特表 2024-547122 抗ＴＮＦＲ２抗体及びその使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-12-26

(54)【発明の名称】抗ＴＮＦＲ２抗体及びその使用

(51)【国際特許分類】

   C07K 16/24 20060101AFI20241219BHJP

   C12N 15/13 20060101ALI20241219BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20241219BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20241219BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20241219BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20241219BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20241219BHJP

   C12P 21/08 20060101ALI20241219BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20241219BHJP

   A61P 35/02 20060101ALI20241219BHJP

   A61K 47/68 20170101ALI20241219BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20241219BHJP

【ＦＩ】

C07K16/24 ZNA

C12N15/13

C12N15/63 Z

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

C12P21/08

A61P35/00

A61P35/02

A61K47/68

A61K39/395 E

A61K39/395 T

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024538148

(86)(22)【出願日】2022-12-22

(85)【翻訳文提出日】2024-06-21

(86)【国際出願番号】 CN2022140958

(87)【国際公開番号】W WO2023116813

(87)【国際公開日】2023-06-29

(31)【優先権主張番号】PCT/CN2021/140487

(32)【優先日】2021-12-22

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】521213200

【氏名又は名称】バイオサイトジェン ファーマシューティカルズ （ベイジン） カンパニー リミテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100099759

【弁理士】

【氏名又は名称】青木 篤

(74)【代理人】

【識別番号】100123582

【弁理士】

【氏名又は名称】三橋 真二

(74)【代理人】

【識別番号】100108903

【弁理士】

【氏名又は名称】中村 和広

(74)【代理人】

【識別番号】100123593

【弁理士】

【氏名又は名称】関根 宣夫

(74)【代理人】

【識別番号】100208225

【弁理士】

【氏名又は名称】青木 修二郎

(74)【代理人】

【識別番号】100217179

【弁理士】

【氏名又は名称】村上 智史

(74)【代理人】

【識別番号】100227592

【弁理士】

【氏名又は名称】孔 詩麒

(72)【発明者】

【氏名】ヤン ヨンフェイ

(72)【発明者】

【氏名】ツァオ シューツェン

(72)【発明者】

【氏名】チャン チン

(72)【発明者】

【氏名】シャオ チョー

(72)【発明者】

【氏名】チアン シュエユアン

【テーマコード（参考）】

4B064

4B065

4C076

4C085

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B064AG27

4B064CA19

4B064CC24

4B064CE12

4B064DA05

4B065AA92X

4B065AB05

4B065AC14

4B065BA08

4B065CA25

4B065CA44

4B065CA46

4C076AA95

4C076CC27

4C076CC41

4C076EE41

4C076EE59

4C085AA13

4C085BB31

4C085CC22

4C085DD61

4C085EE01

4H045AA11

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA10

4H045CA40

4H045DA76

4H045EA28

4H045FA72

4H045FA74

4H045GA26

(57)【要約】

抗ＴＮＦＲ２（腫瘍壊死因子受容体２）抗体、抗原結合断片、及びこれらの使用を提供する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＴＮＦＲ２に結合する抗体又はその抗原結合断片であって、
相補性決定領域（ＣＤＲ）１、２、及び３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）であって、前記ＶＨ ＣＤＲ１領域は、選択されたＶＨ ＣＤＲ１アミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含み、前記ＶＨ ＣＤＲ２領域は、選択されたＶＨ ＣＤＲ２アミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含み、前記ＶＨ ＣＤＲ３領域は、選択されたＶＨ ＣＤＲ３アミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含む、前記重鎖可変領域と、
ＣＤＲ１、２、及び３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）であって、前記ＶＬ ＣＤＲ１領域は、選択されたＶＬ ＣＤＲ１アミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含み、前記ＶＬ ＣＤＲ２領域は、選択されたＶＬ ＣＤＲ２アミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含み、前記ＶＬ ＣＤＲ３領域は、選択されたＶＬ ＣＤＲ３アミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含む、前記軽鎖可変領域と、を含み、
前記選択されたＶＨ ＣＤＲ１、２、及び３アミノ酸配列、並びに、前記選択されたＶＬ ＣＤＲ１、２、及び３アミノ酸配列は、以下：
（１）前記選択されたＶＨ ＣＤＲ１、２、３アミノ酸配列はそれぞれ、配列番号６、７、８に記載され、前記選択されたＶＬ ＣＤＲ１、２、３アミノ酸配列はそれぞれ、配列番号９、１０、１１に記載され、
（２）前記選択されたＶＨ ＣＤＲ１、２、３アミノ酸配列はそれぞれ、配列番号１２、１３、１４に記載され、前記選択されたＶＬ ＣＤＲ１、２、３アミノ酸配列はそれぞれ、配列番号１５、１６、１７に記載され、
（３）前記選択されたＶＨ ＣＤＲ１、２、３アミノ酸配列はそれぞれ、配列番号１８、１９、２０に記載され、前記選択されたＶＬ ＣＤＲ１、２、３アミノ酸配列はそれぞれ、配列番号２１、２２、２３に記載され、
（４）前記選択されたＶＨ ＣＤＲ１、２、３アミノ酸配列はそれぞれ、配列番号２４、２５、２６に記載され、前記選択されたＶＬ ＣＤＲ１、２、３アミノ酸配列はそれぞれ、配列番号２７、２８、２９に記載され、
（５）前記選択されたＶＨ ＣＤＲ１、２、３アミノ酸配列はそれぞれ、配列番号３０、３１、３２に記載され、前記選択されたＶＬ ＣＤＲ１、２、３アミノ酸配列はそれぞれ、配列番号３３、３４、３５に記載され、
（６）前記選択されたＶＨ ＣＤＲ１、２、３アミノ酸配列はそれぞれ、配列番号４２、４３、４４に記載され、前記選択されたＶＬ ＣＤＲ１、２、３アミノ酸配列はそれぞれ、配列番号４５、４６、４７に記載され、
（７）前記選択されたＶＨ ＣＤＲ１、２、３アミノ酸配列はそれぞれ、配列番号４８、４９、５０に記載され、前記選択されたＶＬ ＣＤＲ１、２、３アミノ酸配列はそれぞれ、配列番号５１、５２、５３に記載され、
（８）前記選択されたＶＨ ＣＤＲ１、２、３アミノ酸配列はそれぞれ、配列番号５４、５５、５６に記載され、前記選択されたＶＬ ＣＤＲ１、２、３アミノ酸配列はそれぞれ、配列番号５７、５８、５９に記載され、
（９）前記選択されたＶＨ ＣＤＲ１、２、３アミノ酸配列はそれぞれ、配列番号６０、６１、６２に記載され、前記選択されたＶＬ ＣＤＲ１、２、３アミノ酸配列はそれぞれ、配列番号６３、６４、６５に記載され、又は
（１０）前記選択されたＶＨ ＣＤＲ１、２、３アミノ酸配列はそれぞれ、配列番号６６、６７、６８に記載され、前記選択されたＶＬ ＣＤＲ１、２、３アミノ酸配列はそれぞれ、配列番号６９、７０、７１に記載される、
のうちの１つである、
抗体又はその抗原結合断片。

【請求項2】

Ｋａｂａｔの付番に従い、前記ＶＨは、それぞれ、配列番号６、７、及び８に記載されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、２、３を含み、前記ＶＬは、それぞれ、配列番号９、１０、及び１１に記載されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、２、３を含む、
請求項１に記載の抗体又はその抗原結合断片。

【請求項3】

Ｋａｂａｔの付番に従い、前記ＶＨは、それぞれ、配列番号１２、１３、及び１４に記載されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、２、３を含み、前記ＶＬは、それぞれ、配列番号１５、１６、及び１７に記載されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、２、３を含む、
請求項１に記載の抗体又はその抗原結合断片。

【請求項4】

Ｋａｂａｔの付番に従い、前記ＶＨは、それぞれ、配列番号１８、１９、及び２０に記載されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、２、３を含み、前記ＶＬは、それぞれ、配列番号２１、２２、及び２３に記載されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、２、３を含む、
請求項１に記載の抗体又はその抗原結合断片。

【請求項5】

Ｋａｂａｔの付番に従い、前記ＶＨは、それぞれ、配列番号２４、２５、及び２６に記載されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、２、３を含み、前記ＶＬは、それぞれ、配列番号２７、２８、及び２９に記載されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、２、３を含む、
請求項１に記載の抗体又はその抗原結合断片。

【請求項6】

Ｋａｂａｔの付番に従い、前記ＶＨは、それぞれ、配列番号３０、３１、及び３２に記載されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、２、３を含み、前記ＶＬは、それぞれ、配列番号３３、３４、及び３５に記載されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、２、３を含む、
請求項１に記載の抗体又はその抗原結合断片。

【請求項7】

前記抗体又は抗原結合断片は、ヒトＴＮＦＲ２に特異的に結合する、
請求項１～６のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合断片。

【請求項8】

前記抗体又は抗原結合断片は、ヒト抗体又はその抗原結合断片（例えば、ヒトＩｇＧ１抗体）である、
請求項１～７のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合断片。

【請求項9】

前記抗体又は抗原結合断片は、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）である、
請求項１～８のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合断片。

【請求項10】

ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む核酸であって、
（１）それぞれ、配列番号６、７、及び８に記載されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域（ＣＤＲ）１、２、及び３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）を含む、免疫グロブリン重鎖又はその断片であって、前記ＶＨは、配列番号３７に記載されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）と対形成する際に、ＴＮＦＲ２に結合する、免疫グロブリン重鎖又はその断片、
（２）それぞれ、配列番号９、１０、及び１１に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、２、及び３を含むＶＬを含む、免疫グロブリン軽鎖又はその断片であって、前記ＶＬは、配列番号３６に記載されるアミノ酸配列を含むＶＨと対形成する際に、ＴＮＦＲ２に結合する、免疫グロブリン軽鎖又はその断片、
（３）それぞれ、配列番号１２、１３、及び１４に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、２、及び３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）を含む、免疫グロブリン重鎖又はその断片であって、前記ＶＨは、配列番号３９に記載されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）と対形成する際に、ＴＮＦＲ２に結合する、免疫グロブリン重鎖又はその断片、
（４）それぞれ、配列番号１５、１６、及び１７に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、２、及び３を含むＶＬを含む、免疫グロブリン軽鎖又はその断片であって、前記ＶＬは、配列番号３８に記載されるアミノ酸配列を含むＶＨと対形成する際に、ＴＮＦＲ２に結合する、免疫グロブリン軽鎖又はその断片、
（５）それぞれ、配列番号１８、１９、及び２０に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、２、及び３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）を含む、免疫グロブリン重鎖又はその断片であって、前記ＶＨは、配列番号４１に記載されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）と対形成する際に、ＴＮＦＲ２に結合する、免疫グロブリン重鎖又はその断片、
（６）それぞれ、配列番号２１、２２、及び２３に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、２、及び３を含むＶＬを含む、免疫グロブリン軽鎖又はその断片であって、前記ＶＬは、配列番号４０に記載されるアミノ酸配列を含むＶＨと対形成する際に、ＴＮＦＲ２に結合する、免疫グロブリン軽鎖又はその断片、
（７）それぞれ、配列番号２４、２５、及び２６に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、２、及び３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）を含む、免疫グロブリン重鎖又はその断片であって、前記ＶＨは、配列番号７３に記載されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）と対形成する際に、ＴＮＦＲ２に結合する、免疫グロブリン重鎖又はその断片、
（８）それぞれ、配列番号２７、２８、及び２９に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、２、及び３を含むＶＬを含む、免疫グロブリン軽鎖又はその断片であって、前記ＶＬは、配列番号７２に記載されるアミノ酸配列を含むＶＨと対形成する際に、ＴＮＦＲ２に結合する、免疫グロブリン軽鎖又はその断片、
（９）それぞれ、配列番号３０、３１、及び３２に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、２、及び３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）を含む、免疫グロブリン重鎖又はその断片であって、前記ＶＨは、配列番号７５に記載されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）と対形成する際に、ＴＮＦＲ２に結合する、免疫グロブリン重鎖又はその断片、あるいは
（１０）それぞれ、配列番号３３、３４、及び３５に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、２、及び３を含むＶＬを含む、免疫グロブリン軽鎖又はその断片であって、前記ＶＬは、配列番号７４に記載されるアミノ酸配列を含むＶＨと対形成する際に、ＴＮＦＲ２に結合する、免疫グロブリン軽鎖又はその断片、
を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む核酸。

【請求項11】

前記核酸は、それぞれ、配列番号６、７、及び８に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、２、及び３を含むＶＨを含む、免疫グロブリン重鎖又はその断片を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、
請求項１０に記載の核酸。

【請求項12】

前記核酸は、それぞれ、配列番号９、１０、及び１１に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、２、及び３を含むＶＬを含む、免疫グロブリン軽鎖又はその断片を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、
請求項１０に記載の核酸。

【請求項13】

前記核酸は、それぞれ、配列番号１２、１３、及び１４に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、２、及び３を含むＶＨを含む、免疫グロブリン重鎖又はその断片を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、
請求項１０に記載の核酸。

【請求項14】

前記核酸は、それぞれ、配列番号１５、１６、及び１７に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、２、及び３を含むＶＬを含む、免疫グロブリン軽鎖又はその断片を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、
請求項１０に記載の核酸。

【請求項15】

前記核酸は、それぞれ、配列番号１８、１９、及び２０に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、２、及び３を含むＶＨを含む、免疫グロブリン重鎖又はその断片を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、
請求項１０に記載の核酸。

【請求項16】

前記核酸は、それぞれ、配列番号２１、２２、及び２３に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、２、及び３を含むＶＬを含む、免疫グロブリン軽鎖又はその断片を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、
請求項１０に記載の核酸。

【請求項17】

前記核酸は、それぞれ、配列番号２４、２５、及び２６に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、２、及び３を含むＶＨを含む、免疫グロブリン重鎖又はその断片を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、
請求項１０に記載の核酸。

【請求項18】

前記核酸は、それぞれ、配列番号２７、２８、及び２９に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、２、及び３を含むＶＬを含む、免疫グロブリン軽鎖又はその断片を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、
請求項１０に記載の核酸。

【請求項19】

前記核酸は、それぞれ、配列番号３０、３１、及び３２に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、２、及び３を含むＶＨを含む、免疫グロブリン重鎖又はその断片を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、
請求項１０に記載の核酸。

【請求項20】

前記核酸は、それぞれ、配列番号３３、３４、及び３５に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、２、及び３を含むＶＬを含む、免疫グロブリン軽鎖又はその断片を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、
請求項１０に記載の核酸。

【請求項21】

前記ＶＨは、ＶＬと対形成する際に、ヒトＴＮＦＲ２に特異的に結合するか、又は、前記ＶＬは、ＶＨと対形成する際に、ヒトＴＮＦＲ２に特異的に結合する、
請求項１０～２０のいずれか１項に記載の核酸。

【請求項22】

前記免疫グロブリン重鎖又はその断片は、ヒト免疫グロブリン重鎖又はその断片であり、前記免疫グロブリン軽鎖又はその断片は、ヒト免疫グロブリン軽鎖又はその断片である、
請求項１０～２１のいずれか１項に記載の核酸。

【請求項23】

前記核酸は、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）をコードする、
請求項１０～２２のいずれか１項に記載の核酸。

【請求項24】

前記核酸はｃＤＮＡである、
請求項１０～２３のいずれか１項に記載の核酸。

【請求項25】

請求項１０～２４のいずれか１項に記載の核酸の１つ以上を含む、
ベクター。

【請求項26】

請求項１０～２４のいずれか１項に記載の核酸の２つを含むベクターであって、前記ベクターは、共にＴＮＦＲ２に結合する前記ＶＨ領域及び前記ＶＬ領域をコードする、
ベクター。

【請求項27】

一対のベクターであって、各ベクターは、請求項１０～２４のいずれか１項に記載の核酸の１つを含み、前記一対のベクターと共に、共にＴＮＦＲ２に結合する前記ＶＨ領域及び前記ＶＬ領域をコードする、
一対のベクター。

【請求項28】

請求項２５若しくは２６に記載のベクター、又は請求項２７に記載の一対のベクター、を含む、
細胞。

【請求項29】

前記細胞はＣＨＯ細胞である、
請求項２８に記載の細胞。

【請求項30】

請求項１０～２４のいずれか１項に記載の核酸の１つ以上を含む、
細胞。

【請求項31】

請求項１０～２４のいずれか１項に記載の核酸の２つを含む、
細胞。

【請求項32】

前記２つの核酸は共に、共にＴＮＦＲ２に結合する前記ＶＨ領域及び前記ＶＬ領域をコードする、
請求項３１に記載の細胞。

【請求項33】

抗体又はその抗原結合断片の産生方法であって、
(a) 請求項２８～３２のいずれか１項に記載の細胞を、前記細胞に対して、前記抗体又は前記抗原結合断片を産生するのに十分な条件下で培養することと、
(b) 前記細胞により産生される前記抗体又は前記抗原結合断片を収集することと、
(c) を含む、方法。

【請求項34】

ＴＮＦＲ２に結合する抗体又はその抗原結合断片であって、
選択された重鎖可変領域（ＶＨ）配列と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含むＶＨと、選択された軽鎖可変領域（ＶＬ）配列と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含むＶＬと、を含み、前記選択されたＶＨ配列、及び前記選択されたＶＬ配列は、以下：
（１）前記選択されたＶＨ配列は配列番号３６であり、前記選択されたＶＬ配列は配列番号３７であり、
（２）前記選択されたＶＨ配列は配列番号３８であり、前記選択されたＶＬ配列は配列番号３９であり、
（３）前記選択されたＶＨ配列は配列番号４０であり、前記選択されたＶＬ配列は配列番号４１であり、
（４）前記選択されたＶＨ配列は配列番号７２であり、前記選択されたＶＬ配列は配列番号７３であり、又は
（５）前記選択されたＶＨ配列は配列番号７４であり、前記選択されたＶＬ配列は配列番号７５である、
のうちの１つである、
前記抗体又はその抗原結合断片。

【請求項35】

前記ＶＨは配列番号３６の配列を含み、前記ＶＬは配列番号３７の配列を含む、
請求項３４に記載の抗体又はその抗原結合断片。

【請求項36】

前記ＶＨは配列番号７２の配列を含み、前記ＶＬは配列番号７３の配列を含む、
請求項３４に記載の抗体又はその抗原結合断片。

【請求項37】

前記ＶＨは配列番号３８の配列を含み、前記ＶＬは配列番号３９の配列を含む、
請求項３４に記載の抗体又はその抗原結合断片。

【請求項38】

前記ＶＨは配列番号４０の配列を含み、前記ＶＬは配列番号４１の配列を含む、
請求項３４に記載の抗体又はその抗原結合断片。

【請求項39】

前記ＶＨは配列番号７４の配列を含み、前記ＶＬは配列番号７５の配列を含む、
請求項３４に記載の抗体又はその抗原結合断片。

【請求項40】

前記抗体又は抗原結合断片は、ヒトＴＮＦＲ２に特異的に結合する、
請求項３４～３９のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合断片。

【請求項41】

前記抗体又は抗原結合断片は、ヒト抗体又はその抗原結合断片である、
請求項３４～４０のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合断片。

【請求項42】

前記抗体又は抗原結合断片は、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）である、
請求項３４～４１のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合断片。

【請求項43】

請求項１～９、及び３４～４２のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合断片と交差競合する、
抗体又はその抗原結合断片。

【請求項44】

ＴＮＦＲ２に結合する抗体又はその抗原結合断片であって、
選択された重鎖可変領域（ＶＨ）配列のＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、及びＶＨ ＣＤＲ３と同一のＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、及びＶＨ ＣＤＲ３を含むＶＨ、並びに
選択された軽鎖可変領域（ＶＬ）配列のＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、及びＶＬ ＣＤＲ３と同一のＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、及びＶＬ ＣＤＲ３を含むＶＬを含み、前記選択されたＶＨ配列、及び前記選択されたＶＬ配列は、以下：
（１）前記選択されたＶＨ配列は配列番号３６であり、前記選択されたＶＬ配列は配列番号３７であり、
（２）前記選択されたＶＨ配列は配列番号３８であり、前記選択されたＶＬ配列は配列番号３９であり、
（３）前記選択されたＶＨ配列は配列番号４０であり、前記選択されたＶＬ配列は配列番号４１であり、
（４）前記選択されたＶＨ配列は配列番号７２であり、前記選択されたＶＬ配列は配列番号７３であり、又は
（５）前記選択されたＶＨ配列は配列番号７４であり、前記選択されたＶＬ配列は配列番号７５である、
のうちの１つである、
前記抗体又はその抗原結合断片。

【請求項45】

治療剤に共有結合した、請求項１～９、及び３４～４４のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合断片を含む、
抗体薬物コンジュゲート。

【請求項46】

前記治療剤は、細胞毒性剤又は細胞増殖抑制剤である、
請求項４５に記載の抗体薬物コンジュゲート。

【請求項47】

癌を有する対象の治療方法であって、前記方法は、治療に有効な量の、請求項１～９、及び３４～４４のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合断片、又は、請求項４５若しくは４６に記載の抗体薬物コンジュゲートを含む組成物を、前記対象に投与することを含む、
方法。

【請求項48】

前記対象は、結腸直腸癌、卵巣癌、急性骨髄性白血病、ルイス肺癌、乳癌、肝細胞癌、神経系癌、神経膠腫、及び大腸癌を有する、
請求項４７に記載の方法。

【請求項49】

前記対象は、腎細胞癌、多発性骨髄腫、大腸癌、卵巣癌、神経膠腫、又は皮膚Ｔ細胞リンパ腫を患う、
請求項４７に記載の方法。

【請求項50】

前記癌は大腸癌、神経膠腫、又は卵巣癌である、
請求項４７に記載の方法。

【請求項51】

腫瘍増殖速度を低減する方法であって、
腫瘍細胞を、有効量の、請求項１～９、及び３４～４４のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合断片、又は、請求項４５若しくは４６に記載の抗体薬物コンジュゲートを含む組成物と接触させることを含む、
方法。

【請求項52】

腫瘍細胞の殺傷方法であって、
腫瘍細胞を、有効量の、請求項１～９、及び３４～４４のいずれか１項に記載の前記抗体又はその抗原結合断片、又は、請求項４５若しくは４６に記載の抗体薬物コンジュゲートを含む組成物と接触させることを含む、
方法。

【請求項53】

請求項１～９、及び３４～４４のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合断片と、薬学的に許容される担体と、を含む、
医薬組成物。

【請求項54】

請求項４５又は４６に記載の抗体薬物コンジュゲートと、薬学的に許容される担体と、を含む、
医薬組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

優先権の主張
本出願は、２０２１年１２月２２日に出願された国際出願番号第ＰＣＴ／ＣＮ２０２１／１４０４８７号の利益を主張する。上述の内容全体が参照により、本明細書に組み込まれている。

【0002】

（技術分野）
本開示は、抗ＴＮＦＲ２（腫瘍壊死因子受容体２）抗体、及びその使用に関する。

【背景技術】

【0003】

癌は現在、人間の死亡率が最も高い疾患の一つである。世界保健機関の統計データによると、２０１２年には、世界での癌の発病率、及び死亡症例の数は、それぞれ１４００万件、及び８２０万件に達した。中国では、新しく診断された癌症例は３０７万件であり、死亡者数は２２０万人である。

【0004】

最近の、抗癌抗体の臨床的及び商業的成功によって、抗体ベース療法に多大な関心が寄せられている。癌、又は自己免疫疾患を治療するための、様々な抗体ベース治療法で用いるための抗体の開発が必要とされている。

【発明の概要】

【0005】

本開示は、抗ＴＮＦＲ２抗体、その抗原結合断片、及びその使用に関する。

【0006】

一態様では、本開示は、相補性決定領域（ＣＤＲ）１、２、及び３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）であって、上記ＶＨ ＣＤＲ１領域は、選択されたＶＨ ＣＤＲ１アミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含み、上記ＶＨ ＣＤＲ２領域は、選択されたＶＨ ＣＤＲ２アミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含み、上記ＶＨ ＣＤＲ３領域は、選択されたＶＨ ＣＤＲ３アミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含む、重鎖可変領域と、ＣＤＲ１、２、及び３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）であって、上記ＶＬ ＣＤＲ１領域は、選択されたＶＬ ＣＤＲ１アミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含み、上記ＶＬ ＣＤＲ２領域は、選択されたＶＬ ＣＤＲ２アミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含み、上記ＶＬ ＣＤＲ３領域は、選択されたＶＬ ＣＤＲ３アミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含む、軽鎖可変領域と、を含み、上記選択されたＶＨ ＣＤＲ１、２、及び３アミノ酸配列、並びに上記選択されたＶＬ ＣＤＲ１、２、及び３アミノ酸配列は、以下：
（１）上記選択されたＶＨ ＣＤＲ１、２、３アミノ酸配列はそれぞれ、配列番号６、７、８に記載され、上記選択されたＶＬ ＣＤＲ１、２、３アミノ酸配列はそれぞれ、配列番号９、１０、１１に記載され、
（２）上記選択されたＶＨ ＣＤＲ１、２、３アミノ酸配列はそれぞれ、配列番号１２、１３、１４に記載され、上記選択されたＶＬ ＣＤＲ１、２、３アミノ酸配列はそれぞれ、配列番号１５、１６、１７に記載され、
（３）上記選択されたＶＨ ＣＤＲ１、２、３アミノ酸配列はそれぞれ、配列番号１８、１９、２０に記載され、上記選択されたＶＬ ＣＤＲ１、２、３アミノ酸配列はそれぞれ、配列番号２１、２２、２３に記載され、
（４）上記選択されたＶＨ ＣＤＲ１、２、３アミノ酸配列はそれぞれ、配列番号２４、２５、２６に記載され、上記選択されたＶＬ ＣＤＲ１、２、３アミノ酸配列はそれぞれ、配列番号２７、２８、２９に記載され、
（５）上記選択されたＶＨ ＣＤＲ１、２、３アミノ酸配列はそれぞれ、配列番号３０、３１、３２に記載され、上記選択されたＶＬ ＣＤＲ１、２、３アミノ酸配列はそれぞれ、配列番号３３、３４、３５に記載され、
（６）上記選択されたＶＨ ＣＤＲ１、２、３アミノ酸配列はそれぞれ、配列番号４２、４３、４４に記載され、上記選択されたＶＬ ＣＤＲ１、２、３アミノ酸配列はそれぞれ、配列番号４５、４６、４７に記載され、
（７）上記選択されたＶＨ ＣＤＲ１、２、３アミノ酸配列はそれぞれ、配列番号４８、４９、５０に記載され、上記選択されたＶＬ ＣＤＲ１、２、３アミノ酸配列はそれぞれ、配列番号５１、５２、５３に記載され、
（８）上記選択されたＶＨ ＣＤＲ１、２、３アミノ酸配列はそれぞれ、配列番号５４、５５、５６に記載され、上記選択されたＶＬ ＣＤＲ１、２、３アミノ酸配列はそれぞれ、配列番号５７、５８、５９に記載され、
（９）上記選択されたＶＨ ＣＤＲ１、２、３アミノ酸配列はそれぞれ、配列番号６０、６１、６２に記載され、上記選択されたＶＬ ＣＤＲ１、２、３アミノ酸配列はそれぞれ、配列番号６３、６４、６５に記載され、又は、
（１０）上記選択されたＶＨ ＣＤＲ１、２、３アミノ酸配列はそれぞれ、配列番号６６、６７、６８に記載され、上記選択されたＶＬ ＣＤＲ１、２、３アミノ酸配列はそれぞれ、配列番号６９、７０、７１に記載される、
のうちの１つである、
ＴＮＦＲ２に結合する抗体又はその抗原結合断片に関する。

【0007】

いくつかの実施形態において、Ｋａｂａｔの付番に従い、ＶＨは、それぞれ、配列番号６、７、及び８に記載されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、２、３を含み、及びＶＬは、それぞれ、配列番号９、１０、及び１１に記載されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、２、３を含む。

【0008】

いくつかの実施形態において、Ｋａｂａｔの付番に従い、ＶＨは、それぞれ、配列番号１２、１３、及び１４に記載されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、２、３を含み、及びＶＬは、それぞれ、配列番号１５、１６、及び１７に記載されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、２、３を含む。

【0009】

いくつかの実施形態において、Ｋａｂａｔの付番に従い、ＶＨは、それぞれ、配列番号１８、１９、及び２０に記載されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、２、３を含み、及びＶＬは、それぞれ、配列番号２１、２２、及び２３に記載されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、２、３を含む。

【0010】

いくつかの実施形態において、Ｋａｂａｔの付番に従い、ＶＨは、それぞれ、配列番号２４、２５、及び２６に記載されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、２、３を含み、及びＶＬは、それぞれ、配列番号２７、２８、及び２９に記載されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、２、３を含む。

【0011】

いくつかの実施形態において、Ｋａｂａｔの付番に従い、ＶＨは、それぞれ、配列番号３０、３１、及び３２に記載されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、２、３を含み、及びＶＬは、それぞれ、配列番号３３、３４、及び３５に記載されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、２、３を含む。

【0012】

いくつかの実施形態において、抗体又は抗原結合断片は、ヒトＴＮＦＲ２に特異的に結合する。

【0013】

いくつかの実施形態において、抗体又は抗原結合断片は、ヒト抗体又はその抗原結合断片（例えば、ヒトＩｇＧ１抗体）である。

【0014】

いくつかの実施形態において、抗体又は抗原結合断片は、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）である。

