特表 2024-547057 環状ＲＮＡを使用した細胞の再プログラム化のための組成物及び方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-12-26

(54)【発明の名称】環状ＲＮＡを使用した細胞の再プログラム化のための組成物及び方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 5/10 20060101AFI20241219BHJP

   C12N 5/074 20100101ALI20241219BHJP

   C12N 5/0783 20100101ALI20241219BHJP

   C12N 5/071 20100101ALI20241219BHJP

   C12N 5/079 20100101ALI20241219BHJP

   C12N 5/077 20100101ALI20241219BHJP

   C12N 15/09 20060101ALI20241219BHJP

   C12N 15/87 20060101ALI20241219BHJP

   C12N 15/12 20060101ALN20241219BHJP

   C12N 5/078 20100101ALN20241219BHJP

   C12N 15/113 20100101ALN20241219BHJP

   C12N 9/22 20060101ALN20241219BHJP

【ＦＩ】

C12N5/10 ZNA

C12N5/074

C12N5/0783

C12N5/071

C12N5/079

C12N5/077

C12N15/09 100

C12N15/87 Z

C12N15/12

C12N5/078

C12N15/113 Z

C12N9/22

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024536988

(86)(22)【出願日】2022-12-19

(85)【翻訳文提出日】2024-07-11

(86)【国際出願番号】 US2022081898

(87)【国際公開番号】W WO2023122517

(87)【国際公開日】2023-06-29

(31)【優先権主張番号】63/291,645

(32)【優先日】2021-12-20

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】521445708

【氏名又は名称】エレベートバイオ テクノロジーズ，インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100079108

【弁理士】

【氏名又は名称】稲葉 良幸

(74)【代理人】

【識別番号】100109346

【弁理士】

【氏名又は名称】大貫 敏史

(74)【代理人】

【識別番号】100117189

【弁理士】

【氏名又は名称】江口 昭彦

(74)【代理人】

【識別番号】100134120

【弁理士】

【氏名又は名称】内藤 和彦

(72)【発明者】

【氏名】カーペンター，メリッサ

(72)【発明者】

【氏名】ナラヤン，サントッシュ

(72)【発明者】

【氏名】ティール，オースティン

(72)【発明者】

【氏名】ヤン，イン ミランダ

【テーマコード（参考）】

4B065

【Ｆターム（参考）】

4B065AA94X

4B065AB01

4B065BA03

4B065CA44

(57)【要約】

本開示は、ｉＰＳＣを作製する方法であって、１つ以上の再プログラム化因子をコードする１つ以上の環状ＲＮＡに浮遊状態の細胞（例えば、ＣＤ３４＋細胞又は他の血液細胞）を接触させること、及び再プログラム化されたｉＰＳＣが入手される条件下に細胞を維持することを含む方法を提供する。一部の実施形態において、環状ＲＮＡは、（Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８、ｃ－Ｍｙｃ、又はＬ－Ｍｙｃから選択される再プログラム化因子、又はその断片若しくはバリアントをコードする。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を作製する方法であって、Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８、ｃ－Ｍｙｃ、又はＬ－Ｍｙｃから選択される少なくとも１つの再プログラム化因子、又はその断片若しくはバリアントをコードする環状ＲＮＡに浮遊状態の血液細胞を接触させること、及び前記ｉＰＳＣが入手される条件下に前記細胞を維持することを含む方法。

【請求項2】

前記血液細胞が、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、及び臍帯血単核細胞（ＣＢＭＣ）から選択される、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記血液細胞が、Ｔ細胞及びＮＫ細胞から選択される、請求項１に記載の方法。

【請求項4】

人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を作製する方法であって、Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８、ｃ－Ｍｙｃ、又はＬ－Ｍｙｃから選択される少なくとも１つの再プログラム化因子、又はその断片若しくはバリアントをコードする環状ＲＮＡに浮遊状態のＣＤ３４＋細胞を接触させること、及び前記ｉＰＳＣが入手される条件下に前記細胞を維持することを含む方法。

【請求項5】

前記少なくとも１つの再プログラム化因子が、ヒト又はヒト化再プログラム化因子である、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項6】

前記少なくとも１つの再プログラム化因子がＯｃｔ３／４であり、前記Ｏｃｔ３／４が、配列番号７のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも９０％又は少なくとも９５％同一の配列を有する、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項7】

前記環状ＲＮＡが、配列番号８の核酸配列、又はそれと少なくとも９０％又は少なくとも９５％同一の配列を含む、請求項３に記載の方法。

【請求項8】

前記少なくとも１つの再プログラム化因子がＫｌｆ４であり、前記Ｋｌｆ４が、配列番号９又は１０のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも９０％又は少なくとも９５％同一の配列を有する、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項9】

前記環状ＲＮＡが、配列番号１１の核酸配列、又はそれと少なくとも９０％又は少なくとも９５％同一の配列を含む、請求項８に記載の方法。

【請求項10】

前記少なくとも１つの再プログラム化因子がＳｏｘ２であり、Ｓｏｘ２が、配列番号１２のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも９０％又は少なくとも９５％同一の配列を有する、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項11】

前記環状ＲＮＡが、配列番号１３の核酸配列、又はそれと少なくとも９０％又は少なくとも９５％同一の配列を含む、請求項１０に記載の方法。

【請求項12】

前記少なくとも１つの再プログラム化因子がＮａｎｏｇであり、前記Ｎａｎｏｇが、配列番号１４又は１５のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも９０％又は少なくとも９５％同一の配列を有する、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項13】

前記環状ＲＮＡが、配列番号１６の核酸配列、又はそれと少なくとも９０％又は少なくとも９５％同一の配列を含む、請求項１２に記載の方法。

【請求項14】

前記少なくとも１つの再プログラム化因子がＬｉｎ２８Ａであり、前記Ｌｉｎ２８Ａが、配列番号１７のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも９０％又は少なくとも９５％同一の配列を有する、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項15】

前記環状ＲＮＡが、配列番号１８の核酸配列、又はそれと少なくとも９０％又は少なくとも９５％同一の配列を含む、請求項１４に記載の方法。

【請求項16】

前記少なくとも１つの再プログラム化因子がｃ－Ｍｙｃであり、前記ｃ－Ｍｙｃが、配列番号１９又は２０のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも９０％又は少なくとも９５％同一の配列を有する、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項17】

前記環状ＲＮＡが、配列番号２１の核酸配列、又はそれと少なくとも９０％又は少なくとも９５％同一の配列を含む、請求項１６に記載の方法。

【請求項18】

前記少なくとも１つの再プログラム化因子がＬ－Ｍｙｃであり、前記Ｌ－Ｍｙｃが、配列番号２２～２４のいずれか１つのアミノ酸配列、又はそれと少なくとも９０％又は少なくとも９５％同一の配列を有する、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項19】

前記環状ＲＮＡが、配列番号２５の核酸配列、又はそれと少なくとも９０％又は少なくとも９５％同一の配列を含む、請求項１８に記載の方法。

【請求項20】

前記環状ＲＮＡが、実質的に非免疫原性である、請求項１～１９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項21】

前記環状ＲＮＡが、１つ以上のＭ－６－メチルアデノシン（ｍ^６Ａ）残基を含む、請求項２０に記載の方法。

【請求項22】

前記環状ＲＮＡが、約２００ヌクレオチド～約５，０００ヌクレオチドを含む、請求項１～２１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項23】

前記環状ＲＮＡが、タンパク質コード配列に作動可能に連結された配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を含む、請求項１～２２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項24】

前記環状ＲＮＡが、Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８、ｃ－Ｍｙｃ、又はＬ－Ｍｙｃから選択される２つ以上の再プログラム化因子をコードする、請求項１～２３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項25】

前記方法が、Ｏｃｔ４又はその断片若しくはバリアントをコードする第１の環状ＲＮＡ、Ｓｏｘ２又はその断片若しくはバリアントをコードする第２の環状ＲＮＡ、Ｋｌｆ４又はその断片若しくはバリアントをコードする第３の環状ＲＮＡ、Ｃ－Ｍｙｃ又はその断片若しくはバリアントをコードする第４の環状ＲＮＡ、Ｌｉｎ２８又はその断片若しくはバリアントをコードする第５の環状ＲＮＡ、及びＮａｎｏｇ又はその断片若しくはバリアントをコードする第６の環状ＲＮＡに前記細胞を接触させることを含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項26】

Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８、及びｃ－Ｍｙｃからなる再プログラム化因子の群のうちの１つ以上、又はその断片若しくはバリアントをコードする１つ以上の環状ＲＮＡに前記細胞を接触させることを含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項27】

人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を作製する方法であって、Ｏｃｔ４をコードする第１の環状ＲＮＡ、Ｓｏｘ２をコードする第２の環状ＲＮＡ、Ｋｌｆ４をコードする第３の環状ＲＮＡ、Ｃ－Ｍｙｃをコードする第４の環状ＲＮＡ、Ｌｉｎ２８をコードする第５の環状ＲＮＡ、及びＮａｎｏｇをコードする第６の環状ＲＮＡからなる６つの環状ＲＮＡに浮遊状態の血液細胞又はＣＤ３４＋細胞を接触させること、及び前記ｉＰＳＣが入手される条件下に前記細胞を維持することを含む方法。

【請求項28】

人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を作製する方法であって、Ｏｃｔ４をコードする第１の環状ＲＮＡ、Ｓｏｘ２をコードする第２の環状ＲＮＡ、及びＫｌｆ４をコードする第３の環状ＲＮＡからなる３つの環状ＲＮＡに浮遊状態の血液細胞又はＣＤ３４＋細胞を接触させること、及び前記ｉＰＳＣが入手される条件下に前記細胞を維持することを含む方法。

【請求項29】

Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８、及びｃ－Ｍｙｃのいずれかをコードする環状ＲＮＡに前記血液細胞又はＣＤ３４＋細胞を接触させることを含まない、請求項２８に記載の方法。

【請求項30】

人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を作製する方法であって、Ｏｃｔ４をコードする第１の環状ＲＮＡ、Ｓｏｘ２をコードする第２の環状ＲＮＡ、及びＫｌｆ４をコードする第３の環状ＲＮＡからなる３つの環状ＲＮＡ、及びＣ－Ｍｙｃをコードする第４の環状ＲＮＡに浮遊状態の血液細胞又はＣＤ３４＋細胞を接触させること、及び前記ｉＰＳＣが入手される条件下に前記細胞を維持することを含む方法。

【請求項31】

Ｎａｎｏｇ又はＬｉｎ２８のいずれかをコードする環状ＲＮＡに前記血液細胞又はＣＤ３４＋細胞を接触させることを含まない、請求項３０に記載の方法。

【請求項32】

人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を作製する方法であって、Ｏｃｔ４をコードする第１の環状ＲＮＡ、Ｓｏｘ２をコードする第２の環状ＲＮＡ、及びＫｌｆ４をコードする第３の環状ＲＮＡからなる３つの環状ＲＮＡ、及びＮａｎｏｇをコードする第４の環状ＲＮＡ、及びＬｉｎ ２８をコードする第５の環状ＲＮＡに浮遊状態の血液細胞又はＣＤ３４＋細胞を接触させること、及び前記ｉＰＳＣが入手される条件下に前記細胞を維持することを含む方法。

【請求項33】

ｃ－Ｍｙｃをコードする環状ＲＮＡに前記ＣＤ３４＋細胞を接触させることを含まない、請求項３２に記載の方法。

【請求項34】

前記細胞が、Ｅ３、Ｋ３、Ｂ１８Ｒから選択されるいかなる因子にも接触しない、請求項１～３３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項35】

前記細胞が、いかなるマイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）にも接触しない、請求項１～３３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項36】

前記細胞が、Ｅ３、Ｋ３、Ｂ１８Ｒ、１つ以上のマイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）、又はこれらの組み合わせから選択される１つ以上の因子に接触しない、請求項１～３３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項37】

前記ｍｉＲが、ｍｉＲ３０２ａ、ｍｉＲ３０２ｂ、ｍｉＲ３０２ｃ、ｍｉＲ３０２ｄ、及びｍｉＲ３６７を含む、３５又は３６に記載の方法。

【請求項38】

前記細胞が、前記少なくとも１つの環状ＲＮＡと直接接触する、請求項１～３７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項39】

前記細胞が、前記少なくとも１つの環状ＲＮＡの各々に１回接触する、請求項１～３８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項40】

前記少なくとも１つの環状ＲＮＡの各々に前記細胞を２、３、４回、又はそれ以上接触させることを含む、請求項１～３８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項41】

前記少なくとも１つの環状ＲＮＡの各々に前記細胞を４回未満接触させることを含む、請求項１～３８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項42】

前記少なくとも１つの環状ＲＮＡの各々に前記細胞を２～４回接触させることを含む、請求項１～３８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項43】

前記少なくとも１つの環状ＲＮＡの各々の濃度が、少なくとも３ｐｇ ＲＮＡ／細胞である、請求項１～４２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項44】

前記少なくとも１つの環状ＲＮＡの各々の濃度が、約５ｐｇ ＲＮＡ／細胞～約１５ｐｇ ＲＮＡ／細胞である、請求項１～４２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項45】

前記細胞の前記接触が、エレクトロポレーションにより実施される、請求項１～４４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項46】

Ｅ３、Ｋ３、又はＢ１８Ｒから選択される１つ以上のウイルスタンパク質をコードするＲＮＡポリヌクレオチドに前記細胞を接触させることを更に含む、請求項１～２６又は３８～４５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項47】

（ａ）前記Ｂ１８Ｒが、配列番号２６の配列、又はそれと少なくとも９０％又は少なくとも９５％同一の配列を有し；
（ｂ）前記Ｅ３が、配列番号２７の配列、又はそれと少なくとも９０％又は少なくとも９５％同一の配列を有し；及び／又は
（ｃ）前記Ｋ３が、配列番号２８の配列、又はそれと少なくとも９０％又は少なくとも９５％同一の配列を有する、
請求項４６に記載の方法。

【請求項48】

１つ以上のマイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）に前記細胞を接触させることを更に含む、請求項１～２６又は３８～４７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項49】

前記ｍｉＲが、ｍｉＲ３０２ａ、ｍｉＲ３０２ｂ、ｍｉＲ３０２ｃ、ｍｉＲ３０２ｄ、及びｍｉＲ３６７から選択される、請求項４８に記載の方法。

【請求項50】

（ｉ）１つ以上の線状ＲＮＡでｉＰＳＣを作製する方法と比較した培養の終わりに存在する再プログラム化されたｉＰＳＣの数の増加；及び／又は
（ｉｉ）１つ以上の線状ＲＮＡでｉＰＳＣを作製する方法と比較した再プログラム化中の１時点以上における細胞死の減少
のうちの１つ以上を生じさせる、請求項１～４９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項51】

（ｉ）１つ以上の線状ＲＮＡでｉＰＳＣを作製する方法と比較した培養の終わりに存在する再プログラム化されたｉＰＳＣの数の増加；及び
（ｉｉ）１つ以上の線状ＲＮＡでｉＰＳＣを作製する方法と比較した再プログラム化中の１時点以上における細胞死の減少
の各々を生じさせる、請求項１～４９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項52】

請求項１～５１のいずれか一項に記載の方法を使用して作製されるｉＰＳＣ。

【請求項53】

請求項５２に記載のｉＰＳＣから誘導される分化細胞。

【請求項54】

前記分化細胞が、筋細胞、神経系細胞、中枢神経系細胞、眼細胞、軟骨細胞、骨細胞、腱細胞、腎細胞、心筋細胞、肝細胞、膵島細胞、角化細胞、Ｔ細胞、又はＮＫ細胞である、請求項５３に記載の分化細胞。

【請求項55】

細胞のゲノムの再プログラム化及び編集方法であって、
（ｉ）タンパク質コード配列を含む組換え環状ＲＮＡに前記細胞を接触させることであって、前記タンパク質コード配列が少なくとも１つの再プログラム化因子をコードすること、及び
（ｉｉ）前記細胞のＤＮＡ又はＲＮＡの編集能を有する酵素、又はそれをコードする核酸に前記細胞を接触させること
を含む方法。

【請求項56】

細胞のゲノムの再プログラム化及び編集方法であって、
（ｉ）タンパク質コード配列を含む組換え環状ＲＮＡであって、前記タンパク質コード配列が少なくとも１つの再プログラム化因子をコードする、組換え環状ＲＮＡ、及び
（ｉｉ）前記細胞のＤＮＡ又はＲＮＡの編集能を有する酵素、又はそれをコードする核酸
に同時に前記細胞を接触させることを含む方法。

【請求項57】

前記少なくとも１つの再プログラム化因子が、ヒト又はヒト化再プログラム化因子である、請求項５５又は５６に記載の方法。

【請求項58】

前記少なくとも１つの再プログラム化因子がＯｃｔ３／４であり、前記Ｏｃｔ３／４が、配列番号７のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも９０％又は少なくとも９５％同一の配列を有する、請求項５５～５７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項59】

前記組換え環状ＲＮＡが、配列番号８の核酸配列、又はそれと少なくとも９０％又は少なくとも９５％同一の配列を含む、請求項５９に記載の方法。

【請求項60】

前記少なくとも１つの再プログラム化因子がＫｌｆ４であり、前記Ｋｌｆ４が、配列番号９又は１０のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも９０％又は少なくとも９５％同一の配列を有する、請求項５５～５７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項61】

前記組換え環状ＲＮＡが、配列番号１１の核酸配列、又はそれと少なくとも９０％又は少なくとも９５％同一の配列を含む、請求項６０に記載の方法。

【請求項62】

前記少なくとも１つの再プログラム化因子がＳｏｘ２であり、Ｓｏｘ２が、配列番号１２のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも９０％又は少なくとも９５％同一の配列を有する、請求項５５～５７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項63】

前記組換え環状ＲＮＡが、配列番号１３の核酸配列、又はそれと少なくとも９０％又は少なくとも９５％同一の配列を含む、請求項６２に記載の方法。

【請求項64】

前記少なくとも１つの再プログラム化因子がＮａｎｏｇであり、前記Ｎａｎｏｇが、配列番号１４又は１５のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも９０％又は少なくとも９５％同一の配列を有する、請求項５５～５７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項65】

前記組換え環状ＲＮＡが、配列番号１６の核酸配列、又はそれと少なくとも９０％又は少なくとも９５％同一の配列を含む、請求項６４に記載の方法。

【請求項66】

前記少なくとも１つの再プログラム化因子がＬｉｎ２８Ａであり、前記Ｌｉｎ２８Ａが、配列番号１７のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも９０％又は少なくとも９５％同一の配列を有する、請求項５５～５７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項67】

前記組換え環状ＲＮＡが、配列番号１８の核酸配列、又はそれと少なくとも９０％又は少なくとも９５％同一の配列を含む、請求項６６に記載の方法。

【請求項68】

前記少なくとも１つの再プログラム化因子がｃ－Ｍｙｃであり、前記ｃ－Ｍｙｃが、配列番号１９又は２０のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも９０％又は少なくとも９５％同一の配列を有する、請求項５５～５７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項69】

前記組換え環状ＲＮＡが、配列番号２１の核酸配列、又はそれと少なくとも９０％又は少なくとも９５％同一の配列を含む、請求項６８に記載の方法。

【請求項70】

前記少なくとも１つの再プログラム化因子がＬ－Ｍｙｃであり、前記Ｌ－Ｍｙｃが、配列番号２２～２４のいずれか１つのアミノ酸配列、又はそれと少なくとも９０％又は少なくとも９５％同一の配列を有する、請求項５５～５７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項71】

前記組換え環状ＲＮＡが、配列番号２５の核酸配列、又はそれと少なくとも９０％又は少なくとも９５％同一の配列を含む、請求項７０に記載の方法。

【請求項72】

前記環状ＲＮＡが、実質的に非免疫原性である、請求項５５～５７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項73】

前記環状ＲＮＡが、１つ以上のＭ－６－メチルアデノシン（ｍ^６Ａ）残基を含む、請求項７２に記載の方法。

【請求項74】

前記環状ＲＮＡが、約２００ヌクレオチド～約５，０００ヌクレオチドを含む、請求項５５～７３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項75】

前記環状ＲＮＡが、前記タンパク質コード配列に作動可能に連結された配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を含む、請求項５５～７４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項76】

前記環状ＲＮＡが、Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８、ｃ－Ｍｙｃ、又はＬ－Ｍｙｃから選択される２つ以上の再プログラム化因子をコードする、請求項５５～７５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項77】

Ｏｃｔ４又はその断片若しくはバリアントをコードする第１の環状ＲＮＡ、Ｓｏｘ２又はその断片若しくはバリアントをコードする第２の環状ＲＮＡ、Ｋｌｆ４又はその断片若しくはバリアントをコードする第３の環状ＲＮＡ、Ｃ－Ｍｙｃ又はその断片若しくはバリアントをコードする第４の環状ＲＮＡ、Ｌｉｎ２８又はその断片若しくはバリアントをコードする第５の環状ＲＮＡ、及びＮａｎｏｇ又はその断片若しくはバリアントをコードする第６の環状ＲＮＡに前記細胞を接触させることを含む、請求項５５又は５６に記載の方法。

【請求項78】

Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８、ｃ－Ｍｙｃ、及びＬ－Ｍｙｃ、又はその断片若しくはバリアントをコードする１つ以上の環状ＲＮＡに前記細胞を接触させることを含む、請求項５５又は５６に記載の方法。

【請求項79】

前記細胞が、Ｅ３、Ｋ３、Ｂ１８Ｒ、又は任意のマイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）から選択されるいかなる補助的因子にも接触しない、請求項５５～７８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項80】

前記細胞が、前記少なくとも１つの環状ＲＮＡと直接接触する、請求項５５～７９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項81】

前記細胞が、前記少なくとも１つの環状ＲＮＡの各々と１回接触する、請求項５５～８０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項82】

前記環状ＲＮＡの各々のうちの前記少なくとも１、２、３、４つ、又はそれ以上に前記細胞を接触させることを含む、請求項５５～８０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項83】

前記少なくとも１つの環状ＲＮＡの各々に前記細胞を４回未満接触させることを含む、請求項５５～８０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項84】

前記少なくとも１つの環状ＲＮＡの各々に前記細胞を２～４回接触させることを含む、請求項５５～８０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項85】

前記少なくとも１つの環状ＲＮＡの濃度が、少なくとも３ｐｇ ＲＮＡ／細胞である、請求項５５～８４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項86】

前記少なくとも１つの環状ＲＮＡの濃度が、約５ｐｇ ＲＮＡ／細胞～約１５ｐｇ ＲＮＡ／細胞である、請求項５５～８５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項87】

前記細胞の前記接触が、エレクトロポレーションにより実施される、請求項５５～８６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項88】

前記エレクトロポレーションが、Neon（登録商標）エレクトロポレーションシステムを使用する、請求項８７に記載の方法。

【請求項89】

Ｅ３、Ｋ３、又はＢ１８Ｒから選択される１つ以上のウイルスタンパク質をコードするＲＮＡポリヌクレオチドに前記細胞を接触させることを含む、請求項５５～７８又は８０～８８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項90】

（ａ）前記Ｂ１８Ｒが、配列番号２６の配列、又はそれと少なくとも９０％又は少なくとも９５％同一の配列を有し；
（ｂ）前記Ｅ３が、配列番号２７の配列、又はそれと少なくとも９０％又は少なくとも９５％同一の配列を有し；及び／又は
（ｃ）前記Ｋ３が、配列番号２８の配列、又はそれと少なくとも９０％又は少なくとも９５％同一の配列を有する、
請求項８９に記載の方法。

【請求項91】

ｍｉＲ３０２ａ、ｍｉＲ３０２ｂ、ｍｉＲ３０２ｃ、ｍｉＲ３０２ｄ、及びｍｉＲ３６７から選択されるマイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）に前記細胞を接触させることを含む、請求項５５～７８又は８０～９０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項92】

前記細胞が、Ｅ３、Ｋ３、Ｂ１８Ｒから選択されるいかなるウイルスタンパク質にも接触しないか、又はｍｉＲ３０２ａ、ｍｉＲ３０２ｂ、ｍｉＲ３０２ｃ、ｍｉＲ３０２ｄ、及びｍｉＲ３６７から選択されるいかなるマイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）にも接触しない、請求項５５～８８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項93】

前記酵素が、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、アルゴノートエンドヌクレアーゼ（ＮｇＡｇｏ）、構造ガイド型エンドヌクレアーゼ（ＳＧＮ）、ＲＮＡガイド型ヌクレアーゼ（ＲＧＮ）、ＲＮＡに作用するアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）、又はこれらの修飾された若しくはトランケートされたバリアントである、請求項５５～８２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項94】

前記ＲＧＮが、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ、Ｃａｓ１２（ａ）ヌクレアーゼ（Ｃｐｆ１）、Ｃａｓ１２ｂヌクレアーゼ、Ｃａｓ１２ｃヌクレアーゼ、ＴｒｐＢ様ヌクレアーゼ、Ｃａｓ１３ａヌクレアーゼ（Ｃ２ｃ２）、Ｃａｓ１３ｂヌクレアーゼ、Ｃａｓ１４ヌクレアーゼ又はこれらの修飾された若しくはトランケートされたバリアントから選択されるＣａｓヌクレアーゼである、請求項９３に記載の方法。

【請求項95】

前記ＲＧＮがＣａｓ９ヌクレアーゼであり、前記Ｃａｓ９ヌクレアーゼが、化膿レンサ球菌（S. pyogenes）又は黄色ブドウ球菌（S. aureus）から単離又は誘導される、請求項９４に記載の方法。

【請求項96】

前記ＲＧＮが、ＡＰＧ０５０８３．１、ＡＰＧ０７４３３．１、ＡＰＧ０７５１３．１、ＡＰＧ０８２９０．１、ＡＰＧ０５４５９．１、ＡＰＧ０４５８３．１、及びＡＰＧ１６８８．１、ＡＰＧ０５７３３．１、ＡＰＧ０６２０７．１、ＡＰＧ０１６４７．１、ＡＰＧ０８０３２．１、ＡＰＧ０５７１２．１、ＡＰＧ０１６５８．１、ＡＰＧ０６４９８．１、ＡＰＧ０９１０６．１、ＡＰＧ０９８８２．１、ＡＰＧ０２６７５．１、ＡＰＧ０１４０５．１、ＡＰＧ０６２５０．１、ＡＰＧ０６８７７．１、ＡＰＧ０９０５３．１、ＡＰＧ０４２９３．１、ＡＰＧ０１３０８．１、ＡＰＧ０６６４６．１、ＡＰＧ０９７４８、ＡＰＧ０７４３３．１、ＡＰＧ００９６９、ＡＰＧ０３１２８、ＡＰＧ０９７４８、ＡＰＧ００７７１、ＡＰＧ０２７８９、ＡＰＧ０９１０６、ＡＰＧ０２３１２、ＡＰＧ０７３８６、ＡＰＧ０９９８０、ＡＰＧ０５８４０、ＡＰＧ０５２４１、ＡＰＧ０７２８０、ＡＰＧ０９８６６、及びＡＰＧ００８６８のうちのいずれか１つから選択される、請求項９３に記載の方法。

【請求項97】

ガイドＲＮＡ、又はそれをコードする核酸に前記細胞を接触させることを更に含む、請求項５５～９６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項98】

前記細胞が、前記酵素又はそれをコードする前記核酸に接触する前に前記環状ＲＮＡに接触する、請求項５５又は５７～９７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項99】

前記細胞が、前記酵素又はそれをコードする前記核酸に接触した後に前記組換え環状ＲＮＡに接触する、請求項５５又は８７～９７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項100】

前記細胞が、前記細胞のＤＮＡ又はＲＮＡの編集能を有する酵素、又はそれをコードする核酸、及びガイドＲＮＡ、又はそれをコードする核酸に接触する、請求項５５～９９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項101】

前記酵素が前記細胞のＤＮＡの編集能を有し、前記酵素と前記ガイドＲＮＡとが、前記細胞との接触前にリボ核タンパク質として複合体化する、請求項１００に記載の方法。

【請求項102】

前記細胞の前記接触が、エレクトロポレーションにより実施される、請求項５５～１０１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項103】

請求項５５～１０２のいずれか一項に記載の方法により生成される細胞。

【請求項104】

細胞の再プログラム化方法であって、Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８、及びｃ－Ｍｙｃからなる６つの再プログラム化因子をコードする１つ以上の環状ＲＮＡに細胞を接触させることを含む方法。

【請求項105】

Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８、及びｃ－Ｍｙｃからなる群からの再プログラム化因子を各々がコードする６つの環状ＲＮＡに細胞を接触させることを含む、請求項１０４に記載の方法。

【請求項106】

前記環状ＲＮＡ又は線状ＲＮＡのいずれか１つが、脂質ナノ粒子にコンジュゲートされる、請求項１０４又は１０５に記載の方法。

【請求項107】

前記細胞が、Ｅ３、Ｋ３、Ｂ１８Ｒ、又は１つ以上のマイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）から選択される１つ以上の因子に接触しない、請求項１０４～１０６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項108】

前記環状ＲＮＡが、前記細胞にとって外因性である、請求項１～５１、５５～１０２、又は１０４～１０７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項109】

請求項１０４～１０８のいずれか一項に記載の方法により生成される細胞。

【請求項110】

再プログラム化因子をコードする１つ以上の外因性環状ＲＮＡを含む体細胞であって、前記再プログラム化因子が、Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８、及びｃ－Ｍｙｃからなる群から選択される、体細胞。

【請求項111】

前記体細胞が１つ以上の外因性環状ＲＮＡを含み、前記１つ以上の環状ＲＮＡが、各々、Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８、及びｃ－Ｍｙｃから選択される再プログラム化因子をコードする、請求項１１０に記載の体細胞。

【請求項112】

前記体細胞が６つの外因性環状ＲＮＡを含み、各環状ＲＮＡが、Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８、及びｃ－Ｍｙｃのうちの１つをコードする、請求項１１０に記載の体細胞。

【請求項113】

前記体細胞が５つの外因性環状ＲＮＡを含み、各環状ＲＮＡが、Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、及びＬｉｎ２８のうちの１つをコードする、請求項１１０に記載の体細胞。

【請求項114】

前記体細胞が４つの外因性環状ＲＮＡを含み、各環状ＲＮＡが、Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、及びｃ－Ｍｙｃのうちの１つをコードする、請求項１１０に記載の体細胞。

【請求項115】

前記体細胞が３つの外因性環状ＲＮＡを含み、各環状ＲＮＡが、Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、及びＳｏｘ２のうちの１つをコードする、請求項１１０に記載の体細胞。

【請求項116】

１つ以上のＣＤ３４＋細胞を含む浮遊培養液であって、前記ＣＤ３４＋細胞が、再プログラム化因子をコードする１つ以上の外因性ｃｉｒｃＲＮＡを含む、浮遊培養液。

【請求項117】

前記ＣＤ３４＋細胞が、Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８、及びｃ－Ｍｙｃからなる群から選択される１つの再プログラム化因子を各々がコードする６つの外因性ｃｉｒｃＲＮＡを含む、請求項１１６に記載の浮遊培養液。

【請求項118】

前記ＣＤ３４＋細胞が、Ｅ３、Ｋ３、Ｂ１８Ｒ、又はマイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）から選択される補助的因子をコードする外因性核酸を含まない、請求項１１６又は１１７に記載の浮遊培養液。

【請求項119】

Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８、及びｃ－Ｍｙｃからなる前記再プログラム化因子をコードする１つ以上の環状ＲＮＡを含む組成物。

【請求項120】

Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８、及びｃ－Ｍｙｃからなる前記再プログラム化因子をコードする２つ以上の環状ＲＮＡを含む組成物。

【請求項121】

Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８、及びｃ－Ｍｙｃからなる前記再プログラム化因子のうちの１つを各々がコードする６つの環状ＲＮＡを含む組成物。

【請求項122】

Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、及びＬｉｎ２８からなる前記再プログラム化因子のうちの１つを各々がコードする５つの環状ＲＮＡを含む組成物。

【請求項123】

Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、及びｃ－Ｍｙｃからなる前記再プログラム化因子のうちの１つを各々がコードする４つの環状ＲＮＡを含む組成物。

【請求項124】

Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、及びＳｏｘ２からなる前記再プログラム化因子のうちの１つを各々がコードする３つの環状ＲＮＡを含む組成物。

【請求項125】

請求項１１９～１２４のいずれか一項に記載の組成物を含むキット。

【請求項126】

請求項１１９～１２４のいずれか一項に記載の組成物を含む細胞。

【請求項127】

真核細胞である、請求項１２６に記載の細胞。

【請求項128】

哺乳類細胞である、請求項１２７に記載の細胞。

【請求項129】

ヒト細胞である、請求項１２８に記載の細胞。

【請求項130】

ＣＤ３４＋細胞、Ｔ細胞、又はＮＫ細胞である、請求項１２６～１２８のいずれか一項に記載の細胞。

【請求項131】

Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８、及びｃ－Ｍｙｃ、又はＬ－Ｍｙｃのいずれか一方から選択される１つ以上の再プログラム化因子をコードする１つ以上の環状ＲＮＡを含むＣＤ３４＋細胞。

【請求項132】

前記再プログラム化因子が、Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８、及びｃ－Ｍｙｃの６つ全てからなる、請求項１３１に記載のＣＤ３４＋細胞。

【請求項133】

前記再プログラム化因子が、Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８、及びＬ－Ｍｙｃの６つ全てからなる、請求項１３１に記載のＣＤ３４＋細胞。

【請求項134】

前記再プログラム化因子が、Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、及びＬｉｎ２８からなる、請求項１３１に記載のＣＤ３４＋細胞。

【請求項135】

前記再プログラム化因子が、Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、及びｃ－Ｍｙｃからなる、請求項１３１に記載のＣＤ３４＋細胞。

【請求項136】

前記再プログラム化因子が、Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、及びＳｏｘ２からなる、請求項１３１に記載のＣＤ３４＋細胞。

【請求項137】

ＳＳＥＡ－３、ＳＳＥＡ－４、ＴＲＡ－１－６０、ＴＲＡ－１－８１、ＴＲＡ－２－４９／６Ｅ、アルカリホスファターゼ、Ｓｏｘ２、Ｅ－カドヘリン、ＵＴＦ－１、Ｏｃｔ４、Ｒｅｘ１、Ｎａｎｏｇ、又はこれらの組み合わせから選択される少なくとも１つのステムネスマーカーを呈する、請求項１３１～１３６のいずれか一項に記載のＣＤ３４＋細胞。

【請求項138】

前記１つ以上の環状ＲＮＡが、前記細胞にとって外因性である、請求項１３１～１３７のいずれか一項に記載のＣＤ３４＋細胞。

【請求項139】

１つ以上の遺伝子修飾を更に含む、請求項１３１～１３８のいずれか一項に記載のＣＤ３４＋細胞。

【請求項140】

前記１つ以上の遺伝子修飾が遺伝子ノックアウトを含む、請求項１３９に記載のＣＤ３４＋細胞。

【請求項141】

前記１つ以上の遺伝子修飾が遺伝子ノックインを含む、請求項１３９又は１４０に記載のＣＤ３４＋細胞。

【請求項142】

請求項１３１～１４１のいずれか一項に記載のＣＤ３４＋細胞から誘導された人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）。

【請求項143】

前記細胞が低免疫原性である、請求項１４２に記載のｉＰＳＣ。

【請求項144】

請求項１４２又は１４３に記載のｉＰＳＣから生成された分化細胞。

【請求項145】

疾患又は病態を治療する方法であって、それを必要としている対象に請求項１４２又は１４３に記載のｉＰＳＣ又は請求項１２６に記載の分化細胞を投与することを含む方法。

【請求項146】

体細胞を分化転換させる方法であって、１つ以上の外因性環状ＲＮＡに前記細胞を接触させることを含む方法。

【請求項147】

請求項１４６に記載の方法により作製される分化転換細胞。

【請求項148】

人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）から細胞を分化させる方法であって、１つ以上の環状ＲＮＡに前記ｉＰＳＣを接触させることを含む方法。

【請求項149】

請求項１４８に記載の方法により作製される分化細胞。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
[0001] 本願は、２０２１年１２月２０日に出願された米国仮特許出願第６３／２９１，６４５号に対する優先権を主張するものであり、この内容は全体として参照により本明細書に援用される。

【0002】

電子的に提出されたテキストファイルに関する記載
[0002] 本明細書と共に電子的に提出されたテキストファイルの内容は、全体として参照により援用される：配列表のコンピュータ可読形式複製物（ファイル名：ELVT_015_01WO_SeqList_ST26.xml、サイズ５０．８ＫＢ、作成日２０２２年１１月１６日）。

【背景技術】

【0003】

背景
[0003] 人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）により、創薬及びヘルスケアに変容がもたらされている。ｉＰＳＣは、研究及び／又は治療目的で必要な様々なヒト細胞型の発生を可能にする胚様の多能性状態に戻るよう体細胞を再プログラム化することによって生じる。

【0004】

[0004] ｉＰＳＣは、典型的には１つ以上の再プログラム化因子（例えば、Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８、ｃ－Ｍｙｃ、及び／又はＬ－Ｍｙｃ）を体細胞に導入することによって誘導される。再プログラム化因子は標準的な手法を用いて細胞に導入できるが、そうした手法は様々な欠点に見舞われている。例えば、自己複製性のＲＮＡシステムは、自己複製能力のあるＲＮＡレプリコンを使用する。かかる複製ベクターは、性質上、ゲノム組込みの危険性がある。ｍＲＮＡベースの再プログラム化は骨の折れる作業であり、ｍＲＮＡ分子の代謝回転は速いため、ｍＲＮＡの複数回のトランスフェクションが関わる。外因性ｍＲＮＡはまた免疫原性でもあるため、免疫回避因子（例えば、インターフェロン経路の阻害薬）及び／又は修飾ヌクレオチドを用いて毒性を最小限に抑える必要がある。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

[0005] よって、当該技術分野では、ｉＰＳＣを作製するための改良された組成物及び方法が必要とされている。

【課題を解決するための手段】

【0006】

概要
[0006] 一部の実施形態において、本開示は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を作製する方法であって、Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８、ｃ－Ｍｙｃ、又はＬ－Ｍｙｃから選択される少なくとも１つの再プログラム化因子、又はその断片若しくはバリアントをコードする環状ＲＮＡに浮遊状態の血液細胞を接触させること、及びｉＰＳＣが入手される条件下に細胞を維持することを含む方法を提供する。一部の実施形態において、血液細胞は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、及び臍帯血単核細胞（ＣＢＭＣ）から選択される。一部の実施形態において、血液細胞は、Ｔ細胞及びＮＫ細胞から選択される。

【0007】

[0007] 一部の実施形態において、本開示は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を作製する方法であって、Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８、ｃ－Ｍｙｃ、又はＬ－Ｍｙｃから選択される少なくとも１つの再プログラム化因子、又はその断片若しくはバリアントをコードする環状ＲＮＡに浮遊状態のＣＤ３４＋細胞を接触させること、及びｉＰＳＣが入手される条件下に細胞を維持することを含む方法を提供する。

【0008】

[0008] 一部の実施形態において、少なくとも１つの再プログラム化因子は、ヒト又はヒト化再プログラム化因子である。一部の実施形態において、少なくとも１つの再プログラム化因子はＯｃｔ３／４であり、ここでＯｃｔ３／４は、配列番号７のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも９０％又は少なくとも９５％同一の配列を有する。一部の実施形態において、環状ＲＮＡは、配列番号８の核酸配列、又はそれと少なくとも９０％又は少なくとも９５％同一の配列を含む。

【0009】

[0009] 一部の実施形態において、少なくとも１つの再プログラム化因子はＫｌｆ４であり、ここでＫｌｆ４は、配列番号９又は１０のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも９０％又は少なくとも９５％同一の配列を有する。一部の実施形態において、環状ＲＮＡは、配列番号１１の核酸配列、又はそれと少なくとも９０％又は少なくとも９５％同一の配列を含む。

【0010】

[0010] 一部の実施形態において、少なくとも１つの再プログラム化因子はＳｏｘ２であり、ここでＳｏｘ２は、配列番号１２のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも９０％又は少なくとも９５％同一の配列を有する。一部の実施形態において、環状ＲＮＡは、配列番号１３の核酸配列、又はそれと少なくとも９０％又は少なくとも９５％同一の配列を含む。

【0011】

[0011] 一部の実施形態において、少なくとも１つの再プログラム化因子はＮａｎｏｇであり、ここでＮａｎｏｇは、配列番号１４又は１５のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも９０％又は少なくとも９５％同一の配列を有する。一部の実施形態において、環状ＲＮＡは、配列番号１６の核酸配列、又はそれと少なくとも９０％又は少なくとも９５％同一の配列を含む。

【0012】

[0012] 一部の実施形態において、少なくとも１つの再プログラム化因子はＬｉｎ２８Ａであり、ここでＬｉｎ２８Ａは、配列番号１７のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも９０％又は少なくとも９５％同一の配列を有する。一部の実施形態において、環状ＲＮＡは、配列番号１８の核酸配列、又はそれと少なくとも９０％又は少なくとも９５％同一の配列を含む。

【0013】

[0013] 一部の実施形態において、少なくとも１つの再プログラム化因子はｃ－Ｍｙｃであり、ここでｃ－Ｍｙｃは、配列番号１９又は２０のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも９０％又は少なくとも９５％同一の配列を有する。一部の実施形態において、環状ＲＮＡは、配列番号２１の核酸配列、又はそれと少なくとも９０％又は少なくとも９５％同一の配列を含む。

【0014】

[0014] 一部の実施形態において、少なくとも１つの再プログラム化因子はＬ－Ｍｙｃであり、ここでＬ－Ｍｙｃは、配列番号２２～２４のいずれか１つのアミノ酸配列、又はそれと少なくとも９０％又は少なくとも９５％同一の配列を有する。一部の実施形態において、環状ＲＮＡは、配列番号２５の核酸配列、又はそれと少なくとも９０％又は少なくとも９５％同一の配列を含む。

【0015】

[0015] 一部の実施形態において、環状ＲＮＡは、実質的に非免疫原性である。一部の実施形態において、環状ＲＮＡは、１つ以上のＭ－６－メチルアデノシン（ｍ６Ａ）残基を含む。一部の実施形態において、環状ＲＮＡは、約２００ヌクレオチド～約５，０００ヌクレオチドを含む。

【0016】

[0016] 一部の実施形態において、環状ＲＮＡは、タンパク質コード配列に作動可能に連結された配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を含む。一部の実施形態において、環状ＲＮＡは、Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８、ｃ－Ｍｙｃ、又はＬ－Ｍｙｃから選択される２つ以上の再プログラム化因子をコードする。

【0017】

[0017] 一部の実施形態において、本方法は、Ｏｃｔ４又はその断片若しくはバリアントをコードする第１の環状ＲＮＡ、Ｓｏｘ２又はその断片若しくはバリアントをコードする第２の環状ＲＮＡ、Ｋｌｆ４又はその断片若しくはバリアントをコードする第３の環状ＲＮＡ、Ｃ－Ｍｙｃ又はその断片若しくはバリアントをコードする第４の環状ＲＮＡ、Ｌｉｎ２８又はその断片若しくはバリアントをコードする第５の環状ＲＮＡ、及びＮａｎｏｇ又はその断片若しくはバリアントをコードする第６の環状ＲＮＡに細胞を接触させることを含む。

【0018】

[0018] 一部の実施形態において、本方法は、Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８、及びｃ－Ｍｙｃからなる再プログラム化因子の群のうちの１つ以上、又はその断片若しくはバリアントをコードする１つ以上の環状ＲＮＡに細胞を接触させることを含む。

【0019】

[0019] 一部の実施形態において、本開示は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を作製する方法であって、Ｏｃｔ４をコードする第１の環状ＲＮＡ、Ｓｏｘ２をコードする第２の環状ＲＮＡ、Ｋｌｆ４をコードする第３の環状ＲＮＡ、Ｃ－Ｍｙｃをコードする第４の環状ＲＮＡ、Ｌｉｎ２８をコードする第５の環状ＲＮＡ、及びＮａｎｏｇをコードする第６の環状ＲＮＡからなる６つの環状ＲＮＡに浮遊状態の血液細胞又はＣＤ３４＋細胞を接触させること、及びｉＰＳＣが入手される条件下に細胞を維持することを含む方法を提供する。

