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特表2024-546999ＩＬ－１０を含む二重サイトカイン融合物およびがんを処置するための養子細胞療法または二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-12-26
(54)【発明の名称】ＩＬ－１０を含む二重サイトカイン融合物およびがんを処置するための養子細胞療法または二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー
(51)【国際特許分類】
A61K 39/395 20060101AFI20241219BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20241219BHJP
A61K 9/08 20060101ALI20241219BHJP
A61K 35/17 20150101ALI20241219BHJP
A61P 35/02 20060101ALI20241219BHJP
C12N 5/10 20060101ALN20241219BHJP
C12N 5/0783 20100101ALN20241219BHJP
C07K 19/00 20060101ALN20241219BHJP
C12N 15/62 20060101ALN20241219BHJP
【ＦＩ】
A61K39/395 N
A61P35/00
A61K39/395 D
A61K9/08
A61K35/17
A61P35/02
C12N5/10 ZNA
C12N5/0783
C07K19/00
C12N15/62 Z
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024536179
(86)(22)【出願日】2022-12-16
(85)【翻訳文提出日】2024-08-09
(86)【国際出願番号】 US2022081862
(87)【国際公開番号】W WO2023115033
(87)【国際公開日】2023-06-22
(31)【優先権主張番号】63/265,521
(32)【優先日】2021-12-16
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】524225730
【氏名又は名称】デカ バイオサイエンシーズ， インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100078282
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 秀策
(74)【代理人】
【識別番号】100113413
【弁理士】
【氏名又は名称】森下 夏樹
(74)【代理人】
【識別番号】100181674
【弁理士】
【氏名又は名称】飯田 貴敏
(74)【代理人】
【識別番号】100181641
【弁理士】
【氏名又は名称】石川 大輔
(74)【代理人】
【識別番号】230113332
【弁護士】
【氏名又は名称】山本 健策
(72)【発明者】
【氏名】マム， ジョン
【テーマコード（参考）】
4B065
4C076
4C085
4C087
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B065AA94X
4B065AB01
4B065BA02
4B065CA44
4C076AA11
4C076BB13
4C076BB16
4C076CC27
4C076FF11
4C085AA13
4C085AA14
4C085DD62
4C085EE03
4C085GG02
4C085GG04
4C087AA01
4C087AA02
4C087BB37
4C087BB65
4C087MA02
4C087MA66
4C087NA05
4C087NA14
4C087ZB26
4C087ZB27
4H045AA11
4H045AA30
4H045BA10
4H045BA41
4H045CA40
4H045DA76
4H045EA20
4H045FA74
(57)【要約】
本出願は、がんまたは腫瘍を処置する方法であって、養子細胞療法または二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーと組み合わせて、一本鎖可変断片足場システムおよび第２のサイトカインに融合されたＩＬ－１０またはＩＬ－１０バリアント分子を含む、二重サイトカイン融合タンパク質組成物、その医薬組成物、および／または製剤を投与することを含み、第２のサイトカインが、ｓｃＦｖのヒンジ領域において連結されている、方法に関する。本開示は、バイオテクノロジーの分野、より具体的には、がんを処置するための従来の養子細胞療法（「ＡＣＴ」）または二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（「ＢｉＴＥ」）療法と組み合わせる、インターロイキン－１０（「ＩＬ－１０」）およびインターロイキン－２（「ＩＬ－２」）を含むＤｉａｋｉｎｅｓと呼ばれる新規二重サイトカイン融合タンパク質の使用に関する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
がんおよび／または腫瘍を有する患者を処置する方法であって、治療有効量の標的化ダイアキンおよびキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞を発現する遺伝子改変免疫細胞を、それを必要とする患者に投与することを含み、前記標的化ダイアキンが、ＩＬ１０、ＩＬ２、および第１の腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に対する特異性を有する第１の一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含み、前記ＴＡＡが、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ７０、ＣＤ７９Ｂ、ＣＤ１１７、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ１４７、Ｂ細胞突然変異抗原（ＢＣＭＡ）、Ｃ型レクチン様分子１（ＣＬＬ０１）、潜在膜タンパク質１（ＬＭＰ－１）、シグナル伝達リンパ球活性化分子Ｆ７（ＳＬＡＭＦ７）、ＮＹ－ＥＳＯ－１、膜貫通活性化因子およびＣＡＭＬ相互作用物質（ＴＡＣＩ）、ＣＳ－１、ＣＸＣＲ４、ＮＫＧ２Ｄ、Ｂ７－Ｈ３、ＥＧＦＲ、ＰＤ－１、ＰＤＬ－１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＥｐＣＡＭ、メソテリン、ＰＳＣＡ、ＭＵＣ１、ルイスＹ、ＧＰＣ３、ＡＸＬ、クローディン１８．２、ＧＤ２、ＣＴＬＡ－４、ＣＥＡ、ＰＤＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ２、メソテリン（ＭＥＳＯ）、ＰＳＣＡ、ＰＳＡから選択され、
前記ＣＡＲ Ｔ細胞が、第２のおよび異なるＴＡＡに対する特異性を有する第２のｓｃＦｖを含む、
方法。
【請求項2】
前記がんが、血液がんである、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記血液がんが、リンパ腫または白血病である、請求項２に記載の方法。
【請求項4】
前記血液がんが、Ｂ細胞急性リンパ球性白血病（Ｂ－ＡＬＬ）、多発性骨髄腫（ＭＭ）、Ｂ細胞リンパ腫、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病または非ホジキンリンパ腫である、請求項２に記載の方法。
【請求項5】
前記がんが、固形がんまたは腫瘍である、請求項１に記載の方法。
【請求項6】
前記固形がんが、神経芽細胞腫、小細胞肺がん、黒色腫、卵巣がん、腎細胞癌、結腸がん、肺がん、黒色腫、乳がん、前立腺がん、結腸がん、腎細胞癌、卵巣がん、神経芽細胞腫、横紋筋肉腫、白血病およびリンパ腫である、請求項５に記載の方法。
【請求項7】
前記ＩＬ１０が、ヒトＩＬ１０、ＥＢＶ ＩＬ１０もしくはＣＭＶ ＩＬ１０、またはその突然変異体もしくはバリアントであり、Ｌ２が、野生型ＩＬ２、またはそのバリアントもしくはムテインである、請求項１に記載の方法。
【請求項8】
前記ダイアキンが、配列番号１、３、５または７のＩＬ１０を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項9】
前記ダイアキンおよび前記ＣＡＲ Ｔ細胞が、別々の時に、前記患者に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項10】
前記ＣＡＲ Ｔ細胞が、前記患者への投与前に、ある量のダイアキンの存在下で、解凍されているか、および／または休ませられている、請求項１に記載の方法。
【請求項11】
前記ダイアキンが、前記ＣＡＲ Ｔ細胞の投与の１～３日前に、前記患者に投与される、請求項１１に記載の方法。
【請求項12】
前記ダイアキンおよび前記ＣＡＲ Ｔ細胞が、前記患者に、同時に投与される、請求項１１に記載の方法。
【請求項13】
前記ダイアキンが、前記ＣＡＲ Ｔ細胞の投与の１～３日前に、前記患者に投与され、次いで、ダイアキンが、前記ＣＡＲ Ｔ細胞の投与の１～３日後に、前記患者に再投与される、請求項１１に記載の方法。
【請求項14】
前記ダイアキンが、０．０１～０．２ｍｇ／ｋｇの範囲の用量濃度で投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項15】
前記ダイアキンが、約０．０００１～２００ｎｇ／ｍＬの血清または血漿濃度に達する用量で投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項16】
前記ダイアキンが、皮下または静脈内に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項17】
前記遺伝子改変細胞が、免疫細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項18】
前記遺伝子改変細胞が、ＣＤ８＋、ＣＤ４＋、またはその組合せである、請求項１に記載の方法。
【請求項19】
ＣＡＲ－Ｔ細胞をプライミングする方法であって、０．０１～２００ｎｇ／ｍＬのダイアキンの存在下で、前記ＣＡＲ－Ｔ細胞を接触させることを含む、方法。
【請求項20】
前記ＣＡＲ－Ｔ細胞が、ＣＤ８＋およびＣＤ４＋ Ｔ細胞の両方を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項21】
前記ＣＡＲ－Ｔが、それを必要とする患者への投与前の１～２日の期間、前記ダイアキンの存在下でプライミングされる、請求項１９に記載の方法。
【請求項22】
がんおよび／または腫瘍を有する患者を処置する方法であって、治療有効量の標的化ダイアキンおよび二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）を、それを必要とする患者に投与することを含み、前記標的化ダイアキンが、ＩＬ１０、ＩＬ２、および第１の腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に対する特異性を有する第１の一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含み、前記ＴＡＡが、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ７０、ＣＤ７９Ｂ、ＣＤ１１７、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ１４７、Ｂ細胞突然変異抗原（ＢＣＭＡ）、Ｃ型レクチン様分子１（ＣＬＬ０１）、潜在膜タンパク質１（ＬＭＰ－１）、シグナル伝達リンパ球活性化分子Ｆ７（ＳＬＡＭＦ７）、ＮＹ－ＥＳＯ－１、膜貫通活性化因子およびＣＡＭＬ相互作用物質（ＴＡＣＩ）、ＣＳ－１、ＣＸＣＲ４、ＮＫＧ２Ｄ、Ｂ７－Ｈ３、ＥＧＦＲ、ＰＤ－１、ＰＤＬ－１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＥｐＣＡＭ、メソテリン、ＰＳＣＡ、ＭＵＣ１、ルイスＹ、ＧＰＣ３、ＡＸＬ、クローディン１８．２、ＧＤ２、ＣＴＬＡ－４、ＣＥＡ、ＰＤＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ２、メソテリン（ＭＥＳＯ）、ＰＳＣＡまたはＰＳＡから選択され、
前記ＢｉＴＥが、少なくとも、ＣＤ３に対する第１の抗原結合特異性、および前記ダイアキンｓｃＦｖのＴＡＡ結合特異性とは異なるＴＡＡに対する第２の抗原結合特異性を含む、
方法。
【請求項23】
前記がんが、血液がんである、請求項２４に記載の方法。
【請求項24】
前記血液がんが、リンパ腫または白血病である、請求項２５に記載の方法。
【請求項25】
前記血液がんが、Ｂ細胞急性リンパ球性白血病（Ｂ－ＡＬＬ）、多発性骨髄腫（ＭＭ）、Ｂ細胞リンパ腫、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病または非ホジキンリンパ腫である、請求項２５に記載の方法。
【請求項26】
前記がんが、固形がんまたは腫瘍である、請求項２４に記載の方法。
【請求項27】
前記固形がんが、神経芽細胞腫、小細胞肺がん、黒色腫、卵巣がん、腎細胞癌、結腸がん、肺がん、黒色腫、乳がん、前立腺がん、結腸がん、腎細胞癌、卵巣がん、神経芽細胞腫、横紋筋肉腫、白血病およびリンパ腫である、請求項２８に記載の方法。
【請求項28】
前記ＩＬ１０が、ヒトＩＬ１０、ＥＢＶ ＩＬ１０もしくはＣＭＶ ＩＬ１０、またはそのバリアントおよび／またはムテインである、請求項２４に記載の方法。
【請求項29】
前記ダイアキンが、配列番号１、３、５または７のＩＬ１０を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項30】
前記ＩＬ２が、ヒトである、請求項２４に記載の方法。
【請求項31】
前記ＩＬ２が、野生型ＩＬ２、またはそのバリアントもしくはそのムテインである、請求項３２に記載の方法。
【請求項32】
前記ダイアキンおよび前記ＢｉＴＥが、別々の時に、前記患者に投与される、請求項２４に記載の方法。
【請求項33】
前記ダイアキンが、前記ＢｉＴＥの投与の１～３日前に、前記患者に投与される、請求項３４に記載の方法。
【請求項34】
前記ダイアキンおよび前記ＢｉＴＥが、前記患者に、同時に投与される、請求項３４に記載の方法。
【請求項35】
前記ダイアキンが、前記ＢｉＴＥの投与の１～３日前に、前記患者に投与され、次いで、前記ダイアキンが、前記ＢｉＴＥの投与の１～３日後に、前記患者に再投与される、請求項３４に記載の方法。
【請求項36】
前記ダイアキンが、０．００１～２００ｍｇ／ｋｇの範囲の用量濃度で投与される、請求項２４に記載の方法。
【請求項37】
前記ダイアキンが、約０．０００１～２００ｎｇ／ｍＬの血清または血漿濃度に達する用量で投与される、請求項２４に記載の方法。
【請求項38】
前記ダイアキンが、皮下または静脈内に投与される、請求項２４に記載の方法。
【請求項39】
患者における腫瘍を処置する方法であって、式（Ｉ）ＮＨ２－（ＩＬ１０）－（Ｘ１）－（Ｚｎ）－（Ｘ２）－（ＩＬ１０）－ＣＯＯＨ（式Ｉ）
（式中、
「ＩＬ－１０」は、配列番号１、３、９、１０、１１、１２、１４または１６から選択される単量体配列であり；
「Ｘ１」は、第１のモノクローナル抗体から得られるＶＬまたはＶＨ領域であり；
「Ｘ２」は、第１のモノクローナル抗体から得られるＶＨまたはＶＬ領域であり；
ここで、Ｘ１が、ＶＬである場合、Ｘ２は、ＶＨであるか、またはＸ１が、ＶＨである場合、Ｘ２は、ＶＬであり；
「Ｚ」は、ＩＬ－１０以外のサイトカインであり；
「ｎ」は、０～２から選択される整数である）
の二重サイトカイン融合タンパク質、
およびがんまたは前記腫瘍によって発現される抗原に特異的である組換えにより操作されたＣＡＲ－ＴまたはＴＣＲ－Ｔ細胞
を投与することを含む、方法。
【請求項40】
Ｘ１およびＸ２が、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）；ＣＤ１４；ＣＤ５２；さまざまな免疫チェックポイント標的、例えば、限定されるものではないが、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－１、ＴＩＭ３、ＢＴＬＡ、ＬＡＧ３またはＣＴＬＡ４；ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２；ＣＤ４７；ＧＤ－２；ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２；ＨＥＲ２；ＰＤＧＦＲ；ＥｐＣＡＭ；ＩＣＡＭ（ＩＣＡＭ－１、－２、－３、－４、－５）、ＶＣＡＭ、ＦＡＰα；５Ｔ４；Ｔｒｏｐ２；ＥＤＢ－ＦＮ；ＴＧＦβ Ｔｒａｐ；ＭＡｄＣＡＭ、β７インテグリンサブユニット；α４β７インテグリン；α４インテグリンＳＲ－Ａ１；ＳＲ－Ａ３；ＳＲ－Ａ４；ＳＲ－Ａ５；ＳＲ－Ａ６；ＳＲ－Ｂ；ｄＳＲ－Ｃ１；ＳＲ－Ｄ１；ＳＲ－Ｅ１；ＳＲ－Ｆ１；ＳＲ－Ｆ２；ＳＲ－Ｇ；ＳＲ－Ｈ１；ＳＲ－Ｈ２；ＳＲ－Ｉ１；ＳＲ－Ｊ１；ＨＩＶ、またはエボラに特異的な前記第１のモノクローナル抗体から得られる、請求項４２に記載の方法。
【請求項41】
前記ＶＬおよびＶＨが、抗ＨＩＶまたは抗エボラ抗体である前記第１のモノクローナル抗体から得られる、請求項４２に記載の方法。
【請求項42】
前記抗ＨＩＶまたは抗エボラモノクローナル抗体由来の前記ＶＬおよびＶＨが、第２の抗体由来の６つのＣＤＲでグラフト化可能なフレームワーク領域である、請求項４４に記載の方法。
【請求項43】
前記第２の抗体が、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）；ＣＤ１４；ＣＤ５２；さまざまな免疫チェックポイント標的、例えば、限定されるものではないが、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－１、ＴＩＭ３、ＢＴＬＡ、ＬＡＧ３またはＣＴＬＡ４；ＣＤ２０；ＣＤ４７；ＧＤ－２；ＶＥＧＦＲ１；ＶＥＧＦＲ２；ＨＥＲ２；ＰＤＧＦＲ；ＥｐＣＡＭ；ＩＣＡＭ（ＩＣＡＭ－１、－２、－３、－４、－５）、ＶＣＡＭ、ＦＡＰα；５Ｔ４；Ｔｒｏｐ２；ＥＤＢ－ＦＮ；ＴＧＦβ Ｔｒａｐ；ＭＡｄＣＡＭ、β７インテグリンサブユニット；α４β７インテグリン；α４インテグリンＳＲ－Ａ１；ＳＲ－Ａ３；ＳＲ－Ａ４；ＳＲ－Ａ５；ＳＲ－Ａ６；ＳＲ－Ｂ；ｄＳＲ－Ｃ１；ＳＲ－Ｄ１；ＳＲ－Ｅ１；ＳＲ－Ｆ１；ＳＲ－Ｆ２；ＳＲ－Ｇ；ＳＲ－Ｈ１；ＳＲ－Ｈ２；ＳＲ－Ｉ１；またはＳＲ－Ｊ１から選択されるモノクローナル抗体である、請求項４５に記載の方法。
【請求項44】
前記第２のモノクローナル抗体由来の前記６つのグラフト化されたＣＤＲが、抗ＥＧＦＲ抗体、抗ＨＥＲ２抗体、抗ＶＥＧＦＲ１抗体または抗ＶＥＧＦＲ２抗体由来の６つのＣＤＲを含み、前記６つのＣＤＲが、前記ＶＬ由来のＣＤＲ１～３およびＶＨ由来のＣＤＲ１～３を含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項45】
Ｚが、ＩＬ－６、ＩＬ－４、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－５、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、ＩＬ－１７、ＩＬ－２６、ＩＬ－２７、ＩＬ－２８、ＩＬ－２９、ＧＭ－ＣＳＦ、Ｇ－ＣＳＦ、ＴＳＬＰ、インターフェロン－α、－β、－γ、ＴＧＦ－β、または腫瘍壊死因子－α、－β、塩基性ＦＧＦ、ＥＧＦ、ＰＤＧＦ、ＩＬ－４、ＩＬ－１１、またはＩＬ－１３から選択されるサイトカインである、請求項４２に記載の方法。
【請求項46】
Ｚが、ＩＬ－２である、請求項４２に記載の方法。
【請求項47】
Ｚが、１の整数である、請求項４２に記載の方法。
【請求項48】
前記二重サイトカイン融合タンパク質が、リンカーをさらに含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項49】
前記ＩＬ－１０が、配列番号１０のＤＶ０７である、請求項４２に記載の方法。
【請求項50】
前記ＶＨおよびＶＬ領域が、ヒト抗エボラ抗体である第１の抗体から得られ；前記ＶＨおよびＶＬ領域が、抗ＶＥＧＦＲ２抗体由来の６つのＣＤＲでグラフト化され；前記Ｚが、ＩＬ－２である、請求項４２に記載の方法。
【請求項51】
前記組換えにより操作されたＣＡＲ－Ｔが、ＥＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＥＧＰ－２、ＥＧＰ－４、ＯＥＰＨａ２、ＥｒｂＢ２、３もしくは４、Ｈｅｒ２、Ｌ１－ＣＡＭ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、メソテリン、ＣＥＡ、およびＢ型肝炎表面抗原、抗葉酸受容体、癌胎児抗原（ＣＥＡ）、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、ＰＳＭＡ、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、エフリンＢ２、ＣＤ１２３、ＣＳ－１、ｃ－Ｍｅｔ、ＧＤ－２、およびＭＡＧＥ Ａ３、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＲＯＲ１、ｔＥＧＦＲ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＰＳＣＡ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＭＡＲＴ－１、ｇｐ１００、腫瘍胎児抗原、ＲＯＲ１、ＴＡＧ７２、ＦＢＰ、胎児アセチルコリン受容体、ＧＤ２、ＧＤ３、ＨＭＷ－ＭＡＡ、ＩＬ－２２Ｒ－アルファ、ＩＬ－１３Ｒ－アルファ２、ｋｄｒ、カッパ軽鎖、ルイスＹ、Ｌ１細胞接着分子、ＭＡＧＥ－ＡＬメソテリン、ＣＥ７、ウィルムス腫瘍１（ＷＴ－１）、またはサイクリンに特異的であるＥＡＲＤを含む、請求項４２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願への相互参照
本出願は、２０２１年１２月１６日に出願された米国仮特許出願第６３／２６５５２１号に対する優先権を主張し、その内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０２１年１２月１６日に出願された米国仮特許出願第６３／２６５５２１号に対する優先権を主張し、その内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【0002】
電子配列表への言及
電子配列表（０３９４５１－０００８５－Ｓｅｑｕｅｎｃｅ－Ｌｉｓｔｉｎｇ．ｘｍｌ；サイズ：１０７，４９９バイト；および作成日：２０２２年１２月１６日）の内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
電子配列表（０３９４５１－０００８５－Ｓｅｑｕｅｎｃｅ－Ｌｉｓｔｉｎｇ．ｘｍｌ；サイズ：１０７，４９９バイト；および作成日：２０２２年１２月１６日）の内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【0003】
発明の分野
本開示は、バイオテクノロジーの分野、より具体的には、がんを処置するための従来の養子細胞療法（「ＡＣＴ」）または二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（「ＢｉＴＥ」）療法と組み合わせる、インターロイキン－１０（「ＩＬ－１０」）およびインターロイキン－２（「ＩＬ－２」）を含むＤｉａｋｉｎｅｓと呼ばれる新規二重サイトカイン融合タンパク質の使用に関する。
本開示は、バイオテクノロジーの分野、より具体的には、がんを処置するための従来の養子細胞療法（「ＡＣＴ」）または二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（「ＢｉＴＥ」）療法と組み合わせる、インターロイキン－１０（「ＩＬ－１０」）およびインターロイキン－２（「ＩＬ－２」）を含むＤｉａｋｉｎｅｓと呼ばれる新規二重サイトカイン融合タンパク質の使用に関する。
