細胞または抗体）と併用して投与して、それぞれ患者または移植細胞を特異的に枯渇させることを含む。

【0249】

本明細書で使用される場合、「併用して」または「併用療法で」という用語は、２つ（またはそれ以上）の異なる治療が、障害により対象が苛まれる過程のさ中に対象に送達されること、例えば、２つ以上の治療が、対象が障害と診断された後、障害が治癒もしくは排除される前、または他の理由で治療が中止される前に送達されることを意味する。いくつかの実施形態では、一方の治療の送達が、第２の治療の送達が開始されたときに依然として行われているので、投与に関する重複がある。これは、本明細書では「同時」または「同時送達」と呼ばれることがある。他の実施形態では、一方の治療の送達は、他方の治療の送達が始まる前に終了している。送達は、送達される第１の治療の効果が、第２の治療が送達されるときに依然として検出可能であるようなものであり得る。１つの実施形態において、ＣＤ１１７の第２のアイソフォームまたは第１のアイソフォームに結合する枯渇剤が、本明細書に記載されている用量および／または投薬スケジュールで投与され、第１のアイソフォームを発現する細胞が、本明細書に記載されている用量および／または投薬スケジュールで投与される。いくつかの実施形態では、「と併用して」は、ＣＤ１１７の第２のアイソフォーム（例えば、ＣＤ１１７の第２のアイソフォームを認識するＣＡＲ細胞または抗体）または第１のアイソフォームを標的とする枯渇剤、および前記ＣＤ１１７の前記第１のアイソフォームを発現する細胞の組成物が、同時に投与されなければならない、および／または一緒に送達するべく製剤化されなければならないということを意味するよう意図されてはいない、ただしこれらの送達方法は本開示の範囲内である。枯渇剤（例えば、ＣＤ１１７の第２のアイソフォームを標的とするＣＡＲ細胞または抗体）は、ＣＤ１１７の第１のアイソフォームを発現する造血幹細胞の用量と同時に、その用量の前に、またはその用量の後で投与され得る。特定の実施形態では、各薬剤は、その特定の薬剤について決められている用量および／または時間スケジュールで投与される。

【0250】

本開示による養子細胞移入療法は、がん、遺伝病、自己免疫疾患、感染性疾患、造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）を必要とする疾患、臓器拒絶の予防、腫瘍移植前処置、腫瘍維持療法、最小残存疾患、再発の予防と診断された患者を治療するために使用することができる。

【0251】

本開示はまた、患者における養子移入細胞療法のための医薬の製造における、上記のＣＤ１１７の第１のアイソフォームを発現する細胞の使用に関する。

【0252】

本明細書で使用される場合、「対象」または「患者」という用語は、ヒト、ブタ、チンパンジー、イヌ、ネコ、ウシ、マウス、ウサギまたはラットを含む動物、好ましくは免疫応答が誘発され得る哺乳動物を指す。より好ましくは、患者は、出生前段階の成人、小児およびヒトを含むヒトである。

【0253】

本明細書で使用される場合、「治療」、「治療する」または「治療すること」という用語は、疾患の治療、予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎおよびｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）、および遅延などの患者の健康状態を改善することを意図した任意の行為を指す。特定の実施形態では、そのような用語は、疾患または疾患に関連する症状の改善または根絶を指す。他の実施形態では、この用語は、そのような疾患を有する対象への１つまたは複数の治療薬の投与から生じる疾患の進展または悪化を最小限に抑えることを指す。

【0254】

治療され得るがんには、血管新生していない、またはまだ実質的に血管新生していない腫瘍、ならびに血管新生した腫瘍が含まれる。がんは、非固形腫瘍（例えば、血液腫瘍、例えば、白血病およびリンパ腫、例えば再発および治療関連腫瘍、例えば、細胞傷害療法および造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）後の二次性悪性腫瘍）を含み得るか、または固形腫瘍を含み得る。

【0255】

本明細書で使用される「自己免疫疾患」という用語は、自己免疫応答に起因する障害として定義される。自己免疫疾患は、自己抗原に対する不適切かつ過剰な応答の結果である。

【0256】

感染症は、細菌、ウイルス、寄生虫または真菌などの病原性微生物によって引き起こされる疾患である。特定の実施形態では、本開示による感染症は、ＨＳＣＴ後の患者または固形臓器移植を受けた患者などの免疫抑制患者で起こる。

【0257】

好ましい実施形態では、本開示は、血液がん、好ましくは白血病、リンパ腫、骨髄腫または他のリンパ増殖性障害に使用するための上記のＣＤ１１７の第１のアイソフォームを発現する細胞に関する。前記白血病は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、芽球性形質細胞様樹状細胞新生物（ＢＰＤＣＮ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）を含む骨髄増殖性新生物（ＭＰＮ）、慢性骨髄単球性白血病（ＣＭＭＬ）を含む骨髄異形成症候群／骨髄増殖性新生物（ＭＤＳ／ＭＰＮ）オーバーラップ症候群、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、ＢおよびＴ細胞非ホジキンリンパ腫、急性二表現型白血病、有毛細胞白血病、インターロイキン－３受容体サブユニットα陽性白血病、Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｂ－ＡＬＬ）、Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｔ－ＡＬＬ）、ホドキンリンパ腫（ＨＬ）、全身性肥満細胞症および好ましくはＭＤＳ、好ましくはＡＭＬまたはＢＰＤＣＮからなる群から選択することができる。

【0258】

特定の実施形態では、ＣＤ１１７の第１のアイソフォームを発現する前記細胞または細胞の集団（例えば、造血細胞）は、固形腫瘍の治療、特に患者の固形腫瘍の骨髄細胞の選択的枯渇のために使用して、腫瘍の骨髄細胞は免疫抑制性であり得るので、免疫チェックポイント阻害剤、ＣＡＲ Ｔ細胞または腫瘍浸潤リンパ球などの免疫療法剤が腫瘍にアクセスすることを可能にすることができる。この状況では、上記のような第１のアイソフォームのＣＤ１１７を発現する前記細胞または細胞の集団（例えば、造血細胞）は、固形腫瘍の骨髄細胞を枯渇させることを意図した治療によって影響を受け得る造血系を補充するのに役立ち得る。

【0259】

別の特定の実施形態では、上記のＣＤ１１７の第１のアイソフォームを発現する前記細胞または細胞の集団（例えば、造血細胞）は、狼瘡、多発性硬化症、強皮症または全身性硬化症などの自己免疫疾患の治療に使用することができる。

【0260】

本開示はまた、それを必要とする対象において、宿主細胞または移入細胞をそれぞれ選択的に枯渇させるのに使用するための第１または第２の抗原結合領域を含む枯渇剤（例えば、ＣＡＲ細胞組成物または抗体）に関する。

【0261】

特異的に患者の細胞を枯渇させ、移植された細胞は枯渇させない方法
本開示によれば、上記のようなＣＤ１１７の第１のアイソフォームを発現する前記細胞または細胞の集団（例えば、造血細胞）は、それを必要とする患者の医学的治療に使用され、前記医学的治療は、前記ＣＤ１１７の前記第１のアイソフォームを発現する治療有効量の前記細胞または細胞の集団を、前記ＣＤ１１７の第２のアイソフォームに特異的に結合する治療有効量の枯渇剤（例えば、ＣＡＲ細胞または抗体）と併用して投与することを含む。

【0262】

実際、免疫療法中に、ＣＤ１１７を対象とするＣＡＲ発現免疫細胞などの免疫枯渇剤を患者に投与して、腫瘍細胞を標的とし、殺傷させることができる。しかしながら、腫瘍表面タンパク質はまた、正常な造血細胞の表面で発現されるので、この戦略は、造血を変化させることによって患者に重篤な副作用を誘発することができる。患者における造血を回復させるために、造血細胞をその後に患者に移植することができる。しかしながら、これらの細胞は、前記薬剤によって標的化されないように、前記薬剤（すなわち、ＣＤ１１７発現細胞用の枯渇剤）に対して耐性がある必要がある。

【0263】

したがって、あるいは、本開示によれば、ＣＤ１１７の第２のアイソフォームに特異的に結合する第１の抗原結合領域を含む枯渇剤を投与して、ＣＤ１１７の前記第２のアイソフォームを発現する患者の細胞であって、前記ＣＤ１１７の第１のアイソフォームを発現する移植細胞ではない患者の細胞を特異的にアブレーションすることができる。患者の細胞は枯渇するが移植された細胞は枯渇させない選択的枯渇は、免疫枯渇剤によってもはや枯渇されない健常な造血系で患者を再構成することを可能にする。したがって、本治療的使用によれば、患者は、免疫抑制を長期間経るより、むしろ機能的な免疫系を有する。本開示による細胞の使用は、現在のＨＳＣ移植の主要な合併症としての感染症を排除する。

【0264】

別の実施形態において、本開示は、ＣＤ１１７の第２のアイソフォームを発現する細胞を有する患者において正常な造血を回復させるための養子細胞移入療法のための、好ましくは造血幹細胞移植のための方法に関し、それは以下を含む
（ｉ）ＣＤ１１７の第１のアイソフォームを発現する有効量の細胞（例えば造血幹細胞）であって、前記ＣＤ１１７の第１のアイソフォームを発現する前記細胞が、前記第１のアイソフォームをコードする核酸に少なくとも１つの多型対立遺伝子、好ましくは一塩基多型（ＳＮＰ）対立遺伝子、または遺伝子操作された対立遺伝子を有するゲノムＤＮＡを含み、前記多型が、前記ＣＤ１１７の前記第２のアイソフォームを発現する細胞を有する患者のゲノムに存在しない、細胞、またはその医薬組成物を投与すること、および
（ｉｉ）ＣＤ１１７の前記第２のアイソフォームに特異的に結合し、ＣＤ１１７の前記第１のアイソフォームに結合しないかまたは実質的により弱く結合する少なくとも第１の抗原結合領域を含む薬剤の治療有効量を投与して、ＣＤ１１７の前記第２のアイソフォームを発現する細胞（患者の細胞）を特異的に枯渇させること。

