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▶ インターベット インターナショナル ベー． フェー．の特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2025-01-09
(54)【発明の名称】リーシュマニア症に対するＤＮＡワクチン
(51)【国際特許分類】
C12N 15/12 20060101AFI20241226BHJP
C12N 15/31 20060101ALI20241226BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20241226BHJP
A61K 39/008 20060101ALI20241226BHJP
A61K 39/39 20060101ALI20241226BHJP
A61P 33/02 20060101ALI20241226BHJP
A61P 37/04 20060101ALI20241226BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20241226BHJP
【ＦＩ】
C12N15/12
C12N15/31
C12N15/63 Z
A61K39/008
A61K39/39
A61P33/02
A61P37/04
A61K48/00
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024537399
(86)(22)【出願日】2022-12-22
(85)【翻訳文提出日】2024-08-19
(86)【国際出願番号】 EP2022087392
(87)【国際公開番号】W WO2023118394
(87)【国際公開日】2023-06-29
(31)【優先権主張番号】21217516.0
(32)【優先日】2021-12-23
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】510000976
【氏名又は名称】インターベット インターナショナル ベー． フェー．
(74)【代理人】
【識別番号】100114188
【弁理士】
【氏名又は名称】小野 誠
(74)【代理人】
【識別番号】100119253
【弁理士】
【氏名又は名称】金山 賢教
(74)【代理人】
【識別番号】100124855
【弁理士】
【氏名又は名称】坪倉 道明
(74)【代理人】
【識別番号】100129713
【弁理士】
【氏名又は名称】重森 一輝
(74)【代理人】
【識別番号】100137213
【弁理士】
【氏名又は名称】安藤 健司
(74)【代理人】
【識別番号】100183519
【弁理士】
【氏名又は名称】櫻田 芳恵
(74)【代理人】
【識別番号】100196483
【弁理士】
【氏名又は名称】川嵜 洋祐
(74)【代理人】
【識別番号】100160255
【弁理士】
【氏名又は名称】市川 祐輔
(74)【代理人】
【識別番号】100216839
【弁理士】
【氏名又は名称】大石 敏幸
(74)【代理人】
【識別番号】100228980
【弁理士】
【氏名又は名称】副島 由加里
(74)【代理人】
【識別番号】100151448
【弁理士】
【氏名又は名称】青木 孝博
(74)【代理人】
【識別番号】100146318
【弁理士】
【氏名又は名称】岩瀬 吉和
(74)【代理人】
【識別番号】100127812
【弁理士】
【氏名又は名称】城山 康文
(72)【発明者】
【氏名】アラムニ・ゴンサルベス，ルシアナ
(72)【発明者】
【氏名】ヴェットラート，ルイス・フェルナンド
(72)【発明者】
【氏名】ボノミ・バルフィ，フランシスコ
(72)【発明者】
【氏名】ファッチョリ・ロペス，ヘレナ
(72)【発明者】
【氏名】ラベロ・エンリケス，マイカ
(72)【発明者】
【氏名】フェレイラ・レアル・デ・フレイタス，ジャンヌ
(72)【発明者】
【氏名】ローザ，シモーネ・クリスティーナ
【テーマコード（参考）】
4C084
4C085
【Ｆターム（参考）】
4C084AA13
4C084NA10
4C084NA14
4C084ZB091
4C084ZB092
4C084ZB371
4C084ZC611
4C085AA03
4C085AA38
4C085BA04
4C085BB11
4C085DD62
4C085EE01
4C085EE06
4C085FF18
4C085GG04
(57)【要約】
本発明は獣医学およびウイルス学の分野に関するものであり、リーシュマニア症に対するワクチンを提供する。特に、本発明は、（ｉ）熱ショックタンパク質（ｈｓｐ）６５をコードする核酸を含む第１発現カセットと、（ｉｉ）ＬＡＣＫ［活性化Ｃキナーゼの受容体のリーシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ）ホモログ］をコードする核酸を含む第２発現カセットとを含む単離されたポリヌクレオチドに関する。他の実施形態においては、本発明は、該ポリヌクレオチドを含むＤＮＡプラスミド、リーシュマニア症の治療における使用のためのＤＮＡワクチン、およびリーシュマニア症の感染に対して対象を免疫化する方法に関する。
【選択図】図１
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
（ｉ）熱ショックタンパク質（ｈｓｐ）６５またはその機能的断片をコードする核酸を含む第１発現カセット、および（ｉｉ）ＬＡＣＫ［活性化Ｃキナーゼの受容体のリーシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ）ホモログ］またはその免疫原性断片をコードする核酸を含む第２発現カセット
を含む単離されたポリヌクレオチド。
【請求項2】
ｈｓｐ６５が配列番号１のアミノ酸配列のアミノ酸４８～５８３を含む、またはそれに対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１記載のポリヌクレオチド。
【請求項3】
ＬＡＣＫが配列番号２のアミノ酸配列を含む、またはそれに対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１または２記載のポリヌクレオチド。
【請求項4】
ｈｓｐ６５およびＬＡＣＫをコードする核酸が、異なるプロモーターの制御下にある、前記請求項のいずれか１項記載のポリヌクレオチド。
【請求項5】
ｈｓｐ６５をコードする核酸がサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターの制御下にある、前記請求項のいずれか１項記載のポリヌクレオチド。
【請求項6】
ＬＡＣＫをコードする核酸がＥＦ１α－ＨＴＬＶプロモーターの制御下にある、前記請求項のいずれか１項記載のポリヌクレオチド。
【請求項7】
第２発現カセットが１以上のＣｐＧモチーフを更に含む、前記請求項のいずれか１項記載のポリヌクレオチド。
【請求項8】
請求項１～７のいずれか１項記載のポリヌクレオチドを含むＤＮＡプラスミド。
【請求項9】
ｈｓｐ６５およびＬＡＣＫまたはそれらの免疫原性断片の組換え発現のための、請求項１～７のいずれか１項記載のポリヌクレオチドの、または請求項８記載のＤＮＡプラスミドの使用。
【請求項10】
請求項１～７のいずれか１項記載のポリヌクレオチドを含む、または請求項８記載のＤＮＡプラスミドを含むＤＮＡワクチン。
【請求項11】
薬学的に許容される担体を更に含む、請求項１０記載のＤＮＡワクチン。
【請求項12】
非アジュバント化ワクチンである、請求項１０または１１記載のＤＮＡワクチン。
【請求項13】
アジュバントを含む、好ましくは、アジュバントがサポニンである、請求項１０または１１記載のＤＮＡワクチン。
【請求項14】
リーシュマニア症の感染に対する対象の防御における使用のための、好ましくは対象がイヌである、請求項１０～１３のいずれか１項記載のＤＮＡワクチン。
【請求項15】
感染がイヌリーシュマニア症によるものである、請求項１４記載の使用のためのＤＮＡワクチン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は獣医学および寄生虫学の分野に関するものであり、リーシュマニア症に対するワクチンを提供する。特に、本発明は、（ｉ）マイコバクテリア熱ショックタンパク質（ｈｓｐ）６５をコードする核酸を含む第１発現カセットと、（ｉｉ）ＬＡＣＫ［活性化Ｃキナーゼの受容体のリーシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ）ホモログ］をコードする核酸を含む第２発現カセットとを含む単離されたポリヌクレオチドに関する。他の実施形態においては、本発明は、該ポリヌクレオチドを含むＤＮＡプラスミド、リーシュマニア症の予防的治療における使用のためのＤＮＡワクチン、およびリーシュマニア症の感染に対して対象を免疫化する方法に関する。
【背景技術】
【0002】
発明の背景
リーシュマニア症は、リーシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ）属の寄生原虫によって引き起こされる疾患である。それは雌のサシチョウバエの刺咬によって伝染する。サシチョウバエの多数の種が存在し、それらのうちのごく一部がリーシュマニアの可能な媒介動物である。イヌは、臨床症状を伴う場合も伴わない場合も、サシチョウバエに対して感染性であり、リーシュマニア原虫を伝染させうる。
リーシュマニア症は、リーシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ）属の寄生原虫によって引き起こされる疾患である。それは雌のサシチョウバエの刺咬によって伝染する。サシチョウバエの多数の種が存在し、それらのうちのごく一部がリーシュマニアの可能な媒介動物である。イヌは、臨床症状を伴う場合も伴わない場合も、サシチョウバエに対して感染性であり、リーシュマニア原虫を伝染させうる。
【0003】
リーシュマニアの２３個を超える種が記載されており、それらのほとんどは人獣共通感染性である。家畜を冒す最も重要なリーシュマニア原虫はリーシュマニア・インファンタム（Ｌ．ｉｎｆａｎｔｕｍ）［ラテンアメリカにおいてはリーシュマニア・シャガシ（Ｌ．ｃｈａｇａｓｉ）としても公知である］である。イヌは、リーシュマニア・インファンタム（Ｌ．ｉｎｆａｎｔｕｍ）によって引き起こされるヒト内臓リーシュマニア症の主要保有宿主であり、該疾患はイヌおよびヒトにおいて潜在的に致命的である。イヌの内臓および皮膚が冒されるため、該イヌ疾患は内臓皮膚（ｖｉｓｃｅｒｏｃｕｔａｎｅｏｕｓ）リーシュマニア症またはイヌリーシュマニア症と称される。ネコ、ウマまたは他の哺乳動物はリーシュマニア・インファンタム（Ｌ．ｉｎｆａｎｔｕｍ）または他のリーシュマニア属種（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｓｐｅｃｉｅｓ）に感染しうる。外皮（ｔｅｇｕｍｅｎｔａｒｙ）イヌリーシュマニア症の原因であるリーシュマニア・ブラジリエンシス（Ｌ．ｂｒａｚｉｌｉｅｎｓｉｓ）は南米の地域に広く分布している。