【0020】

[0020] 一部の実施形態において、本開示は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を作製する方法であって、Ｏｃｔ４をコードする第１の環状ＲＮＡ、Ｓｏｘ２をコードする第２の環状ＲＮＡ、及びＫｌｆ４をコードする第３の環状ＲＮＡからなる３つの環状ＲＮＡに浮遊状態の血液細胞又はＣＤ３４＋細胞を接触させること、及びｉＰＳＣが入手される条件下に細胞を維持することを含む方法を提供する。一部の実施形態において、本方法は、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８、及びｃ－Ｍｙｃのいずれかをコードする環状ＲＮＡにＣＤ３４＋細胞を接触させることを含まない。

【0021】

[0021] 一部の実施形態において、本開示は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を作製する方法であって、Ｏｃｔ４をコードする第１の環状ＲＮＡ、Ｓｏｘ２をコードする第２の環状ＲＮＡ、及びＫｌｆ４をコードする第３の環状ＲＮＡからなる３つの環状ＲＮＡ、及びＣ－Ｍｙｃをコードする第４の環状ＲＮＡに浮遊状態の血液細胞又はＣＤ３４＋細胞を接触させること、及びｉＰＳＣが入手される条件下に細胞を維持することを含む方法を提供する。一部の実施形態において、本方法は、Ｎａｎｏｇ又はＬｉｎ２８のいずれかをコードする環状ＲＮＡにＣＤ３４＋細胞を接触させることを含まない。

【0022】

[0022] 一部の実施形態において、本開示は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を作製する方法であって、Ｏｃｔ４をコードする第１の環状ＲＮＡ、Ｓｏｘ２をコードする第２の環状ＲＮＡ、及びＫｌｆ４をコードする第３の環状ＲＮＡからなる３つの環状ＲＮＡ、及びＮａｎｏｇをコードする第４の環状ＲＮＡ、及びＬｉｎ ２８をコードする第５の環状ＲＮＡに浮遊状態の血液細胞又はＣＤ３４＋細胞を接触させること、及びｉＰＳＣが入手される条件下に細胞を維持することを含む方法を提供する。一部の実施形態において、本方法は、ｃ－Ｍｙｃをコードする環状ＲＮＡにＣＤ３４＋細胞を接触させることを含まない。

【0023】

[0023] 一部の実施形態において、細胞は、Ｅ３、Ｋ３、Ｂ１８Ｒから選択されるいかなる因子にも接触しない。一部の実施形態において、細胞は、いかなるマイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）にも接触しない。一部の実施形態において、細胞は、Ｅ３、Ｋ３、Ｂ１８Ｒ、１つ以上のマイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）、又はこれらの組み合わせから選択される１つ以上の因子に接触しない。一部の実施形態において、ｍｉＲは、ｍｉＲ３０２ａ、ｍｉＲ３０２ｂ、ｍｉＲ３０２ｃ、ｍｉＲ３０２ｄ、及びｍｉＲ３６７を含む。

【0024】

[0024] 一部の実施形態において、細胞は、少なくとも１つの環状ＲＮＡと直接接触する。一部の実施形態において、細胞は、少なくとも１つの環状ＲＮＡの各々に１回接触する。一部の実施形態において、本方法は、少なくとも１つの環状ＲＮＡの各々に細胞を２、３、４回、又はそれ以上接触させることを含む。一部の実施形態において、本方法は、少なくとも１つの環状ＲＮＡの各々に細胞を４回未満接触させることを含む。一部の実施形態において、本方法は、少なくとも１つの環状ＲＮＡの各々に細胞を２～４回接触させることを含む。

【0025】

[0025] 一部の実施形態において、少なくとも１つの環状ＲＮＡの各々の濃度は、少なくとも３ｐｇ ＲＮＡ／細胞である。一部の実施形態において、少なくとも１つの環状ＲＮＡの各々の濃度は、約５ｐｇ ＲＮＡ／細胞～約１５ｐｇ ＲＮＡ／細胞である。

【0026】

[0026] 一部の実施形態において、細胞の接触は、エレクトロポレーションにより実施される。

【0027】

[0027] 一部の実施形態において、本方法は、Ｅ３、Ｋ３、又はＢ１８Ｒから選択される１つ以上のウイルスタンパク質をコードするＲＮＡポリヌクレオチドに細胞を接触させることを更に含む。一部の実施形態において、（ａ）Ｂ１８Ｒは、配列番号２６の配列、又はそれと少なくとも９０％又は少なくとも９５％同一の配列を有し；（ｂ）Ｅ３は、配列番号２７の配列、又はそれと少なくとも９０％又は少なくとも９５％同一の配列を有し；及び／又は（ｃ）Ｋ３は、配列番号２８の配列、又はそれと少なくとも９０％又は少なくとも９５％同一の配列を有する。一部の実施形態において、本方法は、１つ以上のマイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）に細胞を接触させることを更に含む。一部の実施形態において、ｍｉＲは、ｍｉＲ３０２ａ、ｍｉＲ３０２ｂ、ｍｉＲ３０２ｃ、ｍｉＲ３０２ｄ、及びｍｉＲ３６７から選択される。

【0028】

[0028] 一部の実施形態において、本方法は、（ｉ）１つ以上の線状ＲＮＡでｉＰＳＣを作製する方法と比較した培養の終わりに存在する再プログラム化されたｉＰＳＣの数の増加；及び／又は（ｉｉ）１つ以上の線状ＲＮＡでｉＰＳＣを作製する方法と比較した再プログラム化中の１時点以上における細胞死の減少のうちの１つ以上を生じさせる。一部の実施形態において、本方法は、（ｉ）１つ以上の線状ＲＮＡでｉＰＳＣを作製する方法と比較した培養の終わりに存在する再プログラム化されたｉＰＳＣの数の増加；及び（ｉｉ）１つ以上の線状ＲＮＡでｉＰＳＣを作製する方法と比較した再プログラム化中の１時点以上における細胞死の減少の各々を生じさせる。

【0029】

[0029] 一部の実施形態において、本開示は、本明細書に記載される方法によって作製されたｉＰＳＣを提供する。一部の実施形態において、本開示は、本明細書に記載されるｉＰＳＣから誘導された分化細胞を提供する。一部の実施形態において、分化細胞は、筋細胞、神経系細胞、中枢神経系細胞、眼細胞、軟骨細胞、骨細胞、腱細胞、腎細胞、心筋細胞、肝細胞、膵島細胞、角化細胞、Ｔ細胞、又はＮＫ細胞である。

【0030】

[0030] 一部の実施形態において、本開示は、細胞のゲノムの再プログラム化及び編集方法であって、（ｉ）タンパク質コード配列を含む組換え環状ＲＮＡに細胞を接触させることであって、タンパク質コード配列が少なくとも１つの再プログラム化因子をコードすること、及び（ｉｉ）細胞のＤＮＡ又はＲＮＡの編集能を有する酵素、又はそれをコードする核酸に細胞を接触させることを含む方法を提供する。

【0031】

[0031] 一部の実施形態において、本開示は、細胞のゲノムの再プログラム化及び編集方法であって、（ｉ）タンパク質コード配列を含む組換え環状ＲＮＡであって、タンパク質コード配列が少なくとも１つの再プログラム化因子をコードする、組換え環状ＲＮＡ、及び（ｉｉ）細胞のＤＮＡ又はＲＮＡの編集能を有する酵素、又はそれをコードする核酸に細胞を同時に接触させることを含む方法を提供する。

【0032】

[0032] 一部の実施形態において、少なくとも１つの再プログラム化因子は、ヒト又はヒト化再プログラム化因子である。

【0033】

[0033] 一部の実施形態において、少なくとも１つの再プログラム化因子はＯｃｔ３／４であり、ここでＯｃｔ３／４は、配列番号７のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも９０％又は少なくとも９５％同一の配列を有する。一部の実施形態において、組換え環状ＲＮＡは、配列番号８の核酸配列、又はそれと少なくとも９０％又は少なくとも９５％同一の配列を含む。

【0034】

[0034] 一部の実施形態において、少なくとも１つの再プログラム化因子はＫｌｆ４であり、ここでＫｌｆ４は、配列番号９又は１０のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも９０％又は少なくとも９５％同一の配列を有する。一部の実施形態において、組換え環状ＲＮＡは、配列番号１１の核酸配列、又はそれと少なくとも９０％又は少なくとも９５％同一の配列を含む。

【0035】

[0035] 一部の実施形態において、少なくとも１つの再プログラム化因子はＳｏｘ２であり、ここでＳｏｘ２は、配列番号１２のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも９０％又は少なくとも９５％同一の配列を有する。一部の実施形態において、組換え環状ＲＮＡは、配列番号１３の核酸配列、又はそれと少なくとも９０％又は少なくとも９５％同一の配列を含む。

【0036】

[0036] 一部の実施形態において、少なくとも１つの再プログラム化因子はＮａｎｏｇであり、ここでＮａｎｏｇは、配列番号１４又は１５のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも９０％又は少なくとも９５％同一の配列を有する。一部の実施形態において、組換え環状ＲＮＡは、配列番号１６の核酸配列、又はそれと少なくとも９０％又は少なくとも９５％同一の配列を含む。

【0037】

[0037] 一部の実施形態において、少なくとも１つの再プログラム化因子はＬｉｎ２８Ａであり、ここでＬｉｎ２８Ａは、配列番号１７のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも９０％又は少なくとも９５％同一の配列を有する。一部の実施形態において、組換え環状ＲＮＡは、配列番号１８の核酸配列、又はそれと少なくとも９０％又は少なくとも９５％同一の配列を含む。

【0038】

[0038] 一部の実施形態において、少なくとも１つの再プログラム化因子はｃ－Ｍｙｃであり、ここでｃ－Ｍｙｃは、配列番号１９又は２０のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも９０％又は少なくとも９５％同一の配列を有する。一部の実施形態において、組換え環状ＲＮＡは、配列番号２１の核酸配列、又はそれと少なくとも９０％又は少なくとも９５％同一の配列を含む。

【0039】

[0039] 一部の実施形態において、少なくとも１つの再プログラム化因子はＬ－Ｍｙｃであり、ここでＬ－Ｍｙｃは、配列番号２２～２４のいずれか１つのアミノ酸配列、又はそれと少なくとも９０％又は少なくとも９５％同一の配列を有する。一部の実施形態において、組換え環状ＲＮＡは、配列番号２５の核酸配列、又はそれと少なくとも９０％又は少なくとも９５％同一の配列を含む。

【0040】

[0040] 一部の実施形態において、環状ＲＮＡは、実質的に非免疫原性である。一部の実施形態において、環状ＲＮＡは、１つ以上のＭ－６－メチルアデノシン（ｍ６Ａ）残基を含む。一部の実施形態において、環状ＲＮＡは、約２００ヌクレオチド～約５，０００ヌクレオチドを含む。

【0041】

[0041] 一部の実施形態において、環状ＲＮＡは、タンパク質コード配列に作動可能に連結された配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を含む。一部の実施形態において、環状ＲＮＡは、Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８、ｃ－Ｍｙｃ、又はＬ－Ｍｙｃから選択される２つ以上の再プログラム化因子をコードする。

【0042】

[0042] 一部の実施形態において、本方法は、Ｏｃｔ４又はその断片若しくはバリアントをコードする第１の環状ＲＮＡ、Ｓｏｘ２又はその断片若しくはバリアントをコードする第２の環状ＲＮＡ、Ｋｌｆ４又はその断片若しくはバリアントをコードする第３の環状ＲＮＡ、Ｃ－Ｍｙｃ又はその断片若しくはバリアントをコードする第４の環状ＲＮＡ、Ｌｉｎ２８又はその断片若しくはバリアントをコードする第５の環状ＲＮＡ、及びＮａｎｏｇ又はその断片若しくはバリアントをコードする第６の環状ＲＮＡに細胞を接触させることを含む。一部の実施形態において、本方法は、Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８、ｃ－Ｍｙｃ、及びＬ－Ｍｙｃ、又はその断片若しくはバリアントをコードする１つ以上の環状ＲＮＡに細胞を接触させることを含む。

【0043】

[0043] 一部の実施形態において、細胞は、Ｅ３、Ｋ３、Ｂ１８Ｒ、又は任意のマイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）から選択されるいかなる補助的因子にも接触しない。一部の実施形態において、細胞は、少なくとも１つの環状ＲＮＡと直接接触する。一部の実施形態において、細胞は、少なくとも１つの環状ＲＮＡの各々と１回接触する。一部の実施形態において、本方法は、環状ＲＮＡのうちの少なくとも１つの各々に細胞を２、３、４回、又はそれ以上接触させることを含む。一部の実施形態において、本方法は、少なくとも１つの環状ＲＮＡの各々に細胞を４回未満接触させることを含む。一部の実施形態において、本方法は、少なくとも１つの環状ＲＮＡの各々に細胞を２～４回接触させることを含む。

【0044】

[0044] 一部の実施形態において、少なくとも１つの環状ＲＮＡの濃度は、少なくとも３ｐｇ ＲＮＡ／細胞である。一部の実施形態において、少なくとも１つの環状ＲＮＡの濃度は、約５ｐｇ ＲＮＡ／細胞～約１５ｐｇ ＲＮＡ／細胞である。

【0045】

[0045] 一部の実施形態において、細胞の接触は、エレクトロポレーションにより実施される。

【0046】

[0046] 一部の実施形態において、本方法は、Ｅ３、Ｋ３、又はＢ１８Ｒから選択される１つ以上のウイルスタンパク質をコードするＲＮＡポリヌクレオチドに細胞を接触させることを含む。一部の実施形態において、（ａ）Ｂ１８Ｒは、配列番号２６の配列、又はそれと少なくとも９０％又は少なくとも９５％同一の配列を有し；（ｂ）Ｅ３は、配列番号２７の配列、又はそれと少なくとも９０％又は少なくとも９５％同一の配列を有し；及び／又は（ｃ）Ｋ３は、配列番号２８の配列、又はそれと少なくとも９０％又は少なくとも９５％同一の配列を有する。一部の実施形態において、本方法は、ｍｉＲ３０２ａ、ｍｉＲ３０２ｂ、ｍｉＲ３０２ｃ、ｍｉＲ３０２ｄ、及びｍｉＲ３６７から選択されるマイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）に細胞を接触させることを含む。

【0047】

[0047] 一部の実施形態において、細胞は、Ｅ３、Ｋ３、Ｂ１８Ｒから選択されるいかなるウイルスタンパク質にも接触しないか、又はｍｉＲ３０２ａ、ｍｉＲ３０２ｂ、ｍｉＲ３０２ｃ、ｍｉＲ３０２ｄ、及びｍｉＲ３６７から選択されるいかなるマイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）にも接触しない。

【0048】

[0048] 一部の実施形態において、酵素は、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、アルゴノートエンドヌクレアーゼ（ＮｇＡｇｏ）、構造ガイド型エンドヌクレアーゼ（ＳＧＮ）、ＲＮＡガイド型ヌクレアーゼ（ＲＧＮ）、ＲＮＡに作用するアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）、又はこれらの修飾された若しくはトランケートされたバリアントである。一部の実施形態において、ＲＧＮは、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ、Ｃａｓ１２（ａ）ヌクレアーゼ（Ｃｐｆ１）、Ｃａｓ１２ｂヌクレアーゼ、Ｃａｓ１２ｃヌクレアーゼ、ＴｒｐＢ様ヌクレアーゼ、Ｃａｓ１３ａヌクレアーゼ（Ｃ２ｃ２）、Ｃａｓ１３ｂヌクレアーゼ、Ｃａｓ１４ヌクレアーゼ又はこれらの修飾された若しくはトランケートされたバリアントから選択されるＣａｓヌクレアーゼである。一部の実施形態において、ＲＧＮはＣａｓ９ヌクレアーゼであり、Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、化膿レンサ球菌（S. pyogenes）又は黄色ブドウ球菌（S. aureus）から単離又は誘導される。一部の実施形態において、ＲＧＮは、ＡＰＧ０５０８３．１、ＡＰＧ０７４３３．１、ＡＰＧ０７５１３．１、ＡＰＧ０８２９０．１、ＡＰＧ０５４５９．１、ＡＰＧ０４５８３．１、及びＡＰＧ１６８８．１、ＡＰＧ０５７３３．１、ＡＰＧ０６２０７．１、ＡＰＧ０１６４７．１、ＡＰＧ０８０３２．１、ＡＰＧ０５７１２．１、ＡＰＧ０１６５８．１、ＡＰＧ０６４９８．１、ＡＰＧ０９１０６．１、ＡＰＧ０９８８２．１、ＡＰＧ０２６７５．１、ＡＰＧ０１４０５．１、ＡＰＧ０６２５０．１、ＡＰＧ０６８７７．１、ＡＰＧ０９０５３．１、ＡＰＧ０４２９３．１、ＡＰＧ０１３０８．１、ＡＰＧ０６６４６．１、ＡＰＧ０９７４８、ＡＰＧ０７４３３．１、ＡＰＧ００９６９、ＡＰＧ０３１２８、ＡＰＧ０９７４８、ＡＰＧ００７７１、ＡＰＧ０２７８９、ＡＰＧ０９１０６、ＡＰＧ０２３１２、ＡＰＧ０７３８６、ＡＰＧ０９９８０、ＡＰＧ０５８４０、ＡＰＧ０５２４１、ＡＰＧ０７２８０、ＡＰＧ０９８６６、及びＡＰＧ００８６８のうちのいずれか１つから選択される。

【0049】

[0049] 一部の実施形態において、本方法は、ガイドＲＮＡ、又はそれをコードする核酸に細胞を接触させることを更に含む。

【0050】

[0050] 一部の実施形態において、細胞は、酵素又はそれをコードする核酸に接触する前に環状ＲＮＡに接触する。一部の実施形態において、細胞は、酵素又はそれをコードする核酸に接触した後に組換え環状ＲＮＡに接触する。一部の実施形態において、細胞は、細胞のＤＮＡ又はＲＮＡの編集能を有する酵素、又はそれをコードする核酸、及びガイドＲＮＡ、又はそれをコードする核酸に接触する。一部の実施形態において、酵素は細胞のＤＮＡの編集能を有し、ここで酵素とガイドＲＮＡとは、細胞との接触前にリボ核タンパク質として複合体化する。一部の実施形態において、細胞の接触は、エレクトロポレーションにより実施される。

【0051】

[0051] 一部の実施形態において、本開示は、本明細書に記載される方法により生成された細胞を提供する。

【0052】

[0052] 一部の実施形態において、本開示は、細胞の再プログラム化方法であって、Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８、及びｃ－Ｍｙｃからなる６つの再プログラム化因子をコードする１つ以上の環状ＲＮＡに細胞を接触させることを含む方法を提供する。一部の実施形態において、本方法は、Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８、及びｃ－Ｍｙｃからなる群からの再プログラム化因子を各々がコードする６つの環状ＲＮＡに細胞を接触させることを含む。

【0053】

[0053] 一部の実施形態において、環状ＲＮＡ又は線状ＲＮＡのいずれか１つは、脂質ナノ粒子にコンジュゲートされる。一部の実施形態において、細胞は、Ｅ３、Ｋ３、Ｂ１８Ｒ、又は１つ以上のマイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）から選択される１つ以上の因子に接触しない。

【0054】

[0054] 一部の実施形態において、本開示は、再プログラム化因子をコードする１つ以上の環状ＲＮＡを含む単離された体細胞を含む組成物を提供し、ここで再プログラム化因子は、Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８、及びｃ－Ｍｙｃからなる群から選択される。

【0055】

[0055] 一部の実施形態において、体細胞は１つ以上の環状ＲＮＡを含み、ここで１つ以上の環状ＲＮＡは、各々、Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８、及びｃ－Ｍｙｃから選択される再プログラム化因子をコードする。一部の実施形態において、体細胞は６つの環状ＲＮＡを含み、ここで各環状ＲＮＡは、Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８、及びｃ－Ｍｙｃのうちの１つをコードする。一部の実施形態において、体細胞は５つの環状ＲＮＡを含み、ここで各環状ＲＮＡは、Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、及びＬｉｎ２８のうちの１つをコードする。一部の実施形態において、体細胞は４つの環状ＲＮＡを含み、ここで各環状ＲＮＡは、Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、及びｃ－Ｍｙｃのうちの１つをコードする。一部の実施形態において、体細胞は３つの環状ＲＮＡを含み、ここで各環状ＲＮＡは、Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、及びＳｏｘ２のうちの１つをコードする。

【0056】

[0056] 一部の実施形態において、本開示は、１つ以上のＣＤ３４＋細胞を含む浮遊培養液を提供し、ここでＣＤ３４＋細胞は、再プログラム化因子をコードする１つ以上のｃｉｒｃＲＮＡを含む。一部の実施形態において、ＣＤ３４＋細胞は、Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８、及びｃ－Ｍｙｃからなる群から選択される１つの再プログラム化因子を各々がコードする６つのｃｉｒｃＲＮＡを含む。一部の実施形態において、ＣＤ３４＋細胞は、Ｅ３、Ｋ３、Ｂ１８Ｒ、又はマイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）から選択される補助的因子をコードする外因性（exogneous）核酸を含まない。

【0057】

[0057] 一部の実施形態において、環状ＲＮＡは、細胞にとって外因性である。

【0058】

[0058] 一部の実施形態において、本開示は、Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８、及びｃ－Ｍｙｃからなる再プログラム化因子をコードする１つ以上の環状ＲＮＡを含む組成物を提供する。一部の実施形態において、本開示は、Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８、及びｃ－Ｍｙｃからなる再プログラム化因子をコードする２つ以上の環状ＲＮＡを含む組成物を提供する。一部の実施形態において、本開示は、Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８、及びｃ－Ｍｙｃからなる再プログラム化因子のうちの１つを各々がコードする６つの環状ＲＮＡを含む組成物を提供する。一部の実施形態において、本開示は、Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、及びＬｉｎ２８からなる再プログラム化因子のうちの１つを各々がコードする５つの環状ＲＮＡを含む組成物を提供する。一部の実施形態において、本開示は、Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、及びｃ－Ｍｙｃからなる再プログラム化因子のうちの１つを各々がコードする４つの環状ＲＮＡを含む組成物を提供する。一部の実施形態において、本開示は、Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、及びＳｏｘ２からなる再プログラム化因子のうちの１つを各々がコードする３つの環状ＲＮＡを含む組成物を提供する。

【0059】

[0059] 一部の実施形態において、本開示は、本明細書に記載される組成物を含むキットを提供する。一部の実施形態において、本開示は、本明細書に記載される組成物を含む細胞を提供する。一部の実施形態において、細胞は、真核細胞である。一部の実施形態において、細胞は、哺乳類細胞である。一部の実施形態において、細胞は、ヒト細胞である。一部の実施形態において、細胞は、ＣＤ３４＋細胞、Ｔ細胞、又はＮＫ細胞である。

【0060】

[0060] 一部の実施形態において、本開示は、Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８、及びｃ－Ｍｙｃ、又はＬ－Ｍｙｃのいずれか一方から選択される１つ以上の再プログラム化因子をコードする１つ以上の環状ＲＮＡを含むＣＤ３４＋細胞を提供する。一部の実施形態において、再プログラム化因子は、Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８、及びｃ－Ｍｙｃの６つ全てからなる。一部の実施形態において、再プログラム化因子は、Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８、及びＬ－Ｍｙｃの６つ全てからなる。一部の実施形態において、再プログラム化因子は、Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、及びＬｉｎ２８からなる。一部の実施形態において、再プログラム化因子は、Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、及びｃ－Ｍｙｃからなる。一部の実施形態において、再プログラム化因子は、Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、及びＳｏｘ２からなる。一部の実施形態において、細胞は、ＳＳＥＡ－３、ＳＳＥＡ－４、ＴＲＡ－１－６０、ＴＲＡ－１－８１、ＴＲＡ－２－４９／６Ｅ、アルカリホスファターゼ、Ｓｏｘ２、Ｅ－カドヘリン、ＵＴＦ－１、Ｏｃｔ４、Ｒｅｘ１、Ｎａｎｏｇ、又はこれらの組み合わせから選択される少なくとも１つのステムネスマーカーを呈する。一部の実施形態において、１つ以上の環状ＲＮＡは、細胞にとって外因性である。

【0061】

[0061] 一部の実施形態において、ＣＤ３４＋は、１つ以上の遺伝子修飾を更に含む。一部の実施形態において、１つ以上の遺伝子修飾は遺伝子ノックアウトを含む。一部の実施形態において、１つ以上の遺伝子修飾は遺伝子ノックインを含む。

【0062】

[0062] 一部の実施形態において、本開示は、本明細書に記載されるＣＤ３４＋細胞から誘導された人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を提供する。一部の実施形態において、細胞は低免疫原性である。

【0063】

[0063] 一部の実施形態において、本開示は、本明細書に記載されるｉＰＳＣから生成された分化細胞を提供する。

【0064】

[0064] 一部の実施形態において、本開示は、疾患又は病態を治療する方法であって、それを必要としている対象に本明細書に記載されるｉＰＳＣ又は分化細胞を投与することを含む方法を提供する。

【0065】

[0065] 一部の実施形態において、本開示は、体細胞を分化転換させる方法であって、１つ以上の外因性環状ＲＮＡに細胞を接触させることを含む方法を提供する。一部の実施形態において、本開示は、本明細書に記載される方法によって作製される分化転換細胞を提供する。

【0066】

[0066] 一部の実施形態において、本開示は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）から細胞を分化させる方法であって、１つ以上の環状ＲＮＡにｉＰＳＣを接触させることを含む方法を提供する。一部の実施形態において、本開示は、本明細書に記載される方法によって作製される分化細胞を提供する。

【0067】

[0067] 本発明の他の目的、利点及び特徴は、以下の明細書から明らかになるであろう。

【0068】

図面の簡単な説明
[0068] 本特許又は出願ファイルは、カラーで作成された少なくとも１つの図面を含んでいる。本特許又は特許出願公報のカラー図面による写しは、請求に応じて、必要な手数料が支払われた場合に、当局により提供されることになる。

【図面の簡単な説明】

【0069】

【図1】[0069]化学合成又はインビトロ転写（ＩＶＴ）を用いて生成した線状ＲＮＡを環状化することによる環状ＲＮＡの生成の例示的プロトコルを示す概略図である。初めに、線状ＲＮＡを調製する。次に、フランキング配列に特異的なプライマーを使用して増幅することにより、線状ＲＮＡの５’末端をリン酸化する。続いてＴ４ ＲＮＡリガーゼを使用して５’末端と３’末端とをライゲートする。環状ＲＮＡを精製するか、又は線状副産物を酵素で変性させる。次に環状ＲＮＡを細胞に接触させてもよく（例えば、それにトランスフェクトしてもよく）、及び／又は脂質ナノ粒子にコンジュゲートしてもよい。

【図2A】[0070]図２Ａ～図２Ｇは、線状ＲＮＡを環状化する例示的方法を示す概略図である。これには、５’リン酸と３’－ＯＨ末端の酵素的ライゲーション（図２Ａ）；

【図2B】[0070]リン酸とＯＨ末端の化学的ライゲーション（５’又は３’末端をリン酸化してもよい）（図２Ｂ）；

【図2C】[0070]３’チオホスフェートとトシル化した５’末端の化学的ライゲーション（図２Ｃ）；

【図2D】[0070]３’－チオホスフェートとヨウ化した５’末端の化学的ライゲーション（図２Ｄ）；

【図2E】[0070]３’－アルデヒドと５０オキソアミンの化学的ライゲーション（オキシム環状化）（図２Ｅ）；

【図2F】[0070]５’－又は３’－アジドと３’－又は５’－アルキンの化学的ライゲーション（クリック環状化）（図２Ｆ）；

【図2G】[0070]金属キレート化による環状化（Ｍ＝Ｚｎ^２＋又はＦｅ^２＋、（＝テルピリジン））（図２Ｇ）が含まれる。

【図3】[0071]線状ＲＮＡを環状化する例示的方法を示す概略図である。図示されるイントロン－エクソンコンストラクトでは、リボザイムの折り畳みに決定的に重要な構造エレメントを保存するようにしてＴ４ファージＴｄ遺伝子のグループＩ触媒イントロンを２つに分ける。次にエクソン断片２（Ｅ２）をエクソン断片１（Ｅ１）の上流にライゲートし、エクソン－エクソンジャンクションの間におよそ１．１ｋｂ長のコード領域を挿入する。スプライシングの間に、グアノシンヌクレオチドの３’ヒドロキシル基がエステル転移反応で５’スプライス部位に会合する結果、介在領域が環状化し、３’イントロンが切り出されることになる。

【図4】[0072]浮遊状態のＣＤ３４＋細胞の再プログラム化についてのタイムライン及びプロセスのスキームを提供する。

【図5】[0073]ＣＤ３４＋細胞再プログラム化の間におけるｉＰＳＣコロニー形成の代表的な画像を提供する。

【図6A】[0074]図６Ａ～図６Ｃは、様々な量のＣ１４再プログラム化カクテルで再プログラム化した後のＴｒａ－１－８１＋及びＯｃｔ４＋細胞の免疫蛍光画像を提供する。図６Ａは、０及び２日目にトランスフェクトした５．２ｐｇのＣ１４カクテルで浮遊状態のＣＤ３４＋細胞を処理することにより作り出されたｉＰＳＣの画像を提供する。

【図6B】[0074]図６Ｂは、０日目及び２日目にトランスフェクトした１３ｐｇのＣ１４カクテルで浮遊状態のＣＤ３４＋細胞を処理することにより作り出されたｉＰＳＣの画像を提供する。

【図6C】[0074]図６Ｃは、０日目、１日目、２日目、及び３日目にトランスフェクトした５．２ｐｇのＣ１４カクテルで浮遊状態のＣＤ３４＋細胞を処理することにより作り出されたｉＰＳＣの画像を提供する。

【図7】[0075]ｃｉｒｃＲＮＡによる再プログラム化ｉＰＳＣクローンの継代１代目の代表的な位相差画像を提供する。

【図8】[0076]１ステップ編集及び再プログラム化同時プロトコルのＴｒａ－１－８１＋及びＯｃｔ４＋染色結果を示す。

【図9】[0077]１ステップ同時再プログラム化及び編集プロトコルから誘導されたｉＰＳＣクローンの代表的な位相差画像を提供する。

【図10】[0078]２ステップ編集及び再プログラム化プロトコルのＴｒａ－１－８１＋及びＯｃｔ４＋染色結果を示す。

【図11】[0079]浮遊状態のＣＤ３４＋細胞の再プログラム化についてのタイムライン及び実験計画のスキームを提供する。

【図12A】[0080]Ｃ１４（図１２Ａ）ｃｉｒｃＲＮＡカクテルを使用したＣＤ３４＋細胞再プログラム化の形態学的進行を示す位相差画像を提供する。

【図12B】[0080]Ｃ６（図１２Ｂ）ｃｉｒｃＲＮＡカクテルを使用したＣＤ３４＋細胞再プログラム化の形態学的進行を示す位相差画像を提供する。

【図12C】[0080]Ｃ１１（図１２Ｃ）ｃｉｒｃＲＮＡカクテルを使用したＣＤ３４＋細胞再プログラム化の形態学的進行を示す位相差画像を提供する。

【図13A】[0081]図１３Ａ～図１３Ｂは、ＣＤ３４＋細胞再プログラム化の結果を示す。図１３Ａは、様々なプレーティング密度でのｉＰＳＣ様コロニーのプレートの代表的な画像を提供する。

【図13B】[0081]図１３Ｂは、異なるｃｉｒｃＲＮＡカクテルによる再プログラム化中、初期（８日目～１０日目）に観察される再プログラム化効率の比較を提供する。

【図14】[0082]ＣＤ３４＋細胞のエレクトロポレーションプロトコルを最適化するための実験計画のスキームを提供する。

【図15】[0083]IncuCyteイメージングにより決定したときのエレクトロポレーション後のｎＧＦＰタンパク質発現の動態を示す。

【図16】[0084]エレクトロポレーションによる初回トランスフェクション翌日のｎＧＦＰタンパク質レベルのフローサイトメトリー分析を例証する。

【図17】[0085]IncuCyteにより分析したときのRNAiMAX（５０ｎｇ／２４ウェル）によるＲＮＡトランスフェクション後の線維芽細胞（ＨＤＦ）におけるｎＧＦＰタンパク質発現の結果を提供する。

【図18】[0086]IncuCyteにより分析したときのNeon（登録商標）（２５０ｎｇ／６ウェル）を使用した浮遊培養細胞のＲＮＡトランスフェクション後のＣＤ３４＋細胞におけるｎＧＦＰタンパク質発現の結果を提供する。

【図19】[0087]浮遊状態のＣＤ３４＋細胞の再プログラム化についての再プログラム化因子数の減少を評価するための実験計画のスキームを提供する。

【図20A】[0088]図２０Ａ～図２０Ｂは、再プログラム化カクテルＣ６、Ｃ５、Ｃ４、及びＣ３で生成したｉＰＳＣクローンの位相差画像を示す。図２０Ａは、再プログラム化カクテルＣ６、Ｃ５、Ｃ４、及びＣ３での時間の経過に伴う形態学的進行を例証するｉＰＳＣクローンの位相差画像を示す。

【図20B】[0088]図２０Ｂは、Ｃ６、Ｃ５、Ｃ４、及びＣ３再プログラム化カクテルによる１４日目のｉＰＳＣ形態の比較を示す。

【図21】[0089]２つの異なる濃度のＣ６カクテルで再プログラム化したｉＰＳＣクローンの位相差画像を示す。

【図22】[0090]Ｓ６又はＬ６再プログラム化カクテルの２回のトランスフェクションによる再プログラム化後にｉＰＳＣクローン形成がないことを実証する位相差画像を示す。

【図23】[0091]１４日目にＳ６又はＬ６再プログラム化カクテルでｉＰＳＣクローン形成がないことと比較した、Ｃ６再プログラム化カクテルで再プログラム化したｉＰＳＣクローンの位相差画像を示す。

【図24A】[0092]図２４Ａ～図２４Ｂは、異なる再プログラム化カクテル及びその濃度で実現した再プログラム化効率を示す。図２４Ａは、様々な再プログラム化カクテルで観察されるＣＤ３４＋細胞についての再プログラム化効率を提供する。

【図24B】[0092]図２４Ｂは、様々な濃度のＣ６再プログラム化カクテルで観察されるＣＤ３４＋細胞についての再プログラム化効率を提供する。

【図25】[0093]様々な濃度のＣ６カクテルによるトランスフェクション後の多能性マーカーＴｒａ－１－８１（緑色）及びＯＣＴ４（赤色）に関する染色を示す。

【図26】[0094]Ｃ３、Ｃ４、又はＣ５カクテルによるトランスフェクション後の多能性マーカーＴｒａ－１－８１（緑色）及びＯＣＴ４（赤色）に関する染色を示す。

【図27】[0095]２０代まで細胞継代した長期インビトロ培養条件におけるｃｉｒｃ－ＲＮＡによる再プログラム化ｉＰＳＣを特徴付けるための実験計画の概略図を提供する。

【図28A】[0096]図２８Ａ～図２８Ｂは、再プログラム化カクテルＣ１４、Ｃ６、Ｃ４、及びＣ３で生成したｉＰＳＣクローンの位相差画像を示す。図２８Ａは、再プログラム化カクテルＣ１４、Ｃ６、及びＣ４での細胞継代１０、１５、及び２０代目における混合ドナーＣＤ３４＋細胞から誘導されたｉＰＳＣクローンの形態を例証する位相差画像を示す。

【図28B】[0096]図２８Ｂは、再プログラム化カクテルＣ６、Ｃ４、及びＣ３での細胞継代１０、１５、及び２０代目における単一ドナーＣＤ３４＋細胞から誘導されたｉＰＳＣクローンの形態を例証する位相差画像を示す。

【図29A】[0097]図２９Ａ～図２９Ｂは、Incucyteにより分析したときの再プログラム化カクテルＣ１４、Ｃ６、Ｃ４及びＣ３で臍帯血ＣＤ３４＋細胞から誘導したｉＰＳＣの生存率の結果を提供する。図２９Ａは、Incucyteにより分析したときの、再プログラム化カクテルＣ１４、Ｃ６、及びＣ４で混合ドナー臍帯血ＣＤ３４＋細胞から誘導したｉＰＳＣの４～２０代にわたる細胞継代各回の生存率の結果を提供する。

【図29B】[0097]図２９Ｂは、Incucyteにより分析したときの、再プログラム化カクテルＣ６、Ｃ４、及びＣ３で単一ドナー臍帯血ＣＤ３４＋細胞から誘導したｉＰＳＣの４～１８代にわたる細胞継代各回の生存率の結果を提供する。

【図30A】[0098]図３０Ａ～図３０Ｂは、Incucyteにより分析したときの再プログラム化カクテルＣ１４、Ｃ６、Ｃ４及びＣ３で臍帯血ＣＤ３４＋細胞から誘導したｉＰＳＣの集団倍加時間の結果を提供する。図３０Ａは、Incucyteにより分析したときの、再プログラム化カクテルＣ１４、Ｃ６、及びＣ４で混合ドナー臍帯血ＣＤ３４＋細胞から誘導したｉＰＳＣの５～２０代にわたる細胞継代各回の集団倍加時間の結果を提供する。

【図30B】[0098]図３０Ｂは、Incucyteにより分析したときの、再プログラム化カクテルＣ６、Ｃ４、及びＣ３で単一ドナー臍帯血ＣＤ３４＋細胞から誘導したｉＰＳＣの４～２０代にわたる細胞継代各回の集団倍加時間の結果を提供する。

【図31A】[0099]図３１Ａ～図３１Ｂは、Incucyteにより分析したときの再プログラム化カクテルＣ１４、Ｃ６、Ｃ４及びＣ３で臍帯血ＣＤ３４＋細胞から誘導したｉＰＳＣの累積集団倍化数の結果を提供する。図３１Ａは、Incucyteにより分析したときの、再プログラム化カクテルＣ１４、Ｃ６、及びＣ４で混合ドナー臍帯血ＣＤ３４＋細胞から誘導したｉＰＳＣの開始時細胞継代５～８代目から細胞継代２０代目までの累積集団倍化数の結果を提供する。

【図31B】[0099]図３１Ｂは、Incucyteにより分析したときの、再プログラム化カクテルＣ６、Ｃ４、及びＣ３で単一ドナー臍帯血ＣＤ３４＋細胞から誘導したｉＰＳＣの４～２０代にわたる細胞継代各回の累積集団倍化数の結果を提供する。

【図32】[0100]Ｃ１４、Ｃ６、Ｃ４又はＣ３カクテルで再プログラム化した後の、内胚葉についてはマーカーＳＯＸ１７及びＦＯＸＡ２、中胚葉についてはＴ（ブラキュリ）及びＦＯＸＡ２並びに外胚葉についてはＰＡＸ６に関するＤＡＰＩを対比染色とした３つの一次胚葉細胞層の染色の例示的な蛍光画像を示す。

【発明を実施するための形態】

【0070】

詳細な説明
概要
[0101] 本開示は、細胞の再プログラム化のための組成物及び方法であって、１つ以上の再プログラム化因子をコードする環状ＲＮＡポリヌクレオチド（ｃｉｒｃＲＮＡ）に細胞を接触させることを含む方法を提供する。様々な実施形態において、本明細書に開示される方法は、意外にも、少ないトランスフェクション回数及び最小限の再プログラム化因子の使用で再プログラム化が起こることを可能にする効率的な再プログラム化を提供する。重要なことに、本開示の方法のこうした特徴により、血液細胞（例えば、ＣＤ３４＋細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、末梢血単核球、臍帯血単核球）を含め、トランスフェクションが困難な細胞を浮遊培養液中で直接再プログラム化することが可能になる。血液細胞はトランスフェクション抵抗性であることが公知であるため、これは再プログラム化技術における大きな進歩である。Warren et al., Molecular Therapy. 2019;27(4):729-734を参照のこと。本明細書に示されるとおり、線維芽細胞のようによりロバストな細胞型をトランスフェクトするために先行技術で利用されている苛酷な方法は、ＣＤ３４＋細胞の再プログラム化における使用には好適でない。更に、本明細書に開示される方法は、線状ＲＮＡ種には機能しない－むしろ本発明者らは、意外にも、ｃｉｒｃＲＮＡがこうした感受性のある細胞を独特に再プログラム化可能であることを実証する。本開示は、細胞の再プログラム化及び編集を同時に行うための方法及び組成物であって、（ｉ）１つ以上の再プログラム化因子をコードするｃｉｒｃＲＮＡ；（ｉｉ）細胞のＤＮＡ又はＲＮＡの編集能を有する酵素；及び（ｉｉｉ）任意選択でガイドＲＮＡポリヌクレオチドに細胞を接触させることを含む方法及び組成物を更に提供する。かかる同時の再プログラム化及び編集を用いると、血液由来細胞（例えば、ＣＤ３４＋細胞）を環状ＲＮＡを使用して浮遊培養液中で直接再プログラム化及び編集し得る。

【0071】

[0102] 本明細書に記載されるｃｉｒｃＲＮＡポリヌクレオチドを利用する再プログラム化方法は、現在当該技術分野において公知の再プログラム化方法に優る利点を提供する。本明細書において実証されるとおり、再プログラム化因子をコードするｃｉｒｃＲＮＡを使用すると、予想外にも、細胞の再プログラム化に必要な外因性因子の総数が減少する。例えば、本明細書に記載される方法は、再プログラム化因子Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、ｃＭｙｃ、Ｎａｎｏｇ、及びＬｉｎ２８をコードするｃｉｒｃＲＮＡに細胞を接触させることにより細胞再プログラム化を実現し、Ｅ３、Ｋ３、及びＢ１８Ｒを含めたウイルスタンパク質（Kogut et al., Nat Commun 9, 745 (2018). https://doi.org/10.1038/s41467-018-03190-3；Poleganov et al., Hum Gene Ther. 2015 Nov;26(11):751-66. doi: 10.1089/hum.2015.045）及び／又はｍｉＲ３０２（Ying et al. Methods Mol Biol. 2018;1733:283-304. doi: 10.1007/978-1-4939-7601-0_23を参照のこと）及びｍｉＲ３６７（Anokye-Danso et al. Cell Stem Cell. 2011;8:376-388；Kogut et al., Nat Commun 9, 745 (2018)を参照のこと）を含めた外因性ｍｉＲＮＡなど、追加の補助的因子は必要ない。本明細書に開示される再プログラム化方法は、補助的因子を必要としないものであり、必要な試薬の数が減少することによりｉＰＳＣの製造コストが低下するのみならず、こうした補助的因子の導入が及ぼす可能性のある望ましくない効果が回避されることにより、生成されるｉＰＳＣの安全性もまた向上する（例えば、ある種のマイクロＲＮＡの発現及び腫瘍発生におけるその関与について記載するVentura and Jacks, MicroRNAs and cancer: short RNAs go a long way. Cell 2009; 586-91；及び白血病細胞株におけるｍｉＲ３０２／３６７クラスターの過剰発現について記載するYu et al. Human microRNA clusters: genomic organization and expression profile in leukemia cell lines. Biochem Biophys Res Commun 2006; 349:59-68を参照のこと）。

【0072】

[0103] 更には、本開示は、これまでに記載されているものと比べて減少した数の再プログラム化因子の数を使用した浮遊状態のＣＤ３４＋細胞の再プログラム化の成功について記載する。例えば、本開示は、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、及びＫｌｆ４による（Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８Ａ又はＬＩＮ２８Ｂ、及び／又はｃ－Ｍｙｃのない）、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、及びｃＭｙｃによる（Ｎａｎｏｇ又はＬｉｎ２８Ａ又はＬｉｎ２８Ｂのない）、及びＯｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、Ｎａｎｏｇ、及びＬｉｎ２８Ａ又はＬＩＮ２８Ｂによる（ｃ－Ｍｙｃのない）再プログラム化の成功を実証する。必要となる補助的因子の数の減少に加えて、本開示は、ＣＤ３４＋細胞を含めた血液細胞の浮遊状態での再プログラム化を成功させるために必要なトランスフェクション回数の減少について記載する。これらの改良点の各々により、再プログラム化のための製造プロセスの実現可能性及び成功率が亢進し、重要なことには、出発細胞集団にかかるストレスが減少する。

