特表 2025-500338 細胞へのＲＮＡの送達のためのアルファレトロウイルスをベースとする粒子

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2025-01-09

(54)【発明の名称】細胞へのＲＮＡの送達のためのアルファレトロウイルスをベースとする粒子

(51)【国際特許分類】

   C12N 7/01 20060101AFI20241226BHJP

   C12N 15/40 20060101ALI20241226BHJP

   C12N 15/113 20100101ALI20241226BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20241226BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20241226BHJP

   A61K 35/76 20150101ALI20241226BHJP

   A61K 31/7105 20060101ALI20241226BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20241226BHJP

【ＦＩ】

C12N7/01 ZNA

C12N15/40

C12N15/113 Z

C12N5/10

A61K48/00

A61K35/76

A61K31/7105

A61P43/00 105

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024537348

(86)(22)【出願日】2022-12-21

(85)【翻訳文提出日】2024-08-06

(86)【国際出願番号】 EP2022087224

(87)【国際公開番号】W WO2023118290

(87)【国際公開日】2023-06-29

(31)【優先権主張番号】21216354.7

(32)【優先日】2021-12-21

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】515195668

【氏名又は名称】メディツィーニシェ・ホーホシューレ・ハノーファー

【氏名又は名称原語表記】Ｍｅｄｉｚｉｎｉｓｃｈｅ Ｈｏｃｈｓｃｈｕｌｅ Ｈａｎｎｏｖｅｒ

(74)【代理人】

【識別番号】100069556

【弁理士】

【氏名又は名称】江崎 光史

(74)【代理人】

【識別番号】100111486

【弁理士】

【氏名又は名称】鍛冶澤 實

(74)【代理人】

【識別番号】100139527

【弁理士】

【氏名又は名称】上西 克礼

(74)【代理人】

【識別番号】100164781

【弁理士】

【氏名又は名称】虎山 一郎

(74)【代理人】

【識別番号】100221981

【弁理士】

【氏名又は名称】石田 大成

(72)【発明者】

【氏名】シャムバッハ・アクセル

(72)【発明者】

【氏名】ガラ・メラニー

(72)【発明者】

【氏名】バロン・イヴォンヌ

【テーマコード（参考）】

4B065

4C084

4C086

4C087

【Ｆターム（参考）】

4B065AA90X

4B065AA97X

4B065AA98Y

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065CA23

4B065CA44

4B065CA60

4C084AA13

4C084NA14

4C084ZB21

4C086AA01

4C086AA02

4C086EA16

4C086MA01

4C086MA04

4C086NA14

4C086ZB21

4C087AA01

4C087AA02

4C087BC83

4C087CA12

4C087NA14

4C087ZB21

(57)【要約】

新規アルファレトロウイルスベースの粒子は、動物細胞、例えばヒトまたはマウス細胞に高効率で一過的に形質導入するために好適であり、これは、アルファレトロウイルスベースの粒子中に含有されるコードおよび非コードＲＮＡを標的細胞へ効率的に導入する。また、アルファレトロウイルスベースの粒子は、入ってくるＲＮＡがその間に分解されないように保護するので、この粒子は、動物細胞へ導入されるＲＮＡの高効率の活性および／または完全性を提供する。転移されるＲＮＡは、非コード性のＲＮＡ（例えば、シングルガイド（ｓｇ）ＲＮＡ、低分子ヘアピン（ｓｈ）ＲＮＡ、マイクロＲＮＡもしくは長鎖非コード（ｌｎｃ）ＲＮＡ）であってもよく、またはＲＮＡは、タンパク質もしくはペプチド、例えば受容体、転写因子、細胞の酵素、ワクチン接種における使用のための抗原、遺伝子／タンパク質療法および／もしくは遺伝子編集ヌクレアーゼ、リコンビナーゼおよびトランスポザーゼをコードしてもよい。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＭＡ－ｐ２－ｐ１０－ＣＡ－ＮＣ－ＰＲからなるアルファレトロウイルスドメイン、７～２５個のアミノ酸のリンカーおよび少なくとも２つのＭＳ２コートタンパク質（２ｘＭＳ２ＣＰ）を含むタンパク質成分、シュードタイピングタンパク質、ならびに前記タンパク質成分と会合した、少なくとも１つの標的部位（ＴＳ）に連結された目的の遺伝子をコードする少なくとも１つのＲＮＡ構築物を含む、アルファレトロウイルスをベースとする（Ｇａｇ．ＭＳ２）粒子。

【請求項2】

前記タンパク質成分が、ＭＡ－ｐ２－ｐ１０－ＣＡ－ＮＣからなることを特徴とする、請求項１に記載のアルファレトロウイルスをベースとする粒子。

【請求項3】

前記アルファレトロウイルスドメインが、前記リンカーの加水分解によって、前記少なくとも２つのＭＳ２コートタンパク質から分離されることを特徴とする、請求項１または２に記載のアルファレトロウイルスをベースとする粒子。

【請求項4】

前記アルファレトロウイルスドメインの各々の間に、プロテアーゼ部位が配置されていることを特徴とする、請求項１～３のいずれか一つに記載のアルファレトロウイルスをベースとする粒子。

【請求項5】

アルファレトロウイルスドメインと少なくとも２つのＭＳ２ドメインとの間の前記リンカーが、ウイルスプロテアーゼ部位であることを特徴とする、請求項１～４のいずれか一つに記載のアルファレトロウイルスをベースとする粒子。

【請求項6】

前記アルファレトロウイルスドメインが、配列番号１２のヌクレオチド１４６２～３５７３番によってコードされるアミノ酸配列（ＭＡ－ｐ２－ｐ１０－ＣＡ－ＮＣ－ＰＲ）と、または配列番号１のヌクレオチド１４６２～３１８６番によってコードされるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を有し、
前記７～２５個のアミノ酸のリンカーが、配列番号１のヌクレオチド３１８７～３２０７番によってコードされるアミノ酸配列と、もしくは配列番号１２のヌクレオチド３５７４～３５９４番によってコードされるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を有するか、またはグリシンリンカーであり、
前記少なくとも２つのＭＳ２コートタンパク質が、配列番号１２のヌクレオチド３６１３～４３８９番によってコードされるアミノ酸配列と、または配列番号１のヌクレオチド３２２３～３９９９番によってコードされるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、
ことを特徴とする、請求項１～５のいずれか一つに記載のアルファレトロウイルスをベースとする粒子。

【請求項7】

前記ＲＮＡ構築物が、コードおよび／もしくは非コードＲＮＡを含むか、または自己増幅ＲＮＡレプリコンを含有し、前記ＲＮＡ構築物が、少なくとも１つの標的部位（ＴＳ）に連結されたシングルガイド（ｓｇ）ＲＮＡ、低分子ヘアピン（ｓｈ）ＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ／ｍｉＲＮＡハイブリッド、自己増幅ＲＮＡレプリコン、ＤＮＡリコンビナーゼのコード配列、酵素のコード配列、受容体のコード配列、転写因子のコード配列、遺伝子編集ヌクレアーゼ、リコンビナーゼ、トランスポゾンのコード配列、抗原のコード配列、またはこれらのうちの少なくとも２つの組合せから選択されることを特徴とする、請求項１～６のいずれか一つに記載のアルファレトロウイルスをベースとする粒子。

【請求項8】

前記ＲＮＡ構築物が、非コードＲＮＡであり、その３’末端にポリＴストレッチが連結されていることを特徴とする、請求項１～７のいずれか一つに記載のアルファレトロウイルスをベースとする粒子。

【請求項9】

各々が少なくとも１つの標的部位（ＴＳ）に連結された、少なくとも２つの異なるｓｇＲＮＡを含むことを特徴とする、請求項１～８のいずれか一つに記載のアルファレトロウイルスをベースとする粒子。

【請求項10】

前記ＲＮＡ構築物が、少なくとも２つの標的部位（ＴＳ）と共に組み込まれたｓｇＲＮＡを含有し、前記標的部位が、６０～４０ヌクレオチド分間隔をあけられ、前記ｓｇＲＮＡが、２つのＴＳドメインのヘアピンセクション間に配置されるか、または前記ＲＮＡ構築物が、直接隣り合う少なくとも２つの標的部位（ＴＳ）の５’に配置されるｓｇＲＮＡを含有することを特徴とする、請求項１～９のいずれか一つに記載のアルファレトロウイルスをベースとする粒子。

【請求項11】

前記標的部位（ＴＳ）が、配列番号２のヌクレオチド１９４３～１９６５および／またはヌクレオチド１９８２～２００４、配列番号３のヌクレオチド１６８１～１７０１および／またはヌクレオチド１７５１～１７７１、配列番号１４のヌクレオチド１７５５～１７７５および／またはヌクレオチド１７９４～１８１４、配列番号５のヌクレオチド５６９７～５７１９および／またはヌクレオチド５７３６～５７５８、配列番号６のヌクレオチド２３３７～２３５９および／またはヌクレオチド２３７６～２３９８から選択される少なくとも１つの配列と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％のヌクレオチド配列を有し、前記２ｘＭＳ２ＣＰが、配列番号１のヌクレオチド３２２３～３９９９番によってコードされるアミノ酸配列と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％の同一性を有することを特徴とする、請求項１～１０のいずれか一つに記載のアルファレトロウイルスをベースとする粒子。

【請求項12】

医学的治療における使用のための、請求項１～１１のいずれか一つに記載のアルファレトロウイルスをベースとする粒子。

【請求項13】

エンベロープ糖タンパク質でシュードタイプ化され、このことにより、前記粒子を特定の細胞タイプに標的化させ、その標的範囲を導き得ることを特徴とする、請求項１～１２のいずれか一つに記載のアルファレトロウイルスをベースとする粒子。

【請求項14】

少なくとも１つのＲＮＡ構築物を、細胞へ導入するための、請求項１～１３のいずれか一つに記載のアルファレトロウイルスをベースとする粒子の使用。

【請求項15】

プロデューサー細胞において、Ｎ末端からＣ末端へとアルファレトロウイルスＭＡ－ｐ２－ｐ１０－ＣＡ－ＮＣまたはＭＡ－ｐ２－ｐ１０－ＣＡ－ＮＣ－ＰＲ、リンカー、および少なくとも１つのＭＳ２コートタンパク質二量体（２ｘＭＳ２ＣＰ）を含むかまたはこれらからなるタンパク質成分を発現させること、ならびにシュードタイピングタンパク質を発現させること、ならびに少なくとも１つの標的部位（ＴＳ）に連結された目的の遺伝子をコードする少なくとも１つのＲＮＡ構築物を発現させることによる、請求項１～１０のいずれか一つに記載のアルファレトロウイルスをベースとする粒子を製造するための方法。

【請求項16】

前記タンパク質が、そのプロテアーゼ部位においてタンパク質分解されて、アルファレトロウイルスドメインを、前記少なくとも１つのＭＳ２コートタンパク質から分離することを特徴とする、請求項１５に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、動物細胞、例えばヒトまたはマウス細胞に高効率で一過的に形質導入するために好適であり、アルファレトロウイルスベースの粒子中に含有されるコードおよび非コードＲＮＡを標的細胞へ効率的に導入するアルファレトロウイルスベースの粒子を提供する。また、アルファレトロウイルスベースの粒子は、進入するＲＮＡが進入中に分解されないように保護するので、この粒子は、動物細胞へ導入されるＲＮＡの高効率の活性および／または完全性を提供する。転移されるＲＮＡは、非コード性のＲＮＡ（例えば、シングルガイド（ｓｇ）ＲＮＡ、低分子ヘアピン（ｓｈ）ＲＮＡ、マイクロＲＮＡもしくは長鎖非コード（ｌｎｃ）ＲＮＡ）であってもよく、またはＲＮＡは、タンパク質もしくはペプチド、例えば受容体、転写因子、細胞の酵素、ワクチン接種に使用するための抗原、遺伝子／タンパク質療法および／もしくは遺伝子編集ヌクレアーゼ、リコンビナーゼおよびトランスポザーゼをコードしてもよい。加えて、転移されるＲＮＡは、言及されるＲＮＡクラスのいずれかをコードする自己増幅ＲＮＡレプリコンであってもよい。アルファレトロウイルスベースの粒子は、少なくとも１つ、例えば少なくとも２または３つのＲＮＡ構築物を含有してもよく、ＲＮＡ構築物は、コードもしくは非コードＲＮＡまたはこれら両方の組合せからなり得る。遺伝子編集ヌクレアーゼは、例えば、転写アクチベーター様エフェクター（ＴＡＬＥＮ）、亜鉛フィンガー（ＺＦＮ）、および好ましくはＲＮＡによりガイドされるＣＲＩＳＰＲ（ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｒｅｇｕｌａｒｌｙ ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ ｓｈｏｒｔ ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ ｒｅｐｅａｔｓ）／ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）ヌクレアーゼ、とりわけＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９から、またｓｇＲＮＡと組み合わせて、選択され得る。リコンビナーゼは、例えば、Ｃｒｅ、Ｄｒｅ、Ｔｒｅ、Ｂｒｅｃ、Ｆｌｐリコンビナーゼから選択され得、トランスポザーゼは、例えば、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙ、ＰｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンから選択され得る。

【背景技術】

【0002】

Ｋｎｏｐｐら、Ｍｏｌ． Ｔｈｅｒ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ １３、２５６～２７４頁 （２０１８）、「Ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ－ｂａｓｅｄ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ Ａｌｌ－ｉｎ－Ｏｎｅ Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｆｏｒ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ， ｔａｒｇｅｔｅｄ ｇｅｎｅ ｋｎｏｃｋ－ｏｕｔ」（非特許文献１）は、ヒトおよびマウス細胞を遺伝子操作するためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ＲＮＡを送達するガンマレトロウイルスベースの粒子を説明する。

【0003】

Ｈｏｆｆｍａｎｎ Ｄ．ら、Ｄｅｔａｉｌｅｄ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｓｔａｂｌｅ ａｎｄ ｈｉｇｈ ｔｒａｎｓｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ２０１７年５月；２４（５）：２９８～３０７頁（非特許文献２）は、ＥＧＦＰについてのレポーター遺伝子構築物（ベクター名称＝ＲＲＬ．ＰＰＴ．ＥＦＳ．ＥＧＦＰ．ＰＲＥ）を説明する。

