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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2025-01-09
(54)【発明の名称】多重ベクターリコンビナーゼ媒介カセット交換
(51)【国際特許分類】
C12N 5/10 20060101AFI20241226BHJP
C12N 5/071 20100101ALI20241226BHJP
C12P 21/08 20060101ALI20241226BHJP
C12N 15/13 20060101ALI20241226BHJP
C12N 15/62 20060101ALI20241226BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20241226BHJP
C07K 16/46 20060101ALN20241226BHJP
C07K 16/00 20060101ALN20241226BHJP
C12N 15/86 20060101ALN20241226BHJP
【ＦＩ】
C12N5/10
C12N5/071 ZNA
C12P21/08
C12N15/13
C12N15/62
C12N15/63 Z
C07K16/46
C07K16/00
C12N15/86 Z
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024538052
(86)(22)【出願日】2022-12-22
(85)【翻訳文提出日】2024-08-16
(86)【国際出願番号】 US2022053761
(87)【国際公開番号】W WO2023122246
(87)【国際公開日】2023-06-29
(31)【優先権主張番号】63/292,869
(32)【優先日】2021-12-22
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】509012625
【氏名又は名称】ジェネンテック， インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】110002077
【氏名又は名称】園田・小林弁理士法人
(72)【発明者】
【氏名】ン， チー キン ドミンゴス
(72)【発明者】
【氏名】シェン， エイミー
(72)【発明者】
【氏名】バーナード， ギャビン クリスチャン
【テーマコード（参考）】
4B064
4B065
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B064AG27
4B064CA10
4B064CA19
4B064CC24
4B064DA01
4B065AA91X
4B065AA93X
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065BA25
4B065CA24
4B065CA25
4B065CA44
4H045AA11
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA10
4H045BA41
4H045DA76
4H045EA20
4H045FA74
(57)【要約】
ここに開示される主題は、組み換えタンパク質、例えば、モノクローナル抗体、並びにそれから得られる組成物、例えば、二重特異性５抗体、及び他の複合フォーマットのタンパク質、例えば、膜タンパク質複合体、及び発現が困難な他の分子を発現する生成宿主細胞のために、目的の配列の標的化取り込みを達成する多重ベクターリコンビナーゼ媒介カセット交換手法に関する。
【選択図】図１
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
標的化取り込み（ＴＩ）宿主細胞であって、ａ）ＮＷ＿００６８７４０４７．１のヌクレオチド４１１９０－４５２６９の全部若しくは一部、ＮＷ＿００６８８４５９２．１のヌクレオチド６３５９０－２０７９１１の全部若しくは一部、ＮＷ＿００６８８１２９６．１のヌクレオチド２５３８３１－４９１９０９の全部若しくは一部、ＮＷ＿００３６１６４１２．１のヌクレオチド６９３０３－７９７６８の全部若しくは一部、ＮＷ＿００３６１５０６３．１のヌクレオチド２９３４８１－３１５２６５の全部若しくは一部、ＮＷ＿００６８８２９３６．１のヌクレオチド２６５０４４３－２６６２０５４の全部若しくは一部、又はＮＷ＿００３６１５４１１．１のヌクレオチド８２２１４－９７７０５の全部若しくは一部と少なくとも約９０％相同であるか；或いは
ｂ）ＮＷ＿００６８７４０４７．１のヌクレオチド４５２７０－４５４９０の全部若しくは一部、ＮＷ＿００６８８４５９２．１のヌクレオチド２０７９１２－７９２３７４の全部若しくは一部、ＮＷ＿００６８８１２９６．１のヌクレオチド４９１９１０－６６７８１３の全部若しくは一部、ＮＷ＿００３６１６４１２．１のヌクレオチド７９７６９－１０００５９の全部若しくは一部、ＮＷ＿００３６１５０６３．１のヌクレオチド３１５２６６－３６２４４２の全部若しくは一部、ＮＷ＿００６８８２９３６．１のヌクレオチド２６６２０５５－２７０１７６８の全部若しくは一部、又はＮＷ＿００３６１５４１１．１のヌクレオチド９７７０６－１０５１１７の全部若しくは一部と少なくとも約９０％相同である
配列内部にある取り込み部位に取り込まれた外因性ヌクレオチド配列を含み；外因性ヌクレオチド配列が、４つ以上の不適合性組み換え認識配列（ＲＲＳ）を含む、ＴＩ宿主細胞。
【請求項2】
ＲＲＳが、ＬｏｘＰ配列、ＬｏｘＰ Ｌ３配列、ＬｏｘＰ ２Ｌ配列、ＬｏｘＦａｓ配列、Ｌｏｘ５ ｌ ｌ配列、Ｌｏｘ２２７２配列、Ｌｏｘ２３７２配列、Ｌｏｘ５ ｌ７ｌ配列、Ｌｏｘｍ２配列、Ｌｏｘ７ｌ配列、Ｌｏｘ６６配列、ＦＲＴ配列、Ｂｘｂｌ ａｔｔＰ配列、Ｂｘｂｌ ａｔｔＢ配列、φＣ３１ ａｔｔＰ配列、及びφＣ３１ ａｔｔＢ配列からなる群から選択される、請求項１に記載のＴＩ宿主細胞。
【請求項3】
ＲＲＳが、Ｃｒｅリコンビナーゼ、ＦＬＰリコンビナーゼ、Ｂｘｂｌインテグラーゼ、及びφＣ３１インテグラーゼからなる群から選択されるリコンビナーゼによって認識される、請求項１に記載のＴＩ宿主細胞。
【請求項4】
外因性ヌクレオチド配列が、最も５’側にあるＲＲＳと３’方向にある次のＲＲＳとの間に位置する選択マーカーを含む、請求項１から３のいずれか一項に記載のＴＩ宿主細胞。
【請求項5】
選択マーカーが、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＨＹＧ）、ネオマイシン、Ｇ４１８（ＡＰＨ）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、グルタミンシンセターゼ（ＧＳ）、アスパラギンシンセターゼ、トリプトファンシンセターゼ（インドール）、ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ（ヒスチジノールＤ）、ブラストサイジン、ブレオマイシン、フレオマイシン、クロラムフェニコール、ゼオシン、及びミコフェノール酸からなる群から選択される、請求項４に記載のＴＩ宿主細胞。
【請求項6】
第２の選択マーカーをさらに含み、第１の選択マーカーと第２の選択マーカーとは異なっている、請求項５に記載のＴＩ宿主細胞。
【請求項7】
第２の選択マーカーが、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＨＹＧ）、ネオマイシン、Ｇ４１８（ＡＰＨ）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、グルタミンシンセターゼ（ＧＳ）、アスパラギンシンセターゼ、トリプトファンシンセターゼ（インドール）、ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ（ヒスチジノールＤ）、ブラストサイジン、ブレオマイシン、フレオマイシン、クロラムフェニコール、ゼオシン、及びミコフェノール酸からなる群から選択される、請求項６に記載のＴＩ宿主細胞。
【請求項8】
第３の選択マーカー及び配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）をさらに含み、ＩＲＥＳが、第３の選択マーカーに作用可能に連結されている、請求項６に記載のＴＩ宿主細胞。
【請求項9】
第３の選択マーカーが、第１の選択マーカー又は第２の選択マーカーとは異なっている、請求項８に記載のＴＩ宿主細胞。
【請求項10】
第３の選択マーカーが、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）マーカー、強化ＧＦＰ（ｅＧＦＰ）マーカー、合成ＧＦＰマーカー、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）マーカー、強化ＹＦＰ（ｅＹＦＰ）マーカー、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）マーカー、ｍＰｌｕｍマーカー、ｍＣｈｅｒｒｙマーカー、ｔｄＴｏｍａｔｏマーカー、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙマーカー、Ｊ－ｒｅｄマーカー、ＤｓＲｅｄ－モノマーマーカー、ｍＯｒａｎｇｅマーカー、ｍＫＯマーカー、ｍＣｉｔｒｉｎｅマーカー、Ｖｅｎｕｓマーカー、ＹＰｅｔマーカー、Ｅｍｅｒａｌｄ６マーカー、ＣｙＰｅｔマーカー、ｍＣＦＰｍマーカー、Ｃｅｒｕｌｅａｎマーカー、及びＴ－Ｓａｐｐｈｉｒｅマーカーからなる群から選択される、請求項９に記載のＴＩ宿主細胞。
【請求項11】
哺乳動物宿主細胞である、請求項１から１０のいずれか一項に記載のＴＩ宿主細胞。
【請求項12】
ハムスター宿主細胞、ヒト宿主細胞、ラット宿主細胞、又はマウス宿主細胞である、請求項１１に記載のＴＩ宿主細胞。
【請求項13】
チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）宿主細胞、ＣＨＯ Ｋ１宿主細胞、ＣＨＯ Ｋ１ ＳＶ宿主細胞、ＤＧ４４宿主細胞、ＤＵＫＸＢ－１ １宿主細胞、ＣＨＯＫ１ Ｓ宿主細胞、又はＣＨＯ Ｋ１Ｍ宿主細胞である、請求項１１又は１２に記載のＴＩ宿主細胞。
【請求項14】
目的の配列（ＳＯＩ）を発現するＴＩ宿主細胞を調製する方法であって、ａ）取り込み部位に取り込まれた外因性ヌクレオチド配列を含むＴＩ宿主細胞を提供することであって、取り込み部位が：
ａ．ＮＷ＿００６８７４０４７．１のヌクレオチド４１１９０－４５２６９の全部若しくは一部、ＮＷ＿００６８８４５９２．１のヌクレオチド６３５９０－２０７９１１の全部若しくは一部、ＮＷ＿００６８８１２９６．１のヌクレオチド２５３８３１－４９１９０９の全部若しくは一部、ＮＷ＿００３６１６４１２．１のヌクレオチド６９３０３－７９７６８の全部若しくは一部、ＮＷ＿００３６１５０６３．１のヌクレオチド２９３４８１－３１５２６５の全部若しくは一部、ＮＷ＿００６８８２９３６．１のヌクレオチド２６５０４４３－２６６２０５４の全部若しくは一部、又はＮＷ＿００３６１５４１１．１のヌクレオチド８２２１４－９７７０５の全部若しくは一部と少なくとも約９０％相同であるか；或いは
ｂ．ＮＷ＿００６８７４０４７．１のヌクレオチド４５２７０－４５４９０の全部若しくは一部、ＮＷ＿００６８８４５９２．１のヌクレオチド２０７９１２－７９２３７４の全部若しくは一部、ＮＷ＿００６８８１２９６．１のヌクレオチド４９１９１０－６６７８１３の全部若しくは一部、ＮＷ＿００３６１６４１２．１のヌクレオチド７９７６９－１０００５９の全部若しくは一部、ＮＷ＿００３６１５０６３．１のヌクレオチド３１５２６６－３６２４４２の全部若しくは一部、ＮＷ＿００６８８２９３６．１のヌクレオチド２６６２０５５－２７０１７６８の全部若しくは一部、又はＮＷ＿００３６１５４１１．１のヌクレオチド９７７０６－１０５１１７の全部若しくは一部と少なくとも約９０％相同である
配列内部にあり；外因性ヌクレオチド配列が、４つ以上の不適合性ＲＲＳを含む、ＴＩ宿主細胞を提供することと；
ｂ）ａ）で提供された細胞に少なくとも３つのベクターを導入することであって、各ベクターが：
ａ．取り込まれた外因性ヌクレオチド配列上の２つの連続して配向されたＲＲＳと一致する２つのＲＲＳ；及び
ｂ．少なくとも１つの外因性ＳＯＩと少なくとも１つの第２の選択マーカーの側面に位置するＲＲＳの各対
を含む、ａ）で提供された細胞に少なくとも３つのベクターを導入することと；
ｃ）リコンビナーゼ又はリコンビナーゼをコードする核酸を導入することであって、リコンビナーゼがＲＲＳを認識する、リコンビナーゼ又はリコンビナーゼをコードする核酸を導入することと；
ｄ）選択マーカーを発現するＴＩ細胞を選択し、それによってＳＯＩを発現するＴＩ宿主細胞を単離することと
を含む方法。
【請求項15】
リコンビナーゼが、Ｃｒｅリコンビナーゼ、ＦＬＰリコンビナーゼ、Ｂｘｂｌインテグラーゼ、及びφＣ３１インテグラーゼから選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項16】
ＳＯＩが、単鎖抗体、抗体軽鎖、抗体重鎖、単鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）、又はＦｃ融合タンパク質をコードする、請求項１４又は１５に記載の方法。
【請求項17】
ＴＩ宿主細胞が、哺乳動物宿主細胞である、請求項１４から１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項18】
ＴＩ宿主細胞が、ハムスター宿主細胞、ヒト宿主細胞、ラット宿主細胞、又はマウス宿主細胞である、請求項１７に記載の方法。
【請求項19】
ＴＩ宿主細胞が、ＣＨＯ宿主細胞、ＣＨＯ Ｋ１宿主細胞、ＣＨＯ Ｋ１ＳＶ宿主細胞、ＤＧ４４宿主細胞、ＤＵＫＸＢ－１ １宿主細胞、ＣＨＯＫ１Ｓ宿主細胞、又はＣＨＯ Ｋ１Ｍ宿主細胞である、請求項１７又は１８に記載の方法。
【請求項20】
ベクターが、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、取り込みファージベクター、非ウイルス性ベクター、トランスポゾン及び／又はトランスポゼースベクター、インテグラーゼ基質、並びにプラスミドからなる群から選択される、請求項１４から１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項21】
ＳＯＩを発現させるための方法であって、ａ）取り込み部位に取り込まれた外因性ヌクレオチド配列を含むＴＩ宿主細胞を提供することであって、取り込み部位が：
ａ．ＮＷ＿００６８７４０４７．１のヌクレオチド４１１９０－４５２６９の全部若しくは一部、ＮＷ＿００６８８４５９２．１のヌクレオチド６３５９０－２０７９１１の全部若しくは一部、ＮＷ＿００６８８１２９６．１のヌクレオチド２５３８３１－４９１９０９の全部若しくは一部、ＮＷ＿００３６１６４１２．１のヌクレオチド６９３０３－７９７６８の全部若しくは一部、ＮＷ＿００３６１５０６３．１のヌクレオチド２９３４８１－３１５２６５の全部若しくは一部、ＮＷ＿００６８８２９３６．１のヌクレオチド２６５０４４３－２６６２０５４の全部若しくは一部、又はＮＷ＿００３６１５４１１．１のヌクレオチド８２２１４－９７７０５の全部若しくは一部と少なくとも約９０％相同であるか；或いは
ｂ．ＮＷ＿００６８７４０４７．１のヌクレオチド４５２７０－４５４９０の全部若しくは一部、ＮＷ＿００６８８４５９２．１のヌクレオチド２０７９１２－７９２３７４の全部若しくは一部、ＮＷ＿００６８８１２９６．１のヌクレオチド４９１９１０－６６７８１３の全部若しくは一部、ＮＷ＿００３６１６４１２．１のヌクレオチド７９７６９－１０００５９の全部若しくは一部、ＮＷ＿００３６１５０６３．１のヌクレオチド３１５２６６－３６２４４２の全部若しくは一部、ＮＷ＿００６８８２９３６．１のヌクレオチド２６６２０５５－２７０１７６８の全部若しくは一部、又はＮＷ＿００３６１５４１１．１のヌクレオチド９７７０６－１０５１１７の全部若しくは一部と少なくとも約９０％相同である
配列内部にあり；外因性ヌクレオチド配列が、４つ以上の不適合性ＲＲＳを含む、ＴＩ宿主細胞を提供することと；
ｂ）ａ）で提供された細胞に少なくとも３つのベクターを導入することであって、各ベクターが：
ａ．取り込まれた外因性ヌクレオチド配列上の２つの連続して配向されたＲＲＳと一致する２つのＲＲＳ；及び
ｂ．少なくとも１つの外因性ＳＯＩと少なくとも１つの第２の選択マーカーの側面に位置するＲＲＳの各対
を含む、少なくとも３つのベクターに導入することと；
ｃ）リコンビナーゼ又はリコンビナーゼをコードする核酸を導入することであって、リコンビナーゼがＲＲＳを認識する、リコンビナーゼ又はリコンビナーゼをコードする核酸を導入することと；
ｄ）選択マーカーを発現するＴＩ細胞を選択し、それによってＳＯＩを発現するＴＩ宿主細胞を単離することと；
ｅ）ｄ）の細胞を、ＳＯＩの発現に適した条件下で培養し、そこから発現されたタンパク質を回収することと
を含む方法。
【請求項22】
リコンビナーゼが、Ｃｒｅリコンビナーゼ、ＦＬＰリコンビナーゼ、Ｂｘｂｌインテグラーゼ、及びφＣ３１インテグラーゼから選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項23】
ＳＯＩが、単鎖抗体、抗体軽鎖、抗体重鎖、単鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）、又はＦｃ融合タンパク質をコードする、請求項２１又は２２に記載の方法。
【請求項24】
ＴＩ宿主細胞が、哺乳動物宿主細胞である、請求項２１から２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項25】
ＴＩ宿主細胞が、ハムスター宿主細胞、ヒト宿主細胞、ラット宿主細胞、又はマウス宿主細胞である、請求項２４に記載の方法。
【請求項26】
ＴＩ宿主細胞が、ＣＨＯ宿主細胞、ＣＨＯ Ｋ１宿主細胞、ＣＨＯ Ｋ１ＳＶ宿主細胞、ＤＧ４４宿主細胞、ＤＵＫＸＢ－１ １宿主細胞、ＣＨＯＫ１Ｓ宿主細胞、又はＣＨＯ Ｋ１Ｍ宿主細胞である、請求項２４又は２５に記載の方法。
【請求項27】
ベクターが、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、取り込みファージベクター、非ウイルス性ベクター、トランスポゾン及び／又はトランスポゼースベクター、インテグラーゼ基質、並びにプラスミドからなる群から選択される、請求項２１から２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項28】
抗体をコードする核酸を含む組み換え哺乳動物細胞を生成するための方法であって、ａ）４つ以上の不適合性ＲＲＳを含む哺乳動物細胞のゲノムの所定の遺伝子座に組み込まれた少なくとも単一の外因性核酸を含む哺乳動物細胞を提供することと；
ｂ）ａ）の組み換え哺乳動物細胞に少なくとも３つのベクターを導入することであって、各ベクターが、哺乳動物細胞のゲノムの所定の遺伝子座に組み込まれた外因性核酸に含まれる不適合性ＲＲＳのうちの２つと一致する一対の不適合性ＲＲＳと、１つ又は複数のＳＯＩの側面に位置する不適合性ＲＲＳの各対とを含み、ＳＯＩが抗体及び／又は１つ若しくは複数の選択マーカーをコードする、少なくとも３つのベクターを導入することと；
ｃ）１つ又は複数のリコンビナーゼを、ＳＯＩ及び／又は選択マーカーを含む少なくとも３つのベクターの導入と同時に又は連続して導入することと；
ｄ）ＳＯＩ及び／又は選択マーカーのうちの１つ又は複数を発現する細胞を選択することと
を含み、それによって抗体をコードする核酸ＳＯＩを含む組み換え哺乳動物細胞を生成する、方法。
【請求項29】
外因性核酸が、ａ．ＮＷ＿００６８７４０４７．１のヌクレオチド４１１９０－４５２６９の全部若しくは一部、ＮＷ＿００６８８４５９２．１のヌクレオチド６３５９０－２０７９１１の全部若しくは一部、ＮＷ＿００６８８１２９６．１のヌクレオチド２５３８３１－４９１９０９の全部若しくは一部、ＮＷ＿００３６１６４１２．１のヌクレオチド６９３０３－７９７６８の全部若しくは一部、ＮＷ＿００３６１５０６３．１のヌクレオチド２９３４８１－３１５２６５の全部若しくは一部、ＮＷ＿００６８８２９３６．１のヌクレオチド２６５０４４３－２６６２０５４の全部若しくは一部、又はＮＷ＿００３６１５４１１．１のヌクレオチド８２２１４－９７７０５の全部若しくは一部と少なくとも約９０％相同であるか；或いは
ｂ．ＮＷ＿００６８７４０４７．１のヌクレオチド４５２７０－４５４９０の全部若しくは一部、ＮＷ＿００６８８４５９２．１のヌクレオチド２０７９１２－７９２３７４の全部若しくは一部、ＮＷ＿００６８８１２９６．１のヌクレオチド４９１９１０－６６７８１３の全部若しくは一部、ＮＷ＿００３６１６４１２．１のヌクレオチド７９７６９－１０００５９の全部若しくは一部、ＮＷ＿００３６１５０６３．１のヌクレオチド３１５２６６－３６２４４２の全部若しくは一部、ＮＷ＿００６８８２９３６．１のヌクレオチド２６６２０５５－２７０１７６８の全部若しくは一部、又はＮＷ＿００３６１５４１１．１のヌクレオチド９７７０６－１０５１１７の全部若しくは一部と少なくとも約９０％相同である
遺伝子座に組み込まれる、請求項２８に記載の方法。
【請求項30】
リコンビナーゼが、Ｃｒｅリコンビナーゼ、ＦＬＰリコンビナーゼ、Ｂｘｂｌインテグラーゼ、及びφＣ３１インテグラーゼから選択される、請求項２８又は２９に記載の方法。
【請求項31】
ＳＯＩが、単鎖抗体、抗体軽鎖、抗体重鎖、単鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）、又はＦｃ融合タンパク質をコードする、請求項２８から３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項32】