【0265】

ＣＤ１１７の第１のアイソフォームを発現する前記細胞またはその医薬組成物は、上記のような第１の抗原結合領域を含む薬剤と併用して（例えば、前に、同時に、または後に）対象に投与される。

【0266】

好ましい実施形態では、枯渇剤（例えば、ＣＤ１１７の第２のアイソフォームを標的とするＣＡＲ細胞または抗体）は、前記表面タンパク質の第１のアイソフォーム（例えば、ＣＤ１１７の第１のアイソフォーム）を発現する造血幹細胞の用量の、（例えば、５分、１５分、３０分、４５分、１時間、２時間、４時間、６時間、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、８週間、１２週間、または１６週間）前、または後（例えば、５分、１５分、３０分、４５分、１時間、２時間、４時間、６時間、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、８週間、１２週間、または１６週間後）に投与される。

【0267】

「治療有効量」または「有効量」とは、上で定義した治療、特に患者における正常な造血の回復を構成するのに十分な、対象に投与される、上で説明したようなＣＤ１１７の第１のアイソフォームを発現するいくつかの細胞、特に造血幹細胞を意図する。

【0268】

本開示による細胞または医薬組成物の投与は、注射、輸血、または移植（ｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ、ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）を含む任意の好都合な様式で行われ得る。本明細書に記載の組成物は、皮下、皮内、腫瘍内、結節内、髄内、筋肉内、静脈内またはリンパ内注射によって、または腹腔内に患者に投与することができる。別の実施形態では、本開示の細胞または医薬組成物は、好ましくは静脈内注射によって投与される。本開示の細胞または医薬組成物は、腫瘍、リンパ節または感染部位に直接注射され得る。

【0269】

細胞または細胞の集団の投与は、それらの範囲内の細胞数のすべての整数の値を含む、１０^４から１０^９細胞／ｋｇ体重、好ましくは１０^５から１０^７細胞／ｋｇ体重、より好ましくは２×１０^６から５×１０^６細胞／ｋｇ体重の投与からなることができる。投与される投与量は、レシピエントの年齢、健康状態および体重、もしあれば併用治療の種類、治療の頻度および所望の効果の性質に依存する。細胞または細胞の集団は、１つまたは複数の用量で投与することができる。投与のタイミングは、管理医師の判断の範囲内であり、対象の臨床状態に依存する。細胞または細胞の集団は、血液バンクまたはドナーなどの任意の供給源から得ることができる。個々の必要性は様々であるが、当技術分野の範囲内の特定の疾患または状態に対する所与の細胞型の有効量の最適範囲の決定がなされた。

【0270】

特に、本開示はまた、それを必要とする対象において、宿主細胞を選択的に枯渇させるのに使用するための第１の抗原結合領域を含む上記の抗ＣＤ１１７剤（例えば、ＣＡＲ細胞組成物または抗体）を枯渇させることに関する。

【0271】

特異的に移植された細胞を枯渇させ、患者の細胞は枯渇させない方法（安全スイッチ）。
本開示によれば、上記のようなＣＤ１１７の第１のアイソフォームを発現する前記細胞または細胞の集団（例えば、造血細胞）は、それを必要とする患者の医学的治療に使用され、前記医学的治療は、ＣＤ１１７の前記第１のアイソフォームを発現する治療有効量の細胞または細胞の集団を、前記表面タンパク質の前記ＣＤ１１７の第１のアイソフォームに特異的に結合する治療有効量の枯渇剤（例えば、ＣＡＲ細胞または抗体）と併用して投与することを含む。

【0272】

本開示のＣＤ１１７の第１のアイソフォームを発現する細胞または細胞の集団、好ましくは免疫細胞は、患者への養子移入細胞移入療法において特に使用される。前記ＣＤ１１７の第１のアイソフォームを発現する前記移植細胞は、移植による移植片対宿主病などの最終的な重篤な副作用を回避するために、特にＣＤ１１７の第１のアイソフォームに特異的に結合し、患者の細胞によって発現されるＣＤ１１７の第２のアイソフォームには結合しないかまたは実質的により弱く結合する第２の抗原結合領域を含む治療有効量の枯渇剤を投与することによって、患者においてさらに枯渇させることができる。この場合、（移植された細胞によって発現される）ＣＤ１１７の前記第１のアイソフォームに特異的に結合する第２の抗原結合領域を含む前記薬剤は、患者の細胞ではなく特異的に移植された細胞を枯渇させるために投与される。移植細胞の選択的枯渇は、「安全スイッチ」を設けることによって重要な安全機能を構成する。

【0273】

移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）は、遺伝的に異なる人からの移植組織の受け入れ後の医学的合併症に関する。提供された組織（移植片）の免疫細胞は、レシピエント（宿主）を外来細胞として認識する。特定の実施形態では、医学的状態は、免疫細胞が患者に移入される造血幹細胞移植または養子細胞移入療法によって引き起こされる移植片対宿主病である。

【0274】

前記副作用は、移植細胞、特にＣＡＲを有する免疫細胞がサイトカイン放出症候群および／または神経毒性などの重篤な副作用を有する場合にも起こり得る。この場合、ＣＤ１１７の第１のアイソフォームを発現する移植細胞は、前記細胞が悪性になるか、または安全スイッチとして任意のタイプの望ましくないオンターゲットまたはオフターゲットの損傷を引き起こすと排除することができる。

【0275】

本開示は、ＣＤ１１７の第２のアイソフォームを発現する細胞を有する患者における養子細胞移入療法のための方法に関し、方法は以下を含む、
（ｉ）ＣＤ１１７の第１のアイソフォームを発現する有効量の細胞であって、前記ＣＤ１１７の第１のアイソフォームを発現する前記細胞が、前記第１のアイソフォームのＣＤ１１７をコードする核酸に少なくとも１つの多型対立遺伝子、好ましくは一塩基多型（ＳＮＰ）対立遺伝子、または遺伝子操作された対立遺伝子を有するゲノムＤＮＡを含み、前記多型が、前記ＣＤ１１７の前記第２のアイソフォームを発現する細胞を有する患者のゲノムに存在しない、細胞、またはその医薬組成物を投与すること、および
（ｉｉ）ＣＤ１１７の前記第１のアイソフォームに特異的に結合し、ＣＤ１１７の前記第２のアイソフォームに結合しないかまたは実質的により弱く結合する少なくとも第２の抗原結合領域を含む薬剤の治療有効量を投与して、ＣＤ１１７の前記第１のアイソフォームを発現する細胞を特異的に枯渇させること。

【0276】

ＣＤ１１７の第１のアイソフォームを発現する前記細胞またはその医薬組成物は、上記のような第２の抗原結合領域を含む薬剤と併用して（例えば、前に、同時に、または後に）対象に投与される。

【0277】

好ましい実施形態では、枯渇剤（例えば、ＣＤ１１７の第２のアイソフォームを標的とするＣＡＲ細胞または抗体）は、ＣＤ１１７の第１のアイソフォームを発現する造血幹細胞の用量の、（例えば、５分、１５分、３０分、４５分、１時間、２時間、４時間、６時間、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、８週間、１２週間、または１６週間）前、または後（例えば、５分、１５分、３０分、４５分、１時間、２時間、４時間、６時間、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、８週間、１２週間、または１６週間後）に投与される。

【0278】

本開示による細胞または医薬組成物の投与は、注射、輸血、または移植（ｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ、ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）を含む、任意の好都合な様式で行われ得る。本明細書に記載の組成物は、皮下、皮内、腫瘍内、結節内、髄内、筋肉内、静脈内またはリンパ内注射によって、または腹腔内に患者に投与することができる。別の実施形態では、本開示の細胞または医薬組成物は、好ましくは静脈内注射によって投与される。本開示の細胞または医薬組成物は、腫瘍、リンパ節または感染部位に直接注射され得る。

【0279】

細胞または細胞の集団の投与は、それらの範囲内の細胞数のすべての整数の値を含む、１０^４から１０^９細胞／ｋｇ体重、好ましくは１０^５から１０^７細胞／ｋｇ体重の投与からなることができる。投与される投与量は、レシピエントの年齢、健康状態および体重、もしあれば併用治療の種類、治療の頻度および所望の効果の性質に依存する。細胞または細胞の集団は、１つまたは複数の用量で投与することができる。投与のタイミングは、管理医師の判断の範囲内であり、対象の臨床状態に依存する。細胞または細胞の集団は、血液バンクまたはドナーなどの任意の供給源から得ることができる。個々の必要性は様々であるが、当技術分野の範囲内の特定の疾患または状態に対する所与の細胞型の有効量の最適範囲の決定がなされた。

【0280】

したがって、特定の実施形態において、本開示は、上で記載されるようなＣＤ１１７の第１のアイソフォームを発現する細胞を投与されたことがある患者において重篤な副作用のリスクを防止することまたは低下させることにおいて使用するための枯渇剤（例えば、ＣＡＲ細胞または抗体）に関し、前記患者は、ＣＤ１１７の第２のアイソフォームを発現する天然の細胞を有し、前記枯渇剤は、前記ＣＤ１１７の第１のアイソフォームに特異的に結合し、前記ＣＤ１１７の第２のアイソフォームに結合しないかまたは実質的により弱く結合する少なくとも第２の抗原結合領域を含む。

【0281】

別の態様では、本開示は、上記のＣＤ１１７の第１のアイソフォームを細胞に発現させるためのキットであって、Ｃａｓタンパク質、塩基エディタもしくはプライムエディタ、核酸構築物、上記の発現ベクターと併用させたガイドＲＮＡなどの遺伝子編集酵素、または本開示による単離細胞を含むキットに関する。