【0004】

Ｈｅｃｋｌ Ｄ、Ｋｏｗａｌｃｚｙｋ ＭＳ、Ｙｕｄｏｖｉｃｈ Ｄ、Ｂｅｌｉｚａｉｒｅ Ｒ、Ｐｕｒａｍ ＲＶ、ＭｃＣｏｎｋｅｙ ＭＥ、Ｔｈｉｅｌｋｅ Ａ、Ａｓｔｅｒ ＪＣ、Ｒｅｇｅｖ Ａ、Ｅｂｅｒｔ ＢＬ． Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ ｍｙｅｌｏｉｄ ｍａｌｉｇｎａｎｃｙ ｗｉｔｈ ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ｇｅｎｅｔｉｃ ｌｅｓｉｏｎｓ ｕｓｉｎｇ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ． Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２０１４年９月；３２（９）：９４１～６頁（非特許文献３）は、Ｔｅｔ２についてのＲＦＰ６５７．Ｔｅｔ２レポーター遺伝子構築物を含有するベクター（ベクター名称＝ＬＫＯ５ｄ．ＳＦＦＶ．ｔＲＦＰ６５７（Ｔｅｔ２．４）．ｉＰＡＣ）を説明する。

【0005】

Ｇａｌｌａ、Ｓｃｈａｍｂａｃｈ、Ｂａｕｍ、Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ ＲＮＡ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ： Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ９６９巻 （２０１３）、Ｒａｂｉｎｏｖｉｃｈ編、第１０章、「Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ－Ｂａｓｅｄ ｍＲＮＡ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ｆｏｒ Ｔｒａｎｓｉｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ」（非特許文献４）は、レトロウイルスベクター粒子の生産のための手技を説明する。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0006】

【非特許文献1】Ｋｎｏｐｐら、Ｍｏｌ． Ｔｈｅｒ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ １３、２５６～２７４頁 （２０１８）、「Ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ－ｂａｓｅｄ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ Ａｌｌ－ｉｎ－Ｏｎｅ Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｆｏｒ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ， ｔａｒｇｅｔｅｄ ｇｅｎｅ ｋｎｏｃｋ－ｏｕｔ」

【非特許文献2】Ｈｏｆｆｍａｎｎ Ｄ．ら、Ｄｅｔａｉｌｅｄ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｓｔａｂｌｅ ａｎｄ ｈｉｇｈ ｔｒａｎｓｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ２０１７年５月；２４（５）：２９８～３０７頁

【非特許文献3】Ｈｅｃｋｌ Ｄ、Ｋｏｗａｌｃｚｙｋ ＭＳ、Ｙｕｄｏｖｉｃｈ Ｄ、Ｂｅｌｉｚａｉｒｅ Ｒ、Ｐｕｒａｍ ＲＶ、ＭｃＣｏｎｋｅｙ ＭＥ、Ｔｈｉｅｌｋｅ Ａ、Ａｓｔｅｒ ＪＣ、Ｒｅｇｅｖ Ａ、Ｅｂｅｒｔ ＢＬ． Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ ｍｙｅｌｏｉｄ ｍａｌｉｇｎａｎｃｙ ｗｉｔｈ ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ｇｅｎｅｔｉｃ ｌｅｓｉｏｎｓ ｕｓｉｎｇ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ． Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２０１４年９月；３２（９）：９４１～６頁

【非特許文献4】Ｇａｌｌａ、Ｓｃｈａｍｂａｃｈ、Ｂａｕｍ、Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ ＲＮＡ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ： Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ９６９巻 （２０１３）、Ｒａｂｉｎｏｖｉｃｈ編、第１０章、「Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ－Ｂａｓｅｄ ｍＲＮＡ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ｆｏｒ Ｔｒａｎｓｉｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ」

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

本発明の目的は、動物細胞、とりわけ、ヒト細胞に効率的に形質導入し、レシピエント細胞に少なくとも１つのＲＮＡ構築物を効率的に、一過性の様式で、送達するアルファレトロウイルスベースの粒子を提供することである。前記のレトロウイルスベースの粒子は、１つまたは複数の目的のＲＮＡ構築物種を同時に含有してもよく、これにより、後者の標的細胞への時空間共送達（例えば、ＲＮＡ構築物から、例えば遺伝子編集ヌクレアーゼを単独で、あるいは非コードＲＮＡ、例えばｓｇＲＮＡであるＲＮＡ構築物、および／または標的細胞ゲノムを改変するための導入遺伝子ＲＮＡ構築物と組み合わせて、一過性に発現させるための）が可能となる。有利には、非組込み型アルファレトロウイルスベースの粒子は、挿入突然変異を引き起こさないＲＮＡ構築物を含有し、より好ましくは、レトロウイルスベースの粒子は、レシピエント細胞のみにおける一過的活性のためのＲＮＡ構築物を送達し、これによりまた、ある特定の導入遺伝子（例えば、ＳｐＣａｓ９、Ｃｒｅリコンビナーゼ、ＺＦＮヌクレアーゼ、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙ ＤＮＡトランスポザーゼ）および／または他のＲＮＡ種を安定的且つ長期的に過剰発現することによって媒介される細胞傷害性の可能性を回避するまたは低下させる。

【課題を解決するための手段】

【0008】

本発明は、特許請求の範囲の特徴によって目的を達成し、とりわけ、タンパク質成分と、少なくとも１つのＲＮＡ構築物であって、前記タンパク質成分および対応する結合ＲＮＡヘアピン構造を介して会合した（特に粒子にパッケージングされた）少なくとも１つのＲＮＡ構築物とを含むかまたはからなるアルファレトロウイルスベースの粒子であるレトロウイルス粒子を提供する。アルファレトロウイルスベースのタンパク質成分粒子は、アルファレトロウイルスマトリックスタンパク質（ＭＡ）、アルファレトロウイルスｐ２タンパク質（ｐ２）、アルファレトロウイルスｐ１０タンパク質（ｐ１０）、アルファレトロウイルスカプシドタンパク質（ＣＡ）、アルファレトロウイルスヌクレオカプシドタンパク質（ＮＣ）および任意に追加的なアルファレトロウイルスプロテアーゼタンパク質（ＰＲ）、ウイルスプロテアーゼ部位であってもよくもしくはプロテアーゼ部位を欠いていてもよいリンカー、ならびにＭＳ２バクテリオファージ由来ＭＳ２コートタンパク質二量体（２ｘＭＳ２ＣＰ）であり、好ましくはＮ末端からＣ末端へこの順序であるドメイン、ならびに好ましくはシュードタイピングタンパク質を含むかまたはからなり、シュードタイピングタンパク質は、任意に、標的化タンパク質、リガンドまたはペプチドを含み得る。アルファレトロウイルスベースの粒子の産生の間、このシュードタイピングタンパク質は、例えば、培養されるプロデューサー細胞において別の発現カセットから発現される。ドメイン間のタンパク質成分は、プロテアーゼ部位を含有するので、アルファレトロウイルスベースの粒子の産生の間、各々に２ｘＭＳ２ＣＰが続くＭＡ－ｐ２－ｐ１０－ＣＡ－ＮＣまたはＭＡ－ｐ２－ｐ１０－ＣＡ－ＮＣ－ＰＲのアルファレトロウイルスドメインを含むかまたはからなる１つのタンパク質が、ウイルスプロテアーゼによってタンパク質分解されて、例えば、ＭＡ、ｐ２、ｐ１０、ＣＡもしくはＮＣのアルファレトロウイルスドメインのうちの１つのみ、または少なくとも２つの接続されたアルファレトロウイルスドメインを含有する別々のタンパク質を生成し得る。アルファレトロウイルスドメインの各々の間に配置されるプロテアーゼ部位は、アルファレトロウイルスの天然のプロテアーゼ部位であり得る。プロデューサー細胞におけるプロテアーゼ活性の非存在下においては、Ｇａｇ－ＭＳ２タンパク質成分は、１つの単鎖タンパク質として、アルファレトロウイルスベースの粒子において存在し得る。アルファレトロウイルスドメイン間にプロテアーゼ部位を含有するタンパク質成分を含有し、そのタンパク質成分が１本鎖（例えばＭＡ－ｐ２－ｐ１０－ＣＡ－ＮＣ－２ｘＭＳＣＰを含む）として存在する、本発明による完全に機能的な、例えば形質導入する能力のある、アルファレトロウイルスベースの粒子を、産生できることが見出された。あるいは、そのタンパク質成分は、ドメイン間のプロテアーゼ部位を欠いていてもよく、例えば、タンパク質成分のアルファレトロウイルスドメインは、プロテアーゼ部位ではないリンカーによって接続されてもよい。

【0009】

プロデューサー細胞における機能的アルファレトロウイルスベースの粒子の生産中に、アルファレトロウイルスタンパク質成分のＣ末端ＮＣドメインとＭＳ２コートタンパク質二量体との間に配置されたウイルスプロテアーゼ部位は、必ずしも加水分解されないことが見出された。それゆえ、任意に、ＭＡ－ｐ２－ｐ１０－ＣＡ－ＮＣまたはＭＡ－ｐ２－ｐ１０－ＣＡ－ＮＣ－ＰＲのアルファレトロウイルスドメインは、プロテアーゼ部位を含有しない、とりわけウイルスプロテアーゼ部位を含有しないリンカー、例えば６～２５個のアミノ酸、好ましくは最高で２０個のアミノ酸の長さを有するリンカーによって、ＭＳ２コートタンパク質、例えば２ｘＭＳ２ＣＰに連結され得る。本明細書において、ＭＡ－ｐ２－ｐ１０－ＣＡ－ＮＣまたはＭＡ－ｐ２－ｐ１０－ＣＡ－ＮＣ－ＰＲのアルファレトロウイルスドメイン（任意にこれらのドメインの各々の間にプロテアーゼ部位を含む）は、ａ．Ｇａｇとも称される。

【0010】

シュードタイピングタンパク質は、アルファレトロウイルスタンパク質ドメインをコードする発現カセットとは別の発現カセットから発現され得る。シュードタイピングタンパク質は、例えば、ＶＳＶｇ、ＶＳＶファミリーの他の株、ＲＤ１１４、ＢａｅＶ、ＭＡＲＡＶ、ＣＯＣＶ、同種指向性（ｅｃｏｔｒｏｐｉｃ）または両指向性（ａｍｐｈｏｔｒｏｐｉｃ）ＭＬＶ Ｅｎｖ、ＧＡＬＶ、麻疹エンベロープ、ニパＶエンベロープから選択され得る。麻疹およびニパＶエンベロープを盲検法（Ｂｌｉｎｄｅｄ）により、標的化タンパク質、リガンド、ｓｃＦｖまたは受容体結合ドメインに融合し得る。本発明のアルファレトロウイルスベースの粒子の標的細胞特異性は、そのシュードタイピングタンパク質によって決定され得ることが見出された。

【0011】

アルファレトロウイルスベースの粒子は、タンパク質成分と会合して、少なくとも１つのＲＮＡ構築物を含有する利点を有し、このＲＮＡ構築物は、非コードＲＮＡ、例えば、ｓｈＲＮＡ、ｓｇＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ／ｍｉＲＮＡハイブリッドであり得るか、または目的の遺伝子（ＧＯＩ）とも呼ばれる少なくとも１つの導入遺伝子をコードするＲＮＡであってもよく、導入遺伝子は、例えば、レシピエントにおいて免疫反応を誘発するための抗原、転写因子をコードする、タンパク質についてのコード配列、または遺伝子編集ヌクレアーゼ、例えばＣａｓ９をコードするコード配列であってもよく、好ましくは、遺伝子編集ヌクレアーゼをコードするコード配列は、少なくとも１つの追加のＲＮＡ構築物、例えばｓｇＲＮＡと組み合わせ、任意に少なくとも２もしくは３つの追加の異なるｓｇＲＮＡと組み合わせる。一般的に、各ｓｇＲＮＡ（シングルガイドＲＮＡ）は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼと協同するために提供される。

【0012】

タンパク質をコードするＲＮＡ構築物について、ＲＮＡ構築物は、好ましくは５’から３’へ、以下のエレメント：Ｃａｐ－ＧＯＩ－２ｘＴＳ－任意にＰＲＥ－ポリＡ尾部を含有し、Ｃａｐは、リボソーム開始部位として働く第１の転写されたヌクレオチドに連結されたＮ７－メチル化ＧＴＰ分子からなるｃａｐ構造であり、ＧＯＩは、コード配列であり、２ｘＴＳは、２つの隣接したＭＳ２標的部位である。

【0013】

抗原であるタンパク質をコードするアルファレトロウイルスベースの粒子は、ワクチン、例えば免疫応答を誘発することにおいて使用するため、ならびに／または例えばウイルスもしくは細菌である感染病原因子に対する免疫保護を生成するため、ならびに／または自己免疫疾患および／もしくはがん疾患の治療のためのワクチンである。例示的な抗原は、免疫保護の生成における抗原、例えば、コロナウイルス、例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ２のスパイクタンパク質、ＨＩＶ－１のＧＰ１２０、マイコバクテリウム・ツベルクローシス（Ｍｙｃｏｂａｃｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）のＡｇ８５（例えばｈｔｔｐｓ：／／ｐｕｂｍｅｄ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／２３０３５２３１／による）、ＯＶＡ（オボアルブミン）をコードする、あるいはがん治療のために、胚性がん抗原としてのＣＥＡ、腫瘍ネオ抗原（例えばＮＹ－ＥＳＯ－１、ＭＡＧＥ－Ａ３）またはアスパラギニルエンドペプチダーゼレグマインをコードする、アルファレトロウイルスベースの粒子の使用のためのウイルス起源もしくは細菌起源のタンパク質、またはがん抗原である。

【0014】

アルファレトロウイルスベースの粒子に含有されるＲＮＡ構築物は、コードまたは非コードＤＮＡ配列からの転写産物として生産されるので、本明細書において概して、ＲＮＡ構築物は、転写産物とも称され得る。