哺乳動物細胞が、ハムスター宿主細胞、ヒト宿主細胞、ラット宿主細胞、又はマウス宿主細胞である、請求項２８に記載の方法。
【請求項33】
哺乳動物細胞が、ＣＨＯ宿主細胞、ＣＨＯ Ｋ１宿主細胞、ＣＨＯ Ｋ１ＳＶ宿主細胞、ＤＧ４４宿主細胞、ＤＵＫＸＢ－１ １宿主細胞、ＣＨＯＫ１Ｓ宿主細胞、又はＣＨＯ Ｋ１Ｍ宿主細胞である、請求項３２に記載の方法。
【請求項34】
ベクターが、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、取り込みファージベクター、非ウイルス性ベクター、トランスポゾン及び／又はトランスポゼースベクター、インテグラーゼ基質、並びにプラスミドからなる群から選択される、請求項２８から３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項35】
１つ又は複数の抗体をコードする核酸を含む組み換え哺乳動物細胞を生成するための方法であって、ａ）哺乳動物細胞のゲノムの所定の遺伝子座に組み込まれた少なくとも２つの外因性核酸を含む哺乳動物細胞を提供することであって、各外因性核酸が、４つ以上の不適合性ＲＲＳを含み、外因性核酸が、同じ又は異なるＲＲＳを含むことができる、哺乳動物細胞を提供することと；
ｂ）ａ）の組み換え哺乳動物細胞に少なくとも３つのベクターを導入することであって、各ベクターが、哺乳動物細胞のゲノムの所定の遺伝子座に組み込まれた外因性核酸の一方又は両方に含まれる不適合性ＲＲＳのうちの２つと一致する一対の不適合性ＲＲＳと、１つ又は複数のＳＯＩの側面に位置する不適合性ＲＲＳの各対とを含み、ＳＯＩが、抗体及び／又は１つ若しくは複数の選択マーカーをコードする、少なくとも３つのベクターを導入することと；
ｃ）１つ又は複数のリコンビナーゼを、ＳＯＩ及び／又は選択マーカーを含む少なくとも３つのベクターの導入と同時に又は連続して導入することと；
ｄ）ＳＯＩ及び／又は選択マーカーのうちの１つ又は複数を発現する細胞を選択することと
を含み、それによって抗体をコードする核酸ＳＯＩを含む組み換え哺乳動物細胞を生成する、方法。
【請求項36】
外因性核酸が、ａ．ＮＷ＿００６８７４０４７．１のヌクレオチド４１１９０－４５２６９の全部若しくは一部、ＮＷ＿００６８８４５９２．１のヌクレオチド６３５９０－２０７９１１の全部若しくは一部、ＮＷ＿００６８８１２９６．１のヌクレオチド２５３８３１－４９１９０９の全部若しくは一部、ＮＷ＿００３６１６４１２．１のヌクレオチド６９３０３－７９７６８の全部若しくは一部、ＮＷ＿００３６１５０６３．１のヌクレオチド２９３４８１－３１５２６５の全部若しくは一部、ＮＷ＿００６８８２９３６．１のヌクレオチド２６５０４４３－２６６２０５４の全部若しくは一部、又はＮＷ＿００３６１５４１１．１のヌクレオチド８２２１４－９７７０５の全部若しくは一部と少なくとも約９０％相同であるか；或いは
ｂ．ＮＷ＿００６８７４０４７．１のヌクレオチド４５２７０－４５４９０の全部若しくは一部、ＮＷ＿００６８８４５９２．１のヌクレオチド２０７９１２－７９２３７４の全部若しくは一部、ＮＷ＿００６８８１２９６．１のヌクレオチド４９１９１０－６６７８１３の全部若しくは一部、ＮＷ＿００３６１６４１２．１のヌクレオチド７９７６９－１０００５９の全部若しくは一部、ＮＷ＿００３６１５０６３．１のヌクレオチド３１５２６６－３６２４４２の全部若しくは一部、ＮＷ＿００６８８２９３６．１のヌクレオチド２６６２０５５－２７０１７６８の全部若しくは一部、又はＮＷ＿００３６１５４１１．１のヌクレオチド９７７０６－１０５１１７の全部若しくは一部と少なくとも約９０％相同である
遺伝子座から選択される別個の遺伝子座に組み込まれる、請求項３５に記載の方法。
【請求項37】
リコンビナーゼが、Ｃｒｅリコンビナーゼ、ＦＬＰリコンビナーゼ、Ｂｘｂｌインテグラーゼ、及びφＣ３１インテグラーゼから選択される、請求項３５又は３６に記載の方法。
【請求項38】
ＳＯＩが、単鎖抗体、抗体軽鎖、抗体重鎖、単鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）、又はＦｃ融合タンパク質をコードする、請求項３５から３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項39】
哺乳動物細胞が、ハムスター宿主細胞、ヒト宿主細胞、ラット宿主細胞、又はマウス宿主細胞である、請求項３５に記載の方法。
【請求項40】
哺乳動物細胞が、ＣＨＯ宿主細胞、ＣＨＯ Ｋ１宿主細胞、ＣＨＯ Ｋ１ＳＶ宿主細胞、ＤＧ４４宿主細胞、ＤＵＫＸＢ－１ １宿主細胞、ＣＨＯＫ１Ｓ宿主細胞、又はＣＨＯ Ｋ１Ｍ宿主細胞である、請求項３９に記載の方法。
【請求項41】
ベクターが、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、取り込みファージベクター、非ウイルス性ベクター、トランスポゾン及び／又はトランスポゼースベクター、インテグラーゼ基質、並びにプラスミドからなる群から選択される、請求項３５から４０のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、２０２１年１２月２２日に出願された米国特許仮出願第６３／２９２８６９号の優先権を主張するものであり、この米国特許仮出願の開示内容は、その全体が参照により本明細書に援用される。
本出願は、２０２１年１２月２２日に出願された米国特許仮出願第６３／２９２８６９号の優先権を主張するものであり、この米国特許仮出願の開示内容は、その全体が参照により本明細書に援用される。
【0002】
配列表
ＷＩＰＯ標準ＳＴ．２６の規則に準拠する配列表が、参照により本明細書に援用される。前記配列表は、ＸＭＬとしてコードされたＡＳＣＩＩ形式で、ＥＦＳ－Ｗｅｂを介して電子文書として提出された。２０２２年１２月２１日に作成されたこの電子文書は、「００Ｂ２０６＿１３１０＿ＳＴ２６．ｘｍｌ」と命名され、大きさは９８３，８８０バイトである。
ＷＩＰＯ標準ＳＴ．２６の規則に準拠する配列表が、参照により本明細書に援用される。前記配列表は、ＸＭＬとしてコードされたＡＳＣＩＩ形式で、ＥＦＳ－Ｗｅｂを介して電子文書として提出された。２０２２年１２月２１日に作成されたこの電子文書は、「００Ｂ２０６＿１３１０＿ＳＴ２６．ｘｍｌ」と命名され、大きさは９８３，８８０バイトである。
【0003】
技術分野
ここに開示される主題は、多重ベクターリコンビナーゼ媒介カセット交換手法を用いて、組み換えタンパク質、例えば、モノクローナル抗体、並びにそれから得られる組成物、例えば、二重特異性抗体、及び他の複合フォーマットのタンパク質、例えば、膜タンパク質複合体、及び発現が困難な他の分子を発現する生成宿主細胞のために、目的の配列の標的化取り込みを達成する細胞株の開発に関する。
ここに開示される主題は、多重ベクターリコンビナーゼ媒介カセット交換手法を用いて、組み換えタンパク質、例えば、モノクローナル抗体、並びにそれから得られる組成物、例えば、二重特異性抗体、及び他の複合フォーマットのタンパク質、例えば、膜タンパク質複合体、及び発現が困難な他の分子を発現する生成宿主細胞のために、目的の配列の標的化取り込みを達成する細胞株の開発に関する。
【背景技術】
【0004】
細胞生物学及び免疫学における急速な進歩により、がん、心血管疾患、及び代謝疾患を含む様々な疾患のための、新規の治療用組み換えタンパク質、例えば、モノクローナル抗体、二重特異性抗体、及び複雑なフォーマットのタンパク質の開発に対する需要がますます高まっている。これら生物医薬品の候補は、一般的には、目的のタンパク質を発現することのできる市販の細胞株によって製造される。例えば、治療用モノクローナル抗体又は二重特異性抗体、並びに近年ではさらに複雑なフォーマットのタンパク質を生成するために、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞が広く適合されてきた。
【0005】
市販の細胞株を開発するための従来の戦略では、通常、目的のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を、無作為に又は特定の（「標的化」）位置に取り込み、続いてそのようなポリペプチドを生成する細胞株を選択及び単離することを目的とした努力が繰り返されている。しかしながら、当技術分野には、リソースを保存するだけでなく、従来の方法と比べて改善された発現レベル、生成物の品質特性、及び生成培養性能を呈する細胞株を生成する新規の細胞株開発戦略が必要とされている。
【発明の概要】
【0006】
ここに開示される主題は、組み換えタンパク質、例えば、モノクローナル抗体、並びにそれから得られる組成物、例えば、二重特異性抗体、及び他の複雑なフォーマットのタンパク質、例えば、膜タンパク質複合体、及び発現が困難な他の分子を発現する生成宿主細胞のための、目的の配列の標的化取り込みを達成する多重ベクターリコンビナーゼ媒介カセット交換（多重ベクターＲＭＣＥ）手法に関する。
【0007】
一部の実施形態では、本開示は、ａ）ＮＷ＿００６８７４０４７．１のヌクレオチド４１１９０－４５２６９の全部若しくは一部、ＮＷ＿００６８８４５９２．１のヌクレオチド６３５９０－２０７９１１の全部若しくは一部、ＮＷ＿００６８８１２９６．１のヌクレオチド２５３８３１－４９１９０９の全部若しくは一部、ＮＷ＿００３６１６４１２．１のヌクレオチド６９３０３－７９７６８の全部若しくは一部、ＮＷ＿００３６１５０６３．１のヌクレオチド２９３４８１－３１５２６５の全部若しくは一部、ＮＷ＿００６８８２９３６．１のヌクレオチド２６５０４４３－２６６２０５４の全部若しくは一部、又はＮＷ＿００３６１５４１１．１のヌクレオチド８２２１４－９７７０５の全部若しくは一部と少なくとも約９０％相同であるか；或いはｂ）ＮＷ＿００６８７４０４７．１のヌクレオチド４５２７０－４５４９０の全部若しくは一部、ＮＷ＿００６８８４５９２．１のヌクレオチド２０７９１２－７９２３７４の全部若しくは一部、ＮＷ＿００６８８１２９６．１のヌクレオチド４９１９１０－６６７８１３の全部若しくは一部、ＮＷ＿００３６１６４１２．１のヌクレオチド７９７６９－１０００５９の全部若しくは一部、ＮＷ＿００３６１５０６３．１のヌクレオチド３１５２６６－３６２４４２の全部若しくは一部、ＮＷ＿００６８８２９３６．１のヌクレオチド２６６２０５５－２７０１７６８の全部若しくは一部、又はＮＷ＿００３６１５４１１．１のヌクレオチド９７７０６－１０５１１７の全部若しくは一部と少なくとも約９０％相同である配列内部にある取り込み部位に取り込まれた外因性ヌクレオチド配列を含むＴＩ宿主細胞を目的とし、外因性ヌクレオチド配列は、４つ以上の不適合性組み換え認識配列（ＲＲＳ）を含む。一部の実施形態では、ＲＲＳは、ＬｏｘＰ配列、ＬｏｘＰ Ｌ３配列、ＬｏｘＰ ２Ｌ配列、ＬｏｘＦａｓ配列、Ｌｏｘ５ ｌ ｌ配列、Ｌｏｘ２２７２配列、Ｌｏｘ２３７２配列、Ｌｏｘ５ ｌ７ｌ配列、Ｌｏｘｍ２配列、Ｌｏｘ７ｌ配列、Ｌｏｘ６６配列、ＦＲＴ配列、Ｂｘｂｌ ａｔｔＰ配列、Ｂｘｂｌ ａｔｔＢ配列、φＣ３１ ａｔｔＰ配列、及びφＣ３１ ａｔｔＢ配列からなる群から選択される。一部の実施形態では、ＲＲＳは、Ｃｒｅリコンビナーゼ、ＦＬＰリコンビナーゼ、Ｂｘｂｌインテグラーゼ、及びφＣ３１インテグラーゼからなる群から選択されるリコンビナーゼによって認識される。一部の実施形態では、外因性ヌクレオチド配列は、最も５’側にあるＲＲＳと３’方向にある次のＲＲＳとの間に位置する選択マーカーを含む。一部の実施形態では、選択マーカーは、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＨＹＧ）、ネオマイシン、Ｇ４１８（ＡＰＨ）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、グルタミンシンセターゼ（ＧＳ）、アスパラギンシンセターゼ、トリプトファンシンセターゼ（インドール）、ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ（ヒスチジノールＤ）、ブラストサイジン、ブレオマイシン、フレオマイシン、クロラムフェニコール、ゼオシン、及びミコフェノール酸からなる群から選択される。一部の実施形態では、細胞は、第２の選択マーカーを含み、第１の選択マーカーと第２の選択マーカーとは異なる。一部の実施形態では、第２の選択マーカーは、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＨＹＧ）、ネオマイシン、Ｇ４１８（ＡＰＨ）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、グルタミンシンセターゼ（ＧＳ）、アスパラギンシンセターゼ、トリプトファンシンセターゼ（インドール）、ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ（ヒスチジノールＤ）、ブラストサイジン、ブレオマイシン、フレオマイシン、クロラムフェニコール、ゼオシン、及びミコフェノール酸からなる群から選択される。一部の実施形態では、細胞は、第３の選択マーカーと配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を含み、ＩＲＥＳは、第３の選択マーカーに作用可能に連結している。一部の実施形態では、第３の選択マーカーは、第１の選択マーカー又は第２の選択マーカーとは異なる。一部の実施形態では、第３の選択マーカーは、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）マーカー、強化ＧＦＰ（ｅＧＦＰ）マーカー、合成ＧＦＰマーカー、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）マーカー、強化ＹＦＰ（ｅＹＦＰ）マーカー、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）マーカー、ｍＰｌｕｍマーカー、ｍＣｈｅｒｒｙマーカー、ｔｄＴｏｍａｔｏマーカー、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙマーカー、Ｊ－ｒｅｄマーカー、ＤｓＲｅｄ－モノマーマーカー、ｍＯｒａｎｇｅマーカー、ｍＫＯマーカー、ｍＣｉｔｒｉｎｅマーカー、Ｖｅｎｕｓマーカー、ＹＰｅｔマーカー、Ｅｍｅｒａｌｄ６マーカー、ＣｙＰｅｔマーカー、ｍＣＦＰｍマーカー、Ｃｅｒｕｌｅａｎマーカー、及びＴ－Ｓａｐｐｈｉｒｅマーカーからなる群から選択される。一部の実施形態では、ＴＩ宿主細胞は、哺乳動物宿主細胞である。一部の実施形態では、ＴＩ宿主細胞は、ハムスター宿主細胞、ヒト宿主細胞、ラット宿主細胞、又はマウス宿主細胞である。一部の実施形態では、ＴＩ宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）宿主細胞、ＣＨＯ Ｋ１宿主細胞、ＣＨＯ Ｋ１ ＳＶ宿主細胞、ＤＧ４４宿主細胞、ＤＵＫＸＢ－１ １宿主細胞、ＣＨＯＫ１ Ｓ宿主細胞、又はＣＨＯ Ｋ１Ｍ宿主細胞である。
【0008】
一部の実施形態では、本開示は、ＳＯＩを発現するＴＩ宿主細胞を調製する方法を目的とし、この方法は、ａ）（Ａ）ＮＷ＿００６８７４０４７．１のヌクレオチド４１１９０－４５２６９の全部若しくは一部、ＮＷ＿００６８８４５９２．１のヌクレオチド６３５９０－２０７９１１の全部若しくは一部、ＮＷ＿００６８８１２９６．１のヌクレオチド２５３８３１－４９１９０９の全部若しくは一部、ＮＷ＿００３６１６４１２．１のヌクレオチド６９３０３－７９７６８の全部若しくは一部、ＮＷ＿００３６１５０６３．１のヌクレオチド２９３４８１－３１５２６５の全部若しくは一部、ＮＷ＿００６８８２９３６．１のヌクレオチド２６５０４４３－２６６２０５４の全部若しくは一部、又はＮＷ＿００３６１５４１１．１のヌクレオチド８２２１４－９７７０５の全部若しくは一部と少なくとも約９０％相同であるか；或いは（Ｂ）ＮＷ＿００６８７４０４７．１のヌクレオチド４５２７０－４５４９０の全部若しくは一部、ＮＷ＿００６８８４５９２．１のヌクレオチド２０７９１２－７９２３７４の全部若しくは一部、ＮＷ＿００６８８１２９６．１のヌクレオチド４９１９１０－６６７８１３の全部若しくは一部、ＮＷ＿００３６１６４１２．１のヌクレオチド７９７６９－１０００５９の全部若しくは一部、ＮＷ＿００３６１５０６３．１のヌクレオチド３１５２６６－３６２４４２の全部若しくは一部、ＮＷ＿００６８８２９３６．１のヌクレオチド２６６２０５５－２７０１７６８の全部若しくは一部、又はＮＷ＿００３６１５４１１．１のヌクレオチド９７７０６－１０５１１７の全部若しくは一部と少なくとも約９０％相同である配列内部にある取り込み部位に取り込まれた外因性ヌクレオチド配列を含み；外因性ヌクレオチド配列が４つ以上の不適合性組み換え認識配列（ＲＲＳ）を含む、ＴＩ宿主細胞を提供することと；ｂ）ａ）で提供された細胞に少なくとも３つのベクターを導入することであって、各ベクターが：（Ａ）取り込まれた外因性ヌクレオチド配列上の２つの連続して配向されたＲＲＳと一致する２つのＲＲＳ；及び（Ｂ）少なくとも１つの外因性ＳＯＩと少なくとも１つの第２の選択マーカーの側面に位置するＲＲＳの各対を含む、少なくとも３つのベクターを導入することと；ｃ）リコンビナーゼ又はリコンビナーゼをコードする核酸を導入することであって、リコンビナーゼがＲＲＳを認識する、リコンビナーゼ又はリコンビナーゼをコードする核酸を導入することと；ｄ）選択マーカーを発現するＴＩ細胞を選択し、それによってＳＯＩを発現するＴＩ宿主細胞を単離することとを含む。一部の実施形態では、リコンビナーゼは、Ｃｒｅリコンビナーゼ、ＦＬＰリコンビナーゼ、Ｂｘｂｌインテグラーゼ、及びφＣ３１インテグラーゼから選択される。一部の実施形態では、ＳＯＩは、単鎖抗体、抗体軽鎖、抗体重鎖、単鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）、又はＦｃ融合タンパク質をコードする。一部の実施形態では、ＴＩ宿主細胞は、哺乳動物宿主細胞である。一部の実施形態では、ＴＩ宿主細胞は、ハムスター宿主細胞、ヒト宿主細胞、ラット宿主細胞、又はマウス宿主細胞である。一部の実施形態では、ＴＩ宿主細胞は、ＣＨＯ宿主細胞、ＣＨＯ Ｋ１宿主細胞、ＣＨＯ Ｋ１ＳＶ宿主細胞、ＤＧ４４宿主細胞、ＤＵＫＸＢ－１ １宿主細胞、ＣＨＯＫ１Ｓ宿主細胞、又はＣＨＯ Ｋ１Ｍ宿主細胞である。一部の実施形態では、ベクターは、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、取り込みファージベクター、非ウイルス性ベクター、トランスポゾン及び／又はトランスポゼースベクター、インテグラーゼ基質、並びにプラスミドからなる群から選択される。
【0009】
一部の実施形態では、本開示は、ＳＯＩを発現させるための方法を目的とし、この方法は：ａ）（Ａ）ＮＷ＿００６８７４０４７．１のヌクレオチド４１１９０－４５２６９の全部若しくは一部、ＮＷ＿００６８８４５９２．１のヌクレオチド６３５９０－２０７９１１の全部若しくは一部、ＮＷ＿００６８８１２９６．１のヌクレオチド２５３８３１－４９１９０９の全部若しくは一部、ＮＷ＿００３６１６４１２．１のヌクレオチド６９３０３－７９７６８の全部若しくは一部、ＮＷ＿００３６１５０６３．１のヌクレオチド２９３４８１－３１５２６５の全部若しくは一部、ＮＷ＿００６８８２９３６．１のヌクレオチド２６５０４４３－２６６２０５４の全部若しくは一部、又はＮＷ＿００３６１５４１１．１のヌクレオチド８２２１４－９７７０５の全部若しくは一部と少なくとも約９０％相同であるか；或いは（Ｂ）ＮＷ＿００６８７４０４７．１のヌクレオチド４５２７０－４５４９０の全部若しくは一部、ＮＷ＿００６８８４５９２．１のヌクレオチド２０７９１２－７９２３７４の全部若しくは一部、ＮＷ＿００６８８１２９６．１のヌクレオチド４９１９１０－６６７８１３の全部若しくは一部、ＮＷ＿００３６１６４１２．１のヌクレオチド７９７６９－１０００５９の全部若しくは一部、ＮＷ＿００３６１５０６３．１のヌクレオチド３１５２６６－３６２４４２の全部若しくは一部、ＮＷ＿００６８８２９３６．１のヌクレオチド２６６２０５５－２７０１７６８の全部若しくは一部、又はＮＷ＿００３６１５４１１．１のヌクレオチド９７７０６－１０５１１７の全部若しくは一部と少なくとも約９０％相同である配列内部にある取り込み部位に取り込まれた外因性ヌクレオチド配列を含み；外因性ヌクレオチド配列が４つ以上の不適合性組み換え認識配列（ＲＲＳ）を含む、ＴＩ宿主細胞を提供することと；ｂ）ａ）で提供された細胞に少なくとも３つのベクターを導入することであって、各ベクターが：（Ａ）取り込まれた外因性ヌクレオチド配列上の２つの連続して配向されたＲＲＳと一致する２つのＲＲＳ；及び（Ｂ）少なくとも１つの外因性ＳＯＩと少なくとも１つの第２の選択マーカーの側面に位置するＲＲＳの各対を含む、少なくとも３つのベクターを導入することと；ｃ）リコンビナーゼ又はリコンビナーゼをコードする核酸を導入することであって、リコンビナーゼがＲＲＳを認識する、リコンビナーゼ又はリコンビナーゼをコードする核酸を導入することと；ｄ）選択マーカーを発現するＴＩ細胞を選択し、それによってＳＯＩを発現するＴＩ宿主細胞を単離することと；ｅ）ｄ）の細胞を、ＳＯＩの発現に適した条件下で培養し、そこから発現されたタンパク質を回収することとを含む。一部の実施形態では、リコンビナーゼは、Ｃｒｅリコンビナーゼ、ＦＬＰリコンビナーゼ、Ｂｘｂｌインテグラーゼ、及びφＣ３１インテグラーゼから選択される。一部の実施形態では、ＳＯＩは、単鎖抗体、抗体軽鎖、抗体重鎖、単鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）、又はＦｃ融合タンパク質をコードする。一部の実施形態では、ＴＩ宿主細胞は、哺乳動物宿主細胞である。一部の実施形態では、ＴＩ宿主細胞は、ハムスター宿主細胞、ヒト宿主細胞、ラット宿主細胞、又はマウス宿主細胞である。一部の実施形態では、ＴＩ宿主細胞は、ＣＨＯ宿主細胞、ＣＨＯ Ｋ１宿主細胞、ＣＨＯ Ｋ１ＳＶ宿主細胞、ＤＧ４４宿主細胞、ＤＵＫＸＢ－１ １宿主細胞、ＣＨＯＫ１Ｓ宿主細胞、又はＣＨＯ Ｋ１Ｍ宿主細胞である。一部の実施形態では、ベクターは、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、取り込みファージベクター、非ウイルス性ベクター、トランスポゾン及び／又はトランスポゼースベクター、インテグラーゼ基質、並びにプラスミドからなる群から選択される。
