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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-12-26
(54)【発明の名称】高ＣＧ含量微生物の遺伝子改変方法
(51)【国際特許分類】
C12N 15/09 20060101AFI20241219BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20241219BHJP
C12P 7/64 20220101ALI20241219BHJP
C12N 15/87 20060101ALN20241219BHJP
【ＦＩ】
C12N15/09 110
C12N1/19 ZNA
C12P7/64
C12N15/87 Z
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024536517
(86)(22)【出願日】2022-11-29
(85)【翻訳文提出日】2024-06-18
(86)【国際出願番号】 EP2022083668
(87)【国際公開番号】W WO2023117332
(87)【国際公開日】2023-06-29
(31)【優先権主張番号】21217144.1
(32)【優先日】2021-12-22
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】517068553
【氏名又は名称】テクニッシェ ウニベルシタット ミュンヘン
(74)【代理人】
【識別番号】100136629
【弁理士】
【氏名又は名称】鎌田 光宜
(74)【代理人】
【識別番号】100080791
【弁理士】
【氏名又は名称】高島 一
(74)【代理人】
【識別番号】100125070
【弁理士】
【氏名又は名称】土井 京子
(74)【代理人】
【識別番号】100121212
【弁理士】
【氏名又は名称】田村 弥栄子
(74)【代理人】
【識別番号】100174296
【弁理士】
【氏名又は名称】當麻 博文
(74)【代理人】
【識別番号】100137729
【弁理士】
【氏名又は名称】赤井 厚子
(74)【代理人】
【識別番号】100152308
【弁理士】
【氏名又は名称】中 正道
(74)【代理人】
【識別番号】100201558
【弁理士】
【氏名又は名称】亀井 恵二郎
(74)【代理人】
【識別番号】100118371
【弁理士】
【氏名又は名称】▲駒▼谷 剛志
(72)【発明者】
【氏名】シャイガニ、パリヤ
(72)【発明者】
【氏名】ブリュック、トーマス
(72)【発明者】
【氏名】メルマー、ノルベルト
【テーマコード（参考）】
4B064
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B064AD12
4B064CA06
4B064CA19
4B064CC24
4B064DA01
4B064DA16
4B064DA20
4B065AA72X
4B065AA73X
4B065AA78X
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA01
4B065CA10
4B065CA13
4B065CA55
4B065CA60
(57)【要約】
本発明は、ＧＣリッチ微生物を遺伝的に改変する方法に関する。本発明は更に、遺伝的に改変されたＧＣリッチ微生物に関する。更に、本発明は、ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼ、少なくとも１つのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、及び任意でドナーＤＮＡを含む組成物に関する。本発明はまた、遺伝的に改変されたＧＣリッチ微生物を用いて、標的化合物、例えばアセチル－ＣｏＡベースの疎水性化合物及び／又は特定の脂肪酸プロファイルを有する油、例えば高オレイン酸油を調製する方法に関する。
【選択図】なし
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
任意でＧＣリッチ微生物におけるアセチル－ＣｏＡベースの疎水性化合物の生成を増加させるために、前記微生物を遺伝的に改変する方法であって、以下の工程を含む方法：ｉ）ＧＣリッチ微生物、好ましくは油性微生物、より好ましくは油性酵母を提供する工程と；
ｉｉ）任意で、前記ＧＣリッチ微生物を前処理する工程であって；好ましくは、前記前処理が、前記ＧＣリッチ微生物をスフェロプラスト化することを含む工程と；
ｉｉｉ）ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼ、少なくとも１つのガイドＲＮＡ、及び任意でドナーＤＮＡを用いて前記ＧＣリッチ微生物を形質転換する工程と；
ｉｖ）任意で、前記ＧＣリッチ微生物の形質転換された細胞を選択する工程と；
ｖ）遺伝的に改変されたＧＣリッチ微生物を得る工程。
【請求項2】
前記ＧＣリッチ微生物が、酵母、真菌、細菌、及び微細藻類から選択され；好ましくは、前記ＧＣリッチ微生物が、油性微生物であり；より好ましくは、前記ＧＣリッチ微生物が、油性酵母であり；更により好ましくは、前記ＧＣリッチ微生物が、ロドスポリジウム属（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）の種、ヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）の種、ロドトルラ属（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）の種、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）の種、リポマイセス属（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ）の種、クタネオトリコスポロン属（Ｃｕｔａｎｅｏｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）の種、トリコスポロン属（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）の種から選択され、好ましくはクタネオトリコスポロン属の種から選択され、より好ましくはクタネオトリコスポロン・オレアギノサス（Ｃｕｔａｎｅｏｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ ｏｌｅａｇｉｎｏｓｕｓ）（ＡＴＣＣ２０５０９）である；及び／又は前記ＧＣリッチ微生物が、少なくとも５０％、好ましくは少なくとも５５％、より好ましくは少なくとも５８％、更により好ましくは少なくとも６０％のグアニン－シトシン（ＧＣ）含量を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼが、ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）エンドヌクレアーゼであり、好ましくは、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１、Ｃａｓ２、Ｃａｓ４、Ｃａｓ３、Ｃａｓ１０、Ｃａｓ１２、Ｃａｓ１３、Ｃｓｍ、ｓｃｆ１、又はそれらのバリアント、例えば、Ｃａｓ１２ａ、ｄＣａｓ９、Ｄ１０Ａ ＣＡＳ９ニッカーゼ、又はＨ８４０Ａ ＣＡＳ９ニッカーゼから選択される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項4】
工程ｉｉｉ）における前記形質転換が、ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼタンパク質の形態で、前記ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼをコードしているＤＮＡの形態で、又は前記ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼをコードしているｍＲＮＡの形態で、好ましくは前記ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼをコードしているｍＲＮＡの形態で、前記ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼを前記ＧＣリッチ微生物に適用することを含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項5】
前記少なくとも１つのガイドＲＮＡが、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）、トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）、及び／又はシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を含み；好ましくは、前記少なくとも１つのガイドＲＮＡが、第１のガイドＲＮＡ及び第２のガイドＲＮＡを含み、前記第１のガイドＲＮＡの配列が、前記第２のガイドＲＮＡの配列とは異なる、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項6】
前記ドナーＤＮＡが、ＤＮＡ修復テンプレート、選択マーカーをコードしているＤＮＡ、及び／又は対象となる遺伝子若しくは配列、例えば脂肪酸等の標的化合物の生成に関与する遺伝子を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項7】
工程ｉｉｉ）における前記形質転換が、前記ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼ及び前記少なくとも１つのガイドＲＮＡを、好ましくは一緒に、リボ核タンパク質複合体の形態で適用することを含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項8】
工程ｉｉｉ）における前記形質転換が、前記ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼをコードしているｍＲＮＡの形態で前記ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼを適用することを含み、前記少なくとも１つのガイドＲＮＡがｓｇＲＮＡを含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項9】
工程ｉｉ）における前記前処理が、酵素的前処理、化学的前処理、及び／又は別のスフェロプラスト化手順を含み；好ましくは、工程ｉｉ）における前記前処理が、グリコシルヒドロラーゼ、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、マンナナーゼ、キシログルカンゼ（ｘｙｌｏｇｌｕｃａｎｓｅ）、キシラナーゼ、グルカナーゼ、グルコシダーゼ、アラビナーゼ、アミラーゼ、フルクタナーゼ、ラミナラーゼ、ヒドロラーゼ、プロテアーゼ、又はそれらの任意の組み合わせから選択される少なくとも１つの酵素、好ましくはセルラーゼ、ヘミセルラーゼ、マンナナーゼ、キシログルカンゼ、キシラナーゼ、グルカナーゼ、及びグルコシダーゼの組み合わせを用いて行われる酵素的前処理を含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項10】
工程ｉｉ）における前記前処理が、ヒドロラーゼ単独又はヒドロラーゼとプロテアーゼとの組み合わせ／ヒドロラーゼに続いてにプロテアーゼよる前記微生物の処理を含み；任意で、前記ヒドロラーゼが、真菌、好ましくは糸状菌、より好ましくはトリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）の種、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）の種、ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）の種、オーレオバシリウム属（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｌｌｉｕｍ）の種、及びフザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）の種から選択される真菌、更により好ましくはトリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）によって生成されるヒドロラーゼから選択される；並びに／又は
任意で、前記プロテアーゼが、アスペルギルス属の種、ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）の種、又はバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）の種によって生成されるプロテアーゼから選択される、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項11】
工程ｉｉｉ）における前記形質転換が、エレクトロポレーション；ＰＥＧベース若しくは他のナノスケールキャリアベースの形質転換；生物学的な弾道飛行；ガラスビーズ形質転換；小胞媒介送達；ウイルストランスフェクション系、例えば、レンチウイルス（ＬＶ）、アデノウイルス（ＡｄＶ）、若しくはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）；リポソーム送達、例えば、リポフェクション；化学的トランスフェクション技術；又はそれらの組み合わせを使用して；好ましくは、エレクトロポレーション及び／又はＰＥＧベースの形質転換を使用して；より好ましくは、エレクトロポレーションを使用して行われる、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項12】
工程ｉｖ）における前記選択を含み、工程ｉｖ）における前記選択が、選択マーカー、任意で前記ドナーＤＮＡによってコードされている選択マーカーに対して選択的な選択剤に前記微生物を曝露することを含み；好ましくは、前記選択が、最小選択可能濃度の１０％～９０％、好ましくは１０％～７０％、より好ましくは１０％～６０％の範囲の濃度の選択剤に前記微生物を曝露すること；及び／又は最小選択可能濃度の９０％～１００％、好ましくは９９％～１００％の範囲の濃度の選択剤に前記微生物を曝露することを含み；
より好ましくは、前記選択が、第１の培地、例えば液体培地又は固形培地、好ましくはアガーの下層中で、最小選択可能濃度の１０％～９０％、好ましくは１０％～７０％、より好ましくは１０％～６０％の範囲の濃度の前記選択剤に前記微生物を曝露し、任意で、その後、第２の培地、例えば液体培地又は固形培地、好ましくはアガーの下層中で、９０％～１００％、好ましくは９９％～１００％の範囲の濃度の選択剤に前記微生物を曝露することを含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項13】
ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼ、少なくとも１つのガイドＲＮＡ、及び任意でドナーＤＮＡを含み；任意で、前記ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼ及び前記少なくとも１つのガイドＲＮＡが、リボ核タンパク質複合体の形態で前記細胞中に存在する、遺伝的に改変されたＧＣリッチ微生物、好ましくは油性微生物、より好ましくは油性酵母、更により好ましくはクタネオトリコスポロン・オレアギノサス。
【請求項14】
－ ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼ；任意でＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼタンパク質、前記ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼをコードしているＤＮＡ、又はＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼをコードしているｍＲＮＡ、好ましくはＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼをコードしているｍＲＮＡであって；好ましくは、ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）エンドヌクレアーゼであり、より好ましくは、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１、Ｃａｓ２、Ｃａｓ４、Ｃａｓ３、Ｃａｓ１０、Ｃａｓ１２、Ｃａｓ１３、Ｃｓｍ、ｓｃｆ１、又はそれらのバリアント、例えば、Ｃａｓ１２ａ、ｄＣａｓ９、Ｄ１０Ａ ＣＡＳ９ニッカーゼ、又はＨ８４０Ａ ＣＡＳ９ニッカーゼから選択され、更により好ましくは、配列番号１～４のいずれかの配列を有するＣａｓ９エンドヌクレアーゼ等のＣａｓ９エンドヌクレアーゼであるＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼと；
－ 少なくとも１つのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）；好ましくはｃｒＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮＡ、及び／又はｓｇＲＮＡであって；
任意で、配列番号５のｔｒａｃｒＲＮＡ配列を含む及び／又は配列番号１４～２６のいずれか１つのｃｒＲＮＡ配列を含むｇＲＮＡと；
－ 任意で、ドナーＤＮＡ；好ましくは、ＤＮＡ修復テンプレート、選択マーカーをコードしているＤＮＡ、及び／又は対象となる遺伝子若しくは配列、例えば脂肪酸等の標的化合物の生成に関与する遺伝子を含むドナーＤＮＡであって、
任意で、前記選択マーカーがＵｒａ５であり；
任意で、前記対象となる遺伝子又は配列が、デルタ－９－デサチュラーゼ、デルタ－１２－デサチュラーゼ、エロンガーゼ、オレイン酸ヒドラターゼ、アルドケトレダクターゼプロモータ、アルドケトレダクターゼターミネータ、転写伸長因子２プロモータ、ＴＥＦプロモータ、及び／又はＴＥＦターミネータをコードしており；
任意で、前記ドナーＤＮＡが、配列番号６～１３及び２７～３６のいずれか、任意で配列番号６～１３及び２７のいずれかの配列を含むドナーＤＮＡと
を含む組成物。
【請求項15】
－ ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼをコードしているｍＲＮＡであって；好ましくは、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼであり、より好ましくは、配列番号１～４のいずれかの配列を有するＣａｓ９エンドヌクレアーゼであるＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼと；
－ 少なくとも１つのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）；好ましくはｃｒＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮＡ、及び／又はｓｇＲＮＡであって；
任意で、配列番号５のｔｒａｃｒＲＮＡ配列を含む及び／又は配列番号１４～２６のいずれか１つのｃｒＲＮＡ配列を含むｇＲＮＡと；
－ 任意で、ドナーＤＮＡ、例えばＤＮＡ修復テンプレートであって；
任意で、配列番号６～１３及び２７～３６のいずれか、任意で配列番号６～１３及び２７のいずれかの配列を有するドナーＤＮＡと
を含むプラスミド又はプラスミドコレクション。
【請求項16】
遺伝的に改変されたＧＣリッチ微生物、好ましくは油性微生物、より好ましくは油性酵母を用いて、標的化合物、例えばアセチル－ＣｏＡ又はアセチル－ＣｏＡベースの疎水性化合物及び／又は特定の脂肪酸プロファイルを有する油、例えば高オレイン酸油を調製する方法であって：ａ）請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法を用いて、遺伝的に改変されたＧＣリッチ微生物、好ましくは油性微生物、より好ましくは油性酵母を提供することであって；前記方法が、前記微生物をドナーＤＮＡを用いて形質転換することを含み、前記ドナーＤＮＡが、対象となる遺伝子又は配列、例えば、前記標的化合物及び／又は特定の脂肪酸の生成に関与する遺伝子を含むことと；
ｂ）前記遺伝的に改変されたＧＣリッチ微生物を増殖させることと；
ｃ）前記標的化合物及び／又は特定の脂肪酸プロファイルを有する油を得ることであって；
好ましくは、前記標的化合物が、飽和短鎖脂肪酸、飽和中鎖脂肪酸、飽和長鎖脂肪酸、一価不飽和脂肪酸、多価不飽和脂肪酸、官能化脂肪酸、エルゴステロール、エルゴステロール誘導体、テルペン、アルカロイド、アセチル－ＣｏＡベースの合成化合物、トコクロマノール、例えばα－トコフェロール及びα－トコトリエノール、モノテルペノイド、セスキテルペノイド、ジテルペノイド、スクアレン、カロテノイド、トリテルペン、フェオフィチン、ビタミン、クエン酸、揮発性脂肪酸、シュウ酸、乳酸、リンゴ酸、及びエキソポリサッカライドから選択されることと
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ＧＣリッチ微生物を遺伝的に改変する方法に関する。本発明は更に、遺伝的に改変されたＧＣリッチ微生物に関する。更に、本発明は、ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼ、少なくとも１つのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、及び任意でドナーＤＮＡを含む組成物に関する。本発明はまた、遺伝的に改変されたＧＣリッチ微生物を用いて、標的化合物、例えばアセチル－ＣｏＡベースの疎水性化合物及び／又は特定の脂肪酸プロファイルを有する油、例えば高オレイン酸油を調製する方法に関する。
【背景技術】
【0002】
バイオ燃料、製薬、及び油脂化学産業における動植物ベースの脂質に対する世界的な需要の増加は、生物多様性に悪影響を及ぼし、その結果、土地利用の変化をもたらした。その結果、微生物油は植物油の代替品として注目を集めている。油性酵母クタネオトリコスポロン・オレアギノサス（Ｃｕｔａｎｅｏｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ ｏｌｅａｇｉｎｏｓｕｓ）ＡＴＣＣ２０５０９等の油性微生物は、「デノボ」脂質生合成経路を通して脂質を蓄積することができる。Ｃ．オレアギノサス等の油性微生物は、コスト効率高く、解毒されていない複雑な廃棄バイオマス流で増殖するので、微生物脂質を生成するために使用することができる。
【0003】
遺伝子操作は、微生物によって生成される化合物、例えば、トリグリセリド、テルペノイド、及び他の代謝由来の付加価値の高い化合物等の高価値化合物を改良し、多様化させるための経路である。油性酵母によって生成される高価値生成物、例えばテーラーメイド脂質の改良及び最適化が報告されている［１］。しかし、効率的な遺伝学的ツールがないことから、その生産性及び生成物の多様性が制限されている。
【0004】
今日まで、ＧＣリッチ微生物、特にＣ．オレアギノサス等の油性微生物のゲノムに発現カセットを安定的にランダムに組み込むために、アグロバクテリウムを介した形質転換（ＡＭＴ）が確立されている［１］。このような遺伝子のゲノムへのランダムな組み込みは、異なる予測不可能な遺伝子発現レベルをもたらし、これは主に可変挿入遺伝子座及び挿入事象の数に依存する。ＧＣリッチ微生物、特にＣ．オレアギノサス等の油性微生物では、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）が相同組換え（ＨＤＲ）よりも優勢であること、またＧＣリッチ微生物に好適なプラスミドがないこと、例えば油性酵母のための人工プラスミドがないことから、標的を絞った広範な遺伝子操作が妨げられてきた［２］。これを受けて、ＧＣリッチ微生物、特に高ＧＣ含量を有する油性微生物、例えばＣ．オレアギノサスをより精密かつ高度に操作することを可能にするために、標的化遺伝子改変のための効率的なゲノム編集ツールの確立が必要とされている。
【0005】
非相同末端結合（ＮＨＥＪ）が相同組換え（ＨＤＲ）より優勢であることが、Ｃ．オレアギノサス等のＧＣリッチ微生物の遺伝的改変の障害となってきた。特に、ＧＣリッチ微生物、例えば高ＧＣ含量、例えば５０％以上又は６０％以上のＧＣ含量を有し、反復配列を多く有する油性微生物等の遺伝子操作は、このような反復配列の存在並びにオフターゲット効果及び核酸二次構造の形成をもたらすＧＣ含量の高さから非常に困難である。
【0006】
