特表 2024-547028 ＲＢＭ３発現を増加する方法及び作用薬

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-12-26

(54)【発明の名称】ＲＢＭ３発現を増加する方法及び作用薬

(51)【国際特許分類】

   C12N 5/0793 20100101AFI20241219BHJP

   C12N 5/0797 20100101ALI20241219BHJP

   C12Q 1/686 20180101ALI20241219BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20241219BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20241219BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20241219BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20241219BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20241219BHJP

   C12N 15/09 20060101ALI20241219BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20241219BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20241219BHJP

   A61K 31/7088 20060101ALI20241219BHJP

   A61K 31/712 20060101ALI20241219BHJP

   A61K 31/7125 20060101ALI20241219BHJP

   A61K 35/76 20150101ALI20241219BHJP

   A61P 25/00 20060101ALI20241219BHJP

   A61P 25/28 20060101ALI20241219BHJP

   A61P 25/16 20060101ALI20241219BHJP

   A61P 25/24 20060101ALI20241219BHJP

   A61P 25/22 20060101ALI20241219BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20241219BHJP

   C12N 15/113 20100101ALN20241219BHJP

【ＦＩ】

C12N5/0793 ZNA

C12N5/0797

C12Q1/686 Z

C12N15/63 Z

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

C12N15/09 110

A61K45/00

A61K48/00

A61K31/7088

A61K31/712

A61K31/7125

A61K35/76

A61P25/00

A61P25/28

A61P25/16

A61P25/24

A61P25/22

A61P43/00 105

C12N15/113 Z

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024536408

(86)(22)【出願日】2022-12-19

(85)【翻訳文提出日】2024-08-16

(86)【国際出願番号】 EP2022086740

(87)【国際公開番号】W WO2023117965

(87)【国際公開日】2023-06-29

(31)【優先権主張番号】2118495.7

(32)【優先日】2021-12-20

(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB

(31)【優先権主張番号】2215713.5

(32)【優先日】2022-10-24

(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】524229244

【氏名又は名称】フライエ ウニベルシテート ベルリン

(74)【代理人】

【識別番号】100079108

【弁理士】

【氏名又は名称】稲葉 良幸

(74)【代理人】

【識別番号】100109346

【弁理士】

【氏名又は名称】大貫 敏史

(74)【代理人】

【識別番号】100117189

【弁理士】

【氏名又は名称】江口 昭彦

(74)【代理人】

【識別番号】100134120

【弁理士】

【氏名又は名称】内藤 和彦

(72)【発明者】

【氏名】プロイスナー，マルコ

(72)【発明者】

【氏名】ハイト，フローリアン

【テーマコード（参考）】

4B063

4B065

4C084

4C086

4C087

【Ｆターム（参考）】

4B063QA01

4B063QA18

4B063QQ42

4B063QQ52

4B063QQ79

4B063QR08

4B063QR32

4B063QR35

4B063QR55

4B063QR62

4B063QR77

4B063QS25

4B063QS33

4B063QX01

4B065AA01X

4B065AA01Y

4B065AA57X

4B065AA57Y

4B065AA72X

4B065AA72Y

4B065AA83X

4B065AA83Y

4B065AA90X

4B065AA90Y

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065CA23

4B065CA44

4C084AA13

4C084MA52

4C084MA55

4C084MA56

4C084MA57

4C084MA58

4C084MA59

4C084MA60

4C084MA65

4C084MA66

4C084NA14

4C084ZA021

4C084ZA022

4C084ZA121

4C084ZA122

4C084ZA151

4C084ZA152

4C084ZA161

4C084ZA162

4C086AA01

4C086AA02

4C086EA16

4C086MA01

4C086MA04

4C086NA14

4C086ZA02

4C086ZA12

4C086ZA15

4C086ZA16

4C086ZC02

4C087AA01

4C087AA02

4C087BC83

4C087CA12

4C087NA14

4C087ZA02

4C087ZA12

4C087ZA15

4C087ZA16

(57)【要約】

【課題】
ＲＢＭ３のポイズンエクソン、エクソン３ａ、又はそのスプライス部位を標的化することによって、ＲＮＡ結合モチーフタンパク質３（ＲＢＭ３）の発現を増加することができる作用薬（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓベースの塩基編集システム）を提供する。
【解決手段】
細胞においてＲＢＭ３の発現を増加する方法、対象においてＲＭＢ３発現によって影響を受ける疾患を治療又は予防する方法、或いは対象に神経保護治療を提供する方法もまた開示される。
【選択図】図４Ｂ

【特許請求の範囲】

【請求項1】

細胞におけるＲＢＭ３コード化成熟ｍＲＮＡのナンセンス介在分解を阻害する方法であって、前記細胞を作用薬に曝露することを含み、前記作用薬は、得られる成熟ｍＲＮＡにエクソン３ａが取り込まれないようにｐｒｅ－ｍＲＮＡのスプライシングを変更するように、ＲＢＭ３のｐｒｅ－ｍＲＮＡの領域とハイブリダイズすることができる、方法。

【請求項2】

前記細胞が哺乳動物細胞であり、任意に前記細胞がマウス細胞又はヒト細胞である、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記細胞が、神経細胞、星状膠細胞、乏突起膠細胞、小膠細胞、上衣細胞又は脳幹細胞である、請求項１又は２に記載の方法。

【請求項4】

生体外（in vitro）又はエクスビボ（ex vivo）での方法である、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項5】

生体内（in vivo）での方法である、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項6】

対象においてＲＭＢ３発現によって影響を受ける疾患を予防又は治療する、或いは対象に神経保護を提供する方法であって、前記対象に作用薬を投与することを含み、前記作用薬が、得られる成熟ｍＲＮＡにエクソン３ａが取り込まれないようにｐｒｅ－ｍＲＮＡのスプライシングを変更するように、ＲＢＭ３のｐｒｅ－ｍＲＮＡの領域とハイブリダイズすることができる、方法。

【請求項7】

前記治療又は処置が：
神経疾患及び／又は新生児低酸素性虚血性脳症、頭部外傷、若しくは脳卒中である疾患；
アルツハイマー病、パーキンソン病、プリオン病、前頭側頭型認知症、タウオパシー、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、及び血管性認知症から任意に選択される神経変性疾患；
心臓外科手術若しくは誘導された昏睡中に任意に起こる神経学的損傷；又は
鬱病若しくは不安
に対するものである、請求項６に記載の方法。

【請求項8】

前記領域がエクソン３ａ内の領域、エクソン３ａのスプライス部位にわたる領域、エクソン３ａの上流の２５０ヌクレオチド内に位置する領域、及びエクソン３ａの下流の２５０ヌクレオチド内に位置する領域から選択される、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項9】

前記領域がスプライシングエンハンサーエレメントを含む、請求項８に記載の方法。

【請求項10】

前記領域が配列番号２７に相当する、請求項９に記載の方法。

【請求項11】

前記領域が配列番号２９に相当する、請求項１０に記載の方法。

【請求項12】

前記領域が配列番号１５に相当する、請求項９に記載の方法。

【請求項13】

前記領域が、配列番号１６、１７、１９、２１、２３、及び２５からなる群から選択される配列番号に相当する、請求項１２に記載の方法。

【請求項14】

前記領域がエクソン３ａの５’スプライス部位にわたる、請求項８に記載の方法。

【請求項15】

前記領域が、配列番号６の２５７～２６９、２５８～２６９、２５９～２６９、２６０～２６９、２６１～２６９、２６２～２６９、２６３～２６９、２６４～２６９、２６５～２６９、２６６～２６９、若しくは２６７～２６９位のヌクレオチド、及び／又は配列番号３３の１～２、１～３、１～４、１～５、１～６、１～７、１～８、１～９、１～１０、１～１１、若しくは１～１２位のヌクレオチドを含む、請求項１４に記載の方法。

【請求項16】

前記領域がエクソン３ａの３’スプライス部位にわたる、請求項８に記載の方法。

【請求項17】

前記領域が、配列番号６の１及び２、１～３、１～４、１～５、１～６、１～７、１～８、１～９、若しくは１～１０位のヌクレオチド、及び／又は配列番号３２の１３６～１４７、１３７～１４７、１３８～１４７、１３９～１４７、１４０～１４７、１４１～１４７、１４２～１４７、１４３～１４７、１４４～１４７、若しくは１４５～１４７位のヌクレオチドを含む、請求項１６に記載の方法。

【請求項18】

前記作用薬がアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）である、請求項１から１７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項19】

前記ＡＳＯが、請求項８に記載の領域のすべて若しくは一部に相補的又は本質的に相補的である、請求項１８に記載の方法。

【請求項20】

前記作用薬が、前記領域のすべて又は一部に１００％相補的であるＡＳＯである、請求項１９に記載の方法。

【請求項21】

前記ＡＳＯが、１０～３０ヌクレオチド長さ、任意に２５ヌクレオチドの長さ、任意に１５、１６、１７、１８若しくは１９ヌクレオチドの長さ、又は任意に１９ヌクレオチドの長さである、請求項１９又は２０に記載の方法。

【請求項22】

前記ＡＳＯが、配列番号４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、８３、８４、８５、８６及び８７のうちの１つを含む、又はからなる、請求項１９に記載の方法。

【請求項23】

前記ＡＳＯが、配列番号５１、５２、５３、５４、５５、５６及び５７のうちの１つを含む、又はからなる、請求項１９に記載の方法。

【請求項24】

前記ＡＳＯが、配列番号３４、３５、３６、３７、３８、３９、６９及び７０のうちの１つを含む、又はからなる、請求項１９に記載の方法。

【請求項25】

前記ＡＳＯがＬＮＡ、ＲＮＡ又はＤＮＡヌクレオチドを含む、請求項１９から２４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項26】

前記ＡＳＯが、交互のＬＮＡ及びＲＮＡヌクレオチドを含む、請求項２５に記載の方法。

【請求項27】

前記ＡＳＯが、交互のＬＮＡ及びＤＮＡヌクレオチドを含む、請求項２５に記載の方法。

【請求項28】

前記ＡＳＯが、交互のＲＮＡ及びＤＮＡヌクレオチドを含む、請求項２５に記載の方法。

【請求項29】

前記ＡＳＯが、任意にホスホロチオエート結合である主鎖修飾を含む、請求項１９から２８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項30】

前記ＡＳＯが、任意に２’－Ｏ－メトキシエチル（ＭＯＥ）修飾である糖部位修飾を含む、請求項１９から２９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項31】

前記ＡＳＯが、２’－Ｏ－メトキシエチル（ＭＯＥ）修飾及びホスホロチオエート結合を含む、請求項２９又は３０に記載の方法。

【請求項32】

前記ＡＳＯが、完全に２’－Ｏ－メトキシエチル修飾及び完全にホスホロチオエート修飾されている、請求項３１に記載の方法。

【請求項33】

前記ＡＳＯが、ホスホロジアミデートモルホリノオリゴヌクレオチドであるか、又はホスホロジアミデートモルホリノオリゴヌクレオチドを含む、請求項１９から２８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項34】

前記細胞若しくは対象に導入又は投与されるＡＳＯをコードする導入遺伝子から、前記ＡＳＯを発現することを含む、請求項１８から２４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項35】

前記ウイルスベクターが組換えＡＡＶベクターである、請求項３４に記載の方法。

【請求項36】

請求項１９から３３のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）。

【請求項37】

細胞においてＲＢＭ３コード化成熟ｍＲＮＡのナンセンス介在分解を阻害する方法であって、前記細胞を作用薬に曝露することを含み、前記作用薬が請求項３６に記載のＡＳＯである、方法。

【請求項38】

対象においてＲＭＢ３発現によって影響を受ける疾患を予防又は治療する、或いは対象に神経保護を提供する方法であって、前記対象に作用薬を投与することを含み、前記作用薬が請求項３６に記載のＡＳＯである、方法。

【請求項39】

前記治療又は処置が：
神経疾患及び／又は新生児低酸素性虚血性脳症、頭部外傷、若しくは脳卒中である疾患；
アルツハイマー病、パーキンソン病、プリオン病、前頭側頭型認知症、タウオパシー、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、及び血管性認知症から任意に選択される神経変性疾患；又は
心臓外科手術若しくは誘導された昏睡中に任意に起こる神経学的損傷；又は
鬱病若しくは不安
に対するものである、請求項３８に記載の方法。

【請求項40】

請求項１から３５又は３７から３９のいずれか一項に従って、ＲＢＭ３コード化成熟ｍＲＮＡのナンセンス介在分解（ＮＭＤ）を阻害する方法で使用される、或いはＲＭＢ３発現によって影響を受ける疾患を治療若しくは予防する、又は神経保護治療を提供する方法で使用される、作用薬。

【請求項41】

請求項１から３５又は３７から３９のいずれか一項に従って、ＲＢＭ３コード化成熟ｍＲＮＡのナンセンス介在分解（ＮＭＤ）を阻害する方法で使用される、或いはＲＭＢ３発現によって影響を受ける疾患を治療若しくは予防する、又は神経保護治療を提供する方法で使用される医薬品の製造における作用薬の使用。

【請求項42】

細胞においてＲＢＭ３の発現を増加することができるアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）を同定する方法であって：
ｉ）前記ＲＢＭ３遺伝子のｐｒｅ－ｍＲＮＡの領域を標的化するＡＳＯを同定する工程であって、前記領域が、エクソン３ａ内の領域、エクソン３ａのスプライス部位にわたる領域、エクソン３ａの上流の２５０ヌクレオチド内に位置する領域、及びエクソン３ａの下流の２５０ヌクレオチド内に位置する領域から選択される、工程；
ｉｉ）工程ｉ）で同定された前記ＡＳＯを前記細胞に送達する工程；及び
ｉｉｉ）工程ｉｉ）の前記細胞におけるＲＢＭ３の発現レベルを測定する工程
を含む、方法。

【請求項43】

ｉｖ）任意にＡＳＯ又はＤＭＳＯであるコントロールで処理された細胞におけるＲＢＭ３の発現レベルと、工程ｉｉｉ）で測定された発現レベルを比較する工程をさらに含む、請求項４２に記載の方法。

【請求項44】

発現の前記レベルが、ＲＴ－ｑＰＣＲ又はウェスタンブロット法によって測定される、請求項４２又は４３に記載の方法。

【請求項45】

請求項１９から２４のいずれか一項に記載のＡＳＯをコードする、任意にベクターである、任意にウイルスベクターである、発現コンストラクト。

【請求項46】

請求項４５に記載の発現コンストラクトを含む、宿主細胞。

【請求項47】

ＲＢＭ３の遺伝子からエクソン３ａを除去するガイドＲＮＡ対であって、第１ガイドＲＮＡがエクソン３ａの上流のゲノム配列とハイブリダイズすることができ、且つ第２ガイドＲＮＡがエクソン３ａの下流のゲノム配列とハイブリダイズすることができる、ガイドＲＮＡ対。

【請求項48】

前記第１ガイドＲＮＡが配列番号１１又は配列番号１２を含み、且つ前記第２ガイドＲＮＡが配列番号１３を含む、請求項４７に記載のガイドＲＮＡ対。

【請求項49】

対象のゲノムＤＮＡにおいてコードされるＲＮＡスプライス部位を変更するためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓベースの塩基編集システムであって、
前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓベースの塩基編集システムが融合タンパク質と、少なくとも１つのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）とを含み、
前記融合タンパク質がＣａｓタンパク質及び塩基編集ドメインを含み、
前記少なくとも１つのｇＲＮＡが、ＲＢＭ３の遺伝子における領域とハイブリダイズすることができ、及び
前記領域が：
（ｉ）配列番号３２の１４６～１４７位のヌクレオチドに位置するスプライス部位が変更されるように、配列番号３２の１３６～１４７、１３７～１４７、１３８～１４７、１３９～１４７、１４０～１４７、１４１～１４７、１４２～１４７、１４３～１４７、１４４～１４７、１４５～１４７、若しくは１４６～１４７位のヌクレオチド、又はその相補的配列；
（ｉｉ）配列番号６の１０６～１０７位のヌクレオチドに位置するスプライス部位が変更されるように、配列番号６又はその相補的配列；或いは
（ｉｉｉ）配列番号３３の最初の２つのヌクレオチドに位置するスプライス部位が変更されるように、配列番号３３の１～２、１～３、１～４、１～５、１～６、１～７、１～８、１～９、１～１０、１～１１、若しくは１～１２位のヌクレオチド、又はその相補的配列；
を含み、
任意に、前記標的領域とハイブリダイズする前記ｇＲＮＡ、又は前記ｇＲＮＡのターゲティングドメインが、１６、１７、１８、１９、２０、又は２１ヌクレオチドの長さである、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓベースの塩基編集システム。

【請求項50】

前記領域が、配列番号３２の最後の２つのヌクレオチドに位置するスプライス部位が変更されるように、配列番号３２の１３６～１４７、１３７～１４７、１３８～１４７、１３９～１４７、１４０～１４７、１４１～１４７、１４２～１４７、１４３～１４７、１４４～１４７、若しくは１４５～１４７位のヌクレオチド、又はその相補的配列を含み、前記領域がさらに、配列番号６の１及び２、１～３、１～４、１～５、１～６、１～７、１～８、１～９、１～１０、１～１１、１～１２、１～１３、１～１４、若しくは１～１５位のヌクレオチド、又はその相補的配列を含む、請求項４９に記載のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓベースの塩基編集システム。

【請求項51】

前記領域が、配列番号３３の最初の２つのヌクレオチドに位置するスプライス部位が変更されるように、配列番号３３の１～２、１～３、１～４、１～５、１～６、１～７、１～８、１～９、１～１０、１～１１、若しくは１～１２位のヌクレオチド、又はその相補的配列を含み、前記領域がさらに、配列番号６の２５４～２６９、２５５～２６９、２５６～２６９、２５７～２６９、２５８～２６９、２５９～２６９、２６０～２６９、２６１～２６９、２６２～２６９、２６３～２６９、２６４～２６９、２６５～２６９、２６６～２６９、又は２６７～２６９位のヌクレオチドを含む、請求項４９に記載のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓベースの塩基編集システム。

【請求項52】

前記領域が、配列番号６の１０６～１７位のヌクレオチドにわたり、且つ配列番号６の１０６～１０７位のヌクレオチドに位置するスプライス部位が変更されるように、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０の隣接ヌクレオチドを含む、請求項４９に記載のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓベースの塩基編集システム。

【請求項53】

前記標的領域が、配列番号９０、９１、及び９２から選択され、
任意に、前記少なくとも１つのｇＲＮＡが、配列番号９０、９１、及び９２のＲＮＡ均等物である配列若しくはその相補的配列を含む、又はからなる、請求項４９又は５０に記載のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓベースの塩基編集システム。

【請求項54】

前記ゲノムＤＮＡにおいてコードされるＲＮＡスプライス部位の変更によって、得られる成熟ｍＲＮＡにエクソン３ａが取り込まれない、請求項４９から５３のいずれか一項に記載のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓベースの塩基編集システム。

【請求項55】

前記Ｃａｓタンパク質がＣａｓ９を含み、任意に前記Ｃａｓタンパク質がＣａｓ９ニッカーゼを含む、請求項４９から５４のいずれか一項に記載のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓベースの塩基編集システム。

【請求項56】

前記塩基編集ドメインが、シチジンデアミナーゼドメイン又はアデノシンデアミナーゼドメインを含む、請求項４９から５５のいずれか一項に記載のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓベースの塩基編集システム。

【請求項57】

ＲＢＭ３の前記遺伝子における領域とハイブリダイズすることができるガイドＲＮＡをコードする単離核酸であって、配列番号９０、９１若しくは９２から選択される配列、又はその相補的配列を含む、単離核酸。

【請求項58】

請求項４９から５６のいずれか一項に記載のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓベースの塩基編集システムをコードする、単離ポリヌクレオチド。

【請求項59】

前記ポリヌクレオチドが、前記融合タンパク質をコードする第１ポリヌクレオチド及び前記少なくとも１つのｇＲＮＡをコードする第２ポリヌクレオチドを含む、請求項５８に記載の単離ポリヌクレオチド。

【請求項60】

請求項５８又は５９に記載の単離ポリヌクレオチドを含む、任意にベクターである、任意にウイルスベクターである、発現コンストラクト。

【請求項61】

請求項５８又は５９に記載の単離ポリヌクレオチド、或いは請求項６０に記載の発現コンストラクトを含む、細胞。

【請求項62】

請求項４９から５６のいずれか一項に記載のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓベースの塩基編集システム、請求項５７から５９に記載の単離ポリヌクレオチド、又は請求項６０に記載の発現コンストラクトを含む、組成物。

【請求項63】

対象においてＲＭＢ３発現によって影響を受ける疾患を予防又は治療する、或いは対象に神経保護を提供する方法であって、前記対象に、請求項４９から５６のいずれか一項に記載のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓベースの塩基編集システム、請求項５７から５９に記載の単離核酸、請求項６０に記載の発現コンストラクト、又は請求項６２に記載の組成物を投与することを含む、方法。

【請求項64】

前記治療又は処置が：
神経疾患及び／又は新生児低酸素性虚血性脳症、頭部外傷、若しくは脳卒中である疾患；
アルツハイマー病、パーキンソン病、プリオン病、前頭側頭型認知症、タウオパシー、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、及び血管性認知症から任意に選択される神経変性疾患；又は
心臓外科手術若しくは誘導された昏睡中に任意に起こる神経学的損傷；又は
鬱病若しくは不安
に対するものである、請求項６３に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本出願は、２０２１年１２月２０日出願の英国特許第２１１８４９５．７号及び２０２２年１０月２４日出願の英国特許第２２１５７１３．５号からの優先権を主張し、その内容及び要素がすべての目的のために参照により本明細書に組み込まれる。

【0002】

発明の分野
本発明は一般に、ＲＮＡ結合モチーフタンパク質３（ＲＢＭ３）の発現を増加する方法及び物質、並びにその目的のための、例えば疾患の療法及び予防に使用される作用薬（agent）に関する。

【背景技術】

【0003】

背景
冬眠及び低体温において、全体的なタンパク質合成及び細胞代謝はダウンレギュレートされるが、低温は、低温ショックタンパク質として知られるタンパク質の小さなサブセットの発現も誘発する（Peretti, D. et al. Nature 518, 236-239 (2015)）。これらの中で、ＲＮＡ結合モチーフタンパク質３（ＲＢＭ３）及び低温誘導性ＲＮＡ結合タンパク質（ＣＩＲＰ、ＣＩＲＢＰとしても知られる）は、脳において高レベルで発現される低温ショックタンパク質である^{１，２，３０，３１}。ＲＢＭ３及びＣＩＲＰＢ（及び他のＲＮＡ結合タンパク質，ＲＢＰ）は、ｍＲＮＡのスプライシング、安定性及び輸送を調節し、遺伝子発現（ＧＥ）の重要な調節因子である。

【0004】

ＲＢＭ３及びＣＩＲＰＢの進化的保存^３及び極端な温度感受性^４にもかかわらず、低温誘導された転写物発現の機構的根拠は、長い間謎のままだった。遺伝子発現の世界的解析から、温度依存性遺伝子発現のコントロールの世界的機構として、ナンセンス介在ｍＲＮＡ分解（ＮＭＤ）と連関する温度調節選択的スプライシング（ＡＳ）が示された^５。

【0005】

ｐｒｅ－ｍＲＮＡの選択的スプライシングから、異なるｍＲＮＡアイソフォームが導かれる。ＮＭＤ経路は、未成熟終止コドン（ＰＴＣ）をコードするｍＲＮＡアイソフォームを認識し、分解のためにこれらのｍＲＮＡを標的化し、したがって、遺伝子発現レベルのスプライシング制御（splicing-controlled）調節が可能となる^６。ＮＭＤ誘導アイソフォームはＲＮＡ結合タンパク質にしばしば見出され^５、ＣＩＲＢＰの熱誘導ＰＴＣ含有アイソフォームによって、低温誘導ＣＩＲＢＰ発現が説明される^７。世界的な解析において、種々のＲＮＡ結合タンパク質（ＲＢＰ）の温度制御ＮＭＤアイソフォームが、ＲＢＭ３の熱誘導ＮＭＤアイソフォームと共に同定された（Neumann A., “Leveraging RNA-sequencing data to obtain insights about mRNA splicing: from daily rhythms to secretory adaptations and cryptic splice sites” thesis, Appendix I publication 6, 2019）。Neumannら^５は、温度調節された（temperature-regulated）ＮＭＤエクソンを有する６０を超えるＲＢＰを報告している。Preussnerら（“Rhythmic gene expression is controlled by alternative splicing triggering nonsense mediated decay”, Abstract submitted at the 24^th Annual meeting of the RNA Society, 2019）は、ＮＭＤ誘導性スプライシングアイソフォームに干渉することによってＲＢＭ３及びＣＩＲＢＰの発現レベルを変化させる方法の確立を目標とすることを考察している。

【0006】

ＣＩＲＢＰは、概日リズム睡眠ホメオスタシスから炎症及び癌の範囲にわたる多様な機能を有し^８－１１、ＲＢＭ３は、低体温の神経保護作用と強く関連する^１２。ＲＢＭ３の神経保護機能は、低酸素性虚血性脳障害^１３、神経毒への曝露^１４及び神経変性疾患（例えば、プリオン感染及びアルツハイマー型マウス）^１５を含む、独立したシステムにおいて確認されている。さらに具体的には、低体温を誘導することによって、又はレンチウイルス送達によって達成されるＲＢＭ３過剰発現の結果、アルツハイマー病のマウスモデルにおいて、及びマウスにおけるプリオン病の経過全体にわたってシナプス保護が得られると同時に、行動上の欠陥及び神経細胞の脱落を予防し、並びに著しく生存時間が引き延ばされる^１５。

【0007】

治療的低体温は、新生児低酸素性虚血性脳症から頭部外傷、脳卒中において、及び成人における心臓外科手術中など、神経保護のための診療において広範に使用される。

【0008】

ヒトにおける低体温誘導神経保護のメカニズムは完全には理解されていない。さらに、ヒトにおける誘導冷却はリスクがないわけではなく、凝血、肺炎等の罹患率が高く、集中治療セットアップを必要とする。

【0009】

本発明は、上記の考察を踏まえて考案された。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0010】

発明の概要
本発明は、低体温の誘導を必要とすることなく、ＲＢＭ３のレベルを増加することに関する。本発明者らは、以前に実験的に特徴付けられていない、温かい温度でＲＢＭ３ ｍＲＮＡのアイソフォームに含まれるエクソンを同定し、このエクソンが、ＲＢＭ３のナンセンス介在分解を担っており、したがって温かい温度でＲＢＭ３発現の減少が引き起こされることを確認した。

【0011】

このエクソン又はそのスプライス部位を標的化する作用薬は、冷却する必要なくＲＢＭ３の発現を増加する。様々なかかる作用薬が本明細書において記述される。

【0012】

Perettiら^１５は、アルツハイマー病及びプリオン病のマウスモデルにおいてＲＢＭ３の発現を誘導するためのレンチウイルスベクターの使用を記述しているが、この記事は、ＲＢＭ３の低温誘導を担うメカニズムと関係しておらず、ＲＢＭ３の選択的スプライシングアイソフォームは同定されていない。

【0013】

Neumann（“Leveraging RNA-sequencing data to obtain insights about mRNA splicing: from daily rhythms to secretory adaptations and cryptic splice sites”, Appendix I publication 6, 2019）は、異なる温度でＮＭＤアイソフォームを特徴付け、ＲＢＭ３などの種々の未注釈のＲＮＡ結合タンパク質のＮＭＤバリアントを同定している。ＲＢＭ３のＮＭＤバリアントは、エクソン３と４の間にそれがあることを示す模式図でのみ説明されるＮＭＤエクソンを含む（図Ｓ２Ａ）。温かい温度に対する低温でのその包含頻度（スプライスされたパーセント，ＰＳＩ）がごく低かったため（ｄＰＳＩ＜１５％，図Ｓ２の説明文参照）、ＮＭＤエクソンの包含は、有意なスプライシング事象として同定されなかった。さらに、ＲＢＭ３ ＮＭＤエクソンの包含レベルは、３８℃でわずか約３％ＰＳＩであり（図Ｓ２Ｂ）、それは世界的解析で報告された最も低いレベルであり、他のＲＢＰ熱誘導ＮＭＤエクソンは３８℃で２０％を超える、又は６０％さえも超えるＰＳＩを有した（図２ＤにおけるｈｎＲＮＰ ＤＬ及びＣＩＲＢＰ）。Neumannは、ＲＢＭ３の相対的発現に対するこのエクソンの包含を防ぐ効果を開示しておらず、このエクソンの具体的な配列又は位置を開示していない。

