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▶ シェンチェン シンセティカ パイオニアリング カンパニー リミテッドの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-12-26
(54)【発明の名称】抗腫瘍活性を有する改変された細菌
(51)【国際特許分類】
C12N 1/21 20060101AFI20241219BHJP
A61K 35/74 20150101ALI20241219BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20241219BHJP
A61P 37/04 20060101ALI20241219BHJP
C12N 15/31 20060101ALN20241219BHJP
C12N 15/11 20060101ALN20241219BHJP
C12N 15/57 20060101ALN20241219BHJP
C12N 1/20 20060101ALN20241219BHJP
【ＦＩ】
C12N1/21 ZNA
A61K35/74 Z
A61P35/00
A61P37/04
C12N15/31
C12N15/11 Z
C12N15/57
C12N1/20 E
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024541221
(86)(22)【出願日】2023-01-10
(85)【翻訳文提出日】2024-08-28
(86)【国際出願番号】 CN2023071506
(87)【国際公開番号】W WO2023131336
(87)【国際公開日】2023-07-13
(31)【優先権主張番号】202210021722.X
(32)【優先日】2022-01-10
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】524258200
【氏名又は名称】シェンチェン シンセティカ パイオニアリング カンパニー リミテッド
【氏名又は名称原語表記】Ｓｈｅｎｚｈｅｎ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃａ Ｐｉｏｎｅｅｒｉｎｇ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．
(74)【代理人】
【識別番号】100107456
【弁理士】
【氏名又は名称】池田 成人
(74)【代理人】
【識別番号】100162352
【弁理士】
【氏名又は名称】酒巻 順一郎
(74)【代理人】
【識別番号】100123995
【弁理士】
【氏名又は名称】野田 雅一
(72)【発明者】
【氏名】リウ， チェンリ
(72)【発明者】
【氏名】ワン， ズオウェイ
(72)【発明者】
【氏名】グオ， シュエン
(72)【発明者】
【氏名】シェン， ファンチェン
(72)【発明者】
【氏名】ザン， ジョンシェン
(72)【発明者】
【氏名】リ， ヤン
(72)【発明者】
【氏名】チェン， チエン
【テーマコード（参考）】
4B065
4C087
【Ｆターム（参考）】
4B065AA26X
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA01
4B065BB08
4B065BB12
4B065BC02
4B065BC12
4B065CA44
4C087AA01
4C087AA02
4C087AA03
4C087BC32
4C087BC33
4C087BC34
4C087BC35
4C087BC36
4C087BC37
4C087BC38
4C087BC39
4C087BC54
4C087CA09
4C087CA12
4C087NA14
4C087ZB09
4C087ZB26
(57)【要約】
本発明は、偏性低酸素誘導プロモーターの制御下に必須遺伝子発現カセットを含み、内因性抗酸化性ストレス応答経路に関与するか又はそれを制御する少なくとも１つの遺伝子又はその機能的発現産物を欠損している、抗腫瘍活性を有する改変された細菌に関する。本発明は、改変された細菌を含む医薬組成物及びその抗腫瘍用途とも関連する。
【選択図】 なし
【選択図】 なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
改変された細菌であって、前記細菌が、偏性低酸素誘導プロモーターの制御下に、前記細菌の必須遺伝子を含む低酸素制御型必須遺伝子発現カセットを含み、前記細菌が、非改変型開始株と比較して、内因性抗酸化性ストレス応答経路に関与するか又はそれを制御する少なくとも１つの遺伝子又はその機能的発現産物を欠損している、改変された細菌。
【請求項2】
前記偏性低酸素誘導プロモーターが、ｐｅｐＴｐ、ｆｎｒＳｐ、ｙｓｇＡｐ、ｓｓｂｐ１、Ｈｉｐ１、ＢＢａ＿Ｉ１４０１８、ＢＢａ＿Ｒ１０７４、Ｐｔｅｔ－ａｒｃＡ、及びＰｔｅｔ－Ｆｎｒからなる群から選択される、請求項１に記載の改変された細菌。
【請求項3】
前記偏性低酸素誘導プロモーターがｓｓｂｐ１プロモーターである、請求項１に記載の改変された細菌。
【請求項4】
前記必須遺伝子の発現産物が、前記細菌内での２，６－ジアミノピメリン酸（ＤＡＰ）の合成に関与し、好気条件下で培養される場合、前記細菌の増殖が、培地中に添加される追加のＤＡＰ又はそのアナログに依存する、請求項１～３のいずれか一項に記載の改変された細菌。
【請求項5】
前記必須遺伝子が、ｄａｐＡ、ｄａｐＢ、ｄａｐＤ、ｄａｐＥ、ａｒｇＤ、ｄａｐＦ、及び任意のこれらの組合せから選択される、請求項４に記載の改変された細菌。
【請求項6】
前記必須遺伝子がｄａｐＡ及びｄａｐＥから選択される、請求項４に記載の改変された細菌。
【請求項7】
前記内因性抗酸化性ストレス応答経路に関与するか又はそれを制御する遺伝子が、ＨｔｒＡセリンプロテアーゼファミリー遺伝子である、請求項１～６のいずれか一項に記載の改変された細菌。
【請求項8】
前記内因性抗酸化性ストレス応答経路に関与するか又はそれを制御する遺伝子の機能的発現産物が、ＨｔｒＡセリンプロテアーゼファミリーに関連するタンパク質である、請求項１～７のいずれか一項に記載の改変された細菌。
【請求項9】
前記細菌が、ＨｔｒＡセリンプロテアーゼの活性を欠損している、請求項１～８のいずれか一項に記載の改変された細菌。
【請求項10】
前記内因性抗酸化性ストレス応答経路に関与するか又はそれを制御する遺伝子がｈｔｒＡである、請求項１～９のいずれか一項に記載の改変された細菌。
【請求項11】
前記細菌がｈｔｒＡを欠損している、請求項１～１０のいずれか一項に記載の改変された細菌。
【請求項12】
前記必須遺伝子が細菌染色体内に天然に存在する遺伝子であり、前記必須遺伝子の天然プロモーターが前記偏性低酸素誘導プロモーターと機能的に置き換わり、それによって前記細菌内での前記必須遺伝子の発現が前記偏性低酸素誘導プロモーターの制御下に完全に置かれる、請求項１～１１のいずれか一項に記載の改変された細菌。
【請求項13】
前記必須遺伝子発現カセットが外因性であり、前記細菌染色体内に天然に存在する必須遺伝子が欠失されるか又は機能的に不活性化されており、それによって前記細菌内での前記必須遺伝子の発現が前記偏性低酸素誘導プロモーターの制御下に完全に置かれる、請求項１～１１のいずれか一項に記載の改変された細菌。
【請求項14】
前記外因性必須遺伝子発現カセットが、前記細菌染色体中に組み込まれている、請求項１３に記載の改変された細菌。
【請求項15】
前記外因性必須遺伝子発現カセットが、前記細菌染色体の外部にある、請求項１３に記載の改変された細菌。
【請求項16】
前記外因性必須遺伝子発現カセットが、前記細菌により担持されるプラスミド内に存在する、請求項１５に記載の改変された細菌。
【請求項17】
ｐＨ制御型発現カセットを更に含み、前記ｐＨ制御型発現カセットが、酸性ｐＨ条件下で活性であるプロモーターの制御下に置かれた、細菌由来のヘモリジンタンパク質をコードする遺伝子を含む、請求項１～１６のいずれか一項に記載の改変された細菌。
【請求項18】
前記細菌由来のヘモリジンタンパク質が、グラム陰性菌ヘモリジンタンパク質である、請求項１７に記載の改変された細菌。
【請求項19】
前記グラム陰性菌ヘモリジンタンパク質をコードする遺伝子が、ｈｌｙＡ又はｈｌｙＥである、請求項１８に記載の改変された細菌。
【請求項20】
前記ｈｌｙＡ又はｈｌｙＥが、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、ビブリオ・コレラ（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ）、又は大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）に由来する、請求項１９に記載の改変された細菌。
【請求項21】
前記酸性ｐＨ条件下で活性であるプロモーターが、７．０、６．９、６．８、６．７、６．６、６．５、６．４、６．３、６．２、６．１、６．０、５．９、５．８、５．７、５．６、又は５．５より低いｐＨにおいて活性である、請求項１７～２０のいずれか一項に記載の改変された細菌。
【請求項22】
前記酸性ｐＨ条件下で活性であるプロモーターが、ｓｓｅＡ、ｓｓｒＡ、ｓｓａＢ、ｓｓａＧ、ｓｓａＭ、及びｓｓａＲからなる群から選択される、請求項１７～２１のいずれか一項に記載の改変された細菌。
【請求項23】
前記酸性ｐＨ条件下で活性であるプロモーターがｓｓｅＡである、請求項１７～２１のいずれか一項に記載の改変された細菌。
【請求項24】
前記非改変型開始株が通性嫌気性細菌である、請求項１～２３のいずれか一項に記載の改変された細菌。
【請求項25】
前記細菌がエンテロバクター科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）の細菌である、請求項１～２４のいずれか一項に記載の改変された細菌。
【請求項26】
前記細菌が、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属、シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）属、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）属、エルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）属、シトロバクター（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）属、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属、プロテウス（Ｐｒｏｔｅｕｓ）属、モルガネラ（Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ）属、プロビデンシア（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ）属、ハフニア（Ｈａｆｎｉａ）属、及びパントエア（Ｐａｎｔｏｅａ）属の細菌である、請求項１～２５のいずれか一項に記載の改変された細菌。
【請求項27】
前記細菌が、大腸菌、エンテロバクター・ブラタエ（Ｅ．ｂｌａｔｔａｅ）、エンテロバクター・フェルグソニイ（Ｅ．ｆｅｒｇｕｓｏｎｉｉ）、エンテロバクター・ヘルマンニイ（Ｅ．ｈｅｒｍａｎｎｉｉ）、エンテロバクター・ヴァルネリス（Ｅ．ｖｕｌｎｅｒｉｓ）、サルモネラ・エンテリカ（Ｓ．ｅｎｔｅｒｉｃａ）、サルモネラ・ボンゴリ（Ｓ．ｂｏｎｇｏｒｉ）、腸チフス菌（Ｓ．ｔｙｐｈｉ）、サルモネラ・コレラエスイス（Ｓ．ｃｈｏｌｅｒａｅｓｕｉｓ）、サルモネラ・チフィムリウム（Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、シゲラ・ディセンテリアエ（Ｓ．ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ）、シゲラ・フレクスネリ（Ｓ．ｆｌｅｘｎｅｒｉ）、シゲラ・ボイディイ（Ｓ．ｂｏｙｄｉｉ）、シゲラ・ゾネイ（Ｓ．ｓｏｎｎｅｉ）、肺炎桿菌（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、クレブシエラ・オキシトカ（Ｋ．ｏｘｙｔｏｃａ）、ペスト菌（Ｙ．ｐｅｓｔｏｓ）、腸炎エルシニア（Ｙ．ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ）、仮性結核菌（Ｙ．ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、エルシニア・アルドヴァエ（Ｙ．ａｌｄｏｕａｅ）、エルシニア・ベルコヴィエリ（Ｙ．ｂｅｒｃｏｖｉｅｒｉ）、エルシニア・フレデリクセニイ（Ｙ．ｆｒｅｄｅｒｉｋｓｅｎｉｉ）、エルシニア・インテルメディア（Ｙ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）、エルシニア・クリステルセニイ（Ｙ．ｋｒｉｓｔｅｒｓｅｎｉｉ）、エルシニア・モラレッティ（Ｙ．ｍｏｌｌａｒｅｔｔｉ）、エルシニア・ローデイ（Ｙ．ｒｏｈｄｅｉ）、エルシニア・ルッケリ（Ｙ．ｒｕｃｋｅｒｉ）、シトロバクター・フロインデイ（Ｃ．ｆｒｅｕｎｄｉｉ）、シトロバクター・コセリ（Ｃ．ｋｏｓｅｒｉ）、シトロバクター・ブラアキイ（Ｃ．ｂｒａａｋｉｉ）、エンテロバクター・アエロゲネス（Ｅ．ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）、エンテロバクター・クロアカエ（Ｅ．ｃｌｏａｃａｅ）、エンテロバクター・ゲルゴヴィアエ（Ｅ．ｇｅｒｇｏｖｉａｃ）、エンテロバクター・サカザキイ（Ｅ．ｓａｋａｚａｋｉｉ）、エンテロバクター・タイロラエ（Ｅ．ｔａｙｌｏｒａｅ）、エンテロバクター・アムニゲヌス（Ｅ．ａｍｎｉｇｅｎｕｓ）、エンテロバクター・インテルメディウス（Ｅ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ）、エンテロバクター・アスブリアエ（Ｅ．ａｓｂｕｒｉａｅ）、エンテロバクター・カンセロゲヌス（Ｅ．ｃａｎｃｅｒｏｇｅｎｕｓ）、エンテロバクター・ディソルヴェンス（Ｅ．ｄｉｓｓｏｌｖｅｎｓ）、エンテロバクター・ニミプレスウラリス（Ｅ．ｎｉｍｉｐｒｅｓｓｕｒａｌｉｓ）、セラチア・マルセセンス（Ｓ．ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）、セラチア・エントモフィラ（Ｓ．ｅｎｔｏｍｏｐｈｉｌａ）、セラチア・フィカリア（Ｓ．ｆｉｃａｒｉａ）、セラチア・フォンチコラ（Ｓ．ｆｏｎｔｉｃｏｌａ）、セラチア・グリメシイ（Ｓ．ｇｒｉｍｅｓｉｉ）、セラチア・リクエファシエンス（Ｓ．ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、セラチア・オドリフェラ（Ｓ．ｏｄｏｒｉｆｅｒａ）、セラチア・プリムティカ（Ｓ．ｐｌｙｍｕｔｈｉｃａ）、セラチア・プロテアマキュランス（Ｓ．ｐｒｏｔｅａｍａｃｕｌａｎｓ）、セラチア・ルビダエア（Ｓ．ｒｕｂｉｄａｅａ）、セラチア・ウレイリチカ（Ｓ．ｕｒｅｉｌｙｔｉｃａ）、プロテウス・ミラビリス（Ｐ．ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）、プロテウス・ヴァルガリス（Ｐ．ｖｕｌｇａｒｉｓ）、プロテウス・ミクソファシエンス（Ｐ．ｍｙｘｏｆａｃｉｅｎｓ）、プロテウス・ペンネリ（Ｐ．ｐｅｎｎｅｒｉ）、プロテウス・ハウセリ（Ｐ．ｈａｕｓｅｒｉ）、モルガネラ・モルガニイ（Ｍ．ｍｏｒｇａｎｉｉ）、プロビデンシア・アルカリファシエンス（Ｐ．ａｌｃａｌｉｆａｃｉｅｎｓ）、プロビデンシア・ルスティジアニイ（Ｐ．ｒｕｓｔｉｇｉａｎｉｉ）、プロビデンシア・スチュアーチイ（Ｐ．ｓｔｕａｒｔｉｉ）、プロビデンシア・レットゲリ（Ｐ．ｒｅｔｔｇｅｒｉ）、プロビデンシア・ヘイムバッカエ（Ｐ．ｈｅｉｍｂｏｃｈａｅ）、ハフニア・アルヴェイ（Ｈ．ａｌｖｅｉ）、及びパントエア・アグロメランス（Ｐ．ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ）からなる群から選択される、請求項１～２６のいずれか一項に記載の改変された細菌。
【請求項28】
前記細菌がサルモネラ・チフィムリウムである、請求項１～２７のいずれか一項に記載の改変された細菌。
【請求項29】
前記開始株がサルモネラ・チフィムリウムＳＬ７２０７である、請求項２８に記載の改変された細菌。
【請求項30】
前記細菌が野生型リポ多糖類（ＬＰＳ）を発現する、請求項１～２９のいずれか一項に記載の改変された細菌。
【請求項31】
前記細菌が、腫瘍を有する対象に投与されると、腫瘍組織内で生存及び増殖する能力を有し、正常組織では速やかに排除される、請求項１～３０のいずれか一項に記載の改変された細菌。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、抗腫瘍活性を有する改変された細菌、改変された細菌を含む医薬組成物、及びその抗腫瘍用途に関する。
【0002】
［背景］
がんは、ヒトの生命及び健康を脅す最も重要な疾患のうちの１つとなったが、既存の処置法（放射線療法、化学療法、手術、及び標的を定めた薬物）のいずれも欠点を有し、また新規処置アプローチを開発する差し迫った必要性が存在する。コーリーの毒素により代表される従来式の細菌腫瘍療法は１５０年の歴史を有するが、その不安定な有効性及び安全性に対する懸念が知られている。遺伝子工学技術の開発は細菌株の毒性低下において目覚ましい進歩を遂げたが、また一連の臨床トライアルより、ヒト腫瘍療法を目的とする工学操作された細菌の減弱化は安全であるものの、その有効性は限定され、すなわち安全性と療法的有効性を併せ持つことができず、そのため臨床的腫瘍療法の必要性を満たすことができないことが実証された。腫瘍療法に対する更なる最適化が必要不可欠である。
がんは、ヒトの生命及び健康を脅す最も重要な疾患のうちの１つとなったが、既存の処置法（放射線療法、化学療法、手術、及び標的を定めた薬物）のいずれも欠点を有し、また新規処置アプローチを開発する差し迫った必要性が存在する。コーリーの毒素により代表される従来式の細菌腫瘍療法は１５０年の歴史を有するが、その不安定な有効性及び安全性に対する懸念が知られている。遺伝子工学技術の開発は細菌株の毒性低下において目覚ましい進歩を遂げたが、また一連の臨床トライアルより、ヒト腫瘍療法を目的とする工学操作された細菌の減弱化は安全であるものの、その有効性は限定され、すなわち安全性と療法的有効性を併せ持つことができず、そのため臨床的腫瘍療法の必要性を満たすことができないことが実証された。腫瘍療法に対する更なる最適化が必要不可欠である。
【0003】
［発明の概要］
本発明に基づき、合成生物学的遺伝的回路によって、偏性嫌気性細菌（動物の身体又はヒトの身体に投与された後に腫瘍に対する治療効果を示し、そして正常組織及び臓器により短時間で排出可能であり、これにより細菌をｉｎ ｖｉｖｏで長期間保持することに起因して、動物の身体又はヒトの身体に対してもたらされる毒性作用及び副作用を低下させ、したがってより信頼性のある抗腫瘍能力及び安全性を提供する）が構築される。
本発明に基づき、合成生物学的遺伝的回路によって、偏性嫌気性細菌（動物の身体又はヒトの身体に投与された後に腫瘍に対する治療効果を示し、そして正常組織及び臓器により短時間で排出可能であり、これにより細菌をｉｎ ｖｉｖｏで長期間保持することに起因して、動物の身体又はヒトの身体に対してもたらされる毒性作用及び副作用を低下させ、したがってより信頼性のある抗腫瘍能力及び安全性を提供する）が構築される。
【0004】
１つの実施形態では、本発明は、改変された細菌であって、細菌が、偏性低酸素誘導プロモーター（ｓｔｒｉｃｔｌｙ ｈｙｐｏｘｉａ ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ）の制御下に細菌の必須遺伝子を含む低酸素制御型必須遺伝子発現カセットを含み、細菌が、非改変型開始株と比較して、マクロファージ内で生存するのに必要とされる少なくとも１つの遺伝子又はその機能的発現産物を欠損している、改変された細菌を提供する。
【0005】
１つの実施形態では、本発明は、細菌が、偏性低酸素誘導プロモーターの制御下に細菌の必須遺伝子を含む低酸素制御型必須遺伝子発現カセットを含み、細菌が、非改変型開始株と比較して、内因性抗酸化性ストレス応答経路に関与するか又はそれを制御する少なくとも１つの遺伝子又はその機能的発現産物を欠損している、改変された細菌を提供する。
【0006】
１つの実施形態では、本発明は、細菌が、偏性低酸素誘導プロモーターの制御下に細菌の必須遺伝子を含む低酸素制御型必須遺伝子発現カセットと、酸性ｐＨ条件下で活性であるプロモーターの制御下に細菌由来のヘモリジンタンパク質をコードする遺伝子を含むｐＨ制御型発現カセットとを含み、細菌が、非改変型開始株と比較して、内因性抗酸化性ストレス応答経路に関与するか又はそれを制御する少なくとも１つの遺伝子又はその機能的発現産物を欠損している、改変された細菌を提供する。
【0007】
１つの実施形態では、本発明は、細菌が、偏性低酸素誘導プロモーターの制御下に細菌の必須遺伝子を含む低酸素制御型必須遺伝子発現カセットと、酸性ｐＨ条件下で活性であるプロモーターの制御下に細菌由来のヘモリジンタンパク質をコードする遺伝子を含むｐＨ制御型発現カセットとを含み、細菌が、野生型リポ多糖類（ＬＰＳ）を発現し、非改変型開始株と比較して、マクロファージ内で生存するのに必要とされる少なくとも１つの遺伝子又はその機能的発現産物を欠損している、改変された細菌を提供する。
【0008】
１つの実施形態では、本発明は、細菌が、偏性低酸素誘導プロモーターの制御下に細菌の必須遺伝子を含む低酸素制御型必須遺伝子発現カセットと、酸性ｐＨ条件下で活性であるプロモーターの制御下に細菌由来のヘモリジンタンパク質をコードする遺伝子を含むｐＨ制御型発現カセットとを含み、細菌が、非改変型開始株と比較して、内因性抗酸化性ストレス応答経路に関与するか又はそれを制御する少なくとも１つの遺伝子又はその機能的発現産物を欠損している、サルモネラ・チフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）の改変された細菌を提供する。
【0009】
１つの実施形態では、本発明は、細菌が、偏性低酸素誘導プロモーターの制御下に細菌の必須遺伝子を含む低酸素制御型必須遺伝子発現カセットと、酸性ｐＨ条件下で活性であるプロモーターの制御下に、細菌由来のヘモリジンタンパク質をコードする遺伝子を含むｐＨ制御型発現カセットとを含み、細菌が野生型リポ多糖類（ＬＰＳ）を発現し、非改変型開始株と比較して、マクロファージ内で生存するのに必要とされる少なくとも１つの遺伝子又はその機能的発現産物を欠損している、サルモネラ・チフィムリウムの改変された細菌を提供する。
【0010】
１つの実施形態では、本発明は、先行する実施形態のいずれか１つに記載の細菌を含む医薬組成物を提供する。１つの実施形態では、医薬組成物は悪性腫瘍を処置するのに使用される。
【0011】
１つの実施形態では、本発明は、悪性腫瘍を処置するための方法であって、悪性腫瘍を有する対象に、先行する実施形態のいずれか１つに記載の医薬組成物を投与するステップを含む方法を提供する。
【0012】
１つの実施形態では、本発明は、悪性腫瘍の処置における、先行する実施形態のいずれか１つに記載の細菌の使用を提供する。
【図面の簡単な説明】
【0013】
【図1】ＤＢ－ＺＷ１株の構築スキームの概略を示す図である。
【図2】様々な細胞内でのＤＢ－ＺＷ１株及びＤＢ－ＺＷ２株の増殖的特徴を示す図である。とりわけ、図２Ａは、ＤＢ－ＺＷ１株及びＤＢ－ＺＷ２株について、嫌気及び好気条件におけるｄａｐＥ遺伝子の転写レベルを示す；図２Ｂは、好気条件下でのＤＢ－ＺＷ１株及びＤＢ－ＺＷ２株の増殖を示す；図２Ｃは、好気条件下（ＤＡＰの添加有り）での、並びに嫌気条件下でのＤＢ－ＺＷ１株の２倍増加時間を示す。
【図3】Ｒａｗ２６４．７マウスマクロファージ又はＭＢ４９マウス膀胱がん細胞内でのＤＢ－ＺＷ１株及びＤＢ－ＺＷ３株の増殖を示す図である。
【図4】正常組織及び腫瘍内での株ＤＢ－ＺＷ１、２、３、４、５、及び野生型ＳＬ７２０７の分布を示す図である；図４Ａは、正常組織内の株ＤＢ－ＺＷ１、２、３、４、５、及び野生型ＳＬ７２０７の含有量を示す；図４Ｂは、腫瘍内の株ＤＢ－ＺＷ１、２、３、４、５、及び野生型ＳＬ７２０７の含有量を示す。
【図5】正常組織及び腫瘍内の株ＤＢ－ＺＷ１、ＤＢ－ＺＷ１（ΔｍｓｂＢ）、ＤＢ－ＺＷ１（Δｌｐｐ）、及びＤＢ－ＺＷ１（ΔｆｌｉＣ）の分布を示す図である。
【図6】マウス内での株ＤＢ－ＺＷ１、ＤＢ－ＺＷ１（ΔｍｓｂＢ）、ＤＢ－ＺＷ１（Δｌｐｐ）及びＤＢ－ＺＷ１（ΔｆｌｉＣ）の抗腫瘍効果を示す図である。とりわけ、図６Ａは、ＭＢ４９膀胱腫瘍担持マウスの腫瘍容積に対する、株ＤＢ－ＺＷ１、ＤＢ－ＺＷ１（ΔｍｓｂＢ）、ＤＢ－ＺＷ１（Δｌｐｐ）、ＤＢ－ＺＷ１（ΔｆｌｉＣ）、及び野生型ＳＬ７２０７の効果を示す；図６Ｂは、ＭＢ４９膀胱腫瘍担持マウスの体重に対する、株ＤＢ－ＺＷ１、ＤＢ－ＺＷ１（ΔｍｓｂＢ）、ＤＢ－ＺＷ１（Δｌｐｐ）、ＤＢ－ＺＷ１（ΔｆｌｉＣ）、及び野生型ＳＬ７２０７の効果を示す；図６Ｃは、ＭＢ４９膀胱腫瘍担持マウスの生存率に対する、株ＤＢ－ＺＷ１、ＤＢ－ＺＷ１（ΔｍｓｂＢ）、ＤＢ－ＺＷ１（Δｌｐｐ）、及びＤＢ－ＺＷ１（ΔｆｌｉＣ）、及び野生型ＳＬ７２０７の効果を示す；図６Ｄは、ＭＢ４９マウス膀胱がんの処置に対するＤＢ－ＺＷ１の様々な応答型を示す。
【図7】腫瘍及び様々な臓器内でのＤＢ－ＺＷ１の分布について、その経時的変化を示す図である。とりわけ、図７Ａは、腫瘍及び様々な臓器内でのＤＢ－ＺＷ１の密度について、その経時的変化を示す；図７Ｂは、様々な正常臓器内でのＤＢ－ＺＷ１の密度について、その経時的変化を示す。
【図8】膀胱がん、黒色腫、及びｉｎ ｓｉｔｕ結腸がんに対するＤＢ－ＺＷ１の抗腫瘍効果を示す図である。とりわけ、図８Ａ～Ｃは、皮下膀胱がん、ｉｎ ｓｉｔｕ黒色腫、及び皮下ｉｎ ｓｉｔｕ結腸がんの腫瘍容積に対する、ＤＢ－ＺＷ１の効果についてそれぞれ例証する；図８Ｄは、ｉｎ ｓｉｔｕ結腸がんの腫瘍数に対するＤＢ－ＺＷ１の効果について例証する。
【図9】腫瘍及び正常臓器内のＤＢ－ＺＷ１バリアントＤＢ－ＺＷ１－ΔｆｌｉＣの含有量を示す。
【図10】ＤＢ－ＺＷ１によるメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化を示す図である。とりわけ、図１０Ａは、マウスのドレイニングリンパ節における、メモリーＣＤ８＋Ｔ細胞の含有量に対するＤＢ－ＺＷ１の効果について例証する；図１０Ｂは、Ｂ１６－ＯＶＡ黒色腫細胞がイノキュレーションされたマウスのドレイニングリンパ節における、メモリーＣＤ８＋Ｔ細胞の含有量に対するＤＢ－ＺＷ１の効果について例証する。
【図11】ＤＢ－ＺＷ１の抗腫瘍効果の腫瘍メモリーを示す図である。とりわけ、図１１Ａは、ＤＢ－ＺＷ１による治癒が施された黒色腫マウスは、１×１０６個のＢ１６黒色腫細胞の別の皮下イノキュレーションを行った後でも腫瘍を発症しないことを例証する；図１１Ｂは、ＤＢ－ＺＷ１による治癒が施された黒色腫マウスは、黒色腫の初回誘発マウスと比較して低めの肺重量を有することを例証する；図１１Ｃは、ＤＢ－ＺＷ１による治癒が施された黒色腫マウスは、１×１０６個のＭＢ４９膀胱がん細胞の別の皮下イノキュレーションを行った後に、ＭＢ４９膀胱がん細胞を初回皮下注射されたマウスとまったく同様に、腫瘍をやはり発症したことを例証する。
【図12】ＤＢ－ＺＷ１によるＩＦＮγ＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化を示す図である。とりわけ、図１２Ａは、ＤＢ－ＺＷ１並びにそのバリアントであるＤＢ－ＺＷ１－ΔｍｓｂＢ及びＤＢ－ＺＷ１－Δｌｐｐｏｎと共に、ＭＢ４９膀胱がん細胞をマウスの皮下にイノキュレーションして処置したときに、それによる腫瘍微小環境内ＩＦＮγ＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の量に対する効果について例証する；図１２Ｂは、ＤＢ－ＺＷ１を用いて処置された腫瘍担持マウスの腫瘍から単離されたＣＤ８＋Ｔ細胞による、ＭＢ４９及びＢ１６細胞に対する殺傷効果について例証する。
【図13】膀胱がんを有するマウス内の腫瘍ドレイニングリンパ節及び腫瘍における、ＣＤ８＋Ｔ細胞のうちＴＲＭ細胞の占める割合、並びにＴＲＭ細胞のうちＩＦＮγ＋細胞の占める割合に対するＤＢ－ＺＷ１処置の効果を示す図である。
【図14】抗ＣＤ３抗体、ＤＢ－ＺＷ１、ＤＢ－ＺＷ１－ΔｍｓｂＢ、及びＤＢ－ＺＷ１－ΔｌｐｐによるＣＤ８＋Ｔ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏでの活性化を示す図である。
【図15】膀胱がんを有する皮下腫瘍担持マウスの血清中ＩＬ－１０量に対する、ＤＢ－ＺＷ１、ＤＢ－ＺＷ１－ΔｍｓｂＢ、及びＤＢ－ＺＷ１－Δｌｐｐｏｎの効果を示す図である。
【図16】ＤＢ－ＺＷ１を用いて腫瘍を処置した際のサイトカインＩＬ－１０の役割を示す図である。とりわけ、図１６Ａは、腫瘍部位においてＤＢ－ＺＷ１により誘発されたＩＦＮγ＋ＣＤ８＋Ｔ細胞に対する、抗ＩＬ－１０抗体の阻害効果を示す；図１６Ａは、ＤＢ－ＺＷ１により誘発された腫瘍容積低下に対する、抗ＩＬ－１０抗体の阻害効果について例証する。
【図17】ＤＢ－ＺＷ１により誘発された一次マクロファージ内でのＩＬ－１０産生を示す図である。
【図18】腫瘍内の好中球、Ｔ細胞、及びマクロファージの分布に対する、ＤＢ－ＺＷ１の効果を示す図である。
【図20】抗腫瘍能力に対する様々なＤＢ－ＺＷ１投与方式の効果を示す図である。とりわけ、図２０Ａは、腫瘍及び正常組織内細菌分布に対するＤＢ－ＺＷ１の腫瘍内注射又は静脈内注射の効果について例証する；図２０Ｂは、腫瘍容積に対するＤＢ－ＺＷ１の腫瘍内注射又は静脈内注射の効果について例証する
【図21】抗腫瘍能力に対する不活性化されたＤＢ－ＺＷ１の効果を示す図である。
【図22】皮下ＭＢ４９膀胱腫瘍担持マウス内の腫瘍容積に対する、ＤＢ－ＺＷ１の様々な投与用量の効果を示す図である。
【図23】実施例で使用される望ましい断片ＰｓｓｅＡ－ｈｌｙＡ－ｌｏｘｐ－ＫｎａＲ－ｌｏｘｐ（配列番号１）（Ａ）、Ｐｓｓｂｐ１－ｄａｐＥ－Ｃｍ（配列番号２）（Ｂ）、ＰｄａｐＥ－ｄａｐＥ－ｌｏｘｐ－ＫｎａＲ－ｌｏｘｐ（配列番号４）（Ｃ）、及びＰｈｔｒＡ－ｈｔｒＡ－ｌｏｘｐ－ａａｄＡ－ｌｏｘｐ（配列番号５）（Ｄ）の概略図を示す図であり、「数字ａ～数字ｂ」は開始及び停止ヌクレオチド（ｎｔ）を表し、配列内の断片内の主要なエレメントについてナンバリングする。
【0014】
［発明の詳細な説明］
定義
本発明では、本明細書で使用される科学的及び技術的用語は、別途定義されない限り、当業者により一般的に理解される意味を有する。また、本明細書で使用されるタンパク質及び核酸化学、分子生物学、細胞及び組織培養、微生物学、免疫学に関連する用語、並びにラボ手順は、対応する分野において幅広く使用されている用語及び慣例的なステップでもある。同時に、本発明をより深く理解するために、関連する用語の定義及び説明を下記に提示する。
定義
本発明では、本明細書で使用される科学的及び技術的用語は、別途定義されない限り、当業者により一般的に理解される意味を有する。また、本明細書で使用されるタンパク質及び核酸化学、分子生物学、細胞及び組織培養、微生物学、免疫学に関連する用語、並びにラボ手順は、対応する分野において幅広く使用されている用語及び慣例的なステップでもある。同時に、本発明をより深く理解するために、関連する用語の定義及び説明を下記に提示する。
【0015】
「低酸素制御型必須遺伝子発現カセット」とは、本明細書において、低酸素条件下で必須遺伝子の発現を促進する能力を有するＤＮＡのストレッチを意味し、低酸素誘導プロモーターの制御下に必須遺伝子を含有し、また必要な場合には、必須遺伝子の発現に必要とされるその他の制御エレメントを更に含有し得る。
【0016】
本明細書で使用される場合、「必須遺伝子」とは、細菌の増殖及び／又は生存にとって決定的である遺伝子を指し、そのような遺伝子又はその機能的発現産物が存在しない場合には、細菌は正常に生存、分裂、及び／又は増殖することができない。必須遺伝子又はその機能的発現産物の欠損の代表的な例は、特定の外因性栄養補助剤の非存在下では、ｉｎ ｖｉｔｒｏ培養条件下で、又はｉｎ ｖｉｖｏ環境内で正常に生存、分裂、及び／又は増殖することができない栄養欠損株である。必須遺伝子は、細菌染色体上で単一のコピーとして通常出現する。
【0017】
本明細書で使用される場合、「偏性低酸素誘導プロモーター」とは、嫌気条件下で特異的遺伝子の転写を開始する能力を有するが、好気条件下では転写物を活性化させ、及び生成することが実質的に不可能であるプロモーターを指す。
【0018】
「偏性低酸素誘導プロモーター」は、本明細書で使用される場合、下記の実験より同定することができる：
テストの対象とされるプロモーターの制御下に必須遺伝子（例えば、ｄａｐＡ／ｄａｐＥ）を含有する発現株が構築され、嫌気性インキュベーター内のルリア－ベルターニ（Ｌｕｒｉａ－Ｂｅｒｔａｎｉ）（ＬＢと省略される）プレート上に画線され、そして３７℃で２４時間嫌気的にインキュベートされる。嫌気条件の下、単一のクローンが選別され、そして２０μＬのＬＢ液体培地中に再懸濁される。２０μＬのモノクローナル再懸濁溶液が、下記の４つの液体チューブＡ、Ｂ、Ｃ、及びＤに等しく添加される（すなわち、各チューブに５μＬ添加される）：
Ａ．２ｍＬのＬＢ液体培地、
Ｂ．２ｍＬのＬＢ液体培地、
Ｃ．２ｍＬのＬＢ液体培地＋ＤＡＰ、
Ｄ．２ｍＬのＬＢ液体培地＋ＤＡＰ。
テストの対象とされるプロモーターの制御下に必須遺伝子（例えば、ｄａｐＡ／ｄａｐＥ）を含有する発現株が構築され、嫌気性インキュベーター内のルリア－ベルターニ（Ｌｕｒｉａ－Ｂｅｒｔａｎｉ）（ＬＢと省略される）プレート上に画線され、そして３７℃で２４時間嫌気的にインキュベートされる。嫌気条件の下、単一のクローンが選別され、そして２０μＬのＬＢ液体培地中に再懸濁される。２０μＬのモノクローナル再懸濁溶液が、下記の４つの液体チューブＡ、Ｂ、Ｃ、及びＤに等しく添加される（すなわち、各チューブに５μＬ添加される）：
Ａ．２ｍＬのＬＢ液体培地、
Ｂ．２ｍＬのＬＢ液体培地、
Ｃ．２ｍＬのＬＢ液体培地＋ＤＡＰ、
Ｄ．２ｍＬのＬＢ液体培地＋ＤＡＰ。
【0019】
チューブＡ及びＣは嫌気性インキュベーター内、３７℃で２４時間、静的にインキュベートされ、並びにチューブＢ及びＤは、好気性シェイカー内、３７℃で、２４時間インキュベートされる。細菌が、チューブＡ、Ｃ、及びＤ内で増殖することができるが、チューブＢ内では増殖できない（ＯＤ６００は、０．０５未満である）場合には、プロモーターは偏性低酸素誘導プロモーターと考えられる。本発明において使用可能である例示的偏性低酸素誘導プロモーターを表１に示す。
【0020】
【表1】
【0021】
本明細書で使用される場合、「内因性抗酸化性ストレス応答経路に関与するか又はそれを制御する遺伝子」とは、ｉｎ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、活性酸素種（ＲＯＳ）の殺傷効果に対する細菌（例えば、細胞内細菌、例えばサルモネラ属）の耐性に関与する遺伝子を指す。
【0022】
本明細書で使用される場合、「マクロファージ内での生存に必要とされる遺伝子」とは、マクロファージ内での細胞内細菌の生存率を維持又は増強することに関与する遺伝子を指す。このような遺伝子産物の機能は、微生物に対するマクロファージの殺傷効果に抵抗する耐性と関連し、したがってこのような遺伝子又はその機能的発現産物の欠損は、マクロファージ内での細菌（例えば、細胞内細菌、例えばサルモネラ属等）の生存率を低下させる可能性がある。
【0023】
本明細書で使用される場合、「機能的発現産物」としてＲＮＡ、タンパク質等が挙げられる。
【0024】
本明細書で使用される場合、「通性嫌気細菌」とは、好気条件及び嫌気条件の両条件下で生存することができる細菌を指す。
【0025】
本明細書で使用される場合、「ｐＨ制御型発現カセット」とは、対応する遺伝子（複数可）の発現が環境ｐＨにより制御される、遺伝子発現エレメントの群を指す。
【0026】
本明細書で使用される場合、「酸性ｐＨ条件下で活性であるプロモーター」とは、酸性ｐＨ条件下で活性化され得、対応する遺伝子（複数可）の発現を制御し得るプロモーターを指す。いくつかの実施形態では、本発明の酸性ｐＨ条件下で活性であるプロモーターは、７．０、６．９、６．８、６．７、６．６、６．５、６．４、６．３、６．２、６．１、６．０、５．９、５．８、５．７、５．６、又は５．５より低いｐＨにおいて活性化され得るか又はプロモーター活性をなおも有し得る。いくつかの実施形態では、酸性ｐＨ条件下で活性であるプロモーターは、中性のｐＨ（例えば、ｐＨ７．０～７．４）においてもプロモーター活性を有する。
【0027】
「ポリペプチド」、「ペプチド」、及び「タンパク質」は、本発明では交換可能に使用され、アミノ酸残基のポリマーを指す。該用語は、１つ又は複数のアミノ酸残基が対応する天然に存在するアミノ酸（複数可）の人工的な化学的アナログであるアミノ酸ポリマー、並びに天然に存在するアミノ酸ポリマーに適用される。用語「ポリペプチド」、「ペプチド」、「アミノ酸配列」、及び「タンパク質」は、グリコシル化、脂質ライゲーション、硫酸化、グルタミン酸残基のγカルボキシル化、及びＡＤＰ－リボシル化を含むが、これらに限定されない修飾された形態も含み得る。
【0028】
本明細書で使用される場合、「ポリヌクレオチド」とは、ホスホジエステル結合を介して複数のヌクレオチドをリンクさせることにより形成されたマクロ分子を指し、その場合、ヌクレオチドはリボヌクレオチド及びデオキシリボヌクレオチドを含む。本発明のポリヌクレオチドの配列は、異なる宿主細胞（例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）等）に対するコドン最適化の対象となり得、これによりポリペプチドの発現が改善し得る。コドン最適化の方法は当技術分野において公知である。
【0029】
２つのポリペプチド配列又は２つのポリヌクレオチド配列の間の「配列同一性」とは、配列間の同一アミノ酸又は同一ヌクレオチドの割合（％）を指す。ポリペプチド配列又はポリヌクレオチド配列間の配列同一性のレベルを評価するための方法は、当技術分野において公知である。配列同一性は、様々な公知の配列分析ソフトウェアを使用して評価可能である。例えば、配列同一性は、ＥＭＢＬ－ＥＢＩのオンラインアライメントツール（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｐｓａ／）により評価可能である。２配列間の配列同一性は、デフォルトパラメーターを使用しながら、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈのアルゴリズムを経由して評価可能である。
【0030】
本明細書で使用される場合、用語「生存細菌」とは、生存可能であり、また活性な栄養代謝により特徴付けられ、そしてそれ独自の生物学的機能を実施する能力を有する株を指す。生存細菌は、株の代謝プロセスにおいて生成される細菌バイオマスを含み得る。
【0031】
本明細書で使用される用語「グラム陰性細菌」とは、グラム染色として知られている手法の一部である初期塩基性色素染色剤（例えば、クリスタルバイオレット）を保持しない細菌を指す。例示的グラム染色では、細胞が熱によりスライドに最初に固定され、そして塩基性色素（例えば、クリスタルバイオレット）を用いて染色されるが、該塩基性色素はグラム陰性菌及びグラム陽性菌の両方に取り込まれる。スライドは、次にモーダント（例えば、グラムヨウ素）を用いて処理され、モーダントは塩基性色素（例えば、クリスタルバイオレット）と結合し、そして細胞内で塩基性色素をトラップする。細胞は、次にアセトン又はアルコールで洗浄され、次に異なる色の第２の色素（例えば、サフラニン）を用いて対比染色される。グラム陽性生物は初期バイオレット染色剤を保持する一方、グラム陰性生物は有機性の洗浄溶媒により脱色され、したがって対比染色を呈する。例示的グラム陰性菌として、大腸菌属種（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｓｐｐ．）、シゲラ属種（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｓｐｐ．）、サルモネラ属種（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｓｐｐ．）、カンピロバクター属種（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｐ．）、ナイセリア属種（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｓｐｐ．）、ヘモフィルス属種（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｓｐｐ．）、アエロモナス属種（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｓｐｐ．）、フランシセラ属種（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｓｐｐ．）、エルシニア属種（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｓｐｐ．）、クレブシエラ属種（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｓｐｐ．）、ボルデテラ属種（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｓｐｐ．）、レジオネラ属種（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｓｐｐ．）、コリネ細菌属種（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉａ ｓｐｐ．）、シトロバクター属種（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｐ．）、クラミジア属種（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｓｐｐ．）、ブルセラ属種（Ｂｒｕｃｅｌｌａ ｓｐｐ．）、シュードモナス属種（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐｐ．）、ヘリコバクター属種（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｐ．）、及びビブリオ属種（Ｖｉｂｒｉｏ ｓｐｐ．）が挙げられるが、これらに限定されない。
【0032】
本明細書で使用される場合、用語「悪性固形腫瘍」とは組織の異常な腫瘤を指し、通常嚢胞又は液体領域を含まない。固形腫瘍は、良性（非がん性）又は悪性（がん性）であり得る。異なる種類の悪性固形腫瘍は、それを形成する細胞の種類について命名される。悪性固形腫瘍の例は、肉腫、癌、及びリンパ腫である。白血病（血液のがん）は悪性固形腫瘍を通常形成しない（ＮＩＨ国立がん研究所（ＮＩＨ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）の定義の通り）。悪性固形腫瘍として、非限定的に、異なる組織型、例えば、肝臓、結腸、結腸直腸、皮膚、乳房、膵臓、子宮頸部、子宮体、膀胱、胆嚢、腎臓、喉頭、口唇、口腔、食道、卵巣、前立腺、胃、睾丸、甲状腺、又は肺に由来し得る異常な細胞のクラスターが挙げられ、したがって悪性固形腫瘍として、悪性固形肝臓腫瘍、結腸腫瘍、結腸直腸腫瘍、皮膚腫瘍、乳房腫瘍、膵臓腫瘍、子宮頸部腫瘍、子宮体腫瘍、膀胱腫瘍、胆嚢腫瘍、腎腫瘍、喉頭腫瘍、口唇腫瘍、口腔腫瘍、食道腫瘍、卵巣腫瘍、前立腺腫瘍、胃腫瘍、精巣腫瘍、甲状腺腫瘍、又は肺腫瘍が挙げられる。
【0033】
本明細書における処置の目的に照らせば、用語「対象」は、好ましくは、標的となる病理学的状態、例えば腫瘍等について処置を必要とする対象である。予防の目的に照らして、対象は、好ましくは、標的となる病理学的状態を発症するリスクを有するか又は発症しやすい対象である。用語「対象」は、生物、例えば原核生物及び真核生物等を含む。対象の例として、哺乳動物、例えばヒト、イヌ、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ネコ、マウス、ウサギ、ラット等、及び遺伝的に改変されたヒト以外の動物が挙げられる。いくつかの好ましい実施形態では、対象はヒトである。
【0034】
本明細書で使用される場合、「処置」は有益な又は望ましい臨床結果を得るためのアプローチである。本発明の目的に照らせば、有益な又は望ましい臨床結果として、新生若しくはがん性細胞の増殖を低下させること（若しくはそれを破壊すること）、新生細胞の転移を阻害すること、腫瘍のサイズを縮小若しくは減少させること、悪性腫瘍の寛解、悪性腫瘍に起因する症状を減少させること、悪性腫瘍に罹患した者の生活の質を向上させること、悪性腫瘍を処置するのに必要とされるその他の医薬品の用量を減少させること、悪性腫瘍の進行を遅延させること、悪性腫瘍を治癒させること、及び／又は悪性腫瘍を有する患者の生存期間を延長すること、のうちの１つ又は複数が挙げられるが、これらに限定されない。
【0035】
本明細書で使用される場合、細菌、医薬、又は医薬組成物の「有効量」又は「有効用量」は、任意の１つ又は複数の有益な又は望ましい結果に影響を及ぼすのに十分な量である。予防用途の場合、有益な又は望ましい結果として、リスクを除去するか又は低下させること、重症度を低減すること、或いは疾患（疾患の生化学的、組織学的症状、及び／又は行動症状、疾患の発症期間中に現れるその合併症及び中間的な病理学的表現型を含む）の発症を遅延させることが挙げられる。治療用途の場合、有益な又は望ましい結果として、例えば腫瘍等の疾患の１つ又は複数の症状を低下させること、疾患を処置するのに必要とされるその他の医薬品の用量を減少させること、別の医薬品の効果を増強すること、及び／又は患者内のがんの進行を遅延させること等が挙げられる。例えば、「有効量」は、好ましくは、未処置の対象と比較して、少なくとも約１０％、好ましくは少なくとも約２０％、より好ましくは少なくとも約３０％、より好ましくは少なくとも約４０％、より好ましくは少なくとも約５０％、より好ましくは少なくとも約６０％、より好ましくは少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約８０％、細胞増殖又は腫瘍増殖を阻害する。化合物が腫瘍増殖を阻害する能力は、ヒト腫瘍における有効性について予測的な動物モデル系において評価可能である。或いは、組成物のこの特質は、化合物の阻害能力を調べることにより評価可能であり、アッセイによるｉｎ ｖｉｔｒｏでのそのような阻害は当業者にとって公知である。治療有効量の治療用化合物は、対象における腫瘍サイズを減少させ、さもなければ症状を良化させることができる。当業者は、対象のサイズ、対象の症状の重症度、及び特定の組成物、又は選択された投与経路等の要因に基づき、そのような量を決定することができる。
【0036】
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体」は、有効成分と組み合わされたとき、成分が生物学的活性を保持するのを可能にし、そして対象の免疫系とは非反応性である任意の材料を含み、崩壊剤、接着剤、充填剤、バッファー、張力剤、安定剤、酸化防止剤、界面活性剤、又は潤滑剤が挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、担体は、静脈内、筋肉内、皮下、非経口、脊髄、又は上皮投与に適する（例えば、注射又は輸液による）。投与経路に応じて、本発明の細菌は、酸の作用及び細菌を不活性化するおそれのあるその他の自然条件から化合物を保護するために、材料内にコーティングされ得る。薬学的に許容される担体として、通常生理食塩溶液、ＰＢＳバッファー、滅菌水溶液又は分散物、及び滅菌注射液又は分散物を即時調製するための滅菌粉末物が挙げられる。薬学的に活性な物質のためのそのような媒体及び薬剤の使用は、当技術分野において公知である。任意の従来型の媒体又は薬剤が活性な化合物に不適合である場合を除き、本発明の医薬組成物におけるその使用が想定される。