報告されている油性微生物等のＧＣリッチ微生物の遺伝的改変のプロトコールには、これまでゲノムへのランダムな遺伝子挿入及びランダムな変異誘発しか記載されていない。従って、油性微生物等のＧＣリッチ微生物を標的を絞って遺伝的に改変する方法が必要とされている。更に、ＧＣリッチ微生物、特に高ＧＣ含量を有する油性微生物、例えばＣ．オレアギノサスを遺伝的に改変する方法が必要とされている。また、例えば、アセチル－ＣｏＡベースの疎水性化合物及び／又は特定の脂肪酸等の標的化合物の生成を増加させるために、標的を絞ってこのようなＧＣリッチ微生物を遺伝的に改変する手段も必要とされている。
【発明の概要】
【0007】
以下、本発明の要素について説明する。これら要素は、具体的な実施形態と共に列挙されるが、これらは更なる実施形態を生み出すために任意の方法及び任意の数で組み合わせることができることが理解されるべきである。様々に記載される実施例及び好ましい実施形態は、本発明を明示的に記載された実施形態のみに限定すると解釈されるべきではない。本明細書は、明示的に記載された実施形態のうちの２つ以上を組み合わせた実施形態又は明示的に記載された実施形態のうちの１つ以上を任意の数の開示された及び／又は好ましい要素と組み合わせた実施形態を裏付け、包含するものであると理解されるべきである。更に、本出願に記載される全ての要素の任意の順列及び組み合わせは、文脈から別段の指示がない限り、本出願の記載により開示されたものとみなされるべきである。
【0008】
第１の態様では、本発明は、任意でＧＣリッチ微生物におけるアセチル－ＣｏＡベースの疎水性化合物の生成を増加させるために、該微生物を遺伝的に改変する方法であって、以下の工程を含む方法に関する：
ｉ）ＧＣリッチ微生物、好ましくは油性微生物、より好ましくは油性酵母を提供する工程と；
ｉｉ）任意で、該ＧＣリッチ微生物を前処理する工程であって；好ましくは、該前処理が、該ＧＣリッチ微生物をスフェロプラスト化することを含む工程と；
ｉｉｉ）ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼ、少なくとも１つのガイドＲＮＡ、及び任意でドナーＤＮＡを用いて該ＧＣリッチ微生物を形質転換する工程と；
ｉｖ）任意で、該ＧＣリッチ微生物の形質転換された細胞を選択する工程と；
ｖ）遺伝的に改変されたＧＣリッチ微生物を得る工程。
ｉ）ＧＣリッチ微生物、好ましくは油性微生物、より好ましくは油性酵母を提供する工程と；
ｉｉ）任意で、該ＧＣリッチ微生物を前処理する工程であって；好ましくは、該前処理が、該ＧＣリッチ微生物をスフェロプラスト化することを含む工程と；
ｉｉｉ）ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼ、少なくとも１つのガイドＲＮＡ、及び任意でドナーＤＮＡを用いて該ＧＣリッチ微生物を形質転換する工程と；
ｉｖ）任意で、該ＧＣリッチ微生物の形質転換された細胞を選択する工程と；
ｖ）遺伝的に改変されたＧＣリッチ微生物を得る工程。
【0009】
一実施形態では、該ＧＣリッチ微生物は、少なくとも５０％、好ましくは少なくとも５５％、より好ましくは少なくとも５８％、更により好ましくは少なくとも６０％のグアニン－シトシン（ＧＣ）含量を有する。
【0010】
一実施形態では、該ＧＣリッチ微生物は、酵母、真菌、細菌、及び微細藻類から選択され；好ましくは、該ＧＣリッチ微生物は、油性微生物であり；より好ましくは、該ＧＣリッチ微生物は、油性酵母であり；更により好ましくは、該ＧＣリッチ微生物は、ロドスポリジウム属（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）の種、ヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）の種、ロドトルラ属（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）の種、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）の種、リポマイセス属（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ）の種、クタネオトリコスポロン属（Ｃｕｔａｎｅｏｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）の種、トリコスポロン属（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）の種から選択され、好ましくはクタネオトリコスポロン属の種から選択され、より好ましくはクタネオトリコスポロン・オレアギノサス（Ｃｕｔａｎｅｏｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ ｏｌｅａｇｉｎｏｓｕｓ）（ＡＴＣＣ２０５０９）である；及び／又は
該ＧＣリッチ微生物は、少なくとも５０％、好ましくは少なくとも５５％、より好ましくは少なくとも５８％、更により好ましくは少なくとも６０％のグアニン－シトシン（ＧＣ）含量を有する。
該ＧＣリッチ微生物は、少なくとも５０％、好ましくは少なくとも５５％、より好ましくは少なくとも５８％、更により好ましくは少なくとも６０％のグアニン－シトシン（ＧＣ）含量を有する。
【0011】
一実施形態では、該ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）エンドヌクレアーゼであり、好ましくは、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１、Ｃａｓ２、Ｃａｓ４、Ｃａｓ３、Ｃａｓ１０、Ｃａｓ１２、Ｃａｓ１３、Ｃｓｍ、ｓｃｆ１、又はそれらのバリアント、例えば、Ｃａｓ１２ａ、ｄＣａｓ９、Ｄ１０Ａ ＣＡＳ９ニッカーゼ、又はＨ８４０Ａ ＣＡＳ９ニッカーゼから選択される。
【0012】
一実施形態では、工程ｉｉｉ）における該形質転換は、ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼタンパク質の形態で、該ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼをコードしているＤＮＡの形態で、又は該ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼをコードしているｍＲＮＡの形態で、好ましくは該ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼをコードしているｍＲＮＡの形態で、該ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼを該ＧＣリッチ微生物に適用することを含む。
【0013】
一実施形態では、該少なくとも１つのガイドＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）、トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）、及び／又はシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を含み；好ましくは、該少なくとも１つのガイドＲＮＡは、第１のガイドＲＮＡ及び第２のガイドＲＮＡを含み、該第１のガイドＲＮＡの配列は、該第２のガイドＲＮＡの配列とは異なる。
【0014】
一実施形態では、該ドナーＤＮＡは、ＤＮＡ修復テンプレート、選択マーカーをコードしているＤＮＡ、及び／又は対象となる遺伝子若しくは配列、例えば脂肪酸等の標的化合物の生成に関与する遺伝子を含む。
【0015】
一実施形態では、工程ｉｉｉ）における該形質転換は、該ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼ及び該少なくとも１つのガイドＲＮＡを、好ましくは一緒に、リボ核タンパク質複合体の形態で適用することを含む。
【0016】
一実施形態では、工程ｉｉｉ）における該形質転換は、該ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼをコードしているｍＲＮＡの形態で該ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼを適用することを含み、該少なくとも１つのガイドＲＮＡはｓｇＲＮＡを含む。
【0017】
一実施形態では、工程ｉｉ）における該前処理は、酵素的前処理、化学的前処理、及び／又は別のスフェロプラスト化手順を含み；
好ましくは、工程ｉｉ）における該前処理は、グリコシルヒドロラーゼ、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、マンナナーゼ、キシログルカンゼ（ｘｙｌｏｇｌｕｃａｎｓｅ）、キシラナーゼ、グルカナーゼ、グルコシダーゼ、アラビナーゼ、アミラーゼ、フルクタナーゼ、ラミナラーゼ、ヒドロラーゼ、プロテアーゼ、又はそれらの任意の組み合わせから選択される少なくとも１つの酵素、好ましくはセルラーゼ、ヘミセルラーゼ、マンナナーゼ、キシログルカンゼ、キシラナーゼ、グルカナーゼ、及びグルコシダーゼの組み合わせを用いて行われる酵素的前処理を含む。
好ましくは、工程ｉｉ）における該前処理は、グリコシルヒドロラーゼ、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、マンナナーゼ、キシログルカンゼ（ｘｙｌｏｇｌｕｃａｎｓｅ）、キシラナーゼ、グルカナーゼ、グルコシダーゼ、アラビナーゼ、アミラーゼ、フルクタナーゼ、ラミナラーゼ、ヒドロラーゼ、プロテアーゼ、又はそれらの任意の組み合わせから選択される少なくとも１つの酵素、好ましくはセルラーゼ、ヘミセルラーゼ、マンナナーゼ、キシログルカンゼ、キシラナーゼ、グルカナーゼ、及びグルコシダーゼの組み合わせを用いて行われる酵素的前処理を含む。
【0018】
一実施形態では、工程ｉｉ）における該前処理は、ヒドロラーゼ単独、又はヒドロラーゼとプロテアーゼとの組み合わせ／ヒドロラーゼに続いてにプロテアーゼよる該微生物の処理を含み；
任意で、該ヒドロラーゼは、真菌、好ましくは糸状菌、より好ましくはトリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）の種、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）の種、ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）の種、オーレオバシリウム属（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｌｌｉｕｍ）の種、及びフザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）の種から選択される真菌、更により好ましくはトリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）によって生成されるヒドロラーゼから選択される；並びに／又は
任意で、該プロテアーゼは、アスペルギルス属の種、ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）の種、又はバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）の種によって生成されるプロテアーゼから選択される。
任意で、該ヒドロラーゼは、真菌、好ましくは糸状菌、より好ましくはトリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）の種、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）の種、ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）の種、オーレオバシリウム属（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｌｌｉｕｍ）の種、及びフザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）の種から選択される真菌、更により好ましくはトリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）によって生成されるヒドロラーゼから選択される；並びに／又は
任意で、該プロテアーゼは、アスペルギルス属の種、ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）の種、又はバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）の種によって生成されるプロテアーゼから選択される。
【0019】
一実施形態では、工程ｉｉｉ）における該形質転換は、エレクトロポレーション；ＰＥＧベース若しくは他のナノスケールキャリアベースの形質転換；生物学的な弾道飛行；ガラスビーズ形質転換；小胞媒介送達；ウイルストランスフェクション系、例えば、レンチウイルス（ＬＶ）、アデノウイルス（ＡｄＶ）、若しくはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）；リポソーム送達、例えば、リポフェクション；化学的トランスフェクション技術；又はそれらの組み合わせを使用して；
好ましくは、エレクトロポレーション及び／又はＰＥＧベースの形質転換を使用して；より好ましくは、エレクトロポレーションを使用して行われる。
好ましくは、エレクトロポレーション及び／又はＰＥＧベースの形質転換を使用して；より好ましくは、エレクトロポレーションを使用して行われる。
【0020】
一実施形態では、該方法は、工程ｉｖ）における該選択を含み、工程ｉｖ）における該選択は、選択マーカー、任意で該ドナーＤＮＡによってコードされている選択マーカーに対して選択的な選択剤に該微生物を曝露することを含み；
好ましくは、該選択は、最小選択可能濃度の１０％～９０％、好ましくは１０％～７０％、より好ましくは１０％～６０％の範囲の濃度の選択剤に該微生物を曝露すること；及び／又は最小選択可能濃度の９０％～１００％、好ましくは９９％～１００％の範囲の濃度の選択剤に該微生物を曝露することを含み；
より好ましくは、該選択は、第１の培地、例えば液体培地又は固形培地、好ましくはアガーの下層中で、最小選択可能濃度の１０％～９０％、好ましくは１０％～７０％、より好ましくは１０％～６０％の範囲の濃度の該選択剤に該微生物を曝露し、任意で、その後、第２の培地、例えば液体培地又は固形培地、好ましくはアガーの下層中で、９０％～１００％、好ましくは９９％～１００％の範囲の濃度の選択剤に該微生物を曝露することを含む。
好ましくは、該選択は、最小選択可能濃度の１０％～９０％、好ましくは１０％～７０％、より好ましくは１０％～６０％の範囲の濃度の選択剤に該微生物を曝露すること；及び／又は最小選択可能濃度の９０％～１００％、好ましくは９９％～１００％の範囲の濃度の選択剤に該微生物を曝露することを含み；
より好ましくは、該選択は、第１の培地、例えば液体培地又は固形培地、好ましくはアガーの下層中で、最小選択可能濃度の１０％～９０％、好ましくは１０％～７０％、より好ましくは１０％～６０％の範囲の濃度の該選択剤に該微生物を曝露し、任意で、その後、第２の培地、例えば液体培地又は固形培地、好ましくはアガーの下層中で、９０％～１００％、好ましくは９９％～１００％の範囲の濃度の選択剤に該微生物を曝露することを含む。
【0021】
更なる態様では、本発明は、ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼ、少なくとも１つのガイドＲＮＡ、及び任意でドナーＤＮＡを含む、遺伝的に改変されたＧＣリッチ微生物、好ましくは油性微生物、より好ましくは油性酵母、更により好ましくはクタネオトリコスポロン・オレアギノサスに関し；任意で、該ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼ及び該少なくとも１つのガイドＲＮＡは、リボ核タンパク質複合体の形態で該細胞中に存在する。
【0022】
一実施形態では、遺伝的に改変されたＧＣリッチ微生物は、本明細書で定義される方法を用いて得られる。
【0023】
この態様では、ＧＣリッチ微生物、油性微生物、油性酵母、ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼ、少なくとも１つのガイドＲＮＡ、ドナーＤＮＡ、及びリボ核タンパク質複合体は、本明細書で定義される通りである。
【0024】
更なる態様では、本発明は、
－ ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼ；任意でＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼタンパク質、該ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼをコードしているＤＮＡ、又はＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼをコードしているｍＲＮＡ、好ましくはＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼをコードしているｍＲＮＡであって；
好ましくは、ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）エンドヌクレアーゼであり、より好ましくは、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１、Ｃａｓ２、Ｃａｓ４、Ｃａｓ３、Ｃａｓ１０、Ｃａｓ１２、Ｃａｓ１３、Ｃｓｍ、ｓｃｆ１、又はそれらのバリアント、例えば、Ｃａｓ１２ａ、ｄＣａｓ９、Ｄ１０Ａ ＣＡＳ９ニッカーゼ、又はＨ８４０Ａ ＣＡＳ９ニッカーゼから選択され、更により好ましくは、配列番号１～４のいずれかの配列を有するＣａｓ９エンドヌクレアーゼ等のＣａｓ９エンドヌクレアーゼであるＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼと；
－ 少なくとも１つのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）；好ましくはｃｒＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮＡ、及び／又はｓｇＲＮＡであって；
任意で、配列番号５のｔｒａｃｒＲＮＡ配列を含む及び／又は配列番号１４～２６のいずれか１つのｃｒＲＮＡ配列を含むｇＲＮＡと；
－ 任意で、ドナーＤＮＡ；好ましくは、ＤＮＡ修復テンプレート、選択マーカーをコードしているＤＮＡ、及び／又は対象となる遺伝子若しくは配列、例えば脂肪酸等の標的化合物の生成に関与する遺伝子を含むドナーＤＮＡであって；
任意で、該選択マーカーがＵｒａ５であり；
任意で、該対象となる遺伝子又は配列が、デルタ－９－デサチュラーゼ、デルタ－１２－デサチュラーゼ、エロンガーゼ、オレイン酸ヒドラターゼ、アルドケトレダクターゼプロモータ、アルドケトレダクターゼターミネータ、転写伸長因子２プロモータ、ＴＥＦプロモータ、及び／又はＴＥＦターミネータをコードしており；
任意で、該ドナーＤＮＡが、配列番号６～１３及び２７～３６のいずれか、任意で配列番号６～１３及び２７のいずれかの配列を含むドナーＤＮＡと
を含む組成物に関する。
－ ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼ；任意でＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼタンパク質、該ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼをコードしているＤＮＡ、又はＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼをコードしているｍＲＮＡ、好ましくはＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼをコードしているｍＲＮＡであって；
好ましくは、ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）エンドヌクレアーゼであり、より好ましくは、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１、Ｃａｓ２、Ｃａｓ４、Ｃａｓ３、Ｃａｓ１０、Ｃａｓ１２、Ｃａｓ１３、Ｃｓｍ、ｓｃｆ１、又はそれらのバリアント、例えば、Ｃａｓ１２ａ、ｄＣａｓ９、Ｄ１０Ａ ＣＡＳ９ニッカーゼ、又はＨ８４０Ａ ＣＡＳ９ニッカーゼから選択され、更により好ましくは、配列番号１～４のいずれかの配列を有するＣａｓ９エンドヌクレアーゼ等のＣａｓ９エンドヌクレアーゼであるＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼと；
－ 少なくとも１つのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）；好ましくはｃｒＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮＡ、及び／又はｓｇＲＮＡであって；
任意で、配列番号５のｔｒａｃｒＲＮＡ配列を含む及び／又は配列番号１４～２６のいずれか１つのｃｒＲＮＡ配列を含むｇＲＮＡと；
－ 任意で、ドナーＤＮＡ；好ましくは、ＤＮＡ修復テンプレート、選択マーカーをコードしているＤＮＡ、及び／又は対象となる遺伝子若しくは配列、例えば脂肪酸等の標的化合物の生成に関与する遺伝子を含むドナーＤＮＡであって；
任意で、該選択マーカーがＵｒａ５であり；
任意で、該対象となる遺伝子又は配列が、デルタ－９－デサチュラーゼ、デルタ－１２－デサチュラーゼ、エロンガーゼ、オレイン酸ヒドラターゼ、アルドケトレダクターゼプロモータ、アルドケトレダクターゼターミネータ、転写伸長因子２プロモータ、ＴＥＦプロモータ、及び／又はＴＥＦターミネータをコードしており；
任意で、該ドナーＤＮＡが、配列番号６～１３及び２７～３６のいずれか、任意で配列番号６～１３及び２７のいずれかの配列を含むドナーＤＮＡと
を含む組成物に関する。
【0025】
一実施形態では、配列番号１～４のいずれかの配列を有する該Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、配列番号１～２のいずれかのアミノ酸配列及び／又は配列番号３～４のいずれかの核酸配列を有する。
【0026】
この態様では、ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼ、少なくとも１つのガイドＲＮＡ、及びドナーＤＮＡは、本明細書で定義する通りである。
【0027】
更なる態様では、本発明は、
－ ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼをコードしているｍＲＮＡであって；
好ましくは、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼであり、より好ましくは、配列番号１～４のいずれかの配列を有するＣａｓ９エンドヌクレアーゼであるＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼと；
－ 少なくとも１つのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）；好ましくはｃｒＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮＡ、及び／又はｓｇＲＮＡであって；
任意で、配列番号５のｔｒａｃｒＲＮＡ配列を含む及び／又は配列番号１４～２６のいずれか１つのｃｒＲＮＡ配列を含むｇＲＮＡと；
－ 任意で、ドナーＤＮＡ、例えばＤＮＡ修復テンプレートであって；
任意で、配列番号６～１３及び２７～３６のいずれか、任意で配列番号６～１３及び２７のいずれかの配列を有するドナーＤＮＡと
を含むプラスミド又はプラスミドコレクションに関する。
－ ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼをコードしているｍＲＮＡであって；
好ましくは、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼであり、より好ましくは、配列番号１～４のいずれかの配列を有するＣａｓ９エンドヌクレアーゼであるＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼと；
－ 少なくとも１つのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）；好ましくはｃｒＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮＡ、及び／又はｓｇＲＮＡであって；