【0004】
イヌリーシュマニア症は、８９を超える国々で流行している主要な人獣共通感染症である。それはヨーロッパ、アフリカ、アジアおよび中南米において蔓延しており、米国においてはイヌからイヌへと垂直感染している。それはまた、外国から持ち込まれる疾患が獣医学上および公衆衛生上の問題となっている非流行国においても懸念されている。イヌリーシュマニア症は、非常に多種多様な免疫応答および臨床症状を示す多臓器疾患である。流行地域においては、感染を有するイヌの分布率は、臨床疾患を示すイヌの分布率より遥かに高い。臨床疾患は、防御をもたらさない顕著な抗体応答を伴う。実際、免疫媒介性メカニズムがイヌリーシュマニア症の病理の多くに関与している。ほとんどの症候性のイヌにおいては、リーシュマニア感染による疾患の最初の徴候は最初の感染の約２～４か月後に現れる。症状には、皮膚のただれ、皮膚の剥離、潰瘍、体重減少、脱毛、結膜炎、失明、鼻水、筋萎縮、炎症、腫脹および臓器不全（軽度の心臓発作を含む）が含まれうる。
【0005】
罹患個体の診断および治療は特に複雑であり、このことは流行地域における感染制御を妨げている。イヌリーシュマニア症の治療に使用される主な化学療法プロトコルはＮ－メチルグルカミンアンチモニアートを含む。治療は、しばしば、病原体を消失させる治療をもたらさない。治療を受けたイヌは感染のキャリアのままとなる可能性があり、再発しうる。それらはサシチョウバエに対して感染性のままとなりうる。
【0006】
イヌリーシュマニア症を予防するための方法は局所殺虫剤の使用、予防的免疫療法およびワクチン接種を含む。２００４年以降に、イヌリーシュマニア症に対する４つのワクチン、すなわち、ブラジルにおける２つ［Ｌｅｉｓｈｍｕｎｅ（登録商標）（その製造および販売の認可は２０１４年に取り消された）およびＬｅｉｓｈ－Ｔｅｃ（登録商標）］およびヨーロッパにおける２つ［ＣａｎｉＬｅｉｓｈ（登録商標）およびＬｅｔｉＦｅｎｄ（登録商標）］が認可されている。Ｌｅｉｓｈ－Ｔｅｃ（登録商標）は、イヌ内臓リーシュマニア症（ＣＶＬ）に対する、リーシュマニアＡ２抗原に基づく組換えワクチンである。数年間の販売の後、ワクチンの有効性および効果、ワクチン接種されたおよび感染した動物の潜在的感染性、またはリーシュマニア・インファンタム（Ｌ．ｉｎｆａｎｔｕｍ）の血清学的診断におけるワクチン誘導抗体の干渉に関する疑念が残っている。
【0007】
したがって、リーシュマニア症に対するワクチン接種による予防的治療が緊急に必要とされている。
【0008】
リーシュマニア症に対する予防ワクチン候補に関する研究が近年進展しており、幾つかのワクチン接種方法および幾つかの抗原が試験された。種々の不活化または弱毒化された寄生虫に基づく第１世代ワクチン、抗原タンパク質または組換えタンパク質に基づく第２世代ワクチン、および異種初回抗原刺激－追加抗原刺激リーシュマニアワクチンを含む抗原コード化ＤＮＡプラスミドに由来する第３世代ワクチンが、リーシュマニア症の制御および予防のために試験されている。ＣＤ４＋ Ｔリンパ球およびＣＤ８＋ Ｔリンパ球が、内臓リーシュマニア症の防御および治癒をもたらすのに重要な役割を果たすことが、明らかになっている。裸ＤＮＡでの免疫化（ＤＮＡワクチン接種）は、ＣＤ４＋ 媒介性応答およびＣＤ８＋ 媒介性応答の両方を促進する、そして感染に対する防御応答の誘導に役立つ新規アプローチである。
【0009】
伴侶動物と食用動物との両方における商業的使用に関して多数のＤＮＡワクチンが既に承認されている。その作用メカニズムはＤＮＡワクチンをリーシュマニア症の制御に魅力的なものとする。過去数年間、研究はＧＰ６３、ＣＰ、ＴＳＡ、ＧＰ６４、ＬｍＳＴＩ１、ＬｅＩｆおよびＰ８、ｐ４およびＬＡＣＫのような幾つかの抗原に焦点を合わせている（Ｊａｉｎ ＫおよびＪａｉｎ ＮＫ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，４２２（２０１５））。ＬＡＣＫ（活性化Ｃキナーゼの受容体のリーシュマニアホモログ）は、サイトゾルおよび膜の外表面に局在する３６ｋＤａのタンパク質である。それは寄生虫のプロマスチゴート形態（前鞭毛型）とアマスチゴート形態（無鞭毛型）との両方において発現される。リーシュマニア属種の宿主－遺伝子相互作用に関与する遺伝子が特定され、Ｐｅａｃｏｃｋら，Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ．，２００７において報告されている。
【0010】
マイコバクテリアＨＳＰ、主としてＨｓｐ６５およびＨｓｐ７０は、免疫系の自然免疫と適応免疫（細胞性および体液性）との両方を調節することが公知である。６５ｋＤａの熱ショックタンパク質（ｈｓｐ６５）としてマイコバクテリア抗原をコードするＤＮＡ構築物は有意な防御免疫を誘導することが示されている。マイコバクテリアｈｓｐ６５を含有するＤＮＡワクチン（ＤＮＡｈｓｐ６５）が最近開発された。ＤＮＡｈｓｐ６５は種々の疾患に対して広範な免疫療法特性を示すことが示された（Ｓｉｌｖａ ＣＬ，Ｍａｌａｒｄｏ ＴおよびＴａｈｙｒａ ＡＳＣ，Ｆｒｏｎｔ．Ｍｅｄ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．２：６０３－６９０（２０２０））。
【発明の概要】
【0011】
発明の概括
本発明において、驚くべきことに、ｈｓｐ６５とＬＡＣＫ（活性化Ｃキナーゼの受容体のリーシュマニアホモログ）とを含むＤＮＡワクチンを使用する６５ｋＤａ熱ショックタンパク質ｈｓｐ６５およびＬＡＣＫでのワクチン接種が、有効な免疫応答および寄生虫量の低減を達成することが判明した。この知見は特に驚くべきものである。なぜなら、ＬＡＣＫ抗原によって誘導される免疫応答は実験的リーシュマニア感染に対する防御をもたらさないことが当技術分野において最近示されていたからである（Ｃｏｅｌｈｏら，Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，７１（７），２００３）。
本発明において、驚くべきことに、ｈｓｐ６５とＬＡＣＫ（活性化Ｃキナーゼの受容体のリーシュマニアホモログ）とを含むＤＮＡワクチンを使用する６５ｋＤａ熱ショックタンパク質ｈｓｐ６５およびＬＡＣＫでのワクチン接種が、有効な免疫応答および寄生虫量の低減を達成することが判明した。この知見は特に驚くべきものである。なぜなら、ＬＡＣＫ抗原によって誘導される免疫応答は実験的リーシュマニア感染に対する防御をもたらさないことが当技術分野において最近示されていたからである（Ｃｏｅｌｈｏら，Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，７１（７），２００３）。
【0012】
したがって、第１の態様においては、本発明は、（ｉ）熱ショックタンパク質（ｈｓｐ）６５またはその機能的断片をコードする核酸を含む第１発現カセットと、（ｉｉ）ＬＡＣＫ（活性化Ｃキナーゼの受容体のリーシュマニアホモログ）またはその免疫原性断片をコードする核酸を含む第２発現カセットとを含む単離されたポリヌクレオチドを提供する。
【0013】
第２の態様においては、本発明は、本明細書に記載されているポリヌクレオチドを含むＤＮＡプラスミドを提供する。
【0014】
第３の態様においては、本発明は、本明細書に記載されているポリヌクレオチドを含むＤＮＡワクチンを提供する。
【0015】
第４の態様においては、ＤＮＡワクチンはリーシュマニア症の感染に対する対象の防御において使用される。
【0016】
第５の態様においては、本明細書に記載されているＤＮＡワクチンの免疫遺伝学的に有効な量を対象に投与することを含む、リーシュマニア症の感染に対して対象を免疫化する方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【0017】
【図1】ＤＮＡＨＳＰ－ＬＡＣＫ： ｈｓｐ６５およびＬＡＣＫ遺伝子を含有する実施例１に記載されているプラスミドＤＮＡベクターの概略図。
【図2】マウスモデルにおける、生理食塩水に再懸濁されたワクチンおよび組合せの免疫原性および有効性の評価のための実験設計。
【図3A】実施例３における免疫原性および有効性の結果からの代表的グラフ。３Ａ － ＩＦＮ－γ応答、３Ｂ － 限界希釈アッセイによる肝臓における寄生虫量。
【図3B】実施例３における免疫原性および有効性の結果からの代表的グラフ。３Ａ － ＩＦＮ－γ応答、３Ｂ － 限界希釈アッセイによる肝臓における寄生虫量。
【図4A】実施例４におけるリンパ節におけるｑＰＣＲによる寄生虫量の代表的グラフ：４Ａ － チャレンジの４３日後、４Ｂ － チャレンジの１９０日後、４Ｃ － チャレンジの３０２日後。
【図4B】実施例４におけるリンパ節におけるｑＰＣＲによる寄生虫量の代表的グラフ：４Ａ － チャレンジの４３日後、４Ｂ － チャレンジの１９０日後、４Ｃ － チャレンジの３０２日後。
【図4C】実施例４におけるリンパ節におけるｑＰＣＲによる寄生虫量の代表的グラフ：４Ａ － チャレンジの４３日後、４Ｂ － チャレンジの１９０日後、４Ｃ － チャレンジの３０２日後。
【図5A】実施例４における骨髄におけるｑＰＣＲによる寄生虫量の代表的グラフ：５Ａ － チャレンジの４３日後、５Ｂ － チャレンジの１９０日後、５Ｃ － チャレンジの３０２日後。
【図5B】実施例４における骨髄におけるｑＰＣＲによる寄生虫量の代表的グラフ：５Ａ － チャレンジの４３日後、５Ｂ － チャレンジの１９０日後、５Ｃ － チャレンジの３０２日後。
【図5C】実施例４における骨髄におけるｑＰＣＲによる寄生虫量の代表的グラフ：５Ａ － チャレンジの４３日後、５Ｂ － チャレンジの１９０日後、５Ｃ － チャレンジの３０２日後。
【0018】
用語の定義
「核酸（配列）」または「ポリ核酸（配列）」なる語はＲＮＡまたはＤＮＡ配列を含む。それは一本鎖または二本鎖でありうる。それは、例えば、ゲノム、組換え、ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡでありうる。本発明においては、ポリ核酸は典型的には二本鎖ＤＮＡである。
「核酸（配列）」または「ポリ核酸（配列）」なる語はＲＮＡまたはＤＮＡ配列を含む。それは一本鎖または二本鎖でありうる。それは、例えば、ゲノム、組換え、ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡでありうる。本発明においては、ポリ核酸は典型的には二本鎖ＤＮＡである。