【0014】

Neumannら^５は、ＲＢＭ３のエクソン３とエクソン４の間のエクソンを同定していない。Neumannら^５において同定される、ＲＢＭ３に関する選択的スプライシング事象は、選択的末端エクソンであるが、これらは、温度依存性であると同定されなかった（「方向付けなし（undirected）」とマークされた、表ＥＶ１のシート３参照）。

【0015】

Llorianら^３２は、分化中の大動脈平滑筋における他の遺伝子の中でＲＢＭ３の選択的スプライシングを研究している。それは、フランキングポイズンエクソンとしてＲＢＭ３のイントロン３及び４を記述し、分化細胞におけるイントロンの保持の増加を示す。著者らは、ＲＢＭ３ ｍＲＮＡのレベルに対する選択的スプライシングの効果を調べておらず、選択的スプライシングに対する温度の役割を調べておらず、エクソンの包含を確認又は調査していない。

【0016】

本発明の発明者らは、エクソン３及び４の間のＮＭＤ誘導エクソンが意外なことに、高温でのその低い包含レベルにもかかわらず、ＲＢＭ３の温度制御発現を支配することを同定した。ＲＢＭ３発現の劇的な増加（３～４倍）が、アンチセンスオリゴヌクレオチドなどのＲＢＭ３ ｐｒｅ－ｍＲＮＡの選択的スプライシングに影響を及ぼすことができる作用薬によって達成されて、本明細書に記載され、且つ実施例で実証されるこのエクソンの包含が防止される。

【0017】

一態様において、本発明は、細胞においてＲＢＭ３コード化成熟ｍＲＮＡのナンセンス介在分解を阻害する方法であって、細胞を作用薬に曝露することを含み、その作用薬が、ｐｒｅ－ｍＲＮＡのスプライシングを変更するようにＲＢＭ３のｐｒｅ－ｍＲＮＡの領域とハイブリダイズすることができ、その結果得られた成熟ｍＲＮＡにおいて、エクソン３ａが取り込まれない、方法を提供する。その方法は、生体外（in vitro）又はエクスビボ（ex vivo）での方法であり得る。一部の実施形態において、その方法は生体内（in vivo）での方法である。細胞は哺乳動物細胞、例えば、霊長類細胞であり得て、任意に細胞は、マウス細胞又はヒト細胞であり得る。細胞は好ましくは、神経細胞、星状膠細胞、乏突起膠細胞、小膠細胞、上衣細胞又は脳幹細胞である。

【0018】

本明細書で使用される「曝露（する）」という用語は、作用薬が細胞に入るような様式で、若しくはかかる条件下にて、作用薬（例えば、ＡＳＯ）に細胞を曝露すること、又は細胞に作用薬を送達することを意味する。例えばJuliano et al.,Bioconjug Chem. 2012 Feb. 15; 23(2):147-57（本明細書にその全体が組み込まれる）を参照のこと。作用薬（例えば、ＡＳＯ）は、細胞の内部に送達され、細胞核に入る。作用薬は細胞に対して外来性である。一実施形態において、細胞に入るベクター（例えば、ウイルスゲノム、プラスミド、人工染色体）と細胞を接触させる。その細胞において、ベクターは、例えば細胞ゲノムから、又は外来性核酸から、細胞におけるＡＳＯの発現を引き起こす。ＡＳＯは、生体内又は生体外で細胞に導入することができる。

【0019】

「ハイブリダイズすることができる」－ハイブリダイゼーションアッセイは当技術分野で公知であり、一般に、相補的核酸プローブ（例えば、標識プローブを用いた、in situハイブリダイゼーション、ノーザンブロット法及び関連技術）の使用を伴う。一部の実施形態において、ハイブリダイゼーションアッセイは蛍光標識プローブなどの標識プローブを用いたin situハイブリダイゼーションアッセイである。

【0020】

１７～３０塩基のオリゴヌクレオチドに適切な選択的ハイブリダイゼーション条件は、６×ＳＳＣ中で４２℃にて一晩ハイブリダイゼーションすることと、４２℃から６５℃への一連の上昇温度にて６×ＳＳＣ中で洗浄することと、を含む。指定の配列相同性の核酸分子間のハイブリダイゼーションを達成するのに必要なストリンジェントな条件を計算する一般式は（Sambrook et al., 1989）：Ｔｍ＝８１．５℃＋１６．６Ｌｏｇ［Ｎａ^＋］＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）－０．６３（ホルムアミド％）－二重鎖中の６００／♯塩基対（ｂｐ）。

【0021】

別の態様において、本発明は、対象におけるＲＭＢ３発現によって影響を受ける疾患の治療又は予防方法であって、対象に作用薬を投与することを含み、その作用薬が、ｐｒｅ－ｍＲＮＡのスプライシングを変更するようにＲＢＭ３のｐｒｅ－ｍＲＮＡの領域とハイブリダイズすることができ、その結果得られた成熟ｍＲＮＡにおいて、エクソン３ａが取り込まれない、方法を提供する。一態様において、対象において神経保護を増加する方法であって、対象に作用薬を投与することを含み、その作用薬が、ｐｒｅ－ｍＲＮＡのスプライシングを変更するようにＲＢＭ３のｐｒｅ－ｍＲＮＡの領域とハイブリダイズすることができ、その結果得られた成熟ｍＲＮＡにおいて、エクソン３ａが取り込まれない、方法を提供する。

【0022】

本発明の作用薬は、エクソン３ａのすべて、又は一部の取り込みを防ぐことが可能であり得る。

【0023】

本明細書で使用される、「発現」は、遺伝子発現又はタンパク質発現であり得て、したがってＲＢＭ３の転写物のレベル又はＲＢＭ３のタンパク質レベルを定量化することによって測定され得る。ＲＢＭ３の発現を測定する例示的な方法は、以下の「方法」セクションに述べられる。

【0024】

本発明の方法及び作用薬を用いて、神経疾患などの疾患が治療若しくは予防され得て、及び／又はその疾患は、新生児低酸素性虚血性脳症、頭部外傷、若しくは脳卒中；不安若しくは鬱病；アルツハイマー病、パーキンソン病、プリオン病、前頭側頭型認知症、タウオパシー、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、及び血管性認知症から任意に選択される神経変性疾患；又は任意に心臓外科手術中に起こる神経学的損傷、若しくは誘導された昏睡（誘導された昏睡）である。

【0025】

一部の実施形態において、ＲＢＭ３のｐｒｅ－ｍＲＮＡの領域は：エクソン３ａ内の領域、エクソン３ａのスプライス部位にわたる領域、エクソン３ａの上流の２５０ヌクレオチド内に位置する領域、及びエクソン３ａの下流の２５０ヌクレオチド内に位置する領域から選択される。一部の実施形態において、領域は、エクソン３ａの上流の２００ヌクレオチド内、又はエクソン３ａの下流の２００ヌクレオチド内位置する。その領域は、エクソン３ａの上流の１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０又は１００ヌクレオチド内であり得る。その領域は、エクソン３ａの下流の１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０又は１００ヌクレオチド内であり得る。その領域は、エクソン３ａの上流の１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０又は２００ヌクレオチド内であり得る。その領域は、エクソン３ａの下流の１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０又は２００ヌクレオチド内であり得る。その領域は、エクソン３ａの上流の２１０、２２０、２３０、２４０又は２５０ヌクレオチド内であり得る。その領域は、エクソン３ａの下流の２１０、２２０、２３０、２４０又は２５０ヌクレオチド内であり得る。その領域は、エクソン３ａの上流又は下流であり得て、ＲＢＭ３遺伝子の注釈付きイントロン３に相当する。

【0026】

一部の実施形態において、その領域は、スプライスエンハンサー要素を含む。例えば、一部の実施形態において、領域は、配列番号２７、好ましくは配列番号２９に相当する。他の実施形態において、領域は、配列番号１５、１６、１７、１９、２１、２３、又は２５に相当する。

【0027】

一部の実施形態において、領域は、エクソン３ａの５’スプライス部位にわたる。特定の実施形態において、領域は、配列番号６の２５７～２６９、２５８～２６９、２５９～２６９、２６０～２６９、２６１～２６９、２６２～２６９、２６３～２６９、２６４～２６９、２６５～２６９、２６６～２６９、若しくは２６７～２６９位のヌクレオチド、及び／又は配列番号３３の１～２、１～３、１～４、１～５、１～６、１～７、１～８、１～９、１～１０、１～１１、若しくは１～１２位のヌクレオチドを含む。一部の実施形態において、領域は、配列番号５の２５９～２７１、２６０～２７１、２６１～２７１、２６２～２７１、２６３～２７１、２６４～２７１、２６５～２７１、２６６～２７１、２６７～２７１、２６８～２７１、又は２６９～２７１位のヌクレオチドを含む。

【0028】

一部の実施形態において、領域は、エクソン３ａの３’スプライス部位にわたる。一部の実施形態において、領域は、配列番号６の１及び２位、１～３、１～４、１～５、１～６、１～７、１～８、１～９若しくは１～１０位のヌクレオチド及び／又は配列番号３２の１３６～１４７、１３７～１４７、１３８～１４７、１３９～１４７、１４０～１４７、１４１～１４７、１４２～１４７、１４３～１４７、１４４～１４７、若しくは１４５～１４７位のヌクレオチドを含む。特定の実施形態において、領域は、配列番号５の１及び２位、１～３、１～４、１～５、１～６、１～７、１～８、１～９、又は１～１０位のヌクレオチドを含む。

【0029】

特定の実施形態において、作用薬はアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）である。この場合には、細胞においてＲＢＭ３コード化成熟ｍＲＮＡのナンセンス介在分解を阻害する方法、神経保護を増加する方法及び／又は本発明に従って疾患を治療若しくは予防する方法はさらに、前記細胞又は対象に導入又は投与されるＡＳＯをコードする導入遺伝子からＡＳＯを発現させることをさらに含み得る。好ましくは、ウイルスベクターは組換えＡＡＶベクターである。

【0030】

別の態様において、本発明は、本明細書に記載のＡＳＯを提供する。本発明によるＡＳＯをコードする発現コンストラクトも提供される。好ましくは、発現コンストラクトはベクター又はウイルスベクターである。発現コンストラクトを含む宿主細胞も提供される。

【0031】

「アンチセンスオリゴヌクレオチド」－本明細書で使用される「アンチセンスオリゴヌクレオチド」、「ＡＳＯ」及び「アンチセンスオリゴマー」という用語は、区別なく使用され、且つワトソン－クリック型塩基対又はゆらぎ塩基対（Ｇ－Ｕ）によって、標的核酸（例えば、ｐｒｅ－ｍＲＮＡ）配列とハイブリダイズする、ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを意味する。

【0032】

好ましくは、ＡＳＯは、本明細書に記載のＲＢＭ３のｐｒｅ－ｍＲＮＡの領域のすべて若しくは一部に相補的又は本質的に相補的である。

【0033】

ＡＳＯは、ｐｒｅ－ｍＲＮＡとハイブリダイズするのに適切な、且つスプライシングの変更に有効な、いずれかの長さであり得る。一部の実施形態において、ＡＳＯは１０～３０ヌクレオチドの長さである。好ましくは、ＡＳＯは２５ヌクレオチドの長さであるか、又はＡＳＯは、１５、１６、１７、１８若しくは１９ヌクレオチドの長さである。特定の実施形態において、ＡＳＯは１９ヌクレオチドの長さである。特定の実施形態において、ＡＳＯは８～３００、好ましくは１８～３０ヌクレオチドの長さであり、より好ましくは、ＡＳＯは、２０、２１、２２、２３、２４又は２５ヌクレオチドの長さである。具体的な実施形態において、ＡＳＯは、３０～４０、４１～５０、又は５１～３００ヌクレオチドの長さである。

【0034】

ＤＮＡ配列が、例えば図面又は配列番号を参照して本明細書で指定されている場合、文脈で特に必要とされていない限り、それが存在する場合にＴがＵで置換されている、「ＲＮＡ同等物」は、必要な変更を加えて開示されることは理解されよう。

【0035】

本発明の目的での、「～に相補的」、「配列番号Ｘに表されるヌクレオチド配列の相補的配列」は、シャルガフの法則（Ａ⇔Ｔ又はＵ；Ｇ⇔Ｃ）に従って、その相補的ヌクレオチドによってヌクレオチドを置き換え、５’から３’方向に、つまり表されるヌクレオチド配列の反対方向に配列を読み取ることによって、表されるヌクレオチド配列から誘導することができるヌクレオチド配列である。

【0036】

ポリヌクレオチド（例えば、オリゴヌクレオチド、ＡＳＯ、ｍＲＮＡ、ｇＲＮＡ等）は互いに「相補的」であり、２つの一本鎖ポリヌクレオチド間で逆平行配置でハイブリダイゼーションが起こる。

【0037】

「～に本質的に相補的」－ＡＳＯは、標的配列に対する正確な配列相補性又は近い相補性（例えば、本質的に相補的であり、標的配列に結合し、且つＲＢＭ３ ｐｒｅ－ｍＲＮＡのスプライシングを変更するのに十分な相補性を有する）を有し得る。

【0038】

ＡＳＯが、スプライセオソームの複合体又はスプライセオソームの成分又はトランス調のｐｒｅ－ｍＲＮＡへの結合をブロック又は阻害し得るいずれかの場合に；ＡＳＯは、それらが標的核酸（例えば、ｐｒｅ－ｍＲＮＡ転写物）に結合（ハイブリダイズ）し、生理学的条件下にてハイブリダイズしたままの状態であるようにデザインされる。

【0039】

通常、ＡＳＯは、目的の（標的）核酸配列以外の部位とハイブリダイズする場合には、それらは、標的核酸ではない限られた数の配列に（標的核酸以外のわずかな部位に）ハイブリダイズする。ＡＳＯが他の部位に結合し、「オフターゲット」効果を引き起こす尤度（likelihood）が限られるように、ＡＳＯのデザインでは、標的核酸配列、又はゲノム若しくは細胞ＲＮＡ／トランスクリプトームにおける他の位置での十分に類似の核酸配列の出現が考慮に入れられる。

【0040】

作用薬（例えば、ＡＳＯ）は、標的配列におけるすべての核酸塩基とハイブリダイズする必要はなく、それがハイブリダイズする核酸塩基は、隣接又は非隣接塩基であり得る。介在又は隣接セグメントがハイブリダイゼーション事象（例えば、ループ構造又はヘアピン構造が形成し得る）に関与しないように、ＡＳＯは、標的核酸の１つ又は複数のセグメントにわたってハイブリダイズし得る。特定の実施形態において、ＡＳＯは、標的核酸における非隣接核酸塩基とハイブリダイズする。例えば、ＡＳＯがハイブリダイズしない１つ又は複数の核酸塩基によって分離される、標的核酸における核酸塩基と、ＡＳＯがハイブリダイズすることができる。

【0041】

このように、作用薬（例えば、ＡＳＯ）は、エクソン３と４の間の領域内の配列の少なくとも８、少なくとも９、又は少なくとも１０の隣接ヌクレオチド（ｎｔ）と相補的である相補性の配列を含み得る。一部の実施形態において、相補性の配列は、エクソン３ａ内の配列の少なくとも８、少なくとも９又は少なくとも１０の隣接ヌクレオチドと相補的である。一部の実施形態において、相補性の配列は、エクソン３ａのスプライス部位にわたる少なくとも８、少なくとも９又は少なくとも１０の隣接ヌクレオチドと相補的である。一部の実施形態において、相補性の配列は、スプライスエンハンサーエレメントの少なくとも８、少なくとも９又は少なくとも１０の隣接ヌクレオチドと相補的である。

【0042】

「相補性」（１つのポリヌクレオチドがもう１つのポリヌクレオチドと相補的である程度）は、一般に認められる塩基対規則に従って、互いに水素結合を形成すると予想される反対の鎖における塩基の割合（例えば、パーセンテージ）の点から数量化することができる。オリゴマー化合物、例えば、ＡＳＯ又はｇＲＮＡの配列は、ハイブリダイズする、その標的核酸の配列と１００％相補的である必要はない。特定の実施形態において、「本質的に相補的」なＡＳＯは、それらが標的化される標的核酸配列内の標的領域に対して少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、又は少なくとも約９９％の配列相補性を含み得る。

【0043】

例えば、オリゴマー化合物の２０核酸塩基のうち１８塩基が標的領域に対して相補的であり、したがって、特異的とハイブリダイズするであろう、ＡＳＯは、９０パーセントの相補性に相当する。この例において、残存する非相補的核酸塩基は、相補的核酸塩基と共にまとまりとなるか、又は相補的核酸塩基と散在し得て、互いに隣接する、又は相補的核酸塩基と隣接する必要はない。標的核酸と完全な相補性の２つの領域によってフランキングされる４つの非相補的核酸塩基を有する、１８核酸塩基の長さであるＡＳＯは、標的核酸との全体的な相補性７７．８％を有し、したがってこの範囲内にあるだろう。

【0044】

標的領域のセンス鎖とハイブリダイズすることができるＡＳＯを考慮する場合、センス又はアンチセンス領域の長さ全体が長いほど、これらの領域と、相当する標的領域（そのの相補的配列）との相補性又は配列同一性の必要条件の厳密性が低くなることは認識されよう。

【0045】

しかしながら、対象の核酸は、標的核酸の相当する部分と１００％の配列同一性を有する共に、約１９個の連続したヌクレオチド、特に約２５ヌクレオチドの配列を含むことが好ましい。

【0046】

「に相当する」－１つの配列における、ある位置でのヌクレオチド若しくはヌクレオチド配列又は領域が、それらが最適にアラインされた場合に、類似の特定のヌクレオチド配列におけるヌクレオチド若しくはヌクレオチド配列又は領域の位置に相当する。通常、相当する領域は、高度の配列同一性を共有する。

【0047】

「最適アライメント」－２つの配列の最適アライメントは、The European Molecular Biology Open Software Suite (EMBOSS, Rice et al., 2000, Trends in Genetics 16(6): 276-277;例えば、https://www.ebi.ac.uk/Tools/emboss/のWorld Wide Webを参照）におけるNeedleman-Wunsch大域的アライメントアルゴリズム（Needleman and Wunsch, 1970, J Mol Biol 48(3):443-53）に従って、デフォルト設定（ギャップ開始ペナルティ＝１０（ヌクレオチドに対して）／１０（タンパク質に対して）及びギャップ伸長ペナルティ＝０．５（ヌクレオチドに対して）／０．５（タンパク質に対して））を用いて、長さ全体にわたって２つの配列をアラインすることによって見出される。ヌクレオチドに関して、使用されるデフォルトのスコアマトリックスはＥＤＮＡＦＵＬＬであり、タンパク質に関しては、デフォルトのスコアマトリックスはＥＢＬＯＳＵＭ６２である。

【0048】

「配列同一性」－本発明の目的のために、パーセンテージで表される２つの関連するヌクレオチド又はアミノ酸配列の配列同一性は、比較される位置の数によって割られた同一残基（×１００）を有する、最適にアラインされた２つの配列における位置の数を意味する。ギャップ、つまり残基が１つの配列に存在するが、もう一方の配列には存在しない場合に、アライメントにおける位置は、非同一残基を有する位置とみなされる。

【0049】

一部の実施形態において、ＡＳＯは、１、２、若しくは３個の置換を任意に有する、配列番号４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９及び５０のうちの１つを含む、又はからなる。一部の実施形態において、ＡＳＯは、１、２、若しくは３個の置換を任意に有する、配列番号５１、５２、５３、５４、５５、５６及び５７のうちの１つを含む、又はからなる。特定の実施形態において、ＡＳＯは、１、２、若しくは３個の置換を任意に有する、配列番号３４、３５、３６、３７、３８、３９、６９及び７０のうちの１つを含む、又はからなる。

【0050】

一部の実施形態において、ＡＳＯは、１、２、若しくは３個の置換を任意に有する、配列番号４０、４１、４２、４３、４４、４６、４７、４８、４９、５０、８３、８４、８５、８６及び８７のうちの１つを含む、又はからなる。

【0051】

一部の実施形態において、ＡＳＯは、１、２、若しくは３個の置換を任意に有する、配列番号８３、８４、８５及び８７のうちの１つを含む、又はからなる。

【0052】

特定の実施形態において、ＡＳＯは、１、２、若しくは３個の置換を任意に有する、配列番号４４、４６、４７、４８、８３、８４、８５、８６及び８７のうちの１つを含む、又はからなる。

【0053】

本明細書に記載のＡＳＯは、ＬＮＡ、ＲＮＡ又はＤＮＡヌクレオチドを含み得る。一部の実施形態において、ＡＳＯは、交互の（alternating）ＬＮＡ及びＲＮＡヌクレオチドを含む。他の実施形態において、ＡＳＯは、交互のＬＮＡ及びＤＮＡヌクレオチドを含む。具体的な実施形態において、ＡＳＯは、交互のＲＮＡ及びＤＮＡヌクレオチドを含む。

【0054】

一部の実施形態において、ＡＳＯは、任意にホスホロチオエート結合である主鎖の修飾を含む。一部の実施形態において、ＡＳＯは、任意に２’－Ｏ－メトキシエチル（ＭＯＥ）修飾である、糖部位の修飾を含む。好ましくは、ＡＳＯは、２’－Ｏ－メトキシエチル（ＭＯＥ）修飾及びホスホロチオエート結合を含む。具体的な実施形態において、ＡＳＯは完全に２’－Ｏ－メトキシエチル修飾及び完全にホスホロチオエート修飾される。一部の実施形態において、ＡＳＯは２’－Ｏ－メチル修飾を含む。一部の実施形態において、ＡＳＯは完全に２’－Ｏ－メチル及び完全にホスホロチオエート修飾される。

【0055】

特定の実施形態において、ＡＳＯは、ホスホロジアミデートモルホリノオリゴヌクレオチドであるか、又はホスホロジアミデートモルホリノオリゴヌクレオチドを含む。

【0056】

別の態様において、本発明は、細胞においてＲＢＭ３コード化成熟ｍＲＮＡのナンセンス介在分解を阻害する方法であって、細胞を作用薬に曝露することを含み、その作用薬が本明細書に記載のＡＳＯである、方法を提供する。

【0057】

別の態様において、対象におけるＲＭＢ３発現によって影響を受ける疾患の治療又は予防方法であって、対象に作用薬を投与することを含み、その作用薬が本明細書に記載のＡＳＯである、方法が提供される。対象において神経保護を増加する方法であって、対象に作用薬を投与することを含み、その作用薬が本明細書に記載のＡＳＯである方法も提供される。

【0058】

本発明はさらに、ＲＢＭ３コード化成熟ｍＲＮＡのナンセンス介在分解（ＮＭＤ）を阻害する方法で使用される、ＲＭＢ３発現によって影響を受ける疾患の治療若しくは予防方法で使用される、又は本明細書に記載のように対象において神経保護を増加する方法で使用される、作用薬を提供する。一部の実施形態において、作用薬はＡＳＯである。

【0059】

別の態様において、ＲＢＭ３コード化成熟ｍＲＮＡのンセンス介在分解（ＮＭＤ）を阻害する方法で使用される医薬品の製造における作用薬の使用、ＲＭＢ３発現によって影響を受ける疾患の治療若しくは予防方法で使用される医薬品の製造における作用薬の使用、又は本明細書に記載のように対象において神経保護を増加するための医薬品の製造における作用薬の使用が提供される。

【0060】

更なる態様において、細胞においてＲＢＭ３の発現を増加することができるアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）を同定する方法であって、ｉ）ＲＢＭ３遺伝子のｐｒｅ－ｍＲＮＡの領域を標的化するＡＳＯを同定する工程であって、その領域が、エクソン３ａ内の領域、エクソン３ａのスプライス部位にわたる領域、エクソン３ａの上流の２５０ヌクレオチド内に位置する領域、及びエクソン３ａの下流の２５０ヌクレオチド内に位置する領域から選択される工程；ｉｉ）工程ｉ）で同定されたＡＳＯを細胞に送達する工程；及びｉｉｉ）工程ｉｉ）の細胞においてＲＢＭ３の発現レベルを測定する工程；を含む方法が提供される。特定の実施形態において、その方法はさらに：ｉｖ）任意にＡＳＯ又はＤＭＳＯであるコントロールで処理された細胞におけるＲＢＭ３の発現のレベルと、工程ｉｉｉ）で測定された発現のレベルを比較する工程を含む。好ましくは、発現のレベルは、ＲＴ－ｑＰＣＲ又はウェスタンブロット法によって測定される。

【0061】

別の態様において、本発明は、そこからエクソン３ａを除去するように、ＲＢＭ３の遺伝子における領域とハイブリダイズすることができる少なくとも１つのｇＲＮＡなど、本明細書に記載のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓベースのシステムを提供する。

【0062】

別の態様において、本発明は、本明細書に記載のスプライス部位の１つ又は複数を編集するように、ＲＢＭ３の遺伝子における領域とハイブリダイズすることができる少なくとも１つのｇＲＮＡなど、本明細書に記載のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓベースの塩基編集システムを提供する。

【0063】

別の態様において、ＲＢＭ３の遺伝子からエクソン３ａを除去するためのガイドＲＮＡ対が提供され、第１ガイドＲＮＡは、エクソン３ａの上流のゲノム配列とハイブリダイズすることができ、且つ第２ガイドＲＮＡは、エクソン３ａの下流のゲノム配列とハイブリダイズすることができる。一部の実施形態において、第１ガイドＲＮＡは、配列番号１１又は配列番号１２を含み、第２ガイドＲＮＡは配列番号１３を含む。

【0064】

一部の実施形態において、ｇＲＮＡは、上記で定義される領域のすべて若しくは一部と相補的又は本質的に相補的である。特定の実施形態において、ｇＲＮＡは、前記領域に対して８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％相補的である。特定の実施形態において、ｇＲＮＡは前記領域に１００％相補的である。

【0065】

ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａシステムをコードする、発現コンストラクト又はコンストラクトの組合せも提供される。好ましくは、発現コンストラクトはベクター又はウイルスベクターである。

【0066】

別の態様において、本発明は、対象におけるＲＭＢ３発現によって影響を受ける疾患を治療若しくは予防する、又は対象に神経保護治療を提供する方法であって、本明細書に記載のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓベースの塩基編集システム、又はそのシステムをコードする発現コンストラクトを対象に投与することを含む方法を提供する。

【0067】

本発明は、かかる組合せが明らかに容認できない、又は特別に避けられる場合を除いては、記載の態様及び好ましい特徴の組合せを含む。

【0068】

発明の詳細な説明
ＲＢＭ３
ＩＳ１－ＲＮＰＬ及びＲＮＰＬとしても知られるＲＮＡ結合モチーフタンパク質３（ＲＢＭ３）は、低下した温度に応じてアップレギュレートされる低温ショックタンパク質である^１。ＲＢＭ３は、進化上、高度に保存されたＲＮＡ結合タンパク質である。

【0069】

ヒトＲＢＭ３遺伝子（ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：５９３５）は、染色体Ｘ４８５７４４８４－４８５８１１６２、ＧＲＣｈ３８．ｐ１３プライマリーアセンブリに位置し、１５７アミノ酸長さのＲＢＭ３タンパク質をコードする（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿００６７３４．１）。マウスＲＢＭ３遺伝子はＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：１９６５２を有する。

【0070】

ＲＢＭ３は、骨髄及び脳組織などの組織において発現する（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene?Db=gene&Cmd=ShowDetailView&TermToSearch=5935#gene-expression）。異なるアイソフォームをコードすると予測される、複数の選択的にスプライスされた転写物バリアントが特徴付けられている。

【0071】

本明細書において、「ＲＢＭ３」とは、いずれかの種からのＲＢＭ３を意味し、且ついずれかの種からのＲＢＭ３のアイソフォーム、断片、バリアント又は相同体を包含する。特定の実施形態において、その種はヒト（Homo sapiens）である。一部の実施形態において、種はマウス（ハツカネズミ（Mus musculus））である。

【0072】

ＲＢＭ３の「バリアント又は相同体」又はそのコード核酸とは、ヒト配列に機能的に対応し、且つその２つが最適にアラインすることができるような、高度の配列類似性又は同一性、及び本明細書に記載の同定された相当する領域を共有する、関連する種における天然ＲＢＭ３を意味する。

【0073】

ｐｒｅ－ｍＲＮＡの選択的スプライシング
大部分のスプライスされていない真核生物ｐｒｅ－ｍＲＮＡはタンパク質コーディングエクソン及び介在非コーディングイントロンからなる。ｐｒｅ－ｍＲＮＡスプライシング中、イントロンは、ｐｒｅ－ｍＲＮＡから切断され、エクソンが連結されて、成熟ｍＲＮＡが形成され、次いでそれがタンパク質へと翻訳される。イントロンとエクソンとの境界が、イントロン－エクソンジャンクションにてスプライス部位（ｓｓ）によってマークされる。