任意で、配列番号５のｔｒａｃｒＲＮＡ配列を含む及び／又は配列番号１４～２６のいずれか１つのｃｒＲＮＡ配列を含むｇＲＮＡと；
－ 任意で、ドナーＤＮＡ、例えばＤＮＡ修復テンプレートであって；
任意で、配列番号６～１３及び２７～３６のいずれか、任意で配列番号６～１３及び２７のいずれかの配列を有するドナーＤＮＡと
を含むプラスミド又はプラスミドコレクションに関する。
【0028】
一実施形態では、該ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼをコードしているｍＲＮＡは、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼをコードしているｍＲＮＡを含むか又はからなり、該Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、配列番号１～２のいずれか及び／又はＣａｓ９エンドヌクレアーゼをコードしているｍＲＮＡのアミノ酸配列を有し、該ｍＲＮＡは、配列番号３～４のいずれかの核酸配列を有する。
【0029】
一実施形態では、該ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼをコードしているｍＲＮＡは、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼをコードしているｍＲＮＡのいずれかを含むか又はからなり、該Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、配列番号１～２のいずれか及びＣａｓ９エンドヌクレアーゼをコードしているｍＲＮＡのアミノ酸配列を有し、該ｍＲＮＡは配列番号３～４のいずれかの核酸配列を有する。
【0030】
一実施形態では、該プラスミド又はプラスミドコレクションは、
－ ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼをコードしているｍＲＮＡであって；
好ましくは、該ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼがＣａｓ９エンドヌクレアーゼであり；より好ましくは、該ｍＲＮＡがＣａｓ９エンドヌクレアーゼをコードしているｍＲＮＡのいずれかであり、該Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼが配列番号１～２のいずれか及びＣａｓ９エンドヌクレアーゼをコードしているｍＲＮＡのアミノ酸配列を有し、該ｍＲＮＡが配列番号３～４のいずれかの核酸配列を有するｍＲＮＡと；
－ 少なくとも１つのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）；好ましくはｃｒＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮＡ、及び／又はｓｇＲＮＡであって；
任意で、配列番号５のｔｒａｃｒＲＮＡ配列を含む及び／又は配列番号１４～２６のいずれか１つのｃｒＲＮＡ配列を含むｇＲＮＡと；
－ 任意で、ドナーＤＮＡ、例えばＤＮＡ修復テンプレートであって；
任意で、配列番号６～１３及び２７～３６のいずれか、任意で配列番号６～１３及び２７のいずれかの配列を有するドナーＤＮＡと
を含む。
－ ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼをコードしているｍＲＮＡであって；
好ましくは、該ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼがＣａｓ９エンドヌクレアーゼであり；より好ましくは、該ｍＲＮＡがＣａｓ９エンドヌクレアーゼをコードしているｍＲＮＡのいずれかであり、該Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼが配列番号１～２のいずれか及びＣａｓ９エンドヌクレアーゼをコードしているｍＲＮＡのアミノ酸配列を有し、該ｍＲＮＡが配列番号３～４のいずれかの核酸配列を有するｍＲＮＡと；
－ 少なくとも１つのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）；好ましくはｃｒＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮＡ、及び／又はｓｇＲＮＡであって；
任意で、配列番号５のｔｒａｃｒＲＮＡ配列を含む及び／又は配列番号１４～２６のいずれか１つのｃｒＲＮＡ配列を含むｇＲＮＡと；
－ 任意で、ドナーＤＮＡ、例えばＤＮＡ修復テンプレートであって；
任意で、配列番号６～１３及び２７～３６のいずれか、任意で配列番号６～１３及び２７のいずれかの配列を有するドナーＤＮＡと
を含む。
【0031】
この態様では、ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼ、少なくとも１つのガイドＲＮＡ、及びドナーＤＮＡは、本明細書で定義する通りである。
【0032】
更なる態様では、本発明は、ＧＣリッチ微生物、特にクタネオトリコスポロン属の種から選択される微生物を遺伝的に改変するための、本明細書で定義される組成物、プラスミド、及び／又はプラスミドコレクションの使用に関する。
【0033】
この態様では、組成物、プラスミド、プラスミドコレクション、ＧＣリッチ微生物、及びクタネオトリコスポロン属の種から選択される微生物は、本明細書で定義される通りである。
【0034】
更なる態様では、本発明は、遺伝的に改変されたＧＣリッチ微生物、好ましくは油性微生物、より好ましくは油性酵母を用いて、標的化合物、例えばアセチル－ＣｏＡ又はアセチル－ＣｏＡベースの疎水性化合物及び／又は特定の脂肪酸プロファイルを有する油、例えば高オレイン酸油を調製する方法であって：
ａ）上記で定義された方法を用いて、遺伝的に改変されたＧＣリッチ微生物、好ましくは油性微生物、より好ましくは油性酵母を提供することであって；該方法が、該微生物をドナーＤＮＡで形質転換することを含み、該ドナーＤＮＡが、対象となる遺伝子又は配列、例えば、該標的化合物及び／又は特定の脂肪酸の生成に関与する遺伝子を含むことと；
ｂ）該遺伝的に改変されたＧＣリッチ微生物を増殖させることと；
ｃ）該標的化合物及び／又は特定の脂肪酸プロファイルを有する油を得ることであって；
好ましくは、該標的化合物が、飽和短鎖脂肪酸、飽和中鎖脂肪酸、飽和長鎖脂肪酸、一価不飽和脂肪酸、多価不飽和脂肪酸、官能化脂肪酸、エルゴステロール、エルゴステロール誘導体、テルペン、アルカロイド、アセチル－ＣｏＡベースの合成化合物、トコクロマノール、例えばα－トコフェロール及びα－トコトリエノール、モノテルペノイド、セスキテルペノイド、ジテルペノイド、スクアレン、カロテノイド、トリテルペン、フェオフィチン、ビタミン、クエン酸、揮発性脂肪酸、シュウ酸、乳酸、リンゴ酸、及びエキソポリサッカライドから選択されることと
を含む方法に関する。
ａ）上記で定義された方法を用いて、遺伝的に改変されたＧＣリッチ微生物、好ましくは油性微生物、より好ましくは油性酵母を提供することであって；該方法が、該微生物をドナーＤＮＡで形質転換することを含み、該ドナーＤＮＡが、対象となる遺伝子又は配列、例えば、該標的化合物及び／又は特定の脂肪酸の生成に関与する遺伝子を含むことと；
ｂ）該遺伝的に改変されたＧＣリッチ微生物を増殖させることと；
ｃ）該標的化合物及び／又は特定の脂肪酸プロファイルを有する油を得ることであって；
好ましくは、該標的化合物が、飽和短鎖脂肪酸、飽和中鎖脂肪酸、飽和長鎖脂肪酸、一価不飽和脂肪酸、多価不飽和脂肪酸、官能化脂肪酸、エルゴステロール、エルゴステロール誘導体、テルペン、アルカロイド、アセチル－ＣｏＡベースの合成化合物、トコクロマノール、例えばα－トコフェロール及びα－トコトリエノール、モノテルペノイド、セスキテルペノイド、ジテルペノイド、スクアレン、カロテノイド、トリテルペン、フェオフィチン、ビタミン、クエン酸、揮発性脂肪酸、シュウ酸、乳酸、リンゴ酸、及びエキソポリサッカライドから選択されることと
を含む方法に関する。
【0035】
この態様では、ＧＣリッチ微生物、油性微生物、油性酵母、及びドナーＤＮＡは、本明細書において定義される通りである。
【図面の簡単な説明】
【0036】
次に、以下の図面を参照することによって本発明を更に説明する。
以下の図の説明に記載されている全ての方法は、実施例に詳細に記載されている通りに実施した。
以下の図の説明に記載されている全ての方法は、実施例に詳細に記載されている通りに実施した。
【図1】図１は、ｍＲＮＡを用いたトランスフェクションにより、より多くのコロニーが得られることを示す。陽性コロニーには丸印を付けてある。プレート上の番号の付いたコロニーは全て、選択剤の有効期間中に出現した。番号の付いていない小さなコロニーは、選択剤がその効果を失った後の非特異的コロニーである。スフェロプラスト化により、ＧＣリッチ微生物、例えばＣ．オレアギノサス等の油性酵母の効率的なトランスフェクションが可能になることが実証されている。更に、ｍＲＮＡの形態のＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼを用いたトランスフェクションは、タンパク質の形態のＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼを用いたトランスフェクションよりも更により効率的であることが示されている。また、スフェロプラスト化を用いてＧＣリッチ微生物、例えば油性微生物を前処理することをｍＲＮＡの形態のＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼを用いて生物をトランスフェクションすることを組み合わせると、ＧＣリッチ微生物の遺伝的改変の効率が相乗的に上昇することも示されている。
【図2】図２は、市販のリチカーゼ酵素を用いてスフェロプラスト化したときには形質転換体が得られないことを示す。このように、それぞれの微生物に適合した酵素ミックスを用いた油性酵母等のＧＣリッチ微生物のスフェロプラスト化は、市販の酵素を用いたスフェロプラスト化よりも驚くほど優れている。予期せぬことに、本発明の方法で使用されるスフェロプラスト化手順は、ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼを使用してＧＣリッチ微生物、例えばＣ．オレアギノサス等の油性酵母を高効率でトランスフェクションすることを可能にする。
【図3】図３は、ゲノムＤＮＡ中のＵｒａ５遺伝子座における例示的な標的部位の改変を示す。Ａ）Ｃａｓ野生型を用いた遺伝的改変。この例では、ＣＡＳ９を用いて標的化フレームシフトを作り出すことによりｕｒａ５遺伝子をノックアウトする。この方法により、選択した遺伝子座における標的化遺伝子ノックアウトが可能となる。Ｂ）Ｃａｓニッカーゼを用いた遺伝的改変。この例では、ＣＡＳニッカーゼを用いて標的化フレームシフトを作り出すことによりｕｒａ５遺伝子をノックアウトする。この方法により、選択した遺伝子座における標的化遺伝子ノックアウトが可能となる。
【図4】図４は、制限消化後の野生型及び変異体（ニッカーゼによって操作）のＵｒａ５遺伝子のＤＮＡゲル電気泳動を示す。アガロースゲル電気泳動：いずれも制限消化酵素（ＷＴ ｕｒａ５遺伝子では非カッター酵素）によって処理した野生型ｕｒａ５遺伝子及び編集されたｕｒａ５遺伝子座。この例のニッカーゼによるｕｒａ５のノックアウトのためのドナーＤＮＡは、非カッター制限消化部位を含んでいた。変異体及び野生型のｕｒａ５遺伝子を増幅し、それぞれの酵素で消化した。
【図6】図６は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓを用いたＧＣリッチ微生物の標的化遺伝的改変の模式図を示す。スフェロプラスト化を含む本発明の方法により、高ＧＣ含量を有する油性微生物等のＧＣリッチ微生物を効率的にトランスフェクトすることが可能になる。
【図7】図７は、最小窒素培地におけるＣＲＩＳＰＲ法を介して操作した株及び野生型の脂肪酸プロファイルを示す。デルタ－９デサチュラーゼのプロモータをＴＥＦプロモータに置き換えると、Ｃ１８：１がより少なく、Ｃ１８：０がより多くなった。従って、本発明の方法により、ＧＣリッチ微生物の脂肪酸プロファイルを有効に改変し、特定の脂肪酸プロファイルを有する油を調製することが可能になる。
【図8】図８は、ＧＣリッチ微生物、特に油性微生物においてデルタ－１２デサチュラーゼ遺伝子をノックアウトすると、この変異体の最終脂肪酸プロファイルにＣ１８：２及びＣ１８：３が存在しなくなることを示す。従って、本発明の方法により、ＧＣリッチ微生物の脂肪酸プロファイルを有効に改変することが可能になり、特定の脂肪酸プロファイルを有する油を調製することが可能になる。
【図9】図９は、グルコースを添加した最小窒素培地を用い、バイオリアクター内において制御された条件下で９６時間培養した後の、Ｄ９プロモータをＡＫＲプロモータに交換した操作株の脂肪酸プロファイルを野生型脂肪酸と比較して示す。
【図10】図１０は、グルコース及び酢酸を添加した窒素リッチ培地を用い、バイオリアクター内において制御された条件下で９６時間培養した後の、Ｄ９プロモータをＡＫＲプロモータに交換した操作株の脂肪酸プロファイルを野生型脂肪酸と比較して示す。
【図11】図１１は、グルコースを添加した最小窒素培地を用い、バイオリアクター内において制御された条件下で９６時間培養した後の、Ｄ９プロモータをＴＥＦプロモータに交換した操作株の脂肪酸プロファイルを野生型脂肪酸と比較して示す。デルタ－９デサチュラーゼのプロモータをＴＥＦプロモータに置き換えると、Ｃ１８：１はより少なく、Ｃ１８：０はより多くなった。
【図12】図１２は、グルコース及び酢酸を添加した窒素リッチ培地を用い、バイオリアクター内において制御された条件下で９６時間培養した後の、Ｄ９プロモータをＴＥＦプロモータに交換した操作株の脂肪酸プロファイルを野生型脂肪酸と比較して示す。
【図15】図１５は、グルコースを添加した最小窒素培地を用い、振盪フラスコで９６時間培養した後の、Ｄ１２デサチュラーゼを過剰発現する操作株の脂肪酸プロファイルを野生型脂肪酸と比較して示す。操作株では、Ｃ１８：２含量のわずかな増加を観察することができる。
【図16】図１６は、グルコースを添加した最小窒素培地を用い、バイオリアクター内において制御された条件下で９６時間培養した後の、Ｄ１２遺伝子をフルノックアウトした操作株の脂肪酸プロファイルを野生型脂肪酸と比較して示す。デルタ－１２デサチュラーゼ遺伝子をノックアウトすると、この変異体の最終脂肪酸プロファイルにＣ１８：２及びＣ１８：３が存在しなくなった。
【発明を実施するための形態】
【0037】
ＧＣリッチ微生物、例えばＣ．オレアギノサス等の油性微生物では、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）が相同組換え（ＨＤＲ）よりも優勢であるため、油性微生物に標的を絞った広範な遺伝子操作が妨げられてきた。更に、油性微生物の遺伝子操作は、油性微生物等のＧＣリッチ微生物用の人工プラスミドがないことからも妨げられてきた。更に、ＧＣリッチ微生物、例えば油性微生物を含有する細胞壁内部への遺伝子及び／又はエンドヌクレアーゼの送達も、細胞壁の存在が原因で障害となっていた。
【0038】
本発明の目的は、増強された形質転換系、例えば、標的を絞った方法でＧＣリッチ微生物を遺伝的に改変する方法を提供することである。具体的には、本発明の目的は、ＧＣリッチ微生物を遺伝的に改変するための増強された手段を提供することである。更に、本発明の目的は、アセチル－ＣｏＡベースの疎水性化合物等の標的化合物を効率的に生成することができる遺伝的に改変された微生物を提供すること、及び／又は改変されたアセチル－ＣｏＡプールを有する遺伝的に改変された微生物を提供することである。また、本発明の目的は、油性微生物等のＧＣリッチ微生物を用いて、アセチル－ＣｏＡベースの疎水性化合物等の標的化合物を効率的に生成することである。本発明の更なる目的は、ＧＣリッチ微生物を効率的に形質転換することであり、例えば、ＧＣリッチ微生物を遺伝的に改変して標的化合物、例えばアセチル－ＣｏＡベースの疎水性化合物を生成することである。また、本発明の目的は、ＧＣリッチ微生物をゲノムの規定の位置で遺伝的に改変する方法を提供することである。更に、本発明は、ＧＣリッチ微生物の形質転換効率を高めることを目的とする。
【0039】
本発明に係るＧＣリッチ微生物を遺伝的に改変する方法は、形質転換前に細胞壁が分解されるという点で非常に有利である。例えば、ＧＣリッチ微生物、好ましくは油性微生物の細胞壁を分解するために酵素的前処理が用いられる。ＧＣリッチ微生物の細胞壁を分解することにより、遺伝子移入、ＲＮＡ移入、タンパク質移入、及び／又はリボ核タンパク質複合体の移入が促進される。有利なことに、酵素的前処理及び／又はスフェロプラスト化手順は、処理されるそれぞれの微生物に特異的に適合させることができ、例えば、使用される酵素をそれぞれの微生物の細胞壁の成分に適合させることができる。従って、有利なことに、本発明の方法により、ＧＣリッチ微生物を前処理するためのテーラーメイドの酵素系を提供することが可能になる。
【0040】
更に、本発明に係る遺伝的に改変する方法は、有利なことに、リボ核タンパク質複合体さえもＧＣリッチ微生物に移入することを可能にする。本発明者らは、ＣＡＳ ｍＲＮＡ及びリボ核タンパク質（ＲＮＰ）を採用することを通してＣａｓを介した効率的なゲノム編集技術の開発に成功した。ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼをｍＲＮＡの形態で又はタンパク質、特にリボ核タンパク質の形態で使用することの利点は、ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼ遺伝子、例えばＣＡＳ遺伝子のプロモータ効率及び発現レベルを考慮する必要がないことである。従って、有利なことに、本発明に係る遺伝的に改変する方法は、ＤＮＡフリーのゲノム編集技術の形態で実施することができる。ｍＲＮＡの形態又はＲＮＰの形態のＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼの利点は、ＲＮＰが時間と共に分解され、Ｃａｓ ｍＲＮＡがＣＡＳタンパク質を一過的に発現させることであり、その結果、クローニングの労力が大幅に軽減され、オフターゲット効果も緩和される。本発明に係る遺伝的に改変する方法は、高ＧＣ含量の微生物でさえも遺伝的に改変することができるという点で非常に有利である。有利なことに、工程ｉｉｉ）における該形質転換が、該ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼをコードしているｍＲＮＡの形態で該ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼを適用することを含む場合、Ｃａｓタンパク質は一過性に発現する。本発明者らは、ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼをｍＲＮＡの形態で適用すると、ＤＮＡ又はタンパク質の形態と比較してオフターゲット効果が減少することを見出した。本発明者らは、クタネオトリコスポロン属の種等のＧＣリッチ微生物を前処理、好ましくはスフェロプラスト化したとき及びＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼを特にｍＲＮＡの形態で使用したとき、オフターゲット効果を非常に低く抑えながら該微生物を効率的に遺伝的に改変できることを見出した。
【0041】
遺伝子改変の特異性を更に高めるために、複数のｓｇＲＮＡ分子を用いてＧＣリッチ微生物を形質転換することができる。例えば、同じ又は異なる標的配列を標的とするｓｇＲＮＡ分子を用いて特異性を高めることができる。一実施形態では、ＧＣリッチ微生物を遺伝的に改変する方法は、１つ以上のｓｇＲＮＡ分子、好ましくは異なる標的配列を標的とする複数のｓｇＲＮＡ分子を用いて該微生物を形質転換することを含む。一実施形態では、ＧＣリッチ微生物を遺伝的に改変する方法は、１つ以上のｔｒａｃｒＲＮＡ及び１つ以上のｃｒＲＮＡ分子、好ましくは異なる標的配列を標的とする複数のｃｒＲＮＡ分子を用いて該微生物を形質転換することを含む。
【0042】
ＧＣリッチ微生物、例えばＣ．オレアギノサス等の油性微生物のゲノムは、ＧＣ含量が豊富（例えば約６１％）であり、このことがｓｇＲＮＡの設計等のガイドＲＮＡの設計を複雑にしている。２０ｂｐのｓｇＲＮＡが、標的とする配列に対するＣＡＳ９等のＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼを特定すると考えられるが、ＰＡＭ－遠位部分に３～５個のミスマッチがあっても許容できることが示されている。ＰＡＭに加えて、ｓｇＲＮＡのシード配列（ＰＡＭに直接隣接する１０～１２ｂｐ）が、一般的にＣＡＳ９：ｓｇＲＮＡ複合体のオンターゲット結合において役割を果たしている。従って、ＧＣリッチ微生物、例えばＣ．オレアギノサス等の高ＧＣ含量を有する油性微生物のゲノムに類似した反復配列が存在することが、ＣＡＳ９：ｓｇＲＮＡのオフターゲット効果を助長している。２つのＣａｓ９ヌクレアーゼドメインのうち１つを変異させることによってＣＡＳ９ニッカーゼの誘導体（Ｄ１０Ａ、Ｈ８４０Ａ）が作り出された結果、ＤＮＡの一本鎖切断が生じた。従って、これらＣＡＳ９誘導体は、必要な二本鎖切断を生成するために、反対側のＤＮＡ鎖を標的とする２つの隣接するｇＲＮＡを備えている。従って、オフターゲット効果を減少させ、ｇＲＮＡの設計を容易にする。
【0043】
ＣＡＳタンパク質／ｍＲＮＡ、合成ｓｇＲＮＡ、及びドナーＤＮＡをＣ．オレアギノサス等の高ＧＣ含量を有する油性微生物に直接送達するために、これまでに確立されている方法を使用することはできない。従って、ＧＣリッチ微生物、例えば油性酵母、具体的にはＣ．オレアギノサスに対するより柔軟な形質転換アプローチが確立され、それにより、効率的なＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼ送達、好ましくはＣａｓ送達が可能となった。スフェロプラスト、例えばＣ．オレアギノサスのスフェロプラストのエレクトロポレーションは、あらゆるタイプの遺伝子要素、例えばｓｓＤＮＡ／ｄｓＤＮＡ断片、ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、低分子ＲＮＡ、及びヌクレアーゼ等のタンパク質を送達するための、より手間がかからず、より迅速な手順を提供する。ＧＣリッチ微生物、例えば油性微生物、好ましくは油性酵母細胞を、酵素産生生物、好ましくは糸状菌、更により好ましくはトリコデルマ・リーゼイから単離した酵素混合物で処理することにより、最適化された効率的なスフェロプラスト単離が達成された。例えば、非制限条件下で培養されたＣ．オレアギノサスのバイオマス上でＴ．リーゼイを発酵させることにより、スフェロプラスト調製に使用されるヒドロラーゼ酵素系が作製された。更に、油形成培養条件下で作製されたＣ．ｏ．バイオマス上でＴ．リーゼイを培養することにより、スフェロプラスト化のためのヒドロラーゼ酵素系が作製された。更に、Ｃ．オレアギノサスのスフェロプラスト化等の下流のスフェロプラスト化のための例示的なヒドロラーゼ生成において、油含有油性微生物のバイオマスを、Ｔ．リーゼイによる発酵の前に、有機相（すなわち、メタノール）及び水洗浄に逐次又は組み合わせて供した。
【0044】