【0282】

特定の実施形態では、本開示は、以下の併用に関する、
ａ）ＣＤ１１７のアイソフォームを発現する哺乳動物細胞または細胞の集団であって、前記ＣＤ１１７のアイソフォームが、野生型ＣＤ１１７の位置１２１のアスパラギン酸のリジンへの置換を特徴とする、哺乳動物細胞または細胞の集団、および
ｂ）以下を含む枯渇剤、
ｉ．ＶＨＣＤＲ１が配列番号１７であり、ＶＨＣＤＲ２が配列番号１８であり、ＶＨＣＤＲ３が配列番号１９である、３つのＣＤＲ、ＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２、およびＶＨＣＤＲ３を含む抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、および
ｉｉ．３つのＣＤＲ ＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２、およびＶＬＣＤＲ３を含む抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）であって、ＶＬＣＤＲ１は配列番号５９、ＶＬＣＤＲ２は配列番号２１、およびＶＬＣＤＲ３は配列番号６０である、抗体軽鎖可変ドメイン、
それを必要とする患者における医学的治療に使用するためのものである。

【0283】

特定の実施形態では、本開示は、以下の併用に関する、
ａ）ＣＤ１１７のアイソフォームを発現する哺乳動物細胞または細胞の集団であって、前記ＣＤ１１７のアイソフォームが、野生型ＣＤ１１７の位置１２３のセリンのリジンへの置換を特徴とする、哺乳動物細胞または細胞の集団、および
ｂ）以下を含む枯渇剤、
ｉ．ＶＨＣＤＲ１が配列番号１７であり、ＶＨＣＤＲ２が配列番号１８であり、ＶＨＣＤＲ３が配列番号１９である、３つのＣＤＲ、ＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２、およびＶＨＣＤＲ３を含む抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、および
ｉｉ．３つのＣＤＲ ＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２、およびＶＬＣＤＲ３を含む抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）であって、ＶＬＣＤＲ１は配列番号５９、ＶＬＣＤＲ２は配列番号２１、およびＶＬＣＤＲ３は配列番号６０である、抗体軽鎖可変ドメイン、
それを必要とする患者における医学的治療に使用するためのものである。

【0284】

特定の実施形態では、本開示は、以下の併用に関する、
ａ）ＣＤ１１７のアイソフォームを発現する哺乳動物細胞または細胞の集団であって、前記ＣＤ１１７のアイソフォームが、野生型ＣＤ１１７の位置１２１のアスパラギン酸のリジンへの置換を特徴とする、哺乳動物細胞または細胞の集団、および
ｂ）以下を含む枯渇剤、
ｉ．ＶＨＣＤＲ１が配列番号１７であり、ＶＨＣＤＲ２が配列番号１８であり、ＶＨＣＤＲ３が配列番号１９である、３つのＣＤＲ、ＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２、およびＶＨＣＤＲ３を含む抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、および
ｉｉ．３つのＣＤＲ ＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２、およびＶＬＣＤＲ３を含む抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）であって、ＶＬＣＤＲ１は配列番号５９、ＶＬＣＤＲ２は配列番号２１、およびＶＬＣＤＲ３は配列番号６１である、抗体軽鎖可変ドメイン、
それを必要とする患者における医学的治療に使用するためのものである。

【0285】

特定の実施形態では、本開示は、以下の併用に関する、
ａ）ＣＤ１１７のアイソフォームを発現する哺乳動物細胞または細胞の集団であって、前記ＣＤ１１７のアイソフォームが、野生型ＣＤ１１７の位置１２３のセリンのリジンへの置換を特徴とする、哺乳動物細胞または細胞の集団、および
ｂ）以下を含む枯渇剤、
ｉ．ＶＨＣＤＲ１が配列番号１７であり、ＶＨＣＤＲ２が配列番号１８であり、ＶＨＣＤＲ３が配列番号１９である、３つのＣＤＲ、ＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２、およびＶＨＣＤＲ３を含む抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、および
ｉｉ．３つのＣＤＲ ＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２、およびＶＬＣＤＲ３を含む抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）であって、ＶＬＣＤＲ１は配列番号５９、ＶＬＣＤＲ２は配列番号２１、およびＶＬＣＤＲ３は配列番号６１である、抗体軽鎖可変ドメイン、
それを必要とする患者における医学的治療に使用するためのものである。

【0286】

特定の実施形態では、本開示は、以下の併用に関する、
ａ）ＣＤ１１７のアイソフォームを発現する哺乳動物細胞または細胞の集団であって、前記ＣＤ１１７のアイソフォームが、野生型ＣＤ１１７の位置１２１のアスパラギン酸のリジンへの置換を特徴とする、哺乳動物細胞または細胞の集団、および
ｂ）以下を含む枯渇剤、
ｉ．ＶＨＣＤＲ１が配列番号１７であり、ＶＨＣＤＲ２が配列番号１８であり、ＶＨＣＤＲ３が配列番号１９である、３つのＣＤＲ、ＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２、およびＶＨＣＤＲ３を含む抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、および
ｉｉ．３つのＣＤＲ ＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２、およびＶＬＣＤＲ３を含む抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）であって、ＶＬＣＤＲ１は配列番号２０、ＶＬＣＤＲ２は配列番号２１、およびＶＬＣＤＲ３は配列番号２２である、抗体軽鎖可変ドメイン、
それを必要とする患者における医学的治療に使用するためのものである。

【0287】

特定の実施形態では、本開示は、以下の併用に関する、
ａ）ＣＤ１１７のアイソフォームを発現する哺乳動物細胞または細胞の集団であって、前記ＣＤ１１７のアイソフォームが、野生型ＣＤ１１７の位置１２３のセリンのリジンへの置換を特徴とする、哺乳動物細胞または細胞の集団、および
ｂ）以下を含む枯渇剤、
ｉ．ＶＨＣＤＲ１が配列番号１７であり、ＶＨＣＤＲ２が配列番号１８であり、ＶＨＣＤＲ３が配列番号１９である、３つのＣＤＲ、ＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２、およびＶＨＣＤＲ３を含む抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、および
ｉｉ．３つのＣＤＲ ＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２、およびＶＬＣＤＲ３を含む抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）であって、ＶＬＣＤＲ１は配列番号２０、ＶＬＣＤＲ２は配列番号２１、およびＶＬＣＤＲ３は配列番号２２である、抗体軽鎖可変ドメイン、
それを必要とする患者における医学的治療に使用するためのものである。

【実施例】

【0288】

実施例１：抗ＣＤ１１７ ＦａｂおよびＭＡｂの作製
６つの異なる抗ＣＤ１１７抗体を、公的に入手可能な配列情報または情報源に基づいてＦａｂおよびＭＡｂフォーマットで作製した。抗体の５つ（Ｒｅｆｍａｂの＃１～＃５）の可変鎖およびＣＤＲ（Ｋａｂａｔ）を表４に示す。第６の抗体（Ｒｅｆｍａｂ＃６）は、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ（カタログ番号第３１３２０２号；代替サプライヤ：Ｄｉａｎｏｖａ（＃１１７ＰＥ－１００Ｔ））から市販されている抗ＣＤ１１７抗体である、抗体１０４Ｄ２である。抗体ＹＢ５．Ｂ８を発現対照（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号第１４－１１７９－８２）として使用した。

【0289】

【表4】

【0290】

抗体のさらなる特徴、ならびに完全長抗体のフォーマットおよびアイソタイプを表５に示す。

【0291】

【表5】

【0292】

実施例２：ＣＤ１１７へのＭＡｂの結合およびアッセイ条件の最適化
ＨＥＫ－２９３Ｔ細胞を、野生型ＣＤ１１７（配列番号１）を含有する構築物または空のベクターでトランスフェクトした。トランスフェクト細胞への抗体の結合および最適なアッセイ条件を３８４ウェルフォーマットで評価した。細胞発現の検出をハイスループットフローサイトメトリーによって測定した。各抗体の連続希釈物を、ＣＤ１１７またはベクターのみを発現する細胞に対する免疫反応性について試験した。生のシグナル値およびシグナル－バックグラウンド計算に基づいて、各抗体の最適スクリーニング濃度を決定した。結果を図１に示す。各点は、４回の反復の平均を表す。

【0293】

Ｍａｂフォーマットの６つすべての抗体は、濃度依存的様式でヒトＣＤ１１７に結合する。空ベクターでトランスフェクトした細胞は、抗ヒトＣＤ１１７抗体への結合を示さなかった。

【0294】

フローサイトメトリーのための最適化されたアッセイ条件を表６に示す。

【0295】

【表6】

【0296】

実施例３：ＣＤ１１７へのＦａｂの結合およびアッセイ条件の最適化
完全長抗体の代わりにＦａｂ断片を試験したことを除いて、実施例２に記載したのと同様の実験を行った。各Ｆａｂの連続希釈物を、野生型ＣＤ１１７またはベクターのみを発現する細胞に対する免疫反応性について試験した。生のシグナル値およびシグナル－バックグラウンド計算に基づいて、各Ｆａｂに対する最適スクリーニング濃度を決定した。結果を図２に示す。各点は、４回の反復の平均を表す。

【0297】

Ｍａｂフォーマットの６つすべての抗体は、濃度依存的様式でヒトＣＤ１１７に結合する。空ベクターでトランスフェクトした細胞は、抗ヒトＣＤ１１７抗体への結合を示さなかった。