【背景技術】
【0004】
序論
通常サイトカイン合成阻害因子と名付けられている（Malefyt, Interleukin 10 inhbits cytokine synthesis by human monocytes: An autoreglatory role of IL-10 produced by monocytes, 1991)ＩＬ－１０は、炎症応答を抑制すること（Fedorak, 2000）、およびより最近では、インターフェロンγ（「ＩＦＮγ」）依存性抗腫瘍免疫応答を誘導するＣＤ８＋Ｔ細胞を活性化すること（Mumm, 2011）の両方が公知の多面的サイトカインである。ＩＬ－１０は、ＩＦＮγと構造類似性を有する非共有結合性ホモ二量体サイトカインである。ＩＬ－１０は、ＩＬ－１０受容体に結合し、これは、ＩＬ１０受容体１（ＩＬ１０Ｒ１）の２つのサブユニットおよびＩＬ－１０受容体２（ＩＬ１０Ｒ２）の２つのサブユニットからなる（Moore, 2001）。ＩＬ－１０受容体複合体は、ほとんどの造血細胞の表面で発現され、マクロファージおよびＴ細胞において最も高く発現される。ＩＬ－１０は、免疫抑制性（Schreiber, 2000）および免疫刺激性（Mumm, 2011）両方のサイトカインであることが報告されているが、クローン患者のＩＬ－１０処置の臨床評価は、逆用量応答をもたらす（Fedorak, 2000；Schreiber, 2000）一方で、ＰＥＧ化ＩＬ－１０によるがん患者の処置は、用量滴定可能な強力な抗腫瘍応答をもたらした（Naing, 2018）。ＰＥＧ化ＩＬ－１０抗腫瘍応答は、内因性ＣＤ８＋ Ｔ細胞およびＩＦＮγを必要とする（Mumm, 2011）。ＰＥＧ化ＩＬ－１０による腫瘍保持動物の処置は、腫瘍内ＣＤ８＋ Ｔ細胞の増加および細胞あたりのＩＦＮγの増加をもたらす。最も最近には、しかしながら、ＰＥＧ化ＩＬ－１０で処置されたがん患者は、免疫刺激の証拠をもたらしたが、抗腫瘍応答の増加はもたらさなかった（Spigel, 2020）。
通常サイトカイン合成阻害因子と名付けられている（Malefyt, Interleukin 10 inhbits cytokine synthesis by human monocytes: An autoreglatory role of IL-10 produced by monocytes, 1991)ＩＬ－１０は、炎症応答を抑制すること（Fedorak, 2000）、およびより最近では、インターフェロンγ（「ＩＦＮγ」）依存性抗腫瘍免疫応答を誘導するＣＤ８＋Ｔ細胞を活性化すること（Mumm, 2011）の両方が公知の多面的サイトカインである。ＩＬ－１０は、ＩＦＮγと構造類似性を有する非共有結合性ホモ二量体サイトカインである。ＩＬ－１０は、ＩＬ－１０受容体に結合し、これは、ＩＬ１０受容体１（ＩＬ１０Ｒ１）の２つのサブユニットおよびＩＬ－１０受容体２（ＩＬ１０Ｒ２）の２つのサブユニットからなる（Moore, 2001）。ＩＬ－１０受容体複合体は、ほとんどの造血細胞の表面で発現され、マクロファージおよびＴ細胞において最も高く発現される。ＩＬ－１０は、免疫抑制性（Schreiber, 2000）および免疫刺激性（Mumm, 2011）両方のサイトカインであることが報告されているが、クローン患者のＩＬ－１０処置の臨床評価は、逆用量応答をもたらす（Fedorak, 2000；Schreiber, 2000）一方で、ＰＥＧ化ＩＬ－１０によるがん患者の処置は、用量滴定可能な強力な抗腫瘍応答をもたらした（Naing, 2018）。ＰＥＧ化ＩＬ－１０抗腫瘍応答は、内因性ＣＤ８＋ Ｔ細胞およびＩＦＮγを必要とする（Mumm, 2011）。ＰＥＧ化ＩＬ－１０による腫瘍保持動物の処置は、腫瘍内ＣＤ８＋ Ｔ細胞の増加および細胞あたりのＩＦＮγの増加をもたらす。最も最近には、しかしながら、ＰＥＧ化ＩＬ－１０で処置されたがん患者は、免疫刺激の証拠をもたらしたが、抗腫瘍応答の増加はもたらさなかった（Spigel, 2020）。
【0005】
インターロイキン－２（「ＩＬ－２」）は、抗腫瘍免疫応答を誘導することが公知の４つのヘリックス束の多面的サイトカインである（Jiang, 2016）が、ナチュラルキラー（「ＮＫ」）細胞およびＣＤ４＋Ｔ細胞によるＩＦＮγの未制御の活性化および分泌、ならびにＴ調節性細胞の拡大増殖に起因して高い毒性も示す（Chinen, 2016）。この理由のために、多くのグループは、高親和性受容体へのその結合を低減するようにＩＬ－２を突然変異させ、ＩＬ－２毒性の低減をもたらそうと試みている（Chen, 2018）。これらのムテインは、実質的な臨床的成功を収めておらず（Bentebibe, 2019）、これは、他のメカニズムを、ＩＬ－２の致死的毒性の可能性を低減するために用いることが必要であることを示唆する。
【0006】
ＩＬ－１０は、ＮＫおよびＣＤ４＋Ｔ細胞の両方によって分泌されるＩＦＮγの産生を駆動するＩＬ－２を抑制することが報告されている（Scott, 2006）が、ＩＬ－２誘導ＣＤ８＋Ｔ細胞増殖のための補因子としても作用することが報告されている（Groux, 1998）。したがって、ＩＬ－２およびＩＬ－１０が、免疫系の細胞を共活性化するまたは互いに相殺するかどうかは知られていない。
【0007】
驚くべきことに、キーとなるＩＬ－１０受容体結合ドメイン領域における１つまたは複数のアミノ酸置換（配列番号３の成熟ＥＢＶ ＩＬ－１０アミノ酸配列のアミノ酸３１位、７５位、または両方の位置における）を有するエプスタインバーウイルス（「ＥＢＶ」）ＩＬ－１０バリアントが、ＩＬ－１０受容体に結合し、それを活性化するＥＢＶ ＩＬ－１０の能力を変更したことを発見した。これらの改変は、ＩＬ－１０受容体に対するＥＢＶ ＩＬ－１０の親和性を増加させる能力を含んでいた。本発明者は、ＥＢＶ ＩＬ－１０バリアント分子が、免疫疾患、炎症性疾患または状態を処置し、およびがんを処置することができる、ＩＬ－１０受容体アゴニストとして作用することを発見した。高親和性ＥＢＶ ＩＬ－１０バリアント（「ＤＶ０７」と称される、３１位および７５位の２つのアミノ酸置換を含む）は、単量体として、非免疫原性可変重（「ＶＨ」）および可変軽（「ＶＬ」）領域を含む一本鎖可変領域（ｓｃＦｖ）足場システムに組み込まれる場合、適切にフォールディングされ、機能的に活性なままの半減期延長分子をもたらした。その全体が参照により本明細書にそれぞれ組み込まれる、米国特許第１０，８５８，４１２号；同第１０９７５，１３３号；同第１０，９８１，９６５号；同第１０，９７５，１３４号；および同第１０，９８１，９６６号を参照されたく、代表的な模式図として図１も参照されたい。足場システムに組み込まれたＥＢＶ ＩＬ－１０バリアントは、炎症細胞（例えば、単球／マクロファージ／樹状細胞）および免疫細胞（例えば、ＣＤ８＋Ｔ細胞）の両方におけるＩＬ－１０機能の増強を示した。同上。１回の反復で、ｓｃＦｖ足場システムは、元はヒト抗エボラ抗体が起源のＶＨおよびＶＬ領域を利用した。単一サイトカイン融合タンパク質は、ＤｅｂｏＤＶ０７と称された。同上。本発明者は、元はヒト抗エボラ抗体が起源のｓｃＦｖのＶＨおよびＶＬ領域由来の６つの相補性決定領域（「ＣＤＲ」）が、さまざまな腫瘍関連抗原（「ＴＡＡ」）を認識する抗体、例えば、抗ＥＧＦＲ、抗ＶＥＧＦＲ１、抗ＶＥＧＦＲ２、および抗ＨＥＲ２抗体由来の６つのＣＤＲでグラフト化された（すなわち、１つの抗体の６つのＣＤＲを、第２の抗体由来の６つのＣＤＲで置き換える）場合に、ＩＬ－１０機能性が、破壊されなかったことも見出した。米国特許第１０，８５８，４１２号；同第１０９７５，１３３号；同第１０，９８１，９６５号；同第１０，９７５，１３４号；および同第１０，９８１，９６６号を参照されたい。
【0008】
本発明者は、第２のサイトカインを単一サイトカイン融合タンパク質に組み込むことによって、ＤｅｂｏＤＶ０７を改善した（上記に記載；その全体が参照により本明細書に組み込まれる、同時係属中の２０２１年３月１１日に出願された米国出願第１７／１９９，２３９号も参照されたい）。具体的には、第２のサイトカインは、ｓｃＦｖのＶＨ領域およびＶＬ領域の間のリンカー領域に組み込まれる。例えば、同上の図２（二重サイトカイン融合タンパク質の代表的な模式図）を参照されたい。二重サイトカイン融合タンパク質は、さまざまなＴＡＡ標的化モノクローナル抗体由来のＣＤＲでグラフト化された場合に、ＩＬ－１０および別のサイトカイン（例えば、限定されるものではないが、ＩＬ－２）の両方を特異的ＴＡＡに送達することができる。本出願では、本発明者は、養子細胞療法（「ＡＣＴ」）、例えば、限定されるものではないが、キメラ抗原受容体Ｔ細胞（「ＣＡＲ－Ｔ」）、操作されたＴ細胞受容体Ｔ細胞（「ＴＣＲ－Ｔ」）、ナチュラルキラー（「ＮＫ」）細胞および／または腫瘍浸潤リンパ球（「ＴＩＬ」）、ならびに二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（「ＢｉＴＥ」）などの他の公知の免疫療法モダリティの支えにおいて、Ｄｉａｋｉｎｅｓ（商標）として公知の（「ＤＫ」）二重サイトカイン融合タンパク質の新規使用を記載する。本出願で使用される場合、「ダイアキン：ｄｉａｋｉｎｅ（単数）」または「ダイアキン：ｄｉａｋｉｎｅｓ（複数）」という用語は、標的化された、半減期を延長するｓｃＦｖにおいて一緒に連結された二重サイトカイン融合タンパク質の新規クラスを指す、一般的な用語である。
【0009】
ＣＡＲ－Ｔ細胞療法に関して、この療法は、血液悪性腫瘍において大きな成功を示したが、固形組織腫瘍においてこれらのＣＡＲ－Ｔ細胞を使用する場合、同等の例は限定されている(Ma, 2019；Castellarin, 2018；Wagner, 2020)。
【0010】
現在のアプローチによる課題は、最も免疫刺激性の療法との類似点を共有すると思われる。具体的には、課題には、オフターゲット毒性（Bonifant, 2016；Bianca Santomasso, 2019）、ＣＡＲ－Ｔ細胞の持続性（Jafarzadeh, 2020；Christopher DeRenzo, 2019）、および腫瘍微小環境（「ＴＭＥ」）に浸潤する能力（Rodriguez-Garcia, 2020；Zou, 2019）が含まれる。
ＩＬ－２（Groux, 1998；Ross, 2018）およびＩＬ－１０（Berman, 1996；Chan, 2015；Naing A. , 2018；Naing A. , Safety, Antitumor Activity, and Immune Activation of Pegylated Recombinant Human Interleukin-10 (AM0010) in Patients With Advanced Solid Tumors, 2016；Emmerich, 2012；Mumm J. , 2011）はどちらも、抗腫瘍Ｔ細胞機能を特異的に増強する。しかしながら、ＰＥＧ化ＩＬ－１０は、ＣＡＲ－Ｔ機能を増強することが報告されている（McCauley, 2018）一方で、ＣＡＲ－Ｔ細胞療法と組み合わせたＩＬ－２の使用は、主にＩＬ－２関連毒性に起因して、課題が多い（Tang, 2018）。
したがって、本出願は、一態様では、（１）ＩＬ－２媒介毒性を制御する、ＤＫ２１０と称される、ＩＬ２およびＩＬ１０、（２）ＩＬ１２およびＩＬ１０、（３）ＩＬ７およびＩＬ１０、または（４）ＩＬ１５およびＩＬ－１０の両方を含むダイアキンを使用することによって、この問題を克服する。ＴＡＡ、例えば、ＥＧＦＲ２、ＨＥＲ２またはＶＥＧＦＲ２に対する標的化を介した、カップリングしたＩＬ－２およびＩＬ１０の腫瘍血管系への濃縮によって（Smith, 2010）、２～３例を挙げると、ＤＫ２１０は、ＣＡＲ－Ｔの腫瘍特異的活性化、ならびにＤＶ０７によるサイトカイン放出症候群およびＩＬ－２毒性の直接的な抑制の両方により、毒性を制限しながら、活性化、浸潤および持続性を可能にする、ＣＡＲ－Ｔ細胞のＴＭＥ活性化を駆動する。同じ前提はまた、ＡＣＴ療法およびＢｉＴＥのために有望であると考えられる。
ＩＬ－２（Groux, 1998；Ross, 2018）およびＩＬ－１０（Berman, 1996；Chan, 2015；Naing A. , 2018；Naing A. , Safety, Antitumor Activity, and Immune Activation of Pegylated Recombinant Human Interleukin-10 (AM0010) in Patients With Advanced Solid Tumors, 2016；Emmerich, 2012；Mumm J. , 2011）はどちらも、抗腫瘍Ｔ細胞機能を特異的に増強する。しかしながら、ＰＥＧ化ＩＬ－１０は、ＣＡＲ－Ｔ機能を増強することが報告されている（McCauley, 2018）一方で、ＣＡＲ－Ｔ細胞療法と組み合わせたＩＬ－２の使用は、主にＩＬ－２関連毒性に起因して、課題が多い（Tang, 2018）。
したがって、本出願は、一態様では、（１）ＩＬ－２媒介毒性を制御する、ＤＫ２１０と称される、ＩＬ２およびＩＬ１０、（２）ＩＬ１２およびＩＬ１０、（３）ＩＬ７およびＩＬ１０、または（４）ＩＬ１５およびＩＬ－１０の両方を含むダイアキンを使用することによって、この問題を克服する。ＴＡＡ、例えば、ＥＧＦＲ２、ＨＥＲ２またはＶＥＧＦＲ２に対する標的化を介した、カップリングしたＩＬ－２およびＩＬ１０の腫瘍血管系への濃縮によって（Smith, 2010）、２～３例を挙げると、ＤＫ２１０は、ＣＡＲ－Ｔの腫瘍特異的活性化、ならびにＤＶ０７によるサイトカイン放出症候群およびＩＬ－２毒性の直接的な抑制の両方により、毒性を制限しながら、活性化、浸潤および持続性を可能にする、ＣＡＲ－Ｔ細胞のＴＭＥ活性化を駆動する。同じ前提はまた、ＡＣＴ療法およびＢｉＴＥのために有望であると考えられる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0011】
【特許文献1】米国特許第１０，８５８，４１２号明細書
【特許文献2】米国特許第１０，９７５，１３３号明細書
【特許文献3】米国特許第１０，９８１，９６５号明細書
【特許文献4】米国特許第１０，９７５，１３４号明細書
【特許文献5】米国特許第１０，９８１，９６６号明細書
【特許文献6】米国特許第１０，８５８，４１２号明細書
【特許文献7】米国特許第１０，９７５，１３３号明細書
【特許文献8】米国特許第１０，９８１，９６５号明細書
【特許文献9】米国特許第１０，９７５，１３４号明細書
【特許文献10】米国特許第１０，９８１，９６６号明細書
【非特許文献】
【0012】
【非特許文献1】Malefyt, Interleukin 10 inhbits cytokine synthesis by human monocytes: An autoreglatory role of IL-10 produced by monocytes, 1991
【非特許文献2】Naing A. , Safety, Antitumor Activity, and Immune Activation of Pegylated Recombinant Human Interleukin-10 (AM0010) in Patients With Advanced Solid Tumors, 2016
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0013】
発明のさまざまな態様の要旨
本開示は、一般に、従来の免疫療法と組み合わせて、ダイアキンと称される二重サイトカイン融合タンパク質を使用する方法に関する。
本開示は、一般に、従来の免疫療法と組み合わせて、ダイアキンと称される二重サイトカイン融合タンパク質を使用する方法に関する。
【0014】
そのため、第１の態様では、本開示は、限定されるものではないが、操作された免疫細胞（例えば、ＣＡＲ－Ｔ細胞、ＴＣＲ－Ｔ細胞、ＴＩＬまたはＮＫ細胞）またはＢｉＴＥを含む、従来の免疫療法と組み合わせて、ＩＬ－１０またはさまざまなＩＬ－１０バリアント、半減期延長標的化ドメイン、および第２のサイトカインを含むダイアキンを使用する方法に関する。ある特定の実施形態では、方法は、ＩＬ－１０、例えば、限定されないが、ヒト、マウス、サイトメガロウイルス（「ＣＭＶ」）またはＥＢＶ ＩＬ－１０の形態、またはそのＩＬ－１０バリアント分子を含むダイアキンを使用し、ここで、ＩＬ－１０バリアントは、ＩＬ－１０受容体結合ドメインに影響を与える１つまたは複数のアミノ酸置換を有する。ある特定の実施形態では、方法は、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２もしくはＩＬ－２７、またはそのバリアントを含むダイアキンを使用する。ＩＬ－１０、ＩＬ－１２またはＩＬ－２７を含む前述のダイアキンの種類のそれぞれはまた、第２のサイトカインを含み、これは、第１のサイトカインとは異なるサイトカインであり、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２もしくはＩＬ－２７、またはそのバリアントとタンデムで働き、その結果、第１および第２のサイトカインがカップリングされ、半減期を延長するダイアキンの抗原標的化ドメインによって、特異的抗原に一緒に標的化される場合に、相加効果または相乗効果がある。これらの第２のサイトカインとしては、その中でも、ＩＬ－６、ＩＬ－４、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－５、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、ＩＬ－２６、ＩＬ－２７、ＩＬ－２８、ＩＬ－２９、ＧＭ－ＣＳＦ、Ｇ－ＣＳＦ、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－γ、ＴＧＦ－β、またはＴＮＦ－α、ＴＮＦ－β、塩基性ＦＧＦ、ＥＧＦ、ＰＤＧＦ、ＩＬ－４、ＩＬ－１１、またはＩＬ－１３、好ましくは、ＩＬ－２が挙げられる。ダイアキンの抗原標的化ドメインは、抗体、抗体断片（例えば、ｓｃＦｖ、抗原結合性断片）、または抗体、抗体断片もしくはその抗原結合性部分の可変重鎖（ＶＨ）および可変軽鎖（ＶＬ）領域によって認識される標的抗原にダイアキンを方向付ける抗原結合性部分から選択される標的化ドメインを含む。ある特定の実施形態では、抗原標的化ドメインは、ｓｃＦｖである。ある特定の態様では、ｓｃＦｖは、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に対する特異性を有し、ＴＡＡは、固形腫瘍または血液腫瘍の表面で見出される各種の抗原性標的から選択される。一態様では、抗原標的化ドメインは、ｓｃＦｖのＶＨ領域中の３つのＣＤＲおよびＶＬ領域中の３つのＣＤＲを含むｓｃＦｖである。別の態様では、ｓｃＦｖは、元のＶＨおよびＶＬフレームワーク領域を保持するが、別の抗体由来のＶＨ中の３つのＣＤＲおよびＶＬ中の３つのＣＤＲでグラフト化されていてもよい。他の実施形態では、操作された細胞は、組換え抗原受容体、例えば、限定されるものではないが、ＣＡＲ、Ｔ細胞受容体（「ＴＣＲ」）または機能性非ＴＣＲ、好ましくは、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）を特異的に標的化するＣＡＲを含む。ある特定の実施形態では、操作された細胞は、Ｔ細胞である。
【0015】
さらに別の態様では、本開示は、操作された免疫細胞またはＢｉＴＥを標的化するＴＡＡと組み合わせて、式（Ｉ）のダイアキンを使用する方法であって、式（Ｉ）が、
ＮＨ２－（ＩＬ１０）－（Ｘ１）－（Ｚｎ）－（Ｘ２）－（ＩＬ１０）－ＣＯＯＨ（式Ｉ）；
（式中、
「ＩＬ１０」は、ＩＬ－１０の単量体であり、ここで、ＩＬ－１０は、ヒト、マウス、ＣＭＶもしくはＥＢＶ ＩＬ－１０、またはそのバリアントであり、より好ましくは、ＩＬ１０は、配列番号１、３、７、９または１０から選択される配列を含む単量体であり；
「Ｘ１」は、第１のモノクローナル抗体から得られるＶＬまたはＶＨ領域であり；「Ｘ２」は、第１のモノクローナル抗体から得られるＶＨまたはＶＬ領域であり；ここで、Ｘ１が、ＶＬである場合、Ｘ２は、ＶＨであるか、またはＸ１が、ＶＨである場合、Ｘ２は、ＶＬであり、好ましくは、ＶＨおよびＶＬ領域は、ヒト抗エボラ抗体から得られるｓｃＦｖであり、ＶＨおよびＶＬ領域は、第２の抗体由来の６つのＣＤＲ（ＶＨ由来の３つおよびＶＬ由来の３つ）でグラフト化されており；
「Ｚ」は、ＩＬ－１０以外の任意のサイトカイン、好ましくは、ＩＬ－６、ＩＬ－４、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－５、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、ＩＬ－２６、ＩＬ－２７、ＩＬ－２８、ＩＬ－２９、ＧＭ－ＣＳＦ、Ｇ－ＣＳＦ、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－γ、ＴＧＦ－β、またはＴＮＦ－α、ＴＮＦ－β、塩基性ＦＧＦ、ＥＧＦ、ＰＤＧＦ、ＩＬ－４、ＩＬ－１１、またはＩＬ－１３であり；
「ｎ」は、１～２から選択される整数である）
であり；
第２の抗体が、ＶＥＧＦＲ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４４、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ７０、ＣＤ７９Ｂ、ＣＤ１１７、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ１４７、ＩＬ－２２Ｒ１、Ｂ細胞突然変異抗原（ＢＣＭＡ）、Ｃ型レクチン様分子１（ＣＬＬ０１）、ＣＤ５、ＣＤ１４７、潜在膜タンパク質１（ＬＭＰ－１）、シグナル伝達リンパ球活性化分子Ｆ７（ＳＬＡＭＦ７）、ＮＹ－ＥＳＯ－１、膜貫通活性化因子およびＣＡＭＬ相互作用物質（ＴＡＣＩ）、ＣＳ－１、ＣＸＣＲ４、ＮＫＧ２Ｄ、Ｂ７－Ｈ３、ＥＧＦＲ、ＰＤ－１、ＰＤＬ－１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＥｐＣＡＭ、ＰＳＣＡ、ＭＵＣ１、ルイスＹ、ＧＰＣ３、ＡＸＬ、クローディン１８．２、ＧＤ２、ＣＴＬＡ－４、ＣＥＡ、ＰＤＧＦＲ、メソテリン（ＭＥＳＯ）、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ＢＣＭＡ、またはＰＳＡである、
方法に関する。
ＮＨ２－（ＩＬ１０）－（Ｘ１）－（Ｚｎ）－（Ｘ２）－（ＩＬ１０）－ＣＯＯＨ（式Ｉ）；
（式中、
「ＩＬ１０」は、ＩＬ－１０の単量体であり、ここで、ＩＬ－１０は、ヒト、マウス、ＣＭＶもしくはＥＢＶ ＩＬ－１０、またはそのバリアントであり、より好ましくは、ＩＬ１０は、配列番号１、３、７、９または１０から選択される配列を含む単量体であり；
「Ｘ１」は、第１のモノクローナル抗体から得られるＶＬまたはＶＨ領域であり；「Ｘ２」は、第１のモノクローナル抗体から得られるＶＨまたはＶＬ領域であり；ここで、Ｘ１が、ＶＬである場合、Ｘ２は、ＶＨであるか、またはＸ１が、ＶＨである場合、Ｘ２は、ＶＬであり、好ましくは、ＶＨおよびＶＬ領域は、ヒト抗エボラ抗体から得られるｓｃＦｖであり、ＶＨおよびＶＬ領域は、第２の抗体由来の６つのＣＤＲ（ＶＨ由来の３つおよびＶＬ由来の３つ）でグラフト化されており；
「Ｚ」は、ＩＬ－１０以外の任意のサイトカイン、好ましくは、ＩＬ－６、ＩＬ－４、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－５、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、ＩＬ－２６、ＩＬ－２７、ＩＬ－２８、ＩＬ－２９、ＧＭ－ＣＳＦ、Ｇ－ＣＳＦ、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－γ、ＴＧＦ－β、またはＴＮＦ－α、ＴＮＦ－β、塩基性ＦＧＦ、ＥＧＦ、ＰＤＧＦ、ＩＬ－４、ＩＬ－１１、またはＩＬ－１３であり；
「ｎ」は、１～２から選択される整数である）
であり；