一実施形態では、真菌、好ましくは糸状菌等の酵素産生微生物が、工程ｉｉ）の該前処理に使用される少なくとも１つの酵素を産生する。一実施形態では、工程ｉｉ）における前処理に使用される該少なくとも１つの酵素は、真菌、好ましくは糸状菌等の酵素産生微生物から得られ、例えば、グリコシルヒドロラーゼ、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、マンナナーゼ、キシログルカンゼ、キシラナーゼ、グルカナーゼ、グルコシダーゼ、アラビナーゼ、アミラーゼ、フルクタナーゼ、ラミナラーゼ、ヒドロラーゼ、プロテアーゼ、又はそれらの任意の組み合わせから選択される任意の酵素は、真菌、好ましくは糸状菌から得られる。一実施形態では、該酵素は、真菌、好ましくは糸状菌等の該酵素産生微生物によって産生され、その後、該酵素を塩析することによって、クロマトグラフィーによって、並びに／又はナノ濾過及び／若しくは限外濾過等の濾過によって該真菌の発酵ブロスから取得され、該取得は、任意で、乾燥手順、例えば噴霧乾燥を更に含む。一実施形態では、工程ｉｉ）における前処理、好ましくは、スフェロプラスト化は、テーラーメイドの酵素系を用いて行われ、該テーラーメイドの酵素系は、誘導系を用いて培養された酵素産生糸状菌によって産生される該少なくとも１つの酵素であり、該誘導系は、該ＧＣリッチ微生物又はその成分を含むか又はからなる。本発明者らは、ＧＣリッチ微生物、特にクタネオトリコスポロン属の種等の細胞壁を含む微生物を遺伝的に改変する方法が、該微生物の前処理、特にスフェロプラスト化を行った場合、高効率であり、特異的かつ効率的に該微生物を遺伝的に改変することを可能にすることを見出した。有利なことに、該微生物、特に細胞壁を含む微生物を該形質転換する前に該微生物をスフェロプラスト化することにより、該微生物は、ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼ、例えばｍＲＮＡの形態のＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼによる効率的な形質転換を受けやすくなる。有利なことに、該微生物を前処理し、ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼを用いて該微生物を形質転換することにより、標的を絞って特異的にドナーＤＮＡを該微生物のゲノムに効率的に組み込むことができる。本発明者らは、テーラーメイドの酵素系で前処理したとき、特にクタネオトリコスポロン属の種から選択されるＧＣリッチ微生物を驚くほど高い効率で遺伝的に改変できることを見出した。更に、特にテーラーメイドの酵素系を用いた前処理と特にｍＲＮＡの形態で適用された場合のＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼとの相乗効果により、非常に高い効率及び収率が得られた。本発明者らは、例えばクタネオトリコスポロン属の種から選択されるＧＣリッチ微生物を改変して、特定の脂肪酸組成を有する微生物油等の微生物油を生成できることを示した。従って、有利なことに、例えば、該微生物を遺伝的に改変することによって、不健康なトランス不飽和脂肪酸をより少なく、健康な脂肪酸をより多く含むように、ＧＣリッチ微生物によって生成される微生物油の組成を変化させることができる。
【0045】
本発明者らは、ＧＣリッチ微生物、例えばＣ．オレアギノサス等の高ＧＣ含量を有する油性微生物の標的化操作のための、そのようなＧＣリッチ微生物用のＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼ、特にＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳシステムを用いる遺伝子編集システムを開発した。本発明の方法は、オフターゲット効果が減少するので有利である。ｃｒＲＮＡの配列とＧＣリッチ微生物、例えばＣ．オレアギノサスのゲノムＤＮＡとの間の配列アラインメントによって、オフターゲット効果を減少させた。具体的には、ｃｒＲＮＡ配列とゲノムＤＮＡとの間の配列アラインメントによってオフターゲットを同定し、次いで、非特異的標的のないｃｒＲＮＡ配列を選択した。ｃｒＲＮＡ配列のライブラリーを構築した後、ゲノムＤＮＡとの配列アラインメントによってライブラリーをスクリーニングし、非特異的ターゲティングのないものを選択した。ＣＡＳ：ｓｇＲＮＡ ＲＮＰ複合体等のＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼに加えてＤ１０Ａ等のそのバリアントを２つのｓｇＲＮＡと一緒に、Ｃ．オレアギノサス等のＧＣリッチ微生物に送達することに成功した。更に、ｍＲＮＡ（例えばＣａｓ ｍＲＮＡ）及びｓｇＲＮＡの形態のＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼを用いて酵母スフェロプラスト等のスフェロプラストを形質転換することによって、標的化遺伝子編集の達成に成功した。更に、一本鎖又は二本鎖のドナーＤＮＡを同時に移入することを通して新たな配列を導入し、その結果ｕｒａ５ノックアウト変異体を得た。変異体はウラシルを含むＹＮＢ－５ｆｏａプレートで選択した。遺伝子配列決定によって更なる分析を行った。一実施形態では、標的部位以外の部位がゲノムＤＮＡ上で検出されないように、ガイドＲＮＡ、例えばｃｒＲＮＡを選択する。一実施形態では、標的部位以外の部位がゲノムＤＮＡ上で検出されないようにガイドＲＮＡ、例えばｃｒＲＮＡを選択することによって、エンドヌクレアーゼのオフターゲット活性が低下する。一実施形態では、ニッカーゼを用いることによってオフターゲット効果は更に減少する。一実施形態では、エンドヌクレアーゼタンパク質又はエンドヌクレアーゼをコードしているｍＲＮＡを送達すると、ゲノムに組み込まれて永久に活性を維持するヌクレアーゼをコードしている遺伝子の送達に比べて、オフターゲット効果が減少する。好ましい実施形態では、例えばＤ１０Ａ ＣＡＳ９ニッカーゼ又はＨ８４０Ａ ＣＡＳ９ニッカーゼ等のエンドヌクレアーゼバリアントと組み合わせて、２つのｓｇＲＮＡをＧＣリッチ微生物に送達する。このようなエンドヌクレアーゼと２つのｓｇＲＮＡの組み合わせによって、方法の効率が更に高まる。
【0046】
ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼ、例えばＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ又はＤ１０Ａ及びＨ８４０Ａ等のそのバリアントを使用する本発明の方法は、ＧＣリッチ微生物、特にＣ．オレアギノサス等の油性酵母の標的化操作のための精密、柔軟、かつ簡便なアプローチを提供する。本発明の方法によって、Ｃ．オレアギノサス等のこれら重要な微生物を工業用細胞工場として十分に使用することができるようになり、アセチル－ＣｏＡ又はアセチル－ＣｏＡベースの疎水性化合物等の代謝由来の生成物をより幅広い用途に最適化することができるようになる。例えば、本発明の方法を使用して、カスタマイズされた脂肪酸プロファイルを有する微生物油、医学的に活性のある化合物、例えば、エルゴステロール、エルゴステロール誘導体、トコクロマノール（α－トコフェロール及びα－トコトリエノール等）、モノ－、セスキ－、及びジテルペノイド、スクアレン、カロテノイド、トリテルペン、フェオフィチン、並びにビタミンを調製することができる。更に、本発明の方法によって、毒性化合物に対する高い耐性を有する並びに／又は広範囲にわたる複雑な原料及び廃棄物の流れを有効に利用する能力を有する、遺伝的に改変されたＧＣリッチ微生物を調製することが可能になる。
【0047】
一実施形態では、「遺伝的に改変する」という用語は、本明細書で使用するとき、生物、好ましくは油性微生物等のＧＣリッチ微生物の遺伝情報を改変することに関する。例えば、このような遺伝的改変は、遺伝子のノックイン、遺伝子のノックアウト、及び／又は点変異を含み得る。油性微生物等のＧＣリッチ微生物を遺伝的に改変することにより、対象となる特徴を改変することができる、例えば、アセチル－ＣｏＡベースの疎水性化合物の生成を増加させることができる及び／又は該ＧＣリッチ微生物によって生成される微生物脂質の特定の脂肪酸プロファイルを実現することができる。一実施形態では、本発明に係る遺伝的に改変する方法は、ＧＣリッチ微生物、好ましくは高ＧＣ含量を有する油性微生物をアセチル－ＣｏＡベースの疎水性化合物の生成増加及び／又は特定の脂肪酸プロファイルの生成等の対象となる特徴を有するように改変することができるので有利である。一実施形態では、本発明のＧＣリッチ微生物を遺伝的に改変する方法は、該微生物におけるアセチル－ＣｏＡベースの疎水性化合物の生成を増加させる及び／又は該微生物のアセチル－ＣｏＡプールを改変若しくは調節する方法である。例えば、アセチル－ＣｏＡ合成に関与する１つ以上の遺伝子を改変することで、アセチル－ＣｏＡベースの疎水性化合物等の多くのアセチル－ＣｏＡ由来生成物の前駆体であるアセチル－ＣｏＡレベルを変化させることができる。更に、アセチル－ＣｏＡ系化合物の代謝に関与する１つ以上の遺伝子を改変することにより、これら化合物を調節及び変化させることもできる。
【0048】
一実施形態では、ＧＣリッチ微生物を遺伝的に改変する方法は、遺伝子改変、例えば改変された遺伝子の発現増加若しくは発現減少、遺伝子欠失、遺伝子挿入、フレームシフト、点変異、及び／又は遺伝子置換を可能にする。
【0049】
「ＧＣリッチ微生物」という用語は、本明細書で使用するとき、少なくとも５０％、好ましくは少なくとも５５％、より好ましくは少なくとも５８％、更により好ましくは少なくとも６０％、例えば約６１％のグアニン－シトシン（ＧＣ）含量を有する微生物に関する。ＧＣ含量（又はグアニン－シトシン含量）とは、グアニン（Ｇ）又はシトシン（Ｃ）のいずれかであるＤＮＡ又はＲＮＡの分子、例えばゲノム中の窒素含有塩基の百分率である。一実施形態では、ＧＣ含量は、ＤＮＡのアデニン及びチミン並びにＲＮＡのアデニン及びウラシルも含む全核酸塩基のうちのＧ塩基及びＣ塩基の割合を示す。一実施形態では、「ＧＣ含量」という用語は、本明細書で使用するとき、ＧＣリッチ微生物のゲノムのＧＣ含量及び／又は該ＧＣリッチ微生物に含まれる全ての核酸のＧＣ含量に関する。一実施形態では、ＧＣ含量は、
【0050】
【数1】
【0051】
として計算される。一実施形態では、ＧＣ含量は、微生物のゲノムを配列決定することによって及び／又は微生物の全核酸含量によって測定される。一実施形態では、ＧＣリッチ微生物は細胞壁を含む。好ましい実施形態では、ＧＣリッチ微生物は、油性微生物、例えば油性酵母である。一実施形態では、ＧＣリッチ微生物とは、ＧＣ含量が少なくとも５０％、好ましくは少なくとも５５％、より好ましくは少なくとも５８％、更により好ましくは少なくとも６０％、例えば約６１％であるゲノムを有する微生物である。一実施形態では、ＧＣリッチ微生物は、ＧＣ含量が少なくとも５０％、好ましくは少なくとも５５％、より好ましくは少なくとも５８％、更により好ましくは少なくとも６０％、例えば約６１％であるゲノムを有する油性微生物である。
【0052】
好ましい実施形態では、ＧＣリッチ微生物は、油性微生物、すなわちＧＣリッチ油性微生物、例えばクタネオトリコスポロン・オレアギノサス等の油性酵母である。油性微生物は、当業者には公知である。例えば、油性酵母、油性真菌、油性細菌、及び油性微細藻類等の油性微生物は、典型的には微生物脂質を産生することができる微生物であり、例えば、細胞乾燥重量ベースで２０％ｗ／ｗ超の脂質を蓄積する微生物である。一実施形態では、ＧＣリッチ微生物は、油性微生物から選択され、好ましくは、油性酵母、油性真菌、油性細菌、及び油性微細藻類から選択される。一実施形態では、該油性酵母は、ロドスポリジウム属の種、ヤロウイア属の種、ロドトルラ属の種、カンジダ属の種、リポマイセス属の種、クタネオトリコスポロン属の種、トリコスポロン属の種から選択され、好ましくはクタネオトリコスポロン属の種から選択され、より好ましくはクタネオトリコスポロン・オレアギノサスである。該油性微生物が酵母である場合、それは油性酵母であり、好ましくは、該油性酵母は、ロドスポリジウム属の種、ヤロウイア属の種、ロドトルラ属の種、カンジダ属の種、リポマイセス属の種、クタネオトリコスポロン属の種、トリコスポロン属の種から選択され、好ましくはクタネオトリコスポロン属の種から選択され、より好ましくはクタネオトリコスポロン・オレアギノサスである。該油性微生物が真菌である場合、それは油性真菌であり、好ましくは、該油性真菌は、クニンガメラ属（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍｅｌｌａ）、アスペルギルス属、モルチエレラ属（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ）、及びフミコーラ属（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）から選択される。該油性微生物が細菌である場合、それは油性細菌であり、好ましくは、該油性細菌は、ロドコッカス属（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）、アシネトバクター属（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、及びバチルス属から選択される。好ましい油性菌の種は、ロドコッカス・オパクス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｏｐａｃｕｓ）、アシネトバクター・カルコアセチクス（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ）、及びバチルス・アルカロフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｌｃａｌｏｐｈｉｌｕｓ）である。該油性微生物が微細藻類である場合、それは油性微細藻類であり、好ましくは、該微細藻類は、クロレラ属（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）、シュードクロロコッカム属（Ｐｓｅｕｄｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｍ）、ナンノクロリス属（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｉｓ）、ナンノクロロプシス属（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ）、イソクリシス属（Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ）、トリボネマ・ミナス（Ｔｒｉｂｏｎｅｍａ ｍｉｎｕｓ）等のトリボネマ属（Ｔｒｉｂｏｎｅｍａ）、デュナリエラ属（Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ）、アンキストロデスムス属（Ａｎｋｉｓｔｒｏｄｅｓｍｕｓ）、ボトリオコッカス・ブラウニイ（Ｂｏｔｒｙｏｃｏｃｃｕｓ ｂｒａｕｎｉｉ）等のボトリオコッカス属（Ｂｏｔｒｙｏｃｏｃｃｕｓ）、パブロバ属（Ｐａｖｌｏｖａ）、スケネデスムス属（Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ）、スケレトネマ属（Ｓｋｅｌｅｔｏｎｅｍａ）、及びニッツキア属（Ｎｉｔｚｓｃｈｉａ）から選択される。
【0053】
一実施形態では、該ＧＣリッチ微生物は、ロドスポリジウム属の種、ヤロウイア属の種、ロドトルラ属の種、カンジダ属の種、リポマイセス属の種、クタネオトリコスポロン属の種、トリコスポロン属の種から選択され、好ましくはクタネオトリコスポロン属の種から選択される油性酵母であり、より好ましくはクタネオトリコスポロン・オレアギノサスである。特に好ましい油性酵母の種は、クタネオトリコスポロン・オレアギノサスである。一実施形態では、該クタネオトリコスポロン・オレアギノサスは、クタネオトリコスポロン・オレアギノサスＡＴＣＣ２０５０９である。一実施形態では、該油性微生物は、少なくとも５０％、好ましくは少なくとも５５％、より好ましくは少なくとも５８％、更により好ましくは少なくとも６０％、例えば約６１％のグアニン－シトシン（ＧＣ）含量を有する。
【0054】
「アセチル－ＣｏＡベースの疎水性化合物」という用語は、本明細書で使用するとき、アセチル－ＣｏＡを含む、並びに／又はアセチル－ＣｏＡを伴って及び／若しくはアセチル－ＣｏＡ代謝を伴って生成される疎水性化合物に関する。一実施形態では、アセチル－ＣｏＡベースの化合物、好ましくはアセチル－ＣｏＡベースの疎水性化合物は、飽和短鎖脂肪酸、飽和中鎖脂肪酸、飽和長鎖脂肪酸、一価不飽和脂肪酸、多価不飽和脂肪酸、官能化脂肪酸、エルゴステロール、エルゴステロール誘導体、テルペン、アルカロイド、アセチル－ＣｏＡベースの合成化合物、トコクロマノール、例えばα－トコフェロール及びα－トコトリエノール、モノテルペノイド、セスキテルペノイド、ジテルペノイド、スクアレン、カロテノイド、トリテルペン、フェオフィチン、ビタミン、クエン酸、揮発性脂肪酸、シュウ酸、乳酸、リンゴ酸、及びエキソポリサッカライドから選択される任意の化合物である。一実施形態では、「短鎖脂肪酸」という用語は、５個以下の炭素原子を有する脂肪酸に関する。一実施形態では、「中鎖脂肪酸」という用語は、６～１２個の炭素原子を有する脂肪酸に関する。一実施形態では、「長鎖脂肪酸」という用語は、１２個以上の炭素原子を有する脂肪酸に関する。一実施形態では、標的化合物は、アセチル－ＣｏＡベースの疎水性化合物及び／又は脂肪酸である。
【0055】
一実施形態では、「スフェロプラスト化」という用語は、本明細書で使用するとき、微生物細胞、好ましくは油性微生物等のＧＣリッチ微生物の細胞壁を部分的又は完全に除去することに関する。例えば、スフェロプラストとは、細胞壁を部分的に欠いた又は完全に欠いた微生物細胞である。一実施形態では、ＧＣリッチ微生物をスフェロプラスト化することにより、ＧＣリッチ微生物の細胞壁の糖、脂質、及びタンパク質が除去される。一実施形態では、ＧＣリッチ微生物、例えば油性微生物の細胞壁を除去及び／又は溶解することにより、微生物はトランスフェクションを受けやすくなる。通常、微生物の細胞壁を消化してスフェロプラストを得ると、膜の張力によって細胞は球形になる。有利なことに、該ＧＣリッチ微生物、例えば油性微生物をスフェロプラスト化することにより、ＧＣリッチ微生物はトランスフェクションを受けやすくなる。本発明者らは、驚くべきことに、油性微生物等のＧＣリッチ微生物を前処理し、それにより該ＧＣリッチ微生物のスフェロプラストを提供した後、該ＧＣリッチ微生物を、例えばｍＲＮＡの形態のＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼを用いてトランスフェクトする等、効率的にトランスフェクトできることを見出した。一実施形態では、ＧＣリッチ微生物は、細胞壁を含む微生物である。一実施形態では、ＧＣリッチ微生物は細胞壁を有する。一実施形態では、ＧＣリッチ微生物が細胞壁を含む場合、ＧＣリッチ微生物を遺伝的に改変する方法は、該微生物を前処理することを含み、好ましくは、該微生物をスフェロプラスト化することを含む。
【0056】
一実施形態では、「前処理」という用語は、本明細書で使用するとき、該ＧＣリッチ微生物のトランスフェクション前に、好ましくはトランスフェクションに対する該ＧＣリッチ微生物の感受性を高めるために、該ＧＣリッチ微生物、好ましくは油性微生物を処理することに関する。一実施形態では、工程ｉｉ）のこのような前処理を行うことにより、このような前処理を行わないＧＣリッチ微生物のトランスフェクションに比べて、このような前処理を行ったＧＣリッチ微生物、例えばこのような前処理を行った油性微生物のトランスフェクションのトランスフェクション効率が上昇する。一実施形態では、工程ｉｉ）における該前処理は、酵素的前処理、化学的前処理、及び／又は別のスフェロプラスト化手順を含む。一実施形態では、該前処理は、該ＧＣリッチ微生物、好ましくは油性微生物と該少なくとも１つの酵素とを接触させることを含む酵素的前処理である。好ましくは、このような少なくとも１つの酵素、例えば酵素ミックスは、糸状菌及び細菌から選択される別の微生物、好ましくは糸状菌から得られる。一実施形態では、真菌は、トリコデルマ属、アスペルギルス属、ペニシリウム属、オーレオバシリウム属、及びフザリウム属から選択される。より好ましい実施形態では、糸状菌はトリコデルマ・リーゼイである。なぜなら、これは、ＧＣリッチ微生物、例えば油性微生物の細胞壁の前処理を可能にする、特に効率的な酵素ミックスを生成することが証明されているからである。一実施形態では、該少なくとも１つの酵素は、誘導系の存在下で培養された真菌、好ましくは糸状菌から得られ、好ましくは、該誘導系は、トランスフェクションのための細胞壁の透過性を改善するために該ＧＣリッチ微生物の細胞壁の前処理を可能にする酵素製剤が得られるように、該ＧＣリッチ微生物の成分、好ましくは該ＧＣリッチ微生物の１つ又は幾つかの細胞壁成分である。好ましくは、このような酵素製剤は、該ＧＣリッチ微生物の細胞壁断片の存在下で該糸状菌を培養することにより生成される。いかなる理論にも束縛されることを望むものではないが、本発明者らは、糸状菌、例えばＴ．リーゼイを該ＧＣリッチ微生物のそのような細胞壁成分の存在に曝露することにより、そのような糸状菌がＧＣリッチ微生物の細胞壁の溶解を完了するのに好適な酵素（複数可）を正確に産生することが可能になると考えられる。特に好ましい実施形態では、トリコデルマ属の糸状菌、例えばトリコデルマ・リーゼイが使用され、特に好ましい実施形態では、トリコデルマ・リーゼイの変異体、例えばＡＴＣＣ寄託番号（複数可）５６７６５及び１３６３１を有する変異体が使用される。糸状菌が培養されると、得られた培養物に濃縮等の更なる加工を施してもよく、糸状菌自体のバイオマスを除去し、得られた上清をそのような形態で使用してもよく、凍結乾燥し、保存のために維持し、その後適切な水溶液で再構成してもよい。
【0057】
一実施形態では、工程ｉｉ）における該前処理は、好ましくはグリコシルヒドロラーゼ、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、マンナナーゼ、キシログルカンゼ、キシラナーゼ、グルカナーゼ、グルコシダーゼ、アラビナーゼ、アミラーゼ、フルクタナーゼ、ラミナラーゼ、ヒドロラーゼ、プロテアーゼ、又はそれらの任意の組み合わせから選択される少なくとも１つの酵素を用いて行われる酵素的前処理を含む。一実施形態では、工程ｉｉ）における該前処理は、該ＧＣリッチ微生物を少なくとも１つの酵素、好ましくは酵素ミックス、例えば糸状菌及び細菌から選択される酵素産生微生物により産生される酵素ミックスと接触させることを含む。一実施形態では、工程ｉｉ）における該前処理は、ヒドロラーゼ単独、又はヒドロラーゼとプロテアーゼとの組み合わせ／ヒドロラーゼに続いてプロテアーゼによる該微生物の処理を含む。任意で、該ヒドロラーゼは、真菌、好ましくは糸状菌、より好ましくはトリコデルマ属の種、アスペルギルス属の種、ペニシリウム属の種、オーレオバシリウム属の種、及びフザリウム属の種から選択される真菌、更により好ましくはトリコデルマ・リーゼイによって生成されるヒドロラーゼから選択される。任意で、該プロテアーゼは、アスペルギルス属の種、ストレプトマイセス属の種、又はバチルス属の種によって生成されるプロテアーゼから選択される。
【0058】
一実施形態では、該微生物を前処理するために使用される該少なくとも１つの酵素、例えば酵素ミックス及び／又はヒドロラーゼは、誘導系の存在下で培養された真菌から得られ、好ましくは、該誘導系は、該ＧＣリッチ微生物の細胞壁の溶解を可能にする酵素ミックス及び／又はヒドロラーゼ製剤が得られるように、該ＧＣリッチ微生物の成分、より好ましくは該ＧＣリッチ微生物の１つ又は幾つかの細胞壁成分である。一実施形態では、該少なくとも１つの酵素、例えば酵素ミックス及び／又はヒドロラーゼ、好ましくは該真菌から得られる少なくとも１つの酵素は、（本発明の工程ｉｉ）の実施とは）別個に調製され、該真菌を培養することから直接得られる液体製剤として、又はその後溶液で再構成されて工程ｉｉ）で使用される凍結乾燥製剤として工程ｉｉ）で使用される。一実施形態では、該少なくとも１つの酵素、好ましくは酵素ミックスは、例えばグリコシルヒドロラーゼ、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、マンナナーゼ、キシログルカンゼ、キシラナーゼ、グルカナーゼ、グルコシダーゼ、アラビナーゼ、アミラーゼ、フルクタナーゼ、ラミナラーゼ、ヒドロラーゼ、プロテアーゼ、又はそれらの任意の組み合わせから選択される酵素活性であるがこれらに限定されない１つ又は幾つかの酵素活性を有する。
【0059】
「少なくとも１つの酵素」という用語は、本明細書で使用するとき、１つ以上の酵素、好ましくは酵素ミックスに関する。一実施形態では、該少なくとも１つの酵素は、該ＧＣリッチ微生物をスフェロプラスト化することができる。一実施形態では、該少なくとも１つの酵素、好ましくは該酵素ミックスは、グリコシルヒドロラーゼ、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、マンナナーゼ、キシログルカンゼ、キシラナーゼ、グルカナーゼ、グルコシダーゼ、アラビナーゼ、アミラーゼ、フルクタナーゼ、ラミナラーゼ、ヒドロラーゼ、プロテアーゼ、及びそれらの任意の組み合わせから選択される１つ以上の酵素を含む。一実施形態では、該少なくとも１つの酵素は、酵素ミックスである。一実施形態では、酵素ミックスは、ヒドロラーゼ及びプロテアーゼを含み、任意で更なる酵素を更に含む。一実施形態では、酵素ミックスは、少なくとも２つ又は３つ、好ましくは少なくとも５つ、より好ましくは少なくとも６つ、更により好ましくは少なくとも７つの酵素を含む。一実施形態では、該少なくとも１つの酵素は、該ＧＣリッチ微生物に適合している、すなわち、誘導系として該ＧＣリッチ微生物の少なくとも１つの成分を該糸状菌と接触させることにより適合しており、該糸状菌は、該ＧＣリッチ微生物に特異的に作用する酵素を産生する。
【0060】
