特表 2025-500456 ＬＩＬＲＢポリペプチド及びその使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2025-01-09

(54)【発明の名称】ＬＩＬＲＢポリペプチド及びその使用

(51)【国際特許分類】

   C07K 14/705 20060101AFI20241226BHJP

   C07K 19/00 20060101ALI20241226BHJP

   C07K 16/00 20060101ALI20241226BHJP

   C12N 15/12 20060101ALI20241226BHJP

   C12N 15/13 20060101ALI20241226BHJP

   C12N 15/62 20060101ALI20241226BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20241226BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20241226BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20241226BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20241226BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20241226BHJP

   C12P 21/02 20060101ALI20241226BHJP

   C12P 21/08 20060101ALI20241226BHJP

   C07K 1/14 20060101ALI20241226BHJP

   C12Q 1/02 20060101ALI20241226BHJP

   A61K 38/16 20060101ALI20241226BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20241226BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20241226BHJP

【ＦＩ】

C07K14/705 ZNA

C07K19/00

C07K16/00

C12N15/12

C12N15/13

C12N15/62 Z

C12N15/63 Z

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

C12P21/02 C

C12P21/08

C07K1/14

C12Q1/02

A61K38/16

A61P35/00

A61K48/00

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024538112

(86)(22)【出願日】2022-12-22

(85)【翻訳文提出日】2024-08-20

(86)【国際出願番号】 IL2022051378

(87)【国際公開番号】W WO2023119295

(87)【国際公開日】2023-06-29

(31)【優先権主張番号】63/293,264

(32)【優先日】2021-12-23

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】63/407,763

(32)【優先日】2022-09-19

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】517307924

【氏名又は名称】カール メディカル リミテッド

【住所又は居所原語表記】２８ Ｄａｍ ＨａＭａｃｂｉｍ Ｓｔｒｅｅｔ， ＰＯ Ｂｏｘ ９， ＭｏｄｉＩｎ Ｍａｋａｂｉｍ－ＲｅＵｔ， Ｉｓｒａｅｌ

(74)【代理人】

【識別番号】110002952

【氏名又は名称】弁理士法人鷲田国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】タミール アミ

(72)【発明者】

【氏名】ブロッチ イタイ

【テーマコード（参考）】

4B063

4B064

4B065

4C084

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B063QA19

4B063QA20

4B063QQ08

4B063QR32

4B063QR35

4B063QR77

4B063QS40

4B064AG20

4B064AG27

4B064CA02

4B064CA05

4B064CA06

4B064CA08

4B064CA10

4B064CA19

4B064CC24

4B064DA01

4B064DA13

4B065AA01X

4B065AA01Y

4B065AA57X

4B065AA57Y

4B065AA72X

4B065AA72Y

4B065AA83X

4B065AA83Y

4B065AA90X

4B065AA90Y

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065BC01

4B065BD14

4B065CA44

4B065CA46

4C084AA02

4C084AA07

4C084AA13

4C084BA01

4C084BA41

4C084BA42

4C084MA66

4C084NA03

4C084NA14

4C084ZB261

4C084ZB262

4H045AA10

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA09

4H045BA41

4H045CA40

4H045DA50

4H045DA76

4H045EA20

4H045EA50

4H045FA74

4H045GA00

(57)【要約】

ＬＩＬＲＢポリペプチドを提供する。よって、配列番号３に示すＨＬＡ－Ｇポリペプチドに結合可能であり、且つＬＩＬＲＢのＤＩドメインの４０～６０位のアミノ酸の中に局在する少なくとも１つの突然変異を有するＬＩＬＲＢポリペプチドであって、同じ長さであり、且つ少なくとも１つの突然変異を含まない配列のＬＩＬＲＢポリペプチドと比較して、増加した安定性及び／又は増加したＨＬＡ－Ｇに対する親和性を有するＬＩＬＲＢポリペプチドを提供する。ＬＩＬＲＢポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ＬＩＬＲＢポリペプチドを発現する宿主細胞、並びにそれを産生する方法及びその使用方法も提供する。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

配列番号３に示すＨＬＡ－Ｇポリペプチドに結合可能であり、且つＬＩＬＲＢのＤ１ドメインの４０～６０位のアミノ酸の中に局在する少なくとも１つの突然変異を有するＬＩＬＲＢポリペプチドであって、同じ長さであり、且つ前記少なくとも１つの突然変異を含まない配列のＬＩＬＲＢポリペプチドと比較して、増加した安定性及び／又は増加した前記ＨＬＡ－Ｇに対する親和性を有する、ＬＩＬＲＢポリペプチド。

【請求項2】

前記ＬＩＬＲＢは、ＬＩＬＲＢ１及びＬＩＬＲＢ２からなる群より選択される、請求項１に記載のＬＩＬＲＢポリペプチド。

【請求項3】

前記ＬＩＬＲＢは、ＬＩＬＲＢ２であり、前記少なくとも１つの突然変異は、配列番号１のＳ４５、Ｉ４９、Ｔ５０及びＶ５７からなる群より選択されるアミノ酸に対応する位置におけるものである、請求項１又は２に記載のＬＩＬＲＢポリペプチド。

【請求項4】

配列番号３に示すＨＬＡ－Ｇポリペプチドに結合可能であり、且つ配列番号１のＳ４５、Ｉ４９、Ｔ５０及びＶ５７からなる群より選択されるアミノ酸に対応する位置に少なくとも１つに突然変異を有するＬＩＬＲＢ２ポリペプチドであって、同じ長さであり、且つ前記少なくとも１つの突然変異を含まない配列のＬＩＬＲＢ２ポリペプチドと比較して、増加した安定性及び／又は増加した前記ＨＬＡ－Ｇに対する親和性を有するＬＩＬＲＢ２ポリペプチド。

【請求項5】

Ｓ４５における前記突然変異は、Ｓ４５Ｒ、Ｓ４５Ｎ、Ｓ４５Ｑ、Ｓ４５Ｈ、Ｓ４５Ｌ、Ｓ４５Ｋ、Ｓ４５Ｍ、Ｓ４５Ｆ、Ｓ４５Ｗ若しくはＳ４５Ｙ突然変異を含み、Ｉ４９における前記突然変異は、Ｉ４９Ｒ、Ｉ４９Ｋ、Ｉ４９Ｆ若しくはＩ４９Ｙ突然変異を含み、Ｔ５０における前記突然変異は、Ｔ５０Ｒ、Ｔ５０Ｎ、Ｔ５０Ｌ、Ｔ５０Ｋ、Ｔ５０Ｆ、Ｔ５０Ｗ若しくはＴ５０Ｙ突然変異を含み、及び／又はＶ５７における前記突然変異は、Ｖ５７Ｒ、Ｖ５７Ｋ、Ｖ５７Ｆ若しくはＶ５７Ｗ突然変異を含む、請求項３又は４に記載のＬＩＬＲＢ２ポリペプチド。

【請求項6】

Ｓ４５における前記突然変異は、Ｓ４５Ｑ突然変異を含み、Ｉ４９における前記突然変異は、Ｉ４９Ｋ突然変異を含み、Ｔ５０における前記突然変異は、Ｔ５０Ｆ突然変異を含み、及び／又はＶ５７における前記突然変異は、Ｖ５７Ｒ突然変異を含む、請求項３又は４に記載のＬＩＬＲＢ２ポリペプチド。

【請求項7】

前記少なくとも１つの突然変異は、少なくとも２つの突然変異を含む、請求項３～６のいずれか一項に記載のＬＩＬＲＢ２ポリペプチド。

【請求項8】

前記少なくとも１つの突然変異は、前記Ｓ４５における突然変異と、前記Ｉ４９、Ｔ５０及び／又はＶ５７における追加の突然変異とを含む、請求項３～５のいずれか一項に記載のＬＩＬＲＢ２ポリペプチド。

【請求項9】

Ｓ４５Ｎ及びＴ５０Ｒ突然変異、Ｓ４５Ｙ及びＴ５０Ｋ突然変異、Ｓ４５Ｒ及びＩ４９Ｆ突然変異、Ｓ４５Ｑ及びＶ５７Ｒ突然変異、Ｓ４５Ｑ及びＩ４９Ｋ突然変異、又はＳ４５Ｙ及びＴ５０Ｎ突然変異を含む、請求項８に記載のＬＩＬＲＢ２ポリペプチド。

【請求項10】

配列番号１に示すＬＩＬＲＢ２ポリペプチドと比較して、増加した前記ＨＬＡ－Ｇに対する親和性を有する、請求項３～９のいずれか一項に記載のＬＩＬＲＢ２ポリペプチド。

【請求項11】

配列番号１に示すＬＩＬＲＢ２ポリペプチドと比較して、増加した安定性を有する、請求項３～１０のいずれか一項に記載のＬＩＬＲＢ２ポリペプチド。

【請求項12】

前記ＬＩＬＲＢ２ポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１又は２３に示すものである、請求項３～４及び１０～１１のいずれか一項に記載のＬＩＬＲＢ２ポリペプチド。

【請求項13】

前記ＬＩＬＲＢは、ＬＩＬＲＢ１であり、前記少なくとも１つの突然変異は、配列番号１０２のＴ４３、Ｉ４７、Ｔ４８及びＶ５５からなる群より選択されるアミノ酸に対応する位置におけるものである、請求項１に記載のＬＩＬＲＢポリペプチド。

【請求項14】

Ｔ４３における前記突然変異は、Ｔ４３Ｒ、Ｔ４３Ｎ、Ｔ４３Ｑ、Ｔ４３Ｈ、Ｔ４３Ｌ、Ｔ４３Ｋ、Ｔ４３Ｍ、Ｔ４３Ｆ、Ｔ４３Ｗ若しくはＴ４３Ｙ突然変異を含み、Ｉ４７における前記突然変異は、Ｉ４７Ｒ、Ｉ４７Ｋ、Ｉ４７Ｆ若しくはＩ４７Ｙ突然変異を含み、Ｔ４８における前記突然変異は、Ｔ４８Ｒ、Ｔ４８Ｎ、Ｔ４８Ｌ、Ｔ４８Ｋ、Ｔ４８Ｆ、Ｔ４８Ｗ若しくはＴ４８Ｙ突然変異を含み、及び／又はＶ５５における前記突然変異は、Ｖ５５Ｒ、Ｖ５５Ｋ、Ｖ５５Ｆ若しくはＶ５５Ｗ突然変異を含む、請求項１３に記載のＬＩＬＲＢ１ポリペプチド。

【請求項15】

Ｖ５５における前記突然変異は、Ｖ５５Ｒ突然変異を含む、請求項１３に記載のＬＩＬＲＢ１ポリペプチド。

【請求項16】

配列番号１０２に示すＬＩＬＲＢ１ポリペプチドと比較して、増加した前記ＨＬＡ－Ｇに対する親和性を有する、請求項１３～１５のいずれか一項に記載のＬＩＬＲＢ１ポリペプチド。

【請求項17】

配列番号１０２に示すＬＩＬＲＢ１ポリペプチドと比較して、増加した安定性を有する、請求項１３～１６のいずれか一項に記載のＬＩＬＲＢ１ポリペプチド。

【請求項18】

請求項１～１７のいずれか一項に記載のＬＩＬＲＢポリペプチドと、前記ＬＩＬＲＢポリペプチドに結合している非タンパク質性部分とを含む、組成物。

【請求項19】

前記非タンパク質性部分は、薬物、化学物質、小分子、ポリヌクレオチド、検出可能部分、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ポリ（スチレンｃｏマレイン酸無水物）（ＳＭＡ）、並びにジビニルエーテル及びマレイン酸無水物コポリマー（ＤＩＶＥＭＡ）からなる群より選択される、請求項１８に記載の組成物。

【請求項20】

前記非タンパク質性部分は、二量体化部分である、請求項１８に記載の組成物。

【請求項21】

異種タンパク質性部分に結合している請求項１～１７のいずれか一項に記載のＬＩＬＲＢポリペプチドを含む、融合ポリペプチド。

【請求項22】

前記異種タンパク質性部分は、二量体化部分である、請求項２１に記載の融合ポリペプチド。

【請求項23】

前記異種タンパク質性部分は、抗体又はその断片のＦｃドメインを含む、請求項２１又は２２に記載の融合ポリペプチド。

【請求項24】

前記Ｆｃドメインは、ＩｇＧ１又はＩｇＧ４のものである、請求項２３に記載の融合ポリペプチド。

【請求項25】

前記Ｆｃドメインは、Ｆｃ受容体へのその結合を変更する、その免疫活性化機能を低減させる、及び／又は前記融合物の半減期を改善するように修飾されている、請求項２３又は２４に記載の融合ポリペプチド。

【請求項26】

請求項１～１７のいずれか一項に記載のＬＩＬＲＢポリペプチド、請求項１８～２０のいずれか一項に記載の組成物、又は請求項２１～２５のいずれか一項に記載の融合ポリペプチドを含む二量体。

【請求項27】

ヘテロ二量体である、請求項２６に記載の二量体。

【請求項28】

前記ヘテロ二量体の第１の単量体は、前記ＬＩＬＲＢポリペプチドを含み、第２の単量体は、ＳＩＲＰα、ＰＤ１、ＴＩＧＩＴ及びＳＩＧＬＥＣ１０からなる群より選択されるタンパク質のアミノ酸配列を含み、前記アミノ酸配列は、その天然の結合ペアに結合し得る、請求項２６に記載の二量体。

【請求項29】

前記ヘテロ二量体の第１の単量体は前記ＬＩＬＲＢポリペプチドを含み、第２の単量体はＳＩＲＰαのアミノ酸配列を含み、前記アミノ酸配列はＣＤ４７に結合し得る、請求項２６に記載の二量体。

【請求項30】

請求項２３～２５のいずれか一項に記載の融合ポリペプチドを含む第１の単量体と、抗体又はその断片のＦｃドメインに結合しているＳＩＲＰαのアミノ酸配列を含む第２の単量体とを含み、ＳＩＲＰαの前記アミノ酸配列はＣＤ４７に結合し得る、ヘテロ二量体。

【請求項31】

前記ＳＩＲＰαアミノ酸配列は、配列番号２７又は８８に示すものである、請求項２９又は３０に記載の二量体。

【請求項32】

請求項１～３１のいずれか一項に記載の二量体を含む組成物であって、前記二量体は、前記組成物中の前記ＬＩＬＲＢの優勢形態である、組成物。

【請求項33】

請求項１～１７及び２１～３１のいずれか一項に記載のＬＩＬＲＢポリペプチド、融合ポリペプチド又は二量体をコードする、ポリヌクレオチド。

【請求項34】

請求項１～１７及び２１～３１のいずれか一項に記載のＬＩＬＲＢポリペプチド、融合ポリペプチド又は二量体をコードするポリヌクレオチドと、宿主細胞中の前記ポリヌクレオチドの発現を指向するための調節エレメントとを含む、核酸構築物。

【請求項35】

請求項１～１７及び２１～３１のいずれか一項に記載のＬＩＬＲＢポリペプチド、融合ポリペプチド若しくは二量体、請求項３３に記載のポリヌクレオチド又は請求項３４に記載の核酸構築物を含む、宿主細胞。

【請求項36】

ポリペプチドを産生する方法であって、請求項３３に記載のポリヌクレオチド若しくは請求項３４に記載の核酸構築物を宿主細胞に導入すること、又は請求項３５に記載の細胞を培養することを含む、方法。

【請求項37】

前記ＬＩＬＲＢポリペプチド、前記融合ポリペプチド又は前記二量体を単離することを含む、請求項３６に記載の方法。

【請求項38】

ＨＬＡ－Ｇを発現する病的細胞と関連する疾患の治療を必要とする対象における前記疾患を治療する方法であって、前記対象に治療有効量の請求項１～３２のいずれか一項に記載のＬＩＬＲＢポリペプチド、組成物、融合ポリペプチド若しくは二量体、請求項３３に記載のポリヌクレオチド、請求項３４に記載の核酸構築物又は請求項３５に記載の宿主細胞を投与し、それにより前記対象における前記疾患を治療することを含む方法。

【請求項39】

ＨＬＡ－Ｇを発現する病的細胞と関連する疾患の治療を必要とする対象における前記疾患の治療における使用のための、請求項１～３２のいずれか一項に記載のＬＩＬＲＢポリペプチド、組成物、融合ポリペプチド若しくは二量体、請求項３３に記載のポリヌクレオチド、請求項３４に記載の核酸構築物又は請求項３５に記載の宿主細胞。

【請求項40】

前記疾患は、癌である、請求項３８に記載の方法又は請求項３９に記載の使用のためのＬＩＬＲＢポリペプチド、組成物、融合ポリペプチド、二量体、ポリヌクレオチド、核酸構築物若しくは宿主細胞。

【請求項41】

前記癌は、膵臓癌、乳癌、皮膚癌、結腸直腸癌、胃癌及び卵巣癌からなる群より選択される、請求項４０に記載の方法又は使用のためのＬＩＬＲＢポリペプチド、組成物、融合ポリペプチド、二量体、ポリヌクレオチド、核酸構築物若しくは宿主細胞。

【請求項42】

免疫細胞を活性化させる方法であって、免疫細胞を請求項１～３２のいずれか一項に記載のＬＩＬＲＢポリペプチド、組成物、融合ポリペプチド若しくは二量体、請求項３３に記載のポリヌクレオチド、請求項３４に記載の核酸構築物又は請求項３５に記載の宿主細胞の存在下、インビトロで活性化させることを含む、方法。

【請求項43】

前記活性化は、ＨＬＡ－Ｇを発現する細胞の存在下で行う、請求項４２に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願
本出願は、２０２１年１２月２３日に出願された米国仮特許出願第６３／２９３，２６４号及び２０２２年９月１９日に出願された米国仮特許出願第６３／４０７，７６３号の優先権の利益を主張し、それらの内容は参照により全体として本明細書に援用される。

【0002】

配列表の記述
標題９４０８７．ｘｍｌのＸＭＬファイルは、２０２２年１２月２１日に作成され、２０６，３０１バイトを含み、本出願の出願と同時に提出され、参照により本明細書に組み込まれる。

【0003】

本発明は、その一部の実施形態において、ＬＩＬＲＢポリペプチド及びその使用に関する。

【背景技術】

【0004】

癌における主な免疫脱出機序の１つは、免疫活性化シグナリングを損なう癌性細胞の表面への阻害分子の発現である。これらの阻害分子の多くは、自己免疫寛容を維持すること、並びに末梢組織内の生理学的免疫応答の持続時間及び作動域をモジュレートして付随的な組織損傷を回避することが最初に実証された多数の阻害経路に属する、免疫チェックポイント（ＩＣＰ）とみなされる。

【0005】

ＨＬＡ－Ｇは、非古典的ＭＨＣクラスＩ分子であり、最初は、その母親の免疫系による破壊に対する保護を胎児へ付与する、したがって母子間免疫寛容に大いに寄与することが公知であった分子である［Carosella et al. Adv Immunol (2015) 127:33-144］。ＨＬＡ－Ｇは、膜結合又は可溶性であり、免疫細胞上のその阻害受容体に強力に結合し、それらのエフェクターの機能を阻害し、したがってＩＣＰ分子として機能して免疫阻害を誘導する。報告されたＨＬＡ－Ｇについての受容体としては、白血球免疫グロブリン様受容体Ｂ１（ＬＩＬＲＢ１、ＩＬＴ２又はＣＤ８５ｊとしても公知）、ＬＩＬＲＢ２（ＩＬＴ４又はＣＤ８５ｄとしても公知）、並びにナチュラルキラー細胞及び一部のＴ細胞上で発現されるＫＩＲ２ＤＬ４（キラー細胞Ｉｇ様受容体２ＤＬ４、ＣＤ１５８ｄとしても公知）［例えば、Shiroishi M et al., Proc Natl Acad Sci USA. (2006) 103(44): 16412-16417、Attia JVD, et al. Int J Mol Sci. (2020) 21(22): 8678］が挙げられる。ＬＩＬＲＢ１は、ヒトマクロファージ、一部のＴ細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞、単球、骨髄、形質細胞様及び寛容原性ＤＣを含む種々の樹状細胞サブセット上で発現され、一方、ＬＩＬＲＢ２は、ヒト単球、Ｂ細胞上で、並びにより低レベルで骨髄及び形質細胞様樹状細胞の細胞表面上で発現される（Katz HR. Adv Immunol. (2006) 91:251-272、Kang X, et al. Cell Cycle. (2016) 15(1):25-40）。ＬＩＬＲＢ１及びＬＩＬＲＢ２の両方は、タンパク質チロシンホスファターゼＳＨＰ－１をリクルートするための免疫受容体チロシンベース阻害モチーフをそれらの細胞質テール内に有すし、その結果、阻害シグナリングをもたらす。ＬＩＬＲＢは広範な白血球上で発現され、阻害シグナルを媒介するため、ＨＬＡ－Ｇは、胎盤中の広範な免疫抑制機能における中心的な役割を有することが考えられる。

【0006】

ＨＬＡ－Ｇは主に胎盤トロホブラスト及び胸腺上皮細胞上で発現される一方（例えば、Shiroishi M et al., 2006）、多くの腫瘍（例えば、膵臓、乳房、皮膚、結腸直腸、胃、卵巣を含む）がＨＬＡ－Ｇの発現を上方調節することが示されている（例えば、Lin,A. et al, Mol Med.21 (2015) 782-791、Amiot, L., et al, Cell Mol Life Sci. 68(2011) 417-431）。さらに、腫瘍細胞は、ＨＬＡ－Ｇ発現を介して免疫寛容／抑制を誘導することにより宿主免疫監視を逃れること、及びＨＬＡ－Ｇの発現は予後不良と関連することが示されている。さらに、ＨＬＡ－Ｇは、他の病理学的病態、例えば、ウイルス感染、自己免疫及び炎症性疾患においても、又は同種移植後にも新たに発現され、及び／又は上方調節され得る。例えば、ウイルス、例えば、ＨＣＭＶ、ＨＳＶ－１、ＲＡＢＶ、ＨＣＶ、ＩＡＶ及びＨＩＶ－１は、ＨＬＡ－Ｇの発現を上方調節して感染細胞が免疫細胞により認識及び攻撃されるのを妨害すると考えられている。

【0007】

病的細胞により用いられる脱出機序としてのＨＬＡ－Ｇ－ＬＩＬＲＢ１／２シグナリングの関連性が広く実証されているため、この経路を標的化するいくつかのアプローチが開発されている［例えば、Carosella ED et al., Trends Immunol (2008) 29:125-32、Carosella ED et al., Blood (2008) 111:4862-70、Yan WH, Endocr Metab Immune Disord Drug Targets (2011) 11:76-89、Blaschitz A et al., Hum Immunol 2000;61:1074-85、Menier C, et al., Hum Immunol 2003; 64:315-26、Francois et al., J Immunother Cancer (2021) 9(3):e001998、米国特許出願公開第２０２１０３０１０２０号明細書、並びに国際公開第２０１４／０７２５３４号パンフレット、国際公開第２０１７２０７７７５号パンフレット及び国際公開第２０１８０９１５８０号パンフレット。

【0008】

追加の背景技術としては、
Shiroishi M et al., Proc Natl Acad Sci USA. (2003) 100(15):8856-61、
Shiroishi M et al., J Biol Chem. (2006) 281(15):10439-47、
Clements CS et al., Proc Natl Acad Sci USA. (2005) 102(9):3360-5
が挙げられる。

【発明の概要】

【0009】

本発明の一部の実施形態の一態様によれば、配列番号３に示すＨＬＡ－Ｇポリペプチドに結合可能であり、ＬＩＬＲＢのＤ１ドメインの４０～６０位のアミノ酸の中に局在する少なくとも１つの突然変異を有するＬＩＬＲＢポリペプチドであって、同じ長さであり、且つ少なくとも１つの突然変異を含まない配列のＬＩＬＲＢポリペプチドと比較して、増加した安定性及び／又は増加したＨＬＡ－Ｇに対する親和性を有するＬＩＬＲＢポリペプチドが提供される。

【0010】

本発明の一部の実施形態によれば、ＬＩＬＲＢは、ＬＩＬＲＢ１及びＬＩＬＲＢ２からなる群より選択される。

【0011】

本発明の一部の実施形態によれば、ＬＩＬＲＢは、ＬＩＬＲＢ２であり、少なくとも１つの突然変異は、配列番号１のＳ４５、Ｉ４９、Ｔ５０及びＶ５７からなる群より選択されるアミノ酸に対応する位置におけるものである。

【0012】

本発明の一部の実施形態の一態様によれば、配列番号３に示すＨＬＡ－Ｇポリペプチドに結合可能であり、配列番号１のＳ４５、Ｉ４９、Ｔ５０及びＶ５７からなる群より選択されるアミノ酸に対応する位置に少なくとも１つの突然変異を有するＬＩＬ２Ｂ２ポリペプチドであって、同じ長さであり、且つ少なくとも１つの突然変異を含まない配列のＬＩＬＲＢ２ポリペプチドと比較して、増加した安定性及び／又は増加したＨＬＡ－Ｇに対する親和性を有するＬＩＬＲＢ２ポリペプチドが提供される。

【0013】

本発明の一部の実施形態によれば、Ｓ４５における突然変異は、Ｓ４５Ｒ、Ｓ４５Ｎ、Ｓ４５Ｑ、Ｓ４５Ｈ、Ｓ４５Ｌ、Ｓ４５Ｋ、Ｓ４５Ｍ、Ｓ４５Ｆ、Ｓ４５Ｗ若しくはＳ４５Ｙ突然変異を含み、Ｉ４９における突然変異は、Ｉ４９Ｒ、Ｉ４９Ｋ、Ｉ４９Ｆ若しくはＩ４９Ｙ突然変異を含み、Ｔ５０における突然変異は、Ｔ５０Ｒ、Ｔ５０Ｎ、Ｔ５０Ｌ、Ｔ５０Ｋ、Ｔ５０Ｆ、Ｔ５０Ｗ若しくはＴ５０Ｙ突然変異を含み、及び／又はＶ５７における突然変異は、Ｖ５７Ｒ、Ｖ５７Ｋ、Ｖ５７Ｆ若しくはＶ５７Ｗ突然変異を含む。

【0014】

本発明の一部の実施形態によれば、Ｓ４５における突然変異は、Ｓ４５Ｑ突然変異を含み、Ｉ４９における突然変異は、Ｉ４９Ｋ突然変異を含み、Ｔ５０における突然変異は、Ｔ５０Ｆ突然変異を含み、及び／又はＶ５７における突然変異は、Ｖ５７Ｒ突然変異を含む。

【0015】

本発明の一部の実施形態によれば、少なくとも１つの突然変異は、少なくとも２つの突然変異を含む。

【0016】

本発明の一部の実施形態によれば、少なくとも１つの突然変異は、Ｓ４５における突然変異と、Ｉ４９、Ｔ５０及び／又はＶ５７における追加の突然変異とを含む。

【0017】

本発明の一部の実施形態によれば、ＬＩＬＲＢ２ポリペプチドは、Ｓ４５Ｎ及びＴ５０Ｒ突然変異、Ｓ４５Ｙ及びＴ５０Ｋ突然変異、Ｓ４５Ｒ及びＩ４９Ｆ突然変異、Ｓ４５Ｑ及びＶ５７Ｒ突然変異、Ｓ４５Ｑ及びＩ４９Ｋ突然変異、又はＳ４５Ｙ及びＴ５０Ｎ突然変異を含む。

【0018】

本発明の一部の実施形態によれば、ＬＩＬＲＢ２ポリペプチドは、配列番号１に示すＬＩＬＲＢ２ポリペプチドと比較して、増加したＨＬＡ－Ｇに対する親和性を有する。

【0019】

本発明の一部の実施形態によれば、ＬＩＬＲＢ２ポリペプチドは、配列番号１に示すＬＩＬＲＢ２ポリペプチドと比較して、増加した安定性を有する。

【0020】

本発明の一部の実施形態によれば、ＬＩＬＲＢ２ポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１及び２３からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一である。

【0021】

本発明の一部の実施形態によれば、ＬＩＬＲＢ２ポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１及び２３からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。

【0022】

本発明の一部の実施形態によれば、ＬＩＬＲＢ２ポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１又は２３に示すものである。

【0023】

本発明の一部の実施形態によれば、ＬＩＬＲＢは、ＬＩＬＲＢ１であり、少なくとも１つの突然変異は、配列番号１０２のＴ４３、Ｉ４７、Ｔ４８及びＶ５５からなる群より選択されるアミノ酸に対応する位置におけるものである。

【0024】

本発明の一部の実施形態によれば、Ｔ４３における突然変異は、Ｔ４３Ｒ、Ｔ４３Ｎ、Ｔ４３Ｑ、Ｔ４３Ｈ、Ｔ４３Ｌ、Ｔ４３Ｋ、Ｔ４３Ｍ、Ｔ４３Ｆ、Ｔ４３Ｗ若しくはＴ４３Ｙ突然変異を含み、Ｉ４７における突然変異は、Ｉ４７Ｒ、Ｉ４７Ｋ、Ｉ４７Ｆ若しくはＩ４７Ｙ突然変異を含み、Ｔ４８における突然変異は、Ｔ４８Ｒ、Ｔ４８Ｎ、Ｔ４８Ｌ、Ｔ４８Ｋ、Ｔ４８Ｆ、Ｔ４８Ｗ若しくはＴ４８Ｙ突然変異を含み、及び／又はＶ５５における突然変異は、Ｖ５５Ｒ、Ｖ５５Ｋ、Ｖ５５Ｆ若しくはＶ５５Ｗ突然変異を含む。

【0025】

本発明の一部の実施形態によれば、Ｖ５５における突然変異は、Ｖ５５Ｒ突然変異を含む。

【0026】

本発明の一部の実施形態によれば、ＬＩＬＲＢ１ポリペプチドは、配列番号１０２に示すＬＩＬＲＢ１ポリペプチドと比較して、増加したＨＬＡ－Ｇに対する親和性を有する。

【0027】

本発明の一部の実施形態によれば、ＬＩＬＲＢ１ポリペプチドは、配列番号１０２に示すＬＩＬＲＢ１ポリペプチドと比較して、増加した安定性を有する。

【0028】

本発明の一部の実施形態の一態様によれば、ＬＩＬＲＢポリペプチド及びＬＩＬＲＢポリペプチドに結合している非タンパク質性部分を含む組成物が提供される。

【0029】

本発明の一部の実施形態の一態様によれば、ＬＩＬＲＢ２ポリペプチド及びＬＩＬＲＢ２ポリペプチドに結合している非タンパク質性部分を含む組成物が提供される。

【0030】

本発明の一部の実施形態によれば、非タンパク質性部分は、薬物、化学物質、小分子、ポリヌクレオチド、検出可能部分、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ポリ（スチレンｃｏマレイン酸無水物）（ＳＭＡ）、並びにジビニルエーテル及びマレイン酸無水物コポリマー（ＤＩＶＥＭＡ）からなる群より選択される。

【0031】

本発明の一部の実施形態によれば、非タンパク質性部分は、二量体化部分である。

【0032】

本発明の一部の実施形態の一態様によれば、異種タンパク質性部分に結合しているＬＩＬＲＢポリペプチドを含む融合ポリペプチドが提供される。

【0033】

本発明の一部の実施形態の一態様によれば、異種タンパク質性部分に結合しているＬＩＬＲＢ２ポリペプチドを含む融合ポリペプチドが提供される。

【0034】

本発明の一部の実施形態によれば、異種タンパク質性部分は、二量体化部分である。

【0035】

本発明の一部の実施形態によれば、異種タンパク質性部分は、抗体又はその断片のＦｃドメインを含む。

【0036】

本発明の一部の実施形態によれば、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ１又はＩｇＧ４のものである。

【0037】

本発明の一部の実施形態によれば、Ｆｃドメインは、Ｆｃ受容体へのその結合を変更し、その免疫活性化機能を低減させ、及び／又は融合物の半減期を改善するように修飾されている。

【0038】

本発明の一部の実施形態の一態様によれば、ＬＩＬＲＢポリペプチド、組成物又は融合ポリペプチドを含む二量体が提供される。

【0039】

本発明の一部の実施形態の一態様によれば、ＬＩＬＲＢ２ポリペプチド、組成物又は融合ポリペプチドを含む二量体が提供される。

【0040】

本発明の一部の実施形態によれば、二量体は、ヘテロ二量体である。

【0041】

本発明の一部の実施形態によれば、ヘテロ二量体の第１の単量体は、ＬＩＬＲＢポリペプチドを含み、第２の単量体は、ＳＩＲＰα、ＰＤ１、ＴＩＧＩＴ及びＳＩＧＬＥＣ１０からなる群より選択されるタンパク質のアミノ酸配列を含み、アミノ酸配列は、その天然結合ペアに結合し得る。

【0042】

本発明の一部の実施形態によれば、ヘテロ二量体の第１の単量体は、ＬＩＬＲＢ２ポリペプチドを含み、第２の単量体は、ＳＩＲＰα、ＰＤ１、ＴＩＧＩＴ及びＳＩＧＬＥＣ１０からなる群より選択されるタンパク質のアミノ酸配列を含み、アミノ酸配列は、その天然結合ペアに結合し得る。

【0043】

本発明の一部の実施形態によれば、ヘテロ二量体の第１の単量体は、ＬＩＬＲＢポリペプチドを含み、第２の単量体は、ＳＩＲＰαのアミノ酸配列を含み、アミノ酸配列は、ＣＤ４７に結合し得る。

【0044】

本発明の一部の実施形態によれば、ヘテロ二量体の第１の単量体は、ＬＩＬＲＢ２ポリペプチドを含み、第２の単量体は、ＳＩＲＰαのアミノ酸配列を含み、アミノ酸配列は、ＣＤ４７に結合し得る。

【0045】

本発明の一部の実施形態の一態様によれば、融合ポリペプチドを含む第１の単量体と、抗体又はその断片のＦｃドメインに結合しているＳＩＲＰαのアミノ酸配列を含む第２の単量体とを含み、ＳＩＲＰαのアミノ酸配列は、ＣＤ４７に結合し得るヘテロ二量体が提供される。

【0046】

本発明の一部の実施形態によれば、ＳＩＲＰαアミノ酸配列は、配列番号２７又は８８と少なくとも９０％同一である。

【0047】

本発明の一部の実施形態によれば、ＳＩＲＰαアミノ酸配列は、配列番号２７又は８８を含む。

【0048】

本発明の一部の実施形態によれば、ＳＩＲＰαアミノ酸配列は、配列番号２７又は８８に示すものである。

【0049】

本発明の一部の実施形態の一態様によれば、二量体を含む組成物であって、二量体は、組成物中のＬＩＬＲＢの優勢形態である、組成物が提供される。

【0050】

本発明の一部の実施形態の一態様によれば、二量体を含む組成物であって、二量体は、組成物中のＬＩＬＲＢ２の優勢形態である、組成物が提供される。

【0051】

本発明の一部の実施形態の一態様によれば、ＬＩＬＲＢポリペプチド、融合ポリペプチド又は二量体をコードするポリヌクレオチドが提供される。

【0052】

本発明の一部の実施形態の一態様によれば、ＬＩＬＲＢ２ポリペプチド、融合ポリペプチド又は二量体をコードするポリヌクレオチドが提供される。

【0053】

本発明の一部の実施形態の一態様によれば、ＬＩＬＲＢポリペプチド、融合ポリペプチド又は二量体をコードするポリヌクレオチドと、宿主細胞中のポリヌクレオチドの発現を指向するための調節エレメントとを含む核酸構築物が提供される。

【0054】

本発明の一部の実施形態の一態様によれば、ＬＩＬＲＢ２ポリペプチド、融合ポリペプチド又は二量体をコードするポリヌクレオチドと、宿主細胞中のポリヌクレオチドの発現を指向するための調節エレメントとを含む核酸構築物が提供される。

【0055】

本発明の一部の実施形態の一態様によれば、ＬＩＬＲＢポリペプチド、融合ポリペプチド若しくは二量体、ポリヌクレオチド又は核酸構築物を含む宿主細胞が提供される。

【0056】

本発明の一部の実施形態の一態様によれば、ＬＩＬＲＢ２ポリペプチド、融合ポリペプチド若しくは二量体、ポリヌクレオチド又は核酸構築物を含む宿主細胞が提供される。

【0057】

本発明の一部の実施形態の一態様によれば、ポリペプチドを産生する方法であって、ポリヌクレオチド若しくは核酸構築物を宿主細胞に導入すること又は細胞を培養することを含む方法が提供される。

【0058】

本発明の一部の実施形態によれば、方法は、ＬＩＬＲＢポリペプチド、融合ポリペプチド又は二量体を単離することを含む。

【0059】

本発明の一部の実施形態によれば、方法は、ＬＩＬＲＢ２ポリペプチド、融合ポリペプチド又は二量体を単離することを含む。

【0060】

本発明の一部の実施形態の一態様によれば、ＨＬＡ－Ｇを発現する病的細胞と関連する疾患の治療を必要とする対象におけるその疾患を治療する方法であって、対象に治療有効量のＬＩＬＲＢポリペプチド、組成物、融合ポリペプチド若しくは二量体、ポリヌクレオチド、核酸構築物又は宿主細胞を投与し、それにより対象における疾患を治療することを含む方法が提供される。

【0061】

本発明の一部の実施形態の一態様によれば、ＨＬＡ－Ｇを発現する病的細胞と関連する疾患の治療を必要とする対象におけるその疾患を治療する方法であって、対象に治療有効量のＬＩＬＲＢ２ポリペプチド、組成物、融合ポリペプチド若しくは二量体、ポリヌクレオチド、核酸構築物又は宿主細胞を投与し、それにより対象における疾患を治療することを含む方法が提供される。

【0062】

本発明の一部の実施形態の一態様によれば、ＨＬＡ－Ｇを発現する病的細胞と関連する疾患の治療を必要とする対象におけるその疾患の治療における使用のための、ＬＩＬＲＢポリペプチド、組成物、融合ポリペプチド若しくは二量体、ポリヌクレオチド、核酸構築物又は宿主細胞が提供される。

【0063】

本発明の一部の実施形態の一態様によれば、ＨＬＡ－Ｇを発現する病的細胞と関連する疾患の治療を必要とする対象におけるその疾患の治療における使用のための、ＬＩＬＲＢ２ポリペプチド、組成物、融合ポリペプチド若しくは二量体、ポリヌクレオチド、核酸構築物又は宿主細胞が提供される。

【0064】

本発明の一部の実施形態によれば、疾患は、癌である。

【0065】

本発明の一部の実施形態によれば、癌は、膵臓癌、乳癌、皮膚癌、結腸直腸癌、胃癌及び卵巣癌からなる群より選択される。

【0066】

本発明の一部の実施形態の一態様によれば、免疫細胞を活性化させる方法であって、免疫細胞をＬＩＬＲＢポリペプチド、組成物、融合ポリペプチド若しくは二量体、ポリヌクレオチド、核酸構築物又は宿主細胞の存在下、インビトロで活性化させることを含む方法が提供される。