【0015】

アルファレトロウイルスベースの粒子に含有されるＲＮＡ構築物は、ＲＮＡ構築物上に存在する対応するＭＳ２標的部位（ＴＳ）と相互作用する、タンパク質成分の２ｘＭＳ２ＣＰを介して結合され、組み込まれる。ＴＳは、各ＲＮＡ構築物に存在する２つの遺伝学的に融合されたヘアピン構造を含むかまたはからなる。タンパク質をコードするＲＮＡ構築物において、ＴＳは好ましくは、目的の遺伝子をコードするセクションに隣り合って、且つＰＲＥエレメント（その下流に隣り合ってポリＡ尾部が配置される）の５’に置かれる。

【0016】

例えば、ｓｇＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ／ｍｉＲＮＡハイブリッドおよび／またはｌｎｃＲＮＡであるＲＮＡ構築物において、ＴＳドメインは、ｓｇＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡおよび／もしくはｌｎｃＲＮＡセクション内に組み込まれるか、またはｓｇＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡおよび／もしくはｌｎｃＲＮＡセクションに隣り合って下流に、例えば３’に置かれる。同様に、他の非コードＲＮＡ構築物について、ＴＳドメインは、組み込まれるかまたは隣り合って配置され得る。加えて、例えば非コードＲＮＡ、例えばｓｇＲＮＡは、２つのＴＳドメインのヘアピンセクション間に配置してもよく、例えばｓｇＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡまたはこれらの少なくとも２つの組合せは、２つのＴＳヘアピンセクションを連結してもよく、とりわけ、２つのＴＳヘアピンセクションの２つのステムセクションを連結し得る。

【0017】

一般的に、本発明のアルファレトロウイルスベースの粒子は、プロデューサー細胞からそれらを派生させたことから生ずる脂質コートを有してもよく、例えば出芽のために、アルファレトロウイルスベースの粒子は、プロデューサー細胞の細胞膜の一部を含み得る。アルファレトロウイルスベースの粒子は、アルファレトロウイルスＭＡ－ｐ２－ｐ１０－ＣＡ－ＮＣ－２ｘＭＳ２ＣＰまたはＭＡ－ｐ２－ｐ１０－ＣＡ－ＮＣ－ＰＲ－２ｘＭＳ２ＣＰのドメインを、各場合において任意にこれらのドメインの各々の間にプロテアーゼ部位を伴って、含むかまたはからなるａ．Ｇａｇ ＭＳ２タンパク質成分を含むかまたはからなり、ａ．Ｇａｇタンパク質成分は、好ましくは配列番号１のヌクレオチド１４６２～３２０７番によってコードされるアミノ酸配列、例えば配列番号１のヌクレオチド１４６２～３１８６番によってコードされるアミノ酸配列との少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％の同一性を有する。好ましいａ．Ｇａｇタンパク質成分において、ドメインは、ウイルスプロテアーゼ部位によって分離され、これらのドメインは、例えば、配列番号１のヌクレオチド３１８７～３２０７によってコードされるアミノ酸配列との少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％の同一性を有するウイルスプロテアーゼ部位であり得るかまたはこれを含有し得る第１のリンカー、任意に第１のリンカーとＭＳ２コートタンパク質（２ｘＭＳ２ＣＰ）との間の追加の第２のリンカーであって、例えば配列番号１のヌクレオチド３２０８～３２２２番によってコードされるアミノ酸配列との少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％の同一性を有する第２のリンカー、および好ましくは配列番号１のヌクレオチド３２２３～３９９９番によってコードされるアミノ酸配列との少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％の同一性を有する、ＭＳ２コートタンパク質二量体（２ｘＭＳ２ＣＰ）、ならびにシュードタイピングタンパク質によって分離される。タンパク質成分と会合して、導入遺伝子コードおよび／または非コードＲＮＡ転写産物である少なくとも１つのＲＮＡ構築物は、少なくとも１つの標的部位（ＴＳ）、好ましくは少なくとも２つの標的部位（２ｘＴＳ）へ連結される。プロデューサー細胞における産生の間に各ＲＮＡ構築物の少なくとも１つのＴＳ、好ましくは少なくとも２つのＴＳは、ＭＳ２コートタンパク質二量体（２ｘＭＳ２ＣＰ）と会合し、ＲＮＡ構築物がタンパク質成分と会合するかまたはこれにパッケージングされることをもたらす。シュードタイピングタンパク質ＶＳＶｇは、配列番号４のヌクレオチド１２４１～２７７６によってコードされるアミノ酸配列を有し得る。一般的に、本発明は、参照により、その優先権出願ＥＰ２１２１６３５４．７のすべてのアミノ酸配列およびすべてのヌクレオチド配列を含む。

【0018】

ＭＳ２標的部位（ＴＳ）の各々は、配列番号２のヌクレオチド１９４３～１９６５および／またはヌクレオチド１９８２～２００４、配列番号３のヌクレオチド１６８１～１７０１および／またはヌクレオチド１７５１～１７７１、配列番号１４のヌクレオチド１７５５～１７７５および／またはヌクレオチド１７９４～１８１４、配列番号５のヌクレオチド５６９７～５７１９および／またはヌクレオチド５７３６～５７５８、配列番号６のヌクレオチド２３３７～２３５９および／またはヌクレオチド２３７６～２３９８から選択される少なくとも１つの配列との少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％のヌクレオチド配列を有し得る。その中で、少なくとも２つの標的部位の各々は、同じまたは異なるヌクレオチド配列を有し得る。好ましくは、標的部位は、６０～４０ヌクレオチド（ｎｔ）分間隔があいており、例えば５０ｎｔ分間隔があいており、この空間をあけるヌクレオチドは、非コードＲＮＡ、例えば、ｓｇＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡを含み得る。２つの標的部位（２ｘＴＳ）は、例えば、配列番号２のヌクレオチド１９１２～２０４５、および／または配列番号２のヌクレオチド１９８２～２００４、またはヌクレオチド１６８１～１７０１のヌクレオチド配列を有し、６０～４０ｎｔ分、例えば５０ｎｔ分間隔があいており、配列番号３のヌクレオチド１７５１～１７７１、例えば配列番号３のヌクレオチド１６６５～１８００、または配列番号５のヌクレオチド５６６６～５７９９、または配列番号６のヌクレオチド２３０６～２４３９のヌクレオチド配列を有し得る。

【0019】

本発明によるアルファレトロウイルスベースの粒子は、少なくとも１つのＲＮＡ構築物を標的細胞へ導入するための、例えば目的の遺伝子をアルファレトロウイルスベースの粒子に含有されるそのｍＲＮＡから発現するため、および／またはＲＮＡ分子、例えば、少なくとも１つの、好ましくは少なくとも２つの非コードＲＮＡ、例えばｓｇＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡもしくはこれらのうちの少なくとも２つの組合せから選択される非コードＲＮＡ、および／またはタンパク質をコードするＲＮＡを導入するための使用に好適である。加えて、上記のＲＮＡ種のいずれかをコードする自己増幅ＲＮＡレプリコンを転移してもよい。

【0020】

本発明によるアルファレトロウイルスベースの粒子を製造するためのプロセスにおいて、アルファレトロウイルスＭＡ－ｐ２－ｐ１０－ＣＡ－ＮＣまたはＭＡ－ｐ２－ｐ１０－ＣＡ－ＮＣ－ＰＲを含むａ．Ｇａｇ．ＭＳ２タンパク質成分、ウイルスプロテアーゼ部位（ｐｒ）を含有し得るリンカー、配列番号１のヌクレオチド１４６２～３２０８によってコードされるアミノ酸との少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％の同一性を有するＭＳ２コートタンパク質二量体（２ｘＭＳ２ＣＰ）（ここで、ＭＡ－ｐ２－ｐ１０－ＣＡ－ＮＣ－ＰＲ、ウイルスプロテアーゼ部位（ｐｒ）を含有し得るリンカー、ＭＳ２コートタンパク質二量体（２ｘＭＳ２ＣＰ）は、配列番号１２のヌクレオチド１４６２～３５９４番によってコードされるアミノ酸との少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％の同一性を有する）、およびシュードタイピングタンパク質、および少なくとも１つの標的部位（ＴＳ）に連結された、好ましくは少なくとも２つの標的部位（２ｘＴＳ）に連結された目的の遺伝子および／またはコードもしくは非コードＲＮＡ種をコードする少なくとも１つのＲＮＡ構築物が、プロデューサー細胞において、例えば、ポリメラーゼＩＩ（Ｐｏｌ ＩＩ）プロモーターエレメントの制御下またはポリメラーゼＩＩＩ（Ｐｏｌ ＩＩＩ）プロモーターエレメントの制御下、例えば、Ｐｏｌ ＩＩプロモーターの例としてＣＭＶプロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＥＦ１ａプロモーターまたはベータ－アクチンプロモーター、ならびにＰｏｌ ＩＩＩプロモーターの例としてｈＵ６およびＨ１の制御下において、発現カセットから、同時発現される。

【0021】

各々のａ．Ｇａｇ．ＭＳ２タンパク質成分をコードするか、またはＧＯＩもしくはタンパク質コード配列を含有するＲＮＡ構築物をコードする発現カセットは、好ましくはそれらの３’末端において、ポリアデニル化シグナル（ｐＡ）、任意に、当該ポリアデニル化シグナルの５’末端と隣り合ったＰＲＥをコードする。ＲＮＡがアルファレトロウイルスベースの粒子中に含有される、ＧＯＩまたはタンパク質コード配列を含有する少なくとも１つのＲＮＡ構築物は、その５’末端にＣａｐ構造を有し、その３’末端においてポリアデニル化尾部を有する。

【0022】

驚くべきことに、ａ．Ｇａｇ．ＭＳ２タンパク質成分は、ＲＮＡ構築物、例えば少なくとも１、２または３つの異なるＲＮＡ構築物を１つのアルファレトロウイルスベースの粒子（そのタンパク質成分は、アルファレトロウイルスドメインＭＡ、ｐ２、ｐ１０、ＣＡ、ＮＣ、任意にＰＲ、およびＭＳ２コートタンパク質二量体（２ｘＭＳ２ＣＰ）ならびにシュードタイピングタンパク質、例えばＶＳＶｇを含むかまたはからなる）内に有効にパッケージングすることが見出された。予想外に、タンパク質成分の２ｘＭＳ２ＣＰ部分は、アルファレトロウイルスＭＡ、ｐ２、ｐ１０、ＣＡ、ＮＣおよび任意にＰＲタンパク質ドメインならびにシュードタイピングタンパク質と共に、プロデューサー細胞において少なくとも１つのＲＮＡ構築物を含有するアルファレトロウイルスベースの粒子を形成する。さらに、これらの粒子が、ヒトまたはマウス標的細胞と有効に会合し、標的細胞にＲＮＡ構築物を輸送するために標的細胞を効率的に形質導入することは予想外であった。本明細書において概して、標的細胞は、本発明のアルファレトロウイルスベースの粒子が結合し、その結合が、例えば、アルファレトロウイルスベースの粒子のシュードタイピングタンパク質の選択によって決定される、任意の細胞である。

【0023】

一般的に、核酸配列エレメントは、別に示されない限り、５’から３’へのそれらの配置において示され、アミノ酸配列は、Ｎ末端からＣ末端へのそれらの配置において示される。

