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特表2025-500109最適化された細胞培養培地と組み合わせてキャリアベースの生産プロセスを使用する腫瘍溶解性Ｈ－１プロトパルボウイルス（Ｈ－１ＰＶ）の大規模生産をさらにスケールアップする方法

書誌要約請求の範囲詳細な説明課題実施例実施するための形態図面の説明

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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2025-01-09

(54)【発明の名称】最適化された細胞培養培地と組み合わせてキャリアベースの生産プロセスを使用する腫瘍溶解性Ｈ－１プロトパルボウイルス（Ｈ－１ＰＶ）の大規模生産をさらにスケールアップする方法

(51)【国際特許分類】

C12N 7/00 20060101AFI20241226BHJP

C12N 5/071 20100101ALN20241226BHJP

C12M 3/00 20060101ALN20241226BHJP

C12N 9/16 20060101ALN20241226BHJP

【ＦＩ】

C12N7/00

C12N5/071

C12M3/00 A

C12N9/16 Z

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024518997

(86)(22)【出願日】2022-09-28

(85)【翻訳文提出日】2024-05-24

(86)【国際出願番号】 EP2022076992

(87)【国際公開番号】W WO2023052429

(87)【国際公開日】2023-04-06

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】512113803

【氏名又は名称】ドイチェスクレブスフォルシュンクスツェントルム

(74)【代理人】

【識別番号】110002697

【氏名又は名称】めぶき弁理士法人

(74)【代理人】

【識別番号】100110973

【弁理士】

【氏名又は名称】長谷川洋

(72)【発明者】

【氏名】リュークス，バーバラ

(72)【発明者】

【氏名】フレフトマン，ヴェロニカ

(72)【発明者】

【氏名】フォーゲル，マーティン

(72)【発明者】

【氏名】ウォルファース，ダニエル

(72)【発明者】

【氏名】ファン，リンミンフック

(72)【発明者】

【氏名】ブルネッカー，エイドリアン

【テーマコード（参考）】

4B029

4B065

【Ｆターム（参考）】

4B029AA21

4B029BB11

4B029BB13

4B065AA95X

4B065BB32

4B065BD18

4B065CA60

(57)【要約】

本発明は、大規模パルボウイルス産生、好ましくは腫瘍溶解性プロトパルボウイルスＨ－１（Ｈ－１ＰＶ）の上流最適化のための方法を提供する。本方法は、マイクロキャリアまたはマクロキャリアおよび懸濁液または固定床におけるそれぞれの使用、最適化された細胞培養培地ならびに培地交換戦略に基づいている。要約すると、最適化された細胞培養培地および新規の培地交換戦略を用いて、本発明者らは、播種された細胞密度および動物血清の減少を確立し、動物血清不含有回収物をもたらした。試験したキャリアは高Ｈ－１ＰＶ収率、細胞増殖およびビーズ間移動能力に最も適しており、本発明者らは、２４ウェルプレートからエルレンマイヤーフラスコ、スピナーフラスコおよびｉＣｅｌｌｉｓナノにプロセスをさらにスケールアップした。結論として、本発明は、高ウイルス収量で腫瘍溶解性プロトパルボウイルスＨ－１を産生しながら、同時に産生コストを低下させ、動物起源の望ましくない生成物を回避する大規模方法を提供する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

パルボウイルスＨ－１（Ｈ－１ＰＶ）を産生する方法であって、
（ａ）産生細胞株ＮＢ－３２４Ｋを用意する工程と、
（ｂ）前記ＮＢ－３２４Ｋ細胞を適切な条件下で増殖させることによって、シードトレインを産生する工程と、
（ｃ）播種時点で、２％動物血清を補足した動物成分不含有細胞培養培地、およびマイクロキャリアまたはマクロキャリアを含む培養容器を用意する工程と、
（ｄ）工程（ｂ）の前記ＮＢ－３２４Ｋ細胞を工程（ｃ）の培養容器に播種する工程と、
（ｅ）前記ＮＢ－３２４Ｋ細胞を細胞増殖する工程と、
（ｆ）感染時点で、マイクロキャリアまたはマクロキャリアを含む動物成分不含有細胞培養培地で１００％培地交換する工程であって、前記動物成分不含有細胞培養培地に１％動物血清が補足されているか、または動物血清が補足されていない、工程と、
（ｇ）感染３～８日後、０．１～１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０を含むか、または含まない、１～１００ｍＭＴｒｉｓ、１～１０ｍＭＭｇＣｌ_２、２．５～１０％ＴｒｙｐＬＥ（商標）、ｐＨ９～１０を含む溶解緩衝液を用いて前記ＮＢ－３２４Ｋ細胞を回収し、溶解緩衝液を撹拌し、続いて１～１００ｍＭＴｒｉｓ、１～１０ｍＭＭｇＣｌ_２、ｐＨ９～１０を含む洗浄緩衝液で洗浄する工程であって、前記溶解緩衝液および洗浄緩衝液が一緒にプールされる工程と、
（ｈ）濾過によって前記パルボウイルス回収物の不純物を除く工程と、
（ｉ）カプセル化されていないウイルスＤＮＡおよび混入した宿主細胞ＤＮＡをＤＮａｓｅ処理によって除去する工程と、
（ｊ）緩衝液交換および濃縮のためにタンジェンシャルフロー濾過を行う工程と、
（ｋ）空の粒子および大部分の不純物を除去するために陰イオン交換クロマトグラフィーを行う工程と、
（ｌ）０～３％ビジパークおよび９７～１００％リンゲル液への緩衝液交換および濃縮のためにタンジェンシャルフロー濾過を行う工程と、
（ｍ）４８％ビジパーク／リンゲル液の最終生成物にする工程と
を含む方法。

【請求項2】

工程（ｇ）において、前記溶解緩衝液が、２５ｍＭＴｒｉｓ、５ｍＭＭｇＣｌ_２、５％ＴｒｙｐＬＥ（商標）、ｐＨ１０を含み、ＣＯ_２を含まず、４０℃で１時間である、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

工程（ｇ）において、前記洗浄工程が２５ｍＭＴｒｉｓ、５ｍＭＭｇＣｌ_２、ｐＨ１０を含む緩衝液で行われ、工程（ｇ）が、２５ｍＭＴｒｉｓ、５ｍＭＭｇＣｌ_２、２．５％ＴｒｙｐＬＥ（商標）を含み、０．２５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０を含むか、または含まない緩衝液をもたらす、請求項１または２に記載の方法。

【請求項4】

前記マイクロキャリアが、Ｃｙｔｏｄｅｘ（登録商標）１または付着増強ＣｅｌｌＢＩＮＤ（登録商標）（ＥＡ）などの、マトリックス全体にわたって分布した正に荷電したＤＥＡＥ（Ｎ，Ｎ－ジエチルアミノエチル）基を有する架橋デキストランマトリックスである、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項5】

前記マクロキャリアが、ポリプロピレンおよびポリエステル不織繊維（Ｆｉｂｒａ－Ｃｅｌ（登録商標））または不織の親水化ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）マクロキャリア（ｉＣＥＬＬｉｓ（登録商標））である、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項6】

前記ＮＢ－３２４Ｋ細胞が、工程（ｄ）で播種および感染が起こる場合には、２．０×１０^４～５．０×１０^４細胞／ｃｍ^２の播種細胞密度で播種されるか、または工程（ｅ）の細胞増殖２～６日後に感染が起こる場合には、５．０×１０^３～８．０×１０^３細胞／ｃｍ^２の播種細胞密度で播種される、請求項５に記載の方法。

【請求項7】

前記動物血清が、熱失活したウシ胎仔血清（ＦＢＳ）である、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項8】

動物血清を補足していない第２の１００％培地交換が工程（ｆ）の後に行われる、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項9】

工程（ｆ）における１００％培地交換の培地が、１％ＦＢＳが添加されているか、またはＦＢＳが添加されておらず、前記第２の１００％培地交換の培地が、ＦＢＳが添加されていない、請求項８に記載の方法。

【請求項10】

前記第２の１００％培地交換が、感染１～３日後に行われる、請求項８または９に記載の方法。

【請求項11】

前記動物成分不含有細胞培養培地が、１６～２２ｍＭグルコース、３～５ｍＭグルタミン、０．１～０．６ｍＭグルタミン酸、０．５～１．０ｍＭ乳酸、０．３ｍＭ未満のアンモニウムおよび３～１０μｇ／μｌタンパク質を含むウイルス産生無血清培地（ＶＰ－ＳＦＭ（商標））である、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項12】

前記動物成分不含有細胞培養培地が、ＶＰ－ＳＦＭ（商標）であり、４ｍＭＬ－グルタミンが添加されている、請求項１１に記載の方法。

【請求項13】

前記方法が、前記シードトレイン中５％ＦＢＳで開始される、請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項14】

前記細胞溶解が、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０を含むか、または含まない、Ｔｒｉｓ、ＭｇＣｌ_２および組換え細胞解離酵素ＴｒｙｐＬＥ（商標）、ｐＨ１０を含む緩衝液で行われる、請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項15】

前記方法が、懸濁培養または固定層バイオリアクターのために使用される、請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、大規模パルボウイルス生産、好ましくは腫瘍溶解性プロトパルボウイルスＨ－１（Ｈ－１ＰＶ）の上流最適化方法を提供する。本方法は、マイクロキャリアまたはマクロキャリアおよび懸濁液または固定床におけるそれぞれの使用、最適化された細胞培養培地ならびに新規の培地交換戦略に基づいている。要約すると、最適化された細胞培養培地および新規の培地交換戦略を用いて、本発明者らは、播種された細胞密度および動物血清の減少を確立し、動物血清不含有回収物をもたらした。試験したキャリアは高Ｈ－１ＰＶ収率、細胞増殖およびビーズ間移動能力に最も適しており、本発明者らは、エルレンマイヤーフラスコ、スピナーフラスコおよびｉＣｅｌｌｉｓナノ中の産生物をさらに試験した。結論として、本発明は、高ウイルス収量で腫瘍溶解性プロトパルボウイルスＨ－１を産生しながら、同時に産生コストを低下させ、動物起源の望ましくない生成物を回避する大規模方法を提供する。