【0019】
「単離された」なる語は、意図的な行為または人間の介入によって、例えば生化学的精製のためのインビトロ操作によって、その天然環境から単離されたものと解釈されるべきである。
【0020】
典型的には、タンパク質（ここでは、本発明による抗原ｈｓｐ６５またはＬＡＣＫ）をコードする「（ポリ）核酸」または「（ポリ）核酸分子」または「遺伝子」はオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）であり、これは、タンパク質への翻訳を途中で終了させる望ましくない終止コドンが存在しないことを示す。本発明では、核酸分子は、典型的には、ｈｓｐ６５またはＬＡＣＫの完全なアミノ酸配列をコードする。あるいは、「核酸」または「核酸分子」は、対応する１以上の機能的断片（ｈｓｐ６５）または免疫原性断片（ＬＡＣＫ）の組換え発現のために、ｈｓｐ６５またはＬＡＣＫタンパク質の１以上の部分のみ、特にエピトープ領域のみをコードしうる。
【0021】
本発明では、本発明による核酸分子の厳密なヌクレオチド配列は重要ではない。ただし、ヌクレオチド配列は所望のアミノ酸配列（ここでは、所望のｈｓｐ６５およびＬＡＣＫタンパク質）の発現を可能にするものでなければならない。しかし、当技術分野でよく知られているとおり、「遺伝暗号の縮重」により、異なる核酸が同一タンパク質をコードしうる。
【0022】
本発明では、核酸分子はＤＮＡまたはＲＮＡ分子でありうるが、典型的にはＤＮＡである。これは、その単離に使用される原材料および意図される用途に左右される。種々の出発材料から１つのタイプまたはその他のタイプの分子を単離するための方法、および１つのタイプをその他のタイプに変換するための方法は、当業者によく知られている。
【0023】
本発明による「単離された（ポリ）核酸」は、それがＤＮＡ形態である場合、ＤＮＡプラスミドのようなベクターの環境（コンテキスト）において簡便に操作されうる。本発明による単離された（ポリ）核酸分子が本発明によるｈｓｐ６５およびＬＡＣＫを実際に発現することを可能にするためには、それは適切な発現制御シグナルおよび適切な環境を要し、これらは「発現カセット」の一部であり、それは、本明細書においては、関心のあるタンパク質（ＰＯＩ）の製造のためのＤＮＡプラスミドからの組換え遺伝子発現のような組換え遺伝子発現に必要な全要素を含む（ポリ）核酸として定義される。
【0024】
例えば、核酸分子は上流プロモーター要素に機能的に連結されている必要があり、コード配列の先頭に翻訳開始点を、コード配列の終結部に翻訳停止点を含有する必要がある。したがって、ｈｓｐ６５およびＬＡＣＫタンパク質の組換え発現用の発現カセットは、典型的には、機能的プロモーターの制御下にあるｈｓｐ６５またはＬＡＣＫ遺伝子を少なくとも含む。また、発現レベルを増加させるために、コード領域の上流および／または下流に翻訳エンハンサーが含まれることが可能であり、これも発現カセットの一部でありうる。典型的には、特定の発現系の環境において使用されるプラスミドおよびベクターがそのような要素およびエンハンサーを提供する。また、転写および翻訳のための生体分子機構は、典型的には、ワクチン接種を受けた対象の細胞によって提供される。種々の要素およびエンハンサーを修飾することによって、本発明による抗原の発現が、例えば時機、レベルおよび質において最適化可能であり、これらは全て、当業者の通常の能力の範囲内である。したがって、好ましい実施形態においては、本発明による単離された核酸分子は発現制御シグナルを更に含む。
【0025】
「翻訳エンハンサー」は、翻訳を促進することによってタンパク質の産生を増加させる要素を構成するヌクレオチド配列である。典型的には、翻訳エンハンサーはｍＲＮＡの５’および３’非翻訳領域（ＵＴＲ）に見出されうる。特に、関心のある遺伝子（ＧＯＩ）の開始ＡＴＧコドンの直上流の５’－ＵＴＲのヌクレオチドは翻訳開始のレベルに顕著な影響を及ぼしうる。
【0026】
「発現ベクター」（同義語「発現構築物」）は、細胞内での組換え遺伝子発現のために設計された、通常はプラスミド、典型的にはＤＮＡプラスミドである。ベクターは、特定の遺伝子を標的細胞内に導入するために使用され、遺伝子によってコードされる関心のあるタンパク質（ＰＯＩ）を生成させるために細胞のタンパク質合成メカニズムを使用しうる。ＰＯＩを生成させるために組換え遺伝子を発現させるためには、発現ベクターは、典型的には、少なくとも、ＧＯＩの発現を駆動するプロモーターを含み、ＰＯＩの収量を増加させるための１以上の翻訳エンハンサーを更に含みうる。
【0027】
本明細書中で用いる「ワクチン」なる語は、対象に投与されると、防御免疫応答を誘導または刺激する調製物を意味する。ワクチンは、特定の疾患に対して生物を免疫性にしうる。本発明の文脈においては、ワクチンはＤＮＡプラスミドであることが可能であり、またはＤＮＡプラスミドを含むことが可能であり、したがって「ＤＮＡワクチン」とも称され、それは、本明細書に記載されている適切な担体および／またはアジュバントを更に含有しうる。
【0028】
「ＤＮＡワクチン接種」は、病原体の抗原または免疫調節物質をコードするＤＮＡプラスミドによる、すなわち「ＤＮＡワクチン」による免疫化を含む。
【0029】
「ＤＮＡワクチン」は、特定の抗原コード化ＤＮＡ配列を、免疫化される種の細胞上に導入するタイプのワクチンである。ＤＮＡワクチンは、免疫応答の対象となる抗原をコードするＤＮＡ配列を含有する遺伝的に操作されたプラスミドを注入することによって働き、したがって、細胞は抗原を直接的に生成して、防御免疫応答を引き起こす。ＧＯＩは、適切な遺伝的要素、例えば転写制御用の真核生物プロモーター、安定で有効な翻訳のためのポリアデニル化シグナル配列および細菌の複製起点と共に、ＤＮＡプラスミド内に挿入される。プラスミドは、例えば直接注入、または適切な送達系による注入によって宿主細胞内にトランスフェクトされる。次いでＧＯＩは宿主細胞機構による転写および翻訳に付されて、自然免疫応答および適応免疫応答（細胞性および体液性）を誘導しうる抗原タンパク質を生成する。
【0030】
ＤＮＡワクチンは、獣医学において特に関心が持たれる他のワクチン接種技術と比較して多数の利点を有する。それは他の市販ワクチンほどは高価にならない可能性がある。なぜなら、それは細菌によって大量に製造可能であり、典型的には、高い生物安全性レベルの高価な施設を要しないからである。それは温度に対して安定であり、安全に輸送でき、これらのことは、遠隔地に位置する農場にとって、または屋外で長期間放置されることを要する野生動物ワクチンにとって重要である。異なる遺伝子が同時に組合されることが可能であり、このことは、病原体の複数の株に対するワクチンの開発、および複数の病原体に対する組合せアプローチを可能にする。また、関連タンパク質が細胞内で産生され提示されるため、細胞性免疫応答と体液性免疫応答との両方が誘導され、このことは、後の時点で動物が自然感染に遭遇した際に、より効率的な免疫応答をもたらす。
【0031】
ＤＮＡワクチンは、免疫応答およびタンパク質分布を改変しうる幾つかの経路および技術によって投与されうる。典型的には、ＤＮＡワクチンは皮下注射または筋肉内注射によって投与される。
【0032】
したがって、本発明の文脈において、「ＤＮＡワクチン」なる語は、免疫調節因子ｈｓｐ６５および抗原ＬＡＣＫの核酸配列をコードするＤＮＡ配列を意味し、これらは、免疫応答を誘導するように、ワクチン接種を受けた対象において組換え発現される。
【0033】
「リーシュマニア感染に対して動物を防御する」は、一般に、リーシュマニアによる病原性感染の予防、改善または治癒を助けること、あるいはその感染から生じる障害の予防、改善または治癒を助けること、例えば、処置後（すなわち、ワクチン接種後）のリーシュマニア感染から生じる１以上の臨床徴候を予防または軽減することを意味する。本発明におけるワクチン接種によって軽減されうる典型的な臨床徴候には、皮膚のただれ、皮膚の剥離、潰瘍、体重減少、脱毛、結膜炎、失明、鼻水、筋萎縮、炎症、腫脹および臓器不全（軽度の心臓発作を含む）の１以上が含まれうる。
【0034】
特に、本発明のワクチンは対象における抗体および細胞性免疫応答の達成を助け、これはリーシュマニア感染後の寄生虫量の減少、および該疾患の臨床徴候の軽減または予防をもたらす。好ましい実施形態においては、本発明のワクチンはリーシュマニア感染の予防または改善に使用される。この実施形態においては、本発明のワクチンによるワクチン接種は感染後の臨床徴候の１以上の軽減および寄生虫量の減少を達成する。最も好ましくは、ワクチン接種はリーシュマニア感染の予防を達成する。
【0035】
「予防」または「予防する」なる語は予防的処置によるリーシュマニア感染の回避、遅延、阻止または妨害を意味すると意図される。ワクチンは、例えば、感染性リーシュマニアが対象に侵入することを予防し、またはその可能性を減少させうる。
【0036】
実施形態の詳細な説明
ポリ核酸およびＤＮＡプラスミド
第１の態様のポリヌクレオチド（または同義語としての核酸）は、典型的には、例えば環状ＤＮＡプラスミドのようなＤＮＡプラスミド（以下、ＤＮＡベクターまたは単にベクターとも称される）の形態であり、またはＤＮＡプラスミドの一部である。したがって、もう１つの態様においては、本発明は、本明細書に記載されているポリヌクレオチドを含むＤＮＡプラスミドを提供する。
ポリ核酸およびＤＮＡプラスミド
第１の態様のポリヌクレオチド（または同義語としての核酸）は、典型的には、例えば環状ＤＮＡプラスミドのようなＤＮＡプラスミド（以下、ＤＮＡベクターまたは単にベクターとも称される）の形態であり、またはＤＮＡプラスミドの一部である。したがって、もう１つの態様においては、本発明は、本明細書に記載されているポリヌクレオチドを含むＤＮＡプラスミドを提供する。
【0037】
本発明のポリヌクレオチドは、マイコバクテリアの熱ショックタンパク質ｈｓｐ６５およびリーシュマニアのＬＡＣＫタンパク質をコードする遺伝子の組換え発現のための少なくとも２つの発現カセットを含む。
【0038】
図１は、本発明によるＤＮＡプラスミド（ＤＮＡＨＳＰ－ＬＡＣＫ）の構築物の一例を示し、これは、本明細書に記載されている２つの発現カセット、すなわち、１つは免疫調節因子（ｈｓｐ６５）の発現用のもの、もう１つは抗原（ＬＡＣＫ）の発現用のものを含む。
【0039】
第１発現カセット（ｉ）は、熱ショックタンパク質（ｈｓｐ）６５またはその免疫原性断片をコードする核酸を含む。
【0040】
