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特表2024-547098抗体とムテインとからなる融合タンパク質

書誌要約請求の範囲詳細な説明課題実施例実施するための形態図面の説明

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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-12-26

(54)【発明の名称】抗体とムテインとからなる融合タンパク質

(51)【国際特許分類】

C07K 19/00 20060101AFI20241219BHJP

C07K 14/55 20060101ALI20241219BHJP

C07K 16/28 20060101ALI20241219BHJP

A61K 38/20 20060101ALI20241219BHJP

A61K 38/19 20060101ALI20241219BHJP

A61P 35/00 20060101ALI20241219BHJP

A61K 48/00 20060101ALI20241219BHJP

A61K 47/68 20170101ALI20241219BHJP

C12N 15/62 20060101ALN20241219BHJP

C12N 15/26 20060101ALN20241219BHJP

C12N 15/13 20060101ALN20241219BHJP

【ＦＩ】

C07K19/00 ZNA

C07K14/55

C07K16/28

A61K38/20

A61K38/19

A61P35/00

A61K48/00

A61K47/68

C12N15/62 Z

C12N15/26

C12N15/13

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024537810

(86)(22)【出願日】2022-12-09

(85)【翻訳文提出日】2024-08-13

(86)【国際出願番号】 CU2022050012

(87)【国際公開番号】W WO2023116951

(87)【国際公開日】2023-06-29

(31)【優先権主張番号】CU-2021-0104

(32)【優先日】2021-12-21

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CU

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】509352381

【氏名又は名称】セントロデインミュノロヒアモレキュラル

(74)【代理人】

【識別番号】110000855

【氏名又は名称】弁理士法人浅村特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】カサデススパソス、アナビクトリア

(72)【発明者】

【氏名】エルナンデスガルシア、テイズ

(72)【発明者】

【氏名】レオンモンソン、カレト

【テーマコード（参考）】

4C076

4C084

4H045

【Ｆターム（参考）】

4C076AA95

4C076BB11

4C076BB13

4C076BB15

4C076BB16

4C076CC27

4C076EE41

4C076EE59

4C084AA02

4C084AA13

4C084BA01

4C084BA41

4C084CA53

4C084DA14

4C084MA56

4C084MA63

4C084MA66

4C084NA05

4C084NA13

4C084ZB261

4C084ZB262

4H045AA10

4H045AA11

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA10

4H045BA41

4H045CA40

4H045DA76

4H045EA22

4H045EA28

4H045FA72

4H045FA74

4H045GA26

(57)【要約】

本発明は、バイオテクノロジー及び免疫腫瘍学の分野に関する。リンカーを介して免疫グロブリンに連結されたインターロイキン２アゴニストムテインを含む融合タンパク質が開示される。これらの融合タンパク質は、抗体がＡＤＣＣ及びＣＤＣを行う能力を同時に維持し、さらに、制御性Ｔ細胞を拡大することなくＮＫ細胞及びＣＤ８＋を活性化することによる、非α ＩＬ－２ムテインに基づく他の同様のものと比較した場合のそれらの優れた特性を考慮すると、がんの治療に有用である。これらの特性の収束は、親抗体よりも、さらにはそれらの非αムテインとの組合せよりも優れた抗腫瘍特性を有する融合タンパク質をもたらす。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＩｇＧ１又はＩｇＧ３アイソタイプの免疫グロブリンに連結されたインターロイキン２（ＩＬ－２）アゴニストムテインを含む融合タンパク質であって、該免疫グロブリンがＦｃγ受容体及び補体カスケード分子によって認識される、融合タンパク質。

【請求項2】

抗原結合部位及びサイトカインに関して二価の分子を特徴とする、請求項１に記載の融合タンパク質。

【請求項3】

ムテインのＩＬ－２受容体のα鎖に結合する能力が少なくとも２桁違いで影響を受ける、請求項１に記載の融合タンパク質。

【請求項4】

ムテインがリンカーによって免疫グロブリンに結合されている、請求項１に記載の融合タンパク質。

【請求項5】

ムテインが免疫グロブリンの重鎖に結合する、請求項１に記載の融合タンパク質。

【請求項6】

ムテインが免疫グロブリンのカルボキシ末端に結合する、請求項５に記載の融合タンパク質。

【請求項7】

ムテインが、配列番号１６～４３を含む群から選択される配列を有する、請求項１～６のいずれか一項に記載の融合タンパク質。

【請求項8】

リンカーが、（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）_ｎＴｈｒＧｌｙ（配列番号４４）及び（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）ｎ（配列番号４５）を含む群から選択されるアミノ酸配列によって形成され、ｎが、１～５の値を有する断片Ｇｌｙ_４Ｓｅｒの繰り返しの数である、請求項４に記載の融合タンパク質。

【請求項9】

ＩｇＧ１又はＩｇＧ３サブクラスが、それぞれ配列番号１１もしくは１２の配列を含むか、又は配列番号１１もしくは１２に対して９７％を超える同一性を有する、請求項１に記載の融合タンパク質。

【請求項10】

免疫グロブリンの軽鎖が、配列番号９に対応する配列を有するヒトκアイソタイプである、請求項１に記載の融合タンパク質。

【請求項11】

免疫グロブリンの軽鎖が、配列番号１０に対応する配列を有するヒトλアイソタイプである、請求項１に記載の融合タンパク質。

【請求項12】

標的腫瘍抗原が、ＣＤ２０、ＣＤ１９、ＮＧｃＧＭ３、ＰＤＬ１、Ｈｅｒ１、Ｈｅｒ２及びＥｐｃａｍを含む群から選択される、請求項１に記載の融合タンパク質。

【請求項13】

０．５ｍｇ／ｍｌ～２０ｍｇ／ｍｌの濃度範囲の請求項１～１２のいずれか一項に記載の融合タンパク質と、許容される医薬ビヒクルとを含む医薬組成物。

【請求項14】

がんの治療における請求項１３に記載の医薬組成物の使用。

【請求項15】

皮下、筋肉内又は腫瘍内注射のための、請求項１～１２のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードする核酸分子の使用。

【請求項16】

請求項１３に記載の医薬組成物を０．０１ｍｇ／Ｋｇ～０．６ｍｇ／Ｋｇ体重の用量範囲で皮下、静脈内、皮内、筋肉内又は腹腔内投与することを含む、治療を必要とする対象の治療方法。

【請求項17】

医薬組成物の投与が、７日～８週間の間隔で、週に１～３回の投与で１～３０サイクル行われる、請求項１６に記載の治療方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、バイオテクノロジー及び免疫腫瘍学の分野に関する。特に、本発明は、腫瘍上に発現される抗原に特異的な抗体に融合したインターロイキン２（ＩＬ－２）の非αムテインアゴニストから構成され、エフェクタ機能を動員することができる融合タンパク質を記載する。

【背景技術】

【0002】

抗体又は抗体断片に融合したサイトカインで構成されるバイオ医薬品である免疫サイトカイン（ＩＣｓ）は、がんの治療のための魅力的な免疫療法ツールであるが、その使用は他の疾患にも拡大されている。