【0073】

[0104] 更には、本明細書に記載される組成物及び方法によれば、ウイルス又は組込みプラスミドを使用する必要なしに、浮遊状態の細胞の「フットプリントフリーな」再プログラム化が可能となる。このように、本明細書に記載される組成物及び方法によれば、当該技術分野で利用可能なものと比べてより容易な安全ｉＰＳＣ技術の製造が可能となる。これまでに記載されている再プログラム化方法は、ウイルスベクター又はＤＮＡプラスミドを利用して必要なトランス遺伝子を血液細胞に送達する。こうしたウイルスは、細胞に残り続けるか、又はゲノムに組み込まれるかのいずれかであり、従って安全性への懸念から、その臨床使用は限られている。ＤＮＡプラスミドもまたゲノムに組み込まれ得るため、製造不良が数多く起こり得る。ＲＮＡを送達すれば、細胞の「フットプリントフリーな」再プログラム化の可能性が開かれるが、これまでに記載されているＲＮＡを利用する方法は、浮遊細胞では不成功に終わっている。詳細には、血液細胞はカチオン性試薬によるトランスフェクションに抵抗性である傾向があり、これがＲＮＡポリヌクレオチドによるその再プログラム化の重大な障害を成し、ここでは典型的には、ＲＮＡがコードするトランス遺伝子の発現を持続させるため、培養物を複数回トランスフェクトする必要がある（Chong, Yeap and Ho, Transfection types, methods and strategies: a technical review (2021) PeerJ 9:e11165）。エレクトロポレーションは、血液細胞への効率的なｍＲＮＡ送達を実現することができるが、ＲＮＡポリヌクレオチドを繰り返し投与する必要があるときには、この手順の苛酷さが同様の困難を引き起こす。

【0074】

[0105] 最近になって、末梢血ＣＤ３４＋細胞から分化させることのできる内皮前駆細胞のｍＲＮＡ再プログラム化が報告されているが、これは２～４週間の接着細胞培養での分化過程及び再プログラム化を必要とする。従って、真の血液系統で機能するＲＮＡベースの再プログラム化プロトコルがなおも必要とされており、しかし未だ対処されていない。

【0075】

[0106] 本開示は、浮遊状態の血液細胞（例えば、ＣＤ３４＋細胞）の再プログラム化を例示する。浮遊培養液中での再プログラム化は、当該技術分野において公知の接着培養方法に優る多くの利点を提供する。例えば、浮遊状態で成長させることのできる細胞は、調達が容易である。臍帯血バンクを含め、特定のハプロタイプ、血液型、年齢等を利用可能な血液バンクは数多くある。更に、本明細書に記載される方法によれば、接着培養で成長させることが必要な生検試料から入手される細胞に頼るのでなく、患者採血から直接入手した細胞の再プログラム化が可能となる。そのため、より広範囲のドナーから細胞を調達できると見込まれ、幅広い健常ドナーの選択が可能となり、既存のゲノム異常がある出発細胞型（例えば皮膚線維芽細胞）が使用される可能性が最小限となる。更には、高齢者からの線維芽細胞は再プログラム化が難しいことが示されている（Narayan et al. OCT4 and SOX2 Work as Transcriptional Activators in Reprogramming Human Fibroblasts. Cell Rep. 2017;20(7):1585-1596. doi:10.1016/j.celrep.2017.07.071）；しかしながら、そのような年齢と血液細胞の再プログラム化との相関は見出されていない（Hokayem et al. Blood Derived Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs): Benefits, Challenges and the Road Ahead. J Alzheimers Dis Parkinsonism. 2016 Oct;6(5):275. doi: 10.4172/2161-0460.1000275. Epub 2016 Oct 25）。採血から直接供給材料を入手すると、時間、試薬コスト、患者に対する侵襲性もまた減少し、再プログラム化されたｉＰＳＣの入手に成功するために出発材料が受けなければならない操作の程度も減少する。例えば、多くの接着細胞型（例えば、線維芽細胞、角化細胞、内皮前駆細胞）は、再プログラム化前に特徴付けて、インビトロで数代の継代にわたり拡大培養しなければならない。

【0076】

[0107] 更には、本開示の方法によれば、ｃｉｒｃＲＮＡで再プログラム化されたｉＰＳＣの長期繁殖が可能となる（実施例７及び８を参照のこと）。本開示の方法により生成されたｉＰＳＣは、その形態が安定していて、生存し続け、一定の速度で細胞分裂を起こし、複数回の細胞継代後にも、及び長期細胞培養条件下でも、ＥＳＣと緊密に類似する細胞アイデンティティを維持している（実施例７を参照のこと）。これらのｉＰＳＣはまた、遺伝的にも及び後成的にも安定性したままである（実施例８を参照のこと）。

【0077】

[0108] 特に定義しない限り、本明細書で使用される全ての科学技術用語は、本開示が属する技術分野の当業者が一般に理解するのと同じ意味を有する。本明細書における詳細な説明で使用される用語は、詳細な実施形態を説明することを目的としているに過ぎず、限定するように意図するものではない。

【0078】

[0109] 文脈上特に指示がない限り、本明細書に記載される様々な特徴を任意の組み合わせで使用できることが具体的に意図される。その上、一部の実施形態において、本明細書に示される任意の特徴又は特徴の組み合わせを除外し、又は省くことができる。更に例示すれば、例えば、ある特定のアミノ酸がＡ、Ｇ、Ｉ、Ｌ及び／又はＶであり得ると本明細書に指示される場合、その文言はまた、そのアミノ酸がこれらの１つ又は複数のアミノ酸のいずれか部分的な一組、例えばＡ、Ｇ、Ｉ又はＬ；Ａ、Ｇ、Ｉ又はＶ；Ａ又はＧ；Ｌのみ等であり得ることも、かかる部分的な組み合わせの各々が本明細書に明示的に示されたものとして指示している。その上、かかる文言はまた、指定されるアミノ酸の１つ以上がディスクレームされ得ることも指示している。例えば、一部の実施形態においてアミノ酸はＡ、Ｇ又はＩでない；Ａでない；Ｇ又はＶでない等であり、かかる可能なディスクレーマーの各々が本明細書に明示的に示されたものとする。

【0079】

[0110] 本明細書において言及される全ての刊行物、特許出願、特許、GenBank又は他の受託番号及び他の参考文献は、あらゆる目的から全体として参照により援用される。

【0080】

一般的方法
[0111] 本発明の実施には、特に指示されない限り、細胞培養、分子生物学（組換え技法を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学及び免疫学の従来技法が用いられることになり、それらは当業者の技能の範囲内にある。かかる技法については、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, third edition (Sambrook et al., 2001) Cold Spring Harbor Press；Oligonucleotide Synthesis (P. Herdewijn, ed., 2004)；Animal Cell Culture (R. I. Freshney), ed., 1987)；Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.)；Handbook of Experimental Immunology (D. M. Weir & C. C. Blackwell, eds.)；Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J. M. Miller & M. P. Calos, eds., 1987)；Current Protocols in Molecular Biology (F. M. Ausubel et al., eds., 1987)；PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al., eds., 1994)；Current Protocols in Immunology (J. E. Coligan et al., eds., 1991)；Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999)；Manual of Clinical Laboratory Immunology (B. Detrick, N. R. Rose, and J. D. Folds eds., 2006)；Immunochemical Protocols (J. Pound, ed., 2003)；Lab Manual in Biochemistry: Immunology and Biotechnology (A. Nigam and A. Ayyagari, eds. 2007)；Immunology Methods Manual: The Comprehensive Sourcebook of Techniques (Ivan Lefkovits, ed., 1996)；Using Antibodies: A Laboratory Manual (E. Harlow and D. Lane, eds.,1988)などの文献に十分に説明されている。

【0081】

定義
[0112] 本明細書及び添付の特許請求の範囲における説明には、以下の用語を使用する。

【0082】

[0113] 単数形「ある（a）」、「ある（an）」、及び「その（the）」には、文脈上特に明確に指示されない限り、複数形も同様に含まれることが意図される。

【0083】

[0114] ポリヌクレオチド又はポリペプチドの長さ、用量、時間、温度などの量など、測定可能な値に言及するときに本明細書で使用されるとおりの用語「約」は、指定される量から±２０％、±１０％、±５％、±１％、±０．５％、又は更には±０．１％の変動を包含することが意味される。

【0084】

[0115] 本明細書で使用されるとき、「及び／又は」は、関連する列挙されている項目のうちの１つ以上の任意の可能なあらゆる組み合わせ、並びに別様に解釈されるときには組み合わせの欠如（「又は」）を指し、及びそれを包含する。

【0085】

[0116] 本明細書で使用されるとき、「環状ＲＮＡ」又は「ｃｉｒｃＲＮＡ」は、より良く知られている線状ＲＮＡと異なり、共有結合的に閉じた連続ループを形成するある種の一本鎖ＲＮＡを指す。本明細書では、任意のタンパク質名の前に「ｃｉｒｃ」が付くと、それはその遺伝子をコードする環状ＲＮＡを指す。ＲＮＡは、細胞において、細胞性スプライシング機構により環状化されてもよい。例えば、環状ＲＮＡは、プレｍＲＮＡスプライシング機構が「バックスプライシング」によりスプライスドナーを上流のスプライスアクセプターにつなぎ合わせ、それによって共有結合的に連結された末端を有する環状ＲＮＡが作製されることにより生成されてもよい。或いは、環状ＲＮＡは、インビトロで、例えば、インビトロ転写（ＩＶＴ）によって産生された線状ＲＮＡの環状化により生成されてもよい。インビトロＲＮＡ環状化のための一般的な戦略は３つある：臭化シアン又は同様の縮合剤を使用した化学的方法、ＲＮＡ又はＤＮＡリガーゼ（例えば、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼＩ又はＩＩ）を使用した酵素的方法、及び自己スプライシング型イントロンを使用したリボザイム方法。グループＩ触媒性イントロンの入れ替えを利用するリボザイム方法は、長鎖ＲＮＡの環状化に適用可能であり、補因子としてＧＴＰ及びＭｇ^２＋を加えるだけで十分である。このイントロン入れ替え－エクソン（permuted intron-exon：ＰＩＥ）スプライシング戦略は、半分のイントロン配列が隣接した部分的エクソンが融合したものからなる。インビトロでは、これらのコンストラクトは、グループＩ触媒性イントロンに特徴的な二重エステル転移反応を起こすが、エクソンが既に融合しているため、それらは、共有結合的に５’から３’に連結された環として切り出される（図３を参照のこと）。線状ＲＮＡを環状化する実例的なプロトコルを図１に提供し、実例的な線状ＲＮＡ環状化戦略の一覧を図２Ａ～図２Ｇに提供する。

【0086】

[0117] 用語「線状ＲＮＡ」及び「線状ｍＲＮＡ」は、文脈に基づけば当業者には明らかであろうとおり、本明細書では同義的に使用される。

【0087】

[0118] 本明細書で使用されるとき、「多能性」は、様々な異なる条件下で、２つ以上の分化細胞型に分化する能力、及び全３つの胚葉に特徴的な細胞型に分化する能力を備えた細胞を指す。一部の実施形態において、多能性は、１つ以上の多能性幹細胞マーカーの発現がエビデンスとなり得る。

【0088】

[0119] 本明細書で使用されるとき、用語「人工多能性幹細胞」及び「ｉＰＳＣ」は、様々な分化した（即ち、複能性又は非多能性の）体細胞から生成される多能性細胞を指す。ｉＰＳＣは、遺伝学的にはそのそれぞれの元の分化した体細胞と実質的に同一であり、培養下で無限に自己再生する能力及び他の細胞型に分化する能力を含め、より高い能力の細胞、例えば胚性幹（ＥＳ）細胞などと同様の特徴を示す。一部の実施形態において、ｉＰＳＣは、ＥＳ細胞と類似した形態学的特性（即ち、円形、大きい核小体及び乏しい細胞質）及び成長特性（即ち、倍加時間）を呈する。一部の実施形態において、ｉＰＳＣは、多能性細胞特異的マーカー（例えば、Ｏｃｔ－４、ＳＳＥＡ－３、ＳＳＥＡ－４、Ｔｒａ－１－６０、Ｔｒａ－１－８１、但しＳＳＥＡ－１は除く）を発現する。

【0089】

[0120] 本明細書で使用されるとき、「分化細胞」又は「体細胞」は、その天然の形態では、本明細書においてこの用語が定義されるとおりの多能性ではない任意の細胞である。用語「体細胞」はまた、複能性（例えば、２つ以上の細胞型を作り出すことができる）であるが、しかし多能性（例えば、３胚葉全てから細胞を作り出すことができる）ではない前駆細胞も包含する。

【0090】

[0121] 用語「再プログラム化」は、本明細書で使用されるとき、体細胞、複能性細胞又は前駆細胞など、細胞の分化状態を変化させる過程を指す。一部の実施形態において、細胞の再プログラム化は、細胞を第１の細胞型から第２の細胞型へと変換することを含み得る。一部の実施形態において、再プログラム化は、分化細胞の表現型を多能性表現型へと変化させることを含み得る。一部の実施形態において、再プログラム化とは、ｉＰＳＣが分化細胞へと変換される「誘導性分化」又は「転写因子の指図による分化」の過程を指し得る。

【0091】

[0122] 本明細書で使用されるとき、用語「再プログラム化因子」は、細胞の再プログラム化を促進する任意の因子又は因子の組み合わせを指す。再プログラム化因子は、例えば、転写因子であり得る。分化細胞からｉＰＳＣを作り出すための実例的な再プログラム化因子としては、Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８（例えば、Ｌｉｎ２８Ａ又はＬｉｎ２８Ｂ）、ｃ－Ｍｙｃ、及びＬ－Ｍｙｃが挙げられる。再プログラム化された細胞を作り出すための実例的な再プログラム化因子及びそれらの組み合わせについては、表１及び表３に提供する。

【0092】

[0123] 本明細書で使用されるとき、「分化転換」は、一つの体細胞型が第２の体細胞型へと直接変換されるある種の細胞再プログラム化を指す。一部の実施形態において、分化転換は、第１の細胞型の体細胞が中間の多能性状態又は前駆細胞型を経ることなく第２の細胞型の体細胞へと変換される「直接の再プログラム化」又は「直接の細胞運命変換」を指し得る。

【0093】

[0124] 本明細書で使用されるとき、「配列内リボソーム進入部位」又は「ＩＲＥＳ」は、キャップ非依存的な翻訳の開始を可能にするＲＮＡエレメントである。ＩＲＥＳは、例えば、ウイルスＩＲＥＳ又は哺乳類ＩＲＥＳ（例えば、ヒトＩＲＥＳ）であり得る。

【0094】

[0125] 「ヌクレオチド三リン酸」又は「ＮＴＰ」は、窒素含有塩基が５炭糖（リボース又はデオキシリボースのいずれか）に結合していて、その糖に３つのリン酸基が結合しているものを含む分子である。

【0095】

[0126] 本明細書で使用されるとき、「修飾されたＮＴＰ」とは、そのＮＴＰを含む核酸に有利に働く特性を付与するため化学的に修飾されているＮＴＰである。かかる有利に働く特性としては、例えば、免疫原性の低下、安定性の増加、化学的官能性、又は結合親和性の変更を挙げることができる。

【0096】

[0127] 用語「修飾されたＲＮＡ」（例えば、「修飾された線状ＲＮＡ」又は「修飾された環状ＲＮＡ」）は、１つ以上の修飾されたＮＴＰを含むＲＮＡ分子を記載するために使用される。

【0097】

[0128] 用語「ベクター」は、核酸（即ち、ＤＮＡ又はＲＮＡ分子）用の担体を指し、核酸を細胞に導入するために使用することができる。「発現ベクター」は、タンパク質又はＲＮＡ（例えば、環状ＲＮＡ）をコードする配列及びその配列が細胞で発現するために必要な必須調節領域を含むベクターである。一部の実施形態において、タンパク質又はＲＮＡをコードする配列は、ベクター内で別の配列に作動可能に連結されている。用語「作動可能に連結されている」は、タンパク質又はＲＮＡをコードする配列が発現するために必要な調節配列が核酸分子内でタンパク質又はＲＮＡの発現のエフェクター配列に対して適切な位置に置かれていることを意味する。

【0098】

[0129] 本明細書で使用されるとき、用語「脂質ナノ粒子」及び「ＬＮＰ」は、サブミクロン範囲の脂質ベースの粒子を記載する。ＬＮＰは、リポソームの構造特性を有してもよく、及び／又は別の非二分子層型の構造を有してもよい。ＬＮＰは、核酸（例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡ分子）にコンジュゲートしてもよく、細胞への核酸の送達に使用し得る。

【0099】

[0130] 用語「バリアント」は、本明細書で使用されるとき、参照ポリヌクレオチド又はポリペプチド配列、例えば天然ポリヌクレオチド又はポリペプチド配列の突然変異体、即ち参照ポリヌクレオチド又はポリペプチド配列と１００％未満の配列同一性を有するものを指す。言い換えれば、バリアントは、参照ポリペプチド配列と比べて少なくとも１個のアミノ酸の違い（例えば、アミノ酸置換、アミノ酸挿入、アミノ酸欠失）又は参照ポリヌクレオチド、例えば天然ポリヌクレオチド又はポリペプチド配列と比べて少なくとも１個の核酸の違い（例えば、核酸置換、核酸挿入、核酸欠失）を含む。例えば、バリアントは、完全長天然ポリヌクレオチド配列と５０％又はそれ以上、６０％又はそれ以上、又は７０％又はそれ以上の配列同一性、例えば、完全長天然ポリヌクレオチド配列と７５％又は８０％又はそれ以上の同一性、８５％、９０％、又は９５％又はそれ以上など、例えば、９８％又は９９％の同一性を有するポリヌクレオチドであり得る。別の例として、バリアントは、完全長天然ポリペプチド配列と７０％又はそれ以上の配列同一性、例えば、完全長天然ポリペプチド配列と７５％又は８０％又はそれ以上の同一性、８５％、９０％、又は９５％又はそれ以上など、例えば、９８％又は９９％の同一性を有するポリペプチドであり得る。バリアントにはまた、参照配列、例えば天然配列の断片と７０％又はそれ以上の配列同一性、例えば天然配列と７５％又は８０％又はそれ以上の同一性、８５％、９０％、又は９５％又はそれ以上など、例えば、９８％又は９９％の同一性を共有する参照配列、例えば、天然配列のバリアント断片も含まれ得る。

【0100】

[0131] ２つ以上の核酸配列又はアミノ酸配列の間の配列類似性又は同一性を決定する方法は、当該技術分野において公知である。例えば、配列類似性又は同一性は、Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2, 482 (1981)の局所配列同一性アルゴリズムを使用するか、Needleman & Wunsch J Mol. Biol. 48, 443 (1970)の配列同一性アラインメントアルゴリズムによるか、Pearson & Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 2444 (1988)の類似性検索方法によるか、これらのアルゴリズムのコンピューター化された実装（Genetics Software Package、Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, WIのGAP、BESTFIT、FASTA、及びTFASTA）によるか、Devereux et al. Nucl. Acid Res. 12, 387-395 (1984)によって記載されるBest Fit配列プログラム、又は目視検査により決定し得る。

【0101】

[0132] 別の好適なアルゴリズムは、Altschul et al. J. Mol. Biol. 215, 403-410, (1990)及びKarlin et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 5873-5787 (1993)に記載されるBLASTアルゴリズムである。特に有用なBLASTプログラムは、Altschul et al. Methods in Enzymology, 266, 460-480 (1996); blast.wustl/edu/blast/README.htmlから得られたWU-BLAST-2プログラムである。WU-BLAST-2では幾つかの検索パラメータが用いられ、それらは任意選択でデフォルト値に設定される。パラメータは動的な値であり、特定の配列の組成及び目的の配列の検索が行われる特定のデータベースの組成に応じてプログラムそれ自体によって確立される；しかしながら、感度を増加させるためにこれらの値を調整してもよい。更に、追加の有用なアルゴリズムは、Altschul et al, (1997) Nucleic Acids Res. 25, 3389-3402によって報告されるとおりのギャップ付きBLASTである。特に指示されない限り、パーセント同一性は、本明細書では、インターネットアドレス：blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgiで利用可能なアルゴリズムを用いて決定する。

【0102】

環状ＲＮＡ
[0133] 本明細書には、環状ＲＮＡが提供される。詳細な実施形態において、環状ＲＮＡは、（単独で、又は他の再プログラム化因子との組み合わせで）分化細胞をｉＰＳＣに再プログラム化する能力を有する、ｉＰＳＣを分化細胞に分化させる能力を有する、及び／又はある分化細胞型を別の分化細胞型に分化させる能力を有する再プログラム化因子をコードする。

【0103】

[0134] 一部の実施形態において、環状ＲＮＡは、約２００ヌクレオチド～約５，０００ヌクレオチドを含む。一部の実施形態において、環状ＲＮＡは約２００～約１，０００ヌクレオチドを含む。一部の実施形態において、環状ＲＮＡは約１，０００ヌクレオチド～約２，５００ヌクレオチドを含む。一部の実施形態において、環状ＲＮＡは約２，５００ヌクレオチド～約５，０００ヌクレオチドを含む。一部の実施形態において、環状ＲＮＡは約５，０００ヌクレオチド超を含む。

【0104】

[0135] 一部の実施形態において、環状ＲＮＡは、１つ以上のオープンリーディングフレームを含む。一部の実施形態において、環状ＲＮＡは、１つ以上のタンパク質コード配列を含む。一部の実施形態において、環状ＲＮＡは、オープンリーディングフレーム、及び／又はタンパク質コード配列を含まない。

【0105】

[0136] 環状ＲＮＡが２つ以上のタンパク質コード核酸配列を含む実施形態において、各配列は、２Ａペプチドなど、自己切断型ペプチドをコードする配列によって分離されていてもよい。例示的な２Ａペプチドとしては、限定はされないが、ＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号１）、ＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号２）、ＱＣＴＮＹＡＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号３）、及びＶＫＱＴＬＮＦＤＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号４）が挙げられる。一部の実施形態において、各タンパク質コード核酸配列は、ＩＲＥＳによって分離されていてもよい。

【0106】

[0137] 環状ＲＮＡは、線状ｍＲＮＡの効率的な翻訳に必要な５’側の７－メチルグアノシンキャップ構造を欠いている。従って、環状ＲＮＡが翻訳されるように、リボソームを動員する代替的な機構を使用し得る。例えば、開始因子又はリボソームそれ自体に直接結合している配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）が使用されてもよい。よって、一部の実施形態において、環状ＲＮＡは、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を含む。一部の実施形態において、ＩＲＥＳは真核生物リボソームと会合する。一部の実施形態において、ＩＲＥＳは、タンパク質コード核酸配列に作動可能に連結される。

【0107】

[0138] ＩＲＥＳ配列の例としては、多種多様なウイルスに由来する配列、例えばピコルナウイルスＵＴＲ（脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）など）のリーダー配列、ポリオリーダー配列、Ａ型肝炎ウイルスリーダー、Ｃ型肝炎ウイルスＩＲＥＳ、ヒトライノウイルス２型ＩＲＥＳ、口蹄疫ウイルスのＩＲＥＳエレメント、ジアルジアウイルスＩＲＥＳなどが挙げられる。種々非ウイルス性ＩＲＥＳ配列もまた使用することができ、限定はされないが、酵母のＩＲＥＳ配列、並びにヒトアンジオテンシンＩＩ １型受容体ＩＲＥＳ、線維芽細胞成長因子ＩＲＥＳ、血管内皮成長因子ＩＲＥＳ、及びインスリン様成長因子２ ＩＲＥＳが挙げられる。本明細書に記載される環状ＲＮＡに使用するのに好適な追加のＩＲＥＳ配列としては、http://iresite.org/で利用可能なデータベースに記載されるものが挙げられる。

【0108】

[0139] 一部の実施形態において、環状ＲＮＡは、タンパク質コード配列に隣接するイントロンエレメントを含む。イントロンエレメントが細胞性スプライシング機構によるバックスプライシングを受けると、共有結合的に閉じた環状ＲＮＡが生じ得る。よって、一部の実施形態において、環状ＲＮＡは、タンパク質コード配列の５’側に位置する第１のイントロンエレメントと、タンパク質コード配列の３’側に位置する第２のイントロンエレメントとを含む。

【0109】

[0140] 一部の実施形態において、環状ＲＮＡは、線状ＲＮＡを環状化することにより生成される。一部の実施形態において、線状ＲＮＡは、例えばそれが自己スプライシング型イントロンを含む場合に自己環状化し得る。環状ＲＮＡは５’又は３’末端を有しないため、エキソヌクレアーゼ介在性の分解に抵抗性を持つことができ、細胞内で多くの線状ＲＮＡよりも安定性が高いものであり得る。

【0110】

[0141] 一部の実施形態において、イントロンエレメントは、任意の公知の１つ又は複数のイントロンエレメントから、任意の組み合わせで、及び任意の倍数及び／又は比で選択される。イントロンエレメントの例としては、circBase環状ＲＮＡデータベース（Glazar et al. RNA 20:1666-1670 (2014);及びwww.circbase.org）及びRybak-Wolf et al. Mol. Cell 58(5):870-885 (2015)（各々、全体として参照により本明細書に援用される）に記載されるものが挙げられる。一部の実施形態において、イントロンエレメントは、哺乳類イントロン又はその断片である。一部の実施形態において、イントロンエレメントは、非哺乳類イントロン（例えば、自己スプライシンググループＩイントロン、自己スプライシンググループＩＩイントロン、スプライセオソームイントロン、又はｔＲＮＡイントロン）、又はその断片である。

【0111】

[0142] 一部の実施形態において、環状ＲＮＡは、環状ＲＮＡからのタンパク質コード配列の安定性及び／又は翻訳を改善する１つ以上の追加のエレメントを含む。例えば、一部の実施形態において、環状ＲＮＡはコザック配列を含み得る。コザックコンセンサス配列の一例は、ＲＣＣ（ＡＵＧ）Ｇ（配列番号５）である（ここでは開始コドンを括弧でくくり、及び－３位の「Ｒ」はプリン（Ａ又はＧ）を表す）。コザックコンセンサス配列の別の例はＲＸＹ（ＡＵＧ）（配列番号６）である（ここでＲはプリン（Ａ又はＧ）であり、ＹはＣ又はＧのいずれかであり、及びＸは任意の塩基である）。

【0112】

[0143] 一部の実施形態において、環状ＲＮＡは、第１のイントロンエレメントと、タンパク質コード配列と、第２のイントロンエレメントとを含む。一部の実施形態において、環状ＲＮＡは、ＩＲＥＳとタンパク質コード配列とを含む。一部の実施形態において、環状ＲＮＡは、第１のイントロン配列と、ＩＲＥＳと、タンパク質コード配列と、第２のイントロン配列とを含む。

【0113】

[0144] 一部の実施形態において、環状ＲＮＡは、再プログラム化因子（例えば、転写因子）をコードする配列を含む。一部の実施形態において、環状ＲＮＡは、第１のイントロンエレメントと、再プログラム化因子をコードする配列と、第２のイントロンエレメントとを含む。

【0114】

[0145] 一部の実施形態において、環状ＲＮＡは、ＩＲＥＳと再プログラム化因子をコードする配列とを含む。一部の実施形態において、環状ＲＮＡは、第１のイントロン配列と、ＩＲＥＳと、再プログラム化因子をコードする配列と、第２のイントロン配列とを含む。一部の実施形態において、環状ＲＮＡは、ＩＲＥＳと再プログラム化因子をコードする配列とを含む。一部の実施形態において、環状ＲＮＡは、第１のイントロンエレメントと、ＩＲＥＳと、再プログラム化因子をコードする配列と、第２のイントロンエレメントとを含む。米国特許出願公開第２０２０／００８０１０６号（これは参照により本明細書に援用される）もまた参照のこと。環状ＲＮＡはまた、修飾された塩基及び／又はＮＴＰも含み得る。一部の実施形態において、環状ＲＮＡは、修飾されたＮＴＰを含む。一部の実施形態において、環状ＲＮＡは、修飾された環状ＲＮＡである。

【0115】

[0146] 修飾塩基としては、５－メチルシトシン（５－ｍｅ－Ｃ）、５－ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２－アミノアデニン、アデニン及びグアニンの６－メチル及び他のアルキル誘導体、アデニン及びグアニンの２－プロピル及び他のアルキル誘導体、２－チオウラシル、２－チオチミン及び２－チオシトシン、５－ハロウラシル及びシトシン、５－プロピニルウラシル及びシトシン並びにピリミジン塩基の他のアルキニル誘導体、６－アゾウラシル、シトシン及びチミン、５－ウラシル（プソイドウラシル）、４－チオウラシル、８－ハロ、８－アミノ、８－チオール、８－チオアルキル、８－ヒドロキシル及び他の８－置換アデニン類及びグアニン類、５－ハロ特に５－ブロモ、５－トリフルオロメチル及び他の５－置換ウラシル類及びシトシン類、７－メチルグアニン及び７－メチルアデニン、２－Ｆ－アデニン、２－アミノ－アデニン、８－アザグアニン及び８－アザアデニン、７－デアザグアニン及び７－デアザアデニン及び３－デアザグアニン及び３－デアザアデニンなど、合成及び天然塩基が挙げられる。更なる修飾塩基としては、三環式ピリミジン類、例えば、フェノキサジンシチジン（１Ｈ－ピリミド［５，４－ｂ］［１，４］ベンゾキサジン－２（３Ｈ）－オン）、フェノチアジンシチジン（１Ｈ－ピリミド［５，４－ｂ］［１，４］ベンゾチアジン－２（３Ｈ）－オン）、置換フェノキサジンシチジンなどのＧ－クランプ（例えば、９－（２－アミノエトキシ）－Ｈ－ピリミド［５，４－ｂ］［１，４］ベンゾキサジン－２（３Ｈ）－オン）、カルバゾールシチジン（２Ｈ－ピリミド［４，５－ｂ］インドール－２－オン）、ピリドインドールシチジン（Ｈ－ピリド［３’，２’：４，５］ピロロ［２，３－ｄ］ピリミジン－２－オン）などが挙げられる。修飾塩基としてはまた、プリン又はピリミジン塩基が他のヘテロサイクル、例えば７－デアザ－アデニン、７－デアザグアノシン、２－アミノピリジン及び２－ピリドンに置き換えられているものも挙げることができる。

【0116】

[0147] 一部の実施形態において、環状ＲＮＡは、修飾された骨格を含む。修飾されたＲＮＡ骨格の例としては、ホスホロチオエート類、キラルホスホロチオエート類、ホスホロジチオエート類、リン酸トリエステル類、アミノアルキルリン酸トリエステル類、メチル及び他のアルキルホスホン酸塩であって、３’－アルキレンホスホン酸塩、５’－アルキレンホスホン酸塩及びキラルホスホン酸塩を含めたもの、ホスフィネート類、ホスホルアミデート類であって、３’－アミノホスホルアミデート及びアミノアルキル－ホスホルアミデート類、チオノホスホロアミデート類、チオノアルキルホスホネート類、チオノアルキル（thionoalkyl）－リン酸トリエステル類、通常の３’－５’連結を有するセレノホスフェート類及びボラノホスフェート類を含めたもの、これらの２’－５’連結された類似体、及び１つ以上のインターヌクレオチド連結が３’から３’、５’から５’又は２’から２’への連結である逆の極性を有するものを含むものが挙げられる。

【0117】

[0148] 一部の実施形態において、環状ＲＮＡは、活性、細胞分布又は細胞取込みを亢進させる１つ以上の部分又はコンジュゲートをＲＮＡに化学的に連結することにより修飾し得る。例えば、環状ＲＮＡは、インターカレーター、レポーター分子、ポリアミン、ポリアミド、ポリエチレングリコール、ポリエーテル、オリゴマーの薬力学的特性を亢進させる基、又はオリゴマーの薬物動態特性を亢進させる基にコンジュゲートし得る。一部の実施形態において、環状ＲＮＡは、コレステロール、脂質、リン脂質、ビオチン、フェナジン、葉酸塩、フェナントリジン、アントラキノン、アクリジン、フルオレセイン、ローダミン、クマリン、又は色素にコンジュゲートし得る。薬力学的特性を亢進させる基としては、ＲＮＡ取込みを改善する基、オリゴマーの分解抵抗性を亢進させる基、及び／又はＲＮＡとの配列特異的ハイブリダイゼーションを強化する基が挙げられる。薬物動態特性を亢進させる基としては、オリゴマー取込み、分布、代謝又は排泄を改善する基が挙げられる。環状ＲＮＡはまた、活性薬物物質、例えば、アスピリン、ワルファリン、フェニルブタゾン、イブプロフェン、スプロフェン、フェンブフェン、ケトプロフェン、（Ｓ）－（＋）－プラノプロフェン、カルプロフェン、ダンシルサルコシン、２，３，５－トリヨード安息香酸、フルフェナム酸、フォリン酸、ベンゾサイアジアザイド、クロロチアジド、ジアゼピン、インドメタシン（indomethicin）、バルビツール酸塩、セファロスポリン、サルファ剤、抗糖尿、抗菌薬又は抗生物質にもコンジュゲートし得る。一部の実施形態において、環状ＲＮＡは、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）にコンジュゲートされる。

【0118】

[0149] 一部の実施形態において、環状ＲＮＡは、複合体の一部である。一部の実施形態において、複合体は、環状ＲＮＡ及び脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を含む。一部の実施形態において、環状ＲＮＡとＬＮＰとはコンジュゲートされる。一部の実施形態において、環状ＲＮＡとＬＮＰとは共有結合的にコンジュゲートされる。一部の実施形態において、環状ＲＮＡとＬＮＰとは非共有結合的にコンジュゲートされる。一部の実施形態において、本明細書に記載される方法は、ＬＮＰと複合体化した１つ以上の環状ＲＮＡに細胞を接触させることを含む。

【0119】

[0150] ＬＮＰは、例えば、１つ以上のカチオン性脂質、非カチオン性脂質、及び／又はＰＥＧ修飾された脂質を含み得る。一部の実施形態において、ＬＮＰは、以下のカチオン性脂質：Ｃ１２－２００、ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ、ＤＯＤＡＰ、ＨＧＴ４００３、ＩＣＥ、ＨＧＴ５０００、又はＨＧＴ５００１のうちの少なくとも１つを含み得る。一部の実施形態において、ＬＮＰは、コレステロール及び／又はＰＥＧ修飾された脂質を含む。一部の実施形態において、ＬＮＰは、ＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋを含む。一部の実施形態において、ＬＮＰは、以下：Ｃ１２－２００、ＤＯＰＥ、コレステロール、ＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋ；ＤＯＤＡＰ、ＤＯＰＥ、コレステロール、ＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋ；ＨＧＴ５０００、ＤＯＰＥ、コレステロール、ＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋ、ＨＧＴ５００１、ＤＯＰＥ、又はＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋのうちの１つを含む。一部の実施形態において、ＬＮＰは、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を含む。

【0120】

[0151] 一部の実施形態において、環状ＲＮＡは、実質的に非免疫原性である。一部の実施形態において、環状ＲＮＡは、それが１つ以上のインターフェロン調節遺伝子（例えば、www.interferome.orgに記載される１つ以上の遺伝子）の発現又は活性を誘導しない場合に非免疫原性と見なされる。一部の実施形態において、インターフェロン調節遺伝子は、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β、及び／又はＴＮＦ－αから選択される。環状ＲＮＡには、その免疫原性を低減するため、様々な修飾を作ることができる。例えば、一部の実施形態において、環状ＲＮＡは、１つ以上のＭ－６－メチルアデノシン（ｍ^６Ａ）、５－メチル－シトシン（５ｍＣ）、又はプソイドウリジン残基を含むように修飾し得る。

【0121】

[0152] 一部の実施形態において、本明細書に記載される環状ＲＮＡは、線状ＲＮＡと比べて免疫原性が低い。例えば、一部の実施形態において、環状ＲＮＡは、１つ以上のインターフェロン調節遺伝子の発現及び／又は活性を実質的に誘導しない。一部の実施形態において、環状ＲＮＡが誘導する１つ以上のインターフェロン調節遺伝子の発現及び／又は活性は、線状ＲＮＡと比べて約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、又は約１００％低い。

【0122】

[0153] 一部の実施形態において、本明細書に記載される環状ＲＮＡは、線状ＲＮＡと比べて長い細胞半減期を有する。例えば、環状ＲＮＡは、線状ＲＮＡと比べて約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、又は約１００％、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍又はそれ以上長い半減期を有し得る。一部の実施形態において、環状ＲＮＡは、線状ＲＮＡと比べて約４時間、約１２時間、約１８時間、約２４時間、約２日、約３日、約４日、約５日、約１０日、又は約１０日長い半減期を有し得る。

【0123】

[0154] 一部の実施形態において、環状ＲＮＡは、細胞内で複製しない。一部の実施形態において、環状ＲＮＡは、ゲノム組込みのリスクがない。そのため、本明細書に記載される環状ＲＮＡは、細胞のゲノムＤＮＡが環状ＲＮＡ組成物による修飾を受けないまま保たれる「フットプリントフリーな」細胞修飾を提供する。

【0124】

[0155] 環状ＲＮＡは、当該技術分野において公知の任意の好適な方法を用いて生成されてもよい。一部の実施形態において、環状ＲＮＡは、インビトロ転写（ＩＶＴ）を用いて、標準プロトコルに従い、及び／又は市販のキット（例えば、ThermoFisher（登録商標）からのMAXIscript（登録商標）又はMEGAscript（登録商標）キット）を使用することにより生成される。例えば、実例的なＩＶＴプロトコルでは、精製された線状ＤＮＡ鋳型（即ち、本明細書に記載されるとおりの環状ＲＮＡをコードするＤＮＡ分子）、リボヌクレオチド三リン酸、ＤＴＴ及びマグネシウムイオンを含む緩衝系、及び環状ＲＮＡの作製に適切なファージＲＮＡポリメラーゼが使用される。ＤＮＡ鋳型には、ファージポリメラーゼが結合してＲＮＡ合成を開始させるところである二本鎖プロモーター領域が含まれる。反応条件（例えば、ヌクレオチド塩の種類、転写緩衝液中の塩の種類及び濃度、酵素濃度及びｐＨ）は、最適化な収率を実現するため、使用される詳細なポリメラーゼ及び一組の成分全体に合わせて最適化される。大規模なＩＶＴ反応では、２０μｌ反応液中で１マイクログラムの鋳型当たり最大１２０～１８０μｇのＲＮＡを作製することができる。一部の実施形態において、環状ＲＮＡは、標準プロトコルに従い、ＲＮＡ合成を用いて生成されてもよい。

【0125】

[0156] ＲＮＡを環状化する様々な方法が当該技術分野において公知である。例えば、線状ＲＮＡの環状化についての実例的なプロトコルを図１に提供し、実例的な線状ＲＮＡ環状化戦略の一覧を図２Ａ～図２Ｇに提供する。一部の実施形態において、ＲＮＡは、例えば、それが自己スプライシング型イントロンを含む場合には自己環状化する。

【0126】

[0157] また、本明細書には、本明細書に記載される環状ＲＮＡをコードする核酸（即ち、ＤＮＡ分子）、及びそれを含むベクターも提供される。

【0127】

再プログラム化因子をコードする環状ＲＮＡ
[0158] 一部の実施形態において、環状ＲＮＡは、再プログラム化因子をコードする。一部の実施形態において、再プログラム化因子は、ヒト又はヒト化再プログラム化因子である。一部の実施形態において、再プログラム化因子は、転写因子である。

【0128】

[0159] 一部の実施形態において、再プログラム化因子は、例えば、表１に掲載される再プログラム化因子のいずれか１つであり得る。一部の実施形態において、再プログラム化因子は、表１に掲載される再プログラム化因子のいずれか１つの断片又はバリアントである。一部の実施形態において、再プログラム化因子は、表１に掲載される再プログラム化因子のいずれか１つと少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有する。

【0129】

【表1】

【0130】

【表2】

【0131】

【表3】

【0132】

[0160] 一部の実施形態において、再プログラム化因子は、以下の再プログラム化因子：Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、ｃ－Ｍｙｃ、Ｌｉｎ２８（例えば、Ｌｉｎ２８Ａ又はＬｉｎ２８Ｂ）、Ｎａｎｏｇ、Ｓａｌｌ４、Ｕｔｆ１、ｐ５３、ｐ２１、ｐ１６^{Ｉｎｋ４ａ}、ＧＬＩＳ１、Ｌ－Ｍｙｃ、ＴＧＦ－β、ＭＤＭ２、ＲＥＭ２、サイクリンＤ１、ＳＶ４０ラージＴ抗原、ＤＯＴ１Ｌ、ＣＸ４３、ＭＢＤ３、ＳＩＲＴ６、ＴＣＬ１ａ、ＲＡＲｙ、ＳＮＡＩＬ、Ｌｒｈ－１、又はＲＣＯＲ２のいずれか１つ、又はこれらの組み合わせである。一部の実施形態において、再プログラム化因子は、以下の再プログラム化因子：Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、ｃ－Ｍｙｃ、Ｌｉｎ２８（例えば、Ｌｉｎ２８Ａ又はＬｉｎ２８Ｂ）、Ｎａｎｏｇ、Ｓａｌｌ４、Ｕｔｆ１、ｐ５３、ｐ２１、ｐ１６^{Ｉｎｋ４ａ}、ＧＬＩＳ１、Ｌ－Ｍｙｃ、ＴＧＦ－β、ＭＤＭ２、ＲＥＭ２、サイクリンＤ１、ＳＶ４０ラージＴ抗原、ＤＯＴ１Ｌ、ＣＸ４３、ＭＢＤ３、ＳＩＲＴ６、ＴＣＬ１ａ、ＲＡＲｙ、ＳＮＡＩＬ、Ｌｒｈ－１、又はＲＣＯＲ２のいずれか１つ、又はこれらの組み合わせの断片又はバリアントである。

【0133】

[0161] 一部の実施形態において、再プログラム化因子は、Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８（例えば、Ｌｉｎ２８Ａ又はＬｉｎ２８Ｂ）、ｃ－Ｍｙｃ、及び／又はＬ－Ｍｙｃのいずれか１つ、又はその断片若しくはバリアントである。一部の実施形態において、再プログラム化因子は、Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８（例えば、Ｌｉｎ２８Ａ又はＬｉｎ２８Ｂ）、及び／又はｃ－Ｍｙｃ、又はその断片若しくはバリアントである。一部の実施形態において、再プログラム化因子は、Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、及び／又はＳｏｘ２又はその断片若しくはバリアントである。一部の実施形態において、再プログラム化因子は、Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、及び／又はｃ－Ｍｙｃ、又はその断片若しくはバリアントである。一部の実施形態において、再プログラム化因子は、Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、及び／又はＬｉｎ２８（例えば、Ｌｉｎ２８Ａ又はＬｉｎ２８Ｂ）、又はその断片若しくはバリアントである。一部の実施形態において、再プログラム化因子は、ヒト又はヒト化再プログラム化因子である。

【0134】

[0162] 一部の実施形態において、環状ＲＮＡは、再プログラム化因子Ｏｃｔ３／４をコードする。一部の実施形態において、コードされるＯｃｔ３／４は、配列番号７のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも９０％又は少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一の配列を有する。一部の実施形態において、環状ＲＮＡは再プログラム化因子Ｏｃｔ３／４をコードし、配列番号８の核酸配列を含むか、又はそれからなる。一部の実施形態において、環状ＲＮＡは、再プログラム化因子Ｏｃｔ３／４をコードし、配列番号８と少なくとも９０％又は少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一の核酸配列を含む。

【0135】

[0163] 一部の実施形態において、環状ＲＮＡは、再プログラム化因子Ｋｌｆ４をコードする。一部の実施形態において、コードされるＫｌｆ４は、配列番号９又は１０のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも９０％又は少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一の配列を有する。一部の実施形態において、環状ＲＮＡは再プログラム化因子Ｋｌｆ４をコードし、配列番号１１の核酸配列を含むか、又はそれからなる。一部の実施形態において、環状ＲＮＡは、再プログラム化因子Ｋｌｆ４をコードし、配列番号１１と少なくとも９０％又は少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一の核酸配列を含む。

【0136】

[0164] 一部の実施形態において、環状ＲＮＡは、再プログラム化因子Ｓｏｘ２をコードする。一部の実施形態において、Ｓｏｘ２は、配列番号１２のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも９０％又は少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一の配列を有する。一部の実施形態において、環状ＲＮＡは再プログラム化因子Ｓｏｘ２をコードし、配列番号１３の核酸配列を含むか、又はそれからなる。一部の実施形態において、環状ＲＮＡは再プログラム化因子Ｓｏｘ２をコードし、配列番号１３と少なくとも９０％又は少なくとも９５％。９６％、９７％、９８％、又は９９％同一の核酸配列を含む。