【0037】
改変された細菌
本発明は、細菌が、非改変型開始株と比較して、低酸素制御型必須遺伝子発現カセットを含む、改変された細菌を提供する。１つの実施形態では、必須遺伝子発現カセットは、偏性低酸素誘導プロモーターの制御下に細菌の必須遺伝子を含む。１つの実施形態では、細菌は、内因性抗酸化性ストレス応答経路に関与するか又はそれを制御する少なくとも１つの遺伝子又はその機能的発現産物を欠損している。１つの実施形態では、細菌は、マクロファージ内で生存するのに必要とされる少なくとも１つの遺伝子又はその機能的発現産物を欠損している。１つの実施形態では、細菌は野生型リポ多糖類（ＬＰＳ）を発現する。
本発明は、細菌が、非改変型開始株と比較して、低酸素制御型必須遺伝子発現カセットを含む、改変された細菌を提供する。１つの実施形態では、必須遺伝子発現カセットは、偏性低酸素誘導プロモーターの制御下に細菌の必須遺伝子を含む。１つの実施形態では、細菌は、内因性抗酸化性ストレス応答経路に関与するか又はそれを制御する少なくとも１つの遺伝子又はその機能的発現産物を欠損している。１つの実施形態では、細菌は、マクロファージ内で生存するのに必要とされる少なくとも１つの遺伝子又はその機能的発現産物を欠損している。１つの実施形態では、細菌は野生型リポ多糖類（ＬＰＳ）を発現する。
【0038】
１つの実施形態では、偏性低酸素誘導プロモーターは、ｐｅｐＴｐ、ｆｎｒＳｐ、ｙｓｇＡｐ、ｓｓｂｐ１、Ｈｉｐ１、ＢＢａ＿Ｉ１４０１８、ＢＢａ＿Ｒ１０７４、Ｐｔｅｔ－ａｒｃＡ、及びＰｔｅｔ－Ｆｎｒからなる群から選択される。好ましくは、偏性低酸素誘導プロモーターは、ｓｓｂｐ１プロモーターである。
【0039】
１つの実施形態では、必須遺伝子の発現産物は、細菌内での２，６－ジアミノピメリン酸（ＤＡＰ）の合成に関与する。１つの実施形態では、好気条件下で培養される場合、細菌の増殖は、培地に添加される追加のＤＡＰ又はそのアナログに立脚する。１つの実施形態では、必須遺伝子は、ｄａｐＡ、ｄａｐＢ、ｄａｐＤ、ｄａｐＥ、ａｒｇＤ、ｄａｐＦ、及び任意のこれらの組合せから選択される。好ましくは、必須遺伝子はｄａｐＡ及びｄａｐＥから選択される。好ましくは、ｄａｐＥは、配列番号２７に対して、少なくとも８１％、好ましくは少なくとも８２％、より好ましくは少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は最も好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。好ましくは、ｄａｐＥのヌクレオチド配列は配列番号２７を含む。好ましくは、ｄａｐＥのヌクレオチド配列は配列番号２７から構成される。
【0040】
１つの実施形態では、内因性抗酸化性ストレス応答経路に関与するか又はそれを制御する遺伝子は、ＨｔｒＡセリンプロテアーゼファミリー遺伝子である。１つの実施形態では、内因性抗酸化性ストレス応答経路に関与するか又はそれを制御する遺伝子の機能的発現産物は、ＨｔｒＡセリンプロテアーゼファミリーに関連するタンパク質である。１つの実施形態では、細菌は、ＨｔｒＡセリンプロテアーゼの活性を欠損している。１つの実施形態では、内因性抗酸化性ストレス応答経路に関与するか又はそれを制御する遺伝子はｈｔｒＡである。１つの実施形態では、細菌はｈｔｒＡを欠損している。好ましくは、ｈｔｒＡは、配列番号２８に対して、少なくとも８１％、好ましくは少なくとも８２％、より好ましくは少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は最も好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。好ましくは、ｈｔｒＡのヌクレオチド配列は配列番号２８を含む。好ましくは、ｈｔｒＡのヌクレオチド配列は配列番号２８から構成される。
【0041】
１つの実施形態では、必須遺伝子は細菌染色体内に天然に存在する遺伝子である。１つの実施形態では、必須遺伝子の天然プロモーターは、偏性低酸素誘導プロモーターと機能的に置き換わる。その結果、細菌内での必須遺伝子の発現は、偏性低酸素誘導プロモーターの制御下に完全に置かれる。
【0042】
１つの実施形態では、必須遺伝子発現カセットは外因性である。１つの実施形態では、細菌染色体内に天然に存在する必須遺伝子は、欠失されるか又は機能的に不活性化される。その結果、細菌内での必須遺伝子の発現は、偏性低酸素誘導プロモーターの制御下に完全に置かれる。１つの実施形態では、外因性必須遺伝子発現カセットが細菌染色体内に組み込まれる。１つの実施形態では、外因性必須遺伝子発現カセットは細菌染色体の外部にある。１つの実施形態では、外因性必須遺伝子発現カセットは、細菌により担持されるプラスミド内に存在する。
【0043】
１つの実施形態では、改変された細菌はｐＨ制御型発現カセットを更に含む。１つの実施形態では、改変された細菌は、非改変型開始株と比較して、低酸素制御型必須遺伝子発現カセット及びｐＨ制御型発現カセットを含む。１つの実施形態では、ｐＨ制御型発現カセットは、酸性ｐＨ条件下で活性であるプロモーターの制御下に細菌由来のヘモリジンタンパク質をコードする遺伝子を含む。本発明のいくつかの実施形態によれば、酸性ｐＨ条件下で活性であるプロモーターは、約ｐＨ４．０～７．０の範囲のｐＨにおいて活性である。いくつかの実施形態では、酸性ｐＨ条件下で活性であるプロモーターは、ｐＨ６．０±１においても活性である。いくつかの実施形態では、酸性ｐＨ条件下で活性であるプロモーターは、７．０、６．９、６．８、６．７、６．６、６．５、６．４、６．３、６．２、６．１、６．０、５．９、５．８、５．７、５．６、若しくは５．５より低い、又はこのような数値の任意の２つの間のｐＨ値において活性である。１つの実施形態では、酸性ｐＨ条件下で活性であるプロモーターは、ｓｓｅＡ、ｓｓｒＡ、ｓｓａＢ、ｓｓａＧ、ｓｓａＭ、及びｓｓａＲからなる群から選択される。１つの実施形態では、酸性ｐＨ条件下で活性であるプロモーターはｓｓｅＡである。１つの実施形態では、細菌由来ヘモリジンタンパク質は、グラム陰性菌のヘモリジンタンパク質である。１つの実施形態では、グラム陰性菌のヘモリジンタンパク質をコードする遺伝子は、ｈｌｙＡ又はｈｌｙＥである。１つの実施形態では、ｈｌｙＡ又はｈｌｙＥは、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、ビブリオ・コレラ（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ）、又は大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）に由来する。好ましくは、ｈｌｙＡは、配列番号２９に対して、≧８１％、好ましくは≧８２％、より好ましくは≧８３％、≧８４％、≧８５％、≧８６％、≧８７％、≧８８％、≧８９％、≧９０％、≧９１％、≧９２％、≧９３％、≧９４％、≧９５％、≧９６％、≧９７％、≧９８％、又は最も好ましくは≧９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。好ましくは、ｈｌｙＡのヌクレオチド配列は配列番号２９を含む。好ましくは、ｈｔｒＡのヌクレオチド配列は配列番号２９から構成される。
【0044】
１つの実施形態では、非改変型開始株は通性嫌気性細菌である。１つの実施形態では、細菌はエンテロバクター科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）の細菌である。好ましくは、細菌は、大腸菌属、サルモネラ属、シゲラ属、クレブシエラ属、エルシニア属、シトロバクター属、エンテロバクター属（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．）、セラチア属（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｓｐ．）、プロテウス属（Ｐｒｏｔｅｕｓ ｓｐ．）、モルガネラ属（Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ ｓｐ．）、プロビデンシア属（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ ｓｐ．）、ハフニア属（Ｈａｆｎｉａ ｓｐ．）、及びパントエア属（Ｐａｎｔｏｅａ ｓｐ．）に由来する細菌である。好ましくは、細菌は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、エンテロバクター・ブラタエ（Ｅ．ｂｌａｔｔａｅ）、エンテロバクター・フェルグソニイ（Ｅ．ｆｅｒｇｕｓｏｎｉｉ）、エンテロバクター・ヘルマンニイ（Ｅ．ｈｅｒｍａｎｎｉｉ）、エンテロバクター・ヴァルネリス（Ｅ．ｖｕｌｎｅｒｉｓ）、サルモネラ・エンテリカ（Ｓ．ｅｎｔｅｒｉｃａ）、サルモネラ・ボンゴリ（Ｓ．ｂｏｎｇｏｒｉ）、腸チフス菌（Ｓ．ｔｙｐｈｉ）、サルモネラ・コレラエスイス（Ｓ．ｃｈｏｌｅｒａｅｓｕｉｓ）、サルモネラ・チフィムリウム（Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、シゲラ・ディセンテリアエ（Ｓ．ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ）、シゲラ・フレクスネリ（Ｓ．ｆｌｅｘｎｅｒｉ）、シゲラ・ボイディイ（Ｓ．ｂｏｙｄｉｉ）、シゲラ・ゾネイ（Ｓ．ｓｏｎｎｅｉ）、肺炎桿菌（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、クレブシエラ・オキシトカ（Ｋ．ｏｘｙｔｏｃａ）、ペスト菌（Ｙ．ｐｅｓｔｉｓ）、腸炎エルシニア（Ｙ．ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ）、仮性結核菌（Ｙ．ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、エルシニア・アルドヴァエ（Ｙ．ａｌｄｏｖａｅ）、エルシニア・ベルコヴィエリ（Ｙ．ｂｅｒｃｏｖｉｅｒｉ）、エルシニア・フレデリクセニイ（Ｙ．ｆｒｅｄｅｒｉｋｓｅｎｉｉ）、エルシニア・インテルメディア（Ｙ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）、エルシニア・クリステルセニイ（Ｙ．ｋｒｉｓｔｅｒｓｅｎｉｉ）、エルシニア・モラレッティ（Ｙ．ｍｏｌｌａｒｅｔｔｉ）、エルシニア・ローデイ（Ｙ．ｒｏｈｄｅｉ）、エルシニア・ルッケリ（Ｙ．ｒｕｃｋｅｒｉ）、シトロバクター・フロインデイ（Ｃ．ｆｒｅｕｎｄｉｉ）、シトロバクター・コセリ（Ｃ．ｋｏｓｅｒｉ）、シトロバクター・ブラアキイ（Ｃ．ｂｒａａｋｉｉ）、エンテロバクター・アエロゲネス（Ｅ．ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）、エンテロバクター・クロアカエ（Ｅ．ｃｌｏａｃａｅ）、エンテロバクター・ゲルゴヴィアエ（Ｅ．ｇｅｒｇｏｖｉａｅ）、エンテロバクター・サカザキイ（Ｅ．ｓａｋａｚａｋｉｉ）、エンテロバクター・タイロラエ（Ｅ．ｔａｙｌｏｒａｅ）、エンテロバクター・アムニゲヌス（Ｅ．ａｍｎｉｇｅｎｕｓ）、エンテロバクター・インテルメディウス（Ｅ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ）、エンテロバクター・アスブリアエ（Ｅ．ａｓｂｕｒｉａｅ）、エンテロバクター・カンセロゲヌス（Ｅ．ｃａｎｃｅｒｏｇｅｎｕｓ）、エンテロバクター・ディソルヴェンス（Ｅ．ｄｉｓｓｏｌｖｅｎｓ）、エンテロバクター・ニミプレスウラリス（Ｅ．ｎｉｍｉｐｒｅｓｓｕｒａｌｉｓ）、セラチア・マルセセンス（Ｓ．ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）、セラチア・エントモフィラ（Ｓ．ｅｎｔｏｍｏｐｈｉｌａ）、セラチア・フィカリア（Ｓ．ｆｉｃａｒｉａ）、セラチア・フォンチコラ（Ｓ．ｆｏｎｔｉｃｏｌａ）、セラチア・グリメシイ（Ｓ．ｇｒｉｍｅｓｉｉ）、セラチア・リクエファシエンス（Ｓ．ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、セラチア・オドリフェラ（Ｓ．ｏｄｏｒｉｆｅｒａ）、セラチア・プリムティカ（Ｓ．ｐｌｙｍｕｔｈｉｃａ）、セラチア・プロテアマキュランス（Ｓ．ｐｒｏｔｅａｍａｃｕｌａｎｓ）、セラチア・ルビダエア（Ｓ．ｒｕｂｉｄａｅａ）、セラチア・ウレイリチカ（Ｓ．ｕｒｅｉｌｙｔｉｃａ）、プロテウス・ミラビリス（Ｐ．ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）、プロテウス・ヴァルガリス（Ｐ．ｖｕｌｇａｒｉｓ）、プロテウス・ミクソファシエンス（Ｐ．ｍｙｘｏｆａｃｉｅｎｓ）、プロテウス・ペンネリ（Ｐ．ｐｅｎｎｅｒｉ）、プロテウス・ハウセリ（Ｐ．ｈａｕｓｅｒｉ）、モルガネラ・モルガニイ（Ｍ．ｍｏｒｇａｎｉｉ）、プロビデンシア・アルカリファシエンス（Ｐ．ａｌｃａｌｉｆａｃｉｅｎｓ）、プロビデンシア・ルスティジアニイ（Ｐ．ｒｕｓｔｉｇｉａｎｉｉ）、プロビデンシア・スチュアーチイ（Ｐ．ｓｔｕａｒｔｉｉ）、プロビデンシア・レットゲリ（Ｐ．ｒｅｔｔｇｅｒｉ）、プロビデンシア・ヘイムバッカエ（Ｐ．ｈｅｉｍｂｏｃｈａｅ）、ハフニア・アルヴェイ（Ｈ．ａｌｖｅｉ）、及びパントエア・アグロメランス（Ｐ．ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ）からなる群から選択される。好ましくは、細菌は、サルモネラ・チフィムリウムの細菌である。好ましくは、開始株は、サルモネラ・チフィムリウムＳＬ７２０７である。
【0045】
１つの実施形態では、細菌は、腫瘍を有する対象に投与されると、腫瘍組織内で生存及び増殖することができるが、正常組織では速やかに排除される。１つの実施形態では、細菌は、悪性腫瘍を有する対象に投与されると、抗腫瘍特異的免疫応答を誘発することができる。１つの実施形態では、細菌は、悪性腫瘍を有する対象に投与されると、抗腫瘍免疫メモリーを誘発することができる。
【0046】
１つの実施形態では、細菌は野生型フラゲリンを発現しない。１つの実施形態では、改変された細菌はｆｌｉＣ遺伝子を欠損している。
【0047】
１つの実施形態では、マクロファージ内での細菌の生存レベルは、非改変型開始株の生存レベルの約５０％～約３０％の範囲である。１つの実施形態では、マクロファージ内での細菌の生存レベルは、非改変型開始株の生存レベルの約３０％～約１０％の範囲である。好ましくは、マクロファージ内での細菌の生存レベルは、非改変型開始株の生存レベルの約１０％～約１％の範囲である。
【0048】
医薬組成物
本発明は、有効量の本発明の改変された細菌を含む医薬組成物を提供する。１つの実施形態では、改変された細菌は生存細菌である。
本発明は、有効量の本発明の改変された細菌を含む医薬組成物を提供する。１つの実施形態では、改変された細菌は生存細菌である。
【0049】
１つの実施形態では、医薬組成物は、悪性腫瘍を処置するのに使用される。１つの実施形態では、医薬組成物は、悪性腫瘍を有する対象において抗腫瘍特異的免疫応答を誘発するのに使用される。１つの実施形態では、医薬組成物は、悪性腫瘍を有する対象において抗腫瘍免疫メモリーを誘発するのに使用される。１つの実施形態では、医薬組成物は、悪性腫瘍の転移又は再発を予防又は処置するのに使用される。１つの実施形態では、医薬組成物は、これまでの抗腫瘍療法に対して耐性であるか又はそれが不奏功であった悪性腫瘍を処置するのに使用される。
【0050】
１つの実施形態では、悪性腫瘍は、神経系、呼吸器系、消化器系、尿路系、生殖器系、造血系、リンパ系、内分泌系、又は皮膚粘膜由来の悪性腫瘍である。いくつかの実施形態では、悪性腫瘍は肉腫又はがんである。１つの実施形態では、悪性腫瘍は固形腫瘍である。１つの実施形態では、悪性腫瘍は、神経膠腫、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、鼻咽頭癌、口腔癌、舌癌、喉頭癌、頭頸部の癌、黒色腫、気管支の癌、肺癌、胸膜癌、食道癌、胃癌、肝細胞癌、膵癌、胆管癌、結腸直腸癌、直腸癌、腎細胞癌、膀胱癌、前立腺癌、スプラレノーマ（ｓｕｐｒａｒｅｎｏｍａ）、甲状腺癌、副甲状腺癌、下垂体腫瘍、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、子宮頸がん、卵巣がん、子宮内膜がん、乳がん、骨がん、及び骨肉腫からなる群から選択される。
【0051】
１つの実施形態では、医薬組成物は薬学的に許容される担体を更に含む。
【0052】
処置方法及び使用
本発明は、悪性腫瘍を処置するための方法であって、有効量の本発明の改変された細菌又は本発明の医薬組成物を、悪性腫瘍を有する対象に投与するステップを含む方法を提供する。
本発明は、悪性腫瘍を処置するための方法であって、有効量の本発明の改変された細菌又は本発明の医薬組成物を、悪性腫瘍を有する対象に投与するステップを含む方法を提供する。
【0053】
本発明は、悪性腫瘍を有する対象において抗腫瘍特異的免疫応答を誘発するための方法であって、有効量の本発明の改変された細菌又は本発明の医薬組成物を、悪性腫瘍を有する対象に投与するステップを含む方法を提供する。
【0054】
本発明は、悪性腫瘍を有する対象において抗腫瘍免疫メモリーを誘発するための方法であって、有効量の本発明の改変された細菌又は本発明の医薬組成物を、悪性腫瘍を有する対象に投与するステップを含む方法を提供する。
【0055】
本発明は、悪性腫瘍の転移又は再発を予防又は処置するための方法であって、有効量の本発明の改変された細菌又は本発明の医薬組成物を、悪性腫瘍を有する対象に投与するステップを含む方法を提供する。
【0056】
本発明は、悪性腫瘍の転移又は再発を予防又は処置するための方法であって、有効量の本発明の改変された細菌又は本発明の医薬組成物を、悪性腫瘍を有するか、又は悪性腫瘍の転移若しくは再発について高リスクに晒されている対象に投与するステップを含む方法を提供する。
【0057】
本発明は、これまでの抗腫瘍療法に対して耐性であるか又はそれが不奏功であった悪性腫瘍を処置するための方法であって、有効量の本発明の改変された細菌又は本発明の医薬組成物を、これまでの抗腫瘍療法に対して耐性であるか又はそれが不奏功であった悪性腫瘍を有する対象に投与するステップを含む方法を提供する。
【0058】
本発明は、悪性腫瘍の処置する際に用いられる医薬の製造における、本発明の改変された細菌の使用を提供する。
【0059】
本発明は、悪性腫瘍を有する対象において抗腫瘍特異的免疫応答を誘発するための医薬の製造における、本発明の改変された細菌の使用を提供する。
【0060】
本発明は、悪性腫瘍を有する対象において抗腫瘍免疫メモリーを誘発するための医薬の製造における、本発明の改変された細菌の使用を提供する。
【0061】
本発明は、悪性腫瘍の転移又は再発を予防又は処置するための医薬の製造における、本発明の改変された細菌の使用を提供する。
【0062】
本発明は、これまでの抗腫瘍療法に対して耐性であるか又はそれが不奏功であった悪性腫瘍を処置するため医薬の製造における、本発明の改変された細菌の使用を提供する。
【0063】
１つの実施形態では、改変された細菌は生存細菌である。
【0064】
１つの実施形態では、悪性腫瘍は、神経系、呼吸器系、消化器系、尿路系、生殖器系、造血系、リンパ系、内分泌系、又は皮膚粘膜由来の悪性腫瘍である。いくつかの実施形態では、悪性腫瘍は肉腫又はがんである。１つの実施形態では、悪性腫瘍は固形腫瘍である。１つの実施形態では、悪性腫瘍は、神経膠腫、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、鼻咽頭癌、口腔癌、舌癌、喉頭癌、頭頸部の癌、黒色腫、気管支の癌、肺癌、胸膜癌、食道癌、胃癌、肝細胞癌、膵癌、胆管癌、結腸直腸癌、直腸癌、腎細胞癌、膀胱癌、前立腺癌、スプラレノーマ、甲状腺癌、副甲状腺癌、下垂体腫瘍、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、子宮頸がん、卵巣がん、子宮内膜がん、乳がん、骨がん、及び骨肉腫からなる群から選択される。
【0065】
１つの実施形態では、本発明の細菌、医薬、又は医薬組成物は、静脈内、腫瘍内、筋肉内、皮下、腹腔内、経脳、胃腸、身体表面、口腔粘膜、経鼻、経直腸、又は経膣の各経路により投与される。１つの実施形態では、本発明の細菌、医薬、又は医薬組成物は、静脈内、腫瘍内、筋肉内、皮下、腹腔内、経脳、胃腸、身体表面、口腔粘膜、経鼻、経直腸、又は経膣の各経路により投与される形態で製剤化され得る。
【0066】
１つの実施形態では、本発明の医薬又は医薬組成物の投与剤形は、例えば、溶液、エマルジョン、凍結乾燥調製物、又は懸濁物の形態であり得、経口投与のためには、投与剤形は、錠剤又はカプセルの形態であり得、鼻腔内投薬のためには、投与剤形は、粉末、ドロップ、又はエアロゾルの形態であり得、身体表面への投与のためには、投与剤形は、水溶液、懸濁物、軟膏、クリーム、又はゲルの形態であり得、直腸又は膣への投与のためには、投与剤形は、内視鏡手技又は結腸内視鏡手技の一環として送達される坐剤、浣腸であり得る。１つの実施形態では、医薬又は医薬組成物は、溶液、エマルジョン、凍結乾燥調製物、又は懸濁物の形態で製剤化され、経口投与のためには、医薬又は医薬組成物は、錠剤又はカプセルの形態で製剤化され得、鼻腔内剤型のためには、医薬又は医薬組成物は、粉末、点鼻剤、又はエアロゾルの形態で製剤化され得、身体表面投与のためには、医薬又は医薬組成物は、水溶液、懸濁物、軟膏、クリーム、又はゲルの形態で製剤化され得、直腸又は膣投与のためには、医薬又は医薬組成物は、内視鏡手技又は結腸内視鏡手技の一環として送達される坐剤、浣腸として製剤化され得る。投与剤形を調製するための当技術分野において公知の方法については、例えば、Ａ．Ｇｅｎｎａｒｏ（２０００年、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｉｎｃ．Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ）により編纂された「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」（第２０版）を参照されたい。
【0067】
いくつかの実施形態では、本発明の細菌、医薬、又は医薬組成物は、リスト化された数値のうちの任意の２つの間の範囲、例えば１分～１０分、１分～３０分、１分～１時間、１分～２時間、１分～４時間、１分～１２時間、１分～１８時間、１分～１日、１０分～３０分、１０分～１時間、１０分～２時間、１０分～４時間、１０分～１２時間、１０分～１８時間、１０分～１日、３０分～１時間、３０分～２時間、３０分～４時間、３０分～１２時間、３０分～１８時間、３０分～１日、３０分～２日間、１時間～２時間、１時間～４時間、１時間～１２時間、１時間～１８時間、１時間～１日、４時間～１２時間、４時間～１８時間、４時間～１日、１時間～２日、１時間～３日、１時間～４日、１時間～５日、１時間～７日、１時間～１０日、２時間～３日、２時間～４日、２時間～５日、２時間～７日、２時間～１０日、又は５日～１０日を含む、１分、２分、３分、４分、５分、６分、７分、８分、９分、１０分、１５分、２０分、２５分、３０分、３５分、４０分、４５分、５０分、５５分、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１３時間、１４時間、１５時間、１６時間、１７時間、１８時間、１９時間、２０時間、２１時間、２２時間、２３時間、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、又は１０日を含むが、これらに限定されない様々な間隔で投与され得る。いくつかの実施形態では、細菌、医薬、又は医薬組成物は、週１回、２週間に１回、３週間に１回、４週間に１回、５週間に１回、６週間に１回、７週間に１回、８週間に１回、９週間に１回、１０週間に１回、１５週間に１回、２０週間に１回、２５週間に１回、又は２６週間に１回投与される。いくつかの実施形態では、本発明の細菌、医薬、又は医薬組成物は、リスト化された数値のうちの任意の２つの間の範囲、例えば１分～１０分、１分～３０分、１分～１時間、１分～２時間、１分～４時間、１分～１２時間、１分～１８時間、１分～１日、１０分～３０分、１０分～１時間、１０分～２時間、１０分～４時間、１０分～１２時間、１０分～１８時間、１０分～１日、３０分～１時間、３０分～２時間、３０分～４時間、３０分～１２時間、３０分～１８時間、３０分～１日、３０分～２日間、１時間～２時間、１時間～４時間、１時間～１２時間、１時間～１８時間、１時間～１日、４時間～１２時間、４時間～１８時間、４時間～１日、１時間～２日、１時間～３日、１時間～４日、１時間～５日、１時間～７日、１時間～１０日、２時間～３日、２時間～４日、２時間～５日、２時間～７日、２時間～１０日、又は５日間～１０日を含む、１分、２分、３分、４分、５分、６分、７分、８分、９分、１０分、１５分、２０分、２５分、３０分、３５分、４０分、４５分、５０分、５５分、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１３時間、１４時間、１５時間、１６時間、１７時間、１８時間、１９時間、２０時間、２１時間、２２時間、２３時間、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、又は１０日を含むが、これらに限定されない様々な間隔で投与されるように製剤化され得る。いくつかの実施形態では、細菌、医薬、又は医薬組成物は、週１回、２週間に１回、３週間に１回、４週間に１回、５週間に１回、６週間に１回、７週間に１回、８週間に１回、９週間に１回、１０週間に１回、１５週間に１回、２０週間に１回、２５週間に１回、又は２６週間に１回投与されるように製剤化される。投与レジメンは、専門家により達成されると予想される薬物動態学的減衰パターンに依存し得る。療法の進行は、慣例的な技術及びアッセイ法によりモニタリングされ得る。投与レジメンは長期間にわたり変化する可能性がある。
【0068】
いくつかの実施形態では、医薬又は医薬組成物内の細菌の有効量は、リスト化された数値のうちの任意の２つの間の範囲、例えば１０４～１０８ｃｆｕ、１０４～１０９ｃｆｕ、１０４～１０１０ｃｆｕ、１０４～１０１１ｃｆｕ、１０４～１０１２ｃｆｕ、１０４～１０１２ｃｆｕ、１０５～１０８ｃｆｕ、１０５～１０９ｃｆｕ、１０５～１０１０ｃｆｕ、１０５～１０１１ｃｆｕ、１０５～１０１２ｃｆｕ、１０５～１０１２ｃｆｕ、１０６～１０８ｃｆｕ、１０６～１０９ｃｆｕ、１０６～１０１０ｃｆｕ、１０６～１０１１ｃｆｕ、１０６～１０１２ｃｆｕ、１０６～１０１２ｃｆｕ、１０７～１０８ｃｆｕ、１０７～１０９ｃｆｕ、１０７～１０１０ｃｆｕ、１０７～１０１１ｃｆｕ、１０７～１０１２ｃｆｕ、１０７～１０１２ｃｆｕ、１０８～１０９ｃｆｕ、１０８～１０１０ｃｆｕ、１０８～１０１１ｃｆｕ、１０８～１０１２ｃｆｕ、又は１０８～１０１２ｃｆｕ等を含む、少なくとも約１０４コロニー形成単位（ｃｆｕ）、例えば少なくとも約１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、１０１１、１０１２、又は１０１３ｃｆｕを含む。
【0069】
いくつかの実施形態では、有効用量の本発明の細菌、医薬、又は医薬組成物の容積は、約３ｍＬ、約２．５ｍＬ、約２ｍＬ、約１．５ｍＬ、約１ｍＬ、約０．７５ｍＬ、約０．５ｍＬ、約０．２５ｍＬ、又は約０．１ｍＬ未満であるか又はそれに等しい。いくつかの実施形態では、有効用量の細菌、医薬、又は医薬組成物の容積は、約２０ｍＬ、約１９ｍＬ、約１８ｍＬ、約１７ｍＬ、約１６ｍＬ、約１５ｍＬ、約１４ｍＬ、約１３ｍＬ、約１２ｍＬ、約１１ｍＬ、約１０ｍＬ、約９ｍＬ、約８ｍＬ、約７ｍＬ、約６ｍＬ、約５ｍＬ、約４ｍＬ、約３ｍＬ、約２ｍＬ、又は約１ｍＬである。或いは、有効用量の細菌、医薬、又は医薬組成物の容積は、約２０．５ｍＬ、約１９．５ｍＬ、約１８．５ｍＬ、約１７．５ｍＬ、約１６．５ｍＬ、約１５．５ｍＬ、約１４．５ｍＬ、約１３．５ｍＬ、約１２．５ｍＬ、約１１．５ｍＬ、約１０．５ｍＬ、約９．５ｍＬ、約８．５ｍＬ、約７．５ｍＬ、約６．５ｍＬ、約５．５ｍＬ、約４．５ｍＬ、約３．５ｍＬ、約２．５ｍＬ、約１．５ｍＬ、又は約０．５ｍＬである。いくつかの実施形態では、有効用量の細菌、医薬、又は医薬組成物の容積は、約２００ｍＬ、約１９０ｍＬ、約１８０ｍＬ、約１７０ｍＬ、約１６０ｍＬ、約１５０ｍＬ、約１４０ｍＬ、約１３０ｍＬ、約１２０ｍＬ、約１１０ｍＬ、約１００ｍＬ、約９０ｍＬ、約８０ｍＬ、約７０ｍＬ、約６０ｍＬ、約５０ｍＬ、約４０ｍＬ、又は約３０ｍＬ、並びにリスト化された数値のうちの任意の２つの間の範囲、例えば１００ｍＬ～１１０ｍＬ、１００ｍＬ～１２０ｍＬ、９０ｍＬ～１２０ｍＬ、９０ｍＬ～１３０ｍＬである。或いは、有効用量の細菌、医薬、又は医薬組成物の容積は、約２０５ｍＬ、約１９５ｍＬ、約１８５ｍＬ、約１７５ｍＬ、約１６５ｍＬ、約１５５ｍＬ、約１４５ｍＬ、約１３５ｍＬ、約１２５ｍＬ、約１１５ｍＬ、約１０５ｍＬ、約９５ｍＬ、約８５ｍＬ、約７５ｍＬ、約６５ｍＬ、約５５ｍＬ、約４５ｍＬ、約３５ｍＬ、又は約２５ｍＬ、並びにリスト化された数値のうちの任意の２つの間の範囲、例えば１０５ｍＬ～１１５ｍＬ、１０５ｍＬ～１２５ｍＬ、９５ｍＬ～１２５ｍＬ、９５ｍＬ～１３５ｍＬである。或いは、有効用量の細菌、医薬、又は医薬組成物の容積は、約９００マイクロリットル、約８００マイクロリットル、約７００マイクロリットル、約６００マイクロリットル、約５００マイクロリットル、約４００マイクロリットル、約３００マイクロリットル、約２００マイクロリットル、又は約１００マイクロリットル、任意選択的に約９５０マイクロリットル、約８５０マイクロリットル、約７５０マイクロリットル、約６５０マイクロリットル、約５５０マイクロリットル、約４５０マイクロリットル、約３５０マイクロリットル、約２５０マイクロリットル、約１５０マイクロリットル、又は約５０マイクロリットルである。いくつかの実施形態では、有効用量の細菌、医薬、又は医薬組成物の容積は、約２．０ｍＬ未満であるか又はそれに等しい。
【0070】
例えば医薬又は医薬組成物中の本発明の細菌濃度は、リスト化された数値のうちの任意の２つの間の範囲、例えば１０３～１０８ｃｆｕ／ｍＬ、１０３～１０９ｃｆｕ／ｍＬ、１０３～１０１０ｃｆｕ／ｍＬ、１０３～１０１１ｃｆｕ／ｍＬ、１０３～１０１２ｃｆｕ／ｍＬ、１０３～１０１３ｃｆｕ／ｍＬ、１０４～１０８ｃｆｕ／ｍＬ、１０４～１０９ｃｆｕ／ｍＬ、１０４～１０１０ｃｆｕ／ｍＬ、１０４～１０１１ｃｆｕ／ｍＬ、１０４～１０１２ｃｆｕ／ｍＬ、１０４～１０１３ｃｆｕ／ｍＬ、１０５～１０８ｃｆｕ／ｍＬ、１０５～１０９ｃｆｕ／ｍＬ、１０５～１０１０ｃｆｕ／ｍＬ、１０５～１０１１ｃｆｕ／ｍＬ、１０５～１０１２ｃｆｕ／ｍＬ、１０５～１０１３ｃｆｕ／ｍＬ、１０６～１０８ｃｆｕ／ｍＬ、１０６～１０９ｃｆｕ／ｍＬ、１０６～１０１０ｃｆｕ／ｍＬ、１０６～１０１１ｃｆｕ／ｍＬ、１０６～１０１２ｃｆｕ／ｍＬ、１０６～１０１３ｃｆｕ／ｍＬ、１０７～１０８ｃｆｕ／ｍＬ、１０７～１０９ｃｆｕ／ｍＬ、１０７～１０１０ｃｆｕ／ｍＬ、１０７～１０１１ｃｆｕ／ｍＬ、１０７～１０１２ｃｆｕ／ｍＬ、１０７～１０１３ｃｆｕ／ｍＬ、１０８～１０９ｃｆｕ／ｍＬ、１０８～１０１０ｃｆｕ／ｍＬ、１０８～１０１１ｃｆｕ／ｍＬ、１０８～１０１２ｃｆｕ／ｍＬ、又は１０８～１０１３ｃｆｕ／ｍＬを含む、少なくとも約１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、１０１１、１０１２、又は１０１３ｃｆｕ／ｍＬであり得る。例えば、医薬又は医薬組成物中の本発明の細菌濃度は、リスト化された数値のうちの任意の２つの間の範囲、例えば１０３～１０８ｃｆｕ／ｇ、１０３～１０９ｃｆｕ／ｇ、１０３～１０１０ｃｆｕ／ｇ、１０３～１０１１ｃｆｕ／ｇ、１０３～１０１２ｃｆｕ／ｇ、１０３～１０１３ｃｆｕ／ｇ、１０４～１０８ｃｆｕ／ｇ、１０４～１０９ｃｆｕ／ｇ、１０４～１０１０ｃｆｕ／ｇ、１０４～１０１１ｃｆｕ／ｇ、１０４～１０１２ｃｆｕ／ｇ、１０４～１０１３ｃｆｕ／ｇ、１０５～１０８ｃｆｕ／ｇ、１０５～１０９ｃｆｕ／ｇ、１０５～１０１０ｃｆｕ／ｇ、１０５～１０１１ｃｆｕ／ｇ、１０５～１０１２ｃｆｕ／ｇ、１０５～１０１３ｃｆｕ／ｇ、１０６～１０８ｃｆｕ／ｇ、１０６～１０９ｃｆｕ／ｇ、１０６～１０１０ｃｆｕ／ｇ、１０６～１０１１ｃｆｕ／ｇ、１０６～１０１２ｃｆｕ／ｇ、１０６～１０１３ｃｆｕ／ｇ、１０７～１０８ｃｆｕ／ｇ、１０７～１０９ｃｆｕ／ｇ、１０７～１０１０ｃｆｕ／ｇ、１０７～１０１１ｃｆｕ／ｇ、１０７～１０１２ｃｆｕ／ｇ、１０７～１０１３ｃｆｕ／ｇ、１０８～１０９ｃｆｕ／ｇ、１０８～１０１０ｃｆｕ／ｇ、１０８～１０１１ｃｆｕ／ｇ、１０８～１０１２ｃｆｕ／ｇ、又は１０８～１０１３ｃｆｕ／ｇを含む、少なくとも約１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、１０１１、１０１２、又は１０１３ｃｆｕ／ｇであり得る。
【0071】
本明細書に記載される投薬量の範囲は例示に過ぎず、医師により選択され得る投薬量の範囲を制限しない。本発明の医薬組成物内の活性化合物（例えば、本発明の細菌）の量は、悪性腫瘍の有無、処置される悪性腫瘍のタイプ及び重症度、細菌、医薬、又は医薬組成物の活性又は生存率、投与経路、処置期間、もしあれば、細菌、医薬、又は医薬組成物と組み合わせて使用される医薬、対象の食習慣及び全身健康状態、並びに当技術分野において周知の類似した要因を含む、いくつかの要因、例えば疾患状態、年齢、性別、及び個体の重量等に基づき変化し得る。投与レジメンが最適な治療応答を実現するために調整され得る。例えば、単回用量が投与される場合もあれば、いくつかの分割された用量が長期的に投与される場合もあり、又は用量は治療状況の緊急性が示すところにより比例的に増減し得る。
【0072】
本発明の細菌、医薬、又は医薬組成物は、当技術分野において周知の方法、例えば、とりわけ、発酵槽内での微生物の増殖、それに後続する濃縮及び遠心分離による洗浄、濾過又は透析、従来式の造粒、混合、溶解、カプセル化、真空凍結乾燥、又は乳化プロセス等により製造され得る。本発明の細菌、医薬、又は医薬組成物は、顆粒、析出物、又は粒子状物質、粉末を含む様々な形態で製造され得るが、そのような形態として、凍結乾燥、ロータリー乾燥、又はスプレー乾燥された粉末、非結晶性粉末、注射剤、エマルジョン、エリキシル剤、懸濁物、又は溶液が挙げられる。製剤は、任意選択的に、安定剤、ｐＨ改変因子、界面活性剤、バイオアベイラビリティー改変因子、及びこれらを組み合わせたものを含有し得る。
【0073】
１つの実施形態では、本発明の細菌、医薬、又は医薬組成物は、担体の存在下において、単独で又はその他の化合物若しくは組成物と組み合わせて投与され得る。１つの実施形態では、細菌、医薬、又は医薬組成物は、放射線療法、化学療法、及び手術を含むが、これらに限定されないその他の悪性腫瘍療法と組み合わせて投与され得る。細菌、医薬、又は医薬組成物は、そのような場合には、療法におけるアジュバントとして使用され得る。したがって、実施形態の別の態様は、放射線療法や化学療法から選択される悪性腫瘍療法においてアジュバントとして使用するための細菌、医薬、又は医薬組成物に関する。
【0074】
例示的実施形態
実施形態Ａ
実施形態Ａ１：細菌が、偏性低酸素誘導プロモーターの制御下に細菌の必須遺伝子を含む低酸素制御型必須遺伝子発現カセットを含み、細菌が、非改変型開始株と比較して、内因性抗酸化性ストレス応答経路に関与するか又はそれを制御する少なくとも１つの遺伝子又はその機能的発現産物を欠損している、改変された細菌。
実施形態Ａ
実施形態Ａ１：細菌が、偏性低酸素誘導プロモーターの制御下に細菌の必須遺伝子を含む低酸素制御型必須遺伝子発現カセットを含み、細菌が、非改変型開始株と比較して、内因性抗酸化性ストレス応答経路に関与するか又はそれを制御する少なくとも１つの遺伝子又はその機能的発現産物を欠損している、改変された細菌。
【0075】
実施形態Ａ２：偏性低酸素誘導プロモーターが、ｐｅｐＴｐ、ｆｎｒＳｐ、ｙｓｇＡｐ、ｓｓｂｐ１、Ｈｉｐ１、ＢＢａ＿Ｉ１４０１８、ＢＢａ＿Ｒ１０７４、Ｐｔｅｔ－ａｒｃＡ、及びＰｔｅｔ－Ｆｎｒからなる群から選択される、実施形態Ａ１に記載の改変された細菌。
【0076】
実施形態Ａ３：偏性低酸素誘導プロモーターがｓｓｂｐ１プロモーターである、実施形態Ａ１に記載の改変された細菌。
【0077】
実施形態Ａ４：必須遺伝子の発現産物が、細菌内での２，６－ジアミノピメリン酸（ＤＡＰ）の合成に関与し、好気条件下で培養される場合、細菌の増殖が、培地中に添加される追加のＤＡＰ又はそのアナログに依存する、先行する実施形態Ａのいずれか１つに記載の改変された細菌。
【0078】
実施形態Ａ５：必須遺伝子が、ｄａｐＡ、ｄａｐＢ、ｄａｐＤ、ｄａｐＥ、ａｒｇＤ、ｄａｐＦ、及び任意のこれらの組合せから選択される、実施形態Ａ４に記載の改変された細菌。
【0079】
実施形態Ａ６：必須遺伝子がｄａｐＡ及びｄａｐＥから選択される、実施形態Ａ４に記載の改変された細菌。
【0080】
実施形態Ａ７：内因性抗酸化性ストレス応答経路に関与するか又はそれを制御する遺伝子が、ＨｔｒＡセリンプロテアーゼファミリー遺伝子である、先行する実施形態Ａのうちのいずれか１つに記載の改変された細菌。
【0081】
実施形態Ａ８：内因性抗酸化性ストレス応答経路に関与するか又はそれを制御する遺伝子の機能的発現産物が、ＨｔｒＡセリンプロテアーゼファミリーに関連するタンパク質である、先行する実施形態Ａのうちのいずれか１つに記載の改変された細菌。
【0082】
実施形態Ａ９：細菌がＨｔｒＡセリンプロテアーゼの活性を欠損している、先行する実施形態Ａのうちのいずれか１つに記載の改変された細菌。
【0083】
実施形態Ａ１０：内因性抗酸化性ストレス応答経路に関与するか又はそれを制御する遺伝子がｈｔｒＡである、先行する実施形態Ａのうちのいずれか１つに記載の改変された細菌。
【0084】
実施形態Ａ１１：細菌がｈｔｒＡを欠損している、先行する実施形態Ａのうちのいずれか１つに記載の改変された細菌。
【0085】
実施形態Ａ１２：必須遺伝子が細菌染色体内に天然に存在する遺伝子であり、必須遺伝子の天然プロモーターが偏性低酸素誘導プロモーターと機能的に置き換わり、それによって細菌内での必須遺伝子の発現が偏性低酸素誘導プロモーターの制御下に完全に置かれる、実施形態Ａ１～Ａ１１のうちのいずれか１つに記載の改変された細菌。
【0086】
実施形態Ａ１３：必須遺伝子発現カセットが外因性であり、細菌染色体内に天然に存在する必須遺伝子が欠失されるか又は機能的に不活性化されており、それによって細菌内での必須遺伝子の発現が偏性低酸素誘導プロモーターの制御下に完全に置かれる、実施形態Ａ１～Ａ１１のうちのいずれか１つに記載の改変された細菌。
【0087】
実施形態Ａ１４：外因性必須遺伝子発現カセットが細菌染色体中に組み込まれている、実施形態Ａ１３に記載の改変された細菌。
【0088】
実施形態Ａ１５：外因性必須遺伝子発現カセットが細菌染色体の外部にある、実施形態Ａ１３に記載の改変された細菌。
【0089】
実施形態Ａ１６：外因性必須遺伝子発現カセットが細菌により担持されるプラスミド内に存在する、実施形態Ａ１５に記載の改変された細菌。
【0090】
実施形態Ａ１７：ｐＨ制御型発現カセットを更に含み、ｐＨ制御型発現カセットが、酸性ｐＨ条件下で活性であるプロモーターの制御下に細菌由来のヘモリジンタンパク質をコードする遺伝子を含む、先行する実施形態Ａのうちのいずれか１つに記載の改変された細菌。
【0091】
実施形態Ａ１８：細菌由来のヘモリジンタンパク質がグラム陰性細菌のヘモリジンタンパク質である、実施形態Ａ１７に記載の改変された細菌。
【0092】
実施形態Ａ１９：グラム陰性菌のヘモリジンタンパク質をコードする遺伝子がｈｌｙＡ又はｈｌｙＥである、実施形態Ａ１８に記載の改変された細菌。
【0093】
実施形態Ａ２０：ｈｌｙＡ又はｈｌｙＥが、リステリア・モノサイトゲネス、ビブリオ・コレラ、又は大腸菌に由来する、実施形態Ａ１９に記載の改変された細菌。
【0094】
実施形態Ａ２１：酸性ｐＨ条件下で活性であるプロモーターが、７．０、６．９、６．８、６．７、６．６、６．５、６．４、６．３、６．２、６．１、６．０、５．９、５．８、５．７、５．６、又は５．５より低いｐＨにおいて活性である、実施形態Ａ１７～Ａ２０のうちのいずれか１つに記載の改変された細菌。
【0095】
実施形態Ａ２２：酸性ｐＨ条件下で活性であるプロモーターが、ｓｓｅＡ、ｓｓｒＡ、ｓｓａＢ、ｓｓａＧ、ｓｓａＭ、及びｓｓａＲからなる群から選択される、実施形態Ａ１７～Ａ２１のうちのいずれか１つに記載の改変された細菌。
【0096】
実施形態Ａ２３：酸性ｐＨ条件下で活性であるプロモーターがｓｓｅＡである、実施形態Ａ１７～Ａ２１のうちのいずれか１つに記載の改変された細菌。
【0097】
実施形態Ａ２４：非改変型開始株が通性嫌気性細菌である、先行する実施形態Ａのうちのいずれか１つに記載の改変された細菌。
【0098】
実施形態Ａ２５：細菌がエンテロバクター科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）の細菌である、先行する実施形態Ａのうちのいずれか１つに記載の改変された細菌。
【0099】
実施形態Ａ２６：細菌が、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属、シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）属、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）属、エルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）属、シトロバクター（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）属、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属、プロテウス（Ｐｒｏｔｅｕｓ）属、モルガネラ（Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ）属、プロビデンシア（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ）属、ハフニア（Ｈａｆｎｉａ）属、及びパントエア（Ｐａｎｔｏｅａ）属の細菌である、先行する実施形態Ａのうちのいずれか１つに記載の改変された細菌。
【0100】
実施形態Ａ２７：細菌が、大腸菌、エンテロバクター・ブラタエ、エンテロバクター・フェルグソニイ、エンテロバクター・ヘルマンニイ、エンテロバクター・ヴァルネリス、サルモネラ・エンテリカ、サルモネラ・ボンゴリ、腸チフス菌、サルモネラ・コレラエスイス、サルモネラ・チフィムリウム、シゲラ・ディセンテリアエ、シゲラ・フレクスネリ、シゲラ・ボイディイ、シゲラ・ゾネイ、肺炎桿菌、クレブシエラ・オキシトカ、ペスト菌、腸炎エルシニア、仮性結核菌、エルシニア・アルドヴァエ、エルシニア・ベルコヴィエリ、エルシニア・フレデリクセニイ、エルシニア・インテルメディア、エルシニア・クリステルセニイ、エルシニア・モラレッティ、エルシニア・ローデイ、エルシニア・ルッケリ、シトロバクター・フロインデイ、シトロバクター・コセリ、シトロバクター・ブラアキイ、エンテロバクター・アエロゲネス、エンテロバクター・クロアカエ、エンテロバクター・ゲルゴヴィアエ、エンテロバクター・サカザキイ、エンテロバクター・タイロラエ、エンテロバクター・アムニゲヌス（、エンテロバクター・インテルメディウス、エンテロバクター・アスブリアエ、エンテロバクター・カンセロゲヌス、エンテロバクター・ディソルヴェンス、エンテロバクター・ニミプレスウラリス、セラチア・マルセセンス、セラチア・エントモフィラ、セラチア・フィカリア、セラチア・フォンチコラ、セラチア・グリメシイ、セラチア・リクエファシエンス、セラチア・オドリフェラ、セラチア・プリムティカ、セラチア・プロテアマキュランス、セラチア・ルビダエア、セラチア・ウレイリチカ、プロテウス・ミラビリス、プロテウス・ヴァルガリス、プロテウス・ミクソファシエンス、プロテウス・ペンネリ、プロテウス・ハウセリ、モルガネラ・モルガニイ、プロビデンシア・アルカリファシエンス、プロビデンシア・ルスティジアニイ、プロビデンシア・スチュアーチイ、プロビデンシア・レットゲリ、プロビデンシア・ヘイムバッカエ、ハフニア・アルヴェイ、及びパントエア・アグロメランスからなる群から選択される、先行する実施形態Ａのうちのいずれか１つに記載の改変された細菌。
【0101】
実施形態Ａ２８：細菌がサルモネラ・チフィムリウムの細菌である、先行する実施形態Ａのうちのいずれか１つに記載の改変された細菌。
【0102】
実施形態Ａ２９：開始株がサルモネラ・チフィムリウムＳＬ７２０７である、実施形態Ａ２８に記載の改変された細菌。
【0103】
実施形態Ａ３０：細菌が野生型リポ多糖類（ＬＰＳ）を発現する、先行する実施形態Ａのうちのいずれか１つに記載の改変された細菌。
【0104】
実施形態Ａ３１：細菌が、腫瘍を有する対象に投与されると、腫瘍組織内で生存及び増殖する能力を有し、正常組織では速やかに排除される、先行する実施形態Ａのうちのいずれか１つに記載の改変された細菌。
【0105】
実施形態Ａ３２：細菌が、悪性腫瘍を有する対象に投与されると、悪性腫瘍の増殖を阻害する能力を有する、先行する実施形態Ａのうちのいずれか１つに記載の改変された細菌。
【0106】
実施形態Ａ３３：細菌が、悪性腫瘍を有する対象に投与されると、抗腫瘍特異的免疫応答を誘発する能力を有する、先行する実施形態Ａのうちのいずれか１つに記載の改変された細菌。
【0107】
実施形態Ａ３４：細菌が、悪性腫瘍を有する対象に投与されると、抗腫瘍免疫メモリーを誘発する能力を有する、先行する実施形態Ａのうちのいずれか１つに記載の改変された細菌。
【0108】
実施形態Ａ３５：野生型フラゲリンを発現しない、先行する実施形態Ａのうちのいずれか１つに記載の改変された細菌。
【0109】
実施形態Ａ３６：ｆｌｉＣ遺伝子を欠損している、先行する実施形態Ａのうちのいずれか１つに記載の改変された細菌。
【0110】
実施形態Ａ３７：マクロファージ内での細菌の生存レベルが、非改変型開始株の生存レベルの約５０％～約３０％の範囲である、先行する実施形態Ａのうちのいずれか１つに記載の改変された細菌。
【0111】
実施形態Ａ３８：マクロファージ内での細菌の生存レベルが、非改変型開始株の生存レベルの約３０％～約１０％の範囲である、実施形態Ａ１～Ａ３６のうちのいずれか１つに記載の改変された細菌。
【0112】
実施形態Ａ３９：マクロファージ内での細菌の生存レベルが、非改変型開始株の生存レベルの約１０％～約１％の範囲である、実施形態Ａ１～Ａ３６のうちのいずれか１つに記載の改変された細菌。
【0113】
実施形態Ｂ
実施形態Ｂ１：細菌が、偏性低酸素誘導プロモーターの制御下に細菌の必須遺伝子を含む低酸素制御型必須遺伝子発現カセットと、酸性ｐＨ条件下で活性であるプロモーターの制御下に、細菌由来のヘモリジンタンパク質をコードする遺伝子を含むｐＨ制御型発現カセットとを含み、細菌が、非改変型開始株と比較して、内因性抗酸化性ストレス応答経路に関与するか又はそれを制御する少なくとも１つの遺伝子又はその機能的発現産物を欠損している、改変された細菌。