【0003】

ＩＬ－２は、Ｔリンパ球の強力な活性化因子であり、ＮＫ細胞及びそれらのＡＤＣＣ（抗体依存性細胞傷害）の刺激因子である（Ｈａｎｋｅｔａｌ．（１９９０）ＪＢｉｏｌＲｅｓｐｏｎｓｅＭｏｄ．９：５－１４）。この理由から、この種の融合タンパク質の生成において最も使用されるサイトカインの１つとなっている。実際に、臨床的進歩の大部分が、ＩＬ－２を腫瘍抗原に特異的な抗体に融合させたもので為されてきた（Ｓｏｎｄｅｌ，Ｐ．Ｍ．ａｎｄＳ．Ｄ．Ｇｉｌｌｉｅｓ．（２０１２）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．１（２）：１４９－１７１）。第ＩＩ相臨床試験での有望な結果にもかかわらず、（Ａｌｂｅｒｔｉｎｉ，Ｍ．Ｒ．ｅｔａｌ．（２０１２）ＣａｎｃｅｒＩｍｍｕｎｏｌＩｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．６１（１２）：２２６１－２２７１；Ｄａｎｉｅｌｌｉ，Ｒ．，ｅｔａｌ．（２０１５）ＣａｎｃｅｒＩｍｍｕｎｏｌＩｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．６４（８）：９９９－１００９；Ｋａｕｆｍａｎ，Ｌ．（２０１４）ＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｌｉｎｉｃａｌＯｎｃｏｌｏｇｙ．３２（１５）；Ｌａｎｓｉｇａｎ，Ｆ．ｅｔａｌ．（２０１６）Ｂｌｏｏｄ．１２８（２２）：６２０）、これらのＩＣは、高い毒性プロファイル（Ｐａｎｅｌｌｉ，Ｍ．Ｃ．ｅｔａｌ．（２００４）ＪＴｒａｎｓｌＭｅｄ．２（１）：１７；Ｓｋｒｏｍｂｏｌａｓ，Ｄ．ａｎｄＪ．Ｇ．Ｆｒｅｌｉｎｇｅｒ．（２０１４）ＥｘｐｅｒｔＲｅｖＣｌｉｎＩｍｍｕｎｏｌ．１０（２）：２０７－２１７；Ｋｌｅｉｎ，Ｃ．，ｅｔａｌ．（２０１７）Ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．６（３）：ｅ１２７７３０６）及び潜在的に抗腫瘍活性を阻害することができる制御性Ｔ細胞の拡大（Ａｈｍａｄｚａｄｅｈ，Ｍ．ａｎｄＳ．Ａ．Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ．（２００６）Ｂｌｏｏｄ．１０７（６）：２４０９－２４１４；Ｊｅｎｓｅｎ，Ｈ．Ｋ．，ｅｔａｌ．（２００９）ＣｌｉｎＣａｎｃｅｒＲｅｓ．１５（３）：１０５２－１０５８；Ｆｏｕｒｎｉｅｒ，Ｐ．，ｅｔａｌ．（２０１１）ＩｎｔＪＯｎｃｏｌ．３８（６）：１７１９－１７２９；Ｇｕｂｂｅｌｓ，Ｊ．Ａ．，ｅｔａｌ．（２０１１）ＣａｎｃｅｒＩｍｍｕｎｏｌＩｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．６０（１２）：１７８９－１８００；Ｐｒｅｔｔｏ，Ｆ．，ｅｔａｌ．（２０１４）ＣａｎｃｅｒＩｍｍｕｎｏｌＩｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．６３（９）：９０１－９１０；Ｓｉｍ，Ｇ．Ｃ．，ｅｔａｌ．（２０１４）ＪＣｌｉｎＩｎｖｅｓｔ．１２４（１）：９９－１１０；Ｌａｎｓｉｇａｎ，Ｆ．ｅｔａｌ．（２０１６）Ｂｌｏｏｄ．１２８（２２）：６２０）のような、組換えＩＬ－２と同様の有害作用を保持する。さらなる制限は、高親和性ＩＬ－２受容体との相互作用のために、最適未満の生体内分布及び腫瘍への標的化に関連する（Ｋｌｅｉｎ，Ｃ．，ｅｔａｌ．（２０１７）Ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．６（３）：ｅ１２７７３０６；Ｗａｌｄｈａｕｅｒ，Ｉ．，ｅｔａｌ．（２０２１）Ｍａｂｓ．１３（１）：１９１３７９１）。この状況は、ＩＬ－２受容体のα鎖に結合する能力が低下しているか又は能力を全く有さず、次に、免疫細胞の特定のサブセットを刺激し、毒性を減少させるように合理的に設計された、ＩＬ－２の突然変異体（非αムテイン）に基づくＩＣの開発を促進した（Ｒｕｎｂｅｃｋ，Ｅ．，ｅｔａｌ．（２０２１）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．（Ｂａｓｅｌ）１０（１））。

【0004】

これらのＩＣの中には、ＩＬ－２受容体のα鎖への結合を無効にし、エフェクタＣＤ８＋Ｔ細胞及びＮＫ細胞の拡大を促進し、制御性Ｔ細胞の選択的増殖を促進しない変異Ｆ４２Ａ、Ｙ４５Ａ、Ｌ７２Ｇの存在を特徴とする、ＩＬ－２ｖに基づくものを含む群がある。これらの融合タンパク質は、完全長ＩｇＧ（ＩｇＧ１）のフォーマットを有し、ＣＤＣ（補体依存性細胞傷害）及びＡＤＣＣなどの古典的な抗体エフェクタ機能を有しないが、サイトカインに関して一価又は単機能性である。この群の中には、その重鎖の１つのＣ末端を介してＩＬ－２ｖ変異体の１分子に融合された癌胎児性抗原（ＣＥＡ）に対する特異的抗体からなる、ＩＣセルグツズマブアムナロイキン（ＣＥＡ－ＩＬ２ｖ）がある（Ｋｌｅｉｎ，Ｃ．，ｙｃｏｌｓ．（２０１７）Ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．６（３）：ｅ１２７７３０６）。

【0005】

このセットには、線維芽細胞活性化タンパク質αに特異的なＩＣＳｉｍｌｕｋａｆｕｓｐａｌｆａ（ＦＡＰ－ＩＬ２ｖ）（Ｗａｌｄｈａｕｅｒ，Ｉ．，ｅｔａｌ．（２０２１）Ｍａｂｓ．１３（１）：１９１３７９１）及びプログラム死１（ＰＤ－１）分子を認識するＩＣ抗ＰＤ１－ＩＬ２ｖ（Ｋｌｅｉｎ，Ｃ．，ｅｔａｌ．（２０１９）ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．７９（１３Ｓｕｐｐｌ）：Ａｂｓｔｒａｃｔｎｒ１５５２）も含まれる（Ｋｌｅｉｎ，Ｃ．，ｅｔａｌ．（２０１９）ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．７９（１３Ｓｕｐｐｌ）：Ａｂｓｔｒａｃｔｎｒ１５５２）。

【0006】

一方で、変異Ｌ８０Ｆ、Ｒ８１Ｄ、Ｌ８５Ｖ、Ｉ８６Ｙ、Ｉ９２Ｆを特徴とするＩＬ－２の変異体（ｓｕｍ－ＩＬ－２）を含む、ＥＧＦＲ（上皮成長因子受容体）に特異的なＩＣＥｒｂ－Ｓｕｍ－ＩＬ２が報告されている。野生型サイトカインに関するこの一連の変化は、ムテイン（変異タンパク質）と受容体のα鎖及びβ鎖との結合の減少ならびに相互作用の増大をそれぞれ決定する。これは、活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞への良好な結合を調節し、制御性Ｔ細胞への結合は調節しない。このＩＣは、一方のアームにｓｕｍ－ＩＬ２モノマーを含み、他方のアームに抗ＥＧＦＲＦａｂを含むヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質として提示される。抗原結合部位及びサイトカインに関するこの一価ＩＣについて、腫瘍微小環境における制御性Ｔ細胞と比較したＣＤ８＋Ｔ細胞の選択的な拡大が記載されているが、ＡＤＣＣ及びＣＤＣなどの抗体の古典的なエフェクタ機能を動員する能力は報告されていない（Ｓｕｎ，Ｚ．，ｅｔａｌ．（２０１９）ＮａｔＣｏｍｍｕｎ．１０（１）：３８７４）。

【0007】

先に記載された背景情報を考慮して、本出願の発明者らは、抗原結合部位及びサイトカインに関して二機能性分子にするために、その設計が、抗体エフェクタ機能を動員する能力を有するＩｇＧ抗体の重鎖のカルボキシル末端へのＩＬ－２アゴニストムテイン（ＩＬ２非α）の融合に基づく、がん治療のためのＩＣのタイプを作製した。驚くべきことに、このタイプの分子は、直接溶解、ＡＤＣＣ及び／又はＣＤＣを実行する抗体の能力を維持するか又は同時に改善し、さらに、制御性Ｔ細胞を拡大することなくＮＫ及びＣＤ８＋Ｔ細胞を活性化することによって、非αムテインに基づく他の同様の分子よりも優れた特性を有する。これらの特性の収束は、親抗体よりも、さらにはそれらのＩＬ２非αとの組合せよりも優れた抗腫瘍特性を有する融合タンパク質をもたらす。最後に、本発明に列挙される融合タンパク質のフォーマット及び組成は、抗体部分の可変領域に関連する生物学的活性を妨げない。これは、アポトーシスを誘導する又はエフェクタ機能とは無関係に細胞傷害性を誘導する能力にも当てはまる。

【発明の概要】

【0008】

一実施形態では、本発明の主題は、ＩｇＧ１又はＩｇＧ３アイソタイプの免疫グロブリンに結合したＩＬ－２アゴニストムテイン（非αムテイン）を含むことを特徴とする融合タンパク質であり、前記免疫グロブリンは、Ｆｃγ受容体及び補体カスケード分子によって認識される。この免疫サイトカインは、抗原結合部位及びサイトカインに関して二価の分子であることを特徴とする。そのようなムテイン及び前記免疫グロブリンは、リンカーを介して連結される。特に、ＩＬ－２受容体のα鎖に結合するムテインの能力は、少なくとも２桁の大きさ（２桁違い）で影響を受け、ムテインは、前記免疫グロブリンの各重鎖のカルボキシ末端を介して免疫グロブリンに結合する。特に、非αムテインは、配列番号１６～４３を含む群から選択される配列を有する。