【0298】

ハイスループットフローサイトメトリーのための最適化されたアッセイ条件を表７に示す。

【0299】

【表7】

【0300】

実施例４：アラニンスキャン
ヒトＣＤ１１７のアラニンスキャンを実施して、調査した６つの抗体への結合に関与するＣＤ１１７の残基を決定した。アラニンスキャンは、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（２０１４）１４３，１３－２０に記載されているように、ショットガン突然変異誘発エピトープマッピング（Ｉｎｔｅｇｒａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ／ＰＡ，ＵＳＡ）によって行った。簡潔には、ハイスループット部位特異的突然変異誘発によってＣＤ１１７の突然変異ライブラリーを作成した。各残基を個別にアラニンに変異させ、アラニンコドンをセリンに変異させた。変異体ライブラリーを３８４ウェルマイクロプレートに配列し、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に一過性にトランスフェクトした。トランスフェクション後、細胞を、野生型ＣＤ１１７の独立した免疫蛍光滴定曲線を使用して所定の濃度で示された抗体（ＩｇＧまたはＦａｂ）と共にインキュベートした。Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８コンジュゲート二次抗体を使用して抗体を検出し、Ｉｎｔｅｌｌｉｃｙｔ ｉＱｕｅフローサイトメトリープラットフォーム（Ｉｎｔｅｌｌｉｃｙｔ／Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を使用して平均細胞蛍光を決定した。変異した残基は、試験抗体の反応性を支持しないが、参照抗体の反応性を支持する場合、抗体エピトープにとって重要であると同定された（抗体ＹＢ５．Ｂ８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号第１４－１１７９－８２））。このカウンタースクリーニング戦略は、局所的にミスフォールドしているかまたは発現欠損を有する変異体の排除を容易にする。各抗体の各変異クローンへの結合を二連で決定した。各点について、バックグラウンド蛍光を生データから差し引いた後、野生型ＣＤ１１７との抗体反応性に対して正規化した。

【0301】

非常に高親和性の抗体のライブラリースクリーニングでは、抗体結合のための重要な残基が得られないことがあるので、高親和性抗体をＦａｂフォーマットに変換して、結合を十分に弱め、結合のための重要な残基の同定を可能にした。標準的な条件下でのＦａｂスクリーニングが、結合のための重要な残基を同定するにはまだ不十分である場合、高ストリンジェンシー条件を実施した。これらの条件には、ｐＨの上昇、塩分濃度の上昇、温度の上昇、および／または洗浄時間の増加の組み合わせが含まれる。高ストリンジェンシー条件を必要とした抗体は「ＨＳ」と示される。

【0302】

各変異クローンについて、平均結合値を発現の関数（対照の反応性によって表される）としてプロットした。図３を参照されたい。予備的な一次重要クローン（灰色の円）を同定するために、対照抗体に対する＞７０％野生型結合および試験抗体に対する＜２０％野生型結合の閾値（破線）を適用した。設定された閾値を満たさなかったが、結合活性の低下および重要な残基への近接性が、変異した残基が抗体エピトープの一部であり得ることを示唆したクローンについては、二次クローン（白丸）を強調している。

【0303】

同定された重要な残基を表８に要約する。同定されたすべての重要な残基について、平均結合反応性（および範囲）を挙げる。抗体結合のための重要な残基（灰色で白抜き）は、変異が試験Ａｂへの結合について陰性であったが、対照抗体への結合について陽性であった残基であった。閾値ガイドラインを満たさないさらなる二次残基（枠付き細胞として概説されている）が同定されたが、その結合活性の低下および重要な残基への近接は、それらが抗体エピトープの一部であり得ることを示唆した。

【0304】

【表8】

【0305】

表９は、試験した６つの抗体のそれぞれについての重要な残基をまとめたものである。変異が特異的抗体との反応性を最も低くした残基を太字で強調し、下線を引く。検証された重要な残基は、その側鎖が抗体－エピトープ相互作用に最も高いエネルギー寄与をするアミノ酸を表す（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９９８）２８０，１－９；Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９９９）２８５，２１７７－２１９８）；したがって、強調された残基は、結合に対する主要なエネルギー寄与体である可能性が高い。

【0306】

【表9】

【0307】

実施例５：包括的突然変異解析
実施例４で特定されたヒトＣＤ１１７に対する６つの抗体のそれぞれの結合のための重要な残基をより詳細に調べた。最初に、結合活性の再現性、表面のアクセス性、構造的局在および他の重要な部位までの距離、ならびに置換アミノ酸の性質および生化学的特性（例えば、システイン形成ジスルフィド架橋または翻訳後修飾部位）を考慮して、同定された重要な残基の検証ステップを行った。検証後、各重要な残基を、置換アミノ酸ならびに新たに導入されたアミノ酸の配列および構造関連特性に基づいて、選択された生物物理学的に適切な非アラニンアミノ酸に包括的突然変異誘発に供した

【0308】

抗体を、ＩｇＧ形式のヒトＣＤ１１７変異体への結合についてスクリーニングした。実施例４と同様に、包括的ライブラリー中の各突然変異体クローンへの各試験抗体の結合をハイスループットフローサイトメトリーによって２連で決定した。各突然変異について、バックグラウンド蛍光を生データから差し引いた後、野生型ＣＤ１１７との抗体反応性に対して正規化した。全変異クローンについて、平均結合反応性および範囲を表１０に列挙する。２５％未満の結合を引き起こした変異は灰色で強調されている。

【0309】

【表10】

【0310】

これらの結果に基づいて、また三次元構造中の個々の残基の位置、ならびに関連タンパク質配列の進化分析に基づいて推定されるそれらの置換傾向を考慮して、表１１に示される残基をフォローアップ研究の最も有望な候補として選択した。

【0311】

【表11】

【0312】

実施例６：選出されたＣＤ１１７変異体の生物物理学的特徴づけ
選出された変異体の生物物理学的特性を試験した。選出されたＣＤ１１７変異体の凝集を分取サイズ排除クロマトグラフィーによって決定した。選出されたＣＤ１１７変異体の収量は、精製後のタンパク質の量を産生量で割ることによって決定した。溶融温度は、Ｓｙｐｒｏ Ｏｒａｎｇｅ（シグマ、ＰＮ：Ｓ５６９２－５０ｕｌ）およびＲＴ－ＰＣＲ装置（Ｃ１０００ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ、Ｂｉｏｒａｄ）を使用した示差走査蛍光測定によって測定した。試料をＰＢＳ緩衝液中０．２５～１．０ｍｇ／ｍＬで二連で測定し、Ｓｙｐｒｏ Ｏｒａｎｇｅを５倍の最終濃度で添加した。温度を２５℃から９５℃に順次上昇させた（０．５℃ずつ１０秒）。蛍光増加を温度の関数としてモニターし、融解温度をシグモイド曲線の変曲点として決定し、野生型ＣＤ１１７と比較した。結果を図４（凝集）、図５（収率）および図６（融解温度）に示す。

【0313】

ほとんどの変異体の単量体含有量は許容できるものであり、わずかな変異体（Ｄ１２１Ｖ、Ｄ１２１Ｙ、Ｄ１２１Ｔ、Ｓ１２３Ｖ、Ｓ１２３Ｉ、Ｓ２３９Ｋ）のみが５０％未満の単量体含有量を示した。また、ごく少数の変異体（Ｅ７３ｄｅｌ、Ｄ１２１Ｖ、Ｓ２３９Ｈ）を除くすべての変異体の産生収率も十分に高かった。同様に、２つの融点が測定された変異体Ｖ１２０Ｐを除いて、融解温度は許容範囲内であり、野生型ＣＤ１１７と比較した構造差を示した。

【0314】

実施例７：選出された変異体への抗体Ｒｅｆｍａｂ＃１の結合
選択された変異体への結合のより高度な分析を、抗体Ｒｅｆｍａｂ＃１を用いて行った。ｗｔおよび変異体（分析物）に対するＲｅｆｍａｂ＃１の結合を、ＯｃｔｅｔシステムＲＥＤ９６ｅまたはＲ８において、１×動的緩衝液（ザルトリウス、ＰＮ：１８－１１０５）を用いて１，０００ｒｐｍで振盪しながら２５℃で測定した。最初に、選出された変異体を、３つの異なる濃度の分析物を使用して、Ｒｅｆｍａｂ＃１に結合する能力についてスクリーニングした。抗体Ｒｅｆｍａｂ＃１を、抗ヒトＦｃキャプチャバイオセンサ（ＡＨＣ）（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ、ＰＮ：１８－５０６０）によって０．５から１ｕｇ／ｍＬで３００秒間捕捉した。分析物として、ドメイン１、２および３（ＣＤ１１７ Ｄ１－２－３）のみを含有するヒトＣＤ１１７ ｗｔおよび変異体を、５００ｎＭ、５０ｎＭおよび５ｎＭで滴定した。Ｒｅｆｍａｂ＃１に対する分析物の会合および解離を、それぞれ３００秒間および９００秒間監視した。参照減算を緩衝液のみのウェルに対して行った。１０ｍＭ Ｇｌｙ－ＨＣｌ ｐＨ１．７を使用してＡＨＣチップを再生した。Ｏｃｔｅｔ Ｄａｔａ ＡｎａｌｙｓｉｓソフトウェアＨＴ １２．０を使用してデータを分析した。データを１：１結合モデルに適合させた（可能な場合）。速度論的速度ｋ_ａおよびｋ_ｄを、全体に適合させた。選出された変異体の結合レベルを野生型と比較し、図７にパーセントとして示す。この定性分析のために、会合ステップの終了時のトップ分析物濃度の結合レベルを使用した。

【0315】

結果を図７に示す。Ｅ７３Ｙ、Ｅ７３Ｒ、Ｄ１２１Ｙ、Ｄ１２１Ｈ、Ｄ１２１Ｋ、Ｄ１２１Ｔ、Ｒ１２２Ｓ、Ｒ１２２Ｈ、Ｒ１２２Ｅ、Ｓ１２３Ｐ、Ｓ１２３Ｆ、Ｓ１２３ＥおよびＳ１２３Ｋが含まれるいくつかのＣＤ１１７変異体は、Ｒｅｆｍａｂ＃１に対する結合の、特に強い減少を示した。変異体Ｅ７３Ｋ、Ｄ１２１Ｒ、Ｓ１２３Ｖ、Ｓ１２３Ｉ、Ｓ１２３ＭおよびＳ１２３Ｑもまた、Ｒｅｆｍａｂ＃１に対する結合の強い減少を示した。Ｏｃｔｅｔシステムの結果はまた、ＦＡＣＳ実験で観察された結果と良好に相関した。