実施形態Ｂ１：細菌が、偏性低酸素誘導プロモーターの制御下に細菌の必須遺伝子を含む低酸素制御型必須遺伝子発現カセットと、酸性ｐＨ条件下で活性であるプロモーターの制御下に、細菌由来のヘモリジンタンパク質をコードする遺伝子を含むｐＨ制御型発現カセットとを含み、細菌が、非改変型開始株と比較して、内因性抗酸化性ストレス応答経路に関与するか又はそれを制御する少なくとも１つの遺伝子又はその機能的発現産物を欠損している、改変された細菌。
【0114】
実施形態Ｂ２：偏性低酸素誘導プロモーターが、ｐｅｐＴｐ、ｆｎｒＳｐ、ｙｓｇＡｐ、ｓｓｂｐ１、Ｈｉｐ１、ＢＢａ＿Ｉ１４０１８、ＢＢａ＿Ｒ１０７４、Ｐｔｅｔ－ａｒｃＡ、及びＰｔｅｔ－Ｆｎｒからなる群から選択される、実施形態Ｂ１に記載の改変された細菌。
【0115】
実施形態Ｂ３：偏性低酸素誘導プロモーターがｓｓｂｐ１プロモーターである、実施形態Ｂ１に記載の改変された細菌。
【0116】
実施形態Ｂ４：必須遺伝子の発現産物が、細菌内での２，６－ジアミノピメリン酸（ＤＡＰ）の合成に関与し、好気条件下で培養される場合、細菌の増殖が、培地中に添加される追加のＤＡＰ又はそのアナログに依存する、先行する実施形態Ｂのうちのいずれか１つに記載の改変された細菌。
【0117】
実施形態Ｂ５：必須遺伝子が、ｄａｐＡ、ｄａｐＢ、ｄａｐＤ、ｄａｐＥ、ａｒｇＤ、ｄａｐＦ、及び任意のこれらの組合せから選択される、実施形態Ｂ４に記載の改変された細菌。
【0118】
実施形態Ｂ６：必須遺伝子がｄａｐＡ及びｄａｐＥから選択される、実施形態Ｂ４に記載の改変された細菌。
【0119】
実施形態Ｂ７：内因性抗酸化性ストレス応答経路に関与するか又はそれを制御する遺伝子が、ＨｔｒＡセリンプロテアーゼファミリー遺伝子である、先行する実施形態Ｂのうちのいずれか１つに記載の改変された細菌。
【0120】
実施形態Ｂ８：内因性抗酸化性ストレス応答経路に関与するか又はそれを制御する遺伝子の機能的発現産物が、ＨｔｒＡセリンプロテアーゼファミリーに関連するタンパク質である、先行する実施形態Ａのうちのいずれか１つに記載の改変された細菌。
【0121】
実施形態Ｂ９：細菌がＨｔｒＡセリンプロテアーゼの活性を欠損している、先行する実施形態Ｂのうちのいずれか１つに記載の改変された細菌。
【0122】
実施形態Ｂ１０：内因性抗酸化性ストレス応答経路に関与するか又はそれを制御する遺伝子がｈｔｒＡである、先行する実施形態Ｂのうちのいずれか１つに記載の改変された細菌。
【0123】
実施形態Ｂ１１：細菌がｈｔｒＡを欠損している、先行する実施形態Ｂのうちのいずれか１つに記載の改変された細菌。
【0124】
実施形態Ｂ１２：必須遺伝子が細菌染色体内に天然に存在する遺伝子であり、必須遺伝子の天然プロモーターが偏性低酸素誘導プロモーターと機能的に置き換わり、それによって細菌内での必須遺伝子の発現が偏性低酸素誘導プロモーターの制御下に完全に置かれる、実施形態Ｂ１～Ｂ１１のうちのいずれか１つに記載の改変された細菌。
【0125】
実施形態Ｂ１３：必須遺伝子発現カセットが外因性であり、細菌染色体内に天然に存在する必須遺伝子が欠失されるか又は機能的に不活性化されており、それによって細菌内での必須遺伝子の発現が偏性低酸素誘導プロモーターの制御下に完全に置かれる、実施形態Ｂ１～Ｂ１１のうちのいずれか１つに記載の改変された細菌。
【0126】
実施形態Ｂ１４：外因性必須遺伝子発現カセットが細菌染色体中に組み込まれている、実施形態Ｂ１３に記載の改変された細菌。
【0127】
実施形態Ｂ１５：外因性必須遺伝子発現カセットが細菌染色体の外部にある、実施形態Ｂ１３に記載の改変された細菌。
【0128】
実施形態Ｂ１６：外因性必須遺伝子発現カセットが細菌により担持されるプラスミド内に存在する、実施形態Ｂ１５に記載の改変された細菌。
【0129】
実施形態Ｂ１７：細菌由来のヘモリジンタンパク質がグラム陰性菌のヘモリジンタンパク質である、先行する実施形態Ｂのうちのいずれか１つに記載の改変された細菌。
【0130】
実施形態Ｂ１８：グラム陰性菌のヘモリジンタンパク質をコードする遺伝子がｈｌｙＡ又はｈｌｙＥである、実施形態Ｂ１７に記載の改変された細菌。
【0131】
実施形態Ｂ１９：ｈｌｙＡ又はｈｌｙＥが、リステリア・モノサイトゲネス、ビブリオ・コレラ、又は大腸菌に由来する、実施形態Ｂ１８に記載の改変された細菌。
【0132】
実施形態Ｂ２０：酸性ｐＨ条件下で活性であるプロモーターが、７．０、６．９、６．８、６．７、６．６、６．５、６．４、６．３、６．２、６．１、６．０、５．９、５．８、５．７、５．６、又は５．５より低いｐＨにおいて活性である、先行する実施形態Ｂのうちのいずれか１つに記載の改変された細菌。
【0133】
実施形態Ｂ２１：酸性ｐＨ条件下で活性であるプロモーターが、ｓｓｅＡ、ｓｓｒＡ、ｓｓａＢ、ｓｓａＧ、ｓｓａＭ、及びｓｓａＲからなる群から選択される、先行する実施形態Ｂのうちのいずれか１つに記載の改変された細菌。
【0134】
実施形態Ｂ２２：酸性ｐＨ条件下で活性であるプロモーターがｓｓｅＡである、先行する実施形態Ｂのうちのいずれか１つに記載の改変された細菌。
【0135】
実施形態Ｂ２３：非改変型開始株が通性嫌気性細菌である、先行する実施形態Ｂのうちのいずれか１つに記載の改変された細菌。
【0136】
実施形態Ｂ２４：細菌がエンテロバクター科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）の細菌である、先行する実施形態Ｂのうちのいずれか１つに記載の改変された細菌。
【0137】
実施形態Ｂ２５：細菌が、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属、シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）属、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）属、エルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）属、シトロバクター（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）属、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属、プロテウス（Ｐｒｏｔｅｕｓ）属、モルガネラ（Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ）属、プロビデンシア（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ）属、ハフニア（Ｈａｆｎｉａ）属、及びパントエア（Ｐａｎｔｏｅａ）属の細菌である、実施形態Ｂのうちのいずれか１つに記載の改変された細菌。
【0138】
実施形態Ｂ２６：細菌が、大腸菌、エンテロバクター・ブラタエ、エンテロバクター・フェルグソニイ、エンテロバクター・ヘルマンニイ、エンテロバクター・ヴァルネリス、サルモネラ・エンテリカ、サルモネラ・ボンゴリ、腸チフス菌、サルモネラ・コレラエスイス、サルモネラ・チフィムリウム、シゲラ・ディセンテリアエ、シゲラ・フレクスネリ、シゲラ・ボイディイ、シゲラ・ゾネイ、肺炎桿菌、クレブシエラ・オキシトカ、ペスト菌、腸炎エルシニア、仮性結核菌、エルシニア・アルドヴァエ、エルシニア・ベルコヴィエリ、エルシニア・フレデリクセニイ、エルシニア・インテルメディア、エルシニア・クリステルセニイ、エルシニア・モラレッティ、エルシニア・ローデイ、エルシニア・ルッケリ、シトロバクター・フロインデイ、シトロバクター・コセリ、シトロバクター・ブラアキイ、エンテロバクター・アエロゲネス、エンテロバクター・クロアカエ、エンテロバクター・ゲルゴヴィアエ、エンテロバクター・サカザキイ、エンテロバクター・タイロラエ、エンテロバクター・アムニゲヌス、エンテロバクター・インテルメディウス、エンテロバクター・アスブリアエ、エンテロバクター・カンセロゲヌス、エンテロバクター・ディソルヴェンス、エンテロバクター・ニミプレスウラリス、セラチア・マルセセンス、セラチア・エントモフィラ、セラチア・フィカリア、セラチア・フォンチコラ、セラチア・グリメシイ、セラチア・リクエファシエンス、セラチア・オドリフェラ、セラチア・プリムティカ、セラチア・プロテアマキュランス、セラチア・ルビダエア、セラチア・ウレイリチカ、プロテウス・ミラビリス、プロテウス・ヴァルガリス、プロテウス・ミクソファシエンス、プロテウス・ペンネリ、プロテウス・ハウセリ、モルガネラ・モルガニイ、プロビデンシア・アルカリファシエンス、プロビデンシア・ルスティジアニイ、プロビデンシア・スチュアーチイ、プロビデンシア・レットゲリ、プロビデンシア・ヘイムバッカエ、ハフニア・アルヴェイ、及びパントエア・アグロメランスからなる群から選択される、実施形態Ｂのうちのいずれか１つに記載の改変された細菌。
【0139】
実施形態Ｂ２７：細菌がサルモネラ・チフィムリウムの細菌である、先行する実施形態Ｂのうちのいずれか１つに記載の改変された細菌。
【0140】
実施形態Ｂ２８：開始株がサルモネラ・チフィムリウムＳＬ７２０７である、実施形態Ｂ２７に記載の改変された細菌。
【0141】
実施形態Ｂ２９：細菌が野生型リポ多糖類（ＬＰＳ）を発現する、先行する実施形態Ｂのうちのいずれか１つに記載の改変された細菌。
【0142】
実施形態Ｂ３０：細菌が、腫瘍を有する対象に投与されると、腫瘍組織内で生存及び増殖する能力を有し、正常組織では速やかに排除される、先行する実施形態Ｂのうちのいずれか１つに記載の改変された細菌。
【0143】
実施形態Ｂ３１：細菌が、悪性腫瘍を有する対象に投与されると、悪性腫瘍の増殖を阻害する能力を有する、先行する実施形態Ｂのうちのいずれか１つに記載の改変された細菌。
【0144】
実施形態Ｂ３２：細菌が、悪性腫瘍を有する対象に投与されると、抗腫瘍特異的免疫応答を誘発する能力を有する、先行する実施形態Ｂのうちのいずれか１つに記載の改変された細菌。
【0145】
実施形態Ｂ３３：細菌が、悪性腫瘍を有する対象に投与されると、抗腫瘍免疫メモリーを誘発する能力を有する、先行する実施形態Ｂのうちのいずれか１つに記載の改変された細菌。
【0146】
実施形態Ｂ３４：野生型フラゲリンを発現しない、先行する実施形態Ａのうちのいずれか１つに記載の改変された細菌。
【0147】
実施形態Ｂ３５：ｆｌｉＣ遺伝子を欠損している、先行する実施形態Ｂのうちのいずれか１つに記載の改変された細菌。
【0148】
実施形態Ｂ３６：マクロファージ内での細菌の生存レベルが、非改変型開始株の生存レベルの約５０％～約３０％の範囲である、先行する実施形態Ｂのうちのいずれか１つに記載の改変された細菌。
【0149】
実施形態Ｂ３７：マクロファージ内での細菌の生存レベルが、非改変型開始株の生存レベルの約３０％～約１０％の範囲である、実施形態Ｂ１～Ｂ３５のうちのいずれか１つに記載の改変された細菌。
【0150】
実施形態Ｂ３８：マクロファージ内での細菌の生存レベルが、非改変型開始株の生存レベルの約１０％～約１％の範囲である、実施形態Ｂ１～Ｂ３５のうちのいずれか１つに記載の改変された細菌。
【0151】
実施形態Ｃ
実施形態Ｃ１：細菌が、偏性低酸素誘導プロモーターの制御下に細菌の必須遺伝子を含む低酸素制御型必須遺伝子発現カセットと、酸性ｐＨ条件下で活性であるプロモーターの制御下に、細菌由来のヘモリジンタンパク質をコードする遺伝子を含むｐＨ制御型発現カセットとを含み、細菌が、非改変型開始株と比較して、内因性抗酸化性ストレス応答経路に関与するか又はそれを制御する少なくとも１つの遺伝子又はその機能的発現産物を欠損している、サルモネラ・チフィムリウムの改変された細菌。
実施形態Ｃ１：細菌が、偏性低酸素誘導プロモーターの制御下に細菌の必須遺伝子を含む低酸素制御型必須遺伝子発現カセットと、酸性ｐＨ条件下で活性であるプロモーターの制御下に、細菌由来のヘモリジンタンパク質をコードする遺伝子を含むｐＨ制御型発現カセットとを含み、細菌が、非改変型開始株と比較して、内因性抗酸化性ストレス応答経路に関与するか又はそれを制御する少なくとも１つの遺伝子又はその機能的発現産物を欠損している、サルモネラ・チフィムリウムの改変された細菌。
【0152】
実施形態Ｃ２：偏性低酸素誘導プロモーターが、ｐｅｐＴｐ、ｆｎｒＳｐ、ｙｓｇＡｐ、ｓｓｂｐ１、Ｈｉｐ１、ＢＢａ＿Ｉ１４０１８、ＢＢａ＿Ｒ１０７４、Ｐｔｅｔ－ａｒｃＡ、及びＰｔｅｔ－Ｆｎｒからなる群から選択される、実施形態Ｃ１に記載の改変された細菌。
【0153】
実施形態Ｃ３：偏性低酸素誘導プロモーターがｓｓｂｐ１プロモーターである、実施形態Ｃ１に記載の改変された細菌。
【0154】
実施形態Ｃ４：必須遺伝子の発現産物が、細菌内での２，６－ジアミノピメリン酸（ＤＡＰ）の合成に関与し、好気条件下で培養される場合、細菌の増殖が、培地中に添加される追加のＤＡＰ又はそのアナログに依存する、先行する実施形態Ｃのうちのいずれか１つに記載の改変された細菌。
【0155】
実施形態Ｃ５：必須遺伝子が、ｄａｐＡ、ｄａｐＢ、ｄａｐＤ、ｄａｐＥ、ａｒｇＤ、ｄａｐＦ、及び任意のこれらの組合せから選択される、実施形態Ｃ４に記載の改変された細菌。
【0156】
実施形態Ｃ６：必須遺伝子がｄａｐＡ及びｄａｐＥから選択される、実施形態Ｃ４に記載の改変された細菌。
【0157】
実施形態Ｃ７：内因性抗酸化性ストレス応答経路に関与するか又はそれを制御する遺伝子が、ＨｔｒＡセリンプロテアーゼファミリー遺伝子である、先行する実施形態Ｃのうちのいずれか１つに記載の改変された細菌。
【0158】
実施形態Ｃ８：内因性抗酸化性ストレス応答経路に関与するか又はそれを制御する遺伝子の機能的発現産物が、ＨｔｒＡセリンプロテアーゼファミリーに関連するタンパク質である、先行する実施形態Ｃのうちのいずれか１つに記載の改変された細菌。
【0159】
実施形態Ｃ９：細菌がＨｔｒＡセリンプロテアーゼの活性を欠損している、先行する実施形態Ｃのうちのいずれか１つに記載の改変された細菌。
【0160】
実施形態Ｃ１０：内因性抗酸化性ストレス応答経路に関与するか又はそれを制御する遺伝子がｈｔｒＡである、先行する実施形態Ｃのうちのいずれか１つに記載の改変された細菌。
【0161】
実施形態Ｃ１１：細菌がｈｔｒＡを欠損している、先行する実施形態Ｃのうちのいずれか１つに記載の改変された細菌。
【0162】
実施形態Ｃ１２：必須遺伝子が細菌染色体内に天然に存在する遺伝子であり、必須遺伝子の天然プロモーターが偏性低酸素誘導プロモーターと機能的に置き換わり、それによって細菌内での必須遺伝子の発現が偏性低酸素誘導プロモーターの制御下に完全に置かれる、実施形態Ｃ１～Ｃ１１のうちのいずれか１つに記載の改変された細菌。
【0163】
実施形態Ｃ１３：必須遺伝子発現カセットが外因性であり、細菌染色体内に天然に存在する必須遺伝子が欠失されるか又は機能的に不活性化されており、それによって細菌内での必須遺伝子の発現が偏性低酸素誘導プロモーターの制御下に完全に置かれる、実施形態Ｃ１～Ｃ１１のうちのいずれか１つに記載の改変された細菌。
【0164】
実施形態Ｃ１４：外因性必須遺伝子発現カセットが細菌染色体中に組み込まれている、実施形態Ｃ１３に記載の改変された細菌。
【0165】
実施形態Ｃ１５：外因性必須遺伝子発現カセットが細菌染色体の外部にある、実施形態Ｃ１３に記載の改変された細菌。
【0166】
実施形態Ｃ１６：外因性必須遺伝子発現カセットが細菌により担持されるプラスミド内に存在する、実施形態Ｃ１５に記載の改変された細菌。
【0167】
実施形態Ｃ１７：細菌由来のヘモリジンタンパク質がグラム陰性菌のヘモリジンタンパク質である、先行する実施形態Ｃのうちのいずれか１つに記載の改変された細菌。
【0168】
実施形態Ｃ１８：グラム陰性菌のヘモリジンタンパク質をコードする遺伝子がｈｌｙＡ又はｈｌｙＥである、実施形態Ｃ１７に記載の改変された細菌。
【0169】
実施形態Ｃ１９：ｈｌｙＡ又はｈｌｙＥが、リステリア・モノサイトゲネス、ビブリオ・コレラ、又は大腸菌に由来する、実施形態Ｃ１８に記載の改変された細菌。
【0170】
実施形態Ｃ２０：酸性ｐＨ条件下で活性であるプロモーターが、７．０、６．９、６．８、６．７、６．６、６．５、６．４、６．３、６．２、６．１、６．０、５．９、５．８、５．７、５．６、又は５．５より低いｐＨにおいて活性である、先行する実施形態Ｃのうちのいずれか１つに記載の改変された細菌。
【0171】
実施形態Ｃ２１：酸性ｐＨ条件下で活性であるプロモーターが、ｓｓｅＡ、ｓｓｒＡ、ｓｓａＢ、ｓｓａＧ、ｓｓａＭ、及びｓｓａＲからなる群から選択される、先行する実施形態Ｃのうちのいずれか１つに記載の改変された細菌。
【0172】
実施形態Ｃ２２：酸性ｐＨ条件下で活性であるプロモーターがｓｓｅＡである、先行する実施形態Ｃのうちのいずれか１つに記載の改変された細菌。
【0173】
実施形態Ｃ２３：非改変型開始株が通性嫌気性細菌である、先行する実施形態Ｃのうちのいずれか１つに記載の改変された細菌。
【0174】
実施形態Ｃ２４：開始株がサルモネラ・チフィムリウムＳＬ７２０７である、先行する実施形態Ｃのうちのいずれか１つに記載の改変された細菌。
【0175】
実施形態Ｃ２５：細菌が野生型リポ多糖類（ＬＰＳ）を発現する、実施形態Ｃ１～Ｃ２４のうちのいずれか１つに記載の改変された細菌。
【0176】
実施形態Ｃ２６：細菌が、腫瘍を有する対象に投与されると、腫瘍組織内で生存及び増殖する能力を有するが、正常組織では速やかに排除される、先行する実施形態Ｃのうちのいずれか１つに記載の改変された細菌。
【0177】
実施形態Ｃ２７：細菌が、悪性腫瘍を有する対象に投与されると、悪性腫瘍の増殖を阻害する能力を有する、先行する実施形態Ｃのうちのいずれか１つに記載の改変された細菌。
【0178】
実施形態Ｃ２８：細菌が、悪性腫瘍を有する対象に投与されると、抗腫瘍特異的免疫応答を誘発する能力を有する、先行する実施形態Ｃのうちのいずれか１つに記載の改変された細菌。
【0179】
実施形態Ｃ２９：細菌が、悪性腫瘍を有する対象に投与されると、抗腫瘍免疫メモリーを誘発する能力を有する、先行する実施形態Ｃのうちのいずれか１つに記載の改変された細菌。
【0180】
実施形態Ｃ３０：野生型フラゲリンを発現しない、先行する実施形態Ｃのうちのいずれか１つに記載の改変された細菌。
【0181】
実施形態Ｃ３１：ｆｌｉＣ遺伝子を欠損している、先行する実施形態Ｃのうちのいずれか１つに記載の改変された細菌。
【0182】
実施形態Ｃ３２：マクロファージ内での細菌の生存レベルが、非改変型開始株の生存レベルの約５０％～約３０％の範囲である、先行する実施形態Ｃのうちのいずれか１つに記載の改変された細菌。
【0183】
実施形態Ｃ３３：マクロファージ内での細菌の生存レベルが、非改変型開始株の生存レベルの約３０％～約１０％の範囲である、実施形態Ｃ１～Ｃ３１のうちのいずれか１つに記載の改変された細菌。
【0184】
実施形態Ｃ３４：マクロファージ内での細菌の生存レベルが、非改変型開始株の生存レベルの約１０％～約１％の範囲である、実施形態Ｃ１～Ｃ３１のうちのいずれか１つに記載の改変された細菌。
【0185】
実施形態Ｄ
実施形態Ｄ１：細菌が、偏性低酸素誘導プロモーターの制御下に細菌の必須遺伝子を含む低酸素制御型必須遺伝子発現カセットを含み、細菌が、非改変型開始株と比較して、マクロファージ内で生存するのに必要とされる少なくとも１つの遺伝子又はその機能的発現産物を欠損している、改変された細菌。
実施形態Ｄ１：細菌が、偏性低酸素誘導プロモーターの制御下に細菌の必須遺伝子を含む低酸素制御型必須遺伝子発現カセットを含み、細菌が、非改変型開始株と比較して、マクロファージ内で生存するのに必要とされる少なくとも１つの遺伝子又はその機能的発現産物を欠損している、改変された細菌。
【0186】
実施形態Ｄ２：偏性低酸素誘導プロモーターが、ｐｅｐＴｐ、ｆｎｒＳｐ、ｙｓｇＡｐ、ｓｓｂｐ１、Ｈｉｐ１、ＢＢａ＿Ｉ１４０１８、ＢＢａ＿Ｒ１０７４、Ｐｔｅｔ－ａｒｃＡ、及びＰｔｅｔ－Ｆｎｒからなる群から選択される、実施形態Ｄ１に記載の改変された細菌。
【0187】
実施形態Ｄ３：偏性低酸素誘導プロモーターがｓｓｂｐ１プロモーターである、実施形態Ｄ１に記載の改変された細菌。
【0188】
実施形態Ｄ４：必須遺伝子の発現産物が、細菌内での２，６－ジアミノピメリン酸（ＤＡＰ）の合成に関与し、好気条件下で培養される場合、細菌の増殖が、培地中に添加される追加のＤＡＰ又はそのアナログに依存する、先行する実施形態Ｄのうちのいずれか１つに記載の改変された細菌。
【0189】
実施形態Ｄ５：必須遺伝子が、ｄａｐＡ、ｄａｐＢ、ｄａｐＤ、ｄａｐＥ、ａｒｇＤ、ｄａｐＦ、及び任意のこれらの組合せから選択される、実施形態Ｄ４に記載の改変された細菌。
【0190】
実施形態Ｄ６：必須遺伝子がｄａｐＡ及びｄａｐＥから選択される、実施形態Ｄ４に記載の改変された細菌。
【0191】
実施形態Ｄ７：マクロファージ内で生存するのに必要とされる遺伝子が、ＳＴＭ３１２０、ＳＴＭ３１１９、ｓｌｙＡ、ｓｉｆＡ、ＳＰＩ－２、ｐｈｏＰ、又はｈｔｒＡ遺伝子である、先行する実施形態Ｄのうちのいずれか１つに記載の改変された細菌。
【0192】
実施形態Ｄ８：マクロファージ内で生存するのに必要とされる遺伝子の機能的発現産物が、ＨｔｒＡセリンプロテアーゼファミリーに関連するタンパク質である、先行する実施形態Ｄのうちのいずれか１つに記載の改変された細菌。
【0193】
実施形態Ｄ９：細菌がＨｔｒＡセリンプロテアーゼの活性を欠損している、先行する実施形態Ｄのうちのいずれか１つに記載の改変された細菌。
【0194】
実施形態Ｄ１０：マクロファージ内で生存するのに必要とされる遺伝子がｈｔｒＡである、先行する実施形態Ｄのうちのいずれか１つに記載の改変された細菌。
【0195】
実施形態Ｄ１１：細菌がｈｔｒＡを欠損している、先行する実施形態Ｄのうちのいずれか１つに記載の改変された細菌。
【0196】
実施形態Ｄ１２：必須遺伝子が細菌染色体内に天然に存在する遺伝子であり、必須遺伝子の天然プロモーターが偏性低酸素誘導プロモーターと機能的に置き換わり、それによって細菌内での必須遺伝子の発現が偏性低酸素誘導プロモーターの制御下に完全に置かれる、実施形態Ｄ１～Ｄ１１のうちのいずれか１つに記載の改変された細菌。
【0197】
実施形態Ｄ１３：必須遺伝子発現カセットが外因性であり、細菌染色体内に天然に存在する必須遺伝子が欠失されるか又は機能的に不活性化されており、それによって細菌内での必須遺伝子の発現が偏性低酸素誘導プロモーターの制御下に完全に置かれる、実施形態Ｄ１～Ｄ１１のうちのいずれか１つに記載の改変された細菌。
【0198】
実施形態Ｄ１４：外因性必須遺伝子発現カセットが細菌染色体中に組み込まれている、実施形態Ｄ１３に記載の改変された細菌。
【0199】
実施形態Ｄ１５：外因性必須遺伝子発現カセットが細菌染色体の外部にある、実施形態Ｄ１３に記載の改変された細菌。
【0200】
実施形態Ｄ１６：外因性必須遺伝子発現カセットが細菌により担持されるプラスミド内に存在する、実施形態Ｄ１５に記載の改変された細菌。
【0201】
実施形態Ｄ１７：ｐＨ制御型発現カセットを更に含み、ｐＨ制御型発現カセットが、酸性ｐＨ条件下で活性であるプロモーターの制御下に細菌由来のヘモリジンタンパク質をコードする遺伝子を含む、先行する実施形態Ｄのうちのいずれか１つに記載の改変された細菌。
【0202】
実施形態Ｄ１８：細菌由来のヘモリジンタンパク質がグラム陰性菌のヘモリジンタンパク質である、実施形態Ｄ１７に記載の改変された細菌。
【0203】
実施形態Ｄ１９：グラム陰性菌のヘモリジンタンパク質をコードする遺伝子がｈｌｙＡ又はｈｌｙＥである、実施形態Ｄ１８に記載の改変された細菌。
【0204】
実施形態Ｄ２０：ｈｌｙＡ又はｈｌｙＥが、リステリア・モノサイトゲネス、ビブリオ・コレラ、又は大腸菌に由来する、実施形態Ｄ１９に記載の改変された細菌。
【0205】
実施形態Ｄ２１：酸性ｐＨ条件下で活性であるプロモーターが、７．０、６．９、６．８、６．７、６．６、６．５、６．４、６．３、６．２、６．１、６．０、５．９、５．８、５．７、５．６、又は５．５より低いｐＨにおいて活性である、実施形態Ｄ１７～Ｄ２０のうちのいずれか１つに記載の改変された細菌。
【0206】
実施形態Ｄ２２：酸性ｐＨ条件下で活性であるプロモーターが、ｓｓｅＡ、ｓｓｒＡ、ｓｓａＢ、ｓｓａＧ、ｓｓａＭ、及びｓｓａＲからなる群から選択される、実施形態Ｄ１７～Ｄ２１のうちのいずれか１つに記載の改変された細菌。
【0207】
実施形態Ｄ２３：酸性ｐＨ条件下で活性であるプロモーターがｓｓｅＡである、実施形態Ｄ１７～Ｄ２１のうちのいずれか１つに記載の改変された細菌。
【0208】
実施形態Ｄ２４：非改変型開始株が通性嫌気性細菌である、先行する実施形態Ｄのうちのいずれか１つに記載の改変された細菌。
【0209】
実施形態Ｄ２５：細菌がエンテロバクター科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）の細菌である、先行する実施形態Ｄのうちのいずれか１つに記載の改変された細菌。
【0210】
実施形態Ｄ２６：細菌が、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属、シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）属、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）属、エルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）属、シトロバクター（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）属、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属、プロテウス（Ｐｒｏｔｅｕｓ）属、モルガネラ（Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ）属、プロビデンシア（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ）属、ハフニア（Ｈａｆｎｉａ）属、及びパントエア（Ｐａｎｔｏｅａ）属の細菌である、先行する実施形態Ｄのうちのいずれか１つに記載の改変された細菌。
【0211】
実施形態Ｄ２７：細菌が、大腸菌、エンテロバクター・ブラタエ、エンテロバクター・フェルグソニイ、エンテロバクター・ヘルマンニイ、エンテロバクター・ヴァルネリス、サルモネラ・エンテリカ、サルモネラ・ボンゴリ、腸チフス菌、サルモネラ・コレラエスイス、サルモネラ・チフィムリウム、シゲラ・ディセンテリアエ、シゲラ・フレクスネリ、シゲラ・ボイディイ、シゲラ・ゾネイ、肺炎桿菌、クレブシエラ・オキシトカ、ペスト菌、腸炎エルシニア、仮性結核菌、エルシニア・アルドヴァエ（、エルシニア・ベルコヴィエリ、エルシニア・フレデリクセニイ、エルシニア・インテルメディア、エルシニア・クリステルセニイ、エルシニア・モラレッティ、エルシニア・ローデイ、エルシニア・ルッケリ、シトロバクター・フロインデイ、シトロバクター・コセリ、シトロバクター・ブラアキイ、エンテロバクター・アエロゲネス、エンテロバクター・クロアカエ、エンテロバクター・ゲルゴヴィアエ、エンテロバクター・サカザキイ、エンテロバクター・タイロラエ、エンテロバクター・アムニゲヌス、エンテロバクター・インテルメディウス、エンテロバクター・アスブリアエ）、エンテロバクター・カンセロゲヌス、エンテロバクター・ディソルヴェンス、エンテロバクター・ニミプレスウラリス、セラチア・マルセセンス）、セラチア・エントモフィラ、セラチア・フィカリア、セラチア・フォンチコラ、セラチア・グリメシイ、セラチア・リクエファシエンス、セラチア・オドリフェラ、セラチア・プリムティカ、セラチア・プロテアマキュランス、セラチア・ルビダエア、セラチア・ウレイリチカ、プロテウス・ミラビリス、プロテウス・ヴァルガリス、プロテウス・ミクソファシエンス、プロテウス・ペンネリ、プロテウス・ハウセリ、モルガネラ・モルガニイ、プロビデンシア・アルカリファシエンス、プロビデンシア・ルスティジアニイ、プロビデンシア・スチュアーチイ、プロビデンシア・レットゲリ、プロビデンシア・ヘイムバッカエ、ハフニア・アルヴェイ、及びパントエア・アグロメランス（Ｐ．ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ）からなる群から選択される、先行する実施形態Ｄのうちのいずれか１つに記載の改変された細菌。
【0212】
実施形態Ｄ２８：細菌がサルモネラ・チフィムリウムの細菌である、先行する実施形態Ｄのうちのいずれか１つに記載の改変された細菌。
【0213】
実施形態Ｄ２９：開始株がサルモネラ・チフィムリウムＳＬ７２０７である、実施形態Ｄ２８に記載の改変された細菌。
【0214】
実施形態Ｄ３０：細菌が野生型リポ多糖類（ＬＰＳ）を発現する、先行する実施形態Ｄのうちのいずれか１つに記載の改変された細菌。
【0215】
実施形態Ｄ３１：細菌が、腫瘍を有する対象に投与されると、腫瘍組織内で生存及び増殖する能力を有し、正常組織では速やかに排除される、先行する実施形態Ｄのうちのいずれか１つに記載の改変された細菌。
【0216】
実施形態Ｄ３２：細菌が、悪性腫瘍を有する対象に投与されると、悪性腫瘍の増殖を阻害する能力を有する、先行する実施形態Ｄのうちのいずれか１つに記載の改変された細菌。
【0217】
実施形態Ｄ３３：細菌が、悪性腫瘍を有する対象に投与されると、抗腫瘍特異的免疫応答を誘発する能力を有する、先行する実施形態Ｄのうちのいずれか１つに記載の改変された細菌。
【0218】
実施形態Ｄ３４：細菌が、悪性腫瘍を有する対象に投与されると、抗腫瘍免疫メモリーを誘発する能力を有する、先行する実施形態Ｄのうちのいずれか１つに記載の改変された細菌。
【0219】
実施形態Ｄ３５：野生型フラゲリンを発現しない、先行する実施形態Ｄのうちのいずれか１つに記載の改変された細菌。
【0220】
実施形態Ｄ３６：ｆｌｉＣ遺伝子を欠損している、先行する実施形態Ｄのうちのいずれか１つに記載の改変された細菌。
【0221】
実施形態Ｄ３７：マクロファージ内での細菌の生存レベルが、非改変型開始株の生存レベルの約５０％～約３０％の範囲である、先行する実施形態Ｄのうちのいずれか１つに記載の改変された細菌。
【0222】
実施形態Ｄ３８：マクロファージ内での細菌の生存レベルが、非改変型開始株の生存レベルの約３０％～約１０％の範囲である、実施形態Ｄ１～Ｄ３６のうちのいずれか１つに記載の改変された細菌。
【0223】
実施形態Ｄ３９：マクロファージ内での細菌の生存レベルが、非改変型開始株の生存レベルの約１０％～約１％の範囲である、実施形態Ｄ１～Ｄ３６のうちのいずれか１つに記載の改変された細菌。
【0224】
実施形態Ｅ
実施形態Ｅ１：細菌が、偏性低酸素誘導プロモーターの制御下に細菌の必須遺伝子を含む低酸素制御型必須遺伝子発現カセットと、酸性ｐＨ条件下で活性であるプロモーターの制御下に細菌由来のヘモリジンタンパク質をコードする遺伝子を含むｐＨ制御型発現カセットとを含み、細菌が野生型リポ多糖類（ＬＰＳ）を発現し、非改変型開始株と比較して、マクロファージ内で生存するのに必要とされる少なくとも１つの遺伝子又はその機能的発現産物を欠損している、改変された細菌。
実施形態Ｅ１：細菌が、偏性低酸素誘導プロモーターの制御下に細菌の必須遺伝子を含む低酸素制御型必須遺伝子発現カセットと、酸性ｐＨ条件下で活性であるプロモーターの制御下に細菌由来のヘモリジンタンパク質をコードする遺伝子を含むｐＨ制御型発現カセットとを含み、細菌が野生型リポ多糖類（ＬＰＳ）を発現し、非改変型開始株と比較して、マクロファージ内で生存するのに必要とされる少なくとも１つの遺伝子又はその機能的発現産物を欠損している、改変された細菌。
【0225】
実施形態Ｅ２：偏性低酸素誘導プロモーターが、ｐｅｐＴｐ、ｆｎｒＳｐ、ｙｓｇＡｐ、ｓｓｂｐ１、Ｈｉｐ１、ＢＢａ＿Ｉ１４０１８、ＢＢａ＿Ｒ１０７４、Ｐｔｅｔ－ａｒｃＡ、及びＰｔｅｔ－Ｆｎｒからなる群から選択される、実施形態Ｅ１に記載の改変された細菌。
【0226】
実施形態Ｅ３：偏性低酸素誘導プロモーターがｓｓｂｐ１プロモーターである、実施形態Ｅ１に記載の改変された細菌。
【0227】
実施形態Ｅ４：必須遺伝子の発現産物が、細菌内での２，６－ジアミノピメリン酸（ＤＡＰ）の合成に関与し、好気条件下で培養される場合、細菌の増殖が、培地中に添加される追加のＤＡＰ又はそのアナログに依存する、先行する実施形態Ｅのうちのいずれか１つに記載の改変された細菌。
【0228】
実施形態Ｅ５：必須遺伝子が、ｄａｐＡ、ｄａｐＢ、ｄａｐＤ、ｄａｐＥ、ａｒｇＤ、ｄａｐＦ、及び任意のこれらの組合せから選択される、実施形態Ｅ４に記載の改変された細菌。
【0229】
実施形態Ｅ６：必須遺伝子がｄａｐＡ及びｄａｐＥから選択される、実施形態Ｅ４に記載の改変された細菌。
【0230】
実施形態Ｅ７：マクロファージ内で生存するのに必要とされる遺伝子が、ＳＴＭ３１２０、ＳＴＭ３１１９、ｓｌｙＡ、ｓｉｆＡ、ＳＰＩ－２、ｐｈｏＰ、又はｈｔｒＡ遺伝子である、先行する実施形態Ｅのうちのいずれか１つに記載の改変された細菌。
【0231】
実施形態Ｅ８：マクロファージ内で生存するのに必要とされる遺伝子の機能的発現産物が、ＨｔｒＡセリンプロテアーゼファミリーに関連するタンパク質である、先行する実施形態Ｅのうちのいずれか１つに記載の改変された細菌。
【0232】
実施形態Ｅ９：細菌がＨｔｒＡセリンプロテアーゼの活性を欠損している、先行する実施形態Ｅのうちのいずれか１つに記載の改変された細菌。
【0233】
実施形態Ｅ１０：マクロファージ内で生存するのに必要とされる遺伝子がｈｔｒＡである、先行する実施形態Ｅのうちのいずれか１つに記載の改変された細菌。
【0234】
実施形態Ｅ１１：細菌がｈｔｒＡを欠損している、先行する実施形態Ｅのうちのいずれか１つに記載の改変された細菌。
【0235】
実施形態Ｅ１２：必須遺伝子が細菌染色体内に天然に存在する遺伝子であり、必須遺伝子の天然プロモーターが偏性低酸素誘導プロモーターと機能的に置き換わり、それによって細菌内での必須遺伝子の発現が偏性低酸素誘導プロモーターの制御下に完全に置かれる、実施形態Ｅ１～Ｅ１１のうちのいずれか１つに記載の改変された細菌。
【0236】
実施形態Ｅ１３：必須遺伝子発現カセットが外因性であり、細菌染色体内に天然に存在する必須遺伝子が欠失されるか又は機能的に不活性化されており、それによって細菌内での必須遺伝子の発現が偏性低酸素誘導プロモーターの制御下に完全に置かれる、実施形態Ｅ１～Ｅ１１のうちのいずれか１つに記載の改変された細菌。
【0237】
実施形態Ｅ１４：外因性必須遺伝子発現カセットが細菌染色体中に組み込まれている、実施形態Ｅ１３に記載の改変された細菌。
【0238】
実施形態Ｅ１５：外因性必須遺伝子発現カセットが細菌染色体の外部にある、実施形態Ｅ１３に記載の改変された細菌。
【0239】
実施形態Ｅ１６：外因性必須遺伝子発現カセットが細菌により担持されるプラスミド内に存在する、実施形態Ｅ１５に記載の改変された細菌。
【0240】
実施形態Ｅ１７：細菌由来のヘモリジンタンパク質がグラム陰性菌のヘモリジンタンパク質である、先行する実施形態Ｅのうちのいずれか１つに記載の改変された細菌。
【0241】
実施形態Ｅ１８：グラム陰性菌のヘモリジンタンパク質をコードする遺伝子がｈｌｙＡ又はｈｌｙＥである、実施形態Ｅ１７に記載の改変された細菌。
【0242】
実施形態Ｅ１９：ｈｌｙＡ又はｈｌｙＥが、リステリア・モノサイトゲネス、ビブリオ・コレラ、又は大腸菌に由来する、実施形態Ｅ１８に記載の改変された細菌。
【0243】
実施形態Ｅ２０：酸性ｐＨ条件下で活性であるプロモーターが、７．０、６．９、６．８、６．７、６．６、６．５、６．４、６．３、６．２、６．１、６．０、５．９、５．８、５．７、５．６、又は５．５より低いｐＨにおいて活性である、先行する実施形態Ｅのうちのいずれか１つに記載の改変された細菌。
【0244】
実施形態Ｅ２１：酸性ｐＨ条件下で活性であるプロモーターが、ｓｓｅＡ、ｓｓｒＡ、ｓｓａＢ、ｓｓａＧ、ｓｓａＭ、及びｓｓａＲからなる群から選択される、実施形態Ｅのうちのいずれか１つに記載の改変された細菌。
【0245】
実施形態Ｅ２２：酸性ｐＨ条件下で活性であるプロモーターがｓｓｅＡである、実施形態Ｅのうちのいずれか１つに記載の改変された細菌。
【0246】
実施形態Ｅ２３：非改変型開始株が通性嫌気性細菌である、実施形態Ｅのうちのいずれか１つに記載の改変された細菌。
【0247】
実施形態Ｅ２４：細菌がエンテロバクター科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）の細菌である、実施形態Ｅのうちのいずれか１つに記載の改変された細菌。
【0248】
実施形態Ｅ２５：細菌が、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属、シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）属、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）属、エルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）属、シトロバクター（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）属、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属、プロテウス（Ｐｒｏｔｅｕｓ）属、モルガネラ（Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ）属、プロビデンシア（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ）属、ハフニア（Ｈａｆｎｉａ）属、及びパントエア（Ｐａｎｔｏｅａ）属の細菌である、実施形態Ｅのうちのいずれか１つに記載の改変された細菌。
【0249】
実施形態Ｅ２６：細菌が、大腸菌、エンテロバクター・ブラタエ、エンテロバクター・フェルグソニイ、エンテロバクター・ヘルマンニイ、エンテロバクター・ヴァルネリス、サルモネラ・エンテリカ、サルモネラ・ボンゴリ、腸チフス菌、サルモネラ・コレラエスイス、サルモネラ・チフィムリウム、シゲラ・ディセンテリアエ、シゲラ・フレクスネリ、シゲラ・ボイディイ、シゲラ・ゾネイ、肺炎桿菌、クレブシエラ・オキシトカ、ペスト菌、腸炎エルシニア、仮性結核菌、エルシニア・アルドヴァエ、エルシニア・ベルコヴィエリ、エルシニア・フレデリクセニイ、エルシニア・インテルメディア、エルシニア・クリステルセニイ、エルシニア・モラレッティ、エルシニア・ローデイ、エルシニア・ルッケリ、シトロバクター・フロインデイ、シトロバクター・コセリ、シトロバクター・ブラアキイ、エンテロバクター・アエロゲネス、エンテロバクター・クロアカエ、エンテロバクター・ゲルゴヴィアエ、エンテロバクター・サカザキイ、エンテロバクター・タイロラエ、エンテロバクター・アムニゲヌス、エンテロバクター・インテルメディウス、エンテロバクター・アスブリアエ、エンテロバクター・カンセロゲヌス、エンテロバクター・ディソルヴェンス、エンテロバクター・ニミプレスウラリス、セラチア・マルセセンス、セラチア・エントモフィラ、セラチア・フィカリア、セラチア・フォンチコラ、セラチア・グリメシイ、セラチア・リクエファシエンス、セラチア・オドリフェラ、セラチア・プリムティカ、セラチア・プロテアマキュランス、セラチア・ルビダエア、セラチア・ウレイリチカ、プロテウス・ミラビリス、プロテウス・ヴァルガリス、プロテウス・ミクソファシエンス、プロテウス・ペンネリ、プロテウス・ハウセリ、モルガネラ・モルガニイ、プロビデンシア・アルカリファシエンス、プロビデンシア・ルスティジアニイ、プロビデンシア・スチュアーチイ、プロビデンシア・レットゲリ、プロビデンシア・ヘイムバッカエ、ハフニア・アルヴェイ、及びパントエア・アグロメランスからなる群から選択される、先行する実施形態Ｅのうちのいずれか１つに記載の改変された細菌。
【0250】
実施形態Ｅ２７：細菌がサルモネラ・チフィムリウムの細菌である、先行する実施形態Ｅのうちのいずれか１つに記載の改変された細菌。
【0251】
実施形態Ｅ２８：開始株がサルモネラ・チフィムリウムＳＬ７２０７である、実施形態Ｅ２７に記載の改変された細菌。
【0252】
実施形態Ｅ２９：細菌が、腫瘍を有する対象に投与されると、腫瘍組織内で生存及び増殖する能力を有し、正常組織では速やかに排除される、先行する実施形態Ｅのうちのいずれか１つに記載の改変された細菌。
【0253】
実施形態Ｅ３０：細菌が、悪性腫瘍を有する対象に投与されると、悪性腫瘍の増殖を阻害する能力を有する、先行する実施形態Ｅのうちのいずれか１つに記載の改変された細菌。
【0254】
実施形態Ｅ３１：細菌が、悪性腫瘍を有する対象に投与されると、抗腫瘍特異的免疫応答を誘発する能力を有する、先行する実施形態Ｅのうちのいずれか１つに記載の改変された細菌。
【0255】
実施形態Ｅ３２：細菌が、悪性腫瘍を有する対象に投与されると、抗腫瘍免疫メモリーを誘発する能力を有する、先行する実施形態Ｅのうちのいずれか１つに記載の改変された細菌。
【0256】
実施形態Ｅ３３：野生型フラゲリンを発現しない、先行する実施形態Ｅのうちのいずれか１つに記載の改変された細菌。
【0257】
実施形態Ｅ３４：ｆｌｉＣ遺伝子を欠損している、先行する実施形態Ｅのうちのいずれか１つに記載の改変された細菌。
【0258】
実施形態Ｅ３５：マクロファージ内での細菌の生存レベルが、非改変型開始株の生存レベルの約５０％～約３０％の範囲である、先行する実施形態Ｅのうちのいずれか１つに記載の改変された細菌。
【0259】
実施形態Ｅ３６：マクロファージ内での細菌の生存レベルが、非改変型開始株の生存レベルの約３０％～約１０％の範囲である、実施形態Ｅ１～Ｅ３４のうちのいずれか１つに記載の改変された細菌。
【0260】
実施形態Ｅ３７：マクロファージ内での細菌の生存レベルが、非改変型開始株の生存レベルの約１０％～約１％の範囲である、実施形態Ｅ１～Ｅ３４のうちのいずれか１つに記載の改変された細菌。
【0261】
実施形態Ｆ
実施形態Ｆ１：細菌が、偏性低酸素誘導プロモーターの制御下に細菌の必須遺伝子を含む低酸素制御型必須遺伝子発現カセットと、酸性ｐＨ条件下で活性であるプロモーターの制御下に、細菌由来のヘモリジンタンパク質をコードする遺伝子を含むｐＨ制御型発現カセットとを含み、細菌が、野生型リポ多糖類（ＬＰＳ）を発現し、非改変型開始株と比較して、マクロファージ内で生存するのに必要とされる少なくとも１つの遺伝子又は機能的発現産物を欠損している、サルモネラ・チフィムリウムの改変された細菌。
実施形態Ｆ１：細菌が、偏性低酸素誘導プロモーターの制御下に細菌の必須遺伝子を含む低酸素制御型必須遺伝子発現カセットと、酸性ｐＨ条件下で活性であるプロモーターの制御下に、細菌由来のヘモリジンタンパク質をコードする遺伝子を含むｐＨ制御型発現カセットとを含み、細菌が、野生型リポ多糖類（ＬＰＳ）を発現し、非改変型開始株と比較して、マクロファージ内で生存するのに必要とされる少なくとも１つの遺伝子又は機能的発現産物を欠損している、サルモネラ・チフィムリウムの改変された細菌。
【0262】
実施形態Ｆ２：偏性低酸素誘導プロモーターが、ｐｅｐＴｐ、ｆｎｒＳｐ、ｙｓｇＡｐ、ｓｓｂｐ１、Ｈｉｐ１、ＢＢａ＿Ｉ１４０１８、ＢＢａ＿Ｒ１０７４、Ｐｔｅｔ－ａｒｃＡ、及びＰｔｅｔ－Ｆｎｒからなる群から選択される、実施形態Ｆ１に記載の改変された細菌。
【0263】
実施形態Ｆ３：偏性低酸素誘導プロモーターがｓｓｂｐ１プロモーターである、実施形態Ｆ１に記載の改変された細菌。
【0264】
実施形態Ｆ４：必須遺伝子の発現産物が、細菌内での２，６－ジアミノピメリン酸（ＤＡＰ）の合成に関与し、好気条件下で培養される場合、細菌の増殖が、培地中に添加される追加のＤＡＰ又はそのアナログに依存する、先行する実施形態Ｆのうちのいずれか１つに記載の改変された細菌。
【0265】
実施形態Ｆ５：必須遺伝子が、ｄａｐＡ、ｄａｐＢ、ｄａｐＤ、ｄａｐＥ、ａｒｇＤ、ｄａｐＦ、及び任意のこれらの組合せから選択される、実施形態Ｆ４に記載の改変された細菌。
【0266】
実施形態Ｆ６：必須遺伝子がｄａｐＡ及びｄａｐＥから選択される、実施形態Ｆ４に記載の改変された細菌。
【0267】
実施形態Ｆ７：マクロファージ内で生存するのに必要とされる遺伝子が、ＳＴＭ３１２０、ＳＴＭ３１１９、ｓｌｙＡ、ｓｉｆＡ、ＳＰＩ－２、ｐｈｏＰ、又はｈｔｒＡ遺伝子である、先行する実施形態Ｆのうちのいずれか１つに記載の改変された細菌。
【0268】
実施形態Ｆ８：マクロファージ内で生存するのに必要とされる遺伝子が、内因性抗酸化性ストレス応答経路に関与するか又はそれを制御する遺伝子である、先行する実施形態Ｆのうちのいずれか１つに記載の改変された細菌。
【0269】
実施形態Ｆ９：内因性抗酸化性ストレス応答経路に関与するか又はそれを制御する遺伝子が、ＨｔｒＡセリンプロテアーゼファミリー遺伝子である、実施形態Ｆ８に記載の改変された細菌。
【0270】
実施形態Ｆ１０：内因性抗酸化性ストレス応答経路に関与するか又はそれを制御する遺伝子の機能的発現産物が、ＨｔｒＡセリンプロテアーゼファミリーに関連するタンパク質である、実施形態Ｆ９に記載の改変された細菌。
【0271】
実施形態Ｆ１１：細菌がＨｔｒＡセリンプロテアーゼの活性を欠損している、実施形態Ｆ９に記載の改変された細菌。
【0272】
実施形態Ｆ１２：内因性抗酸化性ストレス応答経路に関与するか又はそれを制御する遺伝子がｈｔｒＡである、実施形態Ｆ９に記載の改変された細菌。
【0273】
実施形態Ｆ１３：細菌がｈｔｒＡを欠損している、実施形態Ｆ９に記載の改変された細菌。
【0274】
実施形態Ｆ１４：必須遺伝子が細菌染色体内に天然に存在する遺伝子であり、必須遺伝子の天然プロモーターが偏性低酸素誘導プロモーターと機能的に置き換わり、それによって細菌内での必須遺伝子の発現が偏性低酸素誘導プロモーターの制御下に完全に置かれる、実施形態Ｆ１～Ｆ１３のうちのいずれか１つに記載の改変された細菌。
【0275】
実施形態Ｆ１５：必須遺伝子発現カセットが外因性であり、細菌染色体内に天然に存在する必須遺伝子が欠失されるか又は機能的に不活性化されており、それによって細菌内での必須遺伝子の発現が偏性低酸素誘導プロモーターの制御下に完全に置かれる、実施形態Ｆ１～Ｆ１３のうちのいずれか１つに記載の改変された細菌。
【0276】
実施形態Ｆ１６：外因性必須遺伝子発現カセットが細菌染色体中に組み込まれている、実施形態Ｆ１５に記載の改変された細菌。
【0277】
実施形態Ｆ１７：外因性必須遺伝子発現カセットが細菌染色体の外部にある、実施形態Ｆ１５に記載の改変された細菌。
【0278】
実施形態Ｆ１８：外因性必須遺伝子発現カセットが細菌により担持されるプラスミド内に存在する、実施形態Ｆ１７に記載の改変された細菌。
【0279】
実施形態Ｆ１９：細菌由来のヘモリジンタンパク質がグラム陰性菌のヘモリジンタンパク質である、先行する実施形態Ｆのうちのいずれか１つに記載の改変された細菌。
【0280】
実施形態Ｆ２０：グラム陰性菌のヘモリジンタンパク質をコードする遺伝子がｈｌｙＡ又はｈｌｙＥである、実施形態Ｆ１９に記載の改変された細菌。
【0281】
実施形態Ｆ２１：ｈｌｙＡ又はｈｌｙＥが、リステリア・モノサイトゲネス、ビブリオ・コレラ、又は大腸菌に由来する、実施形態Ｆ２０に記載の改変された細菌。
【0282】
実施形態Ｆ２２：酸性ｐＨ条件下で活性であるプロモーターが、７．０、６．９、６．８、６．７、６．６、６．５、６．４、６．３、６．２、６．１、６．０、５．９、５．８、５．７、５．６、又は５．５より低いｐＨにおいて活性である、先行する実施形態Ｆのうちのいずれか１つに記載の改変された細菌。
【0283】
実施形態Ｆ２３：酸性ｐＨ条件下で活性であるプロモーターが、ｓｓｅＡ、ｓｓｒＡ、ｓｓａＢ、ｓｓａＧ、ｓｓａＭ、及びｓｓａＲからなる群から選択される、先行する実施形態Ｆのうちのいずれか１つに記載の改変された細菌。
【0284】
実施形態Ｆ２４：酸性ｐＨ条件下で活性であるプロモーターがｓｓｅＡである、先行する実施形態Ｆのうちのいずれか１つに記載の改変された細菌。
【0285】
実施形態Ｆ２５：開始株がサルモネラ・チフィムリウムＳＬ７２０７である、先行する実施形態Ｆのうちのいずれか１つに記載の改変された細菌。
【0286】