【0010】
一部の実施形態では、本開示は、抗体をコードする核酸を含む組み換え哺乳動物細胞を生成するための方法を目的とし、この方法は、ａ）４つ以上の不適合性ＲＲＳを含む哺乳動物細胞のゲノムの所定の遺伝子座に組み込まれた少なくとも単一の外因性核酸を含む哺乳動物細胞を提供することと；ｂ）ａ）の組み換え哺乳動物細胞に少なくとも３つのベクターを導入することであって、各ベクターが、哺乳動物細胞のゲノムの所定の遺伝子座に組み込まれた外因性核酸に含まれる不適合性ＲＲＳのうちの２つと一致する一対の不適合性ＲＲＳを含み、不適合性ＲＲＳの各対が、１つ又は複数のＳＯＩの側面に位置し、ＳＯＩが抗体及び／又は１つ若しくは複数の選択マーカーをコードする、少なくとも３つのベクターを導入することと；ｃ）１つ又は複数のリコンビナーゼを、ＳＯＩ及び／又は選択マーカーを含む少なくとも３つのベクターの導入と同時に又は連続して導入することと；ｄ）ＳＯＩ及び／又は選択マーカーのうちの１つ又は複数を発現する細胞を選択することとを含み、それによって抗体をコードする核酸ＳＯＩを含む組み換え哺乳動物細胞を生成する。一部の実施形態では、外因性核酸は、（Ａ）ＮＷ＿００６８７４０４７．１のヌクレオチド４１１９０－４５２６９の全部若しくは一部、ＮＷ＿００６８８４５９２．１のヌクレオチド６３５９０－２０７９１１の全部若しくは一部、ＮＷ＿００６８８１２９６．１のヌクレオチド２５３８３１－４９１９０９の全部若しくは一部、ＮＷ＿００３６１６４１２．１のヌクレオチド６９３０３－７９７６８の全部若しくは一部、ＮＷ＿００３６１５０６３．１のヌクレオチド２９３４８１－３１５２６５の全部若しくは一部、ＮＷ＿００６８８２９３６．１のヌクレオチド２６５０４４３－２６６２０５４の全部若しくは一部、又はＮＷ＿００３６１５４１１．１のヌクレオチド８２２１４－９７７０５の全部若しくは一部と少なくとも約９０％相同であるか；或いは（Ｂ）ＮＷ＿００６８７４０４７．１のヌクレオチド４５２７０－４５４９０の全部若しくは一部、ＮＷ＿００６８８４５９２．１のヌクレオチド２０７９１２－７９２３７４の全部若しくは一部、ＮＷ＿００６８８１２９６．１のヌクレオチド４９１９１０－６６７８１３の全部若しくは一部、ＮＷ＿００３６１６４１２．１のヌクレオチド７９７６９－１０００５９の全部若しくは一部、ＮＷ＿００３６１５０６３．１のヌクレオチド３１５２６６－３６２４４２の全部若しくは一部、ＮＷ＿００６８８２９３６．１のヌクレオチド２６６２０５５－２７０１７６８の全部若しくは一部、又はＮＷ＿００３６１５４１１．１のヌクレオチド９７７０６－１０５１１７の全部若しくは一部と少なくとも約９０％相同である遺伝子座に組み込まれている。一部の実施形態では、リコンビナーゼは、Ｃｒｅリコンビナーゼ、ＦＬＰリコンビナーゼ、Ｂｘｂｌインテグラーゼ、及びφＣ３１インテグラーゼから選択される。一部の実施形態では、ＳＯＩは、単鎖抗体、抗体軽鎖、抗体重鎖、単鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）、又はＦｃ融合タンパク質をコードする。一部の実施形態では、哺乳動物細胞は、ハムスター宿主細胞、ヒト宿主細胞、ラット宿主細胞、又はマウス宿主細胞である。一部の実施形態では、哺乳動物細胞は、ＣＨＯ宿主細胞、ＣＨＯ Ｋ１宿主細胞、ＣＨＯ Ｋ１ＳＶ宿主細胞、ＤＧ４４宿主細胞、ＤＵＫＸＢ－１ １宿主細胞、ＣＨＯＫ１Ｓ宿主細胞、又はＣＨＯ Ｋ１Ｍ宿主細胞である。一部の実施形態では、ベクターは、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、取り込みファージベクター、非ウイルス性ベクター、トランスポゾン及び／又はトランスポゼースベクター、インテグラーゼ基質、並びにプラスミドからなる群から選択される。
【0011】
一部の実施形態では、本開示は、１つ又は複数の抗体をコードする核酸を含む組み換え哺乳動物細胞を生成するための方法を目的とし、この方法は：ａ）哺乳動物細胞のゲノムの所定の遺伝子座に組み込まれた少なくとも２つの外因性核酸を含む哺乳動物細胞を提供することであって、各外因性核酸が４つ以上の不適合性ＲＲＳを含み、外因性核酸は同じ又は異なるＲＲＳを含むことができる、哺乳動物細胞を提供することと；ｂ）ａ）の組み換え哺乳動物細胞に少なくとも３つのベクターを導入することであって、各ベクターが、哺乳動物細胞のゲノムの所定の遺伝子座に組み込まれた外因性核酸の一方又は両方に含まれる不適合性ＲＲＳのうちの２つと一致する一対の不適合性ＲＲＳを含み、不適合性ＲＲＳの各対が１つ又は複数のＳＯＩの側面に位置し、ＳＯＩが抗体及び／又は１つ若しくは複数の選択マーカーをコードする、少なくとも３つのベクターを導入することと；ｃ）１つ又は複数のリコンビナーゼを、ＳＯＩ及び／又は選択マーカーを含む少なくとも３つのベクターの導入と同時に又は連続して導入することと；ｄ）ＳＯＩ及び／又は選択マーカーのうちの１つ又は複数を発現する細胞を選択することとを含み、それによって抗体をコードする核酸ＳＯＩを含む組み換え哺乳動物細胞を生成する。一部の実施形態では、外因性核酸は、（Ａ）ＮＷ＿００６８７４０４７．１のヌクレオチド４１１９０－４５２６９の全部若しくは一部、ＮＷ＿００６８８４５９２．１のヌクレオチド６３５９０－２０７９１１の全部若しくは一部、ＮＷ＿００６８８１２９６．１のヌクレオチド２５３８３１－４９１９０９の全部若しくは一部、ＮＷ＿００３６１６４１２．１のヌクレオチド６９３０３－７９７６８の全部若しくは一部、ＮＷ＿００３６１５０６３．１のヌクレオチド２９３４８１－３１５２６５の全部若しくは一部、ＮＷ＿００６８８２９３６．１のヌクレオチド２６５０４４３－２６６２０５４の全部若しくは一部、又はＮＷ＿００３６１５４１１．１のヌクレオチド８２２１４－９７７０５の全部若しくは一部と少なくとも約９０％相同であるか；或いは（Ｂ）ＮＷ＿００６８７４０４７．１のヌクレオチド４５２７０－４５４９０の全部若しくは一部、ＮＷ＿００６８８４５９２．１のヌクレオチド２０７９１２－７９２３７４の全部若しくは一部、ＮＷ＿００６８８１２９６．１のヌクレオチド４９１９１０－６６７８１３の全部若しくは一部、ＮＷ＿００３６１６４１２．１のヌクレオチド７９７６９－１０００５９の全部若しくは一部、ＮＷ＿００３６１５０６３．１のヌクレオチド３１５２６６－３６２４４２の全部若しくは一部、ＮＷ＿００６８８２９３６．１のヌクレオチド２６６２０５５－２７０１７６８の全部若しくは一部、又はＮＷ＿００３６１５４１１．１のヌクレオチド９７７０６－１０５１１７の全部若しくは一部と少なくとも約９０％相同である遺伝子座から選択される別個の遺伝子座に組み込まれる。一部の実施形態では、リコンビナーゼは、Ｃｒｅリコンビナーゼ、ＦＬＰリコンビナーゼ、Ｂｘｂｌインテグラーゼ、及びφＣ３１インテグラーゼから選択される。一部の実施形態では、ＳＯＩは、単鎖抗体、抗体軽鎖、抗体重鎖、単鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）、又はＦｃ融合タンパク質をコードする。一部の実施形態では、哺乳動物細胞は、ハムスター宿主細胞、ヒト宿主細胞、ラット宿主細胞、又はマウス宿主細胞である。一部の実施形態では、哺乳動物細胞は、ＣＨＯ宿主細胞、ＣＨＯ Ｋ１宿主細胞、ＣＨＯ Ｋ１ＳＶ宿主細胞、ＤＧ４４宿主細胞、ＤＵＫＸＢ－１ １宿主細胞、ＣＨＯＫ１Ｓ宿主細胞、又はＣＨＯ Ｋ１Ｍ宿主細胞である。一部の実施形態では、ベクターは、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、取り込みファージベクター、非ウイルス性ベクター、トランスポゾン及び／又はトランスポゼースベクター、インテグラーゼ基質、並びにプラスミドからなる群から選択される。
【図面の簡単な説明】
【0012】
【図1】本開示の例示的多重ベクターＲＭＣＥ戦略を示している。
【図2】本開示の例示的多重ベクターＲＭＣＥ戦略を示している。
【図3】本開示の例示的多重ベクターＲＭＣＥ戦略を示している。
【図4】本開示の例示的多重ベクターＲＭＣＥ戦略を示している。
【図5】本開示の例示的多重ベクターＲＭＣＥ戦略を示している。
【図6】３ベクターＲＭＣＥと比較した、２ベクターＲＭＣＥにより修飾されたＣＨＯ細胞のコピー数の結果を示している。ＣＨＯクローンの遺伝子コピー数は予想に近く、２ベクターＲＭＣＥクローンには２ ＨＣ及び４ ＬＣが予想され、３ベクターＲＭＣＥクローンには３ ＨＣ及び６ ＬＣが予想された。
【図7】本開示の例示的多重ベクターＲＭＣＥ戦略を示している。
【図8】Ａ及びＢは、２プラスミドベースのＲＭＣＥ及び２部位多重ベクタープラスミド（この場合、３プラスミド）ベースのＲＭＣＥを使用したＴＩトランスフェクションプールの生産性の比較を示している。ｍＡｂ Ａの２部位多重ベクタープラスミドベースのＴＩプール（Ａ）及びｍＡｂ ＢのＴＩプール（Ｂ）では、力価（棒グラフ）及びＱｐ（点）はともにより高い。
【図9】Ａ及びＢは、力価（Ａ）及びＱｐ（Ｂ）を含む、ｍＡｂ Ｃ、ｍＡｂ Ｄ、及びｍＡｂ Ｅの種々のＴＩプールについて評価された特定のＣＬＤパラメーターをグラフで示している。
【図10】Ａ～Ｃは、Ａｍｂｒ１５（登録商標）培養物中の各８つのｍＡｂ Ｃクローンについて観察された力価（Ａ）及びそれらｍＡｂ Ｃの８つのクローンの各々について観察されたＱｐ（Ｂ）をグラフで示し、平均的なｍＡｂ Ｃクローンの力価及びｍＡｂ ＣクローンのＱｐの比較を提供している（Ｃ）。
【図11】Ａ～Ｃは、Ａｍｂｒ１５（登録商標）培養物中の各８つのｍＡｂ Ｄクローンについて観察された力価（Ａ）及びそれらｍＡｂ Ｄの８つのクローンの各々について観察されたＱｐ（Ｂ）をグラフで示し、平均的なｍＡｂ Ｄクローンの力価及びｍＡｂ ＤクローンのＱｐの比較を提供している（Ｃ）。
【図12】Ａ及びＢは、２ベクター手法及び多重ベクター手法それぞれの、２つの特異的クローン（クローンＡ及びクローンＢ）の力価（Ａ）及びＱｐ（Ｂ）を比較している。
【発明を実施するための形態】
【0013】
ここに開示される主題は、組み換えタンパク質、例えば、モノクローナル抗体、並びにそれから得られる組成物、例えば、二重特異性抗体、及び他の複合フォーマットのタンパク質、例えば、膜タンパク質複合体、及び発現が困難な他の分子を発現する生成宿主細胞のために、目的の配列の標的化取り込みを達成する多重ベクターＲＭＣＥ手法に関する。
【0014】
ここに開示される主題は、従来の標的化取り込みに基づく手法と比べて、特定の利益を提供する。例えば、３つのベクター、例えば、プラスミドが同時に取り込まれる場合、力価向上、生成物の品質の向上、細胞適合性の向上などのために、少なくとも１５の遺伝子（５つの鎖／ドナープラスミド）を単一のＴＩ部位に同時に導入することができる。同様に、４つのプラスミドが同時に取り込まれる場合、力価向上、生成物の品質の向上、細胞適合性の向上などのために、少なくとも２０の遺伝子（５つの鎖／ドナープラスミド）を導入することができる。
【0015】
本明細書に記載される多重ベクターＲＭＣＥ手法はまた、合理化されたベクター、例えば、プラスミドの構築を可能にする。一部の実施形態では、そのような構築は、単一の取り込み部位に最大９つの鎖を含むｍＡｂ及び１細胞複合フォーマットの両方について、１ステップ６ウェイライゲーションを用いて合理化することができる。同様に、本明細書に記載される多重ベクターＲＭＣＥ手法はまた、４つ若しくは５つ又はそれより多い固有の遺伝子を含む複合二重特異性及び三重特異性抗体が、宿主ゲノムに同時に取り込まれ、高力価及び高生成物品質の生成物を発現する細胞株を生成することを可能にする。加えて、３ベクターＲＭＣＥにより、遺伝子療法生成物を作製するために必要なすべての遺伝子を含有する固有のプラスミドを、宿主ゲノムに同時に取り込むことができる。最後に、さらなる固有のＲＳＳ部位を、Ｃｒｉｓｐｒ／Ｃａｓ又はジンクフィンガー又はＴＡＬＥＮ又は無作為取り込みを介して加えることができ、これら固有のＲＳＳ部位が、Ｃｒｅ及びＦｌｐ以外のリコンビナーゼに対応する場合（例えばφＣ３１インテグラーゼ＆ Ｂｘｂ１他）、これにより１つ又は複数のランディングパッド中へのさらなる遺伝子の同時取り込みが容易になるであろう。
【0016】
開示を明瞭にする目的で、かつ限定を目的とせずに、詳細な記載を以下のサブセクションに分ける：
１．定義
２．外因性ヌクレオチド配列
３．宿主細胞
４．標的化取り込み
５．生成物
１．定義
２．外因性ヌクレオチド配列
３．宿主細胞
４．標的化取り込み
５．生成物
【0017】
１．定義
別途定義のない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語及び科学用語は、当業者によって一般に理解される意味と同じ意味を有する。矛盾が生じる場合、定義を含め、本書が優先される。好ましい方法及び材料が後述されるが、本明細書に記載されるものと類似又は同等の方法及び材料を、ここに開示される主題の実施または試験に使用することができる。本明細書で言及されるすべての刊行物、特許出願、特許、及びその他の参考文献は、その全体が参照により援用される。本明細書に開示される材料、方法、及び例は、単なる例示であって、限定を意図するものではない。
別途定義のない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語及び科学用語は、当業者によって一般に理解される意味と同じ意味を有する。矛盾が生じる場合、定義を含め、本書が優先される。好ましい方法及び材料が後述されるが、本明細書に記載されるものと類似又は同等の方法及び材料を、ここに開示される主題の実施または試験に使用することができる。本明細書で言及されるすべての刊行物、特許出願、特許、及びその他の参考文献は、その全体が参照により援用される。本明細書に開示される材料、方法、及び例は、単なる例示であって、限定を意図するものではない。
【0018】
用語「含む（”ｃｏｍｐｒｉｓｅ”、“ｉｎｃｌｕｄｅ”、“ｃｏｎｔａｉｎ”）」、「有する（“ｈａｖｉｎｇ”、“ｈａｓ”）」、「できる（“ｃａｎ”）」及びこれらの変形は、本明細書で使用される場合、追加の作用又は構造の可能性を除外しない開いた移行句、用語、又は語であることを意図している。単数形（“ａ”、“ａｎ”及び“ｔｈｅ”）は、文脈が明らかに他を示さない限り、複数形への言及を含む。本開示は、明示的に示されているか否かに関わらず、本明細書に提示される実施形態又は要素を「含む」、それら「からなる」、及びそれら「から本質的になる」他の実施形態も想定している。
【0019】
本明細書において数値範囲を列挙する場合、その間の各介在値は、同じ精度で明示的に想定される。例えば、６～９の範囲については、７及び８という数が、６及び９に加えて想定され、６．０～７．０の範囲については、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、及び７．０という数が明示的に想定される。
【0020】
本明細書で使用される用語「約」又は「概ね」は、当業者が決定する特定の値の許容される誤差範囲内を意味し、それは、部分的には値を測定又は決定する方法、すなわち、測定システムの限界に依存するであろう。例えば、「約」は、技術分野毎に、３以内の標準偏差又は３を上回る標準偏差を意味することができる。代替的に、「約」は、所与の値の最大２０％、好ましくは最大１０％、より好ましくは最大５％、さらにより好ましくは最大１％の範囲を意味することができる。代替的に、特に生物学的システム又はプロセスに関して、この用語は、ある値の一定のオーダーの大きさ、好ましくは５倍以内、より好ましくは２倍以内を意味することができる。
【0021】
本明細書で使用される用語「選択マーカー」は、遺伝子を担持する細胞が、対応する選択剤の存在下で、特異的に選択される又は選択されないことを可能にする遺伝子とすることができる。例えば、限定しないが、選択マーカーは、選択マーカー遺伝子で形質転換された宿主細胞が、遺伝子の存在下で正に選択されることを可能にすることができ；非形質転換宿主細胞は、選択条件下で増殖又は生存することができないであろう。選択マーカーは、正、負、又は二機能性でありうる。正の選択マーカーは、マーカーを担持する細胞の選択を可能にすることができ、負の選択マーカーは、マーカーを担持する細胞を選択的に排除することを可能にする。選択マーカーは、薬物に対する耐性を付与することができるか、又は宿主細胞の代謝又は異化欠陥を補うことができる。原核細胞では、なかでも、アンピシリン、テトラサイクリン、カナマイシン又はクロラムフェニコールに対する耐性を与える遺伝子を使用することができる。真核細胞中で選択マーカーとして有用な耐性遺伝子には、限定されないが、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）（例えば、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＨＹＧ）、ネオマイシン及びＧ４１８（ＡＰＨ）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、グルタミンシンセターゼ（ＧＳ）、アスパラギンシンセターゼ、トリプトファンシンセターゼ（インドール）、ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ（ヒスチジノールＤ）のための遺伝子、並びにピューロマイシン、ブラストサイジン、ブレオマイシン、フレオマイシン、クロラムフェニコール、ゼオシン、及びミコフェノール酸に対する耐性をコードする遺伝子が含まれる。さらなるマーカー遺伝子は、国際公開第９２／０８７９６号及び同第９４／２８１４３号に記載されている。
【0022】
対応する選択剤の存在下での選択を容易にするだけでなく、選択マーカーは、代替的に、細胞中に通常は存在しない分子、例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、強化ＧＦＰ（ｅＧＦＰ）、合成ＧＦＰ、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、強化ＹＦＰ（ｅＹＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、ｍＰｌｕｍ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｔｄＴｏｍａｔｏ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、Ｊ－ｒｅｄ、ＤｓＲｅｄ－モノマー、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＫＯ、ｍＣｉｔｒｉｎｅ、Ｖｅｎｕｓ、ＹＰｅｔ、Ｅｍｅｒａｌｄ、ＣｙＰｅｔ、ｍＣＦＰｍ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、及びＴ－Ｓａｐｐｈｉｒｅをコードする遺伝子を提供することができる。このような遺伝子を有する細胞は、例えば、コードされたポリペプチドが放出する蛍光の検出によって、この遺伝子を有さない細胞から区別することができる。
【0023】
本明細書で使用される用語「作用可能に連結され」は、２つ以上の成分の並置を指し、それら成分は、それらがそれに意図されたように機能することを可能にする関係にある。例えば、プロモーター及び／又はエンハンサーは、コード配列の転写を調節するように作用する場合、コード配列に作用可能に連結されている。一部の実施形態では、「作用可能に連結されている」ＤＮＡ配列は、単一の染色体上で近接及び隣接している。一部の実施形態では、例えば、２つのタンパク質コード化領域、例えば分泌リーダーとポリペプチドを接合することが必要であるとき、配列は、近接し、隣接し、同じリーディングフレーム内にある。一部の実施形態では、作用可能に連結されたプロモーターは、コード配列の上流に位置しており、それに隣接している場合がある。一部の実施形態では、例えば、コード配列の発現を調節するエンハンサー配列に関して、２つの成分は、隣接していないが、作用可能に連結することができる。エンハンサーは、コード配列の転写を増加させる場合、コード配列に作用可能に連結されている。作用可能に連結されたエンハンサーは、コード配列の上流、内部、又は下流に位置することができ、コード配列のプロモーターからかなり離れて位置することができる。動作可能な連結は、当技術分野において既知の組み換え方法によって、例えば、ＰＣＲ方法論を使用して及び／又は便利な制限酵素認識部位におけるライゲーションによって達成することができる。便利な制限酵素認識部位が存在しない場合、合成オリゴヌクレオチドアダプター又はリンカーを、慣行に従って使用することができる。内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）は、それが５末端に依存しない方式で内部位置においてＯＲＦの翻訳の開始を可能にする場合、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）に作用可能に連結されている。
【0024】
