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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2025-01-09
(54)【発明の名称】微生物発酵産物中の残留ＤＮＡの低減
(51)【国際特許分類】
C12N 1/08 20060101AFI20241226BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20241226BHJP
C12P 21/02 20060101ALI20241226BHJP
C12N 9/22 20060101ALI20241226BHJP
C07K 14/00 20060101ALI20241226BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20241226BHJP
C12N 9/00 20060101ALI20241226BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20241226BHJP
【ＦＩ】
C12N1/08
C12N1/21 ZNA
C12P21/02 C
C12N9/22
C07K14/00
C12N1/15
C12N9/00
C12N1/19
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024535261
(86)(22)【出願日】2022-12-23
(85)【翻訳文提出日】2024-06-12
(86)【国際出願番号】 EP2022087724
(87)【国際公開番号】W WO2023118565
(87)【国際公開日】2023-06-29
(31)【優先権主張番号】21217519.4
(32)【優先日】2021-12-23
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(31)【優先権主張番号】22205881.0
(32)【優先日】2022-11-07
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】500586299
【氏名又は名称】ノボザイムス アクティーゼルスカブ
(74)【代理人】
【識別番号】100099759
【弁理士】
【氏名又は名称】青木 篤
(74)【代理人】
【識別番号】100123582
【弁理士】
【氏名又は名称】三橋 真二
(74)【代理人】
【識別番号】100117019
【弁理士】
【氏名又は名称】渡辺 陽一
(74)【代理人】
【識別番号】100141977
【弁理士】
【氏名又は名称】中島 勝
(74)【代理人】
【識別番号】100138210
【弁理士】
【氏名又は名称】池田 達則
(74)【代理人】
【識別番号】100134784
【弁理士】
【氏名又は名称】中村 和美
(72)【発明者】
【氏名】カーステン チョート
(72)【発明者】
【氏名】リスト カカレフスキ
(72)【発明者】
【氏名】ジョン スビント
(72)【発明者】
【氏名】クリスティーナ ランド クリステンセン
(72)【発明者】
【氏名】カーステン ブラント ヤコブセン
【テーマコード（参考）】
4B064
4B065
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B064AG01
4B064CA02
4B064CA05
4B064CA06
4B064CA19
4B064CA21
4B064CC24
4B064CD20
4B064CE06
4B064DA20
4B065AA01X
4B065AA57X
4B065AA72X
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065BB28
4B065BC01
4B065BD18
4B065BD44
4B065CA23
4B065CA24
4B065CA27
4B065CA44
4B065CA60
4H045AA10
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA10
4H045EA60
4H045FA74
4H045GA10
(57)【要約】
本発明は、回収プロセス中に、得られる微生物発酵産物にアスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）に由来する真菌ＤＮａｓｅを添加することによって、微生物発酵産物中のＤＮＡの量を低減する方法を提供する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
（ａ）微生物宿主細胞と、前記微生物宿主細胞由来の組換えＤＮＡと、前記微生物宿主細胞によって産生される目的のタンパク質とを含む発酵ブロスを用意するステップと、（ｂ）前記発酵ブロスを凝集又は沈殿ステップに供して、発酵ブロス上清を用意するステップと、
（ｃ）前記発酵ブロス上清を、膜が１００ｋＤａ未満又は１μｍ未満のサイズ排除限度を有する膜濾過ステップに供して、発酵産物を用意するステップと
を含む、微生物発酵産物中のＤＮＡの量を低減する方法であって、
真菌ＤＮａｓｅ又はそのバリアントが、発酵の前若しくは発酵中に発酵培地に、ステップ（ａ）において若しくは後で前記発酵ブロスに、ステップ（ｂ）の後で前記発酵ブロス上清に、又はステップ（ｃ）の後で前記発酵産物に添加される、方法。
【請求項2】
前記目的のタンパク質が、前記微生物宿主細胞と異種である、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
ステップ（ａ）の前記発酵ブロスが、前記目的のタンパク質を少なくとも０．１％ｗ／ｗ、好ましくは少なくとも０．５％ｗ／ｗ、より好ましくは少なくとも１％ｗ／ｗの量で含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項4】
前記目的のタンパク質が、酵素、ヘムを含有するタンパク質、細胞シグナル伝達タンパク質又はリガンド結合タンパク質、好ましくは酵素である、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項5】
ステップ（ｃ）の前記膜濾過が、精密濾過ステップを含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項6】
ステップ（ｃ）の前記膜濾過が、限外濾過ステップを含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項7】
ステップ（ａ）の前記微生物宿主細胞の一部又は全部が、機械的に又は酵素的に破壊／ホモジナイズされている、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項8】
前記真菌ＤＮａｓｅ又はそのバリアントが、配列番号２に対して、少なくとも６０％の、７０％を超える、８０％を超える、９０％を超える、９５％を超える、９６％を超える、９７％を超える、９８％を超える、９９％を超える、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有し、前記バリアントがＤＮａｓｅ活性を示す、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項9】
前記真菌ＤＮａｓｅ又はそのバリアントが、ＤＮａｓｅ＿ＮｕｃＡ＿ＮｕｃＢドメインを含み、モチーフ［ＬＶ］［ＰＴＡ］［ＦＹ］［ＤＥ］［ＶＡＧＰＨ］Ｄ［ＣＦＹ］［ＷＹ］［ＡＴ］［ＩＭ］Ｌ［ＣＹＱ］及び／又はモチーフＧＰＹＣＫ（配列番号３）若しくはＷＦ［ＱＥ］ＩＴ（配列番号４）のいずれかをさらに含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項10】
前記微生物宿主細胞が、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、ハンゼヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、クルイベロマイセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）、サッカロマイセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾサッカロマイセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、アクレモニウム属（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、フザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、フミコラ属（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、ムコール属（Ｍｕｃｏｒ）、ミセリオフトラ属（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）、ニューロスポラ属（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、チエラビア属（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ）、トリポクラジウム属（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ）、及びトリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）からなる群から選択される株である、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項11】
前記微生物宿主細胞が、細菌宿主細胞、好ましくは、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、エシュリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、ブティアウクセラ属（Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ）及びシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）からなる群から選択される株、より好ましくはバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）株である、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項12】
前記微生物発酵産物が、１０ｎｇ／ｇ未満の組換えＤＮＡ、好ましくは５ｎｇ／ｇ未満、１ｎｇ／ｇ未満、０．５ｎｇ／ｇ未満、０．１ｎｇ／ｇ未満、０．０５ｎｇ／ｇ未満、又は０．０１ｎｇ／ｇ未満の組換えＤＮＡを含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項13】
１０ｎｇ／ｇ未満の組換えＤＮＡ、好ましくは５ｎｇ／ｇ未満、１ｎｇ／ｇ未満、０．５ｎｇ／ｇ未満、０．１ｎｇ／ｇ未満、０．０５ｎｇ／ｇ未満、又は０．０１ｎｇ／ｇ未満の組換えＤＮＡを含む、微生物発酵産物。
【請求項14】
真菌ＤＮａｓｅ又はそのバリアント、好ましくはＮＵＣ３ヌクレアーゼをさらに含む、請求項１３に記載の微生物発酵産物。
【請求項15】
目的のタンパク質、好ましくは少なくとも０．１％ｗ／ｗの目的のタンパク質、より好ましくは少なくとも０．５％ｗ／ｗの目的のタンパク質、より一層好ましくは少なくとも１％ｗ／ｗの目的のタンパク質をさらに含む、請求項１３又は１４に記載の微生物発酵産物。
【請求項16】
前記目的のタンパク質が、目的の組換えタンパク質、好ましくは酵素である、請求項１５に記載の微生物発酵産物。
【請求項17】
請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法によって産生される、請求項１３～１６のいずれか一項に記載の微生物発酵産物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
配列表の参照
本出願は、コンピュータ可読形式の配列表を含有する。このコンピュータ可読形式は、参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、コンピュータ可読形式の配列表を含有する。このコンピュータ可読形式は、参照により本明細書に組み込まれる。
【0002】
本発明は、真菌ＤＮａｓｅを使用する、微生物発酵産物中の残留組換えＤＮＡの低減に関する。
【背景技術】
【0003】
発酵によるタンパク質産物の産生は、周知のプロセスであり、多くの相異なる目的のタンパク質の工業規模での製造に使用される。発酵中、目的のタンパク質産物を産生する宿主細胞の中には崩壊するものがあり、ＤＮＡを含むその細胞の内容物は、発酵ブロスに放出される。さらに、目的のタンパク質が細胞内産物として産生される発酵もある。このことが意味するのは、細胞が、発酵後の回収及び精製プロセスの前に、例えばホモジナイゼーションによって破壊／溶解することは避けられず、これによって必然的にかなりの量のＤＮＡが発酵ブロス中に放出され、続いてそれが最終タンパク質産物中に残留ＤＮＡとして存在し得る結果になるということである。
【0004】
例えば、環境又は健康に関する懸念のため、目的のタンパク質を産生する宿主細胞から残留ＤＮＡを回避することが望まれ得る。これは、組換えＤＮＡにおいて特に懸念される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
したがって、発酵産物中の残留ＤＮＡを低減する必要がある。
【課題を解決するための手段】
【0006】
本発明は、第１の態様において、
（ａ）微生物宿主細胞と、微生物宿主細胞由来の組換えＤＮＡと、微生物宿主細胞によって産生される目的のタンパク質とを含む発酵ブロスを用意するステップと、
（ｂ）その発酵ブロスを凝集又は沈殿ステップに供して、発酵ブロス上清を用意するステップと、
（ｃ）その発酵ブロス上清を、膜が１００ｋＤａ未満又は１μｍ未満のサイズ排除限度を有する膜濾過ステップに供して、発酵産物を用意するステップと
を含む、微生物発酵産物中のＤＮＡの量を低減する方法であって、
真菌ＤＮａｓｅ又はそのバリアントが、ステップ（ａ）の前、最中、若しくは後でその発酵ブロスに、ステップ（ｂ）の後でその発酵ブロス上清に、又はステップ（ｃ）の後でその発酵産物に添加される、方法を提供する。
（ａ）微生物宿主細胞と、微生物宿主細胞由来の組換えＤＮＡと、微生物宿主細胞によって産生される目的のタンパク質とを含む発酵ブロスを用意するステップと、
（ｂ）その発酵ブロスを凝集又は沈殿ステップに供して、発酵ブロス上清を用意するステップと、
（ｃ）その発酵ブロス上清を、膜が１００ｋＤａ未満又は１μｍ未満のサイズ排除限度を有する膜濾過ステップに供して、発酵産物を用意するステップと
を含む、微生物発酵産物中のＤＮＡの量を低減する方法であって、
真菌ＤＮａｓｅ又はそのバリアントが、ステップ（ａ）の前、最中、若しくは後でその発酵ブロスに、ステップ（ｂ）の後でその発酵ブロス上清に、又はステップ（ｃ）の後でその発酵産物に添加される、方法を提供する。
【0007】
別の態様において、本発明は、１０ｎｇ／ｇ未満、５ｎｇ／ｇ未満、１ｎｇ／ｇ未満、又は０．１ｎｇ／ｇ未満の組換えＤＮＡを含む微生物発酵産物を提供する。
【0008】
本発明の他の態様及び実施形態は、説明及び実施例から明らかにされる。
【0009】
特に明記しない限り、又は文脈から他の何かを意味することが明らかな場合、全てのパーセンテージは重量パーセンテージ（％ｗ／ｗ）である。
【0010】
特に定義されない限り、本明細書で使用する全ての用語（技術用語及び科学用語を含む）は、本発明が属する技術分野の当業者に一般的に理解されるものと同じ意味を有する。さらに当然のことながら、一般的に使用される辞書に定義されているものなどの用語は、本明細書の文脈及び関連技術におけるその意味と一致する意味を有するものと解釈されるべきであり、本明細書において明示的に理想的な又は過度に形式的な意味に定義されない限り、そのように解釈されてはならない。簡潔に及び／又は明確にするために、周知の機能又は構造は、詳細に記載されない場合がある。
【0011】
本明細書で使用する場合、単数形（「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」）は、文脈上特に明示されていない限り、複数形も含むものとする。
【0012】
定義
配列同一性：２つのアミノ酸配列間又は２つのヌクレオチド配列間の関連性は、「配列同一性」というパラメーターにより説明される。
配列同一性：２つのアミノ酸配列間又は２つのヌクレオチド配列間の関連性は、「配列同一性」というパラメーターにより説明される。
【0013】
本発明においては、２つのアミノ酸配列間の配列同一性は、好ましくはバージョン６．６．０以降の、ＥＭＢＯＳＳパッケージ（ＥＭＢＯＳＳ：Ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｏｐｅｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｓｕｉｔｅ，Ｒｉｃｅ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．１６：２７６－２７７）のＮｅｅｄｌｅプログラムにおいて実装されている、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３－４５３）を使用して、「最長の同一性」のアウトプットとして求められる。使用されるパラメーターは、ギャップ開始ペナルティが１０、ギャップ伸長ペナルティが０．５、及びＥＢＬＯＳＵＭ６２（ＥＭＢＯＳＳバージョン：ＢＬＯＳＵＭ６２）置換マトリックスである。Ｎｅｅｄｌｅプログラムが最長の同一性を報告するために、－ｎｏｂｒｉｅｆオプションをコマンドラインに指定しなければならない。「最長の同一性」と標識されるＮｅｅｄｌｅのアウトプットは、以下のように算出される：
（同一残基×１００）／（アラインメントの長さ－アラインメント中のギャップの合計数）。
（同一残基×１００）／（アラインメントの長さ－アラインメント中のギャップの合計数）。
【0014】
細胞片：「細胞片」という用語は、細胞壁／膜の破壊後、例えば微生物細胞の破壊／溶解／ホモジナイゼーション後に放出される細胞壁及び他の不溶性の細胞成分を指す。細胞壁／膜を意図的に破壊しなくとも、一部の微生物細胞は発酵プロセス中に崩壊し、細胞片を放出することがある。
【0015】
配列
配列番号１：バチルス・シビ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｂｉ）由来のＤＮａｓｅのアミノ酸配列。
配列番号２：アスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）由来のＤＮａｓｅのアミノ酸配列。
配列番号３：ＮＵＣ３ ＤＮａｓｅモチーフのアミノ酸配列。
配列番号４：ＮＵＣ３ ＤＮａｓｅモチーフのアミノ酸配列。
配列番号５～１５：ｄＰＣＲに使用されたプライマー及びプローブのヌクレオチド配列（実施例１）。
配列番号１：バチルス・シビ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｂｉ）由来のＤＮａｓｅのアミノ酸配列。
配列番号２：アスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）由来のＤＮａｓｅのアミノ酸配列。
配列番号３：ＮＵＣ３ ＤＮａｓｅモチーフのアミノ酸配列。
配列番号４：ＮＵＣ３ ＤＮａｓｅモチーフのアミノ酸配列。
配列番号５～１５：ｄＰＣＲに使用されたプライマー及びプローブのヌクレオチド配列（実施例１）。
【発明を実施するための形態】
【0016】
本発明者らは、真菌ＤＮａｓｅ、特にＮＵＣ３ヌクレアーゼが、発酵産物中の残留ＤＮＡを低減又は除去する効率が高いことを発見した。
【0017】
本発明は、目的のタンパク質を発現し、それを発酵ブロス中に分泌するか、又は細胞内産物として蓄積する微生物宿主細胞（特に組換え宿主細胞）の発酵によって産生される、目的のタンパク質を含む産物中の残留ＤＮＡの量を低減する方法を提供する。目的のタンパク質が細胞内産物として産生される場合、微生物宿主細胞は、回収及び精製の前にホモジナイズされる場合がある。
【0018】