実施形態Ｆ２６：細菌が、腫瘍を有する対象に投与されると、腫瘍組織内で生存及び増殖する能力を有し、正常組織では速やかに排除される、先行する実施形態Ｆのうちのいずれか１つに記載の改変された細菌。
【0287】
実施形態Ｆ２７：細菌が、悪性腫瘍を有する対象に投与されると、悪性腫瘍の増殖を阻害する能力を有する、先行する実施形態Ｆのうちのいずれか１つに記載の改変された細菌。
【0288】
実施形態Ｆ２８：細菌が、悪性腫瘍を有する対象に投与されると、抗腫瘍特異的免疫応答を誘発する能力を有する、先行する実施形態Ｆのうちのいずれか１つに記載の改変された細菌。
【0289】
実施形態Ｆ２９：細菌が、悪性腫瘍を有する対象に投与されると、抗腫瘍免疫メモリーを誘発する能力を有する、先行する実施形態Ｆのうちのいずれか１つに記載の改変された細菌。
【0290】
実施形態Ｆ３０：野生型フラゲリンを発現しない、先行する実施形態Ｆのうちのいずれか１つに記載の改変された細菌。
【0291】
実施形態Ｆ３１：ｆｌｉＣ遺伝子を欠損している、先行する実施形態Ｆのうちのいずれか１つに記載の改変された細菌。
【0292】
実施形態Ｆ３２：マクロファージ内での細菌の生存レベルが、非改変型開始株の生存レベルの約５０％～約３０％の範囲である、先行する実施形態Ｆのうちのいずれか１つに記載の改変された細菌。
【0293】
実施形態Ｆ３３：マクロファージ内での細菌の生存レベルが、非改変型開始株の生存レベルの約３０％～約１０％の範囲である、実施形態Ｆ１～Ｆ３１のうちのいずれか１つに記載の改変された細菌。
【0294】
実施形態Ｆ３４：マクロファージ内での細菌の生存レベルが、非改変型開始株の生存レベルの約１０％～約１％の範囲である、実施形態Ｆ１～Ｆ３１のうちのいずれか１つに記載の改変された細菌。
【0295】
実施形態Ｋ
実施形態Ｋ１：有効量の、先行する実施形態Ａ、実施形態Ｂ、実施形態Ｃ、実施形態Ｄ、実施形態Ｅ、又は実施形態Ｆのうちのいずれか１つに記載の改変された細菌を含む医薬組成物。
実施形態Ｋ１：有効量の、先行する実施形態Ａ、実施形態Ｂ、実施形態Ｃ、実施形態Ｄ、実施形態Ｅ、又は実施形態Ｆのうちのいずれか１つに記載の改変された細菌を含む医薬組成物。
【0296】
実施形態Ｋ２：悪性腫瘍を処置するのに使用される、実施形態Ｋ１に記載の医薬組成物。
【0297】
実施形態Ｋ３：悪性腫瘍を有する対象において抗腫瘍特異的免疫応答を誘発するのに使用される、実施形態Ｋ１に記載の医薬組成物。
【0298】
実施形態Ｋ４：悪性腫瘍を有する対象において抗腫瘍免疫メモリーを誘発するのに使用される、実施形態Ｋ１に記載の医薬組成物。
【0299】
実施形態Ｋ５：悪性腫瘍の転移又は再発を予防又は処置するのに使用される、実施形態Ｋ１に記載の医薬組成物。
【0300】
実施形態Ｋ６：これまでの抗腫瘍療法に対して耐性であるか又はそれが不奏功であった悪性腫瘍を処置するのに使用される、実施形態Ｋ１に記載の医薬組成物。
【0301】
実施形態Ｋ７：改変された細菌が生存細菌である、実施形態Ｋ１～Ｋ６に記載の医薬組成物。
【0302】
実施形態Ｌ
実施形態Ｌ１：悪性腫瘍を処置するための方法であって、有効量の、先行する実施形態Ａ、実施形態Ｂ、実施形態Ｃ、実施形態Ｄ、実施形態Ｅ、若しくは実施形態Ｆのうちのいずれか１つに記載の改変された細菌、又は先行する実施形態Ｇのうちのいずれか１つに記載の医薬組成物を、悪性腫瘍に罹患している対象に投与するステップを含む方法。
実施形態Ｌ１：悪性腫瘍を処置するための方法であって、有効量の、先行する実施形態Ａ、実施形態Ｂ、実施形態Ｃ、実施形態Ｄ、実施形態Ｅ、若しくは実施形態Ｆのうちのいずれか１つに記載の改変された細菌、又は先行する実施形態Ｇのうちのいずれか１つに記載の医薬組成物を、悪性腫瘍に罹患している対象に投与するステップを含む方法。
【0303】
実施形態Ｌ２：悪性腫瘍を有する対象において抗腫瘍特異的免疫応答を誘発するための方法であって、有効量の、先行する実施形態Ａ、実施形態Ｂ、実施形態Ｃ、実施形態Ｄ、実施形態Ｅ、若しくは実施形態Ｆのうちのいずれか１つに記載の改変された細菌、又は先行する実施形態Ｇのうちのいずれか１つに記載の医薬組成物を対象に投与するステップを含む方法。
【0304】
実施形態Ｌ３：悪性腫瘍を有する対象において抗腫瘍免疫メモリーを誘発するための方法であって、有効量の、先行する実施形態Ａ、実施形態Ｂ、実施形態Ｃ、実施形態Ｄ、実施形態Ｅ、若しくは実施形態Ｆのうちのいずれか１つに記載の改変された細菌、又は先行する実施形態Ｇのうちのいずれか１つに記載の医薬組成物を対象に投与するステップを含む方法。
【0305】
実施形態Ｌ４：悪性腫瘍の転移又は再発を予防又は処置するための方法であって、有効量の、先行する実施形態Ａ、実施形態Ｂ、実施形態Ｃ、実施形態Ｄ、実施形態Ｅ、若しくは実施形態Ｆのうちのいずれか１つに記載の改変された細菌、又は先行する実施形態Ｇのうちのいずれか１つに記載の医薬組成物を、悪性腫瘍を有する対象に投与するステップを含む方法。
【0306】
実施形態Ｌ５：悪性腫瘍の転移又は再発を予防又は処置するための方法であって、有効量の、先行する実施形態Ａ、実施形態Ｂ、実施形態Ｃ、実施形態Ｄ、実施形態Ｅ、若しくは実施形態Ｆのうちのいずれか１つに記載の改変された細菌、又は先行する実施形態Ｇのうちのいずれか１つに記載の医薬組成物を、悪性腫瘍の転移又は再発を有するか又はそのリスクが高い対象に投与するステップを含む方法。
【0307】
実施形態Ｌ６：これまでの抗腫瘍療法に対して耐性であるか又はそれが不奏功であった悪性腫瘍を処置するための方法であって、有効量の、先行する実施形態Ａ、実施形態Ｂ、実施形態Ｃ、実施形態Ｄ、実施形態Ｅ、若しくは実施形態Ｆのうちのいずれか１つに記載の改変された細菌、又は先行する実施形態Ｇのうちのいずれか１つに記載の医薬組成物を、これまでの抗腫瘍療法に対して耐性であるか又はそれが不奏功であった悪性腫瘍を有する対象に投与するステップを含む方法。
【0308】
実施形態Ｌ７：改変された細菌が生存細菌である、実施形態Ｌ１～Ｌ６の方法。
【0309】
実施形態Ｍ
実施形態Ｍ１：悪性腫瘍を処置するための医薬の製造における、先行する実施形態Ａ、実施形態Ｂ、実施形態Ｃ、実施形態Ｄ、実施形態Ｅ、又は実施形態Ｆのうちのいずれか１つに記載の改変された細菌の使用。
実施形態Ｍ１：悪性腫瘍を処置するための医薬の製造における、先行する実施形態Ａ、実施形態Ｂ、実施形態Ｃ、実施形態Ｄ、実施形態Ｅ、又は実施形態Ｆのうちのいずれか１つに記載の改変された細菌の使用。
【0310】
実施形態Ｍ２：悪性腫瘍を有する対象において抗腫瘍特異的免疫応答を誘発するための医薬の製造における、先行する実施形態Ａ、実施形態Ｂ、実施形態Ｃ、実施形態Ｄ、実施形態Ｅ、又は実施形態Ｆのうちのいずれか１つに記載の改変された細菌の使用。
【0311】
実施形態Ｍ３：悪性腫瘍を有する対象において抗腫瘍免疫メモリーを誘発するための医薬の製造における、先行する実施形態Ａ、実施形態Ｂ、実施形態Ｃ、実施形態Ｄ、実施形態Ｅ、又は実施形態Ｆのうちのいずれか１つに記載の改変された細菌の使用。
【0312】
実施形態Ｍ４：悪性腫瘍の転移又は再発を予防又は処置するための医薬の製造における、先行する実施形態Ａ、実施形態Ｂ、実施形態Ｃ、実施形態Ｄ、実施形態Ｅ、又は実施形態Ｆのうちのいずれか１つに記載の改変された細菌の使用。
【0313】
実施形態Ｍ５：これまでの抗腫瘍療法に対して耐性であるか又はそれが不奏功であった悪性腫瘍を処置するための医薬の製造における、先行する実施形態Ａ、実施形態Ｂ、実施形態Ｃ、実施形態Ｄ、実施形態Ｅ、又は実施形態Ｆのうちのいずれか１つに記載の改変された細菌の使用。
【0314】
実施形態Ｍ７：改変された細菌が生存細菌である、実施形態Ｍ１～Ｍ５に記載の使用。
【0315】
実施形態Ｎ
実施形態Ｎ１：悪性腫瘍が、神経系、呼吸器系、消化器系、尿路系、生殖器系、造血系、リンパ系、内分泌系、又は皮膚粘膜に由来する悪性腫瘍である、実施形態Ｋのうちのいずれか１つに記載の医薬組成物、実施形態Ｌのうちのいずれか１つに記載の方法、又は実施形態Ｍのうちのいずれか１つに記載の使用。
実施形態Ｎ１：悪性腫瘍が、神経系、呼吸器系、消化器系、尿路系、生殖器系、造血系、リンパ系、内分泌系、又は皮膚粘膜に由来する悪性腫瘍である、実施形態Ｋのうちのいずれか１つに記載の医薬組成物、実施形態Ｌのうちのいずれか１つに記載の方法、又は実施形態Ｍのうちのいずれか１つに記載の使用。
【0316】
実施形態Ｎ２：悪性腫瘍が肉腫又はがんである、実施形態Ｋのうちのいずれか１つに記載の医薬組成物、実施形態Ｌのうちのいずれか１つに記載の方法、又は実施形態Ｍのうちのいずれか１つに記載の使用。
【0317】
実施形態Ｎ３：悪性腫瘍が固形腫瘍である、実施形態Ｋのうちのいずれか１つに記載の医薬組成物、実施形態Ｌのうちのいずれか１つに記載の方法、又は実施形態Ｍのうちのいずれか１つに記載の使用。
【0318】
実施形態Ｎ４：悪性腫瘍が、神経膠腫、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、鼻咽頭癌、口腔癌、舌癌、喉頭癌、頭頸部の癌、黒色腫、気管支の癌、肺癌、胸膜癌、食道癌、胃癌、肝細胞癌、膵癌、胆管癌、結腸直腸癌、直腸癌、腎細胞癌、膀胱癌、前立腺癌、スプラレノーマ、甲状腺癌、副甲状腺癌、下垂体腫瘍、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、子宮頸がん、卵巣がん、子宮内膜がん、乳がん、骨がん、及び骨肉腫からなる群から選択される、実施形態Ｋのうちのいずれか１つに記載の医薬組成物、実施形態Ｌのうちのいずれか１つに記載の方法、又は実施形態Ｍのうちのいずれか１つに記載の使用。
【0319】
実施形態Ｎ５：本発明の細菌、医薬、又は医薬組成物が、静脈内、腫瘍内、筋肉内、皮下、腹腔内、経脳、胃腸、身体表面、口腔粘膜、経鼻、経直腸、又は経膣の各経路により投与される、実施形態Ｋのうちのいずれか１つに記載の医薬組成物、実施形態Ｌのうちのいずれか１つに記載の方法、又は実施形態Ｍのうちのいずれか１つに記載の使用。
【0320】
［実施例］
以下に記載の実施形態は、本発明のある特定の特性及び／又は実施形態を例証する実施例として用いられる。これらの実施形態は、本発明が、記載される特定の特性又は実施形態に限定されるものと解釈してはならない。
以下に記載の実施形態は、本発明のある特定の特性及び／又は実施形態を例証する実施例として用いられる。これらの実施形態は、本発明が、記載される特定の特性又は実施形態に限定されるものと解釈してはならない。
【0321】
実施例１：サルモネラ・チフィムリウムＳＬ７２０７株の異なるバリアント株の構築
１．１ ＰｓｓｅＡ－ｈｌｙＡ－ｌｏｘｐ－ＫｎａＲ－ｌｏｘｐプラスミド（配列番号９）、及びＰｓｓｂｐ１－ｄａｐＥ－Ｃｍプラスミド（配列番号１０）をテンプレートとして使用しながら、ＰＣＲ増幅により望ましい断片を得た。ＰｓｓｅＡ－ｈｌｙＡ－ｌｏｘｐ－ＫｎａＲ－ｌｏｘｐの場合、下記のプライマー配列：フォワードプライマー ＴＴＣＡＣＡＧＡＡＡＡＧＴＧＴＴＧＣＣＣＣＣＴＴＣＣＡＴＧＧＣＧＧＡＡＧＧＧＧＧＡＣＡＡＡＧＧＴＧＡＡＴＴＴＧＴＣＣＴＡＣＴＣＡＧＧＡＧＡＧＡＧＣＧＴＴＣＡ（配列番号１１）、及びリバースプライマー ＴＣＴＧＡＣＧＴＡＣＡＣＡＧＣＡＡＴＴＴＴＧＣＧＴＴＡＣＣＴＧＴＴＡＡＴＣＧＡＧＡＴＴＧＡＡＡＣＡＣＣＧＡＡＧＡＡＡＧＧＣＣＣＡＣＣＣＧ（配列番号１２）を使用し、Ｐｓｓｂｐ１－ｄａｐＥ－Ｃｍの場合、下記のプライマー配列：フォワードプライマーＴＴＧＧＴＴＴＣＡＧＴＧＡＡＴＣＣＣＧＴＴＡＴＣＡＧＣＡＧＴＴＴＴＴＴＧＡＴＧＡＧＧＴＧＴＡＧＴＣＴＡＴＴＴＧＴＣＣＴＡＣＴＣＡＧＧＡＧＡＧＣＧ（配列番号１３）、及びリバースプライマーＣＡＡＴＡＴＴＴＴＧＣＣＡＧＣＣＡＧＴＣＣＡＴＧＣＴＴＡＴＴＴＣＣＴＣＴＴＡＣＣＧＧＡＡＣＧＣＴＣＡＣＧＡＡＧＡＡＡＧＧＣＣＣＡＣＣＣＧ（配列番号１４）を使用したが、またアニーリング温度は５５℃である。望ましい断片１は、ＰｓｓｅＡ－ｈｌｙＡ－ｌｏｘｐ－ＫｎａＲ－ｌｏｘｐ（配列番号１）であり、また望ましい断片２はＰｓｓｂｐ１－ｄａｐＥ－Ｃｍ（配列番号２）であった。
１．１ ＰｓｓｅＡ－ｈｌｙＡ－ｌｏｘｐ－ＫｎａＲ－ｌｏｘｐプラスミド（配列番号９）、及びＰｓｓｂｐ１－ｄａｐＥ－Ｃｍプラスミド（配列番号１０）をテンプレートとして使用しながら、ＰＣＲ増幅により望ましい断片を得た。ＰｓｓｅＡ－ｈｌｙＡ－ｌｏｘｐ－ＫｎａＲ－ｌｏｘｐの場合、下記のプライマー配列：フォワードプライマー ＴＴＣＡＣＡＧＡＡＡＡＧＴＧＴＴＧＣＣＣＣＣＴＴＣＣＡＴＧＧＣＧＧＡＡＧＧＧＧＧＡＣＡＡＡＧＧＴＧＡＡＴＴＴＧＴＣＣＴＡＣＴＣＡＧＧＡＧＡＧＡＧＣＧＴＴＣＡ（配列番号１１）、及びリバースプライマー ＴＣＴＧＡＣＧＴＡＣＡＣＡＧＣＡＡＴＴＴＴＧＣＧＴＴＡＣＣＴＧＴＴＡＡＴＣＧＡＧＡＴＴＧＡＡＡＣＡＣＣＧＡＡＧＡＡＡＧＧＣＣＣＡＣＣＣＧ（配列番号１２）を使用し、Ｐｓｓｂｐ１－ｄａｐＥ－Ｃｍの場合、下記のプライマー配列：フォワードプライマーＴＴＧＧＴＴＴＣＡＧＴＧＡＡＴＣＣＣＧＴＴＡＴＣＡＧＣＡＧＴＴＴＴＴＴＧＡＴＧＡＧＧＴＧＴＡＧＴＣＴＡＴＴＴＧＴＣＣＴＡＣＴＣＡＧＧＡＧＡＧＣＧ（配列番号１３）、及びリバースプライマーＣＡＡＴＡＴＴＴＴＧＣＣＡＧＣＣＡＧＴＣＣＡＴＧＣＴＴＡＴＴＴＣＣＴＣＴＴＡＣＣＧＧＡＡＣＧＣＴＣＡＣＧＡＡＧＡＡＡＧＧＣＣＣＡＣＣＣＧ（配列番号１４）を使用したが、またアニーリング温度は５５℃である。望ましい断片１は、ＰｓｓｅＡ－ｈｌｙＡ－ｌｏｘｐ－ＫｎａＲ－ｌｏｘｐ（配列番号１）であり、また望ましい断片２はＰｓｓｂｐ１－ｄａｐＥ－Ｃｍ（配列番号２）であった。
【0322】
１．２ λファージＲｅｄリコンビナーゼを含有するｐＳｉｍ６プラスミド（ＢｉｏＶｅｃｔｏｒ ＮＴＣＣ Ｉｎｃ．社：３５７４８４０）を、通性嫌気性サルモネラ株ＳＬ７２０７（ＮＣＢＩ：ＡＳＭ１３２０７１０ｖ１）に導入して、ｐＳｉｍ６プラスミド含有ＳＬ７２０７株エレクトロコンピテント細胞ＳＬ７２０７（ｐＳｉｍ６）を調製した。
【0323】
１．３ エレクトロポレーション法（Ｅ＝１８ＫＶ／ｃｍ）により、望ましい断片１をＳＬ７２０７（ｐＳｉｍ６）コンピテント細胞に導入した。λ－ｒｅｄ相同的組換え法を使用して、ＳＬ７２０７ゲノム内のｄａｐＥ遺伝子（細胞壁合成にとって必要不可欠なジアミノピメリン酸の合成を制御する）を、望ましい断片１と置き換えた。特に、ｐＳｉｍ６プラスミド含有標的系統を３０℃において培養し；リコンビナーゼ発現を４２℃で１５分間実施し；株ＳＬ７２０７を取得するために、５０ｂｐを含有する相同アームを、標的遺伝子座の上流及び下流のそれぞれから遠ざけて、相同的リコンビナーゼの影響下にあるＰＣＲプライマーに付加することにより、相同的組換えプロセスを完了した（ΔｄａｐＥ：：ＰｓｓｅＡ－ｈｌｙＡ－ＫｎａＲ）。
【0324】
１．４ Ｐ１ファージＣｒｅリコンビナーゼを含有するＣｒｅプラスミド（Ｇｅｎｅ Ｂｒｉｄｇｅｓ社：Ａ１１２）を、組換え用の株ＳＬ７２０７（ΔｄａｐＥ：：ＰｓｓｅＡ－ｈｌｙＡ－ＫｎａＲ）に導入してカナマイシン耐性を取り除き、これによって株ＳＬ７２０７（ΔｄａｐＥ：：ＰｓｓｅＡ－ｈｌｙＡ）を取得した。
【0325】
１．５ ｐＳｉｍ６プラスミドを株ＳＬ７２０７（ΔｄａｐＥ：：ＰｓｓｅＡ－ｈｌｙＡ）に導入して、ＳＬ７２０７（ΔｄａｐＥ：：ＰｓｓｅＡ－ｈｌｙＡ）（ｐＳｉｍ６）エレクトロコンピテント細胞を調製した。
【0326】
１．６ エレクトロポレーション法（Ｅ＝１８ＫＶ／ｃｍ）により、望ましい断片２をＳＬ７２０７（ΔｄａｐＥ：：ＰｓｓｅＡ－ｈｌｙＡ）（ｐＳｉｍ６）エレクトロコンピテント細胞に導入した。λ－ｒｅｄ相同的組換え法を使用しながら、ＳＬ７２０７ゲノム内のｈｔｒＡ遺伝子（セリンプロテアーゼをコードする）（ΔｄａｐＥ：：ＰｓｓｅＡ－ｈｌｙＡ）を望ましい断片２と置き換えて、株ＤＢ－ＺＷ１を取得した（同株は、ｈｔｒＡ遺伝子を欠損しており、ＰｓｓｅＡの制御下にｈｌｙＡ遺伝子及び偏性低酸素誘導プロモーターＰｓｓｂｐ１の制御下にｄａｐＥ遺伝子を含有するＳＬ７２０７株（ΔｄａｐＥ：：ＰｓｓｅＡ－ｈｌｙＡ；ΔｈｔｒＡ：：Ｐｓｓｂｐ１－ｄａｐＥ－Ｃｍ）であった）。
【0327】
１．７ ６０℃のアニーリング温度において、フォワードプライマーＣＡＡＴＡＴＴＴＴＧＣＣＡＧＣＣＡＧＴＣＣＡＴＧＣＴＴＡＴＴＴＣＣＴＣＴＴＡＣＣＧＧＡＡＣＧＣＴＣＡＡＴＴＴＧＴＣＣＴＡＣＴＣＡＧ（配列番号１５）、及びリバースプライマーＴＴＧＧＴＴＴＣＡＧＴＧＡＡＴＣＣＣＧＴＴＡＴＣＡＧＣＡＧＴＴＴＴＴＴＧＡＴＧＡＧＧＴＧＴＡＧＴＣＴＣＧＡＡＧＡＡＡＧＧＣＣＣＡＣＣＣＧ（配列番号１６）を使用した、ＰｄａｐＥ－ｄａｐＥ－ｌｏｘｐ－ＫｎａＲ－ｌｏｘｐ ＰＣＲ産物の調製。Ｐｓｓｂｐ１－ｄａｐＥ断片を置換するλ－ｒｅｄ相同的組換え法を使用しながら、エレクトロポレーション法（Ｅ＝１８ＫＶ／ｃｍ）により、ＰｄａｐＥ－ｄａｐＥ－ｌｏｘｐ－ＫｎａＲ－ｌｏｘｐ ＰＣＲ産物（配列番号４）をＤＢ－ＺＷ１（ｐＳｉｍ６）コンピテント細胞内に移して、ＤＢ－ＺＷ２株を取得した。ＤＢ－ＺＷ２株は、ｈｔｒＡ遺伝子を欠損しており、プロモーターＰｓｓｅＡの制御下にｈｌｙＡ遺伝子、及びその天然プロモーターＰｄａｐＥの制御下にｄａｐＥ遺伝子を含有するＳＬ７２０７株であった。
【0328】
１．８ ５５℃のアニーリング温度において、フォワードプライマーＡＴＧＡＡＡＡＡＡＡＴＡＡＴＧＣＴＡＧＴＴＴＴＴＡＴＴＡＣＡＣＴＴＡＴＡＴＴＡＧＴＴＡＧＴＣＴＡＣＣＧＣＣＧＡＴＣＡＴＡＴＴＣＡＡＴＡＡＣＣＣ（配列番号１７）、及びリバースプライマーＴＴＡＴＴＣＧＡＴＴＧＧＡＴＴＡＴＣＴＡＣＴＴＴＡＴＴＡＣＴＡＴＡＴＴＴＣＧＧＡＴＡＡＡＧＣＧＴＧＧＣＴＡＧＴＧＡＡＣＣＴＣＴＴＣＧＡＧＧＧ（配列番号１８）を使用した、ｌｏｘｐ－ＫｎａＲ－ｌｏｘｐ ＰＣＲ産物の調製。ｈｌｙＡ遺伝子を置換するλ－ｒｅｄ相同的組換え法を使用しながら、エレクトロポレーション法（Ｅ＝１８ＫＶ／ｃｍ）により、ｌｏｘｐ－ＫｎａＲ－ｌｏｘｐ ＰＣＲ産物（配列番号３）をＤＢ－ＺＷ１（ｐＳｉｍ６）コンピテント細胞内に移した。その結果、ｈｔｒＡ遺伝子を欠損しており、偏性低酸素誘導プロモーターＰｓｓｂｐ１の制御下にｄａｐＥ遺伝子を含有するが、ｈｌｙＡ遺伝子を有さないＳＬ７２０７株であるＤＢ－ＺＷ３株を得た。
【0329】
１．９ ５５℃のアニーリング温度において、フォワードプライマーＧＡＴＡＡＴＧＴＡＴＴＣＡＣＡＧＧＴＴＧＣＴＣＣＧＧＧＣＴＴＧＡＡＡＡＡＧＴＴＡＡＡＴＧＡＣＡＴＣＣＡＴＴＴＧＴＣＣＴＡＣＴＣＡＧＧＡＧＡＧＣ（配列番号１９）、及びリバースプライマーＡＡＡＡＧＧＡＡＣＴＴＴＴＴＡＣＣＴＴＴＴＣＧＣＣＴＴＣＣＣＧＴＴＴＣＧＴＴＣＡＡＣＴＴＡＧＴＡＴＡＣＧＡＡＧＡＡＡＧＧＣＣＣＡＣＣＣ（配列番号２０）を使用した、ＰｈｔｒＡ－ｈｔｒＡ－ｌｏｘｐ－ａａｄＡ－ｌｏｘｐ ＰＣＲ産物の調製。λ－ｒｅｄ相同的組換え法を使用しながら、エレクトロポレーション法（Ｅ＝１８ＫＶ／ｃｍ）により、ＰｈｔｒＡ－ｈｔｒＡ－ｌｏｘｐ－ａａｄＡ－ｌｏｘｐ ＰＣＲ産物（配列番号５）をＤＢ－ＺＷ１（ｐＳｉｍ６）及びＤＢ－ＺＷ３（ｐＳｉｍ６）コンピテント細胞内に移し、そしてａｔｔＢ部位を挿入して、株ＤＢ－ＺＷ４及びＤＢ－ＺＷ５をそれぞれ構築した。とりわけ、ＤＢ－ＺＷ４は、天然プロモーターの制御下にｈｔｒＡ遺伝子、プロモーターＰｓｓｅＡの制御下にｈｌｙＡ遺伝子、及びプロモーターＰｓｓｂｐ１の制御下にｄａｐＥ遺伝子を含有するＳＬ７２０７株であり；ＤＢ－ＺＷ５は、天然プロモーターの制御下にｈｔｒＡ遺伝子、プロモーターＰｓｓｂｐ１の制御下にｄａｐＥ遺伝子を含有するが、ｈｌｙＡ遺伝子を有さないＳＬ７２０７株であった。株構築スキームを図１に示す。ＤＢ－ＺＷ２、ＤＢ－ＺＷ３、ＤＢ－ＺＷ４、及びＤＢ－ＺＷ５株の構築の成功は、ＰＣＲ電気泳動により確認した。
【0330】
実施例２：ＤＢ－ＺＷ１及びＤＢ－ＺＷ２株の異なる細胞における増殖の特徴
ＤＢ－ＺＷ１及びＤＢ－ＺＷ２を、嫌気及び好気条件の下、３７℃においてＬＢブロス内でそれぞれ培養し、そしてそれらを０．２のＯＤ６００まで増殖させたとき、細菌を５０００ｒｐｍにおける遠心分離により収集し、ＰＢＳで洗浄した。次に、Ｑｉａｇｅｎ ＲＮＡ抽出キット（７４１０６）を使用してＲＮＡを抽出し、そして逆転写後に、ＲＴ－ｑＰＣＲを使用して各株におけるｄａｐＥの発現を測定した。天然プロモーターを担持する株ＤＢ－ＺＷ２と比較して、株ＤＢ－ＺＷ１は、嫌気条件下でｄａｐＥ遺伝子をより多く転写及び発現することが可能であったが、株ＤＢ－ＺＷ１内でのｄａｐＥ遺伝子の転写及び発現は、好気条件下で有意に低下した（図２Ａ）。一方、嫌気性遺伝子回路を内包するＤＢ－ＺＷ１株、及び嫌気性遺伝子回路を欠いているＤＢ－ＺＷ２株の増殖が好気条件下で観察された。ＤＢ－ＺＷ１及びＤＢ－ＺＷ２を、好気条件下、３７℃においてＬＢブロス内でそれぞれ培養し、その場合、ＤＢ－ＺＷ１の培地には５０μｇ／ｍＬのＤＡＰを添加した。０．２のＯＤ６００まで培養したとき、両細菌を５０００ｒｐｍにおける遠心分離により収集し、ＰＢＳで洗浄し、次に適する量の細菌溶液を採取し、そして２ｃｍガラス底型ペトリ皿に添加し、そして顕微鏡下で観察するためにアガロースゲルパッドを用いてプレスした。約６時間インキュベートした後に、ＤＢ－ＺＷ１株のすべての細菌細胞は溶解し、細菌は死滅した一方、嫌気性遺伝子回路を欠いているＤＢ－ＺＷ２株は、好気条件下で生存及び増殖可能であることが判明した（図２Ｂ）。それに加えて、ＤＢ－ＺＷ１株の２倍増加時間は、ＤＡＰが添加された好気性環境において、及び嫌気性環境において、およそ３８分であることが更に測定された（図２Ｃ）。上記結果より、嫌気性遺伝子回路は異なる酸素条件下で株の増殖を制御可能であることが示唆された。
ＤＢ－ＺＷ１及びＤＢ－ＺＷ２を、嫌気及び好気条件の下、３７℃においてＬＢブロス内でそれぞれ培養し、そしてそれらを０．２のＯＤ６００まで増殖させたとき、細菌を５０００ｒｐｍにおける遠心分離により収集し、ＰＢＳで洗浄した。次に、Ｑｉａｇｅｎ ＲＮＡ抽出キット（７４１０６）を使用してＲＮＡを抽出し、そして逆転写後に、ＲＴ－ｑＰＣＲを使用して各株におけるｄａｐＥの発現を測定した。天然プロモーターを担持する株ＤＢ－ＺＷ２と比較して、株ＤＢ－ＺＷ１は、嫌気条件下でｄａｐＥ遺伝子をより多く転写及び発現することが可能であったが、株ＤＢ－ＺＷ１内でのｄａｐＥ遺伝子の転写及び発現は、好気条件下で有意に低下した（図２Ａ）。一方、嫌気性遺伝子回路を内包するＤＢ－ＺＷ１株、及び嫌気性遺伝子回路を欠いているＤＢ－ＺＷ２株の増殖が好気条件下で観察された。ＤＢ－ＺＷ１及びＤＢ－ＺＷ２を、好気条件下、３７℃においてＬＢブロス内でそれぞれ培養し、その場合、ＤＢ－ＺＷ１の培地には５０μｇ／ｍＬのＤＡＰを添加した。０．２のＯＤ６００まで培養したとき、両細菌を５０００ｒｐｍにおける遠心分離により収集し、ＰＢＳで洗浄し、次に適する量の細菌溶液を採取し、そして２ｃｍガラス底型ペトリ皿に添加し、そして顕微鏡下で観察するためにアガロースゲルパッドを用いてプレスした。約６時間インキュベートした後に、ＤＢ－ＺＷ１株のすべての細菌細胞は溶解し、細菌は死滅した一方、嫌気性遺伝子回路を欠いているＤＢ－ＺＷ２株は、好気条件下で生存及び増殖可能であることが判明した（図２Ｂ）。それに加えて、ＤＢ－ＺＷ１株の２倍増加時間は、ＤＡＰが添加された好気性環境において、及び嫌気性環境において、およそ３８分であることが更に測定された（図２Ｃ）。上記結果より、嫌気性遺伝子回路は異なる酸素条件下で株の増殖を制御可能であることが示唆された。
【0331】
それに加えて、２．５×１０６個のＲＡＷ２６４．７マウスマクロファージ（ＡＴＣＣ番号：ＴＩＢ－７１）、又はＭＢ４９マウス膀胱がん細胞（Ｍｅｒｃｋ社 ＳＣＣ１４８）を、細胞培養用の６ウェルプレートの各ウェルに添加し、細胞を接着させるために、それを３７℃の５％ＣＯ２インキュベーター内の完全培地（ＤＭＥＭ基本培地＋１０％ウシ胎仔血清＋二重抗体）中で培養した。２つのウェルに由来する細胞をカウントし、そしてＤＢ－ＺＷ１及びＤＢ－ＺＷ３株（カウントした後、細菌を５０μｇ／ｍＬのＤＡＰを含有するＤＭＥＭ培地内で再懸濁した）を、細胞の数に基づき、５０：１の感染比を用いてそれぞれ添加し、そして細菌が細胞内に進入するのを可能にするために１５分間又は１時間同時培養した。その後、細胞をＰＢＳで洗浄し、そして１００μｇ／ｍＬのゲンタマイシン及び５０μｇ／ｍＬのＤＡＰを含有するＤＭＥＭ基本培地を用いて１時間培養した。上清を除去し、そして細胞をＰＢＳで洗浄した。細胞を収集した後、その膜を次に破断させ、そして播種により、細胞内の生存細菌の数を決定した。マクロファージ及び腫瘍細胞を使用することにより、ｐＨ制御型遺伝子回路ＰｓｓｅＡ－ｈｌｙＡを内包するＤＢ－ＺＷ１株はマウスマクロファージ細胞株ＲＡＷ２６４．７によってより速やかに排出されることが検証された一方、マウス膀胱がん細胞株ＭＢ４９内では良好な増殖を示すことが検証された（図３）。
【0332】
実施例３：異なるバリアント株のｉｎ ｖｉｖｏ分布
３．１ Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｖｉｔａｌ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．から購入され、約１８ｇの重量を有し、特定病原体フリー（ＳＰＦ）環境内で保持された）に、１×１０６個のＭＢ４９マウス膀胱がん細胞を皮下イノキュレーションして、マウス膀胱がんの皮下腫瘍モデルを確立した。イノキュレーション後の１４～１８日目、腫瘍容積が約１００ｍｍ３のときに、実験を実施した。
３．１ Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｖｉｔａｌ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．から購入され、約１８ｇの重量を有し、特定病原体フリー（ＳＰＦ）環境内で保持された）に、１×１０６個のＭＢ４９マウス膀胱がん細胞を皮下イノキュレーションして、マウス膀胱がんの皮下腫瘍モデルを確立した。イノキュレーション後の１４～１８日目、腫瘍容積が約１００ｍｍ３のときに、実験を実施した。
【0333】
３．２ 腫瘍担持マウスを、７群（マウス３匹からそれぞれ構成される）：ＰＢＳ群、ＤＢ－ＺＷ１群、ＤＢ－ＺＷ２群、ＤＢ－ＺＷ３群、ＤＢ－ＺＷ４群、ＤＢ－ＺＷ５群、及びＳＬ７２０７群に分割した。腫瘍担持マウスの後者６群に、１×１０７ＣＦＵの細菌（１２５μＬの容積）を、尾静脈を介して注射した。腫瘍担持マウスの正常組織及び臓器内の上記株の定量的分布をそれぞれ調べた。注射後１４日目に、その他の群の株と比較して、ＤＢ－ＺＷ１株のみが正常組織（図４Ａ）において速やかに排出され得る一方、腫瘍内では速やかに凝集し得ることが判明した（図４Ｂ）。嫌気性制御型遺伝子回路Ｐｓｓｂｐ１－ｄａｐＥ又はｐＨ制御型遺伝子回路ＰｓｓｅＡ－ｈｌｙＡを喪失すること、又はｈｔｒＡ遺伝子を含有することで、正常組織内でのＤＢ－ＺＷ１株の排出が減速する。
【0334】
実施例４：ＤＢ－ＺＷ１バリアント株の構築
４．１ 望ましい断片３、４及び５を、テンプレートとしてｐＢＳＫプラスミド（Ａｄｄｇｅｎｅ：＃６７５０４）、特に下記のもの：ｍｓｂＢ－ＨＲ－ｌｏｘｐ－ＫｎａＲ－ｌｏｘｐ（配列番号６、フォワードプライマー：ＡＧＧＴＡＧＴＡＣＡＧＧＧＴＴＴＧＴＣＡＧＣＡＴＡＡＡＧＣＣＴＣＴＣＴＴＡＣＧＡＧＡＧＧＣＴＴＴＡＴＧＣＣＧＡＴＣＡＴＡＴＴＣＡＡＴＡＡＣＣＣ（配列番号２１）；リバースプライマー：ＴＣＧＣＴＡＣＡＣＴＡＴＴＣＡＣＡＡＴＴＣＣＴＴＴＴＣＧＣＧＴＣＡＧＣＡＧＡＣＣＣＴＧＧＡＡＡＡＧＣＣＴＡＧＴＧＡＡＣＣＴＣＴＴＣＧＡＧＧＧ（配列番号２２）；アニーリング温度：５５℃）；ｌｐｐ－ＨＲ－ｌｏｘｐ－ＫｎａＲ－ｌｏｘｐ（配列番号７、フォワードプライマー：ＣＧＧＡＣＡＡＡＡＡＡＡＴＧＧＣＧＣＡＣＧＡＴＧＴＧＣＧＣＣＡＴＴＴＴＡＴＡＴＴＧＴＧＣＧＴＣＡＡＡＧＣＣＧＡＴＣＡＴＡＴＴＣＡＡＴＡＡＣＣＣ（配列番号２３）；リバースプライマー：ＡＡＴＡＣＴＴＧＴＡＡＣＧＣＴＡＣＡＴＧＧＡＧＡＴＴＡＡＣＴＣＡＡＴＣＴＡＧＡＧＧＧＴＡＴＴＡＡＴＡＣＴＡＧＴＧＡＡＣＣＴＣＴＴＣＧＡＧＧＧ（配列番号２４）；アニーリング温度：５５℃）；及びｆｌｉＣ－ＨＲ－ｌｏｘｐ－ＫｎａＲ－ｌｏｘｐ（配列番号８、フォワードプライマー：ＧＣＴＴＴＣＧＣＴＧＣＣＴＴＧＡＴＴＧＴＧＴＡＣＣＡＣ ＧＴＧＴＣＧＧＴＧＡＡＴＣＡＡＴＣＧＣＣＧＧＡＧＣＣＧＡＴＣＡＴＡＴＴＣＡＡＴＡＡＣＣＣ（配列番号２５）；リバースプライマー：ＡＣＧＧＴＧＡＧＡＡＡＣＣＧＴＧＧＧＣＡＡＣＡＧＣＣＣＡＡＴＡＡＣＡＴＣＡＡＧＴＴＧＴＡＡＴＴＧＡＴＣＴＡＧＴＧＡＡＣＣＴＣＴＴＣＧＡＧＧＧ（配列番号２６）；アニーリング温度：５５℃）を使用することにより、ＰＣＲ増幅によって取得した。
４．１ 望ましい断片３、４及び５を、テンプレートとしてｐＢＳＫプラスミド（Ａｄｄｇｅｎｅ：＃６７５０４）、特に下記のもの：ｍｓｂＢ－ＨＲ－ｌｏｘｐ－ＫｎａＲ－ｌｏｘｐ（配列番号６、フォワードプライマー：ＡＧＧＴＡＧＴＡＣＡＧＧＧＴＴＴＧＴＣＡＧＣＡＴＡＡＡＧＣＣＴＣＴＣＴＴＡＣＧＡＧＡＧＧＣＴＴＴＡＴＧＣＣＧＡＴＣＡＴＡＴＴＣＡＡＴＡＡＣＣＣ（配列番号２１）；リバースプライマー：ＴＣＧＣＴＡＣＡＣＴＡＴＴＣＡＣＡＡＴＴＣＣＴＴＴＴＣＧＣＧＴＣＡＧＣＡＧＡＣＣＣＴＧＧＡＡＡＡＧＣＣＴＡＧＴＧＡＡＣＣＴＣＴＴＣＧＡＧＧＧ（配列番号２２）；アニーリング温度：５５℃）；ｌｐｐ－ＨＲ－ｌｏｘｐ－ＫｎａＲ－ｌｏｘｐ（配列番号７、フォワードプライマー：ＣＧＧＡＣＡＡＡＡＡＡＡＴＧＧＣＧＣＡＣＧＡＴＧＴＧＣＧＣＣＡＴＴＴＴＡＴＡＴＴＧＴＧＣＧＴＣＡＡＡＧＣＣＧＡＴＣＡＴＡＴＴＣＡＡＴＡＡＣＣＣ（配列番号２３）；リバースプライマー：ＡＡＴＡＣＴＴＧＴＡＡＣＧＣＴＡＣＡＴＧＧＡＧＡＴＴＡＡＣＴＣＡＡＴＣＴＡＧＡＧＧＧＴＡＴＴＡＡＴＡＣＴＡＧＴＧＡＡＣＣＴＣＴＴＣＧＡＧＧＧ（配列番号２４）；アニーリング温度：５５℃）；及びｆｌｉＣ－ＨＲ－ｌｏｘｐ－ＫｎａＲ－ｌｏｘｐ（配列番号８、フォワードプライマー：ＧＣＴＴＴＣＧＣＴＧＣＣＴＴＧＡＴＴＧＴＧＴＡＣＣＡＣ ＧＴＧＴＣＧＧＴＧＡＡＴＣＡＡＴＣＧＣＣＧＧＡＧＣＣＧＡＴＣＡＴＡＴＴＣＡＡＴＡＡＣＣＣ（配列番号２５）；リバースプライマー：ＡＣＧＧＴＧＡＧＡＡＡＣＣＧＴＧＧＧＣＡＡＣＡＧＣＣＣＡＡＴＡＡＣＡＴＣＡＡＧＴＴＧＴＡＡＴＴＧＡＴＣＴＡＧＴＧＡＡＣＣＴＣＴＴＣＧＡＧＧＧ（配列番号２６）；アニーリング温度：５５℃）を使用することにより、ＰＣＲ増幅によって取得した。
【0335】
４．２ ＤＢ－ＺＷ１株エレクトロコンピテント細胞を調製するために、エレクトロポレーション法によりｐＳｉｍ６プラスミドをＤＢ－ＺＷ１株内に移した。
【0336】
４．３ ＤＢ－ＺＷ１（ｐＳｉｍ６）エレクトロコンピテント細胞を調製するために、対数期まで培養したＤＢ－ＺＷ１（ｐＳｉｍ６）細菌溶液を事前冷却した脱イオン水で２回洗浄し、次に同容積の１０％グリセロールで１回洗浄し、最終的に１０％グリセロール中に再懸濁し、そして対数期細菌溶液（各５ｍＬ）からエレクトロコンピテント細胞（１００μＬ）を調製した。
【0337】
４．４ 望ましい断片３、４及び５を、ＤＢ－ＺＷ１（ｐＳｉｍ６）エレクトロコンピテント細胞内にそれぞれ導入した。λ－ｒｅｄ相同的組換え技術により、ＤＢ－ＺＷ１ゲノム内のｍｓｂＢ遺伝子（脂質アシルトランスフェラーゼをコードする、遺伝子ＩＤ：１２５３４１０）、ｌｐｐ遺伝子（リポタンパク質をコードする、遺伝子ＩＤ：１２５２８９５）、及びｆｌｉＣ遺伝子（フラゲリンをコードする、遺伝子ＩＤ：１２５３４８０）を、望ましい断片３、４、及び５とそれぞれ置換して、株ＤＢ－ＺＷ１（ΔｍｓｂＢ）、ＤＢ－ＺＷ１（Δｌｐｐ）、及びＤＢ－ＺＷ１（ΔｆｌｉＣ）を取得した。株ＤＢ－ＺＷ１（ΔｍｓｂＢ）、ＤＢ－ＺＷ１（Δｌｐｐ）、及びＤＢ－ＺＷ１（ΔｆｌｉＣ）が、ＰＣＲ電気泳動により確認されたように奏功的に構築された。
【0338】
実施例５：ＤＢ－ＺＷ１バリアント株の抗がん効果
Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｖｉｔａｌ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．から購入され、約１８ｇの重量を有し、ＳＰＦ環境内で保持された）に、１×１０６個のＭＢ４９マウス膀胱がん細胞を皮下イノキュレーションして、マウス膀胱がんの皮下腫瘍モデルを確立した。イノキュレーション後の１４～１８日目、腫瘍容積が約１００ｍｍ３のときに、実験を実施した。
Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｖｉｔａｌ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．から購入され、約１８ｇの重量を有し、ＳＰＦ環境内で保持された）に、１×１０６個のＭＢ４９マウス膀胱がん細胞を皮下イノキュレーションして、マウス膀胱がんの皮下腫瘍モデルを確立した。イノキュレーション後の１４～１８日目、腫瘍容積が約１００ｍｍ３のときに、実験を実施した。
【0339】
マウスを６群（マウス５匹からそれぞれ構成される）：ＰＢＳ群、ＤＢ－ＺＷ１群、ＤＢ－ＺＷ１（ΔｍｓｂＢ）群、ＤＢ－ＺＷ１（Δｌｐｐ）群、ＤＢ－ＺＷ１（ΔｆｌｉＣ）群、及びＳＬ７２０７群に分割し、そして腫瘍担持マウスの後者５群に、１×１０７ＣＦＵの細菌（１２５μＬ）を、尾静脈注射によりイノキュレーションした。腫瘍担持マウスの正常組織及び腫瘍内の上記株の分布、腫瘍容積の変化、及びマウスの重量変化及び生存率を検出した。
【0340】
５．１ 腫瘍担持マウス内細菌分布：株ＤＢ－ＺＷ１、ＤＢ－ＺＷ１（ΔｍｓｂＢ）、ＤＢ－ＺＷ１（Δｌｐｐ）、ＤＢ－ＺＷ１（ΔｆｌｉＣ）を注射してから１４日後に、正常組織内のすべての細菌は実質的に完全に排出された一方、腫瘍内の細菌の数は１×１０８ＣＦＵ／ｇに達した（図５）。
【0341】
５．２ 腫瘍容積の変化：ＰＢＳ注射を用いて処置されたコントロール群と比較して、ＤＢ－ＺＷ１株は、マウスの腫瘍容積を有意に低下させ、そして生存率を有意に増加させたが、ＤＢ－ＺＷ１－ΔｍｓｂＢ及びＤＢ－ＺＷ１－Δｌｐｐの治療効果はＤＢ－ＺＷ１の治療効果よりも有意に低かった一方、フラゲリン欠損ＤＢ－ＺＷ１－ΔｆｌｉＣの治療効果はＤＢ－ＺＷ１の治療効果に匹敵し（図６Ａ）、またＳＬ７２０７群は死亡する前の腫瘍容積において有意な低下を示した。
【0342】
５．３ マウスの体重変化：ＤＢ－ＺＷ１群及びＤＢ－ＺＷ１－ΔｆｌｉＣ群のマウスの体重変化は、一過性の減少とそれに後続する安定化及びリバウンドといった類似した傾向を示した。ＤＢ－ＺＷ１－ΔｍｓｂＢ及びＤＢ－ＺＷ１－Δｌｐｐ群の体重減少量はＤＢ－ＺＷ１及びＤＢ－ＺＷ１－ΔｆｌｉＣ群よりも小さく（図６Ｂ）、またＳＬ７２０７群の体重は著しく連続的に失われた。
【0343】
５．４ マウス生存率：ＳＬ７２０７群は注射後７日以内に連続的に死亡した。ＰＢＳ、ＤＢ－ＺＷ１－ΔｍｓｂＢ、及びＤＢ－ＺＷ１－Δｌｐｐ群内のマウスは、注射後１２日の間に連続的に死亡した（注記：該３群内の動物は、腫瘍サイズが過剰となったことに起因して倫理的理由から死亡させた）。ＤＢ－ＺＷ１群及びＤＢ－ＺＷ１－ΔｆｌｉＣ群では、実験サイクル期間中に死亡したマウスはいなかった（図６Ｃ）。
【0344】
５．５ 統計的には、マウス内のＭＢ４９膀胱がんを処置した場合、ＤＢ－ＺＷ１は、部分応答率６０％（ｎ＝４２）及び完全応答率３６％を実現し、ＭＢ４９に対して良好な治療効果を有したことが示唆される（図６Ｄ）。
【0345】
上記結果より、ＤＢ－ＺＷ１及びＤＢ－ＺＷ１－ΔｆｌｉＣは、マウス内の膀胱がんの処置及びその生存率の改善において有効であることが明らかとなり、ＤＢ－ＺＷ１内のリポ多糖類（ＬＰＳ）は腫瘍の処置において重要な役割を演じていることが示唆される。全観察サイクル（３５日間）において、ＤＢ－ＺＷ１及びＤＢ－ＺＷ１－ΔｆｌｉＣ群のみが処置後マウス生存率１００％を実現し、株ＤＢ－ＺＷ１及びＤＢ－ＺＷ１－ΔｆｌｉＣは良好な安全性を有したことが示唆される。
【0346】
実施例６：ＤＢ－ＺＷ１による複数の腫瘍モデルに対する抗腫瘍効果
６．１ 腫瘍モデルの構築
Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｖｉｔａｌ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．から購入され、約１８ｇの重量を有し、ＳＰＦ環境内で保持された）に、１×１０６個のＭＢ４９マウス膀胱がん細胞／Ｂ１６黒色腫細胞（ＡＴＣＣ：ＣＲＬ－６４７５）を皮下イノキュレーションして、マウス膀胱がん／黒色腫の皮下腫瘍モデルを確立した。イノキュレーション後の１４～１８日目、腫瘍容積が約１００ｍｍ３のときに、実験を実施した。Ｉｎ ｓｉｔｕ結腸がんモデルをＤＳＳ／ＡＯＭにより誘発した：１０ｍｇ／ｋｇのＡＯＭを腹腔内単回注射した後に、２．５％のＤＳＳを含有する水を１週間経過後７日間、次に通常の飲料水を１４日間与え、これを１サイクルのＤＳＳ処置とした。ＤＳＳ処置を更に３サイクル反復して、結腸直腸がんを有するマウスモデルを取得した。
６．１ 腫瘍モデルの構築
Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｖｉｔａｌ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．から購入され、約１８ｇの重量を有し、ＳＰＦ環境内で保持された）に、１×１０６個のＭＢ４９マウス膀胱がん細胞／Ｂ１６黒色腫細胞（ＡＴＣＣ：ＣＲＬ－６４７５）を皮下イノキュレーションして、マウス膀胱がん／黒色腫の皮下腫瘍モデルを確立した。イノキュレーション後の１４～１８日目、腫瘍容積が約１００ｍｍ３のときに、実験を実施した。Ｉｎ ｓｉｔｕ結腸がんモデルをＤＳＳ／ＡＯＭにより誘発した：１０ｍｇ／ｋｇのＡＯＭを腹腔内単回注射した後に、２．５％のＤＳＳを含有する水を１週間経過後７日間、次に通常の飲料水を１４日間与え、これを１サイクルのＤＳＳ処置とした。ＤＳＳ処置を更に３サイクル反復して、結腸直腸がんを有するマウスモデルを取得した。
【0347】
６．２ 腫瘍及び異なる臓器におけるＤＢ－ＺＷ１の分布変化
１×１０７ＣＦＵのＤＢ－ＺＷ１（１２５μＬ）を、尾静脈を介してＭＢ４９膀胱腫瘍担持マウス（マウス３匹／群）内に注射した。マウス内のおよそ９０％のＤＢ－ＺＷ１が、注射後１日目に腫瘍内に存在すること観察された（１ｄｐｉ）。腫瘍内ＤＢ－ＺＷ１密度は、その後２日間以内に１００倍（１０８ＣＦＵ／ｇまで）更に上昇し、そしてその後２週間高レベルに維持された。対照的に、正常臓器内のＤＢ－ＺＷ１の密度は、２週間以内に１０２ＣＦＵ／ｇ未満まで着実に減少した（図７Ａ）。
１×１０７ＣＦＵのＤＢ－ＺＷ１（１２５μＬ）を、尾静脈を介してＭＢ４９膀胱腫瘍担持マウス（マウス３匹／群）内に注射した。マウス内のおよそ９０％のＤＢ－ＺＷ１が、注射後１日目に腫瘍内に存在すること観察された（１ｄｐｉ）。腫瘍内ＤＢ－ＺＷ１密度は、その後２日間以内に１００倍（１０８ＣＦＵ／ｇまで）更に上昇し、そしてその後２週間高レベルに維持された。対照的に、正常臓器内のＤＢ－ＺＷ１の密度は、２週間以内に１０２ＣＦＵ／ｇ未満まで着実に減少した（図７Ａ）。
【0348】
ＤＢ－ＺＷ１が腫瘍内で選好的に増殖するかどうか更に明確にするために、異なる臓器内に分布する細菌の数を、１×１０７ＣＦＵのＤＢ－ＺＷ１細菌（１２５μＬ）を、尾静脈を介してＭＢ４９膀胱腫瘍担持マウス（マウス３匹／群）内に注射してから２４時間後に決定した（図７Ｂ）。結果より、ＤＢ－ＺＷ１は注射後３０分以内にマウス内に速やかに拡散し、またほとんどのＤＢ－ＺＷ１細胞（約９９．９％）は肝臓、脾臓、及び血液内に分布することが明らかとなった。また、ＤＢ－ＺＷ１細胞の数は注射後４時間以内に有意に低下し、そしてＤＢ－ＺＷ１細胞の合計数は約９０％低下した。その後、腫瘍内のＤＢ－ＺＷ１は約０．７ｈ－１の増殖速度で指数関数的に増殖し、３日以内に飽和に達した。対照的に、正常な臓器内では、ＤＢ－ＺＷ１細胞の数はすべて着実に低下した。ＤＢ－ＺＷ１のこの特別な腫瘍増殖プロファイルは、下記の知見の妥当性を保証する上で重要であった。
【0349】
６．３ 膀胱がん、黒色腫、及び結腸に対するＤＢ－ＺＷ１の抗腫瘍効果
ＤＢ－ＺＷ１を、マウス内の皮下膀胱がん、ｉｎ ｓｉｔｕ黒色腫、並びに皮下及びｉｎ ｓｉｔｕ結腸がんを処置するのに使用した。１×１０７ＣＦＵのＤＢ－ＺＷ１（１２５μＬ）を、尾静脈を介して腫瘍担持マウス（マウス５匹／群）内に注射した。図８Ａ～Ｃに示すように、ＤＢ－ＺＷ１は腫瘍サイズを有意に低下させた。それに加えて、ＤＢ－ＺＷ１を使用してｉｎ ｓｉｔｕ結腸がんを有するマウスを処置することで、マウスの結腸内腫瘍数も有意に低下した（図８Ｄ）。
ＤＢ－ＺＷ１を、マウス内の皮下膀胱がん、ｉｎ ｓｉｔｕ黒色腫、並びに皮下及びｉｎ ｓｉｔｕ結腸がんを処置するのに使用した。１×１０７ＣＦＵのＤＢ－ＺＷ１（１２５μＬ）を、尾静脈を介して腫瘍担持マウス（マウス５匹／群）内に注射した。図８Ａ～Ｃに示すように、ＤＢ－ＺＷ１は腫瘍サイズを有意に低下させた。それに加えて、ＤＢ－ＺＷ１を使用してｉｎ ｓｉｔｕ結腸がんを有するマウスを処置することで、マウスの結腸内腫瘍数も有意に低下した（図８Ｄ）。
【0350】
実施例７：腫瘍内での速やかなＤＢ－ＺＷ１増殖はその嫌気性回路と相関関係を有する
細菌の腫瘍を標的とするコロニー化がその運動性と関連するかどうか検証するために、コントロールとしてＤＢ－ＺＷ１を使用しつつ、実施例２において構築された無鞭毛ＤＢ－ＺＷ１－ΔｆｌｉＣバリアントを使用した。
細菌の腫瘍を標的とするコロニー化がその運動性と関連するかどうか検証するために、コントロールとしてＤＢ－ＺＷ１を使用しつつ、実施例２において構築された無鞭毛ＤＢ－ＺＷ１－ΔｆｌｉＣバリアントを使用した。
【0351】
７．１ 腫瘍モデルの構築
Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｖｉｔａｌ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．から購入され、約１８ｇの重量を有し、ＳＰＦ環境内で保持された）に、１×１０６個のＭＢ４９マウス膀胱がん細胞を皮下イノキュレーションして、マウス膀胱がんの皮下腫瘍モデルを確立した。イノキュレーション後の１４～１８日目、腫瘍容積が約１００ｍｍ３のときに、実験を実施した。
Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｖｉｔａｌ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．から購入され、約１８ｇの重量を有し、ＳＰＦ環境内で保持された）に、１×１０６個のＭＢ４９マウス膀胱がん細胞を皮下イノキュレーションして、マウス膀胱がんの皮下腫瘍モデルを確立した。イノキュレーション後の１４～１８日目、腫瘍容積が約１００ｍｍ３のときに、実験を実施した。
【0352】
７．２ ＤＢ－ＺＷ１及びバリアントＤＢ－ＺＷ１－ΔｆｌｉＣの腫瘍を標的とするコロニー化
１０７ＣＦＵのＤＢ－ＺＷ１及びバリアントＤＢ－ＺＷ１－ΔｆｌｉＣをそれぞれ、ＭＢ４９腫瘍担持マウス（マウス３匹／群）内に、尾静脈を介して注射した。注射後１４日目に、個々の組織臓器（心臓、肝臓、脾臓、腎臓、血液、腫瘍）を採取、秤量し、すり潰し、ＰＢＳで稀釈し、そしてＬＢプレートに適用した。３７℃のインキュベーター内に１６～１８時間配置した後、各プレート上のクローンの数を計測した。ＤＢ－ＺＷ１－ΔｆｌｉＣの運動性は非常に弱かったが、それでも腫瘍内でコロニー形成可能であることが実証された（図９）。この結果より、ＤＢ－ＺＷ１の腫瘍標的効果は細菌の運動性に起因せず、腫瘍内での細菌のコロニー化及び速やかな増殖と密接に関連することが明らかとなった。
１０７ＣＦＵのＤＢ－ＺＷ１及びバリアントＤＢ－ＺＷ１－ΔｆｌｉＣをそれぞれ、ＭＢ４９腫瘍担持マウス（マウス３匹／群）内に、尾静脈を介して注射した。注射後１４日目に、個々の組織臓器（心臓、肝臓、脾臓、腎臓、血液、腫瘍）を採取、秤量し、すり潰し、ＰＢＳで稀釈し、そしてＬＢプレートに適用した。３７℃のインキュベーター内に１６～１８時間配置した後、各プレート上のクローンの数を計測した。ＤＢ－ＺＷ１－ΔｆｌｉＣの運動性は非常に弱かったが、それでも腫瘍内でコロニー形成可能であることが実証された（図９）。この結果より、ＤＢ－ＺＷ１の腫瘍標的効果は細菌の運動性に起因せず、腫瘍内での細菌のコロニー化及び速やかな増殖と密接に関連することが明らかとなった。
【0353】
実施例８：メモリーＣＤ８＋Ｔ細胞を特異的に活性化させるＤＢ－ＺＷ１の能力
８．１ 腫瘍モデルの構築
Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｖｉｔａｌ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．から購入され、約１８ｇの重量を有し、ＳＰＦ環境内で保持された）に、１×１０６個のＭＢ４９マウス膀胱がん細胞を皮下イノキュレーションして、マウス膀胱がんの皮下腫瘍モデルを確立した。イノキュレーション後の１４～１８日目、腫瘍容積が約１００ｍｍ３のときに、実験を実施した。
８．１ 腫瘍モデルの構築
Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｖｉｔａｌ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．から購入され、約１８ｇの重量を有し、ＳＰＦ環境内で保持された）に、１×１０６個のＭＢ４９マウス膀胱がん細胞を皮下イノキュレーションして、マウス膀胱がんの皮下腫瘍モデルを確立した。イノキュレーション後の１４～１８日目、腫瘍容積が約１００ｍｍ３のときに、実験を実施した。
【0354】
８．２ ＤＢ－ＺＷ１によるメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化
マウスを切開し、そして腫瘍ドレイニングリンパ節を採取した。すり潰した後、４０μｍメッシュフィルターを通じた濾過により単一細胞浮遊液を調製した。次に、腫瘍ドレイニングリンパ節内のメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞の量を、抗体染色及びフロー分析により検出した。メモリーＣＤ８＋Ｔ細胞のレベルは、ＰＢＳコントロール群内のマウスと比較して、ＤＢ－ＺＷ１を用いて処置されたマウスのドレイニングリンパ節内で有意に増加していることが判明した（図１０Ａ）。マウスに１×１０６個のＢ１６－ＯＶＡ黒色腫細胞をイノキュレーションすると、そのドレイニングリンパ節内のメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞が増加したが、かかる増加は腫瘍抗原特異的であることが判明した（図１０Ｂ）。１×１０６個のＢ１６－ＯＶＡ黒色腫細胞を別に皮下イノキュレーションした後、ＤＢ－ＺＷ１により治癒が施された黒色腫マウスにおいて腫瘍再発は認められなかった（図１１Ａ）。ＤＢ－ＺＷ１により予め治癒が施され、その後１×１０６個のＭＢ４９膀胱がん細胞が皮下にイノキュレーションされた黒色腫マウスは、腫瘍細胞の初期皮下注射を受けたマウスとまったく同様に腫瘍を発現した（図１１Ｃ）。上記結果より、ＤＢ－ＺＷ１の抗腫瘍効果は腫瘍メモリーにより特徴付けられることが明らかとなった。
マウスを切開し、そして腫瘍ドレイニングリンパ節を採取した。すり潰した後、４０μｍメッシュフィルターを通じた濾過により単一細胞浮遊液を調製した。次に、腫瘍ドレイニングリンパ節内のメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞の量を、抗体染色及びフロー分析により検出した。メモリーＣＤ８＋Ｔ細胞のレベルは、ＰＢＳコントロール群内のマウスと比較して、ＤＢ－ＺＷ１を用いて処置されたマウスのドレイニングリンパ節内で有意に増加していることが判明した（図１０Ａ）。マウスに１×１０６個のＢ１６－ＯＶＡ黒色腫細胞をイノキュレーションすると、そのドレイニングリンパ節内のメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞が増加したが、かかる増加は腫瘍抗原特異的であることが判明した（図１０Ｂ）。１×１０６個のＢ１６－ＯＶＡ黒色腫細胞を別に皮下イノキュレーションした後、ＤＢ－ＺＷ１により治癒が施された黒色腫マウスにおいて腫瘍再発は認められなかった（図１１Ａ）。ＤＢ－ＺＷ１により予め治癒が施され、その後１×１０６個のＭＢ４９膀胱がん細胞が皮下にイノキュレーションされた黒色腫マウスは、腫瘍細胞の初期皮下注射を受けたマウスとまったく同様に腫瘍を発現した（図１１Ｃ）。上記結果より、ＤＢ－ＺＷ１の抗腫瘍効果は腫瘍メモリーにより特徴付けられることが明らかとなった。