【0316】

ＣＤ１１７ Ｄ１－２－３変異体Ｅ７３Ｋ、Ｅ７３Ｌ、Ｅ７３Ｒ、Ｅ７３Ｙ、Ｄ１２１Ｈ、Ｄ１２１Ｋ、Ｓ１２３ＫおよびＳ１２３Ｆに対するＲｅｆｍａｂ＃１の結合をさらに特徴づけるために、分析物を７つの異なる濃度（２０００ｎＭ～５ｎＭ）で滴定した。抗体Ｒｅｆｍａｂ＃１を０．５から１ ｕｇ／ｍＬで３００秒間ＡＨＣバイオセンサによって捕捉した。Ｒｅｆｍａｂ＃１への会合および解離は、それぞれ６００秒および１０００秒に延長された。定常状態分析を行った。

【0317】

ヒトＣＤ１１７のＥ７３Ｋ変異体に対する抗体Ｒｅｆｍａｂ＃１のＫＤは、野生型ＣＤ１１７と比較して１２００倍減少した（２つの個々の実験によって決定されるものとして、１２００ｎＭ対１ｎＭ）。ヒトＣＤ１１７のＥ７３Ｌ変異体に対する抗体Ｒｅｆｍａｂ＃１のＫＤは、野生型ＣＤ１１７と比較して約５００倍減少し（２つの個々の実験によって決定されるものとして、４８５ｎＭ対１ｎＭ）、ヒトＣＤ１１７のＥ７３Ｙ変異体は野生型ＣＤ１１７と比較して約７００倍減少し（２つの個々の実験によって決定されるものとして、６９１ｎＭ対１ｎＭ）、ヒトＣＤ１１７のＥ７３Ｒ変異体は野生型ＣＤ１１７と比較して約１０００倍減少し（２つの個々の実験によって決定されるものとして、９５８ｎＭ対１ｎＭ）、ヒトＣＤ１１７のＳ１２３Ｆ変異体は野生型ＣＤ１１７と比較して約１，５００倍減少した（２つの個々の実験によって決定されるものとして、１５００ｎＭ対１ｎＭ）。２０００ｎＭのヒトＣＤ１１７変異体Ｄ１２１Ｈ、Ｄ１２１ＫおよびＳ１２３Ｋでは、Ｒｅｆｍａｂ＃１の結合（０．１ｎｍを超えるｎｍシフト）は観察されなかった。図８を参照されたい。

【0318】

実施例８：選出されたＣＤ１１７変異体へのＳＣＦ結合
ＳＣＦ結合はＣＤ１１７の一機能である。ＳＣＦ結合は、ＣＤ１１７による機能的シグナルの伝達に重要である。選ばれた変異体のＳＣＦへの結合を、１×ＫｉｎｅｔｉｃＢｕｆｆｅｒ（ザルトリウス、ＰＮ：１８－１１０５）を用いて１０００ｒｐｍで振盪しながら、２５℃でＯｃｔｅｔシステムＲＥＤ９６ｅまたはＲ８で測定した。ビオチン化Ａｖｉｔａｇ－ｈＳＣＦ（Ａｃｒｏｓ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＰＮ：ＳＣＦ－Ｈ８２Ｅ１）をストレプトアビジン（ＳＡ）バイオセンサ（ザルトリウス、ＰＮ：１８－５０１９）に０．５～１ ｕｇ／ｍＬで６００秒間捕捉した

【0319】

野生型ＣＤ１１７のドメイン１、２および３を担持する構築物（ＣＤ１１７ Ｄ１－２－３ｗｔ）ならびに野生型ＣＤ１１７のドメイン４および５を担持する構築物（ＣＤ１１７ Ｄ４－５ｗｔ）をこの実験で使用した。ドメイン１、２、３は、ＳＣＦの結合部位を含む。ドメイン４およびドメイン５を陰性非結合対照として使用した。

【0320】

ＣＤ１１７ Ｄ１－２－３ｗｔおよびその変異体を、１０００ｎＭ～５ｎＭの異なる濃度で滴定する。会合を３００秒間、解離を６００秒間監視した。ヒトＣＤ１１７ドメイン４および５（ＣＤ１１７ Ｄ４－５）への結合を、非結合対照と同じ条件下で行った。参照減算を緩衝液のみのウェルに対して行った。バイオセンサは再生せず、各分析物に新しい組のＳＡバイオセンサを使用した。Ｏｃｔｅｔ Ｄａｔａ ＡｎａｌｙｓｉｓソフトウェアＨＴ １２．０を使用してデータを分析した。相互作用の高速オン／オフ特性のために、定常状態データ分析を行った。

【0321】

結果を図９に示す。

【0322】

選出された変異体は、ＳＣＦに対する異なる程度の結合を示した。特に、Ｅ７３変異体（Ｅ７３Ｌ、Ｅ７３Ｑ、Ｅ７３Ｋ、Ｅ７３Ｙ、Ｅ７３ＲおよびＥ７３Ａ）はＳＣＦへの結合の損失をほとんど示さず、すべての変異体は野生型ＣＤ１１７と比較して２未満のＫ_Ｄ増加を示した。これは、Ｄ１２１変異体Ｄ１２１Ｙ、Ｄ１２１Ｈ、Ｄ１２１Ｋ、Ｄ１２１ＲおよびＤ１２１Ｔ、Ｓ１２３変異体Ｓ１２３Ｐ、Ｓ１２３Ｆ、Ｓ１２３Ｋ、Ｓ１２３Ａ、Ｓ１２３Ｉ、Ｓ１２３ＭおよびＳ１２３Ｑ、Ｓ２３９変異体Ｓ２３９Ｋ、ならびにＹ２５９変異体Ｙ２５９Ａについても観察された。

【0323】

Ｓ１２３Ｖ、Ｋ１２７ＬおよびＹ２５９Ｅの変異体も、わずかに低い程度ではあるが、ＳＣＦへの結合を示した。変異体Ｅ７３Ｌ、Ｅ７３Ｑ、Ｅ７３Ｋ、Ｅ７３Ｙ、Ｅ７３Ｒ、Ｅ７３Ａ、Ｄ１２１Ｙ、Ｄ１２１Ｈ、Ｄ１２１Ｋ、Ｄ１２１Ｒ、Ｄ１２１Ｔ、Ｓ１２３Ｐ、Ｓ１２３Ｆ、Ｓ１２３Ａ、Ｓ１２３Ｉ、Ｓ１２３Ｍ、Ｓ１２３Ｑ、Ｓ２３９ＫおよびＹ２５９ＡのＫＤは、野生型ＣＤ１１７と比較して２倍未満しか増加しなかった。変異体Ｅ７３Ａ、Ｅ７３Ｌ、Ｅ７３Ｑ、Ｅ７３Ｋ、Ｅ７３Ｙ、Ｅ７３Ｒ、Ｄ１２１Ｙ、Ｄ１２１Ｈ、Ｄ１２１Ｋ、Ｄ１２１Ｒ、Ｄ１２１Ｔ、Ｓ１２３Ｖ、Ｓ１２３Ｐ、Ｓ１２３Ｆ、Ｓ１２３Ｋ、Ｓ１２３Ａ、Ｓ１２３Ｉ、Ｓ１２３Ｍ、Ｓ１２３Ｑ、Ｓ１２３Ｖ、Ｓ２３９Ｈ、Ｓ２３９Ｋ、Ｙ２５９Ｅ、Ｙ２５９ＰおよびＹ２５９ＡのＫ_Ｄは、野生型ＣＤ１１７と比較して３倍未満しか増加しなかった。変異体Ｅ７３Ａ、Ｅ７３Ｌ、Ｅ７３Ｑ、Ｅ７３Ｋ、Ｅ７３Ｙ、Ｅ７３Ｒ、Ｄ１２１Ｙ、Ｄ１２１Ｈ、Ｄ１２１Ｋ、Ｄ１２１Ｒ、Ｄ１２１Ｔ、Ｓ１２３Ｖ、Ｓ１２３Ｐ、Ｓ１２３Ｆ、Ｓ１２３Ｋ、Ｓ１２３Ａ、Ｓ１２３Ｉ、Ｓ１２３Ｍ、Ｓ１２３Ｑ、Ｓ２３９Ｈ、Ｓ２３９Ｋ、Ｙ２５９Ｅ、Ｙ２５９ＰおよびＹ２５９ＡのＫ_Ｄは、野生型ＣＤ１１７と比較して４倍未満しか増加しなかった。例示的な結果を図１０に示す。

【0324】

ＳＣＦの結合を測定するための細胞ベースのアッセイも設定した。ビオチン化ＳＣＦとストレプトアビジンＰＥとの１：１混合物を４５分間インキュベートした。インキュベーション中、ＴＦ－１野生型細胞を１００万細胞／ｍｌで播種する。Ｆｃブロッキングを１５分間実施し（Ｔｒｕｓｔａｉｎ Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、次いで、Ｒｅｆ００１（ニワトリ卵白リゾチームに特異性を有するアイソタイプ対照抗体）または抗ＣＤ１１７抗体のいずれか０．１～１００ｕｇ／ｍｌを細胞に添加する。さらに１５分および洗浄ステップの後、ビオチン化ＳＣＦとストレプトアビジンＰＥとの混合物を細胞に３０分間添加する。最後に、さらに２回の洗浄ステップを実施し、７－ＡＡＤ生存率染色溶液を１０分間細胞に添加する。次いで、プレートを、Ｎｏｖｏｃｙｔｅ Ｑｕａｎｔｅｏｎフローサイトメーターを介して測定する。