本明細書で使用される用語「発現」は、転写及び／又は翻訳を指す。一部の実施形態では、所望の生成物の転写のレベルは、存在している対応するｍＲＮＡの量に基づいて決定することができる。例えば、目的の配列から転写されたｍＲＮＡは、ＰＣＲによって又はノーザンハイブリダイゼーションによって定量化することができる。一部の実施形態では、目的の配列によってコードされたタンパク質は、種々の方法、例えばＥＬＩＳＡによって、タンパク質の生物活性をアッセイすることによって、又はタンパク質を認識して結合する抗体を使用して、そのような活性と無関係のアッセイ、例えばウエスタンブロット法又はラジオイムノアッセイを用いることによって、定量化することができる。
【0025】
用語「目的の配列」は、本明細書では、ポリペプチド配列（又は、場合によっては、ポリペプチド配列をコードする核酸）を指すために使用され、ポリペプチド配列の発現が目的とされる。このようなポリペプチド配列は、一部の実施形態では、多サブユニットタンパク質複合体のサブユニットを含む。一部の実施形態では、このようなポリペプチド配列は、このようなサブユニットの断片を含むことができる。このようなポリペプチド配列は、一部の実施形態では、抗体配列、例えば、抗体重鎖又は軽鎖配列を含む。一部の実施形態では、このようなポリペプチド配列は、このような抗体配列の断片を含むことができる。
【0026】
用語「抗体」は、本明細書では最も広い意味で使用され、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば二重特異性抗体）、半抗体、及び所望の抗原結合活性を呈する抗体断片を含むがこれらに限定されない種々の抗体構造を包含する。
【0027】
本明細書で使用される「標準抗体」及び「標準モノクローナル抗体」は、単一の結合特異性を有する抗体又は抗体断片である。一部の実施形態では、標準抗体の単一の結合特異性は、重鎖配列、又はその断片と、軽鎖配列、又はその断片とのペアリングの結果である。
【0028】
本明細書で使用される「二重特異性抗体」又は「ＢｓＡｂ」は、２つの別個のエピトープ、例えば、２つの別個の抗原上の２つの別個のエピトープ又は単一の抗原上の２つの別個のエピトープに同時に結合することのできる抗体である。ＢｓＡｂは多数の別個の構造を包含し、このような構造には、２つの別個の親モノクローナル抗体の可変重（ＶＨ）ドメインと軽（ＶＬ）ドメインとの１つの対を含み、その結果、第１の親抗体の結合特異性を有するＢｓＡｂの１つの「アーム」（すなわち、一対のＶＨとＶＬ）と、第２の親抗体の結合特異性を有するＢｓＡｂの第２の「アーム」をもたらすものが含まれる。ＢｓＡｂは多重特異性抗体のサブセットであり、多重特異性抗体は、少なくとも２つの結合特異性（すなわち、ＢｓＡｂ）を含むだけでなく、三重特異性抗体、並びにさらに多数の特異性を有する抗体も含む。
【0029】
本明細書で使用される用語「抗体断片」は、インタクトな抗体が結合する抗原に結合するインタクトな抗体の一部分を含むインタクトな抗体以外の分子を指す。抗体断片の例には、限定されないが、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨは、Ｆ（ａｂ’）２、ダイアボディ、直鎖状抗体、単鎖抗体分子（例えばｓｃＦｖ）；及び抗体断片から形成された多重特異性抗体が含まれる。
【0030】
本明細書で使用される用語「可変領域」又は「可変ドメイン」は、抗原に抗体を結合させることに関与する抗体重鎖又は軽鎖のドメインを指す。天然抗体の重鎖及び軽鎖の可変ドメイン（それぞれＶＨ及びＶＬ）は通常、各々が４つの保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）と３つの超可変領域（ＨＶＲ）とを含む、類似の構造を有する。例えば、Ｋｉｎｄｔ ｅｔ ａｌ．Ｋｕｂｙ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、６ｔｈ ｅｄ．,Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．,ｐａｇｅ ９１（２００７）を参照。単一のＶＨ又はＶＬドメインは、抗原結合特異性を付与するために十分でありうる。さらに、特定の抗原に結合する抗体は、相補的なＶＬ又はＶＨドメインそれぞれのライブラリーをスクリーニングするために、抗原に結合する抗体由来のＶＨ又はＶＬドメインを使用して単離されうる。例えば、Ｐｏｒｔｏｌａｎｏ ｅｔ ａｌ．, Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０：８８０－８８７（１９９３）；Ｃｌａｒｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．, Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６２４－６２８（１９９１）を参照。
【0031】
本明細書で使用される用語「ベクター」は、結合する別の核酸を伝播することのできる核酸分子を指す。この用語は、自己複製核酸構造物としてのベクター、及び導入された宿主細胞のゲノムに組み込まれたベクターを含む。一部の実施形態では、ベクターは、作用可能に連結している核酸の発現を指示する。このようなベクターを、本明細書では「発現ベクター」と言う。
【0032】
本明細書で使用される用語「相同配列」は、配列のアラインメントによって決定した場合に有意な配列類似性を共有する配列を指す。例えば、２つの配列は、約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、又は９９．９％相同でありうる。アラインメントは、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、及び配列を比較し、配列の長さ、配列同一性及び類似性、並びに配列不一致及びギャップの存在及び長さといった因子に基づいて一致の統計的有意性を計算するＨＭＭＥを含むがこれらに限定されないアルゴリズム及びコンピュータープログラムによって実行される。相同配列は、ＤＮＡともタンパク質配列とも呼ぶことができる。
【0033】
本明細書で使用される用語「側面に位置する（ｆｌａｎｋｉｎｇ）」とは、第１のヌクレオチド配列が第２のヌクレオチド配列の５’末端若しくは３’末端、又はそれらの両方に位置していることを指す。側面に位置するヌクレオチド配列は、第２のヌクレオチド配列に隣接するか、又は第２のヌクレオチド配列から規定された距離にあることができる。側面に位置するヌクレオチド配列の長さに特定の制限はない。例えば、側面に位置する配列は、数個の塩基対又は数千個の塩基対でありうる。
【0034】
本明細書で使用される用語「外因性」は、ヌクレオチド配列が宿主細胞を起源とせず、伝統的なＤＮＡ送達方法によって、例えば、トランスフェクション、エレクトロポレーション、又は形質転換方法によって宿主細胞に導入されていることを指す。用語「内因性」は、ヌクレオチド配列が宿主細胞を起源としていることを指す。「外因性」ヌクレオチド配列は、塩基組成物中で同一である「内因性」のカウンターパートを有することができるが、「外因性」配列は、例えば、組み換えＤＮＡ技術を介して、宿主細胞に導入される。
【0035】
本明細書で使用される「取り込み部位」は、外因性ヌクレオチド配列が挿入されている宿主細胞のゲノム内部に核酸配列を含む。一部の実施形態では、取り込み部位は、宿主細胞のゲノム上の２つの隣接するヌクレオチド間にある。一部の実施形態では、取り込み部位は、ヌクレオチド配列のストレッチを含む。一部の実施形態では、取り込み部位は、ＴＩ宿主細胞のゲノムの特異的な遺伝子座内部に位置している。一部の実施形態では、取り込み部位は、ＴＩ宿主細胞の内因性の遺伝子内部にある。
【0036】
本明細書で使用される「リコンビナーゼ認識配列」（ＲＲＳ）は、リコンビナーゼによって認識されるヌクレオチド配列であり、リコンビナーゼが媒介する組み換え事象に必要かつ十分である。ＲＲＳを使用して、ヌクレオチド配列内で組み換え事象が起こるであろう位置を規定することができる。本明細書で使用される「不適合性」ＲＲＳは、別個のリコンビナーゼによって認識されるＲＲＳである。
【0037】
本明細書で使用される用語「ＴＩ宿主細胞」は、目的の配列の発現における使用のための、１つ以上のゲノム遺伝子座、すなわち、１つ以上の取り込み部位を含む細胞を指す。一部の実施形態では、ＴＩ宿主細胞へのＳＯＩの取り込みは、４つ以上のＲＲＳ、例えば、４つ以上の不適合性ＲＲＳを含む１つ又は複数の取り込み部位における外因性ヌクレオチド配列の存在によって容易になる。
【0038】
２．外因性ヌクレオチド配列
ここに開示される主題は、外因性ヌクレオチド配列の取り込みに適した宿主細胞を提供する。一部の実施形態では、外因性ヌクレオチド配列は、例えば、４つ以上のリコンビナーゼ認識配列を含むことにより、多重ベクター（すなわち、３つ以上のベクター）ＲＭＣＥ戦略における使用のための取り込み部位として役立つ。一部の実施形態では、外因性ヌクレオチド配列は、４つ以上の不適合性リコンビナーゼ認識配列を含む多重ベクターＲＭＣＥ戦略における使用のための取り込み部位として役立つ。一部の実施形態では、外因性ヌクレオチド配列は、目的の配列をコードする。したがって、一部の実施形態では、宿主細胞は、１つ又は複数の目的の配列をコードする１つ又は複数の外因性ヌクレオチド配列の標的化取り込みを容易にするであろう１つ又は複数の外因性ヌクレオチド配列を含むであろう。一部の実施形態では、宿主細胞のゲノム上の取り込み部位に取り込まれた外因性ヌクレオチド配列を含む宿主細胞は、ＴＩ宿主細胞と呼ばれる。この場合、１つ又は複数の目的の配列をコードする外因性ヌクレオチド配列はＴＩ宿主細胞に導入することができ、取り込みは取り込み部位を標的とすることができる。以下に概説するように、ＴＩ宿主細胞は、１つ又は複数の目的の配列をコードする外因性ヌクレオチド配列の取り込みを容易にする要素、例えば、リコンビナーゼ認識配列を含む外因性ヌクレオチド配列の存在によって定義される複数の取り込み部位を含みうる。
ここに開示される主題は、外因性ヌクレオチド配列の取り込みに適した宿主細胞を提供する。一部の実施形態では、外因性ヌクレオチド配列は、例えば、４つ以上のリコンビナーゼ認識配列を含むことにより、多重ベクター（すなわち、３つ以上のベクター）ＲＭＣＥ戦略における使用のための取り込み部位として役立つ。一部の実施形態では、外因性ヌクレオチド配列は、４つ以上の不適合性リコンビナーゼ認識配列を含む多重ベクターＲＭＣＥ戦略における使用のための取り込み部位として役立つ。一部の実施形態では、外因性ヌクレオチド配列は、目的の配列をコードする。したがって、一部の実施形態では、宿主細胞は、１つ又は複数の目的の配列をコードする１つ又は複数の外因性ヌクレオチド配列の標的化取り込みを容易にするであろう１つ又は複数の外因性ヌクレオチド配列を含むであろう。一部の実施形態では、宿主細胞のゲノム上の取り込み部位に取り込まれた外因性ヌクレオチド配列を含む宿主細胞は、ＴＩ宿主細胞と呼ばれる。この場合、１つ又は複数の目的の配列をコードする外因性ヌクレオチド配列はＴＩ宿主細胞に導入することができ、取り込みは取り込み部位を標的とすることができる。以下に概説するように、ＴＩ宿主細胞は、１つ又は複数の目的の配列をコードする外因性ヌクレオチド配列の取り込みを容易にする要素、例えば、リコンビナーゼ認識配列を含む外因性ヌクレオチド配列の存在によって定義される複数の取り込み部位を含みうる。
【0039】
一部の実施形態では、取り込み部位及び／又は取り込み部位の側面に位置するヌクレオチド配列は、実験により同定することができる。一部の実施形態では、取り込み部位及び／又は取り込み部位の側面に位置するヌクレオチド配列をゲノムワイドスクリーニング手法により同定し、所望のレベルで、１つ又は複数の外因性ヌクレオチド配列に取り込まれた１つ又は複数のＳＯＩによってコードされる目的のポリペプチドを発現する宿主細胞を単離することができ、外因性配列自体は、宿主細胞のゲノムの１つ又は複数の遺伝子座に取り込まれる。一部の実施形態では、取り込み部位及び／又は取り込み部位の側面に位置するヌクレオチド配列は、トランスポゼースベースのカセット取り込み事象後にゲノムワイドスクリーニング手法によって同定することができる。一部の実施形態では、取り込み部位及び／又は取り込み部位の側面に位置するヌクレオチド配列は、ブルートフォース無作為取り込みスクリーニングによって同定することができる。一部の実施形態では、取り込み部位及び／又は取り込み部位の側面に位置するヌクレオチド配列は、標的遺伝子座増幅（ＴＬＡ）とそれに続く次世代シーケンシング（ＮＧＳ）及び全ゲノムＮＧＳといった従来のスクリーニング手法によって決定することができる。一部の実施形態では、染色体上の取り込み部位の位置は、蛍光ｉｎ－ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）分析といった従来の細胞生物学手法によって決定することができる。
【0040】
一部の実施形態では、宿主細胞は、宿主細胞のゲノムの特異的な第１の遺伝子座内部の第１の取り込み部位に取り込まれた第１の外因性ヌクレオチド配列と、ゲノムの特異的な第２の遺伝子座内部の第２の取り込み部位に取り込まれた第２の外因性ヌクレオチド配列とを含む。一部の実施形態では、宿主細胞は、宿主細胞のゲノムの複数の取り込み部位に取り込まれた複数の外因性ヌクレオチド配列を含む。
【0041】
２．１ ４つ以上のＲＲＳを含む外因性配列
一部の実施形態では、取り込まれた外因性ヌクレオチド配列は４つ以上のＲＲＳを含み、ＲＲＳはリコンビナーゼによって認識されうる。一部の実施形態では、取り込まれた外因性ヌクレオチド配列は、４つ以上の不適合性ＲＲＳを含む。一部の実施形態では、取り込まれた外因性ヌクレオチド配列は、４つ、５つ、６つ、７つ、若しくは８つ、又はそれより多いＲＲＳを含む。一部の実施形態では、１つ以上のＲＲＳは、ＬｏｘＰ配列、ＬｏｘＰ Ｌ３配列、ＬｏｘＰ ２Ｌ配列、ＬｏｘＦａｓ配列、Ｌｏｘ５１１配列、Ｌｏｘ２２７２配列、Ｌｏｘ２３７２配列、Ｌｏｘ５１７１配列、Ｌｏｘｍ２配列、Ｌｏｘ７１配列、Ｌｏｘ６６配列、ＦＲＴ配列、Ｂｘｂ１ ａｔｔＰ配列、Ｂｘｂ１ ａｔｔＢ配列、φＣ３１ ａｔｔＰ配列、及びφＣ３１ ａｔｔＢ配列からなる群から選択することができる。
一部の実施形態では、取り込まれた外因性ヌクレオチド配列は４つ以上のＲＲＳを含み、ＲＲＳはリコンビナーゼによって認識されうる。一部の実施形態では、取り込まれた外因性ヌクレオチド配列は、４つ以上の不適合性ＲＲＳを含む。一部の実施形態では、取り込まれた外因性ヌクレオチド配列は、４つ、５つ、６つ、７つ、若しくは８つ、又はそれより多いＲＲＳを含む。一部の実施形態では、１つ以上のＲＲＳは、ＬｏｘＰ配列、ＬｏｘＰ Ｌ３配列、ＬｏｘＰ ２Ｌ配列、ＬｏｘＦａｓ配列、Ｌｏｘ５１１配列、Ｌｏｘ２２７２配列、Ｌｏｘ２３７２配列、Ｌｏｘ５１７１配列、Ｌｏｘｍ２配列、Ｌｏｘ７１配列、Ｌｏｘ６６配列、ＦＲＴ配列、Ｂｘｂ１ ａｔｔＰ配列、Ｂｘｂ１ ａｔｔＢ配列、φＣ３１ ａｔｔＰ配列、及びφＣ３１ ａｔｔＢ配列からなる群から選択することができる。
【0042】
一部の実施形態では、取り込まれた外因性ヌクレオチド配列は、少なくとも１つの選択マーカーを含む。一部の実施形態では、取り込まれた外因性ヌクレオチド配列は、少なくとも４つのＲＲＳと、少なくとも１つの選択マーカーとを含む。一部の実施形態では、取り込まれた外因性ヌクレオチド配列は、４つの不適合性ＲＲＳと、少なくとも１つの選択マーカーとを含む。一部の実施形態では、選択マーカーは、第１のＲＲＳと第２のＲＲＳとの間に位置している。一部の実施形態では、４つのＲＲＳのうちの２つは、少なくとも１つの選択マーカーの側面に位置し、すなわち、第１のＲＲＳは選択マーカーの５’上流に位置し、第２のＲＲＳは選択マーカーの３’下流に位置する。一部の実施形態では、第１のＲＲＳは、選択マーカーの５末端に隣接し、第２のＲＲＳは、選択マーカーの３’末端に隣接する。
【0043】
一部の実施形態では、選択マーカーは、第１のＲＲＳと第２のＲＲＳの間に位置し、側面に位置する２つのＲＲＳは異なっている。一部の実施形態では、側面に位置する第１のＲＲＳはＬｏｘＰ Ｌ３配列であり、側面に位置する第２のＲＲＳはＬｏｘＰ ２Ｌ配列である。一部の実施形態では、ＬｏｘＰ Ｌ３配列は選択マーカーの５’に位置し、ＬｏｘＰ ２Ｌ配列は選択マーカーの３’に位置する。一部の実施形態では、側面に位置する第１のＲＲＳは野生型ＦＲＴ配列であり、側面に位置する第２のＲＲＳは変異ＦＲＴ配列である。一部の実施形態では、側面に位置する第１のＲＲＳはＢｘｂ１ ａｔｔＰ配列であり、側面に位置する第２のＲＲＳはＢｘｂ１ ａｔｔＢ配列である。一部の実施形態では、側面に位置する第１のＲＲＳはφＣ３１ ａｔｔＰ配列であり、側面に位置する第２のＲＲＳはφＣ３１ ａｔｔＢ配列である。一部の実施形態では、２つのＲＲＳは、同じ配向に位置決めされている。一部の実施形態では、２つのＲＲＳはともに、順配向又は逆配向にある。一部の実施形態では、２つのＲＲＳは、反対の配向に位置決めされている。
【0044】
一部の実施形態では、選択マーカーは、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）（例えば、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＨＹＧ）、ネオマイシン及びＧ４１８（ＡＰＨ）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、グルタミンシンセターゼ（ＧＳ）、アスパラギンシンセターゼ、トリプトファンシンセターゼ（インドール）、ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ（ヒスチジノールＤ）、及びピューロマイシン、ブラストサイジン、ブレオマイシン、フレオマイシン、クロラムフェニコール、ゼオシン、又はミコフェノール酸に対する耐性をコードする遺伝子とすることができる。一部の実施形態では、選択マーカーは、ＧＦＰ、ｅＧＦＰ、合成ＧＦＰ、ＹＦＰ、ｅＹＦＰ、ＣＦＰ、ｍＰｌｕｍ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｔｄＴｏｍａｔｏ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、Ｊ－ｒｅｄ、ＤｓＲｅｄ－モノマー、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＫＯ、ｍＣｉｔｒｉｎｅ、Ｖｅｎｕｓ、ＹＰｅｔ、Ｅｍｅｒａｌｄ、ＣｙＰｅｔ、ｍＣＦＰｍ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、又はＴ－Ｓａｐｐｈｉｒｅマーカーとすることができる。
【0045】
一部の実施形態では、取り込まれた外因性ヌクレオチド配列は、４つ以上のＲＲＳのうちの少なくとも２つが側方に位置している２つの選択マーカーを含み、第１の選択マーカーは第２の選択マーカーとは異なる。一部の実施形態では、２つの選択マーカーはともに、グルタミンシンセターゼ選択マーカー、チミジンキナーゼ選択マーカー、ＨＹＧ選択マーカー、及びピューロマイシン耐性選択マーカーからなる群から選択される。一部の実施形態では、取り込まれた外因性ヌクレオチド配列は、チミジンキナーゼ選択マーカーとＨＹＧ選択マーカーとを含む。一部の実施形態では、第１の選択マーカーは、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）（例えば、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＨＹＧ）、ネオマイシン及びＧ４１８（ＡＰＨ）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、グルタミンシンセターゼ（ＧＳ）、アスパラギンシンセターゼ、トリプトファンシンセターゼ（インドール）、ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ（ヒスチジノールＤ）、及びピューロマイシン、ブラストサイジン、ブレオマイシン、フレオマイシン、クロラムフェニコール、ゼオシン、及びミコフェノール酸に対する耐性をコードする遺伝子からなる群から選択され、第２の選択マーカーは、ＧＦＰ、ｅＧＦＰ、合成ＧＦＰ、ＹＦＰ、ｅＹＦＰ、ＣＦＰ、ｍＰｌｕｍ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｔｄＴｏｍａｔｏ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、Ｊ－ｒｅｄ、ＤｓＲｅｄ－モノマー、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＫＯ、ｍＣｉｔｒｉｎｅ、Ｖｅｎｕｓ、ＹＰｅｔ、Ｅｍｅｒａｌｄ、ＣｙＰｅｔ、ｍＣＦＰｍ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、及びＴ－Ｓａｐｐｈｉｒｅマーカーからなる群から選択される。一部の実施形態では、第１の選択マーカーはグルタミンシンセターゼ選択マーカーであり、第２の選択マーカーはＧＦＰマーカーである。一部の実施形態では、両選択マーカーの側面に位置する２つのＲＲＳは同じである。一部の実施形態では、両選択マーカーの側面に位置する２つのＲＲＳは異なっている。
【0046】
一部の実施形態では、選択マーカーは、プロモーター配列に作用可能に連結されている。一部の実施形態では、選択マーカーは、ＳＶ４０プロモーターに作用可能に連結されている。一部の実施形態では、選択マーカーは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターに作用可能に連結されている。
【0047】
