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特表2024-547071トレオース核酸アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびその方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-12-26
(54)【発明の名称】トレオース核酸アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびその方法
(51)【国際特許分類】
C12N 15/113 20100101AFI20241219BHJP
A61K 31/712 20060101ALI20241219BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20241219BHJP
【ＦＩ】
C12N15/113 Z ZNA
A61K31/712
A61K48/00
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024537092
(86)(22)【出願日】2022-12-16
(85)【翻訳文提出日】2024-08-08
(86)【国際出願番号】 EP2022086286
(87)【国際公開番号】W WO2023117738
(87)【国際公開日】2023-06-29
(31)【優先権主張番号】21215919.8
(32)【優先日】2021-12-20
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】591003013
【氏名又は名称】エフ． ホフマン－ラ ロシュ アーゲー
【氏名又は名称原語表記】Ｆ． ＨＯＦＦＭＡＮＮ－ＬＡ ＲＯＣＨＥ ＡＫＴＩＥＮＧＥＳＥＬＬＳＣＨＡＦＴ
(74)【代理人】
【識別番号】100102978
【弁理士】
【氏名又は名称】清水 初志
(74)【代理人】
【識別番号】100205707
【弁理士】
【氏名又は名称】小寺 秀紀
(74)【代理人】
【識別番号】100160923
【弁理士】
【氏名又は名称】山口 裕孝
(74)【代理人】
【識別番号】100119507
【弁理士】
【氏名又は名称】刑部 俊
(74)【代理人】
【識別番号】100142929
【弁理士】
【氏名又は名称】井上 隆一
(74)【代理人】
【識別番号】100148699
【弁理士】
【氏名又は名称】佐藤 利光
(74)【代理人】
【識別番号】100188433
【弁理士】
【氏名又は名称】梅村 幸輔
(74)【代理人】
【識別番号】100128048
【弁理士】
【氏名又は名称】新見 浩一
(74)【代理人】
【識別番号】100129506
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 智彦
(74)【代理人】
【識別番号】100114340
【弁理士】
【氏名又は名称】大関 雅人
(74)【代理人】
【識別番号】100214396
【弁理士】
【氏名又は名称】塩田 真紀
(74)【代理人】
【識別番号】100121072
【弁理士】
【氏名又は名称】川本 和弥
(74)【代理人】
【識別番号】100221741
【弁理士】
【氏名又は名称】酒井 直子
(74)【代理人】
【識別番号】100114926
【弁理士】
【氏名又は名称】枝松 義恵
(72)【発明者】
【氏名】ブライヒャー コンラート
(72)【発明者】
【氏名】シャオブリン アドリアン
(72)【発明者】
【氏名】シュミット シュテッフェン
(72)【発明者】
【氏名】リ メイリン
(72)【発明者】
【氏名】コラー エーリッヒ
(72)【発明者】
【氏名】バスティアン ジェシカ マリン オロール
(72)【発明者】
【氏名】クリスチャンセン ヘレ
(72)【発明者】
【氏名】ニューマーク ヘレ
【テーマコード（参考）】
4C084
4C086
【Ｆターム（参考）】
4C084AA13
4C084NA05
4C086AA01
4C086AA02
4C086AA03
4C086EA16
4C086MA01
4C086MA04
4C086NA05
(57)【要約】
１個以上のα－Ｌ－トレオフラノシル（ＴＮＡ）ヌクレオシドを含むアンチセンスオリゴヌクレオチド、並びにＴＮＡヌクレオシドの導入によってアンチセンスオリゴヌクレオチドの特性を調節する方法が記載される。これらは、アンチセンスギャップマーオリゴヌクレオチドに特に適用可能である。
【選択図】なし
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
リボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）Ｈを動員することができる、式５’－Ｆ－Ｇ－Ｆ’－３’（Ｉ）の連続ヌクレオチド配列を含むアンチセンスギャップマーオリゴヌクレオチドであって、Ｇが、少なくとも３個の連続ＤＮＡヌクレオシドを含む１８個までの連結されたヌクレオシドのギャップ領域であり、
ＦおよびＦ’の各々が、独立して、１～１５個の糖修飾ヌクレオシドを含むかまたはそれらからなる、１５個までの連結されたヌクレオシドのフランキング領域であり、かつ
Ｆ、Ｆ’、およびＧのうちの少なくとも１つが、α－Ｌ－トレオフラノシル（ＴＮＡ）ヌクレオシドである糖修飾ヌクレオシドを含む、
アンチセンスギャップマーオリゴヌクレオチド。
【請求項2】
Ｆが、少なくとも１個のＴＮＡヌクレオシドを含む、請求項１に記載のアンチセンスギャップマーオリゴヌクレオチド。
【請求項3】
Ｆが、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４個のＴＮＡヌクレオシドを含む、前記請求項のいずれか一項に記載のアンチセンスギャップマーオリゴヌクレオチド。
【請求項4】
Ｆの全てのヌクレオシドが、ＴＮＡヌクレオシドである、前記請求項のいずれか一項に記載のアンチセンスギャップマーオリゴヌクレオチド。
【請求項5】
Ｆ’が、少なくとも１個のＴＮＡヌクレオシドを含む、前記請求項のいずれか一項に記載のアンチセンスギャップマーオリゴヌクレオチド。
【請求項6】
Ｆ’が、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４個のＴＮＡヌクレオシドを含む、前記請求項のいずれか一項に記載のアンチセンスギャップマーオリゴヌクレオチド。
【請求項7】
Ｆ’の全てのヌクレオシドが、ＴＮＡヌクレオシドである、前記請求項のいずれか一項に記載のアンチセンスギャップマーオリゴヌクレオチド。
【請求項8】
Ｆ、Ｆ’、またはＦとＦ’の両方の前記糖修飾ヌクレオシドが、以下：２’－メトキシ－リボース（２’－ＯＭｅ）、
２’－Ｏ－メトキシエチル－リボース（２’－Ｏ－ＭＯＥ）、
５’－メチル－２’－Ｏ－メトキシエチルリボース（５’－Ｍｅ－２’－Ｏ－ＭＯＥ）、
２’－Ｏ－［２－（メチルチオ）エチル］－リボース（２’－Ｏ－ＭＴＥ）、
２－（Ｎ－メチルカルバモイル）－エチル］－リボース（２’－Ｏ－ＭＣＥ）、
２’－Ｏ－［２－（メチルアミノ）－２－オキソエチル］－リボース（２’－Ｏ－ＮＭＡ）、
２’－デオキシ－２’－フルオロ－リボース（２’－デオキシ－２’－フルオロリボ－核酸；２’－Ｆ－ＲＮＡにおけるような）、
２’－フルオロ－２’－アラビノース（２’－フルオロ－２’－アラビノース－核酸；２’－Ｆ－ＡＮＡにおけるような）、
２’－Ｏ－ベンジル－リボース、
オキシ、アミノまたはチオβ－Ｄ－ロックドリボース（β－Ｄ－ＬＮＡにおけるような）、
オキシ、アミノまたはチオα－Ｌ－ロックドリボース（α－Ｌ－ＬＮＡにおけるような）、
２’，４’拘束２’－Ｏ－エチルリボース（拘束エチルロックド核酸；ｃＥｔにおけるような）、
トリシクロ－デオキシリボース（トリシクロ－デオキシリボースＤＮＡ；ＴｃＤＮＡにおけるような）、
３’－デオキシ－リボース（３’－デオキシ－リボースＤＮＡ；３’－ＤＮＡにおけるような）、
アンロックドリボース（アンロックド核酸；ＵＮＡにおけるような）、
グリコール（グリコール核酸；ＧＮＡにおけるような）、
ヘキシトール（ヘキシトール核酸；ＨＮＡにおけるような）、
３’－フルオロヘキシトール（３’－フルオロヘキシトール核酸；ＦＨＮＡにおけるような）、
３’－アラビノ－フルオロヘキシトール（３’－アラビノ－フルオロ－ヘキシトール核酸；Ａｒａ－ＦＨＮＡにおけるような）、
シクロヘキセン（シクロヘキセン核酸；ＣｅＮＡにおけるような）、および
フルオロ－シクロヘキセニル（２’－フルオロ－シクロヘキセニル核酸；Ｆ－ＣｅＮＡにおけるような）
からなる群から選択される修飾糖部分を含む少なくとも１個の糖修飾ヌクレオシドを含む、前記請求項のいずれか一項に記載のアンチセンスギャップマーオリゴヌクレオチド。
【請求項9】
Ｆ、Ｆ’、またはＦとＦ’の両方の前記糖修飾ヌクレオシドが、１個以上の２’－Ｏ－メトキシエチル－ＲＮＡ（２’－Ｏ－ＭＯＥ）ヌクレオシドを含む、前記請求項のいずれか一項に記載のアンチセンスギャップマーオリゴヌクレオチド。
【請求項10】
少なくとも１個のいずれのＴＮＡヌクレオシドも除いて、Ｆ’およびＦ中の全てのヌクレオシドが、２’－Ｏ－ＭＯＥヌクレオシドである、請求項９に記載のアンチセンスギャップマーオリゴヌクレオチド。
【請求項11】
Ｇが、少なくとも１個のＴＮＡヌクレオシド、例えば少なくとも１、２、または３個のＴＮＡヌクレオシドを含む、前記請求項のいずれか一項に記載のアンチセンスギャップマーオリゴヌクレオチド。
【請求項12】
Ｇ中の少なくとも５’最末端および３’最末端のヌクレオシドが、ＤＮＡヌクレオシドである、前記請求項のいずれか一項に記載のアンチセンスギャップマーオリゴヌクレオチド。
【請求項13】
少なくとも１個のいずれのＴＮＡヌクレオシドも除いて、Ｇの全てのヌクレオシドが、ＤＮＡヌクレオシドである、前記請求項のいずれか一項に記載のアンチセンスギャップマーオリゴヌクレオチド。
【請求項14】
式５’－Ｆ－Ｇ－Ｆ’－３’（Ｉ）の前記連続ヌクレオチド配列が、１２～３２個のヌクレオシド、例えば１２～２８個のヌクレオシド、例えば１２～２６個のヌクレオシド、例えば１４～２６個のヌクレオシド、例えば１４～２４個のヌクレオシド、例えば１４～２２個のヌクレオシド、例えば１６～２２個のヌクレオシド、例えば１６～２０個のヌクレオシドの長さを有する、前記請求項のいずれか一項に記載のアンチセンスギャップマーオリゴヌクレオチド。
【請求項15】
前記連続ヌクレオチド配列が、以下の式：Ｆ１～１５－Ｇ３～１８－Ｆ’１～１５（ＩＶ）、例えば、Ｆ１～１５－Ｇ３～１８－Ｆ’１～１２（ＩＶａ）若しくはＦ１～１２－Ｇ３～１８－Ｆ’１～１５（ＩＶｂ）；
Ｆ１～１２－Ｇ３～１８－Ｆ’１～１２（Ｖ）、例えば、Ｆ１～１２－Ｇ３～１８－Ｆ’１～９（Ｖａ）若しくはＦ１～９－Ｇ３～１８－Ｆ’１～１２（Ｖｂ）；
Ｆ１～１２－Ｇ４～１６－Ｆ’１～１２（ＶＩ）、例えば、Ｆ１～１２－Ｇ４～１６－Ｆ’１～９（ＶＩａ）若しくはＦ１～９－Ｇ４～１６－Ｆ’１～１２（ＶＩｂ）；または
Ｆ３～１２－Ｇ４～１０－Ｆ’３～１２（ＶＩＩ）、例えば、Ｆ３～１２－Ｇ４～１０－Ｆ’３～９（ＶＩＩａ）若しくはＦ３～９－Ｇ４～１０－Ｆ’３～１２（ＶＩＩｂ）
のものであり、式中、数値範囲は、Ｆ、Ｇ及びＦ’中のそれぞれ連結されたヌクレオシドの数を表す、請求項１４に記載のアンチセンスギャップマーオリゴヌクレオチド。
【請求項16】
式ＩＶａの前記連続ヌクレオチド配列が、少なくとも１６個のヌクレオシドの長さを有し、かつ（ａ）Ｆ中の５’最末端のヌクレオシドおよびＦ中のヌクレオシドが、独立して、３、４、または５個の高親和性糖修飾ヌクレオシドであり、
（ｂ）Ｆ中の残りのヌクレオシドが、ＴＮＡヌクレオシドであり、かつ
（ｃ）Ｇ中の全てのヌクレオシドが、ＤＮＡヌクレオシドである、
請求項１５に記載のアンチセンスギャップマーオリゴヌクレオチド。
【請求項17】
Ｇが、最大で１０個の連続ＤＮＡヌクレオシド、例えば９、８、７、６、５、または４個の連続ＤＮＡヌクレオシドを含む、請求項１６に記載のアンチセンスギャップマーオリゴヌクレオチド。
【請求項18】
式ＩＶの前記連続ヌクレオチド配列が、少なくとも１６個のヌクレオシドの長さを有し、かつ（ａ）ＦおよびＦ’が、それぞれ独立して、３、４、または５個のヌクレオシドからなり、
（ｂ）ＦおよびＦ’中の全てのヌクレオシドが、ＴＮＡヌクレオシドであり、
（ｃ）Ｇ中の全てのヌクレオシドが、ＤＮＡヌクレオシドである、
請求項１５に記載のアンチセンスギャップマーオリゴヌクレオチド。
【請求項19】
式ＩＶの前記連続ヌクレオチド配列が、少なくとも１６個のヌクレオシドの長さを有し、かつ（ａ）ＦおよびＦ’が、それぞれ独立して、３、４、若しくは５個の連結された高親和性糖修飾ヌクレオシドを含むか、またはそれらからなり、かつ、いかなるＴＮＡヌクレオシドも含まず、かつ
（ｂ）Ｇ中の５’最末端から２番目、３番目、４番目、または５番目のヌクレオシドが、ＴＮＡヌクレオシドであり、かつＧ中の残りのヌクレオシドが、ＤＮＡヌクレオシドである、
請求項１５に記載のアンチセンスギャップマーオリゴヌクレオチド。
【請求項20】
一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドである、前記請求項のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項21】
前記請求項のいずれか一項に記載のアンチセンスギャップマーオリゴヌクレオチドと、前記オリゴヌクレオチドに共有結合した少なくとも１つのコンジュゲート部分とを、任意にリンカーを介して含む、コンジュゲート。
【請求項22】
請求項１～２０のいずれか一項に記載のアンチセンスギャップマーオリゴヌクレオチドまたは請求項２１に記載のコンジュゲートの、薬学的に許容され得る塩。
【請求項23】
請求項１～２０のいずれか一項に記載のアンチセンスギャップマーオリゴヌクレオチド、請求項２１に記載のコンジュゲート、または請求項２２に記載の薬学的に許容され得る塩と、薬学的に許容され得る希釈剤、溶媒、担体、塩、および／またはアジュバントとを含む、医薬組成物。
【請求項24】
医薬として使用するための、請求項１～２０のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、請求項２１に記載のコンジュゲート、請求項２２に記載の薬学的に許容され得る塩、または請求項２３に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
発明の分野
本発明は、１個以上のα－Ｌ－トレオフラノシル（ＴＮＡ）ヌクレオシドを含むアンチセンスオリゴヌクレオチド、並びにＴＮＡヌクレオシドの導入によってアンチセンスオリゴヌクレオチドの特性を調節する方法に関する。本発明は、アンチセンスギャップマーオリゴヌクレオチドに特に適用可能である。
本発明は、１個以上のα－Ｌ－トレオフラノシル（ＴＮＡ）ヌクレオシドを含むアンチセンスオリゴヌクレオチド、並びにＴＮＡヌクレオシドの導入によってアンチセンスオリゴヌクレオチドの特性を調節する方法に関する。本発明は、アンチセンスギャップマーオリゴヌクレオチドに特に適用可能である。
【背景技術】
【0002】
発明の背景
治療薬としての合成オリゴヌクレオチドは、近年著しい進歩を遂げており、リボヌクレアーゼＨ（ＲＮアーゼＨ）活性化ギャップマー、スプライススイッチングオリゴヌクレオチド、マイクロＲＮＡ阻害剤、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）およびアプタマー（Ｓ．Ｔ．Ｃｒｏｏｋｅ，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｄｒｕｇ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，２ｎｄ ｅｄ．Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，ＦＬ：ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，２００８（非特許文献１））等のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む多様な機構によって作用する臨床的に検証された分子の幅広いポートフォリオをもたらしている。
治療薬としての合成オリゴヌクレオチドは、近年著しい進歩を遂げており、リボヌクレアーゼＨ（ＲＮアーゼＨ）活性化ギャップマー、スプライススイッチングオリゴヌクレオチド、マイクロＲＮＡ阻害剤、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）およびアプタマー（Ｓ．Ｔ．Ｃｒｏｏｋｅ，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｄｒｕｇ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，２ｎｄ ｅｄ．Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，ＦＬ：ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，２００８（非特許文献１））等のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む多様な機構によって作用する臨床的に検証された分子の幅広いポートフォリオをもたらしている。
【0003】
ほぼ間違いなく、最も成功した修飾の１つは、非架橋のリン酸酸素原子の１つが硫黄原子に置き換えられた、ホスホロチオエート結合の導入である（Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ａｎｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ２００９；１０：１１７－１２１（非特許文献２））。ホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチドは、タンパク質結合の増加、並びに核酸分解に対する明らかに高い安定性、したがってそれらの未修飾ホスホジエステル類似体よりも高い血漿、組織および細胞における半減期を示す。これらの重要な特徴は、第１世代のオリゴヌクレオチド治療薬の開発を可能にするとともに、ロックド核酸（ＬＮＡ）等の後の世代の修飾による更なる改善の扉を開いた。他の修飾としては、ロックド核酸（ＬＮＡ）並びに様々な他の修飾ヌクレオシドが挙げられる。例えば、ＴＮＡは、例えば、二本鎖ｓｉＲＮＡ分子で、およびオリゴマーの形態で使用されている（Ｍａｔｓｕｄａ ｅｔ ａｌ．，ＸＸＩＩＩ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｏｕｎｄ Ｔａｂｌｅ ｏｎ Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ，Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ；２０１８（非特許文献３）、Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，ＡＣＳ Ａｐｐｌ．Ｍａｔｅｒ．Ｉｎｔｅｒｆａｃｅｓ ２０１８；１０：９７３６－９７４３（非特許文献４）、国際公開公報第２０１２／０７８５３６号（特許文献１）、国際公開公報第２０１２／１１８９１１号（特許文献２）、および国際公開公報第２０１３／１７９２９２号（特許文献３））。
【0004】
しかしながら、安定で安全で効率的なアンチセンスオリゴヌクレオチドに基づく治療薬が依然として必要とされている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0005】
【特許文献1】国際公開公報第２０１２／０７８５３６号
【特許文献2】国際公開公報第２０１２／１１８９１１号
【特許文献3】国際公開公報第２０１３／１７９２９２号
【非特許文献】
【0006】
【非特許文献1】Ｓ．Ｔ．Ｃｒｏｏｋｅ，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｄｒｕｇ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，２ｎｄ ｅｄ．Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，ＦＬ：ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，２００８
【非特許文献2】Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ａｎｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ２００９；１０：１１７－１２１
【非特許文献3】Ｍａｔｓｕｄａ ｅｔ ａｌ．，ＸＸＩＩＩ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｏｕｎｄ Ｔａｂｌｅ ｏｎ Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ，Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ；２０１８
【非特許文献4】Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，ＡＣＳ Ａｐｐｌ．Ｍａｔｅｒ．Ｉｎｔｅｒｆａｃｅｓ ２０１８；１０：９７３６－９７４３
【発明の概要】
【0007】
本発明者（ら）は、１つ以上のα－Ｌ－トレオフラノシル（ＴＮＡ）ヌクレオシドをアンチセンスオリゴヌクレオチド、特にアンチセンスギャップマーオリゴヌクレオチドに導入して、アンチセンスオリゴヌクレオチドの特性を調節することができることを見出した。驚くべきことに、ＴＮＡ修飾は、本明細書に記載されるようなギャップマー設計に導入されると、治療的使用のための好ましい特性を有する強力な分子をもたらすことができる。
【0008】
したがって、本発明は、少なくとも１つのＴＮＡヌクレオシドを含むアンチセンスオリゴヌクレオチド、特に少なくとも１つのＴＮＡヌクレオシドを含むアンチセンスギャップマーオリゴヌクレオチドに関する。
【0009】
本発明はまた、リボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）Ｈを動員することができる、式５’－Ｆ－Ｇ－Ｆ’－３’（Ｉ）の連続ヌクレオチド配列を含むアンチセンスギャップマーオリゴヌクレオチドに関し、連続ヌクレオチド配列は、少なくとも１つのＴＮＡヌクレオシドを含む。
【0010】
本発明はまた、ＲＮアーゼＨを動員することができる式５’－Ｆ－Ｇ－Ｆ’－３’（Ｉ）の連続ヌクレオチド配列を含むアンチセンスギャップマーオリゴヌクレオチドに関し、式中、
Ｇは、少なくとも３個の連続ＤＮＡヌクレオシドを含む１８個までの連結ヌクレオシドのギャップ領域であり、
ＦおよびＦ’の各々は、独立して、１～１５個の糖修飾ヌクレオシドを含むかまたはそれらからなる、１５個までの連結ヌクレオシドのフランキング領域であり、かつ
Ｆ、Ｆ’、およびＧのうちの少なくとも１つは、α－Ｌ－トレオフラノシル（ＴＮＡ）ヌクレオシドである糖修飾ヌクレオシドを含む。
Ｇは、少なくとも３個の連続ＤＮＡヌクレオシドを含む１８個までの連結ヌクレオシドのギャップ領域であり、
ＦおよびＦ’の各々は、独立して、１～１５個の糖修飾ヌクレオシドを含むかまたはそれらからなる、１５個までの連結ヌクレオシドのフランキング領域であり、かつ
Ｆ、Ｆ’、およびＧのうちの少なくとも１つは、α－Ｌ－トレオフラノシル（ＴＮＡ）ヌクレオシドである糖修飾ヌクレオシドを含む。
【0011】
本発明はまた、本発明によるアンチセンスギャップマーオリゴヌクレオチドと、任意にリンカーを介してアンチセンスギャップマーオリゴヌクレオチドに共有結合した少なくとも１つのコンジュゲート部分とを含むコンジュゲートに関する。
【0012】
本発明はまた、本発明によるアンチセンスギャップマーオリゴヌクレオチドまたはアンチセンスギャップマーコンジュゲートの薬学的に許容され得る塩に関する。
【0013】
本発明はまた、本発明によるアンチセンスギャップマーオリゴヌクレオチド、コンジュゲートまたは薬学的に許容され得る塩と、薬学的に許容され得る希釈剤、溶媒、担体、塩、および／またはアジュバントとを含む、医薬組成物に関する。
【0014】
本発明はまた、医薬として使用するための、本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチド、コンジュゲート、薬学的に許容され得る塩または医薬組成物に関する。
【0015】
本発明はまた、親アンチセンスギャップマーオリゴヌクレオチドの修飾バージョンを調製する方法であって、親アンチセンスギャップマーが、ＲＮアーゼＨを動員することができる式５’Ｆ－Ｇ－Ｆ’３’（Ｉ）の連続ヌクレオチド配列を含み、式中、Ｇは、５～１８個の連結されたＤＮＡヌクレオシドのギャップ領域であり、ＦおよびＦ’の各々は、独立して、ＴＮＡヌクレオシド以外の１～８個の糖修飾ヌクレオシドを含むかまたはそれらからなる８個までの連結ヌクレオシドのフランキング領域であり、修飾バージョンにおいて、親アンチセンスギャップマーオリゴヌクレオチドのＦ、Ｆ’および／またはＧ中の少なくとも１つのヌクレオシドは、ＴＮＡヌクレオシドで置換されており、
方法は、ヌクレオチド単位を反応させて、オリゴヌクレオチドに含まれる共有結合した連続ヌクレオチド単位を形成することによって修飾アンチセンスギャップマーオリゴヌクレオチドを製造する工程を含み、ヌクレオチド単位の少なくとも１つは、ＴＮＡヌクレオシドを含み、
任意に、修飾アンチセンスギャップマーオリゴヌクレオチドを精製または単離することを含む、方法に関する。
方法は、ヌクレオチド単位を反応させて、オリゴヌクレオチドに含まれる共有結合した連続ヌクレオチド単位を形成することによって修飾アンチセンスギャップマーオリゴヌクレオチドを製造する工程を含み、ヌクレオチド単位の少なくとも１つは、ＴＮＡヌクレオシドを含み、
任意に、修飾アンチセンスギャップマーオリゴヌクレオチドを精製または単離することを含む、方法に関する。
【0016】
本発明はまた、本発明の方法によって得られるかまたは得ることができるアンチセンスギャップマーオリゴヌクレオチドに関する。
【0017】
本発明はまた、本発明によるアンチセンスギャップマーオリゴヌクレオチドの調製におけるＴＮＡヌクレオチドの使用に関する。
【0018】
本発明のこれらおよび他の態様および実施形態の更なる詳細は、以下の詳細な開示および特許請求の範囲に提供される。
【発明を実施するための形態】
【0019】
詳細な開示
定義
本発明をより容易に理解され得るように、特定の用語を以下に定義し説明する。
定義
本発明をより容易に理解され得るように、特定の用語を以下に定義し説明する。
【0020】
本明細書を通して、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という語またはその文法的変形は、言及された整数（若しくは成分）または整数（若しくは成分）の群を言外に含み、いずれの他の整数（若しくは成分）または整数（若しくは成分）の群も除外しない。
【0021】
オリゴヌクレオチド
本明細書で使用される場合、「オリゴヌクレオチド」という用語は、修飾ヌクレオシドまたはヌクレオチドを含む、２つ以上の共有結合したヌクレオシドを含む分子として当業者によって一般に理解されるものとして定義される。このような共有結合したヌクレオシドはまた、核酸分子またはオリゴマーとも称され得る。オリゴヌクレオチドは、通常、固相化学合成と、その後の精製によって研究室内で作製される。オリゴヌクレオチド配列に言及する場合、共有結合したヌクレオチドまたはヌクレオシドの核酸塩基部分またはその修飾の配列または順序を参照する。本発明のオリゴヌクレオチドは、人工であり、化学的に合成され、典型的には精製または単離される。ヌクレオシドは、ホスホジエステル（ＰＯ）結合または修飾されたヌクレオシド間結合によって連結され得る。
本明細書で使用される場合、「オリゴヌクレオチド」という用語は、修飾ヌクレオシドまたはヌクレオチドを含む、２つ以上の共有結合したヌクレオシドを含む分子として当業者によって一般に理解されるものとして定義される。このような共有結合したヌクレオシドはまた、核酸分子またはオリゴマーとも称され得る。オリゴヌクレオチドは、通常、固相化学合成と、その後の精製によって研究室内で作製される。オリゴヌクレオチド配列に言及する場合、共有結合したヌクレオチドまたはヌクレオシドの核酸塩基部分またはその修飾の配列または順序を参照する。本発明のオリゴヌクレオチドは、人工であり、化学的に合成され、典型的には精製または単離される。ヌクレオシドは、ホスホジエステル（ＰＯ）結合または修飾されたヌクレオシド間結合によって連結され得る。
【0022】
アンチセンスオリゴヌクレオチド
本明細書で使用される場合、「アンチセンスオリゴヌクレオチド」という用語は、標的核酸、特に標的核酸上の連続配列にハイブリダイズすることによって標的遺伝子の発現を調節することができるオリゴヌクレオチドとして定義される。企図されるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、本質的に二本鎖ではなく、したがってｓｉＲＮＡまたは短いヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）ではない。好ましくは、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは一本鎖である。本発明の一本鎖オリゴヌクレオチドは、自己内または自己間の相補性の程度がオリゴヌクレオチドの全長にわたって５０％超であれば、ヘアピンまたは分子間二重構造（同じオリゴヌクレオチドの２つの分子間の二重鎖）を形成することができるものと理解される。
本明細書で使用される場合、「アンチセンスオリゴヌクレオチド」という用語は、標的核酸、特に標的核酸上の連続配列にハイブリダイズすることによって標的遺伝子の発現を調節することができるオリゴヌクレオチドとして定義される。企図されるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、本質的に二本鎖ではなく、したがってｓｉＲＮＡまたは短いヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）ではない。好ましくは、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは一本鎖である。本発明の一本鎖オリゴヌクレオチドは、自己内または自己間の相補性の程度がオリゴヌクレオチドの全長にわたって５０％超であれば、ヘアピンまたは分子間二重構造（同じオリゴヌクレオチドの２つの分子間の二重鎖）を形成することができるものと理解される。
【0023】
連続ヌクレオチド配列