【0067】

本発明の一部の実施形態の一態様によれば、免疫細胞を活性させる方法であって、免疫細胞をＬＩＬＲＢ２ポリペプチド、組成物、融合ポリペプチド若しくは二量体、ポリヌクレオチド、核酸構築物又は宿主細胞の存在下、インビトロで活性化させることを含む方法が提供される。

【0068】

本発明の一部の実施形態によれば、活性化は、ＨＬＡ－Ｇを発現する細胞の存在下で行う。

【0069】

特に定義のない限り、本明細書において使用される全ての技術及び／又は科学用語は、本発明が属する分野の当業者により一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと類似又は均等の方法及び材料を本発明の実施形態の実践又は試験において使用することができるが、例示的な方法及び／又は材料が以下に記載される。矛盾する場合、定義を含む本特許明細書が優先される。加えて、材料、方法、及び実施例は説明的なものにすぎず、必ずしも限定的であることは意図されない。

【0070】

本発明の一部の実施形態が、例としてのみ、添付の図面を参照して本明細書に記載される。図面を詳細に目下具体的に参照して、示される特定のものは一例であり、本発明の実施形態の説明的な考察を目的とすることが強調される。これに関して、図面とともに用いられる説明により、当業者には本発明の実施形態をいかに実践することができるかは明らかである。

【図面の簡単な説明】

【0071】

【図1-1】図１のＡ～Ｄは、ＬＩＬＲＢ２－ＨＬＡ－Ｇ結合界面の構造分析を実証する。図１のＡは、ＬＩＬＲＢ２（配列番号１、本明細書において「ＷＴ ＬＩＬＲＢ２」とも称される）及びＨＬＡ－Ｇ（配列番号３）のＰＤＢ ＩＤ－２ＤＹＰ複合体構造を示す。ＨＬＡ－Ｇは暗灰色の表面表示で示され、ベータ－２－ミクログロブリン（配列番号４）は灰色リボンディスプレイで示され、ＬＩＬＲＢ２は白色表面表示で示される。図１のＢは、ＨＬＡ－Ｇ及びＬＩＬＲＢ２間の界面残基のマッピングを示す。ＨＬＡ－Ｇ及びベータ－２－ミクログロブリンの両方が暗灰色リボンで示され、ＬＩＬＲＢ２は灰色リボンで示される。相互作用残基は球及び棒で表される。図１のＣは、図１のＢに示すＨＬＡ－Ｇ及びＬＩＬＲＢ２間の相互作用界面の拡大図を示す。相互作用界面において、ＰＨＥ１９５におけるＨＬＡ－Ｇ及びそのホモログ間で単一の優勢な差のみが存在する。図１のＤは、ＬＩＬＲＢ２中の４つのアミノ酸、すなわち、Ｓｅｒ４５、Ｉｌｅ４９、Ｔｈｒ５０及びＶａｌ５７を示し、それらは結合エネルギーに対する有意な影響を有することが見出された。

【図1-2】同上

【図2A】図２Ａと図２Ｂは、還元及び／又は非還元条件下で分離された、ＷＴ ＬＩＬＲＢ２（配列番号１）又は突然変異ＬＩＬＲＢ２（本明細書において「ＬＩＬＲＢ２バリアント」と称される）－Ｆｃ融合物及びＳＩＲＰα－Ｆｃ融合物のいずれかを含むいくつかのヘテロ二量体タンパク質（各ヘテロ二量体の完全な説明については以下の表３を参照のこと）のＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）分析の写真を示す。図中に提示されるサンプルは、粗製（非精製、図２Ａ）又はプロテインＡ精製（図２Ｂ）されたもの（５日目上清）である。上清は、示される組換えタンパク質をコードするプラスミドで形質移入されたエクスピ２９３Ｆ細胞からのものである。

【図2B】同上

【図3A】図３Ａ～図３Ｆは、ＷＴ ＬＩＬＲＢ２と比較した、細胞表面上で発現されたＨＬＡ－Ｇへの、ＬＩＬＲＢ２バリアントを含むいくつかのヘテロ二量体タンパク質の結合を実証する。図３Ａ～図３Ｂは、ＨＴ１０８０及びＨＴ１０８０－ＨＬＡ－Ｇ細胞（図３Ａ）並びにＴＨＰ１－ＥＶ及びＴＨＰ１－ＨＬＡ－Ｇ細胞（図３Ｂ）上のＣＤ４７及びＨＬＡ－Ｇの発現レベルを実証する。ＣＤ４７及びＨＬＡ－Ｇの細胞表面発現レベルは、抗ヒトＣＤ４７抗体及びアイソタイプ対照としてのＩｇＧ１又は抗ヒトＨＬＡ－Ｇ抗体及びアイソタイプ対照としてのＩｇＧ４を用いる細胞系の免疫染色とそれに続くフローサイトメトリー分析により決定した。

【図3B】同上

【図3C】図３Ｃは、ＨＬＡ－Ｇ過剰発現細胞ＨＴ１０８０－ＨＬＡ－Ｇへの、示されるヘテロ二量体の結合を実証する。結合は、インキュベーション後に、抗ヒトＩｇＧ１抗体を使用するＩｇＧ骨格の免疫染色とそれに続くフローサイトメトリー分析により決定した。ＧＭＦＩ値を使用してグラフパッドプリズムソフトウェアを用いて結合曲線グラフを作出した。

【図3D】図３Ｄは、抗ＨＬＡ－Ｇ遮断抗体による、ＨＴ１０８０－ＨＬＡ－Ｇ細胞への、示されるヘテロ二量体の結合の遮断割合を実証する。

【図3E】図３Ｅ～図３Ｆは、ＨＴ１０８０細胞への、若しくはＨＬＡ－Ｇ過剰発現細胞ＨＴ１０８０－ＨＬＡ－Ｇ（図３Ｅ）への、又はＴＨＰ－１－ＥＶ細胞若しくはＨＬＡ－Ｇ過剰発現細胞ＴＨＰ－１－ＨＬＡ－Ｇ（図３Ｆ）への、示されるヘテロ二量体の結合を示されるとおり遮断抗体を用いて又は用いずに実証する。結合は、インキュベーション後に、抗ヒトＩｇＧ１抗体を使用するＩｇＧ骨格の免疫染色とそれに続くフローサイトメトリー分析により決定した。ＧＭＦＩ値を使用してグラフパッドプリズムソフトウェアを用いて結合曲線グラフを作出した。

【図3F】同上

【図4】図４は、ＷＴ ＬＩＬＲＢ２を含むホモ二量体タンパク質（ＬＩＬＲＢ２－Ｖ５）と比較した、細胞表面上で発現されたＨＬＡ－Ｇへの、ＬＩＬＲＢ２バリアントＬＩＬＲＢ－Ｖ１２を含むホモ二量体タンパク質の結合を実証する。ＨＴ１０８０細胞への又はＨＬＡ－Ｇ過剰発現細胞ＨＴ１０８０－ＨＬＡ－Ｇ細胞へのホモ二量体の結合は、遮断抗体を用いて又は用いずに、インキュベーション後に、抗ヒトＩｇＧ１抗体を使用するＩｇＧ骨格の免疫染色とそれに続くフローサイトメトリー分析により決定した。ＧＭＦＩ値を提示し、それを使用してグラフパッドプリズムソフトウェアを用いて結合曲線グラフを作出した。

【図5】図５のＡ～Ｃは、ＨＴ１０８０－ＨＬＡ－Ｇ細胞と同時培養され、示される濃度の本明細書において「ＤＳＰ２１６－Ｖ１２」（図には「ＤＳＰ」と表記）と称される、ＬＩＬＲＢ２バリアント－Ｆｃ融合物及びＳＩＲＰα－Ｆｃ融合物のヘテロ二量体（各ヘテロ二量体の完全な説明については以下の表３を参照のこと）又は陽性対照としての１．５μｇ／ｍｌの抗ＨＬＡ－Ｇ抗体で処理されたＭ－ＣＳＦ処理マクロファージ中のＭ２マーカー、ＣＤ１６３（図５のＡ）及びＣＤ２０６（図５のＢ）、並びにＭ１マーカーＨＬＡ－ＤＲ（図５のＣ）の発現レベルを実証する。細胞表面発現レベルは、抗ヒト－ＣＤ１６３、抗ヒト－ＣＤ２０６又は抗ヒトＨＬＡ－ＤＲ抗体を用いる細胞の免疫染色とそれに続くフローサイトメトリー分析により決定した。ＭＦＩ値を使用してグラフパッドプリズムソフトウェアを用いて結合曲線グラフを作出した。

【図6】図６のＡ～Ｂは、同時培養及び示される濃度のＤＳＰ２１６－Ｖ１２（図には「ＤＳＰ２０１６」と表記）又は陽性対照としての１．５μｇ／ｍｌの抗ＨＬＡ－Ｇ抗体での処理の開始２４時間後の、ＭＣＳ－Ｆ処理マクロファージ及びＴ１０８０ＨＬＡ－Ｇ細胞の同時培養物の上清中のＴＮＦ－α（図６のＡ）又はＩＬ－６（図６のＢ）のレベルを実証する。サイトカインレベル（ｎｇ／ｍＬ）は、サイトメトリックビーズアレイ（ＣＢＡ）を用いる上清の免疫染色とそれに続くフローサイトメトリー分析により決定した。ＭＦＩ値を使用してグラフパッドプリズムソフトウェアを用いて結合曲線グラフを作出した。

【図7】図７は、ＲＢＣ、ＰＢＭＣ上又はＨＴ１０８０－ＨＬＡ－Ｇ細胞上のＣＤ４７の発現レベルを実証する。細胞表面発現レベルは、抗ヒト－ＣＤ４７抗体又はアイソタイプ対照としてのＩｇＧ１を用いる細胞の免疫染色とそれに続くフローサイトメトリー分析により決定した。ＭＦＩ値を使用してグラフパッドプリズムソフトウェアを用いて結合曲線グラフを作出した。

【図8】図８のＡ～Ｂは、フローサイトメトリーにより決定された、ＲＢＣ、ＰＢＭＣ又はＨＴ１０８０－ＨＬＡ－Ｇ細胞へのＤＳＰ２１６－Ｖ１２の結合を実証する。グラフは、４つの独立ドナーサンプルからのＭＦＩの平均（±ＳＥＭ）を表す。図８のＡは、ＲＢＣ、ＰＢＭＣ又はＨＴ１０８０－ＨＬＡ－Ｇ細胞への、０．４～１２．５μｇ／ｍＬの濃度におけるＤＳ２１６－Ｖ１２の結合の平均（±ＳＥＭ）を示すグラフである。図８のＢは、全ての濃度（１．５６、３．１２５、６．２５μｇ／ｍＬ）の、ＰＢＭＣ及びＲＢＣと比較した、ＨＴ１０８０－ＨＬＡ－Ｇ細胞へのＤＳＰ２１６－Ｖ１２（図には「ＤＳＰ２０１６」と表記）の有意に高い結合を示す棒グラフである。^＊Ｐ≦０．０５、^＊＊Ｐ≦０．０１。３．１２５μｇ／ｍＬ濃度についてのＰ値は、ＰＢＭＣに対して０．００４４であり、ＲＢＣに対して０．００２７（Ｔ検定）であった。

【図9】図９は、還元及び非還元条件下で分離された、ＳＩＲＰα－Ｆｃ融合サブユニット及びＷＴ ＬＩＬＲＢ２－又はＬＩＬＲＢ２バリアント－Ｆｃ融合サブユニットを含むいくつかのヘテロ二量体タンパク質（図中に示す各ヘテロ二量体の完全な説明については以下の表３を参照のこと）のＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動分析（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）の写真を示す。図中に提示されるサンプルは、粗製のもの（非精製－５日目上清）である。上清は、示される組換えタンパク質をコードするプラスミドで形質移入されたエクスピ２９３Ｆ細胞からのものである。

【図10】図１０は、ＳＩＲＰα－Ｆｃ融合サブユニット及びＬＩＬＲＢ２バリアント－Ｆｃ融合サブユニットを含むいくつかのヘテロ二量体タンパク質（図中に示す各ヘテロ二量体の完全な説明については以下の表３を参照のこと）のウエスタンブロット分析の写真である。図中に提示されるサンプルは、プロテインＡ精製されたもの（５日目上清）である。上清は、示されるヘテロ二量体をコードするプラスミドで形質移入されたエクスピ２９３Ｆ細胞からのものである。タンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥ上で還元及び非還元条件下で分離し、続いて抗ＬＩＬＲＢ２又は抗ＳＩＲＰα抗体を用いて免疫ブロットした。

【図11】図１１は、ＨＴ１０８０の細胞表面上で発現されたＣＤ４７への、又はＨＬＡ－Ｇを過剰発現するＨＴ１０８０－ＨＬＡ－Ｇ細胞の細胞表面上で発現されたＣＤ４７及びＨＬＡ－Ｇへの、ＳＩＲＰα－Ｆｃ融合サブユニット及びＷＴ ＬＩＬＲＢ２－又はＬＩＬＲＢ２バリアント－Ｆｃ融合サブユニットを含むいくつかのヘテロ二量体タンパク質（図中に示す各ヘテロ二量体の完全な説明については以下の表３を参照のこと）の結合を実証する。抗ＨＬＡ－Ｇ（ＨＬＡ－Ｇ／ＬＩＬＲＢ２相互作用遮断抗体）を用いる又は用いない結合は、ＨＬＡ－Ｇ及びＣＤ４７の両方への結合と比較した、ＣＤ４７のみへの結合を実証する。結合は、抗ヒトＩｇＧ１抗体を使用するＩｇＧ骨格の免疫染色とそれに続くフローサイトメトリー分析後に決定した。ＧＭＦＩ値を提示し、それを使用してグラフパッドプリズムソフトウェアを用いて結合曲線グラフを作出した。

【図12】図１２のＡ～Ｃは、ＨＴ１０８０－ＨＬＡ－Ｇ細胞と同時培養され、示される濃度の本明細書において「ＤＳＰ２１６－Ｖ１２短鎖」と称されるＬＩＬＲＢ２バリアント－Ｆｃ融合物及び短鎖ＳＩＲＰα－Ｆｃ融合物のヘテロ二量体（ヘテロ二量体の完全な説明については以下の表３を参照のこと）又は対照としての１．５μｇ／ｍｌの抗ＨＬＡ－Ｇ抗体で処理されたＭ－ＣＳＦ処理マクロファージ中のＭ２マーカー、ＣＤ１６３（図１２のＡ）及びＣＤ２０６（図１２のＢ）、並びにＭ１マーカーＨＬＡ－ＤＲ（図１２のＣ）の細胞表面発現レベルを実証する。細胞表面発現レベルは、抗ヒト－ＣＤ１６３、抗ヒト－ＣＤ２０６又は抗ヒトＨＬＡ－ＤＲ抗体を用いる細胞の免疫染色とそれに続くフローサイトメトリー分析により決定した。ＭＦＩ値を使用してグラフパッドプリズムソフトウェアを用いて結合曲線グラフを作出した。

【図13】図１３のＡ～Ｂは、フローサイトメトリーにより決定された、Ｍ２ｃマクロファージによる、ＤＳＰ２１６－Ｖ１２又は抗ＣＤ４７抗体で処理された癌細胞の食作用を実証する。グラフは、セルトレースバイオレットについて染色癌細胞の取り込み後に陽性であるＭ２ｃ細胞の平均％（±ＳＤ）を示す。グラフは、空のベクターで形質導入されたＣＤ４７^＋ＨＬＡ－Ｇ^－７２１．２２１細胞（７２１．２２１ＥＶ）（図１３のＡ）又はＨＬＡ－Ｇ発現ベクターで形質導入されたＣＤ４７^＋ＨＬＡ－Ｇ^＋７２１．２２１細胞（７２１．２２１－ＨＬＡ－Ｇ）（図１３のＢ）でのＭ２ｃマクロファージによる平均取り込みを示す。両方の７２１．２２１細胞系を、Ｍ２ｃマクロファージとの混合前に、異なる濃度のＤＳＰ２１６－Ｖ１２又は６μｇ／ｍＬのＣＤ４７遮断抗体を含有する培地中でインキュベートした。^＊Ｐ≦０．０５、^＊＊Ｐ≦０．０１。図１３のＡに提示される、６μｇ／ｍＬのＣＤ４７抗体処理に対する培地中の％食作用についてのＰ値＝０，００２８であり、図１３のＢに提示される、１０μｇ／ｍＬのＤＳＰ２１６－Ｖ１２処理に対する培地中の％食作用についてのＰ値＝０，０４６５（対応のあるＴ検定）である。

【図14】図１４は、ＬＩＬＲＢ２及びＬＩＬＲＢ１間のブラスト相同性分析を示す。

【図15-1】図１５のＡ～Ｄは、ＬＩＬＲＢ１－ＨＬＡ－Ｇ結合界面の構造分析を実証する。図１５のＡは、ＬＩＬＲＢ１（配列番号１０２、本明細書において「ＷＴ ＬＩＬＲＢ１」とも称される）及びＨＬＡ－Ｇ（配列番号３）のＰＤＢ ＩＤ－２ＤＹＰ複合体構造を示す。ＨＬＡ－Ｇは灰色の表面表示で示され、ベータ－２－ミクログロブリン（配列番号４）は暗灰色リボンディスプレイで示され、ＬＩＬＲＢ１は白色表面表示で示される。図１５のＢは、ＨＬＡ－Ｇ及びＬＩＬＲＢ１間の界面残基のマッピングを示す。ＨＬＡ－Ｇ及びベータ－２－ミクログロブリンの両方が暗灰色リボンで示され、ＬＩＬＲＢ１は灰色リボンで示される。相互作用残基は球及び棒で表される。図１５のＣは、図１５Ｂに示すＨＬＡ－Ｇ及びＬＩＬＲＢ１間の相互作用界面の拡大を示し、特にＬＩＬＲＢ１のＶａｌ５５及びＨＬＡ－ＧのＰｈｅ１９５を実証する。図１５のＤは、ＷＴバリンのアルギニンへの置換後にＬＩＬＲＢ１のアミノ酸残基５５へのＨＬＡ－ＧのＰｈｅ１９５の近接を実証する（バリアントＬＩＬＲＢ１配列は配列番号１０３に示す）。

【図15-2】同上

【発明を実施するための形態】

【0072】

本発明は、その一部の実施形態において、ＬＩＬＲＢポリペプチド及びその使用に関する。

【0073】

本発明の少なくとも１つの実施形態を詳細に説明する前に、本発明は、以下の詳細な説明に示され、又は実施例により例示される詳細へのその適用に必ずしも限定されないことが理解されるべきである。本発明は、他の実施形態であり得、又は種々の様式で実践若しくは実施することができる。

【0074】

ＨＬＡ－Ｇは、非古典的ＭＨＣクラスＩ分子であり、最初は、胎児へのその母親の免疫系による破壊からの保護を付与し、したがって母子間免疫寛容に大いに寄与することが公知であった分子である。報告されたＨＬＡ－Ｇについての受容体としては、ＬＩＬＲＢ１、ＬＩＬＲＢ２及びＫＩＲ２ＤＬ４が挙げられる。ＨＬＡ－Ｇは主に胎盤トロホブラスト及び胸腺上皮細胞上で発現され、一方、例えば、癌、ウイルス感染、自己免疫及び炎症性疾患を含む種々の病理学的病態と関連する細胞又は同種移植後の細胞は、ＨＬＡ－Ｇを過剰発現することが示されており、実際、ＨＬＡ－Ｇ－ＬＩＬＲＢ１／２シグナリングは、病的細胞により用いられる免疫脱出機序として示唆されている。

【0075】

本発明の具体的な実施形態の実践を実現させる過程で、本発明者らは、構造－機能ツールを用いて安定性及びＨＬＡ－Ｇに対する結合親和性の増加を目的とするＬＩＬＲＢ２及びＬＩＬＲＢ１中の突然変異を導入した（以下の実施例の項の実施例１及び１１）。この方法を使用して、本発明者らは、野生型ＬＩＬＲＢ２と比較して改善された安定性及びＨＬＡ－Ｇに対する結合親和性を有する、タンパク質のＤ１ドメイン中の特異的領域内の突然変異を有する新規ポリペプチドを生成することができた（以下の実施例の項の実施例１～９）。

【0076】

結果的に、本教示の具体的な実施形態は、これらの新規突然変異を有するＬＩＬＲＢ（例えば、ＬＩＬＲＢ２、ＬＩＬＲＢ１）ポリペプチド、及び治療法におけるそれらの使用を示唆する。

【0077】

したがって、本発明の一態様によれば、配列番号３に示すＨＬＡ－Ｇポリペプチドに結合可能であり、ＬＩＬＲＢのＤ１ドメインの４０～６０位のアミノ酸の中に局在する少なくとも１つの突然変異を有するＬＩＬＲＢポリペプチドであって、同じ長さであり、且つ少なくとも１つの突然変異を含まない配列のＬＩＬＲＢポリペプチドと比較して増加した安定性及び／又は増加したＨＬＡ－Ｇに対する親和性を有するＬＩＬＲＢポリペプチドが提供される。

【0078】

本発明の追加の又は代替的な態様によれば、配列番号３に示すＨＬＡ－Ｇポリペプチドに結合可能であり、配列番号１のＳ４５、Ｉ４９、Ｔ５０及びＶ５７からなる群より選択されるアミノ酸に対応する位置に少なくとも１つの突然変異を有するＬＩＬ２Ｂ２ポリペプチドであって、同じ長さであり、且つ少なくとも１つの突然変異を含まない配列のＬＩＬＲＢ２ポリペプチドと比較して増加した安定性及び／又は増加したＨＬＡ－Ｇに対する親和性を有するＬＩＬＲＢ２ポリペプチドが提供される。

【0079】

「ＬＩＬＲＢ（白血球免疫グロブリン様受容体サブファミリーＢ）」は、ＬＩＬＲＢ１、ＬＩＬＲＢ２、ＬＩＬＲＢ３、ＬＩＬＲＢ４及びＬＩＬＲＢ５を含む、２～４つの細胞外免疫グロブリン様ドメイン（具体的には、Ｃ型Ｉｇ様ドメイン、ＩｎｔｅｒＰｒｏデータベースエントリーＩＰＲ００８４２４又はＰｆａｍデータベースエントリーＰＦ０５７９０）と、ＩＴＩＭドメインを含有する細胞質テールとを含む受容体のファミリーを指す。

【0080】

具体的な実施形態によれば、ＬＩＬＲＢは、ヒトＬＩＬＲＢである。

【0081】

具体的な実施形態によれば、ＬＩＬＲＢは、ＬＩＬＲＢ２である。

【0082】

「ＬＩＬＲＢ２（白血球免疫グロブリン様受容体サブファミリーＢメンバー２）」は、ＬＩＬＲＢ２遺伝子（ヒト遺伝子ＩＤ１０２８８に対応）によりコードされるポリペプチドを指す。具体的な実施形態によれば、ＬＩＬＲＢ２は、ヒトＬＩＬＲＢ２である。具体的な実施形態によれば、ＬＩＬＲＢ２は、例えば、以下のＧｅｎＢａｎｋ番号ＮＰ＿００１０７４４４７、ＮＰ＿００１２６５３３２、ＮＰ＿００１２６５３３３、ＮＰ＿００１２６５３３４、ＮＰ＿００１２６５３３５又はユニプロット番号Ｑ８Ｎ４２３に提供されるヒトＬＩＬＲＢ２を指す。

【0083】

具体的な実施形態によれば、ＬＩＬＲＢは、ＬＩＬＲＢ１である。

【0084】

「ＬＩＬＲＢ１（白血球免疫グロブリン様受容体サブファミリーＢメンバー１）」は、ＬＩＬＲＢ１遺伝子（ヒト遺伝子ＩＤ１０８５９対応する）によりコードされるポリペプチドを指す。具体的な実施形態によれば、ＬＩＬＲＢ１は、ヒトＬＩＬＲＢ１である。具体的な実施形態によれば、ＬＩＬＲＢ１は、例えば、以下のＧｅｎＢａｎｋ番号ＮＰ＿００１０７５１０６、ＮＰ＿００１０７５１０７、ＮＰ＿００１０７５１０８、ＮＰ＿００１２６５３２７、ＮＰ＿００１２６５３２８又はユニプロット番号Ｑ８ＮＨＬ６に提供されるヒトＬＩＬＲＢ１を指す。

【0085】

ＬＩＬＲＢ（例えば、ＬＩＬＲＢ２、ＬＩＬＲＢ１）の公知の結合ペアの１つは、主要組織適合性分子（ＭＨＣ、例えば、ＨＬＡ－Ｇ）である。

【0086】

「ＨＬＡ－Ｇ（ヒト白血球抗原Ｇ）」は、ＨＬＡ－Ｇ遺伝子（遺伝子ＩＤ３１３５）によりコードされるポリペプチドを指す。具体的な実施形態によれば、ＨＬＡ－Ｇアミノ酸配列は、配列番号３に提供されるものである。

【0087】

具体的な実施形態によれば、ＬＩＬＲＢ（例えば、ＬＩＬＲＢ２、ＬＩＬＲＢ１）は、ベータ２－ミクログロブリンの状況下にあるＨＬＡ－Ｇに結合する。ベータ２－ミクログロブリン配列の非限定的な例は、配列番号４に提供される。

【0088】

具体的な実施形態によれば、ＬＩＬＲＢ（例えば、ＬＩＬＲＢ２、ＬＩＬＲＢ１）は、非ベータ２－ミクログロブリンの状況下にない遊離ＨＬＡ－Ｇ又はＨＬＡ－Ｇに結合する。

【0089】

具体的な実施形態によれば、ＬＩＬＲＢ（例えば、ＬＩＬＲＢ２、ＬＩＬＲＢ１）は、遊離ＨＬＡ－Ｇ（すなわち、ペプチドに結合していない）に結合する。

【0090】

具体的な実施形態によれば、ＬＩＬＲＢ（例えば、ＬＩＬＲＢ２、ＬＩＬＲＢ１）は、ペプチドを提示するＨＬＡ－Ｇに結合する。

【0091】

具体的な実施形態によれば、ＬＩＬＲＢ（例えば、ＬＩＬＲＢ２、ＬＩＬＲＢ１）は、ペプチド配列から独立したＨＬＡ－Ｇに結合する。

【0092】

結合を試験するためのアッセイは当技術分野において周知であり、それとしては、限定されるものではないが、フローサイトメトリー、Ｂｉａｃｏｒｅ、バイオレイヤー干渉Ｂｌｉｔｚ（登録商標）アッセイ、ＨＰＬＣが挙げられる。

【0093】

本明細書において使用される場合、用語「ＬＩＬＲＢポリペプチド」、「ＬＩＬＲＢ２ポリペプチド」及び「ＬＩＬＲＢ１ポリペプチド」は、全長ＬＩＬＲＢ、ＬＩＬＲＢ２及びＬＩＬＲＢ１、少なくともＨＬＡ－Ｇに結合する能力を維持するその機能的断片又はそのホモログを指す。例えば、具体的な実施形態によれば、ポリペプチドのアミノ酸配列は、本明細書にさらに記載されるとおり、野生型タンパク質の配列と比較して置換、付加及び／又は欠失突然変異を含む。

【0094】

具体的な実施形態によれば、ＬＩＬＲＢ２ポリペプチドのアミノ酸配列は、上記及び下記にさらに記載されるとおり、置換、付加及び欠失突然変異（例えば、配列番号１に示すＬＩＬＲＢ２ポリペプチドと比較して）を含む。

【0095】

具体的な実施形態によれば、ＬＩＬＲＢ１ポリペプチドのアミノ酸配列は、上記及び下記にさらに記載されるとおり、置換、付加及び欠失突然変異（例えば、配列番号１０２に示すＬＩＬＲＢ１ポリペプチドと比較して）を含む。

【0096】

具体的な実施形態によれば、ＬＩＬＲＢ（例えば、ＬＩＬＲＢ２、ＬＩＬＲＢ１）ポリペプチドは、ＬＩＬＲＢ（例えば、ＬＩＬＲＢ２、ＬＩＬＲＢ１）の細胞外ドメイン又は少なくともＨＬＡ－Ｇに結合し得るその機能的断片を含む。

【0097】

上記のとおり、ＬＩＬＲＢの細胞外ドメインは、当技術分野においてＤドメインとして公知の免疫グロブリン様ドメインを２～４個含み、これらは膜に対して遠位から近位へ（さらにタンパク質のアミノ酸配列のＮ末からＣ末までのそれらの順序に対応）のそれらの位置により１～４と番号付されている。

【0098】

ＬＩＬＲＢ２又はＬＩＬＲＢ１の細胞外ドメインは、Ｄ１～Ｄ４として公知の４つのＩｇ様ドメインを含む。ＬＩＬＲＢ２及びＬＩＬＲＢ１細胞外ドメインの非限定的な例は、配列番号１、１００及び１０２によって提供される。

【0099】

したがって、具体的な実施形態によれば、ＬＩＬＲＢ（例えば、ＬＩＬＲＢ２、ＬＩＬＲＢ１）ポリペプチドのアミノ酸配列は、少なくとも１つのＩｇ様ドメイン又はその機能的断片を含む。

【0100】

具体的な実施形態によれば、ＬＩＬＲＢ（例えば、ＬＩＬＲＢ２、ＬＩＬＲＢ１）ポリペプチドのアミノ酸配列は、少なくとも１つのＩｇ様ドメインを含む。

【0101】

具体的な実施形態によれば、ＬＩＬＲＢ（例えば、ＬＩＬＲＢ２、ＬＩＬＲＢ１）ポリペプチドは、少なくとも２つのＩｇ様ドメイン、少なくとも３つのＩｇ様ドメイン若しくは４つのＩｇ様ドメイン又はそれらの機能的断片を含む。

【0102】

具体的な実施形態によれば、ＬＩＬＲＢ（例えば、ＬＩＬＲＢ２、ＬＩＬＲＢ１）ポリペプチドは、少なくとも２つのＩｇ様ドメイン、少なくとも３つのＩｇ様ドメイン又は４つのＩｇ様ドメインを含む。

【0103】

具体的な実施形態によれば、ＬＩＬＲＢ（例えば、ＬＩＬＲＢ２、ＬＩＬＲＢ１）ポリペプチドは、少なくともＤ１ドメインを含む。

【0104】

具体的な実施形態によれば、ＬＩＬＲＢ２ポリペプチドは、ＬＩＬＲＢ２のドメインＤ１及びＤ２、ＬＩＬＲＢ２のドメインＤ１、Ｄ２及びＤ３、ＬＩＬＲＢ２のドメインＤ１、Ｄ２及びＤ４、又はＬＩＬＲＢ２のドメインＤ１、Ｄ２、Ｄ３及びＤ４を含む。

【0105】

具体的な実施形態によれば、ＬＩＬＲＢ１ポリペプチドは、ＬＩＬＲＢ１のドメインＤ１及びＤ２、ＬＩＬＲＢ１のドメインＤ１、Ｄ２及びＤ３、ＬＩＬＲＢ１のドメインＤ１、Ｄ２及びＤ４、又はＬＩＬＲＢ１のドメインＤ１、Ｄ２、Ｄ３及びＤ４を含む。

【0106】

具体的な実施形態によれば、ＬＩＬＲＢ（例えば、ＬＩＬＲＢ２、ＬＩＬＲＢ１）ポリペプチドは、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、少なくとも１００アミノ酸を含み、各可能性は本発明の別個の実施形態を表す。

【0107】

具体的な実施形態によれば、ＬＩＬＲＢ（例えば、ＬＩＬＲＢ２、ＬＩＬＲＢ１）ポリペプチドは、１００～５９７アミノ酸、１００～５００アミノ酸、１００～４００アミノ酸、１５０～４００アミノ酸、３００～４００アミノ酸、３５０～４００アミノ酸、１５０～２５０アミノ酸を含み、各可能性は本発明の別個の実施形態を表す。

【0108】

用語「ＬＩＬＲＢポリペプチド」、「ＬＩＬＲＢ２ポリペプチド」及び「ＬＩＬＲＢ１ポリペプチド」は、所望の活性（すなわち、ＭＨＣ、例えば、ＨＬＡ－Ｇへの結合）を示す機能的ホモログも包含する。このようなホモログは、例えば、本明細書に記載のＬＩＬＲＢ、ＬＩＬＲＢ２及びＬＩＬＲＢ１のアミノ酸配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％若しくは１００％同一若しくは相同であり得、又はそれをコードするポリヌクレオチド配列（以下にさらに記載される）と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％若しくは１００％同一であり得る。

【0109】

本明細書において使用される場合、「同一性」又は「配列同一性」は、全体的な同一性、すなわち、本明細書に開示されるアミノ酸又は核酸配列全体にわたる同一性を指し、その一部にわたる同一性を指すものではない。

【0110】

配列同一性又は相同性は、任意のタンパク質又は核酸配列アラインメントアルゴリズム、例えば、ブラスト、クラスタルＷ、及びＭＵＳＣＬＥを使用して決定することができる。

【0111】

ホモログは、以下にさらに記載されるとおり、オルソログ、欠失、挿入、又はアミノ酸置換を含む置換バリアントも指し得る。

【0112】

具体的な実施形態によれば、ＬＩＬＲＢ（例えば、ＬＩＬＲＢ２、ＬＩＬＲＢ１）ポリペプチドは、以下にさらに詳述されるとおり、保存的及び／又は非保存的アミノ酸置換（本明細書において「突然変異」とも称される）を含み得る。

【0113】

本明細書に記載のＬＩＬＲＢポリペプチドは、ＬＩＬＲＢのＤ１ドメイン中の少なくとも１つの突然変異を含む。ＬＩＬＲＢ２及びＬＩＬＲＢ１のＤ１ドメインの非限定的な例は、それぞれ配列番号１０４及び１０５に提供される。

【0114】

突然変異は、例えば、点突然変異、置換（あるアミノ酸を別のものに置き換える）、付加及び／又は欠失突然変異であり得る。

【0115】

具体的な実施形態によれば、少なくとも１つの突然変異は、置換突然変異である。

【0116】

具体的な実施形態によれば、少なくとも１つの突然変異は、単一突然変異である。

【0117】

他の具体的な実施形態によれば、少なくとも１つの突然変異は、少なくとも２つの突然変異を含む。

【0118】

他の具体的な実施形態によれば、少なくとも１つの突然変異は、少なくとも３つ又は少なくとも４つの突然変異を含む。

【0119】

具体的な実施形態によれば、少なくとも１つの突然変異は、ＬＩＬＲＢのＤ１ドメインの４０～６０位のアミノ酸の中に局在する。

【0120】

具体的な実施形態によれば、少なくとも１つの突然変異は、ＬＩＬＲＢの４３～４５位、４７～５０位及び／又は５５～７７位のアミノ酸の中に内に局在する。

【0121】

具体的な実施形態によれば、少なくとも１つの突然変異は、Ｓ、Ｉ、Ｔ及びＶからなる群より選択されるアミノ酸におけるものである。

【0122】

具体的な実施形態によれば、少なくとも１つの突然変異は、ＬＩＬＲＢ及びＨＬＡ－ＧのＰｈｅ１９５間の界面のアミノ酸におけるものであり、ナンバリングは配列番号３に対応する。

【0123】

具体的な実施形態によれば、ＬＩＬＲＢ２ポリペプチドは、配列番号１のＳ４５、Ｉ４９、Ｔ５０及びＶ５７からなる群より選択されるアミノ酸に対応する位置に少なくとも１つの突然変異を含む。

【0124】

本明細書において使用される場合、語句「配列番号１の～に対応する」は、任意の他のＬＩＬＲＢ２アミノ酸配列における、対応するアミノ酸残基を含むことを意図する。

【0125】

具体的な実施形態によれば、突然変異は、保存的置換を含む。

【0126】

他の具体的な実施形態によれば、突然変異は、非保存的置換を含む。

【0127】

具体的な実施形態によれば、突然変異は、非天然存在の突然変異である。

【0128】

具体的な実施形態によれば、配列番号１のＳ４５に対応するアミノ酸は、Ｓ４５Ｒ、Ｓ４５Ｎ、Ｓ４５Ｑ、Ｓ４５Ｈ、Ｓ４５Ｌ、Ｓ４５Ｋ、Ｓ４５Ｍ、Ｓ４５Ｆ、Ｓ４５Ｗ又はＳ４５Ｙ突然変異を含む。

【0129】

具体的な実施形態によれば、配列番号１のＳ４５に対応するアミノ酸は、Ｓ４５Ｑ突然変異を含む。

【0130】

具体的な実施形態によれば、配列番号１のＩ４９に対応する突然変異は、Ｉ４９Ｒ、Ｉ４９Ｋ、Ｉ４９Ｆ又はＩ４９Ｙ突然変異を含む。

【0131】

具体的な実施形態によれば、配列番号１のＩ４９に対応する突然変異は、Ｉ４９Ｋ突然変異を含む。

【0132】

具体的な実施形態によれば、配列番号１のＴ５０に対応する突然変異は、Ｔ５０Ｒ、Ｔ５０Ｎ、Ｔ５０Ｌ、Ｔ５０Ｋ、Ｔ５０Ｆ、Ｔ５０Ｗ又はＴ５０Ｙ突然変異を含む。

【0133】

具体的な実施形態によれば、配列番号１のＴ５０に対応する突然変異は、Ｔ５０Ｆ突然変異を含む。

【0134】

具体的な実施形態によれば、配列番号１のＶ５７に対応する突然変異は、Ｖ５７Ｒ、Ｖ５７Ｋ、Ｖ５７Ｆ又はＶ５７Ｗ突然変異を含む。

【0135】

具体的な実施形態によれば、配列番号１のＶ５７に対応する突然変異は、Ｖ５７Ｒ突然変異を含む。

【0136】

具体的な実施形態によれば、ＬＩＬＲＢ２ポリペプチドは、開示される突然変異の１つを含む。

【0137】

具体的な実施形態によれば、ＬＩＬＲＢ２ポリペプチドは、開示される突然変異の少なくとも２つを含む。

【0138】

したがって、具体的な実施形態によれば、ＬＩＬＲＢ２ポリペプチドは、配列番号１のＳ４５及びＩ４９に対応するアミノ酸おける突然変異、配列番号１のＳ４５及びＴ５０に対応するアミノ酸における突然変異、配列番号１のＳ４５及びＶ５７に対応するアミノ酸における突然変異、配列番号１のＩ４９及びＴ５０に対応するアミノ酸における突然変異、配列番号１のＩ４９及びＶ５７に対応するアミノ酸における突然変異、又は配列番号１のＴ５０及びＶ５７に対応するアミノ酸の突然変異を含む。

【0139】

具体的な実施形態によれば、ＬＩＬＲＢ２ポリペプチドは、配列番号１のＳ４５に対応するアミノ酸における突然変異と、配列番号１のＩ４９、Ｔ５０及び／又はＶ５７に対応するアミノ酸における追加の突然変異とを含む。