【0024】

ここで、本発明は、より詳細に、図面を参照して説明される。

【図面の簡単な説明】

【0025】

－図１Ａ 比較のためのガンマレトロウイルスベースのｇ．Ｇａｇ．ＭＳ２粒子の製造のための核酸構築物の概略図である。
－図１Ｂ 本発明によるａ．Ｇａｇ．ＭＳ２アルファレトロウイルスベースの粒子の生成のための核酸構築物の概略図である。
－図１Ｃ ＦＬＰリコンビナーゼインディケーター遺伝子カセットの概略図、および本発明によるＦＬＰリコンビナーゼを転移する３種のアルファレトロウイルスベースの粒子（ａ．ＮＣ．ＭＳ２、ａ．ＮＣ．ｐｒ．ＭＳ２、ａ．ＰＲ．ｐｒ．ＭＳ２）の比較解析による、形質導入後のマウスＳＣ１細胞におけるレポーター遺伝子カセットの組換えの結果を示す図であり、最もよく機能するバリアント（ａ．ＮＣ．ｐｒ．ＭＳ２）を四角で囲み、これを以下の図面においても使用する。
－図１Ｄ 比較のためのガンマレトロウイルスベースの粒子（ｇ．Ｇａｇ．ＭＳ２）および本発明による最もよく機能するアルファレトロウイルスベースの粒子（ａ．ＮＣ．ｐｒ．ＭＳ２）による、図１Ｃからのレポーター細胞におけるＦＬＰ媒介性組換えの結果を示す。
－図１Ｅ 比較のためのガンマレトロウイルスベースの粒子（ｇ．Ｇａｇ．ＭＳ２）および本発明によるアルファレトロウイルスベースの粒子（ａ．ＮＣ．ｐｒ．ＭＳ２）による形質導入後の、ヒトｉＰＳＣにおけるリプログラミング遺伝子（ＯＫＳＭ）カセットのＦＬＰ媒介性切除の結果を示す。
－図１Ｆ 比較のためのガンマレトロウイルスベースの粒子（ｇ．Ｇａｇ．ＭＳ２）および本発明によるアルファレトロウイルスベースの粒子（ａ．ＮＣ．ｐｒ．ＭＳ２）による形質導入後の、ヒトＨＴ１０８０細胞におけるホタルルシフェラーゼの発現の結果を示す。
－図１Ｇ 比較のためのガンマレトロウイルスベースの粒子（ｇ．Ｇａｇ．ＭＳ２）および本発明によるアルファレトロウイルスベースの粒子（ａ．ＮＣ．ｐｒ．ＭＳ２）による形質導入後の、初代ヒト新生児包皮線維芽細胞（ＮｕＦＦ）におけるホタルルシフェラーゼの発現の結果を示す。
－図２Ａ 本発明によるアルファレトロウイルスベースの粒子（ａ．ＮＣ．ｐｒ．ＭＳ２）の上清、および比較のためのガンマレトロウイルスベースの粒子（ｇ．Ｇａｇ．ＭＳ２）におけるｍＲＮＡのコピー数を示す。
－図２Ｂ 本発明によるアルファレトロウイルスベースの粒子（ａ．ＮＣ．ｐｒ．ＭＳ２）による上清、ならびに比較のためのガンマレトロウイルスベースの上清（ｇ．Ｇａｇ．ＭＳ２）ならびに非レトロウイルス細胞外小胞対照（ｐｃＤＮＡ３のみおよびＶＳＶｇのみ）のタイター（粒子／μＬ）を示す。
－図２Ｃ 本発明によるアルファレトロウイルスベースの粒子（ａ．ＮＣ．ｐｒ．ＭＳ２）、ならびに比較のためのガンマレトロウイルスベースの粒子（ｇ．Ｇａｇ．ＭＳ２）ならびに非レトロウイルス細胞外小胞対照（ｐｃＤＮＡ３のみおよびＶＳＶｇのみ）の粒子サイズ測定の結果を示す。
－図２Ｄ 本発明のウイルス様粒子、ならびに各々の野生型（ｗｔ）ガンマレトロウイルスまたはアルファレトロウイルスＧａｇ－Ｐｏｌ（ｗｔ．ｇ．Ｇａｇ－Ｐｏｌおよびｗｔ．ａ．Ｇａｇ－Ｐｏｌ）をパッケージングした対照ベクター粒子を含む比較のためのウイルス様粒子の透過型電子顕微鏡写真を示す。
－図２Ｅ アルファレトロウイルス様粒子（ａ．ＮＣ．ｐｒ．ＭＳ２）および比較のためのガンマレトロウイルス様粒子（ｇ．Ｇａｇ．ＭＳ２）ならびに各々の組込み対照を形質導入した標的細胞におけるホタルルシフェラーゼ導入遺伝子発現の決定の結果を示す。
－図３Ａ 標的細胞へＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９成分を送達する比較のためのガンマレトロウイルスベースの粒子（ｇ．Ｇａｇ．ＭＳ２）の製造のために使用される成分を模式的に示す。
－図３Ｂ 本発明による、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ＲＮＡを送達するアルファレトロウイルスベースの粒子（ａ．ＮＣ．ｐｒ．ＭＳ２）の製造のために使用される成分を模式的に示す。
－図３Ｃ ｓｇＲＮＡスキャフォールド内に（ＴＳ．ｉｎｃ）またはｓｇＲＮＡスキャフォールドと隣り合って（ＴＳ．ａｄｊ）ＭＳ２標的部位を有するマウスＴｅｔ２標的化ｓｇＲＮＡをパッケージングしたａ．ＮＣ．ｐｒ．ＭＳ２ベースのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９粒子によるＲＦＰ６５７．Ｔｅｔ２レポーターノックアウト率を示す。
－図３Ｄ 本発明によるアルファレトロウイルスベースの粒子（ａ．ＮＣ．ｐｒ．ＭＳ２；ここではＴｅｔ２．ＴＳ．ａｄｊ）の上清、および比較のためのガンマレトロウイルスベースの（ｇ．Ｇａｇ．ＭＳ２；ここではＴｅｔ２．ＴＳ．ｉｎｃ）上清中のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ＲＮＡ（ＳｐＣａｓ９．ＴＳ ｍＲＮＡおよびＴｅｔ２．ＴＳ ｓｇＲＮＡ転写産物）のコピー数を示す。
－図３Ｅ ヒトＨＴ１０８０標的細胞におけるＲＦＰ６５７．Ｔｅｔ２レポーター遺伝子構築物のノックアウト率を示す。
－図３Ｆ ヒトｉＰＳ細胞におけるＴｅｔ２標的遺伝子レポーター構築物のノックアウト率を示す。
－図４ ガンマレトロウイルスベース（ｇ．Ｇａｇ．ＭＳ２）およびアルファレトロウイルスベース（ａ．ＮＣ．ｐｒ．ＭＳ２）のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９オールインワン粒子による、ヒトＪｕｒｋａｔ細胞における内因性ＣＸＣＲ４遺伝子のノックアウトを示す。（Ａ）において、代表的なＦＡＣＳ結果を示し、（Ｂ）において、組み込みレンチウイルスＬＩＴ．ＣＸＣＲ４ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９オールインワン粒子および非標的化マウスＴｒｐ５３対照Ｇａｇ．ＭＳ２粒子と比較した、生物学的反復における実験を示す。
－図５Ａ～５Ｄ 細胞当たりに施用されたＳｐＣａｓ９．ＴＳ ｍＲＮＡコピーとして表される、様々な感染多重度（ＭＯＩ）の施用による、（Ａ）初代ヒトＮｕＦＦ細胞、（Ｂ）初代ヒト肝細胞（ＰＨＨ）、（Ｃ）ヒトＣＤ３４＋造血幹細胞・前駆細胞（ＨＳＰＣ）および（Ｄ）初代マウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）における内因性ヒトＴＰ５３遺伝子の、アルファレトロウイルスベースの（ａ．ＮＣ．ｐｒ．ＭＳ２）粒子により媒介されるノックアウト率を示す。
－図６Ａおよび６Ｂ ２つのｓｇＲＮＡ（図６Ａ、ＣＸＣＲ４およびＲＦＰ６５７．Ｔｅｔ２のノックアウト）または３つのｓｇＲＮＡ（図６Ｂ、Ａに加えてＥＧＦＰもまたノックアウトされた）を含有するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を送達するアルファレトロウイルスベースの粒子の使用による多重化実験を示す。
－図７Ａおよび７Ｂ 図７Ａは、ＶＥＥ自己増幅ＲＮＡレプリコン（非構造タンパク質ｎｓＰ１、ｎｓＰ２、ＮｓＰ３、ｎｓＰ４を有する）および目的の遺伝子としてのＥＧＦＰを含有するアルファレトロウイルスベースの粒子のための例示的な発現プラスミドを示す。図７Ｂは、ヒトＨＴ１０８０標的細胞に図７Ａのアルファレトロウイルスベースの粒子を形質導入した結果を示す。
－図８Ａ～８Ｆ 図８Ａ～８Ｃは、ａ．Ｇａｇ．ＭＳ２粒子でもＰＢＳでも処置しなかったがルシフェリンのみで処置した陰性対照としてのマウスを示す。図８Ｄおよび図８Ｆは、ウイルス粒子およびルシフェリンにより処置したマウスを示し、比較のために、図８Ｅは、ＰＢＳのみおよびルシフェリンにより処置した対照マウスを示す。

【発明を実施するための形態】

【0026】

パッケージング細胞において、本発明による、ｍＲＮＡを送達するアルファレトロウイルスベースの粒子（ａ．Ｇａｇ．ＭＳ２粒子）を産生するための核酸構築物を、図１Ｂに模式的に示し、図１Ａは、ガンマレトロウイルスベースの粒子（ｇ．Ｇａｇ．ＭＳ２粒子）を産生するための比較のための核酸構築物を模式的に示す。加えて、図１Ａおよび図１Ｂは、野生型アルファレトロウイルス粒子（ｗｔ ａ．Ｇａｇ－Ｐｏｌ）またはガンマレトロウイルス粒子（ｗｔ ｇ．Ｇａｇ－Ｐｏｌ）を発現するための核酸構築物を模式的に示す。

【0027】

図１Ａは、ｍＲＮＡ転移ガンマレトロウイルスＧａｇ．ＭＳ２（ｇ．Ｇａｇ．ＭＳ２）粒子のパッケージングのための発現構築物を示す。２９３Ｔプロデューサー細胞に、ｇ．Ｇａｇ．ＭＳ２、エンベロープ糖タンパク質（ＶＳＶｇによって例示される）および目的の遺伝子（ＧＯＩ）を有するｍＲＮＡをコードする発現プラスミドをトランスフェクトした。また、後者は、２コピーのＭＳ２ヘアピン構造（ＴＳ）をコードし、これにより、ｇ．Ｇａｇ．ＭＳ２内の遺伝学的に融合されたＭＳ２コートタンパク質二量体（２ｘＭＳ２ＣＰ）による、転写されたＧＯＩ．ＴＳ ｍＲＮＡの、生ずる粒子への特異的パッケージングを可能にする。ウイルスプロテアーゼ（ＰＲ）を含むガンマレトロウイルスＰｏｌ酵素は、ｇ．Ｇａｇ．ＭＳ２粒子生成中に添加されないので、ＭＳ２ＣＰ二量体タンパク質は、ここではリンカーとして機能する天然のウイルスプロテアーゼ部位（ｐｒ、薄灰色の囲み）によってガンマレトロウイルスヌクレオカプシド（ＮＣ）タンパク質から分離される。ガンマレトロウイルス野生型（ｗｔ）Ｇａｇ－Ｐｏｌの構成は、上部に示される。ＣＭＶ：サイトメガロウイルスプロモーター；ＰＲＥ：ウッドチャック肝炎ウイルス（Ｗｏｏｄｃｈｕｃｋ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｖｉｒｕｓ）転写後調節エレメント；ｐＡ：ポリＡシグナル。ＭＡ：ウイルスマトリックスタンパク質、ｐ１２：ウイルスｐ１２タンパク質、ＣＡ：ウイルスカプシドタンパク質、ＲＴ：ウイルス逆転写酵素、ＩＮ：ウイルスインテグラーゼ。

【0028】

図１Ｂは、アルファレトロウイルスＧａｇ．ＭＳ２（ａ．Ｇａｇ．ＭＳ２）粒子の製造のための発現構築物を示す。ＧＯＩ ｍＲＮＡを送達するａ．Ｇａｇ．ＭＳ２粒子のパッケージングを、３つの異なるアルファレトロウイルスａ．Ｇａｇ．ＭＳ２バリアント、ａ．ＮＣ．ＭＳ２、ａ．ＮＣ．ｐｒ．ＭＳ２およびａ．ＰＲ．ｐｒ．ＭＳ２について示す。ａ．ＮＣ．ＭＳ２バリアントにおいて、ＭＳ２ＣＰ二量体は、アルファレトロウイルスＮＣドメインに直接的に融合され、一方でａ．ＮＣ．ｐｒ．ＭＳ２において、ＮＣおよびＭＳ２ＣＰ二量体は、リンカーによって分離され、リンカーは、この場合、薄灰色の囲みによって示される天然ウイルスプロテアーゼ部位（ｐｒ）（延長されたリンカーを含む）である。ａ．ＰＲ．ｐｒ．ＭＳ２をパッケージングした粒子は加えて、出芽後に粒子成熟を促進するウイルスＰＲを含有する。このバリアントにおいて、ＭＳ２ＣＰ二量体は、この位置における天然ウイルスプロテアーゼ部位（ｐｒ；薄灰色の囲み）においてＰＲによって分離される。図１Ｂにおいて模式的に示される通り、翻訳生成物として発現される、本発明のアルファレトロウイルスベースの粒子内のアルファレトロウイルスベースのａ．Ｇａｇ．ＭＳ２タンパク質成分は、ドメインがプロテアーゼ認識部位によって連結されるＭＡ－ｐ２－ｐ１０－ＣＡ－ＮＣ部分と、２ｘＭＳ２ＣＰ部分とを含むかまたはからなり、これらは、１つの共通のコード配列のＮ末端ＭＡ－ｐ２－ｐ１０－ＣＡ－ＮＣとＣ末端２ｘＭＳ２ＣＰとの間に、リンカーとして、延長されたウイルスプロテアーゼ部位（ｐｒ）を含む、１つの融合タンパク質（ａ．ＮＣ．ｐｒ．ＭＳ２）として生成される。ウイルスプロテアーゼの存在下におけるＭＡ－ｐ２－ｐ１０－ＣＡ－ＮＣ部分のドメインは、ドメイン間に配置されるプロテアーゼ部位において分離可能である。この実施形態において、アルファレトロウイルス部分は、野生型Ｇａｇタンパク質のＰＲドメインを含有しないが、プロテアーゼ認識部位ｐｒおよび２ｘＭＳ２ＣＰ部分を伴う、融合タンパク質中のＭＡ－ｐ２－ｐ１０－ＣＡ－ＮＣからなる翻訳生成物として発現される。さらに、アルファレトロウイルス部分、およびそれぞれ、アルファレトロウイルスベースの粒子は、ウイルス酵素タンパク質を含有せず、例えば、逆転写酵素もしくはインテグラーゼおよび／またはウイルスプロテアーゼを含有しない。融合タンパク質の１つの共通のコード配列は、図１Ｂにおいてａ．Ｇａｇ．ＭＳ２として示され、ＤＮＡとして配列番号１のヌクレオチド１４６２～３２０７のＭＡ－ｐ２－ｐ１０－ＣＡ－ＮＣ－ウイルスプロテアーゼ部位－２ｘＭＳ２ＣＰのコード配列を含有し、ＮＣをＭＳ２から分離する、プロテアーゼ部位およびグリシンを含有する延長されたリンカー、および配列番号１のヌクレオチド３２２３～３９９９によってコードされるＭＳ２コートタンパク質二量体を含み、配列番号１のヌクレオチド２３２～８１９のＣＭＶプロモーターによって例示される、プロモーターの制御下にあり、配列番号１のヌクレオチド４０７８～４３０２の３’末端ポリＡシグナル（ｐＡ）を伴う。