一実施形態では、「酵素的前処理」という用語は、本明細書で使用するとき、ＧＣリッチ微生物、例えば油性微生物を少なくとも１つの酵素、好ましくは酵素ミックスで処理することに関する。一実施形態では、酵素的前処理は、ＧＣリッチ微生物を該少なくとも１つの酵素、好ましくは酵素ミックスと接触させることを含む。一実施形態では、このような酵素的前処理の結果、ＧＣリッチ微生物はスフェロプラストの形態で存在するようになる。一実施形態では、このような酵素的前処理により、該ＧＣリッチ微生物の効率的なトランスフェクション、例えば、油性微生物の効率的なトランスフェクションが可能になる。一実施形態では、酵素的前処理は、該ＧＣリッチ微生物を、グリコシルヒドロラーゼ、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、マンナナーゼ、キシログルカンゼ、キシラナーゼ、グルカナーゼ、グルコシダーゼ、アラビナーゼ、アミラーゼ、フルクタナーゼ、ラミナラーゼ、ヒドロラーゼ、プロテアーゼ、又はそれらの任意の組み合わせから選択される少なくとも１つの酵素、例えば、ヒドロラーゼのみ、又はヒドロラーゼとプロテアーゼとの組み合わせ／ヒドロラーゼに続いてプロテアーゼと接触させることを含む。任意で、該ヒドロラーゼは、真菌、好ましくは糸状菌、より好ましくはトリコデルマ属の種、アスペルギルス属の種、ペニシリウム属の種、オーレオバシリウム属の種、及びフザリウム属の種から選択される真菌、更により好ましくはトリコデルマ・リーゼイによって生成されるヒドロラーゼから選択される、並びに／又は該プロテアーゼは、アスペルギルス属の種、ストレプトマイセス属の種、若しくはバチルス属の種によって産生されるプロテアーゼから選択される。
【0061】
一実施形態では、工程ｉｉ）における該前処理は、１６℃～６０℃の範囲の温度で行われる。一実施形態では、工程ｉｉ）における該前処理は、ｐＨ３～ｐＨ１１の範囲のｐＨで行われる。一実施形態では、工程ｉｉ）における該前処理は、撹拌下、好ましくは０，５～１２０ｒｐｍの範囲の回転速度での撹拌下で行われる。一実施形態では、工程ｉｉ）における該前処理は、１６℃～６０℃の範囲の温度で、バッファ系を含む培地中において、及び／又はｐＨ３～ｐＨ１１の範囲のｐＨで、該ＧＣリッチ微生物を少なくとも１つの酵素、好ましくは酵素ミックスで１０分間～７２時間処理することを含む。一実施形態では、バッファ系は、水、リン酸三カリウム、クエン酸バッファ、ＭＥＳバッファ、ＨＥＰＥＳバッファ、及びそれらの任意の組み合わせのいずれかを含む。
【0062】
一実施形態では、該少なくとも１つの酵素は、糸状菌及び細菌、好ましくは糸状菌から選択される微生物によって産生される。一実施形態では、糸状菌及び細菌から選択される微生物は、ＧＣリッチ微生物に適合した、例えばＧＣリッチ微生物の細胞壁を消化するのに適合した少なくとも１つの酵素、好ましくは酵素ミックスを産生することができる。一実施形態では、少なくとも１つの酵素を産生する微生物は、糸状菌及び細菌から選択され、糸状菌は、セラトシスチス属（Ｃｅｒａｔｏｃｙｓｔｉｓ）の種、例えば、セラトシスチス・フィムブリアタ（Ｃｅｒａｔｏｃｙｓｔｉｓ ｆｉｍｂｒｉａｔａ）、セラトシスチス・モニリホルミス（Ｃｅｒａｔｏｃｙｓｔｉｓ ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｉｓ）、及びセラトシスチス・パラドキサ（Ｃｅｒａｔｏｃｙｓｔｉｓ ｐａｒａｄｏｘａ）、好ましくはセラトシスチス・パラドキサ；トリコデルマ属の種、例えば、トリコデルマ・リーゼイ及びトリコデルマ・ハルジアヌム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｈａｒｚｉａｎｕｍ）、好ましくはトリコデルマ・リーゼイ；アスペルギルス属の種、例えば、アスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、アスペルギルス・ツビンゲンシス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｕｂｉｎｇｅｎｓｉｓ）、及びアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）；ニューロスポラ属（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）の種、例えば、ニューロスポラ・インテルメディア（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）；モナスカス属（Ｍｏｎａｓｃｕｓ）の種、例えば、モナスカス・プルプレウス（Ｍｏｎａｓｃｕｓ ｐｕｒｐｕｒｅｕｓ）；リゾプス属（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）の種、例えば、リゾプス・オリザエ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅ）；フザリウム属の種、例えば、フザリウム・ベネナタム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）；サーモマイセス属（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ）の種；ペニシリウム属の種；オーレオバシリウム属の種；イシュノデルマ属（Ｉｓｃｈｎｏｄｅｒｍａ）の種、例えば、イシュノデルマ・ベンゾイナム（Ｉｓｃｈｎｏｄｅｒｍａ ｂｅｎｚｏｉｎｕｍ）；ポリポラス属（Ｐｏｌｙｐｏｒｕｓ）の種、例えば、ポリポラス・デュラス（Ｐｏｌｙｐｏｒｕｓ ｄｕｒｕｓ）；ピクノポラス属（Ｐｙｃｎｏｐｏｒｕｓ）の種、例えば、ピクノポラス・シンナバリヌス（Ｐｙｃｎｏｐｏｒｕｓ ｃｉｎｎａｂａｒｉｎｕｓ）；ファネロカエテ属（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ）の種、例えば、ファネロカエテ・クリソスポリウム（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）；並びにキシラリア属（Ｘｙｌａｒｉａ）の種から選択され；好ましくは、セラトシスチス属の種、トリコデルマ属の種、アスペルギルス属の種、及びフザリウム属の種から選択され；より好ましくは、トリコデルマ属の種、例えば、トリコデルマ・リーゼイから選択され；該細菌は、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）の種、ハロバチルス属（Ｈａｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ）の種、ハロモナス属（Ｈａｌｏｍｏｎａｓ）の種、ロドサーマス属（Ｒｈｏｄｏｔｈｅｒｍｕｓ）の種、ストレプトマイセス属の種、及びバチルス属の種から選択される。好ましい実施形態では、該少なくとも１つの酵素を産生する微生物は、トリコデルマ属の種、好ましくはトリコデルマ・リーゼイから選択される。
【0063】
一実施形態では、該ＧＣリッチ微生物を前処理するための該少なくとも１つの酵素を得るために、糸状菌及び細菌から選択される該酵素産生微生物、例えばトリコデルマ・リーゼイを、誘導系として該ＧＣリッチ微生物又はその成分と共に培養する。一実施形態では、該誘導系を用いた該酵素産生微生物の該培養は、１６℃～６０℃の範囲、好ましくは２０℃～５０℃の範囲、より好ましくは２５℃～４０℃の範囲、例えば約３０℃の温度で行われる。一実施形態では、該酵素産生微生物の該培養は、ｐＨ３～ｐＨ１１の範囲のｐＨで行われる。一実施形態では、該酵素産生微生物の該培養は、１分間～１２日間、好ましくは１０分間～７２時間行われる。一実施形態では、該酵素産生微生物の該培養は、水、リン酸三カリウム、引用バッファ（ｃｉｔｅｄ ｂｕｆｆｅｒ）、及び／又はＭＥＳバッファを含む培地中で行われる。一実施形態では、該酵素産生微生物の該培養は、ｐＯ２＞２０％で行われる。一実施形態では、該酵素産生微生物を該ＧＣリッチ微生物と共に培養することは、糸状菌及び細菌から選択される該酵素産生微生物を該ＧＣリッチ微生物と共に培養し、それにより該酵素産生微生物に少なくとも１つの酵素を産生させることを含む。
【0064】
一実施形態では、糸状菌及び細菌から選択される酵素産生微生物、例えばトリコデルマ・リーゼイを該ＧＣリッチ微生物又はその成分と共に培養して該少なくとも１つの酵素を得る場合、該ＧＣリッチ微生物、例えば油性微生物は、栄養を制限される又は栄養を制限されない。例えば、ＧＣリッチ微生物、例えば油性微生物は、非制限条件下又は油形成条件下で培養される。一実施形態では、酵素産生微生物を該ＧＣリッチ微生物と共に培養する前に、ＧＣリッチ微生物を非制限条件下又は油形成条件下での培養に供する。酵素産生微生物を、非制限条件又は油形成条件に曝露されたＧＣリッチ微生物、例えば油性微生物と共に培養することにより、それぞれ非制限条件下におけるＧＣリッチ微生物の細胞壁に適合した少なくとも１つの酵素又は油形成条件下におけるＧＣリッチ微生物の細胞壁に適合した少なくとも１つの酵素が産生される。
【0065】
一実施形態では、糸状菌及び細菌から選択される該酵素産生微生物によって産生される少なくとも１つの酵素は、炭水化物源としてのＧＣリッチ微生物を加水分解するのに好適である。一実施形態では、産生される該少なくとも１つの酵素は、グリコシルヒドロラーゼ、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、マンナナーゼ、キシログルカンゼ、キシラナーゼ、グルカナーゼ、グルコシダーゼ、アラビナーゼ、アミラーゼ、フルクタナーゼ、ラミナラーゼ、ヒドロラーゼ、プロテアーゼ、又はそれらの任意の組み合わせを含み、好ましくはセルラーゼ、ヘミセルラーゼ、マンナナーゼ、キシログルカンゼ、キシラナーゼ、グルカナーゼ、及びグルコシダーゼの組み合わせを含む。一実施形態では、工程ｉｉ）における該前処理は、該ＧＣリッチ微生物を制限条件下又は非制限条件下で前処理することを含む。一実施形態では、少なくとも１つの酵素が栄養を制限されたＧＣリッチ微生物を用いて産生される場合、工程ｉｉ）における該前処理は、該ＧＣリッチ微生物を制限条件下で前処理することを含む。一実施形態では、少なくとも１つの酵素が栄養を制限されていないＧＣリッチ微生物を用いて産生される場合、工程ｉｉ）における該前処理は、該ＧＣリッチ微生物を非制限条件下で前処理することを含む。一実施形態では、非制限条件下では、必要な全ての栄養素を微生物に供給する。一実施形態では、油形成条件下では、培養培地は、窒素、硫黄、及び／又はリンが制限されている。
【0066】
一実施形態では、該方法は、該少なくとも１つの酵素を得る工程と、該ＧＣリッチ微生物を該少なくとも１つの酵素で前処理して該ＧＣリッチ微生物のスフェロプラストを提供する工程とを含む。一実施形態では、該前処理は、例えば該誘導系を用いて該酵素産生微生物を培養することから得られる、好ましくは直接得られる液体酵素製剤の形態で、又は凍結乾燥酵素製剤、任意で溶液で再構成された凍結乾燥酵素製剤の形態で、該ＧＣリッチ微生物を該少なくとも１つの酵素と接触させることを含む。一実施形態では、該少なくとも１つの酵素を得ることは、該少なくとも１つの酵素を液体の形態で又は凍結乾燥酵素製剤の形態で得ることを含む。一実施形態では、該少なくとも１つの酵素で第２の基質を前処理する前に、そのような該少なくとも１つの酵素の凍結乾燥酵素製剤を溶解させる。
【0067】
一実施形態では、酵素的前処理は、グリコシルヒドロラーゼ、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、マンナナーゼ、キシログルカンゼ、キシラナーゼ、グルカナーゼ、グルコシダーゼ、アラビナーゼ、アミラーゼ、フルクタナーゼ、ラミナラーゼ、ヒドロラーゼ、プロテアーゼ、又はそれらの任意の組み合わせから選択される少なくとも１つの酵素、例えばセルラーゼ、ヘミセルラーゼ、マンナナーゼ、キシログルカンゼ、キシラナーゼ、グルカナーゼ、及びグルコシダーゼの組み合わせを用いて行われる。一実施形態では、酵素的前処理は、１６℃～６０℃の範囲、好ましくは２０℃～５０℃の範囲、より好ましくは２５℃～４０℃の範囲の温度で、例えば１０分間～７２時間、該ＧＣリッチ微生物を該少なくとも１つの酵素と接触させることを含む。一実施形態では、酵素的前処理は、好ましくはｐＨ３～ｐＨ１１の範囲のｐＨを有するバッファを含む培地中で、該ＧＣリッチ微生物を該少なくとも１つの酵素と接触させることを含む。一実施形態では、バッファは、リン酸カリウムバッファ、クエン酸バッファ及び／又はＭＥＳバッファを含むか又はからなる。一実施形態では、酵素的前処理は、該ＧＣリッチ微生物を、例えばグリコシルヒドロラーゼ、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、マンナナーゼ、キシログルカンゼ、キシラナーゼ、グルカナーゼ、グルコシダーゼ、アラビナーゼ、アミラーゼ、フルクタナーゼ、ラミナラーゼ、ヒドロラーゼ、プロテアーゼ、又はそれらの任意の組み合わせから選択される該少なくとも１つの酵素、好ましくはセルラーゼ、ヘミセルラーゼ、マンナナーゼ、キシログルカンゼ、キシラナーゼ、グルカナーゼ、及びグルコシダーゼの組み合わせと、例えば１６℃～６０℃の範囲、好ましくは２０℃～５０℃の範囲、より好ましくは２５℃～４０℃の範囲の温度で、１０分間～７２時間接触させることを含む。
【0068】
一実施形態では、「化学的前処理」という用語は、本明細書で使用するとき、ＧＣリッチ微生物、例えば油性微生物を少なくとも１つの化学物質で処理することに関する。一実施形態では、このような化学的前処理は、例えば、該ＧＣリッチ微生物の細胞壁を部分的若しくは完全に除去することによって又は核酸及びタンパク質の通過を容易にするために細胞壁を透過処理することによって、該ＧＣリッチ微生物がトランスフェクションを受けやすくする。例えば、酢酸リチウム等の化学物質を用いてＧＣリッチ微生物の細胞壁を完全又は部分的に除去することにより、ＧＣリッチ微生物の透過性が高まり、ＤＮＡ又はＲＮＡ等の核酸及びタンパク質のＧＣリッチ微生物への移入が容易になる。一実施形態では、化学的前処理は、酢酸リチウム、ＣａＣｌ２、２－メルカプトエタノール、ＥＤＴＡ、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、ＤＭＳＯ、エタノール、又はそれらの任意の組み合わせによる前処理である。一実施形態では、例えば酢酸リチウムを使用するこのような化学的前処理は、１６℃～６０℃、好ましくは２５℃～５０℃の範囲の温度で行われる。一実施形態では、例えば酢酸リチウムを使用するこのような化学的前処理は、３０秒間～２４時間の持続時間を有する。
【0069】
「別のスフェロプラスト化手順」という用語は、本明細書で使用するとき、上述の酵素的又は化学的前処理以外のＧＣリッチ微生物、例えば油性微生物をスフェロプラスト化する方法、例えば機械的前処理に関する。
【0070】
「形質転換する」及び「形質転換」という用語は、本明細書で使用するとき、細胞膜（複数可）を通して周囲から外来遺伝物質を直接取り込み、組み込むことによって生じる細胞の遺伝的変化、例えば、ＤＮＡ及びＲＮＡ等の核酸の細胞内への導入に関する。様々な化学的、生物学的、又は物理的方法を用いたこのような外来核酸の導入は、細胞の特性を変化させるために用いることができ、例えば、細胞の遺伝子機能及びタンパク質発現を変化させることができる。一実施形態では、「形質転換」という用語は、外来核酸の細胞への任意の人為的な導入、例えばトランスフェクション又は形質導入等の、遺伝子移入の任意の形態に関する。好ましい実施形態では、該ＧＣリッチ微生物、例えば油性微生物の形質転換は、該ＧＣリッチ微生物をトランスフェクトすることを含むか又はからなる。一実施形態では、「形質転換」及び「トランスフェクション」という用語は互換的に用いられる。一実施形態では、「形質転換する」及び「トランスフェクトする」という用語は互換的に用いられる。トランスフェクションとは、ＧＣリッチ微生物の細胞等の細胞に核酸を意図的に導入するプロセスである。トランスフェクションの２つの主な目的は、組換えタンパク質を生成すること又はトランスフェクトされた細胞における遺伝子発現を特異的に増強若しくは阻害することであり、例えば、油性微生物等のＧＣリッチ微生物においてアセチル－ＣｏＡベースの疎水性化合物又は特定の脂肪酸の生成を特異的に増強することである。
【0071】
一実施形態では、工程ｉｉｉ）における該形質転換は、ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼ、少なくとも１つのガイドＲＮＡ、及び任意でドナーＤＮＡを該ＧＣリッチ微生物に移入することを含む。好ましい実施形態では、工程ｉｉｉ）における該形質転換は、ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼと、１つ超、好ましくは少なくとも２つ又は３つのガイドＲＮＡと、任意でドナーＤＮＡとを該ＧＣリッチ微生物に移入することを含む。「１つ超」のガイドＲＮＡ、例えば「少なくとも２つ又は３つの」ガイドＲＮＡという場合、１種類を超えるガイドＲＮＡ及び少なくとも２種類又は３種類のガイドＲＮＡを意味する。ガイドＲＮＡの「種類」とは、特定の配列を有するガイドＲＮＡに関する。すなわち、「少なくとも２つ」のガイドＲＮＡが存在する場合、そのような「少なくとも２つ」のガイドＲＮＡは第１のガイドＲＮＡ及び第２のガイドＲＮＡを含み、該第１のガイドＲＮＡの配列は該第２のガイドＲＮＡの配列とは異なる。一実施形態では、該第１及び第２のガイドＲＮＡは、該ＧＣリッチ微生物のゲノム上の対向するＤＮＡ鎖を標的とする。本発明者らは、驚くべきことに、１つ超のガイドＲＮＡ、例えば少なくとも２つのガイドＲＮＡを用いると、形質転換の特異性及び効率が非常に高まることを見出した。本発明者らは、１つ超のガイドＲＮＡを使用するとオフターゲット効果が減少するので、少なくとも５０％、好ましくは少なくとも５５％、より好ましくは少なくとも５８％、更により好ましくは少なくとも６０％、例えば約６１％の高グアニン－シトシン（ＧＣ）含量を有する微生物の形質転換においてこのような１つ超のガイドＲＮＡの使用が特に有用であることを見出した。通常、ＰＣＲを行うためには高い融解温度を有するプライマーが必要であるので、ＧＣリッチ微生物、例えば少なくとも５０％又は６０％のＧＣ含量を有する油性微生物の形質転換は問題がある。Ｇ－Ｃ塩基対は３つの水素結合を有し、一方、Ａ－Ｔ塩基対は２つ有する。従って、Ｇ－Ｃ塩基対の数が多い二本鎖ＤＮＡは、互いにより強固に結合し、より安定であり、より高い融解温度を有する。更に、ＧＣリッチ微生物、例えば少なくとも５０％又は６０％のＧＣ含量を有する油性微生物に使用されるプライマーは、典型的には二次構造を形成し、それにより、生成物の収率が低くなるか又は全く得られなくなる可能性がある。更に、ＧＣリッチ微生物、例えば少なくとも５０％又は６０％のＧＣ含量を有する油性微生物における反復配列は、オフターゲット効果をもたらす。本発明者らは、驚くべきことに、例えば本発明の方法の工程ｉｉｉ）において油性微生物等のＧＣリッチ微生物を形質転換するときに１つ超のＲＮＡのガイドを用いることにより、このような障害を克服できることを見出した。好ましい実施形態では、本発明の方法は、２つ以上のガイドＲＮＡ、例えば、異なる配列を有する２つ以上のｓｇＲＮＡを用いて該ＧＣリッチ微生物を形質転換することを含む。２つのｇＲＮＡを使用することで、対象となる領域を特異的に標的とする忠実度が更に高まる。
【0072】
一実施形態では、工程ｉｉｉ）における該形質転換は、ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼタンパク質の形態で、該ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼをコードしているＤＮＡの形態で、又は該ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼをコードしているｍＲＮＡの形態で、好ましくは該ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼをコードしているｍＲＮＡの形態で、該ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼを該ＧＣリッチ微生物に適用することを含む。一実施形態では、工程ｉｉｉ）における該形質転換は、該ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼ及び該少なくとも１つのガイドＲＮＡを、好ましくは一緒に、リボ核タンパク質複合体の形態で適用することを含む。有利には、リボ核タンパク質複合体の形態で該ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼを適用することによって、オフターゲット活性を低下させることができる。一実施形態では、工程ｉｉｉ）における該形質転換は、該ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼをコードしているｍＲＮＡの形態で該ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼを適用することを含み、該少なくとも１つのガイドＲＮＡはｓｇＲＮＡを含む。一実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡがｓｇＲＮＡを「含む」という場合、該少なくとも１つのガイドＲＮＡはｓｇＲＮＡを含むか又はからなる。一実施形態では、ｓｇＲＮＡは、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡを含むか又はからなる。好ましい実施形態では、工程ｉｉｉ）における該形質転換は、該ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼをコードしているｍＲＮＡの形態のＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼを用いて該ＧＣリッチ微生物を形質転換することを含む。好ましい実施形態では、工程ｉｉｉ）における該形質転換は、１つ超のガイドＲＮＡ、好ましくは少なくとも２つ又は３つのガイドＲＮＡを用いて該ＧＣリッチ微生物を形質転換することを含む。一実施形態では、該少なくとも１つのガイドＲＮＡは、第１のガイドＲＮＡ及び第２のガイドＲＮＡを含み、該第１のガイドＲＮＡの配列は、該第２のガイドＲＮＡの配列とは異なる。一実施形態では、該少なくとも２つ又は３つのガイドＲＮＡは、第１のガイドＲＮＡ及び第２のガイドＲＮＡ、並びに該少なくとも３つのガイドＲＮＡの場合は第３のガイドＲＮＡを含み、該第１のガイドＲＮＡの配列は、該第２のガイドＲＮＡの配列とは異なり、存在する場合、該第３のガイドＲＮＡの配列とも異なる。
【0073】
一実施形態では、工程ｉｉｉ）における該形質転換は、エレクトロポレーション；ＰＥＧベース若しくは他のナノスケールキャリアベースの形質転換；生物学的な弾道飛行；ガラスビーズ形質転換；小胞媒介送達；ウイルストランスフェクション系、例えば、レンチウイルス（ＬＶ）、アデノウイルス（ＡｄＶ）、若しくはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）；リポソーム送達、例えば、リポフェクション；化学的トランスフェクション技術；又はそれらの組み合わせを使用して行われる。好ましい実施形態では、工程ｉｉｉ）における該形質転換は、エレクトロポレーション及び／又はＰＥＧベースの形質転換を使用して、好ましくはエレクトロポレーションを使用して行われる。一実施形態では、工程ｉｉｉ）における該形質転換は、該ＧＣリッチ微生物、好ましくはＧＣリッチ油性微生物の染色体又はエピソームの標的化遺伝子改変を含む。一実施形態では、ＰＥＧベースの形質転換は、核酸（細胞に移入される核酸）と細胞の表面との会合を促進するＰＥＧを含む。任意で、該ＰＥＧベースの形質転換は、ＤＮＡの細胞内への通過を促進するリチウムイオン及びヒートショックを更に含む。一実施形態では、ナノスケールキャリアベースの形質転換は、例えば、キャリアＤＮＡ、ポリＤＭＡＥＭＡキャリア、及びＢＧ２キャリア等のキャリアを含む、ポリマーベースの形質転換及び／又はナノ粒子ベースの形質転換である。一実施形態では、工程ｉｉｉ）における該形質転換が、該ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼ及び該少なくとも１つのガイドＲＮＡをリボ核タンパク質複合体の形態で適用することを含む場合、該リボ核タンパク質複合体は、小胞媒介送達を用いて適用される。一実施形態では、形質転換の文脈で「適用する」という場合、そのような用語は、ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼ及び少なくとも１つのガイドＲＮＡ等の化合物の移入及び／又は投与に関することを意味する。
【0074】