【0140】

具体的な実施形態によれば、ＬＩＬＲＢ２ポリペプチドは、配列番号１に対応するＳ４５Ｎ及びＴ５０Ｒ突然変異を含む。

【0141】

具体的な実施形態によれば、ＬＩＬＲＢ２ポリペプチドは、配列番号１に対応するＳ４５Ｙ及びＴ５０Ｋ突然変異を含む。

【0142】

具体的な実施形態によれば、ＬＩＬＲＢ２ポリペプチドは、配列番号１に対応するＳ４５Ｒ及びＩ４９Ｆ突然変異を含む。

【0143】

具体的な実施形態によれば、ＬＩＬＲＢ２ポリペプチドは、配列番号１に対応するＳ４５Ｑ及びＶ５７Ｒ突然変異を含む。

【0144】

具体的な実施形態によれば、ＬＩＬＲＢ２ポリペプチドは、配列番号１に対応するＳ４５Ｑ及びＩ４９Ｋ突然変異を含む。

【0145】

具体的な実施形態によれば、ＬＩＬＲＢ２ポリペプチドは、配列番号１に対応するＳ４５Ｙ及びＴ５０Ｎ突然変異を含む。

【0146】

具体的な実施形態によれば、ＬＩＬＲＢ２ポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１及び２３からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％若しくは１００％同一若しくは相同であり、又はそれをコードするポリヌクレオチド配列（以下にさらに記載される）と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％若しくは１００％同一である。

【0147】

具体的な実施形態によれば、ＬＩＬＲＢ２ポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１及び２３からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であり、各可能性は本発明の別個の実施形態を表す。

【0148】

具体的な実施形態によれば、ＬＩＬＲＢ２ポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１及び２３からなる群より選択されるアミノ酸配列を含み、各可能性は本発明の別個の実施形態を表す。

【0149】

具体的な実施形態によれば、ＬＩＬＲＢ２ポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１又は２３に示すものであり、各可能性は本発明の別個の実施形態を表す。

【0150】

具体的な実施形態によれば、ＬＩＬＲＢ１ポリペプチドは、配列番号１０２のＴ４３、Ｉ４７、Ｔ４８及びＶ５５からなる群より選択されるアミノ酸に対応する位置に少なくとも１つの突然変異を含む。

【0151】

本明細書において使用される場合、語句「配列番号１０２の～に対応する」は、任意の他のＬＩＬＲＢ１アミノ酸配列における対応するアミノ酸残基を含むことを意図する。

【0152】

具体的な実施形態によれば、突然変異は、保存的置換を含む。

【0153】

他の具体的な実施形態によれば、突然変異は、非保存的置換を含む。

【0154】

具体的な実施形態によれば、突然変異は、非天然存在の突然変異である。

【0155】

具体的な実施形態によれば、配列番号１０２のＴ４３に対応するアミノ酸は、Ｔ４３Ｒ、Ｔ４３Ｎ、Ｔ４３Ｑ、Ｔ４３Ｈ、Ｔ４３Ｌ、Ｔ４３Ｋ、Ｔ４３Ｍ、Ｔ４３Ｆ、Ｔ４３Ｗ又はＴ４３Ｙ突然変異を含む。

【0156】

具体的な実施形態によれば、配列番号１０２のＩ４７に対応する突然変異は、Ｉ４７Ｒ、Ｉ４７Ｋ、Ｉ４７Ｆ又はＩ４７Ｙ突然変異を含む。

【0157】

具体的な実施形態によれば、配列番号１０２のＴ４８に対応する突然変異は、Ｔ４８Ｒ、Ｔ４８Ｎ、Ｔ４８Ｌ、Ｔ４８Ｋ、Ｔ４８Ｆ、Ｔ４８Ｗ又はＴ４８Ｙ突然変異を含む。

【0158】

具体的な実施形態によれば、配列番号１０２のＶ５５に対応する突然変異は、Ｖ５５Ｒ、Ｖ５５Ｋ、Ｖ５５Ｆ又はＶ５５Ｗ突然変異を含む。

【0159】

具体的な実施形態によれば、配列番号１０２のＶ５５に対応する突然変異は、Ｖ５５Ｒ突然変異を含む。

【0160】

具体的な実施形態によれば、ＬＩＬＲＢ１ポリペプチドは、開示される突然変異の１つを含む。

【0161】

具体的な実施形態によれば、ＬＩＬＲＢ１ポリペプチドは、開示される突然変異の少なくとも２つを含む。

【0162】

具体的な実施形態によれば、ＬＩＬＲＢ１ポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号１０３と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％若しくは１００％同一若しくは相同であり、又はそれをコードするポリヌクレオチド配列（以下にさらに記載される）と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％若しくは１００％同一である。

【0163】

具体的な実施形態によれば、ＬＩＬＲＢ１ポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号１０３と少なくとも９０％同一である。

【0164】

具体的な実施形態によれば、ＬＩＬＲＢ１ポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号１０３を含む。

【0165】

具体的な実施形態によれば、ＬＩＬＲＢ１ポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号１０３に示すものである。

【0166】

具体的な実施形態によれば、ＬＩＬＲＢ（例えば、ＬＩＬＲＢ２、ＬＩＬＲＢ１）ポリペプチドは、同じ長さであり、且つ少なくとも１つの突然変異を含まない配列のＬＩＬＲＢ（例えば、ＬＩＬＲＢ２、ＬＩＬＲＢ１）ポリペプチドと比較して増加した安定性を有する。

【0167】

具体的な実施形態によれば、ＬＩＬＲＢ２ポリペプチドは、配列番号１に示すＬＩＬＲＢ２ポリペプチドと比較して増加した安定性を有する。

【0168】

具体的な実施形態によれば、ＬＩＬＲＢ１ポリペプチドは、配列番号１０２に示すＬＩＬＲＢ２ポリペプチドと比較して増加した安定性を有する。

【0169】

本明細書において使用される場合、語句「増加した安定性」は、同じ長さであり、且つ少なくとも１つの突然変異を含まない配列のＬＩＬＲＢ（例えば、ＬＩＬＲＢ２、ＬＩＬＲＢ１）ポリペプチドと比較した、本明細書に開示される少なくとも１つの突然変異を含むＬＩＬＲＢ（例えば、ＬＩＬＲＢ２、ＬＩＬＲＢ１）ポリペプチドの安定性の統計的に有意な増加を指す。具体的な実施形態によれば、増加した安定性は、ＬＩＬＲＢ－ＨＬＡＧ複合体の増加した安定性により顕在化される。具体的な実施形態によれば、増加は、少なくとも２％、５％、１０％、３０％、４０％又はさらに高く、例えば、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％におけるものである。具体的な実施形態によれば、増加は、少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、又は少なくとも２０倍のものである。

【0170】

ポリペプチドの安定性を決定する方法は当技術分野において周知であり、それとしては、例えば、凝集物形成の物理的状態及び時間依存性を定義するためのサイズ排除高速液体クロマトグラフィー（ＳＥＣ－ＨＰＬＣ）、タンパク質の物理的状態及び時間依存性（統合性）を定義するためのＳＤＳ－ＰＡＧＥ、例えば、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）を用いる融解温度（Ｔｍ）の分析が挙げられる。

【0171】

具体的な実施形態によれば、ＬＩＬＲＢ（例えば、ＬＩＬＲＢ２、ＬＩＬＲＢ１）ポリペプチドは、同じ長さであり、且つ少なくとも１つの突然変異を含まない配列のＬＩＬＲＢ（例えば、ＬＩＬＲＢ２、ＬＩＬＲＢ１）ポリペプチドと比較して増加したＨＬＡ－Ｇに対する親和性を有する。

【0172】

具体的な実施形態によれば、ＬＩＬＲＢ２ポリペプチドは、配列番号１に示すＬＩＬＲＢ２ポリペプチドと比較して増加したＨＬＡ－Ｇに対する親和性を有する。

【0173】

具体的な実施形態によれば、ＬＩＬＲＢ１ポリペプチドは、配列番号１０２に示すＬＩＬＲＢ２ポリペプチドと比較して増加したＨＬＡ－Ｇに対する親和性を有する。

【0174】

本明細書において使用される場合、語句「増加したＨＬＡ－Ｇに対する親和性」は、同じ長さであり、且つ少なくとも１つの突然変異を含まない配列のＬＩＬＲＢ（例えば、ＬＩＬＲＢ２、ＬＩＬＲＢ１）ポリペプチドと比較した、本明細書に開示される少なくとも１つの突然変異を含むＬＩＬＲＢ（例えば、ＬＩＬＲＢ２、ＬＩＬＲＢ１）ポリペプチドの、ＨＬＡ－Ｇポリペプチド（例えば、配列番号３に示す）に対する結合親和性の統計的に有意な増加を指し、それは、直接的に又は天然リガンドの結合の阻害を介して決定することができる。結合親和性の増加は、他のＨＬＡ（例えば、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ）と比較して高いＨＬＡ－Ｇに対する親和性（例えば、Ｋｄ、Ｋａ）及び／又は高いＨＬＡ－Ｇへの選択的結合により顕在化され得る。具体的な実施形態によれば、増加は、少なくとも２％、５％、１０％、３０％、４０％又はさらに高く、例えば、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％におけるものである。具体的な実施形態によれば、増加は、少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、又は少なくとも２０倍のものである。具体的な実施形態によれば、増加は、少なくとも５、１０、１００、１０００又は１００００倍のものである。

【0175】

親和性を決定する方法は当技術分野において周知であり、前述及び後述もされ、それとしては、例えば、ビアコア、ＨＰＬＣ、表面プラズモン共鳴アッセイ（ＳＰＲ）及びフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）が挙げられる。

【0176】

具体的な実施形態によれば、ＬＩＬＲＢ（例えば、ＬＩＬＲＢ２、ＬＩＬＲＢ１）ポリペプチドは、例えば、癌細胞の食作用を誘導し、又は向上させ得る。

【0177】

食作用を決定する方法は当技術分野において公知であり、以下の実施例の項にさらに記載される。

【0178】

具体的な実施形態によれば、ＬＩＬＲＢ（例えば、ＬＩＬＲＢ２、ＬＩＬＲＢ１）ポリペプチドは、腫瘍促進Ｍ２マクロファージの誘導を妨害し、又は低減させ得、腫瘍抑制Ｍ１マクロファージの誘導をもたらし得る。

【0179】

具体的な実施形態によれば、ＬＩＬＲＢ（例えば、ＬＩＬＲＢ２、ＬＩＬＲＢ１）ポリペプチドは、Ｍ０（Ｍ２様）マクロファージをＭ１マクロファージに変換させ得る。

【0180】

マクロファージ表現型を決定する方法は当技術分野において公知であり、以下の実施例の項にさらに記載される。

【0181】

本発明の一部の実施形態のＬＩＬＲＢ（例えば、ＬＩＬＲＢ２、ＬＩＬＲＢ１）ポリペプチドは、非タンパク質性又はタンパク質性部分に結合させることができる。

【0182】

したがって、本発明の一態様によれば、本明細書に開示されるＬＩＬＲＢ（例えば、ＬＩＬＲＢ２、ＬＩＬＲＢ１）ポリペプチド及びＬＩＬＲＢ（例えば、ＬＩＬＲＢ２、ＬＩＬＲＢ１）ポリペプチドに結合している非タンパク質性部分を含む組成物が提供される。

【0183】

本明細書において使用される語句「非タンパク質性部分」は、ペプチドに結合しているペプチド結合アミノ酸を含まない分子を指す。具体的な実施形態によれば、非タンパク質性は、非毒性部分である。本教示に従って使用することができる例示的な非タンパク質性部分としては、限定されるものではないが、薬物、化学物質、小分子、ポリヌクレオチド、検出可能部分、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ポリ（スチレン－ｃｏ－マレイン酸無水物）（ＳＭＡ）、並びにジビニルエーテル及びマレイン酸無水物コポリマー（ＤＩＶＥＭＡ）が挙げられる。本発明の具体的な実施形態によれば、非タンパク質性部分は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む。

【0184】

このような分子は、高度に安定的（おそらく非タンパク質性部分により付与される立体障害に起因してインビボタンパク質分解活性に耐性）であり、以下にさらに記載される安価で高度に効率的な一般的な固相合成法を使用して産生することができる。しかしながら、依然として組換え技術を使用することができ、それにより組換えペプチド産物をインビトロ修飾（例えば、以下にさらに記載されるＰＥＧ化）に供することが認識される。

【0185】

ポリペプチドのアミノ酸配列とＰＥＧとのバイオコンジュゲーション（すなわち、ＰＥＧ化）は、ＰＥＧ誘導体、例えば、ＰＥＧカルボン酸のＮ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステル、モノメトキシＰＥＧ_２－ＮＨＳ、カルボキシメチル化ＰＥＧのスクシンイミジルエステル（ＳＣＭ－ＰＥＧ）、ＰＥＧのベンゾトリアゾールカルボネート誘導体、ＰＥＧのグリシジルエーテル、ＰＥＧｐ－ニトロフェニルカルボネート（ＰＥＧ－ＮＰＣ、例えば、メトキシＰＥＧ－ＮＰＣ）、ＰＥＧアルデヒド、ＰＥＧ－オルトピリジル－ジスルフィド、カルボニルジミダゾール（ｃａｒｂｏｎｙｌｄｉｍｉｄａｚｏｌ）－活性化ＰＥＧ、ＰＥＧ－チオール、ＰＥＧ－マレイミドを使用して行うことができる。このようなＰＥＧ誘導体は、種々の分子量で市販されている［例えば、カタログ、Polyethylene Glycol and Derivatives, 2000（アラバマ州、ハンツビル、Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，Ｉｎｃ．）を参照のこと］。所望により、上記誘導体の多くは、単官能性モノメトキシＰＥＧ（ｍＰＥＧ）形態で利用可能である。一般に、本発明のポリペプチドに付加されるＰＥＧは、数百ダルトンから約１００ｋＤａ（例えば、３～３０ｋＤａ）の分子量（ＭＷ）の範囲であるべきである。より大きいＭＷのＰＥＧを使用することができるが、ＰＥＧ化ポリペプチドの収率のいくらかの損失をもたらし得る。より低いＭＷのＰＥＧで得られるのと同じほど高い純度のより大きいＭＷのＰＥＧを得ることが困難であり得るため、より大きいＰＥＧ分子の純度も監視するべきである。少なくとも８５％の純度、より好ましくは、少なくとも９０％の純度、９５％の純度、又はそれよりも高い純度のＰＥＧを使用することが好ましい。分子のＰＥＧ化は、例えば、Chapter 15のHermanson, Bioconjugate Techniques, Academic Press San Diego, Calif.(1996)、及びDunn and Ottenbrite編, Polymeric Drugs and Drug Delivery Systems, American Chemical Society, Washington, D.C. (1991)内のZalipsky et al., “Succinimidyl Carbonates of Polyethylene Glycol”にさらに考察されている。

【0186】

簡便には、ＰＥＧは、コンジュゲートの活性が保持される限り、部位特異的突然変異誘発によりポリペプチド中の選択位置に結合させることができる。ＰＥＧ化のための標的は、ペプチド配列のＮ末端又はＣ末端における任意のシステイン残基であり得る。付加的に又は代替的に、他のシステイン残基をポリペプチドのアミノ酸配列に（例えば、Ｎ末端又はＣ末端において）付加させ、それによりＰＥＧ化のための標的として機能させることができる。コンピュータ分析を行って活性を減弱させない突然変異誘発に好ましい位置を選択することができる。

【0187】

活性化ＰＥＧ、例えば、ＰＥＧ－マレイミド、ＰＥＧ－ビニルスルホン（ＶＳ）、ＰＥＧ－アクリレート（ＡＣ）、ＰＥＧ－オルトピリジルジスルフィドの種々のコンジュゲーション化学を用いることができる。活性化ＰＥＧ分子を調製する方法は、当技術分野において公知である。例えば、ＰＥＧ－ＶＳは、アルゴン下でＰＥＧ－ＯＨのジクロロメタン（ＤＣＭ）溶液をＮａＨと反応させ、次いでジ－ビニルスルホン（モル比：ＯＨ１：ＮａＨ５：ジビニルスルホン５０、０．２グラムのＰＥＧ／ｍＬのＤＣＭ）と反応させることにより調製することができる。ＰＥＧ－ＡＣは、アルゴン下でＰＥＧ－ＯＨのＤＣＭ溶液を塩化アクリロイル及びトリエチルアミンと反応させることにより作製される（モル比：ＯＨ１：塩化アクリロイル１．５：トリエチルアミン２、０．２グラムのＰＥＧ／ｍＬのＤＣＭ）。このような化学基は、線形化、２－アーム、４－アーム、又は８－アームＰＥＧ分子に結合させることができる。

【0188】

得られたコンジュゲート分子（例えば、ＰＥＧ化又はＰＶＰ－コンジュゲートポリペプチド）は、例えば、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）及び生物学的アッセイを使用して分離、精製及び定量される。

【0189】

具体的な実施形態によれば、非タンパク質性部分は、二量体化部分である。このような二量体化分子は当業者に周知であり、以下にさらに記載される。

【0190】

本発明の追加の又は代替的な態様によれば、異種タンパク質性部分に結合している、本明細書において開示されるＬＩＬＲＢ（例えば、ＬＩＬＲＢ２、ＬＩＬＲＢ１）ポリペプチドを含む融合ポリペプチドが提供される。

【0191】

本明細書において使用される場合、用語「融合ポリペプチド」は、天然で単一アミノ酸配列中に一緒に見出されない２つ以上の部分を有するアミノ酸配列を指す。

【0192】

本明細書において使用される場合、用語「異種」は、引用されるアミノ酸配列（例えば、ＬＩＬＲＢポリペプチド、例えば、ＬＩＬＲＢ２ポリペプチド、ＬＩＬＲＢ１ポリペプチド）に対して少なくとも局在化が天然でなく、又は引用されるアミノ酸配列の天然配列に完全に不存在であるアミノ酸配列を指す。

【0193】

本発明の一部の実施形態のＬＩＬＲＢ（例えば、ＬＩＬＲＢ２、ＬＩＬＲＢ１）ポリペプチドに融合させることができる異種タンパク質性部分の非限定的な例としては、以下にさらに記載されるとおり、二量体化部分、検出可能部分、治療部分、開裂可能部分などが挙げられる。

【0194】

具体的な実施形態によれば、異種タンパク質性部分は、二量体化部分である。このような二量体化部分は当業者に周知であり、以下にさらに記載される。

【0195】

本明細書において使用される場合、用語「二量体化部分」は、２つの異なる単量体に結合して二量体を形成し得る部分を指す。このような二量体化部分は当技術分野において公知であり、それとしては、化学及びタンパク質性部分が挙げられる。

【0196】

具体的な実施形態によれば、二量体化部分は、ポリペプチドに直接結合している。

【0197】

具体的な実施形態によれば、二量体化部分は、ポリペプチドに非直接的に結合している。

【0198】

具体的な実施形態によれば、二量体化部分は、ポリペプチドに共有結合的に結合している。

【0199】

具体的な実施形態によれば、二量体化部分は、ポリペプチドに非共有結合的に結合している。

【0200】

具体的な実施形態によれば、二量体化部分は、少なくとも２つの異なる分子の組成物である。

【0201】

具体的な実施形態によれば、二量体化部分は、非タンパク質性部分、例えば、架橋剤、有機ポリマー、合成ポリマー、小分子などである。

【0202】

多数のこのような非タンパク質性部分が当技術分野において公知であり、例えば、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ社、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社、Ｐｒｏｔｅｏｃｈｅｍ社などから商業的に入手することができる。具体的な実施形態によれば、非タンパク質性部分は、ヘテロ二官能性架橋剤である。ヘテロ二官能性架橋剤は、２つの異なる反応性末端を有する。典型的には、第１のステップにおいて、単量体をヘテロ二官能性試薬の１つの反応性基で修飾し、残りの遊離試薬を除去する。第２のステップにおいて、修飾された単量体を第２の単量体と混合し、次いでそれを試薬の他方の末端における修飾基と反応させる。最も広く使用されるものは、アミン及びスルフヒドリル基を介してタンパク質をカップリングさせる（少なくとも安定的なアミン反応性ＮＨＳ－エステルが最初にカップリングし、カップリングしなかった試薬の除去後、スルフヒドリル基へのカップリングが進行する）。スルフヒドリル反応性基は、一般に、マレイミド、ピリジルジスルフィド及びアルファ－ハロセチルである。他の架橋剤としては、カルボキシル基（－ＣＯＯＨ）及び第１級アミン（－ＮＨ２）間で結合するカルボジイミドが挙げられる。別のアプローチは、１つの単量体のリジン残基をチオールに修飾することであり、第２の単量体はマレイミド基の付加とそれに続く単量体間の安定的なチオエステル結合の形成により修飾する。単量体の１つが天然チオールを有する場合、それらの基は、他の単量体に結合しているマレイミドと直接反応させることができる。１つの光反応性末端を有するヘテロ二官能性架橋剤、例えば、ビス［２－（４－アジドサリチルアミド）エチル）］ジスルフィド、ＢＡＳＥＤも存在する。反応する特異的な基が利用可能でない場合、光反応性基が使用される。それというのも、光反応性基はＵＶ光への曝露時に非特異的に反応するためである。このようなヘテロ二官能性架橋剤の非限定的な例としては、限定されるものではないが、アルキン－ＰＥＧ４－マレイミド、アルキン－ＰＥＧ５－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミジルエステル、マレイミド－ＰＥＧ－スクシンイミジルエステル、アジド－ＰＥＧ４－フェニルオキサジアゾールメチルスルホン、ＬＣ－ＳＭＣＣ（スクシンイミジル－４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシ－（６－アミドカプロエート））、ＭＰＢＨ（４－（４－Ｎ－マレイミドフェニル）酪酸ヒドラジド塩酸塩＋１／２ジオキサン）、ＰＤＰＨ（３－（２－ピリジルジチオ）プロピオニルヒドラジド）、ＳＩＡＢ（Ｎ－スクシンイミジル（４－ヨードアセチル）アミノベンゾエート）、ＳＭＰＨ（スクシンイミジル－６－（（ｂ－マレイミドプロピオンアミド）ヘキサノエート）、スルホ－ＫＭＵＳ（Ｎ－（κ－マレイミドウンデカノイルオキシ）スルホスクシンイミドエステル）、スルホ－ＳＩＡＢ（スルホスクシンイミジル（４－ヨードアセチル）アミノベンゾエート）、３－（マレイミド）プロピオン酸Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル、塩化メトキシカルボニルスルフェニル、プロパルギル－ＰＥＧ－酸、アミノ－ＰＥＧ－ｔ－ブチルエステル、ＢｏｃＮＨ－ＰＥＧ５－酸、ＢＭＰＨ（Ｎ－（β－マレイミドプロピオン酸）ヒドラジド、トリフルオロ酢酸塩）、ＡＮＢ－ＮＯＳ、ＢＭＰＳ、ＥＭＣＳ、ＧＭＢＳ、ＬＣ－ＳＰＤＰ、ＭＢＳ、ＳＢＡ、ＳＩＡ、スルホ－ＳＩＡ、ＳＭＣＣ、ＳＭＰＢ、ＳＭＰＨ、ＳＰＤＰ、スルホ－ＬＣ－ＳＰＤＰ、スルホ－ＭＢＳ、スルホ－ＳＡＮＰＡＨ、スルホ－ＳＭＣＣが挙げられる。

【0203】

他の具体的な実施形態によれば、二量体化部分は、タンパク質性部分である。

【0204】

具体的な実施形態によれば、ＬＩＬＲＢ（例えば、ＬＩＬＲＢ２、ＬＩＬＲＢ１）ポリペプチドは、二量体化タンパク質性部分のＮ末端に結合している。

【0205】

具体的な実施形態によれば、ＬＩＬＲＢ（例えば、ＬＩＬＲＢ２、ＬＩＬＲＢ１）ポリペプチドは、二量体化タンパク質性部分のＣ末端に結合している。

【0206】

具体的な実施形態によれば、二量体化部分は、２つの異なる親和性相補性タグについての２つの別個の親和性部分を有する親和性ペアポリペプチドのメンバーを含む。このような親和性ペアは当技術分野において周知であり、それとしては、限定されるものではないが、ヘマグルチニン（ＨＡ）、抗ＨＡ、アビタグ（商標）、Ｖ５、Ｍｙｃ、Ｔ７、ＦＬＡＧ、ＨＳＶ、ＶＳＶ－Ｇ、Ｈｉｓ、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、リザベジン（ｒｈｉｚａｖｅｄｉｎ）、金属親和性タグ、レシチン親和性タグが挙げられる。当業者は、どのタグを選択するかを把握する。

【0207】

具体的な実施形態によれば、二量体化部分は、ロイシンジッパー又はヘリックス－ループ－ヘリックスを含む。

【0208】

具体的な実施形態によれば、二量体化部分は、抗体又はその断片のＦｃドメインである。

【0209】

具体的な実施形態によれば、Ｆｃは、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ又はＩｇＥのものである。

【0210】

具体的な実施形態によれば、Ｆｃドメインは、ＩｇＧのものである。

【0211】

具体的な実施形態によれば、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ１又はＩｇＧ４のものである。

【0212】

具体的な実施形態によれば、Ｆｃドメインは、ヒトＩｇＧ４のものである。

【0213】

本発明の具体的な実施形態で使用することができるヒトＩｇＧ４Ｆｃドメインの非限定的な例は、配列番号６３に提供される。

【0214】

具体的な実施形態によれば、Ｆｃドメインは、ヒトＩｇＧ１のものである。

【0215】

本発明の具体的な実施形態で使用することができるヒトＩｇＧ１Ｆｃドメインの非限定的な例は、配列番号６４に提供される。

【0216】

具体的な実施形態によれば、Ｆｃドメインは、保存的及び非保存的アミノ酸置換（保存的及び非保存的置換に関する詳細な説明は以下に提供される）を含み得る。Ｆｃドメイン中のこのような置換は当技術分野において公知であり、以下にさらに記載される。

【0217】

例えば、抗体のＦｃドメインを使用してヘテロ二量体を生成するために使用することができる多数の機序、例えば、限定されるものではないが、ノブ・イントゥ・ホール又は電荷ペア（例えば、参照により全体として本明細書に組み込まれるGunasekaran et al., J. Biol. Chem. (2010) 285 (25):19637を参照のこと）が存在する。

【0218】

本発明の具体的な実施形態で使用することができる代表例は、「ノブ・イントゥ・ホール」（「ＫＩＨ」）形態である。このようなノブ及びホール突然変異は当技術分野において周知であり、例えば、内容が完全に参照により本明細書に組み込まれる米国特許第８２１６８０５号明細書、Shane Atwell et Al. J. Mol. Biol. (1997) 270, 26-35、Cater et al. (Protein Engineering vol.9 no.7 pp.617-621, 1996、及びA. Margaret Merchant et.al. Nature Biotechnology (1998) 16 Julyに開示されている。加えて、Merchant et al., Nature Biotech. 16:677 (1998)に記載のとおり、それらの「ノブ及びホール」突然変異は、ジスルフィド結合と組み合わせてヘテロ二量体化への形成の偏りを生じさせることができる。

【0219】

したがって、具体的な実施形態によれば、単量体の一方は、ノブ突然変異を含むＦｃドメインを含み、他方の単量体は、ホール突然変異を含むＦｃドメインを含む。

【0220】

特定の免疫グロブリンクラス及びサブクラスから具体的な免疫グロブリンＦｃドメインを選択すること、並びにノブ突然変異のための第１のＦｃバリアント及びホール突然変異のための他のものを選択することは当業者の範囲内である。具体的な実施形態で使用することができる置換の非限定的な例としては、Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ、Ｔ３６６Ｗ、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ及び／若しくはＥ３５６Ｃ［全長抗体の一部としてのヒトＩｇＧ４に対応するＥＵナンバリング（Kabat,E.A., T. T. Wu, M. Reid-Miller, H. M. Perry and K.S. Gottesman.1987. Sequences of proteins of Immunological Interest. US. Dept. of Health and Human Services, Bethesda）に従う］、又はＬ２３５Ａ、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｗ、Ｔ３５４Ｃ、Ｄ３５６Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及び／若しくはＹ４０７Ｖ［全長抗体の一部としてのヒトＩｇＧ１に対応するＥＵナンバリング（Kabat, E.A., T.T. Wu, M. Reid-Miller, H.M. Perry and K.S. Gottesman. 1987. Sequences of proteins of Immunological Interest. US. Dept. of Health and Human Services, Bethesda）に従う］が挙げられる。

【0221】

本発明の具体的な実施形態で使用することができるノブ突然変異を含むＩｇＧ４Ｆｃドメインの非限定的な例は、配列番号６５、５９及び６０に提供される。

【0222】

本発明の具体的な実施形態で使用することができるホール突然変異を含むＩｇＧ４Ｆｃドメインの非限定的な例は、配列番号６６、６１及び６２に提供される。

【0223】

本発明の具体的な実施形態で使用することができるノブ突然変異を含むＩｇＧ１Ｆｃドメインの非限定的な例は、配列番号３１、６７及び８６に提供される。

【0224】

本発明の具体的な実施形態で使用することができるホール突然変異を含むＩｇＧ１Ｆｃドメインの非限定的な例は、配列番号２９、６８及び８５に提供される。

【0225】

具体的な実施形態によれば、Ｆｃドメインは、配列番号６３、６４、６５、５９、６０、６６、６１、６２、３１、６７、８６、２９、６８及び８５からなる群より選択されるアミノ酸配列若しくは本明細書に開示される所望の活性を示すそれらの機能的断片と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％若しくは１００％の同一性若しくは相同性を有するアミノ酸配列を含み、又はそれをコードするポリヌクレオチド配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％若しくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0226】

具体的な実施形態によれば、Ｆｃドメインは、Ｆｃ受容体へのその結合を変更し、その免疫活性化機能を低減させ、及び／又は融合物の半減期を改善するように修飾されている。

【0227】

他の具体的な実施形態によれば、Ｆｃドメインは、Ｆｃ受容体へのその結合を変更し、その免疫活性化機能を低減させ、及び／又は融合物の半減期を改善するように修飾されていない。

【0228】

具体的な実施形態によれば、Ｆｃドメインは、インビボでＦｃ受容体（例えば、Ｆｃ．ガンマ．ＲＩ、Ｆｃ．ガンマ．ＲＩＩ及びＦｃ．ガンマ．ＲＩＩＩ）への結合を低減させ、又は妨害するように修飾されている。このような修飾は、例えば、一連の突然変異体ＩｇＧ１、ＩｇＧ２及びＩｇＧ４Ｆｃドメイン並びにそれらのＦｃ．ガンマ．Ｒ結合特性を設計及び記載したClarkら（内容が参照により全体として本明細書に組み込まれるArmour et al., 1999、Armour et al., 2002）により記載されている。ヒトＩｇＧ１のＦｃにおけるＦｃ受容体へのその結合を低減させるための追加的又は代替的な修飾は、アミノ酸Ｌ２３４及びＬ２３５［全長抗体に対応するＥＵナンバリング（Kabat et al.）に従う］をＦｃ受容体結合に必須であると同定したCHAPPEL et al.（内容が参照により全体として本明細書に組み込まれるProc. Natl. Acad. Sci (1991) 88:9036-9040）により記載されている。Ｐ３２９のＧへの追加の置換は結合をいっそう弱め、このＬＡＬＡ－ＰＧの置換の組み合わせは、例えば、内容が参照により全体として本明細書に組み込まれるSchlothauer, T., et al. (2016) Protein Eng. Des. Sel. 29, 457-466、及び国際公開第２０１２／１３０８３１号パンフレット）により記載されている。ヒトＩｇＧ４のＦｃにおける、Ｆａｂアーム交換を妨害するため及びＦｃ受容体へのその結合を低減させるための追加的又は代替的修飾は、Ｓ２２８Ｐ及びＬ２３５Ｅ［全長抗体に対応するＥＵナンバリング（Kabat et al.）に従う］をそれぞれ同定したJohn-Paul Silva et al.（内容が参照により全体として本明細書に組み込まれるTHE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY (2015), 290:9, 5462-5469）及びNewman et al.（内容が参照により全体として本明細書に組み込まれるClinical Immunology (2001) 98:2）により記載されている。

【0229】

具体的な実施形態によれば、Ｆｃドメインは、ＦｃγＲＩＩＩａ結合を最大化するために修飾されている。このような修飾は、例えば、内容が参照により全体として本明細書に組み込まれるShields RL J Biol Chem. (2001) 276:6591、Smith P, Proc Natl Acad Sci USA. (2012) 109:6181、Stavenhagen et al., Cancer Res (2007) 67:8882, Lazar et al., Proc Natl Acad Sci USA (2006) 103:4005、Richards et al., 2008 Cancer Ther 7:2517及びMimoto et al.,(2013) MAbs 5:229により記載されている。具体的な実施形態で使用することができるこのような修飾の非限定的な例としては、Ｓ２９８、Ｅ３３３及びＫ３３４から選択される１つ以上のアミノ酸残基の置換［全長抗体に対応するＥＵナンバリング（Kabat et al.）に従う］（例えば、Ｓ２９８Ａ、Ｅ３３３Ａ、Ｋ３３４Ａ）、Ｇ２３６Ａ、Ｓ２３９Ａ、Ａ３３０Ｌ及びＩ３３２Ｅ、Ｆ２４３Ｌ、Ｒ２９２Ｐ、Ｙ３００Ｌ、Ｖ３０５Ｉ及びＰ３９６Ｌ、Ｓ２３９Ｄ、Ｉ３３２Ｅ及びＡ３３０Ｌ、２３６Ａ、Ｓ２３９Ｄ及びＩ３３２Ｅ、並びに重鎖中の非対称置換－Ｌ２３４Ｙ／Ｌ２３５Ｑ／Ｇ２３６Ｗ／Ｓ２３９Ｍ／Ｈ２６８Ｄ／Ｄ２７０Ｅ／Ｓ２９８Ａ及び反対側の重鎖中のＤ２７０Ｅ／Ｋ３２６Ｄ／Ａ３３０Ｍ／Ｋ３３４Ｅが挙げられる。

【0230】

具体的な実施形態によれば、Ｆｃドメインは、エフェクター機能を変更するため、例えば、補体結合を低減させるため、及び／又は補体依存性細胞傷害を低減若しくは停止させるために修飾されている。このような修飾は、例えば、内容が参照により全体として本明細書に組み込まれる米国特許第５，６２４，８２１号明細書及び同第５，６４８，２６０号明細書、米国特許第６，１９４，５５１号明細書、国際公開第９９／５１６４２号パンフレット、Wines et al., 2000, Idusogie et al. (2000) J. Immunol. 164:4178、Tao et al. (1993) J. Exp. Med. 178:661及びCanfield & Morrison (1991) J. Exp. Med. 173:1483に記載されている。具体的な実施形態で使用することができるこのような修飾の非限定的な例としては、２３４、２３５、２３６、２３７、２９７、３１８、３２０及び３２２、３２９、３３１及び３２２、Ｌ２３４及び／又はＬ２３５から選択される位置［全長抗体に対応するＥＵナンバリング（Kabat et al.）に従う］における１つ以上のアミノ酸の置換（例えば、Ｌ２３４Ａ及び／又はＬ２３５Ａ）、Ｄ２７０、Ｋ３２２、Ｐ３２９及びＰ３３１（例えば、Ｄ２７０Ａ、Ｋ３２２Ａ、Ｐ３２９Ａ及びＰ３３１Ａ）が挙げられる。

【0231】

具体的な実施形態によれば、Ｆｃドメインは、融合タンパク質の半減期を改善するように修飾されている。このような変更は、例えば、内容が参照により全体として本明細書に組み込まれる米国特許第５，８６９，０４６号明細書及び米国特許第６，１２１，０２２号明細書に記載されている。例えば、２５２（例えば、Ｔｈｒを導入するため）、２５４（例えば、Ｓｅｒを導入するため）及び２５６（例えば、Ｐｈｅを導入するため）から選択される位置［全長抗体に対応するＥＵナンバリング（Kabat et al.）に従う］における１つ以上のアミノ酸の置換である。半減期を改善するための別の修飾は、サルベージ受容体モチーフ、例えば、ＩｇＧのＦｃ領域のＣＨ２ドメインの２つのループ中に見出されるものを導入するためのＣＨ１又はＣＬ領域の変更によるものであり得る。

【0232】

ＦｃＲｎ結合の最大化及び半減期の延長は、例えば、内容が参照により全体として本明細書に組み込まれるStapleton NM, Nat Commun. (2011) 2:599、Shields RL. J Biol Chem. (2001) 276:6591、Dall’acqua WF J Immunol. (2002) 169:5171、Zalevsky J,Nat Biotechnol. (2010) 28:157、Ghetie V,. Nat. Biotechnol. (1997) 15:637及びMonnet C, MAbs. (2014) 6:422にも記載されている。具体的な実施形態で使用することができるこのような修飾の非限定的な例としては、Ａｒｇ４３５Ｈｉｓ、Ａｓｎ４３４Ａｌａ、Ｍｅｔ２５２Ｔｙｒ、Ｓｅｒ２５４Ｔｈｒ、及びＴｈｒ２５６Ｇｌｕ、Ｍｅｔ４２８Ｌｅｕ及びＡｓｎ４３４Ｓｅｒ、Ｔｈｒ２５２Ｌｅｕ、Ｔｈｒ２５３Ｓｅｒ及びＴｈｒ２５４Ｐｈｅ、Ｇｌｕ２９４デルタ、Ｔｈｒ３０７Ｐｒｏ及びＡｓｎ４３４Ｔｙｒ、Ｔｈｒ２５６Ａｓｎ、Ａｌａ３７８Ｖａｌ、Ｓｅｒ３８３Ａｓｎ及びＡｓｎ４３４Ｔｙｒから選択される１つ以上のアミノ酸残基［全長抗体に対応するＥＵナンバリング（Kabat et al.）に従う］の置換が挙げられる。

【0233】

本発明の具体的な実施形態で使用することができるＬＩＬＲＢ２－Ｆｃ融合物配列の非限定的な例は、以下の表３に記載される。

【0234】

本発明の具体的な実施形態で使用することができるＬＩＬＲＢ２－Ｆｃ融合物配列の非限定的な例は、配列番号３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、９６、９８、及び１０１に提供される。

【0235】

具体的な実施形態によれば、ＬＩＬＲＢ２－Ｆｃ融合物は、配列番号３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５及び５７からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％若しくは１００％の同一性若しくは相同性を有するアミノ酸配列、又はそれをコードするポリヌクレオチド配列（以下にさらに記載される）と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％若しくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0236】

具体的な実施形態によれば、ＬＩＬＲＢ２－Ｆｃ融合物アミノ酸配列は、配列番号３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５及び５７からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であり、各可能性は本発明の別個の実施形態を表す。

【0237】

具体的な実施形態によれば、ＬＩＬＲＢ２－Ｆｃ融合物アミノ酸配列は、配列番号３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５及び５７からなる群より選択されるアミノ酸配列を含み、各可能性は本発明の別個の実施形態を表す。

【0238】

具体的な実施形態によれば、ＬＩＬＲＢ２－Ｆｃ融合物アミノ酸配列は、配列番号３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５及び５７に示すものであり、各可能性は本発明の別個の実施形態を表す。