第２の抗体が、ＶＥＧＦＲ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４４、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ７０、ＣＤ７９Ｂ、ＣＤ１１７、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ１４７、ＩＬ－２２Ｒ１、Ｂ細胞突然変異抗原（ＢＣＭＡ）、Ｃ型レクチン様分子１（ＣＬＬ０１）、ＣＤ５、ＣＤ１４７、潜在膜タンパク質１（ＬＭＰ－１）、シグナル伝達リンパ球活性化分子Ｆ７（ＳＬＡＭＦ７）、ＮＹ－ＥＳＯ－１、膜貫通活性化因子およびＣＡＭＬ相互作用物質（ＴＡＣＩ）、ＣＳ－１、ＣＸＣＲ４、ＮＫＧ２Ｄ、Ｂ７－Ｈ３、ＥＧＦＲ、ＰＤ－１、ＰＤＬ－１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＥｐＣＡＭ、ＰＳＣＡ、ＭＵＣ１、ルイスＹ、ＧＰＣ３、ＡＸＬ、クローディン１８．２、ＧＤ２、ＣＴＬＡ－４、ＣＥＡ、ＰＤＧＦＲ、メソテリン（ＭＥＳＯ）、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ＢＣＭＡ、またはＰＳＡである、
方法に関する。
【0016】
さらに別の態様では、本開示は、免疫細胞またはＢｉＴＥを標的化するＴＡＡと組み合わせて、式（ＩＩ）のＩＬ－１０ダイアキンを使用する方法に関する。
ＮＨ２－（ＩＬ１０）－（Ｌ）－（Ｘ１）－（Ｌ）－（Ｚｎ）－（Ｌ）－（Ｘ２）－（Ｌ）－（ＩＬ１０）－ＣＯＯＨ（式ＩＩ）；
（式中、
「ＩＬ－１０」は、配列番号１、３、７、９または１０から選択される単量体配列であり；
「Ｌ」は、任意のリンカーであり、より好ましくは、リンカーは、配列番号３９、４０または４１から選択され；
「Ｘ１」は、第１のモノクローナル抗体から得られるＶＬまたはＶＨ領域であり；「Ｘ２」は、第１のモノクローナル抗体から得られるＶＨまたはＶＬ領域であり；ここで、Ｘ１が、ＶＬである場合、Ｘ２は、ＶＨであるか、またはＸ１が、ＶＨである場合、Ｘ２は、ＶＬであり、好ましくは、ＶＨおよびＶＬ領域は、ヒト抗エボラ抗体から得られるｓｃＦｖであり、ＶＨおよびＶＬ領域は、第２の抗体由来の６つのＣＤＲ（ＶＨ由来の３つおよびＶＬ由来の３つ）でグラフト化されており、第２の抗体は、ＶＥＧＦＲ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４４、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ７０、ＣＤ７９Ｂ、ＣＤ１１７、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ１４７、ＩＬ－２２Ｒ１、ＢＣＭＡ、ＣＬＬ０１、ＣＤ５、ＣＤ１４７、ｌＬＭＰ－１、ＳＬＡＭＦ７、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＴＡＣＩ、ＣＳ－１、ＣＸＣＲ４、ＮＫＧ２Ｄ、Ｂ７－Ｈ３、ＥＧＦＲ、ＰＤ－１、ＰＤＬ－１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＥｐＣＡＭ、ＰＳＣＡ、ＭＵＣ１、ルイスＹ、ＧＰＣ３、ＡＸＬ、クローディン１８．２、ＧＤ２、ＣＴＬＡ－４、ＣＥＡ、ＰＤＧＦＲ、ＭＥＳＯ、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ＢＣＭＡ、またはＰＳＡであり；
「Ｚ」は、ＩＬ－６、ＩＬ－４、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－５、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、ＩＬ－２６、ＩＬ－２７、ＩＬ－２８、ＩＬ－２９、ＧＭ－ＣＳＦ、Ｇ－ＣＳＦ、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－γ、ＴＧＦ－β、またはＴＮＦ－α、ＴＮＦ－β、塩基性ＦＧＦ、ＥＧＦ、ＰＤＧＦ、ＩＬ－４、ＩＬ－１１、またはＩＬ－１３から選択されるサイトカイン、好ましくは、ＩＬ－２であり；
「ｎ」は、１～２から選択される整数である）
ＮＨ２－（ＩＬ１０）－（Ｌ）－（Ｘ１）－（Ｌ）－（Ｚｎ）－（Ｌ）－（Ｘ２）－（Ｌ）－（ＩＬ１０）－ＣＯＯＨ（式ＩＩ）；
（式中、
「ＩＬ－１０」は、配列番号１、３、７、９または１０から選択される単量体配列であり；
「Ｌ」は、任意のリンカーであり、より好ましくは、リンカーは、配列番号３９、４０または４１から選択され；
「Ｘ１」は、第１のモノクローナル抗体から得られるＶＬまたはＶＨ領域であり；「Ｘ２」は、第１のモノクローナル抗体から得られるＶＨまたはＶＬ領域であり；ここで、Ｘ１が、ＶＬである場合、Ｘ２は、ＶＨであるか、またはＸ１が、ＶＨである場合、Ｘ２は、ＶＬであり、好ましくは、ＶＨおよびＶＬ領域は、ヒト抗エボラ抗体から得られるｓｃＦｖであり、ＶＨおよびＶＬ領域は、第２の抗体由来の６つのＣＤＲ（ＶＨ由来の３つおよびＶＬ由来の３つ）でグラフト化されており、第２の抗体は、ＶＥＧＦＲ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４４、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ７０、ＣＤ７９Ｂ、ＣＤ１１７、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ１４７、ＩＬ－２２Ｒ１、ＢＣＭＡ、ＣＬＬ０１、ＣＤ５、ＣＤ１４７、ｌＬＭＰ－１、ＳＬＡＭＦ７、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＴＡＣＩ、ＣＳ－１、ＣＸＣＲ４、ＮＫＧ２Ｄ、Ｂ７－Ｈ３、ＥＧＦＲ、ＰＤ－１、ＰＤＬ－１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＥｐＣＡＭ、ＰＳＣＡ、ＭＵＣ１、ルイスＹ、ＧＰＣ３、ＡＸＬ、クローディン１８．２、ＧＤ２、ＣＴＬＡ－４、ＣＥＡ、ＰＤＧＦＲ、ＭＥＳＯ、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ＢＣＭＡ、またはＰＳＡであり；
「Ｚ」は、ＩＬ－６、ＩＬ－４、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－５、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、ＩＬ－２６、ＩＬ－２７、ＩＬ－２８、ＩＬ－２９、ＧＭ－ＣＳＦ、Ｇ－ＣＳＦ、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－γ、ＴＧＦ－β、またはＴＮＦ－α、ＴＮＦ－β、塩基性ＦＧＦ、ＥＧＦ、ＰＤＧＦ、ＩＬ－４、ＩＬ－１１、またはＩＬ－１３から選択されるサイトカイン、好ましくは、ＩＬ－２であり；
「ｎ」は、１～２から選択される整数である）
【0017】
他の態様では、本開示は、がんを処置する方法であって、操作された免疫細胞、好ましくは、ＣＡＲ－Ｔ療法またはＢｉＴＥと組み合わせて、有効量のダイアキン、好ましくは、ＤＫ２１０、ＤＫ７１０、ＤＫ１２１０、ＤＫ１５１０ ＤＫ２１１０、ＤＫ２７１０、ＤＫＩＦＮａ１０を、それを必要とする対象に投与することを含み、ＤＫ２１０、ＤＫ７１０、ＤＫ１２１０、ＤＫ１５１０ ＤＫ２１１０、ＤＫ２７１０またはＤＫＩＦＮａ１０が、ＶＥＧＦＲ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４４、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ７０、ＣＤ７９Ｂ、ＣＤ１１７、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ１４７、ＩＬ－２２Ｒ１、ＢＣＭＡ、ＣＬＬ０１、ＣＤ５、ＣＤ１４７、ｌＬＭＰ－１、ＳＬＡＭＦ７、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＴＡＣＩ、ＣＳ－１、ＣＸＣＲ４、ＮＫＧ２Ｄ、Ｂ７－Ｈ３、ＥＧＦＲ、ＰＤ－１、ＰＤＬ－１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＥｐＣＡＭ、ＰＳＣＡ、ＭＵＣ１、ルイスＹ、ＧＰＣ３、ＡＸＬ、クローディン１８．２、ＧＤ２、ＣＴＬＡ－４、ＣＥＡ、ＰＤＧＦＲ、ＭＥＳＯ、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ＢＣＭＡ、またはＰＳＡに対する特異性を有する抗体由来のＣＤＲでグラフト化された抗エボラ足場システム（ＶＨ／ＶＬ対またはｓｃＦｖを含む）を含む、方法に関する。
【0018】
別の態様では、本開示は、ＴＡＡを標的化する操作された免疫細胞またはＢｉＴＥと組み合わせて、式（ＩＩＩ）のＩＬ－１２ダイアキンを使用する方法に関する。
【0019】
ＮＨ２－（Ｒ１）－（Ｘ１）－（Ｚｎ）－（Ｘ２）－（Ｒ２）－ＣＯＯＨ（式ＩＩＩａ）；
【0020】
ＮＨ２－（Ｒ２）－（Ｘ１）－（Ｚｎ）－（Ｘ２）－（Ｒ１）－ＣＯＯＨ（式ＩＩＩｂ）；
（式中、
「Ｒ１」は、任意の多サブユニットの第１のサイトカイン由来のアルファサブユニット、好ましくは、ＩＬ－１２－アルファサブユニット（ｐ３５）またはＩＬ－２７アルファサブユニット（ｐ２８）のいずれか、より好ましくは、配列番号４５または４７のサブユニットであり；
「Ｒ２」は、任意の多サブユニットの第１のサイトカイン由来のベータサブユニット、好ましくは、ＩＬ－１２－ベータサブユニット（ｐ４０）またはＩＬ－２７ベータサブユニット（ＥＢＩ３）のいずれか、より好ましくは、配列番号４６または４８のサブユニットであり；
ここで、Ｒ１が、第１のサイトカインのアルファサブユニットである場合、Ｒ２は、第１のサイトカインのベータサブユニットであるか；またはＲ１が、ｐ３５である場合、Ｒ２は、ｐ４０であるか；またはＲ１が、ｐ２８である場合、Ｒ２は、ＥＢＩ３であるか；またはＲ１が、配列番号４５もしくは４７である場合、Ｒ２は、配列番号４６もしくは４８であるか；またはＲ１が、配列番号４６もしくは４８である場合、Ｒ２は、配列番号４５もしくは４７であり；
「Ｘ１」は、第１のモノクローナル抗体から得られるＶＬまたはＶＨ領域であり；「Ｘ２」は、第１のモノクローナル抗体から得られるＶＨまたはＶＬ領域であり；ここで、Ｘ１が、ＶＬである場合、Ｘ２は、ＶＨであるか、またはＸ１が、ＶＨである場合、Ｘ２は、ＶＬであり；
「Ｚ」は、多サブユニットのサイトカインの生物学的機能を増強する任意のサイトカイン、好ましくは、ＩＦＮａ－２ａ、ＩＬ－２８、ＩＬ－２９であり、
「ｎ」は、１～２から選択される整数であり、
第１のモノクローナル抗体は、ＶＥＧＦＲ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４４、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ７０、ＣＤ７９Ｂ、ＣＤ１１７、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ１４７、ＩＬ－２２Ｒ１、ＢＣＭＡ、ＣＬＬ０１、ＣＤ５、ＣＤ１４７、ｌＬＭＰ－１、ＳＬＡＭＦ７、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＴＡＣＩ、ＣＳ－１、ＣＸＣＲ４、ＮＫＧ２Ｄ、Ｂ７－Ｈ３、ＥＧＦＲ、ＰＤ－１、ＰＤＬ－１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＥｐＣＡＭ、ＰＳＣＡ、ＭＵＣ１、ルイスＹ、ＧＰＣ３、ＡＸＬ、クローディン１８．２、ＧＤ２、ＣＴＬＡ－４、ＣＥＡ、ＰＤＧＦＲ、ＭＥＳＯ、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ＢＣＭＡ、またはＰＳＡに対する特異性を有する第２の抗体由来のＣＤＲでグラフト化されている抗エボラ抗体である）
（式中、
「Ｒ１」は、任意の多サブユニットの第１のサイトカイン由来のアルファサブユニット、好ましくは、ＩＬ－１２－アルファサブユニット（ｐ３５）またはＩＬ－２７アルファサブユニット（ｐ２８）のいずれか、より好ましくは、配列番号４５または４７のサブユニットであり；
「Ｒ２」は、任意の多サブユニットの第１のサイトカイン由来のベータサブユニット、好ましくは、ＩＬ－１２－ベータサブユニット（ｐ４０）またはＩＬ－２７ベータサブユニット（ＥＢＩ３）のいずれか、より好ましくは、配列番号４６または４８のサブユニットであり；
ここで、Ｒ１が、第１のサイトカインのアルファサブユニットである場合、Ｒ２は、第１のサイトカインのベータサブユニットであるか；またはＲ１が、ｐ３５である場合、Ｒ２は、ｐ４０であるか；またはＲ１が、ｐ２８である場合、Ｒ２は、ＥＢＩ３であるか；またはＲ１が、配列番号４５もしくは４７である場合、Ｒ２は、配列番号４６もしくは４８であるか；またはＲ１が、配列番号４６もしくは４８である場合、Ｒ２は、配列番号４５もしくは４７であり；
「Ｘ１」は、第１のモノクローナル抗体から得られるＶＬまたはＶＨ領域であり；「Ｘ２」は、第１のモノクローナル抗体から得られるＶＨまたはＶＬ領域であり；ここで、Ｘ１が、ＶＬである場合、Ｘ２は、ＶＨであるか、またはＸ１が、ＶＨである場合、Ｘ２は、ＶＬであり；
「Ｚ」は、多サブユニットのサイトカインの生物学的機能を増強する任意のサイトカイン、好ましくは、ＩＦＮａ－２ａ、ＩＬ－２８、ＩＬ－２９であり、
「ｎ」は、１～２から選択される整数であり、
第１のモノクローナル抗体は、ＶＥＧＦＲ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４４、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ７０、ＣＤ７９Ｂ、ＣＤ１１７、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ１４７、ＩＬ－２２Ｒ１、ＢＣＭＡ、ＣＬＬ０１、ＣＤ５、ＣＤ１４７、ｌＬＭＰ－１、ＳＬＡＭＦ７、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＴＡＣＩ、ＣＳ－１、ＣＸＣＲ４、ＮＫＧ２Ｄ、Ｂ７－Ｈ３、ＥＧＦＲ、ＰＤ－１、ＰＤＬ－１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＥｐＣＡＭ、ＰＳＣＡ、ＭＵＣ１、ルイスＹ、ＧＰＣ３、ＡＸＬ、クローディン１８．２、ＧＤ２、ＣＴＬＡ－４、ＣＥＡ、ＰＤＧＦＲ、ＭＥＳＯ、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ＢＣＭＡ、またはＰＳＡに対する特異性を有する第２の抗体由来のＣＤＲでグラフト化されている抗エボラ抗体である）
【0021】
さらに別の態様では、本開示は、ＴＡＡを標的化する操作された免疫細胞またはＢｉＴＥと組み合わせて、式（ＩＶ）の２つの多サブユニットサイトカイン、例えば、ＩＬ１２、ＩＬ－２７、またはＩＬ－１０を有するダイアキンを使用する方法であって、前記ダイアキンが、式（ＩＶ）：
ＮＨ２－（Ｒ１）－（Ｌａ）－（Ｘ１）－（Ｌａ）－（Ｗ１）－（Ｌｂ）－（Ｗ２）－（Ｌａ）－（Ｘ２）－（Ｌａ）－（Ｒ２）－ＣＯＯＨ（式ＩＶ）；
（式中、
「Ｒ１」は、第１のサイトカイン、例えば、ＩＬ－１２もしくはＩＬ－２７のアルファサブユニット、またはホモ二量体サイトカイン、例えば、ＩＬ－１０の第１の単量体であり、ここで、Ｒ１は、好ましくは、ｐ４０であり；
「Ｒ２」は、第１のサイトカイン、例えば、ＩＬ－１２もしくはＩＬ－２７のベータアルファサブユニット、またはホモ二量体サイトカイン、例えば、ＩＬ－１０の第２の単量体であり、ここで、Ｒ２は、好ましくは、ｐ３５であり；
「Ｌａ」は、任意のリンカー；好ましくは、配列番号４３～４４であり；
「Ｌｂ」は、任意のリンカー；好ましくは、ＧＧＧＳＧＧＧまたは配列番号４３であり；
「Ｘ１」は、第１のモノクローナル抗体から得られるＶＬまたはＶＨ領域であり；「Ｘ２」は、第１のモノクローナル抗体から得られるＶＨまたはＶＬ領域であり；ここで、Ｘ１が、ＶＬである場合、Ｘ２は、ＶＨであるか、またはＸ１が、ＶＨである場合、Ｘ２は、ＶＬであり；
「Ｗ１」は、第１のサイトカイン、例えば、ＩＬ－１２もしくはＩＬ－２７のアルファサブユニット、またはホモ二量体サイトカイン、例えば、ＩＬ－１０の第１の単量体、好ましくは、ＩＬ－１０の第１の単量体であり；
「Ｗ２」は、第１のサイトカイン、例えば、ＩＬ－１２もしくはＩＬ－２７のベータアルファサブユニット、またはホモ二量体サイトカイン、例えば、ＩＬ－１０の第２の単量体、好ましくは、ＩＬ－１０の第２の単量体であり、
第１のモノクローナル抗体は、ＶＥＧＦＲ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４４、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ７０、ＣＤ７９Ｂ、ＣＤ１１７、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ１４７、ＩＬ－２２Ｒ１、ＢＣＭＡ、ＣＬＬ０１、ＣＤ５、ＣＤ１４７、ｌＬＭＰ－１、ＳＬＡＭＦ７、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＴＡＣＩ、ＣＳ－１、ＣＸＣＲ４、ＮＫＧ２Ｄ、Ｂ７－Ｈ３、ＥＧＦＲ、ＰＤ－１、ＰＤＬ－１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＥｐＣＡＭ、ＰＳＣＡ、ＭＵＣ１、ルイスＹ、ＧＰＣ３、ＡＸＬ、クローディン１８．２、ＧＤ２、ＣＴＬＡ－４、ＣＥＡ、ＰＤＧＦＲ、ＭＥＳＯ、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ＢＣＭＡ、またはＰＳＡに対する特異性を有する抗体由来のＣＤＲでグラフト化されている）
である、方法に関する。
ＮＨ２－（Ｒ１）－（Ｌａ）－（Ｘ１）－（Ｌａ）－（Ｗ１）－（Ｌｂ）－（Ｗ２）－（Ｌａ）－（Ｘ２）－（Ｌａ）－（Ｒ２）－ＣＯＯＨ（式ＩＶ）；
（式中、
「Ｒ１」は、第１のサイトカイン、例えば、ＩＬ－１２もしくはＩＬ－２７のアルファサブユニット、またはホモ二量体サイトカイン、例えば、ＩＬ－１０の第１の単量体であり、ここで、Ｒ１は、好ましくは、ｐ４０であり；
「Ｒ２」は、第１のサイトカイン、例えば、ＩＬ－１２もしくはＩＬ－２７のベータアルファサブユニット、またはホモ二量体サイトカイン、例えば、ＩＬ－１０の第２の単量体であり、ここで、Ｒ２は、好ましくは、ｐ３５であり；
「Ｌａ」は、任意のリンカー；好ましくは、配列番号４３～４４であり；
「Ｌｂ」は、任意のリンカー；好ましくは、ＧＧＧＳＧＧＧまたは配列番号４３であり；
「Ｘ１」は、第１のモノクローナル抗体から得られるＶＬまたはＶＨ領域であり；「Ｘ２」は、第１のモノクローナル抗体から得られるＶＨまたはＶＬ領域であり；ここで、Ｘ１が、ＶＬである場合、Ｘ２は、ＶＨであるか、またはＸ１が、ＶＨである場合、Ｘ２は、ＶＬであり；
「Ｗ１」は、第１のサイトカイン、例えば、ＩＬ－１２もしくはＩＬ－２７のアルファサブユニット、またはホモ二量体サイトカイン、例えば、ＩＬ－１０の第１の単量体、好ましくは、ＩＬ－１０の第１の単量体であり；
「Ｗ２」は、第１のサイトカイン、例えば、ＩＬ－１２もしくはＩＬ－２７のベータアルファサブユニット、またはホモ二量体サイトカイン、例えば、ＩＬ－１０の第２の単量体、好ましくは、ＩＬ－１０の第２の単量体であり、
第１のモノクローナル抗体は、ＶＥＧＦＲ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４４、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ７０、ＣＤ７９Ｂ、ＣＤ１１７、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ１４７、ＩＬ－２２Ｒ１、ＢＣＭＡ、ＣＬＬ０１、ＣＤ５、ＣＤ１４７、ｌＬＭＰ－１、ＳＬＡＭＦ７、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＴＡＣＩ、ＣＳ－１、ＣＸＣＲ４、ＮＫＧ２Ｄ、Ｂ７－Ｈ３、ＥＧＦＲ、ＰＤ－１、ＰＤＬ－１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＥｐＣＡＭ、ＰＳＣＡ、ＭＵＣ１、ルイスＹ、ＧＰＣ３、ＡＸＬ、クローディン１８．２、ＧＤ２、ＣＴＬＡ－４、ＣＥＡ、ＰＤＧＦＲ、ＭＥＳＯ、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ＢＣＭＡ、またはＰＳＡに対する特異性を有する抗体由来のＣＤＲでグラフト化されている）
である、方法に関する。
【0022】
代表的な態様の上記の簡略化した要約は、本開示の基本的な理解を提供する役割を果たす。この要約は、すべての企図される態様の詳細な概説ではなく、すべての態様のキーとなるまたは重要な要素を特定することを意図するものでも、本開示の任意のまたはすべての態様の範囲を表すことを意図するものでもない。その単なる目的は、続く本開示のより詳細な説明に対する前置きとして、簡略化された形態で１つまたは複数の態様を提示することである。前述の達成のために、本開示の１つまたは複数の態様は、特許請求の範囲に記載される特色およびそこで指摘される典型例を含む。
【図面の簡単な説明】
【0023】
【0024】
【0025】
【0026】
【0027】
【0028】
【0029】
【0030】
【0031】
【0032】
【0033】
【0034】
【0035】
【0036】
【発明を実施するための形態】
【0037】
詳細な説明
例示的な態様は、本明細書において、ダイアキンと称される二重サイトカイン融合タンパク質のクラスであって、それによってダイアキンがＩＬ－１０、ＩＬ－１２またはＩＬ－２７を含む、クラス、およびがんを処置する方法であって、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）を標的化する操作された免疫細胞またはＡＣＴ（例えば、ＣＡＲ Ｔ、ＴＣＴ Ｔ、ＴＩＬまたはＮＫ）またはＢｉＴＥと組み合わせて、ＩＬ－１０およびＩＬ－２（ＤＫ２１０）、またはＩＬ－１０およびＩＬ－７（ＤＫ７１０）、ＩＬ－１０およびＩＬ－１２（ＤＫ１２１０）、ＩＬ－１０およびＩＬ－１５（ＤＫ１５１０）、ＩＬ－１０およびＩＬ－２１（ＤＫ２１１０）、ＩＬ－１０およびＩＦＮ－ガンマ（ＤＫＩＦＮａ１０）、またはＩＬ－１０およびＩＬ－２７（ＤＫ２７１０）を含むダイアキンを投与することを含む、方法の文脈で記載される。当業者は、以下の記載が、単なる例示であって、決して限定を意図するものではないことを理解するであろう。他の態様は、本開示の利点を有して、それ自身を当業者に容易に示唆するであろう。参照はここに、添付の以下の開示および図面において示されるように、例示的な態様の実行に対して詳細に行われるであろう。同じ参照標識は、同じまたは類似の項目を指すために、図面および以下の説明全体を通して、可能な範囲まで使用する。
例示的な態様は、本明細書において、ダイアキンと称される二重サイトカイン融合タンパク質のクラスであって、それによってダイアキンがＩＬ－１０、ＩＬ－１２またはＩＬ－２７を含む、クラス、およびがんを処置する方法であって、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）を標的化する操作された免疫細胞またはＡＣＴ（例えば、ＣＡＲ Ｔ、ＴＣＴ Ｔ、ＴＩＬまたはＮＫ）またはＢｉＴＥと組み合わせて、ＩＬ－１０およびＩＬ－２（ＤＫ２１０）、またはＩＬ－１０およびＩＬ－７（ＤＫ７１０）、ＩＬ－１０およびＩＬ－１２（ＤＫ１２１０）、ＩＬ－１０およびＩＬ－１５（ＤＫ１５１０）、ＩＬ－１０およびＩＬ－２１（ＤＫ２１１０）、ＩＬ－１０およびＩＦＮ－ガンマ（ＤＫＩＦＮａ１０）、またはＩＬ－１０およびＩＬ－２７（ＤＫ２７１０）を含むダイアキンを投与することを含む、方法の文脈で記載される。当業者は、以下の記載が、単なる例示であって、決して限定を意図するものではないことを理解するであろう。他の態様は、本開示の利点を有して、それ自身を当業者に容易に示唆するであろう。参照はここに、添付の以下の開示および図面において示されるように、例示的な態様の実行に対して詳細に行われるであろう。同じ参照標識は、同じまたは類似の項目を指すために、図面および以下の説明全体を通して、可能な範囲まで使用する。
【0038】
本明細書に記載されるものと類似または等価ないくつかの方法および材料を、さまざまな記載される実施形態の実施において使用することができるが、好ましい材料および方法を、本明細書に記載する。