【0137】

[0165] 一部の実施形態において、環状ＲＮＡは、再プログラム化因子Ｎａｎｏｇをコードする。一部の実施形態において、Ｎａｎｏｇは、配列番号１４又は１５のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも９０％又は少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一の配列を有する。一部の実施形態において、環状ＲＮＡは、再プログラム化因子Ｎａｎｏｇをコードし、配列番号１６の核酸配列を含むか、又はそれからなる。一部の実施形態において、環状ＲＮＡは、再プログラム化因子Ｎａｎｏｇをコードし、配列番号１６と少なくとも９０％又は少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一の核酸配列を含む。

【0138】

[0166] 一部の実施形態において、環状ＲＮＡは、再プログラム化因子Ｌｉｎ２８Ａをコードする。一部の実施形態において、Ｌｉｎ２８Ａは、配列番号１７のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも９０％又は少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一の配列を有する。一部の実施形態において、環状ＲＮＡは再プログラム化因子Ｌｉｎ２８Ａをコードし、配列番号１８の核酸配列を含むか、又はそれからなる。一部の実施形態において、環状ＲＮＡは、再プログラム化因子Ｌｉｎ２８Ａをコードし、配列番号１８と少なくとも９０％又は少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一の核酸配列を含む。

【0139】

[0167] 一部の実施形態において、環状ＲＮＡは、再プログラム化因子ｃ－Ｍｙｃをコードする。一部の実施形態において、ｃ－Ｍｙｃは、配列番号１９又は２０のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも９０％又は少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一の配列を有する。一部の実施形態において、環状ＲＮＡは再プログラム化因子ｃ－Ｍｙｃをコードし、配列番号２１の核酸配列を含むか、又はそれからなる。一部の実施形態において、環状ＲＮＡは再プログラム化因子ｃ－Ｍｙｃをコードし、配列番号２１と少なくとも９０％又は少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一の核酸配列を含む。

【0140】

[0168] 一部の実施形態において、環状ＲＮＡは、再プログラム化因子Ｌ－Ｍｙｃをコードする。一部の実施形態において、Ｌ－Ｍｙｃは、配列番号２２～２４のいずれか１つのアミノ酸配列、又はそれと少なくとも９０％又は少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一の配列を有する。一部の実施形態において、環状ＲＮＡは再プログラム化因子Ｌ－Ｍｙｃをコードし、配列番号２５の核酸配列を含むか、又はそれからなる。一部の実施形態において、環状ＲＮＡは再プログラム化因子Ｌ－Ｍｙｃをコードし、配列番号２５と少なくとも９０％又は少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一の核酸配列を含む。

【0141】

[0169] 一部の実施形態において、環状ＲＮＡは、２つ以上のタンパク質コード核酸配列を含む。例えば、環状ＲＮＡは、３、４、５、又は６つのタンパク質コード配列を含み得る。一部の実施形態において、タンパク質コード配列のうちの少なくとも１つは、再プログラム化因子（例えば、転写因子）をコードする。一部の実施形態において、環状ＲＮＡは、表３の組み合わせ１～１０６のいずれか１つに係る再プログラム化因子の組み合わせをコードする２、３、４、５、又は６つのタンパク質コード配列を含む。

【0142】

[0170] 一部の実施形態において、環状ＲＮＡは２つ以上のタンパク質コード配列を含み、ここでタンパク質コード配列のうちの少なくとも１つは、再プログラム化因子をコードする。一部の実施形態において、環状ＲＮＡは２つ以上のタンパク質コード配列を含み、ここでタンパク質コード配列のうちの少なくとも１つは、Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８（例えば、Ｌｉｎ２８Ａ又はＬｉｎ２８Ｂ）、ｃ－Ｍｙｃ、又はＬ－Ｍｙｃの１つ以上、又はその断片若しくはバリアントをコードする。一部の実施形態において、環状ＲＮＡは２つ以上のタンパク質コード配列を含み、ここでタンパク質コード配列の各々は、Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８（例えば、Ｌｉｎ２８Ａ又はＬｉｎ２８Ｂ）、ｃ－Ｍｙｃ、及びＬ－Ｍｙｃから選択される再プログラム化因子、又はその断片若しくはバリアントをコードする。

【0143】

[0171] 一部の実施形態において、環状ＲＮＡは、Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８（例えば、Ｌｉｎ２８Ａ又はＬｉｎ２８Ｂ）、ｃ－Ｍｙｃ、又はＬ－Ｍｙｃをコードする配列を含む。一部の実施形態において、環状ＲＮＡは、第１のイントロンエレメントと、Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８（例えば、Ｌｉｎ２８Ａ又はＬｉｎ２８Ｂ）、ｃ－Ｍｙｃ、又はＬ－Ｍｙｃをコードする配列と、第２のイントロンエレメントとを含む。

【0144】

[0172] 一部の実施形態において、環状ＲＮＡは、ＩＲＥＳと、Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８（例えば、Ｌｉｎ２８Ａ又はＬｉｎ２８Ｂ）、ｃ－Ｍｙｃ、又はＬ－Ｍｙｃをコードする配列とを含む。一部の実施形態において、環状ＲＮＡは、第１のイントロンエレメントと、ＩＲＥＳと、Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８（例えば、Ｌｉｎ２８Ａ又はＬｉｎ２８Ｂ）、ｃ－Ｍｙｃ、又はＬ－Ｍｙｃをコードする配列と、第２のイントロンエレメントとを含む。

【0145】

補助的因子をコードするＲＮＡポリヌクレオチド
[0173] 一部の実施形態において、本開示は、細胞の再プログラム化を助ける外因性因子をコードするＲＮＡポリヌクレオチド（例えば、線状ＲＮＡポリヌクレオチド又は環状ＲＮＡ）を提供する。一部の実施形態において、外因性因子は、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）又は長鎖非コードＲＮＡ（例えば、ＬＩＮｃＲＮＡ－ＲＯＲ）など、ＲＮＡである。ｍｉＲＮＡ３０２（ａ～ｄ）クラスター及びｍｉＲ３６７などのｍｉＲＮＡは、再プログラム化因子と併せて使用したとき、再プログラム化効率を改善することが示されている（米国特許第８，７９１，２４８号；米国特許第８，８５２，９４０号；Poleganov et al., Human Gene Therapy.Nov 2015.751-766を参照のこと）。例えば、ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲＮＡ３０２ファミリー（例えば、ｍｉＲ３０２ｄ、ｍｉＲ３０２ａ、ｍｉＲ３０２ｃ及びｍｉＲ３０２ｂ）、ｍｉＲ３６７、ｍｉＲ７６６、ｍｉＲ２００ｃ、ｍｉＲ３６９、ｍｉＲ３７２、Ｌｅｔ７、ｍｉＲ１９ａ／ｂ）のいずれか１つ又はその断片若しくはバリアントであり得る。

【0146】

[0174] 一部の実施形態において、補助的因子は、ｃｉｒｃＢＩＲＣ６、ｃｉｒｃＣＯＲＯ１Ｃ、又はｃｉｒｃＭＡＮ１Ａ２など、ヒト幹細胞（例えば、ヒトＥＳＣ）で濃縮されている環状ＲＮＡである。ｃｉｒｃＢＩＲＣ６、ｃｉｒｃＣＯＲＯ１Ｃ及びｃｉｒｃＭＡＮ１Ａ２。これらの環状ＲＮＡは、「ｍｉＲスポンジ」として働くと考えられている。このように、これらの因子は、多能性関連転写因子ＮＡＮＯＧ、ＳＯＸ２及びＯＣＴ４の発現を抑制することが公知のある種のｍｉＲＮＡ（例えばｍｉＲ３４ａ及び／又はｍｉＲ１４５）に対抗して作用することにより、多能性の促進において調節的役割を有し得る（Yu et al. Nat Commun 8, 1149 (2017)）。

【0147】

[0175] 一部の実施形態において、補助的因子は、自然免疫応答を阻害する１つ以上のウイルスタンパク質である。ウイルスタンパク質は、例えば、ＲＩＧ－１（レチノイン酸誘導性遺伝子Ｉ）又はＰＫＲ（プロテインキナーゼＲ）経路の阻害薬であり得る。例示的ウイルスタンパク質を以下の表２に提供する。本明細書に記載される方法で使用するのに好適な例示的ウイルスタンパク質としては、限定はされないが、ワクシニアウイルス由来のＢ１８Ｒ、Ｅ３、又はＫ３が挙げられる。例示的Ｂ１８Ｒ配列を配列番号２６として提供する。一部の実施形態において、Ｂ１８Ｒタンパク質は、配列番号２６と少なくとも９０％、又は少なくとも９５％同一の配列を有する。例示的Ｅ３配列を配列番号２７として提供する。一部の実施形態において、Ｅ３タンパク質は、配列番号２７と少なくとも９０％、又は少なくとも９５％同一の配列を有する。例示的Ｋ３配列を配列番号２８として提供する。一部の実施形態において、Ｋ３タンパク質は、配列番号２８と少なくとも９０％、又は少なくとも９５％同一の配列を有する。

【0148】

【表4】

【0149】

環状ＲＮＡ組成物
[0176] 一部の実施形態において、本開示は、再プログラム化因子をコードする環状ＲＮＡの組成物を提供する。一部の実施形態において、この組成物は、緩衝液を更に含む。緩衝液は、例えば、１～１０ｍＭクエン酸ナトリウムを含み得る。一部の実施形態において緩衝液のｐＨは、約２、約２．５、約３、約３．５、約４、約４．５、約５、約５．５、約６、約６．５、約７、約７．５、約８、約８．５、約９、約９．５、約１０、約１０．５、約１１、約１１．５、又は約１２である。一部の実施形態において、緩衝液のｐＨは、約６．５である。

【0150】

[0177] 一部の実施形態において、組成物は２つ以上の環状ＲＮＡを含み、各々が、Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８（例えば、Ｌｉｎ２８Ａ又はＬｉｎ２８Ｂ）、ｃ－Ｍｙｃ、及びＬ－Ｍｙｃから選択される再プログラム化因子をコードする。一部の実施形態において、組成物は２つ以上の環状ＲＮＡを含み、各々が、Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８（例えば、Ｌｉｎ２８Ａ又はＬｉｎ２８Ｂ）、及びｃ－Ｍｙｃから選択される再プログラム化因子をコードする。一部の実施形態において、組成物は２つ以上の環状ＲＮＡを含み、各々が、Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、及びＬｉｎ２８（例えば、Ｌｉｎ２８Ａ又はＬｉｎ２８Ｂ）から選択される再プログラム化因子をコードする。一部の実施形態において、組成物は２つ以上の環状ＲＮＡを含み、各々が、Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、及びｃ－Ｍｙｃから選択される再プログラム化因子をコードする。一部の実施形態において、組成物は２つ以上の環状ＲＮＡを含み、各々が、Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、及びＳｏｘ２から選択される再プログラム化因子をコードする。一部の実施形態において、組成物は２つ以上の環状ＲＮＡを含み、各々が、表３に提供される組み合わせから選択される再プログラム化因子をコードする。表３では、各行が環状ＲＮＡの異なる組み合わせを表し、ここで「Ｘ」は、その環状ＲＮＡを細胞に接触させることを指示している。例えば、組み合わせ１番では、組成物は、Ｏｃｔ３／４をコードする環状ＲＮＡとＫｌｆ４をコードする環状ＲＮＡとを含む。組み合わせ１０４番では、組成物は、Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、及びＮａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８（例えば、Ｌｉｎ２８Ａ又はＬｉｎ２８Ｂ）、及びＬ－Ｍｙｃをコードする環状ＲＮＡを含む。

【0151】

【表5】

【0152】

【表6】

【0153】

【表7】

【0154】

【表8】

【0155】

[0178] 一部の実施形態において、組成物は２つの環状ＲＮＡを含み、その一方はＯｃｔ３／４をコードし、その他方は、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｌｉｎ２８（例えば、Ｌｉｎ２８Ａ又はＬｉｎ２８Ｂ）、Ｎａｎｏｇ、及びｃ－Ｍｙｃ又はＬ－Ｍｙｃからなる群から選択される再プログラム化因子をコードする。一部の実施形態において、組成物は２つの環状ＲＮＡを含み、各々が、Ｏｃｔ３／４及びＬｉｎ２８（例えば、Ｌｉｎ２８Ａ又はＬｉｎ２８Ｂ）から選択される再プログラム化因子、又はその断片若しくはバリアントをコードする。一部の実施形態において、組成物は２つの環状ＲＮＡを含み、各々が、Ｏｃｔ３／４及びＳｏｘ２から選択される再プログラム化因子、又はその断片若しくはバリアントをコードする。

【0156】

[0179] 一部の実施形態において、組成物は３つの環状ＲＮＡを含み、各々が、Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２からなる群から選択される再プログラム化因子又はその断片若しくはバリアントをコードする。一部の実施形態において、組成物は、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８（例えば、Ｌｉｎ２８Ａ又はＬｉｎ２８Ｂ）、及び／又はｃ－Ｍｙｃから選択される再プログラム化因子又はその断片若しくはバリアントをコードする環状ＲＮＡを含まない。一部の実施形態において、組成物は３つの環状ＲＮＡからなり、各々が、Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２からなる群から選択される再プログラム化因子又はその断片若しくはバリアントをコードする。一部の実施形態において、組成物は３つの環状ＲＮＡを含み、各々が、Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｌｉｎ２８（例えば、Ｌｉｎ２８Ａ又はＬｉｎ２８Ｂ）からなる群から選択される再プログラム化因子又はその断片若しくはバリアントをコードする。一部の実施形態において、組成物は、Ｎａｎｏｇ、Ｓｏｘ２、及び／又はｃ－Ｍｙｃから選択される再プログラム化因子又はその断片若しくはバリアントをコードする環状ＲＮＡを含まない。一部の実施形態において、組成物は３つの環状ＲＮＡからなり、各々が、Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｌｉｎ２８（例えば、Ｌｉｎ２８Ａ又はＬｉｎ２８Ｂ）からなる群から選択される再プログラム化因子又はその断片若しくはバリアントをコードする。一部の実施形態において、組成物は３つの環状ＲＮＡを含み、各々が、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｌｉｎ２８（例えば、Ｌｉｎ２８Ａ又はＬｉｎ２８Ｂ）からなる群から選択される再プログラム化因子又はその断片若しくはバリアントをコードする。一部の実施形態において、組成物は、Ｎａｎｏｇ、Ｋｌｆ４、及び／又はｃ－Ｍｙｃから選択される再プログラム化因子又はその断片若しくはバリアントをコードする環状ＲＮＡを含まない。一部の実施形態において、組成物は３つの環状ＲＮＡからなり、各々が、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｌｉｎ２８（例えば、Ｌｉｎ２８Ａ又はＬｉｎ２８Ｂ）からなる群から選択される再プログラム化因子又はその断片若しくはバリアントをコードする。

【0157】

[0180] 一部の実施形態において、組成物は４つの環状ＲＮＡを含み、各々が、Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、及びｃ－Ｍｙｃからなる群から選択される再プログラム化因子又はその断片若しくはバリアントをコードする。一部の実施形態において、組成物は、Ｎａｎｏｇ及び／又はＬｉｎ２８（例えば、Ｌｉｎ２８Ａ又はＬｉｎ２８Ｂ）から選択される再プログラム化因子又はその断片若しくはバリアントをコードする環状ＲＮＡを含まない。一部の実施形態において、組成物は４つの環状ＲＮＡからなり、各々が、Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、及びｃ－Ｍｙｃからなる群から選択される再プログラム化因子又はその断片若しくはバリアントをコードする。一部の実施形態において、組成物は５つの環状ＲＮＡを含み、各々が、Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、及び／又はＬｉｎ２８（例えば、Ｌｉｎ２８Ａ又はＬｉｎ２８Ｂ）からなる群から選択される再プログラム化因子又はその断片若しくはバリアントをコードする。一部の実施形態において、組成物は、ｃ－Ｍｙｃをコードする環状ＲＮＡ又はその断片若しくはバリアントを含まない。一部の実施形態において、組成物は５つの環状ＲＮＡからなり、各々が、Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、及び／又はＬｉｎ２８（例えば、Ｌｉｎ２８Ａ又はＬｉｎ２８Ｂ）からなる群から選択される再プログラム化因子又はその断片若しくはバリアントをコードする。一部の実施形態において、組成物は６つの環状ＲＮＡを含み、各々が、Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８（例えば、Ｌｉｎ２８Ａ又はＬｉｎ２８Ｂ）、ｃ－Ｍｙｃからなる群から選択される再プログラム化因子又はその断片若しくはバリアントをコードする。一部の実施形態において、組成物は６つの環状ＲＮＡからなり、各々が、Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８（例えば、Ｌｉｎ２８Ａ又はＬｉｎ２８Ｂ）、ｃ－Ｍｙｃからなる群から選択される再プログラム化因子又はその断片若しくはバリアントをコードする。

【0158】

[0181] 一部の実施形態において、組成物は、１つ以上の再プログラム化因子をコードする１つ以上の環状ＲＮＡを含み、更に、細胞の再プログラム化を助け得る少なくとも１つの追加の補助的因子を含む。一部の実施形態において、組成物は、補助的因子をコードするＲＮＡポリヌクレオチド（例えば、線状ＲＮＡポリヌクレオチド又は環状ＲＮＡ）を更に含む。一部の実施形態において、補助的因子は、ｍｉＲＮＡ（例えば、ｍｉＲＮＡ３０２ファミリー（例えば、ｍｉＲ３０２ｄ、ｍｉＲ３０２ａ、ｍｉＲ３０２ｃ及びｍｉＲ３０２ｂ）、ｍｉＲ３６７、ｍｉＲ７６６、ｍｉＲ２００ｃ、ｍｉＲ３６９、ｍｉＲ３７２、Ｌｅｔ７、ｍｉＲ１９ａ／ｂ）、長鎖非コードＲＮＡ（例えば、ＬＩＮｃＲＮＡ－ＲＯＲ）、及び外因性ｃｉｒｃＲＮＡ（例えば、ｃｉｒｃＢＩＲＣ６、ｃｉｒｃＣＯＲＯ１Ｃ、又はｃｉｒｃＭＡＮ１Ａ２、ｃｉｒｃＢＩＲＣ６、ｃｉｒｃＣＯＲＯ１Ｃ及びｃｉｒｃＭＡＮ１Ａ２）、又はウイルスタンパク質（例えば、表２に記載されるもの）から選択される。一部の実施形態において、組成物は、１つ以上の再プログラム化因子をコードする１つ以上の環状ＲＮＡからなり、細胞の再プログラム化を助け得る補助的因子をコードするいかなる追加のＲＮＡポリヌクレオチド（例えば、線状ＲＮＡポリヌクレオチド又は環状ＲＮＡ）も含まない。

【0159】

細胞の再プログラム化方法
[0182] 一部の実施形態において、本開示は、体細胞の再プログラム化方法を提供する。一部の実施形態において、本開示は、ｉＰＳＣを作製するための体細胞の再プログラム化方法を提供する。詳細な実施形態において、本開示は、ｉＰＳＣを作製するための浮遊培養液中での体細胞の再プログラム化方法を提供する。一部の実施形態において、ｉＰＳＣを作製する方法は、本明細書に記載される環状ＲＮＡの少なくとも１つ又はその組成物に体細胞を接触させること（例えば、浮遊培養液中の細胞を接触させること）及び再プログラム化された細胞（例えば、ｉＰＳＣ）が入手される条件下に細胞を維持することを含む。本明細書では、本明細書に記載される方法により細胞に導入される環状ＲＮＡは、細胞にとって外因性である。換言すれば、細胞へと導入される環状ＲＮＡは、それが導入される細胞に天然では存在しない。

【0160】

[0183] 一部の実施形態において、体細胞は、原核細胞である。一部の実施形態において、体細胞は、真核細胞である。一部の実施形態において、体細胞は、動物細胞である。一部の実施形態において、体細胞は、哺乳類細胞（例えば、マウス、ウシ、サル、ブタ、ウマ、ヒツジ、又はヒト細胞）である。一部の実施形態において、体細胞は、ヒト細胞である。一部の実施形態において、体細胞は、酵母、真菌、又は植物細胞である。

【0161】

[0184] 一部の実施形態において、体細胞は、線維芽細胞、末梢血由来細胞、内皮前駆細胞、臍帯血由来細胞、肝細胞、角化細胞、メラニン細胞、脂肪組織由来細胞、又は尿由来細胞（例えば、腎上皮前駆細胞）である。一部の実施形態において、細胞は、上皮細胞、内皮細胞、神経細胞、脂肪細胞、心臓細胞、骨格筋細胞、免疫細胞、肝臓細胞、脾細胞、肺細胞、循環血液細胞、胃腸細胞、腎細胞、軟骨細胞、眼細胞、神経系細胞、中枢神経系細胞、骨細胞、骨髄細胞、前駆細胞、又は膵細胞である。一部の実施形態において、細胞は、限定はされないが、脳、肝臓、肺、腸、胃、腸、脂肪、筋肉、子宮、皮膚、脾臓、内分泌器官、骨等を含め、任意の体細胞組織から単離される。

【0162】

[0185] 一部の実施形態において、体細胞は、接着細胞である。一部の実施形態において、細胞は、非接着細胞である。一部の実施形態において、浮遊細胞培養液中で再プログラム化される体細胞。一部の実施形態において、体細胞は、血液細胞（例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、末梢血単核球、又は臍帯血単核球）である。一部の実施形態において、血液細胞は、浮遊細胞培養液中で再プログラム化される。一部の実施形態において、体細胞は、Ｔ細胞又はＮＫ細胞である。一部の実施形態において、Ｔ細胞又はＮＫ細胞は、浮遊細胞培養液中で再プログラム化される。一部の実施形態において、体細胞は、ＣＤ３４＋細胞である。一部の実施形態において、ＣＤ３４＋細胞は、浮遊細胞培養液中で再プログラム化される。

【0163】

[0186] 一部の実施形態において、体細胞は、環状ＲＮＡ又はその組成物に１回接触する。一部の実施形態において、体細胞は、複数の異なる環状ＲＮＡ又はその１つ以上の組成物に１回接触する。一部の実施形態において、体細胞は、少なくとも２つの異なる環状ＲＮＡ又はその１つ以上の組成物（例えば、２、３、４、５、又は６つの環状ＲＮＡ又はその１つ以上の組成物）に１回接触する。一部の実施形態において、接触は浮遊培養液中で実施される。一部の実施形態において細胞は、環状ＲＮＡに２回以上（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０回）接触する。一部の実施形態において細胞は、複数の環状ＲＮＡに２回以上（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０回）接触する。一部の実施形態において、体細胞は、環状ＲＮＡ又はその組成物に２～６回接触する。一部の実施形態において、体細胞は、環状ＲＮＡ又はその組成物に２回接触する。一部の実施形態において、体細胞は、環状ＲＮＡ又はその組成物に３回接触する。一部の実施形態において、体細胞は、環状ＲＮＡ又はその組成物に４回接触する。一部の実施形態において、体細胞は、環状ＲＮＡ又はその組成物に４回未満接触させる。一部の実施形態において、接触は、有効な間隔で実施される。有効な間隔とは、例えば、１日１回、隔日に１回、３日に１回、週１回、２週間に１回、又は月１回であり得る。一部の実施形態において、環状ＲＮＡは、再プログラム化過程が続く間にわたって細胞に接触させるため、従って接触は、再プログラム化過程全体を通じて連続している。一部の実施形態において、体細胞は、複数の環状ＲＮＡに（例えば、浮遊培養液中で）１回以上接触し、ここで接触回数は、少なくとも２つの環状ＲＮＡについて異なる。例えば、一部の実施形態において、体細胞は、複数の環状ＲＮＡに（例えば、浮遊培養液中で）接触し、ここで細胞は、環状ＲＮＡのうちの少なくとも１つに２回以上接触し、細胞は、少なくとも１つの他の環状ＲＮＡに１回のみ接触する。一部の実施形態において、体細胞は、複数の環状ＲＮＡに（例えば、浮遊培養液中で）接触し、ここで細胞は、環状ＲＮＡのうちの少なくとも１つに３回以上接触し、細胞は、少なくとも１つの他の環状ＲＮＡに１回のみ又は２回のみ接触する。

【0164】

[0187] 一部の実施形態において、接触は、環状ＲＮＡを細胞にトランスフェクトすることを含む。様々な実施形態において、本明細書に記載される方法は、ｃｉｒｃＲＮＡ又はその組成物に細胞を直接接触させることを含む。換言すれば、インビトロで合成又は製造された環状ＲＮＡを、ウイルスベクター又はＤＮＡプラスミドの助けを借りずに細胞と直接接触させる（及びそれによって細胞に導入する）。

【0165】

[0188] 一部の実施形態において、細胞を再プログラム化する方法（例えば、ｉＰＳＣを作製する方法）は、環状ＲＮＡ又はその組成物に体細胞を接触させることを含み、ここでＲＮＡは、少なくとも３ｐｇ／細胞の濃度で存在する。一部の実施形態において、ＲＮＡは、約３ｐｇ／細胞～約１５ｐｇ／細胞、約４ｐｇ／細胞～約１５ｐｇ／細胞、約５ｐｇ／細胞～約１５ｐｇ／細胞、約６ｐｇ／細胞～約１５ｐｇ／細胞、約７ｐｇ／細胞～約１５ｐｇ／細胞、約８ｐｇ／細胞～約１５ｐｇ／細胞、約９ｐｇ／細胞～約１５ｐｇ／細胞、約１０ｐｇ／細胞～約１５ｐｇ／細胞、約１１ｐｇ／細胞～約１５ｐｇ／細胞、約１２ｐｇ／細胞～約１５ｐｇ／細胞、約１３ｐｇ／細胞～約１５ｐｇ／細胞、又は約１４ｐｇ／細胞～約１５ｐｇ／細胞の濃度で存在する。一部の実施形態において、ＲＮＡは、約３ｐｇ／細胞～約１４ｐｇ／細胞、約４ｐｇ／細胞～約１４ｐｇ／細胞、約５ｐｇ／細胞～約４ｐｇ／細胞、約６ｐｇ／細胞～約１４ｐｇ／細胞、約７ｐｇ／細胞～約１４ｐｇ／細胞、約８ｐｇ／細胞～約１４ｐｇ／細胞、約９ｐｇ／細胞～約１４ｐｇ／細胞、約１０ｐｇ／細胞～約１４ｐｇ／細胞、約１１ｐｇ／細胞～約１４ｐｇ／細胞、約１２ｐｇ／細胞～約１４ｐｇ／細胞、又は約１３ｐｇ／細胞～約１４ｐｇ／細胞の濃度で存在する。一部の実施形態において、ＲＮＡは、約３ｐｇ／細胞～約１３ｐｇ／細胞、約４ｐｇ／細胞～約１３ｐｇ／細胞、約５ｐｇ／細胞～約１３ｐｇ／細胞、約６ｐｇ／細胞～約１３ｐｇ／細胞、約７ｐｇ／細胞～約１３ｐｇ／細胞、約８ｐｇ／細胞～約１３ｐｇ／細胞、約９ｐｇ／細胞～約１３ｐｇ／細胞、約１０ｐｇ／細胞～約１３ｐｇ／細胞、約１１ｐｇ／細胞～約１３ｐｇ／細胞、又は約１２ｐｇ／細胞～約１３ｐｇ／細胞の濃度で存在する。一部の実施形態において、ＲＮＡは、約３ｐｇ／細胞～約１２ｐｇ／細胞、約４ｐｇ／細胞～約１２ｐｇ／細胞、約５ｐｇ／細胞～約１２ｐｇ／細胞、約６ｐｇ／細胞～約１２ｐｇ／細胞、約７ｐｇ／細胞～約１２ｐｇ／細胞、約８ｐｇ／細胞～約１２ｐｇ／細胞、約９ｐｇ／細胞～約１２ｐｇ／細胞、約１０ｐｇ／細胞～約１２ｐｇ／細胞、又は約１１ｐｇ／細胞～約１２ｐｇ／細胞の濃度で存在する。一部の実施形態において、ＲＮＡは、約３ｐｇ／細胞～約１１ｐｇ／細胞、約４ｐｇ／細胞～約１１ｐｇ／細胞、約５ｐｇ／細胞～約１１ｐｇ／細胞、約６ｐｇ／細胞～約１１ｐｇ／細胞、約７ｐｇ／細胞～約１１ｐｇ／細胞、約８ｐｇ／細胞～約１１ｐｇ／細胞、約９ｐｇ／細胞～約１１ｐｇ／細胞、又は約１０ｐｇ／細胞～約１１ｐｇ／細胞の濃度で存在する。一部の実施形態において、ＲＮＡは、約３ｐｇ／細胞～約１０ｐｇ／細胞、約４ｐｇ／細胞～約１０ｐｇ／細胞、約５ｐｇ／細胞～約１０ｐｇ／細胞、約６ｐｇ／細胞～約１０ｐｇ／細胞、約７ｐｇ／細胞～約１０ｐｇ／細胞、約８ｐｇ／細胞～約１０ｐｇ／細胞、又は約９ｐｇ／細胞～約１０ｐｇ／細胞の濃度で存在する。一部の実施形態において、ＲＮＡは、約３ｐｇ／細胞～約９ｐｇ／細胞、約４ｐｇ／細胞～約９ｐｇ／細胞、約５ｐｇ／細胞～約９ｐｇ／細胞、約６ｐｇ／細胞～約９ｐｇ／細胞、約７ｐｇ／細胞～約９ｐｇ／細胞、又は約８ｐｇ／細胞～約９ｐｇ／細胞の濃度で存在する。一部の実施形態において、ＲＮＡは、約３ｐｇ／細胞～約８ｐｇ／細胞、約４ｐｇ／細胞～約８ｐｇ／細胞、約５ｐｇ／細胞～約８ｐｇ／細胞、約６ｐｇ／細胞～約８ｐｇ／細胞、又は約７ｐｇ／細胞～約８ｐｇ／細胞の濃度で存在する。一部の実施形態において、ＲＮＡは、約３ｐｇ／細胞～約７ｐｇ／細胞、約４ｐｇ／細胞～約７ｐｇ／細胞、約５ｐｇ／細胞～約７ｐｇ／細胞、又は約６ｐｇ／細胞～約７ｐｇ／細胞の濃度で存在する。一部の実施形態において、ＲＮＡは、約３ｐｇ／細胞～約６ｐｇ／細胞、約４ｐｇ／細胞～約６ｐｇ／細胞、又は約５ｐｇ／細胞～約６ｐｇ／細胞の濃度で存在する。一部の実施形態において、ＲＮＡは、約３ｐｇ／細胞～約５ｐｇ／細胞、又は約４ｐｇ／細胞～約５ｐｇ／細胞の濃度で存在する。一部の実施形態において、ＲＮＡは、約３ｐｇ／細胞～約４ｐｇ／細胞の濃度で存在する。一部の実施形態において、ＲＮＡは、約１ｐｇ／細胞、２ｐｇ／細胞、３ｐｇ／細胞、４ｐｇ／細胞、５ｐｇ／細胞、６ｐｇ／細胞、７ｐｇ／細胞、８ｐｇ／細胞、９ｐｇ／細胞、１０ｐｇ／細胞、１１ｐｇ／細胞、１２ｐｇ／細胞、１３ｐｇ／細胞、１４ｐｇ／細胞、又は約１５ｐｇ／細胞の濃度で存在する。

【0166】

[0189] 一部の実施形態において、環状ＲＮＡは、脂質媒介性トランスフェクションを用いて細胞にトランスフェクトされる。脂質媒介性トランスフェクションは、エンドサイトーシスによる核酸の能動的取込みを刺激する。例示的脂質媒介性トランスフェクション試薬は、Lipofectamine（登録商標）（例えば、ThermoFisher（登録商標）からのLipofectamine（登録商標）RNAiMAX（登録商標））である。一部の実施形態において、細胞のトランスフェクション方法は、（ｉ）ＲＮＡ及びトランスフェクション試薬を別個のチューブにおいて希釈するステップ、（ｉｉ）ＲＮＡをトランスフェクション試薬と合わせて複合体を形成するステップ、（ｉｉｉ）複合体を細胞に加えるステップ、（ｉｖ）細胞をタンパク質発現に関してアッセイするステップを含む。細胞におけるタンパク質発現の検出は、とりわけ、ウエスタンブロット分析、免疫細胞化学、及び蛍光媒介検出（例えば、ＦＡＣＳ）を含め、幾つかの技法により実現することができる。

【0167】

[0190] 一部の実施形態において、接触は、環状ＲＮＡ又はその組成物を細胞にエレクトロポレーションすることを含む。エレクトロポレーションは、核酸が高濃度で存在する溶液中に細胞がある間に、細胞膜に一過性に穴を開けることによって核酸を送達する。一部の実施形態において、エレクトロポレーションには、Neon（登録商標）エレクトロポレーションシステムを使用する。

【0168】

[0191] 一部の実施形態において、接触は、細胞をｃｉｒｃＲＮＡ－ＬＮＰ複合体とインキュベートすることを含む。

【0169】

[0192] 一部の実施形態において、接触は、バリスティックトランスフェクション（即ち、遺伝子銃又は微粒子銃トランスフェクション）、マグネトフェクション、ペプチド媒介性トランスフェクション（Sigma-AldrichのN-TER（商標）トランスフェクションシステムなど、非共有結合性ペプチド／ＲＮＡナノ粒子ベースのトランスフェクションか、又はペプチドをＲＮＡに共有結合的に取り付けることによるかのいずれか）、及び／又はマイクロインジェクションなど、１つ以上の技法を含む。順次又は同時に用いられるこれらの技法の組み合わせもまた用いることができる。

【0170】

[0193] 一部の実施形態において、細胞を再プログラム化する方法（例えばｉＰＳＣを作製する方法）は、再プログラム化因子（例えば、転写因子）をコードする少なくとも１つの環状ＲＮＡに体細胞を接触させること、及び再プログラム化された細胞（例えばｉＰＳＣ）が入手される条件下に細胞を維持することを含む。再プログラム化因子は、例えば、表１に示される再プログラム化因子のいずれかであり得る。一部の実施形態において、細胞は複数の環状ＲＮＡに接触し、ここで各環状ＲＮＡは、表１に示される再プログラム化因子から選択される再プログラム化因子をコードする。

【0171】

[0194] 一部の実施形態において、本開示は、細胞を再プログラム化する方法を提供し、ここで細胞は、以下の表３Ａに示されるとおりの組み合わせ１～１０６のいずれか１つに係る環状ＲＮＡの組み合わせに接触させる。

【0172】

【表9】

【0173】

【表10】

【0174】

【表11】

【0175】

【表12】

【0176】

[0195] 一部の実施形態において、本開示は、浮遊状態の細胞を再プログラム化する方法であって、上記の表３Ａに示されるとおりの組み合わせ１～１０６のいずれか１つに係る環状ＲＮＡの組み合わせに細胞を接触させることを含む方法を提供する。一部の実施形態において、かかる組み合わせ（即ち、組み合わせ１～１０６のうちの１つ）の環状ＲＮＡは、浮遊状態の細胞に複数回接触させる。一部の実施形態において、かかる組み合わせ（即ち、組み合わせ１～１０６のうちの１つ）の環状ＲＮＡのうちの少なくとも１つは、浮遊状態の細胞に複数回接触させて、かかる組み合わせの環状ＲＮＡのうちの少なくとも１つは、浮遊状態の細胞に１回接触させる。一部の実施形態において、かかる組み合わせの環状ＲＮＡの１つ以上は、浮遊状態の細胞に１回、２回、３回、又は４回接触させる。

【0177】

[0196] 一部の実施形態において、本開示は、血液細胞（例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、末梢血単核球、臍帯血単核球、ＣＤ３４＋細胞）を再プログラム化する方法であって、上記の表３Ａに示されるとおりの組み合わせ１～１０６のいずれか１つに係る環状ＲＮＡの組み合わせに細胞を接触させることを含む方法を提供する。一部の実施形態において、血液細胞は、Ｔ細胞である。一部の実施形態において、かかる組み合わせ（即ち、組み合わせ１～１０６のうちの１つ）の環状ＲＮＡは、浮遊状態のＴ細胞に複数回接触させる。一部の実施形態において、かかる組み合わせ（即ち、組み合わせ１～１０６のうちの１つ）の環状ＲＮＡのうちの少なくとも１つは、浮遊状態のＴ細胞に複数回接触させて、かかる組み合わせの環状ＲＮＡのうちの少なくとも１つ他のものは、浮遊状態のＴ細胞に１回接触させる。一部の実施形態において、かかる組み合わせの環状ＲＮＡの１つ以上は、浮遊状態のＴ細胞に１回、２回、３回、又は４回接触させる。

【0178】

[0197] 一部の実施形態において、血液細胞は、ＮＫ細胞である。一部の実施形態において、かかる組み合わせ（即ち、組み合わせ１～１０６のうちの１つの環状ＲＮＡ）は、浮遊状態のＮＫ細胞に複数回接触させる。一部の実施形態において、かかる組み合わせ（即ち、組み合わせ１～１０６のうちの１つ）の環状ＲＮＡのうちの少なくとも１つは、浮遊状態のＮＫ細胞に複数回接触させて、かかる組み合わせの環状ＲＮＡのうちの少なくとも１つは、浮遊状態のＮＫ細胞に１回接触させる。一部の実施形態において、かかる組み合わせの環状ＲＮＡの１つ以上は、浮遊状態のＮＫ細胞に１回、２回、３回、又は４回接触させる。

【0179】

[0198] 一部の実施形態において、本開示は、浮遊状態のＣＤ３４＋細胞を再プログラム化する方法であって、上記の表３Ａに示されるとおりの組み合わせ１～１０６のいずれか１つに係る環状ＲＮＡの組み合わせにＣＤ３４＋細胞を接触させることを含む方法を提供する。一部の実施形態において、かかる組み合わせ（即ち、組み合わせ１～１０６のうちの１つ）の環状ＲＮＡは、浮遊状態のＣＤ３４＋細胞に複数回接触させる。一部の実施形態において、かかる組み合わせ（即ち、組み合わせ１～１０６のうちの１つ）の環状ＲＮＡのうちの少なくとも１つは、浮遊状態のＣＤ３４＋細胞に複数回接触させて、かかる組み合わせの環状ＲＮＡのうちの少なくとも１つの他のものは、浮遊状態のＣＤ３４＋細胞に１回接触させる。一部の実施形態において、かかる組み合わせの環状ＲＮＡの１つ以上は、浮遊状態のＣＤ３４＋細胞に１回、２回、３回、又は４回接触させる。

【0180】

[0199] 一部の実施形態において、再プログラム化因子は、Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８（例えば、Ｌｉｎ２８Ａ又はＬｉｎ２８Ｂ）、ｃ－Ｍｙｃ、又はＬ－Ｍｙｃである。一部の実施形態において、再プログラム化因子は、Ｏｃｔ３／４である。一部の実施形態において、再プログラム化因子は、Ｋｌｆ４である。一部の実施形態において、再プログラム化因子は、Ｓｏｘ２である。一部の実施形態において、再プログラム化因子は、Ｎａｎｏｇである。一部の実施形態において、再プログラム化因子は、Ｌｉｎ２８（例えば、Ｌｉｎ２８Ａ又はＬｉｎ２８Ｂ）である。一部の実施形態において、再プログラム化因子は、ｃ－Ｍｙｃである。一部の実施形態において、再プログラム化因子は、Ｌ－Ｍｙｃである。

【0181】

[0200] 一部の実施形態において、細胞を再プログラム化する方法（例えばｉＰＳＣを作製する方法）は、２つ以上の環状ＲＮＡに体細胞を接触させることであって、各環状ＲＮＡが、Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８（例えば、Ｌｉｎ２８Ａ又はＬｉｎ２８Ｂ）、ｃ－Ｍｙｃ、及びＬ－Ｍｙｃから選択される再プログラム化因子をコードすること、及び再プログラム化された細胞（例えば、ｉＰＳＣ）が入手される条件下に細胞を維持することを含む。一部の実施形態において、細胞は、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０個、又はそれ以上の環状ＲＮＡであって、各々が、Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８（例えば、Ｌｉｎ２８Ａ又はＬｉｎ２８Ｂ）、ｃ－Ｍｙｃ、又はＬ－Ｍｙｃから選択される再プログラム化因子をコードする環状ＲＮＡに接触させる。

【0182】

[0201] 一部の実施形態において、細胞を再プログラム化する方法（例えば、ｉＰＳＣを作製する方法）は、再プログラム化因子Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８（例えば、Ｌｉｎ２８Ａ又はＬｉｎ２８Ｂ）、及びｃ－Ｍｙｃをコードする６つの環状ＲＮＡに体細胞を接触させることを含む。一部の実施形態において、細胞を再プログラム化する方法（例えば、ｉＰＳＣを作製する方法）は、再プログラム化因子Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８（例えば、Ｌｉｎ２８Ａ又はＬｉｎ２８Ｂ）、及びＬ－Ｍｙｃをコードする６つの環状ＲＮＡに体細胞を接触させることを含む。

【0183】

[0202] 一部の実施形態において、細胞を再プログラム化する方法（例えば、ｉＰＳＣを作製する方法）は、再プログラム化因子Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、及びＬｉｎ２８（例えば、Ｌｉｎ２８Ａ又はＬｉｎ２８Ｂ）をコードする５つの環状ＲＮＡに体細胞を接触させることを含む。一部の実施形態において、本方法は、ｃ－Ｍｙｃ又はＬ－Ｍｙｃをコードする環状ＲＮＡに体細胞を接触させることを含まない。

【0184】

[0203] 一部の実施形態において、細胞を再プログラム化する方法（例えば、ｉＰＳＣを作製する方法）は、再プログラム化因子Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、及びｃ－Ｍｙｃをコードする４つの環状ＲＮＡに体細胞を接触させることを含む。一部の実施形態において、細胞を再プログラム化する方法（例えば、ｉＰＳＣを作製する方法）は、再プログラム化因子Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、及びＬ－Ｍｙｃをコードする４つの環状ＲＮＡに体細胞を接触させることを含む。一部の実施形態において、本方法は、Ｎａｎｏｇ及び／又はＬｉｎ２８（例えば、Ｌｉｎ２８Ａ又はＬｉｎ２８Ｂ）をコードする環状ＲＮＡに体細胞を接触させることを含まない。

【0185】

[0204] 一部の実施形態において、細胞を再プログラム化する方法（例えば、ｉＰＳＣを作製する方法）は、再プログラム化因子Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、及びＳｏｘ２をコードする３つの環状ＲＮＡに体細胞を接触させることを含む。一部の実施形態において、本方法は、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８（例えば、Ｌｉｎ２８Ａ又はＬｉｎ２８Ｂ）、ｃ－Ｍｙｃ、及び／又はＬ－ｍｙｃをコードする環状ＲＮＡに体細胞を接触させることを含まない。

【0186】

[0205] 一部の実施形態において、体細胞を再プログラム化する（例えば、ｉＰＳＣを作製する）方法は、１つ以上の再プログラム化因子をコードする１つ以上の環状ＲＮＡに体細胞を接触させることを含み、更に、細胞の再プログラム化を助け得る補助的因子をコードする少なくとも１つの追加のＲＮＡポリヌクレオチド（例えば、線状ＲＮＡポリヌクレオチド又は環状ＲＮＡ）に細胞を接触させることを含む。一部の実施形態において、補助的因子は、ｍｉＲＮＡ（例えば、ｍｉＲＮＡ３０２（ａ～ｄ）、ｍｉＲ３６７、ｍｉＲ７６６、ｍｉＲ２００ｃ、ｍｉＲ３６９、ｍｉＲ３７２、Ｌｅｔ７、ｍｉＲ１９ａ／ｂ）、長鎖非コードＲＮＡ（例えば、ＬＩＮｃＲＮＡ－ＲＯＲ）、及び外因性ｃｉｒｃＲＮＡ（例えば、ｃｉｒｃＢＩＲＣ６、ｃｉｒｃＣＯＲＯ１Ｃ、又はｃｉｒｃＭＡＮ１Ａ２、ｃｉｒｃＢＩＲＣ６、ｃｉｒｃＣＯＲＯ１Ｃ及びｃｉｒｃＭＡＮ１Ａ２）、又はウイルスタンパク質（例えば、表２に記載されるもの）から選択される。一部の実施形態において、体細胞を再プログラム化する（例えば、ｉＰＳＣを作製する）方法は、１つ以上の再プログラム化因子をコードする１つ以上の環状ＲＮＡに体細胞を接触させることを含み、更に、ビタミンＣ、バルプロ酸、ＣＨＩＲ９９０２１、パルネート（Parnate）、ＳＢ４３１５４２、ＰＤ０３２５９０１、ＢＩＸ－０１２９４、リチウム マキサジラン、８－Ｂｒ－ｃＡＭＰ、Ａ－８３－０１、チアゾビビン（Tiazovivin）、Ｙ－２７６３２、ＥＰＺ００４７７７、及びＤＡＰＴから選択される少なくとも１つの追加の外因性因子に細胞を接触させることを含む。