発酵及び任意選択のホモジナイゼーションの後、発酵ブロスを凝集又は沈殿ステップに供して、発酵ブロス上清を用意する。これは、事実上、（不溶性の）宿主細胞及び細胞片の大部分を除去し、目的のタンパク質の水性溶液及び一部の可溶性の宿主細胞成分、例えば残留する宿主細胞ＤＮＡを保持する固液分離である。
【0019】
最後に、発酵ブロス上清を膜濾過プロセスで濾過して目的のタンパク質の純度を高め、液体発酵産物を用意する。膜濾過は、膜及び濾過プロセスのタイプに依存して、より高分子量の成分及び／又はより低分子量の成分を除去し得る。濾液を保持する膜濾過プロセス（精密濾過）もあれば、保持液／透過液を保持する膜濾過プロセス（限外濾過）もある。
【0020】
本発明の方法は、真菌ＤＮａｓｅ又はそのバリアントを、発酵の前若しくは発酵中に発酵培地に、凝集／沈殿の前に発酵ブロスに、膜濾過の前に発酵ブロス上清に、又は膜濾過の後に発酵産物に、添加するステップを含む。
【0021】
本発明者らは、水及び他の低分子化合物の量を低減して（限外濾過）、それにより、目的のタンパク質及び残留する宿主細胞ＤＮＡの濃度を高める膜濾過の後に、真菌ＤＮａｓｅが発酵産物に適用されるのが有利であり得ることを発見した。
【0022】
本発明に従って、真菌ＤＮａｓｅ又はそのバリアントが「添加される」、又は「適用される」場合、これは、発酵ブロス中の微生物宿主細胞によるＤＮａｓｅの（内在性の）産生／発現を除外する。真菌ＤＮａｓｅは、外部源から添加されるか又は適用される、単離された又は回収された酵素である。外部源由来のＤＮａｓｅを適用することは有利である。なぜなら、そうすれば、微生物宿主細胞の産生能力が、専ら（商業的）目的のタンパク質を産生するために使用されるからである。
【0023】
ＤＮＡは、単一ヌクレオチド、又は例えばデジタルＰＣＲによって測定される１５０ｂｐ未満のオリゴヌクレオチドまで分解された場合、除去されたと考えられる。
【0024】
微生物宿主細胞
微生物宿主細胞は、任意の属のものとすることができる。所望の目的のタンパク質は、その目的のタンパク質を産生する能力のある宿主細胞と同種でも異種でもよい。
微生物宿主細胞は、任意の属のものとすることができる。所望の目的のタンパク質は、その目的のタンパク質を産生する能力のある宿主細胞と同種でも異種でもよい。
【0025】
「相同タンパク質」又は「未変性タンパク質」という用語は、それが産生される宿主細胞に由来する遺伝子によってコードされるタンパク質を意味する。
【0026】
「異種タンパク質」という用語は、それが産生される宿主細胞には外来性である遺伝子によってコードされるタンパク質を意味する。
【0027】
「組換え宿主細胞」という用語は、本明細書で使用する場合、所望のタンパク質をコードする遺伝子を内部にもち、前記遺伝子を発現して、所望のタンパク質を産生する能力のある宿主細胞を意味する。所望のタンパク質をコードする遺伝子は、当技術分野において周知の技術を使用して、組換え宿主細胞に、形質転換、形質移入、又は形質導入などをされてもよい。
【0028】
所望のタンパク質が異種タンパク質である場合、所望のタンパク質を産生する能力のある組換え宿主細胞は、好ましくは真菌起源又は細菌起源のものである。組換え宿主細胞の選択は、所望のタンパク質をコードする遺伝子及び前記タンパク質の供給源に大幅に依存することになる。
【0029】
「野生型宿主細胞」という用語は、本明細書で使用する場合、所望のタンパク質をコードする遺伝子を、元来内部にもち、前記遺伝子を発現する能力のある宿主細胞を指す。
【0030】
その変異体は、例えば、所望のタンパク質の調製を強化するために、１つ又は複数の遺伝子が欠失された野生型宿主細胞であり得る。
【0031】
好ましい実施形態では、組換え又は野生型の微生物宿主細胞は、細菌又は真菌である。
【0032】
微生物宿主細胞は、酵母細胞、例えば、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、ハンゼヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、クルイベロマイセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）、サッカロマイセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾサッカロマイセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、又はヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）の株であり得る。別の態様において、株は、サッカロマイセス・カールスベルゲンシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ）、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロマイセス・ジアスタティカス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓ）、サッカロマイセス・ドウグラシイ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｄｏｕｇｌａｓｉｉ）、サッカロマイセス・クルイベリ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｋｌｕｙｖｅｒｉ）、サッカロマイセス・ノルベンシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｎｏｒｂｅｎｓｉｓ）、又はサッカロマイセス・オビフォルミス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｏｖｉｆｏｒｍｉｓ）の株である。
【0033】
微生物宿主細胞は、アクレモニウム属（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）、アガリクス属（Ａｇａｒｉｃｕｓ）、アルテルナリア属（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、アウレオバシジウム属（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ）、ボトリオスパエリア属（Ｂｏｔｒｙｏｓｐａｅｒｉａ）、セリポリオプシス属（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ）、ケトミジウム属（Ｃｈａｅｔｏｍｉｄｉｕｍ）、クリソスポリウム属（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）、クラビセプス属（Ｃｌａｖｉｃｅｐｓ）、コクリオボルス属（Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ）、コプリノプシス属（Ｃｏｐｒｉｎｏｐｓｉｓ）、コプトテルメス属（Ｃｏｐｔｏｔｅｒｍｅｓ）、コリナスクス属（Ｃｏｒｙｎａｓｃｕｓ）、クリフォネクトリア属（Ｃｒｙｐｈｏｎｅｃｔｒｉａ）、クリプトコッカス属（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ジプロディア属（Ｄｉｐｌｏｄｉａ）、エクシディア属（Ｅｘｉｄｉａ）、フィリバシディウム属（Ｆｉｌｉｂａｓｉｄｉｕｍ）、フザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、ジベレラ属（Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ）、ホロマスチゴトイデス属（Ｈｏｌｏｍａｓｔｉｇｏｔｏｉｄｅｓ）、フミコラ属（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、イルペックス属（Ｉｒｐｅｘ）、レンチヌラ属（Ｌｅｎｔｉｎｕｌａ）、レプトスパエリア属（Ｌｅｐｔｏｓｐａｅｒｉａ）、マグナポルテ属（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ）、メラノカルプス属（Ｍｅｌａｎｏｃａｒｐｕｓ）、メリピルス属（Ｍｅｒｉｐｉｌｕｓ）、ムコール属（Ｍｕｃｏｒ）、ミセリオフトラ属（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）、ネオカリマスティクス属（Ｎｅｏｃａｌｌｉｍａｓｔｉｘ）、ニューロスポラ属（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、ペシロマイセス属（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ）、ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、ファネロカエテ属（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ）、ピロマイセス属（Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ）、ポイトラシア属（Ｐｏｉｔｒａｓｉａ）、シュードプレクタニア属（Ｐｓｅｕｄｏｐｌｅｃｔａｎｉａ）、シュードトリコニンファ属（Ｐｓｅｕｄｏｔｒｉｃｈｏｎｙｍｐｈａ）、リゾムコール属（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ）、シゾフィラム属（Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ）、スキタリジウム属（Ｓｃｙｔａｌｉｄｉｕｍ）、タラロマイセス属（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）、サーモアスカス属（Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ）、チエラビア属（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ）、トリポクラジウム属（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ）、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、トリコファエア属（Ｔｒｉｃｈｏｐｈａｅａ）、バーティシリウム属（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ）、ボルバリエラ属（Ｖｏｌｖａｒｉｅｌｌａ）又はキシラリア属（Ｘｙｌａｒｉａ）の各株などの糸状真菌株であり得る。
【0034】
別の態様において、株は、アクレモニウム・セルロリティカス（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓ）、アスペルギルス・アクレアタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｃｕｌｅａｔｕｓ）、アスペルギルス・アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｗａｍｏｒｉ）、アスペルギルス・フェチダス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｏｅｔｉｄｕｓ）、アスペルギルス・フミガーツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、アスペルギルス・ジャポニカス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、クリソスポリウム・イノプス（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｉｎｏｐｓ）、クリソスポリウム・ケラチノフィラム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｋｅｒａｔｉｎｏｐｈｉｌｕｍ）、クリソスポリウム・ラックノウェンセ（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ）、クリソスポリウム・メルダリウム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｍｅｒｄａｒｉｕｍ）、クリソスポリウム・パンニコラ（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｐａｎｎｉｃｏｌａ）、クリソスポリウム・クィーンズランディカム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｑｕｅｅｎｓｌａｎｄｉｃｕｍ）、クリソスポリウム・トロピカム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｔｒｏｐｉｃｕｍ）、クリソスポリウム・ゾナタム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｚｏｎａｔｕｍ）、フザリウム・バクトリディオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｂａｃｔｒｉｄｉｏｉｄｅｓ）、フザリウム・セレアリス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｃｅｒｅａｌｉｓ）、フザリウム・クルックウェレンセ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｃｒｏｏｋｗｅｌｌｅｎｓｅ）、フザリウム・クルモラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｃｕｌｍｏｒｕｍ）、フザリウム・グラミネアラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）、フザリウム・グラミナム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｇｒａｍｉｎｕｍ）、フザリウム・ヘテロスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｈｅｔｅｒｏｓｐｏｒｕｍ）、フザリウム・ネグンディ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｎｅｇｕｎｄｉ）、フザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）、フザリウム・レチクラタム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｒｅｔｉｃｕｌａｔｕｍ）、フザリウム・ロゼウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｒｏｓｅｕｍ）、フザリウム・サンブキナム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓａｍｂｕｃｉｎｕｍ）、フザリウム・サルコクロウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓａｒｃｏｃｈｒｏｕｍ）、フザリウム・スポロトリキオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｉｏｉｄｅｓ）、フザリウム・スルフレウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｕｌｐｈｕｒｅｕｍ）、フザリウム・トルロサム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｔｏｒｕｌｏｓｕｍ）、フザリウム・トリコテキオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｔｒｉｃｈｏｔｈｅｃｉｏｉｄｅｓ）、フザリウム・ベネナタム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）、フミコラ・グリセア（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｇｒｉｓｅａ）、フミコラ・インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｉｎｓｏｌｅｎｓ）、フミコラ・ラヌギノサ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ）、イルペックス・ラクテウス（Ｉｒｐｅｘ ｌａｃｔｅｕｓ）、ムコール・ミエヘイ（Ｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ）、ミセリオフトラ・サーモフィラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、ニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）、ペニシリウム・フニクロサム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｆｕｎｉｃｕｌｏｓｕｍ）、ペニシリウム・プルプロゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｐｕｒｐｕｒｏｇｅｎｕｍ、ファネロカエテ・クリソスポリウム（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）、チエラビア・アクロマチカ（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ ａｃｈｒｏｍａｔｉｃａ）、チエラビア・アルボマイセス（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ ａｌｂｏｍｙｃｅｓ）、チエラビア・アルボピロサ（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ ａｌｂｏｐｉｌｏｓａ）、チエラビア・アウストラレインシス（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ ａｕｓｔｒａｌｅｉｎｓｉｓ）、チエラビア・フィメティ（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ ｆｉｍｅｔｉ）、チエラビア・ミクロスポラ（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ ｍｉｃｒｏｓｐｏｒａ）、チエラビア・オビスポラ（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ ｏｖｉｓｐｏｒａ）、チエラビア・ペルビアナ（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ ｐｅｒｕｖｉａｎａ）、チエラビア・セトサ（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ ｓｅｔｏｓａ）、チエラビア・スペデドニウム（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ ｓｐｅｄｅｄｏｎｉｕｍ）、チエラビア・サブサーモフィラ（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ ｓｕｂｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、チエラビア・テレストリス（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ）、トリコデルマ・ハルジアナム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｈａｒｚｉａｎｕｍ）、トリコデルマ・コニンギイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｋｏｎｉｎｇｉｉ）、トリコデルマ・ロンギブラキアタム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ）、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）、又はトリコデルマ・ビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｖｉｒｉｄｅ）の株である。
【0035】