【0039】
他に指示されない限り、本明細書に記載される実施形態は、当業者に周知の分子生物学、生化学、薬理学、化学および免疫学の従来の方法および技法を用いる。限定されるものではないが、ＩＬ－１０のヒト、マウス、ＣＭＶおよび／またはＥＢＶ形態、ならびにＩＬ－１０バリアント、前述のサイトカインおよびそのバリアントのそれぞれのアグリコシル化または脱グリコシル化形態を試験するためのアッセイを含む、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、ＩＦＮ－アルファ、またはＩＬ－２７バリアントを設計および製造するための一般的な技法の多くは、当技術分野で容易に利用可能な、詳述されている公知の方法によって達成される。例えば、Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd Edition, 1989)；Methods In Enzymology (S. Colowick and N. Kaplan eds., Academic Press, Inc.)；Handbook of Experimental Immunology, Vols. I-IV (D. M. Weir and C. C. Blackwell eds., Blackwell Scientific Publications)；A. L. Lehninger, Biochemistry (Worth Publishers, Inc., current addition)を参照されたい。ＰＥＧ化化学に基づくＮ末端アルデヒドも、当技術分野において周知である。
定義
定義
【0040】
以下の用語は、本明細書で論じられるさまざまな実施形態を記載するために使用され、下記に示されたように定義されることが意図される。
【0041】
本明細書で使用される場合、さまざまな実施形態の記載において、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が他に明確に指図しない限り、複数の指示対象を含む。
【0042】
「約」という用語は、示された数または数の範囲の０．０００１～５％の逸脱を指す。一実施形態では、「約」という用語は、示された数または数の範囲の１～１０％の逸脱を指す。一実施形態では、「約」という用語は、示された数または数の範囲の最大で２５％の逸脱を指す。より具体的な実施形態では、「約」という用語は、野生型配列と比較した場合に、ヌクレオチド配列相同性またはアミノ酸配列相同性に関して、１～２５％の差を指す。
【0043】
「インターロイキン－１０」または「ＩＬ－１０」という用語は、非共有結合的に接続されて、ホモ二量体を形成する２つの同一のサブユニットを含むタンパク質を指し、ここで、ＩＬ－１０は、２つの６つのヘリックス束（ヘリックスＡ～Ｆ）のインターカレート化二量体である。本明細書で使用される場合、他に指示されない限り、「インターロイキン－１０」および「ＩＬ－１０」は、ヒトＩＬ－１０（「ｈＩＬ－１０」；Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿０００５６３；または米国特許第６，２１７，８５７号）タンパク質（配列番号１）もしくは核酸（配列番号２）；マウスＩＬ－１０（「ｍＩＬ－１０」；Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号：Ｍ３７８９７；または米国特許第６，２１７，８５７号）タンパク質（配列番号７）もしくは核酸（配列番号８）；またはウイルスＩＬ－１０（「ｖＩＬ－１０」）を指す。ウイルスＩＬ－１０ホモログは、ＥＢＶまたはＣＭＶ（それぞれ、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿００７６０５およびＤＱ３６７９６２）に由来していてもよい。ＥＢＶ－ＩＬ１０という用語は、ＩＬ－１０タンパク質（配列番号３）または核酸（配列番号４）のＥＢＶホモログを指す。ＣＭＶ－ＩＬ１０という用語は、ＩＬ－１０タンパク質（配列番号５）または核酸（配列番号６）のＣＭＶホモログを指す。「単量体性」ＩＬ－１０またはＩＬ－１０「の単量体」という用語は、本明細書で使用される場合、ＩＬ－１０、または非共有結合的に接続された場合に、ＩＬ－１０もしくはバリアントＩＬ－１０のホモ二量体を形成するバリアントＩＬ－１０の個々のサブユニットを指す。「野生型」、「ｗｔ」および「ネイティブ」という用語は、問題の特定のＩＬ－１０の起源の種において天然で一般的に見出される、タンパク質（例えば、ＩＬ－１０、ＣＭＶ－ＩＬ１０またはＥＢＶ ＩＬ－ １０）の配列を指すために互換的に本明細書で使用される。例えば、「野生型」または「ネイティブ」ＥＢＶ ＩＬ－１０という用語は、そのため、天然で最も一般的に見出されるアミノ酸配列に対応するであろう。
【0044】
「インターロイキン－１２」または「ＩＬ－１２」という用語は、ヘテロ二量体を形成するために非共有結合的に接続される、アルファ（ｐ３５）およびベータ（ｐ４０）サブユニットを含むタンパク質を指す。本明細書で使用される場合、他に指示されない限り、「インターロイキン－１２」および「ＩＬ－１２」は、ヒト、マウス、またはそのバリアント形態を指す。例えば、「野生型」または「ネイティブ」という用語は、そのため、アルファおよびベータサブユニットについて天然で最も一般的に見出されるアミノ酸配列に対応するであろう。
【0045】
「インターロイキン－２７」または「ＩＬ－２７」という用語は、ヘテロ二量体を形成するために非共有結合的に接続される、アルファ（ｐ２８）およびベータ（ＥＢＩ３）サブユニットを含むタンパク質を指す。本明細書で使用される場合、他に指示されない限り、「インターロイキン－２７」および「ＩＬ－２７」は、ヒト、マウス、またはそのバリアント形態を指す。例えば、「野生型」または「ネイティブ」という用語は、そのため、アルファおよびベータサブユニットについて天然で最も一般的に見出されるアミノ酸配列に対応するであろう。
【0046】
「バリアント」、「アナログ」および「ムテイン」という用語は、例えば抗炎症活性などの所望の活性を保持する、参照分子の生物学的に活性な誘導体を指す。一般に、「バリアント（単数）」、「バリアント（複数）」、「アナログ」および「ムテイン」という用語は、それがポリペプチドに関する場合、ネイティブポリペプチド配列を有する１つまたは複数の化合物、ならびにネイティブ分子に対して１つまたは複数のアミノ酸の付加、置換（天然で保存的であり得る）、および／または欠失を有する構造を指す。そのため、「ＩＬ－１０バリアント」、「バリアントＩＬ－１０」、「ＩＬ－１０バリアント分子」という用語、ならびにその文法的変形形態および複数形はすべて、野生型ＩＬ－１０と配列同一性または相同性の１～２５％のいずれかで異なる、ＩＬ－１０アミノ酸（または核酸）配列を指す用語と等価であることが意図される。そのため、例えば、ＥＢＶ ＩＬ－１０バリアント分子は、１つまたは複数のアミノ酸（またはアミノ酸をコードするヌクレオチド配列）の付加、置換および／または欠失を有することによって、野生型ＥＢＶ ＩＬ－１０と異なるものである。そのため、一形態では、ＥＢＶ ＩＬ－１０バリアントは、合計で約１～４２アミノ酸の差に達する配列相同性の約１％～２５％の差を有することによって、配列番号３の野生型配列と異なるものである。一実施形態では、ＩＬ－１０バリアントは、Ａ７５Ｉアミノ酸突然変異（内部で「ＤＶ０６」と表す；配列番号１４）、またはＶ３１ＬおよびＡ７５Ｉ両方のアミノ酸突然変異（内部で「ＤＶ０７」と表す；配列番号１６）を含むＥＢＶ ＩＬ－１０である。「ＩＬ－１２バリアント」、「バリアントＩＬ－１２」、「ＩＬ－１２バリアント分子」、「ＩＬ－２７バリアント」、「バリアントＩＬ－２７」、「ＩＬ－２７バリアント分子」という用語、ならびにその文法的変形形態および複数形はすべて、野生型ＩＬ－１２またはＩＬ－２７とは異なるＩＬ－１２またはＩＬ－２７アミノ酸（または核酸）配列を指す等価な用語であることが意図される。ＩＬ－１２またはＩＬ－２７についてのアミノ酸配列の差は、配列同一性または相同性の１～２５％のいずれかであるような、アルファ、ベータ、または両サブユニット内の付加、欠失または置換であってもよい。これらのバリアント形態は、タンパク質に対するその脱グリコシル化（脱グリコシル化またはアグリコシル化）形態への改変を含む。
【0047】
「融合タンパク質」という用語は、天然では通常存在しないタンパク質の新規な並びをもたらす、２つまたはそれよりも多くのタンパク質またはポリペプチドの組合せまたはコンジュゲーションを指す。融合タンパク質は、２つまたはそれよりも多くのタンパク質またはポリペプチドの共有結合性連結の結果である。融合タンパク質を作り上げる２つまたはそれよりも多くのタンパク質は、アミノ末端（「ＮＨ２」）からカルボキシ末端（「ＣＯＯＨ」）までの任意の配置で並び得る。そのため、例えば、あるタンパク質のカルボキシ末端は、別のタンパク質のカルボキシ末端またはアミノ末端のいずれかに共有結合的に連結され得る。例示的な融合タンパク質は、単量体性ＩＬ－１０または単量体性バリアントＩＬ－１０分子を１つまたは複数の抗体可変ドメイン（すなわち、ＶＨおよび／またはＶＬ）または一本鎖可変領域（「ｓｃＦｖ」）と組み合わせることを含み得る。
【0048】
「ホモログ」、「相同性」、「相同の」または「実質的に相同の」という用語は、少なくとも２つのポリヌクレオチド配列または少なくとも２つのポリペプチド配列の間の同一性パーセントを指す。配列が、分子の定義された長さにわたって、少なくとも約５０％、好ましくは、少なくとも約７５％、より好ましくは、少なくとも約８０％～８５％、好ましくは、少なくとも約９０％、最も好ましくは、少なくとも約９５％～９８％の配列同一性を示す場合に、配列は互いに相同である。
【0049】
「配列同一性」という用語は、正確なヌクレオチドごとまたはアミノ酸ごとの対応を指す。配列同一性は、１００％の配列同一性～５０％の配列同一性の範囲であり得る。配列同一性パーセントは、限定されるものではないが、配列を整列させること、２つの整列した配列間のマッチの正確な数をカウントすること、参照配列の長さで割ること、および結果に１００を掛けることによる、２つの分子（参照配列および参照配列に対する未知の同一性パーセントを有する配列）間の配列情報の直接比較を含む各種の方法を使用して、決定することができる。容易に利用可能なコンピュータープログラムを、同一性パーセントの特定を助けるために使用することができる。
【0050】
「対象」、「個体」または「患者」という用語は、本明細書で互換的に使用され、脊椎動物、好ましくは、哺乳動物を指す。哺乳動物としては、限定されるものではないが、ネズミ科動物、げっ歯類、類人猿、ヒト、家畜、スポーツ動物およびある特定のペットが挙げられる。
【0051】
「投与すること」という用語は、本出願の活性成分にそれらの意図される機能を行わせる、投与の経路を含む。
【0052】
「治療有効量」または「有効量」は、例えば、ＥＢＶ ＩＬ－１０バリアント、融合タンパク質、二重サイトカイン融合タンパク質、または本明細書に記載されるそのＤＫ２１０、ＤＫ７１０、ＤＫ１２１０、ＤＫ１５１０ ＤＫ２１１０、ＤＫ２７１０もしくはＤＫＩＦＮａ１０を投与することに関する場合、特に、ＴＡＡを標的化する操作された免疫細胞またはＡＣＴまたはＢｉＴＥと組み合わせる文脈において、ある特定の生物活性を促進するのに十分な量を指す。これらは、例えば、骨髄性細胞機能の抑制、クッパー細胞活性の増強、および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞もしくは増強されたＣＤ８＋Ｔ細胞活性における任意の効果の欠如、ならびにＦｃ受容体の肥満細胞の上方調節の遮断、または脱顆粒の防止、または併用療法（例えば、ＣＡＲ－Ｔ療法、またはＢｉＴＥ）の効果に対する促進もしくは増強を含み得る。そのため、「有効量」は、医学的状態の症状または徴候を処置、寛解または予防する。有効量はまた、診断を可能にするまたは容易にするのに十分な量を意味する。
【0053】
「処置する」または「処置」という用語は、疾患または状態の効果を低減する方法を指す。処置は、症状だけよりもむしろ、疾患または状態それ自身の根本的な原因を低減する方法も指し得る。処置は、ネイティブレベルからの任意の低減であり得、また、限定されるものではないが、疾患、状態、または疾患もしくは状態の症状の完全な消失であり得る。
【0054】
「ダイアキン」または「ＤＫ」という用語は、本出願で使用される場合、半減期を延長する抗原標的化ドメイン上で、別のサイトカインと一緒に融合された、ＩＬ－１０（ＩＬ－１０の単量体）、ＩＬ－１２もしくはＩＬ－２７、またはそのバリアントを含む二重サイトカイン融合タンパク質の一般的なクラスを指す。具体的には、ダイアキンは、式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩａ、ＩＩＩｂ、ＩＶの形態を取る。
【0055】
「ＤＫ２１０」という用語は、図２に概略的に表される、ＩＬ－１０またはＩＬ－１０バリアント（例えば、配列番号１０）、ｓｃＦｖのＶＨおよびＶＬ領域間で連結されたＩＬ－２（例えば、配列番号９）を含む、ダイアキンを指し、ここで、ダイアキンは、標的化または非標的化され得る。標的化ＤＫ２１０は、特異的抗原、例えば、ＴＡＡに結合するｓｃＦｖを使用することによって、またはＴＡＡを標的化する抗体由来のｓｃＦｖ足場ＣＤＲ上でグラフト化することによって、標的化分子にされてもよい。これらの分子は、ＤＫ２１０（標的名称）と表示される。例えば、ＥＧＦＲに標的化されるＤＫ２１０は、「ＤＫ２１０（ｅｇｆｒ）」または「ＤＫ２１０ｅｇｆｒ」と表示される。一実施形態では、ＤＫ２１０ｅｇｆｒは、配列番号１９である。別の例では、ＨＥＲ２に標的化されるＤＫ２１０は、「ＤＫ２１０（ｈｅｒ２）」または「ＤＫ２１０ｈｅｒ２」と表示される。一実施形態では、ＤＫ２１０ｈｅｒ２は、配列番号２１、２３または２５である。
【0056】
「ＤＫ７１０」という用語は、図２に概略的に表される、ＩＬ－７またはＩＬ－７バリアント（例えば、アグリコシル化または脱グリコシル化形態）、ならびにｓｃＦｖのＶＨおよびＶＬ領域間で連結されたＩＬ－１０およびＩＬ－１０バリアント（例えば、配列番号１０、またはそのアグリコシル化もしくは脱グリコシル化形態）を含む、ダイアキンを指し、ここで、ダイアキンは、標的化または非標的化され得る。標的化ＤＫ７１０は、特異的抗原、例えば、ＴＡＡに結合するｓｃＦｖを使用することによって、またはＴＡＡを標的化する抗体由来のｓｃＦｖ足場ＣＤＲ上でグラフト化することによって、標的化分子にされてもよい。これらの分子は、ＤＫ７１０（標的名称）と表示される。例えば、ＥＧＦＲに標的化されるＤＫ７１０は、「ＤＫ７１０（ｅｇｆｒ）」または「ＤＫ７１０ｅｇｆｒ」と表示される。一実施形態では、ＤＫ７１０ｅｇｆｒは、配列番号３６である。別の例では、（ａ）ＨＥＲ２に標的化されるＤＫ７１０は、「ＤＫ７１０（ｈｅｒ２）」または「ＤＫ１２１０ｈｅｒ２」と表示され、（ｂ）ＣＤ２０に標的化されるＤＫ７１０は、「ＤＫ７１０（ＣＤ２０）」または「ＤＫ１２１０ＣＤ２０」と表示される。一実施形態では、ＤＫ７１０ｈｅｒ２は、配列番号３７であり、ＤＫ７１０ＣＤ２０は、配列番号３８である。
【0057】
「ＤＫ１２１０」という用語は、図３に概略的に表される、ＩＬ－１２またはＩＬ－１２バリアント（例えば、アグリコシル化または脱グリコシル化形態）、ならびにｓｃＦｖのＶＨおよびＶＬ領域間で連結されたＩＬ－１０およびＩＬ－１０バリアント（例えば、配列番号１０、またはそのアグリコシル化もしくは脱グリコシル化形態）を含む、ダイアキンを指し、ここで、ダイアキンは、標的化または非標的化され得る。標的化ＤＫ１２１０は、特異的抗原、例えば、ＴＡＡに結合するｓｃＦｖを使用することによって、またはＴＡＡを標的化する抗体由来のｓｃＦｖ足場ＣＤＲ上でグラフト化することによって、標的化分子にされてもよい。これらの分子は、ＤＫ１２１０（標的名称）と表示される。例えば、ＥＧＦＲに標的化されるＤＫ１２１０は、「ＤＫ１２１０（ｅｇｆｒ）」または「ＤＫ１２１０ｅｇｆｒ」と表示される。一実施形態では、ＤＫ１２１０ｅｇｆｒは、配列番号２６～３２である。別の例では、（ａ）ＨＥＲ２に標的化されるＤＫ１２１０は、「ＤＫ１２１０（ｈｅｒ２）」または「ＤＫ１２１０ｈｅｒ２」と表示され、（ｂ）ＣＤ２０に標的化されるＤＫ１２１０は、「ＤＫ１２１０（ＣＤ２０）」または「ＤＫ１２１０ＣＤ２０」と表示される。一実施形態では、ＤＫ１２１０ＣＤ２０は、配列番号３４または３５である。
【0058】
「ＤＫ１５１０」という用語は、図２に概略的に表される、ＩＬ－１５またはＩＬ－１５バリアント（例えば、アグリコシル化または脱グリコシル化形態）、ならびにｓｃＦｖのＶＨおよびＶＬ領域間で連結されたＩＬ－１０およびＩＬ－１０バリアント（例えば、配列番号１０、またはそのアグリコシル化もしくは脱グリコシル化形態）を含む、ダイアキンを指し、ここで、ダイアキンは、標的化または非標的化され得る。標的化ＤＫ１５１０は、特異的抗原、例えば、ＴＡＡに結合するｓｃＦｖを使用することによって、またはＴＡＡを標的化する抗体由来のｓｃＦｖ足場ＣＤＲ上でグラフト化することによって、標的化分子にされてもよい。これらの分子は、ＤＫ１５１０（標的名称）と表示される。例えば、ＥＧＦＲに標的化されるＤＫ１５１０は、「ＤＫ１５１０（ｅｇｆｒ）」または「ＤＫ１５１０ｅｇｆｒ」と表示される。
【0059】
「ＤＫ２１１０」という用語は、図２に概略的に表される、ＩＬ－２１またはＩＬ－２１バリアント（例えば、アグリコシル化または脱グリコシル化形態）、ならびにｓｃＦｖのＶＨおよびＶＬ領域間で連結されたＩＬ－１０およびＩＬ－１０バリアント（例えば、配列番号１０、またはそのアグリコシル化もしくは脱グリコシル化形態）を含む、ダイアキンを指し、ここで、ダイアキンは、標的化または非標的化され得る。標的化ＤＫ２１１０は、特異的抗原、例えば、ＴＡＡに結合するｓｃＦｖを使用することによって、またはＴＡＡを標的化する抗体由来のｓｃＦｖ足場ＣＤＲ上でグラフト化することによって、標的化分子にされてもよい。これらの分子は、ＤＫ２１１０（標的名称）と表示される。例えば、ＥＧＦＲに標的化されるＤＫ２１１０は、「ＤＫ２１１０（ｅｇｆｒ）」または「ＤＫ２１１０ｅｇｆｒ」と表示される。
【0060】
「ＤＫ２７１０」という用語は、図２に概略的に表される、ＩＬ－２７またはＩＬ－２７バリアント（例えば、アグリコシル化または脱グリコシル化形態）、ならびにｓｃＦｖのＶＨおよびＶＬ領域間で連結されたＩＬ－１０およびＩＬ－１０バリアント（例えば、配列番号１０、またはそのアグリコシル化もしくは脱グリコシル化形態）を含む、ダイアキンを指し、ここで、ダイアキンは、標的化または非標的化され得る。標的化ＤＫ２７１０は、特異的抗原、例えば、ＴＡＡに結合するｓｃＦｖを使用することによって、またはＴＡＡを標的化する抗体由来のｓｃＦｖ足場ＣＤＲ上でグラフト化することによって、標的化分子にされてもよい。これらの分子は、ＤＫ２７１０（標的名称）と表示される。例えば、ＥＧＦＲに標的化されるＤＫ２７１０は、「ＤＫ２７１０（ｅｇｆｒ）」または「ＤＫ２７１０ｅｇｆｒ」と表示される。
【0061】
「ＤＫＩＦＮａ１０」という用語は、図２に概略的に表される、ＩＦＮａまたはＩＦＮａバリアント（例えば、アグリコシル化または脱グリコシル化形態）、ならびにｓｃＦｖのＶＨおよびＶＬ領域間で連結されたＩＬ－１０およびＩＬ－１０バリアント（例えば、配列番号１０、またはそのアグリコシル化もしくは脱グリコシル化形態）を含む、ダイアキンを指し、ここで、ダイアキンは、標的化または非標的化され得る。標的化ＤＫＩＦＮａ１０は、特異的抗原、例えば、ＴＡＡに結合するｓｃＦｖを使用することによって、またはＴＡＡを標的化する抗体由来のｓｃＦｖ足場ＣＤＲ上でグラフト化することによって、標的化分子にされてもよい。これらの分子は、ＤＫＩＦＮａ１０（標的名称）と表示される。例えば、ＥＧＦＲに標的化されるＤＫＩＦＮａ１０は、「ＤＫＩＦＮａ１０（ｅｇｆｒ）」または「ＤＫＩＦＮａ１０ｅｇｆｒ」と表示される。
【0062】
「ＤＫ１２ＩＦＮａ」という用語は、図２に概略的に表される、ＩＦＮａまたはＩＦＮａバリアント（例えば、アグリコシル化または脱グリコシル化形態）、ならびにｓｃＦｖのＶＨおよびＶＬ領域間で連結されたＩＬ－１２およびＩＬ－１２バリアント（例えば、そのアグリコシル化もしくは脱グリコシル化形態）を含む、ダイアキンを指し、ここで、ダイアキンは、標的化または非標的化され得る。標的化ＤＫ１２ＩＦＮａは、特異的抗原、例えば、ＴＡＡに結合するｓｃＦｖを使用することによって、またはＴＡＡを標的化する抗体由来のｓｃＦｖ足場ＣＤＲ上でグラフト化することによって、標的化分子にされてもよい。これらの分子は、ＤＫ１２ＩＦＮａ（標的名称）と表示される。例えば、ＥＧＦＲに標的化されるＤＫ１２ＩＦＮａは、「ＤＫ１２ＩＦＮａ（ｅｇｆｒ）」または「ＤＫ１２ＩＦＮａｅｇｆｒ」と表示される。
【0063】
「腫瘍」という用語は、本明細書で使用される場合、悪性または良性、およびすべての前がん性およびがん性の細胞および組織にかかわらず、すべての新生細胞の成長および増殖を指す。「がん」、「がん性」、「細胞増殖性障害」、「増殖性障害」および「腫瘍」という用語は、本明細書で言及される場合、相互排他的ではない。
【0064】
腫瘍は、良性または悪性であり得る。良性腫瘍は、転移を起こさないとして特徴付けられる。悪性細胞は、がん細胞であり、転移を起こし得る。本出願の方法が行われ得る腫瘍としては、限定されないが、腺腫、血管肉腫（ａｎｇｉｏ－ｓａｒｃｏｍａ）、星状細胞腫、上皮癌、胚細胞腫、神経膠芽腫、神経膠腫、過誤腫、血管内皮腫、血管肉腫（ｈｅｍａｎｇｉｏｓａｒｃｏｍａ）、血腫、肝芽腫、白血病、リンパ腫、髄芽腫、黒色腫、神経芽細胞腫、骨肉腫、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、肉腫および奇形腫が挙げられる。腫瘍は、末端黒子型黒色腫、日光角化症、腺癌、腺様嚢胞癌、腺腫、腺肉腫、腺扁平上皮癌、アストロサイト腫瘍、バルトリン腺癌、基底細胞癌、気管支腺癌、毛細血管、カルチノイド、癌腫、癌肉腫、海綿状、胆管癌、軟骨肉腫（chondosarcoma）、脈絡叢乳頭腫（choriod plexus papilloma）／癌、明細胞癌、嚢胞腺腫、内胚葉洞腫瘍、子宮内膜増殖症、子宮内膜間質肉腫、類内膜腺癌、上衣、類上皮、ユーイング肉腫、線維層板型、限局性結節性過形成、ガストリノーマ、胚細胞腫瘍、神経膠芽腫、グルカゴノーマ、血管芽腫（hemangiblastoma）、血管内皮腫、血管腫、肝細胞腺腫、肝細胞腺腫症、肝細胞癌、インスリノーマ、上皮内新生物（intaepithelial neoplasia）、上皮間扁平上皮細胞新生物、浸潤性扁平上皮細胞癌、大細胞癌、平滑筋肉腫、悪性黒子型黒色腫、悪性黒色腫、悪性中皮腫、髄芽腫、髄上皮腫、黒色腫、髄膜、中皮、転移性癌、粘膜表皮癌、神経芽細胞腫、神経上皮腺癌、結節型黒色腫、燕麦細胞癌、オリゴデンドログリア、骨肉腫、膵臓の乳頭状漿液性腺癌、松果体細胞、下垂体腫瘍、形質細胞腫、偽肉腫、肺芽細胞腫、腎細胞癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、肉腫、漿液性癌、小細胞癌、軟組織癌、ソマトスタチン分泌腫瘍、扁平上皮癌、扁平上皮細胞癌、中皮下、表在拡大型黒色腫、未分化癌、ぶどう膜黒色腫、疣状癌、ビポーマ、高分化癌、およびウィルムス腫瘍から選択することができる。
【0065】
「がん」および「がん性」という用語は、典型的には、未調節の細胞成長／増殖によって特徴付けられる、哺乳動物における生理学的状態を指すか、またはそれを記載する。がんの例としては、限定されるものではないが、癌腫、リンパ腫（例えば、ホジキンリンパ腫および非ホジキンリンパ腫）、芽細胞腫、肉腫および白血病が挙げられる。そのようながんのより特定の例としては、扁平上皮細胞がん、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、肺の腺癌、肺の扁平上皮癌、腹膜のがん、肝細胞がん、胃腸がん、膵臓がん、神経膠腫、子宮頸がん、卵巣がん、肝臓がん、膀胱がん、肝細胞腫、乳がん、結腸がん、結腸直腸がん、子宮内膜または子宮癌、唾液腺癌、腎臓がん、肝臓がん、前立腺がん、外陰部がん、甲状腺がん、肝癌、白血病および他のリンパ増殖性障害、ならびにさまざまな種類の頭頸部がんが挙げられる。