「連続ヌクレオチド配列」という用語は、標的核酸に相補的なオリゴヌクレオチドの領域を指す。この用語は、本明細書で「連続核酸塩基配列」という用語および「オリゴヌクレオチドモチーフ配列」という用語と互換的に用いられる。例えば、オリゴヌクレオチドの全てのヌクレオチドは、連続ヌクレオチド配列を構成し得る。或いは、オリゴヌクレオチドは、連続ヌクレオチド配列、例えばＦ－Ｇ－Ｆ’ギャップマー領域を含んでもよく、任意に、更なるヌクレオチド（複数可）、例えば、官能基を連続ヌクレオチド配列に結合するのに使用され得るヌクレオチドリンカー領域を含んでもよい。ヌクレオチドリンカー領域は、標的核酸に対して相補的であってもよく、または相補的でなくてもよい。有利には、連続ヌクレオチド配列は、標的核酸に１００％相補的である。
「連続ヌクレオチド配列」という用語は、標的核酸に相補的なオリゴヌクレオチドの領域を指す。この用語は、本明細書で「連続核酸塩基配列」という用語および「オリゴヌクレオチドモチーフ配列」という用語と互換的に用いられる。例えば、オリゴヌクレオチドの全てのヌクレオチドは、連続ヌクレオチド配列を構成し得る。或いは、オリゴヌクレオチドは、連続ヌクレオチド配列、例えばＦ－Ｇ－Ｆ’ギャップマー領域を含んでもよく、任意に、更なるヌクレオチド（複数可）、例えば、官能基を連続ヌクレオチド配列に結合するのに使用され得るヌクレオチドリンカー領域を含んでもよい。ヌクレオチドリンカー領域は、標的核酸に対して相補的であってもよく、または相補的でなくてもよい。有利には、連続ヌクレオチド配列は、標的核酸に１００％相補的である。
【0024】
ヌクレオチド
ヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドの構成要素であり、本発明の目的のためには、天然に存在するヌクレオチドおよび非天然のヌクレオチドの両方を含む。本来、ＤＮＡヌクレオチドおよびＲＮＡヌクレオチド等のヌクレオチドは、リボース糖部分、核酸塩基部分、および１つ以上のリン酸基（ヌクレオシドには存在しない）を含む。ヌクレオシドおよびヌクレオチドはまた、「単位」または「モノマー」と互換的に称されてもよい。
ヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドの構成要素であり、本発明の目的のためには、天然に存在するヌクレオチドおよび非天然のヌクレオチドの両方を含む。本来、ＤＮＡヌクレオチドおよびＲＮＡヌクレオチド等のヌクレオチドは、リボース糖部分、核酸塩基部分、および１つ以上のリン酸基（ヌクレオシドには存在しない）を含む。ヌクレオシドおよびヌクレオチドはまた、「単位」または「モノマー」と互換的に称されてもよい。
【0025】
核酸塩基
核酸塩基という用語は、ヌクレオシドおよびヌクレオチドに存在するプリン（例えばアデニンおよびグアニン）およびピリミジン（例えばウラシル、チミンおよびシトシン）部分を含み、これらは核酸ハイブリダイゼーションにおいて水素結合を形成する。本発明の文脈において、核酸塩基という用語は、天然に存在する核酸塩基とは異なり得るが、核酸ハイブリダイゼーション中に機能的である修飾核酸塩基も包含する。この文脈において、「核酸塩基」は、アデニン、グアニン、シトシン、チミジン、ウラシル、キサンチンおよびヒポキサンチン等の天然に存在する核酸塩基と天然に存在しない変異体の両方を指す。このようなバリアントは、例えば、Ｈｉｒａｏ ｅｔ ａｌ（２０１２）Ａｃｃｏｕｎｔｓ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｖｏｌ ４５．ｐａｇｅ ２０５５ ａｎｄ Ｂｅｒｇｓｔｒｏｍ（２００９）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｓｕｐｐｌ．３７，１．４．１．に記載されている。
核酸塩基という用語は、ヌクレオシドおよびヌクレオチドに存在するプリン（例えばアデニンおよびグアニン）およびピリミジン（例えばウラシル、チミンおよびシトシン）部分を含み、これらは核酸ハイブリダイゼーションにおいて水素結合を形成する。本発明の文脈において、核酸塩基という用語は、天然に存在する核酸塩基とは異なり得るが、核酸ハイブリダイゼーション中に機能的である修飾核酸塩基も包含する。この文脈において、「核酸塩基」は、アデニン、グアニン、シトシン、チミジン、ウラシル、キサンチンおよびヒポキサンチン等の天然に存在する核酸塩基と天然に存在しない変異体の両方を指す。このようなバリアントは、例えば、Ｈｉｒａｏ ｅｔ ａｌ（２０１２）Ａｃｃｏｕｎｔｓ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｖｏｌ ４５．ｐａｇｅ ２０５５ ａｎｄ Ｂｅｒｇｓｔｒｏｍ（２００９）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｓｕｐｐｌ．３７，１．４．１．に記載されている。
【0026】
核酸塩基部分は、任意に、プリンまたはピリミジンを修飾プリンまたはピリミジン、例えば置換プリンまたは置換ピリミジン、例えばイソシトシン、シュードイソシトシン、５－メチルシトシン、５－チオゾロ－シトシン、５－プロピニル－シトシン、５－プロピニル－ウラシル、５－ブロモウラシル５－チアゾロ－ウラシル、２－チオ－ウラシル、２’－チオ－チミン、イノシン、ジアミノプリン、６－アミノプリン、２－アミノプリン、２，６－ジアミノプリンおよび２－クロロ－６－アミノプリンから選択される核酸塩基に変えることにより修飾することができる。
【0027】
核酸塩基部分は、対応する各核酸塩基についての文字コード、例えば、Ａ、Ｔ、Ｇ、ＣまたはＵにより示されてもよく、各文字は、任意に等価な機能の修飾核酸塩基を含んでもよい。例えば、いくつかのオリゴヌクレオチドにおいて、核酸塩基部分は、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃおよび５－メチルシトシン（ｍＣ）から選択される。
【0028】
修飾ヌクレオシド
本明細書で使用される場合、「修飾ヌクレオシド」または「ヌクレオシド修飾」という用語は、糖部分または（核酸）塩基部分の１つ以上修飾の導入によって、同等のＤＮＡまたはＲＮＡヌクレオシドと比較して修飾されたヌクレオシドを指す。好ましくは、修飾ヌクレオシドは修飾された糖部分を含む。「修飾ヌクレオシド」という用語は、本明細書では用語「ヌクレオシド類似体」または修飾「単位」または修飾「モノマー」とも区別せずに使用され得る。非修飾ＤＮＡまたはＲＮＡ糖部分を有するヌクレオシドは、本明細書ではＤＮＡまたはＲＮＡヌクレオシドと称される。ＤＮＡまたはＲＮＡヌクレオシドの塩基領域に修飾を有するヌクレオシドは、それらがワトソン・クリック塩基対合可能な場合には、依然として一般的にＤＮＡまたはＲＮＡと称される。
本明細書で使用される場合、「修飾ヌクレオシド」または「ヌクレオシド修飾」という用語は、糖部分または（核酸）塩基部分の１つ以上修飾の導入によって、同等のＤＮＡまたはＲＮＡヌクレオシドと比較して修飾されたヌクレオシドを指す。好ましくは、修飾ヌクレオシドは修飾された糖部分を含む。「修飾ヌクレオシド」という用語は、本明細書では用語「ヌクレオシド類似体」または修飾「単位」または修飾「モノマー」とも区別せずに使用され得る。非修飾ＤＮＡまたはＲＮＡ糖部分を有するヌクレオシドは、本明細書ではＤＮＡまたはＲＮＡヌクレオシドと称される。ＤＮＡまたはＲＮＡヌクレオシドの塩基領域に修飾を有するヌクレオシドは、それらがワトソン・クリック塩基対合可能な場合には、依然として一般的にＤＮＡまたはＲＮＡと称される。
【0029】
糖修飾ヌクレオシド
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、修飾糖部分、すなわち、ＤＮＡおよびＲＮＡに見られるリボース糖部分と比較した場合の糖部分の修飾を有する１つ以上のヌクレオシドを含み得る。
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、修飾糖部分、すなわち、ＤＮＡおよびＲＮＡに見られるリボース糖部分と比較した場合の糖部分の修飾を有する１つ以上のヌクレオシドを含み得る。
【0030】
リボース糖部分の修飾を有する数多くのヌクレオシドが、親和性および／またはヌクレアーゼ耐性等のオリゴヌクレオチドのある特定の性質を改善することを主な目的として作製されてきた。
【0031】
そのような修飾には、例えばヘキソース環（ＨＮＡ）または二環式環（典型的には、リボース環（ＬＮＡ）のＣ２とＣ４炭素の間に架橋を有する）、または典型的にはＣ２とＣ３炭素の間の結合を欠く非結合リボース環（例えば、ＵＮＡ）で置き換えることにより、リボース環構造が修飾されているものが含まれる。他の糖修飾ヌクレオシドには、例えばビシクロヘキソース核酸（国際公開公報第２０１１／０１７５２１号）または三環式核酸（国際公開公報第２０１３／１５４７９８号）が含まれる。修飾ヌクレオシドにはまた、糖部分が例えばペプチド核酸（ＰＮＡ）またはモルホリノ核酸の場合には非糖部分で置き換えられているヌクレオシドが含まれる。
【0032】
糖修飾にはまた、リボース環上の置換基を、水素以外の基、またはＤＮＡおよびＲＮＡヌクレオシド中に天然に存在する２’－ＯＨ基に変更することによってなされる修飾も含まれる。置換基は、例えば２’、３’、４’、または５’位で導入され得る。
【0033】
修飾された糖部分の非限定的な例としては、以下が挙げられる：
α－Ｌ－トレオフラノシル（トレオース核酸；ＴＮＡにおけるような）、
２’－メトキシ－リボース（２’－ＯＭｅ）、
２’－Ｏ－メトキシエチル－リボース（２’－Ｏ－ＭＯＥ）、
５’－メチル－２’－Ｏ－メトキシエチルリボース（５’－Ｍｅ－２’－Ｏ－ＭＯＥ）、
２’－Ｏ－［２－（メチルチオ）エチル］－リボース（２’－Ｏ－ＭＴＥ）、
２－（Ｎ－メチルカルバモイル）－エチル］－リボース（２’－Ｏ－ＭＣＥ）、
２’－Ｏ－［２－（メチルアミノ）－２－オキソエチル］－リボース（２’－Ｏ－ＮＭＡ）、
２’－デオキシ－２’－フルオロ－リボース（２’－デオキシ－２’－フルオロリボ－核酸；２’－Ｆ－ＲＮＡにおけるような）、
２’－フルオロ－２’－アラビノース（２’－フルオロ－２’－アラビノース－核酸；２’－Ｆ－ＡＮＡにおけるような）、
２’－Ｏ－ベンジル－リボース、
オキシ、アミノまたはチオβ－Ｄ－ロックドリボース（β－Ｄ－ＬＮＡにおけるような）、
オキシ、アミノまたはチオα－Ｌ－ロックドリボース（α－Ｌ－ＬＮＡにおけるような）、
２’，４’拘束２’－Ｏ－エチルリボース（拘束エチルロックド核酸；ｃＥｔにおけるような）、
トリシクロ－デオキシリボース（トリシクロ－デオキシリボースＤＮＡ；ＴｃＤＮＡにおけるような）、
３’－デオキシ－リボース（３’－デオキシ－リボースＤＮＡ；３’－ＤＮＡにおけるような）、
アンロックドリボース（アンロックド核酸；ＵＮＡにおけるような）、
グリコール（グリコール核酸；ＧＮＡにおけるような）、
ヘキシトール（ヘキシトール核酸；ＨＮＡにおけるような）、
３’－フルオロヘキシトール（３’－フルオロヘキシトール核酸；ＦＨＮＡにおけるような）、
３’－アラビノ－フルオロヘキシトール（３’－アラビノ－フルオロ－ヘキシトール核酸；Ａｒａ－ＦＨＮＡにおけるような）、
シクロヘキセン（シクロヘキセン核酸；ＣｅＮＡにおけるような）、および
フルオロ－シクロヘキセニル（２’－フルオロ－シクロヘキセニル核酸；Ｆ－ＣｅＮＡにおけるような）。
α－Ｌ－トレオフラノシル（トレオース核酸；ＴＮＡにおけるような）、
２’－メトキシ－リボース（２’－ＯＭｅ）、
２’－Ｏ－メトキシエチル－リボース（２’－Ｏ－ＭＯＥ）、
５’－メチル－２’－Ｏ－メトキシエチルリボース（５’－Ｍｅ－２’－Ｏ－ＭＯＥ）、
２’－Ｏ－［２－（メチルチオ）エチル］－リボース（２’－Ｏ－ＭＴＥ）、
２－（Ｎ－メチルカルバモイル）－エチル］－リボース（２’－Ｏ－ＭＣＥ）、
２’－Ｏ－［２－（メチルアミノ）－２－オキソエチル］－リボース（２’－Ｏ－ＮＭＡ）、
２’－デオキシ－２’－フルオロ－リボース（２’－デオキシ－２’－フルオロリボ－核酸；２’－Ｆ－ＲＮＡにおけるような）、
２’－フルオロ－２’－アラビノース（２’－フルオロ－２’－アラビノース－核酸；２’－Ｆ－ＡＮＡにおけるような）、
２’－Ｏ－ベンジル－リボース、
オキシ、アミノまたはチオβ－Ｄ－ロックドリボース（β－Ｄ－ＬＮＡにおけるような）、
オキシ、アミノまたはチオα－Ｌ－ロックドリボース（α－Ｌ－ＬＮＡにおけるような）、
２’，４’拘束２’－Ｏ－エチルリボース（拘束エチルロックド核酸；ｃＥｔにおけるような）、
トリシクロ－デオキシリボース（トリシクロ－デオキシリボースＤＮＡ；ＴｃＤＮＡにおけるような）、
３’－デオキシ－リボース（３’－デオキシ－リボースＤＮＡ；３’－ＤＮＡにおけるような）、
アンロックドリボース（アンロックド核酸；ＵＮＡにおけるような）、
グリコール（グリコール核酸；ＧＮＡにおけるような）、
ヘキシトール（ヘキシトール核酸；ＨＮＡにおけるような）、
３’－フルオロヘキシトール（３’－フルオロヘキシトール核酸；ＦＨＮＡにおけるような）、
３’－アラビノ－フルオロヘキシトール（３’－アラビノ－フルオロ－ヘキシトール核酸；Ａｒａ－ＦＨＮＡにおけるような）、
シクロヘキセン（シクロヘキセン核酸；ＣｅＮＡにおけるような）、および
フルオロ－シクロヘキセニル（２’－フルオロ－シクロヘキセニル核酸；Ｆ－ＣｅＮＡにおけるような）。
【0034】
別段特定されない限り、または文脈に矛盾しない限り、「ＭＯＥ」という用語は、本明細書では、リボース環の２’位にＯ－メトキシエチル基を含むいかなるヌクレオシドも指し得、２’－Ｏ－ＭＯＥおよび５’－Ｍｅ－２’－Ｏ－ＭＯＥが含まれるが、これらに限定されない。
【0035】
トレオース核酸（ＴＮＡ）
本明細書で使用される場合、「α－Ｌ－トレオフラノシルヌクレオシド」、「α－Ｌ－トレオース核酸ヌクレオシド」、「ＴＮＡヌクレオシド」、「ＴＮＡ修飾ヌクレオシド」、「ＴＮＡ単位」、「ＴＮＡ部分」等は、α－Ｌ－トレオフラノシル部分を含む糖修飾ヌクレオシドを指す。
本明細書で使用される場合、「α－Ｌ－トレオフラノシルヌクレオシド」、「α－Ｌ－トレオース核酸ヌクレオシド」、「ＴＮＡヌクレオシド」、「ＴＮＡ修飾ヌクレオシド」、「ＴＮＡ単位」、「ＴＮＡ部分」等は、α－Ｌ－トレオフラノシル部分を含む糖修飾ヌクレオシドを指す。
【0036】
ＴＮＡヌクレオシドは、隣接する２つのＴＮＡヌクレオシドについて以下に示すように、（２’→３’）ヌクレオシド間結合、例えばホスホジエステル（ＰＯ）または修飾ヌクレオシド間結合によって隣接するヌクレオシドに連結される。
【0037】
核酸塩基（Ｂ）がシトシンである場合、ＴＮＡヌクレオシドは有利には５－メチル－シトシン（ｍＣ）ＴＮＡヌクレオシドである。
【0038】
２’糖修飾ヌクレオシド
２’糖修飾ヌクレオシドは、２’位にＨまたは－ＯＨ以外の置換基を有するヌクレオシド（２’置換ヌクレオシド）である。これは、リボース環内の２’炭素と第２の炭素との間に架橋を形成することができる２’結合バイラジカルを含むヌクレオシド、例えばＬＮＡ（２’－４’架橋）ヌクレオシドを含む。
２’糖修飾ヌクレオシドは、２’位にＨまたは－ＯＨ以外の置換基を有するヌクレオシド（２’置換ヌクレオシド）である。これは、リボース環内の２’炭素と第２の炭素との間に架橋を形成することができる２’結合バイラジカルを含むヌクレオシド、例えばＬＮＡ（２’－４’架橋）ヌクレオシドを含む。
【0039】
本開示の目的のために、ＴＮＡヌクレオシドは２’置換ヌクレオシドではない。
【0040】
多数の２’置換ヌクレオシドは、オリゴヌクレオチドに組み込まれたときに有益な特性を有することが見出されている。例えば、２’修飾された糖は、結合親和性の向上および／またはヌクレアーゼ耐性の増大をオリゴヌクレオチドに付与し得る。２’置換修飾ヌクレオシドの例は、２’－Ｏ－アルキル－ＲＮＡ、２’－Ｏ－メチル－ＲＮＡ、２’－アルコキシ－ＲＮＡ、２’－Ｏ－メトキシエチル－ＲＮＡ（２’－Ｏ－ＭＯＥ）、２’－アミノ－ＤＮＡ、２’－フルオロ－ＲＮＡ、２’－Ｆ－ＡＮＡ、およびＬＮＡのような２’架橋分子である。更なる例については、例えばＦｒｅｉｅｒ＆Ａｌｔｍａｎｎ；Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．，１９９７，２５，４４２９－４４４３ ａｎｄ Ｕｈｌｍａｎｎ；Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，２０００，３（２），２９３－２１３，ａｎｄ Ｄｅｌｅａｖｅｙ ａｎｄ Ｄａｍｈａ，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２０１２，１９，９３７．を参照されたい。以下のスキーム１は、いくつかの２’置換修飾ヌクレオシドの例示を示す。
スキーム１：
スキーム１：
【0041】
ロックド核酸（ＬＮＡ）
「ＬＮＡヌクレオシド」は、リボース環の立体構造を制限または固定する、当該ヌクレオシドのリボース糖環のＣ２’とＣ４’とを連結するバイラジカル（「２’－４’架橋」とも称される）を含む２’修飾ヌクレオシドである。これらのヌクレオシドはまた、文献において、架橋核酸または二環式核酸（ＢＮＡ）とも称されている。リボースの立体配座の固定は、ＬＮＡが相補的ＲＮＡまたはＤＮＡ分子のオリゴヌクレオチドに組み込まれる場合、ハイブリダイゼーションの親和性の向上（二重鎖安定化）に関連している。これは、オリゴヌクレオチド／相補二重鎖の融解温度を測定することによって、日常的に決定され得る。
「ＬＮＡヌクレオシド」は、リボース環の立体構造を制限または固定する、当該ヌクレオシドのリボース糖環のＣ２’とＣ４’とを連結するバイラジカル（「２’－４’架橋」とも称される）を含む２’修飾ヌクレオシドである。これらのヌクレオシドはまた、文献において、架橋核酸または二環式核酸（ＢＮＡ）とも称されている。リボースの立体配座の固定は、ＬＮＡが相補的ＲＮＡまたはＤＮＡ分子のオリゴヌクレオチドに組み込まれる場合、ハイブリダイゼーションの親和性の向上（二重鎖安定化）に関連している。これは、オリゴヌクレオチド／相補二重鎖の融解温度を測定することによって、日常的に決定され得る。
【0042】
非限定的で例示的なＬＮＡヌクレオシドは、国際公開公報第９９／０１４２２６号、国際公開公報第００／６６６０４号、国際公開公報第９８／０３９３５２号、国際公開公報第２００４／０４６１６０号、国際公開公報第００／０４７５９９号、国際公開公報第２００７／１３４１８１号、国際公開公報第２０１０／０７７５７８号、国際公開公報第２０１０／０３６６９８号、国際公開公報第２００７／０９００７１号、国際公開公報第２００９／００６４７８号、国際公開公報第２０１１／１５６２０２号、国際公開公報第２００８／１５４４０１号、国際公開公報第２００９／０６７６４７号、国際公開公報第２００８／１５０７２９号、Ｍｏｒｉｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ＆Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．２００２，１２，７３－７６，Ｓｅｔｈ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．２０１０，Ｖｏｌ ７５（５）ｐｐ．１５６９－８１、およびＭｉｔｓｕｏｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２００９，３７（４），１２２５－１２３８、およびＷａｎ ａｎｄ Ｓｅｔｈ，Ｊ．Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２０１６，５９，９６４５－９６６７を参照されたい。
【0043】
更なる非限定的な例示的ＬＮＡヌクレオシドを、スキーム２に開示する。
スキーム２：
スキーム２：
【0044】
特定のＬＮＡヌクレオシドは、ベータ－Ｄ－オキシ－ＬＮＡ、６’－メチル－ベータ－Ｄ－オキシＬＮＡ、例えば（Ｓ）－６’－メチル－ベータ－Ｄ－オキシ－ＬＮＡ（ＳｃＥＴ）およびＥＮＡである。特に有利なＬＮＡは、ベータ－Ｄ－オキシ－ＬＮＡである。
【0045】
ヌクレオシド間結合
「ヌクレオシド間結合」という用語は、当業者によって一般的に理解されるように、２つのヌクレオシドを互いに共有結合する結合として定義される。本明細書に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドでは、ヌクレオシド間結合は、隣接するヌクレオシドを互いに共有結合し、典型的には隣接するヌクレオシドの糖部分間に結合を形成する。ヌクレオシド間結合の非限定的な例としては、ホスホジエステル（ＰＯ）結合および修飾ヌクレオシド間結合が挙げられる。
「ヌクレオシド間結合」という用語は、当業者によって一般的に理解されるように、２つのヌクレオシドを互いに共有結合する結合として定義される。本明細書に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドでは、ヌクレオシド間結合は、隣接するヌクレオシドを互いに共有結合し、典型的には隣接するヌクレオシドの糖部分間に結合を形成する。ヌクレオシド間結合の非限定的な例としては、ホスホジエステル（ＰＯ）結合および修飾ヌクレオシド間結合が挙げられる。
【0046】
修飾ヌクレオシド間結合
「修飾ヌクレオシド間結合」という用語は、２つのヌクレオシドを互いに共有結合する、ホスホジエステル（ＰＯ）結合以外の結合として当業者に一般的に理解されるように定義される。修飾されたヌクレオシド間結合は、ホスホジエステル結合と比較して、オリゴヌクレオチドのヌクレアーゼ耐性を増加させ得る。修飾ヌクレオシド間結合は、インビボ使用のためのオリゴヌクレオチドの安定化に特に有用であり、オリゴヌクレオチド中のＤＮＡまたはＲＮＡヌクレオシドの領域、例えばギャップマーオリゴヌクレオチドのギャップ領域内、並びに修飾ヌクレオシドの領域、例えば領域ＦおよびＦ’においてヌクレアーゼ切断から保護され得る。
「修飾ヌクレオシド間結合」という用語は、２つのヌクレオシドを互いに共有結合する、ホスホジエステル（ＰＯ）結合以外の結合として当業者に一般的に理解されるように定義される。修飾されたヌクレオシド間結合は、ホスホジエステル結合と比較して、オリゴヌクレオチドのヌクレアーゼ耐性を増加させ得る。修飾ヌクレオシド間結合は、インビボ使用のためのオリゴヌクレオチドの安定化に特に有用であり、オリゴヌクレオチド中のＤＮＡまたはＲＮＡヌクレオシドの領域、例えばギャップマーオリゴヌクレオチドのギャップ領域内、並びに修飾ヌクレオシドの領域、例えば領域ＦおよびＦ’においてヌクレアーゼ切断から保護され得る。
【0047】
ヌクレアーゼ耐性は、オリゴヌクレオチドを血清中でインキュベートすることにより、またはヌクレアーゼ耐性アッセイ（例えばヘビ毒ホスホジエステラーゼ（ＳＶＰＤ））を用いることにより決定され得、これらは両方とも当技術分野で周知である。いくつかのオリゴヌクレオチドにおいて、オリゴヌクレオチドの全てのヌクレオシド間結合またはその連続ヌクレオチド配列は、ヌクレアーゼ耐性のヌクレオシド間結合であり得る。オリゴヌクレオチドを非ヌクレオチド官能基、例えばコンジュゲートに連結するヌクレオシドは、ホスホジエステルであってもよいことが企図される。
【0048】
ホスホロチオエートヌクレオシド間結合
好ましい修飾ヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート（ＰＳ）である。ホスホロチオエートヌクレオシド間結合は、ヌクレアーゼ耐性、有益な薬物動態、および製造の容易さに起因して、特に有用である。いくつかのオリゴヌクレオチドにおいて、オリゴヌクレオチドの全てのヌクレオシド間結合またはその連続ヌクレオチド配列は、ホスホロチオエート結合である。
好ましい修飾ヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート（ＰＳ）である。ホスホロチオエートヌクレオシド間結合は、ヌクレアーゼ耐性、有益な薬物動態、および製造の容易さに起因して、特に有用である。いくつかのオリゴヌクレオチドにおいて、オリゴヌクレオチドの全てのヌクレオシド間結合またはその連続ヌクレオチド配列は、ホスホロチオエート結合である。
【0049】
ホスホロチオエート結合等のヌクレアーゼ耐性結合は、標的核酸と二重鎖を形成するときにヌクレアーゼを動員することができるオリゴヌクレオチド領域、例えばギャップマーの領域Ｇにおいて特に有用である。しかしながら、ホスホロチオエート結合は、非ＲＮａｓｅ Ｈ動員領域および／または親和性増強領域、例えばギャップマーの領域ＦおよびＦ’においても有用であり得る。
【0050】
相補性
「相補性」という用語は、ヌクレオシド／ヌクレオチドのＷａｔｓｏｎ－Ｃｒｉｃｋ塩基対形成の能力を表す。ワトソン・クリック塩基対は、グアニン（Ｇ）－シトシン（Ｃ）およびアデニン（Ａ）－チミン（Ｔ）／ウラシル（Ｕ）である。オリゴヌクレオチドは修飾核酸塩基を有するヌクレオシドを含んでいてもよく、例えば５－メチルシトシンは、しばしばシトシンの代わりに用いられ、したがって、相補性という用語は、非修飾核酸塩基と修飾核酸塩基との間のワトソン・クリック塩基対合を包含することが理解されよう（例えば、Ｈｉｒａｏ ｅｔ ａｌ（２０１２）Ａｃｃｏｕｎｔｓ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｖｏｌ ４５，ｐａｇｅ ２０５５ ａｎｄ Ｂｅｒｇｓｔｒｏｍ（２００９）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｓｕｐｐｌ．３７，１．４．１を参照）。
「相補性」という用語は、ヌクレオシド／ヌクレオチドのＷａｔｓｏｎ－Ｃｒｉｃｋ塩基対形成の能力を表す。ワトソン・クリック塩基対は、グアニン（Ｇ）－シトシン（Ｃ）およびアデニン（Ａ）－チミン（Ｔ）／ウラシル（Ｕ）である。オリゴヌクレオチドは修飾核酸塩基を有するヌクレオシドを含んでいてもよく、例えば５－メチルシトシンは、しばしばシトシンの代わりに用いられ、したがって、相補性という用語は、非修飾核酸塩基と修飾核酸塩基との間のワトソン・クリック塩基対合を包含することが理解されよう（例えば、Ｈｉｒａｏ ｅｔ ａｌ（２０１２）Ａｃｃｏｕｎｔｓ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｖｏｌ ４５，ｐａｇｅ ２０５５ ａｎｄ Ｂｅｒｇｓｔｒｏｍ（２００９）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｓｕｐｐｌ．３７，１．４．１を参照）。
【0051】
本明細書で使用される場合、「相補性％」という用語は、個別の核酸分子（例えば、標的核酸または標的配列）の所与の位置のヌクレオチドの連続配列に所与の位置において相補的な（すなわち、Ｗａｔｓｏｎ Ｃｒｉｃｋ塩基対を形成する）、核酸分子内の連続ヌクレオチド配列（例えばオリゴヌクレオチド）のヌクレオチドの数を％で表したものを指す。百分率は、（標的配列５’－３’とオリゴヌクレオチド配列３’－５’を整列させたとき）２つの配列間で対を形成する整列した塩基の数を計数し、その数をオリゴヌクレオチド中のヌクレオチドの総数で除し、１００を乗じることにより計算される。このような比較において、整列（塩基対を形成）しない核酸塩基／ヌクレオチドは、ミスマッチと称される。好ましくは、挿入および欠失は、連続ヌクレオチド配列の相補性％の計算において許容されない。
【0052】
「完全に相補的な」という用語は、１００％の相補性を指す。
【0053】
同一性
本明細書で使用される場合、「同一性」という用語は、連続ヌクレオチド配列にわたって参照配列（例えば、配列モチーフ）と同一である、核酸分子（例えば、オリゴヌクレオチド）内の連続ヌクレオチド配列のヌクレオチドの割合（パーセントで表される）を指す。したがって、同一性の百分率は、２つの配列（例えば、本発明の化合物の連続ヌクレオチド配列および参照配列）の間で同一の（一致する）整列された塩基の数を計数し、その数を整列された領域内のヌクレオチドの総数で除し、１００を乗ずることにより計算される。したがって、同一性の百分率＝（一致数×１００）／整列された領域（例えば、連続ヌクレオチド配列）の長さ。挿入および欠失は、連続ヌクレオチド配列の同一性の百分率の計算において許容されない。同一性の決定において、核酸塩基の化学的修飾は、核酸塩基がワトソン・クリック塩基対合を形成する機能的能力が保持される限り、無視されることが理解されるであろう（例えば、５－メチルシトシンは、同一性％を計算する目的では、シトシンと同一であると見なされる）。
本明細書で使用される場合、「同一性」という用語は、連続ヌクレオチド配列にわたって参照配列（例えば、配列モチーフ）と同一である、核酸分子（例えば、オリゴヌクレオチド）内の連続ヌクレオチド配列のヌクレオチドの割合（パーセントで表される）を指す。したがって、同一性の百分率は、２つの配列（例えば、本発明の化合物の連続ヌクレオチド配列および参照配列）の間で同一の（一致する）整列された塩基の数を計数し、その数を整列された領域内のヌクレオチドの総数で除し、１００を乗ずることにより計算される。したがって、同一性の百分率＝（一致数×１００）／整列された領域（例えば、連続ヌクレオチド配列）の長さ。挿入および欠失は、連続ヌクレオチド配列の同一性の百分率の計算において許容されない。同一性の決定において、核酸塩基の化学的修飾は、核酸塩基がワトソン・クリック塩基対合を形成する機能的能力が保持される限り、無視されることが理解されるであろう（例えば、５－メチルシトシンは、同一性％を計算する目的では、シトシンと同一であると見なされる）。
【0054】
ハイブリダイゼーション
本明細書で使用される場合、「ハイブリダイズ」または「ハイブリダイズする」という用語は、２つの核酸鎖（例えば、オリゴヌクレオチドおよび標的核酸）が対向する鎖上の塩基対間に水素結合を形成することにより二重鎖を形成することと理解されるべきである。２つの核酸鎖の間の結合の親和性が、ハイブリダイゼーションの強度である。これは、オリゴヌクレオチドの半分が標的核酸と二重鎖を形成する温度として規定される、融解温度（Ｔｍ）によって説明されることが多い。生理学的条件では、Ｔｍは親和性に厳密に比例しない（Ｍｅｒｇｎｙ ａｎｄ Ｌａｃｒｏｉｘ，２００３，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ １３：５１５－５３７）。標準状態でのギブスの自由エネルギーΔＧ°は、結合親和性をより正確に表しており、ΔＧ°＝－ＲＴｌｎ（Ｋｄ）（式中、Ｒは気体定数であり、Ｔは絶対温度である）によって反応の解離定数（Ｋｄ）と関連付けられている。したがって、オリゴヌクレオチドと標的核酸との間の反応の非常に低いΔＧ°は、オリゴヌクレオチドと標的核酸との間の強いハイブリダイゼーションを反映している。ΔＧ°は、水溶液濃度が１Ｍ、ｐＨが７、温度が３７℃である反応に関連したエネルギーである。標的核酸に対するオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションは、自発的反応であり、自発的反応の場合のΔＧ°は、ゼロ未満である。ΔＧ°は、例えば、Ｈａｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９６５，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍ．３６－３８ ａｎｄ Ｈｏｌｄｇａｔｅ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ Ｔｏｄａｙに記載される等温滴定熱量測定（ＩＴＣ）により、実験的に測定することができる。当業者は、ΔＧ°測定のために市販の装置が入手可能であることを知るであろう。ΔＧ°はまた、Ｓｕｇｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３４：１１２１１－１１２１６およびＭｃＴｉｇｕｅ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４３：５３８８－５４０５によって記載された適切に導出された熱力学パラメータを使用して、ＳａｎｔａＬｕｃｉａ，１９９８，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．９５：１４６０－１４６５によって記載された最近傍モデルを使用することによって数値的に推定することができる。その意図した核酸標的をハイブリダイゼーションによって調節する可能性を確保するために、本発明のオリゴヌクレオチドは、１０～３０ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドに対して－１０ｋｃａｌ未満の推定ΔＧ°値で標的核酸にハイブリダイズする。例えば、ハイブリダイゼーションの程度または強度は、標準状態Ｇｉｂｂｓ自由エネルギーΔＧ°によって測定することができる。オリゴヌクレオチドは、８～３０ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドに対して－１０ｋｃａｌの範囲未満、例えば－１５ｋｃａｌ未満、例えば－２０ｋｃａｌ未満、および例えば－２５ｋｃａｌ未満の推定ΔＧ°値で標的核酸にハイブリダイズし得る。オリゴヌクレオチドは、例えば、－１０～－６０ｋｃａｌ、例えば－１２～－４０、例えば－１５～－３０ｋｃａｌ、または－１６～－２７ｋｃａｌ、例えば－１８～－２５ｋｃａｌの推定ΔＧ°値で、標的核酸にハイブリダイズし得る。