一部の実施形態では、取り込まれた外因性ヌクレオチド配列は、少なくとも１つの選択マーカーとＩＲＥＳとを含み、ＩＲＥＳは、選択マーカーに作用可能に連結されている。一部の実施形態では、ＩＲＥＳに作用可能に連結された選択マーカーは、ＧＦＰ、ｅＧＦＰ、合成ＧＦＰ、ＹＦＰ、ｅＹＦＰ、ＣＦＰ、ｍＰｌｕｍ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｔｄＴｏｍａｔｏ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、Ｊ－ｒｅｄ、ＤｓＲｅｄ－モノマー、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＫＯ、ｍＣｉｔｒｉｎｅ、Ｖｅｎｕｓ、ＹＰｅｔ、Ｅｍｅｒａｌｄ、ＣｙＰｅｔ、ｍＣＦＰｍ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、及びＴ－Ｓａｐｐｈｉｒｅマーカーからなる群から選択される。一部の実施形態では、ＩＲＥＳに作用可能に連結された選択マーカーは、ＧＦＰマーカーである。一部の実施形態では、取り込まれた外因性ヌクレオチド配列は、ＩＲＥＳと、４つ以上のＲＲＳのうちの少なくとも２つが側面に位置している２つの選択マーカーとを含み、ＩＲＥＳは、第２の選択マーカーに作用可能に連結されている。一部の実施形態では、取り込まれた外因性ヌクレオチド配列は、ＩＲＥＳと、少なくとも４つＲＲＳのうちの少なくとも２つが側面に位置している３つの選択マーカーとを含み、ＩＲＥＳは、第３の選択マーカーに作用可能に連結されている。一部の実施形態では、取り込まれた外因性ヌクレオチド配列は、ＩＲＥＳと、少なくとも４つＲＲＳのうちの少なくとも２つが側面に位置している３つの選択マーカーとを含み、ＩＲＥＳは、第３の選択マーカーに作用可能に連結されている。一部の実施形態では、第３の選択マーカーは、第１の選択マーカー又は第２の選択マーカーとは異なる。一部の実施形態では、取り込まれた外因性ヌクレオチド配列は、プロモーターに作用可能に連結された第１の選択マーカーと、ＩＲＥＳに作用可能に連結された第２の選択マーカーとを含む。一部の実施形態では、取り込まれた外因性ヌクレオチド配列は、ＳＶ４０プロモーターに作用可能に連結されたグルタミンシンセターゼ選択マーカーと、ＩＲＥＳに作用可能に連結されたＧＦＰ選択マーカーとを含む。一部の実施形態では、取り込まれた外因性ヌクレオチド配列は、ＣＭＶプロモーターに作用可能に連結されたチミジンキナーゼ選択マーカー及びＨＹＧ選択マーカーと、ＩＲＥＳに作用可能に連結されたＧＦＰ選択マーカーとを含む。
【0048】
一部の実施形態では、取り込み部位として役立つ外因性ヌクレオチド配列は、ＴＩ宿主細胞のゲノムの特異的な遺伝子座内部の部位に存在するであろう。例示的ＴＩ宿主細胞及び同細胞の使用のための戦略は、米国特許出願公開第２０２１０００２６６９号に詳細に記載されており、その内容は、参照によりその全体が組み込まれる。
【0049】
標的化取り込みを用いる一部の実施形態では、外因性ヌクレオチド配列は、ＴＩ宿主細胞のゲノムの特異的な遺伝子座内部の部位に取り込まれる。一部の実施形態では、外因性ヌクレオチド配列が取り込まれている遺伝子座は、コンティグＮＷ＿００６８７４０４７．１、ＮＷ＿ ００６８８４５９２．１、ＮＷ＿ ００６８８１２９６．１、ＮＷ＿ ００３６１６４１２．１、ＮＷ＿ ００３６１５０６３．１、ＮＷ＿ ００６８８２９３６．１、及びＮＷ＿ ００３６１５４１１．１から選択される配列と少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、又は少なくとも約９９．９％相同である。
【0050】
一部の実施形態では、取り込まれた外因性配列の５’に直接隣接するヌクレオチド配列は、ＮＷ＿００６８７４０４７．１のヌクレオチド４１１９０－４５２６９、ＮＷ＿００６８８４５９２．１のヌクレオチド６３５９０－２０７９１１、ＮＷ＿００６８８１２９６．１のヌクレオチド２５３８３１－４９１９０９、ＮＷ＿００３６１６４１２．１のヌクレオチド６９３０３－７９７６８、ＮＷ＿００３６１５０６３．１のヌクレオチド２９３４８１－３１５２６５、ＮＷ＿００６８８２９３６．１のヌクレオチド２６５０４４３－２６６２０５４、又はＮＷ＿００３６１５４１１．１のヌクレオチド８２２１４－９７７０５及びそれらと少なくとも５０％相同である配列からなる群から選択される。一部の実施形態では、取り込まれた外因性配列の５’に直接隣接するヌクレオチド配列は、ＮＷ＿００６８７４０４７．１のヌクレオチド４１１９０－４５２６９、ＮＷ＿００６８８４５９２．１のヌクレオチド６３５９０－２０７９１１、ＮＷ＿００６８８１２９６．１のヌクレオチド２５３８３１－４９１９０９、ＮＷ＿００３６１６４１２．１のヌクレオチド６９３０３－７９７６８、ＮＷ＿００３６１５０６３．１のヌクレオチド２９３４８１－３１５２６５、ＮＷ＿００６８８２９３６．１のヌクレオチド２６５０４４３－２６６２０５４、又はＮＷ＿００３６１５４１１．１のヌクレオチド８２２１４－９７７０５と少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、又は少なくとも約９９．９％相同である。
【0051】
一部の実施形態では、取り込まれた外因性配列の３’に直接隣接するヌクレオチド配列は、ＮＷ＿００６８７４０４７．１のヌクレオチド４５２７０－４５４９０、ＮＷ＿００６８８４５９２．１のヌクレオチド２０７９１２－７９２３７４、ＮＷ＿００６８８１２９６．１のヌクレオチド４９１９１０－６６７８１３、ＮＷ＿００３６１６４１２．１のヌクレオチド７９７６９－１０００５９、ＮＷ＿００３６１５０６３．１のヌクレオチド３１５２６６－３６２４４２、ＮＷ＿００６８８２９３６．１のヌクレオチド２６６２０５５－２７０１７６８、又はＮＷ＿００３６１５４１１．１のヌクレオチド９７７０６－１０５１１７及びそれらと少なくとも５０％相同である配列からなる群から選択される。一部の実施形態では、取り込まれた外因性配列の３’に直接隣接するヌクレオチド配列は、ＮＷ＿００６８７４０４７．１のヌクレオチド４５２７０－４５４９０、ＮＷ＿００６８８４５９２．１のヌクレオチド２０７９１２－７９２３７４、ＮＷ＿００６８８１２９６．１のヌクレオチド４９１９１０－６６７８１３、ＮＷ＿００３６１６４１２．１のヌクレオチド７９７６９－１０００５９、ＮＷ＿００３６１５０６３．１のヌクレオチド３１５２６６－３６２４４２、ＮＷ＿００６８８２９３６．１のヌクレオチド２６６２０５５－２７０１７６８、又はＮＷ＿００３６１５４１１．１のヌクレオチド９７７０６－１０５１１７と、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、又は少なくとも約９９．９％相同である。
【0052】
一部の実施形態では、取り込まれた外因性配列の５’の側面には、ＮＷ＿００６８７４０４７．１のヌクレオチド４１１９０－４５２６９、ＮＷ＿００６８８４５９２．１のヌクレオチド６３５９０－２０７９１１、ＮＷ＿００６８８１２９６．１のヌクレオチド２５３８３１－４９１９０９、ＮＷ＿００３６１６４１２．１のヌクレオチド６９３０３－７９７６８、ＮＷ＿００３６１５０６３．１のヌクレオチド２９３４８１－３１５２６５、ＮＷ＿００６８８２９３６．１のヌクレオチド２６５０４４３－２６６２０５４、及びＮＷ＿００３６１５４１１．１のヌクレオチド８２２１４－９７７０５からなる群から選択されるヌクレオチド配列、並びにそれらと少なくとも５０％相同である配列が位置している。一部の実施形態では、取り込まれた外因性配列の３’の側面には、ＮＷ＿００６８７４０４７．１のヌクレオチド４５２７０－４５４９０、ＮＷ＿００６８８４５９２．１のヌクレオチド２０７９１２－７９２３７４、ＮＷ＿００６８８１２９６．１のヌクレオチド４９１９１０－６６７８１３、ＮＷ＿００３６１６４１２．１のヌクレオチド７９７６９－１０００５９、ＮＷ＿００３６１５０６３．１のヌクレオチド３１５２６６－３６２４４２、ＮＷ＿００６８８２９３６．１のヌクレオチド２６６２０５５－２７０１７６８、及びＮＷ＿００３６１５４１１．１のヌクレオチド９７７０６－１０５１１７からなる群から選択されるヌクレオチド配列、並びにそれらと少なくとも５０％相同である配列が位置している。一部の実施形態では、取り込まれた外因性ヌクレオチド配列の５’の側面に位置するヌクレオチド配列は、ＮＷ＿００６８７４０４７．１のヌクレオチド４１１９０－４５２６９、ＮＷ＿００６８８４５９２．１のヌクレオチド６３５９０－２０７９１１、ＮＷ＿００６８８１２９６．１のヌクレオチド２５３８３１－４９１９０９、ＮＷ＿００３６１６４１２．１のヌクレオチド６９３０３－７９７６８、ＮＷ＿００３６１５０６３．１のヌクレオチド２９３４８１－３１５２６５、ＮＷ＿００６８８２９３６．１のヌクレオチド２６５０４４３－２６６２０５４、及びＮＷ＿００３６１５４１１．１のヌクレオチド８２２１４－９７７０５と少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、又は少なくとも約９９．９％相同である。一部の実施形態では、取り込まれた外因性ヌクレオチド配列の３’の側面に位置するヌクレオチド配列は、ＮＷ＿００６８７４０４７．１のヌクレオチド４５２７０－４５４９０、ＮＷ＿００６８８４５９２．１のヌクレオチド２０７９１２－７９２３７４、ＮＷ＿００６８８１２９６．１のヌクレオチド４９１９１０－６６７８１３、ＮＷ＿００３６１６４１２．１のヌクレオチド７９７６９－１０００５９、ＮＷ＿００３６１５０６３．１のヌクレオチド３１５２６６－３６２４４２、ＮＷ＿００６８８２９３６．１のヌクレオチド２６６２０５５－２７０１７６８、及びＮＷ＿００３６１５４１１．１のヌクレオチド９７７０６－１０５１１７と少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、又は少なくとも約９９．９％相同である。
【0053】
一部の実施形態では、取り込まれた外因性ヌクレオチド配列は、コンティグＮＷ＿００６８７４０４７．１、ＮＷ＿ ００６８８４５９２．１、ＮＷ＿ ００６８８１２９６．１、ＮＷ＿ ００３６１６４１２．１、ＮＷ＿ ００３６１５０６３．１、ＮＷ＿ ００６８８２９３６．１、及びＮＷ＿ ００３６１５４１１．１、並びにそれらと少なくとも５０％相同である配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列に作用可能に連結されている。一部の実施形態では、外因性ヌクレオチド配列に作用可能に連結されたヌクレオチド配列は、コンティグＮＷ＿００６８７４０４７．１、ＮＷ＿ ００６８８４５９２．１、ＮＷ＿ ００６８８１２９６．１、ＮＷ＿ ００３６１６４１２．１、ＮＷ＿ ００３６１５０６３．１、ＮＷ＿ ００６８８２９３６．１、及びＮＷ＿ ００３６１５４１１．１から選択される配列と少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、又は少なくとも約９９．９％相同である。
【0054】
一部の実施形態では、目的の生成物をコードする核酸は、トランスポゼースベースの取り込みを使用して宿主細胞のゲノムに取り込むことができる。トランスポゼースベースの取り込み技術は、例えば、Ｔｒｕｂｉｔｓｙｎａ ｅｔ ａｌ．, Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ４５（１０）：ｅ８９（２０１７），Ｌｉ ｅｔ ａｌ．, ＰＮＡＳ １１０（２５）：Ｅ２２７９－Ｅ２２８７（２０１３）及び国際公開第２００４／００９７９２号に開示されており、これらは、参照によりその全体が本明細書に援用される。
【0055】
表１は、例示的なＴＩ宿主細胞の取り込み部位を示す：
表１－ＴＩ宿主細胞の取り込み部位
表１－ＴＩ宿主細胞の取り込み部位
【0056】
２．２ ＳＯＩを含む外因性ヌクレオチド配列
一部の実施形態では、取り込まれた外因性ヌクレオチド配列は、少なくとも１つの外因性ＳＯＩを含む。一部の実施形態では、取り込まれた外因性ヌクレオチド配列は、少なくとも１つの選択マーカーと、少なくとも１つの外因性ＳＯＩとを含む。一部の実施形態では、取り込まれた外因性ヌクレオチド配列は、少なくとも１つの選択マーカーと、少なくとも１つの外因性ＳＯＩと、少なくとも１つのＲＲＳとを含む。一部の実施形態では、取り込まれた外因性ヌクレオチド配列は、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、少なくとも１０、又はそれより多いＳＯＩを含む。一部の実施形態では、ＳＯＩは同じである。一部の実施形態では、ＳＯＩは異なっている。
一部の実施形態では、取り込まれた外因性ヌクレオチド配列は、少なくとも１つの外因性ＳＯＩを含む。一部の実施形態では、取り込まれた外因性ヌクレオチド配列は、少なくとも１つの選択マーカーと、少なくとも１つの外因性ＳＯＩとを含む。一部の実施形態では、取り込まれた外因性ヌクレオチド配列は、少なくとも１つの選択マーカーと、少なくとも１つの外因性ＳＯＩと、少なくとも１つのＲＲＳとを含む。一部の実施形態では、取り込まれた外因性ヌクレオチド配列は、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、少なくとも１０、又はそれより多いＳＯＩを含む。一部の実施形態では、ＳＯＩは同じである。一部の実施形態では、ＳＯＩは異なっている。
【0057】
上記のように、一部の実施形態では、ＳＯＩは、多サブユニットタンパク質複合体の１つ又は複数のサブユニットをコードする。一部の実施形態では、このようなポリペプチド配列は、このようなサブユニット配列の断片を含むことができる。一部の実施形態では、目的の配列は、このようなサブユニット配列の組み合わせを含むことができる。例えば、限定しないが、このような組み合わせは、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、又はそれより多い第１のサブユニット配列及び／又は１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、又はそれより第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０又はそれを超えるサブユニット配列を含むことができる。さらに、一部の実施形態では、このような組み合わせは、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、又はそれより多い第１のサブユニット配列の別個のバリエーション及び／又は１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、又はそれより多い第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０又はそれを超えるサブユニット配列の別個のバリエーションを含むことができる。
【0058】
一部の実施形態では、ＳＯＩは、単鎖抗体又はその断片をコードする。一部の実施形態では、ＳＯＩは、抗体重鎖配列又はその断片をコードする。一部の実施形態では、ＳＯＩは、抗体軽鎖配列又はその断片をコードする。一部の実施形態では、取り込まれた外因性ヌクレオチド配列は、抗体重鎖配列又はその断片をコードするＳＯＩと、抗体軽鎖配列又はその断片をコードするＳＯＩとを含む。一部の実施形態では、取り込まれた外因性ヌクレオチド配列は、第１の抗体重鎖配列又はその断片をコードするＳＯＩと、第２の抗体重鎖配列又はその断片をコードするＳＯＩと、抗体軽鎖配列又はその断片をコードするＳＯＩとを含む。一部の実施形態では、取り込まれた外因性ヌクレオチド配列は、第１の抗体重鎖配列又はその断片をコードするＳＯＩと、第２の抗体重鎖配列又はその断片をコードするＳＯＩと、第１の抗体軽鎖配列又はその断片をコードするＳＯＩと、抗体軽鎖配列又はその断片をコードする第２のＳＯＩを含む。一部の実施形態では、重鎖配列及び軽鎖配列をコードするＳＯＩの数は、重鎖ポリペプチド及び軽鎖ポリペプチドの所望の発現レベルを達成するため、例えば、所望の量の二重特異性抗体の生成を達成するために選択することができる。一部の実施形態では、重鎖配列及び軽鎖配列をコードする個々のＳＯＩは、ＴＩ宿主細胞内部の、例えば、単一の取り込み部位に存在する単一の外因性核酸配列に、単一の取り込み部位に存在する複数の外因性核酸配列に、又は別個の取り込み部位に取り込まれた複数の外因性核酸配列に、取り込むことができる。
【0059】
一部の実施形態では、取り込まれた外因性ヌクレオチド配列は、少なくとも１つの選択マーカーと、少なくとも１つの外因性ＳＯＩと、１つのＲＲＳとを含む。一部の実施形態では、ＲＲＳは、少なくとも１つの選択マーカー又は少なくとも１つの外因性ＳＯＩに隣接して位置している。一部の実施形態では、取り込まれた外因性ヌクレオチド配列は、少なくとも１つの選択マーカーと、少なくとも１つの外因性ＳＯＩと、２つのＲＲＳとを含む。一部の実施形態では、取り込まれた外因性ヌクレオチド配列は、少なくとも１つの選択マーカーと、第１のＲＲＳと第２のＲＲＳとの間に位置する少なくとも１つの外因性ＳＯＩとを含む。一部の実施形態では、選択マーカーの側面に位置する２つのＲＲＳと、外因性ＳＯＩとは、同じである。一部の実施形態では、選択マーカーの側面に位置する２つのＲＲＳと、外因性ＳＯＩとは、異なっている。一部の実施形態では、側面に位置する第１のＲＲＳはＬｏｘＰ Ｌ３配列であり、側面に位置する第２のＲＲＳはＬｏｘＰ ２Ｌ配列である。一部の実施形態では、Ｌ３ ＬｏｘＰ配列は、外因性ＳＯＩ及び選択マーカーの５’に位置しており、ＬｏｘＰ ２Ｌ配列は、外因性ＳＯＩ及び選択マーカーの３’に位置している。
【0060】
一部の実施形態では、取り込まれた外因性ヌクレオチド配列は、３つのＲＲＳと２つの外因性ＳＯＩとを含み、第３のＲＲＳは、第１のＲＲＳと第２のＲＲＳとの間に位置している。一部の実施形態では、第１のＳＯＩは、第１のＲＲＳと第３のＲＲＳとの間に位置しており、第２のＳＯＩは、第３のＲＲＳと第２のＲＲＳとの間に位置している。一部の実施形態では、第１のＳＯＩと第２のＳＯＩとは異なっている。一部の実施形態では、第１のＲＲＳと第２のＲＲＳとは同じであり、第３のＲＲＳは、第１のＲＲＳ又は第２のＲＲＳとは異なっている。一部の実施形態では、３つすべてのＲＲＳは異なっている。一部の実施形態では、第１のＲＲＳはＬｏｘＰ Ｌ３部位であり、第２のＲＲＳはＬｏｘＰ ２Ｌ部位であり、第３のＲＲＳはＬｏｘＦａｓ部位である。一部の実施形態では、取り込まれた外因性ヌクレオチド配列は、３つのＲＲＳと、１つの外因性ＳＯＩと、１つの選択マーカーとを含む。一部の実施形態では、ＳＯＩは、第１のＲＲＳと第３のＲＲＳとの間に位置しており、選択マーカーは、第３のＲＲＳと第２のＲＲＳとの間に位置している。一部の実施形態では、取り込まれた外因性ヌクレオチド配列は、３つのＲＲＳと、２つの外因性ＳＯＩと、１つの選択マーカーとを含む。一部の実施形態では、第１のＳＯＩ及び選択マーカーは、第１のＲＲＳと第３のＲＲＳとの間に位置しており、第２のＳＯＩは、第３のＲＲＳと第２のＲＲＳとの間に位置している。
【0061】
一部の実施形態では、外因性ＳＯＩは、抗体、酵素、サイトカイン、増殖因子、ホルモン、ウイルスタンパク質、細菌タンパク質、ワクチンタンパク質、又は治療機能を有するタンパク質を含むがこれらに限定されない目的のポリペプチドをコードする。一部の実施形態では、外因性ＳＯＩは、抗体又はその抗原結合断片をコードする。一部の実施形態では、外因性ＳＯＩは、単鎖抗体、抗体軽鎖、抗体重鎖、単鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）、又はＦｃ融合タンパク質をコードする。一部の実施形態では、外因性ＳＯＩは、少なくとも１つのシス作用エレメント、例えば、プロモーター又はエンハンサーに作用可能に連結されている。一部の実施形態では、外因性ＳＯＩは、ＣＭＶプロモーターに作用可能に連結されている。
【0062】
一部の実施形態では、取り込まれた外因性ヌクレオチド配列は、２つのＲＲＳと、２つのＲＲＳ間に位置する少なくとも２つの外因性ＳＯＩとを含む。一部の実施形態では、抗体の１つの重鎖と１つの軽鎖とをコードするＳＯＩは、２つのＲＲＳ間に位置している。一部の実施形態では、抗体の１つの重鎖と２つの軽鎖とをコードするＳＯＩは、２つのＲＲＳ間に位置している。一部の実施形態では、抗体の重鎖及び軽鎖のコピーの異なる組み合わせをコードするＳＯＩは、２つのＲＲＳ間に位置している。
【0063】
一部の実施形態では、取り込まれた外因性ヌクレオチド配列は、３つのＲＲＳと少なくとも２つの外因性ＳＯＩとを含み、第３のＲＲＳは、第１のＲＲＳと第２のＲＲＳとの間に位置している。一部の実施形態では、少なくとも１つのＳＯＩは、第１のＲＲＳと第３のＲＲＳとの間に位置しており、少なくとも１つのＳＯＩは、第３のＲＲＳと第２のＲＲＳとの間に位置している。一部の実施形態では、第１のＲＲＳと第２のＲＲＳとは同じであり、第３のＲＲＳは、第１のＲＲＳ又は第２のＲＲＳとは異なっている。一部の実施形態では、３つすべてのＲＲＳは異なっている。一部の実施形態では、第１の抗体の１つの重鎖と１つの軽鎖をコードするＳＯＩは、第１のＲＲＳと第３のＲＲＳとの間に位置しており、第２の抗体の１つの重鎖と１つの軽鎖をコードするＳＯＩは、第３のＲＲＳと第２のＲＲＳとの間に位置している。一部の実施形態では、第１の抗体の１つの重鎖と２つの軽鎖をコードするＳＯＩは、第１のＲＲＳと第３のＲＲＳとの間に位置しており、第２の抗体の１つの重鎖と１つの軽鎖をコードするＳＯＩは、第３のＲＲＳと第２のＲＲＳとの間に位置している。一部の実施形態では、第１の抗体の１つの重鎖と３つの軽鎖をコードするＳＯＩは、第１のＲＲＳと第３のＲＲＳとの間に位置しており、第１の抗体の１つの軽鎖及び第２の抗体の１つの重鎖と１つの軽鎖をコードするＳＯＩは、第３のＲＲＳと第２のＲＲＳとの間に位置している。一部の実施形態では、第１の抗体の１つの重鎖と３つの軽鎖をコードするＳＯＩは、第１のＲＲＳと第３のＲＲＳとの間に位置しており、第１の抗体の２つの軽鎖及び第２の抗体の１つの重鎖と１つの軽鎖をコードするＳＯＩは、第３のＲＲＳと第２のＲＲＳとの間に位置している。一部の実施形態では、複数の抗体の重鎖及び軽鎖のコピーの異なる組み合わせをコードするＳＯＩは、第１のＲＲＳと第３のＲＲＳとの間、及び第３のＲＲＳと第２のＲＲＳとの間に位置している。