用語「ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼ」は、本明細書で使用するとき、当業者に公知の任意のＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼに関する。一実施形態では、該ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）エンドヌクレアーゼであり、好ましくは、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１、Ｃａｓ２、Ｃａｓ４、Ｃａｓ３、Ｃａｓ１０、Ｃａｓ１２、Ｃａｓ１３、Ｃｓｍ、ｓｃｆ１、又はそれらのバリアント、例えば、Ｃａｓ１２ａ、ｄＣａｓ９、Ｄ１０Ａ ＣＡＳ９ニッカーゼ、又はＨ８４０Ａ ＣＡＳ９ニッカーゼから選択される。ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼの「バリアント」とは、例えば、二本鎖ではなく一本鎖のみを切断するように改変された切断部位等の所望の特徴を含むように点変異等の変異によって人為的に改変されているか、又は異なる生物に由来するその起源に起因して自然に改変を含んでいるＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼ、例えば、エンドヌクレアーゼのアナログ、ホモログ、及びオルソログに関する。例えば、Ｃａｓ９のバリアントは、ｄＣａｓ９、Ｄ１０Ａ ＣＡＳ９ニッカーゼ、又はＨ８４０Ａ ＣＡＳ９ニッカーゼであり、Ｃａｓ１２のバリアントはＣａｓ１２ａである。一実施形態では、エンドヌクレアーゼ、例えばＣａｓ９という場合、任意の微生物から得られた該エンドヌクレアーゼ、例えば、化膿レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）（ＳｐＣａｓ９）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）（ＳａＣａｓ９）、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）（ＳｔＣａｓ９）、ストレプトコッカス・カニス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｃａｎｉｓ）（ＳｃＣａｓ９）、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）（ＮｍＣａｓ９）、フランシセラ・ノビシダ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａ）（ＦｎＣａｓ９）、又はカンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ）（ＣｊＣａｓ９）から単離されたＣａｓ９を意味する。一実施形態では、ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼは、本発明の方法、例えば工程ｉｉｉ）において、ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼタンパク質の形態で、該ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼをコードしているＤＮＡの形態で、又は該ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼをコードしているｍＲＮＡの形態で、好ましくは該ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼをコードしているｍＲＮＡの形態で使用される。一実施形態では、工程ｉｉｉ）における該形質転換は、ｍＲＮＡの形態の該ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼ、並びにｓｇＲＮＡの形態又はｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡの形態の該少なくとも１つのガイドＲＮＡ、好ましくは１つ超のガイドＲＮＡを適用することを含む。本発明の方法の利点は、ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼをｍＲＮＡの形態で適用することができ、少なくとも１つのガイドＲＮＡをｓｇＲＮＡの形態で又はｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡの形態で適用することができ、それに形質転換収率の高い高効率の方法を提供することである。更に、１種類を超えるガイドＲＮＡ、すなわち、異なる配列を有する少なくとも２つのガイドＲＮＡ、例えば、異なる配列を有する少なくとも２つのｓｇＲＮＡを用いることで、ゲノム中に反復及びＧＣリッチ配列を有する微生物に対する標的特異性が高まるので、オフターゲット活性の頻度の低下が観察される。従って、ＧＣリッチ微生物を遺伝的に改変する方法の利点は、ＧＣリッチ微生物、例えば高ＧＣ含量を有する油性微生物を、反復配列が豊富に存在するにもかかわらず効率的に形質転換できることである。一実施形態では、ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９、例えば、配列番号１～４のいずれかの配列を含むＣａｓ９である。
【0075】
「ガイドＲＮＡ」又は「ｇＲＮＡ」という用語は、本明細書で使用するとき、例えば、ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼ、例えばｓｇＲＮＡ等のＲＮＡ又はＤＮＡの標的化酵素と複合体を形成すること等により、ＲＮＡ又はＤＮＡの標的化酵素のガイドとして機能するＲＮＡに関する。一実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）、トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）、及びシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）のいずれかを含み、好ましくは、ａ）ｓｇＲＮＡ並びに／又はｂ）ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡを含む。一実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡは、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡを含むか若しくはからなる、並びに／又はｓｇＲＮＡを含むか若しくはからなる。「少なくとも１つのガイドＲＮＡ」という用語は、本明細書で使用するとき、１つ以上のガイドＲＮＡ、好ましくは１種類以上のガイドＲＮＡ、例えば異なる配列を有するガイドＲＮＡに関する。一実施形態では、該少なくとも１つのガイドＲＮＡが２つ以上のガイドＲＮＡを含む場合、第２又は更なるガイドＲＮＡの配列は、第１のガイドＲＮＡの配列とは異なる。更に、該更なるガイドＲＮＡの配列は、該第１及び第２のガイドＲＮＡの配列とは異なる。一実施形態では、工程ｉｉｉ）における該形質転換は、該少なくとも１つのガイドＲＮＡの各々、例えば該１種類以上のガイドＲＮＡの各々を、該ＧＣリッチ微生物に１分子以上、好ましくは数分子移入することを含む。有利なことに、少なくとも２種類のガイドＲＮＡを用いると、本発明の方法の形質転換の効率をより更に高めることができる。一実施形態では、該少なくとも１つのガイドＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）、トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）、及び／又はシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を含むか又はからなる。好ましい実施形態では、該少なくとも１つのガイドＲＮＡは、ｓｇＲＮＡを含むか又はからなる。一実施形態では、該ｓｇＲＮＡは、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡを含む。好ましい実施形態では、該少なくとも１つのガイドＲＮＡは、第１のガイドＲＮＡ及び第２のガイドＲＮＡを含み、該第１のガイドＲＮＡの配列は、該第２のガイドＲＮＡの配列とは異なる。一実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡは、配列番号５を有する配列を含むか又はからなる。
【0076】
一実施形態では、「ドナーＤＮＡ」という用語は、本明細書で使用するとき、該ＧＣリッチ微生物に移入される、好ましくは該ＧＣリッチ微生物のゲノムに組み込まれる、任意の対象となるＤＮＡに関する。一実施形態では、ドナーＤＮＡは、ＤＮＡ修復テンプレート、選択マーカーをコードしているＤＮＡ、及び／又は対象となる遺伝子若しくは配列、例えばアセチル－ＣｏＡ若しくはアセチル－ＣｏＡベースの疎水性化合物又は脂肪酸等の標的化合物の産生に関与する遺伝子を含む。例えば、ＤＮＡ修復テンプレートを使用する場合、特定の変異、例えば点変異及び／又はノックアウトを該ＧＣリッチ微生物のゲノムに組み込むことができる。一実施形態では、対象となる遺伝子又は配列は、デルタ－９－デサチュラーゼ、デルタ－１２－デサチュラーゼ、エロンガーゼ、オレイン酸ヒドラターゼ、アルドケトレダクターゼプロモータ、アルドケトレダクターゼターミネータ、転写伸長因子２プロモータ、ＴＥＦプロモータ、及び／又はＴＥＦターミネータをコードしている。一実施形態では、ドナーＤＮＡは、一本鎖又は二本鎖である。一実施形態では、ドナーＤＮＡは、配列番号６～１３及び２７のいずれかの配列、並びに／又は配列番号６～１３及び２７のいずれかの配列と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、若しくは少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含むか又はからなる。一実施形態では、ドナーＤＮＡは、ｉ）例えば細胞壁／膜／エンベロープの生合成、細胞運動性、翻訳後修飾、タンパク質ターンオーバー、シャペロン、シグナル伝達機構、細胞内輸送、分泌、小胞輸送、防御機構、細胞外構造、核構造、及び／又は細胞骨格に関与する細胞プロセス及びシグナル伝達；ｉｉ）例えばＲＮＡのプロセシング及び修飾、クロマチンの構造及び動態、翻訳、リボソームの構造及び生合成、転写、並びに／又は複製、組換え及び修復に関与する情報の保存及び処理；ｉｉｉ）例えばエネルギーの生産及び変換、細胞周期制御、細胞分裂、染色体分配、アミノ酸の輸送及び代謝、ヌクレオチドの輸送及び代謝、炭水化物の輸送及び代謝、補酵素の輸送及び代謝、脂質の輸送及び代謝、無機イオンの輸送及び代謝、並びに／又は二次代謝産物の生合成、輸送、及び異化に関与する代謝のいずれかに関与する遺伝子をコードしているＤＮＡを含む。
【0077】
一実施形態では、「形質転換された細胞を選択する」という用語は、本明細書で使用するとき、形質転換に成功したＧＣリッチ微生物を選択することに関する。ＧＣリッチ微生物が、該ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼ、該少なくとも１つのガイドＲＮＡ、及び任意で該ドナーＤＮＡを含む場合；好ましくは、例えば、該ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼによって切断されたＤＮＡ切断によって及び／又は存在する場合には該ドナーＤＮＡの該ＧＣリッチ微生物のゲノムへの組み込みによって、該ＧＣリッチ微生物が遺伝的に改変されている場合、ＧＣリッチ微生物は形質転換に成功している。一実施形態では、工程ｉｖ）における該形質転換された細胞の選択は、存在する場合、選択マーカー及び／又は選択剤を用いて、該形質転換されたＧＣリッチ微生物、例えば形質転換された油性微生物を選択することを含む。一実施形態では、該方法は、工程ｉｖ）における該選択を含み、工程ｉｖ）における該選択は、該選択マーカー、任意で該ドナーＤＮＡによってコードされている選択マーカーに対して選択的な選択剤に該微生物を曝露することを含む。一実施形態では、該選択は、最小選択可能濃度の１０％～９０％、好ましくは１０％～７０％、より好ましくは１０％～６０％の範囲の濃度の選択剤に該微生物を曝露すること；及び／又は最小選択可能濃度の９０％～１００％、好ましくは９９％～１００％の範囲の濃度の選択剤に該微生物を曝露することを含む。
【0078】
一実施形態では、工程ｉｖ）における該選択は、存在する場合、二段階選択であり、第１の段階では、該ＧＣリッチ微生物を、第２の段階の培地よりも低い選択強度を有する培地に曝露し、第２の段階では、該ＧＣリッチ微生物を、第１の段階の培地よりも高い選択強度を有する培地に曝露する。一実施形態では、工程ｉｖ）における該選択は、存在する場合、二段階選択であり、第１の段階では、該ＧＣリッチ微生物を、アガーの下層よりも低い選択強度を有するアガーの上層に曝露し、第２の段階では、該ＧＣリッチ微生物を、アガーの上層よりも高い選択強度を有するアガーの下層に曝露する。好ましい実施形態では、該アガーの上層及び該アガーの下層を互いに重ねて１枚のプレートに配置する。一実施形態では、工程ｉｖ）における該選択は、存在する場合、該ＧＣリッチ微生物を、アガーの下層の選択強度よりも低い選択強度を有するアガーの上層に曝露することを含み、該ＧＣリッチ微生物が形質転換に成功した場合、該ＧＣリッチ微生物は該上層上で増殖する。一実施形態では、該上層上で増殖しているＧＣリッチ微生物が該下層に向かって、好ましくは該下層に向かってかつ該下層上で更に増殖した場合、該下層は該上層よりも高い選択強度を有し、該ＧＣリッチ微生物は形質転換に成功したＧＣリッチ微生物である。
【0079】
一実施形態では、選択強度は、特定の濃度の選択剤の存在に関連し、例えば、６０％の選択強度は、該選択剤の最小選択可能濃度の６０％の濃度又は最小致死濃度の６０％の濃度の選択剤の存在に関連する。一実施形態では、該選択は、第１の培地、例えば液体培地又は固形培地、好ましくはアガーの下層中で、最小選択可能濃度の１０％～９０％、好ましくは１０％～７０％、より好ましくは１０％～６０％の範囲の濃度の該選択剤に該微生物を曝露し、その後、第２の培地、例えば液体培地又は固形培地、好ましくはアガーの下層中で、９０％～１００％、好ましくは９９％～１００％の範囲の濃度の選択剤に該微生物を曝露することを含む。一実施形態では、工程ｉｖ）における該選択は、二段階選択を含む、すなわち、該選択は、該微生物を第１のアガー及び第２のアガーに曝露することを含む。このような二段階選択は、選択剤の濃度が低い第１のアガーでは、選択剤の濃度が第２のアガーよりも低い、例えば低いが選択可能な範囲である、例えば（毒性作用を有する化合物、例えば５－ＦＯＡの）ＩＣ５０よりも低い環境において、微生物、好ましくはスフェロプラストを再生できる点で有利である。このような微生物の再生は、後続工程で形質転換を受ける微生物、例えば、後続工程で対象となる遺伝子編集／選択可能マーカー遺伝子を得る微生物にとって特に有利である。一実施形態では、「最小選択可能濃度」という用語は、本明細書で使用するとき、可視又は測定可能な選択が可能な剤、例えば選択剤の濃度に関する。一実施形態では、最小選択可能濃度は最小発育阻止濃度に関する。一実施形態では、最小選択可能濃度は、選択剤を連続希釈したプレートを調製し、微生物の増殖を観察することによって求められる。
【0080】
一実施形態では、「遺伝的に改変されたＧＣリッチ微生物」という用語は、本明細書で使用するとき、形質転換及び／又はトランスフェクトされたＧＣリッチ微生物、例えば油性微生物、好ましくは本発明の方法を用いて遺伝的に改変されたＧＣリッチ微生物に関する。例えば、遺伝的に改変されたＧＣリッチ微生物の遺伝物質は、遺伝子操作を用いて変更されている。一実施形態では、遺伝的に改変されたＧＣリッチ微生物は、少なくとも５０％、好ましくは少なくとも５５％、より好ましくは少なくとも５８％、更により好ましくは少なくとも６０％、例えば約６１％のＧＣ含量を有する。一実施形態では、遺伝的に改変されたＧＣリッチ微生物は、遺伝的に改変された油性微生物、例えば、好ましくはクタネオトリコスポロン属の種から選択され、より好ましくはクタネオトリコスポロン・オレアギノサスである油性酵母である。一実施形態では、遺伝的に改変されたＧＣリッチ微生物は、ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼ、少なくとも１つのガイドＲＮＡ、及び任意でドナーＤＮＡを含む。一実施形態では、該ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼ及び該少なくとも１つのガイドＲＮＡは、リボ核タンパク質複合体の形態で該細胞内に存在する。一実施形態では、該方法は、工程ｖ）で得られた遺伝的に改変されたＧＣリッチ微生物のゲノムの配列を決定する工程を更に含む。
【0081】
一実施形態では、「遺伝的に改変された油性微生物」という用語は、本明細書で使用するとき、形質転換及び／又はトランスフェクトされた油性微生物、好ましくは本発明の方法を用いて遺伝的に改変された油性微生物に関する。例えば、遺伝的に改変された油性微生物の遺伝物質は、遺伝子操作を用いて変更されている。一実施形態では、遺伝的に改変された油性微生物は、ＧＣ含量が少なくとも５０％、好ましくは少なくとも５５％、より好ましくは少なくとも５８％、更により好ましくは少なくとも６０％である油性微生物である。一実施形態では、遺伝的に改変された油性微生物は、遺伝的に改変された、好ましくはクタネオトリコスポロン属の種から選択され、より好ましくはクタネオトリコスポロン・オレアギノサスである油性酵母である。一実施形態では、遺伝的に改変された油性微生物は、ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼ、少なくとも１つのガイドＲＮＡ、及び任意でドナーＤＮＡを含む。一実施形態では、該ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼ及び該少なくとも１つのガイドＲＮＡは、リボ核タンパク質複合体の形態で該細胞内に存在する。好ましい実施形態では、本発明の遺伝的に改変されたＧＣリッチ微生物は、少なくとも５０％、好ましくは少なくとも５５％、より好ましくは少なくとも５８％、更により好ましくは少なくとも６０％、例えば約６１％のＧＣ含量を有する。
【0082】
「選択剤」という用語は、本明細書で使用するとき、例えば抗生物質等の所与の環境において生物が生存する能力に影響を与える剤に関する。例えば、トランスフェクションに成功した後、ＧＣリッチ微生物は選択マーカーを含み得、その結果、トランスフェクションに成功した細胞は、該選択マーカーに特異的な選択剤を用いて選択することができる。例えば、抗生物質等の選択剤により、それぞれの抗生物質耐性遺伝子を含むトランスフェクトされた細胞を特異的に選択することが可能になる。一実施形態では、本発明の方法で使用される選択剤は、５－フルオロオロチン酸、５－フルオロアントラニル酸、ハイグロマイシンＢ、ジェネテシン、フレオマイシン、及びそれらの任意の組み合わせから選択される。
【0083】
一実施形態では、「選択マーカー」という用語は、本明細書で使用するとき、選択に適した形質を付与する、細胞に含まれる核酸配列、例えば遺伝子又は化合物に関する。一実施形態では、選択マーカーは、人為的選択に適した形質を付与する、細胞に導入される遺伝子である。典型的には、選択マーカーは、形質転換、トランスフェクション、又は外来ＤＮＡを細胞に導入することを意図する任意の手順の成功を示す。選択マーカーは、抗生物質耐性遺伝子であってもよい。例えば、選択マーカーは、外来ＤＮＡを細胞に導入することを意図するトランスフェクション又は他の手順の成功を示すためのレポーター遺伝子及び／又は抗生物質耐性遺伝子であってよい。好ましい実施形態では、選択マーカーは、抗生物質耐性遺伝子である。工程ｉｉｉ）で形質転換を受けたＧＣリッチ微生物は、対応する選択剤、例えば該抗生物質を含有する培地上で増殖することができ、増殖できるコロニーは、導入された遺伝物質、例えばドナーＤＮＡの取り込み及び発現に成功している。一実施形態では、選択マーカーは、陽性又は陰性選択マーカーである。一実施形態では、選択マーカーは、該ドナーＤＮＡによってコードされている。一実施形態では、選択マーカーは、デノボの核酸及びアミノ酸の合成の必須酵素をコードしているマーカー遺伝子、アセトアミダーゼ等の栄養利用に関与するマーカー遺伝子、並びに抗菌剤耐性遺伝子から選択される。一実施形態では、選択マーカーは、ＵＲＡ５、ＵＲＡ３、ＨＩＳ、ＬＥＵ、ＴＲＰ、ＭＥＴ、ＡＤＥ、ＬＹＳ、ＵＲＡ、ＡＲＧ、ＡＬＡ、スルホニルウレア、スルホメツロン、アセトアミド、ホルムアミド、ハイグロマイシンＢ耐性遺伝子、ＫａｎＭｘ耐性遺伝子、ゼオシン耐性遺伝子、ノーセオスリシン、フレオマイシン、ピューロマイシン、オーレオバシジン、シクロヘキシミド、及びエリスロマイシンから選択される。更に、内因性遺伝子を選択マーカーとして使用することもでき、例えば、ある化合物又は薬物は、特定の内因性遺伝子の発現により、形質転換されていないＧＣリッチ微生物に対して毒性を示し得るが、形質転換された細胞は毒性化合物を形成する能力がないため生き残る。適切な阻害剤を添加した培地に形質転換体をプレーティングすることにより、これら標的遺伝子上に生じた変異を選択することができる。一実施形態では、選択マーカーは、例えばドナーＤＮＡの一部として形質転換を介して該細胞に導入されるか、又は該細胞に内因性である。
【0084】
