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特表2024-547130ＦＸＲタンパク質とＣａｓｐａｓｅ８タンパク質との間の相互作用のエンハンサの調製におけるエンハンサ３Ｃ１の使用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-12-26
(54)【発明の名称】ＦＸＲタンパク質とＣａｓｐａｓｅ８タンパク質との間の相互作用のエンハンサの調製におけるエンハンサ３Ｃ１の使用
(51)【国際特許分類】
A61K 31/53 20060101AFI20241219BHJP
A61P 1/16 20060101ALI20241219BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20241219BHJP
【ＦＩ】
A61K31/53
A61P1/16
A61P43/00 111
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024538213
(86)(22)【出願日】2022-06-02
(85)【翻訳文提出日】2024-06-21
(86)【国際出願番号】 CN2022096810
(87)【国際公開番号】W WO2023123865
(87)【国際公開日】2023-07-06
(31)【優先権主張番号】202111681403.3
(32)【優先日】2021-12-31
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】515252031
【氏名又は名称】中国▲薬▼科大学
【氏名又は名称原語表記】ＣＨＩＮＡ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ
【住所又は居所原語表記】Ｎｏ． ６３９ Ｌｏｎｇｍｉａｎ Ｒｏａｄ Ｊｉａｎｇｎｉｎｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｚｏｎｅ Ｎａｎｊｉｎｇ， Ｊｉａｎｇｓｕ， Ｃｈｉｎａ
(74)【代理人】
【識別番号】110000291
【氏名又は名称】弁理士法人コスモス国際特許商標事務所
(72)【発明者】
【氏名】▲ハオ▼ 海平
(72)【発明者】
【氏名】王 洪
(72)【発明者】
【氏名】孫 慧涌
(72)【発明者】
【氏名】胡 慧健
(72)【発明者】
【氏名】潘 暁潔
(72)【発明者】
【氏名】王 广基
(72)【発明者】
【氏名】徐 小為
(72)【発明者】
【氏名】崔 双
【テーマコード（参考）】
4C086
【Ｆターム（参考）】
4C086AA01
4C086AA02
4C086BC64
4C086MA01
4C086MA04
4C086MA17
4C086MA35
4C086MA37
4C086MA41
4C086MA43
4C086MA52
4C086NA14
4C086ZA75
(57)【要約】
本発明は、ＦＸＲタンパク質とＣａｓｐａｓｅ８タンパク質との間の相互作用のエンハンサの調製におけるエンハンサ３Ｃ１の使用を開示する。本発明のエンハンサは、ＦＸＲタンパク質とＣａｓｐａｓｅ８タンパク質との間の相互作用を促進し、Ｃａｓｐａｓｅ８のアポトーシス複合体への動員を阻害し、アポトーシス複合体の形成をブロックし、Ｃａｓｐａｓｅ８の切断活性化を阻害し、アポトーシスのプロセスをブロックし、細胞アポトーシスを阻害することができる。したがって、本発明のエンハンサは、アポトーシス表現型を伴う肝疾患を治療する薬物の調製に有用であり、市場の将来性が期待できる。
【選択図】図１
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＦＸＲタンパク質とＣａｓｐａｓｅ８タンパク質との間の相互作用のエンハンサの調製における式（１）で示されるエンハンサ３Ｃ１の使用。【化3】
【請求項2】
前記エンハンサ３Ｃ１は、生理学的又は病理学的状態でのＦＸＲタンパク質とＣａｓｐａｓｅ８タンパク質との間の相互作用を促進する、ことを特徴とする請求項１に記載の使用。
【請求項3】
前記エンハンサは、Ｃａｓｐａｓｅ８タンパク質のアポトーシス複合体への動員をブロックすることにより、アポトーシス複合体の形成をブロックする、ことを特徴とする請求項１に記載の使用。
【請求項4】
前記エンハンは、Ｃａｓｐａｓｅ８タンパク質の切断活性化をサブロックする、ことを特徴とする請求項１に記載の使用。
【請求項5】
前記エンハンサは、薬学的に許容される補助材料を添加して製剤を調製する、ことを特徴とする請求項１に記載の使用。
【請求項6】
前記薬学的に許容される補助材料は、希釈剤、バインダ、崩壊剤、流動促進剤、滑沢剤、矯味剤、封入材、及び吸着材を含む、ことを特徴とする請求項５に記載の使用。
【請求項7】
前記製剤は、顆粒剤、散剤、錠剤、カプセル剤、丸剤、及び経口液剤である、ことを特徴とする請求項５に記載の使用。
【請求項8】
エンハンサ３Ｃ１のＦＸＲタンパク質とＣａｓｐａｓｅ８タンパク質との間の相互作用のエンハンサとしての肝細胞アポトーシスに抵抗する薬の調製における使用。
【請求項9】
エンハンサ３Ｃ１のＦＸＲタンパク質とＣａｓｐａｓｅ８タンパク質との間の相互作用のエンハンサとしての肝保護薬の調製における使用。
【請求項10】
エンハンサ３Ｃ１のＦＸＲタンパク質とＣａｓｐａｓｅ８タンパク質との間の相互作用のエンハンサとしての肝線維症・肝損傷治療薬の調製における使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、タンパク質相互作用エンハンサの調製におけるエンハンサの使用に関し、具体的には、ＦＸＲタンパク質とＣａｓｐａｓｅ８タンパク質との間の相互作用のエンハンサの調製におけるエンハンサ３Ｃ１の使用に関する。
【背景技術】
【0002】
現在、様々な急性・慢性肝疾患（薬物誘発性肝損傷、アルコール誘発性肝損傷、非アルコール性脂肪肝、胆汁うっ滞性肝損傷、ウイルス性肝炎、肝線維症、肝硬変、肝がんなど）は、世界中で発症率が高く、人間の健康を脅かす重要な死因の１つである。現在、世界中で約１億８，５００万人がＣ型肝炎ウイルスに感染しており、非アルコール性脂肪肝（ＮＡＦＬＤ：Ｎｏｎａｌｃｏｈｏｌｉｃ ｆａｔｔｙ ｌｉｖｅｒ ｄｉｓｅａｓｅ）の有病率は２５％を超え、１億人以上が非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ：Ｎｏｎａｌｃｏｈｏｌｉｃ ｓｔｅａｔｏｈｅｐａｔｉｔｉｓ）に進行している。しかし、Ｃ型肝炎ウイルスを除いて、他のタイプの肝疾患の治療に利用できる特定の薬は現在少ない。