【0074】

複数の異なる成熟ｍＲＮＡが形成されるように、９５％を超えるヒトのマルチエクソン遺伝子をスプライスすることができる（Pan, Q. et al. (2008), Deep surveying of alternative splicing complexity in the human transcriptome by high-throughput sequencing., Nature genetics, 40(12), pp. 1413-5. doi: 10.1038/ng.259.; Barbosa-Morais, N. L. et al. (2012) The evolutionary landscape of alternative splicing in vertebrate species., Science 338(6114), pp. 1587-93. doi:10.1126/science.1230612; Merkin, J. et al. (2012) Evolutionary dynamics of gene and isoform regulation in Mammalian tissues., Science. 338(6114), pp. 1593-9. doi:10.1126/science.1228186.）。構成的スプライシングと対照的に、ｍＲＮＡアイソフォーム１つのみが遺伝子から作られる場合、このプロセスは選択的スプライシング（ＡＳ）と呼ばれる。ＡＳは、主な５つのカテゴリーに分類される：選択的５’又は３’スプライス部位（Ａ５ｓｓ／Ａ３ｓｓ）を使用することによるエクソンの短縮、カセットエクソンのスキッピング（ＳＥ）、２つの連続したエクソンのいずれか１つのスキッピング、及びもう一方（相互に排他的なエクソン，ＭＸＥ）の同時包含、又はイントロンの保持（ＲＩ）。

【0075】

選択的スプライシング因子は、スプライセオソームの成分と相互作用することによってＡＳを調節し、特定のスプライス部位の利用を促進又は抑制することができる。これらのトランス作用性タンパク質因子は、その配列内のシス調節エレメントにてｐｒｅ－ｍＲＮＡに結合する。シス調節エレメントは、その位置及び調節のタイプに基づいて４つのカテゴリーに分けられる：イントロン内スプライシングエンハンサー（ＩＳＥ）、エクソン内スプライシングエンハンサー（ＥＳＥ，どちらもｓｓ利用を促進する）、イントロン内スプライシングサイレンサー（ＩＳＳ）及びエクソン内スプライシングサイレンサー（ＥＳＳ，どちらもｓｓ利用を抑制する）（Black, D. L. (2003) Mechanisms of Alternative Pre-Messenger RNA Splicing, Annual Review of Biochemistry. pp. 291-336. doi: 10.1146/annurev.biochem.72.121801.161720.）。

【0076】

ｍＲＮＡレベルをコントロールし、したがってタンパク質レベルをコントロールする選択的スプライシング事象の一例は、ＲＮＡ結合タンパク質において高度に保存されたエクソンである^５。転写物に包含された場合に、これらのエクソンは、ナンセンス介在分解（ＮＭＤ）経路を経てｍＲＮＡの分解を導く。したがって、これらのエクソンの包含を防ぐことによって、ｍＲＮＡのナンセンス介在分解（ＮＭＤ）を阻害することができ、ＲＮＡ結合タンパク質のｍＲＮＡ及びタンパク質レベルを増加することができる。

【0077】

本明細書におけるすべての実施形態において、「ｍＲＮＡ」、「ＲＮＡ」又は「転写物」の言及は、一次転写物（ｐｒｅ－ｍＲＮＡ）であり得るメッセンジャーＲＮＡ分子、又は成熟ｍＲＮＡと呼ばれる、ｐｒｅ－ｍＲＮＡのプロセシング及びスプライシングの産物を意味する。Ｐｒｅ－ｍＲＮＡは、スプライスされておらず、したがってイントロンを含む。

【0078】

ナンセンス介在分解（ＮＭＤ）
ナンセンス介在ｍＲＮＡ分解（ＮＭＤ）は、真核生物のＲＮＡ分解経路であり、それを介して一組のＮＭＤ因子が、異常な状況に位置する翻訳終止コドンを含有するｍＲＮＡアイソフォームを認識及び分解する。これらのコドンは未成熟終止コドン（ＰＴＣ）と呼ばれる。ＰＴＣ含有ｍＲＮＡアイソフォームはしばしば、ポイズン（poison）アイソフォームと呼ばれる。

【0079】

ポイズンアイソフォームは頻繁に、ＲＮＡ結合タンパク質において見出され、選択的スプライシングによって、ＰＴＣ含有エクソン、ポイズンエクソンの、転写物への包含が導かれる^５。ＣＩＲＢＰの熱誘導ポイズンエクソンは、低温誘導ＣＩＲＢＰ発現の説明を提供する^５。

【0080】

ＰＴＣ認識はｍＲＮＡの翻訳中に起こり、ｍＲＮＡを最終的に分解するためにいくつかのタンパク質を必要とする。これらのタンパク質としては、ＵＰＦ１、ＵＰＦ２及びＵＰＦ３及びＳＭＧ６及びＳＭＧ５～ＳＭＧ７などのＮＭＤ因子が挙げられる^６。ＮＭＤのプロセスは、より詳細にLykke-Andersen, S. & Jensen, T. H. Nature Reviews Molecular Cell Biology 16, 665 (2015)に記述されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0081】

翻訳の阻害剤を用いて、分解が起こる前にポイズンｍＲＮＡアイソフォームが安定化され得て、したがってポイズンｍＲＮＡアイソフォームの蓄積及び検出が可能となる。翻訳の例示的な阻害剤はシクロヘキシミド（ＣＨＸ）である。その代わりとして、ＮＭＤは、ＵＰＦ１、及び／又はＭＧ６及びＳＭＧ７などのＮＭＤにおいて役割を果たす他のタンパク質をノックダウンすることによって阻害され得る。

【0082】

ＲＢＭ３エクソン３ａ
ＲＢＭ３ポリペプチド（ＮＰ＿００６７３４．１）をコードするヒトＲＢＭ３の成熟ｍＲＮＡは、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＭ＿００６７４３．５において定義され、７つの注釈付きエクソンからなる。エクソン３（配列番号１）は、ＮＭ＿００６７４３．５のヌクレオチド２０７～３１３にわたり、エクソン４（配列番号２）は、ＮＭ＿００６７４３．５のヌクレオチド３１４～４１９にわたる。

【0083】

ＲＢＭ３ポリペプチドアイソフォーム１（ＮＰ＿００１１５９８８１．１）をコードするマウスＲＢＭ３の成熟ｍＲＮＡは、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＭ＿００１１６６４０９．２で定義され、７つの注釈付きエクソンからなる。エクソン３（配列番号３）は、ＮＭ＿００１１６６４０９．２のヌクレオチド３６２～４６８にわたり、エクソン４（配列番号４）は、ＮＭ＿００１１６６４０９．２のヌクレオチド４６９～５６８にわたる。

【0084】

本発明者らは、本明細書でエクソン３ａと呼ばれる、以前に注釈されていないエクソンの、ＲＢＭ３転写物への包含を導く選択的スプライシング事象を同定した。エクソン３ａはＰＴＣを含有し、転写物のナンセンス介在分解（ＮＭＤ）を誘導し、したがってＲＢＭ３のｍＲＮＡレベル及びタンパク質レベルが低減される。本発明者らはさらに、温かい温度でエクソン３ａの包含が誘導されることを同定した。

【0085】

エクソン３ａは、ＲＢＭ３の注釈付きイントロン３内に、注釈付きエクソン３及び４の間に位置する。表１から、マウス及びヒトゲノム上にマッピングされたエクソン３ａの配列が実証される。２つの配列は高い（９１％）配列同一性を共有する。

【0086】

本発明は、スプライシングを調節し、それによって、成熟ＲＢＭ３ ｍＲＮＡへのエクソン３ａ（又は少なくともその関連ＰＴＣ）の取り込みを回避する方法を提供する。エクソン３ａの取り込みの回避とは、エクソン３ａのすべて又は一部が成熟ＲＢＭ３ ｍＲＮＡに取り込まれないことを意味する。実施例３に記載のように、エクソン３ａの配列（例えば、配列番号６及び配列番号５）の１０７位に選択的な内部３’ｓｓが存在し、したがって、本発明の作用薬及び方法によって、配列番号５の１０８～２７１位のヌクレオチド又は配列番号６の１０８～２６９位のヌクレオチドが取り込まれない（それらはスキップされる）成熟ｍＲＮＡが導かれ得る。したがって、本発明の作用薬によって、エクソン３ａのすべて又はエクソン３ａの一部、例えば配列番号６の１０８～２６９位のヌクレオチドのスキッピングが生じ得る。

【0087】

【表1】

【0088】

特定の実施形態において、種はヒト（Homo sapiens）であり、したがって「エクソン３ａ」は配列番号６を意味する。

【0089】

一部の実施形態において、種はマウス（ハツカネズミ）であり、したがって「エクソン３ａ」は配列番号５を意味する。

【0090】

ＲＢＭ３は、種全体にわたって高度に保存されている（ZhouRBetal. Oncotarget. 2017; 8(13): 22235-22250）。ＲＢＭ３の高い進化的保存を考慮して、エクソン３ａは、既知のアライメント技術を用いて他の種のゲノム上にマッピングされ得る。

【0091】

したがって、本明細書で使用される「エクソン３ａ」は、ヒトＲＢＭ３遺伝子のエクソン３ａの配列（配列番号６）又はマウスＲＢＭ３遺伝子のエクソン３ａの配列（配列番号５）を含み得て、或いは配列番号６又は配列番号５の相同体若しくは他のバリアントである配列を含み得る。請求される本発明の文脈において、ＲＢＭ３エクソン３ａは通常、関連する細胞又は対象に対してネイティブである。

【0092】

エクソン３ａの検出
ＲＢＭ３のｍＲＮＡにおけるエクソン３ａの存在は、エクソン３ａの上流及び下流の配列に相補的であるＰＣＲプライマーを使用することによって、例えばエクソン３及び４又は５、或いはエクソン３ａの上流及び下流のイントロン配列に結合することによって検出され得る。上記で論述されるように、翻訳の阻害を用いて、ＮＭＤを介した分解が起こる前に、エクソン３ａ含有ｍＲＮＡアイソフォームが安定化され得る。

【0093】

したがって、別の態様において、ＰＣＲプライマー対が提供される。一部の実施形態において、ＰＣＲプライマーはフォワードプライマー（５’－ＴＣＡＴＣＡＣＣＴＴＣＡＣＣＡＡＣＣＣＡ（配列番号７））及びリバースプライマー（５’－ＴＣＴＡＧＡＧＴＡＧＣＴＧＣＧＡＣＣＡＣ（配列番号８））である。一部の実施形態において、ＰＣＲプライマーは、マウスＲＢＭ３遺伝子用にデザインされた、フォワードプライマー（５’－ＴＣＡＴＣＡＣＣＴＴＣＡＣＡＡＡＣＣＣＡ（配列番号９））及びリバースプライマー（５’－ＧＴＧＧＴＣＧＣＡＧＴＴＡＣＴＣＴＡＧＡ（配列番号１０））である。

【0094】

ゲノム編集
ＲＢＭ３エクソン３ａを欠損している細胞系を作成するために、又は本明細書に記載の疾患を予防若しくは治療するための療法として、ゲノム編集が用いられ得る。種々のゲノム編集技術、例えばＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９が用いられて、ＲＢＭ３の遺伝子からエクソン３ａが除去され得る。ガイドＲＮＡ対を用いて、エクソン３ａが除去され得る。エクソン３ａを欠損している遺伝子操作細胞は、例えば実施例５の具体的な実施形態で示すように、低温でさえ、ＲＢＭ３のより高い発現を示し得る。

【0095】

別の態様において、エクソン３ａを欠損している遺伝子操作細胞が提供される。特定の実施形態において、遺伝子操作細胞におけるＲＢＭ３の発現は、野生型（又は他のコントロール）細胞におけるＲＢＭ３の発現と比較して高い。一部の実施形態において、３２℃、３３℃、３４℃、３５℃、３６℃、３７℃、３８℃、３９℃、４０℃、又は４１℃でのＲＢＭ３の発現は、野生型（又は他のコントロール）細胞におけるＲＢＭ３の発現と比較して、遺伝子操作細胞において高い。

【0096】

一態様において、ＲＢＭ３の遺伝子からクソン３ａを除去するためのガイドＲＮＡ対が提供され、任意に第１ガイドＲＮＡは、エクソン３ａの上流の遺伝子とハイブリダイズすることができ、第２ガイドＲＮＡは、エクソン３ａの下流の遺伝子とハイブリダイズすることができる。一部の実施形態において、第１ガイドＲＮＡは配列番号１１又は配列番号１２を含み、第２ガイドＲＮＡは配列番号１３を含む。

【0097】

塩基編集
ＣＲＩＳＰＲ介在塩基編集を用いて、ＲＢＭ３エクソン３ａのスプライス部位が変更され得て、その結果、永久的にエクソンが排除される（非取り込み）。

【0098】

Ｃａｓタンパク質がｇＲＮＡの３’末端と複合体を形成する。ＣＲＩＳＰＲベースのシステムの特異性は、２つの因子：ターゲティング配列及びプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）に応じて異なる。標的化又は認識配列は、ｇＲＮＡの５’末端に位置し、且つプロトスペーサーとして知られる正確なＤＮＡ配列にて宿主ＤＮＡ（標的核酸又は標的ＤＮＡ）上で塩基対と対をなすように設計される。ｇＲＮＡの認識配列を単に交換することによって、Ｃａｓタンパク質は、新しいゲノム標的に方向付けされ得る。ＰＡＭ配列は、変更されるべきＤＮＡ上に位置し、且つＣａｓタンパク質によって認識される。Ｃａｓタンパク質のＰＡＭ認識配列は、種特異的であり得る。

【0099】

当技術分野でよく知られているように（例えば、Kluesner, Mitchell G., et al. “CRISPR-Cas9 cytidine and adenosine base editing of splice-sites mediates highly-efficient disruption of proteins in primary and immortalized cells.” Nature communications 12.1 (2021): 1-12参照）、塩基エディタ（base editor）は、塩基編集ドメインに融合されたＣａｓタンパク質からなる遺伝子編集酵素のクラス、例えばヌクレオチドデアミナーゼドメインに融合されたＣａｓ９ニッカーゼである。原則として、塩基エディタは、ｇＲＮＡによってガイドされるゲノムにおける標的領域に局在化する。一旦結合すると、Ｃａｓ９複合体は、非結合鎖に取って代わり、ｓｓＤＮＡ Ｒループを形成する。Ｒループは、繋ぎ止められたデアミナーゼドメインにアクセス可能な状態となり、それによって、シチジンデアミナーゼ塩基エディタ（ＣＢＥ，Ｃ：Ｇ→Ｔ：Ａ）がＣ→Ｕに脱アミノ化し、Ｔのように塩基対合し、及びアデノシンデアミナーゼ塩基エディタ（ＡＢＥ，Ａ：Ｔ→Ｇ：Ｃ）がＡ→Ｉに脱アミノ化し、Ｇのように塩基対合する。次いで、コアＣａｓ９ニッカーゼによる未編集鎖の同時ニッキングは、ＤＮＡ修復を刺激し、新たに脱アミノ化された塩基がＤＮＡ重合の鋳型として使用され、それによって、ＤＮＡの両方の鎖における編集が防がれる。

【0100】

治療的塩基編集の例が、例えば国際公開第２０２２０８１６１２Ａ１号に開示されている。

【0101】

一部の実施形態において、塩基編集ドメインは、アデノシンデアミナーゼ塩基エディタ（ＡＢＥ）を含む。アデニン塩基エディタとしては、例えば、その野生型及び変異体を含むｅｃＴａｄＡが挙げられる。アデノシンデアミナーゼ塩基エディタは、Gaudelli et al. (Nature 2017, 551, 464-471), Koblan et al. (Nature Biotech.2018, 36, 843-846), Richter et al. (Nature Biotech.2020, 38, 883-891)、及びGaudelli et al. (Nature Biotech.2020, 38, 892-900）に記載されており、それぞれが参照により本明細書に組み込まれる。

【0102】

一部の実施形態において、塩基編集ドメインはシチジンデアミナーゼドメインを含む。シチジンデアミナーゼドメインは、ＤＮＡ塩基シトシンをウラシルへ変換することができる。一部の実施形態において、シチジンデアミナーゼドメインとしては、アポリポタンパク質Ｂ ｍＲＮＡ編集酵素、触媒ポリペプチド様（ＡＰＯＢＥＣ）ファミリーデアミナーゼが挙げられる。一部の実施形態において、シチジンデアミナーゼドメインとしては、ＡＰＯＢＥＣ１デアミナーゼ、ＡＰＯＢＥＣ２デアミナーゼ、ＡＰＯＢＥＣ３Ａデアミナーゼ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｂデアミナーゼ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｃデアミナーゼ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｄデアミナーゼ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｆデアミナーゼ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇデアミナーゼ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｈデアミナーゼ、又はその組合せが挙げられる。一部の実施形態において、シチジンデアミナーゼドメインはＡＰＯＢＥＣ１デアミナーゼを含む。一部の実施形態において、シチジンデアミナーゼドメインはラットＡＰＯＢＥＣ１デアミナーゼを含む。一部の実施形態において、シチジンデアミナーゼ酵素（例えば、ｒＡＰＯＢＥＣ１）をｄＣａｓのＮ末端と融合させて、ＢＥ１と呼ばれる塩基編集酵素が産生され得る。

【0103】

一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓベースの塩基編集システムは、触媒活性を伴わないｄＣａｓ９など、Ｃａｓ９タンパク質を含む。Ｃａｓ９タンパク質は、核酸を切断するエンドヌクレアーゼであり、且つＣＲＩＳＰＲ遺伝子座によってコードされ、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムに関与する。Ｃａｓ９分子は、１つ又は複数のｇＲＮＡと、且つｇＲＮＡ分子と共に、相互作用し得て、標的ドメインを含む部位、特定の実施形態においてＰＡＭ配列を含む部位に局在化する。例えば、形質転換アッセイを用いて、ＰＡＭ配列を認識する、Ｃａｓ９分子の能力を決定することができる。一部の実施形態において、Ｃａｓ９タンパク質は、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Streptococcus pyogenes）に由来する。一部の実施形態において、Ｃａｓ９タンパク質は、スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）に由来する。

【0104】

一部の実施形態において、Ｃａｓ９タンパク質は、ヌクレアーゼ活性が低下又は不活化されるように変異され得る。

【0105】

野生型Ｃａｓ９は、ＤＮＡを切断する２つの活性部位（ＲｕｖＣ及びＨＮＨヌクレアーゼドメイン）を有し、二重らせんの各鎖に対して１つを有する。しかしながら、ＲｕｖＣ又はＨＮＨヌクレアーゼドメインの触媒不活化のために、ＤＮＡの一方の鎖のみを切断することができるＣａｓ９のニッカーゼバリアント（例えば、Addgene，プラスミド番号（♯）４８８７３）は容易に入手可能である。したがって、特定の実施形態において、Ｃａｓタンパク質はＣａｓ９ニッカーゼを含む。好ましい実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、Ｓ．アウレウス（S. aureus）Ｃａｓ９ Ｄ１０Ａニッカーゼを含む。別の実施形態において、Ｃａｓタンパク質はＳ．アウレウス（S. aureus）Ｃａｓ９ Ｈ８４０Ａニッカーゼを含む。

【0106】

エンドヌクレアーゼ活性を伴わない不活化Ｃａｓ９タンパク質（「ｄＣａｓ９」とも呼ばれる「ｉＣａｓ９」）が、ｇＲＮＡによって、細菌、酵母、及びヒト細胞における遺伝子に標的化され、立体障害を介して遺伝子発現がサイレンシングされ得る。ヌクレアーゼ活性を低減又は不活化する、Ｓ．ピオゲネス（S. pyogenes）Ｃａｓ９配列に関する例示的な変異としては：Ｄ１０Ａ、Ｅ７６２Ａ、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ、Ｎ８６３Ａ及び／又はＤ９８６Ａが挙げられる。ヌクレアーゼ活性を不活化する、Ｓ．アウレウス（S. aureus）Ｃａｓ９配列に関する例示的な変異としては、Ｄ１０Ａ及びＮ５８０Ａが挙げられる。

【0107】

Ｃａｓ９タンパク質又は変異Ｃａｓ９タンパク質は、細菌又は古細菌種、例えばストレプトコッカス・ピオゲネス（Streptococcus pyogenes）、スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Streptococcus thermophilus）、又はナイセリアメニンギティディス（Neisseria meningitidis）に由来し得る。一部の実施形態において、Ｃａｓタンパク質又は変異Ｃａｓ９タンパク質は、ストレプトコッカス属（Streptococcus）、スタフィロコッカス属（Staphylococcus）、ブレビバチルス属（Brevibacillus）、コルネバクター属（Corynebacter）、サテレラ属（Sutterella）、レジオネラ属（Legionella）、フランシセラ属（Francisella）、トレポネーマ属（Treponema）、フィリファクター属（Filifacto）、ユーバクテリウム属（Eubacterium）、ラクトバシラス属（Lactobacillus）、バクテロイデス属（Bacteroides）、フラビイボラ属（Flaviivola）、フラボバクテリウム（Flavobacterium）、スフェロヘータ属（Sphaerochaeta）、アゾスピリラム属（Azospirillum）、グルコンアセトバクター属（Gluconacetobacter）、ナイセリア属（Neisseria）、ロゼブリア属（Roseburia）、パルビバクラム属（Parvibaculum)、スタフィロコッカス属(Staphylococcus）、ニトラティフラクター属（Nitratifractor）、マイコプラスマ属（Mycoplasma）、又はカンピロバクター属（Campylobacter）の細菌属に由来するＣａｓ９タンパク質である。一部の実施形態において、Ｃａｓ９タンパク質又は変異Ｃａｓ９タンパク質は、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Streptococcus pyogenes）、フランシセラ・ノビサイダ（Francisella novicida）、スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）、ナイセリアメニンギティディス（Neisseria meningitidis）、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Streptococcus thermophilus）、トレポネーマ・デンティコラ（Treponema denticola）、ブレビバチルス・ラテロスポルス（Brevibacillus laterosporus）、カンピロバクター・ジェジュニ（Campylobacter jejuni）、コリネバクテリウム・ジフテリア（Corynebacterium diphtheria）、ユーバクテリウム・ベントリオサム（Eucobacterium ventriosum）、ストレプトコッカス・パステウリアヌス（Streptococcus pasteurianus）、ラクトバチルスファルシミニス（Lactobacillus farciminis）、スフェロヘータ・グロブス（Sphaerochaeta globus）、アゾスピリラム属（Azospirillum）、グルコンアセトバクター・ジアゾトロフィカス（Gluconacetobacter diazotrophicus）、ナイセリア・シネレア（Neisseria cinerea）、ロゼブリア・インテスティナリス（Roseburia intestinalis）、パルビバクラム・ラバメンティボランス（Parvibaculum lavamentivorans）、ニトラティフラクター・サルスギニス（Nitratifractor salsuginis）及びカンピロバクター・ラリ（Campylobacter lari）を含む群から選択される。

【0108】

ベクター及び核酸
一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ融合タンパク質は、融合タンパク質及び任意にｇＲＮＡをコードする核酸（例えば、ベクター、コンストラクト）から提供され得る。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓベースの塩基編集システムをコードするベクターは、例えばAddgeneから市販されている（例えば、pCMV-ABE7.10,https://www.addgene.org/102919/参照）。ｇＲＮＡ発現のためのクローニング部位を含むベクターの例としては、ｇＲＮＡ発現カセットを含有する修飾ＡＢＥ７．１０バージョン（例えば、Escobar, Helena, et al. “Base editing repairs an SGCA mutation in human primary muscle stem cells.” JCI insight 6.10 (2021)に記載のＡＢＥ７．１０＿４．１及びＡＢＥ７．１０＿３．１と呼ばれるもの）が挙げられる。

【0109】

編集される領域
一態様において、対象のゲノムＤＮＡにおいてコードされるＲＮＡスプライス部位を変更するための、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓベースの塩基編集システムが提供される。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓベースの塩基編集システムは、融合タンパク質と少なくとも１つのｇＲＮＡを含み、融合タンパク質はＣａｓタンパク質及び塩基編集ドメインを含み、少なくとも１つのｇＲＮＡが、ＲＢＭ３の遺伝子における領域（つまり、標的領域）とハイブリダイズすることができる。

【0110】

一部の実施形態において、その領域は、ＲＢＭ３のエクソン３ａの３’スプライス部位にわたる領域である。

【0111】

他の実施形態において、その領域は、ＲＢＭ３のエクソン３ａの５’スプライス部位にわたる領域である。

【0112】

さらに他の実施形態において、その領域は、エクソン３ａのヌクレオチド１０７位にあるＲＢＭ３のエクソン３ａの内部選択的スプライス部位にわたる領域である。

【0113】

一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓベースの塩基編集システムは、３’スプライス部位にわたる領域を標的化する１つのｇＲＮＡ、５’スプライス部位にわたる領域を標的化するｇＲＮＡ、及び／又はエクソン３ａの内部選択的スプライス部位を標的化するｇＲＮＡを含む。

【0114】

本明細書に記載のシステムを用いて塩基編集され得るスプライス部位は、以下の配列において太字で示される：

【化1】

【化2】

は、エクソン３ａの３’スプライス部位の直前のスプライスアクセプターである。

【化3】

は、エクソン３ａの内部プライス部位（ヌクレオチド１０６～１０７）である。

【化4】

は、エクソン３ａの５’スプライス部位の直後のスプライスドナーである。

【0115】

ｇＲＮＡ
上記で説明されるように、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓベースの塩基編集システムは少なくとも１つのｇＲＮＡを含む。ｇＲＮＡはＲＢＭ３遺伝子を標的化する。ｇＲＮＡは本明細書に記載のＲＢＭ３遺伝子の領域に結合し、標的化し得る。ｇＲＮＡは、ＲＢＭ３遺伝子におけるＲＮＡスプライス部位を標的化し得る。ｇＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓベースの塩基編集システムの標的化を提供する。ｇＲＮＡは、２つの非コードＲＮＡ：ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡの融合物であり得る。ｇＲＮＡは、通常２０ヌクレオチドの領域にわたる、目的のＤＮＡ標的との相補的な塩基対合（base pairing）を通じて、目的のＤＮＡ配列を標的化し得る。ｔｒａｃｒＲＮＡは、Ｃａｓヌクレアーゼの結合足場（binding scaffold）としての役割を果たす。

【0116】

編集のためにスプライス部位が選択されていたとしても、多くの異なる特定の標的領域、及び特定のｇＲＮＡが、その変化をもたらすために使用され得ることは、当業者によって理解されるだろう。これは、選択されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓベースの塩基編集システムによって利用されるＰＡＭ部位（例えば、「ＮＧＧ」）、及びその部位からの「編集窓の距離」、並びに行うことが決定された編集に応じて異なるだろう。本明細書における開示内容及び一般的な知識を考慮に入れて、当業者は、適切なｇＲＮＡ及びシステムを選択することができるだろう。

【0117】

「標的領域」とは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓベースの遺伝子編集システムが標的化及び結合する、標的遺伝子の領域を意味する。ゲノムにおける標的配列を標的化する（標的配列とハイブリダイズする）ｇＲＮＡの部分は、「ターゲティング配列」又は「ターゲティング部分」又は「ターゲティングドメイン」と呼ばれ得る。「プロトスペーサー」又は「ｇＲＮＡスペーサー」とは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベースの遺伝子編集システムが標的化及び結合する、標的遺伝子の領域を意味し得て；「プロトスペーサー」又は「ｇＲＮＡスペーサー」は、ゲノムにおける標的化された配列に相補的であるｇＲＮＡの部分も意味し得る。ｇＲＮＡはｇＲＮＡ足場を含み得る。ｇＲＮＡ足場は、ｇＲＮＡへのａｓ９の結合を促進し、エンドヌクレアーゼ活性を促進し得る。ｇＲＮＡ足場は、ｇＲＮＡが標的化する配列に相当するｇＲＮＡの部分に従うポリヌクレオチド配列である。総合すると、ｇＲＮＡ標的化部分及びｇＲＮＡ足場は１つのポリヌクレオチドを形成する。

【0118】

ｇＲＮＡは、適切なプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）がそれに続く場合に、例えば、標的遺伝子の標的領域の約１０～約２０ヌクレオチドとハイブリダイズすることができるのに十分に、標的領域に対して相補的であるターゲティングドメインを、その５’末端に含み得る。ゲノムにおいて、標的領域又はプロトスペーサーに続いて、プロトスペーサーの３’末端にＰＡＭ配列がある。

【0119】

ｇＲＮＡのターゲティングドメインは、標的ＤＮＡの標的領域に完全に相補的である必要はない。一部の実施形態において、ｇＲＮＡのターゲティングドメインは、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０ヌクレオチドなどの長さにわたって標的領域に、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は少なくとも９９％相補的である（又は、標的領域と比較して１、２又は３ミスマッチを有する）。