【0239】

一部の実施形態のＬＩＬＲＢ（例えば、ＬＩＬＲＢ２、ＬＩＬＲＢ１）ポリペプチドは二量体化部分を含むため、本発明の追加的又は代替的態様によれば、本明細書に開示されるＬＩＬＲＢ（例えば、ＬＩＬＲＢ２、ＬＩＬＲＢ１）ポリペプチド、それを含む組成物又はそれを含む融合ポリペプチドを含む二量体が提供される。

【0240】

本発明の追加的又は代替的態様によれば、本明細書に開示される二量体を含む組成物であって、二量体は、組成物中のＬＩＬＲＢ（例えば、ＬＩＬＲＢ２、ＬＩＬＲＢ１）の優勢形態である組成物が提供される。

【0241】

具体的な実施形態によれば、組成物中のＬＩＬＲＢ２ポリペプチドの少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％は、本明細書に開示される二量体である。

【0242】

具体的な実施形態によれば、組成物中のＬＩＬＲＢ（例えば、ＬＩＬＲＢ２、ＬＩＬＲＢ１）ポリペプチドの少なくとも９０％は、本明細書に開示される二量体である。

【0243】

二量体化を決定する方法は当技術分野において周知であり、それとしては、限定されるものではないが、ネイティブ－ＰＡＧＥ、ＳＥＣ－ＨＰＬＣ２Ｄゲル、ゲル濾過、ＳＥＣ－ＭＡＬＳ、分析的超遠心（ＡＵＣ）質量分析（ＭＳ）、キャピラリーゲル電気泳動（ＣＧＥ）が挙げられる。

【0244】

具体的な実施形態によれば、二量体の単量体は、共有結合的に結合していない。

【0245】

他の具体的な実施形態によれば、二量体の単量体は、共有結合的に結合している。

【0246】

他の具体的な実施形態によれば、二量体の単量体は、ジスルフィド結合により結合している。

【0247】

二量体は、ホモ二量体又はヘテロ二量体であり得る。

【0248】

具体的な実施形態によれば、二量体は、ヘテロ二量体である。

【0249】

本明細書に記載のとおり、用語「ヘテロ二量体」は、２つの異なるタンパク質（本明細書において単量体と称される）の人工的結合により形成される、非天然存在の二量体タンパク質を指す。

【0250】

したがって、本発明の追加的又は代替的態様によれば、本明細書に開示されるＬＩＬＲＢ（例えば、ＬＩＬＲＢ２、ＬＩＬＲＢ１）ポリペプチドを含む第１の単量体、それを含む組成物又はそれを含む融合ポリペプチドと、ＬＩＬＲＢ（例えば、ＬＩＬＲＢ２、ＬＩＬＲＢ１）とは区別されるポリペプチドを含む第２の単量体とを含むヘテロ二量体が提供される。

【0251】

第２の単量体中に含まれる好適な区別されるポリペプチドを選択することは当業者の範囲内である。このようなポリペプチドの非限定的な例としては、Ｉ型膜タンパク質、ＩＩ型膜タンパク質及び免疫チェックポイントタンパク質又は少なくともそれらの天然結合ペアに結合し得るそれらの機能的断片若しくはホモログが挙げられる。

【0252】

本明細書において使用される場合、語句「Ｉ型膜タンパク質」は、Ｎ末端細胞外ドメインを有する膜貫通タンパク質を指す。

【0253】

本発明の具体的な実施形態で使用することができるこのようなＩ型膜タンパク質の非限定的な例としては、ＰＤ１、ＳＩＲＰα、ＬＡＧ３、ＢＴＮ３Ａ１、ＣＤ２７、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＥＮＧ、ＮＬＧＮ４Ｘ、ＣＤ８４、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ４０、ＩＬ－８、ＩＬ－１０、ＣＤ１６４、ＬＹ６Ｇ６Ｆ、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ４、ＢＴＬＡ、ＬＩＬＲＢ１、ＬＩＬＲＢ４、ＴＹＲＯＢＰ、ＩＣＯＳ、ＶＥＧＦＡ、ＣＳＦ１、ＣＳＦ１Ｒ、ＶＥＧＦＢ、ＢＭＰ２、ＢＭＰ３、ＧＤＮＦ、ＰＤＧＦＣ、ＰＤＧＦＤ、ＲＡＥＴ１Ｅ、ＣＤ１５５、ＣＤ１６６、ＭＩＣＡ、ＮＲＧ１、ＨＶＥＭ、ＤＲ３、ＴＥＫ、ＴＧＦＢＲ（例えば、ＴＧＦＢＲ１）、ＬＹ９６、ＣＤ９６、ＫＩＴ、ＣＤ２４４ ＧＦＥＲ及びＳＩＧＬＥＣ（例えば、ＳＩＧＬＥＣ１０）が挙げられる。

【0254】

具体的な実施形態によれば、Ｉ型膜タンパク質は、ＰＤ１、ＳＩＲＰα、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＬＩＬＲＢ１、ＣＳＦ１、ＣＳＦ１Ｒ及びＴＧＦＢＲからなる群より選択される。

【0255】

具体的な実施形態によれば、Ｉ型膜タンパク質は、ＰＤ１、ＳＩＲＰα、ＴＩＧＩＴ及びＳＩＧＬＥＣからなる群より選択される。

【0256】

具体的な実施形態によれば、Ｉ型膜タンパク質は、免疫モジュレーターである。

【0257】

本明細書において使用される場合、用語「免疫モジュレーター」は、免疫細胞応答（すなわち、活性化又は機能）を調節するタンパク質を指す。免疫モジュレーターは、免疫細胞活性化若しくは機能を正に調節し得、又は免疫細胞活性化若しくは機能を負に調節し得る。このような免疫モジュレーターは当技術分野において公知であり、それとしては、免疫チェックポイントタンパク質、サイトカインなどが挙げられる。

【0258】

具体的な実施形態によれば、免疫モジュレーターは、免疫アクチベーターである。

【0259】

他の具体的な実施形態によれば、免疫モジュレーターは、免疫サプレッサー又はインヒビターである。

【0260】

Ｉ型膜タンパク質免疫モジュレーターの非限定的な例としては、限定されるものではないが、ＰＤ１、ＳＩＲＰα、ＣＤ２８、ＣＳＦ１Ｒ、ＩＬ－８、ＩＬ－１０、ＣＴＬＡ４、ＩＣＯＳ、ＣＤ２７、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＳＩＧＬＥＣ１０及びＴＩＧＩＴが挙げられる。

【0261】

本明細書において使用される場合、語句「ＩＩ型膜タンパク質」は、Ｃ末端細胞外ドメインを有する膜貫通タンパク質を指す。

【0262】

本発明の具体的な実施形態で使用することができるこのようなＩＩ型膜タンパク質の非限定的な例としては、４－１ＢＢＬ、ＦａｓＬ、ＴＲＡＩＬ、ＴＮＦ－アルファ、ＴＮＦ－ベータ、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ２７Ｌ、ＣＤ３０Ｌ、ＲＡＮＫＬ、ＴＷＥＡＫ、ＡＰＲＩＬ、ＢＡＦＦ、ＬＩＧＨＴ、ＶＥＧＩ、ＧＩＴＲＬ、ＥＤＡｌ／２、リンホトキシンアルファ及びリンホトキシンベータが挙げられる。

【0263】

具体的な実施形態によれば、ＩＩ型膜タンパク質は、４－１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ４０Ｌ、ＬＩＧＨＴ及びＧＩＴＲＬからなる群より選択される。

【0264】

具体的な実施形態によれば、ＩＩ型膜タンパク質は、免疫モジュレーターである。

【0265】

このような免疫モジュレーターとしては、限定されるものではないが、４－１ＢＢＬ、ＴＮＦ－アルファ、ＴＮＦ－ベータ、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ２７Ｌ及びＣＤ３０Ｌが挙げられる。

【0266】

本明細書において使用される場合、用語「免疫チェックポイントタンパク質」は、免疫細胞活性化又は機能を調節するタンパク質を指す。免疫チェックポイントタンパク質は、共刺激タンパク質（すなわち、免疫細胞の活性化をもたらす刺激シグナルを伝達する）又は阻害タンパク質（すなわち、免疫細胞の活性抑制をもたらす阻害シグナルを伝達する）のいずれかであり得る。一部の実施形態によれば、免疫チェックポイントタンパク質は、Ｔ細胞の活性化又は機能を調節する。多数のチェックポイントタンパク質は当技術分野において公知であり、それとしては、限定されるものではないが、ＰＤ１、ＰＤＬ－１、Ｂ７Ｈ２、Ｂ７Ｈ４、ＣＴＬＡ－４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＬＡＧ－３、ＴＩＭ－３、ＫＩＲ、ＩＤＯ、ＣＤ１９、ＯＸ４０、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＣＤ２７、ＣＤ７０、ＣＤ４０、ＧＩＴＲ、ＣＤ２８及びＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）が挙げられる。

【0267】

具体的な実施形態によれば、ヘテロ二量体の第１の単量体は、本明細書に開示されるＬＩＬＲＢ（例えば、ＬＩＬＲＢ２、ＬＩＬＲＢ１）ポリペプチドを含み、第２の単量体は、ＳＩＲＰα、ＰＤ１、ＴＩＧＩＴ及びＳＩＧＬＥＣ１０からなる群より選択されるタンパク質のアミノ酸配列を含み、アミノ酸配列は、その天然結合ペアに結合し得る。

【0268】

具体的な実施形態によれば、ヘテロ二量体の第１の単量体は、本明細書に開示されるＬＩＬＲＢ（例えば、ＬＩＬＲＢ２、ＬＩＬＲＢ１）ポリペプチドを含み、第２の単量体は、ＳＩＲＰαのアミノ酸配列を含み、アミノ酸配列は、ＣＤ４７に結合し得る。

【0269】

本発明の具体的な実施形態で使用することができるＬＩＬＲＢ２及びＳＩＲＰαのヘテロ二量体の配列の非限定的な例は、以下の表３に記載される。

【0270】

「ＳＩＲＰα（シグナル調節タンパク質アルファ、ＣＤ１７２ａとしても公知）」は、ＳＩＲＰＡ遺伝子（遺伝子ＩＤ１４０８８５）によりコードされるポリペプチドを指す。具体的な実施形態によれば、ＳＩＲＰαは、ヒトＳＩＲＰαである。具体的な実施形態によれば、ＳＩＲＰαは、例えば、以下のＧｅｎＢａｎｋ番号ＮＰ＿００１０３５１１１、ＮＰ＿００１０３５１１２、ＮＰ＿００１３１７６５７又はＮＰ＿５４２９７０で提供されるヒトＳＩＲＰαを指す。

【0271】

ＳＩＲＰαの公知の結合ペアは、ＣＤ４７である。具体的な実施形態によれば、ＣＤ４７タンパク質は、例えば、以下のＧｅｎＢａｎｋ番号ＮＰ＿００１７６８又はＮＰ＿９４２０８８で提供されるヒトタンパク質を指す。

【0272】

本明細書において使用される場合、用語「ＳＩＲＰαポリペプチド」は、全長ＳＩＲＰα、少なくともＣＤ４７に結合する能力を維持するその機能的断片又はそのホモログを指す。例えば、具体的な実施形態によれば、ＳＩＲＰαのアミノ酸配列は、さらに前述及び後述される置換、付加及び欠失突然変異を含む。

【0273】

具体的な実施形態によれば、ＳＩＲＰαポリペプチドは、ＳＩＲＰαの細胞外ドメイン又はＣＤ４７に結合し得るその機能的断片を含む。

【0274】

具体的な実施形態によれば、ＳＩＲＰαポリペプチドは、配列番号２７又はＣＤ４７に結合し得るその機能的断片を含む。

【0275】

具体的な実施形態によれば、ＳＩＲＰαポリペプチドは、配列番号２７を含む。

【0276】

具体的な実施形態によれば、ＳＩＲＰαポリペプチドは、配列番号２７からなる。

【0277】

具体的な実施形態によれば、ＳＩＲＰαポリペプチドは、配列番号８８又はＣＤ４７に結合し得るその機能的断片を含む。

【0278】

具体的な実施形態によれば、ＳＩＲＰαポリペプチドは、配列番号８８を含む。

【0279】

具体的な実施形態によれば、ＳＩＲＰαポリペプチドは、配列番号８８からなる。

【0280】

用語「ＳＩＲＰαポリペプチド」は、所望の活性（すなわち、ＣＤ４７への結合）を示す機能的ホモログも包含する。このようなホモログは、例えば、本明細書に記載されるＳＩＲＰα配列（例えば、配列番号２７、８８）と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％若しくは１００％同一若しくは相同であり得、又はそれをコードするポリヌクレオチド配列（以下にさらに記載される）と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％若しくは１００％同一であり得る。

【0281】

具体的な実施形態によれば、ＳＩＲＰαアミノ酸配列は、配列番号２７又は８８と少なくとも９０％同一である。

【0282】

具体的な実施形態によれば、ＳＩＲＰαポリペプチドは、保存的及び非保存的アミノ酸置換（保存的及び非保存的置換に関する詳細な説明は以下に提供される）を含み得る。このような置換の非限定的な例は当技術分野において公知であり、例えば、内容が完全に参照により本明細書に組み込まれるWeiskopf K et al. Science. (2013), 341 (6141):88-91に開示されている。

【0283】

具体的な実施形態によれば、ＳＩＲＰαポリペプチドは、１００～５０４、１００～５００アミノ酸、１５０～４５０アミノ酸、２００～４００アミノ酸、２５０～４００アミノ酸、３００～４００アミノ酸、３２０～４２０アミノ酸、３４０～３５０アミノ酸、３００～４００アミノ酸、３４０～４５０アミノ酸、１００～２００アミノ酸、１００～１５０アミノ酸、１００～１２５アミノ酸、１００～１２０アミノ酸、１００～１１９アミノ酸、１０５～１１９アミノ酸、１１０～１１９アミノ酸、１１５～１１９アミノ酸、１０５～１１８アミノ酸、１１０～１１８アミノ酸、１１５～１１８アミノ酸、１０５～１１７アミノ酸、１１０～１１７アミノ酸、１１５～１１７アミノ酸を含み、各可能性は本発明の別個の実施形態を表す。

【0284】

具体的な実施形態によれば、ヘテロ二量体の第１の単量体は、配列番号５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１及び２３からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＬＩＬＲＢ２ポリペプチドを含み、第２の単量体は、ＳＩＲＰαのアミノ酸配列を含み、アミノ酸配列は、配列番号２７又は８８と少なくとも少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0285】

具体的な実施形態によれば、ヘテロ二量体の第１の単量体は、配列番号５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１及び２３からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むＬＩＬＲＢ２ポリペプチドを含み、第２の単量体は、ＳＩＲＰαのアミノ酸配列を含み、アミノ酸配列は、配列番号２７又は８８を含む。

【0286】

具体的な実施形態によれば、ヘテロ二量体の第１の単量体は、配列番号３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５及び５７からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ヘテロ二量体の第２の単量体は、配列番号３５、９０、９４、及び９８と少なくとも少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0287】

具体的な実施形態によれば、ヘテロ二量体の第１の単量体は、配列番号３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５及び５７からなる群より選択されるアミノ酸配列を含み、ヘテロ二量体の第２の単量体は、配列番号３５を含む。

【0288】

具体的な実施形態によれば、ヘテロ二量体の第１の単量体は、配列番号３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５又は５７に示すものであり、ヘテロ二量体の第２の単量体は、配列番号３５、９０、９４又は９８に示すものである。

【0289】

具体的な実施形態によれば、本明細書に開示されるＬＩＬＲＢ（例えば、ＬＩＬＲＢ２、ＬＩＬＲＢ１）ポリペプチドと、ＳＩＲＰαのアミノ酸配列とを含むヘテロ二量体は、例えば、癌細胞の食作用を誘導し、又は向上させ得る。

【0290】

具体的な実施形態によれば、本明細書に開示されるＬＩＬＲＢ（例えば、ＬＩＬＲＢ２、ＬＩＬＲＢ１）ポリペプチドと、ＳＩＲＰαのアミノ酸配列とを含むヘテロ二量体は、腫瘍促進Ｍ２マクロファージの誘導を妨害し、又は低減させ、腫瘍抑制Ｍ１マクロファージの誘導をもたらし得る。

【0291】

具体的な実施形態によれば、本明細書に開示されるＬＩＬＲＢ（例えば、ＬＩＬＲＢ２、ＬＩＬＲＢ１）ポリペプチドと、ＳＩＲＰαのアミノ酸配列とを含むヘテロ二量体は、Ｍ０（Ｍ２様）マクロファージをＭ１マクロファージに変換し得る。

【0292】

具体的な実施形態によれば、本明細書に開示されるＬＩＬＲＢ（例えば、ＬＩＬＲＢ２、ＬＩＬＲＢ１）ポリペプチドと、ＳＩＲＰαのアミノ酸配列とを含むヘテロ二量体は、例えば、フローサイトメトリー分析により決定されるとおり、ＣＤ４７及びＨＬＡ－Ｇの両方を発現する細胞に結合し、ＣＤ４７及びＨＬＡ－Ｇの一方のみを発現する細胞に有意に結合しない。

【0293】

具体的な実施形態によれば、本明細書に開示されるＬＩＬＲＢ（例えば、ＬＩＬＲＢ２、ＬＩＬＲＢ１）ポリペプチドと、ＳＩＲＰαのアミノ酸配列とを含むヘテロ二量体は、フローサイトメトリー分析により決定されるとおり、赤血球（ＲＢＣ）に有意に結合しない。

【0294】

具体的な実施形態によれば、ＬＩＬＲＢ（例えば、ＬＩＬＲＢ２、ＬＩＬＲＢ１）ポリペプチド又はそれを含む組成物、融合物若しくは二量体は、異種治療部分に結合している、又はそれを含む。治療部分は、小分子化合物及びポリペプチドを含む任意の分子であり得る。

【0295】

本発明の具体的な実施形態で使用することができる治療部分の非限定的な例としては、細胞傷害性部分、毒性部分、サイトカイン部分、免疫調節部分（例えば、上記にさらに記載される免疫チェックポイント部分、サイトカイン）、ポリペプチド、抗体、薬物、化学物質及び／又は放射性同位体が挙げられる。

【0296】

本発明の一部の実施形態によれば、治療部分は、本発明の一部の実施形態のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、治療部分をコードする核酸配列と翻訳により融合させることによりコンジュゲートされる。

【0297】

追加的に又は代替的に、治療部分は、当業者に公知の任意のコンジュゲーション法を使用して本発明の一部の実施形態のＬＩＬＲＢ（例えば、ＬＩＬＲＢ２、ＬＩＬＲＢ１）ポリペプチド又はそれを含む組成物、融合物若しくは二量体に化学的にコンジュゲート（カップリング）させることができる。例えば、ペプチドは、３－（２－ピリジルジチオ）プロピオン酸Ｎヒドロキシスクシンイミドエステル（Ｎ－スクシンイミジル３－（２ピリジルジチオ）プロピオネートとも呼ばれる）（「ＳＤＰＤ」）（Ｓｉｇｍａ社製、カタログ番号Ｐ－３４１５、例えば、Cumber et al. 1985, Methods of Enzymology 112:207-224を参照のこと）、グルタルアルデヒドコンジュゲーション手順（例えば、Bioconjugate Techniques,Academic Press, San Diego内のG.T. Hermanson 1996, “Antibody Modification and Conjugationを参照のこと）又はカルボジイミドコンジュゲーション手順［例えば、J. March, Advanced Organic Chemistry: Reaction’s, Mechanism, and Structure, pp.349-50 & 372-74 (3d ed.), 1985、B. Neises et al. 1978, Angew Chem., Int. Ed. Engl. 17:522、A. Hassner et al. 1978, Tetrahedron Lett. 4475、E.P.Boden et al. 1986, J. Org. Chem. 50:2394及びL.J. Mathias 1979, Synthesis 561を参照のこと］を使用して目的の薬剤にコンジュゲートさせることができる。

【0298】

治療部分は、当技術分野において広く実践される標準的な化学合成技術［例えば、ｈｙｐｅｒｔｅｘｔｔｒａｎｓｆｅｒｐｒｏｔｏｃｏｌ：／／ｗｏｒｌｄｗｉｄｅｗｅｂ（ｄｏｔ）ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（ｄｏｔ）ｏｒｇ／ｐｏｒｔａｌ／Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）を参照のこと］を使用して、例えば、ペプチド結合（機能的部分がポリペプチドである場合）を介する、又は介在リンカーエレメント、例えば、リンカーペプチド又は他の化学部分、例えば、有機ポリマーへの共有結合を介する直接的又は間接的な任意の好適な化学結合を使用して、例えば、本発明の一部の実施形態のＬＩＬＲＢ（例えば、ＬＩＬＲＢ２、ＬＩＬＲＢ１）ポリペプチド又はそれを含む組成物、融合物若しくは二量体に結合させることができる。キメラペプチドは、ペプチドのカルボキシ（Ｃ）若しくはアミノ（Ｎ）末端における結合を介して、又は内部化学基、例えば、直鎖、分枝鎖若しくは環状側鎖、内部炭素若しくは窒素原子への結合などを介して結合させることができる。

【0299】

具体的な実施形態によれば、ＬＩＬＲＢ（例えば、ＬＩＬＲＢ２、ＬＩＬＲＢ１）ポリペプチド又はそれを含む組成物、融合物若しくは二量体は、検出可能タグを含む。本明細書において使用される場合、一実施形態において、用語「検出可能タグ」は、実務者により当技術分野において公知の技術を使用して検出することができる任意の部分を指す。検出可能タグは、ペプチド配列であり得る。任意選択で、検出可能タグは、化学物質により、又は酵素的手段、例えば、タンパク質分解により除去可能であり得る。本発明の一部の実施形態の検出可能タグは、ポリペプチド、組成物、融合物又は二量体の精製に使用することができる。例えば、用語「検出可能タグ」には、キチン結合タンパク質（ＣＢＰ）－タグ、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）－タグ、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）－タグ、ポリ（Ｈｉｓ）－タグ、ＦＬＡＧタグ、エピトープタグ、例えば、Ｖ５－タグ、ｃ－ｍｙｃ－タグ、及びＨＡ－タグ、及び蛍光タグ、例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）、及びシアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、並びにそれらのタグの誘導体、又は当技術分野において公知の任意のタグが含まれる。用語「検出可能タグ」には、用語「検出可能マーカー」も含まれる。

【0300】

具体的な実施形態によれば、ＬＩＬＲＢ（例えば、ＬＩＬＲＢ２、ＬＩＬＲＢ１）ポリペプチド又はそれを含む組成物、融合物若しくは二量体は、開裂可能部分を含む。したがって、例えば、回収を容易にするため、発現されるコード配列は、本発明の一部の実施形態のポリペプチド及び融合される開裂可能部分をコードするように工学操作することができる。一実施形態において、ポリペプチドは、それが親和性クロマトグラフィーにより、例えば、開裂可能部分に特異的なカラム上の固定化により容易に単離されるように設計される。一実施形態において、開裂部位はポリペプチド及び開裂可能部分間で工学操作され、ペプチドはクロマトグラフィーカラムから、融合タンパク質をこの部位で特異的に開裂させる適切な酵素又は薬剤での処理により放出させることができる［例えば、Booth et al., Immunol. Lett. 19:65-70 (1988)、及びGardella et al., J. Biol. Chem. 265:15854-15859 (1990)を参照のこと］。

【0301】

具体的な実施形態によれば、本明細書に開示される組成物、融合物又は二量体中の部分の各々は、部分間を、例えば、ポリペプチド（例えば、ＬＩＬＲＢ、ＬＩＬＲＢ２、ＬＩＬＲＢ１、ＳＩＲＰα）と二量体化部分とを分離するリンカーを含み得る。

【0302】

他の具体的な実施形態によれば、本明細書に開示される組成物、融合物又は二量体は、ポリペプチド（例えば、ＬＩＬＲＢ、ＬＩＬＲＢ２、ＬＩＬＲＢ１、ＳＩＲＰα）及び二量体化部分間のリンカーを含まない。

【0303】

当技術分野において公知の任意のリンカーを、本発明の具体的な実施形態で使用することができる。

【0304】

具体的な実施形態によれば、リンカーは、天然存在のマルチドメインタンパク質に由来し得、又は例えば、内容全体が参照により本明細書に組み込まれるChichili et al., (2013), Protein Sci. 22(2):153-167、Chen et al, (2013), Adv Drug Deliv Rev. 65 (10):1357-1369に記載の実験的リンカーである。一部の実施形態において、リンカーは、リンカー設計データベース及びコンピュータプログラム、例えば、内容全体が参照により本明細書に組み込まれるChen et al., (2013), Adv Drug Deliv Rev. 65 (10):1357-1369及びCrasto et al., (2000), Protein Eng. 13 (5):309-312に記載のものを使用して設計することができる。

【0305】

具体的な実施形態によれば、リンカーは、合成リンカー、例えば、ＰＥＧである。

【0306】

具体的な実施形態によれば、リンカーは、機能的であり得る。例えば、限定されるものではないが、リンカーは、組成物のフォールディング及び／若しくは安定性を改善し、発現を改善し、薬物動態を改善し、並びに／又は生物活性を改善するように機能し得る。別の例において、リンカーは、組成物を特定の細胞タイプ又は局在に標的化させるように機能し得る。

【0307】

具体的な実施形態によれば、リンカーは、ポリペプチドである。

【0308】

ポリペプチドリンカーの非限定的な例としては、配列ＬＥ、ＧＧＧＧＳ（配列番号６９）、（ＧＧＧＧＳ）_ｎ（ｎ＝１～４）（配列番号７０）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号７１）、（ＧＧＧＧＳ）×２（配列番号３３）、（ＧＧＧＧＳ）×２＋ＧＧＧＧ（配列番号７２）、（ＧＧＧＧＳ）×３（配列番号７３）、（ＧＧＧＧＳ）×４（配列番号７４）、（Ｇｌｙ）_８（配列番号７５）、（Ｇｌｙ）_６（配列番号７６）、（ＥＡＡＡＫ）_ｎ（ｎ＝１～３）（配列番号７７）、Ａ（ＥＡＡＡＫ）_ｎＡ（ｎ＝２～５）（配列番号７８）、ＡＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＡ（配列番号７９）、Ａ（ＥＡＡＡＫ）_４ＡＬＥＡ（ＥＡＡＡＫ）４Ａ（配列番号８０）、ＰＡＰＡＰ（配列番号８１）、ＫＥＳＧＳＶＳＳＥＱＬＡＱＦＲＳＬＤ（配列番号８２）、ＥＧＫＳＳＧＳＧＳＥＳＫＳＴ（配列番号８３）、ＧＳＡＧＳＡＡＧＳＧＥＦ（配列番号８４）、及び（ＸＰ）_ｎ（Ｘは任意のアミノ酸、例えば、Ａｌａ、Ｌｙｓ、又はＧｌｕを指定する）を有するリンカーが挙げられる。

【0309】

具体的な実施形態によれば、リンカーは、（ＧＧＧＧＳ）×２（配列番号３３）である。

【0310】

具体的な実施形態によれば、リンカーは、１～６アミノ酸の長さのものである。

【0311】

具体的な実施形態によれば、リンカーは、（ＧＧＧＧＳ）×３（配列番号７３）である。

【0312】

具体的な実施形態によれば、リンカーは、１～６アミノ酸の長さのものである。

【0313】

具体的な実施形態によれば、リンカーは、実質的に、グリシン及び／又はセリン残基（例えば、約３０％、又は約４０％、又は約５０％、又は約６０％、又は約７０％、又は約８０％、又は約９０％、又は約９５％、又は約９７％又は１００％のグリシン及びセリン）から構成される。

【0314】

具体的な実施形態によれば、リンカーは、単一アミノ酸リンカーである。

【0315】

本発明の一部の実施形態において、１つのアミノ酸は、グリシンである。

【0316】

具体的な実施形態によれば、本明細書に開示される組成物［例えば、ＬＩＬＲＢ（例えば、ＬＩＬＲＢ２、ＬＩＬＲＢ１）ポリペプチド、それを含む組成物、融合物及び二量体］は、可溶性である（すなわち、合成又は天然存在の表面に固定化されない）。

【0317】

具体的な実施形態によれば、本明細書に開示される組成物［例えば、ＬＩＬＲＢ（例えば、ＬＩＬＲＢ２、ＬＩＬＲＢ１）ポリペプチド、それを含む組成物、融合物及び二量体］は、合成又は天然存在の表面に固定化される。

【0318】

本明細書に開示される組成物［例えば、ＬＩＬＲＢ（例えば、ＬＩＬＲＢ２、ＬＩＬＲＢ１）ポリペプチド、それを含む組成物、融合物及び二量体、それをコードするポリヌクレオチド又はそれを発現する宿主細胞］はＬＩＬＲＢ（例えば、ＬＩＬＲＢ２、ＬＩＬＲＢ１）ポリペプチドを含むため、それらはインビトロ、エクスビボ及び／又はインビボで免疫細胞を活性化させる方法において使用することができる。

【0319】

したがって、本発明の一態様によれば、免疫細胞を活性化させる方法であって、免疫細胞をＬＩＬＲＢ（例えば、ＬＩＬＲＢ２、ＬＩＬＲＢ１）ポリペプチド、それを含む組成物、融合ポリペプチド若しくは二量体、それをコードするポリヌクレオチド、又はそれを発現する宿主細胞の存在下、インビトロで活性化させることを含む方法が提供される。

【0320】

本明細書において使用される場合、用語「末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）」は、単一の核を有する血球を指し、それには、リンパ球、単球及び樹状細胞（ＤＣ）が含まれる。

【0321】

具体的な実施形態によれば、ＰＢＭＣは、樹状細胞（ＤＣ）、マクロファージ、多形核細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞及びＮＫＴ細胞からなる群より選択される。

【0322】

ＰＢＭＣを得る方法は当技術分野において周知であり、例えば、対象からの全血採血及び抗凝固剤（例えば、ヘパリン又はクエン酸塩）を含有する容器中での収集、及びアフェレーシスである。続いて、具体的な実施形態によれば、少なくとも１つのタイプのＰＢＭＣを末梢血から精製する。全血からＰＢＭＣを精製するための当業者に公知のいくつかの方法及び試薬、例えば、白血球アフェレーシス、沈降、密度勾配遠心（例えば、フィコール）、遠心エルトリエーション、分画、例えば、赤血球の化学的溶解（例えば、ＡＣＫによる）、細胞表面マーカーを使用する（例えば、ＦＡＣＳソーター若しくは磁気細胞分離技術、例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、Ｃｅｌｌｐｒｏ社、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍａｇｎｅｔｉｃｓ社、若しくはＭｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社などから市販されているものを使用する）特異的細胞タイプの選択、並びに特異的抗体での根絶（例えば、殺傷）などの方法による、又は陰性選択に基づく親和性ベース精製（例えば、磁気細胞分離技術、ＦＡＣＳソーター及び／又は捕捉ＥＬＩＳＡ標識を使用する）による特異的細胞タイプの枯渇が存在する。このような方法は、例えば、THE HANDBOOK OF EXPERIMENTAL IMMUNOLOGY、第１巻～第４巻（D.N. Weir編）及びFLOW CYTOMETRY AND CELL SORTING（A. Radbruch編、Springer Verlag, 200）に記載されている。

【0323】

具体的な実施形態によれば、免疫細胞は、腫瘍浸潤リンパ球を含む。

【0324】

本明細書において使用される場合、用語「腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）は、血流を出て腫瘍中に遊走した単核白血球細胞を指す。

【0325】

具体的な実施形態によれば、ＴＩＬは、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞及び単球からなる群より選択される。

【0326】

ＴＩＬを得る方法は当技術分野において周知であり、例えば、対象から例えば、生検又は剖検により腫瘍サンプルを得ること及びその単一細胞懸濁液を調製することである。単一細胞懸濁液は、任意の好適な様式で、例えば、機械的に（例えば、ＧｅｎｔｌｅＭＡＣＳ（商標）ディソシエーター、カリフォルニア、オーバーン、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社製を使用して腫瘍を脱凝集させる）又は酵素的に（例えば、コラゲナーゼ若しくはＤＮアーゼ）得ることができる。続いて、少なくとも１つのタイプのＴＩＬを細胞懸濁液から精製することができる。所望のタイプのＴＩＬを精製するための当業者に公知のいくつかの方法及び試薬、例えば、細胞表面マーカーを使用する（例えば、ＦＡＣＳソーター若しくは磁気細胞分離技術、例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、Ｃｅｌｌｐｒｏ社、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍａｇｎｅｔｉｃｓ社、若しくはＭｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社などから市販されているものを使用する）特異的細胞タイプの選択、並びに特異的抗体での根絶（例えば、殺傷）などの方法による、又は陰性選択に基づく親和性ベース精製（例えば、磁気細胞分離技術、ＦＡＣＳソーター及び／又は捕捉ＥＬＩＳＡ標識を使用する）による特異的細胞タイプの枯渇が存在する。このような方法は、例えば、THE HANDBOOK OF EXPERIMENTAL IMMUNOLOGY、第１巻～第４巻（D.N. Weir編）及びFLOW CYTOMETRY AND CELL SORTING（A. Radbruch編、Springer Verlag, 200）に記載されている。

【0327】

具体的な実施形態によれば、免疫細胞は、食作用細胞を含む。

【0328】

本明細書において使用される場合、用語「食作用細胞」は、食作用し得る細胞を指し、それには、プロフェッショナル及び非プロフェッショナル食作用細胞の両方が含まれる。食作用を分析する方法は当技術分野において周知であり、それとしては、例えば、キリングアッセイ、フローサイトメトリー及び／又は顕微鏡的評価（生細胞イメージング、蛍光顕微鏡法、共焦点顕微鏡法、電子顕微鏡法）が挙げられる。具体的な実施形態によれば、食作用細胞は、単球、樹状細胞（ＤＣ）及び顆粒球からなる群より選択される。

【0329】

具体的な実施形態によれば、食細胞は、顆粒球を含む。

【0330】

具体的な実施形態によれば、食細胞は、単球を含む。

【0331】

具体的な実施形態によれば、免疫細胞は、単球を含む。

【0332】

具体的な実施形態によれば、用語「単球」は、循環単球及び組織中に存在するマクロファージ（単核食細胞とも称される）の両方を指す。

【0333】

具体的な実施形態によれば、単球は、マクロファージを含む。典型的には、マクロファージの細胞表面表現型としては、ＣＤ１４、ＣＤ４０、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ６４、Ｆ４／８０（マウス）／ＥＭＲ１（ヒト）、リゾチームＭ、ＭＡＣ－１／ＭＡＣ－３及びＣＤ６８が挙げられる。

【0334】

具体的な実施形態によれば、単球は、循環単球を含む。典型的には、循環単球の細胞表面表現型としては、ＣＤ１４及びＣＤ１６（例えば、ＣＤ１４＋＋ＣＤ１６－、ＣＤ１４＋ＣＤ１６＋＋、ＣＤ１４＋＋ＣＤ１６＋）が挙げられる。

【0335】

具体的な実施形態によれば、免疫細胞は、ＤＣを含む。

【0336】

本明細書において使用される場合、用語「樹状細胞（ＤＣ）」は、リンパ又は非リンパ組織中に見出される形態学的に類似の細胞タイプの多様な集団の任意のメンバーを指す。ＤＣは、プロフェッショナル抗原提示細胞のクラスであり、ＨＬＡ拘束性Ｔ細胞を感作する能力が高い。ＤＣとしては、例えば、形質細胞様樹状細胞、骨髄樹状細胞（未成熟及び成熟樹状細胞を含む）、ランゲルハンス細胞、指状嵌入細胞、濾胞樹状細胞が挙げられる。樹状細胞は、機能により、又は表現型により、特に細胞表面表現型により認識することができる。これらの細胞は、細胞表面上のベール様突起を有するそれらの区別される形態、中程度から高レベルの表面ＨＬＡクラスＩＩ発現及び抗原をＴ細胞に、特にナイーブＴ細胞に提示する能力により特徴付けられる（Steinman R,et al., Ann. Rev. Immunol. 1991, 9:271-196を参照のこと）。典型的には、ＤＣの細胞表面表現型としては、ＣＤｌａ＋、ＣＤ４＋、ＣＤ８６＋、又はＨＬＡ－ＤＲが挙げられる。ＤＣという用語は、未成熟及び成熟ＤＣの両方を包含する。

【0337】

具体的な実施形態によれば、免疫細胞は、顆粒球を含む。

【0338】

本明細書において使用される場合、用語「顆粒球」は、細胞質中の顆粒の存在により特徴付けられる多形核白血球を指す。

【0339】

具体的な実施形態によれば、顆粒球は、好中球を含む。

【0340】

具体的な実施形態によれば、顆粒球は、肥満細胞を含む。

【0341】

具体的な実施形態によれば、免疫細胞は、Ｔ細胞を含む。

【0342】

本明細書において使用される場合、用語「Ｔ細胞」は、ＣＤ３＋、ＣＤ４＋又はＣＤ８＋表現型のいずれかを有するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）＋を有する分化リンパ球を指す。Ｔ細胞は、エフェクター又は制御性Ｔ細胞のいずれかであり得る。

【0343】

本明細書において使用される場合、用語「エフェクターＴ細胞」は、他の免疫細胞を例えば、サイトカインの産生により活性化させ、若しくは指向し、又は細胞傷害活性を有するＴ細胞、例えば、ＣＤ４＋、Ｔｈ１／Ｔｈ２、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球を指す。

【0344】

本明細書において使用される場合、用語「制御性Ｔ細胞」は「Ｔｒｅｇ」は、エフェクターＴ細胞を含む他のＴ細胞、及び自然免疫系細胞の活性化を負に調節するＴ細胞を指す。Ｔｒｅｇ細胞は、エフェクターＴ細胞応答の持続的抑制により特徴付けられる。具体的な実施形態によれば、Ｔｒｅｇは、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔ細胞である。

【0345】

具体的な実施形態によれば、Ｔ細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞である。

【0346】

他の具体的な実施形態によれば、Ｔ細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞である。

【0347】

具体的な実施形態によれば、Ｔ細胞は、メモリーＴ細胞である。メモリーＴ細胞の非限定的な例としては、ＣＤ３＋／ＣＤ４＋／ＣＤ４５ＲＡ－／ＣＣＲ７－表現型を有するエフェクターメモリーＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ３＋／ＣＤ４＋／ＣＤ４５ＲＡ－／ＣＣＲ７＋表現型を有するセントラルメモリーＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ３＋／ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＡ－／ＣＣＲ７－表現型を有するエフェクターメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞及びＣＤ３＋／ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＡ－／ＣＣＲ７＋表現型を有するセントラルメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞が挙げられる。

【0348】

具体的な実施形態によれば、Ｔ細胞は、目的の発現産物をコードする核酸配列で形質導入された工学操作Ｔ細胞を含む。

【0349】

具体的な実施形態によれば、目的の発現産物は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）又はキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である。

【0350】

本明細書において使用される場合、語句「ＴＣＲをコードする核酸配列で形質導入された」又は「ＴＣＲをコードする核酸配列で形質導入すること」は、ＭＨＣの状況下で提示される所望の抗原に対する特異性を有するＴ細胞からの可変α及びβ鎖のクローニングを指す。ＴＣＲで形質導入する方法は当技術分野において公知であり、例えば、Nicholson et al. Adv Hematol.2012, 2012:404081、Wang and Riviere Cancer Gene Ther. 2015 Mar, 22(2):85-94)、及びLamers et al, Cancer Gene Therapy (2002) 9,613-623に開示されている。