【0009】

特定の実施形態では、リンカーは、（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）_ｎＴｈｒＧｌｙ（配列番号４４）及び（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）_ｎ（配列番号４５）を含む群から選択されるアミノ酸配列から構成され、ここで、ｎはＧｌｙ_４Ｓｅｒ断片の繰り返しの数であり、１～５の値を有する。

【0010】

特定の実施形態では、免疫グロブリン重鎖は、ヒトＩｇＧ１又はＩｇＧ３サブクラスに属し、かつ配列番号１１もしくは１２の配列を含むか、又は配列番号１１もしくは１２と９７％を超える同一性を有する。

【0011】

特定の実施形態では、免疫グロブリンの軽鎖は、ヒトκアイソタイプに属することを特徴とし、かつ配列番号９に対応する配列を有する。

【0012】

特定の実施形態では、免疫グロブリンの軽鎖は、ヒトλアイソタイプに属することを特徴とし、かつ配列番号１０に対応する配列を有する。

【0013】

本発明の免疫サイトカインは、腫瘍抗原を認識することをさらに特徴とし、その中には、ＣＤ２０、ＣＤ１９、ＮＧｃＧＭ３、ＰＤＬ１、Ｈｅｒ１、Ｈｅｒ２及びＥｐｃａｍが含まれる。

【0014】

さらなる実施形態では、本発明は、０．５ｍｇ／ｍｌ～２０ｍｇ／ｍｌの濃度範囲の本明細書に記載の融合タンパク質と薬学的に許容されるビヒクルとを含む医薬組成物に関する。

【0015】

さらに、本発明は、本発明において開示される融合タンパク質のがんの治療における使用に関する。特に、皮下、筋肉内又は腫瘍内注射のための、本発明の融合タンパク質をコードする核酸分子の使用に関する。

【0016】

さらなる実施形態では、本発明は、０．０１ｍｇ／Ｋｇ～０．６ｍｇ／Ｋｇ重量の用量範囲での本発明の医薬組成物の皮下、静脈内、皮内、筋肉内又は腹腔内投与を含む、治療を必要とする対象のための治療方法に関する。特に、前記医薬組成物の投与は、週に１～３回で１～３０サイクル実施され、サイクル間の時間は７日～８週間である。

【0017】

ＩＣの説明
一実施形態では、本発明の目的は、抗原結合部位及びサイトカインに関して二機能性分子にするために、抗体の古典的エフェクタ機能を動員する能力を有する免疫グロブリンの重鎖に結合した、受容体のα鎖に対する結合親和性が少なくとも２桁低下している（Ｌｅｏｎｅｔａｌ．（２０１８）ＳｅｍｉｎＯｎｃｏｌ．４５（１－２）：９５－１０４）、ＩＬ－２アゴニスト非αムテイン（非αムテイン）に基づく融合タンパク質又はＩＣである。

【0018】

本発明で使用される「融合タンパク質」という用語は、ペプチドリンカーを介して連結された、抗体のアミノ酸配列と、異種ポリペプチド又はタンパク質、すなわち、通常は抗体の一部ではないポリペプチド又はタンパク質のアミノ酸配列とを含むポリペプチドを指す。

【0019】

本明細書で使用される免疫サイトカイン（ＩＣ）という用語は、サイトカインに結合する抗体フォーマットを指す。そのようなサイトカインは、重鎖のカルボキシ末端でリンカーによって抗体に融合される。

【0020】

「融合タンパク質」及び「ＩＣ」という用語は、本発明では互換的に使用される。

【0021】

本発明に記載されるＩＣの一部を形成するムテインは、少なくとも２桁の大きさ（２桁違い）で、制御性Ｔ細胞において構成的に発現される高親和性受容体、具体的にはα鎖に対するそれらの結合能によって影響を受ける。本発明の融合タンパク質は、他の非αムテインベースのＩＣが有しない特性である、直接溶解、ＡＤＣＣ及び／又はＣＤＣなどのエフェクタ機能を動員しながら、制御性Ｔ細胞を拡大することなくＮＫ及びＣＤ８＋Ｔ細胞を活性化する能力を示す。これらのムテインは、本明細書では非αムテインと呼ばれる。

【0022】

特に、ＩＣ抗体部分は、そのアミノ酸配列がそれぞれ配列番号１１及び配列番号１２として同定されるものと９７％を超える同一性を有するＩｇＧ１又はＩｇＧ３の天然又は修飾対立遺伝子変異体に対応し、Ｆｃγ受容体及び補体分子に結合するヒトＩｇＧ１又はＩｇＧ３サブクラスの免疫グロブリンである。したがって、それらはＡＤＣＣ及びＣＤＣの活性と適合性である。本発明の融合タンパク質の一部を形成する抗体の軽鎖の定常領域は、ヒトκ又はλアイソタイプのものであり、それらの配列は配列番号９及び配列番号１０に記載されている。一方で、抗体部分の可変領域は、マウス、ヒト化又は完全ヒトであり得、ＡＤＣＣ及びＣＤＣを奏する能力を有する免疫グロブリンに由来し得る。本発明のＩＣの抗体部分の可変領域は、ＣＤ２０、ＣＤ１９、ガングリオシドＮＧｃＧＭ３、ＰＤＬ１、Ｈｅｒ１、Ｈｅｒ２、及びＥｐｃａｍなどのヒト腫瘍において発現される抗原を認識する。

【0023】

本発明に記載の非αムテインは、柔軟なリンカーペプチド（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）_ｎＴｈｒＧｌｙ（配列番号４４）又は（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎ（配列番号４５）を介して各抗体重鎖のカルボキシル末端に結合しており［ここで、ｎはＧｌｙ４Ｓｅｒ断片の繰り返しの数である］、制御性Ｔ細胞の拡大を損ない、ＣＤ８＋及びＮＫエフェクタＴ細胞を選択的に拡大する能力を有する。

【0024】

非αムテインは、以前に米国特許第９，２０６，２４３Ｂ２号及び米国特許出願第２０１９／０３１５８２６Ａ１号に開示されている配列番号１６～４３に記載されているもの、又は以前に国際公開第２０１２１０７４１７号に開示されているＩＬ－２ｖ（配列番号４０）及び配列番号４１～４３に記載されているその変異体のいずれかであり得る。分子免疫学センター（ＣｅｎｔｅｒｆｏｒＭｏｌｅｃｕｌａｒＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）で作製された配列番号１６～２１に記載されるムテインはＩＬ－２アゴニストであり、制御性Ｔ細胞において構成的に発現される高親和性受容体へのそれらの結合能は少なくとも２桁の大きさ（２桁違い）で影響を受ける。野生型ＩＬ－２に関するそれらの改変の結果として、それらは、ＮＫ及びメモリＣＤ８＋Ｔ細胞のエフェクタ集団を選択的に拡大することができ、天然ＩＬ－２のアゴニスト作用を有し、動物モデルにおいて天然ＩＬ－２よりも大きい抗腫瘍効果を有する（米国特許第９，２０６，２４３０９号）。ＩＩＬ２非α Ｋ３５Ｅ、ＩＬ２非α Ｋ３５Ｑ及びＩＬ２非α Ｋ３５Ｄムテイン（配列番号２２～３９）は、異なる宿主系における発現を促進し、ＩＬ－２受容体の異なる鎖と非αムテインとの相互作用プロファイルと適合性である点突然変異を含む、米国特許第９，２０６，２４３号に記載されている方法で得られたＩＬ２非αの変異体である（Ｒｏｊａｓ，Ｇ．，ｅｔａｌ．（２０１５）ＪＭｏｌＲｅｃｏｇｎｉｔ．２８（４）：２６１－２６８）。ＩＬ－２ｖ突然変異体及びその変異体（配列番号４０～４３）は、制御性Ｔ細胞の選択的拡大を妨げ、エフェクタＴＣＤ８＋及びＮＫ細胞の拡大を促進する、受容体のα鎖への結合を妨げる野生型ＩＬ－２に関する突然変異を含む（Ｋｌｅｉｎ，Ｃ．，ｅｔａｌ．（２０１７）Ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．６（３）：ｅ１２７７３０６）。

【0025】

要約すると、本発明の融合タンパク質のフォーマットは、抗体の古典的なエフェクタ機能（直接溶解、ＡＤＣＣ及びＣＤＣ）の維持又は改善を保証し、これは、制御性Ｔ細胞に対するエフェクタ細胞の選択的増殖の誘導からなる、非αムテインの特定の免疫調節特性と一致する。

【0026】

医薬組成物
本発明のＩＣ対象物は、そのための種々の適切な医薬組成物及び薬学的に許容されるビヒクルの一部を形成する活性成分として見出され得る。前記医薬組成物中の活性成分の濃度は、０．５ｍｇ／ｍｌ～２０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは１ｍｇ／ｍｌ～１０ｍｇ／ｍｌの範囲であり、又は凍結乾燥されている。