本明細書中で用いるＨｓｐ６５は、リーシュマニア症を含む、異なるＴｈ１／Ｔｈ２免疫応答パターンを有する幾つかの疾患の実験モデルにおいて、免疫応答をモジュレーションおよび／または調節する能力を既に示しているマイコバクテリアｈｓｐ６５遺伝子を意味する（Ｓｉｌｖａ ＣＬ，Ｍａｌａｒｄｏ ＴおよびＴａｈｙｒａ ＡＳＣ，Ｆｒｏｎｔ．Ｍｅｄ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．２：６０３６９０（２０２０））。したがって、本発明のポリヌクレオチド構築物においては、マイコバクテリアの熱ショックタンパク質ｈｓｐ６５は免疫調節因子として機能する。
【0041】
ｈｓｐ６５のアミノ酸配列は配列番号１によって表示可能であり、これは、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＡ２５３５４．１に由来するマイコバクテリア株マイコバクテリウム・レプラエ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｅｐｒａｅ）のｈｓｐ６５のアミノ酸配列を指し、これは、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｍ１４３４１．１（Ｍ．ｌｅｐｒａｅ ６５ｋｄ抗原）として提供される核酸配列によってコードされうる。本発明には、免疫調節効果を達成するのに必須の該タンパク質の関連部分を含有する、ｈｓｐ６５タンパク質の機能的断片も含まれる。特に、配列番号１のアミノ酸４８～５８３を含む機能的断片が好ましく使用される。なぜなら、配列番号１のアミノ酸１～４７は、ｈｓｐ６５タンパク質のコード化および発現に関連していないからである。
【0042】
マイコバクテリア株間の自然配列変異のため、本発明は、タンパク質の保存領域内で配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するｈｓｐ６５アミノ酸配列またはその機能的断片をも包含し、これは、好ましくは、配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の配列同一性を有し、最も好ましくは、配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有し、例えば、Ｇｅｎｅ Ｂａｎｋアクセッション番号ＡＡＡ２５３５４．１のアミノ酸配列またはその機能的断片に対して９１％、９２％、９３％、９４％または９５％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する。
【0043】
第２発現カセット（ｉｉ）は、ＬＡＣＫタンパク質またはその免疫原性断片をコードする核酸を含む。
【0044】
本明細書において言及されるＬＡＣＫ（活性化Ｃキナーゼ受容体のリーシュマニアホモログ）は３６ｋＤａのタンパク質であり、これはリーシュマニア・インファンタム（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｉｎｆａｎｔｕｍ）のサイトゾルおよび外膜表面に天然に存在するタンパク質であり、寄生虫のプロマスチゴート形態（前鞭毛型）とアマスチゴート形態（無鞭毛型）との両方において発現される。本発明のワクチンにおいては、ＬＡＣＫは本発明のポリヌクレオチドから発現され、ワクチン接種を受けた対象においてＬＡＣＫタンパク質に対する免疫応答を達成するための抗原として機能する。したがって、本発明のポリヌクレオチド構築物においては、リーシュマニアのＬＡＣＫタンパク質は、免疫応答を誘導するための抗原として機能する。
【0045】
ＬＡＣＫのアミノ酸配列は配列番号２によって表示可能であり、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＬＰ７３４２７．１のアミノ酸配列を指し、これは、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＫＴ１８４３１７．１［リーシュマニア・インファンタム（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｉｎｆａｎｔｕｍ）株ＭＨＯＭ／ＴＲ／２００９／ＥＰ１７４活性化タンパク質キナーゼＣ受容体（ＬＡＣＫ）遺伝子］として提供される核酸配列によってコードされうる。本発明にはまた、抗原結合に影響を及ぼし、ワクチン接種を受けた対象において免疫原性応答を達成するための関連エピトープを含有するＬＡＣＫタンパク質の免疫原性断片も含まれる。
【0046】
リーシュマニア株間の自然配列変異のため、本発明はまた、配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する、好ましくは、配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の配列同一性を有する、最も好ましくは、配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する、例えば、Ｇｅｎｅ Ｂａｎｋアクセッション番号ＡＬＰ７３４２７．１のアミノ酸配列に対して９１％、９２％、９３％、９４％または９５％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有するＬＡＣＫアミノ酸配列またはその免疫原性断片をも含む。
【0047】
Ｈｓｐ６５およびＬＡＣＫは共に、ワクチン接種を受けた対象における該タンパク質の組換え発現に適した同一または個別のプロモーターの制御下で発現されうる。典型的には、ｈｓｐ６５およびＬＡＣＫは個別のプロモーターの制御下で発現される。ｈｓｐ６５およびＬＡＣＫの組換え発現に使用されうる適切なプロモーターは当技術分野でよく知られており、例えば、Ｐｏｕｌａｉｎ Ａ．ら，Ｊ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１７ ２５５：１６－２７；Ｋｉｍ ＳＹら，Ｊ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００２；９３（２）：１８３－７；Ｊ．Ｒ．Ｄｅｅｒ，Ｄ．Ｓ．Ａｌｌｉｓｏｎ，Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ２００４，２０（３）：８８０－８８９；Ｒ．Ｖ．Ｇｏｐａｌｋｒｉｓｈｎａｎら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９９ ２７（２４）：４７７５－４７８２；Ｗａｎｇ Ｘ．ら，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ：Ｍｅｄ．２０１７ ２１（１１）：３０４４－３０５４に記載されており、これらの文献に記載されているプロモーターの全体を参照により本明細書に組み入れることとする。
【0048】
本発明のワクチンの構築には、ＥＦ１α／ＨＴＬＶと称されるプロモーターが好ましく使用される。このプロモーターは、組換え遺伝子発現のための遺伝子の挿入に使用されうるＮｏｔＩおよびＥｃｏＲＩ制限部位を含む。ＥＦ１α－ＨＴＬＶプロモーターは、ヒト伸長因子１α（ＥＦ－１α）コアプロモーターとヒトＴ細胞白血病ウイルス（ＨＴＬＶ）１型長末端反復のＲセグメントおよびＵ５配列の一部（Ｒ－Ｕ５’）とを含む複合プロモーターである。ＥＦ－１αプロモーターは強力な活性を示し、インビボでのトランスジーンの長期持続発現をもたらす。Ｒ－Ｕ５’は、ＲＮＡの安定性を増強するためにＥＦ－１αコアプロモーターに結合している（Ｋｉｍ ＳＹら，Ｊ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００２；９３（２）：１８３－７）。
【0049】
したがって、好ましい実施形態においては、ｈｓｐ６５はサイトメガロウイルスＣＭＶプロモーターの制御下で発現され、ＬＡＣＫはＥＦ１α／ＨＴＬＶプロモーターの制御下で発現される。
【0050】
また、発現カセットは、発現エンハンサーまたは他のシス作用要素を含む、ｈｓｐ６５および／またはＬＡＣＫの発現を調節または増強するために使用される１以上の要素を含有しうる。
【0051】
好ましい実施形態においては、発現カセットは１以上のＣｐＧモチーフを含有する。プラスミド骨格におけるＣｐＧ配列はＤＮＡワクチンにおいて重要なアジュバントの役割を果たす。これらの配列は同一ＤＮＡ鎖上の非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドのペアに相当する。例えば、プラスミド系の免疫原性を増強するために、１～１０個、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個、好ましくは２～６個、例えば３、４または５個、最も好ましくは４個のＣｐＧモチーフが付加されることが可能であり、典型的には、一方または両方の発現カセットのＳＶ４０ポリアデニル化部位の後に存在する。特に好ましい実施形態においては、ＬＡＣＫ発現をもたらす発現カセットは４個のＣｐＧモチーフを含む。
【0052】
もう１つの態様においては、本明細書に記載されているポリヌクレオチドまたはＤＮＡプラスミドはｈｓｐ６５およびＬＡＣＫまたはその免疫原性断片の組換え発現に使用され、これらはリーシュマニア感染に対する防御のためのワクチンにおける組換えタンパク質として使用されうる。
【0053】
もう１つの態様においては、本発明は、リーシュマニア感染の予防のための医薬組成物または医薬の製造における使用のための、マイコバクテリアの熱ショックタンパク質ｈｓｐ６５遺伝子とリーシュマニアのＬＡＣＫ遺伝子とを含有するＤＮＡ構築物、例えばＤＮＡプラスミドを提供する。
【0054】
もう１つの態様においては、本発明は、本明細書に記載されているポリヌクレオチドまたはＤＮＡプラスミドを含むＤＮＡワクチンを提供する。
【0055】
担体およびアジュバント
もう１つの態様においては、本発明は、薬学的に許容される担体および／またはアジュバントを更に含む、本明細書に記載されているＤＮＡワクチンを提供する。
もう１つの態様においては、本発明は、薬学的に許容される担体および／またはアジュバントを更に含む、本明細書に記載されているＤＮＡワクチンを提供する。
【0056】
薬学的に許容される担体は当技術分野でよく知られている。単なる例示に過ぎないが、そのような担体は、滅菌水、生理食塩水またはバッファー溶液（緩衝液）、例えばＰＢＳのような単純なものでありうる。ワクチンは、単一の担体を、または２以上の担体の組合せを含みうる。好ましい実施形態においては、薬学的に許容される担体は水または生理食塩水であり、最も好ましくは生理食塩水である。
【0057】
本発明および／またはその実施形態によるワクチンおよびその使用または方法のための適切な担体は当技術分野でよく知られており、希釈剤、アジュバント、抗微生物剤、安定剤、保存剤、不活性化剤またはそれらの組合せを包含する。適切な希釈剤は蒸留水、塩、培地成分、滅菌水、バッファー、安定剤、保存剤、殺菌剤、抗生物質、および溶解を助ける化学物質を包含しうる。