【0029】

さらなる実施形態として、図１Ｂは、ＮＣドメインと延長されたウイルスプロテアーゼ部位リンカーとの間に配置されたＰＲドメインを含有するＭＡ－ｐ２－ｐ１０－ＣＡ－ＮＣ－ＰＲ－ウイルスプロテアーゼ部位－２ｘＭＳ２ＣＰ（ａ．ＰＲ．ｐｒ．ＭＳ２）のコード配列の配置を示す。ＰＲドメインは、アルファレトロウイルスプロテアーゼをコードする。ＭＡ－ｐ２－ｐ１０－ＣＡ－ＮＣ－ＰＲ－ウイルスプロテアーゼ部位－２ｘＭＳ２ＣＰの１つの共通のコード配列は、配列番号１２に含有され、ここで、コドン最適化配列において、ヌクレオチド１４６２～３５９４は、ポリタンパク質ＭＡ－ｐ２－ｐ１０－ＣＡ－ＮＣ－ＰＲ－ウイルスプロテアーゼ部位をコードし、ヌクレオチド３５９５～３６１２は、隣り合うリンカーをコードし、ヌクレオチド３６１３～４３８９は、隣り合うＭＳ２コートタンパク質二量体をコードし、これらのコード配列は、１つの融合タンパク質をコードする。配列番号１２のプラスミド骨格は、ｐｃＤＮＡ３由来である。

【0030】

図１Ｂは、ＮＣドメインと２ｘＭＳ２ＣＰとの間に、延長されたウイルスプロテアーゼ認識部位リンカー（ｐｒ）を含有しないＭＡ－ｐ２－ｐ１０－ＣＡ－ＮＣ－２ｘＭＳ２ＣＰ（ａ．ＮＣ．ＭＳ２）のコード配列の配置を示す。

【0031】

プロデューサー細胞においてアルファレトロウイルス粒子を産生する場合、ＤＮＡは、ＲＮＡ、例えばコード配列を有するｍＲＮＡに転写される。ポリＡシグナルは、ｍＲＮＡへのポリアデニル化尾部の付加に影響を及ぼし、このｍＲＮＡは、タンパク質成分に翻訳される。ウイルスプロテアーゼの存在下においてはＭＡ－ｐ２－ｐ１０－ＣＡ－ＮＣのドメイン間に配置されたウイルスプロテアーゼ部位のために、タンパク質分解が起こって複数のシングルドメインが生じ、少なくとも１つ、好ましくは２つまたはそれを超える標的部位（ＴＳ）を含有するＲＮＡ分子と会合したＭＳ２コートタンパク質を含む、エンベロープに被包された／シュードタイプ化されたアルファレトロウイルスベースの粒子がアセンブリされる。アルファレトロウイルスドメイン間のプロテアーゼ部位についてのタンパク質分解活性の非存在下においてアルファレトロウイルスベースの粒子を産生する場合（例えば、配列番号１からのＭＡ－ｐ２－ｐ１０－ＣＡ－ＮＣ－ウイルスプロテアーゼ部位－２ｘＭＳ２ＣＰ）、このタンパク質成分は、１つのアミノ酸鎖として存在し、ウェスタンブロットにおいて本質的にタンパク質分解プロセッシングは観察されないことが見出された。したがって、ＭＡ－ｐ２－ｐ１０－ＣＡ－ＮＣ－ウイルスプロテアーゼ部位－２ｘＭＳ２ＣＰを含むかまたはからなる本発明のタンパク質成分において、ドメイン間のプロテアーゼ部位は、非機能性であってもよく、例えば、ドメインは、プロテアーゼ部位を含有しないリンカーによって連結してもよく、したがって、ｇａｇポリタンパク質成分は、１つの単一のタンパク質として存在し得る。このことは、ｇａｇポリタンパク質成分のアルファレトロウイルスドメイン間のプロテアーゼ部位は、本発明の機能的アルファレトロウイルスベースのＧａｇ．ＭＳ２粒子を産生する場合、タンパク質分解切断される必要はないことを示す。注目すべきことに、ＮＣの３’、２ｘＭＳ２ＣＰの５’に、延長されたプロテアーゼ部位リンカー（プロテアーゼ部位およびグリシンリンカーから構成される）を有する延長されたリンカーの存在は、機能性に重要であった（図１Ｃを参照されたく、ａ．ＮＣ．ＭＳ２およびａ．ＮＣ．ｐｒ．ＭＳ２の比較によって示される）。

【0032】

プロテアーゼＰＲを含むタンパク質成分、例えば、配列番号１２によってコードされるＭＡ－ｐ２－ｐ１０－ＣＡ－ＮＣ－ＰＲ－ウイルスプロテアーゼ部位－２ｘＭＳ２ＣＰ（ａ．ＰＲ．ｐｒ．ＭＳ２）の実施形態において、また、ウイルスプロテアーゼの存在は、本発明の機能的アルファレトロウイルスベースの粒子の産生をもたらすことが見出された（図１Ｂおよび１Ｃのａ．ＰＲ．ｐｒ．ＭＳ２）。好ましくは、２ｘＭＳ２ＣＰは、アルファレトロウイルスＧａｇ（ＭＡ－ｐ２－ｐ１０－ＣＡ－ＰＲ）部分から切断され得る。標的細胞の有効な形質導入、および転移されたＲＮＡの活性により、ａ．ＮＣ．ｐｒ．ＭＳ２およびａ．ＰＲ．ｐｒ．ＭＳ２バリアントから機能的ａ．Ｇａｇ．ＭＳ２粒子が有効に形成されることが示される。両方のバリアントが機能的ＲＮＡを転移する能力があるという事実は、プロテアーゼ、およびＧａｇ．ＭＳ２サブドメインへのタンパク質切断が可能であることは、機能性にとって必須ではないことを示す。したがって、これらのａ．Ｇａｇ．ＭＳ２粒子において、ウイルスＧａｇサブドメイン間、およびＧａｇと２ｘＭＳ２ＣＰとの間のウイルスプロテアーゼ部位は、非加水分解性であってよく（例えば、ａ．ＮＣ．ｐｒ．ＭＳ２）、または任意に加水分解されて（例えば、ａ．ＰＲ．ｐｒ．ＭＳ２）、ＭＡ、ｐ２、ｐ１０、ＣＡ、ＮＣ、ＰＲの別々のまたは連結したドメインを生成してもよく、好ましくは２ｘＭＳ２ＣＰは、ｇａｇ部分から切断され得る。

【0033】

プロデューサー細胞において、ＲＮＡ構築物は、ＣＭＶプロモーターによって例示されるプロモーターの制御下においてＤＮＡから転写され、目的の遺伝子（ＧＯＩ）のコード配列、少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つの標的部位およびポリＡシグナルを含むかまたはからなり、任意にＧＯＩとポリＡシグナルとの間にＰＲＥを伴う（ＧＯＩ．ＴＳ）。得られるＲＮＡは、５’から３’へ、ＧＯＩのコード配列、少なくとも１つのＴＳ、好ましくは少なくとも２つのＴＳ、任意にＰＲＥ、および好ましくはポリアデニル化尾部からなる。例において、ＲＮＡ構築物と会合し（パッケージングを含む）、ａ．Ｇａｇ．ＭＳ２粒子を形成するためのＭＳ２ＣＰタンパク質と相互作用する、２つの標的部位（ＴＳ）が示される。ＧＯＩは、例えば、遺伝子編集ヌクレアーゼ、トランスポザーゼ、リコンビナーゼ、酵素または他の細胞タンパク質、非コードＲＮＡ、例えば、ｓｇＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ（低分子ヘアピンＲＮＡ）、ｍｉＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡまたはコードおよび非コードＲＮＡの組合せであり得る。好ましくは、非コード構築物を含有するＲＮＡは、ポリメラーゼＩＩＩプロモーター、例えばヒトＵ６（ｈＵ６）またはＨ１プロモーターの制御下においてＤＮＡから転写される。

【0034】

本発明によると、アルファレトロウイルスベースの粒子は、少なくとも１、２、３つまたはそれを超えるＲＮＡコードおよび非コード構築物を含有してもよく、各ＲＮＡ構築物は、分子に組み込まれる（例えば、組み込まれるかまたは隣り合う）ＴＳ、任意にＰＲＥ（転写後調節エレメント、例えばウッドチャック肝炎ウイルスのＰＲＥ）、ならびにとりわけタンパク質コードＲＮＡおよびｍｉＲＮＡについて、より好ましくは３’末端ポリアデニル化尾部を伴う。

【0035】

一般的に好ましくは、コードＧＯＩおよび任意に非コードＧＯＩ、例えば、ｌｎｃＲＮＡ、ｍｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡ／ｍｉＲＮＡハイブリッドは、Ｐｏｌ．ＩＩプロモーター、例えばＣＭＶプロモーターの制御下においてＤＮＡから転写されることができ、好ましくは、ＧＯＩの３’に、少なくとも１つの、隣り合うかまたは組み込まれたＴＳ、ポリＡシグナル、任意にＰＲＥが続く。非コードＧＯＩ、とりわけ、ｓｈＲＮＡ、ｓｇＲＮＡおよび他の短鎖非コードＲＮＡは、Ｐｏｌ．ＩＩＩプロモーター、例えばｈＵ６、Ｈ１プロモーターの制御下においてＤＮＡから転写されることができ、非コードＲＮＡの３’に、好ましくはＰｏｌ．ＩＩＩ終止シグナル（ポリＴストレッチ、ＴＴＴＴＴ）が続く。

【0036】

ａ．Ｇａｇ．ＭＳ２粒子を生成するために、シュードタイプエンベロープタンパク質の付加が必要である。したがって、プロデューサー細胞は、ＣＭＶプロモーターによって例示されるプロモーターの制御下において、シュードタイピングタンパク質、例えばＶＳＶｇ（水疱性口内炎ウイルスの糖タンパク質）、任意にイントロン、および３’末端ポリアデニル化シグナルを発現するための、トランスフェクトされたかまたは安定に発現される構築物を含有する（ＣＭＶ－ＶＳＶｇ－ｐＡ）。シュードタイピングタンパク質は、プロデューサー細胞において発現される場合、アルファレトロウイルスベースの粒子の脂質エンベロープに組み込まれる。

【0037】

好ましくは、ＶＳＶｇ ｃＤＮＡは、ガンマレトロウイルス、アルファレトロウイルスおよびレンチウイルスを含むレトロウイルスでベクターをシュードタイプ化するために好適である別のエンベロープタンパク質によって置き換えられてもよく、本明細書において説明されるａ．Ｇａｇ．ＭＳ２粒子を使用してもよい（上記に提供されるエンベロープタンパク質のリストを参照されたい）。

【0038】

例１：ＦＬＰリコンビナーゼまたはホタルルシフェラーゼｍＲＮＡを送達するアルファレトロウイルスベースの粒子のパッケージングおよび性能
アルファレトロウイルスベースのＧａｇ．ＭＳ２（ａ．Ｇａｇ．ＭＳ２）粒子の産生のために使用される成分を、図１Ｂに模式的に示す。２９３Ｔプロデューサー細胞に、ａ．Ｇａｇ．ＭＳ２（配列番号１）をコードする発現プラスミドをトランスフェクトし、ＶＳＶｇエンベロープ糖タンパク質を、配列番号４から発現させ、目的の遺伝子（ＧＯＩ）を有するｍＲＮＡを配列番号２（ＦＬＰ）および配列番号６（ホタルルシフェラーゼ）から転写する。また、ＦＬＰ ＧＯＩをコードするｍＲＮＡは、配列番号２のヌクレオチド１９４３～１９６５およびヌクレオチド１９８２～２００４の２コピーのＭＳ２ヘアピン構造（ＴＳ）をコードし、それらのＴＳは、生ずるアルファレトロウイルスベースの粒子のＭＳ２コートタンパク質二量体（２ｘＭＳ２ＣＰ）への、転写されたＧＯＩ．ＴＳ ｍＲＮＡの特異的パッケージングを可能にする。対応して、また、ホタルルシフェラーゼをコードするｍＲＮＡは、配列番号６のヌクレオチド２３３７～２３５９およびヌクレオチド２３７６～２３９８の２コピーのＭＳ２ヘアピン構造（ＴＳ）をコードする。

【0039】

比較のために、同じＧＯＩをコードするｍＲＮＡを有するガンマレトロウイルスタンパク質成分ｇ．Ｇａｇ．ＭＳ２相関物を、比較のためのガンマレトロウイルス様粒子を産生するために使用する。図１Ａにおいて示される通り、比較のためのガンマレトロウイルスベースの粒子ｇ．Ｇａｇ．ＭＳ２も、レトロウイルスドメインと２ｘＭＳＣＰとの間に、延長されたプロテアーゼ認識部位ｐｒ（薄灰色の囲み）を含有し、また、ＶＳＶｇによってシュードタイプ化された。

【0040】

ＣＭＶ：サイトメガロウイルスプロモーター；ＰＲＥ：ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント；ｐＡ：ポリＡシグナル。

【0041】

アルファレトロウイルスベースのＧａｇ．ＭＳ２粒子を産生するために、標準のリン酸カルシウムＤＮＡ沈殿法を使用する２９３Ｔプロデューサー細胞の一過性トランスフェクション後に、ウイルス上清を生成した。簡潔に説明すると、トランスフェクションの前日に、１０ｃｍの直径の培養皿（Ｓａｒｓｔｅｄｔ社、Ｎｕｅｍｂｒｅｃｈｔ、ドイツ）１枚当たり細胞５～６ｘ１０^６個を播種した。ヒト胎児由来腎臓２９３Ｔ（２９３Ｔ）細胞に、ａ．Ｇａｇ．ＭＳ２（配列番号１）、ＴＳを伴うＦＬＰリコンビナーゼまたはＴＳを伴うホタルルシフェラーゼのコード配列を含有するＧＯＩ．ＴＳ（ＦＬＰについて配列番号２、およびホタルルシフェラーゼについて配列番号６）ならびにＰＲＥおよびポリアデニル化シグナルをコードするプラスミドと、ＶＳＶｇ（配列番号４）のコード配列を含有する発現プラスミドとを同時トランスフェクトすることによって、ウイルス粒子を生成した。

【0042】

アルファレトロウイルスベースのＧａｇ．ＭＳ２粒子を、４℃において、８２，７４０ｘｇにて２時間、または１３，２３８ｘｇにて一晩の超遠心分離によって、１００倍濃縮し、アルファレトロウイルスベースの粒子上清として使用した。

【0043】

比較のために、ガンマレトロウイルス粒子を、同じプロトコールを使用して、ただし、配列番号１３のガンマレトロウイルスＧａｇ．ＭＳ２発現構築物のコード配列を使用して産生した。