【0187】

[0206] 一部の実施形態において、体細胞を再プログラム化する（例えば、ｉＰＳＣを作製する）方法は、１つ以上の再プログラム化因子をコードする１つ以上の環状ＲＮＡに体細胞を接触させることを含み、細胞の再プログラム化を助け得る補助的因子をコードする任意の追加のＲＮＡポリヌクレオチド（例えば、線状ＲＮＡポリヌクレオチド又は環状ＲＮＡ）に細胞を接触させることを含まない。一部の実施形態において、体細胞を再プログラム化する（例えば、ｉＰＳＣを作製する）方法は、１つ以上の再プログラム化因子をコードする１つ以上の環状ＲＮＡに体細胞を接触させることを含み、細胞の再プログラム化を助ける補助的因子に細胞を接触させることを含まない。

【0188】

[0207] 細胞を再プログラム化する方法において使用される一部の実例的なＲＮＡの組み合わせを以下の表４に示す。表４では、各行が、細胞と接触させることのできる異なる組み合わせを表し、ここで「Ｘ」は、そのＲＮＡを細胞に接触させることを指示している。例えば、組み合わせ１番では、細胞は、再プログラム化因子をコードする環状ＲＮＡに接触させる。組み合わせ１５番では、細胞は、再プログラム化因子をコードする環状ＲＮＡ、いかなるタンパク質又はｍｉＲＮＡもコードしない環状ＲＮＡ、ｍｉＲＮＡをコードする環状又は線状ＲＮＡ、及びウイルスタンパク質をコードする環状又は線状ＲＮＡに接触させる。

【0189】

【表13】

【0190】

[0208] 接触は、トランスフェクション、エレクトロポレーション、及び／又はｃｉｒｃＲＮＡ－ＬＮＰ複合体の使用によるなど、上記に記載される方法のいずれによっても実施し得る。一部の実施形態において、接触は、再プログラム化因子をコードする環状ＲＮＡなど、１つ以上の環状ＲＮＡと共に細胞をインキュベートすることを含む。

【0191】

[0209] 一部の実施形態において、ｉＰＳＣの作製方法は、再プログラム化されたｉＰＳＣが入手される条件下に細胞を維持することを含み得る。かかる条件は当業者に公知であり、細胞型によって異なり得る。一例として、初めに、体細胞を適切な培地が入ったフラスコに入れ、ｃｉｒｃＲＮＡと接触させる当日（０日目）にそれが約７５％～約９０％コンフルエントとなるようにし得る。次に細胞をｃｉｒｃＲＮＡと（例えば、トランスフェクションにより）接触させ得る。トランスフェクトされた細胞を培養皿に入れ、一晩インキュベートし得る。次の１０～１４日間、必要に応じて培地を交換し得る。一部の実施形態では、培地に１つ以上の追加の薬剤を補足して細胞の再プログラム化を亢進させ得る。ｉＰＳＣコロニーの出現に関して細胞をモニタしてもよく、ｉＰＳＣコロニーをピッキングし、拡大培養のため別の皿に移し替える。

【0192】

[0210] ｉＰＳＣの多能性を確認するため、単離したクローンを１つ以上の幹細胞マーカーの発現に関して試験することができる。幹細胞マーカーは、例えば、Ｏｃｔ４、Ｌｉｎ２８（例えば、Ｌｉｎ２８Ａ又はＬｉｎ２８Ｂ）、ＳＯＸ２、ＳＳＥＡ４、ＳＳＥＡ３、ＴＲＡ－１－８１、ＴＲＡ－１－６０、ＣＤ９、Ｎａｎｏｇ、Ｆｂｘｌ５、Ｅｃａｔｌ、Ｅｓｇｌ、Ｅｒａｓ、Ｇｄｆ３、Ｆｇｆ４、Ｃｒｉｐｔｏ、Ｄａｘｌ、Ｚｐｆ２９６、Ｓｌｃ２ａ３、Ｒｅｘｌ、Ｕｔｆｌ、及びＮａｔ１から選択することができる。かかるマーカーの発現の検出方法としては、例えば、ＲＴ－ＰＣＲ及びコードされるポリペプチドの存在を検出する免疫学的方法を挙げることができる。

【0193】

[0211] 一部の実施形態において、細胞の多能性は、細胞が３胚葉の各々の細胞に分化する能力を測定することにより確認される。一部の実施形態において、免疫無防備状態のげっ歯類における奇形腫形成を用いて、単離されたクローンの多能性の性質を判定することができる。

【0194】

[0212] 一部の実施形態において、ｃｉｒｃＲＮＡ再プログラム化では、（線状ＲＮＡベースの手法と比較したとき）ｉＰＳＣ再プログラム化を実現するのに必要なトランスフェクションの頻度が低く、及び／又はその回数が少ない。例えば、ｃｉｒｃＲＮＡ再プログラム化では、線状ＲＮＡベースの手法と比較したとき、再プログラム化を実現するのに必要なトランスフェクションが約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、又は約１００％少なくて済み得る。

【0195】

[0213] 一部の実施形態において、ｃｉｒｃＲＮＡ再プログラム化によると、線状ＲＮＡベースの手法と比較して再プログラム化効率が亢進する。「再プログラム化効率」とは、出発細胞集団からのｉＰＳＣ生成の定量的又は定性的尺度を指す。再プログラム化効率の読取り値としては、再プログラム化プロトコル中の特定の時点で（コロニー形成速度の評価として）又は再プログラム化プロトコルの完了時に（特定のプロトコルの間に生成されたｉＰＳＣコロニーの総数の評価として）存在するｉＰＳＣコロニー数の定量化が挙げられる。ｉＰＳＣコロニーは、定量的に（多能性マーカーに関して染色し、染色された細胞の数をカウントすることによるなど）又は定性的に形態学的特徴（例えば、コロニー中の各細胞が多かれ少なかれ均一な形状及び直径を有し、コロニーが明確に定められた境界を含み、且つｉＰＳＣコロニー内の細胞が高い核対細胞質比及び顕著な核小体を含むような密に詰まった細胞）の評価によって同定することができる。再プログラム化効率としてはまた、様々な再プログラム化プロトコル間でのｉＰＳＣコロニーの相対的成熟度の評価も挙げることができる。ｉＰＳＣコロニーの成熟は、上記に指摘した形態学的特徴により決定することができる。

【0196】

[0214] 再プログラム化効率の増加とは、２つ以上の再プログラム化プロトコルを比較したときの再プログラム化効率についての１つ以上の読取り値の増加を指す。例えば、及び本実施例に詳述するとおり、ｃｉｒｃＲＮＡがコードする再プログラム化因子で再プログラム化すると、線状ＲＮＡがコードする再プログラム化因子による再プログラム化と比較して再プログラム化効率が増加する。

【0197】

[0215] 一部の実施形態において、再プログラム化効率の増加は、初回再プログラム化プロトコルの終わりに存在する総ｉＰＳＣコロニー数の、２回目及び／又は３回目の再プログラム化プロトコルの終わりに存在する総ｉＰＳＣコロニー数と比較した増加を含む。一部の実施形態において、再プログラム化効率の増加は、初回再プログラム化プロトコル中の特定の時点で存在する総ｉＰＳＣコロニー数の、２回目及び／又は３回目の再プログラム化プロトコル中の同じ時点で存在する総ｉＰＳＣコロニー数と比較した増加（即ち、ｉＰＳＣコロニー形成速度の増加）を含む。

【0198】

細胞の分化転換方法
[0216] 本明細書には、環状ＲＮＡを使用した細胞の分化転換方法が提供される。一部の実施形態において、細胞を第１の細胞型から第２の細胞型に直接変換する方法は、本明細書に記載されるとおりの環状ＲＮＡ又はその組成物に細胞を接触させること、及び細胞が第２の細胞型に変換される条件下に細胞を維持することを含む。一部の実施形態において、細胞は中間的な多能性状態には入らない。一部の実施形態において、細胞は第１の細胞型から第２の細胞型に直接変換され、前駆細胞になることはない。

【0199】

[0217] 一部の実施形態において、環状ＲＮＡは、細胞を第１の細胞型から第２の細胞型に分化転換させる能力を有する１つ以上の分化転換因子をコードする。一部の実施形態において、再プログラム化因子（例えば、表１にある再プログラム化因子）は、所与のコンテクストでは、又は他の分化転換因子と組み合わせて使用されるときには分化転換因子として機能することができる。例えば、Ｓｏｘ２は、体細胞からｉＰＳＣへの再プログラム化で使用されるとき再プログラム化因子として機能するが、第１の体細胞（例えば、線維芽細胞）から第２の体細胞（例えば、神経幹細胞又は心筋細胞）への分化転換において使用されるときには分化転換因子として機能する。一部の実施形態において、環状ＲＮＡは、ＭｙｏＤ、Ｃ／ＥＢＰα、Ｃ／ＥＢＰβ、Ｐｄｘ１、Ｎｇｎ３、Ｍａｆａ、Ｐｄｘ１、Ｈｎｆ４α、Ｆｏｘａ１、Ｆｏｘａ２、Ｆｏｘａ３、Ａｓｃｌ１（別名Ｍａｓｈ１）、Ｂｒｎ２、Ｍｙｔ１ｌ、ｍｉＲ－１２４、Ｂｒｎ２、Ｍｙｔ１ｌ、Ａｓｃｌ１、Ｎｕｒｒ１、Ｌｍｘ１ａ、Ａｓｃｌ１、Ｂｒｎ２、Ｍｙｔ１ｌ、Ｌｍｘ１ａ、ＦｏｘＡ２、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４及びｃ－Ｍｙｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｆ２ｃ、Ｇａｔａ－４、及び／又はＭｅｓｐ１をコードする。一部の実施形態において、環状ＲＮＡは、表１に掲載される１つ以上の再プログラム化因子をコードする。

【0200】

[0218] 一部の実施形態において、第１の細胞型は、ｉＰＳＣである。一部の実施形態において、第１の細胞型は、分化した線維芽細胞である。

【0201】

[0219] 一部の実施形態において、第２の細胞型は、筋細胞、ニューロン、心筋細胞、肝細胞、腎細胞、軟骨細胞、骨細胞、島細胞、角化細胞、Ｔ細胞、又はＮＫ細胞である。一部の実施形態において、第２の細胞型は、筋細胞、ニューロン、心筋細胞、肝細胞、膵島細胞、角化細胞、Ｔ細胞、又はＮＫ細胞である。

【0202】

[0220] 一部の実施形態において、細胞を第１の細胞型から第２の細胞型に直接変換する方法は、細胞を複数の環状ＲＮＡに接触させることを含み、ここで各環状ＲＮＡは、表５に掲載される組み合わせのうちの１つに係る分化転換因子をコードする。

【0203】

[0221] 一部の実施形態において、細胞を第１の細胞型から第２の細胞型に直接変換する方法は、細胞を複数の環状ＲＮＡに接触させることを含み、ここで各環状ＲＮＡは、表５に掲載される分化転換因子をコードする。一部の実施形態において、細胞は、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０個、又はそれ以上の環状ＲＮＡに接触する。

【0204】

[0222] 一部の実施形態において、細胞を第１の細胞型から第２の細胞型に直接変換する方法は、細胞を２つの環状ＲＮＡに接触させること、及び細胞が第２の細胞型に変換される条件下に細胞を維持することを含む。一部の実施形態において、第１及び第２の環状ＲＮＡは、各々、表５に掲載される分化転換因子をコードし、ここで第１及び第２の環状ＲＮＡは、同じ分化転換因子をコードしない。

【0205】

[0223] 一部の実施形態において、細胞を第１の細胞型から第２の細胞型に直接変換する方法は、細胞を３つの環状ＲＮＡに接触させること、及び細胞が第２の細胞型に変換される条件下に細胞を維持することを含む。一部の実施形態において、第１、第２、及び第３の環状ＲＮＡは、各々、表５に掲載される分化転換因子をコードし、ここで第１、第２、及び第３の環状ＲＮＡは、同じ分化転換因子をコードしない。

【0206】

[0224] 一部の実施形態において、細胞を第１の細胞型から第２の細胞型に直接変換する方法は、細胞を４つの環状ＲＮＡに接触させること、及び細胞が第２の細胞型に変換される条件下に細胞を維持することを含む。一部の実施形態において、第１、第２、第３、及び第４の環状ＲＮＡは、各々、表５に掲載される分化転換因子をコードし、ここで第１、第２、第３、及び第４の環状ＲＮＡは、同じ分化転換因子をコードしない。

【0207】

[0225] 一部の実施形態において、細胞を第１の細胞型から第２の細胞型に直接変換する方法は、細胞を５つの環状ＲＮＡに接触させること、及び細胞が第２の細胞型に変換される条件下に細胞を維持することを含む。一部の実施形態において、第１、第２、第３、第４、及び第５の環状ＲＮＡは、各々、表５に掲載される分化転換因子をコードし、ここで第１、第２、第３、第４及び第５の環状ＲＮＡは、同じ分化転換因子をコードしない。

【0208】

[0226] 一部の実施形態において、細胞を第１の細胞型から第２の細胞型に直接変換する方法は、細胞を６つの環状ＲＮＡに接触させること、及び細胞が第２の細胞型に変換される条件下に細胞を維持することを含む。一部の実施形態において、第１、第２、第３、第４、第５、及び第６の環状ＲＮＡは、各々、表５に掲載される分化転換因子をコードし、ここで第１、第２、第３、第４、第５及び第６の環状ＲＮＡは、同じ分化転換因子をコードしない。

【0209】

[0227] 一部の実施形態において、細胞を第１の細胞型から第２の細胞型に直接変換する方法は、細胞を７つの環状ＲＮＡに接触させること、及び細胞が第２の細胞型に変換される条件下に細胞を維持することを含む。一部の実施形態において、第１、第２、第３、第４、第５、及び第６の環状ＲＮＡは、各々、表５に掲載される分化転換因子をコードし、ここで第１、第２、第３、第４、第５、及び第６の環状ＲＮＡは、同じ分化転換因子をコードしない。

【0210】

[0228] 一部の実施形態において、細胞を第１の細胞型から第２の細胞型に直接変換する方法は、細胞を複数の環状ＲＮＡに接触させること、及び細胞が第２の細胞型に変換される条件下に細胞を維持することを含む。一部の実施形態において、環状ＲＮＡの各々は、各々、表５に掲載される分化転換因子をコードし、ここで環状ＲＮＡのいずれも、同じ分化転換因子をコードしない。

【0211】

[0229] 一部の実施形態において、細胞は、表５に掲載される１つ以上の再プログラム化因子をコードする環状ＲＮＡに接触させる。一部の実施形態において、細胞を表５に示されるとおりの第１の細胞型から表５に示されるとおりの第２の細胞型に直接変換する方法は、表５に掲載される１つ以上の再プログラム化因子をコードする環状ＲＮＡに細胞を接触させること、及び細胞が第２の細胞型に変換される条件下に細胞を維持することを含む。第１の細胞型は、例えば、表５に掲載される細胞型のいずれかであり得る。第２の細胞型は、例えば、表５に掲載される細胞型のいずれかであり得る。

【0212】

[0230] 一部の実施形態において、本開示は、１つ以上の環状ＲＮＡを含む組成物を提供し、ここで各環状ＲＮＡは、表５に掲載される分化転換因子の１つ以上をコードする。一部の実施形態において、本開示は、複数の環状ＲＮＡを含む組成物を提供し、各環状ＲＮＡが、表５に掲載される分化転換因子の少なくとも１つをコードする。

【0213】

[0231] 一部の実施形態において、細胞の分化転換方法は、１つ以上の環状ＲＮＡに細胞を接触させることを含み、ここで環状ＲＮＡの各々は、表５に掲載される分化転換因子をコードする。一部の実施形態において、細胞の分化転換方法は、１つ以上の環状ＲＮＡに細胞を接触させることを含み、ここで環状ＲＮＡの各々は、表５に掲載される分化転換因子をコードし、ここで細胞は、表５に掲載される「第１の細胞型」のいずれか１つである。

【0214】

[0232] 一部の実施形態において、細胞の分化転換方法は、表５に示される任意の組み合わせ番号の列Ａに掲載される第１の細胞型を、その同じ分化転換組み合わせの列Ｂに示される対応する１つ又は複数の分化転換因子に接触させることにより、その同じ組み合わせ番号の列Ｃに示される第２の細胞型を作製することを含み、ここで列Ｂに示される少なくとも１つの分化転換因子は、環状ＲＮＡによってコードされる。一部の実施形態において、所与の分化転換組み合わせについて列Ｂに示される１つ又は複数の分化転換因子の全てが、１つ以上の環状化されたＲＮＡによってコードされる。一部の実施形態において、第１の細胞型は、組み合わせ番号１～１５１のいずれか１つについて列Ｂに掲載される分化転換因子を使用して第２の細胞型に分化転換される。一部の実施形態において、第１の細胞型は、組み合わせ番号１～１５１のいずれか１つについて列Ａに掲載される細胞型のいずれか１つである。一部の実施形態において、第２の細胞型は、組み合わせ番号１～１５１のいずれか１つについて列Ｃに掲載される第２の細胞型のいずれか１つである。

【0215】

【表14】

【0216】

【表15】

【0217】

【表16】

【0218】

【表17】

【0219】

【表18】

【0220】

【表19】

【0221】

【表20】

【0222】

[0233] 接触は、上記に記載される方法のいずれによっても（例えば、トランスフェクション、エレクトロポレーション、及び／又はｃｉｒｃＲＮＡ－ＬＮＰ複合体の使用による）実施し得る。

【0223】

[0234] 一部の実施形態において、細胞は、環状ＲＮＡに１回接触する。一部の実施形態において細胞は、環状ＲＮＡに２回以上、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０回接触する。一部の実施形態において、接触は、有効な間隔で実施される。有効な間隔は、例えば、１日１回、隔日に１回、３日に１回、週１回、２週間に１回、又は月１回であり得る。

【0224】

[0235] 上記に説明したとおり、細胞を第１の細胞型から第２の細胞型に直接変換する方法は、細胞が第２の細胞型に変換される条件下に細胞を維持することを含み得る。かかる条件は当業者に公知であり、細胞型によって異なり得る。一例として、細胞を１つ以上の環状ＲＮＡに接触させた後、任意選択で様々な再プログラム化因子を補足した標準培地中でそれらの細胞を培養することができる。細胞をモニタして、形態、及び第２の細胞型に特徴的なマーカーの存在を観察することになる。

【0225】

[0236] また、本明細書には、本明細書に記載される方法を用いて作製される分化転換細胞も提供される。

【0226】

[0237] また、本明細書には、分化転換細胞を含む組成物も提供され、ここで分化転換細胞は、分化転換因子をコードする１つ以上の環状ＲＮＡを含む。一部の実施形態において、分化転換因子は、表５に掲載される分化転換因子又は分化転換因子の組み合わせのいずれか１つである。一部の実施形態において、分化転換細胞は、表５に掲載される第２の細胞型のいずれか１つである。一部の実施形態において、分化転換細胞は、表５に掲載される第１の細胞型のうちのいずれか１つである第１の細胞型から誘導される。

【0227】

環状ＲＮＡを使用したｉＰＳＣの分化
[0238] また、本明細書に記載される方法を用いて作製されるｉＰＳＣも提供される。一部の実施形態において、ｉＰＳＣは、Ｏｃｔ４、ＳＯＸ２、Ｌｉｎ２８、ＳＳＥＡ４、ＳＳＥＡ３、ＴＲＡ－１－８１、ＴＲＡ－１－６０、ＣＤ９、Ｎａｎｏｇ、Ｆｂｘｌ５、Ｅｃａｔｌ、Ｅｓｇｌ、Ｅｒａｓ、Ｇｄｆ３、Ｆｇｆ４、Ｃｒｉｐｔｏ、Ｄａｘｌ、Ｚｐｆ２９６、Ｓｌｃ２ａ３、Ｒｅｘｌ、Ｕｔｆｌ、及びＮａｔ１のうちの１つ以上を発現する。

【0228】

[0239] また、本明細書には、本明細書に記載される方法を用いて作製されるｉＰＳＣから誘導された分化細胞も提供される。ｉＰＳＣの分化方法は、当業者に公知である。一部の実施形態において、分化細胞は、筋細胞、神経系細胞、中枢神経系細胞、眼細胞、軟骨細胞、骨細胞、腱細胞、心筋細胞、肝細胞、腎細胞、膵島細胞、角化細胞、Ｔ細胞、又はＮＫ細胞である。一部の実施形態において、分化細胞は、限定はされないが、例えば－筋肉、神経、眼、軟骨、骨、結合組織、心臓、肝臓、腎臓、膵臓、皮膚、又は造血系統に属する細胞型である。

【0229】

[0240] 一部の実施形態において、本明細書に記載されるｉＰＳＣ（又は本明細書に記載されない方法を用いて作製されたｉＰＳＣ）は、分化因子をコードする１つ以上の環状ＲＮＡにｉＰＳＣを接触させることにより分化させてもよい。例えば、一部の実施形態において、ｉＰＳＣは、Ｔ細胞など、目的の細胞型へとｉＰＳＣを分化させる能力を有する分化因子をコードする環状ＲＮＡ、又はそれをコードするＤＮＡ分子に接触させる。一部の実施形態において、分化因子は、ＲＯＲＡ、ＨＬＦ、ＭＹＢ、ＫＬＦ４、ＥＲＧ、ＳＯＸ４、ＬＵＣ、ＨＯＸＡ９、ＨＯＸＡ１０、及びＨＯＸＡ５から選択される。一部の実施形態において、ｉＰＳＣは、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、又は少なくとも１１個の環状ＲＮＡに接触し、ここで各環状ＲＮＡは、ＲＯＲＡ、ＨＬＦ、ＭＹＢ、ＫＬＦ４、ＥＲＧ、ＳＯＸ４、ＬＵＣ、ＨＯＸＡ９、ＨＯＸＡ１０、及びＨＯＸＡ５から選択される分化因子をコードする。一部の実施形態において、ｉＰＳＣは、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、又は少なくとも５個の環状ＲＮＡに接触し、ここで各環状ＲＮＡは、ＨＯＸＡ９、ＥＲＧ、ＲＯＲＡ、ＳＯＸ４、又はＭＹＢから選択される分化因子をコードする。一部の実施形態において、ｉＰＳＣは、複数の環状ＲＮＡに接触し、ここで各環状ＲＮＡは、ＨＯＸＡ９、ＥＲＧ、ＲＯＲＡ、ＳＯＸ４、又はＭＹＢのうちの少なくとも１つをコードする。一部の実施形態において、ｉＰＳＣは、少なくとも１つの環状ＲＮＡに接触し、ここでｃｉｒｃＲＮＡは、表６に掲載される分化因子の１つ以上をコードする。一部の実施形態において、ｉＰＳＣは、加えてＥＺＨ１ ｓｈＲＮＡに接触する。ＥＺＨ１ ｓｈＲＮＡが発現すると、系統限定的な造血前駆細胞から多リンパ系の潜在能力のある前駆細胞への切替えが容易になり得る。

【0230】

[0241] 一部の実施形態において、ｉＰＳＣはＣＤ３４＋ＣＤ３８－細胞に分化する。一部の実施形態において、以下の分化因子のうちの１つ以上をコードする環状ＲＮＡの１つ以上にｉＰＳＣを接触させると、ｉＰＳＣがＣＤ３４＋ＣＤ３８－細胞に分化する：ＲＯＲＡ、ＨＬＦ、ＭＹＢ、ＫＬＦ４、ＥＲＧ、ＳＯＸ４、ＬＵＣ、ＨＯＸＡ９、ＨＯＸＡ１０、又はＨＯＸＡ５。

【0231】

[0242] 一部の実施形態においてＣＤ３４＋ＣＤ４５＋骨髄前駆細胞を、ＲＯＲＡ、ＨＬＦ、ＭＹＢ、ＫＬＦ４、ＥＲＧ、ＳＯＸ４、ＬＵＣ、ＨＯＸＡ９、ＨＯＸＡ１０、又はＨＯＸＡ５の１つ以上をコードする環状ＲＮＡ、又はそれをコードするＤＮＡ分子に接触させる。一部の実施形態においてＣＤ３４＋ＣＤ４５＋骨髄前駆細胞を、ＨＯＸＡ９、ＥＲＧ、ＲＯＲＡ、ＳＯＸ４、又はＭＹＢの１つ以上をコードする環状ＲＮＡ、又はそれをコードするＤＮＡ分子に接触させる。一部の実施形態において、上記に記載されるとおりｉＰＳＣを１つ以上の環状ＲＮＡに接触させると、ＣＤ３４＋ＣＤ４５＋細胞がＣＤ３４＋ＣＤ３８－細胞に分化転換する。一部の実施形態において、接触後に生じる細胞は、赤血球系及びリンパ系の潜在能力のある自己再生性ＨＳＰＣ（造血幹細胞・前駆細胞）である。

【0232】

[0243] 一部の実施形態において、本明細書に記載される方法を用いて作製されるｉＰＳＣは、再プログラム化因子をコードするウイルスベクターの使用又は再プログラム化因子をコードする線状ＲＮＡのトランスフェクションなど、従来方法を用いて作製されるｉＰＳＣと比較したとき、より若い。本明細書に記載されるとき、「より若い」とは、従来方法と比較したとき（即ち、約９日又はそれ以上）、その細胞がより速く（即ち、トランスフェクション後約５、約６、約７、又は約８日以内に）再プログラム化されることを指す。

【0233】

[0244] 一部の実施形態において、本ｉＰＳＣは、従来方法を用いて作製されるｉＰＳＣと比較したとき、１つ以上のバイオマーカーを異なるレベルで発現する。例えば、一部の実施形態において、本ｉＰＳＣは、従来方法を用いて作製されるｉＰＳＣと比較したとき、細胞ストレス及び／又は細胞死（アポトーシス）に関連するマーカーの発現レベルがより低い。例えば、一部の実施形態において、本ｉＰＳＣは、１つ以上の熱ショックタンパク質又はカスパーゼの発現レベルがより低い。

【0234】

[0245] 一部の実施形態において、本ｉＰＳＣのゲノムは、従来方法を用いて作製されるｉＰＳＣと比較したとき、異なる後成的修飾を有する。例えば、一部の実施形態において、本ｉＰＳＣは、変化したレベルのＤＮＡメチル化及び／又はヒストン修飾を含み得る。

【0235】

[0246] 一部の実施形態において、Ｔ細胞の有効性を改善することのできる因子をコードする１つ以上の環状ＲＮＡ（又はそれをコードするＤＮＡ分子）にＴ細胞を接触させる。これに関連して、有効性の改善とは、免疫腫瘍学セッティングで使用されるとき、Ｔ細胞の生存、及び／又はその抗腫瘍活性を促進することを指す。例えば、Ｔ細胞は、ＩＬ－１２、ＩＬ－１８、ＩＬ－１５、又はＩＬ－７をコードする１つ以上の環状ＲＮＡに接触させてもよい。

【0236】

[0247] 一部の実施形態において、Ｔ細胞は、Ｔ細胞が腫瘍組織にホーミングする能力を改善する１つ以上の環状ＲＮＡ（又はそれをコードするＤＮＡ分子）に接触させる。例えば、Ｔ細胞は、ＣＸＣＲ２、ＣＣＲ２Ｂ、又はヘパラナーゼをコードする１つ以上の環状ＲＮＡに接触させてもよい。

【0237】

[0248] 一部の実施形態において、Ｔ細胞は、生存の改善及び／又はセントラルメモリー表現型へのスイッチングの促進を助ける１つ以上の環状ＲＮＡ（又はそれをコードするＤＮＡ分子）に接触させる。例えば、Ｔ細胞は、Ｓｕｖ３９ｈ１をコードする１つ以上の環状ＲＮＡに接触させてもよい。

【0238】

細胞のゲノムの再プログラム化及び編集のための組み合わせ方法
[0249] ｉＰＳＣの生成方法をそのゲノム編集方法と組み合わせることにより、ｉＰＳＣの診断力及び治療力が亢進する。本明細書で使用されるとき、用語「ゲノム編集」及び「ゲノムを編集すること」は、細胞の核酸（例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡ）の特異的遺伝子座の修飾を指す。ゲノム編集は、罹患患者に由来する、病変の原因となる遺伝子突然変異を修正することができ、同様に無疾患の野生型細胞（ｉＰＳＣなど）に特異的突然変異を誘導するために使用することもできる。よって、本開示は、細胞のゲノムの再プログラム化及び編集のための組み合わせ方法を提供する。一部の実施形態において、本明細書に記載される環状ＲＮＡは、細胞のゲノムの再プログラム化及び編集方法において使用し得る。

【0239】

[0250] ゲノム編集は、例えば、遺伝子修飾領域に二本鎖ＤＮＡ切断を誘導することを含み得る。一部の実施形態において、ターゲティングベクターを補足することにより、ＤＮＡの遺伝子座が外因性の配列に置き換えられる。以下の酵素：ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ホーミングエンドヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ（転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ）、ＮｇＡｇｏ（アルゴノートエンドヌクレアーゼ）、ＳＧＮ（構造ガイド型エンドヌクレアーゼ）、ＲＧＮ（ＲＮＡガイド型ヌクレアーゼ）、又はこれらの修飾された若しくはトランケートされたバリアントのうちのいずれか１つを使用して細胞のＤＮＡを編集し得る。一部の実施形態において、ＲＮＡガイド型ヌクレアーゼは、国際公開第２０１９／２３６５６６号（例えば、ＡＰＧ０５０８３．１、ＡＰＧ０７４３３．１、ＡＰＧ０７５１３．１、ＡＰＧ０８２９０．１、ＡＰＧ０５４５９．１、ＡＰＧ０４５８３．１、及びＡＰＧ１６８８．１ ＲＮＡガイド型ヌクレアーゼ）、国際公開第２０２１／０３０３４４号（例えば、ＡＰＧ０５７３３．１、ＡＰＧ０６２０７．１、ＡＰＧ０１６４７．１、ＡＰＧ０８０３２．１、ＡＰＧ０５７１２．１、ＡＰＧ０１６５８．１、ＡＰＧ０６４９８．１、ＡＰＧ０９１０６．１、ＡＰＧ０９８８２．１、ＡＰＧ０２６７５．１、ＡＰＧ０１４０５．１、ＡＰＧ０６２５０．１、ＡＰＧ０６８７７．１、ＡＰＧ０９０５３．１、ＡＰＧ０４２９３．１、ＡＰＧ０１３０８．１、ＡＰＧ０６６４６．１、ＡＰＧ０９７４８、及びＡＰＧ０７４３３．１ ＲＮＡガイド型ヌクレアーゼ）、及び国際公開第２０２０／１３９７８３号（ＡＰＧ００９６９、ＡＰＧ０３１２８、ＡＰＧ０９７４８、ＡＰＧ００７７１、ＡＰＧ０２７８９、ＡＰＧ０９１０６、ＡＰＧ０２３１２、ＡＰＧ０７３８６、ＡＰＧ０９９８０、ＡＰＧ０５８４０、ＡＰＧ０５２４１、ＡＰＧ０７２８０、ＡＰＧ０９８６６、ＡＰＧ００８６８ ＲＮＡガイド型ヌクレアーゼ）（これらの各々は、本明細書において全体として参照により援用される）のいずれか１つに開示されるＲＮＡガイド型ヌクレアーゼである。一部の実施形態において、ＲＮＡガイド型ヌクレアーゼは、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ、Ｃａｓ１２（ａ）ヌクレアーゼ（Ｃｐｆ１）、Ｃａｓ１２ｂヌクレアーゼ、Ｃａｓ１２ｃヌクレアーゼ、ＴｒｐＢ様ヌクレアーゼ、Ｃａｓ１３ａヌクレアーゼ（Ｃ２ｃ２）、Ｃａｓ１３ｂヌクレアーゼ、Ｃａｓ１４ヌクレアーゼ又はこれらの修飾された若しくはトランケートされたバリアントである。

【0240】

[0251] 一部の実施形態において、Ｃａｓ９ヌクレアーゼを使用して細胞のゲノムを編集する。Ｃａｓ９は、２つの推定ヌクレアーゼドメイン、ＨＮＨ及びＲｕｖＣ様を有する大型の多機能タンパク質である。ＨＮＨ及びＲｕｖＣ様ドメインは、それぞれ、ｃｒＲＮＡの相補的な２０ヌクレオチド配列及びその相補鎖の反対側のＤＮＡ鎖を切断する。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムの幾つかのバリアントが存在し、それらのバリアントのいずれか１つを本明細書に開示される方法において使用し得る：（１）元のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムは、シングルＲＮＡによって導かれる野生型Ｃａｓ９ヌクレアーゼが惹起するＤＮＡ二本鎖切断を誘導することにより機能する。（２）Ｃａｓ９ ＨＮＨドメイン又はＲｕｖＣ様ドメインのいずれかの突然変異によって生成されるＣａｓ９のニッカーゼバリアント（Ｄ１０Ａ突然変異体）は、対を成すガイドＲＮＡによって導かれる。（３）特異性が亢進したＣａｓ９の操作されたヌクレアーゼバリアント（ｅＳｐＣａｓ９）。（４）触媒的に不活性なデッドＣａｓ９（ｄＣａｓ９）バリアントは、両方のドメイン（ＨＮＨ及びＲＵｖＣ様）を突然変異させることによって生成される。ｄＣａｓ９は、転写抑制因子又は活性化因子と合わせて一つにすると、内因性遺伝子の転写を修飾することができ（ＣＲＩＳＰＲａ又はＣＲＩＳＰＲｉ）、又は蛍光タンパク質と融合すると、ゲノム遺伝子座を画像化するために使用することができる。（５）ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９をシチジンデアミナーゼと融合すると、シチジンからウリジンへの直接の変換を誘導する、ひいてはＤＮＡ二本鎖切断を回避するバリアントが生じる。一部の実施形態において、Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、化膿レンサ球菌（S. pyogenes）又は黄色ブドウ球菌（S. aureus）から単離され、又はそれに由来する。

【0241】

[0252] Ｃａｓ９、及び他のＲＮＡガイド型ヌクレアーゼは、特異的遺伝子座を標的化するためにＲＮＡガイド配列（「ガイドＲＮＡ」又は「ｇＲＮＡ」）を必要とする。一部の実施形態において、ｇＲＮＡは、シングルガイド（「ｓｇＲＮＡ」）である。ｓｇＲＮＡは、スペーサー配列と足場配列とを含み得る。スペーサー配列は標的切断配列と相補的で、そこに酵素を向かわせる。足場領域はＲＮＡガイド型ヌクレアーゼ酵素に結合する。

【0242】

[0253] 細胞のＲＮＡの編集に使用し得る例示的酵素としては、限定はされないが、ＡＤＡＲ（ＲＮＡに作用するアデノシンデアミナーゼ）ファミリーの酵素が挙げられる。例えば、酵素は、ヒトＡＤＡＲ１、ＡＤＡＲ２、又はＡＤＡＲ３、又はこれらの修飾された若しくはトランケートされたバリアントであり得る。一部の実施形態において、酵素は、ｓｑＡＤＡＲ２など、イカ（例えば、アメリカケンサキイカ（Loligo pealeii））由来のＡＤＡＲ、又はその修飾された若しくはトランケートされたバリアントであり得る。一部の実施形態において、酵素は、Ｃ．エレガンス（C. elegans）由来（例えば、ｃｅＡＤＡＲ１又はｃｅＡＤＡＲ２）又はキイロショウジョウバエ（D. melanogaster）由来（例えば、ｄＡＤＡＲ）のＡＤＡＲ、又はこれらの修飾された若しくはトランケートされたバリアントであり得る。

【0243】

[0254] 一部の実施形態において、細胞のゲノムの再プログラム化及び編集方法は、（ｉ）タンパク質コード配列を含む環状ＲＮＡに細胞を接触させることであって、タンパク質コード配列が少なくとも１つの再プログラム化因子をコードすること、及び（ｉｉ）細胞のＤＮＡ又はＲＮＡの編集能を有する酵素に細胞を接触させることを含む。

【0244】

[0255] 一部の実施形態において、細胞のゲノムの再プログラム化及び編集方法は、（ｉ）タンパク質コード配列を含む環状ＲＮＡであって、タンパク質コード配列が少なくとも１つの再プログラム化因子をコードする、環状ＲＮＡ、及び（ｉｉ）細胞のＤＮＡ又はＲＮＡの編集能を有する酵素をコードする核酸に細胞を接触させることを含む。

【0245】

[0256] 一部の実施形態において、細胞は、酵素又はそれをコードする核酸に接触する前に環状ＲＮＡに接触する。一部の実施形態において、細胞は、酵素又はそれをコードする核酸に接触した後に環状ＲＮＡに接触する。一部の実施形態において、細胞は、酵素又はそれをコードする核酸に接触するのとほぼ同じ時点で環状ＲＮＡに接触する。

【0246】

[0257] 一部の実施形態において、細胞のゲノムの再プログラム化及び編集方法は、ガイドＲＮＡをコードする核酸、又はガイドＲＮＡに細胞を接触させることを更に含む。

【0247】

[0258] 細胞のゲノムの再プログラム化及び編集のための組成物は、例えば、環状ＲＮＡ（又はそれをコードするＤＮＡ分子）とＤＮＡ又はＲＮＡの編集能を有する酵素（又はそれをコードするＤＮＡ又はＲＮＡ分子）とを含み得る。一部の実施形態において、環状ＲＮＡは、タンパク質コード配列を含む。一部の実施形態において、環状ＲＮＡはタンパク質をコードしない。一部の実施形態において、環状ＲＮＡは、ｃｉｒｃＢＩＲＣ６（配列番号２９）、ｃｉｒｃＣＯＲＯ１Ｃ（配列番号３０）、又はｃｉｒｃＭＡＮ１Ａ２（配列番号３１）である。

【0248】

細胞のゲノムの分化転換及び編集のための組み合わせ方法
[0259] 本明細書に記載される環状ＲＮＡはまた、細胞のゲノムの分化転換及び編集方法においても使用し得る。よって、本明細書には、細胞のゲノムの分化転換及び編集のための組成物及び方法が提供される。

【0249】

[0260] 一部の実施形態において、細胞のゲノムの分化転換及び編集方法は、（ｉ）タンパク質コード配列を含む環状ＲＮＡであって、タンパク質コード配列が少なくとも１つの分化転換因子をコードする、環状ＲＮＡ、及び（ｉｉ）細胞のＤＮＡ又はＲＮＡの編集能を有する酵素に細胞を接触させることを含む。一部の実施形態において、分化転換因子は、表５に掲載されるもののいずれかから選択される。

【0250】

[0261] 一部の実施形態において、細胞のゲノムの分化転換及び編集方法は、（ｉ）タンパク質コード配列を含む環状ＲＮＡであって、タンパク質コード配列が少なくとも１つの分化転換因子をコードする、環状ＲＮＡ、及び（ｉｉ）細胞のＤＮＡ又はＲＮＡの編集能を有する酵素をコードする核酸に細胞を接触させることを含む。

【0251】

[0262] 細胞のゲノムを分化転換及び編集する方法においてＤＮＡ又はＲＮＡの編集に使用される酵素は、上記に挙げた酵素のいずれかであり得る。

【0252】

[0263] 一部の実施形態において、細胞は、酵素又はそれをコードする核酸に接触する前に環状ＲＮＡに接触する。一部の実施形態において、細胞は、酵素又はそれをコードする核酸に接触した後に環状ＲＮＡに接触する。一部の実施形態において、細胞は、酵素又はそれをコードする核酸に接触するのとほぼ同じ時点で環状ＲＮＡに接触する。

【0253】

[0264] 一部の実施形態において、細胞のゲノムの分化転換及び編集方法は、ガイドＲＮＡをコードする核酸、又はガイドＲＮＡに細胞を接触させることを更に含む。

【0254】

[0265] 細胞のゲノムの分化転換及び編集のための組成物は、例えば、環状ＲＮＡ（又はそれをコードするＤＮＡ分子）とＤＮＡ又はＲＮＡの編集能を有する酵素（又はそれをコードするＤＮＡ又はＲＮＡ分子）とを含み得る。一部の実施形態において、環状ＲＮＡは、タンパク質コード配列を含む。一部の実施形態において、環状ＲＮＡはタンパク質をコードしない。一部の実施形態において、環状ＲＮＡは、ｃｉｒｃＢＩＲＣ６（配列番号２９）、ｃｉｒｃＣＯＲＯ１Ｃ（配列番号３０）、又はｃｉｒｃＭＡＮ１Ａ２（配列番号３１）である。一部の実施形態において、環状ＲＮＡは、本明細書に開示される再プログラム化因子をコードする。一部の実施形態において、環状ＲＮＡは、１つ以上のＯｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８（例えば、Ｌｉｎ２８Ａ又はＬｉｎ２８Ｂ）、ｃ－Ｍｙｃ、及びＬ－Ｍｙｃをコードする。一部の実施形態において、環状ＲＮＡは、表５に掲載される分化転換因子の１つ以上をコードする。

【0255】

追加的な方法
[0266] 当業者は理解するであろうとおり、本明細書に記載される環状ＲＮＡ、及び関連する組成物は、以下の方法のうちの１つ以上に有用であり得る。

【0256】

[0267] 一部の実施形態において、本明細書には、線状ＲＮＡを使用した方法と比較したとき細胞死の減少を生じさせる細胞の再プログラム化方法であって、本明細書に記載されるとおりの環状ＲＮＡ、複合体、ベクター、又は組成物に細胞を接触させること、及びタンパク質が発現する条件下に細胞を維持することを含む方法が提供される。一部の実施形態において、再プログラム化によって誘導される細胞死は、線状ＲＮＡを使用した再プログラム化方法と比べて少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、少なくとも２００％、少なくとも５００％又はそれ以上減少する。一部の実施形態において、細胞は環状ＲＮＡの組み合わせに接触し、ここで環状ＲＮＡの組み合わせは、（ｉ）ｃｉｒｃＯｃｔ３／４、ｃｉｒｃＫｌｆ４、ｃｉｒｃＳｏｘ２、ｃｉｒｃＮａｎｏｇ、ｃｉｒｃＬｉｎ２８（例えば、Ｌｉｎ２８Ａ又はＬｉｎ２８Ｂ）、及びｃｉｒｃ ｃ－Ｍｙｃ；（ｉｉ）ｃｉｒｃＯｃｔ３／４、ｃｉｒｃＫｌｆ４、ｃｉｒｃＳｏｘ２、ｃｉｒｃＮａｎｏｇ、及びｃｉｒｃＬｉｎ２８（例えば、Ｌｉｎ２８Ａ又はＬｉｎ２８Ｂ）；（ｉｉｉ）ｃｉｒｃＯｃｔ３／４、ｃｉｒｃＫｌｆ４、ｃｉｒｃＳｏｘ２、ｃｉｒｃＮａｎｏｇ、ｃｉｒｃＬｉｎ２８（例えば、Ｌｉｎ２８Ａ又はＬｉｎ２８Ｂ）、及びｃｉｒｃＬ－Ｍｙｃ；（ｉｖ）ｃｉｒｃＯｃｔ３／４、ｃｉｒｃＫｌｆ４、ｃｉｒｃＳｏｘ２、ｃｉｒｃＮａｎｏｇ、及びｃｉｒｃＬｉｎ２８（例えば、Ｌｉｎ２８Ａ又はＬｉｎ２８Ｂ）；（ｖ）ｃｉｒｃＯｃｔ３／４、ｃｉｒｃＫｌｆ４、ｃｉｒｃＳｏｘ２、及びｃｉｒｃＣ－Ｍｙｃ；（ｖｉ）ｃｉｒｃＯｃｔ３／４、ｃｉｒｃＫｌｆ４、ｃｉｒｃＳｏｘ２、及びｃｉｒｃＬ－Ｍｙｃ；又は（ｖｉｉ）ｃｉｒｃＯｃｔ３／４、ｃｉｒｃＫｌｆ４、及びｃｉｒｃＳｏｘ２から選択される。一部の実施形態において、細胞は、ｃｉｒｃＭｙｏＤに接触する。