本明細書で使用される場合、「ハイブリダイズ」または「ハイブリダイズする」という用語は、２つの核酸鎖（例えば、オリゴヌクレオチドおよび標的核酸）が対向する鎖上の塩基対間に水素結合を形成することにより二重鎖を形成することと理解されるべきである。２つの核酸鎖の間の結合の親和性が、ハイブリダイゼーションの強度である。これは、オリゴヌクレオチドの半分が標的核酸と二重鎖を形成する温度として規定される、融解温度（Ｔｍ）によって説明されることが多い。生理学的条件では、Ｔｍは親和性に厳密に比例しない（Ｍｅｒｇｎｙ ａｎｄ Ｌａｃｒｏｉｘ，２００３，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ １３：５１５－５３７）。標準状態でのギブスの自由エネルギーΔＧ°は、結合親和性をより正確に表しており、ΔＧ°＝－ＲＴｌｎ（Ｋｄ）（式中、Ｒは気体定数であり、Ｔは絶対温度である）によって反応の解離定数（Ｋｄ）と関連付けられている。したがって、オリゴヌクレオチドと標的核酸との間の反応の非常に低いΔＧ°は、オリゴヌクレオチドと標的核酸との間の強いハイブリダイゼーションを反映している。ΔＧ°は、水溶液濃度が１Ｍ、ｐＨが７、温度が３７℃である反応に関連したエネルギーである。標的核酸に対するオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションは、自発的反応であり、自発的反応の場合のΔＧ°は、ゼロ未満である。ΔＧ°は、例えば、Ｈａｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９６５，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍ．３６－３８ ａｎｄ Ｈｏｌｄｇａｔｅ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ Ｔｏｄａｙに記載される等温滴定熱量測定（ＩＴＣ）により、実験的に測定することができる。当業者は、ΔＧ°測定のために市販の装置が入手可能であることを知るであろう。ΔＧ°はまた、Ｓｕｇｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３４：１１２１１－１１２１６およびＭｃＴｉｇｕｅ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４３：５３８８－５４０５によって記載された適切に導出された熱力学パラメータを使用して、ＳａｎｔａＬｕｃｉａ，１９９８，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．９５：１４６０－１４６５によって記載された最近傍モデルを使用することによって数値的に推定することができる。その意図した核酸標的をハイブリダイゼーションによって調節する可能性を確保するために、本発明のオリゴヌクレオチドは、１０～３０ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドに対して－１０ｋｃａｌ未満の推定ΔＧ°値で標的核酸にハイブリダイズする。例えば、ハイブリダイゼーションの程度または強度は、標準状態Ｇｉｂｂｓ自由エネルギーΔＧ°によって測定することができる。オリゴヌクレオチドは、８～３０ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドに対して－１０ｋｃａｌの範囲未満、例えば－１５ｋｃａｌ未満、例えば－２０ｋｃａｌ未満、および例えば－２５ｋｃａｌ未満の推定ΔＧ°値で標的核酸にハイブリダイズし得る。オリゴヌクレオチドは、例えば、－１０～－６０ｋｃａｌ、例えば－１２～－４０、例えば－１５～－３０ｋｃａｌ、または－１６～－２７ｋｃａｌ、例えば－１８～－２５ｋｃａｌの推定ΔＧ°値で、標的核酸にハイブリダイズし得る。
【0055】
標的核酸
標的核酸は、アンチセンスオリゴヌクレオチドがハイブリダイズし、それによって標的遺伝子の発現を調節することができる核酸である。標的核酸は、例えば、遺伝子、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、プレ－ｍＲＮＡ、長い非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）、成熟ｍＲＮＡ若しくはｃＤＮＡ配列、またはＤＮＡ若しくはＲＮＡに由来する合成核酸であり得る。ＲＮＡである標的核酸は、「ＲＮＡ標的配列」、「標的ＲＮＡ配列」等と称され得る。
標的核酸は、アンチセンスオリゴヌクレオチドがハイブリダイズし、それによって標的遺伝子の発現を調節することができる核酸である。標的核酸は、例えば、遺伝子、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、プレ－ｍＲＮＡ、長い非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）、成熟ｍＲＮＡ若しくはｃＤＮＡ配列、またはＤＮＡ若しくはＲＮＡに由来する合成核酸であり得る。ＲＮＡである標的核酸は、「ＲＮＡ標的配列」、「標的ＲＮＡ配列」等と称され得る。
【0056】
標的配列
本明細書で使用される場合、「標的配列」という用語は、本明細書に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドに相補的な核酸塩基配列を含む、標的核酸中に存在するヌクレオチドの配列を指す。標的配列は、例えば、標的核酸上の、本発明のオリゴヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列に相補的な領域からなり得る。
本明細書で使用される場合、「標的配列」という用語は、本明細書に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドに相補的な核酸塩基配列を含む、標的核酸中に存在するヌクレオチドの配列を指す。標的配列は、例えば、標的核酸上の、本発明のオリゴヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列に相補的な領域からなり得る。
【0057】
標的細胞
本明細書で使用される場合、「標的細胞」という用語は、標的核酸を発現している細胞を指す。適切には、標的細胞は、そのゲノム中に標的遺伝子の少なくとも１つのコピーを含む。標的細胞は、インビボまたはインビトロであり得る。標的細胞は、例えば、哺乳動物細胞、例えばげっ歯類細胞、例えばマウス細胞若しくはラット細胞、または霊長類細胞、例えばサル細胞（例えばカニクイザル細胞）若しくはヒト細胞であり得る。
本明細書で使用される場合、「標的細胞」という用語は、標的核酸を発現している細胞を指す。適切には、標的細胞は、そのゲノム中に標的遺伝子の少なくとも１つのコピーを含む。標的細胞は、インビボまたはインビトロであり得る。標的細胞は、例えば、哺乳動物細胞、例えばげっ歯類細胞、例えばマウス細胞若しくはラット細胞、または霊長類細胞、例えばサル細胞（例えばカニクイザル細胞）若しくはヒト細胞であり得る。
【0058】
発現の調節
本明細書で使用される場合、「発現の調節」という用語は、標的遺伝子から発現されるタンパク質または転写されるＲＮＡの量を変化させるオリゴヌクレオチドの能力の全体的な用語として理解されるべきである。発現の調節は、対照実験を参照することによって決定され得る。対照は、生理食塩水組成物で処置した個体若しくは標的細胞、または非標的オリゴヌクレオチド（モック）で処置した個体若しくは標的細胞であり得る。
本明細書で使用される場合、「発現の調節」という用語は、標的遺伝子から発現されるタンパク質または転写されるＲＮＡの量を変化させるオリゴヌクレオチドの能力の全体的な用語として理解されるべきである。発現の調節は、対照実験を参照することによって決定され得る。対照は、生理食塩水組成物で処置した個体若しくは標的細胞、または非標的オリゴヌクレオチド（モック）で処置した個体若しくは標的細胞であり得る。
【0059】
高親和性修飾ヌクレオシド
高親和性修飾ヌクレオシドは、修飾されたヌクレオチドであり、これは、オリゴヌクレオチドに組み込まれる場合、例えば融解温度（Ｔｍ）によって測定されるように、その相補的標的に対するオリゴヌクレオチドの親和性を高める。高親和性修飾ヌクレオシドは、好ましくは、修飾ヌクレオシドあたり＋０．５～＋１２℃、より好ましくは＋１．５～＋１０℃、最も好ましくは＋３～＋８℃の融解温度の上昇をもたらす。多くの高親和性修飾ヌクレオシドが当技術分野で公知であり、例えば、多くの２’糖置換ヌクレオシド、例えば２’－Ｏ－ＭＯＥ、２’－Ｆ－ＲＮＡおよびＬＮＡ並びにそれらの類似体（例えば、Ｆｒｅｉｅｒ＆Ａｌｔｍａｎｎ；Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．，１９９７，２５，４４２９－４４４３ ａｎｄ Ｕｈｌｍａｎｎ；Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，２０００，３（２），２９３－２１３を参照）が挙げられる。
高親和性修飾ヌクレオシドは、修飾されたヌクレオチドであり、これは、オリゴヌクレオチドに組み込まれる場合、例えば融解温度（Ｔｍ）によって測定されるように、その相補的標的に対するオリゴヌクレオチドの親和性を高める。高親和性修飾ヌクレオシドは、好ましくは、修飾ヌクレオシドあたり＋０．５～＋１２℃、より好ましくは＋１．５～＋１０℃、最も好ましくは＋３～＋８℃の融解温度の上昇をもたらす。多くの高親和性修飾ヌクレオシドが当技術分野で公知であり、例えば、多くの２’糖置換ヌクレオシド、例えば２’－Ｏ－ＭＯＥ、２’－Ｆ－ＲＮＡおよびＬＮＡ並びにそれらの類似体（例えば、Ｆｒｅｉｅｒ＆Ａｌｔｍａｎｎ；Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．，１９９７，２５，４４２９－４４４３ ａｎｄ Ｕｈｌｍａｎｎ；Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，２０００，３（２），２９３－２１３を参照）が挙げられる。
【0060】
ＲＮａｓｅ Ｈの活性および動員
アンチセンスオリゴヌクレオチドのリボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）Ｈ活性とは、相補的ＲＮＡ分子との二重鎖にあるときにＲＮａｓｅ Ｈを動員するその能力を指す。国際公開公報第０１／２３６１３号は、ＲＮａｓｅＨ活性を決定するためのインビトロ法を提供し、これはＲＮａｓｅＨをリクルートする能力を決定するために使用され得る。組換えヒトＲＮａｓｅ Ｈ１は、Ｌｕｂｉｏ Ｓｃｉｅｎｃｅ ＧｍｂＨ（スイス国ルツェルン）から入手可能である。典型的には、オリゴヌクレオチドは、相補的な標的核酸配列が提供される場合、ｐｍｏｌ／ｌ／分で測定される標的ＲＮＡ分子の初期切断速度が、試験されるアンチセンスオリゴヌクレオチドと同じ塩基配列を有するが、オリゴヌクレオチド中の全てのモノマー間にホスホロチオエート結合を有するＤＮＡモノマーのみを含有するオリゴヌクレオチドを使用し、国際公開公報第０１／２３６１３号の実施例９１～９５（参照により本明細書に組み込まれる）によって提供される方法論を使用した場合に決定される初期切断速度の少なくとも５％、例えば少なくとも１０％または２０％超であれば、ＲＮａｓｅ Ｈを動員することができると見なされる。
アンチセンスオリゴヌクレオチドのリボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）Ｈ活性とは、相補的ＲＮＡ分子との二重鎖にあるときにＲＮａｓｅ Ｈを動員するその能力を指す。国際公開公報第０１／２３６１３号は、ＲＮａｓｅＨ活性を決定するためのインビトロ法を提供し、これはＲＮａｓｅＨをリクルートする能力を決定するために使用され得る。組換えヒトＲＮａｓｅ Ｈ１は、Ｌｕｂｉｏ Ｓｃｉｅｎｃｅ ＧｍｂＨ（スイス国ルツェルン）から入手可能である。典型的には、オリゴヌクレオチドは、相補的な標的核酸配列が提供される場合、ｐｍｏｌ／ｌ／分で測定される標的ＲＮＡ分子の初期切断速度が、試験されるアンチセンスオリゴヌクレオチドと同じ塩基配列を有するが、オリゴヌクレオチド中の全てのモノマー間にホスホロチオエート結合を有するＤＮＡモノマーのみを含有するオリゴヌクレオチドを使用し、国際公開公報第０１／２３６１３号の実施例９１～９５（参照により本明細書に組み込まれる）によって提供される方法論を使用した場合に決定される初期切断速度の少なくとも５％、例えば少なくとも１０％または２０％超であれば、ＲＮａｓｅ Ｈを動員することができると見なされる。
【0061】
ギャップマー
アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその連続ヌクレオチド配列は、ギャップマーであり得るか、ギャップマーを含み得る。ギャップマーは、通常、ＲＮａｓｅ Ｈ媒介分解を介した標的核酸の阻害に使用される。ギャップマーは、本明細書では５’－Ｆ－Ｇ－Ｆ’－３’（式Ｉ）として表され、「５→３」の向きの少なくとも３つの異なる構造領域、すなわち５’－フランク、ギャップ、および３’－フランクを含む。「ギャップ」領域（Ｇ）は、オリゴヌクレオチドがＲＮａｓｅ Ｈを動員することを可能にする一続きの連続するＤＮＡヌクレオチドを含む。ギャップ領域は、１つ以上の糖修飾ヌクレオシドを含む５’フランキング領域（Ｆ）と、１つ以上の糖修飾ヌクレオシドを含む３’フランキング領域（Ｆ’）とに隣接している。領域ＦおよびＦ’における１つ以上の糖修飾ヌクレオシドは、標的核酸に対するオリゴヌクレオチドの親和性を高めてもよく（すなわち、高親和性修飾ヌクレオシド等の親和性増強糖修飾ヌクレオシド）、または所望に応じて他の特性を調節してもよい。
アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその連続ヌクレオチド配列は、ギャップマーであり得るか、ギャップマーを含み得る。ギャップマーは、通常、ＲＮａｓｅ Ｈ媒介分解を介した標的核酸の阻害に使用される。ギャップマーは、本明細書では５’－Ｆ－Ｇ－Ｆ’－３’（式Ｉ）として表され、「５→３」の向きの少なくとも３つの異なる構造領域、すなわち５’－フランク、ギャップ、および３’－フランクを含む。「ギャップ」領域（Ｇ）は、オリゴヌクレオチドがＲＮａｓｅ Ｈを動員することを可能にする一続きの連続するＤＮＡヌクレオチドを含む。ギャップ領域は、１つ以上の糖修飾ヌクレオシドを含む５’フランキング領域（Ｆ）と、１つ以上の糖修飾ヌクレオシドを含む３’フランキング領域（Ｆ’）とに隣接している。領域ＦおよびＦ’における１つ以上の糖修飾ヌクレオシドは、標的核酸に対するオリゴヌクレオチドの親和性を高めてもよく（すなわち、高親和性修飾ヌクレオシド等の親和性増強糖修飾ヌクレオシド）、または所望に応じて他の特性を調節してもよい。
【0062】
ギャップマー設計において、ギャップ領域の５’最末端および３’最末端のヌクレオシドは、典型的にはＤＮＡヌクレオシドであり、それぞれ、５’（Ｆ）または３’（Ｆ’）領域の糖修飾ヌクレオシドに隣接して配置されている。フランクは更に、ギャップ領域から最も遠い端、すなわち５’フランクの５’末端および３’フランクの３’末端に少なくとも１つの糖修飾ヌクレオシドを有することによって定義されてもよい。
【0063】
領域Ｆ－Ｇ－Ｆ’は、連続ヌクレオチド配列を形成する。アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその連続ヌクレオチド配列は、式Ｉのギャップマー、すなわちＦ－Ｇ－Ｆ’を含み得るか、またはそれからなり得る。
【0064】
ギャップマー設計Ｆ－Ｇ－Ｆ’の全長は、典型的には、１２～３２個のヌクレオシド、例えば１２～２８個、例えば１２～２６個、例えば１４～２６個、例えば１４～２４個、例えば１４～２２個、例えば１６～２２個、例えば１６～２０個のヌクレオシドである。
【0065】
ＴＮＡヌクレオシドを含まない従来のギャップマー設計には、例えばＦ１～８－Ｇ５～１８－Ｆ’１～８（ＩＩ）、例えばＦ１～８－Ｇ７～１６－Ｆ’２～８（ＩＩＩ）が含まれるが、典型的にはギャップマー領域Ｆ－Ｇ－Ｆ’の全長は少なくとも１２、例えば少なくとも１４個のヌクレオチド長であることを条件とする。
【0066】
本発明によるＴＮＡギャップマーに適した設計には、例えば、Ｆ１～１５－Ｇ３～１８－Ｆ’１～１５（ＩＶ）が含まれるが、ただし、ギャップマー領域Ｆ－Ｇ－Ｆ’の全長は、少なくとも１２、例えば少なくとも１４ヌクレオチド長であることを条件とする。そのようなギャップマーの追加の設計（例えば、式ＩＶ～式ＶＩＩ）は、本明細書の他の箇所に更に詳細に記載されている。
【0067】
領域Ｆ、Ｇ、およびＦ’は、以下に更に記載され、Ｆ－Ｇ－Ｆ’式のいずれかに組み込まれ得る。
【0068】
ギャップマー－領域Ｇ
ギャップマーの領域Ｇ（ギャップ領域）は、オリゴヌクレオチドがＲＮａｓｅＨ、例えばヒトＲＮａｓｅＨ１を動員することを可能にするヌクレオシド、典型的にはＤＮＡヌクレオシドの領域である。ＲＮａｓｅＨは、ＤＮＡとＲＮＡとの間の二重鎖を認識し、ＲＮＡ分子を酵素的に切断する細胞性酵素である。
ギャップマーの領域Ｇ（ギャップ領域）は、オリゴヌクレオチドがＲＮａｓｅＨ、例えばヒトＲＮａｓｅＨ１を動員することを可能にするヌクレオシド、典型的にはＤＮＡヌクレオシドの領域である。ＲＮａｓｅＨは、ＤＮＡとＲＮＡとの間の二重鎖を認識し、ＲＮＡ分子を酵素的に切断する細胞性酵素である。
【0069】
ＴＮＡヌクレオシドを含まない従来のギャップマーは、例えば、少なくとも５または６連続ＤＮＡヌクレオシド、例えば５～１６連続ＤＮＡヌクレオシド、例えば６～１５連続ＤＮＡヌクレオシド、例えば７～１４連続ＤＮＡヌクレオシド、例えば８～１２連続ＤＮＡヌクレオチド、例えば８～１２連続ＤＮＡヌクレオチド長のギャップ領域（Ｇ）を含む。
【0070】
本発明による適切なギャップマー、特に本明細書に記載の１つ以上のＴＮＡヌクレオシドを含むギャップマーは、少なくとも３個の連続ＤＮＡヌクレオシドを含むギャップ領域（Ｇ）を有し得る。ギャップ領域Ｇは、例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、または１８個の連続ＤＮＡヌクレオシドを含むかまたはそれからなり得る。好ましくは、ギャップ領域Ｇは、少なくとも４、少なくとも５、または少なくとも６個の連続ＤＮＡヌクレオシドを含む。
【0071】
本明細書に記載の１つ以上のＴＮＡヌクレオシドを含むギャップ領域（Ｇ）は、ギャップの５’末端に（領域Ｆの３’ヌクレオシドに隣接して）ＤＮＡヌクレオシドを有し、ギャップの３’末端に（領域Ｆ’の５’ヌクレオシドに隣接して）ＤＮＡヌクレオシドを有し、典型的には、ギャップ領域の５’末端、３’末端、またはその両方のいずれかに少なくとも３または４個の連続ＤＮＡヌクレオシドの領域を保持する。
【0072】
ギャップ領域Ｇの全長は、典型的には、１８個までの連続ヌクレオシドである。例えば、ギャップ領域Ｇの全長は、３～１８個の連続ヌクレオシド、例えば３～１６個の連続ヌクレオシド、例えば４～１８個、４～１６個、４～１４個、４～１２個、または４～１０個の連続ヌクレオシド、例えば５～１８個、５～１６個、５～１４個、５～１２個、または５～１０個の連続ヌクレオシド、例えば６～１８個、６～１６個、６～１４個、６～１２個、または６～１０個の連続ヌクレオシドであり得る。より短いギャップ領域、例えば４、５、６、７、８、または９個の連続ヌクレオシド、例えば連続ＤＮＡヌクレオシドを含むまたはそれらからなる領域Ｇも企図される。
【0073】
ギャップ領域中の１つ以上のシトシン（Ｃ）ＤＮＡヌクレオシドは、場合によってはメチル化されていてもよい（例えば、Ｃ ＤＮＡヌクレオシドの後にグアニン（Ｇ）ＤＮＡヌクレオシドが続き、５－メチル－シトシン（ｍｅＣまたはｍＣ）としてアノテーションが付けられる場合）。
【0074】
企図されるオリゴヌクレオチドには、ギャップ中の全ての修飾ヌクレオシド間結合がホスホロチオエート結合であるオリゴヌクレオチド、またはギャップ中の全てのヌクレオシド間結合がホスホロチオエート結合であるオリゴヌクレオチドが含まれる。
【0075】
従来のギャップマーはＤＮＡギャップ領域を有するが、ギャップ領域内で用いられる場合にＲＮａｓｅ Ｈの動員を可能にする修飾ヌクレオシドの例が数多く存在する。ギャップ領域内に含まれる場合にＲＮａｓｅ Ｈを補充することができると報告されている修飾ヌクレオシドには、例えば、アルファ－Ｌ－ＬＮＡ、Ｃ４’アルキル化ＤＮＡ（ＰＣＴ／ＥＰ２００９／０５０３４９および Ｖｅｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．１８（２００８）２２９６－２３００（いずれも参照により本明細書に組み込まれる）に記載される）、ＡＮＡおよび２’Ｆ－ＡＮＡのようなアラビノース由来ヌクレオシド（Ｍａｎｇｏｓ ｅｔ ａｌ．２００３ Ｊ．ＡＭ．ＣＨＥＭ．ＳＯＣ．１２５，６５４－６６１）、ＵＮＡ（アンロックド核酸）（Ｆｌｕｉｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｓｙｓｔ．，２００９，１０，１０３９（参照により本明細書に組み込まれる）に記載される）が含まれる。ＵＮＡまたは「アンロックド核酸」は、典型的には、リボースのＣ２とＣ３との間の結合が除去され、アンロックド「糖」残基を形成している場合である。ギャップマーに使用される修飾ヌクレオシドは、ギャップ領域に導入されると２’－エンド（ＤＮＡ様）構造をとるヌクレオシドであり得、ＲＮアーゼＨ動員を可能にする。本明細書に記載のＤＮＡ Ｇａｐ領域（Ｇ）は、例えば、任意に、１つ以上（例えば、１～３個）の糖修飾ヌクレオシドを含んでいてもよい。ギャップ中の任意の２つ以上の糖修飾ヌクレオシドは、連続していてもよく、または１つ以上のＤＮＡヌクレオシドによって分離されていてもよい。
【0076】
本明細書に記載されるように、ギャップ領域で使用され得る修飾ヌクレオシドには、ＴＮＡヌクレオシドが含まれる。
【0077】
領域Ｇ－「ギャップブレーカー」
いくつかのＲＮａｓｅ Ｈ活性を保持しながら、ギャップマーのギャップ領域に３’エンド配座を付与する修飾ヌクレオシドの挿入に関する多数の報告もある。１つ以上の３’エンド修飾ヌクレオシドを含むギャップ領域を有するギャップマーは、「ギャップブレーカー」または「ギャップ破壊」ギャップマーと称され、例えば、ＷＯ２０１３／０２２９８４を参照されたい。ギャップブレーカーオリゴヌクレオチドは、ＲＮａｓｅＨ動員を可能にするために、ギャップ領域内にＤＮＡヌクレオシドの十分な領域を保持する。ＲＮａｓｅＨを動員するためのギャップブレーカーオリゴヌクレオチド設計の能力は、典型的には、配列特異的、または化合物特異的でさえあり（Ｒｕｋｏｖ ｅｔ ａｌ．２０１５ Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．Ｖｏｌ．４３ ｐｐ．８４７６－８４８７を参照）、当該文献は、いくつかの場合、標的ＲＮＡのより特異的な切断を提供するＲＮａｓｅＨを動員する「ギャップブレーカー」オリゴヌクレオチドを開示している。ギャップブレーカーオリゴヌクレオチドのギャップ領域内で使用される修飾ヌクレオシドは、例えば、３’エンドコンフォメーションを付与する修飾ヌクレオシド、例えば２’－Ｏ－メチル（ＯＭｅ）若しくは２’－Ｏ－ＭＯＥ（ＭＯＥ）ヌクレオシド、またはベータ－Ｄ ＬＮＡヌクレオシド（ヌクレオシドのリボース糖環のＣ２’とＣ４’との間の架橋が、ベータ立体配座である）、例えばベータ－Ｄ－オキシＬＮＡ若しくはＳｃＥＴヌクレオシドであってもよい。
いくつかのＲＮａｓｅ Ｈ活性を保持しながら、ギャップマーのギャップ領域に３’エンド配座を付与する修飾ヌクレオシドの挿入に関する多数の報告もある。１つ以上の３’エンド修飾ヌクレオシドを含むギャップ領域を有するギャップマーは、「ギャップブレーカー」または「ギャップ破壊」ギャップマーと称され、例えば、ＷＯ２０１３／０２２９８４を参照されたい。ギャップブレーカーオリゴヌクレオチドは、ＲＮａｓｅＨ動員を可能にするために、ギャップ領域内にＤＮＡヌクレオシドの十分な領域を保持する。ＲＮａｓｅＨを動員するためのギャップブレーカーオリゴヌクレオチド設計の能力は、典型的には、配列特異的、または化合物特異的でさえあり（Ｒｕｋｏｖ ｅｔ ａｌ．２０１５ Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．Ｖｏｌ．４３ ｐｐ．８４７６－８４８７を参照）、当該文献は、いくつかの場合、標的ＲＮＡのより特異的な切断を提供するＲＮａｓｅＨを動員する「ギャップブレーカー」オリゴヌクレオチドを開示している。ギャップブレーカーオリゴヌクレオチドのギャップ領域内で使用される修飾ヌクレオシドは、例えば、３’エンドコンフォメーションを付与する修飾ヌクレオシド、例えば２’－Ｏ－メチル（ＯＭｅ）若しくは２’－Ｏ－ＭＯＥ（ＭＯＥ）ヌクレオシド、またはベータ－Ｄ ＬＮＡヌクレオシド（ヌクレオシドのリボース糖環のＣ２’とＣ４’との間の架橋が、ベータ立体配座である）、例えばベータ－Ｄ－オキシＬＮＡ若しくはＳｃＥＴヌクレオシドであってもよい。
【0078】
ＴＮＡヌクレオシドは、ギャップブレーカーとしても企図され得る。
【0079】
上述した領域Ｇを含むギャップマーと同様に、ギャップブレーカーまたはギャップ破壊ギャップマーのギャップ領域は、ギャップの５’末端に（領域Ｆの３’ヌクレオシドに隣接して）ＤＮＡヌクレオシドを有し、ギャップの３’末端に（領域Ｆ’の５’ヌクレオシドに隣接して）ＤＮＡヌクレオシドを有する。破壊されたギャップを含むギャップマーは、典型的には、ギャップ領域の５’末端、３’末端、またはその両方のいずれかに少なくとも３または４個の連続ＤＮＡヌクレオシドの領域を保持する。
【0080】
本明細書に記載のギャップブレーカギャップマーの例示的な設計は、
Ｆ１～１５－［Ｄ３～４－Ｅ１－Ｄ３～４］－Ｆ’１～１５
Ｆ１～１５－［Ｄ１～４－Ｅ１－Ｄ３～４］－Ｆ’１～１５
Ｆ１－１５－［Ｄ３－４－Ｅ１－Ｄ１－４］－Ｆ’１－１５
を含み、領域Ｇは角括弧［Ｄｎ－Ｅｒ－Ｄｍ］内であり、ＤはＤＮＡヌクレオシドの連続する配列であり、Ｅは修飾ヌクレオシド（ギャップブレーカーまたはギャップ破壊ヌクレオシド）であり、ＦおよびＦ’は本明細書に定義したフランキング領域であるが、ただし、ギャップマー領域Ｆ－Ｇ－Ｆ’の全長は、少なくとも１２、例えば１４ヌクレオチド長であることを条件とする。
Ｆ１～１５－［Ｄ３～４－Ｅ１－Ｄ３～４］－Ｆ’１～１５
Ｆ１～１５－［Ｄ１～４－Ｅ１－Ｄ３～４］－Ｆ’１～１５
Ｆ１－１５－［Ｄ３－４－Ｅ１－Ｄ１－４］－Ｆ’１－１５
を含み、領域Ｇは角括弧［Ｄｎ－Ｅｒ－Ｄｍ］内であり、ＤはＤＮＡヌクレオシドの連続する配列であり、Ｅは修飾ヌクレオシド（ギャップブレーカーまたはギャップ破壊ヌクレオシド）であり、ＦおよびＦ’は本明細書に定義したフランキング領域であるが、ただし、ギャップマー領域Ｆ－Ｇ－Ｆ’の全長は、少なくとも１２、例えば１４ヌクレオチド長であることを条件とする。
【0081】
本明細書に記載のギャップ破壊ギャップマーの領域Ｇは、少なくとも４つのＤＮＡヌクレオシド、例えば４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または１６個のＤＮＡヌクレオシドを含み得る。上記のように、ＤＮＡヌクレオシドは連続であってもよく、任意に、１つ以上の修飾ヌクレオシドが散在してもよいが、ただし、ギャップ領域Ｇが、ＲＮａｓｅＨ動員を媒介できることを条件とする。
【0082】
ギャップマー－フランキング領域、ＦおよびＦ’
領域Ｆ’は、領域Ｇの５’ＤＮＡヌクレオシドのすぐ隣に配置されている。領域Ｆの３’最末端のヌクレオシドは、糖修飾ヌクレオシドである。有利には、領域Ｆの５’最末端の１または２個のヌクレオシドも糖修飾ヌクレオシドである。本明細書に記載のギャップマー、特に１つ以上のＴＮＡヌクレオシドを含むギャップマーにおいて、領域Ｆは、少なくとも１、例えば少なくとも２、例えば少なくとも３個の連続ヌクレオチド長である。典型的には、領域Ｆは、１５個までの連続ヌクレオチド長である。例えば、領域Ｆは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５個の連続ヌクレオチド長、例えば３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２個の連続ヌクレオチド長であり得る。
領域Ｆ’は、領域Ｇの５’ＤＮＡヌクレオシドのすぐ隣に配置されている。領域Ｆの３’最末端のヌクレオシドは、糖修飾ヌクレオシドである。有利には、領域Ｆの５’最末端の１または２個のヌクレオシドも糖修飾ヌクレオシドである。本明細書に記載のギャップマー、特に１つ以上のＴＮＡヌクレオシドを含むギャップマーにおいて、領域Ｆは、少なくとも１、例えば少なくとも２、例えば少なくとも３個の連続ヌクレオチド長である。典型的には、領域Ｆは、１５個までの連続ヌクレオチド長である。例えば、領域Ｆは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５個の連続ヌクレオチド長、例えば３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２個の連続ヌクレオチド長であり得る。
【0083】