【0003】
細胞アポトーシスは、生物の進化／発達及び恒常性において重要な役割を果たす基本的な生物学的現象である。細胞アポトーシス障害は、多くの疾患の発症と進行に密接に関係している。例えば、肝細胞アポトーシスは、さまざまな肝疾患（薬物誘発性肝損傷、アルコール誘発性肝損傷、ＮＡＬＦＤ／ＮＡＳＨ、ウイルス性肝炎、胆汁うっ滞性肝損傷、虚血再灌流肝損傷、肝レンズ核変性症、肝線維化／肝硬変、肝がんなど）共通の特徴と病理学的メカニズムである。肝細胞アポトーシスを阻害することは、肝疾患の治療における重要な戦略の１つであると広く考えられている（Cellular and molecular mechanisms of liver injury. Gastroenterology, 2008, 134(6): 1641-54.）。
【0004】
ファルネソイドＸ受容体（ＦＸＲ：Ｆａｒｎｅｓｏｉｄ Ｘ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ＮＲ１Ｈ４としても知られる）は核内受容体スーパーファミリーのメンバーであり、胆汁酸、糖、脂質代謝において重要な役割を果たしており、エネルギーバランス、炎症、細胞運命、線維化、肝再生などの生理学的及び病理学的プロセスと密接に関連している。したがって、ＦＸＲは、肝保護薬開発の重要な標的として広く考えられている（FXR modulators for enterohepatic and metabolic diseases. Expert OpinTher Pat. 2018 Nov;28(11):765-782.）。ＦＸＲを標的とした現在の薬物開発戦略は、ＦＸＲの転写活性を制御するためのＦＸＲアゴニスト又はアンタゴニストの開発に主に焦点を当てている。オベチコール酸は、２０１６年５月に抗特発性胆汁性肝硬変の治療薬として米国ＦＤＡによって承認されたＦＸＲアゴニストである。これは、ＦＸＲを標的とする初めて市販に成功した薬物であり、ＮＡＳＨに対するその作用についての第ＩＩＩ相臨床研究が完成したが、その臨床効果は良好ではない（Obeticholic acid for the treatment of non-alcoholic steatohepatitis: interim analysis from a multicentre, randomised, placebo-controlled phase 3 trial. Lancet. 2019 Dec 14;394(10215):2184-2196.）。
【0005】
研究により、ＮＡＳＨと肝線維症には重大な肝細胞アポトーシスが伴うことが示されている。ＦＸＲアゴニストは、ＮＡＳＨやその他の疾患における肝細胞アポトーシス状態の大幅な上昇を改善する作用がない。これは、ＦＸＲアゴニストの臨床効果が限られている主な理由の１つである（Combined obeticholic acid and apoptosis inhibitor treatment alleviates liver fibrosis. Acta Pharm Sin B. 2019 May;9(3):526-536.）。また、プロジェクトチームによる予備研究では、肝細胞においてＦＸＲタンパク質とＣａｓｐａｓｅ８タンパク質との間に安定したタンパク質間相互作用が存在することが示された。肝細胞がアポトーシスによって刺激されると、ＦＸＲとＣａｓｐａｓｅ８タンパク質との間の相互作用が弱まり、Ｃａｓｐａｓｅ８がＦＡＤＤ及びＲＩＰ１と結合してアポトーシス複合体を形成する。この複合体はＣａｓｐａｓｅ８の切断活性化を促進し、アポトーシスのプロセスを促進する（Noncanonical farnesoid X receptor signaling inhibits apoptosis and impedes liver fibrosis.EBioMedicine. 2018 Nov;37:322-333.）。したがって、ＦＸＲタンパク質とＣａｓｐａｓｅ８タンパク質の間の相互作用を安定化し強化することは、アポトーシスシグナル伝達及びアポトーシスの発生と進行をブロックするための重要な戦略である。しかし、ＦＸＲタンパク質とＣａｓｐａｓｅ８タンパク質との間の相互作用がどのように制御されるのかはまだ不明であり、現時点ではＦＸＲとＣａｓｐａｓｅ８タンパク質との間の相互作用のための制御剤はない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
発明の目的：本発明の目的は、ＦＸＲタンパク質とＣａｓｐａｓｅ８タンパク質との間の相互作用のエンハンサの調製における、エンハンサ３Ｃ１の使用を提供することである。本発明の別の目的は、ＦＸＲタンパク質とＣａｓｐａｓｅ８タンパク質との間の相互作用のエンハンサとしての肝線維症・肝損傷治療薬の調製におけるエンハンサ３Ｃ１の使用を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0007】
技術的解決手段：ＦＸＲタンパク質とＣａｓｐａｓｅ８タンパク質との間の相互作用のエンハンサの調製における本発明の式（１）で示されるエンハンサ３Ｃ１の使用。
【0008】
【化1】
【0009】
前記エンハンサ３Ｃ１は、生理学的又は病理学的状態でのＦＸＲタンパク質とＣａｓｐａｓｅ８タンパク質との間の相互作用を促進する。
【0010】
前記エンハンサは、Ｃａｓｐａｓｅ８タンパク質のアポトーシス複合体への動員をブロックすることにより、アポトーシス複合体の形成をブロックする。
【0011】
前記エンハンは、Ｃａｓｐａｓｅ８タンパク質の切断活性化をサブロックする。
【0012】
前記エンハンサは、薬学的に許容される補助材料を添加して製剤を調製する。
【0013】
前記薬学的に許容される補助材料は、希釈剤、バインダ、崩壊剤、流動促進剤、滑沢剤、矯味剤、封入材、及び吸着材を含む。
【0014】
前記製剤は、顆粒剤、散剤、錠剤、カプセル剤、丸剤、及び経口液剤である。
【0015】
前記エンハンサ３Ｃ１のＦＸＲタンパク質とＣａｓｐａｓｅ８タンパク質との間の相互作用のエンハンサとしての肝細胞アポトーシスに抵抗する薬の調製における使用。
【0016】