【0027】

薬学的に許容されるビヒクルには、生理食塩水、ｐＨ中性リン酸緩衝生理食塩水などが含まれるが、これらに限定されない。他の緩衝剤、分散剤、及び患者への送達に適した非毒性の不活性物質が本発明の組成物に含まれ得る。組成物は、投与に適した溶液であり得、通常無菌であり、望ましくない粒子を含まない。

【0028】

治療的使用及び治療
本発明に記載されるＩＣの新規性は、ＩｇＧ１又はＩｇＧ３免疫グロブリン及び非αムテインに基づく二機能性融合タンパク質における、制御性Ｔ細胞よりもメモリＴＣＤ８＋及びＮＫ細胞などのエフェクタ細胞を選択的に拡大し、活性化する能力、ならびに直接溶解、ＡＤＣＣ及びＣＤＣなどの抗体の典型的なエフェクタ機能を維持又は増強する能力の収束からなる。この同時実行性は、これまでに記載されている非αムテインに基づくＩＣのいずれについても記載されていない。さらに、ＩＣ分子あたり２つの非α ＩＬ－２ムテイン分子の存在は、融合タンパク質の固有の免疫調節活性を増加させることを可能にする。これは、内皮細胞上の高親和性受容体との非相互作用に起因する毒性の潜在的な減少にさらに寄与する。Ｆｃ領域は、とりわけ、プロテインＡを用いたアフィニティクロマトグラフィによって高度に精製された融合タンパク質を得る可能性を提供し、これは、循環中のこれらの薬剤の半減期を増加させ、ひいては治療有効性を増加させながら、それらを様々な経路（皮下、静脈内、皮内、筋肉内、腹腔内）によって可溶性タンパク質として投与することを可能にする。

【0029】

本発明のＩＣは、それぞれ合計０．７及び４２ｍｇに相当する０．０１ｍｇ／Ｋｇ重量～０．６ｍｇ／Ｋｇ重量の用量範囲で、好ましくは皮下又は静脈内経路で、対象に適用される（これらの対象は、ヒトなどの脊椎動物である）。ＩＣは、週に１～３回の頻度で１～３０サイクルにわたって患者に投与される。投与サイクル間の時間は７日～８週間である。

【0030】

さらに、これらのＩＣのために本発明で用いられる送達戦略はまた、ｍＲＮＡ及びそれらをコードする形質導入粒子の注射などの遺伝子治療アプローチによる生成物の注射を含み得る。

【0031】

これらの分子の免疫調節特性を考慮すると、抗原特異的抗腫瘍応答の増強に加えて、全身免疫刺激能は、様々なタイプのがんを有する患者における他の標的に対する治療との組合せの可能性を支持する。同様に、他の免疫調節剤ならびに化学療法及び放射線療法などの古典的腫瘍治療との組合せも可能である。特に、このタイプのバイオ医薬品は、Ｂ細胞リンパ増殖性障害、例えば非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、バーキットリンパ腫（ＢＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、濾胞性リンパ腫、低悪性度リンパ腫、辺縁体リンパ腫（ＭＺＬ）、重症リンパ形質細胞性リンパ腫（ＰＬ）、Ｂ細胞リンパ増殖症候群、進行期固形腫瘍、頭頸部腫瘍、脳腫瘍、成人及び小児神経膠腫、膵臓がん、食道がん、非小細胞肺がん、ならびに鼻咽頭腫瘍の治療において使用することができる。

【0032】

このように、上述のＩＣは、現在がんの治療に使用されている、抗体及びＩＬ－２の保護作用を増強する治療最前線を構成することが意図されている。この効果は、重要な抗腫瘍機構であるＡＤＣＣ及びＣＤＣ活性を同時に有し、制御性Ｔ細胞ではなく細胞傷害性Ｔ細胞及びＮＫ細胞を選択的に拡大することができる融合タンパク質の生成に関連し、より効率的な抗腫瘍免疫応答、したがって腫瘍成長の遅延及び治療される個体の生存延長をもたらす。さらに、使用されるＩＬ－２ムテインによって保証されるより低いレベルの毒性は、野生型サイトカインを用いた治療と比較して成功の確率を高める。このすべてが、治療患者における平均余命及び生活の質の向上につながる。

【図面の簡単な説明】

【0033】

【図1A】ＩＣＩｇＧ－ＩＬ２非αのスキームの表示。

【図1B】ＩＣＩｇＧ－ＩＬ２非αのフォーマットの表示。

【図2A】形質導入されたＣＨＯ細胞の上清中のＩＣの発現の評価。

【図2B】一過性にトランスフェクトされた懸濁液中のＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＩＣの発現の評価。

【図2C】一過性にトランスフェクトされた懸濁液中のＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＩＣの発現の評価。

【図2D】一過性にトランスフェクトされた懸濁液中のＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＩＣの発現の評価。

【図2E】形質導入されたＣＨＯ細胞の上清中のＩＣの発現の評価。

【図2F】形質導入されたＣＨＯ細胞の上清中のＩＣの発現の評価。

【図3A】非還元条件下での抗ＣＤ２０－ＩｇＧ１ｈ－ＩＬ２非α（ＩＣ１）のドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）。

【図3B】還元条件下での抗ＣＤ２０－ＩｇＧ１ｈ－ＩＬ２非α（ＩＣ１）のドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）。

【図4A】非還元条件下でのヒトＩｇＧに対する特異的抗体を用いたウェスタンブロットによるＩＣ１及び単純対照の免疫同定。

【図4B】還元条件下でのヒトＩｇＧに対する特異的抗体を用いたウェスタンブロットによるＩＣ１及び単純対照の免疫同定。

【図4C】非還元条件下でのＩＬ－２に対する特異的抗体を用いたウェスタンブロットによるＩＣ１及び単純対照の免疫同定。

【図5A】ＴＳＫゲル３０００カラムでのＩＣ１のサイズ排除高速液体クロマトグラフィ（ＳＥＣ－ＨＰＬＣ）分析。

【図5B】ＴＳＫゲル３０００カラムでのリツキシマブのサイズ排除高速液体クロマトグラフィ（ＳＥＣ－ＨＰＬＣ）分析。

【図6A】非還元条件下でのＩＣ抗ＣＤ２０－ＩｇＧ２ａ－ＩＬ２非α（ＩＣ７）のＳＤＳ－ＰＡＧＥ。

【図6B】還元条件下でのＩＣ抗ＣＤ２０－ＩｇＧ２ａ－ＩＬ２非α（ＩＣ７）のＳＤＳ－ＰＡＧＥ。

【図7】非還元条件下での、ＩＬ－２に対する特異的抗体を用いたウェスタンブロットによるＩＣ７及び単純対照の免疫同定。

【図8】ＴＳＫｇｅｌ３０００カラムでのＩＣ７のＳＥＣ－ＨＰＬＣ分析。

【図9A】非還元条件下でのＩＣ抗ＮＧｃＧＭ３－ＩＬ２非α（ＩＣ８）のＳＤＳ－ＰＡＧＥ。

【図9B】還元条件下でのＩＣ抗ＮＧｃＧＭ３－ＩＬ２非α（ＩＣ８）のＳＤＳ－ＰＡＧＥ。

【図10】非還元条件下での、ＩＬ－２に対する特異的抗体を用いたウェスタンブロットによるＩＣ８及び単純対照の免疫同定。

【図11】ＴＳＫｇｅｌ３０００カラムでのＩＣ８（１）及び１４Ｆ７ｍ（２）のＳＥＣ－ＨＰＬＣ分析。

【図12】非還元条件下での、ヒトＩｇＧに対する特異的抗体を用いたウェスタンブロットによるＩＣ４及び単純対照の免疫同定。

【図13A】ＲＴＸ抗体及びＩＣ１によるＥＬ４－ｈｕＣＤ２０＋細胞株の認識。

【図13B】マウスＲＴＸ－ＩｇＧ２ａ抗体及びＩＣ７によるＥＬ４－ｈｕＣＤ２０＋細胞株の認識。

【図14A】ＩＣ１による腫瘍細胞上のＣＤ２０分子の認識。

【図14B】コンジュゲートの平均蛍光強度（ＭＦＩ）に対するＲＴＸ及びＩＣ１のＭＦＩの比。

【図15】ＩＣ１によるＣＤＣの誘導。

【図16】ＩＣ１によるアポトーシスの誘導。

【図16A】ＩＣ１で処理したＲａｍｏｓ細胞における初期アポトーシス。

【図16B】ＩＣ１で処理したＲａｍｏｓ細胞におけるアポトーシス（すべてのアネキシンＶ＋細胞の合計）。

【図16C】ＩＣ１で処理したＲａｍｏｓ細胞におけるカスパーゼ３の活性化。

【図17A】ＩＣ１によるＡＤＣＣの誘導。

【図17B】ＩＣ１による健常ドナーからのＢ細胞（ＣＤ１９＋）のインビトロ枯渇。

【図17C】ＩＣ１によるびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫を有する患者からのＢ細胞（ＣＤ１９＋）のインビトロ枯渇。