【0355】
８．３ ＤＢ－ＺＷ１による転移性腫瘍の阻害
１×１０６個のＢ１６細胞を含有する細胞懸濁物（１２５μＬ）を、ＤＢ－ＺＷ１治癒後の黒色腫マウスに尾静脈注射を通じてイノキュレーションするのに使用し、そしてマウス肺内での腫瘍転移形成を１８日後に検出した。マウスの肺にＤＢ－ＺＷ１による治癒を施した場合、最初に誘発された黒色腫を有するマウスと比較して、その体重が有意に低下することが判明した（図１１Ｂ）。
１×１０６個のＢ１６細胞を含有する細胞懸濁物（１２５μＬ）を、ＤＢ－ＺＷ１治癒後の黒色腫マウスに尾静脈注射を通じてイノキュレーションするのに使用し、そしてマウス肺内での腫瘍転移形成を１８日後に検出した。マウスの肺にＤＢ－ＺＷ１による治癒を施した場合、最初に誘発された黒色腫を有するマウスと比較して、その体重が有意に低下することが判明した（図１１Ｂ）。
【0356】
実施例９：ＤＢ－ＺＷ１によるメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞の抗腫瘍効果の活性化
９．１ 腫瘍モデルの構築
Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｖｉｔａｌ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．から購入され、約１８ｇの重量を有し、ＳＰＦ環境内で保持された）に、１×１０６個のＭＢ４９マウス膀胱がん細胞を皮下イノキュレーションして、マウス膀胱がんの皮下腫瘍モデルを確立した。イノキュレーション後の１４～１８日目、腫瘍容積が約１００ｍｍ３のときに、実験を実施した。
９．１ 腫瘍モデルの構築
Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｖｉｔａｌ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．から購入され、約１８ｇの重量を有し、ＳＰＦ環境内で保持された）に、１×１０６個のＭＢ４９マウス膀胱がん細胞を皮下イノキュレーションして、マウス膀胱がんの皮下腫瘍モデルを確立した。イノキュレーション後の１４～１８日目、腫瘍容積が約１００ｍｍ３のときに、実験を実施した。
【0357】
９．２ ＤＢ－ＺＷ１によるＩＦＮγ＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化
ＭＢ４９膀胱がん細胞が皮下にイノキュレーションされたマウス（マウス３匹／群）を、ＤＢ－ＺＷ１及びバリアントＤＢ－ＺＷ１－ΔｍｓｂＢ及びＤＢ－ＺＷ１－Δｌｐｐを用いてそれぞれ処置した。各群の腫瘍微小環境内ＩＦＮγ＋ＣＤ８＋Ｔ細胞含有量を検出し、そしてＤＢ－ＺＷ１処置群においてマウスの腫瘍微小環境内に浸潤したＩＦＮγ＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の数は、ＰＢＳコントロール群並びにバリアントＤＢ－ＺＷ１－ΔｍｓｂＢ及びＤＢ－ＺＷ１－Δｌｐｐ処置群における数よりも有意に高かった（図１２Ａ）。
ＭＢ４９膀胱がん細胞が皮下にイノキュレーションされたマウス（マウス３匹／群）を、ＤＢ－ＺＷ１及びバリアントＤＢ－ＺＷ１－ΔｍｓｂＢ及びＤＢ－ＺＷ１－Δｌｐｐを用いてそれぞれ処置した。各群の腫瘍微小環境内ＩＦＮγ＋ＣＤ８＋Ｔ細胞含有量を検出し、そしてＤＢ－ＺＷ１処置群においてマウスの腫瘍微小環境内に浸潤したＩＦＮγ＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の数は、ＰＢＳコントロール群並びにバリアントＤＢ－ＺＷ１－ΔｍｓｂＢ及びＤＢ－ＺＷ１－Δｌｐｐ処置群における数よりも有意に高かった（図１２Ａ）。
【0358】
ＣＤ８＋Ｔ細胞と膀胱がん細胞株ＭＢ４９及び黒色腫細胞株Ｂ１６とのｉｎ ｖｉｔｒｏでの同時培養実験を実施した。ＣＤ８＋Ｔ細胞を、ＤＢ－ＺＷ１を用いて処置された腫瘍担持マウスの腫瘍から単離し、次にＭＢ４９又はＢ１６腫瘍細胞と共に、５：１の比、３７℃のＣＯ２インキュベーターにおいて５時間同時培養した。標的細胞に対する殺傷効果を、各同時培養ウェルから収集された上清において、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）放出量を測定することにより決定した。結果より、単離されたＣＤ８＋Ｔ細胞は、Ｂ１６細胞を殺傷することよりもＭＢ４９細胞を殺傷することにおいて有意により有効であることが明らかとなった（図１２Ｂ）。ＤＢ－ＺＷ１注射後の腫瘍内ＣＤ８＋Ｔ細胞は、特異的に処置された腫瘍細胞に対してより強い殺傷効果を有することが判明した。この結果は、ＤＢ－ＺＷ１は腫瘍内ＩＦＮγ＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の特異的活性化により抗腫瘍効果を発揮することを示唆した。
【0359】
実施例１０：ＤＢ－ＺＷ１による腫瘍内組織常在性メモリーＴ細胞（ＴＲＭ細胞）の活性化
１０．１ 腫瘍モデルの構築
Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｖｉｔａｌ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．から購入され、約１８ｇの重量を有し、ＳＰＦ環境内で保持された）に、１×１０６個のＭＢ４９マウス膀胱がん細胞を皮下イノキュレーションして、マウス膀胱がんの皮下腫瘍モデルを確立した。イノキュレーション後の１４～１８日目、腫瘍容積が約１００ｍｍ３のときに、実験を実施した。
１０．１ 腫瘍モデルの構築
Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｖｉｔａｌ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．から購入され、約１８ｇの重量を有し、ＳＰＦ環境内で保持された）に、１×１０６個のＭＢ４９マウス膀胱がん細胞を皮下イノキュレーションして、マウス膀胱がんの皮下腫瘍モデルを確立した。イノキュレーション後の１４～１８日目、腫瘍容積が約１００ｍｍ３のときに、実験を実施した。
【0360】
１０．２ ＤＢ－ＺＷ１によるＴＲＭ細胞の活性化
ＤＢ－ＺＷ１を用いた処置の前及び後における腫瘍微小環境内の、ＣＤ６２Ｌ－ＣＤ６９＋、ＣＤ６２Ｌ－ＣＤ６９＋ＣＤ１０３＋、又はＣＤ６２Ｌ－ＣＤ６９＋ＣＤ１０３－それぞれのＣＤ８＋Ｔ細胞の含有量を検出したが、この場合、ＣＤ６２Ｌ－ＣＤ６９＋ＣＤ８＋Ｔ細胞はＴＲＭ細胞であった。ＤＢ－ＺＷ１を用いて処置されたマウスの腫瘍ドレイニングリンパ節及び腫瘍において、ＣＤ８＋Ｔ細胞に占めるＴＲＭ細胞の割合、並びにＴＲＭ細胞に占めるＩＦＮγ＋細胞の割合は、ＰＢＳを用いて処置されたコントロール群よりも有意に高いことが判明した（図１３）。
ＤＢ－ＺＷ１を用いた処置の前及び後における腫瘍微小環境内の、ＣＤ６２Ｌ－ＣＤ６９＋、ＣＤ６２Ｌ－ＣＤ６９＋ＣＤ１０３＋、又はＣＤ６２Ｌ－ＣＤ６９＋ＣＤ１０３－それぞれのＣＤ８＋Ｔ細胞の含有量を検出したが、この場合、ＣＤ６２Ｌ－ＣＤ６９＋ＣＤ８＋Ｔ細胞はＴＲＭ細胞であった。ＤＢ－ＺＷ１を用いて処置されたマウスの腫瘍ドレイニングリンパ節及び腫瘍において、ＣＤ８＋Ｔ細胞に占めるＴＲＭ細胞の割合、並びにＴＲＭ細胞に占めるＩＦＮγ＋細胞の割合は、ＰＢＳを用いて処置されたコントロール群よりも有意に高いことが判明した（図１３）。
【0361】
この結果は、ＤＢ－ＺＷ１は腫瘍内でＴＲＭ細胞を特異的に活性化させることにより抗腫瘍効果を発揮し得ることを示唆した。
【0362】
実施例１１：ＤＢ－ＺＷ１によるマクロファージ内ＩＬ－１０産生刺激を通じたＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化
１１．１ 腫瘍モデルの構築
Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｖｉｔａｌ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．から購入され、約１８ｇの重量を有し、ＳＰＦ環境内で保持された）に、１×１０６個のＭＢ４９マウス膀胱がん細胞を皮下イノキュレーションして、マウス膀胱がんの皮下腫瘍モデルを確立した。イノキュレーション後の１４～１８日目、腫瘍容積が約１００ｍｍ３のときに、実験を実施した。
１１．１ 腫瘍モデルの構築
Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｖｉｔａｌ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．から購入され、約１８ｇの重量を有し、ＳＰＦ環境内で保持された）に、１×１０６個のＭＢ４９マウス膀胱がん細胞を皮下イノキュレーションして、マウス膀胱がんの皮下腫瘍モデルを確立した。イノキュレーション後の１４～１８日目、腫瘍容積が約１００ｍｍ３のときに、実験を実施した。
【0363】
１１．２ ＩＬ－１０によるＣＤ８＋Ｔ細胞の抗腫瘍効果の活性化
単離された腫瘍内ＣＤ８＋Ｔ細胞を、抗ＣＤ３抗体、及びＤＢ－ＺＷ１、ＤＢ－ＺＷ１－ΔｍｓｂＢ、ＤＢ－ＺＷ１－Δｌｐｐをそれぞれ使用しながらｉｎ ｖｉｔｒｏで刺激した場合、ＤＢ－ＺＷ１、ＤＢ－ＺＷ１－ΔｍｓｂＢ、及びＤＢ－ＺＷ１－Δｌｐｐのいずれも、ＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化を有効に刺激することができないことが判明した（図１４）。マウス内皮下膀胱がんをＤＢ－ＺＷ１、ＤＢ－ＺＷ１－ΔｍｓｂＢ、及びＤＢ－ＺＷ１－Δｌｐｐをそれぞれ用いて更に処置し、そして血清内の様々な炎症性因子のレベルを検出した。ＤＢ－ＺＷ１処置群におけるＩＬ－１０の含有量は、その他の群における含有量よりも有意に高いことが判明し（図１５）、ＩＬ－１０は、ＤＢ－ＺＷ１による腫瘍の処置において重要な役割を演じている可能性があることが示唆される。
単離された腫瘍内ＣＤ８＋Ｔ細胞を、抗ＣＤ３抗体、及びＤＢ－ＺＷ１、ＤＢ－ＺＷ１－ΔｍｓｂＢ、ＤＢ－ＺＷ１－Δｌｐｐをそれぞれ使用しながらｉｎ ｖｉｔｒｏで刺激した場合、ＤＢ－ＺＷ１、ＤＢ－ＺＷ１－ΔｍｓｂＢ、及びＤＢ－ＺＷ１－Δｌｐｐのいずれも、ＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化を有効に刺激することができないことが判明した（図１４）。マウス内皮下膀胱がんをＤＢ－ＺＷ１、ＤＢ－ＺＷ１－ΔｍｓｂＢ、及びＤＢ－ＺＷ１－Δｌｐｐをそれぞれ用いて更に処置し、そして血清内の様々な炎症性因子のレベルを検出した。ＤＢ－ＺＷ１処置群におけるＩＬ－１０の含有量は、その他の群における含有量よりも有意に高いことが判明し（図１５）、ＩＬ－１０は、ＤＢ－ＺＷ１による腫瘍の処置において重要な役割を演じている可能性があることが示唆される。
【0364】
ＤＢ－ＺＷ１により腫瘍を処置する際のサイトカインＩＬ－１０の役割を実証するために、抗ＩＬ－１０（ＢｉｏＸＣｅｌｌ社：＃ＢＥ００４９）、ＩＬ－１０の中和抗体、及びＤＢ－ＺＷ１を、ＭＢ４９誘発膀胱がんマウスを処置するのに使用した。処置から７日後、抗ＩＬ－１０抗体は、ＰＢＳコントロール群と比較して、腫瘍部位においてＤＢ－ＺＷ１誘発ＩＦＮγ＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の割合（％）が増加するのを有意に阻害した（図１６Ａ）。一方、腫瘍容積を測定することにより、ＤＢ－ＺＷ１は、ＰＢＳコントロール群と比較して腫瘍容積を有意に低下させたが、抗ＩＬ－１０抗体はＤＢ－ＺＷ１により誘発された腫瘍容積の低下を有意に阻害することが明らかとなった（図１６Ｂ）。
【0365】
１１．３ ＤＢ－ＺＷ１により誘発された一次マクロファージにおけるＩＬ－１０産生
マウス骨髄細胞のフローソーティングにより一次マクロファージを取得し、そしてｉｎ ｖｉｔｒｏで培養した一次マクロファージをＤＢ－ＺＷ１により刺激した。刺激後、すべてのＲＮＡをＴＲＩｚｏｌ試薬により抽出した。逆転写によりｃＤＮＡを取得した後、ＩＬ－１０の転写物レベルをｑＰＣＲにより検出し、標準曲線法を使用して遺伝子の相対的発現量を計算し、そしてＡｃｔｂの発現レベルに対して標準化した。ＤＢ－ＺＷ１は一次マクロファージ内でのＩＬ－１０発現を有意に誘発することが判明した（図１７）。
マウス骨髄細胞のフローソーティングにより一次マクロファージを取得し、そしてｉｎ ｖｉｔｒｏで培養した一次マクロファージをＤＢ－ＺＷ１により刺激した。刺激後、すべてのＲＮＡをＴＲＩｚｏｌ試薬により抽出した。逆転写によりｃＤＮＡを取得した後、ＩＬ－１０の転写物レベルをｑＰＣＲにより検出し、標準曲線法を使用して遺伝子の相対的発現量を計算し、そしてＡｃｔｂの発現レベルに対して標準化した。ＤＢ－ＺＷ１は一次マクロファージ内でのＩＬ－１０発現を有意に誘発することが判明した（図１７）。
【0366】
これらの結果は、ＤＢ－ＺＷ１により刺激を受けたマクロファージはＩＬ－１０を産生し、次に活性化されたＣＤ８＋Ｔ細胞が抗腫瘍効果を発揮することを示唆した。
【0367】
実施例１２：ＤＢ－ＺＷ１による腫瘍内免疫環境のリモデリング
ＤＢ－ＺＷ１注射を用いて処置されたＭＢ４９膀胱がんマウスに由来する腫瘍をサンプリングし、そして凍結切片化及び蛍光免疫染色に付した。腫瘍を採取した後、それらを４％パラホルムアルデヒド組織固定化溶液中に浸漬して５時間固定し、次に３０％スクロースに移して１２時間脱水した。次に、腫瘍をＯＣＴ包埋剤中に包埋し、そして－２０℃の冷蔵庫内で凍結した。凍結式ミクロトームを使用して凍結したサンプルを１０ｍｍの厚さで連続的に切片化し、そして－８０℃で保管した。アセトン内で１０分間固定した後、切片を風乾し、室温に戻した後、対応する抗体を用いて染色し、最終的にＤＡＰＩ含有抗蛍光封入剤を滴下して被覆した後、カバースリップで覆い、マニキュア液を用いて密封した。切片を観察し、そして蛍光顕微鏡下で写真撮影した。ほとんどのＤＢ－ＺＷ１は腫瘍切片の中央部に局在し、また好中球が凝集し、そしてＤＢ－ＺＷ１の周りにリングを形成することが判明した（図１８）。腫瘍内のＴ細胞及びマクロファージは、ＤＢ－ＺＷ１を用いて処置した後に、腫瘍内で無秩序に分布した状態から規則正しく外側から内側に向かって整列した状態に変化することも判明した（図１８）。また更に、好中球リング構造の形成は、ＴＭＥ内のＩＬ－１０のレベルと密接に関連し、好中球の明確なリング構造は対応する抗ＩＬ－１０抗体を使用すると完全に消滅し（図１９Ａ、図１９Ｂ）、また好中球及び残存するＤＢ－ＺＷ１細胞の空間的分布は均一であり、そしてＤＢ－ＺＷ１密度が有意に減少すると共に腫瘍切片全体を通じて重なり合うことが判明した。
ＤＢ－ＺＷ１注射を用いて処置されたＭＢ４９膀胱がんマウスに由来する腫瘍をサンプリングし、そして凍結切片化及び蛍光免疫染色に付した。腫瘍を採取した後、それらを４％パラホルムアルデヒド組織固定化溶液中に浸漬して５時間固定し、次に３０％スクロースに移して１２時間脱水した。次に、腫瘍をＯＣＴ包埋剤中に包埋し、そして－２０℃の冷蔵庫内で凍結した。凍結式ミクロトームを使用して凍結したサンプルを１０ｍｍの厚さで連続的に切片化し、そして－８０℃で保管した。アセトン内で１０分間固定した後、切片を風乾し、室温に戻した後、対応する抗体を用いて染色し、最終的にＤＡＰＩ含有抗蛍光封入剤を滴下して被覆した後、カバースリップで覆い、マニキュア液を用いて密封した。切片を観察し、そして蛍光顕微鏡下で写真撮影した。ほとんどのＤＢ－ＺＷ１は腫瘍切片の中央部に局在し、また好中球が凝集し、そしてＤＢ－ＺＷ１の周りにリングを形成することが判明した（図１８）。腫瘍内のＴ細胞及びマクロファージは、ＤＢ－ＺＷ１を用いて処置した後に、腫瘍内で無秩序に分布した状態から規則正しく外側から内側に向かって整列した状態に変化することも判明した（図１８）。また更に、好中球リング構造の形成は、ＴＭＥ内のＩＬ－１０のレベルと密接に関連し、好中球の明確なリング構造は対応する抗ＩＬ－１０抗体を使用すると完全に消滅し（図１９Ａ、図１９Ｂ）、また好中球及び残存するＤＢ－ＺＷ１細胞の空間的分布は均一であり、そしてＤＢ－ＺＷ１密度が有意に減少すると共に腫瘍切片全体を通じて重なり合うことが判明した。
【0368】
腫瘍浸潤性マクロファージを枯渇させるために、抗ＣＳＦ１Ｒ抗体（５０ｍｇ／ｋｇ、ＢｉｏＸＣｅｌｌ社、ＢＥ０２１３）を、細菌処置の３日前、及び実験のエンドポイントまで２～３日毎に尾静脈を介して注射すると、好中球のリング構造が消滅し（図１９Ｃ）、また腫瘍内のＤＢ－ＺＷ１密度も減少したことが判明した。これは、マクロファージは、好中球ファゴサイトーシスから細菌を保護することが可能であることを示唆した。これらの結果より、ＤＢ－ＺＷ１は腫瘍内免疫環境をリモデルすることができ、その場合、腫瘍の中心部に存在する細菌は好中球を引き付ける一方、細菌はマクロファージ内でＩＬ－１０産生を刺激することにより好中球から防御することが示唆される。ＩＬ－１０が除去されれば、好中球は腫瘍中心部に侵入して細菌を破壊してしまう。
【0369】
実施例１３：異なる投与方式及び投与用量を用いたときのＤＢ－ＺＷ１の抗腫瘍効果
現在のところ、臨床診療における一般的な投与経路として、皮下注射、静脈内注射、経口投与、及び局所適用が挙げられる。薬剤投与の経路は、様々な臨床状態に対する治療効果と密接に関係しており、また同一の薬物であっても、投与経路に応じて有意に異なる効果を有し得る。標的とする腫瘍内でのＤＢ－ＺＷ１の特異性を踏まえ、治療効果に対する腫瘍内注射及び静脈内注射の両者の効果について探索した。最初に、ＤＢ－ＺＷ１の投与経路及び用量を最適化した。図２０Ａに示すように、腫瘍内注射（ｉ．ｔ．）又は静脈内注射（ｉ．ｖ．）により１×１０７ＣＦＵのＤＢ－ＺＷ１を投与してから１４日後に、ＤＢ－ＺＷ１の腫瘍内分布は、すべてその他の正常組織内の分布よりも有意に高かった。静脈内注射投与群の抗腫瘍効果は、腫瘍内注射投与群のそれよりも優れた（図２０Ｂ）。
現在のところ、臨床診療における一般的な投与経路として、皮下注射、静脈内注射、経口投与、及び局所適用が挙げられる。薬剤投与の経路は、様々な臨床状態に対する治療効果と密接に関係しており、また同一の薬物であっても、投与経路に応じて有意に異なる効果を有し得る。標的とする腫瘍内でのＤＢ－ＺＷ１の特異性を踏まえ、治療効果に対する腫瘍内注射及び静脈内注射の両者の効果について探索した。最初に、ＤＢ－ＺＷ１の投与経路及び用量を最適化した。図２０Ａに示すように、腫瘍内注射（ｉ．ｔ．）又は静脈内注射（ｉ．ｖ．）により１×１０７ＣＦＵのＤＢ－ＺＷ１を投与してから１４日後に、ＤＢ－ＺＷ１の腫瘍内分布は、すべてその他の正常組織内の分布よりも有意に高かった。静脈内注射投与群の抗腫瘍効果は、腫瘍内注射投与群のそれよりも優れた（図２０Ｂ）。
【0370】
不活性化ＤＢ－ＺＷ１を用いた腫瘍処置も試みられ（図２１）、そして注射後１４日目に得られた腫瘍容積の結果より、不活性化ＤＢ－ＺＷ１でもしかるべき抗腫瘍効果（注射投薬量が増加するに従い改善した）を示すことが明らかとなった。
【0371】
皮下ＭＢ４９膀胱腫瘍担持マウスを対象とした治療効果に対するＤＢ－ＺＷ１の異なる投与用量の効果について更に探索した（図２２）。ＤＢ－ＺＷ１の静脈内注射後１４日目の結果より、ＤＢ－ＺＷ１の量が１×１０４ＣＦＵ未満のとき、治療効果は認められない一方、ＤＢ－ＺＷ１の量が１×１０５ＣＦＵ以上のとき、治療効果が現れ始め、１×１０６ＣＦＵのＤＢ－ＺＷ１を静脈内注射した際には、より顕著な効果が認められることが明らかとなった。
【0372】
上記結果は、ＤＢ－ＺＷ１の投与経路及び用量と治療効果との間に非常に緊密な関連性が存在することを示唆する。この結果は、ＤＢ－ＺＷ１を薬物として将来的に実用化するための技術的ガイダンスを提供する。
【0373】
配列リスト
配列番号１：ＰｓｓｅＡ－ｈｌｙＡ－ｌｏｘｐ－ＫｎａＲ－ｌｏｘｐ
TTCACAGAAAAGTGTTGCCCCCTTCCATGGCGGAAGGGGGACAAAGGTGAATTTGTCCTACTCAGGAGAGCGTTCACCGACAAACAACAGATAAAACGAAAGGCCCAGTCTTTCGACTGAGCCTTTCGTTTTATTTGATGCACTAGTGCCGATCATATTCAATAACCCTTAATATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATTAGGTCTGAAGAGGAGTTTACGTCCCATATGGAGTCCCGCTCAGAAGAACTCGTCAAGAAGGCGATAGAAGGCGATGCGCTGCGAATCGGGAGCGGCGATACCGTAAAGCACGAGGAAGCGGTCAGCCCATTCGCCGCCAAGCTCTTCAGCAATATCACGGGTAGCCAACGCTATGTCCTGATAGCGGTCCGCCACACCCAGCCGGCCACAGTCGATGAATCCAGAAAAGCGGCCATTTTCCACCATGATATTCGGCAAGCAGGCATCGCCATGGGTCACGACGAGATCCTCGCCGTCGGGCATGCGCGCCTTGAGCCTGGCGAACAGTTCGGCCGGCGCGAGCCCCTGATGCTCTTCGTCCAGATCATCCTGATCGACAAGACCGGCTTCCATCCGAGTACGTGCTCGCTCGATGCGATGTTTCGCTTGGTGGTCGAATGGGCAGGTAGCCGGATCAAGCGTATGCAGCCGCCGCATTGCATCAGCCATGATGGATACTTTCTCGGCAGGAGCAAGGTGAGATGACAGGAGATCCTGCCCCGGCACTTCGCCCAATAGCAGCCAGTCCCTTCCCGCTTCAGTGACAACGTCGAGCACAGCTGCGCAAGGAACGCCCGTCGTGGCCAGCCACGATAGCCGCGCTGCCTCGTCCTGCAGTTCATTCAGGGCACCGGACAGGTCGGTCTTGACAAAAAGAACCGGGCGCCCCTGCGCTGACAGCCGGAACACGGCGGCATCAGAGCAGCCGATTGTCTGTTGTGCCCAGTCATAGCCGAATAGCCTCTCCACCCAAGCGGCCGGAGAACCTGCGTGCAATCCATCTTGTTCAATCATGCGAAACGATCCTCATCCTGTCTCTTGATCAGATCCTGATCCCCTGCGCCATCAGATCCTTGGCGGCAAGAAAGCCATCCAGTTTACTTTGCAGGGCTTCCCAACCTTACCAGAGGGCGCCCCAGCTGGCAATTCCGACGTCATTGCGTTGCTAGCCAAGCTTAGGATCCGGAACCCTTAATATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATTAGGTCCCTCGAAGAGGTTCACTAGCTATCTAGAGCTTGGACTCCTGTTGATAGATCCAGTAATGACCTCAGAACTCCATCTGGATTTGTTCAGAACGCTCGGTTGCCGCCGGGCGTTTTTTATTGGTGAGAATCCAAGCCCGGGAAACGGGATCCTGATCTTGATCAGGCTGTGGGTCAGGCCACTCTTGGCATCGACACCAATGTGGGCCTTCATGCCAAAGTGCCACTGATTGCCTTTCTTGGTCTGATGCATCTCCGGATCGCGTTGCTGCTCTTTGTTCTTGGTCGAGCTGGGTGCCTCAATGATGGTGGCATCGACCAAGGTGCCTTGAGTCATCATGACGCCTGCTTCGGCCAGCCAGCGATTGATGGTCTTGAACAATTGGCGGGCCAGTTGATGCTGCTCCAGCAGGTGGCGGAAATTCATGATGGTGGTGCGGTCCGGCAAGGCGCTATCCAGGGATAACCGGGCAAACAGACGCATGGAGGCGATTTCGTACAGAGCATCTTCCATCGCGCCATCGCTCAGGTTGTACCAATGCTGCATGCAGTGAATGCGTAGCATGGTTTCCAGCGGATAAGGTCGCCGGCCATTACCAGCCTTGGGGTAAAACGGCTCGATGACTTCCACCATGTTTTGCCATGGCAGAATCTGCTCCATGCGGGACAAGAAAATCTCTTTTCTGGTCTGACGGCGCTTACTGCTGAATTCACTGTCGGCGAAGGTAAGTTGATGACTCATGATGAACCCTGTTCTATGGCTCCAGATGACAAACATGATCTCATATCAGGGACTTGTTCGCACCTTCCTTAGCACGTTAATTATCTATCGTGTATATGGAGGGGATCTAGAATGAAAAAAATAATGCTAGTTTTTATTACACTTATATTAGTTAGTCTACCAATTGCGCAACAAACTGAAGCAAAGGATGCATCTGCATTCAATAAAGAAAATTCAATTTCATCCATGGCACCACCAGCATCTCCGCCTGCAAGTCCTAAGACGCCAATCGAAAAGAAACACGCGGATGAAATCGATAAGTATATACAAGGATTGGACTACAATAAAAACAATGTATTAGTATACCACGGAGATGCAGTGACAAATGTGCCGCCAAGAAAAGGTTACAAAGATGGAAATGAATATATTGTTGTGGAGAAAAAGAAGAAATCCATCAATCAAAATAATGCAGACATTCAAGTTGTGAATGCAATTTCGAGCCTAACCTATCCAGGTGCTCTCGTAAAAGCGAATTCGGAATTAGTAGAAAATCAACCAGATGTTCTCCCTGTAAAACGTGATTCATTAACACTCAGCATTGATTTGCCAGGTATGACTAATCAAGACAATAAAATCGTTGTAAAAAATGCCACTAAATCAAACGTTAACAACGCAGTAAATACATTAGTGGAAAGATGGAATGAAAAATATGCTCAAGCTTATCCAAATGTAAGTGCAAAAATTGATTATGATGACGAAATGGCTTACAGTGAATCACAATTAATTGCGAAATTTGGTACAGCATTTAAAGCTGTAAATAATAGCTTGAATGTAAACTTCGGCGCAATCAGTGAAGGGAAAATGCAAGAAGAAGTCATTAGTTTTAAACAAATTTACTATAACGTGAATGTTAATGAACCTACAAGACCTTCCAGATTTTTCGGCAAAGCTGTTACTAAAGAGCAGTTGCAAGCGCTTGGAGTGAATGCAGAAAATCCTCCTGCATATATCTCAAGTGTGGCGTATGGCCGTCAAGTTTATTTGAAATTATCAACTAATTCCCATAGTACTAAAGTAAAAGCTGCTTTTGATGCTGCCGTAAGCGGAAAATCTGTCTCAGGTGATGTAGAACTAACAAATATCATCAAAAATTCTTCCTTCAAAGCCGTAATTTACGGAGGTTCCGCAAAAGATGAAGTTCAAATCATCGACGGCAACCTCGGAGACTTACGAGATATTTTGAAAAAAGGCGCTACTTTTAATCGAGAAACACCAGGAGTTCCCATTGCTTATACAACAAACTTCCTAAAAGACAATGAATTAGCTGTTATTAAAAACAACTCAGAATATATTGAAACAACTTCAAAAGCTTATACAGATGGAAAAATTAACATCGATCACTCTGGAGGATACGTTGCTCAATTCAACATTTCTTGGGATGAAGTAAATTATGATCCTGAAGGTAACGAAATTGTTCAACATAAAAACTGGAGCGAAAACAATAAAAGTAAGCTAGCTCATTTCACATCGTCCATCTATTTGCCAGGTAACGCGAGAAATATTAATGTTTACGCTAAAGAATGCACTGGTTTAGCTTGGGAATGGTGGAGAACGGTAATTGATGACCGGAACTTACCACTTGTGAAAAATAGAAATATCTCCATCTGGGGCACCACGCTTTATCCGAAATATAGTAATAAAGTAGATAATCCAATCGAATAAGTCGACCTCGAGGACTAGTGAACCTCTTCGAGGGACCTAATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTATATTAAGGGTTATTGAATATGATCGGCTCGAGATTACTTCGCATTGCAATCAGCTACGGACTCAAGCTTACGTCAGGTCATACGATGAAGGCGATAAGTCGCGTAAGTTGCTAGCCCACGCGGCTCACCTTCACGGGTGGGCCTTTCTTCGGTGTTTCAATCTCGATTAACAGGTAACGCAAAATTGCTGTGTACGTCAGA
配列番号１：ＰｓｓｅＡ－ｈｌｙＡ－ｌｏｘｐ－ＫｎａＲ－ｌｏｘｐ
TTCACAGAAAAGTGTTGCCCCCTTCCATGGCGGAAGGGGGACAAAGGTGAATTTGTCCTACTCAGGAGAGCGTTCACCGACAAACAACAGATAAAACGAAAGGCCCAGTCTTTCGACTGAGCCTTTCGTTTTATTTGATGCACTAGTGCCGATCATATTCAATAACCCTTAATATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATTAGGTCTGAAGAGGAGTTTACGTCCCATATGGAGTCCCGCTCAGAAGAACTCGTCAAGAAGGCGATAGAAGGCGATGCGCTGCGAATCGGGAGCGGCGATACCGTAAAGCACGAGGAAGCGGTCAGCCCATTCGCCGCCAAGCTCTTCAGCAATATCACGGGTAGCCAACGCTATGTCCTGATAGCGGTCCGCCACACCCAGCCGGCCACAGTCGATGAATCCAGAAAAGCGGCCATTTTCCACCATGATATTCGGCAAGCAGGCATCGCCATGGGTCACGACGAGATCCTCGCCGTCGGGCATGCGCGCCTTGAGCCTGGCGAACAGTTCGGCCGGCGCGAGCCCCTGATGCTCTTCGTCCAGATCATCCTGATCGACAAGACCGGCTTCCATCCGAGTACGTGCTCGCTCGATGCGATGTTTCGCTTGGTGGTCGAATGGGCAGGTAGCCGGATCAAGCGTATGCAGCCGCCGCATTGCATCAGCCATGATGGATACTTTCTCGGCAGGAGCAAGGTGAGATGACAGGAGATCCTGCCCCGGCACTTCGCCCAATAGCAGCCAGTCCCTTCCCGCTTCAGTGACAACGTCGAGCACAGCTGCGCAAGGAACGCCCGTCGTGGCCAGCCACGATAGCCGCGCTGCCTCGTCCTGCAGTTCATTCAGGGCACCGGACAGGTCGGTCTTGACAAAAAGAACCGGGCGCCCCTGCGCTGACAGCCGGAACACGGCGGCATCAGAGCAGCCGATTGTCTGTTGTGCCCAGTCATAGCCGAATAGCCTCTCCACCCAAGCGGCCGGAGAACCTGCGTGCAATCCATCTTGTTCAATCATGCGAAACGATCCTCATCCTGTCTCTTGATCAGATCCTGATCCCCTGCGCCATCAGATCCTTGGCGGCAAGAAAGCCATCCAGTTTACTTTGCAGGGCTTCCCAACCTTACCAGAGGGCGCCCCAGCTGGCAATTCCGACGTCATTGCGTTGCTAGCCAAGCTTAGGATCCGGAACCCTTAATATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATTAGGTCCCTCGAAGAGGTTCACTAGCTATCTAGAGCTTGGACTCCTGTTGATAGATCCAGTAATGACCTCAGAACTCCATCTGGATTTGTTCAGAACGCTCGGTTGCCGCCGGGCGTTTTTTATTGGTGAGAATCCAAGCCCGGGAAACGGGATCCTGATCTTGATCAGGCTGTGGGTCAGGCCACTCTTGGCATCGACACCAATGTGGGCCTTCATGCCAAAGTGCCACTGATTGCCTTTCTTGGTCTGATGCATCTCCGGATCGCGTTGCTGCTCTTTGTTCTTGGTCGAGCTGGGTGCCTCAATGATGGTGGCATCGACCAAGGTGCCTTGAGTCATCATGACGCCTGCTTCGGCCAGCCAGCGATTGATGGTCTTGAACAATTGGCGGGCCAGTTGATGCTGCTCCAGCAGGTGGCGGAAATTCATGATGGTGGTGCGGTCCGGCAAGGCGCTATCCAGGGATAACCGGGCAAACAGACGCATGGAGGCGATTTCGTACAGAGCATCTTCCATCGCGCCATCGCTCAGGTTGTACCAATGCTGCATGCAGTGAATGCGTAGCATGGTTTCCAGCGGATAAGGTCGCCGGCCATTACCAGCCTTGGGGTAAAACGGCTCGATGACTTCCACCATGTTTTGCCATGGCAGAATCTGCTCCATGCGGGACAAGAAAATCTCTTTTCTGGTCTGACGGCGCTTACTGCTGAATTCACTGTCGGCGAAGGTAAGTTGATGACTCATGATGAACCCTGTTCTATGGCTCCAGATGACAAACATGATCTCATATCAGGGACTTGTTCGCACCTTCCTTAGCACGTTAATTATCTATCGTGTATATGGAGGGGATCTAGAATGAAAAAAATAATGCTAGTTTTTATTACACTTATATTAGTTAGTCTACCAATTGCGCAACAAACTGAAGCAAAGGATGCATCTGCATTCAATAAAGAAAATTCAATTTCATCCATGGCACCACCAGCATCTCCGCCTGCAAGTCCTAAGACGCCAATCGAAAAGAAACACGCGGATGAAATCGATAAGTATATACAAGGATTGGACTACAATAAAAACAATGTATTAGTATACCACGGAGATGCAGTGACAAATGTGCCGCCAAGAAAAGGTTACAAAGATGGAAATGAATATATTGTTGTGGAGAAAAAGAAGAAATCCATCAATCAAAATAATGCAGACATTCAAGTTGTGAATGCAATTTCGAGCCTAACCTATCCAGGTGCTCTCGTAAAAGCGAATTCGGAATTAGTAGAAAATCAACCAGATGTTCTCCCTGTAAAACGTGATTCATTAACACTCAGCATTGATTTGCCAGGTATGACTAATCAAGACAATAAAATCGTTGTAAAAAATGCCACTAAATCAAACGTTAACAACGCAGTAAATACATTAGTGGAAAGATGGAATGAAAAATATGCTCAAGCTTATCCAAATGTAAGTGCAAAAATTGATTATGATGACGAAATGGCTTACAGTGAATCACAATTAATTGCGAAATTTGGTACAGCATTTAAAGCTGTAAATAATAGCTTGAATGTAAACTTCGGCGCAATCAGTGAAGGGAAAATGCAAGAAGAAGTCATTAGTTTTAAACAAATTTACTATAACGTGAATGTTAATGAACCTACAAGACCTTCCAGATTTTTCGGCAAAGCTGTTACTAAAGAGCAGTTGCAAGCGCTTGGAGTGAATGCAGAAAATCCTCCTGCATATATCTCAAGTGTGGCGTATGGCCGTCAAGTTTATTTGAAATTATCAACTAATTCCCATAGTACTAAAGTAAAAGCTGCTTTTGATGCTGCCGTAAGCGGAAAATCTGTCTCAGGTGATGTAGAACTAACAAATATCATCAAAAATTCTTCCTTCAAAGCCGTAATTTACGGAGGTTCCGCAAAAGATGAAGTTCAAATCATCGACGGCAACCTCGGAGACTTACGAGATATTTTGAAAAAAGGCGCTACTTTTAATCGAGAAACACCAGGAGTTCCCATTGCTTATACAACAAACTTCCTAAAAGACAATGAATTAGCTGTTATTAAAAACAACTCAGAATATATTGAAACAACTTCAAAAGCTTATACAGATGGAAAAATTAACATCGATCACTCTGGAGGATACGTTGCTCAATTCAACATTTCTTGGGATGAAGTAAATTATGATCCTGAAGGTAACGAAATTGTTCAACATAAAAACTGGAGCGAAAACAATAAAAGTAAGCTAGCTCATTTCACATCGTCCATCTATTTGCCAGGTAACGCGAGAAATATTAATGTTTACGCTAAAGAATGCACTGGTTTAGCTTGGGAATGGTGGAGAACGGTAATTGATGACCGGAACTTACCACTTGTGAAAAATAGAAATATCTCCATCTGGGGCACCACGCTTTATCCGAAATATAGTAATAAAGTAGATAATCCAATCGAATAAGTCGACCTCGAGGACTAGTGAACCTCTTCGAGGGACCTAATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTATATTAAGGGTTATTGAATATGATCGGCTCGAGATTACTTCGCATTGCAATCAGCTACGGACTCAAGCTTACGTCAGGTCATACGATGAAGGCGATAAGTCGCGTAAGTTGCTAGCCCACGCGGCTCACCTTCACGGGTGGGCCTTTCTTCGGTGTTTCAATCTCGATTAACAGGTAACGCAAAATTGCTGTGTACGTCAGA
【0374】
配列番号２：Ｐｓｓｂｐ１－ｄａｐＥ－Ｃｍ
TTGGTTTCAGTGAATCCCGTTATCAGCAGTTTTTTGATGAGGTGTAGTCTATTTGTCCTACTCAGGAGAGCGTTCACCGACAAACAACAGATAAAACGAAAGGCCCAGTCTTTCGACTGAGCCTTTCGTTTTATTTGATGCACTAGTGCCGATCATATTCAATAACCCTTAATATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATTAGGTCTGAAGAGGAGTTTACGTCCCATATGGAGTCCCGCTTACGCCCCGCCCTGCCACTCATCGCAGTACTGTTGTAATTCATTAAGCATTCTGCCGACATGGAAGCCATCACAGACGGCATGATGAACCTGAATCGCCAGCGGCATCAGCACCTTGTCGCCTTGCGTATAATATTTGCCCATGGTGAAAACGGGGGCGAAGAAGTTGTCCATATTGGCCACGTTTAAATCAAAACTGGTGAAACTCACCCAGGGATTGGCTGAGACGAAAAACATATTCTCAATAAACCCTTTAGGGAAATAGGCCAGGTTTTCACCGTAACACGCCACATCTTGCGAATATATGTGTAGAAACTGCCGGAAATCGTCGTGGTATTCACTCCAGAGCGATGAAAACGTTTCAGTTTGCTCATGGAAAACGGTGTAACAAGGGTGAACACTATCCCATATCACCAGCTCACCGTCTTTCATTGCCATACGAAATTCCGGATGAGCATTCATCAGGCGGGCAAGAATGTGAATAAAGGCCGGATAAAACTTGTGCTTATTTTTCTTTACGGTCTTTAAAAAGGCCGTAATATCCAGCTGAACGGTCTGGTTATAGGTACATTGAGCAACTGACTGAAATGCCTCAAAATGTTCTTTACGATGCCATTGGGATATATCAACGGTGGTATATCCAGTGATTTTTTTCTCCATGCGAAACGATCCTCATCCTGTCTCTTGATCAGATCCTGATCCCCTGCGCCATCAGATCCTTGGCGGCAAGAAAGCCATCCAGTTTACTTTGCAGGGCTTCCCAACCTTACCAGAGGGCGCCCCAGCTGGCAATTCCGACGTCATTGCGTTGCTAGCCAAGCTTAGGATCCGGAACCCTTAATATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATTAGGTCCCTCGAAGAGGTTCACTAGCTATCTAGAGCTTGGACTCCTGTTGATAGATCCAGTAATGACCTCAGAACTCCATCTGGATTTGTTCAGAACGCTCGGTTGCCGCCGGGCGTTTTTTATTGGTGAGAATCCAAGCCCGGGAAACGGGATCCTGATCTTGATCAACCGAGGTCACAACATAGTAAAAGCGCTATTGGTAATGGTACAATCGCGCGTTTACACTTATTCAGAACGATTTTTTTCAGGAGGGCCTACTTGTCACACAGGACGGTAATGTCGTGCCCGGTTATTGAGCTGACACAGCAACTTATTCGTCGCCCCTCCCTGAGTCCGGATGACGCAGGCTGTCAGGCATTAATGATTGAACGCCTGCGTAAAATCGGTTTTACCATTGAGCATATGGATTTTGGCGACACGCAAAATTTTTGGGCATGGCGTGGGCGTGGCGAAACGCTGGCGTTCGCCGGGCATACTGACGTCGTACCGGCTGGCGATGTCGATCGCTGGATCAATCCGCCGTTTGAGCCTACGATTCGCGACGGAATGTTGTTCGGTCGCGGCGCGGCGGATATGAAAGGTTCACTGGCGGCCATGGTGGTGGCTGCTGAACGTTTTGTTGCGCAGCATCCTCATCACCGGGGCCGCCTCGCATTTTTGATTACCTCTGATGAGGAAGCCAGCGCAAAAAATGGCACCGTAAAGGTGGTTGAAGCGCTGATGGCCCGTAACGAGCGGCTGGATTACTGTCTGGTCGGCGAACCTTCCAGTACTGAAATTGTGGGCGATGTCGTCAAAAACGGGCGTCGCGGTTCTCTCACCTGTAACCTCACTATCCATGGCGTTCAGGGGCACGTCGCCTATCCGCATCTGGCGGATAACCCTGTTCATCGCGCCGCGCCTTTTCTTAATGAACTGGTCGCTATCGAGTGGGATCGGGGCAATGACTTTTTCCCGGCCACCAGTATGCAGGTAGCCAATATCCAGGCAGGCACCGGCAGCAATAATGTCATTCCCGGCGAACTGTTCGTGCAGTTTAACTTCCGTTTCAGCACGGAACTGACCGATGAGATGATCAAAGAGCGGGTACATGCGCTGCTTGAAAAGCATCAGCTACGCTATACCGTAGACTGGTGGCTTTCCGGGCAGCCGTTCCTGACCGCACGCGGCAAGCTGGTGGACGCGGTGGTAAACGCCATTGAGCACTATAATGAAATTAAACCGCAATTACTGACGACGGGCGGTACGTCCGACGGACGTTTTATCGCCCGTATGGGAGCGCAGGTGGTAGAACTGGGGCCGGTGAACGCCACCATTCATAAAATTAATGAATGTGTGAATGCCGCCGATCTCCAGCTACTGGCCCGTATGTATCAACGCATTATGGAACAGCTCGTCGCCCATCACCATCACCATCACTAAGATTACTTCGCATTGCAATCAGCTACGGACTCAAGCTTACGTCAGGTCATACGATGAAGGCGATAAGTCGCGTAAGTTGCTAGCCCACGCGGCTCACCTTCACGGGTGGGCCTTTCTTCGTGAGCGTTCCGGTAAGAGGAAATAAGCATGGACTGGCTGGCAAAATATTG
TTGGTTTCAGTGAATCCCGTTATCAGCAGTTTTTTGATGAGGTGTAGTCTATTTGTCCTACTCAGGAGAGCGTTCACCGACAAACAACAGATAAAACGAAAGGCCCAGTCTTTCGACTGAGCCTTTCGTTTTATTTGATGCACTAGTGCCGATCATATTCAATAACCCTTAATATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATTAGGTCTGAAGAGGAGTTTACGTCCCATATGGAGTCCCGCTTACGCCCCGCCCTGCCACTCATCGCAGTACTGTTGTAATTCATTAAGCATTCTGCCGACATGGAAGCCATCACAGACGGCATGATGAACCTGAATCGCCAGCGGCATCAGCACCTTGTCGCCTTGCGTATAATATTTGCCCATGGTGAAAACGGGGGCGAAGAAGTTGTCCATATTGGCCACGTTTAAATCAAAACTGGTGAAACTCACCCAGGGATTGGCTGAGACGAAAAACATATTCTCAATAAACCCTTTAGGGAAATAGGCCAGGTTTTCACCGTAACACGCCACATCTTGCGAATATATGTGTAGAAACTGCCGGAAATCGTCGTGGTATTCACTCCAGAGCGATGAAAACGTTTCAGTTTGCTCATGGAAAACGGTGTAACAAGGGTGAACACTATCCCATATCACCAGCTCACCGTCTTTCATTGCCATACGAAATTCCGGATGAGCATTCATCAGGCGGGCAAGAATGTGAATAAAGGCCGGATAAAACTTGTGCTTATTTTTCTTTACGGTCTTTAAAAAGGCCGTAATATCCAGCTGAACGGTCTGGTTATAGGTACATTGAGCAACTGACTGAAATGCCTCAAAATGTTCTTTACGATGCCATTGGGATATATCAACGGTGGTATATCCAGTGATTTTTTTCTCCATGCGAAACGATCCTCATCCTGTCTCTTGATCAGATCCTGATCCCCTGCGCCATCAGATCCTTGGCGGCAAGAAAGCCATCCAGTTTACTTTGCAGGGCTTCCCAACCTTACCAGAGGGCGCCCCAGCTGGCAATTCCGACGTCATTGCGTTGCTAGCCAAGCTTAGGATCCGGAACCCTTAATATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATTAGGTCCCTCGAAGAGGTTCACTAGCTATCTAGAGCTTGGACTCCTGTTGATAGATCCAGTAATGACCTCAGAACTCCATCTGGATTTGTTCAGAACGCTCGGTTGCCGCCGGGCGTTTTTTATTGGTGAGAATCCAAGCCCGGGAAACGGGATCCTGATCTTGATCAACCGAGGTCACAACATAGTAAAAGCGCTATTGGTAATGGTACAATCGCGCGTTTACACTTATTCAGAACGATTTTTTTCAGGAGGGCCTACTTGTCACACAGGACGGTAATGTCGTGCCCGGTTATTGAGCTGACACAGCAACTTATTCGTCGCCCCTCCCTGAGTCCGGATGACGCAGGCTGTCAGGCATTAATGATTGAACGCCTGCGTAAAATCGGTTTTACCATTGAGCATATGGATTTTGGCGACACGCAAAATTTTTGGGCATGGCGTGGGCGTGGCGAAACGCTGGCGTTCGCCGGGCATACTGACGTCGTACCGGCTGGCGATGTCGATCGCTGGATCAATCCGCCGTTTGAGCCTACGATTCGCGACGGAATGTTGTTCGGTCGCGGCGCGGCGGATATGAAAGGTTCACTGGCGGCCATGGTGGTGGCTGCTGAACGTTTTGTTGCGCAGCATCCTCATCACCGGGGCCGCCTCGCATTTTTGATTACCTCTGATGAGGAAGCCAGCGCAAAAAATGGCACCGTAAAGGTGGTTGAAGCGCTGATGGCCCGTAACGAGCGGCTGGATTACTGTCTGGTCGGCGAACCTTCCAGTACTGAAATTGTGGGCGATGTCGTCAAAAACGGGCGTCGCGGTTCTCTCACCTGTAACCTCACTATCCATGGCGTTCAGGGGCACGTCGCCTATCCGCATCTGGCGGATAACCCTGTTCATCGCGCCGCGCCTTTTCTTAATGAACTGGTCGCTATCGAGTGGGATCGGGGCAATGACTTTTTCCCGGCCACCAGTATGCAGGTAGCCAATATCCAGGCAGGCACCGGCAGCAATAATGTCATTCCCGGCGAACTGTTCGTGCAGTTTAACTTCCGTTTCAGCACGGAACTGACCGATGAGATGATCAAAGAGCGGGTACATGCGCTGCTTGAAAAGCATCAGCTACGCTATACCGTAGACTGGTGGCTTTCCGGGCAGCCGTTCCTGACCGCACGCGGCAAGCTGGTGGACGCGGTGGTAAACGCCATTGAGCACTATAATGAAATTAAACCGCAATTACTGACGACGGGCGGTACGTCCGACGGACGTTTTATCGCCCGTATGGGAGCGCAGGTGGTAGAACTGGGGCCGGTGAACGCCACCATTCATAAAATTAATGAATGTGTGAATGCCGCCGATCTCCAGCTACTGGCCCGTATGTATCAACGCATTATGGAACAGCTCGTCGCCCATCACCATCACCATCACTAAGATTACTTCGCATTGCAATCAGCTACGGACTCAAGCTTACGTCAGGTCATACGATGAAGGCGATAAGTCGCGTAAGTTGCTAGCCCACGCGGCTCACCTTCACGGGTGGGCCTTTCTTCGTGAGCGTTCCGGTAAGAGGAAATAAGCATGGACTGGCTGGCAAAATATTG