【0325】

実施例９：選ばれたＣＤ１１７変異体のＳＣＦ依存性増殖
ＳＣＦ依存性増殖はＣＤ１１７の別の機能である。ＳＣＦ依存性増殖を以下のように測定した：ＴＦ－１細胞を、ＲＰＭＩ培地＋１０％ ＦＣＳ中の滅菌白血球培養処理プレートに１５０，０００細胞／ｍｌの細胞濃度で播種した。細胞を１００ｎｇ／ｍｌのＳＣＦで処理し、様々なＣＤ１１７抗体または異なる濃度のアイソタイプ対照抗体の滴定を行った。３日間のインキュベーション後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ ２．０アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を行い、ルミノメーター（例えば、ＥｎｖｉｓｉｏｎまたはＰｈｅｒａ Ｓｔａｒプレートリーダ）で発光を読み取った。

【0326】

ＣＤ１１７野生型ＴＦ－１細胞を、Ｅ７３Ｋノックインを有するＴＦ１細胞と比較した。クローン集団におけるＥ７３Ｋノックは、ＫＩ１が最初にＡｌｔ－Ｒ ＨＤＲ Ｅｎｈａｎｃｅｒ Ｖ２（ＩＤＴ）で処理され、対立遺伝子の６１％がＮＧＳを介して観察されるＨＤＲ媒介性編集を介して修復されたのに対して、ＫＩ２は未処理であり、３９％のＨＤＲをもたらしたという点で異なる。ＳＯＮＹ ＭＡ９００を使用して編集されたＴＦ１細胞を選別し、最終サブセットから野生型細胞およびノックアウト細胞を除去すると、ＫＩ１およびＫＩ２の両方が得られ、したがって高純度のノックインが得られた。

【0327】

結果を図１１に示す。野生型およびＥ７３Ｋノックイン細胞の両方が強く増殖したが、ノックアウト細胞は増殖しなかった。漸増濃度のＲｅｆｍａｂ＃１による処理は、野生型細胞の増殖の減少をもたらしたが、Ｅ７３Ｋ細胞ではそうではなかった。アバプリチニブで処理した細胞も同様に、いずれのタイプの細胞についても増殖を示さなかった（野生型、Ｅ７３およびノックアウト；データ図示せず）。

【0328】

別の実験では、変異体Ｅ７３Ｋ、Ｅ７３Ｙ、Ｄ１２１Ｋ、Ｓ１２３ＦおよびＳ１２３ＫのＳＣＦ依存性増殖を野生型ＣＤ１１７と比較した。ＴＦ－１細胞を、ＲＰＭＩ＋ＧｌｕｔａＭａｘ＋１０％ ＦＣＳ中透明な底の滅菌白血球培養処理プレートに１５０，０００細胞／ｍｌの細胞濃度で播種した。細胞をＳＣＦの滴定で処理した。３日間のインキュベーション後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ ２．０アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を実施し、ルミノメーター（Ｅｎｖｉｓｉｏｎプレートリーダ）で発光を読み取り、ＥＣ５０を決定した。各実験において３連で２つの異なる実験を行った。

【0329】

ＥＣ５０は、試験したすべての構築物について同様であった。表１２

【0330】

【表12】

【0331】

したがって、変異体のＳＣＦへの結合は、野生型と比較して影響を受けなかった。

【0332】

次に、一定濃度のＳＣＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）で、漸増濃度のＲｅｆＭａｂ＃１を用いて変異体の増殖を試験した。ＴＦ－１細胞を、ＲＰＭＩ＋ＧｌｕｔａＭａｘ＋１０％ ＦＣＳ中透明底および培地中１００ｎｇ／ｍｌのＳＣＦの固定濃度を有する滅菌白血球培養処理プレート中に１５０，０００細胞／ｍｌの細胞濃度で播種し、細胞を異なる濃度のＲｅｆＭａｂ＃１で処理した。３日間のインキュベーション後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ ２，０アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を実施し、ルミノメーター（Ｅｎｖｉｓｉｏｎプレートリーダ）で発光を読み取った。

【0333】

結果を図１６に示す。ＲｅｆＭａｂ＃１は、野生型ＴＦ－１細胞の増殖に対して顕著な効果を有したが、試験したすべてのＣＤ１１７変異体の増殖は、ＲｅｆＭａｂ＃１によって影響されなかった。

【0334】

ヒトＣＤ３４＋ＨＳＣ（異なるドナー）の場合、細胞を、１００ｎｇ／ｍｌのＳＣＦ、５０ｎｇ／ｍｌのＴＰＯおよび５０ｎｇ／ｍｌのＦＬＴ－３リガンドを含むＸ－Ｖｉｖｏ ２０培地中、滅菌白血球培養処理プレートに３０，０００細胞／ｍｌの細胞密度で播種する。次いで、ＨＳＣを様々なＣＤ１１７抗体または異なる濃度のアイソタイプ対照抗体で処理し、プレートを５日間インキュベートする。５日後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ ２．０アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を行い、ルミノメーター（例えば、ＥｎｖｉｓｉｏｎまたはＰｈｅｒａ Ｓｔａｒプレートリーダ）で発光を読み取る。

【0335】

実施例１０：選ばれたＣＤ１１７変異体のＳＣＦ依存性リン酸化
ＳＣＦ依存性リン酸化はＣＤ１１７の別の機能である。ＳＣＦ依存性リン酸化を、ＣＤ１１７を発現するＴＦ－１細胞を使用して測定した（以前の実験で示されるように）。ＴＦ－１細胞を、６ウェルプレート中の１ｍＬの培地（ＧｌｕｔａＭＡＸ＋１０％熱不活性化ＦＢＳを補充したＲＰＭＩ１６４０）に１００万細胞／ｍＬの濃度で播種した。細胞を０．５ｕｇ／ｍＬの抗体または５００ｎＭのアバプラチニブで処理した。次いで、細胞を１００ｎｇ／ｍＬの組換えヒトＳＣＦ（１ｍｇ／ｍＬのＰｅｐｒｏＧＭＰ（登録商標）組換えヒトＳＣＦ）で５分間処理した後、細胞を回収した。細胞を氷冷ＰＢＳで洗浄した後、細胞を２５０μＬの溶解緩衝液（プロテアーゼ阻害剤およびホスファターゼ阻害剤を含有するＳｉｇｎａｌｉｎｇ製の溶解緩衝液）に再懸濁した。細胞を液体窒素中で急速凍結し、３７℃で２回解凍した後、さらなる使用まで－８０℃で凍結した。希釈していない試料を解凍し、ＰａｔｈＳｃａｎ（登録商標）Ｐｈｏｓｐｈｏ－ｃ－Ｋｉｔ（Ｔｙｒ７１９）Ｓａｎｄｗｉｃｈ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）の製造業者プロトコルに従って処理した。吸光度（ＯＤ＿４５０ｎｍ）を、Ｅｎｖｉｓｉｏｎ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を使用して評価した。

【0336】

例示的な結果を、ＣＤ１１７のＥ７３Ｋ変異体について図１２に示す。野生型細胞では、ＳＣＦ誘導性リン酸化は、ＣＤ１１７への結合についてＳＣＦと競合する抗体で遮断することができる。ＳＣＦ誘導性リン酸化はまた、ＣＤ１１７－ＳＣＦ相互作用の公知の阻害剤であるアバプリチニブによっても遮断される。対照的に、ＳＣＦ誘導性リン酸化は、ＣＤ１１７のＥ７３Ｋ変異体に対する抗体では遮断されない。アバプリチニブは、Ｅ７３Ｋ変異体におけるＳＣＦ誘導性リン酸化を依然として遮断する。

【0337】

実施例１１：第１または第２のアイソフォームを発現する細胞の選択的遮断／枯渇
選択されたＣＤ１１７変異体は、ゲノム編集によってＴＦ－１細胞に導入される。次いで、編集された細胞をＳＲ－１にカップリングされた毒素と共にインキュベートする。結合性（野生型）ＣＤ１１７アイソフォームを発現する細胞の選択的枯渇を、ＦＡＣＳまたは生存性アッセイによってモニターすることができる。アッセイは、バルク編集された細胞を用いて行うことができる。ＨＤＲの場合、これは、野生型細胞、ＫＯ細胞および正しく編集された変異体を有するノックイン細胞を含む細胞の混合集団をもたらす。３つの集団は、ＳＲ－１および１０４Ｄ２を使用してＦＡＣＳによって識別することができる。あるいは、３つの集団をＦＡＣＳによって精製し、続いてＳＲ－１にカップリングされた毒素と共にインキュベートすることができる。

【0338】

野生型ＣＤ１１７を発現する細胞は死亡するが、変異体を発現する遺伝子編集細胞は生存する。

【0339】

ＳＲ－１に結合した毒素の代わりに、ＡＤＣＣまたはＣＡＲ Ｔを含むがこれらに限定されない他の作用様式を使用することができる。

【0340】

ＴＦ－１細胞の代わりに、ＣＤ１１７を内因的に発現しない他の細胞株（例えばＨＥＫ２９３、ＤＦ－１）を使用することができる。次いで、一過性または安定に野生型または変異体ＣＤ１１７の組換え発現を、死滅アッセイのための標的細胞として使用することができる。あるいは、初代ヒトＨＳＣをＣＤ３４＋細胞として単離することができる。遺伝子編集ＣＤ３４＋ＨＳＣを、生着研究のために免疫不全マウス（例えば、ＮＳＧ、ＮＳＧ－ＳＧＭ３またはＮＢＳＧＷ）に移入することができる。これにより、前駆細胞の生着および分化をインビボでモニターすることが可能になる。さらに、非結合ＣＤ１１７変異体ではなく結合ＣＤ１１７アイソフォームの選択的枯渇を監視するために、枯渇剤、例えば毒素結合ＳＲ－１をインビボで適用することができる。