前記エンハンサ３Ｃ１のＦＸＲタンパク質とＣａｓｐａｓｅ８タンパク質との間の相互作用のエンハンサとしての肝保護薬の調製における使用。
【0017】
前記エンハンサ３Ｃ１のＦＸＲタンパク質とＣａｓｐａｓｅ８タンパク質との間の相互作用のエンハンサとしての肝線維症・肝損傷治療薬の調製における使用。
【発明の効果】
【0018】
従来技術と比較して、本発明には次の顕著な利点がある。（１）このエンハンサは、生理学的状態でＦＸＲタンパク質とＣａｓｐａｓｅ８タンパク質との間の相互作用を強化することができ、対照群とは有意差があり、最適な場合、＊＊＊Ｐ＜０．００１に達する。（２）このエンハンサは、アポトーシス状態で弱まったＦＸＲタンパク質とＣａｓｐａｓｅ８タンパク質との間の相互作用を回復し、強化することができる。（３）このエンハンサは、さまざまな原因によって引き起こされる肝細胞アポトーシスに抵抗することができ、対照群とは有意差があり、最適な場合、＊＊＊Ｐ＜０．００１に達する。（４）このエンハンサは、標的が正確で、特異性が高く、的確性が高く、適応症が多く、肝細胞アポトーシス表現型を伴うさまざまな肝疾患を治療するための薬物の調製に用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【0019】
【図1】細胞アポトーシス状態におけるＦＸＲタンパク質とＣａｓｐａｓｅ８タンパク質との間の相互作用である。
【図2】本願のエンハンサ３Ｃ１による、健康な細胞におけるＦＸＲタンパク質とＣａｓｐａｓｅ８タンパク質との間の相互作用の制御である。
【図3】本願のエンハンサ３Ｃ１による、アポトーシス細胞におけるＦＸＲタンパク質とＣａｓｐａｓｅ８タンパク質との間の相互作用の制御である。
【図4】細胞アポトーシスに対する本願のエンハンサ３Ｃ１の保護作用であり、（Ａ）ＡｃｔＤ／ＴＮＦαによって引き起こされる肝細胞アポトーシス、（Ｂ）ＣＨＸ／ＦａｓＬによって引き起こされる肝細胞アポトーシス、（Ｃ）ＴＲＡＩＬによって引き起こされる肝細胞アポトーシス。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図5A】ＣＣｌ４によって引き起こされる肝損傷に対する本願のエンハンサ３Ｃ１の保護作用であり、（Ａ）血清ＡＬＴレベル、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図5B】ＣＣｌ４によって引き起こされる肝損傷に対する本願のエンハンサ３Ｃ１の保護作用であり、（Ｂ）血清ＡＳＴレベル、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図5C】ＣＣｌ４によって引き起こされる肝損傷に対する本願のエンハンサ３Ｃ１の保護作用であり、（Ｃ）肝Ｈ＆Ｅ染色、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図5D】ＣＣｌ４によって引き起こされる肝損傷に対する本願のエンハンサ３Ｃ１の保護作用であり、（Ｄ）肝Ｓｉｒｉｕｓ ｒｅｄ染色、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図5E】ＣＣｌ４によって引き起こされる肝損傷に対する本願のエンハンサ３Ｃ１の保護作用であり、（Ｅ）肝Ｔｉｍｐ１のｍＲＮＡレベル、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図5F】ＣＣｌ４によって引き起こされる肝損傷に対する本願のエンハンサ３Ｃ１の保護作用であり、（Ｆ）肝Ｔｉｍｐ２のｍＲＮＡレベル、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【発明を実施するための形態】
【0020】
実施例１
細胞アポトーシス状態におけるＦＸＲタンパク質とＣａｓｐａｓｅ８タンパク質との間の相互作用の変化
１．実験材料
ＤＭＥＭ培地はＧＩＢＣＯ（Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＵＳＡ）から購入した。ウシ胎児血清（ＦＢＳ：Ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ）は、Ｈｙｃｌｏｎｅ（Ｌｏｇａｎ，Ｕｔａｈ，ＵＳＡ）から購入した。トリプシンＴｒｙｐｓｉｎは、Ａｍｅｒｓｃｏ（Ｓｏｌｏｎ，Ｏｈｉｏ，ＵＳＡ）から購入した。細胞培養消耗品はＣｏｓｔａｒ（ＵＳＡ）から購入した。アクチノマイシンＤ（ＡｃｔＤ：Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ）及びシクロヘキシミド（ＣＨＸ：ｃｙｃｌｏｈｅｘｉｍｉｄｅ）は、ＭｅｄＣｈｅｍ Ｅｘｐｒｅｓｓ（ＮＪ，ＵＳＡ）から購入した。組換えヒト腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα：Ｔｕｍｏｒ Ｎｅｃｒｏｓｉｓ Ｆａｃｔｏｒ ａｌｐｈａ）はＰｅｐｒｏｔｅｃｈ社（Ｒｏｃｋｙ Ｈｉｌｌ，ＵＳＡ）から購入し、組換えヒトＦａｓＬタンパク質及び組換えヒトＴＲＡＩＬタンパク質はＳｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ社（Ｗａｙｎｅ，ＰＡ，ＵＳＡ）から購入した。
細胞アポトーシス状態におけるＦＸＲタンパク質とＣａｓｐａｓｅ８タンパク質との間の相互作用の変化
１．実験材料
ＤＭＥＭ培地はＧＩＢＣＯ（Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＵＳＡ）から購入した。ウシ胎児血清（ＦＢＳ：Ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ）は、Ｈｙｃｌｏｎｅ（Ｌｏｇａｎ，Ｕｔａｈ，ＵＳＡ）から購入した。トリプシンＴｒｙｐｓｉｎは、Ａｍｅｒｓｃｏ（Ｓｏｌｏｎ，Ｏｈｉｏ，ＵＳＡ）から購入した。細胞培養消耗品はＣｏｓｔａｒ（ＵＳＡ）から購入した。アクチノマイシンＤ（ＡｃｔＤ：Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ）及びシクロヘキシミド（ＣＨＸ：ｃｙｃｌｏｈｅｘｉｍｉｄｅ）は、ＭｅｄＣｈｅｍ Ｅｘｐｒｅｓｓ（ＮＪ，ＵＳＡ）から購入した。組換えヒト腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα：Ｔｕｍｏｒ Ｎｅｃｒｏｓｉｓ Ｆａｃｔｏｒ ａｌｐｈａ）はＰｅｐｒｏｔｅｃｈ社（Ｒｏｃｋｙ Ｈｉｌｌ，ＵＳＡ）から購入し、組換えヒトＦａｓＬタンパク質及び組換えヒトＴＲＡＩＬタンパク質はＳｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ社（Ｗａｙｎｅ，ＰＡ，ＵＳＡ）から購入した。