【0015】

一態様では、本開示は、
（１）それぞれ、配列番号６、７、及び８に記載されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域（ＣＤＲ）１、２、及び３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）を含む、免疫グロブリン重鎖又はその断片であって、上記ＶＨは、配列番号３７に記載されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）と対形成する際に、ＴＮＦＲ２に結合する、免疫グロブリン重鎖又はその断片、
（２）それぞれ、配列番号９、１０、及び１１に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、２、及び３を含むＶＬを含む、免疫グロブリン軽鎖又はその断片であって、上記ＶＬは、配列番号３６に記載されるアミノ酸配列を含むＶＨと対形成する際に、ＴＮＦＲ２に結合する、免疫グロブリン軽鎖又はその断片、
（３）それぞれ、配列番号１２、１３、及び１４に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、２、及び３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）を含む、免疫グロブリン重鎖又はその断片であって、上記ＶＨは、配列番号３９に記載されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）と対形成する際に、ＴＮＦＲ２に結合する、免疫グロブリン重鎖又はその断片、
（４）それぞれ、配列番号１５、１６、及び１７に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、２、及び３を含むＶＬを含む、免疫グロブリン軽鎖又はその断片であって、上記ＶＬは、配列番号３８に記載されるアミノ酸配列を含むＶＨと対形成する際に、ＴＮＦＲ２に結合する、免疫グロブリン軽鎖又はその断片、
（５）それぞれ、配列番号１８、１９、及び２０に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、２、及び３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）を含む、免疫グロブリン重鎖又はその断片であって、上記ＶＨは、配列番号４１に記載されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）と対形成する際に、ＴＮＦＲ２に結合する、免疫グロブリン重鎖又はその断片、
（６）それぞれ、配列番号２１、２２、及び２３に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、２、及び３を含むＶＬを含む、免疫グロブリン軽鎖又はその断片であって、上記ＶＬは、配列番号４０に記載されるアミノ酸配列を含むＶＨと対形成する際に、ＴＮＦＲ２に結合する、免疫グロブリン軽鎖又はその断片、
（７）それぞれ、配列番号２４、２５、及び２６に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、２、及び３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）を含む、免疫グロブリン重鎖又はその断片であって、上記ＶＨは、配列番号７３に記載されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）と対形成する際に、ＴＮＦＲ２に結合する、免疫グロブリン重鎖又はその断片、
（８）それぞれ、配列番号２７、２８、及び２９に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、２、及び３を含むＶＬを含む、免疫グロブリン軽鎖又はその断片であって、上記ＶＬは、配列番号７２に記載されるアミノ酸配列を含むＶＨと対形成する際に、ＴＮＦＲ２に結合する、免疫グロブリン軽鎖又はその断片、
（９）それぞれ、配列番号３０、３１、及び３２に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、２、及び３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）を含む、免疫グロブリン重鎖又はその断片であって、上記ＶＨは、配列番号７５に記載されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）と対形成する際に、ＴＮＦＲ２に結合する、免疫グロブリン重鎖又はその断片、あるいは、
（１０）それぞれ、配列番号３３、３４、及び３５に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、２、及び３を含むＶＬを含む、免疫グロブリン軽鎖又はその断片であって、上記ＶＬは、配列番号７４に記載されるアミノ酸配列を含むＶＨと対形成する際に、ＴＮＦＲ２に結合する、免疫グロブリン軽鎖又はその断片、
を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む核酸に関する。
いくつかの実施形態において、核酸は、それぞれ、配列番号６、７、及び８に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、２、及び３を含むＶＨを含む、免疫グロブリン重鎖又はその断片を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。

【0016】

いくつかの実施形態において、核酸は、それぞれ、配列番号９、１０、及び１１に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、２、及び３を含むＶＬを含む、免疫グロブリン軽鎖又はその断片を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。

【0017】

いくつかの実施形態において、核酸は、それぞれ、配列番号１２、１３、及び１４に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、２、及び３を含むＶＨを含む、免疫グロブリン重鎖又はその断片を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。

【0018】

いくつかの実施形態において、核酸は、それぞれ、配列番号１５、１６、及び１７に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、２、及び３を含むＶＬを含む、免疫グロブリン軽鎖又はその断片を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。

【0019】

いくつかの実施形態において、核酸は、それぞれ、配列番号１８、１９、及び２０に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、２、及び３を含むＶＨを含む、免疫グロブリン重鎖又はその断片を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。

【0020】

いくつかの実施形態において、核酸は、それぞれ、配列番号２１、２２、及び２３に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、２、及び３を含むＶＬを含む、免疫グロブリン軽鎖又はその断片を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。

【0021】

いくつかの実施形態において、核酸は、それぞれ、配列番号２４、２５、及び２６に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、２、及び３を含むＶＨを含む、免疫グロブリン重鎖又はその断片を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。

【0022】

いくつかの実施形態において、核酸は、それぞれ、配列番号２７、２８、及び２９に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、２、及び３を含むＶＬを含む、免疫グロブリン軽鎖又はその断片を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。

【0023】

いくつかの実施形態において、核酸は、それぞれ、配列番号３０、３１、及び３２に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、２、及び３を含むＶＨを含む、免疫グロブリン重鎖又はその断片を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。

【0024】

いくつかの実施形態において、核酸は、それぞれ、配列番号３３、３４、及び３５に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、２、及び３を含むＶＬを含む、免疫グロブリン軽鎖又はその断片を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。

【0025】

いくつかの実施形態において、ＶＨは、ＶＬと対形成する際に、ヒトＴＮＦＲ２に特異的に結合するか、又は、ＶＬは、ＶＨと対形成する際に、ヒトＴＮＦＲ２に特異的に結合する。

【0026】

いくつかの実施形態において、免疫グロブリン重鎖又はその断片は、ヒト免疫グロブリン重鎖又はその断片であり、及び免疫グロブリン軽鎖又はその断片は、ヒト免疫グロブリン軽鎖又はその断片である。

【0027】

いくつかの実施形態において、核酸は、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）をコードする。

【0028】

いくつかの実施形態において、核酸はｃＤＮＡである。

【0029】

一態様では、本開示は、本明細書に記載する核酸の１つ以上を含むベクターに関する。

【0030】

一態様では、本開示は、本明細書に記載する核酸のうちの２つを含むベクターに関し、ベクターは、共にＴＮＦＲ２に結合するＶＨ領域及びＶＬ領域をコードする。

【0031】

一態様では、本開示は、一対のベクターに関し、各ベクターは、本明細書に記載する核酸のうちの１つを含み、一対のベクターと共に、共にＴＮＦＲ２に結合するＶＨ領域及びＶＬ領域をコードする。

【0032】

一態様では、本開示は、本明細書に記載するベクター、又は、本明細書に記載する一対のベクターを含む、細胞に関する。いくつかの実施形態において、細胞はＣＨＯ細胞である。

【0033】

一態様では、本開示は、本明細書に記載する核酸の１つ以上を含む細胞に関する。

【0034】

一態様では、本開示は、本明細書に記載される核酸のうちの２つを含む細胞に関する。いくつかの実施形態において、２つの核酸は共に、共にＴＮＦＲ２に結合するＶＨ領域及びＶＬ領域をコードする。

【0035】

一態様では、本開示は、抗体又はその抗原結合断片の産生方法であって、（ａ）本明細書に記載する細胞を、当該細胞が、抗体又は抗原結合断片を産生するのに十分な条件下で培養することと、（ｂ）上記細胞により産生される抗体又は抗原結合断片を収集することと、を含む、上記方法に関する。

【0036】

一態様では、本開示は、選択された重鎖可変領域（ＶＨ）配列と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含むＶＨと、選択された軽鎖可変領域（ＶＬ）配列と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含むＶＬと、を含み、上記選択されたＶＨ配列、及び上記選択されたＶＬ配列は、以下：
（１）上記選択されたＶＨ配列は配列番号３６であり、上記選択されたＶＬ配列は配列番号３７であり、
（２）上記選択されたＶＨ配列は配列番号３８であり、上記選択されたＶＬ配列は配列番号３９であり、
（３）上記選択されたＶＨ配列は配列番号４０であり、上記選択されたＶＬ配列は配列番号４１であり、
（４）上記選択されたＶＨ配列は配列番号７２であり、上記選択されたＶＬ配列は配列番号７３であり、又は、
（５）上記選択されたＶＨ配列は配列番号７４であり、上記選択されたＶＬ配列は配列番号７５である、
のうちの１つである、ＴＮＦＲ２に結合する抗体又はその抗原結合断片に関する。

【0037】

いくつかの実施形態において、ＶＨは配列番号３６の配列を含み、ＶＬは配列番号３７の配列を含む。

【0038】

いくつかの実施形態において、ＶＨは配列番号７２の配列を含み、ＶＬは配列番号７３の配列を含む。

【0039】

いくつかの実施形態において、ＶＨは配列番号３８の配列を含み、ＶＬは配列番号３９の配列を含む。

【0040】

いくつかの実施形態において、ＶＨは配列番号４０の配列を含み、ＶＬは配列番号４１の配列を含む。

【0041】

いくつかの実施形態において、ＶＨは配列番号７４の配列を含み、ＶＬは配列番号７５の配列を含む。

【0042】

いくつかの実施形態において、抗体又は抗原結合断片は、ヒトＴＮＦＲ２に特異的に結合する。

【0043】

いくつかの実施形態において、抗体又は抗原結合断片は、ヒト抗体又はその抗原結合断片である。

【0044】

いくつかの実施形態において、抗体又は抗原結合断片は、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）である。

【0045】

一態様では、本開示は、本明細書に記載する抗体又はその抗原結合断片と交差競合する、抗体又はその抗原結合断片に関する。

【0046】

一態様では、本開示は、選択されたＶＨ配列のＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、及びＶＨ ＣＤＲ３と同一のＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、及びＶＨ ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、並びに、選択されたＶＬ配列のＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、及びＶＬ ＣＤＲ３と同一のＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、及びＶＬ ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、ＴＮＦＲ２に結合する抗体又はその抗原結合断片に関し、上記選択されたＶＨ配列、及び上記選択されたＶＬ配列は、以下：
（１）上記選択されたＶＨ配列は配列番号３６であり、上記選択されたＶＬ配列は配列番号３７であり、
（２）上記選択されたＶＨ配列は配列番号３８であり、上記選択されたＶＬ配列は配列番号３９であり、
（３）上記選択されたＶＨ配列は配列番号４０であり、上記選択されたＶＬ配列は配列番号４１であり、
（４）上記選択されたＶＨ配列は配列番号７２であり、上記選択されたＶＬ配列は配列番号７３であり、又は、
（５）上記選択されたＶＨ配列は配列番号７４であり、上記選択されたＶＬ配列は配列番号７５である、
のうちの１つである。

【0047】

一態様では、本開示は、治療剤に共有結合した、本明細書に記載する抗体又はその抗原結合断片を含む抗体薬物コンジュゲートに関する。いくつかの実施形態において、治療剤は、細胞毒性剤又は細胞増殖抑制剤である。

【0048】

一態様では、本開示は、癌を有する対象の治療方法であって、上記方法は、治療に有効な量の、本明細書に記載する抗体若しくはその抗原結合断片を含む組成物、又は、本明細書に記載する抗体薬物コンジュゲートを投与することを含む、上記方法に関する。

【0049】

いくつかの実施形態において、対象は、結腸直腸癌、卵巣癌、急性骨髄性白血病、ルイス肺癌、乳癌、肝細胞癌及び大腸癌、神経膠腫を患う。いくつかの実施形態において、対象は、腎細胞癌、多発性骨髄腫、大腸癌、卵巣癌、神経膠腫、又は皮膚Ｔ細胞リンパ腫を患う。いくつかの実施形態において、癌は、大腸癌、神経膠腫、又は卵巣癌である。

【0050】

一態様では、本開示は、腫瘍増殖速度を低減する方法であって、上記方法は、腫瘍細胞を、有効量の、本明細書に記載する抗体若しくはその抗原結合断片を含む組成物、又は、本明細書に記載する抗体薬物コンジュゲートと接触させることを含む、上記方法に関する。

【0051】

一態様では、本開示は、腫瘍細胞の殺傷方法であって、上記方法は、腫瘍細胞を、有効量の、本明細書に記載する抗体若しくはその抗原結合断片を含む組成物、又は、本明細書に記載する抗体薬物コンジュゲートと接触させることを含む、上記方法に関する。

【0052】

一態様では、本開示は、本明細書に記載する抗体又はその抗原結合断片と、薬学的に許容される担体と、を含む医薬組成物に関する。

【0053】

一態様では、本開示は、本明細書に記載する抗体薬物コンジュゲートと、薬学的に許容される担体と、を含む医薬組成物に関する。

【0054】

本明細書で使用する場合、「癌」という用語は、自律増殖能を有する細胞を意味する。このような細胞の例としては、細胞増殖の急速な増殖を特徴とする、異常な状態又は条件を有する細胞が挙げられる。この用語は、組織変化の種類又は侵襲性のステージに関係なく、癌性増殖、例えば、腫瘍、発癌性プロセス、転移性組織、及び悪性形質転換細胞、組織、又は器官を含むことを意味する。様々な器官系、例えば、頭頸、呼吸器、心臓血管、腎、生殖、血液、神経系、肝、胃腸、及び内分泌系の悪性腫瘍、加えて、大部分の大腸癌、腎細胞癌、前立腺癌及び／又は精巣腫瘍、肺の非小細胞癌、小腸癌、神経膠腫、及び小腸癌もまた、含まれる。「自然に発生する」癌としては、対象に癌細胞を移植することによって実験的に誘発されない任意の癌が挙げられ、例えば、自然に生じる癌、患者を発癌性物質に曝露することで引き起こされる癌、トランスジェニック癌遺伝子の挿入、又は癌抑制遺伝子のノックアウトにより生じる癌、及び感染症、例えば、ウイルス感染症により引き起こされる癌が挙げられる。「癌腫」という用語は、当該技術分野で認識されており、上皮又は内分泌腺組織の悪性腫瘍を意味する。この用語は、癌性及び肉腫性組織で構成される悪性腫瘍を含む癌肉腫もまた含む。「腺癌」とは、腺組織に由来する癌腫、又は、腫瘍細胞が認識可能な腺構造を形成する癌腫を意味する。「肉腫」という用語は当該技術分野において認知されており、間葉由来の悪性腫瘍を意味する。「造血性腫瘍性疾患」という用語は、造血性由来の過形成／新生細胞を伴う疾患を含む。造血腫瘍性疾患は、骨髄、リンパ系、若しくは赤血球リネージ、又はこれらの前駆細胞から生じる可能性がある。血液癌は、骨髄などの血液形成組織、又は、免疫系の細胞にて開始する癌である。血液癌の例としては、例えば、白血病、リンパ腫、及び多発性骨髄腫などが挙げられる。

【0055】

本明細書で使用する場合、「抗体」という用語は、少なくとも１つ（例えば、１、２、３、４、５、又は６つ）の相補性決定領域（ＣＤＲ）（例えば、免疫グロブリン軽鎖由来の３つのＣＤＲのいずれか、又は、免疫グロブリン重鎖由来の３つのＣＤＲのいずれか）を含有し、エピトープに特異的に結合可能な、任意の抗原結合分子を意味する。抗体の非限定例としては、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異的抗体（二重特異的抗体）、一本鎖抗体、キメラ抗体、ヒト抗体、及びヒト化抗体が挙げられる。いくつかの実施形態において、抗体は、ヒト抗体のＦｃ領域を含有することができる。抗体という用語は、誘導体、例えば、抗体断片から形成される、二重特異的抗体、一本鎖抗体、ダイアボディ、線状抗体、及び多重特異的抗体もまた含む。

【0056】

本明細書で使用する場合、「抗原結合断片」という用語は、全長抗体の一部を意味し、抗体の当該部分は、抗原に特異的に結合可能である。いくつかの実施形態において、抗原結合断片は、少なくとも１つの可変ドメイン（例えば、重鎖の可変ドメイン、又は、軽鎖の可変ドメイン）を含有する。抗体断片の非限定例としては、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）_２、及びＦｖ断片が挙げられる。

【0057】

本明細書で使用する場合、「ヒト抗体」という用語は、ヒトに由来する内因性核酸（例えば、再配置されたヒト免疫グロブリン重鎖又は軽鎖座位）によりコードされる抗体を意味する。いくつかの実施形態において、ヒト抗体は、ヒトから回収されるか、又は、ヒト細胞培養液中（例えば、ヒトハイブリドーマ細胞内）で産生される。いくつかの実施形態において、ヒト抗体は、非ヒト細胞（例えば、マウス又はハムスター細胞株）内で産生される。いくつかの実施形態において、ヒト抗体は、細菌細胞又は酵母菌細胞内で産生される。いくつかの実施形態において、ヒト抗体は、再配列されていない、又は、再配列されたヒト免疫グロブリン座位（例えば、重鎖又は軽鎖ヒト免疫グロブリン座位）を含有するトランスジェニック非ヒト動物（例えば、ウシ）で産生される。

【0058】

本明細書で使用する場合、「キメラ抗体」という用語は、少なくとも２つの異なる種に存在する配列を含有する抗体（例えば、ヒト及びマウス抗体など、２つの異なる哺乳動物種由来の抗体）を意味する。キメラ抗体の非限定例は、非ヒト（例えば、マウス）抗体の、可変ドメイン配列（例えば、軽鎖及び／又は重鎖可変ドメイン配列の全て又は一部）、並びに、ヒト抗体の定常ドメインを含有する抗体である。キメラ抗体の更なる例は、本明細書に記載され、当該技術分野において周知である。

【0059】

本明細書で使用する場合、「ヒト化抗体」という用語は、非ヒト（例えば、マウス）免疫グロブリンに由来する最小配列を含有し、かつ、ヒト免疫グロブリンに由来する配列を含有する、非ヒト抗体を意味する。非限定例では、ヒト化抗体は、レシピエント抗体の超可変（例えば、ＣＤＲ）領域の残基が、非ヒト抗体（例えば、ドナー抗体）、例えば、所望の特異性、親和性、及び能力を有する、マウス、ラット、又はウサギ抗体の超可変（例えば、ＣＤＲ）領域の残基により置き換えられている、ヒト抗体（レシピエント抗体）である。いくつかの実施形態において、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基は、対応する非ヒト（例えば、マウス）免疫グロブリン残基により置き換えられている。いくつかの実施形態において、ヒト化抗体は、レシピエント抗体、又はドナー抗体にて発見されない残基を含有することができる。これらの修飾を行うことによって、抗体の性能を更に洗練することができる。いくつかの実施形態において、ヒト化抗体は、ほぼ全ての少なくとも１つ、及び、典型的には２つの可変ドメインを含有し、超可変ループ（ＣＤＲ）の全て又は実質的に全てが、非ヒト（例えば、マウス）免疫グロブリンの超可変ループに対応し、フレームワーク領域の全て又は実質的に全てが、ヒト免疫グロブリン配列のものである。ヒト化抗体は、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、典型的には、ヒト免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部分もまた含有することができる。ヒト化抗体は、当該技術分野において周知の分子生物学法を用いて産生することができる。ヒト化抗体を生成する方法の非限定例は、本明細書に記載される。

【0060】

本明細書で使用する場合、「一本鎖抗体」という用語は、抗原に特異的に結合可能な、少なくとも２つの免疫グロブリン可変ドメイン（例えば、哺乳動物免疫グロブリン重鎖又は軽鎖の可変ドメイン）を含有する、単一のポリペプチドを意味する。一本鎖抗体の非限定例は、本明細書に記載される。

【0061】

本明細書で使用する場合、「多量体抗体」という用語は、４つ以上（例えば、６つ、８つ、又は１０個）の免疫グロブリン可変ドメインを含有する抗体を意味する。

【0062】

本明細書で使用する場合、「対象」及び「患者」という用語は、明細書を通して同じ意味で用いられ、本発明の方法に従った治療が提供される動物、ヒト、又は非ヒトを表す。獣医学的及び非獣医学的用途が、本開示では想到される。ヒト患者は、成人のヒト又は若年のヒト（例えば、１８歳未満のヒト）であることができる。ヒトに加えて、患者としては、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、フェレット、ネコ、イヌ、及び霊長類が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、非ヒト霊長類（例えば、サル、チンパンジー、ゴリラなど）、齧歯類（例えば、ラット、マウス、スナネズミ、ハムスター、フェレット、ウサギ）、ウサギ科動物、ブタ科動物（例えば、ブタ、ミニブタ）、ウマ科動物、イヌ科動物、ネコ科動物、ウシ科動物、並びに、他の家庭用、家畜用、及び動物園用動物が挙げられる。

【0063】

本明細書で使用する場合、抗体を言及する際に、「特異的に結合する（ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ ｂｉｎｄｉｎｇ）」、及び「特異的に結合する（ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ ｂｉｎｄｓ）」という語句は、相互作用が、標的分子に特定の構造（即ち、抗原決定基又はエピトープ）が存在することに依存するために、換言すれば、試薬が、一般的に、全分子よりも、特定の構造を含む分子を認識し、これに結合するために、抗体が、好ましくは他の分子よりも、その標的分子（例えば、ＴＮＦＲ２）と相互作用することを意味する。標的分子に特異的に結合する抗体は、標的特異的抗体と呼ばれることも可能である。例えば、ＴＮＦＲ２分子に特異的に結合する抗体は、ＴＮＦＲ２特異的抗体、又は、抗ＴＮＦＲ２抗体と呼ばれることも可能である。

【0064】

本明細書で使用する場合、「ポリペプチド」、「ペプチド」、及び「タンパク質」という用語は、同じ意味で用いられ、少なくとも２つのアミノ酸の、任意の長さのアミノ酸のポリマーを意味する。

【0065】

本明細書で使用する場合、「ポリヌクレオチド」、「核酸分子」、及び「核酸配列」という用語は、本明細書では同じ意味で用いられ、少なくとも２つのヌクレオチドの、任意の長さのヌクレオチドのポリマーを意味し、限定されるものではないが、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド、及びこれらの修飾物が挙げられる。

【0066】

別段の定義がない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本発明で使用するための方法及び材料が、本明細書に記載される；他の好適な、当該技術分野において既知の方法及び材料もまた使用することができる。材料、方法、及び例は、例示に過ぎず、限定的であることは意図されない。本明細書で言及される全ての刊行物、特許出願、特許、配列、データベースエントリ、及び他の参考文献は、参照によりその全体が援用される。矛盾する場合には、定義を含めて本明細書が優先する。

【0067】

本発明の他の特徴及び利点は、以下の詳細な説明及び図面、並びに特許請求の範囲から明らかになるであろう。

【図面の簡単な説明】

【0068】

【図1】ＭＣ３８癌細胞を注射し、対照としてのＰＢＳ（リン酸塩緩衝生理食塩水）（Ｇ１）、抗ｈＴＮＦＲ２抗体ＢＣ-１Ｆ４-ＩｇＧ１（Ｇ２）、ＢＣ-３Ｂ７-ＩｇＧ１（Ｇ３）、ＢＣ-１Ｆ１０-ＩｇＧ（Ｇ４）、１４-１Ｂ３-ｈＨｖＫｖ-ＩｇＧ１（Ｇ５）、ＢＣ-１Ａ８-ＩｇＧ１（Ｇ６）、ＢＣ-１Ｃ３-ＩｇＧ１（Ｇ７）、１４-４Ａ９-ｈＨｖＫｖ-ＩｇＧ１（Ｇ８）、及び抗ｍＰＤ-１（Ｇ９）で治療したマウスにおける、経時的な腫瘍サイズを示すグラフである。

【図2】ＭＣ３８癌細胞を注射し、対照としてのＰＢＳ（Ｇ１）、抗体ＢＣ－１Ａ８－ＩｇＧ１（Ｇ２）、ＢＣ－１Ｆ１０－ＩｇＧ１（Ｇ３）、ＢＣ－１Ｆ４－ＩｇＧ１（Ｇ４）、抗ｍＰＤ－１（Ｇ５）、抗ｍＣＴＬＡ４（Ｇ６）で治療したマウスにおける、経時的な腫瘍サイズを示すグラフである。

【図3】ＭＣ３８癌細胞を注射し、対照としてのＰＢＳ（Ｇ１）、抗体ＢＣ－１Ｃ３－ｌｇＧ１（Ｇ２）、抗ｍＰＤ－１（Ｇ３）、抗ｍＣＴＬＡ４（Ｇ４）で治療したマウスにおける、経時的な腫瘍サイズを示すグラフである。

【図4】ＭＣ３８癌細胞を注射し、対照としてのＰＢＳ（Ｇ１）、抗体ＢＣ－１Ａ８－ＩｇＧ１（Ｇ２）、ＢＣ－１Ｃ３－ｌｇＧ１（Ｇ３）、ＢＣ－１Ｆ１０－ｌｇＧ１（Ｇ４）、ＢＣ－１Ｆ４－ｌｇＧ１（Ｇ５）、ＢＣ－１Ｂ６－ｌｇＧ１（Ｇ６）で治療したマウスにおける、経時的な腫瘍サイズを示すグラフである。

【図5】ＭＣ３８癌細胞を注射し、対照としてのＰＢＳ（Ｇ１）、ＢＣ－１Ａ８－ＩｇＧ１（Ｇ２）、ＢＣ－１Ｃ３－ＩｇＧ１（Ｇ３）、ＢＣ－１Ｆ１０－ＩｇＧ１（Ｇ４）、ＢＣ－１Ｆ４－ＩｇＧ１（Ｇ５）、ＢＣ－１Ｂ６－ＩｇＧ１（Ｇ６）で治療したマウスにおける、経時的な腫瘍サイズを示すグラフである。

【図6】ＭＣ３８癌細胞を注射し、対照としてのＰＢＳ（Ｇ１）、ＢＣ－１Ｃ３－ｌｇＧ１（Ｇ２）、抗ｍＰＤ－１（Ｇ３）で治療したｈＴＮＦα／ｈＴＮＦＲ２マウスにおける、経時的な腫瘍サイズを示すグラフである。

【図7A-7B】群を割り当てた５日後（Ｄ５）での、マウスの末梢血中での、血液生化学指標（ＡＳＴ、ＡＬＴ）の試験結果を示す。

【図8】抗ｈＴＮＦＲ２抗体間での、エピトープ相関を示す。

【図9】ＢＣ－１Ｃ３－ＩｇＧ１、ＢＣ－１Ｃ３－ＩｇＧ１－ＳＩ、ＢＣ－１Ｃ３－ＩｇＧ１－ＬＡＬＡ、及びヒトＩｇＧ１に対する細胞毒性データを示す。

【図10】異なる抗体薬剤を注射した後の、ヒト化ＴＮＦＲ２マウスの血清中における抗体薬剤の濃度変化を示す薬剤の濃度－時間曲線である。

【図11A】レポーター細胞（Ｊｕｒｋａｔ－ＧＦＰ－ＴＮＦＲ２細胞）の活性化を示す蛍光シグナルを示す。

【図11B】レポーター細胞（Ｊｕｒｋａｔ－ＧＦＰ－ＴＮＦＲ２細胞）の活性化を示す蛍光シグナルを示す。ＴＮＦαは表示していない。

【図12】レポーター細胞（Ｊｕｒｋａｔ－ＧＦＰ－ＴＮＦＲ２細胞）の活性化を示す蛍光シグナルを示す。

【図13A-13B】マウスの末梢血中での、血液生化学指標（ＡＳＴ、ＡＬＴ）の試験結果を示す。

【図14】Ｋａｂａｔの付番スキームにより定義される、抗ＴＮＦＲ２抗体ＢＣ－１Ａ８（「１Ａ８」）、ＢＣ－１Ｂ６（「１Ｂ６」）、ＢＣ－１Ｃ３（「１Ｃ３」）、ＢＣ－１Ｆ４（「１Ｆ４」）、ＢＣ－１Ｆ１０（「１Ｆ１０」）のＣＤＲ配列を列挙する。

【図15】Ｃｈｏｔｈｉａの付番スキームにより定義される、抗ＴＮＦＲ２抗体ＢＣ－１Ａ８（「１Ａ８」）、ＢＣ－１Ｂ６（「１Ｂ６」）、ＢＣ－１Ｃ３（「１Ｃ３」）、ＢＣ－１Ｆ４（「１Ｆ４」）、ＢＣ－１Ｆ１０（「１Ｆ１０」）のＣＤＲ配列を列挙する。

【図16】抗ＴＮＦＲ２抗体（１Ａ８、１Ｂ６、１Ｃ３、１Ｆ４、及び１Ｆ１０）の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のアミノ酸配列を列挙する。

【図17】ある特定の、関連するアミノ酸配列を列挙する。

【図18】ＭＣ３８癌細胞を注射し、ＰＢＳ（Ｇ１）、ＢＣ－１Ｃ３－ｌｇＧ１（Ｇ２）、抗ｍＰＤ－１（Ｇ３）、ＢＣ－１Ｃ３－ｌｇＧ１と抗ｍＰＤ１の組み合わせ（Ｇ４）、アテゾリズマブアナログ（Ｇ５）、又は、ＢＣ－１Ｃ３－ｌｇＧ１とアテゾリズマブアナログの組み合わせ（Ｇ６）で治療したマウスにおける、経時的な腫瘍サイズを示すグラフである。

【図19】ＧＬ２６１癌細胞を注射し、ＰＢＳ（Ｇ１）、１ｍｇ／ｋｇのＢＣ－１Ｃ３－ＩｇＧ１（Ｇ２）、３ｍｇ／ｋｇのＢＣ－１Ｃ３－ＩｇＧ１（Ｇ３）、１０ｍｇ／ｋｇのＢＣ－１Ｃ３－ＩｇＧ１（Ｇ４）、又は抗ｍＰＤ－１（Ｇ５）で治療したマウスにおける、経時的な腫瘍サイズを示すグラフである。