【背景技術】

【0002】

世界保健機関（ＷＨＯ）によると、癌は、２０１８年には世界中で２番目に多い死因であり、推定９６０万人が死亡した。癌に関連する経済損失は顕著であって増大しており、２０１０年だけで合計約１兆１６００億ドルになる（Ｓｔｅｗａｒｔ２０１４）。ウイルス（ＯＶ）療法は、この疾患を治療するための有望なアプローチである。ＯＶは、健康な組織を害することなく癌細胞を選択的に破壊する、遺伝子改変されたまたは天然起源のウイルスである（Ｆｕｋｕｈａｒａ２０１６）。２０１５年には、最初のＯＶ治療薬（Ｔ－ＶＥＣまたはＩｍｌｙｇｉｃ（商標））がＦＤＡによって承認され、続いてしばらくしてからＥＭＡによって承認された。異なるウイルスプラットフォームに基づく他のＯＶ治療薬（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｅｂｓ．ｉｉｉｔｄ．ｅｄｕ．ｉｎ／ｒａｇｈａｖａ／ｏｖｉｒｕｓｔｄｂ／ｃｌｉｎｉｃａｌ．ｐｈｐ）も開発パイプラインにある。

【0003】

ＯＶ薬剤「ＰａｒｖＯｒｙｘ（登録商標）」は、パルボウイルス科パルボウイルス亜科のプロトパルボウイルス属に属する野生型パルボウイルスＨ－１ＰＶを利用している（Ｃｏｔｍｏｒｅ２０１４）。このウイルスは、様々な培養細胞株、動物実験（Ｒｏｍｍｅｌａｅｒｅ２０１０；Ｎｕｅｓｃｈ２０１２）およびいくつかのヒト腫瘍種に対する異種移植片モデル（Ｇｅｌｅｔｎｅｋｙ２０１０；Ｆａｉｓｓｔ１９９８；Ａｎｇｅｌｏｖａ２００９ｂ；Ｄｕｐｒｅｓｓｏｉｒ１９８９；Ａｎｇｅｌｏｖａ２００９ａ）における、臨床前のプルーフ・オブ・コンセプト試験中に腫瘍溶解特性および腫瘍抑制特性を示した。Ｈ－１ＰＶはまた、第Ｉ／ＩＩａ相臨床試験（Ｇｅｌｅｔｎｅｋｙ２０１２；Ｇｅｌｅｔｎｅｋｙ２０１７）および第ＩＩ相試験（Ｈａｊｄａ２０２１）で安全性および免疫原性活性を示した。

【0004】

したがって、腫瘍溶解性プロトパルボウイルスＨ－１ＰＶによる患者の治療は、いくつかの種類の癌に対する臨床試験で有望な結果を示している（Ｈａｊｄａ２０２１；Ｇｅｌｅｔｎｅｋｙ２０１７）。しかしながら、将来のＨ－１ＰＶの市場放出に備え、培養培地と産生プロセスを堅牢かつ制御された大規模なものに適合させ、最適化する必要があり、すなわち、撹拌速度、通気、播種細胞密度、感染時期、感染の多重度、回収時期、回収戦略などのシステムパラメータに応じたものである。

【0005】

したがって、例えば、産生細胞株ＮＢ－３２４Ｋを使用してパルボウイルス粒子を産生する方法に関する欧州特許第３３１３９８７号を参照し、この方法では、大規模ウイルス産生のために動物成分を含む細胞培養培地を使用する。動物由来成分などの不要な汚染物質を除去するために、改良された感染性粒子の精製が導入され、この精製は、１回目はＰＢＳ中、２回目はリンゲル中で、２回続くイオジキサノール密度勾配超遠心工程に基づいている。さらに、欧州特許出願ＥＰ１７７７１３７６．５には、主に動物成分不含有細胞培養培地ＶＰ－ＳＦＭ（商標）に基づくパルボウイルス産生のためのさらに最適化されたプロセスにより、ＮＢ－３２４Ｋ細胞により産生されたパルボウイルスの産生および精製がより容易かつ費用効果的に行えることが記載されている。

【0006】

しかしながら、いずれのアプローチも、高ウイルス収量で腫瘍溶解性プロトパルボウイルスＨ－１を産生しながら、同時に産生コストを低下させ、動物起源の望ましくない生成物を回避する大規模方法を提供するものではなかった。

【0007】

したがって、本発明の根底にある技術的課題は、パルボウイルスの大規模産生をさらに最適化することである。

【0008】

この解決策は、特許請求の範囲に記載された実施形態を提供することによって達成される。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0009】

腫瘍溶解性プロトパルボウイルスＨ－１ＰＶによる患者の治療は、いくつかの種類の癌に対する臨床試験で有望な結果を示している（Ｈａｊｄａ２０２１；Ｇｅｌｅｔｎｅｋｙ２０１７）。これらのデータは、大規模バイオリアクターシステムでＨ－１ＰＶを産生した最初の結果を示している。しかしながら、このプロセスは、撹拌速度、通気、播種細胞密度、感染時期、感染の多重度、回収時間などのシステムパラメータに応じて適合させ、最適化する必要がある。

【0010】

最初に、先に述べた細胞培養培地は、細胞増殖、代謝、および増殖を刺激するために不可欠であるとして、動物血清の補足を必要とする。したがって、細胞培養におけるウシ胎児血清（ＦＢＳ）などの動物血清の添加は依然として一般的であるが、品質、ロット間の再現性、動物福祉、供給、コスト（ｖａｎｄｅｒＶａｌｋ２０１８）、将来的な規制上の制限の可能性などの点で問題がある。

【課題を解決するための手段】

【0011】

したがって、本発明の方法は、ＦＢＳ不含有パルボウイルス産生に適した最適化培養培地ＶＰ－ＳＦＭ（商標）（Ｌｉｕ２０１７；Ｒｏｕｒｏｕ２００７；Ｍａｒｔｉｎｅｚ２０２０）、および同等のウイルス収量でＦＢＳ不含有回収のために必要なＦＢＳ量を最大８０％減少させるための少なくとも２段階の培地交換戦略を使用する。培地交換を追加し、例えばＦＢＳを２％から１％へ、および０％へと３段階に減少させることで、２％から０％へのＦＢＳ減少およびその後の２回目の０％へのＦＢＳ減少と比較して、約０．３ｌｏｇの産生量増加が達成され、必要なＦＢＳを最大４０％減少させることができた。本発明をもたらす実験において少なくとも２段階の培地交換戦略を適用することにより、好ましくは３段階の培地交換戦略を適用することにより、ＦＢＳ不含有回収物で高いウイルス産生収量および下流プロセスのためのより少ない不純物が達成することができた。

【0012】

さらに、本発明による方法、より具体的には非同時の播種および感染プロセスを使用して、播種密度を７．９Ｅ３細胞／ｃｍ^２から５．０Ｅ３細胞／ｃｍ^２に低減することができ、一方でＶＰ－ＳＦＭ（商標）に適応させた後の同様のウイルス収量が維持された。このようにして、増殖時間を短縮することができ、シードトレインに必要な資源がより少なくなるため、細胞産生コストを低下させることができた。

【0013】

さらに、従来技術では、産生細胞株ＮＢ－３２４Ｋなどの付着細胞を用いた大規模Ｈ－１ＰＶ産生のために、懸濁培養のためのマイクロキャリアまたは固定床バイオリアクターのためのマクロキャリアを使用することが一般的である。大規模産生方法では、過去に用いられた凍結融解サイクルの実施は困難であり、そのため、本発明の方法は、トリプシン処理工程および凍結融解サイクルを必要とせずに実施される。代わりに、本発明者らは、以前に、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１００（重要な成分：２－［４－（２，４，４－トリメチルペンタン－２－イル）フェノキシ］エタノール）ベースの化学的細胞溶解を導入した。Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１００による溶解では、様々なマイクロキャリアおよびマクロキャリアで満足のいく産生収量が達成されている。しかしながら、現在、界面活性剤Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１００は、規制当局（ｈｔｔｐｓ：／／ｅｃｈａ．ｅｕｒｏｐａ．ｅｕ／ａｕｔｈｏｒｉｓａｔｉｏｎ－ｌｉｓｔ）によって環境毒性であると考えられている。したがって、本発明の一実施形態では、Ｔｒｉｓ、ＭｇＣｌ_２および組換え細胞解離酵素ＴｒｙｐＬＥ（商標）をＴｗｅｅｎ（登録商標）８０と共に含有する溶解緩衝液を代替溶解緩衝液として試験し、なぜなら、この緩衝液はＴｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１００緩衝液よりも環境に優しく、また、ウイルス収量に悪影響を及ぼすことなく溶解緩衝液のレシピからＴｗｅｅｎ（登録商標）８０を省略することができるからである。

【0014】

本発明をもたらす実験において、いくつかのマイクロキャリアおよびマクロキャリアを試験した。最初に、本発明の一実施形態では、マトリックス全体にわたって分布した正に荷電したＤＥＡＥ（Ｎ，Ｎ－ジエチルアミノエチル）基を有する架橋デキストランマトリックスである固体マイクロキャリアＣｙｔｏｄｅｘ（登録商標）１は、大規模産生または付着増強ＣｅｌｌＢＩＮＤ（登録商標）（ＥＡ）マイクロキャリアによく適していることが見出されている。付着増強ＣｅｌｌＢＩＮＤ（登録商標）（ＥＡ）マイクロキャリアは、ポリスチレン表面に組み込まれた酸素含有官能基のために負の表面電荷を有する。これらのマイクロキャリアは、細胞増殖およびウイルス産生の間に有望なビーズ間細胞移動能力を示した。現在まで、Ｃｙｔｏｄｅｘ（登録商標）１は、アデノウイルスおよびレトロウイルス（Ｗｕ２００２）、ワクシニアウイルス（Ｌｉｕ２０１７）、ならびにインフルエンザウイルスＡ（Ｔｒｅｅ２００１）について報告されている。