領域Ｆ’は、領域Ｇの３’ＤＮＡヌクレオシドのすぐ隣に配置されている。領域Ｆ’の５’最末端のヌクレオシドは、糖修飾ヌクレオシドである。有利には、領域Ｆ’の３’最末端の１または２個のヌクレオシドも糖修飾ヌクレオシドである。本明細書に記載のギャップマー、特に１つ以上のＴＮＡヌクレオシドを含むギャップマーにおいて、領域Ｆ’は、少なくとも１、例えば少なくとも２、例えば少なくとも３個の連続ヌクレオチド長である。典型的には、領域Ｆ’は、１５個までの連続ヌクレオチド長である。例えば、領域Ｆ’は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５個の連続ヌクレオチド長、例えば３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２個の連続ヌクレオチド長であり得る。
【0084】
アンチセンスオリゴヌクレオチドがＲＮアーゼＨを動員する能力および任意の他の所望の特性を保持することを条件として、本明細書に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドの領域Ｆおよび／またはＦ’において任意の糖修飾ヌクレオチドを使用することができる。Ｆ、Ｆ’、またはＦとＦ’の両方で使用するための糖修飾ヌクレオシドの例は、本明細書に記載されており、限定されないが、「トレオース核酸（ＴＮＡ）」、「２’糖修飾ヌクレオシド」および「ロックド核酸」と題するセクションでより詳細に記載されているものを含めて、「糖修飾ヌクレオシド」と題するセクションで開示されているものを含む。本明細書に記載のＴＮＡギャップマーは、例えば、１つ以上のＴＮＡヌクレオシド、ＬＮＡヌクレオシド、ＭＯＥヌクレオシド、またはそれらの混合物を含み得る。
【0085】
ＬＮＡギャップマー
ＬＮＡギャップマーは、領域ＦおよびＦ’の一方または両方がＬＮＡヌクレオシドを含むかまたはＬＮＡヌクレオシドからなるギャップマーである。ベータ－Ｄ－オキシギャップマーは、領域ＦおよびＦ’の一方または両方に、ベータ－Ｄ－オキシＬＮＡヌクレオシドを含むか、若しくはそれからなるギャップマーである。ＬＮＡギャップマーは、例えば、以下の式を有することができる。［ＬＮＡ］１－５－［領域Ｇ］－［ＬＮＡ］１－５（式中、領域Ｇは、「ギャップマー－領域Ｇ」と題されたセクションに記載されるとおりである。具体的なＬＮＡギャップマー設計の例は、３－１０－３（ＬＮＡ－ＤＮＡ－ＬＮＡ）である。
ＬＮＡギャップマーは、領域ＦおよびＦ’の一方または両方がＬＮＡヌクレオシドを含むかまたはＬＮＡヌクレオシドからなるギャップマーである。ベータ－Ｄ－オキシギャップマーは、領域ＦおよびＦ’の一方または両方に、ベータ－Ｄ－オキシＬＮＡヌクレオシドを含むか、若しくはそれからなるギャップマーである。ＬＮＡギャップマーは、例えば、以下の式を有することができる。［ＬＮＡ］１－５－［領域Ｇ］－［ＬＮＡ］１－５（式中、領域Ｇは、「ギャップマー－領域Ｇ」と題されたセクションに記載されるとおりである。具体的なＬＮＡギャップマー設計の例は、３－１０－３（ＬＮＡ－ＤＮＡ－ＬＮＡ）である。
【0086】
ＭＯＥギャップマー
ＭＯＥギャップマーは、領域ＦおよびＦ’の一方または両方がＭＯＥヌクレオシド、例えば２’－Ｏ－ＭＯＥヌクレオシドを含むかまたはそれからなるギャップマーである。ＭＯＥギャップマーは、例えば、式ＭＯＥ］１－８－［領域Ｇ］－［ＭＯＥ］１－８、例えば［ＭＯＥ］２－７－［領域Ｇ］５－１６－［ＭＯＥ］２－７、例えば［ＭＯＥ］３－６－［領域Ｇ］－［ＭＯＥ］３－６を有することができ、式中、領域Ｇは、「ギャップマー－領域Ｇ」と題するセクションに記載されているとおりである。５－１０－５設計（ＭＯＥ－ＤＮＡ－ＭＯＥ）を有するＭＯＥギャップマーは、当該技術分野で広く使用されている。
ＭＯＥギャップマーは、領域ＦおよびＦ’の一方または両方がＭＯＥヌクレオシド、例えば２’－Ｏ－ＭＯＥヌクレオシドを含むかまたはそれからなるギャップマーである。ＭＯＥギャップマーは、例えば、式ＭＯＥ］１－８－［領域Ｇ］－［ＭＯＥ］１－８、例えば［ＭＯＥ］２－７－［領域Ｇ］５－１６－［ＭＯＥ］２－７、例えば［ＭＯＥ］３－６－［領域Ｇ］－［ＭＯＥ］３－６を有することができ、式中、領域Ｇは、「ギャップマー－領域Ｇ」と題するセクションに記載されているとおりである。５－１０－５設計（ＭＯＥ－ＤＮＡ－ＭＯＥ）を有するＭＯＥギャップマーは、当該技術分野で広く使用されている。
【0087】
ＴＮＡギャップマー
「ＴＮＡギャップマー」または「ＴＮＡ修飾ギャップマー」は、領域Ｆ、Ｆ’、およびＧの１つ以上の連結ヌクレオシドが少なくとも１つのＴＮＡヌクレオシドを含むギャップマーである。
「ＴＮＡギャップマー」または「ＴＮＡ修飾ギャップマー」は、領域Ｆ、Ｆ’、およびＧの１つ以上の連結ヌクレオシドが少なくとも１つのＴＮＡヌクレオシドを含むギャップマーである。
【0088】
ＴＮＡギャップマーは、例えば、Ｆ、Ｆ’、またはＦとＦ’の両方のヌクレオシドがＴＮＡヌクレオシドからなる式を有することができる。ＴＮＡギャップマーの具体的な設計の例は、本明細書の他の箇所に記載されている。
【0089】
混合ウイングギャップマー
混合ウイングギャップマーは、領域Ｆおよび領域Ｆ’の一方または両方が２種類以上の糖修飾ヌクレオシドを含むギャップマーである。多くの糖修飾ヌクレオシドが当技術分野で公知であり、この目的のために企図される。フランク領域中の２つ以上の異なる糖修飾ヌクレオシドは、例えば、「トレオース核酸（ＴＮＡ）」、「２’糖修飾ヌクレオシド」および「ロックド核酸」と題するセクションに開示されているものを含むがこれらに限定される、「糖修飾ヌクレオシド」と題するセクションに開示されているものから選択することができる。
混合ウイングギャップマーは、領域Ｆおよび領域Ｆ’の一方または両方が２種類以上の糖修飾ヌクレオシドを含むギャップマーである。多くの糖修飾ヌクレオシドが当技術分野で公知であり、この目的のために企図される。フランク領域中の２つ以上の異なる糖修飾ヌクレオシドは、例えば、「トレオース核酸（ＴＮＡ）」、「２’糖修飾ヌクレオシド」および「ロックド核酸」と題するセクションに開示されているものを含むがこれらに限定される、「糖修飾ヌクレオシド」と題するセクションに開示されているものから選択することができる。
【0090】
企図される混合ウイングギャップマーとしては、例えば、領域Ｆおよび領域Ｆ’の少なくとも一方がＴＮＡヌクレオシドを含むものが挙げられる。次いで、他の糖修飾ヌクレオシド（複数可）は、例えば、２’－Ｏ－アルキル－ＲＮＡ単位、２’－Ｏ－メチル－ＲＮＡ、２’－アミノ－ＤＮＡ単位、２’－フルオロ－ＤＮＡ単位、２’－アルコキシ－ＲＮＡ、ＭＯＥ単位、アラビノ核酸（ＡＮＡ）単位および２’－フルオロ－ＡＮＡ単位、例えばＭＯＥヌクレオシドからなる群から独立して選択される２’置換ヌクレオシド等の２’置換ヌクレオシドから選択されてもよい。
【0091】
領域ＦおよびＦ’の少なくとも一方、または領域ＦとＦ’の両方が少なくとも１つのＴＮＡヌクレオシドを含む場合、領域ＦおよびＦ’の残りのヌクレオシドが、ＭＯＥおよびＬＮＡからなる群から独立して選択される、混合ウイングギャップマーも企図される。領域ＦおよびＦ’の少なくとも一方、または領域ＦとＦ’の両方が少なくとも２つのＬＮＡヌクレオシドを含む場合、領域ＦおよびＦ’の残りのヌクレオシドは、例えば、ＭＯＥおよびＬＮＡからなる群から独立して選択することができる。いくつかの混合ウイングギャップマーにおいて、領域ＦおよびＦ’の一方または両方が、１つ以上のＤＮＡヌクレオシドを更に含んでもよい。
【0092】
混合ウイングギャップマー設計は、国際公開公報第２００８／０４９０８５号および国際公開公報第２０１２／１０９３９５号（これらの両方は参照により本明細書に組み込まれる）に開示されている。
【0093】
交互フランクギャップマー
交互フランクを有するオリゴヌクレオチドはギャップマーオリゴヌクレオチドであり、フランクの少なくとも１つ（ＦまたはＦ’）は、糖修飾ヌクレオシド、例えば、「トレオース核酸」、「２’糖修飾ヌクレオシド」および「ロックド核酸」と題するセクションに記載されているものを含むがこれらに限定される、「糖修飾ヌクレオシド」と題するセクションに本明細書に記載されているものから選択される糖修飾ヌクレオシドに加えてＤＮＡを含む。例えば、ＤＮＡとは別に、交互フランクギャップマーは、ＴＮＡ、ＬＮＡおよび／またはＭＯＥヌクレオシド（複数可）を含み得る。
交互フランクを有するオリゴヌクレオチドはギャップマーオリゴヌクレオチドであり、フランクの少なくとも１つ（ＦまたはＦ’）は、糖修飾ヌクレオシド、例えば、「トレオース核酸」、「２’糖修飾ヌクレオシド」および「ロックド核酸」と題するセクションに記載されているものを含むがこれらに限定される、「糖修飾ヌクレオシド」と題するセクションに本明細書に記載されているものから選択される糖修飾ヌクレオシドに加えてＤＮＡを含む。例えば、ＤＮＡとは別に、交互フランクギャップマーは、ＴＮＡ、ＬＮＡおよび／またはＭＯＥヌクレオシド（複数可）を含み得る。
【0094】
例えば、領域Ｆ若しくはＦ’の少なくとも一方、または領域ＦとＦ’の両方は、糖修飾ヌクレオシドおよびＤＮＡヌクレオシドの両方を含み得る。フランキング領域Ｆ若しくはＦ’、またはＦとＦ’の両方は、典型的には少なくとも３つのヌクレオシドを含み、Ｆおよび／またはＦ’領域の５’および３’大部分のヌクレオシドは糖修飾ヌクレオシドである。
【0095】
領域Ｄ’またはＤ’’
本明細書に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的核酸に完全に相補的ではない更なる５’および／または３’ヌクレオシドを含み得る。更なる５’および／または３’ヌクレオシドは、本明細書では領域Ｄ’およびＤ’’と称され得る。
本明細書に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的核酸に完全に相補的ではない更なる５’および／または３’ヌクレオシドを含み得る。更なる５’および／または３’ヌクレオシドは、本明細書では領域Ｄ’およびＤ’’と称され得る。
【0096】
領域Ｄ’またはＤ’’の付加は、連続ヌクレオチド配列、例えばギャップマーをコンジュゲート部分または別の官能基に連結する目的のために使用され得る。連続ヌクレオチド配列をコンジュゲート部分と連結するために使用される場合、切断可能なリンカーとしての役割を果たすことができる。それはまた、または代替的に、エキソヌクレアーゼ保護を提供するために、または合成若しくは製造を容易にするために使用され得る。
【0097】
領域Ｄ’およびＤ’’は、それぞれ、領域Ｆの５’末端または領域Ｆ’の３’末端に結合されて、以下の式Ｄ’－Ｆ－Ｇ－Ｆ’、Ｆ－Ｇ－Ｆ’－Ｄ’’、またはＤ’－Ｆ－Ｇ－Ｆ’－Ｄ’’の設計を生成することができる。この場合、Ｆ－Ｇ－Ｆ’はオリゴヌクレオチドのギャップマー部分であり、領域Ｄ’またはＤ’’は、オリゴヌクレオチドの別個の部分を構成する。
【0098】
領域Ｄ’またはＤ’’は、独立して、１、２、３、４、または５の追加のヌクレオチドを含むか、またはそれからなり、これは、標的核酸に相補的であっても、相補的でなくてもよい。ＦまたはＦ’領域に隣接するヌクレオチドは、ＤＮＡ若しくはＲＮＡまたはこれらの塩基修飾バージョン等の、糖修飾ヌクレオチドではない。Ｄ’またはＤ’’領域は、ヌクレアーゼ感受性の生体切断可能なリンカーとしての役割を果たし得る。例えば、追加の５’および／または３’末端ヌクレオチドは、ＤＮＡまたはＲＮＡヌクレオチドであり得、ホスホジエステル結合によって連結され得る。
【0099】
領域Ｄ’またはＤ’’としての使用に好適なヌクレオチドベースの生体切断可能なリンカーは、国際公開公報第２０１４／０７６１９５号に開示されており、これには例としてホスホジエステルで連結されたＤＮＡジヌクレオチドが含まれる。ポリオリゴヌクレオチドコンストラクトにおける生体切断可能なリンカーの使用は国際公開公報第２０１５／１１３９２２号に開示されており、それらは複数のアンチセンスコンストラクト（例えば、ギャップマー領域）を単一のオリゴヌクレオチド内で連結するのに使用されている。
【0100】
コンジュゲート
本明細書で使用される場合、コンジュゲートという用語は、非ヌクレオチド部分（コンジュゲート部分または領域Ｃまたは第３の領域）に共有結合したオリゴヌクレオチドを指す。
本明細書で使用される場合、コンジュゲートという用語は、非ヌクレオチド部分（コンジュゲート部分または領域Ｃまたは第３の領域）に共有結合したオリゴヌクレオチドを指す。
【0101】
本明細書に記載されるアンチセンスオリゴヌクレオチドの１つ以上の非ヌクレオチド部分へのコンジュゲーションは、例えば、オリゴヌクレオチドの活性、細胞分布、細胞取り込みまたは安定性に影響を及ぼすことによって、オリゴヌクレオチドの薬理学を改善し得る。コンジュゲーションは、例えば、オリゴヌクレオチドの細胞分布、バイオアベイラビリティ、代謝、排泄、透過性および／または細胞取り込みを改善することによって、オリゴヌクレオチドの薬物動態学的特性を修飾または増強し得る。特に、コンジュゲートは、オリゴヌクレオチドを特定の器官、組織、または細胞型に標的化し、それによって、その器官、組織、または細胞型におけるオリゴヌクレオチドの有効性を高め得る。同時に、コンジュゲートは、非標的細胞型、組織または器官内のオリゴヌクレオチドの活性を低下させるのに役立ち得る（例えば、非標的細胞型、組織または器官におけるオフターゲット活性または活性）。
【0102】
非ヌクレオチド部分（コンジュゲート部分）は、例えば、炭水化物、細胞表面受容体リガンド、原薬、ホルモン、親油性物質、ポリマー、タンパク質、ペプチド、毒素（例えば、細菌毒素）、ビタミン、ウイルスタンパク質（例えば、キャプシド）またはそれらの組み合わせからなる群から選択することができる。
【0103】
リンカー
結合またはリンカーは、１つ以上共有結合を介して関心対象の１つの化学基またはセグメントを関心対象の別の化学基またはセグメントに連結する、２つの原子間の接続である。コンジュゲート部分は、直接または連結部分（例えば、リンカーまたはテザー）を介してオリゴヌクレオチドに連結させることができる。リンカーは、第３の領域、例えばコンジュゲート部分（領域Ｃ）を、第１の領域、例えばオリゴヌクレオチドまたは連続ヌクレオチド配列またはギャップマー領域Ｆ－Ｇ－Ｆ’（領域Ａ）に共有結合する役割を果たす。
結合またはリンカーは、１つ以上共有結合を介して関心対象の１つの化学基またはセグメントを関心対象の別の化学基またはセグメントに連結する、２つの原子間の接続である。コンジュゲート部分は、直接または連結部分（例えば、リンカーまたはテザー）を介してオリゴヌクレオチドに連結させることができる。リンカーは、第３の領域、例えばコンジュゲート部分（領域Ｃ）を、第１の領域、例えばオリゴヌクレオチドまたは連続ヌクレオチド配列またはギャップマー領域Ｆ－Ｇ－Ｆ’（領域Ａ）に共有結合する役割を果たす。
【0104】
コンジュゲートまたはオリゴヌクレオチドコンジュゲートは、任意に、標的核酸に対して相補的なオリゴヌクレオチドまたは連続ヌクレオチド配列（領域Ａまたは第１の領域）と、コンジュゲート部分（領域Ｃまたは第３の領域）との間に位置するリンカー領域（第２の領域または領域Ｂおよび／または領域Ｙ）を含み得る。
【0105】
領域Ｂは、哺乳動物の体内で通常遭遇するまたは遭遇するものに類似した条件下で切断可能である生理学的に不安定な結合を含むか、またはそれからなる生体切断可能なリンカーを指す。生理学的に不安定なリンカーが化学的変換（例えば、切断）を受ける条件には、ｐＨ、温度、酸化条件若しくは還元条件または酸化剤若しくは還元剤等の化学条件、並びに哺乳動物の細胞で見られるまたは遭遇するものに類似した塩濃度が含まれる。哺乳動物の細胞内条件には、タンパク質分解酵素または加水分解酵素またはヌクレアーゼ等の哺乳動物細胞に通常存在する酵素活性の存在も含まれる。生体切断可能なリンカーは、例えば、Ｓ１ヌクレアーゼ切断を受けやすいものであり得る。ＤＮＡホスホジエステルを含む生体切断可能なリンカーは、国際公開公報第２０１４／０７６１９５号（参照により本明細書に組み込まれる）に更に詳細に記載されている。本明細書の領域Ｄ’またはＤ’’も参照されたい。
【0106】
領域Ｙは、必ずしも生体切断可能ではないが、主にコンジュゲート部分（領域Ｃまたは第３の領域）をオリゴヌクレオチド（領域Ａまたは第１の領域）に共有結合によって接続させる役割を果たすリンカーを指す。領域Ｙリンカーは、エチレングリコール、アミノ酸単位またはアミノアルキル基等の反復単位の鎖構造またはオリゴマーを含み得る。オリゴヌクレオチドコンジュゲートは、以下の領域要素Ａ－Ｃ、Ａ－Ｂ－Ｃ、Ａ－Ｂ－Ｙ－Ｃ、Ａ－Ｙ－Ｂ－ＣまたはＡ－Ｙ－Ｃから構築することができる。リンカー（領域Ｙ）は、例えば、Ｃ６～Ｃ１２アミノアルキル基を含むＣ２～Ｃ３６アミノアルキル基等のアミノアルキルであり得る。好ましくは、リンカー（領域Ｙ）はＣ６アミノアルキル基である。
【0107】
処置
本明細書で使用される場合、「処置」という用語は、既存の疾患（例えば、本明細書では疾患または障害と呼ばれる）の処置、または疾患の予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）、すなわち予防（ｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）の両方を指す。したがって、本明細書で言及される処置は、予防的であり得ることが認識されよう。
本明細書で使用される場合、「処置」という用語は、既存の疾患（例えば、本明細書では疾患または障害と呼ばれる）の処置、または疾患の予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）、すなわち予防（ｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）の両方を指す。したがって、本明細書で言及される処置は、予防的であり得ることが認識されよう。
【0108】
ＴＮＡ修飾アンチセンスオリゴヌクレオチド
非天然であるにもかかわらず、トレオース核酸（ＴＮＡ）は、安定なワトソン－クリック二本鎖を形成することができ、相補的ＲＮＡ標的に対して強い親和性および特異性を示す。本明細書に示されるように、ＴＮＡ修飾ギャップマーは、アンチセンスオリゴヌクレオチド用途のための新しい設計戦略を提供する。カスパーゼ３／７活性化、インビトロ標的ノックダウンおよび熱融解アッセイを使用して、標的核酸に対する標的ノックダウン有効性および親和性を依然として維持しながら、ＴＮＡ修飾を使用して毒性を緩和することができることが実証された。例えば、ＬＮＡまたはＭＯＥギャップマー等の技術水準の設計のギャップマーでは、ＴＮＡユニットは、フランク領域内の１つ以上または全てのＬＮＡまたはＭＯＥユニットを置き換えることができる。ＴＮＡ単位はまた、技術水準の設計のギャップマーのギャップ領域内の１つ以上の、または３つ若しくは４つを除く全ての連続ＤＮＡ単位を置換することができ、例えば、５’または３’フランクの拡張およびギャップの縮小を効果的にもたらし得る。さらに、ＴＮＡは、ヌクレアーゼによってほとんど認識されない。したがって、アンチセンスオリゴヌクレオチド配列に設計される場合、ＴＮＡ単位は、代謝安定性の増加、作用持続時間の延長またはその両方をもたらし得る。したがって、ＴＮＡ修飾ギャップマーは、古典的なギャップマー設計と比較して増大した治療指数を有する長時間作用性治療薬をもたらすことができる。
非天然であるにもかかわらず、トレオース核酸（ＴＮＡ）は、安定なワトソン－クリック二本鎖を形成することができ、相補的ＲＮＡ標的に対して強い親和性および特異性を示す。本明細書に示されるように、ＴＮＡ修飾ギャップマーは、アンチセンスオリゴヌクレオチド用途のための新しい設計戦略を提供する。カスパーゼ３／７活性化、インビトロ標的ノックダウンおよび熱融解アッセイを使用して、標的核酸に対する標的ノックダウン有効性および親和性を依然として維持しながら、ＴＮＡ修飾を使用して毒性を緩和することができることが実証された。例えば、ＬＮＡまたはＭＯＥギャップマー等の技術水準の設計のギャップマーでは、ＴＮＡユニットは、フランク領域内の１つ以上または全てのＬＮＡまたはＭＯＥユニットを置き換えることができる。ＴＮＡ単位はまた、技術水準の設計のギャップマーのギャップ領域内の１つ以上の、または３つ若しくは４つを除く全ての連続ＤＮＡ単位を置換することができ、例えば、５’または３’フランクの拡張およびギャップの縮小を効果的にもたらし得る。さらに、ＴＮＡは、ヌクレアーゼによってほとんど認識されない。したがって、アンチセンスオリゴヌクレオチド配列に設計される場合、ＴＮＡ単位は、代謝安定性の増加、作用持続時間の延長またはその両方をもたらし得る。したがって、ＴＮＡ修飾ギャップマーは、古典的なギャップマー設計と比較して増大した治療指数を有する長時間作用性治療薬をもたらすことができる。
【0109】
したがって、本発明は、１つ以上のＴＮＡヌクレオシドを含むアンチセンスオリゴヌクレオチド、特に１つ以上のＴＮＡヌクレオシドを含むアンチセンスギャップマーオリゴヌクレオチドを提供する。アンチセンスギャップマーオリゴヌクレオチドは、特に、リボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）Ｈを動員することができる、式５’－Ｆ－Ｇ－Ｆ’－３’（Ｉ）の連続ヌクレオチド配列を含み得る。少なくとも１つのＴＮＡ残基を含む式５’－Ｆ－Ｇ－Ｆ’－３’（Ｉ）の連続ヌクレオチド配列は、本明細書では「ＴＮＡギャップマー」と呼ぶことができる。ＴＮＡギャップマーについて企図される設計には、
Ｇが、少なくとも３個の連続ＤＮＡヌクレオシドを含む１８個までの連結ヌクレオシドのギャップ領域であり、
ＦおよびＦ’の各々が、独立して、１～１５個の糖修飾ヌクレオシドを含むかまたはそれらからなる、１５個までの連結ヌクレオシドのフランキング領域であり、
Ｆ、Ｆ’、およびＧのうちの少なくとも１つが、ＴＮＡヌクレオシドである糖修飾ヌクレオシドを含む
ものが含まれる。
Ｇが、少なくとも３個の連続ＤＮＡヌクレオシドを含む１８個までの連結ヌクレオシドのギャップ領域であり、
ＦおよびＦ’の各々が、独立して、１～１５個の糖修飾ヌクレオシドを含むかまたはそれらからなる、１５個までの連結ヌクレオシドのフランキング領域であり、
Ｆ、Ｆ’、およびＧのうちの少なくとも１つが、ＴＮＡヌクレオシドである糖修飾ヌクレオシドを含む
ものが含まれる。
【0110】
以下のセクションは、本発明によるＴＮＡギャップマーに関する更なる詳細を提供するが、特に指示しない限り、または文脈と矛盾しない限り、それらは、ＴＮＡギャップマーを含むか、またはＴＮＡギャップマーからなるアンチセンスギャップマーオリゴヌクレオチドまたはそのコンジュゲートにも等しく適用されることを理解されたい。
【0111】
有利には、ＴＮＡギャップマーは、典型的には標的核酸にハイブリダイズすることによって、ｍＲＮＡおよび／またはタンパク質へのその発現を減少または阻害することによって標的遺伝子の発現を調節することができる。標的核酸がＲＮＡ、例えばプレ－ｍＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ウイルスＲＮＡ、マイクロＲＮＡまたはｌｎｃＲＮＡ標的核酸である場合、ＴＮＡギャップマーは標的ＲＮＡの発現を低減または阻害することができる。これは、ＴＮＡギャップマーと標的ＲＮＡとの間の相補性、および適切には、ＲＮａｓｅ Ｈ等の細胞ＲＮａｓｅの動員によって達成される。ＴＮＡギャップマーは、マイクロＲＮＡ阻害、プレｍＲＮＡのスプライス調節の減少、またはｌｎｃＲＮＡとクロマチンとの間の相互作用の遮断をもたらす立体的遮断機構等の非ＲＮアーゼＨ媒介機構によって標的ＲＮＡの発現を減少または阻害することが更に可能であり得る。
【0112】
好ましくは、ＴＮＡギャップマーは、標的の発現レベルを、標的の正常発現レベルと比較して少なくとも約２０％、より好ましくは、標的の正常発現レベルと比較して少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％低下させることができる。ＴＮＡギャップマーは、好ましくはまた、または代替的に、標的の正常発現レベルと比較して少なくとも約２０％、より好ましくは標的の正常発現レベルと比較して少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％、標的の発現を阻害することができる。
【0113】
発現レベルの低下または特定の標的の発現の阻害を評価するためのアッセイは、当業者に公知である。適切なアッセイには、ゲノム中に標的遺伝子の少なくとも１つのコピーを含み、標的、例えば標的ＲＮＡを発現する標的細胞を使用するインビトロアッセイが含まれる。例えば、標的細胞を約２５μＭのＴＮＡギャップマーと共にインキュベートするインビトロアッセイでは、ＴＮＡギャップマーは、ＲＮＡ標的の正常発現レベルと比較して、ＲＮＡ標的の発現レベルを少なくとも約５０％、例えば少なくとも約６０％低下させることができる。そのようなアッセイでは、ＴＮＡギャップマーはまた、または代替として、ＲＮＡ標的の正常発現と比較して、ＲＮＡ標的の発現を少なくとも約５０％、例えば少なくとも約６０％阻害することができる。約２５μＭの濃度で、ＴＮＡギャップマーはまた、標的の正常発現レベルと比較して、ＲＮＡ標的の発現レベルを少なくとも約７０％、例えば少なくとも約８０％、例えば少なくとも約９０％低下または阻害することができ得る。
【0114】
ＲＮＡ標的の正常発現レベルは、標的細胞をＴＮＡギャップマーなしで（例えば、ビヒクルのみの存在下で）または無関係の対照オリゴヌクレオチドと共にインキュベートする対照を使用して決定することができる。インビトロアッセイのための標的細胞は、（例えば、細胞株の形態の）商業的供給源から得ることができ、またはヒト若しくは実験動物の血液若しくは他の組織から単離することができる。標的細胞は、例えば、ＴＮＡギャップマーまたは対照と共に約１～５日間、例えば約２、３、または４日間、例えば約３日間インキュベートされ得る。次いで、ＲＮＡを抽出し、遺伝子発現分析によって試験試料および対照試料中の残存標的ＲＮＡのレベルを決定することができる。或いは、残りの標的ＲＮＡを決定する代わりに、標的ＲＮＡに由来するＲＮＡ種（例えば、ｍＲＮＡ）またはタンパク質のレベルを試験試料および対照試料において決定することができる。他の標的および標的細胞に適合させることができる、ＴＮＡギャップマーによる標的ＲＮＡの発現レベルの低下または発現の阻害を評価するための典型的なアッセイの例を実施例２に提供する。
【0115】
ＴＮＡギャップマーが標的の発現レベルを低下させるかまたは標的の発現を阻害する能力はまた、ＩＣ５０値、すなわち標的核酸の発現レベルが半分に低下するＴＮＡギャップマーの濃度を決定することによって評価することができる。ゲノム中に標的遺伝子の少なくとも１つのコピーを含み、標的、例えば標的ＲＮＡを発現する標的細胞を使用するインビトロアッセイでは、ＩＣ５０は、好ましくは約２０μＭ以下、例えば約１０μＭ以下、例えば約５μＭ以下である。典型的には、ＩＣ５０値は、標的細胞をＩＣ５０値に及ぶＴＮＡギャップマーの希釈系列と共にインキュベートすることを除いて、既に記載したものと同様の細胞アッセイで決定される。他の標的および標的細胞に適合させることができるＴＮＡギャップマーによる発現レベルのＩＣ５０低下または標的ＲＮＡの発現の阻害を評価するための典型的なアッセイの例を実施例３に提供する。
【0116】
ＴＮＡギャップマーの能力はまた、ＴＮＡギャップマーが由来し、いかなるＴＮＡヌクレオシドも含まない対照または「親」ギャップマーに関して評価することもできる。ＴＮＡギャップマーのＩＣ５０値は、好ましくは、対照または「親」ギャップマーのＩＣ５０値の約１０倍以下、約８倍以下、約６倍以下、約４倍以下、または約２倍以下である。
【0117】
本明細書に記載のＴＮＡギャップマーは、低い毒性を有することを特徴とすることもできる。例えば、ＴＮＡギャップマーは、そのヌクレオシドがいかなるＴＮＡヌクレオシドも含まないという点でＴＮＡギャップマーとは異なる技術水準の参照ギャップマーまたは「親」ギャップマー等の対応する対照ギャップマーよりも低い毒性を有し得る。ギャップマーまたはアンチセンスヌクレオチドの毒性を評価するための適切なアッセイは当技術分野で公知であり、例えば、カスパーゼ３／７アッセイ等のインビトロアッセイが挙げられる。カスパーゼ３／７アッセイは、化合物によって誘導されるアポトーシスのレベルを反映し、例えば、肝細胞または細胞株に対する試験に基づいて化合物の肝毒性のリスクを評価するのに適している。簡潔には、商業的供給源からのＨｅｐＧ２細胞を、適切なビヒクル中の１００ｎＭ ＴＮＡまたは対照ギャップマーでトランスフェクトし、トランスフェクションの約２４時間後にカスパーゼ３／７活性化を決定することができる。好ましくは、ＴＮＡギャップマーによるトランスフェクションからのカスパーゼ３／７活性化は、対応する対照ギャップマーの最大で約７０％、例えば最大で約６０％、例えば最大で約５０％、例えば最大で約４０％、例えば最大で約３０％、例えば最大で約２０％である。或いは、実施例４に記載されるカスパーゼ３／７アッセイを使用して、ＴＮＡギャップマーについて決定されるパーセンテージ（全細胞に対するアポトーシス細胞を反映するアッセイウィンドウ％）は、好ましくは最大で約２００％、より好ましくは最大で約１５０％、最大で約１００％、最大で約８０％、最大で約６０％、最大で約５０％、最大で約４０％、最大で約３０％、最大で約２０％または最大で約１０％である。好ましくは、実施例４に記載されるカスパーゼ３／７アッセイを使用して、ＴＮＡギャップマーについて決定されるパーセンテージ（アッセイウィンドウ％）は、最大で約６０％である。
【0118】
本明細書に記載のＴＮＡギャップマーは、標的核酸、例えば標的ＲＮＡ、特にその核酸塩基配列が相補的である標的配列にハイブリダイズすることができる。ＴＮＡギャップマーがその標的核酸にハイブリダイズする能力は、当技術分野で公知の任意のアッセイに従って評価することができる。有利には、熱融解（Ｔｍ）分析を使用して、ＴＮＡギャップマーとそのＲＮＡ標的配列との間の二重鎖がどの温度で変性するかを決定することができ、これは融解温度または単にＴｍと表すことができる。ＴＮＡギャップマー（すなわち、相補的ＲＮＡ標的配列との二重鎖の形態）のＴｍを決定するための典型的なアッセイを実施例５に記載する。簡潔には、ＴＮＡギャップマーおよびＲＮＡ標的配列を２０ｍＭリン酸二ナトリウム緩衝液、２００ｍＭ ＮａＣｌおよび０．２ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ７）に添加して、１．５μＭの最終濃度を得ることができる。試料を９５℃に５分間加熱し、次いで１時間かけて室温までゆっくり冷却し、温度勾配を用いて、例えば２５°Ｃから９５°Ｃまで５°Ｃ／分上昇させ、次いで２５°Ｃまで低下させて、２６０ｎｍで熱融解曲線を記録することができる。両方の曲線の導関数から、融解温度（Ｔｍ）を決定することができる。好ましくは、ＴＮＡギャップマーは、少なくとも約５０℃、例えば少なくとも約５２℃、例えば少なくとも約５４℃、例えば少なくとも約５６℃、例えば少なくとも約５８℃、例えば少なくとも約６０℃、例えば少なくとも約６５℃、例えば少なくとも約７０℃のＴｍを有する。
【0119】
いくつかの場合、オリゴヌクレオチドと標的核酸との間に１つまたは２つのミスマッチ等のミスマッチが存在し得る。ミスマッチにもかかわらず、標的核酸へのハイブリダイゼーションは、標的を調節する所望の能力を示すのに依然として十分であり得る。