【図20】ＭＣ３８癌細胞を注射し、ＰＢＳ（Ｇ１）、ＢＣ－１Ｃ３－ｌｇＧ１（Ｇ２）、ＢＩ－１８０８アナログ（Ｇ３）、ｈ６００－２５－１０８アナログ（Ｇ４）、又はＨＦＢ３－１ｈｚ６－ｈＧ１アナログ（Ｇ５）で治療したマウスにおける、経時的な腫瘍サイズを示すグラフである。

【図21】ＭＣ３８癌細胞を注射し、ＰＢＳ（Ｇ１）、ＢＣ－１Ｃ３－ｌｇＧ１（Ｇ２）、又はｈ６００－２５－７１アナログ（Ｇ３）で治療したマウスにおける、経時的な腫瘍サイズを示すグラフである。

【図22】フローサイトメトリーにより測定される、ｈＣＤ８ａ＋Ｔ細胞の増殖を示すグラフである。

【図23】フローサイトメトリーにより測定される、ｈＣＤ８ａ＋Ｔ細胞の増殖を示すグラフである。

【図24A】ヒトＩＬ１２の放出を示すグラフである。

【図24B】ヒトＩＦＮγの放出を示すグラフである。

【発明を実施するための形態】

【0069】

腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）は一般に、主要な炎症誘発性サイトカインと考えられる（Ａｌ－Ｈａｔａｍｌｅｈ ｅｔ ａｌ．「Ａ ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ ｒｅｖｉｅｗ ｏｎ ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ ｉｎ ｔｈｅ ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＴＮＦ－ＴＮＦＲ２ ａｘｉｓ ｉｎ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．」Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｏｎｃｏｌｏｇｙ ２０１９（２０１９））。炎症性プロセス（癌微小環境を含む）の間、ＴＮＦは、最初に分泌されて産生される、ある炎症性メディエーターである。それは、サイトカインカスケードの生成を支え、他の炎症性メディエーター（例えば、転写因子、インターロイキン（ＩＬ）－１、ＩＬ－６）の産生を促進する。細胞表面に局在する、２種類のＴＮＦ受容体（ＴＮＦＲ１及びＴＮＦＲ２）が存在する。ＴＮＦＲ２は、ＴＮＦＲ１よりも優先して上方制御され、抗ＴＮＦモノクローナル抗体による治療は、腫瘍の数及びサイズを低減したことが、炎症関連癌の実験から明らかとなった。したがって、ＴＮＦ－ＴＮＦＲ２軸が、免疫応答の抑制において示唆され、腫瘍の進行及び転移に影響を及ぼす。

【0070】

本開示は、ＴＮＦＲ２（腫瘍壊死因子受容体２）に結合する、抗体、その抗原結合断片の例を提供する。
ＴＮＦＲ２及び癌
Ｔ細胞は、これらが、ＣＤ８＋エフェクターＴ細胞（Ｔｅｆｆ）としてもまた知られている、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）である場合に、腫瘍細胞を直接殺傷する能力故に、癌免疫療法の重要な焦点となってきている。しかし、Ｔｒｅｇ細胞は、Ｔｅｆｆ細胞を抑制することができ、それによって、腫瘍を取り除く適切な宿主免疫応答が停止される。したがって、抑制性Ｔｒｅｇ細胞の阻害、及び、細胞毒性ＣＤ８＋Ｔｅｆｆの、同時の活性化は、癌を治療するための潜在的な戦略であることができる（Ｖａｎａｍｅｅ，Ｅｖａ Ｓ．，ｅｔ ａｌ．「ＴＮＦＲ２：ａ ｎｏｖｅｌ ｔａｒｇｅｔ ｆｏｒ ｃａｎｃｅｒ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．」Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２３．１１（２０１７）：１０３７～１０４６）。

【0071】

ＴＮＦＲ２は、ＴＮＦＲスーパーファミリー（ＴＮＦＲＳＦ）のメンバーであり、ＴＮＦにより活性化される。これは、細胞の生残及び増殖を制御する、細胞表面受容体であり、この受容体を標的とすることが、潜在的な次世代癌治療アプローチとして現れている。ある特定のヒト腫瘍細胞は、異常にＴＮＦＲ２を発現する可能性があり、腫瘍浸潤は、高度に抑制性のＴＮＦＲ２＋Ｔｒｅｇ細胞により支配されている。

【0072】

ＴＮＦＲ２は主に、免疫系の細胞、特に、制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞内に、及び、内皮細胞により発現され、優先的に、膜貫通ＴＮＦ（ｔｍＴＮＦ）に結合する。ＴＮＦＲ１及びＴＮＦＲ２は、４つのシステインリッチモチーフで構成される、主に細胞外ドメインに２８％の相同性を有する、１回膜貫通糖タンパク質である。しかし、ＴＮＦ受容体の細胞内ドメインはほぼ無関係であり、相同配列を欠いており、このことは、異なるシグナル伝達機能が、２つの異なる受容体に由来することを示唆している。ＴＮＦＲ１は、主に、細胞死のシグナル伝達に関与する、Ｆａｓ関連細胞死ドメイン（ＦＡＤＤ）のＴＮＦＲ１関連細胞死ドメインタンパク質（ＴＲＡＤＤ）に結合する、細胞内細胞死ドメイン（ＤＤ）を含有する。ＴＮＦＲ２は細胞質ＤＤを含有しないが、ＴＮＦ関連因子２（ＴＲＡＦ２）と相互作用し、主に、細胞生残をもたらす。ＴＮＦＲ２のシグナル伝達回路網は、他のＴＮＦＲのＴＮＦＲ２回路網とは異なる。ＴＮＦＲ１は、細胞内細胞死ドメインを含有し、アポトーシス又は炎症性経路のいずれかを活性化することができる一方で、ＴＮＦＲ２は、ＴＮＦ受容体関連因子（ＴＲＡＦ）に結合し、古典的及び非古典的ＮＦ－κΒ経路の両方を活性化し、ヒト及びマウスの両方において、細胞生残及び増殖を制御することができる。

【0073】

ＴＮＦＲ２は、４６１個のアミノ酸を有し、アミノ酸１～２２はシグナルペプチドであり、アミノ酸２３～２５７は細胞外ドメインであり、アミノ酸２５８～２８７は膜貫通ドメインであり、アミノ酸２８８～４６１は、ＴＲＡＦ２結合部位を有する細胞質ドメインである。ＴＲＡＦ２は、アポトーシスタンパク質１の阻害剤（ｃＩＡＰ１）、及び、アポトーシスタンパク質２の阻害剤（ｃＩＡＰ２）である、ＴＲＡＦ１、ＴＲＡＦ３に結合することができる。

【0074】

アンタゴニスト性抗ＴＮＦＲ２抗体は、休止（非シグナル伝達）逆平行二量体配置において、リガンド結合を遮断し、膜受容体をロックすることができる一方で、アゴニスト性架橋抗体は、平行ＴＮＦ－ＴＮＦＲ２複合体を安定させることができる、即ち、活性シグナル伝達ネットワークの構造的な安定化をもたらすことができる。更に、ＴＮＦＲ２は、炎症性環境において、ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ表現型の安定化に寄与することが、ここで十分に認識されている。

【0075】

ＴＮＦＲ２及びその機能の詳細な説明は、例えば、Ａｌ－Ｈａｔａｍｌｅｈ， ｅｔ ａｌ．「Ａ ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ ｒｅｖｉｅｗ ｏｎ ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ ｉｎ ｔｈｅ ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＴＮＦ－ＴＮＦＲ２ ａｘｉｓ ｉｎ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．」Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｏｎｃｏｌｏｇｙ ２０１９（２０１９）、Ｖａｎａｍｅｅ， ｅｔ ａｌ．「ＴＮＦＲ２：ａ ｎｏｖｅｌ ｔａｒｇｅｔ ｆｏｒ ｃａｎｃｅｒ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．」Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２３．１１（２０１７）：１０３７～１０４６、Ｏｒｔｉ－Ｃａｓａｎ， ｅｔ ａｌ．「Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ＴＮＦＲ２ ａｓ ａ ｎｏｖｅｌ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｆｏｒ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ．」Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ １３（２０１９）：４９、Ｃｈｅｎ，ｅｔ ａｌ．「Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ ＴＮＦ ｗｉｔｈ ＴＮＦ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｙｐｅ ２ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｏｕｓｅ ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｃｅｌｌｓ．」Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １７９．１（２００７）：１５４～１６１、に見出すことができ、これらそれぞれの全体が参照により組み込まれている。

【0076】

本開示は、抗ＴＮＦＲ２抗体、その抗原結合断片、並びに、これらの抗ＴＮＦＲ２抗体及び抗原結合断片を用いて、腫瘍増殖を阻害し、例えば、癌を含む、様々な疾患を治療する方法を提供する。
抗ＴＮＦＲ２抗体及び抗原結合断片
本開示は、ＴＮＦＲ２（例えば、ヒトＴＮＦＲ２）に特異的に結合する抗体及びその抗原結合断片を提供する。本明細書に記載する抗体及び抗原結合断片は、ＴＮＦＲ２に結合可能である。いくつかの実施形態において、これらの抗体は、ＴＮＦＲ２シグナル伝達経路を遮断し、したがって、免疫応答を増大させることができる。いくつかの実施形態において、これらの抗体は、補体依存性細胞傷害（ＣＭＣ）、又は抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を開始することができる。

【0077】

本開示は、例えば、抗ＴＮＦＲ２抗体ＢＣ－１Ａ８（「１Ａ８」）、ＢＣ－１Ｂ６（「１Ｂ６」）、ＢＣ－１Ｃ３（「１Ｃ３」）、ＢＣ－１Ｆ４（「１Ｆ４」）、ＢＣ－１Ｆ１０（「１Ｆ１０」）、ＢＣ－３Ｂ７（「３Ｂ７」）、例えば、キメラ抗体、ヒト化抗体、及びヒト抗体を含む、これらの修飾抗体を提供する。

【0078】

１Ａ８、及び１Ａ８由来の抗体（例えば、ヒト化抗体）に対するＣＤＲ配列としては、Ｋａｂａｔの付番により定義される、重鎖可変ドメインのＣＤＲ、配列番号６、７、８、及び、軽鎖可変ドメインのＣＤＲ、配列番号９、１０、１１が挙げられる。ＣＤＲは、Ｃｈｏｔｈｉａシステムによってもまた定義することができる。Ｃｈｏｔｈｉａの付番の下では、重鎖可変ドメインのＣＤＲ配列は、配列番号４２、４３、４４に記載され、軽鎖可変ドメインのＣＤＲ配列は、配列番号４５、４６、４７に記載される。

【0079】

１Ｂ６、及び１Ｂ６由来の抗体に対するＣＤＲ配列としては、Ｋａｂａｔの付番により定義される、重鎖可変ドメインのＣＤＲ、配列番号１２、１３、１４、及び、軽鎖可変ドメインのＣＤＲ、配列番号１５、１６、１７が挙げられる。Ｃｈｏｔｈｉａの付番の下では、重鎖可変ドメインのＣＤＲ配列は、配列番号４８、４９、５０に記載され、軽鎖可変ドメインのＣＤＲは、配列番号５１、５２、５３に記載される。

【0080】

１Ｃ３、及び１Ｃ３由来の抗体に対するＣＤＲ配列としては、Ｋａｂａｔの付番により定義される、重鎖可変ドメインのＣＤＲ、配列番号１８、１９、２０、及び、軽鎖可変ドメインのＣＤＲ、配列番号２１、２２、２３が挙げられる。Ｃｈｏｔｈｉａの付番の下では、重鎖可変ドメインのＣＤＲ配列は、配列番号５４、５５、５６に記載され、軽鎖可変ドメインのＣＤＲは、配列番号５７、５８、５９に記載される。

【0081】

１Ｆ４、及び１Ｆ４由来の抗体に対するＣＤＲ配列としては、Ｋａｂａｔの付番により定義される、重鎖可変ドメインのＣＤＲ、配列番号２４、２５、２６、及び、軽鎖可変ドメインのＣＤＲ、配列番号２７、２８、２９が挙げられる。Ｃｈｏｔｈｉａの付番の下では、重鎖可変ドメインのＣＤＲ配列は、配列番号６０、６１、６２に記載され、軽鎖可変ドメインのＣＤＲは、配列番号６３、６４、６５に記載される。

【0082】

１Ｆ１０、及び１Ｆ１０由来の抗体に対するＣＤＲ配列としては、Ｋａｂａｔの付番により定義される、重鎖可変ドメインのＣＤＲ、配列番号３０、３１、３２、及び、軽鎖可変ドメインのＣＤＲ、配列番号３３、３４、３５が挙げられる。Ｃｈｏｔｈｉａの付番の下では、重鎖可変ドメインのＣＤＲ配列は、配列番号６６、６７、６８に記載され、軽鎖可変ドメインのＣＤＲは、配列番号６９、７０、７１に記載される。

【0083】

１Ａ８抗体の重鎖可変領域に対するアミノ酸配列は、配列番号３６に記載される。１Ａ８抗体の軽鎖可変領域に対するアミノ酸配列は、配列番号３７に記載される。

【0084】

１Ｂ６抗体の重鎖可変領域に対するアミノ酸配列は、配列番号３８に記載される。１Ｂ６抗体の軽鎖可変領域に対するアミノ酸配列は、配列番号３９に記載される。

【0085】

１Ｃ３抗体の重鎖可変領域に対するアミノ酸配列は、配列番号４０に記載される。１Ｃ３抗体の軽鎖可変領域に対するアミノ酸配列は、配列番号４１に記載される。

【0086】

１Ｆ４抗体の重鎖可変領域に対するアミノ酸配列は、配列番号７２に記載される。１Ｆ４抗体の軽鎖可変領域に対するアミノ酸配列は、配列番号７３に記載される。

【0087】

１Ｆ１０抗体の重鎖可変領域に対するアミノ酸配列は、配列番号７４に記載される。１Ｆ１０抗体の軽鎖可変領域に対するアミノ酸配列は、配列番号７５に記載される。

【0088】

修飾抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域に対するアミノ酸配列もまた提供する。いくつかの実施形態において、重鎖可変領域は、配列番号３６、３８、４０、７２又は７４と、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一である。いくつかの実施形態において、軽鎖可変領域は、配列番号３７、３９、４１、７３又は７５と、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一である。重鎖可変領域配列を、対応する軽鎖可変領域配列と対形成することができ、これらは共に、ＴＮＦＲ２に結合する。

【0089】

ヒト化割合とは、国際免疫遺伝情報システム（ＩＭＧＴ）データベースのヒト抗体配列と比較した、重鎖又は軽鎖可変領域配列の同一性割合を意味する。上位ヒットは、重鎖又は軽鎖可変領域配列が、他の種よりも、特定の種に近いことを意味する。例えば、ヒトに対する上位ヒットとは、配列が、他の種よりも、ヒトに近いことを意味する。ヒト及びカニクイザルに対する上位ヒットとは、配列が、ヒト配列及びカニクイザル配列に対して、同じ同一性割合を有し、これらの同一性割合が、他の種の配列と比較して最も高いことを意味する。いくつかの実施形態において、ヒト化割合は、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、又は９５％を超える。ヒト化割合の決定方法、及び、上位ヒットの決定方法に関する詳細な説明は、当該技術分野において周知であり、例えば、Ｊｏｎｅｓ，ｅｔ ａｌ．「Ｔｈｅ ＩＮＮｓ ａｎｄ ｏｕｔｓ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｎｏｎｐｒｏｐｒｉｅｔａｒｙ ｎａｍｅｓ．」ＭＡｂｓ．Ｖｏｌ．８．Ｎｏ．１．Ｔａｙｌｏｒ＆Ｆｒａｎｃｉｓ、２０１６において記載されており、その全体が本明細書に参照により組み込まれている。高いヒト化割合は、多くの場合、様々な利点を有する、例えば、ヒトにおいてより安全であり、より効果的である、ヒト対象によって認容される可能性がより高い、及び／又は、副作用を有する可能性が低い。いくつかの実施形態において、可変領域は完全にヒトである、例えば、ヒト重鎖免疫グロブリン座位配列（例えば、ヒトＩＧＨＶ、ＩＧＨＤ、及びＩＧＨＪ遺伝子の組み合わせ）、並びに／又は、ヒトκ鎖免疫グロブリン座位配列（例えば、ヒトＩＧＫＶ及びＩＧＫＪ遺伝子の組み合わせ）に由来する。

【0090】

更に、いくつかの実施形態において、本明細書に記載する抗体又はその抗原結合断片は、配列番号６～８、配列番号１２～１４、配列番号１８～２０、配列番号２４～２６、及び配列番号３０～３２（Ｋａｂａｔの付番）からなる群から選択される、１、２、又は３つの重鎖可変領域ＣＤＲ、並びに／又は、配列番号９～１１、配列番号１５～１７、配列番号２１～２３、配列番号２７～２９、及び配列番号３３～３５（Ｋａｂａｔの付番）からなる群から選択される、１、２、又は３つの軽鎖可変領域ＣＤＲもまた含有することができる。

【0091】

いくつかの実施形態において、抗体は、相補性決定領域（ＣＤＲ）１、２、３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）を有することができ、上記ＣＤＲ１領域は、選択されたＶＨ ＣＤＲ１アミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、又は９５％同一であるアミノ酸配列を含み、又はそれからなり、上記ＣＤＲ２領域は、選択されたＶＨ ＣＤＲ２アミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、又は９５％同一であるアミノ酸配列を含み、又はそれからなり、上記ＣＤＲ３領域は、選択されたＶＨ ＣＤＲ３アミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、又は９５％同一であるアミノ酸配列を含む、又はそれからなる。いくつかの実施形態において、抗体は、ＣＤＲ１、２、３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を有することができ、上記ＣＤＲ１領域は、選択されたＶＬ ＣＤＲ１アミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、又は９５％同一であるアミノ酸配列を含み、又はそれからなり、上記ＣＤＲ２領域は、選択されたＶＬ ＣＤＲ２アミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、又は９５％同一であるアミノ酸配列を含み、又はそれからなり、上記ＣＤＲ３領域は、選択されたＶＬ ＣＤＲ３アミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、又は９５％同一であるアミノ酸配列を含む、又はそれからなる。選択されたＶＨ ＣＤＲ１、２、３アミノ酸配列、及び、選択されたＶＬ ＣＤＲ１、２、３アミノ酸配列は、図１４（ＫａｂａｔのＣＤＲ）、及び、図１５（ＣｈｏｔｈｉａのＣＤＲ）に示される。

【0092】

いくつかの実施形態において、本明細書に記載する抗体又は抗原結合断片は、０、１又は２個のアミノ酸挿入、欠失、又は置換を有する配列番号６、０、１又は２個のアミノ酸挿入、欠失、又は置換を有する配列番号７、０、１又は２個のアミノ酸挿入、欠失、又は置換を有する配列番号８のＣＤＲの、１つ、２つ、又は３つを含有する重鎖可変ドメインを含有することができる。

【0093】

いくつかの実施形態において、本明細書に記載する抗体又は抗原結合断片は、０、１又は２個のアミノ酸挿入、欠失、又は置換を有する配列番号１２、０、１又は２個のアミノ酸挿入、欠失、又は置換を有する配列番号１３、０、１又は２個のアミノ酸挿入、欠失、又は置換を有する配列番号１４のＣＤＲの、１つ、２つ、又は３つを含有する重鎖可変ドメインを含有することができる。

【0094】

いくつかの実施形態において、本明細書に記載する抗体又は抗原結合断片は、０、１又は２個のアミノ酸挿入、欠失、又は置換を有する配列番号１８、０、１又は２個のアミノ酸挿入、欠失、又は置換を有する配列番号１９、０、１又は２個のアミノ酸挿入、欠失、又は置換を有する配列番号２０のＣＤＲの、１つ、２つ、又は３つを含有する重鎖可変ドメインを含有することができる。

【0095】

いくつかの実施形態において、本明細書に記載する抗体又は抗原結合断片は、０、１又は２個のアミノ酸挿入、欠失、又は置換を有する配列番号２４、０、１又は２個のアミノ酸挿入、欠失、又は置換を有する配列番号２５、０、１又は２個のアミノ酸挿入、欠失、又は置換を有する配列番号２６のＣＤＲの、１つ、２つ、又は３つを含有する重鎖可変ドメインを含有することができる。

【0096】

いくつかの実施形態において、本明細書に記載する抗体又は抗原結合断片は、０、１又は２個のアミノ酸挿入、欠失、又は置換を有する配列番号３０、０、１又は２個のアミノ酸挿入、欠失、又は置換を有する配列番号３１、０、１又は２個のアミノ酸挿入、欠失、又は置換を有する配列番号３２のＣＤＲの、１つ、２つ、又は３つを含有する重鎖可変ドメインを含有することができる。

【0097】

いくつかの実施形態において、本明細書に記載する抗体又は抗原結合断片は、０、１又は２個のアミノ酸挿入、欠失、又は置換を有する配列番号９、０、１又は２個のアミノ酸挿入、欠失、又は置換を有する配列番号１０、０、１又は２個のアミノ酸挿入、欠失、又は置換を有する配列番号１１のＣＤＲの、１つ、２つ、又は３つを含有する軽鎖可変ドメインを含有することができる。

【0098】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載する抗体又は抗原結合断片は、０、１又は２個のアミノ酸挿入、欠失、又は置換を有する配列番号１５、０、１又は２個のアミノ酸挿入、欠失、又は置換を有する配列番号１６、０、１又は２個のアミノ酸挿入、欠失、又は置換を有する配列番号１７のＣＤＲの、１つ、２つ、又は３つを含有する軽鎖可変ドメインを含有することができる。

【0099】

いくつかの実施形態において、本明細書に記載する抗体又は抗原結合断片は、０、１又は２個のアミノ酸挿入、欠失、又は置換を有する配列番号２１、０、１又は２個のアミノ酸挿入、欠失、又は置換を有する配列番号２２、０、１又は２個のアミノ酸挿入、欠失、又は置換を有する配列番号２３のＣＤＲの、１つ、２つ、又は３つを含有する軽鎖可変ドメインを含有することができる。

【0100】

いくつかの実施形態において、本明細書に記載する抗体又は抗原結合断片は、０、１又は２個のアミノ酸挿入、欠失、又は置換を有する配列番号２７、０、１又は２個のアミノ酸挿入、欠失、又は置換を有する配列番号２８、０、１又は２個のアミノ酸挿入、欠失、又は置換を有する配列番号２９のＣＤＲの、１つ、２つ、又は３つを含有する軽鎖可変ドメインを含有することができる。

【0101】

いくつかの実施形態において、本明細書に記載する抗体又は抗原結合断片は、０、１又は２個のアミノ酸挿入、欠失、又は置換を有する配列番号３３、０、１又は２個のアミノ酸挿入、欠失、又は置換を有する配列番号３４、０、１又は２個のアミノ酸挿入、欠失、又は置換を有する配列番号３５のＣＤＲの、１つ、２つ、又は３つを含有する軽鎖可変ドメインを含有することができる。

【0102】

挿入、欠失、及び置換は、ＣＤＲ配列内、又は、ＣＤＲ配列の片方若しくは両方の末端に存在することができる。いくつかの実施形態において、ＣＤＲは、Ｋａｂａｔの付番スキームに基づき決定される。いくつかの実施形態において、ＣＤＲは、Ｃｈｏｔｈｉａの付番スキームに基づき決定される。いくつかの実施形態において、ＣＤＲは、ＫａｂａｔとＣｈｏｔｈｉａの付番スキームの組み合わせに基づき決定される。

【0103】

本開示は、ＴＮＦＲ２に結合する抗体又はその抗原結合断片もまた提供する。抗体又はその抗原結合断片は、選択された重鎖可変領域（ＶＨ）配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、又は９５％同一であるアミノ酸配列を含む、又はそれからなるＶＨ、及び、選択された軽鎖可変領域（ＶＬ）配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、又は９５％同一であるアミノ酸配列を含む、又はそれからなるＶＬを含有する。いくつかの実施形態において、選択されたＶＨ配列は配列番号３６であり、選択されたＶＬ配列は配列番号３７である。いくつかの実施形態において、選択されたＶＨ配列は配列番号３８であり、選択されたＶＬ配列は配列番号３９である。いくつかの実施形態において、選択されたＶＨ配列は配列番号４０であり、選択されたＶＬ配列は配列番号４１である。いくつかの実施形態において、選択されたＶＨ配列は配列番号７２であり、選択されたＶＬ配列は配列番号７３である。いくつかの実施形態において、選択されたＶＨ配列は配列番号７４であり、選択されたＶＬ配列は配列番号７５である。

【0104】

２つのアミノ酸配列、又は、２つの核酸配列の同一性パーセントを測定するために、最適に比較するために配列をアライメントする（例えば、比較するために、最適にアライメントするように第１及び第２のアミノ酸又は核酸配列の１つ又は両方にギャップを導入してもよく、非相同配列を無視してもよい）。比較のためにアラインされる参照配列の長さは、参照配列の長さ少なくとも８０％であり、いくつかの実施形態において、少なくとも９０％、９５％、又は１００％である。続いて、対応するアミノ酸位置又はヌクレオチド位置にあるアミノ酸残基又はヌクレオチドを比較する。第１の配列の位置が第２の配列の対応する位置のアミノ酸残基又はヌクレオチドと同じものによって占められている場合、分子はその位置で同一である。２つの配列間の同一性パーセントは、２つの配列を最適にアライメントするために導入される必要のあるギャップの数及び各ギャップの長さを考慮して、配列に共有される同一の位置の数の関数である。例えば、２つの配列間の配列比較及び同一性パーセントの測定は、ギャップペナルティ１２、ギャップ伸長ペナルティ４、及び、フレームシフトギャップペナルティ５の、Ｂｌｏｓｓｕｍ６２スコアリングマトリックスを用いて実施することができる。

【0105】

本開示は、免疫グロブリン重鎖又は免疫グロブリン軽鎖を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む核酸もまた提供する。免疫グロブリン重鎖又は免疫グロブリン軽鎖は、図１４若しくは図１５に示されるＣＤＲを含むか、又は、図１６に示される配列を有する。ポリペプチドが、対応するポリペプチド（例えば、対応する重鎖可変領域、又は、対応する軽鎖可変領域）と対形成される場合、対形成されるポリペプチドは、ＴＮＦＲ２に結合する。

【0106】

抗ＴＮＦＲ２抗体及び抗原結合断片はまた、抗体又は抗体断片の抗体変異体（誘導体及びコンジュゲートを含む）、並びに、多重特異的（例えば、二重特異的）抗体又は抗体断片であることも可能である。本明細書により提供される追加の抗体は、ポリクローナル、モノクローナル、多量体、多重特異的（例えば、二重特異的）、ヒト抗体、キメラ抗体（例えば、ヒト－マウスキメラ）、一本鎖抗体、細胞内で製造された抗体（即ち、イントラボディ）、及び、それらの抗原結合断片である。抗体又はその抗原結合断片は、任意のタイプ（例えばＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、及びＩｇＹ）、クラス（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２）又はサブクラスであることができる。いくつかの実施形態において、抗体又はその抗原結合断片は、ＩｇＧ抗体又はその抗原結合断片である。

【0107】

抗体の断片は、それらが、全長抗体の所望の親和性及び特異性を保持する限り、提供される方法での使用に好適である。したがって、ＴＮＦＲ２に結合する抗体の断片は、ＴＮＦＲ２に結合する能力を保持する。Ｆｖ断片は、完全な抗原認識及び結合部位を含有する、抗体断片である。この領域は、１個の重鎖可変ドメインと、１個の軽鎖可変ドメインが密接に会合した二量体で構成され、これは、本質的には、例えば、ｓｃＦｖにおいて、共有結合であることができる。この構成においては、各可変ドメインの３つのＣＤＲが相互作用し、ＶＨ－ＶＬ二量体の表面上で、抗原結合部位を画定する。全体的に、６つのＣＤＲ又はそれらのサブセットはまとまって、抗体に対する抗原結合特異性を付与する。しかしながら、単一の可変ドメイン（又は、ある抗原に特異的なＣＤＲを３つのみ含むＦｖの半分）でさえも、抗原を認識してそれに結合する能力を有することができるが、通常は、結合部位全体よりも親和性が低い。一本鎖Ｆｖ又は（ｓｃＦｖ）抗体断片は、抗体のＶＨ及びＶＬドメイン（又は領域）を含み、これらのドメインは、単一のポリペプチド鎖内に存在する。一般に、ｓｃＦｖポリペプチドはＶＨドメインとＶＬドメインとの間にポリペプチドリンカーを更に含み、それはｓｃＦｖが抗原結合のための望ましい構造を形成することを可能にする。