【0375】
配列番号３：ｌｏｘｐ－ｋｎａｒ－ｌｏｘｐ
TTATTCGATTGGATTATCTACTTTATTACTATATTTCGGATAAAGCGTGGCTAGTGAACCTCTTCGAGGGACCTAATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTATATTAAGGGTTCCGGATCCTAAGCTTGGCTAGCAACGCAATGACGTCGGAATTGCCAGCTGGGGCGCCCTCTGGTAAGGTTGGGAAGCCCTGCAAAGTAAACTGGATGGCTTTCTTGCCGCCAAGGATCTGATGGCGCAGGGGATCAGGATCTGATCAAGAGACAGGATGAGGATCGTTTCGCATGATTGAACAAGATGGATTGCACGCAGGTTCTCCGGCCGCTTGGGTGGAGAGGCTATTCGGCTATGACTGGGCACAACAGACAATCGGCTGCTCTGATGCCGCCGTGTTCCGGCTGTCAGCGCAGGGGCGCCCGGTTCTTTTTGTCAAGACCGACCTGTCCGGTGCCCTGAATGAACTGCAGGACGAGGCAGCGCGGCTATCGTGGCTGGCCACGACGGGCGTTCCTTGCGCAGCTGTGCTCGACGTTGTCACTGAAGCGGGAAGGGACTGGCTGCTATTGGGCGAAGTGCCGGGGCAGGATCTCCTGTCATCTCACCTTGCTCCTGCCGAGAAAGTATCCATCATGGCTGATGCAATGCGGCGGCTGCATACGCTTGATCCGGCTACCTGCCCATTCGACCACCAAGCGAAACATCGCATCGAGCGAGCACGTACTCGGATGGAAGCCGGTCTTGTCGATCAGGATGATCTGGACGAAGAGCATCAGGGGCTCGCGCCGGCCGAACTGTTCGCCAGGCTCAAGGCGCGCATGCCCGACGGCGAGGATCTCGTCGTGACCCATGGCGATGCCTGCTTGCCGAATATCATGGTGGAAAATGGCCGCTTTTCTGGATTCATCGACTGTGGCCGGCTGGGTGTGGCGGACCGCTATCAGGACATAGCGTTGGCTACCCGTGATATTGCTGAAGAGCTTGGCGGCGAATGGGCTGACCGCTTCCTCGTGCTTTACGGTATCGCCGCTCCCGATTCGCAGCGCATCGCCTTCTATCGCCTTCTTGACGAGTTCTTCTGAGCGGGACTCCATATGGGACGTAAACTCCTCTTCAGACCTAATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTATATTAAGGGTTATTGAATATGATCGGCGGTAGACTAACTAATATAAGTGTAATAAAAACTAGCATTATTTTTTTCAT
TTATTCGATTGGATTATCTACTTTATTACTATATTTCGGATAAAGCGTGGCTAGTGAACCTCTTCGAGGGACCTAATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTATATTAAGGGTTCCGGATCCTAAGCTTGGCTAGCAACGCAATGACGTCGGAATTGCCAGCTGGGGCGCCCTCTGGTAAGGTTGGGAAGCCCTGCAAAGTAAACTGGATGGCTTTCTTGCCGCCAAGGATCTGATGGCGCAGGGGATCAGGATCTGATCAAGAGACAGGATGAGGATCGTTTCGCATGATTGAACAAGATGGATTGCACGCAGGTTCTCCGGCCGCTTGGGTGGAGAGGCTATTCGGCTATGACTGGGCACAACAGACAATCGGCTGCTCTGATGCCGCCGTGTTCCGGCTGTCAGCGCAGGGGCGCCCGGTTCTTTTTGTCAAGACCGACCTGTCCGGTGCCCTGAATGAACTGCAGGACGAGGCAGCGCGGCTATCGTGGCTGGCCACGACGGGCGTTCCTTGCGCAGCTGTGCTCGACGTTGTCACTGAAGCGGGAAGGGACTGGCTGCTATTGGGCGAAGTGCCGGGGCAGGATCTCCTGTCATCTCACCTTGCTCCTGCCGAGAAAGTATCCATCATGGCTGATGCAATGCGGCGGCTGCATACGCTTGATCCGGCTACCTGCCCATTCGACCACCAAGCGAAACATCGCATCGAGCGAGCACGTACTCGGATGGAAGCCGGTCTTGTCGATCAGGATGATCTGGACGAAGAGCATCAGGGGCTCGCGCCGGCCGAACTGTTCGCCAGGCTCAAGGCGCGCATGCCCGACGGCGAGGATCTCGTCGTGACCCATGGCGATGCCTGCTTGCCGAATATCATGGTGGAAAATGGCCGCTTTTCTGGATTCATCGACTGTGGCCGGCTGGGTGTGGCGGACCGCTATCAGGACATAGCGTTGGCTACCCGTGATATTGCTGAAGAGCTTGGCGGCGAATGGGCTGACCGCTTCCTCGTGCTTTACGGTATCGCCGCTCCCGATTCGCAGCGCATCGCCTTCTATCGCCTTCTTGACGAGTTCTTCTGAGCGGGACTCCATATGGGACGTAAACTCCTCTTCAGACCTAATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTATATTAAGGGTTATTGAATATGATCGGCGGTAGACTAACTAATATAAGTGTAATAAAAACTAGCATTATTTTTTTCAT
【0376】
配列番号４：ＰｄａｐＥ－ｄａｐＥ－ｌｏｘｐ－ＫｎａＲ－ｌｏｘｐ
CAATATTTTGCCAGCCAGTCCATGCTTATTTCCTCTTACCGGAACGCTCAATTTGTCCTACTCAGGAGAGCGTTCACCGACAAACAACAGATAAAACGAAAGGCCCAGTCTTTCGACTGAGCCTTTCGTTTTATTTGATGCACTAGTGCCGATCATATTCAATAACCCTTAATATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATTAGGTCTGAAGAGGAGTTTACGTCCCATATGGAGTCCCGCTCAGAAGAACTCGTCAAGAAGGCGATAGAAGGCGATGCGCTGCGAATCGGGAGCGGCGATACCGTAAAGCACGAGGAAGCGGTCAGCCCATTCGCCGCCAAGCTCTTCAGCAATATCACGGGTAGCCAACGCTATGTCCTGATAGCGGTCCGCCACACCCAGCCGGCCACAGTCGATGAATCCAGAAAAGCGGCCATTTTCCACCATGATATTCGGCAAGCAGGCATCGCCATGGGTCACGACGAGATCCTCGCCGTCGGGCATGCGCGCCTTGAGCCTGGCGAACAGTTCGGCCGGCGCGAGCCCCTGATGCTCTTCGTCCAGATCATCCTGATCGACAAGACCGGCTTCCATCCGAGTACGTGCTCGCTCGATGCGATGTTTCGCTTGGTGGTCGAATGGGCAGGTAGCCGGATCAAGCGTATGCAGCCGCCGCATTGCATCAGCCATGATGGATACTTTCTCGGCAGGAGCAAGGTGAGATGACAGGAGATCCTGCCCCGGCACTTCGCCCAATAGCAGCCAGTCCCTTCCCGCTTCAGTGACAACGTCGAGCACAGCTGCGCAAGGAACGCCCGTCGTGGCCAGCCACGATAGCCGCGCTGCCTCGTCCTGCAGTTCATTCAGGGCACCGGACAGGTCGGTCTTGACAAAAAGAACCGGGCGCCCCTGCGCTGACAGCCGGAACACGGCGGCATCAGAGCAGCCGATTGTCTGTTGTGCCCAGTCATAGCCGAATAGCCTCTCCACCCAAGCGGCCGGAGAACCTGCGTGCAATCCATCTTGTTCAATCATGCGAAACGATCCTCATCCTGTCTCTTGATCAGATCCTGATCCCCTGCGCCATCAGATCCTTGGCGGCAAGAAAGCCATCCAGTTTACTTTGCAGGGCTTCCCAACCTTACCAGAGGGCGCCCCAGCTGGCAATTCCGACGTCATTGCGTTGCTAGCCAAGCTTAGGATCCGGAACCCTTAATATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATTAGGTCCCTCGAAGAGGTTCACTAGCTATCTAGAGCTTGGACTCCTGTTGATAGATCCAGTAATGACCTCAGAACTCCATCTGGATTTGTTCAGAACGCTCGGTTGCCGCCGGGCGTTTTTTATTGGTGAGAATCCAAGCCCGGGAAACGGGATCCTGATCTTGATCAGGAACATGGCATTGATTATCGTTTTCACGATTACCGTGTGGATGGCATAGACCTCCCTCTTCTTAATACCTTTATTGCCGAACTCGGCTGGCAGCCTTTACTGAATACGCGCGGCACAACATGGCGCAAACTGGATGAAGGCCACCGCAGCGGGATTACCGATGCCGACTCCGCCGCTGCTCTCATGGTTGAACAGCCGGCAATCATCAAACGCCCATTGCTCTGCGCGCCCGGGAAGCCTATGCTGCTTGGTTTCAGTGAATCCCGTTATCAGCAGTTTTTTGATGAGGTGTAGTCTGGCCTACTTGTCACACAGGACGGTAATGTCGTGCCCGGTTATTGAGCTGACACAGCAACTTATTCGTCGCCCCTCCCTGAGTCCGGATGACGCAGGCTGTCAGGCATTAATGATTGAACGCCTGCGTAAAATCGGTTTTACCATTGAGCATATGGATTTTGGCGACACGCAAAATTTTTGGGCATGGCGTGGGCGTGGCGAAACGCTGGCGTTCGCCGGGCATACTGACGTCGTACCGGCTGGCGATGTCGATCGCTGGATCAATCCGCCGTTTGAGCCTACGATTCGCGACGGAATGTTGTTCGGTCGCGGCGCGGCGGATATGAAAGGTTCACTGGCGGCCATGGTGGTGGCTGCTGAACGTTTTGTTGCGCAGCATCCTCATCACCGGGGCCGCCTCGCATTTTTGATTACCTCTGATGAGGAAGCCAGCGCAAAAAATGGCACCGTAAAGGTGGTTGAAGCGCTGATGGCCCGTAACGAGCGGCTGGATTACTGTCTGGTCGGCGAACCTTCCAGTACTGAAATTGTGGGCGATGTCGTCAAAAACGGGCGTCGCGGTTCTCTCACCTGTAACCTCACTATCCATGGCGTTCAGGGGCACGTCGCCTATCCGCATCTGGCGGATAACCCTGTTCATCGCGCCGCGCCTTTTCTTAATGAACTGGTCGCTATCGAGTGGGATCGGGGCAATGACTTTTTCCCGGCCACCAGTATGCAGGTAGCCAATATCCAGGCAGGCACCGGCAGCAATAATGTCATTCCCGGCGAACTGTTCGTGCAGTTTAACTTCCGTTTCAGCACGGAACTGACCGATGAGATGATCAAAGAGCGGGTACATGCGCTGCTTGAAAAGCATCAGCTACGCTATACCGTAGACTGGTGGCTTTCCGGGCAGCCGTTCCTGACCGCACGCGGCAAGCTGGTGGACGCGGTGGTAAACGCCATTGAGCACTATAATGAAATTAAACCGCAATTACTGACGACGGGCGGTACGTCCGACGGACGTTTTATCGCCCGTATGGGAGCGCAGGTGGTAGAACTGGGGCCGGTGAACGCCACCATTCATAAAATTAATGAATGTGTGAATGCCGCCGATCTCCAGCTACTGGCCCGTATGTATCAACGCATTATGGAACAGCTCGTCGCCCATCACCATCACCATCACTAAGATTACTTCGCATTGCAATCAGCTACGGACTCAAGCTTACGTCAGGTCATACGATGAAGGCGATAAGTCGCGTAAGTTGCTAGCCCACGCGGCTCACCTTCACGGGTGGGCCTTTCTTCGAGACTACACCTCATCAAAAAACTGCTGATAACGGGATTCACTGAAACCAA
CAATATTTTGCCAGCCAGTCCATGCTTATTTCCTCTTACCGGAACGCTCAATTTGTCCTACTCAGGAGAGCGTTCACCGACAAACAACAGATAAAACGAAAGGCCCAGTCTTTCGACTGAGCCTTTCGTTTTATTTGATGCACTAGTGCCGATCATATTCAATAACCCTTAATATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATTAGGTCTGAAGAGGAGTTTACGTCCCATATGGAGTCCCGCTCAGAAGAACTCGTCAAGAAGGCGATAGAAGGCGATGCGCTGCGAATCGGGAGCGGCGATACCGTAAAGCACGAGGAAGCGGTCAGCCCATTCGCCGCCAAGCTCTTCAGCAATATCACGGGTAGCCAACGCTATGTCCTGATAGCGGTCCGCCACACCCAGCCGGCCACAGTCGATGAATCCAGAAAAGCGGCCATTTTCCACCATGATATTCGGCAAGCAGGCATCGCCATGGGTCACGACGAGATCCTCGCCGTCGGGCATGCGCGCCTTGAGCCTGGCGAACAGTTCGGCCGGCGCGAGCCCCTGATGCTCTTCGTCCAGATCATCCTGATCGACAAGACCGGCTTCCATCCGAGTACGTGCTCGCTCGATGCGATGTTTCGCTTGGTGGTCGAATGGGCAGGTAGCCGGATCAAGCGTATGCAGCCGCCGCATTGCATCAGCCATGATGGATACTTTCTCGGCAGGAGCAAGGTGAGATGACAGGAGATCCTGCCCCGGCACTTCGCCCAATAGCAGCCAGTCCCTTCCCGCTTCAGTGACAACGTCGAGCACAGCTGCGCAAGGAACGCCCGTCGTGGCCAGCCACGATAGCCGCGCTGCCTCGTCCTGCAGTTCATTCAGGGCACCGGACAGGTCGGTCTTGACAAAAAGAACCGGGCGCCCCTGCGCTGACAGCCGGAACACGGCGGCATCAGAGCAGCCGATTGTCTGTTGTGCCCAGTCATAGCCGAATAGCCTCTCCACCCAAGCGGCCGGAGAACCTGCGTGCAATCCATCTTGTTCAATCATGCGAAACGATCCTCATCCTGTCTCTTGATCAGATCCTGATCCCCTGCGCCATCAGATCCTTGGCGGCAAGAAAGCCATCCAGTTTACTTTGCAGGGCTTCCCAACCTTACCAGAGGGCGCCCCAGCTGGCAATTCCGACGTCATTGCGTTGCTAGCCAAGCTTAGGATCCGGAACCCTTAATATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATTAGGTCCCTCGAAGAGGTTCACTAGCTATCTAGAGCTTGGACTCCTGTTGATAGATCCAGTAATGACCTCAGAACTCCATCTGGATTTGTTCAGAACGCTCGGTTGCCGCCGGGCGTTTTTTATTGGTGAGAATCCAAGCCCGGGAAACGGGATCCTGATCTTGATCAGGAACATGGCATTGATTATCGTTTTCACGATTACCGTGTGGATGGCATAGACCTCCCTCTTCTTAATACCTTTATTGCCGAACTCGGCTGGCAGCCTTTACTGAATACGCGCGGCACAACATGGCGCAAACTGGATGAAGGCCACCGCAGCGGGATTACCGATGCCGACTCCGCCGCTGCTCTCATGGTTGAACAGCCGGCAATCATCAAACGCCCATTGCTCTGCGCGCCCGGGAAGCCTATGCTGCTTGGTTTCAGTGAATCCCGTTATCAGCAGTTTTTTGATGAGGTGTAGTCTGGCCTACTTGTCACACAGGACGGTAATGTCGTGCCCGGTTATTGAGCTGACACAGCAACTTATTCGTCGCCCCTCCCTGAGTCCGGATGACGCAGGCTGTCAGGCATTAATGATTGAACGCCTGCGTAAAATCGGTTTTACCATTGAGCATATGGATTTTGGCGACACGCAAAATTTTTGGGCATGGCGTGGGCGTGGCGAAACGCTGGCGTTCGCCGGGCATACTGACGTCGTACCGGCTGGCGATGTCGATCGCTGGATCAATCCGCCGTTTGAGCCTACGATTCGCGACGGAATGTTGTTCGGTCGCGGCGCGGCGGATATGAAAGGTTCACTGGCGGCCATGGTGGTGGCTGCTGAACGTTTTGTTGCGCAGCATCCTCATCACCGGGGCCGCCTCGCATTTTTGATTACCTCTGATGAGGAAGCCAGCGCAAAAAATGGCACCGTAAAGGTGGTTGAAGCGCTGATGGCCCGTAACGAGCGGCTGGATTACTGTCTGGTCGGCGAACCTTCCAGTACTGAAATTGTGGGCGATGTCGTCAAAAACGGGCGTCGCGGTTCTCTCACCTGTAACCTCACTATCCATGGCGTTCAGGGGCACGTCGCCTATCCGCATCTGGCGGATAACCCTGTTCATCGCGCCGCGCCTTTTCTTAATGAACTGGTCGCTATCGAGTGGGATCGGGGCAATGACTTTTTCCCGGCCACCAGTATGCAGGTAGCCAATATCCAGGCAGGCACCGGCAGCAATAATGTCATTCCCGGCGAACTGTTCGTGCAGTTTAACTTCCGTTTCAGCACGGAACTGACCGATGAGATGATCAAAGAGCGGGTACATGCGCTGCTTGAAAAGCATCAGCTACGCTATACCGTAGACTGGTGGCTTTCCGGGCAGCCGTTCCTGACCGCACGCGGCAAGCTGGTGGACGCGGTGGTAAACGCCATTGAGCACTATAATGAAATTAAACCGCAATTACTGACGACGGGCGGTACGTCCGACGGACGTTTTATCGCCCGTATGGGAGCGCAGGTGGTAGAACTGGGGCCGGTGAACGCCACCATTCATAAAATTAATGAATGTGTGAATGCCGCCGATCTCCAGCTACTGGCCCGTATGTATCAACGCATTATGGAACAGCTCGTCGCCCATCACCATCACCATCACTAAGATTACTTCGCATTGCAATCAGCTACGGACTCAAGCTTACGTCAGGTCATACGATGAAGGCGATAAGTCGCGTAAGTTGCTAGCCCACGCGGCTCACCTTCACGGGTGGGCCTTTCTTCGAGACTACACCTCATCAAAAAACTGCTGATAACGGGATTCACTGAAACCAA
【0377】
配列番号５：ＰｈｔｒＡ－ｈｔｒＡ－ｌｏｘｐ－ａａｄＡ－ｌｏｘｐ
GATAATGTATTCACAGGTTGCTCCGGGCTTGAAAAAGTTAAATGACATCCATTTGTCCTACTCAGGAGAGCGTTCACCGACAAACAACAGATAAAACGAAAGGCCCAGTCTTTCGACTGAGCCTTTCGTTTTATTTGATGCACTAGTGCCGATCATATTCAATAACCCTTAATATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATTAGGTCTGAAGAGGAGTTTACGTCCCATATGGAGTCCCGCCTTATTTGCCGACTACCTTGGTGATCTCGCCTTTCACGTAGTGGACAAATTCTTCCAACTGATCTGCGCGCGAGGCCAAGCGATCTTCTTCTTGTCCAAGATAAGCCTGTCTAGCTTCAAGTATGACGGGCTGATACTGGGCCGGCAGGCGCTCCATTGCCCAGTCGGCAGCGACATCCTTCGGCGCGATTTTGCCGGTTACTGCGCTGTACCAAATGCGGGACAACGTAAGCACTACATTTCGCTCATCGCCAGCCCAGTCGGGCGGCGAGTTCCATAGCGTTAAGGTTTCATTTAGCGCCTCAAATAGATCCTGTTCAGGAACCGGATCAAAGAGTTCCTCCGCCGCTGGACCTACCAAGGCAACGCTATGTTCTCTTGCTTTTGTCAGCAAGATAGCCAGATCAATGTCGATCGTGGCTGGCTCGAAGATACCTGCAAGAATGTCATTGCGCTGCCATTCTCCAAATTGCAGTTCGCGCTTAGCTGGATAACGCCACGGAATGATGTCGTCGTGCACAACAATGGTGACTTCTACAGCGCGGAGAATCTCGCTCTCTCCAGGGGAAGCCGAAGTTTCCAAAAGGTCGTTGATCAAAGCTCGCCGCGTTGTTTCATCAAGCCTTACGGTCACCGTAACCAGCAAATCAATATCACTGTGTGGCTTCAGGCCGCCATCCACTGCGGAGCCGTACAAATGTACGGCCAGCAACGTCGGTTCGAGATGGCGCTCGATGACGCCAACTACCTCTGATAGTTGAGTCGATACTTCGGCGATCACCGCTTCCCTCATGACATTGCACTCCACCGCTGATGACATCAGTCGATCATAGCACGATCAACGGCACTGTTGCAAATAGTCGGTGGTGATAAACTTATCATCCCCTTTTGCTGATGGAGCTGCACATGAACTCGAGACGTCATTGCGTTGCTAGCCAAGCTTAGGATCCGGAACCCTTAATATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATTAGGTCCCTCGAAGAGGTTCACTAGCTATCTAGAGCTTGGACTCCTGTTGATAGATCCAGTAATGACCTCAGAACTCCATCTGGATTTGTTCAGAACGCTCGGTTGCCGCCGGGCGTTTTTTATTGGTGAGAATCCAAGCCTTATCGCTGTCGGTTGATTCAGGATTATATCAGCGGGATGACTGACCTTTACGCATGGGATGAATATCGGCGTTTGATGGCGGTCGAACAGTAAATGGACTTTTGTAAAGATGGACAATAAATTTTTACTTTTTCCAGAAACTTTATTCCGGAACTTCGCGTTATAAAATGAATCTGACGTACACAGCAATTTTGCGTTACCTGTTAATCGAGATTGAAACACATGAAAAAAACCACATTAGCAATGAGTGCACTGGCTCTGAGTTTAGGTTTGGCATTGTCGCCTCTGTCTGCCACGGCGGCTGAAACGTCCTCTTCAGCAATGACTGCCCAGCAGATGCCAAGCCTGGCACCGATGCTCGAAAAAGTGATGCCATCGGTGGTCAGTATTAATGTTGAAGGTAGCACCACGGTGAATACGCCGCGTATGCCGCGTAATTTCCAGCAGTTCTTTGGCGATGACTCCCCGTTCTGCCAGGACGGTTCTCCGTTCCAGAATTCTCCGTTCTGCCAGGGCGGCGGTAACGGCGGCAACGGCGGTCAACAACAGAAATTCATGGCGCTGGGCTCCGGCGTAATTATTGACGCCGCGAAGGGCTACGTCGTCACCAACAACCACGTGGTTGATAACGCCAGCGTGATTAAAGTACAGCTTAGCGATGGGCGTAAATTCGATGCTAAAGTGGTGGGCAAAGATCCGCGTTCTGATATCGCGCTGATTCAAATTCAGAATCCGAAGAACCTGACGGCGATTAAGCTGGCGGACTCCGACGCGCTGCGCGTGGGGGATTATACCGTCGCTATTGGTAACCCGTTTGGTCTGGGCGAAACGGTGACGTCAGGTATCGTTTCGGCGCTGGGGCGTAGCGGCCTGAACGTAGAAAATTACGAGAACTTTATTCAGACCGACGCCGCGATTAACCGTGGTAACTCCGGCGGCGCGCTGGTGAACCTGAACGGTGAGCTGATCGGTATTAACACCGCGATTCTGGCGCCGGACGGCGGCAACATCGGTATCGGCTTCGCTATCCCCAGTAACATGGTGAAAAACCTGACGTCGCAGATGGTGGAATACGGCCAGGTGAAACGCGGCGAACTGGGGATCATGGGGACTGAGCTGAATTCCGAATTGGCGAAAGCGATGAAAGTCGACGCCCAGCGAGGCGCGTTCGTCAGCCAGGTGATGCCGAATTCGTCCGCGGCGAAAGCGGGTATCAAAGCCGGGGATGTCATTACCTCGCTGAACGGTAAACCGATCAGCAGCTTTGCGGCGCTGCGCGCTCAGGTCGGCACTATGCCGGTCGGCAGCAAAATCAGCCTCGGTCTGCTGCGTGAAGGTAAAGCGATTACGGTGAATCTGGAACTGCAGCAGAGCAGCCAGAGTCAGGTTGATTCCAGCACCATCTTCAGCGGGATTGAAGGCGCTGAAATGAGCAATAAAGGCCAGGATAAAGGCGTTGTGGTGAGCAGCGTGAAAGCGAACTCACCCGCCGCGCAAATTGGCCTCAAAAAAGGCGATGTGATTATCGGCGCTAACCAGCAGCCGGTGAAAAATATCGCCGAGCTGCGTAAGATTCTCGACAGCAAGCCGTCGGTTCTGGCGCTGAATATTCAGCGTGGTGATAGTTCTATTTATTTGCTGATGCAGTAAGAAGTCGCGTAAGTTGCTAGCCCACGCGGCTCACCTTCACGGGTGGGCCTTTCTTCGTATACTAAGTTGAACGAAACGGGAAGGCGAAAAGGTAAAAAGTTCCTTTT
GATAATGTATTCACAGGTTGCTCCGGGCTTGAAAAAGTTAAATGACATCCATTTGTCCTACTCAGGAGAGCGTTCACCGACAAACAACAGATAAAACGAAAGGCCCAGTCTTTCGACTGAGCCTTTCGTTTTATTTGATGCACTAGTGCCGATCATATTCAATAACCCTTAATATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATTAGGTCTGAAGAGGAGTTTACGTCCCATATGGAGTCCCGCCTTATTTGCCGACTACCTTGGTGATCTCGCCTTTCACGTAGTGGACAAATTCTTCCAACTGATCTGCGCGCGAGGCCAAGCGATCTTCTTCTTGTCCAAGATAAGCCTGTCTAGCTTCAAGTATGACGGGCTGATACTGGGCCGGCAGGCGCTCCATTGCCCAGTCGGCAGCGACATCCTTCGGCGCGATTTTGCCGGTTACTGCGCTGTACCAAATGCGGGACAACGTAAGCACTACATTTCGCTCATCGCCAGCCCAGTCGGGCGGCGAGTTCCATAGCGTTAAGGTTTCATTTAGCGCCTCAAATAGATCCTGTTCAGGAACCGGATCAAAGAGTTCCTCCGCCGCTGGACCTACCAAGGCAACGCTATGTTCTCTTGCTTTTGTCAGCAAGATAGCCAGATCAATGTCGATCGTGGCTGGCTCGAAGATACCTGCAAGAATGTCATTGCGCTGCCATTCTCCAAATTGCAGTTCGCGCTTAGCTGGATAACGCCACGGAATGATGTCGTCGTGCACAACAATGGTGACTTCTACAGCGCGGAGAATCTCGCTCTCTCCAGGGGAAGCCGAAGTTTCCAAAAGGTCGTTGATCAAAGCTCGCCGCGTTGTTTCATCAAGCCTTACGGTCACCGTAACCAGCAAATCAATATCACTGTGTGGCTTCAGGCCGCCATCCACTGCGGAGCCGTACAAATGTACGGCCAGCAACGTCGGTTCGAGATGGCGCTCGATGACGCCAACTACCTCTGATAGTTGAGTCGATACTTCGGCGATCACCGCTTCCCTCATGACATTGCACTCCACCGCTGATGACATCAGTCGATCATAGCACGATCAACGGCACTGTTGCAAATAGTCGGTGGTGATAAACTTATCATCCCCTTTTGCTGATGGAGCTGCACATGAACTCGAGACGTCATTGCGTTGCTAGCCAAGCTTAGGATCCGGAACCCTTAATATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATTAGGTCCCTCGAAGAGGTTCACTAGCTATCTAGAGCTTGGACTCCTGTTGATAGATCCAGTAATGACCTCAGAACTCCATCTGGATTTGTTCAGAACGCTCGGTTGCCGCCGGGCGTTTTTTATTGGTGAGAATCCAAGCCTTATCGCTGTCGGTTGATTCAGGATTATATCAGCGGGATGACTGACCTTTACGCATGGGATGAATATCGGCGTTTGATGGCGGTCGAACAGTAAATGGACTTTTGTAAAGATGGACAATAAATTTTTACTTTTTCCAGAAACTTTATTCCGGAACTTCGCGTTATAAAATGAATCTGACGTACACAGCAATTTTGCGTTACCTGTTAATCGAGATTGAAACACATGAAAAAAACCACATTAGCAATGAGTGCACTGGCTCTGAGTTTAGGTTTGGCATTGTCGCCTCTGTCTGCCACGGCGGCTGAAACGTCCTCTTCAGCAATGACTGCCCAGCAGATGCCAAGCCTGGCACCGATGCTCGAAAAAGTGATGCCATCGGTGGTCAGTATTAATGTTGAAGGTAGCACCACGGTGAATACGCCGCGTATGCCGCGTAATTTCCAGCAGTTCTTTGGCGATGACTCCCCGTTCTGCCAGGACGGTTCTCCGTTCCAGAATTCTCCGTTCTGCCAGGGCGGCGGTAACGGCGGCAACGGCGGTCAACAACAGAAATTCATGGCGCTGGGCTCCGGCGTAATTATTGACGCCGCGAAGGGCTACGTCGTCACCAACAACCACGTGGTTGATAACGCCAGCGTGATTAAAGTACAGCTTAGCGATGGGCGTAAATTCGATGCTAAAGTGGTGGGCAAAGATCCGCGTTCTGATATCGCGCTGATTCAAATTCAGAATCCGAAGAACCTGACGGCGATTAAGCTGGCGGACTCCGACGCGCTGCGCGTGGGGGATTATACCGTCGCTATTGGTAACCCGTTTGGTCTGGGCGAAACGGTGACGTCAGGTATCGTTTCGGCGCTGGGGCGTAGCGGCCTGAACGTAGAAAATTACGAGAACTTTATTCAGACCGACGCCGCGATTAACCGTGGTAACTCCGGCGGCGCGCTGGTGAACCTGAACGGTGAGCTGATCGGTATTAACACCGCGATTCTGGCGCCGGACGGCGGCAACATCGGTATCGGCTTCGCTATCCCCAGTAACATGGTGAAAAACCTGACGTCGCAGATGGTGGAATACGGCCAGGTGAAACGCGGCGAACTGGGGATCATGGGGACTGAGCTGAATTCCGAATTGGCGAAAGCGATGAAAGTCGACGCCCAGCGAGGCGCGTTCGTCAGCCAGGTGATGCCGAATTCGTCCGCGGCGAAAGCGGGTATCAAAGCCGGGGATGTCATTACCTCGCTGAACGGTAAACCGATCAGCAGCTTTGCGGCGCTGCGCGCTCAGGTCGGCACTATGCCGGTCGGCAGCAAAATCAGCCTCGGTCTGCTGCGTGAAGGTAAAGCGATTACGGTGAATCTGGAACTGCAGCAGAGCAGCCAGAGTCAGGTTGATTCCAGCACCATCTTCAGCGGGATTGAAGGCGCTGAAATGAGCAATAAAGGCCAGGATAAAGGCGTTGTGGTGAGCAGCGTGAAAGCGAACTCACCCGCCGCGCAAATTGGCCTCAAAAAAGGCGATGTGATTATCGGCGCTAACCAGCAGCCGGTGAAAAATATCGCCGAGCTGCGTAAGATTCTCGACAGCAAGCCGTCGGTTCTGGCGCTGAATATTCAGCGTGGTGATAGTTCTATTTATTTGCTGATGCAGTAAGAAGTCGCGTAAGTTGCTAGCCCACGCGGCTCACCTTCACGGGTGGGCCTTTCTTCGTATACTAAGTTGAACGAAACGGGAAGGCGAAAAGGTAAAAAGTTCCTTTT
【0378】
配列番号６：Ｍｓｂｂ－ＨＲ－ｌｏｘｐ－ＫｎａＲ－ｌｏｘｐ
AGGTAGTACAGGGTTTGTCAGCATAAAGCCTCTCTTACGAGAGGCTTTATGCCGATCATATTCAATAACCCTTAATATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATTAGGTCTGAAGAGGAGTTTACGTCCCATATGGAGTCCCGCTCAGAAGAACTCGTCAAGAAGGCGATAGAAGGCGATGCGCTGCGAATCGGGAGCGGCGATACCGTAAAGCACGAGGAAGCGGTCAGCCCATTCGCCGCCAAGCTCTTCAGCAATATCACGGGTAGCCAACGCTATGTCCTGATAGCGGTCCGCCACACCCAGCCGGCCACAGTCGATGAATCCAGAAAAGCGGCCATTTTCCACCATGATATTCGGCAAGCAGGCATCGCCATGGGTCACGACGAGATCCTCGCCGTCGGGCATGCGCGCCTTGAGCCTGGCGAACAGTTCGGCCGGCGCGAGCCCCTGATGCTCTTCGTCCAGATCATCCTGATCGACAAGACCGGCTTCCATCCGAGTACGTGCTCGCTCGATGCGATGTTTCGCTTGGTGGTCGAATGGGCAGGTAGCCGGATCAAGCGTATGCAGCCGCCGCATTGCATCAGCCATGATGGATACTTTCTCGGCAGGAGCAAGGTGAGATGACAGGAGATCCTGCCCCGGCACTTCGCCCAATAGCAGCCAGTCCCTTCCCGCTTCAGTGACAACGTCGAGCACAGCTGCGCAAGGAACGCCCGTCGTGGCCAGCCACGATAGCCGCGCTGCCTCGTCCTGCAGTTCATTCAGGGCACCGGACAGGTCGGTCTTGACAAAAAGAACCGGGCGCCCCTGCGCTGACAGCCGGAACACGGCGGCATCAGAGCAGCCGATTGTCTGTTGTGCCCAGTCATAGCCGAATAGCCTCTCCACCCAAGCGGCCGGAGAACCTGCGTGCAATCCATCTTGTTCAATCATGCGAAACGATCCTCATCCTGTCTCTTGATCAGATCCTGATCCCCTGCGCCATCAGATCCTTGGCGGCAAGAAAGCCATCCAGTTTACTTTGCAGGGCTTCCCAACCTTACCAGAGGGCGCCCCAGCTGGCAATTCCGACGTCATTGCGTTGCTAGCCAAGCTTAGGATCCGGAACCCTTAATATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATTAGGTCCCTCGAAGAGGTTCACTAGGCTTTTCCAGGGTCTGCTGACGCGAAAAGGAATTGTGAATAGTGTAGCGA
AGGTAGTACAGGGTTTGTCAGCATAAAGCCTCTCTTACGAGAGGCTTTATGCCGATCATATTCAATAACCCTTAATATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATTAGGTCTGAAGAGGAGTTTACGTCCCATATGGAGTCCCGCTCAGAAGAACTCGTCAAGAAGGCGATAGAAGGCGATGCGCTGCGAATCGGGAGCGGCGATACCGTAAAGCACGAGGAAGCGGTCAGCCCATTCGCCGCCAAGCTCTTCAGCAATATCACGGGTAGCCAACGCTATGTCCTGATAGCGGTCCGCCACACCCAGCCGGCCACAGTCGATGAATCCAGAAAAGCGGCCATTTTCCACCATGATATTCGGCAAGCAGGCATCGCCATGGGTCACGACGAGATCCTCGCCGTCGGGCATGCGCGCCTTGAGCCTGGCGAACAGTTCGGCCGGCGCGAGCCCCTGATGCTCTTCGTCCAGATCATCCTGATCGACAAGACCGGCTTCCATCCGAGTACGTGCTCGCTCGATGCGATGTTTCGCTTGGTGGTCGAATGGGCAGGTAGCCGGATCAAGCGTATGCAGCCGCCGCATTGCATCAGCCATGATGGATACTTTCTCGGCAGGAGCAAGGTGAGATGACAGGAGATCCTGCCCCGGCACTTCGCCCAATAGCAGCCAGTCCCTTCCCGCTTCAGTGACAACGTCGAGCACAGCTGCGCAAGGAACGCCCGTCGTGGCCAGCCACGATAGCCGCGCTGCCTCGTCCTGCAGTTCATTCAGGGCACCGGACAGGTCGGTCTTGACAAAAAGAACCGGGCGCCCCTGCGCTGACAGCCGGAACACGGCGGCATCAGAGCAGCCGATTGTCTGTTGTGCCCAGTCATAGCCGAATAGCCTCTCCACCCAAGCGGCCGGAGAACCTGCGTGCAATCCATCTTGTTCAATCATGCGAAACGATCCTCATCCTGTCTCTTGATCAGATCCTGATCCCCTGCGCCATCAGATCCTTGGCGGCAAGAAAGCCATCCAGTTTACTTTGCAGGGCTTCCCAACCTTACCAGAGGGCGCCCCAGCTGGCAATTCCGACGTCATTGCGTTGCTAGCCAAGCTTAGGATCCGGAACCCTTAATATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATTAGGTCCCTCGAAGAGGTTCACTAGGCTTTTCCAGGGTCTGCTGACGCGAAAAGGAATTGTGAATAGTGTAGCGA
【0379】
配列番号７：Ｌｐｐ－ＨＲ－ｌｏｘｐ－Ｋｎａｒ－ｌｏｘｐ
CGGACAAAAAAATGGCGCACGATGTGCGCCATTTTATATTGTGCGTCAAAGCCGATCATATTCAATAACCCTTAATATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATTAGGTCTGAAGAGGAGTTTACGTCCCATATGGAGTCCCGCTCAGAAGAACTCGTCAAGAAGGCGATAGAAGGCGATGCGCTGCGAATCGGGAGCGGCGATACCGTAAAGCACGAGGAAGCGGTCAGCCCATTCGCCGCCAAGCTCTTCAGCAATATCACGGGTAGCCAACGCTATGTCCTGATAGCGGTCCGCCACACCCAGCCGGCCACAGTCGATGAATCCAGAAAAGCGGCCATTTTCCACCATGATATTCGGCAAGCAGGCATCGCCATGGGTCACGACGAGATCCTCGCCGTCGGGCATGCGCGCCTTGAGCCTGGCGAACAGTTCGGCCGGCGCGAGCCCCTGATGCTCTTCGTCCAGATCATCCTGATCGACAAGACCGGCTTCCATCCGAGTACGTGCTCGCTCGATGCGATGTTTCGCTTGGTGGTCGAATGGGCAGGTAGCCGGATCAAGCGTATGCAGCCGCCGCATTGCATCAGCCATGATGGATACTTTCTCGGCAGGAGCAAGGTGAGATGACAGGAGATCCTGCCCCGGCACTTCGCCCAATAGCAGCCAGTCCCTTCCCGCTTCAGTGACAACGTCGAGCACAGCTGCGCAAGGAACGCCCGTCGTGGCCAGCCACGATAGCCGCGCTGCCTCGTCCTGCAGTTCATTCAGGGCACCGGACAGGTCGGTCTTGACAAAAAGAACCGGGCGCCCCTGCGCTGACAGCCGGAACACGGCGGCATCAGAGCAGCCGATTGTCTGTTGTGCCCAGTCATAGCCGAATAGCCTCTCCACCCAAGCGGCCGGAGAACCTGCGTGCAATCCATCTTGTTCAATCATGCGAAACGATCCTCATCCTGTCTCTTGATCAGATCCTGATCCCCTGCGCCATCAGATCCTTGGCGGCAAGAAAGCCATCCAGTTTACTTTGCAGGGCTTCCCAACCTTACCAGAGGGCGCCCCAGCTGGCAATTCCGACGTCATTGCGTTGCTAGCCAAGCTTAGGATCCGGAACCCTTAATATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATTAGGTCCCTCGAAGAGGTTCACTAGTATTAATACCCTCTAGATTGAGTTAATCTCCATGTAGCGTTACAAGTATT
CGGACAAAAAAATGGCGCACGATGTGCGCCATTTTATATTGTGCGTCAAAGCCGATCATATTCAATAACCCTTAATATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATTAGGTCTGAAGAGGAGTTTACGTCCCATATGGAGTCCCGCTCAGAAGAACTCGTCAAGAAGGCGATAGAAGGCGATGCGCTGCGAATCGGGAGCGGCGATACCGTAAAGCACGAGGAAGCGGTCAGCCCATTCGCCGCCAAGCTCTTCAGCAATATCACGGGTAGCCAACGCTATGTCCTGATAGCGGTCCGCCACACCCAGCCGGCCACAGTCGATGAATCCAGAAAAGCGGCCATTTTCCACCATGATATTCGGCAAGCAGGCATCGCCATGGGTCACGACGAGATCCTCGCCGTCGGGCATGCGCGCCTTGAGCCTGGCGAACAGTTCGGCCGGCGCGAGCCCCTGATGCTCTTCGTCCAGATCATCCTGATCGACAAGACCGGCTTCCATCCGAGTACGTGCTCGCTCGATGCGATGTTTCGCTTGGTGGTCGAATGGGCAGGTAGCCGGATCAAGCGTATGCAGCCGCCGCATTGCATCAGCCATGATGGATACTTTCTCGGCAGGAGCAAGGTGAGATGACAGGAGATCCTGCCCCGGCACTTCGCCCAATAGCAGCCAGTCCCTTCCCGCTTCAGTGACAACGTCGAGCACAGCTGCGCAAGGAACGCCCGTCGTGGCCAGCCACGATAGCCGCGCTGCCTCGTCCTGCAGTTCATTCAGGGCACCGGACAGGTCGGTCTTGACAAAAAGAACCGGGCGCCCCTGCGCTGACAGCCGGAACACGGCGGCATCAGAGCAGCCGATTGTCTGTTGTGCCCAGTCATAGCCGAATAGCCTCTCCACCCAAGCGGCCGGAGAACCTGCGTGCAATCCATCTTGTTCAATCATGCGAAACGATCCTCATCCTGTCTCTTGATCAGATCCTGATCCCCTGCGCCATCAGATCCTTGGCGGCAAGAAAGCCATCCAGTTTACTTTGCAGGGCTTCCCAACCTTACCAGAGGGCGCCCCAGCTGGCAATTCCGACGTCATTGCGTTGCTAGCCAAGCTTAGGATCCGGAACCCTTAATATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATTAGGTCCCTCGAAGAGGTTCACTAGTATTAATACCCTCTAGATTGAGTTAATCTCCATGTAGCGTTACAAGTATT