【0257】

[0268] また、本明細書には、再プログラム化からピッキングまでの時間を減少させる方法であって、本明細書に記載される環状ＲＮＡ、複合体、ベクター又は組成物に細胞を接触させること、及びタンパク質が発現する条件下に細胞を維持することを含む方法も提供され、ここで再プログラム化からピッキングまでの時間は、線状ＲＮＡを使用した再プログラム化方法と比べて減少する。本明細書で使用されるとき、用語「ピッキング」は、機械的解離によるｉＰＳＣコロニーの手作業での選択を指す。一部の実施形態において、この時間は、線状ＲＮＡを使用した再プログラム化方法と比べて少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、少なくとも２００％、少なくとも５００％又はそれ以上減少する。一部の実施形態において、細胞は環状ＲＮＡの組み合わせに接触し、ここで環状ＲＮＡの組み合わせは、（ｉ）ｃｉｒｃＯｃｔ３／４、ｃｉｒｃＫｌｆ４、ｃｉｒｃＳｏｘ２、ｃｉｒｃＮａｎｏｇ、ｃｉｒｃＬｉｎ２８（例えば、Ｌｉｎ２８Ａ又はＬｉｎ２８Ｂ）、及びｃｉｒｃ ｃ－Ｍｙｃ；（ｉｉ）ｃｉｒｃＯｃｔ３／４、ｃｉｒｃＫｌｆ４、ｃｉｒｃＳｏｘ２、ｃｉｒｃＮａｎｏｇ、及びｃｉｒｃＬｉｎ２８（例えば、Ｌｉｎ２８Ａ又はＬｉｎ２８Ｂ）；（ｉｉｉ）ｃｉｒｃＯｃｔ３／４、ｃｉｒｃＫｌｆ４、ｃｉｒｃＳｏｘ２、ｃｉｒｃＮａｎｏｇ、ｃｉｒｃＬｉｎ２８（例えば、Ｌｉｎ２８Ａ又はＬｉｎ２８Ｂ）、及びｃｉｒｃＬ－Ｍｙｃ；（ｉｖ）ｃｉｒｃＯｃｔ３／４、ｃｉｒｃＫｌｆ４、ｃｉｒｃＳｏｘ２、ｃｉｒｃＮａｎｏｇ、及びｃｉｒｃＬｉｎ２８（例えば、Ｌｉｎ２８Ａ又はＬｉｎ２８Ｂ）；（ｖ）ｃｉｒｃＯｃｔ３／４、ｃｉｒｃＫｌｆ４、ｃｉｒｃＳｏｘ２、及びｃｉｒｃＣ－Ｍｙｃ；（ｖｉ）ｃｉｒｃＯｃｔ３／４、ｃｉｒｃＫｌｆ４、ｃｉｒｃＳｏｘ２、及びｃｉｒｃＬ－Ｍｙｃ；又は（ｖｉｉ）ｃｉｒｃＯｃｔ３／４、ｃｉｒｃＫｌｆ４、及びｃｉｒｃＳｏｘ２から選択される。一部の実施形態において、細胞は、ｃｉｒｃＭｙｏＤに接触する。

【0258】

[0269] また、本明細書には、細胞の再プログラム化を達成するために誘導するトランスフェクションの回数を減少させる方法であって、本明細書に記載される環状ＲＮＡ、複合体、ベクター、又は組成物に細胞を接触させること、及びタンパク質が発現する条件下に細胞を維持することを含む方法も提供される。一部の実施形態において、トランスフェクションの回数は、線状ＲＮＡを使用した方法と比べて減少する。一部の実施形態において、細胞の再プログラム化を誘導するためのトランスフェクションの回数は、１、２、３、４、５、６、又は７回である。一部の実施形態において、トランスフェクションの回数は、線状ＲＮＡを使用した方法と比べて少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、少なくとも２００％、少なくとも５００％又はそれ以上減少する。一部の実施形態において、細胞は環状ＲＮＡの組み合わせに接触し、ここで環状ＲＮＡの組み合わせは、（ｉ）ｃｉｒｃＯｃｔ３／４、ｃｉｒｃＫｌｆ４、ｃｉｒｃＳｏｘ２、ｃｉｒｃＮａｎｏｇ、ｃｉｒｃＬｉｎ２８（例えば、Ｌｉｎ２８Ａ又はＬｉｎ２８Ｂ）、及びｃｉｒｃ ｃ－Ｍｙｃ；（ｉｉ）ｃｉｒｃＯｃｔ３／４、ｃｉｒｃＫｌｆ４、ｃｉｒｃＳｏｘ２、ｃｉｒｃＮａｎｏｇ、及びｃｉｒｃＬｉｎ２８（例えば、Ｌｉｎ２８Ａ又はＬｉｎ２８Ｂ）；（ｉｉｉ）ｃｉｒｃＯｃｔ３／４、ｃｉｒｃＫｌｆ４、ｃｉｒｃＳｏｘ２、ｃｉｒｃＮａｎｏｇ、ｃｉｒｃＬｉｎ２８、及びｃｉｒｃＬ－Ｍｙｃ；（ｉｖ）ｃｉｒｃＯｃｔ３／４、ｃｉｒｃＫｌｆ４、ｃｉｒｃＳｏｘ２、ｃｉｒｃＮａｎｏｇ、及びｃｉｒｃＬｉｎ２８（例えば、Ｌｉｎ２８Ａ又はＬｉｎ２８Ｂ）；（ｖ）ｃｉｒｃＯｃｔ３／４、ｃｉｒｃＫｌｆ４、ｃｉｒｃＳｏｘ２、及びｃｉｒｃＣ－Ｍｙｃ；（ｖｉ）ｃｉｒｃＯｃｔ３／４、ｃｉｒｃＫｌｆ４、ｃｉｒｃＳｏｘ２、及びｃｉｒｃＬ－Ｍｙｃ；又は（ｖｉｉ）ｃｉｒｃＯｃｔ３／４、ｃｉｒｃＫｌｆ４、及びｃｉｒｃＳｏｘ２から選択される。一部の実施形態において、細胞は、ｃｉｒｃＭｙｏＤに接触する。

【0259】

[0270] また、本明細書には、細胞におけるタンパク質発現の持続時間を増加させる方法であって、本明細書に記載される環状ＲＮＡ、複合体、ベクター、又は組成物に細胞を接触させること、及びタンパク質が発現する条件下に細胞を維持することを含む方法も提供される。一部の実施形態において、タンパク質発現の持続時間は、同じタンパク質をコードする線状ＲＮＡによる細胞のトランスフェクションを含む方法と比べて増加する。一部の実施形態において、タンパク質発現の持続時間は、同じタンパク質をコードする線状ＲＮＡによる細胞のトランスフェクションを含む方法と比べて少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、少なくとも２００％、少なくとも５００％又はそれ以上増加する。一部の実施形態において、タンパク質発現の持続時間は、同じタンパク質をコードする線状ＲＮＡによる細胞のトランスフェクションを含む方法と比べて少なくとも１時間、少なくとも４時間、少なくとも８時間、少なくとも１２時間、少なくとも１日、少なくとも２日、少なくとも３日、少なくとも４日、少なくとも５日、少なくとも６日、少なくとも１週間、少なくとも２週間、少なくとも３週間、又はそれ以上増加する。一部の実施形態において、細胞は環状ＲＮＡの組み合わせに接触し、ここで環状ＲＮＡの組み合わせは、（ｉ）ｃｉｒｃＯｃｔ３／４、ｃｉｒｃＫｌｆ４、ｃｉｒｃＳｏｘ２、ｃｉｒｃＮａｎｏｇ、ｃｉｒｃＬｉｎ２８（例えば、Ｌｉｎ２８Ａ又はＬｉｎ２８Ｂ）、及びｃｉｒｃ ｃ－Ｍｙｃ；（ｉｉ）ｃｉｒｃＯｃｔ３／４、ｃｉｒｃＫｌｆ４、ｃｉｒｃＳｏｘ２、ｃｉｒｃＮａｎｏｇ、及びｃｉｒｃＬｉｎ２８（例えば、Ｌｉｎ２８Ａ又はＬｉｎ２８Ｂ）；（ｉｉｉ）ｃｉｒｃＯｃｔ３／４、ｃｉｒｃＫｌｆ４、ｃｉｒｃＳｏｘ２、ｃｉｒｃＮａｎｏｇ、ｃｉｒｃＬｉｎ２８（例えば、Ｌｉｎ２８Ａ又はＬｉｎ２８Ｂ）、及びｃｉｒｃＬ－Ｍｙｃ；（ｉｖ）ｃｉｒｃＯｃｔ３／４、ｃｉｒｃＫｌｆ４、ｃｉｒｃＳｏｘ２、ｃｉｒｃＮａｎｏｇ、及びｃｉｒｃＬｉｎ２８（例えば、Ｌｉｎ２８Ａ又はＬｉｎ２８Ｂ）；（ｖ）ｃｉｒｃＯｃｔ３／４、ｃｉｒｃＫｌｆ４、ｃｉｒｃＳｏｘ２、及びｃｉｒｃＣ－Ｍｙｃ；（ｖｉ）ｃｉｒｃＯｃｔ３／４、ｃｉｒｃＫｌｆ４、ｃｉｒｃＳｏｘ２、及びｃｉｒｃＬ－Ｍｙｃ；又は（ｖｉｉ）ｃｉｒｃＯｃｔ３／４、ｃｉｒｃＫｌｆ４、及びｃｉｒｃＳｏｘ２から選択される。一部の実施形態において、細胞は、ｃｉｒｃＭｙｏＤに接触する。

【0260】

[0271] また、本明細書には、細胞の再プログラム化効率を改善する方法であって、本明細書に記載される環状ＲＮＡ、複合体、ベクター、又は組成物に細胞を接触させること、及びタンパク質が発現する条件下に細胞を維持することを含む方法も提供され、ここで細胞の再プログラム化の有効性は、線状ＲＮＡが使用される細胞の再プログラム化方法と比べて増加する。一部の実施形態において、細胞の再プログラム化効率は、線状ＲＮＡが使用される方法と比べて少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、少なくとも２００％、少なくとも５００％又はそれ以上増加する。細胞の再プログラム化効率の亢進は、限定はされないが、細胞死の減少、ＩＦＮ－γ分泌によって測定したときの免疫応答誘導性ストレスの減少、ストレス応答遺伝子誘導の減少を含め、定性的及び／又は定性的評価に基づいて観察し得る。一部の実施形態において、細胞は環状ＲＮＡの組み合わせに接触し、ここで環状ＲＮＡの組み合わせは、（ｉ）ｃｉｒｃＯｃｔ３／４、ｃｉｒｃＫｌｆ４、ｃｉｒｃＳｏｘ２、ｃｉｒｃＮａｎｏｇ、ｃｉｒｃＬｉｎ２８（例えば、Ｌｉｎ２８Ａ又はＬｉｎ２８Ｂ）、及びｃｉｒｃ ｃ－Ｍｙｃ；（ｉｉ）ｃｉｒｃＯｃｔ３／４、ｃｉｒｃＫｌｆ４、ｃｉｒｃＳｏｘ２、ｃｉｒｃＮａｎｏｇ、及びｃｉｒｃＬｉｎ２８（例えば、Ｌｉｎ２８Ａ又はＬｉｎ２８Ｂ）；（ｉｉｉ）ｃｉｒｃＯｃｔ３／４、ｃｉｒｃＫｌｆ４、ｃｉｒｃＳｏｘ２、ｃｉｒｃＮａｎｏｇ、ｃｉｒｃＬｉｎ２８（例えば、Ｌｉｎ２８Ａ又はＬｉｎ２８Ｂ）、及びｃｉｒｃＬ－Ｍｙｃ；（ｉｖ）ｃｉｒｃＯｃｔ３／４、ｃｉｒｃＫｌｆ４、ｃｉｒｃＳｏｘ２、ｃｉｒｃＮａｎｏｇ、及びｃｉｒｃＬｉｎ２８（例えば、Ｌｉｎ２８Ａ又はＬｉｎ２８Ｂ）；（ｖ）ｃｉｒｃＯｃｔ３／４、ｃｉｒｃＫｌｆ４、ｃｉｒｃＳｏｘ２、及びｃｉｒｃＣ－Ｍｙｃ；（ｖｉ）ｃｉｒｃＯｃｔ３／４、ｃｉｒｃＫｌｆ４、ｃｉｒｃＳｏｘ２、及びｃｉｒｃＬ－Ｍｙｃ；又は（ｖｉｉ）ｃｉｒｃＯｃｔ３／４、ｃｉｒｃＫｌｆ４、及びｃｉｒｃＳｏｘ２から選択される。一部の実施形態において、細胞は、ｃｉｒｃＭｙｏＤに接触する。

【0261】

[0272] また、本明細書には、再プログラム化後に形成される再プログラム化された細胞コロニーの数を増加させる方法であって、環状ＲＮＡ、複合体、ベクター、又は組成物に細胞を接触させること、及びタンパク質が発現する条件下に細胞を維持することを含む方法も提供され、ここで再プログラム化後に形成される再プログラム化された細胞コロニーの数は、線状ＲＮＡが使用される細胞の再プログラム化方法と比べて増加する。一部の実施形態において、再プログラム化された細胞コロニーの数は、線状ＲＮＡが使用される方法と比べて少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、少なくとも２００％、少なくとも５００％又はそれ以上増加する。一部の実施形態において、コロニーの数の増加は、転写因子をコードする１つ以上のｃｉｒｃＲＮＡによるトランスフェクション後約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、又は約２０日で観察し得る。一部の実施形態において、細胞は環状ＲＮＡの組み合わせに接触し、ここで環状ＲＮＡの組み合わせは、（ｉ）ｃｉｒｃＯｃｔ３／４、ｃｉｒｃＫｌｆ４、ｃｉｒｃＳｏｘ２、ｃｉｒｃＮａｎｏｇ、ｃｉｒｃＬｉｎ２８（例えば、Ｌｉｎ２８Ａ又はＬｉｎ２８Ｂ）、及びｃｉｒｃ ｃ－Ｍｙｃ；（ｉｉ）ｃｉｒｃＯｃｔ３／４、ｃｉｒｃＫｌｆ４、ｃｉｒｃＳｏｘ２、ｃｉｒｃＮａｎｏｇ、及びｃｉｒｃＬｉｎ２８（例えば、Ｌｉｎ２８Ａ又はＬｉｎ２８Ｂ）；（ｉｉｉ）ｃｉｒｃＯｃｔ３／４、ｃｉｒｃＫｌｆ４、ｃｉｒｃＳｏｘ２、ｃｉｒｃＮａｎｏｇ、ｃｉｒｃＬｉｎ２８（例えば、Ｌｉｎ２８Ａ又はＬｉｎ２８Ｂ）、及びｃｉｒｃＬ－Ｍｙｃ；（ｉｖ）ｃｉｒｃＯｃｔ３／４、ｃｉｒｃＫｌｆ４、ｃｉｒｃＳｏｘ２、ｃｉｒｃＮａｎｏｇ、及びｃｉｒｃＬｉｎ２８（例えば、Ｌｉｎ２８Ａ又はＬｉｎ２８Ｂ）；（ｖ）ｃｉｒｃＯｃｔ３／４、ｃｉｒｃＫｌｆ４、ｃｉｒｃＳｏｘ２、及びｃｉｒｃＣ－Ｍｙｃ；（ｖｉ）ｃｉｒｃＯｃｔ３／４、ｃｉｒｃＫｌｆ４、ｃｉｒｃＳｏｘ２、及びｃｉｒｃＬ－Ｍｙｃ；又は（ｖｉｉ）ｃｉｒｃＯｃｔ３／４、ｃｉｒｃＫｌｆ４、及びｃｉｒｃＳｏｘ２から選択される。一部の実施形態において、細胞は、ｃｉｒｃＭｙｏＤに接触する。

【0262】

[0273] また、本明細書には、細胞を浮遊状態で再プログラム化する方法であって、本明細書に記載される環状ＲＮＡ、複合体、ベクター、又は組成物に浮遊状態の細胞を接触させること、及びタンパク質が発現する条件下に細胞を維持することを含む方法も提供される。一部の実施形態において、細胞はＣＤ３４を発現する（即ち、細胞はＣＤ３４＋である）。一部の実施形態において、細胞は環状ＲＮＡの組み合わせに接触し、ここで環状ＲＮＡの組み合わせは、（ｉ）ｃｉｒｃＯｃｔ３／４、ｃｉｒｃＫｌｆ４、ｃｉｒｃＳｏｘ２、ｃｉｒｃＮａｎｏｇ、ｃｉｒｃＬｉｎ２８（例えば、Ｌｉｎ２８Ａ又はＬｉｎ２８Ｂ）、及びｃｉｒｃ ｃ－Ｍｙｃ；（ｉｉ）ｃｉｒｃＯｃｔ３／４、ｃｉｒｃＫｌｆ４、ｃｉｒｃＳｏｘ２、ｃｉｒｃＮａｎｏｇ、及びｃｉｒｃＬｉｎ２８（例えば、Ｌｉｎ２８Ａ又はＬｉｎ２８Ｂ）；（ｉｉｉ）ｃｉｒｃＯｃｔ３／４、ｃｉｒｃＫｌｆ４、ｃｉｒｃＳｏｘ２、ｃｉｒｃＮａｎｏｇ、ｃｉｒｃＬｉｎ２８（例えば、Ｌｉｎ２８Ａ又はＬｉｎ２８Ｂ）、及びｃｉｒｃＬ－Ｍｙｃ；（ｉｖ）ｃｉｒｃＯｃｔ３／４、ｃｉｒｃＫｌｆ４、ｃｉｒｃＳｏｘ２、ｃｉｒｃＮａｎｏｇ、及びｃｉｒｃＬｉｎ２８（例えば、Ｌｉｎ２８Ａ又はＬｉｎ２８Ｂ）（ｖ）ｃｉｒｃＯｃｔ３／４、ｃｉｒｃＫｌｆ４、ｃｉｒｃＳｏｘ２、及びｃｉｒｃＣ－Ｍｙｃ；（ｖｉ）ｃｉｒｃＯｃｔ３／４、ｃｉｒｃＫｌｆ４、ｃｉｒｃＳｏｘ２、及びｃｉｒｃＬ－Ｍｙｃ；又は（ｖｉｉ）ｃｉｒｃＯｃｔ３／４、ｃｉｒｃＫｌｆ４、及びｃｉｒｃＳｏｘ２から選択される。一部の実施形態において、細胞は、ｃｉｒｃＭｙｏＤに接触する。

【0263】

[0274] また、本明細書には、再プログラム化されたコロニーの形態学的成熟度を改善する方法であって、本明細書に記載される環状ＲＮＡ、複合体、ベクター、又は組成物に浮遊状態の細胞を接触させること、及びタンパク質が発現する条件下に細胞を維持することを含む方法も提供され、ここで形態学的成熟度は、線状ＲＮＡが使用される細胞の再プログラム化方法と比べて改善する。改善する形態学的成熟度としては、例えば、より密に詰まったコロニー、より多くの細胞が均一な形状及び直径を有するコロニー、明確に定められた境界を含むコロニー、及びより高い核対細胞質比及び／又は顕著な核小体を含むｉＰＳＣコロニー内の細胞を挙げることができる。一部の実施形態において、再プログラム化されたコロニーの形態学的成熟度は、線状ＲＮＡが使用される方法と比べて少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、少なくとも２００％、少なくとも５００％又はそれ以上改善する。一部の実施形態において、細胞は環状ＲＮＡの組み合わせに接触し、ここで環状ＲＮＡの組み合わせは、（ｉ）ｃｉｒｃＯｃｔ３／４、ｃｉｒｃＫｌｆ４、ｃｉｒｃＳｏｘ２、ｃｉｒｃＮａｎｏｇ、ｃｉｒｃＬｉｎ２８（例えば、Ｌｉｎ２８Ａ又はＬｉｎ２８Ｂ）、及びｃｉｒｃ ｃ－Ｍｙｃ；（ｉｉ）ｃｉｒｃＯｃｔ３／４、ｃｉｒｃＫｌｆ４、ｃｉｒｃＳｏｘ２、ｃｉｒｃＮａｎｏｇ、及びｃｉｒｃＬｉｎ２８（例えば、Ｌｉｎ２８Ａ又はＬｉｎ２８Ｂ）；（ｉｉｉ）ｃｉｒｃＯｃｔ３／４、ｃｉｒｃＫｌｆ４、ｃｉｒｃＳｏｘ２、ｃｉｒｃＮａｎｏｇ、ｃｉｒｃＬｉｎ２８（例えば、Ｌｉｎ２８Ａ又はＬｉｎ２８Ｂ）、及びｃｉｒｃＬ－Ｍｙｃ；（ｉｖ）ｃｉｒｃＯｃｔ３／４、ｃｉｒｃＫｌｆ４、ｃｉｒｃＳｏｘ２、ｃｉｒｃＮａｎｏｇ、及びｃｉｒｃＬｉｎ２８（例えば、Ｌｉｎ２８Ａ又はＬｉｎ２８Ｂ）；（ｖ）ｃｉｒｃＯｃｔ３／４、ｃｉｒｃＫｌｆ４、ｃｉｒｃＳｏｘ２、及びｃｉｒｃＣ－Ｍｙｃ；（ｖｉ）ｃｉｒｃＯｃｔ３／４、ｃｉｒｃＫｌｆ４、ｃｉｒｃＳｏｘ２、及びｃｉｒｃＬ－Ｍｙｃ；又は（ｖｉｉ）ｃｉｒｃＯｃｔ３／４、ｃｉｒｃＫｌｆ４、及びｃｉｒｃＳｏｘ２から選択される。一部の実施形態において、細胞は、ｃｉｒｃＭｙｏＤに接触する。

【0264】

[0275] また、本明細書には、１つ以上のＣＤ３４発現細胞を含む浮遊培養液も提供され、ここでＣＤ３４発現細胞は、再プログラム化因子をコードする１つ以上のｃｉｒｃＲＮＡを含む。一部の実施形態において、再プログラム化因子は、Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８（例えば、Ｌｉｎ２８Ａ又はＬｉｎ２８Ｂ）、ｃ－Ｍｙｃ、及びＬ－Ｍｙｃから選択される。

【0265】

[0276] また、本明細書には、体細胞からｉＰＳＣへの間葉上皮転換（ＭＥＴ）を誘導する方法であって、再プログラム化因子をコードする１つ以上の環状ＲＮＡに体細胞を接触させることを含む方法も提供される。

【0266】

[0277] また、本明細書には、体細胞からｉＰＳＣへの間葉上皮転換（ＭＥＴ）を誘導する方法であって、再プログラム化因子をコードする１つ以上の環状ＲＮＡに体細胞を接触させることを含む方法も提供される。

【0267】

組成物、及び細胞
[0278] また、本明細書には、環状ＲＮＡを含む組成物も提供される。一部の実施形態において、組成物は、（ｉ）環状ＲＮＡ及び（ｉｉ）担体を含む。一部の実施形態において、組成物は、（ｉ）環状ＲＮＡをコードするベクター及び（ｉｉ）担体を含む。好適な担体としては、例えば、滅菌水、滅菌緩衝溶液（例えば、リン酸塩、クエン酸塩又は酢酸塩等で緩衝された溶液）、滅菌培地、ポリアルキレングリコール類、水素化ナフタレン（例えば、生体適合性ラクチドポリマー）、ラクチド／グリコリドコポリマー又はポリオキシエチレン／ポリオキシプロピレンコポリマーが挙げられる。一部の実施形態において、担体は、ラクトース、マンニトール、ポリエチレングリコールなどのポリマーを共有結合性に取り付けるための物質、金属イオンとの錯体又はポリ乳酸などのポリマー化合物の特定の調製物内若しくはその上への材料の取込み、ポリグリコール酸、ヒドロゲル又はリポソーム上、マイクロエマルション、ミセル、単層又は多層小胞、赤血球断片又はスフェロプラストを含み得る。一部の実施形態において、担体のｐＨは、約６．０～約７．０の範囲など、５．０～８．０の範囲である。一部の実施形態において、担体は、塩成分（例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム）、又は溶液を例えば等張性にする他の成分を含む。更に、担体は、ウシ胎仔血清、成長因子、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、ポリソルベート８０、糖類又はアミノ酸など、追加の成分を含み得る。好適なベクターとしては、プラスミド（例えば、ＤＮＡプラスミド）及びウイルスベクターが挙げられる。

【0268】

[0279] また、本明細書には、本明細書に記載されるとおりの環状ＲＮＡ又は組成物を含む細胞も提供される。一部の実施形態において、細胞は、原核細胞である。一部の実施形態において、細胞は、真核細胞である。一部の実施形態において、細胞は、哺乳類細胞（例えば、マウス、ウシ、サル、ブタ、ウマ、ヒツジ、又はヒト細胞）である。一部の実施形態において、細胞は、ヒト細胞である。

【0269】

キット
[0280] 細胞の再プログラム化のためのキット及びｉＰＳＣの作製のためのキットもまた提供される。一部の実施形態において、キットは、本明細書に記載されるとおりの少なくとも１つの環状ＲＮＡを含む。一部の実施形態において、キットは、環状ＲＮＡを収容する容器を含む。一部の実施形態において、キットは複数の容器を含み、ここでは各容器が環状ＲＮＡを含む。一部の実施形態において、キットは、複数の環状ＲＮＡ分子を含む容器を含み、ここでは各環状ＲＮＡ分子がタンパク質をコードする。一部の実施形態において、キットはまた、細胞を再プログラム化するための少なくとも１つの環状ＲＮＡの使用に関する一組の説明書も含む。

【0270】

[0281] 一部の実施形態において、キットは１つ以上の環状ＲＮＡを含み、ここで各環状ＲＮＡは、少なくとも１つのタンパク質をコードする。一部の実施形態において、キットは、ｍｉＲＮＡをコードする線状又は環状ＲＮＡを更に含み得る。一部の実施形態において、キットは、（ｉ）各環状ＲＮＡがタンパク質をコードする１つ以上の環状ＲＮＡ、（ｉｉ）任意選択で、いかなるタンパク質又はｍｉＲＮＡもコードしない環状ＲＮＡ（例えば、ｃｉｒｃＢＩＲＣ６、ｃｉｒｃＣＯＲＯ１ｃ、ｃｉｒｃＭＡＮ１Ａ２）、（ｉｉｉ）任意選択で、ｍｉＲＮＡをコードする線状又は環状ＲＮＡの各々を収容する単一の容器を含み得る。一部の実施形態において、キットは複数の容器を含んでもよく、ここで各容器は、（ｉ）タンパク質をコードする少なくとも１つの環状ＲＮＡ、（ｉｉ）任意選択で、いかなるタンパク質又はｍｉＲＮＡもコードしない環状ＲＮＡ、又はそれをコードするＤＮＡ分子、（ｉｉｉ）任意選択で、ｍｉＲＮＡをコードする線状又は環状ＲＮＡのうちの１つを含む。一部の実施形態において、キットはまた、細胞を再プログラム化するための少なくとも１つの環状ＲＮＡの使用に関する一組の説明書も含む。

【0271】

[0282] 一部の実施形態において、体細胞の再プログラム化及び／又はｉＰＳＣの生成のためのキットが提供される。一部の実施形態において、キットは、再プログラム化因子（例えば、転写因子）をコードする少なくとも１つの環状ＲＮＡを含む。一部の実施形態において、キットは、環状ＲＮＡを収容する容器を含む。一部の実施形態において、キットは複数の容器を含み、ここでは各容器が環状ＲＮＡを含む。一部の実施形態において、キットは、複数の環状ＲＮＡ分子を含む容器を含み、ここでは各環状ＲＮＡ分子が転写因子をコードする。一部の実施形態において、キットはまた、体細胞の再プログラム化及び／又はｉＰＳＣの生成のための少なくとも１つの環状ＲＮＡの使用に関する一組の説明書も含む。

【0272】

[0283] 一部の実施形態において、キットは１つ以上の環状ＲＮＡを含み、ここでは各環状ＲＮＡが、少なくとも１つの再プログラム化因子をコードする。再プログラム化因子は、例えば、表１に掲載される再プログラム化因子のいずれか１つであり得る。一部の実施形態において、キットは、いかなるタンパク質又はｍｉＲＮＡもコードしない環状ＲＮＡ、又はそれをコードするＤＮＡ分子を更に含み得る。一部の実施形態において、キットは、ｍｉＲＮＡをコードする線状又は環状ＲＮＡ、又はそれをコードするＤＮＡ分子を更に含み得る。一部の実施形態において、キットは、（ｉ）各環状ＲＮＡが再プログラム化因子をコードする１つ以上の環状ＲＮＡ、（ｉｉ）任意選択で、いかなるタンパク質又はｍｉＲＮＡもコードしない環状ＲＮＡ（例えば、ｃｉｒｃＢＩＲＣ６、ｃｉｒｃＣＯＲＯ１ｃ、ｃｉｒｃＭＡＮ１Ａ２）、（ｉｉｉ）任意選択で、ｍｉＲＮＡをコードする線状又は環状ＲＮＡの各々を収容する単一の容器を含み得る。一部の実施形態において、キットは複数の容器を含んでもよく、ここでは各容器が、（ｉ）再プログラム化因子をコードする少なくとも１つの環状ＲＮＡ、（ｉｉ）任意選択で、いかなるタンパク質又はｍｉＲＮＡもコードしない環状ＲＮＡ（例えば、ｃｉｒｃＢＩＲＣ６、ｃｉｒｃＣＯＲＯ１ｃ、ｃｉｒｃＭＡＮ１Ａ２）、（ｉｉｉ）任意選択で、ｍｉＲＮＡをコードする線状又は環状ＲＮＡのうちの１つを含む。一部の実施形態において、キットはまた、細胞の再プログラム化及び／又はｉＰＳＣの生成のための少なくとも１つの環状ＲＮＡの使用に関する一組の説明書も含む。

【0273】

[0284] 一部の実施形態において、細胞の分化転換のためのキットが提供される。一部の実施形態において、キットは、再プログラム化因子（例えば、転写因子）をコードする少なくとも１つの環状ＲＮＡを含む。一部の実施形態において、キットは、環状ＲＮＡを収容する容器を含む。一部の実施形態において、キットは複数の容器を含み、ここでは各容器が環状ＲＮＡを含む。一部の実施形態において、キットは、複数の環状ＲＮＡ分子を含む容器を含み、ここでは各環状ＲＮＡ分子が、分化転換因子をコードする配列を含む。一部の実施形態において、キットはまた、細胞の分化転換のための少なくとも１つの環状ＲＮＡの使用に関する一組の説明書も含む。

【0274】

[0285] 一部の実施形態において、キットは１つ以上の環状ＲＮＡを含み、ここで各環状ＲＮＡは、少なくとも１つの分化転換因子をコードする配列を含む。分化転換因子は、例えば、表５に掲載される分化転換因子のいずれか１つであり得る。一部の実施形態において、キットは、いかなるタンパク質又はｍｉＲＮＡもコードしない環状ＲＮＡを更に含み得る。一部の実施形態において、キットは、ｍｉＲＮＡをコードする環状ＲＮＡを更に含み得る。一部の実施形態において、キットは、（ｉ）各環状ＲＮＡが分化転換因子をコードする１つ以上の環状ＲＮＡ、（ｉｉ）任意選択で、いかなるタンパク質又はｍｉＲＮＡもコードしない環状ＲＮＡ、（ｉｉｉ）任意選択で、ｍｉＲＮＡをコードする環状ＲＮＡの各々を収容する単一の容器を含み得る。一部の実施形態において、キットは複数の容器を含んでもよく、ここでは各容器が、（ｉ）分化転換因子をコードする少なくとも１つの環状ＲＮＡ、（ｉｉ）任意選択で、いかなるタンパク質又はｍｉＲＮＡもコードしない環状ＲＮＡ、（ｉｉｉ）任意選択で、ｍｉＲＮＡをコードする環状ＲＮＡのうちの１つを含む。一部の実施形態において、キットはまた、細胞における分化転換因子の発現のための少なくとも１つの環状ＲＮＡの使用に関する一組の説明書も含む。

【0275】

[0286] 一部の実施形態において、キットは複数の環状ＲＮＡを含み、ここで各環状ＲＮＡは、Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８（例えば、Ｌｉｎ２８Ａ又はＬｉｎ２８Ｂ）、ｃ－Ｍｙｃ、及びＬ－Ｍｙｃから選択される再プログラム化因子、又はこれらの組み合わせをコードする。環状ＲＮＡの各々は、別個の容器に提供されてもよく、又は単一の容器に提供されてもよい。

【0276】

[0287] 一部の実施形態において、キットは複数の環状ＲＮＡを含み、ここで環状ＲＮＡの各々は、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、及びＫｌｆ４から選択される再プログラム化因子、又はこれらの組み合わせをコードする。環状ＲＮＡの各々は、別個の容器に提供されてもよく、又は単一の容器に提供されてもよい。

【0277】

[0288] 一部の実施形態において、キットは複数の環状ＲＮＡを含み、ここで環状ＲＮＡの各々は、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、ｃ－Ｍｙｃ、及びＫｌｆ４から選択される再プログラム化因子、又はこれらの組み合わせをコードする。環状ＲＮＡの各々は、別個の容器に提供されてもよく、又は単一の容器に提供されてもよい。

【0278】

[0289] 一部の実施形態において、キットは複数の環状ＲＮＡを含み、ここで環状ＲＮＡの各々は、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｌ－Ｍｙｃ、及びＫｌｆ４から選択される再プログラム化因子、又はこれらの組み合わせをコードする。環状ＲＮＡの各々は、別個の容器に提供されてもよく、又は単一の容器に提供されてもよい。

【0279】

[0290] 一部の実施形態において、キットは複数の環状ＲＮＡを含み、ここで各環状ＲＮＡは、Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、及びＬｉｎ２８（例えば、Ｌｉｎ２８Ａ又はＬｉｎ２８Ｂ）から選択される再プログラム化因子、又はこれらの組み合わせをコードする。環状ＲＮＡの各々は、別個の容器に提供されてもよく、又は単一の容器に提供されてもよい。

【0280】

[0291] 一部の実施形態において、キットは複数の環状ＲＮＡを含み、ここで各環状ＲＮＡは、Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８（例えば、Ｌｉｎ２８Ａ又はＬｉｎ２８Ｂ）、及びｃ－Ｍｙｃから選択される再プログラム化因子、又はこれらの組み合わせをコードする。環状ＲＮＡの各々は、別個の容器に提供されてもよく、又は単一の容器に提供されてもよい。

【0281】

[0292] 一部の実施形態において、キットは複数の環状ＲＮＡを含み、ここで各環状ＲＮＡは、Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８（例えば、Ｌｉｎ２８Ａ又はＬｉｎ２８Ｂ）、及びＬ－Ｍｙｃから選択される再プログラム化因子、又はこれらの組み合わせをコードする。環状ＲＮＡの各々は、別個の容器に提供されてもよく、又は単一の容器に提供されてもよい。

【0282】

[0293] 一部の実施形態において、キットは、環状化される能力を有する線状ＲＮＡ、又はそれをコードするＤＮＡ配列を含み得る。一部の実施形態において、キットは、ＲＮＡ又はＤＮＡリガーゼ、又はＭｇ２＋及びグアノシン５’三リン酸（ＧＴＰ）など、線状ＲＮＡを環状化するための１つ以上の試薬を更に含み得る。

【0283】

[0294] 一部の実施形態において、キットは、（ｉ）ＯＣＴ４をコードする環状ＲＮＡ及び緩衝液（例えば、１～１０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ６．５）を含む容器；（ｉｉ）ＳＯＸ２をコードする環状ＲＮＡ及び緩衝液（例えば、１～１０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ６．５）を含む容器；（ｉｉｉ）ＫＬＦ４をコードするｃｉｒＲＮＡ及び緩衝液（例えば、１～１０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ６．５）を含む容器；及び（ｉｖ）それのための包装及び説明書を含む。キットは、ｃ－ＭＹＣ又はＬ－ＭＹＣをコードする環状ＲＮＡ及び緩衝液（例えば、１～１０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ６．５）を含む容器；ＬＩＮ２８（例えば、Ｌｉｎ２８Ａ又はＬｉｎ２８Ｂ）をコードするｃｉｒＲＮＡ及び緩衝液（例えば、１～１０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ６．５）を含む容器；ＮＡＮＯＧをコードするｃｉｒＲＮＡ及び緩衝液（例えば、１～１０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ６．５）を含む容器；又はこれらの組み合わせを更に含み得る。

【0284】

[0295] 一部の実施形態において、キットは、（ｉ）：（ａ）表３に掲載されるいずれか１つ以上の環状化された再プログラム化因子の組み合わせのうちの１つ又は複数の環状ＲＮＡ再プログラム化因子であって、各々が個々に別個の容器含まれるか、又はかかる因子の２つ以上が単一又は複数の容器に一緒に組み合わされる、因子；及び（ｉｉ）それのための包装及び説明書を含む。

【0285】

[0296] 一部の実施形態において、キットは、（ｉ）：表３に掲載されるいずれか１つ以上の環状化された再プログラム化因子の組み合わせのうちの１つ又は複数の環状ＲＮＡ再プログラム化因子であって、各々が個々に別個の容器含まれるか、又はかかる因子の２つ以上が単一又は複数の容器に一緒に組み合わされ；及び表３のそれぞれ環状化された再プログラム化因子及び／又は環状ＲＮＡ、それぞれ、緩衝液中に懸濁される、因子；及び（ｉｉｉ）それのための包装及び説明書を含む。

【0286】

[0297] 上記に記載するキットのいずれにおいても、環状ＲＮＡは、緩衝液を更に含む組成物中に提供されてもよい。緩衝液は、例えば１～１０ｍＭ クエン酸ナトリウムを含み得る。一部の実施形態において、緩衝液のｐＨは、約６．５など、約２～約１２の範囲である。

【0287】

【表21】

【0288】

【表22】

【0289】

【表23】

【0290】

【表24】

【0291】

【表25】

【0292】

【表26】

【0293】

【表27】

【0294】

【表28】

【0295】

【表29】

【0296】

更なる番号付けされる実施形態
[0298] 更なる番号付けされる本開示の実施形態は、以下のとおりである。

【0297】

[0299] 実施形態１．人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を作製する方法であって、Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８、ｃ－Ｍｙｃ、又はＬ－Ｍｙｃから選択される少なくとも１つの再プログラム化因子、又はその断片若しくはバリアントをコードする環状ＲＮＡに浮遊状態の血液細胞を接触させること、及びｉＰＳＣが入手される条件下に細胞を維持することを含む方法。

【0298】

[0300] 実施形態２．血液細胞が、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、及び臍帯血単核細胞（ＣＢＭＣ）から選択される、実施形態１に記載の方法。

【0299】

[0301] 実施形態３．血液細胞が、Ｔ細胞及びＮＫ細胞から選択される、実施形態１に記載の方法。

【0300】

[0302] 実施形態４．人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を作製する方法であって、Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８、ｃ－Ｍｙｃ、又はＬ－Ｍｙｃから選択される少なくとも１つの再プログラム化因子、又はその断片若しくはバリアントをコードする環状ＲＮＡに浮遊状態のＣＤ３４＋細胞を接触させること、及びｉＰＳＣが入手される条件下に細胞を維持することを含む方法。

【0301】

[0303] 実施形態５．少なくとも１つの再プログラム化因子が、ヒト又はヒト化再プログラム化因子である、実施形態１～４のいずれか一つに記載の方法。

【0302】

[0304] 実施形態６．少なくとも１つの再プログラム化因子がＯｃｔ３／４であり、Ｏｃｔ３／４が、配列番号７のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも９０％又は少なくとも９５％同一の配列を有する、実施形態１～５のいずれか一つに記載の方法。

【0303】

[0305] 実施形態７．環状ＲＮＡが、配列番号８の核酸配列、又はそれと少なくとも９０％又は少なくとも９５％同一の配列を含む、実施形態３に記載の方法。

【0304】

[0306] 実施形態８．少なくとも１つの再プログラム化因子がＫｌｆ４であり、Ｋｌｆ４が、配列番号９又は１０のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも９０％又は少なくとも９５％同一の配列を有する、実施形態１～５のいずれか一つに記載の方法。

【0305】

[0307] 実施形態９．環状ＲＮＡが、配列番号１１の核酸配列、又はそれと少なくとも９０％又は少なくとも９５％同一の配列を含む、実施形態８に記載の方法。

【0306】

[0308] 実施形態１０．少なくとも１つの再プログラム化因子がＳｏｘ２であり、Ｓｏｘ２が、配列番号１２のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも９０％又は少なくとも９５％同一の配列を有する、実施形態１～５のいずれか一つに記載の方法。

【0307】

[0309] 実施形態１１．環状ＲＮＡが、配列番号１３の核酸配列、又はそれと少なくとも９０％又は少なくとも９５％同一の配列を含む、実施形態１０に記載の方法。

【0308】

[0310] 実施形態１２．少なくとも１つの再プログラム化因子がＮａｎｏｇであり、Ｎａｎｏｇが、配列番号１４又は１５のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも９０％又は少なくとも９５％同一の配列を有する、実施形態１～５のいずれか一つに記載の方法。

【0309】

[0311] 実施形態１３．環状ＲＮＡが、配列番号１６の核酸配列、又はそれと少なくとも９０％又は少なくとも９５％同一の配列を含む、実施形態１２に記載の方法。

【0310】

[0312] 実施形態１４．少なくとも１つの再プログラム化因子がＬｉｎ２８Ａであり、Ｌｉｎ２８Ａが、配列番号１７のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも９０％又は少なくとも９５％同一の配列を有する、実施形態１～５のいずれか一つに記載の方法。

【0311】

[0313] 実施形態１５．環状ＲＮＡが、配列番号１８の核酸配列、又はそれと少なくとも９０％又は少なくとも９５％同一の配列を含む、実施形態１４に記載の方法。

【0312】

[0314] 実施形態１６．少なくとも１つの再プログラム化因子がｃ－Ｍｙｃであり、ｃ－Ｍｙｃが、配列番号１９又は２０のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも９０％又は少なくとも９５％同一の配列を有する、実施形態１～５のいずれか一つに記載の方法。

【0313】

[0315] 実施形態１７．環状ＲＮＡが、配列番号２１の核酸配列、又はそれと少なくとも９０％又は少なくとも９５％同一の配列を含む、実施形態１６に記載の方法。

【0314】

[0316] 実施形態１８．少なくとも１つの再プログラム化因子がＬ－Ｍｙｃであり、Ｌ－Ｍｙｃが、配列番号２２～２４のいずれか１つのアミノ酸配列、又はそれと少なくとも９０％又は少なくとも９５％同一の配列を有する、実施形態１～５のいずれか一つに記載の方法。

【0315】

[0317] 実施形態１９．環状ＲＮＡが、配列番号２５の核酸配列、又はそれと少なくとも９０％又は少なくとも９５％同一の配列を含む、実施形態１８に記載の方法。

【0316】

[0318] 実施形態２０．環状ＲＮＡが、実質的に非免疫原性である、実施形態１～１９のいずれか一つに記載の方法。

【0317】

[0319] 実施形態２１．環状ＲＮＡが、１つ以上のＭ－６－メチルアデノシン（ｍ６Ａ）残基を含む、実施形態２０に記載の方法。

【0318】

[0320] 実施形態２２．環状ＲＮＡが、約２００ヌクレオチド～約５，０００ヌクレオチドを含む、実施形態１～２１のいずれか一つに記載の方法。

【0319】

[0321] 実施形態２３．環状ＲＮＡが、タンパク質コード配列に作動可能に連結された配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を含む、実施形態１～２２のいずれか一つに記載の方法。

【0320】

[0322] 実施形態２４．環状ＲＮＡが、Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８、ｃ－Ｍｙｃ、又はＬ－Ｍｙｃから選択される２つ以上の再プログラム化因子をコードする、実施形態１～２３のいずれか一つに記載の方法。