【0108】

本開示はまた、本明細書に記載する任意の抗体又はその抗原結合断片と交差競合する、抗体又はその抗原結合断片を提供する。交差競合アッセイは、当該技術分野において周知であり、例えば、Ｍｏｏｒｅ ｅｔ ａｌ．，「Ａｎｔｉｂｏｄｙ ｃｒｏｓｓ－ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ １ ｇｐ１２０ ｅｘｔｅｒｉｏｒ ｅｎｖｅｌｏｐｅ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ．」Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７０．３（１９９６）：１８６３～１８７２に記載されており、その全体が、参照により本明細書に組み込まれている。一態様では、本開示は、本明細書に記載される任意の抗体又は抗原結合断片と同じエピトープ又は領域に結合する、抗体又はその抗原結合断片もまた提供する。エピトープ結合アッセイは、当該技術分野において周知であり、例えば、Ｅｓｔｅｐ ｅｔ ａｌ．「Ｈｉｇｈ ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ－ｂａｓｅｄ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｙ－ａｎｔｉｇｅｎ ａｆｆｉｎｉｔｙ ａｎｄ ｅｐｉｔｏｐｅ ｂｉｎｎｉｎｇ．」ＭＡｂｓ．Ｖｏｌ．５．Ｎｏ．２．Ｔａｙｌｏｒ＆Ｆｒａｎｃｉｓ，２０１３に記載されており、その全体が本明細書に参照により組み込まれている。
抗体及び抗原結合断片
本開示は、本明細書に記載される抗ＴＮＦＲ２抗体に由来する、様々な抗体及びその抗原結合断片を提供する。一般的に、抗体（免疫グロブリンとも呼ばれる）は、２つのクラスのポリペプチド鎖、軽鎖、及び重鎖で構成される。本開示の抗体の非限定例は、２つの重鎖と２つの軽鎖とを含む、インタクトな４つの免疫グロブリン鎖抗体であることができる。抗体の重鎖は、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、若しくはＩｇＤを含む任意のアイソタイプ、又は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＥ１、ＩｇＥ２などを含むサブアイソタイプであることができる。軽鎖は、κ軽鎖又はλ軽鎖であることができる。抗体は、２つの同一のコピーの軽鎖、及び、２つの同一のコピーの重鎖を含むことができる。それぞれが、１個の可変ドメイン（又は可変領域、Ｖ_Ｈ）、及び、複数の定常ドメイン（又は定常領域）を含有する重鎖は、それらの定常ドメイン内で、ジスルフィド結合を介して互いに結合し、抗体の「幹」を形成する。それぞれが１個の可変ドメイン（又は、可変領域、Ｖ_Ｌ）、及び、１個の定常ドメイン（又は、定常領域）を含有する軽鎖は、それぞれ、ジスルフィド結合を介して、１個の重鎖に結合する。各軽鎖の可変領域を、それが結合する重鎖の可変領域とアラインする。軽鎖及び重鎖の両方の可変領域は、より保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）どうしの間に挟まされた、３つの超可変領域を含有する。

【0109】

相補性決定領域（ＣＤＲ）として知られる超可変領域は、抗体の抗原結合表面を含むループを形成する。４つのフレームワーク領域は、βシート構造にほとんど適応し、ＣＤＲは、βシート構造を接続するループを形成し、場合によってはβシート構造の一部を形成する。各鎖のＣＤＲはフレームワーク領域に近接して保持され、かつ、他の鎖のＣＤＲと共に、抗原結合領域の形成に寄与している。

【0110】

抗体のアミノ酸配列を分析することにより、抗体のＣＤＲ領域を識別する方法は周知であり、いくつかのＣＤＲの定義が、一般的に用いられる。Ｋａｂａｔの定義は配列の変動性に基づき、Ｃｈｏｔｈｉａの定義は、構造ループ領域の位置に基づく。これらの方法及び定義は、例えば、Ｍａｒｔｉｎ、「Ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｏｍａｉｎｓ、」Ａｎｔｉｂｏｄｙ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｂｅｒｌｉｎ Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、２００１．４２２～４３９、Ａｂｈｉｎａｎｄａｎ， ｅｔ ａｌ．「Ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔｓ ｔｏ Ｋａｂａｔ ａｎｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌｌｙ ｃｏｒｒｅｃｔ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｏｍａｉｎｓ、」Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ４５．１４（２００８）：３８３２～３８３９、Ｗｕ，Ｔ．Ｔ．ａｎｄ Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．（１９７０）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１３２：２１１～２５０、Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２０３：１２１－５３（１９９１）、Ｍｏｒｅａ ｅｔ ａｌ．、Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｃｈｅｍ．６８（１－３）：９－１６（Ｏｃｔ． １９９７）、Ｍｏｒｅａ ｅｔ ａｌ．、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２７５（２）：２６９－９４（Ｊａｎ ．１９９８）、Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ ３４２（６２５２）：８７７－８３（Ｄｅｃ．１９８９）、Ｐｏｎｏｍａｒｅｎｋｏ ａｎｄ Ｂｏｕｒｎｅ、ＢＭＣ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ７：６４（２００７）、に記載されており、これらそれぞれの全体が、本明細書に参照により組み込まれている。

【0111】

ＣＤＲは、抗原のエピトープを認識するのに重要である。本明細書で使用される場合、「エピトープ」とは、抗体の抗原結合ドメインにより、特異的に結合されることが可能な、標的分子の最小部分である。エピトープの最小サイズは、約３、４、５、６、又は７個のアミノ酸であり得るが、エピトープは、抗原の二次及び三次構造に基づいて、抗原の３次元構造に依存し得るため、これらのアミノ酸は、抗原の一次構造の、連続した直鎖状配列にある必要はない。

【0112】

いくつかの実施形態において、抗体は、インタクトな免疫グロブリン分子（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＡ）である。ＩｇＧサブクラス（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４）は、高度に保存されており、その定常領域、特に、ヒンジ及び上部ＣＨ２ドメインが異なっている。ＩｇＧサブクラスの配列及び違いは、当該技術分野において周知であり、例えば、Ｖｉｄａｒｓｓｏｎ，ｅｔ ａｌ、「ＩｇＧ ｓｕｂｃｌａｓｓｅｓ ａｎｄ ａｌｌｏｔｙｐｅｓ： ｆｒｏｍ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｔｏ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ．」Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ５（２０１４）、Ｉｒａｎｉ，ｅｔ ａｌ．「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ＩｇＧ ｓｕｂｃｌａｓｓｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｄｅｓｉｇｎｉｎｇ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｇａｉｎｓｔ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｄｉｓｅａｓｅｓ．」Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ６７．２（２０１５）：１７１～１８２、Ｓｈａｋｉｂ，Ｆａｒｏｕｋ，ｅｄ．Ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ＩｇＧ ｓｕｂｃｌａｓｓｅｓ：ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ．Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、２０１６、に記載されており、これらそれぞれの全体が、本明細書に参照により組み込まれている。

【0113】

抗体はまた、任意の種（例えば、ヒト、齧歯類、マウス、ラクダ）に由来する免疫グロブリン分子であることもできる。本明細書で開示する抗体としては、ポリクローナル、モノクローナル、単一特異的、多重特異的抗体、及び、別のポリペプチドに融合した免疫グロブリン結合ドメインを含むキメラ抗体が挙げられるが、これらに限定されない。「抗原結合ドメイン」又は「抗原結合断片」という用語は、インタクトな抗体の特異的結合活性を保持する抗体の一部、即ち、インタクトな抗体の標的分子上のエピトープに特異的に結合可能な抗体の、任意の部分である。これは、例えば、これらの断片のＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、及び変異体を含む。したがって、いくつかの実施形態において、抗体又はその抗原結合断片は、例えば、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、Ｆｄ、ｄＡｂ、二重特異的抗体、二重特異的ｓｃＦｖ、ダイアボディ、線状抗体、一本鎖抗体分子、抗体断片から形成される多重特異的抗体、及び、抗体結合ドメインである結合ドメイン、又はこれと相同である結合ドメインを含む、任意のポリペプチドであってもよい。抗原結合ドメインの非限定例としては、例えば、インタクトな抗体の重鎖及び／若しくは軽鎖ＣＤＲ、インタクトな抗体の重鎖及び／若しくは軽鎖可変領域、インタクトな抗体の全長重鎖若しくは軽鎖、又は、インタクトな抗体の重鎖若しくは軽鎖のいずれかに由来する個別のＣＤＲが挙げられる。

【0114】

本明細書に記載の方法で用いるのに好適な抗体の断片もまた、提供する。Ｆａｂ断片は、軽鎖の可変及び定常ドメイン、並びに、重鎖の可変ドメイン及び１番目の定常ドメイン（ＣＨ１）を含有する。Ｆ（ａｂ’）２抗体断片は、これらの間のヒンジシステインにより、一般に、カルボキシ末端付近で共通結合した、Ｆａｂ断片の対を含む。抗体断片の他の化学的結合は、当該技術分野において周知である。

【0115】

ダイアボディは、２つの抗原結合部位を含む小さな抗体断片であり、この断片は、同じポリペプチド鎖内に、ＶＬに接続したＶＨ（ＶＨ及びＶＬ）を含む。同じ鎖上の２つのドメイン間での対形成を可能にするには短すぎるリンカーを使用することによって、ドメインを別の鎖の相補的ドメインと対形成させ、２つの抗原結合部位を生成することができる。

【0116】

線状抗体は、相補性軽鎖ポリペプチドと共に、一対の抗原結合領域を形成する、一対のタンデムＦｄセグメント（ＶＨ－ＣＨ１－ＶＨ－ＣＨ１）を含む。線状抗体は、二重特異的又は単一特異的であってもよい。

【0117】

本開示の抗体及び抗体断片を、Ｆｃ領域内で修飾し、所望のエフェクター機能又は血清半減期を付与することができる。

【0118】

抗体の多量体化は、抗体の自然な凝集により、又は、当該技術分野において周知の、化学的若しくは組み換え結合技術により、達成することができる。例えば、精製された抗体調製物（例えば、精製されたＩｇＧ_１分子）の何パーセントかは、自然に、抗体ホモダイマーと、他の高次抗体多量体とを含有する、タンパク質アグリゲートを形成する。

【0119】

あるいは、抗体ホモダイマーは、当該技術分野において周知の化学結合技術により形成することができる。例えば、ＳＭＣＣ（スクシンイミジル ４－（マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシレート）、及びＳＡＴＡ（Ｎ－スクシンイミジル Ｓ－アセチルチオ－アセテート）を含むがこれらに限定されないヘテロ二官能性架橋剤を使用して、抗体多量体を形成することができる。抗体ホモ二量体を形成するための例示的な手順は、Ｇｈｅｔｉｅ ｅｔ ａｌ．（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９４：７５０９－７５１４，１９９７）に記載されている。ペプシン消化によって、抗体ホモ二量体を、Ｆａｂ’_２ホモ二量体に転換することができる。抗体ホモ二量体を形成する別の方法は、Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２５：３９６－４０４，２００２）に記載されている、自己好性ａｕｔｏｐｈｉｌｉｃ）Ｔ１５ペプチドを使用することである。

【0120】

いくつかの実施形態において、多重特異的抗体は、二重特異的抗体である。一対の抗体分子の間の界面を組み換えて、組み換え細胞培養液から回収したヘテロ二量体の割合を最大化することにより、二重特異的抗体を製造することができる。例えば、界面は、少なくとも、抗体定常ドメインのＣＨ３ドメインの一部を含有することができる。この方法では、第１の抗体分子の界面からの１つ以上の小さいアミノ酸側鎖が、より大きな側鎖（例えばチロシン又はトリプトファン）で置き換えられる。大きなアミノ酸側鎖を小さいもの（例えばアラニン又はトレオニン）で置き換えることにより、大きな側鎖と同じ又は同様のサイズの代償性「キャビティ」を、第２の抗体分子の界面に作り出す。これにより、ホモ二量体などの不要の他の最終産物よりも、ヘテロ二量体の収率を増大させるメカニズムが提供される。本方法は、例えば、ＷＯ ９６／２７０１１に記載されており、その全体が参照により組み込まれている。

【0121】

二重特異的抗体としては、架橋型、又は「ヘテロコンジュゲート」抗体が挙げられる。例えば、ヘテロコンジュゲート内の抗体の一方をアビジンに、そして、他方をビオチンに、結合させることができる。ヘテロコンジュゲート抗体は、任意の便利な架橋法を用いてもまた、製造することができる。好適な架橋剤及び架橋技術が、当該技術分野において周知であり、米国特許第４，６７６，９８０号に開示されており、その全体が本明細書に参照により組み込まれている。

【0122】

本明細書に記載する抗体又は抗原結合断片のいずれかを、安定化分子（例えば、対象内で、又は溶液中で、抗体又はその抗原結合断片の半減期を増大させる分子）とコンジュゲートすることができる。安定化分子の非限定例としては、ポリマー（例えば、ポリエチレングリコール）、又はタンパク質（例えば、ヒト血清アルブミンなどの血清アルブミン）が挙げられる。安定化分子のコンジュゲーションにより、インビトロで（例えば、組織培養液中で、若しくは、医薬組成物として貯蔵した際に）、又は、インビボで（例えば、ヒトにおいて）、抗体又は抗原結合断片の半減期を増大させることができる、又は、この生物活性を延長することができる。

【0123】

いくつかの実施形態において、本明細書に記載する抗体又は抗原結合断片を、治療剤とコンジュゲートすることができる。抗体又はその抗原結合断片を含む抗体薬物コンジュゲートは、治療剤に共有、又は非共有結合することができる。いくつかの実施形態において、治療剤は、細胞毒性又は細胞増殖抑制剤（例えば、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、エチジウムブロマイド、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テニポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラセン、メイタンシノイド（ＤＭ－１及びＤＭ－４など）、ジオン、マイトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１－デヒドロテストステロン、糖質コルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、ピューロマイシン、エピルビシン、並びにシクロホスファミド、並びにアナログ）である。

【0124】

いくつかの実施形態において、抗原結合断片は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の一部を形成することができる。いくつかの実施形態において、キメラ抗原受容体は、ＣＤ３ζ膜貫通及びエンドドメインに融合した、本明細書に記載する一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）の融合物である。いくつかの実施形態において、キメラ抗原受容体は、様々な共刺激性タンパク質受容体（例えば、ＣＤ２８、４１ＢＢ、ＩＣＯＳ）由来の細胞内シグナル伝達ドメインもまた含む。いくつかの実施形態において、キメラ抗原受容体は、効力を増大させるための、複数のシグナル伝達ドメイン、例えば、ＣＤ３ｚ－ＣＤ２８－４１ＢＢ、又はＣＤ３ｚ－ＣＤ２８－ＯＸ４０を含む。したがって、一態様では、本開示は、本明細書に記載するキメラ抗原受容体を発現する細胞（例えば、Ｔ細胞）を更に提供する。

【0125】

いくつかの実施形態において、ｓｃＦｖは、重鎖可変ドメインを１つ、及び、軽鎖可変ドメインを１つ有する。いくつかの実施形態において、ｓｃＦｖは、重鎖可変ドメインを２つ、及び、軽鎖可変ドメインを２つ有する。
抗体の特性
本明細書に記載する抗体又はその抗原結合断片は、ＴＮＦＲ２とＴＮＦＲ２リガンドの間の結合を遮断することができる。いくつかの実施形態において、ＴＮＦＲ２に結合することにより、抗体は、ＴＮＦＲ２シグナル伝達経路を阻害することができる。いくつかの実施形態において、抗体は、免疫応答を上方制御することができる。いくつかの実施形態において、抗体は、ＴＮＦＲ２を発現する細胞を有する動物での腫瘍体積を低減することができる。

【0126】

いくつかの実施態様において、抗体（又はその抗原結合断片）は、ＴＮＦＲ２（ヒトＴＮＦＲ２、マウスＴＮＦＲ２、サルＴＮＦＲ２、イヌＴＮＦＲ２、キメラＴＮＦＲ２）に、０．１ｓ^－１未満、０．０１ｓ^－１未満、０．００１ｓ^－１未満、０．０００１ｓ^－１未満、又は、０．００００１ｓ^－１未満の解離速度（ｋｏｆｆ）で特異的に結合する。いくつかの実施形態において、解離速度（ｋｏｆｆ）は、０．０１ｓ^－１超、０．００１ｓ^－１超、０．０００１ｓ^－１超、０．００００１ｓ^－１超、又は、０．０００００１ｓ^－１超である。

【0127】

いくつかの実施形態において、運動会合速度（ｋｏｎ）は、１×１０^２／Ｍｓ超、１×１０^３／Ｍｓ超、１×１０^４／Ｍｓ超、１×１０^５／Ｍｓ超、又は、１×１０^６／Ｍｓ超である。いくつかの実施形態において、運動会合速度（ｋｏｎ）は、１×１０^５／Ｍｓ未満、１×１０^６／Ｍｓ未満、又は、１×１０^７／Ｍｓ未満である。

【0128】

親和性を、運動速度定数の商から推定することができる（ＫＤ＝ｋｏｆｆ／ｋｏｎ）。いくつかの実施形態において、ＫＤは、１×１０^－６Ｍ未満、１×１０^－７Ｍ未満、１×１０^－８Ｍ未満、１×１０^－９Ｍ未満、又は、１×１０^－１０Ｍ未満である。いくつかの実施形態において、ＫＤは、５０ｎＭ、３０ｎＭ、２０ｎＭ、１５ｎＭ、１０ｎＭ、９ｎＭ、８ｎＭ、７ｎＭ、６ｎＭ、５ｎＭ、４ｎＭ、３ｎＭ、２ｎＭ、又は１ｎＭ未満である。いくつかの実施形態において、ＫＤは、１×１０^－７Ｍ超、１×１０^－８Ｍ超、１×１０^－９Ｍ超、１×１０^－１０Ｍ超、１×１０^－１１Ｍ超、又は、１×１０^－１２Ｍ超である。

【0129】

抗原に対する抗体の親和性を測定する一般的な技術としては、例えば、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、及び表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）が挙げられる。いくつかの実施形態において、抗体は、ヒトＴＮＦＲ２（配列番号１）、マウスＴＮＦＲ２（例えば、配列番号２）、サルＴＮＦＲ２（例えば、配列番号３）、イヌＴＮＦＲ２（配列番号４）、及び／又は、キメラＴＮＦＲ２（配列番号５）に結合する。いくつかの実施形態において、抗体は、サルＴＮＦＲ２、イヌＴＮＦＲ２、キメラＴＮＦＲ２、及び／又はマウスＴＮＦＲ２に結合しない。

【0130】

ＴＮＦＲ２は、４つのシステインリッチドメイン（ＣＲＤ）を有する。ＣＲＤ１は、配列番号１の３９ａａ～７６ａａであり、ＣＲＤ２は、配列番号１の７７ａａ～１１８ａａであり、ＣＲＤ３は、配列番号１の１１９ａａ～１６２ａａであり、ＣＲＤ４は、配列番号１の１６８ａａ～１９６ａａである。いくつかの実施形態において、抗体（又はその抗体結合断片）は、ＣＲＤ１、ＣＲＤ２、ＣＲＤ３、及び／又はＣＲＤ４に特異的に結合する。いくつかの実施形態において、エピトープは、ＣＲＤ３とＣＲＤ４の接合部に位置する。

【0131】

いくつかの実施形態において、本明細書に記載する抗体又はその抗原結合断片は、Ｔｒｅｇ細胞によるＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖の阻害を、遮断することができる。

【0132】

いくつかの実施形態において、本明細書に記載する抗体又はその抗原結合断片は、ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を促進することができる。いくつかの実施形態において、本明細書に記載する抗体又はその抗原結合断片は、ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を、１０％超、１５％超、２０％超、２５％超、３０％超、４０％超、５０％超、６０％超、７０％超、又は８０％超促進することができる。

【0133】

いくつかの実施形態において、本明細書に記載する抗体又はその抗原結合断片は、ＣＤ８＋Ｔ細胞によるサイトカイン放出を向上させることができる。いくつかの実施形態において、本明細書に記載する抗体又はその抗原結合断片は、ＣＤ８＋Ｔ細胞によるＩＬ－２の放出を向上させることができる。いくつかの実施形態において、本明細書に記載する抗体又はその抗原結合断片は、ＣＤ８＋Ｔ細胞によるＩＬ－２の放出を、１０％超、１５％超、２０％超、２５％超、３０％超、４０％超、５０％超、６０％超、７０％超、又は８０％超向上することができる。いくつかの実施形態において、本明細書に記載する抗体又はその抗原結合断片は、ＣＤ８＋Ｔ細胞によるＩＦＮ－γの放出を向上させることができる。いくつかの実施形態において、本明細書に記載する抗体又はその抗原結合断片は、ＣＤ８＋Ｔ細胞によるＩＦＮ－γの放出を、１０％超、１５％超、２０％超、２５％超、３０％超、４０％超、５０％超、６０％超、７０％超、又は８０％超向上することができる。

【0134】

いくつかの実施形態において、本明細書に記載する抗体又はその抗原結合断片は、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、又は２００％超の、腫瘍増殖阻害割合（ＴＧＩ_ＴＶ％）を有する。いくつかの実施形態において、抗体は、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、又は２００％未満の、腫瘍増殖阻害割合を有する。ＴＧＩ_ＴＶ％は、例えば、治療の開始の３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、若しくは３０日後、又は治療の開始の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、若しくは１２ヶ月後に、測定することができる。本明細書で使用する場合、腫瘍増殖阻害割合（ＴＧＩ_ＴＶ％）は、以下の式を用いて計算される：
ＴＧＩ_ＴＶ（％）＝［１－（Ｔｉ－Ｔ０）／（Ｖｉ－Ｖ０）］×１００％
Ｔｉは、ｉ日目における、治療群での平均腫瘍体積である。Ｔ０は、０日目における、治療群での平均腫瘍体積である。Ｖｉは、ｉ日目における、対照群での平均腫瘍体積である。Ｖ０は、０日目における、対照群での平均腫瘍体積である。

【0135】

いくつかの実施形態において、本明細書に記載する抗体又はその抗原結合断片は、例えば、ＴＮＦＲ２を発現する細胞に対する細胞毒性を有する。細胞毒性の測定方法は、当該技術分野において周知である。いくつかの実施形態において、細胞毒性は、以下の式により計算される：

【0136】

【数1】

【0137】

式中、実験とは、実験区（エフェクター細胞＋標的細胞＋試験産物）の吸光度の値を意味し、エフェクターとは、エフェクター細胞（エフェクター細胞のみ）の吸光度の値を意味する。標的とは、標的細胞（標的細胞のみ）の吸光度の値を意味する。自然放出量とは、細胞培養培地（細胞培養培地のみ、エフェクター細胞、標的細胞なし）の自己蛍光の、吸光度の値を意味する。標的最大値とは、標的細胞（標的細胞＋細胞溶解物）の、吸光度の最大値を意味する。自然放出量＊とは、細胞培養培地体積対照ウェル（培地のみ＋細胞溶解物）の吸光度の値を意味する。ＥＣ５０もまた、計算することができる。いくつかの実施形態において、ＥＣ５０は、２００、１５０、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、又は１０μｇ／ｍＬ未満である。

【0138】

いくつかの実施形態において、本明細書に記載される抗体又はその抗原結合断片は、ＴＮＦＲ２アンタゴニストである。いくつかの実施形態において、抗体又は抗原結合断片は、ＴＮＦＲ２を発現する標的細胞（例えば、ＴｒｅｇなどのＴ細胞）内で、ＴＮＦＲ２シグナル形質導入を低減する。

【0139】

いくつかの実施形態において、本明細書に記載される抗体又はその抗原結合断片は毒性がない。いくつかの実施形態において、例えば、０．３ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、又は２５ｍｇ／ｋｇにおいて、治療群と対照群との間で、体重の有意差を観察することはできない。

【0140】

いくつかの実施形態において、抗体又は抗原結合断片は、ＴＮＦＲ２を発現する腫瘍細胞に結合することができる。いくつかの実施形態において、抗体又は抗原結合断片は、補体依存性細胞傷害（ＣＭＣ）及び／又は抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を誘発し、腫瘍細胞を殺傷することができる。

【0141】

いくつかの実施形態において、抗体又は抗原結合断片は、機能的Ｆｃ領域を有する。いくつかの実施形態において、機能的Ｆｃ領域のエフェクター機能は、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）である。いくつかの実施形態において、機能的Ｆｃ領域のエフェクター機能はファゴサイトーシスである。いくつかの実施形態において、機能的Ｆｃ領域のエフェクター機能はＡＤＣＣ及びファゴサイトーシスである。

【0142】

いくつかの実施形態において、抗体又は抗原結合断片は、補体媒介性細胞傷害（ＣＭＣ）を誘発することができる。

【0143】

いくつかの実施形態において、Ｆｃ領域は、ヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２、ヒトＩｇＧ３、又はヒトＩｇＧ４である。いくつかの実施形態において、抗体は、ヒトＩｇＧ１抗体である。

【0144】

いくつかの実施形態において、抗体又は抗原結合断片は、機能的Ｆｃ領域を有しない。例えば、抗体又は抗原結合断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖ断片である。いくつかの実施形態において、Ｆｃ領域は、ＬＡＬＡ変異（ＥＵの付番におけるＬ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ変異）、又は、ＬＡＬＡ－ＰＧ変異（ＥＵの付番におけるＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｐ３２９Ｇ変異）を有する。

【0145】

いくつかの実施形態において、Ｆｃは、ＳＩ変異（ＥＵの付番におけるＳ２３９Ｄ及びＩ３３２Ｅ変異）を有する。
抗ＴＮＦＲ２抗体の製造方法
ヒトＴＮＦＲ２の単離された断片（例えば、細胞外領域）を、免疫原として使用し、ポリクローナル及びモノクローナル抗体調製のための標準的な技術を用いて抗体を生成することができる。ポリクローナル抗体は、抗原ペプチド又はタンパク質を複数回注射（例えば、皮下又は腹腔内注射）することにより、動物で生じさせることができる。いくつかの実施形態において、抗原ペプチド又はタンパク質は、少なくとも１つのアジュバントと共に注射される。いくつかの実施形態において、抗原ペプチド又はタンパク質は、免疫化される種において免疫原性である薬剤とコンジュゲートすることができる。動物には、抗原ペプチド又はタンパク質を２回以上（例えば、２回、３回、又は４回）注射することができる。

【0146】

全長ポリペプチド又はタンパク質を用いることができるか、あるいは、その抗原ペプチド断片を、免疫原として用いることができる。タンパク質の抗原ペプチドは、ＴＮＦＲ２のアミノ酸配列の、少なくとも８（例えば、少なくとも１０、１５、２０、又は３０）個のアミノ酸残基を含み、ペプチドに対して生成された抗体が、タンパク質との特異的な免疫複合体を形成するように、タンパク質のエピトープを包含する。前述したように、ヒトＴＮＦＲ２の全長配列は、当該技術分野において周知である（配列番号１）。いくつかの実施形態において、Ｆｃタグ化ヒトＴＮＦＲ２タンパク質（Ｆｃ融合タンパク質は、配列番号１の位置２３～２５７に、ヒトＴＮＦＲ２細胞外ドメインを含有する）を、免疫原として使用する。

【0147】

免疫原は典型的には、好適な対象（例えば、少なくとも１つのヒト免疫グロブリン座位を発現するヒト又はトランスジェニック動物）を免疫付与することによる抗体の調製のために使用される。適切な免疫原性調製物は、例えば、組み換えにより発現した、又は、化学的に合成されたポリペプチド（例えば、ヒトＴＮＦＲ２の断片）を含有することができる。調製物は、フロイント完全若しくは不完全アジュバントなどのアジュバント、又は、同様の免疫刺激剤を更に含むことができる。

【0148】

好適な対象に、ＴＮＦＲ２ポリペプチド、又は、その抗原ペプチド（例えば、細胞外領域などの、ＴＮＦＲ２の一部）を免疫原として免疫付与することにより、上述の通りにポリクローナル抗体を調製することができる。不動化されたＴＮＦＲ２ポリペプチド又はペプチドを用いる、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）などの標準的な技術により、免疫付与された対象における抗体力価を、経時的にモニタリングすることができる。所望する場合、抗体分子を哺乳動物から（例えば、血液から）単離し、タンパク質ＧクロマトグラフィーのプロテインＡなど、周知の技術により更に精製して、ＩｇＧ画分を入手することができる。免疫付与後の適切な時期、例えば、特異的抗体の力価が最大となる時期において、抗体産生細胞を対象から入手し、これを用いて、Ｋｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５－４９７，１９７５）により元々記載されているハイブリドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂｏｒ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ ４：７２，１９８３）、及び、ＥＢＶ－ハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，ｐｐ．７７－９６，１９８５）、又はトリオーマ技術などの、標準的な技術により、モノクローナル抗体を調製することができる。ハイブリドーマを産生する技術は周知である（一般的には、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１９９４，Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．（Ｅｄｓ．），Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ）を参照されたい）。例えば、標準的なＥＬＩＳＡアッセイを用い、対象となるポリペプチド又はエピトープに結合する抗体用のハイブリドーマ培養上清液をスクリーニングすることにより、モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞が検出される。

【0149】

適切なヌクレオチドの変化を、ヒト、ヒト化、若しくはキメラ抗体、又は、本明細書に記載する抗体若しくはその抗原結合断片をコードするＤＮＡに導入することにより、あるいは、ペプチド合成により本明細書に記載する抗体又は抗原結合断片の変異体を調製することができる。このような変異体としては、例えば、抗体の抗原結合部位又は抗原結合ドメインを製造する配列のアミノ酸内での、残基の欠失、挿入、又は置換が挙げられる。このような変異体の集団において、一部の抗体又は抗原結合断片は、標的タンパク質、例えば、ＴＮＦＲ２に対する親和性が増大する。欠失、挿入、及び／又は組み合わせの任意の組み合わせを、標的に対して結合親和性が増大した、抗体又はその抗原結合断片において実現することができる。グリコシル化部位の数の変化（例えば、増加若しくは減少）、グリコシル化部位の種類の変化（例えば、異なる糖が、細胞内に存在する酵素により結合されるように、アミノ酸配列を変化させること）、又は、新規のグリコシル化部位を導入することなどの、抗体又は抗原結合断片に導入したアミノ酸の変化によって、抗体又は抗原結合断片を変化させる、又は、抗体又は抗原結合断片に、新規の翻訳後修飾を導入することができる。