【0021】
２．実験方法
２．１．細胞培養及び投与処理
ヒト肝細胞株Ｌ０２を１０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ完全培地で培養し、３７℃、５％ＣＯ２の細胞インキュベータに入れて培養し、対数増殖期の細胞を２×１０５細胞／ウェルで１２ウェルプレートに播種した。２４ｈ後、ＴＲＡＩＬ、ＡｃｔＤ／ＴＮＦα、及びＣＨＸ／ＦａｓＬ法を使用してアポトーシスモデルを作成した。ＴＲＡＩＬの投与濃度は５０ｎｇ／ｍｌ、ＴＲＡＩＬによる処理時間は０、２、４、８、１２、２４ｈであった。ＡｃｔＤ／ＴＮＦαの投与濃度は０．２μＭ及び２０ｎｇ／ｍｌであり、ＡｃｔＤは３０ｍｉｎ事前投与され、ＡｃｔＤによる処理時間は０、１、２、４、８及び１２ｈであった。ＣＨＸ／ＦａｓＬの投与濃度は５０μＭ及び５０ｎｇ／ｍｌであり、ＣＨＸは３０ｍｉｎ事前投与され、ＣＨＸによる処理時間は０、２、４及び８ｈであった。
２．１．細胞培養及び投与処理
ヒト肝細胞株Ｌ０２を１０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ完全培地で培養し、３７℃、５％ＣＯ２の細胞インキュベータに入れて培養し、対数増殖期の細胞を２×１０５細胞／ウェルで１２ウェルプレートに播種した。２４ｈ後、ＴＲＡＩＬ、ＡｃｔＤ／ＴＮＦα、及びＣＨＸ／ＦａｓＬ法を使用してアポトーシスモデルを作成した。ＴＲＡＩＬの投与濃度は５０ｎｇ／ｍｌ、ＴＲＡＩＬによる処理時間は０、２、４、８、１２、２４ｈであった。ＡｃｔＤ／ＴＮＦαの投与濃度は０．２μＭ及び２０ｎｇ／ｍｌであり、ＡｃｔＤは３０ｍｉｎ事前投与され、ＡｃｔＤによる処理時間は０、１、２、４、８及び１２ｈであった。ＣＨＸ／ＦａｓＬの投与濃度は５０μＭ及び５０ｎｇ／ｍｌであり、ＣＨＸは３０ｍｉｎ事前投与され、ＣＨＸによる処理時間は０、２、４及び８ｈであった。
【0022】
２．２ 免疫共沈降（Ｃｏ－ＩＰ）
１）予冷したＰＢＳで細胞を２回洗浄し、最後に適量の予冷したＰＢＳを加え、予冷したセルスクレーパーを使用して培養皿又は培養ボトルから細胞をこすり取り、懸濁液を１．５ｍｌ ＥＰチューブに移した。４℃、４０００ｒｐｍで５ｍｉｎ遠心分離し、上清を捨て、適量のＮＰ４０溶解液を加えて均一に振盪し、１回あたり５秒、合計３回超音波で細胞を破砕し、細胞を完全に溶解した。次に、４℃、１４,０００ｇで１０ｍｉｎ遠心分離し、上清を新しいＥＰチューブに集めると、タンパク質溶解液を得た。ＢＣＡ法によりタンパク質濃度を測定した。
１）予冷したＰＢＳで細胞を２回洗浄し、最後に適量の予冷したＰＢＳを加え、予冷したセルスクレーパーを使用して培養皿又は培養ボトルから細胞をこすり取り、懸濁液を１．５ｍｌ ＥＰチューブに移した。４℃、４０００ｒｐｍで５ｍｉｎ遠心分離し、上清を捨て、適量のＮＰ４０溶解液を加えて均一に振盪し、１回あたり５秒、合計３回超音波で細胞を破砕し、細胞を完全に溶解した。次に、４℃、１４,０００ｇで１０ｍｉｎ遠心分離し、上清を新しいＥＰチューブに集めると、タンパク質溶解液を得た。ＢＣＡ法によりタンパク質濃度を測定した。
【0023】
２）２５μｌのＰｒｏｔｅｉｎ Ａ Ｂｅａｄｓを取り、５％ＢＳＡを用いて室温で１ｈブロックし、ＰＢＳで３回洗浄し、毎回１４,０００ｇで１ｍｉｎ遠心分離し、上清を捨てた。均一な濃度のタンパク質溶解液をＢｅａｄｓに加え、４℃で１ｈ振盪し、サンプルをプレクリア（Ｐｒｅ－Ｃｌｅａｒ）した。１４,０００ｇで１ｍｉｎ遠心分離し、上清を新しいＥＰチューブに移した。Ｃａｓｐａｓｅ８抗体とＩｇＧをタンパク質溶解液に加え、４℃のシェーカーで一晩振盪し、抗原－抗体複合体を調製した。翌日、Ｂｅａｄｓを２回洗浄した後、１４,０００ｇ、４℃で１ｍｉｎ遠心分離した。次に、Ａｇ－Ａｂ混合物をＢｅａｄｓに加え、４℃のシェーカーで３ｈ時間振盪し、Ｂｅａｄｓ－抗原－抗体複合体を調製した。次に、１４,０００ｇ、４℃で１ｍｉｎ遠心分離した。上清を捨て、底部のもの（Ｂｅａｄｓ）を残した。Ｂｅａｄｓを３回洗浄し、瞬間遠心分離をした。２×Ｌｏａｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（３０μｌ）をＢｅａｄｓに加え、沸騰水中で５ｍｉｎ沸騰させ、１２，０００ｒｐｍで５ｍｉｎ遠心分離した。Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ及びゲルイメージング分析を実施した。
【0024】
２．３ Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ
１）細胞を収集して氷上に置き、１００μｌのＲＩＰＡ細胞溶解液、１％Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｃｏｃｋｔａｉｌ（Ｓｉｇｍａ）、及び１％ホスファターゼ阻害剤を、２０μｌの充填細胞容量ごとに加えた。凝集塊を十分にピペッティングし、氷上で３０ｍｉｎ溶解した後、超音波破砕を２ｓずつ５回行い、途中溶解液が冷めるまで数秒間停止した。１３,０００ｇで１０ｍｉｎ遠心分離し、得られた上清を抽出された総タンパク質サンプルとして新しい遠心分離チューブに移し、ＢＣＡ法を使用してタンパク質含有量を測定し、４×ｌｏａｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒを加え、均一に混合し、１０ｍｉｎ煮沸させ、ローディングに備えた。
１）細胞を収集して氷上に置き、１００μｌのＲＩＰＡ細胞溶解液、１％Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｃｏｃｋｔａｉｌ（Ｓｉｇｍａ）、及び１％ホスファターゼ阻害剤を、２０μｌの充填細胞容量ごとに加えた。凝集塊を十分にピペッティングし、氷上で３０ｍｉｎ溶解した後、超音波破砕を２ｓずつ５回行い、途中溶解液が冷めるまで数秒間停止した。１３,０００ｇで１０ｍｉｎ遠心分離し、得られた上清を抽出された総タンパク質サンプルとして新しい遠心分離チューブに移し、ＢＣＡ法を使用してタンパク質含有量を測定し、４×ｌｏａｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒを加え、均一に混合し、１０ｍｉｎ煮沸させ、ローディングに備えた。