【0321】

[0323] 実施形態２５．Ｏｃｔ４又はその断片若しくはバリアントをコードする第１の環状ＲＮＡ、Ｓｏｘ２又はその断片若しくはバリアントをコードする第２の環状ＲＮＡ、Ｋｌｆ４又はその断片若しくはバリアントをコードする第３の環状ＲＮＡ、Ｃ－Ｍｙｃ又はその断片若しくはバリアントをコードする第４の環状ＲＮＡ、Ｌｉｎ２８又はその断片若しくはバリアントをコードする第５の環状ＲＮＡ、及びＮａｎｏｇ又はその断片若しくはバリアントをコードする第６の環状ＲＮＡに細胞を接触させることを含む、実施形態１～５のいずれか一つに記載の方法。

【0322】

[0324] 実施形態２６．Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８、及びｃ－Ｍｙｃからなる再プログラム化因子の群のうちの１つ以上、又はその断片若しくはバリアントをコードする１つ以上の環状ＲＮＡに細胞を接触させることを含む、実施形態１～５のいずれか一つに記載の方法。

【0323】

[0325] 実施形態２７．人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を作製する方法であって、Ｏｃｔ４をコードする第１の環状ＲＮＡ、Ｓｏｘ２をコードする第２の環状ＲＮＡ、Ｋｌｆ４をコードする第３の環状ＲＮＡ、Ｃ－Ｍｙｃをコードする第４の環状ＲＮＡ、Ｌｉｎ２８をコードする第５の環状ＲＮＡ、及びＮａｎｏｇをコードする第６の環状ＲＮＡからなる６つの環状ＲＮＡに浮遊状態のＣＤ３４＋細胞を接触させること、及びｉＰＳＣが入手される条件下に細胞を維持することを含む方法。

【0324】

[0326] 実施形態２８．人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を作製する方法であって、Ｏｃｔ４をコードする第１の環状ＲＮＡ、Ｓｏｘ２をコードする第２の環状ＲＮＡ、及びＫｌｆ４をコードする第３の環状ＲＮＡからなる３つの環状ＲＮＡに浮遊状態のＣＤ３４＋細胞を接触させること、及びｉＰＳＣが入手される条件下に細胞を維持することを含む方法。

【0325】

[0327] 実施形態２９．Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８、及びｃ－Ｍｙｃのいずれかをコードする環状ＲＮＡにＣＤ３４＋細胞を接触させることを含まない、実施形態２８に記載の方法。

【0326】

[0328] 実施形態３０．人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を作製する方法であって、Ｏｃｔ４をコードする第１の環状ＲＮＡ、Ｓｏｘ２をコードする第２の環状ＲＮＡ、及びＫｌｆ４をコードする第３の環状ＲＮＡからなる３つの環状ＲＮＡ、及びＣ－Ｍｙｃをコードする第４の環状ＲＮＡに浮遊状態のＣＤ３４＋細胞を接触させること、及びｉＰＳＣが入手される条件下に細胞を維持することを含む方法。

【0327】

[0329] 実施形態３１．Ｎａｎｏｇ又はＬｉｎ２８のいずれかをコードする環状ＲＮＡにＣＤ３４＋細胞を接触させることを含まない、実施形態３０に記載の方法。

【0328】

[0330] 実施形態３２．人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を作製する方法であって、Ｏｃｔ４をコードする第１の環状ＲＮＡ、Ｓｏｘ２をコードする第２の環状ＲＮＡ、及びＫｌｆ４をコードする第３の環状ＲＮＡからなる３つの環状ＲＮＡ、及びＮａｎｏｇをコードする第４の環状ＲＮＡ、及びＬｉｎ ２８をコードする第５の環状ＲＮＡに浮遊状態のＣＤ３４＋細胞を接触させること、及びｉＰＳＣが入手される条件下に細胞を維持することを含む方法。

【0329】

[0331] 実施形態３３．ｃ－Ｍｙｃをコードする環状ＲＮＡにＣＤ３４＋細胞を接触させることを含まない、実施形態３２に記載の方法。

【0330】

[0332] 実施形態３４．細胞が、Ｅ３、Ｋ３、Ｂ１８Ｒから選択されるいかなる因子にも接触しない、実施形態１～３３のいずれか一つに記載の方法。

【0331】

[0333] 実施形態３５．細胞が、いかなるマイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）にも接触しない、実施形態１～３３のいずれか一つに記載の方法。

【0332】

[0334] 実施形態３６．細胞が、Ｅ３、Ｋ３、Ｂ１８Ｒ、１つ以上のマイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）、又はこれらの組み合わせから選択される１つ以上の因子に接触しない、実施形態１～３３のいずれか一つに記載の方法。

【0333】

[0335] 実施形態３７．ｍｉＲが、ｍｉＲ３０２ａ、ｍｉＲ３０２ｂ、ｍｉＲ３０２ｃ、ｍｉＲ３０２ｄ、及びｍｉＲ３６７を含む、３５又は３６に記載の方法。

【0334】

[0336] 実施形態３８．細胞が、少なくとも１つの環状ＲＮＡと直接接触する、実施形態１～３７のいずれか一つに記載の方法。

【0335】

[0337] 実施形態３９．細胞が、少なくとも１つの環状ＲＮＡの各々に１回接触する、実施形態１～３８のいずれか一つに記載の方法。

【0336】

[0338] 実施形態４０．少なくとも１つの環状ＲＮＡの各々に細胞を２、３、４回、又はそれ以上接触させることを含む、実施形態１～３８のいずれか一つに記載の方法。

【0337】

[0339] 実施形態４１．少なくとも１つの環状ＲＮＡの各々に細胞を４回未満接触させることを含む、実施形態１～３８のいずれか一つに記載の方法。

【0338】

[0340] 実施形態４２．少なくとも１つの環状ＲＮＡの各々に細胞を２～４回接触させることを含む、実施形態１～３８のいずれか一つに記載の方法。

【0339】

[0341] 実施形態４３．少なくとも１つの環状ＲＮＡの各々の濃度が、少なくとも３ｐｇ ＲＮＡ／細胞である、実施形態１～４２のいずれか一つに記載の方法。

【0340】

[0342] 実施形態４４．少なくとも１つの環状ＲＮＡの各々の濃度が、約５ｐｇ ＲＮＡ／細胞～約１５ｐｇ ＲＮＡ／細胞である、実施形態１～４２のいずれか一つに記載の方法。

【0341】

[0343] 実施形態４５．細胞の接触が、エレクトロポレーションにより実施される、実施形態１～４４のいずれか一つに記載の方法。

【0342】

[0344] 実施形態４６．Ｅ３、Ｋ３、又はＢ１８Ｒから選択される１つ以上のウイルスタンパク質をコードするＲＮＡポリヌクレオチドに細胞を接触させることを更に含む、実施形態１～２６又は３８～４５のいずれか一つに記載の方法。

【0343】

[0345] 実施形態４７．（ａ）Ｂ１８Ｒが、配列番号２６の配列、又はそれと少なくとも９０％又は少なくとも９５％同一の配列を有し；（ｂ）Ｅ３が、配列番号２７の配列、又はそれと少なくとも９０％又は少なくとも９５％同一の配列を有し；及び／又は（ｃ）Ｋ３が、配列番号２８の配列、又はそれと少なくとも９０％又は少なくとも９５％同一の配列を有する、実施形態４６に記載の方法。

【0344】

[0346] 実施形態４８．１つ以上のマイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）に細胞を接触させることを更に含む、実施形態１～２６又は３８～４７のいずれか一つに記載の方法。

【0345】

[0347] 実施形態４９．ｍｉＲが、ｍｉＲ３０２ａ、ｍｉＲ３０２ｂ、ｍｉＲ３０２ｃ、ｍｉＲ３０２ｄ、及びｍｉＲ３６７から選択される、実施形態４８に記載の方法。

【0346】

[0348] 実施形態５０．（ｉ）１つ以上の線状ＲＮＡでｉＰＳＣを作製する方法と比較した培養の終わりに存在する再プログラム化されたｉＰＳＣの数の増加；及び／又は（ｉｉ）１つ以上の線状ＲＮＡでｉＰＳＣを作製する方法と比較した再プログラム化中の１時点以上における細胞死の減少のうちの１つ以上を生じさせる、実施形態１～４９のいずれか一つに記載の方法。

【0347】

[0349] 実施形態５１．（ｉ）１つ以上の線状ＲＮＡでｉＰＳＣを作製する方法と比較した培養の終わりに存在する再プログラム化されたｉＰＳＣの数の増加；及び（ｉｉ）１つ以上の線状ＲＮＡでｉＰＳＣを作製する方法と比較した再プログラム化中の１時点以上における細胞死の減少の各々を生じさせる、実施形態１～４９のいずれか一つに記載の方法。

【0348】

[0350] 実施形態５２．実施形態１～５１のいずれか一つに記載の方法を用いて作製されるｉＰＳＣ。

【0349】

[0351] 実施形態５３．実施形態５２に記載のｉＰＳＣから誘導される分化細胞。

【0350】

[0352] 実施形態５４．筋細胞、神経系細胞、中枢神経系細胞、眼細胞、軟骨細胞、骨細胞、腱細胞、腎細胞、心筋細胞、肝細胞、膵島細胞、角化細胞、Ｔ細胞、又はＮＫ細胞である、実施形態５３に記載の分化細胞。

【0351】

[0353] 実施形態５５．細胞のゲノムの再プログラム化及び編集方法であって、（ｉ）タンパク質コード配列を含む組換え環状ＲＮＡに細胞を接触させることであって、タンパク質コード配列が少なくとも１つの再プログラム化因子をコードすること、及び（ｉｉ）細胞のＤＮＡ又はＲＮＡの編集能を有する酵素、又はそれをコードする核酸に細胞を接触させることを含む方法。

【0352】

[0354] 実施形態５６．細胞のゲノムの再プログラム化及び編集方法であって、（ｉ）タンパク質コード配列を含む組換え環状ＲＮＡであって、タンパク質コード配列が少なくとも１つの再プログラム化因子をコードする、組換え環状ＲＮＡ、及び（ｉｉ）細胞のＤＮＡ又はＲＮＡの編集能を有する酵素、又はそれをコードする核酸に細胞を同時に接触させることを含む方法。

【0353】

[0355] 実施形態５７．少なくとも１つの再プログラム化因子が、ヒト又はヒト化再プログラム化因子である、実施形態５５又は５６に記載の方法。

【0354】

[0356] 実施形態５８．少なくとも１つの再プログラム化因子がＯｃｔ３／４であり、Ｏｃｔ３／４が、配列番号７のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも９０％又は少なくとも９５％同一の配列を有する、実施形態５５～５７のいずれか一つに記載の方法。

【0355】

[0357] 実施形態５９．組換え環状ＲＮＡが、配列番号８の核酸配列、又はそれと少なくとも９０％又は少なくとも９５％同一の配列を含む、実施形態５９に記載の方法。

【0356】

[0358] 実施形態６０．少なくとも１つの再プログラム化因子がＫｌｆ４であり、Ｋｌｆ４が、配列番号９又は１０のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも９０％又は少なくとも９５％同一の配列を有する、実施形態５５～５７のいずれか一つに記載の方法。

【0357】

[0359] 実施形態６１．組換え環状ＲＮＡが、配列番号１１の核酸配列、又はそれと少なくとも９０％又は少なくとも９５％同一の配列を含む、実施形態６０に記載の方法。

【0358】

[0360] 実施形態６２．少なくとも１つの再プログラム化因子がＳｏｘ２であり、Ｓｏｘ２が、配列番号１２のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも９０％又は少なくとも９５％同一の配列を有する、実施形態５５～５７のいずれか一つに記載の方法。

【0359】

[0361] 実施形態６３．組換え環状ＲＮＡが、配列番号１３の核酸配列、又はそれと少なくとも９０％又は少なくとも９５％同一の配列を含む、実施形態６２に記載の方法。

【0360】

[0362] 実施形態６４．少なくとも１つの再プログラム化因子がＮａｎｏｇであり、Ｎａｎｏｇが、配列番号１４又は１５のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも９０％又は少なくとも９５％同一の配列を有する、実施形態５５～５７のいずれか一つに記載の方法。

【0361】

[0363] 実施形態６５．組換え環状ＲＮＡが、配列番号１６の核酸配列、又はそれと少なくとも９０％又は少なくとも９５％同一の配列を含む、実施形態６４に記載の方法。

【0362】

[0364] 実施形態６６．少なくとも１つの再プログラム化因子がＬｉｎ２８Ａであり、ここでＬｉｎ２８Ａが、配列番号１７のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも９０％又は少なくとも９５％同一の配列を有する、実施形態５５～５７のいずれか一つに記載の方法。

【0363】

[0365] 実施形態６７．組換え環状ＲＮＡが、配列番号１８の核酸配列、又はそれと少なくとも９０％又は少なくとも９５％同一の配列を含む、実施形態６６に記載の方法。

【0364】

[0366] 実施形態６８．少なくとも１つの再プログラム化因子がｃ－Ｍｙｃであり、ｃ－Ｍｙｃが、配列番号１９又は２０のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも９０％又は少なくとも９５％同一の配列を有する、実施形態５５～５７のいずれか一つに記載の方法。

【0365】

[0367] 実施形態６９．組換え環状ＲＮＡが、配列番号２１の核酸配列、又はそれと少なくとも９０％又は少なくとも９５％同一の配列を含む、実施形態６８に記載の方法。

【0366】

[0368] 実施形態７０．少なくとも１つの再プログラム化因子がＬ－Ｍｙｃであり、Ｌ－Ｍｙｃが、配列番号２２～２４のいずれか１つのアミノ酸配列、又はそれと少なくとも９０％又は少なくとも９５％同一の配列を有する、実施形態５５～５７のいずれか一つに記載の方法。

【0367】

[0369] 実施形態７１．組換え環状ＲＮＡが、配列番号２５の核酸配列、又はそれと少なくとも９０％又は少なくとも９５％同一の配列を含む、実施形態７０に記載の方法。

【0368】

[0370] 実施形態７２．環状ＲＮＡが、実質的に非免疫原性である、実施形態５５～５７のいずれか一つに記載の方法。

【0369】

[0371] 実施形態７３．環状ＲＮＡが、１つ以上のＭ－６－メチルアデノシン（ｍ６Ａ）残基を含む、実施形態７２に記載の方法。

【0370】

[0372] 実施形態７４．環状ＲＮＡが、約２００ヌクレオチド～約５，０００ヌクレオチドを含む、実施形態５５～７３のいずれか一つに記載の方法。

【0371】

[0373] 実施形態７５．環状ＲＮＡが、タンパク質コード配列に作動可能に連結された配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を含む、実施形態５５～７４のいずれか一つに記載の方法。

【0372】

[0374] 実施形態７６．環状ＲＮＡが、Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８、ｃ－Ｍｙｃ、又はＬ－Ｍｙｃから選択される２つ以上の再プログラム化因子をコードする、実施形態５５～７５のいずれか一つに記載の方法。

【0373】

[0375] 実施形態７７．Ｏｃｔ４又はその断片若しくはバリアントをコードする第１の環状ＲＮＡ、Ｓｏｘ２又はその断片若しくはバリアントをコードする第２の環状ＲＮＡ、Ｋｌｆ４又はその断片若しくはバリアントをコードする第３の環状ＲＮＡ、Ｃ－Ｍｙｃ又はその断片若しくはバリアントをコードする第４の環状ＲＮＡ、Ｌｉｎ２８又はその断片若しくはバリアントをコードする第５の環状ＲＮＡ、及びＮａｎｏｇ又はその断片若しくはバリアントをコードする第６の環状ＲＮＡに細胞を接触させることを含む、実施形態５５又は５６に記載の方法。

【0374】

[0376] 実施形態７８．Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８、ｃ－Ｍｙｃ、及びＬ－Ｍｙｃ、又はその断片若しくはバリアントをコードする１つ以上の環状ＲＮＡに細胞を接触させることを含む、実施形態５５又は５６に記載の方法。

【0375】

[0377] 実施形態７９．細胞が、Ｅ３、Ｋ３、Ｂ１８Ｒ、又は任意のマイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）から選択されるいかなる補助的因子にも接触しない、実施形態５５～７８のいずれか一つに記載の方法。

【0376】

[0378] 実施形態８０．細胞が、少なくとも１つの環状ＲＮＡと直接接触する、実施形態５５～７９のいずれか一つに記載の方法。

【0377】

[0379] 実施形態８１．細胞が、少なくとも１つの環状ＲＮＡの各々と１回接触する、実施形態５５～８０のいずれか一つに記載の方法。

【0378】

[0380] 実施形態８２．環状ＲＮＡの各々のうちの少なくとも１、２、３、４つ、又はそれ以上に細胞を接触させることを含む、実施形態５５～８０のいずれか一つに記載の方法。

【0379】

[0381] 実施形態８３．少なくとも１つの環状ＲＮＡの各々に細胞を４回未満接触させることを含む、実施形態５５～８０のいずれか一つに記載の方法。

【0380】

[0382] 実施形態８４．少なくとも１つの環状ＲＮＡの各々に細胞を２～４回接触させることを含む、実施形態５５～８０のいずれか一つに記載の方法。

【0381】

[0383] 実施形態８５．少なくとも１つの環状ＲＮＡの濃度が、少なくとも３ｐｇ ＲＮＡ／細胞である、実施形態５５～８４のいずれか一つに記載の方法。

【0382】

[0384] 実施形態８６．少なくとも１つの環状ＲＮＡの濃度が、約５ｐｇ ＲＮＡ／細胞～約１５ｐｇ ＲＮＡ／細胞である、実施形態５５～８５のいずれか一つに記載の方法。

【0383】

[0385] 実施形態８７．細胞の接触が、エレクトロポレーションにより実施される、実施形態５５～８６のいずれか一つに記載の方法。

【0384】

[0386] 実施形態８８．エレクトロポレーションが、Neon（登録商標）エレクトロポレーションシステムを使用する、実施形態８７に記載の方法。

【0385】

[0387] 実施形態８９．Ｅ３、Ｋ３、又はＢ１８Ｒから選択される１つ以上のウイルスタンパク質をコードするＲＮＡポリヌクレオチドに細胞を接触させることを含む、実施形態５５～７８又は８０～８８のいずれか一つに記載の方法。

【0386】

[0388] 実施形態９０．（ａ）Ｂ１８Ｒが、配列番号２６の配列、又はそれと少なくとも９０％又は少なくとも９５％同一の配列を有し；（ｂ）Ｅ３が、配列番号２７の配列、又はそれと少なくとも９０％又は少なくとも９５％同一の配列を有し；及び／又は（ｃ）Ｋ３が、配列番号２８の配列、又はそれと少なくとも９０％又は少なくとも９５％同一の配列を有する、実施形態８９に記載の方法。

【0387】

[0389] 実施形態９１．ｍｉＲ３０２ａ、ｍｉＲ３０２ｂ、ｍｉＲ３０２ｃ、ｍｉＲ３０２ｄ、及びｍｉＲ３６７から選択されるマイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）に細胞を接触させることを含む、実施形態５５～７８又は８０～９０のいずれか一つに記載の方法。

【0388】

[0390] 実施形態９２．細胞が、Ｅ３、Ｋ３、Ｂ１８Ｒから選択されるいかなるウイルスタンパク質にも接触しないか、又はｍｉＲ３０２ａ、ｍｉＲ３０２ｂ、ｍｉＲ３０２ｃ、ｍｉＲ３０２ｄ、及びｍｉＲ３６７から選択されるいかなるマイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）にも接触しない、実施形態５５～８８のいずれか一つに記載の方法。

【0389】

[0391] 実施形態９３．酵素が、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、アルゴノートエンドヌクレアーゼ（ＮｇＡｇｏ）、構造ガイド型エンドヌクレアーゼ（ＳＧＮ）、ＲＮＡガイド型ヌクレアーゼ（ＲＧＮ）、ＲＮＡに作用するアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）、又はこれらの修飾された若しくはトランケートされたバリアントである、実施形態５５～８２のいずれか一つに記載の方法。

【0390】

[0392] 実施形態９４．ＲＧＮが、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ、Ｃａｓ１２（ａ）ヌクレアーゼ（Ｃｐｆ１）、Ｃａｓ１２ｂヌクレアーゼ、Ｃａｓ１２ｃヌクレアーゼ、ＴｒｐＢ様ヌクレアーゼ、Ｃａｓ１３ａヌクレアーゼ（Ｃ２ｃ２）、Ｃａｓ１３ｂヌクレアーゼ、Ｃａｓ１４ヌクレアーゼ又はこれらの修飾された若しくはトランケートされたバリアントから選択されるＣａｓヌクレアーゼである、実施形態９３に記載の方法。

【0391】

[0393] 実施形態９５．ＲＧＮがＣａｓ９ヌクレアーゼであり、Ｃａｓ９ヌクレアーゼが、化膿レンサ球菌（S. pyogenes）又は黄色ブドウ球菌（S. aureus）から単離又は誘導される、実施形態９４に記載の方法。

【0392】

[0394] 実施形態９６．ＲＧＮが、ＡＰＧ０５０８３．１、ＡＰＧ０７４３３．１、ＡＰＧ０７５１３．１、ＡＰＧ０８２９０．１、ＡＰＧ０５４５９．１、ＡＰＧ０４５８３．１、及びＡＰＧ１６８８．１、ＡＰＧ０５７３３．１、ＡＰＧ０６２０７．１、ＡＰＧ０１６４７．１、ＡＰＧ０８０３２．１、ＡＰＧ０５７１２．１、ＡＰＧ０１６５８．１、ＡＰＧ０６４９８．１、ＡＰＧ０９１０６．１、ＡＰＧ０９８８２．１、ＡＰＧ０２６７５．１、ＡＰＧ０１４０５．１、ＡＰＧ０６２５０．１、ＡＰＧ０６８７７．１、ＡＰＧ０９０５３．１、ＡＰＧ０４２９３．１、ＡＰＧ０１３０８．１、ＡＰＧ０６６４６．１、ＡＰＧ０９７４８、ＡＰＧ０７４３３．１、ＡＰＧ００９６９、ＡＰＧ０３１２８、ＡＰＧ０９７４８、ＡＰＧ００７７１、ＡＰＧ０２７８９、ＡＰＧ０９１０６、ＡＰＧ０２３１２、ＡＰＧ０７３８６、ＡＰＧ０９９８０、ＡＰＧ０５８４０、ＡＰＧ０５２４１、ＡＰＧ０７２８０、ＡＰＧ０９８６６、及びＡＰＧ００８６８のうちのいずれか１つから選択される、実施形態９３に記載の方法。

【0393】

[0395] 実施形態９７．ガイドＲＮＡ、又はそれをコードする核酸に細胞を接触させることを更に含む、実施形態５５～９６のいずれか一つに記載の方法。

【0394】

[0396] 実施形態９８．細胞が、酵素又はそれをコードする核酸に接触する前に環状ＲＮＡに接触する、実施形態５５又は５７～９７のいずれか一つに記載の方法。

【0395】

[0397] 実施形態９９．細胞が、酵素又はそれをコードする核酸に接触した後に組換え環状ＲＮＡに接触する、実施形態５５又は８７～９７のいずれか一つに記載の方法。

【0396】

[0398] 実施形態１００．細胞が、細胞のＤＮＡ又はＲＮＡの編集能を有する酵素、又はそれをコードする核酸、及びガイドＲＮＡ、又はそれをコードする核酸に接触する、実施形態５５～９９のいずれか一つに記載の方法。

【0397】

[0399] 実施形態１０１．酵素が細胞のＤＮＡの編集能を有し、酵素とガイドＲＮＡとが、細胞との接触前にリボ核タンパク質として複合体化する、実施形態１００に記載の方法。

【0398】

[0400] 実施形態１０２．細胞の接触がエレクトロポレーションにより実施される、実施形態５５～１０１のいずれか一つに記載の方法。

【0399】

[0401] 実施形態１０３．実施形態５５～１０２のいずれか一つに記載の方法により生成される細胞。

【0400】

[0402] 実施形態１０４．細胞の再プログラム化方法であって、Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８、及びｃ－Ｍｙｃからなる６つの再プログラム化因子をコードする１つ以上の環状ＲＮＡに細胞を接触させることを含む方法。

【0401】

[0403] 実施形態１０５．Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８、及びｃ－Ｍｙｃからなる群からの再プログラム化因子を各々がコードする６つの環状ＲＮＡに細胞を接触させることを含む、実施形態１０４に記載の方法。

【0402】

[0404] 実施形態１０６．環状ＲＮＡ又は線状ＲＮＡのいずれか１つが脂質ナノ粒子にコンジュゲートされる、実施形態１０４又は１０５に記載の方法。

【0403】

[0405] 実施形態１０７．細胞が、Ｅ３、Ｋ３、Ｂ１８Ｒ、又は１つ以上のマイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）から選択される１つ以上の因子に接触しない、実施形態１０４～１０６のいずれか一つに記載の方法。

【0404】

[0406] １０７Ａ．環状ＲＮＡが細胞にとって外因性である、請求項１～５１、５５～１０２、又は１０４～１０７のいずれか一項に記載の方法。

【0405】

[0407] 実施形態１０８．実施形態１０４～１０７Ａのいずれか一つに記載の方法により生成される細胞。

【0406】

[0408] 実施形態１０９．再プログラム化因子をコードする１つ以上の外因性環状ＲＮＡを含む体細胞であって、再プログラム化因子が、Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８、及びｃ－Ｍｙｃからなる群から選択される、体細胞。

【0407】

[0409] 実施形態１１０．体細胞が１つ以上の外因性環状ＲＮＡを含み、１つ以上の環状ＲＮＡが、各々、Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８、及びｃ－Ｍｙｃから選択される再プログラム化因子をコードする、実施形態１０９に記載の体細胞。

【0408】

[0410] 実施形態１１１．体細胞が６つの外因性環状ＲＮＡを含み、各環状ＲＮＡが、Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８、及びｃ－Ｍｙｃのうちの１つをコードする、実施形態１０９に記載の体細胞。

【0409】

[0411] 実施形態１１２．体細胞が５つの外因性環状ＲＮＡを含み、各環状ＲＮＡが、Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、及びＬｉｎ２８のうちの１つをコードする、実施形態１０９に記載の体細胞。

【0410】

[0412] 実施形態１１３．体細胞が４つの外因性環状ＲＮＡを含み、各環状ＲＮＡが、Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、及びｃ－Ｍｙｃのうちの１つをコードする、実施形態１０９に記載の体細胞。

【0411】

[0413] 実施形態１１４．体細胞が３つの外因性環状ＲＮＡを含み、各環状ＲＮＡが、Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、及びＳｏｘ２のうちの１つをコードする、実施形態１０９に記載の体細胞。

【0412】

[0414] 実施形態１１５．１つ以上のＣＤ３４＋細胞を含む浮遊培養液であって、ＣＤ３４＋細胞が、再プログラム化因子をコードする１つ以上の外因性ｃｉｒｃＲＮＡを含む、浮遊培養液。

【0413】

[0415] 実施形態１１６．ＣＤ３４＋細胞が、Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８、及びｃ－Ｍｙｃからなる群から選択される１つの再プログラム化因子を各々がコードする６つの外因性ｃｉｒｃＲＮＡを含む、実施形態１１５に記載の浮遊培養液。

【0414】

[0416] 実施形態１１７．ＣＤ３４＋細胞が、Ｅ３、Ｋ３、Ｂ１８Ｒ、又はマイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）から選択される補助的因子をコードする外因性（exogneous）核酸を含まない、実施形態１１５又は１１６に記載の浮遊培養液。

【0415】

[0417] 実施形態１１８．Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８、及びｃ－Ｍｙｃからなる再プログラム化因子をコードする１つ以上の環状ＲＮＡを含む組成物。

【0416】

[0418] 実施形態１１９．Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８、及びｃ－Ｍｙｃからなる再プログラム化因子をコードする２つ以上の環状ＲＮＡを含む組成物。

【0417】

[0419] 実施形態１２０．Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８、及びｃ－Ｍｙｃからなる再プログラム化因子のうちの１つを各々がコードする６つの環状ＲＮＡを含む組成物。

【0418】

[0420] 実施形態１２１．Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、及びＬｉｎ２８からなる再プログラム化因子のうちの１つを各々がコードする５つの環状ＲＮＡを含む組成物。

【0419】

[0421] 実施形態１２２．Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、及びｃ－Ｍｙｃからなる再プログラム化因子のうちの１つを各々がコードする４つの環状ＲＮＡを含む組成物。

【0420】

[0422] 実施形態１２３．Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、及びＳｏｘ２からなる再プログラム化因子のうちの１つを各々がコードする３つの環状ＲＮＡを含む組成物。

【0421】

[0423] 実施形態１２４．実施形態１１８～１２３のいずれか一つに記載の組成物を含むキット。

【0422】

[0424] 実施形態１２５．実施形態１１８～１２３のいずれか一つに記載の組成物を含む細胞。

【0423】

[0425] 実施形態１２６．真核細胞である、実施形態１２５に記載の細胞。

【0424】

[0426] 実施形態１２７．哺乳類細胞である、実施形態１２６に記載の細胞。

【0425】

[0427] 実施形態１２８．ヒト細胞である、実施形態１２７に記載の細胞。

【0426】

[0428] 実施形態１２９．ＣＤ３４＋細胞、Ｔ細胞、又はＮＫ細胞である、実施形態１２５～１２８のいずれか一つに記載の細胞。

【0427】

[0429] 実施形態１３０．Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８、及びｃ－Ｍｙｃ、又はＬ－Ｍｙｃのいずれか一方から選択される１つ以上の再プログラム化因子をコードする１つ以上の環状ＲＮＡを含むＣＤ３４＋細胞。

【0428】

[0430] 実施形態１３１．再プログラム化因子が、Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８、及びｃ－Ｍｙｃの６つ全てからなる、実施形態１３０に記載のＣＤ３４＋細胞。

【0429】

[0431] 実施形態１３２．再プログラム化因子が、Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８、及びＬ－Ｍｙｃの６つ全てからなる、実施形態１３０に記載のＣＤ３４＋細胞。

【0430】

[0432] 実施形態１３３．再プログラム化因子が、Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、及びＬｉｎ２８からなる、実施形態１３０に記載のＣＤ３４＋細胞。

【0431】

[0433] 実施形態１３４．再プログラム化因子が、Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、及びｃ－Ｍｙｃからなる、実施形態１３０に記載のＣＤ３４＋細胞。

【0432】

[0434] 実施形態１３５．再プログラム化因子が、Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、及びＳｏｘ２からなる、実施形態１３０に記載のＣＤ３４＋細胞。

【0433】

[0435] 実施形態１３６．ＳＳＥＡ－３、ＳＳＥＡ－４、ＴＲＡ－１－６０、ＴＲＡ－１－８１、ＴＲＡ－２－４９／６Ｅ、アルカリホスファターゼ、Ｓｏｘ２、Ｅ－カドヘリン、ＵＴＦ－１、Ｏｃｔ４、Ｒｅｘ１、Ｎａｎｏｇ、又はこれらの組み合わせから選択される少なくとも１つのステムネスマーカーを呈する、実施形態１３０～１３５のいずれか一つに記載のＣＤ３４＋細胞。

【0434】

[0436] 実施形態１３７．１つ以上の環状ＲＮＡが、細胞にとって外因性である、実施形態１３０～１３６のいずれか一つに記載のＣＤ３４＋細胞。

【0435】

[0437] 実施形態１３８．１つ以上の遺伝子修飾を更に含む、実施形態１３０～１３７のいずれか一つに記載のＣＤ３４＋細胞。

【0436】

[0438] 実施形態１３９．１つ以上の遺伝子修飾が遺伝子ノックアウトを含む、実施形態１３８に記載のＣＤ３４＋細胞。

【0437】

[0439] 実施形態１４０．１つ以上の遺伝子修飾が遺伝子ノックインを含む、実施形態１３８又は１３９に記載のＣＤ３４＋細胞。

【0438】

[0440] 実施形態１４１．実施形態１３０～１４０のいずれか一つに記載のＣＤ３４＋細胞から誘導された人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）。

【0439】

[0441] 実施形態１４２．細胞が低免疫原性である、実施形態１４１に記載のｉＰＳＣ。

【0440】

[0442] 実施形態１４３．実施形態１４１又は１４２に記載のｉＰＳＣから生成される分化細胞。

【0441】

[0443] 実施形態１４４．疾患又は病態を治療する方法であって、それを必要としている対象に実施形態１４１又は１４２に記載のｉＰＳＣ又は実施形態１２６に記載の分化細胞を投与することを含む方法。

【0442】

[0444] 実施形態１４５．体細胞を分化転換させる方法であって、１つ以上の外因性環状ＲＮＡに細胞を接触させることを含む方法。

【0443】

[0445] 実施形態１４６．実施形態１４５に記載の方法によって作製される分化転換細胞。

【0444】

[0446] 実施形態１４７．人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）から細胞を分化させる方法であって、１つ以上の環状ＲＮＡにｉＰＳＣを接触させることを含む方法。

【0445】

[0447] 実施形態１４８．実施形態１４７に記載の方法によって作製される分化細胞。

【実施例】

【0446】

実施例
[0448] 本明細書にあくまでも例示を目的として含まれる以下の例は、限定することを意図するものではない。

【0447】

実施例１：ＣＤ３４＋細胞の浮遊状態での環状ＲＮＡ再プログラム化
[0449] ＣＤ３４＋細胞を浮遊状態で再プログラム化することの実現可能性を評価する実験を実施した。この再プログラム化実験のタイムライン及びプロセスの概略図を図４に提供する。環状化されたＲＮＡの例示的配列を配列番号８、１１、１３、１６、１８、及び２１に提供し、以下の表６に詳述する。

【0448】

【表30】

【0449】

[0450] 簡潔に言えば、臍帯血由来のＣＤ３４＋細胞を、５つのサイトカイン－ＳＣＦ、ＦＬＴ３Ｌ、ＴＰＯ、ＩＬ－３、及びＩＬ－６（各１００ｎｇ／ｍＬ）を含有するＳＣＧＭ培地（Cellgenix）において３日間（－３日目から０日目まで）拡大した。０日目、各条件につき０．５×１０^６細胞をペレット化し、洗浄し、エレクトロポレーションによるトランスフェクションのため１００～１２０μＬの緩衝液に再懸濁した。１６００Ｖ、１０ｍｓパルス幅、３パルスに設定したNeon（登録商標）エレクトロポレーターで細胞をエレクトロポレーションした。ＲＮＡカクテル（Ｃ１４及びＣ６）を２つの濃度：５．２ｐｇ／細胞及び１３ｐｇ／細胞でＣＤ３４細胞に送達した。これらの濃度は、より低いＲＮＡ／細胞比（２．６ｐｇ／細胞）を使用し、ＣＤ３４＋細胞再プログラム化が不成功に終わった以前の実験（データは示さず）に基づき選択した。この実験で使用したＲＮＡカクテルは、以下の成分を含む：
（ａ）Ｃ１４カクテル－ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、ｃＭＹＣ、ＮＡＮＯＧ及びＬＩＮ２８Ａ（ＯＳＫＭＮＬ）を別個にコードする６つのｃｉｒｃＲＮＡ＋Ｅ３／Ｋ３／Ｂ１８Ｒ（ＥＫＢ）をコードする線状ＲＮＡ＋５つのｍｉＲ（ｍｉＲ３０２ａ、－ｂ、－ｃ、－ｄ及びｍｉＲ３６７）
（ｂ）Ｃ６カクテル＝ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、ｃＭＹＣ、ＮＡＮＯＧ及びＬＩＮ２８Ａ（ＯＳＫＭＮＬ）を別個にコードする６つのｃｉｒｃＲＮＡ。

【0450】

[0451] ６つの再プログラム化因子ＯＳＫＭＮＬの化学量論は、３：１：１：１：１：１である。トランスフェクション頻度及びカクテルの各々で送達されるＲＮＡ量を表７に示す。

【0451】

【表31】

【0452】

[0452] ０日目にＯＳＫＭを発現するセンダイウイルス（Cytotune 2.0キット）で形質導入したＣＤ３４＋細胞（０．５×１０^６）を陽性対照として使用した。陰性対照には、他のトランスフェクションと同時に行ったモックトランスフェクション（ＲＮアーゼ及びＤＮアーゼ不含水）（１日１回で６日間（表７の群１４）又は隔日１回で４日間（表７の群１３））並びにトランスフェクトしなかったＣＤ３４細胞が含まれた。対照は全て、０．５×１０^６ ＣＤ３４＋細胞で実施した。

【0453】

[0453] トランスフェクション後に毎回、１０μＭのＲＯＣＫ阻害薬Y27632を含有する完全ＳＣＧＭ培地に細胞を再懸濁し、２４ウェル非接着性プレートに播種した。最終回のトランスフェクションを終えた翌日、対照（ＳｅＶ、モック、及びＣＤ３４＋単独細胞）を含めた条件毎に、細胞数及び生存能力を決定した。細胞は全て、完全ＳＣＧＭ培地（サイトカイン含有）及び１０μＭのY27632が入ったiMatrix-511コートした１２ウェル組織培養処理済みプレートにプレーティングした。プレーティングした細胞は、５％Ｏ２（低酸素インキュベーター）で成長させた。

【0454】

[0454] ４～６日目、各ウェルから培地の半分（１ｍｌ）をサイトカイン不含の１ｍｌのＳＣＧＭ培地に交換した。４日目の交換培地には、１０μＭのY27632が含まれた。残りの日の交換培地には、１０μＭのY27632は含まれなかった。７日目、各ウェルから培地の半分（１ｍｌ）を１ｍｌのＰＳＣ培地（iM511上で成長させる細胞にはNutristem hPSC-XF又はVtn上で成長させる細胞にはStemfit培地）に交換した。８日目以降、ｉＰＳＣコロニーがピッキングできる状態になるまで、各ウェルの培地全てを２ｍｌのＰＳＣ培地に交換した。

【0455】

[0455] 初めに、６日目～７日目（ＳｅＶについて）及び８日目（Ｃ１４について）までにｉＰＳＣ様コロニーに似た小さい凝集塊が観察された。１１日目までに、ｃｉｒｃＲＮＡ条件のうちの３つ（上の３行）に細胞クラスターが観察された。これらのクラスターは増殖及びサイズ成長し続け、ｉＰＳＣ形態を呈した。図５を参照のこと。

【0456】

[0456] 再プログラム化の２２～２３日目、培養物を固定し、多能性マーカーＴｒａ－１－８１及びＯＣＴ４で染色し、IncuCyteを使用して全ウェル画像をスキャンした。ｉＰＳＣコロニーは、多能性マーカーに関して陽性染色Ｔｒａ－１－８１＋及びＯｃｔ４＋を示した。５．２ｐｇ（群１）又は１３ｐｇ（群５）のいずれかのＣ１４カクテルを使用してトランスフェクションを２回行った（０日目及び２日目に実施した）培養物は（図６Ａ及び図６Ｂ）、より大きい面積のＴｒａ－１－８１／Ｏｃｔ４ダブルポジティブ細胞を示した。５．２ｐｇ（群３）のＣ１４カクテルの４日連日のトランスフェクション（図６Ｃ）によってもまた、ＴＲＡ－１－８１及びＯＣＴ４陽性のｉＰＳＣコロニーが生じた。

【0457】

[0457] ｃｉｒｃＲＮＡで再プログラム化した継代１代目のｉＰＳＣクローンの代表的な位相差画像を図７に示す。ｃｉｒｃＲＮＡで再プログラム化したＣＤ３４細胞から誘導されたこれらのｉＰＳＣクローンは、培養下でのピッキング及び拡大が可能であった。

【0458】

[0458] これらの結果は、再プログラム化因子をコードするｃｉｒｃＲＮＡを使用したＣＤ３４＋細胞の浮遊状態での再プログラム化を実証している。Ｃ１４カクテルは、１）０日目及び２日目のトランスフェクション、又は２）１、２、３及び４日目のトランスフェクションのいずれによってもＣＤ３４細胞の再プログラム化に成功した。再プログラム化効率は、ＳｅＶ再プログラム化（群１１）と同様であったことから、ｃｉｒｃＲＮＡ再プログラム化のロバスト性が更に実証される。モックエレクトロポレーション（×２）と、続くＳｅＶ再プログラム化では、多量の細胞死が生じたものの、なおもｉＰＳＣコロニーが生じた。これは、エレクトロポレーション手順それ自体は、ｉＰＳＣ再プログラム化の開始及び進行の点で禁忌でないことを示唆している。

【0459】

実施例２：線維芽細胞の同時の再プログラム化及び遺伝子編集
[0459] Ｂ２Ｍ遺伝子の同時の再プログラム化（ｃｉｒｃＲＮＡによる）及び編集によるＢ２Ｍ－／－ｉＰＳＣの生成を実証するため、線維芽細胞（ＨＤＦ）を使用して実験を実施した。

【0460】

[0460] ２つのプロトコルを比較した：（１）ＨＤＦの同時の再プログラム化及び編集を例証する１ステッププロトコル、及び（２）ＨＤＦの順次の編集及び再プログラム化を例証する２ステッププロトコル。

【0461】

[0461] １ステッププロトコルについては、以前最適化したｃｉｒｃＲＮＡ再プログラム化プロトコル－即ち、０及び２日目にRNAiMAXトランスフェクション試薬を使用して２回のトランスフェクションを実施するプロトコルに従いＨＤＦをｃｉｒｃＲＮＡで再プログラム化した。Ｃ１４再プログラム化カクテルを使用し、このカクテルは、再プログラム化因子ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、ｃＭＹＣ、ＮＡＮＯＧ及びＬＩＮ２８Ａ（ＯＳＫＬＭＮ）をコードする６つのｃｉｒｃＲＮＡ＋Ｅ３／Ｋ３／Ｂ１８Ｒをコードする線状ｍＲＮＡ＋５つのマイクロＲＮＡ（ｍｉＲ３０２ａ、－ｂ、－ｃ、－ｄ及びｍｉＲ３６７）を含んだ。ＬＥＧ１４ ＲＮＡガイド型ヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡポリヌクレオチド（Life Edit Therapeutics、Morrisville, NC）及びＢ２Ｍ遺伝子を標的化するｓｇＲＮＡ（Life Edit Therapeutics、Morrisville, NC）をｃｉｒｃＲＮＡ再プログラム化カクテルと共にコトランスフェクトした。以下の３条件を試験した：
（ａ）ヌクレアーゼ／ｓｇＲＮＡのコトランスフェクションなし
（ｂ）０日目にヌクレアーゼ／ｓｇＲＮＡをコトランスフェクトする（ＲＥ１）
（ｃ）０及び２日目にヌクレアーゼ／ｓｇＲＮＡをコトランスフェクトする（ＲＥ２）

【0462】

[0462] ＲＥ１及びＲＥ２の各々については、３つの異なる密度のＨＤＦ（各ウェル２５Ｋ、５０Ｋ及び７５Ｋ）を同時に再プログラム化し、編集した。

【0463】

[0463] ２ステッププロトコルについては、初めにＨＤＦに、ＲＮＡガイド型ヌクレアーゼとＢ２ＭターゲティングｓｇＲＮＡとを含むＲＮＰ複合体をNeon（登録商標）エレクトロポレーターを使用してトランスフェクトした。３つの異なるセッティングを試験した（表９を参照のこと）。次にエレクトロポレーションしたＨＤＦを培養下にプレーティングして最適なコンフルエンシーに至らせ（約６日）、ｃｉｒｃＲＮＡ再プログラム化のため、１ステッププロトコルに使用したのと同じ手順に従い６ウェルプレートに播種した。

【0464】

[0464] 再プログラム化の２１日目、培養物を固定し、多能性マーカーＴｒａ－１－８１及びＯＣＴ４で染色し、IncuCyteを使用して全ウェル画像をスキャンした。ｉＰＳＣコロニーは、Ｔｒａ－１－８１－及びＯｃｔ４に関して陽性染色を示した。図８は、１ステッププロトコルの染色結果を示す。図１０は、２ステッププロトコルの染色結果を示す。

【0465】

[0465] １ステップ（同時）及び２ステップ（順次）プロトコルの編集効率を、ｓｇＲＮＡ標的部位（Ｂ２Ｍ遺伝子のエクソン１）の辺りの領域でインデルを示した％リードによって測定した。編集効率は、目的の領域のＰＣＲ増幅及び得られたアンプリコンについてのIluminaのMi-Seq NGSシステムを使用したシーケンシングにより決定した。１ステッププロトコルの結果を表８に示す。細胞を２回編集したとき（ＲＥ２）、全てのリードが多様なインデルを示したとおり、１００％の編集効率が観察された。