【0064】
３．宿主細胞
一部の実施形態では、宿主細胞は、真核生物宿主細胞である。一部の実施形態では、宿主細胞は、哺乳動物宿主細胞である。一部の実施形態では、宿主細胞は、ハムスター宿主細胞、ヒト宿主細胞、ラット宿主細胞、又はマウス宿主細胞である。一部の実施形態では、宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）宿主細胞、ＣＨＯ Ｋ１宿主細胞、ＣＨＯ Ｋ１ＳＶ宿主細胞、ＤＧ４４宿主細胞、ＤＵＫＸＢ－１１宿主細胞、ＣＨＯＫ１Ｓ宿主細胞、又はＣＨＯ Ｋ１Ｍ宿主細胞である。
一部の実施形態では、宿主細胞は、真核生物宿主細胞である。一部の実施形態では、宿主細胞は、哺乳動物宿主細胞である。一部の実施形態では、宿主細胞は、ハムスター宿主細胞、ヒト宿主細胞、ラット宿主細胞、又はマウス宿主細胞である。一部の実施形態では、宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）宿主細胞、ＣＨＯ Ｋ１宿主細胞、ＣＨＯ Ｋ１ＳＶ宿主細胞、ＤＧ４４宿主細胞、ＤＵＫＸＢ－１１宿主細胞、ＣＨＯＫ１Ｓ宿主細胞、又はＣＨＯ Ｋ１Ｍ宿主細胞である。
【0065】
一部の実施形態では、宿主細胞は、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ－７）、ヒト胎児性腎臓株（例えば、ｉｎ Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．, Ｊ． Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ． ３６：５９（１９７７）に記載される２９３又は２９３細胞）、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）、マウスセルトリ細胞（例えば、Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ． Ｒｅｐｒｏｄ． ２３：２４３－２５１（１９８０）に記載されるＴＭ４細胞）、サル腎臓細胞（ＣＶ１）、アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ－７６）、ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ）、イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ；バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ ３Ａ）、ヒト肺細胞（Ｗ１３８）、ヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ Ｇ２）、マウス乳房腫瘍（ＭＭＴ ０６０５６２）、例えば、Ｍａｔｈｅｒ ｅｔ ａｌ．, Ａｎｎａｌｓ Ｎ．Ｙ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ３８３：４４－６８（１９８２）に記載されるＴＲＩ細胞、ＭＲＣ ５細胞、ＦＳ４細胞、Ｙ０細胞、ＮＳ０細胞、Ｓｐ２／０細胞、及びＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞からなる群から選択される。
【0066】
一部の実施形態では、宿主細胞は、細胞株である。一部の実施形態では、宿主細胞は、特定数の世代にわたって培養された細胞株である。一部の実施形態では、宿主細胞は、一次細胞である。
【0067】
一部の実施形態では、目的のポリペプチドの発現は、発現レベルが一定のレベルに維持されるか、その上昇又は低下が１０、２０、３０、５０、１００、２００、又は３００世代にわたって２０％未満である場合、安定している。一部の実施形態では、目的のポリペプチドの発現は、培養物が選択なしで維持することができる場合、安定している。一部の実施形態では、目的のポリペプチドの発現は、目的の遺伝子のポリペプチド生成物が約１ｇ／Ｌ、約２ｇ／Ｌ、約３ｇ／Ｌ、約４ｇ／Ｌ、約５ｇ／Ｌ、約１０ｇ／Ｌ、約１２ｇ／Ｌ、約１４ｇ／Ｌ、又は約１６ｇ／Ｌに到達する場合、高い。
【0068】
一部の実施形態では、目的のポリペプチドが生成され、細胞培地中に分泌される。一部の実施形態では、目的のポリペプチドが発現され、宿主細胞内部に保持される。一部の実施形態では、目的のポリペプチドが発現され、宿主細胞膜に挿入されて保持される。
【0069】
目的の外因性ヌクレオチド又はベクターは、トランスフェクション、形質導入、エレクトロポレーション、又は注入を含むがこれらに限定されない従来の細胞生物学的方法によって宿主細胞に導入することができる。一部の実施形態では、目的の外因性ヌクレオチド又はベクターは、脂質ベースのトランスフェクション方法、リン酸カルシウムベースのトランスフェクション方法、カチオンポリマーベースのトランスフェクション方法、又はナノ粒子ベースのトランスフェクションを含む化学に基づくトランスフェクション方法によって宿主細胞に導入される。一部の実施形態では、目的の外因性ヌクレオチドは、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、又はアデノ随伴ウイルス媒介形質導入を含むがこれらに限定されないウイルス媒介形質導入によって宿主細胞に導入される。一部の実施形態では、目的の外因性ヌクレオチド又はベクターは、遺伝子銃媒介注入を介して宿主細胞に導入される。一部の実施形態では、ＤＮＡ分子及びＲＮＡ分子の両方が、本明細書に記載される方法を使用して宿主細胞に導入される。
【0070】
４．標的化取り込み
標的化取り込み手法は、外因性ヌクレオチド配列の、宿主細胞のゲノムの１つ又は複数の所定の部位への取り込みを可能にする。一部の実施形態では、標的化取り込みは、１つ又は複数のＲＲＳを認識するリコンビナーゼによって媒介される。一部の実施形態では、標的化取り込みは、相同的組み換えによって媒介される。
標的化取り込み手法は、外因性ヌクレオチド配列の、宿主細胞のゲノムの１つ又は複数の所定の部位への取り込みを可能にする。一部の実施形態では、標的化取り込みは、１つ又は複数のＲＲＳを認識するリコンビナーゼによって媒介される。一部の実施形態では、標的化取り込みは、相同的組み換えによって媒介される。
【0071】
４．１．多重ベクターＲＭＣＥを介した標的化取り込み
多重ベクターＲＭＣＥは、１つ又は複数のドナーＤＮＡ分子の、宿主細胞ゲノムの所定の部位への一方向取り込み、及びドナーＤＮＡ上に存在するＤＮＡカセットと取り込み部位が存在する宿主ゲノム上のＤＮＡカセットとの正確な交換を可能にする。ＤＮＡカセットは４つの異種特異的ＲＲＳを特徴とし、少なくとも２つが少なくとも１つの選択マーカー（一部のＲＭＣＥの例では「スプリット選択マーカー」を使用することができるが）と少なくとも１つの外因性ＳＯＩの側面に位置する。ＲＭＣＥは、ドナーＤＮＡ分子及び標的ゲノム遺伝子座内部の２つの異種特異的ＲＲＳ間における、リコンビナーゼによって触媒される二重組み換えクロスオーバー事象を伴う。ＲＭＣＥは、ＳＯＩ又は選択マーカーのコピーを、宿主細胞ゲノムの所定の遺伝子座に導入するように設計される。１つのクロスオーバー事象のみを伴う組み換えとは異なり、ＲＭＣＥは、原核生物ベクター配列が宿主細胞のゲノムに導入されないように実施することができ、よって、宿主の免疫機制又は防衛機制の不要なトリガーを減少及び／又は防止される。ＲＭＣＥ手順は、複数のＤＮＡカセットを用いて繰り返すことができる。例えば、ＲＭＣＥ手順を用いて、複数の別個の「フロント」カセットと複数の別個の「バック」カセットの導入を容易にすることができる。しかしながら、上記のように、ＲＭＣＥ（及び他の取り込み戦略）を用いて、わずか１つのカセット、及び１０個以上ものカセットを、宿主細胞のゲノムの単一の所定の部位に導入することができる。例えば、図１～５に概説されるように、３つすべてのベクターを多重ベクターＲＭＣＥ手法に使用して、３つ以上のＳＯＩを単一の遺伝子座に導入することができる。一部の実施形態では、多重ＲＭＣＥを使用して、わずか１つのカセットを及び１０個以上ものカセットを、同時に又は連続して、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、又はそれより多い別個の遺伝子座に導入することができる。
多重ベクターＲＭＣＥは、１つ又は複数のドナーＤＮＡ分子の、宿主細胞ゲノムの所定の部位への一方向取り込み、及びドナーＤＮＡ上に存在するＤＮＡカセットと取り込み部位が存在する宿主ゲノム上のＤＮＡカセットとの正確な交換を可能にする。ＤＮＡカセットは４つの異種特異的ＲＲＳを特徴とし、少なくとも２つが少なくとも１つの選択マーカー（一部のＲＭＣＥの例では「スプリット選択マーカー」を使用することができるが）と少なくとも１つの外因性ＳＯＩの側面に位置する。ＲＭＣＥは、ドナーＤＮＡ分子及び標的ゲノム遺伝子座内部の２つの異種特異的ＲＲＳ間における、リコンビナーゼによって触媒される二重組み換えクロスオーバー事象を伴う。ＲＭＣＥは、ＳＯＩ又は選択マーカーのコピーを、宿主細胞ゲノムの所定の遺伝子座に導入するように設計される。１つのクロスオーバー事象のみを伴う組み換えとは異なり、ＲＭＣＥは、原核生物ベクター配列が宿主細胞のゲノムに導入されないように実施することができ、よって、宿主の免疫機制又は防衛機制の不要なトリガーを減少及び／又は防止される。ＲＭＣＥ手順は、複数のＤＮＡカセットを用いて繰り返すことができる。例えば、ＲＭＣＥ手順を用いて、複数の別個の「フロント」カセットと複数の別個の「バック」カセットの導入を容易にすることができる。しかしながら、上記のように、ＲＭＣＥ（及び他の取り込み戦略）を用いて、わずか１つのカセット、及び１０個以上ものカセットを、宿主細胞のゲノムの単一の所定の部位に導入することができる。例えば、図１～５に概説されるように、３つすべてのベクターを多重ベクターＲＭＣＥ手法に使用して、３つ以上のＳＯＩを単一の遺伝子座に導入することができる。一部の実施形態では、多重ＲＭＣＥを使用して、わずか１つのカセットを及び１０個以上ものカセットを、同時に又は連続して、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、又はそれより多い別個の遺伝子座に導入することができる。
【0072】
一部の実施形態では、ＲＲＳは、ＬｏｘＰ配列、ＬｏｘＰ Ｌ３配列、ＬｏｘＰ ２Ｌ配列、ＬｏｘＦａｓ配列、Ｌｏｘ５１１配列、Ｌｏｘ２２７２配列、Ｌｏｘ２３７２配列、Ｌｏｘ５１７１配列、Ｌｏｘｍ２配列、Ｌｏｘ７１配列、Ｌｏｘ６６配列、ＦＲＴ配列、Ｂｘｂ１ ａｔｔＰ配列、Ｂｘｂ１ ａｔｔＢ配列、φＣ３１ ａｔｔＰ配列、及びφＣ３１ ａｔｔＢ配列からなる群から選択される。
【0073】
一部の実施形態では、ＲＲＳは、Ｃｒｅリコンビナーゼによって認識されうる。一部の実施形態では、ＲＲＳは、ＦＬＰリコンビナーゼによって認識されうる。一部の実施形態では、ＲＲＳは、Ｂｘｂ１インテグラーゼによって認識されうる。一部の実施形態では、ＲＲＳは、φＣ３１インテグラーゼによって認識されうる。
【0074】
一部の実施形態では、ＲＲＳがＬｏｘＰ部位であるとき、宿主細胞は、組み換えを実施するためにＣｒｅリコンビナーゼを必要とする。一部の実施形態では、ＲＲＳがＦＲＴ部位であるとき、宿主細胞は、組み換えを実施するためにＦＬＰリコンビナーゼを必要とする。一部の実施形態では、ＲＲＳがＢｘｂ１ ａｔｔＰ又はＢｘｂ１ ａｔｔＢ部位であるとき、宿主細胞は、組み換えを実施するためにＢｘｂ１インテグラーゼを必要とする。一部の実施形態では、ＲＲＳがφＣ３１ ａｔｔＰ又はφＣ３１ａｔｔＢ部位であるとき、宿主細胞は、組み換えを実施するためにφＣ３１インテグラーゼを必要とする。リコンビナーゼは、酵素のコード配列を含む発現ベクターを使用して、宿主細胞に導入することができる。
【0075】
Ｃｒｅ－ＬｏｘＰ部位に特異的な組み換え系は、多くの生物学的実験系において広く使用されている。Ｃｒｅは、３４ｂｐ ＬｏｘＰ配列を認識する、３８－ｋＤａの部位特異的ＤＮＡリコンビナーゼである。Ｃｒｅは、バクテリオファージＰ１から得られ、チロシンファミリー部位に特異的なリコンビナーゼに属する。Ｃｒｅリコンビナーゼは、ＬｏｘＰ配列間での分子内及び分子間両方の組み換えを媒介することができる。ＬｏｘＰ配列は、２つの１３ｂｐ逆方向反復が側面に位置する８ｂｐの非回文コア領域から構成される。Ｃｒｅリコンビナーゼは、１３ｂｐの反復に結合し、それにより８ｂｐのコア領域内部での組み換えを媒介する。Ｃｒｅ－ＬｏｘＰ媒介組み換えは、高効率で起こり、他の宿主因子をまったく必要としない。同じヌクレオチド配列上で２つのＬｏｘＰ配列が同じ配向で配置される場合、Ｃｒｅ媒介組み換えは、２つのＬｏｘＰ配列間に位置するＤＮＡ配列を、共有結合により閉じた環として切除するであろう。２つのＬｏｘＰ配列が同じヌクレオチド配列上の逆位置に置かれている場合、Ｃｒｅ媒介組み換えは、２つの配列間に位置するＤＮＡ配列の配向を反転させるであろう。ＬｏｘＰ配列はまた、異なる染色体上に置かれて、異なる染色体間の組み換えを容易にすることができる。２つのＬｏｘＰ配列が２つの異なるＤＮＡ分子上にある場合、及び１つのＤＮＡ分子が環状である場合、Ｃｒｅ媒介組み換えは、環状ＤＮＡ配列の取り込みをもたらすであろう。
【0076】
一部の実施形態では、ＬｏｘＰ配列は、野生型ＬｏｘＰ配列である。一部の実施形態では、ＬｏｘＰ配列は、変異ＬｏｘＰ配列である。変異ＬｏｘＰ配列は、Ｃｒｅ媒介取り込み又は置き換えの効率を上昇させるために開発された。一部の実施形態では、変異ＬｏｘＰ配列は、ＬｏｘＰ Ｌ３配列、ＬｏｘＰ ２Ｌ配列、ＬｏｘＦａｓ配列、Ｌｏｘ５１１配列、Ｌｏｘ２２７２配列、Ｌｏｘ２３７２配列、Ｌｏｘ５１７１配列、Ｌｏｘｍ２配列、Ｌｏｘ７１配列、及びＬｏｘ６６配列からなる群から選択される。例えば、Ｌｏｘ７１配列では、左側１３ｂｐ反復において５ｂｐが変異している。Ｌｏｘ６６配列では、右側１３ｂｐ反復において５ｂｐが変異している。野生型ＬｏｘＰ配列及び変異ＬｏｘＰ配列の両方が、Ｃｒｅ依存性組み換えを媒介することができる。
【0077】
ＦＬＰ－ＦＲＴ部位特異的な組み換え系は、Ｃｒｅ－Ｌｏｘ系に類似している。この系には、酵母サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の２μｍのプラスミドから得られるフリッパーゼ（ＦＬＰ）リコンビナーゼが含まれる。ＦＬＰはまた、チロシンファミリー部位特異的リコンビナーゼに属する。ＦＲＴ配列は、各々が８ｂｐスペーサーの側面に位置する１３ｂｐの２つの回文配列からなる ３４ｂｐ配列である。ＦＬＰは、１３ｂｐ回文配列に結合し、８ｂｐスペーサー内部でのＤＮＡの破壊、交換及びライゲーションを媒介する。Ｃｒｅリコンビナーゼと同様に、２つのＦＲＴ配列の位置及び配向が、ＦＬＰ媒介組み換えの結果を決定する。一部の実施形態では、ＦＲＴ配列は、野生型ＦＲＴ配列である。一部の実施形態では、ＦＲＴ配列は、変異ＦＲＴ配列である。野生型配列及び変異ＦＲＴ配列の両方が、ＦＬＰ依存性組み換えを媒介することができる。一部の実施形態では、ＦＲＴ配列は、限定されないが、タモキシフェン応答性受容体ドメイン配列といった応答性受容体ドメイン配列に融合している。
【0078】
Ｂｘｂ１及びφＣ３１は、セリンリコンビナーゼファミリーに属する。それらはともに、バクテリオファージから得られ、これらバクテリオファージによって使用されて溶原性を確立し、ファージゲノムの細菌ゲノムへの部位特異的な取り込みを容易にする。これらインテグラーゼは、元々ファージＤＮＡ及び細菌ＤＮＡ上にそれぞれ位置する結合部位であるａｔｔＰ配列及びａｔｔＢ配列と呼ばれる短い（４０～６０ｂｐ）ＤＮＡ基質間の部位特異的な組み換え事象を触媒する。組み換え後、ａｔｔＬ配列及びａｔｔＲ配列と呼ばれる２つの新規配列が形成され、これらの各々はａｔｔＰとａｔｔＢから得られる半分の配列を含む。組み換えはまた、ａｔｔＬ配列とａｔｔＲ配列の間で起こり、取り込まれたファージを細菌ＤＮＡから切除することができる。両方のインテグラーゼは、追加の宿主因子の助けなしで、組み換えを触媒することができる。補助因子の非存在下では、これらインテグラーゼは、ａｔｔＰとａｔｔＢの間の一方向組み換えを、８０％を上回る効率で媒介する。これらインテグラーゼによって認識されうる短いＤＮＡ配列及び一方向組み換えにより、これら組み換え系は、遺伝子工学の目的のために広く使用されるＣｒｅ－ＬｏｘＰ系及びＦＲＴ－ＦＬＰ系の補償として開発された。
【0079】
用語「一致するＲＲＳ」は、組み換えが２つのＲＲＳ間で起こることを示す。一部の実施形態では、２つの一致するＲＲＳは同じである。一部の実施形態では、両方のＲＲＳは、野生型ＬｏｘＰ配列である。一部の実施形態では、両方のＲＲＳは、変異ＬｏｘＰ配列である。一部の実施形態では、両方のＲＲＳは、野生型ＦＲＴ配列である。一部の実施形態では、両方のＲＲＳは、変異ＦＲＴ配列である。一部の実施形態では、２つの一致するＲＲＳは、異なる配列であるが、同じリコンビナーゼによって認識されうる。一部の実施形態では、第１の一致するＲＲＳはＢｘｂ１ ａｔｔＰ配列であり、第２の一致するＲＲＳはＢｘｂ１ ａｔｔＢ配列である。一部の実施形態では、第１の一致するＲＲＳはφＣ３１ ａｔｔＢ配列であり、第２の一致するＲＲＳはφＣ３１ ａｔｔＢ配列である。
【0080】
一部の実施形態では、標的化取り込みは複数のＲＭＣＥによって達成され、各々が、２つの異種特異的ＲＲＳが側面に位置する少なくとも外因性のＳＯＩ又は少なくとも１つの選択マーカーを含む複数のベクター由来のＤＮＡカセットは、宿主細胞ゲノムの所定の部位にすべて取り込まれる。一部の実施形態では、選択マーカーは、複数のＲＭＣＥの取り込みにより選択マーカーの発現が可能になるように、第１のベクター上に部分的にコードすることができ、第２の、第３の、又はそれを超えるベクター上に部分的にコードすることができる。一部の実施形態では、リコンビナーゼが媒介組み換えを介した標的化取り込みにより、原核生物ベクター由来の配列と一緒に、選択マーカー又は１つ若しくは複数の外因性ＳＯＩが、宿主細胞ゲノムの１つ又は複数の所定の取り込み部位に取り込まれる。
【0081】
一部の実施形態では、リコンビナーゼ媒介組み換えを介した標的化取り込みにより、選択マーカー又は１つ若しくは複数の外因性ＳＯＩが、原核生物ベクター由来の配列を有さない宿主細胞ゲノムの１つ又は複数の所定の取り込み部位に取り込まれる。多重ベクターＲＭＣＥの一部の実施形態では、選択マーカー及び２つのＳＯＩは、第１の遺伝子座に組み込むことができ、追加の切片マーカー及びもう１つのＳＯＩは、第２の遺伝子座に組み込まれる。追加的に、又は代替的に、本明細書に記載される方法は、複数の遺伝子座における複数のＳＯＩの組み込みを提供し、各遺伝子座は、ＳＯＩのうちの１つ又は複数のための組み込みの部位とすることができる。
【0082】
一部の実施形態では、目的の配列は、多サブユニットタンパク質複合体の１つ又は複数のサブユニットの配列を含む。一部の実施形態では、このようなポリペプチド配列は、このようなサブユニット配列の断片を含むことができる。一部の実施形態では、目的の配列は、このようなサブユニット配列の組み合わせを含むことができる。例えば、限定しないが、このような組み合わせは、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、又はそれより多い第１のサブユニット配列及び／又は１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、又はそれより多い第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０又はそれを超えるサブユニット配列を含むことができる。さらに、一部の実施形態では、このような組み合わせは、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、又はそれより多い第１のサブユニット配列の別個のバリエーション及び／又は１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、又はそれより多い第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０又はそれを超えるサブユニット配列の別個のバリエーションを含むことができる。
【0083】
一部の実施形態では、複数の目的の配列は、１つ又は複数の抗体重鎖配列（「Ｈ」）及び／又は１つ又は複数の抗体軽鎖配列（「Ｌ」）を含む。本明細書で使用される場合、このような「Ｈ」及び「Ｌ」配列は、完全長重鎖配列又は軽鎖配列、並びに可変領域断片及び相補性決定領域断片を含むがこれらに限定されない重鎖断片又は軽鎖断片とすることができる。一部の実施形態では、目的の配列は、このようなＨ配列及びＬ配列の組み合わせを含むことができる。例えば、限定しないが、このような組み合わせは、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、又はそれより多いＨ配列及び／又は１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、又はそれより多いＬ配列を含むことができる。さらに、一部の実施形態では、このような組み合わせは、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、又はそれより多い同じ又は異なる別個のＨ’配列及び／又は１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、又はそれより多い同じ又は異なる別個のＬ’配列を含むことができる。１から１０個（又はそれより多い数）の追加のＨ配列及びＬ配列、例えば、Ｈ’’、Ｈ’’’、Ｌ’’、及びＬ’’’を含めることも、ここに開示される主題により包含される。例示的実施形態には、限定されないが、種々の別個のＨ及び種々の別個のＬ配列、例えば：ＨＬ；ＬＨ；Ｈ’Ｌ；ＬＨ’；Ｈ’Ｌ’；Ｌ’Ｈ’；ＨＬＬ；ＨＨＬ；ＬＬＨ；ＬＨＨ；Ｈ’ＬＬ；Ｈ’ＨＬ；Ｌ’ＨＨ；Ｌ’ＬＨ；Ｈ’Ｈ’Ｌ；ＬＨ’Ｈ’；ＨＬＬＬ；ＬＬＬＨ；ＨＬＨＬ；ＬＨＬＨ；Ｈ’ＬＬＬ；Ｌ’ＬＬＨ；Ｈ’ＬＨＬ；Ｌ’ＨＬＨ；などの任意の組み合わせを含む配列が含まれる。