【0015】

本発明の方法の代替的な実施形態は、ポリプロピレンおよびポリエステル不織繊維（Ｆｉｂｒａ－Ｃｅｌ（登録商標））または不織の親水化ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）マクロキャリア（ｉＣＥＬＬｉｓ（登録商標））によって表され、なぜなら、それらを使用することによって懸濁培養において良好な産生収量がもたらされ、これらのマクロキャリアはまた、より高い収率が達成され得る固定床バイオリアクターのために設計されるからである。

【0016】

要約すると、本発明をもたらす実験において、本発明者らは、細胞培養培地を最適化し、新しい培地交換戦略を適用した。最後に、本発明者らは、播種細胞密度および動物血清の補足の減少を確立し、動物成分不含有回収物をもたらした。したがって、増殖時間および不純物の量を減少させることができ、シードトレインに必要な資源がより少なくなったため、細胞産生コストを低下させることができた。さらに、本発明者らは、高いＨ－１ＰＶ収量、細胞増殖、およびビーズ間移動能力に最も適したマイクロキャリアおよびマクロキャリアを試験し、２４ウェルプレートからエルレンマイヤーフラスコおよびスピナーフラスコへとプロセスを首尾よくスケールアップし、マイクロキャリアを含む大型の撹拌タンクバイオリアクターまたは固定床バイオリアクター、例えば、ｉＣＥＬＬｉｓ（登録商標）５００ｍ^２における産生が有望であると考えられる。

【0017】

要約すると、本発明は、パルボウイルスＨ－１を産生する方法であって、
（ａ）産生細胞株ＮＢ－３２４Ｋを用意する工程と、
（ｂ）ＮＢ－３２４Ｋ細胞を適切な条件下で増殖させることによって、シードトレインを産生する工程と、
（ｃ）播種時点で、２％動物血清を補足した動物成分不含有細胞培養培地、およびマイクロキャリアまたはマクロキャリアを含む培養容器を用意する工程と
（ｄ）工程（ｂ）のＮＢ－３２４Ｋ細胞を工程（ｃ）の培養容器に播種する工程と、
（ｅ）ＮＢ－３２４Ｋ細胞を細胞増殖する工程と、
（ｆ）感染時点で、マイクロキャリアまたはマクロキャリアを含む動物成分不含有細胞培養培地で１００％培地交換する工程であって、動物成分不含有細胞培養培地に１％動物血清が補足されているか、または動物血清が補足されていない、工程と、
（ｇ）感染３～８日後、０．１～１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０を含むか、または含まない、１～１００ｍＭＴｒｉｓ、１～１０ｍＭＭｇＣｌ_２、２．５～１０％ＴｒｙｐＬＥ（商標）、ｐＨ９～１０を含む溶解緩衝液を用いてＮＢ－３２４Ｋ細胞を回収し、溶解緩衝液を撹拌し、続いて１～１００ｍＭＴｒｉｓ、１～１０ｍＭＭｇＣｌ_２、ｐＨ９～１０を含む洗浄緩衝液で洗浄する工程であって、溶解緩衝液および洗浄緩衝液が一緒にプールされる工程と、
（ｈ）濾過によってパルボウイルス回収物の不純物を除く工程と、
（ｉ）カプセル化されていないウイルスＤＮＡおよび混入した宿主細胞ＤＮＡをＤＮａｓｅ処理によって除去する工程と、
（ｊ）緩衝液交換および濃縮のためにタンジェンシャルフロー濾過を行う工程と、
（ｋ）空の粒子および大部分の不純物を除去するために陰イオン交換クロマトグラフィーを行う工程と、
（ｌ）０～３％ビジパークおよび９７～１００％リンゲル液への緩衝液交換および濃縮のためにタンジェンシャルフロー濾過を行う工程と、
（ｍ）４８％ビジパーク／リンゲル液の最終生成物にする工程と
を含む方法。

【0018】

好ましい一実施形態では、工程（ｇ）において、溶解緩衝液は、２５ｍＭＴｒｉｓ、５ｍＭＭｇＣｌ_２、５％ＴｒｙｐＬＥ（商標）、ｐＨ１０を含む。

【0019】

別の好ましい実施形態では、工程（ｇ）において、洗浄工程は、２５ｍＭＴｒｉｓ、５ｍＭＭｇＣｌ_２、ｐＨ１０を含む緩衝液で行われ、工程（ｇ）は、２５ｍＭＴｒｉｓ、５ｍＭＭｇＣｌ_２、２．５％ＴｒｙｐＬＥ（商標）を含み、０．１～１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０、好ましくは０．２５％未満のＴｗｅｅｎ（登録商標）８０を含むか、または含まない緩衝液をもたらす。

【0020】

別の好ましい実施形態では、工程（ｇ）において、溶解緩衝液での処理は、７０ｒｐｍで振盪されるか、またはバイオリアクター内で循環されるＣＯ_２を伴わずに（ｗ／ｏ）、４０℃で１時間実施され、洗浄緩衝液での処理は、７０ｒｐｍで振盪されるか、またはバイオリアクター内で循環されるＣＯ_２を伴わずに１分間実施される。

【図面の簡単な説明】

【0021】

【図1】ＶＰ－ＳＦＭ（商標）培地を使用したプロセスタイムラインおよびＦＢＳ含有量の概要を示す図である。

【図2】５％ＦＢＳまたは２段階ＦＢＳ減少スキームを用いた同様のＨ－１ＰＶ特異的ウイルス収量を示す図である。ここで、３．６Ｅ４ＮＢ－３２４Ｋ細胞／ｃｍ^２を、５％または２％ＦＢＳを添加したＶＰ－ＳＦＭ（商標）培地に播種した。３日間の細胞増殖後、０．０５のＭＯＩでの感染、および５％または０％ＦＢＳでの１００％培地交換を行った。感染４日後に細胞を回収し、溶解した。

【図3】ＶＰ－ＳＦＭ（商標）を使用した３段階ＦＢＳ減少によるＨ－１ＰＶ特異的ウイルス収量のブーストを示す図である。ここで、５Ｅ３ＮＢ－３２４Ｋ細胞／ｃｍ^２を２％ＦＢＳに播種した。３日間の細胞増殖後、１％または０％ＦＢＳのいずれかへの第１の１００％培地交換を行い、０．０１のＭＯＩでの感染を、３～５日目の産生期Ｉに対して行った。感染２日後、第２の１００％培地交換を、５日目～７日目の産生期ＩＩに対してＦＢＳなしで実施した。感染４日後の７日目に細胞を回収し、溶解した。

【図4】Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１００プロセス、ウイルスＴｒｉｓ（ＶＴ）緩衝液中での凍結融解プロセス、および０．２５％Ｔｗｅｅｎ８０を含むか、または含まず、２．５％ＴｒｙｐＬＥｐＨ１０を含むか、または含まない、および２５ｍＭＴｒｉｓ、５ｍＭＭｇＣｌ_２を用いた回収物の比較を示す図である。ＮＢ－３２４Ｋ細胞を１７５ｃｍ^２のフラスコに５Ｅ３細胞／ｃｍ^２、２％ＦＢＳを含むＶＰ－ＳＦＭ（商標）で３日間播種し、次いで０％ＦＢＳを含むＶＰ－ＳＦＭ（商標）に１００％培地交換し、０．０５のＭＯＩで感染させた。感染４日後、細胞を溶解の前に１×ＰＢＳで洗浄し、異なる溶解方法で回収した。

【図5】コンフルエントになったマイクロキャリアと添加したばかりのマイクロキャリア間の細胞ブリッジの顕微鏡観察を示す図である。ａ：付着増強（１０×）；ｂ：Ｃｙｔｏｄｅｘ（登録商標）１（１０×）；スケールバー＝２００μｍ

【図6a】様々なキャリアを用いたＨ－１ＰＶ特異的ウイルス収量スクリーニングを示す図である。ここで、４Ｅ４ＮＢ－３２４Ｋ細胞／ｃｍ^２を２４ウェルプレートに各キャリアの増殖面積１０ｃｍ^２／ｍｌ（ｉＣは１１．２ｃｍ^２／ｍｌ）で播種し、１００ｒｐｍで振盪した。感染４日後に細胞を回収し、溶解した。

【図6b】様々なキャリアを用いたビーズ間移動後のＨ－１ＰＶ特異的ウイルス収量スクリーニングを示す図である。２Ｅ４［黒塗り］または４Ｅ４［斜線］ＮＢ－３２４Ｋ細胞／ｃｍ^２を２４ウェルプレートに各マイクロキャリアの増殖面積５ｃｍ^２／ｍｌで播種し、１００ｒｐｍでオービタル振盪した。３日間の細胞増殖後、細胞を０．０１のＭＯＩで感染させ、新しい培地に新しいマイクロキャリアを加えることで増殖表面と培地量を２倍にし、その後１：２に分割して培地量およびマイクロキャリア密度の開始条件に戻した。感染後４日目に細胞を回収し、溶解した。感染４日後に細胞を回収し、溶解した。

【図7】最も優れたマイクロキャリアおよびマクロキャリアのスケールアップ後のＨ－１ＰＶ特異的ウイルス収量を示す図である。ここで、２Ｅ４ＮＢ－３２４Ｋ細胞／ｃｍ^２を１０ｃｍ^２／ｍｌの増殖面積（ａ：マイクロキャリアＥＡまたはＣＤ１；ｂ：マクロキャリアｉＣまたはＦＣ）に１２５ｍｌエルレンマイヤーフラスコ［黒塗り］あたり４０ｍｌまたはスピナーフラスコ［斜線］あたり１００ｍｌのＶＰ－ＳＦＭ（商標）で播種した。播種は、４０ｒｐｍで１分、続いて０ｒｐｍで３０分のサイクルを４回繰り返し、合計播種時間は２時間とした。次いで、撹拌は、エルレンマイヤーフラスコでは３０～１００ｒｐｍ、またはスピナーフラスコでは４０ｒｐｍに設定した。３日間の細胞増殖後、細胞を０．０１のＭＯＩで感染させ、培地の５０％を新しい培地で交換した。感染４日後に細胞を回収し、溶解した。