一態様において、真菌宿主細胞は、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、ハンゼヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、クルイベロマイセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）、サッカロマイセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾサッカロマイセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、アクレモニウム属（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、フザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、フミコラ属（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、ムコール属（Ｍｕｃｏｒ）、ミセリオフトラ属（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）、ニューロスポラ属（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、チエラビア属（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ）、トリポクラジウム属（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ）及びトリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）からなる群から選択される株である。
【0036】
より好ましい実施形態では、糸状真菌宿主細胞は、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）及びアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）の宿主細胞、特に、トリコデルマ・ハルジアナム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｈａｒｚｉａｎｕｍ）、トリコデルマ・コニンギイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｋｏｎｉｎｇｉｉ）、トリコデルマ・ロンギブラキアタム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ）、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）、トリコデルマ・ビリデル（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｖｉｒｉｄｅｌ）、アスペルギルス・アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｗａｍｏｒｉ）、アスペルギルス・フミガーツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、アスペルギルス・フェチダス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｏｅｔｉｄｕｓ）、アスペルギルス・ジャポニカス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）又はアスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）の株からなる群から選択され、特に、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）の株である。
【0037】
別の好ましい実施形態では、組換え又は野生型の微生物宿主細胞は、細菌である。
【0038】
組換え宿主細胞は、本発明のポリヌクレオチドの単一のコピー又は少なくとも２つのコピー、例えば、３つ、４つ、５つ若しくはそれより多くのコピーを含んでもよい。
【0039】
宿主細胞は、任意のグラム陽性菌又はグラム陰性菌とすることができる。グラム陽性菌としては、以下に限定されないが、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、ゲオバチルス属（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトコッカス属（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、オセアノバチルス属（Ｏｃｅａｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、スタフィロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）及びストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）が挙げられる。グラム陰性菌としては、以下に限定されないが、カンピロバクター属（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、フラボバクテリウム属（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、フソバクテリウム属（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ヘリコバクター属（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ）、イリオバクター属（Ｉｌｙｏｂａｃｔｅｒ）、ナイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）及びウレアプラズマ属（Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ）が挙げられる。
【0040】
宿主細胞は、以下に限定されないが、バチルス・アルカロフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルス・ブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）、バチルス・サーキュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、バチルス・クラウジイ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｌａｕｓｉｉ）、バチルス・コアグランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、バチルス・フィルムス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｉｒｍｕｓ）、バチルス・ラウタス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｕｔｕｓ）、バチルス・レンタス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｅｎｔｕｓ）、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、バチルス・プミルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓ）、バチルス・ステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）及びバチルス・チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）の各細胞を含む任意のバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞とすることができる。一実施形態では、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞は、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）又はバチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の各細胞である。
【0041】
一実施形態では、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞は、バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞である。
【0042】
別の実施形態では、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞は、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞である。
【0043】
本発明においては、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）綱／属／種は、Ｐａｔｅｌ ａｎｄ Ｇｕｐｔａ，２０２０，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｓｙｓｔ．Ｅｖｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７０：４０６－４３８に記載されているとおりに定義されるものとする。
【0044】
細菌宿主細胞は、以下に限定されないが、ストレプトコッカス・エクイシミリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉｓｉｍｉｌｉｓ）、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトコッカス・ウベリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｕｂｅｒｉｓ）及びストレプトコッカス・エクイ亜種ズーデミカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉ ｓｕｂｓｐ．Ｚｏｏｅｐｉｄｅｍｉｃｕｓ）の各細胞を含む任意のストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）細胞とすることもできる。
【0045】
細菌宿主細胞は、以下に限定されないが、ストレプトマイセス・アクロモゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトマイセス・アベルミティリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）、ストレプトマイセス・セリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）、ストレプトマイセス・グリセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｕｓ）及びストレプトマイセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ）の各細胞を含む任意のストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）細胞とすることもできる。
【0046】
ＤＮＡを原核生物宿主細胞の中に導入する方法は、当技術分野において周知であり、以下に限定されないが、プロトプラスト形質転換、コンピテント細胞形質転換、エレクトロポレーション、コンジュゲーション、形質導入を含む任意の適切な方法を使用することができ、ＤＮＡは、線状ポリヌクレオチドとして又は環状ポリヌクレオチドとして導入される。当業者は、ＤＮＡを、例えば属に依存して所与の原核生物細胞の中に導入するのに適切な方法を容易に特定することができるであろう。ＤＮＡを原核生物宿主細胞の中に導入する方法は、例えば、Ｈｅｉｎｚｅ ｅｔ ａｌ．，２０１８，ＢＭＣ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １８：５６，Ｂｕｒｋｅ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９８：６２８９－６２９４，Ｃｈｏｉ ｅｔ ａｌ．，２００６，Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ６４：３９１－３９７、及びＤｏｎａｌｄ ｅｔ ａｌ．，２０１３，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９５（１１）：２６１２－２６２０に記載されている。
【0047】
真菌ＤＮａｓｅ
本発明において使用される真菌ＤＮａｓｅは、真菌微生物に由来するデオキシリボヌクレアーゼ又はそのバリアントである。ＤＮａｓｅは、ＤＮＡ骨格中のホスホジエステル結合の加水切断を触媒し、これによりＤＮＡを分解する任意の酵素である。活性の遺伝子座に基づいて２つの主要な分類がある。エキソヌクレアーゼは、末端から核酸を消化する。エンドヌクレアーゼは、ＤＮＡ分子の中央の領域に作用する。
本発明において使用される真菌ＤＮａｓｅは、真菌微生物に由来するデオキシリボヌクレアーゼ又はそのバリアントである。ＤＮａｓｅは、ＤＮＡ骨格中のホスホジエステル結合の加水切断を触媒し、これによりＤＮＡを分解する任意の酵素である。活性の遺伝子座に基づいて２つの主要な分類がある。エキソヌクレアーゼは、末端から核酸を消化する。エンドヌクレアーゼは、ＤＮＡ分子の中央の領域に作用する。
【0048】
真菌ＤＮａｓｅの例は、例えば、特許出願国際公開第２０１７／０５９８０２号パンフレット及び国際公開第２０１７／０５９８０１号パンフレット（参照により組み込まれる）に見出すことができ、これらは、真菌ＤＮａｓｅをコードするアミノ酸配列を開示している。真菌ＤＮａｓｅは、真菌株に起源をもつ野生型ＤＮａｓｅである。特に好ましい真菌ＤＮａｓｅは、配列番号２として示されるアスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）ＤＮａｓｅである。
【0049】
真菌ＤＮａｓｅのバリアントは、真菌の野生型ＤＮａｓｅに対して、６０％を超える、７０％を超える、８０％を超える、又は９０％を超えるアミノ酸配列同一性を有し得る。
【0050】
特定の実施形態では、真菌ＤＮａｓｅ又はそのバリアントは、配列番号２に対して、６０％を超える、７０％を超える、８０％を超える、９０％を超える、９５％を超える、９６％を超える、９７％を超える、９８％を超える、又は９９％を超えるアミノ酸配列同一性を有する。或いは、真菌ＤＮａｓｅ又はそのバリアントは、配列番号２と比較して、１つ、２つ、３つ、４つ又は５つのアミノ酸置換、欠失又は挿入、好ましくは１つ、２つ、３つ、４つ又は５つの保存的アミノ酸置換を有する。
【0051】
好ましい実施形態では、真菌ＤＮａｓｅ又はそのバリアントは、ＮＵＣ３ヌクレアーゼである。
【0052】
ＤＮａｓｅ＿ＮｕｃＡ＿ＮｕｃＢ（Ｐｆａｍドメインｉｄ ＰＦ１４０４０、Ｐｆａｍバージョン３１．０ Ｆｉｎｎ（２０１６）。Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｄａｔａｂａｓｅ Ｉｓｓｕｅ ４４：Ｄ２７９－Ｄ２８５）のサブグループは、ＮＵＣ３と名付けられている。ＮＵＣ３ヌクレアーゼは、ＤＮａｓｅ＿ＮｕｃＡ＿ＮｕｃＢドメインを含有し、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するアスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）ＤＮａｓｅの２４～３５位のアミノ酸に相当するモチーフ［ＬＶ］［ＰＴＡ］［ＦＹ］［ＤＥ］［ＶＡＧＰＨ］Ｄ［ＣＦＹ］［ＷＹ］［ＡＴ］［ＩＭ］Ｌ［ＣＹＱ］、及び／又は配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するアスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）ＤＮａｓｅの１５７～１６１位のアミノ酸に相当するＧＰＹＣＫ（配列番号３）モチーフ（複数）のうちいずれか、又は配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するアスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）ＤＮａｓｅの１４６～１５０位のアミノ酸に相当するＷＦ［ＱＥ］ＩＴ（配列番号４）を含む。
【0053】
したがって、配列番号２として示されるアスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）ＤＮａｓｅは、ＮＵＣ３ ＤＮａｓｅである。
【0054】
ＤＮａｓｅバリアントにおけるアミノ酸変化は、上記のように、典型的には１～３０アミノ酸の小規模な欠失；アミノ末端メチオニン残基などの小型のアミノ末端又はカルボキシル末端延長；最大２０～２５残基の小型のリンカーペプチド；又は正味電荷若しくはポリヒスチジントラクト、抗原エピトープ若しくは結合モジュールなどの別の機能を変化させることによって精製を容易にする小規模な延長などの、タンパク質の折り畳み及び／又は活性に有意な影響を及ぼさない保存的アミノ酸置換又は挿入である、軽微な性質のものであり得る。
【0055】
ポリペプチド（タンパク質、酵素）中の必須アミノ酸は、部位特異的変異誘発又はアラニンスキャニング変異誘発などの当技術分野において公知の手順に従って同定することができる（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ ａｎｄ Ｗｅｌｌｓ，１９８９，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１０８１－１０８５）。後者の技術では、分子中の全ての残基に単一のアラニン変異を導入し、得られた分子をＤＮａｓｅ活性について試験して、分子の活性に不可欠なアミノ酸残基を同定する。Ｈｉｌｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：４６９９－４７０８も参照されたい。酵素の活性部位又は他の生物学的相互作用は、推定される接触部位アミノ酸の変異と組み合わせて、核磁気共嗚、結晶構造解析、電子回折又は光親和性標識などの技術で測定される構造の物理的分析によって判定することもできる。例えば、ｄｅ Ｖｏｓ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５５：３０６－３１２、Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２４：８９９－９０４、Ｗｌｏｄａｖｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９２，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．３０９：５９－６４を参照されたい。必須アミノ酸の同定は、関連ポリペプチドとのアラインメントから推測することもでき、及び／又は関連ポリペプチドとの、又はポリペプチド若しくはタンパク質ファミリー内で、共通祖先に由来するポリペプチド／タンパク質（典型的には類似の３次元構造、機能及び有意な配列類似性を有する）との、配列相同性及び保存触媒機構から推測することもできる。追加として又は代替として、タンパク質構造の予測ツールをタンパク質構造のモデル化のために使用して、ポリペプチドの必須アミノ酸及び／又は活性部位を同定することができる。例えば、Ｊｕｍｐｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０２１，“Ｈｉｇｈｌｙ ａｃｃｕｒａｔｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ＡｌｐｈａＦｏｌｄ”，Ｎａｔｕｒｅ ５９６：５８３－５８９を参照されたい。
【0056】