【0058】
担体はＮａＣｌ、炭酸ナトリウム、チオメルサール、緩衝生理食塩水、スクロース、アジピン酸二ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム二水和物を包含しうる。
【0059】
ワクチンは、薬学的に許容される補助物質、例えばｐＨ調整剤および緩衝化剤、張度調整剤、湿潤剤など、例えば酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、ソルビタンモノラウラート、トリエタノールアミンオレアートなどを含有しうる。
【0060】
本発明によるワクチンにおける適切な賦形剤としては、加水分解ゼラチン、カゼイン、ソルビトールおよびリン酸二ナトリウム二水和物が挙げられる。
【0061】
安定剤は、例えば、ワクチンの貯蔵寿命を延長するために、または凍結乾燥効率を改善するために、または製品の外観を改善するために使用されうる。有用な安定剤としては、とりわけ、ＳＰＧＡ、炭水化物、例えばソルビトール、マンニトール、トレハロース、デンプン、糖、例えばスクロース、デキストラン、ラクトースまたはグルコース、アミノ酸、例えばグリシンおよびグルタミン酸一ナトリウム（アミノ酸の塩）、タンパク質、例えば（組換え）アルブミン、ゼラチン、加水分解コラーゲン、またはカゼインまたはその分解産物、およびバッファー、例えばリン酸アルカリ金属が挙げられる。
【0062】
もう１つの態様においては、本発明は、薬学的に許容される担体と本発明のワクチンとの液体組成物に関するものであり、ここで、担体は天然深共晶溶媒（ＮＡＤＥＳ）、好ましくは、約０．８未満の水分活性を有するものである。ＮＡＤＥＳ担体はＷＯ ２０１９／１２２３２９（その全体を参照により本明細書に組み入れることとする）に記載されている。
【0063】
更に、ワクチンはアジュバントを含有することが可能であり、あるいはアジュバントを含有していなくてもよい（非アジュバント化ワクチン）。アジュバントはそれらの成分の起源、それらの物理化学的特性またはそれらの作用メカニズムによって分類されうる。分子アジュバントは免疫刺激物質（例えば、免疫反応を刺激するＴＬＲリガンド、サイトカイン、サポニンおよび細菌外毒素）として作用し、免疫系に直接作用して、抗原に対する免疫応答を増強しうる。
【0064】
本発明のワクチンは、本発明のポリヌクレオチドから発現されてアジュバントとして作用する免疫刺激性タンパク質としてｈｓｐ６５を含んでいるため、本発明においては（追加的な）アジュバントの添加は必ずしも必要でない。しかし、ワクチン接種を受けた対象における増強したまたはより迅速な免疫応答をもたらすためには、更なるアジュバントの添加が望ましいかもしれない。
【0065】
適切には、本発明および／またはそのいずれかの実施形態によるワクチン組成物におけるアジュバントには、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、サポニン、コレステロールと複合体形成したサポニン、コレステロールおよび脂質と複合体形成したサポニン、非代謝性油、鉱物油および／または植物油／野菜油および／または動物油、ポリマー、カルボマー、界面活性剤、天然有機化合物、植物抽出物、炭水化物、コレステロール、脂質、油中水型エマルジョン、水中油型エマルジョン、水中油中水型エマルジョン、アクリル酸ポリマー、アクリル酸糖架橋ポリマー、アクリル酸ポリオール架橋ポリマーが含まれうる。
【0066】
適切には、本発明および／またはそのいずれかの実施形態によるワクチン組成物におけるアジュバントには、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、サポニン、Ｑｕｉｌ Ａ、ＱＳ－２１、ＧＰＩ－０１００、非代謝性油、鉱物油および／または植物油／野菜油および／または動物油、ポリマー、カルボマー、界面活性剤、天然有機化合物、植物抽出物、炭水化物、コレステロール、脂質、油中水型エマルジョン、水中油型エマルジョン、水中油中水型エマルジョン、ＨＲＡ－３（アクリル酸糖架橋ポリマー）、綿実油（ＣＳＯ）含有ＨＲＡ－３、またはＨＲＡ－５（アクリル酸ポリオール架橋ポリマー）、ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸが含まれうる。適切には、アジュバントはサポニン、アクリル酸ポリマーおよび／または水酸化アルミニウムである。適切には、サポニンはＱｕｉｌ Ａ、ＩＳＣＯＭ、ＱＳ２１、ＩＳＣＯＰＲＥＰ ７０３、ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ、ＡＳシリーズ、ＩＳＣＯＰＲＥＰサポニン、ＧＰＩ０１００、ＡｂＩＳＣＯ、マトリックス（Ｍａｔｒｉｘ）Ｍ、マトリックスＣ、Ｐｏｓｉｎｔｒｏである。適切には、アクリル酸ポリマーはＣａｒｂｏｐｏｌ、例えばＨＲＡ－３、ＨＲＡ－５、Ｃａｒｂｏｐｏｌ ９４０、Ｃａｒｂｏｐｏｌ ９４１、Ｃａｒｂｏｐｏｌ ９３４、Ｃａｒｂｏｐｏｌ ９７１、Ｈａｖｌｏｇｅｎ、ＣＡＲＢＩＧＥＮである。
【0067】
適切なアジュバントとしては、サポニンに基づくアジュバントであり、より適切には、キラヤサポニンに基づくアジュバントである。サポニンに基づく例としては、Ｑｕｉｌ Ａ、ＩＳＣＯＭ、ＱＳ２１、ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ、ＩＳＣＯＰＲＥＰ ７０３、ＡＳシリーズ、ＧＰＩ０１００、ＡｂＩＳＣＯ、Ｐｏｓｉｎｔｒｏが挙げられる。適切なアジュバントとしては、コレステロールと複合体形成したサポニンである。適切なコレステロール複合サポニンとしては、ＡＳ０１、ＡＳ１５、ＡＳ０２、ＩＳＣＯＭ、ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ、Ｍａｔｒｉｘ－Ｍ、ＡｂＩＳＣＯである。
【0068】
適切には、アジュバントは、最終製品の体積に対して、容量％として約０．０１～約５０％の濃度、または約２％～約４５％の濃度、または約５％～約４０％の濃度、または約７％～約３５％の濃度、または約１０％～約３０％の濃度である。適切には、アジュバントは約０．０１～約１０％の濃度、または約０．０２～約５％の濃度、または約０．０５～約２．５％の濃度、または約０．１～約２％の濃度、または約０．１５～約１．５％の濃度、または約０．２～約１．２％の濃度、または約０．３～約１％の濃度、または約０．４～約０．８％の濃度、または約０．５～約０．７％の濃度である。
【0069】
したがって、好ましくは、本発明によるワクチンは凍結乾燥形態であり、すなわち、凍結乾燥物として提供される。
【0070】
ワクチンは、別の活性物質、例えば、ＬＡＣＫ誘導性適応免疫応答の前に早期防御を刺激しうる活性物質を含むことが可能であり、またはそれを発現する能力を有しうる。活性物質はまた、ワクチン接種を受けた対象において別の疾患に対する免疫応答を誘導しうる別の抗原でありうる（混合ワクチン）。
【0071】
ワクチンおよびその製造
ｈｓｐ６５およびＬＡＣＫの組換え発現用の２つの発現カセット（ｉ）および（ｉｉ）を含む、本発明によるポリヌクレオチド分子を製造するためには、当業者に公知のインビトロ組換えＤＮＡ法が用いられうる。簡便には、これは、ＰＣＲ断片の作製およびサブクローニングによって、またはデノボ（ｄｅ ｎｏｖｏ）遺伝子合成技術によって行われうる。
ｈｓｐ６５およびＬＡＣＫの組換え発現用の２つの発現カセット（ｉ）および（ｉｉ）を含む、本発明によるポリヌクレオチド分子を製造するためには、当業者に公知のインビトロ組換えＤＮＡ法が用いられうる。簡便には、これは、ＰＣＲ断片の作製およびサブクローニングによって、またはデノボ（ｄｅ ｎｏｖｏ）遺伝子合成技術によって行われうる。
【0072】
あるいは、本発明によるポリヌクレオチド分子は、細胞に基づくインビトロ発現系によって製造されうる。なぜなら、これは収量および安全性の面での利点をもたらすからである。該発現系は原核細胞または真核細胞に基づくものであることが可能であり、真核細胞の場合には、酵母、哺乳類、昆虫または植物由来の宿主細胞に基づくことが可能であり、これらは全て、先行技術において記載されている。
【0073】
したがって、本発明は更に、ワクチンの製造において使用される前記のポリヌクレオチド、例えばＤＮＡプラスミドの製造に関する。特に、本発明のＤＮＡプラスミドは対象のワクチン接種に使用されうる。好ましくは、ＤＮＡプラスミドは、該ＤＮＡプラスミドと１以上の薬学的に許容される担体および／またはアジュバントとを含む組成物中に配合される。
【0074】
もう１つの態様においては、本発明は、リーシュマニア感染に対する対象の防御における使用のためのＤＮＡワクチンを提供する。対象は特に限定されず、動物またはヒトでありうる。好ましくは、対象はイヌであり、これは、イヌリーシュマニアに感染しやすい動物種である。したがって、本発明の実施形態の好ましい有用性は、特に、リーシュマニア症に対するイヌのワクチン接種のための、獣医学用途におけるものである。
【0075】
感染は、哺乳動物に感染する約３０種の公知リーシュマニア属種のうちの２０種以上によって引き起こされうる。本発明のワクチンは１以上のリーシュマニア属種に対する防御をもたらしうる。特に、ＬＡＣＫ領域はリーシュマニア属種間で保存されているため、本発明のワクチンは広範なリーシュマニア属種に対する広範な防御を達成しうる。したがって、好ましい実施形態においては、本発明のワクチンは以下のリーシュマニア属種による感染に対する防御をもたらす：３つの種［リーシュマニア・ドノバニ（Ｌ．ｄｏｎｏｖａｎｉ）、リーシュマニア・インファンタム（Ｌ．ｉｎｆａｎｔｕｍ）およびリーシュマニア・シャガシ（Ｌ．ｃｈａｇａｓｉ）］を含むリーシュマニア・ドノバニ（Ｌ．ｄｏｎｏｖａｎｉ）複合物；３つの主要種［リーシュマニア・メキシカーナ（Ｌ．ｍｅｘｉｃａｎａ）、リーシュマニア・アマゾネンシス（Ｌ．ａｍａｚｏｎｅｎｓｉｓ）およびリーシュマニア・ベネズエレンシス（Ｌ．ｖｅｎｅｚｕｅｌｅｎｓｉｓ）］を含むリーシュマニア・メキシカーナ（Ｌ．ｍｅｘｉｃａｎａ）複合物；リーシュマニア・トロピカ（Ｌ．ｔｒｏｐｉｃａ）；リーシュマニア・メジャー（Ｌ．ｍａｊｏｒ）；リーシュマニア・エチオピカ（Ｌ．ａｅｔｈｉｏｐｉｃａ）；および４つの主要種［リーシュマニア（Ｖ．）ブラジリエンシス（Ｌ．（Ｖ．）ｂｒａｚｉｌｉｅｎｓｉｓ）、リーシュマニア（Ｖ．）グヤネンシス（Ｌ．（Ｖ．）ｇｕｙａｎｅｎｓｉｓ）、リーシュマニア（Ｖ．）パナメンシス（Ｌ．（Ｖ．）ｐａｎａｍｅｎｓｉｓ）およびリーシュマニア（Ｖ．）ペルビアナ（Ｌ．（Ｖ．）ｐｅｒｕｖｉａｎａ）］を含むビアンニア（Ｖｉａｎｎｉａ）亜属。感染の大多数はリーシュマニア・インファンタム（Ｌ．ｉｎｆａｎｔｕｍ）によって引き起こされる。異なる種は形態学的には識別不能であるが、それらはアイソザイム分析、分子的方法またはモノクローナル抗体によって識別されうる。