【0120】
好ましくは、本発明によるＴＮＡギャップマーは、
（ａ）標的核酸の発現レベルを、標的の正常発現レベルと比較して、少なくとも約５０％、例えば少なくとも約６０％、例えば少なくとも約７０％、例えば少なくとも約８０％、例えば少なくとも約９０％低下させることができるか、
（ｂ）標的核酸の発現レベルを低下させるための約２０μＭ以下、例えば約１０μＭ以下、例えば約５μＭ以下のＩＣ５０を有するか、
（ｃ）実施例４に記載されるカスパーゼ３／７アッセイを使用する場合、アッセイウィンドウパーセンテージ（ＡＷ％）は、好ましくは最大で約６０％、例えば最大で約４０％、例えば最大で約２０％、例えば最大で約１０％であるか、
（ｄ）アンチセンスギャップマーオリゴヌクレオチドとＲＮＡ標的配列との二重鎖の形態で、少なくとも約５０℃、例えば少なくとも約５２℃、例えば少なくとも約５４℃、例えば少なくとも約５６℃、例えば少なくとも約５８℃、例えば少なくとも約６０℃の融解温度（Ｔｍ）を有するか、または
（ｅ）（ａ）～（ｄ）のうちのいずれか２つ以上の組み合わせである。
（ａ）標的核酸の発現レベルを、標的の正常発現レベルと比較して、少なくとも約５０％、例えば少なくとも約６０％、例えば少なくとも約７０％、例えば少なくとも約８０％、例えば少なくとも約９０％低下させることができるか、
（ｂ）標的核酸の発現レベルを低下させるための約２０μＭ以下、例えば約１０μＭ以下、例えば約５μＭ以下のＩＣ５０を有するか、
（ｃ）実施例４に記載されるカスパーゼ３／７アッセイを使用する場合、アッセイウィンドウパーセンテージ（ＡＷ％）は、好ましくは最大で約６０％、例えば最大で約４０％、例えば最大で約２０％、例えば最大で約１０％であるか、
（ｄ）アンチセンスギャップマーオリゴヌクレオチドとＲＮＡ標的配列との二重鎖の形態で、少なくとも約５０℃、例えば少なくとも約５２℃、例えば少なくとも約５４℃、例えば少なくとも約５６℃、例えば少なくとも約５８℃、例えば少なくとも約６０℃の融解温度（Ｔｍ）を有するか、または
（ｅ）（ａ）～（ｄ）のうちのいずれか２つ以上の組み合わせである。
【0121】
例えば、いくつかの実施形態では、好ましいＴＮＡギャップマーは、特徴（ａ）と（ｂ）の両方を特徴とし得るいくつかの実施形態では、好ましいＴＮＡギャップマーは、特徴（ａ）と（ｃ）の両方を特徴とし得るいくつかの実施形態では、好ましいＴＮＡギャップマーは、特徴（ａ）と（ｄ）の両方を特徴とし得る。いくつかの実施形態では、好ましいＴＮＡギャップマーは、特徴（ｂ）と（ｃ）の両方を特徴とし得るいくつかの実施形態では、好ましいＴＮＡギャップマーは、特徴（ｂ）と（ｄ）の両方を特徴とし得るいくつかの実施形態では、好ましいＴＮＡギャップマーは、特徴（ｃ）と（ｄ）の両方を特徴とし得るいくつかの実施形態では、好ましいＴＮＡギャップマーは、特徴（ａ）と（ｂ）と（ｃ）とを特徴とし得るいくつかの実施形態では、好ましいＴＮＡギャップマーは、特徴（ａ）と（ｂ）と（ｄ）とを特徴とし得るいくつかの実施形態では、好ましいＴＮＡギャップマーは、特徴（ａ）と（ｃ）と（ｃ）とを特徴とし得るいくつかの実施形態では、好ましいＴＮＡギャップマーは、特徴（ｂ）と（ｃ）と（ｄ）とを特徴とし得るさらに、いくつかの実施形態では、好ましいＴＮＡギャップマーは、特徴（ａ）～（ｄ）の全てを特徴とし得る。
【0122】
好ましくは、（ａ）および（ｂ）の標的核酸はＲＮＡであり、（ｃ）のＲＮＡ標的配列は、ＴＮＡギャップマーの連続ヌクレオチド配列に相補的な核酸塩基配列を有する。（ａ）および（ｂ）の発現レベルの低下は、例えば、既に上に記載したように、標的核酸を発現する、約２５μＭの濃度でアンチセンスギャップマーオリゴヌクレオチドと共に約３日間インキュベートされた標的細胞において決定することができる。
【0123】
本発明によるいくつかのＴＮＡギャップマーでは、領域Ｆは少なくとも１つのＴＮＡヌクレオシドを含む。ＴＮＡギャップマーの領域Ｆは、例えば、１５個までのＴＮＡヌクレオシドを含み得る。
【0124】
いくつかのＴＮＡギャップマーでは、Ｆのヌクレオシドは、少なくとも１個のＴＮＡヌクレオシドを含み得る。Ｆのヌクレオシドはまた、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個または少なくとも１２個のＴＮＡヌクレオシド、例えば２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５個のＴＮＡヌクレオシドを含み得る。Ｆのヌクレオシドが１つのＴＮＡヌクレオシドを含むかまたは１つのＴＮＡヌクレオシドからなるＴＮＡギャップマーも企図される。
【0125】
いくつかのＴＮＡギャップマーでは、Ｆのヌクレオシドは、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２個の隣接するＴＮＡヌクレオシド、例えば２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５個の隣接するＴＮＡヌクレオシドを含む。Ｆのヌクレオシドはまた、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５個の隣接するＴＮＡヌクレオシドからなってもよい。
【0126】
いくつかのＴＮＡギャップマーでは、Ｆ中の少なくとも３’最末端のヌクレオシドは、ＴＮＡヌクレオシドである。適切には、Ｆ中の３’最末端の少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、または少なくとも１２個のヌクレオシドは、ＴＮＡヌクレオシドであり得る。例えば、Ｆ中の３’最末端の２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４個のヌクレオシドは、ＴＮＡヌクレオシドであり得る。
【0127】
いくつかのＴＮＡギャップマーでは、Ｆ’中の少なくとも５’最末端のヌクレオシドは、ＴＮＡヌクレオシドである。適切には、Ｆ中の５’最末端の少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、または少なくとも１２個のヌクレオシドは、ＴＮＡヌクレオシドであり得る。例えば、Ｆ’中の５’最末端の２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４個のヌクレオシドは、ＴＮＡヌクレオシドであり得る。
【0128】
いくつかのＴＮＡギャップマーでは、Ｆ中の３’最末端のヌクレオシドと５’最末端のヌクレオシドの両方がＴＮＡヌクレオシドである。例えば、Ｆ中の３’最末端および／または５’最末端のヌクレオシドは、独立して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２個のＴＮＡヌクレオシドから選択することができる。
【0129】
Ｆ中の任意の残りのヌクレオシド（複数可）は、ＴＮＡヌクレオシド（例えば、混合ウイングギャップマーの形態で）または１つ以上のＤＮＡヌクレオシド（例えば、交互フランクギャップマーの形態で）以外の１つ以上の他の糖修飾ヌクレオシドであり得る。例えば、Ｆは、ＴＮＡヌクレオシド以外の１～８個の糖修飾ヌクレオシド、例えばＴＮＡヌクレオシド以外の２、３、４、または５個の糖修飾ヌクレオシドを更に含み得る。糖修飾ヌクレオシドの非限定的な例としては、「糖修飾ヌクレオシド」と題するセクションに記載されているものが挙げられる。
【0130】
Ｆの全ての糖修飾ヌクレオシドがＴＮＡヌクレオシドであるＴＮＡギャップマーも企図される。ＴＮＡギャップマーは、例えば、ＦのヌクレオシドがＤＮＡおよび例えば１、２、または３個のＤＮＡヌクレオシドを有するＴＮＡからなる交互フランクギャップマーであり得る。適切には、Ｆの少なくとも５’最末端および３’最末端のヌクレオシドは、ＴＮＡヌクレオシドである。
【0131】
Ｆのヌクレオシドはまた、ＴＮＡヌクレオシドからなり得る。或いは、Ｆのヌクレオシドは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２個のＴＮＡヌクレオシド等の２以上のＴＮＡヌクレオシドからなっていてもよい。Ｆのヌクレオシドが１３、１４、または１５個のＴＮＡヌクレオシドからなるＴＮＡヌクレオシドも企図される。典型的には、Ｆのヌクレオシドが２つ以上のＴＮＡヌクレオシドからなる場合、Ｆは連結されたＴＮＡヌクレオシドの連続配列である。
【0132】
いくつかのＴＮＡギャップマーでは、ＦはＴＮＡヌクレオシドを含まない。
【0133】
本発明によるいくつかのＴＮＡギャップマーでは、領域Ｆ’は少なくとも１つのＴＮＡヌクレオシドを含む。ＴＮＡギャップマーの領域Ｆ’は、例えば、１５個までのＴＮＡヌクレオシドを含み得る。
【0134】
いくつかのＴＮＡギャップマーでは、Ｆ’のヌクレオシドは、少なくとも１個のＴＮＡヌクレオシドを含み得る。Ｆ’のヌクレオシドはまた、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、１３、１４、または１５個のＴＮＡヌクレオシドを含み得る。Ｆ’のヌクレオシドが１つのＴＮＡヌクレオシドを含むかまたは１つのＴＮＡヌクレオシドからなるＴＮＡギャップマーも企図される。
【0135】
いくつかのＴＮＡギャップマーでは、Ｆ’のヌクレオシドは、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２個の隣接するＴＮＡヌクレオシド、例えば２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５個の隣接するＴＮＡヌクレオシドを含む。Ｆ’のヌクレオシドはまた、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５個の隣接するＴＮＡヌクレオシドからなってもよい。
【0136】
いくつかのＴＮＡギャップマーでは、Ｆ’のヌクレオシドは、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２個のＴＮＡヌクレオシド、例えば２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５個の隣接するＴＮＡヌクレオシドを含む。Ｆ’のヌクレオシドはまた、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５個の隣接するＴＮＡヌクレオシドからなってもよい。
【0137】
いくつかのＴＮＡギャップマーでは、Ｆ’中の少なくとも５’最末端のヌクレオシドはＴＮＡヌクレオシドである。適切には、Ｆ’中の５’最末端の少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、または少なくとも１２個のヌクレオシドは、ＴＮＡヌクレオシドであり得る。例えば、Ｆ’中の５’最末端の２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４個のヌクレオシドは、ＴＮＡヌクレオシドであり得る。
【0138】
いくつかのＴＮＡギャップマーでは、Ｆ’中の少なくとも３’最末端のヌクレオシドは、ＴＮＡヌクレオシドである。適切には、Ｆ’中の３’最末端の少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、または少なくとも１２個のヌクレオシドは、ＴＮＡヌクレオシドであり得る。例えば、Ｆ’中の３’最末端の２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４個のヌクレオシドは、ＴＮＡヌクレオシドであり得る。
【0139】
いくつかのＴＮＡギャップマーでは、Ｆ’中の３’最末端のヌクレオシドと５’最末端のヌクレオシドの両方がＴＮＡヌクレオシドである。例えば、Ｆ’中の３’最末端および／または５’最末端のヌクレオシドは、独立して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２個のＴＮＡヌクレオシドから選択することができる。
【0140】
Ｆ’中の任意の残りのヌクレオシド（複数可）は、ＴＮＡヌクレオシド（例えば、混合ウイングギャップマーの形態で）または１つ以上のＤＮＡヌクレオシド（例えば、交互フランクギャップマーの形態で）以外の１つ以上の他の糖修飾ヌクレオシドであり得る。例えば、Ｆ’は、ＴＮＡヌクレオシド以外の１～８個の糖修飾ヌクレオシド、例えばＴＮＡヌクレオシド以外の２、３、４、または５個の糖修飾ヌクレオシドを更に含み得る。糖修飾ヌクレオシドの非限定的な例としては、「糖修飾ヌクレオシド」と題するセクションに記載されているものが挙げられる。
【0141】
Ｆ’の全ての糖修飾ヌクレオシドがＴＮＡヌクレオシドであるＴＮＡギャップマーも企図される。ＴＮＡギャップマーは、例えば、Ｆ’のヌクレオシドがＤＮＡおよび例えば１、２、または３個のＤＮＡヌクレオシドを有するＴＮＡからなる交互フランクギャップマーであり得る。適切には、Ｆ’の少なくとも５’最末端および３’最末端のヌクレオシドは、ＴＮＡヌクレオシドである。
【0142】
Ｆ’のヌクレオシドはまた、ＴＮＡヌクレオシドからなり得る。或いは、Ｆ’のヌクレオシドは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２個のＴＮＡヌクレオシド等の２以上のＴＮＡヌクレオシドからなっていてもよい。Ｆ’のヌクレオシドが１３、１４、または１５個のＴＮＡヌクレオシドからなるＴＮＡヌクレオシドも企図される。典型的には、Ｆ’のヌクレオシドが２つ以上のＴＮＡヌクレオシドからなる場合、Ｆ’は連結されたＴＮＡヌクレオシドの連続配列である。
【0143】
いくつかのＴＮＡギャップマーでは、Ｆ’はＴＮＡヌクレオシドを含まない。
【0144】
Ｇは、アンチセンスオリゴヌクレオチドがＲＮａｓｅ Ｈを動員することを可能にする一続きの連続ＤＮＡヌクレオシドを含む。適切には、Ｇは、ＤＮＡヌクレオシド等の１８個までのヌクレオシドを含み得る。典型的には、Ｇ中の少なくとも５’最末端のヌクレオシドおよびＧ中の３’最末端のヌクレオシドはＤＮＡヌクレオシドである。
【0145】
本発明によるいくつかのＴＮＡギャップマーでは、ＧはＴＮＡヌクレオシドを含まない。例えば、Ｇは、少なくとも４つのＤＮＡヌクレオシド、例えば４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または１６個の連続ＤＮＡヌクレオシドを含み得る。
【0146】
本発明によるいくつかのＴＮＡギャップマーでは、Ｇは少なくとも１つのＴＮＡヌクレオシドを含む。例えば、領域Ｇの全長に応じて、Ｇ中の５’最末端から２番目、３番目、４番目、５番目、６番目、７番目、または８番目のヌクレオシドは、ＴＮＡヌクレオシドであり得る。或いは、領域Ｇの全長に応じて、Ｇ中の３’最末端から２番目、３番目、４番目、５番目、６番目、７番目、または８番目のヌクレオシドは、ＴＮＡヌクレオシドであり得る。
【0147】
Ｇが２つまたは３つのＴＮＡヌクレオシドを含むＴＮＡギャップマーも企図される。２つまたは３つのＴＮＡヌクレオシドは、連続していても非連続であってもよい。
【0148】
Ｇが少なくとも２つまたは少なくとも３つのＴＮＡヌクレオシドを含むＴＮＡギャップマーも企図される。少なくとも２つまたは少なくとも３つのＴＮＡヌクレオシドは、連続していても非連続であってもよい。領域Ｇは、例えば、任意に連続する、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４個のＴＮＡヌクレオシドを含み得る。
【0149】
さらに、本明細書に記載されるように、他の修飾ヌクレオシドは、ギャップ領域内に含まれる場合にＲＮａｓｅ Ｈを動員することができると報告されており、またまたは代替的に、ＴＮＡギャップマーのギャップ領域に含まれてもよく、含まれてもよい。好ましくは、少なくとも１つ、例えば１、２若しくは３個のＴＮＡヌクレオシドまたは他の修飾ヌクレオシドを含むＴＮＡギャップマーにおいて、例えばギャップ領域Ｇにおいて、ギャップ領域Ｇは、少なくとも３個の連続ＤＮＡヌクレオシド、例えば少なくとも４個の連続ＤＮＡヌクレオシド、例えば少なくとも５個の連続ＤＮＡヌクレオシド、例えば４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または１６個の連続ＤＮＡヌクレオシドを依然として含む。いくつかのＴＮＡギャップマーでは、１つ、２つ、または３つのいずれのＴＮＡヌクレオシドも除いて、Ｇの全てのヌクレオシドは、ＤＮＡヌクレオシドである。いくつかのＴＮＡギャップマーでは、全てのヌクレオシドがＤＮＡヌクレオシドである。
【0150】
いくつかのＴＮＡでは、任意の１、２、または３つのＴＮＡヌクレオシド、特に２つ以上のＴＮＡヌクレオシドの任意の連続ストレッチが、領域Ｇの３’末端よりも領域Ｇの５’末端の近くに位置する。領域Ｇ内の２つ以上のＴＮＡヌクレオシドの任意の連続ストレッチは、例えば、領域Ｇ内の５’最末端のヌクレオシドに隣接して位置し得て、典型的にはＤＮＡヌクレオシドである。
【0151】
本明細書に示されるように、ＴＮＡギャップマーは、ＲＮアーゼＨの動員を依然として可能にしながら、３つまたは４つの連続ＤＮＡヌクレオシドのみのストレッチを含み得る。理論に限定されるものではないが、従来のギャップマー設計のギャップ領域よりも短いギャップ領域を有するおよび／またはギャップ領域内に１つ以上のＴＮＡ残基を有するＴＮＡギャップマーは、従来のギャップマー設計と比較して、エンドヌクレアーゼ媒介性分解に対する耐性の増加および／またはオフターゲット結合の減少をもたらし得ることが企図される。その結果、本発明によるいくつかのＴＮＡギャップマーにおいて、Ｇは、最大で１０個のＤＮＡヌクレオシド、例えば９、８、７、６、５、または４個のＤＮＡヌクレオシドを含む。任意に、Ｇは、最大で１０個の連続ＤＮＡヌクレオシド、例えば９、８、７、６、５、または４個の連続ＤＮＡヌクレオシドを含む。さらに、以下により詳細に記載されるように、ＴＮＡギャップマー中のＧが９、８、７、６、５、または４個の連続ＤＮＡヌクレオシドを含む場合、Ｆ’およびＦは、任意に異なる長さであってもよく、その結果、例えば、ＦがＦ’よりも多くの連結ヌクレオシドを含む。
【0152】
各それぞれの領域Ｆ、Ｇ、および／またはＦ’における少なくとも１つのＴＮＡヌクレオシドの数および配置に関する詳細は上記に記載されており、一般的なギャップマー式５’－Ｆ－Ｇ－Ｆ’－３’（Ｉ）に組み込むことができる。具体的に企図されるＴＮＡギャップマーとしては、
（ｉ）領域Ｆは少なくとも１つのＴＮＡヌクレオシドを含むが、領域Ｆ’およびＧはＴＮＡヌクレオシドを含まない；
（ｉｉ）領域Ｆ’は少なくとも１つのＴＮＡヌクレオシドを含むが、領域ＦおよびＧはＴＮＡヌクレオシドを含まない；
（ｉｉｉ）領域Ｇは少なくとも１つのＴＮＡヌクレオシドを含むが、領域ＦおよびＦ’はＴＮＡヌクレオシドを含まない；
（ｉｖ）領域ＦおよびＦ’はそれぞれ少なくとも１つのＴＮＡヌクレオシドを含むが、領域ＧはＴＮＡヌクレオシドを含まない；
（ｖ）領域ＦおよびＧはそれぞれ少なくとも１つのＴＮＡヌクレオシドを含むが、領域Ｆ’はＴＮＡヌクレオシドを含まない；
（ｖｉ）領域ＧおよびＦ’はそれぞれ少なくとも１つのＴＮＡヌクレオシドを含むが、領域ＦはＴＮＡヌクレオシドを含まない；並びに
（ｖｉｉ）領域Ｆ、Ｇ、およびＦ’はそれぞれ、少なくとも１つのＴＮＡヌクレオシドを含む
ものが挙げられる。
（ｉ）領域Ｆは少なくとも１つのＴＮＡヌクレオシドを含むが、領域Ｆ’およびＧはＴＮＡヌクレオシドを含まない；
（ｉｉ）領域Ｆ’は少なくとも１つのＴＮＡヌクレオシドを含むが、領域ＦおよびＧはＴＮＡヌクレオシドを含まない；
（ｉｉｉ）領域Ｇは少なくとも１つのＴＮＡヌクレオシドを含むが、領域ＦおよびＦ’はＴＮＡヌクレオシドを含まない；
（ｉｖ）領域ＦおよびＦ’はそれぞれ少なくとも１つのＴＮＡヌクレオシドを含むが、領域ＧはＴＮＡヌクレオシドを含まない；
（ｖ）領域ＦおよびＧはそれぞれ少なくとも１つのＴＮＡヌクレオシドを含むが、領域Ｆ’はＴＮＡヌクレオシドを含まない；
（ｖｉ）領域ＧおよびＦ’はそれぞれ少なくとも１つのＴＮＡヌクレオシドを含むが、領域ＦはＴＮＡヌクレオシドを含まない；並びに
（ｖｉｉ）領域Ｆ、Ｇ、およびＦ’はそれぞれ、少なくとも１つのＴＮＡヌクレオシドを含む
ものが挙げられる。
【0153】
例えば、項目（ｉｖ）または（ｖｉｉ）に記載のＴＮＡギャップマーでは、ＦおよびＦ’はそれぞれ、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２個のＴＮＡヌクレオシドを含むかまたはそれらからなり得る。
【0154】
項目（ｉｖ）または（ｖｉｉ）に記載のＴＮＡギャップマーでは、例えば、ＦおよびＦ’は、それぞれ独立して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５個のＴＮＡヌクレオシドを含み得る。ＦおよびＦ’がそれぞれ独立して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５個の連続したＴＮＡヌクレオシドを含む、項目（ｉｖ）または（ｖｉｉ）に記載のＴＮＡギャップマーも企図される。
【0155】
或いは、（ｉｉｉ）以外の任意の項目によるＴＮＡギャップマーにおいて、ＦおよびＦ’は、一緒になって、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個または少なくとも２０個のＴＮＡヌクレオシド、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０個のＴＮＡヌクレオシドを含んでもよい。例えば、項目（ｉｖ）に記載のＴＮＡギャップマーでは、ＦおよびＦ’は一緒に１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２個のＴＮＡヌクレオシドを含み得る。
【0156】
いくつかのＴＮＡギャップマーでは、領域ＦおよびＦ’の各々は、独立して、連結された糖修飾ヌクレオシドの連続した配列を含むかまたはそれからなり得る。
【0157】
いくつかのＴＮＡギャップマーでは、領域ＦおよびＦ’の少なくとも一方は、１種類の糖修飾ヌクレオシドのみからなり得る。例えば、糖修飾ヌクレオシドは、高親和性ヌクレオシドまたはＴＮＡヌクレオシドであり得る。
【0158】
いくつかのＴＮＡギャップマーでは、領域ＦおよびＦ’は両方とも、１種類の糖修飾ヌクレオシドのみからなり得る（均一なフランクまたは均一なギャップマー設計）。例えば、糖修飾ヌクレオシドは、高親和性ヌクレオシドまたはＴＮＡヌクレオシドであり得る。いくつかのＴＮＡギャップマーでは、領域ＦおよびＦ’のヌクレオシドは全てＴＮＡヌクレオシドである。いくつかのＴＮＡギャップマーでは、領域ＦおよびＦ’のヌクレオシドは全て、ＴＮＡヌクレオシド以外の糖修飾ヌクレオシドである。
【0159】
いくつかのＴＮＡギャップマーでは、領域ＦおよびＦ’の一方または両方は、独立して、２つの異なる糖修飾ヌクレオシドを含み得る（混合ウイング設計）。２つの異なる糖修飾ヌクレオシドの一方はＴＮＡヌクレオシドであり得、他方の糖修飾ヌクレオシドは、例えば高親和性ヌクレオシドであり得る。
【0160】
いくつかのＴＮＡギャップマーでは、領域Ｆの全てのヌクレオシドはＴＮＡヌクレオシドであり得る。次いで、領域Ｆ’のヌクレオシドは、例えば、ＴＮＡヌクレオシド以外の糖修飾ヌクレオシド、例えば高親和性ヌクレオシド等の２’糖修飾ヌクレオシドを含むかまたはそれらからなり得る。任意に、領域Ｆ’は、２つの異なる糖修飾ヌクレオシドを含んでもよく、そのうちの１つはＴＮＡであってもよい。例えば、Ｆ’は、ＴＮＡヌクレオシド以外の１～８個の糖修飾ヌクレオシド、例えばＴＮＡヌクレオシド以外の３、４、または５個の糖修飾ヌクレオシドを含み得る。或いは、Ｆ’は、ＴＮＡヌクレオシド以外の１～８個の糖修飾ヌクレオシド、例えばＴＮＡヌクレオシド以外の３、４、または５個の糖修飾ヌクレオシドからなっていてもよい。
【0161】
いくつかのＴＮＡギャップマーでは、領域Ｆ’の全てのヌクレオシドはＴＮＡヌクレオシドであり得る。次いで、領域Ｆのヌクレオシドは、例えば、ＴＮＡヌクレオシド以外の糖修飾ヌクレオシド、例えば高親和性ヌクレオシド等の２’糖修飾ヌクレオシドを含むかまたはそれらからなり得る。任意に、領域Ｆは、２つの異なる糖修飾ヌクレオシドを含んでもよく、そのうちの１つはＴＮＡであってもよい。例えば、Ｆは、ＴＮＡヌクレオシド以外の１～８個の糖修飾ヌクレオシド、例えばＴＮＡヌクレオシド以外の３、４、または５個の糖修飾ヌクレオシドを含み得る。或いは、Ｆは、ＴＮＡヌクレオシド以外の１～８個の糖修飾ヌクレオシド、例えばＴＮＡヌクレオシド以外の３、４、または５個の糖修飾ヌクレオシドからなっていてもよい。
【0162】
Ｆ、Ｆ’、またはＦとＦ’の両方がＴＮＡヌクレオシド以外の１つ以上の糖修飾ヌクレオシドを含むかまたはそれらからなるＴＮＡギャップマーにおいて、糖修飾ヌクレオシドの非限定的な例としては、以下からなる群から選択される修飾糖部分を有するものが挙げられる：
２’－メトキシ－リボース（２’－ＯＭｅ）、
２’－Ｏ－メトキシエチル－リボース（２’－Ｏ－ＭＯＥ）、
５’－メチル－２’－Ｏ－メトキシエチルリボース（５’－Ｍｅ－２’－Ｏ－ＭＯＥ）、
２’－Ｏ－［２－（メチルチオ）エチル］－リボース（２’－Ｏ－ＭＴＥ）、
２－（Ｎ－メチルカルバモイル）－エチル］－リボース（２’－Ｏ－ＭＣＥ）、
２’－Ｏ－［２－（メチルアミノ）－２－オキソエチル］－リボース（２’－Ｏ－ＮＭＡ）、
２’－デオキシ－２’－フルオロ－リボース（２’－デオキシ－２’－フルオロリボ－核酸；２’－Ｆ－ＲＮＡにおけるような）、
２’－フルオロ－２’－アラビノース（２’－フルオロ－２’－アラビノース－核酸；２’－Ｆ－ＡＮＡにおけるような）、
２’－Ｏ－ベンジル－リボース、
オキシ、アミノまたはチオβ－Ｄ－ロックドリボース（β－Ｄ－ＬＮＡにおけるような）、
オキシ、アミノまたはチオα－Ｌ－ロックドリボース（α－Ｌ－ＬＮＡにおけるような）、
２’，４’拘束２’－Ｏ－エチルリボース（拘束エチルロックド核酸；ｃＥｔにおけるような）、
トリシクロ－デオキシリボース（トリシクロ－デオキシリボースＤＮＡ；ＴｃＤＮＡにおけるような）、
３’－デオキシ－リボース（３’－デオキシ－リボースＤＮＡ；３’－ＤＮＡにおけるような）、
アンロックドリボース（アンロックド核酸；ＵＮＡにおけるような）、
グリコール（グリコール核酸；ＧＮＡにおけるような）、
ヘキシトール（ヘキシトール核酸；ＨＮＡにおけるような）、
３’－フルオロヘキシトール（３’－フルオロヘキシトール核酸；ＦＨＮＡにおけるような）、
３’－アラビノ－フルオロヘキシトール（３’－アラビノ－フルオロ－ヘキシトール核酸；Ａｒａ－ＦＨＮＡにおけるような）、
シクロヘキセン（シクロヘキセン核酸；ＣｅＮＡにおけるような）、および
フルオロ－シクロヘキセニル（２’－フルオロ－シクロヘキセニル核酸；Ｆ－ＣｅＮＡにおけるような）。
２’－メトキシ－リボース（２’－ＯＭｅ）、
２’－Ｏ－メトキシエチル－リボース（２’－Ｏ－ＭＯＥ）、
５’－メチル－２’－Ｏ－メトキシエチルリボース（５’－Ｍｅ－２’－Ｏ－ＭＯＥ）、
２’－Ｏ－［２－（メチルチオ）エチル］－リボース（２’－Ｏ－ＭＴＥ）、
２－（Ｎ－メチルカルバモイル）－エチル］－リボース（２’－Ｏ－ＭＣＥ）、
２’－Ｏ－［２－（メチルアミノ）－２－オキソエチル］－リボース（２’－Ｏ－ＮＭＡ）、
２’－デオキシ－２’－フルオロ－リボース（２’－デオキシ－２’－フルオロリボ－核酸；２’－Ｆ－ＲＮＡにおけるような）、
２’－フルオロ－２’－アラビノース（２’－フルオロ－２’－アラビノース－核酸；２’－Ｆ－ＡＮＡにおけるような）、
２’－Ｏ－ベンジル－リボース、
オキシ、アミノまたはチオβ－Ｄ－ロックドリボース（β－Ｄ－ＬＮＡにおけるような）、
オキシ、アミノまたはチオα－Ｌ－ロックドリボース（α－Ｌ－ＬＮＡにおけるような）、
２’，４’拘束２’－Ｏ－エチルリボース（拘束エチルロックド核酸；ｃＥｔにおけるような）、
トリシクロ－デオキシリボース（トリシクロ－デオキシリボースＤＮＡ；ＴｃＤＮＡにおけるような）、
３’－デオキシ－リボース（３’－デオキシ－リボースＤＮＡ；３’－ＤＮＡにおけるような）、
アンロックドリボース（アンロックド核酸；ＵＮＡにおけるような）、
グリコール（グリコール核酸；ＧＮＡにおけるような）、
ヘキシトール（ヘキシトール核酸；ＨＮＡにおけるような）、
３’－フルオロヘキシトール（３’－フルオロヘキシトール核酸；ＦＨＮＡにおけるような）、
３’－アラビノ－フルオロヘキシトール（３’－アラビノ－フルオロ－ヘキシトール核酸；Ａｒａ－ＦＨＮＡにおけるような）、
シクロヘキセン（シクロヘキセン核酸；ＣｅＮＡにおけるような）、および
フルオロ－シクロヘキセニル（２’－フルオロ－シクロヘキセニル核酸；Ｆ－ＣｅＮＡにおけるような）。
【0163】
Ｆ、Ｆ’、またはＦとＦ’の両方の糖修飾ヌクレオシドが、高親和性２’糖修飾ヌクレオシド等の１つ以上の２’糖修飾ヌクレオシドを含むかまたはそれからなるＴＮＡギャップマーが特に企図される。
【0164】
いくつかのＴＮＡギャップマーでは、Ｆ、Ｆ’、またはＦとＦ’の両方の糖修飾ヌクレオシドは、１つ以上のＬＮＡヌクレオシドを含む。例えば、少なくとも１つのいずれのＴＮＡヌクレオシドも除いて、Ｆ’、Ｆ、またはＦとＦ’の両方における１、２、３、４、５、６、７、８個または全てのヌクレオシドは、ＬＮＡヌクレオシドであり得る。領域Ｇのみが１つ以上のＴＮＡヌクレオシドを含むＴＮＡギャップマーでは、領域ＦおよびＦ’は、例えば、それぞれ１、２、３、４、５、６、７、８個のＬＮＡヌクレオシド、例えば３、４、または５個のＬＮＡヌクレオシドを含むかまたはそれらからなってもよい。適切なＬＮＡヌクレオシドとしては、オキシ、アミノ若しくはチオβ－Ｄ－ロックドリボース（β－Ｄ－ＬＮＡ）から選択されるか、またはオキシ、アミノ若しくはチオα－Ｌ－ロックドリボース（α－Ｌ－ＬＮＡ）、例えばβ－Ｄ－オキシ－ＬＮＡ、６’－メチル－β－Ｄ－オキシＬＮＡ、例えば（Ｓ）－６’－メチル－β－Ｄ－オキシ－ＬＮＡ（ＳｃＥＴ）およびＥＮＡから選択される修飾糖部分を有するもの、並びにスキーム２に開示されるＬＮＡヌクレオシドが挙げられる。特に企図されるＬＮＡヌクレオシドは、β－Ｄ－オキシ－ＬＮＡである。
【0165】
いくつかのＴＮＡギャップマーでは、Ｆ、Ｆ’、またはＦとＦ’の両方の糖修飾ヌクレオシドは、１つ以上のＭＯＥヌクレオシドを含む。例えば、少なくとも１つのいずれのＴＮＡヌクレオシドも除いて、Ｆ’、Ｆ、またはＦとＦ’の両方における１、２、３、４、５、６、７、８個または全てのヌクレオシドは、ＭＯＥヌクレオシドであり得る。領域Ｇのみが１つ以上のＴＮＡヌクレオシドを含むＴＮＡギャップマーでは、領域ＦおよびＦ’は、例えば、それぞれ１、２、３、４、５、６、７、８個のＭＯＥヌクレオシド、例えば３、４、または５個のＭＯＥヌクレオシドを含むかまたはそれらからなってもよい。適切なＭＯＥヌクレオシドには、２’－Ｏ－ＭＯＥおよび５’－Ｍｅ－２’－Ｏ－ＭＯＥが含まれる。特に企図されるＭＯＥヌクレオシドは、２’－Ｏ－ＭＯＥである。
【0166】