単一又は複数のアミノ酸の置換、欠失及び／又は挿入は、変異誘発、組換え及び／又はシャッフリングの既知の方法、続いて関連するスクリーニング手順（例えば、Ｒｅｉｄｈａａｒ－Ｏｌｓｏｎ ａｎｄ Ｓａｕｅｒ，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１：５３－５７、Ｂｏｗｉｅ ａｎｄ Ｓａｕｅｒ，１９８９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：２１５２－２１５６、国際公開第９５／１７４１３号パンフレット、又は国際公開第９５／２２６２５号パンフレットに開示されているものなど）を使用して、実行し、試験することができる。使用することができる他の方法としては、エラープローンＰＣＲ、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集、ファージディスプレイ（例えば、Ｌｏｗｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３０：１０８３２－１０８３７、米国特許第５，２２３，４０９号明細書、国際公開第９２／０６２０４号パンフレット）、及び部位特異的変異誘発（Ｄｅｒｂｙｓｈｉｒｅ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｇｅｎｅ ４６：１４５、Ｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８８，ＤＮＡ ７：１２７）が挙げられる。
【0057】
目的のタンパク質
目的のタンパク質は、微生物宿主細胞によって産生される。そのようなタンパク質は、生存生物内で広範囲の機能（反応の触媒、ＤＮＡ複製、刺激への応答、細胞及び生物への構造の提供、及びある位置から別の位置への分子の輸送を含む）を実行する小さな（ペプチド；＜５０アミノ酸）又は大きな（ポリペプチド；＞５０アミノ酸）生体分子であり得る。タンパク質は重合アミノ酸の鎖から構成され、その鎖は極めて特殊な３次元構造に折り畳まれている。３次元構造は、タンパク質の機能を維持するために不可欠である。一部の化学物質は、折り畳みを変更することができるか、又は３次元構造をほどく（変性させる）ことさえでき、その結果、機能の損失、例えば酵素活性の損失が生じる。
目的のタンパク質は、微生物宿主細胞によって産生される。そのようなタンパク質は、生存生物内で広範囲の機能（反応の触媒、ＤＮＡ複製、刺激への応答、細胞及び生物への構造の提供、及びある位置から別の位置への分子の輸送を含む）を実行する小さな（ペプチド；＜５０アミノ酸）又は大きな（ポリペプチド；＞５０アミノ酸）生体分子であり得る。タンパク質は重合アミノ酸の鎖から構成され、その鎖は極めて特殊な３次元構造に折り畳まれている。３次元構造は、タンパク質の機能を維持するために不可欠である。一部の化学物質は、折り畳みを変更することができるか、又は３次元構造をほどく（変性させる）ことさえでき、その結果、機能の損失、例えば酵素活性の損失が生じる。
【0058】
一実施形態では、タンパク質は、ポリペプチド、好ましくは球状タンパク質／ポリペプチドである。別の実施形態では、タンパク質は、生理学的条件で可溶性である。
【0059】
タンパク質は、少なくとも４つの明確な群、即ち、酵素、細胞シグナル伝達タンパク質、リガンド結合タンパク質及び構造タンパク質に分類される。
【0060】
別の実施形態では、少なくとも１つの目的のポリペプチドは、抗体、抗体断片、抗体系薬物、Ｆｃ融合タンパク質、抗凝固剤、血液因子、骨形成タンパク質、改変タンパク質足場、成長因子、血液凝固因子、ホルモン、インターフェロン（インターフェロンアルファ－２ｂなど）、インターロイキン、ラクトフェリン、アルファ－ラクトアルブミン、ベータ－ラクトアルブミン、オボムコイド、オボスタチン、サイトカイン、オベスタチン、ヒトガラクトシダーゼ（ヒトアルファ－ガラクトシダーゼＡなど）、ワクチン、タンパク質ワクチン及び血栓溶解剤からなる群から選択される治療用ポリペプチドを含む。
【0061】
酵素は、以下に記載される。
【0062】
細胞シグナル伝達タンパク質及びリガンド結合タンパク質としては、例えば、受容体、膜タンパク質、イオンチャネル、抗体（例えば単一ドメイン抗体）、ホルモン、ヘモグロビン及びヘモグロビン様分子などのタンパク質が挙げられる。ヘムを含有する酵素、例えばペルオキシゲナーゼ及びペルオキシダーゼは、酵素活性を含み得るか、又はヘムを含有する酵素の不活性化バリアントであり得る。
【0063】
構造タンパク質は、剛性及び硬性を付与されなければ流動性である生物学的成分に、それらを付与する。
【0064】
好ましくは、タンパク質は、酵素、細胞シグナル伝達タンパク質又はリガンド結合タンパク質であり、より好ましくは、タンパク質は酵素である。
【0065】
酵素
目的のタンパク質は、酵素（触媒タンパク質）であり得る。タンパク質が酵素である場合、タンパク質の量は、活性酵素タンパク質である。
目的のタンパク質は、酵素（触媒タンパク質）であり得る。タンパク質が酵素である場合、タンパク質の量は、活性酵素タンパク質である。
【0066】
「活性酵素タンパク質」という用語は、本明細書において、触媒タンパク質の量と定義され、これは酵素活性を表す。これは、活性ベースの分析用酵素アッセイを使用して求めることができる。そのようなアッセイにおいて、酵素は通常、有色化合物を生成する反応を触媒する。有色化合物の量は、測定することができ、活性酵素タンパク質の濃度に相関し得る。この技術は、当技術分野において周知である。
【0067】
酵素は、例えば、ヒドロラーゼ、リアーゼ、トランスフェラーゼ、プロテアーゼ、アミラーゼ、グルコアミラーゼ、ペクチナーゼ、ペクチン酸リアーゼ、セルラーゼ、キシラナーゼ、アラビナーゼ、アルビノフラノシダーゼ（ａｒｂｉｎｏｆｕｒａｎｏｓｉｄａｓｅ）、マンナナーゼ、カラジーナナーゼ、キサンタナーゼ、エンドグルカナーゼ、キチナーゼ、アスパラギナーゼ、リパーゼ、ホスホリパーゼ、クチナーゼ、リゾチーム、フィターゼ、デアミダーゼ、トランスグルタミナーゼ、オキシドレダクターゼ（糖オキシダーゼ、ラッカーゼ、ペルオキシダーゼ、カタラーゼなど）、ラクターゼ、グルコースイソメラーゼ、キシロースイソメラーゼ及びエステラーゼからなる群から選択される１つ又は複数の酵素とすることができる。
【0068】
酵素は、細菌又は真菌起源の天然の酵素とすることができ、又は酵素は、遺伝子シャッフリングによる、及び／若しくは１つ又は複数のアミノ酸の置換、欠失若しくは挿入による、１つ又は複数の天然の酵素に由来するバリアントとすることができる。化学修飾された又はタンパク質が改変された変異体が含まれる。
【0069】
発酵ブロス
本発明は、工業規模の任意の発酵、例えば、少なくとも５０リットル、好ましくは少なくとも５００リットル、より好ましくは少なくとも５，０００リットル、より一層好ましくは少なくとも５０，０００リットルの培養培地を有する任意の発酵に有用であり得る。
本発明は、工業規模の任意の発酵、例えば、少なくとも５０リットル、好ましくは少なくとも５００リットル、より好ましくは少なくとも５，０００リットル、より一層好ましくは少なくとも５０，０００リットルの培養培地を有する任意の発酵に有用であり得る。
【0070】
目的のタンパク質を産生する微生物は、当技術分野において公知の任意の方法で発酵させることができる。発酵培地は、例えば国際公開第９８／３７１７９号パンフレットに記載されているような最小培地としてもよく、又は発酵培地は、複合窒素源及び炭素源を含む複合培地としてもよく、複合窒素源は、国際公開第２００４／００３２１６号パンフレットに記載されているように、部分的に加水分解されていてもよい。
【0071】
発酵は、バッチ、反復バッチ、フェドバッチ、反復フェドバッチ又は連続発酵プロセスとして実行されてもよい。
【0072】
フェドバッチプロセスでは、発酵の開始前に、１つ又は複数の栄養素を含む化合物は、培地に添加されないか、又はその化合物の一部が培地に添加され、発酵プロセスの間、１つ又は複数の栄養素を含む化合物の全部又は残部がそれぞれフィードされる。フィードするために選択された化合物は、発酵プロセスに、一緒に又は別々にフィードすることができる。
【0073】
反復フェドバッチ又は連続発酵プロセスでは、発酵中に、完全開始培地がさらにフィードされる。開始培地は、構造要素のフィードと一緒に又はそれとは別にフィードすることができる。反復フェドバッチプロセスでは、バイオマスを含む発酵ブロスの一部が一定時間間隔で除去されるが、連続プロセスでは、発酵ブロスの一部の除去が連続的に発生する。これにより、発酵プロセスは、取り除かれた発酵ブロスの量に相当する新鮮培地の一部を補充される。
【0074】
本発明の好ましい実施形態では、フェドバッチ発酵プロセスからの発酵ブロスが好ましい。
【0075】
一実施形態では、発酵ブロスは、少なくとも２４時間、少なくとも４８時間、少なくとも７２時間、少なくとも９６時間又は少なくとも１２０時間の培養時間後に供給される。
【0076】
特定の実施形態では、発酵ブロスは、少なくとも１２０時間の培養時間後に供給される。
【0077】
本発明によれば、発酵ブロスは、水で２０００％（ｗ／ｗ）まで希釈されてもよく、好ましくは、発酵ブロスは、水で１０～２０００％（ｗ／ｗ）希釈されてもよく、より好ましくは、発酵ブロスは、水で１００～１５００％（ｗ／ｗ）希釈されてもよく、より好ましくは、発酵ブロスは、水で１００～１０００％（ｗ／ｗ）希釈されてもよく、より好ましくは、発酵ブロスは、水で２００～８００％（ｗ／ｗ）希釈されてもよい。
【0078】
水での希釈とは、本発明によれば、希釈媒体は、水でもよく、又は目的のタンパク質の産生物からの限外濾過の透過液でもよく、又は目的のタンパクの質の産生物からの水のリサイクル物でもよく、又は加熱器からの縮合物でもよく、又は上記の任意の組み合わせ、例えば水と限外濾過の透過液との混合物でもよいことを意味する。
【0079】
発酵ブロスは、宿主細胞（目的のポリペプチドを産生するために使用される、目的のポリペプチドをコードする遺伝子を含有する宿主細胞を含む）、細胞片、バイオマス、細菌宿主細胞由来の組換えＤＮＡ、発酵培地及び／又は発酵産物を含む。一部の実施形態では、組成物は、有機酸、死滅細胞及び／又は細胞片並びに培養培地を含有する、細胞が死滅した全ブロスである。
【0080】
例えば、発酵ブロスは、培養微生物を飽和まで成長させ、炭素制限条件下でインキュベートして、タンパク質合成（例えば、宿主細胞による酵素の発現）及び細胞培養培地への分泌を可能にすると、生成される。発酵ブロスは、発酵の終了時に得られる発酵材料の未分画内容物又は分画内容物を含有し得る。典型的には、発酵ブロスは、未分画であり、例えば遠心分離によって微生物細胞（例えばバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞）が除去された後に存在する、使用済み培養培地及び細胞片を含む。一部の実施形態では、発酵ブロスは、使用済み細胞培養培地、細胞外酵素、並びに生存及び／又は非生存微生物細胞を含有する。
【0081】
細胞が死滅した全ブロス又は細胞組成物は、発酵の終了時に得られる発酵材料の未分画内容物を含有し得る。典型的には、細胞が死滅した全ブロス又は細胞組成物は、微生物細胞（例えばバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞）を飽和まで成長させ、炭素制限条件下でインキュベートして、タンパク質合成を可能にした後に存在する、使用済み培養培地及び細胞片を含有する。一部の実施形態では、細胞が死滅した全ブロス又は細胞組成物は、使用済み細胞培養培地、微生物宿主細胞由来の組換えＤＮＡ、細胞外酵素及び死滅微生物細胞を含有する。一部の実施形態では、細胞が死滅した全ブロス又は組成物の中に存在する微生物細胞は、当技術分野において公知の方法を使用して、透過処理及び／又は溶解することができる。
【0082】
本明細書に記載される全ブロス又は細胞組成物は、典型的には液体であるが、不溶性成分、例えば、死滅細胞、微生物宿主細胞由来の組換えＤＮＡ、細胞片、培養培地成分、及び／又は不溶性酵素などを含有し得る。一部の実施形態では、不溶性成分を除去して、清澄化した液体組成物を得ることができる。
【0083】
本発明の全ブロス製剤及び細胞組成物は、国際公開第９０／１５８６１号パンフレット又は国際公開第２０１０／０９６６７３号パンフレットに記載されている方法によって生成することができる。
【0084】
凝集／沈殿
発酵ブロスを凝集させるため、二価の塩、特にカルシウム塩及び／又はマグネシウム塩、例えば塩化カルシウム又は塩化マグネシウムを発酵ブロスに添加してもよい。好ましい実施形態は、カルシウム塩、特に塩化カルシウムである。
発酵ブロスを凝集させるため、二価の塩、特にカルシウム塩及び／又はマグネシウム塩、例えば塩化カルシウム又は塩化マグネシウムを発酵ブロスに添加してもよい。好ましい実施形態は、カルシウム塩、特に塩化カルシウムである。
【0085】
塩は、発酵ブロスに、０．０１～１０％（ｗ／ｗ）／ｋｇ発酵ブロス（無希釈）、好ましくは０．５～１０％（ｗ／ｗ）／ｋｇ発酵ブロス（無希釈）、より好ましくは１～９％（ｗ／ｗ）／ｋｇ発酵ブロス（無希釈）、特に２～８％（ｗ／ｗ）／ｋｇ発酵ブロス（無希釈）の濃度で添加することができる。
【0086】
ポリアルミニウム化合物
ＤＮＡの発酵ブロスからの除去をさらに改善するため、ポリアルミニウム化合物を発酵ブロスに添加してもよい。多くのアルミニウム化合物、例えば、Ａｌ２（ＳＯ４）３、ＮａＡｌＯ２、Ｋ２Ａｌ２Ｏ４、ＡｌＣｌ３、Ａｌ（ＮＯ３）３、酢酸Ａｌ及びギ酸Ａｌは、凝集を改善することが知られている。
ＤＮＡの発酵ブロスからの除去をさらに改善するため、ポリアルミニウム化合物を発酵ブロスに添加してもよい。多くのアルミニウム化合物、例えば、Ａｌ２（ＳＯ４）３、ＮａＡｌＯ２、Ｋ２Ａｌ２Ｏ４、ＡｌＣｌ３、Ａｌ（ＮＯ３）３、酢酸Ａｌ及びギ酸Ａｌは、凝集を改善することが知られている。
【0087】
特に有用なポリ塩化アルミニウムは、ＣＡＳ番号：１３２７－４１－９の、式Ａｌｎ（ＯＨ）ｍＣｌ（３ｎ－ｍ）及びポリ塩化アルミニウム及びクロロヒドロキシアルミニウムの化合物を含む。
【0088】
有用なポリ塩化アルミニウムの例は、クロロヒドロキシアルミニウム、Ｇｕｌｂｒａｎｄｓｅｎから入手可能なＧＣ８５０（商標）（Ａｌ２（ＯＨ）５Ｃｌ）又は実験式（ｂｒｕｔｔｏ ｆｏｒｍｕｌａ）Ａｌ（ＯＨ）１，２Ｃｌ１，８を有するアルミニウム錯体であるＮｏｒｄＰａｃ１８（Ｎｏｒｄｉｓｋ Ａｌｕｍｉｎａｔ Ａ／Ｓ、デンマークから入手可能）を含む。式Ａｌ（ＯＨ）１，２Ｃｌ１，８を有する有用なポリ塩化アルミニウムの別の例は、ＰＡＸ－ＸＬ１００（Ｋｅｍｉｒａから入手可能）である。有用なポリ塩化アルミニウムの別の２つの例は、ＰＡＣ（Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｈａｏｔｉａｎ Ｗａｔｅｒ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ Ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ Ｃｏ．，Ｌｔｄから入手可能、固体形態で供給される）又はＰＡＣ（Ｔｉａｎｊｉｎ Ｋａｉｒｕｉｔｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｔｄ．から入手可能、液体形態で供給される）である。式Ａｌ（ＯＨ）１，２Ｃｌ１，８を有する有用なポリ塩化アルミニウムの別の例は、ＰＡＸ１８（Ｋｅｍｉｒａ Ｗａｔｅｒ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓから入手可能）である。
【0089】
ポリ塩化アルミニウムの濃度は、通常、ｋｇ発酵ブロス（無希釈）当たりで算出された０．１～１０％（ｗ／ｗ）の範囲、好ましくはｋｇ発酵ブロス（無希釈）当たりで算出された０．５～５％（ｗ／ｗ）の範囲にある。
【0090】
ポリ塩化アルミニウムの添加後、ｐＨを調整することができる。ｐＨは、ｐＨ２～ｐＨ１１の範囲内のｐＨに調整することができる。ｐＨは、当技術分野において知られているように任意の酸又は塩基で調整することができる。
【0091】
ポリ塩化アルミニウムは、微生物が発酵ブロスから分離された後に添加することもできる。
【0092】
ポリ塩化アルミニウムは、２つ以上のステップで、例えば、微生物が発酵ブロスから除去される前に、及び次いで微生物が除去された後に再度、その後の下流の処理液中などに添加することもできる。
【0093】
ポリマー
ポリマーは、粒子凝集のために使用することができる。アニオン性ポリマー及びカチオン性ポリマーが好ましい。有用なカチオン性ポリマーはポリアミンであり得、有用なアニオン性ポリマーはポリアクリルアミドであり得る。有用なポリマーの濃度は、通常、ｋｇ発酵ブロス（無希釈）当たりで算出された０．５～２０％（ｗ／ｗ）の範囲、好ましくはｋｇ発酵ブロス（無希釈）当たりで算出された１～１０％（ｗ／ｗ）の範囲にある。
ポリマーは、粒子凝集のために使用することができる。アニオン性ポリマー及びカチオン性ポリマーが好ましい。有用なカチオン性ポリマーはポリアミンであり得、有用なアニオン性ポリマーはポリアクリルアミドであり得る。有用なポリマーの濃度は、通常、ｋｇ発酵ブロス（無希釈）当たりで算出された０．５～２０％（ｗ／ｗ）の範囲、好ましくはｋｇ発酵ブロス（無希釈）当たりで算出された１～１０％（ｗ／ｗ）の範囲にある。
【0094】
有用なアニオン性ポリマーの例は、Ｓｕｐｅｒｆｌｏｃ（商標）Ａ１３０（Ｋｅｍｉｒａ）である。有用なカチオン性ポリマーの例は、Ｐｏｌｙｃａｔ（商標）（Ｋｅｍｉｒａ）、Ｃ５２１（Ｋｅｍｉｒａ）及びＣ５９１（Ｋｅｍｉｒａ）である。
【0095】
濾過及び他の下流の操作
凝集した細胞片は、当技術分野において公知の方法、例えば、以下に限定されないが、濾過、例えば、ドラム濾過、膜濾過、フィルタープレス全量濾過、クロスフロー濾過又は遠心分離などにより、除去することができる。
凝集した細胞片は、当技術分野において公知の方法、例えば、以下に限定されないが、濾過、例えば、ドラム濾過、膜濾過、フィルタープレス全量濾過、クロスフロー濾過又は遠心分離などにより、除去することができる。
【0096】
次いで、得られた発酵上清は、当技術分野において公知の方法でさらに処理又は精製することができる。例えば、タンパク質は、以下に限定されないが、限外濾過及び透析濾過などのさらなる濾過、抽出、噴霧乾燥、蒸発、沈殿又は結晶化を含む従来の手順で回収することができる。
【0097】
「回収する」又は「回収」という用語は、細胞、核酸又は他の特定の材料のリストから選択される少なくとも１つの発酵ブロス成分からのポリペプチドの取り出し、例えば、全発酵ブロスからの、又は細胞を含まない発酵ブロスからのポリペプチドの回収を意味し、それは、ポリペプチド結晶収集によって、濾過、例えば深層濾過（濾過助剤若しくは充填濾過材、チャンバーフィルター内布濾過、回転式ドラム濾過、ドラム濾過、回転式真空ドラムフィルター、キャンドルフィルター、水平葉状フィルター又は類似のものを、枠組式又はモジュラー式の設定中でシード（ｓｈｅｅｄ）又はパッド濾過を用いて使用することによる）若しくは膜濾過（クロスフロー、動的クロスフロー又は全量操作のいずれかにおいてシート濾過、モジュール濾過、キャンドル濾過、精密濾過、限外濾過を使用する）によって、又は遠心分離（デカンター型遠心分離機、分離板型遠心分離機、液体サイクロン又は類似のものを使用する）によって、又はポリペプチドを沈殿させ、適切な固液分離方法を使用して、粒径による分類分離の使用により、ポリペプチドをブロス培地から収集することによって行われる。回収は、ポリペプチドの単離及び／又は精製を包含する。
【0098】
次に、単離されたタンパク質は、以下に限定されないが、クロマトグラフィー、例えばイオン交換、親和性、疎水性、クロマトフォーカシング及びサイズ排除、並びに／又は電気泳動的手順、例えば分取等電点電気泳動、並びに／又は吸収率較差溶解度、例えば硫酸アンモニウム沈殿、並びに／又は抽出を含む、当技術分野において公知の様々な手順により、さらに精製及び／又は改変されてもよい。
【0099】
精密濾過は、１０００ｋＤａより大きい、５００ｋＤａより大きい、１００ｋＤａより大きい、若しくは５０ｋＤａより大きい、及び／又は５μｍより大きい、１μｍより大きい、０．５μｍより大きい、０．４μｍより大きい、０．３μｍより大きい、０．２μｍより大きい、若しくは０．１μｍより大きいサイズ排除限度を有する膜、或いは等価な分子量排除特性を有する他のフィルターを必要とし得るものであり、発酵産物は、精密濾過の濾液である。
【0100】
精密濾過の後で、又は組み合わされたプロセスにおいて、発酵産物は、１００ｋＤａより大きい、８０ｋＤａより大きい、６０ｋＤａより大きい、５０ｋＤａより大きい、４０ｋＤａより大きい、３０ｋＤａより大きい、２０ｋＤａより大きい、１５ｋＤａより大きい、１０ｋＤａより大きい、５ｋＤａより大きい、若しくは１ｋＤａより大きいサイズ排除限度を有する膜、又は等価な分子量排除特性を有する別のフィルターを必要とする限外濾過ステップに供され得る。