【図8】異なる固定床およびそれぞれのＴｆｌａｓｋランコントロールを用いたｉＣＥＬＬｉｓ（登録商標）ナノにおけるＨ－１ＰＶ特異的ウイルス収量を示す図である。別々のバイオリアクター運転において、ｉＣＥＬＬｉｓ（登録商標）ナノ固定床［黒塗り］およびＴｆｌａｓｋランコントロール［斜線］に５Ｅ３細胞／ｃｍ^２（０．５３ｍ^２）または９Ｅ３細胞／ｃｍ^２（４ｍ^２）を播種した。ＶＰ－ＳＦＭ（商標）細胞増殖培地による３日の細胞増殖後、１回目の１００％培地交換をＶＰ－ＳＦＭ（商標）感染培地に行い、０．０１のＭＯＩでの感染を３日目から５日目までの産生期Ｉに対して行った。感染２日後、２回目の１００％培地交換を、ＦＢＳ不含有ＶＰ－ＳＦＭ（商標）培地で５日目から７日目の産生期ＩＩに対して行った。感染４日後の７日目に細胞を回収し、溶解した。

【発明を実施するための形態】

【0022】

本発明の根底にある技術的問題は、腫瘍溶解性プロトパルボウイルス産生、好ましくはＨ－１ＰＶの大規模産生をさらに最適化することであり、なぜなら、現在利用可能などのアプローチも、高ウイルス収量でＨ－１ＰＶを産生しながら、同時に産生コストを低下させ、動物起源の望ましくない生成物を回避する大規模方法を提供していないからである。

【0023】

ウイルス収量を増加させながら、産生コストを低下させ、動物起源の望ましくない生成物を回避するために、本発明をもたらす実験において、播種および感染の間に５％ＦＢＳを添加した動物成分不含有細胞培養培地ＶＰ－ＳＦＭ（商標）を、播種の間に２％ＦＢＳ添加し、感染の間に０％ＦＢＳを添加したＶＰ－ＳＦＭ（商標）と比較した。

【0024】

この点において、「細胞培養」という用語は、人口のインビトロ環境での細胞の維持を意味する。本発明の培地を使用して、付着性哺乳動物細胞、すなわち、培養容器に付着する細胞、好ましくは上皮細胞、例えばサルウイルス４０で形質転換されたヒト新生児腎臓細胞（ＮＢ－３２４Ｋ）（Ｔａｔｔｅｒｓａｌｌ１９８３）を培養することができ、「産生細胞株」を表す。

【0025】

「培養」または「増殖」という用語は、細胞の活性状態または静止状態での増殖、分化または継続的な生存に有利な条件下でのインビトロでの細胞の維持を意味する。

【0026】

「細胞培養培地」という用語は、細胞を培養するための栄養溶液を指す。

【0027】

「成分」という用語は、化学的起源であれ生物学的起源であれ、細胞増殖の成長を維持または促進するために細胞培養培地中で使用され得る任意の化合物を指す。「構成成分」、「栄養素」および「成分」という用語は、交換可能に使用することができ、全てこのような化合物を指すことを意味する。細胞培養培地に使用される典型的な成分としては、グルコース、グルタミン、グルタミン酸、増殖因子、インスリンおよびタンパク質が挙げられる。

【0028】

「動物成分不含有」または「無血清」培地という用語は、動物血清不含有培地である。無血清培地は、いずれも血清を含む低血清培地および本質的に無血清の培地と区別される。より具体的には、「血清」むしろ「動物血清」という用語は、例えば熱失活したウシ胎仔血清（ＦＢＳ；Ｂｉｏｗｅｓｔ、フランス）を指す。

【0029】

本発明のプロセスは、グルコース、グルタミン、グルタミン酸、タンパク質（例えば増殖因子、インスリンなど）の成分を含む「動物成分不含有細胞培養培地」を使用し、この培地は、Ｈ－１ＰＶの産生のために、インビトロで上皮細胞、好ましくはＮＢ－３２４Ｋ細胞の培養を支持することができる。

【0030】

本発明の培地は、ヒト上皮細胞、好ましくはＮＢ－３２４Ｋ細胞を高密度に増殖させるため、および／またはパルボウイルス産生を増加させるために使用することができる。好ましい一実施形態では、本発明のプロセスは、１６～２２ｍＭグルコース、３～５ｍＭグルタミン、０．１～０．６ｍＭグルタミン酸、０．５～１．０ｍＭ乳酸、０．３ｍＭ未満のアンモニウムおよび３～１０ｍｇ／ｍｌのタンパク質を含み、動物成分不含有細胞培養培地を使用し、この培地は、Ｈ－１ＰＶの産生のためにＮＢ－３２４Ｋ細胞の培養を支持することができる。

【0031】

好ましくは、動物成分不含有細胞培養培地は、１７～２０ｍＭグルコース、約４ｍＭグルタミン、約０．１５～０．５ｍＭグルタミン酸、約０．７ｍＭ乳酸、０．２ｍＭ未満のアンモニウムおよび４～８ｍｇ／ｍｌのタンパク質、例えば補充物、上皮増殖因子およびインスリンを含む。

【0032】

特定の好ましい一実施形態では、動物成分不含有細胞培養培地は、１９．１４ｍＭグルコース、４．２５ｍＭグルタミン、０．１７４ｍＭグルタミン酸、０．６６９ｍＭ乳酸、０．０５ｍＭ未満のアンモニウムおよび約５ｍｇ／ｍｌのタンパク質を含む。これらのタンパク質としては、ＥＧＦ、インスリンおよびタンパク質性補充物が挙げられる。この培地は、ＶＰ－ＳＦＭ（商標）（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ、米国）と呼ばれる。

【0033】

したがって、本発明によれば、ＮＢ－３２４Ｋ細胞をＶＰ－ＳＦＭ（商標）培地で培養する。より具体的な実施形態では、ＮＢ－３２４Ｋ細胞を５％ＣＯ_２雰囲気中、３７℃で培養する。

【0034】

更なる一実施形態では、細胞培養培地には、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、および３～５ｍＭＬ－グルタミンを添加する（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ、米国）。最後に、４ｍＭグルタミンを添加したＶＰ－ＳＦＭ（商標）培地は、より高い濃度がウイルス収量の増加をもたらさず、したがって、産生コストを低下させるので、好ましい（表１を参照されたい）。

【0035】

【表1】

【0036】

本発明をもたらす実験では、ＮＢ－３２４Ｋ細胞は、０％、１％、２％、または５％ＦＢＳを含むＶＰ－ＳＦＭ（商標）培地で培養されたが（表１を参照されたい）、産生のために５％または２％ＦＢＳを添加して播種した。同様のウイルス収量が、播種のために２％ＦＢＳを添加し、産生のために０％ＦＢＳを添加したＶＰ－ＳＦＭ（商標）と比較して、播種および産生のために５％ＦＢＳを添加したＶＰ－ＳＦＭ（商標）で示された（図２を参照されたい）。したがって、本発明によれば、２％ＦＢＳを添加したＶＰ－ＳＦＭ（商標）培地が好ましく、本発明の方法は、好ましくは、シードトレイン中の５％ＦＢＳで開始する。上記ですでに述べたように、播種時に２％ＦＢＳを添加し、感染時に０％ＦＢＳを添加したＶＰ－ＳＦＭ（商標）培地は、５％ＦＢＳ添加と比較して好ましく、なぜなら同様のウイルス収量をもたらし、ＦＢＳの量を８０％まで減少させるからである（図２を参照されたい）。したがって、高ウイルス収量でＨ－１ＰＶを産生するための本明細書に記載の方法を適用することにより、産生コストを低下させることができ、同時に動物起源の望ましくない生成物を回避する。

【0037】

本発明の方法におけるウイルス感染に関して、野生型Ｈ－１ＰＶのウイルスストックを使用して、好ましくは、ＮＢ－３２４Ｋ細胞を感染させ、より好ましくは、細胞あたり０．５～５×１０^２プラーク形成単位（ＰＦＵ）、むしろ細胞あたり０．０１または０．０５ＰＦＵ（ＰＦＵ／細胞）ＭＯＩで感染させる。本発明によれば、ＮＢ－３２４Ｋ細胞は播種時にＨ－１ＰＶに感染させる（「同時の」播種・感染）か、あるいはＮＢ－３２４Ｋ細胞の細胞増殖を開始してから２～６日後、好ましくは３～６日目にＨ－１ＰＶに感染させる（「非同時の」播種・感染）。

【0038】

本発明の特定の一実施形態では、ＮＢ－３２４Ｋ細胞を２．０×１０^４～５．０×１０^４細胞／ｃｍ^２の細胞密度でパルボウイルスに感染させ、感染時期（ＴＯＩ）は、播種時（「同時の」播種および感染）または２～６日間の細胞増殖後、好ましくはＮＢ－３２４Ｋ細胞の細胞増殖が開始してから３～６日後（「非同時の」播種および感染）のいずれかである。

【0039】

同時の播種および感染のために、本発明のＮＢ－３２４Ｋ細胞を、２％動物血清を補足した動物成分不含有細胞培養培地（動物成分不含有細胞培養培地はＶＰ－ＳＦＭ（商標）培地である）が予め敷かれた培養容器に播種する。本発明の特定の一実施形態では、ＮＢ－３２４Ｋ細胞を２．０×１０^４～５．０×１０^４細胞／ｃｍ^２、好ましくは４．０×１０^４細胞／ｃｍ^２の細胞密度で感染させる。さらに特定の実施形態では、感染３～５日後、好ましくは感染４日後に細胞を回収する。