いくつかのＴＮＡギャップマーでは、Ｆ、Ｆ’、またはＦとＦ’の両方の糖修飾ヌクレオシドは、１つ以上の２’－ＯＭｅヌクレオシドを含む。例えば、少なくとも１つのいずれのＴＮＡヌクレオシドも除いて、Ｆ’、Ｆ、またはＦとＦ’の両方における１、２、３、４、５、６、７、８個または全てのヌクレオシドは、２’－ＯＭｅヌクレオシドであり得る。領域Ｇのみが１つ以上のＴＮＡヌクレオシドを含むＴＮＡギャップマーでは、領域ＦおよびＦ’は、例えば、それぞれ１、２、３、４、５、６、７、８個の２’－ＯＭｅヌクレオシド、例えば３、４、または５個の２’－ＯＭｅヌクレオシドを含むかまたはそれらからなってもよい。
【0167】
いくつかのＴＮＡギャップマーでは、Ｆ、Ｆ’、またはＦとＦ’の両方の糖修飾ヌクレオシドは、１つ以上の２’－Ｏ－ＭＴＥヌクレオシドを含む。例えば、少なくとも１つのいずれのＴＮＡヌクレオシドも除いて、Ｆ’、Ｆ、またはＦとＦ’の両方における１、２、３、４、５、６、７、８個または全てのヌクレオシドは、２’－Ｏ－ＭＴＥヌクレオシドであり得る。領域Ｇのみが１つ以上のＴＮＡヌクレオシドを含むＴＮＡギャップマーでは、領域ＦおよびＦ’は、例えば、それぞれ１、２、３、４、５、６、７、８個の２’－Ｏ－ＭＴＥヌクレオシド、例えば３、４、または５個の２’－Ｏ－ＭＴＥヌクレオシドを含むかまたはそれらからなってもよい。
【0168】
いくつかのＴＮＡギャップマーでは、Ｆ、Ｆ’、またはＦとＦ’の両方の糖修飾ヌクレオシドは、１つ以上の２’－Ｏ－ＭＣＥヌクレオシドを含む。例えば、少なくとも１つのいずれのＴＮＡヌクレオシドも除いて、Ｆ’、Ｆ、またはＦとＦ’の両方における１、２、３、４、５、６、７、８個または全てのヌクレオシドは、２’－Ｏ－ＭＣＥヌクレオシドであり得る。領域Ｇのみが１つ以上のＴＮＡヌクレオシドを含むＴＮＡギャップマーでは、領域ＦおよびＦ’は、例えば、それぞれ１、２、３、４、５、６、７、８個の２’－Ｏ－ＭＣＥヌクレオシド、例えば３、４、または５個の２’－Ｏ－ＭＣＥヌクレオシドを含むかまたはそれらからなってもよい。
【0169】
いくつかのＴＮＡギャップマーでは、Ｆ、Ｆ’、またはＦとＦ’の両方の糖修飾ヌクレオシドは、１つ以上の２’－Ｏ－ＮＭＡヌクレオシドを含む。例えば、少なくとも１つのいずれのＴＮＡヌクレオシドも除いて、Ｆ’、Ｆ、またはＦとＦ’の両方における１、２、３、４、５、６、７、８個または全てのヌクレオシドは、２’－Ｏ－ＮＭＡヌクレオシドであり得る。領域Ｇのみが１つ以上のＴＮＡヌクレオシドを含むＴＮＡギャップマーでは、領域ＦおよびＦ’は、例えば、それぞれ１、２、３、４、５、６、７、８個の２’－Ｏ－ＮＭＡヌクレオシド、例えば３、４、または５個の２’－Ｏ－ＮＭＡヌクレオシドを含むかまたはそれらからなってもよい。
【0170】
いくつかのＴＮＡギャップマーでは、Ｆ、Ｆ’、またはＦとＦ’の両方の糖修飾ヌクレオシドは、１つ以上の２’－デオキシ－２’－フルオロ－リボースヌクレオシドを含む。例えば、少なくとも１つのいずれのＴＮＡヌクレオシドも除いて、Ｆ’、Ｆ、またはＦとＦ’の両方における１、２、３、４、５、６、７、８個または全てのヌクレオシドは、２’－デオキシ－２’－フルオロ－リボースヌクレオシドであり得る。領域Ｇのみが１つ以上のＴＮＡヌクレオシドを含むＴＮＡギャップマーでは、領域ＦおよびＦ’は、例えば、それぞれ１、２、３、４、５、６、７、８個の２’－デオキシ－２’－フルオロ－リボースヌクレオシド、例えば３、４、または５個の２’－デオキシ－２’－フルオロ－リボースヌクレオシドを含むかまたはそれらからなり得る。
【0171】
いくつかのＴＮＡギャップマーでは、Ｆ、Ｆ’、またはＦとＦ’の両方の糖修飾ヌクレオシドは、１つ以上の２’－フルオロ－２’－アラビノースヌクレオシドを含む。例えば、少なくとも１つのいずれのＴＮＡヌクレオシドも除いて、Ｆ’、Ｆ、またはＦとＦ’の両方における１、２、３、４、５、６、７、８個または全てのヌクレオシドは、２’－フルオロ－２’－アラビノースヌクレオシドであり得る。領域Ｇのみが１つ以上のＴＮＡヌクレオシドを含むＴＮＡギャップマーでは、領域ＦおよびＦ’は、例えば、それぞれ１、２、３、４、５、６、７、８個の２’－フルオロ－２’－アラビノースヌクレオシド、例えば３、４、または５個の２’－フルオロ－２’－アラビノースヌクレオシドを含むかまたはそれらからなり得る。
【0172】
いくつかのＴＮＡギャップマーでは、Ｆ、Ｆ’、またはＦとＦ’の両方の糖修飾ヌクレオシドは、１つ以上の２’－Ｏ－ベンジル－リボースヌクレオシドを含む。例えば、少なくとも１つのいずれのＴＮＡヌクレオシドも除いて、Ｆ’、Ｆ、またはＦとＦ’の両方における１、２、３、４、５、６、７、８個または全てのヌクレオシドは、２’－Ｏ－ベンジル－リボースヌクレオシドであり得る。領域Ｇのみが１つ以上のＴＮＡヌクレオシドを含むＴＮＡギャップマーでは、領域ＦおよびＦ’は、例えば、それぞれ１、２、３、４、５、６、７、８個の２’－Ｏ－ベンジル－リボースヌクレオシド、例えば３、４、または５個の２’－Ｏ－ベンジル－リボースヌクレオシドを含むかまたはそれらからなり得る。
【0173】
いくつかのＴＮＡギャップマーでは、Ｆ、Ｆ’、またはＦとＦ’の両方の糖修飾ヌクレオシドは、１つ以上のｃＥｔヌクレオシドを含む。例えば、少なくとも１つのいずれのＴＮＡヌクレオシドも除いて、Ｆ’、Ｆ、またはＦとＦ’の両方における１、２、３、４、５、６、７、８個または全てのヌクレオシドは、ｃＥｔヌクレオシドであり得る。領域Ｇのみが１つ以上のＴＮＡヌクレオシドを含むＴＮＡギャップマーでは、領域ＦおよびＦ’は、例えば、それぞれ１、２、３、４、５、６、７、８個のｃＥｔヌクレオシド、例えば３、４、または５個のｃＥｔヌクレオシドを含むかまたはそれらからなってもよい。
【0174】
いくつかのＴＮＡギャップマーでは、Ｆ、Ｆ’、またはＦとＦ’の両方の糖修飾ヌクレオシドは、１つ以上のＴｃＤＮＡヌクレオシドを含む。例えば、少なくとも１つのいずれのＴＮＡヌクレオシドも除いて、Ｆ’、Ｆ、またはＦとＦ’の両方における１、２、３、４、５、６、７、８個または全てのヌクレオシドは、ＴｃＤＮＡヌクレオシドであり得る。領域Ｇのみが１つ以上のＴＮＡヌクレオシドを含むＴＮＡギャップマーでは、領域ＦおよびＦ’は、例えば、それぞれ１、２、３、４、５、６、７、８個のＴｃＤＮＡヌクレオシド、例えば３、４、または５個のＴｃＤＮＡヌクレオシドを含むかまたはそれらからなってもよい。
【0175】
いくつかのＴＮＡギャップマーでは、Ｆ、Ｆ’、またはＦとＦ’の両方の糖修飾ヌクレオシドは、１つ以上の３’－ＤＮＡヌクレオシドを含む。例えば、少なくとも１つのいずれのＴＮＡヌクレオシドも除いて、Ｆ’、Ｆ、またはＦとＦ’の両方における１、２、３、４、５、６、７、８個または全てのヌクレオシドは、３’－ＤＮＡヌクレオシドであり得る。領域Ｇのみが１つ以上のＴＮＡヌクレオシドを含むＴＮＡギャップマーでは、領域ＦおよびＦ’は、例えば、それぞれ１、２、３、４、５、６、７、８個の３’－ＤＮＡヌクレオシド、例えば３、４、または５個の３’－ＤＮＡヌクレオシドを含むかまたはそれらからなってもよい。
【0176】
いくつかのＴＮＡギャップマーでは、Ｆ、Ｆ’、またはＦとＦ’の両方の糖修飾ヌクレオシドは、１つ以上のＵＮＡヌクレオシドを含む。例えば、少なくとも１つのいずれのＴＮＡヌクレオシドも除いて、Ｆ’、Ｆ、またはＦとＦ’の両方における１、２、３、４、５、６、７、８個または全てのヌクレオシドは、ＵＮＡヌクレオシドであり得る。領域Ｇのみが１つ以上のＴＮＡヌクレオシドを含むＴＮＡギャップマーでは、領域ＦおよびＦ’は、例えば、それぞれ１、２、３、４、５、６、７、８個のＵＮＡヌクレオシド、例えば３、４、または５個のＵＮＡヌクレオシドを含むかまたはそれらからなってもよい。
【0177】
いくつかのＴＮＡギャップマーでは、Ｆ、Ｆ’、またはＦとＦ’の両方の糖修飾ヌクレオシドは、１つ以上のＧＮＡヌクレオシドを含む。例えば、少なくとも１つのいずれのＴＮＡヌクレオシドも除いて、Ｆ’、Ｆ、またはＦとＦ’の両方における１、２、３、４、５、６、７、８個または全てのヌクレオシドは、ＧＮＡヌクレオシドであり得る。領域Ｇのみが１つ以上のＴＮＡヌクレオシドを含むＴＮＡギャップマーでは、領域ＦおよびＦ’は、例えば、それぞれ１、２、３、４、５、６、７、８個のＧＮＡヌクレオシド、例えば３、４、または５個のＧＮＡヌクレオシドを含むかまたはそれらからなってもよい。
【0178】
いくつかのＴＮＡギャップマーでは、Ｆ、Ｆ’、またはＦとＦ’の両方の糖修飾ヌクレオシドは、１つ以上のＨＮＡヌクレオシドを含む。例えば、少なくとも１つのいずれのＴＮＡヌクレオシドも除いて、Ｆ’、Ｆ、またはＦとＦ’の両方における１、２、３、４、５、６、７、８個または全てのヌクレオシドは、ＨＮＡヌクレオシドであり得る。領域Ｇのみが１つ以上のＴＮＡヌクレオシドを含むＴＮＡギャップマーでは、領域ＦおよびＦ’は、例えば、それぞれ１、２、３、４、５、６、７、８個のＨＮＡヌクレオシド、例えば３、４、または５個のＨＮＡヌクレオシドを含むかまたはそれらからなってもよい。適切なＨＮＡヌクレオシドには、ＨＮＡ、ＦＨＮＡおよびＡｒａ－ＦＨＮＡが含まれる。
【0179】
いくつかのＴＮＡギャップマーでは、Ｆ、Ｆ’、またはＦとＦ’の両方の糖修飾ヌクレオシドは、１つ以上のＣｅＮＡヌクレオシドを含む。例えば、少なくとも１つのいずれのＴＮＡヌクレオシドも除いて、Ｆ’、Ｆ、またはＦとＦ’の両方における１、２、３、４、５、６、７、８個または全てのヌクレオシドは、ＣｅＮＡヌクレオシドであり得る。領域Ｇのみが１つ以上のＴＮＡヌクレオシドを含むＴＮＡギャップマーでは、領域ＦおよびＦ’は、例えば、それぞれ１、２、３、４、５、６、７、８個のＣｅＮＡヌクレオシド、例えば３、４、または５個のＣｅＮＡヌクレオシドを含むかまたはそれらからなってもよい。適切なＣｅＮＡヌクレオシドには、ＣｅＮＡおよびＦ－ＣｅＮＡが含まれる。
【0180】
式５’－Ｆ－Ｇ－Ｆ’－３’（Ｉ）の連続ヌクレオチド配列が、１２～３２個のヌクレオシド、例えば１２～２８個のヌクレオシド、例えば１２～２６個のヌクレオシド、例えば１４～２６個のヌクレオシド、例えば１４～２４個のヌクレオシド、例えば１４～２２個のヌクレオシド、例えば１６～２２個のヌクレオシド、例えば１６～２０個のヌクレオシドの長さを有するＴＮＡギャップマーが特に企図される。しかしながら、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、および３２個の連結ヌクレオシドを含むがこれらに限定される、任意の適切な長さをＦ－Ｇ－Ｆ’設計に使用することができる。
【0181】
例として、本発明によるＴＮＡギャップマーは、領域Ｆ－Ｇ－Ｆ’の全長が少なくとも１２、例えば少なくとも１４ヌクレオチド長であることを条件として、領域Ｆ－Ｇ－Ｆ’についての以下の式（式Ｉ）のうちの１つ以上によって表すことができる：
Ｆ１～１５－Ｇ３～１８－Ｆ’１～１５（ＩＶ）、例えば、Ｆ１～１５－Ｇ３～１８－Ｆ’１～１２（ＩＶａ）またはＦ１～１２－Ｇ３～１８－Ｆ’１～１５（ＩＶｂ）；
Ｆ１～１２－Ｇ３～１８－Ｆ’１～１２（Ｖ）、例えば、Ｆ１～１２－Ｇ３～１８－Ｆ’１～９（Ｖａ）またはＦ１～９－Ｇ３～１８－Ｆ’１～１２（Ｖｂ）；
Ｆ１～１２－Ｇ４～１６－Ｆ’１～１２（ＶＩ）、例えば、Ｆ１～１２－Ｇ４～１６－Ｆ’１～９（ＶＩａ）またはＦ１～９－Ｇ４～１６－Ｆ’１～１２（ＶＩｂ）；および
Ｆ３～１２－Ｇ４～１０－Ｆ’３～１２（ＶＩＩ）、例えば、Ｆ３～１２－Ｇ４－１０－Ｆ’３～９（ＶＩＩａ）またはＦ３～９－Ｇ４～１０－Ｆ’３～１２（ＶＩＩｂ）。
Ｆ１～１５－Ｇ３～１８－Ｆ’１～１５（ＩＶ）、例えば、Ｆ１～１５－Ｇ３～１８－Ｆ’１～１２（ＩＶａ）またはＦ１～１２－Ｇ３～１８－Ｆ’１～１５（ＩＶｂ）；
Ｆ１～１２－Ｇ３～１８－Ｆ’１～１２（Ｖ）、例えば、Ｆ１～１２－Ｇ３～１８－Ｆ’１～９（Ｖａ）またはＦ１～９－Ｇ３～１８－Ｆ’１～１２（Ｖｂ）；
Ｆ１～１２－Ｇ４～１６－Ｆ’１～１２（ＶＩ）、例えば、Ｆ１～１２－Ｇ４～１６－Ｆ’１～９（ＶＩａ）またはＦ１～９－Ｇ４～１６－Ｆ’１～１２（ＶＩｂ）；および
Ｆ３～１２－Ｇ４～１０－Ｆ’３～１２（ＶＩＩ）、例えば、Ｆ３～１２－Ｇ４－１０－Ｆ’３～９（ＶＩＩａ）またはＦ３～９－Ｇ４～１０－Ｆ’３～１２（ＶＩＩｂ）。
【0182】
本明細書に記載の領域Ｆ、Ｇ、およびＦ’の各々は、Ｆ－Ｇ－Ｆ’式のいずれかに組み込むことができる。
【0183】
いくつかのＴＮＡギャップマーでは、式ＩＶａの連続ヌクレオチド配列は、少なくとも１６個のヌクレオシドの長さを有し、かつ
（ａ）Ｆ’中の５’最末端のヌクレオシドおよびＦ中のヌクレオシドは、独立して、３、４、または５個の高親和性糖修飾ヌクレオシドであり、
（ｂ）Ｆ中の残りのヌクレオシドは、ＴＮＡヌクレオシドであり、かつ
（ｃ）Ｇ中の全てのヌクレオシドは、ＤＮＡヌクレオシドである。
（ａ）Ｆ’中の５’最末端のヌクレオシドおよびＦ中のヌクレオシドは、独立して、３、４、または５個の高親和性糖修飾ヌクレオシドであり、
（ｂ）Ｆ中の残りのヌクレオシドは、ＴＮＡヌクレオシドであり、かつ
（ｃ）Ｇ中の全てのヌクレオシドは、ＤＮＡヌクレオシドである。
【0184】
例えば、Ｇは、最大で１０個の連続ＤＮＡヌクレオシド、例えば９、８、７、６、５、または４個の連続ＤＮＡヌクレオシド、例えば４、５、または６個の連続ＤＮＡヌクレオシドを含み得る。Ｆは、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２個の連続したＴＮＡヌクレオシドを含み得る。
【0185】
いくつかのＴＮＡギャップマーでは、式ＩＶの連続ヌクレオチド配列は、少なくとも１６個のヌクレオシドの長さを有し、かつ
（ａ）ＦおよびＦ’は、それぞれ独立して、３個、４個または５個のヌクレオシドからなり、ＦおよびＦ’中のヌクレオシドの少なくとも１つはＴＮＡヌクレオシドであり、残りのヌクレオシドは高親和性糖修飾ヌクレオシドであり、かつ
（ｂ）Ｇ中の全てのヌクレオシドはＤＮＡヌクレオシドである。
（ａ）ＦおよびＦ’は、それぞれ独立して、３個、４個または５個のヌクレオシドからなり、ＦおよびＦ’中のヌクレオシドの少なくとも１つはＴＮＡヌクレオシドであり、残りのヌクレオシドは高親和性糖修飾ヌクレオシドであり、かつ
（ｂ）Ｇ中の全てのヌクレオシドはＤＮＡヌクレオシドである。
【0186】
例えば、ＦおよびＦ’中の全てのヌクレオシドは、ＴＮＡヌクレオシドであり得る。
【0187】
いくつかのＴＮＡギャップマーでは、式ＩＶの連続ヌクレオチド配列は、少なくとも１６個のヌクレオシドの長さを有し、かつ
（ａ）ＦおよびＦ’は、それぞれ独立して、３、４、若しくは５個の連結された高親和性糖修飾ヌクレオシドを含むか、またはそれらからなり、かつ、いかなるＴＮＡヌクレオシドも含まず、かつ
（ｂ）Ｇ中の５’最末端から２番目、３番目、４番目、または５番目のヌクレオシドは、ＴＮＡヌクレオシドであり、かつＧ中の残りのヌクレオシドは、ＤＮＡヌクレオシドである。
（ａ）ＦおよびＦ’は、それぞれ独立して、３、４、若しくは５個の連結された高親和性糖修飾ヌクレオシドを含むか、またはそれらからなり、かつ、いかなるＴＮＡヌクレオシドも含まず、かつ
（ｂ）Ｇ中の５’最末端から２番目、３番目、４番目、または５番目のヌクレオシドは、ＴＮＡヌクレオシドであり、かつＧ中の残りのヌクレオシドは、ＤＮＡヌクレオシドである。
【0188】
例えば、ＴＮＡヌクレオシドは、Ｇの３’末端よりも領域Ｇの５’末端の近くに位置し得る。
【0189】
ＴＮＡギャップマーの特に企図される設計は以下の通りである：
ＴＴＴＴＴｄｄｄｄｄｄｄｄｄｄＴＴＴＴＴ（設計Ａ）、式中、ＴはＴＮＡであり、ｄはＤＮＡである。
ＭＭＭＭＭＴＴＴＴＴＴｄｄｄｄＭＭＭＭＭ（設計Ｂ）、式中、ＭはＭＯＥ（例えば、２’－Ｏ－ＭＯＥ）であり、ＴはＴＮＡであり、ｄはＤＮＡである。
ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴｄｄｄｄｄＭＭＭＭＭ（設計Ｃ）、式中、Ｍは２’－Ｏ－ＭＯＥであり、ＴはＴＮＡであり、ｄはＤＮＡである。
ＴＴＴＴＴｄｄｄｄｄｄｄｄｄｄＴＴＴＴＴ（設計Ａ）、式中、ＴはＴＮＡであり、ｄはＤＮＡである。
ＭＭＭＭＭＴＴＴＴＴＴｄｄｄｄＭＭＭＭＭ（設計Ｂ）、式中、ＭはＭＯＥ（例えば、２’－Ｏ－ＭＯＥ）であり、ＴはＴＮＡであり、ｄはＤＮＡである。
ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴｄｄｄｄｄＭＭＭＭＭ（設計Ｃ）、式中、Ｍは２’－Ｏ－ＭＯＥであり、ＴはＴＮＡであり、ｄはＤＮＡである。
【0190】
ＴＮＡギャップマーを含むアンチセンスギャップマーオリゴヌクレオチド、すなわち、式５’－Ｆ－Ｇ－Ｆ’－３’（Ｉ）の連続ヌクレオチド配列は、ＴＮＡギャップマーの３’および／または５’末端に、追加の連結ヌクレオシド、例えば、１～１００、１～４０、４０、１～３０、１～２０、１～１０、または１～５個の連結ヌクレオシドを含み得る。追加の連結ヌクレオシドは、例えば、意図された部位へのアンチセンスギャップマーオリゴヌクレオチドの送達を促進し得るか、または第２の分子を標的化し得る。アンチセンスギャップマーオリゴヌクレオチドは、より長い核酸コンストラクトであってもよく、またはその一部であってもよい。しかしながら、アンチセンスギャップマーオリゴヌクレオチドがＴＮＡギャップマーからなり得ることも企図される。
【0191】
一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドであるＴＮＡギャップマーおよびアンチセンスギャップマーオリゴヌクレオチドが、本発明について特に企図される。本発明によるＴＮＡギャップマーまたはアンチセンスギャップマーオリゴヌクレオチドの調製において、ＴＮＡギャップマーまたはアンチセンスギャップマーオリゴヌクレオチドは、ＴＮＡギャップマー分子またはアンチセンスギャップマーオリゴヌクレオチド分子の大部分が一本鎖形態であるように、本質的に一本鎖である。
【0192】
製造方法
ヌクレオチド単位を反応させ、それによってオリゴヌクレオチドからなる共有結合した連続ヌクレオチド単位を形成することを含む、本発明のオリゴヌクレオチドを製造するための方法も提供される。好ましくは、この方法は、ホスホラミダイト化学を使用する（例えば、Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ ｅｔ ａｌ，１９８７，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ｖｏｌ．１５４，ｐａｇｅｓ ２８７－３１３を参照）。
ヌクレオチド単位を反応させ、それによってオリゴヌクレオチドからなる共有結合した連続ヌクレオチド単位を形成することを含む、本発明のオリゴヌクレオチドを製造するための方法も提供される。好ましくは、この方法は、ホスホラミダイト化学を使用する（例えば、Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ ｅｔ ａｌ，１９８７，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ｖｏｌ．１５４，ｐａｇｅｓ ２８７－３１３を参照）。
【0193】
ＴＮＡモノマーの合成およびオリゴヌクレオチドへのそれらの組み込みは、例えば、Ｚｈａｎｇ ａｎｄ Ｃｈａｐｕｔ，’’Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｒｅｏｓｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ（ＴＮＡ）Ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ Ｍｏｎｏｍｅｒｓ ａｎｄ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４．５１．１－４．５１．２６，２０１２’’、国際公開公報第２０１２／０７８５３６号、国際公開公報第２０１２／１１８９１１号および国際公開公報第２０１３／１７９２９２号Ａ１に開示されている。
【0194】
特に、親アンチセンスギャップマーオリゴヌクレオチドの修飾バージョンを調製する方法であって、親アンチセンスギャップマーが、ＲＮアーゼＨを動員することができる式５’Ｆ－Ｇ－Ｆ’３’（Ｉ）の連続ヌクレオチド配列を含み、式中、Ｇは、５～１８個の連結されたＤＮＡヌクレオシドのギャップ領域であり、ＦおよびＦ’の各々は、独立して、ＴＮＡヌクレオシド以外の１～８個の糖修飾ヌクレオシドを含むかまたはそれらからなる８個までの連結ヌクレオシドのフランキング領域であり、修飾バージョンにおいて、親アンチセンスギャップマーオリゴヌクレオチドのＦ、Ｆ’および／またはＧ中の少なくとも１つのヌクレオシドは、ＴＮＡヌクレオシドで置換されており、
方法は、ヌクレオチド単位を反応させて、オリゴヌクレオチドに含まれる共有結合した連続ヌクレオチド単位を形成することによって修飾アンチセンスギャップマーオリゴヌクレオチドを製造する工程を含み、ヌクレオチド単位の少なくとも１つは、ＴＮＡヌクレオシドを含み、
任意に、修飾アンチセンスギャップマーオリゴヌクレオチドを精製または単離することを含む、方法が提供される。
方法は、ヌクレオチド単位を反応させて、オリゴヌクレオチドに含まれる共有結合した連続ヌクレオチド単位を形成することによって修飾アンチセンスギャップマーオリゴヌクレオチドを製造する工程を含み、ヌクレオチド単位の少なくとも１つは、ＴＮＡヌクレオシドを含み、
任意に、修飾アンチセンスギャップマーオリゴヌクレオチドを精製または単離することを含む、方法が提供される。
【0195】
一実施形態では、修飾アンチセンスギャップマーオリゴヌクレオチドは、親アンチセンスギャップマーオリゴヌクレオチドと比較して、毒性、任意に、肝毒性が低下している。一実施形態では、修飾アンチセンスギャップマーオリゴヌクレオチドは、任意に、カスパーゼ３／７アッセイによって決定されるように、親アンチセンスギャップマーオリゴヌクレオチドよりもＨｅｐＧ２細胞に対して毒性が低い。一実施形態では、修飾アンチセンスギャップマーオリゴヌクレオチドは、親アンチセンスギャップマーオリゴヌクレオチドと比較して、エキソヌクレアーゼ耐性が増加している。一実施形態では、修飾アンチセンスギャップマーオリゴヌクレオチドは、親アンチセンスギャップマーオリゴヌクレオチドと比較して、エンドヌクレアーゼ耐性が増加している。
【0196】
任意に、親アンチセンスギャップマーオリゴヌクレオチドは、ＬＮＡギャップマーまたはＭＯＥギャップマー、例えば全てのヌクレオシド間結合がホスホロチオエート結合であるＬＮＡギャップマーまたはＭＯＥギャップマーであり得る。さらに、製造工程で使用されるヌクレオチド単位は、有利にはヌクレオシドホスホラミダイトである。
【0197】
修飾アンチセンスギャップマーオリゴヌクレオチドは、例えば、領域Ｆ、Ｇ、およびＦ’、並びにＦ－Ｇ－Ｆ’設計に関して、本明細書に記載の任意のＴＮＡギャップマーの特徴を含み得る。
【0198】
本発明によって、上記方法によって得られるまたは得ることができるアンチセンスギャップマーオリゴヌクレオチドも提供される。
【0199】
この方法は、連続ヌクレオチド配列をコンジュゲーティング部分（リガンド）と反応させて、コンジュゲート部分をオリゴヌクレオチドに共有結合させることを更に含み得る。
【0200】
更なる態様では、オリゴヌクレオチドまたはコンジュゲートしたオリゴヌクレオチドを、薬学的に許容され得る希釈剤、溶媒、担体、塩、および／またはアジュバントと混合することを含む、組成物を製造するための方法が提供される。
【0201】
医薬組成物
更なる態様では、本発明は、前述のオリゴヌクレオチドおよび／またはオリゴヌクレオチドコンジュゲートまたはその塩のいずれかと、薬学的に許容され得る希釈剤、担体、塩、および／またはアジュバントとを含む、医薬組成物を提供する。
更なる態様では、本発明は、前述のオリゴヌクレオチドおよび／またはオリゴヌクレオチドコンジュゲートまたはその塩のいずれかと、薬学的に許容され得る希釈剤、担体、塩、および／またはアジュバントとを含む、医薬組成物を提供する。
【0202】
更なる態様では、本発明は、前述のオリゴヌクレオチドおよび／またはオリゴヌクレオチドコンジュゲートまたはその塩のいずれかと、薬学的に許容され得る希釈剤、担体、塩またはアジュバントとを含む、医薬組成物を提供する。
【0203】
薬学的に許容され得る希釈剤には、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）が含まれ、薬学的に許容され得る塩には、限定するものではないが、ナトリウム塩およびカリウム塩が含まれる。いくつかの実施形態では、薬学的に許容され得る希釈剤は、無菌リン酸緩衝生理食塩水である。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、５０～３００μＭ溶液の濃度で薬学的に許容され得る希釈剤中で使用される。
【0204】
本発明によるオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドコンジュゲートは、それらの薬学的に許容され得る塩の形態で存在し得る。「薬学的に許容され得る塩」という用語は、本発明の化合物の生物学的有効性および特性を保持し、適切な非毒性の有機若しくは無機酸または有機若しくは無機塩基から形成される従来の酸付加塩または塩基付加塩を指す。酸付加塩としては、例えば、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硫酸、スルファミン酸、リン酸および硝酸等の無機酸に由来するもの、並びにｐ－トルエンスルホン酸、サリチル酸、メタンスルホン酸、シュウ酸、コハク酸、クエン酸、リンゴ酸、乳酸、フマル酸等の有機酸に由来するもの等が挙げられる。塩基付加塩としては、アンモニウム、カリウム、ナトリウムおよび第四級アンモニウムヒドロキシド、例えば、テトラメチルアンモニウムヒドロキシドに由来するものが挙げられる。薬学的化合物の塩への化学修飾は、化合物の改善された物理的および化学的安定性、吸湿性、流動性並びに溶解性を得るために、薬学者に周知の技術である。これは例えば、Ｂａｓｔｉｎ，Ｏｒｇａｎｉｃ Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ＆Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ２０００，４，４２７－４３５ ｏｒ ｉｎ Ａｎｓｅｌ，Ｉｎ：Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，６ｔｈ ｅｄ．（１９９５），ｐｐ．１９６ ａｎｄ １４５６－１４５７．に記載されている。例えば、本明細書で提供される化合物の薬学的に許容され得る塩は、ナトリウム塩であり得る。
【0205】
本発明での使用に適した製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｐａ．，１７ｔｈ ｅｄ．，１９８５．に見られる。薬物送達の方法の簡単な概説については、例えば、Ｌａｎｇｅｒ（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７－１５３３，１９９０）を参照されたい。国際公開公報第２００７／０３１０９１号は、薬学的に許容され得る希釈剤、担体およびアジュバントの適切で好ましい更なる例を提供する（参照により本明細書に組み込まれる）。適切な用量、製剤、投与経路、組成物、剤形、他の治療薬との組合せ、プロドラッグ製剤もまた、国際公開公報第２００７／０３１０９１号に提供されている。
【0206】
本発明のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドコンジュゲートは、医薬組成物または製剤の調製のために、薬学的に許容され得る活性または不活性物質と混合され得る。医薬組成物の調製のための組成物および方法は、限定されるものではないが、投与経路、疾患の程度、または投与される用量を含む多くの基準に依存する。
【0207】
これらの組成物は、従来の滅菌技術によって滅菌されても、または滅菌フィルタにかけられてもよい。得られた水溶液は、そのまま使用するために包装するか、または凍結乾燥され得て、凍結乾燥された調製物は、投与前に滅菌水性担体と組み合わされる。調製物のｐＨは、典型的には３～１１、より好ましくは５～９または６～８、最も好ましくは７～８、例えば７～７．５であろう。得られた固体形態の組成物は、錠剤またはカプセルの密封パッケージ等のように、各々が上記の薬剤または薬剤群の固定量を含む複数の単回用量単位で包装され得る。固体形態の組成物はまた、局所適用可能なクリームまたは軟膏用に設計された絞り出し可能なチューブ等の柔軟な量の容器に包装することもできる。
【0208】
いくつかの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドコンジュゲートはプロドラッグである。特にオリゴヌクレオチドコンジュゲートに関して、プロドラッグが作用部位、例えば標的細胞に送達されると、コンジュゲート部分はオリゴヌクレオチドから切断される。
【0209】
用途
本明細書に記載のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドコンジュゲートは、研究試薬として、または診断薬、治療薬および予防薬として利用され得る。
本明細書に記載のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドコンジュゲートは、研究試薬として、または診断薬、治療薬および予防薬として利用され得る。
【0210】
研究において、オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドコンジュゲートは、細胞（例えば、インビトロ細胞培養物における）および実験動物における標的核酸の発現を特異的に調節するために使用されてもよく、それにより、標的の機能的分析または治療的介入のための標的としてのその有用性の評価が容易になる。典型的には、標的調節は、タンパク質を生成するｍＲＮＡを分解または阻害し、それによりタンパク質形成を防止することによって、またはタンパク質を生成する遺伝子若しくはｍＲＮＡのモジュレータを分解若しくは阻害することによって達成される。
【0211】
研究または診断においてオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドコンジュゲートを用いる場合、標的核酸は、ｃＤＮＡまたはＤＮＡ若しくはＲＮＡに由来する合成核酸であり得る。
【0212】
標的核酸を含む、標的細胞における標的遺伝子の発現を調節するためのインビボまたはインビトロ方法であって、本発明のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドコンジュゲートを有効量で当該細胞に投与することを含む方法も提供される。
【0213】
いくつかの実施形態では、標的細胞は、哺乳動物細胞、特にヒト細胞である。標的細胞は、ヒト等の哺乳動物の組織の一部を形成するインビトロ細胞培養物またはインビボ 細胞であり得る。
【0214】
オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドコンジュゲートを使用して、ノーザンブロッティング、ｉｎ－ｓｉｔｕハイブリダイゼーションまたは同様の技術によって細胞および組織における標的遺伝子の発現を検出および定量し得る診断用途も提供される。
【0215】
医薬として使用するための本明細書に記載のオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチドコンジュゲート、または医薬組成物も提供される。