【0341】

実施例１２：ＣＤ１１７の遺伝子編集変異体へのＳＲ－１の結合
ＣＤ１１７の遺伝子編集を、ＨＤＲを使用してＴＦ－１細胞において行った。１２個の異なるｃｒＲＮＡを試験し、そのうち６個はアミノ酸残基Ｅ７３を標的とし（表３）、６個はアミノ酸残基１２０～１２３を標的とした（表３）。図１３は、位置Ｅ７３に対する試験されたｃｒＲＮＡの結合を示すマップを示す。図１４は、１２０～１２３位に対する試験されたｃｒＲＮＡの結合を示すマップを示す。

【0342】

ＴＦ－１細胞への抗体ＳＲ－１の結合を、Ｃａｓ９タンパク質、ｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡまたはｓｇＲＮＡおよびＨＤＲ鋳型によるエレクトロポレーションの７日後にＦＡＣＳによって測定した（表４）。野生型細胞と比較した遺伝子編集変異体への結合の喪失を表１３に示す：

【0343】

【表13】

【0344】

抗ＣＤ１１７抗体１０４Ｄ２でも同様の結果が得られた。

【0345】

配列番号１５～１８のＨＤＲ鋳型を、Ａｌｔ－Ｒ（商標）ＨＤＲ Ｄｏｎｏｒ Ｏｌｉｇｏｓ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）として順序付ける。ＨＤＲ鋳型は２つの異なる長さを有し、プラス鎖またはマイナス鎖にあり、少なくとも１つの塩基突然変異によってＥからＫへの突然変異が導入される。ＨＤＲテンプレートは、ｃｒＲＮＡ ＫＩＴ＿Ｅ７３＿４（配列番号６）と共に使用される。ＨＤＲテンプレートは、リカットを回避するためにＰＡＭに少なくとも１つのサイレント突然変異を含み得る。

【0346】

実施例１３：抗体のＣＤ１１７変異体への内在化
抗体内在化は、ＦＡＣＳなどの任意の一般的に使用されるアッセイによって当業者によって試験することができる。ＣＤ１１７を発現する細胞を、フルオロフォア、例えば、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８（ＡＦ４８８）で標識された抗体と様々な時点（０．５～６時間）インキュベートした後、洗浄し、抗ＡＦ４８８抗体で１時間クエンチする。内在化抗体はＦＡＣＳ読み取りでシグナルを与えることができるが、細胞表面に結合した抗体のシグナルはクエンチされ、検出できない。

【0347】

ＣＤ１１７またはその変異体を発現するＴＦ－１細胞への抗体内在化をＦＡＣＳによって測定する。ＴＦ－１細胞を、９６ウェルプレート中の０．１ｍＬの培地（ＧｌｕｔａＭＡＸ＋１０％熱不活性化ＦＢＳ＋２ｎｇ／ｍＬ ＧＭ－ＣＳＦを補充したＲＰＭＩ１６４０）に１００万細胞／ｍＬの濃度で播種する。翌日、細胞を、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８（ＡＦ４８８；Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８ Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｆａｓｔ）－Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ－Ｌｉｎｋ（登録商標）、Ａｂｃａｍ）で標識した２～２０μｇ／ｍＬの抗体で３７℃または４℃で３０～３６０分間処理した後、細胞を収集し、氷冷ＰＢＳで洗浄する。細胞を、２０～２００ｕｇ／ｍＬの抗ＡＦ４８８抗体（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８ポリクローナル抗体、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を含有する氷冷ＰＢＳに１時間再懸濁した後、ＦＡＣＳ機器（ＮｏｖｏＣｙｔｅ、Ａｇｉｌｅｎｔ）でデータを取得する。内在化抗体のシグナルをＦＡＣＳによって測定し、細胞外の抗体のシグナルをクエンチする。抗体内在化の割合は、クエンチャーと共にインキュベートした細胞のシグナルを、クエンチャーなしでインキュベートした細胞のシグナルで割ることによって計算される。

【0348】

実施例１４：選出された変異体への抗体Ｒｅｆｍａｂの＃２および＃３の結合
実施例７と同様の実験を行ったが、Ｒｅｆｍａｂの＃２および＃３を利用した。結果を図１５に示す。

【0349】

Ｒｅｆｍａｂ＃２は、野生型ＣＤ１１７と比較して、変異体Ｒ１２２Ｈ、Ｓ２３９ＨおよびＳ２３９Ｋへの結合の強い減少を示した。Ｒｅｆｍａｂ＃３は、野生型ＣＤ１１７と比較して、変異体Ｙ２５９Ａ、Ｙ２５９Ｇ、Ｙ２５９ＰおよびＳ２６１Ｖへの結合の強い減少を示した。変異体Ｓ２６１ＱおよびＳ２６１Ｅを有するＲｅｆｍａｂ＃３について、結合の完全な喪失が観察された。

【0350】

実施例１５：改善されたＲｅｆｍａｂ抗体
抗体Ｒｅｆｍａｂ＃１の改善バージョンを生成した。改善された結合剤、Ｒｅｆｍａｂ＃１－ＥｒｎｉｅおよびＲｅｆｍａｂ＃１－Ｂｅｒｔのアミノ酸配列を表１４に示す。

【0351】

【表14】

【0352】

Ｒｅｆｍａｂ＃１、Ｒｅｆｍａｂ＃１－ＥｒｎｉｅおよびＲｅｆｍａｂ＃１－Ｂｅｒｔを様々なアッセイで比較した。両誘導体は、ＳＣＦ依存性増殖アッセイにおいて、ＴＦ－１細胞（０．２７６０μｇ／ｍｌと比較して０．０１７６および０．０４４１μｇ／ｍｌ）およびＨＳＰＣ（０．０６２３μｇ／ｍｌと比較して０．００５２１および０．０３１３μｇ／ｍｌ）に対して元のＲｅｆｍａｂ＃１抗体のＩＣ５０より低いＩＣ５０を有する。両方の誘導体はまた、元のＲｅｆｍａｂ＃１抗体と少なくとも同程度に強くＳＣＦ依存性リン酸化を阻害した。両方の誘導体はまた、ＣＤ１１７に対するＳＣＦの結合を阻害した。すべての抗体はまた、造血幹細胞におけるＣＤ１１７に対するＳＣＦの結合を阻害する。すべての抗体はまた、ヒトＣＤ３４＋ＨＳＰＣを移植したマウスにおいてヒトＨＳＣを枯渇させる。

【0353】

実施例１６：操作されたＴＦ－１細胞に対するＲｅｆｍａｂ＃１滴定
Ｒｅｆｍａｂ＃１の結合をフローサイトメトリーアッセイで評価した。ＴＦ－１細胞をＦＡＣＳ Ｂｕｆｆｅｒ（ＰＢＳ＋２％ ＦＣＳ＋１ｍＭ ＥＤＴＡ）に１００万細胞／ｍｌの細胞濃度で播種した。ＦＡＣＳ緩衝液中の１：２０希釈ＴｒｕＳｔａｉｎ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、＃４２２３０２）を用いて４℃で１５分間Ｆｃブロッキングした後、細胞をＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した。続いて、プレートシェーカー４℃で３０分間、５－０．０００１５μｇ／ｍＬ抗体を使用してＳＲ－１滴定を細胞に加えた。細胞をＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、二次標識抗体（ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）交差吸着ヤギ抗ヒト、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ａ１１０１３）をプレートシェーカーにおいて４℃で３０分間細胞に添加した。細胞をＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した後、ＦＡＣＳ緩衝液中の７ＡＡＤ染色（細胞生存率）の１：１００希釈溶液を数分間添加し、Ｎｏｖｏｃｙｔｅ Ｑｕａｎｔｅｏｎ（Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用して細胞を分析した。

【0354】

結果を図１７に示す。抗体Ｒｅｆｍａｂ＃１の結合は、ＣＤ１１７変異体Ｅ７３Ｋを発現するＴＦ－１細胞では完全に消失する。２つの独立したＴＦ－１ Ｅ７３Ｋクローンの結果を示す。

【0355】

実施例１７：ＣＤ１１７のＳＣＦ依存性リン酸化
ＴＦ－１細胞（ＣＤ１１７の野生型、ノックアウトおよび変異体Ｅ７３Ｋ、Ｄ１２１ＫおよびＳ１２３Ｋ）を、６ウェルプレート中の２ｍＬの培地（ＧｌｕｔａＭＡＸ＋１０％熱不活性化ＦＢＳを補充したＲＰＭＩ１６４０）に１００万細胞／ｍＬの濃度で播種した。細胞を、細胞の収集の前に、１～２０ｎｇ／ｍＬの組換えヒトＳＣＦ（１ｍｇ／ｍＬのＰｅｐｒｏＧＭＰ組換えヒトＳＣＦ）で５分間処理した。細胞を氷冷ＰＢＳで洗浄した後、細胞を５００μＬの溶解緩衝液（プロテアーゼ阻害剤およびホスファターゼ阻害剤を含有するＳｉｇｎａｌｉｎｇ製の溶解緩衝液）に再懸濁した。細胞を液体窒素中で急速凍結し、３７℃で２回解凍した後、さらなる使用まで－８０℃で凍結した。希釈していない試料を解凍し、ＰａｔｈＳｃａｎ Ｐｈｏｓｐｈｏ－ｃ－Ｋｉｔ（Ｔｙｒ７１９）Ｓａｎｄｗｉｃｈ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）の製造業者プロトコルに従って処理した。吸光度（ＯＤ＿４５０ｎｍ）を、Ｅｎｖｉｓｉｏｎ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を使用して評価した。

【0356】

変異体Ｅ７３Ｋの例示的な結果を図１８に示す。野生型ＴＦ－１細胞ならびにＣＤ１１７のＥ７３Ｋ、Ｄ１２１ＫおよびＳ１２３Ｋ変異体は、ＣＤ１１７のＴｙｒ７１９位でＳＣＦ依存性リン酸化を示した。ノックアウト細胞のリン酸化レベルはバックグラウンドレベルである。