【0351】

本明細書において使用される場合、語句「ＣＡＲをコードする核酸配列で形質導入された」又は「ＣＡＲをコードする核酸配列で形質導入すること」は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸配列のクローニングを指し、ＣＡＲは、抗原認識部分及びＴ細胞活性化部分を含む。キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、Ｔ細胞シグナリング又はＴ細胞活性化ドメインに結合している抗体の抗原結合ドメイン（例えば、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ））を含有する人工的に構築されたハイブリッドタンパク質又はポリペプチドである。ＣＡＲで形質導入する方法は当技術分野において公知であり、例えば、Davila et al. Oncoimmunology. 2012 Dec 1, 1(9): 1577-1583、Wang and Riviere Cancer Gene Ther. 2015 Mar, 22 (2): 85-94)、Maus et al. Blood. 2014 Apr 24, 123 (17): 2625-35、Porter DL The New England journal of medicine. 2011, 365 (8):725-733、Jackson HJ, Nat Rev Clin Oncol. 2016, 13 (6):370-383、及びGloberson-Levin et al. Mol Ther. 2014, 22 (5):1029-1038に開示されている。

【0352】

具体的な実施形態によれば、免疫細胞は、Ｂ細胞を含む。

【0353】

本明細書において使用される場合、用語「Ｂ細胞」は、Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）＋、ＣＤ１９＋及び又はＢ２２０＋表現型を有するリンパ球を指す。Ｂ細胞は、特異的抗原に結合し、体液性応答を誘発するそれらの能力により特徴付けられる。

【0354】

具体的な実施形態によれば、免疫細胞は、ＮＫ細胞を含む。

【0355】

本明細書において使用される場合、用語「ＮＫ細胞」は、ＣＤ１６＋ＣＤ５６＋及び／又はＣＤ５７＋ＴＣＲ－表現型を有する分化リンパ球を指す。ＮＫは、「自己」ＭＨＣ／ＨＬＡ抗原を発現し得ない細胞に結合し、それを特異的細胞溶解酵素の活性化により殺傷するそれらの能力、ＮＫ活性化受容体についてのリガンドを発現する腫瘍細胞又は他の疾患細胞を殺傷する能力、及び免疫応答を刺激又は阻害するサイトカインと呼ばれるタンパク質分子を放出させる能力により特徴付けられる。

【0356】

具体的な実施形態によれば、免疫細胞は、ＮＫＴ細胞を含む。

【0357】

本明細書において使用される場合、用語「ＮＫＴ細胞」は、セミインバリアントαβＴ細胞受容体を発現するが、典型的にはＮＫ細胞、例えば、ＮＫ１．１と関連する種々の分子マーカーも発現するＴ細胞の特殊化集団を指す。ＮＫＴ細胞としては、ＮＫ１．１＋及びＮＫ１．１－、並びにＣＤ４＋、ＣＤ４－、ＣＤ８＋及びＣＤ８－細胞が挙げられる。ＮＫＴ細胞上のＴＣＲは、それがＭＨＣＩ様分子ＣＤ１ｄにより提示される糖脂質抗原を認識するという点でユニークである。ＮＫＴ細胞は、炎症又は免疫寛容のいずれかを促進するサイトカインを産生するそれらの能力に起因して保護又は有害効果のいずれかを有し得る。

【0358】

具体的な実施形態によれば、免疫細胞は、健常対象から得られる。

【0359】

具体的な実施形態によれば、免疫細胞は、病変（例えば、癌）に罹患している対象から得られる。

【0360】

具体的な実施形態によれば、活性化は、ＨＬＡ－Ｇを発現する細胞の存在下で行う。

【0361】

具体的な実施形態によれば、ＨＬＡ－Ｇを発現する細胞は、病変（疾患）細胞、例えば、癌細胞を含む。

【0362】

具体的な実施形態によれば、活性化は、細胞増殖、成熟、サイトカイン産生、食作用及び／又は免疫細胞の調節若しくはエフェクター機能の誘導をもたらす少なくとも一次活性化シグナル［例えば、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）と、抗原提示細胞（ＡＰＣ）上の主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）／ペプチド複合体とのライゲーション］を伝達し得る刺激作用物質の存在下で行う。具体的な実施形態によれば、刺激作用物質は、二次共刺激シグナルも伝達し得る。

【0363】

刺激作用物質は、免疫細胞を抗原依存的又は非依存的（すなわち、ポリクローナル）様式で活性化させ得る。

【0364】

刺激作用物質の量及び刺激作用物質と免疫細胞との比を決定する方法は当業者の技能の十分範囲内であり、したがって本明細書に規定されない。

【0365】

具体的な実施形態によれば、免疫細胞は、活性化後に精製される。

【0366】

したがって、本発明はまた、本発明の方法に従って得られる単離免疫細胞を企図する。

【0367】

具体的な実施形態によれば、本発明に従って使用される、及び／又は得られた免疫細胞は、新鮮単離し、貯蔵し、例えば、任意の段階で、例えば、液体窒素温度で将来的な使用のために長期間（例えば、数か月間、数年間）凍結保存（すなわち、冷凍）することができ、細胞系であり得る。

【0368】

凍結保存の方法は一般に当業者により知られており、例えば、国際公開第２００７０５４１６０号パンフレット及び国際公開第２００１０３９５９４号パンフレット並びに米国特許出願公開第２０１２０１４９１０８号明細書に開示されている。

【0369】

具体的な実施形態によれば、本発明に従って得られた細胞は、細胞バンク又は寄託機関又は貯蔵施設中で貯蔵することができる。

【0370】

結果的に、本教示は、限定されるものではないが、養子免疫細胞療法のための資源としての、本発明の単離免疫細胞の使用及び方法をさらに示唆する。

【0371】

したがって、具体的な実施形態によれば、本発明の方法は、免疫細胞を必要とする対象に免疫細胞を活性化後に養子移植することを含む。

【0372】

具体的な実施形態によれば、養子細胞療法における使用のための、本発明の方法に従って得られる免疫細胞が提供される。

【0373】

本発明の具体的な実施形態に従って使用される細胞は、自家性又は非自家性であり得、それは同系又は非同系であり得：対象に対して同種又は異種であり得、各可能性は本発明の別個の実施形態を表す。

【0374】

本教示はまた、ＨＬＡ－Ｇを発現する病的細胞と関連する疾患を治療する方法における本発明の組成物［例えば、ＬＩＬＲＢ（例えば、ＬＩＬＲＢ２、ＬＩＬＲＢ１）ポリペプチド、それを含む組成物、融合物若しくは二量体、それをコードするポリヌクレオチド又はそれを発現する宿主細胞］の使用を企図する。

【0375】

したがって、本発明の一態様によれば、ＨＬＡ－Ｇを発現する病的細胞と関連する疾患の治療を必要とする対象におけるその疾患を治療する方法であって、対象に治療有効量の本明細書に開示されるＬＩＬＲＢ（例えば、ＬＩＬＲＢ２、ＬＩＬＲＢ１）ポリペプチド、組成物、融合ポリペプチド若しくは二量体、それをコードするポリヌクレオチド、又はそれを発現する宿主細胞を投与し、それにより対象における疾患を治療することを含む方法が提供される。

【0376】

本発明の追加的又は代替的態様によれば、ＨＬＡ－Ｇを発現する病的細胞と関連する疾患の治療を必要とする対象におけるその疾患の治療における使用のための、本明細書に開示されるＬＩＬＲＢ（例えば、ＬＩＬＲＢ２、ＬＩＬＲＢ１）ポリペプチド、組成物、融合ポリペプチド若しくは二量体、それをコードするポリヌクレオチド、又はそれを発現する宿主細胞が提供される。

【0377】

本明細書において使用される場合、用語「対象」は、ＭＨＣ系、例えば、ヒトにおけるＨＬＡ系を有するヒト又は非ヒト個体を指す。対象は、任意の性別及び任意の年齢の対象であり得る。

【0378】

具体的な実施形態によれば、対象は、ヒト対象である。

【0379】

具体的な実施形態によれば、対象は、疾患（例えば、癌）を有すると診断されており、又は疾患（例えば、癌）を発症するリスクがある。

【0380】

具体的な実施形態によれば、対象の病的細胞は、以下にさらに記載されるとおり、所定の閾値を上回るレベルのＨＬＡ－Ｇを呈する。

【0381】

したがって、具体的な実施形態によれば、本明細書に開示される方法は、例えば、ＬＩＬＲＢ（例えば、ＬＩＬＲＢ２、ＬＩＬＲＢ１）ポリペプチド、それを含む組成物、融合物若しくは二量体、それをコードするポリヌクレオチド又はそれを発現する宿主細胞の投与前に、対象の生物学的サンプル中のＨＬＡ－Ｇのレベルを決定すること及びそれに応じて対象を治療することをさらに含む。

【0382】

本明細書において使用される場合、用語「治療」は、病変（疾患、障害、若しくは病態、例えば、癌）の発症を阻害し、予防し、若しくは停止させること、及び／又は病変の軽減、寛解、若しくは退縮を引き起こすことを指す。当業者は、種々の方法及びアッセイを使用して病変の発症を評価することができ、同様に種々の方法及びアッセイを使用して病変の軽減、寛解又は退縮を評価することができることを理解する。

【0383】

具体的な実施形態によれば、治療は、腫瘍容積の減少、腫瘍細胞数の減少、転移数の減少、平均余命の増加、又は癌性病態と関連する種々の生理学的症状の好転により評価することができる。

【0384】

本明細書において使用される場合、語句「ＨＬＡ－Ｇを発現する病的細胞と関連する疾患」は、ＨＬＡ－Ｇを呈する病的細胞が疾患の発生及び／又は進行をドライブする疾患を指す。

【0385】

具体的な実施形態によれば、病的細胞は、所定の閾値を上回るレベルのＨＬＡ－Ｇを呈する。

【0386】

このような所定の閾値は、疾患（例えば、癌）を有すると診断された対象に由来する生物学的サンプル中の呈示レベルを、健常対象（例えば、疾患、例えば、癌を有さない）から得られた生物学的サンプルと比較することにより実験的に決定することができる。代替的に又は追加的に、このような所定の閾値は、病的細胞（例えば、癌細胞）中の呈示レベルを、同じ対象から得られた健常細胞中の呈示レベルと比較することにより実験的に決定することができる。或いは、このようなレベルは、科学文献から及びデータベースから得ることができる。

【0387】

具体的な実施形態によれば、所定の閾値を上回るレベルは、統計的に有意である。

【0388】

具体的な実施形態によれば、所定の閾値からの増加は、同じアッセイを使用して測定される対照サンプルと比較して少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも１００％又はそれよりも多く、約２倍超、約３倍超、約４倍超、約５倍超、約６倍超、約７倍超、約８倍超、約９倍超、約２０倍超、約５０倍超、約１００倍超、約２００倍超、約３５０超、約５００倍超、約１０００倍超、又はそれよりも多い。

【0389】

ＨＬＡ－Ｇ発現を決定する方法は当技術分野において公知であり、それとしては、例えば、フローサイトメトリー、免疫組織化学検査、ＥＬＩＳＡなどが挙げられる。

【0390】

代替的に又は追加的に、このような所定の閾値は、ＥＬＩＳＡ、免疫組織化学検査又はフローサイトメトリーにより決定される、ＨＬＡ－Ｇの検出可能レベルである。

【0391】

本発明の具体的な実施形態で治療することができる疾患の非限定的な例としては、癌、ウイルス感染（例えば、ＨＣＭＶ、ＨＳＶ－１、ＲＡＢＶ、ＨＣＶ、ＩＡＶ及びＨＩＶ－１）、自己免疫及び炎症性疾患、同種移植後、ＧＶＨＤが挙げられる。

【0392】

具体的な実施形態によれば、疾患は、癌である。

【0393】

本発明の一部の実施形態により治療することができる癌は、任意の固形又は非固形腫瘍、癌転移及び／又は前癌であり得る。

【0394】

具体的な実施形態によれば、癌は、悪性癌である。

【0395】

癌の例としては、限定されるものではないが、癌腫、芽細胞腫、肉腫及びリンパ腫が挙げられる。このような癌のより特定の例としては、限定されるものではないが、胃腸管の腫瘍（結腸癌腫、直腸癌腫、結腸直腸癌腫、結腸直腸癌、結腸直腸腺腫、遺伝性非ポリポーシス１型、遺伝性非ポリポーシス２型、遺伝性非ポリポーシス３型、遺伝性非ポリポーシス６型、結腸直腸癌、遺伝性非ポリポーシス７型、小腸及び／若しくは大腸癌腫、食道癌、食道癌を伴う胼胝症、胃癌腫、膵臓癌腫、膵内分泌腫瘍）、子宮内膜癌腫、隆起性皮膚線維肉腫、胆嚢癌腫、胆道腫瘍、前立腺癌、前立腺腺癌、腎臓癌（例えば、ウィルムス腫瘍２型又は１型）、肝臓癌（例えば、肝芽腫、肝細胞癌腫、肝細胞癌）、膀胱癌、胎児性横紋筋肉腫、胚細胞腫瘍、絨毛性腫瘍、精巣胚細胞腫瘍、卵巣、子宮、上皮性卵巣の未熟型奇形腫、仙尾部腫瘍、絨毛腫、胎盤部トロホブラスト腫瘍、上皮性成人腫瘍（ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ａｄｕｌｔ ｔｕｍｏｒ）、卵巣癌腫、漿液性卵巣癌、卵巣性索腫瘍、子宮頸癌腫（ｃｅｒｖｉｃａｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、子宮頸癌腫（ｕｔｅｒｉｎｅ ｃｅｒｖｉｘ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、小細胞及び非小細胞肺癌腫、鼻咽頭癌腫、乳癌腫（例えば、乳管癌、浸潤性乳管内癌、散発性、乳癌、乳癌の感受性、４型乳癌、乳癌１期、乳癌３期、乳癌卵巣癌）、扁平上皮癌腫（例えば、頭頸部における）、神経原性腫瘍、星状細胞腫、神経節芽細胞腫、神経芽細胞腫、リンパ腫（例えば、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、Ｂ細胞、バーキット、皮膚Ｔ細胞性、組織球性、リンパ芽球性、Ｔ細胞、胸腺）、神経膠腫、腺癌、副腎腫瘍、遺伝性副腎皮質癌腫、脳悪性腫瘍（腫瘍）、種々の他の癌腫（例えば、気管支原性大細胞（ｂｒｏｎｃｈｏｇｅｎｉｃ ｌａｒｇｅ ｃｅｌｌ）、腺管、エールリッヒ・レットル腹水、類表皮、大細胞、ルイス肺、髄様、粘膜類表皮、燕麦細胞、小細胞、紡錘細胞、有棘細胞、移行細胞、未分化、癌肉腫、絨毛腫、嚢胞腺癌）、上衣芽細胞腫、上皮腫、赤白血病（例えば、フレンド、リンパ芽球）、線維肉腫、巨細胞腫、グリア系腫瘍、膠芽細胞腫（例えば、多形性、星状細胞腫）、神経膠腫 ヘパトーマ、ヘテロハイブリドーマ、ヘテロ骨髄腫、組織球腫、ハイブリドーマ（例えば、Ｂ細胞性）、副腎腫、インスリノーマ、膵島腫瘍、角化症、平滑筋芽細胞腫、平滑筋肉腫、白血病（例えば、急性リンパ球性白血病、急性リンパ芽球性白血病、前駆Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病、Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病、急性巨核芽球性白血病、単球性白血病、急性骨髄性（ａｃｕｔｅ ｍｙｅｌｏｇｅｎｏｕｓ）白血病、急性骨髄性（ａｃｕｔｅ ｍｙｅｌｏｉｄ）白血病、好酸球増多を伴う急性骨髄性白血病、Ｂ細胞白血病、好塩基球性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性白血病、Ｂ細胞白血病、好酸球性白血病、フレンド白血病、顆粒球又は骨髄性白血病、有毛細胞白血病、リンパ球性白血病、巨核芽球性白血病、単球性白血病、単球性－マクロファージ白血病、骨髄芽球性白血病、骨髄性白血病、骨髄単球性白血病、形質細胞性白血病、前駆Ｂ細胞白血病、前骨髄球性白血病、亜急性白血病、Ｔ細胞白血病、リンパ球性新生物、骨髄性悪性腫瘍の素因、急性非リンパ球性白血病）、リンパ肉腫、黒色腫、乳腺腫瘍、肥満細胞腫、髄芽腫、中皮腫、転移性腫瘍、単球性腫瘍、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、骨髄腫、腎芽細胞腫、神経組織グリア系腫瘍、神経組織神経細胞性腫瘍、神経線維腫症、神経芽細胞腫、乏突起膠腫、骨軟骨腫、骨髄腫、骨肉腫（例えば、ユーイング肉腫）、乳頭腫、移行細胞、褐色細胞腫、下垂体腫瘍（浸潤性）、形質細胞腫、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、肉腫（例えば、ユーイング肉腫、組織球性細胞肉腫、ジェンセン肉腫、骨肉腫、細網細胞肉腫）、神経鞘腫、皮下腫瘍、奇形癌腫（例えば、多分化能性）、奇形腫、精巣腫瘍、胸腺腫及び毛包上皮腫、胃癌、線維肉腫、多形性膠芽細胞腫、多発性グロムス腫瘍、リー・フラウメニ症候群、脂肪肉腫、リンチ家族性癌症候群ＩＩ型、男子生殖細胞腫瘍、肥満細胞性白血病、甲状腺髄様、多発性髄膜腫、内分泌腺腫 粘液肉腫、傍神経節腫、家族性非クロム親和型、毛母腫、乳頭状、家族性及び散発性、ラブドイド素因症候群、家族性、ラブドイド腫瘍、軟部組織肉腫、並びに膠芽細胞腫を伴うターコット症候群が挙げられる。

【0396】

具体的な実施形態によれば、癌は、前悪性癌である。

【0397】

前癌は、十分に特徴付けされており、当技術分野において公知である（例えば、Berman JJ. and Henson DE., 2003. Classifying the pre-cancers: a metadata approach. BMC Med Inform Decis Mak. 3:8を参照のこと）。前癌の例としては、限定されるものではないが、後天性の小型前癌、核異型を伴う後天性の大型病変、癌に進行する遺伝性過形成症候群を併発する前駆病変、並びに後天性びまん性過形成及びびまん性化生が挙げられる。小型前癌の非限定的な例としては、ＨＧＳＩＬ（子宮頸部の高度扁平上皮内病変）、ＡＩＮ（肛門上皮内新生物）、声帯異形成、（結腸の）異常腺窩、ＰＩＮ（前立腺上皮内新生物）が挙げられる。

【0398】

核異型を伴う後天性の大型病変の非限定的な例としては、管状腺腫、ＡＩＬＤ（異常タンパク血症を伴う血管免疫芽球性リンパ節症）、異型性髄膜腫、胃ポリープ、大局面型類乾癬、脊髄異形成、乳頭移行細胞の上皮内癌腫、芽球増加を伴う不応性貧血、及びシュナイダー乳頭腫が挙げられる。癌に進行する遺伝性過形成症候群を併発する前駆病変の非限定的な例としては、非定型母斑症候群、Ｃ細胞腺腫症及びＭＥＡが挙げられる。後天性びまん性過形成及びびまん性化生の非限定的な例としては、骨パジェット病及び潰瘍性大腸炎が挙げられる。

【0399】

具体的な実施形態によれば、癌は、膵臓癌、乳癌、皮膚癌、結腸直腸癌、胃癌及び卵巣癌からなる群より選択される。

【0400】

具体的な実施形態によれば、本明細書に開示される組成物［例えば、ＬＩＬＲＢ（例えば、ＬＩＬＲＢ２、ＬＩＬＲＢ２）ポリペプチド、それを含む組成物、融合物若しくは二量体、それをコードするポリヌクレオチド及び／又はそれを発現する宿主細胞］は、対象に、限定されるものではないが、麻酔薬、化学療法剤、放射線療法剤、細胞傷害療法（コンディショニング）、ホルモン療法、抗体及び当技術分野において周知の他の治療レジメン（例えば、手術）を含む、疾患を治療するための他の確立された又は実験的な治療レジメンとの組み合わせで投与することができる。

【0401】

具体的な実施形態によれば、本発明の一部の実施形態の組成物との組み合わせで投与される治療剤は、抗体を含む。

【0402】

具体的な実施形態によれば、本明細書に開示される組成物［例えば、ＬＩＬＲＢ（例えば、ＬＩＬＲＢ２、ＬＩＬＲＢ１）ポリペプチド、それを含む組成物、融合物若しくは二量体、それをコードするポリヌクレオチド及び／又はそれを発現する宿主細胞］は、対象に、養子細胞移植、例えば、限定されるものではないが、骨髄細胞、造血幹細胞、ＰＢＭＣ、臍帯血幹細胞及び／又は誘導多能性幹細胞の移植との組み合わせで投与することができる。

【0403】

具体的な実施形態によれば、本発明の一部の実施形態の組成物との組み合わせで投与される治療剤は、抗癌剤を含む。

【0404】

具体的な実施形態によれば、本発明の一部の実施形態の組成物との組み合わせで投与される治療剤は、抗感染剤（例えば、抗生物質及び抗ウイルス剤）を含む。

【0405】

具体的な実施形態によれば、組み合わせ療法は、相加効果を有する。

【0406】

具体的な実施形態によれば、組み合わせ療法は、相乗効果を有する。

【0407】

本発明の別の態様によれば、疾患を治療するための治療剤を包装する包装材料、並びにＬＩＬＲＢ（例えば、ＬＩＬＲＢ２、ＬＩＬＲＢ１）ポリペプチド、それを含む組成物、融合物若しくは二量体、それをコードするポリヌクレオチド及び／又はそれを発現する宿主細胞を含む製造品が提供される。

【0408】

具体的な実施形態によれば、製造品は、ＨＬＡ－Ｇを発現する病的細胞と関連する疾患、例えば、癌の治療のために識別される。

【0409】

具体的な実施形態によれば、疾患を治療するための治療剤、並びにＬＩＬＲＢ（例えば、ＬＩＬＲＢ２、ＬＩＬＲＢ１）ポリペプチド、それを含む組成物、融合物若しくは二量体、それをコードするポリヌクレオチド及び／又はそれを発現する宿主細胞は、別個の容器中で包装される。

【0410】

具体的な実施形態によれば、疾患を治療するための治療剤、並びにＬＩＬＲＢ（例えば、ＬＩＬＲＢ２、ＬＩＬＲＢ１）ポリペプチド、それを含む組成物、融合物若しくは二量体、それをコードするポリヌクレオチド及び／又はそれを発現する宿主細胞は、共製剤中で包装される。

【0411】

本明細書において使用される場合、用語「アミノ酸配列」、「タンパク質」、「ペプチド」、「ポリペプチド」及び「タンパク質性部分」は、本明細書において互換的に使用され、天然ペプチド（分解産物、合成により合成されたペプチド又は組換えペプチドのいずれか）及びペプチド模倣体（典型的には、合成により合成されたペプチド）、並びに例えば、ペプチドを体内に存在する間、より安定的にし、又は細胞中により浸透し得るようにする修飾を有し得るペプチドアナログであるペプトイド及びセミペプトイドを包含する。このような修飾としては、限定されるものではないが、Ｎ末端修飾、Ｃ末端修飾、ペプチド結合修飾、骨格修飾、及び残基修飾が挙げられる。ペプチド模倣化合物を調製する方法は当技術分野において周知であり、例えば、本明細書に完全に示すかのように参照により組み込まれるQuantitative Drug Design, C.A. Ramsden Gd., Chapter 17.2, F. Choplin Pergamon Press (1992)に規定されている。これに関するさらなる詳細は以下に提供される。

【0412】

ペプチド内のペプチド結合（－ＣＯ－ＮＨ－）は、例えば、Ｎ－メチル化アミド結合－Ｎ（ＣＨ３）－ＣＯ－）、エステル結合（－Ｃ（＝Ｏ）－Ｏ－）、ケトメチレン結合（－ＣＯ－ＣＨ２－）、スルフィニルメチレン結合（－Ｓ（＝Ｏ）－ＣＨ２－）、α－アザ結合（－ＮＨ－Ｎ（Ｒ）－ＣＯ－）（式中、Ｒは、任意のアルキル（例えば、メチル）である）、アミン結合（－ＣＨ２－ＮＨ－）、スルフィド結合（－ＣＨ２－Ｓ－）、エチレン結合（－ＣＨ２－ＣＨ２－）、ヒドロキシエチレン結合（－ＣＨ（ＯＨ）－ＣＨ２－）、チオアミド結合（－ＣＳ－ＮＨ－）、オレフィン性二重結合（－ＣＨ＝ＣＨ－）、フッ素化オレフィン性二重結合（－ＣＦ＝ＣＨ－）、レトロアミド結合（－ＮＨ－ＣＯ－）、ペプチド誘導体（－Ｎ（Ｒ）－ＣＨ２－ＣＯ－）（式中、Ｒは、炭素原子上に天然に存在する「通常の」側鎖である）により置換させることができる。

【0413】

これらの修飾は、ペプチド鎖に沿う結合のいずれかにおいて、さらにはいくつかの（２～３つの）結合において同時に生じ得る。

【0414】

天然芳香族アミノ酸、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ及びＰｈｅは、非天然芳香族アミノ酸、例えば、１，２，３，４－テトラヒドロイソキノリン－３－カルボン酸（Ｔｉｃ）、ナフチルアラニン、Ｐｈｅの環メチル化誘導体、Ｐｈｅのハロゲン化誘導体又はＯ－メチル－Ｔｙｒにより置換させることができる。

【0415】

本発明の一部の実施形態のペプチドは、１つ以上の修飾アミノ酸又は１つ以上の非アミノ酸単量体（例えば、脂肪酸、複合炭水化物など）も含み得る。

【0416】

用語「アミノ酸（ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ）」又は「アミノ酸（ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ）」は、２０種の天然存在のアミノ酸、例えば、ヒドロキシプロリン、ホスホセリン及びホスホトレオニンを含むインビボで翻訳後修飾されることが多いそれらのアミノ酸、並びに限定されるものではないが、２－アミノアジピン酸、ヒドロキシリジン、イソデスモシン、ノルバリン、ノルロイシン及びオルニチンを含む他の異常アミノ酸を含むことが理解される。さらに、用語「アミノ酸」には、Ｄ－及びＬ－アミノ酸の両方が含まれる。

【0417】

以下の表４及び５は、本発明の一部の実施形態で使用することができる天然存在のアミノ酸（表４）、及び非慣用又は修飾アミノ酸（例えば、合成、表５）を列記する。

【0418】

【表1】

【0419】

【表2】

【0420】

本発明の一部の実施形態のポリペプチドは、好ましくは、直鎖形態で利用されるが、環化がペプチド特徴に著しく干渉しない場合には環状形態のペプチドを利用することもできることが認識される。

【0421】

本ポリペプチドは、好ましくは、ポリペプチドが可溶性形態であることを要求する治療薬において利用されるため、本発明の一部の実施形態のポリペプチドは、限定されるものではないが、ヒドロキシル含有側鎖に起因してペプチド溶解度を増加させ得るセリン及びトレオニンを含む１つ以上の非天然又は天然極性アミノ酸を含む。

【0422】

本発明のポリペプチドのアミノ酸は、保存的又は非保存的に置換させることができる。

【0423】

本明細書において使用される用語「保存的置換」は、ペプチドにおける天然配列中に存在するアミノ酸を、類似の立体特性を有する天然存在又は非天然存在のアミノ又はペプチド模倣体で置き換えることを指す。置き換えるべき天然アミノ酸の側鎖が極性又は疎水性のいずれかである場合、保存的置換は、天然存在のアミノ酸、非天然存在のアミノ酸を用い、又は同様に極性若しくは疎水性である（置き換えられるアミノ酸の側鎖と同じ立体特性を有することに加えて）ペプチド模倣体部分を用いるべきである。

【0424】

天然存在のアミノ酸は典型的にはそれらの特性に従って分類されるため、天然存在のアミノ酸による保存的置換は、本発明によれば、荷電アミノ酸の立体的に類似の非荷電アミノ酸による置き換えが保存的置換とみなされるという事実を考慮して容易に決定することができる。

【0425】

非天然存在のアミノ酸による保存的置換をもたらすため、当技術分野において周知のアミノ酸アナログ（合成アミノ酸）を使用することも可能である。天然存在アミノ酸のペプチド模倣体は、実務者に公知の文献に十分報告されている。

【0426】

保存的置換を行う場合、置換アミノ酸は、元のアミノ酸と同じ又は類似の側鎖中の官能基を有するべきである。

【0427】

機能的に類似のアミノ酸を提供する保存的置換表は、当技術分野において周知である。どのアミノ酸電荷が表現型的にサイレントである可能性が高いかに関する指針は、Bowie et al., 1990, Science 247:1306 1310に見出すこともできる。このような保存的に修飾されたバリアントは、多型バリアント、種間ホモログ、及びアレルに追加され、それらを除外しない。典型的な保存的置換としては、限定されるものではないが、１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）、５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）、６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）、７）セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、及び８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）が挙げられる（例えば、Creighton, Proteins (1984)を参照のこと）。アミノ酸は、側鎖と関連する特性に基づき置換させることができ、例えば、極性側鎖を有するアミノ酸、例えば、セリン（Ｓ）及びトレオニン（Ｔ）、側鎖の電荷に基づくアミノ酸、例えば、アルギニン（Ｒ）及びヒスチジン（Ｈ）、並びに疎水性側鎖を有するアミノ酸、例えば、バリン（Ｖ）及びロイシン（Ｌ）を置換させることができる。示されるとおり、変化は典型的には軽度のものであり、例えば、タンパク質のフォールディングにも活性にも顕著に影響を与えない保存的アミノ酸置換である。

【0428】

本明細書において使用される語句「非保存的置換」は、親配列中に存在するアミノ酸を、異なる電気化学的及び／又は立体特性を有する別の天然又は非天然存在アミノ酸により置き換えることを指す。したがって、置換アミノ酸の側鎖は、置換されている天然アミノ酸の側鎖よりも顕著に大きく（若しくは小さく）てよく、及び／又は置換されているアミノ酸と顕著に異なる電子的特性を有する官能基を有し得る。このタイプの非保存的置換の例としては、フェニルアラニン又はシクロヘキシルメチルグリシンのアラニンについての置換、イソロイシンのグリシンについての置換、又は－ＮＨ－ＣＨ［（－ＣＨ_２）_５－ＣＯＯＨ］－ＣＯ－のアスパラギン酸についての置換が挙げられる。本発明の範囲内に収まるそれらの非保存的置換は、抗菌特性を有するペプチドを依然として構成するものである。

【0429】

本発明のペプチド及び組成物のＮ及びＣ末端は、官能基により保護することができる。好適な官能基は、教示が参照により本明細書に組み込まれるGreen and Wuts, “Protecting Groups in Organic Synthesis”, John Wiley and Sons, 第５章及び第７章、1991に記載されている。好ましい保護基は、例えば、化合物の親水性を低減させ、親油性を増加させることにより、それに結合した化合物の細胞中への輸送を容易にするものである。

【0430】

具体的な実施形態によれば、アミノ酸の１つ以上を例えば官能基の付加により修飾することができる（概念的には「化学修飾する」とみなされる）。例えば、天然配列中に存在する側鎖アミノ酸残基は、任意選択で修飾することができるが、代替的に、下記のとおり、タンパク質の他の部分を側鎖アミノ酸残基に加えて又はそれに代えて任意選択で修飾することができる。修飾は、化学合成プロセスが続く場合、任意選択で、分子の合成中、例えば化学修飾されたアミノ酸を付加することによって実施することができる。しかしながら、アミノ酸が分子中に既に存在する場合、アミノ酸の化学修飾（「インサイチュー」修飾）も可能である。ペプチド又はタンパク質に対する修飾は、例えば、遺伝子合成、エキソヌクレアーゼ欠失による部位特異的（例えば、ＰＣＲベース）若しくはランダム突然変異誘発（例えば、ＥＭＳ）により、化学修飾により、又は異種ドメイン若しくは結合タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列の融合により導入することができる。

【0431】

本明細書において使用される場合、用語「化学修飾」は、ペプチドを指す場合、そのアミノ酸残基の少なくとも１つが、天然プロセス、例えば、プロセシング若しくは他の翻訳後修飾、又は当技術分野において周知の化学修飾技術のいずれかにより修飾されているペプチドを指す。修飾の非限定的な例示的タイプとしては、カルボキシメチル化、アセチル化、アシル化、リン酸化、グリコシル化、アミド化、ＡＤＰ－リボシル化、脂肪酸アシル化、ファルネシル基、イソファルネシル基、炭水化物基、脂肪酸基、コンジュゲーションのためのリンカーの付加、官能化、ＧＰＩアンカー形成、脂質若しくは脂質誘導体の共有結合結合、メチル化、ミリスチル化、ペグ化、プレニル化、リン酸化、ユビキチン化、又は任意の類似のプロセス及び公知の保護基／ブロッキング基が挙げられる。エーテル結合を任意選択で使用してセリン又はトレオニンのヒドロキシルを糖のヒドロキシルに結合させることができる。アミド結合を任意選択で使用してグルタメート又はアスパルテートのカルボキシル基を糖のアミノ基に結合させることができる（Garg and Jeanloz, Advances in Carbohydrate Chemistry and Biochemistry, Vol.43, Academic Pres s(1985), Kunz, Ang. Chem. Int. Ed. English 26:294-308 (1987)）。アミノ酸と炭水化物との間にアセタール及びケタール結合を任意選択で形成することもできる。例えば、遊離アミノ基（例えば、リジン）のアシル化により、脂肪酸アシル誘導体を任意選択で作製することができる（Toth et al., Peptides: Chemistry, Structure and Biology, Rivier and Marshal, eds., ESCOM Publ., Leiden, 1078-1079 (1990)）。

【0432】

具体的な実施形態によれば、修飾としては、本明細書に完全に示すかのように参照により本明細書に組み込まれるＰＣＴ出願である国際公開第２００６／０５０２６２号パンフレットに記載のとおり、ペプチドへのシクロアルカン部分の付加が挙げられる。これらの部分は生体分子との使用のために設計され、任意選択で使用して種々の特性をタンパク質に付与することができる。

【0433】

さらに、任意選択で、ペプチド上の任意の点を修飾することができる。例えば、本明細書に完全に示すかのように参照により本明細書に組み込まれるＰＣＴ出願である国際公開第２００６／０５０２４７号パンフレットに記載のとおり、及び上記にさらに記載されるとおり、タンパク質上のグリコシル化部分のペグ化を任意選択で実施することができる。１つ以上のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）基をＯ－結合型及び／又はＮ－結合型グリコシル化に任意選択で付加することができる。ＰＥＧ基は、任意選択で、分枝鎖又は直鎖であり得る。任意選択で、任意のタイプの水溶性ポリマーを、グリコシルリンカーを介してタンパク質上のグリコシル化部位に結合させることができる。

【0434】

具体的な実施形態によれば、ペプチドは、変更された（すなわち、元の又は天然のグリコシル化パターンから変更された）グリコシル化パターンを有するように修飾される。本明細書において使用される場合、「変更された」は、１つ以上の炭水化物部分が欠失していること、及び／又は元のタンパク質に付加された少なくとも１つのグリコシル化部位を有することを意味する。

【0435】

タンパク質のグリコシル化は、典型的には、Ｎ－結合型又はＯ－結合型のいずれかである。Ｎ－結合型は、アスパラギン残基の側鎖への炭水化物部分の結合を指す。トリペプチド配列のアスパラギン－Ｘ－セリン及びアスパラギン－Ｘ－トレオニン（式中、Ｘは、プロリンを除く任意のアミノ酸である）は、アスパラギン側鎖への炭水化物部分の酵素的結合のための認識配列である。したがって、ポリペプチド中のこれらのトリペプチド配列のいずれかの存在は、潜在的なグリコシル化部位を作出する。Ｏ－結合型グリコシル化は、ヒドロキシアミノ酸（最も一般にはセリン又はトレオニンであるが、５－ヒドロキシプロリン又は５－ヒドロキシリジンを使用することもできる）へのＮ－アセチルガラクトサミン、ガラクトース、又はキシロースの糖の１つの結合を指す。

【0436】

ペプチドへのグリコシル化部位の付加は、ペプチドのアミノ酸配列が上記トリペプチド配列の１つ以上を含有するようにこれを変更することにより簡便に遂行される（Ｎ－結合型グリコシル化部位について）。変更は、元のペプチドの配列中の１つ以上のセリン又はスレオニン残基の付加、又はそれらによる置換により作製することもできる（Ｏ－結合型グリコシル化部位について）。ペプチドのアミノ酸配列は、ＤＮＡレベルの変化の導入により変更することもできる。

【0437】

ペプチド上の炭水化物部分の数を増加させる別の手段は、ペプチドのアミノ酸残基へのグリコシドの化学的又は酵素的カップリングによるものである。使用されるカップリング方式に応じて、糖を（ａ）アルギニン及びヒスチジン、（ｂ）フリーカルボキシル基、（ｃ）フリースルフヒドリル基、例えば、システインのもの、（ｄ）フリーヒドロキシル基、例えば、セリン、トレオニン、若しくはヒドロキシプロリンのもの、（ｅ）芳香族残基、例えば、フェニルアラニン、チロシン、若しくはトリプトファンのもの、又は（ｆ）グルタミンのアミド基に結合させることができる。これらの方法は、例えば、国際公開第８７／０５３３０号パンフレット、及びAplin and Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem., 22:259-306 (1981)に記載されている。

【0438】

ペプチド上に存在するあらゆる炭水化物部分の除去は、化学的に、酵素的に又はＤＮＡレベルの変化の導入により遂行することができる。化学的脱グリコシル化は、トリフルオロメタンスルホン酸、又は同等の化合物へのペプチドの曝露を要求する。この処理は、アミノ酸配列をインタクトのままにして結合糖（Ｎ－アセチルグルコサミン又はＮ－アセチルガラクトサミン）を除くほとんど又は全ての糖の開裂をもたらす。

【0439】

化学的脱グリコシル化は、Hakimuddin et al., Arch. Biochem. Biophys., 259:52 (1987)、及びEdge et al., Anal. Biochem., 118:131 (1981)により記載されている。ペプチド上の炭水化物部分の酵素的開裂は、Thotakura et al., Meth. Enzymol., 138:350 (1987)により記載されているとおり、種々のエンド及びエキソグリコシダーゼの使用により達成することができる。

【0440】

本発明の一部の実施形態の組成物［例えば、ＬＩＬＲＢ（例えば、ＬＩＬＲＢ２、ＬＩＬＲＢ１）ポリペプチド、それを含む組成物、融合物又は二量体］は、ペプチド合成の当業者に公知の任意の技術、例えば、限定されるものではないが、固相及び組換え技術により合成及び精製することができる。