【0044】

細胞ベースのＦＬＰリコンビナーゼ（ＦＬＰ）レポーター系を利用して、各々のアルファレトロウイルスＧａｇ．ＭＳ２粒子機能性、および粒子中に含有されるＲＮＡの活性を評価した（図１Ｃ）。この目的のために、ＧＯＩ．ＴＳとしてＦＬＰリコンビナーゼ（ＦＬＰ）ｍＲＮＡを送達する様々なａ．Ｇａｇ．ＭＳ２粒子を、図１Ｂにおいて示される通りに産生し、ＳＣ１ベースのＦＬＰレポーター細胞について試験し、このレポーター細胞では、ＦＬＰ媒介性組換えが、ＥＧＦＰからｄＴｏｍａｔｏ発現への変換によって示される。

【0045】

ＦＬＰレポーター細胞は、レポーター構築物（ＦＬＰインディケーターカセット）を含有し、この構築物においては、ＥＧＦＰ（高感度緑色蛍光タンパク質）が、２つのＦＲＴ（ＦＬＰ認識標的）部位によって挟まれており、この３’に、ＡＴＧ開始コドンを欠く第２のレポーター遺伝子として赤色蛍光ｄＴｏｍａｔｏを含有した。したがって、ＦＬＰの活性は、ＥＧＦＰの切除をもたらし、ｄＴｏｍａｔｏ発現を誘導する。細胞は、ＦＬＰインディケーターカセットを３つのコピー分、含有したので、ＦＬＰによるすべての３つの対立遺伝子の不完全な組換えは、ｄＴｏｍａｔｏおよびＥＧＦＰの両方を発現する細胞ももたらす。それら、およびｄＴｏｍａｔｏのみを発現する細胞は、両方とも、グラフのＹ軸において示される通り組換え細胞と考えられた。

【0046】

バリアントａ．ＮＣ．ｐｒ．ＭＳ２およびａ．ＰＲ．ｐｒ．ＭＳ２は、バリアントａ．ＮＣ．ＭＳ２よりも優れた性能を発揮した。最も優れているバリアントａ．ＮＣ．ｐｒ．ＭＳ２を四角で囲み、以下の解析において使用する。これは、好ましくは、ａ．Ｇａｇ．ＭＳ２タンパク質成分内において、２ｘＭＳ２ＣＰは、リンカー領域によってＧａｇサブドメインから分離すべきであることを示す。

【0047】

図１Ｄは、最も優れているアルファレトロウイルスベースのＧａｇ．ＭＳ２粒子（ａ．ＮＣ．ｐｒ．ＭＳ２；（黒丸））による、それらのガンマレトロウイルスベースの相関物（ｇ．Ｇａｇ．ＭＳ２、図１Ａ、（白丸））と比較した、ＦＬＰ ｍＲＮＡの高効率の転移を示す。ＦＬＰインディケーターカセットを含有するＳＣ－１ベースのＦＬＰレポーター細胞を、示される体積のｇ．Ｇａｇ．ＭＳ２．ＦＬＰまたはａ．ＮＣ．ｐｒ．ＭＳ２．ＦＬＰ上清で形質導入した。Ｙ軸は、ＦＲＴに両側を挟まれたＥＧＦＰの、ＦＬＰにより媒介される切除から明らかになった、組換え細胞の百分率を示す。アルファレトロウイルスベースのａ．ＮＣ．ｐｒ．ＭＳ２．ＦＬＰ粒子は、増強されたＦＬＰ媒介性組換えを示す。

【0048】

図１Ｅは、目的の遺伝子としてＦＬＰリコンビナーゼを含有する例示的なａ．Ｇａｇ．ＭＳ２粒子（ａ．ＮＣ．ｐｒ．ＭＳ２）による、ヒト人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）のゲノムからのリプログラミングベクターカセット（ＳＦＦＶ．ＯＫＳＭ）の高効率の除去の結果を示す。レポーターカセットを含有する１つのＳＦＦＶ．ＯＫＳＭベクター組込みを有するヒトｉＰＳＣ細胞を、比較のためのガンマレトロウイルスベースの（白丸）ｇ．Ｇａｇ．ＭＳ２粒子上清またはアルファレトロウイルスベースの（黒丸）ａ．Ｇａｇ．ＭＳ２粒子上清により処理した。

【0049】

図１Ｅにおいて模式的に示される、レポーターカセットからのＳＦＦＶ．ＯＫＳＭの切除（ＦＬＰ媒介性ＯＫＳＭカセット切除）を、ＯＫＳＭリプログラミングカセットの一部であるコドン最適化（ｃｏ）ＯＣＴ４遺伝子（Ｏ）を検出するプライマーを使用する定量的リアルタイムＰＣＲによって解析した（ＶＣＮ：ベクターコピー数；ＬＴＲ：末端反復配列；ＳＩＮ／ＦＲＴ：自己不活性化ＬＴＲおよびＦＲＴ部位）。結果は、ＦＬＰ ｍＲＮＡの送達は、ガンマレトロウイルスベースの粒子（４２％）と比較して、アルファレトロウイルスベースの粒子によると、よりいっそう効率的である（９７％）ことを示す。

【0050】

図１Ａおよび１Ｂにおいて示される通り、さらなるＧＯＩとして、ホタルルシフェラーゼｍＲＮＡを、アルファレトロウイルスベースのａ．Ｇａｇ．ＭＳ２粒子、および比較のためのガンマレトロウイルスベースのｇ．Ｇａｇ．ＭＳ２粒子にパッケージングした（ＧＯＩ．ＴＳ、配列番号６のヌクレオチド６２４～２４３９）。結果は、アルファレトロウイルスベースのａ．Ｇａｇ．ＭＳ２粒子によるホタルルシフェラーゼｍＲＮＡの優れた転移を示す。グラフは、ヒトＨＴ１０８０細胞（図１Ｆ）または初代ヒト新生児包皮線維芽細胞（ＮｕＦＦ）（図１Ｇ）における全タンパク質について正規化した相対的光単位（ＲＬＵ）を示す。

【0051】

Ｇａｇ．ＭＳ２「ｍＲＮＡのみ」の送達の場合、１００倍濃縮された上清中のコードｍＲＮＡのコピー数を、定量的リアルタイムＲＴ（逆転写）ＰＣＲ（ｑＲＴ－ＰＣＲ）によって決定した。潜在的なプラスミド夾雑を除去するために、上清を、２ユニットのＴＵＲＢＯ ＤＮアーゼ（Ａｍｂｉｏｎ／Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）により３７℃において１時間処理した。続いて、ＱＩＡＧＥＮ ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｃｒｏ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社、Ｈｉｌｄｅｎ、ドイツ）を使用して製造業者のプロトコールに従うがカラム上での追加のＤＮアーゼ消化ステップを伴って、Ｇａｇ．ＭＳ２粒子からＲＮＡを抽出した。抽出したＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写し、その後、ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を使用してｑＲＴ－ＰＣＲを行った。ＰＣＲのために、構築物上に存在するｗＰＲＥに特異的なプライマーを使用した。プラスミド標準の連続希釈を利用して、絶対コピー数を計算した。

【0052】

図２Ａは、本発明によるアルファレトロウイルスベースのａ．Ｇａｇ．ＭＳ２（ａ．ＮＣ．ｐｒ．ＭＳ２バリアント）粒子ベースの上清におけるＦＬＰリコンビナーゼをコードするｍＲＮＡのコピー数（黒丸）、および比較のためのガンマレトロウイルスベースのｇ．Ｇａｇ．ＭＳ２上清におけるＦＬＰリコンビナーゼｍＲＮＡ含有量（白丸）を測定した結果を示す。各データ点は、２９３Ｔプロデューサー細胞を利用して産生された、独立して調製された１つの粒子上清を反映する。結果は、アルファレトロウイルスベースのＧａｇ．ＭＳ２粒子を含有する上清について、より高い濃度の、ＦＬＰリコンビナーゼをコードする目的の遺伝子のｍＲＮＡを示す。

【0053】

全視野干渉（ＦＦＩ：ｆｕｌｌ－ｆｉｅｌｄ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｒｙ；（白丸））により、またはナノ粒子トラッキング解析（ＮＴＡ；（黒丸））により、同じ上清において粒子含有量を決定した。さらなる対照として、ｐｃＤＮＡ３、またはＶＳＶｇをコードする発現プラスミドを単独でトランスフェクトした２９３Ｔプロデューサー細胞からの上清を解析した。

【0054】

図２Ｂは、ｐｃＤＮＡ３（空のｐｃＤＮＡ３プラスミド）またはＶＳＶｇコードプラスミド（配列番号４）のみをトランスフェクトしたプロデューサー細胞からの濃縮された上清についての粒子数の結果を示す。両方の調製物を、アルファおよびガンマレトロウイルスベースのＧａｇ．ＭＳ２上清内の細胞外小胞の割合の見積もりのための対照として使用した。加えて、図１Ａ（ｇ．Ｇａｇ．ＭＳ２）または図１Ｂ（ａ．Ｇａｇ．ＭＳ２、配列番号１のａ．ＮＣ．ｐｒ．ＭＳ２）において説明される通りに生成したガンマおよびアルファレトロウイルスベースのＧａｇ．ＭＳ２上清を解析した。結果は、より高濃度の、アルファレトロウイルスベースのＧａｇ．ＭＳ２タンパク質成分からなるウイルス様粒子を示す。

【0055】

図２Ｃは、ＮＴＡによる同じ上清のウイルス粒子サイズ測定の結果を示し、ａ．ＮＣ．ｐｒ．ＭＳ２からなり、ＦＬＰ．ＴＳ ｍＲＮＡを送達するアルファレトロウイルスベースのＧａｇ．ＭＳ２粒子（黒丸）は、比較のためのガンマレトロウイルスベースの粒子（白丸）と類似するサイズを示すことを明らかにする。

【0056】

図２Ｄは、図１Ｃ～１Ｅおよび図２Ａ～２Ｃの構築物においても使用される、タンパク質成分ＭＡ－ｐ２－ｐ１０－ＣＡ－ＮＣ－ウイルスプロテアーゼ部位－２ｘＭＳ２ＣＰを有し、３’末端ＴＳを伴うＦＬＰリコンビナーゼ（ＦＬＰ．ＴＳ）をコードするｍＲＮＡを含有する、アルファレトロウイルスベースのＧａｇ．ＭＳ２粒子（ａ．ＮＣ．ｐｒ．ＭＳ２）、および同じｍＲＮＡ構築物を含有する比較のためのガンマレトロウイルスベースのＧａｇ．ＭＳ２粒子（ｇ．Ｇａｇ．ＭＳ２）の透過型電子顕微鏡写真（ＴＥＭ写真、同拡大、サイズバーは１００ｎｍである）を示す。比較のために、完全Ｇａｇ－Ｐｏｌを有する野生型ウイルスベクター粒子を、アルファレトロウイルス（ｗｔ ａ．Ｇａｇ－Ｐｏｌ）およびガンマレトロウイルス（ｗｔ ｇ．Ｇａｇ－Ｐｏｌ）由来ベクター粒子について示す。白色矢印は、高電子密度カプシドまたはそれらの部分を指し示す。黒色矢印は、高電子密度カプシドが不完全であるように見える領域において見ることができる膜の隆起を強調する。

【0057】

図２Ｅは、Ｇａｇ．ＭＳ２媒介性導入遺伝子発現を決定した結果を示し、これは一過性であることが示される。ＨＴ１０８０細胞に、ホタルルシフェラーゼｍＲＮＡ転移Ｇａｇ．ＭＳ２粒子を形質導入した後のホタルルシフェラーゼの発現を、経時的にモニターした。各々のアルファおよびガンマレトロウイルス組込み転移ベクター粒子（ｇ．ＲＩＴおよびａ．ＲＩＴ）を、陽性対照として使用した。この実験において、アルファレトロウイルスベースのＧａｇ．ＭＳ２粒子からのホタルルシフェラーゼの一過性の発現は、ガンマレトロウイルスベースのＧａｇ．ＭＳ２粒子からの一過性の発現よりも一貫して高いことが見出された。比較のための組込み構築物ｇ．ＲＩＴおよびａ．ＲＩＴは、連続的な高発現を示す。このアッセイの前に、ｑＲＴ－ＰＣＲにより、上清中のレポーターｍＲＮＡ（ホタルルシフェラーゼ）の含有量を決定し、等しい量のホタルルシフェラーゼｍＲＮＡコピーを標的細胞へ施用するために上清の体積を調節した。興味深いことに、両方のＧａｇ．ＭＳ２粒子系の一過性の性質に加えて、ａ．ＮＣ．ｐｒ．ＭＳ２からなるａ．Ｇａｇ．ＭＳ２粒子は、粒子施用の１時間後に、より高いルシフェラーゼ発現を示し、ａ．Ｇａｇ．ＭＳ２粒子について、上清体積当たりのより機能的な粒子、より効率的な細胞侵入、および／または標的細胞形質導入中の他の利点を示唆する。

【0058】

例２：ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ＲＮＡ（ＳｐＣａｓ９ ｍＲＮＡおよび各々のｓｇＲＮＡ）を送達するアルファレトロウイルスベースのａ．Ｇａｇ．ＭＳ２粒子のパッケージングおよび性能
アルファレトロウイルスベースのａ．Ｇａｇ．ＭＳ２粒子の産生のために使用される成分を、図３Ｂに模式的に示す。図３Ｂにおいて示される発現カセットである、ＣＭＶプロモーターの制御下においてＭＡ－ｐ２－ｐ１０－ＣＡ－ＮＣ－ウイルスプロテアーゼ部位－２ｘＭＳ２ＣＰ（ａ．Ｇａｇ．ＭＳ２、配列番号１のヌクレオチド１４６２～３９９９）をコードする発現カセットと、ブタテッショウウイルス（ｔｅｓｃｈｏｖｉｒｕｓ）－１のＰ２Ａプロテアーゼ部位のコード配列に融合され、ＥＧＦＰのコード配列、２コピーのＭＳ２標的部位ヘアピン（ＴＳ）、ＰＲＥエレメントおよびポリアデニル化シグナル（ｐＡ）が続くストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９）のｍＲＮＡを産生するための、ＣＭＶプロモーターの制御下におけるＶＳＶｇ（配列番号４）をコードする別の発現ベクターとを含有する粒子を、２９３Ｔプロデューサー細胞において産生した。後者の構築物を、ＳｐＣａｓ９．ＴＳ（配列番号５）と命名する。この構築物は、ＴＳ、ＰＲＥおよびｐＡに連結されたＳｐＣａｓ９－Ｐ２Ａ－ＥＧＦＰのｍＲＮＡをコードする。この構築物から、ＳｐＣａｓ９（目的の遺伝子）およびＥＧＦＰ（レポーター）は、単一のｍＲＮＡ転写産物として転写され、Ｐ２Ａ部位によって媒介されるペプチド結合スキッピングにより翻訳中に分離される。