【0357】

実施例１８：ブロッキング抗体の存在下でのＣＤ１１７変異体の保存されたシグナル伝達
ＴＦ－１細胞（ＣＤ１１７の野生型および変異体Ｅ７３Ｋ、Ｅ７３Ｙ、Ｄ１２１Ｋ、Ｓ１２３ＦおよびＳ１２３Ｋ）を、６ウェルプレート中の２ｍＬの培地（ＧｌｕｔａＭＡＸ＋１０％熱不活性化ＦＢＳを補充したＲＰＭＩ１６４０）に１００万細胞／ｍＬの濃度で播種した。細胞を０．５μｇ／ｍＬの抗体Ｒｅｆｍａｂ＃１－ＥｒｎｉｅまたはＲｅｆｍａｂ＃１－Ｂｅｒｔで３０分間前処理した後、１００ｎｇ／ｍＬの組換えヒトＳＣＦ（１ｍｇ／ｍＬ ＰｅｐｒｏＧＭＰ（登録商標）組換えヒトＳＣＦ）を５分間添加した。細胞を回収し、氷冷ＰＢＳで１回洗浄し、５００μＬの溶解緩衝液（プロテアーゼ阻害剤およびホスファターゼ阻害剤を含有するＳｉｇｎａｌｉｎｇからの溶解緩衝液）に再懸濁した。次いで、細胞を液体窒素中で急速凍結し、３７℃で２回解凍した後、さらなる使用まで－８０℃で凍結した。希釈していない試料を解凍し、ＰａｔｈＳｃａｎ Ｐｈｏｓｐｈｏ－ｃ－Ｋｉｔ（Ｔｙｒ７１９）Ｓａｎｄｗｉｃｈ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）またはＨｕｍａｎ ｃ－Ｋｉｔ（ＣＤ１１７）ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ（Ａｂｃａｍ）の製造業者プロトコルに従って処理した。吸光度（ＯＤ＿４５０ｎｍ）を、Ｅｎｖｉｓｉｏｎ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を使用して評価した。

【0358】

変異体Ｄ１２１ＫおよびＳ１２３Ｋの例示的な結果を図１９に示す。野生型ＴＦ－１細胞におけるＳＣＦ依存性ＣＤ１１７リン酸化は、抗体Ｒｅｆｍａｂ＃１－ＥｒｎｉｅおよびＲｅｆｍａｂ＃１－Ｂｅｒｔによって遮断されるが、ＣＤ１１７リン酸化のＤ１２１ＫおよびＳ１２３Ｋ変異体を有するＴＦ－１細胞では影響を受けない。同じことが変異体Ｅ７３Ｋ、Ｅ７３ＹおよびＳ１２３Ｆについても観察される（データは示さず）。

【0359】

実施例１９：ＨＳＣ枯渇実験
様々なｍＡｂを使用するマウスにおけるヒトＨＳＣの枯渇を、Ｐａｎｇ ｅｔ ａｌ．（Ｂｌｏｏｄ（２０１９）１３３：２０６９－７８）から適合させた。

【0360】

ＮＢＳＧＷマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に１ Ｍｉｏ ＨＳＰＣを注射した。細胞注射の８、１０、１２および１４日後、マウスは、投与あたりｉ．ｖ．で２５ｍｇ／ｋｇの抗体Ｒｅｆｍａｂ＃１－Ｂｅｒｔを投与された。１６週間後、マウスを安楽死させ、血液、脾臓および骨髄をＦＡＣＳによって分析した。骨髄ＨＳＣ枯渇の結果を図２０に示す。図は、アイソタイプ対照抗体を受けた動物と比較した、Ｒｅｆｍａｂ＃１－Ｂｅｒｔの注射後のＨＳＣのインビボ枯渇を示す。ＨＳＣは、ＦＡＣＳによって、生／ｈＣＤ４５＋／ＣＤ３４＋／ＣＤ３８－／ＣＤ４５ＲＡ－／ＣＤ９０＋として同定された。

【0361】

別の実験では、ＮＳＧマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に、ＣＤ１１７のＥ７３Ｋ変異体を担持する１ Ｍｉｏ遺伝子編集ＨＳＰＣを注射の１日前に亜致死的に照射した。細胞注射の８、１０、１２および１４日後、マウスに２５ｍｇ／ｋｇ抗体Ｒｅｆｍａｂ＃１－Ｂｅｒｔまたは２５ｍｇ／ｋｇ同位体対照抗体を投与あたり静脈内投与した。１６週間後、マウスを安楽死させ、血液、脾臓および骨髄をＦＡＣＳによって分析した。

【0362】

骨髄の結果を図２１に示す。ＣＤ１１７＋骨髄系細胞は、ＦＡＣＳによって、生／ｈＣＤ４５＋／ＣＤ３３＋／ＣＤ１１７＋として同定された。ＣＤ１１７＋細胞を同定するために、ＣＤ１１７に対するＲｅｆｍａｂ＃１およびＲｅｆｍａｂ＃１－Ｂｅｒｔの結合を妨害しない抗体クローン１０４Ｄ２を使用した。クローン１０４Ｄ２を発現対照として使用した。抗ＣＤ１１７クローンＳＲ－１および抗ＣＤ１１７クローン１０４Ｄ２による二重染色に基づいて、細胞を編集されていない（１０４Ｄ２＋およびＳＲ－１＋）またはＥ７３Ｋ編集（１０４Ｄ２＋だがＳＲ－１－）として分類した。

【0363】

図２１は、抗体Ｒｅｆｍａｂ＃１－Ｂｅｒｔを投与したマウスにおける未編集細胞の枯渇を、アイソタイプ対照抗体を投与したマウスと比較して示す。対照的に、Ｒｅｆｍａｂ＃１－Ｂｅｒｔの注射は、アイソタイプ対照抗体を受けた動物と比較してＥ７３Ｋ変異体細胞の濃縮をもたらした。

【0364】

実施例２０：ＣＤ１１７変異体はＡＤＣによる処置に耐性である
この実験では、ニワトリＤＦ－１細胞を使用した。ＤＦ－１細胞はＣＤ１１７を欠く。細胞を、選択されたＣＤ１１７変異体（Ｅ７３Ｙ、Ｄ１２１Ｋ、Ｓ１２３Ｋ）でトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞を、０．１、１および１０μｇ／ｍｌの濃度のＡＤＣ（両方ともテセリンにカップリングされた抗体Ｒｅｆｍａｂ＃１－ＥｒｎｉｅおよびＲｅｆｍａｂ＃１－Ｂｅｒｔ）で処理した。４８時間後、細胞をＦＡＣＳによって分析した。

【0365】

結果を図２２に示す。Ｄ１２１Ｋ Ａ５およびＤ１２１Ｋ Ａ６は、同じ変異体に対するプラスミドの２つの異なるバッチを示す。両方の試験したＡＤＣ、Ｒｅｆｍａｂ＃１－Ｅｒｎｉｅ－ｔｅｓｅｒｉｎｅおよびＲｅｆｍａｂ＃１－Ｂｅｒｔ－ｔｅｓｅｒｉｎｅは、野生型ＤＦ－１細胞の有効な枯渇をもたらしたが、ＣＤ１１７のＤ１２１ＫまたはＳ１２３Ｋ変異体でトランスフェクトしたＤＦ－１細胞は枯渇しなかった。

【0366】

実施例２１：追加のＨＳＣ枯渇実験
様々なｍＡｂを使用するマウスにおけるヒトＨＳＣの枯渇を、Ｐａｎｇ ｅｔ ａｌ．（Ｂｌｏｏｄ（２０１９）１３３：２０６９－７８）から適合させた。

【0367】

ＮＢＳＧＷマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に、ＣＤ１１７のＥ７３Ｋ、Ｓ１２３ＫまたはＤ１２１Ｋ変異体を有する２名の異なるドナー由来の１ Ｍｉｏ ＨＳＰＣを注射した。マウスの対照群は、未編集のエレクトロポレーション対照ＨＳＰＣを受けた。細胞注射の７、９、１１および１２日後、マウスは、４ｍｇ／ｋｇの抗体Ｒｅｆｍａｂ＃１－Ｂｅｒｔを、投与あたりｉ．ｖ．投与された。１６週間後、マウスを安楽死させ、血液、脾臓および骨髄をＦＡＣＳによって分析した。ＣＤ１１７未編集細胞の枯渇およびＣＤ１１７編集細胞の濃縮についての結果を図２３に示す。未編集細胞および編集細胞を同定するために、ＣＤ１１７特異的抗体クローン１０４Ｄ２およびＳＲ－１を使用した。１０４Ｄ２の結合は遺伝子編集の影響を受けないが、ＳＲ－１はＣＤ１１７の編集された変異体には結合しない。両方の抗ＣＤ１１７クローンでの二重染色に基づいて、細胞を未編集（１０４Ｄ２＋およびＳＲ－１＋）または編集（１０４Ｄ２＋だがＳＲ－１－）として分類した。

【0368】

図２３は、抗体Ｒｅｆｍａｂ＃１－Ｂｅｒｔを受けたマウスにおける未編集のＣＤ３４＋前駆細胞（生／ｈＣＤ４５＋／ＣＤ３４＋／ＣＤ３８－としてゲーティング）の枯渇を、アイソタイプ対照抗体を受けたマウスと比較して示す。対照的に、Ｒｅｆｍａｂ＃１－Ｂｅｒｔの注射は、アイソタイプ対照抗体を受けた動物と比較して、Ｅ７３Ｋ、Ｄ１２１ＫおよびＳ１２３Ｋ編集変異体細胞の濃縮をもたらした。

【図1-1】

【図1-2】

【図2-1】

【図2-2】

【図3-1】

【図3-2】

【図3-3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【配列表】

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【国際調査報告】