【0120】

通常、標的ＤＮＡ領域とハイブリダイズする、ｃｒＲＮＡ又はｇＲＮＡのターゲティングドメイン若しくは部分は、１６、１７、１８、１９、２０、又は２１ヌクレオチドの長さ、より好ましくは１７～２０ヌクレオチドの長さ、任意に２０ヌクレオチドの長さである。

【0121】

ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓベースの塩基編集システム、並びに関連材料及び方法の実施例
一態様において、対象のゲノムＤＮＡにおいてコードされるＲＮＡスプライス部位を変更するための、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓベースの塩基編集システムを提供し、
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓベースの塩基編集システムは、融合タンパク質及び少なくとも１つのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含み、
融合タンパク質は、Ｃａｓタンパク質及び塩基編集ドメインを含み、
その少なくとも１つのｇＲＮＡは、ＲＢＭ３の遺伝子における領域とハイブリダイズすることができ、
その領域は：
（ｉ）配列番号３２の１４６～１４７位のヌクレオチドに位置するスプライス部位が変更されるように、配列番号３２の１３６～１４７、１３７～１４７、１３８～１４７、１３９～１４７、１４０～１４７、１４１～１４７、１４２～１４７、１４３～１４７、１４４～１４７、１４５～１４７、又は１４６～１４７位のヌクレオチド、又はその相補的配列；
（ｉｉ）配列番号６の１０６～１０７位のヌクレオチドに位置するスプライス部位が変更されるように、配列番号６又はその相補的配列；或いは
（ｉｉｉ）配列番号３３の最初の２つのヌクレオチドに位置するスプライス部位が変更されるように、配列番号３３の１～２、１～３、１～４、１～５、１～６、１～７、１～８、１～９、１～１０、１～１１、又は１～１２位のヌクレオチド又はその相補的配列；
を含み、
任意に、ｇＲＮＡ、又は標的領域とハイブリダイズするｇＲＮＡのターゲティングドメインが、１６、１７、１８、１９、２０、又は２１ヌクレオチドの長さである。

【0122】

一実施形態において、その領域は、配列番号３２の少なくとも２つのヌクレオチドに位置するスプライス部位が変更されるように、配列番号３２の１３６～１４７、１３７～１４７、１３８～１４７、１３９～１４７、１４０～１４７、１４１～１４７、１４２～１４７、１４３～１４７、１４４～１４７、又は１４５～１４７位のヌクレオチド、又はその相補的配列を含み、その領域はさらに、配列番号６の１及び２、１～３、１～４、１～５、１～６、１～７、１～８、１～９、１～１０、１～１１、１～１２、１～１３、１～１４、又は１～１５位のヌクレオチド、又はその相補的配列を含む。

【0123】

一実施形態において、その領域は、配列番号３３の最初の２つのヌクレオチドに位置するスプライス部位が変更されるように、配列番号３３の１～２、１～３、１～４、１～５、１～６、１～７、１～８、１～９、１～１０、１～１１、又は１～１２位のヌクレオチド、又はその相補的配列を含み、その領域はさらに、配列番号６の２５４～２６９、２５５～２６９、２５６～２６９、２５７～２６９、２５８～２６９、２５９～２６９、２６０～２６９、２６１～２６９、２６２～２６９、２６３～２６９、２６４～２６９、２６５～２６９、２６６～２６９、又は２６７～２６９位のヌクレオチドを含む。

【0124】

一実施形態において、その領域は、配列番号６の１０６～１７位のヌクレオチドにわたり、且つ配列番号６の１０６～１０７位のヌクレオチドに位置するスプライス部位が変更されるように、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０の隣接ヌクレオチドを含む。

【0125】

したがって、一部の実施形態において、本明細書に開示のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓベースの塩基編集システムは、エクソン３ａのスキッピングを促進する、「ＡＡ」又は「ＧＧ」へと「ＡＧ」（スプライスアクセプター）を変換することによって、スプライス部位を変更するためのシステムである。他の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓベースの塩基編集システムは、エクソン３ａのスキッピングを促進する、「ＧＣ」又は「ＡＴ」へと「ＧＴ」（スプライスドナー）を変換することによって、スプライス部位の変更を可能にする。

【0126】

コード又は非コードＤＮＡ鎖上のアデノシン又はシチジン塩基編集を用いて、Ｒｂｍ３エクソン３ａの３’スプライス部位（ヒトにおける配列番号３２又はマウスにおける配列番号３０の最後の２つのヌクレオチド）、Ｒｂｍ３エクソン３ａの５’スプライス部位（ヒトにおける配列番号３３又はマウスにおける配列番号３１の最初の２つのヌクレオチド）及び／又は配列番号６（ヒト）若しくは配列番号５（マウス）における１０６～１０７位の内部３’スプライス部位が変更され得る。

【0127】

一部の実施形態において、塩基編集ドメインは、配列番号３２の１４６～１４７位の「ＡＧ」を「ＧＧ」に変換する、アデノシンデアミナーゼ塩基エディタを含む。

【0128】

一部の実施形態において、ｇＲＮＡは、エクソン３ａの３’スプライス部位にわたる領域とハイブリダイズする。具体的な実施形態において、ｇＲＮＡは、配列ＴＴＣＴａＧＧＧＧＧＴＧＧＡＧＧＧＣＡＧ（配列番号９０）又はその相補的配列を含み、任意にその配列は１、２又は３個のヌクレオチド置換を有する。

【0129】

一部の実施形態において、配列番号９０は、配列番号３２の１４６～１４７位の「ＡＧ」を「ＧＧ」に変換する、アデノシンデアミナーゼ塩基エディタと共に使用される。

【0130】

一部の実施形態において、塩基編集ドメインは、エクソン３ａの内部スプライス部位（ヌクレオチド１０６～１０７）の「ＡＧ」を変換するアデノシンデアミナーゼ塩基エディタを含む。

【0131】

一部の実施形態において、ｇＲＮＡはエクソン３ａの３’スプライス部位にわたる領域とハイブリダイズする。具体的な実施形態において、ｇＲＮＡは、配列ＣＴＡＣＴＡＣＣＴＡＡＧＣＣＣＡＡＧＧＣ（配列番号９１）又はその相補的配列を含み、任意にその配列は１、２又は３個のヌクレオチド置換を有する。かかるｇＲＮＡ配列は、逆ＤＮＡ鎖に結合し、ＡＧに相補的である「Ｃ」を標的化し得る。

【0132】

一部の実施形態において、塩基編集ドメインは、エクソン３ａの５’スプライス部位のすぐ後の

【化5】

スプライスドナーを変換するアデノシンデアミナーゼ塩基エディタを含む。

【0133】

一部の実施形態において、ｇＲＮＡは、このスプライス部位にわたる領域とハイブリダイズする。具体的な実施形態において、ｇＲＮＡは、配列ＣＴＴＡＣＡＴＣＴＴＧＡＣＴＧＡＡＣＴＣ（配列番号９２）又はその相補的配列を含み、任意にその配列は１、２又は３個のヌクレオチド置換を有する。かかるｇＲＮＡ配列は、逆ＤＮＡ鎖に結合し、ＡＢＥ又はＣＢＥを用いて、ＧＴに相補的である「Ｃ」又は「Ａ」を標的化し得る。

【0134】

したがって、一実施形態において、標的領域は、配列番号９０、９１、及び９２から選択され、且つ少なくとも１つのｇＲＮＡが、配列番号９０、９１、及び９２のＲＮＡ均等物である配列若しくはその相補的配列を含む、又はからなる。

【0135】

一実施形態において、ゲノムＤＮＡにおいてコードされるＲＮＡスプライス部位を変更した結果、得られる成熟ｍＲＮＡにおいてエクソン３ａは取り込まれない。

【0136】

一実施形態において、Ｃａｓタンパク質はＣａｓ９を含み、任意にＣａｓタンパク質はＣａｓ９ニッカーゼを含む。

【0137】

一実施形態において、塩基編集ドメインは、シチジンデアミナーゼドメイン又はアデノシンデアミナーゼドメインを含む。

【0138】

一実施形態において、ＲＢＭ３の遺伝子における領域とハイブリダイズすることができるガイドＲＮＡをコードし、且つ発現することができる単離核酸が提供され、その単離核酸は、配列番号９０、９１又は９２、又はその相補的配列から選択される配列を含む。

【0139】

ｇＲＮＡなどの、本明細書に記載のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓベースの塩基編集システムをコードする１つ又は複数の単離ポリヌクレオチドもまた提供される。

【0140】

一実施形態において、そのポリヌクレオチドは、融合タンパク質をコードする第１ポリヌクレオチド及び少なくとも１つのｇＲＮＡをコードする第２ポリヌクレオチドを含む。

【0141】

上述のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムをコードする単離ポリヌクレオチドを含む、任意にベクターであり、任意にウイルスベクターである、発現コンストラクトも提供される。

【0142】

単離ポリヌクレオチド又は発現コンストラクトを含む細胞も提供される。

【0143】

ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓベースの塩基編集システム、単離ポリヌクレオチド、又は発現コンストラクトを含む組成物も提供される。

【0144】

ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓベースの塩基編集システムを使用する方法
別の態様において、細胞におけるＲＢＭ３コード化成熟ｍＲＮＡのナンセンス介在分解を阻害し、及び／又は細胞におけるＲＢＭ３の発現を増加する方法であって、エクソン３ａのスプライス部位を変更するように、本明細書に記載のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓベースの塩基編集システム、又はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓベースの塩基編集システムをコードするポリヌクレオチドに細胞を曝露することを含む、方法が提供される。

【0145】

別の態様において、対象におけるＲＭＢ３発現によって影響を受ける疾患を治療若しくは予防し、又は対象に神経保護治療を提供する方法であって、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓベースの塩基編集システム、単離核酸、発現コンストラクト、又は上述の組成物を対象に投与することを含む方法が提供される。

【0146】

一実施形態において、治療又は処置は：
神経疾患及び／又は新生児低酸素性虚血性脳症、頭部外傷、若しくは脳卒中である疾患；
アルツハイマー病、パーキンソン病、プリオン病、前頭側頭型認知症、タウオパシー、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、及び血管性認知症から任意に選択される神経変性疾患；又は
心臓外科手術若しくは誘導された昏睡中に任意に起こる神経学的損傷；又は
鬱病若しくは不安；に対するものである。

【0147】

ＲＢＭ３の発現を誘導することができる作用薬
本発明の種々の態様に従って、一部の実施形態において、作用薬は、ＲＢＭ３ ｐｒｅ－ｍＲＮＡの選択的スプライシングを阻害する（エクソン３ａの包含を阻害する）ことができる作用薬である。特定の実施形態において、作用薬は、エクソン３のスキッピングを誘導することができる作用薬である。作用薬は、細胞に対して外因性であり得る。

【0148】

作用薬は通常、ｐｒｅ－ｍＲＮＡ転写物の特定の領域に結合し、ｐｒｅ－ｍＲＮＡのスプライシングを調節又は変更することができる。

【0149】

本発明の種々の態様に従って、一部の実施形態において、得られる成熟ｍＲＮＡにおけるエクソン３と４の間に未成熟終止コドン（ＰＴＣ）が包含されないように、ｐｒｅ－ｍＲＮＡのスプライシングを変更するために、作用薬をＲＢＭ３のｐｒｅ－ｍＲＮＡの領域とハイブリダイズすることができる。一部の実施形態において、作用薬は、得られる成熟ｍＲＮＡにおけるエクソン３と４の間に未成熟終止コドン（ＰＴＣ）が包含されないように、ｐｒｅ－ｍＲＮＡのスプライシングを変更するために、ＲＢＭ３のｐｒｅ－ｍＲＮＡに相補的である。特定の実施形態において、スプライシングは、得られる成熟ｍＲＮＡにエクソン３ａが取り込まれない（スキップされる）ように変更される。

【0150】

本発明の種々の態様に従って、一部の実施形態において、作用薬は、ＲＢＭ３のゲノム配列においてコードされるＲＮＡスプライス部位の変更に有用である。したがって、しかるべき場合に、「作用薬」とは、本明細書に記載のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓベースの塩基編集システム、本明細書に記載のガイドＲＮＡ、又は本発明のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓベースの塩基編集システムをコードするポリヌクレオチド／発現コンストラクトを意味し得る。標的スプライス部位が本明細書に開示のシステムによって「変更」されることが示される場合、適切な条件下にて標的ゲノムＤＮＡを含む細胞に導入する場合に、かかるシステムはスプライス部位の変更に適応される、且つスプライス部位を変更することができると理解される。

【0151】

一部の実施形態において、作用薬は、ワトソン－クリック型塩基対又はゆらぎ塩基対（Ｇ－Ｕ）によって標的核酸（例えば、ｐｒｅ－ｍＲＮＡ）配列とハイブリダイズすることができる。作用薬は、標的配列に対する正確な配列相補性又は近い相補性を有し得て、例えば、本質的に相補的（例えば、標的配列に結合し、且つｐｒｅ－ｍＲＮＡのスプライシングを変更するのに十分な相補性）であり得る。作用薬（例えば、ｇＲＮＡ）は、標的配列に対する正確な配列相補性又は近い相補性を有し得て、例えば、本質的に相補的（例えば、標的配列に結合し、且つスプライス部位の変更を可能にするのに十分な相補性）であり得る。

【0152】

本明細書において、「得られる成熟ｍＲＮＡ」とは、ｐｒｅ－ｍＲＮＡのスプライシングの産物を意味する。それは必ずしも、成熟ｍＲＮＡのすべてを意味するわけではなく、作用薬は、成熟ｍＲＮＡの少なくとも一部が上記の特性を有するようにスプライシングを変更し得る。

【0153】

一部の実施形態において、作用薬は、ｐｒｅ－ｍＲＮＡにおけるエクソン３ａ又はそのスプライス部位にわたる領域とハイブリダイズすることができる（又は相補的である）作用薬である。特定の実施形態において、作用薬は、ｐｒｅ－ｍＲＮＡにおけるエクソン３ａの３’スプライス部位にわたる領域とハイブリダイズすることができる（又は相補的である）作用薬である。一部の実施形態において、作用薬は、ｐｒｅ－ｍＲＮＡにおけるエクソン３ａの５’スプライス部位にわたる領域とハイブリダイズすることができる（又は相補的である）作用薬である。特定の実施形態において、作用薬は、エクソン３ａの上流の２５０ヌクレオチド以内に位置する領域とハイブリダイズすることができる（又は相補的である）。特定の実施形態において、作用薬は、エクソン３ａの下流の２５０ヌクレオチド以内に位置する領域とハイブリダイズすることができる（又は相補的である）。

【0154】

一部の実施形態において、作用薬は、エクソン３ａの上流の２００ヌクレオチド内に位置する領域とハイブリダイズすることができる（又は相補的である）。一部の実施形態において、作用薬は、エクソン３ａの下流の２００ヌクレオチド内に位置する領域とハイブリダイズすることができる（又は相補的である）。その領域は、エクソン３ａの上流の１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０又は１００ヌクレオチド内であり得る。その領域は、エクソン３ａの下流の１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０又は１００ヌクレオチド内であり得る。その領域は、エクソン３ａの上流の１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０又は２００ヌクレオチド内であり得る。その領域は、エクソン３ａの下流の１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０又は２００ヌクレオチド内であり得る。その領域は、エクソン３ａの上流の２１０、２２０、２３０、２４０又は２５０ヌクレオチド内であり得る。その領域は、エクソン３ａの下流の２１０、２２０、２３０、２４０又は２５０ヌクレオチド内であり得る。その領域は、エクソン３ａの上流又は下流であり得て、ＲＢＭ３遺伝子の注釈付きイントロン３に相当し、例えば、以下の表３に示す配列に相当する領域であり得る。

【0155】

一部の実施形態において、作用薬は、核酸及び／又は核酸類似体、例えばオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドである。一部の実施形態において、作用薬は、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）である。

【0156】

本開示の一実施形態は、ＲＢＭ３のナンセンス介在ｍＲＮＡ分解（ＮＭＤ）を阻害する、ポリヌクレオチドを含む組成物など、核酸及び／又は核酸類似体を含む組成物である。

【0157】

核酸又はポリヌクレオチドは通常、ｐｒｅ－ｍＲＮＡ転写物の特異的領域とハイブリダイズすることができ、スプライシングを調節又は変更することができるアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）である。ＡＳＯは、選択的スプライス部位を標的化し、スプライセオソームによってその使用をブロックし得る。一部の実施形態において、ＡＳＯは、エクソン３ａの５’スプライス部位若しくは３’スプライス部位の近傍の、又はエクソン３ａの５’スプライス部位若しくは３’スプライス部位にオーバーラップする調節配列を標的化する。ヒト及びマウスエクソン３ａの５’スプライス部位でのエクソンのライゲーションは、表１及び図１Ｅ（図４Ａも参照）に示す配列の最後のヌクレオチドで起こる。３’スプライス部位でのエクソンのライゲーションは、表１及び図１Ｅに示すエクソン３ａの配列の最初のヌクレオチドでのライゲーションである。

【0158】

作用薬（例えば、ＡＳＯ）は、ｐｒｅ－ｍＲＮＡにおけるシス調節エレメントへのトランス作用因子の結合を妨げ得る。したがって、作用薬は、エクソン３ａの包含を促進又は誘導するシス調節エレメント（スプライシングエンハンサーエレメント）を標的化し得る。特定の実施形態において、作用薬は、スプライシングエンハンサーエレメントを標的化する（例えば、スプライシングエンハンサーエレメントとハイブリダイズすることができる）。

【0159】

スプライシングエンハンサーエレメントは、本明細書に記載のようにエクソン３ａ内に位置し得る。

【0160】

スプライシングエンハンサーエレメントは、本明細書に記載のようにエクソン３ａの上流又は下流の領域に位置し得る。好ましくは、スプライシングエンハンサーエレメントは、エクソン３ａの上流又は下流の２５０ヌクレオチド内に位置する。スプライシングエンハンサーエレメントは、ＲＢＭ３遺伝子の注釈付きイントロン３に相当する、エクソン３とエクソン４の間の領域に位置し得る。一部の実施形態において、スプライシングエンハンサーエレメントは、エクソン３ａの上流の２００ヌクレオチド内に位置する。一部の実施形態において、スプライシングエンハンサーエレメントは、エクソン３ａの下流の２００ヌクレオチド内に位置する。スプライシングエンハンサーエレメントは、エクソン３ａの上流の１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０又は１００ヌクレオチド内にあり得る。スプライシングエンハンサーエレメントは、エクソン３ａの下流の１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０又は１００ヌクレオチド内にあり得る。スプライシングエンハンサーエレメントは、エクソン３ａの上流の１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０又は２００ヌクレオチド内にあり得る。スプライシングエンハンサーエレメントは、エクソン３ａの下流の１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０又は２００ヌクレオチド内にあり得る。スプライシングエンハンサーエレメントは、エクソン３ａの上流の２１０、２２０、２３０、２４０又は２５０ヌクレオチド内にあり得る。スプライシングエンハンサーエレメントは、エクソン３ａの下流の２１０、２２０、２３０、２４０又は２５０ヌクレオチド内にあり得る。

【0161】

スプライシングエンハンサー及びサイレンサーなどの調節因子は、ＲＢＭ３遺伝子の領域に沿って変異誘発をスクリーニングし、野生型遺伝子に関する各変異の転写物におけるエクソン３ａの包含レベルを測定することによって同定され得る。例示的な方法は実施例３に記述される。

【0162】

別の態様において、ＲＢＭ３の転写物におけるエクソン３ａの包含をコントロールすることができるシス調節エレメントを同定する方法が提供される。その方法は、
ｉ）エクソン３ａ内の領域、ＲＢＭ３遺伝子におけるエクソン３ａの上流の２５０ヌクレオチド内の領域、又はエクソン３ａの下流の２５０ヌクレオチド内の領域において一組のヌクレオチドを変異又は欠失する工程、
ｉｉ）転写物におけるエクソン３ａの包含レベルを測定する工程、及び
ｉｉｉ）野生型遺伝子の転写物における包含レベルと、工程ｉｉ）の包含レベルを比較する工程、を含む。エクソン３ａの包含レベルは、スプライシング感受性ＲＴ－ＰＣＲによって測定され得る。

【0163】

特定の実施形態において、作用薬（例えば、ＡＳＯ）は、スプライシングエンハンサーエレメントを含む領域を標的化する。具体的な実施形態において、その領域は：Ｍ２、Ｍ２－２、Ｍ２－２、Ｍ２－３、Ｍ２－４、Ｍ２－６、Ｍ２－７及びＭ２－９、Ｍ４、及びＭ４－７から選択される。一部の実施形態において、領域はＭ４－７である。一部の実施形態において、領域はＭ２－９である。他の実施形態において、その領域は「Ｍ２コア」領域（配列番号８８）又は「Ｍ４コア」領域（配列番号８９）に相当する。表２は、各領域の配列、配列番号及び位置を提供する。

【0164】

【表2】

【0165】

【表3】

【0166】

特定の実施形態において、作用薬（例えば、ＡＳＯ）は、エクソン３ａのスプライス部位にわたる領域を標的化する。特定の実施形態において、領域は、エクソン３ａの５’スプライス部位にわたり、例えば領域は、配列番号５の２５９～２７１、２６０～２７１、２６１～２７１、２６２～２７１、２６３～２７１、２６４～２７１、２６５～２７１、２６６～２７１、２６７～２７１、２６８～２７１、又は２６９～２７１位のヌクレオチド（ｎｔ）を含み得る。したがって、ヒトエクソン３ａにおける領域は、配列番号６の２５７～２６９、２５８～２６９、２５９～２６９、２６０～２６９、２６１～２６９、２６２～２６９、２６３～２６９、２６４～２６９、２６５～２６９、２６６～２６９又は２６７～２６９位のｎｔを含み得る。一部の実施形態において、領域は、エクソン３ａの３’スプライス部位にわたる。その領域は、配列番号５の１及び２、１～３、１～４、１～５、１～６、１～７、１～８、１～９、又は１～１０位のヌクレオチドを含み得る。したがって、ヒトエクソン３ａにおける領域は、配列番号６の１及び２、１～３、１～４、１～５、１～６、１～７、１～８、１～９、又は１～１０位のｎｔを含み得る。一部の実施形態において、領域は、配列番号６の１及び２、１～３、１～４、１～５、１～６、１～７、１～８、１～９、又は１～１０位のｎｔ及び／又は配列番号３２の１３６～１４７、１３７～１４７、１３８～１４７、１３９～１４７、１４０～１４７、１４１～１４７、１４２～１４７、１４３～１４７、１４４～１４７、又は１４５～１４７位のヌクレオチドを含む。領域は、配列番号５の１及び２、１～３、１～４、１～５、１～６、１～７、１～８、１～９、又は１～１０位のｎｔ及び／又は配列番号３０の１１７～１２７、１１８～１２７、１１９～１２７、１２０～１２７、１２１～１２７、１２２～１２７、１２３～１２７、１２４～１２７、１２５～１２７、又は１２６～１２７位のｎｔを含み得る。

【0167】

一部の実施形態において、作用薬（例えば、ＡＳＯ）は、エクソン３ａの上流の２５０ヌクレオチド内又はエクソン３ａの下流の２５０ヌクレオチド内の領域を標的化する。これらの上流及び下流領域は、イントロン３領域であり得る（表３に示す）。作用薬は、表３に記載の上流又は下流領域のうちの１つの領域内のスプライシングエンハンサーエレメントを標的化する。特定の実施形態において、作用薬は、配列番号３０、３１、３２又は３３内の領域を標的化し、好ましくはその領域はスプライシングエンハンサーエレメントを含む。

【0168】

【表4】

【0169】

本明細書におけるすべての実施形態において、「１つの（an）ｍＲＮＡ」又は「その（the）ｍＲＮＡ」の言及は、１つ又は複数の（少なくとも１つの）ｍＲＮＡ分子を意味し、「１つの（a）ｐｒｅ－ｍＲＮＡ」又は「その（the）ｐｒｅ－ｍＲＮＡ」の言及は、１つ又は複数の（少なくとも１つの）ｐｒｅ－ｍＲＮＡ分子を意味する。

【0170】

ＡＳＯは、標的ｍＲＮＡ（例えば、ｐｒｅ－ｍＲＮＡ）、糖部位、及びモノマーを連結する主鎖上に存在する相補的核酸塩基とハイブリダイズすることができる、核酸塩基を含むヌクレオチドで作成されたポリヌクレオチドである。ＡＳＯという用語は、標的ｍＲＮＡ（例えば、ｐｒｅ－ｍＲＮＡ）上の相補的核酸塩基とハイブリダイズすることができる核酸塩基を含むが、ペプチド核酸（ＰＮＡ）などの糖部位を含まない、オリゴマー分子も具体化する。

【0171】

一部の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）は合成オリゴヌクレオチドである。ＡＳＯは、人工、修飾、非天然オリゴヌクレオチドであり得て、つまり天然ＲＮＡ若しくはＤＮＡポリヌクレオチド又はヌクレオチドと比較して、１つ又は複数の化学修飾を含む。したがって、ＡＳＯは、天然ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、修飾ヌクレオチド、又は前述の２若しくは３個のいずれかの組合せで構成され得る。「天然ヌクレオチド」という用語は、デオキシリボヌクレオチド及びリボヌクレオチドを含む。「修飾ヌクレオチド」という用語は、修飾若しくは置換された糖基を有し、及び／又は修飾された主鎖を有するヌクレオチドを含む。本明細書に記載の方法及び組成物と適合性である、ＡＳＯ又はＡＳＯの構成要素の化学修飾は当業者には明らかであり、例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第８，２５８，１０９Ｂ２号、米国特許第５，６５６，６１２号、米国特許出願公開第２０１２／０１９０７２８号及びDiasand Stein, Mol. Cancer Ther. 2002, 1, 347-355に記載されている。

【0172】

ＡＳＯは、２’－Ｏ－４’－Ｃメチレン架橋（ＬＮＡ，ロック核酸）ヌクレオチドを有する修飾ヌクレオチドを含み得る。ＡＳＯは、ＲＮＡ及び／又はＤＮＡヌクレオチドを含み得る。ＡＳＯは、ＬＮＡヌクレオチドと非修飾ヌクレオチドの組合せを含み得る。ＡＳＯは、ＬＮＡヌクレオチドとＲＮＡヌクレオチドの組合せを含み得る。アンチセンス核酸は、ＬＮＡヌクレオチドとＤＮＡヌクレオチドの組合せを含み得る。その組合せは、交互のＬＮＡ及びＲＮＡ、交互のＬＮＡ及びＤＮＡ、又は交互のＲＮＡ及びＤＮＡであり得る。さらに好ましいオリゴヌクレオチド修飾は、２’－ヒドロキシル基が糖の環の３’又は４’炭素原子に連結し、それによって二環式糖部位が形成される、ロック核酸（ＬＮＡ）を含む。

【0173】

スプライシングエンハンサーエレメント又はスプライス部位にてＲＢＭ３のｐｒｅ－ｍＲＮＡを標的化する例示的なＡＳＯは表４に示される。一部の実施形態において、ＡＳＯは、表４に示す配列番号のうちの１つを含む。一部の実施形態において、ＡＳＯは、配列番号３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、６９及び７０のうちの１つを含み、任意にその配列は、１、２、又は３個のヌクレオチド置換を有する。一部の実施形態において、ＡＳＯは、１、２、又は３個の置換を任意に有する、配列番号４０、４１、４２、４３、４４、４６、４７、４８、４９、５０、８３、８４、８５、８６及び８７のうちの１つを含む、又はからなる。一部の実施形態において、ＡＳＯは、１、２、又は３個の置換を任意に有する、配列番号８３、８４、８５及び８７のうちの１つを含む、又はからなる。特定の実施形態において、ＡＳＯは、１、２、又は３個の置換を任意に有する、配列番号４４、４６、４７、４８、８３、８４、８５、８６及び８７のうちの１つを含む、又はからなる。

【0174】

一部の実施形態において、ＡＳＯは配列番号６０を含み、任意にその配列は１、２、又は３個のヌクレオチド置換を有する。

【0175】

【表5】

【0176】

【表6】

【0177】

^＊Ｍ２Ｄの配列は、ヒトとマウスの間で１００％保存されており、そのため配列番号４５及び４６は同一である。ＡＳＯが、配列番号４５及び４６の両方を含んで本明細書に列挙される場合、この重複なく、相当するリスト（つまり、配列番号４６のみ）が必要な変更を加えて開示されることは認識されるだろう。

【0178】

本発明は、対象におけるＲＢＭ３発現によって影響を受ける疾患を治療又は予防する方法において使用される、配列番号３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６又は５７を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。ＡＳＯは、１、２、又は３個のヌクレオチド置換を有する、配列番号３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６又は５７を含み得る。一部の実施形態において、ＡＳＯは配列番号６０を含み、任意にその配列は１、２、又は３個のヌクレオチド置換を有する。