【0466】

【表32】

【0467】

[0466] １ステップ同時再プログラム化及び編集プロトコルから誘導された２つのｉＰＳＣクローンのＢ２Ｍアレルを更に分析した。結果は、この編集プロトコルによりヘテロ接合体クローン及びホモ接合体クローンの両方が生じたことを示している（データは示さず）。

【0468】

[0467] ２ステッププロトコルの結果を表９に示す。約３×１０^５個のＨＤＦに、ＲＮＡガイド型ヌクレアーゼとＢ２Ｍ遺伝子を標的化するｓｇＲＮＡとを含むリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体をエレクトロポレーションした。編集した細胞を培養下で拡大し、Ｃ１４ ｃｉｒｃＲＮＡカクテルによる再プログラム化のため６ウェルプレートに３つの異なる密度（２５Ｋ、５０Ｋ及び７５Ｋ）で播種した。溶解及び目的の領域のＰＣＲ増幅のためサブクローニングした１６の異なる物理的に別個のクローンで（３つの異なるNeon（登録商標）パラメータについて）編集効率を決定した。IluminaのMi-Seq NGSシステムを使用してアンプリコンリードをシーケンシングした。表９に示されるとおり、３つ全てのエレクトロポレーションパラメータ条件で、Ｂ２Ｍ遺伝子の高い編集効率が生じた。

【0469】

【表33】

【0470】

[0468] 図９は、１ステップ同時再プログラム化及び編集プロトコルから誘導されたｉＰＳＣクローンの代表的な画像を提供する。これらのクローンは、典型的なｉＰＳＣ形態を呈し、培養下で拡大することができる。ＲＥ１プロトコル（編集因子の１回の送達）から誘導されたクローンを上段に示す。ＲＥ２プロトコル（編集因子の２回の送達）から誘導されたクローンを下段に示す。

【0471】

[0469] これらのデータは、１ステップ（同時）及び２ステップ（順次）の両方の編集プロトコルが、編集された（Ｂ２Ｍ－／－又はＢ２Ｍ－／＋）ｉＰＳＣの生成に成功したことを実証する。１ステッププロトコルは、真の同時再プログラム化及び編集に相当する。編集因子（ＲＮＡガイド型ヌクレアーゼ＋ｓｇＲＮＡ）の１回のトランスフェクションにより、編集効率は５０～７０％となり、編集因子の２回のトランスフェクションにより、編集効率は約１００％となった。２ステッププロトコルによってもまた、編集効率は約１００％と極めて高くなった。

【0472】

実施例３：補助的因子のないＣＤ３４＋細胞の浮遊状態でのｃｉｒｃＲＮＡ再プログラム化
[0470] ＣＤ３４＋細胞の浮遊状態でのＣ６ ｃｉｒｃＲＮＡカクテル再プログラム化について、異なるトランスフェクションレジメンを試験する実験を実施した。このカクテルは、再プログラム化因子ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、ｃＭＹＣ、ＬＩＮ２８Ａ、及びＮＡＮＯＧ（ＯＳＫＭＬＮ）をコードするｃｉｒｃＲＮＡのみを含有する。これらの実験の目標は、浮遊細胞を再プログラム化することの実現可能性を実証すること、及びｃｉｒｃＲＮＡカクテルで再プログラム化するときＥ３／Ｋ３／Ｂ１８Ｒ及びマイクロＲＮＡは必要でないことを更に実証することであった。

【0473】

[0471] 図１１は、これらの実験のタイミング及び実験計画の概略図を提供する。表１０は、試験した条件の各々についての実験の詳細を提供する。Ｃ１４及びＣ６カクテルに加えて、Ｃ１１カクテル（ＯＳＫＭＬＮ再プログラム化因子をコードする６つのｃｉｒｃＲＮＡ＋５つのマイクロＲＮＡを含む）もまた試験した。

【0474】

【表34】

【0475】

[0472] 臍帯血由来のＣＤ３４＋細胞に以下のカクテルのうちの１つをエレクトロポレーションすることにより、この細胞をｉＰＳＣへと再プログラム化した：
（ａ）Ｃ１４カクテル－ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、ｃＭＹＣ、ＮＡＮＯＧ及びＬＩＮ２８Ａ再プログラム化因子（ＯＳＫＭＮＬ）を別個にコードするｃｉｒｃＲＮＡ＋Ｅ３／Ｋ３／Ｂ１８Ｒをコードする線状ＲＮＡ＋５つのｍｉＲ（ｍｉＲ３０２ａ、－ｂ、－ｃ、－ｄ及びｍｉＲ３６７）；
（ｂ）Ｃ１１カクテル－ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、ｃＭＹＣ、ＮＡＮＯＧ及びＬＩＮ２８Ａ再プログラム化因子（ＯＳＫＭＮＬ）を別個にコードする６つのｃｉｒｃＲＮＡ＋５つのｍｉＲ（ｍｉＲ３０２ａ、－ｂ、－ｃ、－ｄ及びｍｉＲ３６７）；又は
（ｃ）Ｃ６カクテル－ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、ｃＭＹＣ、ＮＡＮＯＧ及びＬＩＮ２８Ａ（ＯＳＫＭＮＬ）を別個にコードするｃｉｒｃＲＮＡ

【0476】

[0473] ６つの再プログラム化因子ＯＳＫＭＮＬの化学量論は、３：１：１：１：１：１であった。

【0477】

[0474] 簡潔に言えば、臍帯血由来のＣＤ３４＋細胞を、５つのサイトカイン－ＳＣＦ、ＦＬＴ３Ｌ、ＴＰＯ、ＩＬ３及びＩＬ６（各１００ｎｇ／ｍｌ）を含有するＳＣＧＭ培地（Cellgenix）において３日間（－３日目から０日目まで）拡大した。０日目、各条件につき０．５×１０^６細胞をペレット化し、洗浄し、エレクトロポレーションによるトランスフェクションのため１００～１２０μＬの緩衝液に再懸濁した。ＲＮＡカクテルを導入するため、１６００Ｖ、１０ｍｓパルス幅、３パルスに設定したNeon（登録商標）エレクトロポレーターで細胞をエレクトロポレーションした。この実験の陰性対照には、１日１回で４日間実施したモックトランスフェクション（ＲＮアーゼ、ＤＮアーゼ不含水）、並びにトランスフェクトしていないＣＤ３４＋細胞を含めた。両方の陰性対照とも、０．５×１０^６個のＣＤ３４＋細胞で実施した。トランスフェクション後に毎回、１０μＭのY27632を含有する完全ＳＣＧＭ培地に細胞を再懸濁し、２４ウェル非接着性プレートに播種した。

【0478】

[0475] 最終回のトランスフェクションの翌日、対照（モックトランスフェクトした及びトランスフェクトしていないＣＤ３４＋細胞）を含めた条件毎に、細胞数及び生存能力を決定した。細胞は全て、完全ＳＣＧＭ培地（サイトカイン含有）及び１０μＭのY27632が入ったiMatrix-511コートした１２ウェル組織培養処理済みプレートにプレーティングした。細胞は、５％Ｏ_２（低酸素インキュベーター）で成長させた。

【0479】

[0476] ４～５日目、各ウェルから培地の半分（１ｍｌ）をサイトカイン不含の１ｍｌ ＳＣＧＭ培地＋１０μＭのY27632培地に交換した。６日目、各ウェルから培地の半分（１ｍｌ）をサイトカイン不含の１ｍｌ ＳＣＧＭ培地及び１０μＭのY27632培地不含に交換した。７日目、各ウェルから培地の半分（１ｍｌ）を１ｍｌのＰＳＣ培地（iM511上で成長させる細胞にはNutristem hPSC-XF又はVtn上で成長させる細胞にはStem fit培地）に交換した。８日目以降、ｉＰＳＣコロニーをピッキングできる状態になるまで、各ウェルの培地全てを２ｍｌのＰＳＣ培地に交換した。

【0480】

[0477] 図１２Ａ～図１２Ｃは、Ｃ１４、Ｃ６、及びＣ１１ ｃｉｒｃＲＮＡカクテルを使用したＣＤ３４＋細胞再プログラム化の形態学的進行を示す。４日目、ほとんどの条件から、小さい付着した細胞クラスターが観察された。７日目、全ての条件から、初期ｉＰＳＣ様コロニーが出現した。これらのクラスターは増殖及びサイズ成長し続け、ｉＰＳＣ形態を呈した。

【0481】

[0478] 図１３Ａは、Incucyteの分析モジュールにあるオブジェクトカウント機能を使用してセグメンテーションし及び同定した、Ｃ６（８ｐｇ）再プログラム化カクテルで再プログラム化したｉＰＳＣコロニーの６ウェルプレートの代表的な画像を提供する。図１３Ｂは、異なるｃｉｒｃＲＮＡカクテルによる再プログラム化時の初期（８日目～１０日目）に観察される再プログラム化効率の比較を提供する。

【0482】

[0479] 試験した全ての条件で（Ｃ１４、Ｃ１１、Ｃ６及びＣ１４＋編集）、４～７日目までにＣＤ３４＋細胞からｉＰＳＣコロニーが生じた。両方のトランスフェクションスケジュールとも（隔日で２回のトランスフェクション（図１２）及び４日連日のトランスフェクション（データは示さず））、再プログラム化及びｉＰＳＣの生成が生じた。これらの条件の中でも、８ｐｇのＣ６（２回の隔日トランスフェクション）によるとき、他の全ての条件と比較して最大数のｉＰＳＣコロニーが生じた（図１３Ｂを参照のこと）。低い播種密度であっても（１２．５Ｋ細胞もの低さ）、３日目にコロニーが観察された。８ｐｇのＣ６カクテルでは、再プログラム化効率は約３％となった。

【0483】

実施例４：ＣＤ３４＋細胞におけるＲＮＡエレクトロポレーションの最適化
[0480] ＣＤ３４＋細胞のエレクトロポレーションプロトコルを最適化する実験を実施した。線状ｍＲＮＡ対ｃｉｒｃＲＮＡ ＲＮＡのトランスフェクションを試験するとともに、Neon（登録商標）エレクトロポレーション（１００μＬチップ容積）とLonza Amaxa nucleofector（２０μＬ容積）とを比較した。

【0484】

[0481] 実験的方法の概略図を図１４に示す。簡潔に言えば、臍帯血由来のＣＤ３４＋細胞を解凍し、５つのサイトカイン－ＳＣＦ、ＦＬＴ３Ｌ、ＴＰＯ、ＩＬ－３及びＩＬ－６（各１００ｎｇ／ｍｌ）を含有するＳＣＧＭ培地（Cellgenix）で３日間（－３日目から０日目まで）拡大培養した。０日目、ＣＤ３４＋細胞を収集し、洗浄し、Neon（登録商標）システム又はLonzaのNucleofactorを使用したエレクトロポレーションに好適な緩衝液中に再懸濁した。

【0485】

[0482] ｎＧＦＰ（０．２５又は０．５ｕｇ）をコードする線状の修飾されていないｍＲＮＡ（TriLink）又はｃｉｒｃＲＮＡ（修飾されていない）をNeon（登録商標）又はLonzaエレクトロポレーションシステムを使用してエレクトロポレーションした。トランスフェクションを２回、０日目及び２日目に実施した。Neon（登録商標）ベースのトランスフェクションについては、１×１０^６細胞を洗浄し、Buffer Tに再懸濁し、Neon（登録商標）の１００μｌチップにより１６００Ｖ、１０ｍｓパルス幅、３パルスでエレクトロポレーションした。Lonzaベースのトランスフェクションについては、１×１０^６細胞を洗浄し、製造者の指示どおり（４．５：１比）補足した２０μｌのP3 nucleofector溶液中に再懸濁した。Lonzaが推奨する浮遊細胞用のプログラムE0-100を使用して１６ウェルキュベットにて細胞をエレクトロポレーションした。細胞を完全ＳＣＧＭ培地が入った非接着性プレートに直ちに移し替えた。

【0486】

[0483] エレクトロポレーション後１、２、３、４、及び５日目に１００，０００細胞を回収し、固定して、タンパク質発現を分析した。ｎＧＦＰタンパク質発現はまた、浮遊状態の生細胞においてIncucyteリアルタイムイメージングプラットフォームも使用して測定し、並びに初回トランスフェクションの後にはフローサイトメトリーによっても（細胞レベルでのｎＧＦＰ発現を測定するため）測定した。

【0487】

[0484] 図１５は、IncuCyteイメージングにより決定したときのｎＧＦＰタンパク質発現の動態を示す。ｎＧＦＰタンパク質レベルをIncucyteにより６時間毎に測定した。Lonza Amaxa nucleofectorではなく、Neon（登録商標）エレクトロポレーターでトランスフェクトしたＲＮＡ（線状又は環状）は、０日目の初回トランスフェクション後にｎＧＦＰタンパク質発現の有意なピークを生じた。２日目における２回目のトランスフェクション後、Neon（登録商標）エレクトロポレーターでトランスフェクトしたｃｉｒｃＲＮＡのみが、ｎＧＦＰタンパク質発現の高いピークを生じた。Neon（登録商標）エレクトロポレーターでトランスフェクトした線状ｍＲＮＡは、２回目のトランスフェクション後に生じたピークは極めて低かった。Lonza Amaxa nucleofectorを使用すると、線状ｍＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡのいずれのトランスフェクションも、何ら有意なｎＧＦＰタンパク質発現を生じなかった。

【0488】

[0485] 図１６は、初回トランスフェクション翌日のｎＧＦＰタンパク質レベルのフローサイトメトリー分析を例証する。Neon（登録商標）エレクトロポレーターでＲＮＡをトランスフェクトすると、Lonza Amaxa nucleofectorでＲＮＡをトランスフェクトするのと比べてｎＧＦＰタンパク質レベルが高くなった。

【0489】

[0486] これらのデータは、少なくともこれらの条件下では、Neon（登録商標）システムを使用した臍帯血由来のＣＤ３４＋細胞のエレクトロポレーションが、Lonzaの4D nucleoporatorによるエレクトロポレーションと比べて線状ｍＲＮＡ及びｃｉｒｃＲＮＡの両方の送達においてより効率的であることを実証している。Neon（登録商標）システムを使用した２回のトランスフェクション後、ｃｉｒｃＲＮＡでは、線状ｍＲＮＡと比べてｎＧＦＰタンパク質レベルがはるかに高くなった（図１５）。

【0490】

実施例５：レポータータンパク質発現により決定したときのＲＮアーゼＲ処理がｃｉｒｃＲＮＡ合成に及ぼす効果
[0487] ＲＮアーゼＲ処理（ｃｉｒｃＲＮＡ作製過程の一部としての）が下流タンパク質発現及び／又は細胞生存能力に何らかの効果を及ぼすかどうかを決定する実験を実施した。

【0491】

[0488] ２つの細胞型－ＨＤＦ及びＣＤ３４＋細胞を使用した。ｎＧＦＰをコードするｃｉｒｃＲＮＡによるＲＮアーゼＲ処理を伴う又は伴わない単回トランスフェクションを実施した。ｎＧＦＰをコードする線状ｍＲＮＡを参照として使用した。トランスフェクション方法及び実験パラメータについては、表１１に概要を示す。ｎＧＦＰ発現の読取りは、Incucyte（６時間毎）及びフローサイトメトリー（２４時間毎、１～５日目）により実施した。

【0492】

【表35】

【0493】

[0489] 図１７は、IncuCyteにより分析したときのRNAiMAX（５０ｎｇ／２４ウェル）によるＲＮＡトランスフェクション後の線維芽細胞（ＨＤＦ）のｎＧＦＰタンパク質発現の結果を提供する。線状ｍＲＮＡをコードするｎＧＦＰ、ＲＮアーゼＲ処理を伴うｃｉｒｃＲＮＡをコードするｎＧＦＰ、又はＲＮアーゼＲ処理のないｃｉｒｃＲＮＡをコードするｎＧＦＰの単回トランスフェクションをRNAiMAXを使用して実施した。トランスフェクション後、ｎＧＦＰタンパク質レベルをIncuCyteにより６時間毎に測定した。線状ｍＲＮＡトランスフェクションの結果、ｎＧＦＰタンパク質が急激に増加して４８時間前後にピークに達した後、続いて次の２日間で発現は急速に減少した。ＲＮアーゼＲ処理を伴う及び伴わないｃｉｒｃＲＮＡは、同様のタンパク質発現パターン－線状ｍＲＮＡと比較して小幅なｎＧＦＰタンパク質レベルの増加を示し、これもまた４８時間前後にピークに達した後、次の２日間で徐々に低下した。精製ステップとしてｃｉｒｃＲＮＡをＲＮアーゼＲで処理すると、ｃｉｒｃＲＮＡプレップの純度が高くなり（約６０％から約９０％ｃｉｒｃＲＮＡに、データは示さず）、ここで線維芽細胞でのタンパク質発現に対する効果は最小限であった。

【0494】

[0490] 図１８は、IncuCyteにより分析したときのNeon（登録商標）（２５０ｎｇ／６ウェル）を使用したＲＮＡトランスフェクション後のＣＤ３４細胞におけるｎＧＦＰタンパク質発現の結果を提供する。線状ｍＲＮＡをコードするｎＧＦＰ、ＲＮアーゼＲ処理を伴うｃｉｒｃＲＮＡをコードするｎＧＦＰ、又はＲＮアーゼＲ処理を伴わないｃｉｒｃＲＮＡをコードするｎＧＦＰをNeon（登録商標）エレクトロポレーターを使用してＣＤ３４＋細胞にトランスフェクトした。１回のトランスフェクション後、ｎＧＦＰタンパク質レベルをIncuCyteにより６時間毎に測定した。線維芽細胞での観察結果と対照的に、ｃｉｒｃＲＮＡでは（ＲＮアーゼＲ処理あり及びなしの両方で）、線状ｍＲＮＡと比較してより高い、且つより長く続くタンパク質発現が生じた。ＲＮアーゼＲ＋ｃｉｒｃＲＮＡとＲＮアーゼＲ－ｃｉｒｃＲＮＡとの間のタンパク質レベルの差は最小限であった。

【0495】

実施例６：ＣＤ３４＋細胞を再プログラム化するための再プログラム化因子数の低減
[0491] ｃ－Ｍｙｃ、Ｌｉｎ２８Ａ、及び／又はＮａｎｏｇが存在しないときのＣＤ３４＋細胞の再プログラム化を評価する実験を実施した。また、Ｃ６カクテル（ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、ｃ－ＭＹＣ、ＮＡＮＯＧ及びＬＩＮ２８Ａ）の単回のトランスフェクションがＣＤ３４＋細胞の再プログラム化に十分であったかどうかも評価した。ｃｉｒｃＲＮＡ再プログラム化因子による再プログラム化結果を線状ｍＲＮＡカクテルと比較した。

【0496】

[0492] これらの実験で試験した条件について、表１２に概要を示す。

【0497】

【表36】

【0498】

[0493] 試験した再プログラム化カクテルは、以下のとおりであった
（ｉ）Ｃ６カクテル－ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、ｃＭＹＣ、ＮＡＮＯＧ及びＬＩＮ２８Ａ（ＯＳＫＭＮＬ）を別個にコードするｃｉｒｃＲＮＡ。これらの６つの再プログラム化因子ＯＳＫＭＮＬの化学量論は、３：１：１：１：１：１である
（ｂ）Ｃ５（ｃＭｙｃ脱落）－ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、ＮＡＮＯＧ及びＬＩＮ２８Ａ（ＯＳＫＮＬ）を別個にコードするｃｉｒｃＲＮＡ。これらの５つの再プログラム化因子ＯＳＫＮＬの化学量論は、３：１：１：１：１：１である
（ｉ）Ｃ４（Ｎａｎｏｇ及びＬｉｎ２８Ａ脱落）－ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、及びｃＭＹＣ（ＯＳＫＭ）を別個にコードするｃｉｒｃＲＮＡ。これらの４つの再プログラム化因子ＯＳＫＭの化学量論は、３：１：１：１である
（ｉｉ）Ｃ３（ｃＭｙｃ、Ｎａｎｏｇ及びＬｉｎ２８Ａ脱落）－ＯＣＴ４、ＳＯＸ２及びＫＬＦ４（ＯＳＫ）を別個にコードするｃｉｒｃＲＮＡ。これらの３つの再プログラム化因子の化学量論は、３：１：１である。
（ｃ）線状ｍＲＮＡ－Stemgent再プログラム化キットからのカクテル及びTrilinkから購入した線状ｍＲＮＡを試験した－各々、６つの因子ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、ｃＭＹＣ、ＮＡＮＯＧ及びＬＩＮ２８Ａ（ＯＳＫＭＮＬ）をコードした

【0499】

[0494] Stemgent（Ｓ）、TriLink（Ｌ）、及びｃｉｒｃＲＮＡ（Ｃ）カクテル中の再プログラム化に使用した６つの因子は同一であることに留意されたい。しかしながら、これらの因子をコードするコンストラクトの総分子量は異なる。従って、このことが、トランスフェクション１回につき各細胞に送達される全ＲＮＡ量に影響を与えた（表１２に示されるとおり）。

【0500】

[0495] この実験プロトコルをまとめた概要を図１９に示す。

【0501】

[0496] 簡潔に言えば、臍帯血由来のＣＤ３４＋細胞を、５つのサイトカイン－ＳＣＦ、ＦＬＴ３Ｌ、ＴＰＯ、ＩＬ３及びＩＬ６（各１００ｎｇ／ｍＬ）を含有するＳＣＧＭ培地（Cellgenix）において３日間（－３日目から０日目まで）拡大した。０日目、各条件につき０．５×１０^６細胞をペレット化し、洗浄し、エレクトロポレーションによるトランスフェクションのため１００～１２０μＬの緩衝液に再懸濁した。１６００Ｖ、１０ｍｓパルス幅、３パルスに設定したNeonエレクトロポレーターでエレクトロポレーションした。

【0502】

[0497] 陰性対照として、他のトランスフェクションと同時にモックトランスフェクション（ＲＮアーゼ、ＤＮアーゼ不含水による）を行った（表１２の条件１０）。トランスフェクトしなかったＣＤ３４＋細胞もまた陰性対照として含めた（表１２の条件１１）。両方の対照とも、全ての試験条件と同じ数の細胞を有した（０．５×１０^６細胞／条件）。この実験で使用した陽性対照は、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、及びｃ－ＭｙｃをコードするSeV Cytotune 2.0コード再プログラム化カクテルであった。

【0503】

[0498] トランスフェクション後に毎回、１０μＭのY27632を含有する完全ＳＣＧＭ培地に細胞を再懸濁し、２４ウェル非接着性プレートに播種した。最終回のトランスフェクションを終えた当日（３日目）、対照（モック条件及びＣＤ３４単独条件）を含めた条件毎に細胞数及び生存能力を決定した。細胞は全て、完全ＳＣＧＭ培地（サイトカイン含有）及び１０μＭのY27632が入ったiMatrix-511コートした１２ウェル組織培養処理済みプレートにプレーティングした。細胞は、５％Ｏ２（低酸素インキュベーター）で成長させた。

【0504】

[0499] ４～６日目、各ウェルから培地の半分（１ｍＬ）をサイトカイン不含の１ｍＬ ＳＣＧＭ培地に交換し、４日目までに限り培地に１０μＭのY27632を補足した。７日目、各ウェルから培地の半分（１ｍＬ）を１ｍＬのＰＳＣ培地（iM511上で成長させる細胞にはNutristem hPSC-XF又はVtn上で成長させる細胞にはStemfit培地）に交換した。８日目以降、ｉＰＳＣコロニーをピッキングできる状態になるまで、各６ウェルの培地全てを２ｍＬのＰＳＣ培地に交換した。

【0505】

[0500] 図２０Ａに示されるとおり、Ｃ６カクテルでは、典型的なｉＰＳＣ形態を有するコロニーを生じさせることに成功した。ｃＭｙｃをなおも含有したが、Ｎａｎｏｇ及びＬｉｎ２８Ａは除外したＣ４カクテルでもまた、多数のｉＰＳＣコロニーが生じた（Ｃ６と同様）。重要なことに、両方ともｃ－Ｍｙｃを除外したものであるＣ５及びＣ３カクテルによる再プログラム化では、再プログラム化効率がＣ６及びＣ４カクテルと比較して低いことが実証されたが、これらの条件でもｉＰＳＣコロニーは生じた。よって、Ｃ５及びＣ３培養物では、Ｃ６及びＣ４培養物と比較すると少ないコロニーが存在した。更なる結果を図２０Ｂに示し、ここではＣ５、Ｃ４、及びＣ３カクテル全てがＣＤ３４＋細胞を再プログラム化するが、ｃ－Ｍｙｃが存在しないと、コロニーが小さくなり、全体的な効率が下がるという観察を例証している。

【0506】

[0501] 図２１は、Ｃ６ ｃｉｒｃＲＮＡカクテルのトランスフェクションを１回のみ使用したＣＤ３４＋再プログラム化の形態学的進行を示す。２つのＲＮＡ量－１細胞当たり８ｐｇ及び１細胞当たり３．２ｐｇを試験した。１細胞当たり８ｐｇ ＲＮＡをトランスフェクトした培養物では、およそ８日目に接着細胞クラスターが出現し、サイズが増加し続けてｉＰＳＣ様コロニーになった。しかしながら、１細胞当たり３．２ｐｇ ＲＮＡを１回トランスフェクトしたところ、ＣＤ３４＋細胞の再プログラム化の成功には至らなかった。これは、十分な濃度のＲＮＡが使用されるのであれば、再プログラム化因子をコードするｃｉｒｃＲＮＡの単回送達によってＣＤ３４＋細胞を再プログラム化できることを実証している。

【0507】

[0502] 図２２は、線状ｍＲＮＡを使用したＣＤ３４＋再プログラム化の形態学的進行を示す。ReproCell/StemgentのStemRNA第３世代再プログラム化キットからの再プログラム化ＲＮＡカクテル（Ｓ６、ＯＳＫＭＬＮ）及びTrilinkから購入した個別の線状ｍＲＮＡを含む線状ｍＲＮＡカクテル（Ｌ６、ＯＳＫＭＬＮ）を使用してＣＤ３４＋細胞を再プログラム化した。０及び２日目に２回のトランスフェクションを行った。しかしながら、Ｓ６又はＬ６のいずれの培養物においても、ｉＰＳＣコロニーは形成されなかった。Ｃ６カクテルで観察される形態学的進行とＳ６及びＬ６カクテルで観察される進行との間の比較を図２３に提供する。

【0508】

[0503] 図２４は、IncuCyteを使用して測定したＣＤ３４＋細胞の再プログラム化効率を実証する。ｃｉｒｃＲＮＡカクテルＣ６、Ｃ５、Ｃ４及びＣ３、並びにStemgent（Ｓ６）及びTrilink（Ｌ６）からの線状ｍＲＮＡカクテルの再プログラム化効率を図２４Ａにおいて比較する。１回又は２回のトランスフェクションによるｃｉｒｃＲＮＡ Ｃ６カクテルを使用したＣＤ３４＋細胞の再プログラム化を図２４Ｂに示す。各トランスフェクションでの１細胞当たりのＲＮＡ量について２つの異なる量（３．２ｐｇ及び８ｐｇ）を試験した。高量のＲＮＡ量（８ｐｇ）によってのみ、Ｃ６カクテルによる１回のトランスフェクション後にｉＰＳＣが再プログラム化された ことに留意されたい。高量（８ｐｇ）及び低量（３．２ｐｇ）のＲＮＡ量は、２回のトランスフェクションでＣＤ３４＋細胞を再プログラム化することが可能であった。

【0509】

[0504] 図２５及び図２６は、様々な濃度のＣ６カクテル（図２５）及びＣ３、Ｃ４、Ｃ５カクテル（図２６）でトランスフェクトした６ウェルプレートについての多能性マーカーＴｒａ－１－８１（緑色）及びＯＣＴ４（赤色）に関する染色を示す。全ウェル画像をIncuCyteを使用して４倍でスキャンした。異なるウェルは、異なる播種密度を表している（左から右、上から下に：１２．５ｋ、２５ｋ、２５ｋ、５０ｋ、及び５０ｋ）。Ｔｒａ－１－８１－及びＯｃｔ４ダブルポジティブ範囲が、推定ｉＰＳＣコロニーである。

【0510】

[0505] これらの実験は、以下の結論を実証する：

【0511】

[0506] １．ｃｉｒｃＲＮＡを使用すると、因子数を最小限に抑えた再プログラム化が可能になる。ｃ－Ｍｙｃを除外すると（Ｃ５及びＣ３カクテル）、ｉＰＳＣになるまでの形態学的進行速度並びに全体的な再プログラム化効率が、Ｃ６カクテル（ＯＳＫＭＬＮ）で観察される進行速度及び効率と比較して実に減少するが、これらのデータは、ｃ－Ｍｙｃが存在しなくてもＣＤ３４＋細胞の再プログラム化が成功することを実証している。同様に、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８及びｃ－Ｍｙｃを除外すると（Ｃ３カクテル）、再プログラム化効率は減少したが、この減少は、Ｃ５カクテルと比較して重大というわけではなかった。換言すれば、Ｃ５及びＣ３は、その再プログラム化効率の点で比較的類似していた。たとえ効率が減少するとしても、Ｃ５及びＣ３の両方の培養物には、典型的なｉＰＳＣ形態を有し且つ多能性マーカーを発現するコロニーが見出される可能性がある。

【0512】

[0507] ２．ｃ－Ｍｙｃを保持したままＮａｎｏｇ及びＬｉｎ２８を除外すると（Ｃ４カクテル）、Ｃ６カクテルと同様の再プログラム化進行及び効率が示された。これは、ｃｉｒｃＲＮＡが再プログラム化因子の送達に使用されるとき、ＣＤ３４＋細胞からｉＰＳＣへの再プログラム化にＮａｎｏｇ及びＬｉｎ２８は必須でないことを示唆している。

【0513】

[0508] ３．ｃ－Ｍｙｃは、ＣＤ３４＋細胞における効率的なｃｉｒｃＲＮＡ再プログラム化を促進する。しかしながら、ｃ－Ｍｙｃが存在しないときにも、ｃ－Ｍｙｃを含有するカクテルと比較すると効率は下がるものの（ｉＰＳＣコロニー形成速度が下がる、ｉＰＳＣコロニー数が減る）、ｃｉｒｃＲＮＡ再プログラム化はなおも起こり得る（図２０Ａ及び図２０Ｂを参照のこと）。

【0514】

[0509] ４．ＣＤ３４＋細胞は、Ｃ６カクテルの単回のトランスフェクションで再プログラム化することができる。これらの実験は、再プログラム化の成功を実現するためにＲＮＡ濃度が重要であることを実証している。１細胞当たり８ｐｇ ＲＮＡでは、再プログラム化は成功したが、１細胞当たり３．２ｐｇ ＲＮＡでは、ｉＰＳＣコロニーは形成されなかった。

【0515】

[0510] ５．Ｃ６ ｃｉｒｃＲＮＡカクテルに（モル量及び化学量論の点で）類似した線状ｍＲＮＡカクテル（Ｓ６及びＬ６）は、類似のｃｉｒｃＲＮＡ再プログラム化カクテルに使用される同じトランスフェクション／エレクトロポレーションプロトコル（０日目及び２日目に２回のトランスフェクション）に従ったところ、ＣＤ３４＋細胞の再プログラム化に失敗した。これらの実験は、環状ＲＮＡ再プログラム化がフットプリントフリーな浮遊培養再プログラム化に独特に好適であり、これらの環状ＲＮＡコンストラクトが、類似の線状ｍＲＮＡコンストラクトと比較して有益な機能的効果を提供することを実証している。

【0516】

実施例７：長期培養におけるｃｉｒｃＲＮＡで再プログラム化されたｉＰＳＣの特徴付け
[0511] ２０代まで細胞継代した長期培養条件で前出の例に記載される方法により生成したｉＰＳＣを特徴付ける実験を実施した。実験プロトコルをまとめた概要を図２７に示す。簡潔に言えば、ｃｉｒｃＲＮＡ再プログラム化カクテルの２回のエレクトロポレーション（０日目及び２日目）後、典型的には１０～１４日目の間にｉＰＳＣコロニーが出現し、１８日目までにピッキングできる状態になった。個々のｉＰＳＣコロニーを手作業でピッキングし、特徴付けのため継代２０代目までStemFit Basic 03培地で培養した。継代時、バーゼン液（Thermo Fisher）を使用してｉＰＳＣを剥がし、小さい凝集塊に解離させた。継代日にＲＯＣＫ阻害薬Y-27632を加え、翌日除去した。継代時には毎回、全てのクローンについて４日という一定の継代周期を可能にするような特定の密度でｉＰＳＣを播種した。形態、生存能力、集団倍加時間、及び３つの異なる胚葉への分化能力を判定した。これらの実験で各ｉＰＳＣクローンに使用した再プログラム化条件を表１３に規定する。

【0517】

【表37】

【0518】

[0512] 使用した様々なプロトコルの全体的な再プログラム化効率を表１４に提供する。示されるとおり、Ｃ６、Ｃ４、及びＣ３カクテルでＣＤ３４＋細胞の再プログラム化に成功することができ、Ｃ６及びＣ４でより高い再プログラム化効率が生み出された。

【0519】

【表38】

【0520】

[0513] 継代０代目の細胞を４～７日間成長させた後、継代した。後続の継代からの細胞は、４日毎に継代した。エレクトロポレーション後５２～６３日目の間に、その継代１０代目のｉＰＳＣ細胞培養物を回収し、染色し、ＯＣＴ４、ＳＳＥＡ４、及びＴＲＡ １－８１発現に関してフローサイトメトリーにより分析した。この実験で使用した陽性対照は、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、Ｍｙｃ、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８及びＳＶ４０をコードするエピソームベクター由来の市販のｉＰＳＣであった（epiIPSC、A18945、Thermo Fisher）。２９３ Ｔ細胞を陰性染色対照として使用した。表１５に示されるとおり、Ｃ１４、Ｃ６、Ｃ４及びＣ３カクテルで再プログラム化すると、継代１０代目で特徴付けたとき、ＯＣＴ４、ＳＳＥＡ４、及びＴＲＡ １－８１（多能性マーカー）を発現するｉＰＳＣの割合が高い培養物につながった。

【0521】

【表39】

【0522】

[0514] 図２８Ａに示されるとおり、再プログラム化カクテルＣ１４、Ｃ６、及びＣ４で混合ドナーＣＤ３４＋細胞から誘導されたｉＰＳＣクローンは、典型的なｉＰＳＣ形態のコロニーを生じ、これは継代２０代目まで維持された。同様に、図２８Ｂは、再プログラム化カクテルＣ６、Ｃ４、及びＣ３で単一ドナーＣＤ３４＋細胞から誘導されたｉＰＳＣクローンが典型的なｉＰＳＣ形態のコロニーを生じ、これが継代２０代目まで維持されたことを示す。

【0523】

[0515] 更には、図２９Ａ及び図２９Ｂに示されるとおり、ｉＰＳＣクローンは、nucleocounter NC_200により分析したとき、長期培養での（即ち、２０代の細胞継代にわたる）高い生存能力を呈した。「Ａｌｔ」は、試料の表示に使用されるとき「隔日」を意味し、即ち上記に記載されるとおり、クローンが０日目及び２日目の２回のｃｉｒｃＲＮＡエレクトロポレーションにより生成されたことを意味する。混合ドナー（図２９Ａ）臍帯血ＣＤ３４＋細胞から誘導されたｉＰＳＣクローンは、４代目～２０代目までの毎回の細胞継代時に７５～９８％の生存率を維持し、ほとんどのクローンは９０％を超える生存率を保った。２つのクローンが継代１８代目におよそ８５％の生存率であったことを除いては、単一ドナー（図２９Ｂ）臍帯血ＣＤ３４＋細胞から誘導された全てのクローンが、４代目～１８代目までの毎回の細胞継代時に一貫して９０％を超える生存率であった。

【0524】

[0516] 加えて、図３０Ａ及び図３０Ｂに示されるとおり、ｃｉｒｃＲＮＡ誘導ｉＰＳＣは、長期培養にわたり、継代日毎の生存細胞数に基づき計算したとき一貫した集団倍加時間を呈した。混合ドナー（図３０Ａ）及び単一ドナー（図３０Ｂ）臍帯血ＣＤ３４＋細胞から誘導されたｉＰＳＣクローンは、継代４代目から継代２０代目まで、平均１８～２４時間で数が倍加したが、これは典型的なｉＰＳＣ倍加時間と一致している。集団倍加時間を記録し始める継代数は、クローン間でばらつきがあったため（ｐ５、ｐ６及びｐ８から）、結果として図３１Ａで３群は平行線となった。混合ドナーＣＤ３４＋細胞からのｃｉｒｃＲＮＡ誘導ｉＰＳＣの累積集団倍化数は、図３１Ａに示されるとおり、一貫して継代２０代目に６０～８０倍であった一方、単一ドナーＣＤ３４＋細胞からのｃｉｒｃＲＮＡ誘導ｉＰＳＣの累積集団倍化数は、図３１Ｂに示されるとおり、一貫して継代２０代目に７０～８０倍であった。

【0525】

[0517] その上、図３２は、Ｃ１４、Ｃ６、Ｃ４又はＣ３カクテルで再プログラム化した後、得られるｉＰＳＣ細胞は、３つ全ての一次胚葉細胞層を生じることが可能であったことを示している。内胚葉はＳＯＸ１７及びＦＯＸＡ２を発現した。中胚葉はブラキュリ（Ｔ）を発現し、ＦＯＸＡ２を発現しなかった。外胚葉はＰＡＸ６を発現した。得られたｉＰＳＣ培養物に関してＲＮＡシーケンシング（ＲＮＡ ｓｅｑ）解析もまた実施した。得られたｉＰＳＣ培養物に関して３つの別個のＲＮＡ ｓｅｑランを実施した。第１のシーケンシングランには、１１個のＶＲ１＋ＶＲ２クローン並びにＣ１４、Ｃ６、及びＣ４カクテルで再プログラム化した混合ドナーＣＤ３４＋細胞からの９個のクローンからの試料が含まれた。第２及び第３のシーケンシングランには、各々、Ｃ６、Ｃ４及びＣ３カクテルで再プログラム化した単一ドナーＣＤ３４＋細胞からの、デュプリケートでランを行った、１０個のクローンからの試料が含まれ、臍帯血細胞を対照として使用した。セルネット（CELL net）解析を用いて試料をその調節シグネチャの発現に基づき細胞型に分類した。

【0526】

[0518] 全てのｃｉｒｃＲＮＡ誘導ｉＰＳＣクローンが、CellNet解析により２０６個の遺伝子で構成されるＥＳＣの遺伝子調節ネットワーク（ＧＲＮ）に基づき定義される胚性幹細胞（ＥＳＣ）のシグネチャに対応する遺伝子シグネチャを有した。ＥＳＣ ＧＲＮに関連するこれらの２０６個の遺伝子のうち、ＬＩＮ２８Ａ、ＬＩＮ２８Ｂ、ＮＡＮＯＧ、ＰＯＵ５Ｆ１、及びＳＯＸ２の発現が全てのｃｉｒｃＲＮＡ誘導ｉＰＳＣ試料で高かった。主成分分析（ＰＣＡ）及びピアソン相関により、バッチ効果はなかったことが確認され、Ｃ６、Ｃ４及びＣ３の間にクラスター形成は示されなかった（データは示さず）。

【0527】

[0519] まとめると、このデータは、本開示に記載されるとおりＣ１４、Ｃ６、Ｃ４及びＣ３カクテルを使用して再プログラム化した、異なるドナーからのｃｉｒｃＲＮＡ再プログラム化ｉＰＳＣが、複数回の細胞継代後にも、及び長期細胞培養条件下にあっても、その形態の点で安定しており、生存能力を保っていて、同様の速度で細胞分裂を起こし続け、ＥＳＣに極めて良く似た一貫した細胞アイデンティティを維持していることを示している。

【0528】

実施例８：ｃｉｒｃＲＮＡで再プログラム化されたｉＰＳＣの遺伝的及び後成的安定性
[0520] 複数回の細胞継代及び長期培養後のｃｉｒｃＲＮＡで再プログラム化したｉＰＳＣの遺伝的及び後成的安定性を評価する実験を実施した。ｃｉｒｃＲＮＡで再プログラム化したｉＰＳＣクローン合計３２個について、継代１０代目でＧ分染法核型タイピングを実施し、３２個のクローン中２９個は正常核型であった。次に、これらの２９個のクローンの核型を継代２０代目で再び決定した。表１６に要約するとおり、８５％を超えるクローンが継代１０代目及び２０代目で正常核型を有したが、これは一般的に予想される割合である８０％よりも高い。

【0529】

【表40】

【0530】

[0521] 発癌バリアントの検出のため、同じクローンに対して全ゲノムシーケンシングもまた実施した。表１７にまとめるとおり、発癌ＴＰ５３バリアントが見られたクローンは一つもなかった。更には、ＤＮＡメチル化の検出のため、同じクローンに対してバイサルファイトゲノムシーケンシングを実施し、表１７に示されるとおり、全てのクローンが、親のＤＮＡメチル化と一致するＩＧＦ２／Ｈ１９インプリンティング制御領域にＤＮＡメチル化を示した。

【0531】

【表41】

【0532】

[0522] まとめると、これらのデータは、ｃｉｒｃＲＮＡ誘導ｉＰＳＣが長期インビトロ培養後に遺伝的にも後成的にも両方ともに安定していることを実証している。

【0533】

実施例９：ｃｉｒｃＲＮＡによるｉＰＳＣ再プログラム化の利点
[0523] 本明細書に提示する実験データに基づいて、ｃｉｒｃＲＮＡによるｉＰＳＣ再プログラム化の特徴を、センダイウイルス、エピソームベクター、及びｍＲＮＡによる再プログラム化など、他の再プログラム化方法と比較した。表１８に、ｃｉｒｃＲＮＡによるｉＰＳＣ再プログラム化の利点をまとめる。ｃｉｒｃＲＮＡによる再プログラム化は血液細胞に好適であり、ゲノム組込みのリスクがなく、ｉＰＳＣにある外因的に導入された再プログラム化因子を除去する必要がなく（ＲＮＡは半減期が短いため、一たび送達されると、数日以内に速やかに除去される）、再プログラム化因子の組み合わせの一部としてｐ５３を含める必要がなく、免疫回避を媒介するため追加の因子を使用する必要がなく、マイクロＲＮＡを使用する必要がなく、及びｍｙｃを使用しない再プログラム化が可能であった。他の再プログラム化方法のうち、センダイウイルス及びエピソームベクターを使用すると、再プログラム化因子の除去が必要であった。センダイウイルス、エピソームベクター、及びｍＲＮＡを使用すると、効率的な再プログラム化のためにｍｙｃの使用が必要であった。更には、エピソームベクターを使用すると、ゲノム組込みのリスクがあった一方、ｍＲＮＡの使用は、血液細胞の再プログラム化には好適でなく、免疫回避の媒介及び再プログラム化効率の亢進のために追加の因子を使用する必要があった。まとめると、エピソームベクター及びｍＲＮＡでのｉＰＳＣ再プログラム化は複雑で法外に高く、一方、センダイウイルスでの再プログラム化は、眼及び中枢神経系の適応疾患における使用に制限されていることを示した。しかしながら、ｃｉｒｃＲＮＡでのｉＰＳＣ再プログラム化は、これらの制限を克服するのみならず、浮遊状態の血液細胞からの直接の再プログラム化もまた可能にし、従って優れた方法と見られる。

【0534】

【表42】

【0535】

[0524] 上記は本発明を例示するものであり、それを限定するものと解釈されるべきではない。本発明は、以下の特許請求の範囲により定義され、そこには特許請求の範囲の均等物が含まれる。

【図1】

【図2A】

【図2B】

【図2C】

【図2D】

【図2E】

【図2F】

【図2G】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6A-6C】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12A】

【図12B】

【図12C】

【図13A】

【図13B】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20A】

【図20B】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24A】

【図24B】

【図25】

【図26】

【図27】

【図28A】

【図28B】

【図29A】

【図29B】

【図30A】

【図30B】

【図31A】

【図31B】

【図32】

【配列表】

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【国際調査報告】