【0150】

本明細書で開示する抗体は、哺乳動物を含む、動物の任意の種に由来することができる。天然抗体の非限定例としては、ヒト、霊長類、例えば、サル及び類人猿、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ラクダ科動物（例えば、ラクダ及びラマ）、ニワトリ、ヤギ、並びに、ヒト抗体を産生するように遺伝子組み換えされたトランスジェニック齧歯類を含む、齧歯類（例えば、ラット、マウス、ハムスター、及びウサギ）に由来する抗体が挙げられる。

【0151】

ヒト及びヒト化抗体としては、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列に由来する（又は、これに由来するものと同じアミノ酸配列を有する）可変及び定常領域を有する抗体が挙げられる。ヒト抗体としては、例えばＣＤＲ内に、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列（例えば、インビトロでのランダム若しくは部位特異的突然変異誘発、又はインビボでの体細胞突然変異により導入された変異）によりコードされないアミノ酸残基を挙げることができる。

【0152】

ヒト化抗体は、典型的には、非ヒトＣＤＲが移植されたヒトフレームワーク（ＦＲ）を有する。したがって、ヒト化抗体は、非ヒトである源からヒトに導入された、１つ以上のアミノ酸配列を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基は多くの場合、「インポート」残基と呼ばれ、典型的には、これは、「インポート」可変ドメインから取得される。ヒト化は、本質的には、例えば、齧歯類のＣＤＲ又はＣＤＲ配列を、ヒト抗体の対応する配列で置換することにより実施することができる。これらの方法は、例えば、Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．「Ｒｅｐｌａｃｉｎｇ ｔｈｅ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ－ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎｓ ｉｎ ａ ｈｕｍａｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｗｉｔｈ ｔｈｏｓｅ ｆｒｏｍ ａ ｍｏｕｓｅ．」Ｎａｔｕｒｅ ３２１．６０６９（１９８６）：５２２、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．「Ｒｅｓｈａｐｉｎｇ ｈｕｍａｎ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅｒａｐｙ．」Ｎａｔｕｒｅ ３３２．６１６２（１９８８）：３２３、Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ ｅｔ ａｌ．「Ａｎｔｉｂｏｄｙ ｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎ ｂｙ ｆｒａｍｅｗｏｒｋ ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ．」Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６．１（２００５）：４３－６０、に記載されており、これらそれぞれの全体が、本明細書に参照により組み込まれている。したがって、「ヒト化」抗体とは、実質的に、インタクトなヒトＶドメイン未満が、非ヒト種に由来する、対応する配列により置換されている、キメラ抗体である。実際には、ヒト化抗体は、典型的には、いくつかのＣＤＲ残基、及び、いくつかのＦＲ残基が、ヒト抗体内の類似の部位に由来する残基により置換されている、マウス抗体である。

【0153】

ヒト化抗体の製造で用いるヒトＶＨ及びＶＬドメインの選択は、免疫原性を低減するために非常に重要である。いわゆる「ベストフィット」法に従うと、マウス抗体のＶドメインの配列を、既知のヒトドメイン配列のライブラリー全体に対してスクリーニングする。次に、マウスの配列に最も近いヒト配列を、ヒト化抗体用のヒトＦＲとして受け入れる（Ｓｉｍｓ ｅｔ ａｌ．「Ａ ｈｕｍａｎｉｚｅｄ ＣＤ１８ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｃａｎ ｂｌｏｃｋ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈｏｕｔ ｃｅｌｌ ｄｅｓｔｒｕｃｔｉｏｎ．」Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １５１．４（１９９３）：２２９６－２３０８；Ｃｈｏｔｈｉａ，ｅｔ ａｌ．，「Ｃａｎｏｎｉｃａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ．」Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ １９６．４（１９８７）：９０１－９１７）。

【0154】

更に、抗原に対する高い特異性及び親和性、並びに、他の好ましい生物学的性質を保持したまま、抗体をヒト化することが重要である。この目標を達成するために、親及びヒト化配列の３次元モデルを使用する、親配列及び様々な概念的なヒト化生成物の分析プロセスにより、ヒト化抗体を調製することができる。３次元免疫グロブリンモデルは一般的に入手可能であり、当業者によく知られている。選択された候補免疫グロブリン配列の、可能性のある３次元立体構造を図示して表示することができるコンピュータプログラムが、利用可能である。これらの表示を観察することで、候補免疫グロブリン配列の機能化における残基が取り得る役割の分析、即ち候補免疫グロブリンの、その抗原との結合能力に影響を及ぼす残基の分析が可能になる。このようにして、ＦＲ残基を、レシピエント及びインポート配列から選択して組み合わせることができ、所望の抗体特性、例えば、標的抗原に対する親和性の増大が達成される。

【0155】

通常、ヒト、ヒト化、又はキメラ抗ＴＮＦＲ２抗体のアミノ酸配列変異体は、元の抗体の軽鎖又は重鎖に存在する配列と、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性パーセントを有するアミノ酸配列を含有する。

【0156】

いくつかの実施形態において、ヒト化重鎖免疫グロブリン座位、及び、ヒト化κ鎖免疫グロブリン座位を有するマウス（例えば、ＲｅｎＭａｂマウス）を使用して、抗体を生成する。重鎖免疫グロブリン座位とは、抗体の重鎖に対する遺伝子を含有する、染色体上の領域である。座位は、例えば、ヒトＩＧＨＶ（可変）遺伝子、ヒトＩＧＨＤ（多様性）遺伝子、ヒトＩＧＨＪ（結合）遺伝子、及び、マウス重鎖定常ドメイン遺伝子を含むことができる。κ鎖免疫グロブリン座位とは、抗体の軽鎖（κ鎖）をコードする遺伝子を含有する、染色体上の領域である。κ鎖免疫グロブリン座位としては、例えば、ヒトＩＧＫＶ（可変）遺伝子、ヒトＩＧＫＪ（結合）遺伝子、及び、マウス軽鎖定常ドメイン遺伝子を挙げることができる。ＲｅｎＭａｂマウスに関する詳細な説明は、ＰＣＴ／ＣＮ２０２０／０７５６９８に見出すことができ、その全体が本明細書に参照により組み込まれている。マウスにより生成される抗体は、完全ヒトＶＨ、完全ヒトＶＬ、及び、マウス定常領域を有する。いくつかの実施形態において、ヒトＶＨ及びヒトＶＬは、ヒトＩｇＧ定常領域（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４）に結合する。いくつかの実施形態において、定常領域は、配列番号７６、７７、７８、又は９０と、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一である配列を有する。

【0157】

元の配列に対する同一性又は相同性とは、通常、配列をアラインして、必要な場合、ギャップを導入し、最大のパーセント配列同一性を達成した後に、配列同一性の一部としての保存的置換を考慮しない、ヒト、ヒト化、又はキメラ抗ＴＮＦＲ２抗体又は断片内に存在する配列と同一である候補配列内に存在する、アミノ酸残基の割合である。

【0158】

抗ＴＮＦＲ２抗体又は抗原結合断片に、更なる修飾を加えることができる。例えば、システイン残基をＦｃ領域に導入して、この領域内での、鎖間ジスルフィド結合形成を可能にすることができる。このように生成されたホモ二量体抗体は、なんらかの、増大したインビトロ及び／又はインビボ半減期を有し得る。例えば、Ｗｏｌｆｆ ｅｔ ａｌ．Ｗｏｌｆｆ ｅｔ ａｌ．（「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｈｏｍｏｄｉｍｅｒｓ：ｅｎｈａｎｃｅｄ ａｎｔｉｔｕｍｏｒ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ｎｕｄｅ ｍｉｃｅ．」Ｃａｎｃｅｒ ｒｅｓｅａｒｃｈ ５３．１１（１９９３）：２５６０－２５６５）に記載されているヘテロ二官能性架橋剤を用いてもまた、インビトロ及び／又はインビボ半減期が増大したホモ二量体抗体を調製することができる。あるいは、二重Ｆｃ領域を有する抗体を改変することができる。

【0159】

いくつかの実施形態において、抗ＴＮＦＲ２抗体又はその抗原結合断片に、共有結合修飾を加えることができる。これらの共有結合修飾は、化学若しくは酵素合成により、又は、酵素又は化学切断により加えることができる。抗体又は抗体断片の、他の種類の共有結合修飾を、抗体又は断片の標的とされたアミノ酸残基を、選択された側鎖、又は、Ｎ若しくはＣ末端残基と反応可能な、有機誘導体化剤と反応させることにより、分子に導入する。

【0160】

いくつかの実施形態において、Ｆｃ領域に（直接又は間接的に）結合したフコースを欠く炭水化物構造を有する抗体変異体を提供する。例えば、そのような抗体組成物におけるフコースの量は、１％～８０％、１％～６５％、５％～６５％、又は２０％～４０％であってもよい。フコースの量は、例えば、ＷＯ ２００８／０７７５４６に記載のＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ質量分析によって測定される、Ａｓｎ２９７に結合した全ての糖構造（例えば、複合体、ハイブリッド、及び高マンノース構造）の合計に対する、Ａｓｎ２９７での糖鎖内のフコースの平均量を計算することによって決定される。Ａｓｎ２９７は、Ｆｃ領域内の位置２９７（Ｆｃ領域残基のＥｕの付番、又は、Ｋａｂａｔの付番における位置３１４）に位置するアスパラギン残基を指し、しかし、Ａｓｎ２９７はまた、抗体における微小な配列変動に起因して、位置２９７から約±３アミノ酸の上流又は下流、即ち、位置２９４～位置３００の間に位置してもよい。そのようなフコシル化変異体は、改善されたＡＤＣＣ機能を有し得る。いくつかの実施形態において、グリカンの不均質性を低減するために、抗体のＦｃ領域を更に組み換え、位置２９７におけるアスパラギンをアラニンで置き換える（Ｎ２９７Ａ）。

【0161】

いくつかの実施形態において、Ｆａｂ－アーム交換を避けることで産生効率を促進するために、抗体のＦｃ領域を更に組み換え、ＩｇＧ４の位置２２８（ＥＵの付番）におけるセリンを、プロリンで置き換える（Ｓ２２８Ｐ）。Ｓ２２８変異に関する詳細の説明は、例えば、Ｓｉｌｖａ ｅｔ ａｌ．「Ｔｈｅ Ｓ２２８Ｐ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｐｒｅｖｅｎｔｓ ｉｎ ｖｉｖｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＩｇＧ４ Ｆａｂ－ａｒｍ ｅｘｃｈａｎｇｅ ａｓ ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｄ ｕｓｉｎｇ ａ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｏｖｅｌ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ ａｎｄ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｍａｔｒｉｘ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ．」Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２９０．９（２０１５）：５４６２－５４６９で説明されており、その全体が参照により組み込まれている。
組み換えベクター
本開示はまた、本明細書で開示される単離ポリヌクレオチド（例えば、本明細書で開示されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド）を含む組み換えベクター（例えば、発現ベクター）、組み換えベクターが導入された宿主細胞（即ち、当該宿主細胞が、ポリヌクレオチド、及び／又は、ポリヌクレオチドを含むベクターを含有するように）、並びに、組み換え技術による、組み換え抗体ポリペプチド又はその断片の産生を提供する。

【0162】

本明細書で使用する場合、「ベクター」とは、ベクターが宿主細胞に導入されたときに、宿主細胞に、対象となる１つ以上のポリヌクレオチドを送達することができる、任意のコンストラクトである。「発現ベクター」は、対象となる１つ以上のポリヌクレオチドを、発現ベクターが導入されている宿主細胞内で、コードされたポリペプチドとして送達し、発現することが可能である。したがって、発現ベクター内では、対象となるポリヌクレオチドが、発現ベクターと共に導入された宿主細胞内で翻訳されるように、対象となるポリヌクレオチドの組み込み部位において、又はこの付近で、又はこれに隣接して、ベクター内、又は宿主細胞のゲノムのいずれかにて、プロモーター、エンハンサー、及び／又はポリＡテールなどの制御エレメントと作動可能に結合されることにより、ベクター内での発現のために、対象となるポリヌクレオチドが配置される。

【0163】

当該技術分野において周知の方法、例えば、電気穿孔法、化学トランスフェクション（例えば、ＤＥＡＥ－デキストラン）、形質転換、トランスフェクション、並びに、感染及び／又は形質導入（例えば、組み換えウイルスによる）により、ベクターを宿主細胞に導入することができる。したがって、ベクターの非限定例としては、ウイルスベクター（組み換えウイルスを生成するために使用可能なもの）、ネイキッドＤＮＡ又はＲＮＡ、プラスミド、コスミド、ファージベクター、及び、カチオン性縮合剤と会合したＤＮＡ又はＲＮＡ発現ベクターが挙げられる。

【0164】

いくつかの実施態様において、本明細書で開示されるポリヌクレオチド（例えば、本明細書で開示されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド）を、ウイルス発現系（例えば、痘疹若しくは他のポックスウイルス、レトロウイルス、又はアデノウイルス）を用いて導入し、これには、非病原性（欠損型）の複製可能なウイルスの使用を伴う場合があるか、又は、複製不能ウイルスを用いる場合がある。後者の場合、ウイルス増殖は一般的に、補完的なウイルスパッケージング細胞においてのみ生じる。例えば、Ｆｉｓｈｅｒ－Ｈｏｃｈ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：３１７－３２１、Ｆｌｅｘｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ Ｓｃｉ．５６９：８６－１０３、Ｆｌｅｘｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｖａｃｃｉｎｅ，８：１７－２１、米国特許第４，６０３，１１２号、同第４，７６９，３３０号、及び同第５，０１７，４８７号、ＷＯ ８９／０１９７３、米国特許第４，７７７，１２７号、ＧＢ ２，２００，６５１、ＥＰ ０，３４５，２４２、ＷＯ ９１／０２８０５、Ｂｅｒｋｎｅｒ－Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，６：６１６－６２７，１９８８；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５２：４３１－４３４；Ｋｏｌｌｓ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１：２１５－２１９；Ｋａｓｓ－Ｅｉｓｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：１１４９８－１１５０２；Ｇｕｚｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，８８：２８３８－２８４８；ａｎｄ Ｇｕｚｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｃｉｒ．Ｒｅｓ．，７３：１２０２－１２０７において、好適なシステムが開示されている。ＤＮＡを、このような発現系に組み込む技術は、当業者に周知である。ＤＮＡはまた、例えば、Ｕｌｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５９：１７４５－１７４９，ａｎｄ Ｃｏｈｅｎ，１９９３，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５９：１６９１－１６９２に記載されているように、「ネイキッド」であってもよい。ＤＮＡを、細胞に効率的に輸送される生分解性ビーズにコーティングすることにより、ネイキッドＤＮＡの取り込みを増大させることができる。

【0165】

発現のために、本明細書で開示する、抗体をコードする、又は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むＤＮＡインサートを、いくつかの例を挙げると、ファージλＰＬプロモーター、大腸菌ｌａｃ、ｔｒｐ及びｔａｃプロモーター、ＳＶ４０初期及び後期プロモーター、並びに、レトロウイルス型ＬＴＲのプロモーターなどの適切なプロモーター（例えば、異種プロモーター）に作動可能に連結することができる。他の好適なプロモーターが、当業者には既知である。いくつかの実施形態において、プロモーターは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターである。発現コンストラクトは更に、転写開始及び終了のための部位、並びに、転写領域内に、翻訳のためのリボソーム結合部位を含有することができる。コンストラクトにより発現した成熟転写物のコード部分は、先頭に翻訳開始、及び翻訳されるポリペプチドの末端部におおよそ配置される終止コドン（ＵＡＡ、ＵＧＡまたはＵＡＧ）を含むことができる。

【0166】

示したように、発現ベクターは、少なくとも１つの選択可能なマーカーを含むことができる。このようなマーカーとしては、真核細胞培養のためのジヒドロ葉酸レダクターゼ、又はネオマイシン耐性、並びに大腸菌及び他の細菌培養のためのテトラサイクリン又はアンピシリン耐性遺伝子が挙げられる。適切な宿主の代表例としては、大腸菌、ストレプトミセス、及びネズミチフス菌細胞などの細菌細胞、酵母細胞などの真菌細胞、ショウジョウバエＳ２及びハスモンヨトウＳｆ９細胞などの昆虫細胞、ＣＨＯ、ＣＯＳ、Ｂｏｗｅｓ黒色腫、及びＨＫ ２９３細胞などの動物細胞、並びに、植物細胞が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書に記載する宿主細胞に対する、適切な培養培地及び条件は、当該技術分野において周知である。

【0167】

細菌で用いるための非限定的なベクターとしては、Ｑｉａｇｅｎから入手可能なｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０及びｐＱＥ－９、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから入手可能なｐＢＳベクター、Ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔベクター、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ；及び、Ｐｈａｒｍａｃｉａから入手可能なｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３－３、ｐＫＫ２３３－３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５が挙げられる。非限定的な真核細胞ベクターとしては、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから入手可能なｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１、及びｐＳＧ、並びに、Ｐｈａｒｍａｃｉａから入手可能なｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、及びｐＳＶＬが挙げられる。他の好適なベクターは、当業者には容易に明らかであろう。

【0168】

使用に好適な、非限定的な細菌プロモーターとしては、大腸菌ｌａｃＩ及びｌａｃＺプロモーター、Ｔ３及びＴ７プロモーター、ｇｐｔプロモーター、λＰＲ及びＰＬプロモーター、並びにｔｒｐプロモーターが挙げられる。好適な真核細胞プロモーターとしては、ＣＭＶ前初期プロモーター、ＨＳＶチミジンキナーゼプロモーター、初期及び後期ＳＶ４０プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）のものなどの、レトロウイルス型ＬＴＲのプロモーター、及び、マウスメタロチオネイン－Ｉプロモーターなどのメタロチオネインプロモーターが挙げられる。

【0169】

酵母菌サッカロマイセス・セレヴィシエにおいて、アルファ因子、アルコールオキシダーゼ、及びＰＧＨなどの、体質性又は誘導性プロモーターを含有する、いくつかのベクターを使用することができる。

【0170】

コンストラクトの宿主細胞への導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ－デキストラン媒介性トランスフェクション、カチオン性脂質媒介性トランスフェクション、電気穿孔法、形質導入、感染、又は他の方法により行うことができる。このような方法は、Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９８６）などの、多くの標準的な実験室用マニュアルに記載されており、その全体が本明細書に参照により組み込まれている。

【0171】

より多くの真核生物による、本開示の抗体をコードするＤＮＡの転写は、エンハンサー配列をベクターに挿入することで増大させることができる。エンハンサーは、通常、所与の宿主細胞型において、プロモーターの転写活性を増大させる役割を果たす、約１０～３００ｂｐの、ＤＮＡのｃｉｓ作用型エレメントである。エンハンサーの例としては、塩基対１００～２７０において、複製起点の後ろ側に位置する、ＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後ろ側のポリオーマエンハンサー、及び、アデノウィルスエンハンサーが挙げられる。

【0172】

翻訳されたタンパク質を、小胞体の内腔、ペリプラズム空間、又は、細胞外環境に分泌させるために、適切な分泌シグナルを、発現したポリペプチドに組み込むことができる。シグナルは、ポリペプチドに対して内因性であることができる、又は、シグナルは、異種シグナルであることができる。

【0173】

ポリペプチド（例えば、抗体）は、融合タンパク質（例えば、ＧＳＴ融合物）などの修飾形態で、又は、ヒスチジンタグにより発現することができ、分泌シグナルだけでなく、追加の異種機能領域もまた含むことができる。例えば、追加のアミノ酸、特に、荷電アミノ酸の領域を、ポリペプチドのＮ末端に付加して、精製中に、又は、その後の取り扱い及び貯蔵の間に、宿主細胞での安定性及び耐久力を改善することができる。また、ペプチド部分をポリペプチドに付加して、精製を促進することができる。このような領域は、ポリペプチドの最終調製前に取り除くことができる。ペプチド部分をポリペプチドに付加して、とりわけ、分泌又は排泄を生じさせ、安定性を改善し、精製を促進することは、周知かつ日常的な当該技術である。
治療方法
本開示の抗体又はその抗原結合断片を、様々な治療目的のために使用することができる。

【0174】

一態様では、本開示は、対象における癌の治療方法、対象における腫瘍体積の増加速度を、経時的に下げる方法、転移が生じるリスクを軽減する方法、又は、対象において更なる転移が生じるリスクを軽減する方法を提供する。いくつかの実施形態において、治療によって、癌の進行を中断させる、遅くする、阻止する、又は阻害することができる。いくつかの実施形態において、治療によって、対象における癌の１つ以上の症状の数、重症度、及び／又は持続期間の軽減をもたらすことができる。

【0175】

一態様では、本開示は、治療に有効な量の、本明細書で開示される抗体又はその抗原結合断片を、必要とする対象（例えば、癌、例えば、乳癌（例えば、トリプルネガティブ乳癌）、カルチノイド癌、子宮頸癌、子宮体癌、神経系癌、頭頸癌、肝癌、肺癌、小細胞肺癌、リンパ腫、黒色腫、卵巣癌、膵癌、前立腺癌、腎癌、結腸直腸癌、胃癌、精巣癌、甲状腺癌、膀胱癌、尿道癌、又は悪性血液疾患を有する、又は、これを有すると同定若しくは診断された対象）に投与することを含む方法に関する。いくつかの実施形態において、癌は、切除不能な黒色腫若しくは転移性黒色腫、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）、膀胱癌、又は、転移性ホルモン不応性前立腺癌である。いくつかの実施形態において、対象は、充実性腫瘍を患う。いくつかの実施形態において、癌は、頭頸部の扁平上皮細胞癌（ＳＣＣＨＮ）、腎細胞癌（ＲＣＣ）、トリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）、又は結腸癌である。いくつかの実施形態において、対象はホジキンリンパ腫を患う。いくつかの実施形態において、対象は、トリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）、胃癌、尿路上皮癌、メルケル細胞癌、又は頭頸癌を患う。いくつかの実施形態において、癌は、黒色腫、膵臓癌、中皮腫、神経膠腫、血液悪性腫瘍、特に、非ホジキンリンパ腫、リンパ腫、慢性リンパ性白血病、又は進行性充実性腫瘍である。

【0176】

いくつかの実施形態において、本明細書で開示される組成物及び方法を、癌のリスクを有する患者の治療に用いることができる。癌を患う患者は、当該技術分野において周知の様々な方法で同定することができる。

【0177】

いくつかの態様において、本開示は、自己免疫疾患又は炎症の治療方法であって、上記方法は、上記対象に、有効量の本明細書に記載される抗体又はその抗原結合断片、又は、本明細書に記載される抗体薬物コンジュゲートを含む組成物を投与することを含む、方法に関する。

【0178】

一態様では、本開示は、例えば、Ｔｒｅｇの機能に影響を及ぼすことによる、異常な、又は望ましくない免疫応答、例えば、自己免疫疾患と関連する障害の治療、予防、又は、この発症リスクの軽減方法を提供する。これらの自己免疫疾患としては、円形脱毛症、狼瘡、強直性脊椎炎、メニエール病、抗リン脂質症候群、混合性結合織疾患、自己免疫性アジソン病、多発性硬化症、自己免疫性溶血性貧血、重症筋無力症、自己免疫性肝炎、尋常天疱瘡、ベーチェット病、悪性貧血、水疱性類天疱瘡、結節性多発性関節炎、心筋症、多発軟骨炎、腹腔スプルー皮膚炎、多腺性症候群、慢性疲労症候群（ＣＦＩＤＳ）、リウマチ性多発筋痛、慢性炎症性脱髄、多発性筋炎及び皮膚筋炎、慢性炎症性多発神経障害、原発性無ガンマグロブリン血症、チャーグ・ストラウス症候群、原発性胆汁性肝硬変、瘢痕性類天疱瘡、乾癬、クレスト症候群、レイノー現象、寒冷凝集素疾患、ライター症候群、クローン病、リウマチ熱、円板状ループス、関節リウマチ、寒冷グロブリン血症サルコイドーシス、線維筋痛、強皮症、グレーブス病、シェーグレン症候群、ギラン・バレー、スティッフマン症候群、橋本甲状腺炎、高安動脈炎、特発性肺胞線維症、側頭動脈炎／巨細胞動脈炎、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、潰瘍性大腸炎、ＩｇＡ腎症、ぶどう膜炎、糖尿病（例えば、Ｉ型）、血管炎、扁平苔癬、及び白斑が挙げられるが、これらに限定されない。抗ＴＮＦＲ２抗体又はその抗原結合断片をまた、対象に投与して、細胞、組織、又は臓器移植と関連する異常な、又は望ましくない免疫応答と関連する障害、例えば、腎臓、肝臓、及び心臓移植、例えば、移植片対宿主拒絶反応（ＧＶＨＤ）を治療、予防する、又は、それが進行するリスクを軽減することができる、あるいは同種移植片拒絶を予防することができる。いくつかの実施形態において、対象は、クローン病、潰瘍性大腸炎、又は１型糖尿病を患う。いくつかの実施形態において、抗体又は抗原結合断片を用いて、炎症を治療することができる。

【0179】

いくつかの実施形態において、抗体又はその抗原結合断片は、ＴＮＦＲ２アゴニストである。

【0180】

いくつかの態様において、本開示は、対象における免疫応答の阻害方法であって、上記方法は、上記対象に、有効量の本明細書に記載される抗体又はその抗原結合断片、又は、本明細書に記載される抗体薬物コンジュゲートを含む組成物を投与することを含む、方法に関する。いくつかの実施形態において、対象は、自己免疫疾患を患う。

【0181】

本明細書で使用される場合、「有効量」とは、疾患、例えば、癌の進行を中断する、遅らせる、阻止する、又は阻害することを含む、有益な、又は所望の結果をもたらすのに十分な量又は用量を意味する。有効量は、例えば、抗体、抗原結合断片、抗体をコードするポリヌクレオチド、そのポリヌクレオチドを含むベクター、及び／又はその組成物が投与される対象の年齢及び体重、症状の重症度、並びに投与経路に応じて変化し、故に、投与は、個別に決定することができる。

【0182】

有効量は、１回以上の投与で投与することができる。例えば、有効量の抗体又は抗原結合断片とは、患者における自己免疫疾患若しくは癌の進行を緩和する、停止する、安定させる、逆転させる、阻害する、遅くする、及び／若しくは遅延させるのに十分な量、又は、インビトロで、細胞（例えば、生検細胞、本明細書に記載される癌細胞のいずれか、若しくは細胞株（例えば、癌細胞株））の増殖を緩和する、停止する、安定させる、逆転させる、遅くする、及び／若しくは遅延させるのに十分な量である。当該技術分野において理解されるように、有効量の抗体又は抗原結合断片は、とりわけ、患者の病歴、加えて、用いた抗体の種類（及び／又は用量）などの、他の因子に応じて変化する場合がある。

【0183】

本明細書で開示される抗体、抗体をコードするポリヌクレオチド、及び／又は組成物を投与するための有効量及びスケジュールは、実験によって決定することができ、このような決定を行うことは、当業者の範囲内である。当業者は、投与される必要がある用量は、例えば、本明細書で開示される抗体、抗体をコードするポリヌクレオチド、及び／若しくは組成物を受ける哺乳動物、投与経路、抗体の具体的な種類、抗体をコードするポリヌクレオチド、抗原結合断片、並びに／又は、使用される、本明細書で開示される組成物、及び、哺乳動物に投与される他の薬剤に応じて変化することを理解するであろう。

【0184】

有効量の抗体の、典型的な日用量は、０．０１ｍｇ／ｋｇ～１００ｍｇ／ｋｇ（患者の体重１ｋｇ当たりのｍｇ）である。いくつかの実施形態において、用量は、１００ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇ、４０ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇ、２５ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、９ｍｇ／ｋｇ、８ｍｇ／ｋｇ、７ｍｇ／ｋｇ、６ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、４ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、又は０．１ｍｇ／ｋｇ未満であることができる。いくつかの実施形態において、用量は、５０ｍｇ／ｋｇ、４０ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、９ｍｇ／ｋｇ、８ｍｇ／ｋｇ、７ｍｇ／ｋｇ、６ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、４ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．０５ｍｇ／ｋｇ、又は０．０１ｍｇ／ｋｇ超であることができる。いくつかの実施形態において、用量は、約５０ｍｇ／ｋｇ、４０ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇ、２５ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、９ｍｇ／ｋｇ、８ｍｇ／ｋｇ、７ｍｇ／ｋｇ、６ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、４ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、０．９ｍｇ／ｋｇ、０．８ｍｇ／ｋｇ、０．７ｍｇ／ｋｇ、０．６ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、０．４ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、０．２ｍｇ／ｋｇ、又は０．１ｍｇ／ｋｇである。

【0185】

本明細書に記載される方法のいずれかでは、少なくとも１つの抗体、その抗原結合断片、又は医薬組成物（例えば、本明細書に記載する抗体、抗原結合断片、又は医薬組成物のいずれか）、並びに、任意選択的に、少なくとも１つの追加の治療剤を、対象に、少なくとも週に１回（例えば、週に１回、週に２回、週に３回、週に４回、１日１回、１日２回、又は１日３回）投与することができる。いくつかの実施形態において、少なくとも２つの異なる抗体及び／又は抗原結合断片は、同じ組成物（例えば、液体組成物）で投与される。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの抗体又は抗原結合断片、及び、少なくとも１つの追加の治療剤は、同じ組成物（例えば、液体組成物）で投与される。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの抗体又は抗原結合断片、及び、少なくとも１つの追加の治療剤は、２つの異なる組成物（例えば、少なくとも１つの抗体又は抗原結合断片を含有する液体組成物、及び、少なくとも１つの追加の治療剤を含有する固体口腔用組成物）で投与される。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの追加の治療剤は、丸薬、錠剤、又はカプセルとして投与される。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの追加の治療剤は、徐放性経口製剤で投与される。