【0179】

本発明は、対象におけるＲＢＭ３発現によって影響を受ける疾患を治療又は予防する方法において使用される、配列番号３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、８３、８４、８５、８６又は８７を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。

【0180】

ＡＳＯは、１、２、又は３個のヌクレオチド置換を有する、配列番号３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、８３、８４、８５、８６又は８７を含み得る。

【0181】

一部の実施形態において、使用されるＡＳＯは、配列番号４０、４１、４２、４３、４４、４６、４７、４８、４９、５０、８３、８４、８５、８６及び８７のうちの１つを含む、又はからなる。

【0182】

一部の実施形態において、使用されるＡＳＯは、配列番号８３、８４、８５及び８７のうちの１つを含む、又はからなる。

【0183】

特定の実施形態において、使用されるＡＳＯは、配列番号４４、４６、４７、４８、８３、８４、８５、８６及び８７のうちの１つを含む、又はからなる。

【0184】

本明細書に記載のＡＳＯのいずれかは、天然ヌクレオチドに存在する、リボース若しくはデオキシリボースを含む糖部位、又はモルホリン環を含有する糖部位など、修飾された糖部位を含有し得る。修飾糖部位の非制限的な例としては、２’置換、例えば２’－Ｏ－メチル、２’－Ｏ－メトキシエチル（ＭＯＥ）、２’－Ｏ－アミノエチル、２’－フルオロ（２’Ｆ）；Ｎ３’－＞Ｐ５’ホスホロアミダート、２’ジメチルアミノオキシエトキシ、２’ジメチルアミノエトキシエトキシ、２’－グアニジニウム、２’－Ｏ－グアニジニウムエチル、カルバメート修飾糖、及び二環式修飾糖が挙げられる。一部の実施形態において、糖部位の修飾は、２’－Ｏ－メチル、２’－フルオロ及び２’－Ｏ－メトキシエチル（ＭＯＥ）から選択される。

【0185】

本明細書に記載のＡＳＯは、オリゴマーの構成要素を連結する主鎖構造も含む。「主鎖構造」及び「オリゴヌクレオチド結合（linkage）」という用語は区別なく使用され得て、ＡＳＯのモノマー間の連結を意味する。天然オリゴヌクレオチドにおいて、主鎖は、オリゴマーの糖部位を連結する３’－５’リン酸ジエステル結合を含む。本明細書に記載のＡＳＯの主鎖構造又はオリゴヌクレオチド結合としては（限定されないが）、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレルロアート（phosphoroselerloate）、ホスホロジセレノアート（phosphorodiselenoate）、ホスホロアニロチオアート（phosphoroanilothioate）、ホスホラニラダート（phoshoraniladate）、ホスホロンミダート（phosphoronmidate）等が挙げられる。一部の実施形態において、主鎖修飾は、ホスホロチオエート結合である。例えば、LaPlanche et al. Nucleic Acids Res. 14:9081 (1986); Stec et al. J. Am. Chem. Soc. 106:6077 (1984), Stein et al. Nucleic Acids Res. 16:3209 (1988), Zon et al. Anti Cancer Drug Design 6:539 (1991); Zon et al. Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, pp. 87-108 (F. Eckstein, Ed., Oxford University Press, Oxford England (1991))■ Stec et al. U.S. Pat. No. 5,151,510; Uhlmann and Peyman Chemical Reviews 90:543 (1990)を参照のこと。

【0186】

一部の例において、ＡＳＯの各モノマーは、同様に未修飾であるか、又は修飾されており、例えばＡＳＯの主鎖の各結合は、ホスホロチオエート結合を含み、又は各リボース糖部位は２’－Ｏ－メトキシエチル（ＭＯＥ）修飾を含む。ＡＳＯのモノマー成分のそれぞれに存在する修飾は、「均一な修飾」と呼ばれ、ＡＳＯは「完全修飾」と呼ばれる。一部の例において、異なる修飾の組合せが望まれる場合があり、例えば、ＡＳＯが、ホスホロジアミデート結合と、モルホリン環（モルホリノ）を含む糖部位との組合せを含み得る。ＡＳＯに対する異なる修飾の組合せは、「混合修飾」又は「混合化学（mixed chemistry）」と呼ばれる。

【0187】

一部の実施形態において、ＡＳＯは１つ又は複数の主鎖修飾を含む。一部の実施形態において、ＡＳＯは１つ又は複数の糖部位修飾を含む。一部の実施形態において、ＡＳＯは１つ又は複数の主鎖修飾及び１つ又は複数の糖部位修飾を含む。一部の実施形態において、ＡＳＯはＭＯＥ修飾及びホスホロチオエート主鎖を含む。一部の実施形態において、ＡＳＯは２’－Ｏ－メチル修飾及びホスホロチオエート主鎖を含む。一部の実施形態において、ＡＳＯはホスホロジアミデートモルホリノ（ＰＭＯ）を含む。一部の実施形態において、ＡＳＯはペプチド核酸（ＰＮＡ）を含む。一部の実施形態において、ＡＳＯはリボフラノシル又は２’デオキシリボフラノシル修飾を含む。一部の実施形態において、ＡＳＯは２’４’－拘束（constrained）２’Ｏ－メチルオキシエチル（ｃＭＯＥ）修飾を含む。一部の実施形態において、ＡＳＯは、ｃＥｔ２’，４’－拘束２’－ＯエチルＢＮＡ修飾を含む。

【0188】

ＡＳＯのリン酸主鎖を修飾して、ペプチド核酸分子を産生することができる。本明細書で使用される、「ペプチド核酸」又は「ＰＮＡ」という用語は、核酸ミミック（mimic）、例えば、デオキシリボースリン酸主鎖が偽ペプチド（pseudopeptide）主鎖によって置換され、且つ天然核酸塩基４つのみが保持される、ＤＮＡミミックを意味する。ＰＮＡの天然主鎖は、低イオン強度の条件下にて、ＤＮＡ及びＲＮＡとの特異的なハイブリダイゼーションを可能にすることが示されている。ＰＮＡオリゴマーの合成は、例えば標準固相ペプチド合成プロトコルを用いて実施することができる。

【0189】

アンチセンス核酸は、モルホリノオリゴヌクレオチドとして製剤化することもできる。かかる実施形態では、オリゴヌクレオチド試薬のオリゴヌクレオチドの各サブユニットのリボシド部位が、モルホリン部位へと変換される。モルホリノはまた、例えば、ペプチド結合型モルホリノ、ホスホロジアミデートモルホリノ等として修飾され得る。

【0190】

他の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ペプチド（例えば、生体内（in vivo）で宿主細胞受容体を標的化する）などの官能基、又は細胞膜若しくは血液脳関門を横切る輸送を促進する作用薬に連結することができる。開示のオリゴヌクレオチド試薬はまた、オリゴヌクレオチド試薬の生体内での薬理学的特性を向上させる化学部位（例えば、コレステロール）で修飾され得る。開示のオリゴヌクレオチドは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Nagata et al. Nat Biotechnol (2021) https://doi.org/10.1038/s41587-021-00972-xに記載のＤＮＡ／ＲＮＡヘテロ二本鎖オリゴヌクレオチド（ＨＤＯ）としても形成され得る。ＲＮＡ鎖の５’末端でのコレステロール又はα－トコフェロールへの抱合は、皮下又は静脈内投与後にＨＤＯがＣＮＳに到達することを可能にすることが示されている（Nagata et al. 2021）。

【0191】

本明細書に記載のＡＳＯのいずれか又はＡＳＯのいずれかの構成要素（例えば、核酸塩基、糖部位、主鎖）は、ＡＳＯの所望の特性若しくは活性を達成するために、又はＡＳＯの望ましくない特性若しくは活性を低減するために修飾され得る。例えば、ｍＲＮＡ（例えば、ｐｒｅ－ｍＲＮＡ）上の標的配列への結合親和性を高め；非標的配列への結合を低減し；細胞ヌクレアーゼ（つまり、ＲＮａｓｅ Ｈ）による分解を低減し；細胞内及び／又は細胞の核内へのＡＳＯの取り込みを向上させ；ＡＳＯの薬物動態学又は薬力学を変化させ；ＡＳＯの半減期を調節するために、ＡＳＯ又はＡＳＯの１つ若しくは複数の成分が修飾され得る。

【0192】

一部の実施形態において、ＡＳＯは、ＭＯＥ－ホスホロチオエート－修飾ヌクレオチドで構成される。かかるヌクレオチドで構成されるＡＳＯは、本明細書に開示される方法に特によく適しており；かかる修飾を有するオリゴヌクレオチドは、ヌクレアーゼ分解に対して有意に高められた耐性、及び増加したバイオアベイラビリティを有することが示されており、それによって、本明細書に記載の一部の実施形態において、例えば経口、髄腔内、全身送達に適している。例えば、髄腔内注入後^２３に中枢神経系全体に十分に分布される、ＦＤＡ承認薬ヌシネルセン（nusinersen）^２２を参照のこと。

【0193】

ＡＳＯなどのオリゴヌクレオチドを合成する方法は当業者には公知である。その代わりとして又はさらに、ＡＳＯは、商業的供給元から入手され得る。

【0194】

他の方法
別の態様において、細胞においてＲＢＭ３の発現を増加することができるアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）を同定する方法が提供される。その方法は：
ｉ）エクソン３ａ内の領域、エクソン３ａのスプライス部位にわたる領域、エクソン３ａの上流の２５０ヌクレオチド内に位置する領域、及びエクソン３ａの下流の２５０ヌクレオチド内に位置する領域、又は本明細書に記載の領域から選択される領域内で、ＲＢＭ３遺伝子のｐｒｅ－ｍＲＮＡの領域を標的化するＡＳＯを同定する工程と、
ｉｉ）工程ｉ）で同定されたＡＳＯを細胞に送達する工程と、
ｉｉｉ）工程ｉｉ）の細胞におけるＲＢＭ３の発現レベルを測定する工程と、を含む。任意に、その方法はさらに：
ｉｖ）コントロールＡＳＯ又はＤＭＳＯで処理された細胞におけるＲＢＭ３の発現レベルと、工程ｉｉｉ）で測定された発現レベルを比較する工程を含む。ＲＢＭ３の発現のレベルは、転写物レベル又はタンパク質レベルであり得る。発現のレベルは、ＲＴ－ｑＰＣＲ又はウェスタンブロット法によって測定され得る。

【0195】

別段の指定がない限り、一本鎖核酸（例えば、ｍＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、ＡＳＯ等）配列の左巻き末端は５’末端であり、一本鎖若しくは二本鎖核酸配列の左巻き方向は、５’方向とも呼ばれる。同様に、核酸配列（一本鎖又は二本鎖）の右巻き末端又は方向は、３’末端又は方向である。一般に、核酸における基準点に対する５’である領域又は配列は「上流」と呼ばれ、核酸における基準点に対する３’である領域又は配列は「下流」と呼ばれる。一般に、開始（initiation又はstart）コドンは５’付近に位置し、終止コドンは３’末端付近に位置する。

【0196】

特定の態様において、細胞においてＲＢＭ３コード化成熟ｍＲＮＡのナンセンス介在分解を阻害する方法、細胞においてＲＢＭ３の発現を増加／誘導する方法、及び細胞においてＲＢＭ３コード化ｐｒｅ－ｍＲＮＡのスプライシングを調節する方法が提供される。各方法は、作用薬を細胞に曝露することを含み、その作用薬は、本明細書に記載のように、得られる成熟ｍＲＮＡにエクソン３ａが取り込まれないように、ｐｒｅ－ｍＲＮＡのスプライシングを変更するために、ＲＢＭ３のｐｒｅ－ｍＲＮＡの領域とハイブリダイズすることができる。

【0197】

本明細書に記載のように、細胞においてＲＢＭ３コード化成熟ｍＲＮＡのナンセンス介在分解を阻害する方法、細胞においてＲＢＭ３の発現を増加／誘導する方法、及び細胞においてＲＢＭ３コード化ｐｒｅ－ｍＲＮＡのスプライシングを調節する方法は、ＲＢＭ３の発現のレベルを増加することを目的とする。一部の実施形態において、その方法は生体外（in vitro）で実施される。特定の実施形態において、その方法は、冷却することなく実施され、好ましくは、その方法は、≧３４℃、≧３５℃、≧３６℃、又は≧３７℃の温度で実施される。他の実施形態において、これらの方法はそれぞれ、冷却して実施され、好ましくは、その方法は、≦３５℃、≦３４℃、≦３３℃又は≦３２℃の温度で実施される。一部の実施形態において、細胞は中枢神経系の細胞である。一部の実施形態において、細胞は神経細胞、好ましくは１次ニューロンであり、より好ましくは一次海馬神経細胞である。一部の実施形態において、細胞は、星状膠細胞、乏突起膠細胞、小膠細胞、上衣細胞又は脳幹細胞である。特定の実施形態において、細胞はマウス又はヒト細胞である。一部の実施形態において、細胞は生体外（in vitro）又はエクスビボ（ex vivo）の細胞である。

【0198】

本明細書で使用される、「発現」は、遺伝子発現又はタンパク質発現であり得て、したがってＲＢＭ３の転写物のレベル又はＲＢＭ３のタンパク質レベルを定量化することによって測定され得る。

【0199】

遺伝子発現は、例えば、ＲＢＭ３をコードするｍＲＮＡの検出によって決定することができる。ｍＲＮＡレベルを測定又は定量化する方法は当技術分野でよく知られており、例えば、ＲＴ－ＰＣＲ、定量的リアルタイムＰＣＲ（ＲＴ－ｑＰＣＲ）、マイクロアレイ解析、ノーザンブロット解析、ＲＮａｓｅ保護解析、又は例えばRio, D.C., RNA: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2011（その全体が本明細書に組み込まれる）に記載の他のいずれかの適切な方法が挙げられる。

【0200】

タンパク質発現は、例えばタンパク質の検出によって、例えば当業者によく知られている抗体ベースの方法、例えばウェスタンブロット解析、免疫組織化学、免疫細胞化学、フローサイトメトリー、ＥＬＩＳＡ、及び質量分析法、又は例えば、Link, A. J., Proteomics: A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2009（その全体が本明細書に組み込まれる）に記載の他のいずれかの適切な方法などによって決定することができる。

【0201】

本明細書で使用される、「ＮＭＤを阻害する」という用語は、ＮＭＤが起こる程度を（一部又は完全に）低減することを意味する。ＮＭＤを阻害した結果、ＲＢＭ３のｍＲＮＡレベルが増加する。例えば、ＲＢＭ３コード化成熟ｍＲＮＡのＮＭＤを阻害すると、ＲＢＭ３のｍＲＮＡの量が測定可能に増加する。本明細書で使用される、「ＲＢＭ３のｍＲＮＡ」又は「ＲＢＭ３ ｍＲＮＡ」は、ＲＢＭ３遺伝子のすべてのｍＲＮＡアイソフォーム（転写物）を含み、ＲＢＭ３のｍＲＮＡのレベルは、スプライシング感受性ではないＲＢＭ３特異的なＰＣＲプライマーを使用して測定され得る。かかるプライマー対の例を実施例５の表６に示す。

【0202】

ＮＭＤを阻害した結果、作用薬若しくはＡＳＯの非存在下／処置の非存在下でのＲＢＭ３ ｍＲＮＡレベル（例えば、作用薬又はＡＳＯが細胞に存在しない、総レベル）と比較して、又はコントロールＡＳＯでの処置が行われたＲＢＭ３ ｍＲＮＡレベル（例えば、コントロールＡＳＯが細胞に存在する、総レベル）と比較して、ＲＢＭ３ ｍＲＮＡレベルが５％以上、例えば９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、１２５％、１５０％、１７５％、２００％、２５０％、３００％、３５０％、４００％、４５０％、５００％、５５０％、６００％、６５０％、７００％、７５０％、８００％、８５０％、９００％、１０００％又はそれ以上増加する。ＮＭＤを阻害した結果、作用薬若しくはＡＳＯの非存在下／処置の非存在下でのＲＢＭ３ ｍＲＮＡレベル（例えば、作用薬又はＡＳＯが細胞に存在しない、総レベル）と比較して、又はコントロールＡＳＯでの処置が行われたＲＢＭ３ ｍＲＮＡレベル（例えば、コントロールＡＳＯが細胞に存在する、総レベル）と比較して、ＲＢＭ３ ｍＲＮＡレベルが１．０１、１．０５、１．１０、１．２５、１．５０、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、１０倍又はそれ以上増加する。

【0203】

エクソン３ａの包含を阻害することによるＲＢＭ３コード化成熟ｍＲＮＡのＮＭＤの阻害によって、エクソン３ａを含有しないｍＲＮＡアイソフォームのレベルが増加する、つまりエクソン３ａが取り込まれない（エクソン３ａがスキッピングされた）成熟ｍＲＮＡ、又はエクソン３及び４が介在エクソンなしで互いにスプライシングされた成熟ｍＲＮＡが生じる。かかるｍＲＮＡのレベルは、スプライシング感受性ＰＣＲプライマーを使用して測定され得る。エクソン３ａの包含を阻害することによりＮＭＤを阻害した結果、作用薬若しくはＡＳＯの非存在下／処置の非存在下でのレベル（例えば、作用薬又はＡＳＯが細胞に存在しない、総レベル）と比較して、又はコントロールＡＳＯでの処置が行われたレベル（例えば、コントロールＡＳＯが細胞に存在する、総レベル）と比較して、５％以上、例えば９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、１２５％、１５０％、１７５％、２００％、２５０％、３００％、３５０％、４００％、４５０％、５００％、５５０％、６００％、６５０％、７００％、７５０％、８００％、８５０％、９００％、１０００％又はそれ以上、かかるｍＲＮＡのレベルが増加する。ＮＭＤを阻害した結果、作用薬若しくはＡＳＯの非存在下／処置の非存在下でのレベル（例えば、ＡＳＯが細胞に存在しない、総レベル）と比較して、又はコントロールＡＳＯでの処置が行われたレベル（例えば、コントロールＡＳＯが細胞に存在する、総レベル）と比較して、かかるｍＲＮＡのレベルが１．０１、１．０５、１．１０、１．２５、１．５０、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、１０倍又はそれ以上増加する。

【0204】

エクソン３ａの包含を阻害することによるＮＭＤの阻害によって、エクソン３ａの包含頻度（inclusion frequency）が減少する。エクソン３ａの包含頻度は、「スプライスされたパーセント」（ＰＳＩ）として定量化され得て、それは、エクソン３ａが、ＲＢＭ３のアイソフォームのすべての存在量を超えて取り込まれる、ｍＲＮＡのアイソフォームの存在量（abundance）の割合に相当する（×１００％）。２つの条件間でのＰＳＩの差は、「ｄＰＳＩ」と呼ばれ、減算によって計算される（ｄＰＳＩ（％）＝ＰＳＩ_{コントロール}－ＰＳＩ_処置）。翻訳阻害剤を使用して、エクソン３ａ含有ｍＲＮＡが安定化され得て、したがってエクソン３ａ含有ｍＲＮＡの蓄積及び検出が可能となる。翻訳の例示的な阻害剤はシクロヘキシミド（ＣＨＸ）である。エクソン３ａの包含を阻害することによるＮＭＤの阻害によって、作用薬若しくはＡＳＯの非存在下／処置の非存在下での包含レベル（例えば、作用薬又はＡＳＯが細胞に存在しない、ＰＳＩ）と比較して、又はコントロールＡＳＯが細胞に存在する、包含レベル（ＰＳＩ）と比較して、エクソン３ａの包含頻度（ＰＳＩ）が減少し、その減少は、１％以上、例えば２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、又はそれ以上である。

【0205】

エクソン３ａの包含を阻害することによるＮＭＤの阻害によって、タンパク質のレベル、例えばＲＢＭ３の転写物のタンパク質産物レベルが増加する。例えば、エクソン３ａの包含を阻害することによるＲＢＭ３コード化成熟ｍＲＮＡのＮＭＤの阻害によって、ＲＢＭ３ ｍＲＮＡから翻訳され得る総タンパク質の量が測定可能に増加する。タンパク質産物は、切断型（truncated）又は完全長タンパク質であり得る。一部の態様において、エクソン３ａの包含を阻害することによるＮＭＤの阻害によって、作用薬若しくはＡＳＯの非存在下／処置の非存在下でのＲＢＭ３タンパク質レベル（例えば、ＡＳＯが細胞に存在しない、ＲＢＭ３タンパク質の発現レベル）又はコントロールＡＳＯでの処置が行われた場合のＲＢＭ３タンパク質レベルと比較して、５％以上、例えば９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、１２５％、１５０％、１７５％、２００％、２５０％、３００％、３５０％、４００％、４５０％、５００％又はそれ以上、ＲＢＭ３タンパク質レベルが増加する。一部の態様において、エクソン３ａの包含を阻害することによるＮＭＤの阻害によって、作用薬若しくはＡＳＯの非存在下／処置の非存在下でのＲＢＭ３タンパク質レベル、又はコントロールＡＳＯの存在下でのＲＢＭ３タンパク質レベルと比較して、１．０１、１．０５、１．１０、１．２０、１．２５、１．３、１．３５、１．４０、１．４５ １．５０、１．５５、１．６０、１．６５、１．７０、１．７５、１．８０、１．８５、１．９０、１．９５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０倍又はそれ以上、タンパク質レベルが増加する。

【0206】

投与方法
一部の細胞によって取り込まれる「遊離」又は「裸の」ＡＳＯの送達、細胞膜透過性ペプチド（ＣＰＰ，例えば、ＴＡＴ及びアンテナペディアペプチド）にコンジュゲートされたＡＳＯの送達、細胞受容体取り込みのリガンドにコンジュゲートされたＡＳＯ（例えば、ＡＳＯ－コレステロールコンジュゲート、ＡＳＯ－葉酸コンジュゲート、Ｎ－アセチルガラクトサミンコンジュゲート、ＡＳＯ－インスリン様成長因子１コンジュゲート、ＡＳＯ－ＲＧＤペプチドコンジュゲート、ＡＳＯ－ボンベシンコンジュゲート等）の送達、ナノキャリアと結合されたＡＳＯ（例えば、脂質ベースの担体、パーフルオロ炭素ナノ粒子と結合されたＡＳＯ、ＡＳＯ－抗体コンジュゲート等）の送達など、上記で参照されるJulianoらによって記述される方法など様々な方法のいずれかによって個体にＡＳＯを提供することができる。ＡＳＯなどの核酸を送達する他の方法は当技術分野で公知であり、限定されないが、コール酸（Manoharan et al.,Bioorg.Med. Chem. Let., 1994, 4, 1053-1060）、チオエーテル、例えばヘキシル－Ｓ－トリチルチオール（tritylthiol）（Manoharan et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., 1992, 660, 306-309; Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Let., 1993, 3, 2765-2770）、チオコレステロール（Oberhauser et al., Nucl. Acids Res., 1992, 20, 533-538）、脂肪族鎖、例えばドデカンジオール又はウンデシル残基（Saison-Behmoaras et al, EMBOJ., 1991, 10, 1111-1118; Kabanov et al, FEBS Lett, 1990, 259, 327-330; Svinarchuk et al, Biochimie, 1993, 75, 49-54）、リン脂質、例えばジ－ヘキサデシル－ｒａｃグリセロール又はトリエチルアンモニウム１，２－ジ－Ｏ－ヘキサデシル－ｒａｃグリセロ－３－Ｈ－ホスホネート（Manoharan et al. Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651-3654; Shea et al, Nucl. Acids Res., 1990, 18, 3777-3783）、ポリアミン又はポリエチレングリコール鎖（Manoharan et al. Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14, 969-973）、或いはアダマンタン酢酸（Manoharan et al. Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651-3654）、パルミチル部位（Mishra et al, Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264, 229- 237）、或いはオクタデシルアミン又はヘキシルアミノ－カルボニル－オキシコレステロール部位（Crooke et al, J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277, 923-937）との核酸コンジュゲートの形成を含む。

【0207】

疾患又は病状
本発明の方法及び作用薬は、ＲＢＭ３発現によって影響を受ける可能性を有するいずれかの疾患の治療又は予防において有用であり得る。したがって、本発明は、対象においてＲＢＭ３発現によって影響を受ける疾患を治療又は予防する方法で使用される、本明細書に記載の作用薬を提供する。

【0208】

治療上の低体温法は、ＲＢＭ３の発現を誘導することが知られており、本発明の方法及び作用薬は、治療的な低体温を誘導することによって治療又は予防される、いずれかの疾患若しくは病状の治療又は予防において有用であり得る。

【0209】

治療上の低体温は、現在まで研究されている最も強力な神経保護薬の１つである（Yenari M. & Han H., Neuroprotective mechanisms of hypothermia in brain ischaemia. Nature Reviews Neuroscience, 13, 267-278 (2012)）。したがって、一部の実施形態において、疾患は、神経変性疾患又は神経学的損傷若しくは傷害である。一部の実施形態において、疾患は、鬱病又は不安である。一部の実施形態において、本発明の作用薬は、神経保護薬として使用される。例えば、本発明の作用薬は、心臓外科手術若しくは誘導された昏睡中に、又は新生児における低酸素性虚血性脳症の治療において使用され得て、或いは本明細書に記載の疾患若しくは病状を治療又は予防するために神経保護薬として使用され得る。神経保護薬は、神経保護を増加することができる作用薬である。

【0210】

一部の実施形態において、疾患は神経変性疾患である。特定の実施形態において、疾患は、アルツハイマー病、プリオン病、パーキンソン病、前頭側頭型認知症、筋萎縮性側索硬化症、タウオパシー、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、血管性認知症及び関連する障害である。

【0211】

ＲＢＭ３の誘導又は過剰発現は、プリオン病及びアルツハイマー病の動物モデルにおいて保護的である（Peretti et al; Nature 518, pages 236-239 (2015), Peretti et al; Life Science Alliance vol. 4 no. 4 e202000884 (2021）。

【0212】

一部の実施形態において、疾患は神経学的損傷又は傷害である。特定の実施形態において、疾患は脳卒中、頭部又は脳損傷、脊椎損傷、新生児の低酸素性虚血性脳症である。一部の実施形態において、疾患は無酸素性脳損傷である。一部の実施形態において、疾患は、心拍停止によって起こる神経学的損傷である。特定の実施形態において、疾患は、心臓外科手術又は誘導された昏睡中に起こる神経学的損傷である。

【0213】

以下のセクションは、ＲＢＭ３及び／又は誘導された低体温によって影響を受ける、疾患／病状に関連する更なる説明を提供する。

【0214】

治療的低体温は、一次障害を効率的に低減し、急性虚血（Yenari M & Han H、 2012）における二次障害及び脊椎損傷（ＳＣＩ）を効率的に低減することができるだけでなく（Alkabie S, Boileau AJ (2015) The role of therapeutic hypothermia after traumatic spinal cord injury-a systematic review. World Neurosurg. doi:10.1016/j.wneu.2015.1009.1079）、慢性神経変性疾患の進行を遅らせることもできる（Salerian AJ, Saleri NG (2008) Cooling core body temperature may slow down neurodegeneration. CNS Spectr 13(3):227-229）。マウスモデルにおいて、冷却による、上流又は下流のメディエーターを誘導することによる、低体温及びＲＢＭ３の誘導は、プリオン病のマウス及びアルツハイマー病のマウスにおいて極めて神経保護的であり、シナプス数、記憶が回復し、脳細胞死が予防され、生存時間が増加する（Peretti et. al. Nature 2015; Bastide et al., 2017, Current Biology 27, 638-650; Peretti et al. Life Sci Alliance. 2021;4(4):e202000884. doi: 10.26508/lsa.202000884）。生体外において、２つの低温誘導性タンパク質ＣＩＲＰ及びＲＢＭ３の両方が、培養された１次ニューロン又は神経細胞様ＰＣ１２細胞においてアポトーシスに対して機能する［Chip S, et al. (2011) Neurobiol Dis 43(2):388-396; Zhang HT, et al. (2015) Brain Res 1622:474-483; Kita H, et al. (2002) Hum Mol Genet 11(19):2279-2287; Zhu et al. Cell. Mol. Life Sci. (2016) 73:3839-3859）。