二重サイトカイン融合タンパク質の構造
二重サイトカイン融合タンパク質の構造
【0066】
本開示は、公知の免疫療法、例えば、ＴＡＡを標的化する操作された免疫細胞またはＢｉＴＥ療法の機能を増大または増強するための、米国特許出願第１７／１９９，２３９号（２０２１年３月１１日出願、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に以前に記載されているダイアキンの使用に関する。簡潔には、米国特許第１０，８５８，４１２号および同第１０，９７５，１３３号（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に以前に記載されたＩＬ－１０融合タンパク質の前のバージョンに対する改善である、本出願の方法において使用されるダイアキンは、ＩＬ－１０またはＩＬ－１０バリアント分子の２つの単量体、およびｓｃＦｖのヒンジ領域に連結された第２のサイトカイン分子を含む。ダイアキンは、米国特許第１０，８５８，４１２号および同第１０，９７５，１３３号に記載されている第一世代のＩＬ－１０融合分子（図１）において構築される。簡潔には、第一世代のＩＬ－１０融合タンパク質は、それぞれの末端におけるＩＬ－１０の２つの単量体（すなわち、アミノ末端における第１のＩＬ－１０単量体およびカルボキシ末端における第２のＩＬ－１０単量体）を特徴とする、ＶＨおよびＶＬ ｓｃＦｖ足場において構築される。足場システムは、ＶＨのＣＤＲ１～３およびＶＬのＣＤＲ１～３を有する６つの相補性決定領域（「ＣＤＲ」）を有する、ヒトモノクローナル抗エボラ抗体から得られたｓｃＦｖを含む。ＶＨおよびＶＬ領域は、特異的抗原に対してＩＬ－１０融合タンパク質を標的化することができ、これは、ＶＨおよびＶＬ対の６つのＣＤＲ領域（ＶＨの３つのＣＤＲおよびＶＬの３つのＣＤＲ）を、受容体もしくは抗原標的化抗体、またはその抗原結合性断片のＶＨおよびＶＬ由来の６つのＣＤＲ領域で置換することによって達成される。ｓｃＦｖの６つのＣＤＲおよびフレームワーク領域を置換および最適化する能力、ならびに本明細書に記載されるｓｃＦｖ足場にＣＤＲをグラフトする能力は、周知であり、当業者によって実施される。
【0067】
第１の態様では、本出願は、ＩＬ－１０またはＩＬ－１０バリアントおよび少なくとも１つの他のサイトカインを含み、それによって、二重サイトカイン融合タンパク質は、米国特許第１０，８５８，４１２号に以前に記載されたＩＬ－１０融合タンパク質と比較した場合に、併用または相乗的機能性を有する、ダイアキンと称される二重サイトカイン融合タンパク質に関する。図２は、ＩＬ－１０を含むダイアキンの代表図である。特に、ダイアキンは、ＶＨおよびＶＬを含み、それによって、ＩＬ－１０の２つの単量体が、アミノおよびカルボキシ末端で二重サイトカイン融合タンパク質が終わる、ｓｃＦｖから作られた足場システムを利用する。第２のサイトカインは、ｓｃＦｖのヒンジ領域であるｓｃＦｖのＶＨおよびＶＬ領域の間で融合することによって、ＩＬ－１０（またはＩＬ－１０バリアント）の単量体にコンジュゲートされる。ダイアキンは、機能的タンパク質複合体を形成することができ、それによって、ＩＬ－１０（またはＩＬ－１０バリアント）の単量体を機能的ＩＬ－１０分子にホモ二量体化し、ＶＨおよびＶＬ領域は、一緒に会合する対を形成して、抗原結合および認識を可能にするｓｃＦｖ複合体を形成する。
【0068】
ある特定の態様では、ＩＬ－１０を含むダイアキンまたは二重サイトカイン融合タンパク質は、式Ｉ
ＮＨ２－（ＩＬ－１０）－（Ｘ１）－（Ｚｎ）－（Ｘ２）－（ＩＬ－１０）－ＣＯＯＨ
（式中、
「ＩＬ１０」は、ＩＬ－１０の単量体であり、ここで、ＩＬ－１０は、ヒト、マウス、ＣＭＶもしくはＥＢＶ ＩＬ－１０、またはそのバリアントであり、より好ましくは、ＩＬ１０は、配列番号１、３、７、９または１０から選択される配列を含む単量体であり；
「Ｘ１」は、第１のモノクローナル抗体から得られるＶＬまたはＶＨ領域であり；「Ｘ２」は、第１のモノクローナル抗体から得られるＶＨまたはＶＬ領域であり；ここで、Ｘ１が、ＶＬである場合、Ｘ２は、ＶＨであるか、またはＸ１が、ＶＨである場合、Ｘ２は、ＶＬであり、好ましくは、ＶＨおよびＶＬ領域は、ヒト抗エボラ抗体から得られるｓｃＦｖであり、ＶＨおよびＶＬ領域は、第２の抗体由来の６つのＣＤＲ（ＶＨ由来の３つおよびＶＬ由来の３つ）でグラフト化され；
「Ｚ」は、ＩＬ－１０以外の任意のサイトカイン、好ましくは、ＩＬ－６、ＩＬ－４、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－５、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、ＩＬ－２６、ＩＬ－２７、ＩＬ－２８、ＩＬ－２９、ＧＭ－ＣＳＦ、Ｇ－ＣＳＦ、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－γ、ＴＧＦ－β、またはＴＮＦ－α、ＴＮＦ－β、塩基性ＦＧＦ、ＥＧＦ、ＰＤＧＦ、ＩＬ－４、ＩＬ－１１、またはＩＬ－１３であり；
「ｎ」は、１～２から選択される整数である）
を有する構造である。
好ましい一実施形態では、ＩＬ－１０は、配列番号１０のアミノ酸３１位および７５位に置換を含む、ＤＶ０７と称される高親和性バリアントである。別の実施形態では、ＶＨおよびＶＬ領域は、固形腫瘍または血液腫瘍の表面で見出されるＴＡＡに結合することができる、任意のモノクローナル抗体から得られるｓｃＦｖである。別の態様では、ｓｃＦｖは、ＶＥＧＦＲ２に対する抗体から得られる。一態様では、ｓｃＦｖは、ヒトモノクローナル抗エボラ抗体から得られ、ここで、抗エボラ抗体の６つのＣＤＲ（ＶＨの３つおよびＶＬの３つ）は、必要に応じて、ＴＡＡに結合することができる任意のモノクローナル抗体由来の６つのＣＤＲと置き換えられる。別の態様では、ｓｃＦｖは、固形腫瘍または血液腫瘍と関連するＴＡＡに対する特異性を有するＣＤＲでグラフト化されている、ヒトモノクローナル抗エボラ抗体由来のＶＨおよびＶＬフレームワーク領域を含む。一態様では、ｓｃＦｖのＶＨおよびＶＬ領域は、抗ＶＥＧＦＲ２抗体由来の６つのＣＤＲ（ＶＨ由来の３つおよびＶＬ由来の３つ）でグラフト化される。さらに別の好ましい実施形態では、第２のサイトカインは、ＩＬ－２、より好ましくは、配列番号９である。
ＮＨ２－（ＩＬ－１０）－（Ｘ１）－（Ｚｎ）－（Ｘ２）－（ＩＬ－１０）－ＣＯＯＨ
（式中、
「ＩＬ１０」は、ＩＬ－１０の単量体であり、ここで、ＩＬ－１０は、ヒト、マウス、ＣＭＶもしくはＥＢＶ ＩＬ－１０、またはそのバリアントであり、より好ましくは、ＩＬ１０は、配列番号１、３、７、９または１０から選択される配列を含む単量体であり；
「Ｘ１」は、第１のモノクローナル抗体から得られるＶＬまたはＶＨ領域であり；「Ｘ２」は、第１のモノクローナル抗体から得られるＶＨまたはＶＬ領域であり；ここで、Ｘ１が、ＶＬである場合、Ｘ２は、ＶＨであるか、またはＸ１が、ＶＨである場合、Ｘ２は、ＶＬであり、好ましくは、ＶＨおよびＶＬ領域は、ヒト抗エボラ抗体から得られるｓｃＦｖであり、ＶＨおよびＶＬ領域は、第２の抗体由来の６つのＣＤＲ（ＶＨ由来の３つおよびＶＬ由来の３つ）でグラフト化され；
「Ｚ」は、ＩＬ－１０以外の任意のサイトカイン、好ましくは、ＩＬ－６、ＩＬ－４、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－５、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、ＩＬ－２６、ＩＬ－２７、ＩＬ－２８、ＩＬ－２９、ＧＭ－ＣＳＦ、Ｇ－ＣＳＦ、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－γ、ＴＧＦ－β、またはＴＮＦ－α、ＴＮＦ－β、塩基性ＦＧＦ、ＥＧＦ、ＰＤＧＦ、ＩＬ－４、ＩＬ－１１、またはＩＬ－１３であり；
「ｎ」は、１～２から選択される整数である）
を有する構造である。
好ましい一実施形態では、ＩＬ－１０は、配列番号１０のアミノ酸３１位および７５位に置換を含む、ＤＶ０７と称される高親和性バリアントである。別の実施形態では、ＶＨおよびＶＬ領域は、固形腫瘍または血液腫瘍の表面で見出されるＴＡＡに結合することができる、任意のモノクローナル抗体から得られるｓｃＦｖである。別の態様では、ｓｃＦｖは、ＶＥＧＦＲ２に対する抗体から得られる。一態様では、ｓｃＦｖは、ヒトモノクローナル抗エボラ抗体から得られ、ここで、抗エボラ抗体の６つのＣＤＲ（ＶＨの３つおよびＶＬの３つ）は、必要に応じて、ＴＡＡに結合することができる任意のモノクローナル抗体由来の６つのＣＤＲと置き換えられる。別の態様では、ｓｃＦｖは、固形腫瘍または血液腫瘍と関連するＴＡＡに対する特異性を有するＣＤＲでグラフト化されている、ヒトモノクローナル抗エボラ抗体由来のＶＨおよびＶＬフレームワーク領域を含む。一態様では、ｓｃＦｖのＶＨおよびＶＬ領域は、抗ＶＥＧＦＲ２抗体由来の６つのＣＤＲ（ＶＨ由来の３つおよびＶＬ由来の３つ）でグラフト化される。さらに別の好ましい実施形態では、第２のサイトカインは、ＩＬ－２、より好ましくは、配列番号９である。
【0069】
別の態様では、ＩＬ－１０を含むダイアキンまたは二重サイトカイン融合タンパク質は、式ＩＩ
ＮＨ２－（ＩＬ１０）－（Ｌ）－（Ｘ１）－（Ｌ）－（Ｚｎ）－（Ｌ）－（Ｘ２）－（Ｌ）－（ＩＬ１０）－ＣＯＯＨ
（式中、
「ＩＬ－１０」は、ＩＬ－１０単量体、例えば、限定されないが、ヒト、マウス、ＣＭＶ、ＥＢＶ ＩＬ－１０、またはそのバリアントであり；
「Ｌ」は、リンカー、好ましくは、配列番号３９、４０または４１のリンカーであり；
「Ｘ１」は、第１のモノクローナル抗体から得られるＶＬまたはＶＨ領域であり；
「Ｘ２」は、第１のモノクローナル抗体から得られるＶＨまたはＶＬ領域であり；
ここで、Ｘ１が、ＶＬである場合、Ｘ２は、ＶＨであるか、またはＸ１が、ＶＨである場合、Ｘ２は、ＶＬであり、Ｘ１およびＸ２は、一緒に、ｓｃＦｖであり；
「Ｚ」は、第２のサイトカインであり、ここで、第２のサイトカインは、ＩＬ－１０以外のサイトカインであり；
「ｎ」は、１～２から選択される整数である）
を有する構造である。
好ましい一態様では、ＩＬ－１０は、配列番号１０のアミノ酸３１位および７５位に置換を含む、ＤＶ０７と称される高親和性バリアントである。別の実施形態では、ＶＨおよびＶＬ領域は、固形腫瘍または血液腫瘍の表面で見出されるＴＡＡに結合することができる、任意のモノクローナル抗体から得られるｓｃＦｖである。別の態様では、ｓｃＦｖは、ＶＥＧＦＲ２に対する抗体から得られる。一態様では、ｓｃＦｖは、ヒトモノクローナル抗エボラ抗体から得られ、ここで、抗エボラ抗体の６つのＣＤＲ（ＶＨの３つおよびＶＬの３つ）は、必要に応じて、ＴＡＡに結合することができる任意のモノクローナル抗体由来の６つのＣＤＲと置き換えられる。別の態様では、ｓｃＦｖは、固形腫瘍または血液腫瘍と関連するＴＡＡに対する特異性を有するＣＤＲでグラフト化されている、ヒトモノクローナル抗エボラ抗体由来のＶＨおよびＶＬフレームワーク領域を含む。一態様では、ｓｃＦｖのＶＨおよびＶＬ領域は、抗ＶＥＧＦＲ２抗体由来の６つのＣＤＲ（ＶＨ由来の３つおよびＶＬ由来の３つ）でグラフト化される。さらに別の好ましい実施形態では、第２のサイトカインは、ＩＬ－２、より好ましくは、配列番号９である。
ＮＨ２－（ＩＬ１０）－（Ｌ）－（Ｘ１）－（Ｌ）－（Ｚｎ）－（Ｌ）－（Ｘ２）－（Ｌ）－（ＩＬ１０）－ＣＯＯＨ
（式中、
「ＩＬ－１０」は、ＩＬ－１０単量体、例えば、限定されないが、ヒト、マウス、ＣＭＶ、ＥＢＶ ＩＬ－１０、またはそのバリアントであり；
「Ｌ」は、リンカー、好ましくは、配列番号３９、４０または４１のリンカーであり；
「Ｘ１」は、第１のモノクローナル抗体から得られるＶＬまたはＶＨ領域であり；
「Ｘ２」は、第１のモノクローナル抗体から得られるＶＨまたはＶＬ領域であり；
ここで、Ｘ１が、ＶＬである場合、Ｘ２は、ＶＨであるか、またはＸ１が、ＶＨである場合、Ｘ２は、ＶＬであり、Ｘ１およびＸ２は、一緒に、ｓｃＦｖであり；
「Ｚ」は、第２のサイトカインであり、ここで、第２のサイトカインは、ＩＬ－１０以外のサイトカインであり；
「ｎ」は、１～２から選択される整数である）
を有する構造である。
好ましい一態様では、ＩＬ－１０は、配列番号１０のアミノ酸３１位および７５位に置換を含む、ＤＶ０７と称される高親和性バリアントである。別の実施形態では、ＶＨおよびＶＬ領域は、固形腫瘍または血液腫瘍の表面で見出されるＴＡＡに結合することができる、任意のモノクローナル抗体から得られるｓｃＦｖである。別の態様では、ｓｃＦｖは、ＶＥＧＦＲ２に対する抗体から得られる。一態様では、ｓｃＦｖは、ヒトモノクローナル抗エボラ抗体から得られ、ここで、抗エボラ抗体の６つのＣＤＲ（ＶＨの３つおよびＶＬの３つ）は、必要に応じて、ＴＡＡに結合することができる任意のモノクローナル抗体由来の６つのＣＤＲと置き換えられる。別の態様では、ｓｃＦｖは、固形腫瘍または血液腫瘍と関連するＴＡＡに対する特異性を有するＣＤＲでグラフト化されている、ヒトモノクローナル抗エボラ抗体由来のＶＨおよびＶＬフレームワーク領域を含む。一態様では、ｓｃＦｖのＶＨおよびＶＬ領域は、抗ＶＥＧＦＲ２抗体由来の６つのＣＤＲ（ＶＨ由来の３つおよびＶＬ由来の３つ）でグラフト化される。さらに別の好ましい実施形態では、第２のサイトカインは、ＩＬ－２、より好ましくは、配列番号９である。
【0070】
一実施形態では、ＩＬ－１０単量体は、ヒト（配列番号１）、ＣＭＶ（配列番号５）、ＥＢＶ（配列番号３）またはマウス（配列番号７）を含む、ＩＬ－１０の任意の形態を含む。別の実施形態では、ＩＬ－１０単量体は、米国特許第１０，８５８，４１２号に記載されているものを含む、ＥＢＶ ＩＬ－１０（配列番号３）の改変されたまたはバリアント形態である。好ましい実施形態では、ＥＢＶ ＩＬ－１０は、アミノ酸３１位および７５位に、配列番号３における２つの置換を含む（「ＤＶ０７」）。さらに別の実施形態では、ＩＬ－１０単量体は、配列番号１、３、７または１０の配列である。ＩＬ－１０またはＩＬ－１０バリアント分子の第１および第２の単量体は、図２に表されるように、融合タンパク質の末端にそれぞれ位置する（すなわち、アミノ末端の第１の単量体およびカルボキシ末端の第２の単量体）。
【0071】
別の態様では、本開示は、ＴＡＡを標的化する操作された免疫細胞またはＢｉＴＥと組み合わせて、式（ＩＩＩ）のＩＬ－１２ダイアキンを使用する方法に関する。
【0072】
ＮＨ２－（Ｒ１）－（Ｘ１）－（Ｚｎ）－（Ｘ２）－（Ｒ２）－ＣＯＯＨ（式ＩＩＩａ）；
【0073】
ＮＨ２－（Ｒ２）－（Ｘ１）－（Ｚｎ）－（Ｘ２）－（Ｒ１）－ＣＯＯＨ（式ＩＩＩｂ）；
（式中、
「Ｒ１」は、任意の多サブユニットの第１のサイトカイン由来のアルファサブユニット、好ましくは、ＩＬ－１２－アルファサブユニット（ｐ３５）またはＩＬ－２７アルファサブユニット（ｐ２８）のいずれか、より好ましくは、配列番号４５または４７のサブユニットであり；
「Ｒ２」は、任意の多サブユニットの第１のサイトカイン由来のベータサブユニット、好ましくは、ＩＬ－１２－ベータサブユニット（ｐ４０）またはＩＬ－２７ベータサブユニット（ＥＢＩ３）のいずれか、より好ましくは、配列番号４６または４８のサブユニットであり；
ここで、Ｒ１が、第１のサイトカインのアルファサブユニットである場合、Ｒ２は、第１のサイトカインのベータサブユニットであるか；またはＲ１が、ｐ３５である場合、Ｒ２は、ｐ４０であるか；またはＲ１が、ｐ２８である場合、Ｒ２は、ＥＢＩ３であるか；またはＲ１が、配列番号４５もしくは４７である場合、Ｒ２は、配列番号４６もしくは４８であるか；またはＲ１が、配列番号４６もしくは４８である場合、Ｒ２は、配列番号４５もしくは４７であり；
「Ｘ１」は、第１のモノクローナル抗体から得られるＶＬまたはＶＨ領域であり；「Ｘ２」は、第１のモノクローナル抗体から得られるＶＨまたはＶＬ領域であり；ここで、Ｘ１が、ＶＬである場合、Ｘ２は、ＶＨであるか、またはＸ１が、ＶＨである場合、Ｘ２は、ＶＬであり；
「Ｚ」は、多サブユニットのサイトカインの生物学的機能を増強する任意のサイトカイン、好ましくは、ＩＦＮａ－２ａ、ＩＬ－２８、ＩＬ－２９であり、
「ｎ」は、１～２から選択される整数であり、
第１のモノクローナル抗体は、ＶＥＧＦＲ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４４、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ７０、ＣＤ７９Ｂ、ＣＤ１１７、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ１４７、ＩＬ－２２Ｒ１、ＢＣＭＡ、ＣＬＬ０１、ＣＤ５、ＣＤ１４７、ｌＬＭＰ－１、ＳＬＡＭＦ７、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＴＡＣＩ、ＣＳ－１、ＣＸＣＲ４、ＮＫＧ２Ｄ、Ｂ７－Ｈ３、ＥＧＦＲ、ＰＤ－１、ＰＤＬ－１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＥｐＣＡＭ、ＰＳＣＡ、ＭＵＣ１、ルイスＹ、ＧＰＣ３、ＡＸＬ、クローディン１８．２、ＧＤ２、ＣＴＬＡ－４、ＣＥＡ、ＰＤＧＦＲ、ＭＥＳＯ、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ＢＣＭＡ、またはＰＳＡに対する特異性を有する第２の抗体由来のＣＤＲでグラフト化されている抗エボラ抗体である）
（式中、
「Ｒ１」は、任意の多サブユニットの第１のサイトカイン由来のアルファサブユニット、好ましくは、ＩＬ－１２－アルファサブユニット（ｐ３５）またはＩＬ－２７アルファサブユニット（ｐ２８）のいずれか、より好ましくは、配列番号４５または４７のサブユニットであり；
「Ｒ２」は、任意の多サブユニットの第１のサイトカイン由来のベータサブユニット、好ましくは、ＩＬ－１２－ベータサブユニット（ｐ４０）またはＩＬ－２７ベータサブユニット（ＥＢＩ３）のいずれか、より好ましくは、配列番号４６または４８のサブユニットであり；
ここで、Ｒ１が、第１のサイトカインのアルファサブユニットである場合、Ｒ２は、第１のサイトカインのベータサブユニットであるか；またはＲ１が、ｐ３５である場合、Ｒ２は、ｐ４０であるか；またはＲ１が、ｐ２８である場合、Ｒ２は、ＥＢＩ３であるか；またはＲ１が、配列番号４５もしくは４７である場合、Ｒ２は、配列番号４６もしくは４８であるか；またはＲ１が、配列番号４６もしくは４８である場合、Ｒ２は、配列番号４５もしくは４７であり；
「Ｘ１」は、第１のモノクローナル抗体から得られるＶＬまたはＶＨ領域であり；「Ｘ２」は、第１のモノクローナル抗体から得られるＶＨまたはＶＬ領域であり；ここで、Ｘ１が、ＶＬである場合、Ｘ２は、ＶＨであるか、またはＸ１が、ＶＨである場合、Ｘ２は、ＶＬであり；
「Ｚ」は、多サブユニットのサイトカインの生物学的機能を増強する任意のサイトカイン、好ましくは、ＩＦＮａ－２ａ、ＩＬ－２８、ＩＬ－２９であり、
「ｎ」は、１～２から選択される整数であり、
第１のモノクローナル抗体は、ＶＥＧＦＲ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４４、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ７０、ＣＤ７９Ｂ、ＣＤ１１７、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ１４７、ＩＬ－２２Ｒ１、ＢＣＭＡ、ＣＬＬ０１、ＣＤ５、ＣＤ１４７、ｌＬＭＰ－１、ＳＬＡＭＦ７、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＴＡＣＩ、ＣＳ－１、ＣＸＣＲ４、ＮＫＧ２Ｄ、Ｂ７－Ｈ３、ＥＧＦＲ、ＰＤ－１、ＰＤＬ－１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＥｐＣＡＭ、ＰＳＣＡ、ＭＵＣ１、ルイスＹ、ＧＰＣ３、ＡＸＬ、クローディン１８．２、ＧＤ２、ＣＴＬＡ－４、ＣＥＡ、ＰＤＧＦＲ、ＭＥＳＯ、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ＢＣＭＡ、またはＰＳＡに対する特異性を有する第２の抗体由来のＣＤＲでグラフト化されている抗エボラ抗体である）
【0074】
さらに別の態様では、本開示は、ＴＡＡを標的化する操作された免疫細胞またはＢｉＴＥと組み合わせて、式（ＩＶ）の２つの多サブユニットサイトカイン、例えば、ＩＬ１２、ＩＬ－２７、またはＩＬ－１０を有するダイアキンを使用する方法であって、前記ダイアキンが、式（ＩＶ）：
ＮＨ２－（Ｒ１）－（Ｌａ）－（Ｘ１）－（Ｌａ）－（Ｗ１）－（Ｌｂ）－（Ｗ２）－（Ｌａ）－（Ｘ２）－（Ｌａ）－（Ｒ２）－ＣＯＯＨ（式ＩＶ）；
（式中、
「Ｒ１」は、第１のサイトカイン、例えば、ＩＬ－１２もしくはＩＬ－２７のアルファサブユニット、またはホモ二量体サイトカイン、例えば、ＩＬ－１０の第１の単量体であり、ここで、Ｒ１は、好ましくは、ｐ４０であり；
「Ｒ２」は、第１のサイトカイン、例えば、ＩＬ－１２もしくはＩＬ－２７のベータアルファサブユニット、またはホモ二量体サイトカイン、例えば、ＩＬ－１０の第２の単量体であり、ここで、Ｒ２は、好ましくは、ｐ３５であり；
「Ｌａ」は、任意のリンカー；好ましくは、配列番号４３または４４であり；
「Ｌｂ」は、任意のリンカー；好ましくは、配列番号ＧＧＧＳＧＧＧまたは配列番号４２であり；
「Ｘ１」は、第１のモノクローナル抗体から得られるＶＬまたはＶＨ領域であり；「Ｘ２」は、第１のモノクローナル抗体から得られるＶＨまたはＶＬ領域であり；ここで、Ｘ１が、ＶＬである場合、Ｘ２は、ＶＨであるか、またはＸ１が、ＶＨである場合、Ｘ２は、ＶＬであり；
「Ｗ１」は、第１のサイトカイン、例えば、ＩＬ－１２もしくはＩＬ－２７のアルファサブユニット、またはホモ二量体サイトカイン、例えば、ＩＬ－１０の第１の単量体、好ましくは、ＩＬ－１０の第１の単量体であり；
「Ｗ２」は、第１のサイトカイン、例えば、ＩＬ－１２もしくはＩＬ－２７のベータアルファサブユニット、またはホモ二量体サイトカイン、例えば、ＩＬ－１０の第２の単量体、好ましくは、ＩＬ－１０の第２の単量体であり、
第１のモノクローナル抗体は、ＶＥＧＦＲ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４４、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ７０、ＣＤ７９Ｂ、ＣＤ１１７、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ１４７、ＩＬ－２２Ｒ１、ＢＣＭＡ、ＣＬＬ０１、ＣＤ５、ＣＤ１４７、ｌＬＭＰ－１、ＳＬＡＭＦ７、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＴＡＣＩ、ＣＳ－１、ＣＸＣＲ４、ＮＫＧ２Ｄ、Ｂ７－Ｈ３、ＥＧＦＲ、ＰＤ－１、ＰＤＬ－１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＥｐＣＡＭ、ＰＳＣＡ、ＭＵＣ１、ルイスＹ、ＧＰＣ３、ＡＸＬ、クローディン１８．２、ＧＤ２、ＣＴＬＡ－４、ＣＥＡ、ＰＤＧＦＲ、ＭＥＳＯ、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ＢＣＭＡ、またはＰＳＡに対する特異性を有する抗体由来のＣＤＲでグラフト化されている）
である、方法に関する。
ＮＨ２－（Ｒ１）－（Ｌａ）－（Ｘ１）－（Ｌａ）－（Ｗ１）－（Ｌｂ）－（Ｗ２）－（Ｌａ）－（Ｘ２）－（Ｌａ）－（Ｒ２）－ＣＯＯＨ（式ＩＶ）；
（式中、
「Ｒ１」は、第１のサイトカイン、例えば、ＩＬ－１２もしくはＩＬ－２７のアルファサブユニット、またはホモ二量体サイトカイン、例えば、ＩＬ－１０の第１の単量体であり、ここで、Ｒ１は、好ましくは、ｐ４０であり；
「Ｒ２」は、第１のサイトカイン、例えば、ＩＬ－１２もしくはＩＬ－２７のベータアルファサブユニット、またはホモ二量体サイトカイン、例えば、ＩＬ－１０の第２の単量体であり、ここで、Ｒ２は、好ましくは、ｐ３５であり；
「Ｌａ」は、任意のリンカー；好ましくは、配列番号４３または４４であり；
「Ｌｂ」は、任意のリンカー；好ましくは、配列番号ＧＧＧＳＧＧＧまたは配列番号４２であり；