【0441】

具体的な実施形態によれば、ポリペプチドの調製は、固相ペプチド合成を含む。

【0442】

固相ペプチド合成については、多くの技術の概要をJ. M. Stewart and J.D. Young, Solid Phase Peptide Synthesis, W.H. Freeman Co. (San Francisco), 1963及びJ. Meienhofer, Hormonal Proteins and Peptides, vol.2, p.46, Academic Press (New York), 1973に見出すことができる。古典的溶液合成については、G. Schroder and K. Lupke, The Peptides, vol.1, Academic Press (New York), 1965を参照のこと。

【0443】

一般に、これらの方法は、成長ペプチド鎖への１つ以上のアミノ酸又は好適に保護されたアミノ酸の逐次的付加を含む。通常、最初のアミノ酸のアミノ又はカルボキシル基のいずれかを好適な保護基により保護する。次いで、保護又は誘導化されたアミノ酸を、アミド結合の形成に好適な条件下で、好適に保護された相補的な（アミノ又はカルボキシル）基を有する配列中の次のアミノ酸に付加することにより不活性な固体支持体に結合させ、又は溶液中で利用することができる。次いで、この新たに付加されたアミノ酸残基から保護基を除去し、次いで次の（好適に保護された）アミノ酸を付加するなどである。全ての所望のアミノ酸を適切な順序で結合させた後、あらゆる残留保護基（及びあらゆる固体支持体）を逐次的又は同時に除去して最終ペプチド化合物を得る。この一般的手順の単純な修飾により、例えば、保護されたトリペプチドを適切に保護されたジペプチドと（キラル中心をラセミ化しない条件下で）カップリングさせて脱保護後にペンタペプチドなどを形成することにより、成長鎖に一度に２つ以上のアミノ酸を付加することが可能である。ペプチド合成のさらなる説明は、米国特許第６，４７２，５０５号明細書に開示されている。

【0444】

大規模ペプチド合成は、Andersson Biopolymers 2000, 55(3):227-50により記載されている。

【0445】

具体的な実施形態によれば、ポリペプチド［例えば、ＬＩＬＲＢ（例えば、ＬＩＬＲＢ２、ＬＩＬＲＢ１）ポリペプチド、それを含む組成物、融合物又は二量体］は、インビトロ発現系を使用して合成される。

【0446】

したがって、本明細書に記載のポリペプチドのいずれもポリヌクレオチドからコードさせることができる。これらのポリヌクレオチドは、それ自体で使用し、又は本明細書に開示されるポリペプチドの組換え産生において使用することができる。

【0447】

「組換え」ポリペプチドは、組換えＤＮＡ技術により産生されるポリペプチドを指し、すなわち、所望のポリペプチドをコードする外因性ＤＮＡ構築物により形質転換された細胞から産生される。

【0448】

したがって、本発明の別の態様によれば、本明細書に開示されるＬＩＬＲＢ（例えば、ＬＩＬＲＢ２、ＬＩＬＲＢ１）ポリペプチド、融合ポリペプチド又は二量体をコードするポリヌクレオチドが提供される。

【0449】

本発明の具体的な実施形態で使用することができるポリヌクレオチド配列の非限定的な例は、以下の表３に記載される。

【0450】

本発明の一部の実施形態のＬＩＬＲＢ２ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの非限定的な例は、配列番号６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２及び２４に提供される。

【0451】

本発明の一部の実施形態のＬＩＬＲＢ２－Ｆｃ融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの非限定的な例は、配列番号４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、９７及び１０６に提供される。

【0452】

本発明の一部の実施形態のＳＩＲＰα－Ｆｃ融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの非限定的な例は、配列番号３６、９１、９５及び９９に提供される。

【0453】

本明細書において使用される場合、用語「ポリヌクレオチド」は、ＲＮＡ配列、相補的ポリヌクレオチド配列（ｃＤＮＡ）、ゲノムポリヌクレオチド配列及び／又は複合ポリヌクレオチド配列（例えば、上記の組み合わせ）の形態で単離及び提供される一本鎖又は二本鎖の核酸配列を指す。

【0454】

具体的な実施形態によれば、本明細書に開示されるポリヌクレオチド及び核酸配列のいずれも、保存的核酸置換を含み得る。保存的に修飾されたポリヌクレオチドは、同一の又は本質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸を指し、又は核酸がアミノ酸配列をコードしない場合、本質的に同一の又は関連する（例えば、天然に連続する）配列を示す。遺伝コードの縮重のため、多数の機能的に同一の核酸がほとんどのタンパク質をコードする。例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ及びＧＣＵは、全てアミノ酸アラニンをコードする。したがって、アラニンがコドンにより規定される全ての位置において、このコドンは、コードされるポリペプチドを変更せず、記載される対応するコドンの別のものに変更することができる。このような核酸変異は、「サイレント変異」であり、それは保存的に修飾されたポリヌクレオチドの一種である。具体的な実施形態によれば、本明細書におけるポリペプチドをコードする本明細書に記載の任意のポリヌクレオチド及び核酸配列は、その核酸のサイレント変異も説明する。当業者は、ある状況において、機能的に同一の分子を得るように核酸中の各コドン（通常、メチオニンについての唯一のコドンであるＡＵＧ及び通常、トリプトファンについての唯一のコドンであるＴＧＧを除く）を修飾することができることを認識する。したがって、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのサイレント変異は、発現産物に関して記載される配列に黙示される。

【0455】

外因性ポリペプチドを哺乳類細胞中で発現させるため、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列は、好ましくは、哺乳類細胞発現に好適な核酸構築物中にライゲートされる。このような核酸構築物は、細胞中のポリヌクレオチド配列の転写を構成的又は誘導性の様式で指向するためのプロモーター配列を含む。

【0456】

したがって、本発明の一態様によれば、ＬＩＬＲＢ２ポリペプチド、融合ポリペプチド又は二量体をコードするポリヌクレオチドと、宿主細胞中のポリヌクレオチドの発現を指向するための調節エレメントとを含む核酸構築物が提供される。

【0457】

具体的な実施形態によれば、調節エレメント（プロモーター）は、異種調節エレメントである。

【0458】

本発明の一部の実施形態の核酸構築物（本明細書において「発現ベクター」とも称される）は、このベクターを、原核生物、真核生物、又は好ましくはその両方における複製及び組み込みに好適にする追加の配列を含む（例えば、シャトルベクター）。加えて、典型的なクローニングベクターは、転写及び翻訳開始配列、転写及び翻訳ターミネーター並びにポリアデニル化シグナルも含有し得る。例として、このような構築物は、典型的には、５’ＬＴＲ、ｔＲＮＡ結合部位、パッケージングシグナル、第２鎖ＤＮＡ合成起点、及び３’ＬＴＲ又はその一部を含む。

【0459】

本発明の一部の実施形態の核酸構築物は、典型的には、構築物が装入される宿主細胞からペプチドの分泌のためのシグナル配列を含む。好ましくは、この目的のためのシグナル配列は、哺乳類シグナル配列又は本発明の一部の実施形態のポリペプチドバリアントのシグナル配列である。具体的な実施形態によれば、核酸構築物は、例えば、配列番号２５～２６に提供されるようなシグナルペプチドを含む。

【0460】

真核生物プロモーターは、典型的には、２つのタイプの認識配列、ＴＡＴＡボックス及び上流プロモーターエレメントを含有する。ＴＡＴＡボックスは、転写開始部位の２５～３０塩基対上流に局在し、ＲＮＡポリメラーゼのＲＮＡ合成開始の指向に関与すると考えられている。他方の上流プロモーターエレメントは、転写が開始される率を決定する。

【0461】

好ましくは、本発明の一部の実施形態の核酸構築物により利用されるプロモーターは、形質転換された特異的細胞集団において活性である。細胞タイプ特異的プロモーター及び／又は組織特異的プロモーターの例としては、肝臓特異的であるアルブミンなどのプロモーター［Pinkert et al., (1987) Genes Dev. 1:268-277］、リンパ系特異的プロモーター［Calame et al., (1988) Adv. Immunol. 43:235-275］、特にＴ細胞受容体のプロモーター［Winoto et al., (1989) EMBO J. 8:729-733］及び免疫グロブリンのプロモーター、［Banerji et al. (1983) Cell 33729-740］、ニューロン特異的プロモーター、例えば、ニューロフィラメントプロモーター［Byrne et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:5473-5477］、膵臓特異的プロモーター［Edlunch et al. (1985) Science 230:912-916］又は乳腺特異的プロモーター、例えば、乳清プロモーター（米国特許第４，８７３，３１６号明細書及び欧州特許出願公開第２６４，１６６号明細書）が挙げられる。

【0462】

エンハンサーエレメントは、転写を結合した同種又は異種プロモーターから最大１，０００倍刺激し得る。エンハンサーは、転写開始部位から下流又は上流に配置された場合に活性である。ウイルスに由来する多くのエンハンサーエレメントは広い宿主範囲を有し、種々の組織中で活性である。例えば、ＳＶ４０初期遺伝子エンハンサーは、多くの細胞タイプに好適である。本発明の一部の実施形態に好適な他のエンハンサー／プロモーターの組み合わせとしては、ポリオーマウイルス、ヒト又はマウスサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）に由来するもの、種々のレトロウイルス、例えば、マウス白血病ウイルス、マウス又はラウス肉腫ウイルス及びＨＩＶからの長い末端反復配列が挙げられる。参照により本明細書に組み込まれるEnhancers and Eukaryotic Expression, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. 1983を参照されたい。

【0463】

発現ベクターの構築において、プロモーターは、好ましくは、その自然環境における転写開始部位からの距離とほぼ同じ距離だけ異種の転写開始部位から離れて位置される。しかしながら、当技術分野において公知のとおり、この距離のいくらかの変動はプロモーター機能の損失がなければ受け入れることができる。

【0464】

ポリアデニル化配列を発現ベクターに付加してｍＲＮＡ翻訳の効率を増加させることもできる。正確で効率的なポリアデニル化には、２つの区別される配列エレメント：ポリアデニル化部位から下流に局在するＧＵ又はＵリッチ配列及び１１～３０ヌクレオチド上流に局在する、高度に保存された６ヌクレオチドの配列ＡＡＵＡＡＡが要求される。本発明の一部の実施形態に好適な終結及びポリアデニル化シグナルとしては、ＳＶ４０に由来するものが挙げられる。

【0465】

本発明の一部の実施形態の発現ベクターは、既に記載されたエレメントに加えて、典型的にはクローニングされた核酸の発現のレベルを増加させること又は組換えＤＮＡを担持する細胞の識別を容易にすることが意図される他の特殊化したエレメントを含有し得る。例えば、多数の動物ウイルスは、許容細胞タイプ中のウイルスゲノムの染色体外複製を促進するＤＮＡ配列を含有する。これらのウイルスレプリコンを担持するプラスミドは、プラスミド上又は宿主細胞のゲノムと担持される遺伝子により適切な因子が提供される限り、エピソームとして複製される。

【0466】

ベクターは、真核生物レプリコンを含んでも含まなくてもよい。真核生物レプリコンが存在する場合、ベクターは、適切な選択可能マーカーを使用して真核細胞中で増幅可能である。ベクターが真核生物レプリコンを含まない場合、エピソーム増幅は不可能である。代わりに、組換えＤＮＡは、工学操作細胞のゲノム中に組み込まれ、そこでプロモーターが所望の核酸の発現を指向する。

【0467】

本発明の一部の実施形態の発現ベクターは、例えば、単一ｍＲＮＡからのいくつかのタンパク質の翻訳を可能にする追加のポリヌクレオチド配列、例えば、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）及びプロモーター－キメラポリペプチドのゲノム組み込みのための配列をさらに含み得る。

【0468】

したがって、具体的な実施形態によれば、ヘテロ二量体中に含まれる両方の単量体は、単一構築物から発現される。

【0469】

他の具体的な実施形態によれば、ヘテロ二量体中に含まれる単量体の各々は、異なる構築物から発現される。

【0470】

発現ベクター中に含まれる個々のエレメントは、種々の構成で配置され得ることが認識される。例えば、エンハンサーエレメント、プロモーターなど、及びさらには「ヘッドトゥテール」構成で配置されるポリペプチドをコードする（１つ以上の）ポリヌクレオチド配列は、逆相補鎖として、又は逆平行鎖として相補鎖構成で存在し得る。このような構成の多様性は、発現ベクターの非コードエレメントとともに生じる可能性がより高い一方、発現ベクター内のコード配列の代替的な構成も想定される。

【0471】

哺乳類発現ベクターについての例としては、限定されるものではないが、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社から入手可能なｐｃＤＮＡ３、ｐｃＤＮＡ３．１（＋／－）、ｐｃＤＮＡ３．４、ｐＧＬ３、ｐＺｅｏＳＶ２（＋／－）、ｐＳｅｃＴａｇ２、ｐＤｉｓｐｌａｙ、ｐＥＦ／ｍｙｃ／ｃｙｔｏ、ｐＣＭＶ／ｍｙｃ／ｃｙｔｏ、ｐＣＲ３．１、ｐＳｉｎＲｅｐ５、ＤＨ２６Ｓ、ＤＨＢＢ、ｐＮＭＴ１、ｐＮＭＴ４１、ｐＮＭＴ８１、Ｐｒｏｍｅｇａ社から入手可能なｐＣＩ、Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ社から入手可能なｐＭｂａｃ、ｐＰｂａｃ、ｐＢＫ－ＲＳＶ及びｐＢＫ－ＣＭＶ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社から入手可能なｐＴＲＥＳ、並びにそれらの誘導体が挙げられる。

【0472】

真核生物ウイルス、例えば、レトロウイルスからの調節エレメントを含有する発現ベクターを使用することもできる。ＳＶ４０ベクターとしては、ｐＳＶＴ７及びｐＭＴ２が挙げられる。ウシパピローマウイルスに由来するベクターとしては、ｐＢＶ－１ＭＴＨＡが挙げられ、エプスタイン・バーウイルスに由来するベクターとしては、ｐＨＥＢＯ、及びｐ２Ｏ５が挙げられる。他の例示的なベクターとしては、ｐＭＳＧ、ｐＡＶ００９／Ａ＋、ｐＭＴＯ１０／Ａ＋、ｐＭＡＭｎｅｏ－５、バキュロウイルスｐＤＳＶＥ、及びＳＶ－４０初期プロモーター、ＳＶ－４０後期プロモーター、メタロチオネインプロモーター、マウス乳腺腫瘍ウイルスプロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、ポリヘドリンプロモーター、又は真核細胞中の発現に有効であることが示されている他のプロモーターの指向下でタンパク質の発現を可能にする任意の他のベクターが挙げられる。

【0473】

上記のとおり、ウイルスは、多くの場合、宿主の防御機序を回避するように進化してきた、非常に特殊化した感染性因子である。典型的には、ウイルスは、特異的細胞タイプに感染し、それらにおいて伝播する。ウイルスベクターの標的化特異性は、所定の細胞タイプを特異的に標的化するその天然の特異性を利用し、それにより組換え遺伝子を感染細胞中に導入する。したがって、本発明の一部の実施形態により使用されるベクターのタイプは、形質転換される細胞タイプに依存する。形質転換される細胞タイプに従って好適なベクターを選択する能力は、十分に当業者の技能の範囲内であり、したがって選択の検討事項の一般的記載は本明細書に提供されない。例えば、骨髄細胞は、ヒトＴ細胞白血病ウイルスＩ型（ＨＴＬＶ－Ｉ）を使用して標的化することができ、腎臓細胞は、Liang CY et al., 2004 (Arch Virol. 149:51-60)に記載の、バキュロウイルスのAutographa californica核多角体病ウイルス（ＡｃＭＮＰＶ）中に存在する異種プロモーターを使用して標的化することができる。

【0474】

組換えウイルスベクターは、それらが水平感染及び標的化特異性などの利点を提供するため、ポリペプチドのインビボ発現に有用である。水平感染は、例えば、レトロウイルスの生活環に固有であり、単一の感染細胞が、出芽し、隣接細胞に感染する多くの子孫ビリオンを産生するプロセスである。その結果、広い範囲が急速に感染し、そのほとんどは、最初は元のウイルス粒子により感染されていなかったものである。これは、感染性因子が娘子孫を介してのみ伝播する垂直型の感染と対照的である。水平に伝播し得ないウイルスベクターを産生することもできる。この特徴は、所望の目的が規定された遺伝子を限局的な数の標的化細胞のみに導入することである場合に有用であり得る。

【0475】

種々の方法を使用して本発明の一部の実施形態の発現ベクターを細胞中に導入することができる。このような方法は、一般にSambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Laboratory, New York (1989, 1992)、Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, Md. (1989)、Chang et al., Somatic Gene Therapy, CRC Press, Ann Arbor, Mich.(1995)、Vega et al., Gene Targeting, CRC Press, Ann Arbor Mich. (1995), Vectors: A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses, Butterworths, Boston Mass. (1988)及びGilboa et at. [Biotechniques 4(6): 504-512, 1986]に記載されており、それとしては、例えば、安定的又は一過性形質移入、ポリエチレンイミンリポフェクション、エレクトロポレーション及び組換えウイルスベクターの感染が挙げられる。加えて、陽性陰性選択法については米国特許第５，４６４，７６４号明細書及び同第５，４８７，９９２号明細書を参照のこと。

【0476】

ウイルス感染による核酸の導入は、他の方法、例えば、リポフェクション及びエレクトロポレーションと比べていくつかの利点を提供する。それというのも、ウイルスの感染性の性質に起因してより高い形質移入効率を得ることができるからである。

【0477】

現在好ましいインビボ核酸移入技術としては、ウイルス又は非ウイルス構築物、例えば、アデノウイルス、レンチウイルス、単純ヘルペスウイルスＩ型、又はアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）及び脂質ベースの系による形質移入が挙げられる。遺伝子の脂質媒介移入に有用な脂質は、例えば、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＰＥ及びＤＣ－Ｃｈｏｌである［Tonkinson et al., Cancer Investigation, 14 (1):54-65 (1996)］。遺伝子療法における使用に最も好ましい構築物はウイルスであり、最も好ましくはアデノウイルス、ＡＡＶ、レンチウイルス、又はレトロウイルスである。ウイルス構築物、例えば、レトロウイルス構築物は、少なくとも１つの転写プロモーター／エンハンサー若しくは（１つ以上の）遺伝子座規定エレメント（ｌｏｃｕｓ－ｄｅｆｉｎｉｎｇ ｅｌｅｍｅｎｔ）、又は他の手段、例えば、メッセンジャーの選択的スプライシング、核ＲＮＡ輸送若しくは翻訳後修飾により遺伝子発現を制御する他のエレメントを含む。このようなベクター構築物は、ウイルス構築物中に既に存在しない限り、パッケージングシグナル、長い末端反復配列（ＬＴＲ）又はその一部、並びに使用されるウイルスに適切なプラス及びマイナス鎖プライマー結合部位も含む。加えて、このような構築物は、典型的には、構築物が装入される宿主細胞からのペプチドの分泌のためのシグナル配列を含む。好ましくは、この目的のためのシグナル配列は、哺乳類シグナル配列又は本発明の一部の実施形態のポリペプチドバリアントのシグナル配列である。任意選択で、構築物は、ポリアデニル化を指向するシグナル、並びに１つ以上の制限部位及び翻訳終結配列も含み得る。例として、このような構築物は、典型的には、５’ＬＴＲ、ｔＲＮＡ結合部位、パッケージングシグナル、第２鎖ＤＮＡ合成起点、及び３’ＬＴＲ又はその一部を含む。非ウイルス性の他のベクター、例えば、カチオン性脂質、ポリリジン、及びデンドリマーを使用することができる。

【0478】

上述のとおり、本発明の一部の実施形態の発現構築物は、挿入されるコード配列の転写及び翻訳に必要なエレメントの含有とは別に、発現されるポリペプチドの安定性、産生、精製、収率又は毒性を向上させるように工学操作された配列も含み得る。例えば、本発明の一部の実施形態のポリペプチド及び異種タンパク質を含む融合タンパク質又は開裂可能融合タンパク質の発現を工学操作することができる。このような融合タンパク質は、親和性クロマトグラフィーにより、例えば、異種タンパク質に特異的なカラム上の固定化により融合タンパク質が容易に単離され得るように設計することができる。本発明の一部の実施形態のポリペプチドと異種タンパク質との間に開裂部位を工学操作した場合、開裂部位を破壊する適切な酵素又は薬剤で処理することにより、ポリペプチドをクロマトグラフィーカラムから放出させることができる［例えば、Booth et al. (1988) Immunol. Lett. 19:65-70、及びGardella et al., (1990) J. Biol. Chem. 265:15854-15859を参照のこと］。

【0479】

本発明は、本明細書に記載の組成物を含む細胞並びにそれを生成及び使用する方法も企図する。

【0480】

したがって、本発明の一態様によれば、ＬＩＬＲＢ（例えば、ＬＩＬＲＢ２、ＬＩＬＲＢ１）ポリペプチド、それを含む融合ポリペプチド若しくは二量体、又はそれをコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞が提供される。

【0481】

上述のとおり、種々の原核又は真核細胞を本発明の一部の実施形態のポリペプチドを発現させるための宿主発現系として使用することができる。これらとしては、限定されるものではないが、微生物、例えば、コード配列を含有する組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ又はコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換された細菌、コード配列を含有する組換え酵母発現ベクターで形質転換された酵母、コード配列を含有する、組換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ、タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）に感染され、又は組換えプラスミド発現ベクター、例えば、Ｔｉプラスミドで形質転換された植物細胞系が挙げられる。哺乳類発現系を使用して本発明の一部の実施形態のポリペプチドを発現させることもできる。

【0482】

細菌構築物の例としては、E. coli発現ベクターのｐＥＴ系列が挙げられる［Studier et al. (1990) Methods in Enzymol. 185:60-89）。

【0483】

本発明の教示とともに使用することができる真核細胞の例としては、限定されるものではないが、哺乳類細胞、真菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞、藻類細胞又は植物細胞が挙げられる。

【0484】

酵母において、米国特許出願第５，９３２，４４７号に開示されている構成的又は誘導性プロモーターを含有する多数のベクターを使用することができる。或いは、酵母染色体中への外来ＤＮＡ配列の組み込みを促進するベクターを使用することができる。

【0485】

植物発現ベクターが使用される場合、多数のプロモーターによりコード配列の発現をドライブすることができる。例えば、ウイルスプロモーター、例えば、ＣａＭＶの３５Ｓ ＲＮＡ及び１９Ｓ ＲＮＡプロモーター［Brisson et al. (1984) Nature 310:511-514］、又はＴＭＶのコートタンパク質プロモーター［Takamatsu et al. (1987) EMBO J. 6:307-311］を使用することができる。或いは、植物プロモーター、例えば、ＲＵＢＩＳＣＯの小サブユニット［Coruzzi et al. (1984) EMBO J. 3:1671-1680及びBrogli et al., (1984) Science 224:838-843］又は熱ショックプロモーター、例えば、ダイズｈｓｐ１７．５－Ｅ又はｈｓｐ１７．３－Ｂ［Gurley et al. (1986) Mol. Cell. Biol. 6:559-565］を使用することができる。これらの構築物は、Ｔｉプラスミド、Ｒｉプラスミド、植物ウイルスベクター、ダイレクトＤＮＡ形質転換、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション及び当業者に周知の他の技術を使用して、植物細胞中に導入することができる。例えば、Weissbach & Weissbach, 1988, Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, NY, Section VIII, pp 421-463を参照のこと。

【0486】

他の発現系、例えば、当技術分野において周知の昆虫及び哺乳類宿主細胞系を本発明の一部の実施形態により使用することもできる。

【0487】

具体的な実施形態によれば、細胞は、哺乳類細胞である。

【0488】

具体的な実施形態によれば、細胞は、ヒト細胞である。

【0489】

具体的な実施形態によれば、細胞は、ヒト胚に由来しない。

【0490】

具体的な実施形態によれば、細胞は、単離細胞である。

【0491】

具体的な実施形態によれば、細胞は、細胞系である。

【0492】

別の具体的な実施形態によれば、細胞は、初代細胞である。

【0493】

細胞は、限定されるものではないが、血液、筋肉、神経、脳、心臓、肺、肝臓、膵臓、脾臓、胸腺、食道、胃、腸、腎臓、精巣、卵巣、毛髪、皮膚、骨、乳房、子宮、膀胱、脊髄、又は種々の種類の体液を含む好適な組織に由来し得る。細胞は、胚、胎児及び成体期を含む任意の発生段階、並びに任意の発生起源、すなわち、外胚葉、中胚葉、及び内胚葉起源に由来し得る。

【0494】

哺乳類細胞の非限定的な例としては、ＳＶ４０により形質転換されたサル腎臓ＣＶ１系（ＣＯＳ、例えば、ＣＯＳ－７、ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６５１）、ヒト胚腎臓系（ＨＥＫ２９３又は懸濁液培養物中の成長のためにサブクローニングされたＨＥＫ２９３細胞、Graham et al., J. Gen Virol., 36:59 1977）、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ１０）、マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 1980）、サル腎臓細胞（ＣＶ１ ＡＴＣＣ ＣＣＬ７０）、アフリカミドリザル腎臓細胞（ベロ－７６、ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１５８７）、ヒト子宮頸癌腫細胞（ヒーラ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ２）、ＮＩＨ３Ｔ３、ジャーカット、イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ３４）、バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ ３Ａ、ＡＴＣＣ ＣＲＬ１４４２）、ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ ＣＣＬ７５）、ヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ Ｇ２、ＨＢ８０６５）、マウス乳腺腫瘍（ＭＭＴ０６０５６２、ＡＴＣＣ ＣＣＬ５１）、ＴＲＩ細胞（Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci., 383:44-68 1982）、ＭＲＣ５細胞、ＦＳ４細胞、並びにヒトヘパトーマ系（Ｈｅｐ Ｇ２）、ＰＥＲ．Ｃ６、Ｋ５６２、及びチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）が挙げられる。

【0495】

本発明の一部の実施形態によれば、哺乳類細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）、ＨＥＫ２９３、ＰＥＲ．Ｃ６、ＨＴ１０８０、ＮＳ０、Ｓｐ２／０、ＢＨＫ、ナマルバ、ＣＯＳ、ヒーラ及びベロ細胞からなる群より選択される。

【0496】

本発明の一部の実施形態によれば、宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）、ＰＥＲ．Ｃ６又は２９３（例えば、エクスピ２９３Ｆ）細胞を含む。

【0497】

本発明の別の態様によれば、ポリペプチドを産生する方法であって、本明細書に記載のポリヌクレオチド若しくは核酸構築物を宿主細胞に導入すること又は本明細書に記載のポリヌクレオチド若しくは核酸構築物を発現する細胞を培養することを含む方法が提供される。

【0498】

具体的な実施形態によれば、方法は、インビトロ又はエクスビボ法である。

【0499】

具体的な実施形態によれば、産生は、３２～３７℃、５～１０％のＣＯ_２で５～１３日間培養することを含む。

【0500】

本発明の具体的な実施形態で使用することができる産生条件の非限定的な例は、以下の実施例の項に開示される。

【0501】

したがって、例えば、ポリペプチドをコードする発現ベクターを哺乳類細胞、例えば、エクスピ２９３Ｆ、エクスピＣＨＯ細胞、ＣＨＯ－Ｋ１、ＣＨＯ－Ｓ、ＣＨＯ－ＤＵＣ又はＣＨＯ－ＤＧ４４中に導入する。次いで、形質移入された細胞を細胞特異的培養培地中で３２～３７℃、５～１０％のＣＯ_２で培養し、少なくとも５日間の培養後、タンパク質を上清から収集し、精製する。

【0502】

具体的な実施形態によれば、培養は、回分、分割回分（ｓｐｌｉｔ－ｂａｔｃｈ）、流加、又は灌流方式で操作される。

【0503】

具体的な実施形態によれば、培養は、流加条件で操作される。

【0504】

具体的な実施形態によれば、培養は、３６．５℃で行われる。

【0505】

具体的な実施形態によれば、培養は、３６．５℃で行われ、３２℃への温度シフトを伴う。この温度シフトは、定常期に達する前に細胞代謝を減速させるために行うことができる。

【0506】

具体的な実施形態によれば、方法は、ＬＩＬＲＢ（例えば、ＬＩＬＲＢ２、ＬＩＬＲＢ１）ポリペプチド、融合ポリペプチド又は二量体を単離することを含む。

【0507】

具体的な実施形態によれば、組換えポリペプチドの回収は、適切な時間の培養後に行われる。

【0508】

具体的な実施形態によれば、組換えポリペプチドの回収は、ヘテロ二量体を含有する全培養培地を収集することを指し、追加の分離又は精製のステップを意味することを必要としない。具体的な実施形態によれば、本発明の一部の実施形態のポリペプチドは、種々の標準的なタンパク質精製技術、例えば、限定されるものではないが、親和性クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、濾過、電気泳動、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、コンカナバリンＡクロマトグラフィー、ミックスモードクロマトグラフィー、金属親和性クロマトグラフィー、レクチン親和性クロマトグラフィー、クロマトフォーカシング及び示差的可溶化（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｓｏｌｕｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ）を使用して精製することができる。

【0509】

具体的な実施形態によれば、産生及び精製後、ポリペプチドの治療効力をインビボ又はインビトロのいずれかでアッセイすることができる。このような方法は当技術分野において公知であり、例えば、結合、細胞生存率、トランスジェニックマウスの生存、及び活性化マーカーの発現が挙げられる。

【0510】

本発明の一部の実施形態の組成物［例えば、本明細書に記載のＬＩＬＲＢ（例えば、ＬＩＬＲＢ２、ＬＩＬＲＢ１）ポリペプチド、それを含む組成物、融合タンパク質若しくは二量体、それをコードするポリヌクレオチド及び／又は細胞］は、それ自体で、又は組成物が好適な担体若しくは賦形剤と混合された医薬組成物で生物に投与することができる。

【0511】

したがって、本発明は、一部の実施形態において、治療有効量の本明細書に開示される組成物を含む医薬組成物を特徴とする。

【0512】

本明細書において、用語「活性成分」は、生物学的効果を担う組成物［例えば、本明細書に記載のＬＩＬＲＢ（例えば、ＬＩＬＲＢ２、ＬＩＬＲＢ１）ポリペプチド、それを含む組成物、融合タンパク質若しくは二量体、それをコードするポリヌクレオチド及び／又は細胞］を指す。

【0513】

本明細書において、用語「賦形剤」は、活性成分の投与をさらに容易にするために医薬組成物に添加される不活性物質を指す。賦形剤の例としては、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、種々の糖及びデンプンのタイプ、セルロース誘導体、ゼラチン、植物油及びポリエチレングリコールが挙げられる。

【0514】

以下、互換的に使用することができる語句「生理学的に許容可能な担体」及び「薬学的に許容可能な担体」は、生物に対する顕著な刺激を引き起こさず、投与される化合物の生物学的活性及び特性を抑止しない担体又は希釈剤を指す。これらの語句にはアジュバントが含まれる。

【0515】

本明細書において使用される場合、「薬学的に許容可能な担体」には、生理学的に適合性であるあらゆる溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤などが含まれる。好ましくは、担体は、静脈内、筋肉内、皮下、非経口、脊髄又は上皮投与（例えば、注射又は注入による）に好適である。活性化合物は、投与経路に応じて１つ以上の薬学的に許容可能な塩を含み得る。「薬学的に許容可能な塩」は、親化合物の所望の生物学的活性を保持し、いかなる不所望な毒性学的効果も付与しない塩を指す（例えば、Berge, S.M., et al. (1977) J. Pharm. Sci. 66:1-19を参照のこと）。このような塩の例としては、酸付加塩及び塩基付加塩が挙げられる。酸付加塩としては、非毒性の無機酸、例えば、塩酸、硝酸、リン酸、硫酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、亜リン酸などに由来するもの、並びに非毒性の有機酸、例えば、脂肪族モノ及びジカルボン酸、フェニル置換アルカン酸、ヒドロキシアルカン酸、芳香族酸、脂肪族及び芳香族スルホン酸などに由来するものが挙げられる。塩基付加塩としては、アルカリ土類金属、例えば、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウムなどに由来するもの、並びに非毒性の有機アミン、例えば、Ｎ，Ｎ’－ジベンジルエチレンジアミン、Ｎ－メチルグルカミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、プロカインなどに由来するものが挙げられる。

【0516】

本発明の少なくとも一部の実施形態による医薬組成物は、薬学的に許容可能な酸化防止剤も含み得る。薬学的に許容可能な酸化防止剤の例としては、（１）水溶性酸化防止剤、例えば、アスコルビン酸、システイン塩酸塩、重硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウムなど、（２）油溶性酸化防止剤、例えば、パルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、レシチン、没食子酸プロピル、アルファ－トコフェロールなど、及び（３）金属キレート剤、例えば、クエン酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ソルビトール、酒石酸、リン酸などが挙げられる。本発明の少なくとも一部の実施形態による医薬組成物は、添加剤、例えば、洗浄剤及び可溶化剤（例えば、ツイーン２０（ポリソルベート－２０）、ツイーン８０（ポリソルベート－８０））及び保存剤（例えば、チメルゾール（Ｔｈｉｍｅｒｓｏｌ）、ベンジルアルコール）並びに増量物質（例えば、ラクトース、マンニトール）も含み得る。

【0517】

本発明の少なくとも一部の実施形態による医薬組成物に用いることができる好適な水性及び非水性の担体の例としては、水、種々の緩衝液含有物（例えば、トリス－ＨＣｌ、酢酸塩、リン酸塩）、ｐＨ及びイオン強度の緩衝生理食塩水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）、及びそれらの好適な混合物、植物油、例えば、オリーブ油、並びに注射用有機エステル、例えば、オレイン酸エチルが挙げられる。

【0518】

適切な流動性は、例えば、コーティング材料、例えば、レシチンの使用により、分散液の場合には要求される粒子サイズの維持により、及び界面活性剤の使用により維持することができる。

【0519】

これらの組成物は、アジュバント、例えば、保存剤、湿潤剤、乳化剤及び分散剤も含有し得る。微生物の存在の予防は、前掲の滅菌手順、並びに種々の抗菌剤及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノールソルビン酸などの包含の両方により確保することができる。等張剤、例えば、糖、塩化ナトリウムなどを組成物中に含めることが望ましい場合もある。加えて、注射医薬形態の持続的吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンの包含によりもたらすことができる。

【0520】

薬学的に許容可能な担体としては、無菌水溶液又は分散液及び無菌注射溶液又は分散液の即時調製のための無菌粉末が挙げられる。薬学的に活性な物質のためのこのような媒体及び薬剤の使用は、当技術分野において公知である。任意の慣用の媒体又は薬剤が活性化合物と不適合性である場合を除き、本発明の少なくとも一部の実施形態による医薬組成物におけるその使用が企図される。補助的な活性化合物を組成物中に取り込むこともできる。

【0521】

治療組成物は、典型的には、製造及び貯蔵の条件下で無菌で安定的でなければならない。組成物は、液剤、マイクロエマルジョン、リポソーム、又は高い薬物濃度に好適な他の秩序構造として製剤化することができる。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコールなど）、及びそれらの好適な混合物を含有する溶媒又は分散媒であり得る。適切な流動性は、例えば、コーティング、例えば、レシチンの使用により、分散液の場合には要求される粒子サイズの維持により、及び界面活性剤の使用により維持することができる。多くの場合、等張剤、例えば、糖、多価アルコール、例えば、マンニトール、ソルビトール、又は塩化ナトリウムを組成物中に含めることが好ましい。注射組成物の持続的吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸塩及びゼラチンを組成物中に含めることによりもたらすことができる。無菌注射溶液は、要求量の活性化合物を適切な溶媒中に、必要に応じて上記に列挙される成分の１つ又は組み合わせと取り込み、続いて滅菌精密濾過を行うことにより調製することができる。一般に、分散液は、基礎分散媒及び上記に列挙されるものからの要求される他の成分を含有する滅菌ビヒクル中に活性化合物を取り込むことにより調製される。無菌注射溶液の調製のための無菌粉末の場合、好ましい調製方法は、活性成分と任意の追加の所望の成分の粉末を、予め滅菌濾過されたその溶液から生じさせる真空乾燥及びフリーズドライ（凍結乾燥）である。

【0522】

無菌注射溶液は、要求される量の活性化合物を適切な溶媒中に、要求に応じて上記に列挙される成分の１つ又は組み合わせと取り込み、続いて滅菌精密濾過を行うことにより調製することができる。一般に、分散液は、基礎分散媒及び上記に列挙されるものからの要求される他の成分を含有する無菌ビヒクル中に活性化合物を取り込むことにより調製される。無菌注射溶液の調製のための無菌粉末の場合、好ましい調製方法は、活性成分と任意の追加の所望の成分の粉末を、予め滅菌濾過されたその溶液から生じさせる真空乾燥及びフリーズドライ（凍結乾燥）である。

【0523】

単一剤形を産生するために担体材料と組み合わせることができる活性成分の量は、治療されている対象、及び特定の投与方式に応じて変動する。単一剤形を産生するために担体材料と組み合わせることができる活性成分の量は、一般に、治療効果をもたらす組成物の量である。一般に、この量は、１００パーセントのうち、約０．０１パーセント～約９９パーセントの活性成分、好ましくは、約０．１パーセント～約７０パーセント、最も好ましくは約１パーセント～約３０パーセントの薬学的に許容可能な担体との組み合わせの活性成分の範囲である。

【0524】

投与量レジメンは、最適な所望の応答（例えば、治療応答）を提供するように調整される。例えば、単回ボーラスを投与することができ、いくつかの分割用量を経時的に投与することができ、又は治療状況の緊急性により示されるとおり用量を比例的に低減若しくは増加させることができる。投与の容易性及び投与量の均一性のために単位剤形の非経口組成物を製剤化することが特に有利である。本明細書において使用される単位剤形は、治療すべき対象のための単位投与量として好適な物理的に区別される単位を指し、各単位は、要求される薬学的担体を伴って所望の治療効果をもたらすように計算された所定量の活性化合物を含有する。本発明の少なくとも一部の実施形態による単位剤形についての仕様は、（ａ）活性化合物のユニークな特徴及び達成すべき特定の治療効果、並びに（ｂ）個体の感受性の治療のためにそのような活性化合物を配合する当技術分野における固有の制約により定められ、それらに直接依存的である。

【0525】

薬物の製剤化及び投与のための技術は、参照により本明細書に組み込まれる“Remington’s Pharmaceutical Sciences,” Mack Publishing Co., Easton, PAの最新版に見出すことができる。

【0526】

本発明の一部の実施形態の医薬組成物は、当技術分野において周知のプロセスにより、例えば、慣用の混合、溶解、造粒、糖衣錠作製、すり潰し、乳化、カプセル化、捕捉又は凍結乾燥プロセスにより製造することができる。