一実施形態では、「ＤＮＡ修復テンプレート」という用語は、本明細書で使用するとき、対象となるＤＮＡ配列、例えば、所望の改変の位置を中心とするゲノムＤＮＡの領域の断片を含むＤＮＡに関する。例えば、このようなＤＮＡ修復テンプレートは、生物のゲノムに点変異等の遺伝子改変を組み込むために用いることができる。一実施形態では、ＤＮＡ修復テンプレートはＧＣリッチ微生物のゲノムの配列を含み、このような配列は所望の変異を含む。一実施形態では、用語「対象となる遺伝子又は配列」は、本明細書で使用するとき、対象となる核酸、例えば、アセチル－ＣｏＡプール若しくはアセチル－ＣｏＡベースの疎水性化合物若しくは脂肪酸等の標的化合物の産生に関与する遺伝子、該標的化合物の産生に関与するプロモータ若しくはターミネータ、及び／又は選択マーカーに関する。一実施形態では、対象となる遺伝子又は配列は、タンパク質又は酵素等の対象となる産物をコードしている。一実施形態では、対象となる遺伝子又は配列は、ｉ）例えば細胞壁／膜／エンベロープの生合成、細胞運動性、翻訳後修飾、タンパク質ターンオーバー、シャペロン、シグナル伝達機構、細胞内輸送、分泌、小胞輸送、防御機構、細胞外構造、核構造、及び／又は細胞骨格に関与する細胞プロセス及びシグナル伝達；ｉｉ）例えばＲＮＡのプロセシング及び修飾、クロマチンの構造及び動態、翻訳、リボソームの構造及び生合成、転写、並びに／又は複製、組換え及び修復に関与する情報の保存及び処理；ｉｉｉ）例えばエネルギーの生産及び変換、細胞周期制御、細胞分裂、染色体分配、アミノ酸の輸送及び代謝、ヌクレオチドの輸送及び代謝、炭水化物の輸送及び代謝、補酵素の輸送及び代謝、脂質の輸送及び代謝、無機イオンの輸送及び代謝、並びに／又は二次代謝産物の生合成、輸送、及び異化に関与する代謝に関与する任意の遺伝子をコードしている。一実施形態では、「該標的化合物及び／又は特定の脂肪酸の産生に関与する遺伝子」という場合、対象となる遺伝子又は配列を意味する。一実施形態では、対象となる遺伝子又は配列は、デルタ－９－デサチュラーゼ；デルタ－１２－デサチュラーゼ；エロンガーゼ；オレイン酸ヒドラターゼ；アルドケトレダクターゼプロモータ；アルドケトレダクターゼターミネータ；転写伸長因子２プロモータ；ＴＥＦプロモータ；ＴＥＦターミネータ；１，２－α－マンノシダーゼ；１，４－α－グルカン分岐酵素／デンプン分岐酵素ＩＩ；１５－ヒドロキシプロスタグランジンデヒドロゲナーゼ及び関連デヒドロゲナーゼ；１７β－ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ；１－アシル－ｓｎ－グリセロール－３－リン酸アシルトランスフェラーゼ；２－エノイル－ＣｏＡヒドラターゼ／３－ヒドロキシアシル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼ／ペルオキシソーム３－ケトアシル－ＣｏＡ－チオラーゼ；ステロール結合ドメイン及び関連酵素；２－オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ；３－ヒドロキシ－３－メチルグルタリル－ＣｏＡ（ＨＭＧ－ＣｏＡ）レダクターゼ；３－ヒドロキシアシル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼ；３－ケトステロールレダクターゼ；３－メチルクロトニル－ＣｏＡカルボキシラーゼ；プロピオニル－ＣｏＡカルボキシラーゼ；α鎖／アセチル－ＣｏＡカルボキシラーゼ；３－メチルクロトニル－ＣｏＡカルボキシラーゼ；アセチル－ＣｏＡカルボキシラーゼカルボキシルトランスフェラーゼ；３－オキソアシルＣｏＡチオラーゼ；３－オキソアシル－（アシル－キャリア－タンパク質）合成酵素（Ｉ及びＩＩ）；３－ホスホグリセレートキナーゼ；５’－ＡＭＰ活性化プロテインキナーゼ；５’－ホスホリボシルグリシンアミドホルミルトランスフェラーゼ；６－ホスホグルコネートデヒドロゲナーゼ；６－ホスホグルコノラクトナーゼ；アセチル－ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ；アセチル－ＣｏＡカルボキシラーゼ；アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＥＸＴ１／エクソストシン１；酸スフィンゴミエリナーゼ及びＰＨＭ５リン酸代謝タンパク質；アコニターゼ／ホモアコニターゼ（アコニターゼスーパーファミリー）；アシルキャリアタンパク質／ＮＡＤＨ－ユビキノンオキシドレダクターゼ；アシル－ＣｏＡオキシダーゼ；アシル－ＣｏＡ合成酵素；アシル－ＣｏＡチオエステラーゼ；アシル－ＣｏＡ：ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＤＧＡＴ）；アシル－ＣｏＡ結合タンパク質；アシルホスファターゼ；アルコールデヒドロゲナーゼ；アルデヒドデヒドロゲナーゼ；アルカリセラミダーゼ；αアミラーゼ；α－１；４－Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ；α－アミラーゼ；α－マンノシダーゼ；アミダーゼ；アクアポリン；ＡＴＰ結合タンパク質；ＡＴＰ－クエン酸リアーゼ；β－１，６－Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ；β－フルクトフラノシダーゼ（インベルターゼ）；β－グルコシダーゼ；ラクターゼフロリジンヒドロラーゼ；及び関連タンパク質；β－グルクロニダーゼＧＵＳＢ（グリコシルヒドロラーゼスーパーファミリー２）；ベタインアルデヒドデヒドロゲナーゼ；β－Ｎ－アセチルヘキソサミニダーゼ；二官能性ロイコトリエンＡ４ヒドロラーゼ／アミノペプチダーゼＬＴＡ４Ｈ；分岐鎖α－ケト酸デヒドロゲナーゼ複合体；Ｃ－３ステロールデヒドロゲナーゼ／３－β－ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ及び関連デヒドロゲナーゼ；Ｃ－４ステロールメチルオキシダーゼ；カルニチンＯ－アシルトランスフェラーゼ；ＣＤＰ－アルコールホスファチジルトランスフェラーゼ／ホスファチジルグリセロール－リン酸合成酵素；ＣＤＰ－ジアシルグリセロール合成酵素；セラミドグルコシルトランスフェラーゼ；キチナーゼ；コレステロール輸送タンパク質；コリン輸送体様タンパク質；シス－プレニルトランスフェラーゼ；クエン酸合成酵素；クラスＩＩアルドラーゼ／アデュシンＮ末端ドメインタンパク質；シトクロムｂ５；シトクロムｃ；シトクロムｃオキシダーゼ；シトクロムｃ１；シトクロムＰ４５０ ＣＹＰ４／ＣＹＰ１９／ＣＹＰ２６サブファミリー；デルタ６－脂肪酸デサチュラーゼ／デルタ８スフィンゴ脂質デサチュラーゼ；ジヒドロリポアミドアセチルトランスフェラーゼ；ジヒドロリポアミドデヒドロゲナーゼ；ジヒドロリポアミドスクシニルトランスフェラーゼ（２－オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ；Ｅ２サブユニット）；ジヒドロリポアミドトランスアシラーゼ（α－ケト酸デヒドロゲナーゼＥ２サブユニット）；ジヒドロキシアセトンキナーゼ／グリセロンキナーゼ；二量体ジヒドロジオールデヒドロゲナーゼ；ドリコールキナーゼ；ドリチルピロリン酸ホスファターゼ及び関連酸ホスファターゼ；Ｄ－リブロース－５－リン酸３－エピメラーゼ；ｄＴＤＰ－グルコース４－６－デヒドラターゼ／ＵＤＰ－グルクロン酸デカルボキシラーゼ；電子伝達フラビンタンパク質ユビキノンオキシドレダクターゼ；電子伝達フラビンタンパク質；エノラーゼ；エノイル－ＣｏＡヒドラターゼ；エノイル－ＣｏＡヒドラターゼ／イソメラーゼ；エノイル－ＣｏＡイソメラーゼ；エキソポリホスファターゼ及び関連タンパク質；Ｆ０Ｆ１型ＡＴＰ合成酵素；Ｆ１－ＡＴＰ合成酵素アセンブリタンパク質；脂肪酸デサチュラーゼ；脂肪アシル－ＣｏＡエロンガーゼ／多価不飽和脂肪酸特異的伸長酵素；フェレドキシン；フラボヘムタンパク質ｂ５＋ｂ５Ｒ；フルクトース－１，６－ビスリン酸アルドラーゼ；フルクトース－１，６－ビスホスファターゼ；フルクトース－６－リン酸２－キナーゼ／フルクトース－２，６－ビホスファターゼ；フマラーゼ；フマル酸レダクターゼ；フマリルアセトアセターゼ；ガラクトース－１－リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ；ガラクトシルトランスフェラーゼ；γ－ブチロベタイン；２－オキソグルタル酸ジオキシゲナーゼ；ＧＤＰ－マンノースピロホスホリラーゼ；グロビン及び関連ヘムタンパク質；グルコン酸キナーゼ；グルコン酸輸送誘導タンパク質；グルコサミン－６－リン酸イソメラーゼ；グルコース－６－リン酸１－デヒドロゲナーゼ；グルコース－６－リン酸イソメラーゼ；グルコース－６－リン酸／リン酸及びホスホエノールピルビン酸／リン酸アンチポーター；グルコシダーゼＩ；グルコシダーゼＩＩ触媒（α）サブユニット及び関連酵素；グリコシルヒドロラーゼファミリー３１；グリセルアルデヒド３－リン酸デヒドロゲナーゼ；グリセロール－３－リン酸デヒドロゲナーゼ；グリセロール－３－リン酸デヒドロゲナーゼ／ジヒドロキシアセトン３－リン酸レダクターゼ；グリセロホスホリルジエステルホスホジエステラーゼ；グリコーゲンホスホリラーゼ；グリコーゲン合成酵素；グリコーゲン合成酵素キナーゼ；グリコール酸オキシダーゼ；糖脂質２－α－マンノシルトランスフェラーゼ（α－１，２－マンノシルトランスフェラーゼ）；糖脂質転移タンパク質；グリコシルヒドロラーゼ；グリコシルトランスフェラーゼ；グリオキサラーゼ；グリオキシレート／ヒドロキシピルビン酸レダクターゼ（Ｄ－異性体特異的２－ヒドロキシ酸デヒドロゲナーゼスーパーファミリー）；ヘキソキナーゼ；ホロシトクロムｃ合成酵素／ヘム－リアーゼ；ホルモン感受性リパーゼＨＳＬ；ヒドロキシアシル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼ／エノイル－ＣｏＡヒドラターゼ；ヒドロキシメチルグルタリル－ＣｏＡリアーゼ；ヒドロキシメチルグルタリル－ＣｏＡ合成酵素；無機ピロホスファターゼ；イノシトールモノホスファターゼ；イノシトールリン脂質合成タンパク質；Ｓｃｓ３ｐ；イノシトールポリリン酸マルチキナーゼ；イソアミル酢酸加水分解エステラーゼ；イソクエン酸リアーゼ；イソバレリル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼ；キヌレニン３－モノオキシゲナーゼ；レシチン：コレステロールアシルトランスフェラーゼ（ＬＣＡＴ）／アシルセラミド合成酵素；脂質輸出体ＡＢＣＡ１及び関連タンパク質；ＡＢＣスーパーファミリー；ＰＡＰ２ファミリーの脂質リン酸ホスファターゼ及び関連酵素；リポイルトランスフェラーゼ；長鎖アシル－ＣｏＡ合成酵素（ＡＭＰ形成）；低密度リポタンパク質Ｂ様タンパク質；リゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼエンドフィリン／ＳＨ３ＧＬ；リゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼＬＰＡＡＴ及び関連アシルトランスフェラーゼ；リゾホスホリパーゼ；リンゴ酸合成酵素；マルターゼグルコアミラーゼ及び関連ヒドロラーゼ；グリコシルヒドロラーゼファミリー３１；ＭＡＭ３３；ミトコンドリアマトリックス糖タンパク質；マンノース－６－リン酸イソメラーゼ；マンノシルトランスフェラーゼ；中鎖アシル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼ；メチルマロン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ；メバロン酸ピロリン酸デカルボキシラーゼ；ミトコンドリアＡＤＰ／ＡＴＰキャリアタンパク質；ミトコンドリアアスパラギン酸／グルタミン酸キャリアタンパク質Ａｒａｌａｒ／Ｃｉｔｒｉｎ；ミトコンドリアカルニチン－アシルカルニチンキャリアタンパク質；ミトコンドリアキャリアタンパク質；ミトコンドリアＦ１Ｆ０－ＡＴＰ合成酵素；ミトコンドリアＦＡＤキャリアタンパク質；ミトコンドリアＦｅ－Ｓクラスター生合成タンパク質ＩＳＡ２；ミトコンドリアオキサロ酢酸キャリアタンパク質；ミトコンドリアオキソジカルボン酸キャリアタンパク質；ミトコンドリアオキソグルタル酸／リンゴ酸キャリアタンパク質；ミトコンドリアリン酸キャリアタンパク質；ミトコンドリアタンパク質Ｓｕｒｆｅｉｔ１／ＳＵＲＦ１／ＳＨＹ１；ミトコンドリア溶質キャリアタンパク質；ミトコンドリアトリカルボン酸／ジカルボン酸キャリアタンパク質；ミトコンドリア／色素体β－ケトアシル－ＡＣＰレダクターゼモノカルボン酸輸送体；コエンザイムＱ（ユビキノン）生合成に関与するモノオキシゲナーゼ；Ｍｙｏ－イノシトール－１－リン酸合成酵素；Ｎ－アセチルグルコサミンキナーゼ；Ｎ－アセチルグルコサミン－６－リン酸デアセチラーゼ；Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ複合体；ＮＡＤ依存性リンゴ酸デヒドロゲナーゼ；ＮＡＤＨ：フラビンオキシドレダクターゼ／１２－オキソフィトジエノエートレダクターゼ；ＮＡＤＨ：ユビキノンオキシドレダクターゼ；ＮＡＤＨ－シトクロムｂ－５レダクターゼ；ＮＡＤＨ－デヒ
ドロゲナーゼ；ＮＡＤＰ／ＦＡＤ依存性オキシドレダクターゼ；ＮＡＤＰ＋依存性リンゴ酸酵素；ＮＡＤＰ依存性フラビンタンパク質レダクターゼ；ＮＡＤＰ依存性イソクエン酸デヒドロゲナーゼ；ＮＡＤＰＨオキシダーゼ；中性トレハラーゼ；Ｎ－ミリストイルトランスフェラーゼ；ヌクレオチド－糖輸送体；オリゴケチドシクラーゼ／脂質輸送タンパク質；Ｏ－結合型Ｎ－アセチルグルコサミントランスフェラーゼＯＧＴ；オキシドスクアレン－ラノステロールシクラーゼ；オキシステロール結合タンパク質；パルミトイルタンパク質チオエステラーゼ；ペルオキシソーム３－ケトアシル－ＣｏＡ－チオラーゼＰ－４４／ＳＣＰ２；ペルオキシソーム長鎖アシル－ＣｏＡ輸送体；ＡＢＣスーパーファミリー；ペルオキシソーム多官能性β酸化タンパク質；ペルオキシソームフィタノイル－ＣｏＡヒドロキシラーゼ；リン酸アシルトランスフェラーゼ；ホスファチジン酸優先ホスホリパーゼＡ１；ホスファチジルグリセロールリン酸合成酵素；ホスファチジルイノシトール合成酵素；ホスファチジルイノシトール転移タンパク質ＰＤＲ１６及び関連タンパク質；ホスファチジルイノシトール転移タンパク質ＳＥＣ１４及び関連タンパク質；ホスファチジルセリンデカルボキシラーゼ；ホスホグルコムターゼ；ホスホグルコムターゼ／ホスホマンノムターゼ；ホスホグリセレートムターゼ；ホスホイノシチドホスファターゼＳＡＣ１；ホスホリパーゼ；ホスホリパーゼＡ２；ホスホリパーゼＡ２活性化タンパク質；ホスホリパーゼＤ１；リン脂質メチルトランスフェラーゼ；ホスホマンノムターゼ；ホスホメバロン酸キナーゼ；ホスホリルコリントランスフェラーゼ／コリンリン酸シチジリルトランスフェラーゼ；フィトエン／スクアレン合成酵素；ｐｆｋＢファミリー炭水化物キナーゼ；２－オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ；β－マンノシダーゼ；デヒドロゲナーゼ；γ－ブチロベタイン，２－オキソグルタル酸ジオキシゲナーゼ；Ｌ－カルニチンデヒドラターゼ／α－メチルアシル－ＣｏＡラセマーゼ；リパーゼ／カルモジュリン結合ヒートショックタンパク質；ミトコンドリアキャリアタンパク質；ミトコンドリアコレステロール輸送体；ムタロターゼ；オキシドレダクターゼ；ホスホグルコサミンアセチルトランスフェラーゼ；ホスホグリセリン酸ムターゼ；ホスホリパーゼ；キノンオキシドレダクターゼ；糖キナーゼ；糖輸送体；ＵＤＰ－ガラクトース輸送体；プリスタノイル－ＣｏＡ／アシル－ＣｏＡオキシダーゼ；ＰＩＤスーパーファミリーのプロヒビチン及びストマチン；ＦＡＤ結合ドメインを含むタンパク質；紫色酸性ホスファターゼ；シトクロムＣオキシダーゼアセンブリタンパク質；リパーゼ、例えば、液胞内のオートファジー体の分解に必須のリパーゼ；ＮＡＤ＋依存性エピメラーゼ；ホスホイノシチドホスファターゼ；トレハラーゼ；ピロリン酸依存性ホスホフルクト－１－キナーゼ；ピルビン酸カルボキシラーゼ；ピルビン酸デヒドロゲナーゼＥ１；ピルビン酸キナーゼ；リボキナーゼ；リボース５－リン酸イソメラーゼ；リブロースキナーゼ及び関連炭水化物キナーゼ；ＳＡＭ依存性メチルトランスフェラーゼ；セリン／スレオニンキナーゼ受容体；セリン／スレオニンプロテインキナーゼ；セリン／スレオニン特異的プロテインホスファターゼ；短鎖アシル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼ；ｓｎ－１，２－ジアシルグリセロールエタノールアミン及びコリンホスホトランフェラーゼ；可溶性エポキシドヒドロラーゼ；スフィンゴイド塩基－リン酸ホスファターゼ；スフィンゴ脂質脂肪酸ヒドロキシラーゼ；スフィンゴ脂質ヒドロキシラーゼ；スフィンゴシンキナーゼ；スクアレンモノオキシゲナーゼ；スクアレン合成酵素；ステロイドレダクターゼ；ステロールＣ５デサチュラーゼ；ステロールＯ－アシルトランスフェラーゼ／ジアシルグリセロールＯ－アシルトランスフェラーゼ；ステロールレダクターゼ／ラミンＢ受容体；コハク酸デヒドロゲナーゼ；スクシニル－ＣｏＡ合成酵素；スクシニル－ＣｏＡ：α－ケト酸－ＣｏＡトランスフェラーゼ；ショ糖輸送体及び関連タンパク質；糖（ペンチュロース及びヘキスロース）キナーゼ；糖輸送体／スピンスター膜貫通タンパク質；スルファターゼ；スルフィド：キノンオキシドレダクターゼ／フラボ結合タンパク質；トランスアルドラーゼ；トランスケトラーゼ；トランスサイレチン及び関連タンパク質；トレハロース－６－リン酸合成酵素；トリグリセリドリパーゼ－コレステロールエステラーゼ；トリオースリン酸イソメラーゼ；ユビキノールシトクロムｃレダクターゼアセンブリタンパク質；ユビキノールシトクロムｃレダクターゼ；ＵＤＰ－ガラクトース輸送体；ＵＤＰ－グルコースピロホスホリラーゼ；ＵＤＰ－グルコース／ＧＤＰ－マンノースデヒドロゲナーゼ；ＵＤＰ－グルコース：糖タンパク質グルコシルトランスフェラーゼ；ＵＤＰ－グルクロノシル及びＵＤＰ－グルコシルトランスフェラーゼ；ＵＤＰ－Ｎ－アセチルグルコサミン輸送体；アルドース１－エピメラーゼ；液胞Ｈ＋－ＡＴＰアーゼ；超長鎖アシル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼ；ビギリン；電位開口型シェーカー様Ｋ＋チャネル；亜鉛結合オキシドレダクターゼ、並びにそれらの任意の組み合わせのいずれかをコードしている。
ドロゲナーゼ；ＮＡＤＰ／ＦＡＤ依存性オキシドレダクターゼ；ＮＡＤＰ＋依存性リンゴ酸酵素；ＮＡＤＰ依存性フラビンタンパク質レダクターゼ；ＮＡＤＰ依存性イソクエン酸デヒドロゲナーゼ；ＮＡＤＰＨオキシダーゼ；中性トレハラーゼ；Ｎ－ミリストイルトランスフェラーゼ；ヌクレオチド－糖輸送体；オリゴケチドシクラーゼ／脂質輸送タンパク質；Ｏ－結合型Ｎ－アセチルグルコサミントランスフェラーゼＯＧＴ；オキシドスクアレン－ラノステロールシクラーゼ；オキシステロール結合タンパク質；パルミトイルタンパク質チオエステラーゼ；ペルオキシソーム３－ケトアシル－ＣｏＡ－チオラーゼＰ－４４／ＳＣＰ２；ペルオキシソーム長鎖アシル－ＣｏＡ輸送体；ＡＢＣスーパーファミリー；ペルオキシソーム多官能性β酸化タンパク質；ペルオキシソームフィタノイル－ＣｏＡヒドロキシラーゼ；リン酸アシルトランスフェラーゼ；ホスファチジン酸優先ホスホリパーゼＡ１；ホスファチジルグリセロールリン酸合成酵素；ホスファチジルイノシトール合成酵素；ホスファチジルイノシトール転移タンパク質ＰＤＲ１６及び関連タンパク質；ホスファチジルイノシトール転移タンパク質ＳＥＣ１４及び関連タンパク質；ホスファチジルセリンデカルボキシラーゼ；ホスホグルコムターゼ；ホスホグルコムターゼ／ホスホマンノムターゼ；ホスホグリセレートムターゼ；ホスホイノシチドホスファターゼＳＡＣ１；ホスホリパーゼ；ホスホリパーゼＡ２；ホスホリパーゼＡ２活性化タンパク質；ホスホリパーゼＤ１；リン脂質メチルトランスフェラーゼ；ホスホマンノムターゼ；ホスホメバロン酸キナーゼ；ホスホリルコリントランスフェラーゼ／コリンリン酸シチジリルトランスフェラーゼ；フィトエン／スクアレン合成酵素；ｐｆｋＢファミリー炭水化物キナーゼ；２－オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ；β－マンノシダーゼ；デヒドロゲナーゼ；γ－ブチロベタイン，２－オキソグルタル酸ジオキシゲナーゼ；Ｌ－カルニチンデヒドラターゼ／α－メチルアシル－ＣｏＡラセマーゼ；リパーゼ／カルモジュリン結合ヒートショックタンパク質；ミトコンドリアキャリアタンパク質；ミトコンドリアコレステロール輸送体；ムタロターゼ；オキシドレダクターゼ；ホスホグルコサミンアセチルトランスフェラーゼ；ホスホグリセリン酸ムターゼ；ホスホリパーゼ；キノンオキシドレダクターゼ；糖キナーゼ；糖輸送体；ＵＤＰ－ガラクトース輸送体；プリスタノイル－ＣｏＡ／アシル－ＣｏＡオキシダーゼ；ＰＩＤスーパーファミリーのプロヒビチン及びストマチン；ＦＡＤ結合ドメインを含むタンパク質；紫色酸性ホスファターゼ；シトクロムＣオキシダーゼアセンブリタンパク質；リパーゼ、例えば、液胞内のオートファジー体の分解に必須のリパーゼ；ＮＡＤ＋依存性エピメラーゼ；ホスホイノシチドホスファターゼ；トレハラーゼ；ピロリン酸依存性ホスホフルクト－１－キナーゼ；ピルビン酸カルボキシラーゼ；ピルビン酸デヒドロゲナーゼＥ１；ピルビン酸キナーゼ；リボキナーゼ；リボース５－リン酸イソメラーゼ；リブロースキナーゼ及び関連炭水化物キナーゼ；ＳＡＭ依存性メチルトランスフェラーゼ；セリン／スレオニンキナーゼ受容体；セリン／スレオニンプロテインキナーゼ；セリン／スレオニン特異的プロテインホスファターゼ；短鎖アシル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼ；ｓｎ－１，２－ジアシルグリセロールエタノールアミン及びコリンホスホトランフェラーゼ；可溶性エポキシドヒドロラーゼ；スフィンゴイド塩基－リン酸ホスファターゼ；スフィンゴ脂質脂肪酸ヒドロキシラーゼ；スフィンゴ脂質ヒドロキシラーゼ；スフィンゴシンキナーゼ；スクアレンモノオキシゲナーゼ；スクアレン合成酵素；ステロイドレダクターゼ；ステロールＣ５デサチュラーゼ；ステロールＯ－アシルトランスフェラーゼ／ジアシルグリセロールＯ－アシルトランスフェラーゼ；ステロールレダクターゼ／ラミンＢ受容体；コハク酸デヒドロゲナーゼ；スクシニル－ＣｏＡ合成酵素；スクシニル－ＣｏＡ：α－ケト酸－ＣｏＡトランスフェラーゼ；ショ糖輸送体及び関連タンパク質；糖（ペンチュロース及びヘキスロース）キナーゼ；糖輸送体／スピンスター膜貫通タンパク質；スルファターゼ；スルフィド：キノンオキシドレダクターゼ／フラボ結合タンパク質；トランスアルドラーゼ；トランスケトラーゼ；トランスサイレチン及び関連タンパク質；トレハロース－６－リン酸合成酵素；トリグリセリドリパーゼ－コレステロールエステラーゼ；トリオースリン酸イソメラーゼ；ユビキノールシトクロムｃレダクターゼアセンブリタンパク質；ユビキノールシトクロムｃレダクターゼ；ＵＤＰ－ガラクトース輸送体；ＵＤＰ－グルコースピロホスホリラーゼ；ＵＤＰ－グルコース／ＧＤＰ－マンノースデヒドロゲナーゼ；ＵＤＰ－グルコース：糖タンパク質グルコシルトランスフェラーゼ；ＵＤＰ－グルクロノシル及びＵＤＰ－グルコシルトランスフェラーゼ；ＵＤＰ－Ｎ－アセチルグルコサミン輸送体；アルドース１－エピメラーゼ；液胞Ｈ＋－ＡＴＰアーゼ；超長鎖アシル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼ；ビギリン；電位開口型シェーカー様Ｋ＋チャネル；亜鉛結合オキシドレダクターゼ、並びにそれらの任意の組み合わせのいずれかをコードしている。
【0085】
「特定の脂肪酸プロファイルを有する油、例えば高オレイン酸油」という用語は、本明細書で使用するとき、所望の脂肪酸プロファイルを有する油、例えば不飽和脂肪酸等の特定の種類の脂肪酸を含む油に関する。一実施形態では、高オレイン酸油は、少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、例えば少なくとも７０％のオレイン酸を含む油である。
【0086】
一実施形態では、ＧＣリッチ微生物、例えば油性微生物を遺伝的に改変する該方法、及び／又は工程ｉｉ）における該前処理は、
ａ）該ＧＣリッチ微生物、例えば油性微生物を、０．２～５．０のＯＤまで、例えば０．２×１０７～２×１０８細胞／ｍＬまで増殖させること；
ｂ）工程ａ）で増殖した細胞を収集すること；
ｃ）工程ｂ）で収集した細胞を、例えば滅菌水に続いてソルビトール（１Ｍ）で洗浄すること；
ｄ）工程ｃ）で洗浄した細胞を、好ましくは好適なバッファ中において該少なくとも１つの酵素で処理すること；
ｅ）工程ｄ）で処理した細胞を収集すること；
ｆ）工程ｅ）で収集した細胞を好適なバッファ、例えばソルビトール又はマンニトール及びＣａＣｌ２を含有するトリス－ＨＣｌバッファに再懸濁させること
を含む。
ａ）該ＧＣリッチ微生物、例えば油性微生物を、０．２～５．０のＯＤまで、例えば０．２×１０７～２×１０８細胞／ｍＬまで増殖させること；
ｂ）工程ａ）で増殖した細胞を収集すること；
ｃ）工程ｂ）で収集した細胞を、例えば滅菌水に続いてソルビトール（１Ｍ）で洗浄すること；
ｄ）工程ｃ）で洗浄した細胞を、好ましくは好適なバッファ中において該少なくとも１つの酵素で処理すること；
ｅ）工程ｄ）で処理した細胞を収集すること；
ｆ）工程ｅ）で収集した細胞を好適なバッファ、例えばソルビトール又はマンニトール及びＣａＣｌ２を含有するトリス－ＨＣｌバッファに再懸濁させること
を含む。
【0087】
一実施形態では、工程ｉｉｉ）における該形質転換の前に、該ＧＣリッチ微生物を増殖させ、洗浄し、該少なくとも１つの酵素で処理する。一実施形態では、工程ｉｉ）における該前処理は、好ましくは、該微生物を例えばグリコシルヒドロラーゼ、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、マンナナーゼ、キシログルカンゼ、キシラナーゼ、グルカナーゼ、グルコシダーゼ、アラビナーゼ、アミラーゼ、フルクタナーゼ、ラミナラーゼ、ヒドロラーゼ、プロテアーゼ、又はそれらの任意の組み合わせから選択される少なくとも１つの酵素と接触させる前に、該微生物を有機相、例えばメタノール、エタノール、ブタノール、及び／若しくはアミルアルコール；バッファ；並びに／又は水で洗浄する工程を含む。一実施形態では、工程ｉｉ）における該前処理は、該微生物を、酵素産生糸状菌によって産生される少なくとも１つの酵素と接触させることを含む、酵素的前処理及び／又は別のスフェロプラスト化手順を含み；任意で、該酵素的前処理及び／又は該別のスフェロプラスト化手順は、該接触の前に、該微生物を有機相、バッファ、及び／又は水で洗浄することを含む。一実施形態では、本発明の方法は、例えば、工程ｉｉ）の該前処理の前に、該ＧＣリッチ微生物を有機相、バッファ、及び／又は水で洗浄する工程を含む。一実施形態では、本発明の方法は、好ましくは、該ＧＣリッチ微生物の少なくとも１つの酵素との該接触前に、該ＧＣリッチ微生物を有機相、バッファ、及び／又は水で洗浄する工程を含む。
【0088】
一実施形態では、有機相は、メタノール、アミルアルコール、エタノール、ブタノール、又はそれらの任意の組み合わせを含むか又はからなる。一実施形態では、該酵素産生糸状菌は、セラトシスチス属の種、例えば、セラトシスチス・フィムブリアタ、セラトシスチス・モニリホルミス、及びセラトシスチス・パラドキサ、好ましくはセラトシスチス・パラドキサ；トリコデルマ属の種、例えば、トリコデルマ・リーゼイ及びトリコデルマ・ハルジアヌム、好ましくはトリコデルマ・リーゼイ；アスペルギルス属の種、例えば、アスペルギルス・オリザエ、アスペルギルス・ツビンゲンシス、及びアスペルギルス・ニガー；ニューロスポラ属の種、例えば、ニューロスポラ・インテルメディア；モナスカス属の種、例えば、モナスカス・プルプレウス；リゾプス属の種、例えば、リゾプス・オリザエ；フザリウム属の種、例えば、フザリウム・ベネナタム；サーモマイセス属の種；ペニシリウム属の種；オーレオバシリウム属の種；イシュノデルマ属の種、例えば、イシュノデルマ・ベンゾイナム；ポリポラス属の種、例えば、ポリポラス・デュラス；ピクノポラス属の種、例えば、ピクノポラス・シンナバリヌス；ファネロカエテ属の種、例えば、ファネロカエテ・クリソスポリウム；及びキシラリア属の種から選択され；好ましくは、トリコデルマ・リーゼイによって産生される。
【0089】