【図18A】ＥＬＩＳＡによって測定されたＩＣ８によるＮＧｃＧＭ３ガングリオシドの認識。

【図18B】フローサイトメトリによって測定されたＩＣ８によるＮＧｃＧＭ３ガングリオシドの認識。

【図19】ＩＣ８による補体非依存性細胞傷害の誘導。

【図20A】ＣＴＬＬ－２細胞株の増殖アッセイによって測定された、ＩＣ１のＩＬ２非α型活性。

【図20B】ＣＴＬＬ－２細胞株の増殖アッセイによって測定された、ＩＣ７及びＩＣ８のＩＬ２非α型活性。濃度値は、各試料に含まれる非α ＩＬ－２部分を指す。

【図21A】ＩＣ１によって誘導されるＮＫ細胞活性化の表面マーカ、ＣＤ１６の測定。

【図21B】ＩＣ１によって誘導されるＮＫ細胞活性化の表面マーカ、ＣＤ６９の測定。

【図21C】ＩＣ１によって誘導されるＮＫ細胞活性化の表面マーカ、ＣＤ１０７ａの測定。

【図22】ＥＬ４－ｈｕＣＤ２０モデルにおけるＩＣ７の抗腫瘍効果。

【図22A】高用量での親抗体との比較。

【図22B】親抗体とＩＬ２非αムテインとの組合せ（等モル量）との比較。

【図23】ＥＬ４－ｈｕＣＤ２０モデルにおけるＩＣ１の抗腫瘍効果。

【図23A】高用量リツキシマブとの比較。

【図23B】等モル量のリツキシマブとの比較。

【図23C】腫瘍細胞で再度チャレンジした生存動物におけるＩＣ１の長期保護効果。

【図23D】３ＬＬ－Ｄ１２２モデルにおける等モル量の抗体及びＩＬ２非αムテインに関するＩＣ８の抗腫瘍効果。

【図24】ＥＬ４－ｈＣＤ２０腫瘍を担持するＣ５７ＢＬ／６マウスにおけるＩＣ１によるインビボ免疫調節。

【図24A】ＣＤ８＋Ｔ細胞の絶対数。

【図24B】ＮＫ１．１＋ＣＤ３－細胞の絶対数。

【図24C】ＦＯＸＰ３＋ＣＤ４＋／ＣＤ８＋細胞の割合。

【図24D】ＦＯＸＰ３＋ＣＤ４＋／ＮＫ１．１＋ＣＤ３＋細胞の割合。

【図24E】ＦＯＸＰ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の絶対数。

【実施例】

【0034】

本発明を以下の例及び図面によってさらに詳述する。しかしながら、これらの例は、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。

【0035】

例１．ＩＣの設計及び取得。
抗原結合部位に関して二価の分子からなり、変異ＩＬ－２部分に関して二機能性であり、完全長ＩｇＧフォーマットに基づくヒトＩＣを設計した。具体的には、ＩＣ１、ＩＣ２、ＩＣ３、ＩＣ４、ＩＣ５及びＩＣ６は、図１（Ａ～Ｂ）に表されているようなフォーマットに対応する。

【0036】

ＩＣ１及びＩＣ２はヒトＣＤ２０分子に特異的であり、それらの可変領域の配列は、Ｂ細胞リンパ増殖性障害に対する受動療法における主要なモノクローナル抗体であるリツキシマブの配列である（Ｐｉｅｒｐｏｎｔ，Ｔ．Ｍ．，ｅｔａｌ．（２０１８）ＦｒｏｎｔＯｎｃｏｌ８：１６３；Ｓｅｈｎ，Ｌ．Ｈ．＆Ｇ．Ｓａｌｌｅｓ．（２０２１）ＮＥｎｇｌＪＭｅｄ．３８４（９）：８４２－８５８）。これらのＩＣの各々の軽鎖は、ＶＬ可変領域（配列番号１）及びヒトＣκ定常領域（配列番号９）によって形成される。重鎖は、配列番号２のＶＨ可変領域と、それに続く、カルボキシ末端に融合したリンカーペプチド（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）３ＴｈｒＧｌｙ（配列番号４４）を有するヒトＩｇＧ１定常領域（配列番号１１）と、その後にＩＬ２非α分子（ＩＣ１については配列番号２１、ＩＣ２については配列番号３７）とによって構成される。ＩＬ－２の突然変異体を含むこの特異性のＩＣは、これまで記載されていない。

【0037】

ＩＣ３及びＩＣ４は、正常組織には存在しないか又は少量しか検出されない、ＮＧｃＧＭ３ガングリオシドに特異的である（Ｖａｒｋｉ，Ａ．（２００９）ＧｌｙｃｏｃｏｎｊＪ２６（３）：２３１－２４５）。それらの可変領域の配列は、現在、進行期固形腫瘍の治療のための臨床試験中である（ＥＣ－ＩＩＣＲＤＥＣ１６８）、１４Ｆ７ｈＴ抗体の配列である。両方のＩＣの軽鎖は、ＶＬ可変領域（配列番号３）及びヒトＣκ定常領域（配列番号９）によって形成される。重鎖は、配列番号４のＶＨ可変領域と、それに続く、カルボキシル末端に融合したリンカーペプチド（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３ＴｈｒＧｌｙ（配列番号４４）を有するヒトＩｇＧ１定常領域（配列番号１１）と、その後に続くＩＬ２非α分子（ＩＣ３については配列番号２１、ＩＣ４については配列番号３７）とからなる。これまで、この抗体に基づくＩＣは得られておらず、ＮＧｃＧＭ３ガングリオシドに特異的な他のＩＣも得られていない。

【0038】

ＩＣ５及びＩＣ６はＥＧＦＲ受容体を認識し、それらの可変領域の配列は、上皮起源の腫瘍の治療に広く使用されている抗体ニモツズマブ（米国特許第５，８９１，９９６Ｂ２号）の配列に対応する（ＣｒｏｍｂｅｔＴ，ｅｔａｌ．（２００２）ＩｎｔＪＣａｎｃｅｒ１０１（６）：５６７－７５Ｒａｍｏｓ－ＳｕｚａｒｔｅＭｅｔａｌ（２０１２）ＣａｎｃｅｒＢｉｏｌＴｈｅｒ１３（８）：６００－５ＳｕａｒｅｚＭａｒｔｉｎｅｚＧａｎｄＢｅｎｃｏｍｏＹａｎｅｓＡ．（２０１４）ＢｉｏｔｅｃｎｏｌＡＰＬ［Ｉｎｔｅｒｎｅｔ］３１（２）：１５９－１６７，ＣｒｏｍｂｅｔＴ．（２０１４）Ｈａｎｄｂｏｏｋｏｆｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．１６７９－９４）。軽鎖は、ＶＬ可変領域（配列番号５）及びヒトＣκ定常領域（配列番号９）から構成される。重鎖は、配列番号６の配列のＶＨ可変領域と、それに続く、カルボキシ末端に融合したリンカーペプチド（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）_３ＴｈｒＧｌｙ（配列番号４４）を有するヒトＩｇＧ１定常領域（配列番号１１）と、その後に続くＩＬ２非α分子（ＩＣ５については配列番号２１、ＩＣ６については配列番号３７）とから構成される。

【0039】

完全マウスＩｇＧフォーマットに基づいて、抗原結合部位に関して二価であり、変異ＩＬ－２部分に関して二機能性である他の２つのＩＣを並行して設計した（図１Ａ～Ｂ）。

【0040】

ＩＣ７はヒトＣＤ２０分子に特異的であり、その可変領域の配列はリツキシマブの配列である。軽鎖は、ＶＬ可変領域（配列番号１）及びＣκマウス定常領域（配列番号１３）から構成される。重鎖は、配列番号２のＶＨ可変領域と、それに続く、カルボキシル末端に融合したリンカーペプチド（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３ＴｈｒＧｌｙ（配列番号４４）を有するマウスＩｇＧ２ａの定常領域（配列番号１５）と、それに続くＩＬ２非α分子（配列番号２１）とから構成される。

【0041】

ＩＣ８は、ＮＧｃＧＭ３ガングリオシドに特異的である。その可変領域の配列は、１４Ｆ７ｈＴのマウス祖先である１４Ｆ７抗体（米国特許第６，４２９，２９５Ｂ１号）の配列である。軽鎖は、ＶＬ可変領域（配列番号７）及びＣκマウス定常領域（配列番号１３）によって形成される。重鎖は、配列番号８のＶＨ可変領域と、それに続く、カルボキシ末端に融合したリンカーペプチド（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）_３ＴｈｒＧｌｙ（配列番号４４）を有するマウスＩｇＧ１の定常領域（配列番号１４）と、その後にＩＬ２非α分子（配列番号２１）とから構成される。