【0076】
ワクチンは、既存のリーシュマニア感染を治療するために、治療的に使用されうるが、好ましくは、感染を阻止し若しくはその可能性を低減するために、および／または感染の臨床徴候を改善するため、および／または該疾患の蔓延を予防し若しくはその可能性を低減するために、予防的に使用される。
【0077】
本発明はまた、本発明のワクチンの有効量を投与することにより、リーシュマニア感染に対して対象を防御する方法を提供する。リーシュマニア感染に対して対象を防御する方法は、前記のとおりにＤＮＡプラスミドを製造し、所望により、薬学的に許容される担体および／またはアジュバントを添加し、対象にワクチンを投与する工程を含む。
【0078】
更に、本発明は、リーシュマニア感染に対して対象を防御するためのＤＮＡワクチンの製造における使用のための、本明細書に記載されているポリヌクレオチドを提供する。
【0079】
投与
本発明は、本発明によるＤＮＡワクチンの有効量を動物に少なくとも１回投与することを想定している。ＤＮＡワクチンは、いずれかの局所または全身投与方法を含む、当技術分野で公知のいずれかの方法で投与されうる。投与は、例えば、抗原を筋肉組織（筋肉内、ＩＭ）、真皮内（皮内、ＩＤ）、皮膚の下（皮下、ＳＣ）、粘膜の下（粘膜下、ＳＭ）、静脈内（静脈内、ＩＶ）、体腔内（腹腔内、ＩＰ）、経口、肛門などに投与することによって行われうる。現在のワクチンでは、ＩＭ、ＩＤおよびＳＣ投与が好ましい。
本発明は、本発明によるＤＮＡワクチンの有効量を動物に少なくとも１回投与することを想定している。ＤＮＡワクチンは、いずれかの局所または全身投与方法を含む、当技術分野で公知のいずれかの方法で投与されうる。投与は、例えば、抗原を筋肉組織（筋肉内、ＩＭ）、真皮内（皮内、ＩＤ）、皮膚の下（皮下、ＳＣ）、粘膜の下（粘膜下、ＳＭ）、静脈内（静脈内、ＩＶ）、体腔内（腹腔内、ＩＰ）、経口、肛門などに投与することによって行われうる。現在のワクチンでは、ＩＭ、ＩＤおよびＳＣ投与が好ましい。
【0080】
本発明は以下の実施形態に関する。
【0081】
第１の実施形態においては、本発明は、
（ｉ）熱ショックタンパク質（ｈｓｐ）６５またはその機能的断片をコードする核酸を含む第１発現カセット、および
（ｉｉ）ＬＡＣＫ（活性化Ｃキナーゼの受容体のリーシュマニアホモログ）またはその免疫原性断片をコードする核酸を含む第２発現カセット
を含む単離されたポリヌクレオチドを提供する。
（ｉ）熱ショックタンパク質（ｈｓｐ）６５またはその機能的断片をコードする核酸を含む第１発現カセット、および
（ｉｉ）ＬＡＣＫ（活性化Ｃキナーゼの受容体のリーシュマニアホモログ）またはその免疫原性断片をコードする核酸を含む第２発現カセット
を含む単離されたポリヌクレオチドを提供する。
【0082】
実施形態２においては、本発明は、ｈｓｐ６５が配列番号１のアミノ酸配列のアミノ酸４８～５８３を含む、またはそれに対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態１記載のポリヌクレオチドに関する。
【0083】
実施形態３においては、本発明は、ＬＡＣＫが配列番号２のアミノ酸配列を含む、またはそれに対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態１または２記載のポリヌクレオチドに関する。
【0084】
実施形態４においては、本発明は、ｈｓｐ６５およびＬＡＣＫをコードする核酸が、異なるプロモーターの制御下にある、前記実施形態のいずれか１項記載のポリヌクレオチドに関する。
【0085】
実施形態５においては、本発明は、ｈｓｐ６５をコードする核酸がサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターの制御下にある、前記実施形態のいずれか１項記載のポリヌクレオチドに関する。
【0086】
実施形態６においては、本発明は、ＬＡＣＫをコードする核酸がＥＦ１α－ＨＴＬＶプロモーターの制御下にある、前記実施形態のいずれか１項記載のポリヌクレオチドに関する。
【0087】
実施形態７においては、本発明は、第２発現カセットが１以上のＣｐＧモチーフを更に含む、前記実施形態のいずれか１項記載のポリヌクレオチドに関する。
【0088】
実施形態８においては、本発明は、実施形態１～７のいずれか１項記載のポリヌクレオチドを含むＤＮＡプラスミドに関する。
【0089】
実施形態９においては、本発明は、ｈｓｐ６５およびＬＡＣＫまたはその免疫原性断片の組換え発現のための、実施形態１～７のいずれか１項記載のポリヌクレオチドの、または実施形態８記載のＤＮＡプラスミドの使用に関する。
【0090】
実施形態１０においては、本発明は、実施形態１～７のいずれか１項記載のポリヌクレオチドを含む、または実施形態８記載のＤＮＡプラスミドを含むＤＮＡワクチンに関する。
【0091】
実施形態１１において、本発明は、薬学的に許容される担体を更に含む、実施形態１０記載のＤＮＡワクチンに関する。
【0092】
実施形態１２においては、本発明は、非アジュバント化ワクチンである、実施形態１０または１１記載のＤＮＡワクチンに関する。
【0093】
実施形態１３においては、本発明は、アジュバントを含む、実施形態１０または１１記載のＤＮＡワクチンに関する。
【0094】
実施形態１４において、本発明は、アジュバントがサポニンである、実施形態１３記載のＤＮＡワクチンに関する。
【0095】
実施形態１５においては、本発明は、リーシュマニア症の感染に対する対象の防御における使用のための、実施形態１０～１４のいずれか１項記載のＤＮＡワクチンに関する。
【0096】
実施形態１６において、本発明は、対象がイヌである、実施形態１５記載の使用のためのＤＮＡワクチンに関する。
【0097】
実施形態１７においては、本発明は、感染がイヌリーシュマニア症によるものである、実施形態１５または１６記載の使用のためのＤＮＡワクチンに関する。
【0098】
実施形態１８においては、本発明は、実施形態１０～１４のいずれか１項記載のＤＮＡワクチンの免疫遺伝学的に有効な量を対象に投与することを含む、リーシュマニア症による感染に対して対象を免疫化する方法に関する。
【0099】
本明細書に記載されている実施形態の組合せが予想され、簡潔にするために、幾つかの例示的な組合せのみが明示的に記載されていると理解されるべきである。しかし、これは、記載されている実施形態に限定されると解釈されるべきではない。
実施例
実施例１：プラスミドｐＶＡＸ＿ｈｓｐ６５＿ｌａｃｋの構築
ｈｓｐ６５遺伝子を含有するｐＶＡＸ＿ｈｓｐ６５プラスミドをｐＶＡＸベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）から構築した。このプラスミドをＢａｍＨＩおよびＮｏｔＩ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ，ＵＳＡ）で消化し、次いで配列番号１のアミノ酸４８－４８３を含む配列番号４のマイコバクテリウム・レプレ（Ｍ．ｌｅｐｒａｅ）ｈｓｐ６５遺伝子とＣＭＶイントロンＡとを挿入した。ｐＶＡＸまたはｐＶＡＸｈｓｐ６５で形質転換されたＤＨ５α大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を、カナマイシン（１００μｇ／ｍｌ）を含有するＬＢ液体培地（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ，ＵＳＡ）内で培養した。コンサート高純度マキシプレップ系（Ｃｏｎｃｅｒｔ Ｈｉｇｈ Ｐｕｒｉｔｙ Ｍａｘｉｐｒｅｐ Ｓｙｓｔｅｍ）（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ，ＵＳＡ）を使用して、該プラスミドを精製した。ジーン・クアントＩＩ装置（Ｇｅｎｅ Ｑｕａｎｔ ＩＩ ａｐｐａｒａｔｕｓ）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ，ＵＫ）を使用して、λ＝２６０および２８０ｎｍでの分光光度測定によって、プラスミド濃度を測定した。
【化1】
実施例１：プラスミドｐＶＡＸ＿ｈｓｐ６５＿ｌａｃｋの構築
ｈｓｐ６５遺伝子を含有するｐＶＡＸ＿ｈｓｐ６５プラスミドをｐＶＡＸベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）から構築した。このプラスミドをＢａｍＨＩおよびＮｏｔＩ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ，ＵＳＡ）で消化し、次いで配列番号１のアミノ酸４８－４８３を含む配列番号４のマイコバクテリウム・レプレ（Ｍ．ｌｅｐｒａｅ）ｈｓｐ６５遺伝子とＣＭＶイントロンＡとを挿入した。ｐＶＡＸまたはｐＶＡＸｈｓｐ６５で形質転換されたＤＨ５α大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を、カナマイシン（１００μｇ／ｍｌ）を含有するＬＢ液体培地（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ，ＵＳＡ）内で培養した。コンサート高純度マキシプレップ系（Ｃｏｎｃｅｒｔ Ｈｉｇｈ Ｐｕｒｉｔｙ Ｍａｘｉｐｒｅｐ Ｓｙｓｔｅｍ）（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ，ＵＳＡ）を使用して、該プラスミドを精製した。ジーン・クアントＩＩ装置（Ｇｅｎｅ Ｑｕａｎｔ ＩＩ ａｐｐａｒａｔｕｓ）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ，ＵＫ）を使用して、λ＝２６０および２８０ｎｍでの分光光度測定によって、プラスミド濃度を測定した。
【0100】
プラスミドｐＶＡＸ＿ｈｓｐ６５に基づくリーシュマニアＤＮＡワクチンの構築のために、ＥＦ１ａ／ＨＴＬＶと称されるプロモーターを挿入した。この場合、ＮｏｔＩおよびＥｃｏＲＩ酵素の配列（ＧＣＧＧＣＣＧＣ－ＮｏｔＩ酵素部位／ＧＡＡＴＴＣ－ＥｃｏＲＩ）を制限部位として有するＬａｃｋ遺伝子が挿入可能であった。ＥＦ１ａ－ＨＴＬＶプロモーターは、ヒト伸長因子１α（ＥＦ－１α）コアプロモーターと、ヒトＴ細胞白血病ウイルス（ＨＴＬＶ）１型長末端反復のＲセグメントおよびＵ５配列の一部（Ｒ－Ｕ５’）とを含む複合プロモーターである。したがって、ＤＮＡプラスミドの最終的な構築は、異なるプロモーター（ｈｓｐ６５ではＣＭＶプロモーター、およびＬａｃｋではＥＦ１ａ／ＨＴＬＶ）内へのｈｓｐ６５およびＬａｃｋ遺伝子の挿入に基づくものであった。