【0101】
微生物発酵産物は、液体製剤又は固体製剤とすることができ、又はそのような製剤を調製するために使用することができる。
【0102】
液体製剤はポリオール（多価アルコール）を、例えば、少なくとも１０％ｗ／ｗ、少なくとも２５％ｗ／ｗ、又は少なくとも５０％ｗ／ｗの量で含み得る。ポリオールは、２つ以上のヒドロキシル基を有するアルコールである。有用なポリオールは、典型的には５００ｇ／ｍｏｌより低い分子量を有する。
【0103】
ポリオールは、非糖ポリオール、例えば、グリセロール、エチレングリコール、ジエチレングリコール、トリエチレングリコール、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、トリプロピレングリコール、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）など、並びに糖アルコール、例えば、ソルビトール、マンニトール、エリスリトール、ズルシトール、イノシトール、キシリトール及びアドニトールなどを含む。ポリオールは、糖ポリオールも、例えば単糖類及び二糖類、例えば、グルコース、フルクトース、ガラクトース、スクロース、ラクトース、マルトース及びトレハロースも含む。
【0104】
固体製剤は、例えば、高剪断造粒若しくは流動層造粒又は組み合わせによって調製される粒状体とすることができる。塩又はポリマーでのコーティングも適用され得る。
【0105】
残留する宿主細胞ＤＮＡの検出
残留する宿主細胞ＤＮＡという用語は、産生株、及び目的のタンパク質をコードするＤＮＡの断片に由来するゲノムＤＮＡを含んでいる。
残留する宿主細胞ＤＮＡという用語は、産生株、及び目的のタンパク質をコードするＤＮＡの断片に由来するゲノムＤＮＡを含んでいる。
【0106】
残留する微量の宿主細胞ＤＮＡの検出及び定量化は、当技術分野において公知の種々の方法によって実現することができる。特定の単一の標的配列を測定するために多くの方法が開発されている。方法の例は以下のとおりである。
（ａ）ドットブロット、及び宿主細胞の全ゲノムを網羅する代表的なプローブを生成するためにランダム六量体を使用する、放射性同位体標識されたＤＮＡプローブのハイブリダイゼーションを用いる、定義された起源の特定のＤＮＡを検出するハイブリダイゼーションベースの方法、
（ｂ）精製し、種の一致したゲノムＤＮＡを使用する増幅及び較正のための、特定の遺伝子配列を標的とする、定義された起源の特定のＤＮＡを検出する定量的なＰＣＲベースの方法、及び
（ｃ）精製し、種の一致したゲノムＤＮＡを使用する増幅及び較正のための、特定の遺伝子配列を標的とする、定義された起源の特定のＤＮＡを検出する定性的なＰＣＲ方法。閾値は、この方法を使用して検出することができるゲノムＤＮＡの最低量に基づいて決定される。
（ａ）ドットブロット、及び宿主細胞の全ゲノムを網羅する代表的なプローブを生成するためにランダム六量体を使用する、放射性同位体標識されたＤＮＡプローブのハイブリダイゼーションを用いる、定義された起源の特定のＤＮＡを検出するハイブリダイゼーションベースの方法、
（ｂ）精製し、種の一致したゲノムＤＮＡを使用する増幅及び較正のための、特定の遺伝子配列を標的とする、定義された起源の特定のＤＮＡを検出する定量的なＰＣＲベースの方法、及び
（ｃ）精製し、種の一致したゲノムＤＮＡを使用する増幅及び較正のための、特定の遺伝子配列を標的とする、定義された起源の特定のＤＮＡを検出する定性的なＰＣＲ方法。閾値は、この方法を使用して検出することができるゲノムＤＮＡの最低量に基づいて決定される。
【0107】
本発明に従い、微量のＤＮＡの精製を、ＦａｓｔＤＮＡ（商標）Ｓｐｉｎ Ｋｉｔ（ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）を使用して実現した。次いで、溶離した試料を、宿主細胞の染色体の遺伝子座に特定のプライマーを使用して、ＰＣＲ反応に供した。陽性対照は、既知量の宿主ＤＮＡがＰＣＲ反応に異なる濃度で添加される場合に含まれる。ＰＣＲ反応後、試料をゲル電気泳動に供し、ＤＮＡバンドの強度を比較して、元試料中の宿主ＤＮＡの濃度を推定する。ＰＣＲの詳細なプロトコルは、ｌｎｎｉｓ ｅｔ ａＬ（１９９０）ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙに記載されている。
【0108】
本方法を使用して、発酵ブロス又は他のタンパク質調製物を処理すると、発酵ブロス中に存在するＤＮＡの量の有意な低減が生じ、好ましくは、ＤＮＡ含量は、検出不能レベルまで低減される。レベルは、一倍体ゲノム中の単一コピーの中に存在するゲノムＤＮＡの任意のセグメントをＰＣＲ増幅し、次いで臭化エチジウム染色しても可視バンドが現れない場合に検出不能と考えられる。
【0109】
好ましくは、発酵ブロス中のＤＮＡレベルは、１μｇ／ｍｌ未満、好ましくは５００ｎｇ／ｍｌ未満、好ましくは２００ｎｇ／ｍｌ未満、好ましくは１００ｎｇ／ｍｌ未満、好ましくは５０ｎｇ／ｍｌ未満、好ましくは２０ｎｇ／ｍｌ未満、好ましくは１０ｎｇ／ｍｌ未満、好ましくは５ｎｇ／ｍｌ未満、好ましくは２ｎｇ／ｍｌ未満、好ましくは１ｎｇ／ｍｌ未満のレベルまで、最も好ましくは５００ｐｇ／ｍｌ未満のレベルまで低減される。
【0110】
一実施形態では、微生物発酵産物は、１０ｎｇ／ｇ未満、５ｎｇ／ｇ未満、１ｎｇ／ｇ未満、０．５ｎｇ／ｇ未満、０．１ｎｇ／ｇ未満、０．０５ｎｇ／ｇ未満、又は０．０１ｎｇ／ｇ未満の組換えＤＮＡを含む。
【0111】
典型的な規制環境の例において、検出限界が、例えば１、５、１０又は２０ｎｇ／ｍＬの酵素調製物であるＰＣＲベースのアッセイを使用すると、検出可能なＤＮＡがないことを確認することができる。
【0112】
加えて、発酵ブロス又は他のタンパク質調製物からＤＮＡを取り出す従来の方法と組み合わせる即製の方法の使用も企図される。
【0113】
本発明の一部のさらなる実施形態は、以下を含む。
【0114】
実施形態１．
（ａ）微生物宿主細胞と、微生物宿主細胞由来の組換えＤＮＡと、微生物宿主細胞によって産生される目的のタンパク質とを含む発酵ブロスを用意するステップと、
（ｂ）その発酵ブロスを凝集又は沈殿ステップに供して、発酵ブロス上清を用意するステップと、
（ｃ）その発酵ブロス上清を、膜が１００ｋＤａ未満又は１μｍ未満のサイズ排除限度を有する膜濾過ステップに供して、発酵産物を用意するステップと
を含む、微生物発酵産物中のＤＮＡの量を低減する方法であって、
真菌ＤＮａｓｅ又はそのバリアントが、発酵の前若しくは発酵中に発酵培地に、ステップ（ａ）において若しくは後でその発酵ブロスに、ステップ（ｂ）の後でその発酵ブロス上清に、又はステップ（ｃ）の後でその発酵産物に添加される、方法。
（ａ）微生物宿主細胞と、微生物宿主細胞由来の組換えＤＮＡと、微生物宿主細胞によって産生される目的のタンパク質とを含む発酵ブロスを用意するステップと、
（ｂ）その発酵ブロスを凝集又は沈殿ステップに供して、発酵ブロス上清を用意するステップと、
（ｃ）その発酵ブロス上清を、膜が１００ｋＤａ未満又は１μｍ未満のサイズ排除限度を有する膜濾過ステップに供して、発酵産物を用意するステップと
を含む、微生物発酵産物中のＤＮＡの量を低減する方法であって、
真菌ＤＮａｓｅ又はそのバリアントが、発酵の前若しくは発酵中に発酵培地に、ステップ（ａ）において若しくは後でその発酵ブロスに、ステップ（ｂ）の後でその発酵ブロス上清に、又はステップ（ｃ）の後でその発酵産物に添加される、方法。
【0115】
実施形態２．真菌ＤＮａｓｅ又はそのバリアントが、発酵の前又は発酵中にその発酵培地に添加される、実施形態１に記載の方法。
【0116】
実施形態３．真菌ＤＮａｓｅ又はそのバリアントが、ステップ（ａ）においてその発酵ブロスに添加される、実施形態１に記載の方法。
【0117】
実施形態４．真菌ＤＮａｓｅ又はそのバリアントが、ステップ（ａ）の後でその発酵ブロスに添加される、実施形態１に記載の方法。
【0118】
実施形態５．真菌ＤＮａｓｅ又はそのバリアントが、ステップ（ｂ）の後でその発酵ブロスに添加される、実施形態１に記載の方法。
【0119】
実施形態６．真菌ＤＮａｓｅ又はそのバリアントが、ステップ（ｃ）の後でその発酵ブロスに添加される、実施形態１に記載の方法。
【0120】
実施形態７．目的のタンパク質が、微生物宿主細胞と異種である、実施形態１～６のいずれか１つに記載の方法。
【0121】
実施形態８．目的のタンパク質が、微生物宿主細胞によって発酵ブロス中に分泌される、実施形態１～７のいずれか１つに記載の方法。
【0122】
実施形態９．目的のタンパク質が、微生物宿主細胞によって発酵ブロス中に分泌されない、実施形態１～８のいずれか１つに記載の方法。
【0123】
実施形態１０．ステップ（ａ）の発酵ブロスが、目的のタンパク質を少なくとも０．１％ｗ／ｗの量で含む、実施形態１～９のいずれか１つに記載の方法。
【0124】
実施形態１１．ステップ（ａ）の発酵ブロスが、目的のタンパク質を少なくとも０．５％ｗ／ｗの量で含む、実施形態１～１０のいずれか１つに記載の方法。
【0125】
実施形態１２．ステップ（ａ）の発酵ブロスが、目的のタンパク質を少なくとも１％ｗ／ｗの量で含む、実施形態１～１１のいずれか１つに記載の方法。
【0126】
実施形態１３．目的のタンパク質が、酵素、ヘムを含有するタンパク質、細胞シグナル伝達タンパク質又はリガンド結合タンパク質である、実施形態１～１２のいずれか１つに記載の方法。
【0127】
実施形態１４．目的のタンパク質が、酵素である、実施形態１～１３のいずれか１つに記載の方法。
【0128】
実施形態１５．ステップ（ｃ）の膜濾過が、精密濾過ステップを含む、実施形態１～１４のいずれか１つに記載の方法。
【0129】
実施形態１６．精密濾過膜が、０．１μｍ～１０μｍのサイズ排除限度を有する、実施形態１５に記載の方法。
【0130】
実施形態１７．精密濾過膜が、０．５μｍ～５μｍのサイズ排除限度を有する、実施形態１６に記載の方法。
【0131】
実施形態１８．ステップ（ｃ）の膜濾過が、限外濾過ステップを含む、実施形態１～１７のいずれか１つに記載の方法。
【0132】
実施形態１９．限外濾過膜が、１００ｋＤａ未満のサイズ排除限度を有する、実施形態１８に記載の方法。
【0133】
実施形態２０．限外濾過膜が、５０ｋＤａ未満のサイズ排除限度を有する、実施形態１９に記載の方法。
【0134】
実施形態２１．限外濾過膜が、４０ｋＤａ未満のサイズ排除限度を有する、実施形態２０に記載の方法。
【0135】
実施形態２２．限外濾過膜が、３０ｋＤａ未満のサイズ排除限度を有する、実施形態２１に記載の方法。
【0136】
実施形態２３．限外濾過膜が、２０ｋＤａ未満のサイズ排除限度を有する、実施形態２２に記載の方法。
【0137】
実施形態２４．限外濾過膜が、１０ｋＤａ未満のサイズ排除限度を有する、実施形態２３に記載の方法。
【0138】
実施形態２５．ステップ（ａ）の微生物宿主細胞の一部又は全部が、機械的に又は酵素的に破壊／ホモジナイズされている、実施形態１～２４のいずれか１つに記載の方法。
【0139】
実施形態２６．真菌ＤＮａｓｅ又はそのバリアントが、野生型真菌ＤＮａｓｅ、又は野生型真菌ＤＮａｓｅと少なくとも６０％のアミノ酸配列同一性を有するそのバリアントであり、そのバリアントがＤＮａｓｅ活性を示す、実施形態１～２５のいずれか１つに記載の方法。
【0140】
実施形態２７．そのバリアントが、野生型真菌ＤＮａｓｅと少なくとも７０％のアミノ酸配列同一性を有する、実施形態２５に記載の方法。
【0141】
実施形態２８．そのバリアントが、野生型真菌ＤＮａｓｅと少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有する、実施形態２５に記載の方法。
【0142】
実施形態２９．そのバリアントが、野生型真菌ＤＮａｓｅと少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有する実施形態２５に記載の方法。
【0143】
実施形態３０．そのバリアントが、野生型真菌ＤＮａｓｅと少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有する、実施形態２５に記載の方法。
【0144】
実施形態３１．そのバリアントが、野生型真菌ＤＮａｓｅと少なくとも９６％のアミノ酸配列同一性を有する、実施形態２５に記載の方法。
【0145】
実施形態３２．そのバリアントが、野生型真菌ＤＮａｓｅと少なくとも９７％のアミノ酸配列同一性を有する、実施形態２５に記載の方法。
【0146】
実施形態３３．そのバリアントが、野生型真菌ＤＮａｓｅと少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性を有する、実施形態２５に記載の方法。
【0147】
実施形態３４．そのバリアントが、野生型真菌ＤＮａｓｅと少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有する、実施形態２５に記載の方法。
【0148】
実施形態３５．真菌ＤＮａｓｅ又はそのバリアントが、野生型真菌ＤＮａｓｅ、又は１つ、２つ、３つ、４つ又は５つの置換、欠失又は挿入、好ましくは１つ、２つ、３つ、４つ又は５つの保存的置換を有するそのバリアントである、実施形態１～３４のいずれか１つに記載の方法。
【0149】
実施形態３６．真菌ＤＮａｓｅ又はそのバリアントが、野生型真菌ＤＮａｓｅ、又は１つ、２つ、３つ、４つ又は５つの保存的置換を有するそのバリアントである、実施形態１～３５のいずれか１つに記載の方法。
【0150】
実施形態３７．野生型真菌ＤＮａｓｅが、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有する、実施形態２５～３５のいずれか１つに記載の方法。
【0151】
実施形態３８．真菌ＤＮａｓｅ又はそのバリアントがＮＵＣ３ヌクレアーゼである、実施形態１～３７のいずれか１つに記載の方法。
【0152】
実施形態３９．真菌ＤＮａｓｅ又はそのバリアントが、ＤＮａｓｅ＿ＮｕｃＡ＿ＮｕｃＢドメインを含み、モチーフ［ＬＶ］［ＰＴＡ］［ＦＹ］［ＤＥ］［ＶＡＧＰＨ］Ｄ［ＣＦＹ］［ＷＹ］［ＡＴ］［ＩＭ］Ｌ［ＣＹＱ］及び／又はモチーフＧＰＹＣＫ（配列番号３）若しくはＷＦ［ＱＥ］ＩＴ（配列番号４）のいずれかをさらに含む、実施形態１～３８のいずれか１つに記載の方法。
【0153】
実施形態４０．真菌ＤＮａｓｅ又はそのバリアントが、配列番号２のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる、実施形態１～３９のいずれか１つに記載の方法。
【0154】
実施形態４１．微生物宿主細胞が、細菌宿主細胞、真菌宿主細胞又は酵母宿主細胞であり、好ましくは、微生物宿主細胞が、細菌宿主細胞である、実施形態１～４０のいずれか１つに記載の方法。
【0155】
実施形態４２．微生物宿主細胞が、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、ハンゼヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、クルイベロマイセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）、サッカロマイセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾサッカロマイセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、アクレモニウム属（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、フザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、フミコラ属（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、ムコール属（Ｍｕｃｏｒ）、ミセリオフトラ属（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）、ニューロスポラ属（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、チエラビア属（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ）、トリポクラジウム属（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ）及びトリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）からなる群から選択される株である、実施形態１～４１のいずれか１つに記載の方法。
【0156】
実施形態４３．微生物宿主細胞が、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）の株である、実施形態１～４２のいずれか１つに記載の方法。
【0157】
実施形態４４．微生物宿主細胞が、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）の株である、実施形態１～４３のいずれか１つに記載の方法。
【0158】
実施形態４５．微生物宿主細胞が、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、エシュリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、ブティアウクセラ属（Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ）及びシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）からなる群から選択される株である、実施形態１～４４のいずれか１つに記載の方法。
【0159】
実施形態４６．微生物宿主細胞が、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）又はエシュリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）の株である、実施形態１～４５のいずれか１つに記載の方法。
【0160】
実施形態４７．微生物宿主細胞が、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞、好ましくは、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）又はバチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）宿主細胞である、実施形態１～４６のいずれか１つに記載の方法。
【0161】
実施形態４８．微生物発酵産物が、１０ｎｇ／ｇ未満の組換えＤＮＡを含む、実施形態１～４７のいずれか１つに記載の方法。
【0162】
実施形態４９．微生物発酵産物が、５ｎｇ／ｇ未満の組換えＤＮＡを含む、実施形態１～４８のいずれか１つに記載の方法。
【0163】
実施形態５０．微生物発酵産物が、１ｎｇ／ｇ未満の組換えＤＮＡを含む、実施形態１～４９のいずれか１つに記載の方法。
【0164】
実施形態５１．微生物発酵産物が、０．５ｎｇ／ｇ未満の組換えＤＮＡを含む、実施形態１～５０のいずれか１つに記載の方法。
【0165】
実施形態５２．微生物発酵産物が、０．１ｎｇ／ｇ未満の組換えＤＮＡを含む、実施形態１～５１のいずれか１つに記載の方法。
【0166】
実施形態５３．微生物発酵産物が、０．０５ｎｇ／ｇ未満の組換えＤＮＡを含む、実施形態１～５２のいずれか１つに記載の方法。
【0167】
実施形態５４．微生物発酵産物が、０．０１ｎｇ／ｇ未満の組換えＤＮＡを含む、実施形態１～５３のいずれか１つに記載の方法。
【0168】
実施形態５５．微生物発酵産物が、真菌ＤＮａｓｅ又はそのバリアントを含む、実施形態１～５４のいずれか１つに記載の方法。
【0169】
実施形態５６．
（ａ）微生物宿主細胞と、微生物宿主細胞由来の組換えＤＮＡと、微生物宿主細胞によって産生される目的のタンパク質とを含む発酵ブロスを用意するステップと、
（ｂ）その発酵ブロスを凝集又は沈殿ステップに供して、発酵ブロス上清を用意するステップと、
（ｃ）その発酵ブロス上清を、膜が１００ｋＤａ未満又は１μｍ未満のサイズ排除限度を有する膜濾過ステップに供して、発酵産物を用意するステップと
を含む、微生物発酵産物中のＤＮＡの量を低減する方法であって、
ＤＮａｓｅが、発酵の前若しくは発酵中に発酵培地に、ステップ（ａ）において若しくは後でその発酵ブロスに、ステップ（ｂ）の後でその発酵ブロス上清に、又はステップ（ｃ）の後でその発酵産物に添加され、