【0042】

ヒトＩＣを得るために、リツキシマブ、ニモツズマブ又は１４Ｆ７ｈＴ抗体の軽鎖の可変領域をコードする遺伝子を、ヒトＣκ定常領域遺伝子を含むベクターｐＦＵＳＥ（Ｃｋｈ）にクローニングし、したがって、それぞれの軽鎖をコードする遺伝子を構築した。

【0043】

続いて、そのＮ末端を介してリンカーペプチド（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）_３ＴｈｒＧｌｙ（配列番号４４）に融合したＩＬ２非αムテイン（配列番号２１又は配列番号３７）をコードする遺伝子セグメントを、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用することによって増幅し、次に、ＥｃｏＲＶ／ＸｂａＩを、ＥｃｏＲＶ部位の挿入のために予め改変されたベクターｐＦＵＳＥ（ＩｇＧ１ｈ）にクローニングした。得られた遺伝子構築物において、ＰＣＲによって予め増幅された対応するＶＨ遺伝子をＥｃｏＲＩ／ＮｈｅＩにクローニングした。

【0044】

ＩＣ１重鎖及び軽鎖遺伝子（抗ＣＤ２０）をｐＬＶ－ＣＭＶ－ＩＲＥＳ－Ｎｅｏベクターに独立してクローニングして、それぞれの移入ベクターを作製し、それを用いて本発明者らはレンチウイルス形質導入粒子の入手へと進んだ。組換え安定クローンの生成のために、先に得られたレンチウイルス粒子をＣＨＯ－Ｋ１細胞に形質導入した。ヒトＦｃ領域に対する特異的ＥＬＩＳＡを使用して、ＩＣ１融合タンパク質（抗ＣＤ２０）を、形質導入ＣＨＯＫ１細胞の上清において検出した（図２Ａ）。

【0045】

ＩＣ２（抗ＣＤ２０）を、ｐＦＵＳＥベクターにおける軽鎖及び重鎖をコードする遺伝子構築物に対応するプラスミドＤＮＡからの一過性発現によって得た（図２Ｂ）。

【0046】

ＩＣ３及びＩＣ４（抗ＮＧｃＧＭ３）を、ｐＦＵＳＥベクター中の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子構築物に対応するプラスミドＤＮＡを用いた一過性発現によって得た。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞をこれらの遺伝子構築物で一過性にトランスフェクトし、ＩＣ発現を、ヒトＦｃ領域に対する特異的ＥＬＩＳＡを使用して７日後に検証した（図２Ｃ）。

【0047】

ＩＣ５及びＩＣ６（抗ＥＧＦＲ）は、ｐＦＵＳＥベクター中の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子構築物に対応するプラスミドＤＮＡを用いたＨＥＫ２９３Ｔ細胞の一過性発現によって得た。懸濁液中で増殖させ、ＰＥＩでトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞の上清を、ヒトＦｃ領域に対する特異的ＥＬＩＳＡによって評価し、融合タンパク質の存在を確認した（図２Ｄ）。

【0048】

マウスＩＣを得るために、リツキシマブ抗体の軽鎖の可変領域をコードする遺伝子、又は１４Ｆ７を、マウスＣκ定常領域遺伝子を含むベクターｐＦＵＳＥ（Ｃｋｍ）にクローニングし、それぞれの軽鎖をコードする遺伝子を構築した。

【0049】

ＩＣ７（抗ＣＤ２０）の場合、重鎖遺伝子を、リツキシマブのＶＨ領域（配列番号２）、マウスＩｇＧ２ａのＣＨ領域（配列番号１５）、連結ペプチド（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）_３ＴｈｒＧｌｙ（配列番号４４）をコードする遺伝子セグメント及びＩＬ２非α分子（配列番号２１）のＰＣＲアセンブリによって得た。ｐＦＵＳＥベクターに含まれる得られた重鎖遺伝子及び軽鎖遺伝子をＰＣＲによって増幅し、ｐＬＶ－ＣＭＶ－ＩＲＥＳ－Ｎｅｏベクターに独立してクローニングした。このようにして、得られた移入ベクターを使用して、ＣＨＯ－Ｋ１細胞の形質導入にさらに使用されるレンチウイルス粒子を作製した。マウスＦｃ領域に対する特異的ＥＬＩＳＡを使用して、ＩＣ７（抗ＣＤ２０）融合タンパク質を、形質導入ＣＨＯＫ１細胞の上清において検出した（図２Ｅ）。

【0050】

ＩＣ８（抗ＮＧｃＧＭ３）については、そのＮ末端を介してリンカーペプチド（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）_３ＴｈｒＧｌｙに融合したＩＬ２非αムテイン（配列番号２１）をコードする遺伝子セグメントをＰＣＲによって増幅し、ＥｃｏＲＶ／ＸｂａＩを、ＥｃｏＲＶ部位の挿入のために予め改変されたｐＦＵＳＥベクター（マウスＩｇＧ１）にクローニングした。得られた遺伝子構築物において、予めＰＣＲによって増幅された遺伝子ＶＨ１４Ｆ７をＥｃｏＲＩ／ＮｈｅＩにクローニングした。ｐＦＵＳＥベクターに含まれる重鎖及び軽鎖遺伝子をＰＣＲによって増幅し、ｐＬＶ－ＣＭＶ－ＩＲＥＳ－Ｎｅｏベクターに独立してクローニングした。このようにして、得られた移入ベクターを使用して、ＣＨＯ－Ｋ１細胞の共形質導入にさらに使用されるレンチウイルス粒子を作製した。マウスＦｃ領域に対する特異的ＥＬＩＳＡを使用して、ＩＣ８融合タンパク質（抗ＮＧｃＧＭ３）を、形質導入ＣＨＯＫ１細胞の上清において検出した（図２Ｅ）。

【0051】

例２．ＩＣは、インタクトでかつ機能性のタンパク質として発現される。
組換えＣＨＯ－Ｋ１クローンの培養上清から、本発明者らは、ＩＣ抗ＣＤ２０－ＩＬ２非α（ＩｇＧ１ｈ）（ＩＣ１）、抗ＣＤ２０－ＩＬ２非α（マウスＩｇＧ２ａ）（ＩＣ７）及び抗ＮＧｃＧＭ３－ＩＬ２非α（マウスＩｇＧ１）（ＩＣ８）の精製へと進んだ。ゲル濾過を使用して、プロテインＡ捕捉工程及びその後の分取規模での分子排除クロマトグラフィを行った。次いで、精製タンパク質のサイズ及び免疫化学的同一性を評価した。ＩＣは、その電気泳動移動度が非還元条件については１８０ｋＤａのおおよその理論的サイズに対応するタンパク質として発現され（図３Ａ、図６Ａ及び図９Ａ）、還元条件では、理論的サイズに対応する移動度を有する組換え分子の両方の鎖の存在が観察されることが確認された：ＩＬ２非αムテインの存在に起因して、重鎖については約６５ｋＤａ（１５ｋＤａ）、及び軽鎖については２５ｋＤａ（図３Ｂ、図６Ｂ及び図９Ｂ）。抗体部分の同一性を、ヒトＩｇＧに特異的なウェスタンブロットアッセイを実施することによって検証し（図４Ａ～Ｂ及び図１２）、ＩＣの構造におけるサイトカインの存在を、ヒトＩＬ－２に対する特異的抗体を用いた同じ技術によって証明した（図４Ｃ、図７及び図１０）。融合タンパク質の純度を、ＴＳＫ３０００カラムを用いて、分析規模でＳＥＣ－ＨＰＬＣによって分析した（図５Ａ、図８及び図１１）。それらはＩｇＧ抗体（１５０ｋＤａ）と比較してより高い分子量を有するので、参照ｍＡｂよりも短い保持時間を示した（図５Ａ～Ｂ及び図１１）。高い割合のモノマー種（＞９５％）も観察され、それらの高い純度を示唆した（図５Ａ、図８及び図１１）。