【0527】

本発明の組成物は、当技術分野において公知の種々の方法の１つ以上を使用して、１つ以上の投与経路を介して投与することができる。当業者により認識されるとおり、投与経路及び／又は方式は、所望の結果に応じて変動する。本発明の少なくとも一部の実施形態による治療剤の好ましい投与経路としては、血管内送達（例えば、注射又は注入）、静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内、皮下、脊髄、経口、経腸、直腸、肺（例えば、吸入）、鼻腔、局所（経皮、頬側及び舌下を含む）、膀胱内、硝子体内、腹腔内、腟、脳送達（例えば、脳室内、脳内、及び対流強化拡散）、ＣＮＳ送達（例えば、髄腔内、脊髄周囲（ｐｅｒｉｓｐｉｎａｌ）、及び脊髄内）若しくは非経口（皮下、筋肉内、腹腔内、静脈内（ＩＶ）及び皮内を含む）、経皮（受動的又はイオントフォレシス若しくはエレクトロポレーションの使用のいずれか）、経粘膜（例えば、舌下投与、鼻腔、腟、直腸、又は舌下）の投与、又はインプラントを介する投与、又は例えば、注射若しくは注入による他の非経口投与経路、又は当技術分野において公知の他の送達経路及び／若しくは投与の形態が挙げられる。本明細書において使用される語句「非経口投与」は、経腸及び局所投与以外の投与方式を意味し、通常、注射によるものであり、それとしては、限定されるものではないが、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、嚢下、くも膜下、脊髄内、硬膜外及び胸骨内の注射及び注入又は生体内分解性インサートの使用が挙げられ、各投与経路に適切な剤形で製剤化することができる。具体的な実施形態において、本発明の少なくとも一部の実施形態によるタンパク質、治療剤又は医薬組成物は、腹腔内又は静脈内投与することができる。

【0528】

具体的な実施形態によれば、本明細書において開示される組成物は、水溶液中で非経口注射により投与される。製剤は、懸濁液又はエマルジョンの形態でもよい。一般に、有効量の本明細書に記載の組成物を含む非経口注射のための医薬組成物が提供され、それは任意選択で薬学的に許容可能な希釈剤、保存剤、可溶化剤、乳化剤、アジュバント及び／又は担体を含む。このような組成物は、任意選択で、以下の１つ以上：希釈剤、滅菌水、種々の緩衝液含有物（例えば、トリス－ＨＣｌ、酢酸塩、リン酸塩）、ｐＨ及びイオン強度の緩衝生理食塩水、並びに添加剤、例えば、洗浄剤及び可溶化剤（例えば、ツイーン２０（ポリソルベート－２０）、ツイーン８０（ポリソルベート－８０））、酸化防止剤（例えば、水溶性酸化防止剤、例えば、アスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム、システイン塩酸塩、重硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、油溶性酸化防止剤、例えば、パルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、レシチン、没食子酸プロピル、アルファ－トコフェロール、及び金属キレート剤、例えば、クエン酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ソルビトール、酒石酸、リン酸）、及び保存剤（例えば、チメルゾール、ベンジルアルコール）並びに増量物質（例えば、ラクトース、マンニトール）を含む。非水性溶媒又はビヒクルの例は、エタノール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油、例えば、オリーブ油及びトウモロコシ油、ゼラチン、並びに注射用有機エステル、例えば、オレイン酸エチルである。製剤は、フリーズドライ（凍結乾燥）又は真空乾燥し、使用直前に再溶解／再懸濁させることができる。製剤は、例えば、細菌保持フィルタに通す濾過により、滅菌剤を組成物中に組み込むことにより、組成物を放射線照射することにより、又は組成物を加熱することにより滅菌することができる。

【0529】

本明細書に開示される種々の組成物（例えば、ポリペプチド）は、局所適用することができる。局所投与は、ほとんどのペプチド製剤についてそれほど機能しないが、それは特に肺、鼻腔、口腔（舌下、頬側）、腟、又は直腸粘膜に適用される場合に有効であり得る。

【0530】

本発明の組成物は、約５ミクロン未満の空気力学的直径を有するエアロゾル又は噴霧乾燥粒子のいずれかとして送達する場合、吸入中に肺に送達することができ、肺上皮層を越えて血流に移動し得る。限定されるものではないが、ネブライザー、定量吸入器、及び粉末吸入器を含む、治療製品の肺送達用に設計された広範な機械デバイスを使用することができ、それらの全て当業者によく知られている。市販デバイスの一部の具体例は、ウルトラベントネブライザー（ミズーリ、セントルイス、Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ Ｉｎｃ．製）、エイコーンＩＩネブライザー（コロラド、エングルウッド、Ｍａｒｑｕｅｓｔ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ社製）、ベントリン定量吸入器（ノースカロライナ、リサーチトライアングルパーク、Ｇｌａｘｏ Ｉｎｃ．製）、及びスピンヘイラー粉末吸入器（マサチューセッツ、ベドフォード、Ｆｉｓｏｎｓ Ｃｏｒｐ．製）である。Ｎｅｋｔａｒ社、Ａｌｋｅｒｍｅｓ社及びＭａｎｎｋｉｎｄ社は全て、承認された吸入可能インスリン粉末調製物を有し、又は技術が本明細書に記載の製剤に適用され得る臨床試験中である。

【0531】

粘膜への投与のための製剤は、典型的には、錠剤、ゲル剤、カプセル剤、懸濁液又はエマルジョン中に取り込むことができる噴霧乾燥薬物粒子である。標準的な医薬賦形剤は、任意の製剤業者から入手可能である。経口製剤は、チューインガム、ゲルストリップ、錠剤又はロゼンジの形態であり得る。

【0532】

経皮製剤を調製することもできる。これらは、典型的には、軟膏剤、ローション剤、噴霧剤、又は貼付剤であり、それらの全ては標準的な技術を使用して調製することができる。経皮製剤は、浸透向上剤の包含を要求する。本発明の医薬組成物中の活性成分の実際の投与量レベルは、患者への毒性なしで、特定の患者、組成物、及び投与方式について所望の治療応答を達成するために有効な量の活性成分を得るように変えることができる。選択される投与量レベルは、用いられる特定の本発明の組成物の活性、投与経路、投与時間、用いられている特定の化合物の排泄速度、治療の継続期間、用いられる特定の組成物との組み合わせで使用される他の薬物、化合物及び／又は材料、治療されている患者の年齢、性別、体重、病態、全身健康状態及び既往歴を含む種々の薬物動態学的要因、並びに医学分野において周知の同様の要因に依存する。

【0533】

具体的な実施形態によれば、本明細書に開示される組成物は、対象に治療有効量で投与される。本明細書において使用される場合、用語「有効量」又は「治療有効量」は、治療されている障害の１つ以上の症状を治療し、阻害し、若しくは緩和するために十分であり、又はそうでなければ所望の薬理学的及び／又は生理学的効果を提供するために十分な投与量を意味する。治療有効量の決定は、特に本明細書に提供される詳細な開示に照らして十分に当業者の技能の範囲内である。

【0534】

本発明の方法において使用される任意の調製物について、治療有効量又は用量は、インビトロ及び細胞培養アッセイから最初に推定することができる。例えば、用量は、所望の濃度又は力価を達成するように動物モデルにおいて製剤化することができる。このような情報を使用してヒトにおける有用な用量をより正確に決定することができる。本明細書に記載の活性成分の毒性及び治療効力は、インビトロで、細胞培養物又は実験動物において標準的な医薬手順により決定することができる。これらのインビトロ及び細胞培養アッセイ並びに動物試験から得られたデータは、ヒトにおける使用のための投与量の範囲の製剤化において使用することができる。投与量は、用いられる剤形及び利用される投与経路に応じて変動し得る。正確な製剤化、投与経路及び投与量は、個々の医師により患者の病態を考慮して選択され得る（例えば、“The Pharmacological Basis of Therapeutics”, Ch.1 p.1内のFingl,et al., 1975を参照のこと）。

【0535】

投与量の量及び間隔は、生物学的効果を誘導又は抑制するために十分である活性成分のレベル（最小有効濃度、ＭＥＣ）を提供するように個々に調整することができる。ＭＥＣは、各調製物について変動するが、インビトロデータから推定することができる。ＭＥＣを達成するために必要な投与量は、個々の特徴及び投与経路に依存する。検出アッセイを使用して血漿濃度を決定することができる。

【0536】

治療すべき病態の重症度及び応答性に応じて、投薬は、単回又は複数回投与のものであり得、治療の過程は数日間から数週間まで、又は治癒がなされ、若しくは病状の縮小が達成されるまで持続する。

【0537】

投与すべき組成物の量は、無論、治療されている対象、苦痛の重症度、投与様式、処方医の判断などに依存的である。

【0538】

ある実施形態において、組成物［例えば、本明細書に記載のＬＩＬＲＢ（例えば、ＬＩＬＲＢ２、ＬＩＬＲＢ１）ポリペプチド、それを含む組成物、融合タンパク質若しくは二量体、それをコードするポリヌクレオチド及び／又は細胞］は、例えば、治療すべき部位への直接注射により局所投与される。典型的には、注射は、全身投与により達成され得る濃度よりも高い、組成物の局所濃度の増加を引き起こす。組成物を上記のマトリックスと組み合わせ、治療すべき部位からのポリペプチドの受動拡散を低減させることにより、ポリペプチド組成物の局所濃度増加の作出を支援することができる。

【0539】

本発明の医薬組成物は、当技術分野において公知の医療デバイスを用いて投与することができる。例えば、任意選択の実施形態において、本発明の少なくとも一部の実施形態による医薬組成物は、有針皮下注射デバイス、例えば、米国特許第５，３９９，１６３号明細書、同第５，３８３，８５１号明細書、同第５，３１２，３３５号明細書、同第５，０６４，４１３号明細書、同第４，９４１，８８０号明細書、同第４，７９０，８２４号明細書、又は同第４，５９６，５５６号明細書に開示されているデバイスを用いて投与することができる。本発明において有用な周知のインプラント及びモジュールの例としては、医薬を制御速度で分注するための埋め込み型微量注入ポンプを開示する米国特許第４，４８７，６０３号明細書、皮膚を介して医薬を投与するための治療デバイスを開示する米国特許第４，４８６，１９４号明細書、医薬を正確な注入速度で送達するための医薬注入ポンプを開示する米国特許第４，４４７，２３３号明細書、連続的な薬物送達のための流量可変埋め込み型注入装置を開示する米国特許第４，４４７，２２４号明細書、マルチチャンバーコンパートメントを有する浸透圧薬物送達系を開示する米国特許第４，４３９，１９６号明細書、及び浸透圧薬物送達系を開示する米国特許第４，４７５，１９６号明細書が挙げられる。これらの特許は、参照により本明細書に組み込まれる。多くの他のこのようなインプラント、送達系、及びモジュールが当業者に公知である。

【0540】

活性化合物は、化合物を急速な放出から保護する担体を用いて調製することができ、これは、例えば、インプラント、経皮貼付剤、及びマイクロカプセル化送達系を含む放出制御製剤である。生分解性の生体適合性ポリマー、例えば、エチレン酢酸ビニル、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、及びポリ乳酸を使用することができる。このような製剤を調製するための多くの方法は特許されており、又は一般に当業者に公知である。例えば、Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R.Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978を参照のこと。

【0541】

ポリマーデバイス（ロッド、シリンダ、フィルム、ディスク）の埋め込み又は注射（マイクロ粒子）後の長期全身放出のための放出制御ポリマーデバイスを作製することができる。マトリックスは、マイクロ粒子、例えば、ペプチドが固体ポリマーマトリックス内に分散されるマイクロスフェア又はコアがポリマーシェルと異なる材料のものであり、実質的に液体又は固体であり得るコア中でペプチドが分散若しくは懸濁されているマイクロカプセルの形態であり得る。本明細書において具体的に定義されない限り、マイクロ粒子、マイクロスフェア、及びマイクロカプセルは、互換的に使用される。或いは、ポリマーは、ナノメートル単位から４センチメートルまでの範囲の薄いスラブ若しくはフィルムとして成型することができ、粉砕若しくは他の標準的な技術により生成される粉末であり得、又はさらにはゲル、例えば、ヒドロゲルであり得る。

【0542】

非生分解性又は生分解性マトリックスのいずれも本明細書に開示される活性薬剤の送達に使用することができるが、生分解性マトリックスが好ましい。これらは、天然又は合成ポリマーであり得るが、分解及び放出プロファイルのより良好な特徴付けに起因して合成ポリマーが好ましい。ポリマーは、放出が所望される期間に基づき選択される。一部の場合、線形放出が最も有用であり得るが、他の場合、パルス放出又は「バルク放出」がより有効な結果を提供し得る。ポリマーは、ヒドロゲル（典型的には最大約９０重量％の水を吸収する）の形態であり得、任意選択で多価イオン又はポリマーと架橋させることができる。

【0543】

マトリックスは、溶媒蒸発、噴霧乾燥、溶媒抽出及び当業者に公知の他の方法により形成することができる。生体内分解性マイクロスフェアは、例えば、Mathiowitz and Langer, J. Controlled Release, 5:13-22(1987)、 Mathiowitz ,et al., Reactive Polymers, 6:275-283 (1987)、及びMathiowitz, et al., J. Appl Polymer ScL, 35:755-774 (1988)に記載されている、薬物送達のためのマイクロスフェアの作製のために開発された方法のいずれかを使用して調製することができる。

【0544】

デバイスは、典型的には、身体全体の治療のための投与量よりもかなり少ない投与量を送達する埋め込み若しくは注射の領域を治療する局所放出のために製剤化することができ、又は全身送達のために製剤化することができる。これらは、皮下、筋肉、脂肪中に埋め込み、若しくは注射し、又は嚥下させることができる。

【0545】

ある実施形態において、本発明の少なくとも一部の実施形態による治療化合物がＢＢＢを通過することを確保するため（所望される場合）、それらを、例えば、リポソーム中で製剤化することができる。リポソームの製造方法については、例えば、米国特許第４，５２２，８１１号明細書、同第５，３７４，５４８号明細書、及び同第５，３９９，３３１号明細書を参照のこと。リポソームは、特異的な細胞又は器官中に選択的に輸送され、したがって標的化薬物送達を向上させる１つ以上の部分を含み得る（例えば、V.V. Ranade (1989) J. Clin. Pharmacol. 29:685を参照のこと）。例示的な標的化部分としては、葉酸塩又はビオチン（例えば、Low et al.の米国特許第５，４１６，０１６号明細書を参照のこと）、マンノシド（Umezawa et al., (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 153:1038）、抗体（P.G. Bloeman et al. (1995) FEBS Lett. 357:140、M.Owais et al. (1995) Antimicrob. Agents Chemother. 39:180）、サーファクタントプロテインＡ受容体（Briscoe et al. (1995) Am. J Physiol. 1233: 134)、ｐ１２０（Schreier et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:9090）が挙げられ、K. Keinanen, M.L. Laukkanen (1994) FEBS Lett. 346:123, J.J. Killion, I.J. Fidler (1994) Immunomethods 4:273も参照のこと。

【0546】

本発明の一部の実施形態の組成物は、所望により、活性成分を含有する１つ以上の単位剤形を含有し得るパック又はディスペンサーデバイス、例えば、ＦＤＡ承認キットとして提供することができる。パックは、例えば、金属又はプラスチック箔、例えば、ブリスターパックを含み得る。パック又はディスペンサーデバイスには、投与についての説明書が添付され得る。パック又はディスペンサーには、医薬品の製造、使用又は販売を規制する行政機関により規定される形態の容器に付随する通知も収められ得、その通知は、組成物の形態又はヒト若しくは動物投与のその機関による承認を反映するものである。このような通知は、例えば、処方薬についての米国食品医薬品局により承認されたラベリング又は承認された製品の添付文書のものであり得る。適合性の薬学的担体中で製剤化された本発明の調製物を含む組成物を調製し、適切な容器中に装入し、さらに上記で詳述された適応される病態の治療についてラベリングすることもできる。

【0547】

具体的な実施形態によれば、本明細書に記載の遺伝子、ポリヌクレオチド、タンパク質、ポリペプチド及び／又はタンパク質性部分のいずれも、ヒト遺伝子、ポリヌクレオチド、タンパク質、ポリペプチド及び／若しくはタンパク質性部分の配列又は本明細書に記載の所望の活性を示すそれらの機能的断片若しくはホモログを有し得る。

【0548】

具体的な実施形態によれば、遺伝子、ポリヌクレオチド、タンパク質、ポリペプチド及び／又はタンパク質性部分は、ヒト起源のものである。

【0549】

他の具体的な実施形態によれば、遺伝子、ポリヌクレオチド、タンパク質、ポリペプチド及び／又はタンパク質性部分は、ヒト遺伝子、ポリヌクレオチド、タンパク質、ポリペプチド及び／又はタンパク質性部分のホモログである。このようなホモログは、例えば、ヒト配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％同一又は相同であり得る。

【0550】

本明細書において使用される場合、用語「約」は、±１０％を指す。

【0551】

用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する」及びそれらの活用形は、「限定されるものではないが、～を含む」を意味する。

【0552】

用語「からなる」は、「～を含み、～に限定される」ことを意味する。

【0553】

用語「から本質的になる」は、組成物、方法又は構造が追加の成分、ステップ及び／又は部分を含み得ることを意味するが、追加の成分、ステップ及び／又は部分が、特許請求される組成物、方法又は構造の基本的で新規な特徴を実質的に変更しない場合のみである。

【0554】

本明細書において使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」には、文脈が特に明示しない限り、複数の参照対象が含まれる。例えば、用語「化合物」又は「少なくとも１つの化合物」には複数の化合物も含まれ、それらの混合物も含まれ得る。

【0555】

本明細書全体にわたり、本発明の種々の実施形態は、範囲形式で提示され得る。範囲形式での記載は単に簡便性及び簡潔さのためであることが理解されるべきであり、本発明の範囲の変更不可能な限定と解釈されるべきではない。したがって、範囲の記載は、全ての可能な部分的範囲及びその範囲内の個々の数値を具体的に開示しているとみなされるべきである。例えば、範囲、例えば、１～６という記載は、部分範囲、例えば、１～３、１～４、１～５、２～４、２～６、３～６など、並びにその範囲内の個々の数値、例えば、１、２、３、４、５及び６を具体的に開示しているとみなされるべきである。これは、範囲の幅に関係なく適用される。

【0556】

数値範囲が本明細書に示す場合は常に、それは示される範囲内の任意の引用数（分数又は整数）を含むことを意味する。第１の示される数と第２の示される数との「間の範囲である／間の範囲」という語句及び第１の示される数「から」第２の示される数「までの範囲である／までの範囲」という語句は本明細書において互換的に使用され、第１及び第２の示される数並びにそれらの間の全ての分数及び整数の数値を含むことを意味する。

【0557】

本明細書において使用される場合、用語「方法」は、限定されるものではないが、化学、薬理学、生物学、生化学及び医療分野の実務者に公知の、又はその実務者により公知の様式、手段、技術及び手順から容易に開発される様式、手段、技術及び手順を含む、所与の課題を遂行するための様式、手段、技術及び手順を指す。

【0558】

特定の配列表が参照される場合、そのような参照は、例えば、シーケンシングエラー、クローニングエラー、又は塩基置換、塩基欠失若しくは塩基付加をもたらす他の変更から生じる、わずかな配列変異を含む相補的配列に実質的に対応する配列も包含するものと理解されるべきであり、但しそのような変異の頻度は、５０ヌクレオチド中１つ未満、或いは、１００ヌクレオチド中１つ未満、或いは、２００ヌクレオチド中１つ未満、或いは、５００ヌクレオチド中１つ未満、或いは、１０００ヌクレオチド中１つ未満、或いは、５，０００ヌクレオチド中１つ未満、或いは、１０，０００ヌクレオチド中１つ未満であることを条件とする。

【0559】

明確性のために別個の実施形態に関連して記載される本発明のある特徴は、単一の実施形態における組み合わせで提供することもできることが認識される。逆に、簡潔性のために単一の実施形態に関連して記載される本発明の種々の特徴は、別個に、又は任意の好適な下位の組み合わせで、又は本発明の任意の他の記載される実施形態において好適であるとして提供することもできる。種々の実施形態に関連して記載されるある特徴は、その実施形態がそれらの要素なしでは作動不能でない限り、それらの実施形態の本質的な特徴であるとみなされるべきではない。

【0560】

上記で詳述され、以下の特許請求の範囲のセクションで特許請求される本発明の種々の実施形態及び態様は、以下の実施例において実験的に裏付けられる。

【実施例】

【0561】

以下、上述した詳細な説明と共に本発明の一部の実施形態を非限定的に説明する、次の実施例に参照する。

【0562】

実施例１
ＬＩＬＲＢ２バリアントの設計
材料及び方法：
ＬＩＬＲＢ２（配列番号１、本明細書において「ＷＴ ＬＩＬＲＢ２」とも称される）の構造分析を行ってその安定性及びＨＬＡ－Ｇ（配列番号３）に対する結合親和性を最適化し、増加させ得るアミノ酸置換を同定した。それは以下のステップを含んでいた。

【0563】

１．バイオビアディスカバリースタジオの「タンパク質の調製」プロトコル１（ｄａｓｓａｕｌｔ ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を使用するＬＩＬＲＢ２及びＨＬＡＧの両方の複合体構造の調製。調製は、電荷の固定及び側鎖の欠落、並びにエネルギー最小化を含んだ。

【0564】

２．ＬＩＬＲＢ２及びＨＬＡ－Ｇ間の潜在的な相互作用点を同定するための構造分析（図１のＡ～Ｂ、ＰＤＢ ＩＤ：２ＤＹＰは、この目的に使用される高分解能複合体構造である）。

【0565】

３．ＬＩＬＲＢ２－ＨＬＡ－Ｇ相互作用（図１のＢ）に特異的なＬＩＬＲＢ２相互作用部位を同定するためのＨＬＡホモログ：ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ及びＨＬＡ－Ｇ間の配列比較。

【0566】

４．上記のステップ３で同定されたＨＬＡ－Ｇの、すなわちＨＬＡ－ＡにもＨＬＡ－ＢにもＨＬＡ－Ｃにも存在しない、特異的な１つ又は複数のアミノ酸と相互作用するＬＩＬＲＢ２界面中のアミノ酸の同定（図１のＤ）。

【0567】

５．ＬＩＬＲＢ２上の上記のステップ３～４で定義された残基のサブセットにおける可能な各突然変異のインシリコサンプリング。このプロセスは以下を含んでいた。各位置における特異的突然変異をコンピュータにより別個に導入すること、突然変異を最良に収容するように構造を最適化すること並びにＣＨＡＲＭＭベース力場エネルギー計算を使用して全体的なタンパク質安定性及び結合エネルギーの両方に関するＬＩＬＲＢ２野生型配列（配列番号１）と任意の突然変異との間のエネルギー差（ΔＧ）（ＷＴに対するΔＧ）を予測すること。計算された実際のエネルギー項は、ΔＧのみではなく結合及び安定性のポテンシャルエネルギーに対する突然変異の効果であった。しかしながら、ΔＧはドミナントであり、したがってヒント（ｈｉｎｔ）はΔＧに対する効果に関する。

【0568】

６．結合／安定性エネルギー計算の結果をランク付けリストにコンパイルし、結合及び安定性の検討事項の両方に有益であると予測されたＬＩＬＲＢ２配列（配列番号１）上の特異的点突然変異（置換）を選択した。

【0569】

７．選択された置換を２回目の突然変異分析のラウンドにおいて使用し、この回は毎回２つの置換の組み合わせを導入し、ＨＬＡ－Ｇへの結合及び安定性の両方に関するエネルギー評価のプロセスを繰り返した。

【0570】

さらなる試験のための示唆される代用物の最終リストを、この分析の間に検討されるいくつかのパラメータに基づき選択した。
・アポタンパク質（特徴的な補欠分子族又は金属を欠くタンパク質）に関する安定性についての置換のエネルギー寄与（ΔＧ）、
・複合体構造及び相互作用エネルギーに関する安定性についての置換のエネルギー寄与（ΔＧ）、
・タンパク質に対する立体構造の最小化（例えば、ＷＴ ＬＩＬＲＢ２配列と比較してサイズ、形状及び化学的性質に関して隔たりがある置換を導入することによる）、
・タンパク質複合体界面の範囲内の形状相補性。

【0571】

結果：
ＨＬＡ－Ｇ（配列番号３）－ＬＩＬＲＢ２（配列番号１）相互作用界面の構造分析及びＨＬＡホモログ間の配列比較は、ＨＬＡ－Ｇ及びそのホモログ、すなわち、ＨＬＡ－Ｇ中のＰｈｅ１９５が他のホモログ中でＳｅｒにより置き換えられたものの間の単一のドミナントな差のみを明らかにした（図１のＣ）。したがって、ＬＩＬＲＢ２上の密接に相互作用する残基を分析において主に検討した。

【0572】

ＬＩＬＲＢ２及びＨＬＡ－Ｇ Ｐｈｅ１９５相互作用残基、すなわち、ＬＩＬＲＢ２（配列番号１）残基Ｓｅｒ４５、Ｉｌｅ４９、Ｔｈｒ５０及びＶａｌ５７（図１のＤ）間の界面を定義するアミノ酸残基のサブセットにおける考えられる各突然変異のインシリコサンプリングは、結合エネルギーに対する有意な正の影響、すなわち、より低いΔＧを有することが見出された。加えて、４つのアミノ酸、Ｓｅｒ４５、Ｉｌｅ４９、Ｔｈｒ５０及びＶａｌ５７における考えられる各突然変異の計算された結合／安定性エネルギーの結果をランク付けリストにコンパイルした。無論、ランク付けは、個々のタンパク質安定性及び結合自由エネルギー（親和性）の両方に対する突然変異のインシリコ予測寄与により行った。

【0573】

以下の表１は、上位ランク付けされた単一置換を示し、以下の表２は、上位ランク付けされた二重置換を示す。

【0574】

続いて、以下の実施例にさらに記載されるとおり、特異的な単一置換及び２つのアミノ酸の置換の組み合わせをさらなる分析のために選択した。

【0575】

【表3】

【0576】

【表4】

【0577】

実施例２
ＬＩＬＲＢ２バリアントの産生及び特徴付け
材料及び方法：
試薬 － エクセルバンド（商標）３色ハイレンジタンパク質マーカー又はエクセルバンド（商標）３色エクストラレンジタンパク質マーカー（ＳＭＯＢＩＯ社製、それぞれカタログ＃ＰＭ２６００又はＰＭ２８００）、サンプル緩衝液（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社製 カタログ＃Ｍ００６７６）、ポリアクリルアミドゲル８％又は４－２０％ジェンスクリプト それぞれカタログ＃Ｍ００６６２又はＭ００６５６）、フージーン（登録商標）ＨＤ形質移入試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ社製、カタログ＃ＴＭ３２８）、ＥＣＬプラスウエスタンブロッティング基質（Ｐｉｅｒｃｅ社製、カタログ＃３２１３２）。

【0578】

抗体 － ＡＰＣ抗ヒトＨＬＡ－Ｇ（特許の米国特許出願公開第２０２０／０１０２３９０Ａ１号明細書から）、ＡＰＣヒトＩｇＧ４（Ｂｉｏｅｇｅｎｄ社製、カタログ＃４０３７０６）、ＡＰＣ抗ヒトＩｇＧ１（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製、カタログ＃９０５２－３１）、ＡＰＣマウスＩｇＧ１ｋ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製、カタログ＃４００１２０）、ＡＰＣ抗ヒトＣＤ４７抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製、カタログ＃３２３１２４）、ＣＤ４７ブロッカーＡｂ（特許の国際公開第２０１１／１４３６２４Ａ２号パンフレットから）、ウサギ抗ヒトＬＩＬＲＢ２（Ａｂｃｌｏｎａｌ社製 カタログ＃Ａ１０１３５）、ビオチン化ウサギ抗ヒトＳＩＲＰα ＬｓＢｉｏ社製 カタログ（＃ＬＳ－Ｃ３７０３３７）、ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）－ＨＲＰコンジュゲート（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ社製、カタログ＃１７０－６５１５）、ＨＲＰコンジュゲート－ストレプトアビジン（Ｐｉｅｒｃｅ社製 カタログ＃ＴＳ２１１２６）。

【0579】

細胞系 － エクスピ２９３Ｆ（Ｇｉｂｃｏ社製、カタログ＃Ａ１４２５７）、ＨＴ１０８０細胞系（ＡＴＣＣ製、ＣＣＬ－１２１）、ＨＴ１０８０－ＨＬＡ－Ｇ、ＴＨＰ１細胞系（ＡＴＣＣ製、ＴＩＢ－２０２）、ＴＨＰ１－ＥＶ及びＴＨＰ１－ＨＬＡ－Ｇ。細胞は、ＨＬＡ－Ｇ発現プラスミド又は空のベクター（ＥＶ）でのウイルス感染により生成した。簡潔に述べると、２９３Ｔ細胞をレンチウイルスプラスミド（ＨＬＡ－Ｇ構築物又は空のベクター及びレポーター試薬ＧＦＰを含有する）で形質移入した。３７℃、５％のＣＯ２で４８時間後、上清を収集し、ＨＴ１０８０又はＴＨＰ１細胞の形質導入に使用した。細胞を２４時間形質導入した。ＨＬＡ－Ｇ細胞はＧＦＰ陽性である。

【0580】

培地及び組織培養試薬 － エクスピ２６９培地（Ｇｉｂｃｏ社製、カタログ＃Ａ－１４３５１－０１）、ＲＰＭＩ１６４０（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ社製、カタログ＃０１－１００－１Ａ）、ＥＭＥＭ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ社製、カタログ＃０１－０４０－１Ａ）、ＤＭＥＭ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ社製、カタログ＃０１－０５５－１Ａ）、ＤＭＥＭ／Ｆ－１２（カタログ＃３１３３００９５、Ｇｉｂｃｏ社製）、ＦＣＳ（Ｇｉｂｃｏ社製、カタログ＃１２６５７－０２９）、１０％のＢＳＡ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ社製、カタログ＃０３－０１０－１Ｂ）、ＥＤＴＡ（Ｓｉｇｍａ社製、カタログ＃Ｅ７８８９）、トリプＬＥエクスプレス（Ｇｉｂｃｏ社製、カタログ＃１２６０４－１３）、グルタマックス（Ｇｉｂｃｏ社製、カタログ＃３５０５０－０３８）、ペニシリン－ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ社製、カタログ＃１５１１４０－１２２）。

【0581】

設備 － ＦＡＣＳデバイス（Ｓｔｒａｔａｄｉｇｍ社製、サイトメトリーＳ１０００ＥＸＩ）。

【0582】

組換えタンパク質の製造 － 比較機能分析及び産生評価のため、野生型（ＷＴ）ＬＩＬＲＢ２ドメイン（配列番号１）又は突然変異ＬＩＬＲＢ２ドメイン（本明細書において「ＬＩＬＲＢ２バリアント」と称される）を含むいくつかの組換えタンパク質を産生した（以下の表３を参照のこと）。産生は、所望のＦｃ融合タンパク質についてのコード配列でクローニングされたｐｃＤＮＡ３．４発現ベクターにより形質移入されたエクスピ２９３Ｆ細胞中で行った。制限酵素、例えば、ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ又はＸｂａＩ及びＥｃｏＲＶを使用し、コザック配列及び終止コドンと人工シグナルペプチド（ＭＥＳＰＡＱＬＬＦＬＬＬＬＷＬＰＤＧＶＨＡ、配列番号２５）を付加して配列をベクター中にクローニングした。タンパク質を細胞培養物の上清から収集し、一部の場合、プロテインＡ（ＰＡ）ポロスマブキャプチャーＡ樹脂を使用する１ステップ精製によりタンパク質を精製した。

【0583】

【表5】

【0584】

ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析 － ３５μｌの細胞培養物上清又は各組換えタンパク質サンプルからの３μｇの精製タンパク質を、β－メルカプトエタノールを有する又は有さない（それぞれ還元及び非還元条件）ローディング緩衝液と混合し、９５℃で５分間加熱し、８％のゲル電気泳動ＳＤＳ－ＰＡＧＥ上で分離した。ゲル上のタンパク質移動をｅ－ステイン機器（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社製）により製造業者の説明書に従って可視化した。

【0585】

ウエスタンブロット分析 － 産生されたヘテロ二量体を含有するサンプル（レーン当たり５０～５００ｎｇ）を還元又は非還元条件（それぞれβ－メルカプトエタノールを有する又は有さないローディング緩衝液中）で処理し、９５℃で５分間加熱し、８％又は４～２０％勾配のＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル上で分離した。続いて、タンパク質をＰＶＤＦ膜上に転写し、一次抗体と１時間又は一晩インキュベートし、続いてＨＲＰ－コンジュゲート二次抗体と１時間インキュベートした。シグナルをＥＣＬ発生後に検出した。

【0586】

フローサイトメトリー － 細胞の表面上で発現されたＨＬＡ－Ｇへの組換えタンパク質の結合を評価するため、ＨＴ１０８０－ＷＴ細胞若しくはＴＨＰ－１－ＥＶ細胞、又はヒトＨＬＡ－Ｇを過剰発現するＨＴ１０８０若しくはＴＨＰ－１細胞を、産生された組換えタンパク質の段階希釈物と４℃で３０分間インキュベートし、続いてＩｇＧ１骨格に特異的な蛍光標識抗体で免疫染色し、フローサイトメトリー分析した。結合特異性を試験するため、細胞を、組換えタンパク質とのインキュベーション前に５μｇ／ｍｌの濃度のヒトＨＬＡ－Ｇに対するブロッカー抗体とのプレインキュベーションに３７℃で１時間供した。ＭＦＩ値を使用してグラフパッドプリズムソフトウェア）を用いて結合曲線グラフを作出した。

【0587】

結果：
ＷＴ ＬＩＬＲＢ２（配列番号１）又は突然変異ＬＩＬＲＢ２（本明細書において「ＬＩＬＲＢ２バリアント」と称される）のいずれか－Ｆｃ融合物及びＳＩＲＰα－Ｆｃ融合物を含むいくつかのヘテロ二量体タンパク質を産生及び分析した。ＷＴ ＬＩＬＲＢ２を含むヘテロ二量体は本明細書において「ＤＳＰ２１６－Ｖ５」と称される一方、ＬＩＬＲＢ２バリアントを含むヘテロ二量体は本明細書において「ＤＳＰ２１６－Ｖ１１」、「ＤＳＰ２１６－Ｖ１２」、「ＤＳＰ２１６－Ｖ１３」、「ＤＳＰ２１６－Ｖ１４」、「ＤＳＰ２１６－Ｖ１５」、「ＤＳＰ２１６－Ｖ１６」、「ＤＳＰ２１６－Ｖ１７」、「ＤＳＰ２１６－Ｖ１８」、「ＤＳＰ２１６－Ｖ１９」、「ＤＳＰ２１６－Ｖ２０」と称される。加えて、２つのＬＩＬＲＢ２ホモ二量体タンパク質を産生及び分析した：本明細書において「ＬＩＬＲＢ－Ｖ５－Ｆｃ」と称されるＷＴ ＬＩＬＲＢ２を含むホモ二量体及び本明細書において「ＬＩＬＲＢ２－Ｖ１２－Ｆｃ」と称されるＬＩＬＲＢ２バリアントを含むホモ二量体。各ヘテロ二量体／ホモ二量体の完全な説明は、上記の表３に提供される）。

【0588】

図２Ａに実証されるとおり、予測ヘテロ二量体分子量形態のタンパク質の高い比率が非還元条件下で観察され、２つのサブユニットの発現が還元条件下で確認された。

【0589】

続いて、ＨＴ１０８０－ＷＴ及びＨＬＡ－Ｇを過剰発現するＨＴ１０８０（ＨＴ１０８０－ＨＬＡ－Ｇ）及び空のベクターで形質導入されたＴＨＰ１モック（ＴＨＰ１－ＥＶ）又はＨＬＡ－Ｇを過剰発現するＴＨＰ１（ＴＨＰ１－ＨＬＡ－Ｇ）の細胞系並びに検出抗体としての抗ｈＩｇＧ１を使用するフローサイトメトリー分析により、産生されたヘテロ二量体のＨＬＡ－Ｇへの結合を決定した（図３Ａ～Ｆ）。ｈＣＤ４７のみを発現するＷＴ又はＥＶ細胞と比較してＨＬＡ－Ｇ過剰発現細胞への有意に高い結合が観察された（図３Ａ～Ｂ）。さらに、ＬＩＬＲＢ２バリアントドメインを含むヘテロ二量体のＨＬＡ－Ｇ発現細胞への結合は、ＷＴ ＬＩＬＲＢ２ドメインを含むヘテロ二量体（ＤＳＰ２１６－Ｖ５）の結合よりも有意に高かった（図３Ｃ）。

【0590】

ＣＤ４７のみを発現するＨＴ１０８０細胞と比較してＨＴ１０８０－ＨＬＡ－Ｇ細胞はＨＬＡ－Ｇ及びＣＤ４７の両方を発現するため（図３Ａ）、ＨＬＡ－Ｇへの産生されたヘテロ二量体の特異的結合を、抗ＨＬＡ－Ｇ遮断抗体を使用してさらに試験した。ＬＩＬＲＢ２バリアントを含むヘテロ二量体に関する抗ＨＬＡ－Ｇ結合阻害レベルは、ＷＴ ＬＩＬＲＢ２を含むヘテロ二量体に対する阻害と比較して高く、ＨＬＡ－Ｇへの特異的結合のそれらの優位性を示した（図３Ｄ～Ｆ）。

【0591】

ＨＴ１０８０－ＷＴ及びＨＬＡ－Ｇを過剰発現するＨＴ１０８０（ＨＴ１０８０－ＨＬＡ－Ｇ）、並びに検出抗体としての抗ｈＩｇＧ１を使用するフローサイトメトリー分析によりＨＬＡ－ＧへのＬＩＬＲＢ２－Ｖ５又はＬＩＬＲＢ２－Ｖ１２ホモ二量体の結合を決定した（図４）。ｈＣＤ４７のみを発現するＷＴ細胞と比較してＨＬＡ－Ｇ過剰発現細胞へのＬＩＬＲＢ２－Ｖ１２ホモ二量体の有意に高い結合が観察された（図４）。さらに、ＨＬＡ－Ｇ発現細胞への、ＬＩＬＲＢ２－Ｖ１２バリアントドメインを含むホモ二量体の結合は、ＷＴ ＬＩＬＲＢ２ドメインを含むホモ二量体（ＬＩＬＲＢ２－Ｖ５、図４）の結合よりも有意に高かった。さらに、ＬＩＬＲＢ２－Ｖ１２バリアントを含むホモ二量体に関する抗ＨＬＡ－Ｇ結合阻害レベルは、ＷＴ ＬＩＬＲＢ２を含むホモ二量体に対する阻害と比較して高く、ＨＬＡ－Ｇへの特異的結合のそれらの優位性を示した（図４）。

【0592】

ＬＡＬＡ突然変異を有する又は有さないＦｃドメイン（それぞれ配列番号２９及び８５）に融合しているＬＩＬＲＢ２バリアントの融合物並びにＬＡＬＡ突然変異を有する又は有さないＦｃ（それぞれ配列番号３１及び８６）に融合しているＳＩＲＰα（配列番号２７又は８８の融合物を含む追加のヘテロ二量体タンパク質を産生及び分析した。各ヘテロ二量体の完全な説明は、上記の表３に提供される。