ＤＮａｓｅが、配列番号２と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有し、且つ
微生物発酵産物が、１０ｎｇ／ｇ未満の組換えＤＮＡを含む、方法。
（ａ）微生物宿主細胞と、微生物宿主細胞由来の組換えＤＮＡと、微生物宿主細胞によって産生される目的のタンパク質とを含む発酵ブロスを用意するステップと、
（ｂ）その発酵ブロスを凝集又は沈殿ステップに供して、発酵ブロス上清を用意するステップと、
（ｃ）その発酵ブロス上清を、膜が１００ｋＤａ未満又は１μｍ未満のサイズ排除限度を有する膜濾過ステップに供して、発酵産物を用意するステップと
を含む、微生物発酵産物中のＤＮＡの量を低減する方法であって、
ＤＮａｓｅが、発酵の前若しくは発酵中に発酵培地に、ステップ（ａ）において若しくは後でその発酵ブロスに、ステップ（ｂ）の後でその発酵ブロス上清に、又はステップ（ｃ）の後でその発酵産物に添加され、
ＤＮａｓｅが、配列番号２と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有し、且つ
微生物発酵産物が、１０ｎｇ／ｇ未満の組換えＤＮＡを含む、方法。
【0170】
実施形態５７．ＤＮａｓｅが、発酵の前又は発酵中にその発酵培地に添加される、実施形態５６に記載の方法。
【0171】
実施形態５８．ＤＮａｓｅが、ステップ（ａ）においてその発酵ブロスに添加される、実施形態５６に記載の方法。
【0172】
実施形態５９．ＤＮａｓｅが、ステップ（ａ）の後でその発酵ブロスに添加される、実施形態５６に記載の方法。
【0173】
実施形態６０．ＤＮａｓｅが、ステップ（ｂ）の後でその発酵ブロスに添加される、実施形態５６に記載の方法。
【0174】
実施形態６１．ＤＮａｓｅが、ステップ（ｃ）の後でその発酵ブロスに添加される、実施形態５６に記載の方法。
【0175】
実施形態６２．目的のタンパク質が、微生物宿主細胞と異種である、実施形態１～６１のいずれか１つに記載の方法。
【0176】
実施形態６３．目的のタンパク質が、微生物宿主細胞によって発酵ブロス中に分泌される、実施形態１～６２のいずれか１つに記載の方法。
【0177】
実施形態６４．目的のタンパク質が、微生物宿主細胞によって発酵ブロス中に分泌されない、実施形態１～６３のいずれか１つに記載の方法。
【0178】
実施形態６５．ステップ（ａ）の発酵ブロスが、目的のタンパク質を少なくとも０．１％ｗ／ｗの量で含む、実施形態１～６４のいずれか１つに記載の方法。
【0179】
実施形態６６．ステップ（ａ）の発酵ブロスが、目的のタンパク質を少なくとも０．５％ｗ／ｗの量で含む、実施形態１～６５のいずれか１つに記載の方法。
【0180】
実施形態６７．ステップ（ａ）の発酵ブロスが、目的のタンパク質を少なくとも１％ｗ／ｗの量で含む、実施形態１～６６のいずれか１つに記載の方法。
【0181】
実施形態６８．目的のタンパク質が、酵素、ヘムを含有するタンパク質、細胞シグナル伝達タンパク質又はリガンド結合タンパク質である、実施形態１～６７のいずれか１つに記載の方法。
【0182】
実施形態６９．目的のタンパク質が、酵素である、実施形態１～６８のいずれか１つに記載の方法。
【0183】
実施形態７０．膜が、５０ｋＤａ未満のサイズ排除限度を有する、実施形態６９に記載の方法。
【0184】
実施形態７１．膜が、４０ｋＤａ未満のサイズ排除限度を有する、実施形態７０に記載の方法。
【0185】
実施形態７２．膜が、３０ｋＤａ未満のサイズ排除限度を有する、実施形態７１に記載の方法。
【0186】
実施形態７３．膜が、２０ｋＤａ未満のサイズ排除限度を有する、実施形態７２に記載の方法。
【0187】
実施形態７４．膜が、１０ｋＤａ未満のサイズ排除限度を有する、実施形態７３に記載の方法。
【0188】
実施形態７５．ステップ（ａ）の微生物宿主細胞の一部又は全部が、機械的に又は酵素的に破壊／ホモジナイズされている、実施形態１～７４のいずれか１つに記載の方法。
【0189】
実施形態７６．ＤＮａｓｅが、配列番号２と少なくとも８５％のアミノ酸配列同一性を有する、実施形態１～７５のいずれか１つに記載の方法。
【0190】
実施形態７７．ＤＮａｓｅが、配列番号２と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有する、実施形態１～７６のいずれか１つに記載の方法。
【0191】
実施形態７８．ＤＮａｓｅが、配列番号２と少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有する、実施形態１～７７のいずれか１つに記載の方法。
【0192】
実施形態７９．ＤＮａｓｅが、配列番号２と少なくとも９６％のアミノ酸配列同一性を有する、実施形態１～７８のいずれか１つに記載の方法。
【0193】
実施形態８０．ＤＮａｓｅが、配列番号２と少なくとも９７％のアミノ酸配列同一性を有する、実施形態１～７９のいずれか１つに記載の方法。
【0194】
実施形態８１．ＤＮａｓｅが、配列番号２と少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性を有する、実施形態１～８０のいずれか１つに記載の方法。
【0195】
実施形態８２．ＤＮａｓｅが、配列番号２と少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有する、実施形態１～８１のいずれか１つに記載の方法。
【0196】
実施形態８３．ＤＮａｓｅが、配列番号２に示されるアミノ酸配列と比較して、１つ、２つ、３つ、４つ又は５つの置換、欠失又は挿入、好ましくは１つ、２つ、３つ、４つ又は５つの保存的置換を有する、実施形態１～８２のいずれか１つに記載の方法。
【0197】
実施形態８４．ＤＮａｓｅが、ＮＵＣ３ヌクレアーゼである、実施形態１～８３のいずれか１つに記載の方法。
【0198】
実施形態８５．ＤＮａｓｅが、ＤＮａｓｅ＿ＮｕｃＡ＿ＮｕｃＢドメインを含み、モチーフ［ＬＶ］［ＰＴＡ］［ＦＹ］［ＤＥ］［ＶＡＧＰＨ］Ｄ［ＣＦＹ］［ＷＹ］［ＡＴ］［ＩＭ］Ｌ［ＣＹＱ］及び／又はモチーフＧＰＹＣＫ（配列番号３）若しくはＷＦ［ＱＥ］ＩＴ（配列番号４）のいずれかをさらに含む、実施形態１～８４のいずれか１つに記載の方法。
【0199】
実施形態８６．ＤＮａｓｅが、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有する、実施形態１～８５のいずれか１つに記載の方法。
【0200】
実施形態８７．微生物宿主細胞が、細菌宿主細胞、真菌宿主細胞又は酵母宿主細胞である、実施形態１～８６のいずれか１つに記載の方法。
【0201】
実施形態８８．微生物宿主細胞が、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、ハンゼヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、クルイベロマイセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）、サッカロマイセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾサッカロマイセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、アクレモニウム属（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、フザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、フミコラ属（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、ムコール属（Ｍｕｃｏｒ）、ミセリオフトラ属（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）、ニューロスポラ属（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、チエラビア属（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ）、トリポクラジウム属（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ）及びトリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）からなる群から選択される株である、実施形態１～８７のいずれか１つに記載の方法。
【0202】
実施形態８９．微生物宿主細胞が、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）の株である、実施形態１～８８のいずれか１つに記載の方法。
【0203】
実施形態９０．微生物宿主細胞が、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）の株である、実施形態１～８９のいずれか１つに記載の方法。
【0204】
実施形態９１．微生物宿主細胞が、細菌宿主細胞である、実施形態１～９０のいずれか１つに記載の方法。
【0205】
実施形態９２．微生物宿主細胞が、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、エシュリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、ブティアウクセラ属（Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ）及びシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）からなる群から選択される株である、実施形態１～９１のいずれか１つに記載の方法。
【0206】
実施形態９３．微生物宿主細胞が、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）又はエシュリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）の株である、実施形態１～９２のいずれか１つに記載の方法。
【0207】
実施形態９４．微生物宿主細胞が、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞、好ましくは、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）又はバチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）宿主細胞である、実施形態１～９３のいずれか１つに記載の方法。
【0208】
実施形態９５．微生物発酵産物が、５ｎｇ／ｇ未満の組換えＤＮＡを含む、実施形態１～９４のいずれか１つに記載の方法。
【0209】
実施形態９６．微生物発酵産物が、１ｎｇ／ｇ未満の組換えＤＮＡを含む、実施形態１～９５のいずれか１つに記載の方法。
【0210】
実施形態９７．微生物発酵産物が、０．５ｎｇ／ｇ未満の組換えＤＮＡを含む、実施形態１～９６のいずれか１つに記載の方法。
【0211】
実施形態９８．微生物発酵産物が、０．１ｎｇ／ｇ未満の組換えＤＮＡを含む、実施形態１～９７のいずれか１つに記載の方法。
【0212】
実施形態９９．微生物発酵産物が、０．０５ｎｇ／ｇ未満の組換えＤＮＡを含む、実施形態１～９８のいずれか１つに記載の方法。
【0213】
実施形態１００．微生物発酵産物が、０．０１ｎｇ／ｇ未満の組換えＤＮＡを含む、実施形態１～９９のいずれか１つに記載の方法。
【0214】
実施形態１０１．微生物発酵産物が、ＤＮａｓｅを含む、実施形態１～１００のいずれか１つに記載の方法。
【0215】
実施形態１０２．
（ａ）バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞由来の組換えＤＮＡ、及びバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞によって産生される酵素を含む発酵ブロスを用意するステップと、
（ｂ）その発酵ブロスを凝集又は沈殿ステップに供して、発酵ブロス上清を用意するステップと、
（ｃ）その発酵ブロス上清を、膜が１００ｋＤａ未満又は１μｍ未満のサイズ排除限度を有する膜濾過ステップに供して、発酵産物を用意するステップと
を含む、微生物発酵産物中のＤＮＡの量を低減する方法であって、
ＤＮａｓｅが、発酵の前若しくは発酵中に発酵培地に、ステップ（ａ）において若しくは後でその発酵ブロスに、ステップ（ｂ）の後でその発酵ブロス上清に、又はステップ（ｃ）の後でその発酵産物に添加され、
ＤＮａｓｅが、配列番号２と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有し、且つ
微生物発酵産物が、１０ｎｇ／ｇ未満の組換えＤＮＡを含む、方法。
（ａ）バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞由来の組換えＤＮＡ、及びバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞によって産生される酵素を含む発酵ブロスを用意するステップと、
（ｂ）その発酵ブロスを凝集又は沈殿ステップに供して、発酵ブロス上清を用意するステップと、
（ｃ）その発酵ブロス上清を、膜が１００ｋＤａ未満又は１μｍ未満のサイズ排除限度を有する膜濾過ステップに供して、発酵産物を用意するステップと
を含む、微生物発酵産物中のＤＮＡの量を低減する方法であって、
ＤＮａｓｅが、発酵の前若しくは発酵中に発酵培地に、ステップ（ａ）において若しくは後でその発酵ブロスに、ステップ（ｂ）の後でその発酵ブロス上清に、又はステップ（ｃ）の後でその発酵産物に添加され、
ＤＮａｓｅが、配列番号２と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有し、且つ
微生物発酵産物が、１０ｎｇ／ｇ未満の組換えＤＮＡを含む、方法。
【0216】
実施形態１０３．ＤＮａｓｅが、発酵の前又は発酵中にその発酵培地に添加される、実施形態１０２に記載の方法。
【0217】
実施形態１０４．ＤＮａｓｅが、ステップ（ａ）においてその発酵ブロスに添加される、実施形態１０２に記載の方法。
【0218】
実施形態１０５．ＤＮａｓｅが、ステップ（ａ）の後でその発酵ブロスに添加される、実施形態１０２に記載の方法。
【0219】
実施形態１０６．ＤＮａｓｅが、ステップ（ｂ）の後でその発酵ブロスに添加される、実施形態１０２に記載の方法。
【0220】
実施形態１０７．ＤＮａｓｅが、ステップ（ｃ）の後でその発酵ブロスに添加される、実施形態１０２に記載の方法。
【0221】
実施形態１０８．酵素が、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞と異種である、実施形態１～１０７のいずれか１つに記載の方法。
【0222】
実施形態１０９．酵素が、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞によって発酵ブロス中に分泌される、実施形態１～１０８のいずれか１つに記載の方法。
【0223】
実施形態１１０．ステップ（ａ）の発酵ブロスが、酵素を少なくとも０．１％ｗ／ｗの量で含む、実施形態１～１０９のいずれか１つに記載の方法。
【0224】
実施形態１１１．ステップ（ａ）の発酵ブロスが、酵素を少なくとも０．５％ｗ／ｗの量で含む、実施形態１～１１０のいずれか１つに記載の方法。
【0225】
実施形態１１２．ステップ（ａ）の発酵ブロスが、酵素を少なくとも１％ｗ／ｗの量で含む、実施形態１～１１１のいずれか１つに記載の方法。
【0226】
実施形態１１３．膜が、５０ｋＤａ未満のサイズ排除限度を有する、実施形態１１２に記載の方法。
【0227】
実施形態１１４．膜が、４０ｋＤａ未満のサイズ排除限度を有する、実施形態１１３に記載の方法。
【0228】
実施形態１１５．膜が、３０ｋＤａ未満のサイズ排除限度を有する、実施形態１１４に記載の方法。
【0229】
実施形態１１６．膜が、２０ｋＤａ未満のサイズ排除限度を有する、実施形態１１５に記載の方法。
【0230】
実施形態１１７．膜が、１０ｋＤａ未満のサイズ排除限度を有する、実施形態１１６に記載の方法。
【0231】
実施形態１１８．ＤＮａｓｅが、配列番号２と少なくとも８５％のアミノ酸配列同一性を有する、実施形態１～１１７のいずれか１つに記載の方法。
【0232】
実施形態１１９．ＤＮａｓｅが、配列番号２と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有する、実施形態１～１１８のいずれか１つに記載の方法。
【0233】
実施形態１２０．ＤＮａｓｅが、配列番号２と少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有する、実施形態１～１１９のいずれか１つに記載の方法。
【0234】
実施形態１２１．ＤＮａｓｅが、配列番号２と少なくとも９６％のアミノ酸配列同一性を有する、実施形態１～１２０のいずれか１つに記載の方法。
【0235】
実施形態１２２．ＤＮａｓｅが、配列番号２と少なくとも９７％のアミノ酸配列同一性を有する、実施形態１～１２１のいずれか１つに記載の方法。
【0236】
実施形態１２３．ＤＮａｓｅが、配列番号２と少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性を有する、実施形態１～１２２のいずれか１つに記載の方法。
【0237】
実施形態１２４．ＤＮａｓｅが、配列番号２と少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有する、実施形態１～１２３のいずれか１つに記載の方法。
【0238】
実施形態１２５．ＤＮａｓｅが、配列番号２に示されるアミノ酸配列と比較して、１つ、２つ、３つ、４つ又は５つの置換、欠失又は挿入、好ましくは１つ、２つ、３つ、４つ又は５つの保存的置換を有する、実施形態１～１２４のいずれか１つに記載の方法。
【0239】
実施形態１２６．ＤＮａｓｅが、ＮＵＣ３ヌクレアーゼである、実施形態１～１２５のいずれか１つに記載の方法。
【0240】
実施形態１２７．ＤＮａｓｅが、ＤＮａｓｅ＿ＮｕｃＡ＿ＮｕｃＢドメインを含み、モチーフ［ＬＶ］［ＰＴＡ］［ＦＹ］［ＤＥ］［ＶＡＧＰＨ］Ｄ［ＣＦＹ］［ＷＹ］［ＡＴ］［ＩＭ］Ｌ［ＣＹＱ］及び／又はモチーフＧＰＹＣＫ（配列番号３）若しくはＷＦ［ＱＥ］ＩＴ（配列番号４）のいずれかをさらに含む、実施形態１～１２６のいずれか１つに記載の方法。
【0241】
実施形態１２８．ＤＮａｓｅが、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有する、実施形態１～１２７のいずれか１つに記載の方法。
【0242】
実施形態１２９．バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞が、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）又はバチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）宿主細胞である、実施形態１～１２８のいずれか１つに記載の方法。
【0243】
実施形態１３０．微生物発酵産物が、５ｎｇ／ｇ未満の組換えＤＮＡを含む、実施形態１～１２９のいずれか１つに記載の方法。
【0244】
実施形態１３１．微生物発酵産物が、１ｎｇ／ｇ未満の組換えＤＮＡを含む、実施形態１～１３０のいずれか１つに記載の方法。
【0245】
実施形態１３２．微生物発酵産物が、０．５ｎｇ／ｇ未満の組換えＤＮＡを含む、実施形態１～１３１のいずれか１つに記載の方法。
【0246】
実施形態１３３．微生物発酵産物が、０．１ｎｇ／ｇ未満の組換えＤＮＡを含む、実施形態１～１３２のいずれか１つに記載の方法。
【0247】
実施形態１３４．微生物発酵産物が、０．０５ｎｇ／ｇ未満の組換えＤＮＡを含む、実施形態１～１３３のいずれか１つに記載の方法。
【0248】
実施形態１３５．微生物発酵産物が、０．０１ｎｇ／ｇ未満の組換えＤＮＡを含む、実施形態１～１３４のいずれか１つに記載の方法。
【0249】
実施形態１３６．微生物発酵産物が、ＤＮａｓｅを含む、実施形態１～１３５のいずれか１つに記載の方法。
【0250】
実施形態１３７．１０ｎｇ／ｇ未満の組換えＤＮＡを含む微生物発酵産物。
【0251】
実施形態１３８．５ｎｇ／ｇ未満の組換えＤＮＡを含む、実施形態１３７に記載の微生物発酵産物。