【0216】
オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチドコンジュゲートまたは医薬組成物が使用される疾患または障害は、典型的には、標的遺伝子の発現に関連する。好ましくは、疾患または障害は、標的遺伝子の発現を調節することによって処置され得るものである。
【0217】
オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチドコンジュゲートまたは医薬組成物は、例えば、標的遺伝子または標的遺伝子由来の発現産物、例えばＲＮＡ若しくはタンパク質の異常なレベルおよび／または活性によって引き起こされる疾患または障害を処置または予防するために使用され得る。疾患または障害はまた、または代替的には、標的遺伝子における突然変異に関連し得る。したがって、いくつかの実施形態では、標的核酸は、標的遺伝子の変異型である。標的遺伝子の非限定的な例としては、１つ以上の癌、感染性疾患、神経学的疾患若しくは障害、眼疾患若しくは障害、または心血管疾患若しくは障害に関連する遺伝子が挙げられる。
【0218】
本発明に従ったオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチドコンジュゲートまたは医薬組成物は、典型的には有効量で投与される。
【0219】
オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチドコンジュゲート、または医薬組成物が、疾患または障害に罹患しているか、または疾患または障害を有すると疑われる動物またはヒトにおける疾患または障害の処置または予防に使用するための治療用途も提供される。典型的には、疾患または障害は、標的遺伝子の発現を調節することによって処置することができるものである。
【0220】
疾患または障害に罹患しているか、または疾患または障害を有すると疑われる動物またはヒトにおける疾患または障害を処置または予防するための医薬の製造におけるオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドコンジュゲートの使用も提供される。典型的には、疾患または障害は、標的遺伝子の発現を調節することによって処置することができるものである。
【0221】
また、疾患または障害を処置または予防する方法であって、治療有効量または予防有効量のオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチドコンジュゲートまたは医薬組成物を、疾患または障害に罹患しているかまたは罹患しやすい対象に投与することを含む方法も提供される。
【0222】
投与
いくつかの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドまたは医薬組成物を、経口投与され得る。更なる実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドまたは医薬組成物は、局所または腸内または非経口（静脈内、皮下、筋肉内、脳内、脳室内、または髄腔内等）で投与され得る。
いくつかの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドまたは医薬組成物を、経口投与され得る。更なる実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドまたは医薬組成物は、局所または腸内または非経口（静脈内、皮下、筋肉内、脳内、脳室内、または髄腔内等）で投与され得る。
【0223】
好ましい実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドまたは医薬組成物は、非経口経路、例えば、静脈内、動脈内、皮下、腹腔内若しくは筋肉内注射若しくは注入、または髄腔内若しくは頭蓋内投与、例えば脳内または脳室内投与、または硝子体内投与によって投与される。一実施形態では、活性オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドコンジュゲートは、静脈内投与される。別の実施形態では、活性オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドコンジュゲートは、皮下投与される。
【0224】
いくつかの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチドコンジュゲートまたは医薬組成物は、０．１～１５ｍｇ／ｋｇ、例えば０．２～１０ｍｇ／ｋｇ、例えば０．２５～５ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。投与は、週に１回、２週に１回、３週に１回、または月に１回であり得る。
【0225】
併用療法
いくつかの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチドコンジュゲートまたは医薬組成物は、別の治療薬との併用処置で使用される。治療薬は、例えば、本発明のオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチドコンジュゲートまたは医薬組成物で処置される疾患または障害の標準治療であり得る。
いくつかの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチドコンジュゲートまたは医薬組成物は、別の治療薬との併用処置で使用される。治療薬は、例えば、本発明のオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチドコンジュゲートまたは医薬組成物で処置される疾患または障害の標準治療であり得る。
【0226】
実施形態
以下の番号が付けられた実施形態が特に企図される。
以下の番号が付けられた実施形態が特に企図される。
【0227】
１．リボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）Ｈを動員することができる、式５’－Ｆ－Ｇ－Ｆ’－３’（Ｉ）の連続ヌクレオチド配列を含むアンチセンスギャップマーオリゴヌクレオチドであって、
Ｇが、少なくとも３個の連続ＤＮＡヌクレオシドを含む１８個までの連結ヌクレオシドのギャップ領域であり、
ＦおよびＦ’の各々が、独立して、１～１５個の糖修飾ヌクレオシドを含むかまたはそれらからなる、１５個までの連結ヌクレオシドのフランキング領域であり、
Ｆ、Ｆ’、およびＧのうちの少なくとも１つが、α－Ｌ－トレオフラノシル（ＴＮＡ）ヌクレオシドである糖修飾ヌクレオシドを含む、
アンチセンスギャップマーオリゴヌクレオチド。
Ｇが、少なくとも３個の連続ＤＮＡヌクレオシドを含む１８個までの連結ヌクレオシドのギャップ領域であり、
ＦおよびＦ’の各々が、独立して、１～１５個の糖修飾ヌクレオシドを含むかまたはそれらからなる、１５個までの連結ヌクレオシドのフランキング領域であり、
Ｆ、Ｆ’、およびＧのうちの少なくとも１つが、α－Ｌ－トレオフラノシル（ＴＮＡ）ヌクレオシドである糖修飾ヌクレオシドを含む、
アンチセンスギャップマーオリゴヌクレオチド。
【0228】
２．Ｆが、少なくとも１個のＴＮＡヌクレオシドを含む、実施形態１に記載のアンチセンスギャップマーオリゴヌクレオチド。
【0229】
３．Ｆが、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４個のＴＮＡヌクレオシドを含む、前記実施形態のいずれか１つに記載のアンチセンスギャップマーオリゴヌクレオチド。
【0230】
４．Ｆが、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４個のＴＮＡヌクレオシドを含むまたはそれからなる、前記実施形態のいずれか１つに記載のアンチセンスギャップマーオリゴヌクレオチド。
【0231】
５．Ｆ中の少なくとも３’最末端のヌクレオシドが、ＴＮＡヌクレオシドである、前記実施形態のいずれか１つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【0232】
６．Ｆ中の少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１１、１２、１３、または１４個の３’最末端のヌクレオシドが、ＴＮＡヌクレオシドである、前記実施形態のいずれか１つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【0233】
７．Ｆ中の２、３、４、５、６、７、８、９、１２、１３、または１４個の３’最末端のヌクレオシドが、ＴＮＡヌクレオシドである、前記実施形態のいずれか１つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【0234】
８．Ｆ中の少なくとも５’最末端のヌクレオシドが、ＴＮＡヌクレオシドである、前記実施形態のいずれか１つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【0235】
９．Ｆ中の少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１３、または１４個の５’最末端のヌクレオシドが、ＴＮＡヌクレオシドである、前記実施形態のいずれか１つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【0236】
１０．Ｆ中の２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４個の５’最末端のヌクレオシドが、ＴＮＡヌクレオシドである、前記実施形態のいずれか１つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【0237】
１１．Ｆの全ての糖修飾ヌクレオシドが、ＴＮＡヌクレオシドである、前記実施形態のいずれか１つに記載のアンチセンスギャップマーオリゴヌクレオチド。
【0238】
１２．Ｆの全てのヌクレオシドが、ＴＮＡヌクレオシドである、前記実施形態のいずれか１つに記載のアンチセンスギャップマーオリゴヌクレオチド。
【0239】
１３．Ｆ’がいかなるＴＮＡヌクレオシドも含まない、実施形態１～１２のいずれか１つに記載のアンチセンスギャップマーオリゴヌクレオチド。
【0240】
１４．Ｆ’が少なくとも１個のＴＮＡヌクレオシドを含む、実施形態１～１２のいずれか１つに記載のアンチセンスギャップマーオリゴヌクレオチド。
【0241】
１５．Ｆ’が、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４個のＴＮＡヌクレオシドを含む、前記実施形態のいずれか１つに記載のアンチセンスギャップマーオリゴヌクレオチド。
【0242】
１６．Ｆ’が、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４個のＴＮＡヌクレオシドを含むまたはそれからなる、前記実施形態のいずれか１つに記載のアンチセンスギャップマーオリゴヌクレオチド。
【0243】
１７．Ｆ’中の少なくとも５’最末端のヌクレオシドが、ＴＮＡヌクレオシドである、前記実施形態のいずれか１つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【0244】
１８．Ｆ’中の少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４個の５’最末端のヌクレオシドが、ＴＮＡヌクレオシドである、前記実施形態のいずれか１つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【0245】
１９．Ｆ’中の２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４個の５’最末端のヌクレオシドが、ＴＮＡヌクレオシドである、前記実施形態のいずれか１つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【0246】
２０．Ｆ’中の少なくとも３’最末端のヌクレオシドが、ＴＮＡヌクレオシドである、前記実施形態のいずれか１つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【0247】
２１．Ｆ’中の少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４個の３’最末端のヌクレオシドが、ＴＮＡヌクレオシドである、前記実施形態のいずれか１つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【0248】
２２．Ｆ’中の２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４個の３’最末端のヌクレオシドが、ＴＮＡヌクレオシドである、前記実施形態のいずれか１つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【0249】
２３．Ｆ’の全ての糖修飾ヌクレオシドが、ＴＮＡヌクレオシドである、前記実施形態のいずれか１つに記載のアンチセンスギャップマーオリゴヌクレオチド。
【0250】
２４．Ｆ’の全てのヌクレオシドが、ＴＮＡヌクレオシドである、前記実施形態のいずれか１つに記載のアンチセンスギャップマーオリゴヌクレオチド。
【0251】
２５．Ｆ’がいかなるＴＮＡヌクレオシドも含まない、実施形態１および１４～２４のいずれか１つに記載のアンチセンスギャップマーオリゴヌクレオチド。
【0252】
２６．ＦおよびＦ’の各々が、独立して、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４個のＴＮＡヌクレオシドを含むまたはそれからなる、前記実施形態のいずれか１つに記載のアンチセンスギャップマーオリゴヌクレオチド。
【0253】
２７．ＦおよびＦ’が一緒になって、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個のＴＮＡヌクレオシドを含む、前記実施形態のいずれか１つに記載のアンチセンスギャップマーオリゴヌクレオチド。
【0254】
２８．Ｆ、Ｆ’、またはＦとＦ’の両方が、ＴＮＡヌクレオシド以外の１～８個の糖修飾ヌクレオシド、例えばＴＮＡヌクレオシド以外の３、４、または５個の糖修飾ヌクレオシドを更に含む、前記実施形態のいずれか１つに記載のアンチセンスギャップマーオリゴヌクレオチド。
【0255】
２９．Ｆ、Ｆ’、またはＦとＦ’の両方の糖修飾ヌクレオシドが、以下：
２’－メトキシ－リボース（２’－ＯＭｅ）、
２’－Ｏ－メトキシエチル－リボース（２’－Ｏ－ＭＯＥ）、
５’－メチル－２’－Ｏ－メトキシエチルリボース（５’－Ｍｅ－２’－Ｏ－ＭＯＥ）、
２’－Ｏ－［２－（メチルチオ）エチル］－リボース（２’－Ｏ－ＭＴＥ）、
２－（Ｎ－メチルカルバモイル）－エチル］－リボース（２’－Ｏ－ＭＣＥ）、
２’－Ｏ－［２－（メチルアミノ）－２－オキソエチル］－リボース（２’－Ｏ－ＮＭＡ）、
２’－デオキシ－２’－フルオロ－リボース（２’－デオキシ－２’－フルオロリボ－核酸；２’－Ｆ－ＲＮＡにおけるような）、
２’－フルオロ－２’－アラビノース（２’－フルオロ－２’－アラビノース－核酸；２’－Ｆ－ＡＮＡにおけるような）、
２’－Ｏ－ベンジル－リボース、
オキシ、アミノまたはチオβ－Ｄ－ロックドリボース（β－Ｄ－ＬＮＡにおけるような）、
オキシ、アミノまたはチオα－Ｌ－ロックドリボース（α－Ｌ－ＬＮＡにおけるような）、
２’，４’拘束２’－Ｏ－エチルリボース（拘束エチルロックド核酸；ｃＥｔにおけるような）、
トリシクロ－デオキシリボース（トリシクロ－デオキシリボースＤＮＡ；ＴｃＤＮＡにおけるような）、
３’－デオキシ－リボース（３’－デオキシ－リボースＤＮＡ；３’－ＤＮＡにおけるような）、
アンロックドリボース（アンロックド核酸；ＵＮＡにおけるような）、
グリコール（グリコール核酸；ＧＮＡにおけるような）、
ヘキシトール（ヘキシトール核酸；ＨＮＡにおけるような）、
３’－フルオロヘキシトール（３’－フルオロヘキシトール核酸；ＦＨＮＡにおけるような）、
３’－アラビノ－フルオロヘキシトール（３’－アラビノ－フルオロ－ヘキシトール核酸；Ａｒａ－ＦＨＮＡにおけるような）、
シクロヘキセン（シクロヘキセン核酸；ＣｅＮＡにおけるような）、および
フルオロ－シクロヘキセニル（２’－フルオロ－シクロヘキセニル核酸；Ｆ－ＣｅＮＡにおけるような）
からなる群から選択される修飾糖部分を含む少なくとも１個の糖修飾ヌクレオシドを含むか又はそれからなる、前記実施形態のいずれか１つに記載のアンチセンスギャップマーオリゴヌクレオチド。
２’－メトキシ－リボース（２’－ＯＭｅ）、
２’－Ｏ－メトキシエチル－リボース（２’－Ｏ－ＭＯＥ）、
５’－メチル－２’－Ｏ－メトキシエチルリボース（５’－Ｍｅ－２’－Ｏ－ＭＯＥ）、
２’－Ｏ－［２－（メチルチオ）エチル］－リボース（２’－Ｏ－ＭＴＥ）、
２－（Ｎ－メチルカルバモイル）－エチル］－リボース（２’－Ｏ－ＭＣＥ）、
２’－Ｏ－［２－（メチルアミノ）－２－オキソエチル］－リボース（２’－Ｏ－ＮＭＡ）、
２’－デオキシ－２’－フルオロ－リボース（２’－デオキシ－２’－フルオロリボ－核酸；２’－Ｆ－ＲＮＡにおけるような）、
２’－フルオロ－２’－アラビノース（２’－フルオロ－２’－アラビノース－核酸；２’－Ｆ－ＡＮＡにおけるような）、
２’－Ｏ－ベンジル－リボース、
オキシ、アミノまたはチオβ－Ｄ－ロックドリボース（β－Ｄ－ＬＮＡにおけるような）、
オキシ、アミノまたはチオα－Ｌ－ロックドリボース（α－Ｌ－ＬＮＡにおけるような）、
２’，４’拘束２’－Ｏ－エチルリボース（拘束エチルロックド核酸；ｃＥｔにおけるような）、
トリシクロ－デオキシリボース（トリシクロ－デオキシリボースＤＮＡ；ＴｃＤＮＡにおけるような）、
３’－デオキシ－リボース（３’－デオキシ－リボースＤＮＡ；３’－ＤＮＡにおけるような）、
アンロックドリボース（アンロックド核酸；ＵＮＡにおけるような）、
グリコール（グリコール核酸；ＧＮＡにおけるような）、
ヘキシトール（ヘキシトール核酸；ＨＮＡにおけるような）、
３’－フルオロヘキシトール（３’－フルオロヘキシトール核酸；ＦＨＮＡにおけるような）、
３’－アラビノ－フルオロヘキシトール（３’－アラビノ－フルオロ－ヘキシトール核酸；Ａｒａ－ＦＨＮＡにおけるような）、
シクロヘキセン（シクロヘキセン核酸；ＣｅＮＡにおけるような）、および
フルオロ－シクロヘキセニル（２’－フルオロ－シクロヘキセニル核酸；Ｆ－ＣｅＮＡにおけるような）
からなる群から選択される修飾糖部分を含む少なくとも１個の糖修飾ヌクレオシドを含むか又はそれからなる、前記実施形態のいずれか１つに記載のアンチセンスギャップマーオリゴヌクレオチド。
【0256】
３０．Ｆ、Ｆ’、またはＦとＦ’の両方の糖修飾ヌクレオシドが、１個以上の２’糖修飾ヌクレオシド、例えば高親和性２’糖修飾ヌクレオシドを含むかまたはそれからなる、前記実施形態のいずれか１つに記載のアンチセンスギャップマーオリゴヌクレオチド。
【0257】
３１．Ｆ、Ｆ’、またはＦとＦ’の両方の糖修飾ヌクレオシドが、１個以上のＬＮＡヌクレオシドを含む、前記実施形態のいずれか１つに記載のアンチセンスギャップマーオリゴヌクレオチド。
【0258】
３２．少なくとも１個のいずれのＴＮＡヌクレオシドも除いて、Ｆ’およびＦ中の全てのヌクレオシドが、ＬＮＡヌクレオシドである、実施形態３１に記載のアンチセンスギャップマーオリゴヌクレオチド。
【0259】
３３．Ｆ、Ｆ’、またはＦとＦ’の両方の前記糖修飾ヌクレオシドが、１個以上の２’－Ｏ－メトキシエチル－ＲＮＡ（２’－Ｏ－ＭＯＥ）ヌクレオシドを含む、前記実施形態のいずれか１つに記載のアンチセンスギャップマーオリゴヌクレオチド。
【0260】
３４．少なくとも１個のいずれのＴＮＡヌクレオシドも除いて、Ｆ’およびＦ中の全てのヌクレオシドが、２’－Ｏ－ＭＯＥヌクレオシドである、実施形態３３に記載のアンチセンスギャップマーオリゴヌクレオチド。
【0261】
３５．Ｇが、いかなるＴＮＡヌクレオシドも含まない、前記実施形態のいずれか１つに記載のアンチセンスギャップマーオリゴヌクレオチド。
【0262】
３６．Ｇが、少なくとも１個のＴＮＡヌクレオシド、例えば少なくとも１、２、または３個のＴＮＡヌクレオシドを含む、実施形態１～３４のいずれか１つに記載のアンチセンスギャップマーオリゴヌクレオチド。
【0263】
３７．Ｇ中の５’最末端から２番目、３番目、４番目、５番目、６番目、７番目、または８番目のヌクレオシドが、ＴＮＡヌクレオシドである、実施形態３６に記載のアンチセンスギャップマーオリゴヌクレオチド。
【0264】
３８．Ｇ中の３’最末端から２番目、３番目、４番目、５番目、６番目、７番目、または８番目のヌクレオシドが、ＴＮＡヌクレオシドである、実施形態３６または３７に記載のアンチセンスギャップマーオリゴヌクレオチド。
【0265】
３９．Ｇ中の少なくとも５’最末端および３’最末端のヌクレオシドが、ＤＮＡヌクレオシドである、前記実施形態のいずれか１つに記載のアンチセンスギャップマーオリゴヌクレオチド。
【0266】
４０．少なくとも１個のいずれのＴＮＡヌクレオシドも除いて、Ｇの全てのヌクレオシドが、ＤＮＡヌクレオシドである、前記実施形態のいずれか１つに記載のアンチセンスギャップマーオリゴヌクレオチド。
【0267】
４１．前記ギャップ領域Ｇが、少なくとも４個のＤＮＡヌクレオシド、例えば４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または１６個の連続ＤＮＡヌクレオシドを含む、前記実施形態のいずれか１つに記載のアンチセンスギャップマーオリゴヌクレオチド。
【0268】
４２．Ｇが最大で１０個のＤＮＡヌクレオシド、例えば９、８、７、６、５、または４個のＤＮＡヌクレオシドを含む、前記実施形態のいずれか１つに記載のアンチセンスギャップマー。
【0269】
４３．少なくとも１つの修飾されたヌクレオシド間結合を含む、前記実施形態のいずれか１つに記載のアンチセンスギャップマーオリゴヌクレオチド。
【0270】
４４．ヌクレアーゼ耐性修飾ヌクレオシド間結合を含む、前記実施形態のいずれか１つに記載のアンチセンスギャップマーオリゴヌクレオチド。
【0271】
４５．全てのヌクレオシド間結合が、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合である、前記実施形態のいずれか１つに記載のアンチセンスギャップマーオリゴヌクレオチド。
【0272】
４６．式５’－Ｆ－Ｇ－Ｆ’－３’（Ｉ）の前記連続ヌクレオチド配列が、１２～３２個のヌクレオシド、例えば１２～２８個のヌクレオシド、例えば１２～２６個のヌクレオシド、例えば１４～２６個のヌクレオシド、例えば１４～２４個のヌクレオシド、例えば１４～２２個のヌクレオシド、例えば１６～２２個のヌクレオシド、例えば１６～２０個のヌクレオシドの長さを有する、前記実施形態のいずれか１つに記載のアンチセンスギャップマーオリゴヌクレオチド。
【0273】
４７．前記連続ヌクレオチド配列が、以下の式：
Ｆ１～１５－Ｇ３～１８－Ｆ’１～１５（ＩＶ）、例えば、Ｆ１～１５－Ｇ３～１８－Ｆ’１～１２（ＩＶａ）若しくはＦ１～１２－Ｇ３～１８－Ｆ’１～１５（ＩＶｂ）；
Ｆ１～１２－Ｇ３～１８－Ｆ’１～１２（Ｖ）、例えば、Ｆ１～１２－Ｇ３～１８－Ｆ’１～９（Ｖａ）、若しくはＦ１～９－Ｇ３～１８－Ｆ’１～１２（Ｖｂ）；
Ｆ１～１２－Ｇ４～１６－Ｆ’１～１２（ＶＩ）、例えば、Ｆ１～１２－Ｇ４～１６－Ｆ’１～９（ＶＩａ）若しくはＦ１～９－Ｇ４～１６－Ｆ’１～１２（ＶＩｂ）；または
Ｆ３～１２－Ｇ４～１０－Ｆ’３～１２（ＶＩＩ）、例えば、Ｆ３～１２－Ｇ４～１０－Ｆ’３～９（ＶＩＩａ）若しくはＦ３～９－Ｇ４～１０－Ｆ’３～１２（ＶＩＩｂ）
のものであり、式中、数値範囲は、Ｆ、ＧおよびＦ’中のそれぞれ連結ヌクレオシドの数を表す、実施形態４６に記載のアンチセンスギャップマーオリゴヌクレオチド。
Ｆ１～１５－Ｇ３～１８－Ｆ’１～１５（ＩＶ）、例えば、Ｆ１～１５－Ｇ３～１８－Ｆ’１～１２（ＩＶａ）若しくはＦ１～１２－Ｇ３～１８－Ｆ’１～１５（ＩＶｂ）；
Ｆ１～１２－Ｇ３～１８－Ｆ’１～１２（Ｖ）、例えば、Ｆ１～１２－Ｇ３～１８－Ｆ’１～９（Ｖａ）、若しくはＦ１～９－Ｇ３～１８－Ｆ’１～１２（Ｖｂ）；
Ｆ１～１２－Ｇ４～１６－Ｆ’１～１２（ＶＩ）、例えば、Ｆ１～１２－Ｇ４～１６－Ｆ’１～９（ＶＩａ）若しくはＦ１～９－Ｇ４～１６－Ｆ’１～１２（ＶＩｂ）；または
Ｆ３～１２－Ｇ４～１０－Ｆ’３～１２（ＶＩＩ）、例えば、Ｆ３～１２－Ｇ４～１０－Ｆ’３～９（ＶＩＩａ）若しくはＦ３～９－Ｇ４～１０－Ｆ’３～１２（ＶＩＩｂ）
のものであり、式中、数値範囲は、Ｆ、ＧおよびＦ’中のそれぞれ連結ヌクレオシドの数を表す、実施形態４６に記載のアンチセンスギャップマーオリゴヌクレオチド。
【0274】
４８．前記アンチセンスギャップマーオリゴヌクレオチドが、
（ａ）標的核酸の前記発現レベルを、前記標的の正常発現レベルと比較して、少なくとも約５０％、例えば少なくとも約６０％、例えば少なくとも約７０％、例えば少なくとも約８０％、例えば少なくとも約９０％低下させることができる、
（ｂ）標的核酸の発現レベルを低下させるための約２０μＭ以下、例えば約１０μＭ以下、例えば約５μＭ以下のＩＣ５０を有する、
（ｃ）実施例４に記載されるカスパーゼ３／７アッセイを使用する場合、アッセイウィンドウパーセンテージ（ＡＷ％）は、好ましくは最大で約６０％、例えば最大で約４０％、例えば約最大で２０％、例えば最大で約１０％である、
（ｄ）アンチセンスギャップマーオリゴヌクレオチドとＲＮＡ標的配列との二重鎖の形態で、少なくとも約５０℃、例えば少なくとも約５２℃、例えば少なくとも約５４℃、例えば少なくとも約５６℃、例えば少なくとも約５８℃、例えば少なくとも約６０℃の融解温度（Ｔｍ）を有する、または
（ｅ）（ａ）と（ｂ）、（ａ）と（ｃ）、（ａ）と（ｄ）、（ｂ）と（ｃ）、（ｂ）と（ｄ）、（ａ）と（ｂ）と（ｃ）、（ａ）と（ｂ）と（ｄ）、（ａ）と（ｃ）と（ｄ）、（ｂ）と（ｃ）と（ｄ）の組み合わせ、または（ａ）～（ｄ）の全てである、
前記実施形態のいずれか１つに記載のアンチセンスギャップマーオリゴヌクレオチド。
（ａ）標的核酸の前記発現レベルを、前記標的の正常発現レベルと比較して、少なくとも約５０％、例えば少なくとも約６０％、例えば少なくとも約７０％、例えば少なくとも約８０％、例えば少なくとも約９０％低下させることができる、
（ｂ）標的核酸の発現レベルを低下させるための約２０μＭ以下、例えば約１０μＭ以下、例えば約５μＭ以下のＩＣ５０を有する、
（ｃ）実施例４に記載されるカスパーゼ３／７アッセイを使用する場合、アッセイウィンドウパーセンテージ（ＡＷ％）は、好ましくは最大で約６０％、例えば最大で約４０％、例えば約最大で２０％、例えば最大で約１０％である、
（ｄ）アンチセンスギャップマーオリゴヌクレオチドとＲＮＡ標的配列との二重鎖の形態で、少なくとも約５０℃、例えば少なくとも約５２℃、例えば少なくとも約５４℃、例えば少なくとも約５６℃、例えば少なくとも約５８℃、例えば少なくとも約６０℃の融解温度（Ｔｍ）を有する、または
（ｅ）（ａ）と（ｂ）、（ａ）と（ｃ）、（ａ）と（ｄ）、（ｂ）と（ｃ）、（ｂ）と（ｄ）、（ａ）と（ｂ）と（ｃ）、（ａ）と（ｂ）と（ｄ）、（ａ）と（ｃ）と（ｄ）、（ｂ）と（ｃ）と（ｄ）の組み合わせ、または（ａ）～（ｄ）の全てである、
前記実施形態のいずれか１つに記載のアンチセンスギャップマーオリゴヌクレオチド。
【0275】
４９．前記標的核酸がＲＮＡ標的配列であり、前記ＲＮＡ標的配列が、式Ｉの連続ヌクレオチド配列に相補的な核酸塩基配列を有し、任意に、（ａ）および（ｂ）が、前記標的核酸を発現する標的細胞において決定され、約２５μＭの濃度で約３日間、前記アンチセンスギャップマーオリゴヌクレオチドと共にインキュベートされる、実施形態４８に記載のアンチセンスギャップマーオリゴヌクレオチド。
【0276】
５０．リボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）Ｈを動員することができる、式５’－Ｆ－Ｇ－Ｆ’－３’（Ｉ）の連続ヌクレオチド配列を含むアンチセンスギャップマーオリゴヌクレオチドであって、連続ヌクレオチド配列が、少なくとも１個のＴＮＡヌクレオシドを含む、アンチセンスギャップマーオリゴヌクレオチド。
【0277】
５１．式５’－Ｆ－Ｇ－Ｆ’－３’（Ｉ）の前記連続ヌクレオチド配列が、１２～３２個のヌクレオシド、例えば１２～２８個のヌクレオシド、例えば１２～２６個のヌクレオシド、例えば１４～２６個のヌクレオシド、例えば１４～２４個のヌクレオシド、例えば１４～２２個のヌクレオシド、例えば１６～２２個のヌクレオシド、例えば１６～２０個のヌクレオシドの長さを有する、実施形態５０に記載のアンチセンスギャップマーオリゴヌクレオチド。
【0278】
５２．前記連続ヌクレオチド配列が、以下の式：
Ｆ１～１５－Ｇ３～１８－Ｆ’１～１５（ＩＶ）、例えば、Ｆ１～１５－Ｇ３～１８－Ｆ’１～１２（ＩＶａ）若しくはＦ１～１２－Ｇ３～１８－Ｆ’１～１５（ＩＶｂ）；
Ｆ１～１２－Ｇ３～１８－Ｆ’１～１２（Ｖ）、例えば、Ｆ１～１２－Ｇ３～１８－Ｆ’１～９（Ｖａ）若しくはＦ１～９－Ｇ３～１８－Ｆ’１～１２（Ｖｂ）；
Ｆ１～１２－Ｇ４～１６－Ｆ’１～１２（ＶＩ）、例えば、Ｆ１～１２－Ｇ４～１６－Ｆ’１～９（ＶＩａ）若しくはＦ１～９－Ｇ４～１６－Ｆ’１～１２（ＶＩｂ）；または
Ｆ３～１２－Ｇ４～１０－Ｆ’３～１２（ＶＩＩ）、例えば、Ｆ３～１２－Ｇ４～１０－Ｆ’３～９（ＶＩＩａ）若しくはＦ３～９－Ｇ４～１０－Ｆ’３～１２（ＶＩＩｂ）
のものであり、式中、数値範囲は、Ｆ、ＧおよびＦ’中のそれぞれ連結ヌクレオシドの数を表す、実施形態５０および５１のいずれか１つに記載のアンチセンスギャップマーオリゴヌクレオチド。
Ｆ１～１５－Ｇ３～１８－Ｆ’１～１５（ＩＶ）、例えば、Ｆ１～１５－Ｇ３～１８－Ｆ’１～１２（ＩＶａ）若しくはＦ１～１２－Ｇ３～１８－Ｆ’１～１５（ＩＶｂ）；
Ｆ１～１２－Ｇ３～１８－Ｆ’１～１２（Ｖ）、例えば、Ｆ１～１２－Ｇ３～１８－Ｆ’１～９（Ｖａ）若しくはＦ１～９－Ｇ３～１８－Ｆ’１～１２（Ｖｂ）；
Ｆ１～１２－Ｇ４～１６－Ｆ’１～１２（ＶＩ）、例えば、Ｆ１～１２－Ｇ４～１６－Ｆ’１～９（ＶＩａ）若しくはＦ１～９－Ｇ４～１６－Ｆ’１～１２（ＶＩｂ）；または
Ｆ３～１２－Ｇ４～１０－Ｆ’３～１２（ＶＩＩ）、例えば、Ｆ３～１２－Ｇ４～１０－Ｆ’３～９（ＶＩＩａ）若しくはＦ３～９－Ｇ４～１０－Ｆ’３～１２（ＶＩＩｂ）
のものであり、式中、数値範囲は、Ｆ、ＧおよびＦ’中のそれぞれ連結ヌクレオシドの数を表す、実施形態５０および５１のいずれか１つに記載のアンチセンスギャップマーオリゴヌクレオチド。
【0279】
５３．実施形態２～４９のいずれか１つの特徴を更に含む、実施形態５０～５２のいずれか１つに記載のアンチセンスギャップマー。
【0280】
５４．式ＩＶａの前記連続ヌクレオチド配列が、少なくとも１６個のヌクレオシドの長さを有し、かつ
（ａ）Ｆ中の５’最末端のヌクレオシドおよびＦ中のヌクレオシドが、独立して、３、４、または５個の高親和性糖修飾ヌクレオシドであり、
（ｂ）Ｆ中の残りのヌクレオシドが、ＴＮＡヌクレオシドであり、かつ