【0186】

いくつかの実施形態において、１つ以上の追加の治療剤を、少なくとも１つの抗体、抗原結合抗体断片、又は医薬組成物（例えば、本明細書に記載される抗体、抗原結合抗体断片、又は医薬組成物のいずれか）を投与する前、又は、投与した後に、対象に投与することができる。いくつかの実施形態において、１つ以上の追加の治療剤、及び、少なくとも１つの抗体、抗原結合抗体断片、又は医薬組成物（例えば、本明細書に記載される抗体、抗原結合抗体断片、又は医薬組成物のいずれか）は、対象内で、１つ以上の追加の治療剤の生物活性期間と、少なくとも１つの抗体又は抗原結合断片（例えば、本明細書に記載される抗体又は抗原結合断片のいずれか）の生物活性期間に、重なりが生じるように、対象に投与される。

【0187】

いくつかの実施形態において、長期間にわたり（例えば、少なくとも１週間、２週間、３週間、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、７ヶ月、８ヶ月、９ヶ月、１０ヶ月、１１ヶ月、１２ヶ月、１年、２年、３年、４年、又は５年の期間にわたり）、少なくとも１つの抗体、抗原結合抗体断片、又は医薬組成物（例えば、本明細書に記載する抗体、抗原結合抗体断片、又は医薬組成物のいずれか）を、対象に投与することができる。熟練した医療専門家は、治療の有効性を診断する、又は追跡する（例えば、癌の少なくとも１つの症状を観察する）ために、本明細書に記載の方法のいずれかを用いて治療期間の長さを決定することができる。本明細書に記載されるように、熟練した医療専門家はまた、対象に投与される抗体若しくは抗原結合抗体断片（及び／又は、１つ以上の追加の治療剤）の同一性及び数を変化させる（例えば、増加又は減少させる）ことができ、また、（例えば、本明細書に記載の、及び、当該技術分野において周知の方法のいずれかを用いる）治療の有効性の評価に基づき、対象への、少なくとも１つの抗体若しくは抗原結合抗体断片（及び／又は、１つ以上の追加の治療剤）の投与用量又は頻度を調整する（例えば、増加又は減少させる）ことができる。

【0188】

いくつかの実施形態において、１つ以上の追加の治療剤を、対象に投与することができる。追加の治療剤は、Ｂ－Ｒａｆの阻害剤、ＥＧＦＲ阻害剤、ＭＥＫの阻害剤、ＥＲＫの阻害剤、Ｋ－Ｒａｓの阻害剤、ｃ－Ｍｅｔの阻害剤、未分化リンパ腫キナーゼ（ＡＬＫ）の阻害剤、ホスファチジルイノシトール ３－キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）の阻害剤、Ａｋｔの阻害剤、ｍＴＯＲの阻害剤、二重ＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲ阻害剤、ブルトン型チロシンキナーゼ（ＢＴＫ）の阻害剤、並びに、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ１（ＩＤＨ１）及び／又はイソクエン酸デヒドロゲナーゼ２（ＩＤＨ２）の阻害剤からなる群から選択される１つ以上の阻害剤を含むことができる。いくつかの実施形態において、追加の治療剤は、インドールアミン ２，３－ジオキシゲナーゼ－１（ＩＤＯ１）の阻害剤（例えば、エパカドスタット）である。

【0189】

いくつかの実施形態において、追加の治療剤は、ＨＥＲ３の阻害剤、ＬＳＤ１の阻害剤、ＭＤＭ２の阻害剤、ＢＣＬ２の阻害剤、ＣＨＫ１の阻害剤、活性化ヘッジホッグシグナル伝達経路の阻害剤、及び、エストロゲン受容体を選択的に分解する薬剤からなる群から選択される１つ以上の阻害剤を含むことができる。

【0190】

いくつかの実施形態において、追加の治療剤は、トラベクテジン、ｎａｂ－パクリタキセル、トレバナニブ、パゾパニブ、セディラニブ、パルボシクリブ、エベロリムス、フルオロピリミジン、ＩＦＬ、レゴラフェニブ、レオリシン、アリムタ、ジカイダ、スーテント、テムシロリムス、アキシチニブ、エベロリムス、ソラフェニブ、ヴォトリエント、パゾパニブ、ＩＭＡ－９０１、ＡＧＳ－００３、カボザンチニブ、ビンフルニン、Ｈｓｐ９０阻害剤、Ａｄ－ＧＭ－ＣＳＦ、テモゾロミド、ＩＬ－２、ＩＦＮａ、ビンブラスチン、サロミド、ダカルバジン、シクロホスファミド、レナリドマイド、アザシチジン、レナリドマイド、ボルテゾミブ、アムルビシン、カルフィルゾミブ、プララトレキサート、及びエンザスタウリンからなる群から選択される１つ以上の治療剤を含むことができる。

【0191】

いくつかの実施形態において、追加の治療剤は、アジュバント、ＴＬＲアゴニスト、ＩＬ－１、ＨＭＧＢ１、ＩＬ－１０アンタゴニスト、ＩＬ－４アンタゴニスト、ＩＬ－６アンタゴニスト（例えば、ＩＬ－６受容体）、ＩＬ－１３アンタゴニスト、ＩＬ－１７アンタゴニスト、ＨＶＥＭアンタゴニスト、ＩＣＯＳアゴニスト、ＣＸ３ＣＬ１を標的とする治療、ＣＸＣＬ９を標的とする治療、ＣＸＣＬ１０を標的とする治療、ＣＣＬ５を標的とする治療、ＬＦＡ－１アゴニスト、ＩＣＡＭ１アゴニスト、及びセレクチンアゴニストからなる群から選択される１つ以上の治療剤を含むことができる。

【0192】

いくつかの実施形態において、カルボプラチン、ｎａｂ－パクリタキセル、パクリタキセル、シスプラチン、ペメトレキセド、ゲムシタビン、ＦＯＬＦＯＸ、又はＦＯＬＦＩＲＩが、対象に投与される。

【0193】

いくつかの実施形態において、追加の治療剤は、抗ＯＸ４０抗体、抗ＰＤ－１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、抗ＰＤ－Ｌ２抗体、抗ＬＡＧ－３抗体、抗ＴＩＧＩＴ抗体、抗ＢＴＬＡ抗体、抗ＣＴＬＡ－４抗体、抗ＧＩＴＲ抗体、抗ＴＩＭ－３抗体、又は抗ＣＤ４０抗体である。
医薬組成物及び投与経路
本明細書に記載される抗体又は抗原結合断片のいずれかの、１つ以上（例えば、１、２、３、又は４つ）が、任意の組み合わせで、医薬組成物に存在することができる。本明細書に記載される抗体又は抗原結合断片のいずれかの、２つ以上（例えば、２、３、又は４つ）が、任意の組み合わせで、医薬組成物に存在することができる。医薬組成物は、当該技術分野において周知の任意の様式で、製剤化することができる。

【0194】

医薬組成物は、その意図する投与経路（例えば、静脈内、動脈内、筋肉内、皮内、皮下、又は腹腔内）と適合性を有するように、製剤化される。組成物は、無菌希釈剤（例えば、無菌水若しくは生理食塩水）、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール又は他の合成溶剤、抗菌若しくは抗カビ剤（例えば、ベンジルアルコール若しくはメチルパラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなど）、酸化防止剤（アスコルビン酸若しくは亜硫酸水素ナトリウムなど）、キレート剤（エチレンジアミン四酢酸など）、緩衝剤（アセテート、シトレート、若しくはホスフェートなど）、及び、等張剤（例えば、糖類（例えば、デキストロース）、ポリアルコール（例えば、マンニトール若しくはソルビトール）、若しくは塩類（例えば、塩化ナトリウム））、又はこれらの任意の組み合わせを含むことができる。リポソーム懸濁液もまた、薬学的に許容される担体として使用可能である。組成物の調製物は、アンプル、使い捨てシリンジ、又は複数回投与用バイアルに製剤化し、封入することができる。必要な場合（例えば、注射可能な製剤におけるように）、適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング、又は界面活性剤を用いることにより、維持することができる。吸収を遅らせる剤（例えば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチン）を含めることにより、抗体又はその抗原結合断片の吸収を長くすることができる。あるいは、徐放は、インプラント及びマイクロカプセル化デリバリーシステムによって達成することができ、これらとしては、生分解性・生体適合性ポリマー（例えば、エチレンビニルアセテート、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、及びポリ乳酸）を挙げることができる。

【0195】

本明細書に記載される抗体又は抗原結合断片のいずれかの１つ以上を含有する組成物は、単位剤形（即ち、投与を容易にし、用量を均一にするための、所定量の活性化合物を含有する、物理的に別個の単位）で、非経口（例えば、静脈内、動脈内、筋肉内、皮内、皮下、又は腹腔内）投与のために製剤化することができる。

【0196】

非経口投与のための医薬組成物は、好ましくは滅菌されており、実質的に等張性であり、グッドマニュファクチャリングプラクティス（ＧＭＰ）条件の下で製造される。医薬組成物は、単位剤形（即ち、単回投与のための用量）で提供され得る。医薬組成物は、１つ以上の生理学的に許容される担体、希釈物質、賦形剤、又は補助剤を使用して製剤化することができる。製剤化は、選ばれた投与経路に依存する。注射のために、抗体は、水溶液中で、好ましくは、生理学的に適合性の緩衝液中で製剤化し、注射部位における不快感を軽減することができる。溶液は、懸濁化剤、安定化剤、及び／又は分散剤などの配合剤を含有することができる。あるいは、抗体は、使用前に、好適なビヒクル、例えば、無菌のパイロジェンフリーの水と共に構築するための、凍結乾燥形態であることができる。

【0197】

組成物の毒性及び治療効果は、細胞培養液又は実験用動物（例えば、サル）における、標準的な薬学的手順により決定することができる。例えば、ＬＤ５０（集団の５０％に対して致死性の用量）、及び、ＥＤ５０（集団の５０％において治療に有効な用量）を決定することができ、治療指数は、ＬＤ５０：ＥＤ５０の比率である。高い治療指数を示す薬剤が好ましい。薬剤が、望ましくない副作用を示す場合、損害の可能性を最低限に抑える（即ち、望ましくない副作用を軽減する）ためのケアを取る必要がある。毒性及び治療効果は、他の標準的な薬学的手順により決定することができる。

【0198】

細胞培養アッセイ及び動物研究から入手したデータを、対象（例えば、ヒト）で用いるための、任意の所与の剤の適切な用量の製剤化において使用することができる。治療に有効な量の、１つ以上の（例えば、１、２、３、又は４つ）の抗体又はその抗原結合断片（例えば、本明細書に記載される抗体又は抗体断片のいずれか）は、対象（例えば、癌を有すると同定されたヒト対象）、又は、疾患を発症するリスクがあると同定された対象（例えば、以前に癌を発症したが、現在は治癒している対象）において、対象の疾患を治療する（例えば、癌細胞を殺傷する）量、対象（例えば、ヒト）における、疾患の１つ以上の症状の重症度、頻度、及び／又は持続時間を低減する量である。本明細書に記載される抗体又は抗原結合断片のいずれかの有効性及び投与は、当該技術分野において周知の方法を使用して、健康管理の専門家又は獣医学の専門家により、加えて、対象（例えば、ヒト）における疾患の１つ以上の症状を観察することにより、決定することができる。ある特定の因子は、対象を効果的に治療するのに必要な用量及びタイミング（例えば、疾患又は障害の重症度、以前の治療、対象の総体的な健康及び／又は年齢、並びに、他の疾患の存在）に影響を及ぼし得る。

【0199】

例示的な用量としては、対象の体重１キログラム当たりの、本明細書に記載される抗体又は抗原結合断片のいずれかの量（ミリグラム又はマイクログラム）（例えば、約１μｇ／ｋｇ～約５００ｍｇ／ｋｇ、約１００μｇ／ｋｇ～約５００ｍｇ／ｋｇ、約１００μｇ／ｋｇ～約５０ｍｇ／ｋｇ、約１０μｇ／ｋｇ～約５ｍｇ／ｋｇ、約１０μｇ／ｋｇ～約０．５ｍｇ／ｋｇ、約１μｇ／ｋｇ～約５０μｇ／ｋｇ、約０．３ｍｇ／ｋｇ～約２５ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、又は、約１ｍｇ／ｋｇ～約５ｍｇ／ｋｇ）が挙げられる。これらの用量は広範囲をカバーしているものの、抗体及びその抗原結合断片を含む治療剤は、これらの効能、及び有効量を、当該技術分野において周知の方法により決定することができることを、当業者は理解するであろう。典型的には、比較的低用量をまず投与し、担当の健康管理の専門家若しくは獣医学の専門家（治療用途の場合）、又は、研究者（依然として開発段階で働いている場合）が続けて、及び徐々に、適切な応答が得られるまで、用量を増大させることができる。加えて、任意の特定の対象に対する、具体的な用量レベルは、用いる具体的な化合物の活性、対象の年齢、体重、総体的な健康、性別、及び食事、投与時間、投与経路、排泄速度、並びに、インビボでの抗体又は抗体断片の半減期を含む様々な因子に依存すると理解されている。

【0200】

医薬組成物は、容器、パック、又はディスペンサーに、投与用の取扱説明書と共に含めることができる。本開示は、本明細書に記載される様々な用途のための、抗体又はその抗原結合断片の製造方法もまた提供する。
実施例
本発明を以下の実施例で更に説明し、これらは、特許請求の範囲に記載する本発明の範囲を限定するものではない。

実施例１．抗ｈＴＮＦＲ２抗体の生成
ヒトＴＮＦＲ２（ＴＮＦＲ２、配列番号１）に対する抗体を生成するために、ＲｅｎＭａｂマウスに、ヒトＴＮＦＲ２を免疫付与した。後述の方法により、抗ＴＮＦＲ２抗体を製造した。

【0201】

ＲｅｎＭａｂマウスは、ヒト化重鎖免疫グロブリン座位、及び、ヒト化κ鎖免疫グロブリン座位の両方を有する。重鎖免疫グロブリン座位とは、抗体の重鎖に対する遺伝子を含有する、染色体上の領域である。座位は、ＩＧＨＶ（可変）、ＩＧＨＤ（多様性）、ＩＧＨＪ（結合）、及び重鎖定常ドメイン遺伝子を含む。κ鎖免疫グロブリン座位とは、抗体の軽鎖（κ鎖）をコードする遺伝子を含有する、染色体上の領域である。κ鎖免疫グロブリン座位は、ＩＧＫＶ（可変）、ＩＧＫＪ（結合）、及び軽鎖定常ドメイン遺伝子を含む。ＲｅｎＭａｂマウスに関する詳細な説明は、ＰＣＴ／ＣＮ２０２０／０７５６９８に見出すことができ、その全体が本明細書に参照により組み込まれている。
マウスの免疫付与
ＲｅｎＭａｂマウスに、Ｆｃタグ化ヒトＴＮＦＲ２タンパク質を免疫付与した（Ｆｃ融合タンパク質は、配列番号１の位置２３ａａ～２５７ａａに、ヒトＴＮＦＲ２細胞外ドメインを含有する）。Ｆｃタグ化ヒトＴＮＦＲ２タンパク質をアジュバントで乳化し、マウスの背中の４箇所に注射した。最初の皮下（ｓ．ｃ．）注射のために、希釈した抗原を、等体積の完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）で乳化した。その後の皮下注射では、タンパク質を、等体積の不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）で乳化した。少なくとも４回の注射を、注射２回毎に少なくとも１４日の間隔で実施した。３回目の注射、又はブースター免疫付与の７日後に、血液（血清）を収集し、蛍光励起細胞分取（ＦＡＣＳ）を用いて、抗体力価を分析した。

【0202】

別の実験では、ヒトＴＮＦＲ２をコードする発現プラスミドをマウスに注射することにより、マウスを数匹免疫付与した。抗原をコードするプラスミドを、前脛骨筋に注射した（筋肉注射、ｉ．ｍ．注射）。少なくとも４回の注射を、注射２回毎に少なくとも１４日の間隔で実施した。最後の免疫付与の７日後に血液（血清）を収集し、ＥＬＩＳＡにより、血清の抗体力価を試験した。

【0203】

免疫付与の、少なくとも１４日後に、（プラスミドを注射する、又は、タンパク質を注射するいずれかにより）免疫付与を向上させる手順を実施した。表面にＴＮＦＲ２抗原を発現するＣＨＯ細胞を、尾静脈を通してマウスに静脈内注射した。注射の４日後に、免疫系臓器（例えば、骨髄、リンパ節、脾臓など）を収集した。

【0204】

脾臓細胞を収集し、マウス骨髄腫細胞と融合させて、生存能を維持しながらハイブリドーマ細胞株を形成した。ハイブリドーマ細胞をスクリーニングし、選択して、ＴＮＦＲ２特異的抗体を産生した細胞株を同定した。本技術、及び、前述の免疫原を用いて、いくつかの抗ＴＮＦＲ２キメラ抗体（即ち、ヒト可変ドメインとマウス定常ドメインを有する抗体）を入手した。具体的には、刺激免疫付与の後、マウスの免疫臓器を回収し、磁気ビーズにより形質細胞を分離した。ハイブリドーマ融合技術を用いて、抗原特異的モノクローナル抗体を分泌するモノクローナルハイブリドーマ細胞を選別して除外した。選択したモノクローナルハイブリドーマ細胞での逆転写及びＰＣＲ配列決定により、抗体の軽鎖及び重鎖Ｖ領域配列を入手した。抗体の軽鎖及び重鎖Ｖ領域配列を、抗体発現ベクター内で構築し、Ｅｘｐｉ ＣＨＯ－ＳＴＭ ＣＥＬＬ発現系により検証した。細胞を２４ウェル系にトランスフェクトし、血清中で、３日目に、抗体を収集した。ＦＡＣＳを用いて、抗体とＴＮＦＲ２との間での結合の特異性を検証した。本技術を用いて、いくつかの抗ＴＮＦＲ２キメラ抗体（即ち、ヒト可変ドメインとマウス定常ドメインを有する抗体）を入手した。これらの抗体の定常ドメインを、容易に置き換えて、完全ヒト抗ＴＮＦＲ２抗体（抗ｈＴＮＦＲ２抗体）を得ることができる。本方法により入手される例示的な完全ヒト抗体は、以下の通りに名前が付けられる：１４－１Ｂ３－ｈＨｖＫｖ（「１４－１Ｂ３」又は「１Ｂ３」）、及び、１４－４Ａ９－ｈＨｖＫｖ（「１４－４Ａ９」又は「４Ａ９」）。一例として、抗体ＶＨ＼ＶＬが、ＩｇＧ１亜型などの、異なる亜型に接続する場合、１４－４Ａ９－ｈＨｖＫｖを用いて、抗体は、１４－４Ａ９－ｈＨｖＫｖ－ＩｇＧ１と名付けられる。

【0205】

抗原陽性Ｂ細胞をまた、骨髄腫細胞との融合を行うことなく、免疫付与したマウスから直接単離した。抗ＴＮＦＲ２抗体を更に、抗原陽性Ｂ細胞から単離した。抗体の軽鎖及び重鎖Ｖ領域配列を、抗原陽性Ｂ細胞から直接単離した。例えば、シングルセル技術（例えば、Ｂｅａｃｏｎ（登録商標） Ｏｐｔｏｆｌｕｉｄｉｃ Ｓｙｓｔｅｍ、Ｂｅｒｋｅｌｅｙ Ｌｉｇｈｔｓ Ｉｎｃ．）を使用して、抗原特異的モノクローナル抗体を分泌する形質細胞をスクリーニングし、発見した。逆転写及びＰＣＲ配列決定を用いて、抗体Ｖ領域配列を入手した。抗体が発現された。ＦＡＣＳを用いて、抗体とＴＮＦＲ２との間での結合を検証した。本方法により入手した例示的抗体としては、ＢＣ－１Ａ８（「１Ａ８」）、ＢＣ－１Ｂ６（「１Ｂ６」）、ＢＣ－１Ｃ３（「１Ｃ３」）、ＢＣ－１Ｆ４（「１Ｆ４」）、ＢＣ－１Ｆ１０（「１Ｆ１０」）、ＢＣ－３Ｂ７（「３Ｂ７」）が挙げられる。ＢＣ－１Ｆ４を例に取ると、抗体ＶＨ＼ＶＬが、ＩｇＧ１亜型などの、異なる亜型に接続する場合、抗体は、ＢＣ－１Ｆ４－ＩｇＧ１と名付けられる。他の亜型の例は、以下の通りである：ＢＣ－１Ｆ４－ＩｇＧ１－ＳＩ、ＢＣ－１Ｆ４－ＩｇＧ１－ＬＡＬＡ。

【0206】

１Ａ８に対する、重鎖及び軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３アミノ酸配列を、配列番号６～１１（Ｋａｂａｔの付番）、又は、配列番号４２～４７（Ｃｈｏｔｈｉａの付番）に示した。抗体のヒト重鎖可変領域及びヒト軽鎖可変領域を、配列番号３６又は配列番号３７に示した。

【0207】

１Ｂ６に対する、重鎖及び軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３アミノ酸配列を、配列番号１２～１７（Ｋａｂａｔの付番）、又は、配列番号４８～５３（Ｃｈｏｔｈｉａの付番）に示した。抗体のヒト重鎖可変領域及びヒト軽鎖可変領域を、配列番号３８又は配列番号３９に示した。

【0208】

１Ｃ３に対する、重鎖及び軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３アミノ酸配列を、配列番号１８～２３（Ｋａｂａｔの付番）、又は、配列番号５４～５９（Ｃｈｏｔｈｉａの付番）に示した。抗体のヒト重鎖可変領域及びヒト軽鎖可変領域を、配列番号４０又は配列番号４１に示した。

【0209】

１Ｆ４に対する、重鎖及び軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３アミノ酸配列を、配列番号２４～２９（Ｋａｂａｔの付番）、又は、配列番号６０～６５（Ｃｈｏｔｈｉａの付番）に示した。抗体のヒト重鎖可変領域及びヒト軽鎖可変領域を、配列番号７２又は配列番号７３に示した。

【0210】

１Ｆ１０に対する、重鎖及び軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３アミノ酸配列を、配列番号３０～３５（Ｋａｂａｔの付番）、又は、配列番号６６～７１（Ｃｈｏｔｈｉａの付番）に示した。抗体のヒト重鎖可変領域及びヒト軽鎖可変領域を、配列番号７４又は配列番号７５に示した。
抗体の調製
配列検証ステージの陽性抗体配列を、プラスミド抽出に供し、２５ｍＬの系にトランスフェクトした。細胞培養の１０～１２日後に、発現上清を収集し、親和性クロマトグラフィーに供した。入手した抗体試料を、インビトロ試験及びスクリーニングで用いた。

実施例２．抗ＴＮＦＲ２抗体のインビトロ試験
ヒトＴＮＦＲ２とＴＮＦαとの結合の遮断
遮断アッセイを実施して、抗ＴＮＦＲ２抗体が、ＴＮＦＲ２と、そのリガンドであるｈＴＮＦαとの結合を遮断することができるか否かを判定した。

【0211】

具体的には、ヒトＴＮＦ受容体２（ＴＮＦＲ２）を一過的にトランスフェクトした、３０μＬのＣＨＯ細胞（１×１０^５ｃｅｌｌ）を、プレートの各ウェルに添加した。精製した抗体を、１０、２．５、０．６２５、０．１５６５、０．０３９μｇ／ｍＬの終濃度まで滴定した。滴定した抗体を、４℃で、ウェル当たり３０μＬにて各ウェルに添加し、３０分間インキュベートした。

【0212】

３０μＬのビオチン－ｈＴＮＦα（Ａｃｒｏ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号：ＴＮＡ－Ｈ８２Ｅ１）を、（各ウェル０．５μｇ／ｍＬの終濃度で）各ウェルに添加した。ビオチン－ｈＴＮＦαを含む細胞と抗体を、４℃で３０分間インキュベートした。

【0213】

リン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄した後、５０μＬの、ＰＥ標識及び抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ抗体（ＰＥ抗ヒトＩｇＧ、Ｒｃ、Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号：１０９－１１５－０９８）の１：１００の希釈液、及び、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標） ６４７標識ストレプトアビジン（ＡＦ６４７ストレプトアビジン、Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ カタログ番号：０１６－６００－０８４）の１：５００の希釈液を各ウェルに添加し、１５分間４℃でインキュベートした後、ＰＢＳで洗浄した。ＡＦ６４７及びＰＥに対するシグナルを、フローサイトメトリー（Ｔｈｅｒｍｏ Ａｔｔｕｎｅ ＮＸ）により判定した。

【0214】

以下の表１は、フローサイトメトリー分析において、ストレプトアビジンシグナルを有した試験細胞の割合を示す。抗体濃度が低下する一方で、ストレプトアビジンシグナルを有する試験細胞（ＡＦ６４７）の割合が増加する場合、抗体は、遮断親和性を有する（強力な結合親和性を示す）。データに基づくと、ＢＣ－１Ａ８－ＩｇＧ１、ＢＣ－１Ｆ４－ＩｇＧ１、ＢＣ－３Ｂ７－ＩｇＧ１、及びＢＣ－１Ｆ１０－ＩｇＧ１は、強力な遮断効果を有した。しかし、ＢＣ－１Ｂ６－ＩｇＧ１、ＢＣ－１Ｃ３－ＩｇＧ１、１４－１Ｂ３－ｈＨｖＫｖ－ＩｇＧ１、及び１４－４Ａ９－ｈＨｖＫｖ－ＩｇＧ１は、ＴＮＦＲ２とＴＮＦαの間の結合を、効果的に遮断することができない。

【表1】

【0215】

抗ＴＮＦＲ２抗体の、ヒトＴＮＦＲ２及びＴＮＦＲ１に対する結合親和性
予め不動化されたプロテインＡセンサチップを装着した、Ｂｉａｃｏｒｅ（Ｂｉａｃｏｒｅ、ＩＮＣ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ ＮＪ）８Ｋバイオセンサーを用いる表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を使用して、抗ＴＮＦＲ２抗体の、ヒトＴＮＦＲ２及びＴＮＦＲ１（腫瘍壊死因子受容体１）への結合親和性を測定した。

【0216】

精製した抗ＴＮＦＲ２抗体を１μｇ／ｍＬまで希釈し、その後、約５０秒間、１０μＬ／分で、Ｂｉａｃｏｒｅ ８Ｋバイオセンサーに注入して、所望のタンパク質密度（例えば、約５０応答単位（ＲＵ））を達成した。続いて、２００、１００、５０、２５、６．２５、又は１．５６ｎＭの濃度で、Ｈｉｓタグ化ヒトＴＮＦＲ１（ヒトＴＮＦＲ１／ＣＤ１２０ａ／ＴＮＦＲＳＦ１Ａタンパク質、Ｈｉｓタグ、Ｂｅｉｊｉｎｇ Ａｃｒｏｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＣＯ．ＬＴＤ．，カタログ番号：ＴＮ１－５２２２）、又は、ＴＮＦＲ２（Ｈｕｍａｎ ＴＮＦＲ２／ＣＤ１２０ｂ／ＴＮＦＲＳＦ１Ｂタンパク質、Ｈｉｓタグ、Ｂｅｉｊｉｎｇ Ａｃｒｏｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＣＯ．ＬＴＤ．，カタログ番号：ＴＮ２－５２２７）を、１２０秒間、３０μＬ／分で注入した。解離を６００秒間モニタリングした。各滴定液の最後の注入の後に、チップをグリシンで再生した（ｐＨ２．０、３０μＬ／分で３０秒間）。

【0217】

Ｂｉａｃｏｒｅ ８Ｋ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア３．０を用いて、データ全体を、１：１のラングミュア結合モデル（Ｋａｒｌｓｓｏｎ，Ｒ．Ｒｏｏｓ，Ｈ．Ｆａｇｅｒｓｔａｍ，Ｌ．Ｐｅｔｅｒｓｓｏｎ，Ｂ．，１９９４．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ６．９９－１１０）に適合させることにより、運動会合速度（ｋｏｎ）及び解離速度（ｋｏｆｆ）を同時に入手した。親和性を、運動速度定数の商から推定した（ＫＤ＝ｋｏｆｆ／ｋｏｎ）。

【0218】

当業者が理解するように、パラメーター（例えば、抗体濃度）を適切に調整した同じ方法を、各試験抗体に対して実施した。試験抗体に対する結果を、以下の表２にまとめる。

【表2】

【0219】

結果は、これらのヒト抗体が、ヒトＴＮＦＲ２に対して非常に高い結合親和性を有することを示している。８つの抗体（ＢＣ－１Ａ８－ＩｇＧ１、ＢＣ－１Ｂ６－ＩｇＧ１、ＢＣ－１Ｃ３－ＩｇＧ１、ＢＣ－１Ｆ４－ＩｇＧ１、ＢＣ－１Ｆ１０－ＩｇＧ１、１４－１Ｂ３－ｈＨｖＫｖ－ＩｇＧ１、及び１４－４Ａ９－ｈＨｖＫｖ－ＩｇＧ１）のいずれもが、ＴＮＦＲ１に結合できない。
抗ＴＮＦＲ２抗体の、サルＴＮＦＲ２に対する結合親和性
上述の結合親和性実験と同様に、抗ＴＮＦＲ２抗体ＢＣ－１Ｂ６－ＩｇＧ１、ＢＣ－１Ｃ３－ＩｇＧ１、及びＢＣ－１Ｆ４－ＩｇＧ１の、Ｈｉｓタグ化サル（カニクイザル）のＴＮＦＲ２（ｆＴＮＦＲ２－Ｈｉｓ、Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、カタログ番号：９０１０２－Ｃ０８Ｈ）に対する結合親和性を測定した。結果を以下の表３にまとめ、本表は、３つの抗ＴＮＦＲ２抗体全てが、良好な結合親和性でサルＴＮＦＲ２に結合できることを示している。