「Ｘ１」は、第１のモノクローナル抗体から得られるＶＬまたはＶＨ領域であり；「Ｘ２」は、第１のモノクローナル抗体から得られるＶＨまたはＶＬ領域であり；ここで、Ｘ１が、ＶＬである場合、Ｘ２は、ＶＨであるか、またはＸ１が、ＶＨである場合、Ｘ２は、ＶＬであり；
「Ｗ１」は、第１のサイトカイン、例えば、ＩＬ－１２もしくはＩＬ－２７のアルファサブユニット、またはホモ二量体サイトカイン、例えば、ＩＬ－１０の第１の単量体、好ましくは、ＩＬ－１０の第１の単量体であり；
「Ｗ２」は、第１のサイトカイン、例えば、ＩＬ－１２もしくはＩＬ－２７のベータアルファサブユニット、またはホモ二量体サイトカイン、例えば、ＩＬ－１０の第２の単量体、好ましくは、ＩＬ－１０の第２の単量体であり、
第１のモノクローナル抗体は、ＶＥＧＦＲ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４４、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ７０、ＣＤ７９Ｂ、ＣＤ１１７、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ１４７、ＩＬ－２２Ｒ１、ＢＣＭＡ、ＣＬＬ０１、ＣＤ５、ＣＤ１４７、ｌＬＭＰ－１、ＳＬＡＭＦ７、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＴＡＣＩ、ＣＳ－１、ＣＸＣＲ４、ＮＫＧ２Ｄ、Ｂ７－Ｈ３、ＥＧＦＲ、ＰＤ－１、ＰＤＬ－１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＥｐＣＡＭ、ＰＳＣＡ、ＭＵＣ１、ルイスＹ、ＧＰＣ３、ＡＸＬ、クローディン１８．２、ＧＤ２、ＣＴＬＡ－４、ＣＥＡ、ＰＤＧＦＲ、ＭＥＳＯ、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ＢＣＭＡ、またはＰＳＡに対する特異性を有する抗体由来のＣＤＲでグラフト化されている）
である、方法に関する。
【0075】
ＶＨおよびＶＬ領域は、抗体、抗体断片、またはその抗原結合性断片由来である。抗原結合性断片としては、限定されるものではないが、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｖ－ＮＡＲ、ダイアボディまたはナノボディが挙げられる。好ましくは、ＶＨおよびＶＬは、一本鎖可変断片（「ｓｃＦｖ」）由来である。ある態様では、ｓｃＦｖは、ヒトモノクローナル抗エボラ抗体から得られる。別の態様では、ｓｃＦｖは、抗エボラ抗体由来のフレームワーク領域、および固形腫瘍または血液腫瘍の表面で発現される任意のＴＡＡに特異的なモノクローナル抗体由来の６つのＣＤＲ（３つのＶＨおよび３つのＶＬ）を含む。ｓｃＦｖ抗体またはグラフト化可能なＣＤＲは、ＶＥＧＦＲ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４４、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ７０、ＣＤ７９Ｂ、ＣＤ１１７、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ１４７、ＩＬ－２２Ｒ１、ＢＣＭＡ、ＣＬＬ０１、ＣＤ５、ＣＤ１４７、ｌＬＭＰ－１、ＳＬＡＭＦ７、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＴＡＣＩ、ＣＳ－１、ＣＸＣＲ４、ＮＫＧ２Ｄ、Ｂ７－Ｈ３、ＥＧＦＲ、ＰＤ－１、ＰＤＬ－１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＥｐＣＡＭ、ＰＳＣＡ、ＭＵＣ１、ルイスＹ、ＧＰＣ３、ＡＸＬ、クローディン１８．２、ＧＤ２、ＣＴＬＡ－４、ＣＥＡ、ＰＤＧＦＲ、ＭＥＳＯ、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ＢＣＭＡもしくはＰＳＡに特異的な抗体、またはその多標的化形態から選択されるモノクローナル抗体から得られる。
【0076】
別の態様では、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２またはＩＬ－２７を含むダイアキンは、単一抗体由来のＶＨおよびＶＬ対を含む。ＶＨおよびＶＬ対は、ＩＬ－１０またはそのバリアントの単量体が付着し得る足場として作用し、その結果、ＩＬ－１０またはそのバリアントの単量体は、機能するＩＬ－１０分子にホモ二量体化することが可能であり得る。したがって、当業者は、融合タンパク質において使用されるＶＨおよびＶＬ足場が、ＩＬ－１０単量体もしくはＩＬ－１０単量体バリアントの適正なホモ二量体化および／またはＶＨおよびＶＬ標的化能力を維持する切望に必要な、所望の物理的特質に基づいて選択され得ることを認識するであろう。同様に、当業者はまた、ＶＨおよびＶＬ対内の６つのＣＤＲ（ＶＨ由来の３つのＣＤＲおよびＶＬ由来の３つのＣＤＲ）も、他の抗体由来の６つのＣＤＲで置換されて、特異的な標的化融合タンパク質が得られ得ることを理解するであろう。一実施形態では、任意のモノクローナル抗体のＶＨ由来の３つのＣＤＲおよびＶＬ由来の３つのＣＤＲ（すなわち、ＶＨおよびＶＬ対）は、配列番号１２または１５を含む足場システムにグラフト化され得る。配列番号１２または１５に記載される足場システムは、ダイアキンとして製造される場合、分子のＶＨおよびＶＬ部分のヒンジ領域内で連結された第２のサイトカインも含む。二重サイトカイン融合タンパク質が任意の特異的抗原を標的にすることが意図されない場合、ＶＨおよびＶＬ対は、任意の特定の抗原を標的化しない足場（またはｉｎ ｖｉｖｏで低存在量の抗原である）、例えば、抗ＨＩＶおよび／または抗エボラ抗体由来のＶＨおよびＶＬ対として選択され得ることも想定される。そのため、ある実施形態では、本出願のＩＬ－１０融合タンパク質は、ヒト抗エボラ抗体由来のＶＨおよびＶＬ対、より好ましくは、配列番号１２または１５において見出されるＶＨおよびＶＬ配列を含み得る。融合タンパク質は、１～４つの範囲の可変領域を含み得る。別の実施形態では、可変領域は、同じ抗体由来、または少なくとも２つの異なる抗体由来であり得る。
【0077】
別の態様では、抗体可変鎖、またはＶＨおよびＶＬ対、またはＶＨおよびＶＬ対の６つのＣＤＲの標的特異性としては、限定されるものではないが、タンパク質、細胞受容体および／または腫瘍関連抗原を標的化するものが挙げられ得る。別の実施形態では、任意のＶＨおよびＶＬ対由来のＣＤＲ領域は、上記に記載される足場システムにグラフト化され得、そのような足場は、好ましくは、Ｄｅｂｏ（図１に概略的に表される）と呼ばれるシステムを含み、それによって、ＩＬ－１０単量体は、ヒト抗エボラ抗体のＶＨおよびＶＬ領域を含むｓｃＦｖに連結され、第２のサイトカインは、ｓｃＦｖのヒンジ領域に連結される（図２に概略的に表される）。より好ましくは、Ｄｅｂｏ足場システムへのグラフト化は、配列番号１２または１５の配列を含む足場において起こる。さらに別の実施形態では、可変領域、またはＶＨおよびＶＬ対、またはＶＨおよびＶＬ対の６つのＣＤＲは、さまざまな疾患（例えば、がん）、または健康な対象の血清において典型的に見出されないか、もしくはまれに見出されるものと関連する抗原を標的化する抗体、例えば、ＥＧＦＲ、ＰＤＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、Ｈｅｒ２Ｎｅｕ、ＦＧＦＲ、ＧＰＣ３、または他の腫瘍関連抗原、ＭＡｄＣＡＭ、ＩＣＡＭ、ＶＣＡＭ、ＣＤ１４、または他の炎症関連細胞表面タンパク質、ＨＩＶおよび／またはエボラに対する抗体由来の可変領域から得られる。そのため、一実施形態では、可変領域は、例えば、抗ＥＧＦＲ、抗ＭＡｄＣＡＭ、抗ＨＩＶ（Chan et al, J. Virol, 2018, 92(18):e006411-19）、抗ＩＣＡＭ、抗ＶＣＡＭ、抗ＣＤ１４、または抗エボラ（その全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１８／０１８０６１４号、特に、表２、３および４に記載されるｍＡｂ）抗体から得られるか、またはそれに由来する。別の実施形態では、可変領域は、ＩＬ－１０およびＩＬ－２がその生物学的効果を誘発することが可能であるように、特異的標的領域に対するサイトカイン、例えば、ＩＬ－１０およびＩＬ－２の濃度を濃縮することができる抗体から得られるか、またはそれに由来する。そのような抗体は、ある特定の罹患した領域における過剰発現もしくは上方調節された受容体もしくは抗原を標的化するもの、またはある特定の影響を受けた領域において特異的に発現されるものを含み得る。例えば、可変領域は、２～３例を挙げると、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）；ＣＤ５２；ＣＤ１４；さまざまな免疫チェックポイント標的、例えば、限定されるものではないが、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－１、ＴＩＭ３、ＢＴＬＡ、ＬＡＧ３またはＣＴＬＡ４；ＣＤ２０；ＣＤ４７；ＧＤ－２；ＶＥＧＦＲ１；ＶＥＧＦＲ２；ＨＥＲ２；ＰＤＧＦＲ；ＥｐＣＡＭ；ＩＣＡＭ（ＩＣＡＭ－１、－２、－３、－４、－５）、ＶＣＡＭ、ＦＡＰα；５Ｔ４；Ｔｒｏｐ２；ＥＤＢ－ＦＮ；ＴＧＦβ Ｔｒａｐ；ＭＡｄＣＡＭ、β７インテグリンサブユニット；α４β７インテグリン；α４インテグリンＳＲ－Ａ１；ＳＲ－Ａ３；ＳＲ－Ａ４；ＳＲ－Ａ５；ＳＲ－Ａ６；ＳＲ－Ｂ；ｄＳＲ－Ｃ１；ＳＲ－Ｄ１；ＳＲ－Ｅ１；ＳＲ－Ｆ１；ＳＲ－Ｆ２；ＳＲ－Ｇ；ＳＲ－Ｈ１；ＳＲ－Ｈ２；ＳＲ－Ｉ１；およびＳＲ－Ｊ１に特異的な抗体から得られ得る。他の可変領域は、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ５６、ＣＤ７０、ＣＤ７９Ｂ、ＣＤ１１７、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ１４７、Ｂ細胞突然変異抗原（ＢＣＭＡ）、Ｃ型レクチン様分子１（ＣＬＬ０１）、潜在膜タンパク質１（ＬＭＰ－１）、シグナル伝達リンパ活性化分子Ｆ７（ＳＬＡＭＦ７）、ＮＹ－ＥＳＯ－１、膜貫通活性化因子およびＣＡＭＬ相互作用物質（ＴＡＣＩ）、ＣＳ－１、ＣＸＣＲ４、ＮＫＧ２Ｄ、Ｂ７－Ｈ３、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ３、ＥｐＣＡＭ、メソテリン、ＰＳＣＡ、ＭＵＣ１、ルイスＹ、ＧＰＣ３、ＡＸＬ、クローディン１８．２、ＧＤ２、ＣＴＬＡ－４、ＣＥＡ、ＰＤＧＦＲ、メソテリン（ＭＥＳＯ）、ＰＳＣＡ、ＰＳＡに特異的な抗体から得られるものを含み得る。ＩＬ－１０（例えば、ヒト、ＣＭＶまたはＥＢＶ）またはバリアントＩＬ－１０分子の単量体（本明細書に記載）は、単量体ＩＬ－１０またはバリアントＩＬ－１０分子が互いと二量体化することが可能であるように、可変領域（ＶＨまたはＶＬ）のアミノ末端またはカルボキシ末端のいずれかにコンジュゲートされる。好ましい実施形態では、ＩＬ－１０（またはバリアントＩＬ－１０）の単量体は、式ＩまたはＩＩに従って、ＶＨおよびＶＬ対に融合され、ここで、ＩＬ－１０単量体は、ＩＬ－１０のＥＢＶ ＩＬ－１０、ＤＶ０５、ＤＶ０６、またはＤＶ０７形態である。
【0078】
ダイアキン、二重サイトカイン融合タンパク質または二重サイトカイン融合タンパク質複合体はまた、抗原標的化機能を有し得る。ダイアキンまたは二重サイトカイン融合タンパク質または二重サイトカイン融合タンパク質複合体は、一緒に会合して、抗原結合部位またはＡＢＳを形成することが可能であるＶＨおよびＶＬ対を含む。一部の配置では、ＩＬ－１０単量体またはそのＩＬ－１０バリアント単量体は、抗原結合部位を含む末端に共有結合的に連結される。可変領域は、対象における抗原性を低減する１つまたは複数のアミノ酸を変更することによって、さらに改変されていてもよい（例えば、付加、サブトラクション、または置換によって）。可変領域への他の改変は、ＶＨおよびＶＬ領域の６つのＣＤＲ領域の外側で見出され、ｓｃＦｖのＶＨおよびＶＬ領域の安定性および発現を増加させる役割を果たす、アミノ酸の置換、欠失または付加を含み得る。例えば、改変は、ＣＤＲ領域が、抗ＥＧＦＲまたは抗ＶＥＧＦＲ１または抗ＶＥＧＦＲ２抗体のＶＨおよびＶＬ領域から得られ、ＣＤＲ外の領域が、ｓｃＦｖを安定化するように最適化され、および／または発現を増加させるように最適化されている改変を含み得、これは、ｓｃＦｖのＶＨおよびＶＬ領域の間の第２のサイトカインの連結に基づいて使用され得る。これらの種類の改変が当業者の範囲内であることを実証するために、ＣＤＲ領域およびＣＤＲ外の領域への類似の改変を、ＤＶ０７を含み、ヒトＨＥＲ２を標的化するＤＫ２１０形態（すなわち、ＤＫ２１０ｈｅｒ２）の分子、例えば、配列番号５２～５４、または５５、より好ましくは、配列番号２１（バリアント４）または２３（バリアント５）に記載されるものに対して行った。これらのおよび他の改変を、ＤＶ０７を含み、ヒトＶＥＧＦＲ１またはＶＥＧＦＲ２Ａを標的化するＤＫ２１０形態の分子に対しても行い得、当業者は、ｓｃＦｖを安定化する、および／または発現の目的のために配列を最適化するための他の改変を決定することができるであろう。
【0079】
ＶＨおよびＶＬ対は、複数の抗体について得られたＣＤＲ領域がグラフトまたはグラフト化され得る、足場を形成する。そのような抗体ＣＤＲ領域は、公知のおよび上記に記載の抗体を含む。上記に記載されるＶＨおよびＶＬ足場におけるＣＤＲ領域は、ＣＤＲグラフト化／挿入に利用可能な以下の番号のアミノ酸位置を含む。
好ましい実施形態では、ＩＬ－１０を含む二重サイトカイン融合タンパク質は、ＶＨおよびＶＬ対が、抗エボラ抗体（例えば、配列番号１９に記載されるもの）に由来し、それによって、抗エボラ抗体由来の６つのＣＤＲ領域が除去され、特異的標的抗体、例えば、限定されるものではないが、ＥＧＦＲ；ＣＤ５２；ＣＤ１４；さまざまな免疫チェックポイント標的、例えば、限定されるものではないが、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－１、ＴＩＭ３、ＢＴＬＡ、ＬＡＧ３またはＣＴＬＡ４；ＣＤ１９、ＣＤ２０；ＣＤ２２、ＣＤ４７；ＧＤ－２；ＶＥＧＦＲ１；ＶＥＧＦＲ２；ＨＥＲ２；ＰＤＧＦＲ；ＥｐＣＡＭ；ＩＣＡＭ（ＩＣＡＭ－１、－２、－３、－４、－５）、ＶＣＡＭ、ＣＤ１４、ＦＡＰα；５Ｔ４；Ｔｒｏｐ２；ＥＤＢ－ＦＮ；ＴＧＦβ Ｔｒａｐ；ＭＡｄＣａｍ、β７インテグリンサブユニット；α４β７インテグリン；α４インテグリンＳＲ－Ａ１；ＳＲ－Ａ３；ＳＲ－Ａ４；ＳＲ－Ａ５；ＳＲ－Ａ６；ＳＲ－Ｂ；ｄＳＲ－Ｃ１；ＳＲ－Ｄ１；ＳＲ－Ｅ１；ＳＲ－Ｆ１；ＳＲ－Ｆ２；ＳＲ－Ｇ；ＳＲ－Ｈ１；ＳＲ－Ｈ２；ＳＲ－Ｉ１；およびＳＲ－Ｊ１のＶＨおよびＶＬ対でグラフト化される、以前に記載された足場ＩＬ－１０融合タンパク質を含む。ある実施形態では、６つの抗エボラＣＤＲ領域は、抗ＥＧＦＲ、抗ＭＡｄＣＡＭ、抗ＶＥＧＦＲ１、抗ＶＥＧＦＲ２、抗ＰＤＧＦＲ、または抗ＣＤ１４、抗ＣＤ１９、抗ＣＤ２０、抗ＣＤ２２、より好ましくは、抗ＶＥＧＦＲ２抗体由来の６つのＣＤＲ領域で置換される。
【表A】
【0080】
さらに別の態様では、第２のサイトカインは、図２に表されるように、ｓｃＦｖのＶＨおよびＶＬの間で融合される。第２のサイトカインは、第２のサイトカインがその機能的性質を保持するように、ｓｃＦｖのＶＨまたはＶＬ領域の間でコンジュゲートされるか、融合されるか、または連結される。一実施形態では、第２のサイトカインは、ＩＬ－１０単量体とは異なる。別の実施形態では、第２のサイトカインは、ＩＬ－１０である。一実施形態では、第２のサイトカインは、ＩＬ－６、ＩＬ－４、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－５、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＩＬ－１５、ＩＬ－１７、ＩＬ－２１、ＩＬ－２６、ＩＬ－２７、ＩＬ－２８ａ、ＩＬ２８ｂ、ＩＬ－２９、ＴＳＬＰ、ＧＭ－ＣＳＦ、Ｇ－ＣＳＦ、インターフェロン－α、－β、－γ、ＴＧＦ－β、もしくは腫瘍壊死因子－α、－β、塩基性ＦＧＦ、ＥＧＦ、ＰＤＧＦ、ＩＬ－４、ＩＬ－１１、もしくはＩＬ－１３、またはそのバリアントもしくはムテイン、例えば、限定されるものではないが高、中および低受容体親和性バリアントである。好ましい実施形態では、ＩＬ－１０を含むダイアキンにおける第２のサイトカインは、ＩＬ－２である。より好ましい実施形態では、ダイアキンまたは二重サイトカイン融合タンパク質は、ＤＫ２１０形態であり、ここで、ＩＬ－１０単量体は、ＤＶ０７；ヒト抗エボラ抗体由来のＶＨおよびＶＬフレームワーク領域を含む足場システム（すなわち、Ｄｅｂｏ）に連結されたＩＬ－１０バリアント分子であり、抗ＥＧＦＲ、抗ＨＥＲ２、抗ＣＤ１４、抗ＶＥＧＦＲ１、抗ＶＥＧＦＲ２、抗ＭＡｄＣＡＭ、または抗ＰＤＧＦＲ、抗Ｃｄ１９、抗Ｃｄ２０、抗ＣＤ２２、抗ＣＤ３、抗ＣＤ４、抗ＣＤ５、抗ＣＤ７、抗ＣＤ２５、抗ＣＤ３０、抗ＣＤ３３、抗ＣＤ３４、抗ＣＤ３８、抗ＣＤ４０、抗ＣＤ５２、抗ＣＤ５６、抗ＣＤ７０、抗ＣＤ７９Ｂ、抗ＣＤ１１７、抗ＣＤ１２３、抗ＣＤ１３８、抗ＣＤ１４７、抗Ｂ細胞突然変異抗原（ＢＣＭＡ）、抗Ｃ型レクチン様分子１（ＣＬＬ０１）、抗ＣＤ５、抗ＣＤ１４７、抗潜在膜タンパク質１（ＬＭＰ－１）、抗シグナル伝達リンパ球活性化分子Ｆ７（ＳＬＡＭＦ７）、抗ＮＹ－ＥＳＯ－１、抗膜貫通活性化因子およびＣＡＭＬ相互作用物質（ＴＡＣＩ）、抗ＣＳ－１、抗ＣＸＣＲ４、抗ＮＫＧ２Ｄ、抗Ｂ７－Ｈ３、抗ＰＤ－１、抗ＰＤＬ－１、抗ＨＥＲ３、抗ＥｐＣＡＭ、抗メソテリン、抗ＰＳＣＡ、抗ＭＵＣ１、抗ルイスＹ、抗ＧＰＣ３、抗ＡＸＬ、抗クローディン１８．２、抗ＧＤ２、抗ＣＴＬＡ－４、抗ＣＥＡ、抗メソテリン（ＭＥＳＯ）、抗ＰＳＣＡ、または抗ＰＳＡから選択される抗体から得られるＣＤＲによるグラフト化、ならびにＶＨおよびＶＬ対のヒンジ領域に連結されている、ＩＦＮα、ＩＬ２、ＩＬ７、ＩＬ１５、ＩＬ２１、ＩＬ２８、ＩＬ２９、またはその高、中もしくは低親和性バリアントから選択される第２のサイトカインをさらに含む。最も好ましい実施形態では、ダイアキンまたは二重サイトカイン融合タンパク質は、ＤＶ０７を含むＤＫ２１０形態の融合タンパク質であり、抗ＶＥＧＦＲ２抗体由来の６つのＣＤＲでグラフト化されている。
【0081】
別の態様では、ダイアキンは、下記の表１に示される、第１のサイトカイン（またはその高親和性バリアント）、第２のサイトカイン（またはその高親和性バリアント）、および標的化ｓｃＦｖ（またはモノクローナル抗体から得られ、抗エボラ抗体から得られたフレームワーク領域にグラフト化されたＣＤＲ）の組合せである。
【表1-1】
【表1-2】
【0082】
他の態様では、可能性があるダイアキン、またはダイアキンの少なくとも１つおよびＴＡＡ標的化された操作された免疫細胞、ＡＣＴ、またはＢｉＴＥの組合せを使用する方法は、以下の表２ａ～２ｅ）にリストされるものを含む。
【表2a】
【表2b】
【表2c-1】
【表2c-2】
【表2d-1】
【表2d-2】
【表2e-1】
【表2e-2】
【0083】
さらに他の態様では、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２またはＩＬ－２７を含むダイアキンまたは二重サイトカイン融合タンパク質は、リンカーを組み込んでいる。当業者には、リンカーまたはスペーサーを使用して、さまざまな融合タンパク質の部分の適正な空間的配置を達成し、したがって、ＩＬ－１０を含む二重サイトカイン融合タンパク質の形成において使用するための適切なリンカーを選択し得ることが公知である。より好ましい実施形態では、リンカーまたはスペーサーは、抗体のランダムなアミノ酸配列（例えば、配列番号３９～４４）または定常領域であり得る。定常領域は、限定されるものではないがＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤまたはＩｇＥに由来し得る。一実施形態では、リンカーまたはスペーサーは、定常重（「ＣＨ」）領域１、ＣＨ２、またはＣＨ３である。別の態様では、リンカーまたはスペーサーは、少なくとも２つの鎖間ジスルフィド結合をさらに含み得る。
【0084】
他の態様では、本開示は、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２またはＩＬ－２７、および第２のサイトカインを含むダイアキンまたは二重サイトカイン融合タンパク質をコードする核酸分子に関する。これらの核酸分子は、米国特許出願第１７／１１０，１０４号に記載されている。ＩＬ－１０および第２のサイトカインを含むダイアキンまたは二重サイトカイン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列はまた、記載される二重サイトカイン融合タンパク質の機能的性質を変更しない改変を含んでいてもよい。そのような改変は、従来の組換えＤＮＡ技法および方法を用いる。例えば、特定のアミノ酸配列の付加または置換を、合成オリゴヌクレオチドを用いる部位特異的突然変異誘発法を使用して、核酸（ＤＮＡ）レベルで、ＩＬ－１０配列に導入してもよく、この方法も、当技術分野において周知である。好ましい実施形態では、ＩＬ－１０および第２のサイトカインを含む二重サイトカイン融合タンパク質をコードする核酸分子は、ＩＬ－１０バリアント分子の機能性を変更しない、挿入、欠失または置換（例えば、コードを変性する）を含んでいてもよい。ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－２７バリアントおよび／または本明細書に記載される融合タンパク質全体をコードするヌクレオチド配列は、遺伝コードの縮重に起因してアミノ酸配列とは異なっていてもよく、前述の配列に対して、７０～９９％、好ましくは、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％相同であってもよい。したがって、本開示の実施形態は、配列番号３５、４６～５８または５９のタンパク質をコードするが、遺伝コードの縮重に起因して７０～９９％異なる、核酸配列を含む。
【0085】
本明細書に記載されるダイアキンまたは二重サイトカイン融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、例えば、タンパク質の発現、産生または分泌に役立つ、周知の配列をさらに含んでいてもよい。そのような配列は、例えば、リーダー配列、シグナルペプチド、および／または翻訳開始部位／配列（例えば、コザックコンセンサス配列）を含んでいてもよい。本明細書に記載されるヌクレオチド配列はまた、さまざまな発現系／ベクターへの挿入を可能にする、複数の制限酵素部位の１つを含んでいてもよい。
【0086】
別の態様では、二重サイトカイン融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、遺伝子治療において直接使用されてもよい。一実施形態では、本出願のバリアントＩＬ－１０、ＩＬ－１２もしくはＩＬ－２７分子、または融合タンパク質は、突然変異体ＩＬ－１０、ＩＬ－１２またはＩＬ－２７タンパク質の直接投与、および突然変異体ＩＬ－１０タンパク質をコードするベクターを用いる遺伝子治療を含む、当技術分野において公知の任意の方法によって送達することができる。遺伝子治療は、プラスミドＤＮＡ、またはウイルスベクター、例えば、アデノ随伴ウイルスベクター、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクターなどを使用して達成されてもよい。一部の実施形態では、本出願のウイルスベクターは、ウイルス粒子として投与され、また、それらは、プラスミドとして（例えば、「ネイキッド」ＤＮＡとして）投与される。
【0087】
ヌクレオチド配列の送達のための他の方法としては、当技術分野において既に公知であるものが挙げられる。これらには、細胞透過性ペプチド、疎水性部分、静電複合体、リポソーム、リガンド、リポソームナノ粒子、リポタンパク質（好ましくは、ＨＤＬまたはＬＤＬ）、葉酸標的化リポソーム、抗体（例えば、葉酸受容体、トランスフェリン受容体）、標的化ペプチドによる、またはアプタマーによる、ＩＬ－１０またはＩＬ－１０バリアント分子をコードするヌクレオチド配列、例えば、限定されるものではないが、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、またはそのバリアントの送達が含まれるであろう。ＩＬ－１０、ＩＬ－１２またはＩＬ－２７バリアント分子をコードするヌクレオチド配列は、直接注射、注入、パッチ、包帯、ミストもしくはエアロゾルによって、または薄膜送達によって、対象に送達されてもよい。ヌクレオチド（またはタンパク質）は、サイトカイン刺激の標的化送達に望ましい任意の領域に対するものであってもよい。これらには、例えば、肺、ＧＩ管、皮膚、肝臓、頭蓋内注射による脳、超音波ガイド注射を介した深在性転移性腫瘍病変が含まれるであろう。