【0025】
２）３％～５％のスタッキングゲルと６％～１２％の分解ゲルのＳＤＳ－ＰＡＧＥを調製し、電気泳動でタンパク質サンプルを分離した。サンプルを十分に振盪し、各サンプルから同量の５０～１００μｇの総タンパク質をローディングした。電気泳動は、スタッキングゲルでは７５Ｖで４０ｍｉｎ、分解ゲルでは１１５Ｖで６０ｍｉｎの勾配で実行された。セミドライ転写条件でタンパク質の転写を行い、ろ紙、カットゲル、及びＰＶＤＦメンブレンをセミドライ転写緩衝液で平衡化した。濾紙をセミドライト転写タンクに平らに置き、その上にＰＶＤＦメンブレン、ゲル、及びもう一枚の濾紙を順番に置き、すべての層の間の気泡を注意深く取り除いた。セミドライ転写用のカバーをタンクにかぶせ、定電圧を２５Ｖに設定し、３０ｍｉｎ転写した。
【0026】
３）転写後、ＰＶＤＦメンブレンをＴＢＳＴ溶液で調製した５％脱脂粉乳ブロック溶液中でブロックし、３７℃で１ｈブロックした。ブロック溶液で調製した適量の一次抗体を１００μｌ／ｃｍ２ ＰＶＤＦの相対量で加え、４℃で一晩インキュベートした。ＰＶＤＦメンブレンをＴＢＳＴ溶液で５ｍｉｎずつ４回洗浄した。メンブレンをＨＲＰ－結合二次抗体希釈液中で３７℃で６０ｍｉｎインキュベートし、ＰＶＤＦメンブレンをＴＢＳＴ溶液で５ｍｉｎずつ４回洗浄した。
【0027】
４）ＣｈｅｍｉＤｏｃＴＭ ＸＲＳ＋ゲルイメージングシステム（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を使用して露光し、Ｉｍａｇｅ Ｌａｂ ＴＭソフトウェアを使用して濃度測定分析と半定量比較を行った。
【0028】
３．実験結果
図１に示すように、生理的条件下ではＦＸＲタンパク質とＣａｓｐａｓｅ８タンパク質との間に相互作用があるが、ＡｃｔＤ／ＴＮＦα誘発アポトーシスモデルではＦＸＲとＣａｓｐａｓｅ８との間の相互作用が弱まった。
図１に示すように、生理的条件下ではＦＸＲタンパク質とＣａｓｐａｓｅ８タンパク質との間に相互作用があるが、ＡｃｔＤ／ＴＮＦα誘発アポトーシスモデルではＦＸＲとＣａｓｐａｓｅ８との間の相互作用が弱まった。
【0029】
実施例２
ＦＸＲタンパク質とＣａｓｐａｓｅ８タンパク質との間の相互作用に対するエンハンサ３Ｃ１の制御
１．実験材料
化合物３Ｃ１は、ＴａｒｇｅｔＭｏｌ社から購入し、次の構造式を持っている。
残りの試薬は実施例１と同様である。
ＦＸＲタンパク質とＣａｓｐａｓｅ８タンパク質との間の相互作用に対するエンハンサ３Ｃ１の制御
１．実験材料
化合物３Ｃ１は、ＴａｒｇｅｔＭｏｌ社から購入し、次の構造式を持っている。
【化2】
【0030】
２．実験方法
２．１ 細胞培養及び投与処理
ヒト肝細胞株Ｌ０２を１０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ完全培地で培養し、３７℃、５％ＣＯ２の細胞インキュベータに入れて培養した。
２．１ 細胞培養及び投与処理
ヒト肝細胞株Ｌ０２を１０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ完全培地で培養し、３７℃、５％ＣＯ２の細胞インキュベータに入れて培養した。
【0031】
２．２ 生理学的状態におけるＦＸＲ－Ｃａｓｐａｓｅ８タンパク質相互作用に対する化合物３Ｃ１の制御作用
対数増殖期の細胞を２×１０５細胞／ウェルで６ウェルプレートに播種した。２４ｈ後、異なる濃度の化合物３Ｃ１（１μＭ、１０μＭ、及び１００μＭ）を投与し、２ｈ後に細胞を回収した。
対数増殖期の細胞を２×１０５細胞／ウェルで６ウェルプレートに播種した。２４ｈ後、異なる濃度の化合物３Ｃ１（１μＭ、１０μＭ、及び１００μＭ）を投与し、２ｈ後に細胞を回収した。
【0032】
２．３ アポトーシス状態におけるＦＸＲ－Ｃａｓｐａｓｅ８タンパク質相互作用に対する化合物３Ｃ１の制御作用
対数増殖期の細胞を２×１０５細胞／ウェルで６ウェルプレートに播種した。アポトーシスの誘導方法は実施例１と同様である。アポトーシス誘導剤を投与しながら、異なる濃度の化合物３Ｃ１（１μＭ、１０μＭ、及び１００μＭ）を投与し、２ｈ後に細胞を収集した。
対数増殖期の細胞を２×１０５細胞／ウェルで６ウェルプレートに播種した。アポトーシスの誘導方法は実施例１と同様である。アポトーシス誘導剤を投与しながら、異なる濃度の化合物３Ｃ１（１μＭ、１０μＭ、及び１００μＭ）を投与し、２ｈ後に細胞を収集した。
【0033】
２．４ Ｃｏ－ＩＰ
実施例１と同様である。
実施例１と同様である。
【0034】
２．５ Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ
実施例１と同様である。
実施例１と同様である。
【0035】
３．実験結果
３．１ 生理学的状態におけるＦＸＲ－Ｃａｓｐａｓｅ８タンパク質相互作用に対する化合物３Ｃ１の制御作用
図２に示すように、正常細胞では、化合物３Ｃ１の投与により、ＦＸＲタンパク質とＣａｓｐａｓｅ８タンパク質との間の相互作用が大幅に強化され、この作用は用量依存的である。
３．１ 生理学的状態におけるＦＸＲ－Ｃａｓｐａｓｅ８タンパク質相互作用に対する化合物３Ｃ１の制御作用
図２に示すように、正常細胞では、化合物３Ｃ１の投与により、ＦＸＲタンパク質とＣａｓｐａｓｅ８タンパク質との間の相互作用が大幅に強化され、この作用は用量依存的である。
【0036】
３．２ アポトーシス状態におけるＦＸＲ－Ｃａｓｐａｓｅ８タンパク質相互作用に対する化合物３Ｃ１の制御作用
実施例１に記載したように、ＦＸＲ－Ｃａｓｐａｓｅ８タンパク質相互作用は、アポトーシス状態では下方制御された。図３に示すように、ＡｃｔＤ／ＴＮＦα誘発Ｌ０２のアポトーシス状態では、ＦＸＲタンパク質とＣａｓｐａｓｅ８タンパク質との間の相互作用が弱まり、化合物３Ｃ１はこれに対して顕著な逆転効果をもたらす。
上記の結果は、化合物３Ｃ１がＦＸＲとＣａｓｐａｓｅ８タンパク質との間の相互作用のエンハンサであることを確認した。
実施例１に記載したように、ＦＸＲ－Ｃａｓｐａｓｅ８タンパク質相互作用は、アポトーシス状態では下方制御された。図３に示すように、ＡｃｔＤ／ＴＮＦα誘発Ｌ０２のアポトーシス状態では、ＦＸＲタンパク質とＣａｓｐａｓｅ８タンパク質との間の相互作用が弱まり、化合物３Ｃ１はこれに対して顕著な逆転効果をもたらす。