【表3】

【0220】

マウス、イヌ科動物、及びサルＴＮＦＲ２に対する抗ＴＮＦＲ２抗体の交差反応性
各実験において、ＣＨＯ細胞に、ＥＧＦＰ及びヒトＴＮＦＲ２（ＴＮＦＲ２、配列番号１）、マウスＴＮＦＲ２（ｍＴＮＦＲ２、配列番号２）、ｆＴＮＦＲ２、又はイヌ（イヌ科動物）ＴＮＦＲ２（ｄＴＮＦＲ２、配列番号４）をトランスフェクトした。

【0221】

３０μＬのＣＨＯ細胞（１×１０^５ｃｅｌｌ）を、各ウェルに添加した。３０μＬの、精製した抗ＴＮＦＲ２抗体（１０μｇ／ｍＬ）（表４に列挙する通り）を各ウェルに添加し、４℃で３０分間インキュベートした。

【0222】

ＰＢＳ（１６００ｒｍｐ、６分）で２回洗浄した後、５０μＬの、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒで標識した抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ抗体（ＢＣ－１Ａ８－ＩｇＧ１、ＢＣ－１Ｂ６－ＩｇＧ１、ＢＣ－１Ｃ３－ＩｇＧ１、ＢＣ－１Ｆ４－ＩｇＧ１、ＢＣ－１Ｆ１０－ＩｇＧ、ＢＣ－３Ｂ７－ＩｇＧ１、１４－１Ｂ３－ｈＨｖＫｖ－ＩｇＧ１、１４－４Ａ９－ｈＨｖＫｖ－ＩｇＧ１）を、各ウェルに、１：５００に希釈して添加し、４℃で１５分間インキュベートした後、ＰＢＳで洗浄した（１２００ｒｍｐ、５分）。ＡＦ６４７に対するシグナルを、フローサイトメトリーにより検出した。

【0223】

試験抗体の、ヒト（ＴＮＦＲ２）、マウス（ｍＴＮＦＲ２）、サル（ｆＴＮＦＲ２）、及びイヌ（ｄＴＮＦＲ２）ＴＮＦＲ２との交差反応性を、下表にまとめる。

【表4】

【0224】

精製抗ｈＴＮＦＲ２抗体のエピトープ相関分析
一対の、精製抗ＴＮＦＲ２モノクローナル抗体間での標的タンパク質エピトープの相対位置を、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）競合実験により分析した。合計で５つのモノクローナル抗体を用いて、各抗体の、別の抗体：ＢＣ－１Ａ８－ＩｇＧ１、ＢＣ－１Ｆ４－ＩｇＧ１、ＢＣ－３Ｂ７－ＩｇＧ１、ＢＣ－１Ｃ３－ＩｇＧ１、及びＢＣ－１Ｆ１０－ＩｇＧ１での、結合阻害（遮断）効果を研究した。ＨＢＳ－ＥＰ＋緩衝液（１０ｍＭの、４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、及び０．０５％のＰ２０（ｐＨ７．４））を、実験を通してランニング緩衝液として用いた。抗Ｈｉｓ抗体を、アミノ基カップリングにより、シリーズＳセンサチップＣＭ５の表面で固定し、抗Ｈｉｓチップ（即ち、ＣＭ５－抗－Ｈｉｓ－チャネル１，８－チップ）を生成した。次に、１Ｍのエタノールアミン（ｐＨ８．５）を注入して、チップ表面の、残りの活性なカルボキシル基を遮断し、その後、ＨＢＳ－ＥＰ＋緩衝液を用いて２時間平衡させた。Ｈｉｓタグとの組み換えヒトＴＮＦＲ２タンパク質（１μｇ／ｍＬ）を、１０μＬ／分で５０秒間、Ｂｉａｃｏｒｅ ８Ｋバイオセンサーに注入し、抗Ｈｉｓチップ上で捕捉して、所望のタンパク質密度（即ち、２００ＲＵ）を達成した。一対の抗体（それぞれ、２００ｎＭ）を続けて、チップに３０μＬ／分で注入した。注入した第１の抗体（検体１）は、２５０秒の結合時間を有し、続いて、第２の抗体（検体２）を、２５０秒の結合時間で注入した。各分析サイクルで抗体を注入した後、グリシン緩衝液で、チップを２回再生した（ｐＨ１．７、３０秒間、３０μＬ／分）。各モノクローナル抗体が別の抗体と対形成したときに、各対のモノクローナル抗体を、同じ実験ステップに通して、結合阻害データを入手した。

【0225】

各抗体の結合値を、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｉｎｓｉｇｈｔ評価ソフトウェアを用いて入手した。ある抗体の、別の抗体への結合の干渉を定量するために、結合比率を計算し、各対の抗体を比較した。第１の抗体（検体１）の結合値で除した、第２の抗体（検体２）の結合値により、結合比率を定義する。統計ソフトウェアを、クラスター分析のためにもまた用いた。エピトープ相関を分析し、５つの抗ｈＴＮＦＲ２抗体を、４つのエピトープクラスターに分類した（図８）。まとめると、１Ａ８及び１Ｆ４は、同一の、又は重なり合うエピトープを共有した。３Ｂ７、１Ｃ３、及びＦ１０は、他の抗体と、エピトープ相関を示さない。

【0226】

ＴＮＦＲ２は、４つのシステインリッチドメイン（ＣＲＤ）を有する。別の実験では、ＦＡＣＳを用いて、抗ｈＴＮＦＲ２抗体の、異なる構造ドメインを有するＴＮＦＲ２タンパク質への結合を検出した。二次抗体（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標） ６４７ ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｆ（ａｂ’）２断片ヤギ抗ヒトＩｇＧ、Ｆｃγ断片特異的、Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．、カタログ番号：１５１５２４）を使用した。蛍光標識した二次抗体は、抗ｈＴＮＦＲ２抗体のＦｃ領域に結合することができることで、ΔＣＲＤ細胞に結合した抗ｈＴＮＦＲ２抗体が、ＦＡＣＳにより検出することが可能となる。具体的には、ΔＣＲＤ１－ＴＮＦＲ２タンパク質（ＣＲＤ１が欠失）、ΔＣＲＤ２－ＴＮＦＲ２タンパク質（ＣＲＤ２が欠失）、ΔＣＲＤ３－ＴＮＦＲ２タンパク質（ＣＲＤ３が欠失）、又はΔＣＲＤ４－ＴＮＦＲ２タンパク質（ＣＲＤ４が欠失）が、それぞれＣＨＯ－Ｓ細胞で発現し、その後、細胞と、異なる抗ｈＴＮＦＲ２抗体の間での結合が検出された。ＴＮＦＲ２タンパク質を配列番号１に示し、ＣＲＤ１は、配列の３９ａａ～７６ａａであり、ＣＲＤ２は、配列の７７ａａ～１１８ａａであり、ＣＲＤ３は、配列の１１９ａａ～１６２ａａであり、ＣＲＤ４は、配列の１６８ａａ～１９６ａａである。フローサイトメトリー実験の結果を、以下の表５に示す。

【0227】

１Ａ８及び１Ｆ４は、ＣＲＤ３を欠くＴＮＦＲ２には結合せず、ＣＲＤ４を欠くＴＮＦＲ２への結合陽性率もまた著しく低下したことを、結果は示しており、これらは、１Ａ８及び１Ｆ４が、ヒトＴＮＦＲ２に対する同様の結合エピトープを有し、エピトープは、ＣＲＤ３（クラスＩエピトープ）に位置する可能性が高いことを示している。１Ｂ６及び１Ｃ３は、ＣＲＤ３又はＣＲＤ４を欠くＴＮＦＲ２に結合せず、これは、１Ｂ６及び１Ｃ３は、ヒトＴＮＦＲ２への同様の結合エピトープを有し、エピトープはＣＲＤ３及びＣＲＤ４（クラスＩＩＩエピトープ）の接合部に位置する可能性が高いことを示している。１Ｆ１０と、ＣＲＤ３又はＣＲＤ４を欠くＴＮＦＲ２との結合の陽性率は著しく低下し、これは、１Ｆ１０に対する結合エピトープは、クラスＩエピトープ及びクラスＩＩＩエピトープとは異なる（クラスＩＶエピトープ属する）ことを示している。結果は、ＳＰＲエピトープの特性決定と一致していた。

【表5】

【0228】

インビトロでのＡＤＣＣ検出実験
実験を行い、抗ＴＮＦＲ２抗体のＡＤＣＣ効果を評価した。本実験では、ＢＣ－１Ａ８－ＩｇＧ１、ＢＣ－１Ｃ３－ＩｇＧ１、ＢＣ－１Ｆ４－ＩｇＧ１、ＢＣ－１Ｆ１０－ＩｇＧ１、ＢＣ－１Ｂ６－ＩｇＧ１、及び、アイソタイプコントロールのヒトＩｇＧ１（Ｃｒｏｗｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｉｎｃ．、Ｃ０００１－３）を使用した。

【0229】

乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）とは、多くの異なる細胞型で見出される細胞質酵素であり、原形質膜の負傷後、細胞培養培地に放出される。ＣｙＱＵＡＮＴ ＬＤＨ細胞傷害性検出キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号：Ｃ２０３０１）を使用して、細胞外ＬＤＨを正確かつ定量的に測定し、抗体のＡＤＣＣ効果を評価した。

【0230】

抗ＴＮＦＲ２抗体を、最大濃度１００μｇ／ｍＬで、連続希釈（１０倍）した。標的細胞（ヒトＴＮＦＲ２を過剰発現するＭＣ３８細胞）を、９６ウェルプレート（細胞密度２×１０^４ｃｅｌｌ／ウェル、１００μＬ）で播種し、３７℃で３～４時間インキュベートした。エフェクター細胞（末梢血単核球（ＰＢＭＣ））を蘇生した（細胞密度２×１０^４ｃｅｌｌ／ウェル）。同体積（１００μＬ）のエフェクター細胞を、１０μＬの抗体と共に、９６ウェルプレートの各ウェルに添加した。上記９６ウェルプレートを、３７℃で一晩インキュベートした。４９０ｎｍ及び６８０ｎｍの吸光度値を、マイクロプレートリーダーにより検出し、これを使用し、各群の抗体による、標的細胞の殺傷（細胞毒性％）を計算した。抗体濃度を横軸として、及び、細胞毒性を縦軸として用いる非線形適合を用いて、ＥＣ５０値を計算した。

【0231】

【数2】

【0232】

上記式では、実験とは、実験区の吸光度の値を意味し、エフェクターとは、エフェクター細胞の吸光度の値を意味する。標的とは、標的細胞の吸光度の値を意味する。自然放出量とは、細胞培養培地の自己蛍光の吸光度の値を意味する。標的最大値とは、標的細胞の吸光度の最大値を意味する。自然放出量＊とは、細胞培養培地体積対照ウェルの吸光度の値を意味する。

【0233】

ＥＣ５０の結果を、表６に示す。アイソタイプコントロールのｈＩｇＧ１と比較して、抗ＴＮＦＲ２抗体（ＢＣ－１Ａ８－ＩｇＧ１、ＢＣ－１Ｃ３－ＩｇＧ１、ＢＣ－１Ｆ４－ＩｇＧ１、ＢＣ－１Ｆ１０－ＩｇＧ１、又はＢＣ－１Ｂ６－ＩｇＧ１）による標的細胞の殺傷（細胞毒性％）は、これらの抗体の用量が増加するにつれ増大し、これは、ＢＣ－１Ａ８－ＩｇＧ１、ＢＣ－１Ｃ３－ＩｇＧ１、ＢＣ－１Ｆ４－ＩｇＧ１、ＢＣ－１Ｆ１０－ＩｇＧ１、及びＢＣ－１Ｂ６－ＩｇＧ１が全て、ＡＤＣＣ活性を有することを示している。

【表6】

【0234】

別の同様の実験では、標的細胞（ヒトＴＮＦＲ２を過剰発現するＭＣ３８細胞）、及び、エフェクター細胞（ＦｃＲ－ＴＡＮＫ（ＣＤ１６ａ－１５８Ｖ）細胞株、ＩｍｍｕｎｅＯｎｃｏ Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（Ｓｈａｎｇｈａｉ）Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）の、抗ＴＮＦＲ２抗体（ＢＣ－１Ｃ３－ＩｇＧ１、ＢＣ－１Ｃ３－ＩｇＧ１－ＳＩ、及びＢＣ－１Ｃ３－ＩｇＧ１－ＬＡＬＡ）のＡＤＣＣ効果を評価した。

【0235】

細胞毒性データを図９に示す。ＥＣ５０の結果を、表７に示す。アイソタイプコントロールのｈＩｇＧ１と比較して、抗ｈＴＮＦＲ２抗体（ＢＣ－１Ｃ３－ＩｇＧ１及びＢＣ－１Ｃ３－ＩｇＧ１－ＳＩ）による、標的細胞の殺傷（細胞毒性％）は、これらの抗体の用量が増加するにつれ増大し、これは、ＢＣ－１Ｃ３－ＩｇＧ１－ＳＩが全て、より強力なＡＤＣＣ活性を有することを示している。

【表7】

【0236】

実施例３．抗ｈＴＮＦＲ２抗体のインビボ試験
インビボで抗体を試験し、ヒトにおける、これらの抗体の効果を予測するために、ヒト化ＴＮＦＲ２マウスモデルを生成した。ヒト化ＴＮＦＲ２マウスモデルを組み換え、キメラＴＮＦＲ２タンパク質（配列番号５）を発現させ、ここで、マウスＴＮＦＲ２タンパク質の細胞外領域は、対応するヒトＴＮＦＲ２細胞外領域で置き換えた。マウスＴＮＦＲ２（配列番号２）のアミノ酸残基３３～２６０を、ヒトＴＮＦＲ２（配列番号１）のアミノ酸残基３３～２５９で置き換えた。

【0237】

ヒト化ＴＮＦＲ２マウスモデル（例えば、Ｂ－ＴＮＦＲ２マウス）は、ヒト、及び、マウスＴＮＦＲ２を発現する通常のマウスにおける臨床的転帰の差を著しく下げることにより、臨床設定において、新規の治療的処置を試験するための新規のツールをもたらす。ヒト化ＴＮＦＲ２マウスモデルに関する詳細の説明は、ＰＣＴ／ＣＮ２０２０／１１３６１８に見出すことができ、その全体が本明細書に参照により組み込まれている。

【0238】

抗ｈＴＮＦＲ２抗体を、ＴＮＦＲ２ヒト化マウス（Ｂ－ＴＮＦＲ２）で試験し、インビボでの腫瘍増殖におけるこれらの効果を実証した。
ＭＣ３８を含むＢ－ＴＮＦＲ２、１０ｍｇ／ｋｇのインビボ有効性
ＭＣ－３８腫瘍細胞（結腸腺癌細胞）を、Ｂ－ＴＮＦＲ２マウスに皮下注射した。マウスでの腫瘍体積が、１００ｍｍ^３～１５０ｍｍ^３に達したら、腫瘍体積に基づき、マウスをランダムに異なる群に分けた（各群にマウス６匹）。

【0239】

次に、マウスに、対照としてのＰＢＳ（Ｇ１）、抗ｈＴＮＦＲ２抗体ＢＣ－１Ｆ４－ＩｇＧ１（Ｇ２）、ＢＣ－３Ｂ７－ＩｇＧ１（Ｇ３）、ＢＣ－１Ｆ１０－ＩｇＧ（Ｇ４）、１４－１Ｂ３－ｈＨｖＫｖ－ＩｇＧ１（Ｇ５）、ＢＣ－１Ａ８－ＩｇＧ１（Ｇ６）、ＢＣ－１Ｃ３－ＩｇＧ１（Ｇ７）、１４－４Ａ９－ｈＨｖＫｖ－ＩｇＧ１（Ｇ８）、及び抗ｍＰＤ－１（Ｇ９）（ＢＩＯ Ｘ ＣＥＬＬ，ＩＮＣ．，カタログ番号ＢＥ０１４６）を注射した。マウスで有効性が示されている抗ｍＰＤ－１を、陽性対照として使用した。抗体を、３週間にわたり１０ｍｇ／ｋｇで、腹腔内注射により、各週の１日目及び４日目に与えた（合計で６回の注射）。

【0240】

治療期間全体の間、マウスの体重をモニタリングした。異なる群のマウスの体重は全て増加し、統計的有意差は見られなかった（Ｐ＞０．０５）。群を割り当てた日（０日目、「Ｄ０」）に、各群の平均体重は、２０．３ｇ～２１．４ｇの範囲であった。実験の終了時（群の割り当てから２８日後、Ｄ２８）に、各群の平均体重は、２２．７ｇ～２４．７ｇの範囲であり、体重変化は、１０７．４％～１１６．５％の範囲であった。結果は、抗ｈＴＮＦＲ２抗体は十分認容され、マウスに対して無毒性であることを示した。

【0241】

腫瘍サイズ（図１）は、抗ｈＴＮＦＲ２抗体で治療した群において、有意差を示した。各治療群に対する、２８日目（群の割り当てから２８日後）におけるＴＧＩ_ＴＶ％を、以下の表８に示す。陽性対照（抗ｍＰＤ-１、Ｇ９）は、上述の用量及び頻度の下で、良好な治療効果（ＴＧＩ_ＴＶ％＝７８．５％）を示した。ＢＣ-１Ｆ４-ＩｇＧ１（Ｇ２）、ＢＣ-１Ｆ１０-ＩｇＧ１（Ｇ４）、ＢＣ-１Ａ８-ＩｇＧ１（Ｇ６）、ＢＣ-１Ｃ３-ＩｇＧ１（Ｇ７）を含む複数の抗体は、良好な治療効果を示した（ＴＧＩ_ＴＶ％＞６０％）。Ｇ３及びＧ５を除き、ＴＮＦＲ２抗体のＴＧＩ_ＴＶ％は、８０％超であった。このＴＧＩ_ＴＶ％は、陽性対照群（Ｇ１９／抗ｍＰＤ-１ ＴＧＩ_ＴＶ％＝７８．５％）よりも大きかった。

【表8】

【0242】

ＭＣ３８を有するＢ－ＴＮＦＲ２マウス、１ｍｇ／ｋｇのインビボ有効性
前述のインビボ薬剤有効性実験と同様に、腫瘍モデルを構築した後に、マウスに対照としてのＰＢＳ（Ｇ１）、抗ｈＴＮＦＲ２抗体の抗体ＢＣ－１Ａ８－ＩｇＧ１（Ｇ２）、ＢＣ－１Ｆ１０－ＩｇＧ１（Ｇ３）、ＢＣ－１Ｆ４－ＩｇＧ１（Ｇ４）、抗ｍＰＤ－１（Ｇ５）、抗－ｍＣＴＬＡ４（Ｇ６）（ＢＩＯ Ｘ ＣＥＬＬ，ＩＮＣ．，カタログ番号：ＢＥ０１６４）を注射した。抗体を、３週間にわたり１ｍｇ／ｋｇで、腹腔内注射により、各週の１日目及び４日目に与えた（合計で６回の注射）。

【0243】

マウスの体重を、実験全体を通してモニタリングした。異なる群におけるマウスの体重は全て増加し、群の間で有意差は見られなかった（Ｐ＞０．０５）。群の割り当て時（Ｄ０）において、各基の平均体重は、２０．４ｇ～２０．８ｇの範囲であった。実験の終了時（群の割り当てから２４日後、Ｄ２４）に、各群の平均体重は、２１．６ｇ～２３．７ｇの範囲であり、体重変化は、１０２．５％～１１４．７％の範囲であった。以前の実験と同様に、結果は、抗ｈＴＮＦＲ２抗体は十分認容され、マウスに対して無毒性であることを示した。

【0244】

腫瘍サイズは、抗ＴＮＦＲ２抗体で治療した群において有意差を示した（図２）。特に、Ｇ３、Ｇ４、及びＧ５における腫瘍サイズは、Ｇ１よりも有意に小さかった（Ｇ３：Ｐ＝０．００５、Ｇ７：Ｐ＝０．００１、Ｇ８：Ｐ＝０．０１１）。各治療群に対する、２４日目（群の割り当てから２４日後）におけるＴＧＩ_ＴＶ％もまた、以下の表９に示すように計算した。Ｇ２、Ｇ３、及びＧ４は、陽性対照（Ｇ５、Ｇ６）と比較して、良好な腫瘍阻害（ＴＧＩ_ＴＶ％）を示した。

【表9】

【0245】

ＭＣ３８を有するＢ－ＴＮＦＲ２マウス、０．３ｍｇ／ｋｇのインビボ有効性
別の同様の実験では、試験する抗ｈＴＮＦＲ２抗体の用量を、０．３ｍｇ／ｋｇまで減らした。マウスの腫瘍体積が、１００±５０ｍｍ^３に達したときに、（ＭＣ３８腫瘍を有する）マウスを、異なる群にランダムに割り当てた（各群にマウス６匹）。

【0246】

次に、マウスに、対照としてのＰＢＳ（Ｇ１）、抗ｈＴＮＦＲ２抗体のＢＣ－１Ｃ３－ｌｇＧ１（Ｇ２）、抗ｍＰＤ－１（Ｇ３）、抗－ｍＣＴＬＡ４（Ｇ４）を注射した。抗体を、３週間にわたり０．３ｍｇ／ｋｇで、腹腔内注射により、各週の１日目及び４日目に与えた（合計で６回の注射）。

【0247】

マウスの体重を、実験を通してモニタリングした。異なる群におけるマウスの体重は全て増加し、群の間で有意差は見られなかった（Ｐ＞０．０５）。群の割り当て時（Ｄ０）における各群の平均体重は、１９．５ｇ～１９．８ｇの範囲であった。実験の終了時（群の割り当てから２５日後、Ｄ２５）に、平均体重は２１．６ｇ～２３．３ｇの範囲であり、体重変化は、１０８．９％～１１８．２％の範囲であった。以前の結果と同様に、結果は、抗ＴＮＦＲ２抗体は十分認容され、マウスに対して無毒性であることを示した。

【0248】

腫瘍サイズ（図３）は、抗ｈＴＮＦＲ２抗体で治療した群において、有意差を示した。各治療群に対する、２５日目（群の割り当てから２５日後）におけるＴＧＩ_ＴＶ％は、以下の表１０に示すように計算した。ＢＣ－１Ｃ３－ＩｇＧ１（Ｇ２）は、本用量で最も良い有効性を示し、有効性は、陽性対照（Ｇ３、Ｇ４）よりも良好であった。

【表10】

【0249】

Ｂ１６Ｆ１０を有するＢ－ＴＮＦＲ２マウス、１０ｍｇ／ｋｇのインビボ有効性
Ｂ１６Ｆ１０腫瘍細胞（黒色腫細胞）を、Ｂ－ＴＮＦＲ２マウスに皮下注射した。マウスでの腫瘍体積が、１００±５０ｍｍ^３に達したら、腫瘍体積に基づき、マウスをランダムに異なる群に割り当てた（各群にマウス６匹）。

【0250】

次に、マウスに、対照としてのＰＢＳ（Ｇ１）、抗ｈＴＮＦＲ２抗体のＢＣ－１Ａ８－ＩｇＧ１（Ｇ２）、ＢＣ－１Ｃ３－ｌｇＧ１（Ｇ３）、ＢＣ－１Ｆ１０－ｌｇＧ１（Ｇ４）、ＢＣ－１Ｆ４－ｌｇＧ１（Ｇ５）、ＢＣ－１Ｂ６－ｌｇＧ１（Ｇ６）を注射した。抗体を、２週間にわたり１０ｍｇ／ｋｇで、腹腔内注射により、各週の１日目及び４日目に与えた（合計で３回の注射）。

【0251】

マウスの体重を、実験を通してモニタリングした。異なる群におけるマウスの体重は全て増加し、群の間で差は見られなかった（Ｐ＞０．０５）。群の割り当て時（Ｄ０）において、各基の平均体重は、１９．２ｇ～１９．７ｇの範囲であった。群の割り当ての１０日後（Ｄ１０）において、各群の平均体重は、２２．１ｇ～２４．５ｇの範囲であり、体重変化は、１１４．３％～１２６．８％の範囲であった。結果は、抗ｈＴＮＦＲ２抗体は十分認容され、マウスに対して無毒性であることを示した。

【0252】

腫瘍サイズは、抗ＴＮＦＲ２抗体で治療した群において有意差を示した（図４）。ＢＣ－１Ａ８－ＩｇＧ１（Ｇ２）、ＢＣ－１Ｃ３－ＩｇＧ１（Ｇ３）、ＢＣ－１Ｆ１０－ｌｇＧ１（Ｇ４）、及びＢＣ－１Ｂ６－ｌｇＧ１（Ｇ６）は全て、Ｂ１６Ｆ１０黒色腫モデルにおいて、抗腫瘍有効性を示した。各治療群に対する、１０日目（グループ分けから１０日後）におけるＴＧＩ_ＴＶ％を、以下の表１１に示す。

【表11】

【0253】

ＭＣ３８を有するＢ－ＴＮＦＲ２マウス、２５ｍｇ／ｋｇのインビボ有効性及び毒性
別の同様の実験では、試験する抗ｈＴＮＦＲ２抗体の用量を、２５ｍｇ／ｋｇに調整して、インビボ有効性及び毒性を試験した。ＭＣ３８癌腫瘍細胞（結腸腺癌細胞）を、Ｂ－ＴＮＦＲ２マウスに皮下注射した。マウスでの腫瘍体積が、１００±５０ｍｍ^３に達したら、腫瘍体積に基づき、マウスをランダムに異なる群に割り当てた（各群にマウス４匹）。

【0254】

次に、マウスに、対照としてのＰＢＳ（Ｇ１）、抗ｈＴＮＦＲ２抗体のＢＣ－１Ａ８－ＩｇＧ１（Ｇ２）、ＢＣ－１Ｃ３－ＩｇＧ１（Ｇ３）、ＢＣ－１Ｆ１０－ＩｇＧ１（Ｇ４）、ＢＣ－１Ｆ４－ＩｇＧ１（Ｇ５）、ＢＣ－１Ｂ６－ＩｇＧ１（Ｇ６）を注射した。２５ｍｇ／ｋｇの腹腔内注射で、抗体を、群の割り当て日（Ｄ０）、及び、群の割り当てから３日後（Ｄ３）に投与した（合計で２回の注射）。

【0255】

マウスの体重を、実験を通してモニタリングした。異なる群におけるマウスの体重は全て増加し、群の間で有意差は見られなかった。各群の平均体重は、群の割り当て時において、１８．５ｇ～１９．２ｇの範囲であった。実験の終了時（群の割り当てから２１日後、Ｄ２１）に、各群の平均体重は、２１．１ｇ～２３．３ｇの範囲であり、体重変化は、１１０．０％～１２２．７％であった。群の割り当ての５日後（Ｄ５）において、マウスの末梢血を採取し、血液の生化学的指標（ＡＳＴ、ＡＬＴ）を試験した。Ｄ５における、生化学的指数試験の結果（図７Ａ～７Ｂ）は、対照と比較して、ＡＬＴ及びＡＳＴは有意に変化しなかったことを示した。以前の結果と同様に、結果は、２５ｍｇ／ｋｇの抗ｈＴＮＦＲ２抗体は十分認容され、マウスに対して無毒性であることを示した。

【0256】

腫瘍サイズ（図５）は、抗ＴＮＦＲ２抗体で治療した群において、有意差を示した。対照群Ｇ１と比較して、腫瘍体積は、抗ｈＴＮＦＲ２抗体のＢＣ－１Ａ８－ＩｇＧ１（Ｇ２）、ＢＣ－１Ｃ３－ＩｇＧ１（Ｇ３）、ＢＣ－１Ｆ１０－ＩｇＧ１（Ｇ４）、ＢＣ－１Ｆ４－ＩｇＧ１（Ｇ５）、及びＢＣ－１Ｂ６－ＩｇＧ１（Ｇ６）で治療した治療群において、有意に低下した。ＴＧＩ_ＴＶ％は、８１．６％～９８．４％であり、明白な腫瘍抑制効果を示す。各治療群に対する、２１日目（群の割り当てから２１日後）におけるＴＧＩ_ＴＶ％もまた、以下の表１２に示すように計算した。

【表12】

【0257】

ＭＣ３８を有するｈＴＮＦα／ｈＴＮＦＲ２マウス、３ｍｇ／ｋｇのインビボ有効性及び毒性
ヒト化ＴＮＦαマウスモデルを、ヒトＴＮＦαタンパク質（配列番号７９）を発現するように組み換え、ここでは、マウスＴＮＦＲ２タンパク質のコード配列を、対応するヒトコード配列で置き換えた。ＴＮＦαヒト化マウスを、ＴＮＦＲ２ヒト化マウスと交差させることによって、二重ヒト化ＴＮＦα／ＴＮＦＲ２マウスモデル（Ｂ－ｈＴＮＦα／ｈＴＮＦＲ２マウス）もまた生成した。ヒト化ＴＮＦαマウスモデルに関する詳細の説明は、ＰＣＴ／ＣＮ２０２０／０７２７１４に見出すことができ、その全体が本明細書に参照により組み込まれている。