【0084】
一部の実施形態では、本開示は、ＳＯＩを発現させる方法を目的とし、この方法は、複数のＴＩ宿主細胞を提供することと；複数のＴＩ宿主細胞を、１つ又は複数のＳＯＩと少なくとも１つのマーカーとを含む複数のベクターと接触させることと；１つ又は複数のＳＯＩを、複数のＴＩ宿主細胞のうちの１つ又は複数に導入することと；目的の配列を発現するＴＩ細胞を選択することと；細胞を、目的の配列の発現に適した条件下で培養し、そこから目的の配列を回収することとを含む。
【0085】
一部の実施形態では、トランスフェクトされた宿主細胞は、１つ又は複数の目的の配列を含み、目的の配列は、多サブユニットタンパク質複合体の１つ又は複数のサブユニットの配列を含む。一部の実施形態では、このようなポリペプチド配列は、このようなサブユニット配列の断片を含むことができる。一部の実施形態では、目的の配列は、このようなサブユニット配列の組み合わせを含むことができる。例えば、限定しないが、このような組み合わせは、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、又はそれより多い第１のサブユニット配列及び／又は１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、又はそれより多い第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０又はそれを超えるサブユニット配列を含むことができる。さらに、一部の実施形態では、このような組み合わせは、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、又はそれより多い第１のサブユニット配列の同じ又は異なる別個のバリエーション及び／又は１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、又はそれより多い第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０又はそれを超えるサブユニット配列の同じ又は異なる別個のバリエーションを含むことができる。
【0086】
一部の実施形態では、トランスフェクトされた宿主細胞は、１つ又は複数の目的の配列を含み、目的の配列は、Ｈ配列とＬ配列の組み合わせを含むことができる。例えば、限定しないが、このような組み合わせは、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、又はそれより多いＨ配列及び／又は１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、又はそれより多いＬ配列を含むことができる。さらに、一部の実施形態では、このような組み合わせは、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、又はそれより多い別個のＨ’配列及び／又は１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、又はそれより多い別個のＬ’配列を含むことができる。１から１０個（又はそれより多い数）の追加のＨ配列及びＬ配列、例えば、Ｈ’’、Ｈ’’’、Ｌ’’、及びＬ’’’を含めることも、ここに開示される主題により包含される。例示的実施形態には、限定されないが、種々の別個のＨ及び種々の別個のＬ配列、例えば：ＨＬ；ＬＨ；Ｈ’Ｌ；ＬＨ’；Ｈ’Ｌ’；Ｌ’Ｈ’；ＨＬＬ；ＨＨＬ；ＬＬＨ；ＬＨＨ；Ｈ’ＬＬ；Ｈ’ＨＬ；Ｌ’ＨＨ；Ｌ’ＬＨ；Ｈ’Ｈ’Ｌ；ＬＨ’Ｈ’；ＨＬＬＬ；ＬＬＬＨ；ＨＬＨＬ；ＬＨＬＨ；Ｈ’ＬＬＬ；Ｌ’ＬＬＨ；Ｈ’ＬＨＬ；Ｌ’ＨＬＨ；などの任意の組み合わせを含む配列が含まれる。
【0087】
４．２ 制御系
ここに開示される主題はまた、ＴＩ宿主細胞の生成のための多重ベクターＲＭＣＥにおける使用のための制御系に関する。例えば、主にコードされたタンパク質が発現困難であるために、タンパク質発現レベルが最適でない場合が多く存在する。発現困難なタンパク質の低発現レベルは、多岐にわたる同定困難な原因を有しうる。１つの可能性は、宿主細胞中に発現されるタンパク質の毒性である。このような場合、タンパク質をコードする目的の配列が誘導性プロモーターの制御下にある場合、制御される発現系を使用して、毒性タンパク質を発現させることができる。このような系では、発現困難なタンパク質の発現は、制御因子、例えば、限定されないがテトラサイクリン又はそのアナログ、ドキシサイクリン（ＤＯＸ）といった小分子が培養物に加えられたときにのみ促進される。毒性タンパク質の発現を調節することにより、毒性作用が緩和され、培養物は、生成に先立って所望の細胞増殖を達成することができる。一部の実施形態では、本開示に従って調製されるＴＩ発現系は、特異的な遺伝子座に取り込まれたＳＯＩ、例えば、１つ又は複数のＲＲＳを含む外因性核酸配列を含み、それに作用可能に連結された制御されたプロモーターの下で転写される。一部の実施形態では、本開示に従って調製されるＴＩ発現系を使用して、限定されないが抗体のような発現困難な分子の低タンパク質発現の根本にある原因を決定することができる。一部の実施形態では、ＴＩ系においてＳＯＩの発現を選択的に止める能力を使用して、ＳＯＩの発現を観察された有害作用にリンクさせることができる。
ここに開示される主題はまた、ＴＩ宿主細胞の生成のための多重ベクターＲＭＣＥにおける使用のための制御系に関する。例えば、主にコードされたタンパク質が発現困難であるために、タンパク質発現レベルが最適でない場合が多く存在する。発現困難なタンパク質の低発現レベルは、多岐にわたる同定困難な原因を有しうる。１つの可能性は、宿主細胞中に発現されるタンパク質の毒性である。このような場合、タンパク質をコードする目的の配列が誘導性プロモーターの制御下にある場合、制御される発現系を使用して、毒性タンパク質を発現させることができる。このような系では、発現困難なタンパク質の発現は、制御因子、例えば、限定されないがテトラサイクリン又はそのアナログ、ドキシサイクリン（ＤＯＸ）といった小分子が培養物に加えられたときにのみ促進される。毒性タンパク質の発現を調節することにより、毒性作用が緩和され、培養物は、生成に先立って所望の細胞増殖を達成することができる。一部の実施形態では、本開示に従って調製されるＴＩ発現系は、特異的な遺伝子座に取り込まれたＳＯＩ、例えば、１つ又は複数のＲＲＳを含む外因性核酸配列を含み、それに作用可能に連結された制御されたプロモーターの下で転写される。一部の実施形態では、本開示に従って調製されるＴＩ発現系を使用して、限定されないが抗体のような発現困難な分子の低タンパク質発現の根本にある原因を決定することができる。一部の実施形態では、ＴＩ系においてＳＯＩの発現を選択的に止める能力を使用して、ＳＯＩの発現を観察された有害作用にリンクさせることができる。
【0088】
一部の実施形態では、発現困難な分子の原因解明中に転写及び細胞株の変動効果を最小化するために、ＴＩ系を使用することができる。例えば、限定しないが、ＴＩ宿主中のＳＯＩの発現は、制御因子、例えば、ドキシサイクリンの培養物への付加により、トリガーすることができる。一部の実施形態では、ＴＩベクターは、テトラサイクリン制御プロモーターを利用してＳＯＩを発現し、これは、例えば、ＲＲＳを含む外因性核酸配列に取り込むことができ、それ自体は、宿主細胞のゲノム中の取り込み部位に取り込まれ、制御されたＳＯＩの発現を可能にする。
【0089】
一部の実施形態では、本開示に記載されるＴＩ系を使用して、コントロール細胞株と比較した場合のＳＯＩの低タンパク質発現の１つ以上の根本原因、例えば、治療抗体を成功裏に決定することができる。一部の実施形態では、ＴＩ細胞株中のＳＯＩ、例えば、治療抗体の発現が相対的に低いことが確認されたら、ＳＯＩの細胞内蓄積レベル及び分泌レベルを、タンパク質翻訳阻害剤処置、例えば、Ｄｏｘ及びシクロヘキサミドを活用することにより評価することができる。
【0090】
例えば、限定しないが、このような制御は、転写抑制因子又は活性化因子を構成的プロモーター又はミニマルプロモーターに制御下で結合させることにより、ｍＲＮＡ合成をブロック又は活性化するための遺伝子スイッチに基づかせることができる。一部の非限定的実施形態では、抑制は、例えば、タンパク質が転写の開始を立体的にブロックする場合に、抑制タンパク質に結合することにより、又は転写サイレンサを通して転写を能動的に抑制することにより、達成することができる。一部の非限定的実施形態では、哺乳動物又はウイルスのエンハンサーレスミニマルプロモーターの活性化は、制御下で活性化ドメインに結合させることにより達成することができる。
【0091】
一部の実施形態では、転写の抑制因子又は活性化因子の条件付き結合は、外部刺激に応答してプロモーターに結合するアロステリックタンパク質を使用することにより達成することができる。一部の実施形態では、転写の抑制因子又は活性化因子の条件付き結合は、隔離タンパク質から放出され、したがって標的プロモーターに結合することのできる細胞内受容体を使用することにより達成することができる。一部の実施形態では、転写の抑制因子又は活性化因子の条件付き結合は、化学的に誘導される二量化剤を使用することにより達成することができる。
【0092】
一部の実施形態では、本開示のＴＩ系に使用されるアロステリックタンパク質は、抗生物質、細菌のクオラムセンシングメッセンジャー、異化産物に応答して、又は培養パラメーター、例えば温度、例えば冷たい又は暖かい温度に応答して、転写活性を調節するタンパク質とすることができる。一部の実施形態では、このようなＴＩ系は、例えば、代替的炭素源の異化遺伝子を制御する細菌の抑制因子が哺乳動物細胞に移されている場合、異化産物ベースとすることができる。一部の実施形態では、標的プロモーターの抑制は、抑制因子ＣｙｍＲのクメート応答性の結合により達成することができる。一部の実施形態では、異化産物ベースの系は、単純ヘルペスのＶＰ１６トランス活性化ドメインに融合した、原核生物の抑制因子ＨｄｎｏＲの６－ヒドロキシニコチン応答性の結合によるキメラプロモーターの活性化に依存しうる。
【0093】
一部の実施形態では、ＴＩ系は、クオラムセンシング分子による集団内及び集団間通信を管理する原核生物を起源とするクオラムセンシングベースの発現系とすることができる。このようなクオラムセンシング分子は、標的細胞中の受容体に結合し、特異的なレギュロンスイッチの開始に繋がる同族プロモーターに対する受容体の親和性を調節する。一部の実施形態では、クオラムセンシング分子は、Ｎ－（３－オキソ－オクタノイル）－ホモセリンラクトンとすることができ、この分子の存在下では、ＴｒａＲ－ｐ６５融合タンパク質が、ＴｒａＲ特異的なオペレーター配列に融合したミニマルプロモーターからの発現を活性化する一部の実施形態では、クオラムセンシング分子は、ＳＣＢ１の非存在下でその同族オペレーターＯＳｃｂＲに結合するストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）コエリカラーＡ３（２）ＳｃｂＲ抑制因子に基づく系のブチロラクトンＳＣＢ１（ラセミ２－（１’－ヒドロキシ－６－メチルヘプチル）－３－（ヒドロキシメチル）－ブタノリド）とすることができる。一部の実施形態では、クオラムセンシング分子は、緑膿菌クオラムセンシング抑制因子ＲｈｌＲ及びＬａｓＲが、ＳＶ４０Ｔ－抗原核局在化配列と単純ヘルペスＶＰ１６ドメインに融合しているＴＩ系において使用されるホモセリン派生誘導物質とすることができ、特異的なオペレーター配列（ｌａｓボックス）を含むプロモーターを活性化することができる。
【0094】
一部の実施形態では、本開示のＴＩ系において使用されるアロステリックタンパク質を調節する誘導分子は、限定しないが、クメート、イソプロピル－β－Ｄ－ガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）、マクロライド、６－ヒドロキシニコチン、ドキシサイクリン、ストレプトグラミン、ＮＡＤＨ、テトラサイクリンとすることができる。
【0095】
一部の実施形態では、本開示のＴＩ系に使用される細胞内受容体は、細胞質又は核受容体とすることができる。一部の実施形態では、本開示のＴＩ系は、小分子を使用することにより、隔離タンパク質及び阻害タンパク質からの転写因子の放出を利用することができる。一部の実施形態では、本開示のＴＩ系はステロイド制御に依存することができ、この場合、ホルモン受容体は、サイトゾル中のＨＳＰ９０から放出されうる天然又は人工の転写因子に融合し、核中に移動し、選択されたプロモーターを活性化する。一部の実施形態では、内因性ステロイドホルモンによるクロストークを避けるために、合成ステロイドアナログにより制御される変異受容体を使用することができる。一部の実施形態では、受容体は、４－ヒドロキシタモキシフェンに応答性のエストロゲン受容体バリアント又はＲＵ４８６によって誘導可能なプロゲステロン受容体変異体とすることができる。一部の実施形態では、ヒト核ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γ（ＰＰＡＲγ）に基づく核受容体由来ロシグリタゾン応答性の転写スイッチを、本開示のＴＩ系において使用することができる。一部の実施形態では、ステロイド応答性の受容体のバリアントはＲｈｅｏＳｗｉｔｃｈとすることができ、これは、Ｇａｌ４ ＤＮＡ結合ドメイン及びＶＰ１６トランス活性化因子に融合した修飾されたトウシノヒントメハマキ（Ｃｈｏｒｉｓｔｏｎｅｕｒａ ｆｕｍｉｆｅｒａｎａ）エクジソン受容体及びマウスレチノイドＸ受容体（ＲＸＲ）に基づいている。合成エクジソンの存在下では、ＲｈｅｏＳｗｉｔｃｈバリアントは、Ｇａｌ４応答要素の複数の反復に融合したミニマルプロモーターに結合してこれを活性化することができる。
【0096】
一部の実施形態では、本明細書に開示されるＴＩ系は、同族のオペレーターと融合したミニマルコアプロモーターの活性化のために、ＤＮＡ結合タンパク質と転写活性化因子の化学的に誘導された二量体化を利用することができる。一部の実施形態では、本明細書に開示されるＴＩ系は、ＦＫＢＰとＦＲＢのラパマイシン制御二量体化を利用することができる。この系では、ＦＲＢは、ｐ６５トランス活性化因子に融合し、ＦＫＢＰは、操作されたミニマルインターロイキン－１２プロモーターの上流に配置された同族のオペレーター部位に対して特異的なジンクフィンガードメインに融合している。一部の実施形態では、ＦＫＢＰは変異していてもよい。一部の実施形態では、本明細書に開示されるＴＩ系は、細菌ギラーゼＢサブユニット（ＧｙｒＢ）を利用することができ、ＧｙｒＢは、抗生物質クーママイシンの存在下で二量体化し、ノボビオシンと解離する。
【0097】
一部の実施形態では、本開示のＴＩ系は、制御されたｓｉＲＮＡ発現のために使用することができる。一部の実施形態では、制御されたｓｉＲＮＡ発現系は、テトラサイクリン、マクロライド、又はＯＦＦ及びＯＮ型のＱｕｏＲｅｘ系とすることができる。一部の実施形態では、ＴＩ系は、ツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）の末端オリゴピリミジン要素（ＴＯＰ）を利用することができ、これは、５’非翻訳領域内にヘアピン構造を形成することにより翻訳開始をブロックする
【0098】
一部の実施形態では、本開示に記載されるＴＩ系は、気相制御発現、例えば、アセトアルデヒド誘導制御（ＡＩＲ）系を利用することができる。ＡＩＲ系は、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）ＡｌｃＲ転写因子を用いることができ、これは、非毒性濃度の気相又は液相アセトアルデヒドの存在下で、ミニマルヒトサイトメガロウイルスプロモーターに融合したＡｌｃＲ特異的オペレーターから組み立てられたＰＡＩＲプロモーターを特異的に活性化する。
【0099】
一部の実施形態では、本開示のＴＩ系は、Ｔｅｔ－Ｏｎ又はＴｅｔ－Ｏｆｆ系を利用することができる。このような系では、１つ又は複数のＳＯＩの発現は、テトラサイクリン又はそのアナログであるドキシサイクリンにより制御することができる。
【0100】
一部の実施形態では、本開示のＴＩ系は、ＰＩＰ－ｏｎ又はＰＩＰ－ｏｆｆ系を利用することができる。このような系では、ＳＯＩの発現は、例えば、プリスチナマイシン、テトラサイクリン及び／又はエリスロマイシンによって制御することができる。
【0101】
５．生成物
本開示の宿主細胞は、いずれの目的の分子の発現にも使用することができる。一部の実施形態では、本開示の宿主細胞は、ポリペプチド、例えば、哺乳動物のポリペプチドの発現のために使用することができる。このようなポリペプチドの非限定的な例には、ホルモン、受容体、融合タンパク質、制御因子、増殖因子、補体系因子、酵素、凝固因子、抗凝固因子、キナーゼ、サイトカイン、ＣＤタンパク質、インターロイキン、治療用タンパク質、診断用タンパク質及び抗体が含まれる。一部の実施形態では、本開示の宿主細胞は、シャペロン、タンパク質修飾酵素、ｓｈＲＮＡ、ｇＲＮＡ又は他のタンパク質若しくはペプチドの発現のために使用することができると共に、治療用タンパク質又は目的の分子を、恒常的に又は制御下で発現することができる。
本開示の宿主細胞は、いずれの目的の分子の発現にも使用することができる。一部の実施形態では、本開示の宿主細胞は、ポリペプチド、例えば、哺乳動物のポリペプチドの発現のために使用することができる。このようなポリペプチドの非限定的な例には、ホルモン、受容体、融合タンパク質、制御因子、増殖因子、補体系因子、酵素、凝固因子、抗凝固因子、キナーゼ、サイトカイン、ＣＤタンパク質、インターロイキン、治療用タンパク質、診断用タンパク質及び抗体が含まれる。一部の実施形態では、本開示の宿主細胞は、シャペロン、タンパク質修飾酵素、ｓｈＲＮＡ、ｇＲＮＡ又は他のタンパク質若しくはペプチドの発現のために使用することができると共に、治療用タンパク質又は目的の分子を、恒常的に又は制御下で発現することができる。
【0102】
一部の実施形態では、目的のポリペプチドは、二重特異性、三重特異性又は多重特異性ポリペプチド、例えば二重特異性抗体である。
【0103】
本開示の宿主細胞は、従来の細胞培養方法に使用される細胞、例えば、非ＴＩ細胞と比較して、より短い時間枠での大量の目的の分子の生成に用いることができる。一部の実施形態では、本開示の宿主細胞は、従来の細胞培養方法において使用される細胞、例えば、非ＴＩ細胞と比較して、目的の分子の品質を向上させるために用いることができる。一部の実施形態では、本開示の宿主細胞を使用して、経時的に細胞ストレス及びクローン不安定性を引き起こしうる生成物により生じうる慢性毒性を防止することにより、シードトレインの安定性を強化することができる。一部の実施形態では、本開示の宿主細胞は、急性毒性生成物の最適な発現のために使用することができる。
【0104】
一部の実施形態では、本開示の宿主細胞及び系は、細胞培養プロセスの最適化及び／又はプロセスの開発のために使用することができる。
【0105】
一部の実施形態では、本開示の宿主細胞は、治療用分子の選択されたサブユニットの恒常的発現及び同じ治療用分子の他の異なるサブユニットの制御された発現のために使用することができる。一部の実施形態では、治療用分子は、融合タンパク質とすることができる。一部の実施形態では、本開示の宿主細胞を使用して、完全に組み立てられた抗体分子の発現及び分泌における各抗体サブユニットの役割及び効果を理解することができる。
【0106】
一部の実施形態では、本開示の宿主細胞は、調査ツールとして使用することができる。一部の実施形態では、本開示の宿主細胞は、種々の細胞中の問題の分子の低タンパク質発現の原因を精密に示すための診断ツールとして使用することができる。一部の実施形態では、本開示の宿主細胞を使用して、観察された現象又は細胞動態を、細胞中の導入遺伝子の発現に直接リンクさせることができる。本開示の宿主細胞はまた、観察された動態が細胞中で可逆性であるかどうかを実証するために使用することができる。一部の実施形態では、本開示の宿主細胞を利用して、細胞中での１つ以上の導入遺伝子の転写及び発現に関する問題を同定し、軽減することができる。
【0107】
一部の実施形態では、本開示の宿主細胞を使用して、発現困難な分子の、限定しないが抗体のＨＣ及びＬＣサブユニットといった導入遺伝子のサブユニットを、系の平均的な分子の同サブユニットとスワップして、１つ以上の問題のサブユニットを同定することができる。一部の実施形態では、この時アミノ酸配列分析を使用して、低タンパク質発現の原因でありうるアミノ酸残基又は領域を絞り込み、それに焦点を当てることができる。
【実施例】
【0108】
実施例１：２ベクターＲＭＣＥと多重ベクターＲＭＣＥとの比較
本実施例では、２ベクターＲＭＣＥと比較して多重ベクターＲＭＣＥ（この実施例では、３ベクターＲＭＣＥ）を用いたときの、種々のＣＬＤパラメーターの差異を同定する。
本実施例では、２ベクターＲＭＣＥと比較して多重ベクターＲＭＣＥ（この実施例では、３ベクターＲＭＣＥ）を用いたときの、種々のＣＬＤパラメーターの差異を同定する。