上記の結果は、化合物３Ｃ１がＦＸＲとＣａｓｐａｓｅ８タンパク質との間の相互作用のエンハンサであることを確認した。
【0037】
実施例３
細胞アポトーシスに対するエンハンサ３Ｃ１の薬理活性
１．実験材料
メチルチアゾリルジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ：Ｍｅｔｈｙｌｔｈｉａｚｏｌｙｌｄｉｐｈｅｎｙｌ－ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ）は、ＭｅｄＣｈｅｍ Ｅｘｐｒｅｓｓ（ＮＪ，ＵＳＡ）から購入した。
残りの試薬は実施例１と同様である。
細胞アポトーシスに対するエンハンサ３Ｃ１の薬理活性
１．実験材料
メチルチアゾリルジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ：Ｍｅｔｈｙｌｔｈｉａｚｏｌｙｌｄｉｐｈｅｎｙｌ－ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ）は、ＭｅｄＣｈｅｍ Ｅｘｐｒｅｓｓ（ＮＪ，ＵＳＡ）から購入した。
残りの試薬は実施例１と同様である。
【0038】
２．実験方法
２．１ 細胞培養、トランスフェクション及び投与処理
ヒト肝細胞株Ｌ０２を１０％牛胎児血清を含むＤＭＥＭ完全培地で培養し、３７℃、５％ＣＯ２の細胞インキュベータに入れて培養し、対数増殖期の細胞を５×１０３細胞／ウェルで９６ウェルプレートに播種した。２４ｈ後、細胞に５０ｎＭでトランスミッションし、トランスフェクションの４８時間後にアポトーシスモデリングを実行した。具体的な方法は以下の通りである。ＴＲＡＩＬの投与濃度は５０ｎｇ／ｍｌ、ＴＲＡＩＬによる処理時間は２４時間であった。ＡｃｔＤ／ＴＮＦαの投与濃度は０．２μＭ及び２０ｎｇ／ｍｌであり、ＡｃｔＤは３０ｍｉｎ事前投与され、ＡｃｔＤによる処理時間は８ｈであった。ＣＨＸ／ＦａｓＬの投与濃度は５０μＭ及び５０ｎｇ／ｍｌであり、ＣＨＸは３０ｍｉｎ事前投与され、ＣＨＸによる処理時間は８ｈであった。
細胞にアポトーシス試薬を与える一方で、異なる濃度の化合物３Ｃ１：１μＭ、１０μＭ、及び１００μＭを与えた。
２．１ 細胞培養、トランスフェクション及び投与処理
ヒト肝細胞株Ｌ０２を１０％牛胎児血清を含むＤＭＥＭ完全培地で培養し、３７℃、５％ＣＯ２の細胞インキュベータに入れて培養し、対数増殖期の細胞を５×１０３細胞／ウェルで９６ウェルプレートに播種した。２４ｈ後、細胞に５０ｎＭでトランスミッションし、トランスフェクションの４８時間後にアポトーシスモデリングを実行した。具体的な方法は以下の通りである。ＴＲＡＩＬの投与濃度は５０ｎｇ／ｍｌ、ＴＲＡＩＬによる処理時間は２４時間であった。ＡｃｔＤ／ＴＮＦαの投与濃度は０．２μＭ及び２０ｎｇ／ｍｌであり、ＡｃｔＤは３０ｍｉｎ事前投与され、ＡｃｔＤによる処理時間は８ｈであった。ＣＨＸ／ＦａｓＬの投与濃度は５０μＭ及び５０ｎｇ／ｍｌであり、ＣＨＸは３０ｍｉｎ事前投与され、ＣＨＸによる処理時間は８ｈであった。
細胞にアポトーシス試薬を与える一方で、異なる濃度の化合物３Ｃ１：１μＭ、１０μＭ、及び１００μＭを与えた。
【0039】
２．２ 細胞生存率の検出
投与時間が終了した後、ＭＴＴ（５ｍｇ／ｍｌ）２０μｌを各ウェルに加え、３７℃で４ｈインキュベートし続け、培地を吸引して廃棄し、ＤＭＳＯ １５０μｌを各ウェルに加え、３７℃で１０ｍｉｎインキュベートし、４９０ｎｍの波長で吸光度を測定した。
投与時間が終了した後、ＭＴＴ（５ｍｇ／ｍｌ）２０μｌを各ウェルに加え、３７℃で４ｈインキュベートし続け、培地を吸引して廃棄し、ＤＭＳＯ １５０μｌを各ウェルに加え、３７℃で１０ｍｉｎインキュベートし、４９０ｎｍの波長で吸光度を測定した。
【0040】
３．実験結果
図４に示すように、ＦＸＲ－Ｃａｓｐａｓｅ８タンパク質相互作用エンハンサ３Ｃ１は、ＴＲＡＩＬ（図４Ａ）、ＡｃｔＤ／ＴＮＦα（図４Ｂ）、及びＣＨＸ／ＦａｓＬ（図４Ｃ）の３つの古典的なアポトーシスモデルにおいて顕著な抗細胞アポトーシス効果を示した。この抗細胞アポトーシス効果は、用量依存的である。
図４に示すように、ＦＸＲ－Ｃａｓｐａｓｅ８タンパク質相互作用エンハンサ３Ｃ１は、ＴＲＡＩＬ（図４Ａ）、ＡｃｔＤ／ＴＮＦα（図４Ｂ）、及びＣＨＸ／ＦａｓＬ（図４Ｃ）の３つの古典的なアポトーシスモデルにおいて顕著な抗細胞アポトーシス効果を示した。この抗細胞アポトーシス効果は、用量依存的である。
【0041】
実施例４
ＣＣｌ４によって引き起こされる肝損傷に対するエンハンサ３Ｃ１の保護作用
１．実験材料
実験マウス（Ｃ５７ＢＬ／６）は、北京維通利華実験動物技術有限公司から購入した。
ＣＣｌ４は上海凌峰化学試薬公司から購入し、鉱油はＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社から購入し、Ｔｒｉｚｏｌ ＲＮＡｉｓｏｐｌｕｓはＴａｋａｒａ社から購入し、逆転写キット及びＳＹＢＲ ＧｒｅｅｎはＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社から購入し、使用したプライマーはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（中国、上海）社によって設計、合成された。ＤＥＰＣ水はＢｅｙｏｔｉｍｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（中国、上海）から購入した。
残りの生物学的材料／試薬は市販品として入手できる。
残りの実験材料は実施例１と同様である。
ＣＣｌ４によって引き起こされる肝損傷に対するエンハンサ３Ｃ１の保護作用
１．実験材料
実験マウス（Ｃ５７ＢＬ／６）は、北京維通利華実験動物技術有限公司から購入した。
ＣＣｌ４は上海凌峰化学試薬公司から購入し、鉱油はＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社から購入し、Ｔｒｉｚｏｌ ＲＮＡｉｓｏｐｌｕｓはＴａｋａｒａ社から購入し、逆転写キット及びＳＹＢＲ ＧｒｅｅｎはＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社から購入し、使用したプライマーはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（中国、上海）社によって設計、合成された。ＤＥＰＣ水はＢｅｙｏｔｉｍｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（中国、上海）から購入した。