【0258】

以前のインビボ薬剤有効性実験と同様に、これらの抗ｈＴＮＦＲ２抗体の、二重ヒト化ＴＮＦα／ＴＮＦＲ２マウスモデルにおける、インビボ腫瘍増殖での効果について試験した。各群において、二重ヒト化ＴＮＦα／ＴＮＦＲ２マウスに、腹腔内（ｉ．ｐ．）投与によって、リン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、Ｇ１）、ＢＣ－１Ｃ３－ＩｇＧ１（Ｇ２）、及び抗ｍＰＤ－１（Ｇ３）を注射した。３ｍｇ／ｋｇで、腹腔内注射により、抗体を週に２回、３週間投与した（合計で６回の注射）。

【0259】

体重及び腫瘍サイズを、実験を通してモニタリングした。異なる群におけるマウスの体重は全て増加し、群の間で有意差は見られなかった（Ｐ＞０．０５）。群の割り当て時（Ｄ０）における各群の平均体重は、２０．０ｇ～２０．６ｇの範囲であった。実験の終了時（Ｄ２８）に、平均体重は２３．５ｇ～２５．１ｇの範囲であり、体重変化は、１１５．７％～１２７．２％の範囲であった。以前の結果と同様に、結果は、抗ｈＴＮＦＲ２抗体は十分認容され、マウスに対して無毒性であることを示した。

【0260】

腫瘍サイズ（図６）は、抗ｈＴＮＦＲ２抗体で治療した群において、有意差を示した。各治療群に対する、Ｄ２８におけるＴＧＩ_ＴＶ％を、以下の表１３に示す通りに計算した。ＢＣ－１Ｃ３－ＩｇＧ１（Ｇ２）は、本用量で最も良い有効性を示し、有効性は、陽性対照（Ｇ３）よりも良好であった。

【表13】

【0261】

ＭＣ３８を有するＢ－ＴＮＦＲ２マウス、３ｍｇ／ｋｇのインビボ有効性
前述のインビボ薬剤有効性実験と同様に、ＭＣ３８癌腫瘍細胞を、Ｂ－ＴＮＦＲ２マウスに皮下注射した。マウスでの腫瘍体積が、１００ｍｍ^３に達したら、腫瘍体積に基づき、マウスをランダムに異なる群に割り当てた（各群にマウス６匹）。マウスに、対照としてのＰＢＳ（Ｇ１）、３ｍｇ／ｋｇのＢＣ-１Ｃ３-ＩｇＧ１（Ｇ２）、３ｍｇ／ｋｇの抗ｍＰＤ-１（Ｇ３）、３ｍｇ／ｋｇのＢＣ-１Ｃ３-ｌｇＧ１と３ｍｇ／ｋｇの抗ｍＰＤ-１の組み合わせ（ｇ４）、３ｍｇ／ｋｇのアテゾリズマブアナログ（Ｇ５）、又は、３ｍｇ／ｋｇのＢＣ-１Ｃ３-ＩｇＧ１と３ｍｇ／ｋｇのアテゾリズマブアナログの組み合わせ（Ｇ６）を注射した。投与頻度は、週に２回（合計で６回の投与）であった。

【0262】

アテゾリズマブは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈにより開発された、ヒト化抗ＰＤ-Ｌ１モノクローナル抗体（ＶＨ 配列番号８０、ＶＬ 配列番号８１）である。

【0263】

体重及び腫瘍サイズを、実験を通してモニタリングした。異なる群におけるマウスの体重は全て増加し、群の間で有意差は見られなかった（Ｐ＞０．０５）。群の割り当て時（Ｄ０）における各群の平均体重は、１８．９ｇ～１９．３ｇの範囲であった。実験の終了時（Ｄ２４）に、平均体重は２２．４ｇ～２４．２ｇの範囲であり、体重変化は、１１８．６％～１２５．３％の範囲であった。以前の結果と同様に、結果は、抗ｈＴＮＦＲ２抗体は十分認容され、マウスに対して無毒性であることを示した。

【0264】

抗体で治療した群の腫瘍サイズを、図１８に示す。各治療群に対する、Ｄ２４におけるＴＧＩ_ＴＶ％を、以下の表１４に示す通りに計算した。対照群と比較して、治療群における腫瘍増殖は、異なる程度まで阻害された。治療群の間では、抗ＰＤ－１抗体と抗ｈＴＮＦＲ２抗体の組み合わせ（Ｇ４）が、優れた有効性で腫瘍増殖を阻害した。同様に、抗ＰＤ－Ｌ１抗体アテゾリズマブアナログと、抗ｈＴＮＦＲ２抗体の組み合わせ（Ｇ６）もまた、抗ｈＴＮＦＲ２抗体（Ｇ２）、及び抗ＰＤ－Ｌ１抗体アテゾリズマブアナログ（Ｇ５）よりも、優れた腫瘍増殖阻害を示した。

【表14】

【0265】

ＧＬ２６１を有するＢ－ＴＮＦＲ２マウス、１～１０ｍｇ／ｋｇのインビボ有効性
ＧＬ２６１腫瘍細胞（神経膠芽腫細胞）を、Ｂ－ＴＮＦＲ２マウスに皮下注射した。マウスでの腫瘍体積が、約８０ｍｍ^３に達したら、腫瘍体積に基づき、マウスをランダムに異なる群に分けた（各群にマウス６匹）。

【0266】

次に、マウスに、対照としてのＰＢＳ（Ｇ１）、１ｍｇ／ｋｇのＢＣ-１Ｃ３-ＩｇＧ１（Ｇ２）、３ｍｇ／ｋｇのＢＣ-１Ｃ３-ＩｇＧ１（Ｇ３）、１０ｍｇ／ｋｇのＢＣ-１Ｃ３-ＩｇＧ１（Ｇ４）、又は１ｍｇ／ｋｇの抗ｍＰＤ-１（Ｇ５）を注射した。抗体を、３週間にわたり、腹腔内注射により、各週の１日目及び４日目に与えた（合計で６回の注射）。

【0267】

治療期間全体の間、マウスの体重をモニタリングした。異なる群のマウスの体重は全て増加し、統計的有意差は見られなかった（Ｐ＞０．０５）。群を割り当てた日（０日目、「Ｄ０」）に、各群の平均体重は、１９．９ｇ～２０．６ｇの範囲であった。実験の終了時（群の割り当てから２４日後、Ｄ２４）に、各群の平均体重は、２２．５ｇ～２４．２ｇの範囲であり、体重変化は、１０９．４％～１１８．３％の範囲であった。結果は、抗ｈＴＮＦＲ２抗体は十分認容され、マウスに対して無毒性であることを示した。

【0268】

抗体で治療した群の腫瘍サイズデータを、図１９に示す。各治療群に対する、Ｄ２４におけるＴＧＩ_ＴＶ％を、以下の表１５に示す通りに計算した。ＢＣ－１Ｃ３－ＩｇＧは、１ｍｇ／ｋｇの用量において、抗ｍＰＤ-１抗体よりも良好な抗腫瘍効果を示した。加えて、ＢＣ-１Ｃ３-ＩｇＧ１は、用量依存性の抗腫瘍効果を示した（用量レベルが高いほど、抗腫瘍効果がより優れる）。

【表15】

【0269】

ＭＣ３８を有するＢ-ＴＮＦＲ２マウス、３ｍｇ／ｋｇのインビボ有効性
ＢＩ-１８０８（ＶＨ 配列番号８２、ＶＬ 配列番号８３）は、ＢｉｏＩｎｖｅｎｔにより開発された、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー１Ｂ（ＴＮＦＲ２）を標的とするモノクローナル抗体である。本製品は、単剤として、及び、ペムブロリズマブと組み合わせて、充実性腫瘍及び皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＣＬ）を治療するために、初期の臨床開発段階にある。

【0270】

ｈ６００-２５-１０８（ＶＨ 配列番号８４、ＶＬ 配列番号８５）は、Ａｐｅｘｉｇｅｎにより開発された、ヒト化抗ＴＮＦＲ２モノクローナル抗体である。

【0271】

ＨＦＢ３-１ｈｚ６-ｈＧ１（ＶＨ 配列番号８６、ＶＬ 配列番号８７）は、進行性充実性腫瘍を治療するための、ＨｉＦｉＢｉＯ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ製の、第Ｉ相臨床試験でのモノクローナル抗ＴＮＦＲ２アゴニスト抗体である。

【0272】

前述のインビボ薬剤有効性実験と同様に、ＭＣ３８腫瘍細胞を、Ｂ-ＴＮＦＲ２マウスに皮下注射した。腫瘍体積が、１００ｍｍ^３に達したら、腫瘍体積に基づき、マウスをランダムに異なる群に分けた（各群にマウス６匹）。マウスに、ＰＢＳ（Ｇ１）、３ｍｇ／ｋｇのＢＣ-１Ｃ３-ｌｇＧ１（Ｇ２）、３ｍｇ／ｋｇのＢＩ-１８０８アナログ（Ｇ３）、３ｍｇ／ｋｇのｈ６００-２５-１０８アナログ（Ｇ４）、又は３ｍｇ／ｋｇのＨＦＢ３-１ｈｚ６-ｈＧ１アナログ（Ｇ５）を注射した。投与頻度は、週に２回（合計で６回の投与）であった。

【0273】

体重及び腫瘍サイズを、実験を通してモニタリングした。異なる群におけるマウスの体重は全て増加し、群の間で有意差は見られなかった（Ｐ＞０．０５）。群の割り当て時（Ｄ０）における各群の平均体重は、２０．１ｇ～２０．４ｇの範囲であった。実験の終了時（Ｄ２８）に、平均体重は２２．９ｇ～２４．９ｇの範囲であり、体重変化は、１１３．２％～１２２．４％の範囲であった。以前の結果と同様に、結果は、抗ｈＴＮＦＲ２抗体は十分認容され、マウスに対して無毒性であることを示した。

【0274】

腫瘍サイズを、図２０に示す。各治療群に対する、Ｄ２８におけるＴＧＩ_ＴＶ％を、以下の表１６に示す通りに計算した。結果は、ＢＣ-１Ｃ３-ＩｇＧ１抗体（Ｇ２）は、同じ用量レベルにおいて、ＢＩ-１８０８アナログ（Ｇ３）、ｈ６００-２５-１０８アナログ（Ｇ４）、又はＨＦＢ３-１ｈｚ６-ｈＧ１アナログ（Ｇ５）よりも、有意に良好なインビボ有効性を示したことを示した。

【表16】

【0275】

ＭＣ３８を有するＢ-ｈＴＮＦａ／ｈＴＮＦＲ２、３ｍｇ／ｋｇのインビボ有効性
ｈ６００-２５-７１（ＶＨ 配列番号８８、ＶＬ 配列番号８９）は、Ａｐｅｘｉｇｅｎにより開発された、ヒト化抗ＴＮＦＲ２モノクローナル抗体である。

【0276】

前述のインビボ薬剤有効性実験と同様に、ＭＣ３８腫瘍細胞を、Ｂ-ｈＴＮＦａ／ｈＴＮＦＲ２マウスに皮下注射した。腫瘍体積が、１００ｍｍ^３に達したら、腫瘍体積に基づき、マウスをランダムに異なる群に分け（各群にマウス６匹）、ＰＢＳ（Ｇ１）、３ｍｇ／ｋｇのＢＣ-１Ｃ３-ｌｇＧ１（Ｇ２）、又は３ｍｇ／ｋｇ ｈ６００-２５-７１アナログ（Ｇ３）を注射した。投与頻度は、週に２回（合計で６回の投与）であった。

【0277】

体重及び腫瘍サイズを、実験を通してモニタリングした。異なる群におけるマウスの体重は全て増加し、群の間で有意差は見られなかった（Ｐ＞０．０５）。群の割り当て時（Ｄ０）における各群の平均体重は、２１．０ｇ～２１．１ｇの範囲であった。実験の終了時（Ｄ２４）に、平均体重は２３．８ｇ～２４．８ｇの範囲であり、体重変化は、１１３．３％～１１７．５％の範囲であった。以前の結果と同様に、結果は、抗ｈＴＮＦＲ２抗体は十分認容され、マウスに対して無毒性であることを示した。

【0278】

腫瘍サイズを、図２１に示す。各治療群の値に対する、Ｄ２４におけるＴＧＩ_ＴＶ％を、以下の表１７に示す。結果は、ＢＣ-１Ｃ３-ＩｇＧ１は、ｈ６００-２５-７１アナログよりも、有意に良好なインビボ有効性を示したことを示した。

【表17】

【0279】

実施例４．ＰＫ及びＴＩＬＳ分析
ＭＣ３８モデルを有するＢ-ＴＮＦＲ２マウス、１０ｍｇ／ｋｇ、ＰＫ分析
抗ＴＮＦＲ２抗体の薬物動態クリアランス率を、ヒト化ＴＮＦＲ２マウスで測定した。ＭＣ３８細胞（５×１０^５）を、ヒト化ＴＮＦＲ２マウスに皮下注射し、腫瘍が３００ｍｍ^３まで増殖したら、マウスを８つの群（ｎ＝４）に分けた。１０ｍｇ／ｋｇの、ＢＣ-１Ｃ３-ＩｇＧ１（Ｇ２）、ＢＣ-１Ｆ４-ＩｇＧ１（Ｇ３）、ＢＣ-１Ｂ６-ＩｇＧ１（Ｇ４）、ＢＣ-１Ｃ３-ＩｇＧ１-ＳＩ（Ｇ５）、ＢＣ-１Ｆ４-ＩｇＧ１-ＳＩ（Ｇ６）、ＢＣ-１Ｂ６-ＩｇＧ１-ＳＩ（Ｇ７）、又はアイソタイプコントロールＩｇＧ１（Ｇ１）を、静脈内注射により投与した。血液試料を、投与の１５分後、６時間後、２４時間後、３日後、５日後、及び７日後に収集した。

【0280】

ヒト抗体の血清レベルを、サンドイッチＥＬＩＳＡ酵素結合イムノアッセイにより測定した。簡単に言えば、ヤギポリクローナル抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ特異的）キャプチャー抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号：１０９-０３６-０９８）を、０．１Ｍの炭酸塩緩衝液（ｐＨ９．６）で、終濃度２．０μｇ／ｍＬまで希釈し、１００μＬ／ウェルで、９６ウェルプレート（ＥＬＩＳＡプレート）に添加して、４℃で一晩インキュベートした。次に、２００μＬのブロッキング緩衝液（２％ ＢＳＡ）を各ウェルに添加した。ウェルを密封し、室温で１時間インキュベートした。プレートをプレート洗浄機で洗浄した後、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲート化ヤギポリクローナル抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ特異的）抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号：１０９-００５-０８８）を、ＥＬＩＳＡプレートの各ウェルに１００μＬ／ウェルで添加し、３７℃で１時間インキュベートした。プレートを洗浄した後、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）溶液を、１００μＬ／ウェルで９６ウェルプレートに、基質として添加し、ＨＲＰと反応させた。暗所で室温にてインキュベートした後、１００μＬの停止溶液（Ｂｅｙｏｔｉｍｅ、カタログ番号：Ｐ０２１５）を各ウェルに添加した。マイクロプレートリーダーを用いて、４５０ｎｍ及び６３０ｎｍの波長にて、各ウェルの吸光度の値を読み取った。データ解析ソフトウェアＧｅｎ５を用いて、データを分析した。各試験生成物により調整した較正試料の吸光度の値、及び対応する濃度を用いて、４つのパラメーターを持つ標準曲線を製造した。そして、標準曲線を用いて、各血清試料の抗体濃度を計算した。薬剤濃度－時間曲線を、各時点における、計算した試料濃度を用いて製造した。Ｐｈｏｅｎｉｘ ｗｉｎｎｏｌｉｎ ８．３を用いて、薬物動態パラメーターを計算した。結果を以下の表１８に示す。

【表18】

【0281】

上記結果は、異なる抗体の注射後に、ＴＮＦＲ２ヒト化マウスの血清中での抗体濃度は、時間と共に低下し（図１０を参照されたい）、これは、薬物動態の特徴と一致することを示す。マウスにおける、ＢＣ-１Ｃ３-ＩｇＧ１（Ｇ２）抗体の最も長い半減期は、２．９９日であった。マウスにおける、ＢＣ-１Ｂ６-ＩｇＧ１-ＳＩ（Ｇ７）の最も短い半減期は、０．８６日であった。マウスにおける、他の抗体の半減期は、１．６９日～２．３８日の範囲に収まり、比較的近接していた。サンプリングの７日目の終了時までに、ＢＣ-１Ｃ３-ＩｇＧ１（Ｇ２）抗体の薬剤濃度－時間曲線の、曲線下面積（ＡＵＣ）は２５０．９３時間＊μｇ／ｍＬであり、これは、他の抗体のＡＵＣ（ＡＵＣ０-７ｄａｙ ７７．９０～１６８．８９時間＊μｇ／ｍＬ）よりも長かった。ＢＣ-１Ｃ３-ＩｇＧ１（Ｇ２）抗体のクリアランス率（ＣＬ）は、２８．８５ｍＬ／時間／ｋｇであり、他の抗体のＣＬは、４７．０７～６１．１９ｍＬ／時間／ｋｇの範囲であった。結果は、他の抗体と比較して、ＢＣ-１Ｃ３-ＩｇＧ１（Ｇ２）は、低いクリアランス効率を有し、マウスでのＢＣ-１Ｃ３-ＩｇＧ１（Ｇ２）抗体の代謝は、遅かったことを示した。
実施例５．レポーター細胞活性及び結合アッセイ
レポーター細胞での活性化効果
実験を行い、抗ＴＮＦＲ２抗体がＴＮＦＲ２経路を活性化可能であるか否かを試験した。

【0282】

ヒトＴＮＦαタンパク質（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｃ．，カタログ番号：１０６０２-ＨＮＡＥ）を、陽性対照として、１０ｎｇ／ｍＬの最大濃度で連続希釈した（３倍）。抗ＴＮＦＲ２抗体のＢＣ-１Ｆ４-ＩｇＧ１、ＢＣ-１Ｃ３-ＩｇＧ１、ＢＣ-１Ｂ６-ＩｇＧ１、及びＢＣ-１Ｆ１０-ＩｇＧ１を、６０μｇ／ｍＬの最大濃度で連続希釈した（３倍）。Ｊｕｒｋａｔ-ＧＦＰ-ＴＮＦＲ２細胞を、９６ウェルプレートに播種し（細胞密度は１×１０^５ｃｅｌｌ／ウェル、ウェル当たり１００μＬ）、その後、１００μＬのヒトＴＮＦαタンパク質、又は、１００μＬの抗ＴＮＦＲ２抗体を各ウェルに添加し、３７℃で一晩インキュベートした。インキュベーション後、プレートを取り出し、９６ウェルプレートに移した。各ウェルを１５０μＬのＰＢＳで洗浄した。上清は廃棄した。１００μＬのＰＢＳを各ウェルに添加し、細胞を再懸濁した。次に、プレートをルミネセンス検出器に配置し、蛍光シグナルを検出した。抗体がＴＮＦＲ２を活性化できる場合、レポーター細胞はＧＦＰシグナルを報告する。

【0283】

図１１Ａに示すように、抗ＴＮＦＲ２抗体のＢＣ-１Ｆ４-ＩｇＧ１、ＢＣ-１Ｃ３-ＩｇＧ１、ＢＣ-１Ｂ６-ＩｇＧ１、及びＢＣ-１Ｆ１０-ＩｇＧ１が存在する場合、蛍光シグナルは検出されなかった。一方で、ＢＣ-１Ｃ３-ＩｇＧ１は弱いレポーター細胞活性化を示した（図１１Ｂ）。
レポーター細胞での遮断効果
実験を行い、抗ＴＮＦＲ２抗体が、ＴＮＦＲ２と、そのリガンドのＴＮＦαとの結合を遮断できるか否かを試験した。

【0284】

レポーターＪｕｒｋａｔ-ＧＦＰ-ＴＮＦＲ２細胞を、９６ウェルプレートに播種した（細胞密度は１×１０^５ｃｅｌｌ／ウェル）。ＴＮＦαタンパク質を、１ｎｇ／ｍＬまで希釈した。抗ＴＮＦＲ２抗体のＢＣ-１Ｆ４-ＩｇＧ１、ＢＣ-１Ｃ３-ＩｇＧ１、ＢＣ-１Ｂ６-ＩｇＧ１、及びＢＣ-１Ｆ１０-ＩｇＧ１を、１０μｇ／ｍＬの最大濃度で、連続希釈した（３倍）。５０μＬのヒトＴＮＦαタンパク質、及び、５０μＬの抗体を各ウェルに添加し、３７℃で２４時間インキュベートした。インキュベーション後、プレートを取り出し、９６ウェルプレートに移した。各ウェルを１５０μＬのＰＢＳで洗浄した。上清は廃棄した。１００μＬのＰＢＳを各ウェルに添加し、細胞を再懸濁した。ＧＦＰに対するシグナルを、フローサイトメトリーにより測定した。

【0285】

図１２に示すように、抗ＴＮＦＲ２抗体のＢＣ-１Ｆ１０-ＩｇＧ１及びＢＣ-１Ｆ４-ＩｇＧ１の濃度が増大した際、ＧＦＰシグナル（ＴＮＦαに結合する細胞を示す）は低下し（ｙ軸）、これは、ヒトＴＮＦαとＴＮＦＲ２の間の結合が、抗ＴＮＦＲ２抗体のＢＣ-１Ｆ１０-ＩｇＧ１及びＢＣ-１Ｆ４-ＩｇＧ１により遮断されたことを示唆している。
実施例６．インビボ毒性実験（腫瘍を有しないモデル）
ＴＮＦＲ２ヒト化マウス（６～８週齢）を、それらの体重に従い、対照群と治療群（各群に４匹のマウス）に、ランダムに分けた。対照群に等体積のＰＢＳを注射し、投与群に、抗ｈＴＮＦＲ２抗体（ＢＣ-１Ｃ３-ＩｇＧ１、ＢＣ-１Ｆ４-ＩｇＧ１、若しくはＢＣ-１Ｂ６-ＩｇＧ１）、又はＣＴＬＡ４抗体（抗ｍＣＴＬＡ４）を注射する。抗ｈＴＮＦＲ２抗体及びＣＴＬＡ４抗体の注射用量は、３０ｍｇ／ｋｇ又は１００ｍｇ／ｋｇである。投与頻度は週に１回で、合計４回の投与である。投与の特定の用量、様式、及び頻度を、以下の表１９に示す。実験では、体重の変化、及び、何らかの異常をモニタリングした。群の割り当てから１日後、８日後、１５日後、２２日後、及び２８日後に、血液生化学的指標をモニタリングした。血液生化学的指標としては、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、クレアチンキナーゼ（ＣＫ）、アルブミン（ＡＬＢ）、総タンパク質（ＴＰ）、アミラーゼ（ＡＭＹ）、尿素（ＵＲＥＡ）、クレアチニン（ＣＲＥＡ）、グルコース（ＧＬＵ）、トリグリセリド（ＴＧ）、総コレステロール（ＴＣ）、高密度リポタンパク質コレステロール（ＨＤＬ－Ｃ）、低密度リポタンパク質コレステロール（ＬＤＬ－Ｃ）、カルシウム（Ｃａ）、無機リン（Ｐ）が挙げられる。群の割り当てから２８日後に、血液の日常的試験を実施した。血液ルーチン検査としては、白血球数（ＷＢＣ）、赤血球（ＲＢＣ）、ヘモグロビン（ＨＧＢ）、ヘマトクリット（ＨＴＣ）、赤血球の平均体積（ＭＣＶ）、赤血球ヘモグロビンの平均含有量（ＭＣＨ）、赤血球ヘモグロビンの平均濃度（ＭＣＨＣ）、ＰＬＴ（血小板数）、リンパ球（ＬＹＭＰＨ＃）、リンパ球割合（ＬＹＭＰＨ％）、単球（ＭＯＮＯ＃）、単球の割合（ＭＯＮＯ％）、好中球の割合（ＮＥＵＴ％）での試験が挙げられる。実験の終了時に、マウスの心臓、肝臓、脾臓、肺、腎臓、及び腸を、ＨＥ染色のためにホルマリンに浸け、肝臓、脾臓、及び腎臓の重量を測定した。

【表19】

【0286】

結果は、対照群及び治療群のマウス全ての体重が、実験期間を通して上昇傾向を示し、群の間で、体重の変化に有意差はなかったことを示した。血液生化学的指標試験結果（２８日目における、例示的な血液生化学的指標に関しては、図１３Ａ～１３Ｂを参照されたい）、及び、血液の日常的試験結果は、対照と比較して、有意差を示さなかった。以前の結果と同様に、インビボ毒性結果は、抗ｈＴＮＦＲ２抗体が十分認容され、マウスに対して無毒性であることを、示した。
実施例７．ＴＮＦＲ２抗体は、Ｔｒｅｇ細胞によるＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖阻害を遮断する
ヒトＩｇＧ１（対照）及び抗ＴＮＦＲ２抗体ＢＣ－１Ｃ３－ＩｇＧ１及びＨＦＢ３－１ｈｚ６－ｈＧ１アナログを、２０ｎｇ／ｍＬの終濃度まで希釈した。抗ＣＤ３抗体（ＣＤ３、Ａｃｒｏ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号：ＣＤＥ－Ｍ１２０ａ）を使用して、４℃にて、９６ウェルプレート（１０μｇ／ｍＬ、ウェル当たり１００μＬ）を一晩コーティングした。ＣＦＳＥ（ＣｅｌｌＴｒａｃｅ^TM ＣＦＳＥ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ｋｉｔ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、カタログ番号：ＣＤＥ－Ｍ１２０ａ）で標識した１００μＬのＰＢＭＣ細胞（ＡｌｌＣｅｌｌｓ、カタログ番号：ＰＢ００３Ｆ－Ｃ）、及び５０μＬのＴｒｅｇ細胞（ＯｒｉＣｅｌｌ、カタログ番号：ＦＰＢ００９－４Ｆ－２）を、各ウェルに添加した。４０μＬのＢＣ－１Ｃ３－ＩｇＧ１、４０μＬのヒトＩｇＧ１、又は４０μＬのＨＦＢ３－１ｈｚ６－ｈＧ１アナログを各ウェルに添加し、３７℃、５％ ＣＯ_２で１２０時間インキュベートした。４８時間のインキュベーション後に、１０μＬのＩＬ－２（Ａｃｒｏ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号：ＩＬ－２－Ｈ４１１３）を各ウェルに添加した。インキュベーションの１２０時間後に、細胞を収集し、ｈＣＤ８＋細胞をフローサイトメトリーにより測定した。

【0287】

図２２に示すように、ＢＣ－１Ｃ３－ＩｇＧ１は、Ｔｒｅｇ細胞によるＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖阻害を遮断した。
実施例８．ＣＤ８＋Ｔ細胞活性化アッセイ
ヒトＩｇＧ１（対照）、抗ＴＮＦＲ２抗体ＢＣ－１Ｃ３－ＩｇＧ１及びＨＦＢ３－１ｈｚ６－ｈＧ１アナログを、０．１μｇ／ｍＬ、１μｇ／ｍＬ、及び１０μｇ／ｍＬまで連続希釈した。抗ＣＤ３抗体及び抗ＴＮＦＲ２抗体を使用して、４℃で、９６ウェルプレートを一晩コーティングした。ＣＦＳＥ（ＣｅｌｌＴｒａｃｅ^TM ＣＦＳＥ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ｋｉｔ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、カタログ番号：ＣＤＥ－Ｍ１２０ａ）で標識したＣＤ８＋Ｔ細胞（ＯｒｉＣｅｌｌ）を、各ウェル（１×１０^５ｃｅｌｌ／ウェル、ウェルあたり１００μＬ）に添加し、ｈＣＤ２８（ＢｉｏＸｃｅｌｌ、カタログ番号：ＢＥ０２４８）を各ウェルに添加し（１μｇ／ｍＬ、ウェルあたり１００μＬ）、３７℃、５％ ＣＯ_２で７２時間インキュベートした。上清を収集して、ヒトＩＬ２及びヒトＩＦＮγの分泌レベルを検出し、ペレット内の細胞をフローサイトメトリーにより検出した。

【0288】

図２３に示すように、抗ＴＮＦＲ２抗体のＢＣ－１Ｃ３－ＩｇＧ１の濃度が増加するにつれ、ＣＤ８＋Ｔ細胞は増加した。図２４Ａ～２４Ｂは、抗ＴＮＦＲ２抗体を添加した後の、ヒトＩＬ２及びＩＦＮγの分泌が増大したことを示す。上記結果は、ＢＣ－１Ｃ３－ＩｇＧ１が、ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖及び活性化を促進することができることを示している。
他の実施形態
本発明をその詳細な説明と併せて説明してきたが、上記の説明は例示を目的とするものであり、添付の特許請求の範囲によって規定される本発明の範囲を限定するものではないことを理解されたい。他の態様、利点、及び修正は、以下の特許請求の範囲内である。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11A】

【図11B】

【図12】

【図13A-13B】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17-1】

【図17-2】

【図17-3】

【図17-4】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24A-24B】

【配列表】

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【国際調査報告】