【0052】

例３：ＩＣは、抗体部分に対応する生物学的活性をインビトロで保存及び増強する。
抗体部分が、得られた抗ＣＤ２０ＩＣの構造において活性であるかどうかを決定するために、親分子又は参照分子に関して等モル量を用いてインビトロ実験を行った。ＩＣ抗ＣＤ２０－ＩＬ２非α（ＩｇＧ１ｈ）（ＩＣ１）及び抗ＣＤ２０－ＩＬ２非α（ＩｇＧ２ａマウス）（ＩＣ７）によるヒトＣＤ２０分子の認識を、その膜上に高レベルのヒトＣＤ２０を発現するマウス腫瘍細胞株ＥＬ４－ｈｕＣＤ２０を使用して、フローサイトメトリによって決定した（ＤｉＧａｅｔａｎｏ，Ｎ．，ｅｔａｌ．（２００３）ＪＩｍｍｕｎｏｌ．１７１（３）：１５８１－１５８７）。ＩＣ１及びリツキシマブ（陽性対照）によるＥＬ４－ｈｕＣＤ２０細胞の認識レベル、ならびにＩＣ７及びその親抗体（Ｒｔｘ－ＩｇＧ２ａ）の認識レベルは類似していた（図１３Ａ～Ｂ）。上記の結果は、両方のＩＣがヒトＣＤ２０分子に結合してこれを認識する能力を実証している。ＩＣによるＥＬ４親細胞株の認識は陰性であり、これは、ＥＬ４－ｈｕＣＤ２０マウスリンパ腫細胞株で観察された標識の特異性を裏付ける（図１３Ａ～Ｂ）。さらに、ＣＤ２０を発現するバーキットリンパ腫の２つのヒト細胞株を評価した。図１４Ａ及びＢが示すように、これらの株の各々について、リツキシマブと比較したＩＣ１の認識パターンの違いは見られなかった。標識の特異性は、無関係なＩＣを認識しないこと、及びＩＣ１がＣＤ２０非発現Ｔリンパ腫であるＪｕｒｋａｔ細胞に結合できないことによって支持される（図１４Ａ～Ｂ）。

【0053】

補体カスケードの活性化は、リツキシマブのインビボ治療活性について提案された機構の１つである（Ｓｍｉｔｈ，Ｍ．Ｒ．（２００３）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ．２２（４７）：７３５９－７３６８；Ｓｅｙｆｉｚａｄｅｈ，Ｎ．，ｅｔａｌ．（２０１６）ＣｒｉｔＲｅｖＯｎｃｏｌＨｅｍａｔｏｌ．９７：２７５－２９０）。この理由から、ＩＣ１がＲａｍｏｓ腫瘍細胞株に対してＣＤＣを実行する能力を、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）の組み込みを介してフローサイトメトリによって評価した。１：５の最終希釈度のヒトＡＢ血清を補体源として使用した。３つの独立した試料について得られた陽性ＰＩ細胞の割合（％）の平均値±標準偏差を表示した（図１５）。６ｎＭのＩＣ１は、リツキシマブで観察された細胞傷害効果を保持した。

【0054】

無関係のＩＣは、試験した濃度で細胞傷害性を誘導しなかった（図１５）。この結果は、この活性が、同様のフォーマットの他のＩＣについて生じているので（Ｇｉｌｌｉｅｓ，Ｓ．Ｄ．，ｅｔａｌ．（２００５）Ｂｌｏｏｄ．１０５（１０）：３９７２－３９７８；Ｇｉｌｌｉｅｓ，Ｓ．Ｄ．，ｅｔａｌ．（１９９９）ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．５９（９）：２１５９－２１６６）、この分子については影響を受けないことを示している。

【0055】

腫瘍細胞でのアポトーシスは、臨床でのリツキシマブの治療作用を説明するために提案された機構の別の１つである（Ｓｍｉｔｈ，Ｍ．Ｒ．（２００３）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ．２２（４７）：７３５９－７３６８；Ｓｅｙｆｉｚａｄｅｈ，Ｎ．，ｅｔａｌ．（２０１６）ＣｒｉｔＲｅｖＯｎｃｏｌＨｅｍａｔｏｌ．９７：２７５－２９０）。ホスファチジルセリン曝露は、アポトーシスの初期段階を特徴付ける事象である（Ｋｏｏｐｍａｎ，Ｇ．，ｅｔａｌ．（１９９４）Ｂｌｏｏｄ．８４（５）：１４１５－１４２０）。原形質膜の外側単層におけるこのリン脂質の曝露を、ＩＣ１で処理したＲａｍｏｓ細胞において評価した。ホスファチジルセリンレベルを、アネキシンＶで標識することによってフローサイトメトリによって測定した。３つの試料について得られた平均値±標準偏差を表示した。初期アポトーシスの細胞は、アネキシンＶ＋／ＰＩ－標識を提示したものとして同定した（図１６Ａ）；後期アポトーシスの細胞は、アネキシンＶ＋／ＰＩ＋標識細胞であり、アポトーシスはこれら２つの集団の和として定義した（図１６Ｂ）。驚くべきことに、ＩＣ１はリツキシマブよりも優れた効果を有していた（図１６Ａ～Ｂ）。ホスファチジルセリン曝露が非アポトーシス事象で起こり得ることを考慮して、後期アポトーシスのマーカとしてのカスパーゼ３活性化をさらに評価した。カスパーゼ３の１７／１９ｋＤａ活性断片を、特定のウサギ血清及びＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ－４８８結合ウサギ抗血清を用いたフローサイトメトリによって決定した。３つの独立した試料について得られた活性カスパーゼ３細胞の割合の平均値±標準偏差を表示した。Ｒａｍｏｓ細胞を６ｎＭのＩＣ１と共に４８時間インキュベートすると、この酵素の活性化が誘導された（図１６Ｃ）。

【0056】

ＡＤＣＣは、リツキシマブの抗腫瘍作用を担う機構のもう１つである（Ｓｍｉｔｈ，Ｍ．Ｒ．（２００３）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ．２２（４７）：７３５９－７３６８；Ｓｅｙｆｉｚａｄｅｈ，Ｎ．，ｅｔａｌ．（２０１６）ＣｒｉｔＲｅｖＯｎｃｏｌＨｅｍａｔｏｌ．９７：２７５－２９０）。ＩＣ１がＡＤＣＣを媒介する能力を、細胞損傷の尺度として、標的細胞（Ｒａｍｏｓ）によって放出されたＬＤＨ酵素の活性の評価によって決定した。この実験は、エフェクタ細胞：標的細胞の比（１０：１）及び非活性化エフェクタ細胞の使用に関してリツキシマブの最適未満の設定で行った。末梢血単核細胞（ＰＭＢＣ）をエフェクタ細胞として使用し、Ｒａｍｏｓを標的細胞として使用した。図１７Ａに示すように、ＩＣ１は、リツキシマブ及びリツキシマブとＩＬ２非αとの組合せに関してより高い割合の特異的溶解を誘導した。誘導された細胞傷害性は濃度依存的であった。

【0057】

Ｒａｍｏｓ細胞に対するＡＤＣＣの誘導におけるＩＣ１の優位性を考慮して、ＰＢＭＣを標的細胞及びエフェクタ細胞の供給源として、非ホジキンリンパ腫患者から悪性細胞（ＣＤ１９＋）をインビトロで排除するその能力を検討した。この実験では、ＰＢＭＣをＩＣ及びリツキシマブ（１８ｎＭ）と共に２４時間インキュベートし、ＰＢＭＣ内のＢ細胞の割合をフローサイトメトリによって測定した。図１７Ｂに示すように、ＩＣ１及びリツキシマブは、健常ドナー由来の正常Ｂ細胞を死滅させることができた。特に、ＩＣ１のみが、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫患者のＰＢＭＣ内のＣＤ１９＋細胞の割合を有意に減少させた（図１７Ｂ）。これは、リツキシマブに対する耐性が不全又は非最適なＡＤＣＣに関連する患者においてこのＩＣ１を使用する可能性を示している。

【0058】

マウス免疫サイトカイン抗ＮＧｃＧＭ３－ＩＬ２非α（ＩＣ８）は、親抗体１４Ｆ７と同様に、ＥＬＩＳＡによってガングリオシドＮＧｃＧＭ３を認識した。結合の特異性は、アイソタイプ対照として使用した無関係のｍＡｂの非反応性によって支持される（図１８Ａ）。固相免疫酵素アッセイの補完として、フローサイトメトリ実験を行った。高レベルのガングリオシドＮＧｃＧＭ３を発現するＬ１２１０マウス腫瘍細胞を使用した（Ｒｏｑｕｅ－Ｎａｖａｒｒｏ，Ｌ．，ｅｔａｌ．（２００８）ＭｏｌＣａｎｃｅｒＴｈｅｒ．７（７）：２０３３－２０４１）。ＩＣ８は、１４Ｆ７抗体と同様に、この腫瘍細胞株に結合することができた（図１８Ｂ）。

【0059】

次に、本発明者らは、以前に１４Ｆ７について記載された（Ｒｏｑｕｅ－Ｎａｖａｒｒｏ，Ｌ．，ｅｔａｌ．（２００８）ＭｏｌＣａｎｃｅｒＴｈｅｒ．７（７）：２０３３－２０４１）、Ｌ１２１０細胞におけるエフェクタ機能とは無関係の細胞傷害活性を評価することに進んだ。このために、ＰＩによる核ＤＮＡ標識に対する膜透過性の増加を細胞死の指標として分析した。驚くべきことに、非生存細胞の割合は、ＩＣ抗ＮｅｕＧｃＧＭ３－ＩＬ２非αについて、処理なしの細胞及び親抗体と比較してより高かった（図１９）。