【0040】

非同時の播種および感染のために、本発明のＮＢ－３２４Ｋ細胞を、２％動物血清を補足した動物成分不含有細胞培養培地（動物成分不含有細胞培養培地はＶＰ－ＳＦＭ（商標）培地である）が予め敷かれた培養容器に播種する。具体的な実施形態では、本発明者らは、次いで、２～６日間、好ましくは３～６日間、細胞を増殖させた（「細胞増殖」）。２～６日間の細胞増殖後、好ましくは３～６日後、２％動物血清を補足した動物成分不含有細胞培養培地を、０％、１％または２％ＦＢＳ、好ましくは０％または１％ＦＢＳを添加した新しい動物成分不含有細胞培養培地（新しい動物成分不含有細胞培養培地はＶＰ－ＳＦＭ（商標）培地である）（「２－０－０％ＦＢＳ」および「２－１－０％ＦＢＳ」戦略）と完全に交換する（「１００％培地交換」）。同時に、ＮＢ－３２４Ｋ細胞を野生型Ｈ－１ＰＶのウイルスストックで感染させる。好ましい一実施形態では、０．５×１０^２～５×１０^２ＰＦＵ／細胞、むしろ０．０１または０．０５ＰＦＵ／細胞のＭＯＩでパルボウイルスに細胞を感染させる。本発明の特定の一実施形態では、５．０×１０^３～８．０×１０^３細胞／ｃｍ^２、好ましくは５．０×１０^３または８．０×１０^３細胞／ｃｍ^２、より好ましくは５．０×１０^３細胞／ｃｍ^２の細胞密度でＮＢ－３２４Ｋ細胞を播種する。好ましい一実施形態では、野生型Ｈ－１ＰＶのウイルスストックは、１００％培地交換の新しい動物成分不含有細胞培養培地に含まれる。したがって、非同時の播種および感染のために、ＴＯＩは、２～６日間の細胞増殖後、好ましくはＮＢ－３２４Ｋ細胞の細胞増殖が開始された後３～６日目である。具体的な実施形態では、感染後２日目に０％ＦＢＳへの別の培地交換を行い、感染３～５日後、好ましくは感染４日後に細胞を回収する（図１を参照されたい）。

【0041】

同時および非同時の播種および感染プロセスを比較すると、播種密度が２．０×１０^４～５．０×１０^４細胞／ｃｍ^２から５．０×１０^３～８．０×１０^３細胞／ｃｍ^２に減少するので、本発明によれば非同時の播種および感染プロセスが好ましい。非同時の播種および感染プロセスでＶＰ－ＳＦＭ（商標）培地を適合することによって、播種密度を８．０×１０^３から５．０×１０^３細胞／ｃｍに再び減少させることができたので、非同時の感染が好ましい。このようにして、細胞増殖が抑えられ、シードトレインに必要な資源が少なくなり、産生コストが下がる。

【0042】

動物起源の望ましくない生成物を回避するために、本発明者らは、１つまたは２つの１００％培地交換を使用する２段階ＦＢＳ低減戦略と３段階ＦＢＳ低減戦略を比較して、図１は、全ての培地交換戦略である「５－５％ＦＢＳ」、「２－０％ＦＢＳ」、「２－１－０％ＦＢＳ」および「２－０－０％ＦＢＳ」戦略の概要を示している。

【0043】

本発明によれば、全ての戦略は、好ましくはＮＢ－３２４Ｋ細胞の培養または増殖のための方法から開始し、これは、シードトレイン中で５％ＦＢＳを用いて増殖させ、次いで、２％動物血清を補足した動物成分不含有細胞培養培地が予め敷かれた培養容器に移し、２～６日間、好ましくは３～６日間増殖させる。２～６日間、好ましくは３～６日間の細胞増殖後、１００％培地交換を１回行う。すでに上述したように、感染時期（ＴＯＩ）は、播種時か、または２～６日間、好ましくは３～６日間の細胞増殖後、すなわち１００％培地交換と同時でない時期である。１００％培地交換を０％、１％または２％ＦＢＳ、好ましくは０％または１％ＦＢＳを添加した新しい動物成分不含有細胞培養培地（新しい動物成分不含有細胞培養培地はＶＰ－ＳＦＭ（商標）培地である）で行う（図３の「２－０－０％ＦＢＳ」または「２－１－０％ＦＢＳ」戦略を参照されたい）。２段階プロセスを適用して、例えば０％ＦＢＳ（２－０％ＦＢＳ）で感染させた場合、本発明者らは、全プロセスにわたって５％ＦＢＳ添加（５－５％ＦＢＳ）と同程度のウイルス収量が得られることを検出した（図２を参照されたい）。したがって、本発明によれば、本方法は、０％ＦＢＳを添加した新しい動物成分不含有細胞培養培地との少なくとも１回の１００％培地交換で行われる。

【0044】

３段階戦略では、播種後２～６日目、好ましくは３～６日目、あるいはむしろ細胞増殖を開始してから、０％または１％ＦＢＳを添加した新しい動物成分不含有細胞培養培地による１回の１００％培地交換に続いて、感染後１～３日目、好ましくは２日目に、ＦＢＳを添加していない新しい動物成分不含有細胞培養培地による別の１００％培地交換を行った（「２－１－０％ＦＢＳ」または「２－０－０％ＦＢＳ」）。３段階戦略の２－１－０％ＦＢＳを適用すると、２－０－０％ＦＢＳ戦略と比較して、約０．３ｌｏｇＰＦＵ／ｃｍ^２の増加が示され（図３参照）、したがって、本発明では２－１－０％ＦＢＳ戦略が好ましい。要約すると、２－１－０％ＦＢＳ戦略を適用することにより最も高いウイルス収量が達成され、本明細書で特許請求されているような方法でのＦＢＳの枯渇は実現可能である。

【0045】

したがって、本発明の方法は、好ましくは、ＦＢＳ不含有産生に適した最適化培養培地ＶＰ－ＳＦＭ（商標）、および同等のウイルス収量でＦＢＳ不含有回収のために必要なＦＢＳ量を最大８０％減少させるための少なくとも２段階の培地交換戦略を使用する。感染後２日目に培地交換を追加し、ＦＢＳを２％から１％へ、および０％へと３段階に減少させることで、約０．３ｌｏｇの産生量増加が達成され、必要なＦＢＳを最大４０％減少させることができた。本発明をもたらす実験においてこの戦略を適用することにより、ＦＢＳ不含有回収物で高いウイルス産生収量および下流プロセスのためのより少ない不純物を達成することができた。

【0046】

足場依存性産生細胞株ＮＢ－３２４Ｋなどの付着細胞を用いた大規模なＨ－１ＰＶ産生を単純化するために、本発明者らはキャリアを用いた。好ましい一実施形態では、マイクロキャリアは懸濁培養のために用意され、マクロキャリアは固定床バイオリアクターのために意図される。したがって、本発明における「キャリア」という用語は、両方のシステムが議論される場合に使用される。本発明によるマイクロキャリアおよびマクロキャリアの特徴付けを、それぞれ表２に示す。

【0047】

【表2】

【0048】

本発明による同時の播種および感染のために、本発明者らは、マイクロキャリアまたはマクロキャリアを、好ましくは２％動物血清を補足した動物成分不含有細胞培養培地中に予め敷いた培養容器を用意した。その後、本発明の方法は、前述のように実行される。したがって、ごく簡単に言えば、シードトレインに５％ＦＢＳを添加して増殖させたＮＢ－３２４Ｋ細胞を、２％動物血清を補足した動物成分不含有細胞培養培地とマイクロキャリアまたはマクロキャリアを予め敷いた培養容器に添加し、野生型Ｈ－１ＰＶのウイルスストックを使用して、ＮＢ－３２４Ｋ細胞に、好ましくは０．５×１０^２～５×１０^２ＰＦＵ／細胞、むしろ０．０１または０．０５ＰＦＵ／細胞のＭＯＩで感染させる。本発明によれば、ＮＢ－３２４Ｋ細胞を播種し、２．０×１０^４～５．０×１０^４細胞／ｃｍ^２、好ましくは４．０×１０^４細胞／ｃｍ^２の細胞密度でパルボウイルスに感染させ、感染後３～５日目に、好ましくは感染後４日目に細胞を回収する。

【0049】

同時の播種および感染のために、本発明者らは、ウェルあたりに添加される、約８～１２ｃｍ^２、好ましくは約９．５～１１．５ｃｍ^２、より好ましくは１０ｃｍ^２または１１．３ｃｍ^２のキャリアの添加を提案する。

【0050】

非同時の播種および感染のために、本発明者らは、マイクロキャリアまたはマクロキャリアを、２％動物血清を補足した、好ましくは動物成分不含有細胞培養培地中に予め敷いた培養容器を用意した。その後、本発明の方法は、前述のように実行される。したがって、ごく簡単に言えば、シードトレインにおいて５％ＦＢＳで増殖させたＮＢ－３２４Ｋ細胞を、２％動物血清を補足した動物成分不含有細胞培養培地とマイクロキャリアまたはマクロキャリアを予め敷いた培養容器に添加する。本発明によれば、本発明者らは、次いで、２～６日間、好ましくは３～６日間、細胞を増殖させる（「細胞増殖」）。２～６日間の細胞増殖後、好ましくは３～６日後、２％動物血清を補足した動物成分不含有細胞培養培地を、１％ＦＢＳおよび新鮮なマイクロキャリアを添加した新しい動物成分不含有細胞培養培地と、好ましくは総増殖面積が２倍になるように、完全に交換する（「１００％培地交換」）。別の好ましい実施形態では、野生型Ｈ－１ＰＶのウイルスストックはまた、１００％培地交換の新しい動物成分不含有細胞培養培地に含まれる。したがって、非同時の播種および感染のために、感染時期（ＴＯＩ）は、２～６日間の細胞増殖後、好ましくはＮＢ－３２４Ｋ細胞の細胞増殖が開始された後３～６日目である。０％ＦＢＳへの培地交換は、細胞感染後１～３日目、好ましくは細胞感染後２日目に行う。具体的な実施形態では、ＴＯＩ３～５日後、すなわち感染後、好ましくは感染４日後に細胞を回収する（図１を参照されたい）。

【0051】

非同時の播種および感染のために、本発明者らは、ウェルあたり約４～６ｃｍ^２、好ましくは５ｃｍ^２のキャリアを添加することを提案する。

【0052】

上記ですでに述べたように、本発明によるマイクロキャリアおよびマクロキャリアの特徴付けを、それぞれ表２に示す。多孔性Ｃｙｔｏｐｏｒｅ（商標）１およびＣｙｔｏｐｏｒｅ（商標）２を除いて、全てのマイクロキャリアが満足のいく細胞増殖を示した。さらに、全てのマイクロキャリアは、細胞増殖およびウイルス産生の間に有望なビーズからビーズ間移動能力を示し、新鮮なマイクロキャリアを添加することにより、トリプシン処理工程をスキップする更なる細胞増殖を可能にする。