【0109】
プラスミドの構築
２ベクターベースのＲＭＣＥのために、フロント及びバックの抗体標的化ベクターを構築した。抗体のＨＣ及びＬＣ ｃＤＮＡを、Ｌ３、プロモーター及び開始コドン（ＡＴＧ）とそれに続くＬｏｘＦＡＳ配列を含むフロントベクターバックボーン、並びにＬｏｘＦＡＳ、開始コドンを欠くＰａｃ及び２Ｌ配列を含むバックベクターバックボーンにクローニングした。Ｃｒｅリコンビナーゼプラスミド（ｐＯＧ２３１）を、すべてのＲＭＣＥプロセスのために使用した。
２ベクターベースのＲＭＣＥのために、フロント及びバックの抗体標的化ベクターを構築した。抗体のＨＣ及びＬＣ ｃＤＮＡを、Ｌ３、プロモーター及び開始コドン（ＡＴＧ）とそれに続くＬｏｘＦＡＳ配列を含むフロントベクターバックボーン、並びにＬｏｘＦＡＳ、開始コドンを欠くＰａｃ及び２Ｌ配列を含むバックベクターバックボーンにクローニングした。Ｃｒｅリコンビナーゼプラスミド（ｐＯＧ２３１）を、すべてのＲＭＣＥプロセスのために使用した。
【0110】
３ベクターベースのＲＭＣＥのために、３つの抗体標的化ベクター（プラスミド１、２及び３）を構築した。プラスミド１は、上述の２ベクターベースのＲＭＣＥのフロントベクターと同一である。プラスミド２の骨格は、ＬｏｘＦＡＳ、開始コドンを欠くＰａｃ、ＣＭＶプロモーター及びＦｒｔ３配列を含む。プラスミド３の骨格は、Ｆｒｔ３、ＮｅｏＲ及びＦｒｔ配列を含む。ＦｌｐＯリコンビナーゼのコード配列を、マウスコドン最適化配列に基づいて合成した。配列を、ＣＭＶプロモーターによって駆動され、ポリアデニル化配列を含む独自の発現ベクターにクローニングした。
【0111】
トランスフェクション及びＲＭＣＥ
２ベクターベースのＲＭＣＥのために、ＨＣ及びＬＣを含むフロント及びバックの抗体標的化ベクター、並びにｐＯＧ２３１を、Ｍａｘｃｙｔｅ ＳＴＸ（Ｍａｘｃｙｔｅ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を使用するエレクトロポレーションにより、ＴＩ宿主細胞にトランスフェクトした。
２ベクターベースのＲＭＣＥのために、ＨＣ及びＬＣを含むフロント及びバックの抗体標的化ベクター、並びにｐＯＧ２３１を、Ｍａｘｃｙｔｅ ＳＴＸ（Ｍａｘｃｙｔｅ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を使用するエレクトロポレーションにより、ＴＩ宿主細胞にトランスフェクトした。
【0112】
３ベクターベースのＲＭＣＥのために、ＨＣ及びＬＣを含むプラスミド１、２、３抗体標的化ベクター、並びにｐＯＧ２３１及びＦｌｐＯ発現プラスミドを、Ｍａｘｃｙｔｅ ＳＴＸ（Ｍａｘｃｙｔｅ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を使用するエレクトロポレーションにより、ＴＩ宿主細胞にトランスフェクトした。
【0113】
トランスフェクションの４８時間後、細胞を、遠心分離によりペレット化した。次いでペレットを、独自の独自のＤＭＥＭ／Ｆ１２ベースの選択含有媒体に懸濁し、３７℃及び５％ ＣＯ２で、トランスフェクションプールが回収されるまで培養した。
【0114】
ＲＭＣＥプールのフェッドバッチ振盪フラスコ評価
フェッドバッチ生成培養を、独自の合成培地をボーラス供給を用いて、振盪フラスコ内で、１、３、４日目に実施した。温度は、実行中３５℃に維持した。７日目の力価を、ＵＶ検出を用いるプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーを使用して決定した。パーセント生存率及び生細胞数を、Ｖｉ細胞ＸＲ機器（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用して決定した。
フェッドバッチ生成培養を、独自の合成培地をボーラス供給を用いて、振盪フラスコ内で、１、３、４日目に実施した。温度は、実行中３５℃に維持した。７日目の力価を、ＵＶ検出を用いるプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーを使用して決定した。パーセント生存率及び生細胞数を、Ｖｉ細胞ＸＲ機器（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用して決定した。
【0115】
デジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）によるコピー数分析
１ｘ１０６細胞のペレットからのゲノムＤＮＡを、ＭａｇＮＡ Ｐｕｒｅ ９６ ＤＮＡ及びＶｉｒａｌ ＮＡ Ｓｍａｌｌ Ｖｏｌｕｍｅ Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｃａｔ．Ｎｏ．０６５４３５８８００１）を使用するＭａｇＮＡ Ｐｕｒｅ ９６機器（Ｒｏｃｈｅ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ）により精製した。チャイニーズハムスターＢｃｌ－２関連Ｘタンパク質（Ｂａｘ）及びアルブミン（Ａｌｂ）のコピー数を、ＨＣ及びＬＣそれぞれの遺伝子コピーの決定のための基準として使用した。ｄｄＰＣＲ反応物を、ＱＸ２００ ｄｄＰＣＲシステム（Ｂｉｏ－Ｒａｄ，Ｃａｔ．Ｎｏ．１８６－３０１０）のマニュアルに従って調製した。簡潔には、ｄｄＰＣＲ反応物を、ＨＥＸで標識したＨＣ又はＬＣプローブ、及びＦＡＭで標識したＢａｘ又はＡｌｂプローブを用いて、１反応物あたり２０μｌ中で設定した。次いで試料をＱＸ２００液滴生成器中に配置し、液滴を９６ウェルプレートに移してサーマルサイクラー内でＰＣＲを行い、続いて液滴を読み取った。サイクリング条件は以下の通りである：９５℃で１０分、９４℃で３０秒を４０サイクル、及び６０℃で１分、続いて９８℃で１０分による酵素不活性化。この試験で使用したプライマー及びプローブは、プライマーエクスプレスｖ３．０（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して設計した。
１ｘ１０６細胞のペレットからのゲノムＤＮＡを、ＭａｇＮＡ Ｐｕｒｅ ９６ ＤＮＡ及びＶｉｒａｌ ＮＡ Ｓｍａｌｌ Ｖｏｌｕｍｅ Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｃａｔ．Ｎｏ．０６５４３５８８００１）を使用するＭａｇＮＡ Ｐｕｒｅ ９６機器（Ｒｏｃｈｅ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ）により精製した。チャイニーズハムスターＢｃｌ－２関連Ｘタンパク質（Ｂａｘ）及びアルブミン（Ａｌｂ）のコピー数を、ＨＣ及びＬＣそれぞれの遺伝子コピーの決定のための基準として使用した。ｄｄＰＣＲ反応物を、ＱＸ２００ ｄｄＰＣＲシステム（Ｂｉｏ－Ｒａｄ，Ｃａｔ．Ｎｏ．１８６－３０１０）のマニュアルに従って調製した。簡潔には、ｄｄＰＣＲ反応物を、ＨＥＸで標識したＨＣ又はＬＣプローブ、及びＦＡＭで標識したＢａｘ又はＡｌｂプローブを用いて、１反応物あたり２０μｌ中で設定した。次いで試料をＱＸ２００液滴生成器中に配置し、液滴を９６ウェルプレートに移してサーマルサイクラー内でＰＣＲを行い、続いて液滴を読み取った。サイクリング条件は以下の通りである：９５℃で１０分、９４℃で３０秒を４０サイクル、及び６０℃で１分、続いて９８℃で１０分による酵素不活性化。この試験で使用したプライマー及びプローブは、プライマーエクスプレスｖ３．０（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して設計した。
【0116】
デジタル逆転写酵素ＰＣＲによるｍＲＮＡ発現
１ｘ１０６細胞のペレットからの総ＲＮＡを、ＭａｇＮＡ Ｐｕｒｅ ９６ Ｃｅｌｌｕｌａｒ ＲＮＡ Ｌａｒｇｅ Ｖｏｌｕｍｅ Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｃａｔ．Ｎｏ．０５４６７５３５００１）を使用するＭａｇＮＡ Ｐｕｒｅ ９６機器（Ｒｏｃｈｅ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ）により精製し、Ｎａｎｏｄｒｏｐ ２０００分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｃａｔ．Ｎｏ．ＮＤ－２０００）を使用して定量化した。概ね２０～４０ｐｇのＲＮＡを使用して、Ｏｎｅ－Ｓｔｅｐ ＲＴ－ｄｄＰＣＲ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｋｉｔ ｆｏｒ Ｐｒｏｂｅｓ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ，Ｃａｔ．Ｎｏ．１８６４０２２）を使用するｄｄＲＴ－ＰＣＲを実施した。ＩｇＧ重鎖及び軽鎖用のプライマー及びプローブは、遺伝子コピー分析に使用したものと同一であった。液滴生成、温度サイクリング、及び液滴読み取りを、Ｂｉｏ－Ｒａｄ ＱＸ２００ ｄｄＰＣＲ系（Ｂｉｏ－Ｒａｄ，Ｃａｔ．Ｎｏ．１８６－３０１０）を使用して実行した。温度サイクリング条件は、酵素不活性化のために、５０℃で１時間、９５℃で１０分、次いで９５℃で３０秒を４０サイクル、及び５８℃で１分、続いて９８℃で１０分であった。その結果得られた濃度は、総ＲＮＡ２０ｐｇ当たりのコピーに正規化された。
１ｘ１０６細胞のペレットからの総ＲＮＡを、ＭａｇＮＡ Ｐｕｒｅ ９６ Ｃｅｌｌｕｌａｒ ＲＮＡ Ｌａｒｇｅ Ｖｏｌｕｍｅ Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｃａｔ．Ｎｏ．０５４６７５３５００１）を使用するＭａｇＮＡ Ｐｕｒｅ ９６機器（Ｒｏｃｈｅ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ）により精製し、Ｎａｎｏｄｒｏｐ ２０００分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｃａｔ．Ｎｏ．ＮＤ－２０００）を使用して定量化した。概ね２０～４０ｐｇのＲＮＡを使用して、Ｏｎｅ－Ｓｔｅｐ ＲＴ－ｄｄＰＣＲ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｋｉｔ ｆｏｒ Ｐｒｏｂｅｓ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ，Ｃａｔ．Ｎｏ．１８６４０２２）を使用するｄｄＲＴ－ＰＣＲを実施した。ＩｇＧ重鎖及び軽鎖用のプライマー及びプローブは、遺伝子コピー分析に使用したものと同一であった。液滴生成、温度サイクリング、及び液滴読み取りを、Ｂｉｏ－Ｒａｄ ＱＸ２００ ｄｄＰＣＲ系（Ｂｉｏ－Ｒａｄ，Ｃａｔ．Ｎｏ．１８６－３０１０）を使用して実行した。温度サイクリング条件は、酵素不活性化のために、５０℃で１時間、９５℃で１０分、次いで９５℃で３０秒を４０サイクル、及び５８℃で１分、続いて９８℃で１０分であった。その結果得られた濃度は、総ＲＮＡ２０ｐｇ当たりのコピーに正規化された。
【0117】
表２．２ベクターＲＭＣＥと比較して多重ベクターＲＭＣＥ（この実施例では、３ベクターＲＭＣＥ）を用いたときの、種々のＣＬＤパラメーターの差異を同定する。
【0118】
実施例２：２ベクターＲＭＣＥと多重ベクターＲＭＣＥとのＡｍｂｒ（登録商標）２５０との比較
本実施例では、遺伝子コピー数及びｍＲＮＡ発現は、Ａｍｂｒ（登録商標）２５０システム（ＴＡＰ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）で培養された抗体を発現する細胞株間で比較されるが、１つの細胞株は２プラスミドＲＭＣＥ手法を使用して調製され、第２の細胞株は多重ベクターＲＭＣＥ手法を使用して調製される。２プラスミド手法では、各プラスミドは、重鎖コード配列の１つのコピーと、軽鎖コード配列の２つのコピーとを含む（「ＨＬＬ－ＨＬＬ」）。多重ベクター手法では、各プラスミドは同様に、重鎖コード配列の１つのコピーと、軽鎖コード配列の２つのコピーとを含む。しかしながら、多重ベクターＲＭＣＥ中に第３のプラスミドが存在している場合、この手法は、「ＨＬＬ－ＨＬＬ－ＨＬＬ」構成をもたらす。
本実施例では、遺伝子コピー数及びｍＲＮＡ発現は、Ａｍｂｒ（登録商標）２５０システム（ＴＡＰ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）で培養された抗体を発現する細胞株間で比較されるが、１つの細胞株は２プラスミドＲＭＣＥ手法を使用して調製され、第２の細胞株は多重ベクターＲＭＣＥ手法を使用して調製される。２プラスミド手法では、各プラスミドは、重鎖コード配列の１つのコピーと、軽鎖コード配列の２つのコピーとを含む（「ＨＬＬ－ＨＬＬ」）。多重ベクター手法では、各プラスミドは同様に、重鎖コード配列の１つのコピーと、軽鎖コード配列の２つのコピーとを含む。しかしながら、多重ベクターＲＭＣＥ中に第３のプラスミドが存在している場合、この手法は、「ＨＬＬ－ＨＬＬ－ＨＬＬ」構成をもたらす。
【0119】
１２のクローンが、Ａｍｂｒ（登録商標）２５０システム（ＴＡＰ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）で評価される。Ａｍｂｒ（登録商標）２５０システムは、単回使用２５０ｍＬミニバイオリアクターを用いるハイスループット自動化手法であり、これは、製造者によって推奨されるように本実施例で使用される。簡潔には、３千万個の細胞が、ｐＨ７．１５を有する独自の合成生成培地に播種され、培養温度は、最初の４８時間にわたって３７℃に維持される。次いで培養温度を、残りの培養のために３５℃にシフトさせる。１４日間のフェッドバッチ培養には、１、３、６、９、及び１２日目における５回のボーラス供給を用いる。細胞生存率及び生細胞数が、ＢｉｏＰｒｏｆｉｌｅ Ｆｌｅｘ２（Ｎｏｖａ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ）を使用するトリパンブルー色素排除により監視される。
【0120】
実施例３：２ベクターＲＭＣＥと２部位多重ベクターＲＭＣＥとの比較
本実施例では、２ベクターＲＭＣＥと比較して多重ベクターＲＭＣＥ（この実施例では、２つのベクターが第１の部位に取り込まれており、第３のベクターが第２の部位に取り込まれている、３ベクターＲＭＣＥ）を用いたときの、種々のＣＬＤパラメーターの差異を同定する。図７に示す場合を除き、コンストラクトを発現する抗体を、実施例１に説明されるように調製した。簡潔には、「Ｇ」部位の緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）ランディングパッドは、上述しかつ添付図面に示す第１の２つのプラスミドの組み込みについて示されるように使用され、「Ｂ」部位の青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）ランディングパッドは、ゼオシン耐性遺伝子（ＺｅｏＲ）及びＦｒｔとＦｒｔ３リコンビナーゼ部位が側面に位置する（ＢＦＰ）からなる。プロモーターを持たないＮｅｏが、Ｆｒｔ部位の下流に配置される。「Ｂ」部位のための抗体標的化ベクターは、ＳＡＴ遺伝子と、ＨＣ及びＬＣのｃＤＮＡの種々のコピーをコードするｍＡｂ発現カセットと、それに続くプロモーターとを含み、それらすべての側面にＦｒｔ３とＦｒｔが位置している。
本実施例では、２ベクターＲＭＣＥと比較して多重ベクターＲＭＣＥ（この実施例では、２つのベクターが第１の部位に取り込まれており、第３のベクターが第２の部位に取り込まれている、３ベクターＲＭＣＥ）を用いたときの、種々のＣＬＤパラメーターの差異を同定する。図７に示す場合を除き、コンストラクトを発現する抗体を、実施例１に説明されるように調製した。簡潔には、「Ｇ」部位の緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）ランディングパッドは、上述しかつ添付図面に示す第１の２つのプラスミドの組み込みについて示されるように使用され、「Ｂ」部位の青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）ランディングパッドは、ゼオシン耐性遺伝子（ＺｅｏＲ）及びＦｒｔとＦｒｔ３リコンビナーゼ部位が側面に位置する（ＢＦＰ）からなる。プロモーターを持たないＮｅｏが、Ｆｒｔ部位の下流に配置される。「Ｂ」部位のための抗体標的化ベクターは、ＳＡＴ遺伝子と、ＨＣ及びＬＣのｃＤＮＡの種々のコピーをコードするｍＡｂ発現カセットと、それに続くプロモーターとを含み、それらすべての側面にＦｒｔ３とＦｒｔが位置している。
【0121】
図８のＡ及びＢは、２プラスミドベースのＲＭＣＥと２部位多重ベクタープラスミド（この場合、３プラスミド）ベースのＲＭＣＥを使用したＴＩトランスフェクションプールの生産性の比較を示している。ｍＡｂ Ａの２部位多重ベクタープラスミドベースのＴＩプール（Ａ）及びｍＡｂ ＢのＴＩプール（Ｂ）では、力価（棒グラフ）及びＱｐ（点）はともにより高い。
【0122】
実施例４：２ベクターＲＭＣＥと多重ベクターＲＭＣＥとの比較
この実施例では、ｍＡｂ Ｃ、ｍＡｂ Ｄ、及びｍＡｂ Ｅの、２ベクター及び多重ベクターＲＭＣＥ（この場合３プラスミドＲＭＣＥ）振盪フラスコ培養物を、上記に説明したように調製し、７日間培養した。７日間の培養が完了したら、特定のＣＬＤパラメーターを、ｍＡｂ Ｃ、ｍＡｂ Ｄ、及びｍＡｂ Ｅの種々のＴＩプールについて評価した。これを表３に示す。これら結果は、図９Ａ（力価）及び図９Ｂ（Ｑｐ）にも、グラフで示される。
この実施例では、ｍＡｂ Ｃ、ｍＡｂ Ｄ、及びｍＡｂ Ｅの、２ベクター及び多重ベクターＲＭＣＥ（この場合３プラスミドＲＭＣＥ）振盪フラスコ培養物を、上記に説明したように調製し、７日間培養した。７日間の培養が完了したら、特定のＣＬＤパラメーターを、ｍＡｂ Ｃ、ｍＡｂ Ｄ、及びｍＡｂ Ｅの種々のＴＩプールについて評価した。これを表３に示す。これら結果は、図９Ａ（力価）及び図９Ｂ（Ｑｐ）にも、グラフで示される。
【0123】
表３．
【0124】
実施例５：２ベクターＲＭＣＥと多重ベクターＲＭＣＥとのＡｍｂｒ１５（登録商標）比較
この実施例では、ｍＡｂ Ｃ又はｍＡｂ Ｄを発現する細胞株を、上記に説明したように２ベクター又は多重ベクターＲＭＣＥ（この場合、３プラスミドＲＭＣＥ）を使用して調製した。ｍＡｂ Ｃ及びｍＡｂ Ｄの各々の個別クローン（各抗体について各４つの２ベクターＲＭＣＥ及び多重ベクターＲＭＣＥ）のＡｍｂｒ１５（登録商標）培養（ＴＡＰ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）が実施され、多重ベクターＲＭＣＥクローンは、２ベクターＲＭＣＥクローンと比べて、より高い平均力価とより高い平均Ｑｐを呈した。これを表４に示す。
この実施例では、ｍＡｂ Ｃ又はｍＡｂ Ｄを発現する細胞株を、上記に説明したように２ベクター又は多重ベクターＲＭＣＥ（この場合、３プラスミドＲＭＣＥ）を使用して調製した。ｍＡｂ Ｃ及びｍＡｂ Ｄの各々の個別クローン（各抗体について各４つの２ベクターＲＭＣＥ及び多重ベクターＲＭＣＥ）のＡｍｂｒ１５（登録商標）培養（ＴＡＰ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）が実施され、多重ベクターＲＭＣＥクローンは、２ベクターＲＭＣＥクローンと比べて、より高い平均力価とより高い平均Ｑｐを呈した。これを表４に示す。
【0125】
表４．
【0126】
図１０Ａは、８つのｍＡｂ Ｃクローンの各々に観察された力価をグラフにより示し、図１０Ｂは、それらｍＡｂ Ｃの８つのクローンの各々について観察されたＱｐをグラフにより示す。図１０Ｃは、平均的なｍＡｂ Ｃクローンの力価とｍＡｂ ＣクローンのＱｐを比較する。同様に、図１１Ａは、８つのｍＡｂ Ｄクローンの各々について観察された力価をグラフにより示し、図１１Ｂは、それら８つのｍＡｂ Ｄのクローンの各々について観察されたＱｐをグラフにより示す。図１１Ｃは、平均的なｍＡｂ Ｄクローンの力価と平均的なｍＡｂ ＤクローンのＱｐを比較する。対照的に、図１２のＡ及びＢは、２ベクター手法及び多重ベクター手法の各々について、２つの特異的クローン（クローンＡ及びクローンＢ）の力価（図１２Ａ）及びＱｐ（図１２Ｂ）を比較する。図１２のＡ及びＢにグラフにより示されるデータを、以下の表５にも示す。
【0127】
表５
【0128】
上記実施例は、ここに開示される主題を説明しているにすぎず、いかなる意味でも限定的なものと考慮されるべきでない。
【0129】
示され、特許請求される種々の実施形態に加えて、開示される主題は、本明細書に開示及び特許請求される特徴の他の組み合わせを有する他の実施形態も目的としている。したがって、本明細書に提示される特定の特徴は、開示される主題の範囲内で他の特徴の各々と他の様式で組み合わせることができ、したがって開示される主題は、本明細書に開示される特徴の任意の適切な組み合わせを含む。開示される主題の具体的な実施形態の前述の記載は、説明及び記載を目的として提示された。同記載は、包括的であることも、開示される主題を開示されるそれら実施形態に限定することも、意図していない。
【0130】
当業者であれば、開示される主題の主旨又は範囲から逸脱せずに、開示される主題の組成物及び方法に種々の修正例及び変形例が作製可能であることを理解するであろう。したがって、開示される主題には、特許請求の範囲に含まれる修正例及び変形例、並びにそれらの等価物が含まれることが意図されている。
【0131】
種々の出版物、特許、及び特許出願が本明細書に引用されており、それらの内容は参照によりその全体が本明細書に援用される。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【配列表】
【国際調査報告】