残りの生物学的材料／試薬は市販品として入手できる。
残りの実験材料は実施例１と同様である。
【0042】
２．実験方法
２．１ ＣＣｌ４誘発マウス肝損傷に対するエンハンサ３Ｃ１の作用
実験前に、Ｃ５７ＢＬ／６マウスを室温２２～２６℃、相対湿度４０％～６０％、明暗を１２ｈ交互に変えながら１週間適応的に飼育した。全てのマウスを別々のケージに収容し、水と餌を自由に摂取させ、体重を２０～２２ｇに維持した。この実験は、空白対照群、モデル群、３Ｃ１低用量投与群（５ｍｇ／ｋｇ）、及び３Ｃ１高用量投与群（１０ｍｇ／ｋｇ）に分けた。
２．１ ＣＣｌ４誘発マウス肝損傷に対するエンハンサ３Ｃ１の作用
実験前に、Ｃ５７ＢＬ／６マウスを室温２２～２６℃、相対湿度４０％～６０％、明暗を１２ｈ交互に変えながら１週間適応的に飼育した。全てのマウスを別々のケージに収容し、水と餌を自由に摂取させ、体重を２０～２２ｇに維持した。この実験は、空白対照群、モデル群、３Ｃ１低用量投与群（５ｍｇ／ｋｇ）、及び３Ｃ１高用量投与群（１０ｍｇ／ｋｇ）に分けた。
【0043】
３Ｃ１低用量投与群及び３Ｃ１高用量投与群のＣ５７ＢＬ／６マウスには、５ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ又は１０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙの３Ｃ１を腹腔内注射により前投与した。残りの群には同じ用量のビヒクル対照を与えた。３日後にＣＣｌ４モデリングを行い、空白対照群には同じ用量の鉱油を与えた。４８ｈ後にマウスを安楽死させた。マウスの血液と肝を採取した。
【0044】
２．２ 血清トランスアミナーゼの検出
全血を室温で０．５ｈ静置した後、８,０００ｒｐｍで１０ｍｉｎ遠心分離し、上清を新しいＥＰチューブに移して血清を得た。血清ＡＬＴ及びＡＳＴは、ＡＬＴ及びＡＳＴキットの説明書に従って検出された。
全血を室温で０．５ｈ静置した後、８,０００ｒｐｍで１０ｍｉｎ遠心分離し、上清を新しいＥＰチューブに移して血清を得た。血清ＡＬＴ及びＡＳＴは、ＡＬＴ及びＡＳＴキットの説明書に従って検出された。
【0045】
２．３ ＲＴ－ＰＣＲ
２．３．１ 動物組織サンプルからの総ＲＮＡの抽出
１）各マウスから肝組織サンプル２０ｍｇを量り、ＲＮＡｉｓｏ Ｐｌｕｓ １．０ｍｌを加え、ホモジナイザーでホモジナイズし、ホモジナイズ液を遠心分離管に移し、室温で５ｍｉｎ放置した後、１２，０００ｇ、４℃で５ｍｉｎ遠心分離した。
２．３．１ 動物組織サンプルからの総ＲＮＡの抽出
１）各マウスから肝組織サンプル２０ｍｇを量り、ＲＮＡｉｓｏ Ｐｌｕｓ １．０ｍｌを加え、ホモジナイザーでホモジナイズし、ホモジナイズ液を遠心分離管に移し、室温で５ｍｉｎ放置した後、１２，０００ｇ、４℃で５ｍｉｎ遠心分離した。
【0046】
２）上清８００μｌを移し、クロロホルム１６０μｌを加え、１５ｓ激しく振盪し、室温で５ｍｉｎ放置し、１２，０００ｇで１５ｍｉｎ遠心分離した。サンプルは、黄色の有機相である下層、無色の水相である上層、及び中間層の３層に分かれている。
【0047】
３）上層水相３００μｌを新しいチューブに慎重に移し、イソプロピルアルコール３００μｌを加え、逆様にして均一に混和し、室温で１０ｍｉｎ放置し、１２，０００ｇで１０ｍｉｎ遠心分離し、上清を捨てた。
【0048】
４）ＲＮＡ沈殿を予冷した７５％エタノール１．０ｍｌで洗浄し、１２，０００ｇで５ｍｉｎ遠心分離した。上清を捨てて総ＲＮＡを得、ＤＥＰＣ水２０μｌに再溶解し、定量化後、０．５μｇ／μｌに希釈した。
【0049】
２．３．２ 逆転写
説明書に記載されているシステム比率に従って、ＲＮＡ溶液とキットの成分を合計２０μｌのシステムにし、プログラム温度を設定して逆転写した。特定の比率要件は次のとおりである。
説明書に記載されているシステム比率に従って、ＲＮＡ溶液とキットの成分を合計２０μｌのシステムにし、プログラム温度を設定して逆転写した。特定の比率要件は次のとおりである。
【0050】
【表A】
【0051】
２．３．３ＰＣＲ
ＰＣＲ系は以下の通りである。
ＰＣＲ系は以下の通りである。
【表B】
【0052】
ＰＣＲの使用条件は以下のとおりである。
Ｓｔａｇｅ １：予備変性、９５℃、１ｍｉｎ
Ｓｔａｇｅ ２：ＰＣＲ反応、９５℃、１５ｓ、たとえば、６０℃、３０ｓ、４０サイクル；７２℃、３０ｓ
Ｓｔａｇｅ ３：融解曲線分析６５～９５℃、０．５℃／５ｓｅｃ
Ｓｔａｇｅ １：予備変性、９５℃、１ｍｉｎ
Ｓｔａｇｅ ２：ＰＣＲ反応、９５℃、１５ｓ、たとえば、６０℃、３０ｓ、４０サイクル；７２℃、３０ｓ
Ｓｔａｇｅ ３：融解曲線分析６５～９５℃、０．５℃／５ｓｅｃ
【0053】
２．３．４ 蛍光定量ＰＣＲで使用されるプライマーを以下の表１に示す。
【表1】
【0054】
２．４ 肝の病理学的分析
この部分のＨ＆Ｅ染色とＳｉｒｉｕｓ Ｒｅｄ染色は武漢グーグルバイオテクノロジー社に委託された。
この部分のＨ＆Ｅ染色とＳｉｒｉｕｓ Ｒｅｄ染色は武漢グーグルバイオテクノロジー社に委託された。
【0055】
３ 実験結果
３．１ 血清生化学指標に対するエンハンサ３Ｃ１の作用
図５Ａ及び５Ｂに示すように、ＣＣｌ４は、マウスにおいて血清ＡＬＴ及びＡＳＴレベルの有意な上昇を引き起こすが、エンハンサ３Ｃ１は、ＣＣｌ４注射によって引き起こされる血清ＡＬＴ及びＡＳＴレベルの上昇を有意に低減することができる。
３．１ 血清生化学指標に対するエンハンサ３Ｃ１の作用
図５Ａ及び５Ｂに示すように、ＣＣｌ４は、マウスにおいて血清ＡＬＴ及びＡＳＴレベルの有意な上昇を引き起こすが、エンハンサ３Ｃ１は、ＣＣｌ４注射によって引き起こされる血清ＡＬＴ及びＡＳＴレベルの上昇を有意に低減することができる。
【0056】
３．２ 肝臓病理に対するエンハンサ３Ｃ１の改善作用
肝病理分析及びＨ＆Ｅ染色結果（図５Ｃ）によると、対照群のマウスでは、肝小葉の構造は完全で、肝細胞は中心静脈の周囲に放射状に配置され、線維形成及び炎症細胞は存在しなかった。肝細胞は、サイズが大きく、核が丸く中心にある。ＣＣｌ４の注射後、肝類洞は明らかに充血して拡張し、肝細胞は顆粒状変性を起こし、部分的な肝細胞壊死病巣が多数あり、一部の肝細胞に浮腫と変性や炎症細胞浸潤が認められ、肝臓内の肝小葉構造の一部が破壊され、門脈領域における線維組織の異常な増殖があり、コラーゲン線維は著しく増殖し、帯状の増殖を示した。３Ｃ１投与群では、肝小葉の構造障害が顕著に改善され、炎症細胞の浸潤が減少し、門脈領域のコラーゲン線維が減少した。これは、３Ｃ１に明らかな肝保護作用があることを示している。