【0053】

したがって、本発明によれば、トリプシン処理を伴わないビーズ間移動の能力は、スケールアップされたシードトレインにおける良好な細胞増殖能力を示唆するので、多孔性でないマイクロキャリアが使用されることが好ましい。

【0054】

好ましいキャリアを見出すために、播種およびプロセス撹拌、キャリア密度、細胞播種密度、ＭＯＩ、ＴＯＩ、ビーズ間移動の有無、容器あたりの細胞培養容量、ならびに培地交換計画などの広範囲のパラメータを試験した（表３および４）。好ましいキャリア選択のためのキャリア上のウイルス産生の結果を図６ａおよびｂに要約する。

【0055】

【表3】

【0056】

【表4】

【0057】

したがって、本発明の好ましい一実施形態では、マイクロキャリアは、マトリックス全体にわたって分布した正に荷電したＤＥＡＥ（Ｎ，Ｎ－ジエチルアミノエチル）基を有する架橋デキストランマトリックス（Ｃｙｔｏｄｅｘ（登録商標）１；ＣＤ１）である。本発明の別の好ましい実施形態では、マイクロキャリアは、「付着増強ＣｅｌｌＢＩＮＤ（登録商標）」（ＥＡ、付着が増強された表面処理は、マイクロキャリアの表面に酸素を注入する）を表す。代替的な好ましい一実施形態では、マクロキャリアは、ポリプロピレンおよびポリエステル不織繊維（Ｆｉｂｒａ－Ｃｅｌ（登録商標）；ＦＣ）またはｉＣＥＬＬｉｓ（登録商標）（ｉＣ；またはｉＣ－５００ｍ^２）からの不織の親水化ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）マクロキャリアである。

【0058】

同時および非同時の播種および感染のために、マイクロキャリアＣＤ１およびマクロキャリアｉＣは、本発明の一実施形態では好ましいキャリアを表す。さらに、マクロキャリアＦＣおよびｉＣは、懸濁培養および固定床バイオリアクターにおいて良好な産生収量を示し、固定床バイオリアクターにおいてより高い産生収量が達成されるので、本発明の代替的な好ましい実施形態を表す。

【0059】

本発明の方法を適用することにより、感染性ウイルス粒子の大部分は、回収時に細胞に結合している。Ｈ－１ＰＶを回収するために、Ｔｒｉｓ－ＥＤＴＡ緩衝液（ＶＴＥ）（Ｌｅｕｃｈｓ２０１６）またはＴｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ＶＴ）（Ｌｅｕｃｈｓ２０１７）中での凍結融解細胞溶解が、静置培養物について以前に報告された。しかしながら、凍結融解法は、キャリア上の付着細胞を用いた大規模産生に限定され、そのため、大規模化可能な細胞溶解が必要とされる。したがって、本発明をもたらす実験において、代替的な細胞溶解方法を開発した。一実施形態では、本発明は、Ｔｒｉｓ、ＭｇＣｌ_２および組換え細胞解離酵素ＴｒｙｐＬＥ（商標）をＴｗｅｅｎ（登録商標）８０と共に含有する溶解緩衝液を用いた細胞溶解に言及し、この緩衝液は、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１００よりも環境に優しく、同様のまたはより高い産生収量を達成する。しかしながら、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０は、ウイルス収率に悪影響を及ぼすことなく、溶解緩衝液レシピから省略され得る。

【0060】

本発明によれば、工程（ｇ）におけるＮＢ－３２４Ｋ細胞の溶解は、感染３～５日後に、０．１～１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０を含むか、または含まない、１～１００ｍＭＴｒｉｓ、１～１０ｍＭＭｇＣｌ_２、２．５～１０％ＴｒｙｐＬＥ（商標）、ｐＨ９～１０を含有する「溶解緩衝液」を用いて、好ましくは、２５ｍＭＴｒｉｓ、５ｍＭＭｇＣｌ_２、５％ＴｒｙｐＬＥ（商標）ｐＨ１０を含有する溶解緩衝液を用いて、ＣＯ_２を含まずに４０℃で１時間行われる。

【0061】

本発明によれば、工程（ｇ）における溶解緩衝液での溶解の後に、１～１００ｍＭＴｒｉｓ、１～１０ｍＭＭｇＣｌ_２、ｐＨ９～１０を含有する「洗浄緩衝液」、好ましくは２５ｍＭＴｒｉｓ、５ｍＭＭｇＣｌ_２、ｐＨ１０を含有する洗浄緩衝液での洗浄が続き、溶解緩衝液および洗浄緩衝液は一緒にプールされ、溶解工程および洗浄工程、すなわち、本発明の工程（ｇ）は、０．１～１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０、好ましくは０．２５％未満のＴｗｅｅｎ（登録商標）８０を含むか、または含まない、１～１００ｍＭＴｒｉｓ、好ましくは２５ｍＭＴｒｉｓ；１～１０ｍＭＭｇＣｌ_２、好ましくは５ｍＭＭｇＣｌ_２；２．５～１０％ＴｒｙｐＬＥ（商標）、好ましくは２．５％ＴｒｙｐＬＥ（商標）、ｐＨ１０を含有する緩衝液を生じる。

【0062】

「ＴｒｙｐＬＥ（商標）」は、ブタトリプシン（ＧＩＢＣＯ、米国）に代わる高度に精製された組換え細胞解離酵素を有する試薬である。

【0063】

まとめると、培地最適化および３段階培地交換戦略、ならびにＴｗｅｅｎ（登録商標）８０を含むか、または含まない、好ましくはＴｗｅｅｎ（登録商標）８０を含まない、Ｔｒｉｓ、ＭｇＣｌ_２および組換え細胞解離酵素ＴｒｙｐＬＥ（商標）を含有する溶解緩衝液を用いた回収は、産生をスケールアップするための確かな基礎となる。

【0064】

要約すると、最適化された細胞培養培地ＶＰ－ＳＦＭ（商標）および新しい培地交換戦略を用いて、本発明者らは、播種された細胞密度およびＦＢＳの低減を確立し、ＦＢＳ不含有回収物をもたらし、試験されたキャリアは、高いＨ－１ＰＶ収量、細胞増殖、およびビーズ間移動能力に最も適している。本発明者らはまた、実行可能なキャリアベースの産生を実証し、２４ウェルプレートからエルレンマイヤーフラスコ、スピナーフラスコおよびｉＣｅｌｌｉｓナノへとプロセスを首尾よくスケールアップした。

【0065】

以下の実施例は、本発明を例示することを意図し、本発明を限定することを意図しない。このような実施例は、使用され得るものの典型であるが、当業者に公知の他の方法が代替的に利用され得る。

【実施例1】

【0066】

材料および方法
細胞株および細胞培養培地
サルウイルス４０で形質転換したＮＢ－３２４Ｋヒト新生児腎細胞（Ｔａｔｔｅｒｓａｌｌ１９８３）を、５％ＦＢＳを含むＶＰ－ＳＦＭ（商標）培地（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ、米国）中、３７℃、５％ＣＯ_２雰囲気下で培養した。細胞培養培地には、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、および４ｍＭＬ－グルタミンを添加する（表１を参照されたい）。

【0067】

ウイルスストック、感染時期
自家で産生され、精製された野生型Ｈ－１ＰＶのウイルスストックを使用して、細胞あたり０．０１または０．０５プラーク形成単位（ＰＦＵ）のＭＯＩで細胞を感染させた。感染時期（ＴＯＩ）は、Ｃｏｕｎｔｅｓｓ細胞数に基づく播種時（同時の感染および播種）または３～６日目（非同時感染）のいずれかであった。

【0068】

静置培養における細胞培養およびウイルス産生
同時の播種および感染：３．６Ｅ４細胞／ｃｍ^２を、ＶＰ－ＳＦＭ（商標）完全用、ＦＢＳ不含有ＶＰ－ＳＦＭ（商標）（表１を参照されたい）を含むＴ１７５フラスコに播種し、同時に感染させた。感染４日後（ｄｐｉ）に細胞を回収した。

【0069】

非同時の播種および感染：７．９Ｅ３細胞／ｃｍ^２を、ＶＰ－ＳＦＭ（商標）完全用、またはＶＰ－ＳＦＭ（商標）細胞増殖培地（表１を参照されたい）を含むＴ１７５フラスコに播種した。３日間の細胞増殖後、ＦＢＳ不含有ＶＰ－ＳＦＭ（商標）またはＶＰ－ＳＦＭ（商標）感染培地と培地を完全に交換した。同時に、参照Ｔ１７５フラスコのＣｏｕｎｔｅｓｓ細胞数に従って０．０１または０．０５のＭＯＩで細胞を感染させた。感染後２日目に、３日目からＶＰ－ＳＦＭ（商標）感染培地中にあった細胞について、ＦＢＳ不含有ＶＰ－ＳＦＭ（商標）による別の１００％培地交換を実施した。感染後４日目に、凍結融解によって細胞を回収した。

【0070】

キャリアの調製
マイクロキャリアおよびマクロキャリア（両方のシステムを論じる場合には「キャリア」と呼ぶ）の特徴付けを表２に示す。製造業者の指示に従ってＳｉｇｍａｃｏｔｅ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、ドイツ）でシリコーン処理したボトル中でマイクロキャリアを取り扱い保存した。非カチオン性マイクロキャリアをａｑｕａａｄ．ｉｎｊｅｃｔａｂｌｅ（Ｂ．Ｂｒａｕｎ、ドイツ）中で水和およびオートクレーブし、カチオン性マイクロキャリアを、Ｃａ^２＋およびＭｇ^２＋を含まない１×ＰＢＳ中で、製造業者の指示に従って水和およびオートクレーブした。マクロキャリアは供給時に無菌であり、使用前に３７℃で３０分間細胞培養液で水和した。