【0060】

例４．ＩＣは非α ＩＬ－２部分の機能性を保持する。
ＩＣのＩＬ２非α部分に対応するインビトロ生物学的活性を、ＩＬ－２Ｒの高親和性変異体を発現するＩＬ－２依存性マウス細胞株ＣＴＬＬ－２の増殖アッセイで評価した（図２０Ａ～Ｂ）。図２０に示される濃度値は、各試料に含まれる非α ＩＬ－２部分を指す。

【0061】

ムテイン及びＩＣとのＣＴＬＬ－２細胞のインキュベーションは、それらの増殖の刺激をもたらした。すべての場合に、増殖の程度は濃度依存的挙動を示した。この結果は、ＩＬ２非α部分が融合タンパク質との関連においてその機能性を維持することを実証している（図２０Ａ～Ｂ）。

【0062】

例５．ＩＣはＮＫ細胞活性化を促進する
ＮＫ細胞の活性化はＡＤＣＣにとって重要な工程であり、さらに、これらの細胞は、ＩＬ２非αムテインの抗腫瘍機能の重要なメディエータであることが示されている（Ｃａｒｍｅｎａｔｅ，Ｔ．，ｅｔａｌ．（２０１３）ＪＩｍｍｕｎｏｌ．１９０（１２）：６２３０－６２３８）。アッセイを設定した２０時間後、ＩＣ１がＮＫ細胞を活性化する能力を、１：１０の比の標的（Ｒａｍｏｓ）細胞及びエフェクタ（ＰＭＢＣ）細胞の存在下で、６．６ｎＭで決定した。ＩＣ１で処理した試料のＮＫ細胞集団では、リツキシマブと比較して表面マーカＣＤ１６の発現のより大きな減少が観察され（図２１Ａ）、これは、この細胞型のより高い活性化を示す（Ｂｏｗｌｅｓ，Ｊ．Ａ．ａｎｄＧ．Ｊ．Ｗｅｉｎｅｒ．（２００５）ＪＩｍｍｕｎｏｌＭｅｔｈｏｄｓ．３０４（１－２）：８８－９９）。同様に、ＣＤ６９発現の増加がＮＫ細胞活性化の証拠として検証され、この効果はリツキシマブの存在下でも観察された（図２１Ｂ）。リソソーム脱顆粒に関連する表面マーカであるＣＤ１０７ａの発現は、他の処理と比較して、ＩＣ１と共にインキュベートした細胞で３倍増加した（図２１Ｃ）。まとめると、これらの結果は、リツキシマブ抗体と比較して、この融合タンパク質で処理した細胞におけるＡＤＣＣ活性に関連するＮＫ細胞のより大きな活性化を実証しており、これはおそらくＩＬ２非αによって提供される増強効果によるものであり得る。

【0063】

例６．ＩＣは優れた抗腫瘍効果を有する。
抗体への非αムテインの融合が優れた抗腫瘍効果をもたらし得るという概念を実証するために、本発明者らは、マウスＩｇＧ２ａバージョンのリツキシマブ及び対応するＩＬ２非αベースのＩＣ（ＩＣ７）の抗腫瘍活性を比較した。このために、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに２．５×１０^５個のＥＬ４－ｈｕＣＤ２０＋細胞を静脈内接種し、続いて２０μｇのＩＣ７の３回の注射（１、４及び７日目）又は以前の試験で治療効果が実証されている（Ａｂｅｓ，Ｒ．，ｅｔａｌ．（２０１０）Ｂｌｏｏｄ．１１６（６）：９２６－９３４；Ｃａｓａｄｅｓｕｓ，Ａ．Ｖ．，ｅｔａｌ．（２０２０）Ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．９（１）：１７７０５６５）、２００μｇの親抗体抗ＣＤ２０ＩｇＧ２ａの５回の投与（１、４、７、１０及び１３日目）で腹腔内処置した。興味深いことに、低用量（２０ｕｇ）のＩＣ７による処置は、高用量のＩｇＧ２ａバージョンのリツキシマブを投与されたマウスで得られたものと同様の生存率を可能にした（図２２Ａ）。しかしながら、２０ｕｇのＩＣ７と等モル用量の抗体及び等モル量のＬ２非αムテインとのその組合せは、抗腫瘍効果を有しなかった（図２２Ｂ）。

【0064】

ヒト抗体とマウスエフェクタ細胞、ならびにヒトＩＬ－２とマウスＩＬ－２受容体との間の交差反応性のために（Ａｒｅｎａｓ－Ｒａｍｉｒｅｚ，Ｎ．，ｅｔａｌ．（２０１５）ＴｒｅｎｄｓＩｍｍｕｎｏｌ．３６（１２）：７６３－７７７）、本発明者らは免疫応答性マウスにおけるＩＣ１の有効性を評価した。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに５×１０^５個のＥＬ４－ｈｕＣＤ２０細胞を静脈内接種し、その後、１、４及び７日目に２０μｇのＩＣ１及び以前の試験で治療効果が証明されている（ＤｉＧａｅｔａｎｏ，Ｎ．，ｅｔａｌ（２００３）ＪＩｍｍｕｎｏｌ．１７１（３）：１５８１－１５８７）、１５０μｇのリツキシマブで腹腔内処置した（図２３Ａ）。リツキシマブと比較して７．５倍低い用量のＩＣ１が抗体と同じ抗腫瘍効果を有することが観察された（図２３Ａ）。さらに、ＩＣ１と等モル量のリツキシマブ（２０ｕｇ）は、ＩＣとは異なり、抗腫瘍効果を有していなかった（図２３Ｂ）。さらに、生存マウスを６５日目にＥＬ４－ｈｕＣＤ２０腫瘍細胞とＩＣ１とによる先の処置にチャレンジさせた後、低用量でのＩＣは、高用量のリツキシマブのマウスＩｇＧ２ａ変異体について記載された長期保護効果を維持することが確認された（Ａｂｅｓ，Ｒ．，ｅｔａｌ．（２０１０）Ｂｌｏｏｄ．１１６（６）：９２６－９３４）（図２３Ｃ）。

【0065】

対照に対する抗ＮＧｃＧＭ３－ＩＬ２非α（ＩＣ８）の抗腫瘍効果を比較するために、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、２００μＬの体積の３ＬＬ－Ｄ１２２の２×１０^５個の細胞を０日目に皮下（ｓｃ）接種した。６日後、その付着を確認した後、等モル量の抗体、サイトカイン、及びＩＣ（抗体については８５μｇ、ＩＬ２非αについては１６．６μｇ、ＩＣ８については１００μｇ）を腹腔内投与した。処置を８及び１０日目に繰り返した。ＩＣ８は、対照抗体１４Ｆ７とは異なり、処置動物において腫瘍体積を減少させることができた（図２３Ｄ）。

【0066】

例７．ＩＣは、制御性Ｔ細胞よりもＮＫ細胞及びＣＤ８＋細胞を選択的に拡大させる。
腫瘍状況における免疫細胞の特定の集団に対する非αムテインベースのＩＣの効果を評価するために、例６に記載されているように、ＥＬ４ｈｕ－ＣＤ２０腫瘍担持Ｃ５７ＢＬ／６マウスを抗ＣＤ２０－ＩＬ２非α（ＩＣ１）で処置した。腫瘍チャレンジの１０日後、脾臓を取り出し、異なる細胞集団をフローサイトメトリによって分析した。ＩＣ１については、ＴＣＤ８＋（図２４Ａ）及びＮＫ１．１＋ＣＤ３－（図２４Ｂ）細胞の有意な増加が観察されたが、リツキシマブ又はＰＢＳによる処置については検証されなかった。ＩＣ１は、ＦＯＸＰ３＋ＣＤ４＋／ＴＣＤ８＋とＦＯＸＰ３＋ＣＤ４＋／ＮＫ１．１＋ＣＤ３－との比によって示されるように、制御性Ｔ細胞よりもエフェクタ細胞の拡大を促進したことは注目に値する（図２４Ｃ～Ｄ）。エフェクタ細胞がより拡大しただけでなく、制御性Ｔ細胞の増加が観察されなかったことも注目に値する（図２４Ｅ）。この結果は、ＩＣ１が、観察された優れた抗腫瘍効果に寄与し得る、制御性Ｔ細胞を損なう、エフェクタ細胞に有利な免疫調節を達成することを実証している。

【0067】

まとめると、以前の結果は、以前に記載されたフォーマットを有する非αムテインに基づくＩＣの治療的優位性を指し示しており、証明された直接溶解効果、ＡＤＣＣ及び／又はＣＤＣを有する抗ＣＤ２０抗体と非α ＩＬ－２ムテインとの融合が、定性的又は定量的に異なる分子及び細胞機構の活性化をもたらし、抗体及び非αムテインの対照で得られる抗腫瘍応答よりも大きな抗腫瘍応答の増強を引き起こすことを示している。

【図1A】