【0593】

図９に実証されるとおり、予測ヘテロ二量体分子量形態のタンパク質の高い比率が非還元条件下で観察され、２つのサブユニットの発現が還元条件下で確認された。さらに、図１０に実証されるとおり、ウエスタンブロット分析は、産生されたＤＳＰ２１６－Ｖ１２、ＤＳＰ２１６－Ｖ１２短鎖、ＤＳＰ２１６－Ｖ２１及びＤＳＰ２１６－Ｖ２１短鎖がＳＩＲＰα及びＬＩＬＲＢ２のドメインを含有することを裏付けた。

【0594】

ＤＳＰ２１６－ＷＴ、ＤＳＰ２１６－Ｖ３、ＤＳＰ２１６－Ｖ６、ＤＳＰ２１６－Ｖ１２短鎖、ＤＳＰ２１６－Ｖ２１及びＤＳＰ２１６－Ｖ２１短鎖ヘテロ二量体のＨＬＡ－Ｇへの結合は、ＨＴ１０８０－ＷＴ及びＨＬＡ－Ｇを過剰発現するＨＴ１０８０（ＨＴ１０８０－ＨＬＡ－Ｇ）、並びに検出抗体としての抗ｈＩｇＧ１を使用するフローサイトメトリー分析により決定した。図１１に示すとおり、ｈＣＤ４７のみを発現するＷＴ細胞と比較してＨＬＡ－Ｇ過剰発現細胞への、全ての試験ＤＳＰ２１６ヘテロ二量体の有意に高い結合が観察された。さらに、ＬＩＬＲＢ２配列中のＶ５７Ｒ置換を含有するＤＳＰ２１６バリアント（ＤＳＰ２１６－Ｖ２１、ＤＳＰ２１６－Ｖ２１短鎖及びＤＳＰ２１６－Ｖ１２短鎖）のＨＬＡ－Ｇ発現細胞への結合は、ＷＴ ＬＩＬＲＢ２ドメインを含むヘテロ二量体（ＤＳＰ２１６－ＷＴ、ＤＳＰ２１６－Ｖ３及びＤＳＰ２１６－Ｖ６）の結合と比較して有意に高かった。さらに、有意な結合阻害が抗ＨＬＡ－Ｇブロッカー抗体により実証され、ＨＬＡ－Ｇへの特異的結合を示した。

【0595】

実施例３
ヒトＨＬＡ－ＧへのＬＩＬＲＢ２バリアントの結合
ＬＩＬＲＢ２バリアントの優位性をさらに確認するため、ヒトＨＬＡ－Ｇに対するＬＩＬＲＢ２バリアントの結合親和性及びＷＴ ＬＩＬＲＢ２との競合を、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）アッセイにより決定する。

【0596】

実施例４
ＬＩＬＲＢ２バリアントは天然ＬＩＬＲＢ２－ＨＬＡ－Ｇ結合を遮断する
内因性ＬＩＬＲＢ２は、ヒト単球、Ｂ細胞上で、並びにより低レベルで骨髄及び形質細胞様樹状細胞の細胞表面上で発現される（Katz HR. Adv Immunol. (2006) 91:251-272、Kang X, et al. Cell Cycle. (2016) 15(1): 25-40）。

【0597】

内因性ＬＩＬＲＢ１は、ヒトマクロファージ、一部のＴ細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞、単球、骨髄、形質細胞様及び寛容原性ＤＣを含む種々の樹状細胞サブセット（Katz HR.Adv Immunol. (2006) 91:251-272、Kang X, et al. Cell Cycle. (2016) 15(1):25-40）上で発現される。

【0598】

内因性ＨＬＡ－Ｇは主に胎盤中の細胞性トロホブラスト上で発現され、しかしながら、いくつかの病的状態（例えば、癌、ウイルス感染、自己免疫及び炎症性疾患、ＧｖＨＤ）と関連する細胞がＨＬＡ－Ｇを発現することが示されている（Contini P, et al., Front Immunol. (2020) 11:1613, PMID:32983083、Morandi F, et al., J Immunol Res. (2016) 2016:4326495, PMID:27652273）。

【0599】

免疫細胞上で発現されるＬＩＬＲＢ２、及びＬＩＬＲＢ１と、それらの天然リガンドのＨＬＡ－Ｇとの相互作用は、免疫細胞の活性を阻害するシグナル伝達経路を開始させる。免疫細胞上で発現される内因性ＬＩＬＲＢ２、及びＬＩＬＲＢ１と、例えば、腫瘍細胞上で発現されるＨＬＡ－Ｇとの相互作用を遮断するように、ＬＩＬＲＢ２を含むタンパク質を設計する。

【0600】

ＬＩＬＲＢ２バリアントを含む産生されたタンパク質の、それらの相互作用のブロッカーとしての有効性をＥＬＩＳＡアッセイにより評価し、ＷＴ ＬＩＬＲＢ２と比較する。この目的のため、ＥＬＩＳＡプレートを組換えヒトＨＬＡ－Ｇでコーティングする。続いて、プレートを洗浄し、異なる濃度の産生されたＬＩＬＲＢ２を含むタンパク質又は陽性対照抗ＨＬＡ－Ｇブロッカー抗体と１時間インキュベートする。ＬＩＬＲＢ２－Ｆｃ（ｍＩｇＧ）、又はＬＩＬＲＢ１－Ｆｃ（ｍＩｇＧ）を添加し、続いて追加のインキュベーションを行い、次いでプレートを洗浄し、標準的なＥＬＩＳＡプロトコルに従って抗マウスＩｇＧ－ＨＲＰ及びＴＭＢ基質を用いてブロットする。プレートリーダー（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、マルチスキャンＦＣ）を使用して６２０ｎｍをリファレンスとして４５０ｎｍでプレートを分析する。

【0601】

実施例５
リガンド結合ＥＬＩＳＡ
ＬＩＬＲＢ２のその対応物ＨＬＡ－Ｇへの結合を、結合ＥＬＩＳＡアッセイにより試験する。

【0602】

ｈＨＬＡ－Ｇをプラスチックプレートの表面上に結合させ、ＬＩＬＲＢ２を添加し、固定化ｈＨＬＡ－Ｇに結合させる。洗浄後、ＨＲＰ抗ｈＩｇＧ１を添加し、分子のＦｃ骨格に結合させる。検出は、ＴＭＢ基質を用いて標準的なＥＬＩＳＡプロトコルに従ってプレートリーダー（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、マルチスキャンＦＣ）を使用して５４０ｎｍをリファレンスとして４５０ｎｍで行う。

【0603】

実施例６
ＬＩＬＲＢ２バリアントのインビボ抗腫瘍効果
３つの異なるインビボマウスモデルを、癌の治療におけるＬＩＬＲＢ２バリアントを含む産生されたヘテロ二量体の効力の試験に使用する：
１．ヒト幹細胞又はヒトＰＢＭＣ若しくは固定化ヒトＰＢＭＣと、ＣＤ４７及びＨＬＡ－Ｇを発現するヒト腫瘍細胞とが接種されたＮＳＧマウス。
２．ＣＤ４７及びＨＬＡ－Ｇを発現するヒト腫瘍細胞が接種されたヌードＳＣＩＤマウス。
３．ＣＤ４７及びＨＬＡ－Ｇを発現するマウス癌細胞系が接種されたマウスと、試験ヘテロ二量体のサロゲートマウスタンパク質とを使用した同系マウス腫瘍モデル。

【0604】

全てのモデルにおいて、マウスに腫瘍細胞を静脈内（ＩＶ）、腹腔内（ＩＰ）、皮下（ＳＣ）又は同所的に接種する。腫瘍が触診可能（約８０ｍｍ^３）になったら、マウスを異なる用量及び異なるレジメンの産生されたヘテロ二量体でＩＶ、ＩＰ、ＳＣ又は同所的に処理する。

【0605】

マウスを体重及び臨床的徴候について追跡する。腫瘍を測径器により週に数回測定し、腫瘍容積を以下の式：Ｖ＝長さ×幅^２／２に従って計算する。マウス体重を定型的に測定する。腫瘍成長及び生存率を、実験全体を通してモニタリングする。

【0606】

腫瘍中の免疫細胞の浸潤及びサブタイピングは、腫瘍又は流入領域リンパ節の切除、消化並びに特異的抗体染色及びフローサイトメトリー分析を使用する免疫フェノタイピングにより試験する。追加的に、又は代替的に、免疫細胞の浸潤又は腫瘍の壊死グレードは、腫瘍の切除、特異的抗体での免疫組織化学染色のためのパラフィン包埋及び切片化により決定する。

【0607】

屠殺時、マウス器官をハーベストし、Ｈ＆Ｅ及びＩＨＣ染色のためのパラフィンブロック中に包埋する。

【0608】

以下の試験：ＰＫ分析、血漿中のサイトカイン測定、循環中の血液細胞亜集団のＦＡＣＳプロファイリング、血液学的試験、血清化学物質試験、抗薬物抗体（ＡＤＡ）分析及び中和抗体分析（ＮＡＢ）のために一般的な手順に従って異なる時点でマウスから血液サンプルを採取する。

【0609】

実施例７
Ｍ－ＣＳＦ依存性マクロファージ成熟に対するＬＩＬＲＢ２バリアントの効果
抗原提示細胞（ＡＰＣ）、例えば、マクロファージ及び樹状細胞上で発現される内因性ＬＩＬＲＢ１及びＬＩＬＲＢ２に向かう腫瘍又は免疫細胞上で発現されるＨＬＡ－Ｇにより誘導される免疫抑制シグナルを、それらの相互作用の競合及び遮断により遮断するように、産生されるタンパク質のＬＩＬＲＢ２ドメインを設計する。Ｍ１マクロファージは抗腫瘍活性を示す一方、Ｍ２マクロファージは、腫瘍進行を促進することが報告されている。Ｍ－ＣＳＦは、異なる活性化刺激により続いて炎症促進性（Ｍ１マクロファージ）又は抗炎症性（Ｍ２マクロファージ）表現型に分極化され得るナイーブＭ０（Ｍ２様）マクロファージへの単球の分化をドライブすることが公知である（Chistiakov DA, et al., J. Cell. Mol. Med. (2015) 19(6):1163-1173 PMID:25973901）。Ｍ－ＣＳＦ依存性マクロファージ成熟の間のアンタゴニスト抗体でのＬＩＬＲＢ２の遮断は、ＣＤ１４及びＣＤ１６３のより低い発現を有するより丸く、よりタイトに接着性のＭ１（抗腫瘍）表現型をもたらすことが示された（Chen HM, et al., J Clin Invest. (2018)128(12):5647-5662. PMID:30352428）。生成されたマクロファージのＬＰＳでの刺激後、炎症促進性サイトカインＴＮＦαの分泌の向上及び抗炎症性ＩＬ－１０の分泌の低減が検出された（Chen HM et al.）。

【0610】

Ｍ－ＣＳＦ依存性マクロファージ成熟に対する、ＬＩＬＲＢ２バリアントを含む産生された組換えタンパク質の効果を、Ｍ１／Ｍ２マーカーのフローサイトメトリーベース検出を使用して、並びにＬＰＳ前処理マクロファージの刺激後のＴＮＦα及びＩＬ－６（公知のＭ１関連サイトカイン）放出の測定により評価した。

【0611】

材料：
試薬 － ＤＳＰ２１６－Ｖ１２、ＤＳＰ２１６－Ｖ１２短鎖、健常ドナーからの新鮮軟膜サンプル（Ｈａｄａｓｓａｈ社血液バンク）、フィコール－パック（商標）プラス１．０７７（Ｃｙｔｉｖａ社製、カタログ＃ＧＥ－１７－１４４０－０３）、ヒトトラステインＦｃＸ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製、カタログ＃４２２３０２）、ＰＢＳ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社製、カタログ＃２０－０２３－１Ａ）、ＥＤＴＡ（Ｓｉｇｍａ社製、カタログ＃Ｅ７８８９）、アジ化ナトリウム（Ｓｉｇｍａ社製、カタログ＃Ｓ２００２）、１０％のＢＳＡ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社製、カタログ＃０３－０１０－１Ｂ又はＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ社製、カタログ＃０３－０１０－１Ｂ）、ＢＤサイトメトリックビーズアレイ（ＣＢＡ）（ＢＤ社製、カタログ＃５５１８０９）、ＲＰＭＩ１６４０（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ社製、カタログ＃０１－１００－１Ａ）、ＤＭＥＭ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ社製、カタログ＃０１－０５５－１Ａ）、ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ社製、カタログ＃１２６５７－０２９）、トリプＬＥエクスプレス（Ｇｉｂｃｏ社製、カタログ＃１２６０４－１３）、グルタマックス（Ｇｉｂｃｏ社製、カタログ＃３５０５０－０３８）、ペニシリン－ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ社製、カタログ＃１５１１４０－１２２）、ヒト組換えＭ－ＣＳＦ（Ｒ＆Ｄ社製、カタログ＃２１６－ＭＣ－１００）。

【0612】

抗体 － 抗ＨＬＡ－Ｇ Ｔｉｚｏｎａ様（米国特許出願公開第２０２００１０２３９０号明細書に記載）、ＢＶ７８５抗ヒトＣＤ１１ｂ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製、カタログ＃３０１３４６）、ＡＰＣ抗ヒトＣＤ１６３（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製、カタログ＃３３３６１０）、ＡＰＣ抗ヒトＣＤ２０６（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製、カタログ＃３２１１１０）、ＡＰＣ抗ヒトＨＬＡ－ＤＲ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製、カタログ＃３０７６１０）、ＣＤ１６３及びＣＤ２０６についてのＡＰＣマウスＩｇＧ１（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製、カタログ＃４０１２０）アイソタイプ対照、ＨＬＡ－ＤＲについてのＡＰＣマウスＩｇＧ２ａ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製、カタログ＃４００２２０）アイソタイプ対照。

【0613】

ヒト単球 － ＰＢＭＣを、２つの新鮮軟膜サンプルからフィコール勾配により製造業者の説明書に従って精製した。細胞を、ＲＰＭＩ培地を有するＴ７５フラスコ中で播種し（フラスコ当たり１×１０^８個の細胞）、３７℃、５％のＣＯ２でインキュベートした。２時間のインキュベーション後、培地を、５０ｎｇ／ｍＬのＭ－ＣＳＦが補給された新鮮ＲＰＭＩと交換した。６日間のインキュベーション後、細胞をＭ０マクロファージとして定義する（Tarique AA, et al., American J of Respiratory Cell and Molecular Biology (2015) 53(5): 676-688, PMID:25870903）。

【0614】

細胞系 － 上記の実施例２に記載のＨＬＡ－Ｇを過剰発現するＨＴ１０８０細胞（ＨＴ１０８０－ＨＬＡ－Ｇ）。無論、ＨＬＡ－Ｇを過剰発現するＨＴ１０８０の細胞はＧＦＰ陽性である。

【0615】

方法：
マクロファージをＨＴ１０８０ＨＬＡ－Ｇ細胞と同時培養することにより、Ｍ０マクロファージ分極化に対するＤＳＰ２１６－Ｖ１２の効果を評価した。Ｍ－ＣＳＦとの６日間のインキュベーション後、Ｍ０マクロファージを、一晩のインキュベーションのためにＲＰＭＩ及び５０ｎｇ／ｍｌのＭ－ＣＳＦを有する６ウェルプレート中で播種した（ウェル当たり２５０，０００個の細胞）。翌日、ＨＴ１０８０－ＨＬＡ－Ｇ細胞を、２、４若しくは１０μｇ／ｍｌのＤＳＰ２１６－Ｖ１２又は陽性対照としての１．５μｇ／ｍＬの抗ヒトＨＬＡ－Ｇ（２μｇ／ｍｌのＤＳＰ２１６－Ｖ１２と等モル濃度）と３７℃で１時間インキュベートし、次いで、Ｍ０マクロファージの上部に２：１のＥ：Ｔの比（２５０，０００個のＭ０マクロファージ：１２５，０００個のＨＴ１０８０－ＨＬＡ－Ｇ細胞）で播種した。２４時間のインキュベーション後、細胞を収集し、確立された分極化マーカーの発現をフローサイトメトリー（サイトフレックスＢ５３０００ サイトフレックスＢ５－Ｒ３－Ｖ５）により決定した。具体的には、マクロファージをＣＤ１１ｂ陽性細胞としてゲーティングし、Ｍ２マーカーＣＤ１６３及びＣＤ２０６、並びにＭ１マーカーＨＬＡ－ＤＲの表面発現を評価した。加えて、サイトカイン分泌の決定のために上清を収集した。ＭＦＩ値を使用してＦＡＣＳデータを分析し（フロージョーｖ１０．８．１ソフトウェア）、ＦＣＡＰアレイｖ３．０ソフトウェアを使用して上清中のサイトカインレベルのＣＢＡデータを分析した。

【0616】

結果：
ＤＳＰ２１６－Ｖ１２又はＤＳＰ２１６－Ｖ１２短鎖（ＬＩＬＲＢ２バリアント－Ｆｃ融合物及びＳＩＲＰα－Ｆｃ融合物を含むヘテロ二量体タンパク質、完全な説明については表３の参照のこと）での処理後、ＨＴ１０８０ＨＬＡ－Ｇ細胞と同時培養されたＭ－ＣＳＦ分極化単球中のＣＤ１６３及びＣＤ２０６のＭ２関連マーカーの発現は、非処理又は抗ＨＬＡ－Ｇ対照群と比較して用量依存的様式で下方調節された（図５のＡ～Ｂ及び図１２のＡ～Ｂ）一方、Ｍ１関連マーカーＨＬＡ－ＤＲの発現は上方調節された（図５のＣ及び図１２のＣ）。さらに、ＤＳＰ２１６－Ｖ１２での処理は、Ｍ１関連サイトカイン、ＴＮＦα及びＩＬ－６の分泌を誘導した（図６のＡ～Ｂ）。

【0617】

まとめると、結果は、ＤＳＰ２１６－Ｖ１２及びＤＳＰ２１６－Ｖ１２短鎖がＭ０（Ｍ２様）マクロファージをＭ１マクロファージに変換し得ることを示した。

【0618】

実施例８
マクロファージ及び多形核細胞に対するＬＩＬＲＢ２バリアントの効果
ＡＰＣ、例えば、マクロファージ及び樹状細胞上で発現される内因性ＬＩＬＲＢ１及びＬＩＬＲＢ２に向かう腫瘍又は免疫細胞上で発現されるＨＬＡ－Ｇにより誘導される免疫抑制シグナルを、それらの相互作用の競合及び遮断により遮断するように、タンパク質のＬＩＬＲＢ２ドメインを設計する。ＨＬＡ－Ｇの「ドントイートミーシグナル」のこの遮断は、腫瘍細胞食作用を誘導し、癌及び免疫細胞間の阻害ＨＬＡ－Ｇ－ＬＩＬＲＢ１／２シグナリングを妨害し、次いで食作用を向上させる。

【0619】

腫瘍細胞食作用に対する、ＬＩＬＲＢ２バリアントを含む産生された組換えタンパク質の効果は、マクロファージを、異なる濃度の産生された組換えタンパク質の存在下でプレインキュベートされたＣＦＳＥ細胞又はセルトレースバイオレット（ＣＴＶ）標識癌細胞と混合することにより評価することができる。種々のインキュベーション時間（例えば、３時間）後、マクロファージを抗ＣＤ１１ｂ抗体で染色し、染色癌細胞の食作用取り込みを顕微鏡法又はフローサイトメトリー分析により評価する。

【0620】

材料：
試薬 － ＤＳＰ２１６－Ｖ１２、健常ドナーからの新鮮軟膜サンプル（Ｓａｎｑｕｉｎ社血液バンク）、フィコールリンホプレップ（ノルウェー国、オスロ、Ａｌｅｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＡＳのＳｅｒｕｍｗｅｒｋ Ｂｅｒｎｂｕｒｇ ＡＧ、０４－０３－９３９１／０２）、トリプＬＥエクスプレス（ｇｉｂｃｏ社製、カタログ＃１２６０４０２１）、ＦＣ受容体ブロッキング溶液（Ｎａｎｏｇｅｎ社製）、ＰＢＳ（社内、ｕｍｃｇ薬局）、ＥＤＴＡ（ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ社製、カタログ＃Ｅ９８８４－１ＫＧ）、アジ化ナトリウム（ＢＤＨ Ｃｈｅｍｉｃａｌ ＬＴＤ製）、ＢＳＡ（ＢＳＡフラクションＶ、Ｒｏｃｈｅ社製、カタログ＃１０７３５０９４００１）、ＲＰＭＩ１６４０（ｇｉｂｃｏ社製、５２４００－０２５）、ＦＢＳ（ｇｉｂｃｏ社製）、ヒト組換えＭ－ＣＳＦ（ｉｍｍｕｎｏｔｏｏｌｓ社製カタログ＃１１３４３１１５）、ヒト組換えＩＬ－１０（ｉｍｍｕｎｏｔｏｏｌｓ社製、カタログ＃１１３４１０７）、セルトレース（商標）バイオレット細胞増殖キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、カタログ＃Ｃ３４５５７）。

【0621】

抗体 － 抗ＨＬＡ－Ｇ Ｔｉｚｏｎａ様（米国特許出願公開第２０２００１０２３９０号明細書に記載）、ＡＰＣ抗ヒトＣＤ４７（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製、カタログ＃３２３１２４）ＡＰＣ抗ヒトＣＤ１１ｂ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製、カタログ＃３０１３１０）、ＡＰＣ抗ヒトＣＤ１６３（ｅ－Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製、カタログ＃１７－１６３９－４１）、ＡＰＣ抗ヒトＬＩＬＲＢ２（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製、カタログ＃３３８７０８）、ＨＬＡ－ＧについてのＡＰＣマウスＩｇＧ４（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製、カタログ＃４０３７０６）アイソタイプ対照、ＣＤ４７、ＣＤ１１ｂ及びＣＤ１６３についてのＡＰＣマウスＩｇＧ１（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製、カタログ＃４０１２０）アイソタイプ対照、ＬＩＬＲＢ２についてのＡＰＣラットＩｇＧ２ａ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製、カタログ＃４００５１２）アイソタイプ対照、ＣＤ４７遮断Ａｂ Ｉｎｈｉｂｒｉｘ様（米国特許出願公開第２０１５／０１８３８７４Ａ１号明細書に記載）。

【0622】

ヒト単球 － サンプルを新鮮軟膜サンプルからフィコール勾配上の精製により製造業者の説明書に従って得た。細胞を、１０％のＦＣＳ及び５０ｎｇ／ｍＬのＭ－ＣＳＦが補給されたＲＰＭＩ培地を有する６ウェルプレート中で播種し（２ｍＬ中ウェル当たり５×１０^６個の細胞）、３７℃、５％のＣＯ_２でインキュベートした。一晩のインキュベーション後、培地を、１０％のＦＣＳ及び５０ｎｇ／ｍＬのＭ－ＣＳＦが補給された新鮮ＲＰＭＩと交換した。６日間のインキュベーション後、培地を、１０％のＦＣＳ及び５０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－１０が補給されたＲＰＭＩと交換した。４８時間のインキュベーション後、細胞をＭ２ｃマクロファージとして定義した。

【0623】

細胞系 － ＨＬＡ－Ｇを過剰発現する７２１．２２１細胞（Shimizu, Y., and R. DeMars, J. Immunol. (1989) 142:3320、Markel G. et al., J Immunol (2002) 168(6): 2803-2810）（７２１．２２１－ＨＬＡ－Ｇ）。細胞は、ＨＬＡ－Ｇ及びＧＦＰ又はＧＦＰ単独（空のベクター－ＥＶ）発現プラスミドでのウイルス感染により生成した。

【0624】

方法：
Ｍ２ｃマクロファージ食作用に対するＤＳＰ２１６－Ｖ１２の効果を、マクロファージと７２１．２２１－ＨＬＡ－Ｇ又は７２１．２２１－ＥＶ細胞との同時培養により評価した。７２１．２２１－ＨＬＡ－Ｇ細胞及び７２１．２２１－ＥＶ細胞をＣＴＶで染色し、２５０，０００個の細胞をＦＡＣＳチューブ中で播種し、２．５、５若しくは１０μｇ／ｍＬのＤＳＰ２１６－Ｖ１２又は６μｇ／ｍＬのＣＤ４７遮断抗体を含有する培地と４℃で２０分間インキュベートした。５００００個のＭ２ｃマクロファージを、癌細胞を含有する各チューブに添加した。３時間のインキュベーション後、マクロファージをＡＰＣ－ＣＤ１１ｂ抗体で染色し、食作用の割合をＣＴＶについて陽性のＣＤ１１ｂ^＋細胞の率として決定した。並行して、ＣＤ４７及びＨＬＡ－Ｇ発現を、ＦＡＣＳを使用する７２１．２２１－ＨＬＡ－Ｇ及び－ＥＶ細胞の表面上のそれらの発現の試験により確認し、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１６３及びＬＩＬＲＢ２発現レベルをＭ２ｃマクロファージに関して試験した。ＦＡＣＳデータをフロージョーｖ１０．８．１ソフトウェアにより分析し、統計的分析をグラフパッドソフトウェア（マックＯＳ用プリズム９、バージョン９．４．１）を用いて行った。

【0625】

結果：
ＤＳＰ２１６－Ｖ１２（ＬＩＬＲＢ２バリアント－Ｆｃ融合物及びＳＩＲＰα－Ｆｃ融合物を含むヘテロ二量体タンパク質）での処理後、Ｍ２ｃマクロファージによる７２１．２２１ＥＶ及び７２１．２２１－ＨＬＡ－Ｇ細胞の食作用は用量依存的様式で増加した。ＣＤ４７^＋ＨＬＡ－Ｇ^－７２１．２２１－ＥＶ細胞については、食作用の増加はあらゆるＤＳＰ２１６－Ｖ１２濃度で有意でなかった一方、ＣＤ４７遮断抗体は食作用を有意に増加させた（^＊＊ｐ＝０．００２８）（図１３のＡ）。ＣＤ４７^＋ＨＬＡ－Ｇ^＋７２１．２２１－ＨＬＡ－Ｇ細胞については、食作用の増加は１０μｇ／ｍＬのＤＳＰ２１６－Ｖ１２で有意であった（^＊ｐ＝０，０４６５）一方、ＣＤ４７遮断抗体は食作用を有意に増加させなかった（ｐ＝０，１６５４）（図１３のＢ）。

【0626】

まとめると、結果は、ＤＳＰ２１６－Ｖ１２がＭ２ｃマクロファージによるＣＤ４７^＋／ＨＬＡ－Ｇ^＋細胞の食作用を有意に増加させ得ることを示した。

【0627】

この効果は、ＣＤ４７／ＳＩＲＰα軸をＨＬＡ－Ｇ／ＬＩＬＲＢ１／２軸と一緒に遮断することから生じる。それというのも、ＣＤ４７遮断抗体でのＣＤ４７／ＳＩＲＰα軸のみの遮断は、ＣＤ４７^＋／ＨＬＡ－Ｇ^＋７２１．２２１－ＨＬＡ－Ｇの食作用に対するより低い効果を有するためである。

【0628】

実施例９
ＬＩＬＲＢ２バリアントによるＮＫ細胞の細胞傷害活性化
ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、Ｂ及びＴ細胞としての特異的抗原の認識なしで直接的な細胞傷害又はサイトカイン／ケモカインの分泌を誘導する。ＮＫ細胞傷害は、感染細胞、悪性腫瘍及びストレスを受けた細胞に対する免疫応答における重要な役割を担い、種々の疾患の病理学的プロセスに関与する。

【0629】

ＮＫ活性化に対する、ＬＩＬＲＢ２バリアントを含む産生された組換えタンパク質の効果を決定するために当技術分野において公知の多数のアッセイが使用され、それとしては、限定されるものではないが、以下のものが挙げられる。

【0630】

細胞傷害アッセイ － 同時培養アッセイにおけるＮＫ細胞（エフェクター細胞）による標的細胞の殺傷。殺傷の％をフローサイトメトリー分析（ＦＡＣＳ）により分析する。標的細胞を９６ウェルプレート中に装入し、事前標識された一次ＮＫ細胞と種々のエフェクター－標的（Ｅ：Ｔ）比で、異なる濃度の産生された組換えタンパク質の存在下でインキュベートする。ＮＫ細胞を１０００Ｕ／ｍＬのＩＬ－２と４８時間培養してからアッセイする。細胞を４及び２４時間後にハーベストし、フローサイトメトリーによりアッセイする。ＮＫ細胞を有さない培養物から回収された標的細胞の数を参照として使用する。

【0631】

細胞傷害性アッセイ － 異なる濃度の産生された組換えタンパク質の存在下での同時培養アッセイにおけるＮＫ細胞（エフェクター細胞）による標的細胞の殺傷。殺傷の％は、インキュサイト装置により標識標的細胞及びカスパーゼ感受性蛍光基質を使用して決定する。

【0632】

炎症性サイトカインの分泌 － 一次ＮＫ細胞を種々の標的細胞で、種々の比で異なる濃度の産生された組換えタンパク質の存在下で２４時間刺激する。無細胞培養物上清中のインターフェロンγ（ＩＦＮ－γ）及び顆粒球－マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）のレベルを、ＥＬＩＳＡ又はサイトメトリックビーズアレイ（ＣＢＡ）を用いて決定する。

【0633】

実施例１０
ＨＬＡ－Ｇ及びＣＤ４７の両方を発現する細胞への、ＬＩＬＲＢ２バリアント及びＳＩＲＰαを含むヘテロ二量体の特異的結合

【0634】

材料及び方法：
試薬 － アレクサフルオル６４７標識ＤＳＰ２１６－Ｖ１２、４人の健常ドナーからの新鮮軟膜サンプル（Ｈａｄａｓｓａｈ社血液バンク）、健常ドナーからの新鮮全血（Ｈａｄａｓｓａｈ社血液バンク）、フィコール－パック（商標）プラス１．０７７（Ｃｙｔｉｖａ社製、カタログ＃ＧＥ－１７－１４４０－０３）、ヒトトラステインＦｃＸ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製、カタログ＃４２２３０２）、ＲＢＣ溶解緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、カタログ＃００－４３３３－５７）、ＰＢＳ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社製、カタログ＃２０－０２３－１Ａ）、ＥＤＴＡ（Ｓｉｇｍａ社製、カタログ＃Ｅ７８８９）、アジ化ナトリウム（Ｓｉｇｍａ社製、カタログ＃Ｓ２００２）、１０％のＢＳＡ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社製、カタログ＃０３－０１０－１Ｂ又はＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ社製、カタログ＃０３－０１０－１Ｂ）、アレクサフルオル６４７マイクロスケールタンパク質ラベリングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、カタログ＃Ａ３０００９）、ＲＰＭＩ１６４０（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ社製、カタログ＃０１－１００－１Ａ）、ＤＭＥＭ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ社製、カタログ＃０１－０５５－１Ａ）、ＦＣＳ（Ｇｉｂｃｏ社製、カタログ＃１２６５７－０２９）、トリプＬＥエクスプレス（Ｇｉｂｃｏ社製、カタログ＃１２６０４－１３）、グルタマックス（Ｇｉｂｃｏ社製、カタログ＃３５０５０－０３８）、ペニシリン－ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ社製、カタログ＃１５１１４０－１２２）。

【0635】

抗体 － ＢＶ４２１抗ヒトＣＤ４５（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製、カタログ＃３０４０３２）、ＡＰＣマウスＩｇＧ１ｋ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製、カタログ＃４００１２０）、ＡＰＣ抗ヒトＣＤ４７抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製、カタログ＃３２３１２４）。

【0636】

ヒトＰＢＭＣ及びＲＢＣ － ＰＢＭＣを、４つの新鮮軟膜サンプルからフィコール勾配により製造業者の説明書に従って精製した。４人の健常ドナーからの全血をＰＢＳ中で１：５００希釈し、ＲＢＣとみなした。

【0637】

細胞系 － 上記の実施例２に記載のとおり。ＨＬＡ－Ｇを過剰発現するＨＴ１０８０細胞はＧＦＰ陽性であることに留意されたい。

【0638】

ＣＤ４７発現 － ＲＢＣ、ＰＢＭＣ又はＨＴ１０８０ＨＬＡ－Ｇ細胞を、抗ヒトＣＤ４７抗体とインキュベートし、フローサイトメトリー（サイトフレックスＢ５３０００ サイトフレックスＢ５－Ｒ３－Ｖ５）により分析した。ＭＦＩ値を使用し、代表的なグラフをグラフパッドプリズムソフトウェアを用いて作出した。

【0639】

結合分析 －＿ＰＢＳ中で１：５００希釈された１００μＬ／ウェルの全血サンプル（約１×１０^６個のＲＢＣを含有するＲＢＣサンプルとみなされる）を、２５，０００～５０，０００個／ウェルの精製ＰＢＭＣ及びヒトＨＬＡ－Ｇを過剰発現する２５，００００～５０，０００個のＨＴ１０８０細胞の細胞（ＨＴ１０８０－ＨＬＡ－Ｇ）と混合した。混合された細胞を、アレクサフルオル６４７標識ＤＳＰ２１６－Ｖ１２の段階希釈物と４℃で３０分間インキュベートした。インキュベーション後、細胞を洗浄し、ＢＶ４２１抗ヒトＣＤ４５抗体で免疫染色し、フローサイトメトリー（サイトフレックスＢ５３０００ サイトフレックスＢ５－Ｒ３－Ｖ５）により分析した。ＭＦＩ値を使用してグラフパッドプリズムソフトウェア）を用いて結合曲線グラフを作出した。

【0640】

結果：
ＣＤ４７は、ＨＴ１０８０－ＨＬＡ－Ｇ細胞の表面上で高度に発現された（図７）。健常ドナーからのＰＢＭＣ及びＲＢＣの表面上ではＣＤ４７の低い発現レベルも検出された（図７）。アレクサフルオル６４７標識ＤＳＰ２１６－Ｖ１２の結合は、ＲＢＣ、ＰＢＭＣ及びＨＴ１０８０－ＨＬＡ－Ｇ細胞のミックスを使用するフローサイトメトリーにより決定した。抗ｈＣＤ４５抗体を使用してＲＢＣ（ＣＤ４５陰性細胞）及びＰＢＭＣ（ＣＤ４５陽性細胞）をゲーティングし、ＧＦＰを使用してＨＴ１０８０－ＨＬＡ－Ｇ細胞をゲーティングした。ＤＳＰ２１６－Ｖ１２はＨＴ１０８０－ＨＬＡ－Ｇ細胞に用量依存的様式で結合した一方、ＰＢＭＣへの結合はわずかであることが実証され、ＲＢＣへの結合は観察されなかった（図８のＡ～Ｂ）。

【0641】

実施例１１
ＬＩＬＲＢ１バリアントの設計
材料及び方法：
アラインメントアルゴリズムのブラストを使用してヒトＬＩＬＲＢ２（ユニプロット番号Ｑ８Ｎ４２３）及びＬＩＬＲＢ１（ユニプロット番号Ｑ８ＮＨＬ６）を比較する相同性分析を行った。

【0642】

続いて、ＷＴ ＬＩＬＲＢ１（配列番号１０２）の構造分析を行ってその安定性及びＨＬＡ－Ｇ（配列番号３）に対する結合親和性を最適化し、増加させ得るアミノ酸置換を同定し、それは以下のステップを含んでいた。
１．ＰＤＢ ＩＤ：２ＤＹＰ、３Ｄ２Ｕ複合体構造を使用するＬＩＬＲＢ１及びＨＬＡＧの両方の複合体構造の調製。
２．ＬＩＬＲＢ１及びＨＬＡ－Ｇ（図１４）ＰＤＢ ＩＤ：２ＤＹＰ（ＨＬＡ－Ｇ）及び３Ｄ２Ｕ（ＬＩＬＲＢ１）複合体構造間の潜在的な相互作用点を同定するための構造分析。
３．ＨＬＡ－ＧのＰｈｅ１９５［ＨＬＡ－Ｇに特異的として同定された、すなわち、ＨＬＡ－ＡにもＨＬＡ－ＢにもＨＬＡ－Ｃにも存在しない（図１のＤ）］と相互作用するＬＩＬＲＢ１界面中のアミノ酸の同定。
４．配列番号１０２に示すＬＩＬＲＢ１配列のＶ５５の突然変異の効果のインシリコ評価。

【0643】

結果：
ヒトＬＩＬＲＢ２（ユニプロット番号Ｑ８Ｎ４２３）及びＬＩＬＲＢ１（ユニプロット番号Ｑ８ＮＨＬ６）間、特にＤ１（Ｉｇ様Ｃ２タイプ１）ドメイン（それぞれ配列番号１０４及び１０５）において高い配列相同性を同定した（図１４）。興味深いことに、ＬＩＬＲＢ２及びＨＬＡ－Ｇ Ｐｈｅ１９５相互作用残基間の界面を定義するとして上記の実施例１において同定されたアミノ酸残基（配列番号１の残基Ｓ４５、Ｉ４９、Ｔ５０及びＶ５７）を含有する領域において極めて高い相同性が検出された。これは、本発明者らがＬＩＬＲＢ１の対応するアミノ酸（すなわち、配列番号１０２のＴ４３、Ｉ４７、Ｔ５０及びＶ５５）の突然変異も有意な正の影響、すなわち、結合エネルギーに対するより低いΔＧを有するか否かを評価することを促した。

【0644】

この目的のため、ＨＬＡ－Ｇ（配列番号３）－ＬＩＬＲＢ１（配列番号１０２）相互作用界面、特にＨＬＡ－Ｇ中のＰｈｅ１９５との相互作用界面の構造分析を実施した（図１５のＡ～Ｂ）。続いて、インシリコ分析は、ＬＩＬＲＢ１（配列番号１０２）の残基Ｖ５５の例えばアルギニン（Ｒ）への置換は、ＬＩＬＲＢ１／ＨＬＡ－Ｇ相互作用を安定化させる可能性が高いことを示した（図１５のＣ～Ｄ）。

【0645】

本発明をその具体的な実施形態に関して記載してきたが、多くの代替、改変及び変形が当業者に明らかであることが明白である。したがって、添付の特許請求の範囲の主旨及び広い範囲内に収まる全てのそのような代替、改変及び変形を包含することが意図される。

【0646】

本明細書において参照される全ての刊行物、特許及び特許出願は、個々の各刊行物、特許又は特許出願が参照される場合、それが参照により本明細書に組み込まれるべきであると具体的及び個別的に注記されるかのように、参照により全体として本明細書に組み込まれるべきであることが本出願人らの意図である。加えて、本出願における任意の参考文献の引用又は特定のいずれも、そのような参考文献が本発明の先行技術として利用可能であることを許容すると解釈されるものではない。セクションの見出しが使用される限りでは、それらは必ずしも限定的であると解釈されるべきでない。加えて、本出願のあらゆる優先権文献が参照により全体として本明細書に組み込まれる。

【図1-1】

【図1-2】

【図2A】

【図2B】

【図3A】

【図3B】

【図3C】

【図3D】

【図3E】

【図3F】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15-1】

【図15-2】

【配列表】

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【国際調査報告】