【0071】

キャリアについての細胞培養および産生システム
２４ウェルプレートでのスクリーニング：キャリアのスクリーニング実験は、２４ウェルの超低接着プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、ドイツ）において、ウェルあたり１ｍｌのＶＰ－ＳＦＭ（商標）完全用を用いて、３７℃、５％ＣＯ_２、および１００ｒｐｍのオービタル撹拌で、ＭａｘＱ２０００ＣＯ_２Ｐｌｕｓ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国）を用いて行った。静置対照は、キャリア試料と同様に処理したが、６ウェルプレート（９．６ｃｍ^２の増殖面積）に、ウェルあたり２ｍｌの細胞培養培地を用いて、撹拌せずに播種した。

【0072】

同時の播種および感染のために、１０ｃｍ^２または１１．３ｃｍ^２（ｉＣＥＬＬｉｓ（登録商標）からのマクロキャリアを半分に切断した）のキャリアを、３つのウェルにウェルごとに添加した。次いで、４Ｅ４細胞／ｃｍ^２の播種密度に相当する、ＮＢ－３２４Ｋ細胞を含む１ｍｌのＶＰ－ＳＦＭ（商標）完全用を各ウェルに添加し、０．０１のＭＯＩで感染させた。Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１００を用いて感染４日後に細胞を回収した。

【0073】

非同時の播種および感染のために、２ウェル中に１ウェルあたり５ｃｍ^２の増殖面積を加えた。次いで、２Ｅ４または４Ｅ４細胞／ｃｍ^２の播種密度に相当する、ＮＢ－３２４Ｋ細胞を含む１ｍｌのＶＰ－ＳＦＭ（商標）完全用を各ウェルに添加した。３日目に、キャリアあたり両方のウェルをプールし、試料由来の核を計数した。ウイルスおよび新鮮なキャリアを含む新鮮な細胞培養培地ＶＰ－ＳＦＭ（商標）完全用を添加し、各プールについて総増殖面積を１０ｃｍ^２から２０ｃｍ^２に、細胞培養容量を２ｍｌから４ｍｌに倍増させることによって、細胞を感染させた（０．０１のＭＯＩ）。次いで、使用済みおよび新鮮なキャリアのプールを、ウェルあたり５ｃｍ^２の増殖面積および１ｍｌの細胞培養培地を有する３つのウェルに分けた。Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１００を用いて感染４日後である７日目に細胞を回収した。

【0074】

エルレンマイヤーフラスコ中のマイクロキャリア：スクリーニング後、付着増強（ＥＡ）およびＣｙｔｏｄｅｘ（登録商標）１（ＣＤ１）マイクロキャリアを、ＭａｘＱ２０００ＣＯ_２Ｐｌｕｓ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国）を用いて、３７℃、５％ＣＯ_２、および６０～７０ｒｐｍのオービタル撹拌で、４０ｍｌのＶＰ－ＳＦＭ（商標）完全用を含み１０ｃｍ^２／ｍｌの増殖面積を有する１２５ｍｌエルレンマイヤーフラスコ中でのアップスケーリング実験のために選択した。ここで、２Ｅ４細胞／ｃｍ^２を播種し、撹拌を０ｒｐｍで３０分間、または３０ｒｐｍで３時間に減少させて、細胞付着を促進した。３日目に、試料を採取して、ウイルス感染（０．０１のＭＯＩ）について核数を用いて細胞密度を決定し、ウイルスを、新しいＶＰ－ＳＦＭ（商標）完全用との同じ日の５０％培地交換の間に添加した。

【0075】

マクロキャリアを用いたエルレンマイヤーフラスコ中でのウイルス産生
Ｆｉｂｒａ－Ｃｅｌ（登録商標）およびｉＣＥＬＬｉｓ（登録商標）からのマクロキャリアも、マイクロキャリアについて記載されたものと同様のパラメータを用いて１２５ｍｌエルレンマイヤーフラスコ中で試験した。しかしながら、オービタル撹拌は３０～１００ｒｐｍであり、播種中の撹拌は１００ｒｐｍ、または４０ｒｐｍで１分間、次いで０ｒｐｍで３０分間のサイクルのいずれかであり、これを４回繰り返して、合計播種時間を２時間とした。

【0076】

キャリアを用いたスピナーフラスコ中でのウイルス産生
ＥＡおよびＣＤ１マイクロキャリアを、２５０ｍｌのスピナーフラスコ（ＩｎｔｅｇｒａＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、スイス）中で、Ｆｉｂｒａ－Ｃｅｌ（登録商標）およびｉＣＥＬＬｉｓ（登録商標）からのマクロキャリアを、５００ｍｌのスピナーフラスコ（ＩｎｔｅｇｒａＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、スイス）中で、１００ｍｌのＶＰ－ＳＦＭ（商標）完全用および１０ｃｍ^２／ｍｌの増殖面積で、３７℃、５％ＣＯ_２、および１５～３０ｒｐｍの撹拌でさらにスケールアップした。次いで、２Ｅ４細胞／ｃｍ^２を播種し、撹拌を０ｒｐｍで３０分間、または４０ｒｐｍで１分間、次いで０ｒｐｍで３０分間のサイクルに減少させ、これを４回繰り返して、合計播種時間を２時間とした。３日目に、試料を採取して、ウイルス感染（０．０１または０．０５のＭＯＩ）について核数を用いて細胞密度を決定し、そしてウイルスを、ＶＰ－ＳＦＭ（商標）完全用との同日の５０％培地交換の間に添加した。感染４日後に細胞を回収した。

【0077】

ｉＣＥＬＬｉｓ（登録商標）ナノでのウイルス産生
ｉＣＥＬＬｉｓ（登録商標）ナノシステムを、０．５３ｍ^２および４ｍ^２の固定床サイズで試験した。製造業者の指示に従って固定床を調製した後、バイオリアクターに、２％ＦＢＳを添加した８５０ｍｌのＶＰ－ＳＦＭ（商標）細胞増殖培地を充填した。４ｍ^２の固定床に対して、追加の３１５０ｍｌのＶＰ－ＳＦＭ（商標）細胞増殖培地を供給する再循環ループを接続した。次いで、５Ｅ３細胞／ｃｍ^２を０．５３ｍ^２固定床に、または９Ｅ３細胞／ｃｍ^２を４ｍ^２固定床に播種し、３７℃、ｐＨ７．３、３０～４０％溶存酸素超で維持した。３～６日の細胞増殖後、いくつかのマクロキャリアを固定床の上部から取り出し、細胞を計数し、続いて、１％ＦＢＳを添加したＶＰ－ＳＦＭ（商標）感染培地への１００％培地交換中に０．０１のＭＯＩで感染させた。感染２日後、ＦＢＳ培地不含有ＶＰ－ＳＦＭ（商標）への追加の１００％培地交換を実施した。感染４日後に細胞を回収した。

【0078】

回収
ウェル、エルレンマイヤーフラスコまたはスピナーフラスコに播種したキャリア培養物について、感染４日後に細胞培養培地を除去し、次いで、細胞溶解のために０．０２ｍｌ／ｃｍ^２の１％Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１００、０．１ＭＴｒｉｓ、ｐＨ９．５で３７℃にて３０分間処理した。

【0079】

ｉＣＥＬＬｉｓ（登録商標）ナノ培養物については、感染４日後に細胞培養培地を除去した。次いで、固定床中の細胞をＰＢＳですすぎ、０．５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０を含むか、または含まない０．０９４ｍｌ／ｃｍ^２（０．５３ｍ^２）または０．０１４ｍｌ／ｃｍ^２（４ｍ^２）の溶解緩衝液２５ｍＭＴｒｉｓ、５ｍＭＭｇＣｌ_２、５％ＴｒｙｐＬＥ（商標）ｐＨ１０で、ＣＯ_２を伴わずに４０℃で１時間溶解し、洗浄緩衝液２５ｍＭＴｒｉｓ、５ｍＭＭｇＣｌ_２、ｐＨ１０ですすぐことができる。溶解および洗浄を一緒にプールし、０．２５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０を含むか、または含まない、好ましくはＴｗｅｅｎ（登録商標）８０を含まない、２５ｍＭＴｒｉｓ、５ｍＭＭｇＣｌ_２、２．５％ＴｒｙｐＬＥ（商標）ｐＨ１０を得る。

【0080】

静置培養のために、凍結／融解プロセスを介した細胞溶解を行った。培地を除去し、感染細胞を１×ＰＢＳで洗浄した。培地上清および剥離した細胞を５０００×ｇで５分間遠心分離した。ペレットをＰＢＳで洗浄し、０．０２ｍｌ／ｃｍ^２の０．０５ＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．７（ＶＴ）で３７℃、３０分間再懸濁し、３回の凍結（液体窒素）および解凍（３７℃）サイクルに供した。加えて、培地最適化およびＦＢＳ減少の間に以下の工程を行った。５０００×ｇで５分間の遠心分離後、細胞片を廃棄した。次いで、細胞溶解物を、ＳｏｎｏｒｅｘＳｕｐｅｒ１０Ｐ超音波ホモジナイザー（Ｂａｎｄｅｌｉｎ、ドイツ）を用いて４８Ｗで１分間超音波処理し、５ｍＭＭｇＣｌ_２を添加した後、ＤＮＡｓｅ（５０Ｕ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ、ドイツ）で３７℃、３０分間処理して、非カプシド化ウイルスＤＮＡおよび混入した宿主細胞ＤＮＡを除去した。