【0088】
別の態様では、本開示は、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２またはＩＬ－２７を含むダイアキンまたは二重サイトカイン融合タンパク質を調製および精製する方法に関する。例えば、本明細書に記載されるダイアキンまたは二重サイトカイン融合タンパク質をコードする核酸配列を使用して、融合タンパク質を組換えにより産生させてもよい。例えば、従来の分子生物学およびタンパク質発現技法を使用して、本明細書に記載されるダイアキンまたは二重サイトカイン融合タンパク質は、哺乳動物細胞系から発現および精製され得る。これらの系は、周知の真核細胞発現ベクター系および宿主細胞を含む。各種の好適な発現ベクターが、使用され得、当業者に周知であり、これは、バリアントＩＬ－１０、ＩＬ－１２またはＩＬ－２７分子、および融合タンパク質の発現および導入のために使用することができる。これらのベクターとしては、例えば、ｐＵＣ型ベクター、ｐＢＲ型ベクター、ｐＢＩ型ベクター、ｐＧＡ型、ｐＢｉｎｌ９、ｐＢＩ１２１、ｐＧｒｅｅｎシリーズ、ｐＣＡＭＢＲＩＡシリーズ、ｐＰＺＰシリーズ、ｐＰＣＶ００１、ｐＧＡ４８２、ｐＣＬＤ０４５４１、ｐＢＩＢＡＣシリーズ、ｐＹＬＴＡＣシリーズ、ｐＳＢ１１、ｐＳＢ１、ｐＧＰＴＶシリーズ、およびウイルスベクターなどが挙げられ、それを使用することができる。周知の宿主細胞系としては、限定されるものではないが、ＣＨＯ細胞における発現が挙げられる。
【0089】
ダイアキンまたは二重サイトカイン融合タンパク質を保持する発現ベクターはまた、ベクターの機能性のために必要な他のベクターの構成部品を含んでいてもよい。例えば、ベクターは、二重サイトカイン融合タンパク質の適正な複製および発現に必要な、シグナル配列、タグ配列、プロテアーゼ特定配列、選択マーカー、および他の配列調節配列、例えば、プロモーターを含んでいてもよい。ベクターにおいて利用される特定のプロモーターは、それらが各種の宿主細胞型において二重サイトカイン融合タンパク質の発現を駆動することができる限り、特に限定されない。同様に、タグプロモーターの種類は、タグ配列が発現されるバリアントＩＬ－１０分子の精製をより簡単にまたはより容易にする限り、限定されない。これらには、例えば、６－ヒスチジン、ＧＳＴ、ＭＢＰ、ＨＡＴ、ＨＮ、Ｓ、ＴＦ、Ｔｒｘ、Ｎｕｓ、ビオチン、ＦＬＡＧ、ｍｙｃ、ＲＣＦＰ、ＧＦＰなどが含まれ、それを使用することができる。プロテアーゼ認識配列は、例えば、認識配列、例えば、第Ｘａ因子、トロンビン、ＨＲＶ、３Ｃプロテアーゼに特に限定されず、それを使用することができる。選択マーカーは、これらが形質転換されたコメ植物細胞、例えば、ネオマイシン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子を検出することができる限り、特に限定されず、それを使用することができる。
【0090】
本明細書に記載されるダイアキンまたは二重サイトカイン融合タンパク質はまた、製造プロセスの間に、融合タンパク質の回収または精製に役立つ追加のアミノ酸配列を含んでいてもよい。これらとしては、さまざまな配列改変または親和性タグ、例えば、限定されるものではないが、プロテインＡ、アルブミン結合タンパク質、アルカリホスファターゼ、ＦＬＡＧエピトープ、ガラクトース結合タンパク質、ヒスチジンタグ、および当技術分野において周知である任意の他のタグが挙げられ得る。例えば、Kimple et al（その全体が参照により本明細書に組み込まれるCurr. Protoc. Protein Sci., 2013, 73:Unit 9.9, Table 9.91）を参照されたい。一態様では、親和性タグは、６ヒスチジンのアミノ酸配列を有するヒスチジンタグである。ヒスチジンタグは、最終生成物から除去され得るか、またはそのまま残され得る。別の実施形態では、融合タンパク質に（例えば、本明細書に記載される融合タンパク質のＶＨ領域に）組み込まれる親和性タグは、プロテインＡ改変である。当業者は、本明細書に記載される任意の二重サイトカイン融合タンパク質配列が、当技術分野で記載されている抗体フレームワーク領域内にアミノ酸点置換を挿入することによって、プロテインＡ改変を組み込むように改変され得ることを理解するであろう。
【0091】
別の態様では、二重サイトカイン融合タンパク質をコードするタンパク質および核酸分子は、治療有効量の二重サイトカイン融合タンパク質および薬学的担体および／または薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物として製剤化されてもよい。医薬組成物は、一般に使用される緩衝剤、賦形剤、保存剤、安定剤とともに製剤化されてもよい。二重サイトカイン融合タンパク質を含む医薬組成物は、薬学的に許容される担体または賦形剤と混合される。さまざまな薬学的担体は、当技術分野において公知であり、医薬組成物において使用され得る。例えば、担体は、本出願の二重サイトカイン融合タンパク質組成物を患者に送達するのに好適な、任意の適合性の非毒性物質であり得る。好適な担体の例としては、一般的な生理食塩水、リンゲル液、デキストロース溶液およびハンクス液が挙げられる。担体はまた、限定されるものではないが、２９００（Ｌ６４）、３４００（Ｐ６５）、４２００（Ｐ８４）、４６００（Ｐ８５）、１１，４００（Ｆ８８）、４９５０（Ｐ１０３）、５９００（Ｐ１０４）、６５００（Ｐ１０５）、１４，６００（Ｆ１０８）、５７５０（Ｐ１２３）、および１２，６００（Ｆ１２７）の分子量を有するものを含む、当業者に一般に公知の任意のポロキサマーを含んでいてもよい。担体としては、２～３例を挙げると、限定されるものではないが、ポリソルベート２０、ポリソルベート４０、ポリソルベート６０およびポリソルベート８０を含む、乳化剤も挙げられ得る。非水性担体、例えば、固定油およびオレイン酸エチルも使用され得る。担体はまた、添加剤、例えば、等張性および化学的安定性を増強する物質、例えば、緩衝剤および保存剤を含んでいてもよく、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences and U.S. Pharmacopeia: National Formulary, Mack Publishing Company, Easton, Pa. (1984)を参照されたい。治療剤および診断剤の製剤は、例えば凍結乾燥粉末、スラリー、水溶液または懸濁液の形態の、生理学的に許容される担体、賦形剤または安定剤と混合することによって調製され得る。
【0092】
医薬組成物は、所望の治療結果を提供するために十分な治療有効量で患者への投与のために製剤化される。好ましくは、そのような量は、最小限の負の副作用を有する。一実施形態では、投与される二重サイトカイン融合タンパク質の量は、炎症性疾患または状態を処置または予防するために十分である。別の実施形態では、投与される二重サイトカイン融合タンパク質の量は、免疫疾患または障害を処置または予防するために十分である。さらに別の実施形態では、投与されるダイアキンまたは二重サイトカイン融合タンパク質の量は、がんを処置または予防するために十分である。投与される量は、患者間で変わり得、対象または患者の疾患または状態、患者の健康全般、投与の方法、副作用の重症度などを考慮することによって、決定することが必要である。
【0093】
特定の患者に対する有効量は、処置される状態、患者の健康全般、投与の経路の方法および用量、ならびに副作用の重症度などの要因に応じて変わり得る。患者に投与される適切な用量は、典型的には、当技術分野において処置に影響を及ぼすことが公知もしくは疑われているか、または処置に影響を及ぼすと予測されるパラメーターまたは要因を使用して、臨床医によって決定される。一般に、用量は、いくらか最適用量未満の量で開始し、これは、その後、所望のまたは最適な効果が任意の負の副作用と比べて達成されるまで、小さな増分で増加させる。重要な診断尺度としては、例えば、炎症の症状、または産生される炎症性サイトカインのレベルが挙げられる。
【0094】
本記載の二重サイトカイン融合タンパク質の投薬を決定するための方法は、米国特許第１０，８５８，４１２号に記載されるものと実質的に類似している。一般に、本記載の二重サイトカイン融合タンパク質は、０．５マイクログラム／キログラム～１００マイクログラム／キログラムの範囲の投薬を有する。二重サイトカイン融合タンパク質は、毎日、１週間に３回、１週間に２回、毎週、隔月または毎月投与されてもよい。治療薬の有効量は、症状を緩和することによって、炎症または疾患または状態のレベルに影響を与える。例えば、影響は、疾患または状態が、軽減または完全に処置されるように、少なくとも１０％；少なくとも２０％；少なくとも約３０％；少なくとも４０％；少なくとも５０％；またはそれよりも高い影響のレベルを含み得る。
【0095】
本出願の組成物は、経口投与することができ、または身体に注射することができる。経口使用のための製剤はまた、胃腸管においてバリアントＩＬ－１０分子をプロテアーゼからさらに保護する化合物を含むことができる。注射は、通常、筋肉内、皮下、皮内または静脈内である。あるいは、関節内注射または他の経路を、適切な状況で使用することができる。非経口的に投与される二重サイトカイン融合タンパク質は、好ましくは、薬学的担体および／または薬学的に許容される賦形剤と共同して、単位投薬量の注射形態（溶液、懸濁液、エマルジョン）に製剤化される。他の実施形態では、本出願の組成物は、埋め込み可能または注射可能な薬物送達システムによって患者の身体に導入され得る。
ダイアキンまたは二重サイトカイン融合タンパク質の試験
ダイアキンまたは二重サイトカイン融合タンパク質の試験
【0096】
複数のスクリーニングアッセイが、所望の生物学的機能について試験するために、当業者に公知であり、利用可能である。一実施形態では、所望の生物学的機能としては、限定されるものではないが、抗炎症応答の低減、Ｔ細胞刺激の低減、Ｔ細胞機能の増強、クッパー細胞機能の増強および肥満細胞脱顆粒の低減が挙げられる。
【0097】
例えば、ＩＬ－１０曝露が、Ｔ細胞をプライミングして、Ｔ細胞受容体刺激の際により多くのＩＦＮγを発生および分泌することが公知である。同時に、ＩＬ－１０曝露は、ＬＰＳに応答して単球／マクロファージから分泌されるＴＮＦα、ＩＬ－６および他の炎症促進性サイトカインの分泌を防止する。ＩＬ－１０は、ＦｏｘＰ３＋ＣＤ４＋Ｔｒｅｇ増殖も抑制する。一実施形態では、刺激性および抑制性応答の両方を含むＴ細胞効果を欠くが、単球／マクロファージ抑制を最大化する二重サイトカイン融合タンパク質は、陽性選択される。一実施形態では、抗炎症効果の増加を持つ二重サイトカイン融合タンパク質についてのスクリーニングは、自己免疫疾患、抗炎症疾患、またはその両方の処置のために、陽性選択される。さらに別の実施形態では、刺激性および抑制性応答の両方を含む、Ｔ細胞生物学を最大化し、クッパー細胞捕捉の増強も持つ、二重サイトカイン融合タンパク質は、がんの処置について開発するために選択される。二重サイトカイン融合タンパク質のさまざまなアッセイおよびスクリーニングの方法は、同時係属中の米国特許第１０，８５８，４１２号に以前に記載されており、これは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。米国特許出願第１６／８１１，７１８号の明細書第３９～４２頁を参照されたい。
組換えにより操作された細胞またはＡＣＴ
組換えにより操作された細胞またはＡＣＴ
【0098】
一態様では、本明細書に開示される方法は、ダイアキンとＡＣＴ療法の組合せを含み、例えば、限定されるものではないが、組換えにより操作された細胞としては、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、ＴＣＲまたは機能的非ＴＣＲ、ＴＩＬ、ＮＫ細胞、好ましくは、固形腫瘍と関連するＴＡＡを標的化するＣＡＲ－Ｔの形態の組換え抗原受容体が挙げられる。一部の実施形態では、抗原受容体は、ＴＡＡ抗原に特異的に結合する細胞外抗原認識ドメイン、および細胞内シグナル伝達ドメインを含む。
【0099】
典型的な組換えにより発現されるＣＡＲまたはＴＣＲは、細胞外抗原認識ドメイン（「ＥＡＲＤ」）として、膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインを含む。
【0100】
ＥＡＲＤは、タンパク質、ポリペプチドまたは炭水化物に特異的であり得る。ＴＡＡを標的化するＥＡＲＤが、がんを処置するために特に有用である。例えば、ＥＡＲＤは、ＴＡＡ、例えば、限定されるものではないが、ＥＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＥＧＰ－２、ＥＧＰ－４、ＯＥＰＨａ２、ＥｒｂＢ２、３もしくは４、Ｈｅｒ２、Ｌ１－ＣＡＭ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、メソテリン、ＣＥＡ、およびＢ型肝炎表面抗原、抗葉酸受容体、癌胎児抗原（ＣＥＡ）、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、ＰＳＭＡ、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、エフリンＢ２、ＣＤ１２３、ＣＳ－１、ｃ－Ｍｅｔ、ＧＤ－２、およびＭＡＧＥ Ａ３、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４４、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ７０、ＣＤ７９Ｂ、ＣＤ１１７、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ１４７、ＢＣＭＡ、ＣＬＬ０１、ＬＭＰ－１、ＳＬＡＭＦ７、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＴＣＡＩ、ＣＳ－１、ＣＣＲ４、ＲＯＲ１、ｔＥＧＦＲ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＰＳＣＡ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＭＡＲＴ－１、ｇｐ１００、腫瘍胎児抗原、ＲＯＲ１、ＴＡＧ７２、ＦＢＰ、胎児アセチルコリン受容体、ＧＤ２、ＧＤ３、ＨＭＷ－ＭＡＡ、ＩＬ－２２Ｒ－アルファ、ＩＬ－１３Ｒ－アルファ２、ｋｄｒ、カッパ軽鎖、ルイスＹ、Ｌ１細胞接着分子、ＭＡＧＥ－ＡＬメソテリン、ＣＥ７、ウィルムス腫瘍１（ＷＴ－１）、またはサイクリンを標的化し得る。当業者は、ＥＡＲＤを含む組換えにより操作された細胞が、処置される腫瘍またはがんによって決まることを認識するであろう。したがって、当業者は、がんを標的化するために、適切なＥＡＲＤを有する適切なＣＡＲ－ＴまたはＴＣＲ－Ｔを選択することができる。
【0101】
ＣＡＲまたはＴＣＲの膜貫通ドメインは、人工疎水性領域、またはＥＡＲＤもしくは一般に周知の膜貫通ドメインと通常関連するものである。これらとしては、限定されるものではないが、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤＳ、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、またはＴＣＲのアルファ、ベータもしくはゼータ鎖由来のドメインが挙げられる。
【0102】
当業者はまた、一般に、ＣＡＲ－ＴまたはＴＣＲ－Ｔ細胞の細胞内ドメインが、以下の細胞内シグナル伝達ドメイン：ＩＴＡＭ（例えば、ＣＤ３－ゼータ「ＣＤ３ζ」）、共刺激ドメインＩ（「ＣＭ１」）（例えば、ＣＤ２８、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７／４－１ＢＢまたはＩＣＯＳ）、および／または共刺激ドメインＩＩ（「ＣＭＩＩ」）（例えば、ＣＤ１３４またはＣＤ１３７／４－１ＢＢ）の１つまたは複数を含むことも認識するであろう。
【0103】
組換えにより操作された細胞は、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋ Ｔ細胞を含む、Ｔ細胞であり得る。他の態様では、Ｔ細胞は、自家または同種細胞のいずれか、好ましくは、自家である。一部の実施形態では、ＣＤ４＋細胞のＣＤ８＋細胞に対する比は、約１：５～約５：１である。一部の実施形態では、ＣＤ４＋細胞のＣＤ８＋細胞に対する比は、約１：２～約２：１である。一部の実施形態では、細胞の用量は、それぞれ包含的に、約０．２×１０６個細胞／対象の体重ｋｇ～約６×１０６個細胞／ｋｇ、約０．５×１０６個細胞／対象の体重ｋｇ～約３×１０６個細胞／ｋｇ、約０．７５×１０６個細胞／ｋｇ～約２．５×１０６個細胞／ｋｇ、または約１×１０６個細胞／ｋｇ～約２×１０６個細胞／ｋｇを含む。
二重特異性モノクローナル抗体
二重特異性モノクローナル抗体
【0104】
一態様では、本明細書に開示される方法は、Ｄｉｋａｉｎｅと二重特異性モノクローナル抗体（ＢＳＭａｂ）の組合せを含む。ＢＳＭａｂは、一般に、当技術分野において公知であり、限定されないが、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）、タンデム一本鎖可変断片（ｔａＦｖ）、ダイアボディ（Ｄｂ）、一本鎖ダイアボディ（ｓｃＤｂ）、トリプルボディもしくは四価抗体またはその断片、二重親和性再標的化抗体（ＤＡＲＴ）、あるいはＴｒｉｄｅｎｔ技術が挙げられる。ＢＳＭａｂの代表的な例としては、ＢｉＴＥが挙げられ、これは、２つの異なる抗原決定基または標的をエンゲージすることができる二重特異性モノクローナル抗体である場合を広く記載する。慣例的に、ＢｉＴＥは、２つのｓｃＦｖ分子から構成され、ここで、第１のｓｃＦｖは、ポリクローナル免疫細胞（例えば、ＣＤ８＋もしくはＣＤ４＋ Ｔ細胞またはＮＫ細胞）を認識することができ、第２のｓｃＦｖは、腫瘍抗原標的またはＴＡＡを認識することができる。これは、一般に、Ｔ細胞（またはＮＫ細胞）の表面のＣＤ３を認識する第１のｓｃＦｖ、およびＴＡＡ、例えば、ＣＤ２０を認識する第２のｓｃＦｖを有することによって達成される。
【0105】
一態様では、ＢｉＴＥは、ＣＤ３に対する特異性を有するｓｃＦｖを含むが、第２のｓｃＦｖは、血液腫瘍および固形腫瘍の両方の表面で見出される各種のＴＡＡに対する特異性を有し得る。一実施形態では、ＣＤ３に特異的な第１のｓｃＦｖは、ＥＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＥＧＰ－２、ＥＧＰ－４、ＯＥＰＨａ２、ＥｒｂＢ２、３もしくは４、Ｈｅｒ２、Ｌ１－ＣＡＭ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、メソテリン、ＣＥＡ、およびＢ型肝炎表面抗原、抗葉酸受容体、癌胎児抗原（ＣＥＡ）、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、ＰＳＭＡ、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ＨＥＲ３、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、エフリンＢ２、ＣＤ１２３、ＣＳ－１、ｃ－Ｍｅｔ、ＧＤ－２、およびＭＡＧＥ Ａ３、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４４、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ７０、ＣＤ７９Ｂ、ＣＤ１１７、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ１４７、ＢＣＭＡ、ＣＬＬ０１、ＬＭＰ－１、ＳＬＡＭＦ７、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＴＣＡＩ、ＣＳ－１、ＣＣＲ４、ＲＯＲ１、ｔＥＧＦＲ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＰＳＣＡ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、Ｂ７－Ｈ３、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＥｐＣＡＭ、ＰＳＣＡ、ＧＰＣ３、ＡＸＬ、クローディン１８．２、ＣＴＬＡ－４、ＣＥＡ、ＰＳＡ、ＭＡＲＴ－１、ｇｐ１００、腫瘍胎児抗原、ＲＯＲ１、ＴＡＧ７２、ＦＢＰ、胎児アセチルコリン受容体、ＧＤ２、ＧＤ３、ＨＭＷ－ＭＡＡ、ＩＬ－２２Ｒ－アルファ、ＩＬ－１３Ｒ－アルファ２、ｋｄｒ、カッパ軽鎖、ルイスＹ、Ｌ１細胞接着分子、ＭＡＧＥ－ＡＬメソテリン、ＣＥ７、ウィルムス腫瘍１（ＷＴ－１）、またはサイクリンに特異的な第２のｓｃＦｖと組み合わされ得る。一態様では、ＢＳＭａｂ（より具体的には、ＢｉＴＥ）は、ＴＡＡへの１つの特異性を有するが、ダイアキンは、異なるＴＡＡに対する特異性を有する。例えば、ＢｉＴＥは、ＣＤ３およびＣＤ２０に対する特異性を有するＢＳＭａｂであり得るが、Ｄｉｋａｉｎｅは、ＣＤ１９に特異的なＶＨおよびＶＬ ｓｃＦｖを有するＤＫ２１０形態である。
ＡＣＴまたはＢｉＴＥと組み合わせてダイアキンを使用する、処置およびまたは予防する方法
ＡＣＴまたはＢｉＴＥと組み合わせてダイアキンを使用する、処置およびまたは予防する方法
【0106】
任意の特定の理論に縛られないが、本発明者は、例えば、ダイアキンをＶＥＧＦＲ２に方向付けることによる、腫瘍血管系へのＩＬ－１０およびＩＬ－２の両方の標的化が、ＣＡＲ－Ｔ細胞の腫瘍特異的活性化、ならびにＤＶ０７（ＩＬ－１０の高親和性形態）によるサイトカイン放出症候群およびＩＬ－２毒性の直接抑制の両方を通じて毒性を制限しながら、活性化、浸潤および持続を可能にすると考えている。本発明者はまた、米国特許第１０，８５８，４１２号（構造の代表例として図１も参照されたい）に記載されるように、Ｄｖｅｇｆｒ２ＤＶ０７における融合タンパク質の単一サイトカインバージョンを使用する、腫瘍血管系へのＩＬ－１０単独の標的化も、ＣＡＲ－Ｔ細胞の有効な腫瘍特異的活性化であると考えている。別の実施形態では、類似の理論に基づいて、ダイアキンは、ＩＬ－１０およびＩＬ－７、またはＩＬ－１２およびＩＬ－１０、またはＩＬ－１０およびＩＬ－１５、またはＩＬ－１０およびＩＦＮ－アルファ、またはＩＬ－１０およびＩＬ－２１、またはＩＬ－１０およびＩＬ－２７の組合せを含む。別の理論では、本発明者は、ＤＫ２１０形態のダイアキンが、免疫系をプライミングして、従来のＡＣＴまたはＢｉＴＥ療法の機能を増強または強化することができると考えている。
【0107】
そのため、一態様では、本開示は、悪性腫瘍疾患もしくは状態、またはがんを処置および／または予防する方法であって、ＡＣＴ、例えば、ＣＡＲ－Ｔ細胞もしくはＴＣＲ－Ｔ細胞、またはＢＳＭａｂ、例えばＢｉＴＥと組み合わせて、治療有効量のＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－２７および第２のサイトカインを含むダイアキンまたは二重サイトイン融合タンパク質を、それを必要とする対象に投与することを含む、方法に関する。そのような二重サイトカイン融合タンパク質は、好ましくは、上記に記載されたように、ＤＶ０７の単量体を有し、任意の抗体標的化腫瘍関連抗原（「ＴＡＡ」）由来のＣＤＲでグラフト化された、ＤＫ２１０ ＤＫ７１０、ＤＫ１２１０、ＤＫ１５１０、ＤＫＩＦＮａ１０、ＤＫ２１１０またはＤＫ２７１０形態であり得る。好ましい実施形態では、二重サイトカイン融合タンパク質は、ＤＶ０７を含むＤＫ２１０形態である。当業者は、本明細書に記載されるダイアキンまたは二重サイトカイン融合タンパク質の投薬量が、必要により、または所望の結果に応じて、調整され得ることを理解することができるであろう。一態様では、ダイアキンは、およそ０．００１～０．２５ｍｇ／ｋｇの用量、好ましくは、０．０１～０．２ｍｇ／ｋｇの用量範囲で、それを必要とする患者に投与される。別の態様では、それを必要とする患者に投与される用量は、０．０００５～２５０ｎｇ／ｍＬ、好ましくは、０．００１～２００ｎｇ／ｍＬの範囲の血清または血漿濃度を達成するのに十分である。