【0101】
これらのプラスミド系の大きな利点は、それが、ｈｓｐ６５の免疫調節活性を維持することを可能にし、リーシュマニアによって引き起こされる感染に対するイヌの特異的防御における使用のためのＬＡＣＫ免疫原性遺伝子の挿入を考慮することを可能にすることである。
【0102】
多目的プラスミド系の免疫原性を増強するために、ＬＡＣＫ遺伝子発現カセットのＳＶ４０ポリアデニル化部位の後に４つのＣｐＧモチーフをも付加した。
【0103】
ｈｓｐ６５遺伝子の非存在下でＬａｃｋ遺伝子のみを含有するＤＮＡプラスミドの構築物も作製し、免疫原性およびワクチン有効性研究における対照として使用した。したがって、以下のプラスミドＤＮＡを構築した：
（ｉ）ｐＶＡＸ＿ｈｓｐ６５（対照）
（ｉｉ）ｐＶＡＸ＿ｌａｃｋ（対照）
（ｉｉｉ）ｐＶＡＸ＿ｈｓｐ６５＿ｌａｃｋ
（ｉｖ）ｐＶＡＸ＿Ａ２（参照対照）
（ｖ）ｐＶＡＸ＿ｈｓｐ６５＿Ａ２（参照対照）。
（ｉ）ｐＶＡＸ＿ｈｓｐ６５（対照）
（ｉｉ）ｐＶＡＸ＿ｌａｃｋ（対照）
（ｉｉｉ）ｐＶＡＸ＿ｈｓｐ６５＿ｌａｃｋ
（ｉｖ）ｐＶＡＸ＿Ａ２（参照対照）
（ｖ）ｐＶＡＸ＿ｈｓｐ６５＿Ａ２（参照対照）。
【0104】
組換えタンパク質（ＬＡＣＫ）および特異的抗体（抗ＬＡＣＫ）を得るために、プラスミドｐＥＴ２８ａ＿ｌａｃｋおよびｐＥＴ２８ａ＿Ａ２を標準的な方法によって製造した。これらのプラスミドをＬａｃｋタンパク質の発現のための大腸菌系統ＢＬ２１株の形質転換に使用した。抗Ｌａｃｋポリクローナル抗体の製造、ならびにマウスおよびイヌにおけるＤＮＡワクチンの免疫原性評価実験において、タンパク質を使用した。フロイト不完全アジュバントと共に投与されるタンパク質のそれぞれによる免疫化によって、マウスにおいて、マウス抗Ｌａｃｋポリクローナル抗体の製造を行った。プラスミドｐＶＡＸ＿ｈｓｐ６５、ｐＶＡＸ＿ｈｓｐ６５＿ｌａｃｋ、ｐＶＡＸ＿ｌａｃｋを、制限酵素消化後のポリアクリルアミドゲル分析による各プラスミドにおけるクローン化遺伝子の精製および特徴付けのために、大腸菌ＴＯＰ１０系統内に形質転換された。
【0105】
実験室規模の製造の後、該プラスミドのそれぞれによるＨＥＫ２９３細胞のトランスフェクション、ならびにそれぞれのワクチン構築物における内因性ｈｓｐ６５およびｌａｃｋタンパク質の実証を行った。抗ｈｓｐ６５および抗ＬＡＣＫポリクローナル抗体を使用するウェスタンブロット技術によって、タンパク質の発現を特徴付けした。
【0106】
特異的プライマーを使用するＲＴ－ＰＣＲによってｍＲＮＡを検出した。標準的な方法を用いて、ｐＶＡＸ＿ｈｓｐ６５、ｐＶＡＸ＿ｈｓｐ６５＿ｌａｃｋおよびｐＶＡＸ＿ｌａｃｋワクチンを約１０ｍｇの量で実験室規模で製造した。ベンチ規模での製造の後、ＤＮＡプラスミドを以下の点で特徴付けした：制限酵素消化による同一性；外観、濃度、純度（Ａ２６０／２８０は１．７～２．０）；均質性（スーパーコイル形態が９０％超）；ゲノムＤＮＡ（５％未満）；および内毒素（業界向け指針－ＦＤＡ－２００７ ４０ＥＵ／ｍｇ未満）。ワクチンのそれぞれの特徴付けの後、それらをマウスにおける免疫原性および有効性の研究に使用した。実験室規模の製造および品質管理試験の後、ワクチン構成物ｐＶＡＸ＿ｈｓｐ６５、ｐＶＡＸ＿ｈｓｐ６５＿ｌａｃｋおよびｐＶＡＸ＿ｌａｃｋは、マウスにおけるリーシュマニア症の実験モデルにおける免疫原性および有効性に関して試験される準備が整った。
【0107】
プラスミドｐＶＡＸ＿ｈｓｐ６５上のｌａｃｋ遺伝子のクローニングはＧｅｎｅＳｃｒｉｐｔ社によって行われ、プラスミドｐＶＡＸ＿ｈｓｐ６５＿ｌａｃｋが得られた。ｌａｃｋ遺伝子と共に、プロモーター領域（二重ＥＦ１α／ＨＴＬプロモーター）、ポリアデニル化シグナル（ＳＶ４０）およびＣＰＧ配列も、標準的な技術を用いて前記のとおりにクローニングされた。
【0108】
得られたプラスミドｐＶＡＸ＿ｈｓｐ６５＿ｌａｃｋは配列番号３のものであり、図１の模式図で示される。
【0109】
Ａ２抗原を含有するプラスミド（ｉｖ）および（ｖ）を、ＬＡＣＫ含有抗原に関して前記に記載されているのと同じ手順に従って構築した。免疫調節活性が既に確認されているＤＮＡｈｓｐ６５をワクチンプラットフォーム（原型）として使用し、そのプラスミドにリーシュマニアのＡ２コード化遺伝子を付加して、構築物ｐＶＡＸ＿ｈｓｐ６５＿Ａ２（ｖ）を得た。プラスミドｐＶＡＸ＿Ａ２（ｉｖ）は、ＧｅｎｅＳｃｒｉｐｔ社によってプラスミドｐＶＡＸ＿ｈｓｐ６５＿Ａ２からｈｓｐ６５遺伝子を除去することによって構築された。
【0110】
実施例２：プラスミドｐＶＡＸ＿ｈｓｐ６５＿ｌａｃｋの特徴付け
ＧｅｎｅＳｃｒｉｐｔ社によって構築されたプラスミドｐＶＡＸ＿ｈｓｐ６５＿ｌａｃｋを増殖および貯蔵のために大腸菌系統ＴＯＰ１０内に形質転換した。構築中にｌａｃｋ遺伝子の末端に付加されたＮｏｔＩおよびＥｃｏＲＩ酵素による、ならびにｈｓｐ６５遺伝子のクローニングにおいて使用されたＢａｍＨＩおよびＡｐａＩ酵素による制限分析によって、プラスミドを特徴付けした。消化においては、１μｇ（各消化につき）のプラスミド、１μＬの各酵素を最終的に２０μＬの反応において使用し、これを３７℃で３０分～１時間インキュベートした。１％ アガロースゲル上で、サンプルにＧｅｌＲｅｄを添加して、消化の評価を行った。
ＧｅｎｅＳｃｒｉｐｔ社によって構築されたプラスミドｐＶＡＸ＿ｈｓｐ６５＿ｌａｃｋを増殖および貯蔵のために大腸菌系統ＴＯＰ１０内に形質転換した。構築中にｌａｃｋ遺伝子の末端に付加されたＮｏｔＩおよびＥｃｏＲＩ酵素による、ならびにｈｓｐ６５遺伝子のクローニングにおいて使用されたＢａｍＨＩおよびＡｐａＩ酵素による制限分析によって、プラスミドを特徴付けした。消化においては、１μｇ（各消化につき）のプラスミド、１μＬの各酵素を最終的に２０μＬの反応において使用し、これを３７℃で３０分～１時間インキュベートした。１％ アガロースゲル上で、サンプルにＧｅｌＲｅｄを添加して、消化の評価を行った。
【0111】
プラスミドｐＶＡＸ＿ｈｓｐ６５＿ｌａｃｋを、ＨＥＫ２９３細胞のトランスフェクション、ウエスタンブロットによるｌａｃｋおよびｈｓｐ６５タンパク質発現の評価、ならびに特異的プライマーを使用するＲＴ－ＰＣＲによるｌａｃｋおよびｈｓｐ６５に関するｍＲＮＡの特定にも使用した。プラスミドｐＶＡＸ＿ｈｓｐ６５＿ｌａｃｋによるＨＥＫ細胞のトランスフェクションを行って、この新たなプラスミド構築物が転写産物（ｍＲＮＡ）およびタンパク質を生成する能力を評価した。ＤＮＡプラスミドの存在下でＨＥＫ細胞を２４時間培養した後、培地を除去し、細胞をＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）で洗浄し、Ｔｒｉｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を加えた。細胞をホモジナイズし、収集し、－７０℃で凍結した。ＲＮＡ抽出を製造業者の説明に従い行った。抽出および定量の後、１μｇのＲＮＡをＤＮＡｓｅＩで処理し、ｃＤＮＡ生成反応に付した。全てのトランスフェクション（ｐＶＡＸ、ｐＶＡＸ＿ｈｓｐ６５およびｐＶＡＸ＿ｈｓｐ６５＿ｌａｃｋによるもの）からのＲＮＡを同じ方法で処理した。
【0112】
プラスミドｐＶＡＸ＿ｈｓｐ６５＿ｌａｃｋによってコードされた転写産物の検出を、特異的オリゴヌクレオチドを使用するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって行った。陽性対照反応として、ＰＣＲ特異的プライマーを、ＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼ）プライマーに使用した。ＤＮＡプラスミドの存在下でＨＥＫ細胞を２４時間培養した後、培地を除去し、細胞をＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳまたはＣｅｌＬｙｔｉｃＭ（Ｓｉｇｍａ）で収集してウエスタンブロットによって評価した。
【0113】
結果は、プラスミドｐＶＡＸ＿ｈｓｐ６５＿ｌａｃｋが正しく構築されたことを示した。なぜなら、遺伝子ｌａｃｋおよびＨｓｐ６５が、それぞれの遺伝子のクローニング部位に特異的な制限酵素によってプラスミドｐＶＡＸ＿ｈｓｐ６５＿ｌａｃｋにおいて特徴付けられたからである。ｐＶＡＸ＿ｈｓｐ６５＿ｌａｃｋでトランスフェクトされたＨＥＫ細胞において、Ｌａｃｋおよびｈｓｐ６５ ｍＲＮＡの発現をＰＣＲによって特徴付けした。また、Ｈｓｐ６５およびｌａｃｋタンパク質を、ｐＶＡＸ＿ｈｓｐ６５＿ｌａｃｋプラスミドでトランスフェクトされたＨＥＫ細胞の上清において、ウェスタンブロット分析によって特徴付けした。
【0114】
実施例３：マウスモデルにおけるｐＶＡＸ＿ｈｓｐ６５＿ｌａｃｋの免疫原性および有効性
マウスモデルにおいて、生理食塩水に再懸濁した異なるプラスミド構築物および組合せを試験した。そのために、マウス（ムス・ムスクルス（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）－Ｂａｌｂ／ｃ）における実験的感染後の免疫原性および有効性を評価するための実験を設計した。合計１２８匹のマウスを以下の８つの実験群に無作為に分割した。
マウスモデルにおいて、生理食塩水に再懸濁した異なるプラスミド構築物および組合せを試験した。そのために、マウス（ムス・ムスクルス（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）－Ｂａｌｂ／ｃ）における実験的感染後の免疫原性および有効性を評価するための実験を設計した。合計１２８匹のマウスを以下の８つの実験群に無作為に分割した。
【0115】
・ 群Ａ－ｐＶＡＸ＿ｈｓｐ６５（対照）
・ 群Ｂ－ｐＶＡＸ＿Ａ２（参照対照）
・ 群Ｃ－Ｌｅｉｓｈ－Ｔｅｃ（登録商標）（対照）
・ 群Ｄ－ｐＶＡＸ＿ｈｓｐ６５＿ｌａｃｋ
・ 群Ｅ－ｐＶＡＸ＿ｈｓｐ６５＿Ａ２（参照対照）
・ 群Ｆ－ｐＶＡＸ＿ｈｓｐ６５＿ｌａｃｋ＋ｐＶＡＸ＿ｈｓｐ６５＿Ａ２
・ 群Ｇ－ｐＶＡＸ＿ｌａｃｋ（対照）
・ 群Ｈ－生理食塩水（陰性対照）
次いで実験群を、それぞれ８匹の動物を含む２つ（免疫原性および有効性）に分割した。各用量間の１５日間隔で皮下適用される３用量で動物をワクチン接種した。次いで、３回目のワクチン接種の１５日後に、リーシュマニア・インファンタム（Ｌ．ｉｎｆａｎｔｕｍ）シャガシ（ｃｈａｇａｓｉ），ｃｅｐａＮＣＬ／ＩＯＣＬ３２４１の１０８匹の寄生虫を実験的に動物に腹腔内経路で感染させた（図２）。
・ 群Ｂ－ｐＶＡＸ＿Ａ２（参照対照）
・ 群Ｃ－Ｌｅｉｓｈ－Ｔｅｃ（登録商標）（対照）
・ 群Ｄ－ｐＶＡＸ＿ｈｓｐ６５＿ｌａｃｋ
・ 群Ｅ－ｐＶＡＸ＿ｈｓｐ６５＿Ａ２（参照対照）