【0081】

ウイルス収量の定量
感染性粒子についてプラーク形成アッセイを行うことによってウイルスを定量した（方法の説明についてはＬｅｕｃｈｓ（２０１６）を参照されたい）。

【実施例2】

【0082】

１００％培地交換を使用する２段階ＦＢＳ減少戦略と３段階ＦＢＳ減少戦略との比較
その後、本発明者らは、１００％培地交換を使用する２段階ＦＢＳ減少戦略と３段階ＦＢＳ減少戦略とを比較した。ＶＰ－ＳＦＭ（商標）培地を用いた全ての培地交換戦略の概要については、図１を参照されたい。全ての戦略は、シードトレインにおいて５％ＦＢＳで開始し、続いて５％または２％ＦＢＳ中で３日間細胞増殖させ、播種後３日目に１００％培地交換と同時感染を行った。２段階プロセスにおいて、０％ＦＢＳ（２－０％）で感染させた場合、１．０Ｅ７ＰＦＵ／ｃｍ^２の得られたウイルス収量は、全プロセスにわたって５％ＦＢＳ添加（５－５％）と同程度であった（図２を参照されたい）。３段階戦略では、２％ＦＢＳで播種した３日後の１００％培地交換に、１％ＦＢＳ（２－１－０％）を含むか、またはＦＢＳ不含有（２－０－０％）のいずれかを添加し、続いて、両方について５日目にＦＢＳを含まない第２の１００％培地交換を行った。３つの独立した実験により、２－１－０％ＦＢＳ戦略は、２－０－０％ＦＢＳ戦略と比較して、収量が７．７Ｅ７ＰＦＵ／ｃｍ^２まで約０．３ｌｏｇＰＦＵ／ｃｍ^２増加することが実証された（図３）。要約すると、結果は、プロセスにわたるＦＢＳの枯渇が、２－１－０％ＦＢＳ戦略を適用することにより達成される最も高いウイルス収量で実現可能であることを示す。しかしながら、ＦＢＳにはＶＰ－ＳＦＭ（商標）だけでは供給できない、高ウイルス収量に必要な成分が含まれている。

【実施例3】

【0083】

大規模Ｈ－１ＰＶ回収に必要な化学的細胞溶解
本発明の方法において、感染性ウイルス粒子の大部分は、回収時に細胞に結合している。Ｈ－１ＰＶを回収するために、Ｔｒｉｓ－ＥＤＴＡ緩衝液（ＶＴＥ）（Ｌｅｕｃｈｓ２０１６）またはＴｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ＶＴ）（Ｌｅｕｃｈｓ２０１７）中での凍結融解細胞溶解が、静置培養物について以前に報告された。キャリア上の付着細胞を用いた大規模産生には、大規模化可能な細胞溶解が必要である。したがって、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０を含むか、または含まない、Ｔｒｉｓ、ＭｇＣｌ_２および組換え細胞解離酵素ＴｒｙｐＬＥ（商標）を含有する溶解緩衝液を用いて、＞２．０Ｅ７ＰＦＵ／ｃｍ^２である満足のいくウイルス収量をもたらす代替的な細胞溶解方法を開発した（図４を参照されたい）。

【0084】

まとめると、培地最適化、ならびにＴｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１００溶解またはＴｗｅｅｎ（登録商標）８０を含むか、または含まないＴｒｉｓ、ＭｇＣｌ_２および組換え細胞解離酵素を含有する溶解緩衝液を用いた３段階培地交換戦略は、産生をスケールアップするための確かな基礎となる。

【実施例4】

【0085】

２４ウェルスケールでのマイクロキャリアおよびマクロキャリア上での細胞増殖のスクリーニングは、ビーズ間の細胞移動が可能である
付着細胞を用いた大規模産生のために、懸濁培養のためのマイクロキャリア、または固定床バイオリアクターのためのマクロキャリアを使用することができる。本発明者らは、１１種類のキャリアについて、細胞増殖、ビーズ間移動能力、およびウイルス収量をスクリーニングした。キャリアでの直接細胞計数は困難だった。したがって、増殖の指標としてグルコースの消費量を測定した。

【0086】

いくつかの細胞株は、連続した細胞増殖のために、コンフルエントなマイクロキャリアから新しいマイクロキャリアへの個々の細胞ブリッジを構築することができる。このビーズ間移動は、新しいマイクロキャリアを添加するだけでよいので、トリプシン処理を伴わずにシードトレイン細胞増殖を容易にすることができる。ビーズ間移動能力を試験するために、細胞をマイクロキャリア上に播種し、４日目および７日目に１：２に分割することによって、更なるマイクロキャリアを新鮮な細胞培養培地と共に添加した。トリプシン処理後のマイクロキャリアのトリパンブルー細胞計数を、１：２分割前の４日目、および１０日目に行った。図５では、細胞ブリッジを用いたビーズ間移動が、マイクロキャリアＥＡおよびＣＤ１を用いて示されている。トリプシン処理を伴わないビーズ間移動能力は、ＮＢ－３２４Ｋ細胞を用いたスケールアップされたシードトレインにおける良好な細胞増殖能力を示唆している。

【実施例5】

【0087】

Ｃｙｔｏｄｅｘ（登録商標）１およびｉＣＥＬＬｉｓ（登録商標）からのマクロキャリアは、最も高いＨ－１ＰＶ収率を示す
キャリア上での細胞増殖を特徴付けた後、本発明者らは、Ｈ－１ＰＶの高いウイルス産生に最も適した条件を同定するために、異なる産生戦略（ビーズ間移動を伴うまたは伴わない、同時の感染／非同時の播種および感染）を適用した。

【0088】

２４ウェルの超低付着プレートにおけるキャリアの同時の感染および播種では、ほとんどのマイクロキャリア（ＨＩＩ、ＳＰ、Ｐ、ＰＰ、ＥＡ、ＳＩＩ、ＣＰ１、ＣＰ２）について同様のウイルス収量がもたらされた。最も高い収率は、マイクロキャリアＣＤ１およびマクロキャリアｉＣで達成され、それぞれ３．４Ｅ７ＰＦＵ／ｃｍ^２および２．０Ｅ７ＰＦＵ／ｃｍ^２であった（図６ａを参照されたい）。マクロキャリアＦＣは、４．２Ｅ６ＰＦＵ／ｃｍ^２の最も低い収量であった。

【0089】

非同時の播種および感染のために、４Ｅ４細胞／ｃｍ^２密度に加えて、５０％減少した２Ｅ４細胞／ｃｍ^２の播種密度を、より高い収率について試験した。播種の３日後、細胞を感染させ、ビーズ間移動のために、１：２分割、新しい細胞培養培地およびマイクロキャリアを添加して容量およびマイクロキャリア密度を維持することを行った。ウイルス収量は、４Ｅ４細胞／ｃｍ^２の播種密度で最も高く、これは、固体ＨＩＩならびに多孔性ＣＰ１およびＣＰ２キャリアを除いて、ビーズ間移動を伴わない同時の播種および感染と比較して、ほとんどのマイクロキャリアについて同様であった（図６ｂを参照されたい）。まとめると、高いウイルス産生は、全ての試験した戦略で可能であるようであるが、４Ｅ４細胞／ｃｍ^２の播種密度を必要とする。加えて、ＨＩＩならびに多孔性マイクロキャリアＣＰ１およびＣＰ２は、ビーズ間移動を伴わない同時の感染および播種でのみ高い収率を示した。

【0090】

選択した２つのマイクロキャリアおよび２つのマクロキャリアを用いて、２４ウェルプレート形式から最大１００ｍｌのエルレンマイヤーフラスコおよびスピナーフラスコでスケールアップを検討した。マイクロキャリアＣＤ１は最も高い収量を示したが、マイクロキャリアＥＡの表面は１０層ＣｅｌｌＳＴＡＣＫ（登録商標）チャンバーの収量と同等であった。２４ウェルプレートの小規模試験には限界があるため、固定床バイオリアクター用の両マクロキャリアをスケールアップ実験にも選択した。播種およびプロセス撹拌、キャリア密度、細胞播種密度、ＭＯＩ、ＴＯＩ、ビーズ間移動の有無、容器あたりの細胞培養容量、ならびに培地交換計画などの広範囲のパラメータを試験した（表３および４を参照されたい）。しかしながら、エルレンマイヤーフラスコで４０ｍｌおよびスピナーフラスコで１００ｍｌの細胞培養液を用いた場合の、最も有望なパラメータのみを示す（図７ａおよびｂを参照されたい）。

【0091】

マイクロキャリアＣＤ１は、エルレンマイヤーフラスコでは４．３Ｅ７ＰＦＵ／ｃｍ^２の収量レベルに達したが、スピナーフラスコでスケールアップすると１ｌｏｇ少なくなった。マイクロキャリアＥＡは全てのシステムでＣＤ１よりウイルス収量が低かった。

【0092】

エルレンマイヤーフラスコ中のマクロキャリアｉＣおよびＦＣ、マクロキャリア密度１０ｃｍ^２／ｍｌ、総細胞表面４００ｃｍ^２で、３．０Ｅ７ＰＦＵ／ｃｍ^２のウイルス収量を達成した。しかしながら、スピナーフラスコにスケールアップした場合、収量は、ビーズ間移動がなく、１０ｃｍ^２／ｍｌ、細胞表面１０００ｃｍ^２で１．０Ｅ６ＰＦＵ／ｃｍ^２以下であった。エルレンマイヤーフラスコにおけるＣＤ１および両マクロキャリアの結果から、懸濁液中で高いウイルス収量が可能であることが確認され、これらのキャリアは更なるスケールアップの最有力候補である。

【実施例6】

【0093】

ｉＣＥＬＬｉｓ（登録商標）ナノでの第１の産生
エルレンマイヤーフラスコで生成した３．０Ｅ７ＰＦＵ／ｃｍ^２の収量を仮定すると、ｉＣＥＬＬｉｓ（登録商標）５００ｍ^２の固定床では、１．５Ｅ１４ＰＦＵのバッチ収量が期待できる（１５，０００回投与に相当し、１回あたり１Ｅ１０ＰＦＵ）。したがって、スケールダウンしたｉＣＥＬＬｉｓ（登録商標）ナノシステムでウイルス産生を試験した。

【0094】

ｉＣＥＬＬｉｓ（登録商標）ナノベンチトップ・バイオリアクターでの産生には、新たに開発した培地交換戦略２－１－０％ＦＢＳを使用した。ここでは、０．５３ｍ^２および４ｍ^２の固定床サイズを試験し、それぞれ３．７Ｅ６ＰＦＵ／ｃｍ^２および５．７Ｅ６ＰＦＵ／ｃｍ^２の結果を得た（図８を参照されたい）。両固定床とも収量は同等であったが、エルレンマイヤーフラスコおよび定常ランコントロールにおけるｉＣＥＬＬｉｓ（登録商標）からのマクロキャリアよりも約１対数ステップ低かった。

【0095】

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【図1】