【0252】
実施形態１３９．１ｎｇ／ｇ未満の組換えＤＮＡを含む、実施形態１～１３８のいずれか１つに記載の微生物発酵産物。
【0253】
実施形態１４０．０．５ｎｇ／ｇ未満の組換えＤＮＡを含む、実施形態１～１３９のいずれか１つに記載の微生物発酵産物。
【0254】
実施形態１４１．０．１ｎｇ／ｇ未満の組換えＤＮＡを含む、実施形態１～１４０のいずれか１つに記載の微生物発酵産物。
【0255】
実施形態１４２．０．０５ｎｇ／ｇ未満の組換えＤＮＡを含む、実施形態１～１４１のいずれか１つに記載の微生物発酵産物。
【0256】
実施形態１４３．０．０１ｎｇ／ｇ未満の組換えＤＮＡを含む、実施形態１～１４２のいずれか１つに記載の微生物発酵産物。
【0257】
実施形態１４４．真菌ＤＮａｓｅ又はそのバリアントをさらに含む、実施形態１～１４３のいずれか１つに記載の微生物発酵産物。
【0258】
実施形態１４５．真菌ＤＮａｓｅ又はそのバリアントが、ＮＵＣ３ヌクレアーゼである、実施形態１４４に記載の微生物発酵産物。
【0259】
実施形態１４６．目的のタンパク質を含む、実施形態１～１４５のいずれか１つに記載の微生物発酵産物。
【0260】
実施形態１４７．目的のタンパク質が、目的の組換えタンパク質である、実施形態１４６に記載の微生物発酵産物。
【0261】
実施形態１４８．少なくとも０．１％ｗ／ｗの目的のタンパク質を含む、実施形態１～１４７のいずれか１つに記載の微生物発酵産物。
【0262】
実施形態１４９．少なくとも０．５％ｗ／ｗの目的のタンパク質を含む、実施形態１～１４８のいずれか１つに記載の微生物発酵産物。
【0263】
実施形態１５０．少なくとも１％ｗ／ｗの目的のタンパク質を含む、実施形態１～１４９のいずれか１つに記載の微生物発酵産物。
【0264】
実施形態１５１．目的のタンパク質が、酵素である、実施形態１５０に記載の微生物発酵産物。
【0265】
実施形態１５２．実施形態１～１５１のいずれか１つに記載の方法によって産生される、実施形態１～１５１のいずれか１つに記載の微生物発酵産物。
【0266】
化学薬品は、少なくとも試薬グレードの商品とした。
【0267】
ＤＮａｓｅ
「細菌のヌクレアーゼ」は、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するバチルス・シビ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｂｉ）ＤＮａｓｅである。
「細菌のヌクレアーゼ」は、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するバチルス・シビ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｂｉ）ＤＮａｓｅである。
【0268】
「真菌のヌクレアーゼ」は、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するアスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）ＤＮａｓｅである。
【0269】
他のＤＮａｓｅも、比較のために使用した。ドナー株は、相当する実施例において示される。
【0270】
ｇＤＮＡ及びｒｅｓＤＮＡの検出は、実施例１に記載のＰＣＲ及びデジタルＰＣＲ（ｄＰＣＲ）分析によって行った。使用した特定の分析は、個々の実施例において述べることにする。
【実施例】
【0271】
実施例１
残留組換えＤＮＡの検出
各試料中の残留組換えＤＮＡの非存在を実証するために使用した方法は、２つのステップに分割することができる。即ち、ステップｉ）溶解ステップを含む、試料からのＤＮＡの抽出、並びにステップｉｉ）ゲル電気泳動が後続する従来のＰＣＲ技術、又はデジタルＰＣＲ技術のいずれかを使用するＰＣＲ増幅による組換えＤＮＡ（標的）の検出である。
残留組換えＤＮＡの検出
各試料中の残留組換えＤＮＡの非存在を実証するために使用した方法は、２つのステップに分割することができる。即ち、ステップｉ）溶解ステップを含む、試料からのＤＮＡの抽出、並びにステップｉｉ）ゲル電気泳動が後続する従来のＰＣＲ技術、又はデジタルＰＣＲ技術のいずれかを使用するＰＣＲ増幅による組換えＤＮＡ（標的）の検出である。
【0272】
溶解ステップを含むＤＮＡの抽出
ＤＮＡ抽出方法は、市販キット（Ｍａｘｗｅｌｌ ＲＳＣ ＰｕｒｅＦｏｏｄ ＧＭＯ ＆ Ａｕｔｈｅｎｔｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ、Ｐｒｏｍｅｇａ）に基づくものである。標準的なプロテイナーゼＫを用いる処理を変更して、タンパク質の効率的な除去を可能にし、それにより、試料マトリックスによるＰＣＲ阻害の可能性を低減した。
ＤＮＡ抽出方法は、市販キット（Ｍａｘｗｅｌｌ ＲＳＣ ＰｕｒｅＦｏｏｄ ＧＭＯ ＆ Ａｕｔｈｅｎｔｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ、Ｐｒｏｍｅｇａ）に基づくものである。標準的なプロテイナーゼＫを用いる処理を変更して、タンパク質の効率的な除去を可能にし、それにより、試料マトリックスによるＰＣＲ阻害の可能性を低減した。
【0273】
最初に、ＣＴＡＢ緩衝液中プロテイナーゼＫ（ＱＩＡｇｅｎカタログ番号１９１３３）を最終濃度１２．５ｍｇプロテイナーゼＫ／ｍｌ試料で用いて、２００μｌの試料を処理した。次いで、この混合物を４０℃で１時間インキュベートして、確実にタンパク質の効率的な除去をした。次に、Ｍａｘｗｅｌｌ ＲＳＣ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔを、その市販キットに記載されている手順に従って使用してＤＮＡを抽出したが、ＤＮＡは、ＤＮａｓｅを含まない水５５μｌの中に溶出した。
【0274】
ＰＣＲ増幅を使用する残留組換えＤＮＡの検出
ＰＣＲ増幅は、極めて少量の標的ＤＮＡの検出のために使用される一般的な方法である。これらの実験において、従来のＰＣＲ技術及びデジタルＰＣＲ技術の両方を使用した。この２つのＰＣＲ法の違いは、以下のとおりである。即ち、従来のＰＣＲ技術は、増幅されたＰＣＲ標的がアガロースゲル電気泳動によって検出される定性的方法である。他方、デジタルＰＣＲ技術は、増幅されたＰＣＲ標的の量を定量化することができるＴａｑＭａｎ技術を基礎とした定量的方法である。
ＰＣＲ増幅は、極めて少量の標的ＤＮＡの検出のために使用される一般的な方法である。これらの実験において、従来のＰＣＲ技術及びデジタルＰＣＲ技術の両方を使用した。この２つのＰＣＲ法の違いは、以下のとおりである。即ち、従来のＰＣＲ技術は、増幅されたＰＣＲ標的がアガロースゲル電気泳動によって検出される定性的方法である。他方、デジタルＰＣＲ技術は、増幅されたＰＣＲ標的の量を定量化することができるＴａｑＭａｎ技術を基礎とした定量的方法である。
【0275】
両方の技術に使用されるプライムは、当該の組換えＤＮＡに対して特有であり（表１）、１５０ｂｐ未満のサイズの標的断片を増幅する。デジタルＰＣＲ技術については、ＴａｑＭａｎ技術を基礎としており、蛍光色素分子及びクエンチャー部分を結合させた配列特異的なオリゴヌクレオチド（プローブ）も必要である（表１）。プライマー、プローブ及びアンプリコンのデザインは、Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚらにより、Ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ｐｒｉｍｅｒｓ ａｎｄ Ｐｒｏｂｅｓ ｆｏｒ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １２７５，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（編集者Ｃ．Ｂａｓｕ）の第３章に記載されているように、ウェブツールを使用して、基本的要件に基づくものとした。
【0276】
【表1】
【0277】
【表2】
【0278】
【表3】
【0279】
【表4】
【0280】
【表5】
【0281】
【表6】
【0282】
従来のＰＣＲ法
所与の標的に適切なプライマーセットを、各プライマーにつき４００ｎＭの濃度で使用して、１０μＬの抽出されたＤＮＡに対してＰＣＲ増幅を実行した。反応毎に、ＧＦ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ製Ｉｌｌｕｓｔｒａ ＰｕｒｅＦｏｏｄ ＰＣＲビーズシステム（カタログ番号２７－９５５７－０２）を１チューブ使用した。ＰＣＲ反応は、以下のサーモサイクラー条件下で実行した。
所与の標的に適切なプライマーセットを、各プライマーにつき４００ｎＭの濃度で使用して、１０μＬの抽出されたＤＮＡに対してＰＣＲ増幅を実行した。反応毎に、ＧＦ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ製Ｉｌｌｕｓｔｒａ ＰｕｒｅＦｏｏｄ ＰＣＲビーズシステム（カタログ番号２７－９５５７－０２）を１チューブ使用した。ＰＣＲ反応は、以下のサーモサイクラー条件下で実行した。
【0283】
【表7】
【0284】
ＰＣＲ増幅後、ＰＣＲ反応を、２．２％アガロースゲル（Ｌｏｎｚａ製ＦｌａｓｈＧｅｌシステム、カタログ番号５７０３１）で可視化した。ＦｌａｓｈＧｅｌ ＤＮＡマーカー１００ｂｐ－４ｋｂ（Ｌｏｎｚａカタログ番号５０４７３）を、バンドサイズ推定のために使用した。
【0285】
デジタルＰＣＲ法
デジタルＰＣＲ（ｄＰＣＲ）は、エンドポイントＰＣＲの手順を使用するが、ＰＣＲ反応を多くの単一区画に分割し、その中でテンプレートが全ての利用可能な区画にランダムに分配される。ＰＣＲ後、増幅は、全陽性区画中の蛍光を測定することによって検出される。ポアソン統計を使用して、試料毎の標的ＤＮＡの平均量を算出することができる。満たされた区画の数は、反応混合物中に存在する参照蛍光染料によって特定される。次に、各試料中の標的ＤＮＡの量の絶対的定量を算出することができる。
デジタルＰＣＲ（ｄＰＣＲ）は、エンドポイントＰＣＲの手順を使用するが、ＰＣＲ反応を多くの単一区画に分割し、その中でテンプレートが全ての利用可能な区画にランダムに分配される。ＰＣＲ後、増幅は、全陽性区画中の蛍光を測定することによって検出される。ポアソン統計を使用して、試料毎の標的ＤＮＡの平均量を算出することができる。満たされた区画の数は、反応混合物中に存在する参照蛍光染料によって特定される。次に、各試料中の標的ＤＮＡの量の絶対的定量を算出することができる。
【0286】
これらの実験について、ＱＩＡＧＥＮ製デジタルシステムＱＩＡｃｕｉｔｙ ＯＮＥを、ＱＩＡｃｕｉｔｙ Ｐｒｏｂｅ ＰＣＲキット（カタログ番号２５０１０１）と一緒に使用した。キットは、各試料を２６，０００区画に分配するＱＩＡｃｕｉｔｙ ｎａｎｏｐｌａｔｅ（カタログ番号２５００１）と一緒に使用するのに最適化された、４×濃縮した使用準備済みのＭａｓｔｅｒ ｍｉｘを含有する。供給業者により説明されている手順を、プライマー及びプローブ濃度に関して、及びＰＣＲサイクル条件について最適化した。これらの実験について、各々８００ｎＭのプライマー濃度及び４００ｎＭのプローブ濃度を使用した。
【0287】
ＱＩＡｃｕｉｔｙ Ｎａｎｏｐｌａｔｅ全体にテンプレートを確実に均一に分配するため、区分化する前に、抽出されたＤＮＡを制限消化によって断片化するべきである。これらの実験について、制限酵素ＥｃｏＲＩを、０．２５Ｕ／４０μｌ反応液の濃度で選択した。この制限酵素を選択した理由は、標的断片内では切断をしないからである。各ｄＰＣＲ反応について、ＤＮａｓｅを含まない水を使用して得られた５μｌのテンプレートＤＮＡを、４０μｌの全反応体積中で使用した。
【0288】
次いで、混合物をナノプレートに移し、密封し、制限酵素が働くように、室温で最低１０分間インキュベートした。
【0289】
その後直ちに、ナノプレートを、以下のサーマルサイクル条件で稼動させた。
【0290】
【表8】
【0291】
ｄＰＣＲ分析の結果は、標的ＰＣＲ断片のコピー数／全反応体積のμｌとして付与される。この値を基に、以下の前提に基づいて、ｎｇ組換えＤＮＡの量／ｇ出発材料中の試料を算出することができる。
・１００％有効なＤＮＡ精製が得られる。
・バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ゲノムの平均重量は、４．２×１０６塩基対であると推定される（参照、Ｊ．Ｔ．Ｔｒｅｖｏｒｓ，１９９６，Ｇｅｎｏｍｅ ｓｉｚｅ ｉｎ ｂａｃｔｅｒｉａ．Ａｎｔｏｎｉｅ ｖａｎ Ｌｅｅｕｗｅｎｈｏｃｅｋ ６９（４）：２９３－３０３）。
・塩基対の分子量は、６５０ダルトンである。
・１ダルトンは、１．６６０５×１０－１５ｎｇに相当する。
・バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ゲノムの重量は、４．５×１０－６ｎｇであると推定される。
・１００％有効なＤＮＡ精製が得られる。
・バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ゲノムの平均重量は、４．２×１０６塩基対であると推定される（参照、Ｊ．Ｔ．Ｔｒｅｖｏｒｓ，１９９６，Ｇｅｎｏｍｅ ｓｉｚｅ ｉｎ ｂａｃｔｅｒｉａ．Ａｎｔｏｎｉｅ ｖａｎ Ｌｅｅｕｗｅｎｈｏｃｅｋ ６９（４）：２９３－３０３）。
・塩基対の分子量は、６５０ダルトンである。
・１ダルトンは、１．６６０５×１０－１５ｎｇに相当する。
・バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ゲノムの重量は、４．５×１０－６ｎｇであると推定される。
【0292】
次に、元試料中の残留組換えＤＮＡの含量を、以下の式を使用して算出することができる。
ｎｇＤＮＡ／ｍｌ試料＝０．０４×Ｄｆ×Ｄ
－式中、Ｄｆは、ｄＰＣＲ分析前のＤＮＡ調製物の希釈係数であり、Ｄは、４０μｌの全反応体積中のコピー数／μｌとして表されるｄＰＣＲ分析の結果である。
ｎｇＤＮＡ／ｍｌ試料＝０．０４×Ｄｆ×Ｄ
－式中、Ｄｆは、ｄＰＣＲ分析前のＤＮＡ調製物の希釈係数であり、Ｄは、４０μｌの全反応体積中のコピー数／μｌとして表されるｄＰＣＲ分析の結果である。
【0293】
実施例２
バチルス・シビ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｂｉ）由来の細菌のヌクレアーゼ及びアスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）由来の真菌のヌクレアーゼを用いる蒸留水中でのゲノムＤＮＡの分解
実験手順
単純で「クリーンな」マトリックス中での精製したゲノムのバチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ＤＮＡ（ｇＤＮＡ）のヌクレアーゼ分解を理解するために、実施例２の全試料を蒸留水（ＤＷ）中に調製した。ｇＤＮＡ分解を評価するため、２つの陽性対照試料をＤＷ中に３００μＬ／試料の全体積で調製した。対照試料に１０００ｎｇ／ｇのｇＤＮＡをｐＨ９で添加した。全量５ｍＭのＭｇＣｌ２を２つの対照試料のうち１つに添加した。別の陽性対照試料をＤＷ中に調製し、１０ｎｇ／ｇのｇＤＮＡを添加した。細菌のヌクレアーゼを使用するｇＤＮＡ分解を用量反応で調査し、係数１０の濃度増加で０．０００５ｇ／Ｌ～０．５ｇ／Ｌの範囲の最終濃度にした。さらに、最終濃度０．００５ｇ／Ｌの予備の試料に、ＭｇＣｌ２（補助因子）を最終濃度５ｍＭまで添加した。最終濃度０．５ｇ／Ｌを、真菌のヌクレアーゼについて使用した。全反応体積をｐＨ９で３００μＬとし、試料を、３７℃で２４時間、穏やかに撹拌しながらインキュベートした。インキュベーション時間の後、試料を凍結することによってヌクレアーゼ反応を停止させた。ヌクレアーゼがｇＤＮＡを分解する能力を、従来のＰＣＲ分析により、表４に示されたプライマーを使用して評価した。
バチルス・シビ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｂｉ）由来の細菌のヌクレアーゼ及びアスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）由来の真菌のヌクレアーゼを用いる蒸留水中でのゲノムＤＮＡの分解
実験手順
単純で「クリーンな」マトリックス中での精製したゲノムのバチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ＤＮＡ（ｇＤＮＡ）のヌクレアーゼ分解を理解するために、実施例２の全試料を蒸留水（ＤＷ）中に調製した。ｇＤＮＡ分解を評価するため、２つの陽性対照試料をＤＷ中に３００μＬ／試料の全体積で調製した。対照試料に１０００ｎｇ／ｇのｇＤＮＡをｐＨ９で添加した。全量５ｍＭのＭｇＣｌ２を２つの対照試料のうち１つに添加した。別の陽性対照試料をＤＷ中に調製し、１０ｎｇ／ｇのｇＤＮＡを添加した。細菌のヌクレアーゼを使用するｇＤＮＡ分解を用量反応で調査し、係数１０の濃度増加で０．０００５ｇ／Ｌ～０．５ｇ／Ｌの範囲の最終濃度にした。さらに、最終濃度０．００５ｇ／Ｌの予備の試料に、ＭｇＣｌ２（補助因子）を最終濃度５ｍＭまで添加した。最終濃度０．５ｇ／Ｌを、真菌のヌクレアーゼについて使用した。全反応体積をｐＨ９で３００μＬとし、試料を、３７℃で２４時間、穏やかに撹拌しながらインキュベートした。インキュベーション時間の後、試料を凍結することによってヌクレアーゼ反応を停止させた。ヌクレアーゼがｇＤＮＡを分解する能力を、従来のＰＣＲ分析により、表４に示されたプライマーを使用して評価した。
【0294】
結果
細菌のヌクレアーゼ及び真菌のヌクレアーゼは両方とも、試験したいずれの濃度においても、ＤＷ中のｇＤＮＡを＜１０ｎｇ／ｇまで分解することができ、追加のＭｇＣｌ２を添加したか否かには関係なかった（表７）。
細菌のヌクレアーゼ及び真菌のヌクレアーゼは両方とも、試験したいずれの濃度においても、ＤＷ中のｇＤＮＡを＜１０ｎｇ／ｇまで分解することができ、追加のＭｇＣｌ２を添加したか否かには関係なかった（表７）。
【0295】
【表9】
【0296】
実施例３
細菌のヌクレアーゼ及び真菌のヌクレアーゼを用いる酵素濃縮物中でのＤＮＡの分解
実験手順
実施例３の全試料を、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）発酵ブロス（ＦＢ）から回収した酵素濃縮物を使用して調製した。酵素濃縮物は、＞＞１０ｎｇ／ｇの残留ＤＮＡ（ｒｅｓＤＮＡ）濃度を有していた。残留ＤＮＡは、Ｂ・リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）宿主細胞に由来する組換えＤＮＡの量である。細菌のヌクレアーゼを使用するｒｅｓＤＮＡ分解を用量反応で調査し、係数１０の濃度増加で０．０００５ｇ／Ｌ～０．５ｇ／Ｌの範囲の最終濃度にした。さらに、最終濃度０．００５ｇ／Ｌの予備の試料に、ＭｇＣｌ２（補助因子）を最終濃度５ｍＭまで添加した。最終濃度０．５ｇ／Ｌを、真菌のヌクレアーゼについて使用した。全反応体積をｐＨ６．５で４００μＬとし、試料を、３７℃で２４時間、穏やかに撹拌しながらインキュベートした。インキュベーション時間の後、試料を凍結することによってヌクレアーゼ反応を停止させた。２つの陽性対照試料、即ち、酵素濃縮物と、１０ｎｇ／ｇのｇＤＮＡを添加したＤＷとを使用した。ｒｅｓＤＮＡ分解を、従来のＰＣＲ分析により、表３に示されたプライマーを使用して評価した。
細菌のヌクレアーゼ及び真菌のヌクレアーゼを用いる酵素濃縮物中でのＤＮＡの分解
実験手順
実施例３の全試料を、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）発酵ブロス（ＦＢ）から回収した酵素濃縮物を使用して調製した。酵素濃縮物は、＞＞１０ｎｇ／ｇの残留ＤＮＡ（ｒｅｓＤＮＡ）濃度を有していた。残留ＤＮＡは、Ｂ・リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）宿主細胞に由来する組換えＤＮＡの量である。細菌のヌクレアーゼを使用するｒｅｓＤＮＡ分解を用量反応で調査し、係数１０の濃度増加で０．０００５ｇ／Ｌ～０．５ｇ／Ｌの範囲の最終濃度にした。さらに、最終濃度０．００５ｇ／Ｌの予備の試料に、ＭｇＣｌ２（補助因子）を最終濃度５ｍＭまで添加した。最終濃度０．５ｇ／Ｌを、真菌のヌクレアーゼについて使用した。全反応体積をｐＨ６．５で４００μＬとし、試料を、３７℃で２４時間、穏やかに撹拌しながらインキュベートした。インキュベーション時間の後、試料を凍結することによってヌクレアーゼ反応を停止させた。２つの陽性対照試料、即ち、酵素濃縮物と、１０ｎｇ／ｇのｇＤＮＡを添加したＤＷとを使用した。ｒｅｓＤＮＡ分解を、従来のＰＣＲ分析により、表３に示されたプライマーを使用して評価した。