【0380】
配列番号８：ｆｌｉＣ－ＨＲ－ｌｏｘｐ－ＫｎａＲ－ｌｏｘｐ
GCTTTCGCTGCCTTGATTGTGTACCACGTGTCGGTGAATCAATCGCCGGAGCCGATCATATTCAATAACCCTTAATATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATTAGGTCTGAAGAGGAGTTTACGTCCCATATGGAGTCCCGCTCAGAAGAACTCGTCAAGAAGGCGATAGAAGGCGATGCGCTGCGAATCGGGAGCGGCGATACCGTAAAGCACGAGGAAGCGGTCAGCCCATTCGCCGCCAAGCTCTTCAGCAATATCACGGGTAGCCAACGCTATGTCCTGATAGCGGTCCGCCACACCCAGCCGGCCACAGTCGATGAATCCAGAAAAGCGGCCATTTTCCACCATGATATTCGGCAAGCAGGCATCGCCATGGGTCACGACGAGATCCTCGCCGTCGGGCATGCGCGCCTTGAGCCTGGCGAACAGTTCGGCCGGCGCGAGCCCCTGATGCTCTTCGTCCAGATCATCCTGATCGACAAGACCGGCTTCCATCCGAGTACGTGCTCGCTCGATGCGATGTTTCGCTTGGTGGTCGAATGGGCAGGTAGCCGGATCAAGCGTATGCAGCCGCCGCATTGCATCAGCCATGATGGATACTTTCTCGGCAGGAGCAAGGTGAGATGACAGGAGATCCTGCCCCGGCACTTCGCCCAATAGCAGCCAGTCCCTTCCCGCTTCAGTGACAACGTCGAGCACAGCTGCGCAAGGAACGCCCGTCGTGGCCAGCCACGATAGCCGCGCTGCCTCGTCCTGCAGTTCATTCAGGGCACCGGACAGGTCGGTCTTGACAAAAAGAACCGGGCGCCCCTGCGCTGACAGCCGGAACACGGCGGCATCAGAGCAGCCGATTGTCTGTTGTGCCCAGTCATAGCCGAATAGCCTCTCCACCCAAGCGGCCGGAGAACCTGCGTGCAATCCATCTTGTTCAATCATGCGAAACGATCCTCATCCTGTCTCTTGATCAGATCCTGATCCCCTGCGCCATCAGATCCTTGGCGGCAAGAAAGCCATCCAGTTTACTTTGCAGGGCTTCCCAACCTTACCAGAGGGCGCCCCAGCTGGCAATTCCGACGTCATTGCGTTGCTAGCCAAGCTTAGGATCCGGAACCCTTAATATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATTAGGTCCCTCGAAGAGGTTCACTAGATCAATTACAACTTGATGTTATTGGGCTGTTGCCCACGGTTTCTCACCGT
GCTTTCGCTGCCTTGATTGTGTACCACGTGTCGGTGAATCAATCGCCGGAGCCGATCATATTCAATAACCCTTAATATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATTAGGTCTGAAGAGGAGTTTACGTCCCATATGGAGTCCCGCTCAGAAGAACTCGTCAAGAAGGCGATAGAAGGCGATGCGCTGCGAATCGGGAGCGGCGATACCGTAAAGCACGAGGAAGCGGTCAGCCCATTCGCCGCCAAGCTCTTCAGCAATATCACGGGTAGCCAACGCTATGTCCTGATAGCGGTCCGCCACACCCAGCCGGCCACAGTCGATGAATCCAGAAAAGCGGCCATTTTCCACCATGATATTCGGCAAGCAGGCATCGCCATGGGTCACGACGAGATCCTCGCCGTCGGGCATGCGCGCCTTGAGCCTGGCGAACAGTTCGGCCGGCGCGAGCCCCTGATGCTCTTCGTCCAGATCATCCTGATCGACAAGACCGGCTTCCATCCGAGTACGTGCTCGCTCGATGCGATGTTTCGCTTGGTGGTCGAATGGGCAGGTAGCCGGATCAAGCGTATGCAGCCGCCGCATTGCATCAGCCATGATGGATACTTTCTCGGCAGGAGCAAGGTGAGATGACAGGAGATCCTGCCCCGGCACTTCGCCCAATAGCAGCCAGTCCCTTCCCGCTTCAGTGACAACGTCGAGCACAGCTGCGCAAGGAACGCCCGTCGTGGCCAGCCACGATAGCCGCGCTGCCTCGTCCTGCAGTTCATTCAGGGCACCGGACAGGTCGGTCTTGACAAAAAGAACCGGGCGCCCCTGCGCTGACAGCCGGAACACGGCGGCATCAGAGCAGCCGATTGTCTGTTGTGCCCAGTCATAGCCGAATAGCCTCTCCACCCAAGCGGCCGGAGAACCTGCGTGCAATCCATCTTGTTCAATCATGCGAAACGATCCTCATCCTGTCTCTTGATCAGATCCTGATCCCCTGCGCCATCAGATCCTTGGCGGCAAGAAAGCCATCCAGTTTACTTTGCAGGGCTTCCCAACCTTACCAGAGGGCGCCCCAGCTGGCAATTCCGACGTCATTGCGTTGCTAGCCAAGCTTAGGATCCGGAACCCTTAATATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATTAGGTCCCTCGAAGAGGTTCACTAGATCAATTACAACTTGATGTTATTGGGCTGTTGCCCACGGTTTCTCACCGT
【0381】
配列番号９：ＰｓｓｅＡ－ｈｌｙＡ－ｌｏｘｐ－ＫｎａＲ－ｌｏｘｐプラスミド
CATGGTCATAGCTGTTTCCTTTAATGCCCATGGCGTTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGACTTCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACGTCTAAGAAACCATTATTATCATGACATTAACCTATAAAAATAGGCGTATCACGAGGCCCTTAGGCCAAATAGGCCGTTCAGATCCTTCCGTATTTAGCCAGTATGTTCTCTAGTGTGGTTCGTTGTTTTTGCGTGAGCCATGAGAACGAACCATTGAGATCATGCTTACTTTGCATGTCACTCAAAAATTTTGCCTCAAAACTGGTGAGCTGAATTTTTGCAGTTAAAGCATCGTGTAGTGTTTTTCTTAGTCCGTTACGTAGGTAGGAATCTGATGTAATGGTTGTTGGTATTTTGTCACCATTCATTTTTATCTGGTTGTTCTCAAGTTCGGTTACGAGATCCATTTGTCTATCTAGTTCAACTTGGAAAATCAACGTATCAGTCGGGCGGCCTCGCTTATCAACCACCAATTTCATATTGCTGTAAGTGTTTAAATCTTTACTTATTGGTTTCAAAACCCATTGGTTAAGCCTTTTAAACTCATGGTAGTTATTTTCAAGCATTAACATGAACTTAAATTCATCAAGGCTAATCTCTATATTTGCCTTGTGAGTTTTCTTTTGTGTTAGTTCTTTTAATAACCACTCATAAATCCTCATAGAGTATTTGTTTTCAAAAGACTTAACATGTTCCAGATTATATTTTATGAATTTTTTTAACTGGAAAAGATAAGGCAATATCTCTTCACTAAAAACTAATTCTAATTTTTCGCTTGAGAACTTGGCATAGTTTGTCCACTGGAAAATCTCAAAGCCTTTAACCAAAGGATTCCTGATTTCCACAGTTCTCGTCATCAGCTCTCTGGTTGCTTTAGCTAATACACCATAAGCATTTTCCCTACTGATGTTCATCATCTGAGCGTATTGGTTATAAGTGAACGATACCGTCCGTTCTTTCCTTGTAGGGTTTTCAATCGTGGGGTTGAGTAGTGCCACACAGCATAAAATTAGCTTGGTTTCATGCTCCGTTAAGTCATAGCGACTAATCGCTAGTTCATTTGCTTTGAAAACAACTAATTCAGACATACATCTCAATTGGTCTAGGTGATTTTAATCACTATACCAATTGAGATGGGCTAGTCAATGATAATTACTAGTCCTTTTCCTTTGAGTTGTGGGTATCTGTAAATTCTGCTAGACCTTTGCTGGAAAACTTGTAAATTCTGCTAGACCCTCTGTAAATTCCGCTAGACCTTTGTGTGTTTTTTTTGTTTATATTCAAGTGGTTATAATTTATAGAATAAAGAAAGAATAAAAAAAGATAAAAAGAATAGATCCCAGCCCTGTGTATAACTCACTACTTTAGTCAGTTCCGCAGTATTACAAAAGGATGTCGCAAACGCTGTTTGCTCCTCTACAAAACAGACCTTAAAACCCTAAAGGCTTAAGTAGCACCCTCGCAAGCTCGGGCAAATCGCTGAATATTCCTTTTGTCTCCGACCATCAGGCACCTGAGTCGCTGTCTTTTTCGTGACATTCAGTTCGCTGCGCTCACGGCTCTGGCAGTGAATGGGGGTAAATGGCACTACAGGCGCCTTTTATGGATTCATGCAAGGAAACTACCCATAATACAAGAAAAGCCCGTCACGGGCTTCTCAGGGCGTTTTATGGCGGGTCTGCTATGTGGTGCTATCTGACTTTTTGCTGTTCAGCAGTTCCTGCCCTCTGATTTTCCAGTCTGACCACTTCGGATTATCCCGTGACAGGTCATTCAGACTGGCTAATGCACCCAGTAAGGCAGCGGTATCATCAACAGGCTTACCCGTCTTACTGTCAAGAGGACATCCGGTCAGATAACCGTCATCTTCGGCTACTGTCTAGGGCGGCGGATTTGTCCTACTCAGGAGAGCGTTCACCGACAAACAACAGATAAAACGAAAGGCCCAGTCTTTCGACTGAGCCTTTCGTTTTATTTGATGCACTAGTGCCGATCATATTCAATAACCCTTAATATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATTAGGTCTGAAGAGGAGTTTACGTCCCATATGGAGTCCCGCTCAGAAGAACTCGTCAAGAAGGCGATAGAAGGCGATGCGCTGCGAATCGGGAGCGGCGATACCGTAAAGCACGAGGAAGCGGTCAGCCCATTCGCCGCCAAGCTCTTCAGCAATATCACGGGTAGCCAACGCTATGTCCTGATAGCGGTCCGCCACACCCAGCCGGCCACAGTCGATGAATCCAGAAAAGCGGCCATTTTCCACCATGATATTCGGCAAGCAGGCATCGCCATGGGTCACGACGAGATCCTCGCCGTCGGGCATGCGCGCCTTGAGCCTGGCGAACAGTTCGGCCGGCGCGAGCCCCTGATGCTCTTCGTCCAGATCATCCTGATCGACAAGACCGGCTTCCATCCGAGTACGTGCTCGCTCGATGCGATGTTTCGCTTGGTGGTCGAATGGGCAGGTAGCCGGATCAAGCGTATGCAGCCGCCGCATTGCATCAGCCATGATGGATACTTTCTCGGCAGGAGCAAGGTGAGATGACAGGAGATCCTGCCCCGGCACTTCGCCCAATAGCAGCCAGTCCCTTCCCGCTTCAGTGACAACGTCGAGCACAGCTGCGCAAGGAACGCCCGTCGTGGCCAGCCACGATAGCCGCGCTGCCTCGTCCTGCAGTTCATTCAGGGCACCGGACAGGTCGGTCTTGACAAAAAGAACCGGGCGCCCCTGCGCTGACAGCCGGAACACGGCGGCATCAGAGCAGCCGATTGTCTGTTGTGCCCAGTCATAGCCGAATAGCCTCTCCACCCAAGCGGCCGGAGAACCTGCGTGCAATCCATCTTGTTCAATCATGCGAAACGATCCTCATCCTGTCTCTTGATCAGATCCTGATCCCCTGCGCCATCAGATCCTTGGCGGCAAGAAAGCCATCCAGTTTACTTTGCAGGGCTTCCCAACCTTACCAGAGGGCGCCCCAGCTGGCAATTCCGACGTCATTGCGTTGCTAGCCAAGCTTAGGATCCGGAACCCTTAATATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATTAGGTCCCTCGAAGAGGTTCACTAGCTATCTAGAGCTTGGACTCCTGTTGATAGATCCAGTAATGACCTCAGAACTCCATCTGGATTTGTTCAGAACGCTCGGTTGCCGCCGGGCGTTTTTTATTGGTGAGAATCCAAGCCCGGGAAACGGGATCCTGATCTTGATCAGGCTGTGGGTCAGGCCACTCTTGGCATCGACACCAATGTGGGCCTTCATGCCAAAGTGCCACTGATTGCCTTTCTTGGTCTGATGCATCTCCGGATCGCGTTGCTGCTCTTTGTTCTTGGTCGAGCTGGGTGCCTCAATGATGGTGGCATCGACCAAGGTGCCTTGAGTCATCATGACGCCTGCTTCGGCCAGCCAGCGATTGATGGTCTTGAACAATTGGCGGGCCAGTTGATGCTGCTCCAGCAGGTGGCGGAAATTCATGATGGTGGTGCGGTCCGGCAAGGCGCTATCCAGGGATAACCGGGCAAACAGACGCATGGAGGCGATTTCGTACAGAGCATCTTCCATCGCGCCATCGCTCAGGTTGTACCAATGCTGCATGCAGTGAATGCGTAGCATGGTTTCCAGCGGATAAGGTCGCCGGCCATTACCAGCCTTGGGGTAAAACGGCTCGATGACTTCCACCATGTTTTGCCATGGCAGAATCTGCTCCATGCGGGACAAGAAAATCTCTTTTCTGGTCTGACGGCGCTTACTGCTGAATTCACTGTCGGCGAAGGTAAGTTGATGACTCATGATGAACCCTGTTCTATGGCTCCAGATGACAAACATGATCTCATATCAGGGACTTGTTCGCACCTTCCTTAGCACGTTAATTATCTATCGTGTATATGGAGGGGATCTAGAATGAAAAAAATAATGCTAGTTTTTATTACACTTATATTAGTTAGTCTACCAATTGCGCAACAAACTGAAGCAAAGGATGCATCTGCATTCAATAAAGAAAATTCAATTTCATCCATGGCACCACCAGCATCTCCGCCTGCAAGTCCTAAGACGCCAATCGAAAAGAAACACGCGGATGAAATCGATAAGTATATACAAGGATTGGACTACAATAAAAACAATGTATTAGTATACCACGGAGATGCAGTGACAAATGTGCCGCCAAGAAAAGGTTACAAAGATGGAAATGAATATATTGTTGTGGAGAAAAAGAAGAAATCCATCAATCAAAATAATGCAGACATTCAAGTTGTGAATGCAATTTCGAGCCTAACCTATCCAGGTGCTCTCGTAAAAGCGAATTCGGAATTAGTAGAAAATCAACCAGATGTTCTCCCTGTAAAACGTGATTCATTAACACTCAGCATTGATTTGCCAGGTATGACTAATCAAGACAATAAAATCGTTGTAAAAAATGCCACTAAATCAAACGTTAACAACGCAGTAAATACATTAGTGGAAAGATGGAATGAAAAATATGCTCAAGCTTATCCAAATGTAAGTGCAAAAATTGATTATGATGACGAAATGGCTTACAGTGAATCACAATTAATTGCGAAATTTGGTACAGCATTTAAAGCTGTAAATAATAGCTTGAATGTAAACTTCGGCGCAATCAGTGAAGGGAAAATGCAAGAAGAAGTCATTAGTTTTAAACAAATTTACTATAACGTGAATGTTAATGAACCTACAAGACCTTCCAGATTTTTCGGCAAAGCTGTTACTAAAGAGCAGTTGCAAGCGCTTGGAGTGAATGCAGAAAATCCTCCTGCATATATCTCAAGTGTGGCGTATGGCCGTCAAGTTTATTTGAAATTATCAACTAATTCCCATAGTACTAAAGTAAAAGCTGCTTTTGATGCTGCCGTAAGCGGAAAATCTGTCTCAGGTGATGTAGAACTAACAAATATCATCAAAAATTCTTCCTTCAAAGCCGTAATTTACGGAGGTTCCGCAAAAGATGAAGTTCAAATCATCGACGGCAACCTCGGAGACTTACGAGATATTTTGAAAAAAGGCGCTACTTTTAATCGAGAAACACCAGGAGTTCCCATTGCTTATACAACAAACTTCCTAAAAGACAATGAATTAGCTGTTATTAAAAACAACTCAGAATATATTGAAACAACTTCAAAAGCTTATACAGATGGAAAAATTAACATCGATCACTCTGGAGGATACGTTGCTCAATTCAACATTTCTTGGGATGAAGTAAATTATGATCCTGAAGGTAACGAAATTGTTCAACATAAAAACTGGAGCGAAAACAATAAAAGTAAGCTAGCTCATTTCACATCGTCCATCTATTTGCCAGGTAACGCGAGAAATATTAATGTTTACGCTAAAGAATGCACTGGTTTAGCTTGGGAATGGTGGAGAACGGTAATTGATGACCGGAACTTACCACTTGTGAAAAATAGAAATATCTCCATCTGGGGCACCACGCTTTATCCGAAATATAGTAATAAAGTAGATAATCCAATCGAATAAGTCGACCTCGAGGACTAGTGAACCTCTTCGAGGGACCTAATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTATATTAAGGGTTATTGAATATGATCGGCTCGAGATTACTTCGCATTGCAATCAGCTACGGACTCAAGCTTACGTCAGGTCATACGATGAAGGCGATAAGTCGCGTAAGTTGCTAGCCCACGCGGCTCACCTTCACGGGTGGGCCTTTCTTCGCGATCCACATG
CATGGTCATAGCTGTTTCCTTTAATGCCCATGGCGTTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGACTTCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACGTCTAAGAAACCATTATTATCATGACATTAACCTATAAAAATAGGCGTATCACGAGGCCCTTAGGCCAAATAGGCCGTTCAGATCCTTCCGTATTTAGCCAGTATGTTCTCTAGTGTGGTTCGTTGTTTTTGCGTGAGCCATGAGAACGAACCATTGAGATCATGCTTACTTTGCATGTCACTCAAAAATTTTGCCTCAAAACTGGTGAGCTGAATTTTTGCAGTTAAAGCATCGTGTAGTGTTTTTCTTAGTCCGTTACGTAGGTAGGAATCTGATGTAATGGTTGTTGGTATTTTGTCACCATTCATTTTTATCTGGTTGTTCTCAAGTTCGGTTACGAGATCCATTTGTCTATCTAGTTCAACTTGGAAAATCAACGTATCAGTCGGGCGGCCTCGCTTATCAACCACCAATTTCATATTGCTGTAAGTGTTTAAATCTTTACTTATTGGTTTCAAAACCCATTGGTTAAGCCTTTTAAACTCATGGTAGTTATTTTCAAGCATTAACATGAACTTAAATTCATCAAGGCTAATCTCTATATTTGCCTTGTGAGTTTTCTTTTGTGTTAGTTCTTTTAATAACCACTCATAAATCCTCATAGAGTATTTGTTTTCAAAAGACTTAACATGTTCCAGATTATATTTTATGAATTTTTTTAACTGGAAAAGATAAGGCAATATCTCTTCACTAAAAACTAATTCTAATTTTTCGCTTGAGAACTTGGCATAGTTTGTCCACTGGAAAATCTCAAAGCCTTTAACCAAAGGATTCCTGATTTCCACAGTTCTCGTCATCAGCTCTCTGGTTGCTTTAGCTAATACACCATAAGCATTTTCCCTACTGATGTTCATCATCTGAGCGTATTGGTTATAAGTGAACGATACCGTCCGTTCTTTCCTTGTAGGGTTTTCAATCGTGGGGTTGAGTAGTGCCACACAGCATAAAATTAGCTTGGTTTCATGCTCCGTTAAGTCATAGCGACTAATCGCTAGTTCATTTGCTTTGAAAACAACTAATTCAGACATACATCTCAATTGGTCTAGGTGATTTTAATCACTATACCAATTGAGATGGGCTAGTCAATGATAATTACTAGTCCTTTTCCTTTGAGTTGTGGGTATCTGTAAATTCTGCTAGACCTTTGCTGGAAAACTTGTAAATTCTGCTAGACCCTCTGTAAATTCCGCTAGACCTTTGTGTGTTTTTTTTGTTTATATTCAAGTGGTTATAATTTATAGAATAAAGAAAGAATAAAAAAAGATAAAAAGAATAGATCCCAGCCCTGTGTATAACTCACTACTTTAGTCAGTTCCGCAGTATTACAAAAGGATGTCGCAAACGCTGTTTGCTCCTCTACAAAACAGACCTTAAAACCCTAAAGGCTTAAGTAGCACCCTCGCAAGCTCGGGCAAATCGCTGAATATTCCTTTTGTCTCCGACCATCAGGCACCTGAGTCGCTGTCTTTTTCGTGACATTCAGTTCGCTGCGCTCACGGCTCTGGCAGTGAATGGGGGTAAATGGCACTACAGGCGCCTTTTATGGATTCATGCAAGGAAACTACCCATAATACAAGAAAAGCCCGTCACGGGCTTCTCAGGGCGTTTTATGGCGGGTCTGCTATGTGGTGCTATCTGACTTTTTGCTGTTCAGCAGTTCCTGCCCTCTGATTTTCCAGTCTGACCACTTCGGATTATCCCGTGACAGGTCATTCAGACTGGCTAATGCACCCAGTAAGGCAGCGGTATCATCAACAGGCTTACCCGTCTTACTGTCAAGAGGACATCCGGTCAGATAACCGTCATCTTCGGCTACTGTCTAGGGCGGCGGATTTGTCCTACTCAGGAGAGCGTTCACCGACAAACAACAGATAAAACGAAAGGCCCAGTCTTTCGACTGAGCCTTTCGTTTTATTTGATGCACTAGTGCCGATCATATTCAATAACCCTTAATATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATTAGGTCTGAAGAGGAGTTTACGTCCCATATGGAGTCCCGCTCAGAAGAACTCGTCAAGAAGGCGATAGAAGGCGATGCGCTGCGAATCGGGAGCGGCGATACCGTAAAGCACGAGGAAGCGGTCAGCCCATTCGCCGCCAAGCTCTTCAGCAATATCACGGGTAGCCAACGCTATGTCCTGATAGCGGTCCGCCACACCCAGCCGGCCACAGTCGATGAATCCAGAAAAGCGGCCATTTTCCACCATGATATTCGGCAAGCAGGCATCGCCATGGGTCACGACGAGATCCTCGCCGTCGGGCATGCGCGCCTTGAGCCTGGCGAACAGTTCGGCCGGCGCGAGCCCCTGATGCTCTTCGTCCAGATCATCCTGATCGACAAGACCGGCTTCCATCCGAGTACGTGCTCGCTCGATGCGATGTTTCGCTTGGTGGTCGAATGGGCAGGTAGCCGGATCAAGCGTATGCAGCCGCCGCATTGCATCAGCCATGATGGATACTTTCTCGGCAGGAGCAAGGTGAGATGACAGGAGATCCTGCCCCGGCACTTCGCCCAATAGCAGCCAGTCCCTTCCCGCTTCAGTGACAACGTCGAGCACAGCTGCGCAAGGAACGCCCGTCGTGGCCAGCCACGATAGCCGCGCTGCCTCGTCCTGCAGTTCATTCAGGGCACCGGACAGGTCGGTCTTGACAAAAAGAACCGGGCGCCCCTGCGCTGACAGCCGGAACACGGCGGCATCAGAGCAGCCGATTGTCTGTTGTGCCCAGTCATAGCCGAATAGCCTCTCCACCCAAGCGGCCGGAGAACCTGCGTGCAATCCATCTTGTTCAATCATGCGAAACGATCCTCATCCTGTCTCTTGATCAGATCCTGATCCCCTGCGCCATCAGATCCTTGGCGGCAAGAAAGCCATCCAGTTTACTTTGCAGGGCTTCCCAACCTTACCAGAGGGCGCCCCAGCTGGCAATTCCGACGTCATTGCGTTGCTAGCCAAGCTTAGGATCCGGAACCCTTAATATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATTAGGTCCCTCGAAGAGGTTCACTAGCTATCTAGAGCTTGGACTCCTGTTGATAGATCCAGTAATGACCTCAGAACTCCATCTGGATTTGTTCAGAACGCTCGGTTGCCGCCGGGCGTTTTTTATTGGTGAGAATCCAAGCCCGGGAAACGGGATCCTGATCTTGATCAGGCTGTGGGTCAGGCCACTCTTGGCATCGACACCAATGTGGGCCTTCATGCCAAAGTGCCACTGATTGCCTTTCTTGGTCTGATGCATCTCCGGATCGCGTTGCTGCTCTTTGTTCTTGGTCGAGCTGGGTGCCTCAATGATGGTGGCATCGACCAAGGTGCCTTGAGTCATCATGACGCCTGCTTCGGCCAGCCAGCGATTGATGGTCTTGAACAATTGGCGGGCCAGTTGATGCTGCTCCAGCAGGTGGCGGAAATTCATGATGGTGGTGCGGTCCGGCAAGGCGCTATCCAGGGATAACCGGGCAAACAGACGCATGGAGGCGATTTCGTACAGAGCATCTTCCATCGCGCCATCGCTCAGGTTGTACCAATGCTGCATGCAGTGAATGCGTAGCATGGTTTCCAGCGGATAAGGTCGCCGGCCATTACCAGCCTTGGGGTAAAACGGCTCGATGACTTCCACCATGTTTTGCCATGGCAGAATCTGCTCCATGCGGGACAAGAAAATCTCTTTTCTGGTCTGACGGCGCTTACTGCTGAATTCACTGTCGGCGAAGGTAAGTTGATGACTCATGATGAACCCTGTTCTATGGCTCCAGATGACAAACATGATCTCATATCAGGGACTTGTTCGCACCTTCCTTAGCACGTTAATTATCTATCGTGTATATGGAGGGGATCTAGAATGAAAAAAATAATGCTAGTTTTTATTACACTTATATTAGTTAGTCTACCAATTGCGCAACAAACTGAAGCAAAGGATGCATCTGCATTCAATAAAGAAAATTCAATTTCATCCATGGCACCACCAGCATCTCCGCCTGCAAGTCCTAAGACGCCAATCGAAAAGAAACACGCGGATGAAATCGATAAGTATATACAAGGATTGGACTACAATAAAAACAATGTATTAGTATACCACGGAGATGCAGTGACAAATGTGCCGCCAAGAAAAGGTTACAAAGATGGAAATGAATATATTGTTGTGGAGAAAAAGAAGAAATCCATCAATCAAAATAATGCAGACATTCAAGTTGTGAATGCAATTTCGAGCCTAACCTATCCAGGTGCTCTCGTAAAAGCGAATTCGGAATTAGTAGAAAATCAACCAGATGTTCTCCCTGTAAAACGTGATTCATTAACACTCAGCATTGATTTGCCAGGTATGACTAATCAAGACAATAAAATCGTTGTAAAAAATGCCACTAAATCAAACGTTAACAACGCAGTAAATACATTAGTGGAAAGATGGAATGAAAAATATGCTCAAGCTTATCCAAATGTAAGTGCAAAAATTGATTATGATGACGAAATGGCTTACAGTGAATCACAATTAATTGCGAAATTTGGTACAGCATTTAAAGCTGTAAATAATAGCTTGAATGTAAACTTCGGCGCAATCAGTGAAGGGAAAATGCAAGAAGAAGTCATTAGTTTTAAACAAATTTACTATAACGTGAATGTTAATGAACCTACAAGACCTTCCAGATTTTTCGGCAAAGCTGTTACTAAAGAGCAGTTGCAAGCGCTTGGAGTGAATGCAGAAAATCCTCCTGCATATATCTCAAGTGTGGCGTATGGCCGTCAAGTTTATTTGAAATTATCAACTAATTCCCATAGTACTAAAGTAAAAGCTGCTTTTGATGCTGCCGTAAGCGGAAAATCTGTCTCAGGTGATGTAGAACTAACAAATATCATCAAAAATTCTTCCTTCAAAGCCGTAATTTACGGAGGTTCCGCAAAAGATGAAGTTCAAATCATCGACGGCAACCTCGGAGACTTACGAGATATTTTGAAAAAAGGCGCTACTTTTAATCGAGAAACACCAGGAGTTCCCATTGCTTATACAACAAACTTCCTAAAAGACAATGAATTAGCTGTTATTAAAAACAACTCAGAATATATTGAAACAACTTCAAAAGCTTATACAGATGGAAAAATTAACATCGATCACTCTGGAGGATACGTTGCTCAATTCAACATTTCTTGGGATGAAGTAAATTATGATCCTGAAGGTAACGAAATTGTTCAACATAAAAACTGGAGCGAAAACAATAAAAGTAAGCTAGCTCATTTCACATCGTCCATCTATTTGCCAGGTAACGCGAGAAATATTAATGTTTACGCTAAAGAATGCACTGGTTTAGCTTGGGAATGGTGGAGAACGGTAATTGATGACCGGAACTTACCACTTGTGAAAAATAGAAATATCTCCATCTGGGGCACCACGCTTTATCCGAAATATAGTAATAAAGTAGATAATCCAATCGAATAAGTCGACCTCGAGGACTAGTGAACCTCTTCGAGGGACCTAATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTATATTAAGGGTTATTGAATATGATCGGCTCGAGATTACTTCGCATTGCAATCAGCTACGGACTCAAGCTTACGTCAGGTCATACGATGAAGGCGATAAGTCGCGTAAGTTGCTAGCCCACGCGGCTCACCTTCACGGGTGGGCCTTTCTTCGCGATCCACATG
【0382】
配列番号１０：Ｐｓｓｂｐ１－ｄａｐＥ－Ｃｍプラスミド
CATGGTCATAGCTGTTTCCTTTAATGCCCATGGCGTTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGACTTCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACGTCTAAGAAACCATTATTATCATGACATTAACCTATAAAAATAGGCGTATCACGAGGCCCTTAGGCCAAATAGGCCGTTCAGATCCTTCCGTATTTAGCCAGTATGTTCTCTAGTGTGGTTCGTTGTTTTTGCGTGAGCCATGAGAACGAACCATTGAGATCATGCTTACTTTGCATGTCACTCAAAAATTTTGCCTCAAAACTGGTGAGCTGAATTTTTGCAGTTAAAGCATCGTGTAGTGTTTTTCTTAGTCCGTTACGTAGGTAGGAATCTGATGTAATGGTTGTTGGTATTTTGTCACCATTCATTTTTATCTGGTTGTTCTCAAGTTCGGTTACGAGATCCATTTGTCTATCTAGTTCAACTTGGAAAATCAACGTATCAGTCGGGCGGCCTCGCTTATCAACCACCAATTTCATATTGCTGTAAGTGTTTAAATCTTTACTTATTGGTTTCAAAACCCATTGGTTAAGCCTTTTAAACTCATGGTAGTTATTTTCAAGCATTAACATGAACTTAAATTCATCAAGGCTAATCTCTATATTTGCCTTGTGAGTTTTCTTTTGTGTTAGTTCTTTTAATAACCACTCATAAATCCTCATAGAGTATTTGTTTTCAAAAGACTTAACATGTTCCAGATTATATTTTATGAATTTTTTTAACTGGAAAAGATAAGGCAATATCTCTTCACTAAAAACTAATTCTAATTTTTCGCTTGAGAACTTGGCATAGTTTGTCCACTGGAAAATCTCAAAGCCTTTAACCAAAGGATTCCTGATTTCCACAGTTCTCGTCATCAGCTCTCTGGTTGCTTTAGCTAATACACCATAAGCATTTTCCCTACTGATGTTCATCATCTGAGCGTATTGGTTATAAGTGAACGATACCGTCCGTTCTTTCCTTGTAGGGTTTTCAATCGTGGGGTTGAGTAGTGCCACACAGCATAAAATTAGCTTGGTTTCATGCTCCGTTAAGTCATAGCGACTAATCGCTAGTTCATTTGCTTTGAAAACAACTAATTCAGACATACATCTCAATTGGTCTAGGTGATTTTAATCACTATACCAATTGAGATGGGCTAGTCAATGATAATTACTAGTCCTTTTCCTTTGAGTTGTGGGTATCTGTAAATTCTGCTAGACCTTTGCTGGAAAACTTGTAAATTCTGCTAGACCCTCTGTAAATTCCGCTAGACCTTTGTGTGTTTTTTTTGTTTATATTCAAGTGGTTATAATTTATAGAATAAAGAAAGAATAAAAAAAGATAAAAAGAATAGATCCCAGCCCTGTGTATAACTCACTACTTTAGTCAGTTCCGCAGTATTACAAAAGGATGTCGCAAACGCTGTTTGCTCCTCTACAAAACAGACCTTAAAACCCTAAAGGCTTAAGTAGCACCCTCGCAAGCTCGGGCAAATCGCTGAATATTCCTTTTGTCTCCGACCATCAGGCACCTGAGTCGCTGTCTTTTTCGTGACATTCAGTTCGCTGCGCTCACGGCTCTGGCAGTGAATGGGGGTAAATGGCACTACAGGCGCCTTTTATGGATTCATGCAAGGAAACTACCCATAATACAAGAAAAGCCCGTCACGGGCTTCTCAGGGCGTTTTATGGCGGGTCTGCTATGTGGTGCTATCTGACTTTTTGCTGTTCAGCAGTTCCTGCCCTCTGATTTTCCAGTCTGACCACTTCGGATTATCCCGTGACAGGTCATTCAGACTGGCTAATGCACCCAGTAAGGCAGCGGTATCATCAACAGGCTTACCCGTCTTACTGTCAAGAGGACATCCGGTCAGATAACCGTCATCTTCGGCTACTGTCTAGGGCGGCGGATTTGTCCTACTCAGGAGAGCGTTCACCGACAAACAACAGATAAAACGAAAGGCCCAGTCTTTCGACTGAGCCTTTCGTTTTATTTGATGCACTAGTGCCGATCATATTCAATAACCCTTAATATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATTAGGTCTGAAGAGGAGTTTACGTCCCATATGGAGTCCCGCTTACGCCCCGCCCTGCCACTCATCGCAGTACTGTTGTAATTCATTAAGCATTCTGCCGACATGGAAGCCATCACAGACGGCATGATGAACCTGAATCGCCAGCGGCATCAGCACCTTGTCGCCTTGCGTATAATATTTGCCCATGGTGAAAACGGGGGCGAAGAAGTTGTCCATATTGGCCACGTTTAAATCAAAACTGGTGAAACTCACCCAGGGATTGGCTGAGACGAAAAACATATTCTCAATAAACCCTTTAGGGAAATAGGCCAGGTTTTCACCGTAACACGCCACATCTTGCGAATATATGTGTAGAAACTGCCGGAAATCGTCGTGGTATTCACTCCAGAGCGATGAAAACGTTTCAGTTTGCTCATGGAAAACGGTGTAACAAGGGTGAACACTATCCCATATCACCAGCTCACCGTCTTTCATTGCCATACGAAATTCCGGATGAGCATTCATCAGGCGGGCAAGAATGTGAATAAAGGCCGGATAAAACTTGTGCTTATTTTTCTTTACGGTCTTTAAAAAGGCCGTAATATCCAGCTGAACGGTCTGGTTATAGGTACATTGAGCAACTGACTGAAATGCCTCAAAATGTTCTTTACGATGCCATTGGGATATATCAACGGTGGTATATCCAGTGATTTTTTTCTCCATTTTAGCTTCCTTAGCTCCTGAAAATCTCGATAACTCAAAAAATACGCCCGGTAGTGATCTTATTTCATTATGGTGAAAGTTGGAACCTCTTACGTGCCGATCAGACGTCATTGCGTTGCTAGCCAAGCTTAGGATCCGGAACCCTTAATATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATTAGGTCCCTCGAAGAGGTTCACTAGCTATCTAGAGCTTGGACTCCTGTTGATAGATCCAGTAATGACCTCAGAACTCCATCTGGATTTGTTCAGAACGCTCGGTTGCCGCCGGGCGTTTTTTATTGGTGAGAATCCAAGCCCGGGAAACGGGATCCTGATCTTGATCAACCGAGGTCACAACATAGTAAAAGCGCTATTGGTAATGGTACAATCGCGCGTTTACACTTATTCAGAACGATTTTTTTCAGGAGGGCCTACTTGTCACACAGGACGGTAATGTCGTGCCCGGTTATTGAGCTGACACAGCAACTTATTCGTCGCCCCTCCCTGAGTCCGGATGACGCAGGCTGTCAGGCATTAATGATTGAACGCCTGCGTAAAATCGGTTTTACCATTGAGCATATGGATTTTGGCGACACGCAAAATTTTTGGGCATGGCGTGGGCGTGGCGAAACGCTGGCGTTCGCCGGGCATACTGACGTCGTACCGGCTGGCGATGTCGATCGCTGGATCAATCCGCCGTTTGAGCCTACGATTCGCGACGGAATGTTGTTCGGTCGCGGCGCGGCGGATATGAAAGGTTCACTGGCGGCCATGGTGGTGGCTGCTGAACGTTTTGTTGCGCAGCATCCTCATCACCGGGGCCGCCTCGCATTTTTGATTACCTCTGATGAGGAAGCCAGCGCAAAAAATGGCACCGTAAAGGTGGTTGAAGCGCTGATGGCCCGTAACGAGCGGCTGGATTACTGTCTGGTCGGCGAACCTTCCAGTACTGAAATTGTGGGCGATGTCGTCAAAAACGGGCGTCGCGGTTCTCTCACCTGTAACCTCACTATCCATGGCGTTCAGGGGCACGTCGCCTATCCGCATCTGGCGGATAACCCTGTTCATCGCGCCGCGCCTTTTCTTAATGAACTGGTCGCTATCGAGTGGGATCGGGGCAATGACTTTTTCCCGGCCACCAGTATGCAGGTAGCCAATATCCAGGCAGGCACCGGCAGCAATAATGTCATTCCCGGCGAACTGTTCGTGCAGTTTAACTTCCGTTTCAGCACGGAACTGACCGATGAGATGATCAAAGAGCGGGTACATGCGCTGCTTGAAAAGCATCAGCTACGCTATACCGTAGACTGGTGGCTTTCCGGGCAGCCGTTCCTGACCGCACGCGGCAAGCTGGTGGACGCGGTGGTAAACGCCATTGAGCACTATAATGAAATTAAACCGCAATTACTGACGACGGGCGGTACGTCCGACGGACGTTTTATCGCCCGTATGGGAGCGCAGGTGGTAGAACTGGGGCCGGTGAACGCCACCATTCATAAAATTAATGAATGTGTGAATGCCGCCGATCTCCAGCTACTGGCCCGTATGTATCAACGCATTATGGAACAGCTCGTCGCCCATCACCATCACCATCACTAAGATTACTTCGCATTGCAATCAGCTACGGACTCAAGCTTACGTCAGGTCATACGATGAAGGCGATAAGTCGCGTAAGTTGCTAGCCCACGCGGCTCACCTTCACGGGTGGGCCTTTCTTCGCGATCCACATG