一実施形態では、真菌によって産生される少なくとも１つの酵素、例えば、真菌によって産生されるヒドロラーゼ又はプロテアーゼは、該真菌を増殖させること；該真菌の細胞を収集すること；任意で、細胞を水及び／又はソルビトールで洗浄することによって生成される。一実施形態では、工程ｉｉ）における該前処理は、例えば酵素的前処理及び／又は別のスフェロプラスト化手順において、酵素を使用することを含む。一実施形態では、工程ｉｉ）における該前処理は、例えば酵素的前処理及び／又は別のスフェロプラスト化手順において、糸状菌、例えばトリコデルマ属の種、アスペルギルス属の種、例えば、Ａ．ニガー及びＡ．アワモリ（Ａ．ａｗａｍｏｒｉ）；ペネシリウム属の種；オーレオバシリウム属の種；ファネロカエテ属の種；フザリウム属の種；ストレプトマイセス属の種；又はバチルス属の種によって産生される及び／又はから得られる酵素を使用することを含む。
【0090】
一実施形態では、本発明の組成物は、ＧＣリッチ微生物を遺伝的に改変するため、特にクタネオトリコスポロン属の種を遺伝的に改変するための組成物である。一実施形態では、該少なくとも１つのガイドＲＮＡ、特に該ｃｒＲＮＡ及び／又は該ｓｇＲＮＡは、ＧＣリッチ微生物、特にクタネオトリコスポロン属の種から選択される微生物の核酸配列を含む。一実施形態では、該少なくとも１つのガイドＲＮＡ、特に該ｃｒＲＮＡ及び／又は該ｓｇＲＮＡは、ＧＣリッチ微生物、特にクタネオトリコスポロン属の種から選択される微生物のゲノムの一部の核酸配列を含む。一実施形態では、該少なくとも１つのガイドＲＮＡ、特に該ｃｒＲＮＡ及び／又は該ｓｇＲＮＡは、ＧＣリッチ微生物、特にクタネオトリコスポロン属の種から選択される微生物のゲノムの核酸配列を標的とするように構成される。一実施形態では、該組成物は、ＧＣリッチ微生物、特にクタネオトリコスポロン属の種から選択される微生物を遺伝的に改変するために使用される。本発明はまた、ＧＣリッチ微生物、特にクタネオトリコスポロン属の種から選択される微生物を遺伝的に改変するための、本明細書で定義される組成物の使用に関する。
【0091】
一実施形態では、該プラスミド又はプラスミドコレクションは、ＧＣリッチ微生物を遺伝的に改変するため、特にクタネオトリコスポロン属の種を遺伝的に改変するためのプラスミド又はプラスミドコレクションである。一実施形態では、該少なくとも１つのガイドＲＮＡ、特に該ｃｒＲＮＡ及び／又は該ｓｇＲＮＡは、ＧＣリッチ微生物、特にクタネオトリコスポロン属の種から選択される微生物の核酸配列を含む。一実施形態では、該少なくとも１つのガイドＲＮＡ、特に該ｃｒＲＮＡ及び／又は該ｓｇＲＮＡは、ＧＣリッチ微生物、特にクタネオトリコスポロン属の種から選択される微生物のゲノムの一部の核酸配列を含む。一実施形態では、該少なくとも１つのガイドＲＮＡ、特に該ｃｒＲＮＡ及び／又は該ｓｇＲＮＡは、ＧＣリッチ微生物、特にクタネオトリコスポロン属の種から選択される微生物のゲノムの核酸配列を標的とするように構成される。一実施形態では、該プラスミド又はプラスミドコレクションは、ＧＣリッチ微生物、特にクタネオトリコスポロン属の種から選択される微生物を遺伝的に改変するために使用される。本発明はまた、ＧＣリッチ微生物、特にクタネオトリコスポロン属の種から選択される微生物を遺伝的に改変するための、本明細書で定義されるプラスミド又はプラスミドコレクションの使用に関する。
【0092】
本明細書で使用するとき、「［本］発明の」、「本発明に従って」、「本発明に係る」等の用語は、本明細書で説明される及び／又は特許請求される本発明の全ての態様及び実施形態を指すことを意図している。
【0093】
本明細書で使用するとき、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」及び「からなる」の両方を包含すると解釈され、いずれも本発明に従って具体的に意図され、従って、個別に開示される実施形態であることを意味する。本明細書で使用するとき、「及び／又は」とは、他方の特徴又は構成要素の有無にかかわらず、２つの指定された特徴又は構成要素のそれぞれが具体的に開示されていると解釈されるべきである。例えば、「Ａ及び／又はＢ」は、それぞれが本明細書に個別に記載されているかのように、（ｉ）Ａ、（ｉｉｉ）Ｂ、並びに（ｉｉｉｉ）Ａ及びＢのそれぞれが具体的に開示されていると解釈されるべきである。本発明の文脈において、「約」及び「およそ」という用語は、当業者が対象となる特徴の技術的効果を依然として確保すると理解する精度の間隔を示す。この用語は通常、指定の数値から±２０％、±１５％、±１０％、例えば±５％の偏差を示す。当業者であれば理解できるように、所与の技術的効果についての数値のこのような具体的な偏差は、その技術的効果の性質に依存する。例えば、自然的又は生物学的な技術的効果は、人工的又は工学的な技術的効果よりも一般的にこのような偏差が大きくなる場合がある。単数名詞に言及する際に不定冠詞又は定冠詞、例えば「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」等が使用される場合、特に断りがない限り、その名詞の複数形も含まれる。
【実施例】
【0094】
実施例１：ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼを用いた油性微生物のトランスフェクション。
図６に示すようにトランスフェクションを行った。
図６に示すようにトランスフェクションを行った。
【0095】
スフェロプラストを、ドナーＤＮＡ及びｓｇＲＮＡと共にエンドヌクレアーゼのｍＲＮＡ又はタンパク質と混合し、エレクトロポレーションし、選択剤を含むアガー上層内の選択プレートにプレーティングした。コロニーが得られるまで、プレートを２８～３０度でインキュベートした。
【0096】
本発明者らは、Ｃａｓ ｍＲＮＡを用いたトランスフェクションが、Ｃａｓタンパク質を用いたトランスフェクションよりも効率的であることを実証した。本発明者らは更に、２つのｓｇＲＮＡを用いたトランスフェクションが、１種類のｓｇＲＮＡのみを用いたトランスフェクションよりも効率的であることを実証した。
【0097】
実施例２：スフェロプラスト化はトランスフェクション効率を高める。
図５に示すようにスフェロプラスト化を行った。
図５に示すようにスフェロプラスト化を行った。
【0098】
市販の酵素及びテーラーメイドの酵素ミックスを用いてスフェロプラストを調製した。両スフェロプラストを、ドナーＤＮＡ及びｓｇＲＮＡと共にエンドヌクレアーゼのｍＲＮＡ又はタンパク質と混合し、エレクトロポレーションし、選択剤を含むアガー上層内の選択プレートにプレーティングした。コロニーが得られるまで、プレートを２８～３０度でインキュベートした。
【0099】
本発明者らは、ＧＣリッチ微生物、特に油性微生物を例えばスフェロプラスト化によって前処理することにより、トランスフェクション効率が高まることを実証した。市販の酵素で処理した微生物からは、いかなる形質転換体も得られなかった。特に、真菌によって産生された酵素ミックス等のテーラーメイドの酵素ミックスを用いたスフェロプラスト化は、事前にスフェロプラスト化を行わないトランスフェクション又は市販のリチカーゼ酵素を用いたスフェロプラスト化よりもはるかに高いトランスフェクション効率を可能にする。
【0100】
実施例３：本発明の方法は、ドナーＤＮＡを油性微生物のゲノムＤＮＡに組み込むことに成功する。
スフェロプラストを、ドナーＤＮＡ及びｓｇＲＮＡと共にエンドヌクレアーゼのｍＲＮＡ又はタンパク質と混合し、エレクトロポレーションし、選択剤を含むアガー上層内の選択プレートにプレーティングした。コロニーが得られるまで、プレートを２８～３０度でインキュベートした。
スフェロプラストを、ドナーＤＮＡ及びｓｇＲＮＡと共にエンドヌクレアーゼのｍＲＮＡ又はタンパク質と混合し、エレクトロポレーションし、選択剤を含むアガー上層内の選択プレートにプレーティングした。コロニーが得られるまで、プレートを２８～３０度でインキュベートした。
【0101】
図３に示すように、例示的な標的部位を遺伝的に改変した。配列決定により、クタネオトリコスポロン・オレアギノサスのゲノムＤＮＡのＵｒａ５遺伝子座における例示的な標的部位の改変が成功したことが確認された。
【0102】
実施例４：本発明の方法は、ドナーＤＮＡを油性微生物のゲノムＤＮＡに組み込むことに成功し、脂質の効率的な産生を可能にする。
クタネオトリコスポロン属の種をスフェロプラスト化によって前処理した。例えば以下のように例示的なドナーＤＮＡを用いて微生物を形質転換した：
１）ＡＫＲｐ－Ｄ９：デルタ９デサチュラーゼプロモータのアルドケトレダクターゼプロモータ（配列番号２８）への交換
対象となるノックイン遺伝子（Ｄ９デサチュラーゼ遺伝子の新規プロモータ）、選択マーカー（ｕｒａ５遺伝子－オロチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ）、及びホモロジーアームを含むドナーＤＮＡ。
ホモロジーアーム上流８００ｂｐ ７．．．８０６
Ｕｒａ５遺伝子（プロモータ、コード配列、及びターミネータ）８０７．．．２１０６
アルドケトレダクターゼプロモータ ２１０７．．．２９０６
ホモロジーアーム下流８００ｂｐ ２９０７．．．３７０６
２）ＴＥＦｐ－Ｄ９：デルタ９デサチュラーゼプロモータの転写伸長因子２プロモータ（配列番号２９）への交換。
対象となるノックイン遺伝子（Ｄ９デサチュラーゼ遺伝子の新規プロモータ）、選択マーカー（ｕｒａ５遺伝子オロチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ）、及びホモロジーアーム。
ホモロジーアーム上流８００ｂｐ ７．．．８０６
ｕｒａ５遺伝子（プロモータ、コード配列、及びターミネータ）８０７．．．２１０６
転写伸長因子２プロモータ ２１０７．．．３０１９
ホモロジーアーム下流８００ｂｐ ３０２０．．．３８１９
３）ＡＫＲｐ－Ｄ１２：デルタ１２デサチュラーゼプロモータのアルドケトレダクターゼプロモータ（配列番号３０）への交換。
対象となるノックイン遺伝子（Ｄ１２デサチュラーゼ遺伝子の新規プロモータ）、選択マーカー（ｕｒａ５遺伝子－オロチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ）、及びホモロジーアームを含むドナーＤＮＡ。
ホモロジーアーム上流８００ｂｐ １．．．７９８
ｕｒａ５遺伝子（プロモータ、コード配列、及びターミネータ）７９９．．．２０９８
アルドケトレダクターゼプロモータ ２０９９．．．２８９８
ホモロジーアーム下流８００ｂｐ ２８９９．．．３６９８
４）ＡＫＲｐ－Ｄ１２：デルタ９デサチュラーゼプロモータのＴＥＦプロモータ（配列番号３１）への交換。
対象となるノックイン遺伝子（Ｄ１２デサチュラーゼ遺伝子の新規プロモータ）、選択マーカー（ｕｒａ５遺伝子－オロチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ）、及びホモロジーアームを含むドナーＤＮＡ。
ホモロジーアーム上流８００ｂｐ １．．．７９８
Ｕｒａ５遺伝子（プロモータ、コード配列、及びターミネータ）７９９．．．２０９８
プロモータ ＴＥＦ ２０９９．．．３０１１
ホモロジーアーム下流８００ｂｐ ３０１２．．．３８１１
５）対象となるノックイン遺伝子（エロンガーゼコード配列、アルドケトレダクターゼのプロモータ及びターミネータ）、選択マーカー（ｕｒａ５遺伝子－オロチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ）、及びホモロジーアーム（配列番号３２）を含むドナーＤＮＡ。
ホモロジーアーム上流８００ｂｐ ７．．．７９９
Ｕｒａ５遺伝子（プロモータ、コード配列、及びターミネータ）８０８．．．１８９６
対象となる遺伝子（エロンガーゼ） １８９７．．．３７９５
プロモータ １８９７．．．２６９６
エロンガーゼコード配列 ２６９７．．．３５２４
ターミネータ ３５２５．．．３７９５
ホモロジーアーム下流８００ｂｐ ３７９６．．．４５９５
６）対象となるノックイン遺伝子（オレイン酸ヒドラターゼコード配列、転写伸長因子２のプロモータ及びターミネータ）、選択マーカー（ｕｒａ５遺伝子－オロチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ）、及びホモロジーアーム（配列番号３３）を含むドナーＤＮＡ。
ホモロジーアーム上流８００ｂｐ ７．．．７９９
Ｕｒａ５遺伝子（プロモータ、コード配列、及びターミネータ）８０８．．．１８９６
プロモータ ＴＥＦ １８９７．．．２８０９
オレイン酸ヒドラターゼ ２８１０．．．４４８９
ＴＥＦターミネータ ４４９０．．．５１０８
ホモロジーアーム下流８００ｂｐ ５１０９．．．５９０８
７）Ｄ９ＯＥ：デルタ９デサチュラーゼの過剰発現（配列番号３４）。
対象となるノックイン遺伝子（デルタ９デサチュラーゼコード配列、アルドケトレダクターゼのプロモータ及びターミネータ）、選択マーカー（ｕｒａ５遺伝子－オロチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ）、及びホモロジーアームを含むドナーＤＮＡ。
ホモロジーアーム上流８００ｂｐ １．．．７９３
Ｕｒａ５遺伝子（プロモータ、コード配列、及びターミネータ）８０２．．．１８９０
プロモータ １８９１．．．２６９０
デルタ９デサチュラーゼのコード配列 ２６９１．．．４３５９
ターミネータ ４３６０．．．４６３０
ホモロジーアーム下流８００ｂｐ ４６３１．．．５４３０
８）Ｄ１２ＯＥ：デルタ１２デサチュラーゼの過剰発現（配列番号３５）。
対象となるノックイン遺伝子（デルタ１２デサチュラーゼコード配列、アルドケトレダクターゼのプロモータ及びターミネータ）、選択マーカー（ｕｒａ５遺伝子－オロチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ）、及びホモロジーアームを含むドナーＤＮＡ。
ホモロジーアーム上流８００ｂｐ １．．．７９３
Ｕｒａ５遺伝子（プロモータ、コード配列、及びターミネータ）８０２．．．１８９０
プロモータ １８９１．．．２６９０
Ｄ１２デサチュラーゼコード配列 ２６９１．．．４５１２
ターミネータ ４５１３．．．４７８３
ホモロゴスアーム下流８００ｂｐ ４７８４．．．５５８３
９）ΔＤ１２：デルタ１２デサチュラーゼのノックアウト（配列番号３６）。
選択マーカーのノックイン遺伝子（ｕｒａ５遺伝子－オロチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ）及びデルタ－１２デサチュラーゼノックアウトのためのホモロジーアームを含むドナーＤＮＡ。
ホモロジーアーム上流８００ｂｐ １．．．６９９
Ｕｒａ５遺伝子（プロモータ、コード配列、及びターミネータ）７００．．．１９９９
ホモロジーアーム下流８００ｂｐ ２０００．．．２６９９
クタネオトリコスポロン属の種をスフェロプラスト化によって前処理した。例えば以下のように例示的なドナーＤＮＡを用いて微生物を形質転換した：
１）ＡＫＲｐ－Ｄ９：デルタ９デサチュラーゼプロモータのアルドケトレダクターゼプロモータ（配列番号２８）への交換
対象となるノックイン遺伝子（Ｄ９デサチュラーゼ遺伝子の新規プロモータ）、選択マーカー（ｕｒａ５遺伝子－オロチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ）、及びホモロジーアームを含むドナーＤＮＡ。
ホモロジーアーム上流８００ｂｐ ７．．．８０６
Ｕｒａ５遺伝子（プロモータ、コード配列、及びターミネータ）８０７．．．２１０６
アルドケトレダクターゼプロモータ ２１０７．．．２９０６
ホモロジーアーム下流８００ｂｐ ２９０７．．．３７０６
２）ＴＥＦｐ－Ｄ９：デルタ９デサチュラーゼプロモータの転写伸長因子２プロモータ（配列番号２９）への交換。
対象となるノックイン遺伝子（Ｄ９デサチュラーゼ遺伝子の新規プロモータ）、選択マーカー（ｕｒａ５遺伝子オロチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ）、及びホモロジーアーム。
ホモロジーアーム上流８００ｂｐ ７．．．８０６
ｕｒａ５遺伝子（プロモータ、コード配列、及びターミネータ）８０７．．．２１０６
転写伸長因子２プロモータ ２１０７．．．３０１９
ホモロジーアーム下流８００ｂｐ ３０２０．．．３８１９
３）ＡＫＲｐ－Ｄ１２：デルタ１２デサチュラーゼプロモータのアルドケトレダクターゼプロモータ（配列番号３０）への交換。
対象となるノックイン遺伝子（Ｄ１２デサチュラーゼ遺伝子の新規プロモータ）、選択マーカー（ｕｒａ５遺伝子－オロチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ）、及びホモロジーアームを含むドナーＤＮＡ。
ホモロジーアーム上流８００ｂｐ １．．．７９８
ｕｒａ５遺伝子（プロモータ、コード配列、及びターミネータ）７９９．．．２０９８
アルドケトレダクターゼプロモータ ２０９９．．．２８９８
ホモロジーアーム下流８００ｂｐ ２８９９．．．３６９８
４）ＡＫＲｐ－Ｄ１２：デルタ９デサチュラーゼプロモータのＴＥＦプロモータ（配列番号３１）への交換。
対象となるノックイン遺伝子（Ｄ１２デサチュラーゼ遺伝子の新規プロモータ）、選択マーカー（ｕｒａ５遺伝子－オロチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ）、及びホモロジーアームを含むドナーＤＮＡ。
ホモロジーアーム上流８００ｂｐ １．．．７９８
Ｕｒａ５遺伝子（プロモータ、コード配列、及びターミネータ）７９９．．．２０９８
プロモータ ＴＥＦ ２０９９．．．３０１１
ホモロジーアーム下流８００ｂｐ ３０１２．．．３８１１
５）対象となるノックイン遺伝子（エロンガーゼコード配列、アルドケトレダクターゼのプロモータ及びターミネータ）、選択マーカー（ｕｒａ５遺伝子－オロチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ）、及びホモロジーアーム（配列番号３２）を含むドナーＤＮＡ。
ホモロジーアーム上流８００ｂｐ ７．．．７９９
Ｕｒａ５遺伝子（プロモータ、コード配列、及びターミネータ）８０８．．．１８９６
対象となる遺伝子（エロンガーゼ） １８９７．．．３７９５
プロモータ １８９７．．．２６９６
エロンガーゼコード配列 ２６９７．．．３５２４
ターミネータ ３５２５．．．３７９５
ホモロジーアーム下流８００ｂｐ ３７９６．．．４５９５
６）対象となるノックイン遺伝子（オレイン酸ヒドラターゼコード配列、転写伸長因子２のプロモータ及びターミネータ）、選択マーカー（ｕｒａ５遺伝子－オロチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ）、及びホモロジーアーム（配列番号３３）を含むドナーＤＮＡ。
ホモロジーアーム上流８００ｂｐ ７．．．７９９
Ｕｒａ５遺伝子（プロモータ、コード配列、及びターミネータ）８０８．．．１８９６
プロモータ ＴＥＦ １８９７．．．２８０９
オレイン酸ヒドラターゼ ２８１０．．．４４８９
ＴＥＦターミネータ ４４９０．．．５１０８
ホモロジーアーム下流８００ｂｐ ５１０９．．．５９０８
７）Ｄ９ＯＥ：デルタ９デサチュラーゼの過剰発現（配列番号３４）。
対象となるノックイン遺伝子（デルタ９デサチュラーゼコード配列、アルドケトレダクターゼのプロモータ及びターミネータ）、選択マーカー（ｕｒａ５遺伝子－オロチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ）、及びホモロジーアームを含むドナーＤＮＡ。
ホモロジーアーム上流８００ｂｐ １．．．７９３
Ｕｒａ５遺伝子（プロモータ、コード配列、及びターミネータ）８０２．．．１８９０
プロモータ １８９１．．．２６９０
デルタ９デサチュラーゼのコード配列 ２６９１．．．４３５９
ターミネータ ４３６０．．．４６３０
ホモロジーアーム下流８００ｂｐ ４６３１．．．５４３０
８）Ｄ１２ＯＥ：デルタ１２デサチュラーゼの過剰発現（配列番号３５）。
対象となるノックイン遺伝子（デルタ１２デサチュラーゼコード配列、アルドケトレダクターゼのプロモータ及びターミネータ）、選択マーカー（ｕｒａ５遺伝子－オロチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ）、及びホモロジーアームを含むドナーＤＮＡ。
ホモロジーアーム上流８００ｂｐ １．．．７９３
Ｕｒａ５遺伝子（プロモータ、コード配列、及びターミネータ）８０２．．．１８９０
プロモータ １８９１．．．２６９０
Ｄ１２デサチュラーゼコード配列 ２６９１．．．４５１２
ターミネータ ４５１３．．．４７８３
ホモロゴスアーム下流８００ｂｐ ４７８４．．．５５８３
９）ΔＤ１２：デルタ１２デサチュラーゼのノックアウト（配列番号３６）。
選択マーカーのノックイン遺伝子（ｕｒａ５遺伝子－オロチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ）及びデルタ－１２デサチュラーゼノックアウトのためのホモロジーアームを含むドナーＤＮＡ。
ホモロジーアーム上流８００ｂｐ １．．．６９９
Ｕｒａ５遺伝子（プロモータ、コード配列、及びターミネータ）７００．．．１９９９
ホモロジーアーム下流８００ｂｐ ２０００．．．２６９９
【0103】
図９～１９に示すように、本発明の方法は、ドナーＤＮＡを用いてＧＣリッチ微生物、例えばクタネオトリコスポロン属の種を効率的に形質転換することを可能にする。ドナーＤＮＡで形質転換されたクタネオトリコスポロン属の種、例えばクタネオトリコスポロン・オレアギノサスは、高い収率で微生物脂質を効率的に産生する。更に、本発明の標的化合物を調製する方法により、明確な組成を有する微生物脂質を生成することが可能になる。
【0104】
参照文献
［１］ Ｇｏｒｎｅｒ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅｔｉｃ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａｎｄ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄｓ ｂｙ ｔｈｅ ｎｏｎ－ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ ｏｌｅａｇｉｎｏｕｓ ｙｅａｓｔ Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ ｏｌｅａｇｉｎｏｓｕｓ ＡＴＣＣ２０５０９．Ｇｒｅｅｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １８，２０３７－２０４６，ｄｏｉ：１０．１０３９／Ｃ５ＧＣ０１７６７Ｊ（２０１６）．
［１］ Ｇｏｒｎｅｒ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅｔｉｃ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａｎｄ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄｓ ｂｙ ｔｈｅ ｎｏｎ－ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ ｏｌｅａｇｉｎｏｕｓ ｙｅａｓｔ Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ ｏｌｅａｇｉｎｏｓｕｓ ＡＴＣＣ２０５０９．Ｇｒｅｅｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １８，２０３７－２０４６，ｄｏｉ：１０．１０３９／Ｃ５ＧＣ０１７６７Ｊ（２０１６）．
【0105】
［２］ Ｂｒａｃｈａｒｚ，Ｆ．，Ｂｅｕｋｈｏｕｔ，Ｔ．，Ｍｅｈｌｍｅｒ，Ｎ．＆ Ｂｒｕｃｋ，Ｔ．Ｏｐｐｏｒｔｕｎｉｔｉｅｓ ａｎｄ ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ Ｃｕｔａｎｅｏｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ ｏｌｅａｇｉｎｏｓｕｓ ＡＴＣＣ２０５０９ ａｓ ａ ｎｅｗ ｃｅｌｌ ｆａｃｔｏｒｙ ｆｏｒ ｃｕｓｔｏｍ ｔａｉｌｏｒｅｄ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｏｉｌｓ． Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｃｅｌｌ ｆａｃｔｏｒｉｅｓ １６，１７８－１７８，ｄｏｉ：１０．１１８６／ｓ１２９３４－０１７－０７９１－９（２０１７）．
【0106】
本明細書、特許請求の範囲、及び／又は添付の図面に開示された本発明の特徴は、個別に、及びそれらの任意の組み合わせの両方において、本発明をその様々な形態で実現するための材料となり得る。
【図1】
【図2】
【図3a】
【図3b】
【図4】
【図5】
【図6-1】
【図6-2】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【配列表】
【国際調査報告】