【0297】
結果
真菌のヌクレアーゼは、酵素濃縮物中の細菌宿主細胞ｒｅｓＤＮＡを＜＜１０ｎｇ／ｇまで分解することができた。細菌のヌクレアーゼは、試験したいずれの濃度においても、細菌宿主細胞ｒｅｓＤＮＡを有意なレベルで分解することができず、追加のＭｇＣｌ２を添加したか否かには関係なかった（表８）。
真菌のヌクレアーゼは、酵素濃縮物中の細菌宿主細胞ｒｅｓＤＮＡを＜＜１０ｎｇ／ｇまで分解することができた。細菌のヌクレアーゼは、試験したいずれの濃度においても、細菌宿主細胞ｒｅｓＤＮＡを有意なレベルで分解することができず、追加のＭｇＣｌ２を添加したか否かには関係なかった（表８）。
【0298】
【表10】
【0299】
実施例４
細菌のヌクレアーゼ及び真菌のヌクレアーゼを様々なｐＨで用いる酵素濃縮物中のＤＮＡの分解
実験手順
実施例３において、真菌のヌクレアーゼが、ｒｅｓＤＮＡの分解に有効な唯一のヌクレアーゼであったため、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ＦＢから回収した酵素濃縮物中で、様々なｐＨで試験を反復した。酵素濃縮物は、＞１０ｎｇ／ｇのｒｅｓＤＮＡ濃度を有していた。最終濃度０．５ｇ／Ｌを、両方のヌクレアーゼについて使用した。全反応体積を、真菌のヌクレアーゼではｐＨ４、５、６、７及び８で、並びに細菌のヌクレアーゼではｐＨ４、６及び８で４００μＬとし、試料を、３７℃で２４時間、穏やかに撹拌しながらインキュベートした。インキュベーション時間の後、試料を凍結することによってヌクレアーゼ反応を停止させた。ヌクレアーゼを一切添加しない酵素濃縮物を、陽性対照試料として使用した。ｒｅｓＤＮＡ分解を、従来のＰＣＲ分析により、表１に示されたプライマーを使用して評価した。
細菌のヌクレアーゼ及び真菌のヌクレアーゼを様々なｐＨで用いる酵素濃縮物中のＤＮＡの分解
実験手順
実施例３において、真菌のヌクレアーゼが、ｒｅｓＤＮＡの分解に有効な唯一のヌクレアーゼであったため、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ＦＢから回収した酵素濃縮物中で、様々なｐＨで試験を反復した。酵素濃縮物は、＞１０ｎｇ／ｇのｒｅｓＤＮＡ濃度を有していた。最終濃度０．５ｇ／Ｌを、両方のヌクレアーゼについて使用した。全反応体積を、真菌のヌクレアーゼではｐＨ４、５、６、７及び８で、並びに細菌のヌクレアーゼではｐＨ４、６及び８で４００μＬとし、試料を、３７℃で２４時間、穏やかに撹拌しながらインキュベートした。インキュベーション時間の後、試料を凍結することによってヌクレアーゼ反応を停止させた。ヌクレアーゼを一切添加しない酵素濃縮物を、陽性対照試料として使用した。ｒｅｓＤＮＡ分解を、従来のＰＣＲ分析により、表１に示されたプライマーを使用して評価した。
【0300】
結果
真菌のヌクレアーゼは、酵素濃縮物中の細菌宿主細胞ｒｅｓＤＮＡを、調査した全てのｐＨで＜＜１０ｎｇ／ｇまで分解することができたが、ｐＨ４で最も効率的であった（＜＜＜１０ｎｇ／ｇ）。細菌のヌクレアーゼは、試験したｐＨのいずれにおいても、酵素濃縮物中の細菌宿主細胞ｒｅｓＤＮＡを有意なレベルで分解することができなかったが、ｐＨ４でわずかな効果が観察された（表９）。
真菌のヌクレアーゼは、酵素濃縮物中の細菌宿主細胞ｒｅｓＤＮＡを、調査した全てのｐＨで＜＜１０ｎｇ／ｇまで分解することができたが、ｐＨ４で最も効率的であった（＜＜＜１０ｎｇ／ｇ）。細菌のヌクレアーゼは、試験したｐＨのいずれにおいても、酵素濃縮物中の細菌宿主細胞ｒｅｓＤＮＡを有意なレベルで分解することができなかったが、ｐＨ４でわずかな効果が観察された（表９）。
【0301】
【表11】
【0302】
実施例５
真菌のヌクレアーゼを様々なｐＨで用いる発酵ブロス及び凝集した発酵ブロス中のＤＮＡの分解
実験の項
実施例５の全試料を、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）に由来するＦＢ又は凝集した発酵ブロス（ｆＦＢ）を使用して調製した。
真菌のヌクレアーゼを様々なｐＨで用いる発酵ブロス及び凝集した発酵ブロス中のＤＮＡの分解
実験の項
実施例５の全試料を、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）に由来するＦＢ又は凝集した発酵ブロス（ｆＦＢ）を使用して調製した。
【0303】
発酵ブロス試料の調製
真菌のヌクレアーゼをＦＢにｐＨ７．５＋／－０．５で直接添加して、最終ヌクレアーゼ濃度０．５ｇ／Ｌを実現した。真菌のヌクレアーゼを一切添加しないＦＢを、陽性対照試料として使用した。試料を、３７℃で２４時間、穏やかに撹拌しながらインキュベートした。インキュベーション時間の後、試料を凍結することによってヌクレアーゼ反応を停止させた。ｒｅｓＤＮＡ分解を、ｄＰＣＲ分析により、表２に示されたプライマー／プローブを使用して評価した。
真菌のヌクレアーゼをＦＢにｐＨ７．５＋／－０．５で直接添加して、最終ヌクレアーゼ濃度０．５ｇ／Ｌを実現した。真菌のヌクレアーゼを一切添加しないＦＢを、陽性対照試料として使用した。試料を、３７℃で２４時間、穏やかに撹拌しながらインキュベートした。インキュベーション時間の後、試料を凍結することによってヌクレアーゼ反応を停止させた。ｒｅｓＤＮＡ分解を、ｄＰＣＲ分析により、表２に示されたプライマー／プローブを使用して評価した。
【0304】
ｆＦＢ試料の調製
ｆＦＢを生成するために、ＦＢを以下のとおりに処理した。
１．水で希釈
２．二価の塩を添加
３．ポリ塩化アルミニウム（ＰＡＣ）を添加
４．ｐＨを４、６又は８に調整
５．真菌のヌクレアーゼを添加して、最終濃度０．５ｇ／Ｌを実現
６．３７℃で２４時間、穏やかに撹拌しながらインキュベーション
ｆＦＢを生成するために、ＦＢを以下のとおりに処理した。
１．水で希釈
２．二価の塩を添加
３．ポリ塩化アルミニウム（ＰＡＣ）を添加
４．ｐＨを４、６又は８に調整
５．真菌のヌクレアーゼを添加して、最終濃度０．５ｇ／Ｌを実現
６．３７℃で２４時間、穏やかに撹拌しながらインキュベーション
【0305】
陽性対照試料を、ステップ５を除いて同様に生成した。インキュベーション時間の後、試料を凍結することによってヌクレアーゼ反応を停止させた。ｒｅｓＤＮＡ分解を、ｄＰＣＲ分析により、表２に示されたプライマー／プローブを使用して評価した。
【0306】
結果
真菌のヌクレアーゼは、それがＦＢに添加されたか、又はｆＦＢに添加されたかに関係なく、対照試料と比較して、細菌宿主細胞ｒｅｓＤＮＡを有意に分解した。さらに、ヌクレアーゼの効率は、試験した全てのｐＨにおいて類似していた（表１０）。
真菌のヌクレアーゼは、それがＦＢに添加されたか、又はｆＦＢに添加されたかに関係なく、対照試料と比較して、細菌宿主細胞ｒｅｓＤＮＡを有意に分解した。さらに、ヌクレアーゼの効率は、試験した全てのｐＨにおいて類似していた（表１０）。
【0307】
【表12】
【0308】
実施例６
発酵ブロスからの酵素の回収中のＤＮＡの分解
実験の項
実施例６の全試料は、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ＦＢからの酵素の回収中の相異なるストリームに由来する。
発酵ブロスからの酵素の回収中のＤＮＡの分解
実験の項
実施例６の全試料は、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ＦＢからの酵素の回収中の相異なるストリームに由来する。
【0309】
ＦＢの調製
発酵を開始する前に、真菌のヌクレアーゼをタンクに添加して、最終ヌクレアーゼ濃度０．５ｇ／Ｌ＋／－０．１を実現した。発酵中及び回収中のｐＨは、７．５＋／－０．５であった。真菌のヌクレアーゼを一切添加しないＦＢを、陽性対照バッチとして使用した。ＦＢを収集し、回収を開始する前に、５℃で２２～２４時間インキュベートした。インキュベーション時間の後、試料を凍結することによってヌクレアーゼ反応を停止させた。ｒｅｓＤＮＡ分解を、ｄＰＣＲ分析により、表２に示されたプライマー／プローブを使用して評価した。
発酵を開始する前に、真菌のヌクレアーゼをタンクに添加して、最終ヌクレアーゼ濃度０．５ｇ／Ｌ＋／－０．１を実現した。発酵中及び回収中のｐＨは、７．５＋／－０．５であった。真菌のヌクレアーゼを一切添加しないＦＢを、陽性対照バッチとして使用した。ＦＢを収集し、回収を開始する前に、５℃で２２～２４時間インキュベートした。インキュベーション時間の後、試料を凍結することによってヌクレアーゼ反応を停止させた。ｒｅｓＤＮＡ分解を、ｄＰＣＲ分析により、表２に示されたプライマー／プローブを使用して評価した。
【0310】
回収プロセス
ｆＦＢを生成するために、ＦＢを以下のとおりに処理した。
１．水で希釈
２．二価の塩を添加
３．ポリ塩化アルミニウム（ＰＡＣ）を添加
４．ｐＨを７．５＋／－０．５に調整
５．カチオン性ポリマーを添加
６．アニオン性ポリマーを添加
７．ｆＦＢを遠心分離して、バイオマスから液相（上清）を分離した
８．カットオフサイズ５．０～０．３μｍのフィルターで上清を濾過して、濾液を生成した
９．カットオフサイズ１０ｋＤａの膜を用いる限外濾過（ＵＦ）を使用して濾液を濃縮し、ＵＦ－濃縮物を生成した
ｆＦＢを生成するために、ＦＢを以下のとおりに処理した。
１．水で希釈
２．二価の塩を添加
３．ポリ塩化アルミニウム（ＰＡＣ）を添加
４．ｐＨを７．５＋／－０．５に調整
５．カチオン性ポリマーを添加
６．アニオン性ポリマーを添加
７．ｆＦＢを遠心分離して、バイオマスから液相（上清）を分離した
８．カットオフサイズ５．０～０．３μｍのフィルターで上清を濾過して、濾液を生成した
９．カットオフサイズ１０ｋＤａの膜を用いる限外濾過（ＵＦ）を使用して濾液を濃縮し、ＵＦ－濃縮物を生成した
【0311】
結果
真菌のヌクレアーゼは、対照ＦＢと比較して、ＦＢ中、ｆＦＢの上清中及びＵＦ－濃縮物中の細菌宿主細胞ｒｅｓＤＮＡを有意に分解した（表１１）。
真菌のヌクレアーゼは、対照ＦＢと比較して、ＦＢ中、ｆＦＢの上清中及びＵＦ－濃縮物中の細菌宿主細胞ｒｅｓＤＮＡを有意に分解した（表１１）。
【0312】
【表13】
【0313】
実施例７
様々な生物に由来するＤＮａｓｅを用いる酵素濃縮物中のＤＮＡの分解
実験手順
実施例７の全試料を、Ｂ・リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ＦＢから回収した、＞＞１０ｎｇ／ｇのｒｅｓＤＮＡ濃度を有する酵素濃縮物を使用して調製した。様々な生物に由来するヌクレアーゼを使用するｒｅｓＤＮＡ分解を、最終ヌクレアーゼ濃度０．５ｇ／Ｌで調査した。酵素濃縮物はｐＨ５．９を有し、試料を、２５℃で１時間、穏やかに撹拌しながらインキュベートした。インキュベーション時間の後、試料を凍結することによってヌクレアーゼ反応を停止させた。酵素濃縮物を陽性対照試料として使用した。ｒｅｓＤＮＡ分解を、ｄＰＣＲ分析により、表５に示されたプライマー／プローブを使用して評価した。
様々な生物に由来するＤＮａｓｅを用いる酵素濃縮物中のＤＮＡの分解
実験手順
実施例７の全試料を、Ｂ・リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ＦＢから回収した、＞＞１０ｎｇ／ｇのｒｅｓＤＮＡ濃度を有する酵素濃縮物を使用して調製した。様々な生物に由来するヌクレアーゼを使用するｒｅｓＤＮＡ分解を、最終ヌクレアーゼ濃度０．５ｇ／Ｌで調査した。酵素濃縮物はｐＨ５．９を有し、試料を、２５℃で１時間、穏やかに撹拌しながらインキュベートした。インキュベーション時間の後、試料を凍結することによってヌクレアーゼ反応を停止させた。酵素濃縮物を陽性対照試料として使用した。ｒｅｓＤＮＡ分解を、ｄＰＣＲ分析により、表５に示されたプライマー／プローブを使用して評価した。
【0314】
結果
真菌のヌクレアーゼ（Ａ・オリゼー（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）由来）は、酵素濃縮物中の細菌宿主細胞ｒｅｓＤＮＡを＜＜１ｎｇ／ｇに分解したが、試験した様々な生物に由来する他のヌクレアーゼはいずれも、ｒｅｓＤＮＡを＜１０ｎｇ／ｇに分解することができなかった（表１２）。
真菌のヌクレアーゼ（Ａ・オリゼー（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）由来）は、酵素濃縮物中の細菌宿主細胞ｒｅｓＤＮＡを＜＜１ｎｇ／ｇに分解したが、試験した様々な生物に由来する他のヌクレアーゼはいずれも、ｒｅｓＤＮＡを＜１０ｎｇ／ｇに分解することができなかった（表１２）。
【0315】
【表14】
【0316】
実施例８
様々な生物に由来するＤＮａｓｅを用いる酵素濃縮物中のＤＮＡの分解
実験手順
実施例８の全試料を、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ＦＢから回収した、＞１０ｎｇ／ｇのｒｅｓＤＮＡ濃度を有する酵素濃縮物を使用して調製した。様々な生物に由来するヌクレアーゼを使用するｒｅｓＤＮＡ分解を、最終ヌクレアーゼ濃度０．５ｇ／Ｌで調査した。酵素濃縮物はｐＨ５．０を有し、試料を、２５℃で１時間、穏やかに撹拌しながらインキュベートした。インキュベーション時間の後、試料を凍結することによってヌクレアーゼ反応を停止させた。酵素濃縮物を陽性対照試料として使用した。ｒｅｓＤＮＡ分解を、ｄＰＣＲ分析により、表２に示されたプライマー／プローブを使用して評価した。
様々な生物に由来するＤＮａｓｅを用いる酵素濃縮物中のＤＮＡの分解
実験手順
実施例８の全試料を、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ＦＢから回収した、＞１０ｎｇ／ｇのｒｅｓＤＮＡ濃度を有する酵素濃縮物を使用して調製した。様々な生物に由来するヌクレアーゼを使用するｒｅｓＤＮＡ分解を、最終ヌクレアーゼ濃度０．５ｇ／Ｌで調査した。酵素濃縮物はｐＨ５．０を有し、試料を、２５℃で１時間、穏やかに撹拌しながらインキュベートした。インキュベーション時間の後、試料を凍結することによってヌクレアーゼ反応を停止させた。酵素濃縮物を陽性対照試料として使用した。ｒｅｓＤＮＡ分解を、ｄＰＣＲ分析により、表２に示されたプライマー／プローブを使用して評価した。
【0317】
結果
真菌のヌクレアーゼ（Ａ・オリゼー（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）由来）は、酵素濃縮物中の細菌宿主細胞ｒｅｓＤＮＡを＜＜＜１ｎｇ／ｇに分解した。細菌のヌクレアーゼ並びにネオサルトリヤ・マッサ（Ｎｅｏｓａｒｔｏｒｙａ ｍａｓｓａ）、アルスログラフィス属（Ａｒｔｈｒｏｇｒａｐｈｉｓ ｓｐ．）０７ＭＡ２０、リゾクトニア・ソラニ（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎｉ）及びモルケラ・コスタタ（Ｍｏｒｃｈｅｌｌａ ｃｏｓｔａｔａ）に由来するヌクレアーゼは、ｒｅｓＤＮＡを＜１０ｎｇ／ｇに分解した。ピレノカエトプシス属（Ｐｙｒｅｎｏｃｈａｅｔｏｐｓｉｓ ｓｐ．）、アルスリニウム・アルンディニス（Ａｒｔｈｒｉｎｉｕｍ ａｒｕｎｄｉｎｉｓ）、クラドスポリウム・クラドスポリオイデス（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｏｉｄｅｓ）、ペニシリウム・ケルセトルム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｑｕｅｒｃｅｔｏｒｕｍ）、フィアロフォラ・ゲニクレート（Ｐｈｉａｌｏｐｈｏｒａ ｇｅｎｉｃｕｌａｔｅ）及びアクレモニウム・クリソゲナム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）に由来するヌクレアーゼは、ｒｅｓＤＮＡを＜１０ｎｇ／ｇに分解することができなかった（表１３）。
真菌のヌクレアーゼ（Ａ・オリゼー（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）由来）は、酵素濃縮物中の細菌宿主細胞ｒｅｓＤＮＡを＜＜＜１ｎｇ／ｇに分解した。細菌のヌクレアーゼ並びにネオサルトリヤ・マッサ（Ｎｅｏｓａｒｔｏｒｙａ ｍａｓｓａ）、アルスログラフィス属（Ａｒｔｈｒｏｇｒａｐｈｉｓ ｓｐ．）０７ＭＡ２０、リゾクトニア・ソラニ（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎｉ）及びモルケラ・コスタタ（Ｍｏｒｃｈｅｌｌａ ｃｏｓｔａｔａ）に由来するヌクレアーゼは、ｒｅｓＤＮＡを＜１０ｎｇ／ｇに分解した。ピレノカエトプシス属（Ｐｙｒｅｎｏｃｈａｅｔｏｐｓｉｓ ｓｐ．）、アルスリニウム・アルンディニス（Ａｒｔｈｒｉｎｉｕｍ ａｒｕｎｄｉｎｉｓ）、クラドスポリウム・クラドスポリオイデス（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｏｉｄｅｓ）、ペニシリウム・ケルセトルム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｑｕｅｒｃｅｔｏｒｕｍ）、フィアロフォラ・ゲニクレート（Ｐｈｉａｌｏｐｈｏｒａ ｇｅｎｉｃｕｌａｔｅ）及びアクレモニウム・クリソゲナム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）に由来するヌクレアーゼは、ｒｅｓＤＮＡを＜１０ｎｇ／ｇに分解することができなかった（表１３）。
【0318】
【表15】
【0319】
実施例９
様々な生物に由来するＤＮａｓｅを用いる酵素濃縮物中のＤＮＡの分解
実験手順
実施例９の全試料を、バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＦＢから回収した、＞＞＞１０ｎｇ／ｇのｒｅｓＤＮＡ濃度を有する酵素濃縮物を使用して調製した。様々な生物に由来するヌクレアーゼを使用するｒｅｓＤＮＡ分解を、最終ヌクレアーゼ濃度０．５ｇ／Ｌで調査した。酵素濃縮物はｐＨ６．２を有し、試料を、２５℃で１時間、穏やかに撹拌しながらインキュベートした。インキュベーション時間の後、試料を凍結することによってヌクレアーゼ反応を停止させた。酵素濃縮物を陽性対照試料として使用した。ｒｅｓＤＮＡ分解を、ｄＰＣＲ分析により、表６に示されたプライマー／プローブを使用して評価した。
様々な生物に由来するＤＮａｓｅを用いる酵素濃縮物中のＤＮＡの分解
実験手順
実施例９の全試料を、バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＦＢから回収した、＞＞＞１０ｎｇ／ｇのｒｅｓＤＮＡ濃度を有する酵素濃縮物を使用して調製した。様々な生物に由来するヌクレアーゼを使用するｒｅｓＤＮＡ分解を、最終ヌクレアーゼ濃度０．５ｇ／Ｌで調査した。酵素濃縮物はｐＨ６．２を有し、試料を、２５℃で１時間、穏やかに撹拌しながらインキュベートした。インキュベーション時間の後、試料を凍結することによってヌクレアーゼ反応を停止させた。酵素濃縮物を陽性対照試料として使用した。ｒｅｓＤＮＡ分解を、ｄＰＣＲ分析により、表６に示されたプライマー／プローブを使用して評価した。
【0320】
結果
真菌のヌクレアーゼ（Ａ・オリゼー（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）由来）は、酵素濃縮物中の細菌宿主細胞ｒｅｓＤＮＡを＜＜１ｎｇ／ｇに分解した。細菌のヌクレアーゼ並びにネオサルトリヤ・マッサ（Ｎｅｏｓａｒｔｏｒｙａ ｍａｓｓａ）、ピレノカエトプシス属（Ｐｙｒｅｎｏｃｈａｅｔｏｐｓｉｓ ｓｐ．）、アルスリニウム・アルンディニス（Ａｒｔｈｒｉｎｉｕｍ ａｒｕｎｄｉｎｉｓ）及びフィアロフォラ・ゲニクラタ（Ｐｈｉａｌｏｐｈｏｒａ ｇｅｎｉｃｕｌａｔａ）に由来するヌクレアーゼは、ｒｅｓＤＮＡを＜１０ｎｇ／ｇに分解することができなかった（表１４）。
真菌のヌクレアーゼ（Ａ・オリゼー（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）由来）は、酵素濃縮物中の細菌宿主細胞ｒｅｓＤＮＡを＜＜１ｎｇ／ｇに分解した。細菌のヌクレアーゼ並びにネオサルトリヤ・マッサ（Ｎｅｏｓａｒｔｏｒｙａ ｍａｓｓａ）、ピレノカエトプシス属（Ｐｙｒｅｎｏｃｈａｅｔｏｐｓｉｓ ｓｐ．）、アルスリニウム・アルンディニス（Ａｒｔｈｒｉｎｉｕｍ ａｒｕｎｄｉｎｉｓ）及びフィアロフォラ・ゲニクラタ（Ｐｈｉａｌｏｐｈｏｒａ ｇｅｎｉｃｕｌａｔａ）に由来するヌクレアーゼは、ｒｅｓＤＮＡを＜１０ｎｇ／ｇに分解することができなかった（表１４）。
【0321】
【表16】
【配列表】
【国際調査報告】