CATGGTCATAGCTGTTTCCTTTAATGCCCATGGCGTTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGACTTCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACGTCTAAGAAACCATTATTATCATGACATTAACCTATAAAAATAGGCGTATCACGAGGCCCTTAGGCCAAATAGGCCGTTCAGATCCTTCCGTATTTAGCCAGTATGTTCTCTAGTGTGGTTCGTTGTTTTTGCGTGAGCCATGAGAACGAACCATTGAGATCATGCTTACTTTGCATGTCACTCAAAAATTTTGCCTCAAAACTGGTGAGCTGAATTTTTGCAGTTAAAGCATCGTGTAGTGTTTTTCTTAGTCCGTTACGTAGGTAGGAATCTGATGTAATGGTTGTTGGTATTTTGTCACCATTCATTTTTATCTGGTTGTTCTCAAGTTCGGTTACGAGATCCATTTGTCTATCTAGTTCAACTTGGAAAATCAACGTATCAGTCGGGCGGCCTCGCTTATCAACCACCAATTTCATATTGCTGTAAGTGTTTAAATCTTTACTTATTGGTTTCAAAACCCATTGGTTAAGCCTTTTAAACTCATGGTAGTTATTTTCAAGCATTAACATGAACTTAAATTCATCAAGGCTAATCTCTATATTTGCCTTGTGAGTTTTCTTTTGTGTTAGTTCTTTTAATAACCACTCATAAATCCTCATAGAGTATTTGTTTTCAAAAGACTTAACATGTTCCAGATTATATTTTATGAATTTTTTTAACTGGAAAAGATAAGGCAATATCTCTTCACTAAAAACTAATTCTAATTTTTCGCTTGAGAACTTGGCATAGTTTGTCCACTGGAAAATCTCAAAGCCTTTAACCAAAGGATTCCTGATTTCCACAGTTCTCGTCATCAGCTCTCTGGTTGCTTTAGCTAATACACCATAAGCATTTTCCCTACTGATGTTCATCATCTGAGCGTATTGGTTATAAGTGAACGATACCGTCCGTTCTTTCCTTGTAGGGTTTTCAATCGTGGGGTTGAGTAGTGCCACACAGCATAAAATTAGCTTGGTTTCATGCTCCGTTAAGTCATAGCGACTAATCGCTAGTTCATTTGCTTTGAAAACAACTAATTCAGACATACATCTCAATTGGTCTAGGTGATTTTAATCACTATACCAATTGAGATGGGCTAGTCAATGATAATTACTAGTCCTTTTCCTTTGAGTTGTGGGTATCTGTAAATTCTGCTAGACCTTTGCTGGAAAACTTGTAAATTCTGCTAGACCCTCTGTAAATTCCGCTAGACCTTTGTGTGTTTTTTTTGTTTATATTCAAGTGGTTATAATTTATAGAATAAAGAAAGAATAAAAAAAGATAAAAAGAATAGATCCCAGCCCTGTGTATAACTCACTACTTTAGTCAGTTCCGCAGTATTACAAAAGGATGTCGCAAACGCTGTTTGCTCCTCTACAAAACAGACCTTAAAACCCTAAAGGCTTAAGTAGCACCCTCGCAAGCTCGGGCAAATCGCTGAATATTCCTTTTGTCTCCGACCATCAGGCACCTGAGTCGCTGTCTTTTTCGTGACATTCAGTTCGCTGCGCTCACGGCTCTGGCAGTGAATGGGGGTAAATGGCACTACAGGCGCCTTTTATGGATTCATGCAAGGAAACTACCCATAATACAAGAAAAGCCCGTCACGGGCTTCTCAGGGCGTTTTATGGCGGGTCTGCTATGTGGTGCTATCTGACTTTTTGCTGTTCAGCAGTTCCTGCCCTCTGATTTTCCAGTCTGACCACTTCGGATTATCCCGTGACAGGTCATTCAGACTGGCTAATGCACCCAGTAAGGCAGCGGTATCATCAACAGGCTTACCCGTCTTACTGTCAAGAGGACATCCGGTCAGATAACCGTCATCTTCGGCTACTGTCTAGGGCGGCGGATTTGTCCTACTCAGGAGAGCGTTCACCGACAAACAACAGATAAAACGAAAGGCCCAGTCTTTCGACTGAGCCTTTCGTTTTATTTGATGCACTAGTGCCGATCATATTCAATAACCCTTAATATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATTAGGTCTGAAGAGGAGTTTACGTCCCATATGGAGTCCCGCTTACGCCCCGCCCTGCCACTCATCGCAGTACTGTTGTAATTCATTAAGCATTCTGCCGACATGGAAGCCATCACAGACGGCATGATGAACCTGAATCGCCAGCGGCATCAGCACCTTGTCGCCTTGCGTATAATATTTGCCCATGGTGAAAACGGGGGCGAAGAAGTTGTCCATATTGGCCACGTTTAAATCAAAACTGGTGAAACTCACCCAGGGATTGGCTGAGACGAAAAACATATTCTCAATAAACCCTTTAGGGAAATAGGCCAGGTTTTCACCGTAACACGCCACATCTTGCGAATATATGTGTAGAAACTGCCGGAAATCGTCGTGGTATTCACTCCAGAGCGATGAAAACGTTTCAGTTTGCTCATGGAAAACGGTGTAACAAGGGTGAACACTATCCCATATCACCAGCTCACCGTCTTTCATTGCCATACGAAATTCCGGATGAGCATTCATCAGGCGGGCAAGAATGTGAATAAAGGCCGGATAAAACTTGTGCTTATTTTTCTTTACGGTCTTTAAAAAGGCCGTAATATCCAGCTGAACGGTCTGGTTATAGGTACATTGAGCAACTGACTGAAATGCCTCAAAATGTTCTTTACGATGCCATTGGGATATATCAACGGTGGTATATCCAGTGATTTTTTTCTCCATTTTAGCTTCCTTAGCTCCTGAAAATCTCGATAACTCAAAAAATACGCCCGGTAGTGATCTTATTTCATTATGGTGAAAGTTGGAACCTCTTACGTGCCGATCAGACGTCATTGCGTTGCTAGCCAAGCTTAGGATCCGGAACCCTTAATATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATTAGGTCCCTCGAAGAGGTTCACTAGCTATCTAGAGCTTGGACTCCTGTTGATAGATCCAGTAATGACCTCAGAACTCCATCTGGATTTGTTCAGAACGCTCGGTTGCCGCCGGGCGTTTTTTATTGGTGAGAATCCAAGCCCGGGAAACGGGATCCTGATCTTGATCAACCGAGGTCACAACATAGTAAAAGCGCTATTGGTAATGGTACAATCGCGCGTTTACACTTATTCAGAACGATTTTTTTCAGGAGGGCCTACTTGTCACACAGGACGGTAATGTCGTGCCCGGTTATTGAGCTGACACAGCAACTTATTCGTCGCCCCTCCCTGAGTCCGGATGACGCAGGCTGTCAGGCATTAATGATTGAACGCCTGCGTAAAATCGGTTTTACCATTGAGCATATGGATTTTGGCGACACGCAAAATTTTTGGGCATGGCGTGGGCGTGGCGAAACGCTGGCGTTCGCCGGGCATACTGACGTCGTACCGGCTGGCGATGTCGATCGCTGGATCAATCCGCCGTTTGAGCCTACGATTCGCGACGGAATGTTGTTCGGTCGCGGCGCGGCGGATATGAAAGGTTCACTGGCGGCCATGGTGGTGGCTGCTGAACGTTTTGTTGCGCAGCATCCTCATCACCGGGGCCGCCTCGCATTTTTGATTACCTCTGATGAGGAAGCCAGCGCAAAAAATGGCACCGTAAAGGTGGTTGAAGCGCTGATGGCCCGTAACGAGCGGCTGGATTACTGTCTGGTCGGCGAACCTTCCAGTACTGAAATTGTGGGCGATGTCGTCAAAAACGGGCGTCGCGGTTCTCTCACCTGTAACCTCACTATCCATGGCGTTCAGGGGCACGTCGCCTATCCGCATCTGGCGGATAACCCTGTTCATCGCGCCGCGCCTTTTCTTAATGAACTGGTCGCTATCGAGTGGGATCGGGGCAATGACTTTTTCCCGGCCACCAGTATGCAGGTAGCCAATATCCAGGCAGGCACCGGCAGCAATAATGTCATTCCCGGCGAACTGTTCGTGCAGTTTAACTTCCGTTTCAGCACGGAACTGACCGATGAGATGATCAAAGAGCGGGTACATGCGCTGCTTGAAAAGCATCAGCTACGCTATACCGTAGACTGGTGGCTTTCCGGGCAGCCGTTCCTGACCGCACGCGGCAAGCTGGTGGACGCGGTGGTAAACGCCATTGAGCACTATAATGAAATTAAACCGCAATTACTGACGACGGGCGGTACGTCCGACGGACGTTTTATCGCCCGTATGGGAGCGCAGGTGGTAGAACTGGGGCCGGTGAACGCCACCATTCATAAAATTAATGAATGTGTGAATGCCGCCGATCTCCAGCTACTGGCCCGTATGTATCAACGCATTATGGAACAGCTCGTCGCCCATCACCATCACCATCACTAAGATTACTTCGCATTGCAATCAGCTACGGACTCAAGCTTACGTCAGGTCATACGATGAAGGCGATAAGTCGCGTAAGTTGCTAGCCCACGCGGCTCACCTTCACGGGTGGGCCTTTCTTCGCGATCCACATG
【0383】
配列番号１１：ＰｓｓｅＡ－ｈｌｙＡ－ｌｏｘｐ－ＫｎａＲ－ｌｏｘｐフォワードプライマー
TTCACAGAAAAGTGTTGCCCCCTTCCATGGCGGAAGGGGGACAAAGGTGAATTTGTCCTACTCAGGAGAGCGTTCA
TTCACAGAAAAGTGTTGCCCCCTTCCATGGCGGAAGGGGGACAAAGGTGAATTTGTCCTACTCAGGAGAGCGTTCA
【0384】
配列番号１２：ＰｓｓｅＡ－ｈｌｙＡ－ｌｏｘｐ－ＫｎａＲ－ｌｏｘｐリバースプライマー
TCTGACGTACACAGCAATTTTGCGTTACCTGTTAATCGAGATTGAAACACCGAAGAAAGGCCCACCCG
TCTGACGTACACAGCAATTTTGCGTTACCTGTTAATCGAGATTGAAACACCGAAGAAAGGCCCACCCG
【0385】
配列番号１３：Ｐｓｓｂｐ１－ｄａｐＥ－Ｃｍフォワードプライマー
TTGGTTTCAGTGAATCCCGTTATCAGCAGTTTTTTGATGAGGTGTAGTCTATTTGTCCTACTCAGGAGAGCG
TTGGTTTCAGTGAATCCCGTTATCAGCAGTTTTTTGATGAGGTGTAGTCTATTTGTCCTACTCAGGAGAGCG
【0386】
配列番号１４：Ｐｓｓｂｐ１－ｄａｐＥ－Ｃｍリバースプライマー
CAATATTTTGCCAGCCAGTCCATGCTTATTTCCTCTTACCGGAACGCTCACGAAGAAAGGCCCACCCG
CAATATTTTGCCAGCCAGTCCATGCTTATTTCCTCTTACCGGAACGCTCACGAAGAAAGGCCCACCCG
【0387】
配列番号１５：ＰｄａｐＥ－ｄａｐＥ－ｌｏｘｐ－ＫｎａＲ－ｌｏｘｐフォワードプライマー
CAATATTTTGCCAGCCAGTCCATGCTTATTTCCTCTTACCGGAACGCTCAATTTGTCCTACTCAG
CAATATTTTGCCAGCCAGTCCATGCTTATTTCCTCTTACCGGAACGCTCAATTTGTCCTACTCAG
【0388】
配列番号１６：ＰｄａｐＥ－ｄａｐＥ－ｌｏｘｐ－ＫｎａＲ－ｌｏｘｐリバースプライマー
TTGGTTTCAGTGAATCCCGTTATCAGCAGTTTTTTGATGAGGTGTAGTCTCGAAGAAAGGCCCACCCG
TTGGTTTCAGTGAATCCCGTTATCAGCAGTTTTTTGATGAGGTGTAGTCTCGAAGAAAGGCCCACCCG
【0389】
配列番号１７：ｌｏｘｐ－ＫｎａＲ－ｌｏｘｐフォワードプライマー
ATGAAAAAAATAATGCTAGTTTTTATTACACTTATATTAGTTAGTCTACCGCCGATCATATTCAATAACCC
ATGAAAAAAATAATGCTAGTTTTTATTACACTTATATTAGTTAGTCTACCGCCGATCATATTCAATAACCC
【0390】
配列番号１８：ｌｏｘｐ－ＫｎａＲ－ｌｏｘｐリバースプライマー
TTATTCGATTGGATTATCTACTTTATTACTATATTTCGGATAAAGCGTGGCTAGTGAACCTCTTCGAGGG
TTATTCGATTGGATTATCTACTTTATTACTATATTTCGGATAAAGCGTGGCTAGTGAACCTCTTCGAGGG
【0391】
配列番号１９：ＰｈｔｒＡ－ｈｔｒＡ－ｌｏｘｐ－ａａｄＡ－ｌｏｘｐフォワードプライマー
GATAATGTATTCACAGGTTGCTCCGGGCTTGAAAAAGTTAAATGACATCCATTTGTCCTACTCAGGAGAGC
GATAATGTATTCACAGGTTGCTCCGGGCTTGAAAAAGTTAAATGACATCCATTTGTCCTACTCAGGAGAGC
【0392】
配列番号２０：ＰｈｔｒＡ－ｈｔｒＡ－ｌｏｘｐ－ａａｄＡ－ｌｏｘｐリバースプライマー
AAAAGGAACTTTTTACCTTTTCGCCTTCCCGTTTCGTTCAACTTAGTATACGAAGAAAGGCCCACCC
AAAAGGAACTTTTTACCTTTTCGCCTTCCCGTTTCGTTCAACTTAGTATACGAAGAAAGGCCCACCC
【0393】
配列番号２１：ｍｓｂＢ－ＨＲ－ｌｏｘｐ－ＫｎａＲ－ｌｏｘｐフォワードプライマー
AGGTAGTACAGGGTTTGTCAGCATAAAGCCTCTCTTACGAGAGGCTTTATGCCGATCATATTCAATAACCC
AGGTAGTACAGGGTTTGTCAGCATAAAGCCTCTCTTACGAGAGGCTTTATGCCGATCATATTCAATAACCC
【0394】
配列番号２２：ｍｓｂＢ－ＨＲ－ｌｏｘｐ－ＫｎａＲ－ｌｏｘｐリバースプライマー
TCGCTACACTATTCACAATTCCTTTTCGCGTCAGCAGACCCTGGAAAAGCCTAGTGAACCTCTTCGAGGG
TCGCTACACTATTCACAATTCCTTTTCGCGTCAGCAGACCCTGGAAAAGCCTAGTGAACCTCTTCGAGGG
【0395】
配列番号２３：ｌｐｐ－ＨＲ－ｌｏｘｐ－ＫｎａＲ－ｌｏｘｐフォワードプライマー
CGGACAAAAAAATGGCGCACGATGTGCGCCATTTTATATTGTGCGTCAAAGCCGATCATATTCAATAACCC
CGGACAAAAAAATGGCGCACGATGTGCGCCATTTTATATTGTGCGTCAAAGCCGATCATATTCAATAACCC
【0396】
配列番号２４：ｌｐｐ－ＨＲ－ｌｏｘｐ－ＫｎａＲ－ｌｏｘｐリバースプライマー
AATACTTGTAACGCTACATGGAGATTAACTCAATCTAGAGGGTATTAATACTAGTGAACCTCTTCGAGGG
AATACTTGTAACGCTACATGGAGATTAACTCAATCTAGAGGGTATTAATACTAGTGAACCTCTTCGAGGG
【0397】
配列番号２５：ｆｌｉＣ－ＨＲ－ｌｏｘｐ－ＫｎａＲ－ｌｏｘｐフォワードプライマー
GCTTTCGCTGCCTTGATTGTGTACCACGTGTCGGTGAATCAATCGCCGGAGCCGATCATATTCAATAACCC
GCTTTCGCTGCCTTGATTGTGTACCACGTGTCGGTGAATCAATCGCCGGAGCCGATCATATTCAATAACCC
【0398】
配列番号２６：ｆｌｉＣ－ＨＲ－ｌｏｘｐ－ＫｎａＲ－ｌｏｘｐリバースプライマー
ACGGTGAGAAACCGTGGGCAACAGCCCAATAACATCAAGTTGTAATTGATCTAGTGAACCTCTTCGAGGG
ACGGTGAGAAACCGTGGGCAACAGCCCAATAACATCAAGTTGTAATTGATCTAGTGAACCTCTTCGAGGG
【0399】
配列番号２７：ｄａｐＥ（スクシニル－１，１－ジアミノピメリン酸デスクシニラーゼをコードする、遺伝子ＩＤ：１２５４００５）
ATGTCGTGCCCGGTTATTGAGCTGACACAGCAACTTATTCGTCGCCCCTCCCTGAGTCCGGATGACGCAGGCTGTCAGGCATTAATGATTGAACGCCTGCGTAAAATCGGTTTTACCATTGAGCATATGGATTTTGGCGACACGCAAAATTTTTGGGCATGGCGTGGGCGTGGCGAAACGCTGGCGTTCGCCGGGCATACTGACGTCGTACCGGCTGGCGATGTCGATCGCTGGATCAATCCGCCGTTTGAGCCTACGATTCGCGACGGAATGTTGTTCGGTCGCGGCGCGGCGGATATGAAAGGTTCACTGGCGGCCATGGTGGTGGCTGCTGAACGTTTTGTTGCGCAGCATCCTCATCACCGGGGCCGCCTCGCATTTTTGATTACCTCTGATGAGGAAGCCAGCGCAAAAAATGGCACCGTAAAGGTGGTTGAAGCGCTGATGGCCCGTAACGAGCGGCTGGATTACTGTCTGGTCGGCGAACCTTCCAGTACTGAAATTGTGGGCGATGTCGTCAAAAACGGGCGTCGCGGTTCTCTCACCTGTAACCTCACTATCCATGGCGTTCAGGGGCACGTCGCCTATCCGCATCTGGCGGATAACCCTGTTCATCGCGCCGCGCCTTTTCTTAATGAACTGGTCGCTATCGAGTGGGATCGGGGCAATGACTTTTTCCCGGCCACCAGTATGCAGGTAGCCAATATCCAGGCAGGCACCGGCAGCAATAATGTCATTCCCGGCGAACTGTTCGTGCAGTTTAACTTCCGTTTCAGCACGGAACTGACCGATGAGATGATCAAAGAGCGGGTACATGCGCTGCTTGAAAAGCATCAGCTACGCTATACCGTAGACTGGTGGCTTTCCGGGCAGCCGTTCCTGACCGCACGCGGCAAGCTGGTGGACGCGGTGGTAAACGCCATTGAGCACTATAATGAAATTAAACCGCAATTACTGACGACGGGCGGTACGTCCGACGGACGTTTTATCGCCCGTATGGGAGCGCAGGTGGTAGAACTGGGGCCGGTGAACGCCACCATTCATAAAATTAATGAATGTGTGAATGCCGCCGATCTCCAGCTACTGGCCCGTATGTATCAACGCATTATGGAACAGCTCGTCGCCTGA
ATGTCGTGCCCGGTTATTGAGCTGACACAGCAACTTATTCGTCGCCCCTCCCTGAGTCCGGATGACGCAGGCTGTCAGGCATTAATGATTGAACGCCTGCGTAAAATCGGTTTTACCATTGAGCATATGGATTTTGGCGACACGCAAAATTTTTGGGCATGGCGTGGGCGTGGCGAAACGCTGGCGTTCGCCGGGCATACTGACGTCGTACCGGCTGGCGATGTCGATCGCTGGATCAATCCGCCGTTTGAGCCTACGATTCGCGACGGAATGTTGTTCGGTCGCGGCGCGGCGGATATGAAAGGTTCACTGGCGGCCATGGTGGTGGCTGCTGAACGTTTTGTTGCGCAGCATCCTCATCACCGGGGCCGCCTCGCATTTTTGATTACCTCTGATGAGGAAGCCAGCGCAAAAAATGGCACCGTAAAGGTGGTTGAAGCGCTGATGGCCCGTAACGAGCGGCTGGATTACTGTCTGGTCGGCGAACCTTCCAGTACTGAAATTGTGGGCGATGTCGTCAAAAACGGGCGTCGCGGTTCTCTCACCTGTAACCTCACTATCCATGGCGTTCAGGGGCACGTCGCCTATCCGCATCTGGCGGATAACCCTGTTCATCGCGCCGCGCCTTTTCTTAATGAACTGGTCGCTATCGAGTGGGATCGGGGCAATGACTTTTTCCCGGCCACCAGTATGCAGGTAGCCAATATCCAGGCAGGCACCGGCAGCAATAATGTCATTCCCGGCGAACTGTTCGTGCAGTTTAACTTCCGTTTCAGCACGGAACTGACCGATGAGATGATCAAAGAGCGGGTACATGCGCTGCTTGAAAAGCATCAGCTACGCTATACCGTAGACTGGTGGCTTTCCGGGCAGCCGTTCCTGACCGCACGCGGCAAGCTGGTGGACGCGGTGGTAAACGCCATTGAGCACTATAATGAAATTAAACCGCAATTACTGACGACGGGCGGTACGTCCGACGGACGTTTTATCGCCCGTATGGGAGCGCAGGTGGTAGAACTGGGGCCGGTGAACGCCACCATTCATAAAATTAATGAATGTGTGAATGCCGCCGATCTCCAGCTACTGGCCCGTATGTATCAACGCATTATGGAACAGCTCGTCGCCTGA
【0400】
配列番号２８：ｈｔｒＡ（セリンプロテアーゼをコードする、遺伝子ＩＤ：１２５１７２７）
ATGAAAAAAACCACATTAGCAATGAGTGCACTGGCTCTGAGTTTAGGTTTGGCATTGTCGCCTCTGTCTGCCACGGCGGCTGAAACGTCCTCTTCAGCAATGACTGCCCAGCAGATGCCAAGCCTGGCACCGATGCTCGAAAAAGTGATGCCATCGGTGGTCAGTATTAATGTTGAAGGTAGCACCACGGTGAATACGCCGCGTATGCCGCGTAATTTCCAGCAGTTCTTTGGCGATGACTCCCCGTTCTGCCAGGACGGTTCTCCGTTCCAGAATTCTCCGTTCTGCCAGGGCGGCGGTAACGGCGGCAACGGCGGTCAACAACAGAAATTCATGGCGCTGGGCTCCGGCGTAATTATTGACGCCGCGAAGGGCTACGTCGTCACCAACAACCACGTGGTTGATAACGCCAGCGTGATTAAAGTACAGCTTAGCGATGGGCGTAAATTCGATGCTAAAGTGGTGGGCAAAGATCCGCGTTCTGATATCGCGCTGATTCAAATTCAGAATCCGAAGAACCTGACGGCGATTAAGCTGGCGGACTCCGACGCGCTGCGCGTGGGGGATTATACCGTCGCTATTGGTAACCCGTTTGGTCTGGGCGAAACGGTGACGTCAGGTATCGTTTCGGCGCTGGGGCGTAGCGGCCTGAACGTAGAAAATTACGAGAACTTTATTCAGACCGACGCCGCGATTAACCGTGGTAACTCCGGCGGCGCGCTGGTGAACCTGAACGGTGAGCTGATCGGTATTAACACCGCGATTCTGGCGCCGGACGGCGGCAACATCGGTATCGGCTTCGCTATCCCCAGTAACATGGTGAAAAACCTGACGTCGCAGATGGTGGAATACGGCCAGGTGAAACGCGGCGAACTGGGGATCATGGGGACTGAGCTGAATTCCGAATTGGCGAAAGCGATGAAAGTCGACGCCCAGCGAGGCGCGTTCGTCAGCCAGGTGATGCCGAATTCGTCCGCGGCGAAAGCGGGTATCAAAGCCGGGGATGTCATTACCTCGCTGAACGGTAAACCGATCAGCAGCTTTGCGGCGCTGCGCGCTCAGGTCGGCACTATGCCGGTCGGCAGCAAAATCAGCCTCGGTCTGCTGCGTGAAGGTAAAGCGATTACGGTGAATCTGGAACTGCAGCAGAGCAGCCAGAGTCAGGTTGATTCCAGCACCATCTTCAGCGGGATTGAAGGCGCTGAAATGAGCAATAAAGGCCAGGATAAAGGCGTTGTGGTGAGCAGCGTGAAAGCGAACTCACCCGCCGCGCAAATTGGCCTCAAAAAAGGCGATGTGATTATCGGCGCTAACCAGCAGCCGGTGAAAAATATCGCCGAGCTGCGTAAGATTCTCGACAGCAAGCCGTCGGTTCTGGCGCTGAATATTCAGCGTGGTGATAGTTCTATTTATTTGCTGATGCAGTAA
ATGAAAAAAACCACATTAGCAATGAGTGCACTGGCTCTGAGTTTAGGTTTGGCATTGTCGCCTCTGTCTGCCACGGCGGCTGAAACGTCCTCTTCAGCAATGACTGCCCAGCAGATGCCAAGCCTGGCACCGATGCTCGAAAAAGTGATGCCATCGGTGGTCAGTATTAATGTTGAAGGTAGCACCACGGTGAATACGCCGCGTATGCCGCGTAATTTCCAGCAGTTCTTTGGCGATGACTCCCCGTTCTGCCAGGACGGTTCTCCGTTCCAGAATTCTCCGTTCTGCCAGGGCGGCGGTAACGGCGGCAACGGCGGTCAACAACAGAAATTCATGGCGCTGGGCTCCGGCGTAATTATTGACGCCGCGAAGGGCTACGTCGTCACCAACAACCACGTGGTTGATAACGCCAGCGTGATTAAAGTACAGCTTAGCGATGGGCGTAAATTCGATGCTAAAGTGGTGGGCAAAGATCCGCGTTCTGATATCGCGCTGATTCAAATTCAGAATCCGAAGAACCTGACGGCGATTAAGCTGGCGGACTCCGACGCGCTGCGCGTGGGGGATTATACCGTCGCTATTGGTAACCCGTTTGGTCTGGGCGAAACGGTGACGTCAGGTATCGTTTCGGCGCTGGGGCGTAGCGGCCTGAACGTAGAAAATTACGAGAACTTTATTCAGACCGACGCCGCGATTAACCGTGGTAACTCCGGCGGCGCGCTGGTGAACCTGAACGGTGAGCTGATCGGTATTAACACCGCGATTCTGGCGCCGGACGGCGGCAACATCGGTATCGGCTTCGCTATCCCCAGTAACATGGTGAAAAACCTGACGTCGCAGATGGTGGAATACGGCCAGGTGAAACGCGGCGAACTGGGGATCATGGGGACTGAGCTGAATTCCGAATTGGCGAAAGCGATGAAAGTCGACGCCCAGCGAGGCGCGTTCGTCAGCCAGGTGATGCCGAATTCGTCCGCGGCGAAAGCGGGTATCAAAGCCGGGGATGTCATTACCTCGCTGAACGGTAAACCGATCAGCAGCTTTGCGGCGCTGCGCGCTCAGGTCGGCACTATGCCGGTCGGCAGCAAAATCAGCCTCGGTCTGCTGCGTGAAGGTAAAGCGATTACGGTGAATCTGGAACTGCAGCAGAGCAGCCAGAGTCAGGTTGATTCCAGCACCATCTTCAGCGGGATTGAAGGCGCTGAAATGAGCAATAAAGGCCAGGATAAAGGCGTTGTGGTGAGCAGCGTGAAAGCGAACTCACCCGCCGCGCAAATTGGCCTCAAAAAAGGCGATGTGATTATCGGCGCTAACCAGCAGCCGGTGAAAAATATCGCCGAGCTGCGTAAGATTCTCGACAGCAAGCCGTCGGTTCTGGCGCTGAATATTCAGCGTGGTGATAGTTCTATTTATTTGCTGATGCAGTAA
【0401】
配列番号２９：ｈｌｙＡ（リステリアヘモリジンをコードする、遺伝子ＩＤ：９８７０３３）
ATGAAAAAAATAATGCTAGTTTTTATTACACTTATATTAGTTAGTCTACCAATTGCGCAACAAACTGAAGCAAAGGATGCATCTGCATTCAATAAAGAAAATTCAATTTCATCCATGGCACCACCAGCATCTCCGCCTGCAAGTCCTAAGACGCCAATCGAAAAGAAACACGCGGATGAAATCGATAAGTATATACAAGGATTGGACTACAATAAAAACAATGTATTAGTATACCACGGAGATGCAGTGACAAATGTGCCGCCAAGAAAAGGTTACAAAGATGGAAATGAATATATTGTTGTGGAGAAAAAGAAGAAATCCATCAATCAAAATAATGCAGACATTCAAGTTGTGAATGCAATTTCGAGCCTAACCTATCCAGGTGCTCTCGTAAAAGCGAATTCGGAATTAGTAGAAAATCAACCAGATGTTCTCCCTGTAAAACGTGATTCATTAACACTCAGCATTGATTTGCCAGGTATGACTAATCAAGACAATAAAATCGTTGTAAAAAATGCCACTAAATCAAACGTTAACAACGCAGTAAATACATTAGTGGAAAGATGGAATGAAAAATATGCTCAAGCTTATCCAAATGTAAGTGCAAAAATTGATTATGATGACGAAATGGCTTACAGTGAATCACAATTAATTGCGAAATTTGGTACAGCATTTAAAGCTGTAAATAATAGCTTGAATGTAAACTTCGGCGCAATCAGTGAAGGGAAAATGCAAGAAGAAGTCATTAGTTTTAAACAAATTTACTATAACGTGAATGTTAATGAACCTACAAGACCTTCCAGATTTTTCGGCAAAGCTGTTACTAAAGAGCAGTTGCAAGCGCTTGGAGTGAATGCAGAAAATCCTCCTGCATATATCTCAAGTGTGGCGTATGGCCGTCAAGTTTATTTGAAATTATCAACTAATTCCCATAGTACTAAAGTAAAAGCTGCTTTTGATGCTGCCGTAAGCGGAAAATCTGTCTCAGGTGATGTAGAACTAACAAATATCATCAAAAATTCTTCCTTCAAAGCCGTAATTTACGGAGGTTCCGCAAAAGATGAAGTTCAAATCATCGACGGCAACCTCGGAGACTTACGAGATATTTTGAAAAAAGGCGCTACTTTTAATCGAGAAACACCAGGAGTTCCCATTGCTTATACAACAAACTTCCTAAAAGACAATGAATTAGCTGTTATTAAAAACAACTCAGAATATATTGAAACAACTTCAAAAGCTTATACAGATGGAAAAATTAACATCGATCACTCTGGAGGATACGTTGCTCAATTCAACATTTCTTGGGATGAAGTAAATTATGATCCTGAAGGTAACGAAATTGTTCAACATAAAAACTGGAGCGAAAACAATAAAAGTAAGCTAGCTCATTTCACATCGTCCATCTATTTGCCAGGTAACGCGAGAAATATTAATGTTTACGCTAAAGAATGCACTGGTTTAGCTTGGGAATGGTGGAGAACGGTAATTGATGACCGGAACTTACCACTTGTGAAAAATAGAAATATCTCCATCTGGGGCACCACGCTTTATCCGAAATATAGTAATAAAGTAGATAATCCAATCGAATAA
ATGAAAAAAATAATGCTAGTTTTTATTACACTTATATTAGTTAGTCTACCAATTGCGCAACAAACTGAAGCAAAGGATGCATCTGCATTCAATAAAGAAAATTCAATTTCATCCATGGCACCACCAGCATCTCCGCCTGCAAGTCCTAAGACGCCAATCGAAAAGAAACACGCGGATGAAATCGATAAGTATATACAAGGATTGGACTACAATAAAAACAATGTATTAGTATACCACGGAGATGCAGTGACAAATGTGCCGCCAAGAAAAGGTTACAAAGATGGAAATGAATATATTGTTGTGGAGAAAAAGAAGAAATCCATCAATCAAAATAATGCAGACATTCAAGTTGTGAATGCAATTTCGAGCCTAACCTATCCAGGTGCTCTCGTAAAAGCGAATTCGGAATTAGTAGAAAATCAACCAGATGTTCTCCCTGTAAAACGTGATTCATTAACACTCAGCATTGATTTGCCAGGTATGACTAATCAAGACAATAAAATCGTTGTAAAAAATGCCACTAAATCAAACGTTAACAACGCAGTAAATACATTAGTGGAAAGATGGAATGAAAAATATGCTCAAGCTTATCCAAATGTAAGTGCAAAAATTGATTATGATGACGAAATGGCTTACAGTGAATCACAATTAATTGCGAAATTTGGTACAGCATTTAAAGCTGTAAATAATAGCTTGAATGTAAACTTCGGCGCAATCAGTGAAGGGAAAATGCAAGAAGAAGTCATTAGTTTTAAACAAATTTACTATAACGTGAATGTTAATGAACCTACAAGACCTTCCAGATTTTTCGGCAAAGCTGTTACTAAAGAGCAGTTGCAAGCGCTTGGAGTGAATGCAGAAAATCCTCCTGCATATATCTCAAGTGTGGCGTATGGCCGTCAAGTTTATTTGAAATTATCAACTAATTCCCATAGTACTAAAGTAAAAGCTGCTTTTGATGCTGCCGTAAGCGGAAAATCTGTCTCAGGTGATGTAGAACTAACAAATATCATCAAAAATTCTTCCTTCAAAGCCGTAATTTACGGAGGTTCCGCAAAAGATGAAGTTCAAATCATCGACGGCAACCTCGGAGACTTACGAGATATTTTGAAAAAAGGCGCTACTTTTAATCGAGAAACACCAGGAGTTCCCATTGCTTATACAACAAACTTCCTAAAAGACAATGAATTAGCTGTTATTAAAAACAACTCAGAATATATTGAAACAACTTCAAAAGCTTATACAGATGGAAAAATTAACATCGATCACTCTGGAGGATACGTTGCTCAATTCAACATTTCTTGGGATGAAGTAAATTATGATCCTGAAGGTAACGAAATTGTTCAACATAAAAACTGGAGCGAAAACAATAAAAGTAAGCTAGCTCATTTCACATCGTCCATCTATTTGCCAGGTAACGCGAGAAATATTAATGTTTACGCTAAAGAATGCACTGGTTTAGCTTGGGAATGGTGGAGAACGGTAATTGATGACCGGAACTTACCACTTGTGAAAAATAGAAATATCTCCATCTGGGGCACCACGCTTTATCCGAAATATAGTAATAAAGTAGATAATCCAATCGAATAA
【0402】
配列番号３０：プロモーターｐｅｐＴｐ
GCAGGGGTAAAAGTGACCTGACGCAATATTTGTCTTTTCTTGCTTCTTAATAATGTTGTCACAAAAAGTGAGGGTGACTACATGG
GCAGGGGTAAAAGTGACCTGACGCAATATTTGTCTTTTCTTGCTTCTTAATAATGTTGTCACAAAAAGTGAGGGTGACTACATGG
【0403】
配列番号３１：プロモーターｆｎｒＳｐ
CGCCGCAAAGTTTGAGCGAAGTCAATAAACTCTCTACCCATTCAGGGCAATATCTCTCTTGCAGGTGAATGCAACGTCAAGCGAT
CGCCGCAAAGTTTGAGCGAAGTCAATAAACTCTCTACCCATTCAGGGCAATATCTCTCTTGCAGGTGAATGCAACGTCAAGCGAT
【0404】
配列番号３２：プロモーターｙｓｇＡｐ
TCAGAAGAAGCAAAAAGACACTTTACCGAAGGGTTTAACATTTTTTCGTGATACTCATCACCATGACGCAAATGCGTTGCATAAA
TCAGAAGAAGCAAAAAGACACTTTACCGAAGGGTTTAACATTTTTTCGTGATACTCATCACCATGACGCAAATGCGTTGCATAAA
【0405】
配列番号３３：プロモーターｓｓｂｐ１
AACCGAGGTCACAACATAGTAAAAGCGCTATTGGTAATGGTACAATCGCGCGTTTACACTTATTCAGAACGATTTTTTTCAGGAG
AACCGAGGTCACAACATAGTAAAAGCGCTATTGGTAATGGTACAATCGCGCGTTTACACTTATTCAGAACGATTTTTTTCAGGAG
【0406】
配列番号３４：プロモーターＨｉｐ１
GGATAAAAGTGACCTGACGCAATATTTGTCTTTTCTTGCTTAATAATGTTGTCA
GGATAAAAGTGACCTGACGCAATATTTGTCTTTTCTTGCTTAATAATGTTGTCA
【0407】
配列番号３５：プロモーターＢＢａ＿Ｉ１４０１８
TGTAAGTTTATACATAGGCGAGTACTCTGTTATGG
TGTAAGTTTATACATAGGCGAGTACTCTGTTATGG
【0408】
配列番号３６：プロモーターＢＢａ＿Ｒ１０７４
TTAAATTTCCTCTCGTCAGGCCGGAATAACTCCCTATAATGCGCCACCACACTGATAGTGCTAGTGTAGATCAC
TTAAATTTCCTCTCGTCAGGCCGGAATAACTCCCTATAATGCGCCACCACACTGATAGTGCTAGTGTAGATCAC
【0409】
配列番号３７：プロモーターＰｔｅｔ－Ｆｎｒ
AAAATTGATCTGAATCAATATTTTGACAAAAATTGATCTGAATCAATATTTACTGAGC
AAAATTGATCTGAATCAATATTTTGACAAAAATTGATCTGAATCAATATTTACTGAGC
【0410】
配列番号３８：プロモーターＰｔｅｔ－ａｒｃＡ
GTTAATAAAATGTTATTGACAGTTAATAAAATGTTATACTGAGC
GTTAATAAAATGTTATTGACAGTTAATAAAATGTTATACTGAGC
【0411】
配列番号３９：プロモーターＰｓｓｅＡ
TTAGCACGTTAATTATCTATCGTGTATATG
TTAGCACGTTAATTATCTATCGTGTATATG
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2024-09-10
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
改変された細菌であって、前記細菌が、偏性低酸素誘導プロモーターの制御下に、前記細菌の必須遺伝子を含む低酸素制御型必須遺伝子発現カセットを含み、前記細菌が、非改変型開始株と比較して、内因性抗酸化性ストレス応答経路に関与するか又はそれを制御する少なくとも１つの遺伝子又はその機能的発現産物を欠損している、改変された細菌。
【請求項2】
前記偏性低酸素誘導プロモーターが、ｐｅｐＴｐ、ｆｎｒＳｐ、ｙｓｇＡｐ、ｓｓｂｐ１、Ｈｉｐ１、ＢＢａ＿Ｉ１４０１８、ＢＢａ＿Ｒ１０７４、Ｐｔｅｔ－ａｒｃＡ、及びＰｔｅｔ－Ｆｎｒからなる群から選択され、
好ましくは、前記偏性低酸素誘導プロモーターがｓｓｂｐ１プロモーターである、請求項１に記載の改変された細菌。
【請求項3】
請求項１に記載の改変された細菌であって、前記必須遺伝子の発現産物が、前記細菌内での２，６－ジアミノピメリン酸（ＤＡＰ）の合成に関与し、好気条件下で培養される場合、前記細菌の増殖が、培地中に添加される追加のＤＡＰ又はそのアナログに依存し、
好ましくは、前記必須遺伝子が、ｄａｐＡ、ｄａｐＢ、ｄａｐＤ、ｄａｐＥ、ａｒｇＤ、ｄａｐＦ、及び任意のこれらの組合せから選択され、
より好ましくは、前記必須遺伝子がｄａｐＡ及びｄａｐＥから選択される、細菌。
【請求項4】
前記内因性抗酸化性ストレス応答経路に関与するか又はそれを制御する遺伝子が、ＨｔｒＡセリンプロテアーゼファミリー遺伝子である、及び／又は、
前記内因性抗酸化性ストレス応答経路に関与するか又はそれを制御する遺伝子の機能的発現産物が、ＨｔｒＡセリンプロテアーゼファミリーに関連するタンパク質である、及び／又は、
前記細菌が、ＨｔｒＡセリンプロテアーゼの活性を欠損している、及び／又は、
前記内因性抗酸化性ストレス応答経路に関与するか又はそれを制御する遺伝子がｈｔｒＡである、及び／又は、
前記細菌がｈｔｒＡを欠損している、請求項１に記載の改変された細菌。
【請求項5】
前記必須遺伝子が細菌染色体内に天然に存在する遺伝子であり、前記必須遺伝子の天然プロモーターが前記偏性低酸素誘導プロモーターと機能的に置き換わり、それによって前記細菌内での前記必須遺伝子の発現が前記偏性低酸素誘導プロモーターの制御下に完全に置かれる、請求項１に記載の改変された細菌。
【請求項6】
前記必須遺伝子発現カセットが外因性であり、前記細菌染色体内に天然に存在する必須遺伝子が欠失されるか又は機能的に不活性化されており、それによって前記細菌内での前記必須遺伝子の発現が前記偏性低酸素誘導プロモーターの制御下に完全に置かれる、請求項１に記載の改変された細菌。
【請求項7】
請求項６に記載の改変された細菌であって、前記外因性必須遺伝子発現カセットが、前記細菌染色体中に組み込まれている、又は
前記外因性必須遺伝子発現カセットが、前記細菌染色体の外部にある、又は
前記外因性必須遺伝子発現カセットが、前記細菌により担持されるプラスミド内に存在する、細菌。
【請求項8】
ｐＨ制御型発現カセットを更に含み、前記ｐＨ制御型発現カセットが、酸性ｐＨ条件下で活性であるプロモーターの制御下に置かれた、細菌由来のヘモリジンタンパク質をコードする遺伝子を含む、請求項１に記載の改変された細菌。
【請求項9】
前記細菌由来のヘモリジンタンパク質が、グラム陰性菌ヘモリジンタンパク質である、請求項８に記載の改変された細菌。
【請求項10】
請求項９に記載の改変された細菌であって、前記グラム陰性菌ヘモリジンタンパク質をコードする遺伝子が、ｈｌｙＡ又はｈｌｙＥであり、好ましくは、前記ｈｌｙＡ又はｈｌｙＥが、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、ビブリオ・コレラ（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ）、又は大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）に由来する、細菌。
【請求項11】
請求項８に記載の改変された細菌であって、前記酸性ｐＨ条件下で活性であるプロモーターが、７．０、６．９、６．８、６．７、６．６、６．５、６．４、６．３、６．２、６．１、６．０、５．９、５．８、５．７、５．６、又は５．５より低いｐＨにおいて活性であり、好ましくは、前記酸性ｐＨ条件下で活性であるプロモーターが、ｓｓｅＡ、ｓｓｒＡ、ｓｓａＢ、ｓｓａＧ、ｓｓａＭ、及びｓｓａＲからなる群から選択され、
より好ましくは、前記酸性ｐＨ条件下で活性であるプロモーターがｓｓｅＡである、細菌。
【請求項12】
請求項１に記載の改変された細菌であって、前記非改変型開始株が通性嫌気性細菌であり、好ましくは、前記開始株がサルモネラ・チフィムリウムＳＬ７２０７である、細菌。
【請求項13】
請求項１に記載の改変された細菌であって、前記細菌がエンテロバクター科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）の細菌であり、好ましくは、前記細菌が、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属、シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）属、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）属、エルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）属、シトロバクター（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）属、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属、プロテウス（Ｐｒｏｔｅｕｓ）属、モルガネラ（Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ）属、プロビデンシア（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ）属、ハフニア（Ｈａｆｎｉａ）属、及びパントエア（Ｐａｎｔｏｅａ）属の細菌であり、
より好ましくは、前記細菌が、大腸菌、エンテロバクター・ブラタエ（Ｅ．ｂｌａｔｔａｅ）、エンテロバクター・フェルグソニイ（Ｅ．ｆｅｒｇｕｓｏｎｉｉ）、エンテロバクター・ヘルマンニイ（Ｅ．ｈｅｒｍａｎｎｉｉ）、エンテロバクター・ヴァルネリス（Ｅ．ｖｕｌｎｅｒｉｓ）、サルモネラ・エンテリカ（Ｓ．ｅｎｔｅｒｉｃａ）、サルモネラ・ボンゴリ（Ｓ．ｂｏｎｇｏｒｉ）、腸チフス菌（Ｓ．ｔｙｐｈｉ）、サルモネラ・コレラエスイス（Ｓ．ｃｈｏｌｅｒａｅｓｕｉｓ）、サルモネラ・チフィムリウム（Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、シゲラ・ディセンテリアエ（Ｓ．ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ）、シゲラ・フレクスネリ（Ｓ．ｆｌｅｘｎｅｒｉ）、シゲラ・ボイディイ（Ｓ．ｂｏｙｄｉｉ）、シゲラ・ゾネイ（Ｓ．ｓｏｎｎｅｉ）、肺炎桿菌（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、クレブシエラ・オキシトカ（Ｋ．ｏｘｙｔｏｃａ）、ペスト菌（Ｙ．ｐｅｓｔｏｓ）、腸炎エルシニア（Ｙ．ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ）、仮性結核菌（Ｙ．ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、エルシニア・アルドヴァエ（Ｙ．ａｌｄｏｕａｅ）、エルシニア・ベルコヴィエリ（Ｙ．ｂｅｒｃｏｖｉｅｒｉ）、エルシニア・フレデリクセニイ（Ｙ．ｆｒｅｄｅｒｉｋｓｅｎｉｉ）、エルシニア・インテルメディア（Ｙ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）、エルシニア・クリステルセニイ（Ｙ．ｋｒｉｓｔｅｒｓｅｎｉｉ）、エルシニア・モラレッティ（Ｙ．ｍｏｌｌａｒｅｔｔｉ）、エルシニア・ローデイ（Ｙ．ｒｏｈｄｅｉ）、エルシニア・ルッケリ（Ｙ．ｒｕｃｋｅｒｉ）、シトロバクター・フロインデイ（Ｃ．ｆｒｅｕｎｄｉｉ）、シトロバクター・コセリ（Ｃ．ｋｏｓｅｒｉ）、シトロバクター・ブラアキイ（Ｃ．ｂｒａａｋｉｉ）、エンテロバクター・アエロゲネス（Ｅ．ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）、エンテロバクター・クロアカエ（Ｅ．ｃｌｏａｃａｅ）、エンテロバクター・ゲルゴヴィアエ（Ｅ．ｇｅｒｇｏｖｉａｃ）、エンテロバクター・サカザキイ（Ｅ．ｓａｋａｚａｋｉｉ）、エンテロバクター・タイロラエ（Ｅ．ｔａｙｌｏｒａｅ）、エンテロバクター・アムニゲヌス（Ｅ．ａｍｎｉｇｅｎｕｓ）、エンテロバクター・インテルメディウス（Ｅ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ）、エンテロバクター・アスブリアエ（Ｅ．ａｓｂｕｒｉａｅ）、エンテロバクター・カンセロゲヌス（Ｅ．ｃａｎｃｅｒｏｇｅｎｕｓ）、エンテロバクター・ディソルヴェンス（Ｅ．ｄｉｓｓｏｌｖｅｎｓ）、エンテロバクター・ニミプレスウラリス（Ｅ．ｎｉｍｉｐｒｅｓｓｕｒａｌｉｓ）、セラチア・マルセセンス（Ｓ．ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）、セラチア・エントモフィラ（Ｓ．ｅｎｔｏｍｏｐｈｉｌａ）、セラチア・フィカリア（Ｓ．ｆｉｃａｒｉａ）、セラチア・フォンチコラ（Ｓ．ｆｏｎｔｉｃｏｌａ）、セラチア・グリメシイ（Ｓ．ｇｒｉｍｅｓｉｉ）、セラチア・リクエファシエンス（Ｓ．ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、セラチア・オドリフェラ（Ｓ．ｏｄｏｒｉｆｅｒａ）、セラチア・プリムティカ（Ｓ．ｐｌｙｍｕｔｈｉｃａ）、セラチア・プロテアマキュランス（Ｓ．ｐｒｏｔｅａｍａｃｕｌａｎｓ）、セラチア・ルビダエア（Ｓ．ｒｕｂｉｄａｅａ）、セラチア・ウレイリチカ（Ｓ．ｕｒｅｉｌｙｔｉｃａ）、プロテウス・ミラビリス（Ｐ．ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）、プロテウス・ヴァルガリス（Ｐ．ｖｕｌｇａｒｉｓ）、プロテウス・ミクソファシエンス（Ｐ．ｍｙｘｏｆａｃｉｅｎｓ）、プロテウス・ペンネリ（Ｐ．ｐｅｎｎｅｒｉ）、プロテウス・ハウセリ（Ｐ．ｈａｕｓｅｒｉ）、モルガネラ・モルガニイ（Ｍ．ｍｏｒｇａｎｉｉ）、プロビデンシア・アルカリファシエンス（Ｐ．ａｌｃａｌｉｆａｃｉｅｎｓ）、プロビデンシア・ルスティジアニイ（Ｐ．ｒｕｓｔｉｇｉａｎｉｉ）、プロビデンシア・スチュアーチイ（Ｐ．ｓｔｕａｒｔｉｉ）、プロビデンシア・レットゲリ（Ｐ．ｒｅｔｔｇｅｒｉ）、プロビデンシア・ヘイムバッカエ（Ｐ．ｈｅｉｍｂｏｃｈａｅ）、ハフニア・アルヴェイ（Ｈ．ａｌｖｅｉ）、及びパントエア・アグロメランス（Ｐ．ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ）からなる群から選択され、
より好ましくは、前記細菌がサルモネラ・チフィムリウムである、細菌。
【請求項14】
前記細菌が野生型リポ多糖類（ＬＰＳ）を発現する、請求項１に記載の改変された細菌。
【請求項15】
前記細菌が、腫瘍を有する対象に投与されると、腫瘍組織内で生存及び増殖する能力を有し、正常組織では速やかに排除される、請求項１に記載の改変された細菌。
【国際調査報告】