【0215】

Yenari M & Han H (2012)は、臨床研究によって、心拍停止が原因の無酸素性脳損傷（Bernard, S. A. et al. Treatment of comatose survivors of out-of-hospital cardiac arrest with induced hypothermia. N. Engl. J. Med. 346, 557-563 (2002); The Hypothermia after Cardiac Arrest Study Group. Mild therapeutic hypothermia to improve the neurologic outcome after cardiac arrest. N. Engl. J. Med. 346, 549-556 (2002)）及び低酸素性虚血性新生児脳症（Gluckman, P. D. et al. Selective head cooling with mild systemic hypothermia after neonatal encephalopathy: multicentre randomised trial. Lancet 365, 663-670 (2005); Shankaran, S. et al. Whole-body hypothermia for neonates with hypoxic-ischemic encephalopathy. N. Engl. J. Med. 353, 1574-1584 (2005)）を含む一部の臨床症状において、神経保護における治療的低体温の役割が証明されたことを論述している。上記の研究によって、脊椎損傷、神経変性疾患、無酸素性脳損傷及び低酸素性虚血性新生児脳症の治療及び予防におけるマウスモデルでの治療的低体温、実験的冷却又は過剰発現によって誘導されるＲＢＭ３の明確な役割が証明される。

【0216】

神経保護作用の他に、高いＲＢＭ３レベルが癌における長期の全生存期間と臨床的に関連している（Avila-Gomez P. et al., Cold stress protein RBM3 responds to hypothermia and is associated with good stroke outcome, Brain Communications, Volume 2, Issue 2, 2020, https://doi.org/10.1093/braincomms/fcaa078）。例えば、長期の全生存期間が、腸型胃癌（Ye FP et al. Med Sci Monit 2017; 23: 6033-41）、浸潤性乳癌（Kang et al., J Breast Cancer 2018; 21: 288-96）及び結腸癌（Jang HH et al., Anticancer Res 2017; 37: 1779-85）、及び転移性結腸直腸癌（Siesing C, et al. PLoS One 2017; 12: e0182512.）を有する患者において確認された。

【0217】

一部の実施形態において、疾患は癌である。特定の実施形態において、癌は胃癌、乳癌、結腸癌又は結腸直腸癌である。

【0218】

本発明は、疾患又は病状の治療又は予防のための方法及び組成物を提供する。

【0219】

病状の治療の文脈において本明細書で使用される「治療」という用語は一般に、いくらかの所望の治療効果、例えば、病状の進行の抑制が達成される、ヒト対象の処置及び療法に関し、且つ進行速度の低減、進行速度の停止、病状の後退、病状の回復、及び病状の治癒を含む。予防的措置（つまり、予防、阻止）としての治療も含まれる。

【0220】

一部の実施形態において、その方法はさらに、本明細書に記載の２種類の作用薬又は２種類のＡＳＯを対象に接触させる、導入する、送達する、又は投与することを含む。

【0221】

本発明による作用薬（例えば、ＡＳＯ）の投与は、好ましくは「治療上有効な」又は「予防的に有効な」量での投与であり、これは、対象に利益を示すのに十分である。

【0222】

本発明で使用される「治療有効量」という用語は、望まれる治療レジメンに従って投与された場合に、妥当な利益／リスク比に見合う、一部の所望の治療効果をもたらすのに有効な作用薬（例えば、ＡＳＯ）の量に関する。

【0223】

同様に、本発明で使用される「予防的に有効な量」という用語は、望まれる治療レジメンに従って投与された場合に、妥当な利益／リスク比に見合う、一部の所望の予防的効果をもたらすのに有効な作用薬（例えば、ＡＳＯ）の量に関する。

【0224】

本明細書の文脈における「予防法」は、完全な成功、つまり完全な保護又は完全な阻止を説明すると理解すべきではない。むしろ本発明の文脈における予防法は、その特定の病状を遅らせる、軽減する、又は避けるのを助けることによって、健康を保つ目的で、症候性状態の検出に先立って施される措置を意味する。

【0225】

治療用途において、本発明の作用薬は好ましくは、当業者によく知られた薬剤として許容される１つ又は複数の他の成分、限定されないが、薬剤として許容される担体、補助剤、賦形剤、希釈剤、充填剤、緩衝剤、保存剤、酸化防止剤、滑沢剤、安定剤、可溶化剤、界面活性剤（例えば、湿潤剤）、マスキング剤、着色剤、香味剤、及び甘味剤と共に医薬品又は薬剤として製剤化される。

【0226】

本明細書で使用される「薬剤として許容される」という用語は、過度な毒性、刺激、アレルギー反応、又は他の問題若しくは合併症なく、当該の対象（例えば、ヒト）の組織と接触して使用するのに適した、健全な医学的判断内にあり、妥当な利益／リスク比に見合う、化合物、成分、材料、組成物、剤形等に関する。

【0227】

各担体、補助剤、賦形剤等はまた、製剤の他の成分と適合性であるという意味で「許容可能」でなければならない。

【0228】

適切な担体、補助剤、賦形剤等は、標準的な薬学テキスト、例えばRemington’s Pharmaceutical Sciences, 18th edition, Mack Publishing Company, Easton, Pa., 1990; and Handbook of Pharmaceutical Excipients, 2nd edition, 1994に記載されている。

【0229】

本発明はさらに、本明細書に記載の作用薬（例えば、ＡＳＯ、ベクター）を含む組成物を提供する。組成物は好ましくは医薬組成物又は医薬品である。

【0230】

本明細書に開示の適切なアンチセンス核酸が、対象に投与され得る。例えば、アンチセンス核酸は、本明細書に記載のＡＳＯであり得る。一部の実施形態において、ＡＳＯは、導入遺伝子から、例えばアンチセンスＲＮＡ転写物として発現される。導入遺伝子は、対象においてアンチセンスＲＮＡ転写物を発現するように遺伝子操作されたＤＮＡ発現コンストラクトで対象に投与され得る。ＤＮＡ発現コンストラクトは、直接、又はウイルスベクター（例えば、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクター）若しくは他の適切なベクターを使用して投与され得る。遺伝子治療プロトコルに使用されているウイルスベクターとしては、限定されないが、レトロウイルス、他のＲＮＡウイルス、例えばポリオウイルス又はシンドビスウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ヘルペスウイルス、ＳＶ４０、ワクシニア、レンチウイルス及び他のＤＮＡウイルスが挙げられる。代替方法としては、導入遺伝子はエクスビボ（ex vivo）で発現され得て、その結果得られるアンチセンスＲＮＡ転写物が対象に直接投与され得る。

【0231】

本明細書に開示される、いずれかの適切なポリヌクレオチド（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓベースの塩基編集システムをコードするポリヌクレオチド）が対象に投与され得る。例えば、本明細書に記載されるように一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓベースの塩基編集システムが１つ又は複数の導入遺伝子から発現され、対象においてＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓベースの塩基編集システムを発現するように遺伝子操作されたＤＮＡ発現コンストラクトで対象に投与され得る。ＤＮＡ発現コンストラクトは、直接又はウイルスベクター（例えば、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクター）若しくは他の適切なベクターを使用して投与され得る。遺伝子治療プロトコルに使用されているウイルスベクターとしては、限定されないが、レトロウイルス、他のＲＮＡウイルス、例えばポリオウイルス又はシンドビスウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ヘルペスウイルス、ＳＶ４０、ワクシニア、レンチウイルス及び他のＤＮＡウイルスが挙げられる。

【0232】

本明細書に開示されるように、アンチセンス核酸（それらを発現するために使用され得るＤＮＡ発現コンストラクトを含む）が、適切な経路によって投与され得る。療法での使用については、アンチセンス核酸（例えば、オリゴヌクレオチド）及び／又は他の治療薬の有効量が、目的の組織に作用薬を送達するいずれかの形式によって対象に投与され得る。一部の実施形態において、作用薬（例えば、ＡＳＯ）は、髄腔内又は全身投与される。他の適切な投与経路としては、限定されないが、経口、非経口、筋肉内、静脈内、腹腔内、鼻腔内、舌下、気管内、吸入、皮下、経眼、経腟、及び経直腸投与が挙げられる。全身経路は経口及び非経口経路を含む。いくつかのタイプのデバイスが、吸入による投与のために定期的に使用される。これらのタイプのデバイスとしては、定量噴霧式吸入器（ＭＤＩ）、呼吸作動式（breath-actuated）ＭＤＩ、ドライパウダー吸入器（ＤＰＩ）、ＭＤＩ及びネブライザーと組み合わせたスペーサー／保持チャンバが挙げられる。

【0233】

経口投与に関しては、当技術分野でよく知られている薬剤として許容される担体と有効化合物を組み合わせることによって、作用薬を容易に製剤化することができる。かかる担体によって、処置される対象によって経口摂取される、錠剤、丸剤、糖衣丸、カプセル剤、液剤、ゲル剤、シロップ剤、スラリー剤、懸濁剤等として、開示の作用薬を製剤化することが可能となる。経口使用のための医薬製剤は、任意に所望の場合に、錠剤又は糖衣丸コアを得るために、適切な助剤を添加した後、得られた混合物を粉砕し、顆粒の混合物を処理して、固体賦形剤として得ることができる。適切な賦形剤は、特に充填剤、例えばラクトース、ショ糖、マンニトール、又はソルビトールなどの糖；セルロース調製物、例えば、トウモロコシデンプン、コムギデンプン、コメデンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチン、トラガカントゴム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、及び／又はポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）などである。所望の場合には、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、又はアルギン酸、又はその塩、例えばアルギン酸ナトリウムなど、崩壊剤が添加され得る。任意に、経口製剤はまた、生理食塩水中で、又は内部酸条件を中和する緩衝液中で製剤化され得て、又は担体なしで投与され得る。

【0234】

経口で使用することができる医薬製剤としては、ゼラチン製の押し込み式カプセル、並びにゼラチン及びグリセロール又はソルビトールなどの可塑剤で製造された密閉ソフトカプセルが挙げられる。押し込み式カプセルは、ラクトースなどの充填剤、デンプンなどの結合剤及び／又はタルク若しくはステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤、及び任意に安定剤との混合物で有効成分を含有し得る。ソフトカプセル剤において、作用薬は、適切な液体、例えば脂肪油、流動パラフィン、又は液体ポリエチレングリコール中に溶解又は懸濁され得る。さらに、安定剤が添加され得る。経口投与用に製剤化される微小球も使用され得る。かかる微小球は、当技術分野において明確に定義されている。経口投与用の製剤は通常、かかる投与に適した投薬量である。

【0235】

口腔投与に関しては、組成物は、従来の方法で製剤化された錠剤又はトローチ剤の形を取り得る。

【0236】

吸入による投与に関して、本開示に従って使用される作用薬（例えば、アンチセンス核酸）は、適切な噴射剤、例えばジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素又は他の適切なガスを使用して、加圧式パック又はネブライザーからエアロゾルスプレーの形態で便利に送達され得る。加圧式エアロゾルの場合、投薬単位は、計量された量を送達するバルブを提供することによって決定され得る。吸入器又は注入器（insufflator）で使用される、例えばゼラチン製のカプセル及びカートリッジは、化合物と、ラクトース又はデンプンなどの適切な粉末ベースとの粉末混合物を含有して製剤化され得る。

【0237】

それらを全身に送達することが望ましい場合に、作用薬（例えば、アンチセンス核酸）は、注入による、例えば、ボーラス注入又は持続注入による非経口投与用に製剤化され得る。注入用の製剤は、保存剤が添加された、例えばアンプル又は複数回量容器で単位剤形をとり得る。組成物は、油性若しくは水性賦形剤中の懸濁液、溶液又はエマルジョンなどの形態を取り得て、懸濁化剤、安定化剤及び／又は分散剤などの製剤化剤（formulatory agent）を含有し得る。

【0238】

対象
対象は動物又はヒトであり得る。対象は好ましくは哺乳類、より好ましくはヒトである。対象は非ヒト哺乳動物であり得るが、より好ましくはヒトである。対象は男性又は女性であり得る。対象は患者であり得る。患者は、本明細書に記載の疾患／病状を有し得る。対象は、治療を必要とする疾患／病状と診断され得て、かかる疾患／病状を有すると疑われるか、又はかかる疾患／病状を発症するリスクがあり得る。

【0239】

配列

【0240】

【表7】

【0241】

【表8】

【0242】

【表9】

【0243】

【表10】

【0244】

【表11】

【0245】

ここで本発明の態様及び実施形態は、添付の図面に関して論述される。更なる態様及び実施形態は当業者には明らかであるだろう。この本文に記載のすべての文書は参照により本明細書に組み込まれる。

【0246】

上述の明細書に、又は以下の特許請求の範囲において、又は添付の図面において開示される特徴であって、その具体的な形態で、又は開示の機能を実施する手段の点から表される特徴、或いは必要に応じて開示の結果を得るための方法又はプロセスは、かかる特徴を別々に、又はかかる特徴のいずれかの組合せで、その多様な形態を現実化するために用いられ得る。

【0247】

本発明は、上述の例示的な実施形態と共に記述されているが、この開示内容を想定すれば、多くの等しい修飾及び変更が当業者には明らかであるだろう。したがって、上記の本発明の例示的な実施形態は、説明的及び非制限的であるとみなされる。本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、上述の実施形態に様々な変更が加えられ得る。

【0248】

不確かさを回避するために、本明細書で提供される理論的説明は、読者の理解を高める目的で提供される。本発明者らは、これらの理論的説明のいずれかよっても束縛されることを望まない。

【0249】

本明細書で使用されるセクションの表題は、単に構造化する目的のためであり、記載の主題を制限すると解釈すべきではない。

【0250】

以下の特許請求の範囲を含めて、本明細書全体を通して、特に文脈で必要とされない限り、「含む（comprise）」及び「包含する（include）」という用語、並びに「含む（comprises）」、「含む（comprising）」及び「包含する（including）」などのバリエーションは、他のいずれかの整数若しくは工程、又は整数若しくは工程のグループの除外ではなく、指定の整数若しくは工程、又は整数若しくは工程のグループの包含を意味すると理解されるだろう。

【0251】

明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される、単数形の「１つ」、「１種類」及び「その」は、文脈に明確に別段の指定がない限り、複数指示物を包含することを留意しなければならない。範囲は、本明細書において「約」の１つの特定の値から、及び／又は、までの「約」の別の特定の値として表され得る。かかる範囲が表される場合、別の実施形態は、その１つの特定の値から、及び／又は、までの他の特定の値を包含する。同様に、先行の「約」の使用によって、値が近似値として表される場合、特定の値は別の実施形態を形成することが理解される。数値に関して「約」という用語は任意であり、例えば＋／－１０％を意味する。

【0252】

図面の概要
本発明の原理を説明する実施形態及び実験は、添付の図面に関して考察される。

【図面の簡単な説明】

【0253】

【図1A】Ｒｂｍ３イントロン３は、進化上保存された熱誘導ポイズンエクソンを含有する。図１Ａは、Ｒｂｍ３イントロン３内の新たなエクソン（Ｅ３ａ；７つの未成熟終止コドンを有する：ＰＴＣ）を同定するSashimiプロットを示す。マウス一次肝細胞を翻訳阻害剤シクロヘキシミド（ＣＨＸ，溶媒コントロールとしてのＤＭＳＯ）と共に、又はなしで３４℃若しくは３８℃にてインキュベートし、ＲＮＡシーケンシングによって解析した。簡略化したエクソン－イントロン構造の下に、Sashimiプロットから、シーケンシング生リード数（ｙ軸における）の分布が示される。エクソン－エクソンジャンクション（exon-exon junction）のリード数（reads）は、エクソンを連結する数によって示される。エクソン３ａは、ＣＨＸ中で３８℃にて主に包含されることに留意のこと。下部に、胎盤種（placental species）わたって高い配列保存が示される。

【図1B】Ｒｂｍ３エクソン３ａの調節は、ヒトにおいて保存される。ＨＥＫ２９３細胞は、方形波温度サイクル（１２時間３４℃／１２時間３８℃）で４８時間予め同調化された（１Ｂ）。最後の２４時間の間、細胞を４時間ごとにＤＭＳＯ又はＣＨＸで処理し、４時間後に収集し、スプライシング感受性ＲＴ－ＰＣＲによって解析した。

【図1C】細胞を指定の温度で１２時間インキュベートし（ＤＭＳＯ／ＣＨＸ 最後の４時間）、スプライシング感受性ＲＴ－ＰＣＲによって解析した。対応のないｔ検定によって統計的有意性を決定し、アスタリスクによって示す：ｐ値：^＊ｐ＜０．０５，^＊＊ｐ＜０．０１，^＊＊＊ｐ＜０．００１（ｎ＝３，平均±ＳＤ）。

【図1D】Ｒｂｍ３の遺伝子発現は、エクソン３ａの包含と逆相関する。Ｒｂｍ３に対する１００万個当たりの転写物（ＴｐＭ）値が、指定の時点で１２時間インキュベートされたＨＥＫ２９３細胞からのＲＮＡシーケンシングデータから誘導され、右のｙ軸にプロットされる（薄い灰色，ｎ＝２，平均±ＳＤ）。エクソン３ａの包含レベルは１Ｃから誘導される。

【図1E】配列番号５及び配列番号６の配列アライメントを示す。マウスＲＢＭ３エクソン３ａが、ＧＲＣｍ３９参照ゲノム染色体Ｘ８０１０６８４～８０１０４１４（配列番号５）に位置する。ヒトＲＢＭ３エクソン３ａが、ＧＲＣｈ３８参照ゲノム染色体Ｘ４８５７５８１５～４８５７６０８３（配列番号６）にある。両方の配列を表１に示す。

【図1F】ＮＭＤ因子のノックダウン及びレスキュー実験に応じてのＲｂｍ３エクソン３ａの安定化を示す。シーケンシングデータをＳＲＰ０８３１３５１７から得た^１７。

【図2A】Ｒｂｍ３エクソン３ａは、温度依存性のＲＢＭ３発現を制御する。ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ９は、Ｒｂｍ３エクソン３ａの除去を仲介した。上流のイントロンを標的化する２つのガイドＲＮＡ（＃１，＃２）のうちの１つが、下流イントロンを標的化するガイドＲＮＡ（＃３）と同時トランスフェクトされた。以下に、ＨＥＫ２９３のクローン選択（clonal selection）後のジェノタイピングＰＣＲを示す。クローン選択後のｐｘ４５９トランスフェクト細胞は、ネガティブコントロールとしての役割を果たす。

【図2B】編集細胞系におけるＲｂｍ３レベルのＲＴ－ｑＰＣＲ（２Ｂ）を示す。図２Ａからのクローン細胞系を３５℃又は４０℃で２４時間インキュベートした。単離ＲＮＡをｑＰＣＲによって調べ、Ｒｂｍ３発現が、ＧＡＰＤＨレベルに対して示される（ｎ＝２～３）。

【図2C】編集細胞系におけるＲｂｍ３レベルのウェスタンブロット（２Ｃ）解析を示す。２Ｃにおいて、独立した実験からのライセートをＲｂｍ３タンパク質発現について調べ、ｈｎＲＮＰ Ｌは、ローディングコントロールとしての役割を果たした。

【図2D】３７℃又は３９℃で２４時間インキュベートされた編集細胞系におけるＲｂｍ３レベルのウェスタンブロット解析を示す。ライセートをＲｂｍ３タンパク質発現について調べ、ｈｎＲＮＰ Ｌは、ローディングコントロールとしての役割を果たした。

【図2E】モルホリノを用いたＲｂｍ３エクソン３ａスプライシングの操作はＲｂｍ３発現レベルを直接コントロールする。エクソン３ａの３’ｓｓ又は５’ｓｓのいずれかをブロックするモルホリノを、ＨＥＫ２９３細胞に３７℃で４８時間トランスフェクトした。Ｒｂｍ３発現は、ＧＡＰＤＨレベルに対して示され、非標的化ＣＴＲＬモルホリノに正規化される。対応のないｔ検定によって統計的有意性を決定し、アスタリスクによって示す：ｐ値：^＊＊ｐ＜０．０１（ｎ＞４）。

【図2F】ブロッキングモルホリノを介したＲｂｍ３エクソン３ａ包含のブロッキングは、Ｒｂｍ３タンパク質レベルを誘導する。ＨＥＫ２９３細胞（２Ｆ）に、指定のモルホリノを４８時間トランスフェクトした。ＨＥＫ２９３細胞を最後の２４時間、３９℃にシフトした。Ｒｂｍ３タンパク質レベルをウェスタンブロット法によって調べた。ｈｎＲＮＰ Ｌ又はＧＡＰＤＨはローディングコントロールとしての役割を果たした。

【図2G】Ｎ２Ａ細胞（２Ｇ）に、指定のモルホリノを４８時間トランスフェクトした。Ｎ２Ａ細胞を指定の温度（３５℃、３７℃又は３９℃）で最後の２４時間インキュベートした。

【図2H】ＴＧ００３によるＣＬＫ１／４キナーゼの阻害が、Ｒｂｍ３発現に対する温度の作用を無効にする。Whippet誘導ＴｐＭ値が、ＤＭＳＯ（３５℃）に対して示される。これは、３５℃対３９℃の６時間ＤＭＳＯと比較して、Ｒｂｍ３レベルの差がほぼ２倍であることを明らかにする。これは、３９℃から３５℃へのシフト中にＴＧ００３を添加することによって本質的に消失することを留意のこと。Haltenhof et al,2020からのデータ。

【図3A】ミニ遺伝子突然変異誘発によって、Ｒｂｍ３エクソン３ａ包含をコントロールするシス調節エレメントのマッピングが可能となる。Ｅ３からＥ４の未短縮配列全体（上流の３’ｓｓ及び下流５’ｓｓを含む）を含有するミニ遺伝子構造を示す。

【図3B】Ｒｂｍ３ミニ遺伝子は、温度制御されるエクソン３ａ包含を再現する。マウスのみからのミニ遺伝子、又はマウス及びヒトからのミニ遺伝子をＨＥＫ２９３（３Ｂ）にトランスフェクトし、１２時間を超える時間、指定の温度でインキュベートした。エクソン３ａの包含をスプライシング感受性ＰＣＲによって調べた。代表的なゲル画像を示す（上部）。アスタリスクは、エクソン３ａにおける１０７位のヌクレオチドにて選択的３から誘導される産物をマークする。ＨＥＫ２９３におけるＮＭＤアイソフォーム形成の定量化を示す（下部）（ｎ＝３；対応のないｔ検定により誘導されたｐ値^＊＊ｐ＜０．０１，^＊＊＊ｐ＜０．００１）。

【図3C】マウスのみからのミニ遺伝子、又はマウス及びヒトからのミニ遺伝子をマウスＮ２Ａ細胞（３Ｃ）にトランスフェクトし、１２時間を超える時間、指定の温度でインキュベートした。Ｎ２ＡにおけるＮＭＤアイソフォーム形成の定量化を示す（ｎ＝３；対応のないｔ検定により誘導された^＊＊ｐ＜０．０１，^＊＊＊ｐ＜０．００１）。

【図3D】マウスミニ遺伝子における調節因子の系統的突然変異スクリーニングを示す。ヒトβ－グロビンからの配列によって指定の配列（３Ｄ）を置き換えた（Ｍ３は、エクソン３ａのヌクレオチド１０７にて内部選択的３’ｓｓを含有し（アスタリスク及び線で示す）、Ｍ６は５’ｓｓを含有し、残りの異性体はエクソン２配列を含有する）。加熱してエクソンスキッピングを生じる変異は灰色で強調される（Ｍ２及びＭ４）。

【図3E】ＨＥＫ２９３及びＮ２Ａ細胞における、３３℃及び３９℃での変異体Ｍ１～Ｍ６におけるＮＭＤエクソン包含の解析（３Ｅ）を示す。

【図3F】Ｍ２領域の詳細な変異スクリーニングを示す。Ｍ２欠失（del）において、Ｍ２配列が除去される（及び置換されない）（３Ｆ）。Ｍ２－１からＭ２－９において、指定の配列がヒトβ－グロビン配列によって置換される。

【図3G】３９℃でＨＥＫ２９３に図３Ｆの各変異体をトランスフェクトした後の、代表的なＰＣＲイメージを示す（３Ｇ）。エクソンスキッピング（Ｍ２、Ｍ２欠失、Ｍ２－２、Ｍ２－３、Ｍ２－４、Ｍ２－６、Ｍ２－７及びＭ２－９）を生じる変異は灰色で強調される。

【図3H】Ｍ２領域（左に示す境界）及びＭ４領域（右に示す境界）の詳細な変異スクリーニングを示す。Ｍ２又はＭ４欠失（del）において、Ｍ２又はＭ４配列が除去される（及び置換されない）。Ｍ２－１からＭ２－９又はＭ４－１からＭ４－７において、指定の配列が、同じ相対的位置からのヒトβ－グロビンエクソン２配列によって置換される。上に、代表的なＰＣＲイメージを示す。下に、検出されたアイソフォームの定量化を示す（ｎ＝２）。

【図3I】指定のミニ遺伝子の温度応答を示す。３Ｉにおいて、本発明者らは、Ｍ２及びＭ４配列の置換を用いた。

【図3J】３Ｊにおいて、本発明者らは、Ｍ２及びＭ４領域の進化上保存されたコアを欠失させた。簡潔には、Ｍ２－２及びＭ２－３は、ヒトとマウスの間で１００％保存された。したがって、Ｍ２－２及びＭ２－３は、ｈＲＢＭ３ミニ遺伝子において次いで欠失する、Ｍ２エンハンサーのコア配列としてみなされる。Ｍ４領域については、Ｍ４－３は、保存された配列の中心領域である。したがって、Ｍ４－５及びＭ４－４の上流配列の一部は、ｈＲＢＭ３ミニ遺伝子におけるＭ４変異のコア配列として欠失した。

【図3K】調節因子の系統的突然変異スクリーニングを示す。３７℃及び３９℃でのＨＥＫ２９３におけるＥ３ａ％の倍変化の分析（平均±ＳＤ，ｎ＝２）。

【図4A】Ｒｂｍ３発現をコントロールするオリゴヌクレオチドのスクリーニングを示す。エンハンサーエレメントＭ２－９（左下）、エンハンサーエレメントＭ４－７（右下）又は５’ｓｓのいずれかを標的化するオリゴヌクレオチドがデザインされた。Ｍ２－９は、エクソン３ａヌクレオチド４２～７１に相当し、Ｍ４－７は、ヌクレオチド１５２～１７１に相当する。

【図4B】Ｎ２Ａ細胞における効率的なＲｂｍ３誘導を示す。ＡＳＯは約２４時間トランスフェクトされ、Ｒｂｍ３誘導がＣＴＲＬ ＡＳＯ（表６参照）に対して、及びＨＰＲＴ発現に対して測定された。３９℃でのＲｂｍ３発現に対する、Ｍ２－９エレメントを標的化するオリゴヌクレオチドの効果を示す。

【図4C】３９℃でのＲｂｍ３発現に対する、Ｍ４－７エレメントを標的化するオリゴヌクレオチドの効果を示す。

【図4D】３９℃でのＲｂｍ３発現に対する、５’ｓｓエレメントを標的化するオリゴヌクレオチドの効果を示す。

【図4E】３９℃でのＲｂｍ３発現（同じＣＴＲＬ試料）に対する２つのオリゴヌクレオチド（ＭＯＥとＭ２Ｄ、ＭＯＥとＭ２Ａ、及びＭ２ＤとＭ２Ａ）の組合せの効果を示す。

【図4F】非トランスフェクト細胞（Ｎ２Ａ＿３７℃）での、追加のコントロールを含む、３７℃でのＲｂｍ３発現に対するＭＯＥ及びＭ２Ｄの効果を示す。

【図4G】非トランスフェクト細胞（Ｎ２Ａ＿３７℃）での、追加のコントロールを含む、３７℃でのＲｂｍ３発現に対するＭＯＥ＋２の効果を示す。

【図4H】Ｍ２Ｄｂ配列に相当するモルホリノオリゴヌクレオチドは、用量依存的な様式（濃度：０．５、１及び３μＭ）で；３７℃及び３９℃の両方にてＲＢＭ３発現を誘導する（灰色で強調される）。モルホリノを４８時間トランスフェクトした。

【図4I】ＰＳ及びＭＯＥ修飾Ｍ２Ｄａが、ヒトＨＥＫ２９３細胞においてＲｂｍ３発現を効率的に誘導する。Ｍ２Ｄａは、ＲＢＭ３発現を１．５倍誘導した。

【図4J】Ｍ２ＤはＲｂｍ３ ｍＲＮＡ発現を誘導する。ＡＳＯが、ヒトヒーラ細胞において３７℃又は４０℃にて２４時間トランスフェクトされた。Ｒｂｍ３の誘導が、ＣＴＲＬ ＡＳＯに対して３７℃で、及びＧＡＰＤＨ発現に対して測定された（平均±ＳＤ，ｎ＝３，個々のすべてのデータポイントが示される；対応のないｔ検定で誘導されたｐ値^＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。