肝病理分析のＳｉｒｉｕｓ Ｒｅｄ染色結果（図５Ｄ）によると、対照群の肝では、赤色のコラーゲン線維染色が少なかった。ＣＣｌ４の注射後、門脈領域には多数の赤色コラーゲン線維が存在した。３Ｃ１投与後、肝内の赤色コラーゲン線維の増殖は大幅に改善された。
肝病理分析及びＨ＆Ｅ染色結果（図５Ｃ）によると、対照群のマウスでは、肝小葉の構造は完全で、肝細胞は中心静脈の周囲に放射状に配置され、線維形成及び炎症細胞は存在しなかった。肝細胞は、サイズが大きく、核が丸く中心にある。ＣＣｌ４の注射後、肝類洞は明らかに充血して拡張し、肝細胞は顆粒状変性を起こし、部分的な肝細胞壊死病巣が多数あり、一部の肝細胞に浮腫と変性や炎症細胞浸潤が認められ、肝臓内の肝小葉構造の一部が破壊され、門脈領域における線維組織の異常な増殖があり、コラーゲン線維は著しく増殖し、帯状の増殖を示した。３Ｃ１投与群では、肝小葉の構造障害が顕著に改善され、炎症細胞の浸潤が減少し、門脈領域のコラーゲン線維が減少した。これは、３Ｃ１に明らかな肝保護作用があることを示している。
肝病理分析のＳｉｒｉｕｓ Ｒｅｄ染色結果（図５Ｄ）によると、対照群の肝では、赤色のコラーゲン線維染色が少なかった。ＣＣｌ４の注射後、門脈領域には多数の赤色コラーゲン線維が存在した。３Ｃ１投与後、肝内の赤色コラーゲン線維の増殖は大幅に改善された。
【0057】
３．３ 肝線維化遺伝子に対するエンハンサ３Ｃ１の改善作用
リアルタイムＲＴ－ＰＣＲの結果（図５Ｅ及び５Ｆ）によると、ＣＣｌ４誘発マウス急性肝損傷モデルでは、肝線維化遺伝子Ｔｉｍｐ１及びＴｉｍｐ２ ｍＲＮＡのレベルが有意に上昇し（Ｐ＜０．００１）、エンハンサ３Ｃ１は、Ｔｉｍｐ１及びＴｉｍｐ２のｍＲＮＡレベルを大幅に低下させることができ（Ｐ＜０．００１）、これは用量依存的である。
上記の結果に基づいて、エンハンサ３Ｃ１には明確な肝保護作用があることが示唆された。
リアルタイムＲＴ－ＰＣＲの結果（図５Ｅ及び５Ｆ）によると、ＣＣｌ４誘発マウス急性肝損傷モデルでは、肝線維化遺伝子Ｔｉｍｐ１及びＴｉｍｐ２ ｍＲＮＡのレベルが有意に上昇し（Ｐ＜０．００１）、エンハンサ３Ｃ１は、Ｔｉｍｐ１及びＴｉｍｐ２のｍＲＮＡレベルを大幅に低下させることができ（Ｐ＜０．００１）、これは用量依存的である。
上記の結果に基づいて、エンハンサ３Ｃ１には明確な肝保護作用があることが示唆された。
【0058】
実施例５
５０ｍｇのエンハンサ３Ｃ１を５０ｍｇの微結晶セルロース及び６０ｍｇのデンプンと混合し、湿潤剤として適量の２０％エタノールを使用して軟材にし、常法により造粒し、タルク及びステアリン酸マグネシウムを加えて混合し、錠剤に打錠した。
５０ｍｇのエンハンサ３Ｃ１を５０ｍｇの微結晶セルロース及び６０ｍｇのデンプンと混合し、湿潤剤として適量の２０％エタノールを使用して軟材にし、常法により造粒し、タルク及びステアリン酸マグネシウムを加えて混合し、錠剤に打錠した。
【0059】
５０ｍｇのエンハンサ３Ｃ１を５０ｍｇのデンプン、１０ｍｇのデキストリン、１０ｍｇのスクロースと混合し、湿潤剤として３０％エタノールを使用して軟材にし、湿式造粒して、顆粒剤を製造した。
【0060】
５０ｍｇのエンハンサ３Ｃ１を５０ｍｇのデンプン、１０ｍｇのデキストリン、１０ｍｇのスクロースと混合し、湿潤剤として３０％エタノールを使用して軟材にし、湿式造粒して、カプセルに充填して、カプセル剤を製造した。
【0061】
５０ｍｇのエンハンサ３Ｃ１を４０ｍｇのデンプン及び１０ｍｇのタルクと混合し、従来技術を使用して、散剤を製造した。
【0062】
５０ｍｇのエンハンサ３Ｃ１を１５ｍｇの粉砂糖及び８ｍＬの水と混合し、従来技術を使用してシロップ剤を製造し、次に７０ｍｇのデンプンを加えて、従来技術を使用して丸剤を製造した。
【0063】
５０ｍｇのエンハンサ３Ｃ１、ポビドン、スクロース、及び水を使用して、従来技術を使用して経口液剤を製造した。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5A】
【図5B】
【図5C】
【図5D】
【図5E】
【図5F】
【手続補正書】
【提出日】2024-12-02
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＦＸＲタンパク質とＣａｓｐａｓｅ８タンパク質との間の相互作用のエンハンサの調製における式（１）で示されるエンハンサ３Ｃ１の使用。【化3】
【請求項2】
前記エンハンサ３Ｃ１は、生理学的又は病理学的状態でのＦＸＲタンパク質とＣａｓｐａｓｅ８タンパク質との間の相互作用を促進する、ことを特徴とする請求項１に記載の使用。
【請求項3】
前記エンハンサは、Ｃａｓｐａｓｅ８タンパク質のアポトーシス複合体への動員をブロックすることにより、アポトーシス複合体の形成をブロックする、ことを特徴とする請求項１に記載の使用。
【請求項4】
前記エンハンサは、Ｃａｓｐａｓｅ８タンパク質の切断活性化をサブロックする、ことを特徴とする請求項１に記載の使用。
【請求項5】
前記エンハンサは、薬学的に許容される補助材料を添加して製剤を調製する、ことを特徴とする請求項１に記載の使用。
【請求項6】
前記薬学的に許容される補助材料は、希釈剤、バインダ、崩壊剤、流動促進剤、滑沢剤、矯味剤、封入材、及び吸着材を含む、ことを特徴とする請求項５に記載の使用。
【請求項7】
前記製剤は、顆粒剤、散剤、錠剤、カプセル剤、丸剤、及び経口液剤である、ことを特徴とする請求項５に記載の使用。
【請求項8】
ＦＸＲタンパク質とＣａｓｐａｓｅ８タンパク質との間の相互作用のエンハンサとしての肝細胞アポトーシスに抵抗する薬の調製における式（１）で示されるエンハンサ３Ｃ１の使用。【化4】
【請求項9】
ＦＸＲタンパク質とＣａｓｐａｓｅ８タンパク質との間の相互作用のエンハンサとしての肝保護薬の調製における式（１）で示されるエンハンサ３Ｃ１の使用。【化5】
【請求項10】
ＦＸＲタンパク質とＣａｓｐａｓｅ８タンパク質との間の相互作用のエンハンサとしての肝線維症・肝損傷治療薬の調製における式（１）で示されるエンハンサ３Ｃ１の使用。【化6】
【国際調査報告】