（ｃ）Ｇ中の全てのヌクレオシドが、ＤＮＡヌクレオシドである、
実施形態４７～５３のいずれか１つに記載のアンチセンスギャップマーオリゴヌクレオチド。
（ａ）Ｆ中の５’最末端のヌクレオシドおよびＦ中のヌクレオシドが、独立して、３、４、または５個の高親和性糖修飾ヌクレオシドであり、
（ｂ）Ｆ中の残りのヌクレオシドが、ＴＮＡヌクレオシドであり、かつ
（ｃ）Ｇ中の全てのヌクレオシドが、ＤＮＡヌクレオシドである、
実施形態４７～５３のいずれか１つに記載のアンチセンスギャップマーオリゴヌクレオチド。
【0281】
５５．Ｇが、最大で１０個の連続ＤＮＡヌクレオシド、例えば９、８、７、６、５、または４個の連続ＤＮＡヌクレオシドを含む、実施形態５４に記載のアンチセンスギャップマーオリゴヌクレオチド。
【0282】
５６．式ＩＶの前記連続ヌクレオチド配列が、少なくとも１６個のヌクレオシドの長さを有し、かつ
（ａ）ＦおよびＦ’が、それぞれ独立して、３、４、または５個のヌクレオシドからなり、
（ｂ）ＦおよびＦ’中のヌクレオシドの少なくとも１個が、ＴＮＡヌクレオシドであり、残りのヌクレオシドが、高親和性糖修飾ヌクレオシドであり、
（ｃ）Ｇ中の全てのヌクレオシドが、ＤＮＡヌクレオシドである、
実施形態４７～５３のいずれか１つに記載のアンチセンスギャップマーオリゴヌクレオチド。
（ａ）ＦおよびＦ’が、それぞれ独立して、３、４、または５個のヌクレオシドからなり、
（ｂ）ＦおよびＦ’中のヌクレオシドの少なくとも１個が、ＴＮＡヌクレオシドであり、残りのヌクレオシドが、高親和性糖修飾ヌクレオシドであり、
（ｃ）Ｇ中の全てのヌクレオシドが、ＤＮＡヌクレオシドである、
実施形態４７～５３のいずれか１つに記載のアンチセンスギャップマーオリゴヌクレオチド。
【0283】
５７．ＦおよびＦ’中の全てのヌクレオシドが、ＴＮＡヌクレオシドである、実施形態５６のアンチセンスギャップマーオリゴヌクレオチド。
【0284】
５８．式ＩＶの前記連続ヌクレオチド配列が、少なくとも１６個のヌクレオシドの長さを有し、かつ
（ａ）ＦおよびＦ’が、それぞれ独立して、３、４、若しくは５個の連結された高親和性糖修飾ヌクレオシドを含むか、またはそれらからなり、かつ、いかなるＴＮＡヌクレオシドも含まず、かつ
（ｂ）Ｇ中の５’最末端から２番目、３番目、４番目、または５番目のヌクレオシドが、ＴＮＡヌクレオシドであり、かつＧ中の残りのヌクレオシドが、ＤＮＡヌクレオシドである、
実施形態４７～５３のいずれか１つに記載のアンチセンスギャップマーオリゴヌクレオチド。
（ａ）ＦおよびＦ’が、それぞれ独立して、３、４、若しくは５個の連結された高親和性糖修飾ヌクレオシドを含むか、またはそれらからなり、かつ、いかなるＴＮＡヌクレオシドも含まず、かつ
（ｂ）Ｇ中の５’最末端から２番目、３番目、４番目、または５番目のヌクレオシドが、ＴＮＡヌクレオシドであり、かつＧ中の残りのヌクレオシドが、ＤＮＡヌクレオシドである、
実施形態４７～５３のいずれか１つに記載のアンチセンスギャップマーオリゴヌクレオチド。
【0285】
５９．前記高親和性糖修飾ヌクレオシドが、実施形態２９の糖修飾ヌクレオシドから選択される、実施形態５４～５８のいずれか１に記載のアンチセンスギャップマーオリゴヌクレオチド。
【0286】
６０．前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドである、前記実施形態のいずれか１つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【0287】
６１．前記実施形態のいずれか１つに記載のアンチセンスギャップマーオリゴヌクレオチドと、前記オリゴヌクレオチドに共有結合した少なくとも１つのコンジュゲート部分とを、任意にリンカーを介して含む、コンジュゲート。
【0288】
６２．前記コンジュゲート部分が、炭水化物、細胞表面受容体リガンド、原薬、ホルモン、親油性物質、ポリマー、タンパク質、ペプチド、毒素、ビタミン、ウイルスタンパク質、およびそれらの組合せから選択される、実施形態６１に記載のコンジュゲート。
【0289】
６３．前記コンジュゲート部分が、脳血液関門を通過する送達を促進する、実施形態６１または６２に記載のコンジュゲート。
【0290】
６４．実施形態１～６０のいずれか１つに記載のアンチセンスギャップマーオリゴヌクレオチドまたは実施形態６１～６３のいずれか１つに記載のコンジュゲートの、薬学的に許容され得る塩。
【0291】
６５．実施形態１～６０のいずれか１つに記載のアンチセンスギャップマーオリゴヌクレオチド、実施形態６１～６３のいずれか１つに記載のコンジュゲート、または実施形態６４に記載の薬学的に許容され得る塩と、薬学的に許容され得る希釈剤、溶媒、担体、塩、および／またはアジュバントとを含む、医薬組成物。
【0292】
６６．医薬として使用するための、実施形態１～６０のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、実施形態６１～６３のいずれか１つに記載のコンジュゲート、実施形態６４に記載の薬学的に許容され得る塩、または実施形態６５に記載の医薬組成物。
【0293】
６７．親アンチセンスギャップマーオリゴヌクレオチドの修飾バージョンを調製する方法であって、前記親アンチセンスギャップマーが、ＲＮアーゼＨを動員することができる式５’Ｆ－Ｇ－Ｆ’３’（Ｉ）の連続ヌクレオチド配列を含み、式中、Ｇは、５～１８個の連結されたＤＮＡヌクレオシドのギャップ領域であり、ＦおよびＦ’の各々は、独立して、ＴＮＡヌクレオシド以外の１～８個の糖修飾ヌクレオシドを含むかまたはそれらからなる８個までの連結ヌクレオシドのフランキング領域であり、前記修飾バージョンにおいて、前記親アンチセンスギャップマーオリゴヌクレオチドのＦ、Ｆ’および／またはＧ中の少なくとも１個のヌクレオシドは、ＴＮＡヌクレオシドで置換されており、
前記方法は、ヌクレオチド単位を反応させて、前記オリゴヌクレオチドに含まれる共有結合した連続ヌクレオチド単位を形成することによって前記修飾アンチセンスギャップマーオリゴヌクレオチドを製造する工程を含み、前記ヌクレオチド単位の少なくとも１つは、ＴＮＡヌクレオシドを含み、
任意に、前記修飾アンチセンスギャップマーオリゴヌクレオチドを精製または単離することを含む、方法。
前記方法は、ヌクレオチド単位を反応させて、前記オリゴヌクレオチドに含まれる共有結合した連続ヌクレオチド単位を形成することによって前記修飾アンチセンスギャップマーオリゴヌクレオチドを製造する工程を含み、前記ヌクレオチド単位の少なくとも１つは、ＴＮＡヌクレオシドを含み、
任意に、前記修飾アンチセンスギャップマーオリゴヌクレオチドを精製または単離することを含む、方法。
【0294】
６８．前記修飾アンチセンスギャップマーオリゴヌクレオチドが、前記親アンチセンスギャップマーオリゴヌクレオチドと比較して、毒性、任意に肝毒性が低下している、実施形態６７に記載の方法。
【0295】
６９．前記修飾アンチセンスギャップマーオリゴヌクレオチドが、任意に、カスパーゼ３／７アッセイによって決定される場合、前記親アンチセンスギャップマーオリゴヌクレオチドよりもＨｅｐＧ２細胞に対して毒性が低い、実施形態６７および６８のいずれか１つに記載の方法。
【0296】
７０．前記修飾アンチセンスギャップマーオリゴヌクレオチドが、前記親アンチセンスギャップマーオリゴヌクレオチドと比較して増大したエキソヌクレアーゼ耐性を有する、実施形態６７～６９のいずれか１つに記載の方法。
【0297】
７１．前記修飾アンチセンスギャップマーオリゴヌクレオチドが、前記親アンチセンスギャップマーオリゴヌクレオチドと比較して増大したエンドヌクレアーゼ耐性を有する、実施形態６７～７０のいずれか１つに記載の方法。
【0298】
７２．前記親アンチセンスギャップマーオリゴヌクレオチドが、ＬＮＡギャップマーまたはＭＯＥギャップマーであり、任意に、全てのヌクレオシド間結合がホスホロチオエート結合である、実施形態６７～７１のいずれか１つに記載の方法。
【0299】
７３．前記ヌクレオチド単位が、ヌクレオシドホスホラミダイトである、実施形態６７～７２のいずれか１つに記載の方法。
【0300】
７４．前記修飾アンチセンスギャップマーオリゴヌクレオチドが、実施形態１～６０のいずれか１つの特徴を含む、実施形態６７～７３のいずれか１つに記載の方法。
【0301】
７５．実施形態６７～７４のいずれか１つに記載の方法によって得られるまたは得ることができる、アンチセンスギャップマーオリゴヌクレオチド。
【0302】
７６．実施形態１～６０のいずれか１つに記載のアンチセンスギャップマーオリゴヌクレオチドまたは実施形態６１～６３のいずれか１つに記載のコンジュゲートの調製における、ＴＮＡヌクレオチドの使用。
【実施例】
【0303】
実施例１：ＴＮＡ修飾を用いたオリゴヌクレオチド合成
ＢｉｏａｕｔｏｍａｔｉｏｎによるＭｅｒＭａｄｅ１２自動ＤＮＡシンセサイザーを使用して、オリゴヌクレオチドを合成した。合成は、ユニバーサルリンカーを備えた制御された細孔ガラス支持体（５００Å）を使用して１μｍｏｌスケールで実施した。
ＢｉｏａｕｔｏｍａｔｉｏｎによるＭｅｒＭａｄｅ１２自動ＤＮＡシンセサイザーを使用して、オリゴヌクレオチドを合成した。合成は、ユニバーサルリンカーを備えた制御された細孔ガラス支持体（５００Å）を使用して１μｍｏｌスケールで実施した。
【0304】
ＤＮＡ、ＭＯＥおよびＬＮＡホスホラミダイトのカップリングのための標準サイクル手順において、４，４－ジメトキシトリチル（ＤＭＴ）脱保護を、ＣＨ２Ｃｌ２中３％（ｗ／ｖ）トリクロロ酢酸を用いて２３０μＬの８回の適用で７０秒間行った。それぞれのホスホラミダイトを、アセトニトリル（またはＬＮＡ－ｍＣ構成要素についてはアセトニトリル／ＣＨ２Ｃｌ２ １：１）中０．１Ｍ溶液９５μＬおよび活性化剤としての無水アセトニトリル中５－ベンジルチオ－１－Ｈ－テトラゾールの０．３Ｍ溶液１１０μＬと、１８０秒のカップリング時間で３回カップリングさせた。
【0305】
新たに調製したα－Ｌ－トレオフラノシル（ＴＮＡ）ホスホラミダイトを、９５μＬのアセトニトリル中０．１Ｍ溶液および１１０μＬの活性化剤としての無水アセトニトリル中５－ベンジルチオ－１－Ｈ－テトラゾールの０．３ Ｍ溶液と、３６０秒のカップリング時間で３回カップリングさせた。３－アミノ－１，２，４－ジチアゾール－５－チオンのアセトニトリル／ピリジン：１／１中０．１Ｍ溶液を用いて、２００μＬを８０秒間２回適用して硫化を行った。酸化は、ＴＨＦ／ｐｙｒ／Ｈ２Ｏ：８８／１０／２中の０．０２Ｍ Ｉ２を使用して２回の適用で８０秒間行った。ＴＨＦ／ルチジン／Ａｃ２Ｏ ８：１：１（ＣａｐＡ、１２５μＬ）およびピリジン中０．６２５％ＤＭＡＰ（ＣａｐＢ、１２５μＬ）を用いて８５秒間２回キャッピングを行った。合成後、制御された細孔ガラス（ＣＰＧ）を次に４ｍＬバイアルに慎重に移し、１ｍＬの２５％ＮＨ４ＯＨを添加し、５５℃で２４時間放置した。粗ＤＭＴオンオリゴヌクレオチドを、Ｃ１８カラムを使用するＲＰ－ＨＰＬＣ精製、続いて８０％酢酸水溶液でＤＭＴを除去することによって、またはカートリッジ精製によって精製した。オリゴヌクレオチドを、高分解能エレクトロスプレー質量分析と組み合わせた逆相超高速液体クロマトグラフィーによって特徴付けた。
【0306】
ＴＮＡホスホラミダイトは、Ｚｈａｎｇ ａｎｄ Ｃｈａｐｕｔ，’’Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｒｅｏｓｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ（ＴＮＡ）Ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ Ｍｏｎｏｍｅｒｓ ａｎｄ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４．５１．１－４．５１．２６，２０１２’’に記載されているように合成した。他の全ての試薬は、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。
【0307】
上記手順に従って、表１に示す分子を調製した。
【0308】
（表１）ＴＮＡ部分を含む合成分子（転移関連肺腺癌転写物１（Ｍａｌａｔ－１）を標的とする）
ＣＭＰ ＩＤ番号＝化合物ＩＤ番号
ＣＭＰ ＩＤ番号＝化合物ＩＤ番号
【0309】
表１～６の配列において、
Ａ、Ｇ、ｍＣおよびＴ（太字）は、α－Ｌ－トレオフラノシル（ＴＮＡ）ヌクレオシドを表し、
Ａ、Ｇ、ｍＣおよびＴ（下線）は、２’－Ｏ－ＭＯＥヌクレオシドを表し、
Ａ、Ｇ、ｍＣおよびＴは、β－Ｄ－オキシ－ＬＮＡヌクレオシドを表し、
ａ、ｇ、ｃおよびｔはＤＮＡヌクレオシドを表す。
Ａ、Ｇ、ｍＣおよびＴ（太字）は、α－Ｌ－トレオフラノシル（ＴＮＡ）ヌクレオシドを表し、
Ａ、Ｇ、ｍＣおよびＴ（下線）は、２’－Ｏ－ＭＯＥヌクレオシドを表し、
Ａ、Ｇ、ｍＣおよびＴは、β－Ｄ－オキシ－ＬＮＡヌクレオシドを表し、
ａ、ｇ、ｃおよびｔはＤＮＡヌクレオシドを表す。
【0310】
全ての結合をホスホロチオエート結合として調製した。
【0311】
表１の分子に関する更なる詳細を表２に示し、表２では、合成された各分子の構造は、高分子の階層編集言語（ＨＥＬＭ）によって定義される（詳細については、Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｉｎｆ．Ｍｏｄｅｌ．２０１２，５２，１０，２７９６－２８０６を参照）。さらに、それぞれの合成された各分子が基づく核酸塩基配列の配列番号を示す。以下のＨＥＬＭ注釈キーが使用される：
［ＬＲ］（Ｇ）は、ベータ－Ｄ－オキシ－ＬＮＡグアニンヌクレオシドであり、
［ＬＲ］（Ｔ）は、ベータ－Ｄ－オキシ－ＬＮＡチミンヌクレオシドであり、
［ＬＲ］（Ａ）は、ベータ－Ｄ－オキシ－ＬＮＡアデニンヌクレオシドであり、
［ＬＲ］（［５ｍｅＣ］）は、ベータ－Ｄ－オキシ－ＬＮＡ５－メチルシトシンヌクレオシドであり、
［ｄＲ］（Ｇ）は、ＤＮＡグアニンヌクレオシドであり、
［ｄＲ］（Ｔ）は、ＤＮＡチミンヌクレオシドであり、
［ｄＲ］（Ａ）は、ＤＮＡアデニンヌクレオシドであり、
［ｄＲ］（［Ｃ］はＤＮＡシトシンヌクレオシドであり、
［ＭＯＥ］（［５ｍｅＣ］）は、２’－Ｏ－ＭＯＥ［２’Ｏ－（２－メトキシエチル）］５－メチルシチジンヌクレオシドであり、
［ＭＯＥ］（Ａ）は、２’－Ｏ－ＭＯＥ［２’Ｏ－（２－メトキシエチル）］アデニンヌクレオシドであり、
［ＭＯＥ］（Ｔ）は、２’－Ｏ－ＭＯＥ［２’Ｏ－（２－メトキシエチル）］チミンヌクレオシドであり、
［ＭＯＥ］（Ｇ）は、２’－Ｏ－ＭＯＥ［２’Ｏ－（２－メトキシエチル）］グアニンヌクレオシドであり、
［ＴＮＡ］（［５ｍｅＣ］）は、ＴＮＡ ５－メチルシチジンヌクレオシドである。
［ＴＮＡ］（Ａ）は、ＴＮＡアデニンヌクレオシドであり、
［ＴＮＡ］（Ｔ）は、ＴＮＡチミンヌクレオシドであり、
［ＴＮＡ］（Ｇ）は、ＴＮＡグアニンヌクレオシドであり、
［ｓＰ］は、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。
［ＬＲ］（Ｇ）は、ベータ－Ｄ－オキシ－ＬＮＡグアニンヌクレオシドであり、
［ＬＲ］（Ｔ）は、ベータ－Ｄ－オキシ－ＬＮＡチミンヌクレオシドであり、
［ＬＲ］（Ａ）は、ベータ－Ｄ－オキシ－ＬＮＡアデニンヌクレオシドであり、
［ＬＲ］（［５ｍｅＣ］）は、ベータ－Ｄ－オキシ－ＬＮＡ５－メチルシトシンヌクレオシドであり、
［ｄＲ］（Ｇ）は、ＤＮＡグアニンヌクレオシドであり、
［ｄＲ］（Ｔ）は、ＤＮＡチミンヌクレオシドであり、
［ｄＲ］（Ａ）は、ＤＮＡアデニンヌクレオシドであり、
［ｄＲ］（［Ｃ］はＤＮＡシトシンヌクレオシドであり、
［ＭＯＥ］（［５ｍｅＣ］）は、２’－Ｏ－ＭＯＥ［２’Ｏ－（２－メトキシエチル）］５－メチルシチジンヌクレオシドであり、
［ＭＯＥ］（Ａ）は、２’－Ｏ－ＭＯＥ［２’Ｏ－（２－メトキシエチル）］アデニンヌクレオシドであり、
［ＭＯＥ］（Ｔ）は、２’－Ｏ－ＭＯＥ［２’Ｏ－（２－メトキシエチル）］チミンヌクレオシドであり、
［ＭＯＥ］（Ｇ）は、２’－Ｏ－ＭＯＥ［２’Ｏ－（２－メトキシエチル）］グアニンヌクレオシドであり、
［ＴＮＡ］（［５ｍｅＣ］）は、ＴＮＡ ５－メチルシチジンヌクレオシドである。
［ＴＮＡ］（Ａ）は、ＴＮＡアデニンヌクレオシドであり、
［ＴＮＡ］（Ｔ）は、ＴＮＡチミンヌクレオシドであり、
［ＴＮＡ］（Ｇ）は、ＴＮＡグアニンヌクレオシドであり、
［ｓＰ］は、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。
【0312】
（表２）ＨＥＬＭアノテーションにおける合成分子
【0313】
ＨＥＬＭのための更なる情報およびオープンソースのツールは、インターネットアドレスｗｗｗ．ｐｉｓｔｏｉａａｌｌｉａｎｃｅ．ｏｒｇ／ｈｅｌｍ－ｔｏｏｌｓ／およびｗｗｗ．ｐｉｓｔｏｉａａｌｌｉａｎｃｅ．ｏｒｇ／ｍｅｍｂｅｒｓｈｉｐ／（いずれも２０２２年１２月２日にアクセス）で見つけることができる。
【0314】
実施例２：２つの異なる濃度（５および２５μＭ）でのＡ５４９細胞におけるＭａｌａｔ１ ＲＮＡを標的とするオリゴヌクレオチドのインビトロ有効性
Ａ５４９細胞株をＡＴＣＣから購入し、供給業者による推奨のとおりに、３７℃、５％ＣＯ２の加湿インキュベーター内で維持した。アッセイでは、３０００細胞／ウェルを９６マルチウェルプレートに完全培養培地中において播種した。細胞を２４時間インキュベートした後、示される最終濃度のＰＢＳに溶解したオリゴヌクレオチドを添加した。オリゴヌクレオチドの添加の３日後に、細胞を採取した。ＲＮｅａｓｙ ９６ ＲＮＡ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を製造者の説明書に従って使用してＲＮＡを抽出し、５０μｌの水に溶出した。続いてＲＮＡをＤＮａｓｅ／ＲＮａｓｅフリー水で１０倍に希釈し、９０℃で１分間加熱した。
Ａ５４９細胞株をＡＴＣＣから購入し、供給業者による推奨のとおりに、３７℃、５％ＣＯ２の加湿インキュベーター内で維持した。アッセイでは、３０００細胞／ウェルを９６マルチウェルプレートに完全培養培地中において播種した。細胞を２４時間インキュベートした後、示される最終濃度のＰＢＳに溶解したオリゴヌクレオチドを添加した。オリゴヌクレオチドの添加の３日後に、細胞を採取した。ＲＮｅａｓｙ ９６ ＲＮＡ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を製造者の説明書に従って使用してＲＮＡを抽出し、５０μｌの水に溶出した。続いてＲＮＡをＤＮａｓｅ／ＲＮａｓｅフリー水で１０倍に希釈し、９０℃で１分間加熱した。
【0315】
遺伝子発現解析では、Ｏｎｅ Ｓｔｅｐ ＲＴ－ｑＰＣＲを、二重鎖セットアップで、ｑＳｃｒｉｐｔ（商標）ＸＬＴ Ｏｎｅ－Ｓｔｅｐ ＲＴ－ｑＰＣＲ ＴｏｕｇｈＭｉｘ（登録商標）、Ｌｏｗ ＲＯＸ（商標）（Ｑｕａｎｔａｂｉｏ）を使用して実施した。次のＴａｑＭａｎプライマーアッセイをｑＲＴ－ＰＣＲに使用した：ＭＡＬＡＴ１、Ｈｓ００２７３９０７＿ｓ１［ＦＡＭ－ＭＧＢ］および内因性対照ＧＡＰＤＨ、Ｈｓ９９９９９９０５＿ｍ１［ＶＩＣ－ＭＧＢ－ＰＬ］。全てのプライマーセットは、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社から購入した。ノックダウン（ＫＤ）値とも呼ばれる相対的なＭＡＬＡＴ１ ＲＮＡ発現レベルを、対象（ＰＢＳ処置細胞）に対するパーセントとして計算した。
【0316】
結果を表３に示す。「／」で区切られた値は、化合物または対照を２つ以上の試験バイアルで試験した場合の個々の結果を示す。
【0317】
（表３）インビトロ有効性結果（ＫＤ）
【0318】
実施例３：用量応答曲線に対する異なる濃度でのＡ５４９細胞におけるＭＡＬＡＴ１ ｍＲＮＡを標的とするオリゴヌクレオチドのインビトロ効力
Ａ５４９細胞株はＡＴＣＣから購入し、供給業者による推奨のとおりに、３７℃、５％ＣＯ２の加湿インキュベーター内で維持した。アッセイでは、３５００細胞／ウェル（Ａ５４９）を培地中の９６マルチウェルプレートに播種した。細胞を２４時間インキュベートした後、ＰＢＳに溶解したオリゴヌクレオチドを添加した。オリゴヌクレオチドの濃度範囲：最高濃度２５μＭ、８段階で１：１希釈。オリゴヌクレオチドの添加の３日後に、細胞を採取した。ＲＮＡは、製造元の指示に従ってＰｕｒｅＬｉｎｋ Ｐｒｏ ９６ ＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して抽出し、５０μｌの水で溶出した。続いてＲＮＡをＤＮａｓｅ／ＲＮａｓｅフリー水（Ｇｉｂｃｏ）で１０倍に希釈し、９０℃で１分間加熱した。
Ａ５４９細胞株はＡＴＣＣから購入し、供給業者による推奨のとおりに、３７℃、５％ＣＯ２の加湿インキュベーター内で維持した。アッセイでは、３５００細胞／ウェル（Ａ５４９）を培地中の９６マルチウェルプレートに播種した。細胞を２４時間インキュベートした後、ＰＢＳに溶解したオリゴヌクレオチドを添加した。オリゴヌクレオチドの濃度範囲：最高濃度２５μＭ、８段階で１：１希釈。オリゴヌクレオチドの添加の３日後に、細胞を採取した。ＲＮＡは、製造元の指示に従ってＰｕｒｅＬｉｎｋ Ｐｒｏ ９６ ＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して抽出し、５０μｌの水で溶出した。続いてＲＮＡをＤＮａｓｅ／ＲＮａｓｅフリー水（Ｇｉｂｃｏ）で１０倍に希釈し、９０℃で１分間加熱した。
【0319】
遺伝子発現解析では、Ｏｎｅ Ｓｔｅｐ ＲＴ－ｑＰＣＲを、二重鎖セットアップで、ｑＳｃｒｉｐｔ（商標）ＸＬＴ Ｏｎｅ－Ｓｔｅｐ ＲＴ－ｑＰＣＲ ＴｏｕｇｈＭｉｘ（登録商標）、Ｌｏｗ ＲＯＸ（商標）（Ｑｕａｎｔａｂｉｏ）を使用して実施した。次のＴａｑＭａｎプライマーアッセイをｑＰＣＲに使用した：ＭＡＬＡＴ１、Ｈｓ００２７３９０７＿ｓ１（ＦＡＭ－ＭＧＢ）と、内因性対照のＧＡＰＤＨ。全てのプライマーセットは、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社から購入した。ＩＣ５０値は、ｎ＝２の生物学的反復からのデータに対してＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ８を使用して決定した。結果を表４に示す。
【0320】
（表４）インビトロ効力結果（ＩＣ５０）
【0321】
実施例４：カスパーゼ３／７活性化
ＨｅｐＧ２細胞を、１０％熱不活化ウシ胎児血清を補充したＧｌｕｔａＭａｘ（Ｇｉｂｃｏ＃４１０９０）を含むＭＥＭ培地でおよそ７０％コンフルエンスで培養した。細胞を０．２５％トリプシン－ＥＤＴＡ溶液（Ｇｉｂｃｏ＃２５２０００５６）で剥離し、１×１０４細胞／ウェルの密度で黒色の透明な９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ＃３９０４、米国ニューヨーク州）に播種した。ＨｅｐＧ２播種の２４時間後、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ番号３１９８５）に溶解した１００ｎＭオリゴヌクレオチドを使用して、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ番号１１６６８０１９）で細胞を一過性にトランスフェクトした。カスパーゼ－３／７活性を、Ｃａｓｐａｓｅ－Ｇｌｏ（登録商標）３／７アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、米国ウィスコンシン州マディソン）を使用して決定した。再構成カスパーゼ－Ｇｌｏ（登録商標）３／７試薬をトランスフェクションの２４時間後に細胞に添加し、６０分間インキュベートし、細胞溶解物を不透明な９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ番号３６００、米国ニューヨーク州）に移した後、製造者の指示に従ってＥｎｓｐｉｒｅマルチモードプレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）で発光を決定した。結果を表５に示し、百分率（アッセイウィンドウ％）は、ビヒクル（ＰＢＳでのみ処置した細胞）に基づく細胞アポトーシスの程度を示す。値が高いほど、アポトーシス活性が高くなり、それによってインビトロ細胞傷害性が高くなる。
ＨｅｐＧ２細胞を、１０％熱不活化ウシ胎児血清を補充したＧｌｕｔａＭａｘ（Ｇｉｂｃｏ＃４１０９０）を含むＭＥＭ培地でおよそ７０％コンフルエンスで培養した。細胞を０．２５％トリプシン－ＥＤＴＡ溶液（Ｇｉｂｃｏ＃２５２０００５６）で剥離し、１×１０４細胞／ウェルの密度で黒色の透明な９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ＃３９０４、米国ニューヨーク州）に播種した。ＨｅｐＧ２播種の２４時間後、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ番号３１９８５）に溶解した１００ｎＭオリゴヌクレオチドを使用して、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ番号１１６６８０１９）で細胞を一過性にトランスフェクトした。カスパーゼ－３／７活性を、Ｃａｓｐａｓｅ－Ｇｌｏ（登録商標）３／７アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、米国ウィスコンシン州マディソン）を使用して決定した。再構成カスパーゼ－Ｇｌｏ（登録商標）３／７試薬をトランスフェクションの２４時間後に細胞に添加し、６０分間インキュベートし、細胞溶解物を不透明な９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ番号３６００、米国ニューヨーク州）に移した後、製造者の指示に従ってＥｎｓｐｉｒｅマルチモードプレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）で発光を決定した。結果を表５に示し、百分率（アッセイウィンドウ％）は、ビヒクル（ＰＢＳでのみ処置した細胞）に基づく細胞アポトーシスの程度を示す。値が高いほど、アポトーシス活性が高くなり、それによってインビトロ細胞傷害性が高くなる。
【0322】
（表５）インビトロ細胞毒性結果
ＡＳＯ＝アンチセンスオリゴヌクレオチド
ＡＳＯ＝アンチセンスオリゴヌクレオチド
【0323】
実施例５：ＲＮＡにハイブリダイズしたＴＮＡ修飾を含有するオリゴヌクレオチドの熱融解温度（Ｔｍ）
変性点（熱融解温度＝Ｔｍ）を以下の手順に従って測定した：
ギャップマーＡＳＯおよび相補的ＲＮＡを２０ｍＭリン酸二ナトリウム緩衝液、２００ｍＭ ＮａＣｌおよび０．２ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ７）に添加して、１．５μＭの最終濃度を得た。試料を９５℃に５分間加熱し、次いで１時間かけて室温までゆっくり冷却した。Ｐｅｌｔｉｅｒ Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｒを備えたＡｇｉｌｅｎｔ Ｃａｒｙ ３５００で、２５℃から９５℃まで５℃／分で上昇させ、次いで２５℃まで低下させた温度勾配を用いて、２６０ｎｍで熱融解曲線を記録した。両方の曲線の一次導関数を使用して融解温度（Ｔｍ）を決定した。値は、３つの加熱および冷却曲線にわたって平均化される（値±標準偏差として報告される）。結果を表６に示す。
変性点（熱融解温度＝Ｔｍ）を以下の手順に従って測定した：
ギャップマーＡＳＯおよび相補的ＲＮＡを２０ｍＭリン酸二ナトリウム緩衝液、２００ｍＭ ＮａＣｌおよび０．２ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ７）に添加して、１．５μＭの最終濃度を得た。試料を９５℃に５分間加熱し、次いで１時間かけて室温までゆっくり冷却した。Ｐｅｌｔｉｅｒ Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｒを備えたＡｇｉｌｅｎｔ Ｃａｒｙ ３５００で、２５℃から９５℃まで５℃／分で上昇させ、次いで２５℃まで低下させた温度勾配を用いて、２６０ｎｍで熱融解曲線を記録した。両方の曲線の一次導関数を使用して融解温度（Ｔｍ）を決定した。値は、３つの加熱および冷却曲線にわたって平均化される（値±標準偏差として報告される）。結果を表６に示す。
【0324】
（表６）熱融解温度（Ｔｍ）の結果
【0325】
参考文献一覧
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Ｍａｔｓｕｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｏｓｔｅｒ；ＸＸＩＩＩ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｏｕｎｄ Ｔａｂｌｅ ｏｎ Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ，Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ；Ａｕｇｕｓｔ ２０１８．ＤＯＩ：１０．１３１４０／ＲＧ．２．２．１０６２７．４５６０５
国際公開公報第２０１２／０７８５３６号（Ｑｕａｒｋ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．）
国際公開公報第２０１２／１１８９１１号（Ｑｕａｒｋ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．）
国際公開公報第２０１３／１７９２９２号Ａ１（ＱＢＩ Ｅｎｔｅｒｐｒｉｓｅｓ Ｌｔｄ．ａｎｄ Ｂｉｏ－Ｌａｂ Ｌｔｄ．）
Ｚｈａｎｇ ａｎｄ Ｃｈａｐｕｔ，’’Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｒｅｏｓｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ（ＴＮＡ）Ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ Ｍｏｎｏｍｅｒｓ ａｎｄ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４．５１．１－４．５１．２６，２０１２’’．
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Ｍａｔｓｕｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｏｓｔｅｒ；ＸＸＩＩＩ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｏｕｎｄ Ｔａｂｌｅ ｏｎ Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ，Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ；Ａｕｇｕｓｔ ２０１８．ＤＯＩ：１０．１３１４０／ＲＧ．２．２．１０６２７．４５６０５
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【配列表】
【国際調査報告】