【図5A】エクソン３Ａを標的化するＡＳＯの生体内（in vivo）投与によって、ＲＢＭ３発現が誘導され、冷却することなく脳におけるエクソン３Ａ包含が低減される。Ｍ２Ｄ、Ｍ２Ｄｂ、ＭＯＥ＋２及びＭ４Ｄ、スクランブルコントロールＡＳＯ（ＳＣＲＭ）及びＰＢＳのみで処理した後の、ＲＢＭ３レベルを示すウェスタンブロットを示す。ｎ＝２匹のマウス／条件。脳室内注入によりスクランブル又はＲＢＭ３ ＡＳＯ１００μｇをマウスに投与した。注入後３週間で、ウェスタンブロットによって海馬のＲＢＭ３レベルを解析した。

【図5B】図５Ｃのウェスタンブロットからの、ＰＢＳ注入コントロールマウスに対するＲＢＭ３レベルの定量化を示す。マウス２匹／群。

【図5C】ＡＳＯ（３００μｇ）が、生体内でＲＢＭ３タンパク質発現を誘導する。２匹の独立したマウス／病状からの海馬試料をウェスタンブロット（上）によって解析し、アクチン及びＰＢＳに対してＲＢＭ３タンパク質を定量化した（下，ｎ＝２）。

【図5D】Ｍ２、Ｍ４又は５’ｓｓを標的化するＡＳＯは、生体内でＥ３ａ包含を低減する（用量３００μｇ／マウス）。２匹の独立したマウス／病状からの小脳ＲＮＡ試料をスプライシング感受性ＲＴ－ＰＣＲによって解析し、Ｅ３ａ％シグナルを定量化した（ｎ＝２）。

【図6A】Ｒｂｍ３エクソン３ａは、温度依存性のＲＢＭ３発現をコントロールする（追加のデータ）。図２Ａに関して、及び実施例２に記述されるように、ＲＢＭ３ Ｅ３ａのＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ９介在除去を実施した。ＣＨＸ処理Ｈｅｋ２９３細胞におけるＲＴ－ＰＣＲによって、ＲＮＡレベルでのΔＥ３ａクローンにおけるＥ３ａのＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ９介在除去が確認される。

【図6B】編集細胞系におけるＲｂｍ３レベルのＲＴ－ｑＰＣＲ（６Ｂ）解析を示す。６Ａからのクローン細胞系を指定の温度で２４時間インキュベートした。６Ｂにおいて、単離ＲＮＡをｑＰＣＲによって調べ、Ｒｂｍ３発現がＧａｐｄｈレベルに対して示される。

【図6C】編集細胞系におけるＲｂｍ３レベルのウェスタンブロット（６Ｃ）解析を示す。代表的なウェスタンブロットが、検出されるＲＢＭ３タンパク質を示す。

【図6D】編集細胞系におけるＲｂｍ３レベルのウェスタンブロット（６Ｄ）解析を示す。独立した実験からのライセートをＲＢＭ３タンパク質発現ついて調べ、ｈｎＲＮＰ Ｌは、ローディングコントロールとしての役割を果たした（平均±ＳＤ，ｎ＝６（３／クローン，黒色／灰色で示される），個々のすべてのデータポイントを示す）。対応のないｔ検定によって統計的有意性が決定され、アスタリスクによって示される^＊ｐ＜０．０５，^＊＊＊ｐ＜０．００１，^＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。

【図7A】ヒトＲｂｍ３発現を制御するオリゴヌクレオチドのスクリーニングを示す（表７に示すヒトＡＳＯ）。Ｍ２－９、Ｍ４－７又は５’ｓｓを標的化するＡＳＯ（図７Ｂ参照）は、ヒトヒーラ細胞においてＲｂｍ３ Ｅ３ａ包含を防ぐ。ＡＳＯトランスフェクト細胞を４０℃で２４時間維持した。３７℃及び４０℃のコントロール試料を示す；ＣＨＸを最後の４時間添加した。スプライシング感受性ＲＴ－ＰＣＲによって、エクソン３ａの包含を調べ、代表的なゲル及びホスフォイメージャー（phosphor imager）定量化を示す（平均±ＳＤ，ｎ＝３）。アスタリスクは、Ｍ４領域を標的化するすべてのＡＳＯによって促進される内部５’及び３’ｓｓの使用をマークする。５’ｓｓを標的化するＡＳＯは、内部５’ｓｓの利用を誘導した（２つのアスタリスクによってマークされる）。

【図7B】Ｍ２－９、Ｍ４－７又は５’ｓｓを標的化するＡＳＯは、ヒトヒーラ細胞においてＲｂｍ３ Ｅ３ａの包含を防ぐ。ＡＳＯトランスフェクト細胞を４０℃で２４時間維持した。３７℃及び４０℃のコントロール試料を示す；ＣＨＸを最後の４時間添加した。スプライシング感受性ＲＴ－ＰＣＲによって、エクソン３ａの包含を調べた。定量化が示される（ｎ＝２；すべてのＭ２Ｄバリアント及びＭ２Ｅについて、ｎ＝５，Ｍ４Ｂについて、ｎ＝１）。アスタリスクは、Ｍ４領域を標的化するすべてのＡＳＯによって促進される内部５’及び３’ｓｓの使用をマークする。Ｍ２Ｄ領域を標的化するすべてのバリアントが、３７℃にてコントロール細胞で確認されるレベルよりも低いレベルまで、Ｅ３ａの包含を防ぐことに留意のこと。

【図7C】図７Ｂにおけるエクソン３ａの包含を定量化するために使用された代表的なゲルを示す。

【図7D】図７Ｂにおけるエクソン３ａの包含を定量化するために使用された代表的なゲルを示す。

【図8A】Ｍ２Ｄは、海馬ＲＢＭ３レベルを上昇させ、生体内で非常に神経保護的である。実験デザインの概略図を示す。プリオン接種ｔｇ３７＋／－マウスに、Ｍ２Ｄ又はスクランブルＡＳＯ２００μｇを接種後３週（w.p.i.）にて注入した。

【図8B】スクランブルされたＡＳＯ又はＭ２Ｄで処理されたプリオン感染マウスからの海馬ライセートのウェスタンブロットを示す。Ｍ２Ｄは、ＡＳＯの注入から９週後、接種後１２週（w.p.i.）にて、スクランブル処理されたマウスと比較して、ＲＢＭ３発現を２倍増加する。

【図8C】スクランブル又はＭ２Ｄ－ＡＳＯでさらに処理された、正常な脳ホモジネート（ＮＢＨ）又はプリオン処置マウスからのヘマトキシリン及びエオシン染色脳スライスの代表的なイメージを示す。スクランブル処理されたマウスがプリオン徴候に対して選別された際に、スライスを接種後１２週にて調製した。Ｍ２Ｄは、ＣＡ１－３錐体細胞層の保存と共に海馬における顕著な神経保護、海馬全体の収縮からの保護、並びに海綿状変性の低減を付与する。

【図8D】ＮＢＨに対してスクランブル処理及びＭ２Ｄ処理プリオンマウスにおける錐体神経細胞のＮｅｕＮカウントを示す。Ｍ２Ｄは、ＮＢＨマウスで見られるレベル付近まで神経保護を付与する。

【図8E】ＮＢＨ、スクランブル処理及びＭ２Ｄ処理プリオンマウスにおける海綿状態の半定量的スコアリングを示す。海綿状態の徴候を示さないセクションを０と評点付けし、重症の海綿状態を４と評点付けした（White et al., 2008）。Ｍ２Ｄは、スクランブル処理プリオンマウスと比較して海綿状態を有意に低減した。

【発明を実施するための形態】

【0254】

実施例
以下の実施例において、本発明者らは、本明細書においてエクソン３ａと呼ばれる、予め注釈付けされていないＲｂｍ３エクソンが、ＲＢＭ３の熱誘導されたスプライシング結合ナンセンス介在分解（ＮＭＤ）の原因であることを実証する。本発明者らはさらに、ＲＢＭ３の発現を制御するために標的化することができる特異的領域をマッピングする。ＲＢＭ３発現の増加は、これらの領域を標的化するアンチセンスオリゴヌクレオチドによって達成された。

【0255】

実施例１：Ｒｂｍ３イントロン３は、進化上保存された熱誘導ポイズンエクソンを含有する。
意外なことに、マウス一次肝細胞ＲＮＡシーケンシングデータの、より焦点を合わせた解析から、本発明者らの初期の包括的解析を免れた、進化上保存されたイントロン３内の未注釈のエクソン（エクソン３ａ，Ｅ３ａ）が明らかとなった（図１Ａ）。このエクソンは、冷たい温度（３４℃）にて存在せず、温かい温度（３８℃）で検出可能であり、ＣＨＸにおけるエクソン３－エクソン３ａ及びエクソン３ａ－エクソン４ジャンクションリード数のより多い数（ＤＭＳＯ中で３８℃にて６７及び２８に対して、ＣＨＸ中で３８℃にて２９０及び２４０）によって実証されるシクロヘキシミド（ＣＨＸ）を介したＮＭＤ阻害で強く安定化し、より高いリード密度（read density）は、３８℃のＤＭＳＯに対してＣＨＸにおけるエクソン３ａに相当する（図１Ａ）。エクソン３ａは７つの未成熟終止コドン（ＰＴＣ）を含有する（図１Ａ，上部）。

【0256】

高い進化的保存との一致（図１Ａ，下部）、及びヒトにおけるほぼ同一のエクソン３ａ配列、温度制御されたＲＢＭ３エクソン３ａの包含が、ヒトＨＥＫ２９３細胞において見出された（図１Ｂ、１Ｃ及び１Ｅ）。ＲＢＭ３エクソン３ａは、外部方形波温度リズムに急速に応答し（３８℃のより高い温度に曝露して４時間以内に）（図１Ｂ）、したがって、概日体温リズムに応じてＲＢＭ３発現をコントロールすることができた^９，１６。さらに、エクソン３ａの包含は、３３℃～３９℃の生理的に関連する温度範囲内で温度応答性であり（図１Ｃ及び１Ｄ）、高度に温度感受性のＲＢＭ３発現と相関する。ＲＢＭ３エクソン３ａの包含は、穏やかな熱ショック温度（３９℃）で特に顕著であり、したがって、発熱（febrile）温度でＲＢＭ３発現の低減に関与し得る。

【0257】

エクソン３ａ内の７つのＰＴＣの存在（図１Ａ）及び翻訳阻害剤ＣＨＸの添加での強い安定化（ＮＭＤは、翻訳連結（translation-coupled）プロセスである）から、エクソン３ａアイソフォームがＮＭＤ介在分解を受けることが示唆される。ＮＭＤ経路による分解の更なる証拠を提供するために、本発明者らは、ＮＭＤ因子ノックダウンに応じてのエクソン３ａ安定化を調べた^１７。ＵＰＦ１は、ＰＣＴ含有ｍＲＮＡに結合し、ＳＭＧ６及びＳＭＧ７などのＮＭＤ因子のリクルートメント、及びＮＭＤ活性化複合体へのその組み立て（assembly）を促進する。

【0258】

ＮＭＤ介在分解と一致すると、ＲＢＭ３エクソン３ａアイソフォームは、ＵＰＦ１、ＳＭＧ６又はＳＭＧ７ノックダウンで安定化され、ＳＭＧ６／７ダブルノックダウンで劇的に安定化される（ＮＭＤアイソフォーム約７５％）（図１Ｆ）。エクソン３ａの安定化は、レスキュー実験（ｓｉ＿Ｓｍｇ６＋７＋Ｓｍｇ７、ｓｉ＿Ｓｍｇ６＋７＋Ｓｍｇ６）において逆戻りされ得る。Ｓｍｇ６レスキュー試料における逆戻りが高いほど、試料は、エクソン３ａアイソフォームのＳＭＧ７依存性ＮＭＤ分解よりも顕著なＳＭＧ６依存性ＮＭＤ分解を示す。

【0259】

要約すれば、エクソン３ａの包含がより高い温度で確認され、ＮＭＤ介在分解が起こることから、ＲＢＭ３における未注釈のポイズンエクソン、エクソン３ａが熱誘導スプライシング結合ＮＭＤの原因であると、これらのデータによって同定される。したがって、ＲＢＭ３の低温誘導発現は、ポイズンエクソン３ａの熱依存性包含に起因し得る。

【0260】

実施例２：Ｒｂｍ３エクソン３ａは温度依存性ＲＢＭ３発現をコントロールする。
ＲＢＭ３エクソン３ａが温度制御されるＲＢＭ３発現に関与するかどうかを調べるために、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９介在ゲノム編集を用いて、ＲＢＭ３エクソン３ａを欠く細胞系を作成した。クローン選択後、別々のガイドＲＮＡ対ｓｇＲＮＡ＃２とｓｇＲＮＡ＃３、及びｓｇＲＮＡ＃１とｓｇＲＮＡ＃３（図２Ａ）から誘導された２つのホモ接合型細胞系が得られた。ｐｘ４５９空ベクタートランスフェクト細胞から作製されたコントロール細胞系は、強い、温度制御ＲＢＭ３ ｍＲＮＡ及びタンパク質発現を示したが、これはエクソン３ａを欠く細胞系ではほぼ抑制された（図２Ｂ及び２Ｃ、及び図６Ｂ、６Ｃ及び６Ｄ）。加熱での強いエクソン３ａ包含と一致して（実施例１参照）、コントロール細胞系と比べて、エクソン３ａを欠く細胞系におけるＲＢＭ３タンパク質発現の増加は、加熱でより顕著であるが（図２Ｃ及び２Ｄ）；３７℃でさえも、エクソン３ａの除去はＲＢＭ３発現を誘導する（図２Ｄ）。

【0261】

重要なことには、Ｅ３ａを欠く細胞系は、Ｒｂｍ３温度感受性を失うだけでなく、コントロール細胞では低温のみで達成される一定の高いＲｂｍ３発現レベルを示した。これらのデータから、ＮＭＤに結合された温度制御選択的スプライシングは、生理的に関連する温度範囲でＲｂｍ３発現レベルを制御する主要なメカニズムである。Ｒｂｍ３発現に対する温度の作用が、阻害されたＣＤＣ様キナーゼを有する条件において強く低減されるため（ＣＬＫ；Haltenhof et al., 2020 及び図２Ｈ）、ＳＲタンパク質の温度依存性リン酸化は、この調節に寄与する可能性がある（Preussner et. al., Body Temperature Cycles Control Rhythmic Alternative Splicing in Mammals. Mol. Cell 67, 433-446.e434 (2017). https://doi.org:10.1016/j.molcel.2017.06.006; Haltenhof et al., A Conserved Kinase-Based Body-Temperature Sensor Globally Controls Alternative Splicing and Gene Expression. Mol. Cell, 78, 57-69.e4 (2020)）。

【0262】

次に、スプライス部位ブロッキングモルホリノを使用して、ＲＢＭ３エクソン３ａの包含をブロックし、遺伝子発現レベルに対する作用を直接測定した。エクソン３ａの３’スプライス部位又は５’スプライス部位のいずれかを標的化するモルホリノが、ＨＥＫ２９３においてＲＢＭ３ ｍＲＮＡレベルを誘導し、ｍＲＮＡレベルを１０倍まで誘導したため、５’スプライス部位ブロッキングモルホリノはより強い作用を有する（図２Ｅ）。モルホリノはまた、３９℃（図２Ｆ）及び３７℃（図２Ｇ）でＲＢＭ３タンパク質発現を誘導し、Ｅ３ａのスプライシングを標的化することによって、Ｒｂｍ３発現をトランス（trans）に制御することができることが確認される。

【0263】

総合して、これらのデータは、スプライシング制御ＲＢＭ３発現の強い証拠を提供し、冷却することなく、ＲＢＭ３発現の治療的増加のための標的としてエクソン３ａを同定する。

【0264】

実施例３：ミニ遺伝子突然変異誘発によって、Ｒｂｍ３エクソン３ａ包含を制御するシス調節エレメントのマッピングが可能となる。
選択的スプライシング（非生産的）を操作する一方法は、アンチセンスオリゴヌクレオチドの使用である。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、広い治療的可能性を有し^{１８，１９}、エクソンスキッピングを誘導するために使用されている^{２０，２１}。したがって、最も強力なアンチセンスオリゴヌクレオチドのデザインには、徹底的なスクリーニングが必要である場合が多い。アンチセンスベースの治療法のための潜在的な標的部位を狭めるため、本発明者らは、ミニ遺伝子解析で開始した。ミニ遺伝子の状況において、ミニ遺伝子が翻訳されないため、ＮＭＤアイソフォームは分解されない。ミニ遺伝子によって、系統的突然変異誘発解析でシス調節エレメントを解読することが可能となる。

【0265】

ＲＢＭ３エクソン３から４を含むヒト又はマウスゲノム配列（図３Ａ）をミニ遺伝子にクローン化し、ヒトＨＥＫ２９３又はマウスニューロンＮ２Ａ細胞にトランスフェクトした後、ミニ遺伝子スプライシングを解析した（図３Ｂ及び３Ｃ）。ミニ遺伝子のエクソン３ａ含有ＮＭＤアイソフォームが温かい温度で検出され（図３Ｂ）、内因性スプライシングと同様に、ミニ遺伝子スプライシングは段階的に温度に応答し（図３Ｂ，下部）、種間で識別不可能であり（図３Ｃ）、ミニ遺伝子が、温度制御選択的スプライシングに必要とされるすべてのシス調節エレメントを含有することを示している。エクソン３ａに対して内部であり、且つエクソン３ａのヌクレオチド１０７に位置する、選択的３’ｓｓ（参考のため、図１Ｅ参照）によって、図３Ｂにおいてアスタリスクによって示される、エクソン３ａの一部、つまり１０８～２７１位のヌクレオチドの温度依存性の取り込みが起こる。

【0266】

５０ヌクレオチド窓をヒトβ－グロビン配列で置き換える突然変異誘発のスクリーニングから、窓Ｍ２及びＭ４での２つの強いエンハンサーエレメントが明らかとなった（図３Ｄ及び３Ｅ）。本発明者らは、３’ｓｓの下流の領域（Ｍ１）、内部３’ｓｓに近い領域（Ｍ３）、及び５’ｓｓの上流の領域（Ｍ６）におけるサイレンサーエレメントも同定した（図３Ｄ、３Ｅ及び３Ｋ）。興味深いことに、内部選択的３’スプライス部位（ｍ３）又は５’スプライス部位（ｍ６）を含む配列の変異後のみ、エクソン３ａの包含が、冷たい温度で可能になる（図３ＥにおけるＭ３、Ｍ６）。したがって、これらの配列は、冷たい状態で（in cold）エクソン３ａの包含を防ぐ、強いサイレンサーエレメントを含有する。それと対照的に、変異ｍ２及びｍ４は、熱を加えた場合でさえ、エクソン３ａの包含を防ぎ、したがって、エンハンサーエレメントがコードされる（図３ＥにおけるＭ２、Ｍ４）。重要なことには、ｍ２配列の欠失もまた、エクソン３ａの包含を止め、且つこれらの置換の結果、加熱状態でエクソンスキッピングが起こるため、より小さな置換（Ｍ２－１からＭ２－９）から、ヌクレオチド４２～７１内のエンハンサーエレメントの位置（図３Ｆ及び３ＧにおけるＭ２－２、Ｍ２－３、Ｍ２－４及びＭ２－９に相当する）が明らかとなった。Ｍ２又はＭ４エンハンサー配列の欠失（置換の代わりに）もまた、エクソン３ａの包含を止め、且つより小さな置換から、第２の同様に強いエンハンサーエレメントとして、Ｍ４領域におけるヌクレオチド１４２～１７１内のエンハンサーエレメント及び具体的にはヌクレオチド１５２～１７１のエンハンサーエレメント（本明細書においてＭ４－７と呼ばれる）の位置が明らかとなった（図３Ｈ）。

【0267】

さらに、エンハンサーＭ２又はＭ４の変異（その進化上保存されたコアの欠失）は、温度に対するスプライシング応答を強力に低減する（図３Ｉ及び３Ｊ）。

【0268】

「Ｍ２コア」は、エクソン３ａのヌクレオチド４２～６１位に位置し、且つ配列ｇｇｃｇａｃｇａｃｔｇｇｔｃｃｔｇｃａｔ（配列番号８８）に相当する。

【0269】

「Ｍ４コア」は、エクソン３ａのヌクレオチド１４６～１６０位に位置し、且つ配列ｇｇａｃｃｔｃｇｔｇａｇｔｃｔ（配列番号８９）に相当する。

【0270】

エクソン３ａのヌクレオチド４２～７１位（Ｍ２－９領域）及び１５２～１７１位（Ｍ４－７領域）の同定されたエンハンサーエレメントは、エクソン３ａの包含を防ぐために標的化され得る。

【0271】

実施例４：Ｒｂｍ３発現を制御するオリゴヌクレオチドのスクリーニング
エンハンサーエレメントを含む領域として、Ｍ２におけるヌクレオチド４２～７１（Ｍ２－９）及びＭ４におけるヌクレオチド１５２～１７１（Ｍ４－７）を同定したミニ遺伝子解析に基づいて（実施例３）、これらの領域に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）が開発され、スクリーニングされた。さらに、エクソン３ａの５’スプライス部位のブロッキングがＲｂｍ３タンパク質レベルを誘導することを示すモルホリノ実験に基づいて（実施例２及び図２Ｅ～２Ｇ参照）、エクソン３ａの５’スプライス部位に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドがスクリーニングされた。図４Ａは、Ｍ２－９を標的化する７つのオリゴヌクレオチドの配列、Ｍ４－７を標的化する４つのオリゴヌクレオチドの配列、及びエクソン３ａの５’ｓｓを標的化する３つのオリゴヌクレオチドの配列を示す。

【0272】

試験されたＡＳＯは、ＦＤＡ承認薬ヌシネルセン（nusinersen）^２２と同様に、均一な２’－Ｏ－メトキシエチル（ＭＯＥ）修飾塩基とホスホロチオエート（ＰＳ）修飾主鎖を併せ持ち、それによって、髄腔内注入後の中枢神経系全体への分布が可能となるはずである^２３。ＰＳ／ＭＯＥ化学、並びにモルホリノ化学（実施例２で使用されるように）は、生体内での全身送達にも使用され得る^２４。

【0273】

Ｎ２Ａ細胞に、各ＰＳ／ＭＯＥ修飾ＡＳＯを約２４時間トランスフェクトし、Ｒｂｍ３誘導が、コントロールＰＳ／ＭＯＥ修飾ＡＳＯ（ＣＴＲＬ）に対して、及びＨＰＲＴ発現に対して測定された。アンチセンスオリゴヌクレオチドの配列を表６に示す。

【0274】

【表12】

【0275】

【表13】

【0276】

Ｍ２領域におけるエンハンサーエレメントを標的化する、試験された７つすべてのＡＳＯ、及びＭ４領域に対する試験された４つすべてのＡＳＯが、Ｎ２Ａ細胞において３９℃でＲＢＭ３レベルを増加し、Ｍ２Ｄ及びＭ４ＤＡＳＯバリアントで少なくとも２倍の増加であった（それぞれ図４Ｂ及び４Ｃ）。

【0277】

５’スプライス部位を標的化するＡＳＯもまた、２倍までＲＢＭ３レベルを増加した（ＭＯＥ，図４Ｄ）。その効果は、延長されたＡＳＯ ＭＯＥｌｏｎｇＡ及びＭＯＥｌｏｎｇＢによって改善されない。

【0278】

Ｍ２標的化（Ｍ２Ｄ）と５’ｓｓ標的化（ＭＯＥ）ＡＳＯを合わせることによって、ＲＢＭ３レベルが４倍を超えるレベルで増加した（図４Ｅ）。様々なＭ２標的化ＡＳＯ（Ｍ２Ａ）とＭＯＥの組合せによって、ＲＢＭ３レベルが約２倍増加し、Ｍ２ＡとＭ２Ｄの組合せもそうであった。

【0279】

選択されたＡＳＯの効果がそれより低い温度（３７℃）で試験された。Ｍ２ＤとＭＯＥのどちらも、３７℃でさえＲＢＭ３レベルを約２倍増加する（図４Ｆ）。Ｍ２Ｄは、３９℃でＲＢＭ３レベルのより高い増加を導き、それは、Ｍ２Ｄによって標的化されたエンハンサーエレメントが、温度が高いと、活性が高くなることを示す。重要なことには、Ｍ２Ｄ ＡＳＯは、３７℃でコントロール細胞において確認されるレベルまで、４０℃でＲｂｍ３発現を誘導し、また３７℃でＲｂｍ３発現を２倍誘導している（図４Ｊ）。

【0280】

マウスＮ２Ａ細胞もまた、ＭＯＥ＋２と呼ばれるＭＯＥの２－ヌクレオチドシフトバリアントを保有するＡＳＯで処理された（表６参照）。Ｍ２Ｄ及びＭＯＥのように、ＭＯＥ＋２は、３７℃でＲＢＭ３発現を２倍誘導する（図４Ｇ）。

【0281】

要約すると、この実験から、エクソン３ａ Ｍ２、Ｍ４又は５’ｓｓを標的化するＡＳＯは、Ｎ２Ａ細胞においてＲＢＭ３のｍＲＮＡ及びタンパク質レベルを増加することが実証され、ＡＳＯが生体内での適用に有望であると同定される。ＡＳＯ Ｍ２Ｄ、Ｍ２Ｄｂ、Ｍ４Ｄ及びＭＯＥ＋２が、実施例７に記載の生体内での研究に選択された。

【0282】

マウスＮ２Ａ細胞は、Ｍ２Ｄｂの配列に相当する異なる修飾（モルホリノ；ＭＯ＿Ｍ２Ｄｂ）を保有するＡＳＯで処理された（表４に、また表６にも示す）。このＡＳＯは、３７℃及び３９℃にて用量依存的な様式でＲＢＭ３発現を誘導し、３μＭにてＲＢＭ３発現の１．５倍を超える増加を達成する（図４Ｈ）。

【0283】

ＨＥＫ２９３細胞に、ＰＳ及びＭＯＥ修飾Ｍ２Ｄａもトランスフェクトした。Ｍ２Ｄａは、３７℃にてＲＢＭ３発現の１．５倍の増加を導いた（図４Ｉ）。

【0284】

ヒトヒーラ細胞におけるＭ２Ｄの効果と共に（図４Ｊ）、ヒトＨＥＫ２９３におけるこれらの実験は、エクソン３ａＭ２を標的化するモルホリノ及び／又はＰＳ及びＭＯＥ修飾ＡＳＯもまた、ヒト細胞においてＲＢＭ３の発現を有意に誘導することができることを示す。

【0285】

実施例５：ヒトＲＢＭ３においてエクソン３ａの包含を制御する、ヒトＡＳＯ配列のスクリーニング
ヒトｒｂｍ３エクソン３ａのＭ２－９、Ｍ４－７又は５’ｓｓを標的化するＡＳＯが、ミニ遺伝子解析に基づいてデザインされ、それを表７に示す。ＡＳＯスクリーニングを実施し、ヒーラ細胞におけるＥ３ａ包含を防ぐ、ヒトｒｂｍ３におけるそれぞれのエンハンサー又は５’ｓｓを標的化する、いくつかのＡＳＯが同定された（図７Ａ及び７Ｂ～７Ｄ、及び表７）。Ｍ４領域又は５’ｓｓを標的化するＡＳＯによって、選択的３’又は５’スプライス部位が部分的に利用され、Ｍ２Ｄ領域を標的化するすべてのバリアントがＥ３ａ包含を定量的に止める（図７Ｄ）。

【0286】

このデータから、ヒトＲＢＭ３エクソン３ａ、具体的にＭ２－９領域を標的化するＡＳＯは、エクソン３ａの包含の阻害に、及びヒト細胞におけるＲＢＭ３発現に有望な作用薬であり、且つ潜在的な治療的用途を有する。

【0287】

【表14】

【0288】

【表15】

【0289】

実施例６：実施例１～４で使用された材料及び方法
ＲＮＡ－Ｓｅｑ解析及びバイオインフォマティクス
マウス一次肝細胞ＲＮＡからのシーケンシングデータをＧＳＥ１５８８８２下で登録する^５。Ｕｐｆ１、Ｓｍｇ６及びＳｍｇ７のノックダウン及びレスキュー後の、ヒーラ細胞からのシーケンシングデータをＳＲＰ０８３１３５から入手した^１７。STAR version 2.5.3a^２５を用いて、参照ゲノム（マウスに対してｍｍ１０，ヒトに対してｈｇ３８）に対するリードのマッピングを実施した。保存スコアをさらに表示するggsashimi^２６のカスタマイズ版を使用して、ＲＢＭ３Sashimiプロットを作成した。ノックダウン及び欠失後のＲＢＭ３エクソン３ａのスプライスされたパーセント（ＰＳＩ）値を手作業で、ジャンクションリード数から計算した。