【0059】

標的細胞においてＳｐＣａｓ９酵素と協同させるためのシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）ｓｇＲＮＡ ＴＳ．ａｄｊまたはｓｇＲＮＡ ＴＳ．ｉｎｃを、Ｐｏｌ ＩＩＩヒトポリメラーゼプロモーターＵ６（ｈＵ６）プロモーターを利用して発現し、２つのＭＳ２ ＴＳコピーに連結し、ポリＴストレッチにより、好ましくは配列ＴＴＴＴＴまたはＴＴＴＴにより終結させる。加えて、これらの構築物は、ＣＭＶプロモーターの制御下においてＤｓＲｅｄｅｘｐを発現し、ポリアデニル化シグナル（ｐＡ）により終結される。ｓｇＲＮＡ ＴＳ．ｉｎｃ構築物（配列番号３）は、ｓｇＲＮＡ骨格内に組み込まれるＴＳコピーを有し、一方で、ｓｇＲＮＡ ＴＳ．ａｄｊ（配列番号１４）構築物においては、ＴＳコピーは、ｓｇＲＮＡ骨格の３’に（隣り合って）置かれた。両方のｓｇＲＮＡ構築物は、各々のプロトスペーサー配列、すなわち、レシピエント細胞ゲノム内の意図されるＤＮＡ標的部位への結合を与えるｓｇＲＮＡの部分が容易に置換されること（各々のｓｇＲＮＡ．ＴＳ骨格に影響を及ぼすことなく）を可能にするように設計された。

【0060】

レポーター遺伝子ＤｓＲｅｄｅｘｐによって代表されるＧＯＩの追加のコード配列を有するこれらのｓｇＲＮＡ構築物において、ｓｇＲＮＡは、ＧＯＩとｐＡとの間に配置される。これらの核酸構築物は、トランスフェクトされた標的細胞における、発現についてのレポーター遺伝子としてのＤｓＲｅｄｅｘｐ（イソギンチャクモドキ（Ｄｉｓｃｏｓｏｍａ ｓｐ．）赤色蛍光タンパク質、ＤｓＲｅｄ－Ｅｘｐｒｅｓｓ、ＢＤ Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社から入手可能、製品番号６９９５－１）のヒトコドン最適化コード配列を含有し、このコード配列は、トランスフェクトされた標的細胞においてｓｇＲＮＡの転写を制御するプロモーターｈＵ６に連結されている。

【0061】

また、ＤｓＲｅｄｅｘｐによって例示されるＧＯＩのｍＲＮＡは、配列番号３のヌクレオチド１６８１～１７０１およびヌクレオチド１７５１～１７７１における２コピーのＭＳ２ヘアピン構造（ＴＳ）をコードし、このＴＳは、転写されたＧＯＩ．ＴＳ ｍＲＮＡを、生ずるアルファレトロウイルス粒子のＭＳ２コートタンパク質二量体（２ｘＭＳ２ＣＰ）へ特異的にパッケージングすることを可能にする。タンパク質成分は、ＭＡ－ｐ２－ｐ１０－ＣＡ－ＮＣ－ウイルスプロテアーゼ部位－２ｘＭＳ２ＣＰ内の融合タンパク質としてコードされる（ａ．Ｇａｇ．ＭＳ２）。この実施形態は、低分子非コードＲＮＡの一例としてのｓｇＲＮＡは、ＴＳの領域へ組み込まれ得ること、例えば、ｓｇＲＮＡが２つのヘアピン構造の間に、および／またはヘアピン構造の５’に直接隣り合って配置されることを示す。一例として、配列番号３は、ヌクレオチド１５６０～１６６８においてＢｓｍＢＩ－スタッファー（ＢｓｍＢＩ－ｓｔｕｆｆｅｒ）と呼ばれるセクションを含み、その部分またはそれは、完全に、ｓｇＲＮＡのプロトスペーサー配列に交換され得る。例示的なｓｇＲＮＡ配列は、マウスメチルシトシンジオキシゲナーゼＴｅｔ２を標的化するためのｓｇＲＮＡについて配列番号７、マウス細胞腫瘍抗原ｐ５３を標的化するｓｇＲＮＡについて配列番号８、ヒト細胞腫瘍サプレッサー遺伝子ｐ５３を標的化するｓｇＲＮＡについて配列番号９、ヒトＣ－Ｘ－Ｃケモカイン受容体４を標的化するｓｇＲＮＡについて配列番号１０、高感度緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）を標的化するｓｇＲＮＡについて配列番号１１として示される。

【0062】

図３Ａは、ａ．Ｇａｇ．ＭＳ２とは対照的に、各々のｇ．Ｇａｇ．ＭＳ２バリアント、同じシュードタイピングタンパク質ＶＳＶｇ、および機能的に同一のＲＮＡ核酸構築物を含有する、比較のためのガンマレトロウイルスベースのＧａｇ．ＭＳ２粒子の産生に使用される成分を模式的に示す。

【0063】

図３Ｃは、マウスＴｅｔメチルシトシンジオキシゲナーゼ２遺伝子（Ｔｅｔ２）に対して方向付けられるＴＳ．ｉｎｃ ｓｇＲＮＡをパッケージングしたアルファレトロウイルスベースのａ．ＮＣ．ｐｒ．ＭＳ２ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９粒子は、それらのｓｇＲＮＡ．Ｔｅｔ．ＴＳ．ａｄｊ相関物よりも優れていることを示す。ヒトＨＴ１０８０細胞におけるＲＦＰ６５７．Ｔｅｔ２のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介性ノックアウト（Ｈｅｃｋｌら、上記の引用による）の成功は、ＲＦＰ６５７発現の喪失によって示される。したがって、ａ．ＮＣ．ｐｒ．ＭＳ２ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９およびｓｇＲＮＡ．ＴＳ．ｉｎｃ転写産物を、次の図面において使用した。レポーターカセットを模式的に示し、Ｔｅｔ２認識部位はＲＦＰ６５７のコード配列内に（ＡＴＧ開始コドンのすぐ下流に）配置されるので、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９は、ＤＮＡ二本鎖の切断を誘導し、不正確なＤＮＡ修復は、フレームシフト、それゆえ、ＲＦＰ６５７発現の喪失をもたらす。ＳＦＦＶ：脾フォーカス形成ウイルス由来のプロモーター。

【0064】

図３Ｄは、ＴＳに連結されたＳｐＣａｓ９コードｍＲＮＡ、およびＴＳに連結されたマウスＴｅｔメチルシトシンジオキシゲナーゼ２遺伝子（Ｔｅｔ２）標的化ｓｇＲＮＡについての、アルファレトロウイルスベースのＧａｇ．ＭＳ２粒子（ａ．Ｇａｇ．ＭＳ２）および比較のためのガンマレトロウイルスベースのＧａｇ．ＭＳ２粒子（ｇ．Ｇａｇ．ＭＳ２）に含有されるｍＲＮＡの転写産物数を示す。結果は、アルファレトロウイルスベースのＧａｇ．ＭＳ２粒子は、各々ガンマレトロウイルスベースのＧａｇ．ＭＳ２粒子と比較して、およそ８倍高い、より高い数のＳｐＣａｓ９ ｍＲＮＡを含有するが、およそ２．３倍低い数のｓｇＲＮＡを含有することを示す。ａ．Ｇａｇ．ＭＳ２粒子に、Ｔｅｔ２．ＴＳ．ｉｎｃをパッケージングし、一方で、ｇ．Ｇａｇ．ＭＳ２粒子に、Ｔｅｔ２．ＴＳ．ａｄｊ ｓｇＲＮＡをパッケージングした。

【0065】

アルファレトロウイルスベースのＧａｇ．ＭＳ２粒子または比較のためのＧａｇ．ＭＳ２ガンマレトロウイルスベースの粒子を形質導入した様々な標的細胞におけるｓｇＲＮＡと組み合わせたＳｐＣａｓ９酵素の活性を、図３Ｅ、３Ｆに示す。

【0066】

ｓｇＲＮＡは、マウスＴｅｔメチルシトシンジオキシゲナーゼ２遺伝子（Ｔｅｔ２）（プロトスペーサー、配列番号７を参照されたい）について特異的であり、ウイルスベースの粒子のｍＲＮＡによってコードされるＳｐＣａｓ９酵素との協同により、図３Ｃにおいても使用される、５’コード領域（ＡＴＧ開始コドンの下流）において対応するＴｅｔ２認識部位（配列番号７）を有するＲＦＰ６５７レポーター遺伝子を含有する標的細胞において、ＲＦＰ６５７のノックアウトをもたらす。このレポーター遺伝子は、脾フォーカス形成ウイルス（ＳＦＦＶ）プロモーター（図３Ｃおよび３Ｅ）により、またはＣＢＸ．ＥＦＳプロモーター（最小遍在性クロマチンオープニングエレメント（ｍｉｎｉｍａｌ ｕｂｉｑｕｉｔｏｕｓ ｃｈｒｏｍａｔｉｎ－ｏｐｅｎｉｎｇ ｅｌｅｍｅｎｔ）ＣＢＸ３、および伸長因子１アルファ短（ＥＦＳ）プロモーター（ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ １ ａｌｐｈａ ｓｈｏｒｔ （ＥＦＳ） ｐｒｏｍｏｔｅｒ）からなるエピジェネティック（ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃ）サイレンシング抵抗性プロモーター）により発現される（図３Ｆ）。

【0067】

ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９をコードする核酸構築物を含有するアルファレトロウイルスベースの粒子ａ．Ｇａｇ．ＭＳ２による、Ｔｅｔ２認識部位を伴うレポーターカセットを含有するヒトＨＴ１０８０線維芽細胞（図３Ｅ）およびヒトｉＰＳＣ（図３Ｆ）におけるレポーター遺伝子ＲＦＰ６５７の優れたノックアウト活性、またはＪｕｒｋａｔ細胞における内因性ＣＸＣＲ４標的遺伝子の優れたノックアウト活性（例３、図４）が、他の点では同様のガンマレトロウイルスベースの粒子と比較して見出された。標的細胞におけるＲＦＰ６５７．Ｔｅｔ２のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介性ノックアウトの成功は、ＲＦＰ６５７発現の喪失によって示される。

【0068】

例３：内因性遺伝子を操作するためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ＲＮＡを送達するアルファレトロウイルスベースのＧａｇ．ＭＳ２粒子のパッケージングおよび性能
内因性遺伝子の一例として、ヒトＣＸＣＲ４遺伝子を、本発明によるアルファレトロウイルスベースのＧａｇ．ＭＳ２粒子によって標的化した。アルファおよびガンマレトロウイルスベースのＧａｇ．ＭＳ２粒子に、配列番号１０のプロトスペーサー配列を含むｓｇＲＮＡを含有する内因性ヒトＣＸＣＲ４標的化ｓｇＲＮＡ．ＴＳ転写産物をパッケージングした。マウスＴｒｐ５３遺伝子（配列番号８に示される対応するプロトスペーサー）に対して方向付けられたｓｇＲＮＡ．ＴＳ転写産物を含有する各々の粒子を、非標的化陰性対照として使用した。図４Ａおよび４Ｂの結果は、アルファレトロウイルスベースの粒子は、ガンマレトロウイルスベースの粒子よりも天然の内因性ＣＸＣＲ４標的遺伝子を操作することにおいてもまたより有効であることを示す。興味深いことに、ａ．Ｇａｇ．ＭＳ２粒子は、レンチウイルス組込みＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９オールインワンベクター対照（ＬＩＴ．ＣＸＣＲ４）よりも優れていた。

【0069】

図４Ａは、Ｊｕｒｋａｔ細胞における内因性ＣＸＣＲ４遺伝子のノックアウトの代表的なＦＡＣＳデータを示す。非形質導入細胞を偽（Ｍｏｃｋ）対照として使用した。アルファおよびガンマレトロウイルスベースのＧａｇ．ＭＳ２粒子に、ＣＸＣＲ４を標的化するｓｇＲＮＡ．ＴＳ転写産物をパッケージングした（ｇ．Ｇａｇ．ＭＳ２：ＣＸＣＲ４．ＴＳ．ａｄｊ；ａ．Ｇａｇ．ＭＳ２ ＣＸＣＲ４．ＴＳ．ｉｎｃ）。マウスＴｒｐ５３遺伝子に対して方向付けられた各々のｓｇＲＮＡ．ＴＳ転写産物を含有する粒子を、陰性対照として使用した。図４Ａの挿入図は、各々のｓｇＲＮＡ．ＴＳによって標的化される内因性ＣＸＣＲ４遺伝子のノックアウトは、ガンマレトロウイルスベースの粒子（ｇ．Ｇａｇ．ＭＳ２）によっては１５％のみであったが、本発明のアルファレトロウイルスベースの粒子（ａ．ＮＣ．ｐｒ．ＭＳ２）については９１％であったことを示す。図４Ｂは、アルファレトロウイルスベースの粒子による、このより高い率の、内因性ＣＸＣＲ４標的遺伝子の遺伝子操作をグラフで示す。