【0108】
当業者は、養子細胞療法（例えば、養子Ｔ細胞療法）が、周知であり、以前に記載された手順に従って実行されることを認識するであろう。例えば、米国特許第４，６９０，９１５号を参照されたい。これらの方法は、自家移入（すなわち、患者に由来する）または同種移入（すなわち、処置される患者以外の別の対象に由来する）を含み得る。
【0109】
ＣＡＲ－ＴまたはＴＣＲ－Ｔ細胞は、公知の方法によって投与され、慣例的に、養子細胞療法に精通している者によって実行される。一実施形態では、投与方法としては、限定されるものではないが、ボーラス注入、静脈内もしくは皮下注射、眼内注射、眼周囲注射、網膜下注射、硝子体内注射、経中隔注射、強膜下注射、脈絡膜内注射、前房内注射、結膜下（ｓｕｂｃｏｎｊｅｃｔｖａｌ）注射、結膜下（ｓｕｂｃｏｎｊｕｎｔｉｖａｌ）注射、テノン嚢下注射、眼球後方注射、眼球周囲注射または後部強膜近傍送達が挙げられる。一部の実施形態では、それらは、非経口、肺内、および鼻腔内、または病巣内もしくは腫瘍内投与によって投与される。非経口注入としては、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内または皮下投与が挙げられる。ある特定の一部の実施形態では、組換えにより操作されたＣＡＲ－ＴまたはＴＣＲ－Ｔは、単回ボーラス投与、複数回ボーラスまたは持続注入として投与される。
【0110】
一実施形態では、二重サイトカイン融合タンパク質およびＣＡＲ－Ｔは、別々の後続期間で投与され、ここで、例えば、ダイアキン（例えば、ＤＫ２１０ｖｅｇｆｒ２）は、組換えにより操作されたＣＡＲ－Ｔ細胞の投与の前に投与される。他の実施形態では、投与される二重サイトカイン融合タンパク質およびＣＡＲ－Ｔは、同時に投与される。他の実施形態では、ダイアキンは、ＣＡＲ－Ｔ療法の１～３日前に投与され、次いで、ＣＡＲ－Ｔと一緒に同時に、および／またはＣＡＲ－Ｔ投与の１～７日後に投与される。ダイアキンは、１日もしくは１週間に１回、または１週間に２～３回、ＣＡＲ－Ｔと組み合わせて、またはそれと併せて投与され得る。別の態様では、ダイアキンは、投与前に、ＣＡＲ－Ｔ細胞の拡大増殖および／または解凍手順において利用される。凍結保存ストックからＣＡＲ－Ｔ細胞を再構成する際に、ＣＡＲ－Ｔは、典型的には、ＣＡＲ－Ｔの有益なサイトカイン（例えば、低用量ＩＬ－２）の存在下で休ませる。一態様では、ＣＡＲ－Ｔ細胞は、ダイアキンの存在下、凍結保存ストックから、プライミングまたは拡大増殖され得る。一態様では、ＣＡＲ－Ｔは、０．００１～３００ｎｇ／ｍＬのダイアキン、より好ましくは、０．０１～２００ｎｇ／ｍＬのダイアキンの存在下、拡大増殖またはプライミングされる。
【0111】
同様に、ダイアキンおよびＢｉＴＥは、別々の後続期間で投与され、ここで、ダイアキン（例えば、ＤＫ２１０ＣＤ２０）は、ＢｉＴＥ（例えば、ＣＤ３×ＣＤ１９ ＢｉＴＥ）の投与の１～３日前に投与される。他の実施形態では、ダイアキンは、ＢｉＴＥの１～３日前に投与され、次いで、ＢｉＴＥと一緒に同時に、および／またはＢｉＴＥ投与の１～７日後に投与される。ダイアキンは、１日もしくは１週間に１回、または１週間に２～３回、ＢｉＴＥと組み合わせて、またはそれと併せて、投与され得る。
【0112】
他の実施形態では、本開示は、第３の治療剤、例えば、当技術分野において周知である、サイトカイン、ステロイド、化学療法剤、抗生物質、抗炎症剤または放射線療法との共投与または共処置の方法も企図する。これらには、他の治療剤、例えば、限定されるものではないが、１つまたは複数の以下：化学療法剤、インターフェロン－β、例えば、ＩＦＮβ－１αおよびＩＦＮ－β－１ β；ミエリン塩基性タンパク質を刺激するタンパク質；コルチコステロイド；ＩＬ－１阻害剤；ＴＮＦ阻害剤；抗ＴＮＦα抗体、抗ＩＬ－６抗体、ＩＬ－１ｂｒ－Ｉｇ融合物、抗ＩＬ－２３抗体、ＣＤ４０リガンドおよびＣＤ８０に対する抗体；ＩＬ－１２およびＩＬ－２３のアンタゴニスト、例えば、ＩＬ－１２およびＩＬ－２３のｐ４０サブユニットのアンタゴニスト（例えば、ｐ４０サブユニットに対する阻害性抗体）；ＩＬ－２２アンタゴニスト；低分子阻害剤、例えば、メトトレキサート、レフルノミド、シロリムス（ラパマイシン）、およびそのアナログ、例えば、ＣＣＩ－７７９；Ｃｏｘ－２およびｃＰＬＡ２阻害剤；ＮＳＡＩＤ；ｐ３８阻害剤；ＴＰＬ－２；Ｍｋ－２；ＮＦｋβ阻害剤；ＲＡＧＥまたは可溶性ＲＡＧＥ；Ｐ－セレクチンまたはＰＳＧＬ－１阻害剤（例えば、低分子阻害剤、それに対する抗体、例えば、Ｐ－セレクチンに対する抗体）；エストロゲン受容体ベータ（ＥＲＢ）アゴニストまたはＥＲＢ－ＮＦｋβアンタゴニストとの組合せ処置を含み得る。
【0113】
加えて、二重サイトカイン融合タンパク質との投与のために有用な組合せ処置としては、例えば、ＴＮＦに結合する、キメラ、ヒト化、有効には、ヒト、ヒトもしくはｉｎ ｖｉｔｒｏ発生抗体、またはその抗原結合性断片を含むＴＮＦ阻害剤；ＴＮＦ受容体の可溶性断片、例えば、ｐ５５もしくはｐ７５ヒトＴＮＦ受容体、またはその誘導体、例えば、７５ｋｄのＴＮＦＲ－ＩｇＧ（７５ｋＤのＴＮＦ受容体－ＩｇＧ融合タンパク質、ＥＮＢＲＥＬ（商標））、ｐ５５ｋＤのＴＮＦ受容体－ＩｇＧ融合タンパク質；およびＴＮＦ酵素アンタゴニスト、例えば、ＴＮＦα変換酵素（ＴＡＣＥ）阻害剤が挙げられ得る。抗炎症剤／薬との他の組合せ処置としては、限定されるものではないが、標準的な非ステロイド抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）およびシクロオキシゲナーゼ２阻害剤が挙げられる。ＮＳＡＩＤとしては、アスピリン、セレコキシブ、ジクロフェナク、ジフルニサル、エトドラク、イブプロフェン、インドメタシン、ケトプロフェン、ケトロラク、ナブメトン、ナプロキセン、オキサプロジン、ピロキシカム、サルサラート、スリンダクおよび／またはトルメチンが挙げられ得る。本出願による組成物において用いられるシクロオキシゲナーゼ２阻害剤は、例えば、セレコキシブまたはロフェコキシブであり得る。
【0114】
二重サイトカイン融合タンパク質と共投与および／または共製剤化され得る追加の治療剤としては、インターフェロン－β、例えば、ＩＦＮβ－１αおよびＩＦＮβ－１β；ＣＯＰＡＸＯＮＥ（登録商標）；コルチコステロイド；ＩＬ－１阻害剤；ＴＮＦアンタゴニスト（例えば、ＴＮＦ受容体の可溶性断片、例えば、ｐ５５もしくはｐ７５ヒトＴＮＦ受容体、またはその誘導体、例えば、７５ｋｄのＴＮＦＲ－ＩｇＧ；ＣＤ４０リガンドおよびＣＤ８０に対する抗体；ならびにＩＬ－１２および／またはＩＬ－２３のアンタゴニスト、例えば、ＩＬ－１２およびＩＬ－２３のｐ４０サブユニットのアンタゴニスト（例えば、ＩＬ－１２およびＩＬ－２３のｐ４０サブユニットに結合する阻害性抗体）；メトトレキサート、レフルノミドおよびシロリムス（ラパマイシン）、またはそのアナログ、例えば、ＣＣＩ－７７９の１つまたは複数が挙げられる。他の治療剤としては、Ｉｍｆｉｍｚｉまたはアテゾリズマブ（Atezolizumb）が挙げられ得る。
【0115】
本明細書に記載される二重サイトカイン融合タンパク質と共投与され得る代表的な化学療法剤としては、以下の非網羅的リスト：アルキル化剤、例えば、チオテパおよびシクロホスファミド（cyclosphosphamide）（ＣＹＴＯＸＡＮ（商標））；アルキルスルホネート、例えば、ブスルファン、インプロスルファンおよびピポスルファン；アジリジン、例えば、ベンゾドパ、カルボコン、メツレドパ、およびウレドパ；アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホルアミド（trietylenephosphoramide）、トリエチレンチオホスホルアミド（triethylenethiophosphaoramide）およびトリメチロールメラミン（trimethylolomelamime）を含む、エチレンイミンおよびメチラメラミン；ナイトロジェンマスタード、例えば、クロラムブシル（chiorambucil）、クロルナファジン、コロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシド塩酸塩、メルファラン、ノボエンビキン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタード；ニトロソウレア（nitrosureas）、例えば、カルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチン；抗生物質、例えば、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、オースラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カリケアマイシン、カラビシン、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６－ジアゾ－５－オキソ－Ｌ－ノルロイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン、ピューロマイシン、クエラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシン；代謝拮抗薬、例えば、メトトレキサートおよび５－フルオロウラシル（５－ＦＵ）；葉酸アナログ、例えば、デノプテリン、メトトレキサート、プテロプテリン、トリメトレキサート；プリンアナログ、例えば、フルダラビン、６－メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニン；ピリミジンアナログ、例えば、アンシタビン、アザシチジン、６－アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジン、５－ＦＵ；アンドロゲン、例えば、カルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン；抗副腎性、例えば、アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタン；葉酸補充薬、例えば、フロリン酸；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；アムサクリン；ベストラブシル；ビスアントレン；エダトレキサート；デフォファミン；デメコルシン；ジアジクオン；エフロルニチン（elfornithine）；エリプチニウム酢酸塩；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシウレア；レンチナン；ロニダミン；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダモール；ニトラクリン；ペントスタチン；フェナメット；ピラルビシン；ポドフィリン酸；２－エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ（登録商標）；ラゾキサン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジクオン；２，２’，２’’－トリクロロトリエチルアミン；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン；アラビノシド（Ａｒａ－Ｃ）；シクロホスファミド；チオテパ；タキソイド、例えば、パクリタキセル（ＴＡＸＯＬ（登録商標） Ｂｒｉｓｔｏｌ－Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ、Ｎ．Ｊ．）およびドセタキセル（doxetaxel）（Ｔａｘｏｔｅｒｅ（商標）、Ｒｈｏｎｅ－Ｐｏｕｌｅｎｃ Ｒｏｒｅｒ、Ａｎｔｏｎｙ、Ｆｒａｎｃｅ）；クロラムブシル；ゲムシタビン；６－チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；白金アナログ、例えば、シスプラチンおよびカルボプラチン；ビンブラスチン；白金；エトポシド（ＶＰ－１６）；イホスファミド；マイトマイシンＣ；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ビノレルビン；ナベルビン；ノバントロン；テニポシド；ダウノマイシン；アミノプテリン；Ｘｅｌｏｄａ（登録商標）Ｒｏｃｈｅ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ；イバンドロネート；ＣＰＴ１１；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイン酸；エスペラミシン；カペシタビン；ならびに上記のいずれかの薬学的に許容される塩、酸または誘導体が挙げられ得る。また、この定義に含まれるものは、腫瘍に対するホルモン作用を調節または阻害するように作用する抗ホルモン剤、例えば、例えば、タモキシフェン、ラロキシフェン、アロマターゼ阻害性４（５）－イミダゾール、４－ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン、ＬＹ１１７０１８、オナプリストンおよびトレミフェン（Ｆａｒｅｓｔｏｎ）を含む、抗エストロゲン薬；ならびに抗アンドロゲン薬、例えば、フルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、ロイプロリド、およびゴセレリン；ならびに上記のいずれかの薬学的に許容される塩、酸または誘導体などである。
【実施例】
【0116】
（実施例１）
ダイアキンおよびＣＡＲ－Ｔの組合せ
ＣＡＲ－Ｔの腫瘍細胞に対するさまざまなエフェクターと標的（Ｅ：Ｔ）の比を調べて、ダイアキンをＣＡＲ－Ｔと組み合わせることで、ＣＡＲ－Ｔ細胞傷害性効果の機能を増強するかどうかを決定する。簡潔には、ＣＡＲ－Ｔ細胞（Ｐｒｏｍａｂ）を、０、１０、または１００ｎｇ／ｍＬのダイアキン（ＤＫ２１０ＣＤ１９）の存在下で、１～３日間、プライミングする。構成的に発現するＧＦＰで安定にトランスフェクトされたＲａｊｉ細胞を、ＣＡＲ－Ｔ機能を調べるためのモデル腫瘍細胞系として使用する。プライミングの後、ＣＡＲ－Ｔ細胞を、３対１または１対３のＥ：Ｔ比で混合し、Ｒａｊｉ－ＧＦＰ細胞に感染させ、ＩｎｃｕＣｙｔｅ Ｓ３システム（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）においてモニターする。ＣＡＲ－Ｔ細胞の細胞溶解有効性を、およそ４８時間の期間にわたって、ＧＦＰの消失によって測定する。
ダイアキンおよびＣＡＲ－Ｔの組合せ
ＣＡＲ－Ｔの腫瘍細胞に対するさまざまなエフェクターと標的（Ｅ：Ｔ）の比を調べて、ダイアキンをＣＡＲ－Ｔと組み合わせることで、ＣＡＲ－Ｔ細胞傷害性効果の機能を増強するかどうかを決定する。簡潔には、ＣＡＲ－Ｔ細胞（Ｐｒｏｍａｂ）を、０、１０、または１００ｎｇ／ｍＬのダイアキン（ＤＫ２１０ＣＤ１９）の存在下で、１～３日間、プライミングする。構成的に発現するＧＦＰで安定にトランスフェクトされたＲａｊｉ細胞を、ＣＡＲ－Ｔ機能を調べるためのモデル腫瘍細胞系として使用する。プライミングの後、ＣＡＲ－Ｔ細胞を、３対１または１対３のＥ：Ｔ比で混合し、Ｒａｊｉ－ＧＦＰ細胞に感染させ、ＩｎｃｕＣｙｔｅ Ｓ３システム（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）においてモニターする。ＣＡＲ－Ｔ細胞の細胞溶解有効性を、およそ４８時間の期間にわたって、ＧＦＰの消失によって測定する。
【0117】
腫瘍細胞成長のパーセンテージ（すなわち、ＧＦＰの消失は、標的細胞が細胞溶解されているという尺度である）を、経時的に測定する。２４時間後、ＣＤ２０ ＣＡＲ－Ｔ細胞とＲａｊｉ細胞の３：１のエフェクターと標的細胞比のダイアキン（１０ｎｇ／ｍＬまたは１００ｎｇ／ｍＬ）の組合せは、ＣＡＲ－Ｔ細胞単独と比較した場合に、およそ６．５分の１への腫瘍細胞成長の低減を示した。図９Ａを参照されたい。同様に、２４時間で、ＣＤ２０ ＣＡＲ－Ｔ細胞とＲａｊｉ細胞の１：３のエフェクターと標的細胞比のダイアキン（１０ｎｇ／ｍＬまたは１００ｎｇ／ｍＬ）の組合せは、ＣＡＲ－Ｔ細胞単独と比較した場合に、およそ２分の１への腫瘍細胞成長の低減を示した。図１０Ｂを参照されたい。これらのデータは、ダイアキンを、投与の前にＣＡＲ－Ｔ細胞をプライミングするために使用する場合に、ＣＡＲ－Ｔが、増強され、より強力な細胞傷害機能を有することを実証する。
（実施例２）
ＣＡＲ－Ｔと組み合わせたダイアキンによる固形腫瘍の処置
（実施例２）
ＣＡＲ－Ｔと組み合わせたダイアキンによる固形腫瘍の処置
【0118】
がんを処置するこの方法では、対象は、有効量のダイアキン（例えば、ＤＫ２１０ｖｅｇｆｒ２）を投与され、これは、ＴＡＡ、例えば、ＶＥＧＦＲ２を過剰発現する腫瘍微小環境に対して、ＩＬ－１０およびＩＬ－２の両方を標的化することができる。その後、養子細胞療法の標準的なプロトコールを使用して、腫瘍細胞においてＥＡＲＤ標的化過剰発現抗原、例えば、ｈｅｒ２／ｎｅｕまたはＰＳＡを発現するＣＡＲ－Ｔ細胞を投与する。患者に投与する前に、ＣＡＲ－Ｔ細胞を、必要に応じてダイアキンの存在下、拡大増殖する。操作された細胞の調製において、ＣＡＲを、そのＥＡＲＤが、処置される腫瘍に特異的な抗原エピトープに特異的に結合するように、選択する。
（実施例３）
ダイアキンおよびＢｉＴＥの組合せ
（実施例３）
ダイアキンおよびＢｉＴＥの組合せ
【0119】
ダイアキンが現在のＢｉＴＥ療法に有益であるかどうかを決定するための論理的根拠を、ＰＢＭＣに曝露された場合にダイアキンがどのように挙動するかを理解することによって、開始した。Ｔ細胞応答を決定するためのモデルシステムを使用して（米国特許第１０，８５８，４１２号の２９～３０欄を参照されたい）、ＰＢＭＣを、さまざまな濃度のダイアキン（０ｎｇ／ｍＬ～１０ｕｇ／ｍＬのＤＫ２１０ｅｇｆｒ）に曝露し、それに続いてサイトカイン誘導プロファイルを調査した。ナイーブＰＢＭＣサイトカイン応答プロファイルは、それぞれ、ＩＬ－１β、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α、ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＦＮα２ａ、およびＩＬ６について、図５Ａ～５Ｆに提供され、それぞれ、ＩＬ－４、ＩＬ－１７、ＩＬ－８、およびＧＭ－ＣＳＦについて、図６Ａ～６Ｄに提供される。これらのデータは、ＩＬ－１０（ＤＶ０７）およびＩＬ－２を一緒に組み合わせる、ＤＫ２１０として構成されたダイアキンは、ＩＬ－２単独と関連するサイトカインの誘導を劇的に抑制し、炎症性サイトカインの同様の急上昇を伴わずに、細胞傷害性機能を増強することができる分子に道を譲ることを実証する。
【0120】
次に、ダイアキン（ＤＫ２１０）プライミングに対するＣＤ８＋ Ｔ細胞応答を評価した。簡潔には、ＣＤ８＋ Ｔ細胞を、磁気選別し、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８で３日間活性化する。活性化後、ＣＤ８＋ Ｔ細胞を休ませ、ダイアキンの存在下で、２４、４８および７２時間、プライミングする。休ませ、プライミングの期間（すなわち、２４、４８または７２時間）後、グランザイムＢ、ＩＦＮ－γおよびＴＮＦ－αのレベルを、４、２０、４８および７２時間の抗ＣＤ３刺激期間の結果として評価する。１ｎｇ／ｍＬ程度のＤＫ２１０形態のダイアキンによるＣＤ８＋ Ｔ細胞のプライミングは、ＩＦＮ－γのレベルの同時的な上昇（図８）とともに、グランザイムＢのレベルの上昇（図７）を示したが、ＴＮＦ－αレベル（図９）は抑制される。総合すれば、これらのデータは、細胞傷害性Ｔ細胞が、ＤＫ２１０形態のダイアキンでプラミングされる場合に、炎症性サイトカインの誘導が、比較的抑制され、刺激された際に、ＣＤ８＋ Ｔ細胞が、標的に対して強力に活性化されることを実証する。
【0121】
上記に示された論理的根拠を利用して、市販のＢｉＴＥ、抗ＣＤ３×抗ＣＤ１９および抗ＣＤ３×抗ＣＤ２０を、それぞれ、ダイアキンＤＫ２１０ｅｇｆｒおよびＤＫ２１０ＣＤ１９との組合せで試験する。簡潔には、健康なドナーから新たに単離されたＣＤ８＋ Ｔ細胞を、構成的に発現するＧＦＰで安定にトランスフェクトされたＲａｊｉ細胞に対するそれらの細胞溶解能について評価した。Ｒａｊｉ細胞も、ＥＧＦＲ、ＣＤ１９およびＣＤ２０を細胞表面発現することが以前に決定されている（ＦＡＣＳによって実証される通り、データは示さない）。ＣＤ８＋ Ｔ細胞を、０～１００ｎｇ／ｍＬのダイアキン（ＤＫ２１０ｅｇｆｒおよびＤＫ２１０ＣＤ１９）の存在下、１～２日の期間プライミングする。Ｒａｊｉ細胞を細胞溶解するＢｉＴＥの有効性を、およそ４８時間の期間にわたるＧＦＰの消失により、ＩｎｃｕＣｙｔｅ Ｓ３システム（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）において測定およびモニターする。同時に、細胞傷害性機能に重要なサイトカイン、プロテアーゼおよびタンパク質である、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α、グランザイムＢおよびパーフォリン（performin）の分析物レベルを評価する。
【0122】
図１１Ｅ～１１Ｆは、４８時間の期間での、ＤＫ２１０ｅｇｆｒ形態のダイアキンと最低の機能的ＣＤ３×ＣＤ１９ ＢｉＴＥ濃度（０．０１ｎｇ／ｍＬ）の組合せの評価を提供する。図１２Ｅ～１２Ｆは、４８時間の期間での、ＤＫ２１０ＣＤ１９形態のダイアキンと最低の機能的ＣＤ３×ＣＤ２０ ＢｉＴＥ濃度（０．１ｎｇ／ｍＬ）の組合せの評価を提供する。これらのデータは、ダイアキンＤＫ２１０ｅｇｆｒまたはＤＫ２１０ＣＤ１９を、それぞれ、ＢｉＴＥ、ＣＤ３×ＣＤ１９またはＣＤ３×ＣＤ２０と組み合わせることで、安全性プロファイル（すなわち、炎症性サイトカイン誘導の低減）、または細胞溶解機能の増強を劇的に増強することを示唆する（図１１Ａ～Ｄおよび１２Ａ～１２Ｄを参照されたい）。
【0123】
ＢｉＴＥと組み合わせたＩＬ－７およびＩＬ－１０（ＤＫ７１０）またはＩＬ１２およびＩＬ－１０（ＤＫ１２１０）を含む追加のダイアキンも、上記に記載される同じアッセイを使用して評価した。図１３および１４を参照されたい。これらのデータは、ＢｉＴＥと組み合わせた異なる種類のダイアキンを組み合わせることが、細胞溶解機能の増強において有効であることを示唆する。
（実施例４）
ＢｉＴＥと組み合わせたダイアキンによる腫瘍の処置
（実施例４）
ＢｉＴＥと組み合わせたダイアキンによる腫瘍の処置
【0124】
がんを処置するこの方法では、対象は、有効量のＤＫ２１０形態のダイアキンを投与され、これは、ＢｉＴＥの投与の前に、１～３日、ＴＡＡを過剰発現する、血液腫瘍または腫瘍微小環境に対して、ＩＬ－１０およびＩＬ－２の両方を標的化することができる。その後、ＢｉＴＥ投与と関連する標準的なプロトコールを使用して、次いで、Ｄｉｋａｉｎｅを、ＢｉＴＥと一緒に、それを必要とする患者に同時に投与する。
【0125】
この明細書は、好ましい実施形態を含む本開示の態様を開示するために、また、任意のデバイスまたはシステムを作製および使用すること、ならびに任意の組み込まれる方法を行うことを含むその態様を任意の当業者が実行できるようにするために、例を使用する。これらの態様の特許可能な範囲は、特許請求の範囲によって定義され、当業者が想到する他の例を含み得る。そのような他の例は、それらが、特許請求の範囲の逐語的言語と相違しない構造要素を有する場合、またはそれらが、特許請求の範囲の逐語的言語とのわずかな相違を有する等価な構造要素を含む場合、特許請求の範囲内であることが意図される。記載されるさまざまな実施形態からの態様、およびそれぞれのそのような態様に対する他の公知の等価物は、当業者によって混合およびマッチされ得、本出願の原理に従って追加の実施形態および技法が構築され得る。
【化1-1】
【化1-2】
【化1-3】
【化1-4】
【化1-5】
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【配列表】
【国際調査報告】