【0290】

組織培養細胞
ＨＥＫ２９３Ｔ及びＮ２Ａ細胞ストックを液体窒素中で維持し、初期継代アリコートを一定間隔で解凍した。マイコプラスマ（Mycoplasma）汚染を除外するために、ＰＣＲベースのアッセイを用いて、細胞形態を日常的に評価し、毎月チェックする。１０％ＦＢＳ及び１％ペニシリン／ストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ高グルコース中で、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を培養した。１０％ＦＢＳ及び１％ペニシリン／ストレプトマイシンを含む５０％OptiMEM／５０％OptiMEM Glutamax中でＮ２Ａ細胞を培養した。上述のように（Peretti et al. Life Sci Alliance. 2021;4(4):e202000884. doi: 10.26508/lsa.202000884）、マウス海馬神経細胞を単離した。すべての細胞系を通常、３７℃及び５％ＣＯ_２に維持した。

【0291】

温度実験に関して、予め平衡化されたインキュベータ内に指定の時間、細胞を移動した。方形波温度サイクルで、本発明者らは、３４℃及び３８℃に設定された２つのインキュベータを使用し、細胞を１２時間ごとに移動した^２７。

【0292】

Rotifect（Roth）を用いたＨＥＫ２９３Ｔ又はＮ２Ａ細胞のトランスフェクション（ミニ遺伝子又はＣＲＩＳＰＲガイドのための）を製造元の説明書に従って実施した。シクロヘキシミド（Sigma）を最終濃度４０μｇ／ｍｌにて、又は溶媒コントロールとしてＤＭＳＯを使用した。

【0293】

モルホリノ実験では、細胞をシーディングし、製造元のマニュアルに従ってEndoporterを使用して、１日後にトランスフェクトした。モルホリノ（Ｒｂｍ３ ５’ｓｓ：ＧＴＣＴＣＣＣＣＴＧＣＴＡＣＴＡＣＴＴＡＣＡＴＣＴ（配列番号３６）；３’ｓｓ：ＣＣＴＣＣＡＣＣＣＣＣＴＡＧＡＡＣＡＧＡＡＧＧＣＡ（配列番号６０）；及び標準コントロール）及びEndoporterトランスフェクション試薬をGene Toolsから購入した。

【0294】

ＰＳ／ＭＯＥ修飾アンチセンスオリゴヌクレオチド（１μｌ，１００ｎｇ／μｌ）をMycrosynthから購入し、RotifectによってＮ２Ａ細胞又はＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトし（１２ウェルプレート上で３^＊１０^６細胞／ウェル）、次いで４時間後に、トランスフェクトされたＮ２Ａ細胞を３９℃（又は３７℃）インキュベータ内に移し、２４時間後にＲＮＡ抽出及びＲＴ－ｑＰＣＲを行った。

【0295】

マウスエクソン３ａ Ｍ２－９（ＭＯ＿Ｍ２Ｄｂ）を標的化するモルホリノを、３７℃及び３９℃で０．５、１及び３μＭにて４８時間、Ｎ２Ａ細胞にトランスフェクトした。

【0296】

ＲＴ－ＰＣＲ及びＲＴ－ｑＰＣＲ
ＲＴ－ＰＣＲを上述のように行った^２８。簡潔には、RNATri（Bio&Sell）を用いてＲＮＡを抽出し、ＲＮＡ１μｇを遺伝子特異的なＲＴ反応で使用した。エクソン３における放射性標識されたフォワードプライマー（５’－ＴＣＡＴＣＡＣＣＴＴＣＡＣＣＡＡＣＣＣＡ（配列番号７））及びエクソン５におけるリバースプライマー（５’－ＴＣＴＡＧＡＧＴＡＧＣＴＧＣＧＡＣＣＡＣ（配列番号８））で内因性ＲＢＭ３スプライシングを解析した。

【0297】

ミニ遺伝子スプライシングの解析のために、ＲＮＡをさらにＤＮａｓｅＩで消化し、再精製した。ミニ遺伝子スプライシングをミニ遺伝子特異的なプライマーで調べた：
Ｔ７ｆｗｄ：５’－ＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＡＣＣＣ（配列番号６１）；
ＢＧＨｒｅｖ：５’－ＴＡＧＡＡＧＧＣＡＣＡＧＴＣＧＡＧＧ（配列番号６２）。

【0298】

ｑＲＴ－ＰＣＲのために、１つのＲＴ反応においてＲｂｍ３遺伝子特異的なプライマーをハウスキーピング遺伝子リバースプライマーと合わせた。次いで、Stratagene Mx3000P装置でBlue S’Green qPCR Kit Separate ROX（Biozym）を使用して、ｑＰＣＲを９６ウェル形式で実施した。ｑＰＣＲを技術上の２つ組で実施し、平均値を用いて、ハウスキーピング遺伝子（ヒト：ＧＡＰＤＨ；マウス：ＨＰＲＴ）に対して発現を正規化し；ＤＣＴ、及びＤ（ＤＣＴ）を異なる条件に対して算出した。

【0299】

【表16】

【0300】

ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９編集細胞の作製及びＲｂｍ３発現の解析
ＨＥＫ２９３細胞におけるゲノムエンジニアリングに関して、Ｒｂｍ３のエクソン３ａにフランキングする配列をｓｇＲＮＡ候補についてイン・シリコ（in silico）でBenchlingツールを使用して解析した。エクソンの上流及び下流の最高ランクの候補ｓｇＲＮＡ^２９のオリゴヌクレオチド対を合成し、ＰＸ４５９ベクターでサブクローニングした。
ｓｇＲＮＡ配列＃１：５’－ＴＧＴＧＴＣＴＧＣＴＣＧＧＧＧＣＡＧＣＧ（配列番号１１）；
ｓｇＲＮＡ配列＃２：５’－ＣＣＴＧＴＧＡＧＴＧＧＧＣＡＣＴＧＣＧ（配列番号１２）；
ｓｇＲＮＡ配列＃３：５’－ＴＣＣＴＧＡＴＧＡＡＧＣＣＡＴＴＣＴＧ（配列番号１３）。

【0301】

製造元の説明書に従って、Rotifect（Roth）を使用して、６ウェルプレートでガイドＲＮＡ＃３、及び＃１又は＃２のいずれかを細胞に同時トランスフェクトした。トランスフェクションから４８時間後に、１μｇ／ｍｌピューロマイシンでトランスフェクト細胞を選択し、希釈によってクローン細胞系を単離した^２９。ＤＮＡ抽出バッファー（２００ｍＭトリス／ＨＣｌ ｐＨ８．３，５００ｍＭ ＫＣｌ，５ｍＭ ＭｇＣｌ_２，Ｈ_２Ｏ中に０．１％ゼラチン）を使用して、ゲノムＤＮＡを抽出し、ＤＮＡレベルでエクソンノックアウトを確認するために、切断部位の上流及び下流のイントロン（ＦＷＤ：５’－ＡＴＣＴＧＣＡＧＡＧＧＧＡＣＣＴＴＧＴＣ（配列番号６３）；ＲＥＶ：５’－ＣＡＧＡＣＴＴＧＣＣＴＧＣＡＴＧＡＴＣＣ（配列番号６４））におけるプライマー結合を用いてジェノタイピングＰＣＲを実施した。有望なクローンにおいて、エクソン３における１つのフォワードプライマー及びエクソン４における１つのリバースプライマーを用いて、スプライシング感受性ＰＣＲによって、ＲＮＡを単離した後に、エクソンノックアウトがさらに確認された（データは示されていない）。Ｒｂｍ３総発現レベルをＲＴ－ｑＰＣＲ及びウェスタンブロットによって調べた。

【0302】

ウェスタンブロット
プロテアーゼ阻害剤ミックス（アプロチニン、ロイペプチン、バナデート（Vanadat）及びＰＭＳＦ）が補充された溶解バッファー（２０ｍＭトリス（ｐＨ８．０）、２％ＮＰ－４０（ｖ／ｖ）、０，０１％デオキシコール酸ナトリウム（ｗ／ｖ）、４ｍＭ ＥＤＴＡ及び２００ｍＭ ＮａＣｌ）で、全細胞抽出物（ＷＣＥ）を調製した。製造元の説明書に従ってRotiNanoquant（Roth）を使用して濃度を決定した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びウェスタンブロット法は標準手順に従った。ImageQuant TLソフトウェアを使用して、ウェスタンブロットを定量化した。以下の抗体をウェスタンブロットに使用した：ｈｎＲＮＰＬ（４Ｄ１１，Santa Cruz）、Ｒｂｍ３（１４３６３－１－ＡＰ，proteintech）、Ｇａｐｄｈ（ＧＴ２３９，GeneTex）。

【0303】

ミニ遺伝子コンストラクト
ＨｉｎｄＩＩＩ及びＸｈｏＩ部位を導入するＰＣＲ、及びｐｃＤＮＡ３．１（＋）中へのライゲーションを用いて、クローニングを実施した。エクソン３の上流のイントロンにおけるフォワードプライマー（マウス：５’－ＡＡＴＴＴＡＡＧＣＴＴｃｔｇｔｇｇｃｔｇｔｇｃｃｔｇｇｃｔ（配列番号６５）；ヒト：５’－ＡＡＣＴＴＡＡＧＣＴＴＴＣＣＧＧＣＣＡＣＣＣＴＴＴＧＣＴＡＣ（配列番号６６））、エクソン４の下流のイントロンにおけるリバースプライマー（マウス：５’－ＡＡＴＴＴＣＴＣＧＡＧｔｔｃａｇａｃａｔａｇｇｃｔｃｔｔａａｃａｔｔ（配列番号６７）；ヒト：５’－ＴＡＧＡＣＴＣＧＡＧＡＴＡＧＧＣＡＡＣＴＣＴＣＣＣＴＣＴＣＡＣ（配列番号６８））及び鋳型としてヒト又はマウスＤＮＡ；を用いて、コンストラクトをクローニングした。

【0304】

ｍＲｂｍ３変異及びサブ変異クローニングのそれぞれについて、変異配列を欠失させるか、又はヒトβ－グロビンからの配列によって置換した（Ｍ３は３’ｓｓを含有し、Ｍ６は５’を含有し、残りの異性体はエクソン２配列を含有する）。簡潔には、変異を導入するＰＣＲプライマー対を用いてｍＲｂｍ３ミニ遺伝子から、２つのＤＮＡ断片を増幅した。次いで、これら２つのＤＮＡ断片をＰＣＲに鋳型として使用し、完全長ｍＲｂｍ３変異体を得た。すべてのミニ遺伝子配列が、シーケンシング（Microsynth SeqLab）によって確認された。

【0305】

実施例７：エクソン３Ａを標的化するＡＳＯはマウスにおいてＲＢＭ３発現を誘導する
７．１ 結果
忍容性の研究は、４つの異なるＲＢＭ３標的化ＡＳＯ（Ｍ２Ｄ、Ｍ２Ｄｂ、ＭＯＥ＋２及びＭ４Ｄ）及びスクランブルコントロール（ＳＣＲＭ）、並びにＰＢＳコントロールのみの注入を含んだ。各ＡＳＯについてｎ＝２である。サンプリング前の３週間、ＡＳＯの投与^１に伴う有害作用（不安定な歩調、体重減少、発作等）なく、用量３０μｇ、１００μｇ及び３００μｇ／マウスはすべて忍容性がよかった。

【0306】

有効性：すべてのＡＳＯは、各用量でウェスタンブロットによって実証されるように、海馬におけるＲＢＭ３発現を１．５倍まで増加し（図５Ａ、５Ｂ及び５Ｃ）、Ｅ３ａ包含レベルの低減と相関する（図５Ｄ）。

【0307】

ＡＳＯによって見られるこのアップレギュレーションは、冷却した場合のＲＢＭ３レベルと同様であり、複数のモデルにおいて神経が保護されることが示されている^２－４。Ｍ２Ｄｂで見られる作用の欠如は、このＡＳＯの安定性若しくは薬物動態学が原因で有効性を欠いているか、又は試験された数が少ないことが反映され得る。

【0308】

手短に言えば、ＲＢＭ３エクソン３Ａに対して異なる領域に相補的である、ＲＢＭ３標的化ＡＳＯ（Ｍ２Ｄ、ＭＯＥ＋２及びＭ４Ｄ）は、低体温で起こる同様なレベルまで、冷却することなくマウスにおいてＲＢＭ３発現を誘導する。

【0309】

参考文献
1. A. L. Southwell et al., In vivo evaluation of candidate allele-specific mutant huntingtin gene silencing antisense oligonucleotides. Molecular therapy: the journal of the American Society of Gene Therapy 22, 2093-2106 (2014).
2. A. Bastide et al., RTN3 Is a Novel Cold-Induced Protein and Mediates Neuroprotective Effects of RBM3. Curr Biol 27, 638-650 (2017).
3. D. Peretti et al., RBM3 mediates structural plasticity and protective effects of cooling in neurodegeneration. Nature 518, 236-239 (2015).
4. D. Peretti et al., TrkB signaling regulates the cold-shock protein RBM3-mediated neuroprotection. Life science alliance 4, (2021).

【0310】

７．２ 材料及び方法
ＡＳＯの投与
すべてのＡＳＯ（Merck）を滅菌ＰＢＳ中で最終体積１０μｌに希釈し、指定の用量（３０μｇ、１００μｇ又は３００μｇ）で左側脳室への脳室内注入によって、これをマウスに送達した。脳定位固定フレームに載せる前にイソフルランを使用して、最初にマウスに麻酔をかけた。露出された頭皮及び頭蓋骨の中心線に沿って切開した。ブレグマ（Bregma）から前方０．３ｍｍ及び側方１ｍｍにて頭蓋骨に小さな穴をドリルで開けて、Hamilton 33Gニューロシリンジを、頭蓋骨の表面下３ｍｍに下げ、ＡＳＯを１分間にわたり注入し、注入の中止から２分後にゆっくりと針を除去した。外科的回復前に、頭部創傷を接着剤で閉鎖した。サンプリング前の３週間、マウスを毎日モニターした。脊椎脱臼によってマウスを殺し、脳をすぐに解剖してチューブに入れ、液体窒素中でフラッシュ凍結した。採取された試料は：海馬、前頭前皮質及び小脳であった。

【0311】

試料の調製
プロテアーゼ及びホスファターゼ阻害剤（Roche）が補充されたＲＩＰＡバッファー（５０ｍＭトリス（ｐＨ８），５０ｍＭ ＮａＣｌ，１％ＩＧＥＰＡＬ，０．５％デオキシコール酸ナトリウム，０．１％ＳＤＳ）（Sigma）３５０μＬ中に氷上で海馬を溶解した。試料を４℃で超音波処理し、次いで１３，０００ｒｐｍにて１０分間遠心して壊死組織片を除去した。ビシンコニン酸（ＢＣＡ）アッセイ（Pierce）を用いて、タンパク質濃度を決定した。

【0312】

ウェスタンブロット法
ライセート１５μｇをＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分離し、０．２μｍニトロセルロース膜上に移し、５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）中でブロッキングした。膜をＲＢＭ３抗体（１：２０００，Proteintech）と共に一晩インキュベートした。ローディングコントロールとしてアクチンを使用した（１：５０００，細胞シグナル伝達）。BioRad ChemiDocでブロットをイメージングし、ImageJを使用して定量化した。

【0313】

実施例８：ＡＳＯ処理は、海馬ＲＢＭ３レベルを高め、且つ顕著に神経保護的である
神経変性の進行に対する、冷却及びＲＢＭ３過剰発現の効果（Peretti, 2015; Bastide, 2017. Curr. Biol. 27, 638-650, doi:10.1016/j.cub.2017.01.047; Peretti, 2021）、並びに多くの他の介入（Mallucci, 2003. Science (New York, N.Y.) 302, 871-874, doi:10.1126/science.1090187）の効果を試験するために、広範に使用されているモデルにおいて、プリオン病におけるＡＳＯ介在Ｅ３ａ包含の治療的可能性を試験した。

【0314】

ヘミ接合ｔｇ３７＋／－マウスは、野生型レベルと比べて、プリオンタンパク質（ＰｒＰ）を約３倍過剰発現する（Mallucci, 2002 EMBO J. 21, 202-210, doi:10.1093/emboj/21.3.202）。Rocky Mountain Laboratory（ＲＭＬ）プリオンを接種した場合に、これらのマウスは急速なインキュベーション時間を示し、接種後わずか１２週で病に倒れ、海馬ＣＡ１－３領域などの脳全体に急速進行性の広範な神経変性を有する（Mallucci, 2002）。

【0315】

ＰＢＭ３レベルをブーストするための初期の冷却（接種後３週にて）、又は海馬へのＲＢＭ３のレンチウイルス送達は、プリオン疾患ｔｇ３７マウスとアルツハイマー病５ｘＦＡＤマウスの両方で顕著に神経保護するのに対して、ＲＢＭ３のＲＮＡｉは、冷却の保護効果を無くす（Peretti, 2015）。

【0316】

冷却の非存在下でのＥ３ａスキッピングを介したＲＢＭ３発現のＡＳＯ介在誘導が同様に神経保護的であるかどうかに取り組むために、本発明者らは、Ｍ２Ｄ又はスクランブルされたＡＳＯコントロール２００μｇでプリオン疾患ｔｇ３７マウス（ｎ＝８）を処置した（図８Ａ；この用量は、１００及び３００μｇの有効な用量の平均として選択された）。

【0317】

ＡＳＯは、本発明者らの以前の介入の時点と一致する、接種後３週にて単回脳室内注入によって送達された（初期の冷却、又はＬＶ－ＲＢＭ３，Peretti, 2005）。すべてのスクランブルＡＳＯ処置マウスがプリオン病に倒れた場合に、Ｍ２Ｄ／スクランブルＡＳＯで処置されたマウスを接種後１２週にて神経保護について解析した。顕著なことには、Ｍ２Ｄ ＡＳＯを単回投与した結果、接種後１２週にて注入から９週後にスクランブル処理マウスよりも、ＲＢＭ３レベルが２倍高くなった（図８Ｂ）。既に述べたように（Peretti, 2015）、ＲＢＭ３のレベルが高いほど、顕著な神経保護と関連し：そのマウス６匹のうち５匹がこれらの領域の著しい神経細胞の脱落を示したスクランブルＡＳＯ処置マウス（図８Ｃ及び８Ｄ）と比較して、Ｍ２Ｄ処置マウスの７／８が、海馬ＣＡ１－３領域における錐体神経細胞の広範な保存を示した（図８Ｃ及び８Ｄ）。Ｍ２Ｄ介在神経保護は、海綿状態の低減とも関連し、Ｍ２Ｄ処置マウス、スクランブル処置マウスと比較して顕著に低い海綿状態スコアを示した（図８Ｅ）。

【0318】

これらのデータから、Ｍ２Ｄの単回投与によって、冷却することなくＲＢＭ３の強力な、及び持続性の誘導が裏付けられ、上述のように９週で、急速進行性神経変性疾患の状況において顕著な神経保護が得られる。治療的低体温の代わりに、ＦＤＡ承認化学を用いた、忍容性がよいＡＳＯの１回投与によるＲＢＭ３レベルを上昇する能力は、新生児の急性設定治療から、成人における心臓外科手術、脳卒中及び頭部外傷、変性疾患におけるより長期の神経保護まで、多様な状態における神経保護に対する強い意味合いを有する。急性設定において、このアプローチは、ＲＢＭ３発現の神経保護をもたらす一方で、凝固問題、肺炎、及び観血的なモニタリングなど、集中治療及び冷却に伴う実質的なリスクを回避する。さらに、そのアプローチは神経変性の予防における著しいアピールを有する。ＡＳＯは、ＳＭＡを有する子供において非常に成功を収めており、成人の急速進行性神経変性疾患、ＡＬＳの治療に対して最近認可された（Miller, T. M. et al. Trial of Antisense Oligonucleotide Tofersen for SOD1 ALS. N Engl J Med 387, 1099-1110, doi:10.1056/NEJMoa2204705 (2022)）。アルツハイマー病及び関連する認知症の疾患の研究において、その長期の発現を生じさせる、ＡＳＯ送達を介したＲＢＭ３の神経保護作用の誘導は、やむを得ない治療的アプローチであり、特に老化に関連するこれらのタンパク質ミスフォールディング疾患の直接的及び間接的毒性作用に抵抗するための鍵である、神経細胞のレジリエンス及びシナプス再生が高められる。

【0319】

８．１実験の詳細
マウス
すべての動物作業は、英国内務省の規制に従い、動物［科学的処置］法（Animal [Scientific Procedures] Act)1986の下で、且つ研究のための動物の管理と使用に関する施設ガイドラインに従って実施された。すべての研究は、ケンブリッジ大学（University of Cambridge）Animal Welfare and Ethical Review Body (AWERB)によって倫理的に審査された。マウスは、１２時間の明暗サイクル下にて動物２～５匹／ケージのグループで収容され、昼間（light phase）に試験された。水及びマウス標準固形飼料を無制限に与えた。ケージ番号によって、マウスをランダムに処置群に割り当てた。実験中、及び臨床的徴候が評価される際には、実験者は群の割り当てを知らされなかった。行動試験のために、形式的なランダム化は必要とされない、又は使用されなかった。手順はAnimal Research: Reporting of In Vivo Experiments (ARRIVE)ガイドラインに完全に準拠した。

【0320】

マウスのプリオン感染
記載のように（Mallucci, 2002）全身麻酔薬下にて、Chandler/RML(Rocky Mountain Laboratories）プリオンの１％脳ホモジネート３０μＬを、３週齢ｔｇ３７＋／－マウスに脳内接種した。Mallucci, 2002; Mallucci, 2003; Mallucci, 2007 Neuron 53, 325-335, doi:10.1016/j. Neuron.2007.01.005に定義されるように、スクレイピーの臨床的徴候を発症した場合には動物を間引いた。コントロールマウスには、１％正常脳ホモジネートを投与した。

【0321】

参考文献
本発明及び本発明に関する現況技術をより完全に説明及び開示するために、多くの出版物が上述されている。これらの参考文献の一部の完全な引用は以下に提供する。これらの参考文献のそれぞれの全体が本明細書に組み込まれる。
1 Danno, S. et al. Increased transcript level of RBM3, a member of the glycine-rich RNA-binding protein family, in human cells in response to cold stress. Biochem. Biophys. Res. Commun. 236, 804-807, doi:10.1006/bbrc.1997.7059 (1997).
2 Nishiyama, H. et al. A glycine-rich RNA-binding protein mediating cold-inducible suppression of mammalian cell growth. J. Cell Biol. 137, 899-908, doi:10.1083/jcb.137.4.899 (1997).
3 Ciuzan, O., Hancock, J., Pamfil, D., Wilson, I. & Ladomery, M. The evolutionarily conserved multifunctional glycine-rich RNA-binding proteins play key roles in development and stress adaptation. Physiol. Plant. 153, 1-11, doi:10.1111/ppl.12286 (2015).
4 Jackson, T. C. et al. Cold stress protein RBM3 responds to temperature change in an ultra-sensitive manner in young neurons. Neuroscience 305, 268-278, doi:https://doi.org/10.1016/j.neuroscience.2015.08.012 (2015).
5 Neumann, A. et al. Alternative splicing coupled mRNA decay shapes the temperature-dependent transcriptome. EMBO Rep 21, e51369, doi:10.15252/embr.202051369 (2020).
6 Lykke-Andersen, S. & Jensen, T. H. Nonsense-mediated mRNA decay: an intricate machinery that shapes transcriptomes. Nature Reviews Molecular Cell Biology 16, 665, doi:10.1038/nrm4063
https://www.nature.com/articles/nrm4063#supplementary-information (2015).
7 Haltenhof, T. et al. A conserved kinase-based body temperature sensor globally controls alternative splicing and gene expression. Mol. Cell (2020).
8 Hoekstra, M. M., Emmenegger, Y., Hubbard, J. & Franken, P. Cold-inducible RNA-binding protein (CIRBP) adjusts clock-gene expression and REM-sleep recovery following sleep deprivation. Elife 8, doi:10.7554/eLife.43400 (2019).
9 Morf, J. et al. Cold-inducible RNA-binding protein modulates circadian gene expression posttranscriptionally. Science (New York, N.Y.) 338, 379-383, doi:10.1126/science.1217726 (2012).
10 Lujan, D. A., Ochoa, J. L. & Hartley, R. S. Cold-inducible RNA binding protein in cancer and inflammation. Wiley Interdiscip Rev RNA 9, doi:10.1002/wrna.1462 (2018).
11 Qiang, X. et al. Cold-inducible RNA-binding protein (CIRP) triggers inflammatory responses in hemorrhagic shock and sepsis. Nat. Med. 19, 1489-1495, doi:10.1038/nm.3368 (2013).
12 Chip, S. et al. The RNA-binding protein RBM3 is involved in hypothermia induced neuroprotection. Neurobiology of Disease 43, 388-396, doi:https://doi.org/10.1016/j.nbd.2011.04.010 (2011).
13 Zhu, X. et al. RBM3 promotes neurogenesis in a niche-dependent manner via IMP2-IGF2 signaling pathway after hypoxic-ischemic brain injury. Nature communications 10, 3983, doi:10.1038/s41467-019-11870-x (2019).
14 Yang, H. J. et al. Cold-inducible protein RBM3 mediates hypothermic neuroprotection against neurotoxin rotenone via inhibition on MAPK signalling. J. Cell. Mol. Med. 23, 7010-7020, doi:10.1111/jcmm.14588 (2019).
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16 Liu, Y. et al. Cold-induced RNA-binding proteins regulate circadian gene expression by controlling alternative polyadenylation. Sci Rep 3, 2054, doi:10.1038/srep02054 (2013).
17 Colombo, M., Karousis, E. D., Bourquin, J., Bruggmann, R. & Muehlemann, O. Transcriptome-wide identification of NMD-targeted human mRNAs reveals extensive redundancy between SMG6- and SMG7-mediated degradation pathways. RNA (New York, N.Y.) 23, 189-201, doi:10.1261/rna.059055.116 (2017).
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21 Puttaraju, M. et al. Systematic screening identifies therapeutic antisense oligonucleotides for Hutchinson-Gilford progeria syndrome. Nat. Med. 27, 526-535, doi:10.1038/s41591-021-01262-4 (2021).
22 Hua, Y. et al. Peripheral SMN restoration is essential for long-term rescue of a severe spinal muscular atrophy mouse model. Nature 478, 123-126, doi:10.1038/nature10485 (2011).
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24 Sheng, L., Rigo, F., Bennett, C. F., Krainer, A. R. & Hua, Y. Comparison of the efficacy of MOE and PMO modifications of systemic antisense oligonucleotides in a severe SMA mouse model. Nucleic Acids Res. 48, 2853-2865, doi:10.1093/nar/gkaa126 (2020).
25 Dobin, A. et al. STAR: ultrafast universal RNA-seq aligner. Bioinformatics 29, 15-21, doi:10.1093/bioinformatics/bts635 %J Bioinformatics (2012).
26 Garrido-Martin, D., Palumbo, E., Guigo, R. & Breschi, A. ggsashimi: Sashimi plot revised for browser- and annotation-independent splicing visualization. PLoS Comput Biol 14, e1006360, doi:10.1371/journal.pcbi.1006360 (2018).
27 Preussner, M. et al. Body Temperature Cycles Control Rhythmic Alternative Splicing in Mammals. Mol. Cell 67, 433-446.e434, doi:10.1016/j.molcel.2017.06.006 (2017).
28 Preussner, M. et al. Rhythmic U2af26 alternative splicing controls PERIOD1 stability and the circadian clock in mice. Mol. Cell 54, 651-662, doi:10.1016/j.molcel.2014.04.015 (2014).
29 Ran, F. A. et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat Protoc 8, 2281-2308, doi:10.1038/nprot.2013.143 (2013).
30 Williams, D. R. et al. Seasonally hibernating phenotype assessed through transcript screening. Physiol Genomics 24, 13-22 (2005).
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32 Llorian, M. et al. The alternative splicing program of differentiated smooth muscle cells involves concerted non-productive splicing of post-transcriptional regulators. Nucleic Acids Research 44, 8933-8950 (2016).

【0322】

分子生物学の標準技術については、Sambrook, J., Russel, D.W.分子クローニング, A Laboratory Manual. 3 ed. 2001, Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Pressを参照のこと。

【図1A】

【図1B】

【図1C】

【図1D】

【図1E】

【図1F】

【図2A】

【図2B】

【図2C】

【図2D】

【図2E】

【図2F】

【図2G】

【図2H】

【図3A】

【図3B】

【図3C】

【図3D】

【図3E】

【図3F】

【図3G】

【図3H】

【図3I】

【図3J】

【図3K】

【図4A】

【図4B】

【図4C】

【図4D】

【図4E】

【図4F】

【図4G】

【図4H】

【図4I】

【図4J】

【図5A】

【図5B】

【図5C】

【図5D】

【図6A】

【図6B】

【図6C】

【図6D】

【図7A】

【図7B】

【図7C】

【図7D】

【図8A】

【図8B】

【図8C】

【図8D】

【図8E】

【配列表】

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【国際調査報告】