・ 群Ｆ－ｐＶＡＸ＿ｈｓｐ６５＿ｌａｃｋ＋ｐＶＡＸ＿ｈｓｐ６５＿Ａ２
・ 群Ｇ－ｐＶＡＸ＿ｌａｃｋ（対照）
・ 群Ｈ－生理食塩水（陰性対照）
次いで実験群を、それぞれ８匹の動物を含む２つ（免疫原性および有効性）に分割した。各用量間の１５日間隔で皮下適用される３用量で動物をワクチン接種した。次いで、３回目のワクチン接種の１５日後に、リーシュマニア・インファンタム（Ｌ．ｉｎｆａｎｔｕｍ）シャガシ（ｃｈａｇａｓｉ），ｃｅｐａＮＣＬ／ＩＯＣＬ３２４１の１０８匹の寄生虫を実験的に動物に腹腔内経路で感染させた（図２）。
【0116】
３回目のワクチン投与から１５日後、免疫原性を評価するために、ＥＬＩＳＡ試験による抗原特異的（Ｈｓｐ６５、ＬａｃｋおよびＡ２）抗体ＩｇＧ１およびＩｇＧ２定量のために、血液サンプルを採取した。また、市販キットにおけるＩＦＮ－ｇ定量のために、製造業者の説明に従い、動物の脾臓サンプル（群あたり８匹）を採取した。
【0117】
実験感染の３０日後、ｑＰＣＲおよび限界希釈アッセイを用いて、肝臓および脾臓における寄生虫量によって、ワクチン製剤の有効性を評価した。
【0118】
結果：
免疫原性の結果はワクチン接種群における抗体応答を示した。ｐＶＡＸ＿ｈｓｐ６５＿ｌａｃｋでワクチン接種された群におけるＩＦＮ－γ応答の増加が観察され（図３Ａ）、これはＴｈ１調節応答を示している。
免疫原性の結果はワクチン接種群における抗体応答を示した。ｐＶＡＸ＿ｈｓｐ６５＿ｌａｃｋでワクチン接種された群におけるＩＦＮ－γ応答の増加が観察され（図３Ａ）、これはＴｈ１調節応答を示している。
【0119】
特に、ｐＶＡＸ＿ｈｓｐ６５＿ｌａｃｋワクチンの抗体応答は市販ワクチンＬｅｉｓｈ－Ｔｅｃの約２倍であった。また、同じｐＶＡＸプラスミド骨格が使用されているがｈｓｐ６５およびＬａｃｋ遺伝子の一方のみを含むＤＮＡワクチンと比較して、ＩＦＮ－γ細胞免疫応答は有意に高かった。更に、抗原としてのＬａｃｋは、免疫調節因子ｈｓｐ６５と組合された場合、高いＩＦＮ－γ応答を達成した。一方、Ａ２抗原を含むワクチンは、ワクチンｐＶＡＸ＿ｈｓｐ６５＿ｌａｃｋに類似した抗体応答を達成したが、ｈｓｐ６５免疫調節因子とのその組合せからの利益は得られなかった。なぜなら、ｈｓｐ６５＿Ａ２組合せ構築物に関しては、該免疫調節因子を含有しないＡ２構築物と比較して、ＩＦＮ－γ応答が低かったからである。興味深いことに、ｐＶＡＸ＿ｈｓｐ６５＿ｌａｃｋとｐＶＡＸ＿ｈｓｐ６５＿Ａ２との両方の組合せ構築物の組合せは、単一の構築物と比較して、抗体応答の増強をもたらさなかった。
【0120】
また、有効性評価においては、３０日間のチャレンジの後のワクチン接種群ｐＶＡＸ＿ｈｓｐ６５＿ｌａｃｋの肝臓における寄生虫量は非ワクチン接種群（生理食塩水）よりも１０３単位低かった（図３Ｂ）。
【0121】
特に、寄生虫量の有意な減少を何ら達成しなかった市販ワクチンＬｅｉｓｈ－ＴｅｃよりもｐＶＡＸ＿ｈｓｐ６５＿ｌａｃｋワクチンにおいて、寄生虫量の減少が高かった。また、同じｐＶＡＸプラスミド骨格が使用されているがｈｓｐ６５およびＬａｃｋ遺伝子の一方のみを含むＤＮＡワクチンと比較して、寄生虫量は低かった。また、Ａ２抗原を使用する比較ワクチンのいずれにおいても、寄生虫量の有意な減少は全く観察できなかった。したがって、ｐＶＡＸ＿Ａ２ワクチンは、ワクチンｐＶＡＸ＿ｈｓｐ６５＿ｌａｃｋに類似した抗体応答を達成したが、この抗体応答は寄生虫量の有意な減少をもたらさなかった。ｐＶＡＸ＿ｈｓｐ６５＿ｌａｃｋとｐＶＡＸ＿ｈｓｐ６５＿Ａ２との両方の組合せ構築物の組合せも、単一の構築物と比較して、測定抗体応答を反映している寄生虫量の有意な減少をもたらさなかった。
【0122】
結論として、マウスモデル実験は、ｐＶＡＸ＿ｈｓｐ６５＿ｌａｃｋ抗原でワクチン接種された群で観察された免疫応答および防御が、その他の実験群より優れていることを示した。特に、驚くべきことに、ｐＶＡＸ＿ｈｓｐ６５＿ｌａｃｋでワクチン接種された群においては、ｐＶＡＸ＿ｈｓｐ６５＿Ａ２でワクチン接種された群と比較して、抗体および細胞免疫応答ならびに寄生虫量が優れていることが観察された。このことは、ｈｓｐ６５免疫調節因子とＬＡＣＫ抗原との組合せによって、ｈｓｐ６５とＡ２抗原との組合せよりも優れた結果が達成されうることを示している。この結果は特に驚くべきものである。なぜなら、ＬＡＣＫ抗原によって誘導される免疫応答は実験的リーシュマニア感染に対する防御をもたらさず、Ａ２抗原の場合より弱いことが、当技術分野において最近示されたからである（Ｃｏｅｌｈｏら，Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，７１（７），２００３）。
【0123】
また、本発明のＤＮＡワクチンは、リーシュマニアのＡ２抗原に基づく市販ワクチンである先行技術ワクチンＬｅｉｓｈ－Ｔｅｃ（登録商標）でワクチン接種された対象と比較して、免疫応答（細胞性および体液性）の増加および寄生虫量の減少を達成することを示すことが可能であった。このことは、先行技術ワクチンと比較して顕著な改善を示すものである。
【0124】
実施例４：イヌモデルにおけるｐＶＡＸ＿ｈｓｐ６５＿ｌａｃｋの免疫原性および有効性
この研究の目的は、イヌにおけるリーシュマニア・インファンタム（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｉｎｆａｎｔｕｍ）に対する実験的ワクチンの有効性および安全性を評価することである。
この研究の目的は、イヌにおけるリーシュマニア・インファンタム（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｉｎｆａｎｔｕｍ）に対する実験的ワクチンの有効性および安全性を評価することである。
【0125】
血清学的検査および骨髄ＰＣＲにおいてリーシュマニア・インファンタム（Ｌ．ｉｎｆａｎｔｕｍ）に関して陰性であった６～１２月齢の予め去勢された４８頭の健康な通常飼育の子イヌ（雄および雌）を研究に使用した。研究は盲検化され、無作為化され、各群１０～１１頭の動物を含む４つの群からなるものであった。各動物は実験ユニットを代表する。動物を、年齢、体重、性別に応じて無作為に実験群に割り当てた。リーシュマニア・インファンタム（Ｌ．ｉｎｆａｎｔｕｍ）に対する２つの実験用ワクチンを試験し、それらの結果を陰性対照群および陽性対照群（ブラジルの商域において入手可能な競合ワクチン）と比較した。
【0126】
全ての群は、皮下経路で２１日間隔で投与される３用量プロトコルでワクチン接種を受けた（表１）。
ワクチンの第３用量の投与の１４週間後、全ての動物をリーシュマニア・インファンタム（Ｌ．ｉｎｆａｎｔｕｍ）接種物で静脈内経路によってチャレンジした。この時点から、検査マーカーおよび臨床徴候を考慮して、イヌリーシュマニア症に関連する臨床変化の発生に関して動物をモニタリングした。
【表1】
【0127】
ワクチンに対する体液性免疫応答および細胞性免疫応答の免疫原性評価のために、第２１日（第２用量の投与前）、第４２日（第３用量の投与前）、第５６日、第１４１日（チャレンジの直前）、第１８４日、第２１９日、第２５４日、第３３１日、第３８８日、４４３日目に血液サンプルを採取した。
【0128】
チャレンジ前の動物における寄生虫感染の非存在を証明するために、またはチャレンジ後の寄生虫量を定量するために、リーシュマニア・インファンタム（Ｌ．ｉｎｆａｎｔｕｍ）ＤＮＡの検出のために、骨髄およびリンパ節（膝窩または前肩甲骨）からの吸引穿刺を行った。骨髄サンプルをＰａｐａｒｃｏｎｅら（２０１３）の方法に従い採取した。チャレンジ直前のリーシュマニア・インファンタム（Ｌ．ｉｎｆａｎｔｕｍ）遺伝物質の非存在を証明するために、第５６日および第１４１日に、骨髄サンプルおよび膝窩リンパ節サンプルを得た。この後、リアルタイムｑＰＣＲによって寄生虫量を定量するために、第１８４日、第２５４日、第３３１日、第３８８日および第４４３日に、同じ組織からのサンプルを採取した。
【0129】
図４Ａ、４Ｂおよび４Ｃはチャレンジ後の第４３日、第１９０日および第３０２日のリンパ節におけるｑＰＣＲによる寄生虫量（個別データおよび中央値）を示す。生理食塩水群はワクチン接種を受けず、群Ｖａｃ５およびＶａｃ６は本発明のｐＤＮＡワクチン（ｐＶＡＸ＿ｈｓｐ６５＿ｌａｃｋ）の投与を受け、参照群は、商業的に入手可能なＬｅｉｓｈ－Ｔｅｃの投与を受けた。Ｖａｃ５は、ｐＤＮＡとサポニンとを含有するワクチンであり、Ｖａｃ６は、ｐＤＮＡと生理食塩水とを含有するワクチンである。リーシュマニア・インファンタム（Ｌ．ｉｎｆａｎｔｕｍ）の寄生虫量を定量するために、寄生虫キネトプラストの環状ＤＮＡ（ｋＤＮＡ）を標的とするプライマー［順方向：５’－ＧＴＧＧＧＧＧＧＧＡＧＧＧＧＣＧＴＴＣＴ－３’（配列番号５）、および逆方向：５’－ＡＴＴＴＴＡＣＡＣＣＡＡＣＣＣＣＣＡＧＴＴ－３’（配列番号６）］を使用するｑＰＣＲを用いた。ｑＰＣＲ反応は、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎプローブを使用して１０ｎｇの精製ゲノムＤＮＡで標準化した。
【0130】
【0131】
リーシュマニアチャレンジ後の第２４７日および第３０２日に臨床検査を行った。臨床症状の幾つかの例には、耳の皮膚炎、爪甲剥離症、リンパ節腫大、筋萎縮、耳の皮膚炎、皮膚の剥離、脱毛症、色素脱失、皮膚潰瘍、角質増殖症、眼瞼炎が含まれた。使用したチャレンジモデルが動物において臨床的変化を引き起こしうることは明らかであり、これは、研究において使用したワクチンの潜在的防御を際立って示している状況である。そのような変化を示す動物は全ての実験群で観察され、それらの群のそれぞれにおいて、多少なりとも臨床的に影響を受けた動物の頻度に差が見られた。
【0132】
それらの群のそれぞれにおける各イヌに関して得られた知見に基づいて、表２を作成した。この表は、身体検査における変化およびイヌリーシュマニア症に関連する検査マーカーにおいて見出された変化を示す、群ごとの動物の頻度を示す。これは、試験ワクチン製剤の潜在的防御効果を際立って示す主要エンドポイントであることが判明した。
表２において認められうるとおり、本発明によるワクチン（Ｖａｃ５、Ｖａｃ６）の投与を受けた群は、症候性疾患を有する動物の最小数を示し、無症候性疾患を有する動物の最大数を示している。
【表2】
【0133】
リンパ節および骨髄における寄生虫量は、チャレンジの３０２日後まで、全てのイヌ群にわたって類似しているが、生理食塩水群および参照ワクチン接種群で得られた臨床徴候および検査変化を比較すると、プラスミドｐＶＡＸ＿Ｌａｃｋ＿Ｈｓｐ６５に基づく実験ワクチンは疾患の重症度を軽減したと結論付けられうる。
【図1】
【図2】
【図3A】
【図3B】
【図4A】
【図4B】
【図4C】
【図5A】
【図5B】
【図5C】
【配列表】
【国際調査報告】