【0070】

例４：様々な初代ヒトおよびマウス細胞種における、内因性ヒト腫瘍サプレッサー遺伝子ＴＰ５３を標的化するアルファレトロウイルスベースのＧａｇ．ＭＳ２ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９粒子の性能（図５）
アルファレトロウイルスベースのＧａｇ．ＭＳ２粒子のタンパク質成分は、上記の例において説明された成分であった。各々のアルファレトロウイルスベースのＧａｇ．ＭＳ２粒子は、ＳｐＣａｓ９をコードするｍＲＮＡ、ならびに続いて２コピーのＴＳヘアピン（ＳｐＣａｓ９．ＴＳ）、任意にＰＲＥ、およびポリＡ尾部、ならびにヒトＴＰ５３遺伝子に特異的な別のｓｇＲＮＡ転写産物およびそのｓｇＲＮＡ骨格に組み込まれたＴＳヘアピン（ＴＳ．ｉｎｃ）を含有する。核酸構築物は、ＳｐＣａｓ９ヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡについて配列番号５、および配列番号３のＢｓｍＢＩスタッファーセクションを置換するプロトスペーサーについて配列番号９である。

【0071】

アルファレトロウイルスベースのＧａｇ．ＭＳ２粒子を、２９３Ｔプロデューサー細胞において産生し、粒子を含有する上清を、標的細胞に形質導入するために使用した。任意に、上清を超遠心分離によって濃縮した。上清を、ＳｐＣａｓ９．ＴＳ ｍＲＮＡの濃度についてｑＲＴ ＰＣＲによって解析し、図面に示されるコピー数のｍＲＮＡを含有するアルファレトロウイルスベースのＧａｇ．ＭＳ２粒子上清の体積を、ヒトＮｕＦＦ（図５Ａ）、初代ヒト肝細胞（ＰＨＨ）（図５Ｂ）、ヒト臍帯血由来ＣＤ３４＋造血幹細胞・前駆細胞（ＣＤ３４＋ＨＳＰＣ）（図５Ｃ）またはマウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ；ＣＦ１もしくはＣ３Ｈマウスに由来する）（図５Ｄ）に形質導入するために使用した。適用したＳｐＣａｓ９．ＴＳ ｍＲＮＡ用量（コピー／細胞）を、Ｘ軸に示し、ここで、２ｘ４１５０（図５Ａを参照されたい）または２ｘ４８００（図５Ｄを参照されたい）は、２用量のアルファレトロウイルスベースのａ．Ｇａｇ．ＭＳ２粒子を示し、各々は、それぞれ、４１５０または４８００個のｍＲＮＡコピーを有する。Ｙ軸は、標的細胞のＴＰ５３遺伝子における欠失の百分率を示す。

【0072】

これらの結果は、アルファレトロウイルスベースのＧａｇ．ＭＳ２粒子は、ヒトおよびマウス初代細胞に有効に形質導入できること、およびコードされる遺伝子編集ヌクレアーゼ、例えばｓｇＲＮＡと組み合わせたＳｐＣａｓ９は、標的細胞ゲノムと有効に反応することを示す。さらに、これらの結果は、標的細胞に対するアルファレトロウイルスベースのＧａｇ．ＭＳ２粒子の活性は、用量依存的であることを示す。

【0073】

例５：標的細胞において２または３つの遺伝子／標的部位を同時編集するためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９をコードするアルファレトロウイルスベースのＧａｇ．ＭＳ２粒子の性能
この例は、本発明のアルファレトロウイルスベースのＧａｇ．ＭＳ２粒子は、細胞の２または３つの標的遺伝子を特異的に操作する、すなわち、遺伝学的に操作するかまたは同時編集することにおいて有効であることを示す。

【0074】

アルファレトロウイルスベースのＧａｇ．ＭＳ２粒子のタンパク質成分は、上記の例において説明された成分であり、上流でＴＳに連結されたＳｐＣａｓ９ ｍＲＮＡ（ＳｐＣａｓ９．ＴＳ、配列番号５）をコードするパッケージングされたｍＲＮＡ、および同時に標的細胞内の２つの遺伝子を編集するための核酸構築物を含有するアルファレトロウイルスベースのＧａｇ．ＭＳ２粒子の一実施形態としての、ヒトＣＸＣＲ４遺伝子に特異的なプロトスペーサー配列（配列番号１０）を含有する第１のｓｇＲＮＡ．ＴＳ．ｉｎｃ構築物と、マウスＴｅｔ２遺伝子に特異的なプロトスペーサー配列（配列番号７）を含有する第２のｓｇＲＮＡ．ＴＳ．ｉｎｃ構築物との組合せ（図６Ａ）を伴う。

【0075】

さらなる実施形態として、標的細胞内の３つの遺伝子／標的部位を同時編集するためのアルファレトロウイルスベースのＧａｇ．ＭＳ２粒子。ＳｐＣａｓ９．ＴＳ．ｍＲＮＡに加えて、ヒトＣＸＣＲ４遺伝子に特異的なプロトスペーサー配列（配列番号１０）を含有する第１のｓｇＲＮＡ．ＴＳ．ｉｎｃ構築物と、マウスＴｅｔ２遺伝子に特異的なプロトスペーサー配列（配列番号７）を含有する第２のｓｇＲＮＡ．ＴＳ．ｉｎｃ構築物と、ＥＧＦＰ遺伝子に特異的なプロトスペーサー（配列番号１１）をコードする第３のｓｇＲＮＡ．ＴＳ．ｉｎｃ構築物とを含有するアルファレトロウイルスベースの粒子を製造した。標的遺伝子のノックアウトに特異的なｓｇＲＮＡの代替としてもしくはこれに加えて、またはＳｐＣａｓ９．ＴＳ．ｍＲＮＡに加えて、さらなるＧＯＩをコードするｍＲＮＡを、アルファレトロウイルスベースの粒子によって導入することができる。

【0076】

各実施形態は、同じタンパク質成分、つまり、アルファレトロウイルスのドメインＭＡ、ｐ２、ｐ１０、ＣＡおよびＮＣによる、ＮＣへのリンカー（このリンカーはウイルスプロテアーゼ部位を含有し得る）を介して連結されるタンパク質、配列番号１から発現されるＭＳ２コートタンパク質二量体（２ｘＭＳ２ＣＰ）、および配列番号４から発現されるＶＳＶｇからなっていた。

【0077】

標的細胞は、ＣＸＣＲ４を内因的に発現し、ＥＧＦＰの発現カセットおよび／またはＲＦＰ６５７．Ｔｅｔ２レポーター遺伝子の発現カセットを含有する核酸構築物をレンチウイルスベクターによって形質導入した（Ｈｏｆｆｍａｎｎら（上記の引用による）、Ｈｅｃｋｌら（上記の引用による）、およびＫｎｏｐｐら（上記の引用による）に従って）Ｊｕｒｋａｔ細胞であった。

【0078】

図６Ａは、ＣＸＣＲ４に特異的なｓｇＲＮＡ．ＴＳ．ｉｎｃとＴｅｔ２に特異的なｓｇＲＮＡ．ＴＳ．ｉｎｃとの組合せの、コードｍＲＮＡ ＳｐＣａｓ９．ＴＳを含有するアルファレトロウイルスベースのＧａｇ．ＭＳ２粒子についての結果を示す。非形質導入／無処理細胞を、陰性対照（偽）として使用した。代表的なＦＡＣＳプロットは、ＣＸＣＲ４遺伝子およびＲＦＰ６５７．Ｔｅｔ２レポーター遺伝子の両方（ＣＸＣＲ４／Ｔｅｔ２）は、アルファレトロウイルスベースのＧａｇ．ＭＳ２ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９粒子によって有効にノックアウトされたことを示す。３回の生物学的反復のＦＡＣＳ結果を表す列は、細胞におけるノックアウト％の数を示し、細胞当たりの増加するＳｐＣａｓ９．ＴＳ ｍＲＮＡコピーとして表される、アルファレトロウイルスベースのＧａｇ．ＭＳ２粒子の用量依存性および正の相関、ならびに処理された培養物中の遺伝子編集された細胞の量を実証する。

【0079】

図６Ｂは、ヒトＣＸＣＲ４、マウスＴｅｔ２およびＥＧＦＰを標的化する、追加の３つのｓｇＲＮＡ．ＴＳ．ｉｎｃ転写産物との組合せの、遺伝子編集ヌクレアーゼＳｐＣａｓ９をコードするｍＲＮＡを含有するアルファレトロウイルスベースのＧａｇ．ＭＳ２粒子の形質導入後の、Ｊｕｒｋａｔ標的細胞のＦＡＣＳ結果を示す。非処理偽細胞を、陰性対照（偽）として使用し、示される代表的なＦＡＣＳプロットにおいて示される通り、非処理偽細胞は、すべての３つのレポーター遺伝子、すなわち、ＣＸＣＲ４、Ｔｅｔ２、ＥＧＦＰについて高く陽性であった。対照的に、アルファレトロウイルスベースのＧａｇ．ＭＳ２粒子を形質導入した標的細胞は、すべての３つの標的化レポーター遺伝子について有効なノックアウトを示した。ＣＸＣＲ４について６４％まで陰性である細胞は、ＲＦＰ６５７およびＥＧＦＰレポーター遺伝子について５８％の追加のノックアウトを示した。棒グラフは、標的細胞当たりのＳｐＣａｓ９．ＴＳ ｍＲＮＡコピーとして決定される、増加する量のアルファレトロウイルスベースのＧａｇ．ＭＳ２粒子は、ＳｐＣａｓ９およびすべての３つのｓｇＲＮＡ．ＴＳ．ｉｎｃ転写産物によって遺伝学的に操作された３重陰性標的細胞の増加する割合をもたらすことを示し、例えば、６８ ＳｐＣａｓ９．ＴＳ ｍＲＮＡコピー／細胞においておよそ２５％、および１７０ ＳｐＣａｓ９．ＴＳ ｍＲＮＡコピー／細胞においておよそ３０％であった。

【0080】

例６：アルファレトロウイルスベースの粒子による、細胞への自己増幅ＲＮＡの形質導入
さらなるＲＮＡの一実施形態として、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥ）に由来する自己増幅ＲＮＡレプリコンを、本発明のアルファレトロウイルスベースの粒子によって細胞へ導入した。この場合、ＧＯＩとしてＥＧＦＰを転移した。しかしながら、転移されるＲＮＡはまた、非コードＲＮＡ、例えば、ｍｉＲＮＡまたはｌｎｃＲＮＡであってもよい。

【0081】

図７Ａは、ＥＧＦＰを転移し、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥ）由来の自己増幅ＲＮＡレプリコンをコードする、アルファレトロウイルスベースのａ．Ｇａｇ．ＭＳ２粒子（ａ．ＮＣ．ｐｒ．ＭＳ２）の核酸構築物を模式的に示す。上部に、ＶＥＥ自己増幅ＲＮＡレプリコンの生成のための発現プラスミドを示す。ｎｓＰ１～４：ＶＥＥ非構造タンパク質；ＲＢＺ：ＨＤＶアンチゲノムリボザイム；ＶＥＥプロモーター：ＶＥＥサブゲノムプロモーター。図７Ｂは、ａ．ＮＣ．ｐｒ．ＭＳ２ベースのＶＥＥレプリコン粒子を形質導入したＨＴ１０８０細胞の代表的なＦＡＣＳプロットを示す。右側に、多数の生物学的反復の要約を示す。１００倍濃縮した上清の増加する量は、ＥＧＦＰ陽性細胞の百分率の増加をもたらした。

【0082】

これは、本発明のアルファレトロウイルスベースの粒子が、ここではＥＧＦＰのコードｍＲＮＡによって例示されるＧＯＩを含む自己増幅ＲＮＡレプリコンを含有し得ることを示す。

【0083】

例６：アルファレトロウイルスベースの粒子によるｉｎ ｖｉｖｏ形質導入
本発明のアルファレトロウイルス粒子に含有される目的の遺伝子の代表例として、アルファレトロウイルスベースのホタルルシフェラーゼをコードするａ．Ｇａｇ．ＭＳ２粒子（図１Ｂにおいて模式的に示される、ａ．ＮＣ．ｐｒ．ＭＳ２、およびＧＯＩとしてルシフェラーゼをコードするＧＯＩ．ＴＳ）であって、図１Ｆおよび１Ｇの結果に使用される粒子を、Ｂａｌｂ／Ｃマウスに、図８Ｄにおいて４ｘ１０^９ｍＲＮＡコピーにて、図８Ｆにおいて６ｘ１０^９ｍＲＮＡコピーにて脾臓内注射した。

【0084】

８時間後、ホタルルシフェラーゼ基質Ｄ－ルシフェリンを腹腔内投与し、マウスを生物発光画像化で調べた。際立ったことに、ＰＢＳのみで処置した対照マウスにおけるバックグラウンドシグナル（図８Ｅにおける色スケール上の０．１ｘ１０^７以下の放射輝度値）と比較して、ａ．Ｇａｇ．ＭＳ２粒子により処置したマウスについて、より強い肝臓特異的シグナルを検出することができた（より大きな領域およびより高い放射輝度、図８Ｄにおけるカラースケール上のおよそ０．１８ｘ１０^７～０．２５ｘ１０^７の値、ならびにさらにより大きな領域およびより高い放射輝度、図８Ｆにおけるカラースケール上のおよそ０．３ｘ１０^７～０．６ｘ１０^７の値）。さらに、シグナルの強さは、施用した粒子の用量と相関した。ルシフェリンのみで処置した、図８Ａ～Ｃの陰性対照は、生物発光を示さなかった。

【0085】

この例は、本発明のアルファレトロウイルス粒子は、哺乳動物への投与において、アルファレトロウイルス粒子に含有されるＲＮＡ構築物内にコードされる目的の遺伝子の発現をもたらすことを示す。

【図1A】

【図1B】

【図1C】

【図1D】

【図1E】

【図1F】

【図1G】

【図2A】

【図2B】

【図2C】

【図2D】

【図2E】

【図3A】

【図3B】

【図3C】

【図3D】

【図3E】

【図3F】

【図4A】

【図4B】

【図5】

【図6A】

【図6B】

【図7A】

【図7B】

【図8】

